CN110449197A - 一种移液器容量的校准方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种移液器容量的校准方法，该方法采用紫外可见分光光度法对移液器的容量进行校准，采用单染色模式对1μL以上的容量校准，通过标准工作曲线和溶液在特定波长下的吸光度，计算出移液器在待校准点的容量；采用双染色模式对1μL以下的容量校准，测量时采用微孔比色板，双染色模式中的稀释液体积通过测量溶液在730nm下的吸光度换算得到，消除了稀释液的添加过程引入的不确定度，提高了测量准确度。本发明相对于现有技术，一方面，克服了衡量法中液体自然蒸发的影响，降低了对环境条件的要求；另一方面，通过单染色和双染色模式，同时实现了1μL以上与1μL以下容量的准确校准，能够满足不同准确度等级下的校准需求。

Description

一种移液器容量的校准方法

技术领域

本发明涉及移液器技术领域，尤其涉及一种移液器容量的校准方法。

背景技术

移液器作为常用的微量液体容量计量器具之一，由于携带方便，操作简单，移液器被广泛用于医院、卫生防疫站、输血站、生化实验室、环境实验室、食品分析实验室中，其应用越来越广，属于精密液体取样仪器，可以对少量液体样品及试液进行迅速、准确的定量取样和加样，对于可调移液器，操作人员还可以根据实际需要调整移液器的容量值。特别是随着生物制药，基因工程与分子诊断的快速发展，该行业对微量液体容量的应用需求越来越高，测量人员对移液器的准确度也越来越关注。移液器作为移液时必要的设备，其容量的校准直接影响测定结果，但在长期使用过程中，操作、温度、人为因素等都会对其精度造成影响，不达标的移液器在使用过程中存在移液不足或过量，可能会导致生产事故或研究成果偏差，为保证结果数据具有良好的精密度、准确度和可信度，必须对其进行定期校准。

现有技术中，对微小容量进行计量校准时通常采用衡量法，即称量被检移液器某一刻度内所放出的纯水的质量，再由此及水的密度求得被检移液器的实际容积，并与检定点容量进行比对。该方法需要配备分度值为0.001mg的精密电子天平，且对使用环境，例如温度、压力、湿度等的要求很高，一般只能在精密恒温实验室进行测量，并且在测量过程中，校准的容量越小，由液体自然蒸发带来的影响也越大，并且人工操作也会带来一定的误差。

本领域迫切需要提供一种移液器容量的校准方法，以解决上述技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种移液器容量的校准方法，以解决背景技术中的移液器采用衡量法校准存在的技术缺陷。

一种移液器容量的校准方法，包括以下步骤：

S1、配制显色液；

S2、移取定量的稀释液至若干比色瓶中；

S3、按照比例移取所述显色液配置成系列标准溶液；

S4、采用分光光度计测定所述系列标准溶液的吸光度值，得到标准工作曲线；

S5、将步骤S2中的装有所述稀释液的比色瓶放入所述分光光度计中进行调零；将移液器调至需要校准的容量，移取对应容量的所述显色液，加入至所述比色瓶中并摇匀，测量吸光度值，根据标准工作曲线计算出在待校准容量点的容量值和误差；

S6、按照预设的校正次数重复步骤S5，计算测量重复性。

进一步地，所述显色液中的显色剂为丽春红S，所述分光光度计的检测波长为520nm。

进一步地，所述移液器所校准的容量在1μL以上，所述预设的校正次数大于等于3次。

进一步地，所述稀释液为纯水，若干个所述比色瓶的吸光度相同。

一种移液器容量的校准方法，包括以下步骤：

S1、配制显色液，所述显色液中含有第一显色剂；

S2、配制稀释液，所述稀释液中含有第二显色剂；

S3、配制基线溶液；

S4、将所述显色液和所述稀释液按比例配制成系列标准溶液，所述系列标准溶液对应不同量程的移液器的校准；

S5、采用分光光度计测量所述系列标准溶液的吸光度值，计算出各标准溶液中所述第一显色剂和所述第二显色剂在最大吸收波长处单位光程下的吸光度；

S6、将所述基线溶液放入所述分光光度计内进行基线校正；将移液器调至要校准的容量，移取对应容量的所述标准溶液至微孔比色板的微孔中，然后再移取一定量的所述稀释液至所述微孔中并混合均匀，将所述微孔比色板放入所述分光光度计中测量所述第一显色剂和所述第二显色剂的吸光度值，根据所述微孔中的液体总体积、所述标准溶液中所述第一显色剂和所述第二显色剂在最大吸收波长处单位光程下的吸光度，计算出在待校准容量点的容量值和误差；

S7、按照预设的校正次数重复步骤S6，计算测量重复性。

进一步地，所述第一显色剂为丽春红S；所述第二显色剂通过氯化铜与乙二胺四乙酸络合形成，所述稀释液的pH为6.0。

进一步地，所述分光光度计的检测波长为520nm和730nm。

进一步地，所述微孔呈截锥形，所述微孔的直径自所述微孔的底部逐渐增大。

进一步地，所述微孔具有已知的锥角角度和底部直径尺寸。

进一步地，所述移液器所校准的容量在1μL以下，所述预设的校正次数大于等于3次。

实施本发明，具有如下有益效果：

本发明的移液器容量的校准方法，采用紫外可见分光光度法对移液器的容量进行校准，采用单染色模式对1μL以上的容量进行校准，通过标准工作曲线和溶液在特定波长下的吸光度，计算出在待校准点的容量；采用双染色模式对1μL以下的容量进行校准，测量时采用微孔比色板，双染色模式中的稀释液体积通过溶液在730nm下的吸光度换算得到，消除了稀释液的添加过程引入的不确定度，提高了测量准确度。该移液器容量的校准方法，一方面，克服了衡量法中液体自然蒸发的影响，降低了校准过程对环境条件和人员操作的要求；另一方面，通过单染色和双染色模式，同时实现了1μL以上与1μL以下容量的准确校准，能够满足不同准确度等级下的校准需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1是本发明实施例中的标准工作曲线；

图2是本发明实施例中的微孔比色板上微孔的结构示意图；

其中，图中：横坐标为各标准溶液的理论计算标准容量值，单位为μL，纵坐标为吸光度，单位为Abs，l为液体的深度，D为微孔的底部直径，θ为截锥形微孔的锥角。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

本实施例提供了一种移液器容量的校准方法，包括以下步骤：

S1、配制显色液；

S2、移取定量的稀释液至若干比色瓶中；

S3、按照比例移取显色液配置成系列标准溶液；

S4、采用分光光度计测定系列标准溶液的吸光度值，得到标准工作曲线；

S5、将步骤S2中的装有稀释液的比色瓶放入分光光度计中进行调零；将移液器调至需要校准的容量，移取对应容量的显色液，加入至比色瓶中并摇匀，测量吸光度值，根据标准工作曲线计算出在待校准容量点的容量值和误差；

S6、按照预设的校正次数重复步骤S5，计算测量重复性。

下面将对本实施例的具体实施方式作详细的说明。

本实施例中所用的仪器设备及规格分别如下：紫外可见分光光度计，±1nm；玻璃量器，A级；精密电子天平，0.001mg；电子天平，0.1mg；移液器，0.5～10μL。

在溶液配制过程中，所用的仪器设备还包括：真空抽滤装置、磁力搅拌器、容量瓶、单标线吸量管和带盖玻璃比色瓶。

本实施例中所用的试剂及等级如下：丽春红S，分析纯；纯水，符合GB/T 6682-2008中一级用水的要求。

本实施例中，移液器容量的校准过程如下：

作为一种具体的实施方式，在步骤S1中，显色液中的显色剂为丽春红S，最大吸收波长在520nm处。称取2.44g丽春红S并用纯水溶解后，转移至单标线容量瓶中并定容至100mL，待完全溶解后使用0.2μm的微孔滤膜进行抽滤，抽滤后将深红色的溶液倒入干净的棕色试剂瓶中，密封后冷藏。

本实施例中，为了促进丽春红S的溶解，可使用磁力搅拌器加速溶解。

需要说明的是，显色液不限于上述步骤S1的配制方法，也可以根据校准需要进行调整。

作为一种具体的实施方式，在步骤S2中，取吸光度一致性较好的干燥带盖玻璃比色瓶若干，加入一定量的稀释液，本实施例中，稀释液为纯水，使用单标线吸量管准确移取10mL(V_D)纯水至比色瓶中，盖上盖子后擦净表面备用。

作为一种具体的实施方式，在步骤S3中，使用单标线吸量管准确移取5mL(V₁)显色液至容量瓶中，加纯水定容至50mL(V_D1)，再准确移取定容后的溶液5mL(V₂)至容量瓶中，加纯水定容至1000mL(V_D2)，配制成标准溶液S₁；使用单标线吸量管准确移取溶液50mL(V₃)和纯水25mL(V_D3)，加入干净的试剂瓶中混匀，配置成标准溶液S₂；按照同样的混合方法依次配制标准溶液S₃、S₄、S₅。公式(1)是系列标准溶液的实际配制比例，与理论计算标准容量值V_Si和10mL(V_D)纯水稀释液的比例关系式，通过公式转换可得到公式(2)，从而计算出标准容量V_S1～V_S5。

作为一种具体的实施方式，在步骤S4中，打开紫外可见分光光度计，点亮光源后预热0.5h以上，在光度测量模式下设置波长为520nm，加10mL纯水至比色瓶中，擦镜纸擦干后放入仪器的比色池中进行光度调零，吸光度值显示为0.000；取出比色瓶，将比色瓶中液体倒掉，并用纯水清洗，再加入少量标准溶液S₅清洗后，加入10mL左右的标准溶液S₅溶液到比色瓶中，擦镜纸擦干后放入仪器比色池，测量并读取吸光度值A₅。按照同样的步骤依次测量标准溶液S₄、S₃、S₂、S₁，对应地得到吸光度值A₄、A₃、A₂、A₁。标准样品的浓度从小到大的顺序进行测量，减少了大浓度样品对小浓度样品的干扰，测量的误差较小。工作曲线的标定计算结果见表1。

表1工作曲线与线性误差

标号	标准容量/μL	吸光度/Abs	回算容量/μL	线性误差/％
					纯水	0.000	0.000	—	—
V<sub>S1</sub>	5.003	1.696	4.997	-0.13
					V<sub>S2</sub>	3.334	1.135	3.344	0.29
V<sub>S3</sub>	2.223	0.756	2.227	0.19
					V<sub>S4</sub>	1.482	0.502	1.479	-0.20
V<sub>S5</sub>	0.988	0.334	0.984	-0.40

根据测量结果，使用最小二乘法进行线性拟合，拟合的线性回归方程为公式(3)：

A_i＝a+b·V_i (3)

参见图1，线性拟合得到工作曲线的截距a为0.00002A，斜率b为0.33944A·μL，线性相关系数为0.999994，各容量点的线性误差为(-0.40～0.29)％，说明当吸光度响应值在(0.3～1.7)Abs范围内时，该光度测量方法的线性较好。

作为一种具体的实施方式，在步骤S5中，将预装了纯水的比色瓶放入紫外可见分光光度计的比色池中，调零后取出比色瓶。将移液器调至要校准的容量，移取对应容量的显色液加入至比色瓶中，盖上盖子并轻轻摇匀后，再次放入紫外可见分光光度计的比色池中，读数吸光度值A_i，将A_i代入公式(4)中，得到移液器在该待校准容量点的计算结果V_i。根据计算出的V_i可以计算出在该待测容量点的相对误差。

作为一种具体的实施方式，在步骤S6中，按照预设的校正次数，重复步骤S5，对每个待校准容量点进行多次测量，并计算多次测量的测量重复性。预设的校正次数大于等于3次。本实施例使用分光光度法对移液器1μL、2μL、5μL的三个容量点分别进行了3次校准，校准结果如表2中所示，现行计量检定规程中对1～5μL各检定点的技术指标见表3，可以看出采用该方法对移液器的三个容量点校准的相对误差均符合指标规定。

表2移液器校准结果

表3移液器(1～5)μL的最大允差

检定点/μL	容量允许误差/％	测量重复性/％
			1	±12％	≤6％
2	±12％	≤6％
			5	±8％	≤4％

本实施例采用单染色模式，单染色模式是通过测量染料在特定波长下的吸光度，然后根据标准工作曲线由吸光度计算出容量。在低容量测量的时候，需要准确添加固定体积的稀释液稀释，此过程中产生的波动会影响体积计算的准确度，因此该模式适合测量1μL以上的容量校准。

本实施例中，使用单标线吸量管准确移取定量稀释液的人员操作稳定性也会影响校准结果准确度。另外，测试样品在520nm处的吸光度A₅₂₀也对校准结果有重要的影响。

实施例

本实施例提供了一种移液器容量的校准方法，包括以下步骤：

S1、配制显色液，显色液中含有第一显色剂；

S2、配制稀释液，稀释液中含有第二显色剂；

S3、配制基线溶液；

S4、将显色液和稀释液按比例配制成系列标准溶液，系列标准溶液对应不同量程的移液器的校准；

S5、采用分光光度计测量系列标准溶液的吸光度值，计算出各标准溶液中第一显色剂和第二显色剂在最大吸收波长处单位光程下的吸光度；

S6、将基线溶液放入分光光度计内进行基线校正；将移液器调至要校准的容量，移取对应容量的标准溶液至微孔比色板的微孔中，然后再移取一定量的稀释液至微孔中并混合均匀，将微孔比色板放入分光光度计中测量第一显色剂和第二显色剂的吸光度值，根据微孔中的液体总体积、标准溶液中第一显色剂和第二显色剂在最大吸收波长处单位光程下的吸光度，计算出在待校准容量点的容量值和误差；

S7、按照预设的校正次数重复步骤S6，计算测量重复性。

下面将对本实施例的具体实施方式作详细的说明。

本实施例所用的主要仪器与设备及规格如下：紫外可见分光光度计，±1nm；玻璃量器，A级；精密电子天平，0.001mg；电子天平，0.1mg；移液器，0.5～10μL。

在溶液配制过程中，所用的仪器设备还包括：真空抽滤装置、磁力搅拌器、容量瓶和带盖玻璃比色瓶。

本实施例中所用的试剂及等级如下：丽春红S，分析纯；氯化铜，分析纯；乙二胺四乙酸(EDTA)，分析纯；邻苯二甲酸氢钾，分析纯；氢氧化钠，分析纯；纯水，符合GB/T 6682-2008中一级用水的要求。

作为一种具体的实施方式，在步骤S1中，显色液中的第一显色剂为红色染料丽春红S，最大吸收波长在520nm处。称取2.44g丽春红S并用纯水溶解后，转移至单标线容量瓶中并定容至100mL，待完全溶解后使用0.2μm的微孔滤膜进行抽滤，抽滤后将深红色的溶液倒入干净的棕色试剂瓶中，密封后冷藏。该显示液呈红色。

本实施例中，为了促进丽春红S的溶解，可使用磁力搅拌器加速溶解。

作为一种具体的实施方式，在步骤S2中，稀释液中的第二显色剂通过氯化铜与乙二胺四乙酸络合形成，呈蓝色，络合物的最大吸收波长在730nm处。称取4.08g邻苯二甲酸氢钾并用纯水溶解至800ml后，加入13.3ml浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，然后加入3.74g的EDTA和1.12g的氯化铜，待完全溶解后调节溶液的pH为6.0，使用0.2μm的微孔滤膜进行抽滤，密封后冷藏。该稀释液呈蓝色。采用两种显色剂，稀释液体积通过测量溶液在730nm下的吸光度换算得到，因此消除了后续稀释液添加过程引入的不确定度，该模式适用于1μL以下的容量测量。

需要说明的是，显色液不限于上述步骤S1的配制方法，稀释液也不限于上述步骤S2的配制方法，可以根据校准需要进行调整。

作为一种具体的实施方式，在步骤S3中，基线溶液不含有染料物质，在测量前做基线校正使用。基线溶液为纯水，或者为邻苯二甲酸氢钾和氢氧化钠混合液。

作为一种具体的实施方式，在步骤S4中，根据需要，准确移取显色液S和稀释液B按比例配制成系列标准溶液，该系列标准溶液对应不同量程的移液器的校准。

作为一种具体的实施方式，在步骤S5中，通过紫外可见分光光度计准确测量系列标准溶液中各标准溶液分别在520nm和730nm处的的吸光度值，并通过软件计算各标准溶液中第一显色剂和第二显色剂分别在520nm和730nm处单位光程下的吸光度a_r和a_b。计算的过程为如下：

根据朗伯比尔定律，如公式(5)所示：

A_λ＝ε_λlC (5)

在公式(5)中，A_λ表示溶液在波长λ下的吸光度，ε_λ表示在波长λ下的摩尔吸光系数，l表示光程，C表示浓度。

由于标准溶液中第一显色剂和第二显色剂的浓度都是已知的，其摩尔吸光系数也是常量，因此单位光程下的吸光度值也就可以得出，计算公式如公式(6)和(7)所示：

在公式(6)和(7)中，A₇₃₀表示溶液在730nm波长下的吸光度，ε₇₃₀表示在730nm波长下的摩尔吸光系数，A₅₂₀表示溶液在520nm波长下的吸光度，ε₅₂₀表示在520nm波长下的摩尔吸光系数，a_r和a_b分别为第一显色剂和第二显色剂单位光程下的吸光度，每个标准溶液的第一显色剂和第二显色剂的单位光程下的吸光度a_r和a_b都可以根据公式(6)和(7)准确测量。

作为一种具体的实施方式，在步骤S6中，每次测量吸光度前先用基线溶液校零，以消除光在通过微孔比色板和溶质中色散的影响。将移液器调至要校准的容量点，移取适应的标准溶液至微孔比色板的微孔中，然后再移取一定量的稀释液至上述微孔中并使其混合均匀。将上述的比色板放入紫外可见分光光度计中分别测量520nm和730nm处的吸光度值，计算移液器在待测点的容量值和误差。

本实施例中，液体的深度就等于通过样品的光程，由于要校准的容量点在1μL以下，蓝色染料的浓度在样品和稀释液中是相同的，因此我们可以通过测量蓝色染料在730nm处的吸光度来得到液体的深度l，计算公式如公式(8)：

参见图2，微孔比色板的微孔呈截锥形，由于液体深度已经测得，可以通过公式求得液体的总体积V_T，计算公式如公式(9)：

在公式(9)中，l为液体的深度，D为微孔的底部直径，θ为截锥形微孔的锥角。

红色显示液的微量体积V_S的计算是基于样品溶液的总体积V_T、样品中蓝色染料在730nm处的吸光度A₇₃₀、样品中红色染料在520nm处的吸光度A₅₂₀、所选用的系列标准溶液中第一显色剂和第二显色剂单位光程下的吸光度a_r和a_b，并依据公式(10)求得：

本实施例中，在步骤S7中，按照预设的校正次数，重复步骤S6，对每个待校准容量点进行多次测量，并计算多次测量的测量重复性。预设的校正次数大于等于3次。

本实施例采用双染色模式，测量时采用微孔比色板，双染色模式中的稀释液体积是通过测量溶液在730nm下的吸光度换算得到，因此消除了稀释液添加过程引入的不确定度，该模式尤其适用于1μL以下的容量校准。

本实施例中，微孔比色板上每个微孔的尺寸特称如底部直径D和锥角θ影响校准结果准确度。因此，在校准前，微孔比色板的每个微孔的尺寸特称都须根据校准需要准确确定。

本发明的移液器容量的校准方法，比色瓶和微孔比色板在分光光度计中通过夹具来固定，通过更换紫外可见分光光度计中的夹具，并且在分光光度计的操作系统中选择对应的测量模式来实现单染色模式和双染色模式的切换。该移液器容量的校准方法，一方面，克服了衡量法中液体自然蒸发的影响，降低了校准过程对环境条件和人员操作的要求；另一方面，通过单染色和双染色模式，实现了1μL以上与1μL以下容量的准确校准，能够满足不同准确度等级下的校准需求。

本发明的上述实施例，具有如下有益效果：本发明的移液器容量的校准方法，采用紫外可见分光光度法对移液器的容量进行校准，采用单染色模式对1μL以上的容量进行校准，通过标准工作曲线和溶液在特定波长下的吸光度，计算出在待校准点的容量；采用双染色模式对1μL以下的容量进行校准，测量时采用微孔比色板，双染色模式中的稀释液体积通过溶液在730nm下的吸光度换算得到，消除了稀释液的添加过程引入的不确定度，提高了测量准确度。该移液器容量的校准方法，一方面，克服了衡量法中液体自然蒸发的影响，降低了校准过程对环境条件和人员操作的要求；另一方面，通过单染色和双染色模式，同时实现了1μL以上与1μL以下容量的准确校准，能够满足不同准确度等级下的校准需求。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种移液器容量的校准方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、配制显色液；

S2、移取定量的稀释液至若干比色瓶中；

S3、按照比例移取所述显色液配置成系列标准溶液；

S4、采用分光光度计测定所述系列标准溶液的吸光度值，得到标准工作曲线；

S5、将步骤S2中的装有所述稀释液的比色瓶放入所述分光光度计中进行调零；将移液器调至需要校准的容量，移取对应容量的所述显色液，加入至所述比色瓶中并摇匀，测量吸光度值，根据标准工作曲线计算出在待校准容量点的容量值和误差；

S6、按照预设的校正次数重复步骤S5，计算测量重复性。

2.根据权利要求1所述的移液器容量的校准方法，其特征在于，所述显色液中的显色剂为丽春红S，所述分光光度计的检测波长为520nm。

3.根据权利要求1所述的移液器容量的校准方法，其特征在于，所述移液器所校准的容量在1μL以上，所述预设的校正次数大于等于3次。

4.根据权利要求2所述的移液器容量的校准方法，其特征在于，所述稀释液为纯水，若干个所述比色瓶的吸光度相同。

5.一种移液器容量的校准方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、配制显色液，所述显色液中含有第一显色剂；

S2、配制稀释液，所述稀释液中含有第二显色剂；

S3、配制基线溶液；

S4、将所述显色液和所述稀释液按比例配制成系列标准溶液，所述系列标准溶液对应不同量程的移液器的校准；

S5、采用分光光度计测量所述系列标准溶液的吸光度值，计算出各标准溶液中所述第一显色剂和所述第二显色剂在最大吸收波长处单位光程下的吸光度；

S6、将所述基线溶液放入所述分光光度计内进行基线校正；将移液器调至要校准的容量，移取对应容量的所述标准溶液至微孔比色板的微孔中，然后再移取一定量的所述稀释液至所述微孔中并混合均匀，将所述微孔比色板放入所述分光光度计中测量所述第一显色剂和所述第二显色剂的吸光度值，根据所述微孔中的液体总体积、所述标准溶液中所述第一显色剂和所述第二显色剂在最大吸收波长处单位光程下的吸光度，计算出在待校准容量点的容量值和误差；

S7、按照预设的校正次数重复步骤S6，计算测量重复性。

6.根据权利要求5所述的移液器容量的校准方法，其特征在于，所述第一显色剂为丽春红S；所述第二显色剂通过氯化铜与乙二胺四乙酸络合形成，所述稀释液的pH为6.0。

7.根据权利要求6所述的移液器校准方法，其特征在于，所述分光光度计的检测波长为520nm和730nm。

8.根据权利要求5所述的移液器容量的校准方法，其特征在于，所述微孔呈截锥形，所述微孔的直径自所述微孔的底部逐渐增大。

9.根据权利要求8所述的移液器容量的校准方法，其特征在于，所述微孔具有已知的锥角角度和底部直径尺寸。

10.根据权利要求5所述的移液器容量的校准方法，其特征在于，所述移液器所校准的容量在1μL以下，所述预设的校正次数大于等于3次。