JP2024519704A - 弱毒化サルモネラガリナルム菌株及びその用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、弱毒化サルモネラガリナルム菌株及びその用途に関する。具体的には、グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子、タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子（ｓｓｒＡＢ）、及びＧｉｆｓｙ ２ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子が全て欠失している新規な弱毒化サルモネラ菌株、及びこれを用いた腫瘍治療又は診断用組成物に関する。【選択図】 図９

Description

本発明は、弱毒化サルモネラガリナルム菌株及びその用途に関する。具体的には、グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子、タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子（ｓｓｒＡ、ｓｓｒＢ、又はｓｓｒＡＢ）、及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子が全て欠失している新規な弱毒化サルモネラ菌株、及びこれを用いた腫瘍治療又は診断用組成物に関する。
２０１９年に癌で死亡した人は合計８１，２０３名であり、全体死亡者の２７．５％が癌で死亡している。このため、癌は最も一般的な死亡原因とされており、韓国癌情報センターによれば全国単位の癌発生統計を算出し始めた１９９９年から最近までその発病率は増加の一途をたどっている。
発病率増加要因としては、大気汚染などの環境汚染物質の増加のような環境的要因、食生活の西欧化による高脂肪食の摂取、及び飲酒及び喫煙のような個人的な要因の増加が挙げられる。したがって、癌の早期予防及び治療のための抗癌素材の開発の重要性がより一層高まっている。また、明確な治療方法がない難治性癌腫は、発病率は低いが、死亡率が高いため、治療剤の開発が至急である。ただし、化合物ベースの抗癌剤は、癌細胞の他にも全身に作用する非特異性を示す場合が多いため、副作用の発生が問題点として指摘されている。
一方、バクテリア感染が抗癌効果を示すとの報告以来、抗腫瘍バクテリア菌株の開発に関する研究が急増した。ここ２０年間に研究された抗腫瘍バクテリアは、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）などである。ただし、このような菌株を用いた癌治療のメカニズムは、未だ完全に明らかになっていない現状である。
前記提示された様々な菌株のうち、既存開発された弱毒化サルモネラ菌株は、癌細胞の他に様々な正常臓器にも分布するため、癌細胞標的化率が低く、菌株自体による副作用が問題となっている。特に、免疫機能が弱まっている患者や老弱者は、弱毒化サルモネラ菌株によっても致命的な敗血症に至ることがあるため、治療効果を考慮するとしても改善策が要求される。したがって、腫瘍標的能及び生体内安定性が格別に高いながらも癌治療に効果的に使用できる新しい菌株の開発が必要である。
そこで、本発明者らは、生体内安全性が高く、腫瘍標的能、生存率及び治療能に優れながらも、正常臓器に対する標的能及び生存率が非常に低い弱毒化サルモネラガリナルム菌株を開発するための研究を行い、本発明を完成するに至った。
韓国登録特許第１０－２０１５５７３号
本発明は、グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子、タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子、及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子が欠失している、新規な弱毒化サルモネラガリナルム菌株を提供する。
また、本発明は、グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子、タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子及びｇｌｍＳ遺伝子が欠失している、新規な弱毒化サルモネラガリナルム菌株を提供する。
具体的には、本発明は、優れた抗腫瘍効果を有するサルモネラガリナルムＳＧ４０４４菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１４５４１ＢＰ）又はＳＧ４０４８菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１４５４２ＢＰ）を提供する。
本発明の菌株を含む腫瘍治療又は診断のための組成物を提供する。
本発明の菌株を被検体に投与する段階；前記菌株の生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を検出する段階；及び、生物発光が検出される場合に、被検体に腫瘍が存在すると判断する段階を含む腫瘍診断のための情報提供方法を提供する。
本発明は、グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子、タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子、及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子が欠失していることを特徴とする弱毒化サルモネラガリナルム菌株に関する。
また、本発明は、グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子、タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子及びｇｌｍＳ遺伝子が欠失している、新規な弱毒化サルモネラガリナルム菌株に関する。
本発明の菌株は、プロモータに作動可能に連結されたｇｌｍＳ遺伝子を含むプラスミドで形質転換された弱毒化サルモネラガリナルム菌株に関する。
前記グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子は、ｒｅｌＡ又はｓｐｏＴであってよい。
前記タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子は、遺伝体に連続的に配列されているｓｓｒＡ、又はｓｓｒＢ、又はｓｓｒＡＢである。
本発明は、サルモネラガリナルムＳＧ４０２１菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１３９８５ＢＰ）においてｒｅｌＡ、ｓｐｏＴ、ｓｓｒＡＢ及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子が欠失している弱毒化サルモネラガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）菌株に関する。
本発明は、サルモネラガリナルムＳＧ４０２１菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１３９８５ＢＰ）においてｒｅｌＡ、ｓｐｏＴ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ及びｇｌｍＳ遺伝子が欠失している弱毒化サルモネラガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）菌株に関する。
一実施態様において、本発明の弱毒化サルモネラガリナルム菌株は、サルモネラガリナルムＳＧ４０４４菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１４５４１ＢＰ）であってよい。
一実施態様において、本発明の弱毒化サルモネラガリナルム菌株は、サルモネラガリナルムＳＧ４０４８菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１４５４２ＢＰ）であってよい。
本発明の菌株は、発光遺伝子をさらに含んでよい。
前記発光遺伝子は、ｌｕｘＣＤＡＢＥであってよい。
本発明は、前記菌株を含む腫瘍診断又は治療用の薬学組成物に関する。前記腫瘍は、固形癌又は腺癌腫であってよく、好ましくは、大腸癌、膵癌、肺癌、皮膚癌又は乳癌であってよいが、これに限定されない。
本発明は、前記菌株を被検体に投与する段階；前記菌株の生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を検出する段階；及び、生物発光が検出される場合に、被検体に腫瘍が存在すると判断する段階を含む腫瘍診断のための情報提供方法に関する。
本発明のグアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）生成能欠如、タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能喪失及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子欠失によって作製された弱毒化サルモネラガリナルム菌株は、腫瘍を特異的に標的化でき、腫瘍増殖阻害活性に優れると同時に腫瘍以外の正常組織の被害を最小化できるので、腫瘍の改善又は治療及び映像化において有用に活用可能である。
野生型（ＳＧ４０２１）、ｐｐＧｐｐ欠失（ＳＧ４０２３）及びｐｐＧｐｐ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ（ＳＧ４０４４）欠失サルモネラガリナルムのアミノ酸要求度を調べた結果である。
野生型サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０２１）の静脈投与において、各投与量によるマウスの生存率を示すグラフである。
ｐｐＧｐｐ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ欠失サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４６）の静脈投与において、各投与量によるマウスの生存率を示すグラフである。
ｐｐＧｐｐ欠失サルモネラティフィムリウム菌株（ＳＭＲ２１３０）の静脈投与において、各投与量によるマウスの生存率を示すグラフである。
ＧｌｍＳ ＋ｐＬｕｘプラスミドで形質転換されたｇｌｍＳ欠失弱毒化サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０５０）及び野生型サルモネラ菌株（ＳＧ４０２１）のプラスミドの安定性を比較したグラフである。
ＧｌｍＳ ＋ｐＬｕｘプラスミドで形質転換された弱毒化サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０５０）を静脈投与した後、様々な腫瘍に対する標的化結果を生物発光信号イメージングによって示す写真である。
ｐｐＧｐｐ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ欠失サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４４）及びｐｐＧｐｐ欠失サルモネラティフィムリウム菌株（ＳＭＲ２１３０）を静脈内投与したＣＴ２６細胞が移植されたマウスにおいて、時間による腫瘍の体積を示すグラフ及び移植された腫瘍の変化を示す写真である（Ｎ＝５／Ｇｒｏｕｐ）。
ｐｐＧｐｐ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ欠失サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４４）及びｐｐＧｐｐ欠失サルモネラティフィムリウム菌株（ＳＭＲ２１３０）を静脈内投与したＣＴ２６細胞が移植されたマウスにおいて、時間によるマウスの生存率を示すグラフである。
ｐｐＧｐｐ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ欠失サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４６）及びｐｐＧｐｐ欠失サルモネラティフィムリウム菌株（ＳＭＲ２１３０）を静脈内投与したＣＴ２６細胞が移植されたマウスにおいて、各臓器別サルモネラ菌株の数を時間によって示すグラフである（Ｎ＝５／Ｇｒｏｕｐ）。
以下、添付の図面を参照して、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、本願の実施態様及び実施例を詳細に説明する。ただし、本願は様々な形態で具現可能であり、ここで説明する実施態様及び実施例に限定されない。
本願明細書全般において、ある部分がある構成要素を「含む」としたとき、これは、特に断らない限り、他の構成要素を除外するのではなく他の構成要素をさらに含み得ることを意味する。
本発明は、グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子、タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子、及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子が欠失している弱毒化サルモネラガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）菌株に関する。
従来、バクテリアを用いた抗癌標的治療研究への利用頻度が最も高いサルモネラ菌株は、サルモネラティフィムリウムであり、サルモネラティフィムリウムの感染による病原性を考慮して必ず弱毒化後に研究に用いられる（Ｆｏｒｂｅｓ，Ｎ．Ｓ．（２０１０）。Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｆｅｃｔ （ｂａｃｔｅｒｉａｌ） ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，１０（１１）、７８５－７９４．）。サルモネラ属は、血清学的分類法によって略２５００種に分類される程度に様々であり、それらのうち一部の菌株が宿主特異的病原を保有することが報告されている（Ｐｏｒｗｏｌｌｉｋ，Ｓ；Ｂｏｙｄ，ＥＦ；Ｃｈｏｙ，Ｃ；Ｃｈｅｎｇ，Ｐ；Ｆｌｏｒｅａ，Ｌ；Ｐｒｏｃｔｏｒ，Ｅ；ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，Ｍ（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２００４））。例えば、サルモネラチフィ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ）及びサルモネラパラチフィ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）は、ヒトを宿主とする病原機序を保有し、サルモネラティフィムリウム（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）は、ヒトを含めてウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、齧歯類などに感染して病症を誘発することが報告されている。一方、サルモネラガリナルム（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）は、鳥類にのみ特異的に感染して病原性を示すことが知られている。したがって、本発明の弱毒化サルモネラガリナルム菌株は、ヒトにとって最も安全ながらも、腫瘍の診断又は治療に効果的に利用可能である。
本発明で使われる用語、「弱毒化」は、菌株の病原性が減少するように変形されることを指す。菌株は、弱毒化によって、腫瘍細胞以外の正常細胞で菌株の病原性によって現れ得る細胞毒性及びその他副作用の防止が可能である。弱毒化菌株は、当業界に公知の様々な方法によって得られる。例えば、弱毒化は、菌株を宿主細胞において生存可能にする毒性因子（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ）の欠失又は破壊によって達成されてよく、ｐａｂ、ｐｒｏＢＣ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｐｍｉ、ｒｐｓＬ、ｏｍｐＲ、ｈｔｒＡ、ｈｅｍＡ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ、ｇａｌＵ、ａｒｏ、ｇａｌＥ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｃｄｔ、ｐｕｒ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｓｓａ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢ、ｃｌｐＰ、ｃｌｐＸ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｒｅｌＡ、ｓｐｏＡ及びｓｐｏＴ遺伝子、及びｓｓａＶ、ｓｓｅＢＣＤ、ｓｓｒＡＢ、ｓｏｐＢ、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧを含むサルモネラ病原性遺伝子島（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ，ＳＰＩ）にコードされた遺伝子の欠失によって達成されてよいが、これに限定されるものではない。
本発明で使われる用語「ｐｐＧｐｐ」は、グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のことを指し、グアノシン５’－二リン酸３’－二リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ５’－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｇｅ ３’－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）又はグアノシン３’５’－ビスピロリン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ３’５’－ｂｉｓｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）で言い換えられてよい。ｐｐＧｐｐは、細胞内信号伝達物質であり、サルモネラガリナルム菌株の毒性を現れるようにする遺伝子のうち、特にサルモネラ病原性遺伝子島（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｉｓｌａｎｄ，ＳＰＩ）にコードされた遺伝子の発現を誘導する。また、本発明において、グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子は、ｒｅｌＡ及びｓｐｏＴ遺伝子を意味できる。
ｒｅｌＡ及びｓｐｏＴ遺伝子の同時欠失は、遺伝子の転写又は翻訳、遺伝子産物の活性の損傷（ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）を招くｒｅｌＡ及びｓｐｏＴ遺伝子の変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）によって達成されてよい。このような遺伝子変形は、ｐｐＧｐｐ合成酵素コーディング配列（ＣＤＳ）の不活性化の他にそのプロモータの不活性化も含んでよい。
サルモネラガリナルム菌株のゲノム上で目的とする遺伝子のみの特異的不活性化は、遺伝子をコードする全体又は一つ以上の部分領域において置換、挿入、欠失又はこれらの組合せによる突然変異によって達成されてよい。例えば、遺伝子の欠失及び遺伝子への異型配列（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の挿入によって、遺伝子の切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、ナンセンス突然変異（ｎｏｎｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、フレームシフト突然変異（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、ミスセンス突然変異（ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）などが発生し得る。このような遺伝子の特異的不活性化は、当業界で一般に用いられる方法によって行われてよい。一方、遺伝子の欠失は、当業界に公知の様々な変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法によって行われてよい。例えば、ｒｅｌＡ及びｓｐｏＴ遺伝子の欠失は、ＰＣＲ突然変異誘発法及びカセット突然変異誘発法で行われてよい。
また、本発明で使われる用語「タイプＩＩＩ分泌システム（Ｔ３ＳＳ）」は、遺伝体上に連続して配列されているｓｓｒＡ及びｓｓｒＢ遺伝子によって調節される。ｓｓｒＢは転写調節者であり、膜タンパク質であるｓｓｒＡによってリン酸化されて活性を有する。したがって、サルモネラガリナルム遺伝体上で前記ｓｓｒＡ及び／又はｓｓｒＢの除去による機能喪失は、サルモネラ病原性遺伝子島２（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄ ２，ＳＰＩ２）に含まれたオペロン及び遺伝子全体を不活性化させる結果を示し得る。サルモネラは、宿主への感染後にＳＰＩ２にエンコードされたタイプＩＩＩ分泌システム（Ｔ３ＳＳ）を配布して宿主細胞機能を修正し、宿主細胞内で繁殖する。
本発明において、Ｇｉｆｓｙ１及び２は、バクテリアを標的とするウイルス（バクテリオファージ、ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）を意味する。本発明者らは、野生型サルモネラガリナルムの遺伝体検査結果から、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅをコードする全体遺伝子配列が含まれていることを確認したし、サルモネラ遺伝体内に挿入されている前記遺伝子の欠失によってサルモネラの病原性を下げることができる。
バクテリアを宿主とするバクテリオファージの遺伝体除去は、病原性を下げて弱毒化に供する。
したがって、ｒｅｌＡ、ｓｐｏＴ、ｓｓｒＡＢ遺伝子及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅをコードする遺伝子全体が欠失している弱毒化サルモネラガリナルム菌株は、野生型サルモネラガリナルムに比べて毒性が百万倍以上弱まり、サルモネラガリナルム菌株の効果的な弱毒化が可能である。
ｇｌｍＳ遺伝子が欠失しているサルモネラガリナルム菌株は、ペプチドグリカン合成成分であるＤ－グルコサミン（Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，ＧｌｃＮ）又はＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，ＧｌｃＮＡｃ）が不足して動物で溶解され得るので、抗生剤耐性遺伝子の代わりにｇｌｍＳ遺伝子はサルモネラガリナルム菌株の選択的決定因子として使用可能である。
均衡致死宿主ベクターシステム（ｂａｌａｎｃｅｄ－ｌｅｔｈａｌ ｈｏｓｔ－ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）は、染色体上のｇｌｍＳ欠失突然変異を相補するためのｇｌｍＳ遺伝子を含むプラスミドの形質転換によって構築されてよい。ｇｌｍＳ遺伝子を含むプラスミドが成功的に形質転換された弱毒化サルモネラガリナルム菌株はＧｌｃＮ又はＧｌｃＮＡｃの生合成が可能なので、ＧｌｃＮ又はＧｌｃＮＡｃが不足している環境でも生存が可能であり、選択的マーカーとして作用可能である。
本発明のプラスミドは、当業界で使用されるプラスミド、例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ及びｐＵＣ１９からなる群から選ばれるものであってよいが、これに限定されない。
本発明のプラスミドは、一つ以上の選択性マーカーをさらに含んでよい。前記マーカーは、通常、化学的な方法で選択され得る特性を有する核酸配列であり、形質転換された細胞を非形質転換細胞から区別できる遺伝子がこれに該当し得る。例えば、グリホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）、グルホシネートアンモニウム（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｍｍｏｎｉｕｍ）又はホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤に対する耐性遺伝子であってよいが、これに限定されない。
本発明のプラスミドの作製は、当該技術分野でよく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造でき、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術の分野で一般的に知られた酵素などを用いて行われてよい。
本発明のプラスミドをサルモネラガリナルム菌株に導入して形質転換する方法は、当業界で核酸を細胞内に導入するために一般に用いている方法であってよく、当業界に公知された適宜の標準技術を選択して行われてよい。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－テキストラン法、陽イオンリポソーム法及び酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法であってよいが、これに限定されない。
本発明で使われる用語「作動可能に連結された」は、遺伝子発現調節配列と異なるヌクレオチド配列間の機能的な結合を意味する。前記遺伝子発現調節配列は、複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）、プロモータ及び転写終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）などからなる群から選ばれる１種以上であってよい。転写終結配列は、ポリアデニル化配列（ｐＡ）であってよく、複製原点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点又はＢＢＶ複製原点などであってよいが、これに限定されない。
本発明で使われる用語「プロモータ」は、構造遺伝子からのＤＮＡアップストリームの領域を意味し、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ分子を指す。
本発明の一具体例によるプロモータは、特定遺伝子の転写開始を調節する転写調節配列の一つで、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐ長のポリヌクレオチド断片であってよい。例えば、プロモータは、ｔａｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｌａｃＵＶ５プロモータ、ｌｐｐプロモータ、ｐＬλプロモータ、ｐＲλプロモータ、ｒａｃ５プロモータ、ａｍｐプロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ＳＰ６プロモータ、ｔｒｐプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｐＢＡＤプロモータ、Ｔｅｔプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｐｅｐＴプロモータ、ｓｕｌＡプロモータ、ｐｏｌ１１（ｄｉｎＡ）プロモータ、ｒｕｖプロモータ、ｕｖｒＡプロモータ、ｕｖｒＢプロモータ、ｕｖｒＤプロモータ、ｕｍｕＤＣプロモータ、ｌｅｘＡプロモータ、ｃｅａプロモータ、ｃａａプロモータ、ｒｅｃＮプロモータ及びｐａｇＣプロモータ及び合成されたプロモータからなる群から選ばれるものであってよいが、これに限定されない。
本発明で使われる用語「発光遺伝子」は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）又は生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）映像撮影が可能なタンパク質をコードする遺伝子のことを指し、様々な由来の生物発光遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）、化学発光遺伝子、蛍光遺伝子を含んでよい。このような遺伝子によって発現する発光現象の撮影装備は当業界に公知であり、当業者によって適切に選択されてよい。
本発明の発光遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたサルモネラガリナルム菌株は腫瘍を標的化するので、腫瘍の視覚的なモニタリングが可能であり、よって、腫瘍治療の正確度及び治療効果を高めることができる。本発明の発光遺伝子と共に使用可能な映像装備は、使用する発光遺伝子の種類によって当業者によって適切に選択されてよい。
本発明における「ｌｕｘＣＤＡＢＥ」は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢの異種二量体）と、前記ルシフェラーゼの基質であるルシフェリン（Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎａｌ）をコードする遺伝子（ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ及びｌｕｘＥ）を全て含んでいるＤＮＡ断片である。発光物質であるルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）が細胞内でＡＴＰによって活性化されて活性ルシフェリンに変換され、発光酵素であるルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の作用によって活性ルシフェリンが酸化ルシフェリンに変換されながら化学エネルギーを光エネルギーに転換させ、発光がなされる。
本発明の発光遺伝子で形質転換されたサルモネラガリナルム菌株によって標的化された腫瘍細胞は、発光遺伝子によって検出可能であり、被検体の腫瘍存在の有無及び被検体に存在する腫瘍の位置、サイズ、及び時間の経過による被検体に存在する腫瘍の変化様相などに関する情報を得ることができる。
本発明において、大腸癌、膵癌、肺癌、皮膚癌及び乳癌細胞株に対する弱毒化サルモネラガリナルム菌株の標的化及び抗癌活性が確認されたし、腺癌腫の一つであるＣＴ２６腫瘍マウスモデルにおいて本発明の弱毒化サルモネラガリナルム菌株の優れた抗癌効果が確認された。
本発明の弱毒化サルモネラガリナルム菌株は、大腸癌、膵癌、肺癌、皮膚癌及び乳癌などの様々な腺癌腫又は固形癌の標的化及び腫瘍抑制活性を示すことができる。
腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）は、特に腺（ｇｌａｎｄ）を構成している細胞で発生する癌で、胃、腸、気管支、子宮、胆嚢などの粘膜をはじめとして、前立腺、甲状腺、膵臓の腺組織又は排泄器官で発生する癌を指す。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。但し、下記の実施例は単に説明の目的のためのもので、本願発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］
弱毒化サルモネラガリナルム菌株作製及び腫瘍抑制活性評価方法
１－１．サルモネラ菌株成長
１％ ＮａＣｌを含有しているＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐを３７℃の激烈な空気供給（Ｖｉｇｏｒｏｕｓ ａｅｒａｔｉｏｎ）で成長させた。固体支持培地（Ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｍｅｄｉｕｍ）は１．５％顆粒寒天（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含んで製造し、抗生剤はＳｉｇｍａ ｃｈｅｍｉｃａｌから購買した。必要によって、抗生剤であるアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，Ａｍｐ）、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋｍ）及びクロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ，Ｃｍ）をそれぞれ１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び１５μｇ／ｍｌの濃度で、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，ＧｌｃＮＡｃ）を１００ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。液体培地内のバクテリア数はヘモサイトメーター（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。
１－２．サルモネラ菌株系統
下表１に示すように、血清型ガリナルム（Ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）突然変異体は、韓国養鶏場で家禽チフス（Ｆｏｗｌ ｔｙｐｈｏｉｄ）を持つニワトリの肝から分離した臨床分離株（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅ）であるＳＧ４０２１に由来するものを使用し、ＳＧ４０２１菌株は、韓国生命工学研究院に２０１９年１０月８日付で寄託した（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１３９８５ＢＰ）。また、ＳＧ４０４４及びＳＧ４０４８菌株を韓国生命工学研究院に２０２１年４月２０日付で寄託した（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１４５４１ＢＰ、ＫＣＴＣ１４５４２ＢＰ）。
全てのサルモネラ菌株系統は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９７．１２（２０００）：６６４０－６６４５）によって開発された方法によって作製され、サルモネラ菌株の弱毒化は、ｐｐＧｐｐ、ｓｓｒＡＢ及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅの欠失（ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、Δ
Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ）によって誘導された。
ｐｐＧｐｐ欠失突然変異は、ＳＧ４０２１のゲノムにｒｅｌＡ：：ｋａｎＲ及びｓｐｏｔ：：ｃｍＲの順次導入によって誘導された。ｓｓｒＡＢ欠失突然変異は、ＳＧ４０２１のゲノムにｓｓｒＡＢ：：ｋａｎＲの導入によって誘導された（ＳＧ３００５）。ｐｐＧｐｐ及びｓｓｒＡＢ欠失突然変異の作製のために、まず、ｐｐＧｐｐ作製のために導入された抗生剤抵抗性遺伝子の不活性化を行ったし（ｋａｎＲ及びＣＭＲ）、ｓｓｒＡＢ：：ｋａｎＲを含む遺伝体を保有したＳＧ３００５菌株にＰ２２バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）を形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）し、ｓｓｒＡＢ：：ｋａｎＲ遺伝子を含むバクテリオファージを生産した。抗生剤抵抗性遺伝子の不活性化は、ＦＬＰ組換え酵素発現が誘導されるｐＣＰ２０（Ｈｅｌｐｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ）の形質転換方法の導入によって完成されたし、本発明のために作製された全ての突然変異サルモネラガリナルムの抗生剤抵抗性遺伝子欠失方法は同一である。
不活性化されたｐｐＧｐｐ欠失突然変異にｓｓｒＡＢ：：ｋａｎＲ遺伝子を含むバクテリオファージを形質導入してΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ｓｓｒＡＢ：：ｋａｎＲ突然変異を作製した（ＳＧ４０４１）。野生型サルモネラガリナルム（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅ）のバクテリオファージ（Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ）遺伝体の存在有無は、野生型サルモネラガリナルムの全体遺伝体配列検査方法によって１種のバクテリオファージ遺伝体（Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ）が存在するということが確認されたし、弱毒化のために、当該ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝体は、Ｌａｍｂｄａ－Ｒｅｄ相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）方法を用いてＳＧ４０２１のゲノムのｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子をクロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ，ｃｍ）抵抗性遺伝子に置換すること（Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ：：ｃｍＲ）によって除去されたし、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝体欠失突然変異サルモネラガリナルムが作製された（ＳＧ４０４２）。
ｐｐＧｐｐ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ欠失突然変異サルモネラガリナルムの作製は、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ：：ｃｍＲを含むバクテリオファージ（Ｐ２２、ＳＧ４０４２菌株活用）をまず作製し、ＳＧ４０４１菌株に形質導入することによって作製された（ΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ｓｓｒＡＢ：：ｋａｎＲ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ：：ｃｍＲ；ＳＧ４０４３）。弱毒化サルモネラガリナルムの抗癌剤の開発において過度な抗生剤耐性の問題の回避のために、ＳＧ４０４３菌株から抗生剤抵抗性遺伝子が全て除去されたＳＧ４０４４（ΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ）菌株が開発されたし、本発明で作製した弱毒化サルモネラ菌株の効能及び価値評価のために、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子のみを保有する菌株が作製された（ΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ΔｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ：：ｃｍＲ；ＳＧ４０４６）。
ＳＧ４０４６菌株の開発のために、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子が除去されたＳＧ４０４５（ΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ΔｓｓｒＡＢ）菌株が作製されて活用された。ｇｌｍＳオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）位置に、カナマイシン抵抗性遺伝子（ｋａｎＲ）を運搬する遺伝子は、４０－ヌクレオチド（ｎｔ）相同性伸長（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）及びｐＫＤ１３を鋳型とする２０－ｎｔプライミング配列を含むそれぞれ一対の６０－ｎｔプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）で生成された。プライマーの塩基配列及び配列番号は、下表２に示す。ＰＣＲに用いられた鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）は、野生型サルモネラガリナルムの細菌染色体ＤＮＡ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ）が用いられた。
精製されたＰＣＲ生成物を、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒａｔｉｏｎ）によって、ｐＫＤ４６を保有する弱毒化サルモネラ（ΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ；ＳＧ４０２３）に形質転換し、これによってｇｌｍＳ遺伝子欠失弱毒化サルモネラガリナルムが作製された（ΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ｇｌｍＳ：：ｋａｎＲ；ＳＧ４０３０）。ｇｌｍＳ遺伝子欠失弱毒化サルモネラガリナルム（ΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ、ｇｌｍＳ：：ｋａｎＲ）の作製のためにｇｌｍＳ：：ｋａｎＲを含むＰ２２ファージ（ｐｈａｇｅ）がまず作製され（ＳＧ４０３０菌株活用）、その後、ＳＧ４０４４（ΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ）に準備されたｇｌｍＳ：：ｋａｎＲを含むＰ２２ファージを形質導入してΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ、ｇｌｍＳ：：ｋａｎＲ（ＳＧ４０４７）突然変異サルモネラガリナルム菌株が作製された。
弱毒化サルモネラガリナルムの抗癌剤開発において過度な抗生剤耐性の問題の回避のために、ＳＧ４０４７のカナマイシン抵抗性遺伝子は上記と同じ方法によって除去され、最終菌株であるΔｒｅｌＡ、ΔｓｐｏＴ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ、ΔｇｌｍＳサルモネラガリナルム菌株が作製された（ＳＧ４０４８）。
サルモネラ菌株は、特に、動物内で生存に不要なレポーター遺伝子を包含及び運搬するプラスミドを放出する傾向があるので、選択的決定因子のために抗生剤耐性遺伝子を活用することは不可能である。したがって、増殖のための必須営養分としてペプチドグリカン合成成分であるＤ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）又はＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が不足して動物系で溶解されるｇｌｍＳ欠失突然変異表現型を利用した。
１－３．ＧｌｍＳ ＋ｐＬｕｘプラスミド
生物発光による腫瘍標的化能力評価及び染色体上のｇｌｍＳ遺伝子欠失を補完するために、サルモネラガリナルム菌株のｇｌｍＳ遺伝子を統合させた均衡致死宿主ベクターシステム（ｂａｌａｎｃｅｄ ｌｅｔｈａｌ ｈｏｓｔ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ）を作製した。
具体的には、 フォトバクテリウムレイオグナティ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉ）のｌｕｘオペロン（ｌｕｘＣＤＡＢＥ、約９．５ｋｂｐ）を含有するｐＬｕｘをｐＵＣ１９プラスミドバックボーンにＸｂａＩ制限酵素部位に挿入した。Ｌｕｘオペロンカセット及びｇｌｍＳを全て含有するプラスミドを作製するために、サルモネラガリナルム菌株のｇｌｍＳ遺伝子を特異的プライマーで増幅した。プライマーの塩基配列及び配列番号は、下表３に示す。ＰＣＲ反応に用いられた鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）は、野生型サルモネラガリナルム（ＳＧ４０２１）の細菌染色体ＤＮＡであった。
ｐＬｕｘベクターと増幅された１．８ｋｂｐ断片をＳａｌ Ｉ制限酵素を用いて断片の両末端を切り、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ）によって接合する方法によってＧｌｍＳ ＋ｐＬｕｘを生成した。作製されたＧｌｍＳ ＋ｐＬｕｘで形質転換されたｇｌｍＳ欠失突然変異サルモネラガリナルム菌株は、Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮ）又はＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が不足している環境でも生存が可能であり、生物発光を示すので、光学生物発光イメージによる分析が可能である。
１－４．腫瘍細胞株
Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからマウス（Ｍｕｒｉｎｅ）由来ＣＴ２６（結腸腫瘍細胞株）、４Ｔ－１（乳房腫瘍細胞株）、Ｂ１６Ｆ１０（黒色腫瘍細胞株）及びＬＬ２（ＬＬＣ－１、肺腫瘍細胞株）を購入し、Ｎａｔｉｏｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ＿Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ＆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（ＤＣＴＤ）からマウス（Ｍｕｒｉｎｅ）由来Ｐａｎｃ０２（膵臓腫瘍細胞株）を購入した。１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有する高ブドウ糖ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）でＣＴ２６、４Ｔ－１、ＬＬＣ－１及びＰａｎｃ０２細胞株を成長させたし、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０でＢ１６Ｆ１０細胞株を成長させた。
１－５．プラスミド安定性測定
１２時間ごとに補充されるＦｌｅｓｈ ＬＢ培地で一晩継代培養（１／１０００）した。２４時間ごとにサンプルを採取し希釈した。アンピシリンの有無に関係なく、ＧｌｃＮＡｃが補充されたＬＢプレート上に適切な体積を３回スプレッドした。コロニーの数を使用して総生存細胞（コロニー形成単位，ＣＦＵ）及びプラスミドを有するサルモネラ菌株の比率を計算した。
１－６．マウスモデル作製
培養された様々な腫瘍細胞株をマウスの右腿に異種移植してマウス腫瘍モデルを作製した。Ｓａｍｔａｋｏ ｃｏｍｐａｎｙ（韓国）から２０～３０ｋｇの５～８週齢雌マウスを購入した。承認されたプロトコルにしたがって全ての動物に対する管理、実験及び安楽死が行われた。
皮下（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）腫瘍を有するマウスを下記の方法で作製した。試験管内で培養された実施例１－４の腫瘍細胞株を回収し、３０ｍｌのＰＢＳに懸濁させた後、ＣＴ２６、４Ｔ－１、ＬＬＣ－１及びＢ１６Ｆ１０細胞株は１×１０６個を、Ｐａｎｃ０２細胞株は１×１０７個をマウス右腿に皮下注射した。ＣＴ２６及び４Ｔ－１細胞株はＢａｌｂ／Ｃマウスに、ＬＬＣ－１、Ｐａｎｃ０２及びＢ１６Ｆ１０細胞株はＣ５７／ＢＬ６マウスに移植した。
腫瘍細胞移植後に、腫瘍のサイズが６０ｍｍ３に到達した時に、実施例１－３のＧｌｍＳ ＋ｐＬｕｘで形質転換された、ｇｌｍＳ欠失突然変異弱毒化サルモネラガリナルム（ＳＧ４０５０）を約５×１０８ＣＦＵで静脈注射し、実施例１－２のｐｐＧｐｐ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ欠失サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４４又はＳＧ４０４６、５×１０８ＣＦＵ）又はｐｐＧｐｐ欠失サルモネラティフィムリウム（ＳＭＲ２１３０、１×１０７ＣＦＵ）菌株を尾静脈から投与した。
１－７．マウス内部臓器別サルモネラ菌株分布評価
サルモネラ菌株の生存数を評価するために、マウスグループ（ｎ＝５）に約１×１０７ＣＦＵ ΔｐｐＧｐｐサルモネラティフィムリウム（ＳＭＲ２１３０）及び約５×１０８ＣＦＵ ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ（ＳＧ４０４６）サルモネラガリナルム菌株を静脈投与した後、１、３、５、１０、１５日目にマウスを犠牲させて臓器を収集し、臓器組織を均質化器を用いて０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する滅菌ＰＢＳで均質化した。均質液からサルモネラ菌株を回収し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール１５μｇ／ｍｌを含有する寒天プレート上にスプレッドして定量化した。
１－８．腫瘍サイズ及びマウス生存率分析
下記の計算式で腫瘍体積を計算した。
［計算式］
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（腫瘍長さ×腫瘍高さ×腫瘍幅）／２
全ての動物実験は、ジョンナム大学校動物実験倫理委員会（ＮＯ．ＣＮＵＩＡＣＵＣ－Ｈ－２０１６－１５）によって承認され、指針に従って腫瘍体積が１，５００ｍｍ３以上であるマウスは犠牲させたし、Ｇｅｈａｎ－Ｂｒｅｓｌｏｗ－Ｗｌｉｃｏｘｏｎテストによってマウスの生存率を評価した。
１－９．光学生物発光イメージング
腫瘍を標的にする指標としてサルモネラ菌株の生物発光（Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を用いてイメージングした。腫瘍標的能のためにマウスを２％イソプルランで麻酔させた後、冷却ＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅｄ ｃｏｕｐｌｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）カメラ付きＩＶＩＳ１００（Ｃａｌｉｐｅｒ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）の光遮断チャンバーに置いた。ルシフェラーゼ発現サルモネラガリナルム菌株から放出される光子を収集し、１分間統合した。Ｌｉｖｉｎｇ ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．２．２５（Ｘｅｎｏｇｅｎ－Ｃａｌｉｐｅｒ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）を用いて光子カウントを示す疑似カラーイメージをマウスの写真上にオーバーレイした。
１－１０．統計分析
ＳＰＳＳ １８．０統計パッケージ（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて統計分析を行った。両側スチューデントのｔ検定（Ｔｗｏ－ｔａｉｌ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）を用いて対照群と治療群間の腫瘍成長の統計的有意性を決定した。０．０５以下のＰ値は統計的に有意なものと見なされたし、全てのデータを平均±ＳＤで表示した。
［実施例２］
弱毒化サルモネラガリナルム菌株の生体内毒性の有無及びプラスミド安定性確認
２－１．サルモネラガリナルム菌株のアミノ酸要求確認
図１に示すように、サルモネラガリナルム野生種は、ロイシン（Ｌｅｕ）が添加された最小培地でのみ育ち、アルギニン（Ａｒｇ）とフェニルアラニン（Ｐｈｅ）が添加されるとその成長が改善されることを確認した。ｐｐＧｐｐ欠失弱毒化サルモネラガリナルムはその他にもイソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）及びバリン（Ｖａｌ）が添加された最小培地で成長した。したがって、ｐｐＧｐｐ欠失サルモネラガリナルムはｐｐＧｐｐ欠失サルモネラティフィムリウム（ＬＴ２）と比較して、要求されるアミノ酸が少ないことを確認した（Ｔｅｄｉｎ ａｎｄ Ｎｏｒｅｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，２００１，１８３：６１８４－６１９６）。
２－２．サルモネラガリナルム菌株の生体内毒性評価
細菌性癌治療にサルモネラガリナルム菌株を適用するために、まず静脈内（ｉｎｔｒａ ｖｅｉｎ，ＩＶ）経路を通じて野生型サルモネラガリナルム菌株を注射した後、マウス生存率を分析した。
図２に示すように、マウスに野生型サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０２１）を静脈投与する場合に、家禽鳥類（Ｆｏｗｌｓ）でのみ腸チフスが誘発されたにもかかわらず、約１０５ＣＦＵ以上を投与した時に全てのマウスが死亡した。
２－３．弱毒化サルモネラガリナルム菌株の生体内毒性評価による投与容量確認
前記実施例２－２で野生型サルモネラガリナルム菌株はマウス生体内毒性を保有することが確認され、ｐｐＧｐｐ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ欠失によってサルモネラガリナルム菌株を弱毒化した。
具体的には、ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４６）及びΔｐｐＧｐｐサルモネラティフィムリウム菌株（ＳＭＲ２１３０）をＢｌａｂ／Ｃマウスに静脈投与し、マウス生存率を分析した。
臓器別菌株分布検査時に正確な菌数確認のために、抗生剤マーカーを含むＳＧ４０４６を使用した。
図３及び図４に示すように、ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４６）では、約５×１０８ＣＦＵまでマウスが生存したことを確認したし、ΔｐｐＧｐｐサルモネラティフィムリウム菌株（ＳＭＲ２１３０）では、約１×１０７ＣＦＵまでマウスが生存したことを確認した。
腫瘍標的能及び抗腫瘍効果が確認された弱毒化サルモネラティフィムリウム（Ａ１－Ｒ）の実験結果から、変形されたリポポリサッカライド、ｍｓｂＢ欠失突然変異（ＶＮＰ２０００９）及びΔｒｆａＧ／ΔｒｆａＤ二重突然変異を有する菌株は、約１×１０６～約１×１０７ＣＦＵの範囲で治療範囲が形成されることを確認した。したがって、本発明の弱毒化サルモネラガリナルムは、弱毒化サルモネラティフィムリウムに比べて生体内安定性が約１５倍以上高いので、より優れた安定性を有することが分かる。
また、生体内安定性が確保されたことが認められる大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．Ｃｏｌｉ）の有効投与量が約１×１０８ＣＦＵ（投与経路：Ｉｎｔｒａ ｖｅｉｎ，ＩＶ）であることからすれば、本発明の弱毒化サルモネラガリナルムの生体内安定性は顕著に優れていることが分かる。
２－４．プラスミド安定性確認
形質転換されたプラスミドの安定性を確認するために、前記実施例１－５を行ってプラスミドの消失の有無を評価した。
図５に示すように、野生型サルモネラ菌株（ＳＧ４０２１）によって運搬されたプラスミドの９９％が４日目に消失されたのに対し、ｇｌｍＳ欠失サルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０５０）によって運搬されたプラスミドは完全に維持されることを確認した。
以後の実験では、腫瘍形成マウスにおいてサルモネラガリナルム菌株を視覚化するために、前記実施例１－３のＧｌｍＳ ＋ｐＬｕｘで形質転換された、染色体上に突然変異ｇｌｍＳ遺伝子を保有するサルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０５０）を使用した。
［実施例３］
弱毒化サルモネラガリナルム菌株による腫瘍標的化確認
ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株の腫瘍標的化を確認するために、実施例１－９を行って弱毒化サルモネラガリナルム菌株の生物発光信号をイメージングした。
図６に示すように、ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ、ΔｇｌｍＳサルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０５０）の注射直後（２０分、注射０日後（０ ｄａｙ ｐｏｓｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，０ｄｐｉ））には、生体内発光信号が主に内皮器官（肝及び脾臓）から検出されることを確認したが、注射３日後（３ｄｐｉ）の生体内発光信号は移植された腫瘍組織にのみ見られることを確認した。特に、弱毒化サルモネラガリナルム菌株は、４個の個別のマウスラインに移植された全ての腫瘍を特異的に標的化することを確認した。
したがって、ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ、ΔｇｌｍＳサルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４８）は、優れた腫瘍標的化効果を示すことが分かる。
［実施例４］
ＣＴ２６腫瘍マウスモデルにおいてΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株の抗癌効果確認
４－１．弱毒化サルモネラガリナルムの抗腫瘍効果及び生存期間延長確認
ＣＴ２６細胞が移植されたＢｌａｂ／Ｃマウスに約５×１０８ＣＦＵ ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４４）を静脈内投与したし、対照群としてＰＢＳ処理群及びΔｐｐＧｐｐサルモネラティフィムリウム菌株（１×１０７ＣＦＵ，ＳＭＲ２１３０）を用いて、ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株の生体内抗腫瘍活性を、前記実施例１－８及び１－１０を行って分析した。
図７に示すように、約５×１０８ＣＦＵ ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４４）を大腸腫瘍形成マウスに処理した結果、対照群と比較して腫瘍成長が有意に遅延されることを確認した。
図８に示すように、ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株（ＳＧ４０４４）を処理した群は、対照群に比べて生存期間が約２倍以上延長されることを確認した。測定された生命延長期間は、ΔｐｐＧｐｐサルモネラティフィムリウム菌株処理群では約２４日、ＰＢＳ処理群では１５日であったし、ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株で処理された群の平均生存期間は３８日であった。
４－２．マウス内サルモネラ菌株分布パターン確認
マウス内サルモネラガリナルム菌株の分布パターンを確認するために、前記実施例１－７を行って時間によるマウス臓器別サルモネラ菌数分布を評価した。
図９に示すように、ΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ，Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株（５×１０８、ＳＧ４０４６）及びΔｐｐＧｐｐサルモネラティフィムリウム菌株（１×１０７、ＳＭＲ２１３０）を投与した群の両方とも、注射３日後（３ｄｐｉ）に腫瘍内で最も多いサルモネラ菌株が観察されたし、腫瘍内で１０日間類似のレベルで菌数を保有するが、１０日以後に漸次減少することを確認した。
また、弱毒化サルモネラティフィムリウム（ＳＭＲ２１３０）では、注射１日後（１ｄｐｉ）に、肝に１０６ＣＦＵ／ｇ、脾臓に１０７ＣＦＵ／ｇ、肺、腎臓及び心臓に１０４ＣＦＵ／ｇ、血清に１０２ＣＦＵ／ｇで存在することを確認したし、このような正常組織内菌数は、血液サンプル以外の他の組織において実験期間に同一のレベルで検出された。一方、弱毒化サルモネラガリナルム（ＳＧ４０４６）では、注射１日後（１ｄｐｉ）に弱毒化サルモネラティフィムリウム（ＳＭＲ２１３０）と類似のレベルの菌数が検出されたが、その後に漸次減少し、１５日には完全に除去されたことを確認した。
したがって、本発明のΔｐｐＧｐｐ、ΔｓｓｒＡＢ、ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅサルモネラガリナルム菌株は、腫瘍を特異的に標的して抗腫瘍効果を示すので、他の臓器への副作用の恐れなく抗腫瘍用途に使用可能であることが分かる。
１． サルモネラガリナルムＳＧ４０２１菌株；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ． ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＳＧ４０２１）；微生物受託番号 ＫＣＴＣ１３９８５ＢＰ
２． サルモネラガリナルムＳＧ４０４４菌株；Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ΔｒｅｌＡ，Δｓｐｏｔ，ΔｓｓｒＡＢ，ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ（ＳＧ４０４４）；微生物受託番号 ＫＣＴＣ１４５４１ＢＰ
３． サルモネラガリナルムＳＧ４０４８菌株；Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ ΔｒｅｌＡ，ΔｓｐｏＴ，ΔｓｓｒＡＢ，ΔＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ，ΔｇｌｍＳ（ＳＧ４０４８） 微生物受託番号：ＫＣＴＣ１４５４２ＢＰ

Claims (16)

  1. グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子、タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子、及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子が欠失していることを特徴とする弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  2. ｇｌｍＳ遺伝子が欠失していることを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  3. 前記グアノシン４リン酸（Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐｐＧｐｐ）合成酵素をコードする遺伝子は、ｒｅｌＡ又はｓｐｏＴであることを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  4. 前記タイプＩＩＩ分泌システム（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｔ３ＳＳ）の機能を誘導する遺伝子は、ｓｓｒＡ、ｓｓｒＢ又はｓｓｒＡＢであることを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  5. 前記菌株は、サルモネラガリナルムＳＧ４０２１菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１３９８５ＢＰ）においてｒｅｌＡ、ｓｐｏＴ、ｓｓｒＡＢ及びＧｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ遺伝子が欠失していることを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  6. 前記菌株は、サルモネラガリナルムＳＧ４０２１菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１３９８５ＢＰ）においてｒｅｌＡ、ｓｐｏＴ、ｓｓｒＡＢ、Ｇｉｆｓｙ ２ ｐｒｏｐｈａｇｅ及びｇｌｍＳ遺伝子が欠失していることを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  7. 前記菌株は、サルモネラガリナルムＳＧ４０４４菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１４５４１ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  8. 前記菌株は、サルモネラガリナルムＳＧ４０４８菌株（微生物受託番号：ＫＣＴＣ１４５４２ＢＰ）であることを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  9. 前記菌株はプロモータに作動可能に連結されたｇｌｍＳ遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたことを特徴とする、請求項２に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  10. 前記菌株は、発光遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  11. 前記発光遺伝子は、ｌｕｘＣＤＡＢＥであることを特徴とする、請求項１０に記載の弱毒化サルモネラガリナルム菌株。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項の菌株を含む腫瘍の診断又は治療用の薬学組成物。
  13. 前記腫瘍は、固形癌であることを特徴とする、請求項１２に記載の腫瘍の診断又は治療用の薬学組成物。
  14. 前記腫瘍は、腺癌腫であることを特徴とする、請求項１２に記載の腫瘍の診断又は治療用の薬学組成物。
  15. 前記腫瘍は、大腸癌、膵癌、肺癌、皮膚癌及び乳癌からなる群から選ばれるいずれか一つの癌であることを特徴とする、請求項１２に記載の腫瘍の診断又は治療用の薬学組成物。
  16. 請求項１０又は１１の菌株を被検体に投与する段階；
    前記菌株の生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を検出する段階；及び
    生物発光が検出される場合に、被検体に腫瘍が存在すると判断する段階を含む腫瘍診断のための情報提供方法。
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