JP2512437B2 - 血液蛋白質、その調製方法、前記蛋白質およびｔ−ＰＡ阻害剤をアツセイする方法、および前記蛋白質を含有する製薬学的組成物 - Google Patents
血液蛋白質、その調製方法、前記蛋白質およびｔ−ＰＡ阻害剤をアツセイする方法、および前記蛋白質を含有する製薬学的組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト血液中において同定されかつそれから
単離された新規な蛋白質に関する。それは、また、他の
哺乳動物、例えば、ラットおよびウサギの血液中に存在
する。この新規な蛋白質は、プラスミノゲン活性化因
子、すなわち、組織型プラスミノゲン活性化因子（tiss
ue type plasminogen activator）（ｔ−PA）および
ウロキナーゼの活性を特異的に阻害するように思われ
る。この蛋白質はPA−結合性蛋白質（PA−BP）と呼ぶ。
単離された新規な蛋白質に関する。それは、また、他の
哺乳動物、例えば、ラットおよびウサギの血液中に存在
する。この新規な蛋白質は、プラスミノゲン活性化因
子、すなわち、組織型プラスミノゲン活性化因子（tiss
ue type plasminogen activator）（ｔ−PA）および
ウロキナーゼの活性を特異的に阻害するように思われ
る。この蛋白質はPA−結合性蛋白質（PA−BP）と呼ぶ。
血漿はｔ−PAの阻害を示すことが知られており、この
ｔ−PAは、例えば、PA−阻害試験によりアッセイ（assa
y）することができる［トロンボシス・ヘマストシス（T
hromb.Haemastos.）、483266−269（1982）］。この阻
害はよく特徴づけられたPA阻害剤のためであり［血液凝
固の最近の発展（Recent Advances in Blood Coagu
lation）、L.ポウラー（Poller）編；チャーチル・リビ
ングストーン（Churchill Livingstone）、ニューヨー
ク、Vol.11−22ページ1985）］、この阻害剤は血小板、
内皮細胞培養物（以下「培養物」を培養基という場合が
ある）および肝細胞培養基中にも見出された。
ｔ−PAは、例えば、PA−阻害試験によりアッセイ（assa
y）することができる［トロンボシス・ヘマストシス（T
hromb.Haemastos.）、483266−269（1982）］。この阻
害はよく特徴づけられたPA阻害剤のためであり［血液凝
固の最近の発展（Recent Advances in Blood Coagu
lation）、L.ポウラー（Poller）編；チャーチル・リビ
ングストーン（Churchill Livingstone）、ニューヨー
ク、Vol.11−22ページ1985）］、この阻害剤は血小板、
内皮細胞培養物（以下「培養物」を培養基という場合が
ある）および肝細胞培養基中にも見出された。
血漿中において、第２蛋白質はｔ−PAの阻害に寄与す
ること、およびこの蛋白質はPA阻害剤に関係しないこと
が発見された。この蛋白質は、100,000の分子質量（mol
ecular mass）（ゲル濾過）を有し、ｔ−PAと可逆的に
反応する蛋白質と思われる。このPA−結合性蛋白質（PA
−BP）を、以後詳細に説明する。
ること、およびこの蛋白質はPA阻害剤に関係しないこと
が発見された。この蛋白質は、100,000の分子質量（mol
ecular mass）（ゲル濾過）を有し、ｔ−PAと可逆的に
反応する蛋白質と思われる。このPA−結合性蛋白質（PA
−BP）を、以後詳細に説明する。
フィブリノゲンのブィブリンへの転化は重要な生物学
的過程である。フィブリンの形成は止血においてきわめ
て重要であるが、それは、また、他の生物学的過程、例
えば、炎症および悪性の病気および組織の修復過程にお
ける１つの重要な面である。有機体におけるフィブリン
の付着物のデグラテイション（degratation）はセリン
プロテイナーゼプラスミンにより触媒され、そしてプラ
スミンは活性化因子の影響のもとにプラスミノゲンから
形成される。２つの型の活性化因子が知られている：組
織型（ｔ−PA）およびウロキナーゼ。フィブリンのデグ
ラテイションは、これらのプラスミノゲン活性化因子に
より、プラスミン阻害剤によりおよび活性化因子阻害剤
により制御されることが知られている。
的過程である。フィブリンの形成は止血においてきわめ
て重要であるが、それは、また、他の生物学的過程、例
えば、炎症および悪性の病気および組織の修復過程にお
ける１つの重要な面である。有機体におけるフィブリン
の付着物のデグラテイション（degratation）はセリン
プロテイナーゼプラスミンにより触媒され、そしてプラ
スミンは活性化因子の影響のもとにプラスミノゲンから
形成される。２つの型の活性化因子が知られている：組
織型（ｔ−PA）およびウロキナーゼ。フィブリンのデグ
ラテイションは、これらのプラスミノゲン活性化因子に
より、プラスミン阻害剤によりおよび活性化因子阻害剤
により制御されることが知られている。
プラスミノゲン活性化因子を介する線維素溶解を制御
する最も重要な阻害性蛋白質は、PA阻害剤である。この
阻害剤は1982〜1983年以来初めて同定され、そしてその
活性はｔ−PAの滴定による簡単な方法でアッセイするこ
とができ、そしてｔ−PAは、例えば、オランダ国特許82
01987号に従う手順によりアッセイすることができる。P
A阻害剤の研究は、この蛋白質がまた不活性または潜在
的な形態で存在することもできるこを示した。
する最も重要な阻害性蛋白質は、PA阻害剤である。この
阻害剤は1982〜1983年以来初めて同定され、そしてその
活性はｔ−PAの滴定による簡単な方法でアッセイするこ
とができ、そしてｔ−PAは、例えば、オランダ国特許82
01987号に従う手順によりアッセイすることができる。P
A阻害剤の研究は、この蛋白質がまた不活性または潜在
的な形態で存在することもできるこを示した。
PA阻害剤の他の研究は阻害剤の活性を中和することが
できかつ不活性な形態と反応する抗体を得ることに導い
た。それは、また、PA阻害剤の活性が37℃で不安定であ
ることが発見された。これらの研究の間に実施された血
漿中のPA阻害剤の活性の測定により、この阻害剤の一部
分は37℃で不安定であり、そしてこの温度においてこの
部分はPA阻害剤に対する抗血清と反応しないことが観察
された。さらに、これらの研究により、第2PA蛋白性蛋
白質が含まれることが示された。
できかつ不活性な形態と反応する抗体を得ることに導い
た。それは、また、PA阻害剤の活性が37℃で不安定であ
ることが発見された。これらの研究の間に実施された血
漿中のPA阻害剤の活性の測定により、この阻害剤の一部
分は37℃で不安定であり、そしてこの温度においてこの
部分はPA阻害剤に対する抗血清と反応しないことが観察
された。さらに、これらの研究により、第2PA蛋白性蛋
白質が含まれることが示された。
PA−BPの性質を、ここで詳述する。
ヒトｔ−PAは２つの相同クリングル（Kringle）構
造、すなわち、表皮成長因子の一部に対して相同の領
域、フィブロネクチンのフィンガー（finger）構造対し
て相同の領域およびセリン含有活性中心をもつ軽鎖領域
を含有する。これらの領域は配位子、蛋白質および細胞
構造体の結合においてある役割を演ずると考えられ、こ
れらの結合はｔ−PAの生物学的機能の調節のために必須
である。関係するプラスミノゲン活性化因子、ウロキナ
ーゼ、はクリングルと活性中心をもつ軽鎖を有する。
造、すなわち、表皮成長因子の一部に対して相同の領
域、フィブロネクチンのフィンガー（finger）構造対し
て相同の領域およびセリン含有活性中心をもつ軽鎖領域
を含有する。これらの領域は配位子、蛋白質および細胞
構造体の結合においてある役割を演ずると考えられ、こ
れらの結合はｔ−PAの生物学的機能の調節のために必須
である。関係するプラスミノゲン活性化因子、ウロキナ
ーゼ、はクリングルと活性中心をもつ軽鎖を有する。
線維素溶解のためのｔ−PAの有効性の制御は、また、
分子中の領域の大きい数をかんがみて、きわめて複雑で
ある。
分子中の領域の大きい数をかんがみて、きわめて複雑で
ある。
フィブリノゲンの凝集において、ｔ−PAは凝血中に組
み込まれる。循環においてあるいは凝血の形成時におけ
る血管壁の内皮細胞からのｔ−PAの急速な再循環におけ
るｔ−PAの有効性は、線維素溶解のための必須のパラメ
ーターである。この面に関してｔ−PAが不十分であるこ
とは、血栓の素質を意味する;t−PAの過剰は出血の素質
を意味する。
み込まれる。循環においてあるいは凝血の形成時におけ
る血管壁の内皮細胞からのｔ−PAの急速な再循環におけ
るｔ−PAの有効性は、線維素溶解のための必須のパラメ
ーターである。この面に関してｔ−PAが不十分であるこ
とは、血栓の素質を意味する;t−PAの過剰は出血の素質
を意味する。
ｔ−PAの活性のフィブリン統制（fibrin−directedne
ss）は、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼ（バク
テリアの生産物）の活性と反対に、重要であり、それに
よるフィブリンへの結合はｔ−PAの活性の二桁の大きさ
の刺激を誘発する。ｔ−PAのこの性質はｔ−PAの応用に
おいて血栓崩壊因子として使用される。血栓症および、
例えば、心不全における凝血の溶解のために必要である
ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼの量は、また、
循環においてかなりな作用を与え、ここでプラスミンの
形成も起こり、そしてプラスミンは望ましくない蛋白質
加水分解を誘発し、その結果出血の危険が増加する。凝
血の外側のｔ−PAの活性は非常に低い。
ss）は、ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼ（バク
テリアの生産物）の活性と反対に、重要であり、それに
よるフィブリンへの結合はｔ−PAの活性の二桁の大きさ
の刺激を誘発する。ｔ−PAのこの性質はｔ−PAの応用に
おいて血栓崩壊因子として使用される。血栓症および、
例えば、心不全における凝血の溶解のために必要である
ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼの量は、また、
循環においてかなりな作用を与え、ここでプラスミンの
形成も起こり、そしてプラスミンは望ましくない蛋白質
加水分解を誘発し、その結果出血の危険が増加する。凝
血の外側のｔ−PAの活性は非常に低い。
ｔ−PAの有効性および活性の制御は、なかでも、阻害
により、すなわち、PA阻害剤により実施される。循環に
おいて、PA阻害剤はｔ−PAの不活性に寄与し、また形成
すべきプラスミンによる望ましくない蛋白質加水分解の
制限に寄与する。この目的で、それは非常に急速にｔ−
PAと可逆的複合体を形成し、その複合体はｔ−PAが不活
性である不可逆的な複合体にゆっくり（半減期約0.5時
間）転化する。PA阻害剤の血液レベルは非常に変動し
（０〜18IU/ml）およびこのPA阻害剤の作用は、それゆ
え、同様に変動する。その上、37℃における凝血の過程
において、PA阻害剤は明らかに自発的に（半減期約80〜
100分）活性プロテインＣおよびトロンビンにより不活
性化される。新しく発見された成分、PA−BP、は非常に
いっそう安定な血漿濃度を有し、安定であり、それゆ
え、循環におけるｔ−PA活性の防止において重要な連続
的因子である。
により、すなわち、PA阻害剤により実施される。循環に
おいて、PA阻害剤はｔ−PAの不活性に寄与し、また形成
すべきプラスミンによる望ましくない蛋白質加水分解の
制限に寄与する。この目的で、それは非常に急速にｔ−
PAと可逆的複合体を形成し、その複合体はｔ−PAが不活
性である不可逆的な複合体にゆっくり（半減期約0.5時
間）転化する。PA阻害剤の血液レベルは非常に変動し
（０〜18IU/ml）およびこのPA阻害剤の作用は、それゆ
え、同様に変動する。その上、37℃における凝血の過程
において、PA阻害剤は明らかに自発的に（半減期約80〜
100分）活性プロテインＣおよびトロンビンにより不活
性化される。新しく発見された成分、PA−BP、は非常に
いっそう安定な血漿濃度を有し、安定であり、それゆ
え、循環におけるｔ−PA活性の防止において重要な連続
的因子である。
その不安定性をかんがみて、PA阻害剤は形成した凝血
中に一時的に存在するだけであり、そして、なかでも、
外部から来るプラスミノゲン活性化因子の、凝血の環境
における、阻害によって、凝血の一時的安定化のために
のみ重要である。PA−BPは永久に存在し、そしてPAの活
性の長期間の制御に重要である。
中に一時的に存在するだけであり、そして、なかでも、
外部から来るプラスミノゲン活性化因子の、凝血の環境
における、阻害によって、凝血の一時的安定化のために
のみ重要である。PA−BPは永久に存在し、そしてPAの活
性の長期間の制御に重要である。
PAを使用する血栓崩壊の治療において、ｔ−PAの多い
投与量は所望の血栓崩壊を得るために必要であるように
思われ、この投与量はPA阻害剤およびPA−BPの濃度より
も高くして、その結果全身の作用を生ずる。この投与量
は、また、高く、肝臓によるｔ−PAの非常に早い消滅
（clearing）（数分の半減期）を補うようにする。
投与量は所望の血栓崩壊を得るために必要であるように
思われ、この投与量はPA阻害剤およびPA−BPの濃度より
も高くして、その結果全身の作用を生ずる。この投与量
は、また、高く、肝臓によるｔ−PAの非常に早い消滅
（clearing）（数分の半減期）を補うようにする。
新規な成分、PA−BP、はｔ−PA阻害試験において、ｔ
−PAのプラスミノゲンを活性化する活性を阻害する活性
を示す。しかしながら、分析によると、また、ｔ−PAと
PA阻害剤との反応が阻害され、これはちょうどｔ−PAを
可逆的に中和することができる他の血漿阻害剤との反応
に似ている。したがって、PA−BPは保護因子として見る
べきであり、この保護因子は、一方において、ｔ−PAを
阻害剤による不活性化に対して保護し、そして他方にお
いて、プラスミノゲンを望ましくないプラスミンの形成
による不活性化に対して保護する。結局、PA−BPは循環
におけるｔ−PAのための安全な担体である。凝血におけ
るｔ−PAのフィブリンへの結合は阻害されない。これら
の理由は、ウロキナーゼの特別な性質に適合するとき、
ウロキナーゼにも等しく有効である。
−PAのプラスミノゲンを活性化する活性を阻害する活性
を示す。しかしながら、分析によると、また、ｔ−PAと
PA阻害剤との反応が阻害され、これはちょうどｔ−PAを
可逆的に中和することができる他の血漿阻害剤との反応
に似ている。したがって、PA−BPは保護因子として見る
べきであり、この保護因子は、一方において、ｔ−PAを
阻害剤による不活性化に対して保護し、そして他方にお
いて、プラスミノゲンを望ましくないプラスミンの形成
による不活性化に対して保護する。結局、PA−BPは循環
におけるｔ−PAのための安全な担体である。凝血におけ
るｔ−PAのフィブリンへの結合は阻害されない。これら
の理由は、ウロキナーゼの特別な性質に適合するとき、
ウロキナーゼにも等しく有効である。
これらのデータから誘導できるように、PA阻害および
PA−BPはｔ−PAの有効性を制御するうえで異なる役割を
演じ、そしてこれらの役割は条件に非常に依存すること
がある。ｔ−PAの領域のどれがフィブリン、PA阻害剤お
よびPA−BPとの相互作用に参加するかについて、なお断
片的な知識が存在する。フィブリンの結合はフィンガー
領域（finger domain）に関係すると思われる。プラス
ミノゲン活性化は、ｔ−PAの軽鎖を研究する場合にの
み、完全である。組み換えDNA技術により得られるｔ−P
Aの突然変異体を研究しているとき、PA−BPとの相互作
用は完全であることがわかり、ここでクリングル１を含
むＮ−末端は欠失した。またクリングル２を欠失する軽
鎖はPA−BPと相互作用しないように思われ、そしてこれ
はDFP不活性化された活性中心をもつｔ−PAの場合には
当てはまらない。明らかに、クリングル２およびｔ−PA
の活性中心はPA−BPとの相互作用に関与する。クリング
ルをもつウロキナーゼおよびそれをもたないウロキナー
ゼの研究によると、クリングルの存在はPA−BPとの相互
作用に必須ではないが、活性中心は、プロウロキナーゼ
が相互作用をまったく示さないので、必須であった。そ
れゆえ、プラスミノゲン活性化因子の少なくとも活性中
心はPA−BPとの相互作用にとって重要性をもつ。
PA−BPはｔ−PAの有効性を制御するうえで異なる役割を
演じ、そしてこれらの役割は条件に非常に依存すること
がある。ｔ−PAの領域のどれがフィブリン、PA阻害剤お
よびPA−BPとの相互作用に参加するかについて、なお断
片的な知識が存在する。フィブリンの結合はフィンガー
領域（finger domain）に関係すると思われる。プラス
ミノゲン活性化は、ｔ−PAの軽鎖を研究する場合にの
み、完全である。組み換えDNA技術により得られるｔ−P
Aの突然変異体を研究しているとき、PA−BPとの相互作
用は完全であることがわかり、ここでクリングル１を含
むＮ−末端は欠失した。またクリングル２を欠失する軽
鎖はPA−BPと相互作用しないように思われ、そしてこれ
はDFP不活性化された活性中心をもつｔ−PAの場合には
当てはまらない。明らかに、クリングル２およびｔ−PA
の活性中心はPA−BPとの相互作用に関与する。クリング
ルをもつウロキナーゼおよびそれをもたないウロキナー
ゼの研究によると、クリングルの存在はPA−BPとの相互
作用に必須ではないが、活性中心は、プロウロキナーゼ
が相互作用をまったく示さないので、必須であった。そ
れゆえ、プラスミノゲン活性化因子の少なくとも活性中
心はPA−BPとの相互作用にとって重要性をもつ。
PA阻害剤についてのアッセイ法をもちいてPA−BPのア
ッセイを実施し、ここで試料中に存在するPA阻害剤の影
響は、この阻害剤に対するIgGの添加により、あるい
は、例えば、37℃における適当な時間にわたる試料の予
備インキュベーションにより破壊され、これによってPA
阻害剤がもっぱら不活性化される。このアッセイ法にお
いて、可溶性刺激剤またはフィブリンモノマーを使用す
ることができる。このアッセイのための用量−応答曲線
は直線状であり、そしてPA阻害剤およびPA−BPの活性は
加法に従う。
ッセイを実施し、ここで試料中に存在するPA阻害剤の影
響は、この阻害剤に対するIgGの添加により、あるい
は、例えば、37℃における適当な時間にわたる試料の予
備インキュベーションにより破壊され、これによってPA
阻害剤がもっぱら不活性化される。このアッセイ法にお
いて、可溶性刺激剤またはフィブリンモノマーを使用す
ることができる。このアッセイのための用量−応答曲線
は直線状であり、そしてPA阻害剤およびPA−BPの活性は
加法に従う。
ｔ−PAとPA−BPとの間の相互作用は可逆的反応論を示
し、ここで結合したｔ−PAの対する遊離の相互的なプロ
ットは１〜５ピコモルの見掛けの解離または阻害の定数
を示す。ｔ−PAとPA−BPとの間の相互作用の可逆性は、
次の観察によって反応論的にさらに支持される。残留す
るｔ−PAの量（過剰のPA−BPにかかわらず）は数時間一
定にとどまり、そして、希釈すると、平衡は遊離のｔ−
PAの百分率が高いとき、解離が高い方向にシフトする。
ｔ−PAとPA−BPとの可逆的特性を示す他の観察を、ｔ−
PAまたはウロキナーゼを血漿に添加することにより実施
した。過剰量のｔ−PAまたはウロキナーゼを血漿に添加
すると、PA−BPの活性はもはや検出されない。このよう
な混合物を37℃でインキュベーションした後、PA−BPの
活性はある時間後に回復する。明らかに、この場合、PA
−BPは最初に中和され、そしてｔ−PAおよびUKは結合さ
れるが、それ以上時間が経過しても、添加したｔ−PAお
よびウロキナーゼは血漿中で血漿の阻害剤、例えば、ア
ルファ−２−抗プラスミンに作用することにより不可逆
的に不活性化される。これが示すように、PA−PBは永久
にプラスミノゲン活性化因子により中和されえない。
し、ここで結合したｔ−PAの対する遊離の相互的なプロ
ットは１〜５ピコモルの見掛けの解離または阻害の定数
を示す。ｔ−PAとPA−BPとの間の相互作用の可逆性は、
次の観察によって反応論的にさらに支持される。残留す
るｔ−PAの量（過剰のPA−BPにかかわらず）は数時間一
定にとどまり、そして、希釈すると、平衡は遊離のｔ−
PAの百分率が高いとき、解離が高い方向にシフトする。
ｔ−PAとPA−BPとの可逆的特性を示す他の観察を、ｔ−
PAまたはウロキナーゼを血漿に添加することにより実施
した。過剰量のｔ−PAまたはウロキナーゼを血漿に添加
すると、PA−BPの活性はもはや検出されない。このよう
な混合物を37℃でインキュベーションした後、PA−BPの
活性はある時間後に回復する。明らかに、この場合、PA
−BPは最初に中和され、そしてｔ−PAおよびUKは結合さ
れるが、それ以上時間が経過しても、添加したｔ−PAお
よびウロキナーゼは血漿中で血漿の阻害剤、例えば、ア
ルファ−２−抗プラスミンに作用することにより不可逆
的に不活性化される。これが示すように、PA−PBは永久
にプラスミノゲン活性化因子により中和されえない。
血漿において、PA−BPの活性は、０〜56℃で１週間ま
でインキュベーションしたとき、安定である。37℃にお
いて、PA阻害剤の活性は80〜100分の半減期で消滅す
る。この半減期の多数倍の数、例えば、一夜のインキュ
ベーション後、血漿はもっぱらPA−BPの活性を含有す
る。PA阻害剤の不活性化は５のQ10で温度に強く依存
し、より高い温度における不活性化が非常に急速であ
る。血漿中で、PA阻害剤に対するIgGを用いる免疫沈殿
後、PA阻害剤は残留し、温度安定性であり、そしてPA−
BPと量的に同一である。PA−BPと同一の、この同じ活性
は、ｔ−PAの阻害についてのアッセイ法においてPA阻害
剤IgGの過剰の添加後に残留する。37℃で一夜の血漿の
インキュベーション後に残留するPA−BP活性は、PA阻害
剤に対する過剰のIgGによる阻害に対しての不感受性で
ある。PA−BPの活性はEDTAの添加に対して不感受性であ
る。プラスミノゲン活性化因子の胎盤阻害剤は正常の血
漿中には見出されず、そしてPA−BPの活性は胎盤の阻害
剤に対する抗体により中和されず、そしてこの抗体は胎
盤の阻害剤の活性を阻害しない。
でインキュベーションしたとき、安定である。37℃にお
いて、PA阻害剤の活性は80〜100分の半減期で消滅す
る。この半減期の多数倍の数、例えば、一夜のインキュ
ベーション後、血漿はもっぱらPA−BPの活性を含有す
る。PA阻害剤の不活性化は５のQ10で温度に強く依存
し、より高い温度における不活性化が非常に急速であ
る。血漿中で、PA阻害剤に対するIgGを用いる免疫沈殿
後、PA阻害剤は残留し、温度安定性であり、そしてPA−
BPと量的に同一である。PA−BPと同一の、この同じ活性
は、ｔ−PAの阻害についてのアッセイ法においてPA阻害
剤IgGの過剰の添加後に残留する。37℃で一夜の血漿の
インキュベーション後に残留するPA−BP活性は、PA阻害
剤に対する過剰のIgGによる阻害に対しての不感受性で
ある。PA−BPの活性はEDTAの添加に対して不感受性であ
る。プラスミノゲン活性化因子の胎盤阻害剤は正常の血
漿中には見出されず、そしてPA−BPの活性は胎盤の阻害
剤に対する抗体により中和されず、そしてこの抗体は胎
盤の阻害剤の活性を阻害しない。
線維素溶解成分との相互作用を示す既知の阻害剤との
PA−BPの同一性は、PA阻害剤を除外する既知の阻害剤の
いずれについてもそれほど低くない血漿中の濃度をかん
がみて、排除される。PA−BPは抗プラスミンに欠乏する
血漿中に通常存在する。精製されたテトラネクチン（オ
ランダ国特許8501682号）はｔ−PAの阻害を示さない。
プラスミノゲンおよびフィブリノゲンは、PA−BPの活性
を破壊せずに、血漿から除去することができる。アルフ
ァ−２−マクログロブリンおよびC1−不活性化因子は、
血漿のゲル濾過においてPA−BPのそれと明瞭に異なる位
置に現われる。プロテアーゼネキシンが存在する線維芽
細胞の培地において、PA−BPは検出されなかった。
PA−BPの同一性は、PA阻害剤を除外する既知の阻害剤の
いずれについてもそれほど低くない血漿中の濃度をかん
がみて、排除される。PA−BPは抗プラスミンに欠乏する
血漿中に通常存在する。精製されたテトラネクチン（オ
ランダ国特許8501682号）はｔ−PAの阻害を示さない。
プラスミノゲンおよびフィブリノゲンは、PA−BPの活性
を破壊せずに、血漿から除去することができる。アルフ
ァ−２−マクログロブリンおよびC1−不活性化因子は、
血漿のゲル濾過においてPA−BPのそれと明瞭に異なる位
置に現われる。プロテアーゼネキシンが存在する線維芽
細胞の培地において、PA−BPは検出されなかった。
血漿において、PA−BPはゲル濾過によりPA阻害剤から
分離することができる。PA阻害剤は高分子量の位置に動
き、そしてPA−BPは100,000の分子量においてプラスミ
ノゲンとほぼ同時に展開する。これらのピークは、PA阻
害剤を抗血清で中和することができかつ温度不安定であ
り、これに対してPA−BPが抗血清に不感受性でありかつ
温度安定性であるという特性に従う。これは、37℃で24
時間予備インキュベーションした血漿のゲル濾過がPA−
BPのみを生ずるという事実に一致する。
分離することができる。PA阻害剤は高分子量の位置に動
き、そしてPA−BPは100,000の分子量においてプラスミ
ノゲンとほぼ同時に展開する。これらのピークは、PA阻
害剤を抗血清で中和することができかつ温度不安定であ
り、これに対してPA−BPが抗血清に不感受性でありかつ
温度安定性であるという特性に従う。これは、37℃で24
時間予備インキュベーションした血漿のゲル濾過がPA−
BPのみを生ずるという事実に一致する。
PA−BPは硫酸アンモニウムで30〜50％の飽和率で沈殿
させ、そしてポリエチレングリコールで０〜９％の飽和
率で沈殿させることができる。PA−BPはリジン−アガロ
ースに結合しないので、血漿はPA−BPを損失しないでこ
のカラムを使用してプラスミノゲン不含とすることがで
きる。PA−BPはDFP処理したｔ−PAのカラムに結合せ
ず、これによりｔ−PAの完全な（intact）活性中心はPA
−BPとの相互作用のために必須であることが示される。
させ、そしてポリエチレングリコールで０〜９％の飽和
率で沈殿させることができる。PA−BPはリジン−アガロ
ースに結合しないので、血漿はPA−BPを損失しないでこ
のカラムを使用してプラスミノゲン不含とすることがで
きる。PA−BPはDFP処理したｔ−PAのカラムに結合せ
ず、これによりｔ−PAの完全な（intact）活性中心はPA
−BPとの相互作用のために必須であることが示される。
アガロース中の電気泳動において、PA−BPは血漿のβ
−グロブリンと同時に展開する単一の活性ピークを与え
る。等電点電気泳動（iso−electric focussing）にお
いて、PA−BPはpH6.5〜7.0に現われ、これはアガロース
中の電気泳動の移動度と一致する。
−グロブリンと同時に展開する単一の活性ピークを与え
る。等電点電気泳動（iso−electric focussing）にお
いて、PA−BPはpH6.5〜7.0に現われ、これはアガロース
中の電気泳動の移動度と一致する。
PA−BPは、ｔ−PA阻害剤と対照的に、内皮細胞、HEP
G2細胞、および肝細胞の培養のコンディショニングし
た培地中に測定可能な量で見出された。また、凍結乾燥
により得られる高度に濃厚な培地（20×）において、測
定可能な量のPA−BPを検出することができた。
G2細胞、および肝細胞の培養のコンディショニングし
た培地中に測定可能な量で見出された。また、凍結乾燥
により得られる高度に濃厚な培地（20×）において、測
定可能な量のPA−BPを検出することができた。
PA阻害剤は血小板のトリトンＸ−100抽出液中で検出
されたが、PA−BPは検出されなかった。これは、PA阻害
剤のすべてをPA阻害剤に対する抗血清で阻害できたとい
う事実から明らかである。
されたが、PA−BPは検出されなかった。これは、PA阻害
剤のすべてをPA阻害剤に対する抗血清で阻害できたとい
う事実から明らかである。
プールした正常の血漿において、5IU/mlのPA−BP濃度
が決定され、ここで100,000の分子量は10ng/mlまたは0.
1ナノモル/lの低い値に相当する。これは休止条件（res
ting conditions）下に得られた血漿中の遊離ｔ−PAに
関して10〜100倍過剰である。１〜５ピコモルのｔ−PA
およびPA−BPの阻害／解離定数では、これはｔ−PAの本
質的にすべてがPA−BPとの複合体中に存在することを意
味する。健康な個体において、かなり一定（標準偏差15
％）のPA−BP濃度が見出された；これはPA阻害剤の大き
い個々の間の変動と対照的である。血漿中のPA阻害剤の
アッセイにおいて、得意的PA阻害剤を測定する目的で合
計からPA−BP値を減じなければならないことが明らかと
なったとき、PA阻害剤の個々の間の変動はなおいっそう
著しくなり、そして多くの場合本質的ゼロのPA阻害剤の
活性が見出された。明らかに、PA阻害剤は血漿で頻繁に
は検出可能ではない。
が決定され、ここで100,000の分子量は10ng/mlまたは0.
1ナノモル/lの低い値に相当する。これは休止条件（res
ting conditions）下に得られた血漿中の遊離ｔ−PAに
関して10〜100倍過剰である。１〜５ピコモルのｔ−PA
およびPA−BPの阻害／解離定数では、これはｔ−PAの本
質的にすべてがPA−BPとの複合体中に存在することを意
味する。健康な個体において、かなり一定（標準偏差15
％）のPA−BP濃度が見出された；これはPA阻害剤の大き
い個々の間の変動と対照的である。血漿中のPA阻害剤の
アッセイにおいて、得意的PA阻害剤を測定する目的で合
計からPA−BP値を減じなければならないことが明らかと
なったとき、PA阻害剤の個々の間の変動はなおいっそう
著しくなり、そして多くの場合本質的ゼロのPA阻害剤の
活性が見出された。明らかに、PA阻害剤は血漿で頻繁に
は検出可能ではない。
血漿中のPA阻害剤の変動は、ここでは２つの別々の成
分のためである。しかしながら、変動は主としてPA阻害
剤のためであることおよび、例えば、阻害の毎日のリズ
ムおよび急性期の反応はPA阻害剤のためであり、これに
対してPA−BPは一定であるかあるいは制限されたばらつ
きを示すことが発見された。
分のためである。しかしながら、変動は主としてPA阻害
剤のためであることおよび、例えば、阻害の毎日のリズ
ムおよび急性期の反応はPA阻害剤のためであり、これに
対してPA−BPは一定であるかあるいは制限されたばらつ
きを示すことが発見された。
また、動物、例えば、ラットおよびウサギの血漿にお
いて、熱安定性の成分が見出され、これはPA−BPに匹敵
した。PA阻害剤の強いばらつきは、例えば、エンドトキ
シンを注射したとき、見られたが、PA−BPは一定にとど
まった。
いて、熱安定性の成分が見出され、これはPA−BPに匹敵
した。PA阻害剤の強いばらつきは、例えば、エンドトキ
シンを注射したとき、見られたが、PA−BPは一定にとど
まった。
ラットにおける高いレベルのPA阻害剤を有するラット
の血漿（他の動物においてエンドトキシンの注射および
４時間後の血液のサンプリングにより得られた）を注入
後、PA阻害剤は３〜４分の半減期を有する急速な消滅
（clearing）を示したが、これに対して注入により同様
に増加したPA−BPのレベルはこの観測期間の間にほとん
ど減少しないことが観察された。このことは、半減期ま
たはPA−BPについて数日程度を示唆する。このことが意
味するように、PA−BPの安定な血漿濃度は、また、ｔ−
PAの循環の間および後に、例えば、DDAVPの注入後に、
急速な合成によって得られない。ｔ−PAが肝臓を経る循
環から急速に消滅するとき、ｔ−PAはPA−BPから解離さ
れること推定すべきである。
の血漿（他の動物においてエンドトキシンの注射および
４時間後の血液のサンプリングにより得られた）を注入
後、PA阻害剤は３〜４分の半減期を有する急速な消滅
（clearing）を示したが、これに対して注入により同様
に増加したPA−BPのレベルはこの観測期間の間にほとん
ど減少しないことが観察された。このことは、半減期ま
たはPA−BPについて数日程度を示唆する。このことが意
味するように、PA−BPの安定な血漿濃度は、また、ｔ−
PAの循環の間および後に、例えば、DDAVPの注入後に、
急速な合成によって得られない。ｔ−PAが肝臓を経る循
環から急速に消滅するとき、ｔ−PAはPA−BPから解離さ
れること推定すべきである。
要約すると、本発明による新規な蛋白質、PA−結合性
蛋白質（PA−BP）、の性質は次の通りである： PA−BPは、ウルトロゲル（Ultrogel:商標）ACA44を使
用するゲルクロマトグラフィーにより推定して、100,00
0の分子質量（molecular mass）を有する血漿蛋白質で
ある。
蛋白質（PA−BP）、の性質は次の通りである： PA−BPは、ウルトロゲル（Ultrogel:商標）ACA44を使
用するゲルクロマトグラフィーにより推定して、100,00
0の分子質量（molecular mass）を有する血漿蛋白質で
ある。
アガロース電気泳動における電気泳動の移動度は、血
漿β−ブロブリンのそれに等しい。
漿β−ブロブリンのそれに等しい。
等電点は6.5〜7.0である。
PA−BPは数日間少なくとも56℃まで熱安定性である。
PA−BPはフィブリンに結合せず、そしてｔ−PAのフィ
ブリンへの結合を阻害しない。PA−BPはコンカナバリン
Ａに結合する糖残基を含有しない。
ブリンへの結合を阻害しない。PA−BPはコンカナバリン
Ａに結合する糖残基を含有しない。
PA−BPは１〜５ピコモルの見掛けの阻害定数でｔ−PA
活性を阻害する。この阻害は短いおよび長い期間にわた
って可逆的であり、そしてまた他の阻害剤によるｔ−PA
の不活性化を阻害する。
活性を阻害する。この阻害は短いおよび長い期間にわた
って可逆的であり、そしてまた他の阻害剤によるｔ−PA
の不活性化を阻害する。
PA−BPはウロキナーゼと相互作用するが、プロウロキ
ナーゼと相互作用しない。
ナーゼと相互作用しない。
PA−BPの相互作用のため、プラスミノゲン活性化因子
の活性中心は必要である。
の活性中心は必要である。
PAとの相互作用において、クリングル２が参加する。
PA−BPは、免疫学的基準および蛋白質−化学的特性に
従い、かつ体中の分布に関するかぎりにおいて、PA阻害
剤と異なる。
従い、かつ体中の分布に関するかぎりにおいて、PA阻害
剤と異なる。
PA−BPは、約10mg/mlの一定の血漿濃度を有し、循環
から数日のゆっくりして消滅し、そして血小板、および
内皮細胞および肝細胞の培養基の中に測定可能な濃度で
存在しない。
から数日のゆっくりして消滅し、そして血小板、および
内皮細胞および肝細胞の培養基の中に測定可能な濃度で
存在しない。
本発明は、前述の性質を有するPA−BPに関する。本発
明は、また、PA−BPを調製する方法に関する。第１に、
PA−BPは哺乳動物、例えば、ヒトまたはウサギまたはラ
ットの血液または血液分画から、蛋白質の性質に適合す
る通常の蛋白質精製技術により得ることができる。
明は、また、PA−BPを調製する方法に関する。第１に、
PA−BPは哺乳動物、例えば、ヒトまたはウサギまたはラ
ットの血液または血液分画から、蛋白質の性質に適合す
る通常の蛋白質精製技術により得ることができる。
本発明は、また、細胞培養物から、組み換えDNA技術
により修飾された微生物または他の宿主有機体により調
製されたPA−BPからなる。
により修飾された微生物または他の宿主有機体により調
製されたPA−BPからなる。
PA−BPの精製は、プラスミノゲン活性化因子、あるい
はつのクリングルを含めて、Ｎ−末端部分が不存在であ
ることができる、突然変異のｔ−PAが結合したカラムを
使用する親和クロマトグラフィーにより実施することが
できる。親和クロマトグラフィーは、例えば、プラスミ
ノゲンの不存在下に実施することができ、そして蛋白質
の性質に適合する伝統的な分離技術を用いて完結するこ
とができる。プラスミノゲン活性化因子の活性中心は、
完全であるか、あるいは限界的に修飾されているべきで
ある。
はつのクリングルを含めて、Ｎ−末端部分が不存在であ
ることができる、突然変異のｔ−PAが結合したカラムを
使用する親和クロマトグラフィーにより実施することが
できる。親和クロマトグラフィーは、例えば、プラスミ
ノゲンの不存在下に実施することができ、そして蛋白質
の性質に適合する伝統的な分離技術を用いて完結するこ
とができる。プラスミノゲン活性化因子の活性中心は、
完全であるか、あるいは限界的に修飾されているべきで
ある。
さらに、本発明は、検出およびアッセイの方法に関
し、ここで試料の予備処理またはPA阻害剤の抗体の添加
は現存する方法を特異的とする。また、本発明は、現存
する方法をこの特定の因子に対して特異的とする方法に
関する。血漿および他の試料の中のPA阻害剤のための既
知のアッセイ法のすべては、ここで使用可能である。こ
うして、このアッセイ法は、PA阻害剤の抗体の添加によ
り、あるいはPA阻害剤を不活性化するために37℃で適当
な期間、例えば、少なくとも10時間の間試料を予備イン
キュベーションすることにより、PA−BPについて特異的
とする。PA阻害剤の特異的寄与は、活性が抗体により中
和されるとき、あるいは予備インキュベーションにより
不活性化されるとき、計算される。
し、ここで試料の予備処理またはPA阻害剤の抗体の添加
は現存する方法を特異的とする。また、本発明は、現存
する方法をこの特定の因子に対して特異的とする方法に
関する。血漿および他の試料の中のPA阻害剤のための既
知のアッセイ法のすべては、ここで使用可能である。こ
うして、このアッセイ法は、PA阻害剤の抗体の添加によ
り、あるいはPA阻害剤を不活性化するために37℃で適当
な期間、例えば、少なくとも10時間の間試料を予備イン
キュベーションすることにより、PA−BPについて特異的
とする。PA阻害剤の特異的寄与は、活性が抗体により中
和されるとき、あるいは予備インキュベーションにより
不活性化されるとき、計算される。
PA−BPはヒト血漿中に0.1ナノモル/lの平均濃度で存
在する。この平均値は正常の健康なボラティアにおいて
決定された。PA−BPの濃度は（0900−1500時間）の日の
間に変化せず、そして急性期の反応または敗血症の患者
において強く異ならない。PA−BPのレベルは循環するｔ
−PAの一時的増加により、例えば、DDAVPの注入により
低下しない。
在する。この平均値は正常の健康なボラティアにおいて
決定された。PA−BPの濃度は（0900−1500時間）の日の
間に変化せず、そして急性期の反応または敗血症の患者
において強く異ならない。PA−BPのレベルは循環するｔ
−PAの一時的増加により、例えば、DDAVPの注入により
低下しない。
PA−BPはｔ−PAおよびウロキナーゼの有効性を特異的
な方法におけるプラスミノゲン活性化因子の可逆的結合
により制御し、ここでｔ−PAのフィブリンへの化合物は
阻害されないが、プラスミノゲン活性化因子の活性は重
合したフィブリンの不存在下におよびフィブリンおよび
フィブリノゲンの断片またはそれらの分解生成物の存在
下に阻害される。プラスミノゲン活性化因子は他の方法
による不活性化に対して保護される。
な方法におけるプラスミノゲン活性化因子の可逆的結合
により制御し、ここでｔ−PAのフィブリンへの化合物は
阻害されないが、プラスミノゲン活性化因子の活性は重
合したフィブリンの不存在下におよびフィブリンおよび
フィブリノゲンの断片またはそれらの分解生成物の存在
下に阻害される。プラスミノゲン活性化因子は他の方法
による不活性化に対して保護される。
PA−BPのこの役割をかんがみて、PA−BPは線維素溶解
抑制因子として使用することができる。循環からの消滅
が遅いため、少量の物質は長時間にわたって血漿レベル
を実質的に増加させることができる。生成物はプラスミ
ノゲン活性化因子の全身作用を低下するという価値を有
することができる。それは血漿崩壊の治療においてｔ−
PAまたはウロキナーゼへの添加剤として価値をもつこと
ができ、そして血栓崩壊作用に比較して全身の作用を低
下させることができる。それはプラスミノゲン活性化因
子のフィブリン依存性活性、細胞外分解、散在性血管内
の凝血の抑制において価値をもつことができる。
抑制因子として使用することができる。循環からの消滅
が遅いため、少量の物質は長時間にわたって血漿レベル
を実質的に増加させることができる。生成物はプラスミ
ノゲン活性化因子の全身作用を低下するという価値を有
することができる。それは血漿崩壊の治療においてｔ−
PAまたはウロキナーゼへの添加剤として価値をもつこと
ができ、そして血栓崩壊作用に比較して全身の作用を低
下させることができる。それはプラスミノゲン活性化因
子のフィブリン依存性活性、細胞外分解、散在性血管内
の凝血の抑制において価値をもつことができる。
したがって、本発明は、また、活性成分としてPA−BP
を含有する製薬学的組成物に関する。
を含有する製薬学的組成物に関する。
以下の実施例により、本発明を説明する。これらの実
施例において使用した物質および方法は次の通りであ
る： ウルトルゲル（Ultrogel）ACA44はLKB（スウェーデ
ン）から入手した。
施例において使用した物質および方法は次の通りであ
る： ウルトルゲル（Ultrogel）ACA44はLKB（スウェーデ
ン）から入手した。
刺激剤は、ヴェルヘイジェン（Verheijen）ら、トロ
ンボシス・ヘマストシス（Thromb.Haemastos.）、48、2
66−269（1982）に記載されるようにして、フィブリノ
ゲンから臭化シアンの処理により調製した。
ンボシス・ヘマストシス（Thromb.Haemastos.）、48、2
66−269（1982）に記載されるようにして、フィブリノ
ゲンから臭化シアンの処理により調製した。
S2251。式Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−ｐ−ニトロアニリ
ド・２時間細胞を有するこの色素発生性プラスミン基質
は、カビ（Kbi）（ウェーデン国モルンダル）から入手
した。
ド・２時間細胞を有するこの色素発生性プラスミン基質
は、カビ（Kbi）（ウェーデン国モルンダル）から入手
した。
プラスミノゲン。プラスミノゲンは、リジン−エウペ
ルギット（lysine−eupergit）を使用する親和クロマト
グラフィーによりコーンフラックションIIIから単離し
た。
ルギット（lysine−eupergit）を使用する親和クロマト
グラフィーによりコーンフラックションIIIから単離し
た。
ｔ−PA。クラフト（Kluft）ら、アドバンス・イン・
バイオテクノロジカル・プロセス（Advance in Biote
chnological Processes）vol.2［ミズラヒ（Mizrah
i）、A.v.ウェゼル（Wezel）AL編］ニューヨーク:ARリ
ス（Liss）、1983、97−100ページに記載されるように
して、ボウエス（Bowes）色素細胞腫系統の細胞培養基
から、一本鎖および二本鎖のｔ−PAを単離した。ファー
マシア（Pharmacia）会社のCNBr−セファロースについ
て取扱説明に従い、ｔ−PAをセファロースの結合した。
ｔ−PAをジイソプロピルフルオロホスフェート（１ミリ
モル）で処理することにより不活性化した。活性中心を
含有するｔ−PAの軽鎖を、二本鎖のｔ−PAの還元、再酸
化およびゲル濾過による分離によって得た。フィンガ
ー、成長ホルモン、およびＮ−末端クリングル領域を欠
く突然変異のｔ−PAを、色素細胞腫のｔ−PAの暗号を指
定するｃ−DNAの組み換えDNA操作によって調製した。突
然変異体の発現はCHO［チャイニーズ・ハムスター・オ
バリウ（Chinese Haster Ovaium）］細胞から得た。
バイオテクノロジカル・プロセス（Advance in Biote
chnological Processes）vol.2［ミズラヒ（Mizrah
i）、A.v.ウェゼル（Wezel）AL編］ニューヨーク:ARリ
ス（Liss）、1983、97−100ページに記載されるように
して、ボウエス（Bowes）色素細胞腫系統の細胞培養基
から、一本鎖および二本鎖のｔ−PAを単離した。ファー
マシア（Pharmacia）会社のCNBr−セファロースについ
て取扱説明に従い、ｔ−PAをセファロースの結合した。
ｔ−PAをジイソプロピルフルオロホスフェート（１ミリ
モル）で処理することにより不活性化した。活性中心を
含有するｔ−PAの軽鎖を、二本鎖のｔ−PAの還元、再酸
化およびゲル濾過による分離によって得た。フィンガ
ー、成長ホルモン、およびＮ−末端クリングル領域を欠
く突然変異のｔ−PAを、色素細胞腫のｔ−PAの暗号を指
定するｃ−DNAの組み換えDNA操作によって調製した。突
然変異体の発現はCHO［チャイニーズ・ハムスター・オ
バリウ（Chinese Haster Ovaium）］細胞から得た。
ウロキナーゼは、レオ（Leo）（スウェーデン国バレ
ラップ］から高分子量および低分子量の形態の混合物と
して、およびアボッド（Abott）から低分子量の形態と
して入手した。
ラップ］から高分子量および低分子量の形態の混合物と
して、およびアボッド（Abott）から低分子量の形態と
して入手した。
プロウロキナーゼは、サル腎細胞培養物から、ウロキ
ナーゼに対するIgGを使用するカラムへの吸着により精
製した。
ナーゼに対するIgGを使用するカラムへの吸着により精
製した。
PA阻害剤に対するIgG。PA阻害剤は、バン・ムーリク
（Van Mourik）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、259、14914−1492
1（1984）に記載されるようにして、内皮細胞培養基か
ら単離した。抗血清はウサギの免疫化により発生させ、
そしてIgGは蛋白質Ａセルァロース［ファーマシア（Pha
rmacia）、スウェーデン国ウップサラ］を使用して精製
した。
（Van Mourik）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、259、14914−1492
1（1984）に記載されるようにして、内皮細胞培養基か
ら単離した。抗血清はウサギの免疫化により発生させ、
そしてIgGは蛋白質Ａセルァロース［ファーマシア（Pha
rmacia）、スウェーデン国ウップサラ］を使用して精製
した。
エンドキシン、大腸菌（Escherichia coli）（血清
型0128:B12）はシグマ（Sigma）、米国セイント・ルウ
スから入手した。
型0128:B12）はシグマ（Sigma）、米国セイント・ルウ
スから入手した。
ウイスター（Wister）ラットは、セントラアアル・プ
レフディエレンベドリジフ（Centraal Proefdierenbed
rijf）TNO、ゼイスト（Zeist）から入手し、そして試験
はネンブタール（Nembutal）の麻酔（60mg/kg 腹腔
内）の下に実施した。
レフディエレンベドリジフ（Centraal Proefdierenbed
rijf）TNO、ゼイスト（Zeist）から入手し、そして試験
はネンブタール（Nembutal）の麻酔（60mg/kg 腹腔
内）の下に実施した。
内皮細胞はへその緒の容器（umbilical cord vesse
l）からコラゲナーゼ発酵により単離し、そして、血清
を添加しない、ダルベッコ（Dullbeco）の変性イーグル
ス（Eagles）培地中でフィブリノネクチン被覆ディスク
上で全面成長に培養した。永久ヘパトーム細胞系統HEP
G2の細胞、肝細胞および線維芽細胞を血清不含培地中
で標準条件下に培養した。
l）からコラゲナーゼ発酵により単離し、そして、血清
を添加しない、ダルベッコ（Dullbeco）の変性イーグル
ス（Eagles）培地中でフィブリノネクチン被覆ディスク
上で全面成長に培養した。永久ヘパトーム細胞系統HEP
G2の細胞、肝細胞および線維芽細胞を血清不含培地中
で標準条件下に培養した。
血漿を供与体の血液から入手し、そして0.11モルのク
エン酸ナトリウムを含有する溶液の0.10容量で安定化し
た。
エン酸ナトリウムを含有する溶液の0.10容量で安定化し
た。
ウルトロゲル（Ultrogel）ACA34のゲル濾過。これは
0.01モルのトリスHCl緩衝液、pH7.4および0.05モルのNa
Clと平衡化しかつそれらを充填した275mlのカラム中で
実施した。このカラムを種々のマーカー蛋白質を使用す
ることによりおよび、カビ（Kbi）会社（ウェーデン国
モルンダル）のストレプトキナーゼ不活性化法に従い血
漿プラスミノゲンの測定を経る内部目盛定めにより目盛
定めした。
0.01モルのトリスHCl緩衝液、pH7.4および0.05モルのNa
Clと平衡化しかつそれらを充填した275mlのカラム中で
実施した。このカラムを種々のマーカー蛋白質を使用す
ることによりおよび、カビ（Kbi）会社（ウェーデン国
モルンダル）のストレプトキナーゼ不活性化法に従い血
漿プラスミノゲンの測定を経る内部目盛定めにより目盛
定めした。
等電フォーカシングはポリアクリルアミドゲルのロッ
ド中で実施し、電気泳動後、このゲルをスライスに切断
した。阻害アッセイ法の試験緩衝液中でスライスを抽出
した後、ｔ−PAの阻害を測定した。3.5〜9.5のpHの勾配
を研究した。
ド中で実施し、電気泳動後、このゲルをスライスに切断
した。阻害アッセイ法の試験緩衝液中でスライスを抽出
した後、ｔ−PAの阻害を測定した。3.5〜9.5のpHの勾配
を研究した。
ｔ−PAのアッセイ、0.13μモルのプラスミノゲン、0.
1％（v/v）のツイーン80、0.12mg/mlのフィブリノゲン
断片（刺激剤またはフィブリンのモノマー）および0.30
ミリモルの色素発生性プラスミン基質（例えば、S225
1）を含有する0.25mlのトリス−HCl緩衝液（0.01モル、
pH7.5）中で、アッセイ25℃でインキュベーションす
る。405nmにおける光の吸収を、種々のインキュベーシ
ョン期間後に測定する。このアッセイは96ウェル（wel
l）を有するマイクロタイタープレート（microtiter p
late）中でタイターテク（Titertek）試験装置［フロー
（Flow）、英国アービン］を使用して実施する。吸収の
増加をインキュベーションの期間の平方で割った値は、
活性化因子の濃度に対して比例する。ｔ−PAの活性は、
WHOのファースト・インターナショナル・スタンダード
（First International Standard）、コード83/517に
従う国際単位で表わす。
1％（v/v）のツイーン80、0.12mg/mlのフィブリノゲン
断片（刺激剤またはフィブリンのモノマー）および0.30
ミリモルの色素発生性プラスミン基質（例えば、S225
1）を含有する0.25mlのトリス−HCl緩衝液（0.01モル、
pH7.5）中で、アッセイ25℃でインキュベーションす
る。405nmにおける光の吸収を、種々のインキュベーシ
ョン期間後に測定する。このアッセイは96ウェル（wel
l）を有するマイクロタイタープレート（microtiter p
late）中でタイターテク（Titertek）試験装置［フロー
（Flow）、英国アービン］を使用して実施する。吸収の
増加をインキュベーションの期間の平方で割った値は、
活性化因子の濃度に対して比例する。ｔ−PAの活性は、
WHOのファースト・インターナショナル・スタンダード
（First International Standard）、コード83/517に
従う国際単位で表わす。
実施例Ｉ ｔ−PA−阻害剤のアッセイは、阻害剤含有試料、例え
ば、血漿をｔ−PA系列を使用する滴定として実施する。
ｔ−PAの活性は前述のｔ−PAアッセイ法を使用して実施
する。
ば、血漿をｔ−PA系列を使用する滴定として実施する。
ｔ−PAの活性は前述のｔ−PAアッセイ法を使用して実施
する。
第１図は、試験において20μｌの血漿を添加して曲線
を作成する方法を示し、これはＸ軸への外挿で、阻害の
量を中和されたｔ−PAの量として表わす。第１図は、ま
た、37℃で一夜インキュベーションした血漿が低い阻害
を示すことを明らかにする。この残留阻害は、内皮細胞
の培養基から単離されたPA阻害剤に対する免疫グロブリ
ンを使用して阻害されえない。これらの免疫グロブリン
は新しい血漿に対して作用を事実有し、そしてｔ−PAの
阻害をインキュベーションした血漿のレベルに減少す
る。したがって、この曲線はプラズマー（マイナス）ｔ
−PA阻害剤の指示を与える。
を作成する方法を示し、これはＸ軸への外挿で、阻害の
量を中和されたｔ−PAの量として表わす。第１図は、ま
た、37℃で一夜インキュベーションした血漿が低い阻害
を示すことを明らかにする。この残留阻害は、内皮細胞
の培養基から単離されたPA阻害剤に対する免疫グロブリ
ンを使用して阻害されえない。これらの免疫グロブリン
は新しい血漿に対して作用を事実有し、そしてｔ−PAの
阻害をインキュベーションした血漿のレベルに減少す
る。したがって、この曲線はプラズマー（マイナス）ｔ
−PA阻害剤の指示を与える。
実施例II PA阻害剤の熱安定性。第２図は、プールした正常の血
漿中のPA阻害剤のｔ−PA阻害剤の活性が０℃により高い
温度においてインキュベーションすると減少することを
示す。PA−BPの阻害は減じられている。不活性化速度
（ｋ）は温度に高度に依存性であり、10℃の温度の上昇
毎にファクター５で増加する（インセット）。PA−BPの
残留阻害は、いずれの場合においても、少なくとも１週
間の間かつ56℃までの温度において安定にとどまること
が観測された。現在まで、PA阻害剤の同一のインキュベ
ーション速度がすべての個々の血漿において得られた。
漿中のPA阻害剤のｔ−PA阻害剤の活性が０℃により高い
温度においてインキュベーションすると減少することを
示す。PA−BPの阻害は減じられている。不活性化速度
（ｋ）は温度に高度に依存性であり、10℃の温度の上昇
毎にファクター５で増加する（インセット）。PA−BPの
残留阻害は、いずれの場合においても、少なくとも１週
間の間かつ56℃までの温度において安定にとどまること
が観測された。現在まで、PA阻害剤の同一のインキュベ
ーション速度がすべての個々の血漿において得られた。
実施例III 阻害の速度論。見掛の阻害定数は、例えば、第１図に
おけるように、遊離のｔ−PAおよび結合したｔ−PAの相
互的な値をプロットすることにより結果から得ることが
できる。これらの直線状の曲線は、すべての場合におい
て、合計の血漿、内皮細胞の培養基およびインキュベー
ションした血漿（PA−BP）について１〜５ピコモルの同
一の値を表わすＸ軸上の軸の区画を示す。ｔ−PAおよび
インキュベーションした血漿または精製したPA−BPの混
合物を異なる希釈でアッセイするとき、異なる百分率の
遊離のｔ−PAが得られる。例えば、ｔ−PAの欠失の場合
において、38％、33％および22％の遊離のｔ−PAが、そ
れぞれ、1:10および1:3の希釈および未希釈において得
られた。これは可逆的な複合体の形成を示唆する。
おけるように、遊離のｔ−PAおよび結合したｔ−PAの相
互的な値をプロットすることにより結果から得ることが
できる。これらの直線状の曲線は、すべての場合におい
て、合計の血漿、内皮細胞の培養基およびインキュベー
ションした血漿（PA−BP）について１〜５ピコモルの同
一の値を表わすＸ軸上の軸の区画を示す。ｔ−PAおよび
インキュベーションした血漿または精製したPA−BPの混
合物を異なる希釈でアッセイするとき、異なる百分率の
遊離のｔ−PAが得られる。例えば、ｔ−PAの欠失の場合
において、38％、33％および22％の遊離のｔ−PAが、そ
れぞれ、1:10および1:3の希釈および未希釈において得
られた。これは可逆的な複合体の形成を示唆する。
実施例IV PA決定PA−BPの可逆的結合。正常の血漿の合計の阻害
剤容量に関して４倍過剰量のｔ−PAまたはウロキナーゼ
の添加は、アッセイすると、ｔ−PAに関する阻害のすべ
てが阻害剤のアッセイにおいて中和されることを示し
た。混合物を37℃で一夜インキュベーションした後、阻
害は再び測定可能であり、これはPA−BPの活性に量的に
等しく、そして安定にとどまった。明らかなように、知
られているように、ｔ−PAおよびウロキナーゼは血漿中
で大量に存在する他のプロテアーゼ阻害剤によりゆっく
り不活性化され、そしてPA−BPは再び開放され、そし
て、明らかに、不可逆的に中和されなかった。
剤容量に関して４倍過剰量のｔ−PAまたはウロキナーゼ
の添加は、アッセイすると、ｔ−PAに関する阻害のすべ
てが阻害剤のアッセイにおいて中和されることを示し
た。混合物を37℃で一夜インキュベーションした後、阻
害は再び測定可能であり、これはPA−BPの活性に量的に
等しく、そして安定にとどまった。明らかなように、知
られているように、ｔ−PAおよびウロキナーゼは血漿中
で大量に存在する他のプロテアーゼ阻害剤によりゆっく
り不活性化され、そしてPA−BPは再び開放され、そし
て、明らかに、不可逆的に中和されなかった。
実施例Ｖ 血漿中のPA−BPのアッセイ。この目的に、血漿を適当
な期間（45℃で２時間または37℃で一夜）インキュベー
ションしてPA阻害剤を不活性化することによって、血漿
を予備処理する。次いで、阻害を前述のｔ−PA阻害剤ア
ッセイ法に従いアッセイする。この方法は、また、例え
ば、PA−BPが同様に見出されるラットおよびウサギの血
漿について有効であるように思われる。すなわち、この
インキュベーション技術は、また、かなりの量のｔ−PA
を含有する試料に適当であり、例えば、線維素溶解を刺
激しかつｔ−PAを注入し、妨害するPAの活性が、また、
インキュベーションにより消失した（実施例IV参照）試
料に適する。血漿を予備処理しない、ｔ−PAまたはウロ
キナーゼを実質的に含有しないヒトの物質の代替法とし
て、内皮PA阻害剤に対するIgGを過剰にアッセイ系に添
加して、ｔ−PA阻害剤のアッセイを実施する。これは≧
１μg/mlの使用する抗血清のIgGである。
な期間（45℃で２時間または37℃で一夜）インキュベー
ションしてPA阻害剤を不活性化することによって、血漿
を予備処理する。次いで、阻害を前述のｔ−PA阻害剤ア
ッセイ法に従いアッセイする。この方法は、また、例え
ば、PA−BPが同様に見出されるラットおよびウサギの血
漿について有効であるように思われる。すなわち、この
インキュベーション技術は、また、かなりの量のｔ−PA
を含有する試料に適当であり、例えば、線維素溶解を刺
激しかつｔ−PAを注入し、妨害するPAの活性が、また、
インキュベーションにより消失した（実施例IV参照）試
料に適する。血漿を予備処理しない、ｔ−PAまたはウロ
キナーゼを実質的に含有しないヒトの物質の代替法とし
て、内皮PA阻害剤に対するIgGを過剰にアッセイ系に添
加して、ｔ−PA阻害剤のアッセイを実施する。これは≧
１μg/mlの使用する抗血清のIgGである。
実施例VI 培地および臨床試料の中のPA−BP。PA−BPアッセイ法
を使用して、正常の供与体の血漿中に存在するPA−BPの
量はかなり一定（標準偏差15％）であり、そして5IU/ml
のｔ−PAに等しいことが決定された。0900〜15000時間
の間の日の間、および高いPA阻害剤のレベルをもつ明瞭
な急性期の反応を有する患者、例えば、多数の外傷（２
以上の骨折）を受けた患者において、変動は見られなか
った。DDAVPの注入の間、PA−BPは循環するｔ−PAによ
り一時的にのみ中和されるように見え、そして血漿のイ
ンキュベーション後には常に正常に検出可能である。ラ
ットにおけるエンドトキシン（10μg/kg）の注射は、４
時間後、血漿中に過度に高い阻害値（1500％まで）を発
生させたが、しかし、これは完全にPA阻害剤によるもの
であった;PA−BPは不変化にとどまった。内皮細胞の培
地およびHEP G2細胞において、ｔ−PA阻害のすべてはP
A阻害剤に対するIgGで阻害することができる。また、20
倍の濃度の培地は測定可能なPA−BPの含量を示さなかっ
た。血液から沈殿させた血小板のトリトンＸ−100抽出
液はｔ−PAの阻害を示さなかったが、この阻害はPA阻害
剤に対するIgGで完全に阻害することができた。プロテ
アーゼネキシンを含有する線維芽細胞の培養基は、PA−
BPの活性を示さなかった。PA−BPは血漿のユーゴブリン
分画中に見出されなかった。
を使用して、正常の供与体の血漿中に存在するPA−BPの
量はかなり一定（標準偏差15％）であり、そして5IU/ml
のｔ−PAに等しいことが決定された。0900〜15000時間
の間の日の間、および高いPA阻害剤のレベルをもつ明瞭
な急性期の反応を有する患者、例えば、多数の外傷（２
以上の骨折）を受けた患者において、変動は見られなか
った。DDAVPの注入の間、PA−BPは循環するｔ−PAによ
り一時的にのみ中和されるように見え、そして血漿のイ
ンキュベーション後には常に正常に検出可能である。ラ
ットにおけるエンドトキシン（10μg/kg）の注射は、４
時間後、血漿中に過度に高い阻害値（1500％まで）を発
生させたが、しかし、これは完全にPA阻害剤によるもの
であった;PA−BPは不変化にとどまった。内皮細胞の培
地およびHEP G2細胞において、ｔ−PA阻害のすべてはP
A阻害剤に対するIgGで阻害することができる。また、20
倍の濃度の培地は測定可能なPA−BPの含量を示さなかっ
た。血液から沈殿させた血小板のトリトンＸ−100抽出
液はｔ−PAの阻害を示さなかったが、この阻害はPA阻害
剤に対するIgGで完全に阻害することができた。プロテ
アーゼネキシンを含有する線維芽細胞の培養基は、PA−
BPの活性を示さなかった。PA−BPは血漿のユーゴブリン
分画中に見出されなかった。
実施例VII PA−BPの特異性。アッセイ阻害剤のアッセイ法を使用
して、PA−BPのみを含有する血漿に添加したどの成分が
PA−BPの活性に影響を及ぼすかを発見しようとした。こ
のようにして、10nmg/mlのレオ（Leo）ウロキナーゼお
よびアボット（Abott）ウロキナーゼはPA−BPの活性を5
0％だけ中和することが発見され、この事実はｔ−PAに
関する等しく強い結合を示唆している。サルの肝細胞か
ら精製されたプロウロキナーゼ（14ng/ml）およびヒト
線維芽細胞培養基中に存在するプロウロキナーゼ（100n
g/ml）は、作用をまったく示さなかった。ｔ−PAについ
ての同一の実験が示すように、DEF不活性化ｔ−PA（100
ng/ml）およびｔ−PAの単離された活性軽鎖（10ng/ml）
は作用をなんら有さなかった。
して、PA−BPのみを含有する血漿に添加したどの成分が
PA−BPの活性に影響を及ぼすかを発見しようとした。こ
のようにして、10nmg/mlのレオ（Leo）ウロキナーゼお
よびアボット（Abott）ウロキナーゼはPA−BPの活性を5
0％だけ中和することが発見され、この事実はｔ−PAに
関する等しく強い結合を示唆している。サルの肝細胞か
ら精製されたプロウロキナーゼ（14ng/ml）およびヒト
線維芽細胞培養基中に存在するプロウロキナーゼ（100n
g/ml）は、作用をまったく示さなかった。ｔ−PAについ
ての同一の実験が示すように、DEF不活性化ｔ−PA（100
ng/ml）およびｔ−PAの単離された活性軽鎖（10ng/ml）
は作用をなんら有さなかった。
このアッセイ手順のｔ−PAの代わりに、組み換えDNA
操作により得られた欠失突然変異体ｔ−PAを使用した。
この突然変異体は、フィンガー、成長ホルモンおよびク
リングルー１の領域を含有しなかった。PA−BP活性は通
常これを用いてなおアッセイ可能であるように思われ
た。明らかなように、PA−BPとプラスミノゲン活性化因
子との間の相互作用は、主として完全な活性中心に依存
し、そしてｔ−PAでは、またクリングル２に依存する。
操作により得られた欠失突然変異体ｔ−PAを使用した。
この突然変異体は、フィンガー、成長ホルモンおよびク
リングルー１の領域を含有しなかった。PA−BP活性は通
常これを用いてなおアッセイ可能であるように思われ
た。明らかなように、PA−BPとプラスミノゲン活性化因
子との間の相互作用は、主として完全な活性中心に依存
し、そしてｔ−PAでは、またクリングル２に依存する。
実施例VIII PA−BPのゲル濾過。ウルトロゲル（Ultrogel）ACA44
を使用する5mlの血漿のゲル濾過は、PA阻害剤とPA−BP
との分離を示す。第３図の２つのピークは、それらの熱
不安定性によって同定された。PA−BPはクロマトグラフ
に、プラスミノゲン（90,000）に近く、そしてアルドラ
ーゼ（147,000）の後の、分子量100,000に相当する位置
に現われる。
を使用する5mlの血漿のゲル濾過は、PA阻害剤とPA−BP
との分離を示す。第３図の２つのピークは、それらの熱
不安定性によって同定された。PA−BPはクロマトグラフ
に、プラスミノゲン（90,000）に近く、そしてアルドラ
ーゼ（147,000）の後の、分子量100,000に相当する位置
に現われる。
実施例IX ｔ−PAのフィブリン結合。ｔ−PAを血漿の添加した。
この血漿は、37℃のインキュベーションのため、PA−BP
活性のみを示した。ｔ−PAはPA−BP容量に等しい量でお
よびその２倍の量で添加した。この血漿を塩化カルシウ
ムの添加およびトロンビンの添加により凝固させ、そし
て形成した凝塊を取り出した。形成した血清において、
同一量、すなわち、出発血漿中に存在したのと同一量、
のPA−BPがｔ−PAを含まない対照において、およびｔ−
PAを有する２つの血漿においてアッセイされた。これに
より示されるように、凝血へのｔ−PAの結合はPA−BPに
妨害されずに起こった。
この血漿は、37℃のインキュベーションのため、PA−BP
活性のみを示した。ｔ−PAはPA−BP容量に等しい量でお
よびその２倍の量で添加した。この血漿を塩化カルシウ
ムの添加およびトロンビンの添加により凝固させ、そし
て形成した凝塊を取り出した。形成した血清において、
同一量、すなわち、出発血漿中に存在したのと同一量、
のPA−BPがｔ−PAを含まない対照において、およびｔ−
PAを有する２つの血漿においてアッセイされた。これに
より示されるように、凝血へのｔ−PAの結合はPA−BPに
妨害されずに起こった。
実施例Ｘ 阻害に対する保護。種々のインキュベーションを、種
々の条件下にPA阻害のアッセイにおいて研究した。PA−
BPのみを含有する血漿において、ｔ−PAの活性はPA−BP
のレベルより低いｔ−PAの濃度で25℃において５時間の
間安定にとどまることが観測された。同等の点より上に
おいて、ｔ−PAは約１時間の半減期で血漿の阻害剤によ
り不活性化される。不活性化はほぼ等価点（equivalenc
e point）で停止するということは、驚くべきことであ
る。PA−BPは血漿の阻害剤による不活性化に対してｔ−
PAを保護する。細胞培養の血清不含培地を使用し、PA阻
害剤のみを存在させる、同様な試験により、ｔ−PAの活
性はゆっくり不可逆的に不活性化される（半減期2.5〜
３時間）ことが示された。PA−BPおよびPA阻害剤の両者
が存在する血漿において、ｔ−PAはPA−BPの等価点より
上において2.5〜３時間の半減期でゆっくり不活性化
し、そしてｔ−PAの活性はこの等価点より下において安
定である。明らかに、PA−BPは、また、PA阻害剤の活性
に対して保護する。
々の条件下にPA阻害のアッセイにおいて研究した。PA−
BPのみを含有する血漿において、ｔ−PAの活性はPA−BP
のレベルより低いｔ−PAの濃度で25℃において５時間の
間安定にとどまることが観測された。同等の点より上に
おいて、ｔ−PAは約１時間の半減期で血漿の阻害剤によ
り不活性化される。不活性化はほぼ等価点（equivalenc
e point）で停止するということは、驚くべきことであ
る。PA−BPは血漿の阻害剤による不活性化に対してｔ−
PAを保護する。細胞培養の血清不含培地を使用し、PA阻
害剤のみを存在させる、同様な試験により、ｔ−PAの活
性はゆっくり不可逆的に不活性化される（半減期2.5〜
３時間）ことが示された。PA−BPおよびPA阻害剤の両者
が存在する血漿において、ｔ−PAはPA−BPの等価点より
上において2.5〜３時間の半減期でゆっくり不活性化
し、そしてｔ−PAの活性はこの等価点より下において安
定である。明らかに、PA−BPは、また、PA阻害剤の活性
に対して保護する。
第１図は、試験において20μｌの血漿を添加して曲線を
作成する方法を示し、これはＸ軸への外挿で、阻害の量
を中和されたｔ−PAの量として表わす。第１図は、ま
た、37℃で一夜インキュベーションした血漿が低い阻害
を示すことを明らかにする。 第２図は、プールした正常の血漿中のPA阻害剤のｔ−PA
阻害剤の活性が０℃により高い温度においてインキュベ
ーションすると減少することを示す。 第３図は、ウルトロゲル（Ultrogel）ACA44を使用する5
mlの血漿のゲル濾過のピークを示す。
作成する方法を示し、これはＸ軸への外挿で、阻害の量
を中和されたｔ−PAの量として表わす。第１図は、ま
た、37℃で一夜インキュベーションした血漿が低い阻害
を示すことを明らかにする。 第２図は、プールした正常の血漿中のPA阻害剤のｔ−PA
阻害剤の活性が０℃により高い温度においてインキュベ
ーションすると減少することを示す。 第３図は、ウルトロゲル（Ultrogel）ACA44を使用する5
mlの血漿のゲル濾過のピークを示す。
Claims (3)
- 【請求項１】次の性質： a.ウルトロゲル（Ultrogel:商標）ACA44を使用するゲル
クロマトグラフィーにより決定して約100,000の分子質
量を有する； b.pH8.6のアガロースにおいて血漿β−グロブリンの電
気泳動移動度に等しい移動度を有する； c.6.5〜7.0の等電点を有する； d.t−PAの遊離の活性中心および特異的クリングル２の
存在下にｔ−PAおよびウロキナーゼに特異的にかつ可逆
的に結合する； e.少なくとも56℃まで熱安定性である； そして f.数日程度の半減期で循環から消滅する； を少なくとも示すことを特徴とするPA結合性蛋白質（PA
−BP）と呼ぶ蛋白質。 - 【請求項２】有効成分として、次の性質： a.ウルトロゲル（Ultrogel:商標）ACA44を使用するゲル
クロマトグラフィーにより決定して約100,000の分子質
量を有する； b.pH8.6のアガロースにおいて血漿β−グロブリンの電
気泳動移動度に等しい移動度を有する； c.6.5〜7.0の等電点を有する； d.t−PAの遊離の活性中心および特異的クリングル２の
存在下にｔ−PAおよびウロキナーゼに特異的にかつ可逆
的に結合する； e.少なくとも56℃まで熱安定性である； そして f.数日程度の半減期で循環から消滅する； を少なくとも示すPA結合性蛋白質（PA−BP）と称される
蛋白質を含有することを特徴とするｔ−PAおよびウロキ
ナーゼの有効性を制御するための医薬組成物。 - 【請求項３】PA−BPと一緒に、ｔ−PAまたはウロキナー
ゼを含有する特許請求の範囲第３項記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8502017 | 1985-07-12 | ||
| NL8502017A NL8502017A (nl) | 1985-07-12 | 1985-07-12 | Nieuw, in het bloed geidentificeerd eiwit, werkwijze ter bereiding daarvan, werkwijze ter bepaling van dit eiwit en tevens van t-pa-remmer, en farmaceutische preparaten die het eiwit bevatten. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6277326A JPS6277326A (ja) | 1987-04-09 |
| JP2512437B2 true JP2512437B2 (ja) | 1996-07-03 |
Family
ID=19846293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61164544A Expired - Lifetime JP2512437B2 (ja) | 1985-07-12 | 1986-07-12 | 血液蛋白質、その調製方法、前記蛋白質およびｔ−ＰＡ阻害剤をアツセイする方法、および前記蛋白質を含有する製薬学的組成物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5004802A (ja) |
| EP (1) | EP0208383B1 (ja) |
| JP (1) | JP2512437B2 (ja) |
| AT (1) | ATE57471T1 (ja) |
| DE (1) | DE3674955D1 (ja) |
| NL (1) | NL8502017A (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5372719A (en) * | 1992-03-30 | 1994-12-13 | Perseptive Biosystems, Inc. | Molecular imaging |
| US5474766A (en) * | 1992-12-18 | 1995-12-12 | Washington University | Methods and compositions for inhibition of hepatic clearance of tissue-type plasminogen activator |
| US5607841A (en) * | 1994-06-20 | 1997-03-04 | Lipinski; Boguslaw | Preparation and proteolytic degradation of a macromolecular protein complex from fibrinogen |
| CN105517565A (zh) | 2013-01-22 | 2016-04-20 | 田纳西大学研究基金会 | 组织纤溶酶原激活物抗体及其用途 |
-
1985
- 1985-07-12 NL NL8502017A patent/NL8502017A/nl not_active Application Discontinuation
-
1986
- 1986-07-10 DE DE8686201213T patent/DE3674955D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-10 EP EP86201213A patent/EP0208383B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-10 AT AT86201213T patent/ATE57471T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-07-11 US US06/884,418 patent/US5004802A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-07-12 JP JP61164544A patent/JP2512437B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0208383A1 (en) | 1987-01-14 |
| NL8502017A (nl) | 1987-02-02 |
| EP0208383B1 (en) | 1990-10-17 |
| JPS6277326A (ja) | 1987-04-09 |
| ATE57471T1 (de) | 1990-11-15 |
| US5004802A (en) | 1991-04-02 |
| DE3674955D1 (de) | 1990-11-22 |
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