JP2024524974A - ナンセンス変異依存ｒｎａ分解機構に基づく病態及び疾患の処置のためのアンチセンスオリゴマー - Google Patents

ナンセンス変異依存ｒｎａ分解機構に基づく病態及び疾患の処置のためのアンチセンスオリゴマー

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ストーク セラピューティクス，インク．
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Abstract

遺伝子における選択的スプライシング事象は、異常な又は低減したタンパク質発現をもたらし得る非生産的ｍＲＮＡ転写物をもたらす可能性があり、遺伝子における選択的スプライシング事象を標的とすることができる治療剤は、患者において機能性タンパク質の発現レベルを調節する、及び／又は異常なタンパク質発現を阻害することができる。そのような治療剤は、タンパク質の欠損によって引き起こされる病態又は疾患を処置するために使用することができる。
【選択図】図１

Description

相互参照
[001]本願は、その全体が本明細書に援用される、２０２１年６月２１日に提出された米国仮特許出願第６３／２１２，９８１号の利益を主張する。
[002]遺伝子における選択的スプライシング事象は、異常な又は低減したタンパク質発現をもたらし得る非生産的ｍＲＮＡ転写物をもたらす可能性があり、遺伝子における選択的スプライシング事象を標的とすることができる治療剤は、患者において機能性タンパク質の発現レベルを調節する、及び／又は異常なタンパク質発現を阻害することができる。そのような治療剤は、タンパク質欠損によって引き起こされる病態又は疾患を処置するために使用することができる。
[003]Ｃｈｕｎｇ Ｊａｎｓｅｎ症候群（ＣＨＵＪＡＮＳ）としても公知のＰＨＩＰ関連障害は、乳児期から明らかな全般的発達遅延、知的発達障害又は学習困難、行動異常、異形特徴、及び肥満を特徴とする。その表現型及びさらなる特徴の重症度は多様である。ＣＨＵＪＡＮＳは、プレクストリン相同ドメイン相互作用タンパク質（ＰＨＩＰ）遺伝子の変化によって引き起こされる珍しい病態である。この遺伝子は、脳及び神経系の発生に関連するいくつかの過程において重要な役割を果たす。ＰＨＩＰ遺伝子はまた、神経組織においてインスリンを制御することにも関与する。今日まで、ＰＨＩＰ関連障害が糖尿病を引き起こすことは知られていないが、この障害を有する人々は、糖尿病の危険因子である過体重となる増加した危険がある。最も一般的な徴候及び症状としては、軽度から重度の学習上の問題、行動上の問題、及び過体重となる傾向が挙げられる。ＰＨＩＰ関連障害は、常染色体優性病態である。ＰＨＩＰ関連障害を有する多くの人々は、軽度から重度の知的障害を有する。知的障害を有しなかった、ＰＨＩＰ関連障害を有する人々は、発話の問題、幼児期における全般的発達遅延、及び学習上の問題を有することが多い。現在、ＰＨＩＰ関連障害患者のための承認された疾患修飾処置は存在せず、そのような処置に対する必要性が存在する。
[004]標的遺伝子から転写されかつナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソン（ＮＭＤエクソン）を含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞において標的タンパク質の発現を調節する方法であって、薬剤又は薬剤をコードするベクターを細胞に接触させ、それによって薬剤がｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンのスプライシングを調節し、それにより、ｍＲＮＡ前駆体からプロセシングされるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルを調節し、そして細胞内で標的タンパク質の発現を調節することを含み、標的遺伝子はＰＨＩＰ遺伝子である、方法が本明細書で提供される。
[005]一部の態様では、薬剤は、（ａ）ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合するか、（ｂ）ＮＭＤエクソンのスプライシングに関与する因子の結合を調節するか、又は（ａ）及び（ｂ）の組合せである。
[006]一部の態様では、薬剤は、ＮＭＤエクソンのスプライシングに関与する因子の、標的化部分の領域への結合に干渉する。
[007]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分はＮＭＤエクソンの近位にある。
[008]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ＮＭＤエクソンの５’末端の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流にある。
[009]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ＮＭＤエクソンの５’末端の、少なくとも約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約１ヌクレオチド上流にある。
[010]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ＮＭＤエクソンの３’末端の、最大約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流にある。
[011]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ＮＭＤエクソンの３’末端の、少なくとも約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約１ヌクレオチド下流にある。
[012]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流にある。
[013]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３の、約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流にある。
[014]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４４３６の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流にある。
[015]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４４３６の、約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流にある。
[016]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ｍＲＮＡ前駆体の２つのカノニカルな（canonical）エクソン領域の間のイントロン領域に位置し、イントロン領域はＮＭＤエクソンを含有する。
[017]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ＮＭＤエクソンと少なくとも部分的に重複する。
[018]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ＮＭＤエクソンの上流又は下流のイントロンと少なくとも部分的に重複する。
[019]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、５’ＮＭＤエクソン－イントロン接合部又は３’ＮＭＤエクソン－イントロン接合部を含む。
[020]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分はＮＭＤエクソン内にある。
[021]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ＮＭＤエクソンの約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、又はそれより多い連続するヌクレオチドを含む。
[022]一部の態様では、ＮＭＤエクソンは、（ａ）配列番号２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは１００％の配列同一性を有するイントロン型（intronic）配列内にある、及び／又は（ｂ）配列番号３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む。
[023]一部の態様では、ＮＭＤエクソンは配列番号３の配列を含む。
[024]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６内にある。
[025]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６の上流又は下流にある。
[026]一部の態様では、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６のエクソン－イントロン接合部を含む。
[027]一部の態様では、プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質は、全長ＰＨＩＰタンパク質又は野生型ＰＨＩＰタンパク質である。
[028]一部の態様では、プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質は、機能性ＰＨＩＰタンパク質である。
[029]一部の態様では、プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質は、野生型ＰＨＩＰタンパク質と比較して少なくとも部分的に機能性である。
[030]一部の態様では、プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質は、全長野生型ＰＨＩＰタンパク質と比較して少なくとも部分的に機能性である。
[031]一部の態様では、プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質は、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６によってコードされるアミノ酸配列を欠くＰＨＩＰタンパク質である。
[032]一部の態様では、方法は、ｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンの排除を促進する。
[033]一部の態様では、薬剤と接触させた細胞におけるｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンの排除は、薬剤が存在しない場合と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。
[034]一部の態様では、方法は、細胞においてプロセシングされたｍＲＮＡのレベルの増加をもたらす。
[035]一部の態様では、薬剤と接触させた細胞におけるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルは、薬剤が存在しない場合と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。
[036]一部の態様では、方法は、細胞において標的タンパク質の発現の増加をもたらす。
[037]一部の態様では、薬剤と接触させた細胞においてプロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質のレベルは、薬剤が存在しない場合と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。
[038]一部の態様では、薬剤は、配列番号４～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む。
[039]一部の態様では、薬剤は遺伝子編集分子をさらに含む。
[040]一部の態様では、遺伝子編集分子はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む。
[041]一部の態様では、薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む。
[042]一部の態様では、薬剤はアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル部分、２’－フルオロ部分、２’－ＮＭＡ部分、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。
[043]一部の態様では、薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが少なくとも１つの修飾糖部分を含む。
[044]一部の態様では、各糖部分は修飾糖部分である。
[045]一部の態様では、薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが、８～５０核酸塩基、８～４０核酸塩基、８～３５核酸塩基、８～３０核酸塩基、８～２５核酸塩基、８～２０核酸塩基、８～１５核酸塩基、９～５０核酸塩基、９～４０核酸塩基、９～３５核酸塩基、９～３０核酸塩基、９～２５核酸塩基、９～２０核酸塩基、９～１５核酸塩基、１０～５０核酸塩基、１０～４０核酸塩基、１０～３５核酸塩基、１０～３０核酸塩基、１０～２５核酸塩基、１０～２０核酸塩基、１０～１５核酸塩基、１１～５０核酸塩基、１１～４０核酸塩基、１１～３５核酸塩基、１１～３０核酸塩基、１１～２５核酸塩基、１１～２０核酸塩基、１１～１５核酸塩基、１２～５０核酸塩基、１２～４０核酸塩基、１２～３５核酸塩基、１２～３０核酸塩基、１２～２５核酸塩基、１２～２０核酸塩基、又は１２～１５核酸塩基から成る。
[046]一部の態様では、方法は、薬剤をコードするベクターを細胞に接触させることを含み、ベクターはウイルスベクターである。
[047]一部の態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターを含む。
[048]一部の態様では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。
[049]一部の態様では、薬剤は修飾ｓｎＲＮＡを含む。
[050]一部の態様では、修飾ヒトｓｎＲＮＡは修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡである。
[051]一部の態様では、修飾ヒトｓｎＲＮＡは修飾Ｕ７ ｓｎＲＮＡである。
[052]一部の態様では、修飾ヒトｓｎＲＮＡの１本鎖ヌクレオチド配列の一部分は、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合する配列を含む。
[053]一部の態様では、方法は、修飾ｓｎＲＮＡをコードするベクターを細胞に接触させることを含む。
[054]一部の態様では、方法は、標的タンパク質のｍＲＮＡレベル又は発現レベルを評価することをさらに含む。
[055]一部の態様では、薬剤は治療剤である。
[056]本明細書に記載される治療剤又は本明細書に記載される治療剤をコードするベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も本明細書で提供される。
[057]治療剤又は治療剤をコードするベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物であって、治療剤が、配列番号４～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む、前記医薬組成物も本明細書で提供される。
[058]一部の態様では、治療剤は、配列番号５５～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む。
[059]一部の態様では、医薬組成物は、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射、経口投与、滑膜注射、硝子体内投与、網膜下注射、局所適用、移植、又は静脈内注射用に製剤化される。
[060]一部の態様では、医薬組成物は、髄腔内注射又は脳脊髄内注射用に製剤化される。
[061]一部の態様では、医薬組成物は第２の治療剤をさらに含む。
[062]一部の態様では、第２の治療剤は低分子を含む。
[063]一部の態様では、第２の治療剤はアンチセンスオリゴマーを含む。
[064]一部の態様では、第２の治療剤はイントロン保持を是正する。
[065]配列番号４～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、アンチセンスオリゴマーは、骨格修飾、糖部分修飾、又はそれらの組合せを含む、前記組成物も本明細書で提供される。
[066]アンチセンスオリゴマーを含むポリヌクレオチドをコードするウイルスベクターを含む組成物であって、アンチセンスオリゴマーが、配列番号４～１８０から成る群より選択される配列からなる、前記組成物も本明細書で提供される。
[067]一部の態様では、ポリヌクレオチドは修飾ｓｎＲＮＡをさらに含む。
[068]一部の態様では、修飾ヒトｓｎＲＮＡは修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡである。
[069]一部の態様では、修飾ヒトｓｎＲＮＡは修飾Ｕ７ ｓｎＲＮＡである。
[070]一部の態様では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号５５～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の配列同一性を有する。
[071]疾患若しくは病態を処置すること又は疾患若しくは病態を発生する可能性を低下させることを必要とする対象の細胞内で標的タンパク質の発現を調節することによって、対象において疾患若しくは病態を処置するか又は疾患若しくは病態を発生する可能性を低下させる方法であって、対象の細胞に本明細書に記載される医薬組成物を接触させることを含む、前記方法も本明細書で提供される。
[072]一部の態様では、疾患又は病態は、ＰＨＩＰ遺伝子における機能喪失型変異に関連する。
[073]一部の態様では、疾患又は病態は、ＰＨＩＰ遺伝子のハプロ不全に関連し、対象は、機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第１のアレル、及びＰＨＩＰタンパク質が産生されないか若しくは低減したレベルで産生される第２のアレル、又は非機能性ＰＨＩＰタンパク質若しくは部分的に機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第２のアレルを有する。
[074]一部の態様では、疾患又は病態は知的障害疾患又は病態を含む。
[075]一部の態様では、疾患又は病態は、Ｃｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群（ＣＨＵＪＡＮＳ）、常染色体優性障害、知的障害、発話遅延、不安、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、攻撃行動（ａｇｇｒｅｓｓｉｏｎ）、顔面異形、カフェオレ斑、ＰＨＩＰハプロ不全によって引き起こされる過体重症候群、発達遅延、肥満、又は異形症を含む。
[076]一部の態様では、疾患又は病態はＣｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群を含む。
[077]一部の態様では、疾患又は病態は知的障害を含む。
[078]一部の態様では、疾患又は病態はＰＨＩＰ遺伝子の常染色体劣性変異に関連し、対象は、（ｉ）ＰＨＩＰタンパク質が産生されないか、若しくは野生型アレルと比較して低減したレベルで産生される、又は（ｉｉ）産生されるＰＨＩＰタンパク質が非機能性であるか、若しくは野生型アレルと比較して部分的に機能性である、第１のアレル、及び（ｉｉｉ）ＰＨＩＰタンパク質が野生型アレルと比較して低減したレベルで産生され、産生されるＰＨＩＰタンパク質が野生型アレルと比較して少なくとも部分的に機能性である、又は（ｉｖ）産生されるＰＨＩＰタンパク質が野生型アレルと比較して部分的に機能性である、第２のアレルを有する。
[079]一部の態様では、対象はヒトである。
[080]一部の態様では、対象は非ヒト動物である。
[081]一部の態様では、対象は胎児、胚、又は小児である。
[082]一部の態様では、細胞はエクスビボである。
[083]一部の態様では、医薬組成物は、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射、経口投与、滑膜注射、硝子体内投与、網膜下注射、局所適用、移植、又は静脈内注射によって投与される。
[084]一部の態様では、医薬組成物は、髄腔内注射又は脳脊髄内注射によって投与される。
[085]一部の態様では、方法は疾患又は病態を処置する。
[086]標的遺伝子から転写されかつナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソン（ＮＭＤエクソン）を含むｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンのスプライシングを調節し、それにより、ｍＲＮＡ前駆体からプロセシングされるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルを調節し、そしてｍＲＮＡ前駆体を有する細胞内で標的タンパク質の発現を調節する薬剤又は該薬剤をコードするベクターを含む組成物であって、標的遺伝子はＰＨＩＰ遺伝子である、前記組成物も本明細書で提供される。
[087]標的遺伝子から転写されかつナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソン（ＮＭＤエクソン）を含むｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンのスプライシングを調節し、それにより、ｍＲＮＡ前駆体からプロセシングされるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルを調節し、そして疾患又は病態の処置を必要とする対象の細胞において標的タンパク質の発現を調節することによって、対象において疾患又は病態を処置する薬剤又は該薬剤をコードするベクターを含む組成物であって、標的遺伝子はＰＨＩＰ遺伝子である、前記組成物も本明細書で提供される。
[088]本明細書に記載される組成物と、薬学的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクルとを含む医薬組成物も本明細書で提供される。
[089]一部の態様では、標的タンパク質はプレクストリン相同ドメイン相互作用タンパク質（ＰＨＩＰ）である。
援用
[090]本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の各刊行物、特許、又は特許出願が援用されることが具体的かつ個別的に指示される場合と同程度に、本明細書に援用される。
図面の簡単な説明
[091]本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載される。本開示の特徴及び利点のより良好な理解は、本開示の原理が利用される例証的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるだろう。
[092]図１Ａ～１Ｂは、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構誘導エクソンを含有する標的ｍＲＮＡ（ＮＭＤエクソンｍＲＮＡ）、及び全長標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を増加させる、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構誘導エクソンの治療剤媒介排除の概略図である。図１Ａは、核及び細胞質区画に分けられた細胞を示す。核において、標的遺伝子のｍＲＮＡ前駆体転写物はスプライシングを受けてｍＲＮＡを生成し、このｍＲＮＡは、細胞質へ輸送され標的タンパク質に翻訳される。この標的遺伝子に関して、ｍＲＮＡの一部の画分は、細胞質において分解されるナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構誘導エクソンを含有し（ＮＭＤエクソン含有成熟ｍＲＮＡ）、したがって標的タンパク質産生をもたらさない。図１Ｂは、核及び細胞質区画に分けられた同じ細胞の１例を示す。治療剤、例えばアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を用いる処理は、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構誘導エクソンの排除を促進し、生産的ｍＲＮＡの増加をもたらし、次に、生産的ｍＲＮＡはより高いレベルの標的タンパク質に翻訳される。 [093]図２は、ナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）によって分解された非生産的ｍＲＮＡ転写物をもたらすＰＨＩＰ遺伝子において同定された新規なＮＭＤエクソン包含事象（エクソンＸ）の例示的な概略図を示す。 [094]図３は、陰の付いた部分及び上部の黒色棒によって示されるＮＭＤ誘導エクソン包含事象（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）を含有するＰＨＩＰ遺伝子における領域のＵＣＳＣゲノムブラウザスナップショットを示す（エクソンは長方形であり、イントロンは矢頭を有する線である）。ＲＮＡ配列決定は、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）又はＤＭＳＯ対照を用いて処理したヒト神経系前駆細胞（ＲｅＮ）及びヒトアストロサイトに由来する。 [095]図４Ａは、ＨＥＫ２９３、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ、及びＲｅＮ ＶＭ細胞株におけるピューロマイシン又はシクロヘキシミド処理を介したＮＭＤ誘導エクソンの確認を示す。水処理（Ｈ）、ＤＭＳＯ処理（Ｄ）、ピューロマイシン処理（Ｐ）、又はシクロヘキシミド処理（Ｃ）細胞に由来する総ＲＮＡを使用するＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＰＨＩＰ遺伝子のＮＭＤ誘導エクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）に対応するバンドの存在を確認した。 [096]図４Ｂは、Ｕ８７細胞株及びアストロサイトにおけるピューロマイシン又はシクロヘキシミド処理を介したＮＭＤ誘導エクソンの確認を示す。水処理（Ｈ）、ＤＭＳＯ処理（Ｄ）、ピューロマイシン処理（Ｐ）、又はシクロヘキシミド処理（Ｃ）細胞に由来する総ＲＮＡを使用するＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＰＨＩＰ遺伝子のＮＭＤ誘導エクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）に対応するバンドの存在を確認した。 [097]図４Ｃは、マウス胚性線維芽細胞におけるピューロマイシン又はシクロヘキシミド処理を介したＮＭＤ誘導エクソンの確認を示す。水処理（Ｈ）、ＤＭＳＯ処理（Ｄ）、ピューロマイシン処理（Ｐ）、又はシクロヘキシミド処理（Ｃ）細胞に由来する総ＲＮＡを使用するＲＴ－ＰＣＲ分析により、ＰＨＩＰ遺伝子のＮＭＤ誘導エクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）に対応するバンドの存在を確認した。 [098]図５は、非ヒト霊長類におけるＮＭＤエクソン事象（１５Ｘ）の保存を示す。 [099]図６は、ＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）領域周辺における例示的なＡＳＯ歩行を示す。ＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）領域周辺に関して、３’スプライス部位の上流の配列、３’スプライス部位を横断する配列、エクソン１５ｘ、５’スプライス部位を横断する配列、及び５’スプライス部位の下流の配列を標的として実施したＡＳＯ歩行のグラフィック表示を示す。ＡＳＯは、１度に５ヌクレオチド、又はエクソンの始端若しくは終端とスプライス部位領域を横断する隣接ＡＳＯとの間では３ヌクレオチド移動することによってこれらの領域を網羅するように設計した。 [100]図７は、シクロヘキシミドの存在下において３μＭの適応のＡＳＯをヌクレオフェクトしたＲｅＮ ＶＭ細胞におけるＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲ（生産的ｍＲＮＡ変化倍数に関して）及びＲＴ－ＰＣＲ（非生産的ｍＲＮＡ変化倍数に関して）によって評価したＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３ ７９００４４３６）領域ＡＳＯ歩行を示す。対照遺伝子と比べたＰＨＩＰ生産的ｍＲＮＡ産物のゲル画像及び変化倍数のグラフをプロットする。 [101]図８は、シクロヘキシミドの非存在下において３μＭの適応のＡＳＯをヌクレオフェクトしたＲｅＮ細胞におけるＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３ ７９００４４３６）領域ＡＳＯ歩行を示す。対照遺伝子と比べた、ゲル画像、並びにＰＨＩＰ非生産的ｍＲＮＡ産物の％、カノニカルなＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数、及び総ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数のグラフをプロットする。 [102]図９は、シクロヘキシミドの存在下において１２０ｎＭの適応のＡＳＯをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３ ７９００４４３６）領域ＡＳＯ歩行を示す。対照遺伝子と比べたＰＨＩＰ生産的ｍＲＮＡ産物のゲル画像及び変化倍数のグラフをプロットする。 [103]図１０Ａ～１０Ｄは、シクロヘキシミドの非存在下において１２０ｎＭの適応のＡＳＯをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３ ７９００４４３６）領域ＡＳＯ歩行を示す。対照遺伝子と比べた、ゲル画像（図１０Ａ～１０Ｃ）、並びにＰＨＩＰ非生産的ｍＲＮＡ産物の％、カノニカルなＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数、及び総ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数のグラフ（図１０Ｄ）をプロットする。 図１０Ａ～１０Ｄは、シクロヘキシミドの非存在下において１２０ｎＭの適応のＡＳＯをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３ ７９００４４３６）領域ＡＳＯ歩行を示す。対照遺伝子と比べた、ゲル画像（図１０Ａ～１０Ｃ）、並びにＰＨＩＰ非生産的ｍＲＮＡ産物の％、カノニカルなＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数、及び総ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数のグラフ（図１０Ｄ）をプロットする。 図１０Ａ～１０Ｄは、シクロヘキシミドの非存在下において１２０ｎＭの適応のＡＳＯをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３ ７９００４４３６）領域ＡＳＯ歩行を示す。対照遺伝子と比べた、ゲル画像（図１０Ａ～１０Ｃ）、並びにＰＨＩＰ非生産的ｍＲＮＡ産物の％、カノニカルなＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数、及び総ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数のグラフ（図１０Ｄ）をプロットする。 図１０Ａ～１０Ｄは、シクロヘキシミドの非存在下において１２０ｎＭの適応のＡＳＯをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３ ７９００４４３６）領域ＡＳＯ歩行を示す。対照遺伝子と比べた、ゲル画像（図１０Ａ～１０Ｃ）、並びにＰＨＩＰ非生産的ｍＲＮＡ産物の％、カノニカルなＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数、及び総ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの変化倍数のグラフ（図１０Ｄ）をプロットする。 [104]図１１は、ＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）領域周辺における例示的なＡＳＯマイクロ歩行を示す。 [105]図１２は、シクロヘキシミドの存在下において３μＭの適応のＡＳＯをヌクレオフェクトしたＲｅＮ細胞におけるＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）領域ＡＳＯマイクロ歩行を示す。対照遺伝子と比べたＰＨＩＰ生産的ｍＲＮＡ産物のゲル画像及び変化倍数のグラフをプロットする。 [106]図１３は、シクロヘキシミドの存在下において１２０ｎＭの適応のＡＳＯをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＴａｑｍａｎ ＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したＰＨＩＰエクソン１５ｘ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）領域ＡＳＯマイクロ歩行を示す。対照遺伝子と比べたＰＨＩＰ生産的ｍＲＮＡ産物のゲル画像及び変化倍数のグラフをプロットする。 [107]図１４Ａは、異なる濃度の例示的なＡＳＯによるＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体からのエクソン１５ｘのスプライシングの調節を実証するゲル画像を示す。図１４Ｂは、異なる濃度の例示的なＡＳＯを用いる処理に応答した、カノニカルなＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の変化倍数及び非生産的ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の変化の定量化をまとめる棒グラフである。 [108]図１５Ａ及び１５Ｂは、例示的なＡＳＯ（ＩＶＳ１４Ｘ：－３、ＩＶＳ１４Ｘ－Ｅｘ１５ＸＸ：７、Ｅｘ１５Ｘ：１９、及びＥｘ１５Ｘ：２３）がＰＨＩＰタンパク質レベルの増加を引き起こしたことを実証する。図１５Ａは、異なる処理条件下におけるＰＨＩＰタンパク質のウェスタンブロッティング画像を示し、図１５Ｂは、異なる処理に応答したＰＨＩＰタンパク質レベルの変化の定量化をまとめる棒グラフである。 [109]図１６Ａ～１６Ｄは、ヌクレオフェクションを介した例示的なＡＳＯを用いる処理が、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１６Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１６Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１６Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらしたことを実証する。図１６Ａは、異なる処理条件下におけるＲＴ－ＰＣＲ増幅産物のゲル画像を示す。 図１６Ａ～１６Ｄは、ヌクレオフェクションを介した例示的なＡＳＯを用いる処理が、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１６Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１６Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１６Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらしたことを実証する。図１６Ａは、異なる処理条件下におけるＲＴ－ＰＣＲ増幅産物のゲル画像を示す。 図１６Ａ～１６Ｄは、ヌクレオフェクションを介した例示的なＡＳＯを用いる処理が、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１６Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１６Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１６Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらしたことを実証する。図１６Ａは、異なる処理条件下におけるＲＴ－ＰＣＲ増幅産物のゲル画像を示す。 図１６Ａ～１６Ｄは、ヌクレオフェクションを介した例示的なＡＳＯを用いる処理が、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１６Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１６Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１６Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらしたことを実証する。図１６Ａは、異なる処理条件下におけるＲＴ－ＰＣＲ増幅産物のゲル画像を示す。 [110]図１７Ａ～１７Ｄは、自由取込みを介した例示的なＡＳＯを用いる処理が、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１７Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１７Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１７Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらしたことを実証する。図１７Ａは、異なる処理条件下におけるＲＴ－ＰＣＲ増幅産物のゲル画像を示す。 図１７Ａ～１７Ｄは、自由取込みを介した例示的なＡＳＯを用いる処理が、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１７Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１７Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１７Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらしたことを実証する。図１７Ａは、異なる処理条件下におけるＲＴ－ＰＣＲ増幅産物のゲル画像を示す。 図１７Ａ～１７Ｄは、自由取込みを介した例示的なＡＳＯを用いる処理が、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１７Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１７Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１７Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらしたことを実証する。図１７Ａは、異なる処理条件下におけるＲＴ－ＰＣＲ増幅産物のゲル画像を示す。 図１７Ａ～１７Ｄは、自由取込みを介した例示的なＡＳＯを用いる処理が、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１７Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１７Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１７Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらしたことを実証する。図１７Ａは、異なる処理条件下におけるＲＴ－ＰＣＲ増幅産物のゲル画像を示す。
[111]（プレクストリン相同相互作用タンパク質）ＰＨＩＰ遺伝子における選択的スプライシング事象は、異常な又は低減したタンパク質発現をもたらし得る非生産的ｍＲＮＡ転写物をもたらす可能性があり、ＰＨＩＰ遺伝子における選択的スプライシング事象を標的とすることができる治療剤は、Ｃｈｕｎｇ Ｊａｎｓｅｎ症候群（ＣＨＵＪＡＮＳ）患者において機能性タンパク質の発現レベルを調節する、及び／又は異常なタンパク質発現を阻害することができる。そのような治療剤は、ＰＨＩＰタンパク質欠損によって引き起こされる病態を処置するために使用することができる。
[112]非生産的ｍＲＮＡ転写物をもたらす可能性がある選択的スプライシング事象の１つは、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構を誘導し得る、ｍＲＮＡ転写物への追加のエクソンの包含である。本開示は、ＰＨＩＰの選択的スプライシングを調節して、タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡ、したがって、翻訳された機能性ＰＨＩＰタンパク質の産生を増加させるための組成物及び方法を提供する。これらの組成物及び方法は、エクソンスキッピング、例えば偽エクソンスキッピングを引き起こし、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体の構成的スプライシングを促進することができるアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を含む。様々な実施形態では、機能性ＰＨＩＰタンパク質を、本開示の方法を使用して増加させて、ＰＨＩＰタンパク質欠損によって引き起こされる病態を処置することができる。
ｍＲＮＡスプライシング
[113]ＲＮＡ配列における介在配列又はイントロンは、スプライソソームと称される、大きく、高度に動的なＲＮＡ－タンパク質複合体によって除去され、スプライソソームは、１次転写物と、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）と、多数のタンパク質との間の複雑な相互作用を調整する。スプライソソームは、その都度各イントロン上に規則正しく集合し、Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる５’スプライス部位（５’ｓｓ）又はＵ２経路による３’スプライス部位（３’ｓｓ）の認識から開始し、Ｕ２経路では、Ｕ２補助因子（Ｕ２ＡＦ）が３’ｓｓ領域に結合して、Ｕ２が分岐点配列（ＢＰＳ）に結合することを容易にする。Ｕ２ＡＦは、ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）に結合するＵ２ＡＦ２によってコードされる６５ｋＤのサブユニット（Ｕ２ＡＦ６５）、及び３‘ｓｓにおいて高度に保存されたＡＧジヌクレオチドと相互作用し、Ｕ２ＡＦ６５結合を安定化させる、Ｕ２ＡＦ１によってコードされる３５ｋＤのサブユニット（Ｕ２ＡＦ３５）から構成される安定なヘテロ２量体である。正確なスプライシングは、ＢＰＳ／ＰＰＴユニット及び３’ｓｓ／５’ｓｓに加えて、イントロン又はエクソンスプライシングエンハンサー若しくはサイレンサーとして公知の、スプライス部位認識を活性化又は抑制する補助配列又は構造を必要とする。これらのエレメントは、同じ配列を有するが本来の部位よりも１０倍多い、高等真核生物のゲノムにおける非常に過剰な潜在的又は偽部位の中から、真のスプライス部位が認識されることを可能にする。エレメントはしばしば制御機能を有するが、その活性化又は抑制の厳密な機構は、十分に理解されていない。
[114]スプライスするか否かの決定は、最も明確なスプライシングシグナルでさえ時折誤ってスプライスすることがあるように、典型的には、決定的な過程というよりはむしろ確率的な過程としてモデル化することができる。しかしながら、通常の条件下では、ｍＲＮＡ前駆体スプライシングは驚くほど高い忠実度で行われる。これは、部分的には、隣接するシス作用性補助エクソン及びイントロンのスプライシング制御エレメント（ＥＳＲ又はＩＳＲ）の活性に起因すると考えられる。典型的には、これらの機能的エレメントは、スプライシングを刺激又は阻害する能力に基づいて、それぞれエクソン又はイントロンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ又はＩＳＥ）又はサイレンサー（ＥＳＳ又はＩＳＳ）のいずれかに分類される。現在、一部の補助的なシス作用性エレメントはスプライソソーム集合の動力学、例えばＵ１ ｓｎＲＮＰと５’ｓｓとの間における複合体の布置に影響を及ぼすことによって作用し得るという証拠が存在するが、多くのエレメントはトランス作用性ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）と協調的に機能するという可能性は、非常に高いように思われる。例えば、ＲＢＰのセリン及びアルギニンが豊富なファミリー（ＳＲタンパク質）は、エクソンを規定することにおいて重要な役割を有するタンパク質の保存されたファミリーである。ＳＲタンパク質は、プレスプライソソームの成分を隣接するスプライス部位に動員することによって、又はその近傍においてＥＳＳの効果を弱めることによってエクソン認識を促進する。ＥＳＳの抑制効果は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）ファミリーのメンバーによって媒介されることがあり、コアスプライシング因子の隣接するスプライス部位への動員を変更させることができる。サイレンサーエレメントは、スプライシング制御における役割に加えて、エクソンの典型的な間隔を有するが機能的なオープンリーディングフレームを有しない数組のデコイイントロンスプライス部位である偽エクソンの抑制における役割を有することが示唆される。ＥＳＥ及びＥＳＳは、それらの同族のトランス作用性ＲＢＰと共に、ｍＲＮＡがその前駆体から組み立てられる方法、場所、及び時を指定する１組のスプライシング統御因子における重要な成分の代表である。
[115]選択的スプライシングは、単一の遺伝子から転写される単一の１次ｍＲＮＡ転写物からプロセシングされる成熟ｍＲＮＡ転写物の複数のアイソフォーム、及びその結果として生じる、複数の成熟ｍＲＮＡアイソフォームの少なくとも一部から翻訳される複数のタンパク質を結果的にもたらし得る、遺伝子発現の間の制御された過程である。この過程において、遺伝子の特定のエクソンは、その遺伝子から産生される最終的なプロセシングされたｍＲＮＡに含まれている場合も、そこから排除されている場合もある。その結果、選択的にスプライスされたｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質は、それらのアミノ酸配列、及び場合によっては、それらの生物学的機能における差を含有し得る。
[116]エクソン－イントロン境界を示す配列は、ヒト遺伝子内に高頻度で生じ得る、様々な強さの縮重したシグナルである。多エクソン遺伝子では、異なる対のスプライス部位が多くの異なる組合せで互いに連結して、単一の遺伝子から多種多様な転写物を作り出すことができる。これは一般的に選択的ｍＲＮＡ前駆体スプライシングと称される。選択的スプライシングによって産生される大半のｍＲＮＡアイソフォームは、核から輸送され、機能性ポリペプチドに翻訳されることができるが、単一の遺伝子に由来する異なるｍＲＮＡアイソフォームは、その翻訳効率に大きくばらつきがあることがある。エクソン接合部複合体の少なくとも５０ｂｐ上流に未成熟終止コドン（ＰＴＣ）を有するそれらのｍＲＮＡアイソフォームは、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）経路による分解の標的となる可能性が高い。伝統的な（ＢＰＳ／ＰＰＴ／３’ｓｓ／５’ｓｓ）及び補助的なスプライシングモチーフにおける変異は、異常なスプライシング、例えばエクソンスキッピング、又は潜在的（又は偽）エクソン包含若しくはスプライス部位活性化を引き起こし、ヒトの罹患率及び死亡率の重大な一因となることがある。異常なスプライシングパターンと選択的スプライシングパターンはいずれも、エクソン及びイントロンにおける天然のＤＮＡバリアントによって影響を及ぼされ得る。
[117]エクソン－イントロン境界がコドンの３つの位置のいずれかで生じ得ることを考慮すると、選択的スプライシング事象のサブセットのみがカノニカルなオープンリーディングフレームを維持することができることは明らかである。例えば、３で割り切れるエクソンのみが、リーディングフレームの一切の変更なしに、スキップされるか、又はｍＲＮＡに包含されることができる。適合性のあるフェーズを有しないスプライシング事象は、フレームシフトを誘導し得る。下流の事象によって取り消されない限り、フレームシフトは確実に１つ又は複数のＰＴＣをもたらし、おそらくＮＭＤによるその後の分解を結果的にもたらすだろう。ＮＭＤは、ＰＴＣを含有するｍＲＮＡを除外する翻訳連動機構（translation-coupled mechanism）である。ＮＭＤは、全ての真核生物に存在する監視経路として機能することができる。ＮＭＤは、未成熟停止コドンを含有するｍＲＮＡ転写物を除外することによって、遺伝子発現における失敗を減らすことができる。これらの異常なｍＲＮＡの翻訳は、場合によっては、生じたタンパク質の有害な機能獲得型又はドミナントネガティブ活性をもたらし得る。ＮＭＤは、ＰＴＣを有する転写物だけでなく、多くの内在性の遺伝子から発現した幅広いｍＲＮＡアイソフォームも標的とし、このことは、ＮＭＤが細胞における定常状態のＲＮＡレベルの微細な調整と大まかな調整の両方を駆動する主要制御因子であることを示唆する。
[118]ＮＭＤ誘導エクソン（「ＮＩＥ」又は「ＮＭＤエクソン」）は、エクソン、又はイントロン内の領域である偽エクソンであり、成熟ＲＮＡ転写物に包含される場合、ＮＭＤ経路を活性化することができる。構成的スプライシング事象では、ＮＭＤエクソンを含有するイントロンは通例切り出されるが、選択的又は異常なスプライシング事象の間には、イントロン又はその部分（例えばＮＭＤエクソン）は保持されることがある。そのようなＮＭＤエクソンを含有する成熟ｍＲＮＡ転写物は、ＮＭＤ経路を誘導するフレームシフトのために、非生産的であり得る。成熟ＲＮＡ転写物へのＮＭＤエクソンの包含は、遺伝子発現を下方制御し得る。ＮＭＤエクソンを含有するｍＲＮＡ転写物は、本開示において、「ＮＩＥ含有ｍＲＮＡ」又は「ＮＭＤエクソンｍＲＮＡ」と称される場合がある。
[119]潜在的（又は偽スプライス部位）は、真のスプライス部位と同じスプライシング認識配列を有するが、スプライシング反応において使用されない。それらはヒトゲノムにおける真のスプライス部位よりも１０倍多く、通常は、今のところ十分に理解されていない分子機構によって抑制される。潜在的５’スプライス部位は、コンセンサスなＮＮＮ／ＧＵＮＮＮＮ又はＮＮＮ／ＧＣＮＮＮＮを有し、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり、／Ｎはエクソン－イントロン境界である。潜在的３’スプライス部位は、コンセンサスなＮＡＧ／Ｎを有する。それらの活性化は、それらを本来のスプライス部位の最適なコンセンサス、すなわち、それぞれ、ＭＡＧ／ＧＵＲＡＧＵ及びＹＡＧ／Ｇにより類似させる周囲のヌクレオチドによって正に影響を及ぼされ、ここで、ＭはＣ又はＡであり、ＲはＧ又はＡであり、ＹはＣ又はＵである。
[120]スプライス部位及びその制御配列は、当業者であれば、例えばＫｒａｌｏｖｉｃｏｖａ、Ｊ．及びＶｏｒｅｃｈｏｖｓｋｙ、Ｉ．（２００７）Ｇｌｏｂａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｂｅｒｒａｎｔ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｎ ｅｘｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒｏｎ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３５、６３９９～６４１３頁に列挙されている公的に利用可能な好適なアルゴリズムを使用して容易に同定することができる。
[121]潜在的スプライス部位又はスプライシング制御配列は、Ｕ２ＡＦ等のＲＮＡ結合タンパク質に関して、ＮＭＤエクソンのスプライス部位と競合し得る。一部の実施形態では、薬剤は、潜在的スプライス部位又はスプライシング制御配列に結合して、ＲＮＡ結合タンパク質の結合を妨げ、それによりＮＭＤエクソンスプライス部位へのＲＮＡ結合タンパク質の結合を有利にし得る。
[122]一部の実施形態では、潜在的スプライス部位は、ＮＭＤエクソンの５’又は３’スプライス部位を含まない場合がある。一部の実施形態では、潜在的スプライス部位は、ＮＭＤエクソン５’スプライス部位の少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、又は少なくとも２００ヌクレオチド上流であり得る。一部の実施形態では、潜在的スプライス部位は、ＮＭＤエクソン３’スプライス部位の少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド下流であり得る。
標的転写物
[123]一部の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、ＰＨＩＰ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体におけるＮＭＤエクソンの存在を活用する。機能性成熟ＰＨＩＰ ｍＲＮＡを産生する、同定されたＰＨＩＰ ＮＭＤエクソンｍＲＮＡ前駆体種のスプライシングは、ＮＭＤエクソンのエクソンスキッピングを刺激するＡＳＯ等の薬剤を使用して誘導することができる。エクソンスキッピングの誘導は、ＮＭＤ経路の阻害をもたらすことができる。生じた成熟ＰＨＩＰ ｍＲＮＡは、通常はＮＭＤ経路を活性化させることなく翻訳され、それにより患者の細胞内でＰＨＩＰタンパク質の量を増加させ、ＰＨＩＰ欠損に関連する病態又は疾患、例えばＣｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群（ＣＨＵＪＡＮＳ）、常染色体優性障害、知的障害、発話遅延、不安、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、攻撃行動、顔面異形、カフェオレ斑、ＰＨＩＰハプロ不全によって引き起こされる過体重症候群、発達遅延、肥満、又は異形症の症状を軽減することができる。
[124]一部の実施形態では、本明細書に開示される方法又は組成物を使用して処置又は改善することができる疾患又は病態は、治療剤が標的とする標的タンパク質（遺伝子）に直接的には関連しない。一部の実施形態では、本明細書で提供される治療剤は、疾患又は病態に直接的には関連しないタンパク質（遺伝子）を標的とし得るが、標的タンパク質（遺伝子）の発現の調節は、疾患又は病態を処置又は改善することができる。
[125]様々な実施形態では、本開示は、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物を標的として、スプライシング又はタンパク質発現レベルを調節することができる治療剤を提供する。治療剤は、低分子、ポリヌクレオチド、又はポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、治療剤はＡＳＯである。ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体の様々な領域又は配列が、治療剤、例えばＡＳＯによって標的化され得る。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソンを含有するＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物のＮＭＤエクソン内の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物のＮＭＤエクソンの５’末端（３’ｓｓ）から上流（又は５’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物のＮＭＤエクソンの３’末端（５’ｓｓ）から下流（又は３’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物のＮＭＤエクソンの５’末端に隣り合うイントロン内の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物のＮＭＤエクソンの３’末端と隣り合うイントロン内の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物のＮＭＤエクソン－イントロン境界を含む配列を標的とする。ＮＭＤエクソン－イントロン境界は、イントロン配列とＮＭＤエクソン領域との接合部を指す場合がある。イントロン配列は、ＮＭＤエクソンの５’末端又はＮＭＤエクソンの３’末端と隣り合っていてもよい。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物のエクソン内の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物のイントロン内の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、イントロンの一部分とＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物のエクソンの一部分との両方を含む配列を標的とする。
[126]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソンの５’末端から約４～約３００ヌクレオチド上流（又は５’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソン領域の５’末端から約１～約２０ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約５０～約１００ヌクレオチド、約１００～約１５０ヌクレオチド、約１５０～約２００ヌクレオチド、約２００～約２５０ヌクレオチド、又は約２５０～約３００ヌクレオチド上流（又は５’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソンの５’末端から３００ヌクレオチド超上流の配列を標的としてもよい。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソンの３’末端から約４～約３００ヌクレオチド下流（又は３’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソンの３’末端から約１～約２０ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約５０～約１００ヌクレオチド、約１００～約１５０ヌクレオチド、約１５０～約２００ヌクレオチド、約２００～約２５０ヌクレオチド、又は約２５０～約３００ヌクレオチド下流の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソンの３’末端から３００ヌクレオチド超下流の配列を標的とする。
[127]一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体転写物は、配列番号１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソンｍＲＮＡ前駆体転写物は、配列番号３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
[128]一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体転写物（又はＮＭＤエクソンｍＲＮＡ）は、配列番号３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体転写物（又はＮＭＤエクソンｍＲＮＡ）は、配列番号３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンｍＲＮＡの標的化部分は、配列番号３の少なくとも８個の連続的な核酸を含む領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
[129]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＩＥエクソン１５を含むＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体のＮＩＥエクソン１５（エクソン１５ｘ）を含むＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１５ｘを標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）を標的とする。
[130]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘであるＰＨＩＰのエクソン１５ｘの５’末端から約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流（又は５’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰのＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３から約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流（又は５’側）の配列を標的とする。
[131]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘの５’末端から最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流（又は５’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰのＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３から最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流（又は５’側）の配列を標的とする。
[132]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘの３’末端から約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流（又は３’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰのＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４４３６から約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流（又は３’側）の配列を標的とする。
[133]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘの３’末端から最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流（又は３’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰのＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４４３６から最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流（又は３’側）の配列を標的とする。
[134]一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に記載のＮＭＤエクソンｍＲＮＡの標的化部分に対して相補的な配列を有する。
[135]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソンの５’末端から上流の配列を標的とする。例えば、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６））の５’末端から上流の配列を標的とするＡＳＯは、配列番号３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
[136]一部の実施形態では、ＡＳＯは、エクソン－イントロン境界（又は接合部）を含有する配列を標的とする。例えば、エクソン－イントロン境界を含有する配列を標的とするＡＳＯは、配列番号３の少なくとも８個の連続的な核酸に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％相補的（complimentary）である配列を含むことができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソンの３’末端から下流の配列を標的とする。例えば、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ）の３’末端から下流の配列を標的とするＡＳＯは、配列番号３、又は配列番号３の少なくとも８個の連続的な核酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。例えば、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６））の３’末端から下流の配列を標的とするＡＳＯは、配列番号３、又は配列番号３の少なくとも８個の連続的な核酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＮＭＤエクソン内の配列を標的とする。
[137]一部の実施形態では、ＡＳＯは、エクソン１５を含むＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１５ｘ、ＮＩＥエクソン１６を含むＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体のＮＩＥエクソン１５ｘを標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１５ｘの５’末端から下流（又は３’側）の配列を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１５ｘの３’末端から上流（又は５’側）の配列を標的とする。
[138]一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、イントロン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９にある。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対するＡＳＯのハイブリダイゼーションは、イントロン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９内の少なくとも１個のＮＭＤエクソンのエクソンスキッピングをもたらし、その後にＰＨＩＰタンパク質産生を増加させる。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ＰＨＩＰのイントロン１５にある。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、ＰＨＩＰのイントロン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００３８５８～７９０１５０８２）である。
[139]一部の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の偽エクソンのエクソンスキッピングを誘導することによってＰＨＩＰの発現を増加させるために使用される。一部の実施形態では、偽エクソンは、イントロン１～３９のいずれかの内部の配列である。一部の実施形態では、偽エクソンは、イントロン１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９のいずれかの内部の配列である。一部の実施形態では、偽エクソンは、ＰＨＩＰイントロン又はその一部分であり得る。一部の実施形態では、偽エクソンはＰＨＩＰのイントロン１５内にある。一部の実施形態では、偽エクソンは、ＰＨＩＰのイントロン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００３８５８ ７９０１５０８２）内にある。
[140]一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物は、配列番号１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物は、配列番号３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
[141]一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物（又はＮＭＤエクソンｍＲＮＡ）は、配列番号３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物（又はＮＭＤエクソンｍＲＮＡ）は、配列番号３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、配列番号３の少なくとも８個の連続的な核酸を含む領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
[142]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１５を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９０１５０８１ ７９０１５２１６）を標的とする。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン１６を標的とし、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００３７２９ ７９００３８５８）を標的とする。
[143]一部の実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３に記載のＮＭＤエクソンｍＲＮＡの標的化部分に対して相補的な配列を有する。
タンパク質発現
[144]一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、機能性ＰＨＩＰタンパク質又はＲＮＡの産生を増加させるために使用される。本明細書で使用する場合、「機能性」という用語は、処置される病態又は疾患、例えば、Ｃｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群のいずれか１つ以上の症状を除外するのに必要なＰＨＩＰタンパク質又はＲＮＡの活性又は機能の量を指す。一部の実施形態では、方法は、部分的に機能性ＰＨＩＰタンパク質又はＲＮＡの産生を増加させるために使用される。本明細書で使用する場合、「部分的に機能性」という用語は、疾患又は病態のいずれか１つ以上の症状を除外又は防止するのに必要な活性又は機能の量よりも少ない、ＰＨＩＰタンパク質又はＲＮＡの活性又は機能の任意の量を指す。一部の実施形態では、部分的に機能性タンパク質又はＲＮＡは、完全機能性タンパク質又はＲＮＡと比べて少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低い活性を有し得る。
[145]一部の実施形態では、方法は、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体を有する対象の細胞によるＰＨＩＰタンパク質の発現を増加させる方法であり、対象は、ＰＨＩＰタンパク質の活性の欠損量によって引き起こされた疾患又は病態、例えば、Ｃｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群を有し、ＰＨＩＰタンパク質の欠損量は、ＰＨＩＰタンパク質のハプロ不全によって引き起こされる。そのような実施形態では、対象は、機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第１のアレル、及びＰＨＩＰタンパク質が産生されない第２のアレルを有する。別のそのような実施形態では、対象は、機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第１のアレル、及び非機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第２のアレルを有する。別のそのような実施形態では、対象は、機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第１のアレル、及び部分的に機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第２のアレルを有する。これらの実施形態のいずれかにおいて、アンチセンスオリゴマーは、第２のアレルから転写されたＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合し、それによりｍＲＮＡ前駆体からの偽エクソンのエクソンスキッピングを誘導し、機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡのレベルの増加、及び対象の細胞におけるＰＨＩＰタンパク質の発現の増加を引き起こす。
[146]一部の実施形態では、方法は、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体を有する対象の細胞によるＰＨＩＰタンパク質の発現を増加させる方法であり、対象は、ＰＨＩＰタンパク質の活性の欠損量によって引き起こされた疾患又は病態を有し、ＰＨＩＰタンパク質の欠損量は、常染色体劣性遺伝によって引き起こされる。
[147]一部の実施形態では、方法は、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体を有する対象の細胞によるＰＨＩＰタンパク質の発現を増加させる方法であり、対象は、ＰＨＩＰタンパク質の活性の欠損量によって引き起こされた疾患又は病態、例えば、Ｃｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群を有し、ＰＨＩＰタンパク質の欠損量は、常染色体優性遺伝によって引き起こされる。
[148]関連する実施形態では、方法は、ＡＳＯを使用して、タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現を増加させる方法である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体を有する対象の細胞内でＰＨＩＰタンパク質の発現を増加させるために使用することができ、対象は、ＰＨＩＰタンパク質の量又は機能における欠損、例えば、Ｃｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群を有する。
[149]一部の実施形態では、疾患又は病態の原因となるタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体転写物は、本明細書に記載される薬剤、例えばオリゴヌクレオチドによって標的とされる。場合によっては、それは、本明細書に記載される薬剤、例えばオリゴヌクレオチドによって標的とされるＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体転写物である。一部の実施形態では、疾患の原因とならないタンパク質をコードするＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体転写物は、ＡＳＯによって標的とされる。例えば、特定の経路における第１のタンパク質の変異又は欠損の結果である疾患は、第２のタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体を標的とし、それにより第２のタンパク質の産生を増加させることによって改善し得る。一部の実施形態では、第２のタンパク質の機能は、第１のタンパク質の変異又は欠損（これは疾患又は病態の原因となる）を補償することができる。
[150]一部の実施形態では、対象は、（ａ）（ｉ）ＰＨＩＰタンパク質が、野生型アレルからの産生と比較して低減したレベルで産生される、（ｉｉ）ＰＨＩＰタンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して低減した機能を有する形態で産生される、又は（ｉｉｉ）ＰＨＩＰタンパク質若しくは機能性ＲＮＡが産生されない、第１の変異アレル、及び（ｂ）（ｉ）ＰＨＩＰタンパク質が、野生型アレルからの産生と比較して低減したレベルで産生される、（ｉｉ）ＰＨＩＰタンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して低減した機能を有する形態で産生される、又は（ｉｉｉ）ＰＨＩＰタンパク質が産生されない、第２の変異アレルを有し、ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体は、第１のアレル及び／又は第２のアレルから転写される。これらの実施形態では、ＡＳＯは、第１のアレル又は第２のアレルから転写されたＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合し、それによりＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体からの偽エクソンのエクソンスキッピングを誘導し、ＰＨＩＰタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルの増加、及び対象の細胞内で標的タンパク質又は機能性ＲＮＡの発現の増加を引き起こす。これらの実施形態では、ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体からの偽エクソンのエクソンスキッピングの結果として生じる発現レベルの増加を有する標的タンパク質又は機能性ＲＮＡは、同等の野生型タンパク質と比較して低減した機能（部分的に機能性）を有するか、又は同等の野生型タンパク質と比較して完全な機能（完全機能性）を有する形態であり得る。
[151]一部の実施形態では、ＰＨＩＰタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、対照細胞、例えば、アンチセンスオリゴマーを用いて処理されない細胞、又はＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合しないアンチセンスオリゴマーを用いて処理される細胞において産生されるＰＨＩＰタンパク質をコードするｍＲＮＡの量と比較した場合、１．１～１０倍増加する。
[152]一部の実施形態では、本開示の方法を使用して処置される対象は、１つのアレルから部分的に機能性ＰＨＩＰタンパク質を発現し、部分的に機能性ＰＨＩＰタンパク質は、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、又は部分的遺伝子欠失によって引き起こされ得る。一部の実施形態では、本開示の方法を使用して処置される対象は、１つのアレルから非機能性ＰＨＩＰタンパク質を発現し、非機能性ＰＨＩＰタンパク質は、１つのアレルにおけるフレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、部分的遺伝子欠失によって引き起こされ得る。一部の実施形態では、本開示の方法を使用して処置される対象は、１つのアレルにおけるＰＨＩＰ全遺伝子欠失を有する。
エクソン包含
[153]本明細書で使用する場合、「ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体」は、少なくとも１個の偽エクソンを含有するｍＲＮＡ前駆体転写物である。選択的又は異常なスプライシングは、成熟ｍＲＮＡ転写物への少なくとも１個の偽エクソンの包含をもたらすことができる。「成熟ｍＲＮＡ」及び「完全スプライスｍＲＮＡ」という用語は、本明細書では交換可能に使用されて、完全にプロセシングされたｍＲＮＡを表す。少なくとも１個の偽エクソンの包含は、非生産的ｍＲＮＡとなり、成熟ｍＲＮＡのＮＭＤをもたらし得る。ＮＭＤエクソン含有成熟ｍＲＮＡは、時折異常なタンパク質発現をもたらす場合がある。
[154]一部の実施形態では、包含偽エクソン（included pseudo-exon）は、細胞内で標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の集団において最も大量に存在する偽エクソンである。一部の実施形態では、包含偽エクソンは、細胞内で標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の集団において最も大量に存在する偽エクソンであり、ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の集団は、２個以上の包含偽エクソンを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質をコードするＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の集団において最も大量に存在する偽エクソンを標的にするアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的にするか又は結合する偽エクソンを含む、集団における１個又は２個以上の偽エクソンのエクソンスキッピングを誘導する。一部の実施形態では、標的化領域は、ＰＨＩＰタンパク質をコードするＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体において最も大量に存在する偽エクソンである偽エクソンにある。
[155]エクソン包含の程度は、エクソン包含率、例えば、所与の偽エクソンが包含されている転写物の百分率として表現することができる。簡潔に述べれば、エクソン包含％は、エクソン包含を有するＲＮＡ転写物の量の、エクソン包含を有するＲＮＡ転写物の量の平均とエクソン排除を有するＲＮＡ転写物の量の平均との合計に対する百分率として算出することができる。
[156]一部の実施形態では、包含偽エクソンは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％の包含率という決定に基づいて、包含偽エクソンとして同定されるエクソンである。実施形態では、包含偽エクソンは、約５％～約１００％、約５％～約９５％、約５％～約９０％、約５％～約８５％、約５％～約８０％、約５％～約７５％、約５％～約７０％、約５％～約６５％、約５％～約６０％、約５％～約５５％、約５％～約５０％、約５％～約４５％、約５％～約４０％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約１０％～約１００％、約１０％～約９５％、約１０％～約９０％、約１０％～約８５％、約１０％～約８０％、約１０％～約７５％、約１０％～約７０％、約１０％～約６５％、約１０％～約６０％、約１０％～約５５％、約１０％～約５０％、約１０％～約４５％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１５％～約１００％、約１５％～約９５％、約１５％～約９０％、約１５％～約８５％、約１５％～約８０％、約１５％～約７５％、約１５％～約７０％、約１５％～約６５％、約１５％～約６０％、約１５％～約５５％、約１５％～約５０％、約１５％～約４５％、約１５％～約４０％、約１５％～約３５％、約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約２０％～約１００％、約２０％～約９５％、約２０％～約９０％、約２０％～約８５％、約２０％～約８０％、約２０％～約７５％、約２０％～約７０％、約２０％～約６５％、約２０％～約６０％、約２０％～約５５％、約２０％～約５０％、約２０％～約４５％、約２０％～約４０％、約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２５％～約１００％、約２５％～約９５％、約２５％～約９０％、約２５％～約８５％、約２５％～約８０％、約２５％～約７５％、約２５％～約７０％、約２５％～約６５％、約２５％～約６０％、約２５％～約５５％、約２５％～約５０％、約２５％～約４５％、約２５％～約４０％、又は約２５％～約３５％の包含率という決定に基づいて、包含偽エクソンとして同定されるエクソンである。ＥＮＣＯＤＥデータ（例えば、Ｔｉｌｇｎｅｒら、２０１２、「Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｓｈｏｗｓ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｃｏ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｔ ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｌｎｃＲＮＡｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（９）：１６１６～２５頁に記載されている）は、エクソン包含の同定を補佐するために使用することができる。
[157]一部の実施形態では、細胞を、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的化部分に対して相補的であるＡＳＯと接触させることは、ＡＳＯの非存在／処理の非存在下における細胞によって産生されるタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又は１０００％の、産生されるＰＨＩＰタンパク質の量の増加をもたらす。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーを接触させた細胞によって産生されるＰＨＩＰタンパク質の総量は、対照化合物によって産生される標的タンパク質の量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴマーを接触させた細胞によって産生されるＰＨＩＰタンパク質の総量は、対照化合物によって産生される標的タンパク質の量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。対照化合物は、例えば、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。
[158]一部の実施形態では、細胞を、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的化部分に対して相補的であるＡＳＯと接触させることは、標的タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡを含むＰＨＩＰをコードするｍＲＮＡの量の増加をもたらす。一部の実施形態では、ＰＨＩＰタンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はＰＨＩＰタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの量は、ＡＳＯの非存在／処理の非存在下における細胞によって産生されるタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又は１０００％増加する。一部の実施形態では、ＰＨＩＰタンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴマーを接触させた細胞において産生されるＰＨＩＰタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの総量は、未処理細胞、例えば、未処理細胞又は対照化合物を用いて処理された細胞において産生される成熟ＲＮＡの量と比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、又は少なくとも約３００％増加する。一部の実施形態では、ＰＨＩＰタンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴマーを接触させた細胞において産生されるＰＨＩＰタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの総量は、未処理細胞、例えば、未処理細胞又は対照化合物を用いて処理された細胞において産生される成熟ＲＮＡの量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する。対照化合物は、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的でないオリゴヌクレオチドであり得る。
[159]ＮＭＤエクソンは任意の長さであり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンはイントロンの完全な配列を含み、その場合、それはイントロン保持と称することができる。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンはイントロンの一部分であり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンは、５’ｓｓ配列を含むイントロンの５’末端部分であり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンは、３’ｓｓ配列を含むイントロンの３’末端部分であり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンは、５’ｓｓ配列の包含を伴わないイントロン内の一部分であり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンは、３’ｓｓ配列の包含を伴わないイントロン内の一部分であり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンは、５’ｓｓ又は３’ｓｓ配列のいずれかの包含も伴わないイントロン内の一部分であり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンは、５ヌクレオチド～１０ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド～１５ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド～２０ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド～２５ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド～３０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド～３５ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド～４０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド～４５ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド～５０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド～５５ヌクレオチド長、５５ヌクレオチド～６０ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド～６５ヌクレオチド長、６５ヌクレオチド～７０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド～７５ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド～８０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド～８５ヌクレオチド長、８５ヌクレオチド～９０ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド～９５ヌクレオチド長、又は９５ヌクレオチド～１００ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも４０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも６０ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチド、少なくとも８０ヌクレオチド長、少なくとも９０ヌクレオチド、又は少なくとも１００ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンは、１００～２００ヌクレオチド長、２００～３００ヌクレオチド長、３００～４００ヌクレオチド長、４００～５００ヌクレオチド長、５００～６００ヌクレオチド長、６００～７００ヌクレオチド長、７００～８００ヌクレオチド長、８００～９００ヌクレオチド長、９００～１，０００ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、ＮＭＤエクソンは１，０００ヌクレオチド長より長くてもよい。
[160]偽エクソンの包含は、フレームシフト、及び成熟ｍＲＮＡ転写物への未成熟終止コドン（ＰＩＣ）の導入をもたらし、転写物をＮＭＤの標的にし得る。ＮＭＤエクソンを含有する成熟ｍＲＮＡ転写物は、タンパク質発現をもたらさない非生産的ｍＲＮＡ転写物であり得る。ＰＩＣは、ＮＭＤエクソンの下流の任意の位置に存在することができる。一部の実施形態では、ＰＩＣは、ＮＭＤエクソンの下流の任意のエクソンに存在することができる。一部の実施形態では、ＰＩＣは、ＮＭＤエクソン内に存在することができる。例えば、ＰＨＩＰ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ転写物へのＰＨＩＰのエクソン１５ｘの包含は、ＰＩＣをｍＲＮＡ転写物に誘導し得る。例えば、ＰＨＩＰによってコードされるｍＲＮＡ転写物へのＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）の包含。
治療剤
[161]本開示の様々な実施形態では、ＰＨＩＰのタンパク質発現レベルを調節する治療剤を含む組成物及び方法が提供される。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節する組成物及び方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングにおいてエクソンスキッピングを誘導する、例えば、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの間に偽エクソンのスキッピングを誘導する組成物及び方法が本明細書で提供される。他の実施形態では、治療剤は、エクソンの包含を誘導してタンパク質発現レベルを減少させるために使用してもよい。
[162]本明細書に開示される治療剤は、ＮＩＥ抑制剤であり得る。治療剤はポリ核酸ポリマーを含んでもよい。
[163]本開示の一態様によれば、機能性ＰＨＩＰタンパク質欠損に関連する病態又は疾患を処置又は防止する方法であって、ＮＩＥ抑制剤を対象に投与して機能性ＰＨＩＰタンパク質のレベルを増加させることを含み、薬剤が、ｍＲＮＡ前駆体転写物の領域に結合して成熟転写物へのＮＭＤエクソンの包含を減少させる、前記方法が本明細書で提供される。例えば、機能性ＰＨＩＰタンパク質欠損に関連する病態を処置又は防止する方法であって、ＮＩＥ抑制剤を対象に投与して機能性ＰＨＩＰタンパク質のレベルを増加させることを含み、薬剤が、ｍＲＮＡ前駆体転写物のＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ）を含有するイントロンの領域、又は同じイントロンにおけるＮＭＤエクソン活性化制御配列に結合する、前記方法が本明細書で提供される。例えば、機能性ＰＨＩＰタンパク質欠損に関連する病態を処置又は防止する方法であって、ＮＩＥ抑制剤を対象に投与して機能性ＰＨＩＰタンパク質のレベルを増加させることを含み、薬剤が、ｍＲＮＡ前駆体転写物のＮＭＤエクソンを含有するイントロン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６））の領域、又は同じイントロンにおけるＮＭＤエクソン活性化制御配列に結合する、前記方法が本明細書で提供される。
[164]成熟ｍＲＮＡへのＮＭＤエクソン包含を低減させることについて言及する場合、低減は、完全、例えば１００％であっても、部分的であってもよい。低減は臨床的に有意であってもよい。低減／是正は、処置を有しない対象におけるＮＭＤエクソン包含のレベルと比べたものであっても、同様の対象の集団におけるＮＭＤエクソン包含の量と比べたものであってもよい。低減／是正は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも１０％少ないＮＭＤエクソン包含であり得る。低減は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも２０％少ないＮＭＤエクソン包含であり得る。低減は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも４０％少ないＮＭＤエクソン包含であり得る。低減は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも５０％少ないＮＭＤエクソン包含であり得る。低減は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも６０％少ないＮＭＤエクソン包含であり得る。低減は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも８０％少ないＮＭＤエクソン包含であり得る。低減は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも９０％少ないＮＭＤエクソン包含であり得る。
[165]活性ＰＨＩＰタンパク質レベルを増加させることについて言及する場合、増加は臨床的に有意であってもよい。増加は、処置を有しない対象における活性ＰＨＩＰタンパク質のレベルと比べたものであっても、同様の対象の集団における活性ＰＨＩＰタンパク質の量と比べたものであってもよい。増加は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも１０％多い活性ＰＨＩＰタンパク質であり得る。増加は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも２０％多い活性ＰＨＩＰタンパク質であり得る。増加は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも４０％多い活性ＰＨＩＰタンパク質であり得る。増加は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも５０％多い活性ＰＨＩＰタンパク質であり得る。増加は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも８０％多い活性ＰＨＩＰタンパク質であり得る。増加は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも１００％多い活性ＰＨＩＰタンパク質であり得る。増加は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも２００％多い活性ＰＨＩＰタンパク質であり得る。増加は、平均的な対象、又は処置前の対象と比べて少なくとも５００％多い活性ＰＨＩＰタンパク質であり得る。
[166]ＮＩＥ抑制剤がポリ核酸ポリマーを含む実施形態では、ポリ核酸ポリマーは約５０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約４５ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約４０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約３５ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約３０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約２４ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約２５ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約２０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１９ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１８ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１７ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１６ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１５ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１４ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１３ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１２ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１１ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１０～約５０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１０～約４５ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１０～約４０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１０～約３５ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１０～約３０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１０～約２５ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１０～約２０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１５～約２５ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１５～約３０ヌクレオチド長であり得る。ポリ核酸ポリマーは約１２～約３０ヌクレオチド長であり得る。
[167]ポリ核酸ポリマーの配列は、ｍＲＮＡ転写物、例えば部分的にプロセシングされたｍＲＮＡ転写物の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％相補的であり得る。ポリ核酸ポリマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的配列に対して１００％相補的であってもよい。
[168]ポリ核酸ポリマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的配列に対して４つ以下のミスマッチを有してもよい。ポリ核酸ポリマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的配列に対して３つ以下のミスマッチを有してもよい。ポリ核酸ポリマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的配列に対して２つ以下のミスマッチを有してもよい。ポリ核酸ポリマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的配列に対して１つ以下のミスマッチを有してもよい。ポリ核酸ポリマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的配列に対してミスマッチを有しなくてもよい。
[169]ポリ核酸ポリマーは、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的配列に特異的にハイブリダイズし得る。例えば、ポリ核酸ポリマーは、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的配列に対して９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列相補性を有し得る。ハイブリダイゼーションは、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われ得る。
[170]ポリ核酸ポリマーは、配列番号２～５から成る群より選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性を有する配列を含む。ポリ核酸ポリマーは、配列番号３に対して１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
[171]ポリ核酸ポリマー配列について言及する場合、当業者は、１つ以上の置換が許容されてもよく、任意選択で２つの置換が配列において許容されてもよく、置換は、ポリ核酸ポリマー配列が、標的配列にハイブリダイズする能力、又は、置換が標的配列にある場合は、標的配列として認識される能力を維持するようなものであることを理解するだろう。配列同一性の基準は、標準／初期パラメーターを使用するＢＬＡＳＴ配列アラインメントによって決定してもよい。例えば、配列は、９９％の同一性を有し、なおも本開示に従って機能することができる。他の実施形態では、配列は、９８％の同一性を有し、なおも本開示に従って機能することができる。別の実施形態では、配列は、９５％の同一性を有し、なおも本開示に従って機能することができる。別の実施形態では、配列は、９０％の同一性を有し、なおも本開示に従って機能することができる。
アンチセンスオリゴマー
[172]ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合することによってエクソンスキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーを含む組成物が本明細書で提供される。本明細書で使用する場合、「ＡＳＯ」及び「アンチセンスオリゴマー」という用語は、交換可能に使用され、ワトソン・クリック塩基対形成又はゆらぎ塩基対形成（Ｇ－Ｕ）によって標的核酸（例えば、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体）配列にハイブリダイズする核酸塩基を含むポリヌクレオチド等のオリゴマーを指す。ＡＳＯは、標的配列に対して相補的な厳密な配列又は非常に高い相補性（near complementarity）（例えば、標的配列に結合するのに十分で、スプライス部位でのスプライシングを増強する相補性）を有し得る。ＡＳＯは、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的化部分）に結合（ハイブリダイズ）し、生理的条件下でハイブリダイズしたままでいるように設計される。典型的には、ＡＳＯは、意図された（標的化）核酸配列以外の部位にハイブリダイズする場合、限られた数の、標的核酸ではない配列（標的核酸以外の少数の部位）にハイブリダイズする。ＡＳＯの設計は、ＡＳＯが他の部位に結合し、「オフターゲット」効果を引き起こす可能性が限定されるように、ゲノム又は細胞のｍＲＮＡ前駆体若しくはトランスクリプトーム中の他の場所における、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的化部分の核酸配列又は十分に類似した核酸配列の存在を考慮に入れることができる。当技術分野で公知の（例えば、本明細書に援用される、「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｃａｙ」という名称の、ＷＯ２０１５／０３５０９１として公開されているＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５４１５１における）任意のアンチセンスオリゴマーは、本明細書に記載される方法を実施するために使用することができる。
[173]一部の実施形態では、ＡＳＯは、標的核酸又はＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に「特異的にハイブリダイズする」又は「特異的」である。典型的には、そのようなハイブリダイゼーションは、３７℃より実質的に高い、好ましくは少なくとも５０℃、典型的には６０℃～およそ９０℃のＴｍで行われる。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に相当する。所与のイオン強度及びｐＨで、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。
[174]オリゴマー、例えばオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが２本の１本鎖ポリヌクレオチド間で、逆平行配置で行われる場合、互いに「相補的」である。２本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの鎖の一方と第２のポリヌクレオチドとの間で行われ得る場合、別のポリヌクレオチドに対して「相補的」であり得る。相補性（１本のポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に許容される塩基対形成則に従って、互いに水素結合を形成することが予期される対向する鎖における塩基の割合（例えば、百分率）の点から定量化可能である。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）の配列は、ハイブリダイズする標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はない。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的にする標的核酸配列内の標的領域に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列相補性を含むことができる。例えば、オリゴマー化合物の２０個の核酸塩基のうち１８個が標的領域に対して相補的である、したがって特異的にハイブリダイズし得るＡＳＯであれば、９０％の相補性を表す。この例において、残りの非相補的な核酸塩基は、一緒にクラスター形成していても相補的な核酸塩基が間に散在していてもよく、互いに対しても相補的な核酸塩基に対しても連続的である必要はない。標的核酸の領域とのＡＳＯの相補％は、当技術分野で公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所アラインメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３～４１０ページ、Ｚｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７、７、６４９～６５６頁）を使用して慣例的に決定することができる。
[175]ＡＳＯは標的配列における全ての核酸塩基にハイブリダイズする必要はなく、ＡＳＯがハイブリダイズする核酸塩基は連続的であっても非連続的であってもよい。ＡＳＯは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象（例えば、ループ構造又はヘアピン構造が形成され得る）に関与しないように、ｍＲＮＡ前駆体転写物の１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい。ある特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的ｍＲＮＡ前駆体転写物における非連続的な核酸塩基にハイブリダイズする。例えば、ＡＳＯは、ＡＳＯがハイブリダイズしない１個以上の核酸塩基によって分離している、ｍＲＮＡ前駆体転写物における核酸塩基にハイブリダイズすることができる。
[176]本明細書に記載されるＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に存在する核酸塩基に対して相補的である核酸塩基を含む。ＡＳＯという用語には、オリゴヌクレオチド、及び標的ｍＲＮＡの相補的な核酸塩基にハイブリダイズすることができる核酸塩基を含むが、糖部分、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）を含まない任意の他のオリゴマー分子が含まれる。ＡＳＯは、天然に存在するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、又は先行するものの２つ若しくは３つの任意の組合せを含んでもよい。「天然に存在するヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドが含まれる。「修飾ヌクレオチド」という用語には、修飾若しくは置換糖基を有する、及び／又は修飾骨格を有するヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態では、ＡＳＯの全てのヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。本明細書に記載される方法及び組成物と適合性があるＡＳＯ又はＡＳＯの成分の化学修飾は、当業者に明白であり得、例えば、その全体が本明細書に援用される、米国特許第８，２５８，１０９Ｂ２号、米国特許第５，６５６，６１２号、米国特許公開第２０１２／０１９０７２８号、並びにＤｉａｓ及びＳｔｅｉｎ、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００２、３４７～３５５頁に見出され得る。
[177]ＡＳＯの１個以上の核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル等の任意の天然に存在する非修飾核酸塩基であっても、標的ｍＲＮＡ前駆体に存在する核酸塩基と水素結合することができるほど十分に非修飾核酸塩基に類似した任意の合成若しくは修飾核酸塩基であってもよい。修飾核酸塩基の例としては、限定されないが、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、及び５－ヒドロキシメチルシトシン（hydroxymethoylcytosine）が挙げられる。
[178]本明細書に記載されるＡＳＯはまた、オリゴマーの成分を接続する骨格構造も含む。「骨格構造」及び「オリゴマー連結」という用語は、交換可能に使用することができ、ＡＳＯのモノマー間の接続を指す。天然に存在するオリゴヌクレオチドにおいて、骨格は、オリゴマーの糖部分を接続する３’－５’ホスホジエステル連結を含む。本明細書に記載されるＡＳＯの骨格構造又はオリゴマー連結としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、及びホスホロアミデート等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９０８１ページ（１９８６）；Ｓｔｅｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７ページ（１９８４）、Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９ページ（１９８８）、Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９ページ（１９９１）；Ｚｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、８７～１０８頁（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ及びＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３（１９９０）を参照のこと。一部の実施形態では、ＡＳＯの骨格構造は、リンを含有せず、むしろ、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はカルバメート、アミド、並びに直鎖状及び環式炭化水素基が挙げられる連結基にペプチド結合を含有する。一部の実施形態では、骨格修飾はホスホロチオエート連結である。一部の実施形態では、骨格修飾はホスホロアミデート連結である。
[179]一部の実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンヌクレオチド間連結（phosphorus internucleotide linkage）の各々における立体化学はランダムである。一部の実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンヌクレオチド間連結の各々における立体化学は統御されており、ランダムではない。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１９４６１０号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」は、核酸オリゴマー中の各リン原子におけるキラリティーの掌性を独立して選択するための方法を記載している。一部の実施形態では、本明細書で表５及び６に記載される任意のＡＳＯが挙げられるがこれらに限定されない、本開示の方法において使用されるＡＳＯは、ランダムではないリンヌクレオチド間連結を有するＡＳＯを含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用される組成物は、純粋なジアステレオマーのＡＳＯを含む。一部の実施形態では、本開示の方法において使用される組成物は、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、約９０％～約１００％、約９１％～約１００％、約９２％～約１００％、約９３％～約１００％、約９４％～約１００％、約９５％～約１００％、約９６％～約１００％、約９７％～約１００％、約９８％～約１００％、又は約９９％～約１００％のジアステレオマー純度を有するＡＳＯを含む。
[180]一部の実施形態では、ＡＳＯは、そのリンヌクレオチド間連結においてＲｐ及びＳｐ配置のランダムではない混合物を有する。例えば、Ｒｐ及びＳｐの混合は、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、良好な活性とヌクレアーゼ安定性との間の均衡を達成するために必要とされることが示唆されている（本明細書に援用される、Ｗａｎら、２０１４、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｈｉｒａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（２２）：１３４５６～１３４６８頁）。一部の実施形態では、本明細書で配列番号３に記載される任意のＡＳＯが挙げられるがこれらに限定されない、本開示の方法において使用されるＡＳＯは、約５～１００％のＲｐ、少なくとも約５％のＲｐ、少なくとも約１０％のＲｐ、少なくとも約１５％のＲｐ、少なくとも約２０％のＲｐ、少なくとも約２５％のＲｐ、少なくとも約３０％のＲｐ、少なくとも約３５％のＲｐ、少なくとも約４０％のＲｐ、少なくとも約４５％のＲｐ、少なくとも約５０％のＲｐ、少なくとも約５５％のＲｐ、少なくとも約６０％のＲｐ、少なくとも約６５％のＲｐ、少なくとも約７０％のＲｐ、少なくとも約７５％のＲｐ、少なくとも約８０％のＲｐ、少なくとも約８５％のＲｐ、少なくとも約９０％のＲｐ、若しくは少なくとも約９５％のＲｐとその残りのＳｐ、又は約１００％のＲｐを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のＡＳＯが挙げられるがこれらに限定されない、本開示の方法において使用されるＡＳＯは、配列番号３のいずれか１つの少なくとも８個の連続的な核酸を含む領域に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含み、約１０％～約１００％のＲｐ、約１５％～約１００％のＲｐ、約２０％～約１００％のＲｐ、約２５％～約１００％のＲｐ、約３０％～約１００％のＲｐ、約３５％～約１００％のＲｐ、約４０％～約１００％のＲｐ、約４５％～約１００％のＲｐ、約５０％～約１００％のＲｐ、約５５％～約１００％のＲｐ、約６０％～約１００％のＲｐ、約６５％～約１００％のＲｐ、約７０％～約１００％のＲｐ、約７５％～約１００％のＲｐ、約８０％～約１００％のＲｐ、約８５％～約１００％のＲｐ、約９０％～約１００％のＲｐ、又は約９５％～約１００％のＲｐ、約２０％～約８０％のＲｐ、約２５％～約７５％のＲｐ、約３０％～約７０％のＲｐ、約４０％～約６０％のＲｐ、又は約４５％～約５５％のＲｐとその残りのＳｐを含む。
[181]一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のＡＳＯが挙げられるがこれらに限定されない、本開示の方法において使用されるＡＳＯは、配列番号３の少なくとも８個の連続的な核酸を含む領域に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含み、約５～１００％のＳｐ、少なくとも約５％のＳｐ、少なくとも約１０％のＳｐ、少なくとも約１５％のＳｐ、少なくとも約２０％のＳｐ、少なくとも約２５％のＳｐ、少なくとも約３０％のＳｐ、少なくとも約３５％のＳｐ、少なくとも約４０％のＳｐ、少なくとも約４５％のＳｐ、少なくとも約５０％のＳｐ、少なくとも約５５％のＳｐ、少なくとも約６０％のＳｐ、少なくとも約６５％のＳｐ、少なくとも約７０％のＳｐ、少なくとも約７５％のＳｐ、少なくとも約８０％のＳｐ、少なくとも約８５％のＳｐ、少なくとも約９０％のＳｐ、若しくは少なくとも約９５％のＳｐとその残りのＲｐ、又は約１００％のＳｐを含む。実施形態では、本明細書で記載される任意のＡＳＯが挙げられるがこれらに限定されない、本開示の方法において使用されるＡＳＯは、配列番号３の少なくとも８個の連続的な核酸を含む領域に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含み、約１０％～約１００％のＳｐ、約１５％～約１００％のＳｐ、約２０％～約１００％のＳｐ、約２５％～約１００％のＳｐ、約３０％～約１００％のＳｐ、約３５％～約１００％のＳｐ、約４０％～約１００％のＳｐ、約４５％～約１００％のＳｐ、約５０％～約１００％のＳｐ、約５５％～約１００％のＳｐ、約６０％～約１００％のＳｐ、約６５％～約１００％のＳｐ、約７０％～約１００％のＳｐ、約７５％～約１００％のＳｐ、約８０％～約１００％のＳｐ、約８５％～約１００％のＳｐ、約９０％～約１００％のＳｐ、又は約９５％～約１００％のＳｐ、約２０％～約８０％のＳｐ、約２５％～約７５％のＳｐ、約３０％～約７０％のＳｐ、約４０％～約６０％のＳｐ、又は約４５％～約５５％のＳｐとその残りのＲｐを含む。
[182]本明細書に記載される任意のＡＳＯは、天然に存在するヌクレオチドに存在するような、リボース若しくはデオキシリボースを含む糖部分、又はモルホリン環を含む、修飾糖部分若しくは糖類似体を含有してもよい。修飾糖部分の非限定的な例としては、２’置換基、例えば２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノエチル、２’Ｆ；２’－ＮＭＡ部分；Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート、２’ジメチルアミノオキシエトキシ、２’ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’－グアニジニウム（guanidinidium）、２’－Ｏ－グアニジニウムエチル、カルバメート修飾糖、及び２環式修飾糖が挙げられる。本明細書で使用する場合、「２’－ＮＭＡ」は、リボシル糖部分の２’－ＯＨ基に代わる－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ３基を意味し得る。「２’－ＮＭＡ糖部分」又は「２’－ＮＭＡ部分」は、リボシル糖部分の２’－ＯＨ基の代わりに２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ３基を有する糖部分である。別段の指示がない限り、２’－ＮＭＡ糖部分はβ－Ｄ配置である。「ＮＭＡ」は、Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミドを意味し得る。一部の実施形態では、糖部分修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’Ｆ、２’－ＮＭＡ、及び２’ＭＯＥから選択される。一部の実施形態では、糖部分修飾は、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）における追加の架橋結合である。一部の実施形態では、糖類似体は、モルホリン環、例えばホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）を含有する。一部の実施形態では、糖部分は、リボフラノシル（ribofuransyl）又は２’デオキシリボフラノシル（deoxyribofuransyl）修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、２’４’－拘束２’Ｏ－メチルオキシエチル（ｃＭＯＥ）修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、ｃＥｔ ２’，４’拘束２’－ＯエチルＢＮＡ修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、エチレン核酸（ＥＮＡ）修飾を含む。一部の実施形態では、糖部分は、ＭＣＥ修飾を含む。修飾は当技術分野で公知であり、文献、例えば、この目的のために参照によって本明細書に組み込まれる、Ｊａｒｖｅｒら、２０１４、「Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖｉｅｗ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２４（１）：３７～４７頁に記載されている。
[183]一部の実施形態では、ＡＳＯの各モノマーは同様に修飾され、例えば、ＡＳＯの骨格の各連結がホスホロチオエート連結を含むか、又は各リボース糖部分が２’－Ｏ－メチル修飾を含む。ＡＳＯのモノマー成分の各々に存在するそのような修飾は、「均一修飾」と称される。一部の例において、異なる修飾の組合せが所望されてもよく、例えば、ＡＳＯは、ホスホロジアミデート連結とモルホリン環（モルホリノ）を含む糖部分との組合せを含んでもよい。ＡＳＯへの異なる修飾の組合せは、「混合修飾」又は「混合化学」と称される。
[184]一部の実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の糖部分修飾を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾、及び１つ以上の糖部分修飾を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、２’ＭＯＥ修飾及びホスホロチオエート骨格を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）を含む。一部の実施形態では、ＡＳＯは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。本明細書に記載されるＡＳＯのいずれか、又はＡＳＯの任意の成分（例えば、核酸塩基、糖部分、骨格）は、ＡＳＯの所望の特性若しくは活性を達成するため、又はＡＳＯの望ましくない特性若しくは活性を低減させるために修飾されてもよい。例えば、ＡＳＯ又は任意のＡＳＯの１つ以上の成分は、ｍＲＮＡ前駆体転写物の標的配列に対する結合親和性を増強するため、任意の非標的配列への結合を低減させるため、細胞のヌクレアーゼ（すなわちＲＮアーゼＨ）による分解を低減させるため、細胞内及び／若しくは細胞の核内へのＡＳＯの取込みを向上させるため、ＡＳＯの薬物動態若しくは薬力学を変更するため、並びに／又はＡＳＯの半減期を調節するために修飾されてもよい。
[185]一部の実施形態では、ＡＳＯは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドで構成される。そのようなヌクレオチドで構成されるＡＳＯは、本明細書に開示される方法にとりわけよく適しており、そのような修飾を有するオリゴマーは、ヌクレアーゼ分解に対する著しく増強された抵抗性及び増加したバイオアベイラビリティを有し、これにより、例えば本明細書に記載される一部の実施形態における経口送達に好適なものになることが示されている。例えば、Ｇｅａｒｙら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００１；２９６（３）：８９０～７頁、Ｇｅａｒｙら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００１；２９６（３）：８９８～９０４頁を参照のこと。
[186]ＡＳＯを合成する方法は、当業者に公知である。代替的に又は付加的に、ＡＳＯは商業的供給業者から入手してもよい。
[187]別段の定めのない限り、１本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ前駆体転写物、オリゴヌクレオチド、ＡＳＯ等）配列の左手末端は５’末端であり、１本鎖又は２本鎖核酸配列の左手方向は５’方向と称される。同様に、核酸配列（１本鎖又は２本鎖）の右手末端又は方向は、３’末端又は方向である。一般に、核酸中の基準点に対して５’側にある領域又は配列は「上流」と称され、核酸中の基準点に対して３’側にある領域又は配列は「下流」と称される。一般に、ｍＲＮＡの５’方向又は末端は、開始又は出発コドンが位置する場所であり、３’末端又は方向は、終止コドンが位置する場所である。一部の態様では、核酸中の基準点の上流にあるヌクレオチドは負の数によって明示されてもよく、基準点の下流にあるヌクレオチドは正の数によって明示されてもよい。例えば、基準点（例えば、ｍＲＮＡにおけるエクソン－エクソン接合部）は「ゼロ」部位として明示されてもよく、その際、基準点に直に隣接する上流のヌクレオチドは「マイナス１」、例えば「－１」と明示され、基準点に直に隣接する下流のヌクレオチドは「プラス１」、例えば「＋１」と明示される。
[188]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体における包含エクソンの５’スプライス部位（又はＮＭＤエクソンの３’末端）の下流（３’方向）（例えば、５’スプライス部位に対して正の数によって明示される方向）にある、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的である（及び結合する）。一部の実施形態では、ＡＳＯは、包含エクソンの５’スプライス部位（又は３’末端）に対して約＋１～約＋５００の領域内にあるＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、包含エクソンの５’スプライス部位（又は３’末端）に対して＋６～＋４０，０００のヌクレオチドの領域内にあるＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的であり得る。一部の態様では、ＡＳＯは、包含エクソンの５’スプライス部位（又は３’末端）に対して約＋１～約＋４０，０００、約＋１～約＋３０，０００、約＋１～約＋２０，０００、約＋１～約＋１５，０００、約＋１～約＋１０，０００、約＋１～約＋５，０００、約＋１～約＋４，０００、約＋１～約＋３，０００、約＋１～約＋２，０００、約＋１～約＋１，０００、約＋１～約＋５００、約＋１～約＋４９０、約＋１～約＋４８０、約＋１～約＋４７０、約＋１～約＋４６０、約＋１～約＋４５０、約＋１～約＋４４０、約＋１～約＋４３０、約＋１～約＋４２０、約＋１～約＋４１０、約＋１～約＋４００、約＋１～約＋３９０、約＋１～約＋３８０、約＋１～約＋３７０、約＋１～約＋３６０、約＋１～約＋３５０、約＋１～約＋３４０、約＋１～約＋３３０、約＋１～約＋３２０、約＋１～約＋３１０、約＋１～約＋３００、約＋１～約＋２９０、約＋１～約＋２８０、約＋１～約＋２７０、約＋１～約＋２６０、約＋１～約＋２５０、約＋１～約＋２４０、約＋１～約＋２３０、約＋１～約＋２２０、約＋１～約＋２１０、約＋１～約＋２００、約＋１～約＋１９０、約＋１～約＋１８０、約＋１～約＋１７０、約＋１～約＋１６０、約＋１～約＋１５０、約＋１～約＋１４０、約＋１～約＋１３０、約＋１～約＋１２０、約＋１～約＋１１０、約＋１～約＋１００、約＋１～約＋９０、約＋１～約＋８０、約＋１～約＋７０、約＋１～約＋６０、約＋１～約＋５０、約＋１～約＋４０、約＋１～約＋３０、又は約＋１～約＋２０の領域内にある標的化部分に対して相補的である。一部の態様では、ＡＳＯは、包含エクソンの５’スプライス部位（又は３’末端）に対して約＋１～約＋１００、約＋１００～約＋２００、約＋２００～約＋３００、約＋３００～約＋４００、又は約＋４００～約＋５００の領域内にある標的化部分に対して相補的である。
[189]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体における包含エクソンの５’スプライス部位（又は３’末端）の上流（５’方向）（例えば、５’スプライス部位に対して負の数によって明示される方向）にある、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的である（又は結合する）。一部の実施形態では、ＡＳＯは、包含エクソンの５’スプライス部位（又は３’末端）に対して約－４～約－２７０の領域内にある、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、包含エクソンの５’スプライス部位（又は３’末端）に対して－１～－４０，０００のヌクレオチドの領域内にある、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的であり得る。一部の態様では、ＡＳＯは、包含エクソンの５’スプライス部位（又は３’末端）に対して約－１～約－４０，０００、約－１～約－３０，０００、約－１～約－２０，０００、約－１～約－１５，０００、約－１～約－１０，０００、約－１～約－５，０００、約－１～約－４，０００、約－１～約－３，０００、約－１～約－２，０００、約－１～約－１，０００、約－１～約－５００、約－１～約－４９０、約－１～約－４８０、約－１～約－４７０、約－１～約－４６０、約－１～約－４５０、約－１～約－４４０、約－１～約－４３０、約－１～約－４２０、約－１～約－４１０、約－１～約－４００、約－１～約－３９０、約－１～約－３８０、約－１～約－３７０、約－１～約－３６０、約－１～約－３５０、約－１～約－３４０、約－１～約－３３０、約－１～約－３２０、約－１～約－３１０、約－１～約－３００、約－１～約－２９０、約－１～約－２８０、約－１～約－２７０、約－１～約－２６０、約－１～約－２５０、約－１～約－２４０、約－１～約－２３０、約－１～約－２２０、約－１～約－２１０、約－１～約－２００、約－１～約－１９０、約－１～約－１８０、約－１～約－１７０、約－１～約－１６０、約－１～約－１５０、約－１～約－１４０、約－１～約－１３０、約－１～約－１２０、約－１～約－１１０、約－１～約－１００、約－１～約－９０、約－１～約－８０、約－１～約－７０、約－１～約－６０、約－１～約－５０、約－１～約－４０、約－１～約－３０、又は約－１～約－２０の領域内にある標的化部分に対して相補的である。
[190]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体における包含エクソンの３’スプライス部位（又は５’末端）の上流（５’方向）（例えば、負の数によって明示される方向）にある、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、包含エクソンの３’スプライス部位（又は５’末端）に対して約－１～約－５００の領域内にある、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、包含エクソンの３’スプライス部位に対して－１～－４０，０００の領域内にあるＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的である。一部の態様では、ＡＳＯは、包含エクソンの３’スプライス部位に対して約－１～約－４０，０００、約－１～約－３０，０００、－１～約－２０，０００、約－１～約－１５，０００、約－１～約－１０，０００、約－１～約－５，０００、約－１～約－４，０００、約－１～約－３，０００、約－１～約－２，０００、約－１～約－１，０００、約－１～約－５００、約－１～約－４９０、約－１～約－４８０、約－１～約－４７０、約－１～約－４６０、約－１～約－４５０、約－１～約－４４０、約－１～約－４３０、約－１～約－４２０、約－１～約－４１０、約－１～約－４００、約－１～約－３９０、約－１～約－３８０、約－１～約－３７０、約－１～約－３６０、約－１～約－３５０、約－１～約－３４０、約－１～約－３３０、約－１～約－３２０、約－１～約－３１０、約－１～約－３００、約－１～約－２９０、約－１～約－２８０、約－１～約－２７０、約－１～約－２６０、約－１～約－２５０、約－１～約－２４０、約－１～約－２３０、約－１～約－２２０、約－１～約－２１０、約－１～約－２００、約－１～約－１９０、約－１～約－１８０、約－１～約－１７０、約－１～約－１６０、約－１～約－１５０、約－１～約－１４０、約－１～約－１３０、約－１～約－１２０、約－１～約－１１０、約－１～約－１００、約－１～約－９０、約－１～約－８０、約－１～約－７０、約－１～約－６０、約－１～約－５０、約－１～約－４０、約－１～約－３０、又は約－１～約－２０の領域内にある標的化部分に対して相補的である。一部の態様では、ＡＳＯは、包含エクソンの３’スプライス部位に対して約－１～約－１００、約－１００～約－２００、約－２００～約－３００、約－３００～約－４００、又は約－４００～約－５００の領域内にある標的化部分に対して相補的である。
[191]一部の実施形態では、ＡＳＯは、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体における包含エクソンの３’スプライス部位（５’末端）の下流（３’方向）（例えば、正の数によって明示される方向）にある、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的である。一部の実施形態では、ＡＳＯは、包含エクソンの３’スプライス部位に対して約＋１～約＋４０，０００の領域内にあるＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に対して相補的である。一部の態様では、ＡＳＯは、包含エクソンの３’スプライス部位に対して約＋１～約＋４０，０００、約＋１～約＋３０，０００、約＋１～約＋２０，０００、約＋１～約＋１５，０００、約＋１～約＋１０，０００、約＋１～約＋５，０００、約＋１～約＋４，０００、約＋１～約＋３，０００、約＋１～約＋２，０００、約＋１～約＋１，０００、約＋１～約＋５００、約＋１～約＋４９０、約＋１～約＋４８０、約＋１～約＋４７０、約＋１～約＋４６０、約＋１～約＋４５０、約＋１～約＋４４０、約＋１～約＋４３０、約＋１～約＋４２０、約＋１～約＋４１０、約＋１～約＋４００、約＋１～約＋３９０、約＋１～約＋３８０、約＋１～約＋３７０、約＋１～約＋３６０、約＋１～約＋３５０、約＋１～約＋３４０、約＋１～約＋３３０、約＋１～約＋３２０、約＋１～約＋３１０、約＋１～約＋３００、約＋１～約＋２９０、約＋１～約＋２８０、約＋１～約＋２７０、約＋１～約＋２６０、約＋１～約＋２５０、約＋１～約＋２４０、約＋１～約＋２３０、約＋１～約＋２２０、約＋１～約＋２１０、約＋１～約＋２００、約＋１～約＋１９０、約＋１～約＋１８０、約＋１～約＋１７０、約＋１～約＋１６０、約＋１～約＋１５０、約＋１～約＋１４０、約＋１～約＋１３０、約＋１～約＋１２０、約＋１～約＋１１０、約＋１～約＋１００、約＋１～約＋９０、約＋１～約＋８０、約＋１～約＋７０、約＋１～約＋６０、約＋１～約＋５０、約＋１～約＋４０、約＋１～約＋３０、又は約＋１～約＋２０、又は約＋１～約＋１０の領域内にある標的化部分に対して相補的である。
[192]一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分は、包含エクソンの５’スプライス部位（３’末端）に対して＋１００から包含エクソンの３’スプライス部位（５’末端）に対して－１００の領域内にある。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分はＮＭＤエクソン内にある。一部の実施形態では、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、偽エクソンとイントロンとの境界を含む。
[193]ＡＳＯは、特異的結合及びスプライシングの効果的な増強に好適な任意の長さであり得る。一部の実施形態では、ＡＳＯは、８～５０核酸塩基からなる。例えば、ＡＳＯは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、又は５０核酸塩基長であり得る。一部の実施形態では、ＡＳＯは、５０核酸塩基超から成る。一部の実施形態では、ＡＳＯは、８～５０核酸塩基、８～４０核酸塩基、８～３５核酸塩基、８～３０核酸塩基、８～２５核酸塩基、８～２０核酸塩基、８～１５核酸塩基、９～５０核酸塩基、９～４０核酸塩基、９～３５核酸塩基、９～３０核酸塩基、９～２５核酸塩基、９～２０核酸塩基、９～１５核酸塩基、１０～５０核酸塩基、１０～４０核酸塩基、１０～３５核酸塩基、１０～３０核酸塩基、１０～２５核酸塩基、１０～２０核酸塩基、１０～１５核酸塩基、１１～５０核酸塩基、１１～４０核酸塩基、１１～３５核酸塩基、１１～３０核酸塩基、１１～２５核酸塩基、１１～２０核酸塩基、１１～１５核酸塩基、１２～５０核酸塩基、１２～４０核酸塩基、１２～３５核酸塩基、１２～３０核酸塩基、１２～２５核酸塩基、１２～２０核酸塩基、１２～１５核酸塩基、１３～５０核酸塩基、１３～４０核酸塩基、１３～３５核酸塩基、１３～３０核酸塩基、１３～２５核酸塩基、１３～２０核酸塩基、１４～５０核酸塩基、１４～４０核酸塩基、１４～３５核酸塩基、１４～３０核酸塩基、１４～２５核酸塩基、１４～２０核酸塩基、１５～５０核酸塩基、１５～４０核酸塩基、１５～３５核酸塩基、１５～３０核酸塩基、１５～２５核酸塩基、１５～２０核酸塩基、２０～５０核酸塩基、２０～４０核酸塩基、２０～３５核酸塩基、２０～３０核酸塩基、２０～２５核酸塩基、２５～５０核酸塩基、２５～４０核酸塩基、２５～３５核酸塩基、又は２５～３０核酸塩基長である。一部の実施形態では、ＡＳＯは１８ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ＡＳＯは１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ＡＳＯは２５ヌクレオチド長である。
[194]一部の実施形態では、異なる化学的性質を有するが、ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の同じ標的化部分に対して相補的な２種以上のＡＳＯが使用される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の異なる標的化部分に対して相補的である２種以上のＡＳＯが使用される。
[195]一部の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の部分又はコンジュゲート、例えば、オリゴヌクレオチドの活性又は細胞の取込みを増強する、標的とする部分又は他のコンジュゲートに化学的に連結する。そのような部分としては、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分としての脂質部分、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール若しくはウンデシル残基、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、及び調製方法は、公開文献に記載されている。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えばＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－Ａｃ－グルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）、若しくはマンノース（例えば、マンノース－６－ホスフェート）、脂質、又はポリ炭化水素化合物が挙げられるがこれらに限定されない部分とコンジュゲートする。コンジュゲートは、当技術分野で理解され、文献に記載されているように、例えばリンカーを使用して、糖、塩基、又はリン酸基のいくつかの位置のいずれかにおいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む任意のヌクレオチドの１個以上に連結することができる。リンカーとしては、２価又は３価の分枝リンカーを挙げることができる。実施形態では、コンジュゲートは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合される。オリゴヌクレオチドコンジュゲートを調製する方法は、例えば、本明細書に援用される米国特許第８，４５０，４６７号、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載されている。
[196]一部の実施形態では、ＡＳＯによって標的とされる核酸は、細胞、例えば真核細胞において発現するＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体、例えば、ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体である。一部の実施形態では、「細胞」という用語は細胞の集団を指す場合がある。一部の実施形態では、細胞は対象内にある。一部の実施形態では、細胞は対象から単離される。一部の実施形態では、細胞はエクスビボである。一部の実施形態では、細胞は、病態又は疾患関連細胞又は細胞株である。一部の実施形態では、細胞はインビトロ（例えば、細胞培養物中）である。
医薬組成物
[197]記載される組成物の、及び記載される方法のいずれかにおける使用のための薬剤、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物又は製剤は、医薬業界において周知かつ公開文献に記載されている従来の技法に従って調製することができる。実施形態では、対象を処置するための医薬組成物又は製剤は、本明細書に記載されるような有効量の任意のアンチセンスオリゴマー、又は薬学的に許容されるその塩、溶媒和物、水和物、又はエステルを含む。アンチセンスオリゴマーを含む医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体をさらに含んでもよい。
[198]薬学的に許容される塩は、過度の毒性、刺激作用、アレルギー応答等を伴わないためにヒト及び下等動物の組織との接触における使用に好適であり、妥当な利益／危険比に相当する。（例えば、この目的のために本明細書に援用されるＳ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６：１～１９頁（１９７７）を参照のこと。塩は、化合物の最終単離及び精製の間にｉｎ ｓｉｔｕで、又は遊離塩基形態を好適な有機酸と反応させることによって別個に調製することができる。薬学的に許容される非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、若しくはマロン酸等の有機酸を用いて、あるいはイオン交換等の他の文書化された方法論を使用することによって形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が挙げられる。さらなる薬学的に許容される塩としては、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩等の対イオンを使用して形成された、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。
[199]一部の実施形態では、組成物は、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル、坐剤、及び浣腸剤等の多くの可能な剤形のいずれかに製剤化される。実施形態では、組成物は、水性、非水性、又は混合媒体中の懸濁剤として製剤化される。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含む、懸濁剤の粘度を増加させる物質をさらに含有してもよい。懸濁剤はまた、安定剤を含有してもよい。実施形態では、本開示の医薬製剤又は組成物としては、溶液、エマルション、マイクロエマルション、泡状物、又はリポソーム含有製剤（例えば、カチオン性又は非カチオン性リポソーム）が挙げられるが、これらに限定されない。
[200]本明細書に記載される医薬組成物又は製剤は、適宜、当業者に周知又は公開文献に記載されている、１種以上の浸透増強剤、担体、賦形剤、又は他の活性若しくは不活性成分を含んでもよい。実施形態では、リポソームとしては、立体的に安定化したリポソーム、例えば、１種以上の特殊化した脂質を含むリポソームも挙げられる。これらの特殊化した脂質は、増強した循環寿命を有するリポソームを結果的にもたらす。実施形態では、立体的に安定化したリポソームは、１種以上の糖脂質を含むか、又は１種以上の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を用いて誘導体化される。一部の実施形態では、界面活性剤が医薬製剤又は組成物に含まれる。薬物生成物、製剤、及びエマルションにおける界面活性剤の使用は、当技術分野で周知である。実施形態では、本開示は、浸透増強剤を用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらす、例えば、細胞膜を越える拡散を助ける、及び／又は親油性の薬物の透過性を増強させる。一部の実施形態では、浸透増強剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、又は非キレート非界面活性剤である。
[201]一部の実施形態では、医薬製剤は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の薬物又は治療剤と組み合わせて投与される。
併用療法
[202]一部の実施形態では、本開示に開示されるＡＳＯは、１種以上のさらなる治療剤と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、１種以上のさらなる治療剤は低分子を含むことができる。例えば、１種以上のさらなる治療剤は、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ２０１６１２８３４３Ａ１、ＷＯ２０１７０５３９８２Ａ１、ＷＯ２０１６１９６３８６Ａ１、ＷＯ２０１４２８４５９Ａ１、ＷＯ２０１５２４８７６Ａ２、ＷＯ２０１３１１９９１６Ａ２、及びＷＯ２０１４２０９８４１Ａ２に記載されている低分子を含むことができる。一部の実施形態では、１種以上のさらなる治療剤は、イントロン保持を是正するために使用することができるＡＳＯを含む。
対象の処置
[203]本明細書で提供される組成物のいずれも、個体に投与することができる。「個体」は、「対象」又は「患者」と交換可能に使用することができる。個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、又は非ヒト霊長類、げっ歯類、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ロバ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、若しくはヒツジ等の動物であり得る。実施形態では、個体はヒトである。実施形態では、個体は胎児、胚、又は小児である。他の実施形態では、個体は別の真核性生物、例えば植物であり得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、細胞にエクスビボで投与される。
[204]一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、疾患又は障害を処置する方法として個体に投与される。一部の実施形態では、個体は、遺伝子疾患、例えば本明細書に記載される疾患のいずれかを有する。一部の実施形態では、個体は、疾患、例えば本明細書に記載される疾患のいずれかを有する危険がある。一部の実施形態では、個体は、不十分な量のタンパク質又はタンパク質の不十分な活性によって引き起こされる疾患又は障害を有する増加した危険がある。個体が不十分な量のタンパク質又はタンパク質の不十分な活性によって引き起こされる疾患又は障害を有する「増加した危険がある」場合、方法は防止又は予防的処置を伴う。例えば、個体は、疾患の家族歴のために、そのような疾患又は障害を有する増加した危険がある場合がある。典型的には、そのような疾患又は障害を有する増加した危険がある個体は、予防的処置から（例えば、疾患又は障害の発症又は進行を防止するか、又は遅延させることによって）恩恵を受ける。実施形態では、胎児は、子宮内で、例えば、ＡＳＯ組成物を胎児に直接的に又は間接的に（例えば母親を介して）投与することによって処置される。
[205]場合によっては、主題の医薬組成物及び方法は、ＰＨＩＰ欠損に関連する病態又は疾患の処置に適用可能である。場合によっては、主題の医薬組成物及び方法は、Ｃｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群（ＣＨＵＪＡＮＳ）、常染色体優性障害、知的障害、発話遅延、不安、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、攻撃行動、顔面異形、カフェオレ斑、ＰＨＩＰハプロ不全によって引き起こされる過体重症候群、発達遅延、肥満、又は異形症の処置に適用可能である。
[206]場合によっては、治療剤は、オリゴヌクレオチドを含む。場合によっては、治療剤は、標的ペプチド配列をコードするｍＲＮＡ前駆体の標的化領域に結合するオリゴヌクレオチドを発現するベクター、例えばウイルスベクターを含む。本明細書で提供される方法は、薬剤、例えばオリゴヌクレオチドをコードするベクターを細胞に接触させることに適合させることができ、その結果、薬剤は、細胞におけるｍＲＮＡ前駆体に結合し、ｍＲＮＡ前駆体のプロセシングを調節する。場合によっては、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又は任意の適用可能なウイルスベクターを含む。場合によっては、治療剤は、非効率的な翻訳領域をコードする遺伝子領域が欠失されるように標的ペプチド配列をコードする遺伝子を修飾するように構成されている遺伝子編集ツールを含む。場合によっては、遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガー、又は他の適用可能な技術に基づく遺伝子編集のためのベクター、例えばウイルスベクターを含む。
[207]本開示のＡＳＯの好適な投与経路は、ＡＳＯの送達が所望される細胞型に応じて変えてもよい。本開示のＡＳＯは、患者に非経口的に、例えば、硝子体内注射、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射によって投与され得る。
[208]実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血液脳関門を越える対象のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を促進することができる１種以上の薬剤と共に、当技術分野で公知の任意の方法によって投与される。例えば、筋肉組織の運動ニューロンへのアデノウイルスベクターの投与による薬剤の送達は、本明細書に援用される米国特許第６，６３２，４２７号、「Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ－ｖｅｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ」に記載されている。脳、例えば、線条体、視床、海馬、又は黒質へのベクターの直接の送達は、例えば、本明細書に援用される米国特許第６，７５６，５２３号、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎ ｂｒａｉｎ」に記載されている。
[209]一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましい医薬的又は薬力学的特性を提供する薬剤と連結又はコンジュゲートされる。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血液脳関門を越える浸透又は運搬を促進する、当技術分野で公知の物質、例えばトランスフェリン受容体に対する抗体とカップリングされる。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウイルスベクターと連結して、例えば、アンチセンス化合物をより効果的にするか、又は血液脳関門を越える運搬を増加させる。複数の実施形態では、浸透圧による血液脳関門破壊は、糖、例えば、メソエリスリトール、キシリトール、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｄ（＋）ラクトース、Ｄ（＋）キシロース、ダルシトール、ミオイノシトール、Ｌ（－）フルクトース、Ｄ（－）マンニトール、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）アラビノース、Ｄ（－）アラビノース、セロビオース、Ｄ（＋）マルトース、Ｄ（＋）ラフィノース、Ｌ（＋）ラムノース、Ｄ（＋）メリビオース、Ｄ（－）リボース、アドニトール、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（－）アラビトール、Ｄ（＋）フコース、Ｌ（－）フコース、Ｄ（－）リキソース、Ｌ（＋）リキソース、及びＬ（－）リキソース、又はアミノ酸、例えば、グルタミン、リシン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、及びタウリンの注入によって補助される。血液脳関門浸透を増強させるための方法及び材料は、例えば、各々が本明細書に援用される、米国特許第９，１９３，９６９号、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｕｒｏｎ ｔｙｐｅｓ」、米国特許第４，８６６，０４２号、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、米国特許第６，２９４，５２０号、「Ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｐａｓｓａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、及び米国特許第６，９３６，５８９号「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載されている。
[210]場合によっては、治療剤は、修飾ｓｎＲＮＡ、例えば修飾ヒトｓｎＲＮＡを含む。場合によっては、治療剤は、修飾ｓｎＲＮＡをコードするベクター、例えばウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、修飾ｓｎＲＮＡは修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡである（例えば、Ａｌａｎｉｓら、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１２、第２１巻、第１１号２３８９～２３９８頁を参照のこと）。一部の実施形態では、修飾ｓｎＲＮＡは修飾Ｕ７ ｓｎＲＮＡである（例えば、Ｇａｄｇｉｌら、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２０２１；２３：ｅ３３２１を参照のこと）。一部の実施形態では、修飾ｓｎＲＮＡは、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体にハイブリダイズする１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾されている。一部の実施形態では、修飾ｓｎＲＮＡは、本明細書に開示されるＡＳＯの１つ又は２つ以上の配列を含む１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾されている。一部の実施形態では、修飾ｓｎＲＮＡは、変異を有するＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の配列にハイブリダイズする１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾されている。一部の実施形態では、修飾ｓｎＲＮＡは、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の２つ以上の標的領域にハイブリダイズする２つ以上の配列を含む１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾されている。例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の少なくとも８個の連続的な核酸にハイブリダイズする１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。一部の実施形態では、修飾ｓｎＲＮＡは、本明細書に開示されるＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の任意の標的領域にハイブリダイズする１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾されている。一部の実施形態では、修飾ｓｎＲＮＡは、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の２つ以上の標的領域にハイブリダイズする２つ以上の配列を含む１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾されている。例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ｍＲＮＡ前駆体転写物のＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））を含有するイントロンの１つ若しくは２つ以上の配列、又は同じイントロンにおけるＮＭＤエクソン活性化制御配列にハイブリダイズする１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン内の領域又はＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の上流若しくは下流の領域にハイブリダイズする１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。一部の実施形態では、修飾ｓｎＲＮＡは、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体にハイブリダイズする１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾されている５’領域を有する。
[211]例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン及びＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の上流のイントロンと重複する領域にハイブリダイズする１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン及びＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の下流のイントロンと重複する領域にハイブリダイズする１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。
[212]例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の下流にあるイントロン配列に対して相補的である１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の上流又は下流にあるイントロン配列の３’スプライス部位に対して相補的である１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の下流にあるイントロン配列の５’スプライス部位に対して相補的である１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。
[213]例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の上流にあるイントロン配列に対して相補的である１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の上流にあるイントロン配列のスプライス部位に対して相補的である１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の上流にあるイントロン配列の３’スプライス部位に対して相補的である１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。例えば、修飾ｓｎＲＮＡは、ＮＭＤエクソン（例えば、ＰＨＩＰのエクソン１５ｘ（例えば、ＰＨＩＰのエクソン（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６）））の上流にあるイントロン配列の５’スプライス部位に対して相補的である１本鎖ヌクレオチド配列を含むように修飾することができる。
[214]一部の実施形態では、方法及び組成物を使用して処置される対象は、状態の向上に関して、当技術分野で公知かつ記載されている任意の方法を使用して評価される。
エクソンスキッピングを誘導するさらなるＡＳＯを同定する方法
[215]ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体のエクソンスキッピング誘導するＡＳＯを同定又は決定するための方法も、本開示の範囲内である。例えば、方法は、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体の偽エクソンスキッピング誘導するＡＳＯを同定又は決定することを含むことができる。ｍＲＮＡ前駆体の標的領域内の異なるヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするＡＳＯは、標的イントロンのスプライシングの速度及び／又は範囲を向上させるＡＳＯを同定又は決定するためにスクリーニングされてもよい。一部の実施形態では、ＡＳＯは、スプライシングリプレッサー／サイレンサーの結合部位を遮断又は干渉してもよい。当技術分野で公知の任意の方法は、エクソンの標的領域にハイブリダイズした場合に所望の効果（例えば、偽エクソンスキッピング、タンパク質又は機能性ＲＮＡ産生）を結果的にもたらすＡＳＯを同定（決定）するために使用してもよい。これらの方法は、包含エクソン又は非包含エクソンと隣り合うイントロンにおける標的化領域に結合することによって包含エクソンのエクソンスキッピングを誘導するＡＳＯを同定するためにも使用することができる。使用され得る方法の１例は以下に提供される。
[216]ＡＳＯ「歩行」と称される１ラウンドのスクリーニングは、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを使用して実施してもよい。例えば、ＡＳＯ歩行に使用されるＡＳＯは、包含エクソンの３’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド上流（例えば、標的／包含エクソンの上流に位置するエクソンの配列の一部分）から標的／包含エクソンの３’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド下流まで、及び／又は包含エクソンの５’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド上流から標的／包含エクソンの５’スプライス部位のおよそ１００ヌクレオチド下流（例えば、標的／包含エクソンの下流に位置するエクソンの配列の一部分）まで、５ヌクレオチドごとにタイリングすることができる。例えば、１５ヌクレオチド長の第１のＡＳＯは、標的／包含エクソンの３’スプライス部位に対して＋６～＋２０のヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。第２のＡＳＯは、標的／包含エクソンの３’スプライス部位に対して＋１１～＋２５のヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするように設計されてもよい。ＡＳＯは、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域にまたがるようなものとして設計される。実施形態では、ＡＳＯはより綿密に、例えば、１、２、３、又は４ヌクレオチドごとにタイリングすることができる。さらに、ＡＳＯは、５’スプライス部位の１００ヌクレオチド下流から３’スプライス部位の１００ヌクレオチド上流までタイリングすることができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３’スプライス部位の約１，１６０ヌクレオチド上流から５’スプライス部位の約５００ヌクレオチド下流までタイリングすることができる。一部の実施形態では、ＡＳＯは、３’スプライス部位の約５００ヌクレオチド上流から３’スプライス部位の約１，９２０ヌクレオチド下流までタイリングすることができる。
[217]１種以上のＡＳＯ、又は対照ＡＳＯ（標的領域にハイブリダイズすることが予期されていない配列であるスクランブル配列を有するＡＳＯ）は、例えばトランスフェクションによって、標的ｍＲＮＡ前駆体（例えば、本明細書に記載されるＮＭＤエクソン含有ｍＲＮＡ前駆体）を発現する疾患関連細胞株へ送達される。各々のＡＳＯのエクソンスキッピング効果は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えばスプライス接合部にまたがるプライマーを使用する逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲによって、実施例２に記載されるように評価してもよい。ＡＳＯ処理細胞における、包含エクソンを含有する（例えばＮＭＤエクソンの隣り合うエクソンを含む）領域にまたがるプライマーを使用して産生された、対照ＡＳＯ処理細胞と比較してより長いＲＴ－ＰＣＲ産物の低減又は非存在は、標的ＮＭＤエクソンのスプライシングが増強されたことを指し示す。一部の実施形態では、エクソンスキッピング効率（又はＮＭＤエクソンを含有するイントロンをスプライスするスプライシング効率）、スプライスされたｍＲＮＡ前駆体のスプライスされていないｍＲＮＡ前駆体に対する比、スプライシングの速度、又はスプライシングの範囲は、本明細書に記載されるＡＳＯを使用して向上させ得る。標的ｍＲＮＡ前駆体によってコードされるタンパク質又は機能性ＲＮＡの量もまた、各ＡＳＯが所望の効果を達成したか（例えば、機能性タンパク質産生を増強したか）否かを決定するために評価することができる。タンパク質産生を評価及び／又は定量化するための当技術分野で公知の任意の方法、例えばウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、及びＥＬＩＳＡが使用され得る。
[218]ＡＳＯ「マイクロ歩行」と称される第２ラウンドのスクリーニングは、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを使用して実施してもよい。ＡＳＯマイクロ歩行に使用されるＡＳＯは、ＡＳＯとハイブリダイズした場合にエクソンスキッピング（又はＮＭＤエクソンの増強されたスプライシング）を結果的にもたらすｍＲＮＡ前駆体のヌクレオチド酸配列をさらに改良するために、１ヌクレオチドごとにタイリングされる。
[219]標的イントロンのスプライシングを促進するＡＳＯによって規定された領域は、１ヌクレオチドステップの間隔で並べられたＡＳＯを伴うＡＳＯ「マイクロ歩行」、及びより長い、典型的には１８～２５ヌクレオチドのＡＳＯによって、より詳細に探索される。
[220]上でＡＳＯ歩行に関して記載されたように、ＡＳＯマイクロ歩行は、１種以上のＡＳＯ、又は対照ＡＳＯ（標的領域にハイブリダイズすることが予期されない配列であるスクランブル配列を有するＡＳＯ）を、例えばトランスフェクションによって、標的ｍＲＮＡ前駆体を発現する疾患関連細胞株へ送達することによって実施される。各々のＡＳＯのスプライシング誘導効果は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えばＮＭＤエクソンにまたがるプライマーを使用する逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲによって、本明細書に記載されるように評価してもよい（例えば実施例２を参照のこと）。ＡＳＯ処理細胞における、ＮＭＤエクソンにまたがるプライマーを使用して産生された、対照ＡＳＯ処理細胞におけるものと比較してより長いＲＴ－ＰＣＲ産物の低減又は非存在は、エクソンスキッピング（又はＮＭＤエクソンを含有する標的イントロンのスプライシング）が増強されたことを指し示す。一部の実施形態では、エクソンスキッピング効率（又はＮＭＤエクソンを含有するイントロンをスプライスするスプライシング効率）、スプライスされたｍＲＮＡ前駆体のスプライスされていないｍＲＮＡ前駆体に対する比、スプライシングの速度、又はスプライシングの範囲は、本明細書に記載されるＡＳＯを使用して向上させ得る。標的ｍＲＮＡ前駆体によってコードされるタンパク質又は機能性ＲＮＡの量もまた、各ＡＳＯが所望の効果を達成したか（例えば、機能性タンパク質産生を増強したか）否かを決定するために評価することができる。タンパク質産生を評価及び／又は定量化するための当技術分野で公知の任意の方法、例えばウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、及びＥＬＩＳＡが使用され得る。
[221]ｍＲＮＡ前駆体の領域にハイブリダイズした場合にエクソンスキッピング（又はＮＭＤエクソンを含有するイントロンの増強されたスプライシング）及び増加したタンパク質産生を結果的にもたらすＡＳＯは、動物モデル、例えば、全長ヒト遺伝子がノックインされたトランスジェニックマウスモデル、又は疾患のヒト化マウスモデルを使用して、インビボで試験してもよい。ＡＳＯの好適な投与経路は、疾患、及び／又はＡＳＯの送達が所望される細胞型に応じて変えてもよい。ＡＳＯは、例えば、硝子体内注射、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射によって投与され得る。投与後、モデル動物の細胞、組織、及び／又は器官は、ＡＳＯ処置の効果を決定するために、例えば当技術分野で公知かつ本明細書に記載されている方法によってスプライシング（例えば、効率、速度、範囲）及びタンパク質産生を評価することによって、評価することができる。動物モデルはまた、疾患又は疾患重症度の任意の表現型又は行動指標にもなり得る。
[222]ＮＭＤ阻害剤、例えば、シクロヘキシミドの存在下においてＮＭＤ誘導エクソンを同定又は認証する方法も本開示の範囲内である。例示的な方法は、実施例３に提供される。
具体的な実施形態
実施形態１。 標的遺伝子から転写され、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソン（ＮＭＤエクソン）を含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞において標的タンパク質の発現を調節する方法であって、薬剤又は薬剤をコードするベクターを細胞に接触させ、それによって薬剤がｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンのスプライシングを調節し、それにより、ｍＲＮＡ前駆体からプロセシングされるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルを調節し、そして細胞において標的タンパク質の発現を調節することを含み、標的遺伝子はＰＨＩＰ遺伝子である、前記方法。
実施形態２。 薬剤が、
ａ．ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合するか、
ｂ．ＮＭＤエクソンのスプライシングに関与する因子の結合を調節するか、又は
ｃ．（ａ）及び（ｂ）の組合せである、
実施形態１に記載の方法。
実施形態３。 薬剤が、ＮＭＤエクソンのスプライシングに関与する因子の、標的化部分の領域への結合に干渉する、実施形態２に記載の方法。
実施形態４。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分がＮＭＤエクソンの近位にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態５。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの５’末端の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態６。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの５’末端の、少なくとも約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約１ヌクレオチド上流にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態７。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの３’末端の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態８。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの３’末端の、少なくとも約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約１ヌクレオチド下流にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態９。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態１０。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３の、約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態１１。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４４３６の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態１２。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４４３６の、約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態１３。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ｍＲＮＡ前駆体の２つのカノニカルなエクソン領域の間のイントロン領域に位置し、イントロン領域がＮＭＤエクソンを含有する、実施形態２に記載の方法。
実施形態１４。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンと少なくとも部分的に重複する、実施形態２に記載の方法。
実施形態１５。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの上流又は下流のイントロンと少なくとも部分的に重複する、実施形態２に記載の方法。
実施形態１６。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、５’ＮＭＤエクソン－イントロン接合部又は３’ＮＭＤエクソン－イントロン接合部を含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態１７。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分がＮＭＤエクソン内にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態１８。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、又はそれより多い連続するヌクレオチドを含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態１９。 ＮＭＤエクソンが、（ａ）配列番号２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは１００％の配列同一性を有するイントロン配列内にある、及び／又は（ｂ）配列番号３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０。 ＮＭＤエクソンが配列番号３の配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６内にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態２２。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６の上流又は下流にある、実施形態２に記載の方法。
実施形態２３。 ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６のエクソン－イントロン接合部を含む、実施形態２に記載の方法。
実施形態２４。 プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、全長ＰＨＩＰタンパク質又は野生型ＰＨＩＰタンパク質である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２５。 プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、機能性ＰＨＩＰタンパク質である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６。 プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、野生型ＰＨＩＰタンパク質と比較して少なくとも部分的に機能性である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２７。 プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、全長野生型ＰＨＩＰタンパク質と比較して少なくとも部分的に機能性である、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２８。 プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６によってコードされるアミノ酸配列を欠くＰＨＩＰタンパク質である、実施形態１～２３又は２５～２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２９。 ｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンの排除を促進する、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０。 薬剤と接触させた細胞におけるｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンの排除が、薬剤が存在しない場合と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３１。 細胞においてプロセシングされたｍＲＮＡのレベルの増加をもたらす、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３２。 薬剤と接触させた細胞におけるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルが、薬剤が存在しない場合と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３。 細胞において標的タンパク質の発現の増加をもたらす、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３４。 薬剤と接触させた細胞におけるプロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質のレベルが、薬剤が存在しない場合と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、実施形態３３に記載の方法。
実施形態３５。 薬剤が、配列番号４～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３６。 薬剤が遺伝子編集分子をさらに含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３７。 遺伝子編集分子がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８。 薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９。 薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル部分、２’－フルオロ部分、２’－ＮＭＡ部分、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０。 薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、実施形態１～３９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４１。 各糖部分が修飾糖部分である、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２。 薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが、８～５０核酸塩基、８～４０核酸塩基、８～３５核酸塩基、８～３０核酸塩基、８～２５核酸塩基、８～２０核酸塩基、８～１５核酸塩基、９～５０核酸塩基、９～４０核酸塩基、９～３５核酸塩基、９～３０核酸塩基、９～２５核酸塩基、９～２０核酸塩基、９～１５核酸塩基、１０～５０核酸塩基、１０～４０核酸塩基、１０～３５核酸塩基、１０～３０核酸塩基、１０～２５核酸塩基、１０～２０核酸塩基、１０～１５核酸塩基、１１～５０核酸塩基、１１～４０核酸塩基、１１～３５核酸塩基、１１～３０核酸塩基、１１～２５核酸塩基、１１～２０核酸塩基、１１～１５核酸塩基、１２～５０核酸塩基、１２～４０核酸塩基、１２～３５核酸塩基、１２～３０核酸塩基、１２～２５核酸塩基、１２～２０核酸塩基、又は１２～１５核酸塩基から成る、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３。 薬剤をコードするベクターを細胞に接触させることを含み、ベクターがウイルスベクターである、実施形態１に記載の方法。
実施形態４４。 ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターを含む、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５。 ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４６。 薬剤が修飾ｓｎＲＮＡを含む、実施形態１に記載の方法。
実施形態４７。 修飾ヒトｓｎＲＮＡが修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡである、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８。 修飾ヒトｓｎＲＮＡが修飾Ｕ７ ｓｎＲＮＡである、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４９。 修飾ヒトｓｎＲＮＡの１本鎖ヌクレオチド配列の一部分が、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合する配列を含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態５０。 修飾ｓｎＲＮＡをコードするベクターを細胞に接触させることを含む、実施形態４６～４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１。 標的タンパク質のｍＲＮＡレベル又は発現レベルを評価することをさらに含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５２。 薬剤が治療剤である、実施形態１～５１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３。 実施形態５２に記載の治療剤又は実施形態５２に記載の治療剤をコードするベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
実施形態５４。 治療剤又は治療剤をコードするベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物であって、治療剤が、配列番号４～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む、前記医薬組成物。
実施形態５５。 治療剤が、配列番号５５～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む、実施形態５４に記載の医薬組成物。
実施形態５６。 脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射、経口投与、滑膜注射、硝子体内投与、網膜下注射、局所適用、移植、又は静脈内注射用に製剤化される、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態５７。 髄腔内注射又は脳脊髄内注射用に製剤化される、実施形態５３～５５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態５８。 第２の治療剤をさらに含む、実施形態５３～５７のいずれか１つに記載の医薬組成物。
実施形態５９。 第２の治療剤が低分子を含む、実施形態５８に記載の医薬組成物。
実施形態６０。 第２の治療剤がアンチセンスオリゴマーを含む、実施形態５８に記載の医薬組成物。
実施形態６１。 第２の治療剤がイントロン保持を是正する、実施形態５８に記載の医薬組成物。
実施形態６２。 配列番号４～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、アンチセンスオリゴマーが、骨格修飾、糖部分修飾、又はそれらの組合せを含む、前記組成物。
実施形態６３。 アンチセンスオリゴマーを含むポリヌクレオチドをコードするウイルスベクターを含む組成物であって、アンチセンスオリゴマーが、配列番号４～１８０から成る群より選択される配列からなる、前記組成物。
実施形態６４。 ポリヌクレオチドが修飾ｓｎＲＮＡをさらに含む、実施形態６３に記載の組成物。
実施形態６５。 修飾ヒトｓｎＲＮＡが修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡである、実施形態６４に記載の組成物。
実施形態６６。 修飾ヒトｓｎＲＮＡが修飾Ｕ７ ｓｎＲＮＡである、実施形態６４に記載の組成物。
実施形態６７。 アンチセンスオリゴマーが、配列番号５５～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の配列同一性を有する、実施形態６２又は６３に記載の組成物。
実施形態６８。 疾患若しくは病態を処置すること又は疾患若しくは病態を発生する可能性を低下させることを必要とする対象の細胞内で標的タンパク質の発現を調節することによって、対象において疾患若しくは病態を処置するか又は疾患若しくは病態を発生する可能性を低下させる方法であって、対象の細胞に実施形態５３～６１のいずれか１つに記載の医薬組成物を接触させることを含む、前記方法。
実施形態６９。 疾患又は病態が、ＰＨＩＰ遺伝子における機能喪失型変異に関連する、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０。 疾患又は病態が、ＰＨＩＰ遺伝子のハプロ不全に関連し、対象が、機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第１のアレル、及びＰＨＩＰタンパク質が産生されないか若しくは低減したレベルで産生される第２のアレル、又は非機能性ＰＨＩＰタンパク質若しくは部分的に機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第２のアレルを有する、実施形態６８又は６９に記載の方法。
実施形態７１。 疾患又は病態が知的障害疾患又は病態を含む、実施形態６８～７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２。 疾患又は病態が、Ｃｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群（ＣＨＵＪＡＮＳ）、常染色体優性障害、知的障害、発話遅延、不安、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、攻撃行動、顔面異形、カフェオレ斑、ＰＨＩＰハプロ不全によって引き起こされる過体重症候群、発達遅延、肥満、又は異形症を含む、実施形態６８～７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７３。 疾患又は病態がＣｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群を含む、実施形態６８～７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７４。 疾患又は病態が知的障害を含む、実施形態６８～７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７５。 疾患又は病態がＰＨＩＰ遺伝子の常染色体劣性変異に関連し、対象が、
（ｉ）ＰＨＩＰタンパク質が産生されないか、若しくは野生型アレルと比較して低減したレベルで産生される、又は
（ｉｉ）産生されるＰＨＩＰタンパク質が非機能性であるか、若しくは野生型アレルと比較して部分的に機能性である、
第１のアレル、及び
（ｉｉｉ）ＰＨＩＰタンパク質が野生型アレルと比較して低減したレベルで産生され、産生されるＰＨＩＰタンパク質が野生型アレルと比較して少なくとも部分的に機能性である、又は
（ｉｖ）産生されるＰＨＩＰタンパク質が野生型アレルと比較して部分的に機能性である、
第２のアレル、
を有する、実施形態６８又は６９に記載の方法。
実施形態７９。 対象がヒトである、実施形態６８～７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８０。 対象が非ヒト動物である、実施形態６８～７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８１。 対象が胎児、胚、又は小児である、実施形態６８～７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８２。 細胞がエクスビボである、実施形態６８～７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８３。 医薬組成物が、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射、経口投与、滑膜注射、硝子体内投与、網膜下注射、局所適用、移植、又は静脈内注射によって投与される、実施形態６８～７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８４。 医薬組成物が、髄腔内注射又は脳脊髄内注射によって投与される、実施形態６８～７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５。 疾患又は病態を処置する、実施形態６８～７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８６。 標的遺伝子から転写されかつナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソン（ＮＭＤエクソン）を含むｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンのスプライシングを調節し、それにより、ｍＲＮＡ前駆体からプロセシングされるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルを調節し、そしてｍＲＮＡ前駆体を有する細胞において標的タンパク質の発現を調節する薬剤又は該薬剤をコードするベクターを含む組成物であって、標的遺伝子がＰＨＩＰ遺伝子である、前記組成物。
実施形態８７。 標的遺伝子から転写されかつナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソン（ＮＭＤエクソン）を含むｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンのスプライシングを調節し、それにより、ｍＲＮＡ前駆体からプロセシングされるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルを調節し、そして疾患又は病態の処置を必要とする対象の細胞において標的タンパク質の発現を調節することによって、対象において疾患又は病態を処置する薬剤又は該薬剤をコードするベクターを含む組成物であって、標的遺伝子がＰＨＩＰ遺伝子である、前記組成物。
実施形態８８。 実施形態８４又は８５に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクルとを含む、医薬組成物。
実施形態８９。 標的タンパク質がプレクストリン相同ドメイン相互作用タンパク質（ＰＨＩＰ）である、実施形態１～８８のいずれか１つに記載の方法又は組成物又は医薬組成物。
[223]本開示は以下の実施例によってより具体的に例証されるだろう。しかしながら、本開示はこれらの実施例によっていかなる形でも限定されないことが理解されるべきである。
実施例１： 配列決定を使用するＲＮＡｓｅｑによる、転写物におけるＮＭＤ誘導エクソン包含事象の同定
[224]全トランスクリプトームショットガン配列決定を、ＲＮＡ配列決定を使用して実行して、本明細書に記載される遺伝子によって産生された転写物のスナップショットを明らかにし、ＮＭＤエクソン包含事象を同定した。この目的のために、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）又はＤＭＳＯ対照を用いて処理したヒト神経系前駆細胞（ＲｅＮ）及びヒトアストロサイトの核及び細胞質画分に由来するポリＡ＋ ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑストランドｍＲＮＡライブラリー調製キットを使用して構築する。ライブラリーをペアエンド配列決定し、ヒトゲノム（２０１７年１２月、ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８アセンブリ）にマッピングされる１００ヌクレオチドの読取りを結果として得る。図３は、ＰＨＩＰ遺伝子における例示的なナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）誘導エクソンの同定を示す。
[225]例示的な遺伝子及びイントロン配列を表１にまとめる（配列番号は、遺伝子番号によって表される、対応するヌクレオチド配列を指し示す）。例示的なイントロンの配列を表２にまとめる。ＰＨＩＰタンパク質配列を表３に提供する。表４、５及び６は、本開示のＰＨＩＰアンチセンスオリゴマーの配列を列挙する。
実施例２： シクロヘキシミド／ピューロマイシン／ＤＭＳＯ処理を介したＮＭＤエクソンの確認
[226]水（Ｈ）、ＤＭＳＯ処理（Ｄ）、又はピューロマイシン（Ｐ）、若しくはシクロヘキシミド処理（Ｃ）したヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、ヒト神経芽細胞（ＳＫ－Ｎ－ＡＳ）、及びヒト神経系前駆細胞（ＲｅＮ）に由来する総ＲＮＡ、並びにＰＨＩＰ遺伝子のエクソン１５及び１６におけるプライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲ分析を使用して、ＮＭＤ誘導エクソンに対応するバンドの存在を確認した。バンドの密度測定分析を実施して、総転写物のＮＭＤエクソン包含％を算出した。ＮＭＤを阻害するための、シクロヘキシミド又はピューロマイシンを用いる細胞の処理は、ＮＭＤ誘導エクソンに対応する産物の増加をもたらすことができる。図４Ａは、ＨＥＫ、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ、及びＲｅＮ ＶＭ細胞それぞれにおいてＤＭＳＯ、シクロヘキシミド、又はピューロマイシン処理を使用した、ＰＨＩＰ遺伝子転写物における例示的なＮＭＤエクソンの確認を示す。Ｕ８７細胞及びアストロサイトを、シクロヘキシミド（Ｃ）、ピューロマイシン（Ｐ）、又はＤＭＳＯ（Ｄ）を用いて同様に処理した。ＰＨＩＰ遺伝子のエクソン１５及び１６におけるプライマーを使用して、ＮＭＤ誘導エクソンに対応するバンドの存在を確認した。Ｕ８７細胞及びアストロサイトに関する結果を図４Ｂに示す。
[227]同様の結果が、水（Ｈ２Ｏ）、ＤＭＳＯ、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、及びピューロマイシンを用いて処理したマウス胚性線維芽（ＭＥＦ）細胞において見出された。４つの異なる増幅サイクル（２６、２９、３２、及び３５）を示す。ＮＭＤエクソン１５ｘ包含は、図４Ｃに示すように、ＭＥＦ細胞において保存されていることが見出された。
実施例３： ＰＨＩＰ ＮＭＤ事象は非ヒト霊長類において保存される
[228]ＲＮＡを、カニクイザル（Macaca fascicularis）の指し示された脳領域から抽出した。ｃＤＮＡを生成し、目的の産物を、エクソン１５における順方向プライマー及びエクソン１６における逆方向プライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。２つの異なる増幅サイクル（２８及び３１）を図５に示す。
実施例４： ＮＭＤエクソン領域ＡＳＯ歩行
[229]ＡＳＯ歩行を、ＮＭＤエクソン領域に関して、３’スプライス部位の直ぐ上流の配列、３’スプライス部位を横断する配列、ＮＭＤエクソン、５’スプライス部位を横断する配列、及び５’スプライス部位の下流の配列を標的とし、ＰＳ骨格の２’－ＭＯＥ ＡＳＯを使用して実施した。ＡＳＯは、３ヌクレオチド離した最後の３’スプライス部位ＡＳＯと最初のエクソンＡＳＯ、及び最後のエクソンＡＳＯと最初の５’スプライス部位ＡＳＯを除いて一度に５ヌクレオチド移動することによって、これらの領域を網羅するように設計した。図６は、例示的なＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン領域に関するＡＳＯ歩行を示す。
[230]ＡＳＯの表示は以下の通りに説明することができる：ＩＶＳ１４Ｘ＝ＮＭＤエクソンの直前のカノニカルなエクソン（カノニカルなエクソン１５）の後ろのカノニカルなイントロン（カノニカルなイントロン１５）のイントロン型配列部分。Ｅｘ１５Ｘ＝ＮＭＤエクソン（カノニカルなイントロン１５内）。ＩＶＳ１５Ｘ＝ＮＭＤエクソンの直後かつＮＭＤエクソンの直後のカノニカルなエクソン（カノニカルなエクソン１６）の前のカノニカルなイントロン（カノニカルなイントロン１５）のイントロン型配列部分。ＡＳＯ歩行については、上記の名称を参照のこと。ＩＶＳ１４Ｘ及びＥｘ１５Ｘにまたがるか又はＥｘ１５Ｘ及びＩＶＳ１５ＸにまたがるＡＳＯは、「ＸＸ」として表示されることに留意されたい。完全にＥｘ１５Ｘの内部にあるＡＳＯは「ＸＸ」として表示されない。
実施例５： ＲＴ－ＰＣＲによって評価したＮＭＤエクソン領域ＡＳＯ歩行
[231]ＡＳＯ歩行配列をＲＴ－ＰＣＲ及びＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって評価した。処理された対照ＡＳＯ（「模擬」又は「－」）、又は以下の表４に示すＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン領域を標的とする２’－ＭＯＥ ＡＳＯを、ＨＥＫ２９３細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘを使用してトランスフェクトしたか、又はＲｅＮ細胞にヌクレオフェクトした。ＰＨＩＰ非生産的ｍＲＮＡ（ＲＴ－ＰＣＲ）及び生産的ｍＲＮＡ（ＴａｑＭａｎ）に対応する産物を定量化し、内部対照に対して正規化し、対照と比べた変化倍数をプロットした。図７は、ＲｅＮ細胞における例示的なＮＭＤエクソン領域に対する様々な例示的なＡＳＯ歩行の、ＲＴ－ＰＣＲ及びＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを介した評価を示す。ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の測定を、エクソン１５及びエクソン１６にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲ、並びにエクソン１５及びエクソン１６におけるプライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲによって、３時間のシクロヘキシミド処理後の、３ｕＭの例示的なＡＳＯを用いた処理の２４時間後の細胞に対して実行した。
[232]図８は、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の測定を示す。分析を、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって、シクロヘキシミド処理の非存在下における、３μＭの少数の例示的なＡＳＯを用いた処理の２４時間後のＲｅＮ細胞に対して実行した。様々なＡＳＯが、カノニカル及び総（ＧＥ）ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの産生を増加させ、産生される非生産的ｍＲＮＡの量を減少させた。
[233]図９は、ＨＥＫ２９３細胞における例示的なＮＭＤエクソン領域に対する様々な例示的なＡＳＯ歩行の、ＲＴ－ＰＣＲ及びＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを介した評価を示す。ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の測定を、エクソン１５及びエクソン１６にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲ、並びにエクソン１５及びエクソン１６におけるプライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲによって、３時間のシクロヘキシミド処理後の、１２０ｎＭの例示的なＡＳＯを用いた処理の２４時間後の細胞に対して実行した。
[234]図１０Ａ～１０Ｄは、例示的なＮＭＤエクソン領域１５ｘに対するＲＴ－ＰＣＲ及びＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを介した少数の例示的なＡＳＯの評価を示す。ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の測定を、シクロヘキシミドの非存在下における、８０ｎＭの例示的なＡＳＯを用いた処理の２４時間後の細胞に対して実行した。図に示すように、様々なＡＳＯが、カノニカルなＰＨＩＰ ｍＲＮＡ及び総ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの産生を増加させ、産生される非生産的ｍＲＮＡの量を減少させた。
実施例６： ＲＴ－ＰＣＲ及びＲＴ－ｑＰＣＲによって評価したＮＭＤエクソン領域ＡＳＯマイクロ歩行
[235]図１１は、例示的なＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン領域に関するＡＳＯマイクロ歩行を示す。ＡＳＯマイクロ歩行配列（エクソン１５ｘを横断する）をＲＴ－ＰＣＲによって評価した。細胞に、処理された対照ＡＳＯ（ＳＭＮ）、又は以下の表５に記載される、ＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン領域を標的とする２’－ＭＯＥ ＡＳＯをトランスフェクトした。ＮＭＤエクソン包含及び全長に対応する産物を定量化し、ＮＭＤエクソン包含％をプロットした。図１２は、ＲｅＮ細胞における例示的なＮＭＤエクソン領域に対する様々な例示的なＡＳＯ歩行の評価を示す。ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の測定を、エクソン１５及びエクソン１６にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって、３時間のシクロヘキシミド処理後の、３ｕＭの例示的なＡＳＯのトランスフェクションの２４時間後のＲｅＮ細胞に対して実行した（図１２）。
[236]図１３は、ＨＥＫ２９３細胞における例示的なＮＭＤエクソン領域に対する様々な例示的なＡＳＯ歩行の評価を示す。ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の測定を、エクソン１５及びエクソン１６にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲ、並びにエクソン１５及びエクソン１６におけるプライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲによって、シクロヘキシミドを用いた３時間の処理後の、１２０ｎＭの例示的なＡＳＯのトランスフェクションの２４時間後のＨＥＫ２９３細胞に対して実行した（図１０）。
[237]以下の表６は、さらなる例示的なＰＨＩＰ ＮＭＤエクソン領域ＡＳＯマイクロ歩行配列（エクソン１５ｘを横断する）を提供する。
実施例７： 用量反応評価
[238]本開示の一部の実施形態によるいくつかの例示的なＡＳＯの用量反応関係を調査する実験を実施した。
[239]ある実験では、ＲｅＮ ＶＭ細胞に異なる濃度のＡＳＯをヌクレオフェクトし、次いでこの細胞をシクロヘキシミドの存在下において２４時間培養した後、細胞におけるＮＭＤエクソン（１５ｘ）のスプライシングを調査するＲＴ－ＰＣＲ分析のために回収した。図１４Ａ及び１４Ｂに示すように、対照ＡＳＯ（「模擬」）、ＳＭＮ ｍＲＮＡを標的とするＡＳＯ（「ＳＭＮ」）、又は例示的なＡＳＯ、例えば「ＩＶＳ１４Ｘ：－３」（配列番号５８）、「ＩＶＳ１４Ｘ－Ｅｘ１５ＸＸ：７」（配列番号６７）、「Ｅｘ１５Ｘ：１９」（配列番号９５）、若しくは「Ｅｘ１５Ｘ：２３」（配列番号９９）を、それぞれ０．３３μＭ、１μＭ、又は３μＭで用いて、細胞を処理した。２４時間後、細胞をＲＴ－ＰＣＲ分析のために回収した。エクソン１５及びエクソン１６を標的とするプライマーをＲＴ－ＰＣＲ反応のために使用し、増幅結果を図１４Ａに示すように可視化し、ここで、下側のバンドはエクソン１５ｘを有しないｍＲＮＡ転写物（「カノニカルなＰＨＩＰ ｍＲＮＡ」）に由来し、上側のバンドはエクソン１５ｘを有するｍＲＮＡ転写物（「非生産的ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ」）に由来した。異なる処理に応答したカノニカルなＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の変化及び非生産的ＰＨＩＰ ｍＲＮＡの量の変化の定量化を図１４Ｂ（「模擬」条件下におけるそれぞれの量によって正規化した）にまとめる。試験された全ての例示的なＰＨＩＰ ＡＳＯに関して、それらが高濃度で適用されるほど、より多くのカノニカルなＰＨＩＰ転写物及びより少ない非生産的ＰＨＩＰ転写物が観察された。
[240]別の実験では、ＲｅＮ ＶＭ細胞に３μＭの様々なＡＳＯをヌクレオフェクトし、この細胞を７２時間培養した後、細胞におけるＰＨＩＰタンパク質レベルを調査するＪＥＳＳアッセイのために回収した。図１５Ａは、２回の反復のウェスタンブロッティング画像を示し、図１５Ｂは、試験された全ての例示的なＡＳＯ（ＩＶＳ１４Ｘ：－３、ＩＶＳ１４Ｘ－Ｅｘ１５ＸＸ：７、Ｅｘ１５Ｘ：１９、及びＥｘ１５Ｘ：２３）が、模擬条件と比較してＰＨＩＰタンパク質レベルの増加を引き起こしたが、ＳＭＮ対照は引き起こさなかったことを実証するプロットを示す。
実施例８： 例示的なＡＳＯによるスプライシングの調節
[241]この実施例は、本開示の一部の実施形態による例示的なＡＳＯによる、ＰＨＩＰ ｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソン１５ｘのスプライシングの調節を実証したさらなる実験を例示する。
[242]ある実験では、ＲｅＮ ＶＭ細胞に３μＭのＡＳＯをヌクレオフェクトし、この細胞をシクロヘキシミドの非存在下において２４時間培養した後、ＲＴ－ＰＣＲ分析のために回収した。具体的には、細胞に、表７に列挙した例示的なＡＳＯのうちの１つ又は対照ＡＳＯ（「模擬」）若しくはＳＭＮ ＡＳＯを、全て３μＭにおいてヌクレオフェクトした。２４時間後、細胞をＲＴ－ＰＣＲ（図１６Ａ～１６Ｂ）又はＲＴ－ｑＰＣＲ（図１６Ｃ～１６Ｄ）のために回収した。図１６Ｂ～１６Ｄに示すように、例示的なＡＳＯは、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１６Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１６Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１６Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらした。
[243]別の実験では、ＡＳＯをＲｅＮ ＶＭ細胞の培養培地に、自由取込みのために６０μＭにおいて添加し、次いで、細胞を３Ｄ条件及びシクロヘキシミドの非存在下において３日間培養した後、ＲＴ－ＰＣＲ分析のために回収した。具体的には、表７に列挙した例示的なＡＳＯのうちの１つ、又は対照ＡＳＯ（「模擬」）若しくはＳＭＮ ＡＳＯを、全て３μＭにおいて用いて、細胞を処理した。２４時間後、細胞をＲＴ－ＰＣＲ（図１７Ａ）又はＲＴ－ｑＰＣＲ（図１７Ｂ～１７Ｄ）のために回収した。図１７Ｂ～１７Ｄに示すように、例示的なＡＳＯは、エクソン１５ｘを有する非生産的ＰＨＩＰ転写物の量の減少（図１７Ｂ）と、エクソン１５及びエクソン１６（カノニカル；図１７Ｃ）並びにエクソン３５及びエクソン３６（ＧＥ；図１７Ｄ）にまたがるプローブを使用するＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって示されるエクソン１５ｘを有しないＰＨＩＰ転写物の量の増加とをもたらした。
[244]本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されているということは、当業者には明らかであろう。今や数多くの変形、変更、及び代用が、本開示から逸脱することなく当業者には思い浮かぶであろう。本開示の実施形態の様々な代替が本開示を実施する際に用いられてもよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの均等物はそれによって網羅されることが意図される。

Claims (86)

  1. 標的遺伝子から転写され、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソン（ＮＭＤエクソン）を含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞において標的タンパク質の発現を調節する方法であって、薬剤又は薬剤をコードするベクターを細胞に接触させ、それによって薬剤がｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンのスプライシングを調節し、それにより、ｍＲＮＡ前駆体からプロセシングされるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルを調節し、そして細胞において標的タンパク質の発現を調節することを含み、標的遺伝子はＰＨＩＰ遺伝子である、前記方法。
  2. 薬剤が、
    （ａ）ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合するか、
    （ｂ）ＮＭＤエクソンのスプライシングに関与する因子の結合を調節するか、又は
    （ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組合せである、
    請求項１に記載の方法。
  3. 薬剤が、ＮＭＤエクソンのスプライシングに関与する因子の、標的化部分の領域への結合に干渉する、請求項２に記載の方法。
  4. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分がＮＭＤエクソンの近位にある、請求項２に記載の方法。
  5. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの５’末端の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流にある、請求項２に記載の方法。
  6. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの５’末端の、少なくとも約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約１ヌクレオチド上流にある、請求項２に記載の方法。
  7. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの３’末端の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流にある、請求項２に記載の方法。
  8. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの３’末端の、少なくとも約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約４ヌクレオチド、約２ヌクレオチド、約１ヌクレオチド下流にある、請求項２に記載の方法。
  9. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流にある、請求項２に記載の方法。
  10. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３の、約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド上流にある、請求項２に記載の方法。
  11. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４４３６の、最大で約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流にある、請求項２に記載の方法。
  12. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ゲノム部位ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４４３６の、約１５００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約７０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド下流にある、請求項２に記載の方法。
  13. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ｍＲＮＡ前駆体の２つのカノニカルなエクソン領域の間のイントロン領域に位置し、イントロン領域がＮＭＤエクソンを含有する、請求項２に記載の方法。
  14. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンと少なくとも部分的に重複する、請求項２に記載の方法。
  15. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの上流又は下流のイントロンと少なくとも部分的に重複する、請求項２に記載の方法。
  16. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、５’ＮＭＤエクソン－イントロン接合部又は３’ＮＭＤエクソン－イントロン接合部を含む、請求項２に記載の方法。
  17. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分がＮＭＤエクソン内にある、請求項２に記載の方法。
  18. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ＮＭＤエクソンの約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、又はそれより多い連続するヌクレオチドを含む、請求項２に記載の方法。
  19. ＮＭＤエクソンが、（ａ）配列番号２に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは１００％の配列同一性を有するイントロン配列内にある、及び／又は（ｂ）配列番号３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、若しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の方法。
  20. ＮＭＤエクソンが配列番号３の配列を含む、請求項１に記載の方法。
  21. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６内にある、請求項２に記載の方法。
  22. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６の上流又は下流にある、請求項２に記載の方法。
  23. ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分が、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６のエクソン－イントロン接合部を含む、請求項２に記載の方法。
  24. プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、全長ＰＨＩＰタンパク質又は野生型ＰＨＩＰタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  25. プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、機能性ＰＨＩＰタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  26. プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、野生型ＰＨＩＰタンパク質と比較して少なくとも部分的に機能性である、請求項１に記載の方法。
  27. プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、全長野生型ＰＨＩＰタンパク質と比較して少なくとも部分的に機能性である、請求項１に記載の方法。
  28. プロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質が、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソンＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：ｃｈｒ６ ７９００４３７３～７９００４４３６によってコードされるアミノ酸配列を欠くＰＨＩＰタンパク質である、請求項１に記載の方法。
  29. ｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンの排除を促進する、請求項１に記載の方法。
  30. 薬剤と接触させた細胞におけるｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンの排除が、薬剤が存在しない場合と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、請求項２９に記載の方法。
  31. 細胞においてプロセシングされたｍＲＮＡのレベルの増加をもたらす、請求項１に記載の方法。
  32. 薬剤と接触させた細胞におけるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルが、薬剤が存在しない場合と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、請求項３１に記載の方法。
  33. 細胞において標的タンパク質の発現の増加をもたらす、請求項１に記載の方法。
  34. 薬剤と接触させた細胞におけるプロセシングされたｍＲＮＡから発現する標的タンパク質のレベルが、薬剤が存在しない場合と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍増加する、請求項３３に記載の方法。
  35. 薬剤が、配列番号４～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む、請求項１に記載の方法。
  36. 薬剤が遺伝子編集分子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  37. 遺伝子編集分子がＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエート連結又はホスホロジアミデート連結を含む骨格修飾を含む、請求項１に記載の方法。
  39. 薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル部分、２’－フルオロ部分、２’－ＮＭＡ部分、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、請求項１に記載の方法。
  40. 薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが少なくとも１つの修飾糖部分を含む、請求項１に記載の方法。
  41. 各糖部分が修飾糖部分である、請求項４０に記載の方法。
  42. 薬剤がアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴマーが、８～５０核酸塩基、８～４０核酸塩基、８～３５核酸塩基、８～３０核酸塩基、８～２５核酸塩基、８～２０核酸塩基、８～１５核酸塩基、９～５０核酸塩基、９～４０核酸塩基、９～３５核酸塩基、９～３０核酸塩基、９～２５核酸塩基、９～２０核酸塩基、９～１５核酸塩基、１０～５０核酸塩基、１０～４０核酸塩基、１０～３５核酸塩基、１０～３０核酸塩基、１０～２５核酸塩基、１０～２０核酸塩基、１０～１５核酸塩基、１１～５０核酸塩基、１１～４０核酸塩基、１１～３５核酸塩基、１１～３０核酸塩基、１１～２５核酸塩基、１１～２０核酸塩基、１１～１５核酸塩基、１２～５０核酸塩基、１２～４０核酸塩基、１２～３５核酸塩基、１２～３０核酸塩基、１２～２５核酸塩基、１２～２０核酸塩基、又は１２～１５核酸塩基から成る、請求項１に記載の方法。
  43. 薬剤をコードするベクターを細胞に接触させることを含み、ベクターがウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
  44. ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、請求項４３に記載の方法。
  46. 薬剤が修飾ｓｎＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
  47. 修飾ヒトｓｎＲＮＡが修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡである、請求項４６に記載の方法。
  48. 修飾ヒトｓｎＲＮＡが修飾Ｕ７ ｓｎＲＮＡである、請求項４６に記載の方法。
  49. 修飾ヒトｓｎＲＮＡの１本鎖ヌクレオチド配列の一部分が、ｍＲＮＡ前駆体の標的化部分に結合する配列を含む、請求項４６に記載の方法。
  50. 修飾ｓｎＲＮＡをコードするベクターを細胞に接触させることを含む、請求項４６に記載の方法。
  51. 標的タンパク質のｍＲＮＡレベル又は発現レベルを評価することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  52. 薬剤が治療剤である、請求項１に記載の方法。
  53. 請求項５２に記載の治療剤又は請求項５２に記載の治療剤をコードするベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
  54. 治療剤又は治療剤をコードするベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物であって、治療剤が、配列番号４～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む、前記医薬組成物。
  55. 治療剤が、配列番号５５～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む、請求項５４に記載の医薬組成物。
  56. 脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射、経口投与、滑膜注射、硝子体内投与、網膜下注射、局所適用、移植、又は静脈内注射用に製剤化される、請求項５３に記載の医薬組成物。
  57. 髄腔内注射又は脳脊髄内注射用に製剤化される、請求項５３に記載の医薬組成物。
  58. 第２の治療剤をさらに含む、請求項５３に記載の医薬組成物。
  59. 第２の治療剤が低分子を含む、請求項５８に記載の医薬組成物。
  60. 第２の治療剤がアンチセンスオリゴマーを含む、請求項５８に記載の医薬組成物。
  61. 第２の治療剤がイントロン保持を是正する、請求項５８に記載の医薬組成物。
  62. 配列番号４～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、アンチセンスオリゴマーは、骨格修飾、糖部分修飾、又はそれらの組合せを含む、前記組成物。
  63. アンチセンスオリゴマーを含むポリヌクレオチドをコードするウイルスベクターを含む組成物であって、アンチセンスオリゴマーは、配列番号４～１８０から成る群より選択される配列から成る、前記組成物。
  64. ポリヌクレオチドが修飾ｓｎＲＮＡをさらに含む、請求項６３に記載の組成物。
  65. 修飾ヒトｓｎＲＮＡが修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡである、請求項６４に記載の組成物。
  66. 修飾ヒトｓｎＲＮＡが修飾Ｕ７ ｓｎＲＮＡである、請求項６４に記載の組成物。
  67. アンチセンスオリゴマーが、配列番号５５～１８０から成る群より選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項６２又は６３に記載の組成物。
  68. 疾患若しくは病態を処置すること又は疾患若しくは病態を発生する可能性を低下させることを必要とする対象の細胞内で標的タンパク質の発現を調節することによって、対象において疾患若しくは病態を処置するか又は疾患若しくは病態を発生する可能性を低下させる方法であって、対象の細胞に請求項５３～６１のいずれか１項に記載の医薬組成物を接触させることを含む、前記方法。
  69. 疾患又は病態が、ＰＨＩＰ遺伝子における機能喪失型変異に関連する、請求項６８に記載の方法。
  70. 疾患又は病態が、ＰＨＩＰ遺伝子のハプロ不全に関連し、対象が、機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第１のアレル、及びＰＨＩＰタンパク質が産生されないか若しくは低減したレベルで産生される第２のアレル、又は非機能性ＰＨＩＰタンパク質若しくは部分的に機能性ＰＨＩＰタンパク質をコードする第２のアレルを有する、請求項６８又は６９に記載の方法。
  71. 疾患又は病態が知的障害疾患又は病態を含む、請求項６８に記載の方法。
  72. 疾患又は病態が、Ｃｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群（ＣＨＵＪＡＮＳ）、常染色体優性障害、知的障害、発話遅延、不安、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、攻撃行動、顔面異形、カフェオレ斑、ＰＨＩＰハプロ不全によって引き起こされる過体重症候群、発達遅延、肥満、又は異形症を含む、請求項６８に記載の方法。
  73. 疾患又は病態がＣｈｕｎｇ－Ｊａｎｓｅｎ症候群を含む、請求項６８に記載の方法。
  74. 疾患又は病態が知的障害を含む、請求項６８に記載の方法。
  75. 疾患又は病態がＰＨＩＰ遺伝子の常染色体劣性変異に関連し、対象が、
    （ｉ）ＰＨＩＰタンパク質が産生されないか、若しくは野生型アレルと比較して低減したレベルで産生される、又は
    （ｉｉ）産生されるＰＨＩＰタンパク質が非機能性であるか、若しくは野生型アレルと比較して部分的に機能性である、
    第１のアレル、及び
    （ｉｉｉ）ＰＨＩＰタンパク質が野生型アレルと比較して低減したレベルで産生され、産生されるＰＨＩＰタンパク質が野生型アレルと比較して少なくとも部分的に機能性である、又は
    （ｉｖ）産生されるＰＨＩＰタンパク質が野生型アレルと比較して部分的に機能性である、
    第２のアレル、
    を有する、請求項６８に記載の方法。
  76. 対象がヒトである、請求項６８に記載の方法。
  77. 対象が非ヒト動物である、請求項６８に記載の方法。
  78. 対象が胎児、胚、又は小児である、請求項６８に記載の方法。
  79. 細胞がエクスビボである、請求項６８に記載の方法。
  80. 医薬組成物が、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、皮下注射、経口投与、滑膜注射、硝子体内投与、網膜下注射、局所適用、移植、又は静脈内注射によって投与される、請求項６８に記載の方法。
  81. 医薬組成物が、髄腔内注射又は脳脊髄内注射によって投与される、請求項６８に記載の方法。
  82. 疾患又は病態を処置する、請求項６８に記載の方法。
  83. 標的遺伝子から転写されかつナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソン（ＮＭＤエクソン）を含むｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンのスプライシングを調節し、それにより、ｍＲＮＡ前駆体からプロセシングされるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルを調節し、そしてｍＲＮＡ前駆体を有する細胞において標的タンパク質の発現を調節する薬剤又は該薬剤をコードするベクターを含む組成物であって、標的遺伝子がＰＨＩＰ遺伝子である、前記組成物。
  84. 標的遺伝子から転写されかつナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構誘導エクソン（ＮＭＤエクソン）を含むｍＲＮＡ前駆体からのＮＭＤエクソンのスプライシングを調節し、それにより、ｍＲＮＡ前駆体からプロセシングされるプロセシングされたｍＲＮＡのレベルを調節し、そして疾患又は病態の処置を必要とする対象の細胞において標的タンパク質の発現を調節することによって、対象において疾患又は病態を処置する薬剤又は該薬剤をコードするベクターを含む組成物であって、標的遺伝子がＰＨＩＰ遺伝子である、前記組成物。
  85. 請求項８３又は８４に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクルとを含む、医薬組成物。
  86. 標的タンパク質がプレクストリン相同ドメイン相互作用タンパク質（ＰＨＩＰ）である、請求項１～８５のいずれか１項に記載の方法又は組成物又は医薬組成物。
JP2023578922A 2021-06-21 2022-06-21 ナンセンス変異依存ｒｎａ分解機構に基づく病態及び疾患の処置のためのアンチセンスオリゴマー Pending JP2024524974A (ja)

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