JP2024514023A - 共有結合性有機フレームワークによる生体内へのインスリン経口投与 - Google Patents

Abstract

イミン結合共有結合性有機フレームワーク（ｎＣＯＦ）ナノ粒子を提供する。ＣＯＦナノ粒子は、２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）と４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ）モノマーの共縮合から形成することができる。ナノ粒子は、インスリンなどのカーゴをカプセル化するために使用することができる。インスリンをカプセル化したナノ粒子は、糖尿病を有するかまたは糖尿病の疑いのある個体を治療する方法に使用することができる。ナノ粒子は経口投与することができる。【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照

本出願は、２０２１年４月５日に出願された米国仮特許出願第６３／１７０，９６７号の優先権を主張するものであり、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

世界人口の１０％近くが罹患する世界第７位の死因であり、その有病率は１９８０年以来４倍に増加し、直接医療費の１５％近くを占める糖尿病とその治療は、世界的に重要である。糖尿病は、膵β細胞膵島がないためにインスリンが分泌されない場合（１型）、あるいは分泌されたインスリンが体内で有効に利用されない場合（２型）に発症する慢性疾患である。生活習慣の改善と相まって、インスリン治療は血糖値をコントロールし、調節するための重要な要素であり、その主なメカニズムはインスリン注射である。しかし、コントロールされていない糖尿病患者の多くがインスリン治療を開始するのが遅れており、最終的に治療を開始した患者でも２年以上の遅れがあることが研究で示されている。痛みや不安だけでなく、注射針や自己注射に対する恐怖も、インスリン治療を開始したくない多くの理由の一部である。インスリンペンは、これらの条件を緩和し、バイアルやシリンジに存在する投与量の問題を克服しているが、この方法自体にエラーがないわけではない。インスリンの経口投与へのシフトは、頻繁な皮下注射による副作用のない非侵襲的な治療法であるため、インスリン療法の普及を改善し、糖尿病治療に革命をもたらす可能性がある。

経口投与されたインスリンは、生理的なインスリン分泌と同様に肝臓を経て全身循環に達することができるが、皮下注射されたインスリンは末梢の高インスリン血症とそれに伴う合併症を引き起こす可能性がある。しかしながら、薬物の経口投与は、溶解性、バイオアベイラビリティ、溶解度、消化管内での安定性など多くの課題に直面している。インスリンの経口バイオアベイラビリティは、消化管（ＧＩ）における固有の不安定性と、腸内の生体膜を通過する透過性の低さ（１％未満）によって著しく妨げられている。いくつかの経口インスリン製剤の臨床試験にもかかわらず、十分な商業的開発はまだ達成されていない。

本発明の開示

高分子、無機および固体脂質ナノ粒子などのナノキャリアが、インスリンの経口投与に関連する多くの問題を回避するインスリンのトランスポーターとして使用されてきたが、最近の臨床試験では、毒性、低レベルの経口バイオアベイラビリティ、インスリン吸収の高い個人差のために失敗に終わっており、これらは課題が依然として残っていることを示す強力な証拠です。インスリンの経口投与に関しては、これまでに2つのシステムがＦＤＡの認可を受けている。Ｏｒａｍｅｄ社が開発した最初のシステム（ＯＲＭＤ－０８０１）は、有効成分を保護する種特異的プロテアーゼ阻害剤と、腸管上皮を通過する吸収を促進する強力な吸収促進剤の両方を組み込んだものである。しかし、このシステムは非特異的であり、長期間の使用は胃の膜バリアを損傷し、毒性につながる可能性がある。２つ目のＤｉａｓｏｍｅ社のＨＤＶ－１は、肝ターゲティングのリポソームをベースにしているが、胃腸での不安定性、高コスト、保存中の薬物放出に問題がある。

本開示の概要

一つの態様において、本開示は、イミン結合共有結合性有機フレームワーク（ｎＣＯＦ）ナノ粒子を提供する。ＣＯＦナノ粒子は、2，6-ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）と4，4'，4''-（1，3，5-トリアジン-2，4，6-トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ）モノマーとの共縮合から形成され得る。例えば、ＣＯＦナノ粒子は、イミン結合した2，6-ジホルミルピリジニルモノマーおよび4，4'，4''-（1，3，5-トリアジン-2，4，6-トリイル）トリアニリニルモノマーの複数のＣＯＦナノシートから構成され得る。実施形態において、ＣＯＦナノ粒子は、１０～２５のＣＯＦナノシート（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５のＣＯＦナノシート）を含む。様々な例において、ＣＯＦナノ粒子は約１８のＣＯＦナノシートを有する。

一つの態様において、本開示はＣＯＦナノ粒子の製造方法を提供する。また、1つ以上のカーゴ分子を含むＣＯＦナノ粒子の方法も提供する。

一つの態様において、本開示は組成物を提供する。組成物は、カーゴ分子（例えば、インスリン）を組み込んだＣＯＦナノ粒子を含んでいてもよい。

一つの態様において、本開示は、糖尿病を有するかまたは有する疑いのある個体を治療する方法を提供する。糖尿病は、１型または２型であり得る。様々な例において、個体は１型糖尿病を有する。

一つの態様において、本開示はキットを提供する。キットは、インスリンが組み込まれたＣＯＦナノ粒子を含む医薬製剤と印刷物とを含むことができる。

本開示の性質と目的をより深く理解するために、添付の図と併せて以下の詳細な説明を参照されたい。

［図１］インスリンがＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの各層の間に挿入されている。ａ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの化学構造と合成経路。ｂ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦのＨＲ－ＴＥＭ像。漫画図はＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの形状を示す。ｃ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの構造モデル。ｈｃｂ層がａｂｃ配列で配置され、積層方向に沿って六角形のチャネルを形成している。ｄ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの層間にインスリンがカプセル化されている様子を模式的に表したもの。漫画図（球）はインスリンを示す。ｅ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンのＨＲ－ＴＥＭ像。ｆ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣの共焦点顕微鏡像；挿入図：蛍光強度。ｇ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ層間に挿入されたインスリンモノマー分子の最適化された位置のファンデルワールス図。ＣＯＦ層に属する原子は、層ごとに白、灰色、黒で表示されている。インスリン分子については、C、N、O、S原子が示されている。H原子はわかりやすくするために省略してある。

［図２］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは、遅延放出とｐＨ感受性のあるグルコース制御放出モードを示す。ａ）３７℃、ＰＢＳ（１０ｍＭ）、ｐＨ２．０またはｐＨ７．４、いくつかのグルコース濃度（［グルコース］＝０、１、３および５ｍｇｍＬ^－１）におけるＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンから放出されたインビトロで蓄積されたインスリン。ｂ）グルコース濃度の関数としての３７℃でのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣの脈動放出のプロファイル（［グルコース］＝１ｖｓ５ｍｇｍＬ^－１）。エラーバーは3回の実験の±Ｓ．Ｄ．を示す。

［図３］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは毒性を引き起こすことなく生体内でのグルコースの取り込みを調節する。インスリン投与量が５０ＩＵ.ｋｇ^－１のＳＴＺ誘発糖尿病ラットにＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンを経口投与した後のａ）血糖値、ｂ）血漿インスリンレベルの変化およびｃ）経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）の時間曲線。５ＩＵ．ｋｇ^－１のインスリンを皮下注射（Ｓ．Ｃ．）した群を陽性コントロールとした。糖尿病ラット（コントロール、黒）の血糖値、血漿インスリン値およびＯＧＴＴも示した。血糖値、血漿インスリン値、ＯＧＴＴについて、対応する曲線下面積（ＡＵＣ）をそれぞれｄ）、ｅ）、ｆ）に示す。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンはＳ．Ｃ．インスリン溶液および糖尿病コントロールと比較して、血糖値、血漿インスリン値およびＯＧＴＴにおいて統計学的に有意な差を示した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。ｇ）病理組織学的研究。コントロール糖尿病ラット（Ｉおよびｉｖ）、Ｓ．Ｃ．インスリン（５ＩＵ．ｋｇ^－１、ｉｉおよびｖ）およびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（５０ＩＵ．ｋｇ^－１、ｉｉｉおよびｖｉ）で治療された糖尿病ラットの肝臓（ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ）および腎臓（ｉｖ、ｖ、ｖｉ）の切片。白矢印：大きな肝細胞、赤矢印：熱細胞の壊死と洞の狭小化、＊：ボウマンカプセル、灰色矢印：糸球体の肥大と尿細管の壊死（黒矢印）。

［図４］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの合成経路と化学構造。

［図５］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦのＨＲ－ＴＥＭ像（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）およびＳＴＥＭ像（ｅ、ｆ）。ｎＣＯＦの（１１０）面に対応する格子フリンジ距離（ｄ＝０．４ｎｍ）も示しており、材料の結晶性が確認できる。

［図６］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ形成の推定メカニズム。黒い矢印は、ナノシート間の水素結合を促進するＨ_２Ｏ共溶媒のわずかな存在によるナノシートの積層を表す。

［図７］０．５ｍＬの酢酸（１７Ｍ、[酢酸]最終＝５．０Ｍ、共溶媒Ｈ_２Ｏなし）を用いて合成したＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦのＨＲＴＥＭ像。

［図８］ｐＨ＝２．０で２４時間懸濁したｎＣＯＦ構造に変化は見られないＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦのＴＥＭ像。

［図９］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンのＨＲ－ＴＥＭ像（ａ、ｂ）およびＳＴＥＭ像（ｃ、ｄ）。

［図１０］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ（ａ、ｃ）とＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（ｂ、ｄ）のＨＲ－ＴＥＭ像（ａ、ｂ）と粒度分布（ｃ、ｄ）。粒子の平均サイズを推定するために、平均３００個の粒子を数えた。

［図１１］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ（ａ、ｂ）とＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（ｃ、ｄ）のＳＴＥＭ像の比較。

［図１２］ａ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦおよびb) ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン中の硫黄元素ＳのＴＥＭマッピング。ｉ）ＳＴＥＭ像、ｉｉ）ＳのＥＤＳマッピング、ｉｉｉ）ナノ粒子中のＳ元素の局在を示すｉ）とｉｉ）の重ね合わせ、ｉｖ）元素分析。

［図１３］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦｓ（ａ、ｂ）およびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦｓ／インスリン（ｃ、ｄ）のＡＦＭ像（ａ、ｃ）および高さプロファイル（ｂ、ｄ）。

［図１４］ｐＨ７．４の１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中での合成後（ｂ）および１２ヶ月後（ｃ）のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの流体力学的直径（ａ）とＴＥＭ像（ｂ、ｃ）。挿入図：ｔ＝０とｔ＝１２ヶ月の溶液の写真。実験は３回繰り返して行った。

［図１５］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（充填率３０％）およびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（充填率６５％）のＰＸＲＤパターン。

［図１６］インスリン充填前後のＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦの７７Ｋにおける窒素吸脱着等温線と細孔径分布曲線（挿入図）。実験は3回繰り返して行った。

［図１７］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦとその前駆体である２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）および４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル)トリアニリン（ＴＴＡ）のＦＴＩＲスペクトルを重ねた図。ｔｒｚ：トリアジン；ａｌｄ：アルデヒド；ｐｙｒ：ピリジン。

［図１８］インスリン（上）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ（中）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（下）のＦＴＩＲスペクトルを重ねた図。

［図１９］インスリン（上）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ（中）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（下）の１７５０－１３５０ｃｍ^－１におけるＦＴＩＲスペクトルの比較図。

［図２０］ａ）ＴＥＭ像、ｂ）ＰＸＲＤパターン、ｃ）ｐＨ＝２．０で２４時間懸濁したＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの窒素吸脱着等温線。

［図２１］一定時間間隔での^１Ｈ ＮＭＲによるＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦへのインスリン取り込みのモニタリング。重水素化ＨＥＰＥＳ緩衝液中、５００ＭＨｚ、３１０Ｋで、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ非存在下（ｐＨを７．４に調整し、インスリンの初期濃度を１０ｍＭとした。下トレース）、およびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ存在下、ｔ＝０、３０分（分）、１時間（時間）、１．５時間、２時間、３時間、６時間、9時間、１２時間、２４時間におけるインスリンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルの重ねた図面。

［図２２］異なるインスリン－ＦＩＴＣ濃度で最大蛍光シグナルを測定して得られた検量線（λ_ｅｘ＝４８８ｎｍ,λ_ｍａｘ=５２０ｎｍ，Ｈ_２Ｏ，２９８Ｋ）。

［図２３］ａ）インスリン－ＦＩＴＣを含浸させたＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの希釈上清溶液のｔ＝０時間および２４時間後の蛍光発光スペクトル。ｂ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣ、およびインスリン－ＦＩＴＣの蛍光発光スペクトル。λ_ｅｘ＝４８８ｎｍ、Ｈ_２Ｏ、ｐＨ７．４、２９８Ｋ。実験は3回繰り返して行った。

［図２４］ＮＰの固定化を確実にするためにカバースリップ上にドロップキャストしたＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣの共焦点顕微鏡像（λ_ｅｘ＝４８８ｎｍ）。実験は3回繰り返して行った。

［図２５］
ｐＨ７．４の１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中での合成後（ｂ）と１２ヶ月後（ｃ）のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの流体力学的直径（ａ）とＴＥＭ像（ｂ、ｃ）。実験は3回繰り返して行った。

［図２６］１００ｍMのＨＥＰＥＳ中ｐＨ７．４におけるインスリン、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンのゼータ(ζ)-電位。エラーバーは３回の測定の標準偏差を表す。

［図２７］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの高分解能ＸＰＳスペクトル。（ａ）ＸＰＳサーベイスペクトル、（ｂ）Ｃ１ｓ、（ｃ）Ｏ１ｓおよび（ｄ）Ｎ１ｓの結合エネルギースペクトル。

［図２８］インスリンの高分解能ＸＰＳスペクトル。（ａ）ＸＰＳサーベイスペクトル、（ｂ）C１ｓ、（ｃ）Ｏ１ｓ、（ｄ）Ｎ１ｓおよび（ｅ）Ｓ２ｓの結合エネルギースペクトル。

［図２９］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの高分解能ＸＰＳスペクトル。（ａ）ＸＰＳサーベイスペクトル、（ｂ）Ｃ１ｓ、（ｃ）Ｏ１ｓ、（ｄ）Ｎ１ｓおよび（ｅ）Ｓ２ｓの結合エネルギースペクトル。

［図３０］ヒト血清およびアミノ酸混合物中、３７℃で２４時間、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンからのインビトロで蓄積されたインスリン－ＦＩＴＣ放出。放出された薬剤の割合％は蛍光発光を用いて測定した。実験は3回繰り返して行った。

［図３１］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンをａ）フルクトース(［フルクトース］＝３ｍｇ．ｍＬ^－１)とｂ）スクロース（［スクロース］＝３ｍｇ．ｍＬ^－１）を含むＰＢＳ中３７℃で２４時間処理し、その後、グルコース([グルコース]＝３ｍｇ．ｍＬ^－１)を添加してインスリン－ＦＩＴＣ放出を誘発したＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンからのインビトロで蓄積されたインスリン－ＦＩＴＣの放出。放出された薬物の割合は、蛍光発光を用いて測定した。実験は3回繰り返し行った。

［図３２］ネイティブインスリン溶液と胃腸環境で培養したインスリンの円偏光二色性スペクトル。Ｄｅｇ=度。実験は3回繰り返して行った。

［図３３］ネイティブインスリン溶液と高血糖条件下（５ｍｇ．ｍＬ^－１）で１２時間培養したＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンから放出されたインスリンの円偏光二色性スペクトル。Ｄｅｇ=度。実験は3回繰り返して行った。

［図３４］ｐＨ７．４（ａ、ｂ）、ｐＨ２．０（ｃ、ｄ）およびリゾチーム（５ｍｇ．ｍＬ^－１、ｅ，ｆ）存在下、ｔ＝０時間および２４時間における１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの流体力学的直径（ａ、ｃ、ｅ）およびＴＥＭ像（ｂ、ｄ、ｆ）。実験は3回繰り返して行った。

［図３５］１００ｍＭのＨＥＰＥＳ中、ｐＨ７．４でインスリン、グルコース、インスリンとグルコースの順でインキュベートしたときのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの充填効率（ｗｔ％）。

［図３６］１００ｍＭのＨＥＰＥＳ中、ｐＨ７．４におけるＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／グルコース、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン+グルコースのゼータ（ζ）電位。

［図３７］グルコースを充填したＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦのＴＥＭ像ａ）、ＰＸＲＤパターンｂ）、窒素吸脱着等温線ｃ）。

［図３８］高血糖状態（[グルコース]＝５ｍｇ．ｍＬ^－１）で放出した後のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンのＴＥＭ像ａ）、ＰＸＲＤパターンb)、および窒素吸脱着等温線c)。

［図３９］ａ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ、ｂ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンおよびｃ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの高血糖状態での放出後のＴＥＭ像。

［図４０］［ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ］＝１ｍｇ．ｍＬ^－１までのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦまたはＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンで４８時間培養した後のＨｅｐ－Ｇ２、ＨＣＴ－１１６、ＨＣＴ－８、ＲＫＯ、ＨｅＬａ、Ａ２７８０、ＭＤＡＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７、ＨＥＫ－２９３およびＵ２５１－ＭＧ細胞の生存率。エラーバーは3回の測定の標準偏差を表す。

［図４１］ＴＥＭで可視化したＨＣＴ－１１６およびＲＫＯ細胞（コントロール細胞）。

［図４２］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンで４時間処理したＨＣＴ－１１６細胞の（ａ）ｔ＝４ｈ、ｂ）ｔ＝２４ｈおよびｃ）ｔ＝４８ｈの様々な倍率でのＴＥＭ像。白矢印は、エンドサイトーシスによるナノ粒子の細胞内への取り込みと細胞質内での通過を示す。

［図４３］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンで４時間処理したＲＫＯ細胞のａ）ｔ＝４ｈ、ｂ）ｔ＝２４ｈおよびｃ）ｔ＝４８ｈの様々な倍率でのＴＥＭ像。白矢印は、エンドサイトーシスによるナノ粒子の細胞内への取り込みと細胞質内での通過を示す。

［図４４］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦおよびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの溶血活性。ａ）異なる濃度のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦおよびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン(最大３ｍｇ．ｍＬ^－１)と１時間培養した新鮮なヒト血液の遠心分離後の写真。ｂ）異なる濃度のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦおよびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（最大３ｍｇ．ｍＬ^－１）によって誘発される溶血率（％）。ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（０．３％）の非存在下または存在下の生理的食塩水を、それぞれ陰性（Ｃ－）および陽性（Ｃ＋）コントロールとして用いた。＊＊＊ｐ＜０．００１、陰性コントロールと有意に異なる。エラーバーは3回の測定の標準偏差を表す。

［図４５］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣの生体外（エックスビボ）透過試験。ａ）３７℃のＤＭＥＭ中、マウスの腸組織を通過するＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣの見かけの透過性プロファイル。研究中の製剤を、摘出したばかりのマウス組織から得た腸嚢に注射した。充填した組織を３７℃の酸素添加緩衝液中で培養した。サンプル溶液は最大１８０分の一定の時間間隔で採取し、新鮮な培地と交換した。データは平均値で示した。挿入図：３００μＬのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣ（１ｍｇ．ｍＬ^－１）を含む腸嚢。試験は、３匹の異なるマウスの３つの異なる腸部分に対して３回実行した。ｂ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／－インスリンの存在を示す（白矢印）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／－インスリン－ＦＩＴＣ処理の１８０分後の生体外腸管組織のＴＥＭ顕微鏡写真。

［図４６］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦが形態や大きさを変えることなく腸関門を無傷で通過できることを示す生体外透過試験の漿液のＴＥＭ画像（ａ、ｂ）。

［図４７］腸を通るＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの分布を示す（白矢印）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣ処理１８０分後の生体外腸組織のＴＥＭ画像。

［図４８］ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ/インスリンは、インビトロおよび生体内（インビボ）でのグルコースの取り込みを制御する。
ａ）いずれもインスリン投与量５０ＩＵ．ｋｇ^－１となるようにＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンと遊離型インスリン溶液を経口投与したＳＴＺ誘発糖尿病ラットの生体内（インビボ）血糖値（初期％）時間変化曲線。５ＩＵ．ｋｇ^－１のインスリンを皮下注射（Ｓ．Ｃ．）した群を陽性コントロールとし、２ｍｇ．ｋｇ^－１の空のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦを経口投与した群を陰性コントロールとした。糖尿病ラットと非糖尿病ラットの血糖値も示した。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは、糖尿病コントロールと比較して血糖降下作用において統計学的に有意な差を示した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。各値は平均値±Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝３）。

［図４９］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは生体内で毒性を示さなかった。インスリン投与量５０ＩＵ．ｋｇ^－１でＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンを経口投与した非糖尿病ラットおよびＳＴＺ誘発糖尿病ラットのａ）尿素、ｂ）クレアチニン値およびトランスアミナーゼ活性：c) アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）およびｄ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）活性。５ＩＵ．ｋｇ^－１のインスリンを皮下注射（Ｓ．Ｃ．）した群を陽性コントロールとし、２ｍｇ．ｋｇ^－１の空のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦを経口投与した群を陰性コントロールとした。糖尿病ラットのレベル（コントロール）も示した。（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。各値は平均値±Ｓ．Ｄ．を表す（ｎ＝３）。

［図５０］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンはインビトロおよび生体内（インビボ）でのグルコースの取り込みを制御する。未処理のＨｅｐＧ２（ＨｅｐＧ２）、未処理耐性ＨｅｐＧ２（Ｒ－ＨｅｐＧ２）、インスリン処理したＲ－ＨｅｐＧ２（インスリン）およびＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ/インスリンの処理後４時間と２４時間のグルコース消費能力。コントロール実験のＨｅｐＧ２細胞の値を１００％として定義した。各値は３回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．を表す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。

［図５１］［ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ］＝１ｍｇ．ｍＬ^－１までのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦまたはＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンで４８時間培養した後のＨｅｐ－Ｇ２細胞の生存率。エラーバーは３回の測定の標準偏差を表す。

［図５２］ａ）無処理（コントロール）、ｂ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ、c)およびd)ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ／インスリンを４時間投与したＴＥＭによって可視化されたＨｅｐ－Ｇ２細胞。矢印は、エンドサイトーシスによりナノ粒子が細胞内に取り込まれ、細胞質内を通過した後、核孔を経由して核内に侵入し、最終的に細胞の基底側で排泄される様子を示している。Ｅ＝エンドサイトーシス、Ｍ＝ミトコンドリア、Ｎ＝核。

［図５３］インスリン－ＦＩＴＣ（［インスリン－ＦＩＴＣ］＝１０μＭ）で4時間培養したＨｅｐ－Ｇ２細胞の共焦点画像。細胞は、ｉ）明視野（ＢＦ）、ｉｉ）ＦＩＴＣチャンネル（４８８ｎｍ）、ｉｉｉ）ＢＦとＦＩＴＣチャンネルの重ね合わせを用いて観察した。スケールバー＝２０μｍ。

［図５４］無添加（コントロール）、ａ）細胞膜マーカー、b)リソソームマーカー、c)アクチンマーカーおよびd)核マーカーで4時間培養したＨｅｐ－Ｇ２細胞の共焦点画像。ｉ）ＦＩＴＣチャンネル（λ_ｅｘ＝４８８ｎｍ）、ii)赤色チャンネル（λ_ｅｘ＝６４７ｎｍ）、ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）の重ね合わせ。スケールバー＝１０μｍ。

［図５５］ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣ（［インスリン－ＦＩＴＣ］＝１０μＭ）と、ａ）細胞膜マーカー、ｂ）リソソームマーカー、ｃ）アクチンマーカーおよびｄ）核マーカーで４時間培養したＨｅｐ－Ｇ２細胞の共焦点画像。ｉ）ＦＩＴＣチャンネル（λ_ｅｘ＝４８８ｎｍ）、ii)赤色チャンネル（λ_ｅｘ＝６４７ｎｍ）、ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）の重ね合わせ。スケールバー＝１０μｍ。

［図５６］無添加（コントロール）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ、インスリン－ＦＩＴＣ、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣ、（［インスリン－ＦＩＴＣ]＝１０μＭ］で4時間処理したＨｅｐ－Ｇ２細胞におけるインスリン－ＦＩＴＣ蛍光を定量化したフローサイトメトリーヒストグラム。各ヒストグラムは５０，０００細胞を表す。

［図５７］［ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ］＝１ｍｇ．ｍＬ^－１までのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦまたはＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンで４８時間培養した後のＲ－Ｈｅｐ－Ｇ２細胞の生存率。エラーバーは3回の測定の標準偏差を表す。

開示の詳細な説明

特許請求される発明を特定の実施形態／実施例の観点から説明するが、本明細書に規定される利点および特徴の全てを有さない実施形態／実施例を含む他の実施形態／実施例も、本開示の範囲内である。本開示の範囲から逸脱することなく、様々な構造的、論理的、およびプロセスステップの変更を行うことができる。

本開示で提供されるすべての範囲には、別段の指示がない限り、すべての範囲と、その範囲に含まれる小数第１０位までのすべての値が含まれる。

態様において、本開示は、イミン結合共有結合性有機フレームワーク（ｎＣＯＦ）ナノ粒子を提供する。ＣＯＦナノ粒子は、2，6-ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）と4，4'，4''-（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ）モノマーとの共縮合から形成され得る。例えば、ＣＯＦナノ粒子は、イミン結合した２，６－ジホルミルピリジニルモノマーおよび４，４‘，４’‘－（1，3，5-トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリニルモノマーの複数のＣＯＦナノシートから構成され得る。実施形態において、ＣＯＦナノ粒子は、１０～２５のＣＯＦナノシート（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のＣＯＦナノシート）からなる。様々な例において、ＣＯＦナノ粒子は約１８のＣＯＦナノシートを有する。

各ナノシートは、２，６－ジホルミルピリジニルモノマーと４，4‘，4’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル)トリアニリニルモノマーの共縮合から形成される。モノマーは以下の構造を有する（ＩＵＰＡＣ名で示す）：

そして、

ナノシートは以下の構造を有していてもよい：

様々な例において、少なくとも1つのＸ_１は－ＮＨ_２ではない。

層は、ずらして積み重ねることができる（図１ｃ参照）。ＣＯＦナノシートは、多結晶球状ナノ粒子が形成されるように凝集する。ＣＯＦネットワークは、以下のような構造を持つことがある：

層は、ａｂｃ配列で配置されたｈｃｂ（ハニカム）層であってもよい。ずらして配置することにより、積層軸に沿って六角形のチャネルが形成される場合がある（図１ｃ参照）。カーゴ分子は層間に貯蔵することができる。様々な例において、層は結晶性で多孔性である。

ＣＯＦナノ粒子は、様々なサイズを有することができる。例えば、ＣＯＦナノ粒子は、０．１ｎｍ毎の値及びその間の範囲（例えば、７５～３００ｎｍ）を含む１０～３００ｎｍの最長直線寸法（例えば、直径）を有する。様々な例において、ＣＯＦナノ粒子は、１００～１５０ｎｍの最長直線寸法（例えば、直径）を有する。他の様々な例では、ＣＯＦナノ粒子は、約１２０ｎｍの最長直線寸法（例えば、直径）を有する。

ＣＯＦナノ粒子は、タンパク質などのカーゴ分子を送達するためのキャリアとして使用することができる。

実施形態において、本発明のナノ粒子はインスリンの送達に使用することができる。例えば、インスリンを充填したＣＯＦナノ粒子は、インスリン経口投与の障壁を克服するためのグルコース応答性の経口インスリンデリバリーに使用することができる。胃耐性ｎＣＯＦは、ナノシート間にインスリンを充填した層状ナノシートから調製された。インスリンを充填したｎＣＯＦは、消化液中でのインスリンを保護し、グルコース応答性の放出を示した。

このデリバリー法のユニークな特徴は、望ましいインスリン充填能力（～６５ｗｔ％）、生体適合性、過酷な条件下でのインスリン保護、高血糖誘発性薬物放出である。インスリンを充填したＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦは腸関門を通過し、糖尿病ラット（Ｔ１Ｄ）の生体内血糖値を持続的に低下させ、非糖尿病ラットのコントロール群と比較して、全身毒性を引き起こすことなく、正常な血糖値に完全に戻した。ＣＯＦナノ粒子は、リポソームやエマルションのような他のナノサイズのコロイドキャリアと比較して、より優れた貯蔵性と生理的安定性を提供し、特にナノスケールのイミン結合共有結合性有機フレームワーク（ｎＣＯＦ）は、薬物送達のための新たなナノメディシン候補として大きな可能性を示している。ｎＣＯＦはまた、有機ビルディングブロックが２次元または３次元で空間的に制御された長距離秩序構造を特徴とし、大きな薬物やタンパク質/酵素の装填と制御放出を容易にする直径を持つ規則的な細孔につながる。さらに、分子構造や機能設計の柔軟性が高いため、汎用性が高く、環境に対するユニークな応答性を持つ。

これらのｎＣＯＦは、インスリン抵抗性細胞にインスリン分子を輸送し、グルコースのアップレギュレーションとインスリン抵抗性症状の消失における２型糖尿病治療の可能性を示した。これは、ｎＣＯＦをベースとしたインスリン経口デリバリーシステムが、従来の皮下注射に取って代わり、インスリン治療を容易にするという強力な証拠である。

ＦＤＡに承認された２つの技術と比較すると、本明細書に記載されたシステムは、生体適合性があり、胃の中で非常に安定で、費用対効果が高く、特異的で、グルコース応答性であるため、インスリン経口投与の将来における一歩前進であり、ｎＣＯＦベースのインスリン経口投与による１型および２型糖尿病の治療の道筋を示すものである。

ＣＯＦナノ粒子は、様々なタイプのカーゴ分子を組み込むことができる。例えば、ＣＯＦナノ粒子はタンパク質を組み込む。様々な例において、タンパク質はインスリンである。インスリン分子はＣＯＦ層間に取り込まれることがある（図1（ｄ）および1（ｇ）参照）。例えば、組み込まれたインスリンの濃度は、ナノ粒子の重量に対して、０．１ｗｔ％ごとの値とその間の範囲を含めて、１０～７５ｗｔ％である。組み込まれたインスリンの重量パーセントは、ナノ粒子に対するインスリンの比率を反映してもよい。様々な例において、組み込まれたインスリンの濃度は３０～７５ｗｔ％である。他の様々な例では、組み込まれたインスリンの濃度は約６５ｗｔ％である。

ＣＯＦナノ粒子は、外部トリガーに曝露されると、そのカーゴを放出する。ＣＯＦナノ粒子は、タンパク質カーゴのゆっくりした、自然な放出を示す可能性があるが、外部トリガーにさらされると、タンパク質カーゴの放出を増加させることができる。例えば、ＣＯＦナノ粒子は、グルコースへの曝露により、取り込まれたインスリンをより速い速度で放出する。

ＣＯＦナノ粒子は、1つ以上の望ましい特徴を有していてもよい。例えば、ナノ粒子は、望ましい取り込み能力を有し、酸性環境（例えば、胃の環境）において損傷を受けず、グルコース応答性放出を有する。

一つの態様において、本開示はＣＯＦナノ粒子の製造方法を提供する。また、1つ以上のカーゴ分子を含むＣＯＦナノ粒子の方法も提供する。

一例において、本開示の共有結合性有機フレームワークのナノ粒子を製造する方法は、２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）および４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン-２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ）を溶媒および酸中で接触させて反応混合物を形成することを含み、反応混合物は室温に保持される。反応混合物は室温で１～３０分間（例えば１０分間）保持される。ＤＦＰとＴＴＡは共縮合し、イミン結合ＣＯＦネットワークを形成する。ＣＯＦ層は積み重なり、多結晶、球状、多孔性のナノ粒子を形成する。様々な有機溶媒、例えば１，４－ジオキサンを使用することができる。また、例えば酢酸など、様々な酸を使用することができる。

本開示の方法は、ＣＯＦナノ粒子を含む反応混合物を精製することをさらに含む。例えば、精製は、反応混合物を水中で透析することからなる。透析は、様々な長さの時間行うことができる。

ＤＦＰとＴＴＡの様々な比率が適用できる。例えば、ＤＦＰとＴＴＡのモル比は５：１である。

方法はさらに、ＣＯＦナノ粒子に１つ以上のカーゴ分子を充填させることを含んでもよい。カーゴ分子の例は本明細書で提供される。カーゴ分子は、カーゴタンパク質であってもよい。例えば、カーゴ分子はインスリンである。充填は、含浸法によって達成され得る。例えば、充填は、ＣＯＦナノ粒子とインスリンの反応混合物を形成することからなる。反応混合物は、例えばＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で緩衝化してもよい。反応混合物は、室温で一定時間（例えば、２４時間）撹拌させてもよい。ＣＯＦナノ粒子とインスリンの重量比は、０．１ごとの比の値およびその間の範囲を含めて、１：２～２：１とすることができる。充填は、１つ以上の追加の精製工程をさらに含んでよい。精製は、遠心分離および水による洗浄を含んでよい。

一つの態様において、本開示は組成物を提供する。組成物は、カーゴ分子（例えば、インスリン）を組み込んだＣＯＦナノ粒子を含んでいてもよい。

組成物は、薬学的に許容されるキャリア（例えば、キャリア）中にインスリンを組み込んだＣＯＦナノ粒子を含むことができる。キャリアは、ヒトを含む個体への投与に適した水性キャリアであり得る。キャリアは無菌であり得る。キャリアは、生理学的緩衝液であり得る。適切なキャリアの例としては、スクロース、デキストロース、生理食塩水、および／またはヒスチジン、クエン酸塩、リン酸塩などのｐＨ緩衝化要素（例えば、ｐＨ５～９、ｐＨ６～８、（例えば、６．５）のｐＨに緩衝化する緩衝化要素）が挙げられる。さらに、薬学的に受容可能なキャリアは、投与される特定の組成物によって部分的に決定され得る。従って、本開示の薬学的組成物の広範な種々の適切な製剤が存在する。キャリアの追加の非限定的な例としては、使用前に溶媒に溶解または懸濁される溶液、懸濁液、およびエマルションなどが挙げられる。組成物は、１つ以上の希釈剤を含んでもよい。希釈剤の例としては、蒸留水、生理的食塩水、植物油、アルコール、ジメチルスルホキシドなど、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、安定剤、可溶化剤、懸濁化剤、乳化剤、鎮静剤、緩衝剤、保存剤など、およびそれらの組み合わせを含むことができる。組成物は、滅菌され得るか、または滅菌手順によって調製され得る。本開示の組成物はまた、例えば、凍結乾燥によって無菌固体製剤に製剤化されてもよく、滅菌後、または使用直前に無菌注射用水もしくは他の無菌希釈剤（複数可）に溶解して使用されてもよい。薬学的に許容されるキャリアのさらなる例としては、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースを含むセルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；例えばココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの油；例えばプロピレングリコールなどのグリコール類；例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール類；例えばオレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；および医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容されるキャリアの追加の非限定的な例は、以下に記載されている：Remington：The Science and Practice of Pharmacy (2012) 22nd Edition, Philadelphia, PA.Lippincott Williams & Wilkins。例えば、組成物は、インスリンを組み込んだ複数のＣＯＦナノ粒子と、ヒトを含む個体への投与に無菌の適切なキャリア、例えば、スクロース、デキストロース、生理食塩水、ｐＨ緩衝化（例えば、ｐＨ５から９、ｐＨ７から８、ｐＨ７．２から７．６、（例えば、７．４））要素、例えば、ヒスチジン、クエン酸塩、またはリン酸塩のような生理学的緩衝剤とからなる。様々な例において、組成物は注射に適していてもよい。非経口投与は、例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下投与などの注入および注射を含む。

一つの態様において、本開示は、糖尿病を有するかまたは有する疑いのある個体を治療する方法を提供する。糖尿病は、１型または２型であり得る。様々な例において、個体は１型糖尿病を有する。

糖尿病を有する、または糖尿病が疑われる個体を治療する方法は、インスリンを組み込んだＣＯＦナノ粒子を個体に経口投与することを含んでよい。インスリンを組み込んだＣＯＦナノ粒子は、薬学的に許容されるキャリアを含む組成物として投与することができる。経口投与後、個体のグルコースレベルは正常化される。正常化されたグルコースレベルは、糖尿病でない個人の正常空腹時血糖値として当技術分野で知られている。例えば、正常空腹時血糖値の期待値は７０ｍｇ／ｄＬから１００ｍｇ／ｄＬの範囲である。

経口投与の場合、インスリンを組み込んだＣＯＦナノ粒子を含む組成物の様々な製剤を使用することができる。製剤の例示としては、ゲル、錠剤、溶液などが挙げられるが、これらに限定されない。

様々な例において、本方法は、例えば注射などの非経口経路を介して組成物またはＣＯＦナノ粒子を投与することからなる。

一つの態様において、本開示はキットを提供する。キットは、インスリンが組み込まれたＣＯＦナノ粒子を含む医薬製剤と印刷物とを含むことができる。

様々な例において、キットは、医薬製剤を含む閉鎖または密封されたパッケージからなる。様々な例において、パッケージは、1つ以上の閉鎖または密封されたバイアル、ボトル、ブリスター（気泡）パック、または本開示の化合物および化合物を含む組成物の販売、もしくは流通、もしくは使用のための任意の他の適切なパッケージからなる。印刷物は、印刷情報を含み得る。印刷情報は、ラベル上、または紙挿入物上に提供されてもよく、または包装材料自体に印刷されてもよい。印刷された情報は、パッケージ内の化合物、他の活性成分および／または不活性成分の量および種類、ならびに所与の期間にわたって服用する服用回数などの組成物の服用に関する指示、および／または薬剤師および／または医師などの他の医療提供者、または患者に向けられた情報を含み得る。印刷物は、医薬組成物および／またはそれとともに提供される他の薬剤が、1型糖尿病または2型糖尿病を有する被験体の治療のためのものであるという表示を含むことができる。様々な例において、製品は、容器の内容物を記載し、１型糖尿病または２型糖尿病を有する対象を治療するための容器の内容物の使用に関する表示および／または指示を提供するラベルを含む。キットは、単回用量または複数回用量を含むことができる。

以下の記述は、本開示の例を示すものである。
ステートメント１．共有結合性有機フレームワーク（ＣＯＦ）ナノ粒子であって、１０～２５のＣＯＦナノシートを含み、ＣＯＦナノシートがずれた配置で積層され、各ＣＯＦナノシートが２，6－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）と４，4‘，4’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ）との共縮合物であり、ＣＯＦナノ粒子が７５～３００ｎｍの最長直線寸法を有する、共有結合性有機フレームワーク（ＣＯＦ）ナノ粒子。
ステートメント２．ＤＦＰとＴＴＡの縮合時のモル比が５：１（ＤＦＰ：ＴＴＡ）である、ステートメント１に記載のＣＯＦナノ粒子。
ステートメント３．ＣＯＦナノ粒子が約１２０ｎｍの最長直線寸法を有する、ステートメント１または２に記載のＣＯＦナノ粒子。
ステートメント４．ＣＯＦナノ粒子が１６～２０のＣＯＦナノシートを有する、先行するいずれか１つのステートメントに記載のＣＯＦナノ粒子。
ステートメント５．ＣＯＦナノ粒子が１８のＣＯＦナノシートを有する、先行するいずれか１つのステートメントに記載のＣＯＦナノ粒子。
ステートメント６．ＣＯＦナノ粒子が複数のカーゴタンパク質を組み込んでいる、先行するいずれか１つのステートメントに記載のＣＯＦナノ粒子。
ステートメント７．カーゴタンパク質がインスリンである、ステートメント６に記載のＣＯＦナノ粒子。
ステートメント８．先行するのいずれか１つのステートメントに記載の複数のＣＯＦナノ粒子と、薬学的に許容されるキャリアとを含む組成物。
ステートメント９．組成物が経口摂取に適している、ステートメント８に記載の組成物。
ステートメント１０．共有結合性有機フレームワーク（ＣＯＦ）ナノ粒子の製造方法であって、２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）、４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ）および酸を溶媒中で接触させて反応混合物を形成し、反応混合物を室温に保持し、一定時間（例えば、１０分）後に、共有結合性有機フレームワークナノ粒子を形成することを含む方法。
ステートメント１１．反応混合物を精製することをさらに含み、精製が反応混合物を水中で透析することを含む、ステートメント１０に記載の方法。
ステートメント１２．ＣＯＦナノ粒子が１以上のカーゴタンパク質をさらに含む、ステートメント１０またはステートメント１１による方法。
ステートメント１３．１以上のカーゴタンパク質がインスリンである、ステートメント１２に記載の方法。
ステートメント１４．１以上のカーゴタンパク質が含浸法によって充填される、ステートメント１２またはステートメント１３に記載の方法。
ステートメント１５．含浸法が、ＣＯＦナノ粒子およびインスリンを含む反応混合物を室温で形成することを含み、ＣＯＦナノ粒子に１つ以上のインスリン分子が含浸される、ことを含む、ステートメント１４による方法。
ステートメント１６．反応混合物が緩衝化された水性混合物である、ステートメント１５による方法。
ステートメント１７．反応混合物をＨＥＰＥＳでｐＨ６～８（例えば、７．４）に緩衝化する、ステートメント１６に記載の方法。
ステートメント１８．含浸されたＣＯＦナノ粒子を精製することをさらに含む、ステートメント１５～１７のいずれか1つに記載の方法。
ステートメント１９．精製が、遠心分離および水による洗浄を含む、ステートメント１８に記載の方法。
ステートメント２０．ＣＯＦナノ粒子が７５～３００ｎｍ（例えば、１２０ｎｍ）の最長直線寸法を有する、ステートメント１０～１９のいずれか1つに記載の方法。
ステートメント２１．ＣＯＦナノ粒子が１０～２５のＣＯＦ層（例えば、１８のＣＯＦ層）を有する、請求項１０～２０のいずれか一つに記載の方法。
ステートメント２２．ＤＦＰとＴＴＡのモル比が５：１である、ステートメント１０～２１のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント２３．溶媒が1，4-ジオキサンである、ステートメント１０～２２のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント２４．酸が酢酸である、ステートメント１０～２３のいずれか１つに記載の方法。
ステートメント２５．ＣＯＦナノ粒子とインスリンの重量比が１：２～２：１である、ステートメント１４～２４のいずれか１つ記載の方法。
ステートメント２６．糖尿病を有するかまたは糖尿病を有する疑いのある個体を治療するための方法であって、ステートメント８または９の組成物を経口投与することを含み、ここで該固体のグルコースレベルが正常化される、方法。
ステートメント２７．個体が１型糖尿病または２型糖尿病に罹患している、ステートメント２６に記載の方法。
ステートメント２８．個体が１型糖尿病に罹患している、ステートメント２７に記載の方法。
ステートメント２９．ステートメント１～７のいずれか1つに記載のＣＯＦナノ粒子、またはステートメント８もしくはステートメント９に記載の組成物を調製するための組成物または成分を含むキット。

以下の実施例は、本開示を説明するために提示されたものである。これらはいかなる事項においても限定することを意図していない。

本実施例では、ＣＯＦナノ粒子およびインスリンを組み込んだＣＯＦナノ粒子、ならびにその製造および使用方法について説明する。

２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）と４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン-２，４，６－トリイル)トリアニリン（ＴＴＡ）の共縮合物から得られたイミンベースのｎＣＯＦ（ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ）は、シード成長法を用いて高結晶性ナノ粒子として調製され、インスリン経口デリバリーシステムとして使用することに成功した。トリアジンベースのＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦの選択は、主に酸性環境を含む過酷な条件下での高い安定性に基づくものであった。このデリバリー法のユニークな特徴は、高いインスリン充填能（～６５ｗｔ％）、生体適合性、過酷な条件下でのインスリン保護、高血糖誘発性薬物放出である。インスリンを充填したＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦは腸関門を通過し、糖尿病ラット（Ｔ１Ｄ）の生体内血糖値を持続的に低下させ、非糖尿病ラットのコントロール群と比較して、全身毒性を引き起こすことなく正常な血糖値に完全に戻した。ＦＤＡが承認した２つの技術と比較すると、このシステムは生体適合性があり、胃の中で非常に安定で、費用対効果が高く、特異的でグルコース応答性であるため、インスリン経口投与の将来における一歩前進であり、ｎＣＯＦベースのインスリン経口投与による１型および２型糖尿病の治療への新たな道筋を示すものである。

結果と考察

ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦは、ＤＦＰ（２１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、５当量)とＴＴＡ（１２ｍｇ、０．０３ ｍｍｏｌ、１当量）を、無水１，４-ジオキサン（３ｍＬ）中、酢酸（０．５ｍＬ、１３Ｍ、［酢酸］_最終=４．０Ｍ）存在下、室温で１０分間共縮合することにより合成された（図１ａ）。Ｈ_２Ｏ中で透析して溶液を洗浄し、安定なナノ粒子懸濁液を得た。室温で１０分間放置すると、平均直径１２３．７ｎｍのイミン結合共有結合有機ナノ粒子（図１ｂ及び図５）が、非晶質のポリイミン沈殿を形成することなく、透明な溶液から出現した。高濃度の酢酸（［酢酸］_最終=４．０Ｍ）を用いると、室温で急速なイミン縮合反応が起こり、離散したｎＣＯＦ結晶性ナノシートが形成される（図５～６）。モノマー消費速度の増大は、結晶性ナノシートの過飽和と、より大きな構造への結晶子成長の阻害を引き起こす。その後、ナノシートは互いに積み重なって凝集し、粗い表面と小さな突起を持つ球形の多結晶ナノ粒子を形成する（図６）。この後者の現象は、ナノシート間の水素結合を促進するＨ_２Ｏ共溶媒のわずかな存在によるものである。Ｈ_２Ｏ（［酢酸］_最終=５．０Ｍ）非存在下の純粋な酢酸を用いて合成を行った場合、ナノ粒子の形成を観察することなく、積層が限定された小さな結晶性ナノシートが得られた（図７）。

ドロップキャスト溶液（図１３）から、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）下では、ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦは高さ７ｎｍの均一な粒子として現れ、～１８のｎＣＯＦ層の積層に相当する。溶液中では、動的光散乱（ＤＬＳ）分析から、平均流体力学的半径６８ｎｍ、多分散度（ＰＤＩ）０．１の粒子として現れ、経時的な沈殿は観察されなかった。凍結乾燥プロセスを用いて一旦固体として単離すると、ナノ粒子は、Ｈ_２Ｏに再分散させることができ、溶液中で少なくとも１２ヶ月間安定であり、その間そのサイズ分布は変化しなかった（図１４）。合成された材料の結晶性の粉末X線回折（ＰＸＲＤ）では、規則正しく並んだ格子の（１１０）面に割り当てられた２θ=４．９度の強いピークと、（００３）面からの反射に対応する２θ=２５．６度を中心とするブロードなピークが観測された（図１ｃ及び１５）。ｎＣＯＦ粉末で一般的に観察される非晶質イミンポリマーの形成が観察されないことから、シードを介した結晶化によって結晶化度の増加が説明できる。Ｎ_２の収着は、ｎＣＯＦの永久的な多孔性を示している。等温線の形状はタイプＩとＩＩの特徴を兼ね備えており、ブルナウアー・エメッ ト・テラー（ＢＥＴ）表面積は３８４．５ｍ²ｇ^－1である（図１６）。等温線は他に報告のナノシートベース材料と同様に、Ｈ３型のヒステリシスを示し、これは板状粒子が凝集してスリット状の細孔を形成していることを示している。

ｎＣＯＦのＦＴＩＲ分析では、１６１７ｃｍ^－１に特徴的なイミン伸縮、トリアジンのＣ－Ｃ＝Ｎとピリジン伸縮に起因する１５８２ｃｍ^－１のピーク、トリアジンコアのＣ－Ｎに対応する１３６５ｃｍ^－1のブロードで強いピーク、およびＣ=Ｃ芳香族結合に対応する１５０７ｃｍ^－１の強い振動ピークが見られると共に、ＴＴＡ第一級アミンのＮ－Ｈ伸縮（約３３２０ｃｍ^－1）とＤＦＰアルデヒド伸縮（１７１１ｃｍ^－１）が消失した（図１７）。胃の環境（ｐＨ２．０）および血流（ｐＨ７．４）をシミュレートする条件下でのＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦの化学的安定性を評価した。ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦは、ＴＥＭイメージング（図５－８）、ＰＸＲＤおよびＢＥＴ（図２０）を通して実証されたように、どちらの条件でも影響を受けなかった。これらの望ましい特徴から、ＣＯＦナノ粒子はインスリン経口投与に使用された。これらのバルク特性を総合すると、ナノサイズのＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦナノ粒子は高品質のイミン結合ｎＣＯＦであることが示された。

ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦのインスリン充填は、まずＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ（５ｍｇ）をインスリン溶液（２．５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中に５ｍｇ）に浸すことで実現し、^１Ｈ ＮＭＲを用いて２４時間にわたってモニターした（図２１）。インスリンのシグナルは、ナノ粒子を添加すると徐々に消失し、ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ内にカプセル化されたため、２４時間後には完全に消失した。

色素（ＦＩＴＣ）標識インスリン(インスリン－ＦＩＴＣ)の使用は、取り込まれたインスリン量の定量を容易にする。インスリン－ＦＩＴＣの取り込みを上清液の蛍光分光法を使用して測定し、充填されていないインスリン－ＦＩＴＣの濃度を定量したところ、ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦは６４．６±１．７ｗｔ％（図２３）のインスリン-ＦＩＴＣ充填能を示し、以前に報告されたインスリン封入が報告されている多孔質材料と同程度であった（表４）。ＮＰｓ内部のインスリン-ＦＩＴＣの存在を視覚的に示すために、共焦点顕微鏡による調査を行った。ＦＩＴＣ－インスリンを充填したＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの蛍光性（λ=４８８ｎｍ、図１ｆ及び２４）により、ナノ材料中にＦＩＴＣ－インスリンが存在することが確認された。

インスリンを充填すると、ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ/インスリンのＰＸＲＤパターンは素のＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦと比較してほぼ平坦になった（図１５、表１）。
ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦは、より少ない量のインスリンを充填した（充填率３０％）。ＰＸＲＤパターンは、２θ=４．９度と２５．６℃のピークの存在を示しているが、それらの強度は素のｎＣＯＦと比較して著しく減少している。インスリンを充填すると、ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ層の周期性がインスリン分子を受け入れるために影響を受け、結晶性が失われることが予想される。

表1.インスリン充填前後のＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦの物理化学的特性。

ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ/インスリンの均一性は、ＡＦＭ分析から明らかであり、インスリンをカプセル化すると、素のｎＣＯＦと比較して１２ｎｍに増加した（図１３、表１）。ＡＦＭ画像はまた、ＴＥＭで裏付けられたように、インスリン充填によりナノ粒子幅の増加を示している（図１ｅ及び９－１１、表１）。これは、インスリン分子を収容するためにナノシートが滑ったことを示唆しており、ＰＸＲＤによって示された結晶性の損失によって裏付けられた事実である。インスリンを充填していないナノ粒子と充填したナノ粒子の流体力学的半径は、溶媒和粒子径の増大と、狭い単分散から中程度の多分散への多分散性の増大を示し、インスリン封入におけるわずかな分布を示した（表１、図２５）。ζ-電位測定では、インスリン充填前後のｎＣＯＦに統計的に有意な差は見られなかったが、両者ともインスリン単体とは著しく異なっており、インスリンがナノ粒子の表面ではなく内部にカプセル化されていることを強く裏付けている（表１、図２６）。インスリン充填後、Ｎ_２吸着（図１６）は、メソポーラス材料に典型的なＩＶ型等温線を示し、低圧のＨ４型ヒステリシスを伴っている。これは、非剛性多孔質構造の膨潤を示すか、超微細孔におけるＮ_２の拡散が遅いため測定中に平衡化が十分に達成されないか、有意な微小孔が存在するがそのアクセスが遮断されていることを示している。

ｎＣＯＦ層の積層によって形成された微細孔チャネルを介した封入または拡散に対して、ナノシート間にインスリンが装填されていることを示すさらなる証拠は、微細孔チャネルの直径（１．７ｎｍ、図１６）と比較したタンパク質分子のサイズ（２．５－３ｎｍ）から導き出される。インスリン分子は、ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ粒子のサイズが小さいために、複数の層の間に割り込んでいるとされていると考えられる。ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ層間のインスリン分子の吸着のシミュレーションは、模擬アニーリングプロセスに従って行われ、1つのインスリンモノマーが2組のＡＢＣ積層層の間に含まれた（図１ｇ）。実験的に達成された最大充填量に匹敵する～７０ｗｔ％に相当する充填量が計算された（計算の詳細は後述）。インスリン分子を収容するため、シミュレーションの過程で、各層のセットは積層方向に沿って２．５ｎm離れた。その結果、図１ｇに示される最小エネルギーのコンフォメーションは、インスリン分子がどのように収容され、ｎＣＯＦ層原子と相互作用するかを示しており、これはインスリン末端ペプチドの一部が尖っている孔の存在によっても有利になっている。ＴＥＭ分散型X線分光法（ＴＥＭ-ＥＤＸ）は、印スリンがＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ全体に均一に分布していることを示している（図１２）。

ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦとインスリンの相互作用を調べるために、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）とX線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いた。インスリンのＦＴ－ＩＲスペクトルは、タンパク質に特徴的なピークを示した：ｉ）ＣＨ_２伸縮結合に対応する２８００－３０００ｃｍ^－１、ｉｉ）アミドＩに対応する１６４５ｃｍ^－1，ｉｉｉ）主にＣ＝Ｏ伸縮振動に起因するアミドＩＩに対応する１５３５ｃｍ^－1（図１８－１９）。インスリンがＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦに封入された後、ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ/インスリンのスペクトルにおいて、２８００－３０００ｃｍ^－１と１６５７ｃｍ^－１に、それぞれインスリンのＣＨ_２伸縮結合とＣ＝ＯアミドIに対応する新しいピークが有意なシフトを伴って観察された（図１８－１９）。１５３５ｃｍ^－１のピークはＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦのＣ=Ｃ芳香族結合と重なっている。さらに、ＣＯＦの１６１７ｃｍ^－１におけるイミン結合の消失も観察された。これらの観察は、インスリンのアミドIのC=O基とCOFのイミン結合との間の弱いインスリン－ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ相互作用に関連している可能性がある。

さらに、ｎＣＯＦとタンパク質の間に起こる相互作用を理解するために、ＸＰＳ分析を行った。ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ/インスリンのＸＰＳサーベイ・スペクトルは、ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦのサーベイ・スペクトルと比較して、酸素の純増（約１０倍）の横に硫黄が存在することから、ナノ粒子内にインスリンが存在することが明確に証明された（図２７－２９）。実際、硫黄はシステインアミノ酸に起因してインスリンに存在し、ｎＣＯＦには存在しない（図２８）。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンのＣ１ｓ高分解能ＸＰＳスペクトル（図２９）は、２８３．４、２８５．１、２８６．３、２８８．２ｅＶの4つのピークからなり、それぞれC=Ｃｓｐ２、Ｃ－Ｃｓｐ３、Ｃ-Ｏ/Ｃ-Ｎ結合、カルボキシル基またはアミド基の炭素に起因する。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンのデコンボリューションされたピークＣ１ｓでは、ｎＣＯＦのＣ１ｓと比較して、Ｃｓｐ３の割合が有意に増加していることが観察された（図２７－３０）。この増加は、インスリンの構造に存在するアミノ酸の側鎖に存在するＣｓｐ３の寄与によるものと考えられる。図２９はＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦのＯ1ｓＸＰＳサーベイスペクトルを示しており、ピークは５３１．４ｅＶ、５３２．３ｅＶ、５３３．５ｅＶを中心とする3つの成分からなり、それぞれカルボキシレート基、アミド基、アルコール基の酸素に起因している。ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦにインスリンを充填させると、カルボキシレートに帰属する酸素の割合の重要な減少（約１２％）が観察された（図２８ｃ）。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦのＮ1ｓスペクトル（図２７ｄ）をデコンボリューションすると、（ｉ）イミン窒素に対応する３９９．０ｅＶ、（ｉｉ）ピリジン窒素に関連する３９９．９ｅＶ、（ｉｉｉ）4級窒素に帰属する４００．７ｅＶに3つの異なるピークの存在が示された。一方、混合物ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンのＮ1ｓスペクトルは、インスリンに存在するアミノ基とアミド基からの窒素の寄与を示す（図２７ｄ）。さらに、ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦと比較して、混合物のＮ1ｓピークにおける第4級アミンの割合の減少（約８％）が観察された。両者を合わせると、インスリンに存在するカルボキシレートに割り当てられた酸素の割合の減少とＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦに存在する4級アミンの割合の減少は、インスリンのカルボキシレートとＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦの4級アミノ基の間で相互作用が起こっていることを強く示している。

インビトロにおけるＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣの有効性は、模擬胃液および腸液（ＳＧＦ、ｐＨ２．０；ＳＩＦ、ｐＨ７．４）に対して試験された。インスリン-ＦＩＴＣ放出の定量は蛍光分光法を用いて行われ、２４時間の培養後、ＳＧＦ（＜５％）とSIF（＜１５％）の両方において、インスリン放出は取るに足らないことが示された（図２ａ）。酸性条件下でナノ粒子内に出現した後のインスリンの円二色性（ＣＤ）構造は影響を受けず、ネイティブなインスリンと同じパターンを示した（図３２）。さらに、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの安定性を確認するために、ｐＨ７．４、２．０、リゾチーム（涙、唾液、粘液などの分泌物に多く含まれる酵素）存在下で24時間にわたるＤＬＳ試験を行い、その後ＴＥＭ像を観察した（図３４）。ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ/インスリンのサイズと形態は、胃を模倣した様々な条件下で変化しない。ｎＣＯＦナノ粒子のナノシート間にインスリンを閉じ込めることで、インスリンの展開や分解が防止され、経口投与に必要な保護が得られる。

ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ／インスリン-ＦＩＴＣの高血糖をトリガーとした薬物放出に対するインビトロでの反応能力を、様々なグルコース濃度に対して調べた。コントロール、正常、糖尿病に対してＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）中、［グルコース］=０，１，３，５ｍｇｍＬ^－１。コントロールの条件下では、２４時間の培養期間中に放出されたインスリンはわずか１２％であり、正常血糖では２８％に上昇し、インスリンのゆっくりとした自然な放出を示した。しかし重要なことに、糖尿病患者（３ｍｇｍＬ^－1）が示す高血糖条件下では、７．５時間の培養でほぼ１００％のインスリンが放出された（図２ａ）。

グルコースレベルは空腹と飽和の間で自然に変動するため、インスリン放出のオン・オフ調節は１時間ごとに正常状態と高血糖状態の間でモニターされ、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣのインスリン放出プロファイルはパルスパターンを示した（図２ｂ）。

インスリン放出がグルコースによって特異的に引き起こされることを確認するために、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣを、ヒト血清、１１種類のアミノ酸の混合物、フルクトース（３ｍｇｍＬ^－１）またはスクロース（３ｍｇｍＬ^－１；図３０－３１）の生理食塩液のいずれかで、３７℃で２４時間培養した。試験した全ての条件において、２４時間まで観察されたインスリン放出は無視でき、インスリン－ＦＩＴＣの最大放出量は、ヒト血清で１５％、アミノ酸で３％、フルクトースで２２％、スクロースで１３％であった。しかし、フルクトースまたはスクロースで培養した後、グルコース濃度を調整して高血糖を模倣すると（３ｍｇｍＬ^－１）、インスリンのバースト放出が観察され、このｎＣＯＦシステムの特異的グルコース応答性が確認された。

インスリンのサイズ（ｄ＝２．５－３．０ｎｍ）に比べ、グルコースはｎＣＯＦの細孔（１．７ｎｍ）内に収まる小さな分子（ｄ＝０．８ｎｍ）である。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦは、多数のヒドロキシル基と骨格の窒素原子との間の水素結合により、最大１８ｗｔ％のグルコースを取り込むことができる（２４時間、５ｍｇ．ｍＬ^－１）（図３５－３８）。高血糖条件下では、グルコースはｎＣＯＦの微細孔を通って強制的に拡散し、ナノシート間からインスリンを置換する。２４時間の高血糖相互作用の後、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦはほとんど空であることがわかった（充填効率６ｗｔ％）。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／グルコースは－２５．８ｍＶの電荷を示す。これはグルコースの水酸基が表面および骨格内に多く存在するためである（図３６）。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンに続いてグルコースを培養すると、－１９．６ｍＶの電荷を示した。これはインスリン置換のグルコース濃度依存性を強く示している。グルコースの大きさは、インスリンには小さすぎるｎＣＯＦ細孔を優先的に満たすことを意味する。しかし、一旦これらの細孔が正常血糖値濃度で満たされてグルコース濃度が増加すると、グルコース分子がナノシート間に浸透し始め、それによってインスリンが置換され、ナノ粒子から押し出される。しかし、ｎＣＯＦの微細孔へのグルコース吸収の程度は、インスリン経口投与の障害にはならない。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦは、患者には起こりそうにない非現実的な高血糖状態の最大１８ｗｔ％のグルコースを取り込むことができる。従って、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは、生体内または患者において、グルコースレベルを急速に低下させて低血糖状態に導くことはないと考えられる。高血糖状態でのインスリン放出後のＴＥＭ、ＰＸＲＤおよびＢＥＴは、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンと比較して、サイズの減少、より良好な結晶化度およびＢＥＴ表面の増加を示した（図３８－３９）。ｎＣＯＦナノ粒子からの放出後のインスリンの二次構造の保持を円偏光二色性を用いて評価したところ、オリジナルのインスリンと同様であった（図３３）。したがって、ｎＣＯＦカプセル化インスリンは、輸送と放出の間、その構造と特性の両方を維持し、このシステムはグルコース・トリガー放出メカニズムを示すことから、糖尿病治療のための理想的な候補である。

生体適合性デリバリービヒクルとしてのＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦの可能性を示すために、１０種類の細胞株（肝臓、結腸、子宮頸部、卵巣、乳房、腎臓および脳、図４０）に対してインビトロ生存率試験を実施した。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦとＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンはともに、４８時間の培養後、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ濃度が１ｍｇｍＬ^－１までであれば細胞毒性作用を示さず、優れた生体適合性を示すことから、経口投与への応用が大いに期待される。

ＴＥＭを用いて、2つの結腸細胞株（ＲＫＯとＨＣＴ-116、培養時間４時間）の細胞構造に対するＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの効果とそれらの細胞小器官（オルガネラ）との相互作用を調べた。そして、この材料は腸関門を通過することを目的としているため、処理後４時間、２４時間、４８時間（５０μｇ.ｍＬ^－１；図４１－４３）の分析を行った。すべてのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン処理サンプルは、ＲＫＯおよびＨＣＴ－１１６細胞の規則的な超微細構造を示し、丸みを帯びた細胞形状、突起（微絨毛など）に富む細胞膜、よく発達した粗面小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリアが見られ、代謝活性の高い細胞が維持されていることが示された。かなりの量のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンが、処理された細胞の一部とその表面で視覚化される。膜の変形も観察され、エンドサイトーシスによるＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの内在化が確認された。時間の経過とともに、どちらの細胞株でも、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは核周囲領域の細胞液胞内に見られるようになりましたが、膜上には見られなくなった。そして、細胞は増殖と分裂を続け、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは無毒で安全で、細胞形態、生存率、ミトコンドリアの健康状態に有害な影響を与えず、活性酸素種の産生にもつながらないことが確認された。

この材料は血流に浸透することを目的としているため、材料の生体適合性と、ヒト赤血球に対する非免疫毒性を測定するため溶血試験が実施された。溶血試験の結果（図４４）、サンプルの溶血率（ＨＲ）は２％未満であった。ＡＳＴＭ Ｆ ７５６－０８（材料の溶結性評価の標準的な方法）によると、溶血率が５％未満であれば、溶血性がないとみなされるため、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦとＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンはヒトの血液赤血球と生体適合性があり、免疫毒性がないという予備的な結果が得られた。ナノ粒子の電荷は溶血反応において重要なパラメータであり、負の表面電荷を持つナノ粒子は溶血しないことがこれらの結果を説明している。正に帯電した粒子は界面活性剤として作用し、赤血球膜の破壊をもたらすことが示唆された。

ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの腸関門通過能力は、生体外実験で評価された（図４５）。粒子サイズによって制御されたナノ粒子を介した治療用タンパク質の腸への取り込みは、タンパク質を胃液中での分解から保護しながら、小腸の上皮内膜を介したタンパク質の輸送能力を向上させることができることが報告された。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣの腸を通過する輸送は、非反転マウス小腸嚢モデルを用いて、ラットの摘出小腸の生体外技術を用いて見かけの透過性を測定することにより評価した。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの輸送は、非開腹マウス小腸嚢の粘膜側から漿膜側への輸送を測定し、蛍光測定により定量した。３時間後のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの透過性は１４．７６μｇ.ｃｍ^－２(初期投与量の６０．８％±１４．２に相当)と計算されたが、純粋なインスリンは８．０２μｇ．ｃｍ^－２と報告された。このことは、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦにインスリンを取り込むと、インスリンの透過性が約２倍増加することを示している。透過性のデータは腸壁への蓄積と相関している。これはおそらく、表面積の増大がインスリン－ＦＩＴＣの拡散速度の増大につながったためと考えられる。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣが腸を通過し、遊離のインスリン－ＦＩＴＣではないことを確認するため、漿膜側を採取し、ＴＥＭ画像を行った。図４６に示すように、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣはその形態とサイズを変えることなく漿膜側に存在していた。この蓄積は、ナノ粒子の潜在的な細胞内在化に起因すると考えられる。そこで、実験終了後、組織を通常の生理食塩水で洗浄し、腸壁へのＮＰ蓄積を腸組織のＴＥＭで調べた（図４７）。腸切片のＴＥＭ画像は、無傷の微絨毛と回腸粘膜の基礎構造を有する形態を示した。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは腸組織全体の杯細胞（ＧＣ）内に存在し、腸ＧＣの分泌を通じて腸管内腔に排泄された。以上のことから、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは、インスリンカーゴを運搬しながら腸関門を通過することができ、腸組織に明らかな病理学的変化を引き起こさないことが確認された。

グルコース応答性ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの生体内薬理効果を、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発1型糖尿病（Ｔ１Ｄ）モデルラットへの経口投与により評価した(図３ａ－ｄおよび４８)。様々な製剤の経口投与またはフリーフォームインスリン溶液の皮下注射後の糖尿病ラットの血糖値の経時的変化を測定した（図３ａ－ｄおよび４８）。インスリンを含まないＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦ（２ｍｇｋｇ^－１）またはフリーフォームインスリン溶液（５０ＩＵｋｇ^－１）の経口投与は、観察された最小限の血糖降下効果によって示されるように、経口薬理学的利用性をほとんど示さなかった。on的に、フリーフォームインスリン溶液（５ＩＵｋｇ^－１）を皮下注射すると、血糖値は１時間以内に著明に低下したが、その効果は持続せず、血糖値は急速にインスリンを含まないｎＣＯＦと同様の値に戻った。しかし、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（５０ＩＵｋｇ^－１）を経口投与すると、血糖値は２時間以内に非糖尿病ラットの血糖値まで有意に低下し、血糖降下作用は１０時間持続し、非糖尿病ラットコントロール群の正常な血糖値を再現した（図３ａ）。これらの結果は、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン処理ラットが最も高いレベルの血漿インスリンを示したインスリン血漿レベルと一致している。皮下インスリンラットは、インスリン注射後1時間でインスリン血漿レベルのピークを示したが、文献に記載されているように、インスリン血漿レベルは急速に減少した。恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）は、空腹時血漿インスリンとグルコース濃度から、インスリン感受性、インスリン抵抗性、β細胞機能を推定するのに用いられる方法である。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン投与ラットは皮下インスリン投与ラットよりもＨＯＭＡ－ＩＲ（インスリン抵抗性指数）が低く、ＨＯＭＡ－ＩＳ（インスリン感受性指数）が高かったことから、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン粒子は皮下インスリンよりも体内への吸収が良いことが示唆された（表２）。経口インスリンは腸管上皮で直接吸収され、門脈を通って肝臓に達し、グルコースホメオスタシスの維持を可能にする。一方、インスリンの非経口投与は、最初に末梢組織に送達されるため、インスリンの自然分泌を模倣することはない。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンのバイオアベイラビリティを計算すると、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン粒子は文献に記載されているインスリン充填粒子と比較して高いバイオアベイラビリティ（２４．１％）を示す。これは、上記で観察されたインスリンおよびグルコースの血漿レベルと一致している。

「表2」糖尿病ラットの皮下インスリンおよびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン投与後のインスリンおよびグルコース濃度の変化を用いた恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）によるβ細胞機能のインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ－ＩＲ）およびインスリン感受性（ＨＯＭＡ－ＩＳ）の測定。

経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）は、食後条件下でのグルコース摂取能力を評価し、内因性インスリンに対する感受性を評価するために用いられた。まず、動物にＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンを経口投与または皮下注射した。先に観察された血清インスリンのピークと一致した３時間後に、１ｍｌの水に溶解した２．５ｇ．ｋｇ^－１のグルコースを動物に投与し、２８０分間にわたって血糖値を評価した（図３ｃ－ｆ）。血糖値を皮下インスリンおよび糖尿病コントロールと比較した。皮下インスリンは、文献に記載されているように、グルコース経口投与後２時間は血漿中のグルコース濃度を著しく低下させる。１５０分以降、血糖値は上昇し始め、ほぼコントロール値に達する。皮下インスリン療法による低血糖エピソードの再発は、脳細胞の機能と完全性を損なうと報告されている。しかし、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの血糖降下作用は、経口インスリン投与により、末梢の高インスリン血症を持続させることなく、門脈に高濃度のインスリンを投与することができるため、神経障害や網膜症を予防することができ、最初は皮下インスリン投与よりも穏やかであった。１２０分以降、血糖値は低く保たれ、安定した。

糖尿病はしばしばラットの腎臓と腎機能の変化を伴う。したがって、これらの重要な機能に対するＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの影響を研究した。図３は、非糖尿病ラット、ＳＣインスリン投与ラットおよびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン投与ラットの臓器病理を検出するための肝臓および腎臓の病理組織学的研究を示している。ＳＣ－インスリン投与群では、糖尿病を誘発するＳＴＺ投与により、肝臓と腎臓に一般的に観察される損傷が観察された。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン処理ラットについては、これらの臓器のいずれにもダメージがないことがわかる。これは、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンが無毒性であることを示唆すると同時に、インスリンの経口投与がラットの糖尿病によって誘発される病理組織学的変化を抑制できることを証明した。

さらに、血液中の肝機能と腎機能の生化学的マーカーを調べることで、毒性作用の始まりを発見するための有益な情報が得られる。尿素とクレアチニンは腎機能の変化を観察するために一般的に使用されるバイオマーカーであり、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）とアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）は肝障害のバイオマーカーであり、文献は、糖尿病ラットにおけるこれら４つのパラメーターの上昇を報告している（図４８）。全体的に、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン処理ラットは、非糖尿病グループと尿素、クレアチニン、ＡＳＡＴおよびＡＬＡＴのレベルが同程度であり（図４９）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン粒子が非毒性であるだけでなく、糖尿病コントロールと比較して腎臓と肝臓の機能を高めることができることを示している。インスリンの経口投与は腎臓と肝臓の機能に有益であると示している。

結論

結論として、インスリン経口デリバリーシステムとしてのナノスケールのイミン結合共有結合性有機フレームワーク（ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ）が調製され、インビトロおよび生体内で試験された。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの結晶性と多孔性の性質により、インスリンの最高レベルの充填が達成され、インスリンは多孔性チャネル内ではなく、ｎＣＯＦナノシートの層間に存在することが示された。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦは、胃の環境を模倣した過酷な条件下で、カプセル化されたインスリンをインビトロで保護することが証明され、一方、インスリンの持続的な放出は、高血糖条件下で達成された。重要なことは、インスリンは、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンからの放出時に活性を維持したことである。ＳＴＺ誘発糖尿病ラットにＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンを経口投与したところ、空腹時血糖値は２～４時間で持続的に低下し、血糖降下効果は生体内で１０時間以上維持され、全身毒性を伴わずに高いインスリンバイオアベイラビリティを示した。このＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦをベースとしたインスリン経口デリバリーシステムは、従来の皮下注射に取って代わり、インスリン治療を必要とする人々の取り込みを促進する可能性が示された。

試薬と技術

すべての試薬と出発物質はSigma-Aldrichから購入し、さらに精製することなく使用した。前駆体である２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）は、公表されている手順に従って合成し、変更は加えなかった。脱イオン水はMillipore Gradient Milli-Q 浄水システムのものを使用した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はシリカゲル60 F254（E. Merck）で行った。プレートは紫外線下で検査した。カラムクロマトグラフィーはシリカゲル60F（Merck 9385, 0.040-0.063 mm）で行った。赤外スペクトルはAgilent Technologies Cary 600 Series ＦＴＩＲ分光計でＡＴＲモードで記録した。サンプルのＰＸＲＤパターンは、X線Panalytical Empyrean回折計を用いて記録した。高解像度透過電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）画像は、CETA 16Mカメラを搭載した加速電圧２００ｋＶ、格子フリンジ分解能０．１４ｎｍのTalos F200X走査／透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）を用いて得た。周期構造の高解像度画像はＴＩＡソフトウェアを用いて解析した。Ｎ^２吸脱着等温線はMicrometrics ASAP 2020表面積アナライザーを用いて７７Ｋで得られた。自己テンプレート化されたサンプルのトポグラフィーは、動的原子間力顕微鏡（５５００原子間力顕微鏡；Keysight Technologies Inc.）によって分析された。トポグラフィー、位相および振幅スキャンを同時に取得した。共振周波数２５０－３００ｋＨｚ、力定数１００－１３０Ｎｍ^－１のシリコンカンチレバー（NanosensorsTM, Neuchatel, Switzerland）を使用した。セットポイント値は２．５Ｖに保った。ＡＦＭスキャンは、０度の固定スキャン角度、０．２０のスキャン速度で、１０２４点／ラインで収集した。スキャンアーチファクトは、同一の画像取得パラメーターの下、９０℃の角度で典型的なスキャンを取得することにより最小化した。ＡＦＭスキャンの後処理には、ＳＰＭデータ可視化・解析ツールであるGwyddionTMフリーソフトウェア（バージョン２．４７）を使用した。室温での水中発光スペクトルは、Perkin Elmer LS55蛍光分光計で記録した。動的光散乱（ＤＬＳ）測定はMalvern Zetasizer NanoSeriesで行い、ナノ粒子のサイズとζ－電位を求めた。ＸＰＳ実験はKratos Axis Ultra DLDスペクトロメーターを用い、～２×１０^－１０ｍｂａｒの圧力下で行った。単色化されたＡｌＫαＸ線源（１４８６．６９ｅＶ）を用い、室温でサンプルに照射した。遠紫外線スペクトルは、窒素を流しながら供給したランプを備えたChirascan CD 分光計 (Applied Photophysics, UK)を用い、２００～２８０ｎｍの波長で記録した。５０マイクロリットルの溶液を０．１ｍｍ光路長の石英キュベット（Hellma, UK）に加え、２０℃で測定を行った（１ｎｍの帯域幅分解能、１秒の取得時間）。通常、少なくとも２回のスキャンを記録し、各スペクトルからベースラインとＨＥＰＥＳスペクトルを差し引いた。データはApplied Photophysics Chirascan ViewerとMicrosoft Excelを用いて処理した。位相差および蛍光画像はOlympus FV1000MPE共焦点走査型顕微鏡で観察した。フローサイトメトリー解析はAccuri C6 フローサイトメーターで行った。ＣＯＦ層間のインスリン分子の最も好ましい位置は、Biovia Materials Studioの吸着ロケーターモジュールを用いて、シミュレートアニーリングプロセスで計算された。このために、まずＴＴＡ－ＤＦＰ ＣＯＦ構造を、インスリン分子を組み込むことができるように、３層のセットを２５Aの距離で分離することによって修正した。インスリンモノマーはタンパク質データバンクの1zni構造から得た。インスリンモノマーはｎＣＯＦユニットセルあたり１個組み込まれ、これは～７０ｗｔ％に相当する。モンテカルロ・シミュレーションは、電荷を割り当てた後、ユニバーサルな力場を用いて実行され、最も低い吸着エネルギーを持つ構造が選択された。

「表３」酵素を充填したＣＯＦ材料の文献例とその応用例。

「表４」インスリンデリバリーシステムの例とその充填容量。

合成

「２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）と４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ）の合成」
２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）は、当技術分野で公知の方法に従って、特に変更を加えずに合成した。４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ）：このトリアミン（ＴＴＡ）は、当技術分野で公知の方法に従って、特に改変を加えずに合成した。

「ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの合成」
ＴＴＡ-ＤＦＰ-ｎＣＯＦは、２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ、２１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、５当量）と４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ、１２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、１当量）を、３ｍＬの無水１，４－ジオキサン中、０．５ｍＬの酢酸（１３Ｍ、[酢酸]_最終＝４．０Ｍ）存在下、室温で１０分間反応させた（図４）。この溶液をＨ_２Ｏ中で透析して洗浄し、安定なコロイド懸濁液を得た。

「コントロール実験：純粋な酢酸中でのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ合成」
ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦは、２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ、２１ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、５当量）と４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ、１２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、１当量）を、３ｍＬの無水１，４－ジオキサン中、０．５ｍＬの酢酸（１７Ｍ，([酢酸]ｆｉｎａｌ＝５．０Ｍ)存在下、室温で１０分間反応させた（図４）。Ｈ_２Ｏ中で透析して溶液を洗浄し、安定なコロイド懸濁液を得た。

「ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦへのインスリン充填」
インスリンは簡単な含浸法でＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦに充填させた。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ（５ｍｇ）を２ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁し、ＨＥＰＥＳ緩衝化インスリン水溶液（[インスリン]=１０ｍｇ．ｍＬ^－１、１ｍＬ）を加えた（ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ:インスリン比＝１：２）。溶液（ｐＨ７．４）を室温で一晩撹拌し、遠心分離によって数回水で洗浄し、最後に脱イオンＨ_２Ｏで洗浄して、充填されていないインスリン分子を除去した。

「ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦへのインスリン－ＦＩＴＣ充填」
インスリン－ＦＩＴＣ（Sigma-Aldrich)を簡単な含浸法でＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦに充填した。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ（５ｍｇ）を２ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁し、ＨＥＰＥＳ緩衝化インスリン水溶液（[インスリン－ＦＩＴＣ]=１０ｍｇ．ｍＬ^－１、１ｍＬ）を加えた（ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ：インスリン－ＦＩＴＣ比＝１：２）。溶液（ｐＨ７．４）を室温で一晩撹拌し、遠心分離により水で数回洗浄し、脱イオンＨ_２Ｏで洗浄して、充填されていないインスリン－ＦＩＴＣ分子を除去した。

「ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦにインスリンを充填し、充填率３０％を達成」
インスリンのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦへの充填は簡単な含浸法で行った。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ（５ｍｇ）を２ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁し、ＨＥＰＥ緩衝化インスリン水溶液（[インスリン]＝２ｍｇ．ｍＬ^－１、０．２ｍＬ）を加えた（ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ：インスリン比＝２：１）。溶液（ｐＨ７．４）を室温で一晩撹拌し、遠心分離により水で数回洗浄し、最後に脱イオンＨ_２Ｏで洗浄し、充填されていないインスリン分子を除去した。

「ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦへのグルコース充填」
ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦにグルコースを含浸させた。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ（５ｍｇ）を２ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁し、グルコース水溶液([グルコース]=５ｍｇ．ｍＬ^－１、１ｍＬ)を加えた。この溶液（ｐＨ７．４）を室温で一晩撹拌した。その後、遠心分離によって溶液を水で数回洗浄し、脱イオンＨ_２Ｏで洗浄して、充填されていないグルコース分子を除去した。

特性

「高分解能透過電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）」
高分解能透過電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）画像は、CETA 16Mカメラを装備した加速電圧２００ｋＶ、格子フリンジ分解能０．１４ｎｍのTalos F200X走査/透過電子顕微鏡を用いて得られた。サンプルは、銅グリッドに取り付けた穴あきカーボンフィルム上に準備した。希釈した粒子溶液をグリッド上に滴下し、室温（２９８Ｋ）で一晩乾燥させた。得られた周期構造の画像は、TIAソフトウェアを用いて解析した。すべての関連領域は、スポットサイズ３の明視野イメージングモードを使用してマークし、マークされた領域は、イメージングにはスポットサイズ９、STEM-HDAAFを実行にはスポットサイズ６でSTEM－HDAAFモードを使用してスキャンした。STEMモードは質量決定の原理で動作するため、元素組成の決定に役立つ。このような測定は、環状検出器を用いて高角度の暗視野信号を収集することにより、低電子線量で行うことができる。このモードは一般に、質量の異なる元素を画像化するために使用され、質量の重い元素ほど明るく表示される。サンプルはスポットサイズ９、スクリーン電流６０ｐＡでスキャンした。データはVelox分析ソフトウェアを用いて分析した。

「元素マッピング」
化学マッピングはSTEM-EDAXモードで行われ、エネルギー分散型X線分析（ＥＤＡＸ）はsuper-X EDS検出器を用いて行われた。このシステムは、試料傾斜角０度で10kcpsの分解能≦１３６ｅＶ@Mn-Kαの優れた感度を持つ。この検出器は、低強度のＥＤＳシグナルでも迅速なデータを提供する。データは4つの検出器の合計であり、高速マッピングモードでの元素マップの収集時間は数時間から数分に短縮できる。データはVelox分析ソフトウェアを使用して分析した。ＨＲＴＥＭ研究用のサンプルは、銅グリッドに取り付けた穴空きのカーボンフィルム上に作製した。

「ＡＦＭ分析」
図１３を参照。

「動的光散乱（ＤＬＳ）特性評価」
ＤＬＳ測定は、Zetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments）を用いて実施し、ゼータ（ζ）電位とナノ粒子の流体力学的サイズを測定した。すべてのサンプルは１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ中、室温で分析した。

「粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）測定」
粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）測定を行い、骨格の結晶性を確認した。その結果、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦは高い結晶性を示した。実際、規則正しく並んだ格子の（１１０）面に割り当てられた４．９°の２θに強いピークが観測された。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦは、（００３）面からの反射に対応する～２４．８０°のブロードなピークを示した。

「Ｎ_２吸脱着実験」
Ｎ_２吸着-脱着等温線は、Micrometrics ASAP 2020表面積アナライザーを用いて７７Ｋで求めた。サンプルの比表面積（ＳＢＥＴ）は、Brunaur-Emmet-Teller（ＢＥＴ）法で計算し、細孔容積（Ｖｐ）と細孔径分布（ＤＢＪＨ）曲線は、Barrett-Joyner-Halenda（ＢＪＨ）法で求めた。

測定の前に、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ（空またはインスリンを充填）は、溶媒と閉じ込められたガスを除去するために、３５８Ｋで２４時間活性化された。ＩＵＰＡＣ分類システムに基づき、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦはマイクロポーラス材料を示すタイプＩＩ等温線を示した。ＢＥＴ比表面積は３８４．５２ｍ^２ｇ^－１であった。

「フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法」
ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの形成とインスリンの充填は、Agilent Technologies Cary 600 Series FTIR分光計を用いたＡＴＲ－ＩＲ分光法によって確認され、特徴づけられた。４０００～６００ｃｍ^－１のスペクトルを記録し、各スペクトルについて スペクトル分解能は２ｃｍ^－１で５１２回のスキャンを平均した。バックグラウンドのスペクトルが最初に記録され、サンプルのスペクトルから自動的に差し引かれた。

「胃の状態（ｐＨ＝２）におけるＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの特性評価」
図２０を参照。

「^１Ｈ ＮＭＲ分光法」
ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦによるインスリンの取り込みを観察するために^１Ｈ ＮＭＲ分光法を用いた。蛍光分光法を用いたＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦに充填されたインスリン－ＦＩＴＣの量の決定 。３７℃、ｐＨ７．４、λex =４８８ｎｍでは、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦは本質的に蛍光を発しない。このことは、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦコンストラクト内で蛍光消光が起こっていることを示している。このような消光は、励起されたインスリン－ＦＩＴＣとＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ間の電子相互作用、あるいはタンパク質の有効濃度が比較的高いナノ粒子内での色素の自己消光に起因すると考えられる。溶液蛍光の強度を検量線と比較して測定した（図２２）。

ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦへのインスリン－ＦＩＴＣの充填量を推定するために、インスリン標準溶液の検量線との比較に基づいて、上清中の充填されていないインスリン－ＦＩＴＣを蛍光分光法で測定した。

「ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンのＤＬＳとゼータ（ζ）ポテンシャル特性」
図２５と２６を参照。

「Ｘ線光電子（ＸＰＳ）分光法」
インスリン添加前後のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの元素組成を分析し、ｎＣＯＦ表面とタンパク質の相互作用を理解するために、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）分析を行った。ＸＰＳ実験はKratos Axis Ultra DLDスペクトロメーターを用い、約２×１０^－１０ｍｂａｒのベース圧で行った。単色ＡｌＫαＸ線源（１４８６．６９ｅＶ）を用い、室温でサンプルに照射した。ＸＰＳスペクトルは７００μｍ×３００μｍの分析領域から記録した。コア準位の高分解能ＸＰＳデータは、０．０５ｅＶのエネルギー分解能で得られた。一貫性を保つため、ＸＰＳ測定はＣ１ｓ（～２８５ｅＶ）に校正された。データの解析にはCasaXPSパッケージを用い、Shirleyバックグラウンドサブトラクションを行った。

「蛍光発光分公報によるＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦからのインスリン－ＦＩＴＣ放出のｐHおよびグルコース依存性」

「インスリン放出条件」
ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦからのインスリン－ＦＩＴＣの放出に及ぼすｐＨの影響を、３７℃、ｐＨ＝２．０と７．４で、ＰＢＳ（１０ｍＭ）で緩衝した水中で経時的にモニターした。溶液のｐＨは１Ｍ ＨＣｌ（ａｑ）溶液を用いて調整した。

ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦからのインスリン－ＦＩＴＣの放出に及ぼすグルコース濃度の影響を、ＰＢＳ（１０ｍＭ）で緩衝した水中、３７℃、いくつかのグルコース濃度（[グルコース]=０、１、３、５ｍｇ．ｍＬ^－１）で、蛍光分光法を用いて経時的にモニターした。

ヒト血清、１１種類のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、チロシン）の混合物、フルクトース（３ｍｇｍＬ^－１）またはスクロース（３ｍｇｍＬ^－１）の生理食塩水の、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦからのインスリン－ＦＩＴＣの放出に及ぼす影響を、ＰＢＳ（１０ｍＭ）で緩衝した水中、３７℃、高血糖条件下（[グルコース]＝３ｍｇ・ｍＬ^－１）で経時的にモニターした。

一定時間ごとにサンプルを採取し、蛍光強度を測定した。

「円偏光二色性（ＣＤ）分光法」
ナノ粒子から放出されたインスリンの活性と構造の変化を評価するため、タンパク質の二次構造を高い信頼性で解析する一般的な方法として、円偏光二色性（ＣＤ）分光法を行った。ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中のネイティブなインスリンのＣＤスペクトルでは、２０８ｎｍと２２２ｎｍに２つの極値があり、それぞれα－ヘリックス構造とβ－構造に起因していた。

ＧＩ液シミュレーション（ｐＨ２．０、２４時間）に曝したＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦに充填されたインスリンの化学的安定性を評価した。酸性ｐＨでは、インスリンはナノ粒子から放出されないため、ＣＤ分析を行うために、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンをＮａＯＨ（０．１Ｍ）に暴露し、タンパク質をナノ粒子から放出させた。図３２に示すように、ＮＰと純粋なインスリン溶液から放出されたインスリンの遠紫外線ＣＤスペクトルでは、それぞれαヘリックス構造とβプリーツシーツ構造に対応する２０８ｎｍと２２２ｎｍに２つの負のバンドが観測された。２０８ｎｍと２２３ｎｍのバンドの強度の比（[Ф]２０８/[Ф]２２３）は、通常、インスリンの結合の定性的な指標として用いられている。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦのネイティブインスリンとＧＩ液にさらされたインスリンの[Ф]２０８/[Ф]２２３比はともに１．２であり、ネイティブインスリンとＧＩ液にさらされたＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの間に二次構造に有意な差がないことを反映していた。

高血糖環境下でＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンから１２時間放出した後のインスリンのＣＤスペクトルは、２つの極値を持つネイティブインスリンのスペクトルと類似していた（図３３）。ネイティブインスリンと放出インスリンのバンド間の比（[φ]２０８/[φ]２２２）はそれぞれ１．２５と１．２４であった。したがって、ナノ粒子から放出されたインスリンの二次構造は、本来のインスリンと類似していた。従って、放出されたインスリンはその構造と特性を維持していた。

「グルコース相互作用」
グルコースによって引き起こされるインスリンの放出メカニズムを研究するために、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦをｉ）インスリン単独、ｉｉ）グルコース単独（５ｍｇ．ｍＬ^－１）、およびｉｉｉ）インスリンに続いてグルコース（５ｍｇ．ｍＬ^－１）を２４時間、３７℃で培養した。サンプルは十分に洗浄し、凍結乾燥した。充填効率（ｗｔ％）は、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの質量との比較による質量差を用いて計算した。

「インビトロ生物学的研究」

「細胞培養」
肝細胞癌（Hep-G2、ATCC HB-8065）、結腸直腸癌（HCT-116、ATCC CCL-247）、結腸癌（RKO、ATCC CRL-2577）、子宮頸部腺癌（Hela、ATCC CCL-2）、乳房腺癌（MCF-7、ATCC HTB-22）、転移性乳房腺癌（MDAMB-231、ATCC HTB.26）、上皮性胚性腎臓（HEK293-T、ATCC CRL-3216）および悪性膠芽腫（U251-MG、ATCC 09063001）のヒト細胞株を、１０％ウシ胎児血清（FBS）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｍＬ Ｌ-グルタミンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。

卵巣癌（A2780、ECACC 93112519）および腸回盲部腺癌（HCT-8 ATCC CCL-244）のヒト細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったロスウェル・パーク記念研究所（RPMI）-1640培地中、５％ＣＯ^２、３７℃で培養した。

「インビトロ細胞生存率」
細胞生存率は、CellTiter-（登録商標） Cell Viability assay（CTB、Promega）を用いて評価した。このアッセイは、生細胞における非蛍光性化合物レザズリンの蛍光性生成物レゾフリンへの代謝還元を測定する。非生存細胞は急速に代謝活性を失うので、レソフリン生成物の量を用いて、処理後の生存細胞数を推定することができる。一度生成されたレソフリンは、生きた細胞から周囲の培地に放出される。したがって、培地の蛍光強度は存在する生細胞数に比例する。

９６ウェルプレートにＨｅｐ－Ｇ２細胞（１００μＬのＤＭＥＭ中のウェルあたり～５，０００個）を播種し、３７℃で２４時間培養した。培地を除去し、新鮮な培地（コントロール）または様々な濃度の試験化合物と交換し、３７℃で４８時間培養した。その後、細胞を１ウェルあたり８０μLのＤＭＥＭと２０μＬのＣＴＢとともに３７℃で６時間培養した。レゾフリン産物の蛍光（λｅｘ／ｅｍ ５６０／６２０）を測定した。未処理のウェルをコントロールとして用いた。

細胞生存率は以下の式で算出した：
生存率（%）=［（F_treated－F_blank）／（F_control－F_blank）］×１００

すべてのアッセイは3回で行い、平均ＩＣ５０±標準偏差を求めた。

「ＴＥＭ分析によるナノ粒子の細胞内分布」
ＴＥＭを用いて、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの細胞内での動態、細胞構造への影響、細胞小器官との相互作用を2つの結腸細胞株（ＲＫＯとＨＣＴ－１１６、培養時間４時間）で調べ、処理後４時間、２４時間、４８時間で分析した。

ＴＥＭ分析のために、細胞を完全ＤＭＥＭ中のＴ７５フラスコに播種し、細胞培地のみ（コントロール）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（[ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ]=５０μｇ．ｍＬ^－１、ＤＭＥＭ中）と４時間培養した。細胞は処理後４、２４、４８時間で回収した。細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞は、高圧フリーザー（Leica Microsystems, Germany）を用いて、液体窒素下、２０００ｂａｒの圧力で数ミリ秒以内に凍結固定した。凍結後、サンプルポッドは液体窒素槽に自動的に放出された。液体窒素中にある間に、あらかじめ冷却した先端の細いピンセットを用いて標本ポッドからサンプル担体を分離し、平板標本担体用のクライオトランスファー保存箱に移し、そこで凍結置換に備えてサンプルを保存した。凍結置換は、１％四酸化オスミウム（ｗ／ｖ）、０．５%酢酸ウラニル（ｗ／ｖ）および５%蒸留水（ｖ／ｖ）を含む１０ｍＬの低温乾燥絶対アセトン（ｖ／ｖ）溶液中で、自動凍結置換（ＡＦＳ）ユニット（Leica EM AFS2, Heerbrugg, Switzerland）を用いて行った。ＡＦＳユニットを－９０℃から０°Cまでゆっくりと昇温し（２℃／ｈ）、－６０℃と－３０℃の両方で８時間保持した。サンプルは、結露を防ぐために密閉容器に入れて室温に移し、無水アセトンで洗浄（３×５分）し、３０、６０、１００%のエポン樹脂でそれぞれ３時間浸透した。エポンを交換し、個々のサンプルを１ｍＬのEppendorf（登録商標）の蓋に６０℃で２４時間包埋した。最後に、サンプルは、ダイヤモンドナイフを用いたクライオウルトラミクロトーム（Leica UC7/FC7）で室温で切片化し、超薄切片をＴＥＭ（Talos F200X STEM）で観察した。

未処理のＨＣＴ－１１６細胞およびＲＫＯ細胞のＴＥＭ像（図４２－４３）は、無傷の細胞膜；と細胞膜表面の多数の微絨毛細胞膜表面の膜ブレビング；よく発達した粗面小胞体、大きなゴルジ体、およびミトコンドリア、小胞、顆粒などの他の細胞小器官や構造体；無傷の核膜に囲まれた明らかな核小体を持つ中心性の大きな核；正常なヘテロクロマチンの分布などの細胞の典型的な形態学的特徴を示した。

すべてのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン処理サンプルは、丸みを帯びた細胞形状と突起（微絨毛など）に富む細胞膜を持つＲＫＯおよびＨＣＴ－１１６細胞の規則的な超微細構造と、よく発達した粗面小胞体と、ゴルジ体と、代謝活性細胞の維持を示すミトコンドリアとを示す（図４２－４３）。

4時間の培養後、かなりの量のＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンが処理された細胞の一部とその表面に可視化される（図４２－４３）。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンはエンドサイトーシスを受け、エンドソームに存在する。膜の変形も観察され、エンドサイトーシスによるＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの内在化が確認された。細胞液胞内に取り込まれたＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは、主に凝集体として見いだされた。さらに、核の近くにはＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは見られなかったが、これはこれらの凝集体が１０－２０ｎｍの大きさの核膜孔を物理的に破ることができないためと考えられる。２４時間後、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは両細胞株とも核周辺領域の液胞内に位置することができたが、膜上にはもう存在しなかった。細胞は、細胞分裂をしながら成長続ける（図４２－４３）。４８時間後、一部のＨＣＴ－１１６細胞は細胞質内の液胞内にナノ粒子をまだ含んでいたが、ほとんどの細胞は含んでいなかった。細胞は、生長と増殖を続ける（図４２－４３）。ＲＫＯ細胞では、ナノ粒子は検出されなかった（図４３）。

「溶血アッセイ」
赤血球の外膜が破壊されると、ヘモグロビンが放出される。サンプル中のヘモグロビンの量を分光光度法で測定することにより、検査で破壊された赤血球の量を推定することができる。３人の健康なドナーからヒト血液を得た。２．０ｍＬのエチレンジアミン四酢酸安定化血液サンプルを４ｍＬの生理的食塩水に加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、８分間）により赤血球を分離した。赤血球を生理的食塩水緩衝液（ＰＢＳ）で５回洗浄し、２％赤血球懸濁液に希釈した。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦまたはＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（０．７５，１．５，３．０ｍｇ．ｍＬ^－１）を所定の濃度で赤血球懸濁液に添加し、緩やかなボルテックスを用いて混合した。一方、陰性コントロールおよび陽性コントロールとして、Triton X-100（０．３％）を含む生理的食塩水または含まない生理的食塩水をそれぞれ赤血球懸濁液に添加した。サンプルを３７℃で１時間静置した。最後に、すべてのサンプルを５０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄１００μLを９６ウェルプレートに入れ、波長５４０ｎｍで検出した。溶血比（ＨＲ）は、サンプル中の赤血球膜の破壊の程度を表す。

「A_sample」、「A_{positive control}」、「A_{negative control}」は、それぞれサンプル、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールの吸光度を表す。これらの検査は３回実行された。

「マウス腸嚢を横断する生体外透過試験」
生体外吸収の評価は、他の文献に記載されているように、摘出したラット小腸での透過測定によって行った。マウス（２５ｇ）をイソフルランで麻酔し、殺して失血死させた。動物は麻酔下に置かれ、別の目的のために安楽死させられたので、組織の回収に倫理的承認は必要なかった。摘出したばかりの腸組織をＰＢＳで洗浄し、５～４ｃｍの大きさに切断した。０．３ｍＬのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣ（１ｍｇ・ｍＬ^－１）を腸嚢に注射した。充填した組織を酸素添加した組織培養ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、１０ｍＬ）中で３７℃で培養した。サンプル溶液（０．１ｍＬ）を１８０分まで一定時間間隔で漿膜側から抜き取り、新鮮な培地と交換した。ＦＩＴＣの蛍光シグナルを蛍光プレートリーダーで測定し（ＦＩＴＣ励起/発光：４９５ｎｍ／５１９ｎｍ）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣの対数希釈の標準曲線（１～１×１０^－６Ｍ）と比較した。試験は3匹の異なるマウスの3つの異なる腸管セグメントで3回実施した。

粘膜表面積の算出には、腸を円柱とみなし、以下の式を用いた：
粘膜表面積（ｃｍ^－２）＝２πｒ（ｈ＋ｒ）
なお、ｈ＝長さであり、ｒ＝腸嚢の半径

実験終了後、組織を通常の生理食塩水で洗浄し、腸壁への薬物蓄積を漿液および腸組織のＴＥＭで調べた。

腸組織は４．５%パラホルムアルデヒド溶液で固定した。固定したサンプルは、高圧フリーザー（Leica Microsystems, Germany）を用いて、液体窒素下、２０００ｂａｒの圧力で数ミリ秒以内に凍結固定した。凍結置換は、自動凍結置換（ＡＦＳ）ユニット（Leica EM AFS2, Heerbrugg, Switzerland）を用いて、１%四酸化オスミウム（ｗ／ｖ）、０．５%酢酸ウラニル（ｗ／ｖ）、５%蒸留水（v/v）を含む低温で乾燥した絶対アセトン（ｖ／ｖ）溶液１０ｍＬ中で行い、エポキシ樹脂で包埋した。その後、超薄切腸標本を作製し、高分解能ＴＥＭ（Talos F200X STEM）で観察した。

「生体内動物評価」
すべての動物は、トレムセン大学施設動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）（認定番号：D01N01UN130120150006）の方針に従って飼育した。

「動物」
この研究にはＷｉｓｔａｒラット（１２週、２００ｇ±２０）を用いた。これらはPasteur Institute（アルジェリア、アルジェ）から入手した。ラットはウッドチップを敷き詰めたプラスチック製ケージに個々に収容し、恒温（２５℃）、１２：１２時間の明暗サイクルで維持し、標準的なペレット食と水を自由摂取させた。本研究は、実験動物の飼育と使用に関する国のガイドラインに従って実施された。

「T1D 誘発」
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ、ｐＨ４．５の１０ｍＭクエン酸緩衝液に溶解）を４５ｍｇ．ｋｇ^－１体重のＳＴＺ用量で単回腹腔内注射し、１型糖尿病を誘発した。ラットはケージに戻され、糖尿病が誘発されるまでの４日間、餌と水を与えられた。血糖値は、血糖モニタリングシステム（AccuChek Performa、Hoffman-La Roche）を用いて、ラットの尾静脈からサンプルを採取してモニターした。空腹時血糖値が２５０ｍｇ／ｄＬ（１３．７ｍｍｏｌ．Ｌ^－１）以上のラットを糖尿病とみなし、試験に選んだ。ラットは一晩絶食させ、実験期間中も絶食のままであったが、水を飲ませた。

「生体内血糖降下作用」
ラットを無作為に６群（ｎ＝３）に分け、Ｔ１Ｄラットに投与した製剤は以下の通りである：１）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン経口投与（ｏ．ｇ．，５０ＩＵ．ｋｇ^－１）、２）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ経口投与（ｏ．ｇ．，２ｍｇ．ｋｇ^－１）、３）インスリン溶液経口投与（ｏ．ｇ．，５０ＩＵ．ｋｇ^－１）；4）インスリン溶液を皮下投与（５ＩＵ．ｋｇ^－１）インスリンの薬理学的利用率が１００％の陽性コントロールとして設定；４）未治療糖尿病ラットおよび６）非糖尿病ラット。血糖値はグルコメーターで測定した。採血は尾静脈から１時間ごとに１０時間行った。

「生体内血漿中インスリン濃度」
ラットを無作為に３群（ｎ＝３）に分け、Ｔ１Ｄラットに投与した製剤は以下の通りである：１）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンを経口投与（ｏ．ｇ．，５０ＩＵ．ｋｇ^－１）、２）インスリンを皮下投与（ＳＣ，５ＩＵ．ｋｇ^－１）、３）未処置の糖尿病ラット。薬理学的効果は、１０時間の糖尿病ラットの血清インスリンの増加を測定することにより決定した。インスリン血漿レベルは、Sigma-AldritchのRat Ins1 Insulin ELISA Kit (RAB00904-1KT)を用いて評価した。血液サンプルは、１０時間にわたって１時間ごとに尾静脈から採取した。曲線上面積（ＡＡＣ）は台形法を用いて算出した。ＳＣ．遊離インスリンの１００％ＰＡに対する累積血糖降下効果として計算された薬理学的有効性（ＰＡ）は、式を用いて決定された：

インスリン抵抗性の恒常性モデル評価（ＨＯＭＡ）（ＨＯＭＡ－ＩＲ）とβ細胞機能のインスリン感受性（ＨＯＭＡ－ＩＳ）は、以下の式を用いて算出した：

「生体内経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）」
経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）では、ラットを無作為に３群（ｎ＝３）に分けた。ｉ）ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンを経口ガベージ投与（ｏ．ｇ．，５０ＩＵ．ｋｇ^－１）、ｉｉ）インスリン溶液を皮下投与（ＳＣ，５ＩＵ．ｋｇ^－１）、ｉｉｉ）糖尿病未治療ラット。動物にはまず、経口ガベージまたは皮下インスリン注射によってＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンを投与した。その３時間後、２．５ｇ．ｋｇ^－１のグルコースを１ｍｌの水に溶かしたものを投与し、２８０分間血糖値を評価した。尾静脈から２．５ｇ．ｋｇ^－１体重のグルコースを経口摂取させた後、０時（基礎）と２８０分まで３０分ごとに血糖値を測定した。

「病理組織学」
採取した組織は、１０％ホルマリンで固定した後、パラフィンに包埋した。連続切片を切り、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。切片を高倍率顕微鏡（２００×）で観察し、顕微鏡写真を撮影した。

ＳＣインスリン投与群の肝臓は、非糖尿病コントロール群と比較して、ＳＴＺ誘発糖尿病による大型肝細胞の増加、肝細胞の壊死、類洞の狭小化が認められた（図３ｇ－ｉｉ）。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン投与群の肝臓の病理組織学的検討では、非糖尿病ラットと同様の構造を示し、肝細胞および類洞は正常であった。腎機能に関しては、ＳＣインスリン投与ラットは、ＳＴＺ投与による糖尿病誘発の影響もあり、ボーマン被膜の増大、糸球体の肥大、尿細管の壊死を示した（図３ｇ－ｖ）。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンを投与したラットの腎臓は、皮下インスリンラットの腎臓よりも変化が少なく、ボウマン腔が小さく、尿細管がよく個体化していた。

「生化学的測定」
肝機能検査は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）やアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）などの血清バイオマーカーを用い、SPINREACTキットを用いて尾静脈から採取した血漿から測定した。腎機能検査は、SPINREACTキットを用いて尿素とクレアチニンを測定した。

本実施例では、2型糖尿病を治療するための本開示のＣＯＦナノ粒子の使用について説明する。

ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦはインスリン抵抗性細胞にインスリンを輸送し、細胞膜に結合する遊離インスリンの一時的効果とは対照的に、長期的なグルコース消費を刺激する。ＦＤＡに承認された２つの技術と比較すると、我々のシステムは生体適合性があり、胃の中で非常に安定で、費用対効果が高く、特異的でグルコース応答性であるため、インスリン経口投与の未来における一歩前進であり、ｎＣＯＦベースのインスリン経口投与による１型および２型糖尿病治療への新しい道筋を示すものである。

最近の研究では、インスリンの細胞内導入が、インスリン抵抗性として知られる現象を克服できることが示されている。この現象は、生理学的調節の変化によって、一定量のインスリンを投与され、正常な人ほどグルコース代謝に影響がないというものである。インスリンの細胞内投与は、インスリンの細胞内への浸透効率が悪いことと、細胞内で放出される代わりに細胞質に捕捉されるとインスリンが急速に分解されることから、困難なアプローチである。インスリン抵抗性は２型糖尿病の予測因子であり、また肝臓は２型糖尿病においてインスリンの標的となる臓器の一つであることから、ヒト肝細胞株（Ｈｅｐ－Ｇ２）を用いて、細胞内のインスリンの内在化に対するｎＣＯＦ－インスリンの有効性をインビトロで評価した。

生体適合性デリバリービヒクルとしてのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦの可能性を示すために、Ｈｅｐ－Ｇ２細胞を用いたインビトロ生存率試験を実施した（図５１）。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦおよびＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンは、いずれも４８時間の培養後、１ｍｇｍＬ^－１までのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ濃度では細胞毒性作用を示さず、望ましい生体適合性を示した。

Ｈｅｐ－Ｇ２細胞内でのＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの局在をＴＥＭで調べた（図５２）。４時間培養後、ナノ粒子は主に細胞の細胞質と核で観察された。ナノ粒子は細胞内を通過し、細胞基底側で排泄されることが検出され、生体適合性が確認された。共焦点顕微鏡を用いると（図５３－５５）、インスリン処理細胞では細胞内インスリン－ＦＩＴＣシグナルは見られず、分子形態の遊離インスリンは細胞内に侵入できないことが示された。一方、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣで処理した細胞の細胞小器官マーカーとインスリン－ＦＩＴＣシグナルの共局在は、４時間の培養後、インスリン－ＦＩＴＣは、リソソーム内および細胞質内で膜に結合しているが、核には結合していないことが示された。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣは細胞質に取り込まれ、インスリンの放出を引き起こしたが、遊離のインスリンは単に細胞内に入っただけであった（図５５）。フローサイトメトリーでは、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣで処理した細胞では、遊離インスリンで処理した細胞に比べて蛍光が１５倍増加した（図５６）。

確立された方法を使用して耐性ＨｅｐＧ２（Ｒ－ＨｅｐＧ２）細胞を取得し、そのグルコース代謝を測定したところ、正常ＨｅｐＧ２細胞(コントロール、グルコース代謝１００%と定義)の５８%であった（図１）。遊離型インスリン、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリンの3つの治療を行い、治療したＲ－ＨｅｐＧ２のグルコース代謝をｔ＝４時間と２４時間で記録した。遊離型インスリン治療により、Ｒ－ＨｅｐＧ２の細胞のグルコース代謝は４時間後に一時的に増加し、２４時間後には統計学的に有意にインスリン抵抗性が悪化した。この現象は、糖尿病に対するインスリンの短期的な効果と一致している。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦで処理した細胞は、どのような糖代謝調節に関しても不活性であった。しかし、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン処理は４時間後にグルコース代謝の改善（７２％）をもたらしただけでなく、このアップレギュレーション効果は２４時間後に増強され、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ処理したＲ－ＨｅｐＧ２細胞のグルコース代謝はほぼ正常ＨｅｐＧ２のそれに戻った。従って、観察された長期的な改善は、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦによって細胞内に供給されたインスリンに起因すると考えられる。

インスリン抵抗性肝細胞に対するＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦは、グルコースのアップレギュレーションとインスリン抵抗性症状の消失の可能性を示している。

「インビトロ生物学的試験」

「細胞培養」
ヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ－Ｇ２、ＡＴＣＣ番号ＨＢ－８０６５）細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｍＬ Ｌ－グルタミンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用い、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。

「Ｈｅｐ－Ｇ２細胞におけるインビトロ細胞生存率」
細胞生存率は、CellTiter-Blue（登録商標）Cell Viability assay（CTB、Promega）を用いて評価した。このアッセイは、生細胞における非蛍光性化合物であるレサズリンの蛍光性生成物であるレソフリンへの代謝現象を測定する。非生存細胞は急速に代謝活性を失うので、レソフリン生成物の量を用いて、処理後の生存細胞数を推定することができる。一度生成されたレソフリンは、生きた細胞から周囲の培地に放出される。したがって、培地の蛍光強度は存在する生細胞数に比例する。

９６ウェルプレートにＨｅｐ－Ｇ２細胞（１００μＬのＤＭＥＭ中にウェルあたり～５，０００個）を播種し、３７℃で２４時間培養した。培地を除去し、新鮮な培地（コントロール）または様々な濃度の試験化合物と交換し、３７℃で４８時間培養した。その後、細胞を1ウェルあたり８０μＬのＤＭＥＭと２０μLのＣＴＢとともに３７℃で６時間培養した。レゾフリン生成物の蛍光（λｅｘ／ｅｍ５６０／６２０）を測定した。未処理のウェルをコントロールとして用いた。

細胞生存率は以下の式で算出した：
生存率（%）=［（F_treated－F_blank）／（F_control－F_blank）］×１００
すべてのアッセイは3回行い、平均ＩＣ５０±標準偏差を求めた。

「ＴＥＭ分析によるナノ粒子の細胞内分布」
ＴＥＭ分析のために、Ｈｅｐ－Ｇ２細胞をＴ７５フラスコに完全ＤＭＥＭで播種し、細胞培地のみ（コントロール）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦまたはＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（[ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ]=０．５ｍｇ．ｍＬ^－１ＤＭＥＭ中）と４時間培養した。採取後、細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞は、高圧フリーザー（Leica Microsystems, Germany）を用いて、液体窒素下、２０００ｂａｒの圧力で数ミリ秒以内に凍結固定した。凍結後、サンプルポッドは液体窒素槽に自動的に放出された。液体窒素中にある間に、あらかじめ冷却した先端の細いピンセットを用いて標本ポッドからサンプル担体を分離し、平板標本担体用のクライオトランスファー保管箱に移し、そこで凍結置換に備えてサンプルを保管した。凍結置換は、1%四酸化オスミウム（w/v）、０．５%酢酸ウラニル（ｗ／ｖ）、５%蒸留水（ｖ／ｖ）を含む冷乾燥絶対アセトン（ｖ／ｖ）溶液１０ｍＬ中で、自動凍結置換（ＡＦＳ）ユニット（Leica EM AFS2, Heerbrugg, Switzerland）を用いて行った。ＡＦＳユニットを－９０℃～０℃までゆっくりと昇温し（２℃／ｈ）、－６０℃と－３０℃の両方で８時間保持した。サンプルは、結露を防ぐために密閉容器に入れて室温に移し、絶対アセトンで洗浄（３×５分）し、３０、６０、１００%のエポン樹脂でそれぞれ３時間浸潤した。エポンを交換し、個々のサンプルを１ｍＬのエッペンドルフ（登録商標）の蓋に６０℃で２４時間包埋した。最後に、室温でダイヤモンドナイフを用いてウルトラミクロトームでサンプルを切片化し、超薄切片をＴＥＭ（Talos F200X STEM）で観察した。

「共焦点顕微鏡によるインビトロインスリン－ＦＩＴＣ細胞内封入試験」
Ｈｅｐ－Ｇ２細胞を完全ＤＭＥＭ中の滅菌カバースリップ上に播種し、２４時間培養した。Ｈｅｐ－Ｇ２細胞をインスリン－ＦＩＴＣ（[インスリン－ＦＩＴＣ]=１０μＭ）と共に４時間培養した。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣのインターナリゼーションを理解するために、細胞を細胞小器官マーカーで染色した。細胞は、NucRed（登録商標）Live 647 ReadyProbes（登録商標）試薬（核を標識）、LysoTracke（登録商標）647 Deep Red（膜を標識）のいずれかで３０分間培養した後、ＰＢＳ洗浄を３サイクル繰り返した。次に、各実験ごとに、細胞をホルムアルデヒド溶液（３．７％）で１０分間固定し、その後ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄サイクルの間、細胞はＰＢＳ中で５分間保持された。ProLong Live Antifade Reagentを添加して光退色を抑制し、蛍光シグナルを保持した。その後、カバースリップを顕微鏡用スライドに固定した。ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣの細胞内インターナリゼーションは、共焦点顕微鏡（Olympus FV1000MPE）を用いて、Ｈｅｐ－Ｇ２細胞におけるインスリン－ＦＩＴＣの蛍光シグナル（４８８ｎｍ）と、プラスミド膜、リソソーム、細胞質、核を標識する４つのマーカーから細胞小器官の蛍光発光（励起/発光６４７／６６８ｎｍ）を測定した。

「フローサイトメトリー解析」
Ｈｅｐ－Ｇ２細胞をＤＭＥＭ中で１０万細胞／ｍＬの密度にシャーレ中で２４時間培養した。Ｈｅｐ－Ｇ２細胞を無添加（コントロール）、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ、ＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン－ＦＩＴＣ（[インスリン－ＦＩＴＣ]=１０μM）と４時間培養した。インスリン－ＦＩＴＣ取り込みはBD Accuri C6フローサイトメーターで測定した。

「インスリン抵抗性」
インスリン抵抗性とは、一定量のインスリンを投与しても、グルコース代謝が健常者と同程度に変化しないような生理的調節の変化と定義される。Ｒ－ＨｅｐＧ２は確立された方法で得られ、そのグルコース代謝は正常ＨｅｐＧ２の５８％と測定された。正常なＨｅｐＧ２はコントロールとして用いられ、そのグルコース代謝は１００％と定義された。

「インスリン抵抗性細胞」
ＨｅｐＧ２細胞を培養培地中の６ウェルプレートに１００，０００個／ウェルの密度で播種した。２４時間後、培地を１０^－６Ｍデキサメタゾン（Alfa Aesar, USA）入りの完全ＤＭＥＭに変え、さらに６０時間培養し、Ｒ－ＨｅｐＧ２を樹立した。

「Ｒ－Ｈｅｐ－Ｇ２細胞のインビトロ細胞生存率」
図５７を参照。

「グルコース消費アッセイ」
Ｒ－Ｈｅｐ－Ｇ２細胞を、グルコースおよびフェノールを含まないＤＭＥＭ ＤＭＥＭ内のシャーレ（１００，０００セル／ｍＬ）中で２４時間培養した。Ｒ－Ｈｅｐ－Ｇ２細胞を、無添加、インスリンまたはＴＴＡ－ＤＦＰ－ｎＣＯＦ／インスリン（[インスリン]=１０μＭ）と共に３７℃で４時間培養した。Amplex（登録商標） Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit (Invitrogen)を用いて、細胞培養液中のグルコース残基を４時間後と２４時間後に測定した。

本開示は、１つまたは複数の特定の実施形態および／または実施例に関して説明されてきたが、本開示の範囲から逸脱することなく、本開示の他の実施形態および／または例がなされ得ることが理解されるであろう。

Claims (25)

1. 共有結合性有機フレームワーク（ＣＯＦ）ナノ粒子であって、
   １０～２５枚のＣＯＦナノシートを含み、
   前記ＣＯＦナノシートはずらして積層され、
   各ＣＯＦナノシートが２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）と４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル）トリアニリン（ＴＴＡ）の共縮合物であり、
   前記ＣＯＦナノ粒子が７５～３００ｎｍの最長直線寸法を有する、
   共有結合性有機フレームワーク（ＣＯＦ）ナノ粒子。
2. ＤＦＰとＴＴＡの縮合時のモル比が５：１（ＤＦＰ：ＴＴＡ）である、
   請求項１に記載のＣＯＦナノ粒子。
3. 前記ＣＯＦナノ粒子が約１２０ｎｍの最長直線寸法を有する、
   請求項１に記載のＣＯＦナノ粒子。
4. 前記ＣＯＦナノ粒子が１６～２０枚の前記ＣＯＦナノシートを有する、
   請求項１に記載のＣＯＦナノ粒子。
5. 前記ＣＯＦナノ粒子が１８枚の前記ＣＯＦナノシートを有する、
   請求項４に記載のＣＯＦナノ粒子。
6. 前記ＣＯＦナノ粒子が複数のカーゴタンパク質を組み込んでいる、
   請求項１に記載のＣＯＦナノ粒子。
7. 前記カーゴタンパク質がインスリンである、請求項６に記載のＣＯＦナノ粒子。
8. 前記インスリンが前記ＣＯＦナノ粒子の重量に対して３０～７５ｗｔ％である、
   請求項７に記載のＣＯＦナノ粒子。
9. 請求項１に記載の複数のＣＯＦナノ粒子と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、
   組成物。
10. ２，６－ジホルミルピリジン（ＤＦＰ）、４，４‘，４’‘－（１，３，５－トリアジン－２，４，６－トリイル)トリアニリン（ＴＴＡ）および酸を溶媒内で混合させて反応混合物を形成し、前記反応混合物を室温に保持し、一定時間後に共有結合性有機フレームワーク（ＣＯＦ）ナノ粒子を形成する工程；および
    前記ＣＯＦナノ粒子に１以上のカーゴタンパク質を含浸させる工程を有する、
    共有結合性有機フレームワーク（ＣＯＦ）ナノ粒子の製造方法。
11. 前記含浸の前の前記反応混合物の精製工程をさらに含み、
    前記精製工程が水中での前記反応混合物の透析を含む、
    請求項１０に記載の方法。
12. １つ以上のカーゴタンパク質がインスリンである、
    請求項１０に記載の方法。
13. 前記ＣＯＦナノ粒子と前記インスリンの重量比が１：２～２：１である、
    請求項１２に記載の方法。
14. 前記含侵させる工程が、前記ＣＯＦナノ粒子と前記インスリンとを含む反応混合物を室温で形成することを含み、
    前記ＣＯＦナノ粒子に1つ以上のインスリン分子が含浸される、
    請求項１０に記載の方法。
15. 前記含浸されたＣＯＦナノ粒子の精製工程をさらに含む、
    請求項１０に記載の方法。
16. 前記精製する工程が、遠心分離および水による洗浄を含む、
    請求項１５に記載の方法。
17. 前記ＣＯＦナノ粒子が７５～３００ｎｍの最長直線寸法を有する、
    請求項１０に記載の方法。
18. 前記ＣＯＦナノ粒子が１０～２５枚のＣＯＦを有する、
    請求項１０に記載の方法。
19. ＤＦＰとＴＴＡのモル比が５：１である、
    請求項１０に記載の方法。
20. 前記溶媒が１，４－ジオキサンである、
    請求項１０に記載の方法。
21. 前記酸が酢酸である、
    請求項１０に記載の方法。
22. 糖尿病を有するかまたは糖尿病が疑われる個体を治療する方法であって、請求項９に記載の組成物を経口投与することを含み、前記個体のグルコースレベルが正常化される、方法。
23. 前記個体が１型糖尿病または２型糖尿病に罹患している、
    請求項２２に記載の方法。
24. 前記個体が１型糖尿病である、
    請求項２３に記載の方法。
25. 請求項１に記載のＣＯＦナノ粒子、または請求項１に記載のＣＯＦナノ粒子を含む組成物を調製するための成分を含むキット。

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