JP2024526908A - 胃腸病原体を検出するための組成物及び方法 - Google Patents

胃腸病原体を検出するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＳｈｉｇａｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）の存在を検出するための組成物、方法、キット、及び使用が提供される。いくつかの実施形態では、組成物、方法、キット、及び使用は、１つ以上のオリゴヌクレオチド、又は１つ以上のオリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ及びＣ．ｃｏｌｉについての別個のプライマー／プローブでの多重アッセイとして実施される。オリゴヌクレオチドのいくつかは、イノシンを含有し、及び／又は５－メチルシトシン置換ヌクレオチドを含有する。増幅反応におけるシクロデキストリン及び／又はポリソルベート２０の使用が記載される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月２７日に出願された、米国仮出願第６３／２２６，０７９号の優先権下での利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
序論及び要約
細菌性胃腸炎は、１４日未満続く急性下痢（１日当たり３回以上のエピソード）を引き起こす胃腸の炎症であり、悪心、嘔吐、腹部けいれんなどの症状も含み得る。Ｔｈｉｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｇｕｅｒｒａｎｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５０：３８－４７，２００４を参照されたい。米国では、１年当たり２億以上の下痢性疾患の症例があり、７３００万の医師による診察、１８０万の入院、及び最大６，０００の死亡をもたらすと推定されている。Ｇｕｅｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３２：３３１－３５０，２００１を参照されたい。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｆｏｏｄ Ｎｅｔデータ（１０州保健局からのデータ編集）によると、２０１０年、報告された感染症の数及び１０万人集団当たりの発生率は、以下を含んだ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（８２５６、１７．６）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（６３６５、１３．６）、及びＳｈｉｇｅｌｌａ（１７８０、３．８）。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，“Ｖｉｔａｌ Ｓｉｇｎｓ：Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｃｏｍｍｏｎｌｙ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｆｏｏｄ－Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ，１０ Ｕ．Ｓ．Ｓｉｔｅｓ，１９９６－２０１０，”ＭＭＷＲ ６０（２２）：７４９－７５５，２０１１を参照されたい。これらの３つの細菌は、Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）とともに、細菌性胃腸炎の一般的な原因である。細菌性胃腸炎感染によるリスクが最も高い集団は、小児（≦５）、高齢者、及び易感染者である。しかしながら、感染症は、全ての年齢群において発生し得る。感染様式は、典型的には、汚染された食物若しくは水を摂取することから、又は不十分な衛生状態（手洗い）の結果としての、便－経口経路を介したものである。
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａは、グラム陰性、好気性、桿菌状ｂａｃｉｌｌｉである。ｅｎｔｅｒｉｃａ及びｂｏｎｇｏｒｉを含む、２種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａがある。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａは、６つの亜種に更に分類され、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種Ｉのほんの一部のみがヒト疾患の原因となっている。Ｓａｂｂａｇｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ３０５：１－１３，２０１０を参照されたい。米国では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、及びＮｅｗｐｏｒｔは、培養確認されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ単離物の約半分を占める。腸チフスを引き起こす株である、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型Ｔｙｐｈｉは、米国では一般的ではないが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ血清型Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ及びＪａｖｉａｎａは、疾患の原因としてますます特定されている。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，“Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｎｏｔｉｆｉａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ－Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，２００８，”ＭＭＷＲ ５７（５４）：１５－１６，２００８を参照されたい。
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒは、湾曲、運動性、微好気性、グラム陰性桿菌である。それらは、１つ又は２つの鞭毛を使用してコルクスクリュー方式で急速、ダーティング運動性を示し、リポ多糖エンドトキシンも有する。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの２つの種、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ及びＣ．ｃｏｌｉは、ヒト感染症の大部分の原因である。Ｋｌｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４２：５５４９－５５５７，２００４、Ｐｏｌｙ ａｎｄ Ｇｕｅｒｒｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２４：２７－３１，２００８、Ｇｒａｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４０２２－４０２７，２０１０を参照されたい。
Ｅ．ｃｏｌｉは、温血生物の下腸において一般的に見出されるグラム陰性桿菌である。Ｅ．ｃｏｌｉのほとんどの株は、非病原性であり、正常な腸内フローラの一部である。しかしながら、ＳＴＥＣなどの、いくつかの株は、ヒトにおける生命を脅かす感染を引き起こし得る。ＳＴＥＣによって産生される志賀毒素の２つの主なタイプ、それぞれ、２つの異なる遺伝子、ｓｔｘ１及びｓｔｘ２で運ばれる、志賀毒素１型及び志賀毒素２型がある。ＳＴＥＣのいくつかの株は、ｓｔｘ１遺伝子を含有し、他の株は、ｓｔｘ２遺伝子を含有する。ｓｔｘ１及びｓｔｘ２遺伝子の両方を含有する特定のＳＴＥＣ株もある。
Ｓｈｉｇｅｌｌａは、Ｅ．ｃｏｌｉと密接に関連したグラム陰性、好気性、桿菌である。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３２：６２７－６５３，２００８を参照されたい。その全てがヒトにおいて疾患を引き起こし、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉ（部分群Ｄ）、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ（部分群Ｂ）、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ（部分群Ｂ）、及びＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（部分群Ａ）を含み得る、Ｓｈｉｇｅｌｌａの４つの種がある。ＣＤＣによって公表された２００６年Ｓｈｉｇｅｌｌａ年次要約によると、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉは、７６％で最も一般的な感染の原因であり、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ（１４％）、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ（１．１％）、及びＳ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（０．５％）が続く。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，“Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ：Ａｎｎｕａｌ Ｓｕｍｍａｒｙ，２００６，”Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８を参照されたい。
細菌性胃腸炎又は関連疾患に罹患しているか、又は罹患している疑いのある患者を治療する医師に診断及び予後情報を提供するために、生物学的検体を含む、試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、及びＳＴＥＣの存在を効率的かつ高感度に検出する必要性がある。
Ｔｈｉｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｇｕｅｒｒａｎｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５０：３８－４７，２００４ Ｇｕｅｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，３２：３３１－３５０，２００１ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，"Ｖｉｔａｌ Ｓｉｇｎｓ：Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｒｅｎｄｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｃｏｍｍｏｎｌｙ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｆｏｏｄ－Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ，１０ Ｕ．Ｓ．Ｓｉｔｅｓ，１９９６－２０１０，"ＭＭＷＲ ６０（２２）：７４９－７５５，２０１１ Ｓａｂｂａｇｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ３０５：１－１３，２０１０ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，"Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ Ｎｏｔｉｆｉａｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ－Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，２００８，"ＭＭＷＲ ５７（５４）：１５－１６，２００８ Ｋｌｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４２：５５４９－５５５７，２００４ Ｐｏｌｙ ａｎｄ Ｇｕｅｒｒｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２４：２７－３１，２００８ Ｇｒａｎａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４０２２－４０２７，２０１０ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．３２：６２７－６５３，２００８ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，"Ｓｈｉｇｅｌｌａ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ：Ａｎｎｕａｌ Ｓｕｍｍａｒｙ，２００６，"Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８
したがって、本明細書では、少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、（ａ）～（ｅ）：
（ａ）（ｉ）配列番号１２及び配列番号１４、（ｉｉ）配列番号２１及び配列番号４７、（ｉｉｉ）配列番号３８及び配列番号３６、（ｉｖ）配列番号３５及び配列番号４０、（ｖ）配列番号１２及び配列番号２８、（ｖｉ）配列番号４２及び配列番号３１、又は（ｖｉｉ）配列番号４１及び配列番号２７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、
（ｂ）（ｉ）配列番号１１及び配列番号１９のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、
（ｃ）（ｉ）配列番号８及び配列番号１０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、
（ｄ）（ｉ）配列番号１５及び配列番号１７、（ｉｉ）配列番号３４及び配列番号２２、又は（ｉｉｉ）配列番号３２及び配列番号３３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、並びに
（ｅ）（ｉ）配列番号２０及び配列番号３、（ｉｉ）配列番号４９及び配列番号３、又は（ｉｉｉ）配列番号４及び配列番号７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも１つを含む、オリゴヌクレオチドのセットが提供される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットを含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号２１及び配列番号４７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号３８及び配列番号３６のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号３５及び配列番号４０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号１２及び配列番号２８のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号４２及び配列番号３１のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号４１及び配列番号２７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセットを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセットを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号１５及び配列番号１７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号３４及び配列番号２２のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号３２及び配列番号３３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及びＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも２つを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及びＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも３つを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及びＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも４つを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及びＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットを含む。
いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号１２及び配列番号１４のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号１１及び配列番号１９のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号８及び配列番号１０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットは、配列番号１５及び配列番号１７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットは、（ｉ）配列番号２０及び配列番号３並びに（ｉｉ）配列番号４及び配列番号７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１２及び配列番号１４のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１３
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１２及び配列番号２８のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１３
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号２１及び配列番号４７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４５
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３８及び配列番号３６のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４４、配列番号２６、若しくは配列番号２５、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３５及び配列番号４０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号３０、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４２及び配列番号３１のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号２３、又は
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４１及び配列番号２７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ検出プローブを更に含む。
いくつかの実施形態では、配列番号２３において、ヌクレオチド２、５、７、及び１４のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号２５において、ヌクレオチド７、９、１３、及び１５のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号２６において、ヌクレオチド９、１８、及び２３のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号２７において、ヌクレオチド６、１０、及び１８のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号３０において、ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号４３において、ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号４４において、ヌクレオチド７、９、１３、及び１５のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号４５において、ヌクレオチド３、６、８、及び１７のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ検出プローブを更に含み、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ検出プローブは、配列番号１８のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号１８において、ヌクレオチド７、１２、及び２５のうちの１つ以上、又はヌクレオチド７及び１２の各々、又はヌクレオチド７、１２、及び２５の各々は、５－メチルシトシンである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、Ｃ．ｃｏｌｉ検出プローブを更に含み、Ｃ．ｃｏｌｉ検出プローブは、配列番号９、配列番号３７、又は配列番号３９のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号９において、ヌクレオチド２、６、１３、１６、２３、２６、２８、及び２９のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号３７において、ヌクレオチド１７、２２、２３、及び２７のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号３９において、ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、
Ｓｈｉｇｅｌｌａ検出プローブを更に含み、Ｓｈｉｇｅｌｌａ検出プローブは、
Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１５及び配列番号１７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１６、
Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３４及び配列番号２２のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４６若しくは配列番号２９、又は
Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３２及び配列番号３３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号２４のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４６において、ヌクレオチド５、１１、及び１２の各々は、５－メチルシトシンである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセットは、
ＳＴＥＣ検出プローブを更に含み、ＳＴＥＣ検出プローブは、
ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号２０及び配列番号３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号４８、
ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４９及び配列番号３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号４８、又は
ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４及び配列番号７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号５若しくは配列番号６のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、配列番号１において、ヌクレオチド６、７、９、１４、１７、及び２４のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号２において、ヌクレオチド５、８、１１、１３、１８、及び２１のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号６において、ヌクレオチド３、７、８、１５、２０、２４、及び２７のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号１５において、ヌクレオチド７及び１５のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号１９において、ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号２１において、ヌクレオチド１３、１７、及び２４のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号２８において、ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号３１において、ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号３２において、ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号３６において、ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号３８において、ヌクレオチド４、６、７、及び８のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号４０において、ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号４７において、ヌクレオチド１１、１６、及び１７のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号７において、ヌクレオチド３、４、１８、及び１９のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号１２において、ヌクレオチド４、１１、１２、及び１６のうちの１つ以上、又は各々は、５－メチルシトシンである。いくつかの実施形態では、配列番号２２において、ヌクレオチド５及び１６の各々は、５－メチルシトシンである。
いくつかの実施形態では、検出プローブのうちの１つ以上、又は各々は、蛍光色素化合物を含む。いくつかの実施形態では、検出プローブの各々は、非蛍光クエンチング色素化合物を更に含む。
本明細書では、少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するためのオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、
配列番号１５（ヌクレオチド７及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号１６、
配列番号１９（ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２１（ヌクレオチド１３、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２３（ヌクレオチド２、５、７、及び１４の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２５（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２６（ヌクレオチド９、１８、及び２３の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２７（ヌクレオチド６、１０、及び１８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２８（ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３０（ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３１（ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３２（ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３６（ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３８（ヌクレオチド４、６、７、及び８の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３９（ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４０（ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４２、
配列番号４３（ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４４（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４５（ヌクレオチド３、６、８、及び１７の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４７（ヌクレオチド１１、１６、及び１７の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号１（ヌクレオチド６、７、９、１４、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２（ヌクレオチド５、８、１１、１３、１８、及び２１の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号６（ヌクレオチド３、７、８、１５、２０、２４、及び２７の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号７（ヌクレオチド３、４、１８、及び１９の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号９（ヌクレオチド２、６、１３、１６、２３、２６、２８、及び２９の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号１２（ヌクレオチド４、１１、１２、及び１６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号１８（ヌクレオチド７及び１２の各々又はヌクレオチド７、１２、及び２５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２２（ヌクレオチド５及び１６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３７（ヌクレオチド１７、２２、２３、及び２７の各々が、５－メチルシトシンである）、及び
配列番号４６（ヌクレオチド５、１１、及び１２の各々が、５－メチルシトシンである）のうちのいずれか１つの配列を含む、オリゴヌクレオチドも提供される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、
配列番号１５（ヌクレオチド７及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号１６、
配列番号１９（ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２１（ヌクレオチド１３、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２３（ヌクレオチド２、５、７、及び１４の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２５（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２６（ヌクレオチド９、１８、及び２３の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２７（ヌクレオチド６、１０、及び１８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２８（ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３０（ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３１（ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３２（ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３６（ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３８（ヌクレオチド４、６、７、及び８の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３９（ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４０（ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４２、
配列番号４３（ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４４（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４５（ヌクレオチド３、６、８、及び１７の各々が、５－メチルシトシンである）、及び
配列番号４７（ヌクレオチド１１、１６、及び１７の各々が、５－メチルシトシンである）のうちのいずれか１つの配列を含む。
本明細書では、上記実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセット又は上記実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含むキットも提供される。
本明細書では、上記実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセット又は上記実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドを含む反応混合物も提供される。
本明細書では、多重化方法であって、
（１）試料であって、少なくとも１つの腸内病原体を含有することが疑われる当該試料を、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットと接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、任意のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣ標的核酸が、当該試料中に存在する場合、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣ標的領域に対応する１つ以上の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、実施することと、
（３）１つ以上の増幅産物の存在又は不在を検出し、
それによって当該試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣのうちの少なくとも１つの存在又は不在を決定することと、を含む、多重化方法も提供される。
いくつかの実施形態では、多重化方法のステップ（３）は、
試料を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ検出プローブ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ検出プローブ、Ｃ．ｃｏｌｉ検出プローブ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ検出プローブ、及びＳＴＥＣ検出プローブのうちの少なくとも１つと接触させること、
試料に対して電気泳動を実施すること、又は
１つ以上の増幅産物の配列を、存在する場合、決定すること、を含む。
本明細書では、オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの核酸塩基残基を含む固体支持体を得るステップであって、少なくとも１つの核酸塩基残基が、固体支持体に３’位で共有結合している、ステップと、
（ｂ）固体支持体から最も遠い核酸塩基残基の５’位を、別の核酸塩基残基の３’位に結合するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を追加の少なくとも１３回繰り返し、それによって固体支持体に結合した少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において生成された少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を切断し、それによってオリゴヌクレオチドを得るステップと、を含み、
オリゴヌクレオチドが、
配列番号１５（ヌクレオチド７及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号１６、
配列番号１９（ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２１（ヌクレオチド１３、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２３（ヌクレオチド２、５、７、及び１４の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２５（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２６（ヌクレオチド９、１８、及び２３の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２７（ヌクレオチド６、１０、及び１８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２８（ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３０（ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３１（ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３２（ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３６（ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３８（ヌクレオチド４、６、７、及び８の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３９（ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４０（ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４２、
配列番号４３（ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４４（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４５（ヌクレオチド３、６、８、及び１７の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号４７（ヌクレオチド１１、１６、及び１７の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号１（ヌクレオチド６、７、９、１４、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２（ヌクレオチド５、８、１１、１３、１８、及び２１の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号６（ヌクレオチド３、７、８、１５、２０、２４、及び２７の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号７（ヌクレオチド３、４、１８、及び１９の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号９（ヌクレオチド２、６、１３、１６、２３、２６、２８、及び２９の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号１２（ヌクレオチド４、１１、１２、及び１６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号１８（ヌクレオチド７及び１２の各々又はヌクレオチド７、１２、及び２５の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号２２（ヌクレオチド５及び１６の各々が、５－メチルシトシンである）、
配列番号３７（ヌクレオチド１７、２２、２３、及び２７の各々が、５－メチルシトシンである）、及び
配列番号４６（ヌクレオチド５、１１、及び１２の各々が、５－メチルシトシンである）のうちのいずれか１つの配列を含む、方法も提供される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１８～３２個の連続した核酸塩基残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２０～３０個の連続した核酸塩基残基の長さを有する。
本明細書では、第１のオリゴヌクレオチドを合成することと、第２のオリゴヌクレオチドを合成することと、を含む、一対のオリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、
第１のオリゴヌクレオチドを合成すること及び第２のオリゴヌクレオチドを合成することの各々が、
（ａ）少なくとも１つの核酸塩基残基を含む固体支持体を得るステップであって、少なくとも１つの核酸塩基残基が、固体支持体に３’位で共有結合している、ステップと、
（ｂ）固体支持体から最も遠い核酸塩基残基の５’位を、別の核酸塩基残基の３’位に結合するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を追加の少なくとも１３回繰り返し、それによって固体支持体に結合した少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において生成された少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を切断し、それによってオリゴヌクレオチドを得るステップと、を含み、
第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、
配列番号１２及び配列番号１４、
配列番号２１及び配列番号４７、
配列番号３８及び配列番号３６、
配列番号３５及び配列番号４０、
配列番号１２及び配列番号２８、
配列番号４２及び配列番号３１、
配列番号４１及び配列番号２７、
配列番号１１及び配列番号１９、
配列番号８及び配列番号１０、
配列番号１５及び配列番号１７、
配列番号３４及び配列番号２２、
配列番号３２及び配列番号３３、
配列番号４９及び配列番号３、
配列番号２０及び配列番号３、並びに
配列番号４及び配列番号７のうちのいずれか１つの配列を含む、方法も提供される。
いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの各々は、１８～３２個の連続した核酸塩基残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの各々は、２０～３０個の連続した核酸塩基残基の長さを有する。
したがって、以下の実施形態は、本開示によって提供されるものの中にある。
実施形態１は、少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、（ａ）～（ｅ）：
（ａ）（ｉ）配列番号１２及び配列番号１４、（ｉｉ）配列番号２１及び配列番号４７、（ｉｉｉ）配列番号３８及び配列番号３６、（ｉｖ）配列番号３５及び配列番号４０、（ｖ）配列番号１２及び配列番号２８、（ｖｉ）配列番号４２及び配列番号３１、又は（ｖｉｉ）配列番号４１及び配列番号２７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、
（ｂ）（ｉ）配列番号１１及び配列番号１９のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、
（ｃ）（ｉ）配列番号８及び配列番号１０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、
（ｄ）（ｉ）配列番号１５及び配列番号１７、（ｉｉ）配列番号３４及び配列番号２２、又は（ｉｉｉ）配列番号３２及び配列番号３３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、並びに
（ｅ）（ｉ）配列番号２０及び配列番号３、（ｉｉ）配列番号４９及び配列番号３、又は（ｉｉｉ）配列番号４及び配列番号７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも１つを含む、オリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットを含む、実施形態１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号２１及び配列番号４７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、実施形態２のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３８及び配列番号３６のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、実施形態２のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態５は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３５及び配列番号４０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、実施形態２のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態６は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１２及び配列番号２８のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、実施形態２のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態７は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４２及び配列番号３１のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、実施形態２のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態８は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４１及び配列番号２７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、実施形態２のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態９は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１０は、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１１は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１２は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１５及び配列番号１７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、実施形態１１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１３は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３４及び配列番号２２のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、実施形態１１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１４は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３２及び配列番号３３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、実施形態１１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１５は、ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１６は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及びＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも２つを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１７は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及びＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも３つを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１８は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及びＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも４つを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態１９は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及びＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２０は、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１２及び配列番号１４のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１１及び配列番号１９のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号８及び配列番号１０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１５及び配列番号１７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、（ｉ）配列番号２０及び配列番号３並びに（ｉｉ）配列番号４及び配列番号７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、直前の実施形態のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２１は、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１２及び配列番号１４のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１３
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１２及び配列番号２８のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１３
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号２１及び配列番号４７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４５
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３８及び配列番号３６のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４４、配列番号２６、若しくは配列番号２５、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３５及び配列番号４０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号３０、
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４２及び配列番号３１のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号２３、又は
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４１及び配列番号２７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ検出プローブを更に含む、実施形態２～２０のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２２は、配列番号２３において、ヌクレオチド２、５、７、及び１４のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態２１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２３は、配列番号２５において、ヌクレオチド７、９、１３、及び１５のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態２１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２４は、配列番号２６において、ヌクレオチド９、１８、及び２３のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態２１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２５は、配列番号２７において、ヌクレオチド６、１０、及び１８のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態２１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２６は、配列番号３０において、ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態２１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２７は、配列番号４３において、ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態２１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２８は、配列番号４４において、ヌクレオチド７、９、１３、及び１５のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態２１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態２９は、配列番号４５において、ヌクレオチド３、６、８、及び１７のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態２１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３０は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ検出プローブを更に含み、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ検出プローブが、配列番号１８のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、実施形態９～２７のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３１は、配列番号１８において、ヌクレオチド７、１２、及び２５のうちの１つ以上、又はヌクレオチド７及び１２の各々、又はヌクレオチド７、１２、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態２９のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３２は、Ｃ．ｃｏｌｉ検出プローブを更に含み、Ｃ．ｃｏｌｉ検出プローブが、配列番号９、配列番号３７、又は配列番号３９のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、実施形態１０～３０のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３３は、配列番号９において、ヌクレオチド２、６、１３、１６、２３、２６、２８、及び２９のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態３１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３４は、配列番号３７において、ヌクレオチド１７、２２、２３、及び２７のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態３１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３５は、配列番号３９において、ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態３１のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３６は、
Ｓｈｉｇｅｌｌａ検出プローブを更に含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ検出プローブが、
Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１５及び配列番号１７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１６、
Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３４及び配列番号２２のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４６若しくは配列番号２９、又は
Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３２及び配列番号３３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号２４のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、実施形態１１～３５のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３７は、実施形態３６のオリゴヌクレオチドのセットであり、配列番号４６において、ヌクレオチド５、１１、及び１２の各々は、５－メチルシトシンを含む。
実施形態３８は、
ＳＴＥＣ検出プローブを更に含み、ＳＴＥＣ検出プローブが、
ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号２０及び配列番号３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号４８、
ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４９及び配列番号３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号４８、又は
ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４及び配列番号７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号５若しくは配列番号６のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、実施形態１５～３７のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態３９は、配列番号１において、ヌクレオチド６、７、９、１４、１７、及び２４のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態３８のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４０は、配列番号２において、ヌクレオチド５、８、１１、１３、１８、及び２１のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態３８のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４１は、配列番号６において、ヌクレオチド３、７、８、１５、２０、２４、及び２７のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、実施形態３８のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４２は、配列番号１５において、ヌクレオチド７及び１５のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４３は、配列番号１９において、ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４４は、配列番号２１において、ヌクレオチド１３、１７、及び２４のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４５は、配列番号２８において、ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４６は、配列番号３１において、ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４７は、配列番号３２において、ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４８は、配列番号３６において、ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態４９は、配列番号３８において、ヌクレオチド４、６、７、及び８のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態５０は、配列番号４０において、ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態５１は、配列番号４７において、ヌクレオチド１１、１６、及び１７のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態５２は、配列番号７において、ヌクレオチド３、４、１８、及び１９のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態５３は、配列番号１２において、ヌクレオチド４、１１、１２、及び１６のうちの１つ以上、又は各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態５４は、配列番号２２において、ヌクレオチド５及び１６の各々が、５－メチルシトシンを含む、先行実施形態のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態５５は、検出プローブのうちの１つ以上、又は各々が、蛍光色素化合物を含む、実施形態２１～５４のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態５６は、検出プローブの各々が、非蛍光クエンチング色素化合物を更に含む、直前の実施形態のオリゴヌクレオチドのセットである。
実施形態５７は、少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するためのオリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチドが、
配列番号１５（ヌクレオチド７及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号１６、
配列番号１９（ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２１（ヌクレオチド１３、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２３（ヌクレオチド２、５、７、及び１４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２５（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２６（ヌクレオチド９、１８、及び２３の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２７（ヌクレオチド６、１０、及び１８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２８（ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３０（ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３１（ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３２（ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３６（ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３８（ヌクレオチド４、６、７、及び８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３９（ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４０（ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４２、
配列番号４３（ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４４（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４５（ヌクレオチド３、６、８、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４７（ヌクレオチド１１、１６、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号１（ヌクレオチド６、７、９、１４、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２（ヌクレオチド５、８、１１、１３、１８、及び２１の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号６（ヌクレオチド３、７、８、１５、２０、２４、及び２７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号７（ヌクレオチド３、４、１８、及び１９の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号９（ヌクレオチド２、６、１３、１６、２３、２６、２８、及び２９の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号１２（ヌクレオチド４、１１、１２、及び１６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号１８（ヌクレオチド７及び１２の各々又はヌクレオチド７、１２、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２２（ヌクレオチド５及び１６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３７（ヌクレオチド１７、２２、２３、及び２７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、及び
配列番号４６（ヌクレオチド５、１１、及び１２の各々が、５－メチルシトシンを含む）のうちのいずれか１つの配列を含む、オリゴヌクレオチドである。
実施形態５８は、オリゴヌクレオチドが、
配列番号１５（ヌクレオチド７及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号１６、
配列番号１９（ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２１（ヌクレオチド１３、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２３（ヌクレオチド２、５、７、及び１４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２５（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２６（ヌクレオチド９、１８、及び２３の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２７（ヌクレオチド６、１０、及び１８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２８（ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３０（ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３１（ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３２（ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３６（ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３８（ヌクレオチド４、６、７、及び８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３９（ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４０（ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４２、
配列番号４３（ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４４（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４５（ヌクレオチド３、６、８、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、及び
配列番号４７（ヌクレオチド１１、１６、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）のうちのいずれか１つの配列を含む、直前の実施形態のオリゴヌクレオチドである。
実施形態５９は、実施形態１～５６のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセット又は実施形態５７若しくは５８のオリゴヌクレオチドを含むキットである。
実施形態６０は、実施形態１～５５のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセット又は実施形態５７若しくは５８のオリゴヌクレオチドを含む反応混合物である。
実施形態６１は、α－シクロデキストリン又はポリソルベート２０を更に含む、直前の実施形態の反応混合物である。
実施形態６２は、α－シクロデキストリン及びポリソルベート２０を更に含む、実施形態６０又は６１の反応混合物である。
実施形態６３は、反応混合物中のα－シクロデキストリンの濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬである、実施形態６１又は６２の反応混合物である。
実施形態６４は、反応混合物中のα－シクロデキストリンの濃度が、約１６ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬである、実施形態６１～６３のいずれか１つの反応混合物である。
実施形態６５は、反応混合物中のα－シクロデキストリンの濃度が、約２０ｍｇ／ｍＬ、約１７．５ｍｇ／ｍＬ、又は約１２．５ｍｇ／ｍＬである、実施形態６１～６４のいずれか１つの反応混合物である。
実施形態６６は、反応混合物中のポリソルベート２０の濃度が、約０．００２％～約０．０５％（ｖ／ｖ）である、実施形態６１～６５のいずれか１つの反応混合物である。
実施形態６７は、反応混合物中のポリソルベート２０の濃度が、約０．００３％～約０．０３％（ｖ／ｖ）である、実施形態６１～６６のいずれか１つの反応混合物である。
実施形態６８は、反応混合物中のポリソルベート２０の濃度が、約０．００４２％（ｖ／ｖ）、約０．００３５％（ｖ／ｖ）、約０．００２６％（ｖ／ｖ）、又は約０．０２％（ｖ／ｖ）である、実施形態６１～６７のいずれか１つの反応混合物である。
実施形態６９は、洗剤を更に含む、実施形態６１～６８のいずれか１つの反応混合物である。
実施形態７０は、洗剤が、ドデシル硫酸ナトリウムを含む、直前の実施形態の反応混合物である。
実施形態７１は、反応混合物中の洗剤の濃度が、約３ｍｇ／ｍＬ～３００ｍｇ／ｍＬである、実施形態６９又は７０の反応混合物である。
実施形態７２は、反応混合物中の洗剤の濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬである、実施形態６９～７１のいずれか１つの反応混合物である。
実施形態７３は、反応混合物中の洗剤の濃度が、約３３．３ｍｇ／ｍＬである、実施形態６９～７２のいずれか１つの反応混合物である。
実施形態７４は、多重化方法であって、
（１）試料であって、少なくとも１つの腸内病原体を含有することが疑われる当該試料を、実施形態１～５６のいずれか１つのオリゴヌクレオチドのセットと接触させることと、
（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、任意のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣ標的核酸が、当該試料中に存在する場合、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣ標的領域に対応する１つ以上の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、実施することと、
（３）１つ以上の増幅産物の存在又は不在を検出し、
それによって当該試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣのうちの少なくとも１つの存在又は不在を決定することと、を含む、多重化方法である。
実施形態７４．１は、インビトロ核酸増幅反応が、実施形態６０～７３のいずれか１つの反応混合物において生じる、直前の実施形態の多重化方法である。
実施形態７５は、実施形態７４の多重化方法であって、（３）が、
試料を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ検出プローブ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ検出プローブ、Ｃ．ｃｏｌｉ検出プローブ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ検出プローブ、及びＳＴＥＣ検出プローブのうちの少なくとも１つと接触させること、
試料に対して電気泳動を実施すること、又は
１つ以上の増幅産物の配列を、存在する場合、決定すること、を含む、多重化方法である。
実施形態７５．１は、インビトロ核酸増幅反応が、実施形態６０～７３のいずれか１つの反応混合物において生じる、直前の実施形態の多重化方法である。
実施形態７６は、オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの核酸塩基残基を含む固体支持体を得るステップであって、少なくとも１つの核酸塩基残基が、固体支持体に３’位で共有結合している、ステップと、
（ｂ）固体支持体から最も遠い核酸塩基残基の５’位を、別の核酸塩基残基の３’位に結合するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を追加の少なくとも１３回繰り返し、それによって固体支持体に結合した少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において生成された少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を切断し、それによってオリゴヌクレオチドを得るステップと、を含み、
オリゴヌクレオチドが、
配列番号１５（ヌクレオチド７及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号１６、
配列番号１９（ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２１（ヌクレオチド１３、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２３（ヌクレオチド２、５、７、及び１４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２５（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２６（ヌクレオチド９、１８、及び２３の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２７（ヌクレオチド６、１０、及び１８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２８（ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３０（ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３１（ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３２（ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３６（ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３８（ヌクレオチド４、６、７、及び８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３９（ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４０（ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４２、
配列番号４３（ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４４（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４５（ヌクレオチド３、６、８、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号４７（ヌクレオチド１１、１６、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号１（ヌクレオチド６、７、９、１４、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２（ヌクレオチド５、８、１１、１３、１８、及び２１の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号６（ヌクレオチド３、７、８、１５、２０、２４、及び２７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号７（ヌクレオチド３、４、１８、及び１９の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号９（ヌクレオチド２、６、１３、１６、２３、２６、２８、及び２９の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号１２（ヌクレオチド４、１１、１２、及び１６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号１８（ヌクレオチド７及び１２の各々又はヌクレオチド７、１２、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号２２（ヌクレオチド５及び１６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
配列番号３７（ヌクレオチド１７、２２、２３、及び２７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、及び
配列番号４６（ヌクレオチド５、１１、及び１２の各々が、５－メチルシトシンを含む）のうちのいずれか１つの配列を含む、方法である。
実施形態７７は、オリゴヌクレオチドが、１８～３２個の連続した核酸塩基残基、又は２０～３０個の連続した核酸塩基残基の長さを有する、実施形態７６の方法である。
実施形態７８は、第１のオリゴヌクレオチドを合成することと、第２のオリゴヌクレオチドを合成することと、を含む、一対のオリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、
第１のオリゴヌクレオチドを合成すること及び第２のオリゴヌクレオチドを合成することの各々が、
（ａ）少なくとも１つの核酸塩基残基を含む固体支持体を得るステップであって、少なくとも１つの核酸塩基残基が、固体支持体に３’位で共有結合している、ステップと、
（ｂ）固体支持体から最も遠い核酸塩基残基の５’位を、別の核酸塩基残基の３’位に結合するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）を追加の少なくとも１３回繰り返し、それによって固体支持体に結合した少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を生成するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において生成された少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を切断し、それによってオリゴヌクレオチドを得るステップと、を含み、
第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、
配列番号１２及び配列番号１４、
配列番号２１及び配列番号４７、
配列番号３８及び配列番号３６、
配列番号３５及び配列番号４０、
配列番号１２及び配列番号２８、
配列番号４２及び配列番号３１、
配列番号４１及び配列番号２７、
配列番号１１及び配列番号１９、
配列番号８及び配列番号１０、
配列番号１５及び配列番号１７、
配列番号３４及び配列番号２２、
配列番号３２及び配列番号３３、
配列番号４９及び配列番号３、
配列番号２０及び配列番号３、並びに
配列番号４及び配列番号７のうちのいずれか１つの配列を含む、方法である。
実施形態７９は、第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドの各々が、１８～３２個の連続した核酸塩基残基、又は２０～３０個の連続した核酸塩基残基の長さを有する、実施形態７８の方法である。
定義
本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物又はプロセスステップに限定されるものではなく、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含めることに留意されたい。よって、例えば、「１つのオリゴマー」への言及は、複数のオリゴマーなどを含む。「又は」という接続詞は、包括的な意味が文脈において不合理ではない限り、包括的な意味で、すなわち、「及び／又は」と同等として解釈されるべきである。
わずか及びごくわずかな偏差が本明細書における教示の範囲内であるように、本開示において考察される温度、濃度、時間などの前には黙示的な「約」があることが理解されるであろう。一般に、「約」という用語は、組成物の活性又は安定性に対していずれの著しい効果も及ぼさない組成物の成分の量におけるごくわずかな変動を示す。全ての範囲は、「エンドポイントを含まない」などの明示的な除外の不在下でエンドポイントを包含すると解釈されるべきであり、よって、例えば、「１０～１５以内」には、１０及び１５の値が含まれる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。上述の概略的な説明及び、詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、その教示を限定するものではないことが理解されるべきである。参照によって組み込まれる任意の資料が本開示の明示的内容と矛盾する限りにおいて、明示的内容が優先する。
特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、又はそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「からなる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」か、又はそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、又はそれらを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものであると想定される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「～から本質的になる」は、本明細書に記載される組成物及び方法の基本的なかつ新規の特徴を実質的に変化させない追加の成分（複数可）、組成物（複数可）、又は方法ステップ（複数可）が、それらの組成物又は方法に含まれ得ることを意味する。そのような特徴には、試料中に存在する腸内病原体の核酸配列を、核酸を他の既知の病原体から区別する特異性で、任意選択的に７５～１５０ＣＦＵ／ｍＬの腸内病原体を検出することができる感度で、並びに、任意選択的に約９０～約１８０分若しくは約１２０～約１５０分、及び／又はサイクル増幅反応が使用されるとき増幅反応の開始から、約３０サイクル～約６０サイクル、約４０サイクル～約５０サイクル、若しくは約４５サイクルで検出する能力が含まれる。
「生物学的」又は「臨床的」試料を含む、「試料」又は「検体」は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、及びＳＴＥＣのうちの１つ以上、又はその成分、例えば、核酸又は核酸の断片を含有し得るか、又は含有することが疑われる任意の材料を指す。試料は、成分の複雑な混合物であり得る。試料は、例えば、便、血液、血漿、血清、血液細胞、唾液、粘膜、及び脳脊髄液を含む、生きた又は死んだ哺乳動物又は生物に由来する任意の組織又は材料を含む「生物学的試料」を含む。試料は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、及びＳＴＥＣのうちの１つ以上による感染の１つ以上の症状を経験している生物からの便を含み得る。試料はまた、感染の任意の症状を経験していないが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、及びＳＴＥＣのうちの１つ以上が人工的に添加される生物からの便などの、「スパイクされた」試料であり得る。試料はまた、例えば、培養培地中の細胞及び組織の成長から生じる馴化培地を含む、インビトロ細胞培養構成要素の試料を含み得る。分析用試料を調製するために、試料は、組織又は細胞構造を破壊して、酵素、緩衝液、塩、洗剤などを含有し得る溶液中に細胞内核酸を放出するように、化学的、物理的、又は機械的に処理され得る。本明細書に記載される方法の１つのステップでは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、及びＳＴＥＣなどの、少なくとも１つの腸内病原体の標的核酸を含有することが疑われる試料が提供される。したがって、このステップは、対象から試料を得る物理的ステップを除外する。
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びそれらの類似体であるポリマーを含む、ポリヌクレオチドを形成するために一緒に結合した窒素系複素環式塩基又は塩基類似体を有するヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指す。核酸「主鎖」は、糖ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」又はＰＮＡ、ＰＣＴ第９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、又は置換、例えば、２’メトキシ又は２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。窒素系塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらの類似体（例えば、イノシン又は他、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照されたい）、プリン又はピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－若しくはアザ－プリン、デアザ－若しくはアザ－ピリミジン、５位若しくは６位に置換基を有するピリミジン塩基、２、６、若しくは８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ４－アルキル－ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ第９３／１３１２１号）であり得る。核酸は、主鎖がポリマーの位置（複数可）に窒素系塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡ若しくはＤＮＡ糖、塩基及び結合のみを含み得るか、又は従来の成分及び置換の両方（例えば、２’メトキシ結合を有する従来の塩基、若しくは従来の塩基及び１つ以上の塩基類似体の両方を含有するポリマー）を含み得る。核酸は、ＲＮＡ模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体である「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼし得るオリゴマーの実施形態は、ＰＮＡオリゴマー、２’－メトキシ若しくは２’－フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、又は荷電結合（例えば、ホスホロチオエート）若しくは中性基（例えば、メチルホスホネート）を含有するオリゴマーを含む、ハイブリダイゼーション複合体の全電荷、電荷密度、若しくは立体会合に影響を及ぼすオリゴマーを含む。別段に示されない限り、５－メチルシトシンは、ＲＮＡ又はＤＮＡ主鎖（又はそれらの混合物）を含む前述の主鎖／糖／結合のいずれかとともに使用され得る。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、又は他の核酸の長さについての範囲に言及するとき、範囲は、全ての整数を含む（例えば、１９～２５個の連続したヌクレオチドの長さは、１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５を含む）ことが理解される。
「Ｃ」又は「シトシン」残基は、文脈が別段に示さない限り、メチル化及び非メチル化シトシンを含む。
「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴマー」は、一般に１，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の核酸を指し、約２～５ｎｔの下限及び約５００～９００ｎｔの上限を有するサイズ範囲のものを含む。いくつかの特定の実施形態は、約５～１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ｎｔの下限及び約５０～６００ｎｔの上限を有するサイズ範囲のオリゴヌクレオチドであり、他の特定の実施形態は、約１０～２０ｎｔの下限及び約２２～１００ｎｔの上限を有するサイズ範囲にある。オリゴヌクレオチドは、天然に存在する供給源から精製され得るが、任意の周知の酵素的又は化学的方法を使用することによって合成され得る。オリゴヌクレオチドは、機能名（例えば、捕捉プローブ、プライマー、又はプロモータープライマー）によって言及され得るが、当業者は、そのような用語がオリゴマーを指すことを理解するであろう。
「アンプリコン」又は「増幅産物」とは、核酸増幅反応において生成され、標的核酸に由来する核酸分子を意味する。アンプリコン又は増幅産物は、標的核酸と同じか又は反対方向のものであり得る標的核酸配列を含有する。
「増幅オリゴヌクレオチド」又は「増幅オリゴマー」は、標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又はその相補体を指し、核酸増幅反応に関与し、例えば、プライマー又は及びプロモーター－プライマーとして機能する。特定の増幅オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列又はその相補鎖の領域に相補的である、少なくとも約１０個の連続した塩基、任意選択的に少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の連続した塩基を含有する。連続した塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は完全に相補的であり得る。当業者は、列挙された範囲が範囲内の全ての整数及び有理数を含むことを理解するであろう（例えば、９２％又は９８．３７７％）。特定の増幅オリゴヌクレオチドは、約１０～約６０塩基長であり、任意選択的に修飾ヌクレオチドを含み得る。
「プライマー」は、鋳型核酸とハイブリダイズし、重合によって伸長される３’末端を有するオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、例えば、標的配列に対して非相補的である５’領域を含めることによって、任意選択的に修飾され得る。そのような修飾は、タグ、プロモーター、又はプライマー若しくは標的オリゴヌクレオチドを操作若しくは増幅することに使用されるか若しくは有用な他の配列などの、機能付加を含むことができる。
転写媒介増幅の文脈内では、５’プロモーター配列で修飾されたプライマーは、「プロモーター－プライマー」と称され得る。分子生物学又は生化学の当業者は、プライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチドが、５’プロモーター配列を含み、プロモーター－プライマーとして機能するように修飾することができ、同様に、任意のプロモーター－プライマーが、その５’プロモーター配列を含む又は含まないプライマーとして機能することができることを理解するであろう。
「核酸増幅」は、標的核酸配列、若しくはその相補的配列の複数コピー、又はそれらの断片（すなわち、完全標的核酸よりも少なく含有する増幅された配列）を産生する任意のインビトロ手順を指す。核酸増幅手順の例には、転写関連方法、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び他のもの（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，４３７，９９０号、同第５，１３０，２３８号、同第４，８６８，１０５号、及び同第５，１２４，２４６号）、レプリカーゼ媒介増幅（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、欧州特許出願第０３２０３０８）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、米国特許第７，２８２，３２８号）、及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号）が含まれる。増幅は、線形又は指数関数的であり得る。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、及びＱＢ－レプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、及び熱循環ステップを使用して、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成する。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別々のオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、及び変性の複数サイクルを使用することによって標的及びその相補鎖を増幅する。ヘリカーゼ依存性増幅は、ヘリカーゼを使用して、ＤＮＡ二本鎖の２つの鎖を分離し、一本鎖鋳型を生成し、続いて鋳型にハイブリダイズする配列特異的プライマーのハイブリダイゼーション及び標的配列を増幅するＤＮＡポリメラーゼによる伸長が行われる。ＳＤＡは、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖をニックするであろう制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを使用し、続いて一連のプライマー伸長及び鎖置換ステップにおける増幅が行われる。特定の実施形態は、ＰＣＲ又はＴＭＡを使用するが、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドが他の増幅方法においてプライマーとして容易に使用され得ることは、当業者には明らかであろう。
転写関連増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、プロモーター含有オリゴヌクレオチドを使用し、最終的に核酸鋳型から複数のＲＮＡ転写物を産生するために、任意選択的に他のオリゴヌクレオチドを含み得る（米国特許第５，３９９，４９１号及び同第５，５５４，５１６号、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，４３７，９９０号、Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＴ第８８／０１３０２号及び同第８８／１０３１５号、Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，１３０，２３８号、Ｍａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８６８，１０５号及び同第５，１２４，２４６号、Ｕｒｄｅａ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＴ第９４／０３４７２号、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＴ第９５／０３４３０号、並びにＲｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．に詳述される）。ＴＭＡを使用する方法は、以前に詳細に記載されている（米国特許第５，３９９，４９１号及び同第５，５５４，５１６号）。
リアルタイムでアンプリコンを検出するサイクリック増幅法において、「閾値サイクル」（Ｃｔ）という用語は、標的の増幅に関連するシグナルの出現時間の尺度であり、一般に、正規化レポーターシグナルの標準偏差の１０倍である。増幅が「閾値サイクル」に達すると、一般にプローブが結合する配列の陽性増幅産物があると考えられる。次いで、増幅産物の同一性は、ゲル電気泳動、核酸配列決定、及び他のそのような分析手順などの、当業者に既知の方法によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「相対蛍光単位」（「ＲＦＵ」）という用語は、蛍光強度の測定の単位である。ＲＦＵは、測定に使用される検出手段の特徴で変動し、試料と対照との間の相対強度を比較するために測定値として使用することができる。
「検出プローブ」又は「プローブ」は、標的核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下、増幅された配列を含む、標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。検出は、直接的（すなわち、標的に直接的にハイブリダイズされるプローブ）又は間接的（すなわち、プローブを標的に結合する中間体構造にハイブリダイズされるプローブ）のいずれかであり得る。プローブの標的配列は、一般に、プローブが特異的にハイブリダイズするより大きな配列内の特異的配列を指す。検出プローブは、標的特異的配列及び非標的相補的配列を含み得る。そのような非標的相補的配列は、検出及び／又は増幅を促進するために使用することができる、ヘアピン構造などの、所望の二次又は三次構造を付与するであろう配列を含むことができる（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８３５，５４２号、及び同第６，８４９，４１２号）。定義された配列のプローブは、例えば、化学合成によって、及び組換え核酸分子からのインビトロ又はインビボ発現によって、当業者に既知の技法によって産生され得る。
本明細書で使用される場合、指定された核酸配列、又はその相補体に「実質的に対応する」核酸は、オリゴヌクレオチドが参照核酸配列と十分に類似し、オリゴヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリダイズするであろうという点で、参照核酸配列と類似のハイブリダイゼーション特性を有することを意味する。実質的に対応する核酸は、特定の核酸から少なくとも１つのヌクレオチドで異なる。この変動は、核酸と特定の核酸との間の配列同一性又は相補性のパーセンテージ（例えば、１００％未満～約８０％）に関して記載され得る。当業者であれば、列挙された範囲が範囲の全ての整数及び有理数を含むことを理解するであろう（例えば、９２％、９２．３７７％など）。
「ハイブリダイゼーション」又は「ハイブリダイズする」とは、２つの完全又は部分的に相補的な核酸鎖の、平行又は逆平行配向で、特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で一体になり、二本鎖領域を有する安定な構造を形成する能力を意味する。ハイブリッドと呼ばれることもある、この二本鎖構造の２つの構成鎖は、水素結合によって一緒に保持される。これらの水素結合は、最も一般的には、単一核酸鎖上の塩基アデニン及びチミン若しくはウラシル（Ａ及びＴ若しくはＵ）又はシトシン及びグアニン（Ｃ及びＧ）を含有するヌクレオチド間で形成されるが、塩基対合は、これらの「カノニカル」対のメンバーではない塩基間で形成することもできる。非カノニカル塩基対合は、当該技術分野で周知である。（例えば、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（１１ｔｈ ｅｄ．１９９２）を参照されたい。）
「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、増幅又は検出プローブオリゴヌクレオチドが、その標的核酸にハイブリダイズして、安定なオリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドを形成することができるが、十分な数の安定なオリゴヌクレオチド：非標的ハイブリッドを形成しないことを意味する。標的核酸に優先的にハイブリダイズする増幅及び検出オリゴヌクレオチドは、標的核酸を増幅及び検出するのに有用であるが、非標的化生物、特に系統発生的に密接に関連した生物には有用ではない。よって、オリゴヌクレオチドは、非標的核酸よりも十分に大きな程度まで標的核酸にハイブリダイズして、当業者が、必要に応じて指定された腸内病原体に由来する核酸の存在（又は不在）を正確に増幅及び／又は検出することを可能にする。一般に、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度を低減することは、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度又は割合を低下させるであろう。しかしながら、１つ以上の非相補的ヌクレオシド又は核酸塩基の包含は、非標的生物に対して区別するオリゴヌクレオチドの能力を促進し得る。
優先的ハイブリダイゼーションは、当該技術分野で既知であり、本明細書、例えば、以下に提供される例に記載される技法を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、試験試料中の標的及び非標的ハイブリダイゼーションシグナル間に少なくとも１０倍差、少なくとも１００倍差、又は少なくとも１，０００倍差がある。いくつかの実施形態では、試験試料中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベル以下である。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェントな条件」とは、オリゴマーが標的核酸（腸内病原体核酸など）に優先的にハイブリダイズすることを可能にするが、密接に関連する非標的核酸に由来する核酸には優先的にハイブリダイズすることを可能にしない条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の定義は変動しないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに使用することができる実際の反応環境は、オリゴヌクレオチドのＧＣ含有量及び長さ、オリゴヌクレオチド配列と試験試料中に存在し得る非標的核酸の配列との間の類似性の程度、並びに標的配列を含む因子に応じて変動し得る。ハイブリダイゼーション条件には、ハイブリダイゼーション試薬又は溶液の温度及び組成が含まれる。１つ以上の標的腸内病原体に由来する標的核酸を本開示のオリゴヌクレオチドで増幅及び／又は検出するための例示的なハイブリダイゼーションアッセイ条件は、一価塩、例えば、ＫＣｌなどの、塩濃度が、約０．０６～０．０９Ｍの範囲にあるとき、約６０℃の温度に対応する。特定のハイブリダイゼーションアッセイ条件は、以下の実施例セクションに記載される。他の許容されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者によって容易に確認され得る。
「アッセイ条件」とは、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの安定したハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。アッセイ条件は、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの優先的ハイブリダイゼーションを必要としない。
「標識」又は「検出可能な標識」は、検出されるか又は検出可能なシグナルをもたらすプローブに直接的又は間接的に結合した部分又は化合物を指す。直接的結合は、共有結合又は非共有相互作用（例えば、水素結合、疎水性又はイオン相互作用、及びキレート又は配位複合体形成）を使用し得るが、間接的結合は、検出可能なシグナルを増幅する、（例えば、抗体又は追加オリゴヌクレオチド（複数可）を介して）架橋部分又はリンカーを使用し得る。任意の検出可能な部分、例えば、放射性核種、ビオチン又はアビジンなどのリガンド、酵素、酵素基質、反応性基、検出可能な色を付与する色素又は粒子（例えば、ラテックス又は金属ビーズ）などの発色団、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、又は化学発光化合物）、及び蛍光化合物（すなわち、フルオロフォア）が使用され得る。フルオロフォアの実施形態には、約４９５～６９０ｎｍの範囲の光を吸収し、約５２０～７０５ｎｍの範囲の光を放出するものが含まれ、これらには、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ ＦＬＵＯＲ（商標）（Ｏｒａｎｇｅ又はＲｅｄ）、及びＱＵＡＳＡＲ（商標）化合物として知られるものが含まれる。フルオロフォアは、フルオロフォアに近接したとき光を吸収してバックグラウンド蛍光を減少させるクエンチャー分子と組み合わせて使用され得る。そのようなクエンチャーは、当該技術分野で周知であり、例えば、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（若しくはＢＨＱ（商標））又はＴＡＭＲＡ（商標）化合物を含む。特定の実施形態には、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブと比較して検出可能な変化を示す均質系において検出可能である「均質な検出可能な標識」が含まれ、これは、ハイブリダイズされていない標識プローブからハイブリダイズされた標識プローブを物理的に除去することなしに、標識が検出されることを可能にする（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、及び同第５，６５８，７３７号）。特定の均質な検出可能な標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、周知である、標準ＡＥ又はＡＥ誘導体を含む、化学発光化合物が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、及び同第５，６３９，６０４号）。標識を合成する方法、標識を核酸に結合する方法、及び標識からシグナルを検出する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）章１０、並びに米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、及び同第４，５８１，３３３号、並びに欧州特許出願第０７４７７０６）。ＡＥ化合物を核酸に結合する特定の方法は、既知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号及び米国特許第５，６３９，６０４号、列１０、行６～列１１、行３、及び実施例８を参照されたい）。特定のＡＥ標識位置は、プローブの中央領域及びＡ／Ｔ塩基対の領域付近、プローブの３’若しくは５’末端、又はプローブが所望の標的配列と比較して検出すべきではない既知の配列とのミスマッチ部位若しくはその付近である。他の検出可能に標識されたプローブには、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子トーチ、及び分子ビーコンが含まれる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ドナー及びアクセプター標識を含み、蛍光は、クエンチャーの存在からフルオロフォアを放出するために増幅中にプローブを酵素的に分解した際に検出される。分子トーチ及びビーコンは、開放及び閉鎖構成で存在し、閉鎖された構成は、フルオロフォアをクエンチし、開放位置は、フルオロフォアをクエンチャーから分離して蛍光を可能にする。標的へのハイブリダイゼーションは、そうでなければ閉鎖されたプローブを開放する。
「伸長不能な」オリゴヌクレオチドは、伸長を防止するためにその３’末端又はその付近に遮断部分を含む。３’末端付近の遮断基は、いくつかの実施形態では、３’末端の５残基以内であり、ポリメラーゼのオリゴマーへの結合を限定するのに十分に大きく、他の実施形態は、３’末端に共有結合した遮断基を含有する。多くの異なる化学基、例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン－ジオールジデオキシヌクレオチド残基、及びコルジセピンは、３’末端を遮断するために使用され得る。遮断部分の更なる例には、３’－デオキシヌクレオチド（例えば、２’，３’－ジデオキシヌクレオチド）；３’－リン酸化ヌクレオチド；フルオロフォア、クエンチャー、若しくは伸長に干渉する他の標識；反転ヌクレオチド（例えば、任意選択的に曝露された５’－ＯＨ若しくはリン酸塩での、３’－～－３’ホスホジエステルを通して先行ヌクレオチドに結合した）；又はポリメラーゼによる新生核酸鎖の更なる伸長を防止するためにオリゴヌクレオチドに結合したタンパク質若しくはペプチドが含まれる。本開示の伸長不能なオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０塩基長であり得、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０以上のヌクレオチド長であり得る。検出可能な標識を含む伸長不能なオリゴヌクレオチドは、プローブとして使用することができる。
特に特許請求の範囲における、「配列番号Ｘの配列」への言及は、別段に特に示されない限り、対応する配列表入力の塩基配列を指し、主鎖（例えば、ＲＮＡ、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、若しくはＤＮＡ）又は塩基修飾（例えば、シトシン残基のメチル化）の同一性を必要としない。
オリゴヌクレオチド中の「非ワトソンクリック」（ＮＷＣ）位置は、（例えば、イノシンのヒポキサンチン（Ｉ）を介した）イノシンの使用によるものを含む、非ワトソンクリック対合で、オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの標的配列にハイブリダイズするように構成される位置を指す。そのようなＮＷＣ対合は、例えば、Ｉ－Ａ、Ｉ－Ｔ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｇ、Ｉ－Ｕ、Ｇ－Ｕ、Ｇ－Ｔ、及びＧ－Ａ（Ｉ／Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ／Ｕのいずれかは、オリゴヌクレオチド中の塩基であり得る）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、Ｉ－Ａ対を介してハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、Ｉ－Ｔ対を介してハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、Ｉ－Ｃ対を介してハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、Ｉ－Ｇ対を介してハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、Ｉ－Ｕ対を介してハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、ワブル（Ｇ－Ｕ）又はプリン－プリン（Ｇ－Ａ）対を介してハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、Ｇ－Ｔ対を介してハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、Ｇ－Ｕ対を介してハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、ＮＷＣ位置は、Ｇ－Ａ対を介してハイブリダイズするように構成される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学及び技術用語は、関連技術における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的な定義は、分子生物学の分野に関連する技術書、例えば、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）又はＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，１９９１，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）に見出され得る。
例示的な組成物、キット、方法、及び使用
本開示は、試料中の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣなどの、少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するために有用な、オリゴマー、組成物、及びキットを提供する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、キット又は組成物中で提供される。オリゴヌクレオチドは一般に、例えば、腸内病原体の標的核酸に特異的にハイブリダイズするように構成された、標的ハイブリダイゼーション領域を含む。異なる長さ及び塩基組成のオリゴヌクレオチドが、標的核酸を増幅するために使用され得るが、いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、約１０～６０塩基長、約１４～５０塩基長、約１４～４０塩基長、約１４～３５塩基長、又は約１５～３０塩基長の標的ハイブリダイゼーション領域を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的ハイブリダイゼーション領域の５’に位置し得る、プロモーターなどの、標的ハイブリダイゼーション領域に加えて第２の配列の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、第２の配列の領域を含まない。
いくつかの実施形態では、一方のオリゴヌクレオチドが、標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズするように構成され、他方のオリゴヌクレオチドが、標的核酸のアンチセンス鎖にハイブリダイズするように構成される、オリゴヌクレオチドのセットが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ又は他の形態の増幅のための増幅オリゴマーセット（例えば、プライマー対）を含む。
いくつかの実施形態では、プライマー対又はプライマー対及び（例えば、プローブとしての使用のために）任意選択的に標識される第３のオリゴヌクレオチドなどの、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣを含む、１つ以上の腸内病原体の標的核酸にハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、複数のプライマー対又は複数のプライマー対及び（例えば、プローブとしての使用のために）任意選択的に標識される第３のオリゴヌクレオチドなどの、複数のオリゴヌクレオチドは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、又はＳＴＥＣを含む、１つ以上の腸内病原体の１つ以上の標的核酸に集合的にハイブリダイズするように構成される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、非ワトソンクリック（ＮＷＣ）位置を含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａプライマー、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａプライマー対、及び／又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａプローブは、イノシンを含む位置などの、ＮＷＣ位置を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉプライマー、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉプライマー対、及び／又はＣ．ｊｅｊｕｎｉプローブは、イノシンを含む位置などの、ＮＷＣ位置を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｃｏｌｉプライマー、Ｃ．ｃｏｌｉプライマー対、及び／又はＣ．ｃｏｌｉプローブは、イノシンを含む位置などの、ＮＷＣ位置を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａプライマー、Ｓｈｉｇｅｌｌａプライマー対、及び／又はＳｈｉｇｅｌｌａプローブは、イノシンを含む位置などの、ＮＷＣ位置を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＥＣプライマー、ＳＴＥＣプライマー対、及び／又はＳＴＥＣプローブは、イノシンを含む位置などの、ＮＷＣ位置を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドは、５－メチルシトシンを含む位置を含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａプライマー、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａプライマー対、及び／又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａプローブは、５－メチルシトシンを含む位置を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉプライマー、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉプライマー対、及び／又はＣ．ｊｅｊｕｎｉプローブは、５－メチルシトシンを含む位置を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ．ｃｏｌｉプライマー、Ｃ．ｃｏｌｉプライマー対、及び／又はＣ．ｃｏｌｉプローブは、５－メチルシトシンを含む位置を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａプライマー、Ｓｈｉｇｅｌｌａプライマー対、及び／又はＳｈｉｇｅｌｌａプローブは、５－メチルシトシンを含む位置を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＥＣプライマー、ＳＴＥＣプライマー対、及び／又はＳＴＥＣプローブは、５－メチルシトシンを含む位置を含む。
いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号１２及び配列番号１４を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号２１及び配列番号４７を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号３８及び配列番号３６を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号３５及び配列番号４０を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号１２及び配列番号２８を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号４２及び配列番号３１を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号４１及び配列番号２７を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号１１及び配列番号１９を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号１１及び配列番号１９を含む標的ハイブリダイゼーション配列からなる。
いくつかの実施形態では、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号８及び配列番号１０を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号８及び配列番号１０を含む標的ハイブリダイゼーション配列からなる。
いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号１５及び配列番号１７を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号３４及び配列番号２２を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号３２及び配列番号３３を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号１５及び配列番号１７を含む標的ハイブリダイゼーション配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号３４及び配列番号２２を含む標的ハイブリダイゼーション配列からなる。いくつかの実施形態では、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号３２及び配列番号３３を含む標的ハイブリダイゼーション配列からなる。
いくつかの実施形態では、ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号２０及び配列番号３を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号４９及び配列番号３を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号４及び配列番号７を含む標的ハイブリダイゼーション配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号２０及び配列番号３を含む標的ハイブリダイゼーション配列からなる。いくつかの実施形態では、ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号４９及び配列番号３を含む標的ハイブリダイゼーション配列からなる。いくつかの実施形態では、ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットの第１及び第２のオリゴマーは、それぞれ、配列番号４及び配列番号７を含む標的ハイブリダイゼーション配列からなる。
例示的なプライマー対及び任意選択の第３のオリゴマー（例えば、プローブ）を、以下の表Ａに記載する。
いくつかの実施形態では、標識を含むオリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは、プローブとして使用することができる。いくつかの実施形態では、標識されたオリゴヌクレオチドは、表Ａのオリゴマー３列に列挙される配列番号に対応する配列を有する。いくつかの実施形態では、標識は、非ヌクレオチド標識である。好適な標識には、検出可能な光シグナルを放出する化合物、例えば、均質な混合物中で検出することができるフルオロフォア又は発光（例えば、化学発光）化合物が含まれる。２つ以上の標識、及び２つ以上のタイプの標識は、特定のプローブ上に存在し得るか、又は検出は、各プローブが検出可能なシグナルを産生する化合物で標識される、プローブの混合物を使用することに依存し得る（例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第６，１８０，３４０号及び同第６，３５０，５７９号を参照されたい）。標識は、共有結合、キレート化、及びイオン相互作用を含む様々な手段によってプローブに結合することができるが、いくつかの実施形態では、標識は、共有結合している。例えば、いくつかの実施形態では、検出プローブは、例えば、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物などの、結合した化学発光標識を有する（例えば、米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、及び同第５，６５６，７４４号を参照されたい）。蛍光又は化学発光標識などの、標識は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合することができる（ｃ特許第５，５８５，４８１号、同第５，６５６，７４４号、及び同第５，６３９，６０４号）。いくつかの実施形態では、標識は、Ｑｕａｓａｒ６７０、ＣａｌＲｅｄ６１０、ＣａｌＯｒａｎｇｅ５６０、フルオレセイン、ＲＯＸ、ＦＡＭ、及びＨＥＸのうちの１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、プローブ（例えば、蛍光標識を含む）は、第１の標識と相互作用する第２の標識を更に含む。例えば、第２の標識は、クエンチャーであり得る。いくつかの実施形態では、第２の標識は、ＢＨＱ－１及びＢＨＱ－２の一方又は両方を含み得る。そのようなプローブは、例えば、プローブの標的又はアンプリコンへのハイブリダイゼーション、続いて５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を含むポリメラーゼによる核溶解が、蛍光標識の解放、及びそれによって増加した蛍光、又は第２の標識との相互作用とは独立した蛍光をもたらす、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイにおいて、使用することができる。
いくつかの用途では、少なくともある程度の自己相補性を示す１つ以上のプローブは、検出前にハイブリダイズされていないプローブの除去をまず必要とすることなしに、試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を促進するために使用される。そのような検出プローブの具体的な実施形態は、例えば、一般にヘアピンと称される立体構造などの、分子内ハイブリダイゼーションによって保持される立体構造を形成するプローブを含む。好適なヘアピンプローブには、「分子トーチ」（例えば、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、及び同第６，３６１，９４５号を参照されたい）及び「分子ビーコン」（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号及び米国特許第５，３１２，７２８号を参照されたい）が含まれる。分子トーチは、結合領域（例えば、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３－リンカー）によって接続され、かつ所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性の別個の領域（造られた「標的結合ドメイン」及び「標的閉鎖ドメイン」）を含む。適切な標的又は変性条件に曝露されるとき、分子トーチの２つの相補的領域（完全に又は部分的に相補的であり得る）が融解し、標的結合ドメインを、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が回復されるとき、標的配列へのハイブリダイゼーションに利用可能にする。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインに対して標的配列へのハイブリダイゼーションを優先するように設計される。分子トーチの標的結合ドメイン及び標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズされるときとは対照的に、分子トーチが自己ハイブリダイズされるときに異なるシグナルが産生されるように位置付けられた相互作用標識（例えば、蛍光／クエンチャー）を含み、それによってそれに関連する実行可能な標識を有するハイブリダイズされていないプローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を可能にする。
本開示に関連して使用され得る相互作用するドナー／アクセプター標識対の例には、ＦＲＥＴを非ＦＲＥＴ対から区別しようとせずに、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオロレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨＱ－１、ＣＹ５／ＢＨＱ－２、ＣＹ３／ＢＨＱ－１、ＣＹ３／ＢＨＱ－２、及びフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が含まれる。当業者であれば、ドナー及びアクセプター色素が異なるとき、アクセプターの増感蛍光の出現によって又はドナー蛍光のクエンチングによって、エネルギー移動が検出され得ることを理解するであろう。ＤＡＢＣＹＬ及びＱＳＹ７色素などの非蛍光アクセプターは、直接（すなわち、非増感）アクセプター励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題を有利に排除する。ドナー－アクセプター対の１つのメンバーとして使用することができる例示的なフルオロフォア部分には、フルオレセイン、ＲＯＸ、及びＣＹ色素（ＣＹ５など）が含まれる。ドナー－アクセプター対の別のメンバーとして使用することができる例示的なクエンチャー部分には、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＤＡＢＣＹＬ及びＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ部分が含まれる。
いくつかの実施形態では、標識されたオリゴヌクレオチド（例えば、プローブ）は、伸長不能である。例えば、標識されたオリゴマーは、３’－リン酸化、３’－末端３’－デオキシヌクレオチド（例えば、末端２’，３’－ジデオキシヌクレオチド）を有すること、３’－末端反転ヌクレオチド（例えば、最後のヌクレオチドが、３’～３’ホスホジエステル結合若しくはその類似体、例えば、ホスホロチオエートによって最後から２番目のヌクレオチドに結合するように反転している）を有すること、又は結合したフルオロフォア、クエンチャー、若しくは伸長に干渉する他の標識（おそらく末端ヌクレオチドの３’位を介して結合しているが、必ずしもそうではない）を有することによって伸長不能にすることができる。いくつかの実施形態では、３’－末端ヌクレオチドは、メチル化されていない。
本開示によって、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣなどの、少なくとも１つの腸内病原体の標的核酸の存在若しくは不在を決定するため、又は試料中のその量を定量化するための反応混合物も提供される。本開示に従った反応混合物は、以下：標的核酸の増幅のための本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、及び標的核酸の増幅産物の存在又は不在を決定するための本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド（例えば、プローブ）のうちの少なくとも１つ以上を含む。増幅オリゴヌクレオチド組み合わせと一緒に検出プローブを含む反応混合物について、反応混合物のための増幅オリゴヌクレオチド及び検出プローブオリゴヌクレオチドは、共通の標的領域によって結合している（すなわち、反応混合物は、反応混合物の増幅オリゴヌクレオチド組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含むであろう）。
反応混合物は、例えば、捕捉プローブ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３／０２０９９９２に記載されるようなポリ－（ｋ）捕捉プローブ、及び／又は参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０２０／０１６５５９９に記載されるようなポリ－（Ｒ）捕捉プローブなどの、多数の任意選択の成分を更に含み得る。増幅反応混合物について、反応混合物は、典型的には、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに／又はＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）、及び／又は酵素（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素及び／若しくはＲＮＡポリメラーゼ）などのインビトロ増幅を実施するために好適な他の試薬を含み、典型的には、標的核酸が存在しても存在しなくてもよい、試験試料成分を含むであろう。好適な試薬には、例えば、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＬｉＯＨ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＯＨ、エタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、トレハロース、Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、常磁性粒子、標的捕捉オリゴヌクレオチド、ＨＥＰＥＳ、コハク酸、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素）、及び／又はＲＮａｓｉｎを含有する製剤が含まれる。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＫＣｌを含む。いくつかの実施形態では、ＫＣｌ濃度は、約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＫＣｌ濃度は、約５０ｍＭ超、例えば、約６０～１５０ｍＭ、約７５～１２５ｍＭ、約８０～１２０ｍＭ、約８５～１１５ｍＭ、又は約９０～１１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＫＣｌ濃度は、５５～６５、６５～７５、７５～８５、８５～９５、９５～１０５、１０５～１１５、１１５～１２５、１２５～１３５、又は１３５～１４５であり、前述の各々は、ｍＭであり、「約」によって任意選択的に修飾される。いくつかの実施形態では、本開示による組成物は、例えば、前述の濃度のいずれかの、ＫＣｌを含む。いくつかの実施形態では、本開示による方法は、例えば、前述の濃度のいずれかの、ＫＣｌの存在下で増幅反応を実施することを含む。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、α－シクロデキストリン及び／又はポリソルベート２０を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物中のα－シクロデキストリンの濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、反応混合物中のα－シクロデキストリンの濃度は、約１６ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、又は約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、反応混合物中のα－シクロデキストリンの濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ、約１７．５ｍｇ／ｍＬ、又は約１２．５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、反応混合物中のポリソルベート２０の濃度は、約０．００２％～約０．０５％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、反応混合物中のポリソルベート２０の濃度は、約０．００３％～約０．０３％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、反応混合物中のポリソルベート２０の濃度は、約０．００４２％（ｖ／ｖ）、約０．００３５％（ｖ／ｖ）、約０．００２６％（ｖ／ｖ）、又は約０．０２％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、反応混合物は、洗剤を含む。いくつかの実施形態では、洗剤は、ドデシル硫酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物中の洗剤の濃度は、約３ｍｇ／ｍＬ～３００ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、反応混合物中の洗剤の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、反応混合物中の洗剤の濃度は、約３３．３ｍｇ／ｍＬである。
本開示によって、本明細書に記載される方法を実施するためのキットも提供される。本開示に従ったキットは、以下：標的核酸の増幅のための本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド、及び標的核酸の増幅産物の存在又は不在を決定するための本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド（例えば、プローブ）のうちの少なくとも１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意のオリゴヌクレオチド組み合わせは、キット中に存在する。キットは、例えば、捕捉プローブ、例えば、ＵＳ２０１３／０２０９９９２に記載されるようなポリ－（ｋ）捕捉プローブ、及び／又はＵＳ２０２０／０１６５５９９に記載されるようなポリ－（Ｒ）捕捉プローブなどの、多数の任意選択の成分を更に含み得る。キット中に存在し得る他の試薬は、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、並びに／又はＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）、及び／又は酵素（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素及び／若しくはＲＮＡポリメラーゼ）などの、インビトロ増幅を実施するために好適な試薬を含む。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、様々な異なる実施形態においてパッケージングされ得、当業者であれば、本開示が多くの異なるキット構成を包含することを理解するであろう。例えば、キットは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣのうちの１つのみ、２つ、３つ、４つ、又は全てのための増幅オリゴヌクレオチドを含み得る。加えて、増幅オリゴマー組み合わせと一緒に検出プローブを含むキットについて、反応混合物のための増幅オリゴヌクレオチド及び検出プローブオリゴヌクレオチドは、共通の標的領域によって結合している（すなわち、反応混合物は、反応混合物の増幅オリゴヌクレオチド組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含むであろう）。特定の実施形態では、キットは、本開示に従った方法を実施するための説明書のセットを更に含み、説明書は、添付文書及び／又はキット若しくはその構成要素のパッケージングに関連し得る。
本開示によって、例えば、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上を使用することによって、試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣを含む、少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するための方法（例えば、多重化方法）も提供される。本明細書に開示されるいずれの方法も、方法の目的に向けられた方法に関与する材料の対応する使用の開示としても理解されるべきである。オリゴヌクレオチドのいずれか、及びそのようなオリゴヌクレオチドを含むいずれかの組み合わせ（例えば、キット及び組成物）は、少なくとも１つの腸内病原体を検出又は定量化することにおける使用、及び少なくとも１つの腸内病原体を検出又は定量化するための組成物の調製における使用についても開示されるものと理解されるべきである。
大まかに述べると、方法は、以下の構成要素：（例えば、臨床試料などの、試料からの）標的核酸が捕捉オリゴヌクレオチドにアニーリングしている、標的捕捉；捕捉オリゴヌクレオチドと関連していない材料を除去するための、単離、例えば、洗浄；増幅；及び増幅とともにリアルタイムで実施され得る、アンプリコン検出、例えば、アンプリコン定量化のうちの１つ以上を含むことができる。特定の実施形態は、前述のステップの各々を伴う。特定の実施形態は、任意選択的に先行する線形増幅ステップとともに、指数関数的増幅を伴う。特定の実施形態は、指数関数的増幅及びアンプリコン検出を伴う。特定の実施形態は、上に列挙される構成要素のうちのいずれか２つを伴う。特定の実施形態は、上に隣接して列挙される任意の２つの構成要素、例えば、洗浄及び増幅、又は増幅及び検出を伴う。
いくつかの実施形態では、増幅は、（１）試料を、標的核酸に対応する標的核酸標的領域を増幅するために少なくとも２つのオリゴヌクレオチドと接触させることであって、オリゴヌクレオチドが、上述される少なくとも２つの増幅オリゴヌクレオチド（例えば、指数関数的増幅のためにセンス方向に配向された１つ以上及びアンチセンス方向に配向された１つ以上）を含む、接触することと、（２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、試料中に存在する任意の標的核酸が、増幅産物を生成するための鋳型として使用される、実施することと、（３）増幅産物の存在又は不在を検出し、それによって試料中の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣを含む、少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定すること、又は試料中の標的核酸の量を定量化することと、を含む。
本開示に従った検出方法は、方法のその後のステップに供される試料を得るステップを更に含むことができる。特定の実施形態では、使用される試料を「得ること」は、例えば、方法の１つ以上のステップが実施される試験施設若しくは他の場所で試料を受け取ること、及び／又は方法の１つ以上のステップが実施される施設内の場所から（例えば、貯蔵若しくは他の保管所から）試料を回収することを含む。
特定の実施形態では、方法は、例えば、捕捉ステップ前などの、増幅前に、試料中の他の成分から標的核酸を精製することを更に含む。そのような精製は、試料中に含有される生物を他の試料成分から分離及び／若しくは濃縮する方法、又は非核酸試料成分、例えば、タンパク質、炭水化物、塩、脂質などを除去若しくは分解する方法を含み得る。いくつかの実施形態では、試料中の核酸は、例えば、ＤＮａｓｅで分解され、任意選択的にＤＮａｓｅを除去若しくは不活性化するか、又は分解された核酸を除去する。
特定の実施形態では、標的核酸を精製することは、標的核酸を捕捉して、標的核酸を他の試料成分から特異的又は非特異的に分離することを含む。非特異的標的捕捉方法は、実質的に水性の混合物からの核酸の選択的沈殿、他の試料成分を除去するために洗浄される支持体への核酸の付着、又は標的核酸及び他の試料成分を含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の手段を伴い得る。
標的捕捉は、典型的には、ハイブリダイゼーション条件下で標的核酸配列にハイブリダイズする１つ以上の捕捉プローブオリゴヌクレオチドを含有する溶液相混合物中で生じる。捕捉プローブテールを含む実施形態について、標的：捕捉－プローブ複合体は、捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリダイズするようにハイブリダイゼーション条件を調整することによって捕捉される。特定の実施形態は、常磁性ビーズなどの、粒子状固体支持体を使用する。
単離は、捕捉に続くことができ、固体支持体上の複合体は、他の試料成分から分離される。単離は、任意の適切な技法、例えば、標的－配列と関連した支持体を１回以上（例えば、２又は３回）洗浄して、他の試料成分及び／又は非結合オリゴマーを除去することによって達成することができる。常磁性ビーズなどの粒子状固体支持体を使用する実施形態では、標的と関連した粒子は、洗浄溶液に懸濁され、いくつかの実施形態では、磁気引力を使用することによって、洗浄溶液から回収され得る。取り扱いステップの数を限定するために、標的核酸は、支持体上の複合体中の標的配列を増幅オリゴマーと単純に混合し、増幅ステップを進めることによって、増幅され得る。
標的配列を指数関数的に増幅することは、増幅される標的領域に隣接する少なくとも２つの増幅オリゴヌクレオチドを使用するインビトロ増幅反応を利用する。いくつかの実施形態では、上述のような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチド対が提供され、複数は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣ標的核酸のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、又は全てをハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチド対を含む。増幅反応は、サイクル又は等温であり得る。好適な増幅方法としては、例えば、レプリカーゼ媒介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び転写媒介又は転写関連増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。
検出ステップは、例えば、増幅産物を標識された検出プローブとハイブリダイズし、（いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション後にプローブから放出される標識からを含む）標識されたプローブから生じるシグナルを検出すること、試料及び／又は増幅産物に対して電気泳動を実施すること、増幅産物の配列を決定することによってなどの、増幅された標的配列に特異的に関連するシグナルを検出するための様々な既知の技法のいずれかを使用して実施され得る。いくつかの実施形態では、標識されたプローブは、上で考察されたように、クエンチャー又は第１の標識と相互作用する他の部分などの、第２の部分を含む。検出ステップは、例えば、その核酸塩基配列の全て又は一部分などの、増幅された配列に関する追加の情報も提供し得る。検出は、増幅反応が完了した後に実施され得るか、又は例えば、リアルタイムで、標的領域を増幅することと同時に実施され得る。一実施形態では、検出ステップは、均質な検出、例えば、混合物からのハイブリダイズされていないプローブの除去なしにハイブリダイズされたプローブの検出を可能にする（例えば、米国特許第５，６３９，６０４号及び同第５，２８３，１７４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、核酸は、検出可能な電位変化などの、物理的変化をもたらす表面と関連している。増幅された核酸は、それらをマトリックス中若しくは上で濃縮し、核酸若しくはそれらと関連した色素（例えば、臭化エチジウム又はサイバーグリーンなどの挿入剤）を検出するか、又は溶液相中の核酸と関連した色素の増加を検出することによって検出され得る。他の検出方法は、増幅された産物中の配列に特異的にハイブリダイズするように構成され、プローブ：産物複合体の存在を検出する核酸検出プローブを使用し得るか、又は増幅された産物と関連した検出可能なシグナルを増幅し得るプローブの複合体を使用することによるものであり得る（例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号、及び同第５，８４９，４８１号を参照されたい）。増幅された産物と特異的に関連する直接的又は間接的に標識されたプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。特に、増幅された産物は、少なくとも１つの腸内病原体の標的核配列における又は標的核配列に相補的な標的配列を含有し、プローブは、増幅された産物に含有される配列に直接的又は間接的に結合して、試験された試料中の病原体の存在又は不在を示すであろう。
増幅ステップの終わり近く又は終わりで増幅された産物を検出する実施形態では、増幅された産物へのプローブのハイブリダイゼーションを示すシグナルを提供するために、線形検出プローブが使用され得る。そのような検出の一例は、標的核酸にハイブリダイズする発光標識されたプローブを使用する。次いで、発光標識は、ハイブリダイズされていないプローブから加水分解される。検出は、ルミノメーターを使用して化学発光によって実施される（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第８９／００２４７６号を参照されたい）。リアルタイム検出を使用する他の実施形態では、検出プローブは、例えば、プローブが増幅産物に結合するときに検出されるレポーター部分で標識される分子ビーコン、分子トーチ、又はハイブリダイゼーションスイッチプローブなどの、ヘアピンプローブであり得る。そのようなプローブは、標的ハイブリダイゼーション配列及び非標的ハイブリダイゼーション配列を含み得る。そのようなプローブの様々な形態は、例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、及び同第６，３６１，９４５号、並びに米国特許出願公開第２００６／００６８４１７Ａ１号及び同第２００６／０１９４２４０Ａ１号に記載されている。
いくつかの実施形態では、増幅反応において、増幅オリゴヌクレオチドは、病原体の標的配列などの、標的核酸と優先的にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、検出ステップにおいて、プローブは、増幅産物などの、標的核酸と優先的にハイブリダイズし得る。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、増幅又は検出プローブオリゴヌクレオチドは、その標的核酸にハイブリダイズして、安定なオリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドを形成することができるが、十分な数の安定なオリゴヌクレオチド：非標的ハイブリッドを形成しない。いくつかの実施形態では、試験試料中の標的と非標的ハイブリダイゼーションシグナルと間（すなわち、オリゴヌクレオチド：標的ハイブリッド及びオリゴヌクレオチド：非標的ハイブリッドのシグナル強度の比）には少なくとも５倍差、少なくとも１０倍差、少なくとも２０倍差、少なくとも５０倍差、少なくとも７５倍差、少なくとも１００倍差、少なくとも２００倍差、少なくとも５００倍差、少なくとも１，０００倍差、又は少なくとも２，０００倍差がある。いくつかの実施形態では、試験試料中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベル以下である。
いくつかの実施形態では、増幅反応及び／又は検出ステップは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施され得る。いくつかの実施形態では、そのようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチド（例えば、増幅オリゴヌクレオチド又はプローブ）が、密接に関連する非標的核酸に由来する核酸ではなく、標的核酸（病原体の標的配列又は増幅産物など）に優先的にハイブリダイズすることを可能にする。異なる実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに使用することができる実際の反応環境は、オリゴヌクレオチドのＧＣ含有量及び長さ、オリゴヌクレオチド配列と試験試料中に存在し得る非標的核酸の配列との間の類似性の程度、並びに標的配列を含む因子に応じて変動し得る。いくつかの実施形態では、増幅反応及び／又は検出ステップについてのハイブリダイゼーション条件は、一価塩、例えば、ＫＣｌなどの、塩濃度が、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、又は約１．０Ｍであるとき、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、又は約６５℃の温度に対応する。
例えば、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上を使用することによって、試料中の、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣを含む、少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するための方法（例えば、多重化方法）は、２５～５００ＣＦＵ／ｍＬ、５０～５００ＣＦＵ／ｍＬ、７５～５００ＣＦＵ／ｍＬ、１００～５００ＣＦＵ／ｍＬ、２５～３００ＣＦＵ／ｍＬ、５０～３００ＣＦＵ／ｍＬ、７５～３００ＣＦＵ／ｍＬ、１００～３００ＣＦＵ／ｍＬ、２５～１５０ＣＦＵ／ｍＬ、５０～１５０ＣＦＵ／ｍＬ、７５～１５０ＣＦＵ／ｍＬ、１００～１５０ＣＦＵ／ｍＬ、２５～１００ＣＦＵ／ｍＬ、５０～１００ＣＦＵ／ｍＬ、７５～１００ＣＦＵ／ｍＬ、２５～７５ＣＦＵ／ｍＬ、５０～７５ＣＦＵ／ｍＬ、又は２５～５０ＣＦＵ／ｍＬの検出感度を有し得る。
本開示によって、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上（例えば、１つ以上の対）を合成するための方法であって、オリゴヌクレオチドが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣを含む、少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するために有用である、方法も提供される。方法は、例えば、（ａ）少なくとも１つの核酸塩基残基を含む固体支持体を得るステップであって、少なくとも１つの核酸塩基残基が、３’位で固体支持体に結合（例えば、共有結合）している、ステップと、（ｂ）固体支持体から最も遠い核酸塩基残基の５’位を別の核酸塩基残基の３’位に結合するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）を追加の少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、又は少なくとも２８回繰り返し、それによって少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０個の連続した固体支持体に結合した核酸塩基残基を生成するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）において生成された少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０個の連続した核酸塩基残基を切断し、それによってオリゴヌクレオチド又は複数のオリゴヌクレオチドを得るステップと、を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１８～３２個の連続した核酸塩基残基の長さを有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２０～３０個の連続した核酸塩基残基の長さを有する。
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上を合成するための方法は、固相法であり得る。例えば、ホスホジエステル結合によってヌクレオチドを結合するためのホスホロアミダイト固相化学は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：２８７（１９８７）に記載される。別の例として、シアノエチルホスホロアミダイト前駆体を使用した自動固相化学合成は、Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓ－ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｈｉｎｅｓ－ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１０）：４０５１（１９８４）に記載される。別の例として、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」と題された、米国特許第５，４４９，７６９号は、ホスホロチオエート結合を含有するオリゴヌクレオチドを合成するための手順を開示する。加えて、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」と題された、米国特許第５，８１１，５３８号は、メチルホスホネート結合を含む、異なる結合を有するオリゴヌクレオチドの合成を開示する。更に、オリゴヌクレオチドの有機合成のための方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）章１０に記載される。
特定のオリゴヌクレオチドの合成及び精製後、いくつかの異なる手順が、オリゴヌクレオチドの品質を精製及び制御するために利用され得る。好適な手順としては、電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、高圧液体クロマトグラフィー）が挙げられる。
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１－プライマー及びプローブの異なる組み合わせを使用したＧＩ－細菌パネル標的のリアルタイムＰＣＲ増幅及び検出
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ／Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ／ＥＩＥＣ）、及びＳｈｉｇａｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）標的のリアルタイムＰＣＲ増幅及び検出のためのいくつかのプライマー及びプローブ組み合わせを試験した。
増幅及び検出反応は、Ｐａｎｔｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ装置（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して行った。典型的には、２０μＬの増幅試薬を、５μＬの標的核酸を有するマルチウェルプレートの反応ウェルにおいて組み合わせた。マルチウェルプレートをＰａｎｔｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ装置に配置し、熱循環に供した。リアルタイム増幅及び検出反応を、一般に４５サイクル（８秒間の９５℃での変性並びに２５秒間の６０℃でのアニーリング及び伸長）にわたる、熱循環によって実施し、３０秒毎に蛍光発光測定値を取った。標的核酸についての蛍光曲線プロファイルを、Ｃｔ及びＲＦＵシグナルについて評価した。
実施例２－分析感度－細菌検出限界
多重化プライマー－プローブ組み合わせを使用して、６つの個々の細菌生物の標的核酸の検出限界（ＬｏＤ）を決定するために分析感度実験を行った。実験で使用されるプライマー及びプローブを表１に示す。各生物の既知のストック濃度（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能）を、生便マトリックスにおいて段階的に希釈して、各生物について一連の５つの希釈濃度を提供した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｈｉｇａ Ｔｏｘｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７（ＳＴＥＣ ｓｔｘ１及びＳＴＥＣ ｓｔｘ２）を各々段階的に希釈して、以下の濃度を提供した：１，０００ＣＦＵ／ｍＬ、５００ＣＦＵ／ｍＬ、３００ＣＦＵ／ｍＬ、１５０ＣＦＵ／ｍＬ、及び１００ＣＦＵ／ｍＬ。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉを段階的に希釈して、以下の濃度を提供した：１，０００ＣＦＵ／ｍＬ、５００ＣＦＵ／ｍＬ、３００ＣＦＵ／ｍＬ、１００ＣＦＵ／ｍＬ、及び７５ＣＦＵ／ｍＬ。希釈の各々を５の反復で試験し、Ｃｔ及びＲＦＵデータを表２に示す。次いで、各生物について１００％陽性であった最も低い濃度を、２０の反復（生便マトリックス及びＣａｒｙ－Ｂｌａｉｒ便マトリックスの両方で作製された希釈液）で更に試験し、Ｃｔ及びＲＦＵデータを表３に示す。試料処理、標的捕捉、増幅、及び検出反応は、概して、本明細書に記載されるように実施した。内部対照核酸は、各増幅反応に存在した。
この実験からのデータは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、ＳＴＥＣ ｓｔｘ１、及びＳＴＥＣ ｓｔｘ２について少なくとも１００ＣＦＵ／ｍＬと低い濃度で１００％陽性（５／５）を示した。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉは、３００ＣＦＵ／ｍＬで１００％陽性であり、１００ＣＦＵ／ｍＬで８０％陽性（４／５）であり、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉは、７５ＣＦＵ／ｍＬで１００％陽性であった。確認試験は、２つの異なる便マトリックスにおいて、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、ＳＴＥＣ ｓｔｘ１、及びＳＴＥＣ ｓｔｘ２の各々について１００％陽性（２０／２０）を示した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、生便マトリックスにおいて９０％陽性、Ｃａｒｙ－Ｂｌａｉｒ便マトリックスにおいて９５％陽性であった。これらのデータは、多重プライマー／プローブ組み合わせが７５～１５０ＣＦＵ／ｍＬの感度を有することを示す。
実施例３－Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの増幅及び検出のためのプライマー－プローブ組み合わせ
いくつかのプライマー及びプローブ組み合わせを調製し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａの増幅及び検出について試験した。組み合わせを以下の表４に記載する。これらのプライマー－プローブ組み合わせを、３つの濃度の段階的に希釈されたストック濃度のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａに対して試験した。希釈液を試料輸送試薬にし、５００ＣＦＵ／ｍＬ、１５０ＣＦＵ／ｍＬ、及び５０ＣＦＵ／ｍＬ濃度を試験した。陰性反応ウェルは、試料輸送培地であった。反応条件を３通りに設定し、リアルタイム増幅及び検出反応を実施した。ＲＦＵ及びＣｔ結果を表５に示す。
プライマー及びプローブ組み合わせ１及び２は、この実験では陰性結果のみを示し、よって結果は表５に示されない。組み合わせ３～７の各々は、バックグラウンドに対して堅牢なＲＦＵを示した。組み合わせ４及び５は、この実験において最も堅牢なＲＦＵ及び最も速いＣｔを示した。
実施例４－分析的特異性及び干渉
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ及びＣ．ｃｏｌｉ、未分化）、及びＳＴＥＣ（ｓｔｘ－１及びｓｔｘ－２未分化）を検出するための例示的な多重化アッセイについての分析的特異性を試験した。アッセイを、表１のプライマー及びプローブ組み合わせ並びに循環パラメータを利用したリアルタイム、多重化ＰＣＲ反応として実行した。
ＰＣＲアッセイの分析的特異性は、表６及び表６．１に列挙される１７個のパネルに分けられた合計８１個の生物を使用して決定した。これらの８１個の生物は、便試料（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能な生物）において一般的に見出される。１７個の生物パネルを陰性Ｃａｒｙ－Ｂｌａｉｒ便マトリックスにスパイクした。生物の濃度は、１Ｅ６ ｒＲＮＡコピー／ｍＬの濃度を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｅｇｇｌｅｒｔｈｅｌｌａ ｌｅｎｔａ、及びＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｃｒｏｓ、並びに１Ｅ４細胞／ｍＬの濃度を有するＥｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａを除いて、各試験において１Ｅ６ＣＦＵ／ｍＬであった。陽性対照は、３倍ＬｏＤでＣａｒｙ－Ｂｌａｉｒ便マトリックスにスパイクされたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（株Ｖ１７９６）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ（株ＲＯ ２６８）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（株２４５７０）、及びＳＴＥＣ（株ＣＤＣ １９９９－３３０２）であった。陰性対照は、Ｃａｒｙ－Ｂｌａｉｒ便マトリックスのみであった。反応を３通りに実行した。反応性又は陽性は、各チャネルについてＣｔ閾値を超える増幅曲線として定義した。この閾値を下回る任意の曲線は、陰性又は反応性ではないとみなされた。使用されたＣｔ閾値は、以下であった：ＦＡＭ、６００；ＨＥＸ、１０００；ＲＯＸ、５００；Ｑ６７０、６００；及びＱ７０５、１０００。結果を、表７、表７．１、表８、及び表８．１に示す。
Figure 2024526908000008
プライマー及びプローブは、表７に示されるように、表６に列挙されるチャレンジ生物のいずれとも反応しなかった。また、表８において示されるように、標的細菌が反応ウェルに存在したとき、プライマー及びプローブは１００％陽性を示した。よって、これらのプライマー及びプローブは、便に一般的に見出されるか、又は標的生物と同様の疾患状態を引き起こす生物との交差反応性を実証しない。プライマー及びプローブは、一般的に見出される非標的生物の存在下であっても、高い特異性を示した。
加えて、Ｓｈｉｇｅｌｌａ及びＥＩＥＣは、実質的に同一のｉｐａＨ遺伝子を有するため、Ｓｈｉｇｅｌｌａプライマー及びプローブは、表７．１に示されるように、表６．１における生物と反応した。また、表８．１において示されるように、標的細菌が反応ウェルに存在したとき、プライマー及びプローブも１００％陽性を示した。そのようなものとして、Ｓｈｉｇｅｌｌａプライマー及びプローブは、試料中のＥＩＥＣの存在を検出するために使用され得る。
実施例５－Ｓｈｉｇｅｌｌａプライマー及びプローブスクリーニング
いくつかのプライマー及びプローブ組み合わせを調製し、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉの増幅及び検出について試験した。組み合わせを以下の表９に記載する。これらのプライマー－プローブ組み合わせを、３つの濃度の段階的に希釈されたストック濃度のＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉに対して試験した。希釈液を試料輸送試薬にし、５００ＣＦＵ／ｍＬ、１５０ＣＦＵ／ｍＬ、及び５０ＣＦＵ／ｍＬ濃度を試験した。陰性反応ウェルは、試料輸送培地であった。反応条件を３通りに設定し、リアルタイム増幅及び検出反応を実施した。ＲＦＵ及びＣｔ結果を分析し、以下に示す。
結果は、各プライマー－プローブ組み合わせについて１００％陽性（１，０００ＲＦＵで設定されたＣｔ閾値）を示した。プライマー－プローブ組み合わせ２は、最も高いＲＦＵ（５００ｃｆｕ／ｍＬで約１２，０００ＲＦＵ）を示したが、５０ｃｆｕ／ｍＬでは、反復のうちの１つは、約２，０００ＲＦＵまで落ちたが、他の２つの反復は、約８，０００ＲＦＵであった。プライマー－プローブ組み合わせ１．２は、試験された反復条件について一貫したＲＦＵ及びＣｔ値で良好な全体的な結果を示した。ＲＦＵ及びＣｔ結果を表１０に示す。
実施例６－共感染／競合的干渉
多重化ＰＣＲアッセイにおいて、表１に示されるプライマー－プローブ組み合わせを使用して、単一試料中の２つ以上の標的生物を検出する性能を測定した。共感染した試料を作製するために、陰性Ｃａｒｙ－Ｂｌａｉｒ便マトリックスを、表１１に示されるように、高濃度（１Ｅ６ ＣＦＵ／ｍＬ）及び低濃度（３ｘＬｏＤ）の標的生物の組み合わせでスパイクした。プライマー－プローブ組み合わせを、共感染物質の不在下で低濃度の標的生物に対して試験し、低濃度の標的生物及び高濃度の別個の標的生物の組み合わせで更に試験した（表１２を参照されたい）。
全ての標的細菌の高濃度及び低濃度の両方の検出は、１００％であった。偽陽性はなく、競合的干渉は観察されなかった。データは、プライマー－プローブ組み合わせが、多重化ＰＣＲを使用して単一試料中に存在する複数の標的細菌を正確に検出することができることを示す。
実施例７－α－シクロデキストリン及び／又はポリソルベート２０での増幅反応の阻害の軽減
例えば、洗浄緩衝液中に存在する洗剤は、核酸増幅反応を阻害又は減少させることが知られている。そのような負の／阻害効果を軽減するα－シクロデキストリン及びポリソルベート２０の能力を調査するために、洗剤を含有する試料で試験するためにいくつかのＰＣＲ反応混合物を調製した。
０．４６Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼ、０．５Ｕ／μＬの逆転写酵素、０．２Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、０．０５ｍＭのｄＵＴＰ、８１及び５．１ｍＭのＫＣｌ及びＭｇＣｌ２を含む無機塩、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、並びに標的核酸の増幅及び検出のためのプライマー及びプローブを含有するようにマスターミックスを調製した。マスターミックスを、条件（Ａ）～（Ｆ）に分離し、条件（Ｂ）及び（Ｄ）は、ポリソルベート２０を０．０２５％（ｖ／ｖ）で更に含有し、条件（Ｂ）、（Ｃ）、及び（Ｆ）は、１２．５ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリンを更に含有し、条件（Ｃ）は、ポリソルベート２０を０．１３％（ｖ／ｖ）で更に含有し、条件（Ｅ）は、５０ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリンを更に含有した。標的核酸を好適な培地中にスパイクすることによって試料を調製し、ポリ－Ｔコーティングされた磁性微粒子及び標的捕捉オリゴマーを含有する緩衝試薬中でインキュベートして、標的核酸を磁性固体支持体に結合した。磁性微粒子及び結合核酸を分離し、追加の分離及び洗浄後、核酸を含有する溶出液を回収した。溶出液を別々の容器に分割し、溶出液部分のうちの１つを３０％（ｖ／ｖ）の洗浄緩衝液で更にスパイクして、１００ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶出液を産生して、上流試料処理ステップからの洗浄緩衝液のキャリーオーバーをシミュレートした。上記マスターミックス条件（Ａ）～（Ｆ）の各々を、洗浄緩衝液スパイク又は非スパイク溶出液（反復当たり２０μＬのマスターミックス、１０μＬの溶出液、３０μＬの総反応体積）のアリコートと組み合わせた。よって、各反応混合物中のポリソルベート２０及び／又はα－シクロデキストリンの最終濃度は、マスターミックスについて上に列挙された濃度の２／３であった。リアルタイム増幅及び検出反応を反復のために設定し、熱循環装置（Ｐａｎｔｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して反応を行った。結果を以下の表１３に示す。
α－シクロデキストリン及びポリソルベート２０の反応混合物への添加は、洗剤が核酸増幅反応に及ぼす負の／阻害効果を軽減した。Ｃｔ及びＲＦＵ値は、これらの２つの試薬の組み合わせが、α－シクロデキストリン又はポリソルベート２０のいずれかを単独で使用して観察される軽減効果と比較して、洗剤誘導阻害に対して相乗的な軽減効果を有したことを更に示す。

Claims (30)

  1. 少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、（ａ）～（ｅ）：
    （ａ）（ｉ）配列番号１２及び配列番号１４、（ｉｉ）配列番号２１及び配列番号４７、（ｉｉｉ）配列番号３８及び配列番号３６、（ｉｖ）配列番号３５及び配列番号４０、（ｖ）配列番号１２及び配列番号２８、（ｖｉ）配列番号４２及び配列番号３１、又は（ｖｉｉ）配列番号４１及び配列番号２７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、
    （ｂ）（ｉ）配列番号１１及び配列番号１９のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、
    （ｃ）（ｉ）配列番号８及び配列番号１０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、
    （ｄ）（ｉ）配列番号１５及び配列番号１７、（ｉｉ）配列番号３４及び配列番号２２、又は（ｉｉｉ）配列番号３２及び配列番号３３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、並びに
    （ｅ）（ｉ）配列番号２０及び配列番号３、（ｉｉ）配列番号４９及び配列番号３、又は（ｉｉｉ）配列番号４及び配列番号７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、Ｓｈｉｇａｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも１つを含む、オリゴヌクレオチドのセット。
  2. 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  3. 前記Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  4. 前記Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  5. 前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  6. 前記ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  7. 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及び前記ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも２つを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  8. 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及び前記ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも３つを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  9. 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及び前記ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットのうちの少なくとも４つを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  10. 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセット、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセット、及び前記ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  11. 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１２及び配列番号１４のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
    前記Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１１及び配列番号１９のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
    前記Ｃ．ｃｏｌｉ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号８及び配列番号１０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
    前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１５及び配列番号１７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含み、
    前記ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、（ｉ）配列番号２０及び配列番号３並びに（ｉｉ）配列番号４及び配列番号７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む、直前の請求項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  12. 前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１２及び配列番号１４のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１３、
    前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１２及び配列番号２８のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１３、
    前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号２１及び配列番号４７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４５、
    前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３８及び配列番号３６のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４４、配列番号２６、若しくは配列番号２５、
    前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３５及び配列番号４０のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号３０、
    前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４２及び配列番号３１のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号２３、又は
    前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４１及び配列番号２７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ検出プローブを更に含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  13. Ｓｈｉｇｅｌｌａ検出プローブを更に含み、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ検出プローブが、
    前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号１５及び配列番号１７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１６、
    前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３４及び配列番号２２のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号４６若しくは配列番号２９、又は
    前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号３２及び配列番号３３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号２４のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、請求項１１又は１２に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  14. ＳＴＥＣ検出プローブを更に含み、前記ＳＴＥＣ検出プローブが、
    前記ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号２０及び配列番号３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号４８、
    前記ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４９及び配列番号３のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号４８、又は
    前記ＳＴＥＣ特異的増幅オリゴマーセットが、配列番号４及び配列番号７のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列をそれぞれ含む第１及び第２のオリゴマーを含む場合、配列番号５若しくは配列番号６のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  15. Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ検出プローブを更に含み、前記Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ検出プローブが、配列番号１８のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、請求項３～１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  16. Ｃ．ｃｏｌｉ検出プローブを更に含み、前記Ｃ．ｃｏｌｉ検出プローブが、配列番号９、配列番号３７、又は配列番号３９のヌクレオチド配列に実質的に対応する標的ハイブリダイゼーション配列を含む、請求項４～１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  17. 前記検出プローブのうちの１つ以上、又は各々が、蛍光色素化合物を含む、請求項１２～１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  18. 前記検出プローブの各々が、非蛍光クエンチング色素化合物を更に含む、直前の請求項に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
  19. 少なくとも１つの腸内病原体の存在又は不在を決定するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、
    配列番号１５（ヌクレオチド７及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号１６、
    配列番号１９（ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２１（ヌクレオチド１３、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２３（ヌクレオチド２、５、７、及び１４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２５（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２６（ヌクレオチド９、１８、及び２３の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２７（ヌクレオチド６、１０、及び１８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２８（ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３０（ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３１（ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３２（ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３６（ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３８（ヌクレオチド４、６、７、及び８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３９（ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４０（ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４２、
    配列番号４３（ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４４（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４５（ヌクレオチド３、６、８、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４７（ヌクレオチド１１、１６、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号１（ヌクレオチド６、７、９、１４、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２（ヌクレオチド５、８、１１、１３、１８、及び２１の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号６（ヌクレオチド３、７、８、１５、２０、２４、及び２７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号７（ヌクレオチド３、４、１８、及び１９の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号９（ヌクレオチド２、６、１３、１６、２３、２６、２８、及び２９の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号１２（ヌクレオチド４、１１、１２、及び１６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号１８（ヌクレオチド７及び１２の各々又はヌクレオチド７、１２、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２２（ヌクレオチド５及び１６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３７（ヌクレオチド１７、２２、２３、及び２７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、及び
    配列番号４６（ヌクレオチド５、１１、及び１２の各々が、５－メチルシトシンを含む）のうちのいずれか１つの配列を含む、オリゴヌクレオチド。
  20. 請求項１～１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット又は請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドを含む、キット。
  21. 請求項１～１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット又は請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドを含む、反応混合物。
  22. α－シクロデキストリン又はポリソルベート２０を更に含む、直前の請求項に記載の反応混合物。
  23. 洗剤を更に含む、請求項２１又は２２に記載の反応混合物。
  24. 前記洗剤が、ドデシル硫酸ナトリウムを含む、直前の請求項に記載の反応混合物。
  25. 多重化方法であって、
    （１）試料であって、前記少なくとも１つの腸内病原体を含有することが疑われる前記試料を、請求項１～５６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセットと接触させることと、
    （２）インビトロ核酸増幅反応を実施することであって、任意のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣ標的核酸が、前記試料中に存在する場合、前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣ標的領域に対応する１つ以上の増幅産物を生成するための鋳型として使用される、実施することと、
    （３）前記１つ以上の増幅産物の存在又は不在を検出し、
    それによって前記試料中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、及びＳＴＥＣのうちの少なくとも１つの存在又は不在を決定することと、を含む、多重化方法。
  26. （３）が、
    前記試料を、前記Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ検出プローブ、前記Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ検出プローブ、前記Ｃ．ｃｏｌｉ検出プローブ、前記Ｓｈｉｇｅｌｌａ検出プローブ、及び前記ＳＴＥＣ検出プローブのうちの少なくとも１つと接触させること、
    前記試料に対して電気泳動を実施すること、又は
    前記１つ以上の増幅産物の前記配列を、存在する場合、決定すること、を含む、直前の請求項に記載の多重化方法。
  27. オリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、
    （ａ）少なくとも１つの核酸塩基残基を含む固体支持体を得るステップであって、前記少なくとも１つの核酸塩基残基が、前記固体支持体に３’位で共有結合している、ステップと、
    （ｂ）前記固体支持体から最も遠い前記核酸塩基残基の５’位を、別の核酸塩基残基の３’位に結合するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）を追加の少なくとも１３回繰り返し、それによって前記固体支持体に結合した少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を生成するステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）において生成された前記少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を切断し、それによって前記オリゴヌクレオチドを得るステップと、を含み、
    前記オリゴヌクレオチドが、
    配列番号１５（ヌクレオチド７及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号１６、
    配列番号１９（ヌクレオチド１、２、７、１４、１５、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２１（ヌクレオチド１３、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２３（ヌクレオチド２、５、７、及び１４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２５（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２６（ヌクレオチド９、１８、及び２３の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２７（ヌクレオチド６、１０、及び１８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２８（ヌクレオチド２、４、１２、１４、１５、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３０（ヌクレオチド２、４、１８、１９、及び２０の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３１（ヌクレオチド６、７、８、１３、２３、２４、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３２（ヌクレオチド５、１１、１２、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３６（ヌクレオチド２、３、４、１６、１８、１９、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３８（ヌクレオチド４、６、７、及び８の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３９（ヌクレオチド２、９、１２、１９、２２、２４、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４０（ヌクレオチド４、１３、１８、及び２２の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４２、
    配列番号４３（ヌクレオチド２、９、１２、１６、１７、２２、２３、及び２６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４４（ヌクレオチド７、９、１３、及び１５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４５（ヌクレオチド３、６、８、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号４７（ヌクレオチド１１、１６、及び１７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号１（ヌクレオチド６、７、９、１４、１７、及び２４の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２（ヌクレオチド５、８、１１、１３、１８、及び２１の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号６（ヌクレオチド３、７、８、１５、２０、２４、及び２７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号７（ヌクレオチド３、４、１８、及び１９の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号９（ヌクレオチド２、６、１３、１６、２３、２６、２８、及び２９の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号１２（ヌクレオチド４、１１、１２、及び１６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号１８（ヌクレオチド７及び１２の各々又はヌクレオチド７、１２、及び２５の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号２２（ヌクレオチド５及び１６の各々が、５－メチルシトシンを含む）、
    配列番号３７（ヌクレオチド１７、２２、２３、及び２７の各々が、５－メチルシトシンを含む）、及び
    配列番号４６（ヌクレオチド５、１１、及び１２の各々が、５－メチルシトシンを含む）のうちのいずれか１つの配列を含む、方法。
  28. 前記オリゴヌクレオチドが、１８～３２個の連続した核酸塩基残基、又は２０～３０個の連続した核酸塩基残基の長さを有する、請求項２７に記載の方法。
  29. 第１のオリゴヌクレオチドを合成することと、第２のオリゴヌクレオチドを合成することと、を含む、一対のオリゴヌクレオチドを合成するための方法であって、
    前記第１のオリゴヌクレオチドを合成すること及び前記第２のオリゴヌクレオチドを合成することの各々が、
    （ａ）少なくとも１つの核酸塩基残基を含む固体支持体を得るステップであって、前記少なくとも１つの核酸塩基残基が、前記固体支持体に３’位で共有結合している、ステップと、
    （ｂ）前記固体支持体から最も遠い前記核酸塩基残基の５’位を、別の核酸塩基残基の３’位に結合するステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）を追加の少なくとも１３回繰り返し、それによって前記固体支持体に結合した少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を生成するステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）において生成された前記少なくとも１５個の連続した核酸塩基残基を切断し、それによって前記オリゴヌクレオチドを得るステップと、を含み、
    前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドが、それぞれ、
    配列番号１２及び配列番号１４、
    配列番号２１及び配列番号４７、
    配列番号３８及び配列番号３６、
    配列番号３５及び配列番号４０、
    配列番号１２及び配列番号２８、
    配列番号４２及び配列番号３１、
    配列番号４１及び配列番号２７、
    配列番号１１及び配列番号１９、
    配列番号８及び配列番号１０、
    配列番号１５及び配列番号１７、
    配列番号３４及び配列番号２２、
    配列番号３２及び配列番号３３、
    配列番号４９及び配列番号３、
    配列番号２０及び配列番号３、並びに
    配列番号４及び配列番号７のうちのいずれか１つの配列を含む、方法。
  30. 前記第１のオリゴヌクレオチド及び前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、１８～３２個の連続した核酸塩基残基、又は２０～３０個の連続した核酸塩基残基の長さを有する、請求項２９に記載の方法。
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