JP2520852B2 - ピペット較正システム - Google Patents

ピペット較正システム

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JP2520852B2
JP2520852B2 JP5515059A JP51505993A JP2520852B2 JP 2520852 B2 JP2520852 B2 JP 2520852B2 JP 5515059 A JP5515059 A JP 5515059A JP 51505993 A JP51505993 A JP 51505993A JP 2520852 B2 JP2520852 B2 JP 2520852B2
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、実験室用ピペットなどの容器（vessel）の
容量を正確に測定するためのシステムに関し、特に、光
度計を用いてピペットの容量を測定する方法及び装置に
関する。
発明の背景 ピペットは、一般的に、少量の液体の測定及び移し変
えのために研究室にて使用される。ピペットの容量が正
確に知られていなければならない場合、ピペットの容量
を較正する必要がある。ピペットの容量較正のための多
くの従来技術が知られている。
従来の重量法では、水は、較正されるピペットから精
密ばかりの上に供給される。水の重量を計り、水の容量
はその重量を基礎として計される。この技術はピペット
の容量を正確に測量するが、正確に実行する場合費用が
嵩み且つ複雑である。少量のピペットを較正する場合、
必要とする秤は比較的高価である。更に、精度は、水の
蒸発作用、水温、周囲の大気圧、静電気、振動及び周囲
の空気の動きに対して変動しやすい。
ピペットの容量の較正の従来の側色技術では、キュベ
ットに所定量の水もしくは他の溶媒が供給される。単一
の染料を含む液体が、較正されるピペットからキュベッ
トへ移され、混合される。その後キュベットは分光光度
計内に配置され、液体の吸光度が測定される。ピペット
の容量はキュベットの液体の吸光度から較正される。
この技術では、光学的変化及び温度変化など不正確に
なりやすい。一般的に、染色溶液のひとつのアリコート
がキュベット内で水に加えられ、測定される。その後、
キュベット内の液体は捨てられ、同じ工程が数回繰り返
されて、繰り返し精度を確実にする。この工程は、比較
的不正確であり、且つ時間を要する。特に、読取り値間
の光度計内に単独のキュベットが再設置されるときの経
路の長さの偏差と同様、各キュベット間の経路の長さに
おける偏差が、不正確引き起こす。
第三の従来技術では、較正されるピペットを用いて酸
性溶液を収容体（container）に移す。その後、機械的
ビュレットを用いて表示染料（indicator dey）を含む
ベース溶液を収容体に加える。表示染料は、酸の濃度が
ベースの濃度と等しい場合、色が変化する。この時、加
えられたベースの容量は、機械ビュレットから読み取れ
る。この技術は、比較的難しく、且つ時間を要する。
発明の概要 本発明の第一の目的は、ピペットもしくは他の容器
（vessel）の容量を較正する改良された方法及び装置を
提供することである。
本発明の第二の目的は、光度計を活用するピペットの
容量を測定する試薬システムを提供することである。
本発明の第三の目的は、高精度にピペットの容量を測
定する方法及び装置を提供することである。
本発明の第四の目的は、測量に高精度のコンテナを必
要としない光度計によるピペットの容量を測定する方法
及び装置を提供することである。
本発明の第五の目的は、使用が容易であると共に安価
なピペットの容量を測定する方法及び装置を提供するこ
とである。
本発明によれば、光度計を用いるピペットなどの容器
の容量を測定する方法において、上記及びその他の目的
及び利点が達成できる。その方法は、第１の波長で最大
吸光度を有する基準溶液を収容する収容体（containe
r）を光度計内に配置する工程と、第１の波長及び第２
の波長において収容体の吸光度を測定する工程と、第１
及び第２の波長における測定された吸光度から第２の波
長における収容体の光路長を計算する工程と、較正され
る容器（vessel）から第２の波長において最大吸光度を
有する収容体（container）へサンプル溶液のアリコー
トを導き、サンプル溶液と基準溶液とを混合し混合物を
形成する工程と第２の波長において収容体内の混合物の
吸光度を測定する工程と基準溶液の既知の容量及び濃度
とサンプル溶液の既知の濃度に基づいて、混合物の吸光
度及び収容体の光路長からアリコートの容量を算出する
工程とを有する。ここにおけるアリコートの容量は容器
の容量に相当する。
ここでいう容器には、一般的にピペットが含まれる。
基準溶液は、好ましくは7.0pH緩衝液で溶解した硫酸銅
を含み、約730ナノメートル（nm）において最大吸光度
を有する。サンプル溶液は、好ましくは7.0pH緩衝液で
溶解したアシッドレッド１（Acid Red 1）からなり、約
520nmにおいて最大吸光度を有する。
好適な実施例において、サンプル溶液のアリコートを
収容体に収納する工程と、混合物の吸光度を測定する工
程と、容量を算出する工程とを繰り返し、収容体を空に
することなく、もしくは、光度計内の位置から収容体を
移動させることなく容器の容量の測定を何度も行う。
光路長を算出する工程は、好ましくは第１の波長にお
ける収容体の吸光度と第２の波長における収容体の吸光
度との差異のゼロオフセット表示により光路長を修正す
る工程を含む。光路長を算出する工程は、好ましくは第
１の波長における収容体の経路の長さと第２の波長にお
けるコンテナの経路の長さとの差異により光路長を修正
する工程を更に含む。
容量を算出する工程は、好ましくはベールの法則を用
いて容量を算出し、ベールの法則からの偏差により算出
された容量を修正する工程を含む。
一般的に、周囲温度は収容体の容量が決定される前に
測定される。容量を算出する工程は、好ましくは測定さ
れた周囲温度における吸光度と基準温度における吸光度
との差異により混合物の測定された吸光度を修正する工
程を含む。容量を算出する工程は、測定された周囲温度
における容量と基準温度における容量との差異により算
出された容量を修正する工程を更に含む。
また本発明によれば、光度計を用いてピペットなどの
容器の容量を測定するシステムが得られる。そのシステ
ムは、第１の波長において最大吸光度を有する所定濃度
の第１の物質を含む所定容量の基準溶液を収納し、光路
長を測定するため光度計内に配置する第１の収容体と、
第２の波長において最大吸光度を有する所定濃度の第２
の物質を含むサンプル溶液を収容する第２の収容体とを
有し、サンプル溶液のアリコートの較正される容器を第
２の収容体から第１の収容体へ移し、第２の波長におけ
る基準溶液とサンプル溶液との混合物の吸光度を測定
し、基準溶液の既知の容量及び濃度とサンプル溶液の既
知の濃度に基づいて、第１のコンテナの光路長と混合物
の吸光度とからアリコートの容量を測定する。ここにお
けるアリコートの容量は容器の容量に相当する。
また本発明によれば、光度計を用いてピペットなどの
容器の容量を測定するシステムが得られる。そのシステ
ムは、光度計と、光度計内に配された第１の波長におい
て最大の吸光度を有する所定容量の基準溶液を収容する
収容体とを有し、光度計は、第１の波長及び第２の波長
において基準溶液を収容する収容体の吸光度を測定する
手段を有する。
またそのシステムは、第１及び第２の波長において測
定された吸光度から第２の波長における収容体の光路長
を算出する手段を有し、光度計は、混合物を形成するた
めに較正される収容体で容器に移されたサンプル溶液の
アリコートと基準溶液を混合する手段を有する。
更にそのシステムは、混合物の測定された吸光度と収
容体の光路長とからアリコートの容量を算出する手段を
有する。ここのおけるアリコートの容量は容器の容量に
相当する。
本発明の更に別の局面によれば、所定の波長における
吸光度の測定に用いる収容体の光路長を測定する方法が
得られる。その方法は、所定の波長とは異なる第１の波
長で最大吸光度を有する基準溶液を収容する収容体を光
度計内に配置する工程と、第１の波長及び所定の波長に
おいて収容体の吸光度を測定する工程と、第１の波長及
び所定の波長における測定された吸光度から所定の波長
における収容体の光路長を計算する工程とを有する。
図面の簡単な説明 本発明及び本発明の更なる目的、効果ならびに可能性
についてより良く理解するために、以下、添付の図面を
参照して説明する。
図１は、本発明のピペット容量較正技術に用いるのに
適した光度計の斜視図である。
図２は、本発明によるピペット容量較正の光度計を用
いた試薬システムの略図である。
図３は、吸光度測量に用いられた光度計の光学を図示
した略図である。
図４は、光度計の主要な電気的構成要素のブロック図
である。
図５は、硫酸銅及びアシッドレッド１の吸光度スペク
トルを示す波長の関数である吸光度のグラフである。
図６は、本発明によるピペット容量較正の方法の工程
系統図である。
図７は、本発明に用いられた分光光度計内の共振周波
数混合器のブロック図である。
発明の詳細な説明 本発明によれば、光度計を用いて実験室用ピペットな
どの容器の容量を正確に測定したり、あるいは較正する
ための方法と装置が得られる。
その技術は、一般的に、サイズが５マイクロリットル
乃至500マイクロリットルの範囲内のピペットの容量を
較正するために用いられる。しかしながら、本発明はこ
の範囲外の容量を有する容器の較正に利用することがで
きる。ピペットの容量を測定するために必要な主要構成
部品は、光度計と較正試薬システムである。結果を記録
するのにプリンタを用いることが好ましい。
好適な光度計は図１、３及び４に示され、『起動時間
を短縮し共振振動数混合を減少した長寿命ランプを有す
る光度計（Photometer Having A Long Lamp Life,Redec
ed Warm−Up Period And Resonant Frequency Mixin
g）』と題され、1992年３月３日発行の米国特許第5,09
2,677号により詳しく説明されており、その全てが参照
できる。
図１に示された光度計器具10は、波長の選択可能な光
度計であり、ピペット容量較正に必要な混合及び測光の
能力を備える。器具は、キーパッド30により操作され、
文字数字ディスプレイ31、ケーブル29に接続されたプリ
ンタ70（図４）、及び各較正測定過程及び結論時の特定
点において視聴覚的な信号を通して、オペレーターへ情
報が伝達される。
ヒンジ付き蓋41は、分析される溶液を収容するキュベ
ット27（図３）を覆う。キュベット27は、蓋41下方区画
内にあるホルダ28に収納されている。これにより、サン
プルがピペット26から直接光度計内にあるキュベットに
加えられる。
光度計の光学部品23の回路図を図３に示してある。ラ
ンプ44により発生した光は、レンズ46により光線が平行
になるようコリメート（collimated）され、窓49は小径
のコリメートされたビームへ光線を制限する。ランプは
タングステンフィラメント電球で、クリプトン、あるい
はアルゴンなどの不活性ガスで満たされている。このラ
ンプは起動時間が短縮されており、不活性ガスはフィラ
メント45からのタングステン原子の蒸発を最小にし、こ
れにより操作温度をより高温にする。
ビームはフィルタ40内を通り、このフィルタ40のより
実験を行なうのに適した波長を選択される。フィルタ40
はフィリタホイール37に設置された多数のフィルタのう
ちの一つである。フィルタホイール37は、フィルタホイ
ールモータ39によりシャフト38を軸に回転する。
次に、光ビームは、部分的に反射するビームスプリッ
タ50により二つに分離する。ビームスプリッタは、レン
ズ47を介して基準光電検出器51へ約10パーセントのビー
ムを反射する。ビームの90パーセントは、ビームスプリ
ッタ50を透過し、更に、キュベットホルダ28内のキュベ
ット27内に収納された溶液11内を通過する。
光ビームの一部は溶液内に吸収され、残部はレンズ48
を介して光電検出器52へ送られる。ランプ44の強度はフ
ィードバック制御回路53により調節される。フィードバ
ック制御回路は基準光電検出器51から入力を受け、滑ら
かで実質的な指数カーブにおける最終的に安定した値に
漸近的に近づくように光源強度を制御する。キュベット
27における溶液11の吸光度は、光電検出器51及び52の出
力との比較により測定される。
その出力がされている時間内に光源強度における差異
を補正するため、光源強度が最終安定値へ到達する間
に、基準光電検出器の出力とサンプル光電検出器の出力
とは異なった時期に行われる。
光度計の電子部のブロック図を図４に示してある。光
電検出器51及び52の出力は、各々前置増幅器61及び62、
及びマツチプレクサ64を通じてADコンバータ66へ出力さ
れる。ADコンバータ66は、精選された光電検出器出力を
デジタル化し、入力はマイクロプロセッサ68へ入力され
る。
マイクロプロセッサ68は光電検出器51及び52から吸光
度測定を受け、以下に詳細に述べるようにピペットの容
量を算出する。さらに、マイクロプロセッサ68は統計値
を算出し、プリンタ70へ出力する。
ピペット較正の実施に適した試薬システムを図２に概
略的に示してある。多数のブランク試薬キュベット78
は、図３中のキュベット27に対応する。各キュベット78
は以下に述べるように所定容量の基準溶液を収容する。
コンテナ80、81及び82は、所定の濃度のサンプル溶液を
収容する。異なる濃度のサンプル溶液は異なるサイズ範
囲のピペットを測定するために用いられる。
好適な実施例では、コンテナ82は、５マイクロリット
ル乃至20マイクロリットルの範囲のピペットの為のサン
プル溶液を収容し、コンテナ80は21マイクロリットル乃
至100マイクロリットルの範囲のピペットの較正のため
のサンプル溶液を収容する。
また、コンテナ81は、101マイクロリットル乃至500マ
イクロリットルの範囲のピペットを測定するために用い
られる。
試薬システムはさらに器具較正溶液Ａ、Ｂ、Ｃを収容
するコンテナと、使い捨てピペットと、サンプルアリコ
ートコンテナとを有する。
試薬システムと測定技術とは、以下に示すベースの法
則の応用に基づく。
Ａ＝Clε （１） 上記式においてＡは溶液の吸光度、Ｃは吸光原種（abso
rbing species）の濃度、Ｌは溶液内を通る光の経路の
長さ、εは吸光原種のモル吸収率を各々示す。以下に述
べるように、光度計により行われる吸光度測定は容量を
測定するために用いられる。
較正システムは、基準溶液とサンプル溶液との二種類
の試薬を用いる。基準溶液は溶液状態のエチレンジアミ
ン四酢酸を有する7.0pHの緩衝液に溶解した硫酸銅から
成る。図２に示したブランク試薬キュベット78はちょう
ど3.5ミリリットルの基準溶液により予め満たされ、堅
固に蓋がされている。サンプル溶液は、7.0pH緩衝液に
溶解したアシッドレッド１である。前述したように、ピ
ペット容量の範囲を較正を可能とするサンプル溶液の濃
度は３種類ある。
基準溶液及びサンプル溶液は、染料を含有し、正確な
ピペット容量較正を行う為に共に機能する。図５に示す
ように、染料の吸光度ピークは異なる。図５のカーブ90
が示すように硫酸銅（染料Ｂ）の吸光度は約730nmにお
いてピークに達する。カーブ92が示すようにアシッドレ
ッド１（染料Ａ）は吸光度は約520nmにおいてピークに
達する。さらにこれらの吸光度スペクトル間にオーバー
ラップはほとんどない。520nmにおいて硫酸銅の吸光度
は相対的に小さく、730nmにおいてアシッドレッド１は
相対的に小さい。
本発明によるピペット容量を測定する技術は、一般
に、測定される溶液を収容するための光度計内に配置さ
れるキュベットの光路長の最初の測定に基づく。キュベ
ット壁の厚みと吸光度が光路長に影響をもたらすことは
理解され得る。実際、許容コストのキュベットは、光路
長が約２パーセント変わることが分かる。さらに、キュ
ベットは完全には丸くないので、光度計内の配置方向に
より光路長は変わる。ピペット容量を誤差１パーセント
以下の精度で測定することが望まれるため、キュベット
を光度計内の所定の配置方向に位置づけた時点で、各キ
ュベットの光路長を測定する必要がある。
キュベットの光路長を測定した後、較正されるピペッ
ト容量が測定される。一般に、容量測定技術は、較正さ
れるピペットにより、キュベット内に移し替えられたサ
ンプル溶液によるキュベット内の基準溶液の希釈に基づ
く。キュベットに移し替えられたサンプル溶液のアリコ
ートは、ピペットの容量に対応する。基準溶液とサンプ
ル溶液とは混合され、混合物の吸光度はサンプル溶液が
最高の吸光度を有する時点の波長において測定される。
混合物の吸光度の増大は、較正されるピペットから加え
られるサンプル溶液の容量による。ピペット容量を較正
する技術を以下に詳細に述べる。
本発明による容量較正手順の工程系統図を図６に示
す。まずステップ102において、測定されるピペットの
標準容量（nominal volume）とシリアルナンバーとをキ
ーパッド30を介して入力する。この情報は、その後較正
の結果をプリントする際に利用される。次にステップ10
4において、光度計は自動較正を行う。その間、後の利
用の為周囲温度を測定し、記憶する。光度計は周囲温度
測定のためサーミスターを有する。次にステップ106に
おいて、使用者はヒンジ蓋41を介してブランク試薬キュ
ベット78を光度計に注入する。ブランク試薬キュベット
78は光度計内の図３に示すキュベット27の位置に配置さ
れる。
従って、光ビームはキュベットとその中に収容された
溶液を通過する。上述したようにブランク試薬キュベッ
ト78は、7.0pHの緩衝剤に溶解した所定の容量の硫酸銅
を収容する。硫酸銅は一般的に.003350モルの既知の濃
度を有する。光度計はステップ108において、730nm、及
び520nmにおいてブランク試薬キュベットの吸光度を測
定する。次にステップ110においてゼロが算出され、ス
テップ112においてブランク試薬キュベット78の経路の
長さが算出される。
好適な実施例においてブランク試薬キュベット78は、
名目経口（nominal daiameter）が21ミリリットルのホ
ウケイ酸ガラス薬びんである。経路の名目長（nominal
pathlength）は18.4ミリリットルである。「キュベッ
ト」という語と「薬びん」（vial）という語とはここに
おいて交換でき、吸光度測定のため光度計に配置される
収容体（container）を指す。
上述したように、経路の長さには２パーセントの許容
範囲があり、薬びんは完全には丸くない。従って、測定
された経路の長さは光度計内の薬びんの配置方向によ
る。
経路の長さの規格の精度の低さは、それが精確でない
ときに容量較正の全体的な精度を悪くする。この不正確
さに対処するために選択された技術は、使用の為に光度
計内に配置された時に各薬びんの経路の長さを測定する
ことである。従って経路の長さの偏差は、光度計内の薬
びんの配置方向と直径とに依存し、結果が算出されると
きに考慮される。
各薬びんの光路長は以下の方法により個別に測定され
る。上述したように硫酸銅染料溶液は730nmにおいて吸
光度がピークに達し、ブランク試薬キュベット78内の基
準溶液として利用される。波長520nmにおける硫酸銅の
吸収はかなり小さい。キュベットが光度計内に配置され
た後、吸光度測定はこれら二つの波長において行われる
（ステップ108）。二つの波長における吸光度測定の差
異は、上述の式（１）で得られるベールの法則による吸
光率の差異と関連する。これらの値は次のように経路の
長さｌを求めるために用いられる。
上記式において、ｌは光路長を、A730は730nmにおけ
る吸光度の測定値を、A520は520nmにおける吸光度の測
定値を、CBは染料Ｂ（硫酸銅）の既知濃度を、εB2及び
εB1は各々波長が730nm及び520nmにおける吸光率を示
す。
算出された光路長に対してわずかな修正が二度行わ
れ、より正確な測定がなされる。最初の修正がゼロオフ
セットにより行われる。薬びんそれ自体の吸光は二つの
波長においてわずかに異なる。従って7.0pHの純粋な緩
衝剤で満たされた薬びんも520nmと730nmとの間で異なる
吸光度を示す。一般に吸光度の差異は約0.01である。こ
の測定値には器具による偏差もわずかに含まれる。
ゼロオフセットは光度計を作動にした時点ごとに測定
される。ディスプレイ31は使用者にCAL A較正薬びん83
（図２）を挿入するよう指示する。
CAL A較正薬びんは染料を含まない7.0pHの純粋な緩衝
剤を収容する。吸光度の差異（ゼロオフセット）、Aoff
は後で当日中に使用されるために測定され、記憶され
る。ゼロオフセットは作動時にブランク試薬キュベット
の測定された吸光度を修正するために用いられ、次の式
により正確な経路の長さが得られる。
ブランク試薬キュベット78はCAL A較正薬びん83と同
じゼロオフセット（0.001以内）を有すると仮定され
る。
二番目の修正は、薬びんの効果的な光路長が測定波長
に依存している事実を説明する。薬びんが丸いため、及
び薬びんに入り込む光ビームがかなり広く（約直径４ミ
リメートル）、薬びんに入り込む時も薬びんから出る時
もガラスを空気との境界において屈折させられるため、
この依存関係が起きる。屈折の総量は、測定波長におけ
るガラスの屈折の率による。波長への光路長の依存は以
下に述べるように測定されて、経路の長さの算出に用い
られる修正率Ｆλcorrを供給する。修正率Ｆλcorrが測
定されると、その値は全ての較正算出に適用される。そ
の値は各薬びん間で一致し、薬びんの製造に用いられた
ガラスの種類のばらつきにのみ依存するので、各薬びん
の修正率を再測定する必要はない。520nmにおける光路
長は次の式により得られる。
修正率Ｆλcorrは以下のように測定される。光路長が
機械測定で0.1パーセントであると知られた高精度の矩
形ガラスキュベットが用いられた。730nmにおいて吸光
度がピークへ達する染料Ｂ硫酸銅の溶液は、矩形キュベ
ット及び標準丸型薬びんへ導入された。矩形キュベッ
ト、及び丸型薬びんは、730nmにおいて吸光度が測定さ
れた。次に520nmにおいて染料Ａアシッドレッド１を用
いて実験は繰り返された。矩形キュベットはよりコリメ
ートされた光ビームに対して垂直な平面を有するので、
矩形キュベットにおいては730nmと520nmとの間における
経路の長さに差異は生じないと仮定された。以下の式に
より所望の修正率が得られる。
上記式においてＡ丸型（520）、及びＡ矩形（520）、
及びＡ矩形（730）、及びＡ丸型（730）は矩形キュベッ
ト、及び丸型薬びんの示された波長における吸光度測定
値を示す。この全部で５回の測定の結果はＦλcorr＝1.
0082±0.0002である。結果の精度がかなり減少するた
め、実験中に矩形キュベットあるいは丸型薬びんの移動
を防止するよう配慮された。光度計内に薬びんとキュベ
ットとを配置したまま、全溶液がピペットにより注入及
び排出された。
ブランク試薬キュベット78の中身は、ステップ108に
おいて吸光度が測定される前に混合される。粒子が存す
るとこれにより粒子はかき回され、従ってそれは520ナ
ノメートルにおいてゼロ測定に含まれる。薬びん詰手順
には薬びん内の微粒子をさけるために十分な注意が必要
であるが、多生の粒子が存在することは避けられない。
ゼロ測定は次の測定と全く同じ状態で行うことが重要で
ある。吸光度測定の結果はＡ（０）であり、CAL A読み
取り値に対して表示される。CAL A読み取り値は器具を
オンにした当日早くに測定されたものである。以下の三
つの理由によりその値はゼロではない。
ａ） CAL A薬びんと容量較正の間吸光測定に用いられ
た薬びんとは、ガラス壁において不規則性を有する。二
つの異なる薬びんあるいは回転後の同じ薬びんでさえも
のゼロ読取り値は、0.01異なる。この差異をA0と読ぶ。
ｂ） CAL A薬びんが読取られてから干渉時間にわたり
光度計上のゼロはドリフトする。器具ドリフトはA0に含
まれる。
ｃ） 硫酸銅のブランク溶液は、CAL A薬びん内の純粋
な7.0pH緩衝剤の吸光度に対してεB1CBLにより得られた
520nmにおける低い吸光度を有する。従って、A0は次の
式により与えられる。
A0＝Ａ（０）−εB1CBL （６） 以上述べたように薬びんの経路の長さが測定された
後、ピペット容量の測定が行われる。図６を再び参照す
ると、ステップ114において、容量P1を有する較正され
るピペットは、濃度がCAで、吸光率が520nmにおいてε
A1の染料Ａアシッドレッド１を含有するサンプル溶液の
アリコートを光度計内のブランク試薬キュベット78に注
入するために用いられる。
ステップ116において、薬びん内のサンプル溶液と基
準溶液とは、光度計内で混合され混合物を形成する。
光度計内の薬びんの配置方向はこの過程の間変えない
のでA0が変化する理由はない。薬びんは最初容量VBの基
準溶液を含有する。この基準溶液は濃度がCBで、吸光率
が520nmにおいてεB1の染料Ｂ硫酸銅を有する。520nmに
おける混合物を収容する薬びんの吸光度Ａ（１）は次の
式により得られる。
吸光度Ａ（１）はステップ118において光度計内で測
定される。測定された吸光度は以下に述べるステップ12
0においてベールの法則により偏差が修正される。次に
他の全ての修正（すなわち温度等）は、ステップ122に
おいて実行され、ピペット容量は算出される。ピペット
容量P1は式（７）により測定される容量である。反応式
（６）、及び（７）を解き、以下の式によりP1が得られ
る。
反応式（８）の右側の全ての値は既知であるか、すで
に測定されたものであり、従ってピペット容量P1を算出
することができる。
ピペット容量P1が算出された後、容量測定過程は所定
の回数繰り返される。これはピペット操作の繰り返し精
度を実証するため、またピペット容量をより正確に測定
するために行われる。一般に容量測定は10回行われる。
最初の容量測定はステップ122において完了し、ステッ
プ124において多数のサンプル読取り値が照合される。
サンプル読取りが10回完了する前に、較正されるピペッ
トは、サンプル溶液の第二アリコートP2を光度計内のブ
ランク試薬キュベット78に移し替えるのに用いられる。
重要なことは、ブランク試薬キュベット78は容量測定の
間、空ではなく、光度計から取り外されたりもしない。
従って、光路長はキュベットの回転、その他の動作によ
って変化しないことが保証される。これでキュベットは
容量P1＋P2のサンプル溶液を収容する。第二サンプル溶
液の容量P2は以下の式により算出される。
Ａ（２）は容量P1＋P2のサンプル溶液が加えられた後
の薬びんの吸光度測定値である。P1は既知なのでP2は算
出できる。所望の回数ピペット容量が測定されるまでこ
の過程は繰り返される。基準溶液に加えられるピペット
容量の限界は、ａ）キュベットの中身の吸光度がＡ＝1.
7を越えない、または光度計の非線形性（linearity）が
過大である、あるいはｂ）キュベットの中身が8.5ミリ
リットルを越えない、または混合が十分に行われず均質
性を確保できないことである。
全容量が測定された後、ステップ126において統計値
が算出される。統計値は平均値と標準偏差と変動係数と
を有する。結果はピペット製造番号、名目容量、個別容
量の読取り値と統計値とを有し、ステップ128において
プリントされる。次に使用者はキュベットを光度計から
取り外し、この結果光度計は次の容量較性シーケンスの
準備を行う。
ベールの法則の古典的なフォームが上記の式（１）で
得られる。これは、広い範囲にわたる数多くの吸光原種
に関しては正確である。しかしながら、一般的にこれは
近似値を求めるのみに適用され、精密ではない。基準溶
液に硫酸銅を用いると共にサンプル溶液にアシッドレッ
ド１を用いた上述の試薬システムにおいて、ベールの法
則から僅かな偏差が生じ、それらは測定され修正され
る。
測定された吸光度読取り値に適用される修正がない場
合、算出されたピペット容量が流れの終端に向かって顕
著な減少を示す。例えば、100マイクロリットルピペッ
トの容量較正において、最初のサンプルの計算されたピ
ペット容量は、104.36マイクロリットルであり、測定さ
れた吸光度は、0.2254であった。一方、10番目に算出さ
れたサンプルのピペット容量は、101.06マイクロリット
ルであり、測定された吸光度は、1.700であった。デー
タの分析により、吸光度の測定値が約１より高い吸光度
における予想値から下がることを示す。
データにおけるこの傾向には２つの理由が考えられ
る。ひとつは、ベールの法則からの偏差であり、２つめ
の理由は、器具に誤差がある（not linear）からであ
る。
器具に誤差がある第一の理由は、迷光である。多くの
実験により、観測された結果は、器具に誤差があること
よりもむしろベールの法則からの偏差を表すことを示し
た。この様にして、１以上の吸光度における正確なピペ
ット較正データを得るため、ベールの法則が修正され
る。
修正の方程式が、多くの実験における平均時の結果の
最善なリニアリティを得る目的で実験に基づいて決定さ
れる。吸光度Ａが測定されるごとに、修正吸光度ACが次
の式で計算される。
Ac＝K2A2＋K1A＋K0 （10） 上記式におけるK0、K1およびK2は、各範囲のデータに
最も適合するものにより測定される。K0、K1およびK2の
値は、下記の表Ｉから得る。修正された吸光度ACはすべ
てのピペット容量計算において用いられる。
ピペット較正システムに用いられる染料Ａ及びＢは、
吸光度の温度依存性を有する。温度依存性は、温度調整
キュベットホルダを備えるバリアンクレイモデル（Vari
an Cary Model）219分光光度計を用いて両方の染料につ
いて測定される。両方の吸光度は、15℃乃至30℃の範囲
で測定される。吸光率の温度依存性が次の一次方程式で
あることが分かった。
ε（Ｔ）−ε15｛１＋Ｋ（Ｔ−15）｝ （11） 上記式において、ε（Ｔ）は温度Ｔにおける吸光率の
値を示し、ε15は15℃における吸光率の値を示し、Ｋは
定数である。Ｋの決められた値は、KA＝＋0.01％／℃お
よびKB＝＋0.14％／℃である。ピペット較正の間使用さ
れるときの染料の温度は、光度計と同じ周囲温度で格納
される必要により測定される。光度計は、ステップ104
における容量較正の開始時における周囲室内温度を正確
に計り、染料の温度も計る。
周囲温度Ｔで計されたすべての生吸光度データ（raw
absorbance data）は、次の式を用いて25℃に修正され
る。
染料の濃度は調整されるので、正確なピペット較正の
結果（温度修正要素の適用なし）が、周囲温度25℃で得
られる。薬びんは、3.5378グラムの染料Ｂ溶液で満たさ
れ、25℃で3500マイクロリットルを有する。
容量較正時における染料Ｂの容量は、次の式による温
度に依存する。
VB（Ｔ）−VB（25゜）｛１＋KV（Ｔ−25）｝ （13） 上記式において、VB（25゜）＝3500マイクロリットル
であり、KV＝2.32X10−4/℃である。VB（Ｔ）は、算出
されピペット容量の較正に用いられる。KVの容量は、
「物理学および化学のハンドブック」（Handbook of Ph
ysics and Chemistry）から得らる水の容量膨張係数と
等しくなるように取られなければならない。
温度の影響のため容量較正システムを修正するため
に、次の２つの修正作業が必要である。ａ）吸光率の温
度依存性のため両方の染料を修正する、ｂ）温度依存性
のため染料Ｂの容量を修正する。これらの係数により、
容量較正システムは、18℃乃至28℃の温度範囲で0.5％
の一般精度内に修正されることが実験で分かった。
図７は、前述した米国特許第5,092,677号に開示され
ているような好適な共振周波数混合装置を示すブロック
図である。光度計内にある間のキュベット27の中身を共
振周波数混合するために、完全な光学アセンブリ23（図
３に図示）は、リーフスプリング24に設置されており、
光学アセンブリ23には器具ベースプレート25上に支持ア
ーム71を介して取り付けられ、勃起された電気磁石65に
反応する永久磁石64が固定されている。
電気磁石と永久磁石との電磁気的連携により、光学ア
クセンリ23は矢印73の方向に振動する。電気磁石65は、
キュベットの中身を最適に混合するための共振周波数で
光学アセンブリを23を駆動するように勃起される。
上述したように、染料Ｂは730nmの最大吸光度を有す
る硫酸銅を有し、染料Ａは520nmの最大吸光度を有する
アシッドレッド１からなる。本発明の範囲内において、
他の染料の組み合わせでもよい。一般的に、染料Ａおよ
び染料Ｂの選択には、使用者の安全、環境の安全、安定
性、染料と染料Ｂとの反応の欠如、可視波長範囲内の最
大吸光度および吸光度スペクトルの比較的少ないオーバ
ーラップが必要となる。測定波長は、一般的に染料Ａと
染料Ｂの最大吸光度に応じて選択される。さられ、図
１、３および４に示され上述された光度計が必ずしも必
要であるとは限らない。正確な吸光度測定が可能な器具
であれば、本発明の範囲内で使用可能である。光度経路
の長さ及び容量を計算するのに用いるマイクロプロセッ
サは、必要であれば光度計と別に設けることが可能であ
る。
本発明の好ましい実施例を考慮して図示および説明し
たが、添付の特許請求の範囲に規定された本発明の範囲
を逸脱することなく様々な変更および修正が成し得るこ
とは当業者により明白である。

Claims (30)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）第１の波長で最大吸光度を有する基準
    溶液を収容する収容体を光度計内に配置する工程と、 ｂ）前記第１の波長および第２の波長において前記収容
    体の吸光度を測定する工程と、 ｃ）前記第１および第２の波長における測定された吸光
    度から前記第２の波長における前記収容体の光路長を計
    算する工程と、 ｄ）較正される容器から前記第２の波長において最大吸
    光度を有するサンプル溶液のアリコートを前記収容体へ
    導き、前記サンプル溶液と前記基準溶液とを混合し混合
    物を形成する工程と、 ｅ）前記第２の波長において前記収容体内の前記混合物
    の吸光度を測定する工程と、 ｆ）前記混合物の吸光度および前記収容体の光路長から
    アリコートの容量を算出し、前記アリコートの容量は容
    器の容量に相当する工程と を有する光度計を用いる容器の容量を測定する方法。
  2. 【請求項２】ｄ）乃至ｆ）までの工程を繰り返し、前記
    収容体を空にすることがなく、もしくは、前記光度計内
    の位置から収容体を移動することなしに容器の容量の測
    定を繰り返す工程を有する請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】基準溶液を収容する収容体を配置する工程
    は、緩衝液内で溶解した硫酸銅を有する基準溶液の使用
    を含み、前記基準溶液は約730nmで最大吸光度を有する
    請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】サンプル溶液のアリコートを導く工程は、
    緩衝液内で溶解したアシッドレッド１を有するサンプル
    溶液の使用を含み、前記サンプル溶液は約520nmで最大
    吸光度を有する請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】光路長を算出する工程は、前記第１の波長
    における前記収容体の吸光度と前記第２の波長における
    前記収容体の吸光度との差異のゼロオフセット表示に関
    し光路長の修正を含む請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】光路長を算出する工程は、前記第１の波長
    における前記収容体の経路の長さと前記第２の波長にお
    ける前記収容体の経路の長さとの差異に関し光路長の修
    正を含む請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】容量を算出する工程は、ベールの法則を用
    いた容量の算出、及び、ベールの法則からの偏差により
    算出された容量の修正を含む請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】周囲温度を測定する工程を更に有し、容量
    を算出する工程は、測定された周囲温度における前記混
    合物の吸光度と基準温度における前記混合物の吸光度と
    の差異による前記混合物の測定された吸光度の修正を含
    む請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】周囲温度を測定する工程を更に有し、測定
    された周囲温度における容量と基準温度における容量と
    の差異により算出された容量を修正する工程を含む請求
    項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記容器は、ピペットを含む請求項１記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】光度計を用いて容器の容量を決定するシ
    ステムであって、 第１の波長において最大吸光度を有する所定濃度の第１
    の光吸収物質を含む所定容量の基準溶液を収容し、光路
    長を決定するため光度計内に配置する第１の収容体と、 第２の波長において最大吸光度を有する所定濃度の第２
    の吸収物質を含むサンプル溶液を収容する第２の収容体
    とを有し、 アリコートの容量を測定するために、サンプル溶液のア
    リコートの較正される容器を第２の収容体から第１の収
    容体へ移し、 アリコートの容量は収容体の容量に相当する光度計を用
    いて容器の容量を測定するシステム。
  12. 【請求項１２】前記第１の収容体は、アリコートの多数
    回の移動を行える容積を有する請求項11記載のシステ
    ム。
  13. 【請求項１３】前記第２の収容体は、ピペットを用いる
    前記第１の収容体にアリコートの多数回の移動のために
    十分なサンプル溶液を収容する請求項11記載のシステ
    ム。
  14. 【請求項１４】前記基準溶液は、緩衝液内で溶解した硫
    黄銅を有する請求項11記載のシステム。
  15. 【請求項１５】前記サンプル溶液は、緩衝液内で溶解し
    たアシッドレッド１を有する請求項11記載のシステム。
  16. 【請求項１６】前記容器は、ピペットを含む請求項11記
    載のシステム。
  17. 【請求項１７】光度計と、 前記光度計内に配された第１の波長において最大の吸光
    度を有する所定容量の基準溶液を収容する収容体と、 前記光度計は、前記第１の波長および第２の波長におい
    て基準溶液を収容する前記収容体の吸光度を測定する手
    段を有し、 前記第１および第２の波長において測定された吸光度か
    ら前記第２の波長における前記収容体の光路長を算出す
    る手段とを有し、 前記光度計は、混合物を形成するために、較正される容
    器により前記収容体に移されたサンプル溶液のアリコー
    トと前記基準溶液を混合する手段を有し、 前記混合物の測定された吸光度と前記収容体の光路長と
    から、前記容器の容量を表すアリコートの容量を算出す
    る手段とを有する容器の容量を測定するためのシステ
    ム。
  18. 【請求項１８】前記収容体は、アリコートの複数回の移
    送を行える容量を有する請求項17記載のシステム。
  19. 【請求項１９】前記算出手段は、アリコートの複数回の
    移送に基づき容量算出を行える請求項17記載のシステ
    ム。
  20. 【請求項２０】前記光路長を算出する手段は、前記第１
    の波長における前記収容体の吸光度と前記第２の波長に
    おける前記収容体の吸光度との差異のゼロオフセット表
    示により光路長を修正する手段を含む請求項17記載のシ
    ステム。
  21. 【請求項２１】前記光路長を算出する手段は、前記第１
    の波長における前記収容体の経路の長さと前記第２の波
    長における前記収容体の経路の長さとの差異により光路
    長を修正する手段を含む請求項17記載のシステム。
  22. 【請求項２２】前記容量を算出する手段は、ベールの法
    則を用いて容量を算出する手段と、ベールの法則からの
    偏差により算出された容量を修正する手段とを含む請求
    項17記載のシステム。
  23. 【請求項２３】周囲温度を測定する手段を更に有し、前
    記容量を算出する手段は、測定された周囲温度における
    前記混合物の吸光度と基準温度における前記混合物の吸
    光度との差異により前記混合物の測定吸光度を修正する
    手段を含む請求項17記載のシステム。
  24. 【請求項２４】周囲温度を測定する手段を更に有し、前
    記容量を算出する手段は、測定された周囲温度における
    容量と基準温度における容量との差異により算出された
    容量を修正する手段を含む請求項17記載のシステム。
  25. 【請求項２５】前記基準溶液は緩衝液内で溶解した硫酸
    銅を有し、前記基準溶液は約730nmで最大吸光度を有す
    る請求項17記載のシステム。
  26. 【請求項２６】サンプル溶液は緩衝液内で溶解したアシ
    ッドレッド１を有し、前記サンプル溶液は約520nmで最
    大吸光度を有する請求項25記載のシステム。
  27. 【請求項２７】前記容器は、ピペットを含む請求項１記
    載の方法。
  28. 【請求項２８】所定の波長における吸光度の測定に用い
    る収容体の光路長を測定する方法であり、 前記所定の波長とは異なる第１の波長で最大吸光度を有
    する基準溶液を収容する工程と、 前記第１の波長および前記所定の波長において前記収容
    体の吸光度を測定する工程と、 前記第１の波長および前記所定の波長における測定され
    た吸光度から前記所定の波長における前記収容体の光路
    長を算出する工程と、 前記収容体にサンプル溶液を加え、所定の波長における
    収容体内のサンプル溶液の吸光測定を少なくとも一度行
    う工程と、 光度計から前記収容体を取り除き、光度計内に別の収容
    体をその直後に配置し、上述の工程を繰り返す工程とを
    有する光路長を測定する方法。
  29. 【請求項２９】前記光路長を算出する工程は、前記第１
    の波長における前記収容体の吸光度と前記所定の波長に
    おける前記収容体の吸光度との差異のゼロオフセット表
    示により光路長を修正する工程を含む請求項28記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】前記光学経路の長さを算出する工程は、
    前記第１の波長における前記収容体の経路の長さと前記
    所定の波長における前記収容体の経路の長さとの差異に
    よる光路長の修正を含む請求項28記載の方法。
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