JP2024515561A - 対象に共投与された治療用タンパク質の、ｌｃ－ｍｒｍ－ｍｓアッセイによる測定方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は概して、対象に共投与された治療用タンパク質を、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳを使用して定量する方法に関する。具体的には、本発明は、共投与された治療用タンパク質の、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳを使用した正確な定量を可能にする、固有のサロゲートペプチドを生成する二重酵素消化の使用に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月８日に出願された米国仮特許出願第６３／１７２，５６７号及び２０２１年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２２４，９５２号の優先権及び恩典を主張し、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
分野
本出願は、対象に共投与された１種類以上の治療用タンパク質の定量のためのアッセイ方法に関する。
背景
タンデム質量分析に連結された液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）は、治療用タンパク質などのバイオ医薬品の分析のための好ましい方法となってきている。リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）は、従来、この目的のために使用されてきたが、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、はるかに速い方法開発プロセスを提供するという多くの利点を提示する。治療用タンパク質を分析するためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用する重要な局面は、タンパク質の固有の識別子として、タンパク質分解消化に由来するサロゲートペプチドの定量を介するものである。
治療用タンパク質は、対象に個別に投与され得るか、又は、例えば抗体カクテル中で、共投与され得る。この場合、マトリクス成分からの干渉又は共投与された治療用タンパク質との競合は、目的の治療用タンパク質における固有のサロゲートペプチドを同定及び定量すること、したがって、当該目的の治療用タンパク質、又は目的の複数の治療用タンパク質を定量することを困難にし得る。
したがって、複数の共投与された治療用タンパク質を正確に、迅速に、かつ同時に定量するための方法に対する必要性が存在することが理解されよう。
概要
二重酵素消化と組み合わせた液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング質量分析（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）ベースのアプローチが、血清試料中の抗体カクテルの各抗体成分の総濃度を決定するために開発された。この生体分析アッセイの性能特性が、直線性、正確度、精度、選択性、特異性、及び酵素消化前後の分析物安定性に関して評価された。開発されたＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイは、ヒト血清マトリクス中の抗体薬物についての約１０～２０００μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有し、これは、臨床薬物動態試験のための２つの投与量群における薬物投与後の０日目から２８日目までの血清薬物濃度をカバーすることができた。ＭＲＭアッセイによって測定された２つの投与量群における薬物動態プロファイルは、十分に検証された電気化学発光（ＥＣＬ）免疫アッセイによって測定されたものと同等だった。
本開示は、少なくとも２種類の共投与された治療用タンパク質を同時に定量するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）第１の治療用タンパク質及び第２の治療用タンパク質を含む試料を得る工程と、（ｂ）当該試料を少なくとも２種類の消化酵素に接触させることによって、当該第１及び第２の治療用タンパク質の各々について固有のサロゲートペプチドを生成する工程と、（ｃ）質量分析計を使用して当該サロゲートペプチドを定量する工程と、（ｄ）定量したサロゲートペプチドを使用して当該第１及び第２の治療用タンパク質を定量する工程とを含む。
一態様において、当該消化酵素は、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣ、及びＡｒｇＣからなる群から選択される。特定の態様において、当該消化酵素は、トリプシン及びＡｓｐＮを含む。
一態様において、当該第１及び第２の治療用タンパク質は、抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、又は融合タンパク質を含む。別の態様において、当該第１の治療用タンパク質は、カシリビマブを含み、当該第２の治療用タンパク質は、イムデビマブを含む。
一態様において、当該質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノ－エレクトロスプレーイオン化質量分析計、又は三連四重極質量分析計である。別の態様において、当該質量分析計は、クロマトグラフィーシステムに連結されている。特定の態様において、当該クロマトグラフィーシステムは、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む。
一態様において、当該試料は、ヒト血清を含む。別の態様において、当該方法は、潜在的なサロゲートペプチドのインシリコ分析を使用して、当該消化酵素を選択する工程を更に含む。更に別の態様において、当該サロゲートペプチドの定量は、多重反応モニタリングの使用を含む。更なる態様において、当該方法は、当該第１及び第２の治療用タンパク質を対象に投与する工程を更に含む。
一態様において、当該方法は、試料中の第１の治療用タンパク質についての約１０～約２０００μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有する。別の態様において、当該方法は、試料中の第２の治療用タンパク質についての約１０～約２０００μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有する。更に別の態様において、当該質量分析計は、多重反応モニタリング又は並列反応モニタリングを行うことができる。
一態様において、当該方法は、当該サロゲートペプチドのペプチドマッピングを行う工程と、サロゲートペプチドの固有のペプチド及び断片イオンを選択して多重反応モニタリング遷移を生成する工程と、サロゲートペプチドの上位２つ又は上位３つの遷移を選択する工程と、サロゲートペプチドの衝突エネルギーを最適化する工程と、続いて較正曲線を生成する工程と、較正曲線に従ってＬＬＯＱ（定量下限）を決定する工程とを更に含む。
一態様において、当該方法は、当該第１又は当該第２の治療用タンパク質に特異的な少なくとも１種類のサロゲートペプチドを選択する工程を更に含み、以下：（ｉ）当該サロゲートペプチドが、定量される当該治療用タンパク質の消化物に特異的であること、（ｉｉ）当該サロゲートペプチドが、少なくとも１種類の当該治療用タンパク質が存在しない調製物のプロテアーゼ消化物には特異的に存在しないこと、（ｉｉｉ）当該サロゲートペプチドが、質量分光分析において強力なシグナルを生成すること、及び（ｉｖ）当該サロゲートペプチドが、質量分光分析において区別可能なシグナルを生成すること、を決定することによって、少なくとも１種類の当該サロゲートペプチドが予め選択される。
一態様において、当該方法は、工程（ｂ）の前に、当該第１の治療用タンパク質及び当該第２の治療用タンパク質を変性させる工程を更に含む。別の態様において、当該変性させる工程は、当該第１の治療用タンパク質及び当該第２の治療用タンパク質を変性溶液に接触させることを含む。更なる態様において、当該変性溶液は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、尿素、又はそれらの組み合わせを含む。別の特定の態様において、当該変性させる工程は、当該試料を約８０℃に加熱することを含む。
一態様において、当該方法は、工程（ｂ）の前に、当該第１の治療用タンパク質及び当該第２の治療用タンパク質を還元する工程を更に含む。別の態様において、当該還元する工程は、当該第１の治療用タンパク質及び当該第２の治療用タンパク質を還元剤に接触させることを含む。更なる態様において、当該還元剤は、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）である。
一態様において、当該方法は、工程（ｂ）の前に、当該第１の治療用タンパク質及び当該第２の治療用タンパク質をアルキル化する工程を更に含む。別の態様において、当該アルキル化する工程は、当該第１の治療用タンパク質及び当該第２の治療用タンパク質をアルキル化剤に接触させることを含む。更なる態様において、当該アルキル化剤は、ヨードアセトアミドである。
本開示はまた、投与された抗体カクテルからのカシリビマブ及びイムデビマブを同時に定量するための方法を提供する。いくつかの例示的な実施形態において、方法は、（ａ）カシリビマブ及びイムデビマブを含む血清試料を得る工程と、（ｂ）当該試料をトリプシン及びＡｓｐＮに接触させることによって、カシリビマブ及びイムデビマブの各々について少なくとも１種類の固有のサロゲートペプチドを生成する工程と、（ｃ）質量分析計を使用して当該サロゲートペプチドを定量する工程と、（ｄ）定量したサロゲートペプチドを使用してカシリビマブ及びイムデビマブを定量する工程とを含む。
一態様において、当該サロゲートペプチドは、アミノ酸配列ＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲ及びＤＴＡＶＹＹＣＡＳＧＳを含む。別の態様において、当該質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノ－エレクトロスプレーイオン化質量分析計、又は三連四重極質量分析計である。更に別の態様において、当該質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに連結されている。
一態様において、当該方法は、カシリビマブ及びイムデビマブを対象に投与する工程を更に含む。別の態様において、当該質量分析計は、多重反応モニタリング又は並列反応モニタリングを行うことができる。
本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮される場合、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態及び多数の具体的な詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。多くの置換、修正、追加、又は再配置が、本発明の範囲内で行われ得る。
例示的な実施形態によるＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ／ＭＳアッセイのためのワークフローを図示する。 図２Ａは、例示的な実施形態による、トリプシン及びＡｓｐＮ消化から生成されたｍＡｂ１におけるサロゲートペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。図２Ｂは、例示的な実施形態による、トリプシン及びＡｓｐＮ消化から生成されたｍＡｂ２におけるサロゲートペプチドのＣＩＤ ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。 例示的な実施形態による、較正標準のＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳから生成された、ｍＡｂ１（図３Ａ～Ｃ）及びｍＡｂ２（図３Ｄ～Ｆ）のサロゲートペプチド（図３Ａ、図３Ｄ）、内部標準（図３Ｂ、図３Ｅ）の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）、及び較正曲線プロット（図３Ｃ、図３Ｆ）を示す。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図３Ａの説明を参照のこと。 図４Ａは、例示的な実施形態による、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１及び２０μｇ／ｍＬのｍＡｂ２を共添加した１０例の個々のナイーブヒト血清試料からのｍＡｂ１のサロゲートペプチドの重ね合わせＸＩＣを示す。図４Ｂは、例示的な実施形態による、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１及び２０μｇ／ｍＬのｍＡｂ２を共添加した１０例の個々のナイーブヒト血清試料からのｍＡｂ２のサロゲートペプチドの重ね合わせＸＩＣを示す。図４Ｃは、例示的な実施形態による、定量下限（ＬＬＯＱ）レベルで添加した薬物を有する１０例の個々のヒト血清試料中の薬物濃度の測定された正確度パーセンテージを示す。 例示的な実施形態によるｍＡｂ１のサロゲートペプチドにおけるＭＲＭ遷移のＸＩＣを示す。 例示的な実施形態によるｍＡｂ２のサロゲートペプチドにおけるＭＲＭ遷移のＸＩＣを示す。 例示的な実施形態による、血清マトリクス中のｍＡｂ２の存在なし、又は血清マトリクスバックグラウンド中の２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ２ありで測定された、５つの品質管理（ＱＣ）レベルでのｍＡｂ１の薬物濃度の正確度パーセンテージの比較を示す。 例示的な実施形態による、血清マトリクス中のｍＡｂ１の存在なし、又は血清マトリクスバックグラウンド中の２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１ありで測定された、５つのＱＣレベルでのｍＡｂ２の薬物濃度の正確度パーセンテージの比較を示す。 図６Ａは、例示的な実施形態による、５つのＱＣレベルでの３つの異なる条件におけるｍＡｂ１安定性の測定の正確度パーセンテージを示す。図６Ｂは、例示的な実施形態による、５つのＱＣレベルでの３つの異なる条件におけるｍＡｂ２安定性の測定の正確度パーセンテージを示す。 図７Ａは、例示的な実施形態による、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイ及び十分に検証された電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイによって血清試料から測定されたｍＡｂ１の薬物動態プロファイルを示す。図７Ｂは、例示的な実施形態による、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイ及び十分に検証されたＥＣＬイムノアッセイによって血清試料から測定されたｍＡｂ２の薬物動態プロファイルを示す。
詳細な説明
ＲＥＧＥＮ－ＣＯＶ（カシリビマブ及びイムデビマブ）は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされたコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の治療のために、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって開発された治験用抗体カクテル療法である（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６９：１０１０－１０１４、Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３７０：１１１０－１１１５、Ｗｅｉｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０２１，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３８４：２３８－２５１）。抗体カクテルは、２種類のヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（本明細書ではｍＡｂ１及びｍＡｂ２と称される）を含み、これらは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質上の非重複エピトープを標的とするように設計され、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスとヒトＡＣＥ２との相互作用を遮断し、ウイルスの急速な遺伝子変異によるウイルス逃避を妨げる（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６９：１０１４－１０１８）。最近の臨床試験では、ＲＥＧＥＮ－ＣＯＶ療法が、入院していないＣＯＶＩＤ－１９患者、特に血清陰性又はベースラインで高いウイルス量を有した患者のウイルス量を減少させ、症状を改善することができることが示されている（Ｗｅｉｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．）。臨床試験からの有望な結果に基づいて、ＲＥＧＥＮ－ＣＯＶは、２０２０年１１月に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、重度のＣＯＶＩＤ－１９及び／又は入院に進行する高いリスクのある成人及び少なくも１２歳で体重が４０ｋｇ以上の小児患者における、最近診断された軽度から中度のＣＯＶＩＤ－１９の治療のための緊急使用許可（ＥＵＡ）が承認された。
患者における薬物投与後の血清中の抗体薬物濃度の時間プロファイルの測定は、タンパク質治療剤の薬物動態（ＰＫ）特性評価及び薬物用量最適化のために重要である。この必要性を満たし、ＣＯＶＩＤ－１９療法の加速した開発を管理するために、ＲＥＧＥＮ－ＣＯＶ薬物動態試験のための目的に適した液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング質量分析（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）アッセイが、従来のリガンド結合アッセイの開発に必要とされるよりもはるかに短い時間枠である１ヶ月で開発及び認定された。リガンド結合アッセイとは異なり、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイはまた、典型的には、開発及び製造に数ヶ月を要する、抗体治療剤に対する高特異的な親和性捕捉及び検出試薬を必要としない。加えて、本発明のＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイは、血清マトリクス中のタンパク質ベースのバイオ医薬品の定量化のために、広いダイナミックレンジ、良好な正確度及び精度、並びに優れた選択性及び特異性も提供する（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ，９２９：１６１－１７９）。最近、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳは、ＬＣ－ＭＳ計装の性能の継続的な改善に起因して、前臨床及び臨床試料分析の両方のためのより頻繁に採用される生体分析戦略となってきている（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８５：９８５９－９８６７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８６：８７７６－８７８４、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８４：１２６７－１２７３、Ｃａｒｄｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，１１：６２０１、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｏｃａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８４：５９５９－５９６７、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８７：８５５５－８５６３）。
ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳを使用した、ヒト血清試料における遊離及び結合抗体を含む総抗体薬物濃度の定量化は、抗体薬物の可変相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来するサロゲートペプチドのイオン強度の測定に基づくことができる（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ＡＡＰＳ Ｊ，１７：１－１６）。患者血清試料を処理するために、典型的には、数マイクロリットルの血清試料を還元し、アルキル化し、次いでプロテアーゼ消化を行った。安定した重同位体標識タンパク質又はサロゲートペプチドは、通常、内部標準（ＩＳ）として使用され、試料処理及び機器性能変動からのシグナル変化を正規化する。アッセイの感度、選択性、及び特異性は、定量化のために選択されている固有のＣＤＲペプチドに依存することができる。共投与された抗体カクテルの場合、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳは、複数の薬物分析物を同時に測定するために容易に多重化することができる。クロマトグラフィー分離による制限されたスループットにもかかわらず、本発明のＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ方法は、臨床試験における数が限られた血清試料におけるＲＥＧＥＮ－ＣＯＶの薬物濃度の早期測定のために必要とされるダイナミックレンジ、感度、選択性、安定性、及び特異性を満たした。本発明のＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイによって測定された外来患者の２つの用量群におけるＲＥＧＥＮ－ＣＯＶの濃度を、十分に検証されたリガンド結合イムノアッセイから得られた結果と比較し、２つのアッセイが良好な一致にあることを実証した。本開示は、緊急のタイムラインを満たすために、検証されたイムノアッセイを実現させることが困難である場合の、又はリガンド結合アッセイのための高品質な抗イディオタイプ抗体試薬が利用できない場合の、臨床試料分析のための目的にかなうＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳの適用としての例を設定している。
別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は同等の任意の方法及び材料は、実施又は試験において使用され得るが、方法及び材料の例が、これより記載される。
「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「目的のタンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含むことができる。タンパク質は、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含み、一般に「ポリペプチド」として当該技術分野で既知である。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造的バリアント、及びペプチド結合を介して連結された合成の非天然に存在するそれらの類似体、関連する天然に存在する構造的バリアント、並びに合成の非天然に存在するそれらの類似体からなるポリマーを指す。「合成ペプチド又はポリペプチド」は、非天然に存在するペプチド又はポリペプチドを指す。合成ペプチド又は合成ポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成方法が、当業者に既知である。タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために１つ以上のポリペプチドを含み得る。タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含むことができる。目的のタンパク質は、任意のバイオ治療用タンパク質、研究又は療法において使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、並びに二重特異性抗体を含むことができる。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の種）、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ派生細胞）などの組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。バイオ治療用タンパク質及びそれらの産生を考察する最近のレビューについて、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ”を参照されたい（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ １４７－１７６（２０１２）、その教示全体が本明細書に組み込まれる）。タンパク質は、組成物及び溶解性に基づいて分類することができ、したがって、球状タンパク質及び繊維状タンパク質などの単純なタンパク質と、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などの複合タンパク質と、一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質とを、含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態において、目的のタンパク質は、組換えタンパク質、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせであることができる。
本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、好適な宿主細胞に導入された組換え発現ベクターに担持された遺伝子の転写及び翻訳の結果として産生されたタンパク質を指す。特定の例示的な実施形態において、組換えタンパク質は、抗体、例えば、キメラ、ヒト化、又は完全ヒト抗体であることができる。特定の例示的な実施形態において、組換えタンパク質は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥからなる群から選択されるアイソタイプの抗体であることができる。特定の例示的な実施形態において、抗体分子は、全長抗体（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４免疫グロブリン）であるか、又は代替的に、抗体は、断片（例えば、Ｆｃ断片又はＦａｂ断片）であることができる。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖である２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲ又はＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの対比分析（ｓｉｄｅ－ｂｙ－ｓｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいて定義され得る。「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、完全抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在するか、酵素的に得られるか、合成か、又は遺伝子操作されたポリペプチド若しくは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質消化又は抗体の可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴う組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準的技術を使用して、完全抗体分子からもたらされ得る。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、あるいは合成することができる。ＤＮＡは、配列決定されて、化学的に又は分子生物学技術を使用することによって操作され、例えば、１つ以上の可変及び／若しくは定常ドメインを好適な配置に配列するか、又はコドンを導入するか、システイン残基を作製するか、アミノ酸を修飾、付加、若しくは欠失させることができる。
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域などのインタクト抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びに抗体断片から形成されたトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、及び多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子である。いくつかの例示的な実施形態において、抗体断片は、それが親抗体と同じ抗原に結合する断片であるように十分な親抗体のアミノ酸配列を含み、いくつかの例示的な実施形態において、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、かつ／又は抗原との結合について親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、酵素的又は化学的にインタクト抗体の断片化によって産生され得、かつ／又はそれは部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換えによって産生され得る。代替的に、又は追加的に、抗体断片は、完全に又は部分的に合成によって産生され得る。抗体断片は、任意選択的に、単鎖抗体断片を含み得る。代替的に、又は追加的に、抗体断片は、例えばジスルフィド結合によって一緒に連結されている複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択的に、複数分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００個のアミノ酸を含む。
「二重特異性抗体」という用語は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖が、異なるエピトープ（２つの異なる分子（例えば、抗原）上の、又は同じ分子（例えば、同じ抗原）上の、いずれかの）に特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は、概して、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも少なくとも１～２桁又は３桁又は４桁低くなり、逆もまた同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じか又は異なる標的上（例えば、同じか又は異なるタンパク質上）に存在し得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合することができ、かかる配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる。
典型的な二重特異性抗体は、各々が３つの重鎖ＣＤＲを有し、続いて、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する、２つの重鎖と、抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合することができるか、又は各重鎖と会合することができ、重鎖抗原結合領域が結合するエピトープのうちの１つ以上と結合することができるか、又は各重鎖と会合することができ、一方若しくは両方の重鎖を一方若しくは両方のエピトープと結合させることができる、免疫グロブリン軽鎖と、を有する。ｂｓＡｂは、２つの主要なクラスであるＦｃ領域（ＩｇＧ様）を有するものと、Ｆｃ領域を欠くものとに分けることができ、後者は、通常、Ｆｃを含むＩｇＧ及びＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、トリオマブ、ノブ・イントゥ・ホールＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、クロスＭａｂ、オルト－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツー・イン・ワンＦａｂ若しくは二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－単鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、又はκλ－ボディなどの異なる形式を有することができるが、これらに限定されない。非ＩｇＧ様の異なる形式としては、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的指向分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、又はドックアンドロック（ＤＮＬ）方法によって産生された抗体が挙げられる（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ ＆ Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ ＆ ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０、Ｄａｆｎｅ Ｍｕｅｌｌｅｒ ＆ Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ， Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ２６５－３１０（２０１４）、それらの教示全体が、本明細書に組み込まれる）。
本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体を指す。かかる分子は、通常、２つの抗原のみに結合するが（すなわち、二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性抗体などの追加の特異性を有する抗体もまた、本明細書に開示されるシステム及び方法によって扱うことができる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で利用可能な又は既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む、単一のクローンからもたらされ得る。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で既知の多種多様な技法を使用して調製することができる。
いくつかの例示的な実施形態において、目的のタンパク質は、哺乳動物細胞から産生することができる。哺乳動物細胞は、ヒト由来又は非ヒト由来であり得、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、及び網膜上皮細胞）、樹立細胞株及びそれらの系統（例えば、２９３胚性腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞及びＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、デトロイト５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－ｌ細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ細胞、ＰＫ－１５細胞、又はそれらの派生細胞）、任意の組織又は器官（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄、及び血液）、脾臓、及び線維芽細胞からの線維芽細胞、並びに線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、ドン細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、デンプシー細胞、デトロイト５５１細胞、デトロイト５１０細胞、デトロイト５２５細胞、デトロイト５２９細胞、デトロイト５３２細胞、デトロイト５３９細胞、デトロイト５４８細胞、デトロイト５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、Ｍｉｄｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、ベロ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、系統２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ系統（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔｊａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、及びジェンセン細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞、又はその派生細胞）を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「治療用タンパク質」という用語は、疾患又は障害の治療のために対象に投与することができる任意のタンパク質を指す。治療用タンパク質は、薬理学的効果を有する任意のタンパク質、例えば、抗体、可溶性受容体、抗体－薬物コンジュゲート、又は酵素であり得る。いくつかの例示的な実施形態において、治療用タンパク質は、カシリビマブ又はイムデビマブを含む、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体であることができる。複数の治療用タンパク質は、薬理学的効果を達成するために、例えば、標的ウイルスの変異によるウイルス逃避を妨げるために、共投与され得る。本明細書で使用される場合、「抗体カクテル」という用語は、少なくとも２種類の治療用抗体を含む共投与される治療用タンパク質を指す。いくつかの例示的な実施形態において、抗体カクテルは、ＲＥＧＥＮ－ＣＯＶを含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態において、試料中の治療用タンパク質の数は、少なくとも２つであることができる。いくつかの特定の実施形態において、治療用タンパク質のうちの１つは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、融合タンパク質、又は抗体－薬物複合体であることができる。いくつかの他の特定の実施形態において、試料中の治療用タンパク質のうちの１つの濃度は、約１０μｇ／ｍＬ～約２０００μｇ／ｍＬであることができる。いくつかの例示的な実施形態において、試料中の治療用タンパク質の数は３つである。いくつかの例示的な実施形態において、試料中の治療用タンパク質の数は４つである。いくつかの例示的な実施形態において、試料中の治療用タンパク質の数は５つである。
本明細書で使用される場合、「試料」は、細胞培養液（ＣＣＦ）、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）、下流処理における任意の工程、原薬（ＤＳ）、又は最終的に製剤化された製品を含む医薬品（ＤＰ）などの、バイオプロセスの任意の工程から得ることができる。いくつかの特定の例示的な実施形態において、試料は、清澄化、クロマトグラフィー生成、ウイルス不活性化、又は濾過の下流プロセスの任意の工程から選択することができる。
いくつかの例示的な実施形態において、試料は、生体試料である。本明細書で使用される場合、「生体試料」という用語は、生きている生物、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物から採取された試料を指す。生体試料は、例えば、全血、血漿、血清、唾液、涙、精液、頬組織、臓器組織、尿、糞便、皮膚、又は毛髪を含み得る。試料は、患者、例えば、臨床試料から採取され得る。
本明細書で使用される場合、「薬物動態」（ＰＫ）という用語は、対象への投与後の薬物の特性を扱う試験の分野を指す。薬物動態分析の例示的な構成要素には、医薬製剤からの薬物の遊離、血液循環への薬物の吸収、全身にわたる薬物の分布、代謝産物への薬物の代謝（生体内変換とも呼ばれる）、及び体内からの薬物の排泄が含まれる。薬物の薬物動態は、バイオ治療用候補の評価のための重要な特性である。特に、薬物動態試験は、対象への投与後に薬物及びその変更された形態及び代謝物のレベルが経時的にどのように変化するかを評価するために行われ得る。バイオ治療用タンパク質は、液体クロマトグラフィー－質量分析を使用して、代表的なペプチド、又は「標的ペプチド」若しくは「サロゲートペプチド」の分析を通じて評価され得る。ペプチドは、それがタンパク質、例えば、抗体の相補性決定領域に固有であるか、又はそれを強力に代表する場合、並びにそれが確実に回収及び測定できる場合、好適な標的ペプチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィー」という用語は、液体によって運ばれる生物学的／化学的混合物が、静止した液相又は固相を通って（又はその中に）流れる際に、成分の差次的分布の結果として成分に分離することができるプロセスを指す。液体クロマトグラフィーの非限定的な例としては、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、又は混合モードクロマトグラフィーが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を同定し、それらの正確な質量電荷比を測定することができるデバイスを含む。本用語は、ポリペプチド又はペプチドを特性評価し得る任意の分子検出器を含むことが意味される。質量分析計は、イオン源、質量分析器、及び検出器の３つの主要なパーツを含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。分析物の原子、分子、又はクラスターは、気相に移され、同時に（エレクトロスプレーイオン化のように）又は別個のプロセスによってイオン化することができる。イオン源の選択は、用途に依存する。いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計は、タンデム質量分析計であることができる。
本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、質量選択及び質量分離の複数の段階を使用することによって、試料分子に関する構造情報が得られる技術を含む。前提条件は、第１の質量選択工程の後、断片が予測可能及び制御可能な方式で形成されるように、試料分子を気相に移し、イオン化することである。多段階ＭＳ／ＭＳ、又はＭＳｎは、意味のある情報を得ることができるか、又は断片イオンシグナルが検出可能である限り、最初に前駆体イオンを選択及び単離することと、それを断片化すること（ＭＳ２）と、一次断片イオンを単離することと、それを断片化すること（ＭＳ３）と、二次断片を単離することと、など（ＭＳ４）によって行うことができる。タンデムＭＳは、様々な分析器の組み合わせで成功裏に行われている。特定の用途のために組み合わせる分析器は、感度、選択性、及び速度などの多くの異なる要因、更にまたサイズ、コスト、及び利用可能性によって決定することができる。タンデムＭＳ方法の２つの主要なカテゴリは、タンデムインスペース及びタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器が空間的に連結される、又はタンデムインスペース分析器と連結されるハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源、前駆体イオン活性化デバイス、及び少なくとも２つの非捕捉質量分析器を含む。特定のｍ／ｚ分離機能は、機器の１つのセクションにおいてイオンが選択され、中間領域において解離され、次いで生成物イオンがｍ／ｚ分離及びデータ取得のために別の分析器に伝達されるように設計することができる。タンデムインタイムでは、イオン源で生成された質量分析計イオンは、同じ物理的デバイス内で捕捉、分離、断片化、及びｍ／ｚ分離することができる。
質量分析計によって同定されたペプチドは、インタクトタンパク質及びそれらの翻訳後修飾を代表するサロゲートとして使用することができる。それらは、実験的及び理論的なＭＳ／ＭＳデータを相関させることによって、タンパク質の特性評価に使用することができ、後者は、タンパク質配列データベースにおける可能なペプチドから生成される。特性評価には、タンパク質断片のアミノ酸を配列決定すること、タンパク質配列決定を決定すること、タンパク質のデノボ配列決定を決定すること、翻訳後修飾を位置付けすること、若しくは翻訳後修飾を特定すること、又は比較可能性分析、あるいはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、試料中に潜在的に存在し得るタンパク質配列の、例えば、ＦＡＳＴＡ形式のファイルの形態で、コンパイルされたコレクションを指す。関連するタンパク質配列は、試験する種のｃＤＮＡ配列に由来し得る。関連するタンパク質配列を検索するために使用され得る公開データベースには、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ又はＳｗｉｓｓ－ｐｒｏｔによってホストされているデータベースが含まれた。データベースは、本明細書で「バイオインフォマティクスツール（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｔｏｏｌｓ）」と称されるものを使用して検索され得る。バイオインフォマティクスツールは、データベース内の全ての可能な配列に対して解釈されていないＭＳ／ＭＳスペクトルを検索する能力を提供し、解釈された（注釈付けられた）ＭＳ／ＭＳスペクトルを出力として提供する。かかるツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）、又はＳｅｑｕｅｓｔ（ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。
いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに連結することができる。
いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計は、液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリングシステムに連結することができる。より一般的には、質量分析計は、連続反応モニタリング（ＣＲＭ）及び並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）による分析が可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「多重反応モニタリング」又は「ＭＲＭ」は、高い感度、特異性、及び幅広いダイナミックレンジで、複雑なマトリクス内の低分子、ペプチド、及びタンパク質を正確に定量化することができる、質量分析ベースの技術を指す（Ｐａｏｌａ Ｐｉｃｏｔｔｉ ＆ Ｒｕｅｄｉ Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｗｏｒｋｆｌｏｗｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｐｉｔｆａｌｌｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，９ ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ ５５５－５６６（２０１２））。ＭＲＭは、典型的には、三連四重極質量分析計を用いて行うことができ、選択された小分子／ペプチドに対応する前駆体イオンが第１の四重極内で選択され、前駆体イオンの断片イオンが第３の四重極内でのモニタリングのために選択された（Ｙｏｎｇ Ｓｅｏｋ Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，９３０ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ Ｂ １２９－１３５（２０１３））。
いくつかの態様において、本出願の方法又はシステムにおける質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノ－エレクトロスプレーイオン化質量分析計、又は三連四重極質量分析計であることができ、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに連結することができ、質量分析計は、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－質量分析）又はＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィー－多重反応モニタリング－質量分析）分析を行うことができる。
本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用して試料中のタンパク質の消化、例えば、酵素消化又は非酵素消化を実行するいくつかのアプローチが存在する。
本明細書で使用される場合、「消化酵素」という用語は、タンパク質の消化を行うことができる多数の異なる薬剤のうちのいずれかを指す。酵素消化を実行することができる加水分解剤の非限定的な例としては、アスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ）からのプロテアーゼ、エラスターゼ、サブチリシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、ペプシン、トリプシン、Ｔｒｙｐ－Ｎ、キモトリプシン、アスペルギロペプシンＩ、ＬｙｓＮプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｎ）、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ（Ａｓｐ－Ｎ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ（Ａｒｇ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（Ｇｌｕ－Ｃ）若しくは外膜タンパク質Ｔ（ＯｍｐＴ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、又はそれらの生物学的に活性な断片、若しくはホモログ、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。タンパク質消化のために利用可能な技術を考察する最近のレビューについて、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ＆Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＭＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １０６７－１０７７（２０１３））を参照されたい。
消化酵素の量及び消化に必要とされる時間を適切に選択することができる。基質に対する酵素の比が不適切に高い場合、相応する高い消化率によって、質量分析計によってペプチドを分析するための十分な時間が許容されず、シーケンスカバレッジが損なわれる。他方、基質に対する酵素の比が低いと、消化時間を長くする必要があるため、データ取得時間が長くなる。酵素対基質比は、約１：０．５～約１：２００の範囲であることができる。
いくつかの例示的な実施形態において、治療用タンパク質を定量する方法は、任意選択的に、治療用タンパク質をタンパク質還元剤に接触させることを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「タンパク質還元剤」という用語は、タンパク質におけるジスルフィド架橋の還元のために使用される薬剤を指す。タンパク質還元剤の非限定的な例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、エルマン試薬、ヒドロキシルアミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、又はそれらの組み合わせである。
いくつかの例示的な実施形態において、タンパク質を定量する方法は、任意選択的に、治療用タンパク質をタンパク質アルキル化剤に接触させることを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「タンパク質アルキル化剤」という用語は、タンパク質における特定の遊離アミノ酸残基をアルキル化するために使用される薬剤を指す。タンパク質アルキル化剤の非限定的な例は、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、クロロアセトアミド（ＣＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、メチルメタンチオスルホン酸（ＭＭＴＳ）、及び４－ビニルピリジン、又はそれらの組み合わせである。
いくつかの例示的な実施形態において、治療用タンパク質を定量する方法は、治療用タンパク質を変性させることを含むことができる。
本明細書で使用される場合、「タンパク質変性」は、分子の三次元形状をその天然の状態から変化させるプロセスを指すことができる。タンパク質変性は、タンパク質変性剤を使用して実行することができる。タンパク質変性剤の非限定的な例には、熱、高いか若しくは低いｐＨ、ＤＴＴのような還元剤（以下を参照）、又はカオトロピック剤への曝露が含まれる。いくつかのカオトロピック剤をタンパク質変性剤として使用することができる。カオトロピック溶質は、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水性効果などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用に干渉することによって、系のエントロピーを増加させる。カオトロピック剤の非限定的な例には、ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、Ｎ－ラウロイルサルコシン、尿素、及びそれらの塩が含まれる。
本発明は、前述の治療用タンパク質、抗体カクテル、宿主細胞、タンパク質変性剤、タンパク質アルキル化剤、タンパク質還元剤、消化酵素、質量分析器、同定に使用される機器、又はクロマトグラフィー方法のうちのいずれかに限定されず、任意の治療用タンパク質、抗体カクテル、宿主細胞、タンパク質変性剤、タンパク質アルキル化剤、タンパク質還元剤、消化酵素、質量分析器、同定に使用される機器、又はクロマトグラフィー方法は、任意の好適な手段によって選択することができることを理解されたい。
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
例示的な実施形態による本発明のＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ／ＭＳアッセイの全体的なワークフローを図１に示す。
化学物質及び試薬。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水中の０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）（ＬＣ－ＭＳグレード）、及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）（ＬＣ－ＭＳグレード）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。超高純度の１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得た。尿素及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。トリプシン（質量分析グレード）及びｒＡｓｐＮは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。プールしたヒト血清及び１０例の個体からの単一のヒト血清は、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｎｏｖｉ，ＭＩ）から購入した。内部標準（ＩＳ）のためのＡＵＱＡグレードのカスタム合成重ペプチド、ＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲ＊（１０Ｄａ）、ＤＴＡＶ＊（６Ｄａ）ＹＹＣＡＳＧＳは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から取り寄せた。ｍＡｂ１及びｍＡｂ２原薬（ＤＳ）は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）で開発され、そこから得た。ＣＯＶＩＤ－１９患者血清試料は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０４４２５６２９）によって依頼されたＲＥＧＥＮ－ＣＯＶの臨床試験からのものだった。
標準溶液の調製。プールしたヒト血清中にｍＡｂ１及びｍＡｂ２ ＤＳを添加することによって、ヒト血清中のＲＥＧＥＮ－ＣＯＶのストック溶液を作製した。較正標準（ｍＡｂ１では２０、２５、３０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ２では１０、２０、２５、３０、５０、１００、２５０、５００、１０００、２０００μｇ／ｍＬ）は、プールしたヒト血清を使用してストック溶液を連続希釈することによって作製した。定量上限（ＵＬＯＱ、２０００μｇ／ｍＬのｍＡｂ１、２０００μｇ／ｍＬのｍＡｂ２）、高ＱＣ（ＨＱＣ、１５００μｇ／ｍＬのｍＡｂ１、１５００μｇ／ｍＬのｍＡｂ２）、中ＱＣ（ＭＱＣ、７５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１、７５０μｇ／ｍＬのｍＡｂ２）、低ＱＣ（ＬＱＣ、６０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１、３０μｇ／ｍＬのｍＡｂ２）、及び定量下限（ＬＬＯＱ、２０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ２）を含む５つの認定ＱＣ標準も、プールしたヒト血清へのｍＡｂ１及びｍＡｂ２ ＤＳの添加及び連続希釈によって調製した。
ｍＡｂ１及びｍＡｂ２ ＤＳを１０例の個々のヒト血清ブランクに共添加することによって、ＬＬＯＱ（２０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１、１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ２）を添加した個々のヒト血清試料を調製した。薬物特異性アッセイでは、１種類の薬物を含有するＱＣ標準を、プールしたヒト血清を希釈液として使用した抗体薬物のストック溶液の連続希釈によって作製した。マトリクスバックグラウンドとして共投与薬物の存在とともに１種類の薬物を含有するＱＣ標準を、希釈液としてプールしたヒト血清中の２ｍｇ／ｍＬの共投与薬物を使用したストック溶液の連続希釈から作製した。
血清試料の消化。試料処理の前に、血清試料（較正標準、ＱＣ標準、及び患者試料）を氷上で解凍した。血清試料消化は、９６ウェルプレート（０．５ｍＬ、ポリプロピレン、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で行った。５μＬの血清試料を、８０μＬの変性溶液（１０ｍＭのＴＣＥＰ、８Ｍの尿素）を事前に加えた各試料ウェルに添加した。９６ウェルプレートを接着プレートシール（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で密封し、６５０ｒｐｍのサーモミキサーＣ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で、８０℃で１０分間加熱した。室温まで冷却した後、１５μＬの０．２５ＭのＩＡＭを各試料ウェルに添加し、プレートを室温で３０分間、暗所において６５０ｒｐｍで振とうすることによってインキュベートした。使用前に、９ｍＬの０．１Ｍトリス緩衝液中の２００μｇのトリプシン、１００μｇのｒＡｓｐＮ、１５０μＬのｍＡｂ１ ＩＳストック溶液（５ｐｍｏｌ／μＬ）、及び１００μｌのｍＡｂ２ ＩＳストック溶液（５ｐｍｏｌ／μＬ）の再構成によって、２種類の酵素及び２種類のＩＳペプチドを含有する消化溶液を作製した。アルキル化後、１０μＬの各試料を第２の９６ウェルプレートに移し、２種類の酵素及びＩＳペプチドを含有する９０μＬの消化液と混合した。試料プレートを密封し、６５０ｒｐｍ振とうしながら３７℃で３時間インキュベートした。消化が終了したとき、１０μＬの１０％ＴＦＡを各試料ウェルに添加し、反応をクエンチした。試料プレートを、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ分析の前に、７００ｒｐｍで１分間スピンさせた。
ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ方法。ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ実験は、６４９５三連四重極質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）と連結したＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＰＬＣシステムを使用して行った。およそ４５ｎＬの元の血清に対応する１０μＬの消化された血清試料を、Ｃ１８カラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ３００ １．７μｍ，２．１ｍｍ×１００ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ）に加え、水中の０．１％ギ酸として移動相Ａ、及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸として移動相Ｂを使用して、０．３ｍＬ／分の流速で逆相勾配溶出によって分離した。各注入前に、試料注入経路を、ＩＰＡ／ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ｖ／ｖ／ｖ（３：１：１）、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＦＡ ｖ／ｖ／ｖ（２５：７５：０．１）、及びＡＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＦＡ ｖ／ｖ／ｖ（５：９５：０．１）で順次フラッシングした。ＭＲＭ実験のためのＬＣ勾配を以下のように設定した。０～０．５分、５％Ｂ；０．５～１６分、５～２５％Ｂ；１６～１８分、２５～９０％Ｂ；１８～２０分、９０％Ｂ；２０～２０．５分、９０～５％Ｂ，及び２０．５～２５，５％Ｂ。試料分析中、カラム温度を６０℃に設定し、オートサンプラーを７℃に維持した。
三連四重極ＭＳイオン源パラメータは、以下のように設定した。ガス温度２００℃、ガス流速１２Ｌ／分、ネブライザーガス２０ｐｓｉ、シースガス温度３００℃、シースガス流速１１Ｌ／分、キャピラリー電圧３５００Ｖ、ノズル電圧５００Ｖ。２種類のサロゲートペプチド及び２種類のＩＳペプチドについての時間スケジュールＭＲＭ遷移を、表１－１及び表１－２に列挙される各遷移チャネルのパラメータで、全ての定量化分析実験に適用した。
（表１－１）ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳデータ取得のための時間スケジュールＭＲＭ遷移
Figure 2024515561000002
（表１－２）ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳデータ取得のための時間スケジュールＭＲＭ遷移
Figure 2024515561000003
データ分析。ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ実験からの生データを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して分析した。モニタリングした遷移の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）ピーク面積を、Ａｇｉｌｅ２アルゴリズムを用いて積分した。各薬物について較正曲線を構築するために、対応する共溶出ＩＳペプチドからのピーク面積によって正規化した較正標準からのサロゲートペプチドのピーク面積を、１／ｘ２重み付けした３パラメータ二次モデル（標準曲線の各点について可変重み付け）を使用してそれぞれの公称濃度に対してプロットし、続いて、それから他の全ての読み取りを計算した。二次フィッティングでの方程式は、ｙ＝ａｘ２＋ｂｘ＋ｃであり、式中、ｙ＝サロゲートペプチドのＸＩＣピーク面積と対応するＩＳペプチドのＸＩＣピーク面積との比、ｘ＝薬物の濃度（μｇ／ｍＬ）、及びａ、ｂ、ｃ＝二次係数、線形係数、及び定数項をそれぞれ示す。標準曲線の各点における重み付けは、分析物濃度に反比例する。較正曲線パラメータは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアによって自動的に計算された。
電気化学発光イムノアッセイ。アッセイ手順は、ビオチン化マウス抗ｍＡｂ１モノクローナル抗体、又はビオチン化マウス抗ｍＡｂ２モノクローナル抗体のいずれかでコーティングしたストレプトアビジンマイクロプレートを使用した。各分子に特異的な、プレート上に捕捉されたｍＡｂ１及びｍＡｂ２を、ｍＡｂ１又はｍＡｂ２のいずれかに特異的である２種類の、ルテニル化した、非競合マウスモノクローナル抗体を使用して、検出した。電圧がプレートに印加されると、ルテニウム標識から生成された電気化学発光シグナルが、ＭＳＤリーダーによって測定された。測定された電気化学発光は、血清試料中の総ｍＡｂ１又は総ｍＡｂ２の濃度に比例する。
実施例１．ＭＲＭアッセイのための方法開発
ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の両方とも、一対の軽鎖及び一対の重鎖からなる二量体分子である。ｍＡｂ１軽鎖は、２２１個のアミノ酸残基を含み、その重鎖は、４５０個のアミノ酸残基を含む。ｍＡｂ２軽鎖は、２１６個のアミノ酸残基を含み、その重鎖は、４５０個のアミノ酸残基を含む。ＩｇＧタンパク質は、ヒト血清中に豊富であり、これらの２種類のヒト化ＩｇＧ１薬物のアミノ酸配列の９３％超が、内因性血清ＩｇＧと同一であるため、ＭＲＭベースのＩｇＧ抗体薬物定量化に好適なサロゲートペプチドの選択は、可変ドメインのＣＤＲ領域（典型的には、重鎖から３つ、軽鎖から３つ）に由来するペプチドに限定される。定常領域からのペプチドは、ヒト血清中の内因性抗体に由来するものと区別することができない。
ＭＲＭ定量化に好適なサロゲートペプチドを選択するために、以下の考慮事項を適用して、ヒトＩｇＧ薬物のＣＤＲ領域におけるプロテアーゼ切断によって生成された候補ペプチドをスクリーニングした。１）Ｕｎｉｐｒｏｔヒトプロテオームデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｂｌａｓｔ／）における同一のＢＬＡＳＴ一致ヒットなし、２）２０アミノ酸残基未満のペプチド長、３）配列が、酵素消化中に切断を見逃しやすい部位、例えばトリプシン切断についてのＫＲ、ＲＤＲなどを含まない、及び４）配列が、試料処理中にインビボでの生体内変換を受けやすい部位又は部分的修飾を受けやすい残基、例えばメチオニンなどを含まない。これらの基準を適用して、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の、インシリコのトリプシン消化産生ＣＤＲペプチドを調べることによって、ｍＡｂ１の軽鎖ＣＤＲ２からの１種類のペプチド、ＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲのみが、ｍＡｂ１定量化のためのサロゲートペプチドとして機能し得ることが見出された。表２－１に示されるように、ｍＡｂ２ ＣＤＲ領域からのトリプシンペプチドのいずれも、上に列挙された基準の全てを満たすことはできなかった。この場合、別のプロテアーゼであるｒＡｓｐＮを使用して、表２－２に示されるように、ｍＡｂ２定量化のために、重鎖ＣＤＲ３から適切な長さの固有のサロゲートペプチド、ＤＴＡＶＹＹＣＡＳＧＳを生成した。ＣＤＲ領域配列が、太字で示されている。ＭＲＭ方法開発のためのＭＲＭサロゲートペプチドとしてペプチドを除外する理由が、「ｘ」でマークされている。
（表２－１）ｍＡｂ１及びｍＡｂ２のトリプシン消化による、ＣＤＲを含むペプチド配列の予測
Figure 2024515561000004
（表２－２）ｍＡｂ２のトリプシン及びＡｓｐＮ組み合わせ消化による、ＣＤＲを含むペプチド配列の予測
Figure 2024515561000005
ｍＡｂ１原薬のトリプシン消化物及びｍＡｂ２原薬のｒＡｓｐＮ消化物を使用して、ＡｇｉｌｅｎｔＱＱＱシステムでＭＲＭ遷移パラメータを最適化した。逆相ＬＣ分離中のサロゲートペプチド候補のための時間スケジュール生成物イオンスキャン実験を行って、最善の遷移及び衝突エネルギーを選択した。取得したＣＩＤ ＭＳ／ＭＳスペクトルに基づいて、＋２前駆体イオンからｙ３生成物イオンへの遷移を選択して、ｍＡｂ１サロゲートペプチドＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲの存在量をモニタリングし（図２Ａ）、＋２前駆体イオンからｙ５生成物イオンへの遷移を選択してアルキル化ｍＡｂ２サロゲートペプチドＤＴＡＶＹＹＣ（Ｃａｍ）ＡＳＧＳの存在量をモニタリングした（図２Ｂ）。明白に、この二重荷電したｍＡｂ２サロゲートペプチドの最適衝突エネルギーは約５Ｖであり、これは二重荷電したトリプシンペプチドに必要な典型的な衝突エネルギーと比較してはるかに小さい。
サロゲートペプチドの選択された遷移チャネル、及び内部標準ペプチドにおけるそれらの対応する遷移を、ヒト血清マトリクスバックグラウンド干渉について調べた。プールしたヒト血清ブランク、さらには、トリプシンとｒＡｓｐＮとの組み合わせで消化した１０例の個体の血清ブランク試料（女性５例、男性５例）を、１６分の逆相ＬＣ勾配及び４つの遷移チャネルの時間スケジュールＭＲＭ取得を用いて分析した。シグナル干渉は、２種類のサロゲートペプチドの軽又は重遷移チャネルのいずれからも観察されなかった。２種類のサロゲートペプチドについて選択された遷移のマトリクス干渉の評価後、機器パラメータをＭＲＭモード下で更に最適化し、表１－１及び表１－２に列挙されたパラメータを、アッセイ認定及び患者試料分析に適用した。
実施例２．ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイ認定
臨床試料分析に適用する前に、開発したＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイの性能を、以下の最も重要なパラメータを使用して評価した。１）直線性、２）正確度及び精度、３）選択性、４）特異性、並びに５）試料消化前後の分析物安定性。
２．１ 直線性
直線性は、線形又は非線形回帰の適切な統計モデルを用いた標準濃度に応答する機器応答の比例性を指す。このＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイにおいて、直線性は、３日間にわたって、ｍＡｂ１について９個の非ゼロ標準及びｍＡｂ２について１０個の非ゼロ標準の、正規化した抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）ピーク面積によって決定された。較正標準からのサロゲートペプチド及びＩＳペプチドの代表的なＸＩＣ、並びに２種類の抗体薬物について較正曲線を、図３に示す。正規化した応答を使用した較正標準のバック計算した薬物濃度及びそれぞれの標準曲線方程式を使用し、以下の方程式を使用して標準の正確度を推定した。
正確度％（ＡＣＣ％）＝１００％×（測定された濃度／公称濃度）。
３つの独立した実験からの、両方の薬物の非ゼロ標準の測定された濃度の統計的プロファイルが表３及び表４に要約される。全ての標準の平均ＡＣＣ％値は、ｍＡｂ１では８９％～１０５％、ｍＡｂ２では９２％～１０６％の範囲であった。全ての非ゼロ標準で測定された濃度値のＣＶ％（変動係数）は、ｍＡｂ１では２．６％～１１％、ｍＡｂ２では０．７％～１２％で様々であった。これらの結果は、ＡＣＣ％が、±２５％以内でなければならないＬＬＯＱ又はＵＬＯＱレベルでの標準を除いて、非ゼロ標準で公称値の±２０％以内にあるべきであり、ＣＶ％が、≦２５％でなければならないＬＬＯＱ又はＵＬＯＱレベルでの標準を除いて、全ての非ゼロ標準について≦２０％でなければならない、という生体分析に関する基準を満たした。
（表３）３つの独立した実験からの、ｍＡｂ１の全ての非ゼロ標準の正確度及び精度
Figure 2024515561000006
（表４）３つの独立した実験からの、ｍＡｂ２の全ての非ゼロ標準の正確度及び精度
Figure 2024515561000007
２．２ 正確度及び精度
正確度は、測定した結果とその理論的真値との間の一致の近さを指し、正確度パーセント（ＡＣＣ％）として表される。精度は、同じ試料についての繰り返しの測定の間のランダムな変動の定量的尺度を指し、変動係数のパーセンテージ（濃度ＣＶ％）として表される。日内正確度及び精度は、３日間にわたる３回の独立した測定において、上記の標準溶液の調製に記載されるように調製された、１回の実行当たり５反復の認定ＱＣによって決定した。日間正確度及び精度は、３日間にわたって、試料調製からＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析までの３回の独立した測定（各々、５反復の認定ＱＣで）によって決定された。日内及び日間の正確度及び精度パラメータのデータを表５－１、表５－２、及び表５－３に示す。
（表５－１）ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイについての５つのＱＣレベルでのｍＡｂ１の日内（Ｎ＝５）正確度及び精度
Figure 2024515561000008
（表５－２）ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイについての５つのＱＣレベルでのｍＡｂ２の日内（Ｎ＝５）正確度及び精度
Figure 2024515561000009
（表５－３）ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイについての５つのＱＣレベルでのｍＡｂ１及びｍＡｂ２の日間（Ｎ＝３）正確度及び精度
Figure 2024515561000010
日間正確度及び精度評価の統計的プロファイルは、５つのＱＣ全てのｍＡｂ１でＡＣＣ％値が９５％～１０３％の範囲であり、５つのＱＣ全てのｍＡｂ２でＡＣＣ％値が９６％～１０６％の範囲であったことを示す。全てのＱＣの日間濃度値ＣＶ％は、ｍＡｂ１で３％及び１３％、ｍＡｂ２で３％及び９％と様々であった。日内評価では、５つのＱＣのｍＡｂ１でＡＣＣ％値が８９％～１１４％であり、濃度値ＣＶ％が１％～６％であり、５つのＱＣのｍＡｂ２のＡＣＣ％値が９２％～１１１％であり、濃度値ＣＶ％が２％～９％であった。これらの結果は、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の両方について、このＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイの日内及び日間両方の正確度が、ＨＱＣ、ＭＱＣ、及びＬＱＣについて８０％～１２０％、並びにＬＬＯＱ及びＵＬＯＱについて７５％～１２５％であることを実証した。測定された濃度の日内及び日間両方のＣＶ％が、ＨＣＱ、ＭＱＣ、及びＬＱＣについて２０％以内であり、ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱについて２５％以内である。
２．３ 選択性
選択性とは、様々な内因性及びアッセイ非特異的マトリクス成分の存在下での分析物の選択的及び特異的定量を指す。１０例の個々のナイーブヒト血清試料のセットを分析して、アッセイが非特異的マトリクス干渉に供されたか調べた。ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の両方について、全ての試料が、ｍＡｂ１では２０μｇ／ｍＬ、ｍＡｂ２では１０μｇ／ｍＬの、定量限界未満（ＢＬＱ）であることが示された。選択性の更なる証拠は、ＬＬＯＱ添加した個々のナイーブヒト血清試料の正確度評価によって評価した。図４に示すように、２０μｇ／ｍＬのｍＡｂ１及び１０μｇ／ｍＬのｍＡｂ２を共添加した１０例の個々の血清試料の各々について、ｍＡｂ１の測定された濃度は、公称値の±２５％以内であり、ＡＣＣ％値は、９２％～１１６％の範囲であった。ｍＡｂ２ではＡＣＣ％値が、８７％～１２６％の範囲にあり、１例の試料中のｍＡｂ２の測定濃度は、公称値の±２５％の範囲外であった。これらの結果は全て、ＬＬＯＱ添加したナイーブ試料の少なくとも８０％が、公称値の±２５％以内のＡＣＣ％の許容基準を満たさなければならないという、産業のための生物分析方法検証ガイダンス（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）に記載された許容基準を満たした（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ２０１８）。
これらの評価から、開発されたＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイが、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２を含有するヒト血清試料について選択的であることが実証された。加えて、ＬＬＯＱ添加試料で得られた結果は、ニートな血清中のアッセイが、２０μｇ／ｍＬの低い全ｍＡｂ１、及び１０μｇ／ｍＬの低い全ｍＡｂ２のレベルを定量することができることを確証し、ＭＲＭアッセイにおけるＬＬＯＱを更に確立した。
２．４ 特異性
特異性は、存在することが予想される他の成分の存在下で分析物を評価する方法の能力を指す。ｍＡｂ１及びｍＡｂ２は、抗体カクテル療法として共投与されるため、各薬物の方法特異性について併用薬物からの干渉を評価した。図５のＸＩＣに示されるように、１４分の保持時間でのｍＡｂ１サロゲートペプチドの遷移チャネル（ｍ／ｚ８５３．０→ｍ／ｚ３５９．２）からのシグナルは、ヒト血清中の２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ２では検出できなかった（図５Ａ）。同様の応答が、ヒト血清中の２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１の試料中のｍＡｂ２の遷移チャネル（ｍ／ｚ５９７．６→ｍ／ｚ４８１．２）からのシグナルで観察された（図５Ｂ）。
各薬物に対する薬物特異性を体系的に評価するために、５つの異なるＱＣ濃度レベルにおいて、１種類の薬物単独で作製されたＱＣ標準の正確度を、２ｍｇ／ｍＬの共投与薬物を含有するＱＣ標準の正確度と比較した。ｍＡｂ１ ＱＣのＡＣＣ％値は、ｍＡｂ２の存在なしで９８％～１０３％の範囲であり、これは、血清中に２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ２を有するｍＡｂ１ ＱＣで測定されたＡＣＣ％範囲（９７％～１２０％）と同等だった（図５Ｃ）。ｍＡｂ２ ＱＣのＡＣＣ％値は、ｍＡｂ１の存在なしで１００％～１１４％の範囲であり、これはまた、血清中に添加した２ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１を有するｍＡｂ２ ＱＣで測定されたＡＣＣ％範囲（９６％～１０８％）と同等だった（図５Ｄ）。共投与薬物の存在の有無にかかわらず、全ての５つのＱＣレベルでの各薬物におけるＱＣのＡＣＣ％値は、公称値の±２５％以内のＵＬＯＱ及びＬＬＯＱのＡＣＣ％を除いて、公称値の±２０％以内のＡＣＣ％の許容基準を満たした。
２．５ 分析物安定性
分析物安定性は、試料がストレス又は異なる保存条件に供されていた後に、分析物をアッセイの許容基準内で正確に測定する能力を指す。このアッセイの目的に合わせるために、３回の凍結／解凍（ＦＴ）サイクルへの曝露後のヒト血清中のインタクト治療用タンパク質の安定性、及びＵＰＬＣオートサンプラーで保存中の消化分析物の安定性を評価した。
凍結／解凍サイクルの条件下での分析物安定性を評価するために、５反復のＵＬＯＱ、ＨＱＣ、ＭＱＣ、及びＬＱＣを、消化前に３サイクル凍結／解凍した。機器オートサンプラー中での分析物の安定性を評価するために、５反復のＵＬＯＱ、ＨＱＣ、ＭＱＣ、ＬＱＣ、及びＬＬＯＱを、オートサンプラー中７℃で７２時間保存した後に分析した。新鮮なＱＣ試料の測定正確度を、消化前に凍結／解凍サイクルを受けたＱＣ試料、並びに消化後にオートサンプラー中で長時間保存されたＱＣ試料の正確度と比較した。図６に示すように、評価した条件について、薬物濃度の測定された正確度の有意な変化は観察されなかった。公称値の±２５％以内のＵＬＯＱのＡＣＣ％を除いて、全てのＱＣが、公称値の±２０％以内の全てのＱＣのＡＣＣ％の許容基準を満たし、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の両方とも、試験した条件下でのヒト血清中で安定であり、この安定性は、本発明の方法を使用して正確に評価することができることを示した。
実施例３．ＣＯＶＩＤ－１９患者血清試料中のＲＥＧＥＮ－ＣＯＶ濃度の測定
ＲＥＧＥＮ－ＣＯＶの特性評価のための信頼性の高い定量的薬物動態アッセイに対する緊急の必要性に起因して、開発されたＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイは、ＣＯＶＩＤ－１９を有する外来患者におけるＲＥＧＥＮ－ＣＯＶの第Ｉ相臨床試験から収集された血清患者試料中のｍＡｂ１及びｍＡｂ２の総濃度を決定する暫定的方法として機能した（Ｗｅｉｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．）。二重盲検臨床試験に参加する患者は、プラセボ、２．４ｇのＲＥＧＥＮ－ＣＯＶ（各抗体１．２ｇ）、又は８．０ｇのＲＥＧＥＮ－ＣＯＶ（各抗体４ｇ）を静脈内注射によって受けるように無作為に割り当てられた（１：１：１）。血清試料は、２．４ｇ及び８．０ｇの投与量群における患者から、投与前、薬物注入の１時間後、及び薬物投与の２、４、６、１４、及び２８日後に収集し、本発明のＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイによって分析した。
較正標準、並びに３連での４つの濃度レベル（ＬＬＯＱ、ＬＱＣ、ＭＱＣ、ＨＱＣ）のＱＣ標準を、患者試料の各バッチと一緒に消化及び分析した。ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ測定における実行許容基準は、非ゼロ較正標準の正確度パーセント、並びにＱＣの正確度パーセント及び変動係数によって定義された。較正標準の測定された濃度の正確度は、ＬＬＯＱで公称濃度の２５％以内、及び他の全ての濃度で公称濃度の２０％以内でなければならない。測定されたＱＣ濃度の少なくとも３分の２は、それらそれぞれの公称値の２０％又は２５％（ＬＬＯＱ）以内でなければならない。各レベルでの少なくとも２反復のＱＣは、それらの公称濃度の２０％又は２５％（ＬＬＯＱ）以内でなければならない。精度の許容基準は、各濃度レベルで決定され、２０％以内であるべきである。測定された全ての投与前の患者血清試料は、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の両方についてＬＬＯＱ未満の応答を有し、このＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイの選択性を更に検証した。
図７に示されるように、単回用量注射後の血清薬物濃度の時間プロファイルを使用して、ｍＡｂ１及びｍＡｂ２の薬物動態パラメータを決定した。結果は、抗体薬物濃度が静脈内注射の１時間以内に最大に達し、経時的に減衰することを示した。各抗体の薬物動態は、直線的であり、用量に比例しており、２９日目の血清中の薬物濃度は、インビトロ及び前臨床データに基づいて予測された中和標的濃度を上回ったままだった（Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｗｅｉｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．）。開発されたアッセイの直線性範囲は、薬物注入後１ヶ月にわたり、両方の投与量群からの、及び６回のＰＫサンプリング時点からの全ての臨床試料をカバーする。
実施例４．イムノアッセイによる方法検証
免疫アッセイは、伝統的に、臨床試料分析における血清マトリクス中の抗体薬物濃度の決定のための選ばれた方法である。イムノアッセイは、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳアッセイにおけるようなプロテアーゼ消化に由来するサロゲート断片を測定する代わりに、インタクト分子としてのタンパク質標的を測定する。臨床ＰＫイムノアッセイ開発のための最も重要な試薬は、抗体薬物のイディオタイプに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体であり、それは通常、これらの試薬をスクリーニング及び生成するのに数ヶ月かかる。イムノアッセイは、典型的には、ｎｇ～ｍＬ範囲で非常に良好な感度を提供し、これは、追加の免疫親和性濃縮ステップなしでは従来のＬＣ－ＭＲＭアッセイによって到達することができなかった。イムノアッセイの別の利点は、方法が確立されると、大量の患者試料分析をハイスループット形式で実行することができることである。
ＲＥＧＥＮ－ＣＯＶについて電気化学発光イムノアッセイが十分に検証された後、第Ｉ相臨床試料をこの方法で再分析した。図７に示されるように、結果は、イムノアッセイによって測定された濃度と本発明のＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ方法によって測定された濃度との間で比較した。比較は、両方のアッセイの結果の間に良好な一致があることを示した。２つのアッセイによって測定された個々の患者（用量群当たりｎ＝１５～２０）からの平均薬物濃度の差は、ｍＡｂ１では２３％以内であり、ｍＡｂ２では１１％だった。これによって、本発明のＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ方法が、抗イディオタイプ抗体試薬に依存するイムノアッセイと比較してより迅速な開発の利点を有しながら、抗体治療剤の正確で、高感度で、特異的な測定に有効であることが検証された。

Claims (22)

  1. 少なくとも２種類の治療用タンパク質を同時に定量するための方法であって、
    （ａ）第１の治療用タンパク質及び第２の治療用タンパク質を含む試料を得る工程と、
    （ｂ）前記試料を少なくとも２種類の消化酵素に接触させることによって、前記第１及び第２の治療用タンパク質の各々について少なくとも１種類の固有のサロゲートペプチドを生成する工程と、
    （ｃ）質量分析計を使用して、前記サロゲートペプチドを定量する工程と、
    （ｄ）定量した前記サロゲートペプチドを使用して、前記第１及び第２の治療用タンパク質を定量する工程と
    を含む、方法。
  2. 前記消化酵素が、トリプシン、キモトリプシン、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣ、及びＡｒｇＣからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記消化酵素が、トリプシン及びＡｓｐＮである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第１及び第２の治療用タンパク質が、抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、抗体のＦａｂ領域、抗体－薬物コンジュゲート、又は融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記第１の治療用タンパク質が、カシリビマブであり、前記第２の治療用タンパク質が、イムデビマブである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノ－エレクトロスプレーイオン化質量分析計、又は三連四重極質量分析計である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記質量分析計が、クロマトグラフィーシステムに連結されている、請求項１に記載の方法。
  8. 前記クロマトグラフィーシステムが、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記試料が、ヒト血清を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 潜在的なサロゲートペプチドのインシリコ分析を使用して、前記消化酵素を選択する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記第１及び第２の治療用タンパク質を対象に投与する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記試料中の前記第１の治療用タンパク質についての約１０～約２０００μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記試料中の前記第２の治療用タンパク質についての約１０～約２０００μｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記質量分析計が、多重反応モニタリング又は並列反応モニタリングを行うことができる、請求項１に記載の方法。
  15. 前記サロゲートペプチドのペプチドマッピングを行う工程と、
    前記サロゲートペプチドの固有のペプチド及び断片イオンを選択して多重反応モニタリング遷移を生成する工程と、
    前記サロゲートペプチドの上位２つ又は上位３つの遷移を選択する工程と、
    前記サロゲートペプチドの衝突エネルギーを最適化する工程と、
    続いて較正曲線を生成する工程と、
    前記較正曲線に従ってＬＬＯＱ（定量下限）を決定する工程と
    を更に含む、請求項１に記載の方法。
  16. 前記第１又は前記第２の治療用タンパク質に特異的な少なくとも１種類のサロゲートペプチドを選択する工程を更に含み、
    以下：
    ｉ．前記サロゲートペプチドが、定量される前記治療用タンパク質の消化物に特異的であること、
    ｉｉ．前記サロゲートペプチドが、少なくとも１種類の前記治療用タンパク質が存在しない調製物のプロテアーゼ消化物には特異的に存在しないこと、
    ｉｉｉ．前記サロゲートペプチドが、質量分光分析において強力なシグナルを生成すること、及び
    ｉｖ．前記サロゲートペプチドが、質量分光分析において区別可能なシグナルを生成すること
    を決定することによって、少なくとも１種類の前記サロゲートペプチドが予め選択される、
    請求項１に記載の方法。
  17. 投与された抗体カクテルからのカシリビマブ及びイムデビマブを同時に定量するための方法であって、
    （ａ）カシリビマブ及びイムデビマブを含む血清試料を得る工程と、
    （ｂ）前記試料をトリプシン及びＡｓｐＮに接触させることによって、カシリビマブ及びイムデビマブの各々について少なくとも１種類の固有のサロゲートペプチドを生成する工程と、
    （ｃ）質量分析計を使用して、前記サロゲートペプチドを定量する工程と、
    （ｄ）定量した前記サロゲートペプチドを使用して、カシリビマブ及びイムデビマブを定量する工程と
    を含む、方法。
  18. 前記サロゲートペプチドが、アミノ酸配列ＬＬＩＹＡＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲ及びＤＴＡＶＹＹＣＡＳＧＳを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノ－エレクトロスプレーイオン化質量分析計、又は三連四重極質量分析計である、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記質量分析計が、液体クロマトグラフィーシステムに連結されている、請求項１７に記載の方法。
  21. カシリビマブ及びイムデビマブを対象に投与する工程を更に含む、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記質量分析計が、多重反応モニタリング又は並列反応モニタリングを行うことができる、請求項１７に記載の方法。
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