JP2534597B2 - プロ―ブ - Google Patents

プロ―ブ

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JP2534597B2
JP2534597B2 JP35948291A JP35948291A JP2534597B2 JP 2534597 B2 JP2534597 B2 JP 2534597B2 JP 35948291 A JP35948291 A JP 35948291A JP 35948291 A JP35948291 A JP 35948291A JP 2534597 B2 JP2534597 B2 JP 2534597B2
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祐輔 中村
督 斎藤
秀也 滝口
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GAN KENKYUKAI
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトVNTR配列を有
するプローブに関する。本発明のプローブは、親子鑑定
や犯罪捜査等における個人識別に利用することができ
る。
【0002】
【従来の技術】染色体DNAは生物種ごとに固有の塩基
配列を持つが、詳細に見ると同一種内でも固体間でわず
かに違いが見られる。これはDNA多型と呼ばれるが、
この多型が制限酵素の認識部位に出現した場合には制限
酵素による切断断片の大きさ(長さ)の違いとしてサザ
ンブロット法等により容易に検出することができるの
で、特に制限断片長多型(restriction f
ragment length polymorphi
sm、RFLP)と呼ばれる。従って、この制限断片長
多型を利用して、個人の識別が可能であり、親子鑑定や
犯罪捜査における個人識別に利用されている。動物DN
Aのタンパク質非コード領域中には、繰り返し頻度が変
化し易い直列型繰り返し配列が存在する。この配列を含
む制限断片は繰り返し配列の反復回数の違いにより、制
限断片長の多型を示す。この型のものはVNTR(va
riable number of tandem r
epeat)と呼ばれ(Science 235,16
16(1987))、個人識別などのDNA診断におい
て有力なマーカーとなっている。従来よりマーカーとし
て利用できる制限断片長多型を示すVNTRは多数知ら
れているが、同時利用できるマーカーの数が増えれば、
それだけ検査の精度は高まるので有効である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、制限断片長多型を示す新規なVNTR配列を有する
プローブを提供することである。
【0004】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研
究の結果、ヒトの第6染色体中にRFLPを示す新規な
VNTR配列を見出し、本発明を完成した。
【0005】すなわち、本発明は、ヒト6番染色体のp
21.3の位置に存在し、PstI及びPvuIIにより
制限断片長多型を示し、PstIに関して3.5kbか
ら2.8kbの間に少なくとも7個の対立遺伝子が存在
し、PvuIIに関して1.8kbから1.2kbの間に
少なくとも6個の対立遺伝子が存在し、 ・・・ CAGGCAGGGGCCGTGGGGGGGCCTGGGAGGCATTGCAAG GACCCAGGCTTTCCTCTGAGAGGAAAGGAAACCCTTGTG GCCAATTTCAAATCGGAAATGCGACTGGTCAACACACAC TGAAAAGGTCACTCTGGTGGCTCTGTTGAAAACGGACTG TCATGGGAGAGACATCTGGAACTGC (ただし、上記配列中、「・・・」は、 SWSSRSKMVGGGGCASYGSGGCCTGGCCAG(AGAG) (ただし、この配列中、SはG又はC、WはA又はT、
RはG又はA、KはG又はT、MはC又はA、VはA又
はC又はG、YはC又はTを示し、配列末尾の(AGA
G)はあってもなくてもよいことを示す)で示される配
列が1回以上繰り返していることを意味する)で示され
塩基配列を有するヒトVNTR配列(以下、cCI6
−7と呼ぶことがある)を有するプローブを提供する。
【0006】
【0007】
【0008】
【0009】
【0010】
【0011】
【0012】
【0013】
【0014】上述のように、本発明は、上記した特徴を
有するcCI6−7と命名したヒトVNTR配列を有す
るプローブを提供したものである。なお、本発明におい
て、「PstIに関して3.5kbから2.8kbの間
に少なくとも7個の対立遺伝子が存在する」とは、下記
説明から明らかなように、PstIで消化した場合に、
3.5kbから2.8kbの範囲内のサイズを有する、
サイズの異なる制限断片が少なくとも7種類存在すると
いう意味である。
【0015】上記ヒトVNTR配列は、後述の実施例に
おいて示すように、公知の方法(Am.J.Hum.G
enet.48,258(1991); Genomi
cs9,536(1991))により、ヒト6番染色体
を分析し、発見されたVNTRマーカーをクローニング
して得られたものである。
【0016】本発明のヒトVNTR配列は、そのDNA
鎖をプローブとして利用することにより固体識別等に用
いることができる。その利用方法は従来法と全く同様で
あり、該DNA鎖に周知の方法により標識を付すことに
より、サザンブロット法におけるプローブとして利用で
きる。また試料を予め遺伝子増幅法により増幅し、この
ようにして増幅したDNAを検出するプローブとしても
利用できる。
【0017】
【発明の効果】本発明により新規なヒトVNTR配列
有するプローブが提供された。本発明は、体識別等を
従来よりも高精度に行なうことに寄与する。
【0018】
【実施例】ヒト第6染色体のみを含むヒト×マウス雑種
細胞A9(neo6/t)よりDNAを抽出し、制限酵
素Sau3AIにて部分的に切断した後、ショ糖密度勾
配遠心を行ない、35−42kb分画を分取した。35
−42kbDNA断片は、Klenow酵素を用い、d
CTP、dTTPにて部分的に挿入した。
【0019】コスミドベクターはpWEX15を用い
た。これはpWE15(Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84,2160(1987))の
BamHI部位をKlenow酵素を用いて挿入した
後、リンカー(5´−CCTCGCGAGG−3´)を
用いて制限酵素XhoIの認識部位に変換したものであ
る。pWEX15は制限酵素XhoIにて切断した後、
Klenow酵素を用い、dCTP、dTTPにて部分
的に挿入した。
【0020】35−42kbDNA断片とベクターDN
A(pWEX15)を66mM Tris−HCl(p
H7.5)、6.6mM MgCl2 、0.1mM A
TP、10mM DTT、T4DNAリガーゼ存在下1
6℃で1晩ライゲーションを行ないin vitro
packaging extracts (Gigap
ack Gold)を用い、パッケージングを行なっ
た。
【0021】コスミドクローンを50μg/mlアンピ
シリンを含むLBアガープレート上に、10−15コロ
ニー/cm2 の密度になるように合計160,000個
まいた。32P標識したヒトDNAをプローブとしてコロ
ニーハイブリダイゼーションを行ない、ヒトDNAを含
んでいるコロニーを選択し、96穴マイクロプレートに
保存した。
【0022】各々のコスミドクローンから自動プラスミ
ド抽出システム(PI−100)を用いてDNA抽出し
た。このDNAをrandom hexanucleo
tide−priming法(Anal.Bioche
m.137,266(1984))にて32P標識し、プ
ローブとした。
【0023】互いに無関係な6人のヒトより抽出したD
NAを各々制限酵素MspI、TaqI、RsaI、B
glII、PstI、PvuIIにて切断し、サザンブロッ
トした。
【0024】プレハイブリダイゼーションは10%SD
S−7%ポリエチレングリコール(8000)、200
μg/mlヒト胎盤DNAを含む溶液にて65℃1晩行
なった。ハイブリダイゼーションは32P標識したDNA
プローブにて65℃16〜24hr行なった。ハイブリ
ダイゼーション後、フィルターを0.1×SSC−0.
1%SDS溶液で65℃2回洗浄後、Kodak XA
Rフィルムを用い、オートラジオグラフィーを行なっ
た。
【0025】RFLPを示したコスミドクローンについ
ては、ビオチン標識プローブによる蛍光in situ
ハイブリダイゼーションを行ない、染色体上の位置を決
定した。染色体標本は70%ホルムアミド−2×SSC
溶液中で70℃2分間処理した後、70%エタノール中
に入れ5分間、さらに100%エタノール中に入れ5分
間静置し脱水した。
【0026】コスミドDNAは、ニックトランスレーシ
ョンにより、ビオチン16−dUTP標識した。超音波
処理したニシン精子DNA、E.coli tRNAを
各々20μg加え、エタノール沈殿した後、ホルムアミ
ド溶液に溶解し、5−10倍量のヒト胎盤DNAを加え
75℃、10分間変性した。ビオチン標識したプローブ
を染色体標本上に滴下し、37℃で1晩ハイブリダイゼ
ーションを行なった。
【0027】標本は50%ホルムアミド−1×SSC、
2×SSCで各々37℃1回洗浄した後、1×SSCで
室温で15分間洗浄した。4×SSC、15μgFIT
C−アビジン/ml、1%BSA溶液下、37℃で45
分間処理し、4×SSC、4×SSC−0.1%Tri
tonX、4×SSCで各々10分間室温で洗浄した。
【0028】標本はpropidium iodide
処理した後、顕微鏡にて観察した。
【0029】VNTRを示したコスミドについては、T
7 Sequencing Kit(Pharmaci
a)を用い、塩基配列の決定を行なった。
【0030】結果 cCI6−7をプローブとしてハイブリダイズした時の
結果を図1に示した。PstIに関しては、3.5kb
から2.8kbの間に7個の対立遺伝子が存在し、6例
中4例で異型接合性を示した。PvuIIに関しては1.
8kbから1.2kbの間に6個の対立遺伝子が存在
し、6例中5例で異型接合性を示した。
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】cCI6−7については、シーケンシング
を行ない、繰り返し領域の塩基配列を決定した(図
)。繰り返し領域の共通配列は下記に示した。
【化1】
【0039】
【0040】
【0041】
【図面の簡単な説明】
【図1】cCI6−7をプローブとしてハイブリダイズ
した時の結果を示すオートラジオグラムの模式図。
【図2】cCI6−7の繰り返し領域の塩基配列を示す
図。

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ヒト6番染色体のp21.3の位置に存
    在し、PstI及びPvuIIにより制限断片長多型を示
    し、PstIに関して3.5kbから2.8kbの間に
    少なくとも7個の対立遺伝子が存在し、PvuIIに関し
    て1.8kbから1.2kbの間に少なくとも6個の対
    立遺伝子が存在し、 ・・・ CAGGCAGGGGCCGTGGGGGGGCCTGGGAGGCATTGCAAG GACCCAGGCTTTCCTCTGAGAGGAAAGGAAACCCTTGTG GCCAATTTCAAATCGGAAATGCGACTGGTCAACACACAC TGAAAAGGTCACTCTGGTGGCTCTGTTGAAAACGGACTG TCATGGGAGAGACATCTGGAACTGC (ただし、上記配列中、「・・・」は、 SWSSRSKMVGGGGCASYGSGGCCTGGCCAG(AGAG) (ただし、この配列中、SはG又はC、WはA又はT、
    RはG又はA、KはG又はT、MはC又はA、VはA又
    はC又はG、YはC又はTを示し、配列末尾の(AGA
    G)はあってもなくてもよいことを示す)で示される配
    列が1回以上繰り返していることを意味する)で示され
    塩基配列を有するヒトVNTR配列を有するプロー
    ブ。
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