JPS6277326A - 血液蛋白質、その調製方法、前記蛋白質およびｔ−ＰＡ阻害剤をアツセイする方法、および前記蛋白質を含有する製薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発１！１１の訂、ＩＩＩな説明 本発明は、ヒト血液中おいて回定されかつそれから中ツ
された新規な蛋白質に関する。それは、また、他の１〜
［Ｊ乳動物、例えば、ラットおよびウサギの血治中に存
在する。この新規な蛋白質は、プラスミノゲン活刊化因
子２すなわち、ｍｌ織型プラスミノゲン活性化因子（ｔ
ｉｓｓｕｅ　　ｔｙｐｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　　ａ
ｃｔｉｖａｔ。

ｒ）（ｔ−ＰＡ）およびウロキナーゼの活性を特異的に
阻害するように思われる。この蛋白質はＰＡ−結合性蛋
白質（ＰＡ−ＢＰ）と呼ぶ。

血漿はｔ−ＰＡの阻害を示すことが知られており、この
ｔ−ＰＡは、例えば、Ｆ　Ａ　−３１１害試験によりア
ッセイ（ａｓｓａｙ）することができる［トロンボシス
−へマストシス（Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｅｍａｓｔ　ｏｓ、）、４８．２６６−２６９（１
９８２）］。この阻害はよく特徴づけられたＰＡ阻害剤
のためであり［血液凝固の最近の発展（Ｒｅｃｅｎｔ　
　Ａｄｖａｎｃｅｓ　　ｉ　ｎ　　Ｂｌｏｏｄ　　Ｃｏ
ａｇｕｌａｔｉｏｎ）、Ｌ、ボウラー（ｒｏｌｌｅｒ）
編；チャーチル争リビングスト−ｙ（Ｃｈｕｒｃｈｉｌ
ｌ　　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）ｔ−−ニーヨーク、Ｖ
ｏｌ、１１−２２ページ（１９８５）］、この阻害剤は
血小板、内皮細胞培養基および肝細胞培ｇ！ｉ基中にも
見出された。

血漿中において、第２蛋白質はｔ−ＰＡの阻害に寄与す
ること、およびこの蛋白質はＰＡ阻害剤に関係しないこ
とが発見された。この蛋白質は、１００．０００（７）
分子質量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓ）（ゲル症過）
を有し、ｔ−ＰＡと可逆的に反応する蛋白質と思われる
。このＰＡ−結合性蛋白質（ＰＡ−ＢＰ）を、以後詳細
に説明する。

フイブリノゲンのフィブリンへの転化は重要な生物学的
過程である。フィブリンの形成は止血においてきわめて
重要であるが、それは、また、他の生物学的過程、例え
ば、炎症および悪性の病気および組織の修復過程におけ
る１つの重要な面である。有機体におけるフィブリンの
付着物のデグラテイショ７　（ｄｅｇｒａｔ　ａｔ　ｉ
　ｏｎ）はセリンブロテイナーゼブラスミンにより触媒
され、そしてプラスミンは活性化因子の影響のもとにプ
ラスミノゲンから形成される。２つの型の活性化因子が
知られている二組織型（ｔ−ＰＡ）およびウロキナーゼ
。フィブリンのデグラテイションは、これらのプラスミ
ノゲン活性化因子により、プラスミン阻害剤によりおよ
び活性化因子阻害剤により制御されることが知られてい
る。

プラスミノゲン活性化因子を介する線維素溶解を制御す
る最も重要な阻害性蛋白質は、ＰＡ酊１害剤である。こ
の阻害剤は１９８２〜１９８３年以来初めて同定され、
そしてその活性はｔ−ＰＡの滴定による簡単な方法でア
ッセイすることができ、そしてｔ−ＰＡは、例えば、オ
ランタ国特許８２０１９８７号に従う手順によりアッセ
イすることができる。ＰＡ阻害剤の研究は、この蛋白質
がまた不Ｐｌ’ｊ性または沿在的な形態で存在すること
もできることを示した。

Ｐ　Ａ　１ｉｆｌ害剤の他の研究は阻害剤の活性を中和
することができかつ不活性な形態と反応する抗体をイ１
１ることに導し）だ。それは、また、ｐ　Ａ　ｐｕ　＝
子側の活性が３７°Ｃで不安定であることが発見された
。

これらの研究の１１ｉ１に実施された血漿中のＰＡ阻害
剤の活性の測定により、この阻害剤の一部分は３７℃で
不安定であり、そしてこの温度においてこの部分はＰＡ
阻害剤に対する抗血清と反応しないことが観察された。

さらに、これらの研究により、第２ＰＡ阻害性蛋白質が
含まれることが示された。

ＰＡ−ＢＰの性質を、ここで詳述する。

ヒｈｔ−ＰＡは２つの相同クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ
）構造、すなわち、表皮成長因子の一部に対して相同の
領域、フィブロネクチンのフィンガー（ｆｉｎｇｅｔ）
構造対して相同の領域およびセリン含有活性中心をもつ
軽鎖領域を含有する。これらの領域は配位子、蛋白質お
よび細胞構造体の結合においである役；１７１を演する
と考えられ、これらの結合はｔ−ＰＡの生物学的機能の
調ｎのために必須である。関係するプラスミノゲン活ｔ
ｌ化因子、ウロキナーゼ、はクリングルとｆｈ　性中心
をもつ軽鎖を有する。

線ｍ素溶解のためのｔ−ＰＡの有効性の制御は、また、
分子中の領域の大きい数をかんがみて、きわめて複雑で
ある。

フィブリノゲンの凝集において、ｔ−ＰＡは凝血中に組
み込まれる。循環においであるいは凝血の形成時におけ
る面管壁の内皮細胞からのｔ−ＰＡの急速な再′＠環に
おけるｔ−ＰＡの有効性は。

ｍｍ素溶解のための必須のパラメーターである。

この面に関してｔ−ＰＡが不士分であることは、血栓の
素質を意味する。ｔ−ＰＡの過剰は出血の素質を意味す
る。

ｔ−ＰＡの活性のフィブリン統制（ｆｉｂｒｉｎ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄｎｅｓｓ）は、ウロキナーゼおよびストレ
プトキナーゼ（バクテリアの生産物）の活性と反対に、
重要であり、それによるフィブリンへの結合はｔ−ＰＡ
の活性の二相の大きさの刺激を誘発する。ｔ−ＰＡのこ
の性質はｔ−ＰＡの応用において血栓崩壊因子として使
用される。血栓症および、例えば、心不全における凝血
の溶解のために必要であるウロキナーゼおよびストレプ
トキナーゼの量は、また、循環においてかなりな作用を
惧え、ここでプラスミンの形成も起こり、そしてプラス
ミンはん望ましくない蛋白質加水分解を誘発し、その結
果出血の危険が増加する。凝血の外側のｔ−ＰＡの活性
は実質的の低い。

ｔ−ＰＡの有効性および活性の制御は、なかでも、阻害
により、すなわち、ＰＡ阻害剤により実施される。循環
において、ＰＡ阻害剤はｔ−ＰＡの不活性に寄り−シ、
また形成すべきプラスミンによる望ましくない蛋白質加
水分解の制限に寄与する。この［−１的で、それは非常
に急速にｔ−ＰＡとｉｉＪ逆的視的複合体成し、その複
合体はｔ−ＰＡが不活性である不可逆的な複合体にゆっ
くり（半減期約０．５時間）に転化する。ＰＡ阻害剤の
血液レベルは非常に変動しくＯ〜１８ＩＵ／ｍｌ）およ
びこのＰＡ阻害剤の作用は、それゆえ、同様に変動する
。その上、３７℃における凝血の過程において、Ｐ　Ａ
　１ｌｆｌ害剤はＩＪＪらかにｇ発的に（半減期約８０
−１００分）活性蛋白質Ｃおよびトロンビンにより不活
性化される。新しく発見された成分、ＰＡ−ＢＰ、は非
常にいっそう安定な血漿濃度を右し、安定であり、それ
ゆえ、循環におけるｔ−ＰＡ活性の防止において重要な
辻統的因子である。

その不安定性をかんがみて、Ｐ　Ａ　ｉｌｌ害剤は形成
した凝血中に一時的に存在するだけであり、そして、な
かでも、外部から来るプラスミノゲン活性化囚了−の、
凝血の環境における、芥旧害によって、凝血の一時的安
定化のためにのみ重要である。ＰＡ−ＢＰはボスに存在
し、そしてＰＡの活性の長期間の制御に重要である。

ＰＡを使用する血栓崩壊の治療において、ｔ−ＰＡの多
い投与量は所望の血栓崩壊を得るために必要であるよう
に思われ、この投与量はＰＡ阻害剤およびＰＡ−ＢＰの
ｅ度よりも高くして、その結果全身の作用を生ずる。こ
の投与量は、また、高く、肝１藏によるｔ−ＰＡの非常
に早い消滅（Ｃｔｅａｒｉｎｇ）”　（数分の半減期）
を補うようにする。

新規な成分、ＰＡ−ＢＰ、はｔ−ＰＡＩｌｆｌ害試験に
おいて、ｔ−ＰＡのプラスミノゲンを活性化する活性を
阻害する活性を示す。しかしながら、分析によると、ま
た、ｔ−ＰＡとＰＡ阻害剤との反応が阻害され、これは
ちょうどｔ−ＰＡを可逆的に中和することができる他の
血漿阻害剤との反応に似ている。したがって、ＰＡ−Ｂ
Ｐは保護因子として見るべきであり、この保護因子は、
一方において、ｔ−ＰＡを阻害剤による不活性化に対し
て保護し、そして他方において、プラスミノゲンを望ま
しくないプラスミンの形成による不活性化に対して保護
する。結局、ＰＡ−ＢＰはＶｉ環におけるｔ−ＰＡのた
めの安全な担体である。凝血におけるｔ−ＰＡのフィブ
リンへの結合は阻害されない。これらの理由は、ウロキ
ナーゼの特別な性質に適合するとき、ウロキナーゼの等
しく有効である。

これらのデータから誘導できるように、ＰＡ阻害剤およ
びＰＡ−ＢＰはｔ−ＰＡの有効性を制御するうえで異な
る役割を演じ、そしてこれらの役割は条件に非常に依存
することがある。ｔ−ＰＡの領域のどれがフィブリン、
ＰＡＩＩＩＩ害剤およびＰＡ−ＢＰとの相互作用に参加
するかについて、なお断片的な知識が存在する。フィブ
リンの結合はフィンガー領域（ｆｉｎｇｅｒ　　ｄｏｍ
ａｉｎ）に関係すると思われる。プラスミノゲン活性化
は、ｔ−ＰＡの軽鎖を研究する場合にのみ、完全である
０組み換えＤＮＡ技術により１４７られるｔ−ＰＡの突
然変異体を研究しているとき、ＰＡ−ＢＰとの相互作用
は完全であることがわかり、ここでクリングルｌを含む
Ｎ−末端は欠失した。またクリングル２を欠失する軽鎖
はＰＡ−ＢＰを相互作用しないように思われ、そしてこ
れはＤＦＰ不活性化された活性中心をもつｔ−ＰＡの場
合には当てはまらない。明らかに、クリングル２および
ｔ−ＰＡの活性中心はＰＡ−ＢＰとの相互作用に参加し
ない、クリングルをもつウロキナーゼおよびそれをもた
ないウロキナーゼの研究によると、クリ／グルの存在は
ＰＡ−ＢＰとの相互作用に必須ではないが、活性中心は
、プロウロキナーゼが相互作用をまったく示さないので
、必須であった。それゆえ、プラスミノゲン活性化因子
の少なくとも活性中心はＰＡ−ＢＰとの相互作用にとっ
て重要性をもつ。

ＰＡ阻害剤についてのアッセイ法をもちいてＰＡ−ＢＰ
のアッセイを実施し、ここで試料中に存在するＰＡ阻害
剤の影響は、この阻害剤に対するＩｇＧの添加により、
あるいは、例えば、３７℃における適当な時間にわたる
試料の予備インキュベーションにより破壊され、これに
よってＰＡ阻害剤がもっばら不活性化される。このアッ
セイ法において、可溶性刺激剤またはフィブリンモノマ
ーを使用することができる。このアッセイのための投与
量一応答曲線は直線状であり、そしてＰＡ阻害剤および
ＰＡ−ＢＰの活性は加法に従う。

ｔ−ＰＡとＰＡ−ＢＰとの間の相互作用は可逆的反応論
を示し、ここで結合したｔ−ＰＡの対する′Ｍ＃の相互
的なプロットは１〜５ピコモルの見掛けの解離または阻
害の定数を示す。ｔ−ＰＡとＰＡ−ＢＰとの間の相互作
用の可逆性は、次の観察によって反応論的にざらの支持
される。残留するｔ−ＰＡの量（過剰のＰＡ−ＢＰにか
かわらず）は数時間一定にとどまり、そして、希釈する
と、平衡は遊離のｔ−ＰＡの百分率が高いとき、解離が
高い方向にシフトする。ｔ−ＰＡとＰＡ−ＢＰとの可逆
的特性を示す他の観察を、ｔ−ＰＡまたはウロキナーゼ
を血漿に添加することにより実施した。過剰Ｉ１１のｔ
−ＰＡまたはウロキナーゼを血漿に添加すると、ＰＡ−
ＢＰの活性はもはや検出されない。このような混合物を
３７℃でインキュベーションした後、ＰＡ−ＢＰの活性
はある時間後に回復する。明らかに、この場合、ＰＡ−
ＢＰは最初に中和され、そしてｔ−ＰＡおよびＵＫは結
合されるが、それ以上時間が経過しても、誰加したｔ−
ＰＡおよびウロキナーゼは血漿中で血漿の阻害剤、例え
ば、アルファー２−抗プラスミンに作用することにより
不可逆的に不活性化される。これが示すように、ＰＡ−
ＢＰは永久にプラスミノゲン活性化因子により中和され
えない。

血漿において、ＰＡ−ＢＰの活性は、θ〜５６”０−ｒ
１週間までインキュベーションしたとき、安定である。

３７℃において、ＰＡ阻害剤の活性は８０〜１００分の
半減期で消滅する。この半減期の多数倍の後、例えば、
−夜のインキュベーション後、血漿はもっばらＰＡ−Ｂ
Ｐの活性を含有する。ＰＡ阻害剤の不活性化は５のＱＩ
Ｏで温度に強く依存し、より高い温度における不活性化
が非常に急速である。血漿中で、ＰＡ阻害剤に対するＩ
ｇＧを用いる免疫沈殿後、ＰＡ阻害剤は残留し、温度安
定性であり、そしてＰＡ−ＢＰと量的に同一である。Ｐ
Ａ−ＢＰと同一の、この同じ活性は、ｔ−ＰＡの阻害に
ついてのアッセイ法においてＰＡ阻害剤ＩｇＧの過剰の
鰯加後に残留する。３７℃で一夜の血漿のインキュベー
ション後に残留するＰＡ−ＢＰ活性は、ＰＡ阻害剤に対
する過剰の工ｇＧによる阻害に対して不感受性である。

ＰＡ−ＢＰの活性はＥＤＴＡの添加に対して不感受性で
ある。プラスミノゲン活性化因子の胎盤阻害剤は正常の
血漿中には見出されず、そしてＰＡ−ＢＰの活性は胎盤
の阻害剤に対する抗体により中和されず、そしてこの抗
体は胎盤の阻害剤の活性を阻害しない。

線維素溶解成分との相互作用を示す既知の阻害剤とのＰ
Ａ−ＢＰの同一性は、ＰＡ阻害剤を除外する既知の阻害
剤のいずれについてもそれほど低くない血漿中の濃度を
かんがみて、排除される。

ＰＡ−ＢＰは抗プラスミンに欠乏する血漿中に通常存在
する。精製されたテトラネクチン（オランタ国特許８５
０１６８２号）はｔ−ＰＡの阻害を示さない。プラスミ
ノゲンおよびフイブリノゲンは、ＰＡ−ＢＰの活性を破
壊せずに、血漿から除去することができる。アルファー
２−マクログロブリンおよびＣ１−不活性化因子は、血
漿のゲル飽過においてＰＡ−ＢＰのそれと明瞭に異なる
位置に現われる。プロテアーゼネキシンが存在する線維
芽細胞の培地において、ＰＡ−ＢＰは検出されなかった
。

血漿において、ＰＡ−ＢＰはゲル症過によりＰＡ阻害剤
から分離することができる。ＰＡ阻害剤は高分子量の位
置に動き、そしてＰＡ−ＢＰはｌｏｏ　、ｏｏｏの分子
量においてプラスミ／ゲンとほぼ同時に展開する。これ
らのピークは、ＰＡ阻害剤を抗血清で中和することがで
きかつ温度不安定性であり、これに対してＰＡ−ＢＰが
抗血清に不感受性でありかつ湿度安定性であるという特
性に従う。これは、３７℃で２４時間予備インキュベー
ションした血漿のゲル症過がＰＡ−ＢＰのみを生ずると
いう事実に一致する。

ＰＡ−ＢＰ４［酸アンモニウムで３０〜５０％の飽和率
で沈殿させ、そしてポリエチレングリコールで０〜９％
の飽和率で沈殿させることができる。ＰＡ−ＢＰはりジ
ン−アガロースに結合しないので、血漿はＰＡ−ＢＰを
損失しないでこの方ラムを使用してプラスミノゲン不合
とすることができる。ＰＡ−ＢＰはＤＦＰ処理したｔ−
ＰＡのカラムに結合せず、これによりｔ−ＰＡの完全な
（ｉｎｔａｃｔ）活性中心はＰＡ−ＢＰとの相互作用の
ために必須であることが示される。

アガロース中の電気泳動において、ＰＡ−ＢＰは血漿の
β−グロブリンと同時に展開する単一の活性ピークを与
える。等電点のフォーカシング（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔｒ
ｉｃ　　ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ）において、ＰＡ−ＢＰは
ｐＨ６，５〜７．０に現われ、これはアガロース中の電
気泳動の移動度と一致する。

ＰＡ−ＢＰは、ｔ−ＰＡ阻害剤と対照的に、内皮細胞、
ＨＥＰ　　Ｇ２細胞、および肝細胞の培養のコンディシ
ョニングした培地中に測定可能な量で見出された。また
、凍結乾煙によりスｉ）られる高度に濃厚な培地（２０
Ｘ）において、測定可能な量のＰＡ−ＢＰを検出するこ
とができた。

ＰＡ阻害剤は血小板のトリトンＸ−１００抽出液中で検
出されたが、ＰＡ−’ＢＰは検出されなかった。これは
、ＰＡ阻害剤のすべてをＰＡ阻害剤に対する抗血清で阻
害できたという事実から明らかである。

プールした正常の血漿において、５ＩＵ／ｍｌのＰＡ−
ＢＰ濃度が決定され、ここで１００，０００の分子量は
１０ｎｇ／ｍｌまたは０．１ナノモル／ｌの低い値に相
当する。これは休止条件（ｒｅｓｔｉｎｇ　　ｃｏｎｄ
ｉｔｉｏｎｓ）下に得られた血漿中の遊ｇｉｌＩｔ−Ｐ
Ａに関して１０−１００倍過剰である。１〜５ピコモル
のｔ−ＰＡおよびＰＡ−ＢＰの阻害／解離定数では、こ
れはｔ−ＰＡの本質的にすべてがＰＡ−ＢＰとの複合体
中に存在することを意味する。Ｐ康な個体において、か
なり一定（標準偏差１５％）のＰＡ−ＢＰ濃度が見出さ
れた；これはＰＡ阻害剤の大きい個々の間の変動と対照
的である。血漿中のＰＡ阻害剤のアッセイにおいて、特
異的ＰＡ阻害剤を測定する目的で合計からＰＡ−ＢＰ（
ａを減じなければならないことがＩＮＪらかとなったと
き、ＰＡ阻害剤の個々の間の変動はなおいっそう著しく
なり、そして多くの場合木質的ゼロのＰＡ阻害剤の活性
が見出された。明らかに、ＰＡ阻害剤は血漿の頻繁には
検出可能ではない。

血漿中のＰＡ阻害剤の変動は、ここでは２つの別々の成
分のためである。しかしながら、変動は主としてＰＡ阻
害剤のためであることおよび、例えば、阻害の毎日のリ
ズムおよび急性期の反応はＰＡ阻害剤のためであり、こ
れに対してＰＡ−ＢＰは一定であるかあるいは制限され
たばらつきを示すことが発見された。

また、動物、例えば、ラットおよびウサギの血漿におい
て、熱安定性の成分が見出され、これはＰＡ−ＢＰに匹
敵した。ＰＡ阻害剤の強いばらつきは、例えば、エンド
トキシンを注射したとき、見られたが、ＰＡ−ＢＰは一
定にとどまった。

ラットにおける高いレベルのＰＡ阻害剤を有するラット
の血＠（他の動物においてエンドトキシンの注射および
４時間後の血液のサンプリングにより得られた）を注入
後、ＰＡ阻害剤は３〜４分の半減期を有する急速な消滅
（ｃｌｅａｒｆｎｇ）を示したが、これに対して注入に
より同様に増加したＰＡ−ＢＰのレベルはこの観測期間
の間にほとんど減少しないことが観察された。このこと
は、半減期またはＰＡ−ＢＰについて数日程度を示唆す
る。このことが意味するように、ＰＡ−ＢＰの安定な血
漿濃度は、また、ｔ−ＰＡの循環の間および後に、例え
ば、ＤＤＡＶＰの注入後に、急速な合成によって得られ
ない。ｔ−ＰＡが肝臓を経る′＠環から急速に消滅する
とき、ｔ−ＰＡはＰＡ−ＢＰから解離されること推定す
べきである。

要約すると、本発明による新規な蛋白質、ＰＡ−結合性
蛋白質（ＰＡ−ＢＰ）、の性質は次の通りである： ＰＡ−ＢＰは、ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅ　Ｉ）Ａ
ＣＡ４４を使用するゲルクロマトグラフィーにより推定
して、１００，０００の分子質重、（ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　　ｍａｓｓ）を有する血漿蛋白質である。

アガロース電気泳動における電気泳動の移動度は、血漿
β−プロプリンのそれに等しい。

等電点は６．５〜７．０である。

ＰＡ−ＢＰは数日間少なくとも５６℃まで熱安定性であ
る。

ＰＡ−ＢＰはフィブリンに結合せず、モしてｔ−ＰＡの
フィブリンへの結合を阻害しない。ＰＡ−ＢＰはコンカ
ナバリンＡに結合する糖残基を含有しない。

ＰＡ−ＢＰは１〜５ピコモルの見掛けの阻害定数でｔ−
ＰＡ活性を阻害する。この阻害は短いおよび長い期間に
わたってｌｌｆ逆的であり、そしてまた他の阻害剤によ
るｔ−ＰＡの不活性化を阻害する。

ＰＡ−ＢＰはウロキナーゼと相互作用するが、プロウロ
キナーゼと相互作用しない。

ＰＡ−ＢＰの相互作用のため、プラスミノゲン活性化因
子の活性中心は必要である。

ＰＡとの相互作用において、クリングル２が参加する。

ＰＡ−ＢＰは、免疫学的基準および蛋白質−化学的特性
に従い、かつ体中の分布に関するかぎりにおいて、ＰＡ
阻害剤と異なる。

ＰＡ−ＢＰは、約１０ｍｇ／ｍｌの一定の血漿濃度を有
し、循環から数日のゆっくりして消滅し、そして血小板
、および内皮細胞および肝細胞の培養基の中に測定可能
な濃度で存在しない。

本発明は、前述の性質を有するＰＡ−ＢＰに関する。本
発明は、また、ＰＡ−ＢＰを調製する方法に関する。第
１に、ＰＡ−ＢＰは吐乳動物、例えば、ヒトまたはウサ
ギまたはラットの血液または血液分画から、蛋白質の性
質に適合する通常の蛋白質精製技術により得ることがで
きる。

本発明は、また、細胞培養物から、組み換えＤＮＡ技術
により修飾された微生物または他の宿主有機体により調
製されたＰＡ−ＢＰからなる。

ＰＡ−ＢＰの精製は、プラスミノゲン活性化因子、ある
いは１つのクリングルを含めて、Ｎ−末端部分が不存在
であることができる、突然変異のｔ−ＰＡが結合したカ
ラムを使用する親和クロマトグラフィーにより実施する
ことができる。親和クロマトグラフィーは、例えば、プ
ラスミノゲンの不存在下に実施することができ、そして
蛋白質の性質に適合する伝統的な分離技術を用いて完結
することができる。プラスミノゲン活性化因子の活性中
心は、完全であるか、あるいは限界的に修飾されている
べきである。

さらに、本発明は、検出およびアッセイの方法に関し、
ここで試料の予備処理またはＰＡ阻害剤の抗体の絵加は
現存する方法を特異的とする。また、本発明は、現存す
る方法をこの特定の因子に対して特異的とする方法に関
する。血漿および他の試料の中のＰＡ阻害剤のだめの既
知のアッセイ法のすべては、ここで使用可能である。こ
うして、このアッセイ法は、ＰＡ阻害剤の抗体の添加に
より、あるいはＰＡ阻害剤を不活性化するために３７℃
で適当な期間、例えば、少なくとも１０時間の間試料を
予備インキュベーションすることにより、ＰＡ−ＢＰに
ついて特異的とする。ＰＡ阻害剤の特異的寄与は、活性
が抗体により中和されるとき、あるいは予備インキュベ
ーションにより不活性化されるとき、計算される ＰＡ−ＢＰはヒト血漿中に０．１ナノモル／１の平均濃
度で存在する。この平均値は正常のｔ！！庚なポラティ
アにおいて決定された。ＰＡ−ＢＰの濃度は（０９００
−１５００時間）の日の間に変化せず、そして急性期の
反応または敗血症の患者において強く異ならない、ＰＡ
−ＢＰのレベルは循環するｔ−ＰＡの＝・時的増加によ
り、例えば、ＤＤＡＶＰの注入により低下しない。

ＰＡ−ＢＰはｔ−ＰＡおよびウロキナーゼの有効性を特
異的な方法におけるプラスミノゲン活性化国子の可逆的
結合により制御し、ここでｔ、　−ＰＡのフィブリンへ
の化合物は阻害されないが、プラスミノゲン活性化因子
の活性は重合したフィブリンの不存在下におよびフィブ
リンおよびフィブリノゲンの断片またはそれらの分解生
成物の存在下に阻害される。プラスミノゲン活性化因子
は他の方法による不活性化に対して保工へされる。

ＰＡ−ＢＰのこの役割をかんがみて、ＰＡ−ＢＰは線維
素溶解抑制因子として使用することができる。循環から
の消滅が遅いため、少量の物質は長時間にわたって血漿
レベルを実質的に増加させることができる。生成物はプ
ラスミ／ゲン活性化因子の全身作用を低下するという価
値を有することができる。それは血栓崩壊の治療におい
てｔ−ＰＡ才たはウロキナーゼへの語加剤として価値を
もつことができ、そして血栓崩壊作用に比較して全身の
作用を低ドさせることができる。それはプラスミノゲン
活性化因子のフィブリン依存性活性、細胞外分解、散在
性血管内の凝血の抑制において価値をもつことができる
。

したがって、本発明は、また、活性成分としてＰＡ−Ｂ
Ｐを含有する製薬学的組成物にｆｆｆＪする。

以下の実施例により、本発明を説明する。これらの実施
例において使用した物質および方法は次の通りである： ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）ＡＣＡ４４はＬＫＢ
　（スウェーデン）から入手した。

刺激剤は、ヴエルヘイジェン（Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ）ら
、トロンボシス・ヘマストシス（Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅ
ｍａｓｔｏｓ、）、４８．２６６−２６９　（１９８２
）に記載されるようにして、フィブリ／ケンから臭化シ
アンの処理により調製した。

５２２５１゜式Ｈ−Ｄ−Ｖａ　１−Ｌｅ　ｕ−ｔｙｓ−
ｐ−ニトロアニリド・２時間細胞を有するこの色素発生
性プラスミン基質は、カビ（Ｋｂｉ）（ウェーデン国モ
ルンダル）から入手した。

プラスミノゲン、プラスミノゲンは、リジンーエウベル
ギット（ｌｙｓｉｎｅ−ｅｕｐｅｒｇｉｔ）を使用する
親和クロマトグラフィーによりコーンフラックション■
から単離した。

ｔ−ＰＡ、クラフト（Ｋｌｕｆｔ）ら、生物技術学の方
法における発展（Ａｄｖａｎｃｅ　　ｉｎＢｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｐ丁ｏｃｅｓｓｅｓ）ｖｏｌ
、２　　［ミズラヒ（Ｍｉｚｒａｈｉ）、Ａ、ｖ、ウェ
ゼル（Ｗｅ　ｚ　ｅ　ｌ）　ＡＬ編］ニューヨーク：Ａ
Ｒリス（Ｌ　ｉ　ｓ　ｓ）、１９８３．９７−１００ペ
ージに記載されるようにして、ボウニス（Ｂｏｗｅｓ）
色素細胞腫系統の細胞培養人（から、−水銀および二本
鎖のｔ−ＰＡを単離した。ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃ　ｉ　ａ）会社のＣＮＢｒ−セファロースについて取
扱説明に従い、ｔ−ＰＡをセファロースの結合した。ｔ
−ＰＡをジインプロピルフルオロホスフェ−］・（１ミ
リモル）で処理することにより不活性化した。活性中心
を含有するｔ−ＰＡの軽鎖を、二本鎖のｔ−ＰＡの還元
、再酸化およびゲル濾過による分離によって得た。フィ
ンガー、成長ホルモン、およびＮ−末端クリンゲル領域
を欠く突然変異のｔ−ＰＡを、色素細胞腫のｔ−ＰＡの
暗号を指定するｃ−ＤＮＡの組み換えＤＮＡ操作によっ
て調製した。突然変異体の発現はＣＨＯ［チャイニーズ
・ハムスター・オバリウム（Ｃｈｉｎｅｓｅ　　Ｈａｍ
ｓｔｅｒ　　Ｏｖａｉｕｍ）］細胞から得た。

ウロキナーゼは、レオ（Ｌｅｏ）（スウェーデン国パレ
ラップコから高分子ら１−および低分子星の形態の混合
物として、および７ポツトｃＡｂｏｔｔ）から低分子清
の形態として入手した。

プロウロキナーゼは、サル腎細胞培り物から、ウロキナ
ーゼに対するＩｇＧを使用するカラムヘの吸着により精
製した。

ＰＡＭ害剤に対するＩｇＧ、ＰＡ阻害剤は、へン・ムー
リク（Ｖａｎ　　Ｍｏ　ｕ　ｒ　ｉ　ｋ）　　ら、ジャ
ーナル舎オブ・バイオロジカル台ケミストリー（Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５９．１４９１４−１４９２
１　（１９８４）に記載されるようにして、内皮細胞ｊ
８養基から単離した。抗血清はウサギに免疫化により発
生させ、そしてＩｇＧ　４；１：　（Ｅ　白質Ａセファ
ロース［ファーマシア（Ｐ）ｌａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ）
、スウェーデン国つップサラＪを使用して精製した。

エンドキシン、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｌｏ
）（血清型　０１２８：Ｂ１２）はシグマ（Ｓ　ｉ　ｇ
ｍａ）、米国セイントールイスから入手した。

ウィスター（Ｗｉ　ｓ　ｔ　ｅ　ｒ）ラットは、セント
ラアアル・プレフディエレンベドリジフ（Ｃｅｎｔｒａ
ａｌ　　Ｐｒｏｅｆｄｉｅｒｅｎｂｅｄｒｉｊ　ｆ）Ｔ
ＮＯ、ゼイスト（Ｚｅｉｓｔ）から入手し、そして試験
はネンブタール（’Ｎｅｍｂｕｔａｌ）の麻酔（６０ｍ
ｇ／ｋｇ　　服腔内）の下に実施した。

内皮細胞はへその緒の容器（ｕｍｂ　ｉ　Ｉ　ｉ　ｃａ
ｌ　　ｃｏｒｄ　　ｖｅｓｓｅｌ）からコラゲナーゼ発
酵により単離し、そして、血清を榛加しない、ダルベツ
コ（Ｄｕｌｌｂｅｃｏ）の変性イーグルス（Ｅａｇｌｅ
ｓ）培地中でフィブリノネクチン被覆ディスク上で全面
成長に培養した。永久へパトーム細胞系統ＨＥＰ　　Ｇ
２の細胞、肝細胞および＆ｌｉｊ維芽細胞を血清不合培
地中で標準条件下に培養した。

血漿を供与体の血液から入手し、そして０．１１モルの
クエン酸ナトリウムを含有する溶液の０．１０容量で安
定化した。

ウルトロゲル（Ｕ　ｌ　ｔ　ｒ　ｏ　ｇｅ　ｌ）　ＡＣ
Ａ３４のゲル濾過、これは０．０１モルのトリスＨＣＩ
緩衝液、ｐＨ７，４および０．０５モルｃ７）　Ｎ　ａ
　ＣＩと平衡化しかつそれらを充填した２７５ｍ１のカ
ラム中で実施した。このカラムを種々のマーカー蛋白質
を使用することによりおよび、カビ（Ｋｂｉ）会社（ウ
ェーデン国モルンダル）のスＩ・レプトキナーゼ不活性
化法に従い血漿プラスミノゲンの測定を経る内部目盛定
めにより目盛定めした。

等電フォーカシングはポリアクリルアミドゲルのロー２
ド中で実施し、電気泳動後、このゲルをスライスに切断
した。阻害アッセイ法の試験緩衝液中でスライスを抽出
した後、ｔ−ＰＡの阻害を測定した。３．５〜９．５の
ｐＨの勾配を研究した。

ｔ−ＰＡのアー、セイ。０．１３終モルのプラスミノゲ
ン、０．１％（Ｖ／Ｖ）のツイーン８０．０．１２ｍｇ
／ｍｌのフィブリノゲン断片（刺激剤またはフィブリン
のモノマー）および０．３０ミリモルの色素発生性プラ
スミン基質（例えば、５２２５１）を含有する０、２５
ｍ１ｃ７）トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｏ　、　ｏ　ｉモル
、ｐＨ７，５）中で、アッセイ２５℃でインキュベーシ
ョンする。

４０５ｎｍにおける光の吸収を、種々のインキュベーシ
ョン期間後に測定する。このアッセイは９６ウエル（ｗ
ｅ　ｌ　Ｉ）を有するマイクロタイタープレート　（ｍ
ｊｃｒｏｔｉｔｅｒ　　ｐｌａｔｅ）中でタイターチク
（Ｔ　ｉ　ｔ　ｅ　ｒ　ｔ　ｅ　ｋ）試験装置［フロー
（Ｆｌｏｗ）、芙国アービン］を使用して実施する。吸
収の増加をインキュベーションの期間の平方で割った値
は、活性化因子のｃ度に対して比例する。ｔ−ＰＡの活
性は、ＷＨＯのファースト・インターナショナル・スタ
ンダード（Ｆｉｒ、ｓｔ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｒ＋
ａｌ　　Ｓｔ　ａｎｄａｒｄ）、ｍｌ−ド８３１５１７
に従う国際単位で表わす。

尖施忽ユ ｔ−ＰＡ−阻害剤のアッセイは、阻害剤含有試ネ４、例
えば、血漿をｔ−ＰＡ系列を使用する滴定として実施す
る。ｔ−ＰＡの活性は前述のｔ−ＰＡアッセイ法を使用
して実施する。

第１図は、試験において２０．１の血漿を添加して曲線
を作成する方法を示し、これはＸ軸への外挿で、阻害の
量を中和されたｔ−ＰＡの量として表わす。第１図は、
また、３７℃で一夜インキユベーションした血漿が低い
阻害を示すことをりＪらかにする。この残留阻害は、内
皮細胞の培養基から単離されたＰＡ阻害剤に対する免疫
グロブリンを使用して阻害されえない、これらの免疫グ
ロブリンは新しい血漿に対して作用を事実有し。

モしてｔ−ＰＡの阻害をインキュベーションした血漿の
レベルに減少する。したがって、この曲線はブラズヤ−
（マイナス）ｔ−ＰＡ阻害剤の指示を与える。

災施負工 ＰＡ阻−剤の熱定　、第２図は、プールした正常の血漿
中のＰＡ阻害剤のｔ−ＰＡ阻害剤の活性が０℃により高
い温度においてインキュベーションすると減少すること
を示す、ＰＡ−ＢＰの阻害は減じられている。不活性化
速度（ｋ）は温度に高度に依存性であり、１０℃の温度
の一ヒ昇ｇにファクター５で増加する（インセット）。

ＰＡ−ＢＰの残留阻害は、いずれの場合においても、少
なくとも１週間の間かつ５６℃までの温度において安定
にとどまることが観測された。現在まで、ＰＡ阻害剤の
同一のインキュベーション速度がすべての個々の血漿に
おいて得られた。

実施例■ 阻害の速度論、見掛の阻害定数は、例えば、第１図にお
けるように、ｉｓのｔ−ＰＡおよび結合したｔ−ＰＡの
相互的な値をプロットすることにより結果から得ること
ができる。これらの直線状の曲線は、すべての場合にお
いて、合計の血漿、内皮細胞の培養基およびインキュベ
ーションした血漿（ＰＡ−ＢＰ）について１〜５ピコモ
ルの同一の値を表わすＸ軸上の軸の区画を示す。ｔ−Ｐ
Ａおよびインキュベーションした血漿または精製したＰ
Ａ−ＢＰの混合物を異なる希釈でアッセイするとき、異
なる百分率の遊離のｔ−ＰＡが得られる０例えば、ｔ−
ＰＡの欠失の場合において、３８％、３３％および２２
％の遊離のｔ−ＰＡが、それぞれ、１：ｌＯおよびｌ：
３の希釈および未希釈において得られた。これは可逆的
な複合体の形成を示唆する。

夾施倒■ ＰＡ決定ＰＡ−ＢＰの可逆的結合、正常の血漿の合計の
阻害剤容量に関して４倍過剰量のｔ−ＰＡまたはウロキ
ナーゼの添加は、アッセイすると、ｔ−ＰＡに関する阻
害のすべてが阻害剤のアッセイにおいて中和されること
を示した。混合物を３７℃で一夜インキユベーションし
た後、阻害は再び測定可能であり、これはＰＡ−ＢＰの
活性に量的に等しく、そして安定にとどまった。明らか
ように、知られているように、ｔ−ＰＡおよびウロキナ
ーゼは血漿中で大量に存在する他のプロテアーゼ阻害剤
によりゆっくり不活性化され、そしてＰＡ−ＢＰは再び
開放され、そして、明らかに、不可逆的に中和されなか
った。

実施例Ｖ 血漿中のＰＡ−ＢＰのアッセイ。この目的に、血漿を適
当な期間（４５℃で２時間または３７℃で一夜）インキ
ュベーションしてＰＡ阻害剤を不活性化することによっ
て、血漿を予備処理する。

次いで、阻害を前述のｔ−ＰＡ阻害剤アッセイ法に従い
アッセイする。この方法は、また、例えば、ＰＡ−ＢＰ
が同様に見出されるラットおよびウサギの血漿について
有効であるように思われる。すなわち、このインキュベ
ーション技術は、また、かなりの量のｔ−ＰＡを含有す
る試料に適当であり、例えば、線維未溶解を刺激しかつ
ｔ−ＰＡを注入し、妨害するＰＡの活性が、また、イン
キュベーションにより消失した（実施例■参照）試料に
適する。血漿を予備処理しない、ｔ−ＰＡまたはウロキ
ナーゼを実質的に含有しないヒトの物質の代替法として
、内皮ＰＡ阻害剤に対するＩｇＧを過剰にアッセイ系に
添加して、ｔ−ＰＡ阻害剤のアッセイを実施する。これ
は≧Ｉｇｇ／ｍ＋の使用する抗血枯のＩｇＧである。

実施例■ 培地および臨床試料の中のＰＡ−ＢＰ、ＰＡ−ＢＰアッ
セイ法を使用して、正常の供与体の血漿中に存在するＰ
Ａ−ＢＰの量はかなり一定（標準偏差１５％）であり、
そして５　Ｉ　Ｕ　／　ｍ　ｌのｔ−ＰＡに等しいこと
が決定された。０９００〜１５０００時間の間の日の間
、および高いＰＡ阻害剤のレベルをもつ明瞭な急性期の
反応を有する患者、例えば、多数の外傷（２以上の骨折
）を受けた患者において、変動は見られなかった。ＤＤ
ＡＶＰの注入の間、ＰＡ−ＢＰは循環するｔ−ＰＡによ
り一時的にのみ中和されるように見え、そして血漿のイ
ンキュベーション後には常に正常に検出可能である。ラ
ットにおけるエンドトキシン（１０ｕＬｇ／ｋｇ）の注
射は、４時間後、血漿中に過度に高い阻害値（１５００
％まで）を発生させたが、しかし、これは完全にＰＡ阻
害剤によるものであった；　ＰＡ−ＢＰは不変化にとど
まつた。内皮細胞の培地およびＨＥＰ　　Ｇ２細胞にお
いて、ｔ−ＰＡ阻害のすべてはＰＡ阻害剤に対するＩｇ
Ｇで１１１１害することができる。また、２０倍の濃度
の培地は側室可能なＰＡ−ＢＰの含量を示さなかった。

血液から沈殿させた血小板のトリトンＸ−１００抽出液
はｔ−ＰＡの阻害を示さなかったが、この阻害はＰＡ阻
害剤に対するＩｇＧで完全に阻害することができた。プ
ロテアーゼネキシンを含有するａｍ芽細胞の培養基は、
ＰＡ−ＢＰの活性を示さなかった。ＰＡ−ＢＰは血漿の
ニーゴブリン分画中に見出されなかった。

丈施舊！ ＰＡ二旦ヱΩｆｆ１．アッセイ阻害剤のアッセイ法を使
用して、ＰＡ−ＢＰのみを含有する血漿に添加したどの
成分がＰＡ−ＢＰの活性に影響を及ぼすかを発見しよう
とした。このようにして、１０ｎｍｇ／ｍｌのレオ（Ｌ
ｅａ）ウロキナーゼおよびアボット（Ａｂｏｔｔ）ウロ
キナーゼはＰＡ−ＢＰの活性を５０％だけ中和すること
が発見され、この事実はｔ−ＰＡに関する等しく強い結
合を示唆している。サルの肝細胞から精製されたプロウ
ロキナーゼ（１４ｎｇ／ｍｌ）およびヒト線維芽細胞培
養基中に存在するプロウロキナーゼ（１００ｎ　ｇ／ｍ
　Ｉ）は、作用をまツタく示さなかった。ｔ−ＰＡにつ
いての同一の実験が示すように、ＤＥＦ不活性化ｔ−Ｐ
Ａ　（１００ｎｇ／ｍｌ）およびｔ−ＰＡの単離された
活性軽鎖（１０ｎ　ｇ／ｍ　Ｉ）は作用をなんら有さな
かった。

このアッセイ手順のｔ−ＰＡの代わりに、組み換えＤＮ
Ａ操作により得られた欠失突然変異体ｔ−ＰＡを使用し
た。この突然変異体は、フィンガー、成長ホルモンおよ
びクリングル−１の領域を含有しなかった。ＰＡ−ＢＰ
活性は通常これを用いてなおアッセイ可能であるように
思われた。

明らかなように、ＰＡ−ＢＰとプラスミノゲン活性化因
子との間の相互作用は、主として完全な活性中心に依存
し、そしてｔ−ＰＡでは、またクリングル２に依存する
。

実施例■ ＰＡ−ＢＰのゲル濾過。ウルトロゲル（Ｕ　ｌ　ｔｒｏ
ｇｅ　１）ＡＣＡ４４を使用する５ｍ１（１）血漿のゲ
ル鉋過は、ＰＡ阻害剤とＰＡ−ＢＰとの分離を示す、第
３図の２つのピークは、それらの熱不安定性によって同
定された。ＰＡ−ＢＰはクロマトグラフに、プラスミノ
ゲン（９０，０００）に近く、そしてアルドラーゼ（１
４７，０００）の後の、分子量１００，０００に相当す
る位置に現われる。

添加した。この血漿は、３７℃のインキュベーションの
ため、ＰＡ−ＢＰ活性のみを示した。ｔ−ＰＡはＰＡ−
ＢＰ容量に等しい量でおよびその２倍の量で添加した。

この血漿を塩化カルシウムの添加およびトロンビンの添
加により凝固こさせ、そして形成した凝塊を取り出した
。形成した血清において、同−星、すなわち、出発血漿
中に存在したのと同一量、のＰＡ−ＢＰがｔ−ＰＡを含
まない対照において、およびｔ−ＰＡを有する２つの血
漿においてアッセイされた。これはにより示されるよう
に、凝血へのｔ−ＰＡの結合はＰＡ−ＢＰに妨害されず
に起こった。

実施例Ｘ 阻害に対する保護０種々のインキュベーションを０、種
々の条件下にＰＡ阻害のアッセイにおいて研究した。Ｐ
Ａ−ＢＰのみを含有する血漿において、ｔ−ＰＡの活性
はＰＡ−ＢＰのレベルより低いｔ−ＰＡの濃度で２５℃
において５時間の間安定にとどまることが観測された。

同等の点より上において、ｔ−ＰＡは約１時間の半減期
で血漿の阻害剤により不活性化される。不活性化はほぼ
等価点（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ　　ｐｏｉｎｔ）で停
止するということは、驚くべきことである。ＰＡ−ＢＰ
は血漿の阻害剤による不活性化に対してｔ−ＰＡを保護
する。細胞培養の血清不合培地を使用し、ＰＡＩＩＩ害
剤のみを存在させる、同様な試験により、ｔ−ＰＡの活
性はゆっくりかつ不可逆的に不活性化される（半減期２
．５〜３時間）ことが示された。ＰＡ−ＢＰおよびＰＡ
阻害剤の両名が存在する血漿において、ｔ−ＰＡはＰＡ
−ＢＰの等価点より」二において２．５〜３時間の半減
期でゆっくり不活性化し、そしてｔ−ＰＡの活性は゛こ
の等価点より下において安定である。明らかに、ＰＡ−
ＢＰは、また、ＰＡ阻害剤の活性に対して保護する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、試験において２０ｐ　Ｉの血漿を添加して曲
線を作成する方法を示し、これはＸ軸への外挿で、阻害
の量を中和されたｔ−ＰＡの量として表わす。第１図は
、また、３７℃で一夜インキユベーションした血漿が低
い阻害を示すことを明らかにする。 第２図は、プールした正常の血漿中のＰＡ阻害剤のｔ−
ＰＡ阻害剤の活性が０℃により高い温度においてインキ
ュベーションすると減少することを示す。 第３図は、ウルトロゲル（Ｕｌ　ｔ　ｒｏｇｅ　Ｉ）Ａ
ＣＡ４４を使用する５ｍｌの血漿のゲル濾過のピークを
示す。 特許出願人　ネーデルランドセ・セントラレ・オルガニ
ザテイエ書フール・テゲ バストーナトウールペテンシャツ ペリークｅオンデルツエク λ１０”２ ｔ”ＰＡ　（噛／７５０Ｐυ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質： ａ、ウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）ＡＣＡ４４を使
   用するゲルクロマトグラフィーにより決定して約１００
   ，０００の分子質量を有する；ｂ、血漿β−グロブリン
   のそれに等しいｐＨ８．６におけるアガロース中の電気
   泳動移動度を有する； ｃ、６．５〜７．０の等電点を有する； ｄ、ｔ−ＰＡの遊離の活性中心および特異的クリングル
   ２の存在下にｔ−ＰＡおよびウロキナーゼに特異的にか
   つ可逆的に結合する； ｅ、少なくとも５６℃まで熱安定性であある；および ｆ、数日程度の半減期で循環から消滅する；を少なくと
   も示すことを特徴とするＰＡ結合性蛋白質（ＰＡ−ＢＰ
   ）と呼ぶ蛋白質。 ２、血液、血液分画または細胞培養基を蛋白質の単離に
   ついて知られている方法に付し、前記方法はＰＡ−ＢＰ
   の特異的性質に適合することを特徴とするＰＡ−ＢＰを
   調製する方法。 ３、単離する方法はウロキナーゼまたは少なくともクリ
   ングル２を含有するｔ−ＰＡを使用する親和クロマトグ
   ラフィーからなり、前記活性化因子は完全な活性中心を
   有する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、試料中に存在するＰＡ阻害剤を不活性化し、次いで
   ＰＡ阻害剤について通常の方法によりＰＡ−ＢＰ含量を
   アッセイすることを特徴とする試料中のＰＡ−ＢＰ含量
   をアッセイする方法。 ５、ＰＡ阻害剤について通常のアッセイを実施し、存在
   するＰＡ阻害剤を不活性化し、ＰＡ阻害剤について通常
   の方法によりＰＡ−ＢＰ含量をアッセイし、そしてＰＡ
   阻害剤について得られた値をＰＡ−ＢＰについて得られ
   た値で補正することを特徴とする試料中のＰＡ阻害剤お
   よびＰＡ−ＢＰの含量をアッセイする方法。 ６、少なくとも３０℃において試料をインキュベーショ
   ンすることによってＰＡ阻害剤を不活性化することを特
   徴とする特許請求の範囲第４または５項記載の方法。 ７、ＰＡ阻害剤の不活性化をこの阻害剤に対する抗体で
   それを中和することによって実施することを特徴とする
   特許請求の範囲第４または５項記載の方法。 ８、ＰＡ−ＢＰを含有することを特徴とする製薬学的組
   成物。 ９、ＰＡ−ＢＰと一緒に、また、プラスミノゲン活性化
   因子、例えば、ｔ−ＰＡまたはウロキナーゼを含有する
   特許請求の範囲第８項記載の製薬学的組成物。