JP2024527982A - ヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３タンパク質とその利用 - Google Patents

Abstract

がん罹患中の腫瘍間質の発達は物理的障壁として作用して免疫細胞が腫瘍に近づくのを制限する可能性があるため、鍵となる役割を果たしている。したがって間質においてβｉｇ－ｈ３（ＴＧＦβｉ）が過剰発現していると、膵管腺癌とそれ以外のがんで予後が悪い。１８Ｂ３と呼ばれるβｉｇ－ｈ３タンパク質に対するモノクローナル抗体は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化阻害を阻止することにより、抗腫瘍免疫応答を直接変化させるのにある役割を果たしていることが示された。発明者らは、予想外に高い親和性、遅い解離速度、および強い熱安定性を持つヒト化抗体を１８Ｂ３から開発した。そのためこれらヒト化抗体は、生体内で間質がβｉｇ－ｈ３を発現しているがんを治療するための強力な候補となる。したがって本発明は、これらのヒト化モノクローナル抗体と、そのようながんを治療する方法に関する。

Description

本発明は抗体の分野に関する。特に本発明により、ヒトβｉｇ－ｈ３タンパク質に対する特異性を持つヒト化抗体と、その利用が提供される。医学的利用、特に間質タンパク質βｉｇ－ｈ３が生体内で発現するがん（膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、肺がん、頭頸部がん、大腸がん、膀胱がん、黒色腫、および後出の他のがんなど）の治療も提供される。

がん罹患中の腫瘍間質の発達は物理的障壁として作用して免疫細胞が腫瘍に近づくのを制限する可能性があるため、鍵となる役割を果たしている。したがって腫瘍間質において発現または過剰発現していて免疫抑制に関与する鍵となる分子が同定されると、新たな治療機会につながるであろう。間質タンパク質のうちのβｉｇ－ｈ３（ＴＧＦβｉとしても知られる）は、間質において過剰発現していると膵管腺癌（ＰＤＡＣ）とそれ以外のがん（肺がん、頭頸部がん、大腸がん、膀胱がん、黒色腫など）で予後が悪いことが示されている。

（マウスとヒトの両方で）ＰＤＡＣモデルを用いる際のβｉｇ－ｈ３間質タンパク質の潜在的な役割を探索することにより、このタンパク質はＴリンパ球の細胞傷害活性を低下させて微小環境が硬化するのを助けるため、免疫系が腫瘍に近づきにくくなることが明らかにされている。

マウスとヒトでは、βｉｇ－ｈ３タンパク質は、健康な個人の膵臓外分泌区画では発現していないが、腫瘍間質には非常に初期に出現する。

そこで鍵となる構成要素（βｉｇ－ｈ３など）のいくつかを特異的な薬の標的とすることによって腫瘍間質を変化させ、固形がんの治療的処置を助けることが提案されている。このタンパク質を特異的に枯渇させるとＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性が回復して間質の硬さを低下させうることが提案されており、すると腫瘍へのアクセスが回復する。

あるタンパク質を枯渇させるための１つの標準的なアプローチは、鍵となるエピトープに特異的に向かうことでそのタンパク質の機能活性を阻止するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製することであり、その後タンパク質／抗体複合体が生体内から排除される。

βｉｇ－ｈ３タンパク質に対する抗体は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化阻害を阻止することにより、抗腫瘍免疫応答を直接変化させるのにある役割を果たしていることが示された（ＷＯ ２０１７／１５８０４３）。ヒトβｉｇ－ｈ３タンパク質（１８Ｂ３と呼ばれる）に向かうマウスモノクローナル抗体はＷＯ ２０２０／０７９１６４に記載された。

新規で好ましくは改善されたがん治療の手段が相変わらず必要とされている。そこで本発明の１つの目的は、がんを治療するための改善された手段を提供することである。特に、これらの改善された手段は、βｉｇ－ｈ３タンパク質を特異的に枯渇させ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性を回復させ、間質の硬さを低下させることで、腫瘍への免疫系のアクセスを回復し、または容易にし、最終的に有意な腫瘍縮小と生存率につながることが想定されている。薬が腫瘍に近づくのを容易にすることも想定されている。βｉｇ－ｈ３タンパク質を枯渇させるための本アプローチは、鍵となるエピトープに特異的に向かうことでそのタンパク質の機能活性を阻止するヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製するというものである。その後、タンパク質／抗体複合体が生体内から排除される。

本発明はしたがって、βｉｇ－ｈ３タンパク質に対する特異性を持つヒト化（Ｈｚ）抗体と、その利用に関する。これらＨｚ抗体はβｉｇ－ｈ３アンタゴニストである。特に、本発明は請求項によって規定される。これら抗体は１８Ｂ３抗体のヒト化バージョンである。これらヒト化抗体は特に魅力的で予想外の特性（例えば細胞培養物の中での親和性、解離速度、熱安定性、生産性）を持っており、治療の用途と、特にＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性の回復と間質の硬さの低下に関して有望な抗体であるため、腫瘍への免疫系の、および／または薬のアクセスが回復する、または容易になる。したがってこれらのヒト化ｍＡｂは、インビトロと生体内の機能的バイオアッセイにおいて成功することが証明された。

前記ｍＡｂは、βｉｇ－ｈ３タンパク質の領域のうちで（Ｔ細胞活性化経路に関与する）インテグリンと（腫瘍微小環境または間質の変化に関与する）コラーゲンの表面における結合に関与することが知られている領域を標的とする。この領域はａｖｂ３（αＶβ３）インテグリン相互作用モチーフであり、アミノ酸（ＡＡ）５４８～６１４に対応する断片の中に存在する。エピトープマッピングの研究から、前記抗体はβｉｇ－ｈ３タンパク質のβｉｇ－ｈ３タンパク質のＦＡＳ１の４番目のドメイン（直線状エピトープＡＬＰＰＲＥＲＳＲＬ、配列番号１６であり、これは、中央の８個のアミノ酸、配列番号３０まで短くすることさえできる）（ＡＡ残基５４９～５５８）を標的とすることが示された。本明細書の中で報告されているいくつかの親和性バイオアッセイと機能的バイオアッセイにより、本明細書に開示されているヒト化（Ｈｚ）モノクローナル抗体の特異的結合を確認することができる。

１つの側面では、本発明は、可変ドメインＶＨと可変ドメインＶＬを含んでいて、βｉｇ－ｈ３タンパク質のエピトープ（前記エピトープは配列番号１６または３０の配列として示されている）に、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して測定したとき１ｎＭ以下、好ましくは０．７ｎＭ以下、より好ましくは０．６または０．５８ｎＭ以下の高親和性Ｋ_Ｄと、４と１０Ｅ－０４秒^－１の間、好ましくは５と８Ｅ－０４秒^－１の間、より好ましくは５．５と７．５Ｅ－０４秒^－１の間に含まれる遅い解離速度Ｋ_ｄで特異的に結合するヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。ＳＰＲはバイオセンサーシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなど）を用いて測定することができる。

本明細書に開示されている親和性と解離速度は測定の方法の部分に記載されているようにして測定した。

一実施形態では、本発明は、可変ドメインＶＨと可変ドメインＶＬを含んでいてβｉｇ－ｈ３タンパク質のエピトープに特異的に結合するヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。前記エピトープは配列番号１６または３０の配列として示されている。ＶＨドメインは配列番号４または２８に示されている配列を持つ。配列番号２８は配列番号４の変異バージョンである。すなわちＨ－ＣＤＲ３の中のシステイン１０２がセリンで置き換えられている。ＶＬはマウス１８Ｂ３ＶＬドメインのヒト化バリアントであり、配列番号１８として示されている配列を持つ。ＶＨとＶＬのこの組み合わせが、ヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に、大きくて予想外の耐熱性、すなわち８０℃以上、特に８０と８３、８３．２、８３．５、または８４℃の間、好ましくは８１と約８３または８３．２℃の間に含まれるＤＳＣを提供する。ＤＳＣは測定の方法の部分に記載されている方法を利用して測定される。１つの側面では、このヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片はさらに、前記エピトープに、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して測定したとき１ｎＭ以下、好ましくは０．７ｎＭ以下、より好ましくは０．６または０．５８ｎＭ以下の高親和性Ｋ_Ｄ、および／または４と１０Ｅ－０４秒^－１の間、好ましくは５と８Ｅ－０４秒^－１の間、より好ましくは５．５と７．５Ｅ－０４秒^－１の間に含まれる遅い解離速度Ｋ_ｄで結合する。ＳＰＲはバイオセンサーシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなど）を用いて測定することができる。

本発明のヒト化抗体はβｉｇ－ｈ３タンパク質を枯渇させることができる。

本発明のヒト化抗体は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性を回復させること、および／または間質の硬さを低下させることができるため、腫瘍へのアクセスが回復する。したがってこれらの抗体は、間質に対する抗βｉｇ－ｈ３抗体の効果のおかげで、腫瘍により容易に近づくことのできる別の抗腫瘍剤と組み合わせて使用することができる。

本発明は、少なくとも１つのヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、医薬として許容可能なビヒクルとを含む医薬組成物にも関する。

本発明は、少なくとも１つのヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、別の抗腫瘍薬（例えば抗体、特にモノクローナル抗体またはその断片）とを含む医薬組成物、医薬組み合わせ、または部品のキットにも関する。

本発明は、がんを予防または治療すること、βｉｇ－ｈ３タンパク質を枯渇させること、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性を回復または活性化させること、および／または間質の硬さを低下させて他の抗腫瘍薬（抗体，モノクローナル抗体など）が腫瘍に近づくのを促進することに利用するための、そのような抗体、医薬組成物、医薬組み合わせ、または部品のキットにも関する。

本発明はがんの予防または治療の方法にも関係しており、この方法は、それを必要とする患者に、有効な量のそのような抗体、医薬組成物、医薬組み合わせ、または部品のキットを投与することを含む。本発明は、βｉｇ－ｈ３タンパク質を枯渇させること、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性を回復または活性化させること、および／または間質の硬さを低下させて他の抗腫瘍薬（抗体、モノクローナル抗体など）が腫瘍に近づくのを促進することにも関する。

図１は、ヒトβｉｇ－ｈ３の構造の模式図である。１８Ｂ３ ｍＡｂは、αｖβ３とコラーゲンの結合にとって重要なＹＨ１８ドメインを含む５４９～５５８エピトープを認識する。 図２は、（参照ｍＡｂと見なす）キメラ１８Ｂ３と前記４つのヒト化バリアントに関するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。６回の実験の平均（＋標準偏差）。 図３は、（参照ｍＡｂと見なす）キメラ１８Ｂ３と前記４つのヒト化バリアントに関する細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化と増殖を示すグラフである。３回の実験の平均（＋標準偏差）。パラメータの統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてなされるスチューデントのｔ検定と一元配置分散分析を通じて評価する。 図４は、ｃｔｒｌ ＩｇＧ１ Ａｂ、（参照ｍＡｂと見なす）キメラ１８Ｂ３のほか、前記４つのヒト化バリアントの存在下における皮下移植した（ｓｃ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ）腫瘍膵臓がん腫瘍細胞の腫瘍の重量を示すグラフである。腫瘍細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ １：１混合物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中に塊として埋め込み、正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脇腹に、マウス１匹当たり６ｍｇのヒト化バージョンｍＡｂとともに皮下注射する。対照は、無関係なアイソタイプ対照ＩｇＧ１ ｍＡｂにある。同じマウス集団（ｎ＝５）を、評価するそれぞれの量について用いる。腫瘍グラフトを分離し、グラフト内の腫瘍細胞の量をその後ＦＡＣＳ染色によって４℃で評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアで分析する。パラメータの統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてなされるスチューデントのｔ検定と一元配置分散分析を通じて評価する。 図５は、ｃｔｒｌ ＩｇＧ１ Ａｂ、（参照ｍＡｂと見なす）キメラ１８Ｂ３のほか、前記４つのヒト化バリアントの存在下における皮下グラフトの中の腫瘍細胞の数を示すグラフである。腫瘍細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ １：１混合物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中に塊として埋め込み、正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脇腹に、マウス１匹当たり６ｍｇのヒト化バージョンｍＡｂとともに皮下注射する。対照は無関係なアイソタイプ対照ＩｇＧ１ ｍＡｂにある。同じマウス集団（ｎ＝５）を、評価するそれぞれの量について用いる。腫瘍グラフトを分離し、グラフト内の腫瘍細胞の量をその後ＦＡＣＳ染色によって４℃で評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアで分析する。パラメータの統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてなされるスチューデントのｔ検定と一元配置分散分析を通じて評価する。 図６は、ｃｔｒｌ ＩｇＧ１ Ａｂ、（参照ｍＡｂと見なす）キメラ１８Ｂ３のほか、前記４つのヒト化バリアントの存在下における皮下グラフトの中の活性化されていないＣＤ８ Ｔ細胞の数を示すグラフである。腫瘍細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ １：１混合物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中に塊として埋め込み、正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脇腹に、マウス１匹当たり６ｍｇのヒト化バージョンｍＡｂとともに皮下注射する。対照は無関係なアイソタイプ対照ＩｇＧ１ ｍＡｂにある。同じマウス集団（ｎ＝５）を、評価するそれぞれの量について用いる。腫瘍グラフトを分離し、グラフト内の腫瘍細胞の量をその後ＦＡＣＳ染色によって４℃で評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアで分析する。パラメータの統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてなされるスチューデントのｔ検定と一元配置分散分析を通じて評価する。 図７は、ｃｔｒｌ ＩｇＧ１ Ａｂのほか、２つのヒト化バリアント（Ｈ３３０／Ｌ４１とＨ３３０／Ｌ２２８）のオリジナルバージョン（Ｖ１）とＣ１０２に関する変異バージョン（Ｖ１．２）の存在下における皮下グラフトの中の腫瘍細胞の数を示すグラフである。両方のｍＡｂについて重鎖３３０の１０２位における変異（システイン残基のセリンによる置換）を実現し、翻訳後修飾（ＰＴＭ）のリスクを最小にする。 腫瘍細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ １：１混合物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中に塊として埋め込み、正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脇腹に、マウス１匹当たり６ｍｇのヒト化バージョンｍＡｂとともに皮下注射する。対照は、無関係なアイソタイプ対照ＩｇＧ１ ｍＡｂにある。同じマウス集団（ｎ＝５）を、評価するそれぞれの量について用いる。腫瘍グラフトを分離し、グラフト内の腫瘍細胞の量をその後ＦＡＣＳ染色によって４℃で評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアで分析する。パラメータの統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてなされるスチューデントのｔ検定と一元配置分散分析を通じて評価する。 図８は、ｃｔｒｌ ＩｇＧ１ Ａｂのほか、２つのヒト化バリアント（Ｈ３３０／Ｌ４１とＨ３３０／Ｌ２２８）のオリジナルバージョン（Ｖ１）とＣ１０２に関する変異バージョン（Ｖ１．２）の存在下における皮下グラフトの中の活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞の数を示すグラフ。腫瘍細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ １：１混合物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中に塊として埋め込み、正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脇腹に、マウス１匹当たり６ｍｇのヒト化バージョンｍＡｂとともに皮下注射する。対照は、無関係なアイソタイプ対照ＩｇＧ１ ｍＡｂにある。同じマウス集団（ｎ＝５）を、評価するそれぞれの量について用いる。腫瘍グラフトを分離し、グラフト内の腫瘍細胞の量をその後ＦＡＣＳ染色によって４℃で評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアで分析する。パラメータの統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてなされるスチューデントのｔ検定と一元配置分散分析を通じて評価する。

ヒト化抗体

１つの側面では、本発明は、可変ドメインＶＨと可変ドメインＶＬを含んでいてβｉｇ－ｈ３タンパク質のエピトープに特異的に結合するヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。エピトープは、配列配列番号１６または３０として示されるものであることが好ましい。もちろん、配列番号１６または３０よりも大きいβｉｇ－ｈ３タンパク質断片と、この配列を含むβｉｇ－ｈ３タンパク質断片に結合できる本発明の抗体またはその断片を除外することはできない。前記抗体またはその断片の結合は、驚くべき高レベルの親和性で起こること、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して測定したとき１ｎＭ以下、好ましくは０．７ｎＭ以下、より好ましくは０．６または０．５８ｎＭ以下の高親和性Ｋ_Ｄで起こることができる。注目すべきことに、そして予想外なことに、前記Ｈｚ抗体またはその断片は、結合後に遅い解離速度Ｋ_ｄを示す。この遅い解離速度は、ＳＰＲを利用して測定したとき４と１０Ｅ－０４秒^－１の間、好ましくは５と８Ｅ－０４秒^－１の間、より好ましくは５．５と７．５Ｅ－０４秒^－１の間に含まれる可能性がある。ＳＰＲはバイオセンサーシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなど）を用いて測定することができる。

本出願で着目した配列は下記の表１に示されている：

凡例：ＶＬとＶＨでは、Ｋａｂａｔに従うＣＤＲは太字であり、他のアミノ酸はＦＲの中にあり、マウスとは異なる特別なアミノ酸には下線が引かれている。

２つのヒト化ＶＨドメイン（Ｈ－３３０とＨ－３１１）と２つのヒト化ＶＬドメイン（Ｌ－４１とＬ－２２８）を作製した。それらは、それぞれが本発明の１つの目的であり、モノクローナル抗体またはその断片の中のそれらＶＨ／ＶＬの組み合わせも同様である。ヒト化ＶＨドメインＨ－１６９とヒト化ＶＬドメインＬ－３１５も本発明の目的であり、モノクローナル抗体またはその断片の中の本発明のＶＬドメインまたはＶＨドメインとそれらの組み合わせも同様である。

システイン１０２からセリンへの変異を持つＨ－３３０の変異バージョンも作製した。この変異バージョンをＨ３３０Ｖ１．２（それに対して原初のＨ３３０はＶ１）またはＨ３３０Ｃ１０２Ｓと呼び、配列番号２８に示されている配列を持つ。この変異はＨ－ＣＤＲ－３の中で起こり、変異したＨ－ＣＤＲ３は配列番号２７に示されている配列を持つ。

これらＶＨドメインを、変異したものを含めて組み合わせることで、抗体結合ドメインＨ－３３０／Ｌ－４１、Ｈ－３３０／Ｌ－２２８、Ｈ－３３０Ｖ１．２／Ｌ－４１、Ｈ－３３０Ｖ１．２／Ｌ－２２８、Ｈ－３１１／Ｌ－４１、およびＨ－３１１／Ｌ－２２８を設計することができる（それぞれが本発明の１つの目的である）。ヒト化ＶＨドメインＨ－３３０、Ｈ－３３０Ｖ１．２、およびＨ－３１１、特にドメインＨ－３３０とＨ－３３０Ｖ１．２は、ｍ１８Ｂ３モノクローナル抗体に由来する任意のヒト化ＶＬドメインと組み合わせることもできる。特に、ヒト化ＶＬドメインは、配列番号７、８、９にそれぞれ示されている配列のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３；または配列番号１１、１２、９にそれぞれ示されている配列のＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、およびＬ－ＣＤＲ３を含む。これらの組み合わせは、βｉｇ－ｈ３タンパク質に、さらに特定するならβｉｇ－ｈ３タンパク質のβｉｇ－ｈ３タンパク質のＦＡＳ１の４番目のドメイン（配列番号１６または３０に示されているエピトープ）（ＡＡ残基５４９－５５８）に特異的に結合すると考えられる。本明細書に記載されている方法、特にＳＰＲ法、例えばバイオセンサーシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなど）を利用して上述のような優れた親和性、または非常に高い親和性での結合を確認し、ドメインＨ－３３０、Ｈ－３３０Ｖ１．２、またはＨ－３１１と、ｍ１８Ｂ３に由来するヒト化ドメインを含む候補の適格性を知ることができる。解離速度を同じ方法で調べることによりこれら候補の適格性を知ることができる。

ＥＬＩＳＡによって測定される親和性に関し、ヒト化バリアントはキメラ１８Ｂ３と比べて統計的有意差がない。これは、ヒト化プロセスがＥＬＩＳＡによって測定される親和性を変化させなかったことを示している。Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを利用すると、これらすべてのヒト化ｍＡｂはナノモル未満の範囲の親和性（ＫＤ）を持ち、驚くべきことにマウス１８Ｂ３およびキメラ１８Ｂ３よりも遅い解離速度を持つ。ヒト化バリアントＨ－３３０／Ｌ－２２８はヒト化ｍＡｂのうちで最高の親和性を示す。

したがっていくつかの側面では、本発明は、Ｈ－３３０／Ｌ－４１、Ｈ－３３０／Ｌ－２２８、Ｈ－３３０Ｖ１．２／Ｌ－４１、Ｈ－３３０Ｖ１．２／Ｌ－２２８、Ｈ－３１１／Ｌ－４１、またはＨ－３１１／Ｌ－２２８のいずれかを含むヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。これらの抗体またはその抗原結合断片はβｉｇ－ｈ３タンパク質のエピトープ（前記エピトープは、配列配列番号１６または３０（または上述のようにそれよりも長い配列）として示されている）に特異的に結合する。この結合は、ＳＰＲを利用して測定したとき、特に１ｎＭ以下、好ましくは０．７ｎＭ以下、より好ましくは０．６または０．５８ｎＭ以下の高親和性Ｋ_Ｄで起こる。この結合は、ＳＰＲを利用して測定したとき、特に４と１０Ｅ－０４秒^－１の間、好ましくは５と８Ｅ－０４秒^－１の間、より好ましくは５．５と７．５Ｅ－０４秒^－１の間に含まれる遅い解離速度Ｋ_ｄで起こることが好都合である。ＳＰＲはバイオセンサーシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなど）を用いて測定することができる。

Ｈ－３３０とＨ－３３０Ｖ１．２は、調べたすべてのＬ－バリアント（Ｌ－４１またはＬ－２２８のいずれか）との組み合わせに例示されているように、ＤＳＣによるとモノクローナル抗体に予想外に大きい熱安定性を提供し、そのＤＳＣは８０℃超であり、特に８１と８３、８３．２、または８３．５℃の間に含まれる。ＶＨドメインとＶＬドメインの他の組み合わせで実施例に示されている追加データは、相補的なＶＨドメインが何であれＨ－３３０がこの向上した熱安定性にとって重要であることを示している。変異Ｃ１０２Ｓを持つＨ－３３０Ｖ１．２の熱安定性は大きく８０℃超にとどまる。Ｈ－３３０とＨ－３３０Ｖ１．２は、調べたすべてのＬ－バリアント（Ｌ－４１またはＬ－２２８のいずれか）との組み合わせに例示されているように、モノクローナル抗体にＣＨＯ細胞の中での一過性発現において予想外に高い生産性も提供する。その生産性は２００μｇ／ｍｌ超であり、特に２３０と３００μｇ／ｍｌの間に含まれる。これにはＥＬＩＳＡとＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）による非常に優れた親和性が付随しており、ヒト化バリアントＨ－３３０／Ｌ－２２８で最高のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）親和性になる。モノクローナル抗体の中のＨ－３３０またはその変異バージョンＣ１０２Ｓの存在と結びついたこれらの特別な特性は、同じＶＬバリアントと組み合わせて用いられたＨ－３１１で得られた結果と比べると、Ｈ－３３０とＨ－３１１の間にはわずか６個のアミノ酸の違いしかないだけに驚くべきものである。

重鎖Ｈ－３３０は、そのＶ１バージョン（配列番号４）またはそのＣ１０２Ｓ Ｖ１．２変異バージョン（配列番号２８）が、異なる軽鎖（Ｌ－４１、Ｌ－２２８、Ｌ－３１５）と会合したとき、βｉｇ－ｈ３タンパク質のエピトープ（配列配列番号１６または３０のエピトープ）に結合する本明細書に開示のモノクローナル抗体の中で大きくて予想外の熱安定性を示す。重鎖の１０２位におけるシステインからセリンへの変異を持つバリアントは、非変異ｍＡｂバージョン（Ｈ－３３０Ｖ１）と似た保存された反応性と安定性の特性を示したため、創薬可能性の目的にとって貴重な候補である。

本明細書に開示されているＤＳＣと、ＣＨＯの中での一過性発現は、測定の方法の部分に記載されているようにして測定した。

特別な１つの側面では、本発明は、βｉｇ－ｈ３タンパク質、好ましくは配列配列番号１６または３０として示されているエピトープに、特に上記の結合親和性および／または解離速度（ＳＰＲを利用して測定したとき、特に１ｎＭ以下、好ましくは０．７ｎＭ以下、より好ましくは０．６または０．５８ｎＭ以下の高親和性Ｋ_Ｄ；ＳＰＲを利用して測定したとき、特に４と１０Ｅ－０４秒^－１の間、好ましくは５と８Ｅ－０４秒^－１の間、より好ましくは５．５と７．５Ｅ－０４秒^－１の間に含まれる遅い解離速度Ｋ_ｄ）で特異的に結合するとともに、
（ａ）－ 配列番号１として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ１；
－ 配列番号２として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ２；
－ 配列番号３または２７として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ３を含む（Ｈ－３３０バリアントまたはＨ－３３０Ｖ１．２のＣＤＲを含む）可変ドメインＶＨ；
（ｂ）１８Ｂ３モノクローナル抗体のヒト化バリアントである、すなわち配列番号１８として示されている配列を持つ１８Ｂ３ ＶＬドメインのヒト化バリアントである可変ドメインＶＬを含むヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。

一実施形態では、前記抗体は、配列番号４として示されている配列を持つＶＨドメインを含む。

このモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、βｉｇ－ｈ３タンパク質に、さらに特定するならβｉｇ－ｈ３タンパク質のＦＡＳ１の４番目のドメイン（配列番号１６または３０として示されているエピトープ）に特異的に結合する。この結合は、ＳＰＲを利用して測定したとき、１ｎＭ以下、好ましくは０．７ｎＭ以下、より好ましくは０．６または０．５８ｎＭ以下の高親和性Ｋ_Ｄと、４と１０Ｅ－０４秒^－１の間、好ましくは５と８Ｅ－０４秒^－１の間、より好ましくは５．５と７．５Ｅ－０４秒^－１の間に含まれる遅い解離速度Ｋ_ｄで起こる。ＳＰＲはバイオセンサーシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなど）を用いて測定することができる。

別の１つの特別な側面では、本発明は、βｉｇ－ｈ３タンパク質に特異的に結合するとともに、
（ａ）－ 配列番号１として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ１；
－ 配列番号２として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ２；
－ 配列番号３または２７として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ３を含む（Ｈ－３３０バリアントまたはＨ－３３０Ｖ１．２のＣＤＲを含む）可変ドメインＶＨ；
（ｂ）－ 配列番号７として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ１；
－ 配列番号８として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ２；
－ 配列番号９として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ３
を含む（Ｌ－４１バリアントのＣＤＲを含む）可変ドメインＶＬを含むヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。

一実施形態では、前記抗体は、配列番号４または２８として示されている配列を持つＶＨドメイン、および／または配列番号１０として示されている配列を持つＶＬドメインを含む。

このモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、
－ 約５．８Ｅ－１０Ｍ以下、特に約５Ｅ－１０と約５．８Ｅ－１０Ｍの間以下、特に約５．３５Ｅ－１０ＭのＫ_Ｄでβｉｇ－ｈ３タンパク質に結合する；および／または
－ 約６Ｅ－０４秒^－１以上、特に約６．２Ｅ－０４と約７Ｅ－０４秒^－１の間、特に約６．５９Ｅ－０４秒^－１のＫ_ｄでβｉｇ－ｈ３タンパク質に結合する；および／または
－ ＤＳＣ（Ｔｍ Ｆａｂ）が約７９℃以上、特に約７９と約８３、８３．２、または８３．５℃の間、典型的には約８１．３℃である安定性を持つ；および／または
－ ＣＨＯ細胞の中での一過性発現において測定値が約２７５μｇ／ｍｌという優れた生産性を持つ。

一実施形態では、このヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体（Ｈ－３３０／Ｌ－４１またはＨ－３３０Ｖ１．２／Ｌ－４１）またはその抗原結合断片は、
－ 配列番号４または２８として示されている配列を持つＶＨドメイン；
－ 配列番号１０として示されている配列を持つＶＬドメインを含む。

一実施形態では、前記ヒト化抗βｉｇ－ｈ３抗体は、
－ 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＨ（配列番号１４として示されている配列を持つＣＨなど）を含む重鎖；
－ 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＬ（配列番号１５として示されている配列を持つＣＬなど）を含む軽鎖を含む。

別の１つの特別な側面では、本発明は、βｉｇ－ｈ３タンパク質に特異的に結合するとともに、
（ａ）－ 配列番号１として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ１；
－ 配列番号２として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ２；
－ 配列番号３または２７として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ３を含む（Ｈ－３３０バリアントまたはＨ－３３０Ｖ１．２のＣＤＲを含む）可変ドメインＶＨ；
（ｂ）－ 配列番号１１として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ１；
－ 配列番号１２として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ２；
－ 配列番号９として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ３
を含む（Ｌ－２２８バリアントのＣＤＲを含む）可変ドメインＶＬを含むヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。

一実施形態では、前記抗体は、配列番号４または２８として示されている配列を持つＶＨドメイン、および／または配列番号１３として示されている配列を持つＶＬドメインを含む。

このモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、
－ 約５Ｅ－１０Ｍ以下、特に約４．５Ｅ－１０Ｍと約５Ｅ－１０Ｍの間、典型的には約４．７６Ｅ－１０ＭのＫ_Ｄでβｉｇ－ｈ３タンパク質に結合する；および／または
－ 約５Ｅ－０４秒^－１以上、特に約５．５Ｅ－０４と約６Ｅ－０４秒^－１の間、特に約５．８３Ｅ－０４秒^－１のＫ_ｄでβｉｇ－ｈ３タンパク質に結合する；および／または
－ ＤＳＣ（Ｔｍ Ｆａｂ）が約７８℃以上、特に約７８～８２℃、典型的には約８０．２℃である安定性を持つ；および／または
－ ＣＨＯ細胞の中での一過性発現において測定値が約２４９μｇ／ｍｌという優れた生産性を持つ。

一実施形態では、このヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体（Ｈ－３３０／Ｌ－２２８またはＨ－３３０Ｖ１．２／Ｌ－２２８）またはその抗原結合断片は、
－ 配列番号４または２８として示されている配列を持つＶＨドメイン；
－ 配列番号１３として示されている配列を持つＶＬドメインを含む。

一実施形態では、前記ヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体は、
－ 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＨ（配列番号１４として示されている配列を持つＣＨなど）を含む重鎖；
－ 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＬ（配列番号１５として示されている配列を持つＣＬなど）を含む軽鎖を含む。

別の１つの特別な側面では、本発明は、βｉｇ－ｈ３タンパク質に特異的に結合するとともに、
（ａ）－ 配列番号１として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ１；
－ 配列番号５として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ２；
－ 配列番号３として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ３を含む（Ｈ－３１１バリアントのＣＤＲを含む）可変ドメインＶＨ；
（ｂ）－ 配列番号７として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ１；
－ 配列番号８として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ２；
－ 配列番号９として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ３
を含む（Ｌ－４１バリアントのＣＤＲを含む）可変ドメインＶＬを含むヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。

一実施形態では、前記抗体は、配列番号６として示されている配列を持つＶＨドメイン、および／または配列番号１０として示されている配列を持つＶＬドメインを含む。

このモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、
－ 約５Ｅ－１０Ｍ以下、特に約４．５と約５Ｅ－１０Ｍの間、特に約４．８２Ｅ－１０ＭのＫ_Ｄでβｉｇ－ｈ３タンパク質に結合する；および／または
－ 約６．８Ｅ－０４秒^－１以上、特に約７Ｅ－０４と約７．５Ｅ－０４秒^－１の間、特に約７．２６Ｅ－０４秒^－１のＫ_ｄでβｉｇ－ｈ３タンパク質に結合する；および／または
－ ＤＳＣ（Ｔｍ Ｆａｂ）が約７５℃以上、特に約７５と約７９℃の間、典型的には約７７℃である安定性を持つ。

一実施形態では、このヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体（Ｈ－３１１／Ｌ－４１）またはその抗原結合断片は、
－ 配列番号６として示されている配列を持つＶＨドメイン；
－ 配列番号１０として示されている配列を持つＶＬドメインを含む。

一実施形態では、前記ヒト化抗βｉｇ－ｈ３抗体は、
－ 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＨ（配列番号１４として示されている配列を持つＣＨなど）を含む重鎖；
－ 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＬ（配列番号１５として示されている配列を持つＣＬなど）を含む軽鎖を含む。

別の１つの特別な側面では、本発明は、βｉｇ－ｈ３タンパク質に特異的に結合するとともに、
（ａ）－ 配列番号１として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ１；
－ 配列番号５として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ２；
－ 配列番号３として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ３を含む（Ｈ－３１１バリアントのＣＤＲを含む）可変ドメインＶＨ；
（ｂ）－ 配列番号１１として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ１；
－ 配列番号１２として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ２；
－ 配列番号９として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ３
を含む（Ｌ－２２８バリアントのＣＤＲを含む）可変ドメインＶＬを含むヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。

一実施形態では、前記抗体は、配列番号６として示されている配列を持つＶＨドメイン、および／または配列番号１３として示されている配列を持つＶＬドメインを含む。

このモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、
－ 約５Ｅ－１０Ｍ以下、特に約４．５と約５Ｅ－１０Ｍの間、特に約４．９Ｅ－１０ＭのＫ_Ｄでβｉｇ－ｈ３タンパク質に結合する；および／または
－ 約６．５Ｅ－０４秒^－１以上、特に約６．８Ｅ－０４と約７．３Ｅ－０４秒^－１の間、特に約７．０７Ｅ－０４秒^－１のＫ_ｄでβｉｇ－ｈ３タンパク質に結合する；および／または
－ ＤＳＣ（Ｔｍ Ｆａｂ）が約７３．５℃以上、特に約７３．５と約７７．５℃（ｏｆ ａｂｏｕｔ ７３．５ ａｎｄ ａｂｏｕｔ ７７．５℃）、典型的には約７５．５℃である安定性を持つ。

一実施形態では、このヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体（Ｈ－３１１／Ｌ－２２８）またはその抗原結合断片は、
－ 配列番号６として示されている配列を持つＶＨドメイン；
－ 配列番号１３として示されている配列を持つＶＬドメインを含む。

一実施形態では、前記ヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体は、
－ 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＨ（配列番号１４として示されている配列を持つＣＨなど）を含む重鎖；
－ 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＬ（配列番号１５として示されている配列を持つＣＬなど）を含む軽鎖を含む。

一実施形態では、本明細書に開示されているヒト化抗体は、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、好ましくは重鎖の定常ドメインヒト－配列番号１４の重ヒトＩｇＧ１ ｍ１，１７（ｔｈｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｏｒ Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｍ１，１７ ｏｆ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、および／または軽鎖、特にカッパの定常ドメイン、好ましくは軽鎖（カッパ）の定常ドメインヒト－配列番号１５の軽鎖ヒトＫｍ３を含む。

定義と特徴

抗体可変ドメインの中の残基は通常、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号付けされる。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、アメリカ合衆国保健福祉省、ＮＩＨ、アメリカ合衆国に示されている（今後は「Ｋａｂａｔら」）。この番号付けシステムを本明細書で使用する。Ｋａｂａｔの残基指定は必ずしも配列番号の配列の中のアミノ酸残基の線形な番号付けに対応しない。実際の線形アミノ酸配列は、フレームワークであれ相補性決定領域（ＣＤＲ）であれ、基本的な可変ドメイン構造の構造要素の短縮、またはその構造要素への挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けにおけるよりも少ないか追加のアミノ酸を含有する可能性がある。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体について、「標準的な」Ｋａｂａｔの番号付けがなされた配列を持つ抗体の配列の中の相同な残基のアラインメントによって判断することができる。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによると、残基３１～３５Ｂ（Ｈ－ＣＤＲ１）、残基５０～６５（Ｈ－ＣＤＲ２）、および残基９５～１０２（Ｈ－ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによると、残基２４～３４（Ｌ－ＣＤＲ１）、残基５０～５６（Ｌ－ＣＤＲ２）、および残基８９～９７（Ｌ－ＣＤＲ３）に位置する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｃｄｒｄｅｆ）。

抗体の「抗原結合断片」という用語は、本明細書では、インタクトな抗体の１つ以上の断片で、βｉｇ－ｈ３抗原に特異的に結合する能力を保持しているものを意味する。抗体の抗原結合機能はインタクトな抗体の断片が実行することができる。抗体の抗原結合断片という用語の範囲に包含される結合断片の例に含まれるのは、Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる１価断片）；Ｆａｂ’断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１ドメイン、およびヒンジ領域からなる１価断片）；Ｆ（ａｂ’）_２断片（ヒンジ領域の位置でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ’断片を含む２価断片）；抗体の単一のアームのＶＨドメインからなるＦｄ断片；単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）（これはＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる）；および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）である。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬとＶＨ）は別々の遺伝子によってコードされているが、それらは組み換え法を利用して人工ペプチドリンカーによって接合することができ、そのリンカーにより、ＶＬ領域とＶＨ領域のペアが１価分子を形成する単一のタンパク質鎖となることが可能になる（一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６と、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８ ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。「ｄｓＦｖ」はジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。２価と多価の抗体断片は、１価ｓｃＦｖの会合によって自発的に形成されること、またはペプチドリンカー（２価ｓｃ（Ｆｖ）２など）による１価ｓｃＦｖのカップリングによって生成させることが可能である。このような一本鎖抗体は、抗体の１つ以上の抗原結合部分または断片を含む。これら抗体断片は当業者に知られている従来の技術を利用して得られ、断片は、有用性に関してインタクトな抗体と同様にしてスクリーニングされる。ユニボディは別のタイプの抗体断片であり、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を欠く。ヒンジ領域が欠失する結果として、伝統的なＩｇＧ４抗体の実質的に半分のサイズであってＩｇＧ４抗体の２価結合領域ではなく１価結合領域を持つ分子になる。抗原結合断片は、単一ドメイン抗体、ＳＭＩＰ、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディに組み込むことができる（例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ， ２００５， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２３， ９， １１２６－１１３６参照）。「ディアボディ」「トリアボディ」または「テトラボディ」という用語は、多価抗原結合部位（２、３、または４）を持つ小さな抗体断片を意味し、これら断片は、同じペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上のこれら２つのドメインの間でペアを形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、これらドメインは別の鎖の相補的ドメインとペアを形成することを強制され、２つの抗原結合部位を創出する。抗原結合断片は、一対のタンデムＦｖ区画（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むことができ、それが相補的な軽鎖ポリペプチドと合わさり、一対の抗原結合領域を形成する（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）； １０５７－１０６２とアメリカ合衆国特許第５，６４１，８７０号）。

一実施形態では、本発明の抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、単一ドメイン抗体、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ユニボディ、ミニボディ、マキシボディ、小型モジュール式免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）としての抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、および本明細書に開示されているＶＬドメインまたはＶＨドメインを含むかそのドメインからなる断片で構成されるグループから選択される抗原結合断片である。

本発明のＦａｂは、βｉｇ－ｈ３と特異的に反応する抗体をプロテアーゼであるパパインで処理することによって取得できる。Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現系または真核生物発現系のためのベクターに挿入し、そのベクターを（必要に応じて）原核生物または真核生物の中に導入してＦａｂを発現させることによって生成させることもできる。

本発明のＦ（ａｂ’）２は、βｉｇ－ｈ３と特異的に反応する抗体をプロテアーゼであるペプシンで処理することによって取得できる。Ｆ（ａｂ’）２は、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合によって結合させることによって生成させることができる。

本発明のＦａｂ’は、βｉｇ－ｈ３と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオトレイトールで処理することによって得ることができる。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物のための発現ベクターまたは真核生物のための発現ベクターに挿入し、そのベクターを（必要に応じて）原核生物または真核生物の中に導入して発現させることによって生成させることができる。

本発明のｓｃＦｖは、ＶＨドメインとＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを以前に記載されているようにして取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構成し、そのＤＮＡを原核生物のための発現ベクターまたは真核生物のための発現ベクターの中に導入した後、その発現ベクターを（必要に応じて）原核生物または真核生物の中に導入してｓｃＦｖを発現させることによって生成させることができる。ヒト化ｓｃＦｖ断片を生成させるのにＣＤＲグラフティングと呼ばれる周知の技術を利用することができる。この技術は、ドナーｓｃＦｖ断片から相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、それらを三次元構造が知られているヒトｓｃＦｖ断片フレームワークにグラフトすることを含む（例えばＷＯ９８／４５３２２；ＷＯ ８７／０２６７１；アメリカ合衆国特許第５，８５９，２０５号；アメリカ合衆国特許第５，５８５，０８９号；アメリカ合衆国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許第０１７３４９４号参照）。

本発明のヒト化モノクローナル抗体は、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を以前に記載されているようにして取得し、（ｉ）ヒト抗体と同じ重鎖定常領域と（ｉｉ）ヒト抗体と同じ軽鎖定常領域をコードする遺伝子を持つ動物細胞のための発現ベクターにそれらを挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構成し、その発現ベクターを動物細胞の中に導入することによってそれら遺伝子を発現させることによって生成させることができる。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在するタイプ、または両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデム式）のいずれかが可能である。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、および動物細胞における抗体のＨ鎖とＬ鎖の発現レベルの間のバランスに関し、タンデム式のヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデム式ヒト化抗体発現ベクターの例に含まれるのは、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などである。従来の組み換えＤＮＡと遺伝子トランスフェクションの技術に基づいてヒト化抗体を生成させる方法は本分野で周知である（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ． ｅｔ ａｌ． １９８８；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ＭＳ． ｅｔ ａｌ． １９８５参照）。抗体は、本分野で知られている多彩な技術を利用してヒト化することができ、技術に含まれるのは、例えばＣＤＲ－グラフティング（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；アメリカ合衆国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたはリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ ＥＡ （１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ＧＭ ｅｔ ａｌ． （１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ ＭＡ． ｅｔ ａｌ． （１９９４））、および鎖シャッフリング（アメリカ合衆国特許第５，５６５，３３２号）である。このような抗体を調製するための一般的な組み換えＤＮＡ技術も知られている（欧州特許出願ＥＰ １２５０２３と国際特許出願ＷＯ ９６／０２５７６参照）。

本明細書では、記号Ｋ_Ｄは解離定数を意味することが想定されており、Ｋａに対するＫｄの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表わされる。抗体のＫ_Ｄ値は本分野でよく確立された方法を利用して求めることができる。抗体のＫ_Ｄを求める１つの方法は、測定の方法の部分に記載されている条件でＳＰＲを利用すること、特にバイオセンサーシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなど）を利用することによる。

記号「ｋ_ｄ」（秒^－１）は、本明細書では、ある特別なＡｂ－抗原相互作用の解離速度定数（［Ａｂ］］［抗原］／［Ａｂ－抗原複合体］）を意味する。前記値はｋ_ｏｆｆ値とも呼ばれる。

記号「ｋ_ａ」（Ｍ^－１×秒^－１）は、本明細書では、ある特別なＡｂ－抗原相互作用の会合速度定数を意味し、ｋ_ｄの逆数である。

記号「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）は、本明細書では、ある特別なＡｂ－抗原相互作用の解離平衡定数を意味し、ｋ_ｄをｋ_ａで割ることによって得られる。

記号「Ｋ_Ａ」（Ｍ^－１）は、本明細書では、ある特別なＡｂ－抗原相互作用の会合平衡定数を意味し、ｋ_ａをｋ_ｄで割ることによって得られる。

本明細書では、熱安定性は示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価される。これは測定の方法の部分に記載されているようにして測定される。

「ヒト化抗体」または「キメラ抗体」は、当業者が利用できて例えば本明細書に開示されている方法によって親マウス抗体から導出される抗体を意味する。「ヒト化抗体」または「キメラ抗体」、またはその抗原結合断片は、マウス抗体ｍ１８Ｂ３の６つのＣＤＲのセットでおそらくＣＤＲの中に変異を持つものを含むことが好ましかろう。

ヒト化抗体（キメラ抗体など）と抗原結合断片は、親マウス抗体ｍ１８Ｂ３の抗原結合特性を保持、または実質的に保持しており、本明細書に開示されているように、ヒト化は、マウスおよび／またはキメラ１８Ｂ３モノクローナル抗体に興味深くて予想外の機能性を与えることができる。

ＣＤＲ、またはそのうちのいくつかは、ＳＤＲアプローチ（超グラフティング）または他の有用な方法の後にマウスＣＤＲとは異なっている可能性がある。本明細書に記載されているヒト化により、本明細書に開示されているように、治療用の機能特性と組み合わされた興味深くて予想外の機能（特に親和性、解離速度、熱安定性（ＤＳＣ））を持つモノクローナル抗体とその抗原結合断片を提供することが可能になる。Ｈ－３３０とＨ－３１１は非常に魅力的であることが示され、Ｌ－４１とＬ－２１８も同様であった。当業者であれば、これらの機能性と機能特性のいくつかを実質的に変化させることなく、アミノ酸変化（例えば１、２、３、４、４、５、６、７、８、９、１０個までのアミノ酸）をこれらＶＨ領域とＶＬ領域に導入することができよう。このように変化したＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインも、これらＶＨドメインとＶＬドメインの定義に包含されると考えられる。

さまざまな抗体分子と断片は、一般に知られている免疫グロブリンのいずれかのクラスに由来することができ、クラスの非限定的な例に含まれるのは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭである。ＩｇＧサブクラスも本分野で周知であり、その非限定的な例に含まれるのは、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４である。ＩｇＧ１を用いることが好ましい。

「治療」または「療法」は、治療的処置と、予防的または防止的措置の両方を意味する。それは治療的処置であることが好ましい。

治療または療法を目的とした「哺乳類」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、その動物に含まれるのは、ヒト、家畜、および動物園、スポーツ、またはペットの動物（イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、など）である。哺乳類はヒトであることが好ましい。異なると示されている場合を除き、「対象」、「患者」などの用語には哺乳類が含まれ、その中にヒトが含まれる。

「がん」と「がん性」という用語は、哺乳類における異常な細胞増殖を典型的な特徴とする生理学的状態を意味または記述する。

「核酸」または「オリゴヌクレオチド」という用語、または文法的に同等な用語は、本明細書では、互いに共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は一本鎖または二本鎖であることが好ましく、一般にホスホジエステル結合を含有する。

抗体のアミノ酸配列「バリアント」（または変異体）は、適切なヌクレオチドの変更を抗体のＤＮＡに導入することによって、またはヌクレオチド合成によって調製される。しかしこのような修飾は、例えば本明細書に記載されているように非常に限定された範囲でだけ実施することができる。例えば修飾は上記の抗体の特徴（ＩｇＧアイソタイプと抗原結合など）を変化させないが、組み換え産生の収量、タンパク質の安定性を改善したり、精製を容易にしたりする可能性がある。

ある分子の「バリアント」は、天然分子の配列に実質的に似た配列である。ヌクレオチド配列については、バリアントに、遺伝暗号の縮重が理由で天然タンパク質の同じアミノ酸配列をコードする配列が含まれる。このような天然のアレルバリアントは、分子生物学の周知の技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とハイブリダイゼーション技術）を利用して同定することができる。バリアントのヌクレオチド配列には、合成由来のヌクレオチド配列（例えば部位指定突然変異誘発の利用によって生成させた、天然タンパク質をコードするものなど）のほか、アミノ酸置換を持つポリペプチドをコードするものも含まれる。一般に、本発明のヌクレオチド配列バリアントは、少なくとも一実施形態では、配列は、天然（内在性）ヌクレオチド配列と４０％、５０％、６０％、７０％まで、例えば７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％まで、一般に少なくとも８０％、例えば８１％～８４％、少なくとも８５％、例えば８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％一致することになろう。

「阻害する」という用語は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメータの減少を意味する。その非限定的な例に含めることができるのは、活性、応答、状態、または疾患の完全な喪失である。その中にやはり含めることができるのは、、例えば天然または対照のレベルと比較したときの活性、応答、状態、または疾患の１０％の低下である。したがって低下として、天然レベルまたは対照レベルと比べたときの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００％、またはこれら数値間の任意の量の低下が可能である。

組成物と医薬組成物

本発明の別の１つの目的は、本明細書に開示され提示されている少なくとも１つのＨｚモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む組成物または医薬組成物である。この組成物は、ビヒクルまたは希釈剤、特に抗体の想定される用途に適したビヒクルまたは希釈剤をさらに含むことができる。組成物が医薬組成物である場合には、使用されるのは、医薬として許容可能な基剤、希釈剤、または

医薬組成物は、（ｉ）本発明による少なくとも１つのヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加抗腫瘍薬（別の標的に向かう抗体、および／または化学療法薬（小分子など）など）を含むことができる。両方の活性成分が同じ組成物の中に存在することができる。あるいは少なくとも２つのこれら活性成分は例えば別々のバイアルまたは組成物に分けられる。１つの側面では、組成物は、がんの治療に、および／または免疫を変化させるのに用いる本明細書に記載の少なくとも２つの活性成分を含んでおり、ヒトを含む哺乳類に同時に、別々に、または逐次的に投与される。

追加活性成分として、特にドキソルビシン、ゲムシタビン、カンプトテシン、パクリタキセルが挙げられる。追加活性成分として別の抗体も可能である。その別の抗体は、別のがんマーカーまたは受容体、免疫コンピテント細胞の表面に発現する別の抗原、免疫チェックポイント、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択することができる。

これら組成物で使用できる医薬として許容可能な基剤または賦形剤の非限定的な例に含まれるのは、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（ヒト血清アルブミンなど）、バッファ物質（リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩など）、または電解質（硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂など）である。

本発明の医薬組成物は、経口、非経口で、吸入スプレーによって、局所、直腸、鼻腔、口腔、膣に、または埋め込まれたリザーバを通じて投与することができる。本明細書で利用されるは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内の注射または輸液の技術を含む。本発明の組成物の減菌注射可能形態として、水性または油性の懸濁液が可能である。これら懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤と懸濁剤を用い、本分野で知られている技術に従って製剤化することができる。減菌注射可能調製物として、非毒性で非経口投与可能な希釈剤または溶媒の中の注射可能な溶液または懸濁液（例えば１，３－ブタンジオールの中の溶液）も可能である。使用できる許容可能なビヒクルと溶媒には、水、リンガー溶液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。それに加え、減菌不揮発性油が溶媒または懸濁培地として通常使用される。この目的で、刺激の少ない任意の不揮発性油（合成モノグリセリドまたはジグリセリドが含まれる）を使用できる。脂肪酸（オレイン酸とそのグリセリド誘導体など）は注射液の調製に有用であり、医薬として許容可能な天然の油（オリーブ油またはひまし油など）、特にそのポリオキシエチル化バージョンも同様である。これらの油性溶液または懸濁液は長鎖アルコール希釈剤または分散剤（カルボキシメチルセルロース、または医薬として許容可能な剤型の製剤（エマルションと懸濁液が含まれる）で一般に使用される同様の分散剤など）も含有することができる。他の一般に使用される界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ、および医薬として許容可能な固体、液体、または他の剤型の製造に利用される他の乳化剤または生物学的利用能増強剤など）も製剤の目的で使用することができる。

本発明の医薬組成物は、経口投与可能な任意の剤型（その非限定な例に、カプセル、錠剤、水性の懸濁液または溶液が含まれる）で経口投与することができる。経口で使用する錠剤の場合には、一般に使用される基剤に含まれるのはラクトースとコーンスターチである。典型的には潤滑剤（ステアリン酸マグネシウムなど）も添加される。カプセルの形態で経口投与するのに有用な希釈剤には例えばラクトースが含まれる。経口での使用に水性懸濁液が必要とされるときには、活性成分は乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。望む場合には、ある甘味剤、香味剤、または着色剤も添加することができる。あるいは本発明の組成物は直腸投与のため座薬の形態で投与することができる。これらは、薬剤を、室温では固体だが直腸温度では液体であるため直腸内で融解して薬を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができる。このような材料に含まれるのは、カカオバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールである。本発明の組成物は、特に治療の標的が局所的適用によって容易にアクセスできる領域または臓器（目、皮膚、または下部腸管の疾患が含まれる）を含むときには局所投与することもできる。適切な局所製剤は、これらの領域または臓器のそれぞれのために容易に調製される。局所的に適用するため、組成物は、１つ以上の基剤の中に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切な軟膏の製剤にすることができる。本発明の化合物を局所投与するための基剤の非限定的な例に含まれるのは、鉱物油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水である。あるいは組成物は、医薬として許容可能な１つ以上の基剤の中に懸濁または溶解された活性成分を含有する適切なローションまたはクリームの製剤にすることができる。適切な基剤の非限定的な例に含まれるのは、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水である。下部腸管のための局所的適用は、直腸座薬製剤（上記参照）または適切な浣腸製剤で実現することができる。パッチも使用できる。本発明の組成物は鼻腔エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。このような組成物は医薬製剤の分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、生物学的利用能を促進するための吸収促進剤、フッ化炭素、および／または他の一般的な可溶剤または分散剤を使用して生理食塩水中の溶液として調製することができる。

例えば本発明の医薬組成物の中に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）いずれかの単回使用バイアルに入れて１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給することができる。前記生成物は、静脈内投与するため、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および注射用減菌水の中で製剤化することができる。ｐＨは６．５に調節することができる。

（例えば筋肉内、静脈内）注射のための本発明の医薬組成物は、医薬として許容可能な基剤、希釈剤、または賦形剤、例えば減菌緩衝化水（例えば筋肉内のため１ｍｌ）と、約１ｎｇ～約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ～約３０ｍｇ、またはより好ましくは約５ｍｇ～約２５ｍｇの本発明の抗体を含有するように調製することができよう。

ある実施形態では、抗体を宿主細胞の中に導入するのにリポソームおよび／またはナノ粒子を利用することを考慮する。リポソームおよび／またはナノ粒子の形成と利用は当業者に知られている。ナノカプセルは、一般に安定で再現可能なやり方で化合物を収容することができる。細胞内にポリマーが過剰になることに起因する副作用を回避するため、そのような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は一般に、生体内で分解可能なポリマーを用いて設計される。これらの条件に合致する生物分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子を本発明で利用することが考慮され、そのような粒子は作製が容易である。リポソームは、水性培地に分散されたリン脂質から形成されて多重層同心二層小胞（多重層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。ＭＬＶは一般に２５ｎｍ～４μｍの直径を持つ。ＭＬＶを超音波処理すると、２００～５００オングストロームの範囲の直径を持っていてコアの中に水溶液を含有する小さな単層小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および２価カチオンの存在に依存する。

利用のため、利用の方法（例えば治療的処置）、製造するための利用

不適切な場合を除き、本明細書に開示されているあらゆる特徴が本発明の異なる目的（「利用のため」、「利用の方法」、または「治療の」、「薬の製造（ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）のための利用」など）に適用される。一実施形態では、患者または対象は哺乳類、好ましくはヒトである。

本発明の別の１つの目的は、薬として利用するための、本明細書に開示されているヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、または医薬組成物である。

１つの側面では、本発明は、（ｉ）固形がんの治療に、または（２ｉ）免疫調節組成物として利用するためのそのようなヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、またはそれを含有する組成物に関する。特に、免疫調節効果は、がんの治療または治療中に助けになる可能性がある。免疫調節は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性の回復または活性化を含むことができる。

別の１つの側面では、本発明は、間質の硬さ低下に利用するためのそのようなヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、またはそれを含む組成物に関する。特に、この機能によって他の抗腫瘍薬（抗体、モノクローナル抗体など）が腫瘍に近づくことが可能になる。

したがって一般に本発明は、固形がんの治療に用いるためのそのようなヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、またはそれを含有する組成物に関する。

一実施形態では、固形腫瘍は、βｉｇ－ｈ３が間質で発現している腫瘍である。

好ましい実施形態では、固形腫瘍は、乳がん、子宮／子宮頸がん、食道がん、膵臓がん、大腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、卵巣がん、前立腺がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん胃がん、起源の腫瘍（すなわち線維肉腫と横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ））、中枢神経系と末梢神経系の腫瘍（すなわち星細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、膠芽腫が含まれる）甲状腺がんである可能性があるか、これらからなるリストから選択される。好ましくは、固形腫瘍膵臓がん食道扁平上皮癌、胃と肝臓の癌、大腸がん、または黒色腫。好ましい一実施形態では、固形腫瘍は膵臓がんである。膵臓がんは膵管腺癌であることがより好ましい。

本発明は固形がんを治療する方法にも関係しており、この方法は、それを必要とする患者に、十分な量のそのような抗体またはその抗原結合断片、またはそれを含む医薬組成物を投与することを含む。

本発明は免疫調節の方法にも関係しており、この方法は、それを必要とする患者に、十分な量のヒト化抗βｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、またはそのような医薬または免疫調節組成物を投与することを含む。前記抗体または断片は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性の回復または活性化を助けることができる。

本明細書では、「治療」と「治療する」という用語は、治癒的治療、または疾患を変化させる治療（その中には、がん（特に間質がβｉｇ－ｈ３を発現するがん）を持っているか、がんであると診断された患者の治療が含まれる）を意味し、臨床的再発の抑制を含む。治療はがんを持つ対象に関係することが可能であり、前記がんの治癒、発生の遅延、重症度の低下、または１つ以上の症状の改善を目的とするか、対象の生存を、そのような治療なしで予想される生存よりも延長させることを目的とする。

開示されている抗体またはその抗原結合断片は、治療剤として、対象（特にヒト）に、１日につき対象の体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ～約１００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約４０ｍｇ、約０．５ｍｇ～約３０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ、または約０．５ｍｇ～約２５ｍｇの範囲の量、または約０．５～約１０、５、３、または２ｍｇで、１日に１回以上投与し、望む治療効果を得ることができる。望ましい用量を、１日に３回、１日に２回、１日に１回、２日ごと、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達することができる。ある実施形態では、望ましい用量を、多数回投与（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはより多数回の投与）を利用して送達することができる。

投与は例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下が可能であり、例えば標的の部位の近位に投与することができる。上記の治療法と利用における投与計画は、最適な望む応答（例えば治療応答）を提供するように調節される。例えば単一ボーラスを投与することができ、いくつかに分割した用量を時間をかけて投与すること、または用量を治療状況の要請に応じて比例的に減量または増量することができる。いくつかの実施形態では、治療の有効性を治療中の例えばあらかじめ決めた時点にモニタする。いくつかの実施形態では、有効性は、疾患領域の可視化によって、または本明細書にさらに記載されている他の診断法によって（例えば本発明の標識した抗体またはその抗原結合断片を用いて例えば１回以上のＰＥＴ－ＣＴスキャンを実施することによって）モニタすることができる。望むのであれば、有効な１日用量の医薬組成物を、１日をかけて適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６つ、またはより多くの下位用量として、場合により単位剤型で投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明のモノクローナル抗体を長期（２４時間超など）にわたるゆっくりとした連続的輸液によって投与し、望まないあらゆる副作用を最少にする。本発明の抗体の有効な用量は、毎週、２週間ごと、または３週間ごとの投与期間を利用して投与することもできる。投与期間は、例えば８週間、１２週間、または臨床的進行が確立するまでに限定することができる。非限定的な例として、本発明による治療は、対象（特にヒト）に、本発明の抗体またはその抗原結合断片の１日用量として、１日に約０．１～１００ｍｇ／ｋｇの量（０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇ／ｋｇなど）で、治療を開始してから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０日後の少なくとも１つ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０週後の少なくとも１つ、またはこれらの任意の組み合わせに、単一用量を用いて、または２４、１２、８、６、４、または２時間ごとに分割用量を用いて、またはこれらの任意の組み合わせを用いて提供することができる。

組み合わせ

本発明により、本発明の抗体またはその抗原結合断片を例えばがんを治療するための少なくとも１つのさらなる治療剤と組み合わせるという治療の応用または治療の方法も提供される。このような投与は、同時、別々、逐次的であること；すなわちそれら２つの活性成分を用いた治療は、同じ時点（例えば同時に、または時期を合わせて）、または異なる時点（例えば連続して、または逐次的に）、またはその組み合わせであることが可能である。さらなる治療剤は、典型的には治療すべき障害に関係する。代表的な治療剤に含まれるのは、他の抗がん抗体、細胞毒性剤、化学療法剤、抗血管新生剤、抗がん免疫原、細胞周期制御／アポトーシス調節剤、ホルモン調節剤、および下に記載する他の薬剤である。

いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、化学療法剤または抗体、特に腫瘍抗原、受容体、またはリガンドを特異的に標的とするモノクローナル抗体（ＩＣＩなど）と組み合わせて使用される。「治療剤」という用語は、腫瘍の増殖を阻害するのに有効な化合物を意味する。

したがって本発明により、固形腫瘍の治療で同時または逐次的に用いるための、
ｉ．本明細書に開示されているヒト化抗体またはその抗原断片と；
ｉｉ．がんを治療するための本明細書に開示されている治療剤
の組み合わせが提供される。

特に本発明により、固形腫瘍の治療で同時または逐次的に用いるための、
ｉ．本明細書に開示されているヒト化抗体またはその抗原断片と；
ｉｉ．免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）
の組み合わせが提供される。

典型的には、チェックポイント阻止がん免疫療法剤は抗体である。いくつかの実施形態では、チェックポイント阻止がん免疫療法剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤｌ抗体、抗ＰＤＬｌ抗体、抗ＰＤＬ２抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＩＤＯｌ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、および抗Ｂ７Ｈ６抗体からなるグループから選択される抗体である。これらの抗体はモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であることが好ましい。抗体として特に、ＰＤ－ｌ阻止抗体（ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブ）、またはＣＴＬＡ－４阻止抗体（イピリムマブ）が可能である。この組み合わせは、ｃｈ１８Ｂ３とＩＣＩの組み合わせが記載されているＷＯ２０２００７９１６４の開示に基づく。この文献は参照によって本明細書に組み込まれている。

本発明の抗体またはその抗原結合断片を既存の化学療法と組み合わせて用いてβｉｇ－ｈ３タンパク質を標的にすると、腫瘍細胞の殺傷において単独の化学療法よりも有効であろう。非限定的な例に含まれるのは、シスプラチン、タキソール、エトポシド、ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、マイトマイシン、ダカルバジン、５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、およびダウノマイシンである。

本発明の抗体またはその抗原結合断片は、さらなる抗がん剤としての免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１、抗ＰＤ－Ｌ１、またはＣＴＬＡ４抗体など）と組み合わせて使用できる。

本発明の１つの方法では、βｉｇ－ｈ３結合抗体または断片は、第２の抗がん剤を投与する前に患者に投与される。

抗体の生成

本発明の抗体とその抗原結合断片は、本分野で知られている任意の技術（例えばその非限定的な例は、任意の化学、生物学、遺伝子、または酵素の技術である）を単独または組み合わせのいずれかで利用することによって生成する。典型的には、望む配列のアミノ酸配列がわかると、当業者はポリペプチド産生の標準的な技術によって前記抗体を容易に生成させることができる。例えば抗体は、周知の固相法、好ましくは（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスター・シティ、カリフォルニア州によって製造された）市販のペプチド合成装置を利用し、製造者の指示に従って合成することができる。あるいは本発明の抗体は本分野で周知の組み換えＤＮＡ技術によって合成することができる。例えば抗体は、それら抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、そのようなベクターを、それら望む抗体を発現することになる適切な真核宿主または原核宿主の中に導入した後にＤＮＡ発現産物として得ることができ、後でそこからそれら抗体を周知の技術を利用して単離することができる。

哺乳類細胞は、ヒトに適用するのに最適な形態のタンパク質をグリコシル化するその能力ゆえ、治療抗体を生成させるのに好ましい宿主である。細菌はタンパク質をグリコシル化することが非常に稀であり、他の似たタイプの一般的な宿主（酵母、糸状真菌、昆虫、および植物の細胞など）は、血流からの迅速な排除に関係するグリコシル化パターンを生じさせる。哺乳類細胞のうちでチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が最もよく用いられる。これらの細胞は、適切なグリコシル化パターンを与えることに加え、遺伝的に安定で非常に生産的なクローン細胞系の着実な生成を可能にする。これらの細胞は簡単なバイオリアクターの中で無血清培地を用いて高密度で培養できるため、安全で再現性のあるバイオプロセスの開発が可能になる。他の一般に使用される動物細胞に含まれるのは、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞、およびＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞である。

一実施形態では、本発明による抗体は、哺乳類細胞、好ましくは野生型哺乳類細胞、好ましくは齧歯類起源のもの、特にＣＨＯ細胞の中で生成されるか発現する。

修飾と変化を本発明の抗体の構造の中に生じさせることができるが、それでも似た特徴を持つ分子が得られる。例えば配列内のあるアミノ酸を、活性の顕著な喪失なしに他のアミノ酸で置換することができる。抗体の相互作用能力と性質がその抗体の生物学的機能活性を規定するため、あるアミノ酸配列の置換を抗体配列（または、もちろんその元になるＤＮＡコード配列）の中で実施しても似た特性を持つ抗体を得ることができる。このような変化を生じさせる際にはアミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することができる。抗体に相互作用的な生物学的機能を与える際のアミノ酸ハイドロパシー指数の重要性は本分野で一般に理解されている。あるアミノ酸を、似たハイドロパシー指数またはスコアを持つ他のアミノ酸で置換し、それでも似た生物活性を持つ抗体を得ることが可能であることが知られている。各アミノ酸には、その疎水性と電荷の特徴に基づくハイドロパシー指数が割り当てられている。

アミノ酸の相対的ハイドロパシーの特徴が、得られる抗体の二次構造を決定し、それが今度は抗体と他の分子（例えば酵素、基質、受容体、抗体、抗原など）の相互作用を規定すると考えられている。本分野では、１つのアミノ酸を似たハイドロパシー指数を持つ別のアミノ酸で置換し、それでも生物学的に機能が同等なポリペプチドが得られることが知られている。このような変化において、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、＋０．５以内であるアミノ酸の置換が特により一層好ましい。

似たアミノ酸の置換をハイドロパシーに基づいて実施することもできる。それは特に、生物学的機能が同等なペプチドまたはポリペプチドがそうすることによって創出されて、免疫に関する実施形態での利用が想定される場合である。参照によって本明細書に組み込まれている、または当業者が参照できるアメリカ合衆国特許第４，５５４，１０１号は、隣接したアミノ酸の親水性によって支配されるポリペプチドの局所的平均親水性の最大値が、そのポリペプチドの免疫原性および抗原性（すなわちそのポリペプチドの生物学的特性）と相関すると述べている。

アメリカ合衆国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（－０．５±１）；トレオニン（－０．４）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；トリプトファン（－３．４）。１つのアミノ酸を似た親水性値を持つ別のアミノ酸で置換しても、生物学的に同等な、特に免疫学的に同等なポリペプチドを得ることができると理解されている。そのような変化では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸の置換が特により一層好ましい。

上に概略を示したように、アミノ酸置換はしたがって一般に、アミノ酸側鎖置換の相対的類似性（例えばその疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づく。アミノ酸置換は異なる選択または選び方をすることができる。可能な置換は、ＷＯ９９／５１６４２、ＷＯ２００７０２４２４９、およびＷＯ２００７１０６７０７に記載されている。

核酸とベクター

本明細書に開示され、提供されている単離されたヌクレオチド配列も本発明の目的である。したがって本発明は、ヌクレオチド配列の配列番号２１、２２、２３、および２４、さらに特定するなら、分離されるか互いに連結された２つのヌクレオチド配列の組み合わせまたはセット：配列番号２１と２３、２１と２４、２２と２３、２２と２４からなるグループから選択される単離されたヌクレオチド配列にも関する。Ｈ－３３０Ｖ１．２をコードするヌクレオチド配列は配列番号２９に示されている通りであり、変異バージョンＣ１０２Ｓを望むときには配列番号２１の代わりに用いてモノクローナル抗体を生成させることができる。

上述のように、抗体を生成させる方法は当業者に知られている。哺乳類細胞に、好ましくは齧歯類細胞（ＣＨＯ細胞など）に、好ましくは野生型細胞に、１つまたはいくつかの発現ベクターをトランスフェクトする。細胞には、軽鎖のための発現ベクターと重鎖のための発現ベクターを同時にトランスフェクトすることが好ましい。細胞へのトランスフェクションも当業者に知られている。実施できるトランスフェクションの非限定的な例として、当業者に周知の標準的なトランスフェクション手続きであるリン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ－デキストランを媒介とするトランスフェクション、電気穿孔、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション（ＡＭＡＸＡ Ｇｍｂｈ、ドイツ国）、リポソームを通じたトランスフェクション（例えばｄｒｅａｍｆｅｃｔ（登録商標）、ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、またはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）技術を利用）、または微量注入などが挙げられる。

発現ベクターは知られている。使用できるベクターの非限定的な例として、ｐｃＤＮＡ３．３、ｐＯｐｔｉＶＥＣ、ｐＦＵＳＥ、ｐＭＣＭＶＨＥ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐｃＤＶ１、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＥＣが挙げられる。単一の発現ベクター、または抗体の異なる部分を発現するいくつかの発現ベクターを用いることができる。

本発明は、本発明のＨｚ抗体の重鎖をコードする発現ベクター、本発明のＨｚ抗体の軽鎖をコードする発現ベクター、またはそのようなＨｚ抗体の重鎖と軽鎖をコードする発現ベクターにも関する。

本発明の別の１つの目的は、本発明の１つのベクターまたは一群のベクターを含有する宿主細胞である。宿主細胞として、哺乳類細胞、好ましくは齧歯類細胞、より好ましくはＣＨＯ細胞が可能である。宿主細胞が、野生型哺乳類細胞、好ましくは野生型齧歯類細胞、最も好ましくは野生型ＣＨＯ細胞であることが、それ以上に好ましい。

当業者は、そのような１つまたは複数のベクターと細胞（ＣＨＯ細胞など）を用いて本発明による抗体を生成させる方法を十分に習得している。

本明細書で利用される測定の方法（完全にするため実施例も参照されたい）

親和性と解離速度

ＤＳＣ

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、タンパク質または他の生体分子の安定性をその本来の形態で直接特徴づけるのに利用される分析技術である。ＤＳＣは、一定速度で加熱するとき分子の熱変性に伴う熱変化を測定することによってそれを実現する。

本明細書で利用したＤＳＣのプロトコル：
・－ ＭｉｃｒｏｃａｌＴＭ ＶＰ－キャピラリＤＳＣシステムを用いて示差走査熱量測定実験を実施した。
・－ サンプルを－２０℃で保管した。解凍後、全サンプルを遠心分離し（２０．０００ｇ、５分間、４℃）、必要なときにはＰＢＳの中で希釈して１ｍｇ／ｍＬの濃度にした。ＤＳＣ分析の前に、サンプルのタンパク質含量をＩｇＧ分析プログラム付きのＮａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計（ｓ／ｎ：４８４７）で定量した。
・－ 前平衡時間は３分間であり、それに続くサーモグラムは、６０℃／時間の走査速度、２５秒間のフィルタリング期間、および中程度のフィードバックを用いて２０と１１０℃の間で獲得した。サンプル分析の前に、５回のバッファ／バッファ走査を測定して装置を安定させ、１回のバッファ／バッファ走査を各タンパク質／バッファ走査の間に実施した。
・－ データを、転移前と転移後の調節をしたベースラインを差し引いて非２状態アンフォールディングモデルにフィットさせた。熱測定エンタルピー（ΔＨ）は転移のピーク下の面積として求めるのに対し、ファントホッフエンタルピー（ΔＨｖ）は使用したモデルから求める。赤色の実線は測定データを表わし、黒色の実線は、使用したモデルに関する最良のフィットを表わし、灰色の線は、タンパク質アンフォールディング全体への単一のアンフォールディングユニットからの寄与を表わす。

・ＤＳＣの一般的考慮事項：
・－ Ｔｍすなわち変性／融解温度は、折り畳まれていない種と折り畳まれた種の濃度が等しくてアンフォールディング転移の中点となる点である。Ｔｍは、１つのパラメータとして熱変性に対するタンパク質の感受性を表わしているため、タンパク質の安定性と関係する。Ｔｍが高いほどタンパク質はより安定である。
・－ Ｔｏｎｓｅｔは、アンフォールディング転移が始まる温度である。このパラメータの値は通常はＴｍよりも５～１０℃低い。これはタンパク質の安定性を表わす１つのパラメータでもあるが、熱変性の耐性と関係がある。
・－ Ｔ１／２は、ピーク高の半分の位置での転移の幅である。これは転移の幅を表わしており、典型値は１と１５℃の間である。このパラメータはタンパク質の充填のコンパクトさと相関しており、より広い転移はコンパクトさが劣るタンパク質に対応する。
・－ ΔＨはアンフォールディングの熱測定エンタルピーであり、タンパク質の分子内相互作用の破壊（すなわちドメイン内とドメイン間の相互作用の破壊）を反映する。このプロセスは吸熱性であるため正のエンタルピー値を与える。
・－ 全面積はアンフォールディングの全エンタルピー（サーモグラム下の全面積）であり、熱力学的安定性を反映する。
・－ モノクローナル抗体は典型的には複雑な多ドメインのサーモグラムを示す。最大で最も目立つドメインのピークは抗体のＦａｂである。ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインも一般に見られる。異なるドメインの相対位置とＴＭは具体的なモノクローナル抗体に依存するため、サブクラスと操作に依存して変化する可能性がある。

ＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクション

ヒト化「Ｖ１バージョン」の抗体をＣＨＯ細胞の中で生成させた。ＣＨＯ ＤＧ４４細胞をオービタル・シェイカー上の３７℃かつ５％ＣＯ２にした換気式エルレンマイヤーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中で維持した。トランスフェクションの前日、（ＭＯ．ＣＥＬ．１２０に従って）細胞を規定の密度で継代させた。トランスフェクションの当日（０日目）、細胞をトランスフェクション試薬およびプラスミドＤＮＡと混合してパイロットロットを作製した（３０ｍｌ）。

非限定的な実施例を用い、図面を参照しながら本発明をこれから記述する。

実施例１：エピトープのマッピング

エピトープマッピングの研究から、この抗体がβｉｇ－ｈ３タンパク質のβｉｇ－ｈ３タンパク質のＦＡＳ１の４番目のドメイン（直線状エピトープＡＬＰＰＲＥＲＳＲＬ）（ＡＡ残基５４９－５５８）を標的とすることが示された。図１参照。エピトープをさらにＬＰＰＲＥＲＳＲに制限することが可能であった。

実施例２：

概念実証（ＰｏＣ）段階が目的とするのは、βｉｇ－ｈ３タンパク質に向かう１８Ｂ３ ｍＡｂ（Ｂａｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１４ Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１４， ２１２， ３０６-３１５）が、βｉｇ－ｈ３タンパク質を効率的かつ特異的に枯渇させ、したがって（ｉ）ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の細胞傷害活性の増加と、（ｉｉ）間質の硬さの低下をもたらすことによりがん治療において鍵となる役割を果たすことができ、そのことで免疫系が腫瘍に近づく可能性が回復し、最終的にマウスにおける有意な腫瘍縮小と生存率につながることの実証である。

その目的のため、（関係するマウスモデルで）多数の実験をインビトロと生体内の両方で実施した。ＰＤＡＣに対処するとともに潜在的に他のがんに対処する際に抗βｉｇ－ｈ３治療ｍＡｂが単独または組み合わせで有効である可能性がある証拠を示す実験の大半を生体内で実施したことに注意すべきである。

簡単に説明すると、このＰｏＣ段階の結論は以下の通りである：

１．ＰＤＡＣモデルにおいて１８Ｂ３ ｍＡｂによってβｉｇ－ｈ３タンパク質を標的として枯渇させることで以下のことが可能になる：
ａ．腫瘍の増殖を制限すること、
ｂ．ＣＤ８^＋ Ｔリンパ球の細胞傷害活性を回復させること、
ｃ．間質の硬さを低下させること、

これは、それを目的とする科学チームによって特別に開発されたインビトロと生体内両方のアッセイで実証された。

２．膵臓腫瘍が発達中の２つの異なるマウス株を用いて実施した実験から、１８Ｂ３を週に２回、３週間にわたって皮下注射して治療した集団に有意な腫瘍縮小と生存率の上昇があることが示された。

３．より高用量の１８Ｂ３で実施したいくつかの実験から、ｍＡｂの濃度を大きくしていくと腫瘍増殖がさらに少なくなってマウスの生存率が増加することが示された。

４．マウスのＨＳＧ卵巣がんと膀胱がんのそれぞれについて、１８Ｂ３ ｍＡｂ治療は腫瘍増殖を有意に減少させることを実証した。抗ＰＤ１耐性膀胱がんでは、１８Ｂ３ ｍＡｂは抗ＰＤ１に対する潜在的な補完物または代替物であることがわかる。

データのこの包括的セットの全体的結論は、βｉｇ－ｈ３タンパク質を枯渇させるｍＡｂを治療に用いるという考え方が確認されるというものである。

実施例３：１８Ｂ３マウスｍＡｂのキメラ化とヒト化

１．方法

このプロジェクトを以下のように４段階で実施した：
・段階１：マウス１８Ｂ３ ｍＡｂのシークエンシング
・段階２：マウス１８Ｂ３ ｍＡｂのキメラ化
・段階３：ＣＤＲグラフティングによるヒト化バリアントの設計（抗体作り変え（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ））
・段階４：ヒト化バリアントの作製と分析試験

段階１：マウス１８Ｂ３ ｍＡｂのシークエンシング

マウス１８Ｂ３（アイソタイプＩｇＧ１／ｋ）のＶＨドメインとＶＬドメインの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をハイブリドーマ細胞からｃＤＮＡシークエンシング法を利用して実施した。

その目的で、ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から抽出した。対応するＤＮＡ鎖をハイファイＲＴ－ＰＣＲによって合成した後に第２の鎖を合成し、二本鎖ｃＤＮＡを得た。次いでｃＤＮＡをシークエンシングし、タンパク質配列に翻訳した。
ＶＨ配列：配列番号１７
ＶＬ配列：配列番号１８

段階２：マウス１８Ｂ３ ｍＡｂのキメラ化

キメラ化は、マウス１８Ｂ３ ｍＡｂの定常ドメインをヒト配列によって置き換えることにある。重鎖の可変ドメイン（ＶＨ配列番号１９）と軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ配列番号２０）をコードする配列を哺乳類細胞の中での発現に関して最適化し、合成した。その後、対応する合成遺伝子を、ＩｇＧ１重鎖（配列番号２５）とカッパ軽鎖（配列番号２６）のヒト定常領域を含有するベクター系にクローニングした。ベクターは、シークエンシングによって確認されると、低エンドトキシンプラスミドＤＮＡを調製するために増幅され、それがシークエンシングによってさらに検証される。

次いでキメラｍＡｂをＣＨＯ哺乳類細胞の中でプラスミドの一過性発現によって生成させた後、精製した：ＣＨＯ ＤＧ４４細胞をオービタル・シェイカー上の３７℃かつ５％ＣＯ２にした換気式エルレンマイヤーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中で維持した。トランスフェクションの前日、細胞を規定された密度で継代した。トランスフェクションの当日（０日目）、１８Ｂ３キメラ抗体の軽鎖と重鎖をコードするＤＮＡプラスミドを細胞懸濁液に添加してトランスフェクション試薬と混合し、パイロットロットを作製した。

上清をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによって精製した。ＰＢＳの中での透析と無菌濾過（０．２２μｍ）の後、分光光度計を２８０ｎｍで読むことによって全タンパク質の濃度を求めた。精製したキメラｍＡｂはその後－２０℃以下の温度で保管した。

キメラｍＡｂの完全さをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって調べた。リガンドに対するキメラの親和性をＥＬＩＳＡによって親マウス１８Ｂ３ ｍＡｂと比較した。

・ＥＬＩＳＡのため：

抗原（組み換えヒトβＩＧ－Ｈ３：ｒｈβＩＧ－Ｈ３、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４０９－ＢＧ、ロットＮＤＭ０６１９１１Ａ）を４℃で一晩、１μｇ／ｍｌで被覆した、

抗原を除去し、ＰＢＳ－ミルクを２．５％で用いて非特異的部位を室温で１時間ブロックした

調べるｍＡｂ（抗ｈβＩＧ－ｈ３ １８Ｂ３親（マウス）またはキメラ）を１０μｇ／ｍｌから添加した後、７つのウエル上で１０倍に希釈し、室温で２時間インキュベートした、

プレートを取り出して洗浄した後、二次抗体を添加し（マウス１８Ｂ３（親）に関するＨＲＰで標識した抗マウスＩｇＧと、キメラ１８Ｂ３に関するＨＲＰで標識した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的））、室温で２時間インキュベートした、

無色の基質（ＴＭＢ：３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を添加するとＨＲＰの作用で青色になった。分光測色シグナルは、抗原に結合したｍＡｂの量に比例する。

硫酸を添加することによって反応を停止させるとＴＭＢが黄色になる。ｍＡｂの量は、分光測色法（光学密度）によって４５０ｎｍで評価した。

キメラ化は成功し、親マウス抗体と比べると非常によく似た生物物理学的特徴になった。

段階３：ＣＤＲグラフティングによるヒト化１８Ｂ３バリアントの設計（抗体作り変え）

この段階の目的は、ヒトにおけるｍＡｂの免疫原性を低下させるとともに半減期を延ばすため、さらにヒト化したキメラ１８Ｂ３のいくつかのバリアントを得ることである。ヒト度の％は８５％超であるべきだと考えられる。

ヒト化はＣＤＲグラフティング技術を利用して実施した。

ヒト化戦略は、技術の組み合わせ、すなわち：
・一次配列の分析とアラインメント。
・３Ｄモデル化、
・最良のヒト生殖細胞系列の選択
に基づく。

実際、構造（３Ｄ）モデルと純粋な配列分析の組み合わせにより、潜在的なＣＤＲ領域の中の実際のパラトープ対面残基と非パラトープ残基を識別することが可能になった。それに加え、構造モデルにより、使用した選択された生殖細胞系列骨格に照らして復帰突然変異に関する選択を推進することができ、より速いヒト化プロセスが可能になる。

Ｋａｂａｔ番号付けシステムを残基の同定に利用したことに注意されたい。

・最初の工程は、配列がマウス１８Ｂ３ ｍＡｂにできるだけ近いヒトＶＨとＶＬの生殖細胞系列の選択である。
・抗ＨｕβＩＧ－Ｈ３ １８Ｂ３マウスＶＨのＣＤＲグラフトバージョンを設計するため、３つのヒト生殖細胞系列（ＩＧＨＶ３－１１＊０１、ＩＧＨＶ３－３０＊０１、およびＩＧＨＶ１－６９＊０８）を選択した（表２参照）。ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ３－１１＊０１を選択したのは、Ｖ遺伝子全体でｍＡｂ １８Ｂ３－ＶＨと配列がよく一致するからである；７６．５％（合計９８個のうちで７５個の残基が一致）。ＩＧＨＶ３－３０＊０１とＩＧＨＶ１－６９＊０８は、配列の一致がより少ない（それぞれ７２．４％と５５％）という事実にもかかわらず選択された。それは、これらがヒト抗体生成のために広く使用されている生殖細胞系列配列であり（ＩＭＧＴ／ＧｅｎｅＦｒｅｑｕｅｎｃｙデータベースによる）、他の興味深い特徴を持っており、特にＩＧＨＶ１－６９＊０８に関しては異なる分子環境でＣＤＲのグラフティングの可能性を提供するからである。Ｈ－ＣＤＲ３とフレームワーク４のＮ末端部については、ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＪ６＊０１（Ｊ－ＧＥＮＥ）が最も近い候補として選択される
・抗ＨｕβＩＧ－Ｈ３ １８Ｂ３マウスＶＬκのＣＤＲグラフトバージョンを設計するのに３つのヒト生殖細胞系列（ＩＧＫＶ４－１＊０１、ＩＧＫＶ２－２８＊０１、およびＩＧＫＶ３－１５＊０１）が最良の選択に見えた。というのもヒトフレームワークアクセプタ領域は、全３つのヒト生殖細胞系列についてのパーセント配列一致が、ＩＧＫＶ４－１＊０１については８２．２％、ＩＧＫＶ２－２８＊０１については６７．３％、ＩＧＫＶ３－１５＊０１については６４．４％だからである。Ｌ－ＣＤＲ３とフレームワーク４のＮ末端部については、ヒト生殖細胞系列ＩＧＫＪ２＊０１（Ｊ－ＧＥＮＥ）が最も近い候補として選択される。

・第２の工程は、配列内にいかなる変異も導入することなく、１８Ｂ３マウスｍＡｂのＣＤＲを選択されたＶＨとＶＬのヒト生殖細胞系列にグラフトすることである：これをヒト化バリアントのＶ０バージョンと呼ぶ。

・第３の工程は、得られた配列を最適化し、（ｉ）ヒト化バリアントの機能性を維持し、（ｉｉ）可能ならヒト度の％を増大させることである。するとヒト化バリアントのバージョンＶ１～Ｖ３になる。最適化は以下のようにして実施した：
・選択されたヒト生殖細胞系列可変領域のフレームワーク領域（Ｆｒ）内のいくつかのアミノ酸残基を逆転させ（復帰突然変異）、対応するマウスアミノ酸残基にした。免疫グロブリン可変領域の構造に関して集めた情報と、ｍＡｂ １８Ｂ３（ＶＨとＶＬ）の分子モデルのガイダンスに基づき、Ｆｒ内のこれら数個の残基は、ＣＤＲの立体構造の維持に潜在的に鍵となる役割を持つこと、または重鎖と軽鎖の可変領域の間のインターフェイスにおいてある役割を果たしていることが特定された。
・また、ＶＬとＶＨは、共有結合を形成することなしに相互作用する２つのドメインである。これら２つのドメイン間の相互作用は水素と静電結合を通じて維持される。この相互作用に関与する残基も維持されねばならず、さもないとパラトープが変化して抗体の親和性が変化する可能性がある。したがってそれらはヒト化バージョンＶ１とＶ１．２変異バージョンＣ１０２Ｓにおいて維持された。

下記の表２に、得られたヒト度の％の結果がまとめられている：

段階４：ヒト化バリアントの作製と試験

この段階の目的は、選択された３つのＶＨと選択された３つのＶＬを組み合わせて選択されたヒト化バリアントを作製することであり、したがって９つの異なるバリアントになる。

作製と精製は、必要に応じてＶＨとＶＬのヌクレオチド配列配列番号２１～２４を使用し、キメラについて記載されているのと正確に同じやり方で実施した。

作製された９つのヒト化バリアントの分析試験をいくつかの方法を利用して実施した：
・配列アラインメントと生殖細胞系列の選択によって実現したヒト化の％
・生産性は哺乳類細胞における一過性発現のレベルによって評価した。
・抗体の親和性を上記のようにしてＥＬＩＳＡによって評価した（段階２のキメラ化）。
・示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価した熱安定性：上記の測定の方法に記載されているようにＭｉｃｒｏｃａｌＴＭ ＶＰ－キャピラリＤＳＣシステムを用いて測定した。純度（凝集）は、高サイズ排除クロマトグラフィ（ＨＰ－ＳＥＣ）によってチェックした：
・以下の構成要素、すなわちＣＢＭ－２０Ａシステム制御装置、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａフォトダイオードアレイ検出器；カラムの炉ＣＴＯ－２０Ａ；自動サンプリング装置ＳＩＬ－ＡＣ；ポンプＬＣ－２０ＡＤ、および脱ガスユニットＤＧＵ－２０Ａ５を備えるＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ。
・ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＣｏｌｕｍｎ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ＧＬカラムを使用した。カラムは、３０℃に設定したカラムの炉を用い、ＰＢＳ１×の中で０．２５ｍＬ／分にて以前に平衡させた。
・全サンプルを遠心分離し（２０．０００×ｇ、５分間、４℃）、そのタンパク質含量をＩｇＧ分析プログラムを備えるＮａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ－１０００分光光度計によって定量した後、ＳＥＣ分析を実施した。必要なときにはサンプルを注入する直前にサンプルをＰＢＳの中で１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。
・アイソクラティックプログラムを、約１５μｇの各サンプルが１８分間にわたって０．２５ｍＬ／分で注入されるように設定した。ＳＥＣ分析の後、２８０ｎｍのクロマトグラムを生データから抽出し、ピーク積分によって分析した。
・ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓの分子量ＳＥＣ較正キットからの一連のタンパク質を用い、サンプルを分析している間に用いたのと同じ条件とバッファでカラムを較正した。使用したタンパク質は、アプロチニン（６．５００Ｄａ）、リボヌクレアーゼＡ（１３．７００Ｄａ）、炭酸脱水酵素（２９．０００Ｄａ）、オボアルブミン（４４．０００Ｄａ）、コンアルブミン（７５．０００Ｄａ）、およびアルドラーゼ（１５８．０００）であった。Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎを用いてカラムの排除体積を求めた。カラムの較正は、ゲル濾過較正キットの指示（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って実施した。

前記９つのバリアントの生成と分析試験は生成させるは以下のことを示した：
・全バリアントが優れた生産性を持ち、特に重鎖＃３３０と＃３１１を持つバリアント（より少ない程度）；重鎖＃１６９を持つバリアントは、キメラ抗体の生産性未満である
・ＥＬＩＳＡアッセイにおけるバリアントの親和性は、キメラ（と親、ＥＬＩＳＡにおいて）と比べると似た結合親和性を示したが；重鎖＃１６９を用いたバリアントはここでも好ましさが劣るように見える。
・ＨＰ－ＳＥＣでは、全バリアントが非常に高純度を示し、潜在的な凝集体は２～３％未満であった
・ＤＳＣでは、全バリアントのＴｍが７０℃超であり、より安定なバリアントは、重鎖＃３３０を用いたバリアントである（キメラ抗体よりも高くて予想外のレベルのＴｍ）。

・生成した前記４つのヒト化バリアントのヒトβＩｇ－ｈ３に対する反応性は比較的似ていた。標的に対する反応性の大きな損失や、生物物理学的特性に関する劣化した挙動は観察されなかった：
・最も近い生殖細胞系列遺伝子Ｈ３１１－Ｖ１を用いたバリアントはキメラｍＡｂと似た反応性と安定性の特性を示した。
・Ｈ３３０－Ｖ１を用いたバリアント（特にバリアントＨ３３０－Ｖ１／Ｌ４１－Ｖ１とＨ３３０－Ｖ１／Ｌ２２８－Ｖ１）は予想外に高いＦａｂ Ｔｍを示す（凝集が少ない傾向と関係している可能性がある）とともに、キメラｍＡｂと似た反応特性を示した。
・データセット全体を分析することにより、Ｈ－３１１またはＨ－３３０を含む重鎖は、標的への結合に関して主要な役割を持つように見えたのに対し、軽鎖は結合に関して主要な役割を果たしているように見えない；そのためＨ－３１１またはＨ－３３０は、異なるＶＬドメインと組み合わせるためのよい選択になる。
・Ｖ１候補Ｈ－３１１／Ｌ－４１（ＶＨとＶＬの両方にとって最も近い生殖細胞系列の遺伝子と、その一般的な特性を利用するため）とＨ－３３０／Ｌ－２２８が好ましい。
・Ｈ３３０－Ｖ１．２／Ｌ４１－Ｖ１とＨ３３０－Ｖ１．２／Ｌ２２８－Ｖ１のＤＳＣは相変わらず８０℃超であり、安定性特性は（Ｈ－３３０Ｖ１を持つ）非変異バージョンと似ている。

Ｖ１候補で得られたヒト度の％は非常に優れている。

フレームワークをわずかに改変し、ＣＤＲの立体構造（「向き」）に関与することが知られているＡＡ残基を維持しつつヒト度を増加させた

ＣＤＲでは、２つの変異をＶＨ３３０とＶＨ３１１のＣＤＲ＃２の５７位と６０位に導入した。３Ｄモデリングから、これらＡＡがパラトープに関与せず、ｍＡｂの構造の中に「隠れている」ことが示された。

選択された全６つのバリアントが、非常に大きい値である明細書の上に示した８９～９７％の範囲のヒト度の％を示しており、ヒトで免疫原性のリスクを今後有意に減らす。

実施例４：ＥＬＩＳＡ

分析法は直接ＥＬＩＳＡ試験に基づく。

抗原（組み換えヒトβｉｇ－ｈ３タンパク質）で９６ウエルのプレートの表面を被覆する。その後、調べるｍＡｂを添加する

次いでセイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素で標識した二次抗ヒトｍＡｂを添加する。

無色の基質（ＴＭＢ：３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を添加するとＨＲＰの作用で青色になる。比色分析シグナルは、抗原に結合したｍＡｂの量に比例する。

硫酸とＴＭＢを添加することによって反応を停止させると黄色になる

ｍＡｂの量を分光測色法（光学密度）によって４５０ｎｍで評価する。

（参照ｍＡｂと見なす）キメラ１８Ｂ３と前記４つのヒト化リードバリアントについて、得られた結果が図２にまとめられている。統計分析（一元配置分散分析）。

得られた結果は、ヒト化バリアントＨ－３１１／Ｌ－２２８が標的に対してキメラバリアントと比べて小さい親和性を示すことを示していた。他の３つのヒト化バリアントはキメラと比べて統計的な有意差がなく、ヒト化プロセスがＥＬＩＳＡによって測定される親和性を変化させなかったことを示している。前記３つのバリアントはＥＣ５０と統計分析では非常によく似た親和性を示すが、重鎖３３０を持つバリアントは一貫して最良のＥＣ５０（そして平均してキメラよりも優れた）を示す。

実施例５：インビトロ機能的バイオアッセイ

この試験の原理は、抗βｉｇ－ｈ３タンパク質に向かう異なるｍＡｂの有効性を、そのタンパク質を枯渇させることにより、細胞傷害性ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性化と増殖を回復する能力について評価することである。

最初に、新たに脾臓から抽出したＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、抗原提示細胞（すなわち、処理されたＯＶＡペプチドを持つ骨髄由来細胞）を用いて接触させて活性化と増殖を促進する。

その後、（ＣＤ８^＋ Ｔ細胞活性化経路を阻止することが知られている）ｒｈβｉｇ－ｈ３タンパク質を、調べるｍＡｂとともに添加する。

７２時間後、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性化と増殖をフローサイトメトリー（ＦＡＣｓ）分析によって定量的に評価する。

ｍＡｂの効率を、活性化／増殖のレベルをアイソタイプ対照（無関係な）ｍＡｂと比較することによって統計的に評価する。

骨由来の骨髄細胞をＣ５７ＢＬ６野生型マウスの骨から取得し、インビトロで５～６日間培養する。次いでそれら骨髄細胞をＬＰＳとともに１２時間インキュベートすることによって成熟させた後、ＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＥＬ）を添加することによって抗原提示細胞として活性化させる。ＯＶＡペプチドは処理されてＢＭＤＣ（ＯＶＡで処理したＢＭＤＣ）の表面に提示されることになる。

並行して、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を、破砕と単一細胞懸濁液の調製により、ＯＴ１マウスの脾臓とリンパ節から抽出する。

ＯＶＡを有するＢＭＤＣとＣＤ８^＋ Ｔ細胞をｒｈ－βｉｇ－ｈ３タンパク質および調べるｍＡｂと１つにまとめる。次いでそれを３７℃で７２時間インキュベートしてＣＤ８^＋ Ｔ細胞の活性化と増殖を可能にする。

次いでＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖と活性化をＦＡＣＳ染色によって４℃で評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアで分析した。

増殖の統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてなされるスチューデントのｔ検定と一元配置分散分析を通じて評価する。

（参照ｍＡｂと見なす）キメラ１８Ｂ３のほか、前記４つのヒト化リードバリアントと陰性対照について、得られた結果が図３にまとめられている。統計分析（一元配置分散分析）。

得られた結果は、すべてのヒト化バリアントが、標的に対して陰性対照と比べて統計的に有意な機能を持つことを示していた。この機能性は参照ｍＡｂ（キメラ１８Ｂ３）と統計的に完全に同等である。その結果、インビトロ機能試験は、選択されたヒト化バリアントを操作してもその特異的標的に対するインビトロの機能を変化させなかったことを示す。これらバリアントはすべて非常によく似ているが、ランキングは、重鎖Ｈ－３３０を持つバリアントが最良の結果を与え、バリアントＨ－３３０／Ｌ－４１が最も効率的であることを示している

実施例６：生体内機能的バイオアッセイ

この一群の実験の目的は、１８Ｂ３ ｍＡｂとＰＤＡＣ特異的腫瘍細胞の同時投与により、アイソタイプ対照ＩｇＧ１ ｍＡｂで治療した対照マウスと比べて（グラフト内の腫瘍細胞の数によって評価する）腫瘍増殖の制限と、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞活性化経路の回復が可能になることを実証することである。

この実験の特別な意図は、上記の効果が、投与された１８Ｂ３の量に比例することを示すことである。

ＰＤＡＣ腫瘍細胞を２．５月齢のＫＩＣマウスの分離された膵臓から取得し、インビトロで培養する。

ＫＩＣ細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ １：１混合物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の中に塊として埋め込み、正常なＣ５７ＢＬ６マウスの脇腹に、マウス１匹当たり増加していく量の１８Ｂ３ ｍＡｂとともに皮下注射する。対照は、評価する１８Ｂ３の最大量で投与される無関係なアイソタイプ対照ＩｇＧ１ ｍＡｂにある。評価するそれぞれの量について同じマウス集団（ｎ＝８）を用いる。

次いでマウスを１０日間モニタした後に安楽死させる。

次いで腫瘍グラフトを計量し、測定し、コラーゲンバッファで消化させた単一細胞懸濁液を取得し、染色のため処理した後、フローサイトメトリーを実施する。

グラフト内の腫瘍細胞の量、およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞の増殖と活性化をその後ＦＡＣＳ染色によって４℃で評価し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエアで分析する。

パラメータの統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてなされるスチューデントのｔ検定と一元配置分散分析を通じて評価する。

結果は、統計的な差が、ヒト化候補とキメラの間と、さまざまなヒト化候補の間に見られることを示している。重鎖Ｈ－３３０を有するヒト化バリアントは全体としてより優れた結果を示す。ヒト化バリアントＨ－３３０／Ｌ－２２８はリードバリアントであり、キメラと同等であるかそれよりも優れてさえいる値を示す。このバリアントは、全３つのパラメータについて最高の均一性（最小の分散－ＳＥＭ）も示す。ヒト化バリアントＨ－３３０／Ｌ－２２８が最良のプロファイルを示す。

実施例７：表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）－親和性、会合速度、および解離速度。

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を用いてアッセイを実施した。それは２つの工程で実施した：
・適切性試験と呼ぶ最初の工程は、アッセイを実施するための最適条件を決定することを目的としていた：ここでは、最良のセンサーチップとランニングバッファの条件を評価し、規定された最高の信号／雑音比にする。
・第２の工程は、結果の再現性とロバストさを保証するため三連で実施したランそのものである。

第１の工程のため、２つのセンサーとさまざまなバッファ条件を、親１８Ｂ３ ｍＡｂと参照としてのキメラ１８Ｂ３ ｍＡｂを用いて評価した。するとセンサーチップＣ１が最適であること、そして３００ｍＭのＮａＣｌと０．２５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するバッファが非特異的結合を減らし、シグナルを増加させることが明確にされた。

ランそのものについては、プロトコルは以下の通りであった：
１．抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧ二次抗体による試験抗体の可逆的固定化（共有結合で固定化）。
２．抗原と捕獲された抗体の相互作用分析。
３．再生：二次抗体の表面Ｓからの抗体と抗原の完全な除去。

追加の詳細は測定の方法の部分に与えられている。

ＳＰＲによって求めた、ｒｈｂＩＧ－Ｈ３と６つの抗体の相互作用の速度定数（ｋ_ａ、ｋ_ｄ）と平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）。実験データを１：１結合モデルにフィットさせた。掲載されているのは、ｎ＝３回の独立な実験の平均値±ＳＤである。

ＳＰＲアッセイの最適化された設定は非常にうまくいき、非常に正確で再現性のある結果を提供した。

すべてのｍＡｂがナノモル未満の範囲の親和性（ＫＤ）を持つ。

全サンプルのｋａ、ｋｄ、およびＫＤに全体としてわずかな差がある：
・マウス抗体ｍ１８Ｂ３の会合速度（ｋａ）は他の全サンプルと比べてわずかに遅い、
・解離速度（ｋｄ）はヒト化（Ｈｚ）バリアントで驚くほどより遅い。
・全体的ＫＤ値（親和性）はキメラ抗体ｃｈ１８Ｂ３が最低であり（０．２ｎＭ）、親マウスと全ヒト化サンプルは非常によく似ている（０．４～０．５ｎＭ）。

実施例８：表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）－Ｈ３３０の中に変異Ｃ１０２Ｓを持つ抗体の親和性、会合速度、および解離速度。

ＳＰＲによる親和性定数の評価

固定化手続き

ランニングバッファ（ＲＢ）：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖからなるＨＢＳ－ＥＰ＋

界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、温度：２５℃

Ｃｙｔｉｖｉａ ２２０６４８８８ＡＦの注意に従ってアミンカップリングを利用し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体をＣＭ５センサーチップの表面に化学的にグラフトさせる。簡単に述べると、ＮＨＳ－ＥＤＣ混合物を注入することによって表面を最初に活性化させる。その後、接触時間を調節して抗ヒトＩｇＧ（固定化バッファの中に２５μｇ／ｍｌ）を数回注入する（キット上の利用可能な１０個の上に３回）。最後に、表面をエタノールアミン１Ｍ ｐＨ８．５で脱活性化させる。

調べる抗体の固定化は、固定化レベルが９０～１００ＲＵになるまで各フローセルに５μＬ／分で逐次的に実施した。２０μｇ／ｍＬのＭＡｂ溶液（ＲＢで希釈したＭＡｂ）を６０秒間注入すると、固定化シグナルが８５０と２５００ＲＵの間になった。高い固定化レベルが得られたとき、再生溶液（ＭｇＣｌ２ ３Ｍ）を３０秒間注入した後、調節した濃度と接触時間で新たに注入した。

陰性対照Ａｂをセンサーフローセル１（Ｆｃ１）の表面に固定化し、陽性対照（キメラ１８Ｂ３ ｍＡＢ）をＦｃ２の表面に固定化する。１８Ｂ３バリアントＡｂをＦｃ３とＦｃ４の表面に固定化する：

単一サイクル動態（ＳＣＫ）アッセイ

ランニングバッファ（ＨＢＳ－ＥＰ＋）：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４、温度：２５℃流速：３０μＬ／分

増加していく濃度（５；１０；２５；５０；１００ｎＭ）の抗原（ｈβＩＧ－Ｈ３）の１８０秒間の注入を各フローセルで実施する。ＲＢの中での短時間の解離を抗原の各濃度で実施する。最大濃度の抗原（１００ｎＭ）を注入した後、ＲＢにおける解離を３６００秒間記録する。

・５回のＲＢ注入を伴う３つの同様のサイクルを実施した後、二重差し引き手続きを実施するため抗原のサイクルを実施する（ブランク・ラン）。

・５回のＲＢ注入と６００秒間の解離時間を伴う３つの同様のサイクルの後にブランク・ランを実施してシステムを安定化させる（スタートアップ・ラン）。

１：１相互作用モデルでの分析：

結論：

・調べた４つのｍＡｂはナノモル未満の親和性（ＫＤ）を持つ。
・ヒト化バリアントの親和性は、キメラバージョンの親和性よりもごくわずか小さい。
・２つのバリアント（Ｈ－３３０／Ｌ－２２８とＨ－３３０／Ｌ－４１）の間には、親Ｖ１バージョンでも変異Ｖ１．２バージョン（Ｃ１０２→Ｓ１０２）でも有意差はない。
・各バリアントについて、その親バージョンとその変異バージョンＣ１０２→Ｓ１０２の間に有意差はない。非常にわずかな差を観察することができ、それは実験条件に関係しているように見える。なぜなら試験は２シリーズで（すなわち２つのＳＰＲチップを用いて）実施したからである。

Claims (16)

1. 可変ドメインＶＨと可変ドメインＶＬを含んでいてβｉｇ－ｈ３タンパク質のエピトープ（前記エピトープは配列番号１６または３０の配列として示されている）に特異的に結合するヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
   （ａ）配列番号４または２８として示されている配列を持つ可変ドメインＶＨ、
   （ｂ）マウス１８Ｂ３ ＶＬドメインのヒト化バリアントであって配列番号１８として示されている配列を持つ可変ドメインＶＬを含み、
   ＤＳＣ（Ｔｍ Ｆａｂ）が７９℃以上、特に７９または８０と８３、８３．２、または８３．５℃の間である熱安定性を示す、ヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
2. － 配列番号４または２８として示されている配列を持つＶＨドメインと、
   － 配列番号１０または１３として示されている配列を持つＶＬドメインを含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
3. 可変ドメインＶＨと可変ドメインＶＬを含んでいてβｉｇ－ｈ３タンパク質のエピトープ（前記エピトープは配列番号１６または３０の配列として示されている）に特異的に結合するヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
   （ａ）－ 配列番号１として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ１；
   － 配列番号２として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ２；
   － 配列番号３または２７として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ３
   を含む可変ドメインＶＨ；
   （ｂ）－ 配列番号７として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ１；
   － 配列番号８として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ２；
   － 配列番号９として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ３
   を含む可変ドメインＶＬを含む、ヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
4. － 前記βｉｇ－ｈ３タンパク質に約５．８Ｅ－１０Ｍ以下、特に約５Ｅ－１０と約５．８Ｅ－１０Ｍの間以下、特に約５．３５Ｅ－１０ＭのＫ_Ｄで結合する；および／または
   － 前記βｉｇ－ｈ３タンパク質に約６Ｅ－０４秒^－１以上、特に約６．２Ｅ－０４と約７Ｅ－０４秒^－１の間、特に約６．５９Ｅ－０４秒^－１のＫ_ｄで結合する；および／または
   － ＤＳＣ（Ｔｍ Ｆａｂ）が約７９℃以上、特に約７９と約８３℃の間、典型的には約８１．３℃である安定性を持つ；および／または
   － ＣＨＯ細胞の中での一過性発現において約２７５μｇ／ｍｌの優れた生産性を持つ、請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
5. － 配列番号４として示されている配列を持つＶＨドメイン；
   － 配列番号１０として示されている配列を持つＶＬドメインを含む、請求項３または４に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
6. － 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＨ、好ましくは配列番号１４として示されている配列を持つＣＨを含む重鎖；
   － 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＬ、好ましくは配列番号１５として示されている配列を持つＣＬを含む軽鎖を含む、請求項３～５のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
7. （ａ）－ 配列番号１として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ１；
   － 配列番号２として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ２；
   － 配列番号３または２７として示されている配列を持つＨ－ＣＤＲ３
   を含む可変ドメインＶＨ；
   （ｂ）－ 配列番号１１として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ１；
   － 配列番号１２として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ２；
   － 配列番号９として示されている配列を持つＬ－ＣＤＲ３
   を含む可変ドメインＶＬを含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
8. － 前記βｉｇ－ｈ３タンパク質に約５Ｅ－１０Ｍ以下、特に約４．５Ｅ－１０Ｍと約５Ｅ－１０Ｍの間、典型的には約４．７６Ｅ－１０ＭのＫ_Ｄで結合する；および／または
   － 前記βｉｇ－ｈ３タンパク質に約５Ｅ－０４秒^－１以上、特に約５．５Ｅ－０４と約６Ｅ－０４秒^－１の間、特に約５．８３Ｅ－０４秒^－１のＫ_ｄで結合する；および／または
   － ＤＳＣ（Ｔｍ Ｆａｂ）が約７８℃以上、特に約７８～８２℃、典型的には約８０．２℃である安定性を持つ；および／または
   － ＣＨＯ細胞の中での一過性発現において約２４９μｇ／ｍｌの生産性を持つ、請求項７に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
9. － 配列番号４または２８として示されている配列を持つＶＨドメイン；
   － 配列番号１３として示されている配列を持つＶＬドメインを含む、請求項７または８に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
10. － 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＨ、例えば配列番号１４として示されている配列を持つＣＨを含む重鎖；
    － 前記可変ドメインと、定常ドメインＣＬ、例えば配列番号１５として示されている配列を持つＣＬを含む軽鎖を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
11. 可変ドメインＶＨと可変ドメインＶＬを含んでいてβｉｇ－ｈ３タンパク質のエピトープ（前記エピトープは配列番号１６または３０の配列として示されている）に特異的に結合するヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
    － 配列番号６として示されている配列を持つＶＨドメイン；
    － 配列番号１０または１３として示されている配列を持つＶＬドメインを含む、ヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
12. 薬として使用するための、請求項１～１１のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
13. 患者でがんの治療に使用するための、請求項１～１１のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
14. 前記がんが、間質タンパク質βｉｇ－ｈ３が内部で発現しているがんである、請求項１３に従って使用するためのヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
15. 前記がんが、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、肺がん、頭頸部がん、大腸がん、膀胱がん、または黒色腫である、請求項１３または１４に従って使用するためのヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
16. 請求項１～１１のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトβｉｇ－ｈ３モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、医薬として許容可能なビヒクルとを含む医薬組成物。

Images