JP2024525190A - 腫瘍評価のための物質及び方法 - Google Patents

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Abstract

本出願は、腫瘍を評価するための、物質及び方法に関する。特に、本出願は、対象における腫瘍発症のリスク及び／又は腫瘍進行を評価するための、物質、キット、デバイス、システム及び方法を提供する。例えば、本出願は、対象から選択された標的ポリヌクレオチド配列のメチル化状態に基づいて、対象における腫瘍形成リスク及び／又は腫瘍進行を評価する方法を提供する。

Description

本出願は、生物医学の分野に関し、具体的には、腫瘍を評価するための、物質及び方法に関する。

背景技術
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）等の膵癌は、世界で最も致死的な疾患の１つである。その５年相対生存率は９％であり、遠隔転移を有する患者については、この率はわずか３％にさらに低下する。高い死亡率の主な理由は、ＰＤＡＣの早期検出のための方法が依然として限定されており、ＰＤＡＣ患者にとって外科的切除を受けることが重要であることである。超音波内視鏡下穿刺吸引法（ＥＵＳ－ＦＮＡ）は、開腹手術を行わずに病理診断を得るための別の一般的な方法であるが、侵襲的であり、ＰＤＡＣが既に進行していることを通常意味する明確な画像所見を必要とする。腫瘍の発生及び発症中に、悪性細胞におけるＤＮＡメチル化パターン及びゲノムＤＮＡのレベルに大きな変化が生じる。いくつかの腫瘍特異的ＤＮＡメチル化は、腫瘍形成の初期に起こることが示されており、腫瘍形成の「促進因子」であり得る。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）分子は、アポトーシス又は壊死腫瘍細胞に由来し、初期悪性腫瘍からの腫瘍特異的ＤＮＡメチル化マーカを有する。近年、様々な癌に対する非侵襲的早期スクリーニングツールの開発のための新たな有望な標的として研究されている。しかしながら、これらの研究のほとんどは、有効な結果をもたらさなかった。
したがって、血漿ＤＮＡから膵癌腫瘍特異的マーカを同定することができる物質及び方法が当技術分野において緊急に必要とされている。

本出願は、試料中の標的遺伝子及び／又は標的配列のメチル化レベルを検出し、その検出結果の差次的な遺伝子メチル化レベルを用いて、膵癌を特定することにより、より高精度、低コストで、膵癌を非侵襲的かつ正確に診断することを目的とする。
一態様では、本出願は、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬を提供し、試薬は、検出対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを検出するための試薬を含み、ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＤＭＲＴＡ２、ＦＯＸＤ３、ＴＢＸ１５、ＢＣＡＮ、ＴＲＩＭ５８、ＳＩＸ３、ＶＡＸ２、ＥＭＸ１、ＬＢＸ２、ＴＬＸ２、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＢＲ１、ＥＶＸ２、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ４、ＴＯＰＡＺ１、ＳＨＯＸ２、ＤＲＤ５、ＲＰＬ９、ＨＯＰＸ、ＳＦＲＰ２、ＩＲＸ４、ＴＢＸ１８、ＯＬＩＧ３、ＵＬＢＰ１、ＨＯＸＡ１３、ＴＢＸ２０、ＩＫＺＦ１、ＩＮＳＩＧ１、ＳＯＸ７、ＥＢＦ２、ＭＯＳ、ＭＫＸ、ＫＣＮＡ６、ＳＹＴ１０、ＡＧＡＰ２、ＴＢＸ３、ＣＣＮＡ１、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＯＴＸ２、Ｃ１４ｏｒｆ３９、ＢＮＣ１、ＡＨＳＰ、ＺＦＨＸ３、ＬＨＸ１、ＴＩＭＰ２、ＺＮＦ７５０、ＳＩＭ２又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数又は全てから選択される。本出願は、配列番号１～５６に示される配列を包含する、上述の遺伝子から選択される標的配列を膵癌関連遺伝子として有するメチル化マーカをさらに提供する。本出願はさらに、上記の標的遺伝子及び／又は標的配列ＤＮＡ配列又はその断片及び／又はそのメチル化情報を担持する培地及びデバイスを提供する。また、本出願は、上記の標的遺伝子及び／又は標的配列ＤＮＡ配列又はその断片、及び／又はそのメチル化情報の、対象の膵癌の診断用キットの調製における、使用を提供する。本出願は、上記のキットをさらに提供する。
別の態様では、本出願は、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬を提供し、試薬は、検出される対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを検出するための試薬を含み、ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列、又はその２０ｋｂ上流若しくは下流の配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、及びＣＩＬＰ２のうちの１つ若しくは複数（少なくとも７つ等）又は全てから選択される。本出願は、配列番号５７～５９に示される配列を包含する、上述の遺伝子から選択される標的配列を膵癌関連遺伝子として有するメチル化マーカをさらに提供する。本出願はさらに、上記の標的遺伝子及び／又は標的配列ＤＮＡ配列又はその断片及び／又はそのメチル化情報を担持する培地及びデバイスを提供する。また、本出願は、上記の標的遺伝子及び／又は標的配列ＤＮＡ配列又はその断片、及び／又はそのメチル化情報の、対象の膵癌の診断用キットの調製における、使用を提供する。本出願は、上記のキットをさらに提供する。
別の態様では、本出願は、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬を提供し、試薬は、検出対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを検出するための試薬を含み、ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＡＲＨＧＥＦ１６、ＰＲＤＭ１６、ＮＦＩＡ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＰＲＲＸ１、ＬＨＸ４、ＡＣＢＤ６、ＦＭＮ２、ＣＨＲＭ３、ＦＡＭ１５０Ｂ、ＴＭＥＭ１８、ＳＩＸ３、ＣＡＭＫＭＴ、ＯＴＸ１、ＷＤＰＣＰ、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＤＹＳＦ、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ４、ＵＢＥ２Ｆ、ＲＡＭＰ１、ＡＭＴ、ＰＬＳＣＲ５、ＺＩＣ４、ＰＥＸ５Ｌ、ＥＴＶ５、ＤＧＫＧ、ＦＧＦ１２、ＦＧＦＲＬ１、ＲＮＦ２１２、ＤＯＫ７、ＨＧＦＡＣ、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＨＭＸ１、ＣＰＺ、ＩＲＸ１、ＧＤＮＦ、ＡＧＧＦ１、ＣＲＨＢＰ、ＰＩＴＸ１、ＣＡＴＳＰＥＲ３、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＰＭ１、ＴＬＸ３、ＮＫＸ２－５、ＢＮＩＰ１、ＰＲＯＰ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＩＲＦ４、ＦＯＸＦ２、ＦＯＸＱ１、ＦＯＸＣ１、ＧＭＤＳ、ＭＯＣＳ１、ＬＲＦＮ２、ＰＯＵ３Ｆ２、ＦＢＸＬ４、ＣＣＲ６、ＧＰＲ３１、ＴＢＸ２０、ＨＥＲＰＵＤ２、ＶＩＰＲ２、ＬＺＴＳ１、ＮＫＸ２－６、ＰＥＮＫ、ＰＲＤＭ１４、ＶＰＳ１３Ｂ、ＯＳＲ２、ＮＥＫ６、ＬＨＸ２、ＤＤＩＴ４、ＤＮＡＪＢ１２、ＣＲＴＡＣ１、ＰＡＸ２、ＨＩＦ１ＡＮ、ＥＬＯＶＬ３、ＩＮＡ、ＨＭＸ２、ＨＭＸ３、ＭＫＩ６７、ＤＰＹＳＬ４、ＳＴＫ３２Ｃ、ＩＮＳ、ＩＮＳ－ＩＧＦ２、ＡＳＣＬ２、ＰＡＸ６、ＲＥＬＴ、ＦＡＭ１６８Ａ、ＯＰＣＭＬ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＶＰＲ１Ａ、ＬＨＸ５、ＳＤＳＬ、ＲＡＢ２０、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＡＲＫＤ、ＣＡＲＳ２、ＳＯＸ１、ＴＥＸ２９、ＳＰＡＣＡ７、ＳＦＴＡ３、ＳＩＸ６、ＳＩＸ１、ＩＮＦ２、ＴＭＥＭ１７９、ＣＲＩＰ２、ＭＴＡ１、ＰＩＡＳ１、ＳＫＯＲ１、ＩＳＬ２、ＳＣＡＰＥＲ、ＰＯＬＧ、ＲＨＣＧ、ＮＲ２Ｆ２、ＲＡＢ４０Ｃ、ＰＩＧＱ、ＣＰＮＥ２、ＮＬＲＣ５、ＰＳＫＨ１、ＮＲＮ１Ｌ、ＳＲＲ、ＨＩＣ１、ＨＯＸＢ９、ＰＲＡＣ１、ＳＭＩＭ５、ＭＹＯ１５Ｂ、ＴＮＲＣ６Ｃ、９－Ｓｅｐ、ＴＢＣＤ、ＺＮＦ７５０、ＫＣＴＤ１、ＳＡＬＬ３、ＣＴＤＰ１、ＮＦＡＴＣ１、ＺＮＦ５５４、ＴＨＯＰ１、ＣＡＣＴＩＮ、ＰＩＰ５Ｋ１Ｃ、ＫＤＭ４Ｂ、ＰＬＩＮ３、ＥＰＳ１５Ｌ１、ＫＬＦ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＮＫＸ２－４、ＮＫＸ２－２、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＲＡＥ１、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＡＲＦＲＰ１、ＭＹＨ９及びＴＸＮ２又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数（少なくとも７等）又は全てから選択される。本出願は、配列番号６０～１６０に示される配列を包含する、上述の遺伝子から選択される標的配列を膵癌関連遺伝子として有するメチル化マーカをさらに提供する。本出願はさらに、上記の標的遺伝子及び／又は標的配列ＤＮＡ配列又はその断片及び／又はそのメチル化情報を担持する培地及びデバイスを提供する。また、本出願は、上記の標的遺伝子及び／又は標的配列ＤＮＡ配列又はその断片、及び／又はそのメチル化情報の、対象の膵癌の診断用キットの調製における、使用を提供する。本出願は、上記のキットをさらに提供する。
別の態様では、本出願は、患者の血漿試料中のＤＮＡメチル化を検出し、標的メチル化マーカのメチル化度データとＣＡ１９－９検出結果とに基づいて、膵癌をより高精度かつ低コストで非侵襲的かつ正確に診断する目的を達成するために、膵癌を診断するための機械学習モデルを構築することを提供する。また、本出願は、（１）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルと、対象のＣＡ１９－９レベルとを取得すること、（２）メチル化状態若しくはレベルを用いて演算し、メチル化スコアを得る数理モデルを用いること、（３）メチル化スコアとＣＡ１９－９レベルとをデータマトリックスに合成すること、（４）データマトリックスに基づいて膵癌診断モデルを構築すること、及び任意に（５）膵癌スコアを得、膵癌スコアに基づいて膵癌を診断することを含む、膵癌の診断又は膵癌診断モデルの構築方法を提供する。１つ又は複数の実施形態では、ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数（例えば、少なくとも２つ）又は全てから選択される。好ましくは、ＤＮＡ配列は、以下の組合せのいずれかから選択される遺伝子配列を包含する：（１）ＳＩＸ３、ＴＬＸ２；（２）ＳＩＸ３、ＣＩＬＰ２；（３）ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２；（４）ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２。また、本出願は、（１）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルと、対象のＣＡ１９－９レベルとを取得すること、（２）メチル化状態又はレベルを用いて数理モデルを用いて算出し、メチル化スコアを取得すること、（３）以下に示すモデルであって、

式中、Ｍは工程（２）で計算された試料のメチル化スコアであり、Ｃは試料のＣＡ１９－９レベルであるモデルに基づいて膵癌スコアを取得し、膵癌スコアに基づいて膵癌を診断することを含む、膵癌の診断方法を提供する。１つ又は複数の実施形態では、ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数（例えば、少なくとも２つ）又は全てから選択される。好ましくは、ＤＮＡ配列は、以下の組合せのいずれかから選択される遺伝子配列を包含する：（１）ＳＩＸ３、ＴＬＸ２；（２）ＳＩＸ３、ＣＩＬＰ２；（３）ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２；（４）ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２。また、本出願は、（１）対象におけるゲノムＤＮＡセグメントのメチル化ハプロタイプ分率及び配列決定デプスを取得し、任意に、（２）メチル化ハプロタイプ分率及び配列決定デプスデータを前処理し、（３）特徴メチル化セグメントを取得するためにクロスバリデーション増分特徴選択を行い、（４）特徴メチル化セグメントのメチル化検出結果についての数学モデルを構築し、メチル化スコアを取得し、（５）メチル化スコア及び対応するＣＡ１９－９レベルに基づいて、膵癌診断モデルを構築する、膵癌診断モデルの構築方法を提供する。１つ又は複数の実施形態において、工程（１）は、１．１）配列決定リードデータを得るために、対象の試料のＤＮＡメチル化を検出すること、１．２）場合により、アダプタ及び／又はスプライシングを除去する等、配列決定データを前処理すること、１．３）メチル化セグメントの位置及び配列決定デプス情報を得るために、配列決定データを参照ゲノムにアラインメントすること、１．４）以下の式であって、

式中、ｉは標的メチル化領域を表し、ｈは標的メチル化ハプロタイプを表し、Ｎｉは標的メチル化領域に位置するリードの数を表し、Ｎｉ、ｈは標的メチル化ハプロタイプを含むリードの数を表す、
式に従ってセグメントのメチル化ハプロタイプ分率（ＭＨＦ）を計算することを含む。本出願は、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬若しくはデバイス、及びＣＡ１９－９レベルを検出するための試薬若しくはデバイスの、膵癌診断用キットの調製における、使用であって、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬若しくはデバイスが、対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを決定するために使用される、使用をさらに提供する。本出願は、上記のキットをさらに提供する。また、本出願は、メモリと、プロセッサと、メモリに格納され、プロセッサで実行可能なコンピュータプログラムと、を包含し、プロセッサがプログラムを実行することにより、工程が実現される、膵癌の診断又は膵癌診断モデルの構築デバイスを提供する。
別の態様では、本出願は、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、及び／又はＴＷＩＳＴ１又はそれらの断片を有するＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、膵腫瘍の存在を決定する、膵腫瘍の発症を評価する、及び／又は膵腫瘍の進行を評価する方法を提供する。さらに、本出願は、試験される試料中の、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、疾患の存在を決定する、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法を提供する。さらに、本出願は、上記断片の修飾状態を同定するためのプローブ及び／又はプライマーの組合せを提供する。また、本出願は、上記物質を含むキットを提供する。別の態様において、本出願は、疾患検出製品の調製における本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットの使用を提供する。別の態様では、本出願は、疾患の存在を決定し、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価し、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットの使用を提供する。別の態様では、本出願は、本出願の方法を実行することができるプログラムを記録した記憶媒体を提供する。別の態様では、本出願は、本出願の記憶媒体を含むデバイスを提供する。
別の態様では、本出願は、試験される試料中の遺伝子ＥＢＦ２及びＣＣＮＡ１、又はＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２及びＥＭＸ１、又はＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３及びＥＮ２、又はＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３、又はそれらの断片を有するＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、膵腫瘍の存在を決定する、膵腫瘍の発症を評価する、及び／又は膵腫瘍の進行を評価する方法を提供する。さらに、本出願は、試験される試料中の、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、又はヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、又はヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、又はヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、及びヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、疾患の存在を決定する、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法を提供する。さらに、本出願は、上記断片の修飾状態を同定するためのプローブ及び／又はプライマーの組合せを提供する。また、本出願は、上記の物質組合せを含むキットを提供する。別の態様において、本出願は、疾患検出製品の調製における本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットの使用を提供する。別の態様では、本出願は、疾患の存在を決定し、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価し、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットの使用を提供する。別の態様では、本出願は、本出願の方法を実行することができるプログラムを記録した記憶媒体を提供する。別の態様では、本出願は、本出願の記憶媒体を含むデバイスを提供する。
当業者は、以下の詳細な説明から本出願の他の態様及び利点を容易に理解するであろう。以下の詳細な説明では、本出願の例示的な実施形態のみを示し、説明する。当業者が理解するように、本出願の内容は、当業者が本出願によって網羅される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に変更を加えることを可能にする。したがって、本出願の明細書における図面及び説明は例示的なものにすぎず、限定的なものではない。
本出願が関連する本発明の特定の特徴は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本出願が関連する本発明の特徴及び利点は、以下に詳細に説明する例示的な実施形態及び図面を参照することによってよりよく理解することができる。図面の簡単な説明は以下の通りである。
本出願の一実施形態による技術的解決策のフローチャートである。 試験群の膵癌診断用の膵癌予測モデルＭｏｄｅｌ ＣＮのＲＯＣ曲線を、横軸を「偽陽性率」、縦軸を「真陽性率」として示す図である。 各群における膵癌予測モデルＭｏｄｅｌＣＮの予測スコア分布を、縦軸を「モデル予測値」として示す図である。 訓練群における配列番号１～５６の５６配列のメチル化レベルを縦軸に「メチル化レベル」として示す図である。 試験群における配列番号１～５６の５６配列のメチル化レベルを縦軸に「メチル化レベル」として示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」をとり、ＣＡ１９－９単独、本出願単独で構築したＳＶＭモデルＣＮ、及び本出願とＣＡ１９－９を組み合わせて構築したモデルについての分類ＲＯＣ曲線を示す図である。 縦軸に「モデル予測値」をとり、ＣＡ１９－９単独、本出願単独で構築したＳＶＭモデルＭｏｄｅｌＣＮ、及び本出願とＣＡ１９－９を組み合わせて構築したモデルについての分類予測スコアの分布を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を用いて、腫瘍マーカＣＡ１９－９に関して陰性と決定された試料（ＣＡ１９－９測定値が３７未満）において、本出願で構築したＳＶＭモデルＣＮのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号９、１４、１３、２６、４０、４３、５２の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号５、１８、３４、４０、４３、４５、４６の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号１１、８、２０、４４、４８、５１、５４の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号１４、８、２６、２４、３１、４０、４６の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号３、９、８、２９、４２、４０、４１の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号５、８、１９、７、４４、４７、５３の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号１２、１７、２４、２８、４０、４２、４７の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号５、１８、１４、１０、８、１９、２７の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号６、１２、２０、２６、２４、４７、５０の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 横軸に「偽陽性率」、縦軸に「真陽性率」を有する、配列番号１、１９、２７、３４、３７、４６、４７の７つのマーカの組合せモデルのＲＯＣ曲線を示す図である。 訓練群と試験群の慢性膵炎と膵癌を鑑別する膵癌予測モデルのＲＯＣ曲線を、横軸を「偽陽性率」、縦軸を「真陽性率」として示す図である。 各群の膵癌予測モデルの予測スコア分布を示し、縦軸が「モデル予測値」である。 訓練群における３つのメチル化マーカのメチル化度を、縦軸を「メチル化度」として示す図である。 試験群における３つのメチル化マーカのメチル化レベルを、縦軸を「メチル化レベル」として示す図である。 従来の方法（すなわち、ＣＡ１９－９測定値が３７未満である）で測定した陰性検体における膵癌診断用の膵癌予測モデルのＲＯＣ曲線を、横軸を「偽陽性率」、縦軸を「真陽性率」として示す図である。 本出願に係る特徴マトリックスに基づいてメチル化マーカをスクリーニングするためのフローチャートを示す図である。 １０１個のマーカの予測スコアの分布を示す図である。 １０１個のマーカのＲＯＣ曲線を示す図である。 ６つのマーカの予測スコアの分布を示す図である。 ６つのマーカのＲＯＣ曲線を示す図である。 ７つのマーカの予測スコアの分布を示す図である。 ７つのマーカのＲＯＣ曲線を示す図である。 １０個のマーカの予測スコアの分布を示す図である。 １０個のマーカのＲＯＣ曲線を示す図である。 ＤＵＡＬＭＯＤＥＬマーカの予測スコアの分布を示す図である。 ＤＵＡＬＭＯＤＥＬマーカのＲＯＣ曲線を示す図である。 ＡＬＬＭＯＤＥＬマーカの予測スコアの分布を示す図である。 ＡＬＬＭＯＤＥＬマーカのＲＯＣ曲線を示す図である。 本発明の一実施形態による技術的解決策のフローチャートを示す図である。 訓練群における３つのメチル化マーカのメチル化レベルの分布を示す図である。 試験群における３つのメチル化マーカのメチル化レベルの分布を示す図である。 試験セットにおけるＣＡ１９－９、膵癌及び膵炎の分化予測モデルｐｐ＿ｍｏｄｅｌ及びｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌのＲＯＣ曲線を示す図である。 試験セット試料におけるＣＡ１９－９、膵癌及び膵炎の分化予測モデルｐｐ＿ｍｏｄｅｌ及びｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌの予測スコアの分布（最大値及び最小値を用いて正規化した値）を示す図である。
発明の詳細な説明
以下、具体例を挙げて本出願発明の実施形態を説明する。当業者は、本明細書の開示から本出願発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。

用語の定義
本出願において、「試験される試料」という用語は、通常、試験される必要がある試料を指す。例えば、試験される試料上の１つ又は複数の遺伝子領域が修飾されているかどうかを検出することができる。
本出願において、「無細胞核酸」又は「ｃｆＤＮＡ」という用語は、一般に、収集されたときに細胞内に含まれない試料中のＤＮＡを指す。例えば、無細胞核酸は、細胞又は組織のインビトロ破壊によって非細胞内にされたＤＮＡを示さない場合がある。例えば、ｃｆＤＮＡは、正常細胞及び癌細胞の両方に由来するＤＮＡを包含し得る。例えば、ｃｆＤＮＡは、血液又は血漿（「循環系」）から得ることができる。例えば、ｃｆＤＮＡは、壊死又はアポトーシス等の分泌又は細胞死方法を介して循環系に放出され得る。
本出願において、「相補的核酸」という用語は、一般に、参照ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を指す。例えば、相補的核酸は、場合により反対の向きを有する核酸分子であり得る。例えば、相補性は、以下の相補的会合：グアニン及びシトシン；アデニン及びチミン；アデニン及びウラシルを有することを指し得る。
本出願において、「ＤＮＡ領域」という用語は、一般に、２つ以上の共有結合した天然に存在する又は修飾されたデオキシリボヌクレオチドの配列を指す。例えば、遺伝子のＤＮＡ領域は、遺伝子が位置する特定のデオキシリボヌクレオチド配列の位置を指すことができ、例えば、デオキシリボヌクレオチド配列は遺伝子をコードする。例えば、本出願のＤＮＡ領域は、ＤＮＡ領域の全長、その相補的領域、又はその断片を包含する。例えば、本出願で提供される検出領域の上流及び下流の少なくとも約２０ｋｂの配列を検出部位として使用することができる。例えば、本出願で提供される検出領域の上流及び下流の少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約３ｋｂ、少なくとも約２ｋｂ、少なくとも約１ｋｂ、又は少なくとも約０．５ｋｂの配列を検出部位として使用することができる。例えば、適切なプライマー及びプローブは、試料のメチル化を検出するためにマイクロコンピュータを使用して上記のものに従って設計することができる。
本出願において、「修飾状態」という用語は、一般に、本出願における遺伝子断片、ヌクレオチド又はそれらの塩基の修飾状態を指す。例えば、本出願における修飾状態は、シトシンの修飾状態を指し得る。例えば、本出願における修飾状態を有する遺伝子断片は、変化した遺伝子発現活性を有し得る。例えば、本出願における修飾状態は、塩基のメチル化修飾を指し得る。例えば、本出願における修飾状態は、例えば５－メチルシトシン（５ｍＣ）になり得るゲノムＤＮＡのＣｐＧ領域中のシトシンの５’炭素位置におけるメチル基の共有結合を指し得る。例えば、修飾状態は、ＤＮＡ配列内の５－メチルシトシン（「５－ｍＣｙｔ」）の存在又は非存在を指し得る。
本出願において、「メチル化」とは、本出願における遺伝子断片、ヌクレオチド又はそれらの塩基のメチル化状態を総称する。例えば、本出願において遺伝子が位置するＤＮＡセグメントは、１つ又は複数の鎖にメチル化を有し得る。例えば、本出願において遺伝子が位置するＤＮＡセグメントは、１つ又は複数の部位にメチル化を有していてもよい。
本出願において、「変換」という用語は、一般に、１つ又は複数の構造の別の構造への変換を指す。例えば、本出願における変換は具体的であり得る。例えば、メチル化修飾を伴わないシトシンは、変換後に他の構造（例えば、ウラシル）に変化し得、メチル化修飾を伴うシトシンは、変換後に基本的に変化しないままであり得る。例えば、メチル化修飾を伴わないシトシンは、変換後に切断され得、メチル化修飾を伴うシトシンは、変換後に基本的に変化しないままであり得る。
本出願において、「脱アミノ化試薬」という用語は、一般に、アミノ基を除去する能力を有する物質を指す。例えば、脱アミノ化試薬は、未修飾シトシンを脱アミノ化することができる。
本出願において、「バイサルファイト」という用語は、一般に、修飾状態を有するＤＮＡ領域を修飾状態を有さないものと区別することができる試薬を指す。例えば、バイサルファイトは、バイサルファイト、又はその類似体、又はそれらの組合せを包含し得る。例えば、バイサルファイトは、修飾されていないシトシンのアミノ基を脱アミノ化して、修飾されたシトシンと区別することができる。本出願において、「類似体」という用語は、一般に、同様の構造及び／又は機能を有する物質を指す。例えば、バイサルファイトの類似体は、バイサルファイトと同様の構造を有し得る。例えば、バイサルファイト類似体は、修飾状態を有するＤＮＡ領域と修飾状態を有さないＤＮＡ領域とを区別することもできる試薬を指し得る。
本出願において、「メチル化感受性制限酵素」とは、一般に、その認識部位のメチル化状態に応じて核酸を選択的に消化する酵素をいう。例えば、認識部位がメチル化されていない場合に特異的に切断する制限酵素の場合、認識部位がメチル化されている場合には、切断が起こらないか、又は切断が著しく効率が低下して起こり得る。認識部位がメチル化されているときに特異的に切断する制限酵素については、認識部位がメチル化されていないときには、切断が起こらないか、又は著しく効率が低下して起こり得る。例えば、メチル化特異的制限酵素は、ＣＧジヌクレオチド（例えば、ｃｇｃｇ又はｃｃｃｇｇｇ）を含む配列を認識することができる。
本出願において、「腫瘍」という用語は、一般に、正常な成長及び／又は発達中に制御の少なくとも部分的な喪失を示す細胞及び／又は組織を指す。例えば、一般的な腫瘍又は癌細胞は、接触阻害を失っていることが多く、浸潤性及び／又は転移する能力を有し得る。例えば、本出願の腫瘍は良性又は悪性であり得る。
本出願において、「進行」という用語は、一般に、疾患のそれほど重症でない状態からより重症な状態への変化を指す。例えば、腫瘍の進行は、腫瘍の数又は重症度、癌細胞転移の程度、癌が成長又は拡大する速度の増加を包含し得る。例えば、腫瘍進行は、ステージＩからステージＩＩ、ステージＩＩからステージＩＩＩ等の、それほど重症でない状態からより重症な状態への癌の進行を包含し得る。
本出願において、「発症」という用語は、一般に、個体における病変の発生を指す。例えば、腫瘍を発症した場合、個体は腫瘍患者と診断され得る。
本出願において、「蛍光ＰＣＲ」という用語は、一般に、定量的又は半定量的ＰＣＲ技術を指す。例えば、ＰＣＲ技術は、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応、定量ポリメラーゼ連鎖反応又は動的ポリメラーゼ連鎖反応であり得る。例えば、標的核酸の初期量は、インターカレーティング蛍光色素又は配列特異的プローブの助けを借りてＰＣＲ増幅を使用することによって定量的に検出することができ、配列特異的プローブは、それが標的核酸にハイブリダイズする場合にのみ検出可能な蛍光レポーターを含むことができる。
本出願において、「ＰＣＲ増幅」という用語は、一般にポリメラーゼ連鎖反応を指す。例えば、本出願におけるＰＣＲ増幅は、ＤＮＡ増幅に使用するために現在知られている任意のポリメラーゼ連鎖増幅反応を含み得る。
本出願において、「蛍光Ｃｔ値」という用語は、一般に、標的核酸の定量的又は半定量的評価のための測定値を指す。例えば、蛍光シグナルが設定された閾値に達するときに経験される増幅反応サイクルの数を指すことができる。
発明の詳細な説明
本出願のメチル化核酸断片マーカに基づいて、膵癌を効果的に同定することができ、本出願は、血漿ｃｆＤＮＡハイスループットメチル化シーケンシングに基づく、ｃｆＤＮＡメチル化マーカと膵癌との間の関係の診断モデルを提供する。このモデルは、非侵襲的で安全かつ便利な検出、高スループット及び高検出特異性という利点を有する。本出願で得られた最適なシーケンシングに基づいて、良好な検出効果を達成しながら検出コストを効果的に制御することができる。本発明のＤＮＡメチル化マーカに基づいて、膵癌患者と慢性膵炎患者とを効果的に鑑別することができる。本発明は、血漿ｃｆＤＮＡハイスループットメチル化シーケンシングに基づく、ｃｆＤＮＡメチル化マーカのメチル化レベルと膵癌との関係の診断モデルを提供する。このモデルは、非侵襲的で安全かつ便利な検出、高スループット及び高検出特異性という利点を有する。本発明で得られた最適なシーケンシングに基づいて、良好な検出効果を達成しながら検出コストを効果的に制御することができる。
本出願は、膵癌の特性が、以下の遺伝子：ＤＭＲＴＡ２、ＦＯＸＤ３、ＴＢＸ１５、ＢＣＡＮ、ＴＲＩＭ５８、ＳＩＸ３、ＶＡＸ２、ＥＭＸ１、ＬＢＸ２、ＴＬＸ２、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＢＲ１、ＥＶＸ２、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ４、ＴＯＰＡＺ１、ＳＨＯＸ２、ＤＲＤ５、ＲＰＬ９、ＨＯＰＸ、ＳＦＲＰ２、ＩＲＸ４、ＴＢＸ１８、ＯＬＩＧ３、ＵＬＢＰ１、ＨＯＸＡ１３、ＴＢＸ２０、ＩＫＺＦ１、ＩＮＳＩＧ１、ＳＯＸ７、ＥＢＦ２、ＭＯＳ、ＭＫＸ、ＫＣＮＡ６、ＳＹＴ１０、ＡＧＡＰ２、ＴＢＸ３、ＣＣＮＡ１、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＯＴＸ２、Ｃ１４ｏｒｆ３９、ＢＮＣ１、ＡＨＳＰ、ＺＦＨＸ３、ＬＨＸ１、ＴＩＭＰ２、ＺＮＦ７５０、ＳＩＭ２又はその２０ｋｂ上流若しくは下流の配列から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０の遺伝子のメチル化レベルに関連することを見出した。１つ又は複数の実施形態では、膵癌の特性は、以下の組合せ：（１）ＬＢＸ２、ＴＢＲ１、ＥＶＸ２、ＳＦＲＰ２、ＳＹＴ１０、ＣＣＮＡ１、ＺＦＨＸ３；（２）ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ４、ＩＮＳＩＧ１、ＳＹＴ１０、ＣＣＮＡ１、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ；（３）ＥＭＸ１、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＯＰＡＺ１、ＺＩＣ２、ＯＴＸ２、ＡＨＳＰ、ＴＩＭＰ２；（４）ＥＭＸ１、ＥＶＸ２、ＲＰＬ９、ＳＦＲＰ２、ＨＯＸＡ１３、ＳＹＴ１０、ＣＬＥＣ１４Ａ；（５）ＴＢＸ１５、ＥＭＸ１、ＬＢＸ２、ＯＬＩＧ３、ＳＹＴ１０、ＡＧＡＰ２、ＴＢＸ３；（６）ＴＲＩＭ５８、ＶＡＸ２、ＥＭＸ１、ＨＯＸＤ４、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＬＨＸ１；（７）ＰＯＵ３Ｆ３、ＨＯＸＤ８、ＲＰＬ９、ＴＢＸ１８、ＳＹＴ１０、ＴＢＸ３、ＣＬＥＣ１４Ａ；（８）ＴＲＩＭ５８、ＥＭＸ１、ＴＬＸ２、ＥＶＸ２、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ４、ＩＲＸ４；（９）ＳＩＸ３、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＯＰＡＺ１、ＲＰＬ９、ＳＦＲＰ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＢＮＣ１；（１０）ＤＭＲＴＡ２、ＨＯＸＤ４、ＩＲＸ４、ＩＮＳＩＧ１、ＭＯＳ、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＣＬＥＣ１４Ａのいずれかから選択される遺伝子の配列のメチル化レベルに関連する。本発明は、上記の遺伝子又はその断片の１つ又は複数のＣｐＧを含む核酸分子を提供する。本出願は、膵癌と膵炎（慢性膵炎等）との間の分化が、遺伝子：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２又はその２０ｋｂ上流又は下流内の以下の配列から選択される１、２、３個の遺伝子のメチル化レベルに関連することを見出した。
本発明において、「遺伝子」という用語は、ゲノム上の目的の遺伝子のコード配列と非コード配列の両方を包含する。非コード配列は、イントロン、プロモータ、調節エレメント又は配列等を包含する。
さらに、膵癌の特性は、ＤＭＲＴＡ２遺伝子領域中の配列番号１、ＦＯＸＤ３遺伝子領域中の配列番号２、ＴＢＸ１５遺伝子領域中の配列番号３、ＢＣＡＮ遺伝子領域中の配列番号４、ＴＲＩＭ５８遺伝子領域中の配列番号５、ＳＩＸ３遺伝子領域中の配列番号６、ＶＡＸ２遺伝子領域中の配列番号７、ＥＭＸ１遺伝子領域中の配列番号８、ＬＢＸ２遺伝子領域中の配列番号９、ＴＬＸ２遺伝子領域中の配列番号１０、ＰＯＵ３Ｆ３遺伝子領域中の配列番号１１及び配列番号１２、ＴＢＲ１遺伝子領域中の配列番号１３、ＥＶＸ２遺伝子領域の配列番号１４及び配列番号１５、ＨＯＸＤ１２遺伝子領域の配列番号１６、ＨＯＸＤ８遺伝子領域の配列番号１７、ＨＯＸＤ４遺伝子領域の配列番号１８及び配列番号１９、ＴＯＰＡＺ１遺伝子領域の配列番号２０、ＳＨＯＸ２遺伝子領域の配列番号２１、ＤＲＤ５遺伝子領域の配列番号２２、ＲＰＬ９遺伝子領域の配列番号２３及び配列番号２４、ＨＯＰＸ遺伝子領域の配列番号２５、ＳＦＲＰ２遺伝子領域の配列番号２６、ＩＲＸ４遺伝子領域の配列番号２７、ＴＢＸ１８遺伝子領域の配列番号２８、ＯＬＩＧ３遺伝子領域の配列番号２９、ＵＬＢＰ１遺伝子領域の配列番号３０、ＨＯＸＡ１３遺伝子領域の配列番号３１、ＴＢＸ２０遺伝子領域の配列番号３２、ＩＫＺＦ１遺伝子領域の配列番号３３、ＩＮＳＩＧ１遺伝子領域の配列番号３４、ＳＯＸ７遺伝子領域の配列番号３５、ＥＢＦ２遺伝子領域の配列番号３６、ＭＯＳ遺伝子領域の配列番号３７、ＭＫＸ遺伝子領域の配列番号３８、ＫＣＮＡ６遺伝子領域の配列番号３９、ＳＹＴ１０遺伝子領域の配列番号４０、ＡＧＡＰ２遺伝子領域の配列番号４１、ＴＢＸ３遺伝子領域の配列番号４２、ＣＣＮＡ１遺伝子領域における配列番号４３、ＺＩＣ２遺伝子領域における配列番号４４及び配列番号４５、ＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子領域における配列番号４６及び配列番号４７、ＯＴＸ２遺伝子領域における配列番号４８、Ｃ１４ｏｒｆ３９遺伝子領域における配列番号４９、ＢＮＣ１遺伝子領域における配列番号５０、ＡＨＳＰ遺伝子領域における配列番号５１、ＺＦＨＸ３遺伝子領域における配列番号５２、ＬＨＸ１遺伝子領域における配列番号５３、ＴＩＭＰ２遺伝子領域における配列番号５４、ＺＮＦ７５０遺伝子領域における配列番号５５及びＳＩＭ２遺伝子領域における配列番号５６から選択される任意の１つ又はランダムな２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５個のセグメント又は５６個全てのセグメントのメチル化レベルに関連する。
いくつかの実施形態では、膵癌の特性は、以下の組合せ：（１）配列番号９、配列番号１３、配列番号１４、配列番号２６、配列番号４０、配列番号４３、配列番号５２、（２）配列番号５、配列番号１８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６、（３）配列番号８、配列番号１１、配列番号２０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５４、（４）配列番号８、配列番号１４、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３１、配列番号４０、配列番号４６、（５）配列番号３、配列番号８、配列番号９、配列番号２９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、（６）配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１９、配列番号４４、配列番号４７、配列番号５３、（７）配列番号１２、配列番号１７、配列番号２４、配列番号２８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４７、（８）配列番号５、配列番号８、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２７、（９）配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２４、配列番号２６、配列番号４７、配列番号５０、（１０）配列番号１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４６、配列番号４７又はその相補配列のいずれかから選択される配列のメチル化レベルに関連する。
本明細書に記載される「膵癌関連配列」は、上記の５０個の遺伝子、その２０ｋｂ上流又は下流内の配列、上記の５６個の配列（配列番号１～５６）又はその相補的配列、サブ領域、及び／又は処理された配列を包含する。
ヒト染色体における上記の５６個の配列の位置は以下の通りである：配列番号１：ｃｈｒ１の５０８８４５０７－５０８８５２０７ｂｐｓ、配列番号２：ｃｈｒ１の６３７８８６１１－６３７８９１５２ｂｐｓ、配列番号３：ｃｈｒ１の１１９５２２１４３－１１９５２２７１９ｂｐｓ、配列番号４：ｃｈｒ１の１５６６１１７１０－１５６６１２２１１ｂｐｓ、配列番号５：ｃｈｒ１の２４８０２０３９１－２４８０２０９７９ｂｐｓ、配列番号６：ｃｈｒ２の４５０２８７９６－４５０２９３７８ｂｐｓ、配列番号７：ｃｈｒ２の７１１１５７３１－７１１１６２７２ｂｐｓ、配列番号８：ｃｈｒ２の７３１４７３３４－７３１４７８３５ｂｐｓ、配列番号９：ｃｈｒ２の７４７２６４０１－７４７２６９２２ｂｐｓ、配列番号１０：ｃｈｒ２の７４７４２８６１－７４７４３３６２ｂｐｓ、配列番号１１：ｃｈｒ２の１０５４８０１３０－１０５４８０８３０ｂｐｓ、配列番号１２：ｃｈｒ２の１０５４８０１５７－１０５４８０６５９ｂｐｓ、配列番号１３：ｃｈｒ２の１６２２８０２３３－１６２２８０７３６ｂｐｓ、配列番号１４：ｃｈｒ２の１７６９４５０９５－１７６９４５６０１ｂｐｓ、配列番号１５：ｃｈｒ２の１７６９４５３２０－１７６９４５８２１ｂｐｓ、配列番号１６：ｃｈｒ２の１７６９６４６２９－１７６９６５２０９ｂｐｓ、配列番号１７：ｃｈｒ２の１７６９９４５１４－１７６９９５０１５ｂｐｓ、配列番号１８：ｃｈｒ２の１７７０１６９８７－１７７０１７５０１ｂｐｓ、配列番号１９：ｃｈｒ２の１７７０２４３５５－１７７０２４８６６ｂｐｓ、配列番号２０：ｃｈｒ３の４４０６３３３６－４４０６３８９３ｂｐｓ、配列番号２１：ｃｈｒ３の１５７８１２０５７－１５７８１２６０４ｂｐｓ、配列番号２２：ｃｈｒ４の９７８３０２５－９７８３５２７ｂｐｓ、配列番号２３：ｃｈｒ４の３９４４８２７８－３９４４８７７９ｂｐｓ、配列番号２４：ｃｈｒ４の３９４４８３２７－３９４４８８７９ｂｐｓ、配列番号２５：ｃｈｒ４の５７５２１１２７－５７５２１７３６ｂｐｓ、配列番号２６：ｃｈｒ４の１５４７０９３６２－１５４７０９８６７ｂｐｓ、配列番号２７：ｃｈｒ５の１８７６１３６－１８７６６４５ｂｐｓ、配列番号２８：ｃｈｒ６の８５４７６９１６－８５４７７４１７ｂｐｓ、配列番号２９：ｃｈｒ６の１３７８１４４９９－１３７８１５０５３ｂｐｓ、配列番号３０：ｃｈｒ６の１５０２８５５９４－１５０２８６０９５ｂｐｓ、配列番号３１：ｃｈｒ７の２７２４４５２２－２７２４５０３７ｂｐｓ、配列番号３２：ｃｈｒ７の３５２９３４３５－３５２９３９５０ｂｐｓ、配列番号３３：ｃｈｒ７の５０３４３５４３－５０３４４２４３ｂｐｓ、配列番号３４：ｃｈｒ７の１５５１６７３１２－１５５１６７８２８ｂｐｓ、配列番号３５：ｃｈｒ８の１０５８８６９２－１０５８９２５３ｂｐｓ、配列番号３６：ｃｈｒ８の２５９０７６４８－２５９０８１５０ｂｐｓ、配列番号３７：ｃｈｒ８の５７０６９４５０－５７０７０１５０ｂｐｓ、配列番号３８：ｃｈｒ１０の２８０３４４０４－２８０３４９０８ｂｐｓ、配列番号３９：ｃｈｒ１２の４９１８９４１－４９１９４８９ｂｐｓ、配列番号４０：ｃｈｒ１２の３３５９２６１２－３３５９３１１７ｂｐｓ、配列番号４１：ｃｈｒ１２の５８１３１０９５－５８１３１６５４ｂｐｓ、配列番号４２：ｃｈｒ１２の１１５１２４７６３－１１５１２５３４８ｂｐｓ、配列番号４３：ｃｈｒ１３の３７００５４４４－３７００５９４５ｂｐｓ、配列番号４４：ｃｈｒ１３の１００６４９４６８－１００６４９９９５ｂｐｓ、配列番号４５：ｃｈｒ１３の１００６４９５１３－１００６５００２７ｂｐｓ、配列番号４６：ｃｈｒ１４の３８７２４４１９－３８７２４９３５ｂｐｓ、配列番号４７：ｃｈｒ１４の３８７２４６０２－３８７２５１０８ｂｐｓ、配列番号４８：ｃｈｒ１４の５７２７５６４６－５７２７６１６２ｂｐｓ、配列番号４９：ｃｈｒ１４の６０９５２３８４－６０９５２９３３ｂｐｓ、配列番号５０：ｃｈｒ１５の８３９５２０５９－８３９５２５９５ｂｐｓ、配列番号５１：ｃｈｒ１６の３１５７９９７０－３１５８０５６１ｂｐｓ、配列番号５２：ｃｈｒ１６の７３０９６７７３－７３０９７４７３ｂｐｓ、配列番号５３：ｃｈｒ１７の３５２９９６９４－３５３００２２４ｂｐｓ、配列番号５４：ｃｈｒ１７の７６９２９６２３－７６９３０１７６ｂｐｓ、配列番号５５：ｃｈｒ１７の８０８４６６１７－８０８４７２１０ｂｐｓ、配列番号５６：ｃｈｒ２１の３８０８１２４７－３８０８１７５２ｂｐｓここで、配列の塩基及びメチル化部位には、参照ゲノムＨＧ１９に対応する番号が付されている。
１つ又は複数の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、ＤＭＲＴＡ２、ＦＯＸＤ３、ＴＢＸ１５、ＢＣＡＮ、ＴＲＩＭ５８、ＳＩＸ３、ＶＡＸ２、ＥＭＸ１、ＬＢＸ２、ＴＬＸ２、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＢＲ１、ＥＶＸ２、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ４、ＴＯＰＡＺ１、ＳＨＯＸ２、ＤＲＤ５、ＲＰＬ９、ＨＯＰＸ、ＳＦＲＰ２、ＩＲＸ４、ＴＢＸ１８、ＯＬＩＧ３、ＵＬＢＰ１、ＨＯＸＡ１３、ＴＢＸ２０、ＩＫＺＦ１、ＩＮＳＩＧ１、ＳＯＸ７、ＥＢＦ２、ＭＯＳ、ＭＫＸ、ＫＣＮＡ６、ＳＹＴ１０、ＡＧＡＰ２、ＴＢＸ３、ＣＣＮＡ１、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＯＴＸ２、Ｃ１４ｏｒｆ３９、ＢＮＣ１、ＡＨＳＰ、ＺＦＨＸ３、ＬＨＸ１、ＴＩＭＰ２、ＺＮＦ７５０、ＳＩＭ２から選択される１つ又は複数の遺伝子の断片であり、断片の長さは１ｂｐ－１ｋｂ、好ましくは１ｂｐ－７００ｂｐであり、断片は、染色体領域中の対応する遺伝子の１つ又は複数のメチル化部位を含む。
本明細書に記載される遺伝子又はその断片におけるメチル化部位には、それだけに限らないが、ｃｈｒ１染色体５０８８４５１４、５０８８４５３１、５０８８４５３３、５０８８４５４１、５０８８４５４４、５０８８４５４７、５０８８４５５０、５０８８４５５２、５０８８４５６６、５０８８４５８２、５０８８４５８６、５０８８４５８９、５０８８４５９１、５０８８４５９８、５０８８４６０６、５０８８４６１０、５０８８４６１２、５０８８４６１５、５０８８４６２１、５０８８４６３３、５０８８４６４６、５０８８４６４９、５０８８４６５８、５０８８４６６２、５０８８４６７３、５０８８４６８２、５０８８４６９１、５０８８４６９９、５０８８４７０２、５０８８４７２４、５０８８４７３２、５０８８４７３５、５０８８４７４２、５０８８４７５１、５０８８４７５４、５０８８４７７４、５０８８４７７７、５０８８４７８０、５０８８４７８３、５０８８４７８６、５０８８４７８９、５０８８４７９２、５０８８４７９５、５０８８４７９８、５０８８４８０１、５０８８４８０４、５０８８４８０７、５０８８４８０９、５０８８４８２０、５０８８４８２２、５０８８４８２５、５０８８４８４９、５０８８４８５２、５０８８４８６８、５０８８４８７１、５０８８４８８５、５０８８４８８９、５０８８４９０２、５０８８４９２４、５０８８４９３９、５０８８４９４２、５０８８４９４５、５０８８４９４８、５０８８４９７５、５０８８４９８０、５０８８４９８３、５０８８４９９９、５０８８５００１、６３７８８６２８、６３７８８６６０、６３７８８６７２、６３７８８６８５、６３７８８６８９、６３７８８７０３、６３７８８７０６、６３７８８７０９、６３７８８７２１、６３７８８７４１、６３７８８７４４、６３７８８７４７、６３７８８７５３、６３７８８７５９、６３７８８７６８、６３７８８７７６、６３７８８７８５、６３７８８７８９、６３７８８７９５、６３７８８８０４、６３７８８８１６、６３７８８８２２、６３７８８８２５、６３７８８８２８、６３７８８８４９、６３７８８８５２、６３７８８８６１、６３７８８８７０、６３７８８８７２、６３７８８８７８、６３７８８８８１、６３７８８８８９、６３７８８８９７、６３７８８９０２、６３７８８９０６、６３７８８９１７、６３７８８９２０、６３７８８９３３、６３７８８９４７、６３７８８９８３、６３７８８９８７、６３７８８９９３、６３７８８９９９、６３７８９００４、６３７８９０１１、６３７８９０１４、６３７８９０２０、６３７８９０２２、６３７８９０２５、６３７８９０３１、６３７８９０３５、６３７８９０４７、６３７８９０５６、６３７８９０５９、６３７８９０６８、６３７８９０７１、６３７８９０７３、６３７８９０７７、６３７８９０８０、６３７８９０８３、６３７８９０９２、６３７８９０９４、６３７８９１０１、６３７８９１０６、６３７８９１０９、６３７８９１２４、

１１９５２２１７２、１１９５２２１８８、１１９５２２１９０、１１９５２２２３３、１１９５２２２３９、１１９５２２３１３、１１９５２２３６８、１１９５２２３８６、１１９５２２３９３、１１９５２２４０９、１１９５２２４２５、１１９５２２４２７、１１９５２２４３６、１１９５２２４４０、１１９５２２４４４、１１９５２２４４６、１１９５２２４４９、１１９５２２４５１、１１９５２２４５６、１１９５２２４５９、１１９５２２４６４、１１９５２２４６９、１１９５２２４７４、１１９５２２４８６、１１９５２２４８８、１１９５２２５００、１１９５２２５０２、１１９５２２５１６、１１９５２２５２９、１１９５２２５３７、１１９５２２５４８、１１９５２２５５０、１１９５２２５５９、１１９５２２５６３、１１９５２２５６６、１１９５２２５７１、１１９５２２５７７、１１９５２２５７９、１１９５２２５８２、１１９５２２５９４、１１９５２２５９９、１１９５２２６０７、１１９５２２６１５、１１９５２２６２１、１１９５２２６２９、１１９５２２６３１、１１９５２２６３７、１１９５２２６６５、１１９５２２６７３、

１５６６１１７１３、１５６６１１７２０、１５６６１１７３３、１５６６１１７３７、１５６６１１７４９、１５６６１１７５２、１５６６１１７６１、１５６６１１７６７、１５６６１１７８４、１５６６１１７９１、１５６６１１７９７、１５６６１１８０２、１５６６１１８１１、１５６６１１８１３、１５６６１１８１９、１５６６１１８３０、１５６６１１８３６、１５６６１１８４２、１５６６１１８５１、１５６６１１８６２、１５６６１１８９０、１５６６１１８９３、１５６６１１９０２、１５６６１１９０５、１５６６１１９１５、１５６６１１９２６、１５６６１１９４５、１５６６１１９４９、１５６６１１９５１、１５６６１１９６０、１５６６１１９６３、１５６６１１９９４、１５６６１２００２、１５６６１２０１５、１５６６１２０２４、１５６６１２０３４、１５６６１２０４２、１５６６１２０４４、１５６６１２０７９、１５６６１２０８７、１５６６１２０９０、１５６６１２０９４、１５６６１２０９７、１５６６１２１０５、１５６６１２１４０、１５６６１２１４７、１５６６１２１６６、１５６６１２１８８、１５６６１２１９１、１５６６１２２０４、１５６６１２２０９、

２４８０２０３９９、２４８０２０４１０、２４８０２０４３６、２４８０２０４４７、２４８０２０４５０、２４８０２０４５３、２４８０２０４７０、２４８０２０４９５、２４８０２０４９７、２４８０２０５０７、２４８０２０５１２、２４８０２０５１６、２４８０２０５２０、２４８０２０５２６、２４８０２０５３６、２４８０２０５４３、２４８０２０５５９、２４８０２０５６２、２４８０２０５６６、２４８０２０５７３、２４８０２０５７９、２４８０２０５８１、２４８０２０５８９、２４８０２０５９１、２４８０２０５９８、２４８０２０６２５、２４８０２０６３２、２４８０２０６４１、２４８０２０６７１、２４８０２０６８０、２４８０２０６８８、２４８０２０６９２、２４８０２０６９５、２４８０２０６９７、２４８０２０７０４、２４８０２０７０７、２４８０２０７１３、２４８０２０７２１、２４８０２０７２９、２４８０２０７４１、２４８０２０７４８、２４８０２０７５６、２４８０２０７６５、２４８０２０７７５、２４８０２０７９１、２４８０２０７９５、２４８０２０７９８、２４８０２０８１２、２４８０２０８１４、２４８０２０８２１、２４８０２０８２６、２４８０２０８２８、２４８０２０８３１、２４８０２０８３６、２４８０２０８３８、２４８０２０８４０、２４８０２０８４５、２４８０２０８４８、２４８０２０８６１、２４８０２０８６９、２４８０２０８７８、２４８０２０８８３、２４８０２０８８６、２４８０２０９０２、２４８０２０９０５、２４８０２０９０８、２４８０２０９１４、２４８０２０９２５、２４８０２０９３０、２４８０２０９３４、２４８０２０９３７、２４８０２０９４０、２４８０２０９５３、２４８０２０９５６、２４８０２０９７５；
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ｃｈｒ１２染色体４９１８９６２、４９１８９６６、４９１８９６８、４９１８９７５、４９１８９８２、４９１９００１、４９１９０５６、４９１９０６５、４９１９０７９、４９１９０８１、４９１９０８６、４９１９０９５、４９１９０９７、４９１９１１８、４９１９１２４、４９１９１３８、４９１９１４５、４９１９１４７、４９１９１６４、４９１９１７０、４９１９１７３、４９１９１８４、４９１９１９１、４９１９１９９、４９１９２１５、４９１９２３０、４９１９２３６、４９１９２３９、４９１９２４２、４９１９２５３、４９１９２６０、４９１９２８１、４９１９２９３、４９１９３００、４９１９３０３、４９１９３０９、４９１９３２７、４９１９３３１、４９１９３５１、４９１９３５８、４９１９３７６、４９１９３８６、４９１９３９５、４９１９４０１、４９１９４０８、４９１９４２１、４９１９４２４、４９１９４３０、４９１９４３８、４９１９４５３、４９１９４６５、４９１９４６９、４９１９４７５、４９１９４８６、３３５９２６１５、３３５９２６２９、３３５９２６３５、３３５９２６４２、３３５９２６５９、３３５９２６６１、３３５９２６６３、３３５９２６７４、３３５９２６８１、３３５９２６８３、３３５９２６９２、３３５９２７０４、３３５９２７０７、３３５９２７０９、３３５９２７１１、３３５９２７１５、３３５９２７２０、３３５９２７２５、３３５９２７２７、３３５９２７４４、３３５９２７７４、３３５９２７９８、３３５９２８０３、３３５９２８１１、３３５９２８３１、３３５９２８４８、３３５９２８５９、３３５９２８６２、３３５９２８６５、３３５９２８６７、３３５９２８７５、３３５９２８８２、３３５９２８８５、３３５９２８８７、３３５９２８９１、３３５９２９０５、３３５９２９０８、３３５９２９１３、３３５９２９１５、３３５９２９２３、３３５９２９３１、３３５９２９３３、３３５９２９５３、３３５９２９５５、３３５９２９７７、３３５９２９８１、３３５９２９８６、３３５９２９８９、３３５９２９９８、３３５９３００４、３３５９３０１７、３３５９３０３５、３３５９３０４９、３３５９３０９０、３３５９３０９３、５８１３１１００、５８１３１１０２、５８１３１１１１、５８１３１１３３、５８１３１１５４、５８１３１１６８、５８１３１１７５、５８１３１１８１、５８１３１２２４、５８１３１２４２、５８１３１２６１、５８１３１２７７、５８１３１３００、５８１３１３０３、５８１３１３０６、５８１３１３０９、５８１３１３１２、５８１３１３１８、５８１３１３２１、５８１３１３３１、５８１３１３４５、５８１３１３４８、５８１３１３８４、５８１３１３９０、５８１３１４０４、５８１３１４１２、５８１３１４１４、５８１３１４２６、５８１３１４２９、５８１３１４４５、５８１３１４５３、５８１３１４７５、５８１３１４７８、５８１３１４８７、５８１３１５０３、５８１３１５１０、５８１３１５２３、５８１３１５４６、５８１３１５４９、５８１３１５５３、５８１３１５５７、５８１３１５６４、５８１３１５７１、５８１３１５７６、５８１３１５８６、５８１３１６０５、５８１３１６０８、５８１３１６２４、５８１３１６４２、１１５１２４７６８、１１５１２４７７３、１１５１２４７８２、１１５１２４８１１、１１５１２４８３８、１１５１２４８５３、１１５１２４８７１、１１５１２４８７４、１１５１２４８９４、１１５１２４９０４、１１５１２４９２４、１１５１２４９３０、１１５１２４９３３、１１５１２４９３５、１１５１２４９４６、１１５１２４９７０、１１５１２４９７３、１１５１２４９８１、１１５１２４９９９、１１５１２５０１３、１１５１２５０３４、１１５１２５０５３、１１５１２５０６０、１１５１２５０９８、１１５１２５１０７、１１５１２５１１４、１１５１２５１２１、１１５１２５１３１、１１５１２５１４１、１１５１２５１５１、１１５１２５１７７、１１５１２５１９２、１１５１２５２２５、１１５１２５３０５、１１５１２５３３５；
ｃｈｒ１３染色体３７００５４５２、３７００５４８９、３７００５５０１、３７００５５２０、３７００５５５１、３７００５５５３、３７００５５５７、３７００５５６２、３７００５５６６、３７００５５７０、３７００５５８２、３７００５５９６、３７００５６０８、３７００５６２９、３７００５６３３、３７００５６３５、３７００５６７３、３７００５６７８、３７００５６８６、３７００５６９４、３７００５７０４、３７００５７０６、３７００５７２１、３７００５７３２、３７００５７３８、３７００５７４１、３７００５７４５、３７００５７７３、３７００５７７８、３７００５７９４、３７００５８０１、３７００５８０５、３７００５８１４、３７００５８１６、３７００５８２１、３７００５８３３、３７００５８３５、３７００５８４４、３７００５８５５、３７００５８５７、３７００５８７８、３７００５８８１、３７００５８８３、３７００５８９２、３７００５８９９、３７００５９０９、３７００５９２４、３７００５９２９、３７００５９３４、３７００５９３９、３７００５９４１、１００６４９４８６、１００６４９４８９、１００６４９５１９、１００６４９５３８、１００６４９５６７、１００６４９５６９、１００６４９５７７、１００６４９５８４、１００６４９６０１、１００６４９６０３、１００６４９６０５、１００６４９６２３、１００６４９６２５、１００６４９６２８、１００６４９６４８、１００６４９６７１、１００６４９６７３、１００６４９６８６、１００６４９６８９、１００６４９６９１、１００６４９７０１、１００６４９７０５、１００６４９７１５、１００６４９７１８、１００６４９７２１、１００６４９７２５、１００６４９７３１、１００６４９７３４、１００６４９７３８、１００６４９７４０、１００６４９７４５、１００６４９７６３、１００６４９７６９、１００６４９７７７、１００６４９７８５、１００６４９７９２、１００６４９８００、１００６４９８４７、１００６４９８８６、１００６４９９１２、１００６４９９１５、１００６４９９１７、１００６４９９４１、１００６４９９４５、１００６４９９４９、１００６４９９６５、１００６４９９７５、１００６４９９８２、１００６５０００５；
ｃｈｒ１４染色体３８７２４４３５、３８７２４４５９、３８７２４４７３、３８７２４４８６、３８７２４５０７、３８７２４５１１、３８７２４５２７、３８７２４５３１、３８７２４５３４、３８７２４５４０、３８７２４５４４、３８７２４５４６、３８７２４５６５、３８７２４５７８、３８７２４５８６、３８７２４５９７、３８７２４６２４、３８７２４６２７、３８７２４６４６、３８７２４６４８、３８７２４６５０、３８７２４６６９、３８７２４６７５、３８７２４６８０、３８７２４６８２、３８７２４６８５、３８７２４７２６、３８７２４７３２、３８７２４７３４、３８７２４７４６、３８７２４７６５、３８７２４７７１、３８７２４７８０、３８７２４７９６、３８７２４７９８、３８７２４８０６、３８７２４８０８、３８７２４８１０、３８７２４８２１、３８７２４８４７、３８７２４８５２、３８７２４８５８、３８７２４８６４、３８７２４８６７、３８７２４８７３、３８７２４８９６、３８７２４９０６、３８７２４９２９、３８７２４９３５、３８７２４９４５、３８７２４９７８、３８７２４９９５、３８７２５００３、３８７２５００５、３８７２５０１４、３８７２５０１６、３８７２５０２３、３８７２５０２６、３８７２５０３０、３８７２５０３４、３８７２５０３８、３８７２５０４８、３８７２５０５８、３８７２５０７７、３８７２５０８１、３８７２５０８８、３８７２５１０１、５７２７５６６９、５７２７５６７４、５７２７５６７７、５７２７５６８１、５７２７５６８３、５７２７５６８７、５７２７５６９０、５７２７５７０６、５７２７５７２５、５７２７５７４９、５７２７５７５２、５７２７５７６１、５７２７５７６８、５７２７５７７２、５７２７５７７８、５７２７５７８５、５７２７５８２１、５７２７５８２３、５７２７５８２７、５７２７５８２９、５７２７５８３１、５７２７５８３５、５７２７５８５２、５７２７５８７４、５７２７５８７６、５７２７５８８５、５７２７５８９６、５７２７５９０８、５７２７５９１２、５７２７５９１４、５７２７５９２４、５７２７５９５６、５７２７５９６７、５７２７５９６９、５７２７５９７１、５７２７５９８１、５７２７５９８８、５７２７５９９３、５７２７５９９５、５７２７６０００、５７２７６０３１、５７２７６０３５、５７２７６０３９、５７２７６０５７、５７２７６０６６、５７２７６０７３、５７２７６０９０、６０９５２３９４、６０９５２３９８、６０９５２４０５、６０９５２４１８、６０９５２４２１、６０９５２４２５、６０９５２４６４、６０９５２４６８、６０９５２４８２、６０９５２５００、６０９５２５０３、６０９５２５０５、６０９５２５１７、６０９５２５２２、６０９５２５４４、６０９５２５５０、６０９５２５５４、６０９５２５９３、６０９５２５９９、６０９５２６１５、６０９５２６１８、６０９５２６３４、６０９５２６５８、６０９５２６８３、６０９５２６８７、６０９５２７３０、６０９５２７３８、６０９５２７５５、６０９５２７６２、６０９５２７８１、６０９５２７９１、６０９５２７９９、６０９５２８２７、６０９５２８２９、６０９５２８３６、６０９５２８３９、６０９５２８４１、６０９５２８４８、６０９５２８５５、６０９５２８５７、６０９５２８７０、６０９５２８７６、６０９５２８７８、６０９５２８８７、６０９５２８９６、６０９５２８９８、６０９５２９０８、６０９５２９１９、６０９５２９２１、６０９５２９３１；
ｃｈｒ１５染色体８３９５２０６８、８３９５２０８１、８３９５２０８４、８３９５２０８７、８３９５２０９５、８３９５２１０５、８３９５２１０８、８３９５２１１４、８３９５２１２５、８３９５２１３５、８３９５２１４０、８３９５２１５６、８３９５２１６０、８３９５２１６２、８３９５２１７５、８３９５２１７８、８３９５２１８１、８３９５２１８４、８３９５２１８８、８３９５２２００、８３９５２２０６、８３９５２２０９、８３９５２２１４、８３９５２２２０、８３９５２２２５、８３９５２２２９、８３９５２２３６、８３９５２２３８、８３９５２２４２、８３９５２２６６、８３９５２２８５、８３９５２２９１、８３９５２２９８、８３９５２３０９、８３９５２３１４、８３９５２３１７、８３９５２３４５、８３９５２３５２、８３９５２３５８、８３９５２３６０、８３９５２３６７、８３９５２４０６、８３９５２４１１、８３９５２４１４、８３９５２４１８、８３９５２４２０、８３９５２４２５、８３９５２４３０、８３９５２４５３、８３９５２４６４、８３９５２４７２、８３９５２４８６、８３９５２４９６、８３９５２４９８、８３９５２５００、８３９５２５０６、８３９５２５０８、８３９５２５２７、８３９５２５５３、８３９５２５５９、８３９５２５６６、８３９５２５７０、８３９５２５８２、８３９５２５９２；
ｃｈｒ１６染色体３１５７９９７６、３１５８００７１、３１５８００７８、３１５８００８１、３１５８００８９、３１５８０１００、３１５８０１１０、３１５８０１１７、３１５８０１３８、３１５８０１５０、３１５８０１５３、３１５８０１５９、３１５８０１６５、３１５８０２２０、３１５８０２４６、３１５８０２５４、３１５８０２６９、３１５８０２８７、３１５８０２９６、３１５８０２９９、３１５８０３０９、３１５８０３１１、３１５８０３１６、３１５８０３４３、３１５８０４２４、３１５８０４９６、３１５８０５２４、３１５８０５６０、７３０９６７８６、７３０９６８４２、７３０９６８８９、７３０９６８９４、７３０９６９０３、７３０９６９１４、７３０９６９２３、７３０９６９２９、７３０９６９３４、７３０９６９４３、７３０９６９４８、７３０９６９６６、７３０９６９７０、７３０９６９７９、７３０９７０００、７３０９７０１５、７３０９７０１７、７３０９７０１９、７３０９７０２８、７３０９７０３７、７３０９７０４５、７３０９７０５７、７３０９７０６０、７３０９７０６６、７３０９７０６９、７３０９７０７８、７３０９７０８０、７３０９７０８２、７３０９７０８４、７３０９７１０８、７３０９７１１４、７３０９７１４２、７３０９７１５６、７３０９７１８３、７３０９７２６０、７３０９７２６７、７３０９７２８４、７３０９７２９６、７３０９７３０１、７３０９７３２９、７３０９７３５７、７３０９７３６４、７３０９７３７７、７３０９７３８１、７３０９７３８７、７３０９７４７０；
ｃｈｒ１７染色体３５２９９６９８、３５２９９７０３、３５２９９７１０、３５２９９７１９、３５２９９７２９、３５２９９７３１、３５２９９７４１、３５２９９７４６、３５２９９７７６、３５２９９８１３、３５２９９８１６、３５２９９８２２、３５２９９８３７、３５２９９８５０、３５２９９８７７、３５２９９８８５、３５２９９９１３、３５２９９９１５、３５２９９９２６、３５２９９９２８、３５２９９９３３、３５２９９９３５、３５２９９９４４、３５２９９９４６、３５２９９９６３、３５２９９９６６、３５２９９９７２、３５２９９９７４、３５２９９９９０、３５２９９９９６、３５２９９９９９、３５３００００６、３５３０００１０、３５３０００２０、３５３０００２７、３５３０００３６、３５３０００３９、３５３０００４４、３５３０００５９、３５３０００６８、３５３０００７４、３５３０００８６、３５３０００９７、３５３００１０９、３５３００１１５、３５３００１４６、３５３００１５１、３５３００１６３、３５３００１６７、３５３００１７２、３５３００１９６、３５３００２０２、３５３００２１４、３５３００２１７、３５３００２２１、７６９２９６４５、７６９２９７０９、７６９２９７１３、７６９２９７４２、７６９２９７６９、７６９２９８２９、７６９２９８７３、７６９２９９２６、７６９２９９８２、７６９３００４３、７６９３００９５、７６９３０１４８、７６９３０１６９、８０８４６６２３、８０８４６６５２、８０８４６６８３、８０８４６７０９、８０８４６７１７、８０８４６７３０、８０８４６７４５、８０８４６７６３、８０８４６７９４、８０８４６８６０、８０８４６８６７、８０８４６８８６、８０８４６９６０、８０８４６９６５、８０８４７０７９、８０８４７０９２、８０８４７１１５、８０８４７１２８、８０８４７１３７、８０８４７１５３、８０８４７１５８、８０８４７２０９；
ｃｈｒ２１染色体３８０８１２４８、３８０８１２５３、３８０８１３００、３８０８１３０３、３８０８１３０６、３８０８１３２１、３８０８１３２７、３８０８１３３３、３８０８１３４１、３８０８１３４４、３８０８１３５２、３８０８１３５４、３８０８１３５６、３８０８１３６３、３８０８１３９４、３８０８１３９６、３８０８１４０７、３８０８１４２１、３８０８１４３０、３８０８１４４３、３８０８１４５４、３８０８１４６１、３８０８１４７８、３８０８１４８０、３８０８１４９２、３８０８１４９７、３８０８１４９９、３８０８１５０２、３８０８１５１４、３８０８１５１７、３８０８１５２０、３８０８１５３７、３８０８１５５７、３８０８１５６３、３８０８１５６６、３８０８１５７７、３８０８１５８３、３８０８１５８６、３８０８１６０６、３８０８１６２５、３８０８１６４２、３８０８１６６５、３８０８１６９５、３８０８１７０７、３８０８１７１９、３８０８１７２５、３８０８１７３２が挙げられる。
上記メチル化部位の塩基には、参照ゲノムＨＧ１９に対応する番号が付されている。
１つ又は複数の実施形態において、膵癌と膵炎との間の分化は、以下の組合せ：（１）ＳＩＸ３、ＴＬＸ２；（２）ＳＩＸ３、ＣＩＬＰ２；（３）ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２；（４）ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２のいずれかから選択される遺伝子由来の配列のメチル化レベルと相関する。本発明は、上記の遺伝子又はその断片の１つ又は複数のＣｐＧを含む核酸分子を提供する。
また、膵癌と膵炎との鑑別は、ＳＩＸ３遺伝子領域の配列番号５７、ＴＬＸ２遺伝子領域の配列番号５８、及びＣＩＬＰ２遺伝子領域の配列番号５９から選択されるいずれか一つのセグメント又はランダムな二つ若しくは三つ全てのセグメントのメチル化レベルに関連する。
いくつかの実施形態では、膵癌と膵炎との間の分化は、（１）配列番号５７、配列番号５８、（２）配列番号５７、配列番号５９、（３）配列番号５８、配列番号５９、（４）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、又はそれらの相補配列からなる群のいずれか１つから選択される配列のメチル化レベルと相関する。
本明細書において「膵癌と膵炎との鑑別に関連する配列」とは、上記３遺伝子、その上流又は下流２０ｋｂ以内の配列、上記３配列（配列番号５７～５９）又はそれらの相補配列を包含する。
ヒト染色体における上記３つの配列の位置は以下の通りである：配列番号５７：ｃｈｒ２の４５０２８７８５－４５０２９３０７、配列番号５８：ｃｈｒ２の７４７４２８３４－７４７４３３５１、配列番号５９：ｃｈｒ１９の１９６５０７４５－１９６５１２７０。ここで、配列の塩基及びメチル化部位には、参照ゲノムＨＧ１９に対応する番号が付されている。
１つ又は複数の実施形態において、本明細書中に記載される核酸分子は、ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２から選択される１つ又は複数の遺伝子の断片であり、断片の長さは１ｂｐ－１ｋｂ、好ましくは１ｂｐ－７００ｂｐであり、断片は、染色体領域中の対応する遺伝子の１つ又は複数のメチル化部位を含む。本明細書に記載される遺伝子又はその断片におけるメチル化部位には、それだけに限らないが、以下が含まれる：ｃｈｒ２の４５０２８８０２、４５０２８８１６、４５０２８８３２、４５０２８８３９、４５０２８９５６、４５０２８９６１、４５０２８９６５、４５０２８９７３、４５０２９００４、４５０２９０１７、４５０２９０３５、４５０２９０４６、４５０２９０５７、４５０２９０６０、４５０２９０６３、４５０２９０６５、４５０２９０７１、４５０２９１０６、４５０２９１１２、４５０２９１１７、４５０２９１２８、４５０２９１４６、４５０２９１７６、４５０２９１７９、４５０２９１８４、４５０２９１８９、４５０２９１９２、４５０２９１９５、４５０２９２１８、４５０２９２２６、４５０２９２２８、４５０２９２３１、４５０２９２３５、４５０２９２６３、４５０２９２７３、４５０２９２８５、４５０２９２８８、４５０２９２９５，７４７４２８３８、７４７４２８４０、７４７４２８４４、７４７４２８５５、７４７４２８７９、７４７４２８８２、７４７４２８９１、７４７４２９１３、７４７４２９２２、７４７４２９２５、７４７４２９４２、７４７４２９５０、７４７４２９５３、７４７４２９６７、７４７４２９８１、７４７４２９８４、７４７４２９９６、７４７４３００４、７４７４３００６、７４７４３００９、７４７４３０１１、７４７４３０１５、７４７４３０２１、７４７４３０３５、７４７４３０５６、７４７４３０５９、７４７４３０６１、７４７４３０６４、７４７４３０６８、７４７４３０７３、７４７４３０８２、７４７４３０８４、７４７４３１０１、７４７４３１０８、７４７４３１１１、７４７４３１１９、７４７４３１２１、７４７４３１２７、７４７４３１３１、７４７４３１３７、７４７４３１３９、７４７４３１４１、７４７４３１４６、７４７４３１７２、７４７４３１７４、７４７４３１８２、７４７４３１８６、７４７４３１９１、７４７４３１９５、７４７４３１９８、７４７４３２０７、７４７４３２３１、７４７４３２３４、７４７４３２４１、７４７４３２４３、７４７４３２６８、７４７４３２９５、７４７４３３０１、７４７４３３０６、７４７４３３１８、７４７４３３２１、７４７４３３２５、７４７４３３２９、７４７４３３３３、７４７４３３３６、７４７４３３４３、７４７４３３４６；ｃｈｒ１９の１９６５０７６６、１９６５０７９１、１９６５０７９６、１９６５０８２２、１９６５０８３７、１９６５０８３９、１９６５０８７４、１９６５０８８２、１９６５０８８７、１９６５０８９３、１９６５０８９５、１９６５０８９９、１９６５０９０７、１９６５０９１７、１９６５０９５５、１９６５０９７８、１９６５０９８１、１９６５０９９５、１９６５０９９７、１９６５１００１、１９６５１００８、１９６５１０２０、１９６５１０２８、１９６５１０４１、１９６５１０５３、１９６５１０５９、１９６５１０６２、１９６５１０６５、１９６５１０７１、１９６５１０９０、１９６５１１０１、１９６５１１０９、１９６５１１１１、１９６５１１１３、１９６５１１２１、１９６５１１２３、１９６５１１２７、１９６５１１３３、１９６５１１４２、１９６５１１４４、１９６５１１５１、１９６５１１６６、１９６５１１７０、１９６５１１７３、１９６５１１７６、１９６５１１７９、１９６５１１８３、１９６５１１８５、１９６５１２０２、１９６５１２０４、１９６５１２０６、１９６５１２２５、１９６５１２２７、１９６５１２３５、１９６５１２３７、１９６５１２４３、１９６５１２４６、１９６５１２６３、１９６５１２６７。上記メチル化部位の非変異塩基は、参照ゲノムＨＧ１９に対応してナンバリングされている。
１つ又は複数の実施形態において、膵癌と膵炎との間の分化は、ＡＲＨＧＥＦ１６、ＰＲＤＭ１６、ＮＦＩＡ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＰＲＲＸ１、ＬＨＸ４、ＡＣＢＤ６、ＦＭＮ２、ＣＨＲＭ３、ＦＡＭ１５０Ｂ、ＴＭＥＭ１８、ＳＩＸ３、ＣＡＭＫＭＴ、ＯＴＸ１、ＷＤＰＣＰ、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＤＹＳＦ、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ４、ＵＢＥ２Ｆ、ＲＡＭＰ１、ＡＭＴ、ＰＬＳＣＲ５、ＺＩＣ４、ＰＥＸ５Ｌ、ＥＴＶ５、ＤＧＫＧ、ＦＧＦ１２、ＦＧＦＲＬ１、ＲＮＦ２１２、ＤＯＫ７、ＨＧＦＡＣ、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＨＭＸ１、ＣＰＺ、ＩＲＸ１、ＧＤＮＦ、ＡＧＧＦ１、ＣＲＨＢＰ、ＰＩＴＸ１、ＣＡＴＳＰＥＲ３、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＰＭ１、ＴＬＸ３、ＮＫＸ２－５、ＢＮＩＰ１、ＰＲＯＰ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＩＲＦ４、ＦＯＸＦ２、ＦＯＸＱ１、ＦＯＸＣ１、ＧＭＤＳ、ＭＯＣＳ１、ＬＲＦＮ２、ＰＯＵ３Ｆ２、ＦＢＸＬ４、ＣＣＲ６、ＧＰＲ３１、ＴＢＸ２０、ＨＥＲＰＵＤ２、ＶＩＰＲ２、ＬＺＴＳ１、ＮＫＸ２－６、ＰＥＮＫ、ＰＲＤＭ１４、ＶＰＳ１３Ｂ、ＯＳＲ２、ＮＥＫ６、ＬＨＸ２、ＤＤＩＴ４、ＤＮＡＪＢ１２、ＣＲＴＡＣ１、ＰＡＸ２、ＨＩＦ１ＡＮ、ＥＬＯＶＬ３、ＩＮＡ、ＨＭＸ２、ＨＭＸ３、ＭＫＩ６７、ＤＰＹＳＬ４、ＳＴＫ３２Ｃ、ＩＮＳ、ＩＮＳ－ＩＧＦ２、ＡＳＣＬ２、ＰＡＸ６、ＲＥＬＴ、ＦＡＭ１６８Ａ、ＯＰＣＭＬ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＶＰＲ１Ａ、ＬＨＸ５、ＳＤＳＬ、ＲＡＢ２０、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＡＲＫＤ、ＣＡＲＳ２、ＳＯＸ１、ＴＥＸ２９、ＳＰＡＣＡ７、ＳＦＴＡ３、ＳＩＸ６、ＳＩＸ１、ＩＮＦ２、ＴＭＥＭ１７９、ＣＲＩＰ２、ＭＴＡ１、ＰＩＡＳ１、ＳＫＯＲ１、ＩＳＬ２、ＳＣＡＰＥＲ、ＰＯＬＧ、ＲＨＣＧ、ＮＲ２Ｆ２、ＲＡＢ４０Ｃ、ＰＩＧＱ、ＣＰＮＥ２、ＮＬＲＣ５、ＰＳＫＨ１、ＮＲＮ１Ｌ、ＳＲＲ、ＨＩＣ１、ＨＯＸＢ９、ＰＲＡＣ１、ＳＭＩＭ５、ＭＹＯ１５Ｂ、ＴＮＲＣ６Ｃ、９－Ｓｅｐ、ＴＢＣＤ、ＺＮＦ７５０、ＫＣＴＤ１、ＳＡＬＬ３、ＣＴＤＰ１、ＮＦＡＴＣ１、ＺＮＦ５５４、ＴＨＯＰ１、ＣＡＣＴＩＮ、ＰＩＰ５Ｋ１Ｃ、ＫＤＭ４Ｂ、ＰＬＩＮ３、ＥＰＳ１５Ｌ１、ＫＬＦ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＮＫＸ２－４、ＮＫＸ２－２、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＲＡＥ１、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＡＲＦＲＰ１、ＭＹＨ９、及びＴＸＮ２のうちのいずれか１つから選択される遺伝子からの配列のメチル化レベルに関する。本発明は、上記の遺伝子又はその断片の１つ又は複数のＣｐＧを含む核酸分子を提供する。
いくつかの実施形態では、膵癌と膵炎との間の分化は、配列番号６０～１６０又はその相補配列からなる群のいずれかから選択される配列のメチル化レベルと相関する。
ここで、「膵癌と膵炎との分化に関連する配列」とは、上記の１０１遺伝子、その上流又は下流２０ｋｂ以内の配列、上記の１０１配列（配列番号６０～１６０）又はそれらの相補配列を包含する。ここで、配列の塩基及びメチル化部位には、参照ゲノムＨＧ１９に対応する番号が付されている。
１つ又は複数の実施形態において、核酸分子の長さは、１ｂｐ－１０００ｂｐ、１ｂｐ－９００ｂｐ、１ｂｐ－８００ｂｐ、１ｂｐ－７００ｂｐである。核酸分子の長さは、上記のいずれかの末端値の間の範囲であり得る。
本明細書で使用される場合、ＤＮＡメチル化を検出する方法は当技術分野で周知であり、例えばバイサルファイト変換ベースのＰＣＲ（例えば、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ））、ＤＮＡ配列決定、全ゲノムメチル化配列決定、単純化メチル化配列決定、メチル化感受性制限酵素アッセイ、蛍光定量、メチル化感受性高解像度融解曲線アッセイ、チップベースのメチル化アトラス、質量分析等である。１つ又は複数の実施形態において、検出は、遺伝子又は部位において任意の鎖を検出することを包含する。
したがって、本発明は、ＤＮＡメチル化検出用試薬に関する。ＤＮＡメチル化を検出する上記の方法で使用される試薬は、当技術分野で周知である。ＤＮＡ増幅を伴う検出方法において、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬は、プライマーを包含する。プライマーの配列はメチル化特異的又は非特異的である。プライマーの配列は、非メチル化特異的ブロッカーを包含し得る。ブロッカーは、メチル化検出の特異性を向上させることができる。ＤＮＡメチル化を検出するための試薬はまた、プローブを包含し得る。典型的には、プローブ配列の５’末端を蛍光レポーターで標識し、３’末端をクエンチャーで標識する。プローブの配列は、例示的に、ＭＧＢ（副溝結合剤）又はＬＮＡ（ロックド核酸）を包含する。ＭＧＢ及びＬＮＡは、Ｔｍ値を増加させ、アッセイの特異性を増加させ、プローブ設計の柔軟性を高めるために使用される。本明細書で使用される「プライマー」は、ヌクレオチド重合が開始されるときに合成をガイドする特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子を指す。プライマーは、通常、２つの人工的に合成されたオリゴヌクレオチド配列である。一方のプライマーは標的領域の一端のＤＮＡ鋳型鎖に相補的であり、他方のプライマーは標的領域の他端の別のＤＮＡ鋳型鎖に相補的であり、それらはヌクレオチド重合の開始点として働く。プライマーは、通常、少なくとも９ｂｐである。インビトロで人工的に設計されたプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ｑＰＣＲ、配列決定及びプローブ合成に広く使用されている。典型的には、プライマーは、増幅産物が１～２０００ｂｐ、１０～１０００ｂｐ、３０～９００ｂｐ、４０～８００ｂｐ、５０～７００ｂｐ、又は少なくとも１５０ｂｐ、少なくとも１４０ｂｐ、少なくとも１３０ｂｐ、少なくとも１２０ｂｐの長さを有するように設計される。
本明細書における「変異体」又は「変異体」という用語は、他の核酸とハイブリダイズする能力を保持しながら、参照配列と比較して１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって核酸配列が変化するポリヌクレオチドを指す。本明細書の実施形態のいずれかによる変異体は、参照配列の生物学的活性を保持しながら、参照配列に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を包含する。２つのアラインメントされた配列間の配列同一性は、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴｎを使用して計算することができる。変異体はまた、参照配列の生物学的活性を依然として保持しながら、参照配列のヌクレオチド配列に１つ又は複数の変異（挿入、欠失又は置換）を有するヌクレオチド配列を包含する。複数の突然変異は、通常、１～８、１～５又は１～３等の１～１０の範囲内の突然変異を指す。置換は、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチドとの間、又はプリンヌクレオチド間又はピリミジンヌクレオチド間であり得る。置換は、好ましくは保存的置換である。例えば、当技術分野では、類似又は類似の特性を有するヌクレオチドによる保存的置換は、一般に、ポリヌクレオチドの安定性及び機能を変化させない。保存的置換は、プリンヌクレオチド（Ａ及びＧ）間の交換及びピリミジンヌクレオチド（Ｔ又はＵ及びＣ）間の交換を包含する。したがって、本発明のポリヌクレオチドにおける１つ又はいくつかの部位の同じ側鎖由来の残基による置換は、その活性に実質的に影響を及ぼさないであろう。さらに、メチル化部位（連続するＣＧ等）は、本発明の変異体では変異していない。すなわち、本発明の方法は、対応する配列中のメチル化可能部位のメチル化状態を検出し、メチル化不可能部位の塩基に変異が生じ得る。典型的には、メチル化部位は連続したＣｐＧジヌクレオチドである。
本明細書に記載されるように、変換は、ＤＮＡ又はＲＮＡの塩基間で起こり得る。本明細書に記載の「変換」、「シトシン変換」又は「ＣＴ変換」は、非酵素的又は酵素的方法を用いてＤＮＡを処理することによって、未修飾シトシン（Ｃ）を、シトシンよりもグアニンに結合する能力が低い塩基（例えば、ウラシル（Ｕ））に変換する方法である。シトシンを変換するための非酵素的又は酵素的方法は、当技術分野で周知である。例示的には、非酵素的方法は、重亜硫酸カルシウム、重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸カリウム、重亜硫酸アンモニウム、重硫酸ナトリウム、重硫酸カリウム及び重硫酸アンモニウム等の重亜硫酸塩、酸性亜硫酸塩又はメタ重亜硫酸塩等の変換試薬での処理を包含する。例示的には、酵素的方法は、デアミナーゼ処理を包含する。変換されたＤＮＡは、場合により精製される。本明細書での使用に適したＤＮＡ精製方法は、当技術分野で周知である。
本発明はさらに、膵癌を診断するためのメチル化検出キットを提供する。キットは、本明細書に記載のプライマー及び／又はプローブを含み、本発明者らによって発見された膵癌関連配列のメチル化レベルを検出するために使用される。キットはまた、内部標準又は陽性対照として、本明細書に記載される、特に第１の態様に記載される核酸分子を含み得る。本明細書に記載の「ハイブリダイゼーション」という用語は、主にストリンジェントな条件下での核酸配列の対合を指す。例示的なストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＰＥ（又は０．１×ＳＳＣ）及び０．１％ＳＤＳの溶液中、６５℃でのハイブリダイゼーション及び膜洗浄である。
プライマー、プローブ及び核酸分子に加えて、キットはまた、ＤＮＡメチル化を検出するために必要とされる他の試薬を含む。例示的には、ＤＮＡメチル化を検出するための他の試薬は、次のうちの１つ又は複数を包含し得る：バイサルファイト及びその誘導体、ＰＣＲ緩衝液、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマー、プローブ、メチル化感受性又は非感受性制限エンドヌクレアーゼ、消化緩衝液、蛍光色素、蛍光消光剤、蛍光レポーター、エキソヌクレアーゼ、アルカリホスファターゼ、内部標準、及び対照。
キットはまた、非メチル化シトシンがグアニンに結合しない塩基に変換される変換陽性標準を含み得る。陽性標準は、完全にメチル化されていてもよい。キットはまた、ＰＣＲ反応試薬を含み得る。好ましくは、ＰＣＲ反応試薬は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ及びＭｇ２＋を包含する。
本発明はさらに、（１）対象の試料中の本明細書に記載の膵癌関連配列のメチル化レベルを検出することと、（２）対照試料及び／又は参照レベルと比較することによって、又は計算によってスコアを得ることと、（３）スコアに基づいて、対象が膵癌に罹患しているか否かを特定することと、を含む、膵癌のスクリーニング方法を提供する。通常、工程（１）の前に、方法は、試料ＤＮＡの抽出及び品質検査、及び／又はＤＮＡ上の非メチル化シトシンをグアニンに結合しない塩基に変換することをさらに含む。
具体的な実施形態において、工程（１）は：ゲノムＤＮＡ又はｃｆＤＮＡを変換試薬で処理して、非メチル化シトシンを、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基（例えば、ウラシル）に変換することと、本明細書に記載の膵癌関連配列の変換された配列を増幅するのに適したプライマーを使用してＰＣＲ増幅を実施することと、増幅産物の有無によって、又は配列同定（例えば、プローブベースのＰＣＲ同定又はＤＮＡ配列決定同定）によって、少なくとも１つのＣｐＧのメチル化状態又はレベルを決定することと、を含む。
あるいは、工程（１）は、ゲノムＤＮＡ又はｃｆＤＮＡをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで処理することと、本明細書に記載の膵癌関連配列の少なくとも１つのＣｐＧの配列を増幅するのに適したプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うことと、増幅産物の存在又は非存在によって少なくとも１つのＣｐＧのメチル化状態又はレベルを決定することと、を含む。ここでいう「メチル化状態」とは、目的とする配列中の任意の位置における任意の数のＣｐＧのメチル化状態の関係を包含する。この関係は、メチル化状態パラメータ（例えば、０又は１）の加算若しくは減算又は数学的アルゴリズム（例えば、平均、パーセンテージ、分数、比、程度、又は数学的モデルを使用した計算）の計算結果であり得、これは、メチル化レベル測定値、メチル化ハプロタイプ比率、又はメチル化ハプロタイプ負荷を包含するが、これらに限定されない。用語「メチル化状態」は、典型的にはメチル化又は非メチル化（例えば、メチル化状態パラメータ０又は１）を包含する特定のＣｐＧ部位のメチル化を示す。
１つ又は複数の実施形態において、対象の試料におけるメチル化レベルは、対照試料及び／又は参照レベルと比較した場合、増加又は減少する。メチル化マーカのレベルがある閾値を満たすとき、膵癌が同定される。あるいは、試験した遺伝子のメチル化レベルを数学的に分析してスコアを得ることができる。試験した試料について、スコアが閾値より大きい場合、決定結果は陽性、すなわち、膵癌が存在し、そうでない場合、それは陰性である、すなわち、膵癌血漿は存在しない。従来の数学的分析方法及び閾値を決定する方法は、当技術分野で公知である。例示的な方法は、数学的モデルである。例えば、差異的メチル化マーカについては、２群の試料に対してサポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデルを構築し、このモデルを用いて検出結果の精度、感度及び特異度、並びに予測値特性曲線下面積（ＲＯＣ）（ＡＵＣ）を統計的に解析し、試験セット試料の予測スコアを統計的に解析する。
１つ又は複数の実施形態において、対象の試料におけるメチル化レベルは、対照試料及び／又は参照レベルと比較した場合、増加又は減少する。メチル化マーカのレベルが特定の閾値を満たす場合、膵癌が同定され、そうでなければ慢性膵炎である。あるいは、試験した遺伝子のメチル化レベルを数学的に分析してスコアを得ることができる。試験される試料について、スコアが閾値より大きい場合、鑑別結果が陽性、すなわち、膵癌が存在し、そうでない場合、それは陰性である、すなわち、それは膵炎である。閾値を決定するための従来の数学的解析方法及び方法は当技術分野で公知であり、例示的な方法はサポートベクターマシン（ＳＶＭ）数学モデルである。例えば、示差的メチル化マーカについては、上記学習群の試料に対してサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を構築し、モデルを用いて検出結果の精度、感度及び特異度、並びに予測値特性曲線下面積（ＲＯＣ）（ＡＵＣ）を統計的に解析し、試験セットの試料の予測スコアを統計的に解析する。サポートベクターマシンの一実施形態では、スコア閾値は０．８９７である。スコアが０．８９７より大きい場合、対象は膵癌患者であるとみなされ、そうでなければ、対象は慢性膵炎の患者である。
好ましい実施形態では、モデル訓練方法は以下の通りである：最初に、各部位のメチル化レベルに従って差次的にメチル化されたセグメントを得て、差次的にメチル化された領域マトリックスを構築すること、例えば、ｓａｍｔｏｏｌｓソフトウェア等を介して、ＨＧ１９ゲノム中の単一のＣｐＧジヌクレオチド位置のメチル化レベルデータからメチル化データマトリックスを構築すること、次いで、ＳＶＭモデルを訓練する工程と、を含む。
例示的なＳＶＭモデル訓練方法は以下の通りである。
ａ）訓練モデルモードが構築される。パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
典型的には、モデル構築中、膵癌を有するカテゴリーは１としてコード化され、膵癌を有さないカテゴリーは０としてコード化され得る。本発明では、ｐｙｔｈｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ３．６．９）及びｓｋｌｅａｒｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（０．２３．１）により閾値は０．８９５に設定される。構築されたモデルは、膵癌の有無で試料を０．８９５で最終的に区別する。
ここで、試料は哺乳動物、好ましくはヒト由来である。試料は、任意の器官（例えば、膵臓）、組織（例えば、上皮組織、結合組織、筋組織及び神経組織）、細胞（例えば、膵癌生検）又は体液（例えば、血液、血漿、血清、間質液、尿）に由来し得る。一般に、試料は、ゲノムＤＮＡ又はｃｆＤＮＡ（無循環ＤＮＡ又は無細胞ＤＮＡ）を含んでいればよい。循環フリーＤＮＡ又は無細胞ＤＮＡと呼ばれるｃｆＤＮＡは、血漿中に放出された分解ＤＮＡ断片である。例示的には、試料は、膵癌生検、好ましくは細針吸引生検である。あるいは、試料は血漿又はｃｆＤＮＡである。
本出願はさらに、膵癌に関連するメチル化ハプロタイプ画分を得るための方法に関する。メチル化標的配列決定（ＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎ）によって得られたメチル化データを例にとると、マーカ部位をスクリーニング及び試験する方法は以下の通りである：元のペアエンドシーケンシングリード－リードを結合して結合されたシングルエンドリードを得ること－アダプタを除去してアダプタフリーリードを得ること－ＢＡＭファイルを形成するためにヒトＤＮＡゲノムに合わせるＢｉｓｍａｒｋ－ハプロタイプファイルを形成するために各リードのＣｐＧ部位メチル化レベルをｓａｍｔｏｏｌｓによって抽出すること－メタファイルを形成するためにＣ部位メチル化ハプロタイプ画分を統計的に分析すること－ＭＨＦ（メチル化ハプロタイプ画分を計算すること－サイトをフィルタリングするためにカバレッジ２００を使用してｍｅｔｈ．ｍａｔｒｉｘ ｍａｔｒｉｘファイルを形成すること－０．１を超えるＮＡ値に基づいてフィルタリングして、サイトをフィルタリングすること－試料を訓練セット及び試験セットに事前に分割すること－訓練セット内の各ハプロタイプの表現型のロジスティック回帰モデルを構築すること－各メチル化ハプロタイプ画分の回帰Ｐ値を選択すること－各ＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎ増幅領域を統計的に分析し、領域のメチル化レベルを表すために最も有意なＰ値を有するメチル化ハプロタイプを選択し、サポートベクターマシンを介してモデル化すること－訓練セット（ＲＯＣプロット）の結果を形成し、検証のためのモデルを使用して試験セットを予測すること。具体的には、膵癌に関連するメチル化ハプロタイプを得るための方法は、以下の工程：（１）試験対象の膵癌を有する又は有さない患者から血漿試料を得、ｃｆＤＮＡを抽出し、ライブラリ構築及び配列決定を行うためにＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎ法を使用し、及び配列決定リードを得る工程と、（２）シーケンシングデータの前処理する工程（シーケンサーによって生成されたシーケンシングデータのアダプタ除去及びスプライシングを包含する）と、（３）上記の前処理後の配列決定データをヒトゲノムのＨＧ１９参照ゲノム配列にアラインして、各断片の位置を決定する工程と、を含む。工程（２）のデータは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームのペアエンド１５０ｂｐ配列決定から得ることができる。工程（２）におけるアダプタ除去は、２つのペアエンド配列決定データの５’末端及び３’末端の配列決定アダプタをそれぞれ除去すること、並びにアダプタを除去した後に低品質塩基を除去することである。工程（２）におけるスプライシング工程は、ペアエンドシーケンシングデータを結合し、それらを元のライブラリ断片に復元することである。これにより、シーケンシング断片のより良好なアライメント及び正確な位置決めが可能になる。例えば、配列決定ライブラリの長さは約１８０ｂｐであり、１５０ｂｐの対の末端はライブラリ断片全体を完全にカバーすることができる。工程（３）は、（ａ）変換された参照ゲノムの２つのセットを構築し、変換された参照ゲノムのアライメントインデックスをそれぞれ構築するために、それぞれＨＧ１９参照ゲノムデータに対してＣＴ及びＧＡ変換を実施する工程と、（ｂ）上の結合された配列決定配列データに対してもＣＴ及びＧＡ変換を行う工程と、（ｃ）上記の変換された参照ゲノム配列をそれぞれアラインメントし、最後にアラインメント結果を要約して、参照ゲノム中の配列決定データの位置を決定する工程と、を含む。
また、膵癌に関するメチル化値の取得方法は、（４）ＭＨＦの算出と、（５）メチル化ハプロタイプＭＨＦデータマトリックスの構築と、（６）試料グループ分けによる各メチル化ハプロタイプのロジスティック回帰モデルの構築と、を含む。工程（４）は、工程（３）で得られたアライメント結果に基づいて、ＨＧ１９参照ゲノムの位置におけるメチル化ハプロタイプ状態及び配列決定デプス情報を得ることを含む。工程（５）は、メチル化ハプロタイプ状態及び配列決定デプス情報データをデータマトリックスに組み合わせることを含む。このうち、深さが２００未満の各データ点は欠損値として扱われ、欠損値を埋めるためにＫ最近傍（ＫＮＮ）法が使用される。工程（６）は、ロジスティック回帰を用いた上記マトリックス中の各位置の統計的モデリングに基づいて、２つの群間で有意な回帰係数を有するハプロタイプをスクリーニングすることからなる。
本発明は、ＤＮＡメチル化及びＣＡ１９－９レベルと、膵癌及び膵炎との関係を調べる。マーカ群ＤＮＡメチル化レベル及びＣＡ１９－９レベルを、膵癌と慢性膵炎とを非侵襲的に鑑別するためのマーカとして、膵癌の非侵襲的診断の精度を向上させることを目的とする。
本発明者らは、膵癌マーカのスクリーニング及び診断において、ＣＡ１９－９のレベルを組み合わせることにより、診断精度を有意に向上させることができることを見出した。
本発明は、最初に、膵癌メチル化マーカをスクリーニングする方法であって、（１）対象のゲノム（ｃｆＤＮＡ等）のＤＮＡセグメントのメチル化ハプロタイプ分率及び配列決定デプスを得ることと、場合により（２）メチル化ハプロタイプ分率及び配列決定デプスデータを前処理することと、（３）クロスバリデーション増分特徴選択を行って特徴メチル化セグメントを得ることと、を含む方法を提供する。
工程（１）のデータ取得は、メチル化検出後のデータ解析であってもよいし、ファイルから直接読み出すことであってもよい。メチル化検出が行われる実施形態では、工程（１）は、１．１）配列決定リードデータを得るために、対象の試料のＤＮＡメチル化を検出すること、１．３）メチル化セグメントの位置及び配列決定デプス情報を得るために、配列決定データを参照ゲノムにアラインメントすること、１．４）以下の式であって、

式中、ｉは標的メチル化領域を表し、ｈは標的メチル化ハプロタイプを表し、Ｎｉは標的メチル化領域に位置するリードの数を表し、Ｎｉ、ｈは標的メチル化ハプロタイプを含むリードの数を表す、
式に従ってセグメントのメチル化ハプロタイプ分率（ＭＨＦ）を計算することを含む。典型的には、標的領域内の各メチル化ハプロタイプについてメチル化ハプロタイプ画分を計算する必要がある。この工程はまた、１．２）アダプタ除去及び／又はスプライシング等、配列決定データを前処理する工程を含み得る。
工程（２）は、メチル化ハプロタイプ比及び配列決定デプス情報データをデータマトリックスに組み合わせる工程を含む。さらに、結果をより正確にするために、工程（２）はまた、データマトリックスにおいて５～１５％（例えば、１０％）より高い欠損値割合を有する部位を除去することを含み、３００（例えば、２００未満）未満の深さを有する各データ点について、それは欠損値として扱われ、欠損値はＫ最近傍法を使用して帰属される。
１つ又は複数の実施形態において、工程（３）は、数学的モデルを使用して訓練データにおけるクロスバリデーション増分特徴選択を実施することを含み、数学的モデルのＡＵＣを増加させるＤＮＡセグメントは、特徴メチル化セグメントである。このうち、数理モデルは、サポートベクターマシンモデル（ＳＶＭ）又はランダムフォレストモデルであり得る。好ましくは、工程（３）は、（３．１）高度に関連性のある候補メチル化セグメントを得るために、メチル化ハプロタイプ分率及び配列決定デプスに従ってＤＮＡセグメントの関連性をランク付けする工程、及び（３．２）クロスバリデーション増分特徴選択を行う工程を含み、候補メチル化セグメントは関連性に従って（例えば、降順の回帰係数に従って）ランク付けされ、毎回１つ又は複数の候補メチル化セグメントデータが追加され、試験データが予測され、平均クロスバリデーションＡＵＣが増加する候補メチル化セグメントは特徴メチル化セグメントである。これらのうち、工程（３．１）は、具体的には、メチル化ハプロタイプ画分及び対象の表現型に関するＤＮＡセグメントの配列決定深度に基づいてロジスティック回帰モデルを構築し、大きな回帰係数を有するＤＮＡセグメントをスクリーニングして、候補メチル化セグメントを形成することを含むことができる。工程（３．２）の予測は、モデル（サポートベクターマシンモデル、ランダムフォレストモデル等）を構築することによって行うことができる。
特徴的なメチル化セグメントを得た後、それらをＣＡ１９－９レベルと組み合わせて、より正確な膵癌診断モデルを構築することができる。したがって、膵癌診断モデルの構築方法では、上記（１）～（３）の工程に加えて、（４）特徴メチル化セグメントのデータに対する数理モデルを構築してメチル化スコアを求める工程、及び（５）メチル化スコアとＣＡ１９－９レベルとをデータマトリックスに結合し、データマトリックスに基づいて膵癌診断モデルを構築する工程も含む。工程（４）における「データ」は、特徴的なメチル化セグメント、好ましくはメチル化ハプロタイプ画分と配列決定デプスとを組み合わせたマトリックスのメチル化検出結果である。
工程（４）の数学的モデルは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデル、ランダムフォレスト、及び回帰モデル等、診断データ分析に一般的に使用される任意の数学的モデルとすることができる。ここで、例示的な数学的モデルは、ベクトルマシン（ＳＶＭ）モデルである。
工程（５）の膵癌診断モデルは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデル、ランダムフォレスト、回帰モデル等、診断データ解析に用いる任意の数理モデルを用いることができる。ここで、膵癌診断モデルの一例として、以下に示すロジスティック回帰膵癌モデルが挙げられ、

式中、Ｍは試料のメチル化スコアであり、Ｃは試料のＣＡ１９－９レベルである。一つ又は複数の実施形態では、モデル閾値は０．８８５であり、この値よりも高い値は膵癌を示すと決定され、この値以下の値は膵癌がないと決定される。
具体的な実施形態において、膵炎及び膵癌を区別するための機械学習に基づく方法は、
（１）試験対象の膵癌又は膵炎の患者の血液を抽出し、患者の年齢、性別、ＣＡ１９－９検査値等を収集することと、（２）試験対象の膵癌又は膵炎を有する患者から血漿試料を得て、ｃｆＤＮＡを抽出し、ＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎ法を使用してライブラリを作成し、配列決定を実施して配列決定リードを得ることと、（３）シーケンシングデータを前処理すること（シーケンサーによって生成されたシーケンシングデータに対してアダプタ除去及びスプライシングを行うことを包含する）と、（４）上記の前処理された配列決定データを参照ゲノム配列にアラインメントして、各断片の位置を決定することと、（５）ＭＨＦ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）メチル化数値マトリックスの計算：対象のメチル化領域は複数のメチル化ハプロタイプを有していてもよく、対象領域内のメチル化ハプロタイプごとにこの値を計算する必要があり、ＭＨＦの計算式は以下のように示され、

（式中、ｉは標的メチル化領域を表し、ｈは標的メチル化ハプロタイプを表し、Ｎｉは標的メチル化領域に位置するリードの数を表し、Ｎｉ、ｈは標的メチル化ハプロタイプを包含するリードの数を表す）と、６）参照ゲノム内の位置について、その位置でメチル化ハプロタイプ画分及び配列決定デプス情報を取得し、メチル化ハプロタイプ画分及び配列決定デプス情報データをデータマトリックスに組合せ、１０％より高い欠損値割合を有する部位を除去し、２００未満の深さを有する各データ点を欠損値とみなし、Ｋ最近傍（ＫＮＮ）法を用いて欠損値を帰属させることと、（７）全ての試料を２つの部分に分割することであって、一方は訓練セットであり、他方は試験セットである、ことと、（８）訓練セット試料群に従って特徴メチル化セグメントを発見すること：表現型についての各メチル化セグメントについてのロジスティック回帰モデルを構築し、増幅された各標的領域について、候補メチル化セグメントを形成するために最も有意な回帰係数を有するメチル化セグメントを選択するためのスクリーニングと、を包含する。訓練セットは、十倍クロスバリデーション増分特徴選択のために１０個の部分にランダムに分割される。各領域における候補メチル化セグメントを回帰係数の有意性に応じて降順に順位付けし、その都度１つのメチル化セグメントのデータを追加して試験データを予測する（予測用のベクターマシン（ＳＶＭ）モデルを構築する）。分化指数は、１０回のクロスバリデーションＡＵＣの平均値である。訓練データのＡＵＣが増加する場合、候補メチル化セグメントは特徴メチル化セグメントとして保持され、そうでない場合は破棄され、（９）工程（８）でスクリーニングした訓練セット中の特徴的なメチル化領域のデータをサポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデルに組み込み、試験セット中のモデルの性能を検証する工程；（１０）工程（９）の訓練セットＳＶＭモデルの予測スコアと訓練セット試料に対応するＣＡ１９－９測定値とを組み合わせたデータマトリックスをロジスティック回帰モデルに組み込み、試験セット内のＣＡ１９－９と組み合わせたモデルの性能を検証する工程。
本発明はさらに、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬又はデバイスと、ＣＡ１９－９レベルを検出するための試薬又はデバイスとを包含する、膵癌診断用キットを提供する。
ＤＮＡメチル化を検出するための試薬は、対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを決定するために使用される。ＤＮＡメチル化を検出するための例示的な試薬は、本発明者らによって見出された膵癌と膵炎との間の分化に関連する配列のメチル化レベルを検出するための本明細書に記載のプライマー及び／又はプローブを包含する。
本明細書に記載のＣＡ１９－９レベルは、主に体液（血液又は血漿等）中のＣＡ１９－９レベルを指す。ＣＡ１９－９レベルを検出するための試薬は、ＣＡ１９－９検出方法で使用することができる当技術分野で公知の任意の試薬、例えば限定するものではないが、ＣＡ１９－９に対する抗体、及び任意の緩衝液、洗浄液等を包含する免疫反応に基づく検出試薬であり得る。本発明で使用される例示的な検出方法は、化学発光イムノアッセイによってＣＡ１９－９の含有量を検出する。具体的な工程は、まず、ＣＡ１９－９に対する抗体を化学発光マーカ（アクリジニウムエステル）で標識し、標識抗体とＣＡ１９－９抗原とを免疫反応させてＣＡ１９－９抗原－アクリジニウムエステル標識抗体複合体を形成した後、酸化剤（Ｈ２Ｏ２）とＮａＯＨを添加してアルカリ環境を形成する。このとき、アクリジニウムエステルは、触媒なしで分解して発光することができる。単位時間当たりに生成された光子エネルギーは、光コレクタ及び光電子増倍管（化学発光検出器）によって受け取られ、記録される。この光の積分はＣＡ１９－９抗原の量に比例し、ＣＡ１９－９の含有量は標準曲線に従って計算することができる。
本発明はさらに、（１）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルと、対象のＣＡ１９－９レベルとを取得すること、（２）メチル化状態若しくはレベルを用いて演算し、メチル化スコアを得る数理モデル（例えば、サポートベクターマシンモデル又はランダムフォレストモデル）を用いること、（３）メチル化スコアとＣＡ１９－９レベルとをデータマトリックスに組み合わせること、（４）データマトリックスに基づいて膵癌診断モデル（例えば、ロジスティック回帰モデル）を構築すること、及び任意に（５）膵癌スコアを得、膵癌スコアが閾値に達したか否かに応じて、膵癌を診断すること、を含む、膵癌の診断方法を包含する。本方法は、工程（１）の前にＤＮＡ抽出及び／又は品質検査をさらに包含し得る。本発明は、膵炎を有する患者から膵癌を同定すること、すなわち、膵癌と膵炎とを区別することに特に適している。
対象は、例えば、膵炎と診断された患者、又は膵炎と診断された（以前の診断）患者である。すなわち、１つ又は複数の実施形態において、方法は、以前に診断された患者を包含する、慢性膵炎と診断された患者における膵癌を同定する。もちろん、本発明の方法は、上記の対象に限定されるものではなく、未診断の対象において直接、膵炎や膵癌を診断・同定するために用いることもできる。
特定の実施形態では、工程（１）は、対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを検出すること、例えば、本明細書に記載のプライマー分子及び／又はプローブ分子を使用してメチル化状態又はレベルを検出することを含む。
メチル化状態又はレベルを検出し、ＣＡ１９－９レベルを検出するための方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。メチル化状態又はレベルを検出するための具体的な方法は、ゲノムＤＮＡ又はｃｆＤＮＡを変換試薬で処理して、非メチル化シトシンを、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基（ウラシル等）に変換することと、本明細書に記載の膵癌と膵炎との間の分化に関連する配列の変換された配列を増幅するのに適したプライマーを使用してＰＣＲ増幅を行うことと、少なくとも１つのＣｐＧのメチル化レベルを、増幅産物の存在若しくは非存在によって、又は配列同定（例えば、プローブベースのＰＣＲ同定又はＤＮＡ配列決定同定）によって決定することと、を含む。
好ましい実施形態では、モデル訓練方法は以下の通りである：最初に、各部位のメチル化レベルに従って差次的にメチル化されたセグメントを得て、差次的にメチル化された領域マトリックスを構築すること、例えば、ｓａｍｔｏｏｌｓソフトウェア等を介して、ＨＧ１９ゲノム中の単一のＣｐＧジヌクレオチド位置のメチル化レベルデータからメチル化データマトリックスを構築すること、次いで、ＳＶＭモデルを訓練する工程と、を含む。
例示的なＳＶＭモデル訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（ｖ０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（ｖ０．２３．１）は、データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
本発明者らの知見によれば、メチル化スコアとＣＡ１９－９レベルとを組み合わせることにより、診断精度を有意に向上させることができる。具体的には、メチル化スコアとＣＡ１９－９レベルとをデータマトリックスに合成し、そのデータマトリックスに基づいて膵癌診断モデル（例えば、ロジスティック回帰モデル）を構築し、膵癌スコアを求める。
メチル化スコア及びＣＡ１９－９レベルのデータマトリックスは、任意選択的に正規化される。標準化は、当該技術分野における従来の標準化方法を用いて行うことができる。本発明の実施形態では、ロバストスケーラ標準化方法が例として使用され、標準化式は以下の通りであり、

ここで、ｘ及びｘ’はそれぞれ正規化前後の試料データであり、中央値は試料の中央値であり、ＩＱＲは試料の四分位範囲である。
メチル化スコアと同様に、従来の数学的モデリングの方法及びデータ行列を介して閾値を決定する方法は、例えばサポートベクターマシン（ＳＶＭ）数学モデル、ランダムフォレストモデル又はロジスティック回帰モデルを介して当技術分野で公知である。例示的な手法は、ロジスティック回帰モデルである。例えば、示差的メチル化マーカについては、上記学習群の試料に対してロジスティック回帰モデルを構築し、モデルを用いて検出結果の精度、感度及び特異度、並びに予測値特性曲線下面積（ＲＯＣ）（ＡＵＣ）を統計的に解析し、試験セットの試料の予測スコアを統計的に解析する。メチル化レベルとＣＡ１９－９レベルとを組み合わせた膵癌スコアが特定の閾値を満たす場合、膵癌が同定され、そうでなければ慢性膵炎が同定される。
別の態様では、本出願は、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１及び／又はＥＭＸ１又はそれらの断片を有するＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、膵腫瘍の存在を決定する、膵腫瘍の発症を評価する、及び／又は膵腫瘍の進行を評価する方法を提供する。例えば、本出願の方法は、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１、又はそれらの断片を有するＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は内容の決定結果に基づいて膵腫瘍が存在するかどうかを決定することを含み得る。例えば、本出願の方法は、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１及び／又はＥＭＸ１、又はそれらの断片を有するＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は内容の決定結果に基づいて、膵腫瘍の発症が診断されるかどうかを評価することを含み得る。例えば、本出願の方法は、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１及び／又はＥＭＸ１、又はそれらの断片を有するＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量の決定結果に基づいて、膵腫瘍の発症と診断されるリスクがあるかどうか及び／又はリスクのレベルを含み得る。例えば、本出願の方法は、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１、又はそれらの断片を有するＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は内容の決定結果に基づいて膵腫瘍の進行を評価することを含み得る。
別の態様では、本出願は、膵腫瘍関連ＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するための方法を提供し、これは、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１、又はそれらの断片でＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含み得る。例えば、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１及び／又はＥＭＸ１、又はそれらの断片を有するＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量に関する決定結果に基づいて、膵腫瘍関連ＤＮＡ領域のメチル化状態を評価することを含む。例えば、膵腫瘍関連ＤＮＡ領域のメチル化状態は、膵腫瘍の発症に関連し得、そのＤＮＡ領域における参照レベルと比較したメチル化の確認された存在又は増加した含有量を指し得る。
例えば、本出願のＤＮＡ領域は、ヒトｃｈｒ２：７４７４０６８６－７４７４４２７５に由来し、ヒトｃｈｒ８：２５６９９２４６－２５９０７９５０に由来し、ヒトｃｈｒ１２：４９１８３４２－４９６０２７８に由来し、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７０１７０１９に由来し、ヒトｃｈｒ１：６３７８８７３０－６３７９０７９７に由来し、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５０１－２４８０４３４３８に由来し、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９８４６７０に由来し、ヒトｃｈｒ６：１３７８１３３３６－１３７８１５５３１に由来し、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５２５７５２６に由来し、ヒトｃｈｒ１９：５１２２６６０５－５１２２８９８１に由来し、ヒトｃｈｒ７：１９１５５０９１－１９１５７２９５に由来し、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５７４－７３１６２０２０に由来し得る。例えば、本出願の遺伝子は、それらの名称及びそれらの染色体座標によって記載することができる。例えば、染色体座標は、２００９年２月に公開されたヒトゲノムデータベースのＨｇ１９バージョン（又は「Ｈｇ１９座標」）と一致し得る。例えば、本出願のＤＮＡ領域は、Ｈｇ１９座標で規定される領域に由来してもよい。
別の態様では、本出願は、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１及び／若しくはＥＭＸ１、又はその相補的領域若しくはその断片を有するＤＮＡ領域の特定のサブ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、疾患の存在を決定する、疾患の発症又は発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法を提供する。
別の態様では、本出願は、試験される試料中の、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含み得る、疾患の存在を決定する、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法を提供する。例えば、本出願の方法は、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその相補的領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量の決定結果に基づいて疾患が存在するかどうかを同定することを含み得る。例えば、本出願の方法は、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその相補的領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量の決定結果に基づいて、疾患の発症が診断されるか否かを評価することを含み得る。例えば、本出願の方法は、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその相補的領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量の決定結果に基づいて、疾患と診断されるリスクがあるかどうか及び／又はリスクのレベルを評価することを含み得る。例えば、本出願の方法は、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその相補的領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量の決定結果に基づいて疾患の進行を評価することを含み得る。
別の態様では、本出願は、試験される試料中の、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含み得る、ＤＮＡ領域のメチル化状態を決定する方法を提供する。例えば、そのＤＮＡ領域におけるメチル化の参照レベルと比較して確認された存在又は増加した含有量は、疾患の発症に関連し得る。例えば、本出願におけるＤＮＡ領域は、ゲノムＤＮＡの特定のセグメントを指し得る。例えば、本出願のＤＮＡ領域は、遺伝子名や染色体座標の集合で指定されてもよい。例えば、遺伝子は、その名称を参照することによってその配列及び染色体位置が決定され得るか、又はその染色体座標を参照することによってその配列及び染色体位置が決定され得る。本出願は、これらの特定のＤＮＡ領域のメチル化状態を一連の分析指標として使用し、感度及び／又は特異性の有意な改善を提供することができ、スクリーニング方法を単純化することができる。例えば、「感度」は、正確に同定された陽性結果の割合、すなわち議論中の疾患を有すると正確に同定された個体の割合を指すことができ、「特異性」は、正確に同定された陰性結果の割合、すなわち議論中の疾患を有さないと正確に同定された個体の割合を指すことができる。
例えば、変異体は、本明細書に記載のＤＮＡ領域に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を含み得、変異体は、１つ又は複数の欠失、付加、置換、逆位配列等を含み得る。例えば、本出願における変異体の修飾状態は、同じ評価結果を達成することができる。本出願のＤＮＡ領域は、あらゆる形態の任意の他の突然変異、多型変異又は対立遺伝子変異を含み得る。
例えば、本出願の方法は、配列番号１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８及び２３２からなる群から選択されるＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる核酸を提供することを含み得る。
別の態様では、本出願は、疾患の存在を決定する、疾患の発症又は発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法を提供し、この方法は、試験される試料中の、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０４２－７４７４３１１３に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３１５７－７４７４３２５３に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０４２－７４７４３１１３に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３１５７－７４７４３２５３に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８６５－２５９０７９３０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８１４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１８８－４９１９２７２に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９０３６－４９１９１６４に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９３４１－４９１９４３８に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６５２－３７００５７２１に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５５９６に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６９４－３７００５８２４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８５０－６３７８８９１３に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０６３５－２４８０２０７３１に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５２１－１７６９４５６０３に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７５０－１３７８１４８１５に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５３１－１５５１６７６１０に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８６２０－５１２２８７２２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７７９－１９１５７９１４に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５７１－７３１４７６２６に由来する、ＤＮＡ領域、又はその相補的領域又はその断片からなる群から選択ＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は内容を決定することを含み得る。
例えば、上記の領域の１つ又は複数は、増幅領域及び／又は検出領域として機能することができる。
例えば、本出願の方法は、配列番号１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９、１９３、１９７、２０１、２０５、２０９、２１３、２１７、２２１、２２５、２２９、及び２３３からなる群から選択される核酸、又はその相補的核酸、又はその断片を提供することを含み得る。例えば、核酸は、標的領域を検出するために使用され得る。例えば、核酸をプローブとして用いてもよい。
例えば、本出願の方法は、配列番号１６６及び１６７、１７０及び１７１、１７４及び１７５、１７８及び１７９、１８２及び１８３、１８６及び１８７、１９０及び１９１、１９４及び１９５、１９８及び１９９、２０２及び２０３、２０６及び２０７、２１０及び２１１、２１４及び２１５、２１８及び２１９、２２２及び２２３、２２６及び２２７、２３０及び２３１、並びに２３４及び２３５からなる群から選択される核酸の組合せ、又はそれらの相補的核酸の組合せ、又はそれらの断片を提供することを含む。例えば、核酸の組合せは、標的領域を増幅するために使用され得る。例えば、核酸の組合せは、プライマーの組合せとして機能し得る。
例えば、疾患は腫瘍を包含し得る。例えば、疾患は固形腫瘍を包含し得る。例えば、疾患は、膵腫瘍等の任意の腫瘍を包含し得る。例えば、場合により、本出願の疾患は、膵癌を包含し得る。例えば、場合により、本出願の疾患は、膵管腺癌を包含し得る。例えば、場合により、本出願の膵腫瘍は、膵管腺癌を包含し得る。
例えば、本出願における「相補的」及び「実質的に相補的」は、ヌクレオチド又は核酸間、例えば二本鎖ＤＮＡ分子の２本の鎖間、又はオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間のハイブリダイゼーション又は塩基対形成又は二本鎖の形成を包含し得る。相補的なヌクレオチドは、典型的には、Ａ及びＴ（又はＡ及びＵ）又はＣ及びＧであり得る。２つの一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子について、一方の鎖のヌクレオチドが、最適に整列され、比較され、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を有する場合、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％（通常、少なくとも約９０％～約９５％、又はさらに約９８％～約１００％）と対になる場合、それらは実質的に相補的であるとみなすことができる。一態様では、２つの相補的ヌクレオチド配列は、２５％未満のミスマッチ、より好ましくは１５％未満のミスマッチ、及び５％未満のミスマッチで、又は逆ヌクレオチド間のミスマッチなしでハイブリダイズすることができる。例えば、２つの分子は、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
例えば、本出願における修飾状態は、ＤＮＡ領域内の特定のヌクレオチド又は複数のヌクレオチドにおける修飾状態の有無及び／又は含有量を指し得る。例えば、本出願における修飾状態は、特定のＤＮＡ配列中の各塩基又は各特定の塩基（例えば、シトシン）の修飾状態を指し得る。例えば、本出願における修飾状態は、特定のＤＮＡ配列における塩基対の組合せ及び／又は塩基の組合せの修飾状態を指し得る。例えば、本出願における修飾状態は、特定のＤＮＡ配列（遺伝子が位置するＤＮＡ領域又はその特定の領域断片を包含する）における領域修飾の密度に関する情報を指すことができるが、配列において修飾がどこで起こるかに関する正確な位置情報を提供しない場合がある。
例えば、本出願の修飾状態は、メチル化状態又はメチル化に類似する状況であり得る。例えば、メチル化されている、又は高度にメチル化されている状態は、特定の領域の転写サイレンシングに関連し得る。例えば、メチル化されている、又は高度にメチル化されている状態は、メチル化特異的変換試薬（例えば、脱アミノ化試薬及び／又はメチル化感受性制限酵素）によって変換され得ることに関連し得る。例えば、変換は、他の物質に変換されること、及び／又は切断若しくは消化されることを指し得る。
例えば、この方法は、試験される試料中の核酸を得ることをさらに含み得る。例えば、核酸は無細胞核酸を包含し得る。例えば、試験される試料は、組織、細胞及び／又は体液を包含し得る。例えば、試験される試料は血漿を包含し得る。例えば、本出願の検出方法は、任意の適切な生物学的試料に対して実施することができる。例えば、試験される試料は、動物に由来し得る等、生物学的材料の任意の試料であり得るが、細胞材料、生物学的流体（血液等）、排出物、組織生検標本、外科標本、又は動物の体内に導入され、その後除去された流体に限定されない。例えば、本出願において試験される試料は、試料が単離された後に任意の形態で処理された試料を包含し得る。
例えば、方法は、ＤＮＡ領域又はその断片を変換することをさらに含み得る。例えば、本出願の変換工程により、修飾された塩基と修飾されていない塩基は、変換後に異なる物質を形成することができる。例えば、修飾状態を有する塩基は、変換後に実質的に変化せず、修飾状態を有さない塩基は、変換後の塩基とは異なる他の塩基（例えば、他の塩基は、ウラシルを包含し得る。）に変化するか、又は変換後に切断される。例えば、塩基はシトシンを包含し得る。例えば、修飾は、メチル化修飾を包含し得る。例えば、変換は、脱アミノ化試薬及び／又はメチル化感受性制限酵素による変換を含み得る。例えば、脱アミノ化試薬は、バイサルファイト又はその類似体を包含し得る。例えば、重亜硫酸ナトリウム又は重亜硫酸カリウムである。
例えば、方法は、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する前に、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその断片を増幅することをさらに含み得る。例えば、増幅はＰＣＲ増幅を包含し得る。例えば、本出願における増幅は、任意の公知の増幅系を包含し得る。例えば、本出願における増幅工程は任意であり得る。例えば、「増幅」は、所望の配列の複数のコピーを生成する方法を指し得る。「複数のコピー」は、少なくとも２つのコピーを指し得る。「コピー」は、鋳型配列に対する完全な配列相補性又は同一性を意味しない場合がある。例えば、コピーは、デオキシイノシン等のヌクレオチド類似体、意図的な配列変更（ハイブリダイズ可能であるが鋳型に相補的ではない配列を包含するプライマーによって導入されたもの等）、及び／又は増幅配列エラー中に起こり得る。
例えば、修飾状態の存在及び／又は含有量を決定するための方法は、変換後の修飾状態を有する塩基によって形成された物質の存在及び／又は含有量を決定することを含み得る。例えば、修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する方法は、修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量を決定することを含み得る。例えば、修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量を直接検出することができる。例えば、修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片は、反応中に修飾状態を有さないＤＮＡ領域又はその断片とは異なる特徴を有し得る（例えば、増幅反応）という様式で検出され得る。例えば、蛍光ＰＣＲ法では、修飾状態のＤＮＡ領域又はその断片を特異的に増幅して蛍光を発することができ、修飾状態を有さないＤＮＡ領域又はその断片は、実質的に増幅されず、基本的に蛍光を発しない。例えば、修飾状態を有する塩基の変換時に形成される種の存在及び／又は含有量を決定する代替方法は、本出願の範囲内に包含され得る。
例えば、修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量は、蛍光ＰＣＲ法によって検出される蛍光Ｃｔ値によって決定される。例えば、膵腫瘍の存在、又は膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクは、ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の存在及び／又はＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の含有量が参照レベルに対してより高いことを決定することによって決定される。例えば、試験される試料の蛍光Ｃｔ値が参照蛍光Ｃｔ値よりも低い場合、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在を決定することができ、及び／又はＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の含有量が参照試料中の修飾状態の含有量よりも高いと決定することができる。例えば、参照試料を検出することにより、参照蛍光Ｃｔ値を求めることができる。例えば、試験される試料の蛍光Ｃｔ値が参照蛍光Ｃｔ値よりも高いか又は実質的に同等である場合、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在は除外され得ず、試験される試料の蛍光Ｃｔ値が、参照蛍光Ｃｔ値よりも高いか又は実質的に同等である場合、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の含有量が、参照試料中の修飾状態の含有量よりも低いか又は実質的に同等であることを確認することができる。
例えば、本出願は、例えば、試験される試料のメチル化レベル及び参照レベルを包含するサイクル閾値（すなわち、Ｃｔ値）を介して、特定のＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は内容を表すことができる。例えば、Ｃｔ値は、ＰＣＲ産物の蛍光がバックグラウンドシグナルを超えて検出され得るサイクル数を指し得る。例えば、Ｃｔ値と試料中の標的マーカの出発含有量との間に負の相関、すなわち、Ｃｔ値が低いほど、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の含有量が大きくなり得る。
例えば、試験される試料のＣｔ値がその対応する基準Ｃｔ値と同じ又はそれより低い場合、それは、特定の疾患の存在として確認され得るか、特定の疾患の発症若しくは発症のリスクとして診断され得るか、又は特定の疾患の特定の進行として評価され得る。例えば、試験される試料のＣｔ値が、その対応する基準Ｃｔ値よりも少なくとも１サイクル、少なくとも２サイクル、少なくとも５サイクル、少なくとも１０サイクル、少なくとも２０サイクル又は少なくとも５０サイクル低い場合、それは、特定の疾患の存在として確認され得るか、特定の疾患の発症若しくは発症のリスクとして診断され得るか、又は特定の疾患の特定の進行として評価され得る。
例えば、対象に由来する細胞試料、組織試料又は試料のＣｔ値が、その対応する参照Ｃｔ値と同じ又はそれより高い場合、それは、特定の疾患の非存在として確認され得るか、特定の疾患の発症又は発症のリスクとして診断され得ないか、又は特定の疾患の特定の進行として評価され得ない。例えば、対象に由来する細胞試料、組織試料又は試料のＣｔ値が、その対応する参照Ｃｔ値よりも少なくとも１サイクル、少なくとも２サイクル、少なくとも５サイクル、少なくとも１０サイクル、少なくとも２０サイクル又は少なくとも５０サイクル高い場合、それは、特定の疾患の非存在として確認され得るか、特定の疾患の発症又は発症のリスクとして診断され得ないか、又は特定の疾患の特定の進行として評価され得ない。例えば、対象に由来する細胞試料、組織試料又は試料のＣｔ値が、同一又は対応する基準Ｃｔ値である場合には、特定の疾患の有無として確認したり、特定の疾患を発症している若しくは発症していないと診断したり、特定の疾患を発症する危険性を有している若しくは有していないと診断したり、特定の疾患が一定程度進行している若しくは有していないと評価したりすることができるとともに、更なる検査の提案を行うことができる。
例えば、本出願における基準レベル又は対照レベルは、正常レベル又は健康レベルを指すことができる。例えば、正常レベルは、疾患を有さない細胞、組織又は個体に由来する試料のＤＮＡ領域の修飾レベルであり得る。例えば、腫瘍の評価に使用される場合、正常レベルは、腫瘍を含まない細胞、組織又は個体に由来する試料のＤＮＡ領域の修飾レベルであり得る。例えば、膵腫瘍の評価に用いられる場合、正常レベルは、膵腫瘍を有さない細胞、組織又は個体に由来する試料のＤＮＡ領域の修飾レベルであり得る。
例えば、本出願における参照レベルは、特定の疾患の有無が対象又は試料において確認される閾値レベルを指し得る。例えば、本出願における基準レベルは、対象が特定の疾患を発症している又は発症するリスクがあると診断される閾値レベルを指し得る。例えば、本出願における基準レベルは、対象が特定の疾患の特定の進行を有すると評価される閾値レベルを指し得る。例えば、細胞試料、組織試料又は対象に由来する試料中のＤＮＡ領域の修飾状態が、対応する参照レベル（例えば、ここでの参照レベルは、特定の疾患を有さない患者のＤＮＡ領域の修飾状態を指し得る）より高いか又は実質的に等しい場合、それは、特定の疾患の存在として確認され得るか、特定の疾患を発症している若しくは発症するリスクがあると診断され得るか、又は特定の疾患の特定の進行として評価され得る。例えば、本出願においてＡとＢが「実質的に等しい」とは、ＡとＢとの差が１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０１％以下、０．００１％以下、又は０．０００１％以下であることを意味し得る。例えば、対象に由来する細胞試料、組織試料又は試料中のＤＮＡ領域の修飾状態が、対応する参照レベルよりも少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍又は少なくとも２０倍高い場合、それは、特定の疾患の存在として確認され得るか、特定の疾患の発症若しくは発症のリスクとして診断され得るか、又は特定の疾患の特定の進行として評価され得る。例えば、多数回の検出のうちの少なくとも１回、少なくとも２回又は少なくとも３回の検出において、対象に由来する細胞試料、組織試料又は試料中のＤＮＡ領域の修飾状態が、対応する参照レベルよりも少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも５回、少なくとも１０回又は少なくとも２０回高い場合、それは、特定の疾患の存在として確認され得るか、特定の疾患の発症若しくは発症のリスクとして診断され得るか、又は特定の疾患の特定の進行として評価され得る。
例えば、細胞試料、組織試料又は対象に由来する試料中のＤＮＡ領域の修飾状態が、対応する参照レベル（例えば、ここでの参照レベルは、特定の疾患を有する患者のＤＮＡ領域の修飾状態を指し得る）よりも低いか又は実質的に等しい場合、それは、特定の疾患の非存在として確認され得ないか、特定の疾患を発症している又は発症するリスクがあると診断され得ないか、又は特定の疾患の特定の進行として評価され得ない。例えば、対象に由来する細胞試料、組織試料又は試料中のＤＮＡ領域の修飾状態が、対応する参照レベルよりも少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％及び少なくとも１００％低い場合、それは、特定の疾患の非存在として確認され得るか、特定の疾患の発症若しくは発症のリスクとして診断され得ないか、又は特定の疾患の特定の進行として評価され得ない。
参照レベルは、所望の感度及び特異性に基づいて当業者によって選択され得る。例えば、本出願における様々な状況における基準レベルは、当業者によって容易に識別可能であり得る。例えば、適切な基準レベル及び／又は基準レベルを取得する適切な手段は、限られた回数の試行に基づいて識別することができる。例えば、参照レベルは、１つ又は複数の参照試料から導出され得、参照レベルは、目的の試料を試験する実験と並行して行われた実験から得られる。あるいは、参照レベルは、１つ又は複数の参照試料又は疾患参照試料からのデータ、標準又はレベルの集合を包含するデータベースで得られてもよい。いくつかの実施形態では、データ、標準又はレベルのセットは、１つ又は複数の試料からのデータと比較することができ、それによって異なる検出条件から生じる誤差を低減するために使用することができるように標準化又は正規化することができる。
例えば、参照レベルは、例えば、１つ又は複数の参照試料及び／又は他の検査室及び臨床データからの標的マーカの修飾レベルを包含する参照データベースであり得るデータベースから導出され得る。例えば、参照データベースは、健康な個体及び／又は対応する疾患に罹患していない個体（すなわち、疾患を有さないことが知られている個体）から得られた参照試料からの参照レベルデータを集約することによって確立することができる。例えば、参照データベースは、治療中の対応する疾患を有する個体から得られた参照試料からの参照レベルデータを集約することによって確立することができる。例えば、参照データベースは、疾患の異なる段階の個体から得られた参照試料からのデータを集約することによって構築することができる。例えば、異なる段階は、本出願の目的のマーカの異なる修飾レベルによって証明され得る。当業者はまた、年齢、性別、病歴、家族歴、症状等の様々な要因に基づいて、個体が対応する疾患に罹患しているか、又は対応する疾患に罹患するリスクがあるかどうかを決定することができる。
例えば、本出願は、サイクル閾値（すなわち、Ｃｔ値）を使用して、特定のＤＮＡ領域又はその断片における修飾状態の存在及び／又は含有量を表すことができる。決定方法は、遺伝子から選択された各配列のメチル化レベルに基づいてスコアを算出し、スコアが０より大きければ陽性、すなわち試料に対応する結果が悪性小結節であり得る、とすることができ、１つ又は複数の実施形態では、スコアが０未満である場合、結果は陰性であり、すなわち、膵臓試料に対応する結果は良性結節であり得る。例えば、ＰＣＲ実施形態において、メチル化レベルは、メチル化レベル＝２＾（－ΔＣｔ試験される試料）／２＾（－ΔＣｔ陽性基準）×１００％（ただし、ΔＣｔ＝Ｃｔ標的遺伝子－Ｃｔ内部参照遺伝子）として算出することができる。配列決定の実施形態において、メチル化レベルは、以下のように計算することができる：メチル化レベル＝メチル化された塩基の数／全塩基の数。
例えば、本出願の方法は、以下の工程：試験される試料中の核酸を得る工程と、ＤＮＡ領域又はその断片を変換する工程と、変換後の修飾状態を有する塩基によって形成された物質の存在及び／又は含有量を決定する工程と、を含み得る。
例えば、本出願の方法は、以下の工程：試験される試料中の核酸を得る工程と、ＤＮＡ領域又はその断片を変換する工程と、検出される試料中のＤＮＡ領域又はその断片を増幅する工程と、変換後の修飾状態を有する塩基によって形成された物質の存在及び／又は含有量を決定する工程と、を含み得る。
例えば、本出願の方法は、以下の工程：試験される試料中の核酸を得る工程と、試験される試料から得られたＤＮＡを、該ＤＮＡ中の非メチル化部位とメチル化部位とを区別可能な試薬で処理して、処理済みＤＮＡを得る工程と、場合により、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその断片を増幅する工程と、試験される試料中の処理されたＤＮＡのメチル化状態の存在及び／又は含有量を定量的、半定量的又は定性的に分析する工程と、試験される試料中の処理されたＤＮＡのメチル化レベルを対応する参照レベルと比較する工程と、を含み得る。試験される試料中のＤＮＡ領域のメチル化状態が、対応する基準レベル以上である場合、特定疾患の存在を確認すること、特定疾患の発症若しくは発症の危険性と診断すること、又は特定疾患の一定の進行と評価することができる。
別の態様では、本出願は、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域に結合することができる配列、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を含み得る核酸を提供する。例えば、核酸は、本出願の任意のプローブであり得る。別の態様では、本出願は、ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１でＤＮＡ領域に結合することができる核酸、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を設計することを含み得る、核酸を調製する方法を提供する。例えば、核酸を調製する方法は、当技術分野で公知の任意の適切な方法であり得る。
別の態様では、本出願は、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域に結合することができる配列、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を含み得る核酸の組合せを提供する。例えば、核酸の組合せは、本出願の任意のプライマーの組合せであり得る。別の態様では、本出願は、ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１でＤＮＡ領域を増幅することができる核酸の組合せ、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を設計することを含み得る、核酸の組合せを調製する方法を提供する。例えば、核酸の組合せにおいて核酸を調製する方法は、当技術分野で公知の任意の適切な方法であり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように構成された単一のプローブ又はプライマーを使用して評価することができる。例えば、標的ポリヌクレオチドのメチル化状態は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように構成された複数のプローブ又はプライマーを使用して評価することができる。
別の態様では、本出願は、本出願の核酸及び／又は本出願の核酸の組合せを含み得るキットを提供する。例えば、本出願のキットは、場合により、対応する用途のための参照試料を含むか、又は対応する用途のための参照レベルを提供し得る。
別の態様では、本出願のプローブは検出可能な物質も含有し得る。１つ又は複数の実施形態において、検出可能な物質は、５’蛍光レポーター及び３’標識クエンチャーであり得る。１つ又は複数の実施形態において、蛍光レポーター遺伝子は、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＦＡＭ及びＶＩＣから選択され得る。
別の態様では、本出願のキットはまた、非メチル化シトシンがグアニンに結合しない塩基に変換される変換陽性標準を含み得る。１つ又は複数の実施形態において、陽性標準は、完全にメチル化され得る。
別の態様では、本出願のキットはまた、ＰＣＲ緩衝液、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、制限エンドヌクレアーゼ、酵素消化緩衝液、蛍光色素、蛍光クエンチャー、蛍光レポーター、エキソヌクレアーゼ、アルカリホスファターゼ、内部標準、対照、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２及び（ＮＨ４）２ＳＯ４から選択される１つ又は複数の物質を含むことができる。
別の態様では、本出願においてＤＮＡメチル化を検出するために使用される試薬は、以下の方法：バイサルファイト変換ベースのＰＣＲ（例えば、メチル化特異的ＰＣＲ）、ＤＮＡ配列決定（例えば、バイサルファイトシーケンシング、全ゲノムメチル化シーケンシング、単純化メチル化シーケンシング）、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼアッセイ、蛍光定量、メチル化感受性高分解能融解曲線アッセイ、チップベースのメチル化アトラス、及び質量分析（例えば、飛行質量分析）の１つ又は複数で使用される試薬であり得る。例えば、試薬は、バイサルファイト及びその誘導体、蛍光色素、蛍光消光剤、蛍光レポーター、内部標準、及び対照のうちの１つ又は複数から選択され得る。
診断方法、調製用途
別の態様において、本出願は、疾患検出製品の調製における本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットの使用を提供する。
別の態様では、本出願は、本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットを提供することを包含し得る疾患検出方法を提供する。
別の態様では、本出願は、疾患検出に使用するための本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットを提供する。
別の態様では、本出願は、疾患の存在を決定し、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価し、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットの使用を提供する。
別の態様では、本出願は、疾患の存在を決定する、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法を提供し、これは、本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットを提供することを含み得る。
別の態様では、本出願は、疾患の存在を決定し、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価し、及び／又は疾患の進行を評価するために使用され得る、本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットを提供する。
別の態様では、本出願は、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態を決定することができる物質の調製における、本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットの使用を提供する。
別の態様では、本出願は、本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットを提供することを含み得る、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態を決定する方法を提供する。
別の態様では、本出願は、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態を決定するために使用され得る、本出願の核酸、本出願の核酸の組合せ及び／又は本出願のキットを提供する。
別の態様では、本出願は、ＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するための、物質の調製における、使用であって、決定のためのＤＮＡ領域が、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域、又はそれらの断片を包含する、使用を提供する。
別の態様では、本出願は、膵腫瘍の存在を決定し、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価し、及び／又は膵腫瘍の進行を評価する方法であって、核酸、核酸の組合せ及び／又はＤＮＡ領域の修飾状態を決定するためのキットを提供することを含み得、決定のためのＤＮＡ領域は、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域、又はそれらの断片を包含する。
別の態様では、本出願は、膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するために使用され得るＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための核酸、核酸の組合せ及び／又はキットを提供し、ここで、決定のためのＤＮＡ領域は、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域、又はそれらの断片を包含する。
別の態様では、本出願は、試験される試料中の、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを包含し得る、疾患の存在を決定する、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法を提供する。
別の態様では、本出願は、膵腫瘍の存在を決定し、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価し、及び／又は膵腫瘍の進行を評価する方法を提供し、これは、核酸、核酸の組合せ及び／又はＤＮＡ領域の修飾状態を決定するためのキットを提供することを含み得、ＤＮＡ領域は、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来するＤＮＡ領域又はその相補的領域又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域を包含し得る。
別の態様において、本出願は、膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するために使用され得るＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための核酸、核酸の組合せ及び／又はキットを提供し、ここで、ＤＮＡ領域は、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域を包含し得る。
別の態様では、本出願は、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域の核酸、又はその変換領域、又はその断片、及び上述の核酸の組合せを提供する。
別の態様では、本出願は、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域の核酸、又はその変換された領域、又はその断片、及び上記の核酸の組合せの、膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するための、物質の調製における、使用を提供する。
別の態様では、本出願は、膵腫瘍の存在を決定し、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価し、及び／又は膵腫瘍の進行を評価する方法であって、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１、又はそれらの変換領域、又はそれらの断片、及び上述の核酸の組合せを有するＤＮＡ領域の核酸を提供することを含む方法を提供する。
別の態様では、本出願は、膵腫瘍の存在を決定し、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価し、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するために使用され得る、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域、又はその変換領域、又はその断片、及び上記の核酸の組合せの核酸を提供する。
別の態様では、本出願は、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片、及び上記の核酸の組合せからなる群から選択されるＤＮＡ領域の核酸を提供する。
別の態様において、本出願は、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来するＤＮＡ領域、若しくはその相補的領域、若しくはその断片、及び上記の核酸の組合せからなる群から選択されるＤＮＡ領域の核酸の、疾患の発症若しくは危険性を決定し、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における、使用を提供する。
別の態様では、本出願は、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来するＤＮＡ領域、その相補的領域、又はその変換領域、又はその断片、並びに上記の核酸の組合せからなる群から選択されるＤＮＡ領域の核酸を提供することを含む、疾患の存在を決定する、疾患の発症又は発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法を提供する。
別の態様では、本出願は、患の存在の決定、疾患の発症又は発症のリスクの評価、及び／又は疾患の進行の評価に使用され得る、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片、ならび上記の核酸の組合せからなる群から選択されるＤＮＡ領域の核酸を提供する。
例えば、本出願における決定に使用されるＤＮＡ領域は、ＥＢＦ２及びＣＣＮＡ１を有するＤＮＡ領域又はその断片からなる群から選択される２つの遺伝子を含む。例えば、それは、試験される試料中のヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０由来及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４由来のＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択される２つのＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む。
例えば、本出願の方法において、標的遺伝子は、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２及びＥＭＸ１からなる群から選択される２つの遺伝子を包含し得る。例えば、本出願の方法において、標的遺伝子は、ＫＣＮＡ６及びＴＬＸ２を包含し得る。
例えば、本出願の方法において、標的遺伝子は、ＫＣＮＡ６及びＥＭＸ１を包含し得る。例えば、本出願の方法において、標的遺伝子は、ＴＬＸ２及びＥＭＸ１を包含し得る。例えば、本出願の方法において、標的遺伝子は、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２及びＥＭＸ１からなる群から選択される３つの遺伝子を包含し得る。例えば、本出願の方法において、標的遺伝子は、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２及びＥＭＸ１を包含し得る。例えば、それは、試験される試料中のヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はそれらの断片からなる群から選択される２つ以上のＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む。
例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３及びＥＮ２からなる群から選択される２つの遺伝子を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８及びＴＷＩＳＴ１を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８及びＦＯＸＤ３を包含し得る。例えば、本出願の方法において、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８及びＥＮ２を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１及びＦＯＸＤ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１及びＥＮ２を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子はＦＯＸＤ３及びＥＮ２を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３及びＥＮ２からなる群から選択される３つの遺伝子を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１及びＦＯＸＤ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１及びＥＮ２を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＦＯＸＤ３及びＥＮ２を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３及びＥＮ２を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３及びＥＮ２からなる群から選択される４つの遺伝子を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３及びＥＮ２を包含し得る。例えば、それは、試験される試料中のヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来するＤＮＡ領域、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来するＤＮＡ領域、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来するＤＮＡ領域、及びヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来するＤＮＡ領域、又はそれらの相補的領域、又はそれらの断片からなる群から選択される２つ以上のＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む。
例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される２つの遺伝子を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８及びＴＷＩＳＴ１を包含し得る。例えば、本出願の方法において、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８及びＣＬＥＣ１１Ａを包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８及びＨＯＸＤ１０を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１及びＣＬＥＣ１１Ａを包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１及びＨＯＸＤ１０を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＣＬＥＣ１１Ａ及びＨＯＸＤ１０を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＣＬＥＣ１１Ａ及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される３つの遺伝子を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１及びＣＬＥＣ１１Ａを包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１及びＨＯＸＤ１０を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＣＬＥＣ１１Ａ及びＨＯＸＤ１０を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＣＬＥＣ１１Ａ及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ及びＨＯＸＤ１０を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される４つの遺伝子を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ及びＨＯＸＤ１０を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される５つの遺伝子を包含し得る。例えば、本出願の方法では、標的遺伝子は、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３を包含し得る。
例えば、それは、試験される試料中のヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来するＤＮＡ領域、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来するＤＮＡ領域、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来するＤＮＡ領域、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来するＤＮＡ領域、及びヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来するＤＮＡ領域、又はそれらの相補的領域、又はそれらの断片からなる群から選択される２つ以上のＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む。
例えば、本出願の核酸は、単離された核酸を指し得る。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、又はそれらの組合せであり得る。例えば、ＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ分子又はその断片であり得る。
別の態様では、本出願は、本出願の方法を実行することができるプログラムを記録した記憶媒体を提供する。
別の態様では、本出願は、本出願の記憶媒体を含むことができるデバイスを提供する。別の態様では、本出願は、コンピュータプログラムが格納された不揮発性コンピュータ可読記憶媒体を提供し、プログラムは、本出願の任意の１つ又は複数の方法を実施するためにプロセッサによって実行される。例えば、不揮発性コンピュータ可読記憶媒体は、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、ソリッドステートストレージ（ＳＳＳ）（ソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）等）、ソリッドステートカード（ＳＳＣ）、ソリッドステートモジュール（ＳＳＭ）、エンタープライズフラッシュドライブ、磁気テープ、又は任意の他の非一時的磁気媒体等を包含し得る。不揮発性コンピュータ可読記憶媒体はまた、パンチカード、紙テープ、光学マークカード（又は穴パターン又は他の光学的に識別可能なマーキングを有する任意の他の物理媒体）、コンパクトディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、コンパクトディスク書き換え可能（ＣＤ－ＲＷ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）、及び／又は任意の他の非一時的光媒体を包含し得る。
例えば、本出願のデバイスは、記憶媒体に結合されたプロセッサをさらに包含することができ、プロセッサは、本出願の方法を実施するために記憶媒体に記憶されたプログラムに基づいて実行するように構成される。例えば、デバイスは、データベースシステム上で実行されたときに本出願の方法が正しい結果を生成することを保証するために様々な機構を実装することができる。本出願では、デバイスは、永久データストレージとして磁気ディスクを使用することができる。本出願では、デバイスは、複数のデータベースクライアントのためのデータベース記憶及び処理サービスを提供することができる。デバイスは、複数の共有記憶デバイスにわたってデータベースデータを記憶することができ、及び／又は複数の実行ノードを有する１つ又は複数の実行プラットフォームを利用することができる。デバイスは、ストレージ及びコンピューティングリソースを効果的に無限に拡張できるように編成することができる。
本明細書に記載の「複数」は、任意の整数を意味する。好ましくは、「１つ又は複数」の「より多く」は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０以上を包含する２以上の任意の整数であってもよい。
実施形態１
１．哺乳動物から単離された核酸分子であって、核酸分子が膵癌関連遺伝子のメチル化マーカであり、核酸分子の配列が、（１）以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、又はそれと少なくとも７０％の同一性を有する変異体におけるメチル化部位が変異していない、変異体のうちの１つ又は複数又は全部、（２）（１）の相補性配列、（３）非メチル化シトシンをシトシンよりもグアニン結合能が低い塩基に変換するように処理された（１）又は（２）の配列を包含し、
好ましくは、核酸分子は、試料中の対応する配列のＤＮＡメチル化レベルを検出するための内部標準又は対照として使用される、
哺乳動物から単離された核酸分子。
２．ＤＮＡメチル化を検出するための試薬であって、検出対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを検出するための試薬を含み、ＤＮＡ配列が、以下の遺伝子配列：ＤＭＲＴＡ２、ＦＯＸＤ３、ＴＢＸ１５、ＢＣＡＮ、ＴＲＩＭ５８、ＳＩＸ３、ＶＡＸ２、ＥＭＸ１、ＬＢＸ２、ＴＬＸ２、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＢＲ１、ＥＶＸ２、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ４、ＴＯＰＡＺ１、ＳＨＯＸ２、ＤＲＤ５、ＲＰＬ９、ＨＯＰＸ、ＳＦＲＰ２、ＩＲＸ４、ＴＢＸ１８、ＯＬＩＧ３、ＵＬＢＰ１、ＨＯＸＡ１３、ＴＢＸ２０、ＩＫＺＦ１、ＩＮＳＩＧ１、ＳＯＸ７、ＥＢＦ２、ＭＯＳ、ＭＫＸ、ＫＣＮＡ６、ＳＹＴ１０、ＡＧＡＰ２、ＴＢＸ３、ＣＣＮＡ１、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＯＴＸ２、Ｃ１４ｏｒｆ３９、ＢＮＣ１、ＡＨＳＰ、ＺＦＨＸ３、ＬＨＸ１、ＴＩＭＰ２、ＺＮＦ７５０、ＳＩＭ２、又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数又は全てから選択され、
好ましくは、
ＤＮＡ配列は、以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、又はその相補的配列又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する、変異体のメチル化部位が変異していない変異体のうちの１つ又は複数又は全てから選択され、並びに／あるいは
試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプライマー分子であり、プライマー分子は、亜硫酸塩処理後にＤＮＡ配列又はその断片を増幅することができ、並びに／あるいは
試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプローブ分子である、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬。
３．ＤＮＡ配列又はその断片及び／又はそのメチル化情報を記録する媒体であって、ＤＮＡ配列が、（ｉ）以下の遺伝子配列：ＤＭＲＴＡ２、ＦＯＸＤ３、ＴＢＸ１５、ＢＣＡＮ、ＴＲＩＭ５８、ＳＩＸ３、ＶＡＸ２、ＥＭＸ１、ＬＢＸ２、ＴＬＸ２、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＢＲ１、ＥＶＸ２、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ４、ＴＯＰＡＺ１、ＳＨＯＸ２、ＤＲＤ５、ＲＰＬ９、ＨＯＰＸ、ＳＦＲＰ２、ＩＲＸ４、ＴＢＸ１８、ＯＬＩＧ３、ＵＬＢＰ１、ＨＯＸＡ１３、ＴＢＸ２０、ＩＫＺＦ１、ＩＮＳＩＧ１、ＳＯＸ７、ＥＢＦ２、ＭＯＳ、ＭＫＸ、ＫＣＮＡ６、ＳＹＴ１０、ＡＧＡＰ２、ＴＢＸ３、ＣＣＮＡ１、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＯＴＸ２、Ｃ１４ｏｒｆ３９、ＢＮＣ１、ＡＨＳＰ、ＺＦＨＸ３、ＬＨＸ１、ＴＩＭＰ２、ＺＮＦ７５０、ＳＩＭ２、又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数又は全てから選択されるか、あるいは（ｉｉ）非メチル化シトシンを、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換するように処理された、（ｉ）の配列であり、
好ましくは、
培地は、配列又はその断片を含む核酸分子の存在、含有量及び／又はメチル化レベルを決定するために、遺伝子メチル化配列決定データとアライメントするために使用され、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列は、ＤＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を含み、並びに／あるいは
断片の長さが１～１０００ｂｐであり、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列は、以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、又はその相補的配列、又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する、変異体におけるメチル化部位が変異していない変異体のうちの１つ又は複数又は全てから選択され、
より好ましくは、
培地は、ＤＮＡ配列若しくはその断片及び／又はそのメチル化情報が印刷された担体であり、並びに／あるいは
媒体は、配列又はその断片及び／又はそのメチル化情報と、コンピュータプログラムとを記憶したコンピュータ読み取り可能な媒体であり、コンピュータプログラムがプロセッサにより実行されると、試料のメチル化シーケンシングデータと配列又はその断片とを比較して、試料中の配列又はその断片を含む核酸分子の存在、含有量及び／又はメチル化レベルを取得する工程であって、存在、含有量及び／又はメチル化レベルが、膵癌の診断に用いられる工程が実施される、ＤＮＡ配列又はその断片及び／又はそのメチル化情報を記録する媒体。
４．対象の膵癌を診断するためのキットの調製における以下の項目（ａ）及び／又は（ｂ）、
（ａ）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを決定するための試薬若しくはデバイス、
（ｂ）非メチル化シトシンを、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換するように処理されたＤＮＡ配列又はその断片の核酸分子
の使用であって、
ここで、ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＤＭＲＴＡ２、ＦＯＸＤ３、ＴＢＸ１５、ＢＣＡＮ、ＴＲＩＭ５８、ＳＩＸ３、ＶＡＸ２、ＥＭＸ１、ＬＢＸ２、ＴＬＸ２、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＢＲ１、ＥＶＸ２、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ４、ＴＯＰＡＺ１、ＳＨＯＸ２、ＤＲＤ５、ＲＰＬ９、ＨＯＰＸ、ＳＦＲＰ２、ＩＲＸ４、ＴＢＸ１８、ＯＬＩＧ３、ＵＬＢＰ１、ＨＯＸＡ１３、ＴＢＸ２０、ＩＫＺＦ１、ＩＮＳＩＧ１、ＳＯＸ７、ＥＢＦ２、ＭＯＳ、ＭＫＸ、ＫＣＮＡ６、ＳＹＴ１０、ＡＧＡＰ２、ＴＢＸ３、ＣＣＮＡ１、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＯＴＸ２、Ｃ１４ｏｒｆ３９、ＢＮＣ１、ＡＨＳＰ、ＺＦＨＸ３、ＬＨＸ１、ＴＩＭＰ２、ＺＮＦ７５０、ＳＩＭ２、又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数又は全てから選択され、
好ましくは、断片の長さは１～１０００ｂｐである、使用。
５．ＤＮＡ配列が、以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、又はその相補配列又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する、変異体のメチル化部位は変異していない変異体のうちの１つ又は複数又は全てから選択される、実施形態４に記載の使用。
６．試薬は、ＤＮＡ配列若しくはその断片とハイブリダイズするプライマー分子を含み、及び／又は
試薬は、ＤＮＡ配列若しくはその断片とハイブリダイズするプローブ分子を含み、及び／又は
試薬は実施形態３の培地を含む、
実施形態４又は５の使用。
７．試料は、哺乳動物の組織、細胞又は体液、例えば膵臓組織又は血液に由来し、並びに／あるいは
試料がゲノムＤＮＡ又はｃｆＤＮＡを包含し、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列が、非メチル化シトシンが、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換され、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列がメチル化感受性制限酵素で処理される、
実施形態４又は５の使用。
８．診断が、対照試料及び／又は参照レベルとの比較又は計算によってスコアを得ること、並びにスコアに基づいて膵癌を診断することを含み、好ましくは、計算は、サポートベクターマシンモデルを構築することによって実行される、実施形態４又は５に記載の使用。
９．膵癌を同定するためのキットであって、
（ａ）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを決定するための試薬若しくはデバイス、及び
場合により、（ｂ）非メチル化シトシンを、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換するようにプロセシングされたＤＮＡ配列又はその断片の核酸分子
を包含し、
ここで、ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＤＭＲＴＡ２、ＦＯＸＤ３、ＴＢＸ１５、ＢＣＡＮ、ＴＲＩＭ５８、ＳＩＸ３、ＶＡＸ２、ＥＭＸ１、ＬＢＸ２、ＴＬＸ２、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＢＲ１、ＥＶＸ２、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ４、ＴＯＰＡＺ１、ＳＨＯＸ２、ＤＲＤ５、ＲＰＬ９、ＨＯＰＸ、ＳＦＲＰ２、ＩＲＸ４、ＴＢＸ１８、ＯＬＩＧ３、ＵＬＢＰ１、ＨＯＸＡ１３、ＴＢＸ２０、ＩＫＺＦ１、ＩＮＳＩＧ１、ＳＯＸ７、ＥＢＦ２、ＭＯＳ、ＭＫＸ、ＫＣＮＡ６、ＳＹＴ１０、ＡＧＡＰ２、ＴＢＸ３、ＣＣＮＡ１、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＯＴＸ２、Ｃ１４ｏｒｆ３９、ＢＮＣ１、ＡＨＳＰ、ＺＦＨＸ３、ＬＨＸ１、ＴＩＭＰ２、ＺＮＦ７５０、ＳＩＭ２、又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数又は全て（例えば、少なくとも７）から選択され、
好ましくは、
ＤＮＡ配列は、以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６又はその相補的配列、又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する、変異体のメチル化部位が変異していない変異体のうちの１つ又は複数又は全てから選択され、並びに／あるいは
キットは、実施形態６～８のいずれか１つの使用に適しており、並びに／あるいは
試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプライマー分子を含み、並びに／あるいは
試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプローブ分子を含み、並びに／あるいは
試薬は実施形態３の培地を含み、並びに／あるいは
試料は、哺乳動物の組織、細胞又は体液、例えば膵臓組織又は血液に由来し、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列が、非メチル化シトシンが、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換され、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列がメチル化感受性制限酵素で処理される、膵癌を同定するためのキット。
１０．メモリと、プロセッサと、メモリに記憶され、プロセッサ上で実行可能なコンピュータプログラムとを包含する、膵癌を診断するためのデバイスであって、プロセッサがプログラムを実行すると、以下の工程、すなわち、
（１）検出対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを得る工程であって、ＤＮＡ配列が以下の遺伝子配列：ＤＭＲＴＡ２、ＦＯＸＤ３、ＴＢＸ１５、ＢＣＡＮ、ＴＲＩＭ５８、ＳＩＸ３、ＶＡＸ２、ＥＭＸ１、ＬＢＸ２、ＴＬＸ２、ＰＯＵ３Ｆ３、ＴＢＲ１、ＥＶＸ２、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ４、ＴＯＰＡＺ１、ＳＨＯＸ２、ＤＲＤ５、ＲＰＬ９、ＨＯＰＸ、ＳＦＲＰ２、ＩＲＸ４、ＴＢＸ１８、ＯＬＩＧ３、ＵＬＢＰ１、ＨＯＸＡ１３、ＴＢＸ２０、ＩＫＺＦ１、ＩＮＳＩＧ１、ＳＯＸ７、ＥＢＦ２、ＭＯＳ、ＭＫＸ、ＫＣＮＡ６、ＳＹＴ１０、ＡＧＡＰ２、ＴＢＸ３、ＣＣＮＡ１、ＺＩＣ２、ＣＬＥＣ１４Ａ、ＯＴＸ２、Ｃ１４ｏｒｆ３９、ＢＮＣ１、ＡＨＳＰ、ＺＦＨＸ３、ＬＨＸ１、ＴＩＭＰ２、ＺＮＦ７５０、ＳＩＭ２のうちの１つ又は複数又は全てから選択される、工程と、
（２）対照試料及び／又は基準レベルと比較することによって、又は計算によってスコアを得る工程と、
（３）スコアに基づいて膵癌を診断する工程と、
が実行され、
好ましくは、
ＤＮＡ配列は、以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、又はその相補的配列又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する、変異体のメチル化部位が変異していない変異体のうちの１つ又は複数又は全てから選択され、並びに／あるいは
工程（１）は、実施形態１の核酸分子及び／若しくは実施形態２の試薬及び／若しくは実施形態３の培地によって試料中の配列のメチル化レベルを検出することを含み、並びに／又は
試料がゲノムＤＮＡ又はｃｆＤＮＡを含み、並びに／あるいは
非メチル化シトシンが、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換される場合配列が変換され、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列がメチル化感受性制限酵素で処理され、並びに／あるいは
工程（２）のスコアは、サポートベクターマシンモデルを構築することによって計算される、膵癌を診断するためのデバイス。
実施形態２
１．哺乳動物から単離された核酸分子であって、核酸分子が、膵癌と膵炎との間の分化に関連するメチル化マーカであり、核酸分子の配列が、（１）配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する変異体中のメチル化部位が変異していない変異体からなる群から選択される配列の１つ又は複数若しくは全部、（２）（１）の相補的配列、（３）非メチル化シトシンをシトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換するように処理された（１）又は（２）の配列、を包含し、
好ましくは、核酸分子は、試料中の対応する配列のＤＮＡメチル化レベルを検出するための内部標準又は対照として使用される、哺乳動物から単離された核酸分子。
２．ＤＮＡメチル化を検出するための試薬であって、検出対象の対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを検出するための試薬を含み、ＤＮＡ配列が、以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２又はその２０ｋｂ上流若しくは下流の配列のうちの１つ又は複数又は全てから選択され、
好ましくは、
ＤＮＡ配列が、以下の配列若しくはその相補配列：配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する変異体のうちの１つ又は複数若しくは全部から選択され、変異体のメチル化部位が変異しておらず、及び／又は
試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプライマー分子であり、プライマー分子は、亜硫酸塩処理後にＤＮＡ配列又はその断片を増幅することができ、及び／又は
試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプローブ分子である、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬。
３．ＤＮＡ配列又はその断片及び／又はそのメチル化情報を記録する媒体であって、ＤＮＡ配列が、（ｉ）以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２、又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数又は全てから選択されるか、又は（ｉｉ）非メチル化シトシンを、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換するように処理された（ｉ）の配列であり、
好ましくは、
培地は、配列又はその断片を含む核酸分子の存在、含有量及び／又はメチル化レベルを決定するために、遺伝子メチル化配列決定データとアライメントするために使用され、及び／又は
ＤＮＡ配列は、ＤＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を含み、及び／又は
断片の長さが１～１０００ｂｐであり、及び／又は
ＤＮＡ配列が、以下の配列又はその相補配列：配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する、変異体のメチル化部位は変異していない変異体のうちの１つ又は複数又は全部から選択され、
より好ましくは、
培地は、ＤＮＡ配列若しくはその断片及び／又はそのメチル化情報が印刷された担体であり、及び／又は
媒体は、配列又はその断片及び／又はそのメチル化情報、並びにコンピュータプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な媒体であり、コンピュータプログラムがプロセッサにより実行されると、以下の工程、試料のメチル化シーケンシングデータと配列又はその断片とを比較して、試料中の配列又はその断片を含む核酸分子の存在、含有量及び／又はメチル化レベルを取得する工程であって、存在、含有量及び／又はメチル化レベルが、膵癌と膵炎との鑑別に用いられる、工程が実行される、ＤＮＡ配列又はその断片及び／又はそのメチル化情報を記録する媒体。
４．以下の項目（ａ）及び／又は（ｂ）、
（ａ）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを決定するための試薬若しくはデバイス、
（ｂ）非メチル化シトシンを、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換するように処理されたＤＮＡ配列又はその断片の核酸分子
の、膵癌と膵炎とを鑑別するためのキットの調製における、使用であって、
ここで、ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列、：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２、又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数又は全てから選択され、
好ましくは、断片の長さは１～１０００ｂｐである、使用。
５．ＤＮＡ配列が、以下の配列：配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、又はその相補配列又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する、変異体のメチル化部位は変異していない変異体のうちの１つ又は複数又は全部から選択される、実施形態４に記載の使用。
６．試薬は、ＤＮＡ配列若しくはその断片とハイブリダイズするプライマー分子を含み、及び／又は
試薬は、ＤＮＡ配列若しくはその断片とハイブリダイズするプローブ分子を含み、及び／又は
試薬は実施形態３の培地を含む、
実施形態４又は５の使用。
７．試料は、哺乳動物の組織、細胞又は体液、例えば膵臓組織又は血液に由来し、並びに／あるいは
試料がゲノムＤＮＡ又はｃｆＤＮＡを包含し、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列が、非メチル化シトシンが、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換され、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列がメチル化感受性制限酵素で処理される、
実施形態４又は５の使用。
８．診断が、対照試料及び／又は参照レベルと比較することによって、又は計算によってスコアを得ること、並びにスコアに基づいて膵癌と膵炎とを区別することを含み、好ましくは、計算は、サポートベクターマシンモデルを構築することによって実行される、実施形態４又は５に記載の使用。
９．膵癌と膵炎とを区別するためのキットであって、
（ａ）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを決定するための試薬若しくはデバイス、及び
場合により、（ｂ）非メチル化シトシンを、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換するようにプロセシングされたＤＮＡ配列又はその断片の核酸分子
を含み、
ここで、ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２、又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数又は全てから選択され、
好ましくは、
ＤＮＡ配列が、以下の配列：配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、若しくはその相補配列又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する、変異体のメチル化部位が変異していない変異体のうちの１つ又は複数若しくは全部から選択され、並びに／あるいは
キットは、実施形態６～８のいずれか１つの使用に適しており、並びに／あるいは
試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプライマー分子を含み、並びに／あるいは
試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプローブ分子を含み、並びに／あるいは
試薬は実施形態３の培地を含み、並びに／あるいは
試料は、哺乳動物の組織、細胞又は体液、例えば膵臓組織又は血液に由来し、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列が、非メチル化シトシンが、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換され、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列がメチル化感受性制限酵素で処理される、膵癌と膵炎とを区別するためのキット。
１０．メモリと、プロセッサと、メモリに記憶され、プロセッサ上で実行可能なコンピュータプログラムとを包含する、膵癌と膵炎とを鑑別するデバイスであって、プロセッサがプログラムを実行すると、以下の工程、
（１）検出対象の対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを得る工程であって、ＤＮＡ配列が、以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２の１つ若しくは複数又は全部から選択される工程と、
（２）対照試料及び／又は基準レベルと比較することによって、又は計算によってスコアを得る工程と、
（３）スコアに基づいて、膵癌と膵炎とを鑑別する工程と、
が実行され、
好ましくは、
ＤＮＡ配列が、以下の配列：配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、若しくはその相補配列又はそれらと少なくとも７０％の同一性を有する、変異体のメチル化部位が変異していない変異体のうちの１つ又は複数若しくは全部から選択され、並びに／あるいは
工程（１）は、実施形態１の核酸分子及び／又は実施形態２の試薬及び／又は実施形態３の培地によって試料中の配列のメチル化レベルを検出することを含み、並びに／あるいは
試料がゲノムＤＮＡ又はｃｆＤＮＡを含み、並びに／あるいは
非メチル化シトシンが、シトシンよりもグアニンに対する結合能が低い塩基に変換される配列、並びに／あるいは
ＤＮＡ配列をメチル化感受性制限酵素で処理し、並びに／あるいは
工程（２）のスコアは、サポートベクターマシンモデルを構築することによって計算される、膵癌と膵炎とを鑑別するデバイス。
実施形態３
１．膵腫瘍の存在及び／又は進行を評価するための方法であって、以下のＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその断片から選択されるＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を試験される試料中で決定することを含む方法。


２．膵腫瘍の存在及び／又は進行を評価する方法であって、試験される試料中の配列番号６０～１６０のいずれか１つから選択されるＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む方法。
膵腫瘍の存在及び／又は進行を評価する方法であって、試験される試料中のＡＲＨＧＥＦ１６、ＰＲＤＭ１６、ＮＦＩＡ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ５、ＰＲＲＸ１、ＬＨＸ４、ＡＣＢＤ６、ＦＭＮ２、ＣＨＲＭ３、ＦＡＭ１５０Ｂ、ＴＭＥＭ１８、ＳＩＸ３、ＣＡＭＫＭＴ、ＯＴＸ１、ＷＤＰＣＰ、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＤＹＳＦ、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ４、ＵＢＥ２Ｆ、ＲＡＭＰ１、ＡＭＴ、ＰＬＳＣＲ５、ＺＩＣ４、ＰＥＸ５Ｌ、ＥＴＶ５、ＤＧＫＧ、ＦＧＦ１２、ＦＧＦＲＬ１、ＲＮＦ２１２、ＤＯＫ７、ＨＧＦＡＣ、ＥＶＣ、ＥＶＣ２、ＨＭＸ１、ＣＰＺ、ＩＲＸ１、ＧＤＮＦ、ＡＧＧＦ１、ＣＲＨＢＰ、ＰＩＴＸ１、ＣＡＴＳＰＥＲ３、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＰＭ１、ＴＬＸ３、ＮＫＸ２－５、ＢＮＩＰ１、ＰＲＯＰ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＩＲＦ４、ＦＯＸＦ２、ＦＯＸＱ１、ＦＯＸＣ１、ＧＭＤＳ、ＭＯＣＳ１、ＬＲＦＮ２、ＰＯＵ３Ｆ２、ＦＢＸＬ４、ＣＣＲ６、ＧＰＲ３１、ＴＢＸ２０、ＨＥＲＰＵＤ２、ＶＩＰＲ２、ＬＺＴＳ１、ＮＫＸ２－６、ＰＥＮＫ、ＰＲＤＭ１４、ＶＰＳ１３Ｂ、ＯＳＲ２、ＮＥＫ６、ＬＨＸ２、ＤＤＩＴ４、ＤＮＡＪＢ１２、ＣＲＴＡＣ１、ＰＡＸ２、ＨＩＦ１ＡＮ、ＥＬＯＶＬ３、ＩＮＡ、ＨＭＸ２、ＨＭＸ３、ＭＫＩ６７、ＤＰＹＳＬ４、ＳＴＫ３２Ｃ、ＩＮＳ、ＩＮＳ－ＩＧＦ２、ＡＳＣＬ２、ＰＡＸ６、ＲＥＬＴ、ＦＡＭ１６８Ａ、ＯＰＣＭＬ、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＶＰＲ１Ａ、ＬＨＸ５、ＳＤＳＬ、ＲＡＢ２０、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＡＲＫＤ、ＣＡＲＳ２、ＳＯＸ１、ＴＥＸ２９、ＳＰＡＣＡ７、ＳＦＴＡ３、ＳＩＸ６、ＳＩＸ１、ＩＮＦ２、ＴＭＥＭ１７９、ＣＲＩＰ２、ＭＴＡ１、ＰＩＡＳ１、ＳＫＯＲ１、ＩＳＬ２、ＳＣＡＰＥＲ、ＰＯＬＧ、ＲＨＣＧ、ＮＲ２Ｆ２、ＲＡＢ４０Ｃ、ＰＩＧＱ、ＣＰＮＥ２、ＮＬＲＣ５、ＰＳＫＨ１、ＮＲＮ１Ｌ、ＳＲＲ、ＨＩＣ１、ＨＯＸＢ９、ＰＲＡＣ１、ＳＭＩＭ５、ＭＹＯ１５Ｂ、ＴＮＲＣ６Ｃ、９－Ｓｅｐ、ＴＢＣＤ、ＺＮＦ７５０、ＫＣＴＤ１、ＳＡＬＬ３、ＣＴＤＰ１、ＮＦＡＴＣ１、ＺＮＦ５５４、ＴＨＯＰ１、ＣＡＣＴＩＮ、ＰＩＰ５Ｋ１Ｃ、ＫＤＭ４Ｂ、ＰＬＩＮ３、ＥＰＳ１５Ｌ１、ＫＬＦ２、ＥＰＳ８Ｌ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ、ＮＫＸ２－４、ＮＫＸ２－２、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＲＡＥ１、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＡＲＦＲＰ１、ＭＹＨ９、及びＴＸＮ２又はその断片からなる群から選択される遺伝子を用いてＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は内容を決定することを含む、膵腫瘍の存在及び／又は進行を評価する方法。
３．試験される試料中の核酸を得ることをさらに含む、実施形態１～２のいずれか一項に記載の方法。
４．核酸が無細胞核酸を包含する、実施形態３に記載の方法。
５．試験される試料が組織、細胞及び／又は体液を包含する、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
６．試験される試料が血漿を包含する、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．ＤＮＡ領域又はその断片を変換することをさらに含む、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．修飾状態を有する塩基及び修飾状態を有さない塩基が、それぞれ変換後に異なる物質を形成する、実施形態７に記載の方法。
９．修飾状態を有する塩基が、変換後に実質的に変化せず、修飾状態を有さない塩基が、変換後の塩基とは異なる他の塩基に変更されるか、又は変換後に切断される、実施形態７～８のいずれか一項に記載の方法。
１０．塩基がシトシンを包含する、実施形態８～９のいずれか一項に記載の方法。
１１．修飾状態がメチル化修飾を包含する、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．他の塩基がシトシンを包含する、実施形態９～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．変換が、脱アミノ化試薬及び／又はメチル化感受性制限酵素による変換を含む、実施形態７～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．脱アミノ化試薬がバイサルファイト又はその類似体を包含する、実施形態１３に記載の方法。
１５．修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する方法が、修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量を決定することを含む、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量が配列決定によって検出される、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．膵腫瘍の存在又は進行が、ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の存在及び／又は参照レベルと比較してより高いＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の含有量を決定することによって決定される、実施形態１～１６に記載の方法。
１８．実施形態１のＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる配列を含む核酸。
１９．配列番号６０～１６０のいずれかから選択されるＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる配列を含む核酸。
２０．実施形態２から選択される遺伝子を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる配列を含む核酸。
２１．実施形態１８～２０のいずれか１つに記載の核酸を含むキット。
２２．実施形態１８～２０のいずれか一項に記載の核酸及び／又は実施形態２１に記載のキットの、疾患検出産物の調製における、使用。
２３．実施形態１８～２０のいずれか一項に記載の核酸及び／又は実施形態２１に記載のキットの、膵腫瘍の存在及び／又は進行を評価するための、物質の調製における、使用。
２４．実施形態１８～２０のいずれか一項に記載の核酸及び／又は実施形態２１に記載のキットの、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態を決定するための物質の調製における、使用。
２５．核酸を調製する方法であって、実施形態１から選択されるＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる核酸を、ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて設計することを含む方法。
２６．配列番号６０～１６０のいずれか一つから選択されるＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて、ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる核酸を設計することを含む、核酸を調製する方法。
２７．核酸を調製する方法であって、実施形態２の遺伝子を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片と結合することができる核酸を、ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて設計することを含む方法。
２８．ＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、膵腫瘍の存在及び／又は進行を評価するための、物質の調製における、使用であって、決定のためのＤＮＡ領域が、実施形態１から選択されるＤＮＡ領域の配列、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を含む使用。
２９．核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、膵腫瘍の存在及び／又は進行を評価するための、物質の調製におけるＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための、使用であって、決定のためのＤＮＡ領域が、配列番号６０～１６０のいずれか一つから選択されるＤＮＡ領域の配列、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を含む使用。
３０．核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、膵腫瘍の存在及び／又は進行を評価するための、物質の調製におけるＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための、使用であって、決定のためのＤＮＡ領域が、実施形態２から選択される遺伝子を有するＤＮＡ領域の配列、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を含む使用。
３１．修飾状態がメチル化修飾を包含する、実施形態２９～３０のいずれか１つの使用。
３２．実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法を実行することができるプログラムを記録した記憶媒体。
３３．実施形態３２の記憶媒体を含み、任意選択的に、記憶媒体に結合されたプロセッサをさらに含み、プロセッサは、記憶媒体に記憶されたプログラムに基づいて実行して、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成される、デバイス。
実施形態４
１．膵癌診断モデルの構築方法であって、
（１）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベル、及び対象のＣＡ１９－９レベルを得ることと、
（２）メチル化状態又はレベルを用いた数理モデルを用いた計算によりメチル化スコアを求める工程と、
（３）メチル化スコアとＣＡ１９－９レベルとをデータマトリックスに組み合わせることと、
（４）データマトリックスに基づいて、膵癌診断モデルを構築することと、
を含む、膵癌診断モデルの構築方法。
２．方法が、以下：
ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数から選択され、
断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、
工程（１）は、対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを検出することを含み、
試料は、哺乳動物の組織、細胞又は体液、例えば膵臓組織又は血液からのものであり、
ＣＡ１９－９レベルが、血液又は血漿ＣＡ１９－９レベルであり、
工程（２）の数学的モデルはサポートベクターマシンモデルであり、
工程（４）の膵癌診断モデルは、ロジスティック回帰モデルである、
から選択される１つ又は複数の特徴をさらに包含する、実施形態１に記載の方法。
３．膵癌診断モデルを構築する方法であって、
（１）対象のゲノムＤＮＡセグメントのメチル化ハプロタイプ分率及び配列決定デプスを得ることと、
場合により（２）メチル化ハプロタイプ分画及び配列決定デプスデータを前処理することと、
（３）特徴メチル化セグメントを得るためにクロスバリデーション増分特徴選択を行う工程と、
（４）特徴メチル化セグメントのメチル化検出結果の数理モデルを構築してメチル化スコアを取得することと、
（５）メチル化スコア及び対応するＣＡ１９－９レベルに基づいて膵癌診断モデルを構築することと、
を含む、膵癌診断モデルを構築する方法。
４．方法は、以下
工程（１）は、
１．１）対象の試料のＤＮＡメチル化を検出して配列決定リードデータを得る工程、
１．２）アダプタ除去及び／又はスプライシング等のシーケンシングデータの任意の前処理する工程、
１．３）配列決定データを参照ゲノムとアラインメントして、メチル化セグメントの位置及び配列決定デプス情報を得る工程、
１．４）以下の式に従ってセグメントのメチル化ハプロタイプ分率（ＭＨＦ）を計算する工程であって、

式中、ｉは標的メチル化領域を表し、ｈは標的メチル化ハプロタイプを表し、Ｎｉは標的メチル化領域に位置するリードの数を表し、Ｎｉ、ｈは標的メチル化ハプロタイプを包含するリードの数を表す、工程
を含み、
工程（２）は、（２．１）メチル化ハプロタイプ分率及び配列決定デプス情報データをデータマトリックスに組み合わせる工程、好ましくは、工程（２）は、２．２）データマトリックスから５～１５％（例えば、１０％）より高い欠損値割合を有する部位を除去する工程、及び／又は２．３）３００（例えば、２００未満）未満の深さを有する各データ点を欠損値として取得し、欠損値に衝突させる工程（例えば、Ｋ最近傍法を用いて）をさらに含み、
工程（３）は、数学的モデルを使用して、訓練データにおけるクロスバリデーション増分特徴選択を実施することを含み、数学的モデルのＡＵＣを増加させるＤＮＡセグメントは、特徴メチル化セグメントであり、
工程（５）は、メチル化スコアとＣＡ１９－９レベルとをデータマトリックスに結合し、データマトリックスに基づいて膵癌診断モデルを構築する工程、から選択される１つ又は複数の特徴をさらに包含する、実施形態３に記載の方法。
５．方法が、以下：
工程（４）の数学的モデルはベクトルマシン（ＳＶＭ）モデルであり、
工程（４）におけるメチル化検出結果が、メチル化ハプロタイプ分率と配列決定デプスとの結合マトリックスであり、
工程（５）の膵癌診断モデルは、ロジスティック回帰モデルである、
から選択される１つ又は複数の特徴をさらに包含する、実施形態３又は４に記載の方法。
６．ＤＮＡメチル化を検出するための試薬若しくはデバイス、及びＣＡ１９－９レベルを検出するための試薬若しくはデバイスの、膵癌診断用キットの調製における、使用であって、ＤＮＡメチル化を検出するための試薬若しくはデバイスが、対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを決定するために使用される、使用。
７．使用が、以下：
ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２、又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数から選択され、
断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、
ＤＮＡメチル化検出用試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプライマー分子を含み、プライマー分子は、亜硫酸塩処理後のＤＮＡ配列又はその断片を増幅することができ、
ＤＮＡメチル化検出用試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプローブ分子を含み、
ＣＡ１９－９レベル検出用試薬は、免疫応答に基づく検出試薬であり、
キットはＰＣＲ反応試薬も含み、
キットは、バイサルファイト変換ベースのＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼアッセイ、蛍光定量、メチル化感受性高分解能融解曲線アッセイ、チップベースのメチル化アトラス、質量分析から選択される１つ又は複数の方法で使用される試薬である、ＤＮＡメチル化を検出するための他の試薬も含み、
診断は、実施形態１～５のいずれか一項に記載の膵癌診断モデルを構築して演算を行い、スコアに基づいて膵癌を診断することを包含する、から選択される１つ又は複数の特徴をさらに包含する、実施形態６に記載の使用。
８．膵癌を診断するためのキットであって、
（ａ）ＤＮＡメチル化を検出するための試薬又はデバイスであって、対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを決定するために使用される、試薬又はデバイスと、
（ｂ）ＣＡ１９－９レベルを検出するための試薬又はデバイス
を含む、膵癌を診断するためのキット。
９．キットが、以下：
ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数から選択され、
断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、
ＤＮＡメチル化検出用試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプライマー分子を含み、プライマー分子は、亜硫酸塩処理後のＤＮＡ配列又はその断片を増幅することができ、
ＤＮＡメチル化検出用試薬は、ＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズするプローブ分子を含み、
ＣＡ１９－９レベル検出用試薬は、免疫応答に基づく検出試薬であり、
キットはＰＣＲ反応試薬も含み、
キットは、ＤＮＡメチル化を検出するための他の試薬も含み、これらの試薬は、以下の方法：バイサルファイト変換ベースのＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼアッセイ、蛍光定量、メチル化感受性高分解能融解曲線アッセイ、チップベースのメチル化アトラス、質量分析の１つ又は複数で使用される試薬である。から選択される１つ又はそれを超える特徴をさらに包含する、実施形態８に記載のキット。
１０．メモリと、プロセッサと、メモリに記憶され、プロセッサ上で実行可能なコンピュータプログラムとを含み、プロセッサがプログラムを実行すると、以下の工程：
（１）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベル、及び対象のＣＡ１９－９レベルを得る工程、
（２）メチル化状態又はレベルを用いた数理モデルを用いた計算によりメチル化スコアを求める工程、
（３）メチル化スコアとＣＡ１９－９レベルとをデータマトリックスに組み合わせる工程、
（４）データマトリックスに基づいて膵癌診断モデルを構築する工程、
任意に（５）膵癌スコアを得、膵癌スコアに基づいて、膵癌を診断する工程、
あるいは
（１）対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル、又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベル、及び対象のＣＡ１９－９レベルを得る工程、
（２）メチル化状態又はレベルを用いた数理モデルを用いた計算によりメチル化スコアを求める工程、
（３）以下に示すモデルに従って膵癌スコアを取得し、該膵癌スコアに基づいて膵癌を診断する工程であって、

式中、Ｍは工程（２）で計算された試料のメチル化スコアであり、Ｃは試料のＣＡ１９－９レベルである、工程
が実行され、
好ましくは、デバイスは、
ＤＮＡ配列は、以下の遺伝子配列：ＳＩＸ３、ＴＬＸ２、ＣＩＬＰ２又はその２０ｋｂ上流若しくは下流内の配列のうちの１つ又は複数から選択され、
断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、
工程（１）は、対象の試料中のＤＮＡ配列若しくはその断片のメチル化レベル又はＤＮＡ配列若しくはその断片中の１つ若しくは複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態若しくはレベルを検出することを包含し、
試料は、哺乳動物の組織、細胞又は体液、例えば膵臓組織又は血液からのものであり、
ＣＡ１９－９レベルが、血液又は血漿ＣＡ１９－９レベルであり、
工程（２）の数学的モデルはサポートベクターマシンモデルであり、
工程（４）の膵癌診断モデルは、ロジスティック回帰モデルである、
から選択される１つ又は複数の特徴をさらに包含する
膵癌を診断するための、又は膵癌診断モデルを構築するための、デバイス。
実施形態５
１．膵腫瘍の存在を決定し、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価し、及び／又は膵腫瘍の進行を評価する方法であって、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１及び／又はＥＭＸ１又はそれらの断片を用いてＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、方法。
２．膵腫瘍関連ＤＮＡ領域のメチル化状態を評価する方法であって、試験される試料中の遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１、又はそれらの断片でＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む方法。
３．ＤＮＡ領域が、ヒトｃｈｒ２：７４７４０６８６－７４７４４２７５に由来し、ヒトｃｈｒ８：２５６９９２４６－２５９０７９５０に由来し、ヒトｃｈｒ１２：４９１８３４２－４９６０２７８に由来し、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７０１７０１９に由来し、ヒトｃｈｒ１：６３７８８７３０－６３７９０７９７に由来し、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５０１－２４８０４３４３８に由来し、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９８４６７０に由来し、ヒトｃｈｒ６：１３７８１３３３６－１３７８１５５３１に由来し、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５２５７５２６に由来し、ヒトｃｈｒ１９：５１２２６６０５－５１２２８９８１に由来し、ヒトｃｈｒ７：１９１５５０９１－１９１５７２９５に由来し、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５７４－７３１６２０２０、実施形態１～２のいずれか一項に記載の方法。
４．試験される試料中の核酸を得ることをさらに含む、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．核酸が無細胞核酸を包含する、実施形態４に記載の方法。
６．試験される試料が組織、細胞及び／又は体液を包含する、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．試験される試料が血漿を包含する、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．ＤＮＡ領域又はその断片を変換することをさらに含む、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
９．修飾状態を有する塩基及び修飾状態を有さない塩基が、変換後に異なる物質を形成する、実施形態８に記載の方法。
１０．修飾状態を有する塩基が、変換後に実質的に変化せず、修飾状態を有さない塩基が、変換後の塩基とは異なる他の塩基に変更されるか、又は変換後に切断される、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。
１１．塩基がシトシンを包含する、実施形態９～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．修飾状態がメチル化修飾を包含する、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．他の塩基がシトシンを包含する、実施形態１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．変換が、脱アミノ化試薬及び／又はメチル化感受性制限酵素による変換を含む、実施形態８～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．脱アミノ化試薬がバイサルファイト又はその類似体を包含する、実施形態１４に記載の方法。
１６．修飾状態の存在及び／又は含有量を決定するための方法が、変換後の修飾状態を有する塩基によって形成される物質の存在及び／又は含有量を決定することを含む、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する方法が、修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量を決定することを含む、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量が、蛍光ＰＣＲ法によって検出される蛍光Ｃｔ値によって決定される、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．膵腫瘍の存在、又は膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクが、ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の存在及び／又はＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の含有量が参照レベルに対してより高いことを決定することによって決定される、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する前に、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその断片を増幅することをさらに含む、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．増幅がＰＣＲ増幅を含む、実施形態２０に記載の方法。
２２．試験される試料中の、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、疾患の存在を決定する、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法。
２３．試験される試料中の、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、ＤＮＡ領域のメチル化状態を決定する方法。
２４．配列番号１６４，１６８，１７２，１７６，１８０，１８４，１８８，１９２，１９６，２００，２０４，２０８，２１２，２１６，２２０，２２４，２２８及び２３２からなる群から選択されるＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる核酸を提供することを含む、実施形態２２～２３のいずれか一項に記載の方法。
２５、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０４２－７４７４３１１３に由来する及びヒトｃｈｒ２：７４７４３１５７－７４７４３２５３に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０４２－７４７４３１１３に由来する及びヒトｃｈｒ２：７４７４３１５７－７４７４３２５３に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８６５－２５９０７９３０に由来する及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８１４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１８８－４９１９２７２に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９０３６－４９１９１６４に由来する及びヒトｃｈｒ１２：４９１９３４１－４９１９４３８に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６５２－３７００５７２１に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５５９６に由来する及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６９４－３７００５８２４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８５０－６３７８８９１３に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０６３５－２４８０２０７３１に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５２１－１７６９４５６０３に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７５０－１３７８１４８１５に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５３１－１５５１６７６１０に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８６２０－５１２２８７２２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７７９－１９１５７９１４に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５７１－７３１４７６２６に由来する、ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域に結合することができる核酸を提供することを含む、実施形態２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
２６．配列番号１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９、１９３、１９７、２０１、２０５、２０９、２１３、２１７、２２１、２２５、２２９、及び２３３からなる群から選択される核酸、又はその相補的核酸、又はその断片を提供することを含む、実施形態２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
２７．配列番号１６６及び１６７、１７０及び１７１、１７４及び１７５、１７８及び１７９、１８２及び１８３、１８６及び１８７、１９０及び１９１、１９４及び１９５、１９８及び１９９、２０２及び２０３、２０６及び２０７、２１０及び２１１、２１４及び２１５、２１８及び２１９、２２２及び２２３、２２６及び２２７、２３０及び２３１、並びに２３４及び２３５からなる群から選択される核酸の組合せ、又はそれらの相補的核酸の組合せ、又はそれらの断片を提供することを含む、実施形態２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．疾患が腫瘍を包含する、実施形態２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．試験される試料中の核酸を得ることをさらに含む、実施形態２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
３０．核酸が無細胞核酸を包含する、実施形態２９に記載の方法。
３１．試験される試料が組織、細胞及び／又は体液を包含する、実施形態２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．試験される試料が血漿を包含する、実施形態２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
３３．ＤＮＡ領域又はその断片を変換することをさらに含む、実施形態２２～３２のいずれか一項に記載の方法。
３４．修飾状態を有する塩基及び修飾状態を有さない塩基が、変換後に異なる物質を形成する、実施形態３３に記載の方法。
３５．修飾状態を有する塩基が、変換後に実質的に変化せず、修飾状態を有さない塩基が、変換後の塩基とは異なる他の塩基に変更されるか、又は変換後に切断される、実施形態２２～３４のいずれか一項に記載の方法。
３６．塩基がシトシンを包含する、実施形態３４～３５のいずれか一項に記載の方法。
３７．修飾状態がメチル化修飾を包含する、実施形態２２～３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．他の塩基がシトシンを包含する、実施形態３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
３９．変換が、脱アミノ化試薬及び／又はメチル化感受性制限酵素による変換を含む、実施形態３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
４０．脱アミノ化試薬がバイサルファイト又はその類似体を包含する、実施形態３９に記載の方法。
４１．修飾状態の存在及び／又は含有量を決定するための方法が、変換後の修飾状態を有する塩基によって形成される物質の存在及び／又は含有量を決定することを含む、実施形態２２～４０のいずれか一項に記載の方法。
４２．修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する方法が、修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量を決定することを含む、実施形態２２～４１のいずれか一項に記載の方法。
４３．修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量が、蛍光ＰＣＲ法によって検出される蛍光Ｃｔ値によって決定される、実施形態２２～４２のいずれか一項に記載の方法。
４４．膵腫瘍の存在、又は膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクが、ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の存在及び／又はＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の含有量が参照レベルに対してより高いことを決定することによって決定される、実施形態２２～４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する前に、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその断片を増幅することをさらに含む、実施形態２２～４４のいずれか一項に記載の方法。
４６．増幅がＰＣＲ増幅を含む、実施形態４５に記載の方法。
４７．遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる配列を含む核酸。
４８．ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１でＤＮＡ領域に結合することができる核酸、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を設計することを含む、核酸を調製する方法。
４９．遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる配列を含む、核酸の組合せ。
５０．ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域を増幅することができる核酸の組合せ、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を設計することを含む、核酸の組合せを調製する方法。
５１．実施形態４７の核酸及び／又は実施形態４９の核酸の組合せを含むキット。
５２．実施形態４７に記載の核酸、実施形態４９に記載の核酸の組合せ、及び／又は実施形態５１に記載のキットの、疾患検出産物の調製における、使用。
５３．実施形態４７の核酸、実施形態４９の核酸の組合せ及び／又は実施形態５１のキットの、疾患の存在を決定するための、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における、使用。
５４．実施形態４７の核酸、実施形態４９の核酸の組合せ及び／又は実施形態５１のキットの、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態を決定するための物質の調製における、使用。
５５．ＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するための、物質の調製における、使用であって、決定のためのＤＮＡ領域が、遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域、又はそれらの断片を包含する、使用。
５６．ＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、疾患の存在を決定するための、疾患の発症又は発症のリスクを評価するための、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における、使用であって、ＤＮＡ領域が、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域を包含する、使用。
５７．遺伝子ＴＬＸ２、ＥＢＦ２、ＫＣＮＡ６、ＣＣＮＡ１、ＦＯＸＤ３、ＴＲＩＭ５８、ＨＯＸＤ１０、ＯＬＩＧ３、ＥＮ２、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＴＷＩＳＴ１、及び／又はＥＭＸ１を有するＤＮＡ領域の核酸、又はその変換された領域、又はその断片、及び上記の核酸の組合せの、膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するための、物質の調製における、使用。
５８．ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７４７４３０８０－７４７４３３０１に由来する、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８９９１－４９１９１８７に由来する、及びヒトｃｈｒ１２：４９１９２３５－４９１９４３９に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１３：３７００５４５８－３７００５６５３に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６８０－３７００５９０４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、ヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来するＤＮＡ領域、若しくはその相補的領域、又はその変換領域、若しくはその断片、並びに上記の核酸の組合せからなる群から選択されるＤＮＡ領域の核酸の、疾患の存在、疾患の発症若しくは発症のリスクを決定し、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における、使用。
５９．実施形態１～４６のいずれか一項に記載の方法を実行することができるプログラムを記録した記憶媒体。
６０．実施形態５９に記載の記憶媒体を含むデバイス。
６１．記憶媒体に結合されたプロセッサをさらに含み、プロセッサが、記憶媒体に記憶されたプログラムに基づいて実行して、実施形態１～４６のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成される、実施形態６０に記載のデバイス。
実施形態６
１．膵腫瘍の存在を決定し、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価し、及び／又は膵腫瘍の進行を評価する方法であって、試験される試料中のＥＢＦ２、並びにＣＣＮＡ１、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２、及びＥＭＸ１、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３、及びＥＮ２、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３、又はそれらの断片からなる群から選択される２つの遺伝子によるＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む方法。
２．膵腫瘍関連ＤＮＡ領域のメチル化状態を評価する方法であって、試験される試料中の、ＥＢＦ２、並びにＣＣＮＡ１、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２、及びＥＭＸ１、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３、及びＥＮ２、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される２つの遺伝子、又はそれらの断片を有するＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む方法。
３．ＤＮＡ領域が、ヒトｃｈｒ８：２５６９９２４６－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７０１７０１９に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１８３４２－４９６０２７８に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４０６８６－７４７４４２７５に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５７４－７３１６２０２０に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５０１－２４８０４３４３８に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５５０９１－１９１５７２９５に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８７３０－６３７９０７９７に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５２５７５２６に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５０１－２４８０４３４３８に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５５０９１－１９１５７２９５に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２６６０５－５１２２８９８１に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９８４６７０に由来する、及びヒトｃｈｒ６：１３７８１３３３６－１３７８１５５３１に由来するＤＮＡ領域からなる群のうちの２つから選択される、実施形態１～２のいずれか一項に記載の方法。
４．試験される試料中の核酸を得ることをさらに含む、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．核酸が無細胞核酸を包含する、実施形態４に記載の方法。
６．試験される試料が組織、細胞及び／又は体液を包含する、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．試験される試料が血漿を包含する、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．ＤＮＡ領域又はその断片を変換することをさらに含む、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
９．修飾状態を有する塩基及び修飾状態を有さない塩基が、変換後に異なる物質を形成する、実施形態８に記載の方法。
１０．修飾状態を有する塩基が、変換後に実質的に変化せず、修飾状態を有さない塩基が、変換後の塩基とは異なる他の塩基に変更されるか、又は変換後に切断される、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。
１１．塩基がシトシンを包含する、実施形態９～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．修飾状態がメチル化修飾を包含する、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．他の塩基がシトシンを包含する、実施形態１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
１４．変換が、脱アミノ化試薬及び／又はメチル化感受性制限酵素による変換を含む、実施形態８～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．脱アミノ化試薬がバイサルファイト又はその類似体を包含する、実施形態１４に記載の方法。
１６．修飾状態の存在及び／又は含有量を決定するための方法が、変換後の修飾状態を有する塩基によって形成される物質の存在及び／又は含有量を決定することを含む、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する方法が、修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量を決定することを含む、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量が、蛍光ＰＣＲ法によって検出される蛍光Ｃｔ値によって決定される、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．膵腫瘍の存在、又は膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクが、ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の存在及び／又はＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の含有量が参照レベルに対してより高いことを決定することによって決定される、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する前に、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその断片を増幅することをさらに含む、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．増幅がＰＣＲ増幅を含む、実施形態２０に記載の方法。
２２．試験される試料中の、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、及びヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択される２つのＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、疾患の存在を決定する、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価する方法。
２３．ＤＮＡ領域のメチル化状態を決定する方法であって、試験される試料中の、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、又はヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、又はヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、又はヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、及びヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択される２つのＤＮＡ領域の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定することを含む、ＤＮＡ領域のメチル化状態を決定する方法。
２４．配列番号１及び５、又はそれらの相補的領域、又はそれらの変換領域、又はそれらの断片からなる群から選択される２つのＤＮＡ領域に結合することができる核酸を提供することを含む、実施形態２２～２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．ヒトｃｈｒ８：２５９０７８６５－２５９０７９３０に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６５２－３７００５７２１に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１８８－４９１９２７２に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０４２－７４７４３１１３に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５７１－７３１４７６２６に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０６３５－２４８０２０７３１に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７７９－１９１５７９１４に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８５０－６３７８８９１３に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１５５１６７５３１－１５５１６７６１０に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０６３５－２４８０２０７３１に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７７９－１９１５７９１４に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８６２０－５１２２８７２２に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５２１－１７６９４５６０３に由来する、及びヒトｃｈｒ６：１３７８１４７５０－１３７８１４８１５に由来する、ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片からなる群から選択される２つのＤＮＡ領域に結合することができる核酸を提供することを含む、実施形態２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
２６．配列番号１７３及び１９３、１８１、１６５及び２３３、２０９、２２９、２０５及び２２１、２０９、２２９、２２５、２１３及び２１７、又はその相補的核酸、又はその断片からなる群から選択される２つの核酸を提供することを含む、実施形態２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
２７．配列番号１７４及び１７５、及び１９４及び１９５、１８２及び１８３、１６６及び１６７、及び２３４及び２３５、２１０及び２１１、２３０及び２３１、２０６及び２０７、及び２２２及び２２３、２１０及び２１１、２３０及び２３１、２２６及び２２７、２１４及び２１５、及び２１８及び２１９、又はそれらの相補的核酸の組合せ、又はそれらの断片からなる群から選択される２つの核酸を提供することを含む、実施形態２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．疾患が腫瘍を包含する、実施形態２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．試験される試料中の核酸を得ることをさらに含む、実施形態２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
３０．核酸が無細胞核酸を包含する、実施形態２９に記載の方法。
３１．試験される試料が組織、細胞及び／又は体液を包含する、実施形態２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．試験される試料が血漿を包含する、実施形態２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
３３．ＤＮＡ領域又はその断片を変換することをさらに含む、実施形態２２～３２のいずれか一項に記載の方法。
３４．修飾状態を有する塩基及び修飾状態を有さない塩基が、変換後に異なる物質を形成する、実施形態３３に記載の方法。
３５．修飾状態を有する塩基が、変換後に実質的に変化せず、修飾状態を有さない塩基が、変換後の塩基とは異なる他の塩基に変更されるか、又は変換後に切断される、実施形態２２～３４のいずれか一項に記載の方法。
３６．塩基がシトシンを包含する、実施形態３４～３５のいずれか一項に記載の方法。
３７．修飾状態がメチル化修飾を包含する、実施形態２２～３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．他の塩基がシトシンを包含する、実施形態３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
３９．変換が、脱アミノ化試薬及び／又はメチル化感受性制限酵素による変換を含む、実施形態３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
４０．脱アミノ化試薬がバイサルファイト又はその類似体を包含する、実施形態３９に記載の方法。
４１．修飾状態の存在及び／又は含有量を決定するための方法が、変換後の修飾状態を有する塩基によって形成される物質の存在及び／又は含有量を決定することを含む、実施形態２２～４０のいずれか一項に記載の方法。
４２．修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する方法が、修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量を決定することを含む、実施形態２２～４１のいずれか一項に記載の方法。
４３．修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量が、蛍光ＰＣＲ法によって検出される蛍光Ｃｔ値によって決定される、実施形態２２～４２のいずれか一項に記載の方法。
４４．膵腫瘍の存在、又は膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクが、ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の存在及び／又はＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の含有量が参照レベルに対してより高いことを決定することによって決定される、実施形態２２～４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する前に、試験される試料中のＤＮＡ領域又はその断片を増幅することをさらに含む、実施形態２２～４４のいずれか一項に記載の方法。
４６．増幅がＰＣＲ増幅を含む、実施形態４５に記載の方法。
４７．ＥＢＦ２、並びにＣＣＮＡ１、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２、及びＥＭＸ１、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３、及びＥＮ２、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される２つの遺伝子を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる配列を含む、核酸。
４８、ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて、ＥＢＦ２、並びにＣＣＮＡ１、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２、及びＥＭＸ１、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３、及びＥＮ２、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される２つの遺伝子、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を有するＤＮＡ領域に結合可能な核酸を設計することを含む、核酸の調製方法。
４９．ＥＢＦ２、並びにＣＣＮＡ１、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２、及びＥＭＸ１、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３、及びＥＮ２、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される２つの遺伝子を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる配列を含む、核酸の組合せ。
５０．ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて、ＥＢＦ２、並びにＣＣＮＡ１、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２、及びＥＭＸ１、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３、及びＥＮ２、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される２つの遺伝子、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を有するＤＮＡ領域を増幅可能な核酸の組合せを、設計することを含む、核酸の組合せの調製方法。
５１．実施形態４７の核酸及び／又は実施形態４９の核酸の組合せを含むキット。
５２．実施形態４７に記載の核酸、実施形態４９に記載の核酸の組合せ、及び／又は実施形態５１に記載のキットの、疾患検出産物の調製における、使用。
５３．実施形態４７の核酸、実施形態４９の核酸の組合せ及び／又は実施形態５１のキットの、疾患の存在を決定するための、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における、使用。
５４．実施形態４７の核酸、実施形態４９の核酸の組合せ及び／又は実施形態５１のキットの、ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態を決定するための物質の調製における、使用。
５５．ＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するための、物質の調製における、使用であって、決定のためのＤＮＡ領域が、ＥＢＦ２、並びにＣＣＮＡ１、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２及びＥＭＸ１、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３及びＥＮ２、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される２つの遺伝子を有するＤＮＡ領域、又はそれらの断片を包含する、使用。
５６．ＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、疾患の存在を決定するための、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における、使用であって、ＤＮＡ領域が、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、及びヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその断片からなる群から選択される２つのＤＮＡ領域を含む、使用。
５７．ＥＢＦ２、並びにＣＣＮＡ１、ＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２、及びＥＭＸ１、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３、及びＥＮ２、ＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０、及びＯＬＩＧ３からなる群から選択される２つの遺伝子を有するＤＮＡ領域の核酸、又はその変換領域、又はその断片、並びに上記の核酸の組合せの、膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症を評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するための、物質の調製における、使用。
５８．ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来する、及びヒトｃｈｒ１３：３７００５６３５－３７００５７５４に由来する、ヒトｃｈｒ１２：４９１９１４２－４９１９２８９に由来する、ヒトｃｈｒ２：７４７４３０３５－７４７４３１５１に由来する、及びヒトｃｈｒ２：７３１４７５２５－７３１４７６４４に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１：６３７８８８１２－６３７８８９５２に由来する、及びヒトｃｈｒ７：１５５１６７５１３－１５５１６７６２８に由来する、ヒトｃｈｒ１：２４８０２０５９２－２４８０２０７７９に由来する、ヒトｃｈｒ７：１９１５６７３９－１９１５７２７７に由来する、ヒトｃｈｒ１９：５１２２８１６８－５１２２８７８２に由来する、ヒトｃｈｒ２：１７６９４５５１１－１７６９４５６３０に由来する、及びヒトｃｈｒ６：１３７８１４７００－１３７８１４８５３に由来するＤＮＡ領域若しくはその相補的領域、若しくはその変換領域、若しくはその断片、及び上記の核酸の組合せからなる群から選択される２つのＤＮＡ領域の核酸の、疾患の存在を決定する、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価する、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における、使用。
５９．実施形態１～４６のいずれか一項に記載の方法を実行することができるプログラムを記録した記憶媒体。
６０．実施形態５９に記載の記憶媒体を含むデバイス。
６１．記憶媒体に結合されたプロセッサをさらに含み、プロセッサが、記憶媒体に記憶されたプログラムに基づいて実行して、実施形態１～４６のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成される、実施形態６０に記載のデバイス。
いかなる理論によっても限定されることを意図するものではないが、以下の例は、本出願の方法及び使用を例示するためのものにすぎず、本出願の発明の範囲を限定することを意図するものではない。
例
例１
１－１：標的化メチル化配列決定による膵癌の示差的メチル化部位のスクリーニング
本発明者らは、合計９４個の膵癌血液試料及び８０個の膵癌非含有血液試料を採取し、全ての登録患者はインフォームドコンセント用紙に署名した。試料情報については以下の表を参照されたい。

血漿ＤＮＡのメチル化配列決定データを、その中のメチル化分類マーカを同定するためにＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎアッセイによって得た。方法は以下の通りである。
１．血漿ｃｆＤＮＡ試料の抽出
Ｓｔｒｅｃｋ採血管を使用して患者から２ｍｌの全血試料を採取し、血漿を適時（３日以内）に遠心分離によって分離し、実験室に輸送し、次いで、指示に従ってＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔを使用してｃｆＤＮＡを抽出した。
２．配列決定及びデータ前処理
１）ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑ ５００シーケンサーを使用してペアエンドシーケンシングした。
２）Ｐｅａｒ（ｖ０．６．０）ソフトウェアは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ Ｘ１０／Ｎｅｘｔｓｅｑ ５００／Ｎｏｖａ ｓｅｑシーケンサーからの同じペアエンド１５０ｂｐシーケンシング断片のペアエンド配列決定データを、最短重複長が２０ｂｐであり、最短長が組み合わせ後に３０ｂｐである一配列に組み合わせた。
３）Ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ ｖ ０．６．０及びｃｕｔａｄａｐｔ ｖ１．８．１ソフトウェアを使用して、結合された配列決定データに対してアダプタ除去を行った。アダプタ配列「ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣ」を配列の５’末端から除去し、両端のシーケンシング品質値が２０未満の塩基を除去した。
３．シーケンシングデータアライメント
本明細書で使用される参照ゲノムデータは、ＵＣＳＣデータベース（ＵＣＳＣ：ＨＧ１９，ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｓｏｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｂｉｇＺｉｐｓ／ｈｇ１９．ｆａ．ｇｚ）からのものであった。
１）まず、Ｂｉｓｍａｒｋ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてＨＧ１９をシトシンからチミン（ＣＴ）及びアデニンからグアニン（ＧＡ）に変換し、Ｂｏｗｔｉｅ２ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて変換後のゲノムのインデックスを構築した。
２）前処理されたデータはまた、ＣＴ及びＧＡの変換に供された。
３）変換された配列を、Ｂｏｗｔｉｅ２ソフトウェアを使用して変換されたＨＧ１９参照ゲノムにアラインメントした。最小シード配列長は２０であり、シード配列においてミスマッチは許容されなかった。
４．ＭＨＦの算出
各標的領域ＨＧ１９のＣｐＧ部位について、上記のアライメント結果に基づいて、各部位に対応するメチル化レベルを求めた。本明細書における部位のヌクレオチド番号付けは、ＨＧ１９のヌクレオチド位置番号付けに対応する。１つの標的メチル化領域は、複数のメチル化ハプロタイプを有し得る。この値は、標的領域内のメチル化ハプロタイプごとに計算する必要がある。ＭＨＦの計算式の一例は以下の通りであり、

式中、ｉは標的メチル化領域を表し、ｈは標的メチル化ハプロタイプを表し、Ｎｉは標的メチル化領域に位置するリードの数を表し、Ｎｉ、ｈは標的メチル化ハプロタイプを含むリードの数を表す。
５．メチル化データマトリックス
１）訓練セット及び試験セット中の各試料のメチル化配列決定データをデータマトリックスに組合せ、２００未満の深さの各部位を欠損値とした。
２）１０％を超える欠損値割合を有する部位を除去した。
３）データマトリックスの欠損値については、ＫＮＮアルゴリズムを使用して欠損データを補間した。
６．学習セット試料群に基づく特徴メチル化セグメントの発見
１）表現型に関して各メチル化セグメントについてロジスティック回帰モデルを構築し、最も有意な回帰係数を有するメチル化セグメントを各増幅標的領域についてスクリーニングして候補メチル化セグメントを形成した。
２）訓練セットを、十倍クロスバリデーション増分特徴選択のために１０の部分にランダムに分割した。
３）各領域における候補メチル化セグメントを回帰係数の有意性に従って降順にランク付けし、１つのメチル化セグメントのデータを毎回追加して試験データを予測した。
４）工程３）では、工程２）で生成されたデータの１０コピーを使用した。データの各コピーについて、１０回の計算を行い、最終ＡＵＣは１０回の計算の平均であった。訓練データのＡＵＣが増加した場合、候補メチル化セグメントは特徴メチル化セグメントとして保持され、そうでない場合は破棄される。
５）訓練セット中の異なる数の特徴の下での平均ＡＵＣ中央値に対応する特徴の組合せを、特徴メチル化セグメントの最終的な組合せとした。
選択された特徴的なメチル化核酸配列の分布は以下の通りである：ＤＭＲＴＡ２遺伝子領域中の配列番号１、ＦＯＸＤ３遺伝子領域中の配列番号２、ＴＢＸ１５遺伝子領域中の配列番号３、ＢＣＡＮ遺伝子領域中の配列番号４、ＴＲＩＭ５８遺伝子領域中の配列番号５、ＳＩＸ３遺伝子領域中の配列番号６、ＶＡＸ２遺伝子領域中の配列番号７、ＥＭＸ１遺伝子領域中の配列番号８、ＬＢＸ２遺伝子領域中の配列番号９、ＴＬＸ２遺伝子領域中の配列番号１０、ＰＯＵ３Ｆ３遺伝子領域中の配列番号１１及び配列番号１２、ＴＢＲ１遺伝子領域中の配列番号１３、ＥＶＸ２遺伝子領域の配列番号１４及び配列番号１５、ＨＯＸＤ１２遺伝子領域の配列番号１６、ＨＯＸＤ８遺伝子領域の配列番号１７、ＨＯＸＤ４遺伝子領域の配列番号１８及び配列番号１９、ＴＯＰＡＺ１遺伝子領域の配列番号２０、ＳＨＯＸ２遺伝子領域の配列番号２１、ＤＲＤ５遺伝子領域の配列番号２２、ＲＰＬ９遺伝子領域の配列番号２３及び配列番号２４、ＨＯＰＸ遺伝子領域の配列番号２５、ＳＦＲＰ２遺伝子領域の配列番号２６、ＩＲＸ４遺伝子領域の配列番号２７、ＴＢＸ１８遺伝子領域の配列番号２８、ＯＬＩＧ３遺伝子領域の配列番号２９、ＵＬＢＰ１遺伝子領域の配列番号３０、ＨＯＸＡ１３遺伝子領域の配列番号３１、ＴＢＸ２０遺伝子領域の配列番号３２、ＩＫＺＦ１遺伝子領域の配列番号３３、ＩＮＳＩＧ１遺伝子領域の配列番号３４、ＳＯＸ７遺伝子領域の配列番号３５、ＥＢＦ２遺伝子領域の配列番号３６、ＭＯＳ遺伝子領域の配列番号３７、ＭＫＸ遺伝子領域の配列番号３８、ＫＣＮＡ６遺伝子領域の配列番号３９、ＳＹＴ１０遺伝子領域の配列番号４０、ＡＧＡＰ２遺伝子領域の配列番号４１、ＴＢＸ３遺伝子領域の配列番号４２、ＣＣＮＡ１遺伝子領域における配列番号４３、ＺＩＣ２遺伝子領域における配列番号４４及び配列番号４５、ＣＬＥＣ１４Ａ遺伝子領域における配列番号４６及び配列番号４７、ＯＴＸ２遺伝子領域における配列番号４８、Ｃ１４ｏｒｆ３９遺伝子領域における配列番号４９、ＢＮＣ１遺伝子領域における配列番号５０、ＡＨＳＰ遺伝子領域における配列番号５１、ＺＦＨＸ３遺伝子領域における配列番号５２、ＬＨＸ１遺伝子領域における配列番号５３、ＴＩＭＰ２遺伝子領域における配列番号５４、ＺＮＦ７５０遺伝子領域における配列番号５５及びＳＩＭ２遺伝子領域における配列番号５６。上記のメチル化マーカのレベルは、膵癌患者のｃｆＤＮＡにおいて増加又は減少した（表１－１、隅付き括弧による表１）。上記の５６個のマーカ領域の配列を配列番号１～５６に示す。各マーカ領域中の全てのＣｐＧ部位のメチル化レベルは、ＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎシーケンシングによって得ることができる。各領域における全てのＣｐＧ部位の平均メチル化レベル、並びに単一のＣｐＧ部位のメチル化レベルは、いずれも膵癌の診断のためのマーカとして使用することができる。

試験セットにおける膵癌罹患者及び膵癌非罹患者のメチル化マーカのメチル化レベルを表１－２（隅付き括弧による表４）に示す。表から分かるように、選択されたメチル化マーカの分布は、膵癌罹患者と膵癌非罹患者とで有意に異なり、良好な分化効果が得られた。

表１－３（隅付き括弧の表５）に、選択した各マーカにおけるランダムな１０個のＣｐＧ部位又はそれらの組合せのメチル化度とマーカ全体のメチル化度との相関（ピアソン相関係数）及び対応する有意性ｐ値を示す。マーカ内の単一のＣｐＧ部位又は複数のＣｐＧ部位の組合せのメチル化レベルは、全領域のメチル化レベルと有意な相関を有し（ｐ＜０．０５）、相関係数はいずれも０．８を超えることが分かる。この強い又は極めて強い相関は、マーカ内の単一のＣｐＧ部位又は複数のＣｐＧ部位の組合せがマーカ全体と同じ良好な分化効果を有することを示す。
















１－２：単一メチル化マーカの予測性能
膵癌患者及び膵癌非罹患患者における単一メチル化マーカの鑑別能を検証するために、単一メチル化マーカのメチル化レベルの値を用いて、単一マーカの予測能を検証した。
まず、５６個のメチル化マーカのメチル化レベルの値を訓練用の訓練セット試料に分けて用いて、膵癌の有無を鑑別するための閾値、感度及び特異度を決定し、次いで、その閾値を用いて、試験セット試料の感度及び特異度を統計的に解析した。結果を以下の表１－４（隅付き括弧による表６）に示す。単一のマーカも良好な分化性能を達成することができることが分かる。


１－３：全マーカの組合せの予測モデル
メチル化核酸断片マーカを用いて膵癌を鑑別する潜在的な能力を検証するために、試験群におけるこのメチル化核酸断片マーカ群の分類予測効果を検証するために、訓練群における５６個のメチル化核酸断片マーカに基づいてサポートベクターマシン疾患分類モデルを構築した。訓練群及び試験群は、訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する割合に従って分割した。
発見されたメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１）試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２）ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
モデルを構築する過程で、膵癌試料型を１とコードし、膵癌非含有試料型を０とコードした。ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）によってモデルを構築する方法では、閾値はデフォルトで０．８９５に設定されていた。構築されたモデルは、膵癌の有無にかかわらず試料を最終的に０．８９５区別した。訓練セット試料に対する２つのモデルの予測スコアを表１－５（隅付き括弧による表７）に示す。

本出願のメチル化核酸断片マーカ群に基づいて、本例ではＳＶＭにより確立されたモデルに従った試験セットで予測した。予測関数を用いて試験セットを予測し、予測結果を出力した（疾患確率：デフォルトスコア閾値は０．８９５であり、スコアが０．８９５より大きい場合、対象は悪性とみなされる）。試験群は５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含し、計算方法は以下の通りである。
コマンドライン：
ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）
ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは、この例で構築されたＳＶＭ予測モデルを使用して取得された試験セット内の試料の予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌは、この例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
試験群の予測スコアを表１－６に示す。ＲＯＣ曲線を図２に示す。予測スコア分布を図３に示す。試験群の全ＡＵＣ下の面積は０．９１１であった。訓練セットにおいて、モデルの感度は、特異度が９０．７％であったときに７１．４％に達することができ、試験セットにおいて、特異度が８８．５％である場合、モデルの感度は８３．９％に達することができた。選択された変数によって確立されたＳＶＭモデルの微分効果が良好であることが分かる。
図４及び図５は、それぞれ訓練群及び試験群における５６個のメチル化核酸断片マーカの分布を示す。このメチル化マーカ群の膵癌非罹患者の血漿と膵癌患者の血漿との差は比較的安定していることが分かる。

１－４：腫瘍マーカ予測比較
本出願のメチル化マーカ群に基づいて、例１－３においてＳＶＭにより確立されたモデルに従った試験セットにおいて予測した。ＣＡ１９－９マーカに基づいて膵癌を予測した。試料は１３０個であった（表１－７）。計算方法は以下の通りである。
コマンドライン：
Ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｓｃａｌａｒ＝ＲｏｂｕｓｔＳｃａｌｅｒ（）．ｆｉｔ（ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ）
ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ＝ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｓｃａｌａｒ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ）
ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｄｆ＝ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｓｃａｌａｒ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｄｆ）
ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｍｏｄｅｌ＝ＬｏｇｉｓｔｉｃＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（）．ｆｉｔ（ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ，ｔｒａｉｎ＿ｃａ１９＿ｐｈｅｎｏ）
ここで、ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆは試験セット試料の例１－３で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアをＣＡ１９－９と結合した訓練セットデータマトリックスを表し、ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆは標準化後の訓練セットデータマトリックスを表す。ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｄｆは、標準化された試験・セットデータマトリックスを表し、ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｍｏｄｅｌは、標準化された訓練・セットデータマトリックスを用いてフィッティングされたロジスティック回帰モデルを表す。
各試料の予測スコアを表１－７に示す。ＲＯＣ曲線を図６に示す。予測スコア分布を図７に示す。試験群の全ＡＵＣは０．９３５である。この図から、確立されたロジスティック回帰モデルの微分効果が良好であることが分かる。
図７は、ＣＡ１９－９のみを用いて構築したＳＶＭモデルと、例３のみを用いて構築したＳＶＭモデルと、例３とＣＡ１９－９とを組み合わせて構築したモデルとの分類予測スコアの分布を示す。この方法は、膵癌の特定においてより安定していることがわかる。



１－５：従来のマーカの陰性試料における分類予測モデルの性能
本出願のメチル化マーカ群に基づいて、例１－３においてＳＶＭによって確立されたモデルに従って、従来の腫瘍マーカＣＡ１９－９（ＣＡ１９－９測定値＜３７）について陰性であった試料に対して試験を行った。
関連する試料のＣＡ１９－９測定値及びモデル予測値を表１－８に示し、ＲＯＣ曲線を図８に示す。スコアリング閾値として０．８９５も使用して、試験セットのＡＵＣ値は０．８８５に達した。ＣＡ１９－９を用いて区別できない患者については、例３で構築したＳＶＭモデルでも比較的良好な結果が得られることが分かる。

１－６：配列番号９、配列番号１４、配列番号１３、配列番号２６、配列番号４０、配列番号４３、配列番号５２の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号９、１４、１３、２６、４０、４３、５２をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図９に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８８１であった。試験セットでは、特異度を０．８４６とした場合、感度は０．７７４に達し（表１－９）（隅付き括弧による表１１）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。

１－７：配列番号５、配列番号１８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号５、配列番号１８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４６をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図１０に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８８１であった。試験セットでは、特異度を０．６９２とした場合、感度は０．８３９に達し（表１－１０、隅付き括弧による表１２）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。
１－８：配列番号８、配列番号１１、配列番号２０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５４の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号８、配列番号１１、配列番号２０、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５１、配列番号５４をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図１１に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８８０であった。試験セットでは、特異度を０．７６９とした場合、感度は０．８３９に達し（表１－１１、隅付き括弧による表１３）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。

１－９：配列番号８、配列番号１４、配列番号２６、配列番号２４、配列番号３１、配列番号４０、配列番号４６の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号８、配列番号１４、配列番号２６、配列番号２４、配列番号３１、配列番号４０、配列番号４６をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図１２に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８７１であった。試験セットでは、特異度を０．８８５とした場合、感度は０．７１０に達し（表１－１２、隅付き括弧による表１４）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。

１－１０：配列番号３、９、８、２９、４２、４０、４１の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号３、９、８、２９、４２、４０、４１をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図１３に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８６６であった。試験セットでは、特異度を０．５３８とした場合、感度は０．９０３に達し（表１－１３、隅付き括弧による表１５）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。

１－１１：配列番号５、８、１９、７、４４、４７、５３の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号５、８、１９、７、４４、４７、５３をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図１４に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８６４であった。試験セットでは、特異度を０．５７７とした場合、感度は０．７７４に達し（表１－１４、隅付き括弧による表１６）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。

１－１２：配列番号１２、１７、２４、２８、４０、４２、４７の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号１２、１７、２４、２８、４０、４２、４７をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図１５に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８６２であった。試験セットでは、特異度を０．７３１とした場合、感度は０．８７１に達し（表１－１５、隅付き括弧による表１７）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。

１－１３：配列番号５、配列番号１８、配列番号１４、配列番号１０、配列番号８、配列番号１９、配列番号２７の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号５、配列番号１８、配列番号１４、配列番号１０、配列番号８、配列番号１９、配列番号２７をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図１６に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８５９であった。試験セットでは、特異度を０．６１５とした場合、感度は０．８３９に達し（表１－１６、隅付き括弧による表１８）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。

１－１４：配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２４、配列番号４７、配列番号５０の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号６、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２４、配列番号４７、配列番号５０をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図１７に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８５７であった。試験セットでは、特異度を０．８４６とした場合、感度は０．７７４に達し（表１－１７、隅付き括弧による表１９）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。

１－１５：配列番号１、１９、２７、３４、３７、４６、４７の７つのマーカの組合せのモデル構築及び性能評価
異なるマーカの組合せの予測性能を検証するために、本出願における５６個のメチル化マーカのクラスターに基づいて、７個のマーカ配列番号１、１９、２７、３４、３７、４６、４７をモデル構築及び性能試験のために選択した。訓練群の１１７個の試料（試料１～１１７）及び試験群の５７個の試料（試料１１８～１７４）を包含する訓練群及び試験群を分割した。
７個のメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおけるサポートベクターマシンモデルを構築した。
１．試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２．ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
３．試験セットデータを使用して試験を実行した：上記のモデルを試験用の試験セットに入れた。コマンドライン：ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）、ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは試験セット試料に対してこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルによって得られた予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌはこの例で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
この７マーカ併用モデルのＲＯＣ曲線を図１８に示す。構築されたモデルのＡＵＣは０．８５６であった。試験セットでは、特異度を０．８０８とした場合、感度は０．７４２に達し（表１－１８、隅付き括弧による表２０）、膵癌患者と健康な人との鑑別効果は良好であった。

この試験では、血漿ｃｆＤＮＡ中の関連遺伝子のメチル化レベルを用いて、膵癌に罹患していない対象の血漿と膵癌に罹患している対象の血漿との差を試験し、有意差のある５６個のメチル化核酸断片をスクリーニングした。上記のメチル化核酸断片マーカ群に基づいて、サポートベクターマシン法による膵癌リスク予測モデルが構築され、膵癌を高い感度及び特異度で効果的に同定することができ、膵癌のスクリーニング及び診断に適している。
例２
２－１：標的化メチル化配列決定による膵癌の示差的メチル化部位のスクリーニング
発明者は、合計９４名の膵癌患者及び２５名の慢性膵炎患者から血液試料を採取し、全ての患者がインフォームドコンセント用紙に署名した。膵癌を有する患者は、膵炎の以前の診断を有していた。試料情報については以下の表を参照されたい。
血漿ＤＮＡのメチル化配列決定データを、その中のＤＮＡメチル化分類マーカを同定するためにＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎアッセイによって得た。方法は以下の通りである。
１．血漿ｃｆＤＮＡ試料の抽出
Ｓｔｒｅｃｋ採血管を使用して患者から２ｍｌの全血試料を採取し、血漿を適時（３日以内）に遠心分離によって分離し、実験室に輸送し、次いで、指示に従ってＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔを使用してｃｆＤＮＡを抽出した。
２．配列決定及びデータ前処理
１）ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑ ５００シーケンサーを使用してペアエンドシーケンシングした。
２）Ｐｅａｒ（ｖ０．６．０）ソフトウェアは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ Ｘ１０／Ｎｅｘｔｓｅｑ ５００／Ｎｏｖａ ｓｅｑシーケンサーからの同じペアエンド１５０ｂｐシーケンシング断片のペアエンド配列決定データを、最短重複長が２０ｂｐであり、最短長が組み合わせ後に３０ｂｐである一配列に組み合わせた。
３）Ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ ｖ ０．６．０及びｃｕｔａｄａｐｔ ｖ１．８．１ソフトウェアを使用して、結合された配列決定データに対してアダプタ除去を行った。アダプタ配列「ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣ」を配列の５’末端から除去し、両端のシーケンシング品質値が２０未満の塩基を除去した。
３．シーケンシングデータアライメント
本明細書で使用される参照ゲノムデータは、ＵＣＳＣデータベース（ＵＣＳＣ：ＨＧ１９，ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｓｏｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｂｉｇＺｉｐｓ／ｈｇ１９．ｆａ．ｇｚ）からのものであった。
１）まず、Ｂｉｓｍａｒｋ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてＨＧ１９をシトシンからチミン（ＣＴ）及びアデニンからグアニン（ＧＡ）に変換し、Ｂｏｗｔｉｅ２ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて変換後のゲノムのインデックスを構築した。
２）前処理されたデータはまた、ＣＴ及びＧＡの変換に供された。
３）変換された配列を、Ｂｏｗｔｉｅ２ソフトウェアを使用して変換されたＨＧ１９参照ゲノムにアラインメントした。最小シード配列長は２０であり、シード配列においてミスマッチは許容されなかった。
４．ＭＨＦの算出
各標的領域ＨＧ１９のＣｐＧ部位について、上記のアライメント結果に基づいて、各部位に対応するメチル化状態を求めた。本明細書における部位のヌクレオチド番号付けは、ＨＧ１９のヌクレオチド位置番号付けに対応する。１つの標的メチル化領域は、複数のメチル化ハプロタイプを有し得る。この値は、標的領域内のメチル化ハプロタイプごとに計算する必要がある。ＭＨＦの計算式の一例は以下の通りであり、

式中、ｉは標的メチル化領域を表し、ｈは標的メチル化ハプロタイプを表し、Ｎｉは標的メチル化領域に位置するリードの数を表し、Ｎｉ、ｈは標的メチル化ハプロタイプを含むリードの数を表す。
５．メチル化データマトリックス
１）訓練セット及び試験セット中の各試料のメチル化配列決定データをデータマトリックスに組合せ、２００未満の深さの各部位を欠損値とした。
２）１０％を超える欠損値割合を有する部位を除去した。
３）データマトリックスの欠損値については、ＫＮＮアルゴリズムを使用して欠損データを補間した。
６．学習セット試料群に基づく特徴メチル化セグメントの発見
１）表現型に関して各メチル化セグメントについてロジスティック回帰モデルを構築し、最も有意な回帰係数を有するメチル化セグメントを各増幅標的領域についてスクリーニングして候補メチル化セグメントを形成した。
２）訓練セットを、十倍クロスバリデーション増分特徴選択のために１０の部分にランダムに分割した。
３）各領域における候補メチル化セグメントを回帰係数の有意性に従って降順にランク付けし、１つのメチル化セグメントのデータを毎回追加して試験データを予測した。
４）工程３）では、工程２）で生成されたデータの１０コピーを使用した。データの各コピーについて、１０回の計算を行い、最終ＡＵＣは１０回の計算の平均であった。訓練データのＡＵＣが増加した場合、候補メチル化セグメントは特徴メチル化セグメントとして保持され、そうでない場合は破棄される。
５）訓練セット中の異なる数の特徴の下での平均ＡＵＣ中央値に対応する特徴の組合せを、特徴メチル化セグメントの最終的な組合せとした。
ＨＧ１９における選択された特徴的なメチル化マーカの分布は以下の通りである：ＳＩＸ３遺伝子領域における配列番号５７、ＴＬＸ２遺伝子領域における配列番号５８、及びＣＩＬＰ２遺伝子領域における配列番号５９。上記のメチル化マーカのレベルは、膵癌患者のｃｆＤＮＡにおいて増加又は減少した（表２－１）。上記３つのマーカ領域の配列を配列番号５７～５９に示す。各マーカ領域中の全てのＣｐＧ部位のメチル化レベルは、ＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎシーケンシングによって得ることができる。各領域における全てのＣｐＧ部位の平均メチル化レベル、並びに単一のＣｐＧ部位のメチル化状態は、いずれも膵癌の診断のためのマーカとして使用することができる。

試験セットにおける膵癌患者及び慢性膵炎患者のメチル化マーカのメチル化レベルを表２－２に示す。表から分かるように、メチル化マーカのメチル化レベルの分布は、膵癌患者と慢性膵炎患者とで有意に異なり、良好な鑑別効果が得られた。

表２－３に、選択した各マーカにおけるランダムな１０個のＣｐＧ部位又はそれらの組合せのメチル化度とマーカ全体のメチル化度との相関（ピアソン相関係数）及び対応する有意性ｐ値を示す。マーカ内の単一のＣｐＧ部位又は複数のＣｐＧ部位の組合せのメチル化レベルは、全領域のメチル化状態又はレベルと有意な相関を有し（ｐ＜０．０５）、相関係数はいずれも０．８を超えることが分かる。この強い又は極めて強い相関は、マーカ内の単一のＣｐＧ部位又は複数のＣｐＧ部位の組合せがマーカ全体と同じ良好な分化効果を有することを示す。
２－２：単一メチル化マーカの予測性能
単一のメチル化マーカが膵炎と膵癌とを区別する能力を検証するために、単一のメチル化マーカのメチル化レベルの値を使用して、単一のマーカの予測性能を検証した。
まず、３つのメチル化マーカのメチル化レベル値を訓練用の訓練セット試料に分けて使用し、膵癌と膵炎とを鑑別するための閾値、感度及び特異度を決定し、次いで、閾値を使用して試験セット中の試料の感度及び特異度を統計的に分析した。結果を以下の表２－４（隅付き括弧による表２５）に示す。単一のマーカも良好な分化性能を達成することができることが分かる。
２－３．分類予測モデルの構築
マーカＤＮＡメチル化レベル（メチル化ハプロタイプ分率等）を用いて膵癌患者と慢性膵炎患者とを分類する潜在的な能力を検証するために、訓練群において、３つのＤＮＡメチル化マーカの組合せに基づいてサポートベクターマシン疾患分類モデルを構築して、試験群におけるこのＤＮＡメチル化マーカ群の分類予測効果を検証した。訓練群及び試験群は、訓練群の８０個の試料（試料１～８０）及び試験群の３９個の試料（試料８０～１１９）を包含する割合に従って分割した。
発見されたＤＮＡメチル化マーカを使用して、両方の試料群の訓練セットにおいて、サポートベクターマシンモデルを構築した。
１）試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２）メチル化マーカを使用して膵癌を同定する可能性を利用するために、疾患分類システムが遺伝子マーカに基づいて開発された。ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）パイソンソフトウェア（ｖ３．６．９）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（ｖ０．２３．１）を使用して、訓練モデルを構築し、訓練モデルの訓練モードを相互検証する。コマンドライン：ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）。
ｂ）ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（ｖ０．２３．１）は、メチル化値データマトリックスを入力してＳＶＭモデルｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｘ＿ｔｒａｉｎ，ｙ＿ｔｒａｉｎ）を構築するために使用され、ｘ＿ｔｒａｉｎは訓練セットデータマトリックスを表し、ｙ＿ｔｒａｉｎは訓練セットの表現型情報を表す。
モデルを構築する過程で、膵癌型は１、慢性膵炎型は０とコードされた。ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（ｖ０．２３．１）によってモデルを構築する方法では、閾値はデフォルトで０．８９７に設定されていた。最後に、構築されたモデルは、膵癌と膵炎とを区別するためのスコア閾値として０．８９７を使用した。訓練セット試料に対する２つのモデルの予測スコアを表２－５（隅付き括弧による表２６）に示す。
２－４：分類予測モデル試験
上記の膵癌及び膵炎の対象の血液試料を用いてＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎシーケンシングを行い、シーケンシング結果における特徴的なメチル化マーカシグナルに基づいて、ＰＣＡ及びクラスタリング等の分類解析を行った。
本出願のメチル化マーカ群に基づいて、例２－３においてＳＶＭにより確立されたモデルに従った試験セットにおいて予測した。予測関数を用いて試験セットを予測して、予測結果を出力した（疾患確率：デフォルトスコア閾値は０．８９７であり、スコアが０．８９７より大きい場合、対象は膵酸を有する患者とみなされ、そうでない場合、対象は慢性膵炎を有する患者である）。試験群は５７個の試料（試料１１８～１７４）を有し、計算方法は以下の通りである。
コマンドライン：
ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）
ここで、ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは、例２－３で構築されたＳＶＭ予測モデルを使用して取得された試験セット内の試料の予測スコアを表し、ｍｏｄｅｌは、例２－３で構築されたＳＶＭ予測モデルを表し、ｔｅｓｔ＿ｄｆは試験セットデータを表す。
試験群の予測スコアを表２－６に示す。ＲＯＣ曲線を図１９に示す。予測スコア分布を図２０に示す。試験群の全ＡＵＣ下の面積は０．８４７であった。訓練セットにおいて、特異度が８８．２％であるとき、このモデルの感度は８８．９％に達することができ、試験セットにおいて、特異度が８７．５％である場合、感度は７４．２％に達することができた。選択された変数によって確立されたＳＶＭモデルの微分効果が良好であることが分かる。
図２１及び２２は、それぞれ訓練群及び試験群における３つのメチル化マーカの分布を示す。このメチル化マーカ群の相違は、膵炎患者の血漿と膵癌患者の血漿とで比較的安定していることが分かる。

２－５：腫瘍マーカ陰性である患者に対する予測効果
本出願のメチル化マーカ群に基づき、例２－３においてＳＶＭにより確立されたモデルに従って、腫瘍マーカＣＡ１９－９陰性（＜３７）の患者を判別した。
試験群の予測スコアを表２－７に、ＲＯＣ曲線を図２３に示す。従来の腫瘍マーカＣＡ１９－９によって区別することができない患者については、構築されたＳＶＭモデルも良好な結果を達成することができることが分かる。
この研究では、血漿ｃｆＤＮＡ中のメチル化マーカのメチル化レベルを使用して、慢性膵炎を有する対象の血漿と膵癌を有する対象の血漿との間の差を研究し、有意差のある３つのＤＮＡメチル化マーカをスクリーニングした。上記のＤＮＡメチル化マーカ群に基づいて、サポートベクターマシン法により、膵癌患者と慢性膵炎患者とを感度及び特異度高く効果的に鑑別することができ、慢性膵炎患者における膵癌のスクリーニング及び診断に適した悪性膵癌リスク予測モデルを構築した。
例３
３－１：標的化メチル化配列決定による膵癌特異的メチル化部位のスクリーニング
年齢及び性別が一致する膵癌血液試料を合計１１０個、膵癌を有さない試料を１１０個採取した。全ての登録患者がインフォームドコンセント用紙に署名した。試料情報を表３－１（隅付き括弧による表２９）に示す。

本出願は、ＤＮＡメチル化マーカのクラスターを提供する。患者の血漿試料中のＤＮＡメチル化マーカのメチル化レベルを検出することにより、検出されたメチル化レベルデータを用いて、診断モデルに従ってスコアを予測し、膵癌患者と健康な人とを識別して、早期スクリーニングの精度が高く、コストが低い膵癌の早期診断という目的を達成する。
１．試料ｃｆＤＮＡ抽出
全ての血液試料をＳｔｒｅｃｋチューブに採取し、血漿を抽出するために、血液試料を最初に１６００ｇで４℃で１０分間遠心分離した。バフィーコート層の損傷を防ぐために、滑らかな制動モードを設定する必要があった。次いで、上清を新しい１．５ｍｌコニカルチューブに移し、４℃で１０分間１６０００ｇで遠心分離した。上清を新しい１．５ｍｌコニカルチューブに再び移し、－８０℃で保存した。
循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を抽出するために、血漿アリコートを解凍し、製造業者の指示に従ってＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ ５５１１４）を使用して直ちに処理した。抽出されたｃｆＤＮＡ濃度を、ｑｕｂｉｔ３．０を使用して定量した。
２．バイサルファイト変換及びライブラリの調製
亜硫酸水素ナトリウム変換キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＭＥＣＯＶ５０）を用いて、シトシン塩基の亜硫酸水素ナトリウム変換を行った。製造者の説明書に従って、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ又はｃｔＤＮＡを下流用途のために変換及び精製した。
試料ＤＮＡの抽出、品質検査、及びＤＮＡ上の非メチル化シトシンのグアニンに結合しない塩基への変換を行った。１つ又は複数の実施形態において、変換は、酵素的方法、好ましくはデアミナーゼによる処理を用いて行われるか、又は変換は、非酵素的方法、好ましくはバイサルファイト若しくは重硫酸塩による処理、より好ましくは亜硫酸水素カルシウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、重亜硫酸アンモニウム、重硫酸ナトリウム、重硫酸カリウム及び重硫酸アンモニウムによる処理を用いて行われる。
ライブラリは、ＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎ（特許番号：ＣＮ２０１９１０５１５８３０）法を用いて構築した。メチルチタン法は以下の通りである。バイサルファイトによって変換されたＤＮＡを脱リン酸化し、次いで、分子タグ（ＵＭＩ）を有するユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプタに連結した。第２鎖の合成及び精製の後、変換されたＤＮＡを、必要な標的領域の標的化増幅のための半標的化ＰＣＲ反応に供した。再度精製した後、試料特異的バーコード及び全長Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプタをＰＣＲ反応によって標的ＤＮＡ分子に加えた。次いで、ＩｌｌｕｍｉｎａのＫＡＰＡライブラリ定量キット（ＫＫ４８４４）を用いて最終ライブラリを定量し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーで配列決定した。ＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎライブラリ構築方法は、必要な標的断片をより少量のＤＮＡ、特にｃｆＤＮＡで効果的に濃縮することができるが、この方法は元のＤＮＡのメチル化状態を十分に保存することができ、最終的に隣接するＣｐＧメチル化シトシン（所与のターゲットは、所与の領域に応じて、数から数十のＣｐＧを有することができる）を分析することによって、その特定の領域の全メチル化パターンは、個々の塩基の状態を比較するのではなく、固有のマーカとして機能することができる。
３．配列決定及びデータ前処理
１）ペアエンド配列決定を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ２５００シーケンサーを使用して行った。配列決定体積は、試料当たり２５～３５Ｍであった。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ ２５００シーケンサーからのペアエンド１５０ｂｐシーケンシングデータを、Ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ ｖ０．６．０及びｃｕｔａｄａｐｔ ｖ２．１ソフトウェアを使用してアダプタ除去に供した。Ｒｅａｄ１の３’末端のアダプタ配列「ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＴＣ」を除去し、Ｒｅａｄ２の３’末端のアダプタ配列「ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＴ」を除去し、シーケンシング品質が２０未満であった塩基を両端から除去した。５’末端に３ｂｐアダプタ配列が存在する場合、リード全体が除去される。３０塩基より短いリードもアダプタ除去後に除去した。
２）ペアエンド配列を、Ｐｅａｒ ｖ０．９．６ソフトウェアを使用してシングルエンド配列に組み合わせた。少なくとも２０塩基が重複する両端からのリードを組合せ、組み合わせたリードが３０塩基より短い場合は破棄した。
４．シーケンシングデータの比較
本出願で使用される参照ゲノムデータは、ＵＣＳＣデータベース（ＵＣＳＣ：ｈｇ１９，ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｓｏｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｂｉｇＺｉｐｓ／ｈｇ１９．ｆａ．ｇｚ）からのものであった。
１）まず、Ｂｉｓｍａｒｋ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてｈｇ１９をシトシンからチミン（ＣＴ）及びアデニンからグアニン（ＧＡ）に変換し、Ｂｏｗｔｉｅ２ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて変換後のゲノムのインデックスを構築した。
２）前処理されたデータはまた、ＣＴ及びＧＡ変換に供された。
３）変換された配列を、Ｂｏｗｔｉｅ２ソフトウェアを使用して変換されたＨＧ１９参照ゲノムにアラインメントした。最小シード配列長は２０であり、シード配列においてミスマッチは許容されなかった。
５．メチル化情報の抽出
各標的領域ｈｇ１９のＣｐＧ部位について、上記のアライメント結果に基づいて、各部位に対応するメチル化レベルを求めた。本発明に関与する部位のヌクレオチド番号付けは、ｈｇ１９のヌクレオチド位置番号付けに対応する。
１）メチル化ハプロタイプ分率（ＭＨＦ）を算出するために、各標的領域ｈｇ１９のＣｐＧ部位について、上記の比較結果に基づいて、リードの各部位に対応する塩基配列を得た（Ｃはこの部位でメチル化が起こることを示し、Ｔはこの部位の非メチル化状態を示す）。本明細書における部位のヌクレオチド番号付けは、ＨＧ１９のヌクレオチド位置番号付けに対応する。１つの標的メチル化領域は、複数のメチル化ハプロタイプを有し得る。この値は、標的領域内のメチル化ハプロタイプごとに計算する必要がある。ＭＨＦの計算式の一例は以下の通りであり、
ＭＨＦｉ，ｈ＝（Ｎｉ，ｈ）／Ｎｉ
式中、ｉは標的メチル化領域を表し、ｈは標的メチル化ハプロタイプを表し、Ｎｉは標的メチル化領域に位置するリードの数を表し、Ｎｉ、ｈは標的メチル化ハプロタイプを含むリードの数を表す。
２）平均メチル化度（ＡＭＦ）の算出は、対象領域毎に、その領域内の平均メチル化度を算出する。式は以下の通りである。
ＡＭＦ＝

式中、ｍは標的中のＣｐＧ部位の総数であり、ｉは領域中の各ＣｐＧ部位であり、ＮＣ、ｉは塩基がＴであるＣｐＧ部位でのリードの数（すなわち、この部位でメチル化されているリードの数）であり、ＮＴ、ｉは塩基がＴであるＣｐＧ部位でのリードの数（すなわち、この部位でメチル化されていない配列決定リードの数）である。
６．特徴マトリックスの構築
１）訓練セット及び試験セットの試料のメチル化ハプロタイプ分率（ＭＨＦ）及び平均メチル化分率（ＡＭＦ）のデータをそれぞれデータマトリックスに組合せ、深度２００未満の各部位を欠損値とした。
２）１０％を超える欠損値割合を有する部位を除去した。
３）データマトリックスの欠損値については、ＫＮＮアルゴリズムを使用して欠損データを補間した。まず、ＫＮＮアルゴリズムによる訓練セットを用いて補間器を訓練した後、訓練セットマトリックス及び試験セットマトリックスをそれぞれ補間した。
７．特徴マトリックスによるメチル化マーカのスクリーニング（図１）
１）訓練セットをランダムに３分割し、ロジスティック回帰モデルを構築し、各標的領域の平均ＡＵＣを計算し、各標的領域のＡＵＣが最大の特徴を領域の代表的な特徴として選択し、ＡＵＣに従って降順にランク付けした。
２）訓練セットを、十倍クロスバリデーション増分特徴選択のために１０の部分にランダムに分割した。特定の方法は、訓練セット内のデータの一部を試験データとして破棄し、訓練セット内の残りのデータを訓練データとして破棄することを含んでいた。上記の順序に従って、各領域の代表的な特徴を特徴の組合せに組み込み、９個の訓練データを用いてロジスティック回帰モデルを構築し、試験データを予測した。１０回繰り返した後、試験データの平均ＡＵＣを算出した。
３）訓練データのＡＵＣが増加すると、メチル化マーカは維持され、そうでなければ除去される。サイクル後、得られた特徴の組合せをメチル化マーカの組合せとし、全ての訓練セットデータを用いて新たなモデルを訓練し、試験セットデータを用いて検証した。
合計１０１個のメチル化マーカをスクリーニングした。ＧＲＥＡＴツール（ｇｒｅａｔ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｅａｔ／ｐｕｂｌｉｃ－３．０．０／ｈｔｍｌ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を遺伝子アノテーションに使用した（表３－２参照）。ＧＲＥＡＴ分析では、マーカ領域を隣接遺伝子と相関させ、隣接遺伝子を有する領域に注釈を付けた。相関を２つの方法に分けた。まず、各遺伝子の調節ドメインを見つけ、次いで、この領域の調節ドメインをカバーする遺伝子をこの領域と相関させた。
例えば、ＡＲＨＧＥＦ１６（－６０，１８５）及びＰＲＤＭ１６（＋３２５，０３０）は、ＡＲＨＧＥＦ１６遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から６０，１８５ｂｐ上流及びＰＲＤＭ１６遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から３２５，０３０ｂｐ下流のマーカを表す。


メチル化マーカ領域のメチル化レベルは、膵癌ｃｆＤＮＡにおいて亢進又は低下していた（表３－３参照）。得られた１０１個のメチル化マーカの配列は、配列番号６０～１６０に示す通りである。各メチル化マーカの全てのＣｐＧ部位のメチル化レベルは、ＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎメチル化シーケンシングによって取得することができる。各領域における全てのＣｐＧ部位の平均メチル化レベル、並びに単一のＣｐＧ部位のメチル化レベルは、いずれも膵癌のマーカとして使用することができる。


表３－３（隅付き括弧による表３１）から分かるように、メチル化マーカ領域における平均メチル化レベルの分布は、膵癌罹患者と膵癌非罹患者とで有意に異なっており、分化効果が良好で有意差がある（Ｐ＜０．０１）ことから、膵癌に対する良好なメチル化マーカであるといえる。
３－２：単一メチル化マーカの分化能
単一のメチル化マーカが膵癌を膵癌非存在下と鑑別する能力を検証するために、例３－１の訓練セットデータにおいて、単一マーカのメチル化度データを用いてモデルを訓練し、試験セットの試料を用いてモデルの性能を検証した。
Ｐｙｔｈｏｎ（Ｖ１．０．１）のｓｋｌｅａｒｎ（Ｖ３．９．７）パッケージのロジスティック回帰モデルを使用した：ｍｏｄｅｌ＝ＬｏｇｉｓｔｉｃＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（）。モデルの式は以下の通りであり、ここで、ｘは試料標的マーカのメチル化レベル値であり、ｗは異なるマーカの係数であり、ｂは切片値であり、ｙはモデル予測スコアである。

訓練は、訓練セット：ｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（Ｔｒａｉｎｄａｔａ，ＴｒａｉｎＰｈｅｎｏ）からの試料を使用して行われ、ここで、ＴｒａｉｎＤａｔａは訓練セット試料中の標的メチル化部位のデータであり、ＴｒａｉｎＰｈｅｎｏは訓練セット試料の形質である（膵癌については１、膵癌非存在については０）。モデルの関連閾値は、訓練セットの試料に基づいて決定された。
試験セットの試料を使用して試験を行った：ＴｅｓｔＰｒｅｄ＝ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ＿ｐｒｏｂａ（ＴｅｓｔＤａｔａ）［：１］、式中、ＴｅｓｔＤａｔａは試験セット試料中の標的メチル化部位のデータであり、ＴｅｓｔＰｒｅｄはモデル予測スコアである。この閾値に基づく予測スコアを用いて、試料が膵癌であるか否かを決定した。
本例における単一メチル化マーカのロジスティック回帰モデルの効果を表３－４に示す。この表から、全てのメチル化マーカのＡＵＣ値は、試験セット及び訓練セットのいずれにおいても０．５５を超えており、いずれも膵癌の良好なマーカであることが分かる。
本特許における各単一メチル化マーカは、膵癌マーカとして使用することができる。ロジスティック回帰モデリングは、訓練セットに従って閾値を設定するために使用される。スコアが閾値より大きい場合、膵癌であると予測され、逆もまた同様である場合、膵癌非存在であると予測される。訓練セット及び試験セットは、非常に良好な精度、特異性及び感度を達成することができ、他の機械学習モデルも同様の結果を達成することができる。


３－３：全ての対象メチル化マーカに対する機械学習モデル
本例では、１０１個のメチル化マーカ全てのメチル化レベルを用いて、データ中の膵癌罹患検体と膵癌非罹患検体とを精度よく判別できるロジスティック回帰機械学習モデルＭＯＤＥＬ１を構築する。具体的な工程は、１０１個の標的メチル化マーカ（配列番号６０～１６０）の全ての組合せのデータ入力モデルを用いること以外は、基本的に例３－２と同様である。
訓練セット及び試験セットにおけるモデル予測スコアの分布を図２５に示す。ＲＯＣ曲線を図２６に示す。訓練セットでは、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９８２に達した。試験セットにおいて、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９７５に達した。閾値を０．６００に設定し、スコアがこの値より大きい場合は膵癌と予測し、そうでない場合は膵癌非存在と予測した。この閾値の下では、訓練セット精度は０．９３９であり、訓練セット特異度は０．９８４であり、訓練セット感度は０．８９９であり、試験セット精度は０．８８６であり、試験セット特異度は０．９１５であり、試験セット感度は０．８５４であり、モデルは、膵癌を有する試料と膵癌を有さない試料とを区別することができる。
３－４：メチル化マーカの組合せ１の機械学習モデル
当該マーカの組合せの効果を検証するために、本例では、１０１個のメチル化マーカの全てから、メチル化レベルに基づいて、配列番号１１３、配列番号１２４、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８０、配列番号９６を包含する計６個のメチル化マーカを選択し、ロジスティック回帰機械学習モデルを構築した。
機械学習モデルの構築方法も例３－２と一致するが、関連する試料は、その例では上記６つのマーカのデータのみを使用する。訓練セット及び試験セットにおけるモデルのモデルスコアを図２７に示す。モデルのＲＯＣ曲線を図２８に示す。このモデルの訓練セット及び試験セットでは、膵癌を有する試料及び膵癌を有さない試料のスコアが、他の癌種のスコアと有意に異なることが分かる。このモデルの訓練セットでは、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９２５に達した。試験セットにおいて、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９５３に達した。閾値を０．５１１に設定し、スコアがこの値より大きい場合は膵癌と予測し、そうでない場合は膵癌非存在と予測した。この閾値の下では、訓練セット精度は０．８８６であり、訓練セット特異度は０．９２１であり、訓練セット感度は０．８５５であり、試験セット精度は０．８８６であり、試験セット特異度は０．９１５であり、試験セット感度は０．８５４であり、この組合せモデルの良好な性能を示している。
３－５：メチル化マーカの組合せ２の機械学習モデル
当該マーカの組合せの効果を検証するために、本例では、全１０１個のメチル化マーカの中から、メチル化レベルに基づいて、配列番号１０８、配列番号１２６、配列番号１３６、配列番号１４１、配列番号１５３、配列番号１５９、配列番号８２を包含する計７個のメチル化マーカを選択し、ロジスティック回帰機械学習モデルを構築した。
機械学習モデルの構築方法も例３－２と一致するが、関連する試料は、その例では上記７つのマーカのデータのみを使用する。訓練セット及び試験セットにおけるモデルのモデルスコアを図２９に示す。モデルのＲＯＣ曲線を図３０に示す。このモデルの訓練セット及び試験セットでは、膵癌を有する試料及び膵癌を有さない試料のスコアが、他の癌種のスコアと有意に異なることが分かる。このモデルの訓練セットでは、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９１９に達した。試験セットにおいて、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９３８に達した。閾値を０．５８１に設定し、スコアがこの値より大きい場合は膵癌と予測し、そうでない場合は膵癌非存在と予測した。この閾値の下では、訓練セット精度は０．８２６であり、訓練セット特異度は０．９２１であり、訓練セット感度は０．７５４であり、試験セット精度は０．８１８であり、試験セット特異度は０．８３０であり、試験セット感度は０．８０５であり、この組合せモデルの良好な性能を示している。
３－６：メチル化マーカの組合せ３の機械学習モデル
当該マーカの組合せの効果を検証するために、本例では、全１０１個のメチル化マーカの中から、メチル化レベルに基づいて、配列番号１１５、配列番号１０９、配列番号１２０、配列番号１３７、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１５８、配列番号８８、配列番号９４、配列番号１０１を包含する合計１０個のメチル化マーカを選択して、ロジスティック回帰機械学習モデルを構築した。
機械学習モデルの構築方法も例３－２と一致するが、関連する試料は、その例では上記１０つのマーカのデータのみを使用する。訓練セット及び試験セットにおけるモデルのモデルスコアを図３１に示す。モデルのＲＯＣ曲線を図３２に示す。このモデルの訓練セット及び試験セットでは、膵癌を有する試料及び膵癌を有さない試料のスコアが、他の癌種のスコアと有意に異なることが分かる。このモデルの訓練セットでは、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９１９に達した。試験セットにおいて、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９５０に達した。閾値を０．５８７に設定し、スコアがこの値より大きい場合は膵癌と予測し、そうでない場合は膵癌非存在と予測した。この閾値の下では、訓練セット精度は０．８４８であり、訓練セット特異度は０．９５２であり、訓練セット感度は０．８１２であり、試験セット精度は０．８８６であり、試験セット特異度は０．９１５であり、試験セット感度は０．８５４であり、この組合せモデルの良好な性能を示している。
３－７：全標的メチル化マーカＭＯＤＥＬ１のモデルと他の特許予測モデルとの融合モデルの予測効果
以前の特許（特許番号：ＣＮ２０２１１０６７９２８１８）において、本発明者らは５６個のメチル化マーカを提供した。本発明者らは、先の特許における５６個のメチル化マーカを用いてロジスティック回帰モデルＭＯＤＥＬ２を構築し、例３－３におけるモデルＭＯＤＥＬ１及び機械学習モデル用ＭＯＤＥＬ２の予測値（予測値については表３－５参照）を用いて融合モデルＤＵＡＬＭＯＤＥＬを構築した。





ＤＵＡＬＭＯＤＥＬモデルの構築は、例３－２と同様であるが、当該試料については、ＭＯＤＥＬ１予測値及びＭＯＤＥＬ２予測値が用いられる。訓練セット及び試験セットにおけるＤＵＡＬＭＯＤＥＬのモデルスコアを図３３に、モデルのＲＯＣ曲線を図３４に示す。このモデルの訓練セット及び試験セットでは、膵癌を有する試料及び膵癌を有さない試料のスコアが、他の癌種のスコアと有意に異なることが分かる。このモデルの訓練セットでは、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９８３に達した。試験セットにおいて、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９７１に達した。閾値を０．４１８に設定し、スコアがこの値より大きい場合は膵癌と予測し、そうでない場合は膵癌非存在と予測した。この閾値の下では、訓練セット精度は０．９３９であり、訓練セット特異度は０．９８４であり、訓練セット感度は０．９１３であり、試験セット精度は０．９０９であり、試験セット特異度は０．８７２であり、試験セット感度は０．９５１であり、これは、本特許及び他の特許されたメチル化マーカの組合せからなる凝集モデルが良好な性能を有することを示している。
３－８：全ての対象メチル化マーカと他の特許メチル化マーカを組み合わせたＡＬＬＭＯＤＥＬ予測モデルの予測効果
先の特許出願（特許番号：ＣＮ２０２１１０６７９２８１８）では５６個のメチル化マーカを用意し、本出願の１０１個のメチル化マーカと先の特許の５６個のメチル化マーカを併せて用いてロジスティック回帰モデルＡＬＬＭＯＤＥＬを構築した。ＡＬＬＭＯＤＥＬモデルの構築は、例３－２と同様であるが、当該試料には、本特許の１０１個のメチル化マーカと、先行特許の５６個のメチル化マーカと、を包含する計１５７個のメチル化マーカが用いられている。訓練セット及び試験セットにおけるＡＬＬＭＯＤＥＬのモデルスコアを図３５に、モデルのＲＯＣ曲線を図３６に示す。このモデルの訓練セット及び試験セットでは、膵癌を有する試料及び膵癌を有さない試料のスコアが、他の癌種のスコアと有意に異なることが分かる。このモデルの訓練セットでは、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９８２に達した。試験セットにおいて、膵癌試料を有する試料と膵癌試料を有さない試料とを区別するためのＡＵＣは０．９７５に達した。閾値を０．５９９に設定し、スコアがこの値より大きい場合は膵癌と予測し、そうでない場合は膵癌非存在と予測した。この閾値の下では、訓練セット精度は０．９３９であり、訓練セット特異度は０．９８４であり、訓練セット感度は０．８９９であり、試験セット精度は０．８８６であり、試験セット特異度は０．９１５であり、試験セット感度は０．８５４であり、これは、本特許のメチル化マーカと他の特許マーカとの組合せを使用して構築されたモデルが良好な性能を有することを示している。
例４
４－１：標的化メチル化配列決定による特徴的なメチル化部位のスクリーニング
発明者は、合計９４名の膵癌患者及び２５名の慢性膵炎患者から血液試料を採取し、全ての患者がインフォームドコンセント用紙に署名した。膵癌を有する患者は、膵炎の以前の診断を有していた。試料情報については以下の表を参照されたい。
血漿ＤＮＡのメチル化配列決定データを、その中のＤＮＡメチル化分類マーカを同定するためにＭｅｔｈｙｌＴｉｔａｎアッセイによって得た。処理については図３７を参照されたく、具体的な処理は以下の通りである。
１．血漿ｃｆＤＮＡ試料の抽出
Ｓｔｒｅｃｋ採血管を使用して患者から２ｍｌの全血試料を採取し、血漿を適時（３日以内）に遠心分離によって分離し、実験室に輸送し、次いで、指示に従ってＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔを使用してｃｆＤＮＡを抽出した。
２．配列決定及びデータ前処理
１）ライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑ ５００シーケンサーを使用してペアエンドシーケンシングした。
２）Ｐｅａｒ（ｖ０．６．０）ソフトウェアは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ Ｘ１０／Ｎｅｘｔｓｅｑ ５００／Ｎｏｖａ ｓｅｑシーケンサーからの同じペアエンド１５０ｂｐシーケンシング断片のペアエンド配列決定データを、最短重複長が２０ｂｐであり、最短長が組み合わせ後に３０ｂｐである一配列に組み合わせた。
３）Ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ ｖ０．６．０及びｃｕｔａｄａｐｔ ｖ１．８．１ソフトウェアを使用して、結合された配列決定データに対してアダプタ除去を行った。アダプタ配列「ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＡＣ」を配列の５’末端から除去し、両端のシーケンシング品質値が２０未満の塩基を除去した。
３．シーケンシングデータアライメント
本明細書で使用される参照ゲノムデータは、ＵＣＳＣデータベース（ＵＣＳＣ：ＨＧ１９，ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｓｏｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｂｉｇＺｉｐｓ／ｈｇ１９．ｆａ．ｇｚ）からのものであった。
１）まず、Ｂｉｓｍａｒｋ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてＨＧ１９をシトシンからチミン（ＣＴ）及びアデニンからグアニン（ＧＡ）に変換し、Ｂｏｗｔｉｅ２ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて変換後のゲノムのインデックスを構築した。
２）前処理されたデータはまた、ＣＴ及びＧＡの変換に供された。
３）変換された配列を、Ｂｏｗｔｉｅ２ソフトウェアを使用して変換されたＨＧ１９参照ゲノムにアラインメントした。最小シード配列長は２０であり、シード配列においてミスマッチは許容されなかった。
４．ＭＨＦの算出
各標的領域ＨＧ１９のＣｐＧ部位について、上記のアライメント結果に基づいて、各部位に対応するメチル化状態を求めた。本明細書における部位のヌクレオチド番号付けは、ＨＧ１９のヌクレオチド位置番号付けに対応する。１つの標的メチル化領域は、複数のメチル化ハプロタイプを有し得る。この値は、標的領域内のメチル化ハプロタイプごとに計算する必要がある。ＭＨＦの計算式の一例は以下の通りであり、

式中、ｉは標的メチル化領域を表し、ｈは標的メチル化ハプロタイプを表し、Ｎｉは標的メチル化領域に位置するリードの数を表し、Ｎｉ、ｈは標的メチル化ハプロタイプを含むリードの数を表す。
５．メチル化データマトリックス
１）訓練セット及び試験セット中の各試料のメチル化配列決定データをデータマトリックスに組合せ、２００未満の深さの各部位を欠損値とした。
２）１０％を超える欠損値割合を有する部位を除去した。
３）データマトリックスの欠損値については、ＫＮＮアルゴリズムを使用して欠損データを補間した。
６．学習セット試料群に基づく特徴メチル化セグメントの発見
１）表現型に関して各メチル化セグメントについてロジスティック回帰モデルを構築し、最も有意な回帰係数を有するメチル化セグメントを各増幅標的領域についてスクリーニングして候補メチル化セグメントを形成した。
２）訓練セットを、十倍クロスバリデーション増分特徴選択のために１０の部分にランダムに分割した。
３）各領域における候補メチル化セグメントを回帰係数の有意性に応じて降順に順位付けし、その都度１つのメチル化セグメントのデータを追加して試験データ（サポートベクターマシン（ＳＶＭ）モデル）を予測する。
４）工程３）では、工程２）で生成されたデータの１０コピーを使用した。データの各コピーについて、１０回の計算を行い、最終ＡＵＣは１０回の計算の平均であった。訓練データのＡＵＣが増加した場合、候補メチル化セグメントは特徴メチル化セグメントとして保持され、そうでない場合は破棄される。
ＨＧ１９における選択された特徴的なメチル化マーカの分布は以下の通りである：ＳＩＸ３遺伝子領域における配列番号５７、ＴＬＸ２遺伝子領域における配列番号５８、及びＣＩＬＰ２遺伝子領域における配列番号５９。上記のメチル化マーカのレベルは、膵癌患者のｃｆＤＮＡにおいて増加又は減少した（表４－１）。上記３つのマーカ領域の配列を配列番号５７～５９に示す。
訓練セット及び試験セットにおける膵癌患者及び慢性膵炎患者のメチル化マーカの平均メチル化レベルをそれぞれ表４－１及び表４－２に示す。膵癌患者及び慢性膵炎患者における訓練セット及び試験セットにおける上記三つのメチル化マーカのメチル化レベルの分布を、それぞれ図３８及び図３９に示す。図及び表から分かるように、メチル化マーカのメチル化レベルは、膵癌患者と慢性膵炎患者とで有意差があり、良好な鑑別効果を有する。


４－２：機械学習に基づく分類予測モデルの構築
マーカＤＮＡメチル化レベル（メチル化ハプロタイプ分率等）を用いて膵癌患者と慢性膵炎患者とを分類する潜在的な能力を検証するために、訓練群において、３つのＤＮＡメチル化マーカの組合せに基づいてサポートベクターマシン疾患分類モデルｐｐ＿ｍｏｄｅｌを構築し、サポートベクターマシンモデル予測スコアとＣＡ１９－９測定値との組合せデータマトリックスに基づくロジスティック回帰疾患分類モデルｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌを構築し、試験群において２つのモデルの分類予測効果を検証した。訓練群及び試験群は、訓練群の８０個の試料（試料１～８０）及び試験群の３９個の試料（試料８０～１１９）を包含する割合に従って分割した。
発見されたＤＮＡメチル化マーカを使用して、訓練セットにおいて、サポートベクターマシンモデルを構築した。
１）試料を２つの部分に事前に分割し、１つの部分をモデルの訓練に使用し、１つの部分をモデル試験に使用した。
２）メチル化マーカを使用して膵癌を同定する可能性を利用するために、疾患分類システムが遺伝子マーカに基づいて開発された。ＳＶＭモデルを、訓練セットにおけるメチル化マーカレベルを使用して訓練した。具体的な訓練方法は以下の通りである。
ａ）訓練モデルは、Ｐｙｔｈｏｎソフトウェア（ｖ０．２３．１）のｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（ｖ３．６．９）、コマンドライン：ｐｐ＿ｍｏｄｅｌ＝ＳＶＲ（）を使用して構築される。
ｂ）メチル化数値マトリックスは、ｓｋｌｅａｒｎソフトウェアパッケージ（ｖ０．２３．１）を使用してＳＶＭモデルｐｐ＿ｍｏｄｅｌ．ｆｉｔ（ｔｒａｉｎ＿ｄｆ，ｔｒａｉｎ＿ｐｈｅｎｏ）を構築するために入力され、ｔｒａｉｎ＿ｄｆは訓練セットのメチル化数値マトリックスを表し、ｔｒａｉｎ＿ｐｈｅｎｏは訓練セットの表現型情報を表し、ｐｐ＿ｍｏｄｅｌは３つのメチル化マーカ数値マトリックスを使用して構築されたＳＶＭモデルを表す。
ｃ）予測スコアを得るために、訓練セット及び試験セットデータがそれぞれｐｐ＿ｍｏｄｅｌモデルに取り込まれる：ｔｒａｉｎ＿ｐｒｅｄ＝ｐｐ＿ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｒａｉｎ＿ｄｆ）
ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｐｐ＿ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｓｔ＿ｄｆ）
ここで、ｔｒａｉｎ＿ｄｆ及びｔｅｓｔ＿ｄｆは、それぞれ訓練セット及び試験セットのメチル化数値行列であり、ｔｒａｉｎ＿ｐｒｅｄ及びｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは、それぞれ訓練セット及び試験セットデータのｐｐ＿ｍｏｄｅｌモデル予測スコアである。
３）膵癌患者と膵炎患者との鑑別能を向上させるために、ＣＡ１９－９の検出値がモデルに包含された。具体的な方法は以下の通りである。
ｄ）訓練セット及び対応するＣＡ１９－９測定データのＳＶＭモデル予測値は、データマトリックスに結合され、標準化される。
Ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｓｃａｌａｒ＿ｔｒａｉｎ＝ＲｏｂｕｓｔＳｃａｌｅｒ（）．ｆｉｔ（ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ）
Ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｓｃａｌａｒ＿ｔｅｓｔ＝ＲｏｂｕｓｔＳｃａｌｅｒ（）．ｆｉｔ（ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｄｆ）
ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ＝Ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｓｃａｌａｒ＿ｔｒａｉｎ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ）
ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｄｆ＝Ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｓｃａｌａｒ＿ｔｅｓｔ．ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｄｆ）
ここで、ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ及びｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｄｆは、試験セット試料及び訓練セット試料のこの例で構築されたｐｐ＿ｍｏｄｅｌ予測モデルによって取得された予測スコアがそれぞれＣＡ１９－９と組み合わされたデータマトリックスを表す。ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ及びｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｄｆは、それぞれ、標準化後の訓練セット及び試験セットのデータマトリックスを表す。
ｅ）訓練セットｐｐ＿ｍｏｄｅｌモデル予測スコアとＣＡ１９－９測定値との組合せ標準化データマトリックスを使用してロジスティック回帰モデルが構築され、このモデルは、試験セットｐｐ＿ｍｏｄｅｌモデル予測スコアとＣＡ１９－９との組合せ標準化データマトリックスを予測するために使用される。
ｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌ＝ＬｏｇｉｓｔｉｃＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（）．ｆｉｔ（ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｒａｉｎ＿ｄｆ，ｔｒａｉｎ＿ｐｈｅｎｏ）
ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄ＝ｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌ．ｐｒｅｄｉｃｔ（ｓｃａｌｅｄ＿ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｄｆ）
ここで、ｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌは、ＣＡ１９－９検出値を組み込んだ標準化された訓練セットデータマトリックスを用いてフィッティングされたロジスティック回帰モデルを表し、ｃｏｍｂｉｎｅ＿ｔｅｓｔ＿ｐｒｅｄは、試験セット内のｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌの予測スコアを表す。
モデルを構築する過程で、膵癌型は１、慢性膵炎型は０とコードされる。モデル予測スコア分布に従って、ｐｐ＿ｍｏｄｅｌ及びｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌ閾値は、それぞれ０．８９２及び０．８８５に設定される。２つのモデルに基づいて、予測スコアが閾値より高い場合、患者は膵癌を有すると分類され、そうでない場合、患者は膵炎を有すると分類される。
訓練セット及び試験セット試料の２つのモデルの予測スコアを、それぞれ表４－３及び表４－４に示す。予測スコアの分布を図４０に示す。二つの機械学習モデルとＣＡ１９－９測定のみのＲＯＣ曲線を図４１に示すが、ＣＡ１９－９単独のＡＵＣ値は０．８４、ｐｐ＿ｍｏｄｅｌのＡＵＣ値は０．８８、ｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌのＡＵＣ値は０．９０である。３つのメチル化マーカを用いて構築されたＳＶＭモデル（ｐｐ＿ｍｏｄｅｌ）の性能は、ＣＡ１９－９のそれよりも有意に良好であり、また、ＣＡ１９－９検出値をｐｐ＿ｍｏｄｅｌモデルの予測値に加算して構築されたロジスティック回帰モデルｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌの性能も、ｐｐ＿ｍｏｄｅｌのそれよりも良好である。
決定された閾値は、試験セット内の統計に使用される（３７の認識された閾値がＣＡ１９－９に使用される）。感度及び特異度を表４－５に示す。検査セットにおける特異度が１００％であると、ｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌの膵癌患者に対する感度は８７％に達することができ、その性能はｐｐ＿ｍｏｄｅｌやＣＡ１９－９よりも優れている。
さらに、ＣＡ１９－９に関して陰性（＜３７）と同定された試料中の２つのモデルの性能を統計的に分析した。結果を表４－６に示す。試験セットにおいてＣＡ１９－９に関して陰性であると同定された膵癌患者について、ｃｐｐ＿ｍｏｄｅｌは依然として６３％の感度及び１００％の特異度に達することができることが分かる。




この研究では、血漿ｃｆＤＮＡ中のメチル化マーカのメチル化レベルを使用して、慢性膵炎を有する対象の血漿と膵癌を有する対象の血漿との間の差を研究し、有意差のある３つのＤＮＡメチル化マーカをスクリーニングした。ＣＡ１９－９検出値を組み合わせた上記ＤＮＡメチル化マーカ群に基づいて、サポートベクターマシン及びロジスティック回帰法により、慢性膵炎と診断された患者における膵癌患者と慢性膵炎患者とを感度及び特異度高く効果的に鑑別することができ、慢性膵炎患者における膵癌のスクリーニング及び診断に適した悪性膵癌リスク予測モデルを構築した。
例５
５－１膵管腺癌、隣接組織及び白血球ＤＮＡ試料のメチル化存在量の比較
膵管腺癌患者の膵臓、癌組織及び隣接組織に異常がない健康な人の白血球からＤＮＡ試料を得た（白血球試料３０個、癌組織試料３０個を包含する）。形質細胞を含まないＤＮＡのほとんどは、白血球の破裂後に放出されたＤＮＡに由来し、そのバックグラウンドは形質細胞を含まないＤＮＡの検出部位の基本的なバックグラウンドシグナルであり得るので、白血球ＤＮＡを参照試料として選択した。説明書に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて白血球ＤＮＡを抽出し、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを用いて組織ＤＮＡを抽出した。Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｑ３２８５４）を使用して、ｃｆＤＮＡの濃度を検出した。
上記工程で得られたＤＮＡ試料２０ｎｇをバイサルファイト試薬（ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：ＭＥＣＯＶ５０）で処理して、変換ＤＮＡを得た。
ＰＣＲ反応系において、各プライマーの終濃度は１００ｎＭであり、各検出プローブの終濃度は１００ｎＭである。例えば、ＰＣＲ反応系は、１０μＬ～１２．５０μＬの２×ＰＣＲ反応混合物、０．１２μＬのフォワードプライマー及びリバースプライマー、０．０４μＬのプローブ、６μＬの試料ＤＮＡ（約１０ｎｇ）、及び約２０μＬの総体積を構成する水を含むことができる。
プライマー及びプローブ配列を表５－１に示す。例えば、ＰＣＲ反応条件は以下の通りであり得る：９５℃で５分間。９５℃で２０秒間、及び６０℃で４５秒間（蛍光収集）、５０サイクル。ＡＢＩ７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、対応する蛍光チャネル内の異なる蛍光を検出した。白血球、隣接組織及び癌組織から得られた試料のＣｔ値を計算し、比較した。メチル化レベル＝２－ΔＣｔ試験対象試料／２－ΔＣｔ陽性標準×１００％。ΔＣｔ＝Ｃｔ標的遺伝子－Ｃｔ内部参照遺伝子



結果は、癌組織におけるメチル化シグナルの陽性率が白血球試料のそれよりもはるかに高くなり得ることを示し、これはまた、癌組織におけるメチル化シグナルを示す。標的メチル化シグナルは、白血球のほとんどの試料で検出できなかった。これらの標的は全て、膵癌の血液検査に使用される可能性を有し得る。これは、腫瘍組織に対する選択された標的マーカの実現可能性及び特異性を実証する。
特異度が９０％を超える場合、検出部位の検出感度統計を以下の表に示す。選択された標的マーカは、腫瘍組織に対して高い感度を有することが証明されている。

膵管腺癌患者及び膵臓に異常がない患者の血漿試料におけるメチル化シグナルの比較
膵臓に異常がない１００人の健康な対照からの血漿及び膵管腺癌を有する１００人の患者からの血漿を試験のために選択した：市販のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号：５１３０４）を使用して上記血漿試料から細胞外ＤＮＡを抽出した。抽出した細胞外遊離ＤＮＡに対して、市販のバイサルファイト変換試薬ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔを用いて亜硫酸塩変換処理を行い、変換ＤＮＡを得た。
上記ＰＣＲ反応系を用いて蛍光ＰＣＲ検出を行った。表５－１に示すプライマー及びプローブ配列を使用し、参照遺伝子ＡＣＴＢを対照として同時に試験した。プライマーの最終濃度は５００ｎＭであり、プローブの最終濃度は２００ｎＭである。ＰＣＲ反応系は、１０μＬの増幅前希釈産物、２．５μＬの検出部位用のプライマー及びプローブマスターミックスを含む。ＰＣＲ試薬（Ｌｕｎａ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ））１２．５μＬ。
蛍光ＰＣＲ反応系は例５－１と同様である。ＰＣＲ反応条件は以下の通りである：９５℃で５分間；９５℃で１５秒間、５６℃で４０秒間（蛍光収集）、５０サイクル。異なる遺伝子プローブ修飾蛍光に従って、対応する検出蛍光チャネルを選択した。メチル化レベル＝２＾（－ΔＣｔ試験試料）／２＾（－ΔＣｔ陽性標準）×１００％。ΔＣｔ＝Ｃｔ標的遺伝子－Ｃｔ内部参照遺伝子


結果は、本出願の全ての標的が膵管腺癌の血液検出に使用できることを示す。これは、腫瘍組織に対する選択された標的マーカの実現可能性及び特異性を実証する。
例６
６－１膵癌の予測のためのＥＢＦ２とＣＣＮＡ１の組合せ
本出願は、膵癌患者１１５名及び健康な人対照８５名の血漿ｃｆＤＮＡに対してメチル化特異的ＰＣＲを行い、本出願の遺伝子組合せのＤＮＡメチル化レベルを利用して、膵癌血漿と正常者血漿とを識別できることを見出した。
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号：５１３０４）を用いて、膵癌患者１１５名及び健康な対照８５名の血漿からｃｆＤＮＡを抽出し、Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｑ３２８５４）を使用してＤＮＡ濃度を検出し、１％アガロースゲル電気泳動により品質検査を行った。
工程１で得られたＤＮＡを、ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：ＭＥＣＯＶ５０）を用いてバイサルファイト変換した。非メチル化シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換し、メチル化シトシンは変換後も変化しなかった。
プライマー及びプローブ配列を表６－１（隅付き括弧による表４７）に示す。

多重メチル化特異的ＰＣＲ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＭＳＰ）を用いた。ＰＣＲ混合物は、ＰＣＲ反応液、プライマー混合物及びプローブ混合物を包含し、単一の試料を調製した。プライマー混合物は、本出願の遺伝子組合せ及び内部参照遺伝子のそれぞれについて、１対のプライマーを包含する。
ＰＣＲ反応系は以下の通りである：５．００μＬの試料ｃｆＤＮＡ／陽性対照／陰性対照、３．４０μＬのマルチプレックスプライマー混合物（１００μＭ）、４．１０μＬの水、及び１２．５μＬの２×ＰＣＲ反応混合物。
ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分間の前変性、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、４５サイクルに設定した。６０℃でのアニーリング及び伸長段階中に蛍光シグナルを収集した。
メチル化レベル＝Ｃｔ内部参照遺伝子－－Ｃｔ標的遺伝子。
本出願の遺伝子組合せのメチル化レベルについて、バイナリーロジスティック回帰分析を行い、フィッティングを行った。例えば、例示式のスコアが０より大きい場合、鑑別結果は陽性、すなわち悪性小結節である。
例示的なフィッティング式は、Ｓｃｏｒｅ＝３．５４６３２＋ＥＢＦ２メチル化レベル×０．０４４２２＋ＣＣＮＡ１メチル化レベル×０．０６９５６であり得る。
ＲＯＣによって分析されるように、本出願における遺伝子の組合せは、７８％の特異性、６２％の感度、及び０．６８９のＡＵＣを有する。
結果は、対照血漿と膵管腺癌血漿との間の本出願における検出部位の組合せのＤＮＡメチル化シグナルの比較を示す。選択された標的マーカは、腫瘍検出に対して高い感度を有することが証明されている。
６－２膵癌予測のためのＫＣＮＡ６、ＴＬＸ２及びＥＭＸ１の組合せ
本出願は、膵癌患者１１５名及び健康な人対照８５名の血漿ｃｆＤＮＡに対してメチル化特異的ＰＣＲを行い、本出願の遺伝子組合せのＤＮＡメチル化レベルを利用して、膵癌血漿と正常者血漿とを識別できることを見出した。
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号：５１３０４）を用いて、膵癌患者１１５名及び健康な対照８５名の血漿からｃｆＤＮＡを抽出し、Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｑ３２８５４）を使用してＤＮＡ濃度を検出し、１％アガロースゲル電気泳動により品質検査を行った。
工程１で得られたＤＮＡを、ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：ＭＥＣＯＶ５０）を用いてバイサルファイト変換した。非メチル化シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換し、メチル化シトシンは変換後も変化しなかった。
プライマー及びプローブ配列を表６－２（隅付き括弧による表４８）に示す。

多重メチル化特異的ＰＣＲ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＭＳＰ）を用いた。ＰＣＲ混合物は、ＰＣＲ反応液、プライマー混合物及びプローブ混合物を包含し、単一の試料を調製した。プライマー混合物は、本出願の遺伝子組合せ及び内部参照遺伝子のそれぞれについて、１対のプライマーを包含する。
ＰＣＲ反応系は以下の通りである：５．００μＬの試料ｃｆＤＮＡ／陽性対照／陰性対照、３．４０μＬのマルチプレックスプライマー混合物（１００μＭ）、４．１０μＬの水、及び１２．５μＬの２×ＰＣＲ反応混合物。
ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分間の前変性、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、４５サイクルに設定した。６０℃でのアニーリング及び伸長段階中に蛍光シグナルを収集した。
メチル化レベル＝Ｃｔ内部参照遺伝子－－Ｃｔ標的遺伝子。
本出願の遺伝子組合せのメチル化レベルについて、バイナリーロジスティック回帰分析を行い、フィッティングを行った。例えば、例示式のスコアが０より大きい場合、鑑別結果は陽性、すなわち悪性小結節である。
例示的なフィッティング式は、Ｓｃｏｒｅ＝３．４８５１１＋ＫＣＮＡ６メチル化度×０．０４８７０＋ＴＬＸ２メチル化度×０．００４６４＋ＥＭＸ１メチル化度×０．０６５５５であり得る。
ＲＯＣによって分析されるように、本出願における遺伝子の組合せは、８１％の特異性、６３％の感度、及び０．７３５のＡＵＣを有する。
結果は、対照血漿と膵管腺癌血漿との間の本出願における検出部位の組合せのＤＮＡメチル化シグナルの比較を示す。選択された標的マーカは、腫瘍検出に対して高い感度を有することが証明されている。
６－３膵癌予測のためのＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＦＯＸＤ３及びＥＮ２の組合せ
本出願は、膵癌患者１１５名及び健康な人対照８５名の血漿ｃｆＤＮＡに対してメチル化特異的ＰＣＲを行い、本出願の遺伝子組合せのＤＮＡメチル化レベルを利用して、膵癌血漿と正常者血漿とを識別できることを見出した。
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号：５１３０４）を用いて、膵癌患者１１５名及び健康な対照８５名の血漿からｃｆＤＮＡを抽出し、Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｑ３２８５４）を使用してＤＮＡ濃度を検出し、１％アガロースゲル電気泳動により品質検査を行った。
工程１で得られたＤＮＡを、ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：ＭＥＣＯＶ５０）を用いてバイサルファイト変換した。非メチル化シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換し、メチル化シトシンは変換後も変化しなかった。
プライマー及びプローブ配列を表６－３（隅付き括弧による表４９）に示す。

多重メチル化特異的ＰＣＲ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＭＳＰ）を用いた。ＰＣＲ混合物は、ＰＣＲ反応液、プライマー混合物及びプローブ混合物を包含し、単一の試料を調製した。プライマー混合物は、本出願の遺伝子組合せ及び内部参照遺伝子のそれぞれについて、１対のプライマーを包含する。
ＰＣＲ反応系は以下の通りである：５．００μＬの試料ｃｆＤＮＡ／陽性対照／陰性対照、３．４０μＬのマルチプレックスプライマー混合物（１００μＭ）、４．１０μＬの水、及び１２．５μＬの２×ＰＣＲ反応混合物。
ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分間の前変性、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、４５サイクルに設定した。６０℃でのアニーリング及び伸長段階中に蛍光シグナルを収集した。
メチル化レベル＝Ｃｔ内部参照遺伝子－－Ｃｔ標的遺伝子。
本出願の遺伝子組合せのメチル化レベルについて、バイナリーロジスティック回帰分析を行い、フィッティングを行った。例えば、例示式のスコアが０より大きい場合、鑑別結果は陽性、すなわち悪性小結節である。
例示的なフィッティング式は、Ｓｃｏｒｅ＝１．７６５９９＋ＴＲＩＭ５８メチル化レベル×０．０３２１４＋ＴＷＩＳＴ１メチル化レベル×０．０２１８７＋ＦＯＸＤ３メチル化レベル×０．０３０７５＋ＥＮ２メチル化レベル×０．０４４２９であり得る。
ＲＯＣによって分析されるように、本出願における遺伝子の組合せは、８０％の特異性、６４％の感度、及び０．７３５のＡＵＣを有する。
結果は、対照血漿と膵管腺癌血漿との間の本出願における検出部位の組合せのＤＮＡメチル化シグナルの比較を示す。選択された標的マーカは、腫瘍検出に対して高い感度を有することが証明されている。
６－４膵癌予測のためのＴＲＩＭ５８、ＴＷＩＳＴ１、ＣＬＥＣ１１Ａ、ＨＯＸＤ１０及びＯＬＩＧ３の組合せ
本出願は、膵癌患者１１５名及び健康な人対照８５名の血漿ｃｆＤＮＡに対してメチル化特異的ＰＣＲを行い、本出願の遺伝子組合せのＤＮＡメチル化レベルを利用して、膵癌血漿と正常者血漿とを識別できることを見出した。
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号：５１３０４）を用いて、膵癌患者１１５名及び健康な対照８５名の血漿からｃｆＤＮＡを抽出し、Ｑｕｂｉｔ（商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｑ３２８５４）を使用してＤＮＡ濃度を検出し、１％アガロースゲル電気泳動により品質検査を行った。
工程１で得られたＤＮＡを、ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ（商標）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：ＭＥＣＯＶ５０）を用いてバイサルファイト変換した。非メチル化シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換し、メチル化シトシンは変換後も変化しなかった。
プライマー及びプローブ配列を表６－４（隅付き括弧による表５０）に示す。

多重メチル化特異的ＰＣＲ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＭＳＰ）を用いた。ＰＣＲ混合物は、ＰＣＲ反応液、プライマー混合物及びプローブ混合物を包含し、単一の試料を調製した。プライマー混合物は、本出願の遺伝子組合せ及び内部参照遺伝子のそれぞれについて、１対のプライマーを包含する。
ＰＣＲ反応系は以下の通りである：５．００μＬの試料ｃｆＤＮＡ／陽性対照／陰性対照、３．４０μＬのマルチプレックスプライマー混合物（１００μＭ）、４．１０μＬの水、及び１２．５μＬの２×ＰＣＲ反応混合物。
ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分間の前変性、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、４５サイクルに設定した。６０℃でのアニーリング及び伸長段階中に蛍光シグナルを収集した。
メチル化レベル＝Ｃｔ内部参照遺伝子－－Ｃｔ標的遺伝子。
本出願の遺伝子組合せのメチル化レベルについて、バイナリーロジスティック回帰分析を行い、フィッティングを行った。例えば、例示式のスコアが０より大きい場合、鑑別結果は陽性、すなわち悪性小結節である。
例示的なフィッティング式は、Ｓｃｏｒｅ＝１．６５３４３＋ＴＲＩＭ５８メチル化レベル×０．０３６３８＋ＴＷＩＳＴ１メチル化レベル×０．０２２６９＋ＣＬＥＣ１１Ａメチル化レベル×０．００５３６－ＨＯＸＤ１０メチル化レベル×０．００４３５＋ＯＬＩＧ３メチル化レベル×０．０２２９３であり得る。
ＲＯＣによって分析されるように、本出願における遺伝子の組合せは、９０％の特異性、５２％の感度、及び０．７２６のＡＵＣを有する。
結果は、対照血漿と膵管腺癌血漿との間の本出願における検出部位の組合せのＤＮＡメチル化シグナルの比較を示す。選択された標的マーカは、腫瘍検出に対して高い感度を有することが証明されている。
上記の詳細な説明は、説明及び例として提供されており、添付の特許請求の範囲を限定することを意図していない。本明細書に記載された実施形態に対する様々な修正は、当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内にとどまる。
配列表１６１ ＜２２３＞ＡＣＴＢプローブ
配列表１６２ ＜２２３＞ＡＣＴＢフォワードプライマー
配列表１６３ ＜２２３＞ＡＣＴＢリバースプライマー
配列表１６４ ＜２２３＞ＴＬＸ２領域１
配列表１６５ ＜２２３＞ＴＬＸ２プローブ１
配列表１６６ ＜２２３＞ＴＬＸ２フォワードプライマー１
配列表１６７ ＜２２３＞ＴＬＸ２リバースプライマー１
配列表１６８ ＜２２３＞ＴＬＸ２領域２
配列表１６９ ＜２２３＞ＴＬＸ２プローブ２
配列表１７０ ＜２２３＞ＴＬＸ２フォワードプライマー２
配列表１７１ ＜２２３＞ＴＬＸ２リバースプライマー２
配列表１７２ ＜２２３＞ＥＢＦ２領域１
配列表１７３ ＜２２３＞ＥＢＦ２プローブ１
配列表１７４ ＜２２３＞ＥＢＦ２フォワードプライマー１
配列表１７５ ＜２２３＞ＥＢＦ２リバースプライマー１
配列表１７６ ＜２２３＞ＥＢＦ２領域２
配列表１７７ ＜２２３＞ＥＢＦ２プローブ２
配列表１７８ ＜２２３＞ＥＢＦ２フォワードプライマー２
配列表１７９ ＜２２３＞ＥＢＦ２リバースプライマー２
配列表１８０ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６領域１
配列表１８１ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６プローブ１
配列表１８２ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６フォワードプライマー１
配列表１８３ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６リバースプライマー１
配列表１８４ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６領域２
配列表１８５ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６プローブ２
配列表１８６ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６フォワードプライマー２
配列表１８７ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６リバースプライマー２
配列表１８８ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６領域３
配列表１８９ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６プローブ３
配列表１９０ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６フォワードプライマー３
配列表１９１ ＜２２３＞ＫＣＮＡ６リバースプライマー３
配列表１９２ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１領域１
配列表１９３ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１プローブ１
配列表１９４ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１フォワードプライマー１
配列表１９５ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１リバースプライマー１
配列表１９６ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１領域２
配列表１９７ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１プローブ２
配列表１９８ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１フォワードプライマー２
配列表１９９ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１リバースプライマー２
配列表２００ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１領域３
配列表２０１ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１プローブ３
配列表２０２ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１フォワードプライマー３
配列表２０３ ＜２２３＞ＣＣＮＡ１リバースプライマー３
配列表２０４ ＜２２３＞ＦＯＸＤ３領域１
配列表２０５ ＜２２３＞ＦＯＸＤ３プローブ１
配列表２０６ ＜２２３＞ＦＯＸＤ３フォワードプライマー１
配列表２０７ ＜２２３＞ＦＯＸＤ３リバースプライマー１
配列表２０８ ＜２２３＞ＴＲＩＭ５８領域１
配列表２０９ ＜２２３＞ＴＲＩＭ５８プローブ１
配列表２１０ ＜２２３＞ＴＲＩＭ５８フォワードプライマー１
配列表２１１ ＜２２３＞ＴＲＩＭ５８リバースプライマー１
配列表２１２ ＜２２３＞ＨＯＸＤ１０領域１
配列表２１３ ＜２２３＞ＨＯＸＤ１０プローブ１
配列表２１４ ＜２２３＞ＨＯＸＤ１０フォワードプライマー１
配列表２１５ ＜２２３＞ＨＯＸＤ１０リバースプライマー１
配列表２１６ ＜２２３＞ＯＬＩＧ３領域１
配列表２１７ ＜２２３＞ＯＬＩＧ３プローブ１
配列表２１８ ＜２２３＞ＯＬＩＧ３フォワードプライマー１
配列表２１９ ＜２２３＞ＯＬＩＧ３リバースプライマー１
配列表２２０ ＜２２３＞ＥＮ２領域１
配列表２２１ ＜２２３＞ＥＮ２プローブ１
配列表２２２ ＜２２３＞ＥＮ２フォワードプライマー１
配列表２２３ ＜２２３＞ＥＮ２リバースプライマー１
配列表２２４ ＜２２３＞ＣＬＥＣ１１Ａ領域１
配列表２２５ ＜２２３＞ＣＬＥＣ１１Ａプローブ１
配列表２２６ ＜２２３＞ＣＬＥＣ１１Ａフォワードプライマー１
配列表２２７ ＜２２３＞ＣＬＥＣ１１Ａリバースプライマー１
配列表２２８ ＜２２３＞ＴＷＩＳＴ１領域１
配列表２２９ ＜２２３＞ＴＷＩＳＴ１プローブ１
配列表２３０ ＜２２３＞ＴＷＩＳＴ１フォワードプライマー１
配列表２３１ ＜２２３＞ＴＷＩＳＴ１リバースプライマー１
配列表２３２ ＜２２３＞ＥＭＸ１領域１
配列表２３３ ＜２２３＞ＥＭＸ１プローブ１
配列表２３４ ＜２２３＞ＥＭＸ１フォワードプライマー１
配列表２３５ ＜２２３＞ＥＭＸ１リバースプライマー１

Claims (61)

  1. 膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価するための、並びに／あるいは膵腫瘍の進行を評価するための、
    試験される試料中の遺伝子ＥＢＦ２を有するＤＮＡ領域又はその断片の、修飾状態の存在及び／又は含有量を決定すること、を含む、
    方法。
  2. 膵腫瘍に関連するＤＮＡ領域のメチル化状態を評価するための、
    試験される試料中の遺伝子ＥＢＦ２を有するＤＮＡ領域又はその断片の、修飾状態の存在及び／又は含有量を決定すること、を含む、
    方法。
  3. ＤＮＡ領域がヒトｃｈｒ８：２５６９９２４６－２５９０７９５０に由来する、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 試験される試料中の核酸を得ることをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 核酸が無細胞核酸を包含する、請求項４に記載の方法。
  6. 試験される試料が、組織、細胞及び／又は体液を包含する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 試験される試料が血漿を包含する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ＤＮＡ領域又はその断片を変換することをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 修飾状態を有する塩基及び前記修飾状態を有さない塩基が、変換後に異なる物質を形成する、請求項８に記載の方法。
  10. 修飾状態を有する塩基が、変換後に実質的に変化せず、前記修飾状態を有さない塩基が、変換後の塩基とは異なる他の塩基に変更されるか、又は変換後に切断される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 塩基がシトシンを包含する、請求項９～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 修飾状態がメチル化修飾を包含する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 他の塩基がウラシルを包含する、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 変換が、脱アミノ化試薬及び／又はメチル化感受性制限酵素による変換を含む、請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 脱アミノ化試薬がバイサルファイト又はその類似体を包含する、請求項１４に記載の方法。
  16. 修飾状態の存在及び／又は含有量を決定するための方法が、前記修飾状態による塩基の変換後に形成される物質の存在及び／又は含有量を決定することを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する方法が、前記修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量を決定することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量が、蛍光ＰＣＲ法によって検出される蛍光Ｃｔ値によって決定される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 膵腫瘍の存在、又は膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクが、ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の存在及び／又は参照レベルに対して前記ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態のより高い含有量を決定することによって決定される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する前に、試験される試料中の前記ＤＮＡ領域又はその断片を増幅することをさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 増幅がＰＣＲ増幅を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 疾患の存在を決定するための、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は疾患の進行を評価するための、
    修飾状態の存在及び／又は含有量の決定を、試験される試料中の、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０由来のＤＮＡ領域及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４由来のＤＮＡ領域からなる群から選択される前記ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその断片について行うこと、を含む、
    方法。
  23. ＤＮＡ領域のメチル化状態を決定するための、
    修飾状態の存在及び／又は含有量の決定を、試験される試料中のヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０由来のＤＮＡ領域、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４由来のＤＮＡ領域からなる群から選択される前記ＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はそれらの断片について行うこと、を含む、
    方法。
  24. 配列番号１７２及び配列番号１７６からなる群から選択されるＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる核酸を提供することを含む、請求項２２～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. ヒトｃｈｒ８：２５９０７８６５－２５９０７９３０由来のＤＮＡ領域、及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８１４由来のＤＮＡ領域からなる群から選択されるＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる核酸を提供することを含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 配列番号１７３及び配列番号１７７からなる群から選択される核酸、又はその相補的核酸、又はその断片を提供することを含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 配列番号１７４及び１７５、並びに配列番号１７８及び１７９からなる群から選択される核酸の組合せ、又はそれらの相補的核酸の組合せ、又はそれらの断片を提供することを含む、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 疾患が腫瘍を包含する、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 試験される試料中の核酸を得ることをさらに含む、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 核酸が無細胞核酸を包含する、請求項２９に記載の方法。
  31. 試験される試料が、組織、細胞及び／又は体液を包含する、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 試験される試料が血漿を包含する、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. ＤＮＡ領域又はその断片を変換することをさらに含む、請求項２２～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 修飾状態を有する塩基及び前記修飾状態を有さない塩基が、変換後に異なる物質を形成する、請求項３３に記載の方法。
  35. 修飾状態を有する塩基が、変換後に実質的に変化せず、前記修飾状態を有さない塩基が、変換後の塩基とは異なる他の塩基に変更されるか、又は変換後に切断される、請求項２２～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 塩基がシトシンを包含する、請求項３４～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 修飾状態がメチル化修飾を包含する、請求項２２～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 他の塩基がウラシルを包含する、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 変換が、脱アミノ化試薬及び／又はメチル化感受性制限酵素による変換を含む、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 脱アミノ化試薬がバイサルファイト又はその類似体を包含する、請求項３９に記載の方法。
  41. 修飾状態の存在及び／又は含有量を決定するための方法が、変換後の前記修飾状態を有する塩基によって形成される物質の存在及び／又は含有量を決定することを含む、請求項２２～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 修飾状態の存在及び／又は含有量を決定するための方法が、前記修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量を決定することを含む、請求２２～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 修飾状態を有するＤＮＡ領域又はその断片の存在及び／又は含有量が、蛍光ＰＣＲ法によって検出される蛍光Ｃｔ値によって決定される、請求項２２～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 膵腫瘍の存在、又は膵腫瘍の発症若しくは発症のリスクが、ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態の存在及び／又は参照レベルに対して前記ＤＮＡ領域若しくはその断片の修飾状態のより高い含有量を決定することによって決定される、請求項２２～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態の存在及び／又は含有量を決定する前に、試験される試料中の前記ＤＮＡ領域又はその断片を増幅することをさらに含む、請求項２２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 増幅がＰＣＲ増幅を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 遺伝子ＥＢＦ２を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる配列を含む核酸。
  48. ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて、遺伝子ＥＢＦ２を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合可能な核酸を設計することを含む、核酸を調製するための方法。
  49. 遺伝子ＥＢＦ２を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片に結合することができる配列を含む核酸の組合せ。
  50. ＤＮＡ領域又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片の修飾状態に基づいて、遺伝子ＥＢＦ２を有するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片を増幅することができる核酸の組合せを設計することを含む、核酸の組合せを調製するための方法。
  51. 請求項４７に記載の核酸及び／又は請求項４９に記載の核酸の組合せを含むキット。
  52. 請求項４７に記載の核酸、請求項４９に記載の核酸の組合せ及び／又は請求項５１に記載のキットの、疾患検出製品の調製における、使用。
  53. 請求項４７に記載の核酸、請求項４９に記載の核酸の組合せ及び／又は請求項５１に記載のキットの、
    疾患の存在を決定するための、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における、
    使用。
  54. 請求項４７に記載の核酸、請求項４９に記載の核酸の組合せ及び／又は請求項５１に記載のキットの、
    ＤＮＡ領域又はその断片の修飾状態を決定するための物質の調製における、
    使用。
  55. 物質の調製におけるＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための、核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、
    膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するための、、
    使用、ここで、
    決定のための前記ＤＮＡ領域は、遺伝子ＥＢＦ２を有するＤＮＡ領域又はその断片を包含する。
  56. 物質の調製におけるＤＮＡ領域の修飾状態を決定するための、核酸、核酸の組合せ及び／又はキットの、
    疾患の存在を決定するための、疾患の発症若しくは発症のリスクを評価するための、及び／又は疾患の進行を評価するための、
    使用、ここで、
    前記ＤＮＡ領域は、ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０由来のＤＮＡ領域及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４由来のＤＮＡ領域からなる群から選択されるＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその断片を包含する。
  57. 遺伝子ＥＢＦ２を有するＤＮＡ領域又はその変換領域又はそれらの断片の核酸、及び上記核酸の組合せの、
    膵腫瘍の存在を決定するための、膵腫瘍の発症又は発症のリスクを評価するための、及び／又は膵腫瘍の進行を評価するための、物質の調製における、
    使用。
  58. ヒトｃｈｒ８：２５９０７８４９－２５９０７９５０に由来するＤＮＡ領域及びヒトｃｈｒ８：２５９０７６９８－２５９０７８９４に由来するＤＮＡ領域、又はその相補的領域、又はその変換領域、又はその断片からなる群から選択されるＤＮＡ領域の核酸、及び上記の核酸の組合せの、
    疾患の存在の決定するための、疾患の発症又は発症のリスクを評価するための、及び／又は疾患の進行を評価するための、物質の調製における、
    使用。
  59. 請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法を実行可能なプログラムを記録する記憶媒体。
  60. 請求項５９に記載の記憶媒体を含むデバイス。
  61. 記憶媒体に結合されたプロセッサをさらに含み、前記プロセッサが、前記記憶媒体に記憶されたプログラムに基づいて実行して、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成される、請求項６０に記載のデバイス。
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