JP2024521792A - 補体媒介性疾患の治療法 - Google Patents

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Abstract

不適切なまたは過剰な補体活性化は、多くの重篤な疾患及び状態の根本的な原因または寄与因子であり、過去数十年にわたり、治療薬としての様々な補体阻害剤の探索に多大な努力が払われてきた。ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ、ならびに補体媒介性疾患の治療におけるそれらの使用を記載する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年５月２６日に出願された米国仮出願第６３／１９３，５７３号の利益を主張するものであり、本明細書に参照によりその全容を援用するものである。
補体は、自然免疫と獲得免疫の両方で重要な役割を果たす、３０を超える血漿タンパク質及び細胞結合タンパク質からなるシステムである。補体系のタンパク質は、様々なタンパク質相互作用及び切断イベントによって一連の酵素カスケードで作用する。補体活性化は、抗体依存性古典経路、別経路、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）経路という３つの主要な経路を介して生じる。不適切なまたは過剰な補体活性化は、多くの重篤な疾患及び状態の根本的な原因または寄与因子であり、過去数十年にわたり、治療薬としての様々な補体阻害剤の探索に多大な努力が払われてきた。
一態様では、本開示は、補体媒介性眼疾患を治療する方法であって、対象の肝臓のＣ３のレベルを減少させることにより、眼障害を治療することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、対象のＣ３ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを対象に全身投与することを含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、肝臓標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、肝臓標的化部分は、ＧａｌＮＡｃ部位である。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、表２Ａ、２Ｂ、４、５、６、１０、１５、１６、１７、１８、２４～７０、または７２～７３に記載される配列を含むアンチセンス鎖を含み、及び／または表１、３Ａ、３Ｂ、１０、１５、１６、１７、１８、または２１～７１に記載される配列を含むセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、アンチセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列に相補的であり、及び／またはセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと１、２、３、または４個以下のヌクレオチドが異なる配列を含むヌクレオチド配列に相補的であり、及び／またはセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと１、２、３、または４個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つを含むヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１０１～１２５のいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方または両方は、少なくとも１つのオーバーハング領域を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオーバーハング領域は、１、２、３、４または５ヌクレオチドのオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオーバーハング領域は、３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオーバーハング領域は、配列番号７５の断片に相補的である。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方または両方は、配列番号７５の断片に相補的ではない少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを、５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方または両方は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル基を含むヌクレオチド、２’－フルオロ基を含むヌクレオチド、及び／または隣接ヌクレオチドとのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、（ｉ）センス鎖の５’末端、（ｉｉ）センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端、及び／または（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端の最後の２、３または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、（ｉ）センス鎖の５’末端、（ｉｉ）センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端、及び／または（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端の最後の３個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、（ｉ）センス鎖の５’末端、（ｉｉ）センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端の最後の２、３または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号７６～１００、１２６～１５０、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５５、２５９、２６４、２６８、２７２、２７６、３２５、３２６、及び３２７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１０１～１２５、１５１～２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５８、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２７４、２７５、２７７、２７８、及び３００～３２４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、以下のセンス／アンチセンス配列番号の組：２０１／２０２、２０３／２０４、２０５／２０６、２０７／２０８、２０９／２１０、２１１／２１２、２１３／２１４、２１５／２１６、２１７／２１８、２１９／２２０、２２１／２２２、２２３／２２４、２２５／２２６、２２７／２２８、２２９／２３０、２３１／２３２、２３３／２３４、２３５／２３６、２３７／２３８、２３９／２４０、２４１／２４２、２４３／２４４、２４５／２４６、２４７／２４８、２４９／２５０、２５１／２５２、２５３／２５４、２０１／２５６、２５５／２５６、２５５／２５７、２０１／２５８、２５５／２５８、２０７／２６０、２５９／２６０、２５９／２６１、２０７／２６２、２５９／２６２、２１７／２６３、２６４／２６３、２６４／２６５、２１７／２６６、２６４／２６６、２１９／２６７、２６８／２６７、２６８／２６９、２１９／２７０、２６８／２７０、２３１／２７１、２７２／２７１、２７２／２７３、２３１／２７４、２７２／２７４、２４３／２７５、２７６／２７５、２７６／２７７、２４３／２７８、２７６／２７８、３２５／２７５、３２６／２６０、及び３２７／２５８のいずれか１つのセンス鎖ヌクレオチド配列／アンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、及びアンチセンス鎖の３’末端のうちの１つ以上に結合された少なくとも１つのリガンドを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、リガンドは３個のＧａｌＮＡｃ部分を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ｓｉＲＮＡをコードする核酸を含む組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたは組成物の投与後に、対象または対象からの生体試料中のＣ３転写産物またはＣ３タンパク質のレベルは、ｓｉＲＮＡまたは組成物の投与前のレベルに対して減少する。いくつかの実施形態では、Ｃ３転写産物またはＣ３タンパク質のレベルは、投与前のレベルに対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％減少する。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたは組成物は、対象に静脈内または皮下投与される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたは組成物は、対象の肝細胞に投与される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたは組成物は、エクスビボで肝細胞に投与される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたは組成物は、インビボで肝細胞に投与される。
いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の薬剤を全身投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、抗Ｃ３抗体またはコンプスタチン類似体である。
いくつかの実施形態では、眼疾患は地図状萎縮または中間型ＡＭＤである。
別の態様では、本開示は、対象の眼内の補体Ｃ３のレベルを、コントロールに対して阻害または減少させる方法であって、対象の肝臓のＣ３のレベルを減少させ、それにより眼内のＣ３のレベルを減少させることを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、対象のＣ３ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを対象に全身投与することを含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、肝臓標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、肝臓標的化部分は、ＧａｌＮＡｃ部位である。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、表２Ａ、２Ｂ、４、５、６、１０、１５、１６、１７、１８、２４～７０、または７２～７３に記載される配列を含むアンチセンス鎖を含み、及び／または表１、３Ａ、３Ｂ、１０、１５、１６、１７、１８、または２１～７１に記載される配列を含むセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、アンチセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列に相補的であり、及び／またはセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと１、２、３、または４個以下のヌクレオチドが異なる配列を含むヌクレオチド配列に相補的であり、及び／またはセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと１、２、３、または４個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つを含むヌクレオチド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１０１～１２５のいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方または両方は、少なくとも１つのオーバーハング領域を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオーバーハング領域は、１、２、３、４または５ヌクレオチドのオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオーバーハング領域は、３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオーバーハング領域は、配列番号７５の断片に相補的である。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方または両方は、配列番号７５の断片に相補的ではない少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを、５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方または両方は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル基を含むヌクレオチド、２’－フルオロ基を含むヌクレオチド、及び／または隣接ヌクレオチドとのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、（ｉ）センス鎖の５’末端、（ｉｉ）センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端、及び／または（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端の最後の２、３または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、（ｉ）センス鎖の５’末端、（ｉｉ）センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端、及び／または（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端の最後の３個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、（ｉ）センス鎖の５’末端、（ｉｉ）センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端、及び（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端の最後の２、３または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号７６～１００、１２６～１５０、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５５、２５９、２６４、２６８、２７２、２７６、３２５、３２６、及び３２７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１０１～１２５、１５１～２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５８、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２７４、２７５、２７７、２７８、及び３００～３２４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、以下のセンス／アンチセンス配列番号の組：２０１／２０２、２０３／２０４、２０５／２０６、２０７／２０８、２０９／２１０、２１１／２１２、２１３／２１４、２１５／２１６、２１７／２１８、２１９／２２０、２２１／２２２、２２３／２２４、２２５／２２６、２２７／２２８、２２９／２３０、２３１／２３２、２３３／２３４、２３５／２３６、２３７／２３８、２３９／２４０、２４１／２４２、２４３／２４４、２４５／２４６、２４７／２４８、２４９／２５０、２５１／２５２、２５３／２５４、２０１／２５６、２５５／２５６、２５５／２５７、２０１／２５８、２５５／２５８、２０７／２６０、２５９／２６０、２５９／２６１、２０７／２６２、２５９／２６２、２１７／２６３、２６４／２６３、２６４／２６５、２１７／２６６、２６４／２６６、２１９／２６７、２６８／２６７、２６８／２６９、２１９／２７０、２６８／２７０、２３１／２７１、２７２／２７１、２７２／２７３、２３１／２７４、２７２／２７４、２４３／２７５、２７６／２７５、２７６／２７７、２４３／２７８、２７６／２７８、３２５／２７５、３２６／２６０、及び３２７／２５８のいずれか１つのセンス鎖ヌクレオチド配列／アンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、センス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、及びアンチセンス鎖の３’末端のうちの１つ以上に結合された少なくとも１つのリガンドをさらに含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、リガンドは３個のＧａｌＮＡｃ部分を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、ｓｉＲＮＡをコードする核酸を含む組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、投与するステップの後、Ｃ３転写産物またはＣ３タンパク質のレベルは、投与するステップの前の対象のＣ３のコントロールレベルに対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％減少する。
いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の薬剤を全身投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、抗Ｃ３抗体またはコンプスタチン類似体である。
いくつかの実施形態では、対象は、補体媒介性疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、眼疾患は地図状萎縮または中間型ＡＭＤである。
本明細書に記載される態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ、組成物、または第２の薬剤は、対象の眼に局所的に投与されない。
定義
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、抗原に結合することができる免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンまたはその誘導体を指す。抗体は、例えばヒト、げっ歯類、ウサギ、ヤギ、ニワトリなど、あらゆる種のものであってよい。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥのヒトのクラス、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのそのサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンのクラスのうちのメンバーであり得る。本発明の様々な実施形態では、抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖可変）または抗原結合部位を保持する他の断片、または組換えにより産生された断片を含む、組換えにより産生されたｓｃＦｖ断片などの断片である。例えば、Ａｌｌｅｎ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ．２，７５０－７６５，２００２、及びその中の参考文献を参照されたい。抗体は一価、二価、または多価であり得る。抗体は、例えば、齧歯動物起源の可変ドメインがヒト起源の定常ドメインに融合され、したがって齧歯動物抗体の特異性を保持するキメラまたは「ヒト化」抗体であり得る。ヒト起源のドメインは、それがヒトで最初に合成されるという意味で、ヒトに直接由来する必要はない。代わりに、「ヒト」ドメインは、ゲノムにヒト免疫グロブリン遺伝子が組み込まれているげっ歯類で生成されていてもよい。例えば、Ｖａｕｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５－５３９を参照されたい。抗体は部分的または完全にヒト化され得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得るが、本発明の目的では、モノクローナル抗体が一般的に好ましい。実質的に任意の目的の分子に特異的に結合する抗体を産生するための方法は、当該技術分野で知られている。例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、（例えば、分子またはその抗原性断片への自然曝露またはそれによる免疫化に続いて）抗体を産生する動物の血液または腹水から精製することができ、細胞培養またはトランスジェニック生物において組換え技術を使用して産生することができ、または少なくとも部分的に化学合成によって作製することができる。
およそ：本明細書で使用される場合、数に関して「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、一般に、特段他が明記されていない限り、または文脈から他が明らかな場合を除いて、数のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい）で５％、１０％、１５％、または２０％の範囲内にある数を含むと解釈される（このような数が０％未満または可能な値の１００％を超える場合を除く）。
相補的：本明細書で使用する場合、その技術分野で受け入れられている意味に従って、「相補的」とは、特定の塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたは核酸間の正確な対合の能力を指す。例えば、アデニン（Ａ）とウリジン（Ｕ）とは相補的であり、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）とは相補的であり、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）とは相補的であり、これらは、当該技術分野ではワトソン・クリック型塩基対合と呼ばれる。鎖同士が反平行の向きでアラインされる際に第１の核酸配列の特定の位置のヌクレオチドが、第２の核酸配列の対向して位置するヌクレオチドと相補的である場合、これらのヌクレオチド同士は相補的な塩基対を形成し、その核酸はその位置で相補的である。第２の核酸に対する第１の核酸の相補性率（％）は、これらの核酸配列を反平行の向きで評価ウインドウにわたって相補性が最大となるようにアラインし、ウインドウ内で相補的塩基対を形成する両方の鎖のヌクレオチド（ｎｔ）の総数を決定し、ウインドウ内のｎｔの総数で割って１００を掛けることによって評価することができる。例えば、ＡＡＡＡＡＡＡＡとＴＴＴＧＴＴＡＴとは、合計１６ｎｔのうち、相補的な塩基対が１２ｎｔあるため、７５％相補的である。特定の相補性率（％）を得るために必要とされる相補性の数を計算する場合、小数は最も近い整数に丸められる。非相補的なヌクレオチドによって占められる位置はミスマッチを構成する。すなわち、その位置は、非相補的な塩基対によって占められる。特定の実施形態では、評価ウインドウは、二重鎖部分または標的部分において本明細書に記載される長さを有する。相補的配列は、第１及び第２のヌクレオチド配列の全長（長さが同じ場合）にわたる、または短い方の配列の全長（長さが異なる場合）にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと第２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書では、互いに対して「完全に相補的」（１００％相補性）と言うことができる。評価ウインドウにわたって少なくとも７０％相補的である核酸同士は、そのウインドウにわたって「実質的に相補的」であるとみなされる。特定の実施形態では、相補的核酸同士は、評価ウインドウにわたり、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％相補的である。第１の配列が本明細書の第２の配列に関して「実質的に相補的」と言われる場合、２つの配列は、完全に相補的であるか、または、それらの目的の用途に最も関係のある条件下でハイブリダイズする能力を維持しつつ、ハイブリダイゼーション時に１つ以上のマッチしない塩基を含んでもよく、例えば、ハイブリダイゼーション時に最大で約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％のマッチしない塩基を含んでもよく、例えば、３０塩基対以下の二重鎖ではハイブリダイゼーション時に１、２、３、４、５、または６個のミスマッチ塩基対を含んでもよい。２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、かかるオーバーハングは、相補性率（％）の決定に関してミスマッチまたは不対合ヌクレオチドとはみなされない点は理解されるはずである。例えば、長さ２１ヌクレオチドの１つのオリゴヌクレオチドと長さ２３ヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡの２本の鎖は、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含み、ヌクレオチド２個のオーバーハングを有する場合、本明細書では「完全に相補的」と言う場合がある。本明細書で使用される「相補的」配列は、それらがハイブリダイズする能力に関する要件が満たされている限り、１つ以上の非ワトソン・クリック塩基対及び／または非天然及び他の修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含んでもよい。そのような非ワトソン・クリック型塩基対としては、これらに限定されるものではないが、Ｇ：Ｕゆらぎまたはフーグスティーン型塩基対が含まれる。当業者には、グアニン、シトシン、アデニン及びウラシルは、いわゆる「ゆらぎ」規則に従って、これらの塩基を有するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変化させることなく他の塩基に置き換えることが可能であることが認識されるところである（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，ＦＶ ＩＶ ＆ Ｖ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｖ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：１２５１－１２５２（２００４））。例えば、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合することができる。従って、本明細書に記載される阻害性ＲＮＡのヌクレオチド配列においては、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドを、例えばイノシンを含むヌクレオチドに置換することができる。「相補的」、「完全に相補的」及び「実質的に相補的」という用語は、文脈から明らかなように、任意の２つの核酸間の塩基マッチング、例えば、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の塩基マッチング、またはｄｓ阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチング、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドと標的配列との間の塩基マッチングに関して使用できる点は理解されよう。本明細書で使用される「ハイブリダイズ」とは、当業者には理解されるように、特定の目的の条件下で安定な二重鎖構造が形成されるように、相補的な部分を含むかまたはそれからなる２つの核酸配列間の相互作用を指す。
補体成分：本明細書で使用される場合、「補体成分」または「補体タンパク質」という用語は、補体系の活性化に関与するか、または１つ以上の補体媒介活性に関与する分子である。古典的補体経路の構成要素としては、例えば、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、及び膜侵襲複合体（ＭＡＣ）とも呼ばれるＣ５ｂ－９複合体、ならびに前述のいずれかの活性断片または酵素的切断産物（例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ５ａなど）が挙げられる。代替経路の構成要素としては、例えば、因子Ｂ、Ｄ、Ｈ、及びＩ、及びプロペルジンが挙げられ、因子Ｈは経路の負の調節因子である。レクチン経路の構成要素としては、例えば、ＭＢＬ２、ＭＡＳＰ－１、及びＭＡＳＰ－２が挙げられる。補体成分としては、可溶性補体成分の細胞結合受容体も挙げられる。このような受容体としては、例えば、Ｃ５ａ受容体（Ｃ５ａＲ）、Ｃ３ａ受容体（Ｃ３ａＲ）、補体受容体１（ＣＲ１）、補体受容体２（ＣＲ２）、補体受容体３（ＣＲ３）などが挙げられる。「補体成分」という用語は、補体活性化の「トリガー」として機能する分子及び分子構造、例えば、抗原－抗体複合体、微生物または人工表面に見られる外来構造などを含むことを意図していない。
宿主細胞：本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、外因性ＤＮＡ（組換えまたはその他の）が導入された細胞を意味する。当業者は、本開示を読めば、そのような用語が特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味することを理解するであろう。突然変異または環境的影響のいずれかに起因して、後続の世代においてある特定の修飾が起こる場合があるため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、外因性ＤＮＡ（例えば、組換え核酸配列）を発現するのに好適な生命界のいずれかから選択される原核細胞及び真核細胞が含まれる。例示的な細胞としては、原核生物及び真核生物のもの（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えばハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウスの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞であり、次の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋｌ、ＤＸＢ－１ １ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含む。
同一性：本明細書で使用する場合、「同一性」という用語は、高分子分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、複数の高分子分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合に互いに対して「実質的に同一」であるとみなされる。例えば、２つの核酸またはポリペプチドの配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較を目的として２つの配列をアラインすることによって行うことができる（例えば、最適なアラインメントのために第１の配列及び第２の配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、比較を目的として非同一配列を無視してもよい）。ある特定の実施形態では、比較目的のためのアラインされた配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、対応する位置にあるヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同一の残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）で占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）のアルゴリズムを使用して、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定できる。いくつかの例示的な実施形態では、ＡＬＩＧＮプログラムを用いる核酸配列の比較では、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、代替的には、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列を使用するＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することもできる。
連結される：本明細書で使用される場合、「連結される」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、部分が物理的に結合または互いに接続されて、部分が、結合が形成される条件、好ましくは、新しい分子構造が使用される条件下、例えば、生理学的条件下で結合されたままであるように十分に安定な分子構造を形成することを意味する。本発明の特定の好ましい実施形態では、連結は共有結合である。他の実施形態では、連結は非共有である。部分は、直接的または間接的に連結され得る。２つの部分が直接連結している場合、それらは互いに共有結合しているか、２つの部分間の分子間力がそれらの結合を維持するように十分に近接している。２つの部分が間接的に連結されている場合、それらはそれぞれ、第３の部分に共有結合または非共有結合のいずれかで連結されており、これにより、２つの部分間の結合が維持される。一般に、２つの部分が「リンカー」または「連結部分」または「連結部分」によって連結されていると呼ばれる場合、２つの連結部分間の連結は間接的であり、典型的には、連結部分のそれぞれは、リンカーに共有結合している。リンカーは、部分の安定性と一致する条件下で（条件に応じて適切に保護され得る）、十分な量で、合理的な期間内に連結される２つの部分と反応して合理的な収量を生じる任意の適切な部分であり得る。
ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：本明細書で使用する場合、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子発現の転写調節及び／または転写後調節において機能し得る小さなノンコーディングＲＮＡ分子を指す。この用語には、成熟ｍｉＲＮＡ配列、または一次転写産物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）及びステムループ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を含む前駆体ｍｉＲＮＡ配列が包含される。天然に存在するｍｉＲＮＡの生合成は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写により核内で開始し、一次転写産物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が生成される。一次転写産物は、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断されて、約７０ｎｔのステムループ前駆体であるｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）が生成される。次いで、プレｍｉＲＮＡは細胞質に能動的にエクスポートされ、そこでダイサーリボヌクレアーゼによって切断されて、「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」（標的配列に実質的に相補的な領域を含む）と「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」（アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含む）とを含む成熟ｍｉＲＮＡを形成する。当業者は、ガイド鎖が標的ＲＮＡの標的領域と完全に相補的であり得るか、または標的ＲＮＡの標的領域と完全には相補的でない場合があることを理解するであろう。このｍｉＲＮＡのガイド鎖は、ｍｉＲＮＡと塩基対合することにより標的ｍＲＮＡを認識するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、一般に標的ｍＲＮＡの翻訳の阻害または不安定化をもたらす。当該分野で理解されているように、天然に存在するｍｉＲＮＡの場合、標的ｍＲＮＡの認識は、ｍＲＮＡとの不完全な塩基対合により生じる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは合成または操作され、標的ｍＲＮＡの認識は、ｍＲＮＡとの完全な塩基対合により生じる。一般的には、標的ｍＲＮＡは、通常、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８に対応する、ｍｉＲＮＡの「シード」配列に相補的な配列を含んでいる。ｍｉＲＮＡならびに関連するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列に関する情報は、ｍｉＲＢａｓｅ（Ｇｒｉｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６，（Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ：Ｄ１５４－Ｄ１５８）及びＮＣＢＩヒトゲノムデータベースなどのｍｉＲＮＡデータベースで入手できる。
機能的に連結された：本明細書で使用する場合、「機能的に連結された」という用語は、記載される各構成要素がそれらの意図される形で機能することを可能とするような関係にある位置関係のことを指す。機能性エレメントに「機能的に連結された」制御エレメントは、機能性エレメントの発現及び／または活性が、制御エレメントと適合する条件下で得られるように関連付けられている。いくつかの実施形態では、「機能的に連結された」制御エレメントは、目的のコーディングエレメントと連続している（例えば共有結合している）。いくつかの実施形態では、制御エレメントは、目的の機能性エレメントにトランス作用するかまたは離れて作用する。
組換え体：本明細書で使用する場合、「組換え体」という用語は、組換え手段によって設計、工学操作、調製、発現、作出、製造、及び／または単離されたポリペプチド、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現されたポリペプチド；組換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリから単離されたポリペプチド；ポリペプチドまたはその１以上の成分（複数可）、部分（複数可）、要素（複数可）、もしくはドメイン（複数可）をコードする及び／またはその発現を指向する遺伝子（単数または複数）または遺伝子成分に関してトランスジェニックである、またはそれらを発現するように別様に操作されている動物（例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、魚など）から単離されたポリペプチド；及び／または選択された核酸配列要素のスプライシングもしくは選択された核酸配列要素同士のライゲーション、選択された配列要素の化学合成、及び／またはポリペプチドまたはその１以上の成分（複数可）、部分（複数可）、要素（複数可）、もしくはドメイン（複数可）をコードする及び／またはその発現を指向する核酸の別法による生成を含む任意の他の手段によって調製、発現、作出、または単離されたポリペプチドを意味するよう意図される。いくつかの実施形態では、かかる選択された配列要素のうちの１以上は、天然に見出される。いくつかの実施形態では、かかる選択された配列要素のうちの１以上は、インシリコで設計される。いくつかの実施形態では、かかる１以上の選択された配列要素は、例えば、例えば、目的のソース生物（例えば、ヒト、マウスなど）の生殖系列のような、天然源または合成源由来の既知の配列要素の変異誘発（例えば、インビボまたはインビボの）から生じる。
ＲＮＡ干渉：ＲＮＡ干渉：本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」という用語は、一般に、二本鎖ＲＮＡ分子または短ヘアピンＲＮＡ分子が、二本鎖または短ヘアピンＲＮＡ分子が実質的または完全な相同性を共有する核酸配列の発現を低減または阻害するプロセスを指す。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、自然界では、ＲＮＡｉ経路は、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を、２塩基の３’オーバーハング（ただし、長さ及びオーバーハングの変化も想到される）を有する、通常は２１～２３塩基対からなる、「短い干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」（「ｓｉＲＮＡ」）と呼ばれる二本鎖フラグメントに切断する、Ｄｉｃｅｒとして知られるタイプＩＩＩエンドヌクレアーゼによって開始されると考えられている。このようなｓｉＲＮＡは、標的配列と実質的に相補的な領域を含む「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」と、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」とを含む２本の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｓ）を含む。当業者は、ガイド鎖が標的ＲＮＡの標的領域と完全に相補的であり得るか、または標的ＲＮＡの標的領域と完全には相補的でない場合があることを理解するであろう。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」または「被験者」という用語は、提供される化合物または組成物が、例えば、実験、診断、予防、及び／または治療の目的で、本発明に従って投与される任意の生物を指す。典型的な対象は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒト、昆虫、蠕虫など）を含む。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害、及び／または状態を患っていてもよい。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全体またはほぼ全体の範囲または度合を示す定性的な状態を指す。生物学分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が、もし存在する場合、めったに完了しないこと、及び／またはめったに完全に進まないこと、または絶対的な結果を達成または回避することはめったにないことを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的現象及び／または化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
～に罹患している：疾患、障害、及び／または状態に「罹患している」個人は、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状があると診断されているか、及び／または疾患、障害、または状態の１つ以上の症状を示す。
標的遺伝子：本明細書で使用する場合、「標的遺伝子」とは、その発現を調節しようとする、例えば阻害しようとする遺伝子を指す。本明細書で使用する場合、「標的ＲＮＡ」という用語は、１つ以上のｍｉＲＮＡを用いて分解しようとする、または翻訳を抑制するもしくは阻害しようとするＲＮＡを指す。標的ＲＮＡは、標的配列または標的転写産物とも呼ばれ得る。ＲＮＡは、標的遺伝子から転写された一次ＲＮＡ転写産物（例えば、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）またはプロセシングされた転写産物（例えば、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）であってよい。本明細書で使用する場合、「標的部分」または「標的領域」という用語は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列の連続した部分を指す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの標的部分は、適当な阻害性ＲＮＡの存在下でその部分内のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介切断の基質として機能するのに少なくとも十分な長さである。標的部分は、約８～３６ヌクレオチドの長さであってよく、例えば約１０～２０または約１５～３０ヌクレオチドの長さであってよい。標的部分の長さは、前述の範囲内の特定の値または部分範囲を有することができる。例えば、特定の実施形態では、標的部分は、約１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～ ２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～ ２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドの長さであってよい。
治療薬剤：本明細書で使用される場合、「治療薬剤」という語句は、対象に投与された際に、治療効果を有し、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、治療薬剤は、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状または特徴を緩和する、改善する、軽減する、阻害する、予防する、発生を遅延させる、重症度を低減させる、及び／または発生率を低減させるために使用され得る任意の物質である。
治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、治療レジメンの一部として投与されたときに所望の生物学的応答を誘発する物質（例えば、治療薬剤、組成物、及び／または製剤）の量を意味する。いくつかの実施形態では、物質の治療有効量は、疾患、障害、及び／または状態に罹患しているまたは罹患しやすい対象に投与された場合に、疾患、障害、及び／または状態を治療する、診断する、予防する、及び／またはその発症を遅延するのに十分な量である。当業者によって理解されるように、物質の有効量は、所望の生物学的評価項目、送達される物質、標的の細胞または組織などのような因子に応じて変動し得る。例えば、疾患、障害、及び／または状態を治療するための製剤中の化合物の有効量は、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状または徴候を、緩和する、改善する、軽減する、阻害する、予防する、その発症を遅延する、その重症度を低減させる、及び／またはその発生率を低減させる量である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、単回用量で投与される；いくつかの実施形態では、治療有効量を送達するために、複数の単位用量が必要とされる。
治療すること：本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、治療を提供すること、すなわち、対象の任意のタイプの医学的管理または外科的管理を提供することを指す。治療は、疾患、障害、もしくは状態の進行を逆転、緩和、阻害、予防または低減するために、または疾患、障害、もしくは状態の１つ以上の症状または徴候を逆転、緩和、その進行を予防、その可能性を低減するために、提供され得る。「予防する」とは、少なくとも一部の個人において、少なくとも一定期間、そのような疾患、障害、状態、または症状もしくは徴候が起こらないようにすることを指す。治療することは、補体媒介性状態を示す１つ以上の症状または徴候の発症後に、例えば、状態を逆転、緩和、重症度を軽減、及び／またはその進行を阻害もしくは予防するために、及び／または状態の１つ以上の症状もしくは徴候を逆転、緩和、重症度を軽減、及び／または阻害するために、対象に薬剤を投与することを含むことができる。本開示の組成物は、補体媒介性疾患を発症している、または一般集団のメンバーと比較してそのような疾患を発症するリスクが高い対象に投与することができる。本開示の組成物は、予防的に、すなわち、症状の発症または状態の徴候の前に投与することができる。この場合、典型的には、対象は症状を発症するリスクがある。
核酸：「核酸」という用語には、任意のヌクレオチド、その類似体、及びそれらのポリマーが含まれる。本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は分子の一次構造を指すため、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。これらの用語には、同等物として、ヌクレオチド類似体及び、例えばメチル化、保護及び／またはキャップされたヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（ただし、これらに限定されない）などの修飾ポリヌクレオチドから作られたＲＮＡまたはＤＮＡの類似体が含まれる。この用語には、ポリまたはオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）及びポリまたはオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）；核酸塩基及び／または修飾核酸塩基のＮ－グリコシドまたはＣ－グリコシドから誘導されるＲＮＡまたはＤＮＡ；糖及び／または修飾糖から誘導される核酸；ならびにリン酸架橋及び／または修飾リン原子架橋（本明細書では「ヌクレオチド間結合」とも呼ばれる）から誘導される核酸が含まれる。この用語には、核酸塩基、修飾核酸塩基、糖、修飾糖、リン酸架橋または修飾リン原子架橋の任意の組み合わせを含む核酸が含まれる。例としては、これらに限定されるものではないが、リボース部分を含む核酸、デオキシリボース部分を含む核酸、リボース部分とデオキシリボース部分の両方を含む核酸、リボース部分と修飾リボース部分を含む核酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、接頭辞「ポリ」は、２～約１０，０００個、２～約５０，０００個、または２～約１００，０００個のヌクレオチドモノマー単位を含む核酸を指す。いくつかの実施形態では、接頭辞「オリゴ」は、２～約２００個のヌクレオチドモノマー単位を含む核酸を指す。
ベクター：本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、その核酸分子に連結された別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つの種類のベクターとして、さらなるＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループのことを指す「プラスミド」がある。別の種類のベクターとして、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができるウイルスベクターがある。特定のベクターは、ベクターが導入された宿主細胞内で自律的に複製することが可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性の哺乳動物ベクターなど）。他のベクター（例えば非エピソーム性の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターはベクターが機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換の標準的な技術が使用される（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に行われるようにして、または本明細書に記載されるようにして行うことができる。上記の技術及び手順は一般に、当該技術分野では周知の従来の方法に従って、かつ本明細書全体を通して引用され、考察される、一般的かつより具体的な様々な参考文献に記載されるようにして行うことができる。例えば、あらゆる目的で本明細書に参照により援用する、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な修飾パターン１～５を開示するチャートを示す。「２ＯＭ」は２’－Ｏ－メチル修飾を表し、「２Ｆ」は、２’－フルオロ修飾を表し、「ＰＳ」は、隣接する３’ヌクレオチドとのホスホロチオエート結合を表す。 ペグセタコプラン（「ＡＰＬ－２」）の構造を示し、ｎは約８００～約１１００、ＰＥＧは約４０ｋＤと仮定している。 非ヒト霊長類におけるインビボ試験の結果を表す。３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇの用量のｓｉＲＮＡ５８、または溶媒を、皮下注射によって投与した。グラフは、各群について投与後６７日までの血清Ｃ３タンパク質レベルの時間的経過を示す。血清中のＣ３タンパク質のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。－１日目の値をベースラインとして使用した。 非ヒト霊長類におけるインビボ試験のデータを示す。３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇの用量のｓｉＲＮＡ５８、または溶媒を、皮下注射によって投与した。グラフは、注射後１５日目に非ヒト霊長類から採取した肝生検におけるＣ３ ｍＲＮＡ発現を示す。試料中のＣ３ ｍＲＮＡのレベルを、定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定した。これらの実験では、Ｃ３ ｍＲＮＡレベルをＡｃｔＢ ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。 非ヒト霊長類におけるインビボ試験のデータを示す。３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇの用量のｓｉＲＮＡ５８、または溶媒を、皮下注射によって投与した。グラフは、注射後４６日目に非ヒト霊長類から採取した肝生検におけるＣ３ ｍＲＮＡ発現を示す。試料中のＣ３ ｍＲＮＡのレベルを、定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定した。これらの実験では、Ｃ３ ｍＲＮＡレベルをＡｃｔＢ ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。 ２９日目までに採取された、異なる用量のｓｉＲＮＡ５８（３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または溶媒）を注射した非ヒト霊長類からの血清中の代替経路（ＡＨ５０）活性のレベルの時間的経過を示す。ＥＬＩＳＡアッセイを用いて代替経路の活性（ＡＨ５０）を決定した。－１日目の値をベースラインとして使用した。 単回ボーラス（Ａ）または１日３回のボーラス（Ｂ）としてのｓｉＲＮＡ５９の皮下投与後のベースラインからの血漿Ｃ３濃度の変化率（％）を示す。ゼロとして示される値は、アッセイのＬＬＯＱを下回っていた。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 溶媒（Ａ）、ｓｉＲＮＡ（－）コントロール（Ｂ）、３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ５９（Ｃ）、１０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ５９（Ｄ）、及び（Ｅ）３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ５９ で皮下処理した動物の血清中の、ＥＬＩＳＡを用いた可溶性Ｃ５ｂ－９複合体の検出及び定量による代替経路活性の測定を示す（光学密度の測定値＝ＯＤ）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 ｓｉＲＮＡ５９の１回投与（Ａ及びＢ）または３回の１日投与（Ｃ）の３日後（Ａ）及び３０日後（Ｂ及びＣ）における肝組織中のＣ３ ｍＲＮＡのレベルを示す。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。 ｓｉＲＮＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒の投与後の様々な時点における非ヒト霊長類からの血清中のＣ３レベルを示す。パネルＡは、平均血清Ｃ３濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。パネルＢは、平均血清Ｃ３低下を、ｓｉＲＮＡまたは溶媒が投与される前のレベル（すなわち、ベースラインレベル）からの減少率（％）として示す。 ｓｉＲＮＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒の投与後の様々な時点における非ヒト霊長類からの血漿中のＣ３ａレベルを示す。パネルＡは、平均血漿Ｃ３ａ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。パネルＢは、平均血漿Ｃ３ａ低下を、ｓｉＲＮＡまたは溶媒が投与される前のレベル（すなわち、ベースラインレベル）からの減少率（％）として示す。 ｓｉＲＮＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒の投与の４４日後の非ヒト霊長類の硝子体液（ＶＨ）中のＣ３（パネルＡ）及びＣ３ａ（パネルＢ）レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。 ｓｉＲＮＡ（１００ｍｇ／ｋｇ）または溶媒の投与の４４日後の非ヒト霊長類の房水（ＡＨ）中のＣ３（パネルＡ）及びＣ３ａ（パネルＢ）レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
本開示は、眼疾患（例えば、補体媒介性眼疾患）は、眼への補体阻害剤の局所投与を行うことなく、肝臓の補体の標的化された減少によって治療可能であるという知見に一部基づいたものである。いくつかの実施形態では、補体媒介眼障害は、１つ以上の補体阻害剤（例えば、本明細書に記載される補体阻害剤、例えば、肝臓に標的化された補体阻害剤）の全身投与により、補体阻害剤、例えば、本明細書に記載される補体阻害剤を眼に局所投与することなく治療することができる。
Ｉ．補体系
本開示の理解を容易にするために、本発明をいかなる意味でも限定しようとするものではないが、このセクションでは補体及びその活性化経路の概要を与える。さらなる詳細については、例えば、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，２００６；Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；６ｔｈ ｅｄ．，２００８；及びＷａｌｐｏｒｔ ＭＪ．，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．Ｆｉｒｓｔ ｏｆ ｔｗｏ ｐａｒｔｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．，３４４（１４）：１０５８－６６，２００１に見られる。
補体は、感染性病原体から体を守るのに重要な役割を果たす自然免疫系の武器である。補体系は、古典的経路、別経路、及びレクチン経路として知られる３つの主要な経路に関与する３０を超える血清及び細胞タンパク質で構成されている。古典的経路は通常、抗原とＩｇＭまたはＩｇＧ抗体の複合体がＣ１に結合することによって引き起こされる（ただし、特定の他の活性化因子も経路を開始することができる）。活性化されたＣ１はＣ４とＣ２を切断して、Ｃ２ａとＣ２ｂに加えて、Ｃ４ａとＣ４ｂを生成する。Ｃ４ｂとＣ２ａが結合してＣ３コンバターゼを形成し、Ｃ３コンバターゼがＣ３を切断してＣ３ａとＣ３ｂを形成する。Ｃ３ｂがＣ３コンバターゼに結合すると、Ｃ５コンバターゼが生成され、Ｃ５がＣ５ａとＣ５ｂに切断される。Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、及びＣ５ａはアナフィラトキシンであり、急性炎症反応における複数の反応を媒介する。Ｃ３ａとＣ５ａは、好中球などの免疫系細胞を誘引する走化性因子でもある。初期に用いられていた「Ｃ２ａ」及び「Ｃ２ｂ」の名称は科学文献では後に逆になっている点は理解されよう。
別経路は、例えば微生物表面及び様々な複合多糖類によって開始され、増幅される。この経路では、低レベルで自然に発生するＣ３からＣ３（Ｈ２Ｏ）への加水分解により、Ｂ因子の結合がもたらされ、これはＤ因子によって切断され、Ｃ３をＣ３ａとＣ３ｂに切断することによって補体を活性化する液相Ｃ３コンバターゼが生成される。Ｃ３ｂは細胞表面などの標的に結合し、因子Ｂと複合体を形成する。これは、後に因子Ｄによって切断され、Ｃ３コンバターゼになる。表面に結合したＣ３コンバターゼは、さらなるＣ３分子を切断して活性化し、活性化部位にごく近接した急速なＣ３ｂ沈着をもたらし、さらなるＣ３コンバターゼを形成し、これにより、さらなるＣ３ｂが生成される。このプロセスにより、Ｃ３切断とＣ３コンバターゼ形成のサイクルが生じ、応答が大幅に増幅される。Ｃ３の切断及びＣ３ｂの別の分子のＣ３コンバターゼへの結合は、Ｃ５コンバターゼを生じさせる。この経路のＣ３コンバターゼ及びＣ５コンバターゼは、細胞分子ＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＤ５９、及びｆＨによって制御されている。これらのタンパク質の作用機序には、崩壊促進活性（すなわち、コンバターゼを解離する能力）、第Ｉ因子によるＣ３ｂまたはＣ４ｂの分解における補因子として機能する能力、あるいはその両方が含まれる。通常、細胞表面に補体調節タンパク質が存在すると、その上で有意な補体活性化が起こるのを防ぐ。
両方の経路で生成されたＣ５コンバターゼは、Ｃ５を切断してＣ５ａとＣ５ｂを生成する。次に、Ｃ５ｂはＣ６、Ｃ７、及びＣ８に結合してＣ５ｂ－８を形成し、Ｃ９の重合を触媒してＣ５ｂ－９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成する。ＭＡＣはそれ自体を標的細胞膜に挿入し、細胞溶解を引き起こす。細胞膜上の少量のＭＡＣは、細胞死以外の様々な結果をもたらし得る。
レクチン補体経路は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）及びＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）の炭水化物への結合によって開始される。ＭＢ１－１遺伝子（ヒトではＬＭＡＮ－１として知られる）は、小胞体とゴルジ体の間の中間領域に局在するＩ型膜内在性タンパク質をコードしている。ＭＢＬ－２遺伝子は、血清中に見られる可溶性マンノース結合タンパク質をコードしている。ヒトのレクチン経路では、ＭＡＳＰ－１とＭＡＳＰ－２がＣ４とＣ２のタンパク質分解に関与し、上記のＣ３コンバターゼをもたらす。
補体活性は、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）または補体活性化（ＲＣＡ）タンパク質の調節因子と呼ばれる様々な哺乳動物タンパク質によって調節される（米国特許第６，８９７，２９０号）。これらのタンパク質は、リガンドの特異性と補体阻害のメカニズム（複数可）に関して異なる。それらは、コンバターゼの通常の崩壊を加速し、及び／または第Ｉ因子の補因子として機能し、Ｃ３ｂ及び／またはＣ４ｂをより小さな断片に酵素的に切断し得る。ＣＣＰは、ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュール、またはＳＵＳＨＩドメインとして知られる、４つのジスルフィド結合システイン（２つのジスルフィド結合）、プロリン、トリプトファン、及び多くの疎水性残基を含む保存されたモチーフを含む長さ約５０～７０アミノ酸の複数の（通常４～５６）相同モチーフの存在を特徴としている。ＣＣＰファミリーには、補体受容体１型（ＣＲ１；Ｃ３ｂ：Ｃ４ｂ受容体）、補体受容体２型（ＣＲ２）、膜補体タンパク質（ＭＣＰ；ＣＤ４６）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、補体因子Ｈ（ｆＨ）、及びＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）が含まれる。ＣＤ５９は、ＣＣＰとは構造的に無関係な膜結合型補体調節タンパク質である。補体調節タンパク質は通常、哺乳動物の細胞または組織、例えばヒト宿主で発生する可能性のある補体活性化を制限する働きをする。したがって、「自己」細胞は通常、補体の活性化がこれらの細胞で進行することで生じる有害な影響から保護される。補体調節タンパク質（複数可）の欠損または欠陥は、例えば本明細書に記載されるような様々な補体媒介性疾患の病因に関与している。
補体成分（Ｃ３タンパク質またはＣ３ ｍＲＮＡを含む）は、眼組織（網膜、ＲＰＥ及び脈絡膜を含む）ならびに各種細胞型（ミクログリア、星状細胞、骨髄細胞及び血管細胞を含む）で発現されることが報告されている（例えば、Ｊｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｐｒｅｔｅｙｅｒｅｓ．２０２１．１００９５２ （２０２１））。網膜内のミクログリア／単球によるＣ３ ｍＲＮＡの発現は、ラットの老化網膜における補体の活性化に寄与することが報告されている（例えば、Ｒｕｔａｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（４）：ｅ９３３４３ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９３３４３ （２０１４）を参照）。さらに、局所的な補体調節の異常が、新生血管年齢に関連する黄斑変性で報告されている（例えば、Ｓｃｈｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｙｅ ３１：８１０－８１３（２０１７）を参照）。網膜変性のマウスモデルを用いて、Ｃ３ ｓｉＲＮＡの硝子体内注射が、補体の活性化及び沈着を阻害し、細胞死を減少させるのに対して、血清中の補体の全身的な減少は効果を示さないことが報告されている（例えばＮａｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ａｍ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．５８：２９７７－２９９０ （２０１７）を参照）。
ＩＩ．Ｃ３に対する阻害性ＲＮＡ
本開示は、標的遺伝子（例えば、Ｃ３）によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合してその発現を阻害する阻害性ＲＮＡである、またはそれを含む、またはそれをコードする１つ以上のヌクレオチド配列に関連する組成物及び方法を含む。阻害性ＲＮＡは、一本鎖（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）または二本鎖の核酸であり得る。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの二本鎖ＲＮＡ二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターである。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ヒトＣ３以外に、１つ以上の非ヒト種のＣ３、例えば非ヒト霊長類のＣ３、例えばカニクイザルのＣ３、または例えばグリーンモンキーのＣ３の発現を阻害することができる。カニクイザルＣ３遺伝子はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１０２１３１４５８として指定されており、カニクイザルＣ３の予測されるアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は、それぞれＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＸＰ＿００５５８７７７６．１及びＸＭ＿００５５８７７１９．２として表記されている。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ヒトとカニクイザルＣ３の転写産物で同一である標的部分に相補的なアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、カニクイザルＣ３の転写産物中の配列と１、２または３個のヌクレオチドが異なるヒトＣ３転写産物の標的部分に相補的なアンチセンス鎖を含む。ヒトＣ３の発現を阻害する阻害性ＲＮＡは、特にＣ３転写産物の保存領域が標的とされる場合には、非霊長類Ｃ３、例えばラットまたはマウスＣ３の発現も阻害できる点は理解されよう。
ヒトＣ３のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は当該技術分野では周知のものであり、一般に利用可能なデータベース、例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（国立バイオテクノロジー情報センター）参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベースで見つけることができ、それぞれ、参照配列アクセッション番号ＮＰ＿００００５５（アクセッションバージョン番号ＮＰ＿００００５５．２）及びＮＭ＿００００６４（アクセッションバージョン番号ＮＭ＿００００６４．４）に記載されている（この関連での「アミノ酸配列」とは、Ｃ３ポリペプチドの配列を指し、「ヌクレオチド配列」とは、ゲノムＤＮＡ内で表されるＣ３のｍＲＮＡ配列を指すが、実際のｍＲＮＡのヌクレオチド配列はＴではなくＵを含むものとして理解される）。当業者には、前述の配列が補体Ｃ３プレプロタンパク質のものであり、切断されるために成熟タンパク質中には存在しないシグナル配列を含んでいる点は認識されよう。ヒトＣ３遺伝子はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７１８として指定されており、ゲノムＣ３配列は参照配列アクセッション番号ＮＧ＿００９５５７（アクセッションバージョン番号ＮＧ＿００９５５７．１）を有している。ヒトＣ３ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を以下に示す（ＴがＵに置き換えられた参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００００６４．３；ＡＵＧ開始コドンに９４位から始まる下線を付している）。
ＡＧＡＵＡＡＡＡＡＧＣＣＡＧＣＵＣＣＡＧＣＡＧＧＣＧＣＵＧＣＵＣＡＣＵＣＣＵＣＣＣＣＡＵＣＣＵＣＵＣＣＣＵＣＵＧＵＣＣＣＵＣＵＧＵＣＣＣＵＣＵＧＡＣＣＣＵＧＣＡＣＵＧＵＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＵＧＧＧＡＣＣＣＡＣＣＵＣＡＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＵＧＣＵＧＣＵＣＣＵＧＣＵＡＣＵＡＡＣＣＣＡＣＣＵＣＣＣＣＣＵＧＧＣＵＣＵＧＧＧＧＡＧＵＣＣＣＡＵＧＵＡＣＵＣＵＡＵＣＡＵＣＡＣＣＣＣＣＡＡＣＡＵＣＵＵＧＣＧＧＣＵＧＧＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＧＡＣＣＡＵＧＧＵＧＣＵＧＧＡＧＧＣＣＣＡＣＧＡＣＧＣＧＣＡＡＧＧＧＧＡＵＧＵＵＣＣＡＧＵＣＡＣＵＧＵＵＡＣＵＧＵＣＣＡＣＧＡＣＵＵＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＡＡＡＣＵＡＧＵＧＣＵＧＵＣＣＡＧＵＧＡＧＡＡＧＡＣＵＧＵＧＣＵＧＡＣＣＣＣＵＧＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＡＵＧＧＧＣＡＡＣＧＵＣＡＣＣＵＵＣＡＣＧＡＵＣＣＣＡＧＣＣＡＡＣＡＧＧＧＡＧＵＵＣＡＡＧＵＣＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧＣＧＣＡＡＣＡＡＧＵＵＣＧＵＧＡＣＣＧＵＧＣＡＧＧＣＣＡＣＣＵＵＣＧＧＧＡＣＣＣＡＡＧＵＧＧＵＧＧＡＧＡＡＧＧＵＧＧＵＧＣＵＧＧＵＣＡＧＣＣＵＧＣＡＧＡＧＣＧＧＧＵＡＣＣＵＣＵＵＣＡＵＣＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＡＧＡＣＣＡＵＣＵＡＣＡＣＣＣＣＵＧＧＣＵＣＣＡＣＡＧＵＵＣＵＣＵＡＵＣＧＧＡＵＣＵＵＣＡＣＣＧＵＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＵＧＣＵＡＣＣＣＧＵＧＧＧＣＣＧＧＡＣＧＧＵＣＡＵＧＧＵＣＡＡＣＡＵＵＧＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＧＣＡＵＣＣＣＧＧＵＣＡＡＧＣＡＧＧＡＣＵＣＣＵＵＧＵＣＵＵＣＵＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＵＵＧＧＣＧＵＣＵＵＧＣＣＣＵＵＧＵＣＵＵＧＧＧＡＣＡＵＵＣＣＧＧＡＡＣＵＣＧＵＣＡＡＣＡＵＧＧＧＣＣＡＧＵＧＧＡＡＧＡＵＣＣＧＡＧＣＣＵＡＣＵＡＵＧＡＡＡＡＣＵＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＵＣＵＵＣＵＣＣＡＣＵＧＡＧＵＵＵＧＡＧＧＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＣＧＵＧＣＵＧＣＣＣＡＧＵＵＵＣＧＡＧＧＵＣＡＵＡＧＵＧＧＡＧＣＣＵＡＣＡＧＡＧＡＡＡＵＵＣＵＡＣＵＡＣＡＵＣＵＡＵＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＧＣＣＵＧＧＡＧＧＵＣＡＣＣＡＵＣＡＣＣＧＣＣＡＧＧＵＵＣＣＵＣＵＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＵＧＧＡＧＧＧＡＡＣＵＧＣＣＵＵＵＧＵＣＡＵＣＵＵＣＧＧＧＡＵＣＣＡＧＧＡＵＧＧＣＧＡＡＣＡＧＡＧＧＡＵＵＵＣＣＣＵＧＣＣＵＧＡＡＵＣＣＣＵＣＡＡＧＣＧＣＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＡＧＧＡＵＧＧＣＵＣＧＧＧＧＧＡＧＧＵＵＧＵＧＣＵＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＵＡＣＵＧＣＵＧＧＡＣＧＧＧＧＵＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＵＧＧＵＧＧＧＧＡＡＧＵＣＵＵＵＧＵＡＣＧＵＧＵＣＵＧＣＣＡＣＣＧＵＣＡＵＣＵＵＧＣＡＣＵＣＡＧＧＣＡＧＵＧＡＣＡＵＧＧＵＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＣＧＧＧＡＵＣＣＣＣＡＵＣＧＵＧＡＣＣＵＣＵＣＣＣＵＡＣＣＡＧＡＵＣＣＡＣＵＵＣＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＣＣＡＡＧＵＡＣＵＵＣＡＡＡＣＣＡＧＧＡＡＵＧＣＣＣＵＵＵＧＡＣＣＵＣＡＵＧＧＵＧＵＵＣＧＵＧＡＣＧＡＡＣＣＣＵＧＡＵＧＧＣＵＣＵＣＣＡＧＣＣＵＡＣＣＧＡＧＵＣＣＣＣＧＵＧＧＣＡＧＵＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＵＧＵＧＣＡＧＵＣＵＣＵＡＡＣＣＣＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＣＧＵＧＧＣＣＡＡＡＣＵＣＡＧＣＡＵＣＡＡＣＡＣＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＣＵＵＧＡＧＣＡＵＣＡＣＧＧＵＧＣＧＣＡＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＵＣＵＣＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＧＣＵＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＵＧＣＡＧＧＣＵＣＵＧＣＣＣＵＡＣＡＧＣＡＣＣＧＵＧＧＧＣＡＡＣＵＣＣＡＡＣＡＡＵＵＡＣＣＵＧＣＡＵＣＵＣＵＣＡＧＵＧＣＵＡＣＧＵＡＣＡＧＡＧＣＵＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＧＡＧＡＣＣＣＵＣＡＡＣＧＵＣＡＡＣＵＵＣＣＵＣＣＵＧＣＧＡＡＵＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＵＣＣＧＣＵＡＣＵＡＣＡＣＣＵＡＣＣＵＧＡＵＣＡＵＧＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＣＵＧＵＵＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＣＧＣＣＡＧＧＵＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＣＣＵＧＧＵＧＧＵＧＣＵＧＣＣＣＣＵＧＵＣＣＡＵＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣＵＵＣＡＵＣＣＣＵＵＣＣＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＵＧＧＣＧＵＡＣＵＡＣＡＣＧＣＵＧＡＵＣＧＧＵＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＧＵＧＧＵＧＧＣＣＧＡＣＵＣＣＧＵＧＵＧＧＧＵＧＧＡＣＧＵＣＡＡＧＧＡＣＵＣＣＵＧＣＧＵＧＧＧＣＵＣＧＣＵＧＧＵＧＧＵＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＧＵＣＡＧＡＡＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＣＵＧＵＡＣＣＵＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＵＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＡＵＡＧＡＧＧＧＵＧＡＣＣＡＣＧＧＧＧＣＣＣＧＧＧＵＧＧＵＡＣＵＧＧＵＧＧＣＣＧＵＧＧＡＣＡＡＧＧＧＣＧＵＧＵＵＣＧＵＧＣＵＧＡＡＵＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＣＵＧＡＣＧＣＡＧＡＧＵＡＡＧＡＵＣＵＧＧＧＡＣＧＵＧＧＵＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡＧＡＣＡＵＣＧＧＣＵＧＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＵＧＧＧＡＡＧＧＡＵＵＡＣＧＣＣＧＧＵＧＵＣＵＵＣＵＣＣＧＡＣＧＣＡＧＧＧＣＵＧＡＣＣＵＵＣＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＵＧＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＵＵＣＡＧＵＧＣＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＡＣＧＣＣＧＵＵＣＣＧＵＧＣＡＧＣＵＣＡＣＧＧＡＧＡＡＧＣＧＡＡＵＧＧＡＣＡＡＡＧＵＣＧＧＣＡＡＧＵＡＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＵＧＣＧＣＡＡＧＵＧＣＵＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＵＧＣＧＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＵＧＡＧＧＵＵＣＵＣＧＵＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＧＡＣＣＣＧＵＵＵＣＡＵＣＵＣＣＣＵＧＧＧＣＧＡＧＧＣＧＵＧＣＡＡＧＡＡＧＧＵＣＵＵＣＣＵＧＧＡＣＵＧＣＵＧＣＡＡＣＵＡＣＡＵＣＡＣＡＧＡＧＣＵＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＧＣＧＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＵＧＧＧＣＣＵＧＧＣＣＡＧＧＡＧＵＡＡＣＣＵＧＧＡＵＧＡＧＧＡＣＡＵＣＡＵＵＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＵＣＧＵＵＵＣＣＣＧＡＡＧＵＧＡＧＵＵＣＣＣＡＧＡＧＡＧＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＡＡＣＧＵＵＧＡＧＧＡＣＵＵＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＵＧＧＡＡＵＣＵＣＵＡＣＧＡＡＧＣＵＣＡＵＧＡＡＵＡＵＡＵＵＵＵＵＧＡＡＡＧＡＣＵＣＣＡＵＣＡＣＣＡＣＧＵＧＧＧＡＧＡＵＵＣＵＧＧＣＵＧＵＧＡＧＣＡＵＧＵＣＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＵＣＵＧＵＧＵＧＧＣＡＧＡＣＣＣＣＵＵＣＧＡＧＧＵＣＡＣＡＧＵＡＡＵＧＣＡＧＧＡＣＵＵＣＵＵＣＡＵＣＧＡＣＣＵＧＣＧＧＣＵＡＣＣＣＵＡＣＵＣＵＧＵＵＧＵＵＣＧＡＡＡＣＧＡＧＣＡＧＧＵＧＧＡＡＡＵＣＣＧＡＧＣＣＧＵＵＣＵＣＵＡＣＡＡＵＵＡＣＣＧＧＣＡＧＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＵＣＡＡＧＧＵＧＡＧＧＧＵＧＧＡＡＣＵＡＣＵＣＣＡＣＡＡＵＣＣＡＧＣＣＵＵＣＵＧＣＡＧＣＣＵＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＧＵＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＧＵＡＡＣＣＡＵＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＵＣＣＵＣＧＵＵＧＵＣＣＧＵＵＣＣＡＵＡＵＧＵＣＡＵＣＧＵＧＣＣＧＣＵＡＡＡＧＡＣＣＧＧＣＣＵＧＣＡＧＧＡＡＧＵＧＧＡＡＧＵＣＡＡＧＧＣＵＧＣＵＧＵＣＵＡＣＣＡＵＣＡＵＵＵＣＡＵＣＡＧＵＧＡＣＧＧＵＧＵＣＡＧＧＡＡＧＵＣＣＣＵＧＡＡＧＧＵＣＧＵＧＣＣＧＧＡＡＧＧＡＡＵＣＡＧＡＡＵＧＡＡＣＡＡＡＡＣＵＧＵＧＧＣＵＧＵＵＣＧＣＡＣＣＣＵＧＧＡＵＣＣＡＧＡＡＣＧＣＣＵＧＧＧＣＣＧＵＧＡＡＧＧＡＧＵＧＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＡＵＣＣＣＡＣＣＵＧＣＡＧＡＣＣＵＣＡＧＵＧＡＣＣＡＡＧＵＣＣＣＧＧＡＣＡＣＣＧＡＧＵＣＵＧＡＧＡＣＣＡＧＡＡＵＵＣＵＣＣＵＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＧＵＧＧＣＣＣＡＧＡＵＧＡＣＡＧＡＧＧＡＵＧＣＣＧＵＣＧＡＣＧＣＧＧＡＡＣＧＧＣＵＧＡＡＧＣＡＣＣＵＣＡＵＵＧＵＧＡＣＣＣＣＣＵＣＧＧＧＣＵＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＣＡＵＧＡＵＣＧＧＣＡＵＧＡＣＧＣＣＣＡＣＧＧＵＣＡＵＣＧＣＵＧＵＧＣＡＵＵＡＣＣＵＧＧＡＵＧＡＡＡＣＧＧＡＧＣＡＧＵＧＧＧＡＧＡＡＧＵＵＣＧＧＣＣＵＡＧＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＧＧＣＣＵＵＧＧＡＧＣＵＣＡＵＣＡＡＧＡＡＧＧＧＧＵＡＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＣＵＧＧＣＣＵＵＣＡＧＡＣＡＡＣＣＣＡＧＣＵＣＵＧＣＣＵＵＵＧＣＧＧＣＣＵＵＣＧＵＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＣＵＧＧＣＵＧＡＣＣＧＣＣＵＡＣＧＵＧＧＵＣＡＡＧＧＵＣＵＵＣＵＣＵＣＵＧＧＣＵＧＵＣＡＡＣＣＵＣＡＵＣＧＣＣＡＵＣＧＡＣＵＣＣＣＡＡＧＵＣＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＣＵＧＵＵＡＡＡＵＧＧＣＵＧＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＧＵＣＵＵＣＣＡＧＧＡＧＧＡＵＧＣＧＣＣＣＧＵＧＡＵＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＵＧＡＵＵＧＧＵＧＧＡＵＵＡＣＧＧＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＡＧＡＣＡＵＧＧＣＣＣＵＣＡＣＧＧＣＣＵＵＵＧＵＵＣＵＣＡＵＣＵＣＧＣＵＧＣＡＧＧＡＧＧＣＵＡＡＡＧＡＵＡＵＵＵＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＵＣＡＡＣＡＧＣＣＵＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＵＣＡＣＵＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＵＵＣＣＵＵＧＡＡＧＣＣＡＡＣＵＡＣＡＵＧＡＡＣＣＵＡＣＡＧＡＧＡＵＣＣＵＡＣＡＣＵＧＵＧＧＣＣＡＵＵＧＣＵＧＧＣＵＡＵＧＣＵＣＵＧＧＣＣＣＡＧＡＵＧＧＧＣＡＧＧＣＵＧＡＡＧＧＧＧＣＣＵＣＵＵＣＵＵＡＡＣＡＡＡＵＵＵＣＵＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡＵＡＡＧＡＡＣＣＧＣＵＧＧＧＡＧＧＡＣＣＣＵＧＧＵＡＡＧＣＡＧＣＵＣＵＡＣＡＡＣＧＵＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＵＣＣＵＡＵＧＣＣＣＵＣＵＵＧＧＣＣＣＵＡＣＵＧＣＡＧＣＵＡＡＡＡＧＡＣＵＵＵＧＡＣＵＵＵＧＵＧＣＣＵＣＣＣＧＵＣＧＵＧＣＧＵＵＧＧＣＵＣＡＡＵＧＡＡＣＡＧＡＧＡＵＡＣＵＡＣＧＧＵＧＧＵＧＧＣＵＡＵＧＧＣＵＣＵＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＵＵＣＡＵＧＧＵＧＵＵＣＣＡＡＧＣＣＵＵＧＧＣＵＣＡＡＵＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＣＧＣＣＣＣＵＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＵＧＡＡＣＣＵＵＧＡＵＧＵＧＵＣＣＣＵＣＣＡＡＣＵＧＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＵＣＣＡＡＧＡＵＣＡＣＣＣＡＣＣＧＵＡＵＣＣＡＣＵＧＧＧＡＡＵＣＵＧＣＣＡＧＣＣＵＣＣＵＧＣＧＡＵＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＵＧＡＧＧＧＵＵＵＣＡＣＡＧＵＣＡＣＡＧＣＵＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＵＵＧＵＣＧＧＵＧＧＵＧＡＣＡＡＵＧＵＡＣＣＡＵＧＣＵＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＡＵＣＡＡＣＵＣＡＣＣＵＧＵＡＡＵＡＡＡＵＵＣＧＡＣＣＵＣＡＡＧＧＵＣＡＣＣＡＵＡＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＧＧＣＣＵＣＡＧＧＡＵＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＵＡＵＧＡＵＣＣＵＵＧＡＧＡＵＣＵＧＵＡＣＣＡＧＧＵＡＣＣＧＧＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧＡＵＧＣＣＡＣＵＡＵＧＵＣＵＡＵＡＵＵＧＧＡＣＡＵＡＵＣＣＡＵＧＡＵＧＡＣＵＧＧＣＵＵＵＧＣＵＣＣＡＧＡＣＡＣＡＧＡＵＧＡＣＣＵＧＡＡＧＣＡＧＣＵＧＧＣＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＧＡＣＡＧＡＵＡＣＡＵＣＵＣＣＡＡＧＵＡＵＧＡＧＣＵＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣＵＵＣＵＣＣＧＡＵＡＧＧＡＡＣＡＣＣＣＵＣＡＵＣＡＵＣＵＡＣＣＵＧＧＡＣＡＡＧＧＵＣＵＣＡＣＡＣＵＣＵＧＡＧＧＡＵＧＡＣＵＧＵＣＵＡＧＣＵＵＵＣＡＡＡＧＵＵＣＡＣＣＡＡＵＡＣＵＵＵＡＡＵＧＵＡＧＡＧＣＵＵＡＵＣＣＡＧＣＣＵＧＧＡＧＣＡＧＵＣＡＡＧＧＵＣＵＡＣＧＣＣＵＡＵＵＡＣＡＡＣＣＵＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＵＧＵＡＣＣＣＧＧＵＵＣＵＡＣＣＡＵＣＣＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＵＧＧＡＡＡＧＣＵＧＡＡＣＡＡＧＣＵＣＵＧＣＣＧＵＧＡＵＧＡＡＣＵＧＵＧＣＣＧＣＵＧＵＧＣＵＧＡＧＧＡＧＡＡＵＵＧＣＵＵＣＡＵＡＣＡＡＡＡＧＵＣＧＧＡＵＧＡＣＡＡＧＧＵＣＡＣＣＣＵＧＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＵＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＵＧＵＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＵＧＧＡＣＵＡＵＧＵＧＵＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＡＣＵＧＧＵＣＡＡＧＧＵＵＣＡＧＣＵＧＵＣＣＡＡＵＧＡＣＵＵＵＧＡＣＧＡＧＵＡＣＡＵＣＡＵＧＧＣＣＡＵＵＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＵＣＡＡＧＵＣＡＧＧＣＵＣＧＧＡＵＧＡＧＧＵＧＣＡＧＧＵＵＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＧＵＵＣＡＵＣＡＧＣＣＣＣＡＵＣＡＡＧＵＧＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＵＧＡＡＧＣＵＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＣＵＣＡＵＧＵＧＧＧＧＵＣＵＣＵＣＣＵＣＣＧＡＵＵＵＣＵＧＧＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＣＵＣＡＧＣＵＡＣＡＵＣＡＵＣＧＧＧＡＡＧＧＡＣＡＣＵＵＧＧＧＵＧＧＡＧＣＡＣＵＧＧＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＵＧＣＣＡＡＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＡＣＡＡＵＧＣＣＡＧＧＡＣＣＵＣＧＧＣＧＣＣＵＵＣＡＣＣＧＡＧＡＧＣＡＵＧＧＵＵＧＵＣＵＵＵＧＧＧＵＧＣＣＣＣＡＡＣＵＧＡＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＵＵＣＣＣＣＣＡＣＵＣＣＡＧＡＵＡＡＡＧＣＵＵＣＡ
ＧＵＵＡＵＡＵＣＵＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７５）
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、Ｃ３転写産物、例えば、Ｃ３ ｍＲＮＡの標的部分に相補的な核酸鎖を含む（例えば、配列番号７５の標的部分と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列に相補的である）。標的部分は１５～３０ヌクレオチド長であってよく、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長であってよいが、より短い標的部分及びより長い標的部分も想到される。いくつかの実施形態では、標的部分は、以下の表１に記載の配列のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
Figure 2024521792000001
阻害性ＲＮＡの投与により、対象または生体試料（例えば、血液、血清または血漿試料、肝細胞を含む試料）中のＣ３転写産物またはＣ３タンパク質のレベルを、組成物の投与前のレベルと比較して減少させることができる。いくつかの実施形態では、Ｃ３転写産物またはＣ３タンパク質のレベルは、投与前のレベルに対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％減少する。Ｃ３タンパク質のレベルは、例えば、血液（血清または血漿）試料中で測定することができる。
マイクロＲＮＡ
本開示はまた、マイクロＲＮＡである、マイクロＲＮＡを含む、またはマイクロＲＮＡをコードする１つ以上のオリゴヌクレオチドに関連する組成物及び方法を含む。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物及び動物のゲノムのＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されない高度に保存された小さなＲＮＡ分子のクラスである。天然に存在するｍｉＲＮＡは、ロングヘアピンを含む一次転写産物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）として最初に転写される。一次転写産物は、ＤｒｏｓｈａリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素によって切断されて、約７０ｎｔのステムループ前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を生成するが、このｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」（標的配列に実質的に相補的な領域を含む）と「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」（アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含む）とを含んでいる。次いでｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質に能動的にエクスポートされ、そこでｐｒｅ－ｍｉＲＮＡはダイサーリボヌクレアーゼによって切断されて成熟ｍｉＲＮＡが形成される。プロセシングされたマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれて、成熟遺伝子サイレンシング複合体を形成し、この複合体は、標的ｍＲＮＡ分解及び／または翻訳抑制を誘導する。これまでに多くのｍｉＲＮＡ配列が同定されており、その例は例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ： ｍｉｃｒｏＲＩＶＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ” Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０－Ｄ１４４；“Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ” Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９－Ｄ１１１にみることができる。
ｍｉＲＮＡは、成熟分子または前駆体（例えば、ｐｒｉ－またはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）として設計及び／または合成することができる。いくつかの実施形態では、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、同じ長さのガイド鎖とパッセンジャー鎖（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、プレｍｉＲＮＡは、異なる長さのガイド鎖とパッセンジャー鎖を含む（例えば、一方の鎖は約１９ヌクレオチドであり、他方の鎖は約２１ヌクレオチドである）。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡのコード領域、５’非翻訳領域、及び／または３’非翻訳領域を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、内因性ｍＲＮＡとハイブリダイズしてその発現を阻害するのに対象の内因性ｍＲＮＡと十分に相補的な配列を有するヌクレオチド配列を含むガイド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号７５の連続する少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドに完全に相補的な領域（例えば、配列番号７６～１００のいずれか１つ）を含む核酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号７６～１００のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む標的部分に完全に相補的なヌクレオチド配列を有する成熟ガイド鎖を含む。
ｓｉＲＮＡ
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってＣ３発現を阻害する。ＲＮＡｉは、例えば、標的遺伝子座に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子機能を特異的に不活性化することができる、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである（Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２００１；２：１１０－１１９；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９９９；１３：１３９－１４１）。このｄｓＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングは、リボヌクレアーゼＩＩＩの切断によってより長いｄｓＲＮＡから生成される短い二本鎖小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介され得る（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００１；４０９：３６３－３６６及びＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１；１５：１８８－２００）。ＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングは配列特異的なＲＮＡ分解によって起こると考えられ、配列特異性はｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡ内のその相補的な配列との相互作用により決定される（例えばＴｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１；２：２３９－２４５）。ＲＮＡｉは、例えば、折り返しステムループ構造を有するｓｉＲＮＡ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００１；４１１：４９４－４９８）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用を伴い得る（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００２；１６： ９４８－９５８；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００２；９９：５５１５－５５２０；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０－５５３；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：５０５－５０８）。
本開示は、Ｃ３転写産物、例えばＣ３ ｍＲＮＡ（配列番号７５）を標的とするｓｉＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、配列番号７６～１００のいずれか１つを含む標的領域に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、（ｉ）配列番号７６～１００（またはその一部）のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列、及び／または（ｉｉ）配列番号７６～１００のいずれか１つ（またはその一部）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｓｉＲＮＡは、アニールされた相補的な一本鎖核酸分子を含む（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７塩基対の）二本鎖核酸二重鎖体である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、アニールされた相補的な一本鎖ＲＮＡを含む短いｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、二重鎖のセンス鎖がＤＮＡ分子であり、二重鎖のアンチセンス鎖がＲＮＡ分子である、アニールされたＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号７６～１００のいずれか１つ（またはその一部）と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、下記表２Ａの配列番号１０１～１２５のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む。
Figure 2024521792000002
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、下記表２Ｂの配列のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む。
Figure 2024521792000003
Figure 2024521792000004
Figure 2024521792000005
Figure 2024521792000006
Figure 2024521792000007
Figure 2024521792000008
Figure 2024521792000009
Figure 2024521792000010
Figure 2024521792000011
Figure 2024521792000012
Figure 2024521792000013
Figure 2024521792000014
Figure 2024521792000015
Figure 2024521792000016
Figure 2024521792000017
Figure 2024521792000018
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、修飾または非修飾の、本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用するところのＷＯ２０２０／１０４６６９、ＷＯ２０２１／０３７９４１、ＷＯ２０１５／０８９３６８、ＷＯ２０１９／０８９９２２、ＷＯ２０２１／０８１０２６、ＷＯ２０２１／１７８６０７、ＵＳ７，５８２，７４６、ＷＯ２００７／０８９３７５、またはＷＯ２００３／０６６８０５に開示される配列のいずれか１つを含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、標的とのミスマッチ（複数可）、二重鎖内のミスマッチ、またはそれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域及び／または二重鎖部分で生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するそれらの傾向に基づいてランク付けすることができる（例えば、特定の対の会合または解離の自由エネルギーに基づいて最も簡単なアプローチは、各対を個々の対ベースで調べることであるが、次の隣接対の分析または同様の分析を使用することもできる）。解離を促進させる観点からは、Ｇ：ＣよりもＡ：Ｕが好ましく、Ｇ：ＣよりもＧ：Ｕが好ましく、Ｇ：ＣよりもＩ：Ｃが好ましい（Ｉ＝イノシン）。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ、及びミスマッチ対の群から独立して選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖部分内の最初の１、２、３、４または５個の塩基対のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖部分内の１位にあるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、及びｄＴからなる群から選択される。上記に加えてまたは上記に代えて、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖部分内の最初の１、２または３個の塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。上記に加えてまたは上記に代えて、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖部分内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、標的配列と同一ではない１個以上（例えば、２，３，４または５個）のヌクレオチドを３’及び／または５’末端に含んでもよく、及び／またはアンチセンス鎖は、標的配列と相補的ではない１個以上（例えば、２，３，４または５個）のヌクレオチドを３’及び／または５’末端に含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖ｓｉＲＮＡは、下記表３に記載される配列を含むセンス鎖を含む。表３の各配列は、３’末端にアデニン（Ａ）ヌクレオチドを含み、これは、一部の配列においては、標的配列に相補的である（例えば、標的配列の次の隣接ヌクレオチドに相補的である）。表３Ａの一部の配列では、３’末端のアデニン（Ａ）ヌクレオチドは、標的配列に相補的ではない（例えば、標的配列の次の隣接ヌクレオチドに相補的ではない）。
Figure 2024521792000019
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、下記表３Ｂの配列のいずれか１つと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するセンス鎖を含む。
Figure 2024521792000020
Figure 2024521792000021
Figure 2024521792000022
Figure 2024521792000023
Figure 2024521792000024
Figure 2024521792000025
Figure 2024521792000026
Figure 2024521792000027
Figure 2024521792000028
Figure 2024521792000029
Figure 2024521792000030
Figure 2024521792000031
Figure 2024521792000032
Figure 2024521792000033
Figure 2024521792000034
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、修飾または非修飾の、本明細書に参照によりその全容をそれぞれ援用するところのＷＯ２０２０／１０４６６９、ＷＯ２０２１／０３７９４１、ＷＯ２０１５／０８９３６８、ＷＯ２０１９／０８９９２２、ＷＯ２０２１／０８１０２６、ＷＯ２０２１／１７８６０７、ＵＳ７，５８２，７４６、ＷＯ２００７／０８９３７５、またはＷＯ２００３／０６６８０５に開示される配列のいずれか１つを含むセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、二重化ｓｉＲＮＡは、両端に平滑末端を含む。いくつかの実施形態では、二重鎖ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つのオーバーハング領域を含む。いくつかの実施形態では、二重鎖ｓｉＲＮＡは、二重鎖のセンス及び／またはアンチセンス鎖に１、２、３、４、５または６ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、二重鎖ｓｉＲＮＡは、二重鎖のセンス及び／またはアンチセンス鎖に１、２、３、４、５または６ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、Ｃ３ ｍＲＮＡ転写産物（配列番号７５）に相補的な１個以上のヌクレオチドを含むオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、Ｃ３ ｍＲＮＡ転写産物（配列番号７５）に相補的な１、２、３、４、５、または６個以上のヌクレオチドを含むオーバーハングを含む。例えば、いくつかの実施形態では、二重鎖ｓｉＲＮＡは、配列番号３００～３２４のいずれか１つの配列を含むアンチセンス鎖を含む。
Figure 2024521792000035
いくつかの実施形態では、二重鎖ｓｉＲＮＡは、配列番号３００～３２４のいずれか１つの配列を含むが、５’末端の「Ｕ」を欠いたアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、Ｃ３ ｍＲＮＡ転写産物（配列番号７５）に相補的でない１個以上のヌクレオチドを含むオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、Ｃ３ ｍＲＮＡ転写産物（配列番号７５）に相補的でない１、２、３、４、５、または６個以上のヌクレオチドを含むオーバーハングを含む。一例では、オーバーハングは、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖に１、２、または３個のウラシルヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。一例では、オーバーハングは、アンチセンス鎖及び／またはセンス鎖に１、２、または３個のウラシルヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、二重鎖ｓｉＲＮＡは、下記表５に記載される配列を含むアンチセンス鎖を含む。
Figure 2024521792000036
いくつかの実施形態では、二重鎖ｓｉＲＮＡは、下記表６に記載される配列を含むアンチセンス鎖を含む。
Figure 2024521792000037
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、５’－リン酸基及び／または３’－ヒドロキシル基（例えば、センス鎖の一方または両方の末端及び／またはアンチセンス鎖の一方または両方の末端に）を含み、及び／または本明細書に記載される１つ以上のさらなる修飾を含むことができる。
修飾
いくつかの実施形態では、本開示の阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）は、１つ以上の天然の核酸塩基及び／または天然の核酸塩基に由来する１つ以上の修飾核酸塩基を含む。例としては、これらに限定されるものではないが、それぞれのアミノ基がアシル保護基により保護されたウラシル、チミン、アデニン、シトシン及びグアニン；２－フルオロウラシル、２－フルオロシトシン、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、２，６－ジアミノプリン、アザシトシン、例えばシュードイソシトシン及びシュードウラシルなどのピリミジン類似体、ならびに８－置換プリン、キサンチン、またはヒポキサンチン（最後の２つは天然分解産物）などの他の修飾核酸塩基が挙げられる。例示的な修飾核酸塩基は、Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ，ＲＮＡ，２００３，９，１０３４－１０４８，Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２，２１８３－２１９６及びＲｅｖａｎｋａｒ ａｎｄ Ｒａｏ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．７，３１３に開示されている。
修飾核酸塩基としては、１個以上のアリール環、例えばフェニル環がサイズが拡大された核酸塩基も挙げられる。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ（ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；Ｋｒｕｅｇｅｒ ＡＴ ｅｔ ａｌ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００７，４０，１４１－１５０；Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２００２，３５，９３６－９４３；Ｂｅｎｎｅｒ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，６，５５３－５４３；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００３，７，７２３－７３３；Ｈｉｒａｏ，Ｉ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，１０，６２２－６２７に記載される核酸塩基置換が、本明細書に記載のｓｉＲＮＡにおいて有用なものとして想到される。修飾核酸塩基には、核酸塩基とはみなされないが、例えばコリン誘導環またはポルフィリン誘導環など（ただし、これらに限定されない）の他の部分である構造も包含される。ポルフィリン誘導塩基置換は、Ｍｏｒａｌｅｓ－Ｒｏｊａｓ，Ｈ ａｎｄ Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００２，４，４３７７－４３８０に記載されている。
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、場合により置換された以下の構造のうちのいずれか１つである：
Figure 2024521792000038
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、蛍光性である。例示的なそのような蛍光性修飾核酸塩基として、以下に示されるような、フェナントレン、ピレン、スチルベン、イソキサンチン、イソザントプテリン、テルフェニル、テルチオフェン、ベンゾテルチオフェン、クマリン、ルマジン、テザードスチルベン、ベンゾウラシル及びナフトウラシルが挙げられる：
Figure 2024521792000039
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は非置換である。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は置換されている。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、例えばヘテロ原子、アルキル基、または蛍光部分、ビオチンもしくはアビジン部分、または他のタンパク質もしくはペプチドに結合されたリンカー部分を含むように置換されている。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、最も古典的な意味での核酸塩基ではなく、核酸塩基と同様に機能する「ユニバーサル塩基」である。このようなユニバーサル塩基の代表例の１つとして、３－ニトロピロールがある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡは、修飾核酸塩基及び／または修飾糖に共有結合した核酸塩基を組み込んだヌクレオシドを含む。修飾核酸塩基を組み込んだヌクレオシドの例としては、４－アセチルシチジン；５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；２’－Ｏ－メチルシチジン；５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン；５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン；ジヒドロウリジン；２’－Ｏ－メチルシュードウリジン；β，Ｄ－ガラクトシルキューオシン；２’－Ｏ－メチルグアノシン；Ｎ６－イソペンテニルアデノシン；１－メチルアデノシン；１－メチルシュードウリジン；１－メチルグアノシン；１－メチルイノシン；２，２－ジメチルグアノシン；２－メチルアデノシン；２－メチルグアノシン；Ｎ７－メチルグアノシン；３－メチルシチジン；５－メチルシチジン；５－ヒドロキシメチルシチジン；５－ホルミルシトシン；５－カルボキシルシトシン；Ｎ６－メチルアデノシン；７－メチルグアノシン；５－メチルアミノエチルウリジン；５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン；β，Ｄ－マンノシルキューオシン；５－メトキシカルボニルメチルウリジン；５－メトキシウリジン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン；Ｎ－（（９－β，Ｄ－リボフラノシル－２－メチルチオプリン－６－イル）カルバモイル）スレオニン；Ｎ－（（９－β，Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）－Ｎ－メチルカルバモイル）スレオニン；ウリジン－５－オキシ酢酸メチルエステル；ウリジン－５－オキシ酢酸（ｖ）；シュードウリジン；キューオシン；２－チオシチジン；５－メチル－２－チオウリジン；２－チオウリジン；４－チオウリジン；５－メチルウリジン；２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン；および２’－Ｏ－メチルウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ヌクレオシドは、６’位に（Ｒ）または（Ｓ）キラリティーのいずれかを有する６’修飾二環式ヌクレオシド類似体を含み、米国特許第７，３９９，８４５号に記載される類似体を含む。他の実施形態では、ヌクレオシドは、５’位に（Ｒ）または（Ｓ）キラリティーのいずれかを有する５’修飾二環式ヌクレオシド類似体を含み、米国特許出願公開第２００７０２８７８３１号に記載される類似体を含む。いくつかの実施形態では、核酸塩基または修飾核酸塩基は、５－ブロモウラシル、５－ヨードウラシル、または２，６－ジアミノプリンである。いくつかの実施形態では、核酸塩または修飾核酸塩は、蛍光部分による置換により修飾される。
修飾核酸塩基の調製方法は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５７，１９１号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１，５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、同第５，７５０，６９２号、同第６，０１５，８８６号、同第６，１４７，２００号、同第６，１６６，１９７号、同第６，２２２，０２５号、同第６，２３５，８８７号、同第６，３８０，３６８号、同第６，５２８，６４０号、同第６，６３９，０６２号、同第６，６１７，４３８号、同第７，０４５，６１０号、同第７，４２７，６７２号、及び同第７，４９５，０８８号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド中のリン酸基または連結リンが糖または修飾糖の様々な位置に結合した１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。非限定的な例として、リン酸基または連結リンは、糖または修飾糖の２’、３’、４’または５’ヒドロキシル部分に結合され得る。本明細書に記載される修飾核酸塩基を組み込んだヌクレオチドも、この関連において想到される。
その他の修飾糖もｓｉＲＮＡ分子内に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、修飾糖は、以下のうちの１つを含む、１つ以上の置換基を２’位に有する：－Ｆ；－ＣＦ３、－ＣＮ、－Ｎ３、－ＮＯ、－ＮＯ２、－ＯＲ’、－ＳＲ’、または－Ｎ（Ｒ’）２（ただし、各Ｒ’は独立して上記に定義され、本明細書に記載される通りである）；－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、－Ｓ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、－ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）２；－Ｏ－（Ｃ２～Ｃ１０アルケニル）、－Ｓ－（Ｃ２～Ｃ１０アルケニル）、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ１０アルケニル）、または－Ｎ（Ｃ２～Ｃ１０アルケニル）２；－Ｏ－（Ｃ２～Ｃ１０アルキニル）、－Ｓ－（Ｃ２～Ｃ１０アルキニル）、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ１０アルキニル）、または－Ｎ（Ｃ２～Ｃ１０アルキニル）２；または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）２、－ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）（ただし、アルキル、アルキレン、アルケニル及びアルキニルは、置換または非置換であってよい）。置換基の例としては、これらに限定されるものではないが、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、及び－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２（ただし、１～約１０である）、ＭＯＥ，ＤＭＡＯＥ，ＤＭＡＥＯＥが挙げられる。また本明細書では、ＷＯ２００１／０８８１９８及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４に記載される修飾糖も想到される。いくつかの実施形態では、修飾糖は、置換シリル基、ＲＮＡ切断基、レポーター基、蛍光標識、インターカレーター、核酸の薬物動態特性を改善するための基、核酸の薬力学的特性を改善するための基、または同様の特性を有する他の置換基から選択される１つ以上の基を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、３’末端ヌクレオチドの３’位または５’末端ヌクレオチドの５’位を含む、糖または修飾糖の２’、３’、４’、５’、または６’位のうちの１つ以上に行われる。
いくつかの実施形態では、リボースの２’－ＯＨは、以下のうちの１つを含む置換基で置換される：－Ｈ、－Ｆ、－ＣＦ３、－ＣＮ、－Ｎ３、－ＮＯ、－ＮＯ２、－ＯＲ’、－ＳＲ’、または－Ｎ（Ｒ’）２（ただし、各Ｒ’は独立して上記に定義され、本明細書に記載される通りである）；－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、－Ｓ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、－ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）２；－Ｏ－（Ｃ２～Ｃ１０アルケニル）、－Ｓ－（Ｃ２～Ｃ１０アルケニル）、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ１０アルケニル）、または－Ｎ（Ｃ２～Ｃ１０アルケニル）２；－Ｏ－（Ｃ２～Ｃ１０アルキニル）、－Ｓ－（Ｃ２～Ｃ１０アルキニル）、－ＮＨ－（Ｃ２～Ｃ１０アルキニル）、または－Ｎ（Ｃ２～Ｃ１０アルキニル）２；または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、または－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）２、－ＮＨ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）、または－Ｎ（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）－（Ｃ１～Ｃ１０アルキレン）－Ｏ－（Ｃ１～Ｃ１０アルキル）（ただし、アルキル、アルキレン、アルケニル及びアルキニルは、置換または非置換であってよい）。いくつかの実施形態では、２’－ＯＨは、－Ｈ（デオキシリボース）で置き換えられる。いくつかの実施形態では、２’－ＯＨは、－Ｆで置き換えられる。いくつかの実施形態では、２’－ＯＨは、－ＯＲ’で置き換えられる。いくつかの実施形態では、２’－ＯＨは、－ＯＭｅで置き換えられる。いくつかの実施形態では、２’－ＯＨは、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅで置き換えられる。
修飾糖には、ロック核酸（ＬＮＡ）も含まれる。いくつかの実施形態では、ロック核酸は、下記に示す構造を有する。下記構造のロック核酸が示されているが、Ｂａは、本明細書に記載の核酸塩基または修飾核酸塩基を表し、Ｒ２ｓは－ＯＣＨ２Ｃ４’－である。
Figure 2024521792000040
いくつかの実施形態では、修飾糖は、例えば、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２７；１３２（４２）：１４９４２－１４９５０に記載されるようなＥＮＡである。いくつかの実施形態では、修飾糖は、ＸＮＡ（ゼノ核酸）、例えば、アラビノース、アンヒドロヘキシトール、トレオース、２’フルオロアラビノース、またはシクロヘキセンでみられるもののいずれかである。
修飾糖は、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分またはシクロペンチル部分などの糖模倣体を含んでいる（例えば、米国特許第４，９８１，９５７号明細書、同第５，１１８，８００号明細書、同第５，３１９，０８０号明細書、及び同第５，３５９，０４４号明細書を参照）。想到されるいくつかの修飾糖としては、リボース環内の酸素原子が、窒素、硫黄、セレンまたは炭素で置き換えられた糖が挙げられる。いくつかの実施形態では、修飾糖は、リボース環内の酸素原子が窒素に置き換えられ、窒素がアルキル基（例えば、メチル、エチル、イソプロピルなど）で場合により置換されたリボースである。
修飾糖の非限定的な例としては、グリセロール核酸（ＧＮＡ）アナログを形成するグリセロールが挙げられる。ＧＮＡアナログの一例は、Ｚｈａｎｇ，Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０，５８４６－５８４７；Ｚｈａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００５，１２７，４１７４－４１７５及びＴｓａｉ ＣＨ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００７，１４５９８－１４６０３に記載されている。ＧＮＡ由来の類似体の別の例として、ホルミルグリセロールの混合アセタールアミナールに基づくフレキシブル核酸（ＦＮＡ）が、Ｊｏｙｃｅ ＧＦ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８７，８４，４３９８－４４０２及びＨｅｕｂｅｒｇｅｒ ＢＤ ａｎｄ Ｓｗｉｔｚｅｒ Ｃ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０，４１２－４１３に記載されている。修飾糖のさらなる非限定的な例としては、ヘキサピラノシル（６’～４’）、ペントピラノシル（４’～２’）、ペントピラノシル（４’～３’）、またはテトラフロラノシル（３’～２’）糖が挙げられる。
修飾糖及び糖模倣体は、当該技術分野では以下のものを含む（ただしこれらに限定されない）周知の方法により調製することができる：Ａ．Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９９），２８４：２１１８；Ｍ．Ｂｏｈｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ （１９９２），７５：１４１６－１４７７；Ｍ．Ｅｇｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００６），１２８（３３）：１０８４７－５６；Ａ．Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ｇｎｏｓｉｓ ｔｏ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ，Ｃ．Ｃｈａｔｇｉｌｉａｌｏｇｌｕ ａｎｄ Ｖ．Ｓｎｅｅｋｕｓ，Ｅｄ．，（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９９６），ｐ．２９３；Ｋ．－Ｕ．Ｓｃｈｏｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０００），２９０：１３４７－１３５１；Ａ．Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９２），７５：２１８；Ｊ．Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９３），７６：２５９；Ｇ．Ｏｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ （１９９３），７６：２７０１；Ｋ．Ｇｒｏｅｂｋｅ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ （１９９８），８１：３７５；及びＡ．Ｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９９），２８４：２１１８。２’位の修飾は、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，６７，９９－１３４及び当該文献内のすべての参照文献にみることができる。リボースに対する特定の修飾は、以下の参考文献にみることができる：２’－フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１－８４１）、２’－ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０－１９３８）、「ＬＮＡ」（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１－３１０）；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／０３０６８３）。
特定の実施態様によれば、様々なヌクレオチド修飾またはヌクレオチド修飾パターンを、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）のセンスまたはアンチセンス鎖のいずれかで選択的に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖内（少なくともその二重鎖部分内）に非修飾リボヌクレオチドを用いることができる一方で、センス鎖内の一部またはすべての位置に修飾ヌクレオチド及び／または修飾または非修飾デオキシリボヌクレオチドを使用することができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖の一部または全部にわたって特定のパターンの改変が用いられる。ヌクレオチドの修飾は、様々なパターンのいずれとしても生じ得る。例えば、交互のパターンを使用することができる。例えば、アンチセンス、センス鎖、またはその両方が、１つおきのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾を有してもよい。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、少なくとも１つの非修飾ヌクレオチドを有するセンス及び／またはアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、センス及び／またはアンチセンス鎖は、３個の連続したヌクレオチドに３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフを含む。例えば、いくつかの実施形態では、二本鎖ｓｉＲＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３個の連続したヌクレオチドに３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフを含む。いくつかの実施形態では、そのようなモチーフは、一方または両方の鎖の切断部位またはその近くにあってよい。そのようなモチーフの例は、米国特許出願公開第２０１５０１９７７４６号、同第２０１５０２４７１４３号、及び同第２０１６０２９８１２４号に記載されている。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、長さ１９ヌクレオチドのブラントマーであり、センス鎖は、５’末端から７、８、９位の３個の連続するヌクレオチドに３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３個の連続するヌクレオチドに３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、長さ２０ヌクレオチドの両側ブラントマー（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端から８、９、１０位の３個の連続するヌクレオチドに３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３個の連続するヌクレオチドに３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、長さ２１ヌクレオチドの両側ブラントマーであり、センス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の３個の連続するヌクレオチドに３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３個の連続するヌクレオチドに３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、１９ヌクレオチドのセンス鎖と２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、５’末端から７、８、９位の３個の連続するヌクレオチドに３つの２’－Ｆ修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の３個の連続するヌクレオチドに３つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも１つのモチーフを含み、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の一方の末端は平滑末端であり、他方の末端はヌクレオチド２個のオーバーハングを含む。好ましくは、ヌクレオチド２個のオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。ヌクレオチド２個のオーバーハングがアンチセンス鎖の３’末端にある場合、３個の末端ヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在してもよく、３個のヌクレオチドのうちの２個はオーバーハングヌクレオチドであり、３番目のヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドの隣の対合したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、さらに、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の５’末端の両方で３個の末端ヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。いくつかの実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖とアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、各残基は、独立して、例えば、交互モチーフの２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロで修飾される。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、１９ヌクレオチドのセンス鎖と２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖とを含み、（ｉ）センス鎖は、５’末端から３、７、８、９、１２、及び１７位に２’－Ｆ修飾を含み、（ｉｉ）センス鎖は、５’末端から１、２、４、５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、１８及び１９位に２’－Ｏ－メチル修飾を含み、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖は、５’末端から２及び１４位に２’－Ｆ修飾を含み、（ｉｖ）アンチセンス鎖は、５’末端から１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、及び２１位に２’－Ｏ－メチル修飾を含み、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の一方の末端は平滑末端であり、他方の末端はアンチセンス鎖の３’末端にヌクレオチド２個のオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、３’末端の３個のヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むアンチセンス鎖を含み、３個のヌクレオチドのうちの２個はオーバーハングヌクレオチドであり、３番目のヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドの隣の対合したヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、さらに、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の５’末端の両方で３個の末端ヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。
いくつかの実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖とアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾されてもよい。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾されてもよく、これらの修飾は、非結合リン酸酸素の一方または両方及び／または結合リン酸酸素の一方または両方の変更、リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’水酸基の変更、リン酸部分の「脱リン」リンカーによる全体的な置換、天然に存在する塩基の修飾または置換、ならびにリボース－リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の残基の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上、例えば１００％が、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ（１，５－アンヒドロヘキシトール核酸）、ＣｅＮＡ（シクロヘキセニル核酸、デオキシリボースが６員のシクロヘキセン環で置き換えられたＤＮＡ模倣体）、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで独立して修飾される。各鎖が複数の修飾を有してもよい。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の残基の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上、例えば１００％は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立して修飾される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる修飾が、センス鎖及びアンチセンス鎖に存在する。これらの２つの修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾、またはその他であってよい。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の二重鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、図１にパターン１～５として示される修飾パターンのうちのいずれか１つを含む。図１では、任意の特定の位置において「２ＯＭ」は２’－Ｏ－メチル修飾を表し、「２Ｆ」は２’－フルオロ修飾を表す。「ＰＳ」は、「ＰＳ」で示される位置にあるヌクレオチドと、「ＰＳ」で示される位置の３’側の隣接ヌクレオチドとの間のホスホロチオエート結合を表す。いくつかの実施形態では、配列番号１７６～２００及び３００～３２４に開示されるアンチセンス鎖のいずれか１つは、図１に開示されるアンチセンス鎖（「ＡＳ」）の修飾パターン１～５のいずれか１つに従って修飾され得る。いくつかの実施形態では、配列番号１２６～１５０に開示されるセンス鎖のいずれか１つは、図１に開示されるセンス鎖（「ＳＳ」）の修飾パターン１～５のいずれか１つに従って修飾され得る いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の二重鎖のセンス及び／またはアンチセンス鎖は、図１にパターン１～５として示される修飾パターンのいずれか１つを含むが、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の１、２、３または４位のいずれかは、パターン１～５のうちの１つで１、２、３または４位に示される修飾を含まない。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、修飾パターン１～５（図１に示される）のいずれか１つを含み、さらに（ｉ）センス鎖の５’末端、（ｉｉ）センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端、及び／または（ｉｖ）アンチセンス鎖の３’末端の最後の２、３または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、（ｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖、及び／または（ｉｖ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、図１における修飾パターン１～５のいずれか１つに従って修飾されてよく、例えば本明細書に記載されるようにリガンドに結合させることもできる。いくつかのこのような場合では、リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端のいずれかに結合させることができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、末端（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖の３’または５’末端）に結合されたリガンド（例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、前記ｓｉＲＮＡは、リガンドに結合された末端の２個、３個、または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含まない。例えば、いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、センス鎖の５’末端に結合されたリガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、ｓｉＲＮＡは、（ｉ）５’末端から１、２，３、または４位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有さないセンス鎖、（ｉｉ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖、及び（ｉｖ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、センス鎖の３’末端に結合されたリガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、ｓｉＲＮＡは、（ｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉ）３’末端から１、２，３、または４位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有さないセンス鎖、（ｉｉｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖、及び（ｉｖ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、アンチセンス鎖の５’末端に結合されたリガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、ｓｉＲＮＡは、（ｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉｉ）５’末端から１、２，３、または４位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有さないアンチセンス鎖、及び（ｉｖ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、アンチセンス鎖の３’末端に結合されたリガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、ｓｉＲＮＡは、（ｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖、及び（ｉｖ）３’末端から１、２，３、または４位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有さないアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、末端（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖の３’または５’末端）に結合されたリガンド（例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、前記ｓｉＲＮＡは、リガンドに結合された末端の２個、３個、または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。
例えば、いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、センス鎖の５’末端に結合されたリガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、ｓｉＲＮＡは、（ｉ）５’末端から１、２，３、または４位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖、及び（ｉｖ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、センス鎖の３’末端に結合されたリガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、ｓｉＲＮＡは、（ｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉ）３’末端から１、２，３、または４位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖、及び（ｉｖ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、アンチセンス鎖の５’末端に結合されたリガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、ｓｉＲＮＡは、（ｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉｉ）５’末端から１、２，３、または４位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖、及び（ｉｖ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、表１０及び１５に記載のｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えば、ｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、アンチセンス鎖の３’末端に結合されたリガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃリガンド、例えば、本明細書に記載の式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）を含み、ｓｉＲＮＡは、（ｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉ）３’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と３’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するセンス鎖、（ｉｉｉ）５’末端から１位及び２位のヌクレオチド間と５’末端から２位及び３位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖、及び（ｉｖ）３’末端から１、２，３、または４位のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、交互パターンの修飾を含む。本明細書で使用する場合、「交互のモチーフ」という用語は、１つ以上の修飾を有するモチーフであって、それぞれの修飾が、１つの鎖の１つ以上のヌクレオチドの交互の群に存在するものを指す。例えば、交互ヌクレオチドとは、ヌクレオチド１個おき、またはヌクレオチド３個おき、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ及びＣがそれぞれヌクレオチドに対する１つの種類の修飾を表す場合、交互のモチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ．．．」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ．．．」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ．．．」などであってよい。
交互のモチーフに含まれる修飾の種類は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれヌクレオチド上の１種類の修飾を表す場合、交互のパターン、すなわち、１個おきのヌクレオチドの修飾は同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖のそれぞれは、「ＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＣＡＣＡＣ．．．」、「ＢＤＢＤＢＤ．．．」、または「ＣＤＣＤＣＤ．．．」のような交互のモチーフ内のいくつかの修飾の可能性の中から選択することができる。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、アンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対してシフトした、センス鎖上の交互モチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾された群が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾を有する群に対応する（またはその逆）ようなものであってよい。例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と対合される場合、センス鎖の交互のモチーフは、二重鎖部分内で鎖の５’～３’方向に「ＡＢＡＢＡＢ」で始まってよく、アンチセンス鎖の交互のモチーフは、鎖の５’～３’方向に「ＢＡＢＡＢＡ」で始まってよい。別の例として、センス鎖とアンチセンス鎖との間で修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトが生じるように、センス鎖の交互のモチーフが二重鎖部分内で鎖の５’～３’方向に「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で始まり、アンチセンス鎖の交互のモチーフが鎖の５’～３’方向に「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で始まってもよい。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、センス鎖上に２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンを含み、アンチセンス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾の交互のモチーフのパターンに対してシフトを有する（すなわち、センス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾されたヌクレオチドは、アンチセンス鎖上の２’－Ｆ修飾されたヌクレオチドと塩基対合する（またはその逆））。センス鎖の１位は、２’－Ｆ修飾で始まってよく、アンチセンス鎖の１位は、２’－Ｏ－メチル修飾で始まってよい。
いくつかの実施形態では、３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフを、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖内に存在する最初の修飾パターンを中断するようにセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の３個の連続したヌクレオチドに導入することができる。いくつかの実施形態では、３個の連続したヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフが鎖のいずれかに導入される場合、そのモチーフの隣のヌクレオチドの修飾は、そのモチーフの修飾とは異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の部分は、「．．．ＮａＹＹＹＮｂ．．．」であり、ただし、「Ｙ」は、３個の連続したヌクレオチド上の３つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」及び「Ｎｂ」は、Ｙの修飾とは異なるモチーフ「ＹＹＹ」の隣のヌクレオチドの修飾を表し、ＮａとＮｂとは同じまたは異なる修飾であってよい。
阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチドに行われてもよく、各ヌクレオチド間結合の修飾が、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖上で交互のパターンで行われてもよく、またはセンス鎖またはアンチセンス鎖が、両方のヌクレオチド間結合の修飾を交互のパターンで含んでもよい。センス鎖上のヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖と同じかまたは異なっていてよく、センス鎖上のヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合の修飾の交互のパターンに対してシフトしていてもよい。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、６～８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端に２個のホスホロチオエート間ヌクレオチド結合を含み、３’末端に２個のホスホロチオエート間ヌクレオチド結合を含み、センス鎖は、５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも２個のホスホロチオエート間ヌクレオチド結合を含む。
特定の実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＷＯ２０１５／０８９３６８号の第５９頁（２０行目）～第６５頁（１５行目）、または米国特許出願公開第２０１６０２９８１２４号の段落［０４６９］～［０５３７］または上記の公開公報のいずれかまたは両方の請求項に記載される構成及び／または修飾パターンのいずれかを有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、センス鎖とアンチセンス鎖とを含み、前記センス鎖は前記アンチセンス鎖に相補的であり、前記アンチセンス鎖は、Ｃ３をコードするｍＲＮＡの部分に相補的な領域（例えば、本明細書に記載の標的領域）を含み、各鎖は、約１４～約３０ヌクレオチドの長さであり、前記薬剤は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（式中、ｉ、ｊ、ｋ、及び１は、それぞれ独立して０または１であり、ｐ、ｐ’、ｑ、及びｑ’は、それぞれ独立して０～６であり、各Ｎａ及びＮａ’は、修飾または非修飾またはその組み合わせである０～２５個のヌクレオチドを含む、少なくとも２個の異なる置換を有するヌクレオチドをそれぞれが含むオリゴヌクレオチド配列を独立して表し、各配列は、各Ｎｂ及びＮｂ’は、修飾または非修飾またはその組み合わせである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を独立して表し、各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、及びｎｑ’は、それぞれ存在してもしなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを独立して表し、ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、及びＺ’Ｚ’Ｚ’は、３個の連続したヌクレオチド上の３つの同一の修飾の１つのモチーフを表し、Ｎｂの修飾はＹの修飾とは異なり、Ｎｂ’の修飾はＹ’の修飾とは異なり、センス鎖は少なくとも１つのリガンドに結合されている）
によって表される。いくつかの実施形態では、ｉは０であるか、ｊは０であるか、ｉは１であるか、ｊは１であるか、ｉ及びｊの両方が０であるか、またはｉ及びｊの両方が１である。いくつかの実施形態では、ＸＸＸはＸ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹはＹ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、ＺＺＺはＺ’Ｚ’Ｚ’に相補的である。各Ｘが同じ修飾を含む限り、各Ｘが異なる塩基を含んでもよい点は理解されるはずである。例えば、ＸＸＸは、ＡＧＣを表すことができ、ただし、各ヌクレオチドは２－Ｆ修飾を含む。同様に、各Ｘ’、各Ｙ、各Ｙ’、各Ｚ及び各Ｚは、異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩａ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
によって表されるか、または式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｂ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（式中、各Ｎｂ及びＮｂ’は、独立して、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表されるか、または式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｃ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（式中、各Ｎｂ及びＮｂ’は、独立して、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表されるか、または式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｄ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５
（式中、Ｎｂ及びＮｂ’はそれぞれ独立して、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各Ｎａ及びＮａ’はそれぞれ独立して、２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す）
によって表される。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの修飾は、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾である。いくつかの実施形態では、リガンドは、２価または３価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。いくつかの実施形態では、リガンドは、式ＸＡ、ＸＢもしくはＸＣ、または本明細書に記載される別のＧａｌＮＡｃ構造に示される。
いくつかの実施形態では、リンカーは、センス鎖の３’末端に結合される。いくつかの実施形態では、結合は、下記に示す式ＸＤに示される通りである。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｐ’＞０、またはｐ’＝２である。
いくつかの実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、かつｐ’オーバーハングのヌクレオチドは、Ｃ３ ｍＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、かつｐ’オーバーハングのヌクレオチドは、Ｃ３ ｍＲＮＡに非相補的である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣のヌクレオチドに結合している
いくつかの実施形態では、リガンドは、核酸分子を肝細胞に標的化する。例えば、いくつかの実施形態では、リガンドは、肝細胞特異的アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合し、例えば、リガンドは、ガラクトース誘導体、例えば、ＧａｌＮＡｃを含む。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の活性、安定性、細胞分布及び／または細胞取り込みを調節（例えば、増加）し、及び／または電荷または溶解性などの阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）の１つ以上の物理的特性を変化させる１つ以上の部分に結合されるか、または物理的に会合される。いくつかの実施形態では、部分は、抗体またはリガンドを含むことができる。リガンドは、炭水化物、レクチン、タンパク質、糖タンパク質、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、核酸ホルモン、成長因子、または受容体であってよい。いくつかの実施形態では、天然に存在するホルモン、成長因子、または他のリガンドの生物学的に不活性なバリアントを使用することもできる。いくつかの実施形態では、部分は、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）を特定の細胞型、例えば肝細胞に標的化する標的化部分を含む。いくつかの実施形態では、標的化部分は、肝細胞特異的アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合する。
いくつかの実施形態では、部分は、可逆的な結合を介して阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）に結合される。「可逆的な結合」とは、可逆的な結合を含む結合（ｌｉｎｋａｇｅ）である。「可逆的結合」（不安定結合または切断可能な結合とも呼ばれる）とは、選択された条件下で分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断または開裂することができる水素原子との共有結合とは異なる共有結合であり、この結合は、同じ分子内の他の共有結合が実質的に切断または開裂されない条件下で選択的に切断または開裂することができる。結合の切断または不安定性は、結合切断の半減期（ｔ１／２）（結合の半分が切断されるのに要する時間）で記述することができる。特に断らない限り、本明細書における目的の可逆的結合は、「生理学的に可逆的な結合」であり、結合が、哺乳類の体内で通常生じるか、または生じるものと同様の条件下で切断可能であることを意味する。生理学的に可逆的な結合は、少なくとも１つの生理学的に可逆的な結合（ｂｏｎｄ）を含む結合（ｌｉｎｋａｇｅ）である。いくつかの実施形態では、生理的に可逆的な結合は、哺乳動物細胞内でみられる、例えばｐＨ、温度、酸化的もしくは還元的な条件または薬剤、及び塩濃度などの化学的条件またはそれらと同様の化学的条件を含む、哺乳動物の細胞内条件下で可逆的である。哺乳動物の細胞内条件としては、例えばタンパク質分解酵素または加水分解酵素により、哺乳動物細胞中に通常存在する酵素活性の存在も挙げられる。酵素的に不安定な結合は、体内の酵素、例えば細胞内酵素によって切断される。ｐＨ的に不安定な結合は、ｐＨ７．０以下で切断される。可逆的な結合（ｂｏｎｄ）及び結合（ｌｉｎｋａｇｅ）の例、ならびに阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）に部分を結合させるためのそれらの使用は、例えば、米国特許出願公開第２０１３０２８１６８５号、及び同第２０１５０２７３０８１号に記載されている。
いくつかの実施形態では、部分は、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む。タンパク質導入ドメインは、ドメインに結合された異種分子の取り込みを促進するポリペプチドまたはその部分である（そのような異種分子は「カーゴ」と呼ばれる場合がある）。ペプチドであるタンパク質導入ドメインは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と呼ばれる場合がある。多くのタンパク質導入ドメイン／ペプチドが当該技術分野で知られている。ＰＴＤには、アルギニンに富む天然または合成の様々なペプチドが含まれる。アルギニンに富むペプチドは、少なくとも３０％のアルギニン残基、例えば少なくとも４０％、５０％、６０％またはそれ以上を含有するペプチドである。ＰＴＤの例としては、ＴＡＴ（少なくともアミノ酸４９～５６）、アンテナペディアホメオドメイン、ＨＳＶ ＶＰ２２、及びポリアルギニンが挙げられる。そのようなペプチドは、カチオン性、疎水性、または両親媒性ペプチドであってよく、かつ非標準的なアミノ酸及び／またはさまざまな修飾もしくは改変、例えば円順列、インベルソ、レトロ、レトロインベルソまたはペプチド模倣体の使用を含み得る。ＰＴＤ及びカーゴの結合は、共有結合または非共有結合であってよい。
使用することができる例示的なＰＴＤは、米国特許出願公開第２００９００９３０２６号、同第２００９００９３４２５号、同第２０１２０１４２７６３号、同第２０１５０２３８５１６号、及び同第２０１６０２１５０２２号に記載されている。ＰＴＤは、２つ以上のＰＴＤ（例えば２～１０個のＰＴＤ）を含むことができ、これらは同じであっても異なっていてもよい。ＰＴＤ同士は、互いに直接結合されていても、１つ以上のアミノ酸及び／または１つ以上の非アミノ酸部分、例えばアルキル鎖またはオリゴエチレングリコール部分を含み得るリンカー部分によって分離されてもよい。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、アニオン性電荷中和部分を含むか、またはそれに物理的に結合されている。アニオン性電荷中和部分とは、それが物理的に結合されている核酸の全体的な正味のアニオン性電荷全体を減少させ得る分子または化学基を指す。１つ以上のアニオン性電荷中和分子または基を、核酸に結合させることができ、それぞれは独立して、アニオン性電荷の減少及び／またはカチオン性電荷の増加に寄与する。「電荷中和された」とは、核酸のアニオン性電荷が、アニオン性電荷中和分子または基の非存在下における同じ核酸よりも減少しているか、中和されているか、またはよりカチオン性であることを意味する。アニオン性電荷中和基の例としては、ホスホジエステル及び／またはホスホチオエート保護基がある。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、負に荷電された基を含む骨格（例えば、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート骨格）の正味のアニオン性電荷を減少させる１つ以上の位置の保護基を含む。いくつかの実施形態では、負に荷電されたホスホジエステル骨格は、細胞質チオエステラーゼの作用によって細胞内で荷電ホスホジエステル結合に変換される生体可逆的なホスホトリエステル保護基を用いた合成によって中和され、その結果、発現を阻害するうえで生物学的に活性な薬剤、例えば、ＲＮＡｉを媒介し得る阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）が得られる。したがって、そのような薬剤は、短鎖干渉リボ核酸中性物質（ｓｉＲＮＮ）とも呼ばれ、ｓｉＲＮＡプロドラッグとして機能し得る。骨格は完全に中和される（すなわち、電荷を失う）必要はない点は理解されはずである。いくつかの実施形態では、５％～１００％、例えば２５％～５０％または５０％～７５％または７５％～１００％のリン酸基が保護される。特定の実施形態では、一方または両方の鎖上の少なくとも５個、６個、７個、８個、９個または１０個のリン酸基が保護される。有用なホスホジエステル及び／またはホスホチオエート保護基の例、それらの製造方法、ならびに核酸における（例えば、ＲＮＡｉ薬剤プロドラッグを生成するための）それらの使用が、米国特許出願公開第２０１１０２９４８６９号、同第２００９００９３４２５号、同第２０１２０１４２７６３号、及び同第２０１５０２３８５１６号に記載されている。様々な実施形態において、ｓｉＲＮＡは、本明細書に記載の修飾のいずれかを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２’糖修飾（例えば、２’－Ｆ、２’－Ｏ－Ｍｅ）を含み得る。さらに、ｓｉＲＮＮは、本明細書に記載の構成または修正パターンのいずれかを有することができる。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）に結合される部分は、炭水化物を含む。代表的な炭水化物としては、約４、５、６、７、８または９個の単糖単位を含む単糖類、二糖類、三糖類及びオリゴ糖類が挙げられる。特定の実施形態では、炭水化物は、ガラクトース、またはガラクトサミン、Ｎ－ホルミルガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－プロピオニル－ガラクトサミン、Ｎ－ｎ－ブタノイル－ガラクトサミン、及びＮ－イソブタノイルガラクトサミンなどのガラクトース誘導体を含む。特に重要な特定の実施形態では、ガラクトース誘導体は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。特定の実施形態では、この部分は、複数のガラクトースまたはガラクトース誘導体、例えば複数のＮ－アセチルガラクトサミン部分、例えば３個のＧａｌＮＡｃ部分を含む。本明細書で使用する場合、「ガラクトース誘導体」という用語は、ガラクトース及びガラクトースと同等以上のアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するガラクトースの誘導体との両方を含む。「ガラクトースクラスター」という用語は、通常、別の部分に共有結合されていることによって互いに物理的に結合された少なくとも２個のガラクトース誘導体を含む構造を指す。いくつかの実施形態では、ガラクトースクラスターは、２～１０（例えば６）個、または２～４（例えば３）個の末端ガラクトース誘導体を有する。末端ガラクトース誘導体は、ガラクトース誘導体のＣ－１炭素を介して他の部分に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、２個以上、例えば３個のガラクトース誘導体が、分岐点として機能し、かつ阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）に結合し得る部分に結合される。いくつかの実施形態では、ガラクトース誘導体は、リンカーまたはスペーサーを介して分岐点として機能する部分に結合される。いくつかの実施形態では、分岐点として機能する部分は、リンカーまたはスペーサーを介して阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）に結合させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、ガラクトース誘導体は、アミド、カルボニル、アルキル、オリゴエチレングリコール部分、またはそれらの組み合わせを含むリンカーまたはスペーサーを介して分岐点に結合される。いくつかの実施形態では、各ガラクトース誘導体に結合されるリンカーまたはスペーサーは、同じである。いくつかの実施形態では、ガラクトースクラスターは、それぞれがアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和性を有する３個の末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体（例えば、ＧａｌＮＡｃ）を有する。分岐点として機能する部分に３個の末端ＧａｌＮＡｃ部分が（例えば、糖のＣ－１炭素を介して）結合した構造は、トリアンテナ型Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ３）と呼ぶことができる。いくつかの実施形態では、ガラクトース誘導体を含む１つ以上のモノマー単位を、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）に部位特異的に組み込むことができる。そのようなガラクトース誘導体含有モノマー単位は、ヌクレオシドまたは非ヌクレオシド部分に結合されたガラクトース誘導体（例えば、ＧａｌＮＡｃ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、少なくとも３個のヌクレオシド－ＧａｌＮＡｃモノマーまたは少なくとも３個の非ヌクレオシド－ＧａｌＮＡｃモノマーが、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）に部位特異的に組み込まれる。いくつかの実施形態では、そのような組み込みは、ホスホロアミダイト化学を使用した固相合成時に、または合成後の結合時に行うことができる。いくつかの実施形態では、ガラクトース誘導体含有モノマー単位同士は、ホスホジエステル結合を介して、互いに、及び／またはガラクトース誘導体が結合されていない阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のヌクレオシドに結合される。いくつかの実施形態では、２個、３個、またはそれ以上のガラクトース誘導体含有モノマー単位が、連続的に（すなわち、ガラクトース誘導体を有さない単位を介在することなく）配置される。いくつかの実施形態では、炭水化物、例えば、ガラクトースクラスター、例えば、トリアンテナ型Ｎ－アセチルガラクトサミンまたは２個以上のＧａｌＮＡｃ含有モノマー単位が、鎖の末端、例えば、センス鎖の３’末端、またはアンチセンス鎖の５’末端に存在する。例示的な炭水化物（例えばガラクトースクラスター）、ガラクトース誘導体含有モノマー単位、炭水化物修飾された阻害性ＲＮＡ、ならびにそれらの製造方法及び使用が、米国特許出願公開第２００９０２０３１３５号、同第２００９０２３９８１４号、同第２０１１０２０７７９９号、同第２０１２０１５７５０９号、同第２０１５０２４７１４３号、米国特許出願公開第「１２４」号、Ｎａｉｒ，ＪＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６，１６９５８－１６９６１ （２０１４）；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０，１１８１－１１８７ （２０１５）；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １６，９０３－９０８ （２０１５）；Ｍｉｇａｗａ，ＭＴ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２６（９）：２１９４－７ （２０１６）；Ｐｒａｋａｓｈ，ＴＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．５９（６）：２７１８－３３ （２０１６）に記載されている。例示的なガラクトースクラスターを以下に示す。
さらなるＧａｌＮＡｃ構造を以下に示す（かつＳｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２９：２４７８－２４８８（２０１８）に記載のように合成することができる）：
いくつかの実施形態では、ｍ＝０及びｎ＝２である。いくつかの実施形態では、ｍ＝１及びｎ＝１である。いくつかの実施形態では、ｍ＝１及びｎ＝２である。いくつかの実施形態では、ｍ＝１及びｎ＝３である。
当業者には、各ＧａｌＮＡｃを分岐点に連結する各リンカー部分の構造は異なり得る点は認識されよう。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、下記に示すＧａｌＮＡｃに結合される：
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ、例えば表１０及び１５に記載されるｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか、例えばｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）が、ＧａｌＮＡｃリガンド（例えば式ＸＤまたはＸＥのＧａｌＮＡｃ）に結合される。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンド（例えば式ＸＤまたはＸＥに示される）は、ｓｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか１つ、例えばｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）のセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンド（例えば式ＸＤまたはＸＥに示される）は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドの糖の３’位に結合される。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンド（例えば式ＸＤまたはＸＥに示される）は、ｓｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ１～５７のいずれか１つ、例えばｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）のセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンド（例えば式ＸＤまたはＸＥに示される）は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’位に結合される。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば配列番号１～５７のｓｉＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）がリガンド（例えばＧａｌＮＡｃリガンド）に結合される場合、阻害性ＲＮＡは、リガンドに結合されるヌクレオチド（複数可）に修飾（例えばホスホロチオエート結合「ＰＳ」）を有さなくてもよい。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ１～５７、例えばｓｉＲＮＡ２２、３２及び５３）は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの一方の末端でＧａｌＮＡｃリガンド（例えば式ＸＤまたはＸＥに示される）に結合される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンドに結合されていない他の３つの末端は、ホスホロチオエート結合（「ＰＳ」）などの修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、２、３、または４個の最も５’側または３’側のヌクレオチド間にＰＳ結合を有する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃリガンドに結合された末端は、２、３、または４個の最も５’側または３’側のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含まない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡは、下記に示すガラクトース構造に結合させることができる：
いくつかの実施形態では、リンカーは、アミド、カルボニル、アルキル、オリゴエチレングリコール部分、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡは、下記に示すガラクトース構造に結合させることができる：
いくつかの実施形態では、リンカーは、アミド、カルボニル、アルキル、オリゴエチレングリコール部分、またはそれらの組み合わせを含む。
ＧａｌＮＡｃリガンドの合成方法、ＧａｌＮＡｃリガンドを阻害性ＲＮＡに結合させる方法及びさらなるＧａｌＮＡｃリガンドは当該技術分野では周知のものであり、例えば、参照によって本明細書にそれらの全容を援用するところのＷＯ２０１７／０２１３８５、ＷＯ２０１７／１７８６５６、ＷＯ２０１８／２１５３９１、ＷＯ２０１９／１４５５４３、ＷＯ２０１７／０８４９８７、ＷＯ２０１７／０５５４２３、及びＷＯ２０１２／０８３０４６に記載のものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、下記に示すリガンドに結合される：
（式中、Ｘは、ＯまたはＳである）。ほとんどの実施形態において、ＸはＯである。当業者であれば、ガラクトースクラスターをリン酸基に連結するリンカー部分の構造は異なり得る点は認識されよう。
特定の実施形態では、部分は、親油性部分を含む。いくつかの実施形態では、親油性部分は、トコフェロール、例えばα－トコフェロールを含む。いくつかの実施形態では、親油性部分は、コレステロールを含む。いくつかの実施形態では、親油性化合物は、アルキル基またはヘテロアルキル基を含む。いくつかの実施形態では、親油性化合物は、パルミトイル、ヘキサデカ－８－エノイル、オレイル、（９Ｅ，１２Ｅ）－オクタデカ－９，１２－ジエノイル、ジオクタノイル、またはＣ１６～Ｃ２０アシルを含む。いくつかの実施形態では、親油性部分は少なくとも１６個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、親油性部分は、－（ＣＨ）ｎ－ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ）ｍ－ＣＨ３を含む。いくつかの実施形態では、ｎ及びｍは、それぞれ独立して１～２０である。いくつかの実施形態では、ｎ＋ｍは少なくとも１０、１２、１４、または１６である。いくつかの実施形態では、親油性部分は、下記に示されるものであり、及び／または下記に示されるように糖部分に結合される。
一般に、部分は、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の末端または内部サブユニットに結合させることができる。いくつかの実施形態では、部分は、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の修飾されたサブユニットに結合される。当業者であれば、結合された部分を有する核酸を製造するための適当な方法は認識されるところである。反応性官能基を含む修飾ヌクレオチドを含む核酸鎖は、第２の反応性官能基を含む部分と反応させることができ、第１と第２の反応性官能基は、核酸鎖の構造の維持に適合した条件下で互いに反応することができる。いくつかの実施形態では、部分は、センス鎖またはアンチセンス鎖をそれぞれ相補的なアンチセンス鎖またはセンス鎖とハイブリダイズさせる前にセンス鎖またはアンチセンス鎖に結合させることができる。いくつかの実施形態では、部分を組み込む前に鎖同士をハイブリダイズさせて二重鎖を形成させることができる。一般に、本明細書に記載される様々なコンジュゲーション方法を使用することができる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，２００８を参照されたい。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）はキメラｓｉＲＮＡである。本明細書で使用される「キメラ」ｓｉＲＮＡは、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位で構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含むｓｉＲＮＡであり、各領域は化合物に異なる特性を付与する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの領域は、ｓｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する高い耐性、細胞への高い取り込み性、及び／または標的核酸に対する高い結合親和性を付与するように修飾され、ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）の基質として機能し得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの少なくとも１つの領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素（例えばＲＮａｓｅ Ｈ）の基質として機能することができ、少なくとも１つの領域は、立体障害によって翻訳を阻害することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）は、アニールされた二重鎖ｓｉＲＮＡとして標的細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、一本鎖のセンス及びアンチセンス核酸配列として標的細胞に導入され、これらは標的細胞内でアニールして阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）二重鎖を形成する。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、標的細胞に導入される発現ベクター（例えば、本明細書に記載される発現ベクター）によってコードされ得る。標的細胞内で発現されると、転写されたセンス鎖とアンチセンス鎖とはアニールして阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を形成することができる。
本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）は、当該技術分野では周知の標準的な方法によって、例えば、自動合成装置を使用して合成することができる。そのような方法によって生成されるＲＮＡは、純度が高くなる傾向があり、効率的にアニールして阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）二重鎖を形成する。化学合成後に一本鎖ＲＮＡ分子を脱保護し、アニールさせてｓｉＲＮＡを形成し、精製することができる（例えば、ゲル電気泳動法またはＨＰＬＣにより）。あるいは、例えば、１つ以上のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列（例えば、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列）を有するＤＮＡ鋳型からＲＮＡをインビトロ転写させる標準的な手法を使用することもできる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してｓｉＲＮＡを調製するためのプロトコールは、当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｄｏｎｚｅ ａｎｄ Ｐｉｃａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２；３０：ｅ４６；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；９９：６０４７－６０５２）。センス及びアンチセンス転写産物は、２つの独立した反応で合成した後にアニールさせてもよく、またはそれらを単一の反応で同時に合成することもできる。
阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）は、細胞内に導入された発現コンストラクトからのＲＮＡの転写により、細胞内で形成させることもできる（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；９９：６０４７－６０５２を参照）。阻害性ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）分子をインビボで産生するための発現コンストラクトは、例えばプロモーターエレメント及び転写終結シグナルを含む、ｓｉＲＮＡコード配列（複数可）の適切な転写に必要なエレメントに機能的に連結された１つ以上のｓｉＲＮＡコード配列を含むことができる。かかる発現コンストラクトで使用するための好ましいプロモーターとしては、ポリメラーゼＩＩＩ ＨＩ－ＲＮＡプロモーター（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：５５０－５５３を参照）及びＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；２０：５０５－５０８；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００２；９９：６０４７－６０５２を参照）が挙げられる。ｓｉＲＮＡ発現コンストラクトは、発現コンストラクトのクローニングを容易にする１つ以上のベクター配列をさらに含むことができる。使用可能な標準的なベクターとしては、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．０－Ｕ６ベクター（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．）が挙げられる。
ＩＩＩ．発現ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡは、発現ベクターを使用して対象に（例えば対象の細胞、例えば対象の肝細胞に）送達される。本明細書に記載の阻害性ＲＮＡを送達するために、多くの形態のベクターを使用することができる。発現ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター（例えば、遺伝子治療に適したベクター）、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、人工染色体などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、ウイルスベクターに組み込まれる。ウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルス（例えば、モロネーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタイン－バーウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、及びポリオウイルスが挙げられる。
インビボでは、Ｃ３を含む多くの補体タンパク質は主に肝臓で合成される。そのため、いくつかの実施形態では、肝細胞が本明細書に記載される阻害性ＲＮＡの送達の標的とされる。いくつかのウイルスベクターのクラスが、レトロウイルスベクター（例えば、Ａｘｅｌｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８７：５１７３－５１７７（１９９０）；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４１－６４７（１９９２）；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｄｒｉｅｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９６：１０３７９－１０３８４（１９９９）；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，ＡＳＡＩＯ Ｊ．４９：４０７－４１６（２００３）；及びＸｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０２：６０８０－６０８５（２００５）を参照）、レンチウイルスベクター（例えば、ＭｃＫａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１７：２５２８－２５４１（２０１１）；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０９：２７９７－２８０５（２００７）；及びＭａｔｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５３：１６９６－１７０７（２０１１）を参照）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９１：４６００－４６０７ （１９９８）を参照）、及びアデノウイルスベクター（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３：８０４－８１０（２００４）及びＥｈｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ９９：３９２３－３９３０（２００２）を参照）を含む遺伝子治療コンストラクトの肝臓を標的とした送達に適していることが示されている。
レトロウイルスは、ウイルスの科のレトロウイルス科に属するエンベロープウイルスである。ウイルスは、宿主の細胞内に入ると、ウイルスの逆転写酵素を使用してそのＲＮＡをＤＮＡに転写することによって複製する。レトロウイルスのＤＮＡは、宿主ゲノムの一部として複製し、プロウイルスと呼ばれる。選択された核酸を、ベクターに挿入し、当該技術分野で周知の技術を使用してレトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。複製欠損レトロウイルスを産生するためのプロトコールは当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．１９９１）。その後、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビトロまたはエクスビボで送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，９９４，１３６号、第６，１６５，７８２号、及び第６，４２８，９５３号を参照されたい）。レトロウイルスには、アルファレトロウイルス属（例えば、トリ白血病ウイルス）、ベータレトロウイルス属（例えば、マウス乳癌ウイルス）、デルタレトロウイルス属（例えば、ウシ白血病ウイルス及びヒトＴリンパ球向性ウイルス）、イプシロンレトロウイルス属（例えば、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス）、及びレンチウイルス属が含まれる。
いくつかの実施形態では、レトロウイルスは、レトロウイルス科のレンチウイルスである。いくつかの例では、レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（Ｓ１Ｖ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡ）、及びビスナウイルスである（ただしこれらに限定されない）。
いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡを含むウイルスの大きな科である。アデノウイルスは、宿主の細胞機構を使用してウイルスのＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質を合成しながら、宿主細胞の核内で複製を行う。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶシステムは、一般に当技術分野でよく知られている（例えば、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）；Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）；及びＡｓｏｋａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照）。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを生成し、使用する方法は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記載されている。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１、ならびにそのバリアントを含むいくつかのＡＡＶ血清型が特徴付けられている。一般に、任意のＡＡＶ血清型を使用して、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡを送達することができる。しかしながら、各血清型は異なる指向性を有し、例えば、各血清型は異なる組織に選択的に感染する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、少なくとも血清型ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９に見られる肝指向性に基づいて選択される（例えば、Ｓｈａｏｙｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３：１８６７－１８７６ （２０１５）を参照）。
ｒＡＡＶベクターのＡＡＶ配列は、通常は、シス作用のある５’及び３’逆位末端反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照）。ＩＴＲ配列は長さ約１４５ｂｐである。いくつかの実施形態では、ＩＴＲをコードする配列のほぼ全体をｒＡＡＶベクター中に用いることができるが、これらの配列のある程度の改変は許容される。これらのＩＴＲ配列の改変は、当該技術分野の範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）；及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２ （１９９６）を参照）。本開示のｒＡＡＶベクターの例として、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードする核酸）を含む「シス作用性」プラスミドがあり、選択された導入遺伝子配列と付随する調節エレメントに５’及び３’側のＡＡＶのＩＴＲ配列が隣接させられたものである。ＡＡＶのＩＴＲ配列は、本明細書で特定される哺乳動物のＡＡＶ型を含むいずれの公知のＡＡＶからも得ることができる。
ｒＡＡＶベクターについて上記に特定された主要なエレメント以外に、ベクターは、ベクターをトランスフェクトした、または本開示により作製されたウイルスを感染させた細胞内での導入遺伝子の転写、翻訳及び／または発現を可能とする形で導入遺伝子と機能的に連結された従来の制御エレメントも含む。発現制御配列は、適当な転写開始配列、転写終止配列、プロモーター配列、及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；及び必要に応じてコードされた産物の分泌を高める配列を含む。天然、構成的、誘導性、及び／または組織特異的なプロモーターをはじめとする多くの発現制御配列が当該技術分野では周知であり、本明細書に記載のベクターに含めることができる。いくつかの実施形態では、機能的に連結されたコード配列は、機能性ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）を生ずる。
構成的プロモーターの例としては、これらに限定されるものではないが、レトロウイルス性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを含む）、ＳＶ４０プロモーター、及びジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能とし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、もしくは例えば急性期、細胞の特定の分化状態などの特定の生理学的状態の存在によって、または複製中の細胞においてのみ調節され得る。誘導性プロモーター及び誘導性システムは、これらに限定されるものではないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＡｒｉａｄをはじめとする広範な販売元から入手可能である。多くの他のシステムが記載されており、当業者によって容易に選択することができる。外因的に与えられるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム、エクジソン昆虫プロモーター、テトラサイクリン抑制システム、テトラサイクリン誘導システム、ＲＵ４８６誘導システム及びラパマイシン誘導システムが挙げられる。この関連で有用となり得るさらに他のタイプの誘導性プロモーターは、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態などの特定の生理学的状態により、または複製中の細胞においてのみ調節されるものである。別の実施形態では、導入遺伝子の天然プロモーターまたはその断片が用いられる。さらなる実施形態では、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列などの他の天然の発現制御エレメントを天然の発現を模倣するために用いることもできる。
いくつかの実施形態では、調節配列は組織特異的な遺伝子発現能を付与する。場合によっては、組織特異的調節配列は、組織特異的な形で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。そのような組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は当該技術分野では周知のものである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、またはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、肝細胞で本明細書に記載の阻害性ＲＮＡを発現させるために設計され、ｒＡＡＶは、阻害性ＲＮＡの発現を肝細胞に実質的に限定する１つ以上の肝臓特異的調節エレメントを含む。一般に、肝臓特異的調節エレメントは、肝臓でのみ発現することが知られている任意の遺伝子に由来し得る。ＷＯ２００９／１３０２０８では、α－アンチトリプシンとしても知られるセルピンペプチダーゼ阻害剤、クラーデＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１；遺伝子ＩＤ５２６５）、アポリポタンパク質Ｃ－Ｉ（ＡＰＯＣ１；遺伝子ＩＤ３４１）、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＶ（ＡＰＯＣ４；遺伝子ＩＤ３４６）、アポリポタンパク質Ｈ（ＡＰＯＨ；遺伝子ＩＤ３５０）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；遺伝子ＩＤ７２７６）、アルブミン（ＡＬＢ；遺伝子ＩＤ２１３）、アルドラーゼＢ（ＡＬＤＯＢ；遺伝子ＩＤ２２９）、シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＥ、ポリペプチド１（ＣＹＰ２Ｅ１；遺伝子ＩＤ１５７１）、フィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ；遺伝子ＩＤ２２４３）、トランスフェリン（ＴＦ；遺伝子ＩＤ７０１８）、及びハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ；遺伝子ＩＤ３２５０）を含む、肝臓特異的に発現されるいくつかの遺伝子を特定している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、これらのタンパク質の１つ以上のゲノム座位に由来する肝臓特異的調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）であり得る。あるいは、他の肝臓特異的プロモーターを使用してもよい（例えば、Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ／を参照、例えば、α１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）；ヒトアルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５１２４ ３２（１９９７））；ｈｕｍＡ１ｂ；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１００２ ９（１９９６））；またはＬＳＰ１。さらなるベクター及び調節エレメントが、例えば、Ｂａｒｕｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．４０：４９７－５１７ （２０１７）に記載されている）。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター（例えばｒＡＡＶベクター）は、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、ベクター（例えばウイルスベクター）は、Ｃ３転写産物、例えばＣ３ ｍＲＮＡ（配列番号７５）の標的部分に相補的な核酸鎖を含む複数（例えば２、３、４、５個、またはそれ以上）のｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、複数のヌクレオチド配列を含み、各ヌクレオチド配列は、本明細書に記載される異なる阻害性ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも２つの異なる阻害性ＲＮＡをコードする複数のヌクレオチド配列を含み、これらのヌクレオチド配列のうちの少なくとも２つは、本明細書に記載の同じ阻害性ＲＮＡのコピーである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の阻害性ＲＮＡをコードする１つ以上の配列に加えて、ベクター（例えばウイルスベクター）は、１つ以上のＣ３阻害剤、例えば本明細書に記載のＣ３阻害剤をコードする１つ以上のさらなるヌクレオチド配列を含む。例えば、Ｃ３阻害剤は、ポリペプチド阻害剤及び／または核酸アプタマーであってよい（例えば、米国特許出願公開第２００３０１９１０８４号を参照）。例示的なポリペプチド阻害剤としては、コンプスタチン類似体（例えば、遺伝子コード可能なアミノ酸を含む、本明細書に記載されるコンプスタチン類似体）、抗Ｃ３または抗Ｃ３ｂ抗体（例えば、ｓｃＦｖまたはシングルドメイン抗体、例えば、ナノボディ）、Ｃ３またはＣ３ｂを分解する酵素（例えば、米国特許第６，６７６，９４３号を参照）、または哺乳動物の補体調節タンパク質（例えば、ＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＦＨ、ＣＦＩ、Ｃ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）、補体受容体１の可溶性形態（ｓＣＲ１）、ＴＰ１０またはＴＰ２０（Ａｖａｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、またはそれらの部分が挙げられる。さらなるポリペプチド阻害剤としては、ミニ因子Ｈ（例えば、米国特許公開第２０１５０１１０７６６号を参照）、黄色ブドウ球菌由来のＥｆｂタンパク質もしくは補体阻害剤（ＳＣＩＮ）タンパク質、またはそのバリアントもしくは誘導体もしくは模倣体（例えば、米国特許出願公開第２０１４０３７１１３３号を参照）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド阻害剤は、発現されたポリペプチド阻害剤の宿主細胞からの分泌のための分泌シグナル配列に結合される。
ＩＶ．発現ベクターの製造
発現ベクター、例えばｒＡＡＶを得るための方法は当該技術分野では周知のものである。一般的に、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質またはその断片と、機能性ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子からなる組換えＡＡＶベクターと、組換えＡＡＶベクターのＡＡＶカプシドタンパク質内へのパッケージングを可能とするのに十分なヘルパー機能と、をコードする核酸配列を含む宿主細胞を培養することを含む。
ｒＡＡＶベクターをＡＡＶベクター内にパッケージングするために宿主細胞内で培養される構成成分は、宿主細胞にトランスで与えることができる。あるいは、必要な構成成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及び／またはヘルパー機能）のいずれか１つ以上が、当業者には周知の方法を用いて必要な構成成分の１つ以上を含むように操作された安定な宿主細胞によって与えられてもよい。いくつかの実施形態では、かかる安定な宿主細胞、誘導性プロモーターの制御下の必要な構成成分（複数可）を含む。他の実施形態では、必要な構成成分（複数可）は構成的プロモーターの制御下にあってもよい。他の実施形態では、選択された安定な宿主細胞は、構成性プロモーターの制御下にある選択された構成成分（複数可）と、１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された構成成分（複数可）とを含むことができる。例えば、２９３細胞（構成性プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含む）から誘導されるが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含む安定な宿主細胞を作製することができる。当業者によれば、常法を用いて他の安定な宿主細胞を作製することができる。
本開示のｒＡＡＶを作製するために必要とされる組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、及びヘルパー機能は、任意の適当な遺伝的エレメント（例えば、ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択された遺伝的エレメントは、当該技術分野において、例えば、核酸操作の分野の当業者には周知の遺伝子操作、組換え操作、及び／または合成技術を含む任意の適当な方法により送達することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は周知であり、任意の適当な方法を本開示で使用することができる（例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２（１９９３）、及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照）。
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、三重トランスフェクション法（例えば、米国特許第６，００１，６５０号に記載される）を用いて作製することができる。いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、及びアクセサリー機能ベクターにパッケージングするためのＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）を宿主細胞にトランスフェクトすることにより作製される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的ＡＡＶ複製及びカプシド形成を行うためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードする。いくつかの実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能性のｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を生成することなく、効率的なＡＡＶの作製を支持する。本開示とともに使用するのに適したベクターの非限定的な例としては、ｐＨＬＰ１９（例えば、米国特許第６，００１，６５０号を参照）、及びｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクター（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号）が挙げられる。アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製するために依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／または細胞機能（すなわち、アクセサリー機能）のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能としては、これらに限定されるものではないが、ＡＡＶ遺伝子の転写活性化、段階特異的なＡＡＶのｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶのＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシドのアセンブリに関与する部分を含む、ＡＡＶの複製に必要とされる機能が挙げられる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外の）、及びワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来するものであってよい。
いくつかの実施形態では、本明細書は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されている場合に「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション法が当該技術分野で一般的に知られている（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ａｎｄ Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７．を参照）。これらの方法を使用して、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子のような１つ以上の外因性核酸を適当な宿主細胞内に導入することができる。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパーコンストラクト、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、及び／または組み換えＡＡＶの生成に関連する他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして用いることができる。用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用するところの「宿主細胞」とは、外因性ＤＮＡ配列をトランスフェクトした細胞を指す場合もある。単一の親細胞の子孫は、天然の変異、偶発的な変異、または意図的な変異のため、形態において、またはゲノム相補体もしくは全ＤＮＡの相補体において、元の親と必ずしも完全に同一でない場合がある点は理解されよう。
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを生成及び単離するためのさらなる方法は、例えば米国特許第７，７９０，４４９号、米国特許第７，２８２，１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及び米国特許第７，５８８，７７２号に記載されている。１つのシステムでは、プロデューサー細胞株に、ＩＴＲを隣接させた導入遺伝子をコードするコンストラクトと、ｒｅｐ及びｃａｐをコードするコンストラクト（複数可）とを一過性にトランスフェクトする。別のシステムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定的に与えるパッケージング細胞株に、ＩＴＲを隣接させた導入遺伝子をコードするコンストラクトを一過性にトランスフェクトする。これらのシステムのそれぞれにおいて、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応じてＡＡＶビリオンが産生され、夾雑ウイルスからｒＡＡＶが分離される。その他のシステムでは、ＡＡＶを回収するためのヘルパーウイルスの感染を必要とせず、ヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、システムによってトランスで与えられる。かかるシステムでは、ヘルパー機能をコードするコンストラクトで細胞を一過性にトランスフェクトすることによってヘルパー機能を与えるか、またはヘルパー機能をコードする遺伝子を安定的に含むように細胞を操作することができ、その遺伝子の発現を転写レベルまたは転写後のレベルで制御することができる。
さらに別のシステムでは、ＩＴＲ及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を隣接させた導入遺伝子を、バキュロウイルスベースのベクターによる感染によって昆虫宿主細胞に導入する。そのような産生システムは、当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照）。これら及び他のＡＡＶ産生システムを製造及び使用する方法は、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，７４１，６８３号、同第６，０５７，１５２号、同第６，２０４，０５９号、同第６，２６８，２１３号、同第６，４９１，９０７号、同第６，６６０，５１４号、同第６，９５１，７５３号、同第７，０９４，６０４号、同第７，１７２，８９３号、同第７，２０１，８９８号、同第７，２２９，８２３号、及び同第７，４３９，０６５号にも記載されている。
組み換えベクターを作製するための上記の方法は限定的であることを意図したものではなく、当業者には他の適当な方法が明らかであろう。
Ｖ．組成物及び投与
阻害性ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）、または本明細書に記載されるｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを使用して、補体媒介性疾患または障害、例えば、本明細書に記載される補体媒介性疾患または障害に罹患しているかまたは罹患しやすい対象を治療することができる。阻害性ＲＮＡの投与経路及び／または投与様式は、所望の結果に応じて異なり得る。当業者、すなわち医師には、投与計画が所望の応答、例えば治療応答を与えるように調整できる点は認識されよう。投与方法は、これらに限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、膣内、経皮、直腸、吸入、または局所が挙げられる。投与様式は、医療従事者の判断に任される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡは、全身投与され、眼に局所投与（例えば、脈絡膜上注射、網膜下注射、または硝子体内注射によって）されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡは全身投与され、さらなる補体阻害剤は投与されない（例えば、対象に全身的にまたは対象の眼に局所的に）。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる本明細書に記載の阻害性ＲＮＡは、全身投与され、眼に局所投与（例えば、脈絡膜上注射、網膜下注射、または硝子体内注射によって）されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡは、全身投与後に、ブルッフ膜に浸透しないかまたは通過しない（例えば、ブルッフ膜を実質的に浸透しないかまたは通過しない）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（または阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）は、阻害性ＲＮＡを眼に標的化し、眼への取り込みを増加させ、及び／またはブルッフ膜を通過する輸送を増加させる部分を含まない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される阻害性ＲＮＡの対象への全身投与は、例えば、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄのコントロールレベル（例えば、阻害性ＲＮＡを投与する前の対象の眼（例えば、眼の硝子体液、房水、網膜及び／または網膜色素上皮）内のＣ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄのコントロールレベル、本明細書に記載の疾患を有する対象の眼（例えば、眼の硝子体液、房水、網膜及び／または網膜色素上皮）内のＣ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄのレベル、及び／または本明細書に記載の疾患を有する対象の集団の眼（例えば、眼の硝子体液、房水、網膜及び／または網膜色素上皮）内のＣ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄの平均のレベル）に対して、対象の眼（例えば、眼の硝子体液、房水、網膜及び／または網膜色素上皮）内のＣ３の発現または活性のレベルの低下（例えば、１つ以上のＣ３活性化産物（例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄ）のレベルの低下）をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される阻害性ＲＮＡの対象への全身投与は、例えば、Ｃ３（及び／またはＣ３活性化産物、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄ）のコントロールレベル（例えば、阻害性ＲＮＡを投与する前の対象の眼のミクログリア、星状細胞、骨髄細胞、血管細胞、ドルーゼンまたはプラーク中、またはその表面上のＣ３（及び／またはＣ３活性化産物、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄ）のレベル、本明細書に記載の疾患を有する対象の眼のミクログリア、星状細胞、骨髄細胞、血管細胞、ドルーゼンまたはプラーク中、またはその表面上のＣ３（及び／またはＣ３活性化産物、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄ）のレベル、及び／または本明細書に記載の疾患を有する対象の集団の眼のミクログリア、星状細胞、骨髄細胞、血管細胞、ドルーゼンまたはプラーク中、またはその表面上のＣ３（及び／またはＣ３活性化産物、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄ）の平均のレベル）に対して、対象の眼のミクログリア、星状細胞、骨髄細胞、血管細胞、ドルーゼンまたはプラーク中、またはその表面上のＣ３（及び／またはＣ３活性化産物、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄ）の測定されるレベルを減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される阻害性ＲＮＡの全身投与は、対象の眼内（例えば、対象の眼の硝子体液、房水、網膜及び／または網膜色素上皮中、及び／または対象の眼のミクログリア、星状細胞、骨髄細胞、血管細胞、ドルーゼンまたはプラーク中）のＣ３（及び／またはＣ３活性化産物、例えば、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄ）のレベルを、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ及び／またはＣ３ｄのコントロールレベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、減少させる。いくつかの実施形態では、Ｃ３のレベルは、Ｃ３タンパク質レベルである。いくつかの実施形態では、Ｃ３のレベルは、Ｃ３のｍＲＮＡレベルである。
本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の細胞への送達は、多くの異なる方法で実現することができる。インビボ送達は、阻害性ＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって、例えば、非経口投与経路、例えば、皮下投与または静脈内投与または筋肉内投与によって行うことができる。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは送達剤と結合される。「送達剤」とは、阻害性ＲＮＡと非共有結合もしくは共有結合によって結合されるかまたは阻害性ＲＮＡと同時投与され、送達剤の非存在下で生物学的活性剤が送達（例えば、対象に投与）された場合にもたらされる安定性及び／または有効性を超えて生物活性剤の安定性及び／または有効性を増加させる１つ以上の機能を果たす物質または実体を指す。例えば、送達剤は、阻害性ＲＮＡを分解（例えば、血液中での）から保護し、阻害性ＲＮＡの細胞または目的の細胞区画（例えば、細胞質）内への進入を促進し、及び／または調節される分子標的を含む特定の細胞との結合性を高めることができる。当業者には、阻害性ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡを送達するために使用することが可能な多くの送達剤が認識されよう。これらの技術のいくつかの概説については、Ｋａｎａｓｔｙ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ．１２（１１）：９６７－７７（２０１３）を参照されたい。いくつかの実施形態では、例えば阻害性ＲＮＡを全身投与するために、阻害性ＲＮＡを、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達システムなどの送達剤と結合させることができる。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、正に帯電したカチオン送達系は、負に帯電した阻害性ＲＮＡの結合を促進し、負に帯電した細胞膜における相互作用を促進して、細胞による阻害性ＲＮＡの効率的な取り込みを可能にするものと考えられる。脂質（例えば、カチオン性脂質または中性脂質）、デンドリマー、またはポリマーを阻害性ＲＮＡに結合させてもよいし、阻害性ＲＮＡを封入するベシクルまたはミセルを形成させてもよい。カチオン性薬剤及び阻害性ＲＮＡを含む複合体を調製及び投与するための方法は、当該技術分野では周知のものである。いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２０１６０２９８１２４号に記載のデリバリー剤のいずれかを使用することが特に想到される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、脂質または脂質含有粒子と結合させて投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ナノ粒子または微粒子の形態であってよいカチオン性ポリマー（ポリペプチドまたは非ポリペプチドポリマーであってよい）、脂質、ペプチド、ＰＥＧ、シクロデキストリン、またはそれらの組み合わせと結合させて投与される。脂質またはペプチドは、カチオン性であってよい。「ナノ粒子」とは、１ナノメートル（ｎｍ）超かつ約１５０ｎｍ未満、例えば、２０ｎｍ～５０ｎｍまたは５０ｎｍ～１００ｎｍの２次元または３次元の寸法を有する粒子を指す。「マイクロ粒子」とは、１５０ｎｍ超かつ約１０００ｎｍ未満の２次元または３次元の寸法を有する粒子を指す。ナノ粒子には、標的部分及び／または細胞透過部分または膜活性部分を、共有結合により、または共有結合によらずに結合させることができる。脂質ナノ粒子などのナノ粒子については、例えば、Ｔａｔｉｐａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７：７７（２０１７）に記載されている。例示的な送達剤、製造方法及び阻害性ＲＮＡの送達における使用は、米国特許第７，４２７，６０５号、同第８，１５８，６０１号、同第９，０１２，４９８号、同第９，４１５，１０９号、同第９，０６２，０２１号、同第９，４０２，８１６号に記載されている。いくつかの実施形態では、当該技術分野において「スマート粒子」（Ｓｍａｒｔｉｃｌｅ）として知られる送達技術を使用することが想到される。いくつかの実施形態では、当該技術分野において「安定核酸脂質粒子」（ＳＮＡＬＰ）として知られる送達技術の使用が想到され、送達しようとする核酸を、中性の親水性外表面を与える拡散性ポリエチレングリコール－脂質（ＰＥＧ－脂質）結合体でやはりコーティングされたカチオン性脂質と融合性脂質の混合物を含む脂質二重層に封入する。
いくつかの実施形態では、送達剤は、米国特許第９，０４４，５１２号に記載されるもののような１種以上のアミノアルコールカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、送達剤は、１種以上のアミノ酸脂質を含む。アミノ酸脂質とは、アミノ酸残基（例えば、アルギニン、ホモアルギニン、ノルアルギニン、ノル－ノルアルギニン、オルニチン、リシン、ホモリシン、ヒスチジン、１－メチルヒスチジン、ピリジルアラニン、アスパラギン、Ｎ－エチルアスパラギン、グルタミン、４－アミノフェニルアラニン、それらのＮ－メチル化体、及びそれらの側鎖修飾誘導体）と１つ以上の親油性尾部とを含む分子である。例示的なアミノ酸脂質及び核酸を送達するためのそれらの使用については、米国特許出願公開第２０１１０１１７１２５号、ならびに米国特許第８，８７７，７２９号、同第９，１３９，５５４号、及び同第９，３３９，４６１号に記載されている。いくつかの実施形態では、例えば、米国特許出願公開第２０１３０２８９２０７号に記載されるもののような膜溶解性ポリ（アミドアミン）ポリマー及び多結合体を使用することができる。いくつかの実施形態では、送達剤は、中心ペプチドを含み、かつ各末端に結合された親油性基を有するリポペプチド化合物を含む。いくつかの実施形態では、親油性基は、天然に存在する脂質から誘導することができる。いくつかの実施形態では、親油性基は、Ｃ（１～２２）アルキル、Ｃ（６～１２）シクロアルキル、Ｃ（６～１２）シクロアルキル－アルキル、Ｃ（３～１８）アルケニル、Ｃ（３～１８）アルキニル、Ｃ（１～５）アルコキシ－Ｃ（１～５）アルキル、またはスフィンガニン、または（２Ｒ，３Ｒ）－２－アミノ－１，３－オクタデカンジオール、イコサスフィンガニン、スフィンゴシン、フィトスフィンゴシン、または４－スフィンゲニンを含み得る。中心ペプチドは、カチオン性または両親媒性アミノ酸配列を含み得る。そのようなリポペプチドの例及び核酸を送達するためのそれらの使用については、例えば米国特許第９，２２０，７８５号に記載されている。
「マスキング部分」とは、他の薬剤（例えば、ポリマー）と物理的に結合させられる場合に薬剤の１つ以上の特性（生物物理学的または生化学的特性）または活性を遮断、阻害または不活性化する分子または基を意味する。いくつかの実施形態では、マスキング部分は阻害性ＲＮＡに共有結合または非共有結合により結合させることができる。マスキング部分は可逆的であってもよく、これは、マスキング部分が可逆的結合を介してマスキングする阻害性ＲＮＡに結合させられていることを意味する。当業者には認識されるように、所望のレベルの不活性化を達成するのに十分な数のマスキング部分が、マスキングしようとする阻害性ＲＮＡに結合させられる。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ポリマーである送達薬剤に結合される。有用な送達ポリマーとしては、例えば、ポリ（アクリレート）ポリマー（例えば、米国特許出願公開第２０１５０１０４４０８号を参照）、ポリ（ビニルエステル）ポリマー（例えば、米国特許第２０１５０１１０７３２号を参照）及び特定のポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、送達ポリマーは、可逆的にマスキングされた膜活性ポリマーである。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡもしくはポリマー、またはその両方に標的部分が結合される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡまたは阻害性ＲＮＡ－標的化部分結合体は、送達ポリマーと同時投与されるが、ポリマーには結合されない。この関連で「同時投与される」とは、阻害性ＲＮＡと送達ポリマーとが、重複する時間に対象中に存在するように対象に投与されることを意味する。阻害性ＲＮＡ－標的化部分結合体と送達ポリマーとは、同時に投与してもよく、または順次送達されてもよい。同時投与の場合、これらを投与に先立って混合してもよい。順次投与の場合、阻害性ＲＮＡまたは送達ポリマーのいずれかを最初に投与することができる。阻害性ＲＮＡ及び送達ポリマーは、同じ組成物中で投与してもよく、または阻害性ＲＮＡの細胞への細胞質送達が、ポリマーの投与なしでもたらされる細胞質送達に対して促進されるように十分に近い時間で別々に投与してもよい。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡと送達ポリマーとは、１５分、３０分、６０分、または１２０分を超えないように離れて投与される。いくつかの実施形態では、送達ポリマーは、標的化された、可逆的にマスキングされた膜活性ポリマーである。このポリマーには、阻害性ＲＮＡの細胞質送達の促進が望ましい細胞にポリペプチドを標的化する標的化部分が結合されている。阻害性ＲＮＡは、場合により同じ標的化部分を用いて同じ細胞に対して標的化することができる。すなわち、阻害性ＲＮＡは、阻害性ＲＮＡ－標的化部分結合体として投与することができる。本明細書で使用する場合、膜活性ポリマーとは、生体膜に対して以下の効果、すなわち、非膜透過性分子が細胞に入るもしくは膜を通過することを可能にするような膜の変性もしくは破壊、膜への細孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解のうちの１つ以上を誘導することができる表面活性の両親媒性ポリマーである。本明細書で使用する場合、膜または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変性または破壊は、以下のアッセイ、すなわち、赤血球の溶解（溶血）、リポソームの漏れ、リポソームの融合、細胞融合、細胞溶解、及びエンドソーム放出のうちの少なくとも１つにおけるポリマーの活性によって機能的に定義することができる。膜活性ポリマーは、例えば、膜に細孔を形成することによって原形質膜または内部小胞膜（エンドソームまたはリソソームなど）を破壊または不安定化することにより、またはエンドソームまたはリソソーム小胞を破壊し、それによって、小胞の内容物を細胞質中に放出させることにより、ポリヌクレオチドの細胞への送達性を高めることができる。いくつかの実施形態では、標的化された、可逆的にマスキングされた膜活性ポリマーは、エンドソーム溶解性ポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーとは、ｐＨの変化に応じてエンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こすか、あるいはエンドソームまたはリソソームなどの細胞の内膜封入小胞からのポリヌクレオチドまたはタンパク質などの通常は細胞膜不透過性の化合物の放出をもたらすことができるポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンであり、可逆的な修飾は、膜活性を阻害し、ポリアミンを中和して正電荷を低減し、中性に近い電荷のポリマーを形成する。可逆的な修飾はまた、ポリマーの細胞型特異的な標的化をもたらし、及び／または非特異的相互作用を阻害することができる。ポリアミンは、ポリアミンの各アミンの可逆的修飾により可逆的に修飾することができる。可逆的にマスキングされた膜活性高分子は、マスキングされている場合には実質的に膜活性ではなく、マスキングが外される場合に膜活性となる。マスキング部分は、一般的に、生理学的に可逆的な結合を介して膜活性ポリマーに共有結合される。生理学的に可逆的な結合を使用することによって、マスキング部分はインビボでポリマーから切断され、それによってポリマーのマスキングを外し、マスキングが外れたポリマーの活性を回復させることができる。適切な可逆的結合を選択することにより、結合体が所望の細胞型または細胞の位置に送達または標的化された後に、膜活性ポリマーの活性が回復される。結合の可逆性は、膜活性ポリマーの選択的活性化を可能とする。生理的に可逆的な結合は、哺乳動物細胞でみられる化学的条件またはそれに類似の化学的条件、例えばｐＨ、温度、酸化的もしくは還元的な条件または薬剤、及び塩濃度を含む哺乳動物の細胞内条件の下で可逆的である。いくつかの実施形態では、標的化部分、例えばＡＳＧＰＲ標的化部分は、マスキング部分として機能することができる。いくつかの実施形態では、ＡＳＧＰＲターゲティング部分には親油性部分が結合されている。例示的な標的化部分（例えばＡＳＧＰＲ標的化部分）、生理学的に不安定な結合（例えば、酵素的に不安定な結合、ｐＨに不安定な結合）、マスキング部分、膜活性ポリマー（例えば、エンドソーム溶解活性ポリマー）、親油性部分、ＲＮＡｉ剤－標的化部分結合体、送達剤－標的化部分結合体、ＲＮＡｉ剤、標的化部分、及び送達剤を含む結合体、ならびに核酸を細胞（例えば、肝細胞）に送達する方法については、米国特許出願公開第２０１３０２４５０９１号、同第２０１３０３１７０７９号、同第２０１２０１５７５０９号、同第２０１２０１６５３９３号、同第２０１２０１７２４１２号、同第２０１２０２３０９３８号、同第２０１４０１３５３８０号、同第２０１４０１３５３８１号、同第２０１５０１０４４０８号、及び同第２０１５０１１０７３２に記載されている。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、例えば米国特許第２０１２０１６５３９３号明細書に記載されるように、メリチンペプチドと同時投与される。阻害性ＲＮＡ、メリチンペプチド、またはその両方には、場合により可逆的結合を介して標的化部分が結合されてもよい。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、例えば米国特許出願公開第２０１５０１１０７３２号に記載されるようなジペプチド－アミドベンジル－カーボネートまたは二置換マレイン酸無水物マスキング部分を含む。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、「ネイキッド」形態で投与することができる（すなわち、送達剤の非存在下で投与することができる）。ネイキッド阻害性ＲＮＡは、適当な緩衝液中に存在してよい。緩衝液は、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。緩衝液のｐＨ及び浸透圧は対象への投与に適するように調整することができる。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、脂質または脂質含有粒子と物理的に結合していない状態で投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ナノ粒子またはマイクロ粒子と物理的に結合していない状態で投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、カチオン性ポリマーと物理的に結合していない状態で投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、シクロデキストリンと物理的に結合していない状態で投与される。いくつかの実施形態では、「ネイキッド」形態で投与される阻害性ＲＮＡは、標的部分を含む。
阻害性ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）、または本明細書に記載のｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、医薬組成物に加えることができる。そのような医薬組成物は、とりわけ、インビボまたはエクスビボでの対象への投与及び送達に有用である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。そのような賦形剤としては、任意の医薬品、例えば、それ自体が組成物を投与される個体に有害な免疫応答を誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る医薬品が挙げられる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」という用語は、生物学的に許容される製剤、気体、液体もしくは固体、またはそれらの混合物を意味し、これは、１つ以上の投与経路、インビボ送達または接触に適している。薬学的に許容される賦形剤としては、水、生理食塩水、グリセロール、糖、及びエタノールなどの液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩などもまたそこに含めることができる。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのようなビヒクルに存在してもよい。
医薬組成物は塩として提供することができ、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むがこれらに限定されない多くの酸で形成することができる。塩は、対応する遊離塩基の形態よりも水性または他のプロトン性の溶媒に溶けやすい傾向にある。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥された粉末であり得る。
医薬組成物は、医薬投与またはインビボでの接触もしくは送達と適合性がある、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルション（例えば、水中油型または油中水型）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散液及び懸濁媒体、コーティング、等張性及び吸収促進剤または吸収遅延剤を含み得る。水性及び非水性の溶媒、溶液及び懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含み得る。そのような薬学的に許容される担体には、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル（ハードまたはソフト）、マイクロビーズ、粉末、顆粒及び結晶が含まれる。補助的な活性化合物（例えば、防腐剤、抗菌剤、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）もまた、組成物に組み込むことができる。
医薬組成物は、本明細書に記載されているように、または当業者に知られているように、特定の投与経路または送達経路と適合性があるように製剤化することができる。したがって、医薬組成物には、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤が含まれる。
非経口投与に適した組成物は、活性化合物の水溶液及び非水溶液、懸濁液またはエマルションを含むことができ、これらの製剤は、典型的には無菌であり、意図されるレシピエントの血液と等張であることができる。非限定的な例示的な例には、水、緩衝生理食塩水、ハンクス液、リンガー液、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物油、植物油、または合成油が含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。任意選択で、そのような懸濁液は、好適な安定剤または高度に濃縮された溶液の調製を可能にする医薬品の溶解度を増加させる薬剤も含有し得る。
共溶媒及びアジュバントを製剤に加えることができる。共溶媒の非限定的な例としては、ヒドロキシル基または他の極性基、例えば、イソプロピルアルコールなどのアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテルなどのグリコール；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコール及びポリオキシエチレン脂肪酸エステルが挙げられる。アジュバントとしては、例えば、大豆レシチン及びオレイン酸などの界面活性剤；ソルビタントリオレエートなどのソルビタンエステル；及びポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
医薬組成物が調製された後、それらは適切な容器に入れられ、治療のために標識され得る。そのような標識には、投与量、投与の頻度、及び投与方法を含めることができる。
本開示の組成物、方法、及び使用に適した医薬組成物及び送達システムは、当該技術分野では周知のものである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５を参照）。
本開示はまた、阻害性ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）、または本明細書に記載のｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを細胞または動物に導入する方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、対象（例えば、対象の細胞または組織）を、対象（例えば、哺乳類などの対象）に、本明細書に記載された阻害性ＲＮＡ（または本明細書に記載された阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）と接触または投与して、阻害性ＲＮＡを対象（例えば、対象の細胞または組織）に発現させることを含む。別の実施形態では、方法は、個体（哺乳類などの患者または対象）の細胞に本明細書に記載される阻害性ＲＮＡ（または本明細書に記載される阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）を与えることにより、阻害性ＲＮＡを個体で発現させることを含む。
本明細書に記載の阻害性ＲＮＡの組成物（または本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター））は、阻害性ＲＮＡの組成物の投与を必要とする対象に十分または有効な量で投与され得る。用量は異なり得、治療の対象となる疾患の種類、発症、進行、重症度、頻度、持続時間、または確率、所望の臨床的エンドポイント、以前のまたは同時の治療、対象の一般的な健康状態、年齢、性別、人種、または免疫適格性、ならびに当業者により認識されるその他の要因に応じて決まる。治療または療法の任意の有害副作用、合併症または他の危険因子、及び対象の状態により示されるように、投与量、回数、頻度または持続時間は、比例して増加または減少させることができる。当業者は、治療的または予防的なベネフィットをもたらすうえで十分な量を与えるために必要な投与量及びタイミングに影響を及ぼし得る要因は認識されよう。
治療効果を得るための用量、例えば、体重１ｋｇ当たりのベクターゲノムの用量（ｖｇ／ｋｇ）（例えば、ベクターによる送達の場合）または体重１ｋｇ当たりのｍｇ（ｍｇ／ｋｇ）は、投与経路、治療効果を得るために必要な阻害性ＲＮＡの発現レベル、治療される特定の疾患、ウイルスベクターに対するあらゆる宿主免疫応答、異種阻害性ＲＮＡに対する宿主免疫応答、及び発現された阻害性ＲＮＡの安定性を含む（ただしこれらに限定されない）複数の要因に基いて異なる。当業者によれば、阻害剤ＲＮＡのベクターによる送達について、上記の要因ならびに他の要因に基づいて特定の疾患または障害を有する患者を治療するためのｒＡＡＶ／ベクターゲノムの用量範囲を決定することができる。一般的には、治療効果を得るためには、用量は、対象の体重１ｋｇ当たり、少なくとも１×１０８以上、例えば、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４以上のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の範囲である。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡの組成物は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇの間の量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ組成物は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ組成物は、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ～２．５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ～５．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、固定用量が投与される。いくつかの実施形態では、用量は、５ｍｇ～１．０ｇ、例えば、５ｍｇ～１０ｍｇ、１０ｍｇ～２０ｍｇ、２０ｍｇ～４０ｍｇ、４０ｍｇ～８０ｍｇ、８０ｍｇ～１６０ｍｇ、１６０ｍｇ～３２０ｍｇ、３２０ｍｇ～６４０ｍｇ、６４０ｍｇ～１ｇである。いくつかの実施形態では、用量は、約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、または１０００ｍｇである。いくつかの実施形態によれば、用量は１日用量である。いくつかの実施形態では、用量は、少なくとも２日間、例えば、少なくとも７日間、例えば、約２、３、４、６または８週間の投与間隔を有する投与計画に従って投与される。例えば、いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ組成物は、少なくとも７日間の投与間隔を有する投与計画に従って投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ組成物は、毎日、毎週、毎月、または２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、または６ヶ月以上おきに投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される用量及び／または投与計画のいずれかが皮下投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ組成物が一旦投与された後に阻害レベルが測定され、阻害レベルが一定レベルに減少した時点で、阻害性組成物の次の用量が投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、例えば投与後少なくとも２日間、例えば少なくとも７日間、例えば約２、３、４、６、８、１０、１２、１６または２０週間の期間にわたり、例えばＣ３ ｍＲＮＡ発現（例えば、肝組織、例えば、肝生検における）によって測定されるＣ３の持続的な阻害を示す。いくつかの実施形態では、対象は血清Ｃ３のレベルの低下を示し、血清Ｃ３のレベルの低下は、例えば投与後少なくとも２日間、例えば少なくとも７日間、例えば約２、３、４、６、８、１０、１２、１６または２０週間の期間にわたって維持される。
有効量または十分な量は、単一の投与で与えることができ（ただし、必須ではない）、複数会の投与を必要とする場合もあり、単独でまたは別の組成物（例えば、本明細書に記載される別の補体阻害剤）と組み合わせて投与することができる（ただし、必須ではない）。例えば、治療される疾患または治療の副作用（ある場合）の対象、種類、状態及び重症度のニーズによって示されるように、量を比例して増加させることができる。有効とみなされる量には、別の治療、治療計画またはプロトコールの使用、例えば、本明細書に記載される別の補体阻害剤の投与の減少につながる量も含まれる。
したがって、本開示の医薬組成物には、意図される治療目的を達成するのに有効な量の有効成分が含まれる組成物が含まれる。治療有効用量を決定することは、本開示で提供される技術及びガイダンスを用いれば十分に当業者の技能の範囲内である。治療用量は、他の要因の中でも、対象の年齢及び一般的状態、補体媒介性疾患または障害の重症度、及び本明細書に記載される阻害性ＲＮＡの発現レベルを調節する制御配列の強度に依存し得る。したがって、ヒトにおける治療有効量は、ベクターによる治療に対する個々の患者の応答に基づいて医療従事者が決定することができる比較的広い範囲に含まれるであろう。医薬組成物は、遺伝子及び／または細胞に基づいた治療によって、または患者もしくはドナーの細胞をエクスビボで改変することによって、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをインビボで産生できるように対象に送達することができる。
本開示の方法及び使用には、任意の経路、例えば注射または注入による全身への送達及び投与が含まれる。インビボでの医薬組成物の送達は、一般に、従来の注射器を使用する注射を介して達成され得るが、対流増強送達などの他の送達方法も使用され得る（例えば、米国特許第５，７２０，７２０号を参照）。例えば、組成物は、皮下、表皮、皮内、粘膜内、腹腔内、静脈内、胸膜内、動脈内、経口、肝内、門脈を介して、及び筋肉内に投与することができる。他の投与様式には、経口及び肺投与、坐剤、及び経皮適用が含まれる。補体媒介性疾患を有する患者の治療を専門とする臨床医は、阻害性ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）、または本明細書に記載されるｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与するための最適な経路を決定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（または本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）は、１日１回、週１回、２週間、３週間もしくは４週間に１回、またはそれより長い間隔で対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（または本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）は、（ｉ）１日１回、週１回、２週間、３週間もしくは４週間に１回、またはそれより長い間隔の最初の投与と、その後の（ｉｉ）例えば、１、２、３、４、５、６、８、９もしくは１０ヶ月、または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０年の非投与期間とを含む投与計画に従って投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、（ｉ）２週間、４週間、または６週間またはそれ以下の最初の期間に１回以上投与し、その後、（ｉｉ）例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０年間の非投与期間を置くことができる。いくつかの実施形態では、対象は、治療の前及び／または後に、例えば代替経路アッセイ、古典的経路アッセイ、またはその両方を使用して測定されるように、Ｃ３の発現及び／または活性のレベルについて監視される。適当なアッセイは当該技術分野では周知のものであり、例えば溶血アッセイを含む。いくつかの実施形態では、対象は、Ｃ３の発現及び／または活性の測定されるレベルが、コントロールの対象におけるＣ３の発現及び／または活性の測定されるレベルに対して１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、またはそれ以上である場合に治療または再治療される。
ＶＩ．疾患、障害及び状態
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（または本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）は、単独で、または本明細書に記載の１つ以上のさらなる補体阻害剤と組み合わせて、黄斑変性（例えば加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及びスターガルト黄斑ジストロフィー）、糖尿病性網膜症、緑内障、またはブドウ炎などの眼疾患を治療するために対象に全身投与（例えば皮下）される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（または本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）は、単独で、または本明細書に記載の１つ以上のさらなる補体阻害剤と組み合わせて、ＡＭＤに罹患しているかまたはＡＭＤのリスクを有する対象を治療するために全身投与（例えば、皮下または静脈内）することができる。いくつかの実施形態では、ＡＭＤは血管新生（滲出型）ＡＭＤである。いくつかの実施形態では、ＡＭＤは、乾性ＡＭＤである。当業者には理解されるように、乾性ＡＭＤには、地理的萎縮症（ＧＡ）、中期ＡＭＤ、及び初期ＡＭＤが含まれる。いくつかの実施形態では、ＧＡを有する対象は、疾患の進行を遅らせるかまたは停止させるために治療される。例えば、いくつかの実施形態では、ＧＡを有する対象の治療は、網膜細胞死の速度を低下させる。網膜細胞死の速度の低下は、単独で、または本明細書に記載の１つ以上のさらなる補体阻害剤と組み合わせた、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（または本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）で治療された患者におけるＧＡ病変の速度の、コントロール（例えば、シャム投与を行った患者）と比較した低下によって示すことができる。いくつかの実施形態では、対象は中期ＡＭＤを有する。いくつかの実施形態では、対象は初期ＡＭＤを有する。いくつかの実施形態では、中期または初期ＧＡを有する対象は、疾患の進行を遅らせるかまたは停止させるために治療される。例えば、いくつかの実施形態では、中期ＡＭＤを有する対象の治療は、進行型のＡＭＤ（血管新生ＡＭＤまたはＧＡ）への進行を遅らせるかまたは防止することができる。いくつかの実施形態では、中期ＡＭＤを有する対象の治療は、進行型のＡＭＤ（血管新生ＡＭＤまたはＧＡ）への進行を遅らせるかまたは防止することができる。いくつかの実施形態では、眼はＧＡ及び血管新生ＡＭＤの両方を有する。いくつかの実施形態では、眼はＧＡを有するが、滲出型ＡＭＤを有さない。
いくつかの実施形態では、対象は、黄斑変性、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、網膜血管新生（ＲＮＶ）、眼炎症、または上記の任意の組み合わせによって特徴付けられる眼疾患を有する。黄斑変性症、ＣＮＶ、ＲＮＶ、及び／または眼炎症は、この疾患の定義及び／または診断上の特徴となり得る。これらの特徴の１つ以上を特徴とする例示的な疾患としては、これらに限定されるものではないが、黄斑変性関連症状、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、増殖性硝子体網膜症、ぶどう膜炎、角膜炎、結膜炎、及び強膜炎が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は眼炎症の治療を必要とする。眼炎症は、結膜（結膜炎）、角膜（角膜炎）、上強膜、強膜（強膜炎）、ブドウ膜路、網膜、血管系、及び／または視神経などの多くの眼の構造に生じ得る。眼炎症の証拠には、眼内の白血球（例、好中球、マクロファージ）などの炎症関連細胞の存在、内因性炎症メディエーター（複数可）の存在、眼痛、充血、光過敏、かすみ目、及び飛蚊症などの１つ以上の症状が含まれ得る。ブドウ膜炎は、眼のブドウ膜、例えば虹彩、毛様体、または脈絡膜を含むブドウ膜の構造のいずれかにおける炎症を指す一般用語である。ブドウ膜炎の特定の種類としては、虹彩炎、虹彩毛様体炎、毛様体炎、扁平部炎及び脈絡膜炎が挙げられる。いくつかの実施形態では、眼疾患は、緑内障などの視神経傷害（例えば、視神経変性）を特徴とする眼疾患である。
いくつかの実施形態では、比較的短期間、例えば１週間～６週間、例えば約２～４週間の、単独で、または本明細書に記載の１つ以上のさらなる補体阻害剤と組み合わされた本明細書に記載の阻害性ＲＮＡ（または本明細書に記載の阻害性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）により、長期的な効果がもたらされる可能性があることが想到される。いくつかの実施形態では、寛解は、長期間、例えば、１～３ヶ月、３～６ヶ月、６～１２ヶ月、１２～２４ヶ月、またはそれ以上にわたって達成される。いくつかの実施形態では、症状が再発する前に、対象を監視及び／または予防的に治療することができる。例えば、対象を、誘因事象への曝露前または曝露後に治療することができる。いくつかの実施形態では、対象を、例えば、バイオマーカー、例えば、Ｔｈ１７細胞もしくはＴｈ１７細胞活性、または補体活性化の指標を含むバイオマーカーの増加について監視することができ、そのようなバイオマーカーのレベルの増加に応じて治療することができる。さらなる考察については、例えばＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４３８４５を参照されたい。
ＶＩＩ．併用療法
いくつかの態様では、本開示の方法は、本明細書に記載のｒＡＡＶを単独で、または１つ以上のさらなる補体阻害剤と組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、別の補体阻害剤による治療をすでに受けている対象に投与される。いくつかの実施形態では、別の補体阻害剤が阻害性ＲＮＡを受けている対象に投与される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡと別の補体阻害剤の両方が対象に投与される。
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡの投与により、単独療法としての第２の補体阻害剤の投与と比較して、第２の補体阻害剤を低減された投薬レジメン（例えば、個々の用量の量を少なくする、投与頻度を減らす、投与回数を減らす、及び／または全体の曝露を減らす）で投与することが可能となる。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、いくつかの実施形態では、第２の補体阻害剤の低減された投薬レジメンにより、これが行われない場合に生じ得る１つ以上の望ましくない副作用を回避することができる。
いくつかの態様では、第２の補体阻害剤と組み合わせた阻害性ＲＮＡの全身投与は、所望の補体阻害度を実現するうえで阻害性ＲＮＡ及び／または第２の補体阻害剤の投薬レジメンの低減が必要とされるよう、対象の血液中のＣ３の量を十分に減少させることができる。
いくつかの態様では、第２の補体阻害剤と組み合わせた阻害性ＲＮＡの全身投与は、補体媒介性疾患の１つ以上の徴候、症状、バイオマーカー、または予後の尺度の所望の量または所望のレベルの改善を実現するうえで、阻害性ＲＮＡ及び／または第２の補体阻害剤の投薬レジメンの低減が必要とされるよう、対象の血液中のＣ３の量を十分に減少させることができる。
いくつかの実施形態では、そのような低減された用量は、単独療法としての阻害性ＲＮＡまたは第２の補体阻害剤の投与と比較して、より少ない量で、またはより低い濃度を使用して、またはより長い投与間隔を使用して、または上記の任意の組み合わせで投与することができる。
任意の補体阻害剤、例えば当該技術分野では周知の補体阻害剤を、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、補体阻害剤は、コンプスタチンまたはコンプスタチン類似体である。
コンプスタチンは、Ｃ３に結合し、補体の活性化を阻害する環状ペプチドである。米国特許第６，３１９，８９７号は、Ｉｌｅ－［Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ａｓｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ］－Ｔｈｒ（配列番号１）の配列を有するペプチドが記載されており、２つのシステイン間のジスルフィド結合は括弧で示されている。「コンプスタチン」という名称は米国特許第６，３１９，８９７号では使用されていないものの、その後、科学文献及び特許文献（例えば、Ｍｏｒｉｋｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，７（３）：６１９－２７，１９９８を参照）において、米国特許第６，３１９，８９７号に開示される配列番号２と同じ配列を有するが、Ｃ末端でアミド化されているペプチドを指して用いられている点は理解されよう。「コンプスタチン」という用語は、本明細書ではそのような使用に合わせて使用されている。コンプスタチンよりも高い補体阻害活性を有するコンプスタチン類似体が開発されている。例えば、ＷＯ２００４／０２６３２８（ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２９６５３）、Ｍｏｒｉｋｉｓ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．３２（Ｐｔ １）：２８－３２，２００４、Ｍａｌｌｉｋ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２７４－２８６，２００５；Ｋａｔｒａｇａｄｄａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４９：４６１６－４６２２，２００６；ＷＯ２００７０６２２４９（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５５３９）；ＷＯ２００７０４４６６８（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３９３９７）、ＷＯ／２００９／０４６１９８（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８５９３）；ＷＯ／２０１０／１２７３３６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３３４５）を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「コンプスタチン類似体」という用語は、コンプスタチン及びその任意の補体阻害類似体を含む。「コンプスタチン類似体」という用語は、コンプスタチン、ならびにコンプスタチン及びコンプスタチンに基づいて設計または同定され、その補体阻害活性が、例えば、当該技術分野で認められている任意の補体活性化アッセイまたは実質的に類似もしくは同等のアッセイを使用して測定したコンプスタチンの保体阻害活性の少なくとも５０％の大きさである他の化合物を包含する。特定の適切なアッセイは、米国特許第６，３１９，８９７号、ＷＯ２００４／０２６３２８、Ｍｏｒｉｋｉｓ，前出，Ｍａｌｌｉｋ，前出，Ｋａｔｒａｇａｄｄａ ２００６，前出、ＷＯ２００７０６２２４９（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５５３９）；ＷＯ２００７０４４６６８（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３９３９７）、ＷＯ／２００９／０４６１９８（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８５９３）；及び／またはＷＯ／２０１０／１２７３３６（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３３４５）に記載されている。アッセイは、例えば、副経路または古典的経路媒介赤血球溶解を測定するか、またはＥＬＩＳＡアッセイであり得る。いくつかの実施形態では、ＷＯ／２０１０／１３５７１７（ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５８７１）に記載されているアッセイが使用される。
表８は、本開示において有用なコンプスタチン類似体の非限定的なリストを提供する。類似体は、親ペプチドであるコンプスタチンと比較して、指定された位置（１～１３）での特定の改変を示すことにより、左の列で省略形で参照される。当該技術分野での使用と一致して、本明細書で使用される「コンプスタチン」、及びコンプスタチンの活性と比較した本明細書に記載のコンプスタチン類似体の活性は、Ｃ末端でアミド化されたコンプスタチンペプチドを指す。別途示されない限り、表８のペプチドはＣ末端でアミド化されている。太字のテキストは、特定の改変を示すために使用される。コンプスタチンと比較した活性は、そこに記載されている公開されたデータ及びアッセイに基づいている（ＷＯ２００４／０２６３２８、ＷＯ２００７０４４６６８、Ｍａｌｌｉｋ，２００５；Ｋａｔｒａｇａｄｄａ，２００６）。特定の実施形態では、表８に列挙されたペプチドは、本開示の治療組成物及び方法において使用される場合、２つのＣｙｓ残基間のジスルフィド結合を介して環化される。ペプチドを環化するための代替手段もまた、本開示の範囲内である。
Figure 2024521792000049
Figure 2024521792000050
本開示の組成物及び方法の特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列９～３６から選択される配列を有する。一実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号２８の配列を有する。本明細書で使用される場合、「Ｌ－アミノ酸」は、タンパク質またはそれらのα－アミノ酸のアルキルエステルに通常存在する天然に存在する左旋性α－アミノ酸のいずれかを指す。「Ｄ－アミノ酸」という用語は、右旋性アルファ－アミノ酸を指す。別段の定めがない限り、本明細書で言及されるすべてのアミノ酸はＬ－アミノ酸である。
いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体（例えば、本明細書に開示されるコンプスタチン類似体のいずれか）の１つ以上のアミノ酸（複数可）は、Ｎ－アルキルアミノ酸（例えば、Ｎ－メチルアミノ酸）であり得る。例えば、非限定的に、ペプチドの環状部分内の少なくとも１つのアミノ酸、環状部分のＮ末端の少なくとも１つのアミノ酸、及び／または環状部分のＣ末端の少なくとも１つのアミノ酸は、Ｎ－アルキルアミノ酸、例えば、Ｎ－メチルアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、例えば、コンプスタチン類似体は、例えば、コンプスタチンの位置８に対応する位置及び／またはコンプスタチンの位置１３に対応する位置に、Ｎ－メチルグリシンを含む。いくつかの実施形態では、表８のコンプスタチン類似体のうちの１つ以上は、例えば、コンプスタチンの位置８に対応する位置及び／またはコンプスタチンの位置１３に対応する位置に、少なくとも１つのＮ－メチルグリシンを含む。いくつかの実施形態では、表８のコンプスタチン類似体のうちの１つ以上は、例えば、コンプスタチンの位置１３に対応する位置に、少なくとも１つのＮ－メチルイソロイシンを含む。例えば、その配列が表８に列挙されているペプチドまたは他の任意のコンプスタチン類似体の配列のＣ末端またはその近くのＴｈｒは、Ｎ－メチルＩｌｅで置き換えることができる。理解されるように、いくつかの実施形態では、Ｎ－メチル化アミノ酸は、位置８にＮ－メチルＧｌｙ及び位置１３にＮ－メチルＩｌｅを含む。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体（例えば、表８に記載されたコンプスタチン類似体のいずれか１つ）は、本明細書に記載された１つ以上の置換の代わりにまたはそれに加えて、配列番号８の３位に対応する位置にイソロイシンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号８～３６のいずれか１つの配列を含むか、またはそれからなり、ただし、３位はイソロイシンである。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体は、配列番号２５、３３、または３６のいずれか１つの配列を含むか、またはそれからなり、ただし、４位はイソロイシンである。さらなるコンプスタチン類似体が、例えば、ＷＯ２０１９／１６６４１１に記載されている。
コンプスタチン類似体は、アミノ酸残基の縮合を介して当該技術分野で知られているペプチド合成の様々な合成方法によって調製することができ、例えば、従来のペプチド合成方法に従って、インビトロでの発現によって、または当該技術分野で知られている方法を使用して、生細胞において、コンプスタチン類似体をコードする適切な核酸配列から調製することができる。例えば、ペプチドは、Ｍａｌｉｋ，前出、Ｋａｔｒａｇａｄｄａ、前出、ＷＯ２００４０２６３２８、及び／またはＷＯ２００７０６２２４９に記載されているような標準的な固相方法論を使用して合成することができる。アミノ基及びカルボキシル基、反応性官能基などの潜在的に反応性の部分は、当該技術分野で知られている様々な保護基及び方法論を使用して保護され、続いて脱保護され得る。例えば、”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，３ｒｄ ｅｄ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．，Ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９９を参照されたい。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣなどの標準的なアプローチを使用して精製できる。ジアステレオマーペプチドの分離は、必要に応じて、逆相ＨＰＬＣなどの既知の方法を使用して実行できる。調製物は、必要に応じて凍結乾燥し、その後、適切な溶媒、例えば水に溶解することができる。得られた溶液のｐＨは、ＮａＯＨなどの塩基を使用して、例えば生理学的ｐＨに調整することができる。ペプチド調製物は、例えば、質量及び／またはジスルフィド結合の形成を確認するために、必要に応じて質量分析によって特徴付けることができる。例えば、Ｍａｌｌｉｋ，２００５、及びＫａｔｒａｇａｄｄａ，２００６を参照されたい。
コンプスタチン類似体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子を付加して、化合物を安定化し、その免疫原性を減少させ、体内でのその寿命を延ばし、その溶解度を増加及び減少させ、及び／または分解に対するその耐性を高めることによって改変できる。ペグ化の方法は当該技術分野でよく知られている（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．＆ Ｈａｒｒｉｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５３－４５６，２００２；Ｄａｖｉｓ，Ｆ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５７－４５８，２００２）；Ｈｉｎｄｓ，Ｋ．Ｄ．＆ Ｋｉｍ，Ｓ．Ｗ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，５０５－５３０（２００２；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．＆ Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｍ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，４５９－４７６；２００２）；Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４，５４７－５７０，２００２）。ポリペプチドを便利に結合できる誘導体化ＰＥＧを含む、ＰＥＧ及び修飾ＰＥＧなどの多種多様なポリマーは、Ｎｅｋｔａｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ２００５－２００６ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌｏｇ，Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡに記載されており、適切な結合手順の詳細も提供されている。
いくつかの実施形態では、配列番号９～３６のいずれかのコンプスタチン類似体は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方において１つ以上のアミノ酸によって伸長され、ここで、アミノ酸の少なくとも１つは、コンプスタチン類似体にＰＥＧを結合するための反応性官能基との結合を促進する、一級アミンもしくは二級アミン、スルフヒドリル基、カルボキシル基（カルボキシレート基として存在し得る）、グアニジノ基、フェノール基、インドール環、チオエーテル、またはイミダゾール環などの反応性官能基を含む側鎖を有する。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体は、一級または二級アミン、例えば、Ｌｙｓ残基を含む側鎖を有するアミノ酸を含む。例えば、Ｌｙｓ残基、またはＬｙｓ残基を含む配列は、本明細書に記載のコンプスタチン類似体（例えば、配列番号９～３６のいずれか１つを含むコンプスタチン類似体）のＮ末端及び／またはＣ末端に付加される。
いくつかの実施形態では、Ｌｙｓ残基は、剛性または可撓性スペーサーによってコンプスタチン類似体の環状部分から分離されている。スペーサーは、例えば、置換または非置換、飽和または不飽和のアルキル鎖、オリゴ（エチレングリコール）鎖、及び／または、例えば、リンカーに関して本明細書に記載されるような他の部分を含み得る。鎖の長さは、例えば、２～２０個の炭素原子の間であり得る。他の実施形態では、スペーサーはペプチドである。ペプチドスペーサーは、例えば、長さが１～２０アミノ酸の間、例えば、長さが４～２０アミノ酸の間であり得る。適切なスペーサーは、例えば、複数のＧｌｙ残基、Ｓｅｒ残基、またはその両方を含むか、またはそれらからなることができる。任意選択で、一級アミンもしくは二級アミンを含む側鎖を有するアミノ酸及び／またはスペーサー中の少なくとも１つのアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である。様々なポリマー骨格または足場のいずれかを使用することができた。例えば、ポリマー骨格または足場は、ポリアミド、多糖、ポリ無水物、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリペプチド、ポリエチレンオキシド、またはデンドリマーであり得る。適切な方法及びポリマー骨格は、例えば、ＷＯ９８／４６２７０（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７１７１）またはＷＯ９８／４７００２（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０６９６３）に記載されている。一実施形態では、ポリマー骨格または足場は、カルボン酸、無水物、またはスクシンイミド基などの複数の反応性官能基を含む。ポリマー骨格または足場は、コンプスタチン類似体と反応する。一実施形態では、コンプスタチン類似体は、ポリマー骨格上の適切な基と反応する、カルボン酸、無水物、またはスクシンイミド基などのいくつかの異なる反応性官能基のいずれかを含む。代替的に、互いに結合してポリマー骨格または足場を形成することができるモノマー単位を最初にコンプスタチン類似体と反応させ、得られたモノマーを重合させる。別の実施形態では、短鎖は、予備重合され、官能化され、次いで、異なる組成の短鎖の混合物が、より長いポリマーに編成される。
いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体部分は、直線状ＰＥＧのそれぞれの末端に付着している。鎖のそれぞれの末端に反応性官能基を有する二官能性ＰＥＧを、例えば、本明細書に記載されるように使用することができる。いくつかの実施形態では、反応性官能基は同一であるが、いくつかの実施形態では、異なる反応性官能基がそれぞれの末端に存在する。
一般に、そして本明細書に示される化合物について、ポリエチレングリコール部分は、繰り返し単位の右側または繰り返し単位の左側に酸素原子を伴って描かれる。１つの配向のみが描かれている場合、本開示は、所与の化合物または属のポリエチレングリコール部分の両方の配向（すなわち、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ及び（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ）を包含する。あるいは、化合物または属が複数のポリエチレングリコール部分を含む場合、配向のすべての組み合わせが本開示に包含される。
いくつかの実施形態では、二官能性直線状ＰＥＧは、その末端のそれぞれに反応性官能基を含む部分を含む。反応性官能基は、同じであっても（ホモ二官能性）または異なっていても（ヘテロ二官能性）よい。いくつかの実施形態では、二官能性ＰＥＧの構造は対称的であり得、同じ部分が、反応性官能基を－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖のそれぞれの末端の酸素原子に接続するために使用される。いくつかの実施形態では、２つの反応性官能基を分子のＰＥＧ部分に接続するために、異なる部分が使用される。例示的な二官能性ＰＥＧの構造を以下に示す。説明のために、反応性官能基がＮＨＳエステルを含む式が示されているが、他の反応性官能基を使用することができる。
いくつかの実施形態では、二官能性直線状ＰＥＧは、式Ａのものである：
式中、それぞれのＴ及び「反応性官能基」は、独立して以下に定義され、本明細書のクラス及びサブクラスに記載され、ｎは、上記に定義され、本明細書のクラス及びサブクラスに記載される。
それぞれのＴは、独立して共有結合またはＣ１－１２直鎖または分岐鎖の、炭化水素鎖であり、Ｔの１つ以上の炭素単位が任意選択で独立して－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｎ（Ｒｘ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｎ（Ｒｘ）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｘ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（Ｒｘ）ＳＯ２－、または－ＳＯ２Ｎ（Ｒｘ）－によって置き換えられ；
それぞれのＲｘは、独立して水素またはＣ１－６脂肪族である。
反応性官能基は、構造－ＣＯＯ－ＮＨＳを有する。
式Ａの例示的な二官能性ＰＥＧには以下が含まれる：
Figure 2024521792000052
いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体上の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基）は、本明細書に記載の「反応性官能基」を有するＰＥＧ含有化合物と反応して、そのようなコンジュゲートを生成する。例として、式Ｉは、以下の構造を有するコンプスタチン類似体コンジュゲートを形成することができる。
Figure 2024521792000053
 式中、
Figure 2024521792000054
 はコンプスタチン類似体上のアミン基の結合点を表す。特定の実施形態では、アミン基は、リジン側鎖基である。
特定の実施形態では、そのようなコンジュゲートのＰＥＧ成分は、約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約１５ｋＤ、約２０ｋＤ、約３０ｋＤ、または約４０ｋＤの平均分子量を有する。特定の実施形態では、そのようなコンジュゲートのＰＥＧ成分は、約４０ｋＤの平均分子量を有する。
「二機能性」または「二機能化」という用語は、本明細書では、ＰＥＧに連結した２つのコンプスタチン類似体部分を含む化合物を指すために使用されることがある。このような化合物は、文字「ＢＦ」で指定することができる。いくつかの実施形態では、二機能化化合物は対称的である。いくつかの実施形態では、二機能化化合物のＰＥＧとそれぞれのコンプスタチン類似体部分との間の結合は同じである。いくつかの実施形態では、二機能化化合物のＰＥＧとコンプスタチン類似体との間のそれぞれの結合は、カルバメートを含む。いくつかの実施形態では、二機能化化合物のＰＥＧとコンプスタチン類似体との間のそれぞれの結合は、カルバメートを含み、エステルを含まない。いくつかの実施形態では、二機能化化合物のそれぞれのコンプスタチン類似体は、カルバメートを介してＰＥＧに直接連結されている。いくつかの実施形態では、二機能化化合物のそれぞれのコンプスタチン類似体は、カルバメートを介してＰＥＧに直接連結され、二機能化化合物は、以下の構造を有する：
Figure 2024521792000055
 。
本明細書に記載の式及び実施形態のいくつかの実施形態では、
Figure 2024521792000056
 は、以下の構造を有するコンプスタチン類似体におけるリジン側鎖基の結合点を表す：
Figure 2024521792000057
 式中、記号
Figure 2024521792000058
 は、分子または化学式の残りの部分への化学的部分の結合点を表す。
１つ以上の反応性官能基を含むＰＥＧは、いくつかの実施形態では、とりわけ、例えば、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐ．Ｗｈｉｔｅ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ ｏｒ ＢＯＣ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４５－１６ Ｒａｍｓｅｙ Ｒｏａｄ Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ １１９６７，ＵＳＡから入手することができ、または当該技術分野で知られている方法を使用して調製することができる。
いくつかの実施形態では、リンカーを使用して、本明細書に記載のコンプスタチン類似体と本明細書に記載のＰＥＧを接続する。コンプスタチン類似体とＰＥＧを接続するための適切なリンカーは、上記及び本明細書のクラス及びサブクラスで広範に記載されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、複数の官能基を有し、１つの官能基は、コンプスタチン類似体に接続され、別の官能基は、ＰＥＧ部分に接続される。いくつかの実施形態では、リンカーは二官能性化合物である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（式中、ｎは１～１０００である）の構造を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡｃ）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、コンプスタチン類似体のポリマー部分または官能基とのコンジュゲーションのために活性化される。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＥＥＡｃのカルボキシル基は、リジン基の側鎖のアミン基とコンジュゲートする前に活性化される。
いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体上の適切な官能基（例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール、またはカルボン酸基）は、直接またはリンカーを介して、ＰＥＧ部分とのコンジュゲーションのために使用される。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体は、アミン基を介してリンカーを介してＰＥＧ部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、アミン基は、アミノ酸残基のα－アミノ基である。いくつかの実施形態では、アミン基は、リジン側鎖のアミン基である。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体は、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（式中、ｎは１～１０００である）の構造を有するリンカーを介して、リジン側鎖のアミノ基（ε－アミノ基）を介してＰＥＧ部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体は、ＡＥＥＡｃリンカーを介してリジン側鎖のアミノ基を介してＰＥＧ部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨリンカーは、コンジュゲート後に、コンプスタチンのリジン側鎖上に－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－部分を導入する。いくつかの実施形態では、ＡＥＥＡｃリンカーは、コンジュゲート後に、コンプスタチンのリジン側鎖上に－ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－部分を導入する。
いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体は、リンカーを介してＰＥＧ部分にコンジュゲートされ、リンカーは、ＡＥＥＡｃ部分及びアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体は、リンカーを介してＰＥＧ部分にコンジュゲートされ、リンカーは、ＡＥＥＡｃ部分及びリジン残基を含む。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体のＣ末端は、ＡＥＥＡｃのアミノ基に接続されており、ＡＥＥＡｃのＣ末端は、リジン残基に接続されている。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体のＣ末端は、ＡＥＥＡｃのアミノ基に接続されており、ＡＥＥＡｃのＣ末端は、リジン残基のα－アミノ酸に接続されている。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体のＣ末端は、ＡＥＥＡｃのアミノ基に接続され、ＡＥＥＡｃのＣ末端は、リジン残基のα－アミノ基に接続され、ＰＥＧ部分は、上記リジン残基のε－アミノ基を介してコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、リジン残基のＣ末端は修飾されている。いくつかの実施形態では、リジン残基のＣ末端は、アミド化によって修飾されている。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体のＮ末端は修飾されている。いくつかの実施形態では、コンプスタチン類似体のＮ末端はアセチル化されている。
特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、Ｍ－ＡＥＥＡｃ－Ｌｙｓ－Ｂ２として表され得、式中、Ｂ２は、ブロッキング部分、例えば、ＮＨ２であり、Ｍは、配列番号９～３６のいずれかを表し、ただし、配列番号９～３６のいずれかのＣ末端アミノ酸が、ペプチド結合を介してＡＥＥＡｃ－Ｌｙｓ－Ｂ２に連結されているという条件である。単官能性または多官能性（例えば、二官能性）のＰＥＧのＮＨＳ部分は、リジン側鎖の遊離アミンと反応して、単機能化（１つのコンプスタチン類似体部分）または多機能化（複数のコンプスタチン類似体部分）のＰＥＧ化コンプスタチン類似体を生成する。様々な実施形態では、反応性官能基を含む側鎖を含む任意のアミノ酸を、Ｌｙｓの代わりに（またはＬｙｓに加えて）使用することができる。適切な反応性官能基を含む単官能性または多官能性ＰＥＧは、ＮＨＳ－エステル活性化ＰＥＧとＬｙｓとの反応と同様の方法でそのような側鎖と反応させることができる。
上記の式及び構造のいずれかに関して、コンプスタチン類似体成分が本明細書に記載の任意のコンプスタチン類似体、例えば、配列番号９～３６の任意のコンプスタチン類似体を含む実施形態が明示的に開示されていると理解されるべきである。例えば、非限定的に、コンプスタチン類似体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含み得る。コンプスタチンアナログ成分が配列番号２８のアミノ酸配列を含む、例示的なＰＥＧ化コンプスタチン類似体を図２に示す。本明細書に記載されるように、ＰＥＧ部分は、様々な実施形態において、様々な異なる分子量または平均分子量を有し得ることが理解されるであろう。特定の実施形態では、コンプスタチン類似体は、ペグセタコプラン（「ＡＰＬ－２」）であり、約８００～約１１００のｎを有する図２の化合物の構造及び約４０ｋＤの平均分子量を有するＰＥＧを有する。ペグセタコプランは、ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル）、α－ヒドロ－ω－ヒドロキシ－、Ｎ－アセチル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－システイン－Ｌ－バリル－１－メチル－Ｌ－トリプトフィル－Ｌ－グルタミニル－Ｌ－α－アスパルチル－Ｌ－トリプトフィルグリシル－Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－アルギニル－Ｌ－システイニル－Ｌ－トレオニル－２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］アセチル－Ｎ６－カルボキシ－Ｌ－リジンアミド環状（２－－＞１２）－（ジスルフィド）を有する１５，１５’－ジエステル；またはＯ，Ｏ’－ビス［（Ｓ２，Ｓ１２－シクロ｛Ｎアセチル－Ｌ－イソロイシル－Ｌ－システイニル－Ｌ－バリル－１－メチル－Ｌ－トリプトフィル－Ｌ－グルタミニル－Ｌ－α－アスパルチル－Ｌ－トリプトフィルグリシル－Ｌ－アラニル－Ｌ－ヒスチジル－Ｌ－アルギニル－Ｌ－システイン－Ｌ－トレオニル－２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］アセチル－Ｌ－リジンアミド｝）－Ｎ６．１５－カルボニル］ポリエチレングリコール（ｎ＝８００～１１００）とも呼ばれる。追加のコンプスタチン類似体は、例えば、ＷＯ２０１２／１５５１０７及びＷＯ２０１４／０７８７３１に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のコンプスタチン類似体は、約８００ｍｇ～約１２００ｍｇ、例えば、約１０６０ｍｇ～約１１００ｍｇ、例えば、約１０７０ｍｇ～約１０９０ｍｇ、例えば、約１０７５ｍｇ～約１０８５ｍｇ、例えば、約１０８０ｍｇの投与量で、約４週間、約８週間、約１２週間、約１６週間、約２０週間、約２４週間、約２８週間、約３２週間、約３６週間、約４０週間、約４４週間、約４８週間、約５２週間、約１．２年間、１．４年間、１．６年間、１．８年間、２年間、３年間、４年間、５年間、またはそれ以上にわたって、週２回または３日ごとに、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の阻害性ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を含むか、または本明細書に記載のｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む組成物は、コンプスタチン類似体と組み合わせて対象に投与され、それにより、コンプスタチン類似体及び／または阻害性ＲＮＡ組成物はより低い頻度及び／またはより低い投与量で投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の阻害性ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）、または本明細書に記載されるｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む組成物は、コンプスタチン類似体と組み合わせて対象に投与され、それにより、コンプスタチン類似体は、週１回、２週に１回、月１回、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、またはそれよりも長い期間に１回、約８００ｍｇ～約１２００ｍｇ、例えば、約１０６０ｍｇ～約１１００ｍｇ、例えば、約１０７０ｍｇ～約１０９０ｍｇ、例えば、約１０７５ｍｇ～約１０８５ｍｇ、例えば、約１０８０ｍｇの投与量で投与される。
いくつかの実施形態では、補体阻害剤は、抗体、例えば、抗Ｃ３抗体及び／または抗Ｃ５抗体、またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントを使用して、Ｃ３またはＣ５の活性化を阻害することができる。断片化された抗Ｃ３または抗Ｃ５抗体は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’（２）、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖであり得る。いくつかの実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体はポリクローナルである。いくつかの実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体は脱免疫化されている。一実施形態では、抗Ｃ３抗体または抗Ｃ５抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗Ｃ５抗体はエクリズマブである。いくつかの実施形態では、補体阻害剤は、抗体、例えば、抗Ｃ３抗体及び／または抗Ｃ５抗体、またはそのフラグメントである。
いくつかの実施形態では、補体阻害剤は、ポリペプチド阻害剤及び／または核酸アプタマーである（例えば、米国特許出願公開第２００３０１９１０８４号を参照）。例示的なポリペプチド阻害剤としては、Ｃ３またはＣ３ｂを分解する酵素が挙げられる（例えば、米国特許第６，６７６，９４３号を参照）。さらなるポリペプチド阻害剤としては、ミニ因子Ｈ（例えば、米国特許公開第２０１５０１１０７６６号を参照）、黄色ブドウ球菌由来のＥｆｂタンパク質もしくは補体阻害剤（ＳＣＩＮ）タンパク質、またはそのバリアントもしくは誘導体もしくは模倣体（例えば、米国特許出願公開第２０１４０３７１１３３号を参照）が挙げられる。
他の様々な補体阻害剤も、本開示の様々な実施形態において使用することができる。いくつかの実施形態では、補体阻害剤は、天然に存在する哺乳動物の補体調節タンパク質、またはそのフラグメントもしくは誘導体である。例えば、補体調節タンパク質は、ＣＲ１、ＤＡＦ、ＭＣＰ、ＣＦＨ、またはＣＦＩであり得る。いくつかの実施形態では、補体調節ポリペプチドは、天然に存在する状態では通常は膜結合しているものである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及び／または細胞内ドメインの一部または全部を欠くこのようなポリペプチドのフラグメントが使用される。例えば、可溶型の補体受容体１（ｓＣＲ１）を使用することもできる。例えば、ＴＰ１０またはＴＰ２０（Ａｖａｎｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）として知られる化合物を使用することができる。Ｃ１阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）を使用することもできる。いくつかの実施形態では、可溶性補体制御タンパク質、例えばＣＦＨが使用される。
Ｃ１の阻害剤を使用することもできる。例えば、米国特許第６，５１５，００２号には、Ｃ１を阻害する化合物（フラニル及びチエニルアミジン、複素環式アミジン、及びグアニジン）が記載されている。米国特許第６，５１５，００２号及び同第７，１３８，５３０号には、Ｃ１を阻害する複素環式アミジンが記載されている。米国特許第米国特許第７，０４９，２８２号には、古典経路の活性化を阻害するペプチドが記載されている。ペプチドの一部は、ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ（配列番号７３）またはＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ（配列番号７４）、またはこれらと有意な配列同一性及び／または立体的構造類似性を有するペプチドを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、これらのペプチドは、ＩｇＧまたはＩｇＭ分子の一部と同一または実質的に同一である。米国特許第米国特許第７，０４１，７９６号は、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体受容体様分子及び補体活性化を阻害するためのその使用を開示している。米国特許第米国特許第６，９９８，４６８号は、補体活性化の抗Ｃ２／Ｃ２ａ阻害剤を開示している。米国特許第米国特許第６，６７６，９４３号は、肺炎球菌由来のヒト補体Ｃ３分解タンパク質を開示している。
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む、本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全容を参照により援用するものとする。さらに、材料、方法、及び実施例はあくまで説明を目的としたものであって、限定することを目的としない。別段の定義がなされない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び物質を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法及び物質を本明細書に記載する。
本開示は以下の実施例によってさらに説明される。実施例は、説明の目的のためにのみ提供される。それらは、本開示の範囲または内容をいかなる形でも限定するものと解釈されるべきではない。
ＶＩＩＩ．実施例
実施例１：ｓｉＲＮＡを用いたＨｅＬａ細胞におけるＣ３発現のノックダウン
細胞培養
ＨｅＬａ細胞をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣとＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙとの共同開発、カタログ番号ＡＴＣＣ－ＣＲＭ－ＣＣＬ－２）より入手し、１０％のウシ胎児血清（＃１２４８Ｄ，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（＃Ａ２２１３、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＨＡＭ’ｓ Ｆ１２ （＃ＦＧ０８１５，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中、加湿したインキュベーター内で５％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃で培養した。ＨｅＬａ細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクションするため、細胞を１５，０００個の細胞／ウェルの密度で９６ウェル組織培養プレート（＃６５５１８０、ＧＢＯ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。
ｓｉＲＮＡ
１７７種のｓｉＲＮＡを、ｍＲＮＡ転写産物の異なる領域を標的にするように設計して合成した。この実験では、各ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、Ｃ３転写産物上の標的領域配列（配列番号７５）と同一の１８個のヌクレオチドと、３’末端の１個のさらなるアデニンヌクレオチドとを含んでいた。さらに、この実験では、アンチセンス鎖は、Ｃ３転写産物上の標的領域配列（配列番号７５）と同一の１８個のヌクレオチドと、５’末端の１個のさらなるウラシルヌクレオチドと、３’末端の２個のさらなるウラシルヌクレオチドとを含んでいた。
この実験では、ｓｉＲＮＡは、以下の修飾パターンを含むセンス鎖の修飾を含んでいた。
ｘｓｘｓＸｆｘｘｘＸｆＸｆＸｆｘｘＸｆｘｘｘｘＸｆｘａ
アンチセンス鎖は、以下の修飾パターンを含んでいた。
ｕｓＸｆｓｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＸｆｘｘｘｘｘｓｕｓｕ
ここで、「ｘ」は任意のヌクレオチドを表し、小文字は２’－Ｏ－メチル基で修飾されたヌクレオチドを表し、「Ｘｆ」は、２’－フルオロ基で修飾されたヌクレオチド（「Ｘ」は任意のヌクレオチドであり得る）を表す。例えば、「Ａｆ」は２’－フルオロ基で修飾されたアデニンヌクレオチドを表す。「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表す。
ｓｉＲＮＡ及びＣ３活性アッセイのトランスフェクション－二重用量実験
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、製造者の指示に従って、リバーストランスフェクションで行った。本実験では、それぞれ１０ｎＭと０．５ｎＭの４重のｓｉＲＮＡを用いて二重用量スクリーニングを行った。Ａｈａ１を標的とするｓｉＲＮＡを、同時にＣ３標的ｍＲＮＡ発現の非特異的コントロールと、Ａｈａ１ ｍＲＮＡレベルに関するトランスフェクション効率を分析するためのポジティブコントロールとして使用した。ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼをモックトランスフェクションとして使用した。
ｓｉＲＮＡによる２４時間のインキュベーション後に培地を除去し、細胞を１５０μｌのＭｅｄｉｕｍ－Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１体積の溶解混合物、２体積の細胞培養培地）中で溶解し、次いで５３℃で３０分間インキュベートした。ｂＤＮＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ＲＮＡアッセイ）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより設計され、Ｍｅｔａｂｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ（Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成された、ヒトＣ３に対するプローブセット（配列の塩基１０６と塩基９０７との間のアクセッション番号ＮＭ＿００００６４）を用い、製造者の指示に従って行った。暗所にて室温で３０分間インキュベートした後、１４２０ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＷＡＬＬＡＣ ＶＩＣＴＯＲ Ｌｉｇｈｔ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｒｏｄｇａｕ－Ｊｕｅｇｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発光を読み取った。
他の２つの標的非特異的コントロール（ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼに対する）は、Ａｈａ１プローブセットを用いたハイブリダイゼーションによりＡｈａ１ ｍＲＮＡレベルのコントロールとして用いた。二重用量スクリーニングにおける各９６ウェルプレート及び両方の用量におけるトランスフェクション効率を、各ウェル中のＡｈａ１レベルと
コントロールで得られたＡｈａ１レベルに対するＡｈａ１－ｓｉＲＮＡ（ＧａｐＤＨに対して正規化）とを関連付けることによって計算した。１０ｎＭの用量のｓｉＡｈａ１によるトランスフェクション効率は、約９０％であり、０．５ｎＭの用量でのトランスフェクション効率は、約８５％であった。
ｓｉＲＮＡの活性を、各標的の最小蛍光または最小ｍＲＮＡ濃度（％）によって測定した。各ウェルについて、標的ｍＲＮＡレベルを対応するＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。特定のｓｉＲＮＡの活性は、各コントロールウェルにわたって平均化した標的ｍＲＮＡ濃度（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化）に対する、処理細胞中の各標的のｍＲＮＡ濃度（％）（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化）として表した。
活性に基づく上位２４位のｓｉＲＮＡの二重用量スクリーニングの結果を下記表９に示す。これらのｓｉＲＮＡの配列を下記表１０に示す。
Figure 2024521792000059
Figure 2024521792000060
Figure 2024521792000061
用量反応実験
用量反応実験（ＤＲＣ）で試験するために両方の用量で最良の活性を示す上位１２位のｓｉＲＮＡを選択した。４重でトランスフェクトした１０の濃度のｓｉＲＮＡを用いて、１００ｎＭから開始して６倍の希釈段階で約１０ｆＭまでの用量反応実験を行った。モックトランスフェクト細胞をＤＲＣ実験のコントロールとして用いた。
各ウェルについて、標的ｍＲＮＡレベルを対応するＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。特定のｓｉＲＮＡの活性は、モックトランスフェクトした各ウェル（ＤＲＣ）にわたって平均化した標的ｍＲＮＡ濃度（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化）に対する、処理細胞中の各標的のｍＲＮＡ濃度（％）（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化）として表した。
ＤＲＣ実験からのＩＣ５０値及びＩＣ８０値と二重用量実験の最大ＫＤの結果（１０ｎｍ用量）を下記表１１に示す。
Figure 2024521792000062
実施例２：ｓｉＲＮＡを用いたＨｅｐＧ２細胞におけるＣ３発現のノックダウン
ＨｅｐＧ２細胞において実証された活性に基づいて、実施例１の二重投与実験を、上位５０位のｓｉＲＮＡについて繰り返した（実施例１）。
ＨｅＰＧ２細胞をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣとＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙとの共同開発、カタログ番号ＡＴＣＣ－ＨＢ－８０６５）より入手し、１０％のウシ胎児血清（＃１２４８Ｄ，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１×非必須アミノ酸（＃Ｋ０２９３；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、４ｍＭのＬ－グルタミン（＃Ｋ０２８３，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（＃Ａ２２１３、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＭＥＭイーグル（＃Ｍ２２７９，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中、加湿したインキュベーター内で５％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃で培養した。
ｓｉＲＮＡ及びＣ３活性アッセイのトランスフェクション－二重用量実験
ＨｅＰＧ２細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクションするため、細胞を１５，０００個の細胞／ウェルの密度で、コラーゲンコーティングした９６ウェル組織培養プレート（＃６５５１５０、ＧＢＯ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、製造者の指示に従って、リバーストランスフェクションで播種直後に行った。本実験では、それぞれ１０ｎＭと０．１ｎＭの４重のｓｉＲＮＡを用いて二重用量スクリーニングを行った。Ａｈａ１を標的とするｓｉＲＮＡを、同時にＣ３標的ｍＲＮＡ発現の非特異的コントロールと、Ａｈａ１ ｍＲＮＡレベルに関するトランスフェクション効率を分析するためのポジティブコントロールとして使用した。ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼをモックトランスフェクションとして使用した。
ｓｉＲＮＡによる２４時間のインキュベーション後に培地を除去し、細胞を１５０μｌのＭｅｄｉｕｍ－Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘｔｕｒｅ（１体積の溶解混合物、２体積の細胞培養培地）中で溶解し、次いで５３℃で３０分間インキュベートした。ｂＤＮＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ＲＮＡアッセイ）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃにより設計され、Ｍｅｔａｂｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＧ（Ｐｌａｎｅｇｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成された、ヒトＣ３に対するプローブセット（配列の塩基１０６と塩基９０７との間のアクセッション番号ＮＭ＿００００６４）を用い、製造者の指示に従って行った。暗所にて室温で３０分間インキュベートした後、１４２０ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＷＡＬＬＡＣ ＶＩＣＴＯＲ Ｌｉｇｈｔ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｒｏｄｇａｕ－Ｊｕｅｇｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発光を読み取った。
Ａｈａ１－ｓｉＲＮＡを、Ａｈａ１プローブセットを用いたハイブリダイゼーションによりＡｈａ１ ｍＲＮＡレベルを測定することにより、Ｃ３ ｍＲＮＡ発現に対する非特異的なコントロールとして、また、トランスフェクション効率を分析するためのポジティブコントロールとして用いた。使用したＡｈａ－１ｓｉＲＮＡは、候補ｓｉＲＮＡの大きな群から以前に選択されたものであり、インビトロ及びインビボで非常に高い活性を有することが知られているものである。各９６ウェルプレートのトランスフェクション効率を、非特異的コントロールと比較したＡｈａ１－ｓｉＲＮＡによるＡｈａ１ノックダウン（ＧａｐＤＨに対して正規化）の分析により計算した。コントロールで得られたＡｈａ１レベルに対するＡｈａ１－ｓｉＲＮＡ（ＧａｐＤＨに対して正規化）。１０ｎＭの用量のｓｉＡｈａ１によるトランスフェクション効率は、約９０％であり、０．５ｎＭの用量でのトランスフェクション効率は、約８５％であった。
ｓｉＲＮＡの活性を、各標的の蛍光またはｍＲＮＡ濃度（％）によって測定した。各ウェルについて、標的ｍＲＮＡレベルを対応するＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。特定のｓｉＲＮＡの活性は、各コントロールウェルにわたって平均化した標的ｍＲＮＡ濃度（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化）に対する、処理細胞中の各標的のｍＲＮＡ濃度（％）（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化）として表した。
活性に基づく上位１２位のｓｉＲＮＡの二重用量スクリーニングの結果を、それぞれ１０ｎｍ及び０．１ｎｍの用量について下記表１２及び１３に示す。
Figure 2024521792000063
Figure 2024521792000064
実施例３：様々な修飾パターンを有するｓｉＲＮＡを使用したＨｅｐＧ２細胞におけるＣ３ノックダウン発現
実施例１及び２の上位６位のｓｉＲＮＡの修飾を試験した。
細胞培養
ＨｅＰＧ２細胞をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣとＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙとの共同開発、カタログ番号ＡＴＣＣ－ＨＢ－８０６５）より入手し、１０％のウシ胎児血清（＃１２４８Ｄ，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１×非必須アミノ酸（＃Ｋ０２９３；Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、４ｍＭのＬ－グルタミン（＃Ｋ０２８３，Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（＃Ａ２２１３、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加したＭＥＭイーグル（＃Ｍ２２７９，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中、加湿したインキュベーター内で５％ＣＯ２を含む雰囲気中、３７℃で培養した。
ｓｉＲＮＡ
実施例１及び２からの活性に関して上位のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ番号：１、４、９、１０、１６及び２２）のヌクレオチド配列に基づいて、異なる修飾パターンのｓｉＲＮＡを設計及び合成した。上位のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列のそれぞれについて５つの「バリアント」を設計及び合成し、各二重鎖を、行われた修飾に応じて「バリアント１」、「バリアント２」、「バリアント３」、「バリアント４」、「バリアント５」と指定する。実施例１及び２からのｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ番号：１、４、９、１０、１６及び２２）は、「バリアント０」と指定する。
各ｓｉＲＮＡ番号１、４、９、１０、１６及び２２のセンス鎖の以下の修飾パターン（５’～３’）を使用した：
ｘｓｘｓＸｆｘｘｘＸｆＸｆＸｆｘｘＸｆｘｘｘｘＸｆｘａ（「バリアント０」及び「バリアント１」及び「バリアント５」でも使用されるパターン）
ＸｆｓｘｓＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＡｆ（「バリアント２」、「バリアント３」及び「バリアント４」で使用されるパターン）
アンチセンス鎖の以下の修飾パターン（５’～３’）を使用した：
ｕｓＸｆｓｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＸｆｘｘｘｘｘｓｕｓｕ（「バリアント０」で使用されるパターン）
ｕｓＸｆｓｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＸｆｘｘｘｘｘｓｘｓｘ（「バリアント１」及び「バリアント３」で使用されるパターン；最後の２個のヌクレオチドがＣ３ ｍＲＮＡ転写産物、すなわち、配列番号７５に相補的である点を除き、「バリアント０」で使用されるのと同じパターンである）
ｕｓＸｆｓｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘＸｆｘｓｘｓｘ（「バリアント２」で使用されるパターン）
ｕｓＸｆｓｘｘｘＸｆｘｘｘｘｘｘｘＸｆｘＸｆｘｘｘｓｘｓｘ（「バリアント４」及び「バリアント５」で使用されるパターン）
ここで、「ｘ」は任意のヌクレオチドを表し、小文字は２’－Ｏ－メチル基で修飾されたヌクレオチドを表し、「Ｘｆ」は、２’－フルオロ基で修飾されたヌクレオチド（「Ｘ」は任意のヌクレオチドであり得る）を表す。例えば、「Ａｆ」は２’－フルオロ基で修飾されたアデニンヌクレオチドを表す。「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表す。
用量反応実験
ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、製造者の指示に従って、リバーストランスフェクションで行った。
各ｓｉＲＮＡを、ＨｅｐＧ２細胞における用量反応実験（ＤＲＣ）を用いて試験した。Ｃ３発現をノックダウンすることが知られている２つのさらなるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ番号２６及び２７）を、ポジティブコントロールとして使用した。
４重でトランスフェクトした１０の濃度のｓｉＲＮＡを用いて、１００ｎＭから開始して６倍の希釈段階で約１０ｆＭまでの用量反応実験を行った。モックトランスフェクトした細胞をネガティブコントロールとして用いた。
各ウェルについて、標的ｍＲＮＡレベルを対応するＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。特定のｓｉＲＮＡの活性は、モックトランスフェクトした各ウェル（ＤＲＣ）にわたって平均化した標的ｍＲＮＡ濃度（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化）に対する、処理細胞中の各標的のｍＲＮＡ濃度（％）（ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに対して正規化）として表した。
ＤＲＣ実験からのＩＣ５０、ＩＣ８０値及び最大ＫＤを下記表１４に示す。これらのｓｉＲＮＡの配列を下記表１５に示す。
Figure 2024521792000065
Figure 2024521792000066
Figure 2024521792000067
Figure 2024521792000068
Figure 2024521792000069
Figure 2024521792000070
表１４のＩＣ５０及びＩＣ８０の値は、修飾パターンの性能が異なっていたことを示している。例えば、ｓｉＲＮＡ番号３２（「バリアント５」で指定された修飾パターンを使用）は、ｓｉＲＮＡ番号１（「バリアント０」）、２８（「バリアント１」）、２９（「バリアント２」）、３０（「バリアント３」）、及び３１（「バリアント４」）と比較して、これらのｓｉＲＮＡのそれぞれが同じヌクレオチド配列に基づいたものであり、Ｃ３転写産物の同じ領域を標的としているのにもかかわらず、より優れた活性（それぞれ０．０１８ｎＭ及び０．１０８ｎＭのＩＣ５０及びＩＣ８０値）を有していた。
さらに、各修飾パターン（すなわち、異なるバリアント）の性能は、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列（すなわち、Ｃ３転写産物の標的領域）ごとに異なるようであった。例えば、「バリアント５」は、ｓｉＲＮＡ１のヌクレオチド配列に基づいたｓｉＲＮＡの中でＣ３ノックダウンに最も効果的であることが示された（例えば、ｓｉＲＮＡ番号１（バリアント０）と比較したｓｉＲＮＡ番号３２（バリアント５））のに対して、ｓｉＲＮＡ２２のヌクレオチド配列に基づいたｓｉＲＮＡの中では、「バリアント０」がＣ３ノックダウンに最も効果的であることが示された（例えば、ｓｉＲＮＡ５５（バリアント３）と比較したｓｉＲＮＡ２２（バリアント０））。
実施例４：非ヒト霊長類におけるｓｉＲＮＡ５８のインビボ評価
ｓｉＲＮＡコンストラクト
実施例３からｓｉＲＮＡ５３を選択し、以下に記載するようにさらに修飾してｓｉＲＮＡ５８を生成した。
Figure 2024521792000071
さらに、ｓｉＲＮＡを、下記に示すＧａｌＮＡｃ構造に、ＮＨＣ６リンカーを介してｓｉＲＮＡ５８のセンス鎖の５’末端で結合させた。
Figure 2024521792000072
次いで、修飾ｓｉＲＮＡ（以後、「ｓｉＲＮＡ５８」と呼ぶ）を非ヒト霊長類において評価した。
試験デザイン
ナイーブな雄性カニクイザル（各群ｎ＝３）に、１日目に３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ５８、または溶媒（リン酸緩衝生理食塩水）の１回用量を皮下（ＳＣ）投与した。
－５、－１、３、８、１５、２２、２９、４０、５７、６７、８２、９７、１１２、１２７、１４２、１５７、１７２及び１８４日目（負の値はｓｉＲＮＡ５８または溶媒の注射前の日数に相当する）に血清試料を採取するように計画した。血清中のＣ３タンパク質のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。さらに、血清試料を代替補体経路活性（ＡＨ５０）についても分析した。－１日目の値をベースラインとして使用した。
肝針生検を、１５日目、４６日目及び７９日目に行った。試料中のＣ３ ｍＲＮＡのレベルを、定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定した。これらの実験では、Ｃ３ ｍＲＮＡレベルをＡｃｔＢ ｍＲＮＡのレベルに対して正規化した。
結果
図３は、各群について投与６７日後までの用量後の血清Ｃ３タンパク質レベルの時間的経過を表す。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ５８の単回皮下投与により、ベースライン値と比較して、２９日目までに３ｍｇ／ｋｇ用量で血清Ｃ３タンパク質レベルが７７％、１０ｍｇ／ｋｇ用量で８５％、３０ｍｇ／ｋｇ用量で９０％減少したことを示しており、１５日目までにこれらのレベルに近い低下が明確となった。さらに、図３のデータは、６７日目まで減少が持続したことを示す。
図４は、ｓｉＲＮＡ５８の単回投与により、１５日目までに溶媒コントロールと比較して、肝臓Ｃ３ ｍＲＮＡが、３ｍｇ／ｋｇ用量で８９％、１０ｍｇ／ｋｇ用量で９７％、３０ｍｇ／ｋｇ用量で９９％減少したことを示す。減少は４６日目まで継続した（図５）。
図６は、６７日目までに採取された血清中の代替補体経路（ＡＨ５０）活性のレベルの時間的経過を示す。これらの結果は、ｓｉＲＮＡ５８の単回皮下投与により、ベースライン値と比較して、２９日目までに３ｍｇ／ｋｇ用量で代替補体経路活性のレベルが６５％、１０ｍｇ／ｋｇ用量で８２％、３０ｍｇ／ｋｇ用量で９２％減少したことを示しており、減少は１５日目までにこれらのレベルに達した。さらに、活性の低下は６７日目まで持続し、活性はベースライン値と比較して、３ｍｇ／ｋｇ用量で６８％、１０ｍｇ／ｋｇ用量で９１％、３０ｍｇ／ｋｇ用量で９８％減少した。
実施例５：非ヒト霊長類におけるｓｉＲＮＡ６０のインビボ評価
ｓｉＲＮＡコンストラクト
実施例３からｓｉＲＮＡ３２を選択し、以下に記載するようにさらに修飾してｓｉＲＮＡ５８を生成する。
Figure 2024521792000073
さらに、ｓｉＲＮＡを、下記に示すＧａｌＮＡｃ構造に、ＮＨＣ６リンカーを介してｓｉＲＮＡ６０のセンス鎖の５’末端で結合させる。
Figure 2024521792000074
次に、修飾ｓｉＲＮＡ（以後、「ｓｉＲＮＡ６０」と呼ぶ）を非ヒト霊長類において評価する。
試験デザイン
ナイーブな雄性カニクイザル（各群ｎ＝３）に、１日目に３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ６０、または溶媒（リン酸緩衝生理食塩水）の１回用量を皮下（ＳＣ）投与する。
－５、－１、３、８、１５、２２、２９、４０、５７、６７、８２、９７、１１２、１２７、１４２、１５７、１７２及び１８４日目（負の値はｓｉＲＮＡ６０または溶媒の注射前の日数に相当する）に血清試料を採取する。血清中のＣ３タンパク質のレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定する。さらに、血清試料を代替補体経路活性（ＡＨ５０）についても分析する。－１日目の値をベースラインとして使用する。
肝針生検を、１５日目、４６日目及び７９日目に行う。試料中のＣ３ ｍＲＮＡのレベルを、定量的ＰＣＲアッセイを使用して測定する。これらの実験では、Ｃ３ ｍＲＮＡレベルをＡｃｔＢ ｍＲＮＡのレベルに対して正規化する。
実施例６：ｓｉＲＮＡ５８のオフターゲット分析及び安全性
ｓｉＲＮＡ５８のセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を、潜在的なオフターゲット活性について分析した（Ｌｉｎｄｏｗ ｅｔ ａｌ．２０１２）。センス鎖及びアンチセンス鎖の潜在的なオフターゲット活性を、成熟ヒトＲＮＡ及び一次ヒトＲＮＡで分析した。
方法
分析した各配列は以下の通りである。
アンチセンス（ガイド）鎖：５’－ｕｇｕａｇｇｕａｕｇｕａｇｕｇｇｃｕ－３’（配列番号３２１）
センス（パッセンジャー）鎖：５’－ｃｃａａｃｕａｃａｕｇａａｃｃｕａｃａ－３’（配列番号１４７）
アンチセンス鎖（成熟ヒトＲＮＡ）：潜在的なオフターゲット遺伝子を特定するために、以下のパラメータでＦＡＳＴＡパッケージ（ｖ３６；Ｐｅａｒｓｏｎ２０００）内のＳｍｉｔｈ－ＷａｔｅｒＭａｎギャップ付き局所的アライメント（ｓＳｅａｒｃｈ）を使用して、類似性検索を行った：
－Ｅ ５０００未満のＥ値Ｅは、このサイズのデータベースを検索した際に、偶然に見つけることが期待できる検索ヒットの数に対応し、この数が比較的多いと、ハイブリダイゼーションのオフ標的配列がすべて確実に検出される。
－Ｗ （アラインメントに隣接する位置の数）は５に設定される
－ｎ 核酸検索について
－ｆ及び－ｇ ギャップ付きアライメントを回避するため、ギャップの形成及び伸長ペナルティについて１０００に設定する。
ｓｓｅａｒｃｈ３６ －ｎ －Ｗ ５ －Ｅ ５０００ －ｆ １０００ －ｇ １０００ クエリーｒｅｆＭｒｎａ．ｆａ
アンチセンス鎖（初代ヒトＲＮＡ）：核内でオフターゲット効果の可能性がある遺伝子を特定するため、オリゴヌクレオチド配列と一次ＲＮＡ（スプライシングされておらず、イントロンを含む）とのマッチングを調べた。具体的には、これらの類似性検索は、以下のパラメータでＦＡＳＴＡパッケージ（ｖ３６；Ｐｅａｒｓｏｎ ２０００）内のＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎギャップ付きローカルアライメント（ｓＳｅａｒｃｈ）を用いてヒトゲノム（バージョンｈｇ３８）に対して実行した：
－Ｅ ５０００未満のＥ値Ｅは、このサイズのデータベースを検索した際に、偶然に見つけることが期待できる検索ヒットの数に対応し、この数が比較的多いと、ハイブリダイゼーションのオフ標的配列がすべて確実に検出される。
－Ｗ （アラインメントに隣接する位置の数）は５に設定される
－ｎ 核酸検索について
－ｆ及び－ｇ ギャップ付きアライメントを回避するため、ギャップの形成及び伸長ペナルティについて１０００に設定する。
ｓｓｅａｒｃｈ３６ －ｎ －Ｗ ５ －Ｅ ５０００ －ｆ １０００ －ｇ １０００ クエリー ｒｅｆＧｅｎｅ．ｆａ
ゲノムアライメントにより、各配列が見つかった参照ゲノム内の位置を特定することができるが、参照ゲノム自体は、遺伝子及び遺伝子本体の位置を含まない。したがって、どの遺伝子がハイブリダイゼーションの可能性を有するかに関する情報を得るため、アラインメントに続いて、各ヒットのｓＲｅｓｅａｒｃｈゲノム座標をｂｅｄファイル形式に変換し、ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｖ２.２８.０）の交差を用いてそれらの遺伝子の遺伝子内ヒットにアノテートした。遺伝子位置を「Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｔａｂｌｅ」からのＵＣＳＣゲノムブラウザであるＴａｂｌｅ Ｖｉｅｗｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｃｏｄｅｖ３２ ａｎｄ ｈｇ３８から取得した。ｂｅｄｔｏｏｌｓを用いたアノテーションには、以下のコマンドを用いた：
ｂｅｄｔｏｏｌｓは、－ａ ｈｉｔＢｅｄＦｉｌｅ．ｂｅｄ －ｂ ｇｅｎｅＢｅｄＦｉｌｅ．ｂｅｄ －ｗｏと交差する。
－ａ及び－ｂは、入力を示す。
－ｗｏは、遺伝子名を取得するために必要なヒット及び完全なアノテーションの両方の元の位置を書き出す。
センス鎖（成熟ヒトＲＮＡ）：潜在的なオフターゲット遺伝子を特定するために、以下のパラメータでＦＡＳＴＡパッケージ（ｖ３６；Ｐｅａｒｓｏｎ２０００）内のＳｍｉｔｈ－ＷａｔｅｒＭａｎギャップ付き局所的アライメント（ｓＳｅａｒｃｈ）を使用して、類似性検索を行った：
－Ｅ ５０００未満のＥ値Ｅは、このサイズのデータベースを検索した際に、偶然に見つけることが期待できる検索ヒットの数に対応し、この数が比較的多いと、ハイブリダイゼーションのオフ標的配列がすべて確実に検出される。
－Ｗ （アラインメントに隣接する位置の数）は５に設定される
－ｎ 核酸検索について
－ｆ及び－ｇ ギャップ付きアライメントを回避するため、ギャップの形成及び伸長ペナルティについて１０００に設定する。
検索は、（１）１１個を超える最長の中断のない相補性（センス配列が短いために１３から減らしている）と１６個を超えるマッチ（２個または１個のミスマッチ）の数を有し、及び／または（２）１６個のマッチ（３個のミスマッチ）を有する１４塩基対以上の中断のない相補性を有する成熟ＲＮＡ配列を検索するように実行した。
センス鎖（一次ヒトＲＮＡ）：核内でオフターゲット効果の可能性がある遺伝子を特定するため、オリゴヌクレオチド配列と一次ＲＮＡ（スプライシングされておらず、イントロンを含む）とのマッチングを調べた。具体的には、これらの類似性検索は、以下のパラメータでＦＡＳＴＡパッケージ（ｖ３６；Ｐｅａｒｓｏｎ ２０００）内のＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎギャップ付き局所的アライメント（ｓＳｅａｒｃｈ）を用いてヒトゲノム（バージョンｈｇ３８）に対して実行した：
－Ｅ ５０００未満のＥ値Ｅは、このサイズのデータベースを検索した際に、偶然に見つけることが期待できる検索ヒットの数に対応し、この数が比較的多いと、ハイブリダイゼーションのオフ標的配列がすべて確実に検出される。
－Ｗ （アラインメントに隣接する位置の数）は５に設定される
－ｎ 核酸検索について
－ｆ及び－ｇ ギャップ付きアライメントを回避するため、ギャップの形成及び伸長ペナルティについて１０００に設定する。
ｓｓｅａｒｃｈ３６ －ｎ －Ｗ ５ －Ｅ ５０００ －ｆ １０００ －ｇ １０００ クエリー ｒｅｆＧｅｎｅ．ｆａ
どの遺伝子がアルゴノートによるそれらの一次ＲＮＡのオフターゲット切断の可能性を有するかに関する情報を得るため、アラインメントに続いて、各ヒットのｓＲｅｓｅａｒｃｈゲノム座標をｂｅｄファイル形式に変換し、ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｖ２.２８.０）の交差を用いてそれらの遺伝子の遺伝子内ヒットにアノテートした。遺伝子位置を「Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｔａｂｌｅ」からのＵＣＳＣゲノムブラウザであるＴａｂｌｅ Ｖｉｅｗｅｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｃｏｄｅｖ３２ ａｎｄ ｈｇ３８から取得した。ｂｅｄｔｏｏｌｓを用いたアノテーションには、以下のコマンドを用いた：
ｂｅｄｔｏｏｌｓは、－ａ ｈｉｔＢｅｄＦｉｌｅ．ｂｅｄ －ｂ ｇｅｎｅＢｅｄＦｉｌｅ．ｂｅｄ －ｗｏと交差する。
－ａ及び－ｂは、入力を示す。
－ｗｏは、遺伝子名を取得するために必要なヒット及び完全なアノテーションの両方の元の位置を書き出す。
遺伝子解析：潜在的な安全性リスクを理解するために、上記の検索に基づいて特定された遺伝子をさらに分析した。オリゴヌクレオチド薬物蓄積の主要臓器（肝臓及び腎臓）における遺伝子発現を評価した。ＧＴＥｘヒト組織発現アトラス（ＧＴＥｘ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ２０１３）を使用して、ＧＴＥｘ内の各対象の各遺伝子についてｌｏｇ２変換したＴＰＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）発現値を計算し、各遺伝子についての中央値を得た。値：３未満は非常に低い発現を示し、３～４は低い発現を示し、４～６は中間の発現を示し、６を超える場合、高い発現を示す。
次に、各標的の完全ノックダウンまたは部分的ノックダウンと疾患との関連のエビデンスに関する検索を行った。標的の完全ノックダウンの存在下での疾患のエビデンスを調べるため、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ Ｍａｎデータベース（ＯＭＩＭ；Ｈａｍｏｓｈ ｅｔ ａｌ．２００２）を使用して、希少生殖系列変異及びヒト遺伝性疾患との関連を探した。上位の遺伝子オフターゲットヒットの大半は、ＲＮＡｉ効率を著しく低下させる複数のミスマッチを含むことが注目された。ほとんどのヒト常染色体遺伝子は用量特異的ではなく（Ｒｉｃｅ ＆ ＭｃＬｙｓａｇｈｔ ２０１７）、また１つのアレルの不活性化は表現型を生じさせないが、ハプロ不全及び三倍体感受性の用量特異的遺伝子の両方に関する情報を収集するＣｌｉｎＧｅｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｅａｒｃｈ．ｃｌｉｎｉｃａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）を使用して、用量特異的作用のエビデンスについてのさらな検索を行った。
結果：
アンチセンス鎖：ｓｉＲＮＡ５８のアンチセンス鎖に対する唯一の完全相補性ヒットは、標的Ｃ３である。一次及び成熟ＲＮＡ間の次の最良のマッチはいずれも、３個以上のミスマッチを有し、有意に低いハイブリダイゼーション依存性のオフターゲット作用を有するものと予想される。上位のオフターゲット候補の大半は、肝臓及び腎臓での発現が低く、及び／またはヒトの遺伝子疾患との関連性を示さなかった。唯一の例外は、特定の機能獲得型短縮変異が、１家族内の遺伝性膵癌症候群に関連していたＲＡＢＬ３であった。ｓｉＲＮＡ５８によるＲＡＢＬ３の潜在的ノックダウンが、この新規機能獲得型変異に似た症状を示すことは予想されない。
センス鎖：ｓｉＲＮＡ５８のセンス鎖に相補的な配列のうち、一次及び成熟ヒトＲＮＡ間で完全な相補性一致は見られなかった。センスオリゴヌクレオチドに対するミスマッチが１個のみであるＧＰＲ１７３を含む、センス鎖に対して相補性を有する遺伝子の大部分は、ヒトの肝臓でも腎臓でも有意に発現せず、また、それらの遺伝子は既知の遺伝子疾患にも関連がみられなかた。
実施例７：ラットにおけるｓｉＲＮＡ５９のインビボ評価
ｓｉＲＮＡコンストラクト
実施例３からのｓｉＲＮＡ５３を、以下に記載するようにさらに修飾してｓｉＲＮＡ５９を生成した。
Figure 2024521792000075
さらに、ｓｉＲＮＡを、下記に示すＧａｌＮＡｃ構造に、ＮＨＣ６リンカーを介してｓｉＲＮＡ５９のセンス鎖の５’末端で結合させた。
Figure 2024521792000076
次いで、修飾ｓｉＲＮＡ（以後、「ｓｉＲＮＡ５９」と呼ぶ）をＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットにおいて評価した。
目的：本試験の目的は、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットに単回皮下注射として投与した場合の、３つの用量レベルでのｓｉＲＮＡ５９の血漿薬物動態（ＰＫ）及び限局的組織分布を決定することとした。本研究の副次的な目的は、３日間（１日１回）にわたって投与した同等の用量に対して、単回皮下注射として投与した３つの用量レベルのｓｉＲＮＡ５９の薬力学的効果を比較することとした。
方法
試験デザイン：
Figure 2024521792000077
投与：第１～第３群及び第８群の動物には、ＰＢＳ溶媒、またはＰＢＳ中にそれぞれ０．６ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ及び６ｍｇ／ｍｌの濃度で配合された３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ５９を単回皮下注射により、５ｍｌの投与体積で投与した。第４群～第７群の動物には、１０ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ（－）コントロール、またはＰＢＳ中にそれぞれ０．２ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、及び２ｍｇ／ｍｌの濃度で配合された１ｍｇ／ｍｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ、または１０ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ５９を１日３回の皮下注射により、５ｍｌの投与体積で投与した。
試料採取：ＰＤ分析用には、血漿及び血清試料を、ベースラインと、投与後３日目、８日目、１５日目、２２日目及び２９日目に採取した。血漿試料は、投与後１５分及び１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間及び７２時間に採取した。肝臓試料を、投与後３日目及び３０日目に剖検採取した。
生体分析法：血漿ＰＤ試料を、製造者の指示に従って二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；血漿希釈度１：１０，０００）を使用して、Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＭＯ，ＵＳＡ）でＣ３タンパク質の濃度について分析してもらった。
血清ＰＤ試料を、ＡＰ Ｗｉｅｓｌａｂアッセイ（Ｅａｇｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＣＯＭＰＬ ＡＰ３３０）を使用して、Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＭＯ、ＵＳＡ）で代替経路（ＡＰ）補体活性化について分析してもらった。
ＰＤ組織試料を、ＥｐｉｇｅｎＤｘ（ＭＡ，ＵＳＡ）で半検証済みＲＴ－ｑＰＣＲ法を使用してＣ３ ｍＲＮＡレベルについて分析してもらった。
結果
循環中のＣ３：５つの時点で血漿を採取し、Ｃ３濃度の変化を評価した。ｓｉＲＮＡに対する明確な用量依存応答が各用量群にわたって認められた（図７）。Ｃ３タンパク質減少の最大レベルが、すべての用量群で試験８日目に得られた。血漿Ｃ３濃度データは、単回用量処理とＱＤｘ３の同等用量群との間で同等であった。血漿Ｃ３タンパク質のベースラインレベルへの完全な回復は、３ｍｇ／ｋｇ用量群でのみ観察された。１０ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇの用量群は、２９日目の最終的な血液採取によって、それぞれのベースラインＣ３タンパク質レベルにまで完全には回復しなかったようである。
代替経路補体活性：単回用量のｓｉＲＮＡ５９及び溶媒で処理した各動物、ならびに複数用量のｓｉＲＮＡ（－）コントロールで処理した動物から採取した血清を、代替経路活性化後のＣ５ｂ－９の形成を測定するＥＬＩＳＡベースのアッセイであるＡＰ Ｗｉｅｓｌａｂアッセイで使用して補体活性化を評価した（図８）。図８は、溶媒（Ａ）、ｓｉＲＮＡ（－）コントロール（Ｂ）、３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ５９（Ｃ）、１０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ５９（Ｄ）、及び（Ｅ）３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ５９ で皮下処理した動物の血清中の、ＥＬＩＳＡを用いた可溶性Ｃ５ｂ－９複合体の検出及び定量による代替経路活性の測定を示す（光学密度の測定値＝ＯＤ）。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。血清ＡＰ補体活性は、各コントロール群で大きな変動がみられた。高用量のｓｉＲＮＡ５９群から採取した血清は、代替経路活性の平均低下率が約９０％であり、これは投与後８日目～１５日目まで持続した。
肝臓組織中のＣ３転写産物：本試験の両方の終了時点において、肝臓中のＣ３ ｍＲＮＡの減少が用量依存的に起こることが観察された（図９）。処理の３日後に、単回投与ＰＫ動物群における肝臓Ｃ３ ｍＲＮＡのレベルは、溶媒コントロールにおけるＣ３の発現と比較して有意に低下した。３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ５９で処理した動物では、肝臓における平均のＣ３の発現量は溶媒処理群における遺伝子発現量の３％であったが、３０日目までに２５％にまで上昇した。処理動物のいずれにおいても、３０日目の試験終了までにＣ３の発現は完全に回復しなかった。
考察：ｓｉＲＮＡ５９の皮下投与後、血漿中のＣ３タンパク質及び肝組織中のＣ３ ｍＲＮＡの明確な用量依存的な減少が観察された。さらに、観察された用量反応は、ｓｉＲＮＡ５９を単回皮下ボーラスとして投与した場合と、３日間にわたって毎日の注射として投与した場合で同様であった。それぞれ２９日目及び３０日目までに、Ｃ３の血漿タンパク質濃度及び肝臓中のｍＲＮＡ発現量は、低用量群でのみ回復した。
Ｃ３血漿タンパク質レベル及び肝臓での遺伝子発現量は、単回用量群と複数用量群との間ですべての時点で同等であった。１０ｍｇ／ｋｇの用量後にＣ３血漿タンパク質濃度が約９０％低下したにもかかわらず、高用量動物からの血清を除いて、いずれの用量群でもＡＰ Ｗｉｅｓｌａｂ活性の変化は認められなかった。いずれの処理群の動物でも苦痛の徴候または行動変化は認められず、ＴＡ投与後に体重の減少は認められず、本試験で使用した各用量の忍容性が高いことが示唆された。
これらの結果は、全身循環中のＣ３タンパク質は、Ｃ３を標的とするＧａｌＮＡｃタグ付きｓｉＲＮＡによる処理後に用量依存的にサイレンシングされ得ることを示している。
実施例８：肝臓に標的化されたｓｉＲＮＡの非ヒト霊長類への投与後の血液画分、房水（ＡＨ）及び硝子体液（ＶＨ）中のＣ３及びＣ３ａの評価
本実施例は、肝臓に標的化されたｓｉＲＮＡ（Ｃ３を標的とする）を全身投与した場合に、非ヒト霊長類の血漿／血清ならびにＡＨ及びＶＨなどの組織中の、特にＣ３及びＣ３ａのタンパク質濃度が減少することを実証するものである。本実施例では、ＧａｌＮＡｃ結合ｓｉＲＮＡ（実施例４の「ｓｉＲＮＡ５８」）を非ヒト霊長類に全身投与した。具体的な材料及び方法を以下に詳しく説明する。
試験デザイン：
ｓｉＲＮＡ５８または溶媒を、１～４日目に１日１回の単回皮下投与として雄性カニクイザルに投与した。
血清／血漿試料を、２週目、４週目及び終了時剖検（６週目）の前に採取した。剖検前に各動物から房水（ＡＨ）及び硝子体液（ＶＨ）の試料を採取した。組織試料を６週目の剖検時に採取した。
この試験の実験デザインを下記表２０に要約する。
方法
血清、ＡＨ、及びＶＨのＣ３分析：各試料を、製造者の指示に従って電気化学発光検出免疫アッセイ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（登録商標）（ＭＳＤ）、カタログ番号Ｋ１５１ＸＹＲ－２）を使用してＣ３タンパク質濃度について分析した。分析に先立って、血清試料を１：１０，０００に希釈し、ＡＨ試料を１：１０に希釈し、ＶＨ試料を１：１０に希釈した。分析に先立ってＡＨ試料及びＶＨ試料をボルテックスにかけた。
血漿、ＡＨ及びＶＨのＣ３ａ分析：各試料を、製造者の指示に従って酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）（Ｑｕｉｄｅｌ（登録商標）、カタログ番号Ａ０３１）を用いてＣ３ａタンパク質濃度について分析した。分析に先立って、血漿試料を１：１００に希釈し、ＡＨ試料及びＶＨ試料を１：５に希釈した。分析に先立ってＡＨ試料及びＶＨ試料をボルテックスにかけた。
結果
血清Ｃ３及び血漿Ｃ３ａのデータ：ｓｉＲＮＡまたは溶媒の投与後の異なる時点における血清中のＣ３レベルを図１０のパネルＡ及びＢに示す。図１０のパネルＡは、平均血清Ｃ３濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。図１０のパネルＢは、平均血清Ｃ３の減少を、ｓｉＲＮＡまたは溶媒が投与される前のレベル（すなわち、ベースラインレベル）からの減少率（％）として示す。
ｓｉＲＮＡまたは溶媒の投与後の異なる時点における血漿中のＣ３ａレベルを、図１１のパネルＡ及びＢに示す。図１１のパネルＡは、平均血漿Ｃ３ａ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。図１１のパネルＢは、平均血清Ｃ３ａの減少を、ｓｉＲＮＡまたは溶媒が投与される前のレベル（すなわち、ベースラインレベル）からの減少率（％）として示す。
これらの結果は、ｓｉＲＮＡ５８の全身投与の結果として、血清／血漿（すなわち、血液画分）中のＣ３及びＣ３ａタンパク質が有意に減少したことを示す。タンパク質濃度の平均減少率またはノックダウン（ＫＤ）は、分析物Ｃ３及びＣ３ａの両方で約８７～９３％であった（図１０のパネルＢ及び図１１のパネルＢを参照）。
硝子体液のＣ３及びＣ３ａデータ：４４日目の硝子体液（ＶＨ）中のＣ３及びＣ３ａレベル（ｎｇ／ｍｌ）を、それぞれ図１２のパネルＡ及びＢに示す。
これらの結果は、ｓｉＲＮＡ５８を投与した動物では、溶媒を投与した動物と比較して、硝子体液（ＶＨ）中のＣ３レベル及びＣ３ａレベルの両方が有意に低下したことを示している。タンパク質濃度（ＫＤ）の平均減少率は、ベースラインのレベル（投与前）と比較した場合、Ｃ３で約７０％、Ｃ３ａでは約８３％であった。ｓｉＲＮＡ５８を投与した処理群の１匹の動物で、Ｃ３ａ値が検出限界（ＬＯＤ）すなわち０．０６ｎｇ／ｍｌを下回ることが報告された。
房水のＣ３及びＣ３ａのデータ：４４日目の房水（ＡＨ）中のＣ３及びＣ３ａレベル（ｎｇ／ｍｌ）を、それぞれ図１３のパネルＡ及びＢに示す。
これらの結果は、ｓｉＲＮＡ５８を投与した動物では、溶媒を投与した動物と比較して、ＡＨ中のＣ３及びＣ３ａタンパク質レベルの両方が有意に低下したことを示している。タンパク質濃度（ＫＤ）の平均減少率は、ベースラインのレベル（投与前）と比較した場合、Ｃ３で約９２％、Ｃ３ａでは約９４％であった。ｓｉＲＮＡ５８を投与した処理群の１匹の動物で、Ｃ３ａ値が検出限界（ＬＯＤ）すなわち０．０６ｎｇ／ｍｌを下回ることが報告された。
これらのデータは、肝臓に標的化されたｓｉＲＮＡの全身投与が眼組織のＣ３及びＣ３活性化産物を減少させ、補体媒介性眼疾患の治療に使用され得るという洞察を裏付けるものである。
ＩＸ．さらなる例示的配列
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均等物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲に記述されるようなものである。

Claims (67)

  1. 補体媒介性疾患を治療する方法であって、対象のＣ３ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを前記対象に全身投与することを含む、前記方法。
  2. 前記ｓｉＲＮＡが、肝臓標的化部分を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記肝臓標的化部分が、ＧａｌＮＡｃ部位である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ｓｉＲＮＡが、表２Ａ、２Ｂ、４、５、６、１０、１５、１６、１７、１８、２４～７０、または７２～７３に記載される配列を含むアンチセンス鎖を含み、及び／または表１、３Ａ、３Ｂ、１０、１５、１６、１７、１８、または２１～７１に記載される配列を含むセンス鎖を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記ｓｉＲＮＡがアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列に相補的であり、及び／または前記センス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記アンチセンス鎖が、配列番号７６～１００のいずれか１つと１、２、３、または４個以下のヌクレオチドが異なる配列を含むヌクレオチド配列に相補的であり、及び／または前記センス鎖が、配列番号７６～１００のいずれか１つと１、２、３、または４個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記アンチセンス鎖が、配列番号７６～１００のいずれか１つを含むヌクレオチド配列に相補的である、請求項５または６に記載の方法。
  8. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１０１～１２５のいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の一方または両方が、少なくとも１つのオーバーハング領域を含む、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記少なくとも１つのオーバーハング領域が、１、２、３、４または５ヌクレオチドのオーバーハングを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記少なくとも１つのオーバーハング領域が、３’オーバーハングを含む、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つのオーバーハング領域が、配列番号７５の断片に相補的である、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記３’オーバーハングが、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の一方または両方が、配列番号７５の断片に相補的ではない少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを、５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に含む、請求項５～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の一方または両方が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項５～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル基を含むヌクレオチド、２’－フルオロ基を含むヌクレオチド、及び／または隣接ヌクレオチドとのホスホロチオエート結合を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、（ｉ）前記センス鎖の５’末端、（ｉｉ）前記センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端、及び／または（ｉｖ）前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の２、３または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、（ｉ）前記センス鎖の５’末端、（ｉｉ）前記センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端、及び／または（ｉｖ）前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の３個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、（ｉ）前記センス鎖の５’末端、（ｉｉ）前記センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端、及び（ｉｖ）前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の２、３または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記センス鎖が、配列番号７６～１００、１２６～１５０、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５５、２５９、２６４、２６８、２７２、２７６、３２５、３２６、及び３２７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項５～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１０１～１２５、１５１～２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５８、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２７４、２７５、２７７、２７８、及び３００～３２４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項５～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記ｓｉＲＮＡが、以下のセンス／アンチセンス配列番号の組：２０１／２０２、２０３／２０４、２０５／２０６、２０７／２０８、２０９／２１０、２１１／２１２、２１３／２１４、２１５／２１６、２１７／２１８、２１９／２２０、２２１／２２２、２２３／２２４、２２５／２２６、２２７／２２８、２２９／２３０、２３１／２３２、２３３／２３４、２３５／２３６、２３７／２３８、２３９／２４０、２４１／２４２、２４３／２４４、２４５／２４６、２４７／２４８、２４９／２５０、２５１／２５２、２５３／２５４、２０１／２５６、２５５／２５６、２５５／２５７、２０１／２５８、２５５／２５８、２０７／２６０、２５９／２６０、２５９／２６１、２０７／２６２、２５９／２６２、２１７／２６３、２６４／２６３、２６４／２６５、２１７／２６６、２６４／２６６、２１９／２６７、２６８／２６７、２６８／２６９、２１９／２７０、２６８／２７０、２３１／２７１、２７２／２７１、２７２／２７３、２３１／２７４、２７２／２７４、２４３／２７５、２７６／２７５、２７６／２７７、２４３／２７８、２７６／２７８、３２５／２７５、３２６／２６０、及び３２７／２５８のいずれか１つのセンス鎖ヌクレオチド配列／アンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む、請求項５～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記ｓｉＲＮＡが、前記センス鎖の５’末端、前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の５’末端、及び前記アンチセンス鎖の３’末端のうちの１つ以上に結合された少なくとも１つのリガンドを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記リガンドが、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記リガンドが、３個のＧａｌＮＡｃ部分を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ｓｉＲＮＡをコードする核酸を含む組成物を前記対象に投与することを含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ｓｉＲＮＡまたは前記組成物の投与後に、前記対象または前記対象からの生体試料中のＣ３転写産物またはＣ３タンパク質のレベルが、前記ｓｉＲＮＡまたは前記組成物の投与前のレベルに対して減少する、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. Ｃ３転写産物またはＣ３タンパク質のレベルが、前記投与前のレベルに対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％減少する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ｓｉＲＮＡまたは前記組成物が、前記対象に静脈内または皮下投与される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記ｓｉＲＮＡまたは前記組成物が、前記対象の肝細胞に投与される、請求項１～２９のいずれか１項も記載の方法。
  31. 前記ｓｉＲＮＡまたは前記組成物が、エクスビボで前記肝細胞に投与される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ｓｉＲＮＡまたは前記組成物が、インビボで前記肝細胞に投与される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記対象に第２の薬剤を全身投与することをさらに含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記第２の薬剤が、抗Ｃ３抗体またはコンプスタチン類似体である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記眼疾患が、地理的萎縮または中間型ＡＭＤである、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 対象の眼内の補体Ｃ３のレベルを、コントロールに対して阻害または減少させる方法であって、前記対象のＣ３ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを前記対象に全身投与することを含む、前記方法。
  37. 前記ｓｉＲＮＡが、肝臓標的化部分を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記肝臓標的化部分が、ＧａｌＮＡｃ部位である、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. 前記ｓｉＲＮＡが、表２Ａ、２Ｂ、４、５、６、１０、１５、１６、１７、１８、２４～７０、または７２～７３に記載される配列を含むアンチセンス鎖を含み、及び／または表１、３Ａ、３Ｂ、１０、１５、１６、１７、８、または２１～７１に記載される配列を含むセンス鎖を含む、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記ｓｉＲＮＡがアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列に相補的であり、及び／または前記センス鎖は、配列番号７６～１００のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項３６～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記アンチセンス鎖が、配列番号７６～１００のいずれか１つと１、２、３、または４個以下のヌクレオチドが異なる配列を含むヌクレオチド配列に相補的であり、及び／または前記センス鎖が、配列番号７６～１００のいずれか１つと１、２、３、または４個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記アンチセンス鎖が、配列番号７６～１００のいずれか１つを含むヌクレオチド配列に相補的である、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１０１～１２５のいずれか１つを含むヌクレオチド配列を含む、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の一方または両方が、少なくとも１つのオーバーハング領域を含む、請求項４０～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記少なくとも１つのオーバーハング領域が、１、２、３、４または５ヌクレオチドのオーバーハングを含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記少なくとも１つのオーバーハング領域が、３’オーバーハングを含む、請求項４４または４５に記載の方法。
  47. 前記少なくとも１つのオーバーハング領域が、配列番号７５の断片に相補的である、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記３’オーバーハングが、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む、請求項４６または４７に記載の方法。
  49. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の一方または両方が、配列番号７５の断片に相補的ではない少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを、５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に含む、請求項４０～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の一方または両方が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項４０～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル基を含むヌクレオチド、２’－フルオロ基を含むヌクレオチド、及び／または隣接ヌクレオチドとのホスホロチオエート結合を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、（ｉ）前記センス鎖の５’末端、（ｉｉ）前記センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端、及び／または（ｉｖ）前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の２、３または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、（ｉ）前記センス鎖の５’末端、（ｉｉ）前記センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端、及び／または（ｉｖ）前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の３個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、（ｉ）前記センス鎖の５’末端、（ｉｉ）前記センス鎖の３’末端、（ｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端、及び（ｉｖ）前記アンチセンス鎖の３’末端の最後の２、３または４個のヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記センス鎖が、配列番号７６～１００、１２６～１５０、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５５、２５９、２６４、２６８、２７２、２７６、３２５、３２６、及び３２７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項４０～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１０１～１２５、１５１～２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５８、２６０、２６１、２６２、２６３、２６５、２６６、２６７、２６９、２７０、２７１、２７３、２７４、２７５、２７７、２７８、及び３００～３２４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項４０～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記ｓｉＲＮＡが、以下のセンス／アンチセンス配列番号の組：２０１／２０２、２０３／２０４、２０５／２０６、２０７／２０８、２０９／２１０、２１１／２１２、２１３／２１４、２１５／２１６、２１７／２１８、２１９／２２０、２２１／２２２、２２３／２２４、２２５／２２６、２２７／２２８、２２９／２３０、２３１／２３２、２３３／２３４、２３５／２３６、２３７／２３８、２３９／２４０、２４１／２４２、２４３／２４４、２４５／２４６、２４７／２４８、２４９／２５０、２５１／２５２、２５３／２５４、２０１／２５６、２５５／２５６、２５５／２５７、２０１／２５８、２５５／２５８、２０７／２６０、２５９／２６０、２５９／２６１、２０７／２６２、２５９／２６２、２１７／２６３、２６４／２６３、２６４／２６５、２１７／２６６、２６４／２６６、２１９／２６７、２６８／２６７、２６８／２６９、２１９／２７０、２６８／２７０、２３１／２７１、２７２／２７１、２７２／２７３、２３１／２７４、２７２／２７４、２４３／２７５、２７６／２７５、２７６／２７７、２４３／２７８、２７６／２７８、３２５／２７５、３２６／２６０、及び３２７／２５８のいずれか１つのセンス鎖ヌクレオチド配列／アンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む、請求項４０～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記ｓｉＲＮＡが、前記センス鎖の５’末端、前記センス鎖の３’末端、前記アンチセンス鎖の５’末端、及び前記アンチセンス鎖の３’末端のうちの１つ以上に結合された少なくとも１つのリガンドをさらに含む、請求項３６～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記リガンドが、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記リガンドが、３個のＧａｌＮＡｃ部分を含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ｓｉＲＮＡをコードする核酸を含む組成物を前記対象に投与することを含む、請求項３６～５７のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記投与するステップの後、Ｃ３転写産物またはＣ３タンパク質のレベルが、前記投与するステップの前の前記対象のＣ３のコントロールレベルに対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％減少する、請求項３６～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記対象に第２の薬剤を全身投与することをさらに含む、請求項３６～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記第２の薬剤が、抗Ｃ３抗体またはコンプスタチン類似体である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記対象が、補体媒介性眼疾患に罹患している、請求項３６～６４のいずれか１項に記載の方法。
  66. 前記眼疾患が、地理的萎縮または中間型ＡＭＤである、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記ｓｉＲＮＡ、前記組成物、または前記第２の薬剤が、前記対象の眼に局所的に投与されない、請求項１～６６のいずれか１項に記載の方法。
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