JP2024511879A - ヘパロサンを産生する組換え細胞 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヘパロサンの生物産生の分野に関する。高度に効率的な合成及び分泌を可能にするヘパロサン産生方法が、当該技術分野において必要とされている。本発明において提案される解決策は、本明細書に記載される多数の改変を含む遺伝子改変された細胞の使用である。本発明は、本発明の遺伝子改変された細胞を使用して、制御された分子量を有するヘパロサンの生物産生を可能にする方法を更に提案する。

Description

本発明は、ヘパロサンの生物産生の分野に関する。
N-アセチルヘパロサンとしても知られているヘパロサンは、ヒドラから脊椎動物までの動物において見出されるヘパリン及びヘパラン硫酸の、天然の真核生物の生物合成前駆体である。より具体的には、反復二糖単位[→4)β-D-グルクロン酸(GlcA)(1→4)N-アセチル-a-D-グルコサミン(GlcNAc)(l→]n.を有する多糖である。自然界では、大腸菌(Escherichia coli)K5及びパスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)D型株が、莢膜多糖としてヘパロサンを産生する(Lindahl U.ら、(1998) J. Biol. Chem., 273(39):24979-24982)。
ヘパロサン由来の誘導体は、止血因子(例えば、抗トロンビンIII、トロンビン)、成長因子(例えば、EGF、VEGF)、及びケモカイン(例えば、IL-8、血小板因子4)、並びにウイルス病原体(例えば、ヘルペス、デング熱)の接着性タンパク質を含む、様々な極めて重要なポリペプチドに結合する。これらの誘導体の中でも、もっとも広く使用されている抗凝固剤又は抗トロンビン薬のうちの1つであるヘパリンは、例えば、血栓塞栓症及び播種性血管内凝固(DIC)の処置、体外循環、及び人口透析中の血液凝固の予防において有用である。加えて、最近の研究では、ヘパリンが、その抗凝固活性とは別個かつ異なる相当な抗新生物活性を有し得ることが示唆され、一方で他の研究では、炎症、不妊、及び感染性疾患を処置することにおけるヘパリンの役割を示す。
現在主に知られているヘパリンの供給源は、動物組織、例えば、ブタ腸粘膜からの抽出であるが、不純物及び汚染の危険性が付随する。
微生物からヘパロサンを調製するための発酵方法は、可能性として規模拡大により低費用で大量のヘパロサンの産生が容易となることから、特に関心が高い。更に、非常に高い分子量のヘパロサンが得られる動物源からのヘパロサン及びその誘導体の単離とは対照的に、微生物発酵は、ある特定の程度まで、出発分子量のサイズを制御することを可能にする。これにより、機械的、物理的、又は化学的手段による更なる分別工程の必要性が回避される。
この目的で、組換えバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)宿主細胞は、10～300KDaの範囲内のヘパロサンを産生する能力を示している(A. Williamsら、Microb. Cell. Fact. 2009 Aug 12; 18(1):132)。同様に、大腸菌K5株は、ヘパロサンを産生する能力を示しているが(Wang Z.ら、(2010) Biotechnol. Bioeng., 107(6):964-973)、しかしながら、基質消費速度の改善及び発酵槽における酸素供給の増加等、依然として解決されないままとなっている課題が多数存在する。
生物学的分子の産生に一般に使用される他の微生物とは対照的に、酵母は、概して、安全であると認識されている。それらは、急速に成長し得、細菌と比較して高密度で培養することができ、無菌環境を必要としない。更に、酵母細胞は、細菌よりも容易に培養培地から分離することができ、産物の抽出及び精製のプロセスを大幅に単純化することができる。最後に、酵母は、培養培地のpHの変化に対してより抵抗性であるという利点を提示し、そのため、より強力な発酵系を表す。
しかしながら、酵母のなかで、種間の特徴を区別することはまた、ある特定の課題を提示し得る。これは、主として、種間における代謝の差に起因する。例えば、P.パストリスにおけるゲノム組込みは安定であるが、1つの形質転換から高変動性のクローンが生じることが多く、様々な産生性特徴又はそれらの生理学における変化を示す。これにより、所望される用途に最適な特性を有するクローンを見出すためには時間のかかるスクリーニングプロセスが必要となる。このクローン変動性は、付加価値のある化学物質を産生するためのプラットフォームとしてのP.パストリスの更なる開発にとって、重大な欠点である。P.パストリスを使用する別の欠点は、それがメタン資化性生物であることである。
対照的に、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、ヒトによって(例えば、ワイン、ビール、又はパンにおいて)使用されるようになってから長い安全な歴史があり、そのため、遺伝子情報が当該技術分野において周知である十分に確立されたモデルであるため、目的の分子の産生のためのツールとして、特に有用である。S.セレビシエは、更に、概してヒト及び動物に対して安全であると認識されているという利点を提示する。更には、この酵母を培養したときに生じる培地の酸性化により、バイオファーメンターの汚染の可能性が低減され、したがって、培地に抗生物質を添加する必要性が排除される。最後に、そのゲノムの安定な改変(染色体内への組込み)を可能にする多数の遺伝子ツールが、開発されている。
Lindahl U.ら、(1998) J. Biol. Chem., 273(39):24979-24982 A. Williamsら、Microb. Cell. Fact. 2009 Aug 12; 18(1):132 Wang Z.ら、(2010) Biotechnol. Bioeng., 107(6):964-973 Astら、(2013) Cell 152: 1134-1145 Ast及びSchuldiner (2013) Crit Rev Biochem Mol Biol 48(3) 273-288 Van der Vaartら、(1997) Applied Environmental Microbiology 63(2) 615-620 D. Burkeら、Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison、1～44頁、Addison Wesley Needleman, S. B.及びWunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453 Rice, P. LongdenJ.及びBleasby、A. Trends in Genetics 16, (6) 276-277頁 http://emboss.bioinformatics.nl/ Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877 Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80 http://hmmer.wustl.edu/ https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ Myers及びMiller (1989 - Cabios 4: 11-17) Altschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: 154-162 www.idtdna.com/CodonOptfrom Murrayら、1989, Nucl Acids Res. 17: 477-508 Dalphinら、1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8 Bitter及びMuir (Analytical Biochemistry, 4, 330-334, 1962) Oka及びJigami (FEBS Journal 273, 2645-2657, 2006) Legrainら、(1982) European Journal of Biochemistry 123, 611-616 Roonら、(1974) Journal of bacteriology 118,89-95 Shiga Shibatan及びHiroaki Kitazawa (Plant Biotechnology 26, 149-152, 2009) Mioら(The Journal of Biological Chemistry, Col. 273, No 23, June 5, 1998, 14392-14397) Tiwari及びBhat (Biochemical and Biophysical Research Communications 366, 340-345, 2008) Roeben (J. Mol. Biol 364, 551-560, 2006) Liら(Anal. Biochem. 370, 142-146, 2007) Bandiniら(Molecular Microbiology 85(3), 513-534, 2012) Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58 Yamanishiら、(2013) ACS synthetic biology 2, 337-347 Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Crueger, Crueger, and Brock, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992) Kiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970 「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland Cherestら、(2000) J Biol. Chem. 275: 14056-14063
したがって、高度に効率的な合成及び分泌を可能にする更なるヘパロサン産生方法が、依然として当該技術分野において必要とされている。特に、費用効率的であり、ヒト適用に安全であるヘパロサンを供給する産生方法を提供する必要性が、依然として存在している。
特定の場合において、具体的かつ制御されたサイズの大量のヘパロサンを得ることを可能にするヘパロサン産生方法が、当該技術分野において依然として必要とされている。
本発明は、したがって、以下の項目に関する。
項目1:ヘパロサンを産生する組換え酵母細胞であって、
(a)ヘパロサンシンターゼ(HSS)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と、
(b)UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH又はHASB)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と
を含む組換え酵母細胞。
実施例に示されるように、本発明の組換え酵母は、天然にはヘパロサンを産生することができない酵母細胞におけるヘパロサンの産生を可能にする。
前記有利な特性は、酵母を、これ以降に記載される追加の改変により組み換えることによって、更に増加させることができる。
項目2:グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含み、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドが、分泌シグナル及び任意選択でアンカリングシグナルを含む、項目1に記載の組換え細胞。
項目3:ヘパロサンを産生する組換え宿主細胞であって、
(a)ヘパロサンシンターゼ(HSS)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と、
(b)UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH若しくはHASB)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と、
(c)グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と
を含み、
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドが、ヘパロサン、特に、所望される分子量のものが宿主細胞によって産生されるように分泌シグナル及び任意選択でアンカリングシグナルを含む、
組換え宿主細胞。
項目4:グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、ペドバクター・ヘパリヌス(Pedobacter heparinus)から得られるか、又はそれに由来する、項目2又は3に記載の組換え細胞。
項目5:グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、pTEF1、pCCW12、pCCW12.sba、pCCW12.Sar、pPDC1、pTEF3、pTDH3、pNUP57、及びpCCW10.agoからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、項目2から4のいずれか1つに記載の組換え細胞。
項目6:ヘパロサンの分子量が、50kDa未満の範囲内、好ましくは、約20kDa～約50kDaの範囲内にある、項目2から5のいずれか1つに記載の組換え細胞。
項目7:ヘパロサンの分子量が、50kDaを上回る範囲内、好ましくは、約50kDa～約250kDaの範囲内にある、項目2から5のいずれか1つに記載の組換え細胞。
項目8:ヘパロサンの分子量が、100kDaを上回る範囲内、好ましくは、約100kDa～約1500kDaの範囲内にある、項目2から5のいずれか1つに記載の組換え細胞。
項目9:UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH又はHASB)活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)、クロレラウイルスPBCV1、又はストレプトコッカス・ズーエピデミクスのうちの少なくとも1つから得られるか、又はそれに由来し、特に、アラビドプシス・サリアナ又はクロレラウイルスPBCV1から得られるか、又はそれに由来する、項目1から8のいずれか1つに記載の組換え細胞。
項目10:ヘパロサンシンターゼ(HSS)活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、パスツレラ・ムルトシダから得られるか、又はそれに由来する、項目1から9のいずれか1つに記載の組換え細胞。
項目11:
(i)グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
(ii)UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)活性を有するポリペプチド
のうちの1つ又は複数をコードする少なくとも1つの組換え核酸を更に含む、項目1から10のいずれか1つに記載の組換え細胞。
項目12:(i)ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
(ii)UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
(iii)グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
(iv)ホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)活性を有するポリペプチド
のうちの1つ又は複数をコードする少なくとも1つの組換え核酸を更に含む、項目1から11のいずれか1つに記載の組換え細胞。
項目13:
- グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- ホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)を有するポリペプチドをコードする核酸
が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)から得られるか、又はそれに由来する、
項目11又は12に記載の組換え細胞。
項目14:組換え宿主細胞が、酵母である、項目3から13のいずれか1つに記載の組換え宿主細胞。
項目15:サッカロマイセス(Saccharomyces)属、又はカンジダ(Candida)属、又はクルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、又はオガタエア(Ogataea)属、又はヤロウイア(Yarrowia)属、又はデバリオマイセス(Debaryomyces)属、又はアシュビア(Ashbya)属、特に、サッカロマイセス属に属する、項目1から14のいずれか1つに記載の組換え細胞。
項目16:サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ブラウディ(Saccharomyces boulardii)、サッカロマイセス・バヤヌス(Saccharomyces bayanus)、サッカロマイセス・パラドクサス(Saccharomyces paradoxus)、サッカロマイセス・ミカタエ(Saccharomyces mikatae)、サッカロマイセス・カステリ(Saccharomyces castelli)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロマイセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クルイベロマイセス・ポリスポラス(Kluyveromyces polysporus)、クルイベロマイセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerens)、オガタエア・ポリモルファ(Ogataea polymorpha)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lypolytica)、デバリオマイセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)、及びアシュビア・ゴシピ(Ashbya gossypii)からなる群から選択され、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエである、項目15に記載の組換え細胞。
項目17:ヘパロサンを産生させる方法であって、
(a)項目1から16のいずれか1つに記載の組換え細胞を、培養培地において、ヘパロサンを産生させるのに十分な時間、培養する工程と、
(b)任意選択で、組換え細胞及び/又は培養培地から、ヘパロサンを単離又は回収する工程と
を含む方法。
項目18:ヘパロサンが、約20kDa～約50kDAの分子量を有する、項目17に記載の方法。
項目19:ヘパロサンが、約50kDa～約150kDaの分子量を有する、項目17に記載の方法。
項目20:ヘパロサンが、約150kDa～約1500kDaの分子量を有する、項目17に記載の方法。
項目21:組換え細胞が、サッカロマイセス属に属する酵母である、項目17から20のいずれか1つに記載の方法。
項目22:ヘパロサンを産生させるのに十分な時間が、約35～約50時間、好ましくは、約40～約50時間、好ましくは、約48時間の期間である、項目17から21のいずれか1つに記載の方法。
項目23:産生されるヘパロサンの分子量が、工程(a)中の培養培地のpHを調節することによって制御される、項目17から22のいずれか1つに記載の方法。
項目24:方法が、工業規模で実施され、好ましくは、培養培地が、少なくとも約100L、より好ましくは約1000L～約3000Lの範囲、更により好ましくは約10,000L、又は更により好ましくは約100,000L、又は更には約250,000Lである、項目17から23のいずれか1つに記載の方法。
項目25:項目1から15のいずれか1つに記載の組換え細胞から、又は項目17から24のいずれか1つに記載の方法から得ることができるヘパロサン。
項目26:項目25に記載のヘパロサンを含む培養培地。
項目27:項目25に記載のヘパロサンを含む組成物。
項目28:(i)項目6から8のいずれか1つに規定の分子量を有する項目25に記載のヘパロサン、(ii)項目26に記載の培養培地、又は(iii)項目27に記載の組成物を含む工業製品、又は消費者製品、又は消耗品。
項目29:化粧用製品、香味製品、芳香製品、食料品、食品、飲料、テクスチャラント(texturant)、医薬組成物、栄養補助食品、栄養医薬、洗浄製品、歯科及び/又は口腔衛生組成物である、項目28に記載の工業製品、又は消費者製品、又は消耗品。
項目30:約20kDa～約50kDa又は約50kDa～約1000kDaの範囲の分子量を有するヘパロサンの産生のための、項目1から116のいずれか1つに記載の組換え細胞の使用。
本発明のある特定の実施形態は、以下の利点:
・制御された分子量のヘパロサンを産生させるためのプロセス、
・サッカロマイセス酵母細胞において制御された分子量のヘパロサンを産生させるためのプロセス、並びに
・遺伝子パラメーター(例えば、調節配列)及び/又はプロセスパラメーター(pH若しくは発酵時間)を変動させることによって制御された分子量のヘパロサンを産生させるためのプロセス
のうちの1つ又は複数を提供し得る。
図1は、ヘパロサンの産生のための概略的な経路を示す。
配列の概要
配列番号1は、パスツレラ・ムルトシダ(HSS1)を起源とするヘパロサンシンターゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号2は、パスツレラ・ムルトシダ(HSS2)を起源とするヘパロサンシンターゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号3は、パスツレラ・ムルトシダ(HSS1)を起源とするヘパロサンシンターゼのアミノ酸配列である
配列番号4は、パスツレラ・ムルトシダ(HSS2)を起源とするヘパロサンシンターゼのアミノ酸配列である
配列番号5は、アラビドプシス・サリアナを起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB)の核酸配列である
配列番号6は、クロレラウイルスPBCV-1を起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB)の再コーディングされた核酸配列である
配列番号7は、クロレラウイルスPBCV-1を起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB-A)の再コーディングされた核酸配列である
配列番号8は、アラビドプシス・サリアナを起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB)のアミノ酸配列である
配列番号9は、クロレラウイルスPBCV1を起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB)のアミノ酸配列である
配列番号10は、N末端分泌シグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号11は、N末端分泌シグナル及びC末端アンカリングシグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号12は、N末端分泌シグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号13は、N末端分泌シグナル及びC末端アンカリングシグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号14は、N末端分泌シグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼのアミノ酸配列である
配列番号15は、N末端分泌シグナル及びC末端アンカリングシグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼのアミノ酸配列である
配列番号16は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)の核酸配列である
配列番号17は、クロレラウイルス1(PBCV-1)を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)の再コーディングされた核酸配列である
配列番号18は、クロレラウイルス1(PBCV-1)を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)の再コーディングされた核酸配列である
配列番号19は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)のアミノ酸配列である
配列番号20は、クロレラウイルス1(PBCV-1)を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)のアミノ酸配列である
配列番号21は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)の核酸配列である
配列番号22は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)のアミノ酸配列である
配列番号23は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホグルコムターゼ-1(PGM1)の核酸配列である。
配列番号24は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホグルコムターゼ-1(PGM1)のアミノ酸配列である
配列番号25は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUTP--グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)の核酸配列である
配列番号26は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUTP--グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)のアミノ酸配列である
配列番号27は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルコサミン6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)の核酸配列である
配列番号28は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルコサミン6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)のアミノ酸配列である
配列番号29は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)の核酸配列である
配列番号30は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)のアミノ酸配列である
配列番号31は、プロモーターpTDH3の核酸配列である
配列番号32は、プロモーターpTDH3.Skの核酸配列である
配列番号33は、プロモーターpTDH3-1.sbaの核酸配列である
配列番号34は、プロモーターpTDH3.Sarの核酸配列である
配列番号35は、プロモーターpENO2の核酸配列である
配列番号36は、プロモーターpTEF3の核酸配列である
配列番号37は、プロモーターpTEF1の核酸配列である
配列番号38は、プロモーターpTEF1.agoの核酸配列である
配列番号39は、プロモーターpTEF1.Sbaの核酸配列である
配列番号40は、プロモーターpPDC1の核酸配列である
配列番号41は、プロモーターpCCW12の核酸配列である
配列番号42は、プロモーターpCCW12.Smの核酸配列である
配列番号43は、プロモーターpCCW12.Skの核酸配列である
配列番号44は、プロモーターpCCW12.Sbaの核酸配列である
配列番号45は、プロモーターpCCW12.Sarの核酸配列である
配列番号46は、プロモーターpNUP57の核酸配列である
配列番号47は、プロモーターpCCW10.agoの核酸配列である
配列番号48は、プロモーターpCWP2の核酸配列である
配列番号49は、プロモーターpCCW120.Scaの核酸配列である
配列番号50は、プロモーターpRPLA1の核酸配列である
配列番号51は、プロモーターpCUP1の核酸配列である
配列番号52は、プロモーターpMET6の核酸配列である
配列番号53は、プロモーターpMET25の核酸配列である
配列番号54は、プロモーターpSAM1の核酸配列である
配列番号55は、ターミネーターtTPI1の核酸配列である
配列番号56は、ターミネーターtMET25の核酸配列である
配列番号57は、ターミネーターtDIT1の核酸配列である
配列番号58は、ターミネーターtRPL3の核酸配列である
配列番号59は、ターミネーターtRPL3.smの核酸配列である
配列番号60は、ターミネーターtRPL3.sbaの核酸配列である
配列番号61は、ターミネーターtRPL41Bの核酸配列である
配列番号62は、ターミネーターtRPL15Aの核酸配列である
配列番号63は、ターミネーターtRPL15A.sbaの核酸配列である
配列番号64は、ターミネーターtIDP1の核酸配列である
配列番号65は、ターミネーターtTEF1.sbaの核酸配列である
配列番号66は、5’に付加される分泌配列の核酸配列である
配列番号67は、N末端に付加される分泌配列のアミノ酸配列である
配列番号68は、3’に付加されるアンカリング配列の核酸配列である
配列番号69は、C末端に付加されるアンカリング配列のアミノ酸配列である
発明の詳細な説明
本発明者らは、天然にはそれを行うことが可能ではない親細胞と比較して、特に、親酵母と比較して、ヘパロサンを産生する能力を有する、遺伝子改変された細胞、特に遺伝子改変された酵母を想起した。
これらの遺伝子改変された細胞は、本明細書全体を通じて説明されている。
定義
「ヘパロサン」という用語は、[-4-N-アセチルグルコサミン-α1,4-グルクロン酸-β1-]リピート[→4)β-D-グルクロン酸(GlcA)(1→4)N-アセチル-a-D-グルコサミン(GlcNAc)(l→] n)から構成される多糖ポリマーである。
ヘパロサンは、組換え細胞において産生され得る。
本明細書において使用される場合、「組換え」という用語は、細胞に言及して使用される場合、その細胞が、内因性及び/若しくは異種核酸若しくはタンパク質の細胞への導入又は生来の細胞の変更によって改変されていること、或いはその細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、生来の(非組換え)形態の細胞内において見出されない遺伝子若しくは核酸を発現するか、又は生来の(例えば、内因性)遺伝子を、それらの生来のレベルとは異なるレベルで発現するか、又は生来(例えば内因性)のものの追加的若しくは補助的なコピーを、それらの生来のレベルとは異なるレベルで発現する。
本明細書において使用される場合、「組換え」という用語は、核酸又はベクターに言及して使用される場合、当業者に周知の遺伝子操作技法によって形成される/得られる配列である。US National Institute for Health(NIH)のガイドラインには、したがって、
「組換え[…]核酸は、
i.(a)核酸分子を結合することによって構築される分子、及び(b)生細胞において複製することができる分子、すなわち、組換え核酸
として定義される」
と示されており、これは、核酸配列に付加される「組換え」という言葉の従来的な使用を反映して、別の核酸の挿入又は別の核酸と一緒に結合した後に組み換えられることを意味する。
生細胞内で組換えDNA又は組換えベクターの発現により生じるタンパク質もまた、組換えタンパク質と称される。
「組換え」という用語は、したがって、「遺伝子改変された」という用語と同義である。「遺伝子」という用語は、「核酸」又は「ヌクレオチド配列」という用語と同義である。
本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母において使用するための組換え核酸配列は、核酸コンストラクトの形態で提供され得る。「核酸コンストラクト」という用語は、生来(例えば、内因性)の天然に存在する遺伝子から単離されるか若しくはそれに由来するか、又は異種核酸であるか、又は天然には存在しないであろう様式で組み合わされて並置された核酸のセグメントを含むように改変されている、一本鎖又は二本鎖のいずれかである核酸分子を指す。「核酸コンストラクト」という用語は、核酸コンストラクトがコーディング配列の発現に必要とされる1つ又は複数の調節エレメントを含む場合、「発現カセット」又は「異種核酸発現カセット」という用語と同義であり、前記制御配列は、前記コーディング配列に作動可能に連結されている。調節エレメントの非限定的な例としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、及びポリ-Aシグナルが挙げられる。
本発明の組換え細胞において使用するための組換え核酸配列は、発現ベクターの形態で提供されてもよく、ここで、ポリヌクレオチド配列は、組換え細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現のための少なくとも1つの制御配列に作動可能に連結されている。
微生物若しくは動物「から得られる」、又は微生物若しくは動物「を起源とする(originate from)」、又は微生物若しくは動物「を起源とする(originating from)」という用語は、一般に、微生物又は動物を起源とする物質(例えば、核酸分子又はポリペプチド)が、その微生物又は動物に生来のものであることを意味する。
微生物又は動物「に由来する」という用語は、微生物又は動物に由来する物質(例えば、核酸分子又はポリペプチド)が、その微生物又は動物に生来のものである(すなわち、そのまま存在する)物質に対して行われた改変の結果であることを意味する。例えば、微生物又は動物に由来する核酸配列に関して、前記核酸配列は、この微生物又は動物に由来する生来の核酸配列の再コーディング及び/又は短縮されたバージョンに相当し得る。当業者に周知の他の改変を、微生物又は動物の生来の物質に行うことにより、使用される物質が前記微生物又は動物「に由来する」ことになり得る。
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含み、5個を上回るアミノ酸残基を含む、分子を指す。アミノ酸は、一文字又は三文字のいずれかの表記によって特定される。本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、「ポリペプチド」という用語と同義であり、更に、2つ又はそれよりも多くのポリペプチドを指し得る。したがって、「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」という用語は、互換可能に使用することができる。ポリペプチドは、任意選択で、機能性を付加するように改変(例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、ファルネシル化、プレニル化、スルホン化等)され得る。活性を示すポリペプチドは、酵素と称され得る。遺伝子コードの縮重の結果として、所与のポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列が産生され得ることが理解されるであろう。
本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母において使用するための組換え核酸によってコードされるポリペプチドは、シグナルペプチド及び/又はプロペプチド配列を含み得る。本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母によって発現されるポリペプチドが、シグナルペプチド及び/又はプロペプチドを含む場合、配列同一性は、成熟ポリペプチド配列にわたって計算され得る。
本明細書において使用される「作動可能に連結された」という用語は、物理的に連結され、互いに機能的関係性にある、2つ又はそれよりも多くの核酸配列エレメントを指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写又は発現を開始又は調節することができる場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結されており、その場合、コーディング配列は、プロモーター「の制御下」にあるとして理解されるものとする。一般に、2つの核酸配列が作動可能に連結されている場合、それらは、同じ配向にあり、通常はまた、同じリーディングフレーム内にある。それらは、通常、本質的に連続しているが、これは、必須ではない。
本明細書において分子、特に、酵素及び核酸に言及して使用される「生来」又は「内因性」という用語は、それらの起源であるか又はそれらが天然に見出される生物において発現される分子を示す。
「内因性遺伝子」という用語は、その遺伝子が、野生型株において、任意の遺伝子改変の前の細胞に存在していたことを意味する。内因性遺伝子は、内因性調節エレメントに加えて、若しくはそれを置き換えるために、異種配列を導入することによって、又は遺伝子の1つ若しくは複数の追加的又は補助的なコピーを染色体若しくはプラスミドに導入することによって、過剰発現され得る(前記追加的若しくは補助的なコピーは、本明細書において定義される「外因性若しくは異種遺伝子」又は「異種ヌクレオチド配列」又は「異種核酸」と表記される)。内因性遺伝子はまた、それらの発現及び/又は活性をモジュレートするように改変され得る。例えば、突然変異をコーディング配列に導入して、遺伝子産物を改変してもよく、又は異種配列を、内因性調節エレメントに加えて若しくはそれを置き換えるために導入してもよい。内因性遺伝子のモジュレーションは、遺伝子産物の活性の上方調節及び/若しくは増強をもたらし得るか、又は代替的には、内因性遺伝子産物の下方調節及び/若しくは減弱化をもたらし得る。内因性遺伝子の発現を増強させる別の手段は、遺伝子の1つ又は複数の追加的又は補助的なコピーを染色体又はプラスミドに導入することである(前記補助的なコピーは、本明細書において定義される「外因性若しくは異種遺伝子」又は「異種ヌクレオチド配列」又は「異種核酸」と表記される)。
本発明による「遺伝子の1つ又は複数の追加的又は補助的なコピー」とは、例えば、本発明において、1～50個のコピー、特に1～30個のコピー、より具体的には1～20個のコピー、好ましくは1～10個のコピーとして理解される。前記コピーは、本発明の組換え細胞の同じ遺伝子座又は異なる遺伝子座に挿入され得る。
「外因性遺伝子」という用語は、遺伝子が、当業者に周知の手段によって細胞に導入されていることを意味するが、この遺伝子は、野生型細胞において天然に存在するか、又は存在しない。細胞は、これらの遺伝子がその細胞におけるそれらの発現を可能にするすべてのエレメントとともにその細胞に導入されている場合、外因性遺伝子を発現することができる。細胞に外因性DNAを形質転換することは、当業者の日常的な業務である。外因性遺伝子は、宿主染色体に組み込まれ得るか、又はプラスミド若しくはベクターから染色体外で発現され得る。複製起点及び細胞におけるコピー数に関して異なる様々なプラスミドは、すべて当該技術分野において公知である。外因性遺伝子の配列は、細胞におけるその発現に適合され得る。実際に、当業者であれば、コドン使用頻度バイアスの概念、及び推定されるタンパク質を改変することなく特定のコドン使用頻度バイアスに核酸配列を適合させる方法を把握している。特定の実施形態において、コドン最適化された遺伝子は、生来の酵素を発現する。
「異種遺伝子」又は「異種核酸配列」という用語は、通常は所与の細胞において天然に見出されない遺伝子又は核酸配列を指す。そのため、異種核酸配列は、(a)その宿主細胞に対して外来であり得る(すなわち、細胞に対して「外因性」である)、(b)宿主細胞において天然に見出される(すなわち、「内因性」)が、細胞において非天然の量(すなわち、宿主細胞において天然に見出されるものよりも多いか若しくは少ない量)で存在し得る、又は(c)宿主細胞において天然に見出されるが、その天然の遺伝子座外に位置し得る。
本出願において、すべての遺伝子は、それらの一般的な名称で、それらのヌクレオチドに関して、及び発生した場合にはそれらのアミノ酸配列に関して、参照される。公知の遺伝子に関して受託番号での参照を使用することで、当業者であれば、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物等における同等の遺伝子を決定することができる。この慣例的な作業は、他の細胞に由来する遺伝子との配列アライメントを実行することによって決定され得るコンセンサス配列を使用し、別の生物における対応する遺伝子をクローニングするための縮重プローブを設計することで、有利に行われる。
当業者であれば、内因性遺伝子の発現をモジュレートする、特に、上方調節又は下方調節するための異なる手段を把握している。例えば、内因性遺伝子の発現を増強させるか又はそれを過剰発現させる手段は、遺伝子の1つ又は複数の追加的又は補助的なコピーを染色体又はプラスミドに導入することである。
別の手段は、遺伝子の内因性プロモーターを、より強力なプロモーターと置き換えることである。これらのプロモーターは、同種であっても異種であってもよい。本発明において特に関心の高いプロモーターは、本明細書の他の箇所により詳細に記載されている。
核酸発現コンストラクトは、更に、5'及び/若しくは3'認識配列並びに/又は選択マーカーを含み得る。
「誘導性プロモーター」という用語は、
- 1つ若しくは複数の特定の代謝産物の存在下において、活性が誘導される、すなわち、増大される、プロモーター(培地中の代謝産物濃度が高いほど、プロモーター活性は強力となる)、又は
- 低濃度の1つ若しくは複数の代謝産物の存在下若しくはその非存在下において、活性が誘導される、すなわち、増大される、プロモーター(これらの代謝産物は、存在が増加するとプロモーターの活性を誘導するものとは異なる。培地中の代謝産物濃度が低いほど、プロモーター活性は強力となる。)
を規定するように使用される。
「抑制性プロモーター」という用語は、
- 1つ若しくは複数の特定の代謝産物の存在下において、活性が抑制される、すなわち、低減される、プロモーター(培地中の代謝産物濃度が高いほど、プロモーター活性は弱くなる)、又は
- 低濃度の1つ若しくは複数の代謝産物の存在下若しくはその非存在下において、活性が抑制される、すなわち、低減される、プロモーター(これらの代謝産物は、存在が増加するとプロモーターの活性を抑制するものとは異なる。培地中の代謝産物濃度が低いほど、プロモーター活性は弱くなる。)
を規定するように使用される。
本明細書において使用される場合、「アンカリングシグナル」という用語は、タンパク質又はポリペプチド、例えば、酵素(例えば、例としてグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチド)とともに使用される場合、例えば、タンパク質若しくはポリペプチドをコードする第2の核酸に作動可能に連結されたタンパク質をコードする第1の核酸、又は第2のタンパク質若しくはポリペプチド、例えば、酵素(例えば、例として融合タンパク質を形成するためのグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチド等)に作動可能に連結された第1のタンパク質若しくはポリペプチドであり、細胞、特に、S.セレビシエ細胞の細胞輸送機序が第1のタンパク質に作動可能に連結された第2のタンパク質を細胞膜に正しくアンカリング及び/又は配置することを可能にするものを意味する。
本明細書において使用される場合、「分泌シグナル」という用語は、タンパク質又はポリペプチド、例えば、酵素(例えば、例としてグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチド)とともに使用される場合、例えば、タンパク質をコードする第2の核酸に作動可能に連結されたペプチド若しくはタンパク質をコードする第1の核酸、又は第2のタンパク質、例えば、酵素(例えば、例として融合タンパク質を形成するためのグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチド等)に連結された第1のタンパク質であり、細胞、特に、S.セレビシエ細胞の細胞輸送機序が、例えば第1のタンパク質が第2のタンパク質から切断された後に、少なくとも第2のタンパク質を細胞膜に配置し、第2のタンパク質を細胞外に分泌することを可能にするものを意味する。
本明細書において使用される場合、「分泌シグナル」及び「アンカリングシグナル」という用語は、タンパク質又はポリペプチド、例えば、酵素(例えば、例としてグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチド)とともに使用される場合、例えば、タンパク質をコードする第2の核酸に作動可能に連結されたペプチド又はタンパク質をコードする第1の核酸、又は第2のタンパク質、例えば、酵素(例えば、例としてグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチド)に作動可能に連結された第1のタンパク質であり、細胞、特に、S.セレビシエ細胞の細胞輸送機序が、少なくとも第2のタンパク質を細胞膜に配置することを可能にするものを意味し、ここで、第2のタンパク質が「アンカリングシグナル」に作動可能に連結されている場合、第2のタンパク質は、分泌されず、細胞膜に結合したままとなる。いくつかの場合において、分泌-アンカリングシグナルは、二重分泌シグナル及びアンカリングシグナル機能を提供し得る。
分泌及びアンカリングシグナルの配列、細胞(例えば、例として酵母細胞)の表面上の異種タンパク質、例えば、酵素(例えば、例としてグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ)の発現、アンカリング、及び/又は分泌のための方法は、当該技術分野において周知である(例えば、Astら、(2013) Cell 152: 1134-1145、Ast及びSchuldiner (2013) Crit Rev Biochem Mol Biol 48(3) 273-288、Van der Vaartら、(1997) Applied Environmental Microbiology 63(2) 615-620を参照されたく、これらの刊行物のそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。
酵素の「活性」は、「機能」という用語と互換可能に使用され、本発明の文脈において、所望される反応を触媒する酵素の能力を指す。宿主細胞における酵素の量は、酵素をコードする遺伝子の転写を改変することによって、変更することができる。これは、例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を改変することによって(例えば、ヌクレオチド配列を含むより高いか若しくは低いコピー数の発現ベクターを使用することによって、又はヌクレオチド配列の追加のコピーを宿主細胞のゲノムに導入することによって、又は宿主細胞のゲノムにおけるヌクレオチド配列を欠失若しくは破壊させることによって)、オペロンのポリシストロニックmRNAにおけるコーディング配列の順序を変更するか、若しくはオペロンをそれぞれがそれ自体の制御エレメントを有する個々の遺伝子に分割することによって、又はヌクレオチド配列が作動可能に連結されるプロモーター若しくはオペレーターの強度を増加させることによって、達成することができる。
代替的に、又は追加として、宿主細胞における酵素のコピー数は、酵素をコードするmRNAの翻訳のレベルを改変することによって、変更することができる。これは、例えば、mRNAの安定性を改変すること、リボソーム結合部位の配列を改変すること、リボソーム結合部位と、酵素コーディング配列の開始コドンとの間の距離若しくは配列を改変すること、酵素コーディング領域の開始コドンの「上流」又は5'側に隣接して位置するシストロン間領域全体を改変すること、ヘアピン及び特化した配列を使用してmRNA転写産物の3'末端を安定させること、酵素のコドン使用頻度を改変すること、酵素の生合成において使用される稀有コドンのtRNAの発現を変更すること、並びに/又は酵素の安定性を、例えば、そのコーディング配列の突然変異によって増加させることによって、達成することができる。
宿主細胞における酵素の活性は、宿主細胞において増加若しくは減少した可溶性を示す酵素の改変形態を発現させること、それを通じて酵素の活性が阻害されるドメインが欠如した酵素の改変形態を発現させること、基質に対する高い若しくは低いKcat又は低い若しくは高いKmを有する酵素の改変形態を発現させること、又は経路内の別の分子によるフィードバック若しくはフィードフォワード調節によってより影響を受けるか若しくはあまり影響を受けない酵素の変更形態を発現させることを含むがこれらに限定されない、いくつかの手段で変更することができる。
「コードする」又は「をコードする」という用語は、ポリヌクレオチドが、転写及び翻訳の機序を通じて、アミノ酸配列を産生する、プロセスを指す。
本発明において考察される酵素をコードする遺伝子は、外因性であっても内因性であってもよい。
本発明において実装される方法は、好ましくは、染色体上の特定の位置への異種ヌクレオチド配列の安定な導入、又は遺伝子改変された細胞における1つ若しくは複数の標的遺伝子の機能的破壊のために、1つ又は複数の染色体組込みコンストラクトの使用を必要とする。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の破壊は、関連する機能性タンパク質の発現を防止する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子の破壊は、破壊された遺伝子からの非機能性タンパク質の発現をもたらす。
本発明の実施において変動し得る染色体組込みコンストラクトのパラメーターとしては、相同配列の長さ、相同配列のヌクレオチド配列、組込み配列の長さ、組込み配列のヌクレオチド配列、及び標的遺伝子座のヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、それぞれの相同配列の長さの有効な範囲は、20～5,000塩基対、好ましくは、50～100塩基対である。特定の実施形態において、それぞれの相同配列の長さは、約50塩基対である。遺伝子標的化に必要とされる相同性の長さに関する更なる情報については、D. Burkeら、Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)を参照されたい。
いくつかの実施形態において、上述のDNAコンストラクトが挿入されることが意図される破壊された遺伝子は、有益には、形質転換された細胞の選択に有用な1つ又は複数の選択可能なマーカーを含み得る。好ましくは、前記選択可能なマーカーは、本発明のDNAコンストラクトに含まれる。
いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの例証的な例としては、NAT1、AURl-C、HPH、DSDA、KAN<R>、及びSH BLE遺伝子産物が挙げられるが、これらに限定されない。S.ノーセイ(S. noursei)由来のNAT遺伝子産物は、ノーセオスリシンに対する耐性を付与し、サッカロマイセス・セレビシエ由来のAURl-C遺伝子産物は、オーレオバシジンA(AbA)に対する耐性を付与し、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)由来のHPH遺伝子産物は、ハイグロマイシンBに対する耐性を付与し、大腸菌(E. coli)由来のDSDA遺伝子産物は、細胞が唯一の窒素源としてD-セリンを有するプレートで成長することを可能にし、Tn903トランスポゾンのKAN<R>遺伝子は、G418に対する耐性を付与し、ストレプトアロテイカス・ヒンダスタヌス(Streptoalloteichus hindustanus)由来のSH BLE遺伝子産物は、ゼオシン(ブレオマイシン)に対する耐性を付与する。
いくつかの実施形態において、抗生物質耐性マーカーは、本発明の遺伝子改変された細胞が単離された後に除去される。当業者であれば、特定の遺伝的状況において好適なマーカーを選択することができる。
特定の実施形態において、本発明による組換え細胞は、いずれの抗生物質耐性マーカーも有さない。これは、有利なことに、選択培地に抗生物質を添加する必要性を防止する。
いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、遺伝子改変された細胞における要求性(例えば、栄養要求性)をレスキューする。そのような実施形態において、親細胞、特に、親酵母は、アミノ酸又はヌクレオチド生合成経路において機能を果たす1つ又は複数の遺伝子産物、例えば、酵母におけるHIS3、LEU2、LYS1、LYS2、MET15、TRP1、ADE2、及びURA3遺伝子産物に、機能性破壊を含み、これにより、親細胞は、1つ又は複数の栄養素の補充を有さない培地において成長することができなくなる(要求性表現型)。要求性表現型は、次いで、親細胞を、破壊された遺伝子産物の機能性コピー(いくつかの実施形態において、遺伝子の機能性コピーは、近似種、例えば、クルイベロマイセス、カンジダ等を起源とし得る)をコードする染色体組込みにより形質転換することによってレスキューすることができ、生成された遺伝子改変された細胞は、親微生物細胞の要求性表現型の消失に基づいて選択することができる。
プロモーター配列、コーディング配列(例えば、酵素コーディング配列)、又はターミネーター配列を含む核酸配列のそれぞれについて、参照配列は、本明細書に記載されている。本明細書の説明はまた、参照核酸配列との特定のパーセンテージの核酸同一性を有する核酸配列も包含する。
目的のアミノ酸配列のそれぞれについて、参照配列は、本明細書に記載されている。本明細書の説明はまた、参照アミノ酸配列との特定のパーセンテージのアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列(例えば、酵素アミノ酸配列)も包含する。
明白な理由のため、本明細書のすべてにおいて、それぞれ、考慮されるヌクレオチド又はアミノ酸同一性に適合する特定の核酸配列又は特定のアミノ酸配列は、更に、所望される生物学的活性を示すタンパク質(又は酵素)を得ることに繋がるはずである。本明細書において使用される場合、2つの核酸配列間又は2つのアミノ酸配列間の「同一性パーセンテージ」は、両方の最適にアライメントした配列を比較ウインドウにわたって比較することによって判定される。
比較ウインドウ内のヌクレオチド又はアミノ酸配列の部分は、したがって、両方の配列の間で最適なアライメントが得られるように、参照配列と比較して付加又は欠失(例えば、「ギャップ」)を含み得る(参照配列はこれらの付加又はこれらの欠失を含まない)。
「配列相同性」又は「配列同一性」又は「相同性」又は「同一性」という用語は、本明細書において互換可能に使用される。本発明の目的で、2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の配列相同性又は配列同一性のパーセンテージを判定するために、配列は、最適な比較の目的でアライメントされることが、本明細書において定義される。2つの配列間のアライメントを最適化するために、ギャップが、比較される2つの配列のいずれかに導入されてもよい。そのようなアライメントは、比較されている配列の全長にわたって行うことができる。或いは、アライメントは、短い方の長さにわたって、例えば、約20個、約50個、約100個、又はそれ以上の核酸/塩基又はアミノ酸にわたって、行われてもよい。配列同一性は、報告されているアライメント領域にわたる2つの配列間の同一な一致のパーセンテージである。
2つの配列間の配列の比較及び配列同一性パーセンテージの判定は、数学的アルゴリズムを使用して、達成することができる。当業者であれば、いくつかの異なるコンピュータプログラムが、2つの配列をアライメントし、2つの配列間の同一性を判定するために利用可能であるという事実を認識しているであろう(Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison、1～44頁、Addison Wesley)。
2つのアミノ酸配列間又は2つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、2つの配列のアライメントのためのNeedleman及びWunschのアルゴリズムを使用して判定することができる。(Needleman, S. B.及びWunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453)。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列のいずれも、アルゴリズムによってアライメントすることができる。Needleman-Wunschのアルゴリズムは、コンピュータプログラムNEEDLEにおいて実装されている。
本発明の目的で、EMBOSSパッケージのNEEDLEプログラムを使用した(バージョン2.8.0以上、EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. LongdenJ.及びBleasby、A. Trends in Genetics 16, (6) 276～277頁、http://emboss.bioinformatics.nl/)。タンパク質配列については、EBLOSUM62を、置換マトリックスに使用する。ヌクレオチド配列については、EDNAFULLを使用する。使用される任意選択のパラメーターは、ギャップ開始ペナルティ10及びギャップ伸長ペナルティ0.5である。エンドギャップペナルティは付加しない。Outputセクションにおいて、Yesは、質問「Brief identity and similarity」に応答して示されており、「SRS pairwise」は、Outputアライメント形式を示す。
上述のプログラムNEEDLEによるアライメントの後に、クエリー配列と本発明の配列との間の配列同一性パーセンテージが、次のように計算される:両方の配列において同一のアミノ酸又は同一のヌクレオチドを示す、アライメント内の対応する位置の数を、アライメントにおけるギャップの総数を減算した後のアライメントの合計長さで除算する。本明細書において定義される同一性は、NEEDLEから、NOBRIEFオプションを使用することによって得ることができ、プログラムの出力時に「longest-identity」としてラベル付けされる。
ヌクレオチド及びアミノ酸配列の類似性、すなわち、配列同一性パーセンテージは、いくつかの他の当該技術分野において公知のアルゴリズムを使用して、好ましくは、Karlin及びAltschulの数学的アルゴリズム(Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877)を用いて、hmmalign(HMMERパッケージ、http://hmmer.wustl.edu/)を用いて、又はhttps://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/で入手可能なCLUSTALアルゴリズム(Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)、又はGAPプログラム(University of Iowaの数学的アルゴリズム)、又はMyers及びMiller (1989 - Cabios 4: 11-17)の数学的アルゴリズム、又はClone Manager 9を用いて、配列アライメントによって判定することができる。使用される好ましいパラメーターは、https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/で設定されているデフォルトのパラメーターである。
配列同一性のグレード(配列一致率)は、BLAST、BLAT、又はBlastZ(若しくはBlastX)を使用して計算され得る。類似のアルゴリズムは、Altschulら、(1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410のBLASTN及びBLASTPプログラムに組み込まれている。関連するタンパク質をコードする核酸に相同であるポリヌクレオチド配列を得るために、BLASTポリヌクレオチド検索が、BLASTNプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて行われる。
SHCポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索が、BLASTPプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて行われる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るために、Altschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402に記載されるように、ギャップ付きBLASTが、利用される。BLAST及びギャップ付きBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターが使用される。配列一致分析は、Shuffle-LAGAN(Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: 154-162)又はマルコフ確率場のような確立されている相同性マッピング技法によって補助され得る。本出願において配列同一性のパーセンテージに言及する場合、これらのパーセンテージは、別途具体的に示されない限り、長い方の配列の全長に関して計算される。
特定の実施形態において、2つの配列間の同一性%は、CLUSTAL O(バージョン1.2.4)を使用して判定される。
「発酵」又は「培養」は、一般に、培養されている細胞に適合された、少なくとも1つの単純な炭素源を含み、必要な場合には補助基質を含む、適切な培養培地を用いて、ファーメンターにおいて行われる。
「発酵組成物」という用語は、遺伝子改変された宿主細胞、及び遺伝子改変された宿主細胞によって産生された産物又は代謝産物を含む組成物を指す。発酵組成物の例は、全細胞培養液であり、これは、細胞、水性相、及び遺伝子改変された宿主細胞から産生された化合物を含む容器(例えば、フラスコ、プレート、又はファーメンター)の全内容物であり得る。
「培地」という用語は、培養(culture)培地、又は培養(cultivation)培地、又は発酵培地を指す。
ヘパロサンの最大の産生のために、産生宿主として使用される組換え細胞は、好ましくは、高い炭水化物利用率を有する。これらの特徴は、突然変異生成及び選択、遺伝子操作によって付与されてもよく、又は天然であってもよい。本細胞の発酵培地又は「培養(culture)培地」又は「培養(cultivation)培地」は、少なくとも約10g/Lのグルコース及び/又はスクロースを含み得る。追加の炭素基質としては、単糖、例えば、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノース、オリゴ糖、例えば、ラクトース、マルトース、ガラクトース、又はスクロース、多糖、例えば、デンプン又はセルロース、又はこれらの混合物、並びに再生可能な原料、例えば、チーズホエイパーミエート(cheese whey permeate)、コーンスティープリカー(corn steep liquor)、てんさい糖蜜(sugar beet molasses)、及び麦芽由来の未精製混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。他の炭素基質としては、グリセロール、アセテート、及び/又はエタノールを挙げることができる。
したがって、本発明において利用される炭素源は、広範な炭素含有基質を包含し得、細胞、特に、酵母の選択肢によってのみ制限されることが、企図される。
上述の炭素基質及びそれらの混合物のすべてが、本発明において好適であることが企図されるが、C5糖、より具体的にはグルコースを使用するように改変された細胞、特に、酵母については、好ましい炭素基質は、グルコース、フルクトース、及びスクロース、又はこれらとC5糖、例えば、キシロース及び/若しくはアラビノースとの混合物である。
好ましい炭素基質は、グルコース又はスクロースである。
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、培養物の成長及び所望される産物の産生に必要な酵素経路の促進に好適な、当業者に公知の好適なミネラル類、塩、補因子、緩衝液、及び他の成分を含有し得る。
更に、本発明による組換え細胞の成長に好適な追加の遺伝子改変が、考慮され得る。
「好気性条件」という用語は、好気性又は通性嫌気性細胞、特に、酵母が、末端電子供与体として二酸素を使用するのに十分である、培養培地中の酸素の濃度を指す。
「微好気性条件」は、酸素濃度が空気中よりも低い、すなわち、最大6% O2の酸素濃度の、培養培地を指す。
「適切な培養培地」は、細胞の維持及び/又は成長に必須又は有益な栄養素、例えば、炭素源又は炭素基質、窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、及びリン酸アンモニウム、リン源、例えば、リン酸一カリウム又はリン酸二カリウム、微量元素(例えば、金属塩)、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩、及び/又はマンガン塩、並びに成長因子、例えば、アミノ酸、ビタミン、成長促進剤等を含む、培地(例えば、滅菌、液体培地)を指す。本発明による「炭素源」又は「炭素基質」又は「炭素供給源」という用語は、細胞の正常な成長を補助するために当業者によって使用され得る任意の炭素供給源を指し、これには、ヘキソース(例えば、グルコース、ガラクトース、又はラクトース)、ペントース、単糖、オリゴ糖、二糖(例えば、スクロース、セロビオース、又はマルトース)、糖蜜、デンプン又はその誘導体、セルロース、ヘミセルロース、及びこれらの組合せが含まれる。
本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母を産生するのに特に適切な培養培地は、以下に更に詳細に記載されている。
本発明のヘパロサンの「制御された」分子量とは、本発明の方法によって産生されるヘパロサンのうちの少なくとも80%、特に、少なくとも85%が、本発明の方法及び/又は組換え細胞の少なくとも1つのパラメーター、例えば、例として、
- 組換え細胞のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の性質及び起源、
- 組換え細胞のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の発現を制御するプロモーターの性質及び起源、
- 組換え細胞のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドに付随するアンカリング及び/若しくは分泌シグナルの存在、
- 組換え細胞の培養工程中の培養培地のpH、並びに/又は
- 組換え細胞の培養の期間
の調節を通じて、所定の分子量の範囲内に含まれる分子量を有することを意味することが意図される。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、当業者によって判定される、値に関する妥当な範囲を指す。ある特定の実施形態において、約という用語は、±1、2、又は3標準偏差を指す。ある特定の実施形態において、約という用語は、±5%、10%、20%、又は25%を指す。ある特定の実施形態において、約という用語は、±0.1、0.2、又は0.3対数単位、例えば、pH単位を指す。
本発明により導入される遺伝子改変の一般的な特徴
- すべてのゲノム改変は、公知の遺伝子操作技法に従って、組換え細胞、特に、組換え酵母に挿入される:
- 本発明による組換え細胞ゲノムに導入される遺伝子コンストラクトに含まれる連続的な核酸配列は、以下の構造のものである:
Prom1-ORF1-term1-ORF2-gene2-term2 - …/… -Promn-ORFn-termn、ここで、
- Prom1は、コーディング配列ORF1の発現を調節する配列であり、
- ORF1は、所望されるタンパク質PROT1、特に、所望される酵素PROT1をコードする核酸配列であり、
- Term1は、新しく合成されたmRNAにおいて、転写複合体からmRNAを放出するプロセスをトリガーするシグナルを提供することによって転写終結を媒介する転写ターミネーター配列であり、
- 「1」、「2」、…/…「n」は、同じORF(オープンリーディングフレーム)、プロモーター、又はターミネーターを示してもよく、又は示さなくてもよい。核酸配列の順序は問題にならない。「n」は、通常、5から20の範囲の整数である。これらのコンストラクトは、制御された位置で、組換え細胞染色体の1つに挿入される。いくつかの実施形態において、挿入部位は、挿入されるコンストラクトの機能性にも、結果として得られる遺伝子改変された細胞の生存性にも重要ではない。
当業者には理解されるように、コーディング配列を、特定の宿主におけるその発現を増強させるように改変することは、有利であり得る。遺伝子コードは、冗長であり、64個の可能性のあるコドンがあるが、ほとんどの生物は、典型的には、これらのコドンのサブセットを使用する。種においてもっとも頻繁に利用されるコドンは、最適なコドンと称され、あまり頻繁に利用されないものは、稀有又は低使用頻度コドンとして分類される。コドンは、「コドン最適化」又は「種コドンバイアスの制御」と称されることのあるプロセスにおいて、宿主の好ましいコドン使用頻度を反映するように置換されてもよい。他の宿主細胞のコドン最適化は、コドン使用頻度表を使用して容易に判定することができるか、又は市販入手可能なソフトウェア、例えば、Integrated DNA TechnologiesからのCodonOp(www.idtdna.com/CodonOptfrom)を使用して行うことができる。特定の原核生物又は真核生物宿主によって好まれるコドンを含む最適化されたコーディング配列(Murrayら、1989, Nucl Acids Res. 17: 477-508)は、例えば、翻訳の速度を増加させるため、又は非最適化配列から産生される転写産物と比較して、望ましい特性、例えば、より長い半減期を有する組換えRNA転写産物を産生するために、調製され得る。翻訳終止コドンもまた、宿主の優先度を反映するように改変され得る。例えば、S.セレビシエ及び哺乳動物の典型的な終止コドンは、それぞれ、UAA及びUGAである。単子葉植物の典型的な終止コドンは、UGAであり、一方で昆虫及び大腸菌は、一般にUAAを終止コドンとして使用する(Dalphinら、1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8)。
- 組換え細胞が、酵母細胞、特に、サッカロマイセス・セレビシエ酵母細胞である場合、酵母ゲノムに導入される、サッカロマイセス・セレビシエではない他の生物を起源とする核酸配列は、一般に、「トランスコード」され(一般に、「コドン最適化」され)、これは、これらの核酸配列が、S.セレビシエにおける発現に最適なコドン使用頻度で合成されることを意味する。S.セレビシエに由来する一部の核酸配列のヌクレオチド配列(タンパク質配列ではない)もまた、前記遺伝子の内因性コピーでの組換えを最小限に抑えるように改変(「トランスコード」)されている。
- 遺伝子は、細胞遺伝子操作において使用される標準的な手順を通じて欠失させてもよい。いくつかの実施形態において、欠失の標的とされる遺伝子は、上述の遺伝子コンストラクトのうちの1つの挿入によって分断され得るか、又は代替的には、欠失の標的とされる遺伝子は、ヌクレオチドの短いストレッチによって置き換えられる。
- 核酸配列は、核酸配列の内因性コピーを欠失させること(必要に応じて)、及びORFの新しいコピーを、誘導性又は抑制性プロモーターの制御下におくことによって、「誘導性又は抑制性」にすることができる。誘導性又は抑制性プロモーターは、環境条件又は外部刺激の変化により、活性が、モジュレート又は制御される、すなわち、増加又は減少する、プロモーターである。誘導又は抑制は、人工的に制御されてもよく、これは、非生物的因子、例えば、目的の細胞、特に、酵母において天然に見出されない化合物、光、酸素レベル、熱、又は低温による誘導又は抑制を包含する。誘導性又は抑制性プロモーターの一覧及び配列は、本明細書の他の箇所に記載されている。
本発明による組換え細胞
本発明者らは、ヘパロサンを産生する能力を有する組換え細胞、特に、組換え酵母を想起した。
本発明は、ヘパロサンを産生する能力を有する組換え細胞、特に、組換え酵母に関し、ここで、ヘパロサンを産生するこの能力は、遺伝子操作方法によって、そのゲノムに導入されている複数の変更を通じて得られる。
本発明は、ヘパロサンを産生する組換え酵母細胞であって、
(a)ヘパロサンシンターゼ(HSS)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と、
(b)UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH若しくはHASB)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と
を含む組換え酵母細胞に関する。
本発明は更に、ヘパロサンを産生する組換え宿主細胞であって、
(a)ヘパロサンシンターゼ(HSS)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と、
(b)UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH若しくはHASB)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と、
(c)グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と
を含み、
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドが、ヘパロサン、特に、所望される分子量のものが宿主細胞によって産生されるように分泌シグナル及び任意選択でアンカリングシグナルを含む、
組換え宿主細胞に関する。
本発明者らは、細胞、特に、酵母細胞がヘパロサンを産生する能力が、これらの細胞のゲノムに複数の遺伝子変更を導入することによって達成され得ることを見出した。
本発明の細胞、特に、本発明の酵母細胞によるヘパロサンの産生は、UDP-グルコース、及び任意選択でUDP-N-アセチル-グルコサミンの内因性代謝を最適化し、後続の人工的に改変された代謝経路を、主としてヘパロサンへと誘導し、同時に、結果として得られる遺伝子改変された細胞の最適な生存性を維持することによって、達成される。
本発明による組換え細胞によるヘパロサンの産生は、グルコース-6-リン酸の継続的な中間代謝産物(i)グルコース-1-リン酸、UDP-グルコース、UDP-グルクロネート、及びヘパロサン、並びに(ii)フルクトース-6-リン酸、グルコサミン-6-リン酸、N-アセチル-グルコサミン-6-リン酸、N-アセチル-グルコサミン-1-リン酸、UDP-N-アセチル-グルコサミン、及びヘパロサンへの変換を増加させ、同時に結果として得られる組換え細胞の良好な生存性を可能にするバランスを維持することによって、増加し得ることが、判定されている。
実際に、本発明の生存性組換え細胞を得るために、多数の異なるコンストラクトを、生存性及び効率的な組換え細胞、特に、生存性組換え酵母を得るために、試験した。特に、そのような組換え酵母は、いくつかの中間体の一時的な蓄積が酵母に毒性であると見られたため、得ることが困難であった。
ヘパロサンを産生することができる、特に、制御された分子量を有するヘパロサンを産生することができる、組換え細胞の調製に好適な条件の確立において、予測外な技術的課題に遭遇した。
本発明のヘパロサンの「制御された」分子量とは、本発明の方法によって産生されるヘパロサンのうちの少なくとも80%、特に、少なくとも85%が、本発明の方法及び/又は組換え細胞の少なくとも1つのパラメーター、例えば、例として、
- 組換え細胞のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の性質及び起源、
- 組換え細胞のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の発現を制御するプロモーターの性質及び起源、
- 組換え細胞のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドに付随するアンカリング及び/若しくは分泌シグナルの存在、
- 組換え細胞の培養工程中の培養培地のpH、並びに/又は
- 組換え細胞の培養の期間
の調節を通じて、ある特定の分子量の範囲内に含まれる分子量を有することを意味することが意図される。
実際に、十分な研究及び実験的試験の後に、本発明者らは、組換え細胞、特に、組換え酵母細胞、より具体的には、組換えサッカロマイセス・セレビシエ酵母細胞を培養して、以下のパラメーター:
- 本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の性質及び起源の選択、並びに/又は
- 本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列の発現を制御するプロモーターの性質及び起源、並びに/又は
- 分泌シグナルに加えて、本発明による組換え細胞、特に、組換え酵母のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するコードされるポリペプチドに付随するアンカリングシグナルの任意選択的な存在、並びに/又は
- 本発明による組換え細胞、特に、組換え酵母細胞を培養する工程中の培養培地のpH、並びに/又は
- 本発明による組換え細胞、特に、組換え酵母細胞の培養の期間
を使用して制御される、制御された分子量を有するヘパロサンを産生することができることが、可能であったことを発見した。
本発明者らの知識によると、これは、これまでに達成されたことはなかった。
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、ペドバクター・ヘパリヌスから得ることができるか、又はそれに由来し得る。
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、pTEF1、pCCW12、pCCW12.sba、pCCW12.Sar、pPDC1、pTEF3、pTDH3、pNUP57、及びpCCW10.agoからなる群から選択されるプロモーターの制御下にあり得る。
ヘパロサンの分子量は、50kDa未満の範囲内、好ましくは、約20kDa～約50kDaの範囲内にあり得る。
代替的には、ヘパロサンの分子量は、50kDaを上回る範囲内、好ましくは、約50kDa～約250kDの範囲内にあり得る。
別の代替形態において、ヘパロサンの分子量は、100kDaを上回る範囲内、好ましくは、約100kDa～約1500kDaの範囲内にあり得る。
UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH又はHASB)活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、アラビドプシス・サリアナ、クロレラウイルスPBCV1、又はストレプトコッカス・ズーエピデミクスのうちの少なくとも1つから得ることができるか、又はそれに由来し得、特に、アラビドプシス・サリアナ又はクロレラウイルスPBCV1から得ることができるか、又はそれに由来し得る。
ヘパロサンシンターゼ(HSS)活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、パスツレラ・ムルトシダから得ることができるか、又はそれに由来し得る。
本発明による組換え細胞は、
(i)グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
(ii)UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)活性を有するポリペプチド
のうちの1つ又は複数をコードする少なくとも1つの組換え核酸を更に含み得る。
本発明による組換え細胞は、
(i)ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
(ii)UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
(iii)グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
(iv)ホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)活性を有するポリペプチド
のうちの1つ又は複数をコードする少なくとも1つの組換え核酸を更に含み得る。
本発明による組換え細胞は更に、
- グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
- ホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)を有するポリペプチドをコードする核酸
が、サッカロマイセス・セレビシエから得られるか又はそれに由来するようなものであり得る。
本発明の組換え宿主細胞は、特に、酵母であり得る。
本発明の組換え細胞は、サッカロマイセス属、又はカンジダ属、又はクルイベロマイセス属、又はオガタエア属、又はヤロウイア属、又はデバリオマイセス属、又はアシュビア属に属する酵母細胞であり得、特に、サッカロマイセス属に属し得、より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・パラドクサス、サッカロマイセス・ミカタエ、サッカロマイセス・カステリ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、クルイベロマイセス・ラクティス、クルイベロマイセス・マルシアヌス、クルイベロマイセス・ポリスポラス、クルイベロマイセス・サーモトレランス、オガタエア・ポリモルファ、ヤロウイア・リポリティカ、デバリオマイセス・ハンセニイ、及びアシュビア・ゴシピからなる群から選択され得、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエであり得る。
本発明の別の目的は、所望される分子量のヘパロサンを産生させる方法であって、
(a)本発明の組換え細胞、すなわち、本発明の組換え酵母細胞又は組換え宿主細胞を、培養培地において、所望される分子量のヘパロサンを産生させるのに十分な時間、培養する工程と、
(b)任意選択で、組換え細胞及び/又は培養培地から、ヘパロサンを単離又は回収する工程と
を含む方法に関する。
本発明の方法において、ヘパロサンは、約20kDa～約50kDA、及び好ましくは20kDa～30kDaの分子量を有し得る。
本発明の方法において、ヘパロサンは、代替的に、30kDa～50kDAの分子量を有し得る。
本発明の方法において、ヘパロサンは、代替的に、約50kDa～約150kDAの分子量を有し得る。
本発明の方法において、ヘパロサンは、代替的に、約150kDa～約1500kDAの分子量を有し得る。
本発明の方法において、組換え細胞は、酵母、特に、サッカロマイセス属のメンバーであり得、特に、サッカロマイセス・セレビシエであり得る。
本発明の方法において、特に、所望される分子量のヘパロサンを産生させるのに十分な時間は、約35時間～約50時間、好ましくは約40時間～約50時間、好ましくは約48時間の期間であり得る。
本発明の方法において、産生されたヘパロサンの分子量は、培養培地のpHによって制御することができる。
本発明の方法において、ヘパロサンの分子量は、本発明の方法の培養工程(a)中の培養培地のpHを調節することによって制御することができる。
本発明の方法において、ヘパロサンの分子量は、培養培地からバイオマスを除去することによって制御することができる。
本発明の方法は、工業規模で実施され、好ましくは、培養培地は、少なくとも約100L、より好ましくは約1000L～約3000Lの範囲、更により好ましくは約10,000L、更により好ましくは約100,000L、又は更には約250,000Lである。
本発明の別の目的は、本発明の組換え細胞又は本発明の方法から得られるか又は得ることができるヘパロサンに関する。
本発明は更に、本発明によるヘパロサンを含む培養培地に関する。
本発明は更に、本発明によるヘパロサンを含む組成物に関する。
本発明は、更に、(i)50kDa未満、好ましくは、約20kDa～約50kDaの範囲、又は50kDaを上回る、好ましくは、約50kDa～約250kDの範囲、又は100kDaを上回る、好ましくは、約100kDa～約1500kDaの範囲内の分子量を有するヘパロサン、(ii)本発明の培養培地、又は(iii)本発明の組成物を含む工業製品、又は消費者製品、又は消耗品に関する。
本発明の工業製品、又は消費者製品、又は消耗品は、化粧用製品、香味製品、芳香製品、食料品、食品、飲料、テクスチャラント、医薬組成物、栄養補助食品、栄養医薬、洗浄製品、歯科及び/又は口腔衛生組成物であり得る。
本発明の別の目的は、約20kDa～約50kDa又は約50kDa～約1000kDaの範囲内の分子量を有するヘパロサンの産生のための、本発明の組換え細胞の使用に関する。
ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸
本発明による組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母は、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸を含む。
本発明によるヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドは、中間代謝産物UDP-グルクロネート及びUDP-N-アセチルグルコサミン(UDP-GlcNAc)をヘパロサン[→4)β-D-グルクロン酸(GlcA)(1→4)N-アセチル-a-D-グルコサミン(GlcNAc)(l→]nに変換するポリペプチドを意味する。
ある実施形態において、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、本発明の組換え細胞において機能性である誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある。
ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、pCCW12.Sar、pCCW120.sca、pTDH3-1.Sba、及びpTDH3.Sarからなる群から選択されるプロモーターの制御下にあり得る。
ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、ストレプトコッカス・ズーエピデミクス(Streptococcus zooepidemicus)(sz)、クロレラウイルス(Chlorella virus)PBCV1(Vir)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)(xl)、又はパスツレラ・ムルトシダ(pm)、特に、パスツレラ・ムルトシダを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1～5個、具体的には、1～3個の組換え核酸を含み得る。本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、例えば、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1、2又は3個の組換え核酸を含み得る。
例示的には、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、組換え細胞、特に、組換え酵母のJLP1遺伝子内、及び/又はLEU2遺伝子内、及び/又はSAM3遺伝子内に挿入され得る。
本発明のある実施形態において、本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母は、
- ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1～5個、具体的には、1～3個の組換え核酸、
- ストレプトコッカス・ズーエピデミクス(sz)、クロレラウイルスPBCV1(Vir)、アフリカツメガエル(xl)、又はパスツレラ・ムルトシダ(pm)を起源とするか又はそれに由来する、特に、パスツレラ・ムルトシダを起源とするか又はそれに由来する、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸、並びに
- 本発明の組換え細胞において機能性である誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下、及び/又はpCCW12.Sar、pCCW120.sca、pTDH3-1.Sba、及びpTDH3.Sarからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸
を含む。
UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH又はHASB)活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸を含む。
本発明によるUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH又はHASB)活性を有するポリペプチドは、中間代謝産物ウリジン-二リン酸-グルコース(UDP-グルコース)をUDP-グルクロネートに変換する、ポリペプチドを意味する。
ある実施形態において、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH又はHASB)活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、本発明の組換え細胞において機能性である誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある。
UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、pCCW12プロモーターの制御下にあり得、特に、pCCW12.sk及びpCCW12.sbaからなる群から選択されるプロモーターの制御下にあり得る。
UDP-グルコースデヒドロゲナーゼデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、アラビドプシス・サリアナ、クロレラウイルスPBCV1、又はストレプトコッカス・ズーエピデミクスを起源とし得るか、又はそれに由来し得、特に、アラビドプシス・サリアナ又はクロレラウイルスPBCV1を起源とするか、又はそれに由来する。
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1～7個、具体的には、2～7個の組換え核酸を含み得る。本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、例えば、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする2又は5個の組換え核酸を含み得る。
例示的には、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、組換え細胞、特に、組換え酵母のJLP1遺伝子内、及び/又はLEU2遺伝子内、及び/又はSAM3遺伝子内に挿入され得る。
本発明のある実施形態において、本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母は、
- UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1～7個、具体的には、2～7個の組換え核酸、
- アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)、クロレラウイルスPBCV1、又はストレプトコッカス・ズーエピデミクスを起源とするか又はそれに由来する、特に、アラビドプシス・サリアナ又はクロレラウイルスPBCV1を起源とするか又はそれに由来する、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸、並びに
- 本発明の組換え細胞において機能性である誘導性若しくは抑制性プロモーターの制御下、及び/又はpCCW12プロモーターの制御下にある、特に、pCCW12.sk及びpCCW12.sbaからなる群から選択されるプロモーターの制御下にあり得る、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸
を含む。
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸を含む。
本発明によるグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドは、ヘパロサンを分解する、すなわち、所与の分子量のヘパロサンを、より低い分子量のヘパロサンに変換する、ポリペプチドを意味する。
前述のように、本発明のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドは、分泌シグナルを含む。
ある実施形態において、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドは、分泌シグナルを含むがアンカリングシグナルを含まない。
ある実施形態において、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドは、分泌シグナル及びアンカリングシグナルの両方を含む。
ある実施形態において、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸は、本発明の組換え細胞において機能性である誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある。
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、pTEF1、pCCW12、pCCW12.sba、pCCW12.Sar、pPDC1、pTEF3、pTDH3、pNUP57、及びpCCW10.agoからなる群から選択されるプロモーターの制御下にあり得る。
特定の実施形態において、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸は、pTEF1、pCCW12、pCCW12.sba、pCCW12.Sar、pPDC1、pTEF3、pTDH3、pNUP57、及びpCCW10.agoからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある。
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、ペドバクター・ヘパリヌス(Ph)、クピエニウス・サレイ(Cupiennius salei)(Csa)、ロクソセレス・インターメディア(Loxosceles intermedia)(Li)、ヒルド・ニッポニア(Hirudo nipponia)(Hn)、ボスロプス・アトロクス(Bothrops atrox)(Ba)、又はティティウス・セルラトゥス(Tityus serrulatus)(Ts)を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。特定の実施形態において、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸は、ペドバクター・ヘパリヌス(Ph)を起源とするか、又はそれに由来する。
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つのみの組換え核酸を含み得る。本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、代替的には、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1～8個、具体的には、1～5個の組換え核酸を含み得る。
例示的には、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、JLP1遺伝子内、及び/又はLYP1遺伝子内、及び/又はSAM3遺伝子内、及び/又はHIS3遺伝子内に挿入され得る。
グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母細胞は、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸を含み得る。
本発明によるグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、フルクトース-6-リン酸をグルコサミン-6-リン酸に変換する、ポリペプチドを意味する。
ある実施形態において、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、本発明の組換え細胞において機能性である誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある。
グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、pTEF1プロモーター、特に、pTEF1.Agoの制御下にあり得る。
グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸は、サッカロマイセス・セレビシエ及びクロレラウイルスPBCV1からなる群を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1～5個、具体的には、1～3個の組換え核酸を含み得る。
例示的には、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、組換え細胞、特に、組換え酵母のSAM3遺伝子内及び/又はJLP1遺伝子内に挿入され得る。
本発明のある実施形態において、本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母は、
- グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1～5個、具体的には、1～3個の組換え核酸、
- サッカロマイセス・セレビシエ及びクロレラウイルスPBCV1からなる群を起源とするか又はそれに由来する、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸、
- pTEF1プロモーター、特に、pTEF1.Agoの制御下にある、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸
を含む。
UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母細胞は、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸を含み得る。
本発明によるUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドは、N-アセチル-グルコサミンをUDP-N-アセチル-グルコサミンに変換する、ポリペプチドを意味する。
ある実施形態において、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、本発明の組換え細胞において機能性である誘導性又は抑制性プロモーター、例えば、例として誘導性又は抑制性プロモーターpMET6又はpCUP1の制御下にある。
UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、プロモーターpTDH3の制御下にあり得る。
UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする5～15個、具体的には、5～12個の組換え核酸を含み得る。本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、例えば、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする8又は10個の組換え核酸を含み得る。
例示的には、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、組換え細胞、特に、組換え酵母のHIS3遺伝子内、及び/又はJLP1遺伝子内、及び/又はSAM3遺伝子内に挿入され得る。
本発明のある実施形態において、本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母は、
- UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする5～15個、特に、5～12個の組換え核酸、
- サッカロマイセス・セレビシエを起源とするか又はそれに由来する、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸、並びに
- 本発明の組換え細胞において機能性である誘導性若しくは抑制性プロモーター、例えば、例として誘導性若しくは抑制性プロモーターpMET6若しくはpCUP1の制御下、及び/又はプロモーターpTDH3の制御下にある、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸
を含む。
ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸を含み得る。
本発明によるホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチドは、グルコース-6-リン酸を中間代謝産物グルコース-1-リン酸に変換する、ポリペプチドを意味する。
ある実施形態において、ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、本発明の組換え細胞において機能性である誘導性又は抑制性プロモーター、例えば、例として誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある。
ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、プロモーターpPDC1の制御下にあり得る。
ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチドをコードする1つのみの組換え核酸を含み得る。
例示的には、ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、組換え細胞、特に、組換え酵母のSAM3遺伝子内に挿入され得る。
本発明のある実施形態において、本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母は、
- ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つのみの組換え核酸、
- サッカロマイセス・セレビシエを起源とするか又はそれに由来する、ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸、及び
- プロモーターpPDC1の制御下にある、ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸
を含む。
UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸を含み得る。
本発明によるUTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)活性を有するポリペプチドは、中間代謝産物グルコース-1-リン酸を中間代謝産物UDP-グルコースに変換する、ポリペプチドを意味する。
ある実施形態において、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、本発明の組換え細胞において機能性である誘導性又は抑制性プロモーター、例えば、例として誘導性又は抑制性プロモーターpSAM1又はpCUP1の制御下にある。
UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、pPDC1及びpENO2からなる群から選択されるプロモーターの制御下にあり得る。
UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする5～15個、具体的には、5～12個の組換え核酸を含み得る。本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、例えば、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする8又は11個の組換え核酸を含み得る。
例示的には、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性遺伝子を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、組換え細胞、特に、組換え酵母のHIS3遺伝子内、及び/又はJLP1遺伝子内、及び/又はSAM3遺伝子内に挿入され得る。
本発明のある実施形態において、本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母は、
- UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする5～15個、具体的には、5～12個の組換え核酸、
- サッカロマイセス・セレビシエを起源とするか又はそれに由来する、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸、並びに
- 本発明の組換え細胞において機能性である誘導性若しくは抑制性プロモーター、例えば、例として誘導性若しくは抑制性プロモーターpSAM1若しくはpCUP1の制御下、及び/又はpPDC1及びpENO2からなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸
を含む。
グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母細胞は、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸を含み得る。
本発明によるグルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)活性を有するポリペプチドは、グルコサミン-6-リン酸をN-アセチル-グルコサミン-6-リン酸に変換する、ポリペプチドを意味する。
ある実施形態において、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、本発明の組換え細胞において機能性である誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある。
グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、プロモーターpCWP2の制御下にあり得る。
グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つのみの組換え核酸を含み得る。
例示的には、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、組換え細胞、特に、組換え酵母のSAM3遺伝子内に挿入され得る。
本発明のある実施形態において、本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母は、
- グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つのみの組換え核酸、
- サッカロマイセス・セレビシエを起源とするか又はそれに由来する、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸、並びに
- プロモーターpCWP2の制御下にある、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸
を含む。
ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母細胞は、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸を含み得る。
本発明によるホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)活性を有するポリペプチドは、N-アセチル-グルコサミン-6-リン酸をN-アセチル-グルコサミン-1-リン酸に変換する、ポリペプチドを意味する。
ある実施形態において、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、本発明の組換え細胞において機能性である誘導性又は抑制性プロモーターの制御下にある。
ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸のうちの1つ又は複数は、pTEF1プロモーターの制御下にあり得る。
ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母は、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つのみの組換え核酸を含み得る。
例示的には、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、本明細書において実施例に示されるように、組換え細胞、特に、組換え酵母のSAM3遺伝子内に挿入され得る。
本発明のある実施形態において、本発明の組換え細胞、特に、組換え酵母は、
- ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つのみの組換え核酸、
- サッカロマイセス・セレビシエを起源とするか又はそれに由来する、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸、並びに
- pTEF1プロモーターの制御下にある、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記組換え核酸
を含む。
ヘパロサンシンターゼ(HSS)
ヘパロサンシンターゼ酵素は、UDP-グルクロネート又はUDP-N-アセチル-グルコースのヘパロサンへの変換を触媒することについて当該技術分野において説明されている、タンパク質である。ストレプトコッカス・ズーエピデミクス、クロレラウイルスPBCV1、アフリカツメガエル、又はパスツレラ・ムルトシダを起源とするヘパロサンシンターゼは、HSSと称され得る。
ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドの活性レベルを測定するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者であれば、有利なことに、Bitter及びMuir (Analytical Biochemistry, 4, 330-334, 1962)によって説明されている濃硫酸及びカルバゾールでの処置後の比色分析による判定の方法を参照することができる。
本明細書におけるヘパロサンシンターゼ活性を有する好ましいポリペプチドは、配列番号1(HSS1)及び配列番号2(HSS2)からなる群から選択される核酸配列を有する酵素である。
好ましい実施形態によると、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物からなる群において選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、古細菌を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、細菌、特に、ストレプトコッカス・ズーエピデミクス(Sz)、クロレラウイルスPBCV1(Vir)、アフリカツメガエル(Xl)、又はパスツレラ・ムルトシダ(Pm)、特に、パスツレラ・ムルトシダを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
なおも好ましい実施形態によると、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)配列番号1(HSS1-Pm)又は配列番号2(HSS2-Pm)の配列として記載される核酸配列との少なくとも65%、有利には少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)それぞれ、配列番号1(HSS1-Pm)又は配列番号2(HSS2-Pm)の配列として記載される核酸配列を有する核酸配列と同じ性質の生物学的活性を有する、核酸配列からなる群から選択され得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に説明されたように、UDP-グルクロネート又はUDP-N-アセチル-グルコースをヘパロサンに変換する酵素をコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも70%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
パスツレラ・ムルトシダを起源とする、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列に関して、当業者であれば、それぞれ、UniProtデータベースの受託番号Q8RP78及びQ5SGE1、又は本明細書に記載される配列番号3(HSS1-Pm)若しくは配列番号4(HSS2-Pm)を参照することができる。
別の特定の実施形態によると、ヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号3(Pm HSS1)又は配列番号4(Pm HSS2)として記載されるアミノ酸配列との少なくとも50%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号3(Pm HSS1)又は配列番号4(Pm HSS2)として記載されるアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に記載された通り、すなわち、UDP-グルクロネート又はUDP-N-アセチル-グルコースのヘパロサンへの変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも50%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の発現レベルは、それぞれヘパロサンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の5'及び3'位置に存在する、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーター、例えば、本明細書においてこれ以降により詳細に定義されるものによって、調節される。
UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH又はHASB)
UDP-グルコースデヒドロゲナーゼは、UDP-グルコースのUDP-グルクロネートへの変換を触媒することが当該技術分野において公知である、タンパク質である。アラビドプシス・サリアナ、クロレラウイルスPBCV1、又はストレプトコッカス・ズーエピデミクスのゲノムを起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼは、HASBと称される場合がある。
UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドの活性レベルを測定するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者であれば、有利なことに、Oka及びJigami (FEBS Journal 273, 2645-2657, 2006)によって説明されている方法を参照することができる。
本明細書におけるUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する好ましいポリペプチドは、EC番号1.1.1.22を有する酵素である。
好ましい実施形態によると、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群において選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、古細菌を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの好ましい実施形態において、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、酵母、特に、アラビドプシス・サリアナ、クロレラウイルスPBCV1、又はストレプトコッカス・ズーエピデミクス、より具体的には、アラビドプシス・サリアナ又はクロレラウイルスPBCV1を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
なおも好ましい実施形態によると、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)配列番号5(At)、配列番号6(Vir)、又は配列番号7(Vir)の配列として記載される核酸との少なくとも65%、有利には少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)配列番号5(At)、配列番号6(Vir)、又は配列番号7(Vir)の配列として記載される核酸と同じ性質の生物学的活性を有する核酸配列からなる群から選択され得る。配列番号5(At)、配列番号6(Vir)、及び配列番号7(Vir)の配列として記載される核酸は、それぞれ、アラビドプシス・サリアナ(At)又はクロレラウイルスPBCV1(Vir)を起源とする、本明細書において集合的にHASBとも称され得るUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に説明されたように、UDP-グルコースをUDP-グルクロネートに変換するポリペプチドをコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも70%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
アラビドプシス・サリアナ、クロレラウイルスPBCV1、又はストレプトコッカス・ズーエピデミクスに由来するUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列に関して、当業者であれば、それぞれ、UniProtデータベースの受託番号NP_173979.1、NP_048965、若しくはKIS19289、又は本明細書に記載される配列番号8(At)及び配列番号9(Vir)に記載される配列を参照することができる。
別の特定の実施形態によると、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号8(At)及び配列番号9(Vir)のアミノ酸配列との少なくとも55%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号8(At)及び配列番号9(Vir)のアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に記載された通り、すなわち、UDP-グルコースのUDP-グルクロネートへの変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも55%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の発現レベルは、それぞれUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の5'及び3'位置に存在する、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーター、例えば、本明細書においてこれ以降により詳細に定義されるものによって、調節される。
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ酵素は、ヘパロサン分子のより小さなヘパロサン分子への分解を触媒することについて当該技術分野において説明されている、タンパク質である。ペドバクター・ヘパリヌスのゲノムによってコードされるグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼは、HEPCと称され得る。
本発明のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドは、分泌シグナル及びアンカリングシグナルの両方を有し得るか、又は分泌シグナルを有し得るがアンカリングシグナルを有さなくてもよく、又は二重分泌及びアンカリング機能を有する分泌-アンカーシグナルを有し得る。
グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドの活性レベルを測定するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者であれば、有利なことに、アガロースゲル上で得られたヘパロサンの分子量をモニタリングすることができる。
本明細書におけるグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有する好ましいポリペプチドは、EC番号3.2.1.56を有する酵素である。
好ましい実施形態によると、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群において選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、古細菌を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは酵母から選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの他の好ましい実施形態において、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
なおも好ましい実施形態によると、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号10(Ph)又は配列番号12(Ph)の核酸との少なくとも65%、有利には少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性を有し、配列番号10(Ph)又は配列番号12(Ph)の核酸と同じ性質の生物学的活性も有する核酸配列からなる群から選択され得る。配列番号10(Ph)及び配列番号12(Ph)の核酸は、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、分泌シグナルを含みアンカリングシグナルを含まず、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするか、又はそれに由来する。
別の好ましい実施形態によると、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号11(Ph)又は配列番号13(Ph)の核酸との少なくとも65%、有利には少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性を有し、配列番号11(Ph)又は配列番号13(Ph)の核酸と同じ性質の生物学的活性も有する核酸配列からなる群から選択され得る。配列番号11(Ph)及び配列番号13(Ph)の核酸は、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードし、分泌シグナル及びアンカリングシグナルを含み、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするか、又はそれに由来する。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に説明されたように、ヘパロサン分子のより小さなヘパロサン分子への分解を触媒するポリペプチドをコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも70%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
ペドバクター・ヘパリヌス由来のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸のアミノ酸配列について、当業者であれば、本明細書に記載される配列番号10(Ph)及び配列番号12(Ph)の両方に対応するUniProtデータベースの受託番号Q59289を参照することができる。
別の特定の実施形態によると、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、分泌シグナルを含みアンカリングシグナルを含まない、配列番号14(Ph)のアミノ酸配列との少なくとも50%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号14(Ph)のアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
別の特定の実施形態によると、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、分泌シグナル及びアンカリングシグナルを含む、配列番号15(Ph)のアミノ酸配列との少なくとも55%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号15(Ph)のアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前述の通り、すなわち、ヘパロサン分子のより小さなヘパロサン分子への分解を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも55%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の発現レベルは、それぞれグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の5'及び3'位置に存在する、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーター、例えば、本明細書においてこれ以降により詳細に定義されるものによって、調節される。
グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)
グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ酵素は、フルクトース-6-リン酸のグルコサミン-6-リン酸への変換を触媒することについて当該技術分野において説明されている、タンパク質である。サッカロマイセス・セレビシエ及びクロレラウイルスPBCV1を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼは、GFA1と称され得る。
グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの活性レベルを測定するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者であれば、有利なことに、Shiga Shibatan及びHiroaki Kitazawa (Plant Biotechnology 26, 149-152, 2009)によって説明されている方法を参照することができる。
本発明におけるグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有する好ましいポリペプチドは、EC番号n°EC 2.6.1.16を有する酵素である。
好ましい実施形態によると、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物を含む群において選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、古細菌を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくはバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)及び酵母から選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの他の好ましい実施形態において、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、酵母、特に、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
なおも好ましい実施形態によると、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)配列番号47(Sc)の配列として記載される核酸配列との少なくとも65%、有利には少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)配列番号47(Sc)の配列として記載される核酸配列と同じ性質の生物学的活性を有する核酸配列からなる群から選択され得る。配列番号47の配列として記載される核酸は、GFA1とも称され得る、サッカロマイセス・セレビシエ又はクロレラウイルスPBCV1を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
なおも好ましい実施形態によると、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)配列番号16(Sc)又はEQの配列として記載される核酸配列との少なくとも65%、有利には少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)配列番号16(Sc)の配列として記載される核酸配列と同じ性質の生物学的活性を有する核酸配列からなる群から選択され得る。配列番号16の配列として記載される核酸は、GFA1とも称され得る、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
なおも別の実施形態によると、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)配列番号15又は配列番号16の配列として記載される核酸配列との少なくとも65%、有利には少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)配列番号17又は配列番号18の配列として記載される核酸配列と同じ性質の生物学的活性を有する核酸配列からなる群から選択され得る。配列番号17又は配列番号18の配列として記載される核酸配列は、クロレラウイルスPBCV1を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に説明されたように、フルクトース-6-リン酸をグルコサミン-6-リン酸に変換するポリペプチドをコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも70%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列について、当業者であれば、UniProtデータベースの受託番号NP8012818、又は本明細書に記載される配列番号19の配列を参照することができる。
クロレラウイルスPBCV1を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列について、当業者であればまた、UniProtデータベースの受託番号NP_048448、又は本明細書に記載される配列番号20の配列を参照することができる。
別の特定の実施形態によると、グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号19又は配列番号20のアミノ酸配列との少なくとも35%、有利には少なくとも65%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号19又は配列番号20のアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に記載された通り、すなわち、フルクトース-6-リン酸のグルコサミン-6-リン酸への変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも35%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも65%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルは、それぞれグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の5'及び3'位置に存在する、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーター、例えば、本明細書においてこれ以降により詳細に定義されるものによって、調節される。
UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)
UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ酵素は、N-アセチル-グルコサミン-6-リン酸のUDP-N-アセチル-グルコースへの変換を触媒することについて当該技術分野において説明されている、タンパク質である。サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼは、QRI1と称され得る。
UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドの活性レベルを測定するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者であれば、Mioら(The Journal of Biological Chemistry, Col. 273, No 23、1998年6月5日、14392-14397)によって説明されている方法を参照することができるが、UDP-N-アセチル-グルコサミンがSynergi RP Fusionカラムを使用してLC MS/MSによって検出されることは除く。
本発明におけるUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有する好ましいポリペプチドは、EC番号n°EC 2.7.7.23を有する酵素である。
好ましい実施形態によると、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物からなる群において選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、古細菌を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくはバチルス・スブチリス及び酵母から選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの他の好ましい実施形態において、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、酵母、特に、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
なおも好ましい実施形態によると、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)配列番号21として記載される核酸配列との少なくとも65%、有利には少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)配列番号21として記載される核酸配列と同じ性質の生物学的活性を有する核酸配列からなる群から選択され得る。配列番号21として記載される核酸配列は、QRI1とも称され得る、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に説明されたように、N-アセチル-グルコサミン-6-リン酸をUDP-N-アセチル-グルコースに変換するポリペプチドをコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも65%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも70%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列について、当業者であれば、UniProtデータベースの受託番号NP_010180、又は本明細書に記載される配列番号22を参照することができる。
別の特定の実施形態によると、UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号22の配列として記載されるアミノ酸配列との少なくとも35%、有利には少なくとも45%、好ましくは少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号22の配列として記載されるアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に記載された通り、すなわち、N-アセチル-グルコサミン-6-リン酸のUDP-N-アセチル-グルコースへの変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも35%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも45%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の発現レベルは、それぞれUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の5'及び3'位置に存在する、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーター、例えば、本明細書においてこれ以降により詳細に定義されるものによって、調節される。
ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)
ホスホグルコムターゼ-1酵素は、グルコース-6-リン酸のグルコース-1-リン酸への変換を触媒することについて当該技術分野において説明されている、タンパク質である。サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホグルコムターゼ-1は、PGM1と称され得る。
ホスホグルコムターゼ-1活性を示すポリペプチドの活性レベルを測定するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者であれば、有利なことに、Tiwari及びBhat (Biochemical and Biophysical Research Communications 366, 340-345, 2008)によって説明されている方法を参照することができる。
本発明におけるホスホグルコムターゼ-1活性を有する好ましいポリペプチドは、EC番号n°5.4.2.2を有する酵素である。
好ましい実施形態によると、ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物からなる群において選択される生物を起源とし得る。いくつかの実施形態において、ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、古細菌を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは細菌から選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。好ましい実施形態において、ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
ある実施形態によると、ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)サッカロマイセス・セレビシエを起源とする、配列番号23の配列として記載される核酸配列との少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)配列番号23の配列として記載される核酸配列と同じ性質の生物学的活性を有する核酸配列からなる群から選択され得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に説明されたように、グルコース-6-リン酸をグルコース-1-リン酸に変換するポリペプチドをコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
サッカロマイセス・セレビシエに由来するホスホグルコムターゼ-1活性を有するペプチドのアミノ酸配列について、当業者であれば、UniProtデータベースの受託番号NP33401、又は本明細書に記載される配列番号24を参照することができる。
別の特定の実施形態によると、ホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号24の配列として記載されるアミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号24の配列として記載されるアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に記載された通り、すなわち、グルコース-6-リン酸のグルコース-1-リン酸への変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の発現レベルは、それぞれホスホグルコムターゼ-1活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の5'及び3'位置に存在する、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーター、例えば、本明細書においてこれ以降により詳細に定義されるものによって、調節される。
UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)
UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ酵素は、グルコース-1-リン酸のUDP-グルコースへの変換を触媒することについて当該技術分野において説明されている、タンパク質である。サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼは、UGP1と称され得る。
UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの活性レベルを測定するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者であれば、有利なことに、Roeben (J. Mol. Biol 364, 551-560, 2006)によって説明されている方法を参照することができる。
本発明におけるUTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有する好ましいポリペプチドは、EC番号n°2.7.7.9を有する酵素である。
好ましい実施形態によると、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物からなる群において選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、古細菌を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは細菌から選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。好ましい実施形態において、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
特定の実施形態によると、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)サッカロマイセス・セレビシエを起源とする、配列番号25の配列として記載される核酸との少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)配列番号25の配列として記載される核酸と同じ性質の生物学的活性を有する核酸配列からなる群から選択され得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に説明されたように、グルコース-1-リン酸をUDP-グルコースに変換するポリペプチドをコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列について、当業者であれば、UniProtデータベースの受託番号NP_32861、又は本明細書に記載される配列番号26の配列として記載される配列を参照することができる。
別の特定の実施形態によると、UTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号26として記載されるアミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号26として記載されるアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に記載された通り、すなわち、グルコース-1-リン酸のUDP-グルコースへの変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるUTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の発現レベルは、それぞれUTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の5'及び3'位置に存在する、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーター、例えば、本明細書においてこれ以降により詳細に定義されるものによって、調節される。
グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)
グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ酵素は、グルコサミン-6-リン酸のN-アセチル-グルコサミン-6-リン酸への変換を触媒することについて当該技術分野において説明されている、タンパク質である。サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼは、GNA1と称され得る。
グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの活性レベルを測定するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者であれば、有利なことに、Liら(Anal. Biochem. 370, 142-146, 2007)によって説明されている方法を参照することができる。
本発明におけるグルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有する好ましいポリペプチドは、EC番号n°2.3.1.4を有する酵素である。
好ましい実施形態によると、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物からなる群において選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの好ましい実施形態において、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、酵母、特に、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
特定の実施形態によると、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)配列番号27の配列として記載される核酸配列との少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)配列番号27の配列として記載される核酸配列と同じ性質の生物学的活性を有する核酸配列からなる群から選択され得る。配列番号27の配列として記載される核酸配列は、GNA1とも称され得る、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に説明されたように、グルコサミン-6-リン酸をN-アセチル-グルコサミン-6-リン酸に変換するポリペプチドをコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列について、当業者であれば、UniProtデータベースの受託番号NP_116637、又は本明細書に記載される配列番号28を参照することができる。
別の特定の実施形態によると、グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号28として記載されるアミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号28として記載されるアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に記載された通り、すなわち、グルコサミン-6-リン酸のN-アセチル-グルコサミン-6-リン酸への変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるグルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の発現レベルは、それぞれグルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の5'及び3'位置に存在する、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーター、例えば、本明細書においてこれ以降により詳細に定義されるものによって、調節される。
ホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)
ホスホアセチルグルコサミンムターゼ酵素は、N-アセチル-グルコサミン-6-リン酸のN-アセチル-グルコサミン-1-リン酸への変換を触媒することについて当該技術分野において説明されている、タンパク質である。サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホアセチルグルコサミンムターゼは、PCM1と称され得る。
ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドの活性レベルを測定するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。
この点に関して、当業者であれば、有利なことに、Bandiniら(Molecular Microbiology 85(3), 513-534, 2012)によって説明されている方法を参照することができる。
本発明におけるホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有する好ましいポリペプチドは、EC番号n°5.4.2.3を有する酵素である。
好ましい実施形態によると、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、好ましくは原核生物及び真核生物からなる群において選択される生物を起源とし得るか、又はそれに由来し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、酵母、特に、サッカロマイセス・セレビシエを起源とし得るか、又はそれに由来し得る。
特定の実施形態によると、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、(i)配列番号29として記載される核酸配列との少なくとも80%の核酸同一性、及び(ii)配列番号29として記載される核酸配列と同じ性質の生物学的活性を有する核酸配列からなる群から選択され得る。配列番号29として記載される核酸は、PCM1とも称され得る、サッカロマイセスを起源とするホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に説明されたように、N-アセチル-グルコサミン-6-リン酸をN-アセチル-グルコサミン-1-リン酸に変換するポリペプチドをコードする能力である。
本明細書に記載されるように、参照核酸配列との少なくとも80%のヌクレオチド同一性を有する核酸配列は、前記参照核酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のヌクレオチド同一性を有し、前記参照核酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、核酸配列を包含する。
サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列について、当業者であれば、UniProtデータベースの受託番号NP_010856、又は本明細書に記載される配列番号30を参照することができる。
別の特定の実施形態によると、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸は、配列番号30として記載されるアミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、配列番号30として記載されるアミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、核酸であり得る。
この配列に関する同じ性質の生物学的活性は、前に記載された通り、すなわち、N-アセチル-グルコサミン-6-リン酸のN-アセチル-グルコサミン-1-リン酸への変換を触媒する能力である。
本明細書に記載されるように、参照アミノ酸配列との少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列は、前記参照アミノ酸配列との少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、及び99%のアミノ酸同一性を有し、前記参照アミノ酸配列と同じ性質の生物学的活性も有する、アミノ酸配列を包含する。
上述のように、本発明におけるホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の発現レベルは、それぞれホスホアセチルグルコサミンムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ又は複数の組換え核酸の5'及び3'位置に存在する、少なくとも1つのプロモーター及び少なくとも1つのターミネーター、例えば、本明細書においてこれ以降により詳細に定義されるものによって、調節される。
プロモーター
本明細書において開示されるように、本発明による組換え細胞を得るための遺伝子操作されている目的の遺伝子の発現は、本発明の組換え細胞、特に、具体的にはサッカロマイセス・セレビシエを含む本発明の組換え酵母細胞において機能性である、適切な調節配列を含む。
様々なプロモーターが、目的のコーディング配列の所望される発現に使用され得る。
本発明によるプロモーターは、以下のプロモーター:
・pTDH3(配列番号31)、
・pTDH3.sk(配列番号32)、
・pTDH3-1.Sba(配列番号33)、
・pTDH3.Sar(配列番号34)、
・pENO2(配列番号35)、
・pTEF3(配列番号36)、
・pTEF1(配列番号37)、
・pTEF1.ago(配列番号38)、
・pTEF1.sba(配列番号39)、
・pPDC1(配列番号40)、
・pCCW12(配列番号41)、
・pCCW12.Sm(配列番号42)、
・pCCW12.sk(配列番号43)、
・pCCW12.sba(配列番号44)、
・pCCW12.sar(配列番号45)、
・pNUP57(配列番号46)、
・pCCW10.ago(配列番号37)、
・pCWP2(配列番号48)、
・pCCW120.Sca(配列番号49)、及び
・pRPLA1(配列番号50)
からなる群から選択され得る。
本発明におけるより具体的に関心のあるプロモーターは、
・pTDH3(配列番号31)、
・pTDH3.sk(配列番号32)、
・pTDH3-1.Sba(配列番号33)、
・pTDH3.Sar(配列番号34)、
・pENO2(配列番号35)、
・pTEF3(配列番号36)、
・pTEF1(配列番号37)、
・pTEF1.ago(配列番号38)、
・pTEF1.sba(配列番号39)、
・pPDC1(配列番号40)、
・pCCW12(配列番号41)、
・pCCW12.Sm(配列番号42)、
・pCCW12.sk(配列番号43)、
・pCCW12.sba(配列番号44)、及び
・pCCW12.sar(配列番号45)
からなる群から選択され得る。
前記プロモーターは、特に、pTDH3、pTDH3-1.Sba、pTDH3.Sar、pENO2、pTEF3、pTEF1、pPDC1、pCCW12、pCCW12.Sm、pCCW12.sk、pCCW12.sba、及びpCCW12.sarからなる群から選択され得る。
代替的には、本発明における関心のあるプロモーターは、
・pNUP57(配列番号46)、及び
・pCCW10.ago(配列番号47)
からなる群から選択され得る。
本発明における他の目的のプロモーターは、
・pCWP2(配列番号48)、
・pCCW120.Sca(配列番号49)、及び
・pRPLA1(配列番号50)
であり得る。
前述のように、誘導性又は抑制性プロモーターは、活性が生物的又は非生物的因子の存在又は不在によって制御され、前記因子の量によっても制御される、プロモーターである。したがって、いくつかのプロモーターに関して、それらの活性は、特に、所与の因子の量が増加するか又はそれを増加させた場合に、誘導され、したがって増加し、したがって、これらの同じプロモーターの活性は、前記因子の量が減少するか又はそれを低減させた場合に、抑制され、したがって低減され得る。誘導性又は抑制性プロモーターを含む本発明の組換え酵母細胞の培養培地における前記因子の量は、当業者によって決定され、したがって制御され得る。
例えば、pCUP-1プロモーターを含む本発明による組換え酵母細胞の培養培地における銅の量を増加させることにより、このプロモーターの制御下にある遺伝子の転写が誘導され、したがって増加するであろう。対照的に、前記培養培地における銅の量を低減させることにより、このプロモーターの制御下にある遺伝子の転写の抑制、したがって低減が引き起こされるであろう。
別の例において、pMET6プロモーターを含む本発明による組換え酵母細胞の培養培地におけるメチオニンの量を増加させることにより、このプロモーターの制御下にある遺伝子の転写が抑制され、したがって減少するであろう。対照的に、前記培養培地におけるメチオニンの量を低減させることにより、このプロモーターの制御下にある遺伝子の転写の誘導、したがって増加が引き起こされるであろう。
この理由により、以下のプロモーターは、本明細書において、「誘導性又は抑制性プロモーター」と称される。
第1の実施形態によると、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、銅で誘導可能又は抑制可能なプロモーター、メチオニンで誘導可能又は抑制可能なプロモーター、及びスレオニンで誘導可能又は抑制可能なプロモーターを含む群から選択され得、特に、pCUP1-銅で誘導可能又は抑制可能である。
この実施形態によると、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、特に、pCUP1(配列番号51)である。
このプロモーターの活性は、上記に示されるように、メチオニン、銅、又はスレオニンの存在を増加させることによって誘導され、それらの活性は、メチオニン、銅、又はスレオニンの量が低減されると減少する、すなわち、抑制される。
第2の実施形態によると、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、銅で誘導可能又は抑制可能なプロモーター、リジンで誘導可能又は抑制可能なプロモーター、及びメチオニンで誘導可能又は抑制可能なプロモーターを含む群から選択され得、特に、
・pMET6-メチオニンで誘導可能又は抑制可能(配列番号52)、
・pMET25-メチオニン誘導可能又は抑制可能(配列番号53)、及び
・pSAM1-メチオニンで誘導可能又は抑制可能(配列番号54)
からなる群から選択され得る。
この特定の実施形態によると、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、pMET6、pMET25、及びpSAM1からなる群から選択され得る。
これらのプロモーターの活性は、したがって、上記に示されるように、メチオニン、銅、リジン、又はグルコースの存在を増加させることによって抑制され、それらの活性は、メチオニン、銅、リジン、又はグルコースの量が低減されると増加する、すなわち、誘導される。
特定の実施形態において、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、銅で誘導可能又は抑制可能なプロモーター、グルコースで誘導可能又は抑制可能なプロモーター、リジンで誘導可能又は抑制可能なプロモーター、メチオニンで誘導可能又は抑制可能なプロモーター、及びスレオニンで誘導可能又は抑制可能なプロモーターを含む群から選択され得る。
より具体的な実施形態によると、本発明による誘導性又は抑制性プロモーターは、pCUP1、pMET6、pSAM1、及びpMET25からなる群から選択され得る。
本発明の特定の実施形態において、本発明における関心のあるプロモーターは、
・pTDH3(配列番号31)、
・pTEF1(配列番号37)、
・pTEF1.ago(配列番号38)、
・pPDC1(配列番号40)、
・pCCW12(配列番号41)、
・pCCW12.sk(配列番号43)、
・pCCW12.sba(配列番号44)、
・pCCW12.sar(配列番号45)、
・pCWP2(配列番号48)、
・pCCW120.Sca(配列番号49)、
・pCUP1(配列番号51)、
・pMET6(配列番号52)、及び
・pSAM1(配列番号54)
からなる群から選択され得る。
Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58に記載される合成プロモーターもまた、使用することができる。
本発明のプロモーターは、半子嚢菌綱(Saccharomycetes class)の任意の生物を起源とし得、特に、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・カステリ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・アルボリコラ(Saccharomyces arboricola)、サッカロマイセス・クドリアブゼビイ(Saccharomyces kudriavzevii)、サッカロマイセス・ミカタエ、アシュビア・ゴシピ、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluveromyces lactis)、ピキア・パストリス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、デバリオマイセス・カステリ(Debaryomyces castelii)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolitica)、及びシベルリンドネラ・ジャディニイ(Cyberlindnera jadinii)のうちの少なくとも1つからなる群から選択される生物を起源とし得る。
本発明のプロモーターは、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ(sc)、サッカロマイセス・ミカタエ(Sm)、サッカロマイセス・クドリアブゼビイ(sk)、サッカロマイセス・バヤヌス(sba)、及びサッカロマイセス・アルボリコラ(Sar)からなる群から選択される生物を起源とし得る。
ターミネーター
本明細書において開示されるように、本発明による組換え細胞、特に、本発明による組換え酵母を得るための遺伝子操作されている目的の遺伝子の発現は、本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母細胞、特に、サッカロマイセス・セレビシエにおいて機能性である、適切な転写ターミネーター配列を含む。
同一又は異なる前記転写ターミネーターは、文献Yamanishiら、(2013) ACS synthetic biology 2, 337-347において見出され得る。
本発明におけるより具体的に関心のあるターミネーターは、
・トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子に由来するtTPI1(配列番号55)、
・O-アセチルホモセリン-O-アセチルセリンスルフヒドリラーゼをコードする遺伝子に由来するtMET25(配列番号56)、
・tDIT1(配列番号57)、
・tRPL3(配列番号58)、
・tRPL3.sm(配列番号59)、
・tRPL3.sba(配列番号60)、
・tRPL41B(配列番号61)、
・tRPL15A(配列番号62)、
・tRPL15A.sba(配列番号63)、
・tIDP1(配列番号64)、及び
・tTEF1.sba(配列番号65)
を含む群から選択され得る。
特に、前記ターミネーターは、tTPI1、tMET25、tDIT1、tRPL3、tRPL3.sm、tRPL3.sba、tRPL41B、tRPL15A、tRPL15A.sba、tIDP1、及びtTEF1.sbaからなる群から選択され得る。
本発明のターミネーターは、半子嚢菌綱に由来する任意の生物を起源とし得、特に、サッカロマイセス・セレビシエ及びサッカロマイセス・バヤヌスからなる群から選択される生物を起源とし得る。
組換え酵母
本発明の組換え細胞は、酵母及び細菌からなる群から選択され得る。
本発明の組換え細胞、例えば、本発明の組換え宿主細胞は、好ましくは、組換え酵母細胞である。
一般に、酵母は、急速に成長し得、細菌と比較して高密度で培養することができ、工業環境において無菌環境を必要としない。更に、酵母細胞は、細菌細胞と比較して容易に培養培地から分離することができ、産物の抽出及び精製のプロセスを大幅に単純化することができる。
本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母細胞は、好ましくは、サッカロマイセス目(Saccharomycetales)細胞である。
本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母は、特に、サッカロマイセス属、又はカンジダ属、又はクルイベロマイセス属、又はオガタエア属、又はヤロウイア属、又はデバリオマイセス属、又はアシュビア属に属し得る。
サッカロマイセス属に属する本発明の組換え細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・パラドクサス、サッカロマイセス・ミカタエ、サッカロマイセス・カステリ、サッカロマイセス・カリオカヌス(Saccharomyces cariocanus)、サッカロマイセス・クドリアブゼビイ、サッカロマイセス・アルボリコラス(Saccharomyces arboricolus)、サッカロマイセス・パストリヌス(Saccharomyces pastorianus)、サッカロマイセス・ウバルム(Saccharomyces uvarum)、及びサッカロマイセス・デルブルエッキ(Saccharomyces delbrueckii)からなる群から選択され得る。
カンジダ属に属する本発明の組換え細胞は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・ダブリニエンシス(Candida dubliniensis)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ルシタニエ(Candida lusitaniae)、及びカンジダ・ギリエルモンディ(Candida guilliermondii)からなる群から選択され得る。
クルイベロマイセス属に属する本発明の組換え細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス、クルイベロマイセス・マルシアヌス、クルイベロマイセス・ポリスポラス、クルイベロマイセス・サーモトレランス、クルイベロマイセス・ドブザンスキイ(Kluyveromyces dobzhanskii)、及びクルイベロマイセス・ウイケルハミイ(Kluyveromyces wickerhamii)からなる群から選択され得る。
オガタエア属に属する本発明の組換え細胞は、オガタエア・ポリモルファ、オガタエア・ヒストリアニカ(Ogataea histrianica)、オガタエア・デアキイ(Ogataea deakii)、オガタエア・コロンバネンシス(Ogataea kolombanensis)、オガタエア・フィロデンドラ(Ogataea philodendra)、オガタエア・シアメンシス(Ogataea siamensis)、オガタエア・アンガスタ(Ogataea angusta)、オガタエア・パラポリモルファ(Ogataea parapolymorpha)、オガタエア・ミヌタ(Ogataea minuta)、オガタエア・ノンファーメンタンス(Ogataea nonfermentans)、及びオガタエア・コダマエ(Ogataea kodamae)からなる群から選択され得る。
ヤロウイア属に属する本発明の組換え細胞は、ヤロウイア・リポリティカ、ヤロウイア・パロフォニイ(Yarrowia parophonii)、ヤロウイア・ガリ(Yarrowia galli)、ヤロウイア・オスロネンシス(Yarrowia oslonensis)、ヤロウイア・アリメンタリア(Yarrowia alimentaria)、ヤロウイア・ホランジカ(Yarrowia hollandica)、及びヤロウイア・ヤクシメンシス(Yarrowia yakushimensis)からなる群から選択され得る。
デバリオマイセス属に属する本発明の組換え細胞は、デバリオマイセス・ハンセニイ、デバリオマイセス・カルソニイ(Debaryomyces carsonii)、デバリオマイセス・カステリ(Debaryomyces castellii)、デバリオマイセス・マラマ(Debaryomyces marama)、デバリオマイセス・オクシデンタリス(Debaryomyces occidentalis)、デバリオマイセス・オヴィホルミス(Debaryomyces oviformis)、デバリオマイセス・ネパレンシス(Debaryomyces nepalensis)、デバリオマイセス・クデルチイ(Debaryomyces coudertii)、デバリオマイセス・ウデニイ(Debaryomyces udenii)、デバリオマイセス・サイクロスポラス(Debaryomyces psychrosporus)、及びデバリオマイセス・ヤマダエ(Debaryomyces yamadae)からなる群から選択され得る。
アシュビア属に属する本発明の組換え細胞は、アシュビア・ゴシピ及びアシュビア・アセリ(Ashbya aceri)からなる群から選択され得る。
本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母細胞は、特に、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・パラドクサス、サッカロマイセス・ミカタエ、サッカロマイセス・カステリ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、クルイベロマイセス・ラクティス、クルイベロマイセス・マルシアヌス、クルイベロマイセス・ポリスポラス、クルイベロマイセス・サーモトレランス、オガタエア・ポリモルファ、ヤロウイア・リポリティカ、デバリオマイセス・ハンセニイ、及びアシュビア・ゴシピからなる群から選択され得、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエである。
特定の実施形態において、本発明による組換え酵母細胞は、サッカロマイセス属、クルイベロマイセス属、又はエレモテシウム(Eremothecium)属のものであり、より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロマイセス・マルシアヌス、オガタエア・ポリモルファ、及びアシュビア・ゴシピからなる群から選択される種のものである。
ある実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、サッカロマイセス目に属する、特に、サッカロマイセス科に属するものから選択される酵母であり、特に、ヤロウイア・リポリティカ、クルイベロマイセス・マルシアヌス、オガタエア・ポリモルファ、アシュビア・ゴシピ、及びサッカロマイセス・セレビシエからなる群から選択される。
本発明の組換え細胞は、より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ細胞であり得る。
上述のように、本発明による組換え細胞は、本発明による1つ又は複数の組換え核酸の挿入によって、ヘパロサンを産生する能力を有する。ある特定の実施形態において、本発明による組換え酵母は、本発明による1つ又は複数の組換え核酸の挿入によって、制御されたサイズを有するヘパロサンを産生する能力を有する。
特定のDNAコンストラクトを遺伝子内に挿入するために実装される方法は、当業者の一般的な知識に属する。関連する方法は、本明細書に後述される実施例においてより詳細に記載されている。
しかしながら、細胞のゲノム、特に、酵母のゲノム、例えば、例としてサッカロマイセス・セレビシエのゲノム内へのDNAコンストラクトの挿入の結果は予測不可能であるため、予想外な技術的問題に遭遇した。具体的には、細胞、特に、酵母の生存率、並びに所望されるヘパロサンを成長及び産生するそれらの能力もまた、予測不可能である。
本発明の組換え細胞、特に、組換え細胞を得るために、多数の異なるコンストラクトが、生存性かつ効率的な組換え細胞、特に、酵母を得るために、本発明者らによって試験された。
培養条件
本発明はまた、ヘパロサン、特に、制御された分子量のヘパロサンの産生のための、本発明の組換え細胞の使用にも関する。
本発明は更に、ヘパロサン、特に、所望される分子量のヘパロサンを産生させる方法であって、
(a)本発明による組換え細胞を、培養培地において、ヘパロサンを産生させるのに十分な時間、培養する工程と、
(b)任意選択で、組換え細胞及び/又は培養培地から、ヘパロサンを単離又は回収する工程と
を含む方法に関する。
典型的には、本発明の細胞、特に、本発明の酵母を、約20℃～約37℃の温度、好ましくは、27～34℃の温度で、適切な培養培地において成長させる。
本発明の細胞、特に、本発明の酵母に好適な増殖培地は、一般に商業的に調製された培地、例えば、酵母窒素源、硫酸アンモニウム、及び炭素/エネルギー源としてのデキストロースを含む培地、又は最良の成長に最適な比率のペプトン、酵母抽出物、及びデキストロースのブレンドであるYPD培地である。他の規定又は合成増殖培地もまた、使用され得、特定の細胞、特に、酵母の成長に適切な培地は、微生物学又は発酵科学の分野における当業者に公知であろう。
本明細書において好適である特定の培地は、SY培地であり、これは、以下のエレメント:
KH2PO4:100mM、MgSO4 7H2O:2,8mM、K2SO4:11,5mM、Na2SO4:1,1mM、NaCl:2,6mM、CaCl2 2H2O:0,7mM、CuSO4 5H2O:15μM、KI:6μM、FeCl3:30μM、ZnSO4 7H2O:61μM、MnSO4 H2O:25μM、H2SO4:110μM、パントテン酸ヘミカルシウム塩:42μM、チアミン塩酸塩:59μM、ピリドキシン塩酸塩:49μM、ミオ-イノシトール(C6H12O6):555μM、ニコチン酸(C6H5NO2):29μM、D-ビオチン:0,82μM、三塩基性クエン酸アンモニウム:33mM、及びグルコース又はスクロース2～30%
を含む。
培養培地において使用され得る炭素源としては、フルクトース、マンノース、キシロース、及びアラビノース、オリゴ糖、例えば、ラクトース、マルトース、ガラクトース、又はスクロース、多糖、例えば、デンプン又はセルロース、又はこれらの混合物、並びに再生可能な原料、例えば、チーズホエイパーミエート、コーンスティープリカー、てんさい糖蜜、及び麦芽由来の未精製混合物が挙げられる。
培養培地に含まれ得る窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、及びこれらの組合せが挙げられる。
培養培地は、微量元素(例えば、金属塩)、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩、及び/又はマンガン塩、並びに成長因子、例えば、アミノ酸、ビタミン、成長促進因子等を更に含み得る。
含まれ得るビタミンの例は、パントテン酸ヘミカルシウム、チアミン塩酸塩、ピリドキシン塩酸塩、ミオ-イノシトール、ニコチン酸、D-ビオチン、葉酸、p-アミノ安息香酸、リボフラビンである。
本発明の培養培地は、希少元素、例えば、CuSO4・5H2O、KI、FeCl3、ZnSO4・7H2O、MnSO4・H2O、又はH2SO4、MgCl2、CaCl2、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、ZnCl、H3BO3、MnSO4、Na2MoO4を更に含み得る。
「適切な培養培地」という用語は、上記に定義されている。
本発明による組換え細胞のための公知の培養培地の例は、当業者に公知であり、以下の刊行物D. Burkeら、Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)に提示されている。
発酵に好適なpH範囲は、pH3.0～pH7.5であり、pH4～pH6が、初期条件として好ましい。
本明細書の他の箇所に記載されるように、培養培地のpH値は、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドの活性をモジュレートするために、本発明の方法の培養工程中に調節することができ、これが、本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母によって産生されるヘパロサン分子の分子量に影響を及ぼすであろう。
具体的には、培養培地のpHは、組換え酵母によって産生されることが意図されるヘパロサンに応じて改変され得る。例えば、培養培地のpHは、培養期間中、4、5.5、又は6のpHのままであってもよい。
特定の実施形態において、培養培地のpHは、本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母の培養の時間長の間、変化してもよく、又は変化させてもよい。前述のように、サッカロマイセス・セレビシエは、それが培養される培地を酸化させ、その培養培地のpHを低減させる。例えば、培養培地のpHは、6で開始し得、4に下がった後、6まで戻してもよい。別の例において、培養培地のpHは、6で開始し得、6のままであり得るか、又は6に維持してもよく、その後で、4に下げられてもよい。
特定の実施形態において、培養培地のpHは、本発明の方法の培養工程(a)の間、本発明の方法の培養工程の終了時に培養培地のpHが前記培養工程(a)の開始時点のpHと同じになるように、モジュレートされ得る。
別の実施形態において、培養培地のpHは、本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母細胞の培養時間の時間長の間、同じままであってもよい。
本発明による組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母細胞の培養の前記時間長は、目的のヘパロサンの分子量に応じて、変動し得る。前記時間長が長いほど、本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母細胞の所与の培養培地におけるヘパロサンの分子量は低くなる。
本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母の培養時間の時間長は、約35時間～約50時間、好ましくは、約40時間～約50時間の期間であり得、特に、約48時間である。
発酵は、好気性条件又は微好気性条件下において行われ得る。
発酵培地におけるヘパロサン産物の量は、当該技術分野において公知のいくつかの方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)又はガスクロマトグラフィー(GC)を使用して判定することができる。
本プロセスは、バッチ発酵方法を利用し得る。古典的なバッチ発酵は、培地の組成を発酵の開始時点で設定し、発酵中に人工的な変更に供さない、閉鎖系である。したがって、発酵の開始時点で、培地に、所望される生物を接種し、発酵を、系に何も添加することなく生じさせる。典型的には、しかしながら、「バッチ」発酵方法又は系は、炭素源の添加に関して、バッチであり、温度、pH、及び酸素濃度等の因子の制御が試みられることが多い。バッチ系において、系の代謝産物及びバイオマスの組成は、発酵を停止させる時点まで、絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞は、静止的な遅滞期から高成長の対数期、及び最終的には成長率が減少又は停止する静止期へと進行する。処置しない場合、静止期の細胞は、最終的に死滅するであろう。一般に、対数期の細胞が、最終生成物又は中間体の産生の大部分を担う。
フェッドバッチ系もまた、本発明において使用され得る。フェッドバッチ系は、典型的なバッチ系に類似であるが、炭素源基質が、発酵の進行に伴い増分で添加されることを除く。フェッドバッチ系は、異化産物抑制(例えば、グルコース抑制)が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合、及び培地内の基質の量を制限することが望ましい場合に、有用である。フェッドバッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、pH、溶解されている酸素、及びCO2等の排ガスの分圧といった測定可能な因子の変化に基づいて推測される。
バッチ及びフェッドバッチ培養方法は、当該技術分野において一般的かつ周知であり、例は、Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Crueger, Crueger, and Brock, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA又はDeshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36, 227, (1992)に見出され得る。本発明は、バッチモードで行われるが、本方法が、連続発酵に適応可能であろうことが企図される。
連続発酵は、処理のために、規定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に等量の条件培地が除去される、開放系である。連続発酵は、一般に、培養物を、細胞が主として対数期増殖にある一定の高密度で維持する。
連続発酵は、細胞成長又は最終産物濃度に影響を及ぼす1つの因子又は任意の数の因子のモジュレーションを可能にする。例えば、1つの方法は、制限栄養素、例えば、炭素源又は窒素レベルを、固定割合に維持し、すべての他のパラメーターの変動を許容するであろう。他の系において、成長に影響を及ぼすいくつかの因子は、連続的に変更され得、一方で、培地濁度によって測定される細胞濃度は、一定に保たれる。連続系は、定常状態の成長条件を維持するよう試み、したがって、培地が流出することに起因する細胞消失は、発酵中の細胞成長速度に対してバランスを取らなければならない。連続発酵プロセスの栄養素及び成長因子をモジュレートする方法、並びに産物形成の速度を最大にするための技法は、産業微生物学の分野において周知である。
本発明は、バッチ、フェッドバッチ、又は連続プロセスのいずれかを使用して実施され得ること、及び任意の公知の発酵様式が好適であろうことが、企図され得る。加えて、細胞は、全細胞触媒として基質上に固定化され、産生のための発酵条件に供され得ることが、企図される。
ヘパロサン産生をなおも向上させるために、特定の実施形態は、本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母細胞を、適切な培養培地、例えば、上述のものにおいて培養することからなり得、ここで、前記培養培地は、最適な量の炭素源、特に、グルコース又はスクロースを含む。
好ましい実施形態において、前記最適な培養培地中に含まれる炭素源は、グルコース及び/又はスクロースからなる。好ましい実施形態において、前記最適な培養培地は、1%w/w以上のグルコース及び/又はスクロースを含み、特に、5%w/w以上のグルコース及び/又はスクロースを含み、特に、10%w/w以上のグルコース及び/又はスクロースを含み、特に、15%w/w以上のグルコース及び/又はスクロースを含む。好ましい実施形態において、前記最適な培養培地は、多くとも40%w/wのグルコースを含み、これには、多くとも35%w/wのグルコースが含まれる。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、工業規模で実行される。
より具体的には、本発明による方法の培養培地は、少なくとも約100L、より好ましくは約1000L～約3000Lの範囲、更により好ましくは約10,000L、更により好ましくは100,000L、又は更には約250,000Lであり得る。
本発明は更に、前述のヘパロサンを産生させるための方法であって、
(a)本発明の組換え細胞を、培養培地において培養する工程と、
(b)前記培養培地からヘパロサンを回収する工程と
を含み、
工程(b)において回収されるヘパロサンが、
- 本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え細胞のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ若しくは複数の組換え核酸の性質及び起源、
- 本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ若しくは複数の組換え核酸の発現を制御するプロモーターの性質及び起源、
- 本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母のグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする1つ若しくは複数の組換え核酸に付随するアンカリングシグナルの存在若しくは不在、
- 本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母を培養する工程中の培養培地のpH、並びに/又は
- 本発明の組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母を培養する期間
の選択を通じて制御される分子量を有する、
方法に関する。
ヘパロサンの分子量は、特定の分子量、又はより好ましくは、特定の範囲の分子量であり、例えば、例として、50kDa未満、約20kDa～約50kDaの範囲、50kDa以上、約50kDa～約150kDaの範囲、約50kDa～約250kDaの範囲、100kDa以上、約100kDa～約1500kDaの範囲、約150kDa～約1500kDaの範囲、1000kDaを上回る、又は1500kDaを上回る。
本発明はまた、約20kDa～約50kDa又は約50kDa～約1000kDaの範囲の分子量を有するヘパロサンの産生のための、本発明による組換え細胞、特に、本発明の組換え酵母細胞の使用に関する。
本発明の分泌シグナルは、例えば、
- 配列番号66として記載される核酸配列、及び/又は
- 配列番号67として記載されるアミノ酸配列
を有し得る。
本発明のアンカリングシグナルは、例えば、
- 配列番号68として記載される核酸配列、及び/又は
- 記載される配列番号69のアミノ酸配列
を有し得る。
分泌シグナルは、シグナルペプチドをコードする核酸配列で開始し、前に定義されているグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸が続くキメラ核酸を作製することによって、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドに融合され得る。
分泌シグナル及びアンカリングシグナルは、シグナルペプチドをコードする核酸配列で開始し、前に定義されているグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸が続き、アンカリングシグナルをコードする核酸配列が続く、キメラ核酸を作製することによって、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドに融合され得る。
そのようなキメラ核酸配列は、当業者に公知の技法、例えば、核酸の化学合成、又は任意の組換え技法、例えば、クローニング若しくはPCRによって、得ることができる。
ヘパロサンの精製
本発明の特定の態様によると、ヘパロサンの発酵産生は、好ましくは、培養培地からの産生されたヘパロサンの単離の工程を含む。培養培地からヘパロサンを回収することは、当業者には日常的な作業である。それは、パーベーパレーション、選択的沈降、濾過、遠心分離、スプレー乾燥、凍結乾燥、又は液体抽出を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において周知のいくつかの技法によって達成され得る。当業者であれば、分離しようとする材料の特徴に応じて、それぞれの技法のパラメーターを適合させる方法を把握している。
本発明における細胞のモデルとしての酵母は、合成されたヘパロサンが、完全に細胞の外部に輸送され、したがって、精製プロセスが簡素化されるという点で、好ましい。
ガスストリッピングは、ヘリウム、アルゴン、二酸化炭素、水素、窒素、又はこれらの混合物から選択されるストリッピングガスを用いて達成される。
液体抽出は、疎水性相として、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、又はドデカン等の有機溶媒を用いて達成される。再生溶媒もまた、使用され得る。
誘導体
「ヘパロサン」という用語は、本明細書において使用される場合、化粧用製品、香味製品、芳香製品、食料品、食品、飲料、テクスチャラント、医薬組成物、栄養補助食品、栄養医薬、洗浄製品、並びに/又は歯科及び/若しくは口腔衛生組成物、又はこれらの組合せにおける用途に有用なヘパロサンの誘導体、例えば、ヘパリン(硫酸化ヘパロサン)を包含することも意図される。
本明細書において使用される場合、「ヘパロサンの誘導体」とは、化学的又は酵素的な方法で改変されており、したがって、ヘパロサンと類似の構造を含む、ヘパロサン化合物である。これらの誘導体は、ヘパロサンと同じ生物学的活性を示してもよく、又は異なる生物学的活性を示してもよい。
好適なヘパロサン誘導体としては、ヘパリン、エノキサパリン、ダルテパリン、及びチンザパリンが挙げられるが、これらに限定されない。
ヘパリンは、抗凝固剤(抗凝血剤)として、並びに心臓発作及び不安定な狭心症の危険性の緩和、それらの低減、予防、及び/又は処置において、有用である。
特に、ヘパリンは、一般に、
・急性冠症候群、例えば、NSTEMI、
・心房細動、
・深部静脈血栓症及び肺塞栓症、
・心臓手術のための心肺バイパス、
・体外生命維持のためのECMO回路、
・血液濾過及び/又は
・留置中心若しくは末梢静脈カテーテル
等であるがこれらに限定されない状態の危険性の緩和、それらの低減、予防、及び/又は処置のために、抗凝固目的で使用される。
ヘパリン及びその低分子量誘導体(例えば、エノキサパリン、ダルテパリン、チンザパリン)は、危険性にある人物において深部静脈血栓症及び肺塞栓症を予防するのに有効である。
ヘパリンは、静脈又は皮下への注射によって与えられる。
他の使用には、試験管及び腎臓透析装置内での適用が、含まれる。
ヘパロサン、特に、ヘパリンは、組成物として調製され得る。
製剤及び製品
本発明の組成物は、製剤/製品、例えば、栄養医薬用、医薬用、獣医学用、ワイン醸造学用、又は化粧用の製剤/製品に組み込まれ得る。
したがって、本発明は、本発明の組成物を含む製剤を提供する。例えば、本発明は、本発明の組成物を含む化粧用製剤を提供し得る。
本発明はまた、本発明の組成物を含む製品を提供する。例えば、本発明は、本発明の組成物を含む化粧用製品を提供し得る。
「化粧用製品」は、ヒトの身体の外部(表皮、毛髪系、爪、口唇、及び外生殖器)又は口腔の歯及び粘膜と、それらを洗浄する、それらに香りをつける、それらの外観を変更する、それらを保護する、それらを良好な状態に保つ、体臭を正す、及び/又はこれらの組合せを排他的に又は主として行う観点で、接触して設置されることが意図される、任意の物質又は混合物を意味することが意図される。
「物質」は、天然の状態又は任意の製造プロセスによって得られる化学元素及びその化合物を意味することが意図され、その安定性を保存するために必要な任意の添加剤、及び使用されるプロセスに由来する任意の不純物を含むが、物質の安定性に影響を及ぼすこともその組成を変化させることもなく分離することができる任意の溶媒を除く。
「混合物」は、2つ又はそれ以上の物質から構成される混合物又は溶液を意味する。
本発明はまた、栄養医薬用、医薬用、獣医学用、ワイン醸造学用、又は化粧用の製剤/製品における本発明の組成物の使用を提供する。
そのような製剤又は製品は、本明細書において以降、「本発明の製剤又は製品」と称される。
栄養医薬用、医薬用、獣医学用、ワイン醸造学用、又は化粧用の製剤/製品は、任意選択で、適宜、医薬用/獣医学用/化粧用(例えば、化粧用活性)成分、例えば、賦形剤、担体、及びこれらの混合物を更に含み得る。
「化粧用」又は「化粧用活性成分」は、個別、又は化合物、成分、中間体、分子、物質、原材料、若しくは製品の混合物の一部としての、ありとあらゆる天然、天然に存在する、天然に同一な、合成、合成で産生された、生合成で産生された、持続可能、再生可能、及び/又は生分解性の化合物、成分、中間体、分子、物質、原材料、又は製品、
ブレンド、組成物、製剤(皮膚湿潤剤、クリーム、バーム、セラム、オイル、眼、顔の化粧、洗い流す毛髪用製品、洗い流さない毛髪用製品、染髪料(天然の染髪料を含むがこれに限定されない)、及び/又はこれらの組合せを含むが、これらに限定されない)、最終製品及び関連技術、例えば、例として、化粧用製剤に組み込まれる成分(例えば、例として皮膚、毛髪、頭皮等に対して活性を有さないが、最終製品の製剤において役割を果たす、天然の着色剤、保存剤、乳化剤、抗酸化剤等)、送達システム、マーケティング補助(例えば、透明な製剤に適用される色付けされたユニスフィア(unisphere))、並びに
- ヒト若しくは動物の身体へ擦りつけること、注ぐこと、振りかけること、噴霧すること、若しくは他の方法によって、及び/又はヒト若しくは動物の身体の様々な外部及び/若しくは表面部分(皮膚、毛髪、体毛、毛髪系、頭皮、爪、口唇、外生殖器、歯、口腔及び/若しくは鼻粘膜等を含むがこれらに限定されない)と接触させることによる、直接的な適用、並びに/或いはヒト若しくは動物の身体への間接的な適用、例えば、例として、テキスタイルの一部としての適用、又はテキスタイルに適用される送達デバイス(例えば、カプセル)若しくは送達系(例えば、ブレンド若しくは製剤)の一部としてのテキスタイルへの適用、並びに/或いは
- ヒト若しくは動物の身体の外部及び/若しくは表面(例えば、頭皮であるがこれに限定されない)又はヒト若しくは動物の身体の審美的外観を洗浄する、ケアする、冷却する、美しくする、整える、処置する、鎮静する、テクスチャ調整する(texturizing)、見栄えを良くする、保護する、維持する、改善する、増強する、変更する、及び/若しくは変化させること、並びに/又は皮膚の沈静化、治癒、修復、若しくは再生、水分補給を提供することによって、又は乾燥、刺激、傷害、若しくは疲労の状態を軽減する、なめらかにする、保湿する、色を調節する、治癒する、滅菌する、緩和する、正す、及び/若しくは改善するために、主として皮膚、口腔粘膜、頭皮、若しくは毛髪を洗浄する、若しくはそれに香りをつける、若しくはそれを保護するか若しくはその良好な状態を維持する、若しくはその体臭を消す、若しくはその外観を変化させる、若しくはバランスの悪い状態を正すか若しくは修復する観点で、並びに/又は色素沈着障害を正す、又はふけ、にきび、刺激、及び/若しくは炎症等の非薬学的予防及び/若しくは処置を提供する、及び/又は皮膚の表面上の細菌叢(例えば、例として、微生物叢)のバランスを取り戻す(例えば、例として、皮膚表面上の有益な細菌叢のレベルを促進することによって)観点で、並びに/又はヒト若しくは動物の身体を健康上及び/若しくは幸福上の目的で良好な状態に保つ目的、及び/又はヒト若しくは動物の身体の外観を、例えば、ヒト若しくは身体に適用される製品の外観を改善することによって改善する目的で、並びに/或いは
- 生物学的活性の利点とともに化粧用及び/若しくは皮膚科学的機能及び/若しくは利点を提供すること(しかしながら、身体の構造若しくは機能に影響を及ぼさない)
において有用である/それに使用される/それが意図される、それに関連するものを作製する方法を意味する。疑いを回避するために、化粧用若しくは化粧用活性成分、又はこれらの一部はまた、機能性成分及び/又は栄養医薬として適格であり得る。
「機能性成分」とは、医薬又は健康上の利益を提供する食品成分又は食品の一部を意味し、以下のうちのいずれかを含む:カロテノイド、食物繊維、脂肪酸、サポニン、抗酸化剤、フラボノイド、イソチオシアネート、フェノール、ポリフェノール(例えば、レスベラトロール)、植物性ステロール又はスタノール(フィトステロール及びフィトスタノール)、ポリオール、プレバイオティクス、フィトエストロゲン、ダイズタンパク質、硫化物/チオール、ビタミン、グルコサミン、保存剤、保水剤、食用ゲル化成分、食用ゲル混合物及びゲル組成物、長鎖第一級脂肪族飽和アルコール、着色剤、テクスチャ調整剤、乳化剤、並びにこれらの組合せ。
「栄養医薬」とは、健康及び/又は化粧上の利益、並びにヒト身体の外観を改善又は維持することと関連する、ありとあらゆる天然の、天然に存在する、持続可能な、合成により産生された、及び生合成により産生された、化合物、化合物の混合物、機能性成分、分子、組成物、原材料、及び中間体(成分及びそれに関連する送達デバイス(例えば、カプセル)、その送達系(例えば、ブレンド若しくは製剤)、並びに前述のものを作製する方法を含む)を意味する。疑いを回避するために、栄養医薬は、固体製剤か、カプセルか、錠剤か、液体製剤か、溶液か、又は懸濁液かにかかわらず、食品又は飲料に対する補助として使用することができる化合物を含む。
代替的に、栄養医薬用、医薬用、獣医学用、ワイン醸造学用、又は化粧用の製剤/製品は、本発明の組成物からなり得るか、又はそれから本質的になり得る。
化粧用製剤/製品は、抗老化製剤であり得る。
本明細書において使用される場合、医薬用、獣医学用、又は化粧用として許容される賦形剤への言及は、当業者に公知の医薬用、獣医学用、又は化粧用として許容されるアジュバント、希釈剤、及び/又は担体を指し得る。
「医薬用/獣医学用/化粧用として許容される」とは、組成物の追加の成分が、一般に、安全で非毒性であり、生物学的にもそれ以外にも望ましくないものではないことを意味する。例えば、追加の成分は、一般に、滅菌かつ発熱物質不含であり得る。そのような成分は、本発明の組成物と適合性があり、そのレシピエントに対して有害ではないという意味で、「許容される」必要がある。したがって、「医薬として許容される賦形剤」は、単に賦形剤として作用することが意図される、すなわち、それ自体が生物学的活性を有することが意図されない、製剤の一部を形成するのに使用される任意の化合物を含む。
栄養医薬用、医薬用、獣医学用、ワイン醸造学用、又は化粧用の製剤/製品は、液体又は固体の形態であり得る。
経口投与のための液体投薬製剤/製品は、溶液、エマルション、水性又は油性懸濁液、シロップ、及びエリキシルを含む。
本明細書に記載される製剤及び製品(例えば、医薬用、獣医学用、又は化粧用の製剤/製品)、例えば、経口投与が意図されるものは、当業者に公知の方法に従って、例えば、製剤/製品の成分を一緒に混合することによって、調製され得る。
製剤又は製品(例えば、医薬用、獣医学用、又は化粧用の製剤/製品)は、1つ又は複数の追加の成分、例えば、医薬成分及び賦形剤、例えば、甘味剤、香味剤、着色剤、及び保存剤を含み得る。
製剤又は製品(例えば、医薬用、獣医学用、又は化粧用の製剤/製品)はまた、1つ又は複数の追加の活性成分、例えば、化粧用又は医薬用活性成分、例えば、ヒアルロン酸、センテラ・アジアチカ(centella asiatica)抽出物、ペプチド、例えば、Matrixyl(登録商標)及びArgireline(登録)、並びにこれらの混合物も含み得る。
本発明の製剤又は製品は、活性成分を、非毒性の医薬として許容される賦形剤(又は成分)との混合で含み得る。これらの賦形剤(又は成分)は、例えば、不活性希釈剤、例として、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、又はリン酸ナトリウム;造粒剤及び崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、マルトデキストリン、又はアルギン酸;結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、若しくはアカシア;又は滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、並びにこれらの混合物であり得る。
液体製剤又は製品(例えば、医薬用、獣医学用、又は化粧用の製剤/製品)は、カプセル内に含まれ得、これは、コーティングされていなくてもよく、又は上記に定義されるようにコーティングされていてもよい。
好適な医薬用又は獣医学用担体としては、不活性固体希釈剤又は充填剤、滅菌水溶液、及び様々な有機溶媒が挙げられる。液体担体の例は、シロップ、ピーナツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン、及び水である。
更に、担体又は希釈剤は、当該技術分野において公知の任意の持続放出材料、例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルを、単独又はワックスと混合して含み得る。
好適な医薬用担体としては、滅菌水溶液及び様々な有機溶媒が挙げられる。液体担体の例は、シロップ、植物油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレン、及び水である。更に、担体又は希釈剤は、当該技術分野において公知の任意の持続放出材料、例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルを、単独又はワックスと混合して含み得る。
好適な化粧用担体は、典型的には、ヒト身体の外表面、例えば、皮膚及び/又は毛髪及び/又は頭皮への局所投与に好適であるものである。
典型的には、そのような担体は、皮膚科学的に許容される。
「皮膚科学的に許容される担体」という語句は、担体が、ケラチン組織への局所適用に好適であり、良好な審美的特性を有し、組成物中の活性物質と適合性があり、いずれの不合理な安全性の問題も毒性の問題も引き起こさないことを意味する。
担体は、広範な形態であり得る。いくつかの場合において、成分(例えば、抽出物、日焼け止め活性物質、追加の成分)の可溶性又は分散性により、担体の形態及び特徴が決定され得る。非限定的な例としては、単純溶液(例えば、水溶液又は無水溶液)、分散体、エマルション、及び固体形態(例えば、ゲルスティック、フロアブル固体、又は非晶質材料)が挙げられる。
皮膚科学的に許容される担体は、エマルションの形態であり得る。エマルションは、一般に、連続水性相(例えば、水中油型及び水中油中水型)又は連続油性相(例えば、油注水型又は水中油型)を有するとして分類され得る。本発明の油性相は、シリコーン油、非シリコーン油、例えば、炭化水素油、エステル、エーテル等、及びこれらの混合物を含み得る。水性相は、典型的には、水及び水溶性成分(例えば、水溶性湿潤剤、コンディショニング剤、抗微生物剤、保湿剤、及び/又は他の皮膚ケア活性物質)を含む。しかしながら、いくつかの場合には、水性相は、水溶性湿潤剤、コンディショニング剤、抗微生物剤、保湿剤、及び/又は他の水溶性皮膚ケア活性物質を含むがこれらに限定されない、水以外の成分を含んでもよい。いくつかの場合には、組成物の水ではない成分は、保湿剤、例えば、グリセリン及び/又は他のポリオールを含む。エマルションはまた、乳化剤を含み得る。乳化剤は、非イオン性であっても、アニオン性であっても、カチオン性であってもよい。
担体は、1つ又は複数の皮膚科学的に許容される親水性希釈剤を含み得る。本明細書において使用される場合、「希釈剤」とは、本発明の組成物が、分散、溶解、又はそれ以外の方法で組み込まれ得る、材料を含む。親水性希釈剤としては、水、有機親水性希釈剤、例えば、低級一価アルコール(例えば、C1～C4)、並びに低分子量グリコール及びポリオール、例えば、プロピレングルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ブチレングリコール、1,2,4-ブタントリオール、ソルビトールエステル、1,2,6-ヘキサントリオール、エタノール、イソプロパノール、ソルビトールエステル、ブタンジオール、エーテルプロパノール、エトキシ化エーテル、プロポキシ化エーテル、並びにこれらの組合せが挙げられる。
化粧用製剤/製品は、任意選択で、化粧用組成物において一般に使用される1つ又は複数の追加の成分(例えば、着色剤、皮膚色調整剤、皮膚抗老化剤、抗炎症剤、日焼け止め剤、これらの組合せ等)を含み得るが、ただし、追加の成分が、組成物によって提供される抗糖化利益を不必要に変更しないことを条件とする。
いくつかの場合において、活性物質が互いと干渉し、それによって両方の薬剤の有効性が低減され得ることのないように、異なる生物学的経路を介して機能する皮膚色調整剤を選択することが望ましい場合がある。追加の成分は、組成物に組み込まれる場合、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応等を伴うことなくヒト皮膚組織と接触して使用するのに好適である必要がある。
「担体」という用語はまた、本明細書において使用される場合、天然の産物、又は起源とする天然の産物とは異なるように形質転換若しくは改変されている自然を起源とする産物、例えば、マルトデキストリンを指し得る。
栄養医薬用、医薬用、獣医学用、ワイン醸造学用、又は化粧用の製剤又は製品中に存在する本発明の組成物の量は、用途に応じて変動するであろう。
典型的には、栄養医薬用、医薬用、獣医学用、ワイン醸造学用、又は化粧用の製剤又は製品中に存在し得る本発明の組成物の量は、栄養医薬用、医薬用、獣医学用、ワイン醸造学用、又は化粧用の製剤又は製品の約0.001～約50重量%、例えば、約0.01%～約30%又は約1%～約20%、例えば、製剤又は製品の約0.01～約20重量%、又は約0.1～10重量%、又は約1～約5重量%となる。
当業者であれば、遺伝子コードの縮重性質に起因して、ヌクレオチド配列が異なる様々なDNA分子が、本開示の所与の酵素をコードするのに使用され得ることを認識するであろう。上述の生合成酵素をコードする生来のDNA配列は、単に、本開示の実施形態を例示するために本明細書において参照され、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のDNA分子を含む。類似の様式において、ポリペプチドは、典型的に、所望される活性の消失又は有意な消失をも伴わないそのアミノ酸配列における1つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を寛容し得る。本開示は、改変されたか又はバリアントのポリペプチドが参照ポリペプチドの酵素的同化又は異化活性を有する限り、本明細書に記載される特定のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するそのようなポリペプチドを含む。更に、本明細書に示されるDNA配列によってコードされるアミノ酸配列は、単に、本開示の実施形態を例示する。
本開示の方法、組成物、及び生物において有用な特定の遺伝子及びタンパク質が、本明細書に記載されているが、しかしながら、そのような遺伝子に対する絶対的な同一性が必要なわけではないことが認識されるであろう。例えば、ポリペプチド又は酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子又はポリヌクレオチドにおける変更が行われてもよく、活性についてスクリーニングされてもよい。典型的には、そのような変更は、保存的突然変異及びサイレント突然変異を含む。そのような改変又は突然変異されたポリヌクレオチド及びポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法を使用して、機能性酵素の発現について、スクリーニングされ得る。
遺伝子コードの本質的な縮重に起因して、実質的に同じか又は機能的に同等のポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドもまた、そのような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニング及び発現するために使用することができる。
当業者に公知の技法は、更なる相同遺伝子及び相同酵素を特定するために好適であり得る。一般に、類似の遺伝子及び/又は類似の酵素は、機能性分析によって特定することができ、機能的類似性を有するであろう。
当業者に公知の技法は、類似の遺伝子及び類似の酵素、又は任意の生合成経路遺伝子、タンパク質、若しくは酵素を特定するために好適であり得、技法には、目的の遺伝子/酵素の公開されている配列に基づくプライマーを使用したPCRによる、又は目的の遺伝子内の保存された領域を増幅するように設計された縮重プライマーを使用した縮重PCRによる、遺伝子のクローニングが挙げられるが、これらに限定されない。更に、当業者であれば、機能的相同性又は類似性を有する相同又は類似の遺伝子、タンパク質、又は酵素を特定するための技法を使用することができる。技法としては、細胞又は細胞培養物を、酵素の触媒活性について、前記活性に関するインビトロ酵素アッセイを通じて試験し(例えば、本明細書又はKiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970に記載される)、次いで、精製によって前記活性を有する酵素を単離すること、Edman変性、可能性のある核酸配列に対するPCRプライマーの設計、PCRによる前記DNA配列の増幅、及び前記核酸配列のクローニング等の技法によって酵素のタンパク質配列を決定することが挙げられる。相同若しくは類似の遺伝子、及び/又は相同若しくは類似の酵素、類似の遺伝子、及び/又は類似の酵素若しくはタンパク質を特定するために、技法には、候補遺伝子又は酵素に関するデータを、BRENDA、KEGG、又はMetaCYC等のデータベースと比較することも含まれる。候補遺伝子又は酵素は、本明細書における教示に従って、上述のデータベース内で特定され得る。
「...～...」及び「...～...の範囲」という用語は、別途指定されない限り、限界値を含むと理解されるものとする。本明細書及びそれに続く特許請求の範囲全体を通じて、文脈により別途要求されない限り、「含む(comprise)」という言葉、並びに「含む(comprises)」、「含むこと(comprising)」、及び「有する(possesses)」等の変化形は、言及された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群の包含を意味し、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群の除外を意味するものではないことを理解されたい。「含む(comprising)」という用語はまた、「含む(including)」並びに「からなる(consisting)」を意味し、例えば、Xを「含む」組成物は、排他的にXからなる場合もあり、又は何らかの追加、例えば、X+Yを含む場合もある。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含むことにも、留意しなければならない。例として、「遺伝子」又は「酵素」への言及は、「1つ若しくは複数の遺伝子」又は「1つ若しくは複数の酵素」への言及である。
本明細書に記載される特定の手法、プロトコール、及び試薬は、変動し得るため、本開示はこれらに限定されるものではないことを理解されたい。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のものにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本開示の範囲を制限することを意図するものではないこともまた、理解されたい。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本開示によると、当業者の技能の範囲内の従来的な分子生物学、微生物学、及び組換えDNA技法が利用され得る。
本開示は、その適用に関して、以下の説明に記載されるか又は図面に図示される構成要素の構築及び配置の詳細に制限されない。本開示は、他の実施形態が可能であり、様々な手段で実施又は実行されることが可能である。また、本明細書において使用される表現及び用語は、説明の目的のためのものであり、制限とみなされるものではない。好ましくは、本明細書において使用される用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H.編(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載されるように定義される。
いくつかの文書が、本明細書全体を通じて引用されている。本明細書に引用される文書のそれぞれ(すべての特許、特許出願、化学刊行物、製造業者の仕様書、説明書、GenBank受託番号配列登録等を含む)は、上述又は後述に関係なく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の実施例及び図面は、例示の目的で提示され、本発明の制限を暗示するものではない。
(実施例1)
本発明による組換えサッカロマイセス・セレビシエ株を作製するためのプロトコール
本明細書において以下に実装される組換えサッカロマイセス・セレビシエ株はすべて、標準的な酵母分子遺伝学手順(Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) by D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press)を使用して、標準的な株から構築した。
以下で言及される遺伝子のクラスターを、配列相同性を有する遊離DNA末端を効率的に組み換える酵母の能力を使用して、組換え酵母に一度に組み込んだ。
加えて、以下の遺伝子型のより良好な理解の目的とし、
- jlp1、lyp1、sam3、his3、leu2、trp1、及びura3は、挿入部位である。
- 小文字は、考察される遺伝子が不活性であることを意味し、大文字は、活性遺伝子を表す。
- 遺伝子名の後の「::」は、遺伝子が、その後のものによって分断されることを意味する(1つを上回る遺伝子が挿入される場合、それらはブラケット[]で示される)。遺伝子の分断は、コーディング配列の全欠失と同時に起こるが、プロモーターは保存される。その結果、「::」が続く遺伝子は、不活性であり、小文字で示される。指定されない場合、挿入された遺伝子の転写は、破壊された遺伝子のプロモーターによって制御される。
- 「遺伝子.Kl」は、遺伝子がクルイベロマイセス・ラクティスを起源とすることを意味する。本実施例において遺伝子の後に何も示されていない場合、これは、遺伝子がサッカロマイセス・セレビシエに由来することを意味する。
より具体的には、クローニングしようとするコーディング配列を、人工的に合成した。異種配列(非酵母)については、酵母コドン使用頻度を使用して同義のコーディング配列を得るために、核酸配列を改変した。制限酵素及び古典的なクローニング技術を使用して、それぞれの合成配列を、転写プロモーターと転写ターミネーター間にクローニングした。それぞれのプロモーター配列の前には、上流遺伝子のターミネーターの配列に相同な50～200個のヌクレオチドの配列がある。同様に、それぞれの遺伝子(プロモーター-コーディング配列-ターミネーターを含む遺伝子)のターミネーターの後には、直後の遺伝子に相同な配列がある。そのため、組み込もうとするユニットのそれぞれは、上流のユニット及び下流のユニットの両方との50～200個のヌクレオチドのオーバーラップを有する。最初のユニットについては、プロモーターの前には、組み込まれる遺伝子座の酵母染色体ヌクレオチドに相同な50～200個のヌクレオチドがある。同様に、最後のユニットについては、ターミネーターの後には、組み込まれる遺伝子座の酵母染色体ヌクレオチドに相同な50～200個のヌクレオチドがある。
それぞれのユニットは、次いで、プラスミドコンストラクトからPCR増幅されて、オーバーラップする配列を有する直鎖状のDNAのXユニットが得られる。この遺伝子の少なくとも1つは、組換え事象を選択するための要求性マーカーである。すべての直鎖状フラグメントを、一度に酵母に形質転換し、使用したマーカーに関連する要求性について、組換え酵母細胞を選択する。配列の完全性を、次いで、PCR及びシーケンシングによって検証する。
(実施例2)
ヘパロサンの産生のための比較例
7つの組換え株は、野生型株CC788-2Dに由来するが(Cherestら、(2000) J Biol. Chem. 275: 14056-14063)、これらは、ヘパロサンをまったく産生しない:YA5398-3、YA5402-1、YA5400-1、YA5401-1、YA5437-18、 YA5435-2、及びDA2531-12。
これら7つの株は、以下の通りである:
YA5398-3 : MAT-α, can1-100, his3::[tRPL3-UGP1-pSAM1, pMET6-QRI1-tIDP1, HIS3]x8, leu2::[URA3.Sba-loxP, pCCW12.Sba-HASB.Vir-tRPL3.Sm, pCCW12.Sk-HASB-A.Vir-tTEF1.Sba, pCCW12.Sar-HSS2.Pm-tRPL3.Sba, pCCW120.Sca-HSS2.Pm-tRPL15A.Sm], leu2, trp1, ura3
YA5402-1 : MAT-α, can1-100, his3::[tRPL3-UGP1-pSAM1, pMET6-QRI1-tIDP1, HIS3]x8, jlp1::[LEU2.Sba-loxP, pCCW12.Sba-HASB.Vir-tRPL3.Sm, pCCW12.Sk-HASB-A.Vir-tTEF1.Sba, pCCW12.Sar-HSS2.Pm-tRPL3.Sba, pCCW120.Sca-HSS2.Pm-tRPL15A.Sm], leu2, trp1, ura3
YA5400-1 : MAT-α, can1-100, his3::[tRPL3-UGP1-pSAM1, pMET6-QRI1-tIDP1, HIS3]x8, jlp1::[LEU2.Sba-loxP, pCCW12.Sba-HASB.Vir-tRPL3.Sm, pCCW12.Sk-HASB-A.Vir-tTEF1.Sba, pCCW12.Sar-HSS2.Pm-tRPL3.Sba, pCCW120.Sca-HSS2.Pm-tRPL15A.Sm, pTEF1.Ago-GFA1-tRPL15A], leu2, trp1, ura3
YA5401-1 : MAT-α, can1-100, his3::[tRPL3-UGP1-pSAM1, pMET6-QRI1-tIDP1, HIS3]x8, jlp1::[LEU2.Sba-loxP, pCCW12.Sba-HASB.Vir-tRPL3.Sm, pCCW12.Sk-HASB-A.Vir-tTEF1.Sba, pCCW12.Sar-HSS2.Pm-tRPL3.Sba, pCCW120.Sca-HSS2.Pm-tRPL15A.Sm, pTEF1.Ago-GFA1.Vir-tRPL15A], leu2, trp1, ura3
YA5437-18 : MAT-α, can1-100, his3::[tRPL3-UGP1-pSAM1, pMET6-QRI1-tIDP1, HIS3]x8, jlp1::[LEU2.Sba-loxP, pCCW12.Sba-HASB.Vir-tRPL3.Sm, pCCW12.Sk-HASB-A.Vir-tTEF1.Sba, pCCW12.Sar-HSS1.Pm-tRPL15A.Sm], leu2, trp1, ura3
YA5435-2: MAT-α, can1-100, his3::[tRPL3-UGP1-pSAM1, pMET6-QRI1-tIDP1, HIS3]x8, jlp1::[LEU2.Sba-loxP, pCCW12.Sba-HASB.Vir-tRPL3.Sm, pCCW12.Sk-HASB-A.Vir-tTEF1.Sba, pCCW12.Sar-HSS1.Pm-tRPL15A.Sm, pTEF1.Ago-GFA1.Vir-tRPL15A], leu2, trp1, ura3
DA2531-12 : MAT-a/MAT-α, CAN1/can1-100, his3/his3::[tRPL3-UGP1-pSAM1, pMET6-QRI1-tIDP1, HIS3]x8, jlp1::[LEU2.Kl-RS, pCUP1-UGP1-tRPL3, pCUP1-QRI1-tIDP1, pPDC1-UGP1-tTPI1, pTDH3-QRI1-tMET25, pCCW12-HASB.At-tRPL15A]/jlp1::[LEU2.Sba-loxP, pCCW12.Sba-HASB.Vir-tRPL3.Sm, pCCW12.Sk-HASB-A.Vir-tTEF1.Sba, pCCW12.Sar-HSS1.Pm-tRPL15A.Sm, pTEF1.Ago-GFA1.Vir-tRPL15A], leu2/leu2, SAM3/sam3::[LEU2.Kl-RS, pPDC1-PGM1-tIDP1, pTEF1.Ago-GFA1-tRPL15A, pENO2-UGP1-tRPL3, pCWP2-GNA1-tTPI1, pTEF1-PCM1-tRPL41B, pCCW12.Sba-HASB.vir-tRPL3.Sm, pCCW12.Sk-HASB-A.Vir-tTEF1.Sba, pCCW12.Sar-HSS2.Pm-tRPL3.Sba, pCCW120.Sca-HSS2.Pm-tRPL15A.Sm, pTDH3-1.Sba-QRI1-tIDP1.Sba, HIS3.Sba-loxP], trp1/trp1, ura3
HSS1.Pmは、パスツレラ・ムルトシダ由来のヘパロサンシンターゼAをコードする配列を表す(UniProt参照番号Q8RP78)。HSS2.Pmは、パスツレラ・ムルトシダ由来のヘパロサンシンターゼBをコードする配列を表す(UniProt参照番号Q5SGE1)。
これらの株をすべて、三角フラスコにおいて、MES 0,1M ph5.5バッフル付き三角フラスコで緩衝化した25mlのSY培地中で、激しい撹拌下において28℃で48時間、インキュベートした。
SY培地は、以下のエレメントを含む:
KH2PO4:100mM、MgSO4 7H2O:2,8mM、K2SO4:11,5mM、Na2SO4:1,1mM、NaCl:2,6mM、CaCl2 2H2O:0,7mM、CuSO4 5H2O:15μM、KI:6μM、FeCl3:30μM、ZnSO4 7H2O:61μM、MnSO4 H2O:25μM、H2SO4:110μM、パントテン酸ヘミカルシウム塩:42μM、チアミン塩酸塩:59μM、ピリドキシン塩酸塩:49μM、ミオ-イノシトール(C6H12O6):555μM、ニコチン酸(C6H5NO2):29μM、D-ビオチン:0,82μM、三塩基性クエン酸アンモニウム:33mM、及びグルコース2%。
増殖培地を、48時間の時点で回収し、ヘパロサン含量及び品質についてアッセイした。培地のアリコートをロードし、0.5%アガロースゲルに流し、続いてブロモフェノールブルーで着色した。培地中に存在するヘパロサンの量を、濃硫酸及びカルバゾールでの処置の後に比色分析による判定によって評価した(Bitter及びMuir (1962) analytical biochemistry 4, 330-334)。
これらの異なる株で得られたヘパロサンの量は、それぞれ、
- YA5398-3: 170mg.L-1
- YA5402-1: 170mg.L-1
- YA5400-1: 110mg.L-1
- YA5401-1: 180mg.L-1
- YA5437-18: 200mg.L-1
- YA5435-2: 190mg.L-1
- DA2531-12: 235mg.L-1
である。
比較として、上述のように、生来の株は、ヘパロサンを産生しない。
この実験から、本発明による改変を含む組換え株が、同じ条件下で培養した場合に、本発明によるすべての遺伝子改変を含まない他の組換え株と比較してより多くの量のヘパロサンを産生することが分かった。
配列
配列番号1は、パスツレラ・ムルトシダ(HSS1)を起源とするヘパロサンシンターゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号2は、パスツレラ・ムルトシダ(HSS2)を起源とするヘパロサンシンターゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号3は、パスツレラ・ムルトシダ(HSS1)を起源とするヘパロサンシンターゼのアミノ酸配列である
配列番号4は、パスツレラ・ムルトシダ(HSS2)を起源とするヘパロサンシンターゼのアミノ酸配列である
配列番号5は、アラビドプシス・サリアナを起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB)の核酸配列である
配列番号6は、クロレラウイルスPBCV-1を起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB)の再コーディングされた核酸配列である
配列番号7は、クロレラウイルスPBCV-1を起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB-A)の再コーディングされた核酸配列である
配列番号8は、アラビドプシス・サリアナを起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB)のアミノ酸配列である
配列番号9は、クロレラウイルスPBCV1を起源とするUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(HASB)のアミノ酸配列である
配列番号10は、N末端分泌シグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号11は、N末端分泌シグナル及びC末端アンカリングシグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号12は、N末端分泌シグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号13は、N末端分泌シグナル及びC末端アンカリングシグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼの再コーディングされた核酸配列である
配列番号14は、N末端分泌シグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼのアミノ酸配列である
配列番号15は、N末端分泌シグナル及びC末端アンカリングシグナルを有する、ペドバクター・ヘパリヌスを起源とするグルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼのアミノ酸配列である
配列番号16は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)の核酸配列である
配列番号17は、クロレラウイルス1(PBCV-1)を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)の再コーディングされた核酸配列である
配列番号18は、クロレラウイルス1(PBCV-1)を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)の再コーディングされた核酸配列である
配列番号19は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)のアミノ酸配列である
配列番号20は、クロレラウイルス1(PBCV-1)を起源とするグルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)のアミノ酸配列である
配列番号21は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)の核酸配列である
配列番号22は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)のアミノ酸配列である
配列番号23は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホグルコムターゼ-1(PGM1)の核酸配列である
配列番号24は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホグルコムターゼ-1(PGM1)のアミノ酸配列である
配列番号25は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUTP-グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)の核酸配列である
配列番号26は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするUTP--グルコース1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)のアミノ酸配列である
配列番号27は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルコサミン6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)の核酸配列である
配列番号28は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするグルコサミン6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)のアミノ酸配列である
配列番号29は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)の核酸配列である
配列番号30は、サッカロマイセス・セレビシエを起源とするホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)のアミノ酸配列である
配列番号31は、プロモーターpTDH3の核酸配列である
配列番号32は、プロモーターpTDH3.Skの核酸配列である
配列番号33は、プロモーターpTDH3-1.sbaの核酸配列である
配列番号34は、プロモーターpTDH3.Sarの核酸配列である
配列番号35は、プロモーターpENO2の核酸配列である
配列番号36は、プロモーターpTEF3の核酸配列である
配列番号37は、プロモーターpTEF1の核酸配列である
配列番号38は、プロモーターpTEF1.agoの核酸配列である
配列番号39は、プロモーターpTEF1.Sbaの核酸配列である
配列番号40は、プロモーターpPDC1の核酸配列である
配列番号41は、プロモーターpCCW12の核酸配列である
配列番号42は、プロモーターpCCW12.Smの核酸配列である
配列番号43は、プロモーターpCCW12.Skの核酸配列である
配列番号44は、プロモーターpCCW12.Sbaの核酸配列である
配列番号45は、プロモーターpCCW12.Sarの核酸配列である
配列番号46は、プロモーターpNUP57の核酸配列である
配列番号47は、プロモーターpCCW10.agoの核酸配列である
配列番号48は、プロモーターpCWP2の核酸配列である
配列番号49は、プロモーターpCCW120.Scaの核酸配列である
配列番号50は、プロモーターpRPLA1の核酸配列である
配列番号51は、プロモーターpCUP1の核酸配列である
配列番号52は、プロモーターpMET6の核酸配列である
配列番号53は、プロモーターpMET25の核酸配列である
配列番号54は、プロモーターpSAM1の核酸配列である
配列番号55は、ターミネーターtTPI1の核酸配列である
配列番号56は、ターミネーターtMET25の核酸配列である
配列番号57は、ターミネーターtDIT1の核酸配列である
配列番号58は、ターミネーターtRPL3の核酸配列である
配列番号59は、ターミネーターtRPL3.smの核酸配列である
配列番号60は、ターミネーターtRPL3.sbaの核酸配列である
配列番号61は、ターミネーターtRPL41Bの核酸配列である
配列番号62は、ターミネーターtRPL15Aの核酸配列である
配列番号63は、ターミネーターtRPL15A.sbaの核酸配列である
配列番号64は、ターミネーターtIDP1の核酸配列である
配列番号65は、ターミネーターtTEF1.sbaの核酸配列である
配列番号66は、5’に付加される分泌配列の核酸配列である
ATGCAATTTAGCACAGTCGCATCAGTAGCCTTCGTTGCCTTGGCCAACTTCGTGGCAGCA
配列番号67は、N末端に付加される分泌配列のアミノ酸配列である
MQFSTVASVAFVALANFVAA
配列番号68は、3’に付加されるアンカリング配列の核酸配列である
配列番号69は、C末端に付加されるアンカリング配列のアミノ酸配列である
AISQITDGQIQATTTATTEATTTAAPSSTVETVSPSSTETISQQTENGAAKAAVGMGAGALAAAAMLL

Claims (30)

  1. ヘパロサンを産生する組換え酵母細胞であって、
    (a)ヘパロサンシンターゼ(HSS)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と、
    (b)UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH若しくはHASB)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と
    を含む組換え酵母細胞。
  2. グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含み、グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドが、分泌シグナル及び任意選択でアンカリングシグナルを含む、請求項1に記載の組換え細胞。
  3. ヘパロサンを産生する組換え宿主細胞であって、
    (a)ヘパロサンシンターゼ(HSS)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と、
    (b)UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH若しくはHASB)活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と、
    (c)グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、1つ又は複数の組換え核酸と
    を含み、
    グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドが、ヘパロサン、特に、所望される分子量のものが宿主細胞によって産生されるように分泌シグナル及び任意選択でアンカリングシグナルを含む、
    組換え宿主細胞。
  4. グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、ペドバクター・ヘパリヌスから得られるか、又はそれに由来する、請求項2又は3に記載の組換え細胞。
  5. グルクロノシル-ジスルホグルコサミングルクロニダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、pTEF1、pCCW12、pCCW12.sba、pCCW12.Sar、pPDC1、pTEF3、pTDH3、pNUP57、及びpCCW10.agoからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項2から4のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  6. ヘパロサンの分子量が、50kDa未満の範囲内、好ましくは、約20kDa～約50kDaの範囲内にある、請求項2から5のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  7. ヘパロサンの分子量が、50kDaを上回る範囲内、好ましくは、約50kDa～約250kDの範囲内にある、請求項2から5のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  8. ヘパロサンの分子量が、100kDaを上回る範囲内、好ましくは、約100kDa～約1500kDaの範囲内にある、請求項2から5のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  9. UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ(UDP-GlcDH又はHASB)活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、アラビドプシス・サリアナ、クロレラウイルスPBCV1、又はストレプトコッカス・ズーエピデミクスのうちの少なくとも1つから得られるか、又はそれに由来し、特に、アラビドプシス・サリアナ又はクロレラウイルスPBCV1から得られるか、又はそれに由来する、請求項1から8のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  10. ヘパロサンシンターゼ(HSS)活性を有するポリペプチドをコードする核酸が、パスツレラ・ムルトシダから得られるか、又はそれに由来する、請求項1から9のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  11. (i)グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
    (ii)UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)活性を有するポリペプチド
    のうちの1つ又は複数をコードする少なくとも1つの組換え核酸を更に含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  12. (i)ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
    (ii)UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
    (iii)グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)活性を有するポリペプチド、及び/又は
    (iv)ホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)活性を有するポリペプチド
    のうちの1つ又は複数をコードする少なくとも1つの組換え核酸を更に含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  13. - グルタミン-フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ(GFA1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
    - UDP-N-アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ(QRI1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
    - ホスホグルコムターゼ-1(PGM1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
    - UTP-グルコース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(UGP1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
    - グルコサミン-6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ(GNA1)活性を有するポリペプチドをコードする核酸、及び/又は
    - ホスホアセチルグルコサミンムターゼ(PCM1)を有するポリペプチドをコードする核酸
    が、サッカロマイセス・セレビシエから得られるか、又はそれに由来する、
    請求項11又は12に記載の組換え細胞。
  14. 組換え宿主細胞が、酵母である、請求項3から13のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  15. サッカロマイセス属、又はカンジダ属、又はクルイベロマイセス属、又はオガタエア属、又はヤロウイア属、又はデバリオマイセス属、又はアシュビア属に属する、特に、サッカロマイセス属に属する、請求項1から14のいずれか一項に記載の組換え細胞。
  16. サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ブラウディ、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・パラドクサス、サッカロマイセス・ミカタエ、サッカロマイセス・カステリ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、クルイベロマイセス・ラクティス、クルイベロマイセス・マルシアヌス、クルイベロマイセス・ポリスポラス、クルイベロマイセス・サーモトレランス、オガタエア・ポリモルファ、ヤロウイア・リポリティカ、デバリオマイセス・ハンセニイ、及びアシュビア・ゴシピからなる群から選択され、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエである、請求項15に記載の組換え細胞。
  17. ヘパロサンを産生させる方法であって、
    (a)請求項1から16のいずれか一項に記載の組換え細胞を、培養培地において、ヘパロサンを産生させるのに十分な時間、培養する工程と、
    (b)任意選択で、組換え細胞及び/又は培養培地から、ヘパロサンを単離又は回収する工程と
    を含む方法。
  18. ヘパロサンが、約20kDa～約50kDaの分子量を有する、請求項17に記載の方法。
  19. ヘパロサンが、約50kDa～約150kDaの分子量を有する、請求項17に記載の方法。
  20. ヘパロサンが、約150kDa～約1500kDaの分子量を有する、請求項17に記載の方法。
  21. 組換え細胞が、サッカロマイセス属に属する酵母であり、特に、サッカロマイセス・セレビシエである、請求項17から20のいずれか一項に記載の方法。
  22. ヘパロサンを産生させるのに十分な時間が、約35～約50時間、好ましくは、約40～約50時間、好ましくは、約48時間の期間である、請求項17から21のいずれか一項に記載の方法。
  23. 産生されるヘパロサンの分子量が、工程(a)中の培養培地のpHを調節することによって制御される、請求項17から22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 方法が、工業規模で実施され、好ましくは、培養培地が、少なくとも約100L、より好ましくは約1000L～約3000Lの範囲、更により好ましくは約10,000L、又は更により好ましくは約100,000L、又は更には約250,000Lである、請求項17から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. 請求項1から16のいずれか一項に記載の組換え細胞から、又は請求項17から24のいずれか一項に記載の方法から得ることができるヘパロサン。
  26. 請求項25に記載のヘパロサンを含む培養培地。
  27. 請求項25に記載のヘパロサンを含む組成物。
  28. (i)請求項6から8のいずれか一項に規定の分子量を有する請求項25に記載のヘパロサン、(ii)請求項26に記載の培養培地、又は(iii)請求項27に記載の組成物を含む工業製品、又は消費者製品、又は消耗品。
  29. 化粧品、香味製品、芳香製品、食料品、食品、飲料、テクスチャラント、医薬組成物、栄養補助食品、栄養医薬、洗浄製品、歯科及び/又は口腔衛生組成物である、請求項28に記載の工業製品、又は消費者製品、又は消耗品。
  30. 約20kDa～約50kDa又は約50kDa～約1000kDaの範囲の分子量を有するヘパロサンの産生のための、請求項1から16のいずれか一項に記載の組換え細胞の使用。
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