JP2024511537A - 細胞内カーゴ送達のための合成ペプチドシャトル媒介物バイオコンジュゲート - Google Patents

細胞内カーゴ送達のための合成ペプチドシャトル媒介物バイオコンジュゲート Download PDF

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Abstract

膜不透過性カーゴのサイトゾル/核及び/又は細胞内の送達を媒介するためのバイオコンジュゲートが本明細書に記載されている。バイオコンジュゲートは、直鎖状又はマルチアーム型生体適合性非アニオン性親水性ポリマーと、切断可能な又は切断不可能な様式でコンジュゲートされた1つ又は複数の合成ペプチドシャトル媒介物を含み、その合成ペプチドシャトル媒介物は、任意で、カーゴと更に共有結合により連結されていてもよい。バイオコンジュゲーションは、一般的に、対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比較して、より高いシャトル媒介物若しくはシャトル媒介物モノマー濃度における使用、より幅広い有効濃度ウィンドウにおける使用、及び/又はインビボ投与(例えば、体液及び/若しくは分泌物に接触し又はそれに近い標的器官若しくは組織への)についてのパフォーマンスの向上を可能にする。

Description

本明細書は、合成ペプチドシャトル媒介物として知られたカーゴ送達ペプチドに関する。より具体的には、本明細書は、例えばインビボ投与による、細胞内カーゴ送達におけるパフォーマンス向上のための合成ペプチドシャトル媒介物のバイオコンジュゲートに関する。
本明細書は、いくつかの文書を参照し、その文書の内容は、全体が参照により本明細書に組み入れられている。
インビボでの膜不透過性カーゴの細胞への送達は、他の方法では「創薬不可能」と長年、考えられてきた、細胞内標的に向けられる新規の治療用物質のための変革の可能性があるツールである。これらの標的のほとんどは、サイトゾル経由でアクセス可能であり、サイトゾルは、タンパク質及び他の生物製剤等の巨大分子にとって特に厄介であり、エンドサイトーシス取込み並びにエンドソームの隔離及び分解が依然として問題となっている。多数の送達ストラテジーが探索されているのに、インビボ適用に適しているのはほとんどない。したがって、インビボ使用に適した細胞内カーゴ送達プラットフォームの必要性が依然としてある。
WO/2016/161516 WO/2018/068135 WO/2020/210916 PCT/CA2021/051490 PCT/CA2021/051458
Del'Guidiceら、「Membrane permeabilizing amphiphilic peptide delivers recombinant transcription factor and CRISPR-Cas9/Cpf1 ribonucleoproteins in hard-to-modify cells.」 PLoS One. (2018) 13(4):e0195558 Krishnamurthyら、「Engineered amphiphilic peptides enable delivery of proteins and CRISPR-associated nucleases to airway epithelia.」 Nat Commun. (2019)、10(1):4906 Formanら、「Glutathione: overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis.」、Mol Aspects Med. (2009)、30(1-2):1~12頁 Giustariniら、「Assessment of glutathione/glutathione disulphide ratio and S-glutathionylated proteins in human blood, solid tissues, and cultured cells.」、Free Radic Biol Med. (2017)、112:360~375頁
第1の態様において、細胞内カーゴ送達の使用に適した、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーとコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含むバイオコンジュゲートが本明細書に記載される。更なる態様において、細胞内生物学的標的と結合し又はそれへ送達されることになっている膜不透過性カーゴ;及び上記カーゴのサイトゾル/核又は細胞内の送達を媒介するためのバイオコンジュゲートであって、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーとコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含むバイオコンジュゲートを含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、シャトル媒介物の生体適合性非アニオン性親水性ポリマーとのコンジュゲーションは、対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物で可能なものより高い濃度でバイオコンジュゲートの使用を可能にする。いくつかの実施形態において、シャトル媒介物の生体適合性非アニオン性親水性ポリマーとのコンジュゲーションは、対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比較して、より幅広い有効濃度ウィンドウ(例えば、治療ウィンドウ)におけるバイオコンジュゲートの使用を可能にする。いくつかの実施形態において、シャトル媒介物の生体適合性非アニオン性親水性ポリマーとのコンジュゲーションは、インビボ投与(例えば、静脈内若しくは他の非経口(例えば、髄腔内)投与、又は体液及び/若しくは分泌物を産生する標的器官若しくは組織(例えば、気道を裏打ちするもの等の粘膜)への投与)についてのカーゴ送達を向上させる。
いくつかの実施形態において、合成ペプチドシャトル媒介物は、別個の正荷電親水性面及び別個の疎水性面を含む溶媒曝露表面を有する少なくとも12アミノ酸長のコア両親媒性αヘリックスモチーフ(シャトル媒介物コアモチーフ)を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたバイオコンジュゲートは、シャトル媒介物内に含まれるシャトル媒介物コアモチーフのコンジュゲートされていない末端が遊離したまま又はコンジュゲートされないままであるように、シャトル媒介物のN末端若しくはC末端で又はその方向で、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーとコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたバイオコンジュゲートは、シャトル媒介物内に含まれるシャトル媒介物コアモチーフのコンジュゲートされていない末端が遊離したまま又は繋留されないままであるように、N末端及び/若しくはC末端で又はその方向で、(例えば、分岐型、超分岐型、又は樹枝状の生体適合性非アニオン性親水性ポリマーを介して)複数の合成ペプチドシャトル媒介物モノマーが一緒に繋留されているシャトル媒介物マルチマーを含み得る。
更なる態様において、好ましくは、シャトル媒介物内に含まれるシャトル媒介物コアモチーフのコンジュゲートされていない末端が相対的に遊離したまま又は繋留されないままであるように、N末端及び/若しくはC末端で又はその方向で(例えば、分岐型、超分岐型、又は樹枝状の生体適合性非アニオン性親水性ポリマーを介して)複数の合成ペプチドシャトル媒介物モノマーが一緒に繋留されているシャトル媒介物マルチマーを含むバイオコンジュゲートが本明細書に記載される。
更なる態様において、バイオコンジュゲートを、好ましくはシャトル媒介物内に含まれるシャトル媒介物コアモチーフのN末端が遊離したまま又は繋留されないままであるように、作製するために、生体適合性非アニオン性ポリマーを合成ペプチドシャトル媒介物とコンジュゲートする工程を含む、薬学的組成物の製造のための方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、方法は、細胞内生物学的標的と結合し又は送達されることになっている膜不透過性カーゴと共にバイオコンジュゲートを製剤化する工程を含んでもよい。
更なる態様において、細胞内生物学的標的と結合し又は送達されることになっている膜不透過性カーゴ及び本明細書に記載されているようなバイオコンジュゲートを、必要とする対象へ共投与する工程を含む、治療用又は診断用カーゴを対象へ送達するための方法が本明細書に記載される。
更なる態様において、本明細書に記載されたバイオコンジュゲートは、細胞内送達のためのカーゴと、切断不可能な結合によって;又は切断可能な結合によって(その結果、カーゴが、その切断可能な結合の切断を通して脱離し、それによりカーゴがサイトゾル/核へ送達されることを可能にする)、コンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含み得る。
更なる態様において、細胞内生物学的標的と結合し又はそれへ送達されることになっている膜不透過性カーゴと切断可能な又は切断不可能な様式で共有結合によりコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含む組成物が本明細書に記載される。
更なる態様において、膜不透過性カーゴを細胞内生物学的標的へ送達する静脈内投与のための、本明細書に記載されているような組成物又は本明細書に記載されているようなバイオコンジュゲートの使用が本明細書に記載される。
更なる態様において、膜不透過性カーゴを肺における細胞内生物学的標的へ送達する鼻腔内投与のための、本明細書に記載されているような組成物又は本明細書に記載されているようなバイオコンジュゲートの使用が本明細書に記載される。
更なる態様において、(例えば、インビボでの)細胞内送達を評価することにおける使用に適している、検出可能な標識(例えば、フルオロフォア)とコンジュゲートされたD-レトロ-インベルソ核移行シグナルペプチドを含むカーゴが本明細書に記載される。
一般的な定義
見出し及び他の識別子、例えば、(a)、(b)、(i)、(ii)等は、単に、本明細書及び特許請求の範囲を読みやすくするために提示される。本明細書又は特許請求の範囲における見出し又は他の識別子の使用は、必ずしも、工程又は要素がアルファベット順若しくは番号順又はそれらが提示される順番で実施されることを必要とするわけではない。
特許請求の範囲及び/又は本明細書において用語「含むこと(comprising)」と共に用いられる場合の語「1つの(a)」又は「1つの(an)」の使用は、「1」を意味し得るが、それは又、「1つ又は複数」、「少なくとも1つ」、及び「1つ又は1つより多い」の意味と一致する。
本明細書で用いられる場合、用語「約」は、値が、その値を決定するために利用されているデバイス又は方法についての誤差の標準偏差を含むことを示す。一般的に、専門用語「約」は、最大10%の可能な変動を指定することを意図される。したがって、値の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、及び10%の変動が、用語「約」に含まれる。他に指示がない限り、範囲の前の用語「約」の使用は、その範囲の両端に適用される。
この明細書及び特許請求の範囲に用いられる場合、語「含むこと(comprising)」(並びに「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」等の「含むこと」の任意の形)、「有すること(having)」(並びに「有する(have)」及び「有する(has)」等の「有すること」の任意の形)、「含むこと(including)」(並びに「含む(includes)」及び「含む(include)」等の「含むこと」の任意の形)、又は「含有すること(containing)」(並びに「含有する(contains)」及び「含有する(contain)」等の「含有すること」の任意の形)は、包括的又はオープンエンドであり、かつ追加の、列挙されていない要素又は方法工程を排除しない。
本明細書で用いられる場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」、又は「ペプチド」は、アミノ酸の任意のペプチド連結鎖を意味し、そのアミノ酸は、任意の型の修飾(例えば、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、硫酸化、SUMO化、プレニル化、ユビキチン化等の化学修飾又は翻訳後修飾)を含んでもよいし、含まなくてもよい。更に明確にすれば、タンパク質/ポリペプチド/ペプチド修飾は、その修飾は、本明細書に記載されたシャトル媒介物のカーゴ形質導入活性又は本明細書に記載されたカーゴの生物学的活性を破壊しない限り、構想される。例えば、本明細書に記載されたシャトル媒介物は直鎖状でも環状でもよく、1つ又は複数のD-又はL-アミノ酸で合成されてもよい。本明細書に記載されたシャトル媒介物は又、置き換えられているアミノ酸と類似した生理化学的性質(例えば、構造、疎水性、又は電荷)の側鎖を有する対応する合成アミノ酸で、少なくとも1個のアミノ酸が置き換えられていてもよい。
本明細書で用いられる場合、「合成ペプチド」、「合成ペプチドシャトル媒介物」、又は「合成ポリペプチド」等の表現で用いられる用語「合成」は、インビトロで作製する(例えば、化学合成する及び/又は組換えDNAテクノロジーを用いて産生する)ことができる天然に存在しない分子を指すことを意図される。様々な合成調製物の純度は、例えば、高速液体クラマトグラフィー分析及び質量分析により、評価され得る。化学合成アプローチは、それらが広範な組換えタンパク質精製工程の必要性(例えば、臨床用途に必要とされる)を除外し得るため、細胞発現系(例えば、酵母又は細菌タンパク質発現系)より有利であり得る。対照的に、より長い合成ポリペプチドは、化学合成アプローチによって作製するにはより複雑であり及び/又はより費用がかかる可能性があり、そのようなポリペプチドは、細胞発現系を用いて、より有利に産生され得る。いくつかの実施形態において、本明細書のペプチド又はシャトル媒介物は、組換え宿主細胞からの発現と対立するものとして、化学合成(例えば、固相又は液相ペプチド合成)され得る。いくつかの実施形態において、本明細書のペプチド又はシャトル媒介物は、N末端メチオニン残基を欠損する場合がある。当業者は、安定性の特別な必要性又は他の必要性に適するように、1つ若しくは複数の修飾アミノ酸(例えば、天然に存在しないアミノ酸)を用いることにより、又は本明細書の合成ペプチド若しくはシャトル媒介物を化学修飾することにより、本明細書の合成ペプチド又はシャトル媒介物を適応させ得る。
本明細書で用いられる場合、用語「独立的な」は、一般的に、お互いに共有結合により結合していない分子又は作用物質を指すことを意図される。例えば、表現「独立的カーゴ」は、本明細書のシャトル媒介物又はシャトル媒介物バイオコンジュゲートと共有結合により結合していない(例えば、融合していない)、細胞内に送達される(形質導入される)ことになっているカーゴを指すことを意図される。
本明細書で用いられる場合、表現「であり、又はそれに由来する」又は「由来する」は、保存的アミノ酸置換、欠失、修飾を含む、所定のタンパク質若しくはペプチド(例えば、本明細書に記載されたシャトル媒介物)又はそのドメイン(例えば、CPD又はELD)の機能性バリアント、加えて、そのタンパク質ドメインの活性を抑止しない、バリアント又は機能誘導体を含む。
本明細書の他の目的、利点、及び特徴は、添付の図面を参照して、例としてのみ示された、以下のその特定の実施形態の非制限的記載を読むことにより、より明らかになるだろう。
合成ペプチドシャトル媒介物を用いるカーゴの細胞内送達の提案機構の1つの概略図である。簡単に述べれば、シャトル媒介物及びカーゴは、細胞膜と相互作用し、おそらくエンドサイトーシスの開始を引き起こすが、シャトル媒介物は、エンドソーム形成の前又はその初期において、カーゴのサイトゾルへの直接的移行を可能にする一過性膜透過処理を媒介することを提案されている。 フローサイトメトリーにより評価された場合の、N末端方向で直鎖状5K、10K、20K、又は40K PEG部分とコンジュゲートされたシャトル媒介物FSD10の存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの送達スコア結果を示す図である。PEGのシャトル媒介物とのコンジュゲーションは、N末端グリシン-システインジペプチドとの切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によった。GFP-NLSが陽性である細胞のパーセンテージを示す。 フローサイトメトリーにより評価された場合の、N末端方向で直鎖状5K、10K、20K、又は40K PEG部分とコンジュゲートされたシャトル媒介物FSD10の存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの送達スコア結果を示す図である。PEGのシャトル媒介物とのコンジュゲーションは、N末端グリシン-シトシンジペプチドとの切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によった。GFP-NLSの送達スコアを示す。 図2の形質導入アッセイの生存率結果を示す図である。 図2の形質導入アッセイの相対的送達-生存率スコアを示す図である。 シャトル媒介物-直鎖状PEGコンジュゲート/モノマーの概略図であり、PEGが、異なるサイズ1K、5K、10K、20K、又は40Kであり得、シャトル媒介物と、C末端システイン残基の遊離チオール基と切断可能な又は切断不可能な結合によってコンジュゲートされている。 分岐型PEG中心コアからなる4アームのシャトル媒介物マルチマーの概略図であり、各アームがシャトル媒介物とコンジュゲートされている。 分岐型PEG中心コアからなる8アームのシャトル媒介物マルチマーの概略図であり、各アームがシャトル媒介物とコンジュゲートされている。 分解性ポリエステルコアからなる6アームのシャトル媒介物マルチマーの概略図であり、各アームが、シャトル媒介物とコンジュゲートされた直鎖状PEGからなる。 分解性ポリエステルコアからなる24アームのシャトル媒介物マルチマーの概略図であり、各アームが、シャトル媒介物とコンジュゲートされた直鎖状PEGからなる。 超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)によるFSD10-mal-PEG5Kの純度の結果を示す図である。 UPLCによるFSD10-SS-PEG10Kの純度の結果を示す図である。 UPLCによるFSD10-SS-PEG20Kの純度の結果を示す図である。 UPLCによるFSD10-mal-PEG40Kの純度の結果を示す図である。 UPLCによるFSD10-SS-PEG40Kの純度の結果を示す図である。 UPLCによる[FSD10-mal-PEG1K]24(ポリエステル)の純度の結果を示す図である。 UPLCによる[FSD10-mal-PEG1K]6(ポリエステル)の純度の結果を示す図である。 GFP-NLS単独を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10(非PEG化)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10(非PEG化)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10スクランブル(FSD10scr)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10スクランブル(FSD10scr)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10scr-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10scr-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10scr-SS-PEG20Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10scr-SS-PEG20Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 TATを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 TATを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 TAT-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 TAT-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 PEG10K-SS-TATを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 PEG10K-SS-TATを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-SS-PEG5Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-SS-PEG5Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-mal-PEG5Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-mal-PEG5Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-mal-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-mal-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-SS-PEG20Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-SS-PEG20Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-mal-PEG20Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-mal-PEG20Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-SS-PEG40Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-SS-PEG40Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-mal-PEG40Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-mal-PEG40Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 10μMにおける[FSD10-SS-]4(PEG20K)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 10μMにおける[FSD10-SS-]4(PEG20K)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 10μMにおける[FSD10-SS-]8(PEG20K)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 10μMにおける[FSD10-SS-]8(PEG20K)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 20μMにおける[FSD10-SS-]8(PEG20K)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(FITC)により獲得されたイメージを表す。 20μMにおける[FSD10-SS-]8(PEG20K)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(FITC)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 DRI-NLS647単独を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10(非PEG化)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10(非PEG化)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10スクランブル(FSD10scr)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10スクランブル(FSD10scr)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10scr-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10scr-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10scr-SS-PEG20Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10scr-SS-PEG20Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-SS-PEG5Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-SS-PEG5Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-mal-PEG5Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-mal-PEG5Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-SS-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-mal-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-mal-PEG10Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-SS-PEG40Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-SS-PEG40Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 FSD10-mal-PEG40Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。 FSD10-mal-PEG40Kを用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 40μMにおける[FSD10-mal-PEG1K]6(ポリエステル)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 140μMにおける[FSD10-mal-PEG1K]24(ポリエステル)を用いての、顕微鏡観察によるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネル(647nm)により獲得されたイメージを表す。パネル「B」は、蛍光チャネル(647nm)の、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造[すなわち、蛍光なし]を表す)でのオーバーレイを表す。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの生存率結果を示す図であり、そのPEG部分がサイズ5Kであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの生存率結果を示す図であり、そのPEG部分がサイズ10Kであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの生存率結果を示す図であり、そのPEG部分がサイズ20Kであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの生存率結果を示す図であり、そのPEG部分がサイズ40Kであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの生存率結果を示す図であり、マルチマーが、4アーム又は8アームの分岐型PEGコアマルチマーであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの生存率結果を示す図であり、マルチマーが、6アーム又は24アームの分解性ポリエステルコアマルチマーであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの相対的送達-生存率スコアとして表現されたカーゴ形質導入活性を示す図であり、そのPEG部分がサイズ5Kであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの相対的送達-生存率スコアとして表現されたカーゴ形質導入活性を示す図であり、そのPEG部分がサイズ10Kであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの相対的送達-生存率スコアとして表現されたカーゴ形質導入活性を示す図であり、そのPEG部分がサイズ20Kであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの相対的送達-生存率スコアとして表現されたカーゴ形質導入活性を示す図であり、そのPEG部分がサイズ40Kであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの相対的送達-生存率スコアとして表現されたカーゴ形質導入活性を示す図であり、マルチマーが4アーム又は8アームの分岐型PEGコアマルチマーであった。 増加性濃度におけるシャトル媒介物FSD10、直鎖状PEG化FSD10シャトル媒介物、又はシャトル媒介物マルチマーの存在下でのカーゴとしてのGFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの相対的送達-生存率スコアとして表現されたカーゴ形質導入活性を示す図であり、マルチマーが6アーム又は24アームの分解性ポリエステルコアマルチマーであった。 蛍光顕微鏡観察による、マウス肝臓におけるFSD10(非PEG化)シャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す;緑色染色は陽性内皮細胞(CD34+)染色を表す;黄色染色はオーバーラップ染色(赤色及び緑色)を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス肝臓におけるFSD10-mal-PEG5Kシャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス肝臓におけるFSD10-SS-PEG10Kシャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス肝臓におけるFSD10-SS-PEG20Kシャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス肝臓におけるFSD10-SS-PEG40Kシャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス肝臓におけるPEGコア(合計PEGサイズ20K)を有する4アームのFSD10-SSシャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス肝臓におけるPEGコア(合計PEGサイズ20K)を有する4アームのFSD10-malシャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス肝臓におけるPEGコア(合計PEGサイズ40K)を有する8アームのFSD10-malシャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス膵臓におけるFSD10-mal-PEG5KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス膵臓におけるFSD10-SS-PEG10KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス膵臓におけるFSD10-SS-PEG40KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス脾臓におけるFSD10-mal-PEG5KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス脾臓におけるFSD10-SS-PEG10KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス脾臓におけるFSD10-SS-PEG40KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス心臓におけるFSD10-mal-PEG5KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス心臓におけるFSD10-SS-PEG10KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス心臓におけるFSD10-SS-PEG40KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す。 非コンジュゲート型FSD10と比較した、蛍光顕微鏡観察による、マウス脳におけるFSD10-SS-PEG20KによるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。青色染色は陽性核染色を表す;赤色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647及び核染色(DAPI)(マージ)を表す。 蛍光顕微鏡観察による異なるマウス器官における異なるシャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果の概要の表である。送達レベルは、顕微鏡観察に基づいており、以下として表された:「送達なし」:送達事象なし;「+」:稀な送達事象;「++」:均一かつ低い核送達事象;「+++」:均一かつ中程度の核送達事象;「++++」:均一かつ高い核送達事象;「+++++」:均一かつ大量の核送達事象;「*」:送達事象が観察されたが、事象は核ではなかった(例えば、サイトゾル);空欄:結果入手不可能。 陽性対照実験として、蛍光顕微鏡観察によるFSD10(非PEG化)シャトル媒介物でのHeLa細胞におけるDRI-NLS647の細胞内送達の結果を示す図である。 蛍光顕微鏡観察により可視化された場合の、HeLa細胞におけるDRI-NLS647の細胞内送達の結果を示す図であり、DRI-NLS647が、FSD10と切断不可能な「mal」結合によって直接的にコンジュゲートされている。 蛍光顕微鏡観察により可視化された場合の、HeLa細胞におけるDRI-NLS647の細胞内送達の結果を示す図であり、DRI-NLS647が、FSD10と切断可能な「SS」結合によって直接的にコンジュゲートされている。 蛍光顕微鏡観察により可視化された場合の、HeLa細胞におけるDRI-NLS647及びGFP-NLSの細胞内送達の結果を示す図であり、DRI-NLS647が、FSD10と切断不可能な「mal」結合によってコンジュゲートされている直鎖状PEG1Kと直接的にコンジュゲートされている。パネル「A」はDRI-NLS647チャネルイメージを表す。矢印は、DRI-NLS647チャネルとGFP-NLSチャネルの両方における異なる蛍光パターンを浮き彫りにする、対応する関心領域を示す。 蛍光顕微鏡観察により可視化された場合の、HeLa細胞におけるDRI-NLS647及びGFP-NLSの細胞内送達の結果を示す図であり、DRI-NLS647が、FSD10と切断不可能な「mal」結合によってコンジュゲートされている直鎖状PEG1Kと直接的にコンジュゲートされている。パネル「B」はGFP-NLSチャネルイメージを表す。矢印は、DRI-NLS647チャネルとGFP-NLSチャネルの両方における異なる蛍光パターンを浮き彫りにする、対応する関心領域を示す。 蛍光顕微鏡観察により可視化された場合の、HeLa細胞におけるDRI-NLS647及びGFP-NLSの細胞内送達の結果を示す図であり、DRI-NLS647が、FSD10と切断可能な「ss」結合によってコンジュゲートされている直鎖状PEG1Kと直接的にコンジュゲートされている。パネル「A」はDRI-NLS647チャネルイメージを表す。矢印は、DRI-NLS647チャネルとGFP-NLSチャネルの両方における共通の核蛍光パターンを浮き彫りにする、対応する関心領域を示す。 蛍光顕微鏡観察により可視化された場合の、HeLa細胞におけるDRI-NLS647及びGFP-NLSの細胞内送達の結果を示す図であり、DRI-NLS647が、FSD10と切断可能な「ss」結合によってコンジュゲートされている直鎖状PEG1Kと直接的にコンジュゲートされている。パネル「B」はGFP-NLSチャネルイメージを表す。矢印は、DRI-NLS647チャネルとGFP-NLSチャネルの両方における共通の核蛍光パターンを浮き彫りにする、対応する関心領域を示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと切断可能な「SS」結合若しくは切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によってコンジュゲートされたFSD10を用いて、又は40μMにおける、対応するPEGと混合されたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。GFP-NLSが陽性である細胞のパーセンテージを示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと切断可能な「SS」結合若しくは切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によってコンジュゲートされたFSD10を用いて、又は40μMにおける、対応するPEGと混合されたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。GFP-NLSの送達スコアを示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと切断可能な「SS」結合若しくは切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によってコンジュゲートされたFSD10を用いて、又は40μMにおける、対応するPEGと混合されたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。生存率結果を示す。 DRI-NLS647カーゴと、切断可能な(「SS」)若しくは切断不可能な(「mal」)結合によって直接的にか又は異なるサイズのPEGリンカー(すなわち、PEG1K又はPEG7.5K)を介してかのいずれかでコンジュゲートされたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。DRI-NLS647が陽性である細胞のパーセンテージを示す。 DRI-NLS647カーゴと、切断可能な(「SS」)若しくは切断不可能な(「mal」)結合によって直接的にか又は異なるサイズのPEGリンカー(すなわち、PEG1K又はPEG7.5K)を介してかのいずれかでコンジュゲートされたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。DRI-NLS647の送達スコアを示す。 DRI-NLS647カーゴと、切断可能な(「SS」)若しくは切断不可能な(「mal」)結合によって直接的にか又は異なるサイズのPEGリンカー(すなわち、PEG1K又はPEG7.5K)を介してかのいずれかでコンジュゲートされたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。生存率結果を示す。 DRI-NLS647カーゴと、切断可能な(「SS」)若しくは切断不可能な(「mal」)結合によって直接的にか又は異なるサイズのPEGリンカー(すなわち、PEG1K又はPEG7.5K)を介してかのいずれかでコンジュゲートされたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。対応する送達-生存率スコアを示す。 非コンジュゲート型FSD10、又は切断可能な「SS」結合若しくは切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって異なるサイズの直鎖状PEGと直接的にコンジュゲートされたFSD10(それにより、DRI-NLS647がそのシャトルと直接的にコンジュゲートされている)による、DRI-NLS647及びGFP-NLSのインビトロ同時送達の結果の概要の表を示す。送達レベルは、顕微鏡観察に基づいており、以下として表された:「送達なし」:送達事象なし;「+」:稀な送達事象;「++」:均一かつ低い核送達事象;「+++」:均一かつ中程度の核送達事象;「++++」:均一かつ高い核送達事象;「+++++」:均一かつ大量の核送達事象;空欄:結果入手不可能。 切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によってDRI-NLS647と直接的にコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネルCy5(すなわち、DRI-NLS647の送達)により獲得されたイメージを表す。 切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によってDRI-NLS647と直接的にコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネルFITC(すなわち、GFP-NLSの送達)により獲得されたイメージを表す。 切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によってDRI-NLS647と直接的にコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「C」は、蛍光チャネルCy5及びFITCの、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造を表す[すなわち、蛍光なし])でのオーバーレイを表す。 切断可能な「SS」結合によってDRI-NLS647と直接的にコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネルCy5(すなわち、DRI-NLS647の送達)により獲得されたイメージを表す。 切断可能な「SS」結合によってDRI-NLS647と直接的にコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネルFITC(すなわち、GFP-NLSの送達)により獲得されたイメージを表す。 切断可能な「SS」結合によってDRI-NLS647と直接的にコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「C」は、蛍光チャネルCy5及びFITCの、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造を表す[すなわち、蛍光なし])でのオーバーレイを表す。 1Kの長さでかつ切断不可能なマレイミド(「mal」)結合による直鎖状PEGリンカーを介して、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネルCy5(すなわち、DRI-NLS647の送達)により獲得されたイメージを表す。 1Kの長さでかつ切断不可能なマレイミド(「mal」)結合による直鎖状PEGリンカーを介して、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネルFITC(すなわち、GFP-NLSの送達)により獲得されたイメージを表す。 1Kの長さでかつ切断不可能なマレイミド(「mal」)結合による直鎖状PEGリンカーを介して、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「C」は、蛍光チャネルCy5及びFITCの、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造を表す[すなわち、蛍光なし])でのオーバーレイを表す。 1Kの長さでかつ切断可能な「SS」結合による直鎖状PEGリンカーを介して、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネルCy5(すなわち、DRI-NLS647の送達)により獲得されたイメージを表す。 1Kの長さでかつ切断可能な「SS」結合による直鎖状PEGリンカーを介して、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネルFITC(すなわち、GFP-NLSの送達)により獲得されたイメージを表す。 1Kの長さでかつ切断可能な「SS」結合による直鎖状PEGリンカーを介して、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「C」は、蛍光チャネルCy5及びFITCの、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造を表す[すなわち、蛍光なし])でのオーバーレイを表す。 7.5Kの長さでかつ切断可能な「SS」結合による直鎖状PEGリンカーを介して、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「A」は、蛍光チャネルCy5(すなわち、DRI-NLS647の送達)により獲得されたイメージを表す。 7.5Kの長さでかつ切断可能な「SS」結合による直鎖状PEGリンカーを介して、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「B」は、蛍光チャネルFITC(すなわち、GFP-NLSの送達)により獲得されたイメージを表す。 7.5Kの長さでかつ切断可能な「SS」結合による直鎖状PEGリンカーを介して、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD10に関して、図72のDRI-NLS647及びGFP-NLS実験のインビトロ同時送達の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。パネル「C」は、蛍光チャネルCy5及びFITCの、微分干渉コントラストチャネル(細胞構造を表す[すなわち、蛍光なし])でのオーバーレイを表す。 異なるサイズの直鎖状PEGと、切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によってコンジュゲートされたFSD396又はFSD396Dを用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。GFP-NLSが陽性である細胞のパーセンテージを示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと、切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によってコンジュゲートされたFSD396又はFSD396Dを用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。GFP-NLSの送達スコアを示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと、切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によってコンジュゲートされたFSD396又はFSD396Dを用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。生存率結果を示す。 直接的にか又は異なる長さの直鎖状PEGリンカーを介してかのいずれかで、及び切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD396又はFSD396Dを用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。DRI-NLS647が陽性である細胞のパーセンテージを示す。 直接的にか又は異なる長さの直鎖状PEGリンカーを介してかのいずれかで、及び切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD396又はFSD396Dを用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。DRI-NLS647の送達スコアを示す。 直接的にか又は異なる長さの直鎖状PEGリンカーを介してかのいずれかで、及び切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD396又はFSD396Dを用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。生存率結果を示す。 直接的にか又は異なる長さの直鎖状PEGリンカーを介してかのいずれかで、及び切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって、DRI-NLS647とコンジュゲートされたFSD396又はFSD396Dを用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。対応する送達-生存率スコアを示す。 蛍光顕微鏡観察による、異なるマウス器官における異なるシャトル媒介物によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果の概要の表であり、DRI-NLS647がシャトルと直接的にコンジュゲートされている。送達レベルは、顕微鏡観察に基づいており、以下として表された:「送達なし」:送達事象なし;「+」:稀な送達事象;「++」:均一かつ低い核達事象;「+++」:均一かつ中程度の送達事象;「++++」:均一かつ高い送達事象;「+++++」:均一かつ大量の送達事象;空欄:結果入手不可能。 フローサイトメトリーによる、マウスの肺の異なるエリアにおける異なるシャトル媒介物によるDRI-NLS647の鼻腔内送達(インビボ)の結果の概要の表である。送達レベルは、肺の異なる細胞型で予めゲーティングされたGFP-NLS又はDRI-NLS647が陽性である%細胞のフローサイトメトリー分析に基づいた。 図81からの結果の代表的なグラフである。各シャトル媒介物コンジュゲートで送達された、マウスの肺におけるDRI-NLS647が陽性である%細胞のシグナル強度を示す。 図81からの結果の代表的なグラフである。各シャトル媒介物コンジュゲートで送達された、マウスの肺におけるDRI-NLS647が陽性である%細胞の近位及び遠位の分布を示す。 図81からの結果の代表的なグラフである。異なるシャトル媒介物コンジュゲートを用いて送達された、マウスの肺におけるDRI-NLS647の細胞型分布を示す;「N.D.」は「検出不可能」を表す。 図81からの結果の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。シャトルなしでのDRI-NLS647の送達が示されている。マウスの肺の異なるエリアにおける陽性DRI-NLS647シグナルは、黄色/白色又は赤色/ピンク色シグナルにより表されている。 図81からの結果の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。FSD10スクランブル(40μM)でのDRI-NLS647の送達が示されている。マウスの肺の異なるエリアにおける陽性DRI-NLS647シグナルは、黄色/白色又は赤色/ピンク色シグナルにより表されている。 図81からの結果の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。FSD10(40μM)でのDRI-NLS647の送達が示されている。マウスの肺の異なるエリアにおける陽性DRI-NLS647シグナルは、黄色/白色又は赤色/ピンク色シグナルにより表されている。 図81からの結果の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。FSD10-SS-PEG10K(40μM)でのDRI-NLS647の送達が示されている。マウスの肺の異なるエリアにおける陽性DRI-NLS647シグナルは、黄色/白色又は赤色/ピンク色シグナルにより表されている。 図81からの結果の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。FSD10-SS-DRI-NLS647(40μM)でのDRI-NLS647の送達が示されている。マウスの肺の異なるエリアにおける陽性DRI-NLS647シグナルは、黄色/白色又は赤色/ピンク色シグナルにより表されている。 図81からの結果の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージを示す図である。FSD10-SS-PEG1K-DRI-NLS647(40μM)でのDRI-NLS647の送達が示されている。マウスの肺の異なるエリアにおける陽性DRI-NLS647シグナルは、黄色/白色又は赤色/ピンク色シグナルにより表されている。 異なるサイズの直鎖状PEGと切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって直接的にコンジュゲートされたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによる、嚢胞線維症患者由来の2%痰(RPMI中)の存在下でHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。GFP-NLSが陽性である細胞のパーセンテージを示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって直接的にコンジュゲートされたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによる、嚢胞線維症患者由来の2%痰(RPMI中)の存在下でHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。GFP-NLSの送達スコアを示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって直接的にコンジュゲートされたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによる、嚢胞線維症患者由来の2%痰(RPMI中)の存在下でHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。未処理の細胞(NT)に対する生存率結果を示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって直接的にコンジュゲートされたFSD10(それにより、DRI-NLS647がそのシャトルと直接的にコンジュゲートされている)を用いての、フローサイトメトリーによる、嚢胞線維症患者由来の0.5%痰(RPMI中)の存在下でHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。DRI-NLS647が陽性である細胞のパーセンテージを示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと、切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって直接的にコンジュゲートされたFSD10(それにより、DRI-NLS647がそのシャトルと直接的にコンジュゲートされている)を用いての、フローサイトメトリーによる、嚢胞線維症患者由来の0.5%痰(RPMI中)の存在下でHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。DRI-NLS647の送達スコアを示す。 異なるサイズの直鎖状PEGと切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって直接的にコンジュゲートされたFSD10(それにより、DRI-NLS647がそのシャトルと直接的にコンジュゲートされている)を用いての、フローサイトメトリーによる、嚢胞線維症患者由来の0.5%痰(RPMI中)の存在下でHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す図である。未処理の細胞(NT)に対する生存率結果を示す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス膀胱における異なるシャトル媒介物(1時間後、250μM)によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。FSD10-SS-DRI-NLS647(それにより、DRI-NLS647がそのシャトルと直接的にコンジュゲートされている)によるDRI-NLS647の送達を示す。青色染色は陽性核染色を表す;赤色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647及び核染色(DAPI)(マージ)を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス膀胱における異なるシャトル媒介物(1時間後、250μM)によるDRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。FSD10-SS-PEG1K-DRI-NLS647(それにより、DRI-NLS647がそのシャトルと直接的にコンジュゲートされている)によるDRI-NLS647の送達を示す。青色染色は陽性核染色を表す;赤色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647及び核染色(DAPI)(マージ)を表す。 蛍光顕微鏡観察による、マウス膀胱における異なるシャトル媒介物による(1時間後、250μM)DRI-NLS647の静脈内送達(インビボ)の結果を示す図である。[FSD10-SS-]4PEG20KによるDRI-NLS647の送達を示す。青色染色は陽性核染色を表す;赤色染色は陽性DRI-NLS647染色を表す;ピンク色染色は陽性DRI-NLS647及び核染色(DAPI)(マージ)を表す。
シャトル媒介物と呼ばれる合成ペプチドは、幅広い種類のカーゴを、直接的に、真核細胞及び組織のサイトゾル/核コンパートメントへ迅速に形質導入する能力を有する、比較的新しいクラスの細胞内送達媒介物を表し、例えば、形質導入するのが最も困難と見なされるものの中へも形質導入し、それにより、送達プラットフォームのロバストネスを際立たせている(Del'Guidiceら、2018; Krishnamurthyら、2019; WO/2016/161516; WO/2018/068135; WO/2020/210916; PCT/CA2021/051490; PCT/CA2021/051458)。理論によって縛られるつもりはないが、サイトゾル/核へのシャトル媒介物媒介性カーゴ送達に付随する迅速な動態は、図1に示されているように、送達の大部分が、エンドソーム形成の上流で又はその初期でさえも起こり得る細胞膜を横断する直接的移行によって起こることを示唆する。
膜不透過性カーゴを全身性に注射の部位の下流の器官へ送達するための静脈内又は他の非経口投与にシャトル媒介物テクノロジーを適応させることは、複数の課題を提示する。第1に、合成ペプチドシャトル媒介物のカーゴ形質導入活性は、濃度依存性であり、培養細胞において、マイクロモル濃度が、直接的にサイトゾル/核への迅速なカーゴ移行を引き起こすことが示されている。更に、インビトロでの効率的なシャトル媒介物媒介性カーゴ形質導入活性についての濃度ウィンドウは比較的狭いことが観察されており、最小濃度が約5μMである場合が多く、より高い濃度での細胞生存率の減少のせいで、最大濃度は約20μMである。そのような濃度は、インビトロで培養された細胞の文脈において、又はインビボでの制御された局所投与によって、容易に達成可能/制御可能であるが、静脈内又は他の非経口投与の文脈においてそのように行うことは、課題を提示する。より特に、血液又は他の体液における合成ペプチドシャトル媒介物の、最小有効濃度より下への即時的希釈はカーゴ形質導入を妨げる可能性があり、又は、望ましくなく、実際的ではなく、及び/若しくは宿主により十分には許容されない非常に高い濃度でのシャトル媒介物の投与を必要とする可能性がある。第2に、血液又は他の体液におけるシャトル媒介物のカーゴからの物理的分離(その2つの間での共有結合による付着の欠如による)は、追加の課題を提示し、逆に、シャトル媒介物をそれらのカーゴと共有結合によりコンジュゲートすることは、インビトロ及びインビボでそれらの形質導入活性を阻害することが観察されている。第3に、(下流の標的器官においての代わりに)主に注射の部位における望ましくない迅速なカーゴ形質導入が、更なる課題を提示する。
シャトル媒介物送達プラットフォームを、静脈内又は他の非経口投与に関連した上記で言及された課題の少なくとも一部に対処するように適応させる取り組みを本明細書で企てた。複数のシャトル媒介物を一緒に共有結合により繋留することが、血液又は他の体液におけるシャトル媒介物希釈を潜在的に緩和するための手段として探索された。したがって、最初の実験は、シャトル媒介物を様々な手段により、かさ高さを漸増させた部分、例えば、異なるサイズのポリエチレングリコール(PEG)に基づいたポリマーとコンジュゲートすることの効果を評価するために実施された。シャトル媒介物の相対的に小さいPEG部分(例えば、約1kDa未満)とのコンジュゲーションは、カーゴ形質導入活性に大きくは影響しなかったが、合成ペプチドシャトル媒介物を、より大きいPEG部分で、様々な位置において、及び切断可能な又は切断不可能な連結によって、PEG化する最初の試みは、PEG部分のサイズの増加と共に漸減する観察されたカーゴ形質導入活性をもたらした。そのようなコンジュゲーションは、一般的に、非PEG化対応物と同じ有効濃度においてインビトロで試験された場合、シャトル媒介物のカーゴ形質導入活性の激しい損失を生じた(実施例4及び実施例6)。興味深いことに、PEG化は一般的に、インビトロでシャトル媒介物の全体的な細胞毒性を減少させ、より高い濃度におけるそれらの潜在的使用を可能にする。より高い濃度(一般的にインビトロで非PEG化シャトル媒介物について細胞毒性であろう)においてカーゴ形質導入活性を再試験することにより、N末端か又はC末端のいずれかにおいてPEG化されたシャトル媒介物が、ロバストな形質導入活性を示すことが明らかにされた。更に、PEG化は又、シャトル媒介物の有効濃度範囲/ウィンドウを、それらの対応する非PEG化シャトル媒介物と比較して、有意に広げることが観察された(図3B及び図46A~46D)。
複数のシャトル媒介物を一緒にそれらのC末端を介して共有結合により繋留することを、更に追求し、切断可能な又は切断不可能な結合によって一緒に繋留された数個のシャトル媒介物モノマーを含有するシャトル媒介物マルチマーを合成した。蛍光標識されたペプチドカーゴ、及び非コンジュゲート型シャトル媒介物か、(切断可能な又は非切断可能な結合によって連結された)異なるサイズの直鎖状PEG部分を有するシャトル媒介物-PEGコンジュゲートか、又は(切断可能な又は非切断可能な結合によって連結された)C末端を介して一緒に繋留された24個までのシャトル媒介物モノマーを有するマルチマーかのいずれかを含有する注射用製剤を調製した。例えばエンドソーム若しくは膜内に閉じ込められたままである細胞内送達カーゴ又は細胞外に残存するものから、成功裏に送達されて自由にその細胞内標的と結合するカーゴを明確に区別するために、ペプチドカーゴは核移行シグナル(NLS)を含有した。その後、注射用製剤をマウスにおいてそれらの尾静脈を介して静脈内投与することにより、インビボ実験を行った。予想外にも、インビトロでの減弱された形質導入活性にもかかわらず、シャトル媒介物-PEGコンジュゲート及びマルチマーは、それらの非コンジュゲート型シャトル媒介物対応物と比較して、様々な器官において有意に向上した核カーゴ送達を示した(実施例7及び実施例11)。興味深いことに、PEG部分のサイズ(1kDa~40kDa)、シャトル媒介物-PEG結合の切断姓、及びマルチマーあたりのシャトル媒介物の数は全て、異なる器官(例えば、肝臓、膵臓、肺、腎臓、脾臓、脳、心臓、及び膀胱)へのカーゴ送達に影響するように調整することができる技術的特徴だった。
最後に、シャトル媒介物がそれらのカーゴと、直接的にか又は直鎖状PEGリンカーを介してかのいずれかで、切断可能な又は切断不可能な結合によって、共有結合により付着しているバイオコンジュゲートを、合成した。興味深いことに、核移行シグナル(NLS)を含有するカーゴと切断不可能な結合によってシャトル媒介物をコンジュゲートすることは、カーゴが核に達することができないように若干、妨げるように思われ、カーゴのかなりの割合が、エンドソーム膜内に閉じ込められているように見えた(実施例8)。逆に、シャトル媒介物を切断可能な結合によってコンジュゲートされたNLS含有カーゴは、より容易に核に達することができ、カーゴのシャトル媒介物からの、例えば、エンドソーム形成の前又はその初期の時点での、脱離が、シャトル媒介物-カーゴコンジュゲートによるカーゴ送達の成功に重要な役割を果たすことを示唆している。しかしながら、顕微鏡観察により、シャトル媒介物-カーゴコンジュゲートのより高い濃度において、漸増する量のカーゴが核において検出された。これらの結果は、十分高いシャトル媒介物濃度において、シャトル媒介物は、インビトロで、他の隣接するシャトル媒介物をカーゴとして形質導入し得ることを示唆する。実施例9及び実施例11に示された結果は、シャトル媒介物-カーゴコンジュゲートが、インビボで静脈内投与後、様々な標的器官へ細胞内にカーゴを送達するために用いられ得ることを実証している。
Krishnamurthyら、2019は、非コンジュゲート型シャトル媒介物が、独立的カーゴをマウスの肺細胞へ鼻腔内点滴注入により送達し得ることを実証したが、実施例10における結果は、カーゴをシャトル媒介物と切断可能な連結で、直接的にか又は短いPEGリンカーを介してかのいずれかでコンジュゲートすることにより、送達の向上を獲得できることを実証している。
静脈内投与のために製剤化された組成物及びバイオコンジュゲート
第1の態様において、(a)細胞内生物学的標的と結合し又はそれへ送達されることになっている膜不透過性カーゴ;及び(b)カーゴのサイトゾル/核又は細胞内の送達を媒介するためのバイオコンジュゲートであって、生体適合性親水性ポリマー、好ましくは非アニオン性親水性ポリマーとコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含むバイオコンジュゲートを含む組成物が本明細書に記載される。本明細書で用いられる場合、表現「細胞内生物学的標的」は、本明細書に記載されたカーゴが結合することを意図される細胞内の分子若しくは構造を指し得、又はカーゴが送達されることを意図される細胞内の特定の位置(例えば、サイトゾル、核、又は他の細胞内コンパートメント、好ましくは非エンドソーム)を指す場合もある。本明細書で用いられる場合、発現「サイトゾル/核送達」は、シャトル媒介物が一般的に、独立的カーゴを真核細胞のサイトゾルへ形質導入し、いったんそのカーゴがサイトゾルへアクセスしたならば、その後、それらは、自由に、サイトゾル内のそれらの生物学的標的と結合し、又は、例えばカーゴそれ自体に存在する細胞内ターゲティングモチーフ(例えば、NLS等の細胞内ターゲティングシグナル)の存在に依存して、オルガネラのコンパートメントへ移動するという観察を指す。本明細書で用いられる場合、表現「細胞内送達」は、カーゴが、その細胞内分布(例えば、サイトゾル、核、又はエンドソーム)にかかわらず、細胞の内側へ送達されることを指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物及びバイオコンジュゲートは、特に、容易には酵素的に分解できないカーゴ(例えば、シャトル媒介物より有意に長い半減期を有する合成又は非タンパク質性カーゴ)が用いられる場合、カーゴを細胞内(エンドソームコンパートメント内を含む)に送達するために用いられ得る。
いくつかの実施形態において、合成ペプチドシャトル媒介物は、別個の正荷電親水性面及び別個の疎水性面を含む溶媒曝露表面を有する少なくとも12アミノ酸長のコア両親媒性αヘリックスモチーフ(「シャトル媒介物コアモチーフ」)を含み得る。本明細書で用いられる場合、表現「シャトル媒介物コアモチーフ」又は「カチオン性両親媒性コアモチーフ」は、インビトロ及び/又はインビボで、ロバストなカーゴ形質導入活性を示す主要な合成ペプチドシャトル媒介物の中で共有される共通の構造的特徴、すなわち、別個の正荷電親水性面及び別個の疎水性面を含む溶媒曝露表面を有する少なくとも12~15アミノ酸長の水溶液中の両親媒性αヘリックスモチーフの形をとると予測されたアミノ酸配列の存在を指す。「正荷電親水性面」は、生理学的pHにおいて負荷電側鎖を有するアミノ酸(例えば、D又はE)を含まない領域を指す。本明細書で用いられる場合、用語「別個の」は、正荷電親水性面を形成するカチオン性アミノ酸側鎖と疎水性面を形成する疎水性側鎖との間に重なりがない又は極小であるような、シャトル媒介物コアモチーフ上の溶媒曝露領域間の明らかな物理的分離を指す。そのような、別個のものへの分離は、例えば、シャトル媒介物コアモチーフの二次構造のインシリコ3Dモデリングにより及び/又はSchiffer-Edmundsonヘリカルホイール表現により、観察することができる。シャトル媒介物の切り詰め研究により、より長いシャトル媒介物がそれらの切り詰められた対応物より優れた形質導入活性をしばしば示したとは言え、多くの場合、シャトル媒介物コアモチーフ単独、又は可動性グリシン/セリンリッチなセグメントに片側若しくは両側に隣接されたシャトル媒介物コアモチーフが、カーゴ形質導入活性に十分であることが明らかにされた(PCT/CA2021/051490)。
いくつかの実施形態において、生体適合性親水性ポリマーは、合成ペプチドシャトル媒介物と、シャトル媒介物コアモチーフに対してN末端側又はC末端側に、コンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、生体適合性親水性ポリマーは、シャトル媒介物内に含まれるシャトル媒介物コアモチーフのN末端が遊離したまま又はコンジュゲートされないままであるように、シャトル媒介物のC末端で又はその方向で合成ペプチドシャトル媒介物とコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、生体適合性親水性ポリマーは、シャトル媒介物内に含まれるシャトル媒介物コアモチーフのC末端が遊離したまま又はコンジュゲートされないままであるように、シャトル媒介物のN末端で又はその方向で合成ペプチドシャトル媒介物とコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、生体適合性親水性ポリマーは、シャトル媒介物のN末端とC末端の両方で又はそれらの方向で、合成ペプチドシャトル媒介物とコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたバイオコンジュゲートは、複数の合成ペプチドシャトル媒介物モノマーが、シャトル媒介物内に含まれるそれらのシャトル媒介物コアモチーフのN末端が遊離したまま又は繋留されないままであるように、それらのN末端若しくはC末端で又はその方向で、(例えば、分岐型、超分岐型、又は樹枝状の生体適合性親水性ポリマーを介して)一緒に繋留されている、シャトル媒介物マルチマーを含み得る。
本明細書で用いられる場合、発現「生体適合性」は、投与されるべき宿主において実質的に有害な反応を誘発しない任意の物質を指す。外来の実体が宿主へ導入された時、その実体が、宿主へのマイナス効果を生じる炎症応答等の免疫応答を誘導する可能性がある。そのような実体は、そのマイナスが、宿主の種の他のメンバーにわたって一貫して観察されるならば、生体適合性ではないと見なされる。いくつかの実施形態において、生体適合性は、宿主がその材料を代謝、吸収、及び/又は排泄することができるという意味で、生分解性材料を指し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物は、非コンジュゲート型合成ペプチドシャトル媒介物を含む対応する組成物と比較して、カーゴを細胞内生物学的標的への送達の増加を達成するのに十分であるバイオコンジュゲートの濃度を含む。いくつかの実施形態において、組成物におけるバイオコンジュゲートの濃度は、少なくとも40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、210μM、220μM、230μM、240μM、250μM、260μM、270μM、280μM、290μM、300μM、310μM、320μM、330μM、340μM、350μM、360μM、370μM、380μM、390μM、400μM、410μM、420μM、430μM、440μM、450μM、460μM、470μM、480μM、490μM、500μM、510μM、520μM、530μM、540μM、550μM、560μM、570μM、580μM、590μM、600μM、610μM、620μM、630μM、640μM、650μM、660μM、670μM、680μM、690μM、700μM、710μM、720μM、730μM、740μM、750μM、760μM、770μM、780μM、790μM、800μM、810μM、820μM、830μM、840μM、850μM、860μM、870μM、880μM、890μM、900μM、910μM、920μM、930μM、940μM、950μM、960μM、970μM、980μM、990μM、又は1000μMであり得る。
いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーのシャトル媒介物とのコンジュゲーションは、対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比較して、シャトル媒介物の最小有効濃度を上昇させる。いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーのシャトル媒介物とのコンジュゲーションは、インビトロ及び/又はインビボでシャトル媒介物の細胞毒性を減少させ、それにより、本明細書に記載されたバイオコンジュゲートの、そうでなければ宿主及び/又は標的細胞によってあまり十分には許容されないだろう用量での投与を可能にする。いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーのシャトル媒介物とのコンジュゲーションは、インビトロ及び/又はインビボでシャトル媒介物のカーゴ形質導入活性を減弱する。いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーのシャトル媒介物とのコンジュゲーションは、対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比較して、シャトル媒介物の有効濃度範囲/ウィンドウを広げ、それにより、例えば正確な過剰投与制御が実用的ではなく又は可能ではないインビボ投与において、それらの使用についてのより高い柔軟性及び/又は多用途性を提供する。いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーのシャトル媒介物とのコンジュゲーションは、対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比較して、シャトル媒介物及び/又はカーゴのインビボ体内分布を変化させる。
生体適合性非アニオン性ポリマー
本明細書で用いられる場合、「非アニオン性親水性ポリマー」は、生理学的pHにおいて(例えば、血液中又は他の体液/分泌物中)負に荷電しておらず、又は生理学的pHにおいてシャトル媒介物媒介性カーゴ形質導入を抑止するのに十分な負電荷を含有していない、水溶性ポリマーを指す。この点において、裸のプラスミドDNA(負荷電リン酸バックボーンを含有する; WO/2016/161516; WO/2018/068135)又はアニオン性ポリサッカライド(ヘパリン; Del'Guidiceら、2018)等の均一に負に荷電したバイオポリマーは、合成ペプチドシャトル媒介物によって不十分に形質導入されることが示されている。理論によって縛られるつもりはないが、負荷電カーゴと合成ペプチドシャトル媒介物のカチオン性領域との間のイオン性相互作用が、シャトル媒介物の形質導入活性にマイナスに影響すると考えられる。
いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、直鎖状、分岐型、超分岐型、又は樹枝状の構造を有し得る。分岐型、超分岐型、又は樹枝状の構造は、シャトル媒介物マルチマーを含むバイオコンジュゲートの合成に特に有利である。
いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、ポリエーテル部分、ポリエステル部分、ポリオキサゾリン部分、ポリビニルピロリドン部分、ポリグリセロール部分、ポリサッカライド部分、親水性ペプチド若しくはポリペプチドリンカー部分、ポリシロキサン部分、ポリリジン部分、非アニオン性ポリヌクレオチド類似体部分(例えば、ホスホロジアミデートバックボーン、アミド(例えば、ペプチド)バックボーン、メチルホスホネートバックボーン、中性ホスホトリエステルバックボーン、スルホンバックボーン、若しくはトリアゾールバックボーンを有する電荷中性ポリヌクレオチド類似体部分;又はアミノアルキル化ホスホラミデートバックボーン、グアニジニウムバックボーン、S-メチルチオウレアバックボーン、若しくはヌクレオシルアミノ酸(NAA)バックボーンを有するカチオン性ポリヌクレオチド類似体部分)、又はそれらの任意の非アニオン性誘導体、又はそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)部分及び/若しくはポリエステル部分、又はそれらの非アニオン性誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、合成ペプチドシャトル媒介物の質量の少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、又は40倍の質量を有する。いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、合成ペプチドシャトル媒介物の質量の1倍、2倍、3倍、4倍、又は5倍から、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、又は40倍までの質量を有する。いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、約1~80kDa、1~70kDa、1~60kDa、1~50kDa、1~40kDa、2~80kDa、2~70kDa、2~60kDa、2~50kDa、2~40kDa、3~80kDa、3~70kDa、3~60kDa、3~50kDa、3~40kDa、4~80kDa、4~70kDa、4~60kDa、4~50kDa、4~40kDa、5~80kDa、5~70kDa、5~60kDa、5~50kDa、5~40kDa、5~35kDa、10~35kDa、10~30kDa、10~25kDa、又は10~20kDaの質量を有する。いくつかの実施形態において、非アニオン性親水性ポリマーは、約1kDa、2kDa、3kDa、4kDa、5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa、33kDa、34kDa、35kDa、36kDa、37kDa、38kDa、39kDa、又は40kDaのサイズを有する。生体適合性非アニオン性親水性ポリマーのサイズの関連において本明細書で用いられる場合、用語「約」は、ポリマー合成の本来的な不均一性を反映することを意図され、ポリマーのサイズは、一般的に、調製におけるポリマーの平均サイズ又は質量を指す。そのような変動は、そのような関連における用語「約」によって包含される。
いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、合成ペプチドシャトル媒介物と切断可能な連結(例えば、ジスルフィド結合又は加水分解性ポリエステル結合)によってコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、合成ペプチドシャトル媒介物と切断不可能な連結(例えば、マレイミド結合)によってコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態において、合成ペプチドシャトル媒介物とコンジュゲートされることに加えて、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、カーゴと、切断可能な又は切断不可能な連結によって更にコンジュゲートされ得る。理論によって縛られるつもりはないが、そのようなカーゴ-シャトル媒介物バイオコンジュゲートは、血液又は他の体液中での希釈により、カーゴのシャトル媒介物からの物理的分離の課題に対処し得る。いくつかの実施形態において、カーゴは、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーと切断不可能な連結によってコンジュゲートされ得、シャトル媒介物と生体適合性非アニオン性親水性ポリマーとの間の切断可能な連結の切断が、バイオコンジュゲートの標的細胞若しくは組織との接触時又はその後に、カーゴのシャトル媒介物からの分離を生じるという旨で、シャトル媒介物は、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーと切断可能な連結によってコンジュゲートされ得る。
マルチマー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたバイオコンジュゲートは、(例えば、前記生体適合性非アニオン性親水性ポリマーを介して)一緒に繋留された少なくとも2個の合成ペプチドシャトル媒介物(すなわち、シャトル媒介物モノマー)を含むマルチマーであり得る。いくつかの実施形態において、シャトル媒介物モノマーは、好ましくは、シャトル媒介物のカチオン性両親媒性コアモチーフのN末端が遊離したまま又は繋留されないままであるように、それらのN末端若しくはC末端で又はその方向で、(例えば、分岐型又は超分岐型生体適合性非アニオン性親水性ポリマーを介して)一緒に繋留される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたマルチマーは、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、又は24個の合成ペプチドシャトル媒介物を一緒に繋留し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたマルチマーは、最高25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個、124個、125個、126個、127個、128個、129個、130個、131個、132個、133個、134個、135個、136個、137個、138個、139個、140個、141個、142個、143個、144個、145個、146個、147個、148個、149個、150個、151個、152個、153個、154個、155個、156個、157個、158個、159個、160個、161個、162個、163個、164個、165個、166個、167個、168個、169個、170個、171個、172個、173個、174個、175個、176個、177個、178個、179個、180個、181個、182個、183個、184個、185個、186個、187個、188個、189個、190個、191個、192個、193個、194個、195個、196個、197個、198個、199個、200個、201個、202個、203個、204個、205個、206個、207個、208個、209個、210個、211個、212個、213個、214個、215個、216個、217個、218個、219個、220個、221個、222個、223個、224個、225個、226個、227個、228個、229個、230個、231個、232個、233個、234個、235個、236個、237個、238個、239個、240個、241個、242個、243個、244個、245個、246個、247個、248個、249個、250個、251個、252個、253個、254個、255個、又は256個までの合成ペプチドシャトル媒介物を一緒に繋留し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたマルチマーは、最高2n個(nは2から8までの任意の整数である)までの合成ペプチドシャトル媒介物を一緒に繋留し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物は、組成物におけるシャトル媒介物モノマー濃度が少なくとも40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、210μM、220μM、230μM、240μM、250μM、260μM、270μM、280μM、290μM、300μM、310μM、320μM、330μM、340μM、350μM、360μM、370μM、380μM、390μM、400μM、410μM、420μM、430μM、440μM、450μM、460μM、470μM、480μM、490μM、500μM、510μM、520μM、530μM、540μM、550μM、560μM、570μM、580μM、590μM、600μM、610μM、620μM、630μM、640μM、650μM、660μM、670μM、680μM、690μM、700μM、710μM、720μM、730μM、740μM、750μM、760μM、770μM、780μM、790μM、800μM、810μM、820μM、830μM、840μM、850μM、860μM、870μM、880μM、890μM、900μM、910μM、920μM、930μM、940μM、950μM、960μM、970μM、980μM、990μM、1000μM、1500μM、2000μM、2500μM、又は3000μMである、シャトル媒介物マルチマーの濃度を含み得る。例えば、4個のシャトル媒介物モノマーを一緒に繋留するマルチマーの25μM濃度が、100μMのシャトル媒介物モノマー濃度を有する。
いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、投与後、合成ペプチドシャトル媒介物の脱繋留(untethering)を可能にする切断可能な又は分解可能な連結を含み得る。いくつかの実施形態において、マルチマーは、分岐型PEG、超分岐型PEG、樹枝状及び/又はポリエステルコアを含み得る。いくつかの実施形態において、ポリエステルコアを含むマルチマーは、インビボで分解可能であり得、投与後、シャトル媒介物モノマーの徐々の放出又は脱繋留を可能にする。
カーゴ
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたカーゴは、膜不透過性カーゴである。本明細書で用いられる場合、表現「膜不透過性カーゴ」は、容易には生物学的組織及び膜(例えば、細胞膜又はエンドソーム膜)を横断して拡散しない、又は生物学的組織及び膜を不十分に横断し、したがって、シャトル媒介物媒介性送達から恩恵を受けるだろう分子を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたカーゴは、細胞透過性ドメイン及び/又はエンドソーム漏出ドメインを欠損する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたカーゴは、合成ペプチドシャトル媒介物及び/又は生体適合性非アニオン性親水性ポリマーと切断可能な結合によって共有結合により連結され得、その結果、カーゴが、投与後(例えば、還元性細胞環境へ曝露された時、及び/又はただし、細胞内に送達される前、それと同時に、若しくはそのすぐ後)、前記結合の切断を通してそれから脱離する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたカーゴは、合成ペプチドシャトル媒介物及び/又は生体適合性非アニオン性親水性ポリマーと切断不可能な結合によって共有結合により連結され得る。いくつかの実施形態において、容易には酵素分解されないカーゴ(例えば、シャトル媒介物より有意に長い半減期を有する合成又は非タンパク質性カーゴ、例えば、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド)が、切断不可能な結合によるシャトル媒介物とのコンジュゲーションに適し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたカーゴは、診断用カーゴ又は治療用カーゴであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたカーゴは、合成ペプチドシャトル媒介物を介した形質導入に適した任意のカーゴであり得、又はそれを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたカーゴは、ペプチド、組換えタンパク質、核タンパク質、ポリサッカライド、小分子、非アニオン性ポリヌクレオチド類似体(例えば、ホスホロジアミデートバックボーン、アミド(例えば、ペプチド)バックボーン、メチルホスホネートバックボーン、中性ホスホトリエステルバックボーン、スルホンバックボーン、若しくはトリアゾールバックボーンを有する電荷中性ポリヌクレオチド類似体部分;又はアミノアルキル化ホスホラミデートバックボーン、グアニジニウムバックボーン、S-メチルチオウレアバックボーン、若しくはヌクレオシルアミノ酸(NAA)バックボーンを有するカチオン性ポリヌクレオチド類似体部分)、又はそれらの任意の組合せであり得、又はそれを含み得る。
いくつかの実施形態において、カーゴは、酵素、抗体若しくは抗体コンジュゲート若しくはその抗原結合断片、転写因子、ホルモン、増殖因子;デオキシリボ核タンパク質(DNP)若しくはリボ核タンパク質(RNP)カーゴである核タンパク質カーゴである組換えタンパク質(例えば、RNAガイド型ヌクレアーゼ、Cas I型、II型、III型、IV型、V型、若しくはVI型ヌクレアーゼ等のCasヌクレアーゼ、又はヌクレアーゼ活性を欠くそのバリアント、塩基エディター、又はプライムエディター、CRISPR関連トランスポサーゼ(CRISPR-associated transposase)、若しくはCas-リコンビナーゼ(例えば、recCas9)、Cpf1-RNP、Cas9-RNP)であり得、又はそれを含み得る。
いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)、ペプチド核酸(PNA)、メチルホスホネートオリゴマー、若しくは低分子干渉リボ核酸中性オリゴヌクレオチド(short interfering ribonucleic neutral oligonucleotide)(siRNN)であり得、又はそれを含み得、カーゴは、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーに含まれたアンチセンス合成オリゴヌクレオチド(ASO)であり得る(例えば、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーが又、カーゴでもある場合)。
合成ペプチドシャトル媒介物及びその機能性断片
合成ペプチドシャトル媒介物は、以前、例えば、Del'Guidiceら、2018; Krishnamurthyら、2019; WO/2016/161516; WO/2018/068135; WO/2020/210916; PCT/CA2021/051490;及びPCT/CA2021/051458に記載されている。したがって、その徹底的な記載は、簡潔さのために本明細書には含まれない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物には、例えば、PCT/CA2021/051490に記載されているように、(例えば、インビトロで、HeLa細胞等の培養細胞において)前記カーゴのサイトゾル/核細胞内形質導入を増加させるのに十分であるシャトル媒介物コアモチーフを有するシャトル媒介物のサブセットが挙げられる。いくつかの実施形態において、シャトル媒介物コアモチーフは、Schiffer-Edmundsonヘリカルホイール表現において40°~160°、40°~140°、60°~140°、若しくは60°~120°の正荷電角度を規定するヘリックスの片側に正荷電残基のクラスターを有する別個の正荷電親水性面;及び/又はSchiffer-Edmundsonヘリカルホイール表現において140°~280°、160°~260°、若しくは180°~240°の疎水性角度を規定するヘリックスの反対側に疎水性アミノ酸残基のクラスターを有する別個の疎水性面を含む。いくつかの実施形態において、疎水性クラスター内の残基の少なくとも20%、30%、40%、又は50%は、疎水性残基(例えば、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、ロイシン、バリン、メチオニン、チロシン、システイン、グリシン、及びアラニンから選択され、又はフェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、及び/若しくはロイシンから選択される疎水性残基)である。いくつかの実施形態において、正荷電クラスター内の残基の少なくとも20%、30%、40%、又は50%は、正荷電残基(例えば、リジン及びアルギニンから選択される正荷電残基)である。
いくつかの実施形態において、シャトル媒介物コアモチーフは、少なくとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、又は5.5の疎水性モーメント(μH)を有する。いくつかの実施形態において、シャトル媒介物コアモチーフは、17個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、又は30個の残基の最大長を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、17~150アミノ酸長のペプチドであり得、WO/2018/068135; WO/2020/210916; PCT/CA2021/051490; PCT/CA2021/051458に以前、記載された1セットのシャトル媒介物ラショナルデザインパラメータの任意の組合せが重んじられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、15、16、17、18、19、又は20から150までのアミノ酸長のペプチドであり得、以下のパラメータの少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、又は全部の任意の組合せが重んじられる:
- ペプチドは、水溶液中、可溶性である(例えば、-0.35未満、-0.40未満、-0.45未満、-0.50未満、-0.55未満、又は-0.60未満の疎水性親水性度の総平均(grand average of hydropathicity)(GRAVY)指標を有する);
- 疎水性面は、ターンあたり3.6残基を有するαヘリックスのオープンシリンドリカル表現(open cylindrical representation)に基づいた、ペプチドのアミノ酸の12~50%に相当する、空間的に隣接するL、I、F、V、W、及び/又はMアミノ酸からなる疎水性コアを含む;
- ペプチドは、3.5~11の疎水性モーメント(μH)を有する;
- ペプチドは、生理学的pHにおいて+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、又は+15の推定正味電荷を有する;
- ペプチドは、8~13又は10~13の等電点(pI)を有する;
- ペプチドは、35%~65%の、アミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、及びVの任意の組合せで構成されている;
- ペプチドは、0%~30%の、アミノ酸: N、Q、S、及びTの任意の組合せで構成されている;
- ペプチドは、35%~85%の、アミノ酸: A、L、K、及びRの任意の組合せで構成されている;
- ペプチドは、ペプチドにおいて少なくとも5%のLがあるという条件で、15%~45%の、アミノ酸:A及びLの任意の組合せで構成されている;
- ペプチドは、20%~45%の、アミノ酸:K及びRの任意の組合せで構成されている;
- ペプチドは、0%~10%の、アミノ酸:D及びEの任意の組合せで構成されている;
- ペプチドにおけるA及びL残基のパーセンテージ(% A+L)と、ペプチドにおけるK及びR残基のパーセンテージ(K+R)との差が、10%以下である;並びに
- ペプチドは、10%~45%の、アミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、及びHの任意の組合せで、好ましくは、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、若しくは1%未満の、D及び/若しくはE、又は好ましくは5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、若しくは1%未満の、D及び/若しくはE残基で構成されている。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、ヒスチジンリッチなドメインを含み得、任意で、ヒスチジンリッチなドメインが以下である:(i)シャトル媒介物のN末端方向及び/若しくはC末端方向に位置する;(ii)少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、若しくは少なくとも90%のヒスチジン残基を含む少なくとも3アミノ酸、少なくとも4アミノ酸、少なくとも5アミノ酸、若しくは少なくとも6アミノ酸のストレッチであり;及び/又は連続した少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、若しくは少なくとも9個のヒスチジン残基を含む;又は(iii)(i)と(ii)の両方。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、可動性リンカードメイン(例えば、(例えば、シャトル媒介物のN末端セグメントとC末端セグメントを分離し;又は前記シャトル媒介物コアモチーフのN末端側及び/若しくはC末端側に位置する)セリン及び/又はグリシン残基等の親水性残基がリッチな)を含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、以下のアミノ酸配列を含み又はそれからなり得る:
(a) [X1]-[X2]-[リンカー]-[X3]-[X4](式1);
(b) [X1]-[X2]-[リンカー]-[X4]-[X3](式2);
(c) [X2]-[X1]-[リンカー]-[X3]-[X4](式3);
(d) [X2]-[X1]-[リンカー]-[X4]-[X3](式4);
(e) [X3]-[X4]-[リンカー]-[X1]-[X2](式5);
(f) [X3]-[X4]-[リンカー]-[X2]-[X1](式6);
(g) [X4]-[X3]-[リンカー]-[X1]-[X2](式7);
(h) [X4]-[X3]-[リンカー]-[X2]-[X1](式8);
(i) [リンカー]-[X1]-[X2]-[リンカー](式9);
(j) [リンカー]-[X2]-[X1]-[リンカー](式10);
(k) [X1]-[X2]-[リンカー](式11);
(l) [X2]-[X1]-[リンカー](式12);
(m) [リンカー]-[X1]-[X2](式13);
(n) [リンカー]-[X2]-[X1](式14);
(o) [X1]-[X2](式15);又は
(p) [X2]-[X1](式16)
[式中、
[X1]は、2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;及び1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-から選択される;
[X2]は、-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;及び-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-から選択される:
[X3]は、-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;又は-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;及び-A-1[+]-A-A-Aから選択される:
[X4]は、-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];及び-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+]から選択される:並びに
[リンカー]は、-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;及び-(GnSn)nSn(GnSn)n-から選択され;
[Φ]は、Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr、又はVal、好ましくはLeu、Phe、Trp、又はIleであるアミノ酸である;
[+]は、Lys又はArgであるアミノ酸である;
[ζ]は、Gln、Asn、Thr、又はSerであるアミノ酸である;
Aは、アミノ酸Alaである;
Gは、アミノ酸Glyである;
Sは、アミノ酸Serである;及び
nは、1~20、1~19、1~18、1~17、1~16、1~15、1~14、1~13、1~12、1~11、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~1~4、又は1~3の整数である]。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、WO/2016/161516; WO/2018/068135; WO/2020/210916; PCT/CA2021/051490;及びPCT/CA2021/051458に記載されているように、確証されたカーゴ形質導入活性を有するシャトル媒介物アミノ酸配列のいずれか1つを含み又はそれからなり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、以下を含み又はそれからなり得る:
(i)配列番号1~50、58~78、80~107、109~139、141~146、149~161、163~169、171、174~234、236~240、242~260、262~285、287~294、296~300、302~308、310、311、313~324、326~332、338~342、344、346、348、352、355、356、358~360、362、363、366、369、若しくは370のいずれか1つのアミノ酸配列;
(ii)配列番号1~50、58~78、80~107、109~139、141~146、149~161、163~169、171、174~234、236~240、242~260、262~285、287~294、296~300、302~308、310、311、313~324、326~332、338~342、344、346、348、352、355、356、358~360、362、363、366、369、若しくは370のいずれか1つと、1アミノ酸以下、2アミノ酸以下、3アミノ酸以下、4アミノ酸以下、5アミノ酸以下、6アミノ酸以下、7アミノ酸以下、8アミノ酸以下、9アミノ酸以下、若しくは10アミノ酸以下だけ、異なるアミノ酸配列(例えば、いかなるリンカードメインも除外する);
(iii)配列番号1~50、58~78、80~107、109~139、141~146、149~161、163~169、171、174~234、236~240、242~260、262~285、287~294、296~300、302~308、310、311、313~324、326~332、338~342、344、346、348、352、355、356、358~360、362、363、366、369、若しくは370のいずれか1つと少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列(例えば、いかなるリンカードメインも除外して計算される);
(iv)配列番号1~50、58~78、80~107、109~139、141~146、149~161、163~169、171、174~234、236~240、242~260、262~285、287~294、296~300、302~308、310、311、313~324、326~332、338~342、344、346、348、352、355、356、358~360、362、363、366、369、若しくは370のいずれか1つと、保存的アミノ酸置換によってのみ(例えば、1個以下、2個以下、3個以下、4個以下、5個以下、6個以下、7個以下、8個以下、9個以下、若しくは10個以下の保存的アミノ酸置換だけ、好ましくは、いかなるリンカードメインも除外して)、異なるアミノ酸配列であって、各保存的アミノ酸置換が、同じアミノ酸クラス内のアミノ酸から選択され、そのアミノ酸クラスが、脂肪族: G、A、V、L、及びI;ヒソロキシル若しくはイオウ/セレン含有: S、C、U、T、及びM;芳香族: F、Y、及びW;塩基性: H、K、及びR;酸性及びそれらのアミド: D、E、N、及びQであ、アミノ酸配列;又は
(v)(i)~(iv)の任意の組合せ。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、本明細書で定義されているような親の合成ペプチドシャトル媒介物の断片を含み又はそれからなり得、断片がカーゴ形質導入活性を保持し、かつ前記シャトル媒介物コアモチーフを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、本明細書で定義されているような親のシャトル媒介物のバリアントを含み又はそれからなり得、バリアントが、カーゴ形質導入活性を保持し、かつ親のシャトル媒介物と比べてC末端正電荷密度の低下を有する点(例えば、K/R等の1つ又は複数のカチオン性残基を非カチオン性残基、好ましくは非カチオン性親水性残基で置換することにより)で(又はその点のみで)、親のシャトル媒介物と異なる。いくつかの実施形態において、断片又はバリアントは、親のシャトル媒介物のC末端切り詰めを含み又はそれからなり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、そのバリアントを含み又はそれからなり得、バリアントは、置き換えられているアミノ酸と類似した生理化学的性質(例えば、構造、疎水性、又は電荷)の側鎖を有する対応する合成アミノ酸で、少なくとも1個のアミノ酸が置き換えられている点を除いて、本明細書で定義されているような合成ペプチドシャトル媒介物と同一であり、バリアントは、合成ペプチドシャトル媒介物の非存在下と比較して、真核細胞において前記カーゴのサイトゾル/核送達を増加させ、好ましくは、合成アミノ酸置き換えが以下である:
(a)塩基性アミノ酸をα-アミノグリシン、α,γ-ジアミノ酪酸、オルニチン、α,β-ジアミノプロピオン酸、2,6-ジアミノ-4-ヘキシン酸、β-(1-ピペラジニル)-アラニン、4,5-デヒドロ-リシン、δ-ヒドロキシリシン、ω,ω-ジメチルアルギニン、ホモアルギニン、ω,ω'-ジメチルアルギニン、ω-メチルアルギニン、β-(2-キノリル)-アラニン、4-アミノピペリジン-4-カルボン酸、α-メチルヒスチジン、2,5-ジヨードヒスチジン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジン、スピナシン、4-アミノフェニルアラニン、3-アミノチロシン、β-(2-ピリジル)-アラニン、又はβ-(3-ピリジル)-アラニンのいずれか1つと置き換える;
(b)非極性(疎水性)アミノ酸をデヒドロ-アラニン、β-フルオロアラニン、β-クロロアラニン、β-ロドアラニン、α-アミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、β-シクロプロピルアラニン、アゼチジン-2-カルボン酸、α-アリルグリシン、プロパルギルグリシン、tert-ブチルアラニン、β-(2-チアゾリル)-アラニン、チアプロリン、3,4-デヒドロプロリン、tert-ブチルグリシン、β-シクロペンチルアラニン、β-シクロヘキシルアラニン、α-メチルプロリン、ノルバリン、α-メチルバリン、ペニシラミン、β,β-ジシクロヘキシルアラニン、4-フルオロプロリン、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、ピペコリン酸、4,5-デヒドロロイシン、allo-イソロイシン、ノルロイシン、α-メチルロイシン、シクロヘキシルグリシン、cis-オクタヒドロインドール-2-カルボン酸、β-(2-チエニル)-アラニン、フェニルグリシン、α-メチルフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、β-(3-ベンゾチエニル)-アラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-ブロモフェニルアラニン、4-tert-ブチルフェニルアラニン、α-メチルトリプトファン、β-(2-ナフチル)-アラニン、β-(1-ナフチル)-アラニン、4-ヨードフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、4-メチルトリプトファン、4-クロロフェニルアラニン、3,4-ジクロロ-フェニルアラニン、2,6-ジフルオロ-フェニルアラニン、n-in-メチルトリプトファン、1,2,3,4-テトラヒドロノルハルマン-3-カルボン酸、β,β-ジフェニルアラニン、4-メチルフェニルアラニン、4-フェニルフェニルアラニン、2,3,4,5,6-ペンタフルオロ-フェニルアラニン、又は4-ベンゾイルフェニルアラニンのいずれか1つと置き換える;
(c)極性で非荷電アミノ酸をβ-シアノアラニン、β-ウレイドアラニン、ホモシステイン、allo-トレオニン、ピログルタミン酸、2-オキソチアゾリジン-4-カルボン酸、シトルリン、チオシトルリン、ホモシトルリン、ヒドロキシプロリン、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、β-(1,2,4-トリアゾール-1-イル)-アラニン、2-メルカプトヒスチジン、β-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-セリン、β-(2-チエニル)-セリン、4-アジドフェニルアラニン、4-シアノフェニルアラニン、3-ヒドロキシメチルチロシン、3-ヨードチロシン、3-ニトロチロシン、3,5-ジニトロチロシン、3,5-ジブロモチロシン、3,5-ジヨードチロシン、7-ヒドロキシ-1,2,3,4-テトラヒドロイソ-キノリン-3-カルボン酸、5-ヒドロキシトリプトファン、チロニン、β-(7-メトキシクマリン-4-イル)-アラニン、又は4-(7-ヒドロキシ-4-クマリニル)-アミノ酪酸のいずれか1つと置き換える;及び/又は
(d)酸性アミノ酸をγ-ヒドロキシグルタミン酸、γ-メチレングルタミン酸、γ-カルボキシグルタミン酸、α-アミノアジピン酸、2-アミノヘプタン二酸、α-アミノスベリン酸、4-カルボキシフェニルアラニン、システイン酸、4-ホスホノフェニルアラニン、又は4-スルホメチルフェニルアラニンのいずれか1つと置き換える。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、細胞透過性ドメイン(CPD)、細胞透過性ペプチド(CPP)、若しくはタンパク質形質導入ドメイン(PTD)を含まなくてもよく、又はエンドソーム漏出ドメイン(ELD)と融合したCPDを含まない。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、エンドソーム漏出ドメイン(ELD)及び/又は細胞透過性ドメイン(CPD)を含み得る。いくつかの実施形態において、ELDは、以下であり得、又はそれに由来し得る:エンドソーム溶解性ペプチド;抗菌性ペプチド(AMP);直鎖状カチオン性αヘリックス抗菌性ペプチド;セクロピン-A/メリチンハイブリッド(CM)ペプチド;pH依存性膜活性ペプチド(PAMP);ペプチド両親媒性物質;インフルエンザヘマグルチニン(HA)のHA2サブユニットのN末端に由来したペプチド;CM18;ジフテリア毒素Tドメイン(DT);GALA;PEA;INF-7;LAH4;HGP;H5WYG;HA2;EB1;VSVG;シュードモナス毒素;メリチン;KALA;JST-1;C(LLKK)3C;G(LLKK)3G;又はそれらの任意の組合せ。いくつかの実施形態において、CPDは、以下であり得、又はそれに由来し得る:細胞透過性ペプチド若しくは細胞透過性ペプチド由来のタンパク質形質導入ドメイン;TAT;PTD4;ペネトラチン;pVEC;M918;Pep-1;Pep-2; Xentry;アルギニンストレッチ;トランスポータン;SynB1;SynB3;又はそれらの任意の組合せ。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された合成ペプチドシャトル媒介物は、環状ペプチドを含み若しくはそれからなり得、及び/又は1個若しくは複数のD-アミノ酸を含む。そのような構造を有するシャトル媒介物バリアントは、カーゴ形質導入活性を有することが示されている。
使用、製造、処置及び診断方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物は、インビボ投与における使用のため、又はインビボ投与のための組成物の製造のためであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物は、静脈内若しくは他の非経口投与(例えば、髄腔内)における使用のため、又は静脈内若しくは他の非経口投与のための医薬(例えば、注射用医薬)の製造のためであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物は、(体液及び/若しくは分泌物(例えば、気道を裏打ちするもの等の粘膜)と接触する又はそれと近位の(例えば、肝臓、膵臓、脾臓、心臓、脳、肺、腎臓、及び/又は膀胱))標的器官若しくは組織への投与における使用のためであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物は、鼻腔内投与における使用のため、又は鼻腔内投与のための医薬(例えば、噴霧器又は吸入器中)の製造のためであり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物は、カーゴが治療用カーゴ(例えば、細胞内治療標的と結合し、又はそれへ送達されることになっている)である、治療における使用のためであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組成物は、対象においてカーゴのサイトゾル/核及び/又は細胞内送達により軽快する疾患若しくは障害を処置するための医薬の製造のためであり得る。
更なる態様において、(a)生体適合性非アニオン性ポリマーを供給する工程;(b)合成ペプチドシャトル媒介物を供給する工程;(c)生体適合性非アニオン性ポリマーを合成ペプチドシャトル媒介物と共有結合によりコンジュゲートし、それにより、バイオコンジュゲートを生成する工程;及び任意で、(d)前記バイオコンジュゲートを、細胞内生物学的標的と結合し又はそれへ送達されることになっている膜不透過性カーゴと共に製剤化する工程を含む、薬学的組成物の製造のための方法が本明細書に記載される。
いくつかの実施形態において、合成ペプチドシャトル媒介物は、別個の正荷電親水性面及び別個の疎水性面を含む溶媒曝露表面を有する少なくとも12アミノ酸長のコア両親媒性αヘリックスモチーフ(シャトル媒介物コアモチーフ)を含み得る。いくつかの実施形態において、生体適合性非アニオン性ポリマーは、合成ペプチドシャトル媒介物と、そのシャトル媒介物コアモチーフに対してN末端側及び/又はC末端側で(例えば、シャトル媒介物のN末端又はC末端で)コンジュゲートされ得る。実施形態において、生体適合性非アニオン性ポリマー、バイオコンジュゲート、カーゴ、シャトル媒介物コアモチーフ、合成ペプチドシャトル媒介物、又はそれらの任意の組合せが本明細書に記載される。
いくつかの態様において、治療用又は診断用カーゴを対象へ(例えば、対象の肝臓、膵臓、脾臓、心臓、脳、肺、腎臓、及び/又は膀胱へ)送達するための方法であって、細胞内生物学的標的と結合し又はそれへ送達される(又は蓄積する)ことになっている膜不透過性カーゴ及び本明細書に記載されているようなバイオコンジュゲートを、それを必要とする対象へ逐次的に又は同時に共投与する(例えば、非経口的に、静脈内に、鼻腔内に、粘膜を通して)工程を含む方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、カーゴは本明細書に記載されている通りである。いくつかの実施形態において、共投与は、本明細書に記載されているような組成物を投与することにより、同時に実施され得る。
いくつかの態様において、本明細書は、本明細書に記載されているようなバイオコンジュゲートに関する。いくつかの実施形態において、バイオコンジュゲートは、細胞内送達のためのカーゴと切断不可能な結合によりコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含む。いくつかの実施形態において、バイオコンジュゲートは、細胞内送達のためのカーゴと切断可能な結合によってコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含み、好ましくは、その結果、カーゴが前記結合の切断を通してそれから脱離し、それにより、カーゴがサイトゾル/核へ送達されるのを可能にする。いくつかの実施形態において、合成ペプチドシャトル媒介物は、別個の正荷電親水性面及び別個の疎水性面を含む溶媒曝露表面を有する少なくとも12アミノ酸長のコア両親媒性αヘリックスモチーフ(シャトル媒介物コアモチーフ)を含み得、カーゴが、好ましくは、合成ペプチドシャトル媒介物と、シャトル媒介物コアモチーフに対してN末端側及び/又はC末端側でコンジュゲートされ、好ましくは、その結果、カーゴが前記結合の切断又はシャトル媒介物の分解を通してそれから脱離し、それにより、カーゴがサイトゾル/核へ送達されるのを可能にする。実施形態において、シャトル媒介物は、本明細書に記載されているような生体適合性非アニオン性親水性ポリマーを介してカーゴとコンジュゲートされる;カーゴは本明細書に記載されている通りである;シャトル媒介物は本明細書に記載されている通りである;又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているバイオコンジュゲートは、標的真核細胞のサイトゾル/核へのカーゴ形質導入における使用のため、又は標的真核細胞のサイトゾル/核へのカーゴ形質導入(インビトロ、エクスビボ、又はインビボでの)における使用のための医薬の製造のためであり得る。
いくつかの態様において、細胞内生物学的標的と結合し又はそれへ送達されることになっている膜不透過性カーゴと、切断可能又は切断不可能な様式で共有結合によりコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、(a)シャトル媒介物は本明細書に定義されている通りである;(b)膜不透過性カーゴは本明細書に定義されている通りである;(c)シャトル媒介物は、本明細書に定義されているような様式でカーゴとコンジュゲートされている;(d)シャトル媒介物は、少なくとも40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、210μM、220μM、230μM、240μM、250μM、260μM、270μM、280μM、290μM、300μM、310μM、320μM、330μM、340μM、350μM、360μM、370μM、380μM、390μM、400μM、410μM、420μM、430μM、440μM、450μM、460μM、470μM、480μM、490μM、500μM、510μM、520μM、530μM、540μM、550μM、560μM、570μM、580μM、590μM、600μM、610μM、620μM、630μM、640μM、650μM、660μM、670μM、680μM、690μM、700μM、710μM、720μM、730μM、740μM、750μM、760μM、770μM、780μM、790μM、800μM、810μM、820μM、830μM、840μM、850μM、860μM、870μM、880μM、890μM、900μM、910μM、920μM、930μM、940μM、950μM、960μM、970μM、980μM、990μM、若しくは1000μMn濃度である;(e)組成物は本明細書に定義されているような使用のためである、又は(f)(a)~(e)の任意の組合せである。
いくつかの実施形態において、本明細書に定義されているような組成物は、鼻腔内投与のために製剤化され、カーゴは、肺又は呼吸器の疾患又は障害(例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、又は肺がん)を処置又は防止するための治療用カーゴである。いくつかの実施形態において、本明細書に定義されているような組成物は、粘液溶解剤、抗炎症剤(例えば、ステロイド)、気管支拡張剤(例えば、アルブテロール)、抗生物質(例えば、アミノグリコシド)、又はそれらの任意の組合せを更に含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に定義されているような組成物は、噴霧器又は吸入器(例えば、定量噴霧式吸入器又はドライパウダー吸入器)中等に、吸入のために製剤化され得る。
いくつかの態様において、本明細書に定義されているような組成物又は本明細書に定義されているようなバイオコンジュゲートの、膜不透過性カーゴを細胞内生物学的標的へ送達する静脈内投与のための使用が本明細書に記載される。
いくつかの態様において、本明細書に定義されているような組成物又は本明細書に定義されているようなバイオコンジュゲートの、膜不透過性カーゴを肺における細胞内生物学的標的へ送達する鼻腔内投与のための使用が本明細書に記載される。
いくつかの態様において、検出可能な標識(例えば、フルオロフォア)とコンジュゲートされたD-レトロ-インベルソ核移行シグナルペプチドを含むカーゴが本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、カーゴは細胞内送達における使用のためである。
(実施例1)
材料及び方法
1.1 材料
アセトニトリル(ACN)を、Laboratoire Mat Inc.社(Quebec、QC、Canada)から購入した。ジメチルスルホキシド(DMSO)、ギ酸、Aldrithiol-2又は2,2'-ジピリジルジスルフィド(DPDS)、及びmPEG5K-mal(マレイミド)を、Sigma-Aldrich社(Oakville、ON、Canada)から購入した。mPEG5K-SH及びmPEG20K-malを、JenKem Technology USA社(Plano、TX、USA)から入手した。mPEG10K-SH及びmPEG10K-malを、Biochempeg社(Watertown、MA、USA)から購入した。mPEG20K-SH、mPEG40K-SH、及びmPEG40K-malを、CreativePEGWorks社(Durham、NC、USA)から購入した。ペプチド、レトロ-インベルソ D型-核移行シグナルペプチド(DRI-NLS)、DRI-NLS-Cys (VKRKKKPPAAHQSDATAEDDSSYC-NH2;配列番号372)、及びDRI-NLS-Cys-v2 (VKRKKKPPAAHQSDATAEDDSSYC-PEG2-Lys(N3)-NH2)を、Expeptise社(Montreal、QC、Canada)及び/又はGL Biochem社(Shanghai、China)から購入した。(スルホ)-Cy5-malを、Lumiprobe社(Hunt Valley、Maryland、USA)から入手した。
1.2 超高速液体クラマトグラフィー(UPLC)
クロマトグラフィーの分離は、固定相及び移動相組成、流速、試料体積、及び検出波長に関して発達した。全ての反応は、Waters社(Waters Inc.、Bedford、MA、USA)製のAcquity(商標)自動試料マネージャー及びフォトダイオードアレイ(PDA)検出器を備えたAcquity(商標)UPLCバイナリーソルベントマネージャーからなる高感度UPLCシステムを用いて、モニターされた。ソルベントシステムは、0.1%ギ酸を含有するMilli-Q(商標)水(ソルベントA)及び0.08%ギ酸を含有するアセトニトリル(ソルベントB)で構成された。分離は、以下の勾配を有する逆相により達成された:室温で維持されたAcquity(商標)UPLC BEHフェニルカラム(2.5×50mm、粒子1.7μm)を通しての0.5mL/分の流速において、0~0.40分(98% A)、0.40~1.20分(72% A)、2.20~2.40分(30% A)、2.40~3.10(10% A)、及び3.10~3.21分(98% A)。検出器波長は、229nm、254nm、及び280nmに設定され、注入体積は、試料濃度に依存して、1μLから10μLの間であった。
1.3 分取HPLC
PEG化シャトル及びPEG-OPSSの精製は、所望の化合物の保持時間に依存して3つの方法(下記参照)を用いるHPLCにより実施された。用いられたデバイスは、Waters(商標)2487二吸光度検出器及びWaters 600コントローラーを有する分取HPLCであった。注入ループは、30μLループであった。カラムは、Xbridge Prep 19mm×150mm、フェニル5μmであった。ソルベントAは、0.1%ギ酸を含むH2Oで構成され、ソルベントBは、0.08%ギ酸を含むCANで構成された。精製後、最終生成物は凍結乾燥された。
・方法1:勾配は、100% Aから始まって、0~10分、80% A、10~40分、50% A、40~50分、0% Aであった。全ての画分は、最終生成物の純度を確認するためにUPLCにより分析された。
・方法2:勾配は、100% Aから始まって、0~10分、70% A、10~50分、30% A、50~60分、0% Aであった。全ての画分は、最終生成物の純度を確認するためにUPLCにより分析された。
・方法3:勾配は、100% Aから始まって、0~10分、65% A、10~30分、45% A、及び30~40分、100% Aであった。全ての画分は、最終生成物の純度を確認するためにUPLCにより分析された。
1.4 直接的酸化によるシャトル媒介物-SS-PEGの合成
まず、フラスコ中の、C末端に遊離チオール基を含むシステインを有するペプチドシャトルの10mgを、500μLのH2Oに溶解した。その後、H2O/ACN(50/50)に溶解した5~10当量のmPEGn-SH(遊離チオール)を、その混合物に加えた。その後、1mLのDMSOも又、その混合物に加え、ジスルフィド結合形成に有利に働くように大気酸素を通して24時間、撹拌した。反応を、UPLCによってモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、上記のような方法2を用いる分取HPLCにより精製し、生じたシャトル-SS-PEGを単離し、凍結乾燥して、85%から95%までの収率を有する白色粉末を得た。直接的酸化によるFS-SS-PEGの合成についての反応スキーム(スキーム1)は下記に示されている:
1.5 PEG-OPSS中間体によるシャトル媒介物-SS-PEGの合成
PEG-SH(500mg)を、まず、500μLのH2O/ACN(50/50)中に溶解し、十分な丸底フラスコへ加えた。1~2当量の2,2'-ジピリジルジスルフィド(DPDS)を、500μL H2O/ACN(50/50)中に溶解し、フラスコへ加えた。その混合物を、室温で2時間、撹拌した。スキーム2に示されているような反応を、UPLCによりモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、上記のような方法3を用いる分取HPLCにより精製し、PEG-OPSSを単離し、凍結乾燥して、80%から90%までの範囲の収率で白色粉末を得た。
その後、スキーム3に示されているように、PEG-OPSSを、遊離チオール基を含むシステインを有するペプチドシャトルと反応させた。10mgのペプチドシャトルを、500μLのH2O中に溶解し、フラスコへ加えた。H2O/ACN(50/50)中に溶解した2.5当量のPEG-OPSSをそのフラスコへ加えた。反応を、UPLCによりモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、上記のような方法2を用いる分取HPLCにより精製し、生じたシャトル媒介物-SS-PEGを単離し、凍結乾燥して、90%から95%までの範囲の収率で白色粉末を得た。PEG-OPSS中間体によるシャトル媒介物-SS-PEGの合成についての2段階反応は下記に示されている:
1.6 シャトル媒介物-mal-PEGの合成
まず、C末端に遊離チオール基を含むシステインを有するシャトル媒介物の10mgを、500μLのH2O中に溶解し、フラスコへ加えた。500μLのACN/H2O 50/50中に溶解した2.5当量のPEG-malをそのフラスコへ加えた。反応を、UPLCによりモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、上記のような方法2を用いる分取HPLCにより精製し、生じたシャトル媒介物-mal-PEGを単離し、凍結乾燥して、90%から97%までの範囲の収率で白色粉末を得た。シャトル媒介物-mal-PEGの合成についての反応段階は下記のスキーム4に示されている:
1.6a マルチアームPEGシャトル媒介物の合成
フラスコにおいて、20kDa又は40kDaの分子量を有する4アーム-PEG-マレイミド又は8アーム-PEG-マレイミドを、500μLのACN/H2O 50/50中に溶解した。C末端に遊離チオール基を含むシステインを有するシャトル媒介物を、4アーム-PEGについては8当量又は8アーム-PEGについては16当量で、500μLのH2O中に溶解し、フラスコへ加えた。反応を、UPLCによりモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、上記のような方法2を用いる分取HPLCにより精製し、生じたシャトル媒介物-mal-マルチアーム-PEGsを単離し、凍結乾燥して、60%から75%までの範囲の収率で白色粉末を得た。
フラスコにおいて、20kDa又は40kDaの分子量を有する4アーム-PEG-OPSS又は8アーム-PEG-OPSSを、500μLのACN/H2O 50/50中に溶解した。C末端に遊離チオール基を含むシステインを有するシャトル媒介物を、4アーム-PEGについては8当量又は8アーム-PEGについては16当量で、500μLのH2O中に溶解し、フラスコへ加えた。反応を、UPLCによりモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、上記のような方法2を用いる分取HPLCにより精製し、生じたシャトル媒介物-SS-マルチアーム-PEGsを単離し、凍結乾燥して、50%から75%までの範囲の収率で白色粉末を得た。
1.7 シャトル媒介物-PEG-デンドリマーの合成
デンドリマー[FSD10-mal-PEG1K]6(ポリエステル)及び[FSD10-mal-PEG1K]24(ポリエステル)の合成
まず、10mgのビス-MPA(商標)(2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸)-アジドデンドリマー(トリメチロールプロパンコア、第一世代又は第三世代;それぞれ、G1[又は6アームポリエステルコア]及びG3[又は24アームポリエステルコア]と名付けられた)を、一方の側にジベンゾシクロオクチン(DBCO)及び他方の側にマレイミドを示す二官能性PEG1K(DBCO-PEG-マレイミド)と混合した。PEGのDBCO基は、G1及びG3のアジドと歪み促進型アジド-アルキン環化付加(SPAAC)によって自発的に反応した。G1及びG3は、それぞれ、6アーム及び24アームを有するため、したがって、それらを、それぞれ、12当量及び48当量のDBCO-PEG-マレイミドと反応させた。反応を、UPLCによりモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、前に記載されているような方法3を用いる分取高速液体クラマトグラフィー(HPLC)により精製し、生じたG1-トラゼオリド(trazeolide)(trz)-PEG-マレイミド及びG3-trz-PEG-マレイミドを単離し、凍結乾燥して、黄色の油を得た。その後、G1-trz-PEG-マレイミド及びG3-trz-PEG-マレイミドを更に、それぞれ、システインを有するシャトル媒介物の12当量及び48当量とチオール-エン反応により、反応させた。反応を、UPLCによりモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、上記のような方法2を用いる分取HPLCにより精製し、生じたG1-trz-PEG-mal-FSD10(すなわち、[FSD10-mal-PEG1K]6(ポリエステル))及びG3-trz-PEG-mal-FSD10(すなわち、[FSD10-mal-PEG1K]24(ポリエステル))を単離し、凍結乾燥して、白色粉末を得た。
デンドリマー[FSD10-SS-PEG1K]6(ポリエステル)及び[FSD10-SS-PEG1K]24(ポリエステル)の合成
まず、10mgのビス-MPA-アジドデンドリマー(トリメチロールプロパンコア、第一世代又は第三世代;それぞれ、G1 [又は6アームポリエステルコア]及びG3[又は24アームポリエステルコア]と名付けられた)を、一方の側にジベンゾシクロオクチン(DBCO)及び他方の側にOPSS基を含有する二官能性PEG1K(DBCO-PEG-OPSS)と混合した。PEGのDBCO基は、G1及びG3のアジドと歪み促進型アジド-アルキン環化付加(SPAAC)によって自発的に反応した。G1及びG3を、それぞれ、12当量及び48当量のDBCO-PEG-OPSSと反応させた。反応を、UPLCによりモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、上記のような方法3を用いる分取HPLCにより精製し、生じたG1-trz-PEG-OPSS及びG3-trz-PEG-OPSSを単離し、凍結乾燥して、黄色の油を得た。その後、G1-trz-PEG-OPSS及びG3-trz-PEG-OPSSを更に、それぞれ、システインを有するシャトル媒介物の12当量及び48当量と反応させた。反応を、UPLCによりモニターした。反応が完了したならば、その混合物を、上記のような方法2を用いる分取HPLCにより精製し、生じたG1-trz-PEG-SS-FSD10(すなわち、[FSD10-SS-PEG1K]6(ポリエステル))及びG3-trz-PEG-SS-FSD10(すなわち、[FSD10-SS-PEG1K]24(ポリエステル))を単離し、凍結乾燥して、白色粉末を得た。
1.8 PEG化シャトル媒介物の特徴づけ
PEG化シャトルを、UPLCを用いて特徴づけして、精製が全ての遊離シャトルを除去することを可能にしたことを確認した。LC-MS及びSDSページを用いて、生じたPEG化シャトル媒介物を特徴づけた。
1.9 カーゴ標識
DRI-NLS-mal-Sulfo-Cy5(DRI-NLS647)の合成:まず、10mgのDRI-NLS-Cysを、0.5mLのH2O中に溶解した。2当量の(スルホ)Cy5-MalをACN中に溶解し、フラスコへ加えた。その混合物を、室温で1時間、撹拌した。反応をUPLCによりモニターし、上記のような方法1を用いるHPLCにより精製した。標識をまた、(スルホ)Cy5に対応する650nmにおいてシグナルを示す吸光度測定により確認した。その後、その生成物を単離し、凍結乾燥した。
GFP-(スルホ)-Cy5の調製:まず、5mg/mLにおける凍結GFP-NLSの200μLを、解凍した。Amicon(商標)フィルター(10kDa)を用いて、pH7.4におけるPBSをpH8におけるPBSへ置き換えるバッファー交換を実施した。遠心分離を14000rpm及び4℃で実施した。DMSO中の3当量の(スルホ)Cy5-NHSエステルを、pH8におけるGFP-NLSを含有するチューブへ加え、暗闇中、室温で1時間、回転式振盪機で撹拌した。未反応の(スルホ)Cy5-NHS-エステルを、14000rpm及び4℃でAmiconフィルター(10kDa)を用いる透析により除去した。標識タンパク質を精製するために、このステップを、pH7.4におけるPBSで少なくとも5~6回、繰り返した。標識を、吸光度測定によりモニターし、最終生成物上のGFPに対応する480nm及びスルホ-Cy5に対応する650nmにおけるシグナルの存在により確認した。
1.10 細胞培養
HeLa細胞を、Table 1(表2)に示されているような製造会社の使用説明書に従い、かつTable 2(表3)に示された材料及び試薬を用いて、培養した。
1.11 分光光度法によるPEG化シャトル定量化
上記のようなPEG化シャトル媒介物の合成後、各凍結乾燥したシャトル媒介物-PEGを、それらの質量及び分子量に基づいて1~2mMのストック濃度に達するように大量のPBS 1×中に再懸濁した。その後、その修飾ペプチドを、UV分光光度法を用い、280nmにおけるトリプトファン及びチロシンモル吸光係数を適用し、かつ以下の式を用いて、定量化した:[ペプチド濃度]mg/mL=(A×DF×MW)/ε;式中、Aは280nmにおける吸光度であり、DFは希釈係数であり、MWは分子量であり、εは吸光係数である。各試料について、濃度を、正確さのために、アミノ酸分析(AAA)により得られた濃度と共に内部標準を用いて250μMに調整した。試料をフリーザー内で保存した。
1.12 インビトロでのカーゴ形質導入プロトコール
HeLa細胞を、形質導入の1日前に、96ウェルディッシュ内にプレーティングした(20000細胞/ウェル)。示された濃度におけるPEG化シャトル媒介物(モノマー又はマルチマー)又は非PEG化シャトル媒介物及び10μMの蛍光カーゴ(例えば、GFP-NLS又はDRI-NLS647)を含む各送達混合物を、10%ヒト血清で補完したRPMI 1640培地を含む50μL中に調製した。細胞を、PBS 1×で1回、洗浄し、その後、調製されたシャトル/カーゴ混合物、PEG化シャトル媒介物/カーゴ混合物と共に、及び/又は陰性対照としてカーゴ単独と共に、5分間、インキュベートした。インキュベーション後、10%FBSを含有するDMEMの100μLを、その混合物へ加え、除去した。細胞を、PBS 1×で1回、洗浄し、10%FBSを含有するDMEM中でインキュベートした。その後、細胞を、1時間のインキュベーション後、蛍光顕微鏡観察(Revolve、Echo社; San Diego、CA、USA)及びフローサイトメトリー(Cytoflex(商標)、Beckman Coulter社; Indianapolis、IN、USA)により分析した。
1.13 フローサイトメトリーによる形質導入効率の分析
蛍光カーゴにより放射されたシグナル強度及びカーゴが送達された細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーにより定量化した。未処理の細胞を、処理された細胞におけるシャトル媒介物の存在下でのカーゴの内部移行の成功から生じる蛍光の増加を定量化するためのベースラインを確立するために用いた。未処理の細胞の最大蛍光より高い蛍光シグナルを有する細胞のパーセンテージ、「平均%」又は「Pos細胞(%)」を、形質導入効率を決定するための陽性蛍光細胞を同定するために用いた。平均蛍光強度(平均FITC/APC)は、蛍光カーゴの送達後の蛍光シグナルを有する各細胞の全蛍光強度の平均である。「送達スコア」は、全カーゴ陽性細胞の中で、細胞あたりの、送達されたカーゴの総量の更なる指標を提供するために計算され、生存可能なカーゴ陽性細胞について測定された(少なくとも2連の試料の)平均蛍光強度に、生存可能なカーゴ陽性細胞の平均パーセンテージを掛け、100,000で割ることにより、計算された。最後に、「送達-生存率スコア」は、10を掛けて送達スコアを掛けた平均生存率として各ペプチドについて計算されることがあり、それらの形質導入活性と毒性の両方に関してシャトル媒介物のランキングを可能にする。更に、血球計数器により検出され、かつ細胞(サイズ及び粒度)に対応する事象を分析した。細胞毒性(%細胞生存率)は、各細胞送達条件のサイズ(FSC)及び粒度(SSC)を未処理の細胞と比較することにより得られた。細胞の送達条件は又、対照として「カーゴのみ」を含んだ。
1.12 顕微鏡観察分析
処理された、及び未処理の細胞を、蛍光顕微鏡(Revolve(商標)、Echo社)を用いる96ウェルプレートにおけるライブ顕微鏡観察により直接的に分析した。フローサイトメトリーに関して、GFP-NLSカーゴについてはFITCフィルターを、DRI-NLS647カーゴについては647フィルターを用いた。顕微鏡観察を用いて、カーゴのサイトゾル/核コンパートメントへの送達の成功を評価し、それにより、カーゴが細胞膜に又はエンドソーム内に捕捉されたままではなかったことを確認した。GFP-NLS及びDRI-NLS647カーゴは、それらの核局在化シグナル(NLS)によりサイトゾルから核へ移行することが予想された。各シャトル/PEG-シャトルで処理された条件について及び陰性対照としてのカーゴ単独についてのイメージを収集した。
1.13 マウスにおける静脈内投与及び器官切片の蛍光イメージング
全身の体内分布研究
雌CD1マウス(Charles River社)週齢6週間(体重22~24g)を、換気されたケージにおいて飼育し、水及び標準の齧歯類用固形飼料を自由に摂取できるようにした。動物を、研究に用いられる時点の少なくとも5日前に順応させた。
ラットの全身の体内分布研究について、雄Sprague-Dawleyラット体重200~225gを、ピンポートを有する、ロック溶液としてヘパリン化食塩水:デキストロースを含有するポリエチレンカニューレ管を用いて、門脈においてカニューレ処置した。動物に、ピンポートにより200μLを与え、投与から1時間後か又は24時間後のいずれかに、安楽死させた。
尾静脈注射について、マウスを、拘束チューブ内に拘束し、注射前に静脈拡張を向上させるために1分間又は2分間、加熱灯下に置いた。注射前、試験媒介物は全て、室温にあった。200μLの試験媒介物を、尾静脈に注射した。その後、動物を、彼らのケージ内での飼育に戻し、定期的な観察を行った。投与から1時間後、マウスを、腹腔内注射によりケタミン-キシラジン(それぞれ、87.5mg/kg及び12.5mg/kg)で麻酔した。その後、動物を、左心室切開、及び右心房におけるPBSの灌流により灌流し、インプット溶液を、PBS中に調製された4%パラホルムアルデヒド(PFA)へ切り替える前に、蠕動ポンプを用いて、40mLのPBSを用いた。40mLのPFAも又、マウスへ灌流した。
器官処理及び組織学的検査
器官を収集し、ペトリディッシュに置いた。その後、そのディッシュを、インビボイメージング装置(IVIS(商標)、Perkin Elmer社)のCy5(商標)蛍光チャネルにおいてイメージングして、各器官における蛍光のレベルを決定した。その後、全ての器官の質量を秤で測定し、PFA 4%中に、4℃で一晩、置き、その後、30%スクロース溶液中に、4℃で少なくとも24時間、置いた。その後、全ての組織を、最適切削温度(OCT)コンパウンド(20%スクロース:OCT、1:1)中に7日以内、包埋し、クリオスタットを用いて薄片にするまで、-80℃で保存した。
器官において、組織は4~5レベルでの7μm切片(それぞれ、300μm、間隔を空ける)として薄片にし、単一のスライドグラス上に置いた。そのスライドを、調製するまで、-80℃で保存した。組織学的イメージングについて、切片を、室温PBS中で5分間、インキュベートして、OCTコンパウンドを除去し、その後、スライドあたり100μLのProLong(商標)Glass NucBlue(商標)(Invitrogen(商標)社)及びカバースリップをアプライする前に、できる限り排出した。スライドを、イメージングの前に、暗闇中、一晩、インキュベートした。スライドを、マウンティング後1~4日以内にイメージングし、その時点まで暗闇中に置いておいた。スライドを、自動スライドスキャナ(PANNORAMIC MIDI II(商標)3DHistech(商標) Ltd.社)においてイメージングした。
エクスビボイメージは、IVISイメージング装置においてイメージング化器官の周囲の関心領域(ROI)を描画することにより分析され、蛍光効率は、ROI内の総効率で定量化され、その後、その総効率は、器官質量に対する比率として報告された。
PAS(過ヨウ素酸シッフ)染色について、脱パラフィン(下記の免疫組織化学的検査[IHC]プロトコールに記載されているように)後、スライドを、過ヨウ素酸0.5%中で5分間、染色し、水で5分間、すすぎ、その後、シッフ試薬中で15分間、インキュベートし、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。その後、スライドを水中ですすぎ、IHCにおいてのように脱水させた。
免疫組織化学的検査
少なくとも24時間、風乾させたミクロトーム切片を、キシレン中3分間、脱パラフィンし、続いて、以下の溶液中、3分間の逐次的インキュベーションで再水和させた:EtOH 100%、70%、50%、30%、蒸留水、クエン酸バッファー(10mM クエン酸ナトリウム pH6.0)。その後、切片を、プレストにおける予熱されたクエン酸バッファー中に置き、30分間、オートクレーブした。圧力を解放したら、そのプレストを氷上に置くことにより、バッファーを冷却した。その後、切片を、0.1% Tween-20を含有するTris緩衝生理食塩水(TBST)中で洗浄した。その後、切片を、3% H2O2中、室温で15分間、インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性を消失させ、その後、洗浄あたりTBST中5分間、3回、洗浄した。Pap Pen(商標)(Dako社)を用いて、組織切片を、疎水性インクを用いて円で囲んで、更なるインキュベーションのために組織上の液体を保持した。その後、スライドを、ブロッキングバッファー(3% BSA及び0.3% Triton(商標)X-100を含むTBST)中、室温で30分間、ブロッキングした。その後、スライドを、TBST 3% BSA中に希釈された抗体と、4℃で一晩、インキュベートした。用いられた抗体は、1/300に希釈されたNF-κB p65(D14E12) XP(登録商標)ウサギmAb(CST社 #8242)、及び1/250に希釈された組換え抗MyD88抗体[Abcam社製のEPR590(N)(ab133739)]であった。切片を、TBST中、3回(それぞれ5分間)、洗浄し、HRPコンジュゲート型二次抗ウサギ抗体(1/2000; Jackson ImmunoResearch社)中、室温で1時間、インキュベートした。切片を、再び、3回、洗浄し、SignalStain(登録商標)DAB(Cell Signaling Technology社)と1分30秒間、インキュベートした。発色反応を、蒸留水で洗浄することにより停止させた。その後、スライドを、ヘマトキシリンで30秒間、対比染色し、NH4OH 10%中で5秒間、区別を生じさせた。その後、スライドを、EtOH 95%、100%、100%、キシレン中で各3分間、逐次的インキュベーションにより脱水させ、その後、Permount溶液中でマウントするまで、再び、キシレン中に置いた。
IHC及び免疫蛍光定量化
組織学的イメージの定量化を、CaseViewer(商標)ソフトウェア(3DHistech社)からのCell-Quant(商標)モジュールを用いて、実施した。免疫組織化学的検査結果は更に、Hスコア(又は「ヒスト(histo)」スコア)を組織の関心領域へ割り当てるために用いられる半定量的アプローチにより評価することができる。まず、膜染色強度(0、1+、2+、又は3+)が、固定フィールドにおける各細胞について決定される。Hスコアは、簡単には、優勢な染色強度に基づき得、又はより複雑には、見られた各強度レベルについての個々のHスコアの和を含み得る。1つの方法により、各染色強度レベルにおける細胞のパーセンテージが計算され、最後に、Hスコアが以下の式を用いて割り当てられる: [1×(% 細胞1+)+2×(% 細胞2+)+3×(% 細胞3+)]。0から300までの範囲である最終スコアは、所定の組織試料において、より高い強度膜染色へより相対的な重みを与える。その後、試料は、特定の識別閾値に基づいて陽性又は陰性と見なすことができる。スコアリング1、2、及び3は、各抗体について定義され、各抗体染色を定量化するために同じパラメータが用いられた。同じことが蛍光についても当てはまる。カーゴの肝臓細胞送達について、血管細胞に対応する核を除去する(肝実質細胞のみを保持する)ために核排除フィルターが適用された。
1.14 マウスにおける鼻腔内投与及び器官切片の蛍光イメージング
鼻腔内投与について、マウスをケタミン-キシラジン(それぞれ、87.5mg/kg及び12.5mg/kg)で腹腔内注射により麻酔した。その後、動物へ、呼吸リズムに対して交互に各鼻孔上へ動物あたり50μLの最終体積を滴下するようにマイクロピペットを用いて試験媒介物を与えた。その後、マウスを、飼育室へ戻す前に、仰向けにし、約10秒間、彼らの胸部を少し、マッサージした。18時間(又は任意の示された時間)後、マウスを、心穿刺、続いて、気管を変化させないように気をつけて、頚部脱臼により屠殺した。その後、気管の上部を露出させ、その後、気管支肺胞洗浄を、糸で固定されたカニューレを用いて実現した。次の洗浄前にできる限り多くの液体を元に戻すように気をつけて、1mLのPBSの3体積を与えた。その後、肺を収集し、イメージングし、PFA 4%中に一晩、固定した。
器官処理及び組織学的検査、免疫組織化学的検査、並びに免疫蛍光定量化は、実施例1.13に記載されているような方法と類似した。
フローサイトメトリー分析
PBS(2×1mL)での気管支肺胞洗浄後、肺を切除し、2つの右肺葉を収集し、0.5mL PBSを含むマイクロチューブ中へ置いた。肺を、外科用ハサミで刻み、0.2% コラゲナーゼIV型(Fisher Scientific社、カタログ番号NC9919937)及び0.04% DNアーゼI(Sigma Aldrich社、カタログ番号DN25-100mg)で構成された2×消化混合物を肺へ加えた。その組織を、水浴中、37℃で1時間、消化させ、15分ごとのチューブ反転により、混合した。肺組織を、1ccシリンジプランジャーを用いて70μm細胞ストレーナー上で粉砕した。細胞ストレーナーを、およそ20mLのPBSですすいだ。細胞懸濁液を、4℃で5分間、600xgで遠心分離し、上清を捨てた。細胞ペレットを、PBS中に懸濁し、Moxi(商標)細胞カウンターを用いてカウントした。細胞濃度を、PBSを用いて、1×107細胞/mLに調整した。
フローサイトメトリー染色を、V底96ウェルプレート内の100μLの単一細胞懸濁液(1×106細胞)に実施した。全ての実験条件からのプールされた細胞懸濁液を用いて、無染色対照及び蛍光マイナス1(fluorescence minus one)(FMO)対照を実施した。細胞を遠心分離し(600xg、4℃で5分間)、上清を捨てた。細胞を、25μLのFc Block(商標)(BD Biosciences社、カタログ番号553142)中に懸濁し、氷上で10分間、インキュベートした。細胞外一次抗体(25μL)を、ウェルに加え、氷上、暗闇中で更に20分間、インキュベートした。Fc Blockと抗体混合物の両方を、染色バッファー(1% BSA、0.1% アジ化ナトリウム)中に調製した。インキュベーション後、細胞を、遠心分離し(600xg、4℃で5分間)、染色バッファーで2回、洗浄した。細胞内染色について、細胞を、100μLのBD固定/透過処理溶液(BD Bioscience社、カタログ番号554714)中に懸濁し、暗闇中、4℃で20分間、インキュベートした。細胞を、BD透過処理バッファー(BD Bioscience社、カタログ番号554714)で1回、洗浄し、透過処理バッファー中に調製された細胞内一次抗体溶液の50μLで懸濁した。細胞を暗闇中、4℃で30分間、インキュベートし、透過処理バッファーで2回、洗浄した。二次抗体を加え、暗闇中、4℃で30分間、インキュベートした。細胞を、FACS Flow(BD Bioscience社、カタログ番号336524)中、2回、洗浄し、懸濁した。蛍光溢流をコンペンセーションビーズ(BD Bioscience社、カタログ番号552844)を用いて補正した。データを、FSCについて475、及びSSCについて260として設定された電圧を用いて、BD LSR Fortessa(商標)X-20フローサイトメトリーにおいて取得した。
DRI-NLS-AF647ビーズ標準曲線(ペプチド含有量)
1滴のArC(商標)反応性ビーズ(Fisher Scientific社、カタログ番号501136946)を、V底96ウェルプレート内の150μL PBSへ加えた。そのビーズを、遠心分離し(600xg、4℃で5分間)、上清を捨てた。DRI-NLS-AF647を、PBSでの段階希釈(100μM、25μM、10μM、5μM、2.5μM、及び1μM)により希釈した。ビーズを、DRI-NLS-AF647溶液中に懸濁し、暗闇中、室温で30分間、インキュベートした。ビーズを、2回、洗浄し、PBS中に懸濁した。ビーズ濃度を、Countess(商標)細胞カウンターを用いて測定した。ビーズの半分を、黒色96ウェルプレート内へ移し、インビボイメージャー(IVIS、Perkin Elmer社)でCy5蛍光チャネルにおいて分析した。ウェルあたりの蛍光効率を、2.5μMから始まって0.2pMまでの2分の1倍DRI-NLS-AF647曲線と比較し、DRI-NLS-AF647ペプチドの量(nmole)に更に変換した。ビーズの残りの半分をBD LSR Fortessa X-20フローサイトメーターで分析して、平均蛍光強度(MFI)を決定した。ビーズあたりのDRI-NLS-AF647の絶対量を、フローサイトメトリーにおいて測定されたMFIと相関させることにより、標準曲線を作成した。その後、細胞集団MFIを、細胞あたりのDRI-NLS-AF647の対応する量(nmole)へ内挿した。
ゲーティングストラテジー
フローサイトメトリーデータを、FlowJo(商標)ソフトウェア(BD社)を用いて分析した。ダブレットを、FCS-W/FCS-H及びSSC-W/SSC-Hを用いて識別し、デブリを、記録されたイベントのサイズ(FCS-A)及び顆粒密度(SSC-A)に従って、除去した。白血球をCD45+として同定し、内皮細胞をCD45-CD31+CD326-として同定し、上皮細胞をCD45-CD326+CD31-として同定し、クラブ細胞をCD45-CC10+として同定した。上皮細胞を、I型肺胞上皮細胞(AEC I; CD45-CD326+MHCII-ポドプラニン+)及びII型肺胞上皮細胞(AEC II; CD45-CD326+MHCII+)に細分した。DRI-NLS-AF647陽性細胞を、PBS対照マウスにおけるベースライン蛍光シグナルに基づいて選択した。DRI-NLS-AF647 HI集団を、ビーズに関する標準曲線により決定された定量範囲に従って選択した。
(実施例2)
合成ペプチドシャトル媒介物: 新しいクラスの細胞内送達ペプチド
シャトル媒介物と呼ばれる合成ペプチドは、カーゴを、真核細胞のサイトゾル/核コンパートメントへ迅速に形質導入する能力を有する新しいクラスの細胞内送達媒介物を表す。伝統的な細胞透過性ペプチドに基づいた細胞内送達ストラテジーとは対照的に、合成ペプチドシャトル媒介物は、形質導入の瞬間にそれらのカーゴと共有結合によりは連結されておらず又は静電気的に複合体化されている場合、非常に効果的であることが示されている。事実、シャトル媒介物をそれらのカーゴと共有結合により連結することは、それらの形質導入活性へマイナス効果を生じることが観察されており、カーゴは膜(例えば、細胞膜又はエンドソーム膜、図66及び図68A)内に閉じ込められたように見える場合が多く、サイトゾル/核へのそれらの効率的な送達を妨げる。合成ペプチドシャトル媒介物は、タンパク質カーゴを形質導入するために初めて開発され、最適化されたが、その後の研究は、種々の型のカーゴを形質導入するプラットフォームの多用途性を実証し(例えば、WO/2016/161516; WO/2018/068135; WO/2020/210916; PCT/CA2021/051490; PCT/CA2021/051458)、かつ形質導入が最も困難な細胞(例えば、初代NK細胞; Del'Guidiceら、2018)及び組織(例えば、マウス肺上皮及びヒト気道上皮細胞の高分化型初代培養物、Krishnamurthyら、2019;マウスの脱毛された皮膚、WO/2020/210916)の一部までへも形質導入し、それにより、そのプラットフォームのロバストネスを際立たせている。
合成ペプチドシャトル媒介物の第一世代は、WO/2016/161516に記載され、細胞透過性ドメイン(CPD)と作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン(ELD)を有し、任意で、1つ又は複数のヒスチジンリッチなドメインを更に含む、マルチドメインに基づいたペプチドからなった。第一世代シャトル媒介物におけるCPD及びELDの存在により、第一世代シャトル媒介物が、直列で(すなわち、段階的に)働く両方のドメインの本来的な機能に基づいて、カーゴ形質導入を媒介すると考えることに最初、惹きつけられた。言い換えれば、第一世代シャトル媒介物のCPDは、シャトル媒介物及びタンパク質カーゴの同じエンドソームへの共エンドサイトーシスを誘導し、その後、シャトル媒介物のELDがエンドソーム膜の破壊を媒介し、タンパク質カーゴのサイトゾルへ逃避するのを可能にした。しかしながら、この機構は、第一世代シャトル媒介物がタンパク質カーゴをサイトゾルへ送達できる極めて速い動態を完全には説明することができなかった。例えば、WO/2016/161516の図27Aは、第一世代シャトル媒介物His-CM18-PTD4が、GFP-NLSカーゴをサイトゾルへ、細胞がシャトル媒介物及びカーゴに曝露された後わずか45秒間で送達することを示し、これらの形質導入動態は、同様に他のシャトルについて検証された。His-CM18-PTD4の作用機構は、Del'Guidiceら、2018において更に研究され、シャトル媒介物が、下記の少なくとも2つの異なる様式でタンパク質カーゴをサイトゾルへ送達できると結論づけた:(1)細胞膜を横断する直接的移行による(より迅速に);及び(2)Del'Guidiceら、2018の図6に例証されているように、エンドサイトーシス及びエンドソーム逃避による(より遅く)。
薬物送達の全体像から興味をそそることは、図1における理論によって縛られるつもりはないが、それに示されているように、第一世代シャトル媒介物が、エンドサイトーシス/エンドソーム逃避に頼ることなく、サイトゾルへ直接的にカーゴを迅速に移行することができるという観察であった。出発点として第一世代シャトル媒介物を用いて、細胞毒性を低下させながら、ポリペプチドカーゴの迅速かつ効率的な形質導入(すなわち、より遅いエンドサイトーシスより、より迅速な直接的移行に有利に働く)のためにシャトル媒介物を最適化するために、ラージスケールの反復デザイン及びスクリーニングプログラムに取り組んだ。プログラムは、ほぼ11,000個の合成ペプチドの手作業及びコンピュータ支援デザイン/モデリング、加えて、数百個の異なるペプチドの合成、並びに複数の細胞及び組織において様々なポリペプチドカーゴを迅速かつ効率的に形質導入する能力についての試験を含んだ。文献に由来した既知の細胞透過性ペプチド(CPD)及びエンドソーム溶解性ペプチド(ELD)の融合体としてシャトル媒介物を考慮するよりむしろ、各ペプチドを、それらの推定の3次元構造及び生理化学的性質に基づいて、全体的に考慮した。デザイン及びスクリーニングプログラムは、第一世代シャトル媒介物に優る、ポリペプチドカーゴについての形質導入/毒性プロファイルの向上を有する、シャトル媒介物の理論的デザインを支配するWO/2018/068135に記載された15個のパラメータの1セットにより定義された合成ペプチドシャトル媒介物の第二世代をもたらした。
かなりの程度のタンパク質形質導入活性を示すシャトル媒介物の大部分により共有される共通の構造的特徴は、それらの3D構造:すなわち、別個の正荷電親水性面及び別個の疎水性面を有する両親媒性αヘリックス構造を有する少なくとも12~15アミノ酸長の「コア」セグメントの存在である。切り詰め研究により、「コア」領域単独、又は片側若しくは両側を可動性グリシン/セリンリッチなセグメントに隣接された「コア」領域からなる合成ペプチドシャトル媒介物が、カーゴ形質導入活性に十分であったが、より長いシャトル媒介物が、それらの切り詰め型対応物より優れた形質導入活性を示す場合が多かったことが示された(PCT/CA2021/051490)。例えば、シャトル媒介物FSD10は、培養HeLa細胞において70%を超えるGFP形質導入効率を日常的に示す34アミノ酸ペプチド(配列番号13)であるが、そのN末端15個の残基(その「コア」領域を含む)のみを含有するその断片は、それにもかかわらず、20%を超えるGFP形質導入効率を示した(PCT/CA2021/051490)。「コア」領域を有する他のより長いシャトル媒介物を切り詰めた場合に、類似した結果が得られた。
(実施例3)
静脈内投与のためのシャトル媒介物テクノロジーの課題
膜不透過性カーゴを全身性に注射の部位の下流の器官へ送達するための静脈内投与にシャトル媒介物テクノロジーを適応させることは、複数の課題を提示する。第一に、合成ペプチドシャトル媒介物のカーゴ形質導入活性は、濃度依存性であることが示されており、マイクロモル濃度のシャトル媒介物が培養細胞において直接的にサイトゾル/核への迅速なカーゴ移行を引き起こし、最大カーゴ送達は一般的に5分以内に観察されている。そのような濃度は、インビトロで培養された細胞の文脈において、又はインビボでの制御された局所投与によって、実行可能であるが、静脈内投与で合成ペプチドシャトル媒介物のマイクロモル濃度に達することの実行可能性は、今のところまだわからない。より特に、血液中の合成ペプチドシャトル媒介物の、最小有効濃度より下への瞬間的な希釈が、カーゴ形質導入を妨げ、又は望ましくない、耐えられない、及び/若しくは非実用的である非常に高い濃度におけるシャトル媒介物の投与を必要とする可能性がある。第二に、シャトル媒介物媒介性形質導入活性は、同じ標的細胞をカーゴとシャトル媒介物の両方と、事実上、同時に接触させることを必要とする。シャトル媒介物とそのカーゴとの共有結合による付着の欠如により、血液中のその2つの物理的分離は、追加の課題を提示し、逆に、シャトル媒介物をそれらのカーゴと共有結合によりコンジュゲートすることは、インビトロで、シャトル媒介物形質導入活性を阻害することが示されている。第三に、インビトロでシャトル媒介物媒介性形質導入について観察された極めて迅速なカーゴ形質導入動態は、下流の標的器官の代わりに、主として注射の部位での望ましくないカーゴ形質導入に有利に働き得る。したがって、静脈内投与に関連した上記で言及された課題の少なくとも一部に対処するようにシャトル媒介物送達プラットフォームを適応させるために、複数のストラテジーが並行して探索された。
(実施例4)
PEG化のシャトル媒介物活性及び細胞毒性への効果
複数のシャトル媒介物を一緒に共有結合により繋留することが、血液中のシャトル媒介物希釈を潜在的に緩和させるための手段として探索された。したがって、最初の実験は、異なるサイズのPEGに基づいたポリマー等の、かさ高さを漸増させた部分へ、シャトル媒介物を、様々な様式及び配向でコンジュゲートすることの効果を評価するために実施した。シャトル媒介物の相対的に小さいPEG部分(例えば、約1kDa未満)とのコンジュゲーションはカーゴ形質導入活性に大きく影響することはなかったが、合成ペプチドシャトル媒介物をより大きいPEG部分と様々な位置において、及び切断可能な又は切断不可能な連結により、PEG化するという最初の試みは、一般的に、PEG部分のサイズの増加と共に、観察されたカーゴ形質導入活性の漸進的な低下をもたらした。より具体的には、そのようなコンジュゲーションの一部は、それらの非PEG化対応物と同じアッセイ条件下でインビトロで試験された場合、シャトル媒介物のカーゴ形質導入活性のほとんど完全な喪失を生じた。合成ペプチドシャトル媒介物の形質導入活性は、一般的に、所定の閾値より下(例えば、50%より下)の細胞生存率を生じないシャトル媒介物の濃度の存在下で、培養細胞をカーゴと2~5分間、インキュベートすることにより、インビトロで評価される。しかしながら、PEG化シャトル媒介物について、それらの非PEG化対応物と同じモル濃度で並べて試験した場合、測定可能な形質導入活性はほとんど又は全く観察されなかった。PEG化は、組換えタンパク質の半減期を増加させることが示されているので、PEG化シャトル媒介物が、これらのより長いインキュベーション時間から生じる、それらの非PEG化対応物に優る利点を示し得るかどうかを探索するために、培養細胞を、カーゴ及びシャトル媒介物と、最長4時間、インキュベートする、より長い形質導入活性実験を行った。しかしながら、より長いインキュベーション時間を用いても、PEG化シャトル媒介物は、それらの非PEG化対応物よりパフォーマンスが優れることはなく(データ未提示)、PEG化により与えられるいかなる潜在的な安定性の増加も、PEG部分の付加に関連した形質導入活性の減少を代償することはできないことを示唆した。
形質導入活性へのマイナスの影響と並行して、PEG化が、一般的に、インビトロで、シャトル媒介物の全体的な細胞毒性を減少させることが観察され、より高い濃度でのそれらの潜在的な使用を可能にする。興味深いことに、インビトロでのアッセイにおいて、より高い濃度での≧5kDa直鎖状PEG化シャトル媒介物のカーゴ形質導入活性を再試験することにより、合成ペプチドシャトル媒介物のカチオン性両親媒性「コア」セグメントに関して、特に好ましい「極性」がないことが明らかにされた。実際、ロバストなカーゴ形質導入活性は、シャトル媒介物のカチオン性両親媒性コアセグメントに対してN末端側又はC末端側でコンジュゲートされたかさ高い部分に関して観察された。例えば、図2、図3、図45、及び図46は、フローサイトメトリーにより評価された場合の、N末端(図2及び図3)又はC末端(図45及び図46)でサイズ5~40kDaの直鎖状PEG部分(PEG5K、PEG10K、PEG20K、PEG40K)とコンジュゲートされた0~160μMのシャトル媒介物FSD10の存在下で、カーゴとしての10μM GFP-NLSに関して実施されたHeLa細胞における形質導入アッセイの結果を示す。直鎖状PEG部分は、シャトル媒介物と、切断可能なジスルフィド結合(-SS-)によるか又は切断不可能なマレイミド結合(-mal-)によるかのいずれかでコンジュゲートされた。30~40μMの濃度で用いられた非PEG化FSD10は、10%未満の細胞生存率を生じ、それにより、これらのより高い濃度において、少しの意味ある%GFP陽性細胞及び送達スコア測定値も妨げられた。対照的に、75~100%の細胞生存率が、40μMで用いられたN末端及びC末端PEG化FSD10シャトル媒介物について見出された(図3A及び図45)。
シャトル媒介物の好ましい極性の欠如及び生存率の増加に関する類似した結果は又、試験された他のシャトル媒介物-PEGバイオコンジュゲートにおいて観察された。したがって、更なるバイオコンジュゲート合成及びその後の実験について、C末端コンジュゲーションを独断的に選択した。
(実施例5)
生体適合性非アニオン性親水性ポリマー/テザーとC末端でコンジュゲートされたシャトル媒介物の合成
直鎖状PEGに基づいたもの、分岐型PEGに基づいたもの、ポリエステルに基づいたもの、混合型直鎖状PEG/ポリエステルに基づいたもの、及びポリリジンのポリマーに基づいたものを含む、異なるサイズ及び構造の様々な可溶性非タンパク質性生体適合性部分とのコンジュゲーションを促進するためにシャトル媒介物のC末端に単一のシステイン残基を付加した。
最初のコンジュゲーション実験は、最大6個のシャトル媒介物モノマーを中心ポリエステルデンドリマーコアへ直接的に(すなわち、直鎖状PEGリンカーなしで)繋留することの実行可能性を確認したが、24個のシャトル媒介物モノマーとコンジュゲートされた中心ポリエステルデンドリマーコアからなるマルチマーは、水溶液中に不溶性である(おそらく、シャトル媒介物自体の本来的な疎水性による)ことが見出された。したがって、水溶解度が増加しているシャトル媒介物モノマーを、実施例1に記載されているように、切断可能な(ジスルフィド)連結と切断不可能な(マレイミド)連結の両方によって、異なるサイズの直鎖状PEGに基づいた部分とシャトル媒介物ペプチドをそれらのC末端システイン残基を介してコンジュゲートすることにより、合成した。直鎖状PEGサイズは、1K、5K、10K、20K、及び40KのPEGを含んだ。シャトル媒介物-直鎖状PEGモノマーの一般的な構造は図4に示されている。
シャトル媒介物-直鎖状PEGモノマーに加えて、一連のシャトル媒介物マルチマーも又、実施例1に記載されているように、合成した。これらのマルチマーは、4アーム、6アーム、8アーム、又は24アームを有するマルチアームのコア構造からなり、それぞれが、シャトル媒介物とそのC末端システイン残基を介してコンジュゲートされ、それにより、4個、6個、8個、又は24個のシャトル媒介物モノマーのいずれかを含むマルチマーを生じた。
4アーム及び8アームのマルチマーは、分岐型PEG中心コアに基づいた。より特に、4アームマルチマー(図5)は、20kDaの分岐型PEGからなり、各直鎖状PEGアームは、およそ5kDaのサイズを有する(4アーム×5kDa/アーム)。8アームマルチマー(図6)は、40kDaの分岐型PEGからなり、各直鎖状PEGアームは、およそ5kDaのサイズを有する(8アーム×5kDa/アーム)。6アーム及び24アームのマルチマーは、6アーム又は24アームが伸びている分岐型ポリエステルコアに基づいており、各アームは、シャトル媒介物-PEG1KモノマーとPEGの末端でコンジュゲートされている。エステル連結は、インビボで分解可能であり、シャトル媒介物-PEGモノマーの放出を可能にする。6アーム及び24アームのマルチマーの構造は、図7及び図8に示されている。
合成されたシャトル媒介物-PEGモノマー及びシャトル媒介物マルチマーの純度は、超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)により確認された場合、95%より高いことが見出された。いくつかの代表的なUPLCクロマトグラムは、図9~図15に示されている。
シャトル媒介物-ポリカチオン性ポリマーバイオコンジュゲートも又、シャトル媒介物FSD10をサイズ8kDaのポリ-L-リジン部分(OPSS-ポリ-L-リジン/OPSS-PLL;NSP官能化ポリマー&コポリマー)とコンジュゲートすることにより合成した(FSD10-SS-PLL8K)。FSD10-SS-PLL8Kバイオコンジュゲートのカーゴ形質導入活性を、実施例1に記載されているように、カーゴGFP-NLS及びDRI-NLS647(10μM)についてHeLa細胞において評価した。両方のカーゴについてロバストなカーゴ形質導入が、FSD10-SS-PLL8Kについて、5μMで用いられた場合、観察されたが(35~40% GFP陽性細胞及びDRI-NLS647陽性細胞)、FSD10-SS-PLL8Kが10μMで用いられた場合、生存率が約10%へ下落した(すなわち、非コンジュゲート型FSD10の4~5倍の細胞毒性)。したがって、PEG等の電荷中性親水性ポリマーとのコンジュゲーションと比較して、シャトル媒介物をポリカチオン性ポリマーとコンジュゲートすることは、シャトル媒介物のカーゴ形質導入を抑止しなかったが、ポリカチオン性ポリマーは、細胞毒性へ逆効果を生じた。
(実施例6)
シャトル媒介物-PEGモノマー及びマルチマーのインビトロ形質導入活性
シャトル媒介物-PEGモノマー及びマルチマーの形質導入活性を、実施例1に示されているように、蛍光顕微鏡観察及びフローサイトメトリーによりインビトロでHeLa細胞において評価した。静脈内投与におけるそれらの意図された適用のため、形質導入実験を、無血清培地を使用する代わりに、10%ヒト血清を加えることにより、より複雑な培地において行った。更に、異なるサイズの蛍光カーゴの形質導入活性及びサイトゾル/核送達を評価し、その蛍光カーゴには、核移行シグナルと融合したより大きい組換えGFP(GFP-NLS)、及びC末端システイン残基で化学的フルオロフォアとコンジュゲートされたD-レトロ-インベルソ(DRI)NLS(核移行シグナル)配列(VKRKKKPPAAHQSDATAEDDSSYC;配列番号372)を含む、より小さい合成ペプチド「DRI-NLS647」が挙げられた。
カーゴGFP-NLS(図16~図31)及びDRI-NLS647(図32~図44)を含むシャトル媒介物FSD10についての代表的な顕微鏡観察結果は図16~図44に示されており、パネル「A」は、カーゴのみの蛍光チャネルで獲得されたイメージであり、パネル「B」は、蛍光チャネルを微分干渉コントラスト(DIC)チャネルとマージしている。図17及び図33に示されているように、シャトル媒介物FSD10(10μMで用いられた)は、HeLa細胞においてロバストな核カーゴ形質導入を媒介したが、カーゴ単独とインキュベートされた細胞(図16及び図32)も10μMの陰性対照ペプチドとインキュベートされた細胞も、有意な形質導入は観察されなかった。「FSD10scr」は、PEG化されているかされていないかにかかわらず、FSD10の同じアミノ酸からなるが、スクランブル順序で再編成して、そのカチオン性両親媒性「コア」セグメント構造を消失させた(図18~図20及び図34~図36)。同様に、対照細胞透過性ペプチドTATがその非PEG化型(図20.1)又はPEG化型(図20.2及び20.3)において10μMの濃度で用いられた場合、有意なGFP-NLS形質導入は観察されなかった。事実、試験されたTATに基づいた対照構築物(すなわち、TAT、TAT-SS-PEG10K、及びPEG10K-SS-TAT)は全て、10μMから220μMまでの範囲の濃度で用いられた場合でさえも、低いGFP-NLS送達スコア(すなわち、一貫して0.3未満)を生じた(データ未提示)。40μMで用いられた場合、PEGが最大20Kのサイズを有する、シャトル媒介物-PEGモノマーについて、PEGが切断可能なジスルフィド結合(「SS」)によってコンジュゲートされていたか切断不可能なマレイミド結合(「mal」)によってコンジュゲートされていたかにかかわらず、核カーゴ形質導入が一貫して、検出された(図21~図26及び図37~図40)。40μMで用いられた場合、核カーゴ形質導入は又、40Kのサイズを有するPEGが切断可能なジスルフィド結合(「SS」;図41)によってコンジュゲートされている、シャトル媒介物-PEGモノマーについて、検出されたが、切断不可能なマレイミド結合(「mal」)(図42)によるものについては検出されなかった。更に、核カーゴ形質導入は又、4アーム、6アーム、8アーム、及び24アームのC末端繋留シャトル媒介物マルチマーについて検出された。10μMで用いられた4アーム型マルチマー(「[FSD10-SS-]4(PEG20K)」)及び10μM又は20μMで用いられた8アームのマルチマー(「[FSD10-SS-]8(PEG20K)」)についての代表的なイメージは、図29~図31に示されている。40μMで用いられた6アーム型マルチマー(「[FSD10-mal-PEG1K]6(ポリエステル)」)及び140μMで用いられた24アームのマルチマー(「[FSD10-mal-PEG1K]24(ポリエステル)」)についての代表的なイメージは、図43及び図44に示されている。
興味深いことには、合成された全てのシャトル媒介物-PEGモノマー及びマルチマーについて、それらの非PEG化対応物と比較して、より低い細胞毒性が一貫して観察された。更に、PEG化シャトル媒介物は、一般的に、それらの非PEG化対応物と比較して、より高い濃度においてそれらの最高形質導入活性を示し、シャトル媒介物濃度のより幅広い範囲/ウィンドウにわたってカーゴ形質導入活性を示した。上記の観察をより十分に例証するために、FSD10の非PEG化、直鎖状PEG化、及びマルチマーの、シャトル媒介物濃度の幅広い範囲(0~160μM)にわたって、HeLa細胞においてカーゴGFP-NLS(10μM)を形質導入する能力を並べて比較する更なる実験を実施した。細胞生存率の結果は、図45に示され、相対的送達-生存率スコアとして表現されたカーゴ形質導入活性は、図46において、5kDa、10kDa、20kDa、及び40kDa(パネルA~D)、4アーム及び8アームの分岐型PEGマルチマー(パネルE)、並びに6アーム及び24アームのポリエステルコアマルチマー(パネルF)のPEG部分について示されている。図46おいて示された相対的送達-生存率スコアについて、実施例1に記載されているように試験されたシャトル媒介物のそれぞれについて、少なくとも2連で実施された実験の平均をとることにより、平均送達スコア及び平均細胞生存率を決定し、その後、送達-生存率スコアを計算した(すなわち、平均送達スコア×平均細胞生存率×10)。対応する非PEG化シャトル媒介物との比較を容易にするために、全ての送達-生存率スコアを、10μMにおけるFSD10について観察された「ピーク」送達-生存率スコア(送達-生存率スコア=73.85)に対して標準化し、それにより、図46にプロットされた相対的送達-生存率スコアを得た。
図45は、非PEG化FSD10についての細胞生存率が20μMにおける55%から40μMにおけるたった6%へ下落し、より高い濃度がHeLa細胞に対して完全に細胞毒性であることを示している。対照的に、対照ペプチドTATのN末端又はC末端PEG化(例えば、TAT-SS-PEG10K及びPEG10K-SS-TAT)は、TATの毒性プロファイルを変化させず、生存率は、10~220μMの濃度において80%より上のままであった(データ未提示)。興味深いことに、全てのFSD10-PEGコンジュゲートは、PEGが切断可能なジスルフィド結合(「SS」;図45A~図45D、破線)によってコンジュゲートされているか切断不可能なマレイミド結合(「mal」;図45A~図45D、実線)よってコンジュゲートされているかにかかわらず、40μMを十分超えるシャトル媒介物濃度においてより高い細胞生存率を示した。更に、細胞生存率は、一般的に、シャトル媒介物とコンジュゲートされたPEGのサイズと共に増加した(サイズ5K、10K、20K、及び40KのPEG、それぞれについての図45A、図45B、図45C、及び図45D参照)。興味深いことに、4アーム及び8アームの分岐型PEG化シャトル媒介物マルチマーは、FSD10と類似した細胞生存率プロファイルを示すように思われたが(図45E)、毒性は、実際、それらのそれぞれのシャトル媒介物モノマー濃度が考慮された場合(すなわち、シャトル媒介物モノマー濃度は、4アーム及び8アームのマルチマー、それぞれについて、×4、及び×8である)、低下した。更に、6アーム及び24アームのポリエステルコアマルチマーは、40μMより上の濃度において、毒性の著しい差を示し(図45F)、前者が後者よりはるかに高い毒性を示した。
図46は、全てのC末端PEG化FSD10コンジュゲートが、10μMで用いられた場合、カーゴ形質導入活性をほとんど又は全く示さなかったが、サイズ10K~40Kのよりかさ高いPEGを有するコンジュゲートについて40μMより上で等のより高い濃度で用いられた場合、有意なカーゴ形質導入活性を示したということを示した。興味深いことに、非PEG化FSD10シャトル媒介物は、約20μMの範囲(すなわち、5μMから25μMまで)にわたる相対的に狭い濃度ウィンドウ内でカーゴ形質導入活性を示したが、全てのC末端PEG化FSD10コンジュゲートは、60μM~100μMの範囲にわたる有意により広い濃度ウィンドウ(例えば、PEG10Kコンジュゲートについて40μMから140μMまで)にわたってカーゴ形質導入活性を示した。更に、切断可能なジスルフィド結合(「SS」)によってPEG部分とコンジュゲートされたFSD10シャトル媒介物は、一般的に、切断不可能なマレイミド結合(「mal」)を有するそれらの対応するコンジュゲートより、インビトロで、より高いカーゴ形質導入活性を示した(図46A~46D)。その効果は、PEG40Kと切断可能な様式でコンジュゲートされたFSD10について最も顕著であり、そのFSD10-SS-PEG40Kコンジュゲートは更に、非PEG化FSD10シャトル媒介物の送達-生存率スコアのほとんど5倍の送達-生存率スコアを示した(図46D)。全てのシャトル媒介物マルチマーは、非PEG化FSD10シャトル媒介物の形質導入活性より低い形質導入活性を示した(図46E及び46F)。
図46DにおいてFSD10-SS-PEG40Kについて見られたより高いカーゴ形質導入活性を仮定して、HeLa細胞を、2.5μMから160μMまでのシャトル媒介物及びPEG濃度においてPEG40Kと単純に混合された(すなわち、共有結合によりは連結されていない)FSD10へ曝露する対照実験を実施した。試験された濃度において、非コンジュゲート型FSD10又はFSD10-SS-PEG40Kに対して、FSD10+PEG40K混合物のカーゴ形質導入活性の増加は見られなかった(データ未提示)。更に、図70A及び図70Bは、直接的比較が、異なるサイズ(5K、10K、20K、40K)の直鎖状PEG部分とコンジュゲートされた(「SS」又は「mal」)か、又は単純に混合された(「+」)かのいずれかのFSD10シャトルペプチド(40μM)の間で、実施された、更なる対照実験の結果を示している。これらの結果は、シャトル媒介物-PEGバイオコンジュゲートとは違って、FSD10を直鎖状PEG部分と単純に混合することは、%GFP陽性細胞(図70A)及びGFP-NLS送達スコア(図70B)に関して非コンジュゲート型FSD10のカーゴ形質導入活性を減弱しなかったことを示した。しかしながら、シャトル媒介物-PEGバイオコンジュゲートとは違って、直鎖状PEG部分の存在は、非コンジュゲート型FSD10の細胞毒性を低下させなかった(図70C)。
バイオコンジュゲートFSD10-SS-PEG5K、FSD10-mal-PEG5K、FSD10-SS-PEG10K、及びFSD10-mal-PEG10Kについてのカーゴ形質導入活性も又、カーゴとして異なるサイズの蛍光標識デキストラン(10kDa、40kDa、及び500kDaのデキストラン-FITC)を用いて、HeLa細胞において測定した(データ未提示)。非コンジュゲート型FSD10シャトル媒介物について見られたように、試験された全てのデキストランサイズについて、ロバストなカーゴ形質導入が観察され(30~60%の%FITC陽性細胞)、PEG化又はバイオコンジュゲーションが、シャトル媒介物によって細胞内に送達することができるカーゴのサイズを制限しないように思われることを示唆した。
シャトル媒介物FSD10に関する結果がここで示されているが、結果は、カチオン性両親媒性「コア」セグメント構造を含むシャトル媒介物について試験された他のシャトル媒介物-PEGコンジュゲートにおいて再現された。例えば、図78は、切断可能な「SS」結合又は切断不可能なマレイミド(「mal」)結合によって、異なるサイズの直鎖状PEGと直接的にコンジュゲートされたFSD396又はFSD396Dを用いた、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるGFP-NLSのインビトロ細胞内送達の結果を示す。図78Aは、GFP-NLが陽性である細胞のパーセンテージを示し、図78Bは、GFP-NLSの送達スコアを示し、図78Cは、生存率結果を示す。更に、PEG化シャトル媒介物は、(それらの最適な濃度で用いられた場合でさえも)インビトロでHeLa細胞において、最長4時間までの長期インキュベーション後でもカーゴ形質導入の動力学を変化させないように思われ(データ未提示)、非PEG化シャトル媒介物と同様に、2~5分以内に最大カーゴ形質導入が観察された。これらの結果は、PEG部分により与えられたシャトル媒介物安定性におけるいかなる潜在的増加(例えば、より長期間の活性を生じる)も、シャトル媒介物媒介性カーゴ形質導入活性(短い又はより長いインキュベーション期間における)に実質的に利益をもたらすことはないことを示唆した。
(実施例7)
マウスにおける静脈内投与によるシャトル媒介物-PEGモノマー及びマルチマーのインビボ形質導入活性
実施例1に記載されているような非PEG化シャトル媒介物、シャトル媒介物-PEGモノマー、又はシャトル媒介物マルチマーのいずれかと予め混合されたDRI-NLS647カーゴを含有する注射用製剤を調製した。シャトル媒介物用量を、インビトロアッセイで観察された形質導入活性に必要とされる最小有効量、及び宿主動物について許容できる最大用量の組合せに基づいて選択した。その後、製剤を、マウスの尾静脈へ注射し、様々な器官における細胞内送達及び核送達を、実施例1に記載されているように、注射から1時間後の各器官から発せられる相対的蛍光強度の定量化、及び器官スライスの蛍光顕微鏡観察により評価した。器官切片の代表的な顕微鏡観察イメージは、図47~図63に示されており、顕微鏡観察により評価された場合の送達所見の概要は図64に示されている。
一般的に、マウスの尾静脈における単回の静脈注射から1時間後、シャトル媒介物コンジュゲートは、複数の器官において異なるレベルの効率及び均一性でのDRI-NLS647カーゴペプチドの送達を可能にした。カーゴペプチドの効率的な核送達は、DRI-NLS647ペプチドがサイトゾル内へ又は細胞の外側で捕捉されたままであるという状況とは異なることに、器官へのカーゴペプチドの均一な分布と強く相関した。シャトル媒介物コンジュゲートに関する効率的な細胞内送達状態において、器官組織の細胞特異的免疫標識により、カーゴシグナルは、器官細胞型(例えば、肝臓における肝実質細胞又は膵臓における腺房細胞)からほとんど排他的に発せられ、内皮細胞及びマクロファージ細胞からは極めて稀にしか発せられなかったことを示した。
肝臓に関して、DRI-NLS647ペプチドの最も高い細胞内送達及び均一な拡散は、FSD10-SS-PEG10K、FSD10-SS-PEG20K、[FSD10-SS-]4(PEG20K)、及び[FSD10-mal-]4(PEG20K)シャトル媒介物コンジュゲートとの同時注射後、観察された。注目すべきことには、4アームのコンジュゲート[FSD10-SS-]4(PEG20K)及び[FSD10-mal-]4(PEG20K)が、単回の静脈内注射後、それぞれ、肝実質細胞の著しい19%及び35%において成功裏にカーゴを送達した(肝臓スライスの免疫蛍光定量化により評価した場合)。膵臓、脾臓、心臓(心筋細胞)、及び脳(皮質細胞)におけるDRI-NLS647ペプチドの効率的かつ均一な送達も又、図64に示されているように、様々なシャトル媒介物コンジュゲートとの同時注射後、観察された。腎臓に関して、DRI-NLS647ペプチドの細胞内送達は観察されなかった。シャトル媒介物の有無にかかわらず、シグナルは、皮質における尿細管の壁から発せられた。
一般的に、シャトル媒介物コンジュゲートは、それらの対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物(例えば、図64におけるFSD10)と比べてより高い器官カーゴ送達を可能にした。PEG部分のサイズ(1K~40K)、シャトル媒介物-PEG結合の切断可能性(ジスルフィド対マレイミド)、及びマルチマーあたりのシャトル媒介物の数は全て、異なる器官へのカーゴ送達に影響する因子であった。したがって、これらのデータは、カーゴの異なる器官への効率的な送達のための、及び器官特異的疾患又は障害を処置するための、切断可能な又は切断不可能なリンカーを有するPEGを付加することによる、シャトル媒介物コンジュゲートの潜在的使用を実証している。
(実施例8)
シャトル媒介物はインビトロでそれと共有結合によりコンジュゲートされたカーゴを成功裏に形質導入する
シャトル媒介物媒介性形質導入活性は、同じ標的細胞を、カーゴとシャトル媒介物の両方と事実上、同時に接触させることを必要とする。シャトル媒介物をそれらのタンパク質カーゴへ、シャトル媒介物及びカーゴが同じポリペプチドバックボーンを共有する融合タンパク質として共有結合により付着させることは、そのカーゴをサイトゾル/核へ送達するシャトル媒介物の能力を阻害することが見出され、カーゴは、一般的に、細胞表面の膜内及び/又はエンドソーム内に閉じ込められたままであった。更に、シャトル媒介物とカーゴの間にエンドソームプロテアーゼ(例えば、カテプシン)切断部位を挿入することは、シャトル媒介物の形質導入活性を救出することはできず(データ未提示)、シャトル媒介物及びカーゴは、エンドソーム形成の前又はその初期に、お互いに独立しているべきであることを示唆した。この実施例に示された実験は、シャトル媒介物をそのカーゴへ、切断可能な結合によって繋留することが、そのカーゴの標的細胞のサイトゾル/核への送達を媒介するシャトル媒介物の能力を保持しながら、その2つの実体を極めて近接して保つことができるかどうかを決定することを目的とした。
C末端でペプチドカーゴDRI-NLS647と切断可能なジスルフィド結合(「FSD10-C-SS-DRI-NLS647」)又は切断不可能なマレイミド結合(「FSD10-C-mal- DRI-NLS647」)によってコンジュゲートされたシャトル媒介物FSD10を含有するシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートを、合成した。その後、カーゴ形質導入実験を、HeLa細胞において行い、代表的な顕微鏡観察イメージは図65~図67に示されている。図65は、HeLa細胞を、FSD10-Cシャトル媒介物(10μM)及び独立的DRI-NLS647カーゴ(10μM)に曝露し、カーゴ移行及び核送達の成功をもたらした、陽性対照実験の結果を示す。図66は、細胞を、そのDRI-NLS647カーゴと切断不可能なマレイミド結合によってコンジュゲートされたFSD10-C(「FSD10-C-mal-DRI-NLS647」;5μM)と接触させた実験の結果を示す。興味深いことに、DRI-NLS647カーゴは、一般的に、核へ送達されず、エンドソームに留まり、シャトル媒介物が、カーゴを膜内に閉じ込め、それにより、それが核に達するのを阻止することを示唆した。最後に、図67は、細胞を、そのDRI-NLS647カーゴと切断可能なジスルフィド結合によってコンジュゲートされたFSD10-C(「FSD10-C-SS-DRI-NLS647」;5μM)と接触させた実験の結果を示す。面白いことに、DRI-NLS647カーゴは、核へ成功裏に送達され、カーゴのそのシャトル媒介物からの脱離(例えば、細胞において、還元性細胞環境による;Formanら、2009;Giustariniら、2017)が、カーゴが核に達するのを促進したことを示唆した。
次に、切断不可能なマレイミド結合(「FSD10-C-mal-PEG1K-DRI-NLS647」)又は切断可能なジスルフィド結合(「FSD10-C-SS-PEG1K-DRI-NLS647」)を有する1-kDa PEGリンカーを介してカーゴDRI-NLS647とコンジュゲートされたシャトル媒介物FSD10を含有するシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートを合成した。その後、シャトル媒介物-カーゴコンジュゲート内のシャトル媒介物が第2の独立的カーゴ(すなわち、GFP-NLS)の形質導入を媒介することができるかどうかを評価するために、HeLa細胞においてカーゴ形質導入実験を行った。図68及び図69は、HeLa細胞を、5μMのFSD10-C-mal-PEG1K-DRI-NLS647(図68)又はFSD10-C-SS-PEG1K-DRI-NLS647(図69)のいずれか及び5μMの独立的GFP-NLSカーゴに曝露させた実験の結果を示す。DRI-NLS647蛍光は、図68A及び69Aに示され、GFP-NLS蛍光は図68B及び69Bに示されている。図68B及び図69Bに示されたGFP-NLS蛍光パターンは、FSD10-C-mal-PEG1K-DRI-NLS647及びFSD10-C-SS-PEG1K-DRI-NLS647コンジュゲートに含まれるシャトル媒介物が、そのシャトル媒介物が膜内に留まっているように見えたにもかかわらず、それらはどちらも、独立的GFP-NLSカーゴを核へ効率的に形質導入することができたので、それらのカーゴ形質導入活性を保持したことを実証した。しかしながら、図68Aに見られたパターンは、DRI-NLS647カーゴが、核へうまく形質導入されず、エンドソームに留まったことを示し、シャトル媒介物を切断不可能な結合によってDRI-NLS647カーゴとコンジュゲートすることは、カーゴをシャトル媒介物と共に膜内に閉じ込めたままにさせ、それにより、カーゴが核へ達するのを阻止することを示唆した。類似した結果は、PEG1Kリンカーを欠いたFSD10-C-mal-DRI-NLS647コンジュゲートに関して見られた(データ未提示)。一方、図69Aに見られた蛍光パターンは、DRI-NLS647カーゴが成功裏に核へ送達されたことを実証し、カーゴのそのシャトル媒介物からの脱離(例えば、細胞表面において還元性細胞環境によるジスルフィド結合の切断から)が、カーゴが核に達するのを可能にしたことを示唆した。並行対照実験は、非コンジュゲート型シャトル媒介物(FSD10-C)が、DRI-NLS647とGFP-NLSの両方の独立的カーゴの効率的な核送達を同時に媒介したことを示した(データ未提示)。
図68及び図69における実験を、シャトル媒介物-カーゴコンジュゲートの濃度の2倍で繰り返した。その結果は、FSD10-C-mal-PEG1K-DRI-NLS647のいくらかの核移行が観察されたことを除いて、図68及び図69に示されたものと類似し、高いシャトル媒介物濃度において、シャトル媒介物が、カーゴとして他の隣接したシャトル媒介物を形質導入し得ることを示唆した。
図71は、切断可能な結合(「SS」)若しくは切断不可能な結合(「mal」)によって直接的にか、及び/又は異なるサイズのPEGリンカーを介して(すなわち、PEG1K又はPEG7.5K)かのいずれかで、DRI-NLS647カーゴとコンジュゲートされたFSD10を用いての、フローサイトメトリーによる、HeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す。図71Aは、DRI-NLS647が陽性の細胞のパーセンテージを示し、図71Bは、DRI-NLS647の送達スコアを示し、図71Cは、生存率結果を示し、図71Dは、対応する相対的送達-生存率スコアを示す。これらの結果は、ロバストな細胞内送達が、シャトルペプチドをそれらのカーゴと切断可能又は切断不可能な連結によって、直接的にか又は電荷中性親水性リンカー(例えば、PEG1K又はPEG7.5K)と共にかのいずれかで、共有結合によりコンジュゲートすることにより、達成できることを示唆している。興味深いことに、シャトル媒介物をカーゴと直接的にコンジュゲートすること(例えば、FSD10-mal-DRI-NLS647、FSD10-SS-DRI-NLS647)又はシャトル媒介物とカーゴを短いPEGリンカーを介してコンジュゲートすること(例えば、FSD10-SS-PEG1K-DRI-NLS647又はFSD10-SS-PEG1K-DRI-NLS647)は、細胞内カーゴ送達を達成するためのシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートのより低い有効濃度を生じ、2.5~5μMにおけるシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートについてロバストな送達スコアが観察された(図71B)。シャトル媒介物-PEGバイオコンジュゲートについての図45及び図70に示された結果と一致して、より大きいPEGリンカー(すなわち、PEG7.5K)の存在は、より低い濃度で用いられた場合、シャトル媒介物のカーゴ形質導入活性を減弱させた(図71A及び図71B)が又、細胞毒性を有意に低下させた(図71C)。
図72は、非コンジュゲート型FSD10による、又は切断可能な結合(「SS」)若しくは切断不可能な結合(「mal」)によって直接的にか、及び/若しくは異なるサイズのPEGリンカー(すなわち、PEG1K又はPEG7.5K)を介してかのいずれかで、DRI-NLS647カーゴとコンジュゲートされたFSD10による、DRI-NLS647及びGFP-NLSのインビトロ同時送達の結果の概要の表を示す。送達レベルは、顕微鏡観察に基づいており、以下として表された:「送達なし」:送達事象なし;「+」:稀な送達事象;「++」:均一かつ低い核送達事象;「+++」:均一かつ中程度の核送達事象;「++++」:均一かつ高い核送達事象;「+++++」:均一かつ大量の核送達事象;空欄:結果入手不可能。図71における結果と一致して、シャトル媒介物をカーゴと直接的にコンジュゲートすること(例えば、FSD10-mal-DRI-NLS647及びFSD10-SS-DRI-NLS647)又はシャトル媒介物とカーゴを短いPEGリンカーを介してコンジュゲートすること(FSD10-mal-PEG1K-DRI-NLS647及びFSD10-SS-PEG1K-DRI-NLS647)は、カーゴDRI-NLS647及びGFP-NLSの細胞内送達を達成するためのシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートのより低い有効濃度を生じた(図72)。図72のDRI-NLS647及びGFP-NLSのインビトロ同時送達実験の代表的な蛍光顕微鏡観察イメージは、図73~図77に示されている。パネル「A」に見られるように、シャトル媒介物が5μMで用いられた場合、シャトル媒介物とカーゴの間の切断可能な連結(「SS」)の存在は、DRI-NLS647の核移行を生じ、一方、シャトル媒介物とカーゴの間の切断不可能な連結(「mal」)の存在は、DRI-NLS647カーゴのわずかな核移行を示唆するパターンを生じた。これらの結果は、図65~図69の結果と一致している。しかしながら、DRI-NLS647カーゴの核移行の量の漸増が、より高い濃度(例えば、10μM又はそれ以上)のコンジュゲートが用いられた場合、切断不可能な連結により連結されたシャトル媒介物/カーゴ媒介物における顕微鏡観察により観察された。
図79は、切断可能な結合(「SS」)若しくは切断不可能な結合(「mal」)によって直接的にか、及び/又はPEGリンカー(すなわち、PEG1K)を介してかのいずれかで、DRI-NLS647カーゴとコンジュゲートされたシャトル媒介物FSD396又はFSD396Dを用いての、フローサイトメトリーによるHeLa細胞におけるDRI-NLS647のインビトロ細胞内送達の結果を示す。図79Aは、DRI-NLS647が陽性の細胞のパーセンテージを示し、図79Bは、DRI-NLS647の送達スコアを示し、図79Cは、生存率結果を示し、図79Dは、対応する送達-生存率スコアを示す。図71Bにおける結果と一致して、シャトル媒介物をカーゴと直接的にコンジュゲートすること(例えば、FSD396-mal-DRI-NLS647)又はシャトル媒介物とカーゴを短いPEGリンカーを介してコンジュゲートすること(例えば、FSD396D-mal-PEG1K-DRI-NLS647及びFSD396D-SS-PEG1K-DRI-NLS647)は、細胞内カーゴ送達を達成するためのシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートのより低い有効濃度を生じ、ロバストな送達スコアが、2.5μMにおいてさえもシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートの濃度について観察された(図79B)。
(実施例9)
シャトル媒介物は、それと共有結合によりコンジュゲートされたカーゴをインビボで成功裏に形質導入する
切断可能なジスルフィド結合(「FSD10-C-SS-DRI-NLS647」)若しくは切断不可能なマレイミド結合(「FSD10-C-mal-DRI-NLS647」)によって、又は切断不可能なマレイミド結合(「FSD10-C-mal-PEG-DRI-NLS647」)若しくは切断可能なジスルフィド結合(「FSD10-C-SS-PEG-DRI-NLS647」)を有する1-kDa若しくは7.5-kDA PEGリンカーを介して、ペプチドカーゴDRI-NLS647とC末端でコンジュゲートされたシャトル媒介物FSD10を含有するシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートを、合成した。シャトル媒介物-カーゴコンジュゲートの体内分布及び異なる器官におけるカーゴの送達を評価するために、シャトル媒介物-カーゴコンジュゲートを、マウスの尾静脈へ注射した。様々な器官における細胞内送達を、注射から1時間後、実施例1に記載されているように、各器官から発せられた相対的蛍光強度の定量化及び器官スライスの蛍光顕微鏡観察により評価した。蛍光顕微鏡により評価された場合の送達所見の概要は、図80に示されている。
一般的に、マウスの尾静脈における単回の静脈内注射から1時間後、PEGの有無にかかわらず、シャトル媒介物-カーゴコンジュゲートは、非PEG化FSD10とDRI-NLS647の混合物と比較して、複数の器官においてDRI-NLS647カーゴペプチドの送達を種々のレベルの効率及び均一性を以て増強した。
肝臓、脳、及び腎臓に関して、DRI-NLS647ペプチドの最も高い細胞内送達及び均一な拡散は、FSD10-SS-DRI-NLS647及びFSD10-mal-DRI-NLS647での注射後、観察された。PEG1K又はPEG7.5Kリンカーをシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートに付加することは、一般的に、DRI-NLS647の送達を減少させた。膵臓及び脾臓に関して、PEG1K又はPEG7.5Kをシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートに付加することは、一般的に、DRI-NLS647の送達を増強した。最後に、肺に関して、PEG1K又はPEG7.5Kリンカーをシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートに付加することは、一般的に、DRI-NLS647の送達を維持し、又はそれへ微量な効果を生じた。
一般的に、シャトル媒介物-カーゴコンジュゲートは、それらの対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比べて、より高い器官カーゴ送達を可能にした。PEG部分のサイズ(1K又は7.5K)、シャトル媒介物-PEG結合の切断可能性(ジスルフィド対マレイミド)、及びマルチマーあたりのシャトル媒介物の数は全て、異なる器官へのカーゴ送達に影響する因子であった。したがって、これらのデータは、カーゴの異なる器官への効率的な送達のための、及び器官特異的疾患又は障害を処置するための、カーゴをコンジュゲートすることによるか及び/又は切断可能な若しくは切断不可能なリンカーを有するPEGを付加することによるかのいずれかでの、シャトル媒介物コンジュゲートの潜在的使用を実証している。
(実施例10)
シャトル媒介物は、鼻腔内投与により、肺においてカーゴを成功裏に形質導入する
シャトル媒介物-カーゴコンジュゲートを含む、シャトル媒介物コンジュゲートの肺における体内分布を評価するために、シャトル媒介物コンジュゲートを、実施例1に記載されているように、鼻腔内投与のための製剤として調製した。肺の様々なエリアにおける細胞内送達を、肺から発せられる相対的蛍光強度の定量化、加えて、肺の異なる細胞型のフローサイトメトリー分析により、評価した。フローサイトメトリーにより評価された場合の送達所見の概要は、図81及び図82に示され、加えて、代表的な蛍光顕微鏡観察イメージは図83A~図83Fに示されている。3つの別々の実験を実施し、それらは、図81において、実験「a」(2匹のマウス)、「b」(4匹のマウス)、及び「c」(2匹のマウス)として示されている。結果の比較は、蛍光設定の違いにより、同じ実験内だけで行うことができる。50%より上のパーセンテージは、図81において太字である。興味深いことに、カーゴをシャトル媒介物と切断可能な連結(「SS」)で、直接的に(FSD10-SS-DRI-NLS647)か又は短いPEGリンカーを介して(FSD10-SS-PEG1K-DRI-NLS647)かのいずれかで、コンジュゲートすることは、特に40μMの濃度で用いられた場合、肺細胞(すなわち、全肺細胞、加えて、近位、中央、及び遠位の肺細胞)において最も高いカーゴ送達パーセンテージを生じた(図81)。フローサイトメトリー分析を、実験「b」からの肺細胞へ実施し、図82Aにおける結果は、弱い、中程度の、又は強いカーゴ陽性肺細胞によって分類されたカーゴ陽性細胞のパーセンテージを示し、図82Bにおける結果は、近位対遠位のカーゴ陽性肺細胞の割合を示す。FSD10-SS-DRI-NLS647及びFSD10-SS-PEG1K-DRI-NLS647のより高い濃度(すなわち、80μM及び160μM)は肺細胞においてより高いカーゴ送達を生じなかったが(図81及び図82A)、これらの結果は、非コンジュゲート型FSD10と比較した、FSD10-SS-DRI-NLS647及びFSD10-SS-PEG1K-DRI-NLS647のより高い細胞毒性を示す図71Cに示された生存率結果を考慮して解釈されるべきである。
図82Cは、異なるシャトル媒介物コンジュゲートを用いて送達された、(図81の実験「a」からの)マウスの肺におけるDRI-NLS647の細胞型分布を示す。y軸は、DRI-NLS647シグナルから計算された細胞あたりのペプチド含有量(nM)を算出する。
図81~図83における実験は、シャトル媒介物コンジュゲートを用いた鼻腔内投与によるカーゴの肺への送達を明らかに実証し、嚢胞線維症等の肺疾患における有望な治療ストラテジーを提供する。しかしながら、嚢胞線維症(CF)を処置することについて、患者は、典型的には、シャトル媒介物の送達効率を不活化し又は減少させ得る作用物質を含有し得る濃くかつ粘着性のある痰を発生する。CF患者由来の痰のシャトル媒介物コンジュゲートへの効果を評価するために、まず、FSD10又はFSD10-mal-PEG20Kの分解を評価して、シャトルへのPEGの付加が痰から守ってくれるかどうかを決定した。UPLCにより決定された場合、FSD10の急速な分解が、2%CF痰の存在下で5分以内に観察され、無傷シャトルの40%損失を生じた。比較して、無傷FSD10-mal-PEG20Kのたった20%損失が観察された(データ未提示)。
次に、嚢胞線維症患者に由来した痰の存在下でのGFP-NLSのシャトル媒介物による送達を評価した。図84に示されているように、切断可能又は切断不可能なリンカーを有する、PEG化FSD10は、一般的に、より低い濃度とより高い濃度のどちらにおいても、細胞生存率(図84C)に影響することなく、GFP-NLSの送達(図84A及び図84B)を増強した。PEG10Kの付加は、PEG40Kより効果的であることが示された。
同様に、DRI-NLS647カーゴペプチドの送達は、PEG(切断可能な又は切断不可能なリンカーを有する)の非存在下又は存在下でカーゴをシャトル媒介物とコンジュゲートすることにより、CF痰の存在下で、用量依存的様式で増強された(図85A及び図85B)。更に、PEGのシャトル媒介物-カーゴコンジュゲートへの付加は、一般的に、細胞の生存率を、特により高い濃度において、増強した(図85C)。
一般的に、これらのデータは、カーゴの肺への効率的な送達のための、及び肺又は呼吸器の疾患又は障害を処置するための、カーゴをコンジュゲートすることによるか及び/又は切断可能な若しくは切断不可能なリンカーを有するPEGを付加することによるかのいずれかでのシャトル媒介物コンジュゲートの潜在的使用を実証している。
(実施例11)
シャトル媒介物は、静脈内投与により、膀胱細胞においてカーゴを成功裏に形質導入する
カーゴの膀胱細胞への細胞内送達は、シャトル媒介物-カーゴコンジュゲート、FSD10-SS-DRI-NLS647及びFSD10-SS-PEG1K-DRI-NLS647、加えて、非コンジュゲート型PEG化シャトル媒介物[FSD10-SS-]4PEG20Kによって成功裏に実施された。シャトル媒介物のそれぞれは、注射から1時間後、膀胱の固有層へDRI-NLS647を送達することが示された(図86)。
この出願は、2022年3月29日に作成されたコンピュータ可読形式での配列表を含有する。そのコンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み入れられている。
(参考文献)
Figure 2024511537000011

Claims (63)

  1. 以下を含む組成物:
    (a)細胞内生物学的標的と結合し、又はそれへ送達されることになっている膜不透過性カーゴ;及び
    (b)前記カーゴのサイトゾル/核又は細胞内の送達を媒介するためのバイオコンジュゲートであって、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーとコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含むバイオコンジュゲート。
  2. 合成ペプチドシャトル媒介物が、別個の正荷電親水性面及び別個の疎水性面を含む溶媒曝露表面を有する少なくとも12アミノ酸長のコア両親媒性αヘリックスモチーフ(シャトル媒介物コアモチーフ)を含む、請求項1に記載の組成物。
  3. 生体適合性非アニオン性ポリマーが、合成ペプチドシャトル媒介物と、前記シャトル媒介物コアモチーフに対してN末端側及び/又はC末端側で(例えば、シャトル媒介物のN末端又はC末端で)コンジュゲートされている、請求項2に記載の組成物。
  4. 生体適合性非アニオン性親水性ポリマーのシャトル媒介物とのコンジュゲーションが以下である、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物:
    (i)対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比較して、シャトル媒介物の最小有効濃度を上昇させる(例えば、インビトロで培養HeLa細胞において決定された場合);
    (ii)対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比較して、シャトル媒介物の細胞毒性を低下させる(例えば、インビトロで培養HeLa細胞において決定された場合);
    (iii)対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比較して、シャトル媒介物の有効濃度ウィンドウを広げる(例えば、インビトロで培養HeLa細胞において決定された場合);
    (iv)対応する非コンジュゲート型シャトル媒介物と比較して、シャトル媒介物及び/若しくはカーゴのインビトロ体内分布を変化させる;又は
    (v)(i)~(iv)の任意の組合せ。
  5. 組成物におけるバイオコンジュゲートの濃度が、非コンジュゲート型合成ペプチドシャトル媒介物を含む対応する組成物と比較して、カーゴの細胞内生物学的標的への送達の増加を達成するのに十分である、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 組成物におけるバイオコンジュゲートの濃度が、少なくとも40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、210μM、220μM、230μM、240μM、250μM、260μM、270μM、280μM、290μM、300μM、310μM、320μM、330μM、340μM、350μM、360μM、370μM、380μM、390μM、400μM、410μM、420μM、430μM、440μM、450μM、460μM、470μM、480μM、490μM、500μM、510μM、520μM、530μM、540μM、550μM、560μM、570μM、580μM、590μM、600μM、610μM、620μM、630μM、640μM、650μM、660μM、670μM、680μM、690μM、700μM、710μM、720μM、730μM、740μM、750μM、760μM、770μM、780μM、790μM、800μM、810μM、820μM、830μM、840μM、850μM、860μM、870μM、880μM、890μM、900μM、910μM、920μM、930μM、940μM、950μM、960μM、970μM、980μM、990μM、又は1000μMである、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 生体適合性非アニオン性親水性ポリマーが直鎖状、分岐型、超分岐型、又は樹枝状構造を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 生体適合性非アニオン性親水性ポリマーが、ポリエーテル部分、ポリエステル部分、ポリオキサゾリン部分、ポリビニルピロリドン部分、ポリグリセロール部分、ポリサッカライド部分、その任意の非アニオン性誘導体、親水性ペプチド若しくはポリペプチドリンカー部分、ポリシロキサン部分、ポリリジン部分、非アニオン性ポリヌクレオチド類似体部分(例えば、ホスホロジアミデートバックボーン、アミド(例えば、ペプチド)バックボーン、メチルホスホネートバックボーン、中性ホスホトリエステルバックボーン、スルホンバックボーン、若しくはトリアゾールバックボーンを有する電荷中性ポリヌクレオチド類似体部分;又はアミノアルキル化ホスホラミデートバックボーン、グアニジニウムバックボーン、S-メチルチオウレアバックボーン、若しくはヌクレオシルアミノ酸(NAA)バックボーンを有するカチオン性ポリヌクレオチド類似体部分)、又はそれらの任意の組合せである、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 生体適合性非アニオン性親水性ポリマーがポリエチレングリコール(PEG)部分及び/又はポリエステル部分を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 生体適合性非アニオン性ポリマーが以下である、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物:
    (a)合成ペプチドシャトル媒介物の質量の少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、若しくは40倍の質量を有する;
    (b)合成ペプチドシャトル媒介物の質量の1倍、2倍、3倍、4倍、若しくは5倍から、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、若しくは40倍までの質量を有する;
    (c)約1~80kDa、1~70kDa、1~60kDa、1~50kDa、1~40kDa、2~80kDa、2~70kDa、2~60kDa、2~50kDa、2~40kDa、3~80kDa、3~70kDa、3~60kDa、3~50kDa、3~40kDa、4~80kDa、4~70kDa、4~60kDa、4~50kDa、4~40kDa、5~80kDa、5~70kDa、5~60kDa、5~50kDa、5~40kDa、5~35kDa、10~35kDa、10~30kDa、10~25kDa、若しくは10~20kDaの質量を有する;又は
    (d)(a)~(c)の任意の組合せ。
  11. 生体適合性非アニオン性親水性ポリマーが、合成ペプチドシャトル媒介物と、切断可能な又は切断不可能な連結によってコンジュゲートされている、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 生体適合性非アニオン性親水性ポリマーが前記カーゴと、切断可能な又は切断不可能な連結によって更にコンジュゲートされている、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。
  13. バイオコンジュゲートが、前記生体適合性非アニオン性親水性ポリマーによって一緒に繋留された少なくとも2個の合成ペプチドシャトル媒介物を含むマルチマーである、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
  14. (a)マルチマーが、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、若しくは24個の合成ペプチドシャトル媒介物を一緒に繋留し;最高25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個、124個、125個、126個、127個、128個、129個、130個、131個、132個、133個、134個、135個、136個、137個、138個、139個、140個、141個、142個、143個、144個、145個、146個、147個、148個、149個、150個、151個、152個、153個、154個、155個、156個、157個、158個、159個、160個、161個、162個、163個、164個、165個、166個、167個、168個、169個、170個、171個、172個、173個、174個、175個、176個、177個、178個、179個、180個、181個、182個、183個、184個、185個、186個、187個、188個、189個、190個、191個、192個、193個、194個、195個、196個、197個、198個、199個、200個、201個、202個、203個、204個、205個、206個、207個、208個、209個、210個、211個、212個、213個、214個、215個、216個、217個、218個、219個、220個、221個、222個、223個、224個、225個、226個、227個、228個、229個、230個、231個、232個、233個、234個、235個、236個、237個、238個、239個、240個、241個、242個、243個、244個、245個、246個、247個、248個、249個、250個、251個、252個、253個、254個、255個、若しくは256個までの合成ペプチドシャトル媒介物を一緒に繋留し;及び/又は最高2n個(nは2から8までの任意の整数である)までの合成ペプチドシャトル媒介物を一緒に繋留する;並びに/又は
    (b)組成物における合成ペプチドシャトル媒介物モノマー濃度が、少なくとも40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、210μM、220μM、230μM、240μM、250μM、260μM、270μM、280μM、290μM、300μM、310μM、320μM、330μM、340μM、350μM、360μM、370μM、380μM、390μM、400μM、410μM、420μM、430μM、440μM、450μM、460μM、470μM、480μM、490μM、500μM、510μM、520μM、530μM、540μM、550μM、560μM、570μM、580μM、590μM、600μM、610μM、620μM、630μM、640μM、650μM、660μM、670μM、680μM、690μM、700μM、710μM、720μM、730μM、740μM、750μM、760μM、770μM、780μM、790μM、800μM、810μM、820μM、830μM、840μM、850μM、860μM、870μM、880μM、890μM、900μM、910μM、920μM、930μM、940μM、950μM、960μM、970μM、980μM、990μM、1000μM、1500μM、2000μM、2500μM、若しくは3000μMである、
    請求項13に記載の組成物。
  15. マルチマーが、分岐型、超分岐型、又は樹枝状のPEG又はポリエステルコアを含む、請求項13又は14に記載の組成物。
  16. 生体適合性非アニオン性親水性ポリマーが、投与後(例えば、還元性細胞環境に曝露された時)、合成ペプチドシャトル媒介物の脱繋留を可能にする切断可能な連結を含む、請求項13~15のいずれか一項に記載の組成物。
  17. カーゴが合成ペプチドシャトル媒介物と共有結合により連結されていない、請求項1から16のいずれか一項に記載の組成物。
  18. カーゴが以下である、請求項1から16のいずれか一項に記載の組成物:
    (a)合成ペプチドシャトル媒介物及び/若しくは生体適合性非アニオン性親水性ポリマーと切断可能な結合によって共有結合により連結されており、その結果、カーゴが、投与後(例えば、還元性細胞環境へ曝露された時、及び/又はただし、細胞内に送達される前、それと同時に、若しくはそのすぐ後)、前記結合の切断を通してそれから脱離する;又は
    (b)合成ペプチドシャトル媒介物及び/若しくは生体適合性非アニオン性親水性ポリマーと切断不可能な結合によって共有結合により連結されている。
  19. カーゴが細胞透過性ドメインを欠く、請求項1から18のいずれか一項に記載の組成物。
  20. カーゴが治療用カーゴ及び/若しくは診断用カーゴであり、又はそれを含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の組成物。
  21. カーゴが、ペプチド、組換えタンパク質、核タンパク質、ポリサッカライド、小分子、非アニオン性ポリヌクレオチド類似体(例えば、ホスホロジアミデートバックボーン、アミド(例えば、ペプチド)バックボーン、メチルホスホネートバックボーン、中性ホスホトリエステルバックボーン、スルホンバックボーン、若しくはトリアゾールバックボーンを有する電荷中性ポリヌクレオチド類似体部分;又はアミノアルキル化ホスホラミデートバックボーン、グアニジニウムバックボーン、S-メチルチオウレアバックボーン、若しくはヌクレオシルアミノ酸(NAA)バックボーンを有するカチオン性ポリヌクレオチド類似体部分)、又はそれらの任意の組合せであり、又はそれを含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の組成物。
  22. (a)カーゴが、酵素、抗体若しくは抗体コンジュゲート若しくはその抗原結合断片、転写因子、ホルモン、増殖因子;デオキシリボ核タンパク質(DNP)若しくはリボ核タンパク質(RNP)カーゴである核タンパク質カーゴである組換えタンパク質(例えば、RNAガイド型ヌクレアーゼ、Cas I型、II型、III型、IV型、V型、若しくはVI型ヌクレアーゼ等のCasヌクレアーゼ、又はヌクレアーゼ活性を欠くそのバリアント、塩基エディター、又はプライムエディター、CRISPR関連トランスポサーゼ、又はCas-リコンビナーゼ(例えば、recCas9)、Cpf1-RNP、Cas9-RNP)であり、若しくはそれを含み;又は
    (b)生体適合性非アニオン性親水性ポリマーが、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)、ペプチド核酸(PNA)、メチルホスホネートオリゴマー、又は低分子干渉リボ核酸中性オリゴヌクレオチド(siRNN)であり若しくはそれを含み、かつカーゴが、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーに含まれたアンチセンス合成オリゴヌクレオチド(ASO)である、
    請求項1から21のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記シャトル媒介物コアモチーフが、(例えば、インビトロで、HeLa細胞等の培養細胞において)前記カーゴのサイトゾル/核細胞内形質導入を増加させるのに十分であり、かつSchiffer-Edmundsonヘリカルホイール表現において40°~160°、40°~140°、60°~140°、若しくは60°~120°の正荷電角度を規定するヘリックスの片側に正荷電残基のクラスターを有する別個の正荷電親水性面;及び/又はSchiffer-Edmundsonヘリカルホイール表現において140°~280°、160°~260°、若しくは180°~240°の疎水性角度を規定するヘリックスの反対側に疎水性アミノ酸残基のクラスターを有する別個の疎水性面を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の組成物。
  24. (a)疎水性クラスター内の残基の少なくとも20%、30%、40%、若しくは50%が、疎水性残基(例えば、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、ロイシン、バリン、メチオニン、チロシン、システイン、グリシン、及びアラニンから選択され、又はフェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、及び/若しくはロイシンから選択される疎水性残基)である;
    (b)正荷電クラスター内の残基の少なくとも20%、30%、40%、若しくは50%が、正荷電残基(例えば、リジン及びアルギニンから選択される正荷電残基)である;
    (c)シャトル媒介物コアモチーフが、少なくとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、若しくは5.5の疎水性モーメント(μH)を有する;
    (d)シャトル媒介物コアモチーフが、14個、15個、16個、17個、18個、19個、若しくは20個の残基の最大長を有する;又は
    (e)(a)~(d)の任意の組合せ
    である、請求項23に記載の組成物。
  25. 合成ペプチドシャトル媒介物が、15、16、17、18、19、又は20から150までのアミノ酸長のペプチドであり、以下のパラメータの少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、又は全部の任意の組合せが重んじられる、請求項1から24のいずれか一項に記載の組成物:
    - ペプチドは、水溶液中、可溶性である(例えば、-0.35未満、-0.40未満、-0.45未満、-0.50未満、-0.55未満、又は-0.60未満の疎水性親水性度の総平均(GRAVY)指標を有する);
    - 疎水性面は、ターンあたり3.6残基を有するαヘリックスのオープンシリンドリカル表現に基づいた、ペプチドのアミノ酸の12~50%に相当する、空間的に隣接するL、I、F、V、W、及び/又はMアミノ酸からなる疎水性コアを含む;
    - ペプチドは、3.5~11の疎水性モーメント(μH)を有する;
    - ペプチドは、生理学的pHにおいて+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、又は+15の推定正味電荷を有する;
    - ペプチドは、8~13又は10~13の等電点(pI)を有する;
    - ペプチドは、35%~65%の、アミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、及びVの任意の組合せで構成されている;
    - ペプチドは、0%~30%の、アミノ酸: N、Q、S、及びTの任意の組合せで構成されている;
    - ペプチドは、35%~85%の、アミノ酸: A、L、K、又はRの任意の組合せで構成されている;
    - ペプチドは、ペプチドにおいて少なくとも5%のLがあるという条件で、15%~45%の、アミノ酸:A及びLの任意の組合せで構成されている;
    - ペプチドは、20%~45%の、アミノ酸:K及びRの任意の組合せで構成されている;
    - ペプチドは、0%~10%の、アミノ酸:D及びEの任意の組合せで構成されている;
    - ペプチドにおけるA及びL残基のパーセンテージ(% A+L)と、ペプチドにおけるK及びR残基のパーセンテージ(K+R)との差が、10%以下である;並びに
    - ペプチドは、10%~45%の、アミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、及びHの任意の組合せで、好ましくは、10%未満、9%未満、8%未満、7%未満、6%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、若しくは1%未満の、D及び/又はEで構成されている。
  26. 合成ペプチドシャトル媒介物が、ヒスチジンリッチなドメインを含み、任意で、ヒスチジンリッチなドメインが、(i)シャトル媒介物のN末端方向及び/若しくはC末端方向に位置する;(ii)少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、若しくは少なくとも90%のヒスチジン残基を含む少なくとも3アミノ酸、少なくとも4アミノ酸、少なくとも5アミノ酸、若しくは少なくとも6アミノ酸のストレッチであり;及び/又は連続した少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、若しくは少なくとも9個のヒスチジン残基を含む;又は(iii)(i)と(ii)の両方である、請求項1から25のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記合成ペプチドシャトル媒介物が、セリン及び/又はグリシン残基がリッチな可動性リンカードメイン(例えば、シャトル媒介物のN末端セグメントとC末端セグメントを分離し;又は前記シャトル媒介物コアモチーフのN末端側及び/若しくはC末端側に位置する)を含む、請求項1から26のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記シャトル媒介物が、以下のアミノ酸配列を含み又はそれからなる、請求項1から27のいずれか一項に記載の組成物:
    (a) [X1]-[X2]-[リンカー]-[X3]-[X4](式1);
    (b) [X1]-[X2]-[リンカー]-[X4]-[X3](式2);
    (c) [X2]-[X1]-[リンカー]-[X3]-[X4](式3);
    (d) [X2]-[X1]-[リンカー]-[X4]-[X3](式4);
    (e) [X3]-[X4]-[リンカー]-[X1]-[X2](式5);
    (f) [X3]-[X4]-[リンカー]-[X2]-[X1](式6);
    (g) [X4]-[X3]-[リンカー]-[X1]-[X2](式7);
    (h) [X4]-[X3]-[リンカー]-[X2]-[X1](式8);
    (i) [リンカー]-[X1]-[X2]-[リンカー](式9);
    (j) [リンカー]-[X2]-[X1]-[リンカー](式10);
    (k) [X1]-[X2]-[リンカー](式11);
    (l) [X2]-[X1]-[リンカー](式12);
    (m) [リンカー]-[X1]-[X2](式13);
    (n) [リンカー]-[X2]-[X1](式14);
    (o) [X1]-[X2] (式15);又は
    (p) [X2]-[X1] (式16)
    [式中、
    [X1]は、2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;及び1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-から選択される;
    [X2]は、-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;及び-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-から選択される:
    [X3]は、-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;又は-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;及び-A-1[+]-A-A-Aから選択される:
    [X4]は、-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];及び-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+]から選択される:並びに
    [リンカー]は、-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;及び-(GnSn)nSn(GnSn)n-から選択され;
    [Φ]は、Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr、又はVal、好ましくはLeu、Phe、Trp、又はIleであるアミノ酸である;
    [+]は、Lys又はArgであるアミノ酸である;
    [ζ]は、Gln、Asn、Thr、又はSerであるアミノ酸である;
    Aは、アミノ酸Alaである;
    Gは、アミノ酸Glyである;
    Sは、アミノ酸Serである;及び
    nは、1~20、1~19、1~18、1~17、1~16、1~15、1~14、1~13、1~12、1~11、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~1~4、又は1~3の整数である]。
  29. シャトル媒介物が以下を含み又はそれからなる、請求項1から28のいずれか一項に記載の組成物:
    (i)配列番号1~50、58~78、80~107、109~139、141~146、149~161、163~169、171、174~234、236~240、242~260、262~285、287~294、296~300、302~308、310、311、313~324、326~332、338~342、344、346、348、352、355、356、358~360、362、363、366、369、若しくは370のいずれか1つのアミノ酸配列;
    (ii)配列番号1~50、58~78、80~107、109~139、141~146、149~161、163~169、171、174~234、236~240、242~260、262~285、287~294、296~300、302~308、310、311、313~324、326~332、338~342、344、346、348、352、355、356、358~360、362、363、366、369、若しくは370のいずれか1つと、1アミノ酸以下、2アミノ酸以下、3アミノ酸以下、4アミノ酸以下、5アミノ酸以下、6アミノ酸以下、7アミノ酸以下、8アミノ酸以下、9アミノ酸以下、若しくは10アミノ酸以下だけ、異なるアミノ酸配列(例えば、いかなるリンカードメインも除外する);
    (iii)配列番号1~50、58~78、80~107、109~139、141~146、149~161、163~169、171、174~234、236~240、242~260、262~285、287~294、296~300、302~308、310、311、313~324、326~332、338~342、344、346、348、352、355、356、358~360、362、363、366、369、若しくは370のいずれか1つと少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列(例えば、いかなるリンカードメインも除外して計算される);
    (iv)配列番号1~50、58~78、80~107、109~139、141~146、149~161、163~169、171、174~234、236~240、242~260、262~285、287~294、296~300、302~308、310、311、313~324、326~332、338~342、344、346、348、352、355、356、358~360、362、363、366、369、若しくは370のいずれか1つと、保存的アミノ酸置換によってのみ(例えば、1個以下、2個以下、3個以下、4個以下、5個以下、6個以下、7個以下、8個以下、9個以下、若しくは10個以下の保存的アミノ酸置換だけ、好ましくは、いかなるリンカードメインも除外して)、異なるアミノ酸配列であって、各保存的アミノ酸置換が、同じアミノ酸クラス内のアミノ酸から選択され、そのアミノ酸クラスが、脂肪族: G、A、V、L、及びI;ヒドロキシル若しくはイオウ/セレン含有: S、C、U、T、及びM;芳香族: F、Y、及びW;塩基性: H、K、及びR;酸性及びそれらのアミド: D、E、N、及びQである、アミノ酸配列;又は
    (v)(i)~(iv)の任意の組合せ。
  30. シャトル媒介物が以下を含み又はそれからなる、請求項1から29のいずれか一項に記載の組成物:
    (a)請求項25から29のいずれか一項に規定の親の合成ペプチドシャトル媒介物の断片であって、カーゴ形質導入活性を保持し、かつ前記シャトル媒介物コアモチーフを含む断片;又は
    (b)請求項25から29のいずれか一項に規定の親のシャトル媒介物のバリアントであって、カーゴ形質導入活性を保持し、かつ親のシャトル媒介物と比べてC末端正電荷密度の低下を有する点(例えば、K/R等の1つ又は複数のカチオン性残基を非カチオン性残基、好ましくは非カチオン性親水性残基で置換することにより)で(又はその点のみで)、親のシャトル媒介物と異なる、バリアント。
  31. 断片又はバリアントが親のシャトル媒介物のC末端切り詰めを含み又はそれからなる、請求項30に記載の組成物。
  32. 合成ペプチドシャトル媒介物が、そのバリアントを含み又はそれからなり、バリアントが、置き換えられているアミノ酸と類似した生理化学的性質(例えば、構造、疎水性、又は電荷)の側鎖を有する対応する合成アミノ酸で少なくとも1個のアミノ酸が置き換えられている点を除いて、請求項23から31のいずれか一項に規定の合成ペプチドシャトル媒介物と同一であり、バリアントが、合成ペプチドシャトル媒介物の非存在下と比較して、真核細胞において前記カーゴのサイトゾル/核送達を増加させ、好ましくは、合成アミノ酸置き換えが以下である、請求項1から31のいずれか一項に記載の組成物:
    (a)塩基性アミノ酸をα-アミノグリシン、α,γ-ジアミノ酪酸、オルニチン、α,β-ジアミノプロピオン酸、2,6-ジアミノ-4-ヘキシン酸、β-(1-ピペラジニル)-アラニン、4,5-デヒドロ-リシン、δ-ヒドロキシリシン、ω,ω-ジメチルアルギニン、ホモアルギニン、ω,ω'-ジメチルアルギニン、ω-メチルアルギニン、β-(2-キノリル)-アラニン、4-アミノピペリジン-4-カルボン酸、α-メチルヒスチジン、2,5-ジヨードヒスチジン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジン、スピナシン、4-アミノフェニルアラニン、3-アミノチロシン、β-(2-ピリジル)-アラニン、又はβ-(3-ピリジル)-アラニンのいずれか1つと置き換える;
    (b)非極性(疎水性)アミノ酸をデヒドロ-アラニン、β-フルオロアラニン、β-クロロアラニン、β-ロドアラニン、α-アミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、β-シクロプロピルアラニン、アゼチジン-2-カルボン酸、α-アリルグリシン、プロパルギルグリシン、tert-ブチルアラニン、β-(2-チアゾリル)-アラニン、チアプロリン、3,4-デヒドロプロリン、tert-ブチルグリシン、β-シクロペンチルアラニン、β-シクロヘキシルアラニン、α-メチルプロリン、ノルバリン、α-メチルバリン、ペニシラミン、β,β-ジシクロヘキシルアラニン、4-フルオロプロリン、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、ピペコリン酸、4,5-デヒドロロイシン、allo-イソロイシン、ノルロイシン、α-メチルロイシン、シクロヘキシルグリシン、cis-オクタヒドロインドール-2-カルボン酸、β-(2-チエニル)-アラニン、フェニルグリシン、α-メチルフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、β-(3-ベンゾチエニル)-アラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-ブロモフェニルアラニン、4-tert-ブチルフェニルアラニン、α-メチルトリプトファン、β-(2-ナフチル)-アラニン、β-(1-ナフチル)-アラニン、4-ヨードフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、4-メチルトリプトファン、4-クロロフェニルアラニン、3,4-ジクロロ-フェニルアラニン、2,6-ジフルオロ-フェニルアラニン、n-in-メチルトリプトファン、1,2,3,4-テトラヒドロノルハルマン-3-カルボン酸、β,β-ジフェニルアラニン、4-メチルフェニルアラニン、4-フェニルフェニルアラニン、2,3,4,5,6-ペンタフルオロ-フェニルアラニン、又は4-ベンゾイルフェニルアラニンのいずれか1つと置き換える;
    (c)極性で非荷電アミノ酸をβ-シアノアラニン、β-ウレイドアラニン、ホモシステイン、allo-トレオニン、ピログルタミン酸、2-オキソチアゾリジン-4-カルボン酸、シトルリン、チオシトルリン、ホモシトルリン、ヒドロキシプロリン、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、β-(1,2,4-トリアゾール-1-イル)-アラニン、2-メルカプトヒスチジン、β-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-セリン、β-(2-チエニル)-セリン、4-アジドフェニルアラニン、4-シアノフェニルアラニン、3-ヒドロキシメチルチロシン、3-ヨードチロシン、3-ニトロチロシン、3,5-ジニトロチロシン、3,5-ジブロモチロシン、3,5-ジヨードチロシン、7-ヒドロキシ-1,2,3,4-テトラヒドロイソ-キノリン-3-カルボン酸、5-ヒドロキシトリプトファン、チロニン、β-(7-メトキシクマリン-4-イル)-アラニン、又は4-(7-ヒドロキシ-4-クマリニル)-アミノ酪酸のいずれか1つと置き換える;及び/又は
    (d)酸性アミノ酸をγ-ヒドロキシグルタミン酸、γ-メチレングルタミン酸、γ-カルボキシグルタミン酸、α-アミノアジピン酸、2-アミノヘプタン二酸、α-アミノスベリン酸、4-カルボキシフェニルアラニン、システイン酸、4-ホスホノフェニルアラニン、又は4-スルホメチルフェニルアラニンのいずれか1つと置き換える。
  33. 合成ペプチドシャトル媒介物が、細胞透過性ドメイン(CPD)、細胞透過性ペプチド(CPP)、若しくはタンパク質形質導入ドメイン(PTD)を含まず、又はエンドソーム漏出ドメイン(ELD)と融合したCPDを含まない、請求項1から32のいずれか一項に記載の組成物。
  34. シャトル媒介物が、エンドソーム漏出ドメイン(ELD)及び/又は細胞透過性ドメイン(CPD)を含む、請求項1から33のいずれか一項に記載の組成物。
  35. (i)前記ELDが、以下であり若しくはそれに由来する:エンドソーム溶解性ペプチド;抗菌性ペプチド(AMP);直鎖状カチオン性αヘリックス抗菌性ペプチド;セクロピン-A/メリチンハイブリッド(CM)ペプチド;pH依存性膜活性ペプチド(PAMP);ペプチド両親媒性物質;インフルエンザヘマグルチニン(HA)のHA2サブユニットのN末端に由来したペプチド;CM18;ジフテリア毒素Tドメイン(DT);GALA;PEA;INF-7;LAH4;HGP;H5WYG;HA2;EB1;VSVG;シュードモナス毒素;メリチン;KALA;JST-1;C(LLKK)3C;G(LLKK)3G;若しくはそれらの任意の組合せ;
    (ii)前記CPDが、以下であり若しくはそれに由来する:細胞透過性ペプチド若しくは細胞透過性ペプチド由来のタンパク質形質導入ドメイン;TAT;PTD4;ペネトラチン;pVEC;M918;Pep-1;Pep-2; Xentry;アルギニンストレッチ;トランスポータン;SynB1;SynB3;若しくはそれらの任意の組合せ;又は
    (iii)(i)と(ii)の両方
    である、請求項34に記載の組成物。
  36. シャトル媒介物が、環状ペプチドであり、及び/又は1個若しくは複数のD-アミノ酸を含む、請求項1から35のいずれか一項に記載の組成物。
  37. インビボ投与における使用のための、又はインビボ投与のための組成物の製造のための、請求項1から36のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 静脈内若しくは他の非経口(例えば、髄腔内)投与における使用のための、又は鼻腔内投与における使用のための、又は静脈内若しくは他の非経口(例えば、髄腔内)投与のための医薬(例えば、注射用医薬)若しくは鼻腔内投与のための医薬の製造のための、請求項1から36のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 体液及び/若しくは分泌物(例えば、気道を裏打ちするもの等の粘膜)と接触する又はそれと近位の標的器官若しくは組織(例えば、肝臓、膵臓、脾臓、心臓、脳、肺、膀胱、及び/又は腎臓)への投与における使用のための、請求項1から36のいずれか一項に記載の組成物。
  40. カーゴが治療用カーゴ(例えば、細胞内治療標的と結合し、又はそれへ送達されることになっている)である、治療における使用のための、又は対象においてカーゴのサイトゾル/核及び/若しくは細胞内送達により軽快する疾患若しくは障害を処置するための医薬の製造のための、請求項1から36のいずれか一項に記載の組成物。
  41. (a)生体適合性非アニオン性ポリマーを供給する工程;
    (b)合成ペプチドシャトル媒介物を供給する工程;
    (c)生体適合性非アニオン性ポリマーを合成ペプチドシャトル媒介物と共有結合によりコンジュゲートし、それにより、バイオコンジュゲートを生成する工程;及び
    (d)前記バイオコンジュゲートを、細胞内生物学的標的と結合し又はそれへ送達されることになっている膜不透過性カーゴと共に製剤化する工程
    を含む、薬学的組成物の製造のための方法。
  42. 合成ペプチドシャトル媒介物が、別個の正荷電親水性面及び別個の疎水性面を含む溶媒曝露表面を有する少なくとも12アミノ酸長のコア両親媒性αヘリックスモチーフ(シャトル媒介物コアモチーフ)を含む、請求項41に記載の方法。
  43. 生体適合性非アニオン性ポリマーが、合成ペプチドシャトル媒介物と、前記シャトル媒介物コアモチーフに対してN末端側及び/又はC末端側で(例えば、シャトル媒介物のN末端又はC末端で)コンジュゲートされる、請求項41又は42に記載の方法。
  44. 生体適合性非アニオン性ポリマーが請求項3から12のいずれか一項に規定の通りであり、バイオコンジュゲートが請求項13から16のいずれか一項に規定の通りであり、カーゴが請求項17から22のいずれか一項に規定の通りであり、シャトル媒介物コアモチーフが請求項23又は24に規定の通りであり、合成ペプチドシャトル媒介物が請求項25から36のいずれか一項に規定の通りであり、又はそれらの任意の組合せである、請求項41に記載の方法。
  45. 薬学的組成物が、請求項37から40のいずれか一項に規定の使用に適しており、又はそのために製剤化される、請求項41から44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 治療用又は診断用カーゴを対象へ(例えば、対象の肝臓、膵臓、脾臓、心臓、脳、肺、膀胱、及び/又は腎臓へ)送達するための方法であって、細胞内生物学的標的と結合し又はそれへ送達されることになっている膜不透過性カーゴ及び請求項1から16又は23から36のいずれか一項に規定のバイオコンジュゲートを、それを必要とする対象へ逐次的に又は同時に(例えば、非経口的に又は鼻腔内に)共投与する工程を含む方法。
  47. カーゴが請求項17から22のいずれか一項に規定の通りである、請求項46に記載の方法。
  48. 共投与が、請求項1から36にいずれか一項に記載の組成物を対象へ投与することにより、同時に実施される、請求項46又は47に記載の方法。
  49. 請求項1から36のいずれか一項に規定のバイオコンジュゲート。
  50. 合成ペプチドシャトル媒介物が、細胞内送達のためのカーゴと切断不可能な結合によってコンジュゲートされ、又は合成ペプチドシャトル媒介物が、細胞内送達のためのカーゴと切断可能な結合によってコンジュゲートされ、好ましくは、その結果、カーゴが前記結合の切断を通してそれから脱離し、それにより、カーゴがサイトゾル/核へ送達されるのを可能にする、請求項49に記載のバイオコンジュゲート。
  51. 合成ペプチドシャトル媒介物が、別個の正荷電親水性面及び別個の疎水性面を含む溶媒曝露表面を有する少なくとも12アミノ酸長のコア両親媒性αヘリックスモチーフ(シャトル媒介物コアモチーフ)を含み、カーゴが、合成ペプチドシャトル媒介物と、前記シャトル媒介物コアモチーフに対してN末端側及び/又はC末端側でコンジュゲートされ、好ましくは、その結果、カーゴが前記結合の切断又はシャトル媒介物の分解を通してそれから脱離し、それにより、カーゴがサイトゾル/核へ送達されるのを可能にする、請求項50に記載のバイオコンジュゲート。
  52. シャトル媒介物が、カーゴと、生体適合性非アニオン性親水性ポリマーを介してコンジュゲートされている、請求項49から51のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
  53. シャトル媒介物が、請求項17から22のいずれか一項に規定のカーゴとコンジュゲートされている;シャトル媒介物が請求項23から36のいずれか一項に規定の通りである;又はそれらの任意の組合せである、請求項49から52のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
  54. 標的真核細胞のサイトゾル/核へのカーゴ形質導入における使用のための、又は標的真核細胞のサイトゾル/核へのカーゴ形質導入における使用のための医薬の製造のための、請求項49から53のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲート。
  55. 検出可能な標識(例えば、フルオロフォア)とコンジュゲートされたD-レトロ-インベルソ核移行シグナルペプチドを含むカーゴ。
  56. 細胞内送達における使用のための、請求項55に記載のカーゴ。
  57. 細胞内生物学的標的と結合し又はそれへ送達されることになっている膜不透過性カーゴと、切断可能な又は切断不可能な様式で共有結合によりコンジュゲートされた合成ペプチドシャトル媒介物を含む組成物。
  58. (a)シャトル媒介物が請求項1若しくは23から36のいずれか一項に規定の通りである;
    (b)膜不透過性カーゴが、請求項19から22のいずれか一項に規定の通りである;
    (c)シャトル媒介物が、請求項18に規定の様式でカーゴとコンジュゲートされている;
    (d)シャトル媒介物が、少なくとも40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM、200μM、210μM、220μM、230μM、240μM、250μM、260μM、270μM、280μM、290μM、300μM、310μM、320μM、330μM、340μM、350μM、360μM、370μM、380μM、390μM、400μM、410μM、420μM、430μM、440μM、450μM、460μM、470μM、480μM、490μM、500μM、510μM、520μM、530μM、540μM、550μM、560μM、570μM、580μM、590μM、600μM、610μM、620μM、630μM、640μM、650μM、660μM、670μM、680μM、690μM、700μM、710μM、720μM、730μM、740μM、750μM、760μM、770μM、780μM、790μM、800μM、810μM、820μM、830μM、840μM、850μM、860μM、870μM、880μM、890μM、900μM、910μM、920μM、930μM、940μM、950μM、960μM、970μM、980μM、990μM、若しくは1000μMnの濃度である;
    (e)組成物が、請求項37から40のいずれか一項に規定の使用のためである;又は
    (f)(a)~(e)の任意の組合せである、
    請求項57に記載の組成物。
  59. カーゴが、肺又は呼吸器の疾患又は障害(例えば、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、又は肺がん)を処置又は防止するための治療用カーゴである、鼻腔内投与のために製剤化された、請求項1から40、57、又は58のいずれか一項に記載の組成物。
  60. 粘液溶解剤、抗炎症剤(例えば、ステロイド)、気管支拡張剤(例えば、アルブテロール)、抗生物質(例えば、アミノグリコシド)、又はそれらの任意の組合せを更に含む、請求項59に記載の組成物。
  61. 噴霧器又は吸入器(例えば、定量噴霧式吸入器又はドライパウダー吸入器)中等に、吸入のために製剤化された、請求項59又は60に記載の組成物。
  62. 請求項1から40若しくは50から61のいずれか一項に記載の組成物又は請求項49から56のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートの、膜不透過性カーゴを細胞内生物学的標的へ送達する静脈内投与のための使用。
  63. 請求項1から40若しくは50から61のいずれか一項に記載の組成物又は請求項49から56のいずれか一項に記載のバイオコンジュゲートの、膜不透過性カーゴを肺における細胞内生物学的標的へ送達する鼻腔内投与のための使用。
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