JP2025539800A

JP2025539800A - バチルスベレゼンシスｊｃｋ－７１５８の培養液又は菌株培養液の抽出物を含む植物病原性真菌防除又は真菌毒素低減用組成物、その製造方法、及び植物病原性真菌防除又は真菌毒素低減方法

Info

Publication number: JP2025539800A
Application number: JP2025528704A
Authority: JP
Inventors: キム，ジン－チョル; ランパク，エ; ヨ，ユジョン
Original assignee: インダストリーファウンデーションオブチョンナムナショナルユニバーシティー
Priority date: 2022-11-17
Filing date: 2023-09-26
Publication date: 2025-12-09
Also published as: KR20240081510A; KR102835536B1; WO2024106740A1

Abstract

本発明は、バチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む植物病原性真菌防除用組成物、その製造方法、及び植物病原性真菌防除方法に関するものであり、前記菌株の培養液又はその抽出物は、抗真菌活性及び誘導抵抗性に著しく優れ、真菌が生成する毒素を低減させる能力に優れているので、植物病原性真菌の防除に利用可能である。
【選択図】図１９

Description

本発明は、農林畜産食品部の支援下で課題固有番号１５４５０２７８０７、細部課題番号３２００３６－５によってなされたものであり、当該課題の研究管理専門機関は農林食品技術企画評価院、研究事業名は「作物ウイルス及び病虫害対応産業化技術開発事業」、研究課題名は「イネ赤かび病に対する環境にやさしい生物学的防除剤の開発」、研究機関はジョンナム大学校産学協力団、研究期間は２０２３．０１．０１～２０２３．１２．３１である。

本発明は、農林畜産食品部の支援下で課題固有番号１５４５０２５７４３、細部課題番号３２００３６－５によってなされたものであり、当該課題の研究管理専門機関は農林食品技術企画評価院、研究事業名は「作物ウイルス及び病虫害対応産業化技術開発事業」、研究課題名は「イネ赤かび病に対する環境にやさしい生物学的防除剤の開発」、研究機関はジョンナム大学校産学協力団、研究期間は２０２２．０１．０１～２０２２．１２．３１である。

本特許出願は、２０２２年１１月１７日に韓国特許庁に提出された韓国特許出願第１０－２０２２－０１５４５９９号に対して優先権を主張し、当該特許出願の開示事項は本明細書に参照によって組み込まれる。

本発明は、バチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む植物病原性真菌防除用組成物、その製造方法、植物病原性真菌防除方法、及び真菌毒素低減方法に関する。

フザリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）とフザリウムアジアティカム（Ｆ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）を含む様々なフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種によって誘発される赤かび病（Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔ）は、小麦、麦、トウモロコシ、稲などに一定の周期で大発生し、全世界的に大きな被害を招いてきた。特に、ここ数年、米国及びカナダを中心に大発生し、世界穀物価格を急騰させる原因とされてきた。

赤かび病は、穀物の生産量減少を招くだけでなく、感染された部位に人畜に有害なトリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）、ゼアラレノン（ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ）などのかび毒素を残留させることによって農産品の品質を低下させ、特にトリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）の一種であるニバレノール（ｎｉｖａｌｅｎｏｌ，ＮＩＶ）とデオキシニバレノール（ｄｅｏｘｙｎｉｖａｌｅｎｏｌ，ＤＯＮ）は、免疫力低下、消化管障害を誘発するなど、深刻な中毒症を招く。

また、韓国内の小麦栽培団地における赤かび（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）汚染率とトリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）検出値に相当な相関関係があることからして、赤かび病によるかび毒素の汚染は国民健康にとって相当な脅威になると言える。

化学的防除による赤かび毒素汚染の予防は、殺菌剤の処理時期がとても重要であるが、小麦は、穂から葯が初めて出る時期に散布しなければならなく、麦は、穂が出る時期に散布しなければならない。

メトコナゾール（ｍｅｔｃｏｎａｚｏｌｅ）、プロピコナゾール（ｐｒｏｐｉｃｏｎａｚｏｌｅ）、テブコナゾール＋プロチオコナゾール（ｔｅｂｕｃｏｎａｚｏｌｅ＋ｐｒｏｔｈｉｏｎａｚｏｌｅ）、テブコナゾール（ｔｅｂｕｃｏｎａｚｏｌｅ）などのＤＭＩ（ＤｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）系列の殺菌剤が最も優れた効果を有するが、局所的浸透移行能と一部の薬剤における残留の問題から収穫３０以前までしか使用できず、圃場における防除価が５０％以下と、薬効に優れない欠点がある。

また、農薬の多数を占める合成農薬の誤用・乱用によって土壌、水質及び農産物の汚染、毒性、生態系攪乱、抵抗性菌株の出現など、諸問題が提起されている。

そこで、最近ではＯＥＣＤ国家を中心に合成農薬の使用量を４０％以上減らそうとしており、また、ウェルビーイングに対する関心の増加と共に先進国を中心に有機農産物に対する需要が急増している中、赤かび病を防除するための環境にやさしい生物製剤の開発が至急必要である。

そこで、本発明者等は、バチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む植物病原性真菌防除用組成物を植物病原性真菌に処理したとき、防除活性に著しく優れ、真菌によって生成される真菌毒素の生産量も効果的に低減することを確認した。

したがって、本発明の目的は、抗真菌活性を有する受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株を提供することである。

本発明の他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む植物病原性真菌防除用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、イツリンＡ（ｉｔｕｒｉｎＡ）、サーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）、２，３－ブタンジオール（２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）、５－メチルヘキサン－２－オン（５－Ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎ－２－ｏｎｅ）、ヘプタン－２－オン（ｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ）、２，５－ジメチルビラジン（２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）、６－メチルヘプタン－２－オン（６－ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ）、及び５－メチル－２－ヘプタノン（５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｈｅｐｔａｎｏｎｅ）からなる群から選ばれる１種以上を含む植物病原性真菌防除用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株を培養して培養液を製造する培養段階を含む植物病原性真菌防除用組成物の製造方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を処理する処理段階を含む植物病原性真菌防除方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、イツリンＡ、サーファクチン、２，３－ブタンジオール、５－メチルヘキサン－２－オン、ヘプタン－２－オン、２，５－ジメチルビラジン、６－メチルヘプタン－２－オン、及び５－メチル－２－ヘプタノンからなる群から選ばれる１種以上を処理する処理段階を含む植物病原性真菌防除方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む真菌毒素低減用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株を培養して培養液を製造する培養段階を含む真菌毒素低減用組成物の製造方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を処理する処理段階を含む真菌毒素低減方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物の植物病原性真菌防除又は真菌毒素低減用途を提供することである。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明の一態様は、抗真菌活性を有する受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株に関する。

本発明において、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株は、配列番号３の塩基配列を含む１６ＳｒＲＮＡを含んでいるものであってよい。

本発明の他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む植物病原性真菌防除用組成物に関する。

本明細書上の用語「培養液」は、微生物を培養した後、該微生物を含んでいるものを意味する。

本明細書上の用語「抽出物」は、菌株の培養液から分離したものを意味し、抽出物は、培養上層液、培養濾液、細胞懸濁液、及び分画物からなる群から選ばれる１種以上を含む。

本発明において、前記抽出物は、イツリンＡ（ｉｔｕｒｉｎＡ）、サーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）、２，３－ブタンジオール（２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）、５－メチルヘキサン－２－オン（５－Ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎ－２－ｏｎｅ）、ヘプタン－２－オン（ｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ）、２，５－ジメチルビラジン（２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）、６－メチルヘプタン－２－オン（６－ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ）、及び５－メチル－２－ヘプタノン（５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｈｅｐｔａｎｏｎｅ）からなる群から選ばれる１種以上の化合物を含むものであってよい。

本明細書上の用語「培養上層液」は、遠心分離方法によって培養液から大部分の微生物を除去して得た上層の液を意味する。

本明細書上の用語「培養濾液」は、遠心分離及び濾過を行うことによって培養液から菌体を濾過して除去した後に残った液体を意味する。培養濾液は、微生物が育つ過程で形成して排出した物質が含まれており、その物質を精製又は抽出してよい。

本発明において、培養濾液は、遠心分離及び濾過を行うことによって培養液から真菌を除去したものを意味する。

本発明において、植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ（Ｃｌａｒｉｒｅｅｄｉａｊａｃｋｓｏｎｉｉ、前にはＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｈｏｍｏｅｏｃａｒｐａとも呼ばれる。）、リゾクトニアソラニＡＧ－４（ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ－４）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ（Ｌａｒｇｅｐａｔｃｈ）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ（Ｂｒｏｗｎｐａｔｃｈ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムアジアティカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ）、フザリウムベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、ピシウムウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ）、ガエウマノミセスグラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）、フィトフソラインフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ボトリティスシネレア（ＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａ）、及びコレトトリクムココデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｄｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一具現例において、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む植物病原性真菌防除用組成物を使用することにより、植物病原性真菌病であるイネ赤かび病を誘発するフザリウムグラミネアラム又はフザリウムアジアティカムに対する防除活性を得ることができる。

本発明のさらに他の態様は、イツリンＡ、サーファクチン、２，３－ブタンジオール、５－メチルヘキサン－２－オン、ヘプタン－２－オン、２，５－ジメチルビラジン、６－メチルヘプタン－２－オン、及び５－メチル－２－ヘプタノンからなる群から選ばれる１種以上の化合物を含む植物病原性真菌防除用組成物である。

本発明において、前記イツリンＡは、下記化学式１の化合物であってよく、分子量は１，０４３であり、分子式はＣ_４８Ｈ_７４Ｏ_１４Ｎ_１２である。

＜化学式１＞

本発明において、前記サーファクチンは、下記化学式２の化合物であってよく、分子量は１，０３６であり、分子式はＣ_５３Ｈ_９３Ｏ_１３Ｎ_７である。

＜化学式２＞

本発明において、前記２，３－ブタンジオールは、下記化学式３の化合物であってよく、分子量は９０であり、分子式はＣ_４Ｈ_１０Ｏ_２である。

＜化学式３＞

本発明において、前記５－メチルヘキサン－２－オンは、下記化学式４の化合物であってよく、分子量は１１４であり、分子式はＣ_７Ｈ_１４Ｏである。

＜化学式４＞

本発明において、前記ヘプタン－２－オンは、下記化学式５の化合物であってよく、分子量は１１４であり、分子式はＣ_７Ｈ_１４Ｏである。

＜化学式５＞

本発明において、前記２，５－ジメチルビラジンは、下記化学式６の化合物であってよく、分子量は１０８であり、分子式はＣ_６Ｈ_８Ｎ_２である。

＜化学式６＞

本発明において、前記６－メチルヘプタン－２－オンは、下記化学式７の化合物であってよく、分子量は１２８であり、分子式はＣ_８Ｈ_１６Ｏである。

＜化学式７＞

本発明において、前記５－メチル－２－ヘプタノンは、下記化学式８の化合物であってよく、分子量は１２８であり、分子式はＣ_８Ｈ_１６Ｏである。

＜化学式８＞

本発明において、前記植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ、リゾクトニアソラニＡＧ－４、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ、フザリウムグラミネアラム、フザリウムアジアティカム、フザリウムベルチシリオイデス、ピシウムウルティマム、ガエウマノミセスグラミニス、フィトフソラインフェスタンス、ボトリティスシネレア、及びコレトトリクムココデスからなる群から選ばれる１種以上であってよい。

本発明において、植物病原性真菌防除用組成物は、添加剤、増量剤、栄養剤、又は崩壊剤などの付加剤をさらに含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、添加剤は、ポリカーボキシレート、リグニンスルホン酸ナトリウム、リグニンスルホン酸カルシウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム、アルキルアリールスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、トリポリリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルアリールリン酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールポリマー、ポリオキシアルキルオンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、スルホン酸ナトリウムナフタレンホルムアルデヒド（ｓｏｄｉｕｍｓｕｌｆｏｎａｔｅｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、トリトン１００、及びツイン８０からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、増量剤は、ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、タルク（ｔａｌｃ）、ダイアライト（ｄｉａｌｉｔｅ）、カオリン（ｋａｏｌｉｎ）、及び炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍｃａｒｂｏｎａｔｅ）からなる群から選ばれる１種以上を含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、栄養剤は、スキムミルク（ｓｋｉｍｍｉｌｋ，培地）、黄粉、コメ、小麦、黄土、珪藻土、ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、デキストリン、ブドウ糖、及び澱粉からなる群から選ばれる１種以上を含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株を培養して培養液を製造する培養段階を含む、植物病原性真菌防除用組成物の製造方法に関する。

本発明において、前記植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ、リゾクトニアソラニＡＧ－４、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ、フザリウムグラミネアラム、フザリウムアジアティカム、フザリウムベルチシリオイデス、ピシウムウルティマム、ガエウマノミセスグラミニス、フィトフソラインフェスタンス、ボトリティスシネレア、及びコレトトリクムココデスからなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記培養段階は、培養液を遠心分離及び濾過して培養液から培養濾液を製造する段階を含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、培養段階の培地は、脱脂乳、ホエー、カゼインなどの牛乳タンパク質、糖類、酵母、及びエキスからなる群から選ばれる１種以上を含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、植物病原性真菌防除用組成物の製造方法は、培養液を濃縮する濃縮段階をさらに含んでよい。

本発明において、植物病原性真菌防除用組成物の製造方法は、培養液を希釈する希釈段階をさらに含んでよい。

本発明において、植物病原性真菌防除用組成物の製造方法は、菌体内の成分を抽出する抽出段階をさらに含んでよい。

本発明において、前記真菌防除用組成物の製造方法は、培養液から活性分画を獲得する分画段階を含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記真菌防除用組成物の製造方法は、下記の段階を含んでよい：

培養液から培養濾液を得る培養濾液収得段階；

培養濾液を溶媒で分画して分画物を得る分画段階；

分画物を濃縮して濃縮物を得る濃縮段階；及び

濃縮物を純化（ｐｕｒｉｆｙ）して活性分画を選別する精製段階。

本発明において、培養濾液収得段階は、培養液を２，０００～５，０００ｒｐｍ、２，５００～５，０００ｒｐｍ、３，０００～５，０００ｒｐｍ、３，５００～５，０００ｒｐｍ、４，０００～５，０００ｒｐｍ、４，５００～５，０００ｒｐｍ、例えば４，５００ｒｐｍで遠心分離する段階を含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、分画段階は、溶媒としてブタノール、エチルアセテート、クロロホルム、メタノール、エタノール、及びヘキサンからなる群から選ばれる１種以上に分画する分画段階を含んでよいが、これに限定されるものではない。

前記分画段階は、次の段階からなるものであってよい：

培養液又はこれから得た培養濾液をブタノールで分画してブタノール層を得る第１分画段階；

前記第１分画段階で得たブタノール層に対してクロロホルム：メタノール：水の混合溶液で溶出する段階であって、５個の分画のうち４番目又は５番目の分画を得る第２分画段階；及び

前記第２分画段階で得た分画に対してクロロホルム：メタノール：水の混合溶液で溶出する段階であって、４個の分画のうち１番目～３番目の分画からなる群から選ばれる１種以上の分画を得る第３分画段階。

前記第２又は第３分画段階において独立して、クロロホルム：メタノール：水の混合体積比は、５０～６０：３０～４０：５～１０であってよく、好ましくは５２～５８：３５～４０：７～９であってよく、例えば、５５：３６：８であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、濃縮段階は、減圧濃縮器を用いて分画物を濃縮する段階を含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、精製段階は、分取用ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製する段階を含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、活性分画は、イツリンＡ、サーファクチン、２，３－ブタンジオール、５－メチルヘキサン－２－オン、ヘプタン－２－オン、２，５－ジメチルビラジン、６－メチルヘプタン－２－オン、及び５－メチル－２－ヘプタノンからなる群から選ばれる１種以上を含んでよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を植物体又は土壌に処理する処理段階を含む植物病原性真菌防除方法に関する。

本発明において、前記処理段階は、散布、土壌灌注、表面散布、根圏処理、種子処理、浸漬、毒入れ、及び燻煙施用からなる群から選ばれる１種以上の方式で行われてよく、例えば、土壌灌注方式で行われてよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、「散布」は、噴霧、ミスティング、アトマイジング、粉末散布、顆粒散布、水面施用及び常時用からなる群から選ばれる１種以上の方式で行われてよい。

本明細書上の用語「灌注」は、土壌や樹木に穴をあけて薬液を注入する薬剤散布の一方法である。

本明細書上の用語「土壌灌注」は、作物裁培土壌に薬液を注入又は散布する方法である。

本発明のさらに他の態様は、イツリンＡ、サーファクチン、２，３－ブタンジオール、５－メチルヘキサン－２－オン、ヘプタン－２－オン、２，５－ジメチルビラジン、６－メチルヘプタン－２－オン、及び５－メチル－２－ヘプタノンからなる群から選ばれる１種以上の化合物を含む植物病原性真菌防除方法である。

本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む真菌毒素低減用組成物に関する。

本発明において、前記抽出物は、イツリンＡ、サーファクチン、２，３－ブタンジオール、５－メチルヘキサン－２－オン、ヘプタン－２－オン、２，５－ジメチルビラジン、６－メチルヘプタン－２－オン、及び５－メチル－２－ヘプタノンからなる群から選ばれる１種以上の化合物を含んでよい。

前記真菌毒素は、植物病原性真菌によって生成されるものであってよく、前記植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ、リゾクトニアソラニＡＧ－４、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ、フザリウムグラミネアラム、フザリウムアジアティカム、フザリウムベルチシリオイデス、ピシウムウルティマム、ガエウマノミセスグラミニス、フィトフソラインフェスタンス、ボトリティスシネレア、及びコレトトリクムココデスからなる群から選ばれる１種以上であってよく、例えば、フザリウムアジアティカムによって生成されるものであってよく、前記真菌毒素はニバレノール（Ｎｉｖａｌｅｎｏｌ，ＮＩＶ）であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株を培養して培養液を製造する培養段階を含む真菌毒素低減用組成物の製造方法に関する。

前記真菌毒素は、植物病原性真菌によって生成されるものであってよく、前記植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ、リゾクトニアソラニＡＧ－４、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ、フザリウムグラミネアラム、フザリウムアジアティカム、フザリウムベルチシリオイデス、ピシウムウルティマム、ガエウマノミセスグラミニス、フィトフソラインフェスタンス、ボトリティスシネレア、及びコレトトリクムココデスからなる群から選ばれる１種以上であってよく、例えば、フザリウムアジアティカムによって生成されるものであってよく、前記真菌毒素はニバレノールであってよいが、これに限定されるものではない。

本発明のさらに他の態様は、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を処理する処理段階を含む真菌毒素低減方法に関する。

前記真菌毒素は、植物病原性真菌によって生成されるものであっよく、前記植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ、リゾクトニアソラニＡＧ－４、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ、フザリウムグラミネアラム、フザリウムアジアティカム、フザリウムベルチシリオイデス、ピシウムウルティマム、ガエウマノミセスグラミニス、フィトフソラインフェスタンス、ボトリティスシネレア、及びコレトトリクムココデスからなる群から選ばれる１種以上であってよく、例えば、フザリウムアジアティカムによって生成されるものであってよく、前記真菌毒素はニバレノールであってよいが、これに限定されるものではない。

前記植物病原性真菌防除用組成物の製造方法及び植物病原性真菌防除方法において、前記植物病原性真菌防除用組成物と重複する内容は、本明細書の複雑性を考慮して省略する。

本発明は、バチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む植物病原性真菌防除又は真菌毒素低減用組成物、その製造方法及び植物病原性真菌防除又は真菌毒素低減方法に関するものであり、前記菌株の培養液又はその抽出物は抗真菌活性及び誘導抵抗性に著しく優れているので、植物病原性真菌の防除又は真菌毒素の低減に利用可能である。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列によって分析した系統図である。

本発明の一実施例によって時間経過によるバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の細胞外プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）活性を示すグラフである。

本発明の一実施例によって時間経過によるバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の細胞外キチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）活性を示すグラフである。

本発明の一実施例によって時間経過によるバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の細胞外セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）活性を示すグラフである。

本発明の一実施例によって時間経過によるバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の細胞外ゼラチナーゼ（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ）活性を示すグラフである。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の細胞外酵素活性を示す写真である。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株のＩＡＡ生産活性結果を示す写真である。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株のアセトイン（ａｃｅｔｏｉｎ）生産活性を示す写真である。

図６Ａ及び図６Ｂは、本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の対峙培養による様々な植物病原性真菌の菌糸生長阻害活性を示す写真である。図６Ａ及び図６Ｂは、本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の対峙培養による様々な植物病原性真菌の菌糸生長阻害活性を示す写真である。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の抗真菌活性物質分画過程を図式化した図である。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株培養濾液ブタノール分画を薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で展開した後、病原性菌株であるフザリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）に対して有する抗真菌活性を分析した写真である。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株のＢＦ４分画から分離した４個の分画の薄膜クロマトグラフィー写真である。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株のＢＦ４－１分画から分離したイツリンＡ（ｉｔｕｒｉｎＡ）の陽イオンモードＬＣ／ＭＳ分析結果グラフである。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株のＢＦ４－１分画から分離したサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）の陽イオンモードＬＣ／ＭＳ分析結果グラフである。

図１２Ａ及び１２Ｂは、本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株が生産する揮発性物質の抗真菌活性による植物病原性真菌の菌糸生長阻害活性を示す写真である。図１２Ａ及び１２Ｂは、本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株が生産する揮発性物質の抗真菌活性による植物病原性真菌の菌糸生長阻害活性を示す写真である。

本発明の一実施例によってバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株が生成する揮発性有機化合物に対する固体相微量抽出（ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ＳＰＭＥ）ＧＣ－ＭＳ分析結果を図式化したグラフである。

本発明の一実施例によって形質転換シロイヌナズナにおいてバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株のＧＵＳ発現の有無によるＰＲ－１遺伝子発現活性を検定した写真である。

本発明の一実施例によって温室条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の誘導抵抗性によるイネ赤かび病（Ｆｕｓａｒｉｕｍｈｅａｄｂｌｉｇｈｔ）に対する防除効果を示すグラフである。

本発明の一実施例によって温室条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果を接種７日後に観察した写真である。

本発明の一実施例によって温室条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株を利用した２種剤形の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果を示すグラフである。

本発明の一実施例によって温室条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株を利用した２種剤形の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果を接種７日後に観察した写真である。

本発明の一実施例によって圃場条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株製剤の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果を示すグラフである。

本発明の一実施例によって圃場条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株製剤の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果を接種２週後に観察した写真である。

本発明の一実施例によって圃場条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株製剤の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果を接種４週後に観察した写真である。

本発明は、抗真菌活性を有する受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株に関する。

以下、本発明を、下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

本明細書全体を通じて、特定物質の濃度を示すために使われる「％」は、特に断らない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、液体／液体は（体積／体積）％である。

実施例１．赤かびに坑菌活性を有するＪＣＫ－７１５８菌株の分離

作物に赤かび病を誘発するフザリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ；Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）に抗真菌活性がある菌株は、韓国ジョンナム・ゴクソンで裁培するシンドンジン稲の茎から分離した。採集した稲の茎（１０ｇ）を滅菌水１００ｍＬを添加して磨砕し、磨砕された茎の試料は滅菌水で４０倍希釈した後、Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ菌糸懸濁液が１％含まれているＴＳＡ（ＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙＡｇａｒ）プレートに塗抹して３０℃で３～７日以上培養し、クリアゾーン（ｃｌｅａｒｚｏｎｅ）を生成するＪＣＫ－７１５８菌株を分離した。

実施例２．ＪＣＫ－７１５８菌株の分子生物学的分析及び系統図分析

稲の茎から分離した菌株ＪＣＫ－７１５８は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列分析によって分子生物学的に同定した。菌株はＴＳＢ培地に接種して、３０℃で３日間１，５８０ｒｐｍで振盪培養（ｓｈａｋｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅ）をした。そして、収穫した菌株はＩ－ｇｅｎｏｍｉｃＢＹＦＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｉｎｉｋｉｔ（ｉＮｔＲＯＮ，韓国）を用いてメーカー提示のプロトコルにしたがって菌株のｇＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ）を抽出した。

菌株の抽出されたｇＤＮＡ、ｉＮｔＲＯＮＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のＰＣＲ－プリミックス（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ－ｐｒｅｍｉｘ）、及び菌株の１６ＳｒＲＮＡを増幅させ得るプライマーセットを混合した後、ＰＣＲによって遺伝子を増幅させた。ＰＣＲは、９５℃５分から始めて、９５℃３０秒、５０℃３０秒、７２℃９０秒を３０回反復した後、７２℃１０分、４℃で増幅を終えた。

増幅された１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ産物は、ジェノテック（韓国デジョン）に塩基配列分析を依頼し、前記分離菌株であるＪＣＫ－７１５８菌株の１６ＳｒＲＮＡコーディング塩基配列として総１３５２ｂｐの塩基配列（配列番号３）を得た。

図１から確認できるように、ＮＣＢＩのＢｌａｓｔＮ検索を用いてＧｅｎＢａｎｋデータベースの塩基配列を比較した結果、ＪＣＫ－７１５８菌株は、バチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）と同定された。したがって、前記菌株をバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株と命名し、２０２２年１１月２日付でＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）に寄託し、受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰが与えられた。

実施例３．バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の生化学的特性－細胞外酵素活性評価

バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株のタンパク質分解酵素プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、キチナーゼ（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）、ゼラチナーゼ（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ）、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）の活性を測定するために、プロテアーゼ培地（１％スキムミルク＋１．５％寒天，Ｄｉｆｃｏ）、キチナーゼ培地（１％コロイダルキチン＋１．５％寒天，Ｄｉｆｃｏ）、ゼラチナーゼ培地（１０％ゼラチン＋１．５％寒天，Ｄｕｋｓａｎ）、セルラーゼ培地（０．４％カルボキシメチルセルロースナトリウム＋１．５％寒天，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を製造した。

キチナーゼ培地は、培地に添加されたコロイダルキチン（ｃｏｌｌｏｉｄａｌｃｈｉｔｉｎ）の製造のために、まず、カニ殻粉末（ｃｒａｂｓｈｅｌｌｐｏｗｄｅｒ）にＨＣｌ（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃａｃｉｄ）を入れて（１０ｇカニ殻粉末／１５０ｍＬＨＣｌ）６時間撹拌した。６時間後、冷たい状態の１Ｌのエタノール（９９．９％）を入れて撹拌器を用いて十分に混ぜ、４℃、４５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。その後、上澄液は除去し、キチン沈殿物は０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）を用いて３～４回洗浄してコロイダルキチンとして使用した。製造されたコロイダルキチンは、高圧蒸気滅菌後から使用前まで４℃で保管した。

ゼラチナーゼ培地は、ＬＢ固体培地に１０％ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）を添加し、その他の培地は、１．５％寒天（ａｇａｒ）を加えて凝固させた。

製造したそれぞれの培地上に、滅菌したペーパーディスク（ｐａｐｅｒｄｉｓｃ，０．８ｃｍ，Ａｄｖａｎｔｅｃ，Ｊａｐａｎ）を位置させ、ＪＣＫ－７１５８菌株培養濾液を、プロテアーゼ培地、キチナーゼ培地、及びセルラーゼ培地には５μＬ、１０μＬ、１５μＬずつ、ゼラチナーゼ培地には２０μＬ、４０μＬ、６０μＬずつそれぞれ分注した。陰性対照区としては滅菌したＬＢと培地をペーパーディスクに同量分注した。実験は３回反復して行われたし、プレートは３０℃で維持させ、それぞれ、細胞外酵素活性によるクリアゾーン（ｃｌｅａｒｚｏｎｅ）観察を行った。セルラーゼ培地とキチナーゼ培地は、視覚化するために、５ｍＬのルゴール液（Ｌｕｇｏｌ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）（２．５ｇ／Ｌヨウ素及び５ｇ／Ｌヨウ化カリウム）をプレートに添加して染色したし、暗条件下で１０分間保持させた後、クリアゾーンを観察した。

図２及び図３から確認できるように、酵素活性を誘導する培地に培養濾液を処理してクリアゾーンを観察した結果、ＪＣＫ－７１５８菌株は、プロテアーゼ培地において試料１５μＬ処理９日後にクリアゾーンの直径が３４．８７ｍｍ、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）培地において試料１５μＬ処理５日後に３５．７２ｍｍ、キチナーゼ培地において試料１５μＬ処理５日後に３８．２６ｍｍ、ゼラチナーゼ培地において試料６０μＬ処理５日後に１９．２９ｍｍ程度のクリアゾーンを形成することが観察できた。結果的に、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株は、プロテアーゼ、キチナーゼ、ゼラチナーゼ、セルラーゼをすべて生産することを確認した。

実施例４．バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株のＩＡＡ生産

バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の植物生長ホルモンであるＩＡＡ（Ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）生産を確認するためにまず、Ｌ－トリプトファン（Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）（１５０ｍｇ／Ｌ）が添加されたＴＳＢ培地にＪＣＫ－７１５８菌株培養液を１％接種して３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。その後、培養液を４℃、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、０．２μｍ無菌フィルターで濾過して得た１ｍＬの培養濾液を２ｍＬのサルコウスキ試薬（Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ’ｓｒｅａｇｅｎｔ）（１５０ｍＬＨ_２ＳＯ_４、２５０ｍＬ滅菌水、７．５ｍＬ０．５ＭＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）と混合した。常温暗条件下で２０分間保持させた後、混合液がピンク色を示すかを確認した。陰性対照区はＬ－トリプトファン（１５０ｍｇ／Ｌ）が添加されたＴＳＢ培地を用いたし、実験は３回反復して行われた。

図４から確認できるように、ＪＣＫ－７１５８菌株の植物生長ホルモンであるＩＡＡの生産を確認するために実験を行った結果、ＪＣＫ－７１５８菌株培養濾液処理区は、試験管内でカラーを示したし、対照区であるＴＳＢ処理区は、培地本然の色を示した。したがって、ＪＣＫ－７１５８菌株が植物生長ホルモンであるＩＡＡを生産するという事実を確認した。

実施例５．バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の２，３－ブタンジオール生産

バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の揮発性物質である２，３－ブタンジオール（２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）生産を確認するために、２，３－ブタンジオールの前駆体であるアセトイン（ａｃｅｔｏｉｎ）生産を確認した。アセトインの生産を確認するために、ＭＲＳ－ＶＰ（５ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌデキストロース、５ｇ／Ｌリン酸二カリウム）培地を使用した。ＭＲＳ－ＶＰ培地にバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８を接種して３０℃、１５０ｒｐｍで３日間振盪培養した後、９６ウェルプレート（ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に１００μｌの培養液、６０μｌの５％ナフトール（Ｎａｐｈｔｏｌ）、２０μｌの４０％水酸化カリウム（Ｐｈｏｔａｓｓｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）を順に入れた。常温条件で１０～１５分間保持させながら混合液がピンク色を示すかを確認した。陰性対照区は、ＭＲＳ－ＶＰ培地のみを使用し、陽性対照区は、アセトイン（Ａｃｅｔｏｉｎ，１ｍｇ／ｍＬ）が添加されたＭＲＳ－ＶＰ培地を使用した。

表２及び図５から確認できるように、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の揮発性物質である２，３－ブタンジオールの生産を、前駆体であるアセトイン生産から確認した結果、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株処理区は、陽性対照区と同様にピンク色に変わったので、アセトインを生成することが確認できたし、このことから、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株が２，３－ブタンジオールを生産することが予測できた。２，３－ブタンジオールは様々な植物に抵抗性を誘導する活性を有すると知られている。したがって、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株培養液も２，３－ブタンジオールを生成して寄主に抵抗性誘導することによって様々な植物病を防除できる潜在力を保有していることが分かる。

実施例６．バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の処理による植物病原菌菌糸のＭＩＣテストによる生長阻害活性

本発明のバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株培養濾液の様々な植物病原性かびの生長に及ぼす影響を確認するために、８種の植物病原菌を対象に生長阻害活性を測定した。ＪＣＫ－６０１９菌株をＴＳＢ液体培地に接種した後、３０℃で３日間１５０ｒｐｍで振盪培養した。培養液を１０，０００Ｘｇで５分間遠心分離した後、上層液を０．２μｍ無菌フィルターで濾過して培養濾液（以下、「試料」という。）を収穫した。９６ウェルミクロ力価測定プレート法（９６－ｗｅｌｌｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ）を応用してＭＩＣ（ＭｉｎｉｍｕｍＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）テストを行ったし、植物病原性真菌としてＣｌａｒｉｒｅｅｄｉａｊａｃｋｓｏｎｉｉ、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ－４、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ２－２（ＩＶ）Ｌａｒｇｅｐａｔｃｈ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ、ＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｄｅｓを使用した。

実験に使用された植物病原性真菌は、ＰＤＢ（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅｂｒｏｔｈ，Ｂｅｃｔｏｎ，ＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏ．，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）培地に接種して２５℃培養器で７日間静置培養した。静置培養の後、菌糸体の重さを測って５０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように滅菌蒸留水を入れて１０，０００ｒｐｍで５秒間均質化器を用いて均質化させた後、ＰＤＢ培地に添加して１％濃度の真菌懸濁液を得た。

植物病原性真菌懸濁液に本発明のバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株培養濾液試料をそれぞれ１０％、５％、２．５％、１．２５％、０．６２５％、０．３１３％、０．１５６％、０．０７８％となるように処理したし、実験は３回反復して行われた。処理したプレート（ｐｌａｔｅ）は密封して２５℃培養器で３～５日間培養して病原菌最小阻害濃度（ＭＩＣ）を調べた。

表３から確認できるように、本発明のバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の植物病原性真菌に対する抗真菌活性を確認するためにＭＩＣテストを行った結果、ＪＣＫ－７１５８菌株は、Ｃｌａｒｉｒｅｅｄｉａｊａｃｋｓｏｎｉｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍに対して１．２５％のＭＩＣ値（ＭＩＣｖａｌｕｅ）の最も強い抗真菌活性を示したし、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ－４、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ２－２（ＩＶ）Ｌａｒｇｅｐａｔｃｈ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ、ＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｄｅｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓなどにも５％のＭＩＣ値の強い活性を示した。また、Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍにおいても１０％のＭＩＣ値を有し、抗真菌活性があることが確認できた。

結果的に、本発明のバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株は、ＭＩＣテストの結果、実験に使用された様々な植物病原性真菌に対して強い抗真菌活性を有することを確認した。

実施例７．バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の処理による植物病原菌の対峙培養による生長阻害活性

本発明のバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の様々な植物病原性菌類に対する菌糸生育阻害活性を調べるために、１３種の植物病原菌を対象に生長阻害活性を対峙培養によって測定した。

対象植物病原性真菌としてＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ－４、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ２－２（ＩＶ）Ｌａｒｇｅｐａｔｃｈ、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ２－２（ＩＶ）Ｂｒｏｗｎｐａｔｃｈ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ、ＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｄｅｓを使用した。

具体的には、ＰＤＡプレートの縁から２ｃｍ離れた地点に本発明のバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株培養液を５ｃｍ長でストリークし、各病原菌の菌糸片を直径６ｍｍのコルクボーラーで切断して、ＪＣＫ－７１５８菌株から５ｃｍ離れた距離に接種した。無処理区は、病原菌の菌糸片のみを接種した。病原性かび菌糸片と本発明のバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株培養液を接種した後、２５℃培養器で培養しながら病原菌の生長速度による病原菌の菌糸生長半径を測定した。実験は３回反復して行われた。抗真菌活性は、ＪＣＫ－７１５８菌株方向に病原菌菌糸の半径（Ｒ２）を測定し、対照群条件で病原菌菌糸の半径（Ｒ１）を測定して計算した。両方の値とも次の公式によって菌糸体生長抑制百分率に変換された。

［菌糸生長抑制率（％）＝（１－Ｒ２／Ｒ１）Ｘ１００］

本発明のバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の様々な植物病原性真菌に対する対峙培養を行った結果、図６及び表４から確認できるように、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株は、実験に使用した全ての病原菌に対して生長阻害活性を示した。そのうちＰｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ以外の実験に使用された全てのかび生育を約５０％阻害した。したがって、ＪＣＫ－７１５８菌株は、対峙培養からも、実験に使用された様々な植物病原性真菌において強い抗真菌活性を有することを確認した。

^ａ１［菌糸生長抑制率（％）＝（１－処理時の真菌生長の長さ／対照群真菌の生長期間）Ｘ１００^ｂ］
各値は、３回反復の平均±標準偏差を表す。

実施例８．バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の坑菌活性物質の分離及び構造同定

バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株が生産する坑菌活性物質を分離するために、前記菌株をＴＳＢ液体培地に接種した後、３０℃で３日間１５０ｒｐｍで振盪培養した。バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株が生産する坑菌活性物質の分離過程は、図７と同じ過程によって行った。

分離過程を詳細に説明すると、培養後、培養液（総３Ｌ）を４５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して培養液の上層液を得た。該上層液（２９０ｍＬ）を同量のエチルアセテート（ＥｔＯＡｃ）とブタノール（ＢｕＯＨ）で２回ずつ分画してエチルアセテート層とブタノール層の有機溶媒層と水溶液層を得た後に減圧濃縮し、それぞれの分画層をアセトン、メタノール、水で再溶解した。各分画の抗真菌活性を検定するために、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍを抗真菌活性検定病原菌として使用した。

図８から確認できるように、抗真菌活性検定の結果、ブタノール分画層がＦ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍに抗真菌活性を示すことが確認できた。活性を示したブタノール分画層は、分取用薄膜クロマトグラフィーにクロロホルム：メタノール：水（１４：６：１，ｖ／ｖ／ｖ）溶媒条件で展開させた後、メタノールで溶出して５個の分画（ＢＦ１～ＢＦ５）を得た。得られた５個の分画に対してＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍに対する抗真菌活性を行った結果、下記表５に示すように、ＢＦ４分画のＭＩＣが１２５ｐｐｍと最も活性が高かった。

抗真菌活性検査の結果、選択された活性分画ＢＦ４分画を再び取用薄膜クロマトグラフィーにおいてクロロホルム：メタノール：水（５５：３６：８，ｖ／ｖ／ｖ）溶媒条件で展開させた後、メタノールで溶出して４個の分画（ＢＦ４－１～ＢＦ４－４）を得た。この４個の分画とシグマ－アルドリッチから購入した標準物質であるイツリン（ｉｔｕｒｉｎ）、フェンジシン（ｆｅｎｇｙｃｉｎ）、サーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）を薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にロードしてクロロホルム：メタノール：水（５５：３６：８，ｖ／ｖ／ｖ）溶媒条件で展開させた後、２５４ｎｍ及び３６５ｎｍの波長においてＵＶで読み出し、ｐ－アニスアルデヒドと水を噴霧して視覚化した。

その結果、図９に示すように、視覚化後に得られた４個の分画はいずれもイツリンＡ（ｉｔｕｒｉｎＡ）を含有していることが確認された。また、それら４個の分画に対して抗真菌活性を検定した結果、表５に示しているように、活性分画ＢＦ４－１の活性がＭＩＣ１２５ｐｐｍを有し、分離された４個分画のうち最も優れていた。

活性分画ＢＦ４－１は、薄膜クロマトグラフィーの結果、イツリンを含有していることが観察されたが、ＢＦ４－１分画のＬＣ／ＭＳ分析の結果、図１０及び図１１に示すように、陽イオンモードピークが分子量１０４３．５５と１０３６．６９においてそれぞれ現れ、この物質がイツリンＡ（ｉｔｕｒｉｎＡ，Ｃ_４８Ｈ_７４Ｏ_１４Ｎ_１２、分子量１，０４３）とサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ，Ｃ_５３Ｈ_９３Ｏ_１３Ｎ_７、分子量１，０３６）であることが分かった。

実施例９．バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株が生産する揮発性有機化合物による抗真菌活性検定

本発明のベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株が生産する揮発性有機化合物の植物病原性真菌Ｃｌａｒｉｒｅｅｄｉａｊａｃｋｓｏｎｉｉ、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ－４、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ２－２（ＩＶ）Ｌａｒｇｅｐａｔｃｈ、ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ２－２（ＩＶ）Ｂｒｏｗｎｐａｔｃｈ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ、ＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｄｅｓに対して抗真菌活性を検定した。

直接接触を遮断するために、中央が分離された二層ペトリ皿（Ｂｉ－ＰｅｔｒｉＤｉｓｈ）（ＳＰＬＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｐｏｃｈｅｏｎ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ，Ｋｏｒｅａ）を使用した。プレートの一方にはＴＳＡを、そして他方にはＰＤＡを分注し、分注後にＪＣＫ－７１５８菌株の培養液を塗抹して培養し、他方のＰＤＡに直径６ｍｍの病原菌菌糸片を接種して２５℃で培養した。無処理区は、ＪＣＫ－７１５８菌株の培養液を塗抹せずにＰＤＡに病原菌のみを接種した。実験は３回反復して行われたし、全てのプレートはパラフィルムで２回密封し、２５℃条件で培養して病原菌の菌糸生長直径を測定した。無処理区は、菌株の培養液を塗抹しないで病原菌のみを接種した。

抗真菌活性は、病原菌菌糸の長さと幅（Ｒ１、Ｒ２）を測定し、対照群条件で病原菌菌糸の長さと幅（Ｒ３、Ｒ４）を測定して計算した。両方の値とも次の公式によって菌糸体生長抑制百分率に変換された。その結果を下表に示した。

［菌糸生長抑制率（％）＝（１－（Ｒ１ＸＲ２）／（Ｒ３ＸＲ４））Ｘ１００］

表７及び図１２から確認できるように、植物病原性真菌に対してＪＣＫ－７１５８菌株が生成する揮発性有機化合物の抗真菌活性を確認した結果、ＪＣＫ－７１５８菌株で生成される揮発性物質は様々な植物病原性かびの生育を阻害したが、その中でも特に果物と作物に灰色かび病を誘発するＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａと穀物に赤かび病を誘発するＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍにそれぞれ６０．５０％と４８．６６％の優れた病原菌菌糸阻害効果を示した。したがって、本発明のＪＣＫ－７１５８菌株は、様々な植物病原性真菌に対して抗真菌活性を示す揮発性物質を生成することが確認できた。

実施例１０．ＧＣ－ＭＳを用いた揮発性有機化合物分析

本発明のＪＣＫ－７１５８菌株が生成する揮発性有機化合物を分析するために、ＳＰＭＥ（ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）ＧＣ－ＭＳ（Ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析を行った。ＪＣＫ－７１５８菌株を５ｍＬのＴＳＢ培地に接種して３０℃、１５０ｒｐｍ条件の下に３日間振盪培養した。ＪＣＫ－７１５８によって生成された揮発性有機化合物はヘッドスペース（ｈｅａｄｓｐａｃｅ）で５０℃で３０分間ＳＰＭＥファイバー（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて収集した。

ＳＰＭＥファイバーに吸着した物質を注入して１分間露出させて脱離させた後、ＤＢ－５ＭＳキャピラリーカラム（３０ｍＸ０．２５ｍｍｉ．ｄ．Ｘ０．２５μｍフィルム厚，Ａｇｉｌｅｎｔ）が装着されたＧＣ－ＭＳ（ＳｈｉｍａｄｚｕＧＣ－ＭＳＱＰ２０１０，Ｓｈｉｍａｄｚｕｃｏ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で分析した。移動相としてはＨｅを使用し、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎに維持した。注入口の温度は２５０℃にしたし、カラム（ｃｏｌｕｍｎ）の温度は、６０℃で２分間維持させた後に２５０℃まで１０℃／ｍｉｎの速度で増加させて２５０℃で２０分間維持させた。質量分析器（Ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）のイオン化電圧（ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ）は７０ｅＶであり、２００℃で５０～４００ｍ／ｚのスキャン（ｓｃａｎ）によって陽イオンモードで分析した。

獲得した質量スペクトルは、ＷＩＬＥＹ８ライブラリーのデータと比較して正確に同定したし、それぞれの物質の含有量は、ＴＩＣ（ｔｏｔａｌｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）ピークの面積比率で示した。

表８及び図１３から確認できるように、分析の結果、本発明のＪＣＫ－７１５８菌株が生成する揮発性有機化合物は、７分以内に５個の物質として検出された。５個物質の化学構造は、質量スペクトル（ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｕｍ）をライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）の物質と比較しながら確認したし、ＧＣ－ＭＳ分析及び質量スペクトル分析の結果、５個の揮発性化合物は、５－ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎ－２－ｏｎｅ、ｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ、２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ、６－ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ、及び５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｈｅｐｔａｎｏｎと確認された。本発明のＪＣＫ－７１５８菌株が生成するこれらの物質が実験に使用された植物病原性真菌の生育を阻害すると判断された。

実施例１１．バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の培養液を用いた剤形製造

本発明のＪＣＫ－７１５８菌株と培養液を用いた粉末水和剤及び液状水和剤を調製するために、前記バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株をＴＳＢ培地２０ｍＬに接種した後、３０℃、１５０ｒｐｍで３日間振盪培養した。３日間培養して収穫した培養液に２０％のフロセットライト（登録商標）（酸化澱粉）を入れて撹拌しながら１４０℃で噴霧乾燥させた。噴霧乾燥して得られた噴霧乾燥試料を、下記の表９及び表１０の通りに調製してＪＣＫ－７１５８菌株液状水和剤（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ；ＳＣ）と粉末水和剤（Ｗｅｔｔａｂｌｅｐｏｗｄｅｒ；ＷＰ）を製造した。

実施例１２．ＪＣＫ－７１５８菌株のシロイヌナズナにおいて抵抗性誘導活性検定

サリチル酸信号伝達系によって植物に抵抗性が誘導され、その結果、ＰＲ－１タンパク質が発現する一連の信号伝達系を活用して植物において抵抗性の誘導有無を検定するマーカー遺伝子としてＰＲ－１遺伝子が使用されている。したがって、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株培養液の抵抗性誘導活性をＰＲ－１遺伝子システムで検定するために、ＰＲ－１プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）にＧＵＳが標識されたベクター（ｖｅｃｔｏｒ）が形質転換されたシロイヌナズナを利用した。

９５％エタノールを用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子の表面を殺菌し、２％ＮａＯＣｌと０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で製造した漂白溶液（ｂｌｅａｃｈｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて２次表面殺菌した。種子に残っている漂白溶液を滅菌蒸留水で洗浄した後、４℃で４８時間浸漬した。

浸漬した種子を、５０ｐｐｍカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を添加したＭＳ寒天（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ－ＳｋｏｏｇＡｇａｒ）に、滅菌した楊枝を用いて載せ、２５℃植物生長培養器で培養した。培養１２日後、２４ウェルプレートの各ウェルに、本発明のバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の培養液、培養濾液、細胞懸濁液、液状水和剤（ＳＣ）、及び粉末水和剤（ＷＰ）を滅菌水に５００、１，０００、２，０００、４，０００倍希釈して２．５ｍＬずつ処理し、各ウェルに２個のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物体が浸るように入れた後、オービタルシェーカーで４８時間常温に維持させた。

４８時間後、反応を固定させるために－２０℃で９０％アセトンに１時間浸漬し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。洗浄の後、染色溶液（ｓｔａｉｎｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２ｍＭＸ－ＧｌｕｃＡ、２．５ｍＭフェリシアン化カリウム、２．５ｍＭフェロシアン化カリウム、滅菌蒸留水）を製造して暗条件下にＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを浸漬し、３７℃恒温水槽に２４時間保持した。

２４時間後に染色溶液を除去し、７０％エタノールに１時間間浸漬した後、９０％エタノールで１時間間隔で複数回浸漬することでクロロフィルなどの不要な色素を除去した。複数回浸漬して色素がすべて除去されると、顕微鏡を用いて青い色を帯びるかを確認することでＰＲ－１遺伝子の発現を確認した。

シロイヌナズナ検定システムによってＧＵＳ発現の有無からＰＲ－１遺伝子の発現を確認し、抵抗性誘導活性を検定した。

表１１及び図１４から確認できるように、陽性対照区であるサリチル酸（ＳＡ）処理区と同一に、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の培養液（ＣｕｌｔｕｒｅＢｒｏｔｈ；ＣＢ）、培養濾液（ＣｕｌｔｕｒｅＦｉｌｔｒａｔｅ；ＣＦ）、細胞懸濁液（Ｃｅｌｌ）、そして実施に１１で製造した２種の製剤液状水和剤（ＳＣ）及び粉末水和剤（ＷＰ）においてＧＵＳが発現し、ＰＲ－１遺伝子の発現が誘導されることが確認されたし、このことから、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株が植物においてサリチル酸と類似の機序によって抵抗性を誘導し、病原性真菌を防除できることを確認した。

実施例１３．温室条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果

本発明のＪＣＫ－７１５８菌株の誘導抵抗性によるイネ赤かび病のｉｎｖｉｖｏ防除活性を温室条件で調べるためにサムカング稲種子を使用した。韓国農村振興庁国立食糧科学院から分譲した１０ｇの「サムカング稲」種子（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａｃｖ．Ｓａｍｋｗａｎｇ）をプラスチック容器に入れ、スポタク乳剤（２５％プロクロラズ、（株）キョンノン）を２，０００倍に希釈し、１日間種子消毒後に暗条件下で２日間水に浸漬した。

２日間催芽した種もみを８０％水稲用床土（重量土，ブノン社）を満たしたプラスチックポット（直径６ｃｍ、高さ６．５ｃｍ）にポット当たり１０個の種子を播種した。播種後、下端に穴が開いた黄色トレーにポットを配置してポット下端が水に浸るようにし、３０℃恒温恒温室で苗代用不織布を覆って培養した。稲が１ｃｍ程度発芽すれば不織布を剥がし、１日に１６時間の光周期で光照射して４週生長させた後、ワグナーポット（上径１７．５ｃｍ、下径１６ｃｍ、高さ１９．８ｃｍ、ＮＦ－５）に植え替えた。

植え替え７日前に、元肥用の複合肥料（フクサラン２１，ナムヘ化学）を水に溶かし、水を引いた水田の土壌に均一に施肥した。その後、恒温恒温室で生長させた若苗を、７０％水田の土壌が満たされたワグナーポット中央に植え替えた。ポットへの植え替え前に、ポット下端の排水口をシリコン栓で塞いだ後、ポットにスチロールフォームのボール（直径４ｃｍ、１０個／ポット）と鉢底ネット（直径１４ｃｍ）を敷いて準備した。

植え替え後、ワグナーポットに水を満たし、ガラス温室（最低２０～２５℃、最高３０～３５℃）で生長させて実験に使用した。ポットへの植え替え２０日後に、スーパーアラリ（１４ｋｇ／１０ａ，ナムヘ化学）で１次追肥し、ポット植え替え２カ月後にエヌケイ２４（Ｎ：Ｐ：Ｋ，２４－０－１２，ファームハンノン）で２次追肥した。

イネ赤かび病の病原菌接種源を準備するために、イネ赤かび病の原因菌であるＦｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ菌株をＰＤＡ培地に接種し、２５℃で６日間静置培養した。培養されたＦ．ａｓｉａｔｉｃｕｍの菌糸で覆われた５個の寒天プラグ（０．１ｃｍ×０．１ｃｍ）を切ってカルボキシメチルセルロース培地（ＣＭＣ，１５ｇカルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１ｇ酵母抽出物、０．５ｇＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇＮＨ_４ＮＯ_３、及び１ｇＫＨ_２ＰＯ_４、１Ｌ蒸留水）に接種し、２５℃、１５０ｒｐｍで４日間振盪培養した。

その後、病原菌培養液を４重のガーゼで濾過して菌糸を除去し、濾別された胞子懸濁液をヘモサイトメーター（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて顕微鏡（ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ．Ａ２，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下で５×１０^５ｓｐｏｒｅ／ｍＬの濃度に調整した。調整した胞子懸濁液は、４℃、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、培地成分を除去するために上層液を捨てた後、同量の０．０５％Ｔｗｅｅｎ－８０で懸濁させて本実験の接種源として使用した。

Ｆ．ａｓｉａｔｉｃｕｍによって発病するイネ赤かび病に対してＪＣＫ－７１５８菌株の誘導抵抗性による病防除効果を調べようとした。ＪＣＫ－７１５８菌株の処理は、ポットへの植え替え１１週後に稲に対して、病原菌接種２週前と１週前にＪＣＫ－７１５８菌株培養液、培養濾液、細胞懸濁液、液状水和剤（ＳＣ）、及び粉末水和剤（ＷＰ）を１，０００倍、２，０００倍に希釈して、稲穂及び茎をぐっしょり濡らし得るように葉面散布処理した。対照薬剤は、病原菌接種１日前に、イネ赤かび病に対する公知薬剤であるプレイ乳剤（Ｐｅｕｌｒｅｉ，ａ．ｉ．１３％ジフェノコナゾール＋１３％プロピコナゾールＥＣ，シンゼンタコリア）を２，０００倍に希釈して使用した。

病原菌接種は、２次薬剤処理７日後に、Ｆ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ胞子懸濁液（２Ｘ１０ｓｐｏｒｅ／ｍＬ）を処理区ごとに同一の量で均一に葉面散布して接種した。薬剤製造時に展着剤であるＴｗｅｅｎ－２０を、ＪＣＫ－７１５８菌株培養液、培養濾液、細胞懸濁液には２５０μｇ／ｍＬ程度で添加した。接種直後にビニールパックを用いて３日間湿室処理し、実験は処理区当たり５回反復して行ったし、接種７日後に、イネ赤かび病の発病面積率による発病度及び無処理区対比の防除価を計算した。

［防除価（％）＝（１－（処理区の発病度／無処理区の発病度））Ｘ１００］

図１５及び図１６から確認できるように、バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果を病原菌接種７日後に調べた結果、ＪＣＫ－７１５８菌株培養液（ＣｕｌｔｕｒｅＢｒｏｔｈ；ＣＢ）、培養濾液（ＣｕｌｔｕｒｅＦｉｌｔｒａｔｅ；ＣＦ）、細胞懸濁液（Ｃｅｌｌ）処理区のいずれにおいてもＦ．ａｓｉａｔｉｃｕｍが誘発するイネ赤かび病の発生を減少させた。

特に、ＪＣＫ－７１５８菌株培養液１，０００倍希釈液において無処理区に比べて４９．８８％、２，０００倍希釈液では３４．７１％の防除活性を示したし、ＪＣＫ－７１５８菌株培養濾液の１，０００倍希釈液では４３．８８％、２，０００倍希釈液では３８．８２％の防除活性を示したし、ＪＣＫ－７１５８菌株細胞懸濁液の１，０００倍希釈液では４７．８８％、２，０００倍希釈液では４２．５９％の防除活性をそれぞれ示した。防除価は、全ての処理区において濃度依存的に効果があることが観察された。対照薬剤として使用したプレイは、２，０００倍希釈液において３４．４１％の防除価を示し、処理区の防除活性が対照薬剤に比べて多少優れていたので、ＪＣＫ－７１５８菌株が誘導抵抗性によってイネ赤かび病を効果的に防除することが確認できた。

また、図１７及び図１８から確認できるように、実施例１１で製造したバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の液状水和剤（ＳＣ）及び粉末水和剤（ＷＰ）の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果を病原菌接種７日後に調べた結果、ＪＣＫ－７１５８菌株の液状水和剤（ＳＣ）及び粉末水和剤（ＷＰ）処理区のいずれも、Ｆ．ａｓｉａｔｉｃｕｍが誘発するイネ赤かび病の発生を減少させた。

特に、ＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）１，０００倍希釈液において無処理区に比べて６３．８７％、２，０００倍希釈液では３５．４３％の防除活性を示した、ＪＣＫ－７１５８菌株粉末水和剤（ＷＰ）の１，０００倍希釈液では３４．４０％、２，０００倍希釈液では３０．４２％の防除活性をそれぞれ示した。防除価は、全ての処理区において濃度依存的に効果があることが観察された。対照薬剤として使用したプレイは、２，０００倍希釈液において４４．８７％の防除価を示したし、ＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）１，０００倍希釈液の防除価（６３．８７％）が対照薬剤に比べて優れており、イネ赤かび病を効果的に防除することが確認できた。したがって、今後ＪＣＫ－７１５８菌株の抵抗性誘導活性を用いて優れた効能のイネ赤かび病防除剤を開発できることを確認した。

実施例１４．圃場条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株製剤の誘導抵抗性によるイネ赤かび病に対する防除効果

本発明のＪＣＫ－７１５８菌株の誘導抵抗性によるイネ赤かび病のｉｎｖｉｖｏ防除活性を圃場条件で調べるためにサムカング稲種子に実施例１１で記述されたバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）を処理した。バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）を１，０００倍、２，０００倍希釈して対象植物であるサムカング稲の稲穂に病原菌接種２週前、１週前に噴霧処理し、Ｆ．ａｓｉａｔｉｃｕｍを接種してバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８製剤の防除効果を調べた。対照薬剤はプレイ乳剤（１３％プロピコナゾール＋１３％ジフェンコナゾール，シンゼンタコリア（株））を２，０００倍に希釈して病原菌接種１日前に使用した。

圃場条件の稲に接種する接種源は、イネ赤かび病を誘発するＦ．ａｓｉａｔｉｃｕｍを前記実施例１３に記述と同様に２．０Ｘ１０^５ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬに調整し、胞子懸濁液に５００μｇ／ｍＬｔｗｅｅｎ２０を添加して準備した。接種源の処理された稲穂は、温室におけると同様に湿度を維持するために、チャック付きポリ袋（８ｃｍｘ２０ｃｍ）に蒸留水を１回かけた後、穂と葉を共に入れてシールして３日間湿室処理効果を与えたし、接種３日後にチャック付きポリ袋を除去し、毎日２回ずつ水を噴射した。処理区当たり３０個の稲穂を基本として３回反復して処理した。

病原菌接種７日後に穂を切って発病度を調査した。発病度は、５％間隔で０％から１００％まで計算した。防除価は、次の公式によって計算した。

図１９～図２１から確認できるように、実施例１１で製造したバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株の液状水和剤（ＳＣ）を、病原菌接種２週前、１週前に先行処理して稲において抵抗性を誘導した後、イネ赤かび病に対する防除効果を圃場条件で調べた結果、病原菌接種２週と４週後、ＪＣＫ－７１５８菌株液状水和剤（ＳＣ）処理区は、Ｆ．ａｓｉａｔｉｃｕｍが誘発するイネ赤かび病の発生を減少させた。

特に、接種２週後、ＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）１，０００倍希釈液において、無処理区に比べて４８．８１％、２，０００倍希釈液では２０．５６％の防除活性を示したし、接種４週後、ＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）１，０００倍希釈液において無処理区に比べて５０．２８％、２，０００倍希釈液では１７．５％の防除活性をそれぞれ示した。防除価は、処理区において濃度依存的に現れ、温室実験の結果が類似であった。対照薬剤として使用したプレイは、病原菌接種２週後と４週後に、２，０００倍希釈液において３２．５７％と３５．２１％の防除価をそれぞれ示したし、イネ赤かび病防除価を測定した両時期のいずれにおいてもＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）１，０００倍希釈液の防除価が対照薬剤に比べて優れることが確認できた。

結果的に、ＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）１，０００倍希釈液処理区は、対照区である化学農薬処理区に比べてイネ赤かび病を効果的に防除した。したがって、ＪＣＫ－７１５８菌株の抵抗性誘導活性を用いたイネ赤かび病防除は、圃場条件においても効率的に作用することが確認できた。

実施例１５．圃場条件でバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８菌株製剤の誘導抵抗性によるイネ赤かび病の毒素生産低減効果

本発明のＪＣＫ－７１５８菌株液状水和剤の処理の効果として、イネ赤かび病誘発病原菌であるフザリウムアジアティカム（Ｆ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）が生成する真菌毒素であるニバレノール（ｎｉｖａｌｅｎｏｌ；ＮＩＶ）生産低減効果を圃場条件で調べるために、前記実施例１１で記述したバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）をサムカング稲種子に処理した。

バチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）を、１，０００倍、２，０００倍希釈して、対象植物であるサムカング稲の穂に、病原菌接種２週前、１週前に噴霧処理した後、フザリウムアジアティカムを接種してバチルスベレゼンシスＪＣＫ－７１５８製剤の防除効果を調べた。対照薬剤は、プレイ乳剤（１３％プロピコナゾール＋１３％ジフェンコナゾール，シンゼンタコリア（株））を２，０００倍に希釈して病原菌接種１日前に使用した。

圃場条件の稲に接種する接種源は、イネ赤かび病を誘発するフザリウムアジアティカムを、前記実施例１３に記述と同一に２．０Ｘ１０^５ｓｐｏｒｅｓ／ｍＬに調整し、胞子懸濁液に５００μｇ／ｍＬｔｗｅｅｎ２０を添加して準備した。接種源の処理された稲穂は、温室におけると同様に湿度を維持するためにチャック付きポリ袋（８ｃｍｘ２０ｃｍ）に蒸留水を１回かけた後、穂と葉を共に入れてシールして３日間湿室処理効果を与えたし、接種３日後にチャック付きポリ袋を除去し、毎日２回ずつ水を噴射した。処理区当たり３０個の稲穂を基本として３回反復して処理した。

病原菌接種６週後にフィールドから子実を収穫して日光とオーブンで３日間乾燥させた。乾燥した試料を粉砕し、粉砕された試料５ｇに滅菌水２５ｍＬを入れた後、１時間３００ｒｐｍで振盪抽出した。その後、３，６００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上澄液５ｍＬにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ）２０ｍＬを添加して希釈した。

希釈溶液２５ｍＬをＤＯＮ－ＮＩＶＷＢ（Ｖｉｃａｍ）カラムにロードし、希釈溶液がすべて流れ出るとＰＢＳ５ｍＬ、滅菌水５ｍＬを順に流して洗浄させた。続いて、カラム内に圧力をかけてカラム内の溶液を除去し、その後、０．５ｍＬのメタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）と１．５ｍＬアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ，ＭｅＣＮ）で溶出させた後、窒素乾燥させた。

その後、滅菌水：ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ（９０：５：５，ｖ／ｖ／ｖ）１ｍＬで再溶解させた。その後、０．２２μｍメンブレインフィルターでフィルタリングし、ＵＰＬＣ－ＰＤＡで分析を行った。機器は、ＰＤＡ（２１８ｎｍ）ディテクター付きＷＡＴＲＥＲＳＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＨＣｌａｓｓを使用したし、カラムは、ＸｓｅｌｅｃｔＣＳＨＣ１８（２．１Ｘ１００ｍｍ、２．５μｍ、ｗａｔｅｒｓ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を使用したし、温度は４０℃に維持させた。流速は０．３ｍＬ／ｍｉｎにして１０μＬを注入し、１０分間分析した。分析の結果、ニバレノール（Ｎｉｖａｌｅｎｏｌ，ＮＩＶ）が検出された。

また、表１２から確認できるように、ＪＣＫ－７１５８液状水和剤処理の場合、無処理区に比べてニバレノールを４０．６２％減少させる効果を示し、化学殺菌剤であるプレイ（毒素低減効果２１．１２％）に比べてかび毒素ニバレノールを減少させる効果に優れていることが確認できた。

結果的に、ＪＣＫ－７１５８液状水和剤（ＳＣ）１，０００倍希釈液処理区は、対照区である化学農薬処理区に比べて、イネ赤かび病を効果的に防除するだけでなく、病原菌が生成する真菌毒素の生成量も、化学薬剤対照区に比べてより効果的に低減させた。したがって、ＪＣＫ－７１５８菌株の抵抗性誘導活性を用いたイネ赤かび病防除は、圃場条件においても効率的に作用することが確認できた。

したがって、残留問題のため収穫前３０日までしか使用できないという不具合がある化学農薬使用の代替剤としてＪＣＫ－７１５８菌株は、防除活性に優れた環境にやさしい菌株であり、予防薬剤として活用する場合、防除しにくかったイネ赤かび病を含む様々な植物病の防除剤の開発に礎石になると思われる。

名称：ＢａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓＪＣＫ－７１５８
受託番号：ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰ

Claims

抗真菌活性を有する受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株。
受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む植物病原性真菌防除用組成物。
前記植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ（Ｃｌａｒｉｒｅｅｄｉａｊａｃｋｓｏｎｉｉ）、リゾクトニアソラニＡＧ－４（ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ－４）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ（Ｌａｒｇｅｐａｔｃｈ）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ（Ｂｒｏｗｎｐａｔｃｈ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムアジアティカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ）、フザリウムベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、ピシウムウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ）、ガエウマノミセスグラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）、フィトフソラインフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ボトリティスシネレア（ＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａ）、及びコレトトリクムココデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｄｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上である、請求項２に記載の植物病原性真菌防除用組成物。
イツリンＡ（ｉｔｕｒｉｎＡ）、サーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）、２，３－ブタンジオール（２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）、５－メチルヘキサン－２－オン（５－Ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎ－２－ｏｎｅ）、ヘプタン－２－オン（ｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ）、２，５－ジメチルビラジン（２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）、６－メチルヘプタン－２－オン（６－ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ）、及び５－メチル－２－ヘプタノン（５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｈｅｐｔａｎｏｎｅ）からなる群から選ばれる１種以上の化合物を含む植物病原性真菌防除用組成物。
前記植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ（Ｃｌａｒｉｒｅｅｄｉａｊａｃｋｓｏｎｉｉ）、リゾクトニアソラニＡＧ－４（ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ－４）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ（Ｌａｒｇｅｐａｔｃｈ）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ（Ｂｒｏｗｎｐａｔｃｈ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムアジアティカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ）、フザリウムベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、ピシウムウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ）、ガエウマノミセスグラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）、フィトフソラインフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ボトリティスシネレア（ＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａ）、及びコレトトリクムココデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｄｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上である、請求項４に記載の植物病原性真菌防除用組成物。
受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株を培養して培養液を製造する培養段階を含む植物病原性真菌防除用組成物の製造方法。
前記植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ（Ｃｌａｒｉｒｅｅｄｉａｊａｃｋｓｏｎｉｉ）、リゾクトニアソラニＡＧ－４（ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ－４）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ（Ｌａｒｇｅｐａｔｃｈ）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ（Ｂｒｏｗｎｐａｔｃｈ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムアジアティカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ）、フザリウムベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、ピシウムウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ）、ガエウマノミセスグラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）、フィトフソラインフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ボトリティスシネレア（ＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａ）、及びコレトトリクムココデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｄｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上である、請求項６に記載の植物病原性真菌防除用組成物の製造方法。
前記製造方法は、培養液又はこれから得た培養濾液をブタノールで分画してブタノール層を得る第１分画段階をさらに含む、請求項６に記載の植物病原性真菌防除用組成物の製造方法。
前記製造方法は、第１分画段階で得たブタノール層に対してクロロホルム：メタノール：水の混合溶液で溶出する段階であって、５個の分画のうち４番目又は５番目の分画を得る第２分画段階をさらに含む、請求項８に記載の植物病原性真菌防除用組成物の製造方法。
前記クロロホルム：メタノール：水の混合体積比は、５０～６０：３０～４０：５～１０である、請求項９に記載の植物病原性真菌防除用組成物の製造方法。
前記製造方法は、第２分画段階で得た分画に対してクロロホルム：メタノール：水の混合溶液で溶出する段階であって、４個の分画のうち１番目～３番目分画からなる群から選ばれる１種以上の分画を得る第３分画段階をさらに含む、請求項９に記載の植物病原性真菌防除用組成物の製造方法。
前記クロロホルム：メタノール：水の混合体積比は、５０～６０：３０～４０：５～１０である、請求項１１に記載の植物病原性真菌防除用組成物の製造方法。
受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を処理する処理段階を含む植物病原性真菌防除方法。
前記処理段階は、散布、土壌灌注、表面散布、根圏処理、種子処理、浸漬、毒入れ、及び燻煙施用からなる群から選ばれる１種以上の方式で行われる、請求項１３に記載の植物病原性真菌防除方法。
前記植物病原性真菌は、クラリレエディアジャックソニイ（Ｃｌａｒｉｒｅｅｄｉａｊａｃｋｓｏｎｉｉ）、リゾクトニアソラニＡＧ－４（ＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＡＧ－４）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ラージパッチ（Ｌａｒｇｅｐａｔｃｈ）、リゾクトニアソラニＡＧ２－２（ＩＶ）ブラウンパッチ（Ｂｒｏｗｎｐａｔｃｈ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．キュキュメリナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｎｕｍ）、フザリウムオキシスポルムＦ．ＳＰ．リコペルシシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）、フザリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムアジアティカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍａｓｉａｔｉｃｕｍ）、フザリウムベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、ピシウムウルティマム（Ｐｙｔｈｉｕｍｕｌｔｉｍｕｍ）、ガエウマノミセスグラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ）、フィトフソラインフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、ボトリティスシネレア（ＢｏｔｒｙｔｉｓＣｉｎｅｒｅａ）、及びコレトトリクムココデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｃｏｃｃｏｄｅｓ）からなる群から選ばれる１種以上である、請求項１３に記載の植物病原性真菌防除方法。
イツリンＡ（ｉｔｕｒｉｎＡ）、サーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）、２，３－ブタンジオール（２，３－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ）、５－メチルヘキサン－２－ｏｎ５－Ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎ－２－ｏｎｅ）、ヘプタン－２－オン（ｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ）、２，５－ジメチルビラジン（２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）、６－メチルヘプタン－２－オン（６－ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎ－２－ｏｎｅ）、及び５－メチル－２－ヘプタノン（５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｈｅｐｔａｎｏｎｅ）からなる群から選ばれる１種以上の化合物を処理する処理段階を含む植物病原性真菌防除方法。
受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を含む真菌毒素低減用組成物。
受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株を培養して培養液を製造する培養段階を含む真菌毒素低減用組成物の製造方法。
受託番号ＫＣＴＣ１５１６９ＢＰで寄託されたバチルスベレゼンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ）ＪＣＫ－７１５８菌株、その培養液又はその抽出物を処理する処理段階を含む真菌毒素低減方法。