JP5848326B2 - ペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤および製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、製薬分野に属し、具体的にはペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤および製造方法に関する。
特許文献１は、ペクチンとアドリアマイシンとを結合してなる固形癌パッシブターゲティング抗癌プロドラッグを公開している。Ｍｗ（Ｍｗ，すなわちｗｅｉｇｈｔ−ａｖｅｒａｇｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ，重量平均分子量，高分子化合物の分子量の表示方法の１つ）が５，０００〜４５，０００の小分子のペクチンとアドリアマイシンとを反応させて得られるＭｗが１００，０００〜１，０００，０００のペクチン−アドリアマイシン複合体であり、懸濁剤を調製した後、ナノ超高圧ホモジナイザーによって処理し、粒径１００ｎｍ〜２００ｎｍ、融点２２０℃〜２４５℃の固形癌パッシブターゲティング抗癌プロドラッグを得る。ペクチンとアドリアマイシンとはアミド結合により連結し、ペクチンとペクチンとの間は、ペクチン分子のカルボキシル基とヒドロキシル基とが縮合してなるエステル結合により連結する。具体的には、前記ペクチン−アドリアマイシン複合体は、ペクチンおよびアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，ＡＤＭ）を、脱水剤ＥＤＣ・ＨＣｌ［すなわち１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩］の作用の下で、ペクチン分子上のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）およびアドリアマイシン上のアミノ基（−ＮＨ２）を反応させてアミド結合を生成し、分子量が数万の大分子プロドラッグに結合したものである。
前記ペクチン−アドリアマイシン複合体は、本特許においてペクチン−アドリアマイシン共役体（Ｐｅｃｔｉｎ−ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃａｔｅ，以下ＰＡＣ）と称する。発明者は、ＰＡＣ応用時に、溶解性がよくないことを発見し、溶解性試験を複数回行い、難溶であることが示された。難溶性薬物は、臨床応用において２つの難題が存在する。１つは薬物溶解度が低いためバイオアベイラビリティが低いことであり、もう１つは通常の製剤方法では難溶性薬物の応用にもある程度の制限があることである。
ＰＡＣの難溶性の問題を解決するため、本発明は以下の手法を提供する。
現在、難溶性薬物に対して、新しい製剤形式であるナノ懸濁液（ｎａｎｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）が注目を集めている。通常の製剤方式に比べ、ナノ懸濁液は多くの長所を有する。例えば、懸濁液において一般に水を分散系として採用し、かつ有効成分の含有量が高く、難水溶剤を採用することによる有害反応を回避することができ、注射投与の方式の可能性もある。Ｏｓｔｗａｌｄ−Ｆｒｅｕｎｄｌｉｃｈ方程式（１ｎＣ２／Ｃ１＝２σＭ／ＲＴρ（１／ｒ２−１／ｒ１）、ｒは粒径であり、ｃは溶解度である）により、懸濁液中の薬物の粒径は小さく、比表面積は大きく、薬物の溶解性およびバイオアベイラビリティをある程度増加させることができる。また、薬物の粒径を２００ｎｍ以下に制御した場合、ナノ粒子はＥＰＲ効果によって標的指向性をよりよく実現することができる。ＰＡＣの難溶性の欠陥を克服するため、発明者は、ＰＡＣをナノ懸濁剤にし、前記技術手段によって難溶の技術的課題を解決し、製剤が便利になるようにバイオアベイラビリティを高める目的を達成する。具体的には、難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体を懸濁液にする方法は以下のとおりである。滅菌注射用水１００ｍＬあたりに、ペクチン−アドリアマイシン共役体５００〜９００ｍｇ、安定剤を添加し、細砕して懸濁液にし、ナノ懸濁液を調製する。
但し、発明者は、ナノ懸濁剤を調製した後、ナノ懸濁液中の粒子は、表面自由エネルギーが比較的大きく、互いに凝集しやすく、すなわち処方に２種の安定剤（例えば、ＰＶＰ Ｋ−３０およびポロキサマー１８８など）を加えても、懸濁液の長期安定性の状況は理想的でないことを発見している。ナノ粒子の粒径は不安定で、ＰＡＣのナノ懸濁剤は懸濁液の状態で長期的に保存できないため、製剤の臨床使用効果に影響を及ぼす。
ＰＡＣナノ懸濁剤が不安定であるという欠陥を克服し、その長期安定性を確保するため、発明者は前記ナノ懸濁剤を凍結乾燥製剤にすることを提供する。具体的には、難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体を懸濁液またはナノ懸濁液として調製し、凍結乾燥支持剤を添加し、冷凍乾燥処理を行い、凍結乾燥製剤を作製する。
用いる凍結乾燥支持剤は、マンニトール、デキストラン、ラクトース、スクロース、グルコース、ソルビトールまたは塩化ナトリウムのうちの少なくとも１種である。目が粗く、外形がぎっしりし、再溶解性がよく、かつ凍結乾燥前後で粒径に大きな差のないものを選択し、上述した要求を達成するため、凍結乾燥支持剤の添加量は４０〜１２０ｍｇ／ｍＬとする。
好ましくは、スクロースを８０ｍｇ／ｍＬで懸濁液またはナノ懸濁液中に添加する。
冷凍乾燥処理の方法は以下のとおりである。
Ａ、懸濁液をバイアル中に小分けし、−４０℃〜−８０℃の条件下で４〜８時間予備冷凍する。
Ｂ、さらに冷凍乾燥機の中に置いて冷凍乾燥する。
Ａ、懸濁液をバイアル中に小分けし、−４０℃〜−８０℃の条件下で４〜８時間予備冷凍する。
Ｂ、さらに冷凍乾燥機の中に置いて冷凍乾燥する。
好ましくは、予備冷凍の温度条件は、−４０℃の条件で予備冷凍する。好ましくは、予備冷凍時間は６時間とする。冷凍乾燥機を採用して乾燥し、乾燥時間は好ましくは少なくとも２４時間である。
難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体を懸濁液にする方法は以下のとおりである。滅菌注射用水１００ｍＬあたりに、ペクチン−アドリアマイシン共役体５００〜９００ｍｇ、安定剤を添加し、細砕して懸濁液をなす。細砕して懸濁液をなした後、バイオアベイラビリティを高めるため、さらにナノ懸濁液とすることができる。高圧ホモジナイザーを採用して懸濁液をナノ懸濁液にすることは、現在、比較的有効な、通常の、常用される、便利な処理方法である。
採用する安定剤はＰＶＰ、ポロキサマー、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリソルベートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースの少なくとも１種である。
ＰＶＰ、すなわちポリビニルピロリドンは、安定剤として用い、親水性補助剤であり、ＰＶＰ Ｋ−３０が好ましい。
ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ，安定剤として用いる，親水性補助剤）は、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７を採用することができ、ポロキサマー１８８が好ましい。
ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ，ＳＤＳ）は、イオン型界面活性剤であり、電荷安定効果を提供することができ、安定剤として用いる。
ポリソルベートは、非イオン型界面活性剤であり、安定剤として用いる。ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）が好ましい。
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，ＨＰＭＣ）は、高分子ポリマーに属し、安定剤として用いる。
懸濁液またはナノ懸濁液の調製に用いる安定剤は、上述したタイプの界面活性剤または高温分子ポリマーを採用することができ、安定電荷を実現し、安定した作用をもたらすことができればよい。
懸濁液またはナノ懸濁液の調製に用いる安定剤は、上述したタイプの界面活性剤または高温分子ポリマーを採用することができ、安定電荷を実現し、安定した作用をもたらすことができればよい。
懸濁液またはナノ懸濁液の調整に用いる安定剤は、上述したタイプの界面活性剤または高温分子ポリマーを採用することができ、安定電荷を実現し、安定した作用をもたらすことができればよい。
具体的には、本発明の凍結乾燥製剤は、滅菌注射用水１００ｍＬあたりにＰＡＣ ５００〜９００ｍｇ、ＰＶＰ Ｋ−３０ ３０００〜６０００ｍｇ、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８ ５００〜９００ｍｇ、スクロース４０００〜１２０００ｍｇを添加して調製した後に冷凍乾燥し、凍結乾燥製剤としたものである。好ましい処方は以下のとおりである。
ＰＡＣ（有効成分）：７７６ｍｇ（２ｍｇ／ｍＬのアドリアマイシン当量を負荷投与量で換算し、負荷投与量２５．８％）。
ＰＶＰ Ｋ−３０（ＰＶＰはポリビニルピロリドンであり、Ｋ−３０はその分子量による分類。安定剤，親水性補助剤）：４０００ｍｇ（ｗ／ｖ，４％）。
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒはポロキサマーであり、１８８は型番。安定剤，親水性補助剤）：７００ｍｇ（ｗ／ｖ，０．７％）。
スクロース（凍結乾燥賦形剤）：８０ｍｇ／ｍＬ；（１００ｍＬあたりにスクロース８０００ｍｇを含むことに相当。）
滅菌注射用水（溶剤）：１００ｍＬ。
ＰＡＣ（有効成分）：７７６ｍｇ（２ｍｇ／ｍＬのアドリアマイシン当量を負荷投与量で換算し、負荷投与量２５．８％）。
ＰＶＰ Ｋ−３０（ＰＶＰはポリビニルピロリドンであり、Ｋ−３０はその分子量による分類。安定剤，親水性補助剤）：４０００ｍｇ（ｗ／ｖ，４％）。
Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒはポロキサマーであり、１８８は型番。安定剤，親水性補助剤）：７００ｍｇ（ｗ／ｖ，０．７％）。
スクロース（凍結乾燥賦形剤）：８０ｍｇ／ｍＬ；（１００ｍＬあたりにスクロース８０００ｍｇを含むことに相当。）
滅菌注射用水（溶剤）：１００ｍＬ。
本発明の凍結乾燥製剤は、滅菌注射用水１００ｍＬあたりにＰＡＣ ７７６ｍｇ、ＰＶＰ Ｋ−３０ ４０００ｍｇ、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８ ７００ｍｇ、スクロース８０００ｍｇを添加して調製した後に、冷凍乾燥し、凍結乾燥製剤とすることに相当する。
具体的には、製造工程は以下のとおりである。前記ＰＡＣナノ懸濁液に、４０〜１２０ｍｇ／ｍＬ（好ましくは８０ｍｇ／ｍＬ）の量で、凍結乾燥支持剤であるスクロースを添加し、超音波で充分に溶解する。製品が充分に凍結乾燥されることを保証するため、一般に液層の高さが２ｃｍを超えないように制御すべきである。
実験室における製造方法は以下のとおりである。凍結乾燥を必要とするＰＡＣナノ懸濁液（凍結乾燥支持剤を添加済）を２ｍＬ／瓶の量で体積１０ｍＬのバイアルに小分けし、Ｔ字形の栓で蓋をした後（凍結乾燥昇華中に水分を排出できることを保証するため、隙間を残すよう注意する）、−４０℃〜−８０℃（好ましくは−４０℃）の冷凍庫の中で４〜８時間（好ましくは６時間）予備冷凍した後、冷凍乾燥機の中に置き、少なくとも２４時間凍結乾燥する。
上述した方法で製造した凍結乾燥製品は、外観が橙赤色のケーク状で、目が粗く、外形がぎっしりし、崩れ落ちておらず、再溶解性がよい。処方量の滅菌注射用水を添加し、軽く振るだけで完全に再溶解する。再溶解後に、凍結乾燥前に比べ、性状および粒径に基本的に変化がなく、マルバーン・レーザー・ナノ粒度計測器で測定し、再溶解後の平均粒径は２００ｎｍ以下、ＰＤＩ値は０．２５未満であった。
本発明で提供する凍結乾燥製剤は、難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体を懸濁液またはナノ懸濁液として調製し、凍結乾燥支持剤を添加し、冷凍乾燥処理を行い、凍結乾燥製剤を作製する。
難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体を懸濁液またはナノ懸濁液にする方法は以下のとおりである。滅菌注射用水１００ｍＬあたりに、ペクチン−アドリアマイシン共役体５００〜９００ｍｇ、安定剤を添加し、細砕して懸濁液をなす。
さらに懸濁液からナノ懸濁液を作製することができる。具体的には、高圧ホモジナイザーを採用して懸濁液からナノ懸濁液を作製する。
採用する安定剤はＰＶＰ、ポロキサマー、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリソルベートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースの少なくとも１種である。
ＰＶＰ、すなわちポリビニルピロリドンは、安定剤として用い、親水性補助剤であり、ＰＶＰ Ｋ−３０が好ましい。
ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ，安定剤として用いる，親水性補助剤）は、ポロキサマー１８８またはポロキサマー４０７を採用することができ、ポロキサマー１８８が好ましい。
ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ，ＳＤＳ）は、イオン型界面活性剤であり、電荷安定効果を提供することができ、安定剤として用いる。
ポリソルベートは、非イオン型界面活性剤であり、安定剤として用いる。ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）が好ましい。
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，ＨＰＭＣ）は、高分子ポリマーに属し、安定剤として用いる。
懸濁液またはナノ懸濁液の調製に用いる安定剤は、上述したタイプの界面活性剤または高温分子ポリマーを採用することができ、安定電荷を実現し、安定した作用をもたらすことができればよい。
懸濁液またはナノ懸濁液の調製に用いる安定剤は、上述したタイプの界面活性剤または高温分子ポリマーを採用することができ、安定電荷を実現し、安定した作用をもたらすことができればよい。
さらに、難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体を懸濁液にする方法は以下のとおりである。滅菌注射用水１００ｍＬあたりに、ペクチン−アドリアマイシン共役体５００〜９００ｍｇ、ＰＶＰ Ｋ−３０ ３０００〜６０００ｍｇおよびポロキサマー１８８ ５００〜９００ｍｇを添加し、細砕して懸濁液をなす。次いで、さらにナノ懸濁液とする。
具体的には、以下の配合比が好ましい。
ＰＡＣ（有効成分）：７７６ｍｇ（処方中の溶剤、すなわち滅菌注射用水１００ｍＬ。２ｍｇ／ｍＬのアドリアマイシン当量で、２００ｍｇのアドリアマイシンを必要とし、ＰＡＣの負荷投与量は２５．８％、２００／２５．８％＝７７５．１９ｍｇであり、切り上げて７７６ｍｇとする）。
ＰＶＰ Ｋ−３０：４０００ｍｇ（ｗ／ｖ，４％）。
ポロキサマー１８８（すなわちＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）：７００ｍｇ（ｗ／ｖ，０．７％）；
滅菌注射用水（溶剤）：１００ｍＬ。
ＰＡＣ（有効成分）：７７６ｍｇ（処方中の溶剤、すなわち滅菌注射用水１００ｍＬ。２ｍｇ／ｍＬのアドリアマイシン当量で、２００ｍｇのアドリアマイシンを必要とし、ＰＡＣの負荷投与量は２５．８％、２００／２５．８％＝７７５．１９ｍｇであり、切り上げて７７６ｍｇとする）。
ＰＶＰ Ｋ−３０：４０００ｍｇ（ｗ／ｖ，４％）。
ポロキサマー１８８（すなわちＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８）：７００ｍｇ（ｗ／ｖ，０．７％）；
滅菌注射用水（溶剤）：１００ｍＬ。
すなわち、滅菌注射用水１００ｍＬあたりに、ペクチン−アドリアマイシン共役体５００〜９００ｍｇ、ＰＶＰ Ｋ−３０ ３０００〜６０００ｍｇおよびポロキサマー１８８ ５００〜９００ｍｇを添加し、細砕して懸濁液をなす。ナノ懸濁剤を得る場合には、さらに調製すればよい。
上述した処方に基づき、下記の方法を参照して本発明のナノ懸濁剤を調製する。
Ａ、ＰＶＰ Ｋ−３０を取り、滅菌注射用水で配合し、ＰＶＰ Ｋ−３０溶液をなす。
Ｂ、ＰＡＣ、ポロキサマー１８８を乾式細砕して均等に混合する（細砕の目的は、ＰＡＣ細砕の粒径を小さくすることであり、均等であればよい）。次いで、少量のＰＶＰ Ｋ−３０溶液を添加して充分に細砕する（充分とは、ＰＡＣ懸濁液の粒径をさらに小さく、さらに均等にして、高圧ホモジナイザーの均質バルブの詰まりを防止することであり、ＰＡＣ懸濁液の初期粒径が８０ミクロン未満になるまで細砕すればよい）。
Ｃ、余ったＰＶＰ Ｋ−３０溶液を何回かに分けて添加して細砕する。（この操作の目的は、乳鉢に付着したＰＡＣを洗浄し、原料の大量の損失を防止することである。）
Ｄ、細砕後の懸濁液を超音波で充分に混合し、懸濁液を作製する。
Ｅ、ステップＤで均等に混合した懸濁液を、高圧ホモジナイザー（ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ Ｃ−３ ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ，Ａｖｅｓｔｉｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ）で処理する。先ず、機器の圧力を２７．６〜５５．２ＭＰａ（４０００〜８０００ＰＳＩ）に制御する（この操作の目的は、機器に適応過程をもたせ、詰まりの現象の発生を防止することであり、３４．５ＭＰａ（５０００ＰＳＩ）が好ましい）。試料を３〜１０分間循環処理する（この操作の目的は、機器に適応過程をもたせ、詰まりの現象の発生を防止することであり、３分間が好ましい）。次いで、機器の圧力を１３８〜２０７ＭＰａ（２００００ＰＳＩ〜３００００ＰＳＩ）に固定する（現在市販されている機器の圧力の上限は、一般に３００００ＰＳＩ、すなわち２００Ｍｐａである。１７２．５ＭＰａ（２５０００ＰＳＩ）が好ましい）。試料を１５〜３０分間循環処理し（この範囲内で処理時間が長いほど、ナノ懸濁剤中のナノ粒子の均等性ＰＤＩ値がよくなる。コストの要素を考慮し、２０分間処理すればよい）、ＰＡＣナノ懸濁剤を得る。
Ａ、ＰＶＰ Ｋ−３０を取り、滅菌注射用水で配合し、ＰＶＰ Ｋ−３０溶液をなす。
Ｂ、ＰＡＣ、ポロキサマー１８８を乾式細砕して均等に混合する（細砕の目的は、ＰＡＣ細砕の粒径を小さくすることであり、均等であればよい）。次いで、少量のＰＶＰ Ｋ−３０溶液を添加して充分に細砕する（充分とは、ＰＡＣ懸濁液の粒径をさらに小さく、さらに均等にして、高圧ホモジナイザーの均質バルブの詰まりを防止することであり、ＰＡＣ懸濁液の初期粒径が８０ミクロン未満になるまで細砕すればよい）。
Ｃ、余ったＰＶＰ Ｋ−３０溶液を何回かに分けて添加して細砕する。（この操作の目的は、乳鉢に付着したＰＡＣを洗浄し、原料の大量の損失を防止することである。）
Ｄ、細砕後の懸濁液を超音波で充分に混合し、懸濁液を作製する。
Ｅ、ステップＤで均等に混合した懸濁液を、高圧ホモジナイザー（ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ Ｃ−３ ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ，Ａｖｅｓｔｉｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ）で処理する。先ず、機器の圧力を２７．６〜５５．２ＭＰａ（４０００〜８０００ＰＳＩ）に制御する（この操作の目的は、機器に適応過程をもたせ、詰まりの現象の発生を防止することであり、３４．５ＭＰａ（５０００ＰＳＩ）が好ましい）。試料を３〜１０分間循環処理する（この操作の目的は、機器に適応過程をもたせ、詰まりの現象の発生を防止することであり、３分間が好ましい）。次いで、機器の圧力を１３８〜２０７ＭＰａ（２００００ＰＳＩ〜３００００ＰＳＩ）に固定する（現在市販されている機器の圧力の上限は、一般に３００００ＰＳＩ、すなわち２００Ｍｐａである。１７２．５ＭＰａ（２５０００ＰＳＩ）が好ましい）。試料を１５〜３０分間循環処理し（この範囲内で処理時間が長いほど、ナノ懸濁剤中のナノ粒子の均等性ＰＤＩ値がよくなる。コストの要素を考慮し、２０分間処理すればよい）、ＰＡＣナノ懸濁剤を得る。
注意が必要なことは、機器で高圧処理中に温度が上昇し医薬品の物理化学的性質に影響を及ぼすことを防止するため、処理過程全体において、熱交換器を用いて機器の温度を２０〜４０℃に一定にすることである（２５℃が好ましい）。アドリアマイシンは、光感受性を有するため、すべての操作は遮光条件下で行う。
具体的には、実験室での作製は、以下の方法を採用することができる。
Ａ、処方量に基づきＰＶＰ Ｋ−３０を精密に秤取し、処方量の滅菌注射用水で溶液を配合する。
Ｂ、ＰＡＣ、ポロキサマー１８８を精密に秤取してメノウ乳鉢中に置き、乾式細砕して均等に混合する。次いで、少量のＰＶＰ Ｋ−３０溶液を添加して粒径８０ミクロン以下まで充分に細砕する（試験によって乳鉢は２０分間で要求に達することができることを確定した）。
Ｃ、余った溶液を数回に分けて添加して細砕し、懸濁液を三角フラスコに移し、細砕上に付着した懸濁液を少量のＰＶＰ Ｋ−３０の溶液できれいに洗浄する。液体を合わせ、超音波処理して充分に混合する（一般に５分間でよい）。
Ｄ、前処理後の試料（アドリアマイシン当量２ｍｇ／ｍＬに相当）を高圧ホモジナイザーで処理する。先ず、機器の圧力を２７．６〜５５．２ＭＰａ（４０００〜８０００ＰＳＩ）に制御し（３４．５ＭＰａ（５０００ＰＳＩ）が好ましい）、試料を３〜１０分間循環処理する（３分間が好ましい）。次いで、機器の圧力を１３８〜２０７ＭＰａ（２００００ＰＳＩ〜３００００ＰＳＩ）に固定し（１７２．５ＭＰａ（２５０００ＰＳＩ）が好ましい）、試料を１５〜３０分間循環処理する（２０分間が好ましい）。温度を２０〜４０℃に制御する（２５℃が好ましい）。
Ａ、処方量に基づきＰＶＰ Ｋ−３０を精密に秤取し、処方量の滅菌注射用水で溶液を配合する。
Ｂ、ＰＡＣ、ポロキサマー１８８を精密に秤取してメノウ乳鉢中に置き、乾式細砕して均等に混合する。次いで、少量のＰＶＰ Ｋ−３０溶液を添加して粒径８０ミクロン以下まで充分に細砕する（試験によって乳鉢は２０分間で要求に達することができることを確定した）。
Ｃ、余った溶液を数回に分けて添加して細砕し、懸濁液を三角フラスコに移し、細砕上に付着した懸濁液を少量のＰＶＰ Ｋ−３０の溶液できれいに洗浄する。液体を合わせ、超音波処理して充分に混合する（一般に５分間でよい）。
Ｄ、前処理後の試料（アドリアマイシン当量２ｍｇ／ｍＬに相当）を高圧ホモジナイザーで処理する。先ず、機器の圧力を２７．６〜５５．２ＭＰａ（４０００〜８０００ＰＳＩ）に制御し（３４．５ＭＰａ（５０００ＰＳＩ）が好ましい）、試料を３〜１０分間循環処理する（３分間が好ましい）。次いで、機器の圧力を１３８〜２０７ＭＰａ（２００００ＰＳＩ〜３００００ＰＳＩ）に固定し（１７２．５ＭＰａ（２５０００ＰＳＩ）が好ましい）、試料を１５〜３０分間循環処理する（２０分間が好ましい）。温度を２０〜４０℃に制御する（２５℃が好ましい）。
検査の結果、上述した方法で製造したナノ懸濁剤の平均粒径は１６７．３ｎｍであり、多分散性ＰＤＩ値は０．１４１であり（図３参照）、ゼータ電位は−１７．５ｍＶであった。この結果、高圧均質化法で製造したＰＡＣナノ懸濁剤は、各種品質管理指標を満たすことができ、粒径は比較的小さく、注射用ナノ懸濁剤の粒径要求に適合することが示された。同時に、前記粒径分布は、ＥＰＲ効果の粒径に対する要求に適合し（ＥＲＰ効果における粒径の要求が２００ｎｍ未満）、ＰＡＣナノ懸濁剤にＥＰＲの腫瘍標的性を最大限に発揮させることができる。ＰＤＩ値は０．２未満であり、粒径分布範囲が比較的狭いことを説明しており、懸濁液における大粒子の存在割合を保証することができる。ゼータ電位は−１７．５ｍＶであり、比較的高い電位安定性を有する。透過型電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＴＥＭ）でナノ懸濁剤中の粒子形態を観察した。ＴＥＭでは、ＰＡＣナノ懸濁剤における粒子形態が規則的な類似球状であることが明晰に観察され（図１参照）、粒径は２００ｎｍ程度であった。これは、ナノレーザー粒度計で測定された結果と基本的に一致している。
ナノ懸濁液中の粒子は、表面自由エネルギーが比較的大きく、互いに凝集しやすい。ＰＡＣナノ懸濁液の長期安定性を以下の方法で考察した。
新しく製造したＰＡＣナノ懸濁液を、２ｍｇ／ｍＬの量で６個のバイアルに小分けし、遮光後に恒温恒湿器の中に置いた。温度を２５℃に、湿度を６０％±１０％に制御した。３日、１０日、２５日、５０日、９０日、６ヵ月の間隔で、１回に１瓶の試料を取り、粒径および多分散性を測定した。ナノ懸濁液安定性試験の結果、懸濁状態のナノ懸濁液を５０日間置いた後、粒子の間で凝集を開始し、粒径は最初の１６７．３ｎｍから４５８ｎｍ程度まで増加した。半年後に平均粒径が増大し（平均粒径が８９５ナノメートルまで増加した）、懸濁液中の粒子凝集が重大であり、ナノ、ミクロン粒子が共存した（図２参照）。懸濁液中の粒子凝集が重大であり、ナノ、ミクロン粒子が共存し、粒径測定中にミクロン範囲で重大なテーリングが現れ、かつ多分散性が非常に悪くなった（ＰＤＩ値は０．６０２であった）。この現象によって、ナノ懸濁液中に大量の安定剤を添加しても、長期安定性は理想的でないことが示された。従って、ナノ粒子の粒径は不安定で、ＰＡＣのナノ懸濁剤は懸濁液の状態で長期的に保存できない。
本発明のナノ懸濁剤は、さらに以下の方法を採用して製造することができる。
１．ＰＡＣ ０．３〜０．６ｇを、ＰＶＰ ０．４〜１．６ｇ、グリセリン２〜６ｍｌおよび１〜３％のレシチン溶液４０〜６０ｍｌに添加して溶剤とし、懸濁液を調製する。高圧ホモジナイザーを採用して処理し、ナノ懸濁液とする。
具体的には、大分子難溶性ペクチン−アドリアマイシン複合体０．４６８ｇを、ＰＶＰ１ｇ、グリセリン３ｍｌおよび２％のレシチン溶液５０ｍｌに添加して溶剤とし、細砕処理して懸濁液をなす。さらに、ナノ超高圧ホモジナイザー（Ｔ−２００Ｄ型河北廊坊通用機器製造有限公司）で処理する。３回に分けてそれぞれナノ超高圧ホモジナイザーに入れて処理し、１回目の圧力１２０ｍｐａ、２回目の圧力１８０ｍｐａ、３回目の圧力１９０ｍｐａとする。
具体的には、大分子難溶性ペクチン−アドリアマイシン複合体０．４６８ｇを、ＰＶＰ１ｇ、グリセリン３ｍｌおよび２％のレシチン溶液５０ｍｌに添加して溶剤とし、細砕処理して懸濁液をなす。さらに、ナノ超高圧ホモジナイザー（Ｔ−２００Ｄ型河北廊坊通用機器製造有限公司）で処理する。３回に分けてそれぞれナノ超高圧ホモジナイザーに入れて処理し、１回目の圧力１２０ｍｐａ、２回目の圧力１８０ｍｐａ、３回目の圧力１９０ｍｐａとする。
２．ＰＡＣ ０．３〜０．６ｇを、ＰＶＰ ０．４〜１．６ｇ、水およびＤＭＳＯの混合溶剤４０〜６０ｍｌに添加し、懸濁液を調製する。そのうち、水：ＤＭＳＯ＝０．５〜０．８５：０．１５〜０．５である。高圧ホモジナイザーを採用して処理し、ナノ懸濁液とする。
具体的には、大分子難溶性ペクチン−アドリアマイシン複合体０．４６８ｇを、ＰＶＰ １ｇ、水およびＤＭＳＯの混合溶剤５０ｍｌ（水：ＤＭＳＯ＝０．７５：０．２５）に添加し、懸濁剤を調製するか、または高圧ホモジナイザーを採用する処理をさらに採用して、ナノ懸濁液を調製する。具体的には、ナノ超高圧ホモジナイザーを採用して処理し、ナノ懸濁液を調製し、１回の圧力は２００ｍｐａを超えない。（発明者は、Ｔ−２００Ｄ型河北廊坊通用機器製造有限公司を採用。）具体的には、３回に分けてそれぞれナノ超高圧ホモジナイザーに入れて処理することができ、１回目の圧力１２０ｍｐａ、２回目の圧力１８０ｍｐａ、３回目の圧力１９０ｍｐａとする。
上述した方法で調製したナノ懸濁剤は、粒径２００ｎｍ以下、ＰＤＩ値０．２５未満であり、電位絶対値は１０ｍＶよりも高かった。高圧均質化法は、難溶性薬物ＰＡＣをナノ懸濁剤にすることができる。品質検査の結果、ナノ懸濁剤のうち、ナノ粒子の粒径、多分散性は要求に適合し、ゼータ電位値は比較的大きく、懸濁液に比較的高い電位安定性をもたせることが示され、透過型電子顕微鏡下で観察し、粒子形態は規則的な類似球状であった。
安定性は、主に物理的安定性と化学的安定性の２種類に分かれる。物理的安定性とは、ＰＡＣナノ懸濁剤中のナノ粒子の空間安定性をいい、粒径および多分散指数の時間による変化を用いて直接表すことができ、体系のゼータ電位を用いて間接的に説明することもできる。化学的安定性とは、懸濁剤中の有効薬物濃度の経時的な分解の程度をいう。ＰＡＣ懸濁液またはそのナノ懸濁液に存在する長期安定性がよくないという欠陥は、いずれも系の物理的安定性がよくないというものである。
ＰＡＣナノ懸濁剤の長期安定性の欠陥を解決するため、発明者は以下の方法を試みた。
（１）大量のＰＶＰｋ−３０を添加し、系の粘度を増加して、ナノ粒子の凝集を防止した。ＰＶＰｋ−３０は、懸濁化作用をもたらし、分散系の粘度を増加した。ｓｔｏｃｋ方程式（Ｖ＝２ｒ２（ρ１−ρ２）g/９η，η−分散介質の粘度）により、系の粘度が大きいほど、薬物粒子の沈降が緩慢になり、安定性がよくなった。試験において、８％のＰＶＰｋ３０を添加して系の粘度を増加することを試みたことがあるが、系の粘度の大幅な増加に伴い、製造過程における高圧ホモジナイザーが負担する圧力を大きくする必要があり、機器の磨損が大きくなった。これにも関わらず、最後に調製されたＰＡＣナノ懸濁剤の粒径効果はよくなく、平均粒径は３００ｎｍを超え、ＰＤＩ値は０．２５を超えたため、この方法は実行不能である。
（２）ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ，ＳＤＳ）などのイオン型界面活性剤を添加し、電荷安定効果を提供した。ＰＡＣナノ懸濁剤に大量のＳＤＳを添加し、系のゼータ電位絶対値が３０Ｍｖを超えるようにした。しかしながら、安定性試験の結果、依然として理想的でなく、６ヵ月後、懸濁系粒径およびＰＤＩ値がいずれも大幅に増加し、顕著な沈殿まで現れたため、この方法も実行不能である。
２つ目の方法は、製剤の長期保存の安定性をまったく保証できないため、採用できない。１つ目の方法においては、大量のＰＶＰを添加するため、生産コストが増加するとともに、調製されるナノ懸濁剤の粒径およびＰＤＩ値が最も優れたものではない。
各方面の要素を総合的に考慮し、最終的に、発明者は、このナノ懸濁剤で凍結乾燥製剤を作製した。最終的な検証によって、ＰＡＣナノ懸濁液凍結乾燥製品の外形、再溶解性および粒径などは、いずれも条件を満たした。
凍結乾燥製品においては、一般に凍結乾燥支持剤が添加され、マンニトール、デキストラン、ラクトース、スクロース、グルコース、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの複数種の物質をいずれも凍結乾燥支持剤とすることができる。具体的には、薬剤および処方の違いにより、支持剤の用量も異なり、用量は統一されておらず、差が非常に大きく、ミリグラムからグラムクラスまである。また、上述した物質は、いずれも凍結乾燥支持剤とすることができるが、凍結乾燥支持剤の違いによって、凍結乾燥製品の外観形態、質感、再溶解性および凍結乾燥前後のナノ懸濁剤粒径の変化などに対する影響が著しいため、発明者は、外観、再溶解性および凍結乾燥前後の粒径の違いを指標とし、凍結乾燥製品の目が粗く、外形がぎっしりし、再溶解性がよく、かつ凍結乾燥前後で粒径に大きな差のない凍結乾燥支持剤を選択した。外観形態、再溶解の速さ、再溶解前後の粒径変化などは、具体的には表１を参照。
選定試験から、多くの凍結乾燥支持剤のうち、スクロースの凍結乾燥効果が最もよく、外観形態、再溶解の速さおよび再溶解前後の粒径の差なども最も優れていることが分かるため、スクロースをナノ懸濁剤の凍結乾燥支持剤として選択した。
また、発明者は、ラクトース、スクロース、グルコース、ソルビトール、マンニトールを添加、およびいかなる支持剤も添加しないという６種類の条件で、ＰＡＣナノ懸濁液で凍結乾燥製剤を作製する状況をそれぞれ考察し、うち５つの支持剤の添加量をそれぞれ４０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬとした。試験の結果、６種類の状況のうち、８０ｍｇ／ｍＬのスクロースを添加した製品が最もよく、外観および再溶解性がよく、凍結乾燥前後にほとんど差がないことが示された。そのため、処方において好ましい凍結乾燥支持剤を８０ｍｇ／ｍＬのスクロースとした。
具体的には、本発明の凍結乾燥製剤の処方は以下のとおりである。本発明の凍結乾燥製剤は、滅菌注射用水１００ｍＬあたりにＰＡＣ ５００〜９００ｍｇ、ＰＶＰ Ｋ−３０ ３０００〜６０００ｍｇ、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８ ５００〜９００ｍｇ、スクロース４０００〜１２０００ｍｇを添加して調製した後に冷凍乾燥し、凍結乾燥製剤としたものである。好ましくは、滅菌注射用水１００ｍＬあたりにＰＡＣ ７７６ｍｇ、ＰＶＰ Ｋ−３０ ４０００ｍｇ、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８ ７００ｍｇ、スクロース８０００ｍｇを添加して調製する（次いで、冷凍乾燥し、凍結乾燥製剤とする）。具体的な製造工程は以下のとおりである。前記方法でＰＡＣナノ懸濁液を調製した後、４０〜１２０ｍｇ／ｍＬ（好ましくは８０ｍｇ／ｍＬ）の量で、凍結乾燥支持剤であるスクロースを添加し、超音波で充分に溶解する。製品が充分に凍結乾燥されることを保証するため、一般に液層の高さが２ｃｍを超えないように制御すべきである。凍結乾燥時に、凍結乾燥するナノ懸濁剤を−４０℃の冷凍庫の中に置き、６時間予備冷凍する。次いで、冷凍乾燥機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｏｄｕｌｙｏ（ｓａｖａｎｆ），Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ． ＵＳＡ）の中に置き、２４時間凍結乾燥すればよい。
また、下記の懸濁剤で凍結乾燥製剤を作製することもできる。すなわち、ＰＡＣ ０．４６８ｇを、ＰＶＰ １ｇ、グリセリン３ｍｌおよび２％のレシチン溶液５０ｍｌに添加して溶剤とし、細砕処理して懸濁剤を調製し（上述した懸濁剤は、ＰＡＣ ０．３〜０．６ｇを、ＰＶＰ ０．４〜１．６ｇ、グリセリン２〜６ｍｌおよび１〜３％のレシチン溶液４０〜６０ｍｌに添加して溶剤とし、懸濁液を調製することもできる）。ナノ超高圧ホモジナイザー（Ｔ−２００Ｄ型河北廊坊通用機器製造有限公司）で処理することもできる。３回に分けてそれぞれナノ超高圧ホモジナイザーに入れて処理し、毎回の圧力は２００ｍｐａを超えない（１回目の圧力１２０ｍｐａ、２回目の圧力１８０ｍｐａ、３回目の圧力１９０ｍｐａ）。懸濁剤を調製した後、４０〜１２０ｍｇ／ｍＬのラクトース、スクロース、グルコース、ソルビトール、マンニトールを添加し、上述した冷凍乾燥工程で凍結乾燥製剤を作製する。スクロースを凍結乾燥支持剤とすることが好ましく、添加量は８０ｍｇ／ｍＬが好ましい。
また、ＰＡＣ ０．４６８ｇを、ＰＶＰ １ｇ、水およびＤＭＳＯの混合溶剤５０ｍｌ（水：ＤＭＳＯ＝０．７５：０．２５）に添加し、懸濁剤を調製し（上述した懸濁剤は、ＰＡＣ ０．３〜０．６ｇを、ＰＶＰ ０．４〜１．６ｇ、水およびＤＭＳＯ［うち、水：ＤＭＳＯ＝０．５〜０．８５：０．１５〜０．５］の混合溶剤４０〜６０ｍｌを添加し、研磨剤を調製することもできる）、ナノ超高圧ホモジナイザー（Ｔ−２００Ｄ型河北廊坊通用機器製造有限公司）で処理することもできる。３回に分けてそれぞれナノ超高圧ホモジナイザーに入れて処理し、１回目の圧力１２０ｍｐａ、２回目の圧力１８０ｍｐａ、３回目の圧力１９０ｍｐａとし、懸濁剤を調製した後、４０〜１２０ｍｇ／ｍＬのラクトース、スクロース、グルコース、ソルビトール、マンニトールを添加し、上述した冷凍乾燥工程で凍結乾燥製剤を作製する。スクロースを凍結乾燥支持剤とすることが好ましく、添加量は８０ｍｇ／ｍＬが好ましい。
凍結乾燥注射剤の長期安定性を考察するため、以下の実験を行った。凍結乾燥処理後のナノ懸濁液（この凍結乾燥懸濁液は、好ましい凍結乾燥製剤の処方で調製した。すなわち、滅菌注射用水１００ｍＬあたりにＰＡＣ ７７６ｍｇ、ＰＶＰ Ｋ−３０ ４０００ｍｇ、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８ ７００ｍｇ、スクロース ８０００ｍｇを添加した）６瓶を抜き取り、遮光後に恒温恒湿器の中に置き、温度を２５℃、湿度を６０％±１０％に制御した。３日、１０日、２５日、５０日、９０日、半年の間隔で、１回に１瓶の試料を取り、粒径および多分散性を測定した。同じ試験条件で、ＰＡＣナノ懸濁液凍結乾燥製品を常温条件で半年放置した後に測定し、粒径は１８２．３ｎｍであった。新しく調製した懸濁液凍結乾燥製品の１７２．６ｎｍに比べ、粒径にほとんど大きな変化がなかった。この試験の結果、懸濁液を凍結乾燥製品にした後、懸濁した保存状態に比べ、安定性が大幅に向上した。ナノ懸濁剤の粒径安定性の面から出発し、ＰＡＣナノ懸濁剤を凍結乾燥製品にし、保存の長期安定性を保証することができる。
本発明のＰＡＣナノ懸濁剤の予定される投与経路は静脈注射であるため、粒径を厳格に制御すべきである。６ヵ月安定性試験の結果、ＰＡＣナノ懸濁剤の初期平均粒径は１６７．３ｎｍ、６ヵ月後の平均粒径は８９５ｎｍであり、かつ粒径凝集度が重大であり、ナノミクロン粒子が共存していることが示された。凍結乾燥後のＰＡＣナノ懸濁剤の初期平均粒径は１７２．６ｎｍ、６ヵ月後の平均粒径は１８２．３ｎｍであり、粒径にほとんど大きな変化がなかった。この結果、ＰＡＣナノ懸濁剤は懸濁状態で長期保存することができず、凍結乾燥製品は長期安定性が良好であり、長期保存できることが示された。ＰＡＣナノ懸濁剤の予定される投与経路は静脈注射であるため、粒径に対する制御は厳しく要求すべきである。普通のナノ懸濁剤と凍結乾燥したナノ懸濁剤とを比較し、後者は粒径安定性の保証の面で、絶対的な優位性を有する。
発明者は、さらにＰＡＣ製剤の長期保存中の負荷投与量について、以下の方法でモニタリングを行った。
１．方法
１．１ 負荷投与量の測定方法
１．１．１ 塩酸アドリアマイシン標準曲線の作成
塩酸アドリアマイシン１０．７ｍｇを精密に秤取し、１００ｍＬメスフラスコの中に入れ、滅菌注射用水で定容して貯蔵液とし、超音波で５分間均等に混合した。塩酸アドリアマイシンの貯蔵液各０．２ｍｌ、０．４ｍｌ、０．８ｍｌ、１．２ｍｌ、１．６ｍｌ、２ｍｌを５ｍｌメスフラスコの中に入れ、それぞれ滅菌注射用水で定容し、よく振った。紫外分光法で、４８０ｎｍの箇所で上述した一連の濃度勾配のアドリアマイシン溶液の吸光度Ａ値を測定した。吸光度Ａを縦座標とし、アドリアマイシンの質量濃度Ｃ（ｍｇ・ｍＬ−１）を横座標とし、線形回帰を行い、方程式：Ａ＝０．０１７８Ｃ＋０．０２８４，Ｒ２＝０.９９９４（ｎ＝３）を得た。
１．１ 負荷投与量の測定方法
１．１．１ 塩酸アドリアマイシン標準曲線の作成
塩酸アドリアマイシン１０．７ｍｇを精密に秤取し、１００ｍＬメスフラスコの中に入れ、滅菌注射用水で定容して貯蔵液とし、超音波で５分間均等に混合した。塩酸アドリアマイシンの貯蔵液各０．２ｍｌ、０．４ｍｌ、０．８ｍｌ、１．２ｍｌ、１．６ｍｌ、２ｍｌを５ｍｌメスフラスコの中に入れ、それぞれ滅菌注射用水で定容し、よく振った。紫外分光法で、４８０ｎｍの箇所で上述した一連の濃度勾配のアドリアマイシン溶液の吸光度Ａ値を測定した。吸光度Ａを縦座標とし、アドリアマイシンの質量濃度Ｃ（ｍｇ・ｍＬ−１）を横座標とし、線形回帰を行い、方程式：Ａ＝０．０１７８Ｃ＋０．０２８４，Ｒ２＝０.９９９４（ｎ＝３）を得た。
１．１．２ ＰＡＣナノ懸濁液の負荷投与量の測定
ＰＡＣナノ懸濁液（好ましい方法で調製）１ｍＬを精密に吸い取り、５０ｍＬメスフラスコの中に入れ（ＰＡＣナノ懸濁剤濃度７．７６ｍｇ／ｍＬ）、滅菌注射用水で定容して均等に振った後、適量を取り、４８０ｎｍで吸光度を測定し、標準曲線を作成してアドリアマイシン濃度Ｃｘを得た。ＰＡＣ負荷投与量＝（Ｃｘ／７．７６）×１００％。
ＰＡＣナノ懸濁液（好ましい方法で調製）１ｍＬを精密に吸い取り、５０ｍＬメスフラスコの中に入れ（ＰＡＣナノ懸濁剤濃度７．７６ｍｇ／ｍＬ）、滅菌注射用水で定容して均等に振った後、適量を取り、４８０ｎｍで吸光度を測定し、標準曲線を作成してアドリアマイシン濃度Ｃｘを得た。ＰＡＣ負荷投与量＝（Ｃｘ／７．７６）×１００％。
１．１．３ ＰＡＣ凍結乾燥製剤の負荷投与量の測定
ＰＡＣ凍結乾燥製剤（好ましい方法で調製）１瓶を取り、２ｍＬ滅菌注射用水で再溶解して均等なナノ懸濁液とした。再溶解後のＰＡＣナノ懸濁液１ｍＬを精密に吸い取り、５０ｍＬメスフラスコの中に入れ（ＰＡＣナノ懸濁剤濃度７．７６ｍｇ／ｍＬ）、滅菌注射用水で定容して均等に振った後、適量を取り、４８０ｎｍで吸光度を測定し、標準曲線を作製してアドリアマイシン濃度Ｃｘを得た。ＰＡＣ負荷投与量＝（Ｃｘ／７．７６）×１００％。
ＰＡＣ凍結乾燥製剤（好ましい方法で調製）１瓶を取り、２ｍＬ滅菌注射用水で再溶解して均等なナノ懸濁液とした。再溶解後のＰＡＣナノ懸濁液１ｍＬを精密に吸い取り、５０ｍＬメスフラスコの中に入れ（ＰＡＣナノ懸濁剤濃度７．７６ｍｇ／ｍＬ）、滅菌注射用水で定容して均等に振った後、適量を取り、４８０ｎｍで吸光度を測定し、標準曲線を作製してアドリアマイシン濃度Ｃｘを得た。ＰＡＣ負荷投与量＝（Ｃｘ／７．７６）×１００％。
１．２ ＰＡＣナノ懸濁液の負荷投与量のモニタリング
新しく製造したＰＡＣナノ懸濁液を、２ｍｇ／ｍＬの量で６個のバイアルに小分けし、遮光後に恒温恒湿器の中に置いた。温度を２５℃に、湿度を６０％±１０％に制御した。３日、１０日、２５日、５０日、９０日、６ヵ月の間隔で、１回に１瓶の試料を取り、１．１．２項により負荷投与量を測定した。
新しく製造したＰＡＣナノ懸濁液を、２ｍｇ／ｍＬの量で６個のバイアルに小分けし、遮光後に恒温恒湿器の中に置いた。温度を２５℃に、湿度を６０％±１０％に制御した。３日、１０日、２５日、５０日、９０日、６ヵ月の間隔で、１回に１瓶の試料を取り、１．１．２項により負荷投与量を測定した。
１．３ ＰＡＣ凍結乾燥製剤の負荷投与量のモニタリング
凍結乾燥処理後のＰＡＣナノ懸濁液（凍結乾燥製剤の調製を参照）６瓶を抜き取り、遮光後に恒温恒湿器の中に置き、温度を２５℃、湿度を６０％±１０％に制御した。３日、１０日、２５日、５０日、９０日、半年の間隔で、１回に１瓶の試料を取り、１．１．３項により負荷投与量を測定した。
凍結乾燥処理後のＰＡＣナノ懸濁液（凍結乾燥製剤の調製を参照）６瓶を抜き取り、遮光後に恒温恒湿器の中に置き、温度を２５℃、湿度を６０％±１０％に制御した。３日、１０日、２５日、５０日、９０日、半年の間隔で、１回に１瓶の試料を取り、１．１．３項により負荷投与量を測定した。
２．結果
ＰＡＣナノ懸濁剤を作製する原薬の負荷投与量は２５．８％であった。ＰＡＣナノ懸濁剤の負荷投与量は、保存中に徐々に低下する傾向にあり、６ヵ月後の負荷投与量は２０．３％になった。凍結乾燥していないナノ懸濁液に比べ、ＰＡＣ凍結乾燥製剤の負荷投与量は保存中に安定する傾向にあり、６ヵ月後の負荷投与量は２４．６％であった。
ＰＡＣナノ懸濁剤を作製する原薬の負荷投与量は２５．８％であった。ＰＡＣナノ懸濁剤の負荷投与量は、保存中に徐々に低下する傾向にあり、６ヵ月後の負荷投与量は２０．３％になった。凍結乾燥していないナノ懸濁液に比べ、ＰＡＣ凍結乾燥製剤の負荷投与量は保存中に安定する傾向にあり、６ヵ月後の負荷投与量は２４．６％であった。
アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ，ＡＤＭ）およびペクチンを反応させて作製したＰＡＣは、大分子プロドラッグである。プロドラッグは、そのままでは不活性の医薬品であり、標的部位に達するまでは活性を有さないか、または非常に低い活性しか有さず、標的部位に達した後、酵素の触媒作用または非酵素作用によって活性化し、活性物質を放出することにより薬理作用を発揮する。ＰＡＣは、保存中に、ＡＤＭをゆっくりと放出し、体内のパッシブターゲティング抗癌活性に対して大きな影響を及ぼす。そのため、ＰＡＣナノ懸濁剤とナノ懸濁剤の凍結乾燥製剤とを比較すると、凍結乾燥製剤は顕著な優位性を有する。
３．結論
原薬の負荷投与量の安定性の面から考慮し、ナノ懸濁剤の保存中に、ナノ粒子の粒径は不安定であり、凝集が増大する傾向にある。ナノ懸濁剤を凍結乾燥製品にした後、ナノ粒径の安定性は増強される。また、ＰＡＣは、水を媒体としたナノ懸濁剤において、負荷投与量が不安定である、最初の２５．８％から２１．６％まで下がる。凍結乾燥製品にした後、負荷投与量の安定性が増強される。そのため、ＰＡＣナノ懸濁剤を凍結乾燥製品にすると、ＰＡＣ保存の長期安定性をさらに保証することができる。
原薬の負荷投与量の安定性の面から考慮し、ナノ懸濁剤の保存中に、ナノ粒子の粒径は不安定であり、凝集が増大する傾向にある。ナノ懸濁剤を凍結乾燥製品にした後、ナノ粒径の安定性は増強される。また、ＰＡＣは、水を媒体としたナノ懸濁剤において、負荷投与量が不安定である、最初の２５．８％から２１．６％まで下がる。凍結乾燥製品にした後、負荷投与量の安定性が増強される。そのため、ＰＡＣナノ懸濁剤を凍結乾燥製品にすると、ＰＡＣ保存の長期安定性をさらに保証することができる。
Claims (12)
- 凍結乾燥支持剤を含む難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体のナノ懸濁液の凍結乾燥製剤であって、
前記凍結乾燥支持剤が、マンニトール、デキストラン、ラクトース、スクロース、グルコース、ソルビトールまたは塩化ナトリウムの少なくとも１種であり、
前記凍結乾燥支持剤の添加量が４０〜１２０ｍｇ／ｍＬである、ペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤。 - 前記凍結乾燥支持剤がスクロースであることを特徴とする請求項１に記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤。
- 前記凍結乾燥支持剤の添加量が８０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項１に記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤。
- （１）難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体をナノ懸濁液として調製するステップと、
（２）凍結乾燥支持剤を添加し、冷凍乾燥するステップと、
を含み、前記冷凍乾燥処理の方法は、以下のとおりであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤の製造方法。
Ａ、懸濁液をバイアル中に小分けし、−４０℃〜−８０℃の条件下で４〜８時間予備冷凍する。
Ｂ、さらに冷凍乾燥機の中に置いて冷凍乾燥する。 - 難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体をナノ懸濁液にする方法は、滅菌注射用水１００ｍＬあたりに、ペクチン−アドリアマイシン共役体５００〜９００ｍｇ及び安定剤を添加して細砕して懸濁液とした後、ナノ懸濁液にすることを特徴とする請求項４に記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤の製造方法。
- 前記安定剤は、ＰＶＰ、ポロキサマー、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリソルベートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースの少なくとも１種であることを特徴とする請求項５に記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤の製造方法。
- 難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体を懸濁液にする方法は、滅菌注射用水１００ｍＬあたりに、ペクチン−アドリアマイシン共役体５００〜９００ｍｇ、ＰＶＰ Ｋ−３０ ３０００〜６０００ｍｇおよびポロキサマー１８８ ５００〜９００ｍｇを添加し、粉砕して懸濁液とすることを特徴とする請求項４に記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤の製造方法。
- 滅菌注射用水１００ｍＬあたりにペクチン−アドリアマイシン共役体 ５００〜９００ｍｇ、ＰＶＰ Ｋ−３０ ３０００〜６０００ｍｇ、ポロキサマー１８８ ５００〜９００ｍｇ、スクロース４０００〜１２０００ｍｇを添加して調製した後に冷凍乾燥し、凍結乾燥製剤としたものであることを特徴とする請求項７に記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤の製造方法。
- 難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体を懸濁液にする方法は、ペクチン−アドリアマイシン共役体 ０．３〜０．６ｇを、ＰＶＰ ０．４〜１．６ｇ、グリセリン２〜６ｍｌおよび１〜３％のレシチン溶液４０〜６０ｍｌに添加して溶剤とし、懸濁液を調製することを特徴とする請求項４に記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤の製造方法。
- 難溶性ペクチン−アドリアマイシン共役体を懸濁液にする方法は、ペクチン−アドリアマイシン共役体 ０．３〜０．６ｇを、ＰＶＰ ０．４〜１．６ｇ、水およびＤＭＳＯの混合溶剤４０〜６０ｍｌに添加し、懸濁液を調製し、水：ＤＭＳＯ＝０．５〜０．８５：０．１５〜０．５であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤の製造方法。
- 懸濁液を調製した後、高圧ホモジナイザーを採用して処理し、ナノ懸濁液を調製することを特徴とする請求項９または１０に記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤の製造方法。
- 請求項７により各成分を秤取した後、以下の方法でペクチン−アドリアマイシン共役体のナノ懸濁液を製造することを特徴とする請求項７に記載のペクチン−アドリアマイシン共役体の凍結乾燥製剤の製造方法。
Ａ．ＰＶＰ Ｋ−３０を取り、滅菌注射用水に配合してＰＶＰ Ｋ−３０溶液を調製し、
Ｂ．ペクチン−アドリアマイシン共役体、ポロキサマー１８８を取り、乾式細砕して均等に混合した後、少量のＰＶＰ Ｋ−３０溶液を添加して充分に細砕し、
Ｃ．余ったＰＶＰ Ｋ−３０溶液を数回に分けて添加して細砕し、
Ｄ．細砕後の懸濁液を超音波で充分に混合して懸濁液を作製し
Ｅ．ステップＤで均等に混合した懸濁液を高圧ホモジナイザーで処理し、先ず、機器の圧力を４０００〜８０００ＰＳＩに制御し、試料を３〜１０分間循環処理した後、機器の圧力を２００００ＰＳＩ〜３００００ＰＳＩに固定し、試料を１５〜３０分間循環処理し、ナノ懸濁液を得る。
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