JP2024510757A - 炎症細胞または活性化細胞を標的とし、炎症性の状態および疼痛を処置するかまたは改善するための組成物および方法 - Google Patents

炎症細胞または活性化細胞を標的とし、炎症性の状態および疼痛を処置するかまたは改善するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

神経障害性疼痛、ＣＮＳ炎症、異痛症、神経損傷後疼痛、術後疼痛、化学療法誘発性末梢神経障害、例えばアルツハイマー病などの神経変性疾患または状態をはじめとする神経変性、痛覚過敏、片頭痛および群発性頭痛などの原発性頭痛、緑内障またはその他の目の炎症性疾患、肺炎症、喘息、ＨＩＶ感染症、血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患を処置するための、アミノ酸配列を修飾し、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質の発現レベルを増加させるための方法が提供される。

Description

関連出願
この特許条約（ＰＣＴ）国際出願は、２０２１年３月１８日に出願された米国仮特許出願第（ＵＳＳＮ）６３／１６２，７１４号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権の利益を主張する。前述の出願は、その全体があらゆる目的において参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本明細書において引用される全ての刊行物、特許、特許出願は、あらゆる目的において参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与された助成金ＮＳ１０２４３２、ＮＳ１０４７６９、ＨＬ１３５７３７、ＡＩ１４７８７９およびＨＬ１３６２７５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
技術分野
本発明は、一般に、医学、炎症、疼痛管理および細胞生物学に関する。特に、代替実施形態では、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ、また、ＮＡＤ（Ｐ）ＨＸエピメラーゼまたはＮＡＸＥとしても公知）の構造を改変し、発現レベルを増加させて、神経障害性疼痛、ＣＮＳ炎症、異痛症、神経損傷後疼痛、術後疼痛、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性異痛症）、例えばアルツハイマー病などの神経変性疾患または状態をはじめとする神経変性、痛覚過敏、片頭痛および群発性頭痛などの原発性頭痛、緑内障、肺炎症および喘息、ＨＩＶ感染症およびその併存疾患、および／または血管炎症および心血管疾患を処置し、改善し、防止し、逆転させ、その重症度および／または持続期間を減少させるための方法が提供される。代替実施形態では、構造の改変および、ヒトもしくは哺乳動物のＡＰＯＡ１ＢＰである、組換えによって改変されたＡＰＯＡ１ＢＰポリペプチドまたはタンパク質、またはペプチド模倣体もしくは合成ＡＰＯＡ１ＢＰ、またはその生物学的等価体を含む製剤および医薬組成物の投与を含む、神経障害性疼痛、異痛症、痛覚過敏、アルツハイマー病などの神経変性疾患または状態、片頭痛などの原発性頭痛、緑内障またはその他の目の炎症性疾患、肺炎症および喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症、インフルエンザ、コロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）またはＨＩＶ感染症をはじめとするウイルス感染症、またはその併存疾患、および／または血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患を処置し、改善し、防止し、逆転させ、その重症度および／または持続期間を減少させるための方法が提供される。
背景
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ結合タンパク質またはＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＩＢＰ）は、ＮＡＸＥ、ＮＡＤ（Ｐ）ＨＸエピメラーゼとも呼ばれ、アポＡ－Ｉと物理的に会合するタンパク質のスクリーニングにおいて発見されたタンパク質である。
神経変性、特にアルツハイマー病（ＡＤ）との関連でのコレステロール代謝の調節は、ＡＰＯＥ遺伝子多型とＡＤリスクとの強い関連もあって十分な注目を集めた。しかしながら、慢性疼痛状態の発症における因子としてのコレステロール調節の役割は未知のままである。化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）は、がんの処置中の抗悪性腫瘍薬使用の衰弱性の有害作用の１つであり、化学療法を受けている患者の５０％超が発症する（Ｓｅｒｅｔｎｙら、２０１４）。脊髄および後根神経節におけるグリア細胞の活性化および浸潤免疫細胞によって媒介される神経炎症は、ＣＩＰＮおよび他の神経障害の重要な構成要素である（Ｌｅｅｓら、２０１７；Ｍａｋｋｅｒら、２０１７）。グリア細胞は、炎症性サイトカイン、ケモカインおよび生物活性脂質の分泌を媒介するトール様受容体４（ＴＬＲ４）を発現する（Ｂｒｕｎｏら、２０１８；Ｇｒｅｇｕｓら、２０１８；Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕら、２０１６）。さらに、ＴＬＲ４シグナル伝達のＣＩＰＮ関連活性化が後根神経節侵害受容器において報告されている（Ｃｈｅｎら、２０１７；Ｌｉら、２０２１）。ＴＬＲ４またはそのシグナル伝達アダプター分子であるＭｙＤ８８およびＴＲＩＦの全身性欠損は、単独でまたは組み合わせて、シスプラチンで
処置されたマウスの痛覚過敏および異痛症を減弱させ、防止する（Ｈｕら、２０１８；Ｐｅｖｉｄａら、２０１３；Ｙａｎら、２０１９）。しかしながら、ＴＬＲ４活性化が異痛症を引き起こす細胞の型は不明である。
概要
代替実施形態では、単離または組換えポリペプチド、またはキメラポリペプチドが提供され、ポリペプチドは、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＩＢＰ）アミノ酸配列およびＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列で構成され（またはこれらを含み）、
ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は少なくとも８個のアミノ酸で構成されるか、または、ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ １３、１４、１５、もしくは１６またはそれを超えるアミノ酸長であり、
ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、関連する生理学的条件下で、ポリペプチドをＴＬＲ４に結合させるために、ＡＩＢＰアミノ酸配列中の潜在的なドメインのアンフォールディングを誘導するか、潜在的なドメインを露出させるか、そうでなければアクセス可能にすることができ、
必要に応じて「関連する生理学的条件」とは、ポリペプチド化合物を必要とする対象に投与によってそれを提供する際に、インビボでポリペプチド化合物が経験する関連する生理学的条件を指し、
ただし、ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、Ｈｉｓタグと、前記条件下で作用させるとＨｉｓタグの消失をもたらすタンパク質切断部位とで構成されていないことを条件とする。
本明細書で提供される単離または組換えポリペプチド、またはキメラポリペプチドの代替実施形態では、
－ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、約８～約４０個の連続したアミノ酸残基（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個またはそれを超える連続したアミノ酸残基）で構成され、そのうちの約３～約１２個の間、または約８～約２０個の間、または約１０～約４０個の間のアミノ酸残基は、独立に、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）からなる群から選択され；
－ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列のＮ末端は、分泌シグナルアミノ酸配列であるかまたはこれを含み、必要に応じて分泌シグナルアミノ酸配列は、フィブロネクチン分泌シグナルドメイン、免疫グロブリン重鎖分泌シグナルドメイン、免疫グロブリンκ軽鎖分泌シグナルドメイン、またはインターロイキン－２シグナルペプチド分泌シグナルドメインであり（またはこれらを含み）、必要に応じてフィブロネクチン分泌シグナルドメインは、ＭＬＲＧＰＧＰＧＲＬＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＳＶＲＣＴＥＴＧＫＳＫＲ（配列番号：２４）であり：
－ＡＩＢＰ配列は、ｈＡＩＢＰ（配列番号６、または配列番号５にコードされる）またはｄ２４ｈＡＩＢＰ（配列番号２１、配列番号２０にコードされる）であり；
－ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、ＡＩＢＰアミノ酸配列のＴＬＲ４結合ドメインのＮ末端側の約６個の、または約５～４０個の間の、連続したヒスチジンアミノ酸残基（例えば、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１））で構成され；
－ポリペプチドは、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質配列のＴＬＲ４結合ドメインのＮ末端間に介在するトロンビン切断ドメインを有し（または含み）、トロンビン切断ドメインは、機能的に動作不能にするように、このドメイン内に１またはそれを超えるアミノ酸欠失および／または変異を有し；
－ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、
ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号２）またはＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＤＧＤＤＧＤＤＤＲ（配列番号１９）であり、それぞれ、機能的に動作不能にするように、そのトロンビン切断ドメインのアミノ酸変異を有し；
－ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、ＴＥＴＧＫＳＫＲ（配列番号２６）、
ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＬＡＡＡＮＳ（配列番号３３）、または
ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＡＡＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号７）からなる群から選択され；
－ＡＩＢＰアミノ酸配列は、哺乳動物ＡＩＢＰアミノ酸配列のものであり（またはこれに由来し）、必要に応じて哺乳動物ＡＩＢＰアミノ酸配列は、ヒトＡＩＢＰアミノ酸配列のものであり（またはこれに由来し）；かつ／あるいは
－ヒトＡＩＢＰアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿６５８９８５．２を有する２８８アミノ酸残基の全長アミノ酸配列、または必要に応じてヒトＡＩＢＰアミノ酸配列は、前記ＡＩＢＰアミノ酸配列からアミノ酸１～２４が欠失している、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿６５８９８５．２を有するヒトＡＩＢＰアミノ酸配列である（またはこれを含む）。
代替実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチド化合物と、非経口投与に適した（非経口投与用に製剤された）少なくとも１つの賦形剤で構成される（またはこれらを含む）医薬組成物または製剤が提供される。代替実施形態では、非経口投与は、髄腔内注射もしくは髄腔内インプラントによるか、または静脈内もしくは眼内（ｉｎｔｒａｃｕｌａｒ）注射による。
代替実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドをコードする核酸配列で構成される（またはこれを含む）核酸が提供される。
代替実施形態では、本明細書で提供されるポリペプチドをコードする核酸配列で構成される（または含む、または有する）発現ベクターが提供される。発現ベクターは、組換えアデノウイルスまたは組換えレンチウイルスなどの組換えウイルスであり得る。
代替実施形態では、以下の症状を処置する、改善する、防止する、逆転する、または以下の症状の重症度もしくは持続期間を減少させるため、または以下の症状の重症度を減少させるための方法および使用が提供される：
－神経障害性疼痛、
－炎症誘発性神経障害性疼痛、
必要に応じて、炎症誘発性神経障害性疼痛は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）媒介性炎症誘発性神経障害性疼痛を含む、
－神経またはＣＮＳの炎症、
必要に応じて、神経またはＣＮＳの炎症は、ＴＬＲ４媒介性神経またはＣＮＳの炎症を含む、
－異痛症、
必要に応じて、異痛症は、ＴＬＲ４媒介性異痛症を含む、
－神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛、
必要に応じて、神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛は、外傷、化学療法、関節炎、糖尿病、またはウイルス感染によって生じるかまたは引き起こされるか、あるいはそれらの後遺症である、
－術後疼痛または神経障害性疼痛、
－化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性ＣＩＰＮまたは異痛症）、
－神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患または状態、必要に応じてアルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、
－原発性頭痛、必要に応じて片頭痛または群発性頭痛、
－痛覚過敏、
－緑内障またはその他の眼の炎症性疾患、
－肺炎症および喘息、
－急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、
－敗血症、
－ウイルス感染症、必要に応じてウイルスは、インフルエンザもしくはコロナウイルス（必要に応じて、コロナウイルスはＣＯＶＩＤ－１９である）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＨＩＶ感染症を引き起こすウイルス、（必要に応じて、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）、または肝炎ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅまたは麻疹ウイルス、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓまたはムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓまたは風疹ウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ウイルス性髄膜炎、ライノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスまたは水痘ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたは痘瘡もしくは天然痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ハンタウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅまたはデングウイルス、ジカウイルス、またはチクングニアウイルス感染症、またはその併存疾患、ならびに／あるいは
－血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、
（対象において、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）を添加することによるか、または、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質のレベルを増加させることによる）、
ここで、該方法は、以下を含む：
（ａ）以下を含む製剤または医薬組成物を提供するステップであって：
（ｉ）少なくとも約１０個のアミノ酸、または約５～２０個の間のアミノ酸、または約１０～１００個の間のアミノ酸、または約２０～８０個の間のアミノ酸、または約３０～５０個の間のアミノ酸の異種（または非ネイティブ、または非ＡＩＢＰまたは非野生型（ｗｔ）、または野生型（ｗｔ）ＡＩＢＰに存在しない任意の配列）アミノ末端アミノ酸配列を有するか、あるいは、ｗｔ ＡＩＢＰに存在しないかまたは（ＡＩＢＰに対して）非ネイティブであるアミノ酸残基もしくはペプチドである（本明細書で提供されるようにＡＩＢＰバリアントとも呼ばれる）、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個またはそれを超えるアミノ酸残基をＡＩＢＰアミノ末端に有する、組換えもしくは合成ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチド化合物または組成物であって、
必要に応じて、ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、Ｈｉｓタグおよび、生理学的条件下（例えば、細胞環境もしくは同等物において、または細胞内部）で作用させるとＨｉｓタグの消失をもたらすタンパク質切断部位で構成されないことを条件とし、
必要に応じて、異種（または非野生型、または非天然）アミノ末端アミノ酸配列（またはアミノ酸残基）はペプチドタグを含み、必要に応じて、ペプチドタグはマルチヒスチジン（ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓ）タグを含み、必要に応じて、ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓタグは６個のヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１））、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個またはそれを超えるヒスチジン残基を含み、
必要に応じて、異種（または非野生型）アミノ末端アミノ酸配列は、酵素切断部位を含み、必要に応じて、酵素切断部位はトロンビン切断部位を含み、
必要に応じて、異種（または非野生型）アミノ末端アミノ酸配列は分泌シグナルを含み、必要に応じて、分泌シグナルは、フィブロネクチン分泌シグナル（例えば、配列番号２４）、免疫グロブリン重鎖分泌シグナルまたは免疫グロブリンκ軽鎖分泌ペプチド、またはインターロイキン－２シグナルペプチドを含み、
必要に応じて、異種（または非野生型）アミノ末端アミノ酸配列は、アミノ酸配列ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号２）を含み、
ここで、本明細書で提供されるこれらのＡＩＢＰバリアント（または、ｗｔ ＡＩＰＢに存在しないアミノ末端配列も含むか、または異種アミノ末端ペプチドもしくはアミノ酸残基を含む、すべてのＡＩＢＰアミノ酸）はすべて、生理学的条件で、ＡＩＢＰとトール様受容体４（ＴＬＲ４）ポリペプチドとの結合を媒介するアミノ酸２５～５１を含むＡＩＢＰ分子内の潜在的なドメインをアンフォールディングさせるか、露出させるか、またはアクセス可能にすることを可能にするか、またはその目的を果たすことができる（言い換えれば、本明細書で提供されるＡＩＢＰバリアントは、本明細書で提供されるＡＩＢＰバリアントが生理学的条件下でＴＬＲ４ポリペプチドに結合できるように、細胞外環境に曝露されたＴＬＲ４結合ドメインを有する）、組換えもしくは合成ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチド化合物または組成物と；
（ｉｉ）（ｉ）のＡＰＯＡ１ＢＰポリペプチドをコードする組換え核酸であって、
必要に応じて、ＡＰＯＡ１ＢＰポリペプチドまたはＡＰＯＡ１ＢＰポリペプチド活性を有するポリペプチドを発現するかまたはコードする核酸は、発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または等価物に含められており、
必要に応じて、ベクターまたはウイルスは、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルス、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、または合成ベクターであるかまたはこれらを含み、
必要に応じて、ＡＡＶベクターは、以下を含むかまたは以下である：
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはアデノウイルスベクター、
ＡＡＶ血清型またはバリアントＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪまたはＡＡＶ－ＤＪ／８（商標）（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、
アカゲザル由来ＡＡＶ、またはアカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
臓器指向性ＡＡＶ、または心臓指向性ＡＡＶ、または心臓指向性ＡＡＶＭ４１変異体、
ここで、必要に応じて、ＡＡＶは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶに対して非許容性である特定の細胞型を標的とする効率を高め、かつ／または目的の細胞型のみに感染する効率を改善するように操作されており、
必要に応じて、ハイブリッドＡＡＶは、１）トランスカプシド化、２）二重特異性抗体のカプシド表面への吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作：を含む、１またはそれを超える改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される、組換え核酸と；
（ｉｉｉ）（ｉ）の組換えもしくは合成ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチドまたはタンパク質、または（ｉｉ）の組換え核酸を含む製剤または医薬組成物であって、必要に応じて、組換えもしくは合成ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチドまたはタンパク質は、ヒトまたは哺乳動物のＡＰＯＡ１ＢＰ、またはＡＩＢＰ１またはＡＩＢＰ２配列の全部または一部であるかまたはこれらを含む、製剤または医薬組成物と；
（ｉｖ）インビボ投与のために製剤化された（ｉｉｉ）の製剤または医薬組成物；または経腸もしくは非経口投与のために、または経口、静脈内（ＩＶ）または髄腔内（ＩＴ）投与のために製剤化された（ｉｉｉ）の製剤または医薬組成物であって、
必要に応じて、製剤もしくは医薬組成物、または組換え体、ペプチド模倣体もしくは合成ＡＰＯＡ１ＢＰ、またはＡＰＯＡ１ＢＰの生物学的等価体、またはＡＰＯＡ１ＢＰをコードする核酸、またはＡＰＯＡ１ＢＰをコードする核酸を含有するベクターは、ナノ粒子、粒子、ミセル、またはリポソームもしくはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、またはデンドリマーに担持され、必要に応じて、細胞もしくはＣＮＳ透過性部分もしくはペプチドまたはＣＮＳ標的化部分もしくはペプチドをさらに含むかまたは発現することができる、製剤化された（ｉｉｉ）の製剤または医薬組成物と；
（ｖ）ナノ粒子、リポソーム、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル剤、ゲルタブ剤、液剤、粉剤・散剤（powder）、乳剤、ローション剤、エアロゾル剤、スプレー剤、ロゼンジ剤、水性もしくは滅菌もしくは注射用液剤、またはインプラント（例えば、髄腔内インプラント）として製剤化された（ｉｉｉ）～（ｉｖ）のいずれかの製剤または医薬組成物を含む、製剤または医薬組成物を提供するステップと；
（ｂ）（ａ）（ｉ）の組換えもしくは合成のＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチドまたはタンパク質、または（ａ）（ｉｉ）の組換え核酸、または（ａ）（ｉｉｉ）もしくは（ａ）（ｉｖ）の製剤もしくは医薬組成物を、それを必要とする対象または個体に投与することであって、ここで、必要に応じて、対象または個体は、哺乳動物、ヒトまたは動物であり、
それにより、以下の症状を処置する、改善する、防止する、逆転するまたは以下の症状の重症度もしくは持続期間を減少させる、または以下の症状の重症度を減少させること：
－神経障害性疼痛、
－炎症誘発性神経障害性疼痛、
必要に応じて、炎症誘発性神経障害性疼痛は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）媒介性炎症誘発性神経障害性疼痛を含む、
－神経またはＣＮＳの炎症、
必要に応じて、神経またはＣＮＳの炎症は、ＴＬＲ４媒介性神経またはＣＮＳの炎症を含む、
－異痛症、
必要に応じて、異痛症は、ＴＬＲ４媒介性異痛症を含む、
－神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛、
必要に応じて、神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛は、外傷、化学療法、関節炎、糖尿病、またはウイルス感染によって生じるかまたは引き起こされるか、あるいはそれらの後遺症である、
－術後疼痛または神経障害性疼痛、
－化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性ＣＩＰＮまたは異痛症）、
－神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患または状態、必要に応じてアルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、
－原発性頭痛、必要に応じて片頭痛または群発性頭痛、
－痛覚過敏、
－緑内障またはその他の眼の炎症性疾患、
－肺炎症および喘息、
－急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、
－敗血症、
－ウイルス感染症、必要に応じてウイルスは、インフルエンザもしくはコロナウイルス（必要に応じて、コロナウイルスはＣＯＶＩＤ－１９である）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＨＩＶ感染症を引き起こすウイルス、（必要に応じて、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）、または肝炎ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅまたは麻疹ウイルス、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓまたはムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓまたは風疹ウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ウイルス性髄膜炎、ライノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスまたは水痘ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたは痘瘡もしくは天然痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ハンタウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅまたはデングウイルス、ジカウイルス、またはチクングニアウイルス感染症、ならびに／あるいは
－血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患。
代替実施形態では、組換えもしくは合成のＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチドまたはタンパク質；組換え核酸；および／または本明細書で提供される方法で使用される製剤または医薬組成物を含み、必要に応じて、本明細書で提供される方法を実施する際の指示を含むキットが提供される。
代替実施形態では、医薬の製造における、本明細書で提供される製剤または医薬組成物の使用が提供される。
代替実施形態では、以下の症状を処置する、改善する、防止する、逆転するまたは以下の症状の重症度もしくは持続期間を減少させるため、または以下の症状の重症度を減少させるための医薬の製造における、本明細書で提供される製剤または医薬組成物の使用が提供される：
－神経障害性疼痛、
－炎症誘発性神経障害性疼痛、
必要に応じて、炎症誘発性神経障害性疼痛は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）媒介性炎症誘発性神経障害性疼痛を含む、
－神経またはＣＮＳの炎症、
必要に応じて、神経またはＣＮＳの炎症は、ＴＬＲ４媒介性神経またはＣＮＳの炎症を含む、
－異痛症、
必要に応じて、異痛症は、ＴＬＲ４媒介性異痛症を含む、
－神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛、
必要に応じて、神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛は、外傷、化学療法、関節炎、糖尿病、またはウイルス感染によって生じるかまたは引き起こされるか、あるいはそれらの後遺症である、
－術後疼痛または神経障害性疼痛、
－化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性ＣＩＰＮまたは異痛症）、
－神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患または状態、必要に応じてアルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、
－原発性頭痛、必要に応じて片頭痛または群発性頭痛、
－痛覚過敏、
－緑内障またはその他の眼の炎症性疾患、
－肺炎症および喘息、
－急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、
－敗血症、
－ウイルス感染症、必要に応じてウイルスは、インフルエンザもしくはコロナウイルス（必要に応じて、コロナウイルスはＣＯＶＩＤ－１９である）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＨＩＶ感染症を引き起こすウイルス、（必要に応じて、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）、または肝炎ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅまたは麻疹ウイルス、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓまたはムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓまたは風疹ウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ウイルス性髄膜炎、ライノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスまたは水痘ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたは痘瘡もしくは天然痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ハンタウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅまたはデングウイルス、ジカウイルス、またはチクングニアウイルス感染症、またはその併存疾患、ならびに／あるいは
－血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患。
代替実施形態では、以下の症状を処置する、改善する、防止する、逆転するまたは以下の症状の重症度もしくは持続期間を減少させるため、または以下の症状の重症度を減少させるための方法に使用するための製剤、医薬組成物または治療的組合せが提供される：
－神経障害性疼痛、
－炎症誘発性神経障害性疼痛、
必要に応じて、炎症誘発性神経障害性疼痛は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）媒介性炎症誘発性神経障害性疼痛を含む、
－神経またはＣＮＳの炎症、
必要に応じて、神経またはＣＮＳの炎症は、ＴＬＲ４媒介性神経またはＣＮＳの炎症を含む、
－異痛症、
必要に応じて、異痛症は、ＴＬＲ４媒介性異痛症を含む、
－神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛、
必要に応じて、神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛は、外傷、化学療法、関節炎、糖尿病、またはウイルス感染によって生じるかまたは引き起こされるか、あるいはそれらの後遺症である、
－術後疼痛または神経障害性疼痛、
－化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性ＣＩＰＮまたは異痛症）、
－神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患または状態、必要に応じてアルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、
－原発性頭痛、必要に応じて片頭痛または群発性頭痛、
－痛覚過敏、
－緑内障またはその他の眼の炎症性疾患、
－肺炎症および喘息、
－急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、
－敗血症、
－ウイルス感染症、必要に応じてウイルスは、インフルエンザもしくはコロナウイルス（必要に応じて、コロナウイルスはＣＯＶＩＤ－１９である）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＨＩＶ感染症を引き起こすウイルス、（必要に応じて、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）、または肝炎ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅまたは麻疹ウイルス、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓまたはムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓまたは風疹ウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ウイルス性髄膜炎、ライノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスまたは水痘ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたは痘瘡もしくは天然痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ハンタウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅまたはデングウイルス、ジカウイルス、またはチクングニアウイルス感染症、またはその併存疾患、ならびに／あるいは
－血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、
前記製剤または前記治療的組合せは、本明細書で提供される製剤または治療的組合せを含み、
前記製剤または治療的組合せは、それを必要とする個体または患者に投与される。
代替実施形態では、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチドの潜在的な（または隠れた、露出していない、アクセス不可能な）Ｎ末端ＴＬＲ４結合ドメインを露出させるための方法であって、ネイティブ（または野生型）ＡＩＢＰポリペプチドに、少なくとも約１０アミノ酸、または約５～５０個の間のアミノ酸、または約１０～１００個の間のアミノ酸、または約２０～８０個の間のアミノ酸、または約３０～５０個の間のアミノ酸の異種（または非ネイティブもしくは非野生型）アミノ末端アミノ酸配列を付加すること、あるいは、ｗｔ ＡＩＢＰに存在しないかまたは非ネイティブ（非ＡＩＢＰ）であるアミノ酸残基もしくはペプチドである５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個またはそれを超えるアミノ酸残基をＡＩＢＰアミノ末端に付加することを含み、
必要に応じて、異種アミノ末端アミノ酸配列は、ペプチドタグを含み、必要に応じて、ペプチドタグは、マルチヒスチジン（ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓ）タグを含み、必要に応じて、ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓタグは、少なくとも６個のヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１））、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個またはそれを超えるヒスチジン残基を含み、
必要に応じて、異種アミノ末端アミノ酸配列は、酵素切断部位を含み、必要に応じて、酵素切断部位は、トロンビン切断部位を含み、
必要に応じて、異種アミノ末端アミノ酸配列は、分泌シグナルを含み、必要に応じて、分泌シグナルは、フィブロネクチン分泌シグナル、免疫グロブリン重鎖分泌シグナルもしくは免疫グロブリンκ軽鎖分泌ペプチド、またはインターロイキン－２シグナルペプチドを含み、
必要に応じて、異種アミノ末端アミノ酸配列は、アミノ酸配列
ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号２）
を含む方法が提供される。
代替実施形態では、ポリペプチド化合物が提供され、ここで、ポリペプチド化合物はＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＩＢＰ）アミノ酸配列およびＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列で構成され、
ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、少なくとも８個のアミノ酸、または４～１２個の間のアミノ酸、または５～１０個の間のアミノ酸で構成され、ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、関連する生理学的条件下で、ポリペプチドをＴＬＲ４に結合させるために、ＡＩＢＰアミノ酸配列中の潜在的なドメインのアンフォールディングを誘導するか、潜在的なドメインを露出させるか、そうでなければアクセス可能にすることができる、ただし、ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、Ｈｉｓタグと、前記生理学的条件下で作用させるとＨｉｓタグの消失をもたらすタンパク質切断部位とで構成されていないことを条件とする。
代替実施形態では、ＴＬＲ４媒介性疾患または状態を処置する、改善する、防止する、逆転するまたはその重症度もしくは持続期間を減少させるために、それを必要とする対象に、
本明細書で提供されるポリペプチド化合物または核酸化合物を含む薬学的に許容され得る組成物であって、核酸化合物の核酸配列が前記ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする組成物を、
提供することによる方法が提供され、
ＴＬＲ４媒介性疾患または状態としては、限定されるものではないが、炎症誘発性疼痛、ＣＮＳ炎症性疾患および状態、関節炎、神経変性疾患および状態、異痛症、痛覚過敏、肺炎症性疾患または状態、眼炎症性疾患および状態、敗血症、血管炎症性疾患および状態、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、およびウイルス感染によって生じるかまたは引き起こされる疾患および状態、またはそれらの後遺症が挙げられる。
本発明の１またはそれを超える実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、あらゆる目的において参照により本明細書に組み込まれる。
図面の簡単な説明
特許または特許出願のファイルには、カラーで描かれた図面が少なくとも１つ含まれている。１つまたは複数のカラー図面を含むこの特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な料金の納付によって、米国特許商標庁より提供される。
本明細書に記載の図面は、本明細書に提供される実施形態の例示であり、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を限定することを意味しない。
図１Ａ～Ｆは、化学療法誘発性末梢神経障害が脊髄ミクログリアにおけるＴＬＲ４二量体化および脂質ラフトを変化させ、ＡＩＢＰによって逆転することを示すデータを示す。
図１Ａは、腹腔内（ｉ．ｐ．）シスプラチン（２．３ｍｇ／ｋｇ／日の２回注射）とそれに続く食塩水（５μｌ）またはＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μｌ）の髄腔内（ｉ．ｔ．）単回投与に応答した野生型（ＷＴ）マウスの離脱閾値を示すデータをグラフで示し；ナイーブマウスは注射されなかった。
図１Ｂ～Ｃは、ＴＬＲ４二量体化（図１Ｂ）およびＣＴｘＢ染色により測定された脂質ラフト含有量（図１Ｃ）を示すＣＤ１１ｂ＋／ＴＭＥＭ１１９＋脊髄ミクログリア細胞の、食塩水またはＡＩＢＰのｉ．ｔ．投与の２４時間後、すなわち、図１Ａに示す時間経過の８日目の分析を示すデータをグラフで示す。
図１Ｃは、完全培地中でＡＩＢＰ（０．２μｇ／ｍＬ）またはビヒクルとともに３０分間インキュベートし、続いてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）とともに５分間インキュベートしたＢＶ－２ミクログリア細胞（左パネル）の画像を示し、ＬＰＳおよび／またはＡＩＢＰを含むまたは含まないＭａｎｄｅｒｓの係数（共局在解析）を示すデータをグラフで示す（右パネル）。
図１Ｅ～Ｆは、ＣＳＦ（図１Ｅ）および腰髄（図１Ｆ）における経時的なＡＩＢＰレベルを示すデータをグラフで示す。
これらは以下の実施例１で詳細に考察される。
図２Ａ～Ｃは、ＣＩＰＮマウスの脊髄ミクログリアにおける遺伝子発現を示すデータを示す。
図２Ａ～Ｂは、ミクログリア（ＣＤ１１ｂ＋ＴＥＭＥＭ１１９＋）を図１Ａに示した３つの群からＦＡＣＳ選別した研究から得たデータを示す。
図１Ａは、すべてのサンプルにわたるＤＥＧのヒートマッププロットの画像を示す。
図１Ｂは、有意なＤＥＧの群が、異なる処置条件の発現プロファイルパターンに基づいてクラスター化されたことを示すデータをグラフで示す。
図１Ｃは、シスプラチン処置によって誘導された上方調節（右パネルの群１）および下方調節（左パネルの群２）された遺伝子の経路およびＧＯ富化解析を示すデータをグラフで示し、上方調節された経路は右パネルの「群１」（赤）に、下方調節された経路は左パネル「群２」（青）に示される。
これらは以下の実施例１で詳細に考察される。
図３Ａ～Ｈは、ＣＩＰＮマウスの脊髄ミクログリアにおける疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）および脂質関連遺伝子発現および脂質滴を示すデータを示す。
図３Ａ～Ｃは、図２と同じ群を示す：図３Ａは、ナイーブマウスに対するシスプラチン処置マウスの脊髄ミクログリアにおける上方調節遺伝子および下方調節遺伝子のボルケーノプロットの画像を示し；図３Ｂは、疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）シグネチャー遺伝子を表すヒートマップの画像を示し；図３Ｂは、脂質関連遺伝子セットを示す行ごとにスケールされたｌｏｇ２正規化遺伝子数のヒートマップの画像を示す。
図３Ｄ～Ｈは、ＩＢＡ１およびＤＡＰＩで共染色された脊髄切片におけるＰＬＩＮ２免疫染色によって測定された、脊髄ミクログリアにおける脂質滴蓄積を示すデータをグラフで示し、図３Ｄがこれを示し；図３Ｅは、シスプラチンおよび／またはＡＩＢＰを含むまたは含まない、フィールドあたりの総ＩＢＡ１＋細胞のうちのＩＢＡ１＋／ＰＬＩＮ２＋細胞をグラフで示し；図３Ｆは、ＡＩＢＰを含むまたは含まない平均ＬＤ数／細胞をグラフで示し；図３Ｇは、シスプラチンおよび／またはＡＩＢＰを含むまたは含まない平均ＬＤサイズをグラフで示し；図３Ｈは、ＡＩＰＢを含むまたは含まない正規化されたＰｌｉｎ２遺伝子数をグラフで示す。
これらは以下の実施例１で詳細に考察される。
図４Ａ～Ｈは、ＣＩＰＮマウスの脊髄ミクログリアにおける遺伝子発現、およびＡＩＢＰの効果を示すデータを示す。
図４Ａは、ＡＩＢＰによって下方調節されたＣＩＰＮ上方調節遺伝子（図２Ｂの群３参照））およびＡＩＢＰによって上方調節されたＣＩＰＮ下方調節遺伝子（群４）の経路および遺伝子オントロジー（ＧＯ）富化解析を示す。
図４Ｂは、シスプラチン／食塩水処置マウスに対する(vs.)、シスプラチン／ＡＩＢＰ処置マウスにおける、上方調節および下方調節された遺伝子のボルケーノプロットである、ｉ．ｔ．ＡＩＢＰによって誘導された脊髄ミクログリアにおける差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を示す。
図４Ｃは、ＣＩＰＮにおいて上方調節され、ＡＩＢＰによって下方調節された群３の炎症遺伝子のヒートマップを示す。
図４Ｄは、ＷＴナイーブ群、シスプラチン／食塩水群およびシスプラチン／ＡＩＢＰ群の脊髄組織におけるサイトカインタンパク質発現を示すデータをグラフで示す。
図４Ｅは、シスプラチンによって誘導されないが、ＡＩＢＰによって下方調節される炎症遺伝子のヒートマップを示す。
図４Ｆは、ＡＩＢＰによって下方調節されるすべての遺伝子の経路およびＧＯ富化解析をグラフで示す。
図４Ｇは、最も富化された経路である、ペプチダーゼ阻害剤活性経路に含まれるＡＩＢＰによって下方調節される非炎症遺伝子のヒートマップを示す。
図４Ｈは、ＣＩＰＮにおけるその下方調節がＡＩＢＰによって逆転する遺伝子のヒートマップを示す。
これらは以下の実施例１で詳細に考察される。
図５Ａ～Ｊは、ミクログリアにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１の発現が侵害受容を制御し、ＣＩＰＮのマウスモデルにおけるＡＩＢＰ媒介性異痛症の逆転に必要であることを示すデータを示す。
図５Ａ～Ｂは、完全培地中でＡＩＢＰ（０．２μｇ／ｍＬ）またはビヒクルとともに３０分間インキュベートし、続いてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）とともに５分間インキュベートしたＢＶ－２細胞からのデータを示すデータを図示し、脂質ラフトにおけるＡＢＣＡ１（図５Ａ）およびＡＰＯＡ１（図５Ｂ）にアクセス可能なコレステロールの共局在を示す。
図５Ｃは、マウスにおけるタモキシフェン、シスプラチン、ＡＩＢＰまたは食塩水注射の例示的な実験デザインおよびタイムラインを概略的に示す。
図５Ｄは、シスプラチン介入の開始前のベースライン（０日目）離脱閾値を示すデータをグラフで示す。
図５Ｅは、ベースライン（０日目）における、ナイーブＷＴおよびＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスのＣＤ１１ｂ＋ＴＭＥＭ１１９＋脊髄ミクログリアにおけるＴＬＲ４表面発現および二量体化および脂質ラフト（ＣＴｘＢ）を示すデータをグラフで示す（両群のＴＬＲ４表面発現および脂質ラフト含有量分析についてｎ＝５）。
図５Ｆは、ＴＡＭ誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおいて、ｉ．ｔ．食塩水またはＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μｌ）とそれに続くｉ．ｔ．ＬＰＳ（０．１μｇ／５μｌ）の後の離脱閾値を示すデータをグラフで示す。
図５Ｇ～Ｈは、ＴＡＭ誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウス（図５Ｇ）および非誘導（ビヒクル）ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウス（図５Ｈ）における、ｉ．ｐ．シスプラチンおよびｉ．ｔ．食塩水またはＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μｌ）注射後の離脱閾値を示すデータをグラフで示す。
図５Ｉ～Ｊは、パネル図５Ｇおよび図５Ｈに示される群における、８日目のＣＤ１１ｂ＋ＴＥＭＥＭ１１９＋脊髄ミクログリアにおけるＴＬＲ４二量体化（図５Ｉ）および脂質ラフト（図５Ｊ）を示すデータをグラフで示す。
これらは以下の実施例１で詳細に考察される。
図６Ａ～Ｇは、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアにおける発現を示すデータを示す。
図６Ａの上の画像は、ナイーブＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアで誘導され、シスプラチンで処置したマウスのＷＴミクログリアと共有される重複遺伝子および経路を、重複遺伝子を結ぶ紫色（濃い、上側）の線と、重複する富化経路を結ぶ青色（淡い、下側）の線で概略的に示し、図６Ａの下の画像は、ＷＴシスプラチンおよびＡＢＣ－ｉｍＫＯナイーブマウス由来の脊髄ミクログリアにおいて上方調節された遺伝子のベン図である。
図６Ｂは、ミクログリアにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１ノックダウンにより誘導される上方調節および下方調節された遺伝子の富化経路分析を示す。
図６Ｃは、ＴＡＭ誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスのナイーブ脊髄ミクログリアにおけるＤＥＧを示す。
図６Ｄは、ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおいてシスプラチン処置により誘導され、シスプラチンで処置されたマウスのＷＴミクログリアと共有される、重複遺伝子および経路を概略的に示す。
図６Ｅは、シスプラチンで処置したＷＴマウスと比較した、シスプラチンで処置した、ＴＡＭ誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアのＤＥＧを示す。
図６Ｆ～Ｇは、ナイーブ条件またはシスプラチン条件のいずれかでの、ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおけるＤＥＧ上方調節遺伝子（図６Ｆ」）または下方調節遺伝子（図６Ｇ）のヒートマップを示す。 これらは以下の実施例１で詳細に考察される。
図７Ａ～Ｆは、ＡＩＢＰによるミクログリアの再プログラミングが、ＡＢＣＡ１／ＡＢＣＧ１発現に依存することを示すデータを示す。
図７Ａは、シスプラチンによりＣＩＰＮが誘発されたＷＴマウスおよびＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおける遺伝子発現に対するＡＩＢＰ処置の効果を比較するベン図を概略的に示す。
図７Ｂは、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスとＷＴマウスにおけるＡＩＢＰ効果を比較する、ＣＩＰＮにおけるＡＩＢＰ処置による上方調節された遺伝子および下方調節された遺伝子のボルケーノプロット表示を概略的に示す。
図７Ｃは、ＡＩＢＰによってＡＢＣ依存的に変化した炎症遺伝子のｌｏｇ２正規化遺伝子数のヒートマップを概略的に示す（ＷＴミクログリアではＡＩＢＰによって下方調節されるが、ＡＢＣ－ｉｍＫＯではＡＩＢＰによって上方調節される）。
図７Ｄは、野生型とＡＢＣ－ｉｍＫＯにおけるシスプラチンとＡＩＢＰ効果を比較する、コレステロール合成およびＬＸＲ関連遺伝子のヒートマップを概略的に示す。
図７Ｅは、ＡＩＢＰによってＡＢＣ依存的に調節される非炎症遺伝子のヒートマップを概略的に示す。
図７Ｆは、ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおいてＡＩＢＰにより上方調節された遺伝子の富化経路分析を概略的に示す。
これらは以下の実施例１で詳細に考察される。
図８Ａ～Ｇは、ミクログリアの内在性ＡＩＢＰおよびＴＬＲ４が、侵害受容に重要であることを示す。
図８Ａは、例示的な実験デザインおよびタイムラインを概略的に示す：タモキシフェン；シスプラチン；ＡＩＢＰ；および／または食塩水が注入される。
図８Ｂは、シスプラチン介入の開始前のベースライン（図８Ａの０日目）離脱閾値をグラフで示す。
図８Ｃは、タモキシフェン注射レジメンの前（ナイーブ、パネルＡタイムラインの－７日目）および後（ＴＡＭ、０日目）に、ＷＴおよびＣｘ３ｃｒ１－ＣｒｅＥＲＴ２（ｆｌｏｘｅｄ遺伝子なし）マウスの離脱閾値を試験したことをグラフで示す。
図８Ｄ～Ｆは、（図８Ｄ）ＴＡＭ誘導ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウス；非誘導（ビヒクル）ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウス（図８Ｅ）；および施設内で繁殖させた全身ＡＩＢＰノックアウトマウス（図８Ｆ）；における、ｉ．ｐ．シスプラチンおよびｉ．ｔ．食塩水またはＡＩＢＰ注射の後の離脱閾値をグラフで示す。
図８Ｇは、シスプラチン注射後のＷＴおよびタモキシフェン誘導ＴＬＲ４－ｉｍＫＯマウスにおける離脱閾値をグラフで示す。
これらは以下の実施例１で詳細に考察される。
図９Ａ～Ｈは、ＴＬＲ４結合を担うＡＩＢＰ分子中のドメインの特定を示すデータを示す。
図９Ａは、シグナルペプチド、アミノ酸（ａａ）１～２４、以前は特徴づけられていなかったＮ末端ドメイン（ａａ２５～５１）、およびＹｊｅＦ＿Ｎドメイン（ａａ５２～２８８）を有するヒトＡＩＢＰを概略的に示す。
図９Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞でＦｌａｇタグ付きＴＬＲ４エクトドメイン（ｅＴＬＲ４）と共発現した、ヒトＡＩＢＰのｆｌａｇタグ付き欠失変異体のＰＡＧＥ分離の画像を示す。細胞溶解物は抗ＴＬＲ４抗体で免疫沈降（ＩＰ）し、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロット（ＩＢ）された。
図９Ｃは、バキュロウイルス／昆虫細胞系で発現させ、試験管内でｅＴＬＲ４－Ｈｉｓと結合させ、続いて抗ＴＬＲ４抗体でＩＰ、抗Ｈｉｓ抗体でＩＢを行った、すべてシグナルペプチドを欠くｈｉｓタグ付きヒト（ｈｕ）、マウス（ｍｏ）およびゼブラフィッシュ（ｚｆ）ＡＩＢＰのＰＡＧＥ分離の画像を示す。
図９Ｄ～Ｈは、３つの独立した実験からの、Ｈｉｓタグ付き野生型（ｗｔ、２５－２８８ ａａ）および欠失変異体（ｍｕｔ、５２－２８８ ａａ）ヒトＡＩＢＰのｅＴＬＲ４、ＡＰＯＡ１およびミクログリアへの結合、ならびに抗ＡＩＢＰ抗体を含む試験管内でのｅＴＬＲ４とｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰの免疫沈降（ＩＰ）、ブロットおよび定量を示すデータを示す。
図９Ｄは、プレートをｅＴＬＲ４でコーティングし、ｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰとともにインキュベートしてＥＬＩＳＡが行われたＰＡＧＥ分離（左の画像）を示し、右の画像は、ｗｔおよびｍｕ ＡＩＰＢのＴＬＲ４／ＡＩＢＰの量をグラフで示す。
図９Ｅは、ＢＳＡ、ｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰでコーティングされ、ＡＰＯＡ１とともにインキュベートしたプレートを用いてＥＬＩＳＡが行われた、固定されたｅＴＬＲ４でのｗｔまたはｍｕｔＡＩＢＰ（またはＡＩＢＰなし）とＡＩＢＰの結合をグラフで示す。
図９Ｆは、ＡＩＢＰに結合したＡＰＯＡ１をグラフで示す。 図９Ｇは、フローサイトメトリーを使用してＡＩＢＰに結合したＡＰＯＡ１を有する細胞の数フローサイトメトリー（上のグラフ）、および非刺激ＬＰＳ刺激細胞におけるｗｔおよびｍｕｔＡＩＢＰに対するＡＩＢＰ結合（倍率変化）（下のグラフ）をグラフで示す。
図９Ｈは、共焦点イメージングを使用してＡＩＢＰに結合したＡＰＯＡ１を示し、ｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰと、未刺激またはＬＰＳで１５分間処理したＢＶ－２ミクログリア細胞の結合を示す。
これらは以下の実施例１で詳細に考察される。
図１０Ａ～Ｇは、ＴＬＲ４結合ドメインを欠くＡＩＢＰの髄腔内送達がＣＩＰＮ異痛症を軽減することができないことを示すデータを示す。
図１０Ａ～Ｂは、ｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰで前処理し、ＬＰＳで刺激したＢＶ－２細胞におけるＴＬＲ４二量体化（図１０Ａ）および脂質ラフト（図１０Ｂ）をグラフで示す。
図１０Ｃは、ｉ．ｔ．ＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）または食塩水（５μＬ）、それに続いてｉ．ｔ．ＬＰＳを投与されたＷＴマウスにおける離脱閾値をグラフで示す。
図１０Ｄは、ｉ．ｐ．シスプラチン、続いてｉ．ｔ．ｗｔＡＩＢＰ、ｍｕｔＡＩＢＰまたは食塩水に応答したＷＴマウスにおける離脱閾値をグラフで示す。
図１０Ｅ～Ｆは、パネル図１０Ｄに示す実験群の、２１日目のマウスの腰髄由来のＣＤ１１ｂ＋／ＴＭＥＭ１１９＋ミクログリアにおけるＴＬＲ４二量体化（図１０Ｅ）および脂質ラフト（図１０Ｆ）をグラフで示す。
図１０Ｇは、シスプラチン誘発性組織損傷（損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ））およびＡＩＢＰ処置を用いた化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）の、ミクログリア遺伝子発現および脂質滴蓄積に対する効果を示す図を概略的に示し、形質膜およびＥＲの黒点はコレステロールを表す。 以下の実施例１で詳細に考察される。
図１１は、ＡＩＢＰ分子の潜在的なＮ末端ドメインをアンフォールティングまたは露出させるモデルを概略的に示す；この図は図１２～１４に示す実験結果を要約して示しており、ネイティブＡＩＢＰではＮ末端ドメイン（緑色）が隠されているかまたは潜在的であるかまたはＴＬＲ４とのＡＩＢＰ結合を媒介するのに十分に露出しておらず（上のパネル）、Ｎ末端を追加のアミノ酸（オレンジ色）で伸長させると、ＡＩＢＰの立体構造が変化し、ＡＩＢＰのＮ末端ドメイン（緑色）をＴＬＲ４結合に利用可能にする（下のパネル）ことを実証する。
図１２は、本明細書で提供される操作されたＡＩＢＰの例示的なアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。この伸長させたＡＩＢＰ分子のアミノ酸配列は図１１の下のパネルに示され、青色の文字は、ネイティブＡＩＢＰ配列由来のアミノ酸；緑色の枠は、ＴＬＲ４結合配列（ヒトＡＩＢＰ配列のアミノ酸２５～５１）；黒色の文字および（赤色の）枠は、付加されたアミノ酸である。
図１３は、様々な例示的な操作された形態のＡＩＢＰのＴＬＲ４結合を概略的に示す：すべてのタンパク質を発現させ、バキュロウイルス／昆虫細胞系から精製した： Ｈｉｓ－ｄ２４ＡＩＢＰ：図１２に示すアミノ酸配列に対応し、アミノ酸配列はオレンジ色の枠の「切断可能なＨｉｓタグ」の配列を示す、 他の図面はすべて、ＡＩＢＰ分子に導入されたアミノ酸配列のさまざまな改変および対応する変化を示し、緑色の「Ｎ末端ドメイン」枠は、ネイティブＡＩＢＰのアミノ酸２５～５１配列を表し、右側の列は、ＴＬＲ４の組換え外部ドメインとのＡＩＢＰバリアントの共免疫沈降実験の結果を示す、 Ｈｉｓ－２４ ＡＩＢＰの場合：ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号２） 「切断型Ｈｉｓ－ｄ２４ ＡＩＢＰ」の場合、ＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号９）、 「５ｘＤ ｍｕｔ Ｈｉｓ－ｄ２４ ＡＩＰＢ」の場合： ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＤＧＤＤＧＤＤＤＲ（配列番号１９）、 「切断型５ｘＤ Ｈｉｓ－ｄ２４ ＡＩＰＢ」の場合ＧＳＤＧＤＤＧＤＤＤＲ（配列番号１０）、 「２ｘＤ ｍｕｔ Ｈｉｓ－ｄ２４ ＡＩＢＰの場合 ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＤＧＤＤＧＩＣＳＲ（配列番号１１）、および 「切断型Ｈｉｓ－ｄ２４ ＡＩＢＰ」の場合、ＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号９）。
図１４は、様々な操作された形態のＡＩＢＰのＴＬＲ４結合を概略的に示す：すべてのタンパク質を哺乳動物系で完全長ＴＬＲ４と共発現させた：ＳＳ、分泌シグナル、ヒトＡＩＢＰ配列中のアミノ酸１～２４に対応する；右側の列は、ＴＬＲ４とのＡＩＢＰバリアントの細胞溶解物からの共免疫沈降の結果を示し、 「Ｆｌａｇ－全長」についてはＭＤＹＫＤＨＫＧＫＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＬＡＡＡＮＳ（配列番号１４）、 フィブロネクチンシグナルペプチドについてはＭＬＲＧＰＧＰＧＲＬＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＳＶＲＣＴＥＴＧＫＳＫＲ（配列番号：２４）である。
ＴＬＲ４親和性：バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための構造を最適化するための様々なＡＩＢＰ構築物を概略的に示す： ＧＳＤＧＤＤＧＤＤＤＲ（配列番号１１）、 ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号２） 「ＰＫＡ部位＋トロンビン切断部位」には：ＭＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号１７） 「トロンビン切断部位」の場合 「３ｘＦＬＡＧ」にはＭＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号１８） 「５ＸＤ」にはＧＳＤＧＤＤＧＤＤＤＲ（配列番号１１）。
図１６は、様々な操作された形態のＡＩＢＰのＴＬＲ４結合を概略的に示す。すべてのタンパク質を発現させ、大腸菌から精製した、右側の列は、ＴＬＲ４の組換え外部ドメインとＡＩＢＰバリアントとの共免疫沈降実験の結果を示す。
図１７Ａ～Ｄは、フローサイトメトリーおよび顕微鏡法に使用されるＴＬＲ４抗体の特異性の検証を提供し、後根神経節マクロファージにおいて測定されたＴＬＲ４二量体化および脂質ラフトも示す。
図１７Ａは、ＣＤ１１ｂ＋（ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５）／ＴＭＥＭ１９９＋（Ｐｅ－Ｃｙ７）ミクログリアのＴＬＲ４－ＡＰＣおよびＴＬＲ４／ＭＤ２－ＰＥ抗体染色を示す、ＷＴ（左の画像）およびＴｌｒ４－／－マウス（右の画像）の脊髄由来の単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーをグラフで示す。
図１７Ｂは、Ｆ４／８０－ＦＩＴＣ抗体とＴＬＲ４－６４７抗体で共染色されたＷＴおよびＴｌｒ４－／－マウス由来の腹膜誘導マクロファージの共焦点画像を示す；スケールバー、５μｍ。
図１７Ｃ～Ｄは、ｉ．ｔ．食塩水またはＡＩＢＰの２４時間後の、ＴＬＲ４二量体化（図１７Ｃ）およびＣＴｘＢ染色により測定された脂質ラフト含有量（図１７Ｄ）を示す、ＣＤ１１ｂ＋ＤＲＧマクロファージ細胞のフローサイトメトリー分析をグラフで示す。
これらは以下の実施例１で考察される。
図１８Ａ～Ｅ（または、図Ｓ２、または補足図２）は、脊髄ミクログリアのＦＡＣＳ選別戦略、ＲＮＡ－ｓｅｑについての品質管理および表現型制御を示す。
図１８Ａは、ＳＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－ＷおよびＳＳＣ－Ｈ、ＵＶＥ／ＤＥＡＤ（ＡＰＣ－Ｃｙ７－Ａ）およびＳＳＣ－Ａ、ＧＬＡＳＴ１およびＣＤ２４、ならびに、ＣＤ１１ｂおよびＴＭＥＭ１１９を含む、腰部ＣＤ１１ｂ＋ＴＭＥＭ１１９＋脊髄ミクログリアの選別戦略を示す。
図１８Ｂは、ＴＭＥＭ１１９およびＣＤ１１ｂ、ＳＳＣ－ＡおよびＧＬＡＳＴ１、ならびにＳＳＣ－１およびＣＤ２４を含む、選別された細胞の純度およびＧＬＡＳＴ１＋星状細胞またはＣＤ２４＋ニューロンの非存在を測定する、選別されたミクログリアのフローサイトメトリー分析を示す。
図１８Ｃは、ミクログリア特異的遺伝子のヒートマップを用いるミクログリア系統解析を示す。
図１８Ｄ～Ｅは、野生型マウスにおける、ＡＩＢＰによって上方調節されたＣＩＰＮ抑制遺伝子（群４）（図１８Ｄ）およびＡＩＢＰによって下方調節されたＣＩＰＮ誘発遺伝子（群３）（図１８Ｅ）のヒートマップを示す。
これらは以下の実施例１で考察される。
同上。
図１９Ａ～Ｄは、タモキシフェン誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のコンディショナルノックアウトの免疫組織化学的検証を提供する。
図１９Ａは、タモキシフェン（ｔａｍｉｘｉｆｅｎ）有りおよび無しの、ＤＡＰＩ、ＩＢＡ１、ＡＢＣＡ１、マージ（ＭＥＲＧＥ）、およびＣＯＬＯＣマスク（ＣＯＬＯＣ ＭＡＳＫ）、を示す。
図１９Ｂは、タモキシフェン有りおよび無しの、ＤＡＰＩ、ＩＢＡ１、ＡＢＣＧ１、マージ、およびＣＯＬＯＣマスクを示す。
図１９Ｃは、タモキシフェン有りおよび無しの、ＤＡＰＩ、ＮｅｕＮ、ＡＢＣＡ１、マージ、およびＣＯＬＯＣマスクを示す。
図１９Ｄは、タモキシフェン有りおよび無しの、ＤＡＰＩ、ＧＦＡＰ、ＡＢＣＡ１、マージ、およびＣＯＬＯＣマスクを示す。
これらは以下の実施例１でさらに詳細に考察される。
図２０Ａ～Ｅは、ｉ．ｔ．ＬＰＳおよびＣＩＰＮ実験における、タモキシフェン処置ＷＴマウスの触覚異痛症データを示し、ＡＢＣ－ｉｍＫＯ依存性遺伝子、およびＷＴマウスに対するＡＢＣ－ｉｍＫＯのシスプラチン効果をための追加のＲＮＡ－ｓｅｑデータを提供する。
図２０Ａ～Ｂは、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの対照として、施設内で繁殖させたＷＴ同腹仔マウスにタモキシフェンレジメン（ＴＡＭ、２００μＬ／日、１０ｍｇ／ｍＬ、連続５日間）を行い、続いて（図２０Ａ）ＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）または食塩水（５μＬ）をｉ．ｔ．注射し、２時間後にｉ．ｔ．ＬＰＳ（０．１μｇ／５μＬ）を投与し；（図２０Ｂ）１日目および３日目にシスプラチン（２．３ｍｇ／Ｋｇ）をｉ．ｐ．注射し、続いて７日目にＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）または食塩水（５μＬ）をｉ．ｔ．注射したデータをグラフで示す。
図２０Ｃは、７日目に、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにＴＡＭを注射し、次いで上記のようにシスプラチンを注射し、続いてｉ．ｔ．食塩水（５μＬ）、ＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）またはｈｐ－β－ＣＤ（０．２５ｍｇ／５μＬ）を注射したデータをグラフで示す。
図２０Ｄは、ＡＢＣ－ｉｍＫＯ方式で調節されたすべての条件（ナイーブ、シスプラチン／食塩水またはシスプラチン／ＡＩＢＰによって誘導）にわたって差次的に調節された遺伝子のヒートマップを示す。
図２０Ｄは、交互作用項（条件：遺伝子型）のない縮小モデルを使用した尤度比検定から得られたすべての有意な遺伝子を示す。
図２０Ｅは、カットオフＰ＜０．０５、富化＞１．５および経路内の３つの遺伝子の最小重複を使用した、ＷＴおよびＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおけるシスプラチン上方調節遺伝子の経路富化のヒートマップを示す。 これらは以下の実施例１でさらに詳細に考察される。
図２１Ａ～Ｂは、タモキシフェン誘導ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアにおけるＡＩＢＰノックアウトの免疫組織化学的検証を提供し、ＢＥ－１モノクローナル抗体がｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰに対して同様の親和性を有することを実証する。
図２１Ａは、ＡＩＢＰ染色とＩＢＡ１（ミクログリア）、ＮｅｕＮ（ニューロン）およびＧＦＡＰ（星状細胞）との共局在を示す、ビヒクルおよびタモキシフェン誘導ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウス由来の脊髄凍結切片のＩＨＣの画像を示す。
図２１Ｂは、マイクロタイタープレート中の捕捉抗体としてＢＥ－１を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡのデータをグラフで示し、ウサギポリクローナル抗ＡＩＢＰ抗体を使用してｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰに対する用量応答曲線を検出した。
これらは以下の実施例１でさらに詳細に考察される。
図２２Ａ～Ｃは、気管支上皮におけるＡＩＢＰ発現の低下をグラフで示す。
図２２Ａは、非喘息および喘息サンプル中のＡＩＢＰ＋気管支上皮をグラフで示す。
図２２Ｂは、非喘息および喘息サンプル中のＡＰＯＡ１ＢＰ／ＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡをグラフで示す。
図２２Ｃは、気管支上皮におけるＡＩＢＰ発現をグラフで示す。
これらは以下の実施例３でさらに詳細に考察される。
図２３Ａ～Ｆは、以下の実施例３でさらに詳細に考察されるように、化合物７が雌および雄マウスの喘息のＨＤＭモデルにおいて気道過敏症および好酸球性肺炎症を軽減することをグラフで示す。 同上。
図２４Ａ～Ｍは、以下の実施例４でさらに詳細に考察されるように、ＡＩＰＢがＤ２緑内障マウスの網膜神経変性を軽減することを示す。
図２５Ａ～Ｄは、以下の実施例４でさらに詳細に考察されるように、ＡＩＰＢが網膜神経変性を軽減し、マイクロビーズ誘発高血圧マウスモデルにおいて視覚機能を改善することを示す。
図２６Ａ～Ｂは、以下の実施例４でさらに詳細に考察されるように、ＡＩＰＢがマウス神経クラッシュモデルにおいて網膜神経変性を軽減することを示す。
様々な図面における同様の参照符号は、同様の要素を示す。
次に、本明細書で提供される様々な例示的な実施形態を詳細に参照するが、その例は添付の図面に示されている。以下の詳細な説明は、本発明の態様および実施形態の特定の詳細のより良い理解を読者に与えるために提供されるものであり、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。
詳細な説明
代替実施形態では、アミノ酸配列の改変、組換えＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）の付加、維持、増強または発現の上方調節を含む、該タンパク質を調節するまたは操作するための組成物および方法（核酸、ポリペプチド、および遺伝子およびポリペプチド送達ビヒクルを含む医薬化合物および製剤を使用する）、ならびにこれらの組成物および方法を実施するための成分の全部または一部を含むキットが提供される。代替実施形態では、血液脳関門を標的とし、かつ／または血液脳関門を透過する能力のある送達ビヒクル、ならびにＡＩＢＰ発現核酸内に含まれているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達ビヒクルなどのベクターおよびウイルスなどの核酸（遺伝子）送達ビヒクルの使用を含む、ＡＩＢＰ配列および構造を変化させ、治療レベルの組換えＡＩＢＰを脳およびＣＮＳを含む身体に送達するための組成物および方法；ならびにＡＩＢＰポリペプチドまたはＡＩＢＰ発現核酸のいずれかを髄腔内（ｉ．ｔ．）投与を介して直接送達するための組成物および方法が提供される。
実施例１は、化学療法誘発性末梢神経障害のマウスモデルを使用した研究を記載しており、ここで、脊髄ミクログリアは、炎症応答を組織化するインフラマラフト（ｉｎｆｌａｍｍａｒａｆｔ）（肥大したコレステロール富化脂質ラフト）の存在を特徴とする。特定の機構の操作により、コレステロール代謝が調節され、インフラマラフトが正常化され、ミクログリアが再プログラムされ、その結果、神経障害性疼痛が長期にわたって軽減された。
本発明者らはまた、ＴＬＲ４結合ドメインを欠くＡＩＢＰの欠失変異体が、化学療法誘発性末梢神経障害のマウスモデルにおいて神経障害性疼痛を逆転させないことも示す。ＡＩＢＰのＴＬＲ４への結合は、この自然免疫受容体が炎症細胞で高度に発現され、細胞表面の脂質ラフトに集中し、炎症応答を媒介するため、重要である。ＴＬＲ４の含有量が増加し、ＴＬＲ４二量体化の証拠がある肥大／クラスター化した脂質ラフトは、「インフラマラフト」と呼ばれる。ＴＬＲ４に結合することにより、ＡＩＢＰは炎症細胞を標的とし、インフラマラフトを破壊し、炎症－脊髄神経炎症および神経障害性疼痛を阻害する。その効果は、ＴＬＲ４が介在する多くの炎症性疾患状態に適用可能である。
本発明者らはまた、ネイティブＡＩＢＰでは、Ｎ末端ＴＬＲ４結合ドメインが潜在的であり、ネイティブＡＩＢＰはＴＬＲ４に結合しないことを見出した。ＡＩＢＰ中のＴＬＲ４結合ドメインは、例えば、図１３に示すような本明細書で提供される組換え操作された形態のＡＩＢＰの場合のように、Ｎ末端を追加のアミノ酸で伸長させると露出する。図１１は、このモデルのグラフ表示である。
代替実施形態では、市販のｐＡｃＨＬＴ－Ｃベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）由来のアミノ酸配列を含む、操作されたＡＩＢＰが提供される。
ＴＬＲ４受容体は、膜脂質ラフトに局在して二量体化する。活性化受容体およびアダプター分子を有する肥大した、コレステロールに富む脂質ラフト（ここではインフラマラフトと呼ぶ（Ｍｉｌｌｅｒら、２０２０））は、炎症性シグナル伝達および細胞応答を開始するための組織化プラットフォームとして機能する。形質膜内のコレステロール含有量の調節は、様々な細胞型におけるインフラマラフトおよびＴＬＲ４二量体化、シグナル伝達および炎症応答に影響を及ぼし得る（Ｋａｒａｓｉｎｓｋａら、２０１３；Ｔａｌｌ ａｎｄ Ｙｖａｎ－Ｃｈａｒｖｅｔ、２０１５；Ｙｖａｎ－Ｃｈａｒｖｅｔら、２００８）。ＴＬＲ４に加えて、インフラマラフトは、（Ｍｉｌｌｅｒら、２０２０）に概説されるように、多数の他の受容体およびシグナル伝達経路の成分の活性化を調節する。したがって、本発明者らは、ＣＩＰＮが脊髄ミクログリアにおけるコレステロール動態の変化に関連し、脊髄におけるインフラマラフトの形成および持続的な神経炎症をもたらすという仮説を立てた。
この仮説を試験するために、本発明者らは、ＣＩＰＮマウスにおいて脊髄ミクログリア脂質ラフトおよびＴＬＲ４二量体化を測定した。コレステロール動態を操作するために、本発明者らは、いくつかの細胞型からのコレステロール除去の効果的なマルチプライヤーであるアポＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＩＢＰ）の髄腔内注射（Ｃｈｏｉら、２０１８；Ｆａｎｇら、２０１３；Ｗｏｌｌｅｒら、２０１８）と、コレステロール輸送体Ａｂｃａ１およびＡｂｃｇ１の誘導ミクログリア特異的ノックダウンを有するマウスを使用した。本発明者らは、ＡＩＢＰがミクログリア膜におけるコレステロールの再分布を誘導し、アクセス可能なコレステロールとコレステロール輸送体ＡＢＣＡ１の共局在を増強することを実証する。この再分布は、形質膜からコレステロールを枯渇させ、炎症性ラフトを生理学的な脂質ラフトに戻すための条件を設定する。ミクログリア特異的Ａｂｃａ１／Ａｂｃｇ１ノックダウンにより、ナイーブマウスにおいて疼痛が誘発され、ＡＩＢＰがＣＩＰＮ異痛症を逆転させるのを防止され、神経障害性疼痛の発症におけるミクログリアのコレステロール恒常性の重要性が強調される。さらに、ミクログリアにおけるＣＩＰＮに関連したミクログリアにおける遺伝子発現の変化の特徴付けから、コレステロール代謝障害が示唆される。
組換えＡＩＢＰ配列
代替実施形態では、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＩＢＰ）アミノ酸配列およびＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列で構成される操作されたタンパク質配列が開示される。ここで、ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列は、ペプチドタグを含み、ペプチドタグはマルチヒスチジン（ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓ）タグを含み、特に、マルチヒスタグは６つの連続するヒスチジン残基（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１））を含む。
他の実施形態では、異種アミノ末端アミノ酸配列は、トロンビン切断部位に変異があるためにトロンビン切断部位が機能しなくなっているアミノ酸配列ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号２）を含む。
一部の実施形態では、市販のｐＡｃＨＬＴ－Ｃベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から産生されるアミノ酸配列を有するペプチドが提供され、このアミノ酸配列は、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＩＢＰ）アミノ酸配列とＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列で構成され、ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列はペプチドタグを含み、ペプチドタグはマルチヒスチジン（ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓ）タグを含む。
代替実施形態では、少なくとも約１０アミノ酸、または約１０～１００個の間のアミノ酸、または約２０～８０個の間のアミノ酸、または約３０～５０個の間のアミノ酸の異種アミノ末端アミノ酸配列、あるいは、ＡＩＢＰポリペプチドの潜在的な（または隠れている、露出されていない）Ｎ末端ＴＬＲ４結合ドメインのアンフォールティングおよび露出をもたらすのに十分な任意の異種アミノ酸配列を有する、組換えもしくは合成のＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチド化合物または組成物をインビボで投与するための方法が提供される。
代替実施形態では、マウスＡＩＢＰ、例えば、配列番号３によってコードされる配列、および／または配列番号４のアミノ酸配列を有するマウスＡＩＢＰが使用され、これは必要に応じて、Ｎ末端にフィブロネクチン分泌シグナル（イタリック）および／またはＣ末端にＨｉｓタグ（下線）を補充する（すなわち、さらに含む）ことができる；この生成物は、ＦＩＢ－ｍＡＩＢＰ－Ｈｉｓと略記される。
配列番号３：
Figure 2024510757000002
 配列番号４：
Figure 2024510757000003
代替実施形態では、本明細書で提供されるヒトＡＩＢＰ（ｈＡＩＢＰ）ポリペプチドのバリアント（例えば、ＴＬＲ４（そうでなければ潜在的）結合部位を露出させる異種アミノ酸配列を有するヒトＡＩＢＰ）、または本明細書で提供されるバリアントＡＩＢＰをコードする核酸は、投与することを必要とする患者または個体に投与されるか、あるいは製剤または医薬を製造するために使用されるか、あるいは投与用のベクターまたは発現ビヒクルを作製するために使用されるか、あるいは本明細書で提供されるキットに含まれ、ＡＩＢＰバリアントは、以下を含むかまたは以下によってコードされ得る：
ヒトＡＩＢＰコード核酸（ｃＤＮＡ）（配列番号５）
Figure 2024510757000004
Figure 2024510757000005
 ヒトＡＩＢＰポリペプチド（配列番号６）
Figure 2024510757000006
一部の実施形態では、ＴＬＲ４結合ドメインおよびを保持し、Ｎ末端残基をネイティブシグナルペプチドで置き換えた修飾ｈＡＩＢＰが使用される、例えば、ｈＡＩＢＰは、ｄ２４ｈＡＩＢＰ（コード核酸）として公知のｈＡＩＢＰ配列のアミノ酸２５～２８８を含む：
Figure 2024510757000007
 ここで、対応するｄ２４ｈＡＩＢＰポリペプチドは：
Figure 2024510757000008
 である。
一部の実施形態では、ＡＩＢＰのＮ末端の一部（アミノ酸１～２４、ｄ２４ｈＡＩＢＰ）がフィブロネクチン分泌シグナル（イタリック）で置き換えられている（またはさらに含む）ヒトＡＩＢＰが提供される；生成物をＦＩＢ－ｄ２４ｈＡＩＢＰと略し、化合物１と命名する：
ヒトＦＩＢ－ｄ２４ｈＡＩＢＰ（化合物１）－コード核酸（ｃＤＮＡ）：
Figure 2024510757000009
Figure 2024510757000010
この実施形態では、ｈＡＩＢＰ断片はアミノ酸２５から２８８（ｄ２４ｈＡＩＢＰとしても公知）を含み、Ｎ末端修飾は以下の通りである：
MLRGPGPGRLLLLAVLCLGTSVRCTETGKSKR（配列番号２４）。
一実施形態では、ＡＩＢＰの強力な分泌を確実にするために分泌シグナルが付加される。例えば、フィブロネクチン分泌シグナルがＡＩＢＰのＮ末端に付加される（配列番号３および配列番号４のイタリック体の配列を参照）。または、分泌シグナルをコードする核酸がＡＩＢＰコード配列に付加される。代替実施形態では、分泌シグナルは、フィブロネクチン分泌シグナル、免疫グロブリン重鎖分泌シグナルまたは免疫グロブリンκ軽鎖分泌ペプチド（例えば、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５；１０（２）：ｅ０１１６８７８参照）、またはインターロイキン－２シグナルペプチド（例えば、Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００５ Ｍａｒ；７（３）：３５４－６５参照）である。
代替的な実施形態では、ポリペプチドコード配列は、プロモーター、例えば構成的、誘導性、組織特異的（例えば、神経または脳組織特異的）もしくは遍在性プロモーターまたは他の転写活性化剤に機能的に連結される。
他の実施形態では、フィブロネクチン－ｈＡＩＢＰ構築物の翻訳後修飾からの生成物は、以下のアミノ酸配列（化合物２）を有する：
Figure 2024510757000011
 ｈＡＩＢＰ断片はｄ２４ｈＡＩＢＰであり、Ｎ末端修飾は、TETGKSKR（配列番号２６）である。
他の実施形態では、ＡＩＢＰポリペプチドの配列は、さらなるペプチド断片を組み込むためにそのＣ末端で修飾される。これは、Ｃ末端Ｈｉｓタグ（対応するアミノ酸配列に下線が引かれている）の付加によって例示される。
（化合物３をコードする核酸配列）：
Figure 2024510757000012
Figure 2024510757000013
アミノ酸配列（化合物３）:
Figure 2024510757000014
 ここで、ｈＡＩＢＰ断片は、Ｈｉｓタグ（ＦＩＢ－ｄ２４ ＡＩＢＰ－Ｈｉｓ）およびＮ末端修飾：
LRGPGPGRLLLLAVLCLGTSVRCTETGKSKR（配列番号２９）
を含むｄ２４ｈＡＩＢＰである。
他の実施形態では、シグナルペプチドの翻訳後修飾により、化合物（化合物４）が得られる：
Figure 2024510757000015
Figure 2024510757000016
 ここで、ｈＡＩＢＰ断片はｄ２４ｈＡＩＢＰ－Ｈｉｓであり、Ｎ末端修飾は、TETGKSKR（配列番号２６）である。
他の実施形態では、ポリペプチドコード配列は、プロモーター、例えば構成的、誘導性、組織特異的（例えば、神経または脳組織特異的）もしくは遍在性プロモーターまたは他の転写活性化剤に機能的に連結される。
他の実施形態では、全長ヒトＡＩＢＰは、そのＮ末端で修飾される。そのような修飾は、ＴＬＲ４結合を促進する、例えば化合物５をコードする核酸（ｃＤＮＡ）：
Figure 2024510757000017
 これは、以下のアミノ酸（化合物５）をコードする：
Figure 2024510757000018
 ここで、ｈＡＩＢＰ断片は全長であり、Ｎ末端修飾は、MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKLAAANS（配列番号３３）である。
他の実施形態では、潜在的なＴＬＲ４結合ドメインを保持するｈＡＩＢＰ配列は、そのＮ末端で修飾される。配列の例は、ｈＡＩＢＰ（ｄ２４ｈＡＩＢＰ）のアミノ酸２５～２８８のＤＮＡおよびペプチド配列を含む：
（化合物６をコードする核酸配列）：
Figure 2024510757000019
 アミノ酸配列（化合物７）：
Figure 2024510757000020
Figure 2024510757000021
 ここで、ｈＡＩＢＰ断片はｄ２４ｈＡＩＢＰであり、Ｎ末端修飾は、以下である：
MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKLAAANS（配列番号３３）
（化合物７をコードする核酸配列）：
Figure 2024510757000022
 ここで、ｈＡＩＢＰ断片はｄ２４ｈＡＩＢＰであり、Ｎ末端修飾は、以下である：
MSPIDPMGHHHHHHGRRRASVAAGILVPRGSPGLDGICSR（配列番号２）、
（化合物８をコードする核酸配列）：
Figure 2024510757000023
Figure 2024510757000024
 （化合物６）：
Figure 2024510757000025
 ここで、ｈＡＩＢＰ断片はｄ２４ｈＡＩＢＰであり、Ｎ末端修飾は、以下である：
MSPIDPMGHHHHHHGRRRASVAAGILVPRGSDGDDGDDDR（配列番号１９）、
（化合物７をコードする核酸配列）：
Figure 2024510757000026
Figure 2024510757000027
 アミノ酸配列（化合物７）：
Figure 2024510757000028
 ここで、ｈＡＩＢＰ断片はｄ２４ｈＡＩＢＰであり、Ｎ末端修飾は、以下である：
MSPIDPMGHHHHHHGRRRASVAAGILVPRGSDGDDGDDDR（配列番号１９）。
他の実施形態では、少なくとも約８アミノ酸、または約８～１００個の間のアミノ酸、または約８～４０個の間のアミノ酸、または約３０～５０個の間のアミノ酸の異種アミノ末端アミノ酸配列、あるいは、ＡＩＢＰポリペプチドの潜在的な（または隠れている、露出されていない）Ｎ末端ＴＬＲ４結合ドメインのアンフォールティングおよび露出をもたらすのに十分な任意の異種アミノ酸配列を有する、組換えもしくは合成のＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチド化合物または組成物のための組成物が提供される。
代替実施形態では、アミノ酸のＮ末端配列は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）から選択される３～１２個の間の塩基性アミノ酸を含む。
他の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、例えば推定ペプチド切断部位を除去することによって、生物活性の特性を改善するためにさらに修飾され得る。配列の例は、以下によって表される：
（化合物８をコードする核酸配列）：
Figure 2024510757000029
 アミノ酸配列（化合物８）：
Figure 2024510757000030
 ここで、ｈＡＩＢＰ断片はｄ２４ｈＡＩＢＰであり、Ｎ末端修飾は、以下である：MSPIDPMGHHHHHHGRRRASVAAGILVPAASPGLDGICSR（配列番号７）。
この配列において、トロンビン切断部位ＬＶＰＲＧＳ（配列番号１３）は、記載されるアミノ酸変異を組み込み、実施例２に記載されているように、切断およびＴＬＲ４結合活性の予想外の消失を防止する。
これらの配列は例示的なものであり、本発明を限定するものではないことを認識されたい。
他の実施形態では、ｈＡＩＢＰのＮ末端修飾におけるアミノ酸はいずれも、非天然であってよく、当業者に公知の方法によって挿入することができる。
製造製品、キット
本明細書で提供される方法を実施するためのインプラントまたはポンプ、キットおよび医薬品などの製造製品も提供される。代替実施形態では、本明細書で提供される方法を実施するために必要なすべての構成成分を含む製造製品、キットおよび／または医薬品が提供される。代替実施形態では、キットはまた、本明細書で提供される方法を実施するための指示を含む。
製剤および医薬組成物
代替実施形態では、神経障害性疼痛を調節するための本明細書で提供される方法および使用を実施するための核酸およびポリペプチドを含む医薬製剤または組成物が提供され、方法は、組換えＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）の発現を上方調節することを含む。代替実施形態では、神経障害性疼痛を処置、防止、逆転および／または改善するためのインビボ、インビトロまたはエクスビボでの方法で使用するための医薬製剤または組成物が提供される。代替実施形態では、組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチドを含むかまたは組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチドの発現または活性の増加をもたらす、本明細書で提供される方法および使用を実施するために用いられる医薬組成物および製剤は、例えば、神経障害性疼痛、神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患、必要に応じて、アルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、必要に応じて、緑内障またはその他の目の炎症性疾患、必要に応じて、肺炎症および喘息、必要に応じて、ＨＩＶ感染またはその併存疾患、および／または必要に応じて血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患を処置、防止、逆転および／または改善するのに十分な量で、投与することを必要とする個体に投与される。代替実施形態では、組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチドを含むかまたは組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチドの発現または活性の増加をもたらす、本明細書で提供される方法および使用を実施するために用いられる医薬組成物および製剤は、例えば、神経障害性疼痛または神経変性疾患または状態を防止するかあるいはその強度および／もしくは頻度を減少させるのに十分な量で、投与することを必要とする個体に投与される。
代替実施形態では、本明細書で提供される方法および使用を実施するために用いられる医薬組成物は、非経口的に、局所的に、経口的に、またはエアロゾルもしくは経皮などによる局所投与によって投与することができる。医薬組成物は、任意の方法で製剤化することができ、状態または疾患および病気の程度、各患者の一般的な医学的状態、得られた好ましい投与方法などに応じて様々な単位剤形で投与することができる。製剤化および投与のための技術に関する詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版を参照されたい。
例えば、代替実施形態では、本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用されるこれらの組成物は、バッファー、食塩溶液、粉末、エマルジョン、小胞、リポソーム、ナノ粒子、ナノ脂質粒子などにおいて製剤化される。代替実施形態では、組成物は、任意の方法で製剤化することができ、所望のインビボ、インビトロまたはエクスビボ条件、所望のインビボ、インビトロまたはエクスビボでの投与方法などに応じて様々な濃度および形態で適用することができる。インビボ、インビトロまたはエクスビボ製剤および投与のための技術に関する詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されている。本明細書で提供される方法または使用を実施するために使用される製剤および／または担体は、インビボ、インビトロまたはエクスビボ用途に適した錠剤、丸剤、粉剤・散剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などの形態であり得る。
代替実施形態では、本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される製剤および医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に配置されるかまたは溶解された組成物の溶液（ペプチド模倣体、ラセミ混合物またはラセミ化合物、異性体、立体異性体、化合物の誘導体および／または類似体を含む）を含むことができ、例えば、使用することができる許容され得るビヒクルおよび溶媒には、水およびリンゲル液、等張塩化ナトリウムが含まれる。さらに、無菌の固定油を溶媒または懸濁媒体として使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリド、またはオレイン酸などの脂肪酸をはじめとする任意の固定油を用いることができる。一実施形態では、本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される溶液および製剤は無菌であり、一般に望ましくない物質を含まないように製造することができる。一実施形態では、これらの溶液および製剤は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌される。
本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される溶液および製剤は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの生理学的条件に近づけるために必要な補助物質を含むことができる。これらの製剤中の活性薬剤の濃度は、広く変動することがあり、選択されたインビボ、インビトロまたはエクスビボ投与の特定の様式および所望の結果に従って、主に流体体積、粘度などに基づいて選択され得る。
本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される組成物および製剤は、リポソームの使用によって送達され得る。リポソームを使用することにより、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンド（例えば、損傷したかまたは病気のニューロン細胞またはＣＮＳ組織）を担持するか、またはそうでなければ特定の組織もしくは器官型に優先的に向けられるリポソームを使用することによって、インビボ、インビトロまたはエクスビボ適用における標的細胞への活性薬剤の送達を集中させることができる。
ナノ粒子、ナノ脂質粒子およびリポソーム
例えば、組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチドを含む組成物をインビボで、例えば、ＣＮＳおよび脳に送達するために、本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される化合物を含むナノ粒子、ナノ脂質粒子、小胞およびリポソーム膜も提供される。代替実施形態では、これらの組成物は、例えば、望ましい細胞型または器官、例えば、神経細胞またはＣＮＳなどを標的とするために、細胞表面ポリペプチドを含むポリペプチドなどの生物学的分子をはじめとする特定の分子を標的とするように設計されている。
本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される化合物を含む多層リポソームが提供され、例えば、Ｐａｒｋら、米国特許出願公開第２００７００８２０４２号に記載されている。多層リポソームは、本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される組成物を捕捉するために、スクアラン、ステロール、セラミド、中性脂質または油、脂肪酸およびレシチン含む油相成分の混合物を使用して、約２００～５０００ｎｍの粒径に調製することができる。
リポソームは、例えば、Ｐａｒｋら、米国特許出願公開第２００７００４２０３１号に記載されるように、活性薬剤（例えば、組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチド）を封入することによりリポソームを生成する方法を含む、任意の方法を用いて作製することができ、この方法は、第１のリザーバに水溶液を提供することと；第２のリザーバに有機脂質溶液を提供することと、その後、第１の混合領域で水溶液と有機脂質溶液とを混合してリポソーム溶液を生成することを含み、有機脂質溶液が水溶液と混合されると実質的に瞬時に活性薬剤を封入するリポソームが生成され；その後直ちにリポソーム溶液と緩衝液とを混合して希釈リポソーム溶液が生成される。
一実施形態では、本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用されるリポソーム組成物は、例えば、米国特許出願公開第２００７０１１０７９８号に記載されるように、例えば、化合物（例えば、組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチド）の、望ましい細胞型（例えば、内皮細胞、神経細胞、またはそれを必要とする任意の組織もしくは領域、例えば、ＣＮＳ）への送達を目標とするために、置換アンモニウムおよび／またはポリアニオンを含む。
例えば、米国特許出願公開第２００７００７７２８６に記載されるように、活性薬剤を含むナノ粒子（例えば、二次ナノ粒子）の形態の化合物（例えば、本明細書で提供される方法を実施するために使用される組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチド）を含むナノ粒子が提供される。一実施形態では、二価または三価の金属塩と作用する脂溶性活性薬剤または脂溶化水溶性活性薬剤を含むナノ粒子が提供される。
一実施形態では、例えば、米国特許出願公開第２００５０１３６１２１号に記載されるように、固体脂質懸濁液を使用して、本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される組成物を製剤化し、インビボで哺乳動物細胞、例えば、ＣＮＳに送達することができる。
送達ビヒクルの修飾およびＡＩＢＰの修飾
代替実施形態では、組換えＡＩＢＰペプチドまたはポリペプチド、またはＡＩＢＰを含むナノ粒子、リポソームなど（例えば、本明細書で提供される方法を実施するために使用される組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸またはポリペプチドをその中に含むかまたは有する）は、髄腔内注射、例えば、脳脊髄液または脳への送達を容易にするために修飾される。例えば、代替実施形態では、ＡＩＢＰペプチドまたはポリペプチド、または組換えＡＩＢＰを含むナノ粒子、リポソームなどは、ＡＩＢＰペプチドまたはポリペプチド、またはＡＩＢＰを含むナノ粒子、リポソームなどが受容体または細胞膜構造に結合することを可能にし、ＣＮＳまたは脳への送達を容易にする部分を含むように操作され、例えば、その部分は、マンノース－６－リン酸受容体、メラノトランスフェリン受容体、ＬＲＰ受容体またはＣＮＳまたは脳細胞の表面に偏在的に発現する任意の他の受容体を含み得る。例えば、マンノース－６－リン酸部分のコンジュゲーションにより、ＡＩＢＰペプチドもしくはポリペプチドまたは組換えＡＩＢＰ含有ナノ粒子、リポソームなどが、マンノース－６－リン酸受容体を発現するＣＮＳ細胞によって取り込まれることが可能になる。代替実施形態では、例えば、米国特許第９，０８９，５６６号に記載されるように、インビボでＣＮＳまたは脳への侵入または送達を可能にするＡＩＢＰペプチドまたはポリペプチド、またはＡＩＢＰを含むナノ粒子、リポソームなどの、任意のプロトコルまたは修飾を使用することができる。
代替実施形態では、組換えＡＩＢＰペプチドまたはポリペプチド、またはＡＩＢＰを含むナノ粒子、リポソームなど（例えば、本明細書で提供される方法を実施するために使用される組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸またはポリペプチドを含むかまたは有する）は、血液脳関門（ＢＢＢ）標的化薬剤、例えば、トランスフェリン、インスリン、レプチン、インスリン様成長因子、カチオン性ペプチド、レクチン、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）（小胞体およびゴルジに局在する３９ｋＤシャペロン、リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）受容体ファミリーリガンド）、アポリポタンパク質Ｂ－１００由来ペプチド、トランスフェリン受容体に対する抗体（例えば、ペプチド模倣モノクローナル抗体）、インスリン受容体に対する抗体（例えば、ペプチド模倣モノクローナル抗体）、インスリン様成長因子受容体に対する抗体（例えば、ペプチド模倣モノクローナル抗体）、レプチン受容体に対する抗体（例えば、ペプチド模倣モノクローナル抗体）などに直接または間接的に連結またはコンジュゲートされる。代替実施形態では、例えば、米国特許出願公開第２００５０１４２１４１号；２００５００４２２２７号に記載されるように、ＢＢＢの通過を促進する、ＡＩＢＰペプチドまたはポリペプチド、またはＡＩＢＰを含むナノ粒子、リポソームなどの任意のプロトコルまたは修飾を使用することができる。例えば、本明細書で提供される方法を実施するために使用される組成物のＣＮＳまたは脳送達を強化するために、任意のプロトコル、例えば、直接頭蓋内注射、ＢＢＢの一過性透過処理、および／または組織分布を変化させるためのＡＩＢＰペプチドもしくはポリペプチド、またはＡＩＢＰ含有ナノ粒子、リポソームなどの修飾を使用することができる。
送達細胞および送達ビヒクル
代替実施形態では、任意の送達ビヒクルを使用して、本明細書で提供される方法または使用を実施し、例えば、インビボでＣＮＳまたは脳に組成物（例えば、組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチド）を送達することができる。例えば、米国特許出願公開第２００６００８３７３７号に記載されるように、例えば、ポリエチレンイミン誘導体などのポリカチオン、カチオン性ポリマーおよび／またはカチオン性ペプチドを含む送達ビヒクルを使用することができる。一実施形態では、送達ビヒクルは、内在性または外来性ＡＩＢＰを発現または過剰発現し、次いで分泌するように操作された形質導入細胞である。
一実施形態では、乾燥したポリペプチド－界面活性剤複合体は、例えば、米国特許出願公開第２００４０１５１７６６号に記載されるように、例えば、本明細書で提供される方法を実施するために使用される組成物を製剤化するために使用される。
一実施形態では、本明細書で提供される方法および使用を実施するために使用される組成物は、例えば、米国特許第７，３０６，７８３号；６，５８９，５０３号に記載されるように、細胞膜透過性ペプチドコンジュゲートを有するビヒクルを使用して細胞に適用することができる。一態様では、送達される組成物は、細胞膜透過性ペプチドにコンジュゲートされている。一実施形態では、送達される組成物および／または送達ビヒクルは、例えば、米国特許第５，８４６，７４３号に記載されるように、高塩基性でポリホスホイノシチドに結合する輸送媒介ペプチドにコンジュゲートされている。
一実施形態では、後にＣＮＳまたは脳に送達される細胞は、ＡＩＢＰ発現核酸、例えば、ベクターで、例えば、電気透過処理によってトランスフェクトまたは形質導入される。この電気透過処理は、例えば、例えば米国特許第７，１０９，０３４号；６，２６１，８１５号；５，８７４，２６８号に記載されているような任意のエレクトロポレーションシステムを使用して、組成物を細胞に送達するための一次的または補助的手段として使用することができる。
ＡＩＢＰコード核酸のインビボ送達
代替実施形態では、ＡＩＢＰペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸、またはＡＩＢＰ活性を有するペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸、またはこれらの核酸を含有するベクターもしくは組換えウイルスを送達するための組成物および方法が提供される。代替の実施形態では、核酸、ベクターまたは組換えウイルスは、インビボのために、またはＣＮＳ送達および発現のために設計される。
代替実施形態では、組換えＡＩＢＰコード核酸もしくは遺伝子、または組換えＡＩＢＰコード核酸もしくは遺伝子を含む（有する その中に含有する）発現ビヒクル（例えば、ベクター、組換えウイルスなど）の送達および制御発現のための組成物および方法が提供され、その結果、ＡＩＢＰタンパク質は血流または全身循環に放出され、例えば、ＣＮＳ、脳または他の標的などの体内で有益な効果をもたらすことができる。
代替実施形態では、目的に合わせた処置および最適な安全性の確保のために、ＡＩＢＰ発現核酸または遺伝子発現を容易かつ効率的にオンおよびオフにすることができる方法が提供される。
代替実施形態では、組換えＡＩＢＰタンパク質または１または複数のＡＩＢＰ発現核酸もしくは遺伝子によって発現されるタンパク質は、たとえそれらの１または複数の作用部位から離れた（例えば、解剖学的に離れた）血液または全身循環に分泌されたとしても、組織または器官、例えば、脳、ＣＮＳ、または他の標的に対して有益なまたは好ましい効果（例えば、治療または予防）を有する。
代替実施形態では、本明細書で提供される方法を実施するための組換えＡＩＢＰコード核酸もしくは遺伝子のインビボ発現のための発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスなどが提供される。代替実施形態では、ＡＩＢＰ核酸または遺伝子を発現する発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスなどは、例えば来院中に、例えば外来患者として、筋肉内（ＩＭ）注射、静脈内（ＩＶ）注射、皮下注射、吸入、微粒子銃粒子送達系（例えば、いわゆる「遺伝子銃」）などによって送達することができる。
代替実施形態では、この「周辺」送達様式、例えば、ＩＭまたはＩＶで注射される発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルスなどは、遺伝子または核酸が器官（例えば、脳またはＣＮＳ）自体で直接発現する場合に遭遇する問題を回避することができる。血流または全身循環におけるＡＩＢＰの持続的な分泌はまた、注入によるタンパク質の投与の困難さと費用を回避する。
代替実施形態では、組換えウイルス（例えば、長期ウイルスまたはウイルスベクター）、またはベクター、または発現ベクターなどは、例えば、全身静脈（例えば、ＩＶ）に、または筋肉内（ＩＭ）注射によるか、吸入によるか、または微粒子銃粒子送達系（例えば、いわゆる「遺伝子銃」）によって、例えば外来患者として、例えば、医院で注射することができる。代替的な実施形態では、数日または数週間後（例えば、４週間後）に、個体、患者または対象に、ＡＩＢＰ発現核酸もしくは遺伝子の発現を誘導する化学物質または医薬品が投与（例えば、吸入、注射または嚥下）される。例えば、遺伝子の発現を活性化する経口抗生物質（例えば、ドキシサイクリンまたはラパマイシン）は、毎日１回（またはそれを超えるかまたはそれ以下の頻度で）投与される。代替実施形態では、核酸または遺伝子の「活性化」または発現の誘導（例えば、誘導性プロモーターによる）の後、ＡＩＢＰタンパク質が合成されて対象の循環中に（例えば、血液中に）放出され、その後、個体または患者に利益をもたらす好ましい生理学的効果、例えば治療的または予防的効果を有する（例えば、心臓、腎臓または肺の機能に有益である）。医師または対象がＡＩＢＰ処置の中止を望む場合、対象は、活性化化学物質または医薬品、例えば抗生物質の服用を単に中止する。代替実施形態は、本明細書で提供される方法を実施するために使用されるヌクレオチド配列、例えば、核酸の発現に影響を及ぼすことができるＡＩＢＰ発現核酸を、例えば、そのような配列と適合する宿主内の構造遺伝子または転写物（例えば、ＡＩＢＰタンパク質をコードする）として含むかまたは有する「発現カセット」の使用を含む。発現カセットには、ポリペプチドコード配列または阻害配列と作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含めることができる；さらに、一態様では、他の配列、例えば、転写終結シグナルを含む。発現を行うのに必要または有用なさらなる因子、例えばエンハンサーも使用され得る。
代替態様では、発現カセットには、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「ネイキッドＤＮＡ」ベクターなども含められる。代替態様では、「ベクター」は、細胞に感染、トランスフェクト、一過性または永続的に形質導入することができる核酸を含み得る。代替態様では、ベクターは、ネイキッド核酸、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化した核酸であり得る。代替態様では、ベクターは、ウイルスまたは細菌の核酸および／またはタンパク質、および／または膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど）を含み得る。代替態様では、ベクターには、限定されるものではないが、ＤＮＡの断片が付着して複製され得るレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）が含まれ得る。したがって、ベクターには、限定されるものではないが、ＲＮＡ、自律的自己複製環状または線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルス、など、例えば、米国特許第５，２１７，８７９号を参照）が含まれ、発現プラスミドと非発現プラスミドの両方を含むことができる。代替態様では、ベクターは、自律構造として有糸分裂中に細胞によって安定に複製され得るか、または宿主のゲノム内に組み込まれ得る。
代替態様では、「プロモーター」は、細胞、例えば筋肉、神経または脳細胞などの哺乳動物細胞におけるコード配列の転写を駆動することができるすべての配列を含む。本明細書で提供される構築物に使用されるプロモーターには、核酸、例えばＡＩＢＰコード核酸の転写のタイミングおよび／または速度を調節することまたはモジュレートすることに関与する、シス作用性転写制御エレメントおよび調節配列が含まれる。例えば、プロモーターは、シス作用性転写制御エレメントであってよく、それには、転写調節に関与する、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組込み配列、５’および３’非翻訳領域、またはイントロン配列が含まれる。これらのシス作用性配列は、通常、タンパク質または他の生体分子と相互作用して転写を行う（オン／オフ切り替え、調節する、モジュレートするなど）。
代替実施形態では、「構成的」プロモーターは、大部分の環境条件下および発生または細胞分化の状態下で継続的に発現を駆動するプロモーターであり得る。代替実施形態では、「誘導性」または「調節性」プロモーターは、環境条件、投与された化学物質、または発生条件の影響下で、核酸、例えばＡＩＢＰコード核酸の発現を指示することができる。
遺伝子治療および遺伝子送達ビヒクル
代替の実施形態では、本発明の方法は、核酸もしくは遺伝子、またはＡＩＢＰ発現核酸、転写物またはメッセージのペイロードを、例えば遺伝子治療送達ビヒクルとして、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで１または複数の細胞に送達するための核酸（例えば、組換えＡＩＢＰコード核酸をコードする遺伝子またはポリペプチド）送達システムの使用を含む。
代替実施形態では、本明細書で提供される方法を実施するために使用される発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または同等物は、以下であるかまたは以下を含む：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクターもしくはアデノウイルスベクター；ＡＡＶ血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９；アカゲザル由来ＡＡＶ、またはアカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２；臓器指向性ＡＡＶ、または神経指向性ＡＡＶ；および／またはＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型。代替実施形態では、ＡＡＶは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶに対して非許容性である特定の細胞型を標的とする効率を高め、かつ／または目的の細胞型のみに感染する効率を改善するように操作される。代替実施形態では、ハイブリッドＡＡＶは、１）トランスカプシド化、２）二重特異性抗体のカプシド表面への吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作を含む、１またはそれを超える改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される。野生型（ｗｔ）ウイルスに対して非許容性である特定の細胞型を標的とする効率を高めるため、および目的の細胞型のみを感染させる効率を改善するために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを操作する方法は当技術分野で周知である。例えば、Ｗｕら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００６ Ｓｅｐ；１４（３）：３１６－２７．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｊｕｌ ７；Ｃｈｏｉ、ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊｕｎ；５（３）：２９９－３１０を参照されたい。
例えば、代替実施形態では、インビボで脳組織への取り込みが増加している血清型ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－ＤＪまたはＡＡＶ－ＤＪ／８（商標）（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、ＣＮＳでの発現のためにＡＩＢＰコード核酸ペイロードを送達する。代替実施形態では、特定の組織を標的化するために、以下の血清型またはそのバリアントが使用される。
Figure 2024510757000031
代替実施形態では、アカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２またはその等価物は、使用することができ、アカゲザル由来ＡＡＶは、ヒトにおける任意の既存の免疫によって阻害されない可能性がある；例えば、Ｓｏｎｄｈｉ、ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２ Ｏｃｔ；２３（５）：３２４－３５、Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ ６；Ｓｏｎｄｈｉ、ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２ Ｏｃｔ １７を参照されたい；これらは、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２をラットおよび非ヒト霊長類のＣＮＳにヒトに拡張可能な用量で直接投与すると、許容され得る安全性プロファイルが得られ、ＣＮＳにおける有意なペイロード発現が媒介されることを教示している。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は霊長類の一般的な感染因子であり、したがって健康な霊長類は、ＡＡＶ媒介性遺伝子導入治療戦略を阻害するＡＡＶ特異的中和抗体（ＮＡｂ）の大きなプールを保有しているため、本明細書で提供される方法は、個別化された処置設計を容易にし、治療有効性を高めるために、処置前に、特に頻繁に使用されるＡＡＶ８カプシド成分を用いてＡＡＶ特異的ＮＡｂについての患者候補をスクリーニングすることを含み得る；例えば、Ｓｕｎ、ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３ Ｊａｎ ３１；３８７（１－２）：１１４－２０、Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｏｃｔ １１を参照されたい。
投薬
本明細書で提供される方法および使用を実施するために用いられる医薬組成物および製剤は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療用途では、組成物は、例えば神経障害性疼痛を含む疾患、状態、感染または疾患およびその合併症の臨床徴候を治癒、軽減、または部分的に停止させるのに十分な量（「治療有効量」）で、すでに疾患、状態、感染または欠損症に罹患している対象に投与される。例えば、代替実施形態では、本明細書で提供される組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸もしくはポリペプチドを含む医薬組成物および製剤は、神経障害性疼痛、炎症誘発性神経障害性疼痛、炎症誘発性神経障害性疼痛、神経またはＣＮＳの炎症、異痛症、神経損傷後疼痛または神経障害性疼痛、術後疼痛または神経障害性疼痛、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性異痛症）、神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患または状態、必要に応じてアルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、片頭痛、痛覚過敏、必要に応じて緑内障またはその他の目の炎症性疾患、必要に応じて肺炎症および喘息、必要に応じてＨＩＶ感染またはその併存疾患、および／または必要に応じて血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患を処置、防止、逆転および／または改善するのに十分な量で、投与することを必要とする個体に投与される。
これを達成するのに十分な医薬組成物の量は、「治療有効量」と定義される。この使用に有効な投薬スケジュールおよび量、すなわち「投与レジメン」は、疾患または状態の段階、疾患または状態の重症度、患者の健康の全般的な状態、患者の身体状態、年齢などを含む様々な要因に依存する。患者の投薬レジメンを計算する際は、投与様式も考慮される。
代替実施形態では、アデノウイルスまたはＡＡＶベクターなどのウイルスベクターは、投与することを必要とする個体に投与され、代替実施形態では、ヒトに投与される投薬量は、体重１ｋｇ当たり約２×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）、または体重１ｋｇ当たり約１０１０～１０１４ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の間、または約１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５ｖｇ／ｋｇ、またはそれより多い用量を含み、これらは必要に応じて単一投薬量または複数投薬量として投与することができる。代替実施形態では、これらの投薬量は、経口、ＩＭ、ＩＶ、または髄腔内に投与される。代替実施形態では、ベクターは、製剤または医薬品として送達され、例えば、ベクターは、ナノ粒子、粒子、ミセルまたはリポソームもしくはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックスまたはデンドリマーに含まれている。代替実施形態では、これらの投薬量は、ＡＩＢＰの発現を実際に測定することによるかまたは治療効果、例えば、疼痛の軽減を監視することによって監視することができる組換えＡＩＢＰのインビボ発現量を維持するために、１日１回、１週間に１回、または必要に応じてその任意の変化形で投与される。投薬レジメンはまた、当技術分野で周知の薬物動態パラメータ、すなわち、活性薬剤の吸収速度、バイオアベイラビリティ、代謝、クリアランスなどを考慮する（例えば、Ｈｉｄａｌｇｏ－Ａｒａｇｏｎｅｓ（１９９６）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８：６１１－６１７；Ｇｒｏｎｉｎｇ（１９９６）Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ５１：３３７－３４１；Ｆｏｔｈｅｒｂｙ（１９９６）Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ ５４：５９－６９；Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９９５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８４：１１４４－１１４６；Ｒｏｈａｔａｇｉ（１９９５）Ｐｈａｒｍａｚｉｅ ５０：６１０－６１３；Ｂｒｏｐｈｙ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１０３－１０８；ｔｈｅ ｌａｔｅｓｔ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ（前出）、を参照）。最新技術により、臨床医は、個々の患者、活性薬剤および処置した疾患または状態について投薬レジメンを決定することができる。医薬品として使用される同様の組成物について提供されるガイドラインは、本明細書で提供される方法を実施して投与される投薬レジメン、すなわち、用量スケジュールおよび投薬量レベルが正確かつ適切であることを決定するためのガイドラインとして使用することができる。
患者が必要とし、許容する投薬量および頻度に応じて、製剤を単回または複数回投与することができる。製剤は、本明細書に記載の状態、疾患または症状を効果的に処置、防止または改善するために十分な量の活性薬剤を提供する必要がある。例えば、本明細書で提供される方法を実施するために使用される組成物の経口投与のための別の例示的な医薬製剤の１日量は、１日あたり体重１キログラム当たり約０．１から０．５から約２０、５０、１００もしくは１０００ｕｇの間またはそれより多い。代替実施形態では、１日当たり患者１人当たり体重１ｋｇ当たり約１ｍｇから約４ｍｇの投薬量が使用される。経口投与とは対照的に、血流中、体腔内、器官の内腔内により低い投薬量を使用することができる。局所もしくは経口投与、または粉末、スプレー、もしくは吸入による投与では、実質的により高い投薬量を使用することができる。非経口的にまたは非経口的でなく（non-parenterally）投与可能な製剤を調製するための実際の方法は、当業者には公知または明らかであり、前出のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓなどの刊行物により詳細に記載されている。
本明細書で提供される方法は、他の薬物または医薬品、例えば、関連する炎症性および自己免疫の疾患および状態などを含む任意の神経もしくは神経筋の疾患、状態、感染または損傷を処置するための組成物との共投与をさらに含むことができる。例えば、本明細書で提供される方法および／または組成物および製剤は、流体、抗生物質、サイトカイン、免疫調節剤、抗炎症剤、疼痛緩和化合物、補体活性化剤、例えばコラーゲン様ドメインまたはフィブリノーゲン様ドメイン（例えば、フィコリン）を含むペプチドまたはタンパク質、炭水化物結合ドメインなどおよびそれらの組合せと共製剤化および／または共投与することができる。
化合物の生物学的等価体
代替の実施形態では、本明細書で提供される方法を実施するために使用される化合物、例えば組換えＡＰＯＡ１ＢＰ活性を有するポリペプチドの生物学的等価体も提供される。本明細書で提供される方法を実施するために使用される生物学的等価体には、例えば、組換えＡＰＯＡ１ＢＰ核酸およびポリペプチドの生物学的等価体が含まれ、これは代替実施形態では、本明細書で提供される方法または使用を実施するために使用される化合物と実質的に同様の生物学的特性を生じる置換基および／または実質的に同様の物理的もしくは化学的特性を有する基による１またはそれを超える置換基および／または基の置き換えを含み得る。一実施形態では、１つの生物学的等価体を別の生物学的等価体に交換する目的は、化学構造に有意な変化を起こさずに化合物の所望の生物学的または物理的特性を向上させることである。
例えば、一実施形態では、１またはそれを超える水素原子は、例えば、代謝的酸化の部位において、１またはそれを超えるフッ素原子で置き換えられる；これにより、代謝（異化）が起こるのを防ぐことができる。フッ素原子は水素原子とサイズが類似しているため、分子の全体的なトポロジーは大きく影響されず、所望の生物学的活性は影響されない。しかし、代謝のための経路が遮断された分子は、半減期が長くなるか、または毒性が低くなることがある。
ＣＮＳまたは脳に治療薬を直接送達するためのデバイス
代替実施形態では、本明細書で提供される方法を実施するために使用されるナノ粒子およびリポソームを含む医薬組成物および製剤は、例えば、静脈内または髄腔内への注射によるか、または当技術分野で公知の様々なデバイスによって、ＣＮＳまたは脳に直接送達される。例えば、米国特許出願公開第２００８０１４００５６号には、医薬品および製剤を直接脳に送達するための髄腔内腔で吻側に進むカテーテルが記載されている。埋め込み型注入デバイスも使用することができる。例えば、注入デバイスから脳に流体を送達するためのカテーテルは、腹部から患者の頭蓋まで皮下に通すことができ、カテーテルはドリル穴を介して個体の脳にアクセスすることができる。あるいは、カテーテルは、患者の脊柱管内の髄腔内に薬剤を送達するように埋め込まれてもよい。患者の頭蓋骨の下に導入するための遠位端と、患者の体外に残っている近位端を有する可撓性ガイドカテーテルも使用することができる。例えば、米国特許出願公開第２００６０１２９１２６号を参照されたい。
代替実施形態では、本明細書で提供される方法を実施するために使用される医薬組成物および製剤は、ナノ粒子およびリポソームを含む医薬組成物および製剤の直接送達、または、例えば、米国特許出願公開第２００８０１３２８７８号に記載されているような細胞移植カニューレ、シリンジなど；または例えば、米国特許第７，３４３，２０５号に記載されているような細長い医療用挿入デバイス；または例えば、米国特許第４，８９９，７２９号に記載されているような外科用カニューレを例えば使用した、ＡＩＢＰを発現する細胞の脳への直接移植を介して送達される。移植用カニューレ、シリンジなども、例えば流体懸濁液などの液体の直接注入に使用することができる。
代替実施形態では、本明細書で提供される方法を実施するために使用される医薬組成物および製剤は、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および／またはＸ線コンピューター断層撮影法（ＣＴ）によって検出可能なトレーサーとともに送達される。トレーサーは、治療薬とともに共注入することができ、例えば、米国特許第７，３７１，２２５号に記載されているように、治療薬が標的組織を通って移動するときの治療薬の分布を監視するために使用することができる。
キットおよび指示
例えば、神経障害性疼痛を処置、改善または防止するための本明細書で提供される方法を実施するための、組成物（本明細書に記載されるデバイスを含む）および／または指示を含むキットが提供される。したがって、キット、細胞、ベクターなども提供することができる。代替実施形態では、本明細書で提供される方法を実施するために使用される組成物、あるいいは本明細書で提供される組成物、医薬組成物または製剤を含み、必要に応じてその使用のための指示を含むキットが提供される。
本発明は、本明細書に記載される実施例を参照してさらに説明される。しかしながら、本発明はそのような例に限定されないことを理解されたい。
実施例
実施例１：疼痛を処置するための例示的な方法において実証された有効性
この実施例は、例えば、例えば異痛症およびＴＬＲ４媒介炎症誘発性神経障害性疼痛を含む神経障害性疼痛を処置または改善するための、例示的な実施形態、および本明細書で提供される方法の有効性を記載および実証する。
神経炎症は、神経障害性疼痛状態への移行とその持続における主要な構成要素である。脊髄神経炎症は、ここではインフラマラフトと呼ばれる肥大したコレステロール富化脂質ラフトに局在するＴＬＲ４の活性化を伴う。ミクログリアにおけるコレステロール輸送体ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１の条件付き欠失は、ナイーブマウスにおいてインフラマラフトの形成をもたらし、触覚異痛症を誘発した。ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＩＢＰ）は、野生型マウスの化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）モデルにおいて、インフラマラフトからのコレステロール枯渇を促進し、神経障害性疼痛を逆転させたが、ＡＩＢＰ（化合物７）は、ＡＢＣＡ１／ＡＢＣＧ１欠損ミクログリアを有するマウスにおいて異痛症を逆転させることができず、コレステロール依存性の機序が示唆された。ＴＬＲ４結合ドメインを欠くＡＩＢＰ変異体はミクログリアに結合せず、ＣＩＰＮ異痛症も逆転させなかった。ＣＩＰＮにおけるＡＩＢＰ（化合物７）単回投与の持続的な治療効果は、抗炎症およびコレステロール代謝の再プログラミングおよびミクログリアにおける脂質滴の蓄積の減少に関連していた。これらの結果は、ミクログリアにおけるＴＬＲ４インフラマラフトおよび遺伝子発現プログラムを制御し、神経炎症の持続を遮断することによる、神経障害性疼痛の調節のコレステロール駆動機構を示唆する。
結果
化学療法誘発性末梢神経障害は、脊髄ミクログリアにおける脂質ラフトおよびＴＬＲ４二量体化を変化させる
化学療法誘発性末梢神経障害モデル（Ｗｏｌｌｅｒら、２０１８）では、シスプラチンの腹腔内注射により、雄マウスに重度の触覚異痛症が誘発された（図１Ａ）。この状態は、脊髄ミクログリアにおける脂質ラフトの形成の増加と関連しており、膜コレステロール動態の変化、およびＴＬＲ４の二量体化の増加を示唆していた（図１Ｂおよび１Ｃ）。髄腔内ＡＩＢＰ（化合物７）は、脊髄ミクログリアにおいてＣＩＰＮ関連異痛症を逆転させ、脂質ラフトおよびＴＬＲ４二量体レベルを正常化した（図１Ａ～Ｃ）。これらのデータは、他の細胞型（Ｃｈｅｎｇら、２０１２；Ｚｈｕら、２０１０）で実証されているように、ＴＬＲ４炎症カスケードの活性化の最初のステップであるＴＬＲ４受容体二量体化がミクログリアの脂質ラフトで起こることを示唆している。この考えは、脂質ラフト中のＴＬＲ４の局在化がＬＰＳで処置したＢＶ－２ミクログリア細胞で有意に増加し、ＡＩＢＰ（化合物７）がＬＰＳ誘導ＴＬＲ４－ＣＴｘＢの共局在を防止した、インビトロ実験で裏付けられた（図１Ｄ）。フローサイトメトリーおよび顕微鏡実験で使用したＴＬＲ４抗体の特異性を、Ｔｌｒ４－／－マウス由来の細胞を用いて検証した（図Ｓ１ＡおよびＢ）。後根神経節（ＤＲＧ）のマクロファージも侵害受容反応に関与してＴＬＲ４を発現するので、本発明者らはそれらのＴＬＲ４二量体化および脂質ラフト含有量を評価した。しかし、ＤＲＧ ＣＤ１１ｂ＋骨髄系細胞ではこの時点で有意な変化は観察されなかった（図Ｓ１ＣおよびＤ）。
ＣＳＦおよび脊髄におけるＡＩＢＰ（化合物７）の短時間曝露
ＡＩＢＰ（化合物７）の単回髄腔内投与は、ＣＩＰＮマウスにおける異痛症を逆転させる持続性の治療効果を少なくとも２か月間持続させた（Ｗｏｌｌｅｒら、２０１８）。このことは、ｉ．ｔ．送達の際に脊髄でのＡＩＢＰ（化合物７）の長期曝露によるか、あるいは遺伝子発現プロファイルの変化に反映される疾患修飾効果のいずれかによって説明することができる。前者を試験するために、本発明者らは組換えＡＩＢＰのｉ．ｔ．送達後のＣＳＦおよび腰髄ホモジネート中のＡＩＢＰの薬物動態を測定した。これらの実験では、脊髄組織における内在性のマウスＡＩＢＰと本発明者らが使用する抗体との交差反応を回避するために、本発明者らはＡｐｏａ１ｂｐ－／－マウスを使用した。この研究では、ＣＳＦおよび脊髄組織におけるＡＩＢＰ（化合物７）の短期間の曝露が実証され、３０分までにピークレベルに達し、４時間後にはすでに検出不能であることが示された（図１Ｅおよび１Ｆ）。これらの結果は、ＣＳＦからの高分子の急速なクリアランスに関する最近の報告と一致しており（Ａｈｎら、２０１９）、膜内のＴＬＲ４動態の緩和と、おそらくＡＩＢＰの他の効果の結果として、脊髄ミクログリアおよび／または他の細胞型の再プログラミングが起こることを示唆している。
化学療法誘発性末梢神経障害は、脊髄ミクログリアにおける遺伝子発現プロファイルを変化させる
ＣＩＰＮにおける脊髄ミクログリアを特徴付けるために、本発明者らは、ナイーブ、シスプラチン／食塩水およびシスプラチン／ＡＩＢＰ（化合物７）で処置した野生型（ＷＴ）マウスから単離した脊髄ミクログリアのＲＮＡ－ｓｅｑおよび差次的遺伝子発現解析を行った（品質管理およびデータセットの特徴付けについては、方法および図Ｓ２を参照されたい）。本発明者らは、尤度比検定（ＬＲＴ）を使用してすべてのサンプルにわたってどの条件によっても調節される遺伝子を特定し、脊髄ミクログリアのトランスクリプトームにおけるＣＩＰＮおよびＡＩＢＰ（化合物７）の主な効果を示す３２５４個の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を特定した（図２Ａ）。これらの変化の大部分はＣＩＰＮ状態によって引き起こされ、ＡＩＢＰ（化合物７）の影響はほとんどなかった（図２Ａおよび２Ｂ、群１および群２）。しかし、ＣＩＰＮ調節遺伝子のより小さな群が存在し、この変化はＡＩＢＰ（化合物７）処置によって完全に逆転した（図２ＡおよびＢ、群３および群４）。ＣＩＰＮにおいて上方調節された経路および遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスの中には、複製、翻訳およびミトコンドリア機能があった。富化された経路のいくつかは、パーキンソン病およびアルツハイマー病などのＣＮＳ疾患に関連するミクログリアの表現型の変化に関連していた（図２Ｃ）。コレステロール輸送体Ａｂｃａ１およびＡｂｃｇ１は、シスプラチン処置マウス由来のミクログリアにおいて下方調節され、膜コレステロール輸送障害を示した（図３Ａおよび３Ｃ）。下方調節された遺伝子の中には、オートファジーおよびリポファジーにおいて重要なリソソーム遺伝子があり、脂質貯蔵調節不全が示唆された。アラキドン酸代謝遺伝子も上方調節されており（図３Ｃ）、生理活性脂質メディエーターの放出および炎症が示唆される。
ＬＲＴ分析後のＣＩＰＮ群とナイーブ群のペアワイズ比較を使用して、本発明者らは、神経変性疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）への移行に関連する表現型であるＣｘ３ｃｒ１、Ｐ２ｒｙ１２およびＴｍｅｍ１１９恒常性マーカー（図３ＡおよびＢ）の下方調節も観察した（Ｍａｓｕｄａら、２０１９；Ｎｕｇｅｎｔら、２０２０；Ｐｒｉｎｚら、２０１９）。ミクログリアのＤＡＭシグネチャー遺伝子のサブセットは、恒常性遺伝子が減少し、炎症性遺伝子とコレステロール代謝遺伝子が増加するＤＡＭシグネチャーが明らかになった。食作用性ＴＡＭ受容体であるＴｙｒｏｂｐ、ＡｘｌおよびＭｅｒｔｋの調節は、ＣＩＰＮミクログリアにおいて、本発明者らがＴｒｅｍ２の下方調節を観察し、そのパートナー受容体遺伝子であるＴｙｒｏｂｐには有意な効果が見られなかった事を除いて、神経変性疾患に特徴的なＤＡＭを部分的に模倣していた（図３Ｂ）。これは、マクログリアおよびマクロファージにおける脂質恒常性の変化および脂質蓄積の増加に関連する食作用性表現型の減少を示唆する（Ｊａｉｔｉｎら、２０１９；Ｍａｒｓｃｈａｌｌｉｎｇｅｒら、２０２０）。
興味深いことに、ＣＩＰＮにおいて富化された脂質貯蔵遺伝子に関連するＤＡＭシグネチャーの一部は、脂質滴タンパク質ＰＬＩＮ２をコードする遺伝子を含め、ＡＩＢＰ（化合物７）によって下方調節された（図３Ｂおよび３Ｃ）。ＰＬＩＮ２免疫組織化学は、ＲＮＡ－ｓｅｑ結果を検証し、シスプラチン処置マウスの脊髄ミクログリアにおける脂質滴の数およびサイズの増加、ならびにＡＩＢＰ（化合物７）によるこの効果の逆転を示した（図３Ｄ～Ｈ）。
ＡＩＢＰ（化合物７）による炎症性遺伝子発現のＣＩＰＮ誘発性変化の選択的逆転
ＣＩＰＮによって上方調節され、ＡＩＢＰによって逆転された遺伝子群（図２Ｂおよび図Ｓ２Ｆの群３）を分析すると、炎症応答、白血球走化性および好中球脱顆粒経路の経路が富化されていることが見出された（図４Ａ）。これらの富化経路中の遺伝子の一部には、Ｉｌ１ｂ、Ｃｃｌ２、Ｇｌｉｐｒ１およびＧｌｉｐｒ２、Ｇｐｎｍｂ、Ｃｘｃｌ２、Ｃｘｃｌ３、Ｓ１００ａ８、Ｉｌ２２ｒａ２、Ｉｌ１ｒ２、Ｆｐｒ１、Ａｐｏｅ、Ｃｃｌ９ならびにＴＬＲ４相互作用因子遺伝子Ｔｒｉｌが含まれる（図４ＢおよびＣ）。脊髄組織におけるサイトカインタンパク質発現を調べ、本発明者らは、ＡＩＢＰ（化合物７）によるＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）およびＣＸＣＬ２（ＭＩＰ２）発現の調節を確認した（図４Ｄ）。ＡＩＢＰ（化合物７）はまた、シスプラチンによって誘導されなかった炎症性遺伝子および非炎症性遺伝子も下方調節した。これらには、Ｃｃｌ２４、Ｉｌ３ｒａ、Ｘｃｒ１およびＴＬＲ４経路関連遺伝子Ｐｔｐｎ２２が含まれる（図４Ｅ）。ＡＩＢＰ（化合物７）によって下方調節されたすべての遺伝子の経路およびＧＯ分析は、サイトカイン－サイトカイン受容体相互作用、プロテインキナーゼＡおよびＣおよびＭＡＰＫ調節経路、受容体媒介エンドサイトーシスおよび他の膜シグナル伝達経路と共に、ＴＬＲ４シグナル伝達経路における富化を示す（図４Ｆ）。カルシウムおよび膜電位の調節も下方調節され、ペプチダーゼ阻害剤経路の富化は、脂質膜と相互作用し、小胞輸送および神経伝達物質放出を調節するＰｉ１６およびα－シヌクレイン遺伝子Ｓｎｃａなどの最近報告された疼痛関連ペプチダーゼ阻害関連遺伝子におけるＡＩＢＰ（化合物７）の効果を示す（図４Ｇ）。
ＣＩＰＮモデルにおけるＡＩＢＰ（化合物７）処置マウス由来のミクログリアの差次的発現解析により、ＣＩＰＮにおいて下方調節され、ＡＩＢＰ（化合物７）によって逆転された４０個の遺伝子も明らかになった（図Ｓ２Ｅ）。富化された経路には、キナーゼおよびホスファターゼ活性の調節（図４Ａ）、ならびにアクチン細胞骨格、膜再編成および核シグナル伝達遺伝子Ｂｉｎ１、Ｐａｋ１、Ｖａｖ２およびＣｃｄｃ８８ａならびに膜脂質シグナル伝達カスケード関連タンパク質Ｄｇｋａの調節（図４Ｈ）が含まれた。全体として、これらの結果は、ＣＩＰＮマウスにおいて誘導されたミクログリア再プログラミングのＡＩＢＰ（化合物７）による逆転が、脂質代謝の調節と、膜から脂質滴および／または細胞外受容体への輸送に関与していることを示唆している。
ＡＩＢＰ（化合物７）は、ＡＢＣＡ１／ＡＢＣＧ１欠損ミクログリアを有するマウスにおいて異痛症を逆転させることができない
ミクログリアのコレステロール動態の侵害受容における役割を評価するために、本発明者らはまず、ＡＬＯＤ４の結合によって検出される、小胞体への流出または輸送に利用可能な膜コレステロールとＡＢＣＡ１コレステロール輸送体の共局在を測定した（Ｈｅら、２０１７）。ＢＶ－２細胞をＬＰＳで処理すると、脂質ラフトドメインにおけるＡＬＯＤ４とＡＢＣＡ１およびＡＰＯＡ１との共局在が減少し、この効果はＡＩＢＰ（化合物７）によって逆転した（図５ＡおよびＢ）。
次に、本発明者らは、タモキシフェン誘導ミクログリア特異的ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１ダブルノックアウトマウス（ＡＢＣ－ｉｍＫＯ、図５Ｃ）を作製し、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１ノックダウンが脊髄ＩＢＡ１＋ミクログリアで観察されたが、ＧＦＡＰ＋星状膠細胞またはＮｅｕＮ＋ニューロンでは観察されなかったことを確認した（図Ｓ３）。ミクログリアにおいてＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１コレステロール輸送体をノックダウンすると、刺激による負荷がなくても、基底異痛症（basal allodynia）が発生した（０日目）（図５Ｄ）。これらの結果は、ミクログリアのコレステロール輸送が障害されると、促進された状態をもたらすという証拠を追加するものである。実際、本発明者らは、ナイーブＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアが、ＷＴマウスのものと比較して、ＴＬＲ４の表面発現の増加、ＴＬＲ４二量体化の増加、およびより高い脂質ラフト含有量を有することを観察した（図５Ｅ）。
注目すべきことに、ＷＴマウスとは異なり、ｉ．ｔ．ＡＩＢＰ（化合物７）は、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおいてｉ．ｔ．ＬＰＳによって誘発される機械的異痛症を防止することができなかった（図５ＦおよびＳ５Ａ）。次に、本発明者らは、シスプラチンを用いてＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスマウスにＣＩＰＮを誘発し、異痛症のさらなる急速な発症を観察した。さらに、ＣＩＰＮモデルの７日目のＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおけるＡＩＢＰのｉ．ｔ．送達は機械的異痛症を逆転させなかったが（図５Ｇ）、ｉ．ｔ．ＡＩＢＰは、タモキシフェンの代わりにビヒクルで処置したトランスジェニック（同腹子）マウス（図５Ｈ）およびタモキシフェンで処置した野生型マウス（図Ｓ５Ｂ）において、ＣＩＰＮ異痛症の逆転に有効であった。形質膜からコレステロールを枯渇させるが、ＡＢＣＡ１またはＡＢＣＧ１の発現を必要としない２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ｈｐ－β－ＣＤ）のｉ．ｔ．注射は、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの異痛症を軽減した（図Ｓ４Ｃ）。ナイーブＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスでは、ＴＬＲ４二量体化および脂質ラフト存在量がナイーブＷＴマウスよりも有意に高く、それらはＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおいてシスプラチンによってもＡＩＢＰによっても有意に変化しなかった（図５ＩおよびＪ）。これらの結果は、ミクログリアにおけるインフラマラフトおよびＴＬＲ４二量体化動態を改変し、異痛症を逆転させるために、ＡＩＢＰがコレステロール輸送体を必要とするという考えを裏付ける。
ＡＢＣＡ１／ＡＢＣＧ１欠損はミクログリアをＣＩＰＮ様表現型に再プログラムする
ＣＩＰＮおよびＡＩＢＰに誘導される転写の変化におけるコレステロール輸送の効果を理解するために、本発明者らは、ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおける示差的遺伝子発現を分析した。本発明者らは、２つの遺伝子型および３つの実験条件にわたって有意に変化した１２１個の遺伝子を同定した（図Ｓ４Ｄ）。シスプラチンを負荷していないナイーブＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアでは、大部分の上方調節された遺伝子と富化された経路が、ＷＴマウスのシスプラチンによって誘導された上方調節された遺伝子と重複していた（図６ＡおよびＢ）。ナイーブＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの富化された経路の中で、本発明者らはインターフェロンに対する応答、炎症応答、補体活性化、およびアラキドン酸代謝経路を特定した（図６Ｂ）。上方調節されたインターフェロン遺伝子には、Ｉｆｉ２０７およびＩｆｉ２７ｌ２ａ、ならびに炎症遺伝子Ｘｃｒ１、Ｃｂ４、Ｃ３、およびＫｌｒｂ１ｂが含まれていた。脂質代謝関連遺伝子ＡｐｏｅおよびＣｈ２５ｈは、ＷＴマウスにおいてシスプラチンによって誘導された変化と同様に、ナイーブＡＢＣ－ｉｍＫＯにおいて有意に上方調節された（図６ＣおよびＦ）。このミクログリアの再プログラミングは、ナイーブＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスで観察される疼痛行動を少なくとも部分的に説明する可能性がある。
ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおけるＣＩＰＮの誘発は、ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアとＷＴミクログリアの両方に共通するいくつかの遺伝子セットおよび経路も上方調節した。しかし、ＷＴとは異なり、シスプラチン処置マウスのＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアでは、ファゴソームなどの経路、食作用カップ形成のためのアクチン動態および細胞周期経路は富化されなかった（図６ＤおよびＳ５Ｅ）。ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリア中のシスプラチンは、いくつかの炎症遺伝子の発現を誘導することができず、Ｃｘｃｌ３、Ｘｒｉｐ１およびファゴソーム関連ＦｃｒｌｓおよびＣｙｂｂ（ＮＯＸ２）の発現を下方調節した（図６ＦおよびＧ）。コレステロール輸送体の非存在下では、シスプラチンはコレステロール合成経路遺伝子を誘導せず、Ｃｈ２５ｈおよびＤｈｃｒ２４を下方調節したことから、過剰の遊離コレステロールが存在して、ＬＸＲアゴニストでありアテローム性動脈硬化症におけるマクロファージ泡沫細胞トランスクリプトームの重要な調節因子であるデスモステロールの蓄積に有利に働くことが示唆された（図６ＥおよびＧ）、（Ｓｐａｎら、２０１２）。食作用の障害およびＴｎｆｒｓｆ２６、Ｔｒｐｖ４、Ｉｌ３ｒａ、Ｉｌ１５ａ、およびＳｈｔｎ１の上方調節（図６Ｅ～Ｇ）は、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおける侵害受容プロセスに対する膜動態の差別的役割を示している可能性がある。
ＡＩＢＰ（化合物７）によるミクログリアの再プログラミングは、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１の発現に依存する
ＷＴマウスおよびＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおけるＡＩＢＰ（化合物７）の特異な効果（differential effect）を理解するために、本発明者らは、両方の遺伝子型においてＡＩＢＰ処置によって誘導される上方調節遺伝子と下方調節遺伝子とを比較した（図７ＡおよびＢ）。遺伝子調節に対するＡＩＢＰ（化合物７）の効果は著しく異なり、両方の遺伝子型で少数の共通遺伝子のみが下方調節された（図７Ａ）。コレステロール輸送機構が存在しない場合、ＡＩＢＰは炎症遺伝子を調節することができず、代わりにそれらの発現を誘導した（図７Ｂおよび図７Ｃ）。炎症遺伝子の誘導は、ＷＴミクログリアにおいて下方調節された、Ｄｈｃｒ２４およびＳｒｅｂｆ２を含む他のコレステロール生合成遺伝子の増加と相関する（図７Ｄ）。このことは、デスモステロールの減少およびコレステロール含有量の増加がミクログリアにおける炎症遺伝子の発現を調節することを示唆する。これと一致して、Ａｐｏｅ、Ａｐｏｃ１およびＰｐａｒｇなどのＬＸＲによって制御される遺伝子の誘導は、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスのミクログリアにおいて認められたが、ＷＴマウスでは認められなかった（図７Ｄ）。ＷＴと比較して、ＡＩＢＰ（化合物７）によってＡＢＣ－ｉｍＫＯにおいて反対方向に調節される他の非炎症遺伝子には、エンドペプチダーゼ活性遺伝子Ｐｉ１６およびＣａｐｎ１１ならびにＡＭＰＡ受容体およびシナプス調節因子Ａｒｃが含まれる（図７Ｅ）。ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおいて、ＡＩＢＰ（化合物７）は、コレステロール代謝経路、サイトカイン放出およびケモカインシグナル伝達調節、キナーゼおよびエンドペプチダーゼ活性ならびに葉状仮足および線維組織化経路を上方調節した（図７Ｆ）。これらの経路のほとんどは、ＷＴミクログリアにおいてＡＩＢＰによって下方調節された（図４Ｆ）。まとめると、これらのデータは、ＡＩＢＰ（化合物７）によって誘導されるミクログリア遺伝子発現の再プログラミングが、コレステロール輸送体ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１によって調節されるコレステロール恒常性に依存することを示している。
ミクログリアＡＩＢＰおよびＴＬＲ４は侵害受容を調節する
上記の実験が、ＡＩＢＰ（化合物７）に調節されるコレステロール恒常性と侵害受容におけるミクログリアＴＬＲ４の活性化を暗示したので、本発明者らは、ＡＩＢＰまたはＴＬＲ４のミクログリア特異的ノックアウトがＣＩＰＮ異痛症に影響するかどうかを調べた。本発明者らは、タモキシフェン誘導のミクログリア特異的Ａｐｏａ１ｂｐノックアウトマウスおよびＴｌｒ４ノックアウトマウスを作製した（ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯおよびＴＬＲ４－ｉｍＫＯ、図８Ａ）。ミクログリアの内在性ＡＩＢＰのノックダウンは、マウスにシスプラチンを負荷する前でさえ機械的異痛症を誘発した（０日目、図８Ｂ）。これは、ＡＩＢＰが機械的侵害受容においてミクログリア恒常性機能の維持に役割を果たすことを示唆している。ｆｌｏｘｅｄ遺伝子をもたない対照Ｃｘ３ｃｒ１－ＣｒｅＥＲＴ２マウスでは、タモキシフェンの注射は機械的異痛症を誘発しなかった（図８Ｃ）。シスプラチン負荷後、ミクログリアＡＩＢＰノックダウンは、対照マウスよりも機械的閾値の減少が早く（図８Ｄの２日目を図８Ｅの６日目と比較）、ミクログリアＡＩＢＰノックダウンマウスにおけるより高い感作を示した。７日目の組換えＡＩＢＰの髄腔内注射は、ビヒクルおよびタモキシフェン誘導ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウスの両方においてＣＩＰＮ関連異痛症を等しく逆転させた（図８Ｃおよび図８Ｄ）。全身Ａｐｏａ１ｂｐノックアウトマウスにおいて、本発明者らは、ＷＴマウスと比較して基底異痛症を観察せず、ｉ．ｔ．ＡＩＢＰはＣＩＰＮ誘発性異痛症を救済した（図８Ｆ）。ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯまたはＡＢＣ－ｉｍＫＯとは対照的に、ＴＬＲ４－ｉｍＫＯマウスは、シスプラチン誘発性異痛症の急速な発症から保護され、遅発性で軽度の異痛症を示し（図８Ｇ）、疼痛感作の媒介におけるミクログリアにおけるＴＬＲ４発現の役割を示唆した。
ＴＬＲ４結合に関与するＡＩＢＰドメインの特定
ＴＬＲ４－ｉｍＫＯマウスは初期／急性ＣＩＰＮから保護されていたため（図８Ｇ）、本発明者らは、このモデルを使用して、以前に報告したＡＩＢＰ－ＴＬＲ４結合のインビボでの重要性を評価することができなかった（Ｗｏｌｌｅｒら、２０１８）。ここで、本発明者らは異なるアプローチを取り、ＴＬＲ４に結合しなかったＡＩＢＰ変異体を作製した。ＡＩＢＰのどのドメインがＴＬＲ４への結合に関与しているかを解明するために、本発明者らは、タンパク質－タンパク質相互作用に関与するＡＩＢＰ（図９Ａ）のＹｊｅＦ＿Ｎドメインの結晶構造（Ｊｈａら、２００８）から予測されるアミノ酸を変異させることから開始したが、これらの変異体はＴＬＲ４結合特性を保持していた（図示せず）。次に、本発明者らは、タンパク質の全長をスキャンするＡＩＢＰの一連の欠失変異体を開発し、ＴＬＲ４外部ドメイン（ｅＴＬＲ４）を用いたプルダウンアッセイでそれらを試験した（図９Ｂ）。これらの実験は、ａａ １～２４シグナルペプチドの後ろに位置する２５～５１アミノ酸のＮ末端ドメインがｅＴＬＲ４結合に関与することを示唆した（図９Ａおよび図９Ｂ）。ａａ ２５～５１のＮ末端ドメインは、公開されているマウスＡＩＢＰの結晶構造では構造化されていなかった（Ｊｈａら、２００８）。ヒトおよびマウスＡＩＢＰは両方とも相同なａａ ２５～５１ Ｎ末端ドメインを含有するが、ゼブラフィッシュＡＩＢＰは含有しない。実際、ヒトおよびマウスとは異なり、ゼブラフィッシュＡＩＢＰはヒトｅＴＬＲ４に結合しなかった（図９Ｃ）。さらなる実験のために、本発明者らは、シグナルペプチドを欠くｗｔＡＩＢＰ（ａａ ２５～２８８）と、シグナルペプチドとＮ末端ドメインの両方を欠くｍｕｔＡＩＢＰ（ａａ ５２～２８８）をバキュロウイルス／昆虫細胞系から発現させ、精製した。
ｗｔＡＩＢＰとは異なり、ｍｕｔＡＩＢＰは、プルダウンアッセイ（図９Ｄ）でも、ｅＴＬＲ４被覆プレートを用いたＥＬＩＳＡでも、ｅＴＬＲ４に結合せず、本発明者らの研究室で開発したＢＥ－１抗ＡＩＢＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた結合ＡＩＢＰの検出（Ｃｈｏｉ他、２０２０）でも結合しなかった（図９Ｅ）。ＢＥ－１ ｍＡｂは、ｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰに対して等しい親和性を有していた（図Ｓ５Ｂ）。ｍｕｔＡＩＢＰとＡＰＯＡ１の結合は、ｗｔＡＩＢＰと比較して変化しなかった（図９Ｆ）。細胞培養実験では、ｗｔＡＩＢＰはＬＰＳで刺激したＢＶ－２ミクログリアに結合したが、ｍｕｔＡＩＢＰは結合しなかった（図９Ｇおよび図９Ｈ）。ＬＰＳに応答したｗｔＡＩＢＰ結合の増加は、細胞表面へのＴＬＲ４の動員およびインフラマラフトへのその局在化によって説明することができる（Ｙｖａｎ－Ｃｈａｒｖｅｔら、２００８；Ｚｈａｎｇら、２０１８；Ｚｈｕら、２０１０）。まとめると、これらの結果は、ＴＬＲ４結合におけるＡＩＢＰのａａ ２５～５１ Ｎ末端ドメインの役割を示唆している。
ＴＬＲ４結合ドメインを欠くＡＩＢＰは、ＣＩＰＮ異痛症を軽減することができない
ｗｔＡＩＢＰとは異なり、ＴＬＲ４結合部位を欠くｍｕｔＡＩＢＰは、ＢＶ－２ミクログリアにおいてＬＰＳ誘導ＴＬＲ４二量体化を阻害することができなかった（図１０Ａ）が、脂質ラフトを減少させる全体的な能力を保持していた（図１０Ｂ）。次に、本発明者らは、このＴＬＲ４の標的化がＡＩＢＰの治療効果を媒介するという仮説を試験した。ｉ．ｔ．ＬＰＳの前に食塩水またはｍｕｔＡＩＢＰをｉ．ｔ．投与されたマウスは、急速かつ同程度に異痛症を発症したのに対して、ｉ．ｔ．ｗｔＡＩＢＰは、ＬＰＳによって誘発される機械的異痛症を防止した（図１０Ｃ）。ＣＩＰＮマウスモデルでは、ｉ．ｔ．ｗｔＡＩＢＰは確立された異痛症を逆転させ、持続的な治療効果は少なくとも１４日間持続した（図１０Ｄ）。しかしながら、ｉ．ｔ．ｍｕｔＡＩＢＰは、機械的閾値の控えめな一過性の逆転のみを誘導し、ナイーブレベルまたはベースラインレベルに到達せず、２～３日間だけ持続した（図１０Ｄ）。２１日目にマウスを屠殺し、腰脊を分析した。注目すべきことに、この遅い時点でも、シスプラチン誘発性多発性神経炎は、脊髄ミクログリアにおけるＴＬＲ４二量体化および脂質ラフトの増加に関連し続けており、これは８日目に観察された効果（図１ＢおよびＣ）と同様に、ｉ．ｔ．ｗｔＡＩＢＰによって有意に減少したが、ｍｕｔＡＩＢＰでは減少しなかった（図１０ＥおよびＦ）。これらの結果は、ＴＬＲ４インフラマラフトのＡＩＢＰ標的化が、ＣＩＰＮのマウスモデルにおけるＡＩＢＰの治療効果の大部分を媒介するという仮説を裏付ける。
考察
本研究では、本発明者らは、化学療法誘発性末梢神経障害（図１０Ｇ）およびおそらくは他の神経障害における神経障害性疼痛の新たなレベルの調節として、脊髄ミクログリアにおけるＴＬＲ４をホストとするインフラマラフトからの選択的コレステロール枯渇の新たな機構を報告する。ミクログリアにおけるコレステロール輸送体ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１の条件付き欠失は、シスプラチン効果との類似性を示すナイーブマウスにおいて自発性異痛症を誘発し、重要なことに、ミクログリアにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１の発現の欠如は、ＬＰＳもしくはシスプラチンによって誘発される異痛症を逆転させるか、または脊髄ミクログリアにおけるインフラマラフトおよびＴＬＲ４二量体化を減少させるＡＩＢＰの能力を消失させた。挙動およびＴＬＲ４動態におけるこの特異な効果は、ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおける差次的な遺伝子発現およびＡＩＢＰが炎症遺伝子を抑制することができないことを伴っていた。
ＡＩＢＰは、活性化された細胞ではインフラマラフトを破壊する特異な能力（singular ability）を有するが、静止細胞では生理学的な脂質ラフトにはほとんど影響を及ぼさない。本発明者らは、これが、炎症細胞の表面で高度に発現するＴＬＲ４へのＡＩＢＰの結合によるものであり、コレステロール枯渇をこれらの細胞に指示していると提案した（Ｍｉｌｌｅｒら、２０２０；Ｗｏｌｌｅｒら、２０１８）。この研究では、本発明者らは、ＴＬＲ４の結合部位としてＡＩＢＰのＮ末端ドメインを特定し、活性化ミクログリアへのＡＩＢＰ結合を可能にするこのドメインの重要な役割およびＣＩＰＮにおけるその治療効果を実証した。これにより、シクロデキストリン、ＡＰＯＡ１およびＡＰＯＡ１模倣ペプチドまたはＬＸＲアゴニストによってもたらされる非選択的なコレステロール除去とは対照的に、ＡＩＢＰがインフラマラフトに向けられた選択的治療となることを本発明者らは提案する。Ｎ末端ドメインを欠く変異したヒトＡＩＢＰは依然としてＡＰＯＡ１に結合しており、このＮ末端ドメインが天然に存在しない野生型ゼブラフィッシュＡｉｂｐは、依然として内皮細胞からのコレステロール流出を増大させ、血管新生を調節し、造血性内皮細胞からの造血幹細胞および前駆細胞の出現を調整するが（Ｆａｎｇら、２０１３；Ｇｕら、２０１９）、このことから、ＡＩＢＰと内皮細胞との相互作用にはＴＬＲ４非依存性の異なる機構があることが示唆される。
ＡＩＢＰの髄腔内送達は、ＣＩＰＮのマウスモデルにおいて持続的な治療効果を有し、本発明者らの以前の研究（Ｗｏｌｌｅｒら、２０１８）では１０週間もの長期間にわたって、本研究では２週間にわたって観察された。これは、ｉ．ｔ．ＡＩＢＰの短時間の曝露とは対照的である。ＡＩＢＰは、３０分でピークに達し、４時間後までにＣＳＦと腰髄組織の両方からほぼ消失した。曝露と治療効果との間の解離は、ＡＩＢＰの疾患修飾作用を示唆している。脊髄ミクログリアにおけるＣＴｘＢ結合の減少とＴＬＲ４二量体の割合の減少は、単回ｉ．ｔ．ＡＩＢＰ注射後２４時間、さらには２週間も観察され、食塩水をｉ．ｔ．注射したＣＩＰＮマウスのミクログリアではそれらが持続的に存在することとは対照的に、ＡＩＢＰによるインフラマラフトの持続的な破壊が示される。ＴＬＲ４インフラマラフトに対する標的効果に加えて、ＡＩＢＰ疾患修飾効果には、脊髄ミクログリアにおける遺伝子発現プロファイルの再プログラミングが関与している可能性がある。ＡＩＢＰは、脊髄ミクログリアにおける発現がＣＩＰＮによって影響された全遺伝子の３％しか逆転させなかったが、ＡＩＢＰは、シスプラチンレジメンによって誘導された脊髄組織における炎症遺伝子発現および炎症性サイトカインのレベルを有意に低下させた。これらには、Ｉｌ１ｂ、Ｃｘｃｌ２およびＣｃｌ２などのＣＩＰＮにおいて役割を有すると記載されているサイトカインおよびケモカインをコードする遺伝子が含まれる（Ｂｒａｎｄｏｌｉｎｉら、２０１９；Ｏｌｉｖｅｉｒａら、２０１４；Ｐｅｖｉｄａら、２０１３；Ｙａｎら、２０１９）。
炎症遺伝子に加えて、シスプラチンレジメンは、疾患関連および神経変性ミクログリア（ＤＡＭ）の遺伝子シグネチャーに類似する転写変化を誘導した。ＣＩＰＮは、ミクログリアにおける脂質代謝遺伝子の発現の変化および脂質滴の蓄積に関連しており、これはＡＩＢＰ（化合物７）処置によって減少した。類似のミクログリア脂質滴表現型およびトランスクリプトームは、最近、加齢および神経変性に関連していることが記載された（Ｍａｒｓｃｈａｌｌｉｎｇｅｒら、２０２０；Ｎｕｇｅｎｔら、２０２０）。これらの病理学的表現型へのミクログリアの移行中に下方調節された恒常性遺伝子（Ｍａｓｕｄａら、２０１９；Ｎｕｇｅｎｔら、２０２０；Ｐｒｉｎｚら、２０１９）は、ＣＩＰＮマウスのミクログリアでも下方調節された。ＣＩＰＮによって誘導されるミクログリアのＡｂｃａ１およびＡｂｃｇ１発現の下方調節は、ＡＩＢＰの効果を理解するための重要な因子である。ＡＩＢＰ（化合物７）は、ＣＩＰＮに関連したＡｂｃａ１またはＡｂｃｇ１ ｍＲＮＡの減少を逆転させなかったが、ＡＢＣＡ１タンパク質を安定化し、コレステロール流出を促進するその能力（Ｚｈａｎｇら、２０１６）は、ミクログリアのコレステロール代謝を正常化するのに十分であり得る。ＡＩＢＰ（化合物７）の異痛症に対する効果は、一過性ではあるものの、ｉ．ｔ．ＡＰＯＡ１またはＬＸＲアゴニストにより再現された（Ｗｏｌｌｅｒら、２０１８）。さらに、ＡＢＣＡ１一塩基バリアントと、有痛性骨転移患者の生活の質スコアとの負の関連が見出されている（Ｆｕｒｆａｒｉら、２０１７）。しかしながら、本発明者らは、ＡＩＢＰ（化合物７）がミクログリアを再プログラムして、疼痛が促進された状態で保護表現型を付与する、ＣＩＰＮの影響を受けた遺伝子のサブセットの逆転とは関係のない他の機構を排除することはできない。
この研究の重要な知見の１つは、ミクログリアにＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１が存在しない場合、ＡＩＢＰは炎症遺伝子を下方調節することができず、それらの一部を上方調節さえし、シナプス可塑性を調節する非炎症性の疼痛関連ＡｒｃおよびＰｉ１６遺伝子を上方調節したことであった（Ｈｏｓｓａｉｎｉら、２０１０；Ｓｉｎｇｈｍａｒら、２０２０）。ＷＴおよびＡＢＣＡ１／ＡＢＣＧ１欠損ミクログリアのＡＩＢＰによる差分再プログラミング（differential reprograming）は、デスモステロール変換酵素Ｄｈｃｒ２４に依存している可能性があり、変換酵素Ｄｈｃｒ２４は、デスモステロールおよびコレステロール含有量を調節し、減少すると泡沫細胞形成および恒常性抗炎症応答に関連する（Ｓｐａｎｎら、２０１２）。重要なことに、ＡＩＢＰ（化合物７）は、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおいてＣＩＰＮまたはＬＰＳ誘発性異痛症も逆転させることができなかった。これらの結果は、ＡＩＢＰの抗炎症および抗侵害受容効果が形質膜からのコレステロール枯渇に依存すること、および、流出機構がない場合、ＡＩＢＰが実際に炎症および細胞傷害効果を促進し得ることを示している。
全体として、この研究の結果は、脊髄ミクログリアの形質膜中のコレステロール含有量の調節が、インフラマラフトに由来する細胞シグナル伝達と、それに続く炎症遺伝子および脂質代謝遺伝子の遺伝子発現に大きな影響を及ぼし、結果的に多発性神経炎の状態下での侵害受容の制御が最高点に達することを示唆している。
材料および方法
動物。野生型Ａｂｃａ１ｆｌ／ｆｌＡｂｃｇ１ｆｌ／ｆｌ、ＴＬＲ４ｆｌ／ｆｌ、Ｓｌｃ１ａ３－ＣｒｅＥＲＴおよびＣｘ３ｃｒ１－ＣｒｅＥＲＴ２マウスは、すべてＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドで、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入するか、または施設内で繁殖させ、離乳させた。ＴＬＲ４－／－マウスは、Ａｋｉｒａ博士（大阪大学）から贈られた。Ａｐｏａ１ｂｐｆｌ／ｆｌマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するＥＳ細胞を使用して本発明者らの研究室で以前に作製された。以下のマウス系統を本発明者らの実験室で交配した：Ａｐｏａ１ｂｐｆｌ／ｆｌ Ｃｘ３ｃｒ１－ＣｒｅＥＲＴ２（ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯ）、ＴＬＲ４ｆｌ／ｆｌ Ｃｘ３ｃｒ１－ＣｒｅＥＲＴ２（ＴＬＲ４－ｉｍＫＯ）、Ａｂｃａ１ｆｌ／ｆｌ Ａｂｃｇ１ｆｌ／ｆｌ Ｃｘ３ｃｒ１－ＣｒｅＥＲＴ２（ＡＢＣ－ｉｍＫＯ）、およびＡｂｃａ１ｆｌ／ｆｌ Ａｂｃｇ１ｆｌ／ｆｌ Ｓｌｃ１ａ３－ＣｒｅＥＲＴ（ＡＢＣ－ｉａＫＯ）。実験で使用したすべてのミクログリア条件付きノックアウトマウスは、Ｃｘ３ｃｒ１ノックアウトの生成を回避するために、Ｃｘ３ｃｒ１－ＣｒｅＥＲＴ２の対立遺伝子を１つだけ有していた。マウスを標準ケージあたり４匹まで室温で収容し、１２：１２時間の明：暗サイクルで維持した。すべての行動試験は明期のサイクル中に行った。食物と水は両方とも自由に摂取可能であった。すべての実験は、雄のマウスを用いて、カリフォルニア大学の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って行われた。
細胞。ＢＶ－２不死化ミクログリア細胞株（Ｂｌａｓｉら、１９９０）を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコＭＥＭ中で培養した。チオグリコール酸誘発腹膜マクロファージをＣ５７ＢＬ／６またはＴＬＲ４－／－マウスから採取し、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で維持した。ＨＥＫ２９３細胞（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００４５）を、１０％ ＦＢＳおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。すべての細胞を３７℃、５％ ＣＯ２雰囲気で培養した。細胞株は継代１～３の間で使用した。
化学療法誘発性末梢神経障害モデル。化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）を発症するために、１日目および３日目にシスプラチン（２．３ｍｇ／ｋｇ／注射；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＭＦＧ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を行った。シスプラチン投与の期間中、体重減少、行動変化および機械的異痛症をモニターし、測定した。安楽死の基準は、体重の２０％を超える体重減少および不規則な行動であった。しかし、安楽死を必要とする動物はいなかった。
機械的異痛症測定。ワイヤーメッシュ表面上の透明なプラスチック製の底なしケージに動物を入れ、試験開始前に少なくとも３０分間順応させた。触覚閾値は、２．４４～４．３１（０．０２～２．００ｇ）の範囲の一連のｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント（Ｂｉｏｓｅｂ）を用いて測定した。５０％の離脱確率の閾値を記録した。機械的離脱閾値は、処置前（ベースラインまたは０日目）および処置後の入力時点において、アップダウン法（Ｃｈａｐｌａｎら、１９９４）を用いて評価した。
ＡＩＢＰ（化合物７）または食塩水の髄腔内送達。麻酔の導入には酸素中５％イソフルランを使用し、麻酔の維持には酸素中２％イソフルランを使用してマウスを麻酔した。髄腔内注射は、（Ｈｙｌｄｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｃｏｘ、１９８０）に従って行った。簡単に説明すると、腰を剃毛して消毒し、動物を親指と人差し指との間に骨盤を押さえて腹臥位に置いた。触診によってＬ５およびＬ６椎骨を特定し、Ｌ５椎骨とＬ６椎骨との間の正中線上に３０Ｇ針を経皮的に挿入した。進入の成功は、テールフリックの観察によって評価した。５μＬの注射を約３０秒の間隔で投与した。髄腔内送達用の薬物は、生理学的に無菌の０．９％ＮａＣｌで製剤化された。以前の研究（Ｗｏｌｌｅｒら、２０１８）に基づいて、これらの研究における脊椎送達のためのＡＩＢＰ（化合物７）の用量は０．５μｇ／５μＬであった。麻酔からの回復後、マウスを正常な運動協調性および筋緊張について評価した。
誘導性Ｃｒｅドライバー株のためのタモキシフェンの腹腔内注射。この試験では、本発明者らはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂのタモキシフェン誘導プロトコルに従った。タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、３７℃で一晩振盪することによって１０ｍｇ／ｍＬの濃度でコーン油に溶解し、アルミホイルに包み、４℃で保存した。２００μＬのタモキシフェンまたはビヒクル（コーン油）を、５日間連続して２４時間毎に腹腔内注射した。
エクスビボおよびインビトロでのＴＬＲ４二量体化および脂質ラフトアッセイ。ＴＬＲ４二量体化アッセイは、フローサイトメトリーのために２つのＴＬＲ４抗体を使用する：ＭＴＳ５１０は、ＴＬＲ４／ＭＤ２をモノマーとして（ＴＬＲ４単位で）認識するが、二量体としては認識しない；ＳＡ１５－２１は、その二量体化状態にかかわらず、任意の細胞表面ＴＬＲ４に結合する（Ａｋａｓｈｉら、２００３；Ｚａｎｏｎｉら、２０１６）。次に、同じ細胞懸濁液中で測定したＭＴＳ５１０およびＳＡ１５－２１から、ＴＬＲ４二量体の割合を計算した。脂質ラフト含有量は、ガングリオシドＧＭ１に結合するＣＴｘＢを使用して測定した。インビトロでＴＬＲ４二量体化を評価するために、ＢＶ－２細胞を血清含有培地中０．２μｇ／ｍｌのＡＩＢＰ（化合物７）と共に３０分間プレインキュベートし、続いてＬＰＳ １００ｎｇ／ｍＬとともに１５分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞を直ちに氷上に置き、ＰＢＳで１回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。次いで、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（ＦｃγＲブロッカー、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する２％正常マウス血清とともに氷上で３０分間インキュベートした後、１：１００希釈のＰＥコンジュゲートＭＴＳ５１０抗体およびＡＰＣコンジュゲートＳＡ１５－２１抗体（それぞれＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよびＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２５６２５０３およびＲＲＩＤ：ＡＢ＿４６６２６３）で、１：２００希釈のＣＴｘＢ－ＦＩＴＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）とともに氷上で３０分間染色した。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して分析した。
エクスビボアッセイのために、脊髄をハイドロエクストルージョン（Ｋｅｎｎｅｄｙら、２０１３）によって採取し、４％ホルムアルデヒドで固定し、処理中は氷上に置いた。神経組織解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、腰椎組織から単細胞懸濁液を得た。ミエリンを除去するために、ミエリン除去ビーズＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）をサンプルに添加し、４℃で１５分間インキュベートし、続いてＬＳカラムおよびＭＡＣＳセパレータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で分離した。単離した後、細胞を抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（ＦｃγＲブロッカー、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する２％正常マウス血清とともに氷上で３０分間インキュベートし、その後、１：１００ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５コンジュゲートＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿８９３２３２）、１：１００ ウサギ抗マウスＴＭＥＭ１１９抗体（Ａｂｃａｍ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２７４４６７３）、ＰＥコンジュゲートＭＴＳ５１０、ＡＰＣコンジュゲートＳＡ１５－２１抗体（それぞれ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２５６２５０３およびＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４６６２６３）および１：２００希釈のＣＴｘＢ－ＦＩＴＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の抗体ミックスで氷上で４５分間染色し、次に、細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ ＰＥＣｙ７コンジュゲート抗ウサギ二次抗体（１：２５０）とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを使用して分析した。
インビトロおよびエクスビボでの染色補正のために、本発明者らは、ビーズおよび／または単一染色細胞を使用してチャンネル間のシグナル重複を補正し、ＣＤ１１ｂ、ＭＴＳ５１０およびＳＡ１５－２１抗体のアイソタイプコントロールをＦＭＯとともに使用してゲートを描写した。データをＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００８５２０）によって分析した。これらのデータから、本発明者らは、脊髄ミクログリアにおける脂質ラフトの存在量およびＴＬＲ４二量体の数の相対的変化を計算した（０個の二量体を無刺激細胞またはナイーブ細胞に無作為に割り当てた）。
免疫蛍光、共焦点イメージングおよび共局在分析。ＢＶ－２細胞を１２ウェルプレートのカバースリップ上に播種し、５％血清含有培地中の０．２μｇ／ｍｌのＡＩＢＰとともに３０分間プレインキュベートし、続いて１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳとともに５分間または１５分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞を直ちに氷上に置き、ＰＢＳで１回洗浄し、４％ホルムアルデヒドで１０分間固定した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５％ＦＢＳを含有するブロッキング緩衝液で３０分間インキュベートした後、１：２００希釈のＣＴｘＢ－Ａｌｅｘａ５５５および１：１００希釈のマウス抗ＴＬＲ４抗体（Ａｂｃａｍ，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４４６７３５）、または１：１００ウサギ抗ＡＰＯＡ１抗体（Ａｂｃａｍ）もしくは１：１００ウサギ抗ＡＢＣＡ１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０，０００，６３０）で染色し、洗浄し、抗ウサギＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート二次抗体とともにインキュベートし、膜中のアクセス可能なコレステロールを染色するために組換えＨｉｓタグ付きＡＬＯＤ４および１：１００ ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓ二次抗体（ＬＳＢｉｏ）とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、カバースリップをＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄでスライドにマウントし、密封した。ＬｉｇｈｔｅｎｉｎｇデコンボリューションまたはＳＴＥＤを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ ８超解像共焦点顕微鏡を用いてスライドを分析した。
ミクログリア特異的ＡＩＢＰまたはＡＢＣＡ１／ＡＢＣＧ１ノックアウトを検証するために、脊髄組織を採取し、４％ホルムアルデヒド中４℃で後固定した。次いで、組織を３０％スクロースで脱水し、切片化するまでＯＣＴで凍結した。クライオスタットを用いて脊髄を１０μｍの切片にスライスし、スライドを－２０℃で保存した。凍結切片を２％ ＦＢＳおよび０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ１００溶液でブロッキングした後、１：１００ウサギ抗ＡＩＢＰ抗体（Ｌｏｎｇｈｏｕ Ｆａｎｇ博士のご厚意により提供されたもの）とともにインキュベートした。別々の切片を、１：１００ウサギ抗ＡＢＣＡ１抗体または１：１００ウサギ抗ＡＢＣＧ１抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１００００６３０およびＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０１２５７１７）で４℃で一晩染色した。スライドを洗浄し、抗ウサギＡｌｅｘａ ４８８（Ａｂｃａｍ，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６３０３５６）またはＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート二次抗体の１：２００希釈物とともに２時間インキュベートした後、３回洗浄し、全ての切片をＡｌｅｘａ４８８コンジュゲートＩＢＡ－１抗体（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）またはＡｌｅｘａ６３３コンジュゲートＩＢＡ１抗体（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６８７９１１）のいずれかとインキュベートした。あるいは、スライドを、１：１００ Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２７９９４７０）または１：１００ Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ＧＦＡＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２６３２８４）のいずれかとインキュベートした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｇｏｌｄ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）でマウントした。各動物の少なくとも１つのスライドの画像取得は、６３Ｘ対物レンズと、Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇデコンボリューションを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡とを使用して行った。Ｃｏｌｏｃ２ツールを使用してＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩ（ＮＩＨ，ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００３０７０／ＳＣＲ＿００２２８５）で共局在解析を行った。閾値、閾値を超えるピアソンのＲ係数とＭａｎｄｅｒｓの係数、ならびにマスクされた共局在画像（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｍａｇｅｓ）、Ｃｏｓｔｅｓ Ｐ値およびピクセル散布図を各画像について生成した。どのチャネルが細胞マーカーを表すかに応じて、ｔＭ１またはｔＭ２が使用された。
ＡＬＯＤ４の発現および精製。ｐＡＬＯＤ４プラスミド（Ｇａｙ Ａ．、２０１５）をＡｄｄｇｅｎｅ（カタログ番号＃１１１０２６、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１１１０２６）から入手し、大腸菌コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換するために使用し、Ａｍｐ＋ＬＢプレートで陽性コロニーを選択した。１ｍＭイソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による発現の誘導および溶解後、イミダゾール溶出のＮｉ－ＮＴＡアガロースカラムを使用してＨｉｓタグ付きＡＬＯＤ４を精製した。タンパク質をＰＢＳに対して透析し、濃度を測定した。アリコートを－８０℃で保存した。
バキュロウイルス／昆虫細胞系におけるｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰのクローニングおよび発現。ＡＩＢＰ（化合物７）は、（Ｃｈｏｉら、２０１８；Ｗｏｌｌｅｒら、２０１８）に記載されているように、翻訳後修飾およびエンドトキシンを含まない調製を確実にするために、バキュロウイルス／昆虫細胞系で生成した。ヒト野生型（ｗｔ）ＡＩＢＰおよび変異体（ｍｕｔ）ＡＩＢＰ、マウス野生型ＡＩＢＰ、およびゼブラフィッシュ野生型ＡＩＢＰ（Ｆａｎｇら、２０１３）を、ポリヘドリンプロモーターの後ろでｐＡｃＨＬＴ－Ｃベクターにクローニングした。ベクターは、精製および検出を可能にするためにＮ末端Ｈｉｓタグを含む。昆虫Ｓｆ９細胞をＢｅｓｔＢａｃバキュロウイルスＤＮＡ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡＩＢＰベクターでトランスフェクトした。４～５日後、上清を回収してバキュロウイルスストックを得た。新鮮なＳｆ９細胞をＡＩＢＰ産生バキュロウイルスに感染させ、３日後に細胞ペレットを回収し、溶解し、超音波処理し、遠心分離によって清澄化し、上清をＮｉ－ＮＴＡアガロースカラムにロードし、イミダゾールで溶出した。タンパク質を食塩水に対して透析し、濃度を測定した。アリコートを－８０℃で保存した。
脊髄組織におけるＡＩＢＰ（化合物７）の薬物動態。ノックアウトＡＩＢＰマウスを薬物動態試験に使用した。ＡＩＢＰ（２．５μｇ／５μＬ）の髄腔内注射を以前に記載されたように行い（Ｈｙｌｄｅｎ ａｎｄ Ｗｉｌｃｏｘ、１９８０）、記載されるように１５分、３０分、１時間、４時間または８時間後にＣＳＦを採取した（ＬｉｕおよびＤｕｆｆ、２００８）。簡単に説明すると、マイクロピペットプラーを使用して毛細管（０．８×１００ｍｍ）を引いた。３％イソフルランを５０％酸素および５０％室内空気の混合物とともに使用してマウスを麻酔した。首の皮膚を剃毛し、定位固定装置上にマウスを置いた。手術部位を拭いた後、後頭部より下の皮膚を矢状に切開した。皮下組織および筋肉を切開して硬膜を露出させた。引いた毛細管を大槽に直接穿刺し、汚染されていないサンプルを採取した。ＣＳＦを採取した後、毛細管を５０μＬの０．０９％ＮａＣｌを含有するＰＣＲチューブに流し込み、次いでマウスに３５ｍＬの０．９％ＮａＣｌを灌流した。脊髄を５ｍＬの０．９％ＮａＣｌでのハイドロエクストルージョンによって洗い流した。脊髄組織を秤量し、氷上で１ｇ／１０ｍＬの完全Ｎ－ＰＥＲ（商標）ニューロンタンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で抽出した。氷上で１０分間インキュベートした後、サンプルを遠心分離（４℃で１０分間１０，０００×ｇ）して細胞残屑をペレット化し、上清を１％ＢＳＡ－ＴＢＳで１：１に希釈した。プレートをＢＥ－１抗ＡＩＢＰモノクローナル抗体（５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、脊髄抽出物またはＣＳＦサンプルとともに３時間インキュベートし、ウサギポリクローナル抗ＡＩＢＰ抗体、続いてヤギ抗ウサギＡＬＰ抗体（シグマ・アルドリッチ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２５８１０３）を用いて検出した。プレートは上記と同様に読み取った。
ＲＮＡ－ｓｅｑのための脊髄ミクログリアのＦＡＣＳ選別。腰髄からの細胞懸濁液を、固定ステップを除いて、上記と同様に調製した。新鮮な組織を処理し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（ＦｃγＲブロッカー、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する２％正常マウス血清で３０分間ブロッキングし、次いで、１：５０ ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲートＣＤ１１ｂ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３１２７９９）、１：５０ ウサギ抗マウスＴＭＥＭ１１９抗体（Ａｂｃａｍ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２７４４６７３）、１：５０ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５コンジュゲートＣＤ２４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１５９５４９１）のミックスで染色し、次いで、細胞を洗浄し、（１：２００）二次Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６３０３５６）とともにインキュベートし、氷上で３０分間インキュベートし、その後、細胞を洗浄し、１：５０ Ａｌｅｘａ ６４７コンジュゲートＧｌａｓｔ１抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）およびＬｉｆｅ／Ｄｅａｔｈ Ｇｈｏｓｔ Ｒｅｄ ７８０色素の１：１００希釈物（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を選別緩衝液で洗浄し、濾過した後、ＢＤ ＦＡＣＳ－Ａｒｉａ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して溶解緩衝液に選別した。同じ動物由来の４００個の細胞をそれぞれ含む３つのテクニカルレプリケートを選別した。選別戦略および選別されたミクログリアの純度の分析については、図Ｓ２ＡおよびＢを参照されたい。
ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの準備、配列決定および品質管理。本発明者らは、（Ｒｏｓａｌｅｓら、２０１８）の低入力バルクｓｅｑ ＳｍａｒｔＳｅｑ２プロトコルに従った。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、ＲＮａｓｅ阻害剤およびオリゴ（ｄＴ）３０－ＶＮを含有する溶解緩衝液に選別された細胞をオリゴ（ｄＴ）＋でｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールにハイブリダイズさせた。ＰＣＲ増幅用の試薬を添加した後、逆転写用試薬を添加してｃＤＮＡライブラリーを構築した（この時点ではｑＰＣＲは行わなかった）。Ｑｕｂｉｔ二本鎖高感度アッセイに加えてＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ高感度Ｄ５０００スクリーニングテープを使用してライブラリーを定量し、ＱＣを行った。すべてのサンプルは、ＮｅｘｔｅｒａＸＴプロトコルに投入するために１ｎｇのｃＤＮＡに調整された。Ｑｕｂｉｔ二本鎖高感度アッセイに加えてＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ高感度Ｄ１０００スクリーンテープを用いてＱＣチェックを行った。サンプルをｑＰＣＲおよびプールに供し、ＮｏｖａＳｅｑ Ｓ１ １００サイクルキットを使用してペアエンド５０×５０リードのためにＮｏｖａＳｅｑにロードした。
ＦＡＳＴＱデータのスプライス認識アライメントを、ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎら、２０１３）を使用して行い、配列決定されたデータおよびアライメントの品質管理を、ＦＡＳＴＱＣ（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿０１４５８３）、ＱｏＲＴｓ（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿０１８６６５）（Ｈａｒｔｌｅｙ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｋｉｎ、２０１５）およびＭｕｌｔｉＱＣツール（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿０１４９８２）（Ｅｗｅｌｓら、２０１６）によって行った。リードに関連する遺伝子のカウントは、ＳＴＡＲ（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿０１５８９９）を使用して行った。
配列決定の品質管理は、良好なデータ品質を示した（ＭｕｌｔｉＱＣレポート）。２つのテクニカルレプリケート（Ｙ＿１０およびＹ＿３０）は、最適以下の遺伝子カバレッジのために除去された。本発明者らは、Ｒパッケージ、ＤＥｓｅｑ２（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿０１５６８７）を使用して差次的発現を分析した（Ｌｏｖｅら、２０１４）。本発明者らは、少なくとも３つのサンプルについて、マッピングされた１００万リードＣＰＭあたり１０カウントを超えるカウントに設定したカットオフを用いて、腰髄ミクログリアにおいて合計１８，８１８個の遺伝子を特定した。１つのサンプルは、他のすべてのサンプルと比較して、ＰＣＡで極端に不規則な分布を示し、最も変動しやすい遺伝子の上位５００にクラスタリングされたため、さらなる分析から除外した。本発明者らは、（Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２０１４）で報告されている４０個のミクログリア特異的遺伝子のサブセットと、ニューロン（Ｎｅｆｌ）、乏突起膠細胞（Ｏｍｇ）および星状膠細胞（Ｓｌｃ６ａ１）に特異的な遺伝子を使用して、本発明者らのサンプルおよびデータにおけるミクログリアの富化を確認した（図Ｓ２Ｄ）。ＤＥＧの決定は、シスプラチンおよびＡＩＢＰの主な効果ならびにこれらの条件によって変化するすべての有意な遺伝子を決定するために、すべての因子にわたるすべてのサンプルを含む尤度比検定（ＬＲＴ）を使用し、条件因子のない縮小デザインを使用して、ＤＥｓｅｑ２二項モデリングによって行った。本発明者らは、遺伝子型（ＡＢＣ－ｉｍＫＯ）依存的に調節される遺伝子を同定するために、条件および遺伝子型の相互作用項のない縮小デザインと比較するＬＲＴモデルを使用した。調整済みＰ＜０．０５および５％のＦＤＲを使用して、有意な遺伝子をフィルタリングした。特定された有意な遺伝子の遺伝子発現パターンによる遺伝子クラスターの決定は、ＤＥＳｅｑ ２関数：ｄｅｇｐａｔｔｅｒｎｓによって行った。実験群のＬＲＴ後のペアワイズ比較をＷａｌｄ検定で行い、ＦＤＲを５％として行った。ボルケーノプロットには、絶対倍率変化が１．５を超える有意に異なる遺伝子が含まれる。経路富化およびＧＯ分析は、ｍｅｔａｓｃａｐｅ．ｏｒｇ（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿０１６６２０）で最低３個の遺伝子およびＰ＜０．０５を使用して行った（Ｚｈｏｕら、２０１９）。
ＴＬＲ４結合についての共免疫沈降アッセイ。試験管中のｅＴＬＲ４およびｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰのプルダウンアッセイを、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００を含有するＰＢＳ中で１μｇのｅＴＬＲ４（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）とＡＩＢＰを混合し、室温で１時間インキュベートすることにより行った。サンプルは、プロテインＡ／Ｇセファロースビーズを室温で３０分間添加した後、１μｇのＢＥ－１モノクローナル抗ＡＩＢＰ抗体を添加し、２時間インキュベートすることによって事前に清澄化した。プロテインＡ／Ｇセファロースビーズを添加し、さらに１時間インキュベートし、続いて０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００を含有するＰＢＳで５回洗浄し、サンプルを免疫ブロットした。
ＨＥＫ２９３細胞（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００４５）をＦｌａｇ－ｅＴＬＲ４およびＦｌａｇ－ＡＩＢＰ（野生型または変異体の１つ）構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの３６時間後、細胞を回収し、氷冷溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ ＮＰ－４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、およびＳｉｇｍａのプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解した。細胞溶解物をプロテインＡ／Ｇセファロースビーズとともに４℃で３０分間プレインキュベートし、マウス抗ＴＬＲ４抗体（Ａｂｃａｍ）とともに４℃で一晩免疫沈降させた。翌日、溶解物をプロテインＡ／Ｇビーズと共に４℃で１時間インキュベートした。未結合タンパク質を溶解緩衝液で洗浄することによって除去し、Ｂｏｌｔ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でビーズを流した。結合したＡＩＢＰを抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）で免疫ブロットすることによって検出した。
ＥＬＩＳＡ結合アッセイ。ＡＩＢＰ－ＴＬＲ４結合を評価するために、９６ウェルプレートを５μｇ／ｍｌのｅＴＬＲ４でコーティングし、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロッキングし、ｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰ、続いて２μｇ／ｍｌのビオチン化ＢＥ－１抗ＡＩＢＰモノクローナル抗体とともにインキュベートした。ＡＩＢＰ－ＡＰＯＡ１結合を評価するために、プレートをＢＳＡ、ｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰでコーティングし、洗浄し、ブロッキングし、５μｇ／ｍｌのヒトＡＰＯＡ１（オーストラリア、メルボルンのＤｍｉｔｒｉ Ｓｖｉｒｉｄｏｖ，Ｂａｋｅｒ Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより贈られたもの）とともにインキュベートし、続いてビオチン化抗ＡＰＯＡ １抗体（Ａｃａｄｅｍｙ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１２３８７８１）とともにインキュベートした。どちらのアッセイでも、ニュートラアビジン－ＡＰを添加し、室温で４５分間インキュベートし、続いてＬｕｍｉＰｈｏｓ ５３０（Ｌｕｍｉｇｅｎ）を添加して９０分間インキュベートし、発光プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、バーモント州）を用いて発光を測定した。
ＡＩＢＰ細胞結合に関するフローサイトメトリーアッセイ。１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで１５分間刺激したかまたは刺激しなかったＢＶ－２ミクログリア細胞を、１％ＢＳＡを含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）で氷上で６０分間ブロッキングし、２μｇ／ｍＬのＢＳＡまたは２μｇ／ｍＬのＡＩＢＰのいずれかとともに氷上で２時間インキュベートした。細胞を固定し、１μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｈｉｓ抗体（ＬＳＢｉｏ）と共に４℃で１時間インキュベートし、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターおよびＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００８５２０）を使用して分析した。
ＥＬＩＳＡによる脊椎組織におけるサイトカイン測定。脊髄溶解物中のＩＬ－６（ＤＹ４０６）、ＩＬ－１β（ＤＹ４０１）、ＭＣＰ－１（ＤＹ４７９）およびＭＩＰ２（ＤＹ４５２）のレベルを、マウスＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の指示に従って使用して測定した。
統計分析。ＲＮＡｓｅｑデータセット以外については、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ＿００２７９８）を使用して、スチューデントｔ検定（２群間の差について）、一元配置分散分析（複数群について）、またはボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析（複数群の時間経過実験について）を用いて結果を分析した。Ｐ＜０．０５の群間の差を統計学的に有意とみなした。
図の凡例
図１は、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）のマウスモデルにおける野生型（ｗｔ）ＡＩＢＰタンパク質による疼痛行動の逆転および炎症促進性脂質ラフト（インフラマラフト（Ｉｎｆｌａｍｍａｒａｆｔｓ））に関連する活性化ＴＬＲ４二量体の減少を実証する。
図１．化学療法誘発性末梢神経障害は、脊髄ミクログリアにおけるＴＬＲ４二量体化および脂質ラフトを変化させる：ＡＩＢＰによる逆転。Ａ、ｉ．ｐ．シスプラチン（２．３ｍｇ／ｋｇ／日の２回注射）、続いてｉ．ｔ．食塩水（５μｌ）またはＡＩＢＰ（化合物７）（０．５μｇ／５μｌ）の単回投与に応答したＷＴマウスにおける離脱閾値。ナイーブマウスは注射を受けなかった。２回の独立した実験からのデータ（群あたりｎ＝６）２回の独立した実験からのデータ。Ｂ～Ｃ、ＴＬＲ４二量体化を示すＣＤ１１ｂ＋／ＴＭＥＭ１１９＋脊髄ミクログリア細胞の分析（Ｂ）およびｉ．ｔ．食塩水またはＡＩＢＰの２４時間後、すなわち、Ａに示される時間経過の８日目にＣＴｘＢ染色によって測定された脂質ラフト含有量（Ｃ）。３回の独立した実験からのデータ（ＴＬＲ４二量体化についてはｎ＝９／群、脂質ラフト染色についてはｎ＝１２）。Ｄ、ＢＶ－２ミクログリア細胞を完全培地中のＡＩＢＰ（化合物７）（０．２μｇ／ｍＬ）またはビヒクルとともに３０分間インキュベートし、続いてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）とともに５分間インキュベートした。スケールバー、５μｍ。棒グラフは、ＭａｎｄｅｒｓのｔＭ１係数を示す。Ｅ～Ｆ、雄ＡＰＯＡ１ＢＰ－／－マウスのＣＳＦ（Ｅ）および腰髄（Ｆ）（ｎ＝５）におけるｉ．ｔ．ＡＩＢＰ（２．５μｇ／５μＬ）の薬物動態。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。グループ化分析での多重比較のためのボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析；３群の多重比較のためのチューキー事後検定による一元配置分散分析およびイメージング定量。
図２は、遺伝子シグネチャーの変化を、ナイーブマウスと、化学療法剤シスプラチンで処置したマウスと、シスプラチンおよび野生型（ｗｔ）ＡＩＢＰタンパク質で処置したマウスとで比較する図である。
図２．ＣＩＰＮマウスの脊髄ミクログリアにおける遺伝子発現。Ａ～Ｂ、ミクログリア（ＣＤ１１ｂ＋ＴＥＭＥＭ１１９＋）を、図１Ａに示す３つの群からＦＡＣＳ選別した：ＷＴナイーブ、またはシスプラチンを注射し（１日目および３日目）、続いて７日目にｉ．ｔ．食塩水（５μＬ）、またはＡＩＢＰ（化合物７）（０．５μｇ／５μＬ）を投与し、８日目に終了し、ＲＮＡ－ｓｅｑに供した；ナイーブおよびシスプラチン／食塩水についてはｎ＝３の生物学的複製（マウス）、シスプラチン／ＡＩＢＰについてはｎ＝２（各生物学的複製は、同じ動物からの３つのテクニカルレプリケートから短くまとめた）。Ａ、すべてのサンプルにわたるＤＥＧのヒートマップ（すべてのテクニカルレプリケートが列に示されている）。ＬＲＴ（尤度比検定）によって試験された主な効果を示す有意な（調整済みＰ＜０．０１）上方遺伝子または下方調節遺伝子。Ｌｏｇ２相対発現、Ｂ、異なる処置条件における発現プロファイルパターンに基づいてクラスター化された有意なＤＥＧの群。Ｃ、調整済みＰ＜０．０５および絶対倍率変化＞１．５および経路内の３つの遺伝子の最小重複を使用した、シスプラチン処置によって誘導された上方調節遺伝子（パネル２Ｂの群１）および下方調節遺伝子（群２）の経路およびＧＯ富化解析。上方調節された経路は赤色で示され、下方調節された経路は青色で示される。
図３は、化学療法を受けたマウスと、ナイーブマウスおよびｗｔＡＩＢＰで処置したＣＩＰＮマウスにおける疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）遺伝子発現シグネチャーおよび脂質滴の違いを比較する。
図３．ＣＩＰＮマウスの脊髄ミクログリアにおけるＤＡＭおよび脂質関連遺伝子発現および脂質滴。Ａ～Ｃ、図２と同じ群。Ａ、シスプラチン処置マウスとナイーブマウスの脊髄ミクログリアにおける上方調節された遺伝子および下方調節された遺伝子のボルケーノプロット。調整済みＰ＜０．０５および絶対倍率変化＞１．５のカットオフは、薄緑色の点で表される。Ｂ、疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）シグネチャー遺伝子を表すヒートマップ。Ｃ、脂質関連遺伝子セットを示す行ごとにスケール化されたｌｏｇ２正規化遺伝子数のヒートマップ。Ｄ～Ｈ、ＩＢＡ１およびＤＡＰＩで共染色した脊髄切片におけるＰＬＩＮ２免疫染色によって測定した脊髄ミクログリアにおける脂質滴蓄積。実験条件は図１Ａと同様；２回の独立した実験からの群あたり５匹のマウスのｎ＝５視野。スケールバー、２０μｍ。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；＊、ナイーブ群と比較してＰ＜０．０５、グループ化分析における多重比較のためのチューキー検定を用いた一元配置分散分析によって試験された。
図４は、ｗｔＡＩＢＰタンパク質で処置したＣＩＰＮマウスにおける遺伝子発現の変化をまとめたものである。
図４．ＣＩＰＮマウスの脊髄ミクログリアにおける遺伝子発現：ＡＩＢＰ（化合物７）の効果。実験条件および分析は図１と同様；群あたりｎ＝２～３の生物学的複製（各生物学的複製は３つのテクニカルレプリケートから短くまとめた）。Ａ、調整済みＰ＜０．０５および絶対倍率変化＞１．５および経路内の３つの遺伝子の最小重複を使用した、ＡＩＢＰ（化合物７）によって下方調節されたＣＩＰＮ上方調節遺伝子（図２Ｂの群３））およびＡＩＢＰ（化合物７）によって上方調節されたＣＩＰＮ下方調節遺伝子（群４）の経路およびＧＯ富化解析。上方調節された経路は赤色で示され、下方調節された経路は青色で示される。Ｂ、ｉ．ｔ．ＡＩＢＰによって誘導された脊髄ミクログリアのＤＥＧ。調整済みＰ＜０．０５およびＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ＜５％は、シスプラチン／ＡＩＢＰ対シスプラチン／食塩水で処置したマウスにおける上方調節および下方調節された遺伝子のボルケーノプロットで表された。カットオフ調整済Ｐ＜０．０５および絶対倍率変化＞１．５は薄緑色の点で示される。Ｃ、ＣＩＰＮで上方調節され、ＡＩＢＰによって下方調節される群３の炎症遺伝子のヒートマップ。Ｄ、ＷＴナイーブ、シスプラチン／食塩水およびシスプラチン／ＡＩＢＰ群由来の脊椎組織におけるサイトカインタンパク質発現；群あたりｎ＝５。Ｅ、シスプラチンによって誘導されないが、ＡＩＢＰ（化合物７）によって下方調節される炎症遺伝子のヒートマップ。Ｆ．調整済みＰ＜０．０５および絶対倍率変化＞１．５および経路における３つの遺伝子の最小重複を使用した、ＡＩＢＰ（化合物７）によって下方調節されるすべての遺伝子の経路およびＧＯ富化解析。Ｇ、最も富化された経路：ペプチダーゼ阻害剤活性経路に含まれるＡＩＢＰ（化合物７）によって下方調節される非炎症性遺伝子のヒートマップ。Ｈ、ＣＩＰＮにおける下方調節がＡＩＢＰ（化合物７）によって逆転された遺伝子のヒートマップ。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；＊ナイーブ群とシスプラチン／ｉ．ｔ．食塩水群とを比較してＰ＜０．０５。
図５は、コレステロール輸送体ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１が、マウスＣＩＰＮのモデルにおける疼痛のＡＩＢＰ媒介性逆転に必要であることを実証する。
図５．ミクログリアにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１の発現は、侵害受容を制御し、ＣＩＰＮのマウスモデルにおける異痛症のＡＩＢＰ（化合物７）媒介性逆転に必要である。Ａ～Ｂ、ＢＶ－２細胞を完全培地中でＡＩＢＰ（化合物７）（０．２μｇ／ｍＬ）またはビヒクルとともに３０分間インキュベートし、続いてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）とともに５分間インキュベートした。脂質ラフトにおけるアクセス可能なコレステロールとＡＢＣＡ１（Ａ）およびＡＰＯＡ１（Ｂ）との共局在化。スケールバー、７μｍ。棒グラフは、ＭａｎｄｅｒｓのｔＭ１係数を示す。Ｃ、実験デザインおよびタイムライン：タモキシフェン（ＴＡＭ、１０ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ／日）、シスプラチン（２．３ｍｇ／Ｋｇ）、ＡＩＢＰ（化合物７）（０．５μｇ／５μｌ）または食塩水（５μｌ）。Ｄ、シスプラチン介入開始前のベースライン（０日目）の離脱閾値。３つの独立した実験からのデータ（ビヒクル処置ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスについてｎ＝８、ＴＡＭ処置ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスについてｎ＝１６、ＴＡＭで処置した同腹仔Ａｂｃａ１ｆｌ／ｆｌＡｂｃｇ１ｆｌ／ｆｌｎｏ－Ｃｒｅ［ＷＴ］マウスについてｎ＝１５）。Ｅ、ベースライン（０日目）でのナイーブＷＴおよびＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスのＣＤ１１ｂ＋ＴＭＥＭ１１９＋脊髄ミクログリアにおけるＴＬＲ４表面発現および二量体化および脂質ラフト（ＣＴｘＢ）（両群についてのＴＬＲ４表面発現および脂質ラフト含有量分析についてｎ＝５、ＴＬＲ４二量体化について、ＷＴについてはｎ＝８、ＡＢＣ－ｉｍＫＯについてはｎ＝９）。Ｆ．ＴＡＭ誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおける、ｉ．ｔ．食塩水またはＡＩＢＰ（化合物７）（０．５μｇ／５μｌ）、続いてｉ．ｔ．ＬＰＳ（０．１μｇ／５μｌ）後の離脱閾値（群あたりｎ＝４）。Ｇ～Ｈ、ＴＡＭ誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯ（Ｇ）マウスおよび非誘導（ビヒクル）ＡＢＣ－ｉｍＫＯ（Ｈ）マウスにおける、ｉ．ｐ．シスプラチンおよびｉ．ｔ．食塩水またはＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μｌ）注射後の離脱閾値（群あたりｎ＝６）；パネルＧおよびＨに示される群における８日目のＣＤ１１ｂ＋ＴＥＭＥＭ１１９＋脊髄ミクログリアにおける２つの独立した実験Ｉ～Ｊ、ＴＬＲ４二量体化（Ｉ）および脂質ラフト（Ｊ）からのデータ。２つの独立した実験からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝７～８）。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。経時的分析における多重比較のためのボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析；２つの群についてのｔ検定、および２よりも大きい群の多重比較のためのチューキー事後検定による一元配置分散分析。
図６は、ＡＢＣ遺伝子ノックアウトマウスにおける遺伝子発現を特徴づける。
図６．ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアにおける遺伝子発現。ミクログリア（ＣＤ１１ｂ＋ＴＥＭＥＭ１１９＋）をＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの３つの群からＦＡＣＳ選別した：ナイーブ、またはシスプラチンを注射し（１日目および３日目）、続いて７日目にｉ．ｔ．食塩水（５μＬ）、またはＡＩＢＰ（化合物７）（０．５μｇ／５μＬ）を注射し、８日目に終了した；ｎ＝３の生物学的複製（各生物学的複製は３つのテクニカルレプリケートから短くまとめた）。ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスおよびＷＴ（同腹子ではない）マウスからのＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを同じ実験で取得した。Ａ、上：ナイーブＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアで誘導され、シスプラチンで処置したマウスのＷＴミクログリアと共有される重複遺伝子および経路は、重複する遺伝子を結ぶ紫色の線と重複する富化経路を結ぶ青色の線で示された。下：ＷＴシスプラチンおよびＡＢＣ－ｉｍＫＯナイーブマウス由来の脊髄ミクログリアにおいて上方調節された遺伝子のベン図。Ｂ．カットオフＰ＜０．０５、富化＞１．５および経路内の３つの遺伝子の最小重複を使用した、ミクログリアにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１ノックダウンによって誘導された上方調節および下方調節された遺伝子の富化経路分析。Ｃ、ＴＡＭ誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスのナイーブ脊髄ミクログリアにおけるＤＥＧ。調整済みＰ＜０．０５およびＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ＜５％。Ｄ．ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおけるシスプラチン処置によって誘導され、シスプラチンで処置されたマウスのＷＴミクログリアと共有される重複遺伝子および経路。Ｅ、シスプラチン処置ＷＴマウスと比較した、シスプラチン処置ＴＡＭ誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアにおけるＤＥＧ。調整済みＰ＜０．０５およびＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ＜５％。Ｆ～Ｇ、ナイーブ条件またはシスプラチン条件のいずれかにおいて、ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアで上方調節された（Ｆ）または下方調節された（Ｇ）ＤＥＧのヒートマップ。
図７：本明細書で提供されるＡＩＢＰタンパク質（化合物７）で処置した野生型およびＡＢＣノックアウトマウスの遺伝子発現を比較。
図７．ＡＩＢＰによるミクログリアの再プログラミングは、ＡＢＣＡ１／ＡＢＣＧ１発現に依存する。Ａ、シスプラチンによりＣＩＰＮが誘発されたＷＴマウスおよびＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスにおける遺伝子発現に対するＡＩＢＰ処置の効果を比較するベン図。Ｂ、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスとＷＴマウスにおけるＡＩＢＰ効果を比較する、ＣＩＰＮにおけるＡＩＢＰ処置による上方調節遺伝子および下方調節遺伝子のボルケーノプロット表示。調整済みＰ＜０．０５および絶対倍率変化＞１．５のカットオフは薄緑色の点で示される。Ｃ、ＡＩＢＰによってＡＢＣ依存的に変化した炎症遺伝子の正規化したｌｏｇ２遺伝子数のヒートマップ（ＷＴミクログリアではＡＩＢＰによって下方調節されるが、ＡＢＣ－ｉｍＫＯではＡＩＢＰによって上方調節される）。Ｄ、野生型およびＡＢＣ－ｉｍＫＯにおけるシスプラチンおよびＡＩＢＰ効果を比較するコレステロール合成およびＬＸＲ関連遺伝子のヒートマップ。Ｅ、ＡＢＣ依存的様式でＡＩＢＰによって調節される非炎症性遺伝子のヒートマップ。Ｆ．カットオフＰ＜０．０５、富化＞１．５および経路内の３つの遺伝子の最小重複を使用した、ＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおけるＡＩＢＰによる上方調節された遺伝子の富化経路分析。
図８は、ＡＩＢＰまたはＴＬＲ４のいずれかのノックアウトが疼痛行動（侵害受容）に寄与することを実証する。
図８．ミクログリアの内在性ＡＩＢＰおよびＴＬＲ４は、侵害受容において重要である。Ａ、実験デザインおよびタイムライン。タモキシフェン（ＴＡＭ、１０ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ／日）；シスプラチン（２．３ｍｇ／ｋｇ／日）；ＡＩＢＰ（化合物７）（０．５μｇ／５μｌ）；食塩水（５μｌ）。Ｂ、シスプラチン介入開始前のベースライン（Ａでは０日目）離脱閾値。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ビヒクル処置についてはｎ＝１５、ＴＡＭ処置ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウスについてはｎ＝１６、ＴＡＭで処置した同腹仔Ａｐｏａ１ｂｐｆｌ／ｆｌｎｏ－Ｃｒｅ［ＷＴ］マウスについてはｎ＝８）。Ｃ、ＷＴおよびＣｘ３ｃｒ１－ＣｒｅＥＲＴ２（ｆｌｏｘｅｄ遺伝子なし）マウスを、タモキシフェン注射レジメン（１０ｍｇ／ｍＬ、２００μＬ／日、５日間）の前（ナイーブ、パネルＡタイムラインの－７日目）および後（ＴＡＭ、０日目）に離脱閾値について試験した。（群あたりｎ＝５。ＷＴ＋ＴＡＭ群では１匹の動物が死亡したことが判明した）。統計的差異は見られなかった。Ｄ～Ｆ、ＴＡＭ誘導ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウス（Ｃ；ｎ＝６～７、２回の独立した実験からのデータ）、非誘導（ビヒクル）ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウス（Ｄ；ｎ＝４～５、２回の独立した実験からのデータ）、および施設内で繁殖させた全身ＡＩＢＰノックアウトマウス（Ｅ；群あたりｎ＝４）における、ｉ．ｐ．シスプラチンおよびｉ．ｔ．食塩水またはＡＩＢＰ（化合物７）注射後の離脱閾値。Ｇ、シスプラチン注射後のＷＴおよびタモキシフェン誘導ＴＬＲ４－ｉｍＫＯマウスにおける離脱閾値（施設内繁殖野生型ではｎ＝４、ＴＬＲ４－ｉｍＫＯマウスではｎ＝７）。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。グループ化分析での多重比較のためのボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析；＞２群の多重比較のためのチューキー事後検定による一元配置分散分析。
図９：ＡＩＢＰとＴＬＲ４の結合に寄与する配列モチーフを特定する。図９．ＴＬＲ４結合に関与するＡＩＢＰ分子中のドメインの特定。Ａ、ヒトＡＩＢＰ：シグナルペプチド（ａａ１～２４）、以前は特徴づけられていなかったＮ末端ドメイン（ａａ２５～５１）、およびＹｊｅＦ＿Ｎドメイン（ａａ５２～２８８）。Ｂ．ヒトＡＩＢＰのＦｌａｇタグ付き欠失変異体を、ＨＥＫ２９３細胞においてＦｌａｇタグ付きＴＬＲ４外部ドメイン（ｅＴＬＲ４）と共発現させた。細胞溶解物を抗ＴＬＲ４抗体で免疫沈降（ＩＰ）し、抗Ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットした（ＩＢ）。Ｃ、バキュロウイルス／昆虫細胞系で発現させた、シグナルペプチドをすべて欠くＨｉｓタグ付きヒト（ｈｕ）、マウス（ｍｏ）およびゼブラフィッシュ（ｚｆ）ＡＩＢＰを、試験管内でｅＴＬＲ４－Ｈｉｓと、続いて抗ＴＬＲ４抗体を含むＩＰおよび抗Ｈｉｓ抗体を含むＩＢと組み合わせた。Ｄ～Ｈ、Ｈｉｓタグ付き野生型（ｗｔ，２５～２８８ａａ）および欠失変異体（ｍｕｔ、５２～２８８ａａ）ヒトＡＩＢＰのｅＴＬＲ４、ＡＰＯＡ１およびミクログリアへの結合。抗ＡＩＢＰ抗体を含む試験管内のｅＴＬＲ４およびｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰのＩＰ；３つの独立した実験からのブロットおよび定量（Ｄ）。ｅＴＬＲ４でコーティングし、ｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰ（ｎ＝３）とともにインキュベートしたプレートを用いたＥＬＩＳＡ（Ｅ）。ＢＳＡ、ｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰでコーティングし、ＡＰＯＡ１とともにインキュベートしたプレートを用いたＥＬＩＳＡ（Ｆ）。刺激なし、またはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で１５分間処理したＢＶ－２ミクログリア細胞へのｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰ（２μｇ／ｍＬ）の結合を示すフローサイトメトリー（ｎ＝６）（Ｆ）および共焦点イメージング（Ｇ）。抗Ｈｉｓ抗体（フロー）および抗ＴＬＲ４抗体（イメージング）による検出。スケールバー、１０μｍ。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ．、有意でない。経時的分析における多重比較のためのボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析；２つの群についてのｔ検定、および２よりも大きい群の多重比較のためのチューキー事後検定による一元配置分散分析。
図１０は、ＴＬＲ４に結合しない変異体ＡＩＢＰがＣＩＰＮマウスにおける疼痛行動を逆転させないことを実証し、ＴＬＲ媒介性疼痛のＡＩＢＰモジュレーションに関するモデルを示唆する。
図１０．ＴＬＲ４結合ドメインを欠くＡＩＢＰの髄腔内送達は、ＣＩＰＮ異痛症を軽減することができない。Ａ～Ｂ、ｗｔＡＩＢＰまたはｍｕｔＡＩＢＰ（０．２μｇ／ｍＬ）で前処理し、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで１５分間刺激したＢＶ－２細胞におけるＡ－Ｂ、ＴＬＲ４二量体化（Ａ）および脂質ラフト（Ｂ）。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ＴＬＲ４二量体化分析において、対照群についてはｎ＝７、ｍｕｔＡＩＢＰ群についてはｎ＝５、ＬＰＳ群についてはｎ＝９、ｗｔＡＩＢＰ群についてはｎ＝８；脂質ラフト分析において、対照群についてはｎ＝８、ｍｕｔＡＩＢＰ、ＬＰＳおよびｗｔＡＩＢＰ群についてはｎ＝１３；２つの独立した実験のデータ）。Ｃ、ｉ．ｔ．ＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）または食塩水（５μＬ）、続いてｉ．ｔ．ＬＰＳ（０．１μｇ／５μＬ）投与されたＷＴマウスにおける離脱閾値；群あたりｎ＝５。Ｄ、ｉ．ｐ．シスプラチン（２．３ｍｇ／ｋｇ／日）、続いてｉ．ｔ．ｗｔＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）、ｍｕｔＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）または食塩水（５μＬ）に応答したＷＴマウスにおける離脱閾値。ナイーブマウスは注射を受けなかった（ナイーブ群についてはｎ＝７、ｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰ群についてはｎ＝８、ｉ．ｔ．食塩水群についてはｎ＝９；２つの独立した実験のデータ）。Ｅ～Ｆ、２１日目の、パネルＤに示す実験群のマウスの腰髄からのＣＤ１１ｂ＋／ＴＭＥＭ１１９＋ミクログリアにおける、ＴＬＲ４二量体化（Ｅ）および脂質ラフト（Ｆ）（ｎ＝７～９；２つの独立した実験のデータ）。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００５。経時的分析における多重比較のためのボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析；および２よりも大きい群の多重比較のためのチューキー事後検定による一元配置分散分析。Ｇ、ミクログリア遺伝子発現および脂質滴蓄積に対するＣＩＰＮおよびＡＩＢＰ（化合物７）処置の効果を示す図。形質膜およびＥＲの黒い点はコレステロールを表す。
図１１は、修飾ＡＩＢＰ配列におけるＡＩＢＰのＴＬＲ４結合部位の露出のモデルを仮定している：図１１。ＡＩＢＰ分子中の潜在的Ｎ末端ドメインをアンフォールディングまたは露出させるモデル。この図は、図１２～１４に示した実験の結果をまとめて示したものであり、天然ＡＩＢＰでは、Ｎ末端ドメイン（緑色）が隠れているか、潜在的であるか、またはＴＬＲ４へのＡＩＢＰ結合を媒介するほど十分に露出していないことを実証している（上のパネル）。Ｎ末端をさらなるアミノ酸（オレンジ色）で伸長させると、ＡＩＢＰ立体構造が変化し、ＡＩＢＰのＮ末端ドメイン（緑色）がＴＬＲ４結合にアクセスできるようになる（下のパネル）。図１２。本明細書で提供される例示的な操作されたＡＩＢＰのアミノ酸配列の一例。伸長されたＡＩＢＰ分子のアミノ酸配列が図１１の下のパネルに表される。青色文字、天然ＡＩＢＰ配列のアミノ酸；緑色の枠、ＴＬＲ４結合配列（ヒトＡＩＢＰ配列のアミノ酸２５～５１）；黒色の文字および赤色の枠、追加のアミノ酸。図１３は、バキュロウイルス発現系に由来する特定の修飾ＡＩＢＰ配列のＴＬＲ４結合を明らかにしている。
図１３。様々な操作された形態のＡＩＢＰのＴＬＲ４結合。すべてのタンパク質を発現させ、バキュロウイルス／昆虫細胞系から精製した。Ｈｉｓ－ｄ２４ＡＩＢＰを表す一番上の図は、図１２に示すアミノ酸配列に対応する。一番上の図の下のアミノ酸配列は、オレンジ色の枠「切断可能なＨｉｓタグ」の配列を示す。他のすべての図は、ＡＩＢＰ分子に導入されたアミノ酸配列のさまざまな修飾と対応する変化を示す。緑色の「Ｎ末端ドメイン」の枠は、天然ＡＩＢＰのアミノ酸２５～５１配列を表す。右側の列は、ＴＬＲ４の組換え外部ドメインを有するＡＩＢＰバリアントの共免疫沈降実験の結果を示す。図１４は、哺乳動物発現系由来の特定の修飾ＡＩＢＰ配列のＴＬＲ４結合を実証する。
図１４．様々な操作された形態のＡＩＢＰのＴＬＲ４結合、続き１。すべてのタンパク質を哺乳動物系で全長ＴＬＲ４と共発現させた。ＳＳ、分泌シグナル、ヒトＡＩＢＰ配列中のアミノ酸１～２４に対応する。右側の列は、ＡＩＢＰバリアントの細胞溶解物とＴＬＲ４との共免疫沈降の結果を示す。
図１５．ＴＬＲ４親和性の構造を最適化するための様々なＡＩＢＰ構築物：バキュロウイルス／昆虫細胞発現系。
図１６は、ＡＩＢＰに対するＮ末端修飾が大腸菌発現系におけるＴＬＲ４結合に必要であることを確認する：
図１６．様々な操作された形態のＡＩＢＰのＴＬＲ４結合、続き２。すべてのタンパク質を大腸菌から発現させ、精製した。右側の列は、ＴＬＲ４の組換え外部ドメインを用いるＡＩＢＰバリアントの共免疫沈降実験の結果を示す。ＡＩＢＰバリアントｄ２４ＡＩＢＰ－ｈｉｓまたはｄ５１ＡＩＢＰ－ｈｉｓを用いたＴＬＲ４結合はなかった。
図１７Ａ～Ｄ（または、図Ｓ１または補足図１）は、フローサイトメトリーおよび顕微鏡法のために使用されるＴＬＲ４抗体の特異性の検証を提供し、後根神経節マクロファージにおいて測定されたＴＬＲ４二量体化および脂質ラフトも示す：
図１７Ａは、ＣＤ１１ｂ＋（ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５）／ＴＭＥＭ１９９＋（Ｐｅ－Ｃｙ７）ミクログリアのＴＬＲ４－ＡＰＣおよびＴＬＲ４／ＭＤ２－ＰＥ抗体染色を示す、ＷＴ（左の画像）およびＴｌｒ４－／－マウス（右の画像）の脊髄由来の単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーをグラフで示す：
図１７Ｂは、Ｆ４／８０－ＦＩＴＣ抗体とＴＬＲ４－６４７抗体で共染色されたＷＴおよびＴｌｒ４－／－マウス由来の腹膜誘発マクロファージの共焦点画像を示す；スケールバー、５μｍ；
および、
図１７Ｃ～Ｄは、ＴＬＲ４二量体化（図１７Ｃ）およびｉ．ｔ．食塩水またはＡＩＢＰの２４時間後、すなわち、図１７Ａに示される時間経過の８日目にＣＴｘＢ染色により測定された脂質ラフト含有量（図１７Ｄ）を示すＣＤ１１ｂ＋ＤＲＧマクロファージ細胞のフローサイトメトリー分析をグラフで示す；２回の独立した実験からのデータ（対照およびＡＩＢＰ群についてはｎ＝５、シスプラチンｉ．ｔ．食塩水群についてはｎ＝９）。
図１８Ａ～Ｅ（または、図Ｓ２、または補足図２）は、脊髄ミクログリアのＦＡＣＳ選別戦略、ＲＮＡ－ｓｅｑについての品質管理および表現型制御を示す：
図１８Ａは、ＳＳＣ－ＡおよびＦＳＣ－Ａ、ＳＳＣ－ＷおよびＳＳＣ－Ｈ、ＵＶＥ／ＤＥＡＤ（ＡＰＣ－Ｃｙ７－Ａ）およびＳＳＣ－Ａ、ＧＬＡＳＴ１およびＣＤ２４、ならびに、ＣＤ１１ｂおよびＴＭＥＭ１１９を含む、腰部ＣＤ１１ｂ＋ＴＭＥＭ１１９＋脊髄ミクログリアについての選別戦略を示す；
図１８Ｂは、ＴＭＥＭ１１９およびＣＤ１１ｂ、ＳＳＣ－ＡおよびＧＬＡＳＴ１、ならびにＳＳＣ－１およびＣＤ２４を含む、選別された細胞の純度およびＧＬＡＳＴ１＋星状細胞またはＣＤ２４＋ニューロンの非存在を測定する、選別されたミクログリアのフローサイトメトリー分析を示す；
図１８Ｃは、ミクログリア特異的遺伝子のヒートマップを用いるミクログリア系統解析を示す。Ｂｕｔｏｖｓｋｙら、２０１４に記載されている４０個のミクログリア特異的遺伝子、ならびにミクログリアでは低レベルだがニューロン（Ｎｅｆｌ）、乏突起膠細胞（Ｏｍｇ）および星状膠細胞（Ｓｌｃ６ａ１）では高レベルで特異的に発現する３つの遺伝子について、すべてのサンプルからの正規化されたカウントのＬｏｇ＋１を計算した；
図１８Ｄ～Ｅは、野生型マウスにおいて、ＡＩＢＰによって上方調節されたＣＩＰＮ抑制遺伝子（群４）（図１８Ｄ）およびＡＩＢＰによって下方調節されたＣＩＰＮ誘発遺伝子（群３）のヒートマップを示す（図１８Ｅ）；行および列によってスケーリングされたＬｏｇ２正規化遺伝子数は、３つの生物学的サンプルのすべてのテクニカルレプリケートを表す。
図１９Ａ～Ｄ（または、図Ｓ３または補足図３）は、タモキシフェン誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアにおけるＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１のコンディショナルノックアウトの免疫組織化学的検証を提供する：
ビヒクルおよびタモキシフェン誘導ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウス由来の脊髄凍結切片のＩＨＣは、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＧ１染色とＩＢＡ１（ミクログリア）、ＮｅｕＮ（ニューロン）およびＧＦＡＰ（星状膠細胞）との共局在を示す。スライドにＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｇＧｏｌｄをマウントした。６３倍の対物レンズで共焦点画像を取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで共局在化について解析した。共局在化マスクおよびピアソンのＲ値、閾値を超えるマンダーの共局在化係数およびランダム化Ｃｏｓｔｅｓ Ｐ値を、実験の各動物について少なくとも１スライドについて、方法に記載されているように計算した。示されている代表的な画像および値は、条件ごとに１匹の動物に対応する。スケールバー、５０μｍ。
図２０Ａ～Ｅ（または、図Ｓ４または補足図４）は、ｉ．ｔ．ＬＰＳおよびＣＩＰＮ実験におけるタモキシフェン処置ＷＴマウスの触覚異痛症データを示す。また、ＡＢＣ－ｉｍＫＯ依存性遺伝子についての追加のＲＮＡ－ｓｅｑデータ、およびＷＴマウスに対するＡＢＣ－ｉｍＫＯに対するシスプラチン効果も提供する。ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスの対照として、施設内繁殖ＷＴ同腹仔マウスにタモキシフェンレジメン（ＴＡＭ、２００μＬ／日、１０ｍｇ／ｍＬ、連続５日間）を行い、続いて（図２０Ａ）ｉ．ｔ．ＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）または食塩水（５μＬ）を注射し、２時間後にｉ．ｔ．ＬＰＳ（０．１μｇ／５μＬ）（ｉ．ｔ．食塩水についてはｎ＝４、ｉ．ｔ．ＡＩＢＰについてはｎ＝５）；（図２０Ｂ）１日目および３日目にシスプラチン（２．３ｍｇ／Ｋｇ）をｉ．ｐ．注射し、続いて７日目にＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）または食塩水（５μＬ）をｉ．ｔ．注射した（１群あたりｎ＝４）。触覚異痛症（離脱閾値）は、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを用いて測定した。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．＊、Ｐ＜０．０５。経時的分析における多重比較のためのボンフェローニ事後検定による二元配置分散分析。Ｃ、ＡＢＣ－ｉｍＫＯマウスに、上記のようにＴＡＭ、次いでシスプラチンを注射し、続いて７日目にｉ．ｔ．食塩水（５μＬ）、ＡＩＢＰ（０．５μｇ／５μＬ）またはｈｐ－β－ＣＤ（０．２５ｍｇ／５μＬ）を注射した。ｉ．ｔ．注射の２４時間後の触覚閾値を示す。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝３～４／群）。＊＊、Ｐ＜０．０１。ダネットの多重比較検定を用いる一元配置分散分析。図２０Ｄ、ＡＢＣ－ｉｍＫＯ方式で調節されたすべての条件（ナイーブ、シスプラチン／食塩水またはシスプラチン／ＡＩＢＰによって誘導）にわたって差次的に調節された遺伝子のヒートマップ。交互作用項のない縮小モデルを使用した尤度比検定から得られたすべての有意な遺伝子（条件：遺伝子型）。行および列によってスケーリングされたＬｏｇ２正規化遺伝子数は、各群から２～３個の生物学的サンプルのすべてのテクニカルレプリケートを表す。図２０Ｅ、カットオフＰ＜０．０５、富化＞１．５および経路内の３つの遺伝子の最小重複を使用した、ＷＴおよびＡＢＣ－ｉｍＫＯミクログリアにおけるシスプラチン上方調節遺伝子の経路富化のヒートマップ。ヒートマップは、両方の遺伝子型においてシスプラチンによって富化された共通の経路および特異的経路を表す。
図２１（または、図Ｓ５または補足図５）は、タモキシフェン誘導ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウスの脊髄ミクログリアにおけるＡＩＢＰノックアウトの免疫組織化学的検証を提供する。これはまた、ＢＥ－１モノクローナル抗体がｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰと同様の親和性を有することを実証している。図２１Ａ：ＡＩＢＰ染色とＩＢＡ１（ミクログリア）、ＮｅｕＮ（ニューロン）およびＧＦＡＰ（星状細胞）との共局在を示す、ビヒクルおよびタモキシフェン誘導ＡＩＢＰ－ｉｍＫＯマウス由来の脊髄凍結切片のＩＨＣ。スライドにＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｇＧｏｌｄをマウントした。６３倍の対物レンズで共焦点画像を取得し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアで共局在化について解析した。共局在化マスクおよびピアソンのＲ値、マンダーの共局在化係数およびランダム化ＣｏｓｔｅｓのＰ値を、実験の各動物について少なくとも１スライドの方法に記載されているように計算した。示されている代表的な画像および値は、条件ごとに１匹の動物に対応する。スケールバー、５０μｍ。図２１Ｂ：マイクロタイタープレート中の捕捉抗体としてＢＥ－１を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ。ウサギポリクローナル抗ＡＩＢＰ抗体を使用して、ｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰに対する用量反応曲線を検出した。多重比較のためにボンフェローニ事後検定を用いた二元配置分散分析を使用して、ｗｔＡＩＢＰおよびｍｕｔＡＩＢＰに対するＢＥ－１親和性について統計的差異は見られなかった。
実施例２．ＡＩＢＰのＴＬＲ４への結合の構造決定因子
この実施例は、昆虫系、哺乳動物系または細菌系で発現した異なるＡＩＢＰバリアントのＴＬＲ４の外部ドメインへの結合を試験するためのプルダウン実験の結果を要約する。この実施例の結果は、図１３および図１４における活性についての描写が、すべてのＮ末端修飾がＴＬＲ４結合ドメインを露出させるわけではないことを実証するという点で予想外である。例として、切断部位を含むＮ末端Ｈｉｓタグの推定切断産物は、ＴＬＲ４結合を実証しない。これらの予想外のデータは、ＡＩＢＰポリペプチドに対するＮ末端修飾が特定のアミノ酸組成要件を有することを示唆している。
本明細書で提供される化合物を使用して、プルダウンアッセイを行った。化合物３、７、８または９ならびに図１３および１４に記載の他の構築物を、バキュロウイルス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＣＨＯ（ＥｘｐｉＣＨＯ、発現系、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）細胞発現系のいずれかから精製し、ＴＬＲ４タンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）とともにインキュベートした。プルダウンは、記載される抗ＡＩＢＰ抗体を用いて行った。ＡＩＢＰに結合したＴＬＲ４は、抗ｈｉｓ抗体（修飾ＡＩＢＰとＴＬＲ４の両方がｈｉｓタグを有する）を用いたウエスタンブロットによって検出された。プルダウン法に関する詳細な実験情報は、実施例１に提供されている。
代替アッセイでは、修飾ＡＩＢＰおよびＴＬＲ４のＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションが用いられた。この研究のために、トランスフェクトされたＦｌａｇ－ＡＩＢＰ（化合物５および６について例示）およびＦｌａｇ－ＴＬＲ４－ｈｉｓ構築物を発現させ、トランスフェクトされた細胞を回収し、溶解した。細胞溶解物を抗ＴＬＲ４抗体と共免疫沈降させ、次いで抗ｆｌａｇ抗体で免疫ブロットした。プルダウン法に関する詳細な実験情報は、実施例１に提供されている。
実施例３：例示的なモデルで実証された有効性：喘息
喘息患者の気管支上皮細胞におけるＡＩＢＰ発現の低下：
アポリポタンパク質Ａ－Ｉ結合タンパク質（ＡＩＢＰ；遺伝子名ＡＰＯＡ１ＢＰまたはＮＡＸＥ）は、分泌タンパク質であり（１）、初代肺胞マクロファージ、内皮細胞およびミクログリアをはじめとする活性化細胞からの過剰なコレステロールの除去を促進する（２－４）。本発明者らは、肺サーファクタントが肺胞マクロファージとインキュベートした場合にコレステロール受容体として機能し得ることを実証した（４）。加えて、ＡｐｏＡ－Ｉは気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中に見出される（５）。これらの知見は、コレステロールの流出が、血液および組織だけでなく、肺気腔においても起こることを示唆している。ＡＩＢＰはサーファクタントタンパク質Ｂに結合し、肺胞マクロファージからサーファクタントへのコレステロール流出を増強する（４）。これにより、形質膜内の脂質ラフト含有量が正常化し、肺胞マクロファージにおいて炎症シグナル伝達が減少し、炎症性サイトカインの発現が減少する。吸入によるＬＰＳ肺損傷に応答して、ＡＩＢＰがＢＡＬＦに分泌される（４）。さらに、ＡＩＢＰはマイトファジーを促進し、ミトコンドリア機能の維持を助け、マクロファージの酸化ストレスを軽減する（６）。ＡＩＢＰ発現が炎症からの保護に役立つという仮説は、肺におけるＡＩＢＰレベルの上昇が治療効果を有し得ることを意味する。
肺（４）および他の組織（３、７）におけるＡＩＢＰによってもたらされる広範な抗炎症保護のために、本研究では、内在性ＡＩＢＰの肺発現が喘息患者に影響を及ぼすかどうか、吸入されたＡＩＢＰが喘息のマウスモデルにおいて肺炎症を軽減し、気道過敏性を緩和することができるかどうかを調べた。
非喘息対象から得られた死後のヒト肺組織の免疫組織化学により、気管支上皮細胞における主なＡＩＢＰタンパク質発現のパターンが明らかになった。興味深いことに、ＡＩＢＰ発現は、喘息をもつ対象の死後の肺の気管支上皮細胞で有意に減少した（図２２Ａを参照）。さらに、喘息対象の死後肺から単離された初代気管支上皮細胞は、非喘息対象と比較してＡＰＯＡ１ＢＰ ｍＲＮＡ発現が有意に低かった（図２１Ｄを参照）。ヒト喘息と同様に、気管支上皮における内在性ＡＩＢＰの発現は、鼻腔内ＰＢＳを投与された対照マウスと比較して、チリダニ（ＨＤＭ）負荷マウスにおいて有意に減少した（図２２Ｃを参照のこと）。マウスの急性ＨＤＭ負荷後の気管支上皮におけるＡＩＢＰ発現低下のこのパターンは、マウス急性肺損傷モデル（４）では観察されなかった。さらに、最高レベルのＡＩＢＰを発現する肺細胞型は２つのモデルで異なり、急性肺損傷における最高のＡＩＢＰ発現は、動員された炎症細胞（すなわち、好中球およびマクロファージ）で観察された（４）。対照的に、急性ＨＤＭ負荷後の主な動員炎症細胞（すなわち、好酸球）は、高レベルのＡＩＢＰを発現しなかった。
内在性ＡＩＢＰ発現は喘息で減少し（図２１）、組換えタンパク質としてまたはアデノ随伴ウイルス送達を介したＡＩＢＰの投与は、神経炎症および神経障害性疼痛（７）、血管炎症およびアテローム性動脈硬化症（３）、ならびに急性肺損傷（４）において抗炎症効果および保護効果をもたらしたため、本発明者らは、組換えＡＩＢＰ（化合物７）の鼻腔内送達が喘息のマウスモデルにおいて治療効果を有するかどうかを試験した。
化合物７を、ＨＤＭの投与の２時間前に投与した。
雌マウスにＨＤＭを毎週４回鼻腔内投与すると、肺の好酸球性炎症およびメタコリン負荷に対する気道過敏性（ＡＨＲ）を誘発する（８）。化合物７の２つの用量、２．５および２５μｇ、またはビヒクル（ＰＢＳ）を、鼻腔内ＨＤＭの２時間前に、鼻腔内滴下注入によって、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌および雄マウスに毎週投与した。鼻腔内化合物７は、明らかな有害作用をもたらさなかった。予想通り、ＰＢＳで前処置したＨＤＭＩ負荷雌マウスはＡＨＲを発症した。対照的に、化合物７の前処置は、ＨＤＭ誘発性ＡＨＲを用量依存的に減少させ、２５μｇの用量でＡＨＲのほぼ完全な阻害がもたらされ（図２３Ａ）、ＨＤＭ誘発性肺およびＢＡＬ好酸球増加症の用量依存的減少ももたらした（図２３Ｂ～Ｃ）。このモデルでは、ＨＤＭは、肺胞マクロファージまたは好中球の数の顕著な変化をもたらさない（８）。同様の結果が、雄マウスにおける化合物７についても得られた（図２３Ｄ～Ｆ）。
まとめると、喘息患者のヒト気管支上皮細胞におけるＡＩＢＰ発現は非喘息患者と比較して有意に減少していること、また、喘息のマウスモデルにおけるＨＤＭ負荷後の気管支上皮細胞においても有意に減少していることを本発明者らの研究は実証する。この結果は、非喘息患者と比較して喘息患者のＢＡＬＦ中のＡｐｏＡ－Ｉレベルの低下という所見に一致する（５）。気道上皮および気管支炎症は、気道平滑筋収縮、気道閉塞および喘息増悪をもたらす喘息の主要な成分である（９）ので、抗炎症特性を有するＡＩＢＰのレベルを回復させることは、喘息の新規な治療戦略を提示し得る。喘息の急性ＨＤＭマウスモデルにおいて治療効果を示す化合物７の鼻腔内投与に関する本発明者らの結果は、この命題を裏付けている。吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）は中等度／重度の喘息の処置の基盤であるため、化合物７をＩＣＳと併用した場合に喘息制御に対して相加的な抗炎症効果を有するか、および／またはＩＣＳに良好に反応しないかまたはＩＣＳの副作用のある喘息対象においてＩＣＳに対する他の抗炎症薬であるかを決定するために、前臨床モデルおよびその後の喘息のヒト対象におけるさらなる試験が必要である。
実施例３の材料および方法
ヒト肺検体
喘息患者および非喘息患者からの死後のヒト肺は、Ａｒｋａｎｓａｓ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ＡｇｅｎｃｙおよびＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅによって調達され、Ａｒｋａｎｓａｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＬｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに送達された。免疫組織化学はカリフォルニア大学サンディエゴ校で行った。病院の医療記録に記載された喘息の医師診断を有し、死亡時に喘息薬を使用していた場合に、対象を喘息患者と分類した。医師による喘息の診断をもたず、死亡時に病院の医療記録に喘息薬の使用が記載されていない場合、対象を非喘息患者と分類した。死亡したドナー組織の取得は、アーカンソー医科大学治験審査委員会によって審査され、ヒトを対象とした研究ではないと判定された。この研究は、カリフォルニア大学サンディエゴ校のＨｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｓプログラムによって承認された。
ヒト気管支上皮細胞
初代気管支上皮細胞を死後の肺の気管支から分離した。手短に言えば、気管支を解剖し、各気管支の内部をＣｅｌｌ Ｌｉｆｔｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｉｎｃ．）で掻き取って気管支上皮細胞を得た。気管支上皮細胞を回収し、ＣｎＴ－１７培地（スイス、ベルンのＣｅｌｌｎｔｅｃ）中で培養した。フローサイトメトリーによるＥ－カドヘリン発現によって評価したところ、これらの初代気管支上皮細胞は９５％超純粋であった。
ヒトおよびマウスの肺の免疫組織化学
パラフィン包埋された肺切片を、本発明者らの研究室で開発されたマウス抗ヒトおよび抗マウスＡＩＢＰモノクローナル抗体Ａ７およびＢＥ－１のカクテル（６、７）を使用して染色し、１：２の比で混合した。マウスおよびヒトＡＩＢＰは相同性が高いため、両方の抗体がマウスとヒトのタンパク質を認識する。上皮細胞におけるＡＩＢＰ陽性染色の定量は、画像解析システム（Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて肺切片ごとに行い、結果をヒト検体における気管支基底膜の長さ１μｍあたりの気管支上皮のＡＩＢＰ陽性面積として表した。マウス肺におけるＡＩＢＰ発現は、Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）の平均グレー値ツールを使用して測定し、内径１５０～２００μｍの細気管支の気管支上皮のサイトゾルにおける値を、隣接する肺胞における値に対して正規化した。操作者にはサンプルの正体を知らせなかった。
ＡＰＯＡ１ＢＰ ｍＲＮＡの定量
喘息患者および非喘息患者由来のヒト気管支上皮細胞におけるＡＰＯＡ１ＢＰ ｍＲＮＡを定量するために、各細胞サンプルからの全ＲＮＡを以前に記載されているようにＲＴ－ｑＰＣＲ用に処理した（８）。簡単に記載すると、サンプルをＲＮＡ－ＳＴＡＴ－６０（ＴｅｌＴｅｓｔ）で処置し、オリゴ－ｄＴおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で逆転写した。ヒトＡＰＯＡ１ＢＰ用のＴａｑＭａｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘおよびＴａｑＭａｎプライマー（Ｈｓ．ＰＴ．５８．２２２７８９５６、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を用いてｑＰＣＲを行った。ＡＰＯＡ１ＢＰ ｍＲＮＡの相対量をハウスキーピング遺伝子ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ－１（ＨＰＲＴ１）の相対量に対して正規化した。
化合物７の製造
簡単に記載すると、化合物７をバキュロウイルス／昆虫細胞系で発現させて、翻訳後修飾およびエンドトキシンフリーの調製を確保し、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーと、それに続くイオン交換クロマトグラフィーおよび緩衝液置換によって精製した。生成物は純度９０％超であり、検出可能な凝集体はなく（ＨＰＬＣ－ＳＥＣ）、残留エンドトキシンは０．２ＥＵ／ｍｇ未満であった。－８０℃で最大６ヶ月間または４℃で１週間の化合物７の貯蔵安定性試験は、その力価または純度の消失を何ら示さなかった。
喘息の急性ＨＤＭマウスモデル
すべての実験は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って行われた。８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄および雌）に、１００μｇの鼻腔内ＨＤＭ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）抽出物（Ｇｒｅｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、以前に記載されているように０、７、１４および２１日目に投与した（８）。各ＨＤＭ投与の２時間前に、５０μｌのＰＢＳ対照または２．５μｇまたは２５μｇ用量のいずれかの化合物７溶液を鼻腔内投与した。対照群には、ＨＤＭの代わりに鼻腔内ＰＢＳを投与した。２４日目に、メタコリンに対する気道過敏性を記載されているように評価し（８）、マウスを屠殺してＢＡＬおよび肺を回収した。気管カテーテルを介して１ｍＬのＰＢＳで洗浄することによってＢＡＬを収集し、遠心分離し、ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。ＢＡＬの総細胞数を測定した後、Ｗｒｉｇｈｔ－Ｇｉｅｍｓａ染色スライドで鑑別細胞数を定量した（８）。肺好酸球数は、抗マウス主要塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ウサギポリクローナル抗体（メイヨー医学教育研究財団のご厚意により提供されたもの）で染色した肺パラフィン包埋切片の気管支周囲腔で定量した。結果は、１５０～２００μｍの内径を有する細気管支あたりの陽性染色された気管支周囲細胞数として表される。各スライドにおいて少なくとも５つの細気管支を計数した。操作者にはサンプルの正体を知らせなかった。
統計：全ての結果は、平均±ＳＥＭとして示される。統計ソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を分析に使用した。マン・ホイットニー検定を２つの群の分析に使用した。２つを超える群を比較する場合は、二元配置または一元配置分散分析と事後チューキーの多重比較検定を使用した。０．０５未満のＰ値を統計学的に有意とみなした。
実施例３についての図の凡例
図２２。気管支上皮におけるＡＩＢＰ発現の低下。Ａ．抗ＡＩＢＰ抗体で染色された、喘息のない人対象および喘息のあるヒト対象の死後の肺検体。ＡＩＢＰ陽性気管支上皮の定量（ｎ＝６）。Ｂ．ＨＰＲＴ１に対して正規化された、非喘息患者（ｎ＝９）および喘息患者（ｎ＝１１）から単離された気管支上皮細胞のＡＰＯＡ１ＢＰ ｍＲＮＡ。Ｃ、抗ＡＩＢＰ抗体で染色されたビヒクルまたは１００μｇのＨＤＭを毎週４回鼻腔内投与したマウスの肺。気管支上皮におけるＡＩＢＰ染色の定量（ｎ＝８）。平均±ＳＥＭ；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
図２３。ＲＦＴ１０８１は、雌マウスおよび雄マウスの喘息の急性ＨＤＭモデルにおいて気道過敏性および好酸球性肺炎症を減少させる。雌（Ａ～Ｃ）および雄（Ｄ～Ｆ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、２．５μｇまたは２５．０μｇのＲＦＴ１０８１またはＰＢＳの腔内滴下注入を毎週４回行った。２時間後、マウスに１００μｇのＨＤＭまたはビヒクルの鼻腔内滴下注入を行った。最後の負荷から３日後、マウスをメタコリンに対する気道抵抗（Ａ、Ｄ）について試験し、肺（Ｂ、Ｅ）およびＢＡＬ（Ｃ、Ｆ）を示したように分析のために採取した。平均±ＳＥＭ；群あたりｎ＝８匹のマウス。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊、Ｐ＜０．０００１
実施例４：例示的な方法で実証された有効性：緑内障
ＡＡＶ－ＡＩＢＰは、実験的緑内障において網膜神経節細胞およびその軸索を保護し、視覚機能を改善する。
緑内障ＤＢＡ／２Ｊ（Ｄ２）マウスモデル。遺伝的Ｄ２モデルを、年齢を一致させた非緑内障対照Ｄ２－Ｇｐｎｍｂ＋マウスと共に使用する利点は、それがヒト緑内障の慢性ＩＯＰの上昇を再現できることであり、網膜の病態は約９～１０ヶ月齢で発症する（１、２）。本発明者らは、他の動物モデルと同様に、Ｄ２には限界があることを認識している。なぜなら、これらのマウスでは、緑内障様の病態が、癒着および色素分散を伴う前区異常に続発して発症するためである（１、２）。予備研究では、本発明者らは、Ａｐｏａ１ｂｐ－／－の網膜におけるコレステロール含有量の有意な上昇をＷＴマウスと比較して認め（図２４Ａ参照）、ＡＩＢＰ欠乏が網膜における過剰なコレステロール蓄積を誘導することが示唆される。注目すべきことに、１０月齢の緑内障Ｄ２マウスでは、本発明者らは、Ｄ２－Ｇｐｎｍｂ＋マウスと比較して網膜のコレステロール含有量も有意に上昇していることを発見した（図２４Ｂ）。したがって、本発明者らは、ＡＡＶ－ＡＩＢＰのインビボ送達によるＡＩＢＰの過剰発現が、緑内障Ｄ２マウスにおいて過剰なコレステロール蓄積を逆転させ、ＲＧＣとその軸索を保護し、中枢視覚経路を維持することができるかどうかを試験した。本発明者らがマウスモデルで使用したＡＡＶ血清型はＡＡＶ－ＤＪ／８であり、フィブロネクチンシグナルペプチドが堅牢なタンパク質分泌を確実にするマウスＡＩＢＰを発現した。本発明者らは、５月齢でＡＡＶ－ＮｕｌｌまたはＡＡＶ－ＡＩＢＰを硝子体内注射し、１０月齢で組織サンプル（網膜、視神経乳頭および脳）を分析した。本発明者らは、多重スプライシング（ＲＢＰＭＳ）およびニューロフィラメント６８（ＮＦ ６８）を用いたＲＮＡ結合タンパク質の染色と、能動的取り込みおよび輸送を介して網膜投射全体を示す上丘（ＳＣ）のコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）標識による中枢視覚経路の保存とによって、ＲＧＣおよびその軸索生存を評価した３、４。ＡＡＶ－ＡＩＢＰ注射後、１０月齢で網膜においてＡＩＢＰタンパク質発現が検出された（図２４Ｅ）。ＡＡＶ－ＮｕｌｌではなくＡＡＶ－ＡＩＢＰは、コレステロール含有量を有意に減少させ（図２４Ｃおよび２４Ｄ）、緑内障Ｄ２網膜の中央および周辺領域のＲＧＣを保護した（図２４Ｇおよび図２４Ｈ）。さらに、本発明者らは、ＳＣへのＣＴＢ輸送の有意な改善を観察し（図２４Ｊ～Ｍ）、ＡＡＶ－ＡＩＢＰが視神経の構造的および機能的完全性の維持に役立ったことが示唆された。
マイクロビーズ誘発高眼圧モデル。最近、本発明者らは、マイクロビーズ誘発高眼圧症のマウスモデルの開発に成功し、これは４月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて処置後６週でＲＧＣの有意な消失を示した（図２５）。インビボでのＲＧＣおよび視覚機能に対するＡＡＶ－ＡＩＢＰの保護効果をさらに検証するために、本発明者らは、マイクロビーズ注射の３週間前にＡＡＶ－ＮｕｌｌまたはＡＡＶ－ＡＩＢＰを硝子体内注射した。ＡＡＶ－ＡＩＢＰはＲＧＣ死を有意に減少させ（図２５Ｃを参照）、重要なことに、視覚機能障害を改善した（図２５Ｄ参照）。
視神経挫滅（ＯＮＣ）モデル。ＯＮＣは、同様にＲＧＣ死および変性を誘導するため、外傷性視神経症だけでなく緑内障損傷の有用なモデルとしても役立つ５。本発明者らは、ＯＮＣの３週間前にＡＡＶ－ＮｕｌｌまたはＡＡＶ－ＡＩＢＰを硝子体内注射し、次いで、ＯＮＣの１週間後にＲＢＰＭＳ染色によってＲＧＣ生存を評価した。ＡＩＢＰの過剰発現は、ＲＧＣをＯＮＣ損傷から保護することが見出された（図２６）。
まとめると、これらの知見は、緑内障性神経変性の３つの異なるインビボモデルにおいて、ＡＡＶ送達ＡＩＢＰ発現がコレステロール含有量を減少させ、ＲＧＣおよびそれらの軸索を保護し、ミクログリア活性化を阻害し（図示せず）、視覚機能を維持することを実証する。
実施例４の図の凡例
図２４。ＡＡＶ－ＡＩＢＰは、緑内障ＤＢＡ／２Ｊ（Ｄ２）マウスの網膜神経変性を軽減する。ＡおよびＢ、Ａｐｏａ１ｂｐ－／－マウス。コレステロールのフィリピン染色（Ａ）。内側網膜におけるフィリピン強度の定量（Ｂ）。Ｃ～Ｍ、緑内障Ｄ２マウス。コレステロールのフィリピン染色（Ｃ）。内側網膜におけるフィリピン強度の定量（Ｄ）。抗Ｈｉｓ抗体（Ｅ）を用いた免疫ブロットによる、網膜におけるＡＩＢＰ発現の確認（Ｅ）。ＩＯＰ測定（Ｆ）。網膜周辺領域のＲＢＰＭＳ（緑色）陽性ＲＧＣ（Ｇ）。網膜中央および網膜周辺におけるＲＧＣ生存の定量的分析（Ｈ）。グリア層のＮＦ６８（緑色）陽性軸索（Ｉ）。網膜におけるＣＴＢ標識（赤色）およびＢｒｎ３ａ（緑色）（Ｊ）。ＳＣにおけるＣＴＢ標識（ＫおよびＬ）。ＳＣにおけるＣＴＢ強度の定量（Ｍ）。平均±ＳＥＭ；ｎ＝５～８網膜。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（一元配置分散分析、テューキーの（Ｔｕｒｋｅｙ’ｓ）多重比較検定）。スケールバー：２０μｍ（ＡおよびＣ）および５０μｍ（ＧおよびＩ）。
図２５。ＡＡＶ－ＡＩＢＰは、マイクロビーズ誘発高血圧マウスモデルにおいて網膜神経変性を軽減し、視覚機能を改善する。Ａ、マイクロビーズを注射した眼におけるＩＯＰの時間経過。Ｂ、マイクロビーズ注射後６週でのＴＵＪ１染色による網膜の周辺領域の代表的な画像。Ｃ、網膜の中央領域におけるＲＧＣ生存の定量的分析。Ｄ、ＰＥＲＧ分析による視覚機能測定。平均±ＳＭ；ｎ＝５～８網膜。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。バー：５０μｍ。
図２６。ＡＡＶ－ＡＩＢＰは、網膜神経変性およびマウス視神経挫滅モデルを軽減する。Ａ、ＯＮＣ損傷後の網膜の中央領域におけるＲＢＰＭＳ陽性ＲＧＣの代表的な画像；Ｂ、網膜の中央および周辺領域におけるＲＧＣ生存の定量的分析。平均±ＳＥＭ；ｎ＝５～８網膜。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定）。バー：５０μｍ。
実施例１の参考文献
Figure 2024510757000032
Figure 2024510757000033
Figure 2024510757000034
Figure 2024510757000035
Figure 2024510757000036
 実施例３の参考文献
Figure 2024510757000037
 実施例４の参考文献
Figure 2024510757000038
本発明のいくつかの実施形態が記載された。それにもかかわらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な修正を行うことができることが理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (25)

  1. 単離または組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＩＢＰ）アミノ酸配列と前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸配列とで構成され、
    前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側の前記アミノ酸配列は少なくとも８個のアミノ酸で構成されるか、または、前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側の前記アミノ酸配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ １３、１４、１５、もしくは１６またはそれを超えるアミノ酸長であり、
    前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側の前記アミノ酸配列は、関連する生理学的条件下で、前記ポリペプチドをＴＬＲ４に結合させるために、前記ＡＩＢＰアミノ酸配列中の潜在的なドメインのアンフォールディングを誘導するか、潜在的なドメインを露出させるか、そうでなければアクセス可能にすることができ、
    必要に応じて「関連する生理学的条件」とは、前記ポリペプチド化合物を必要とする対象に投与によってそれを提供する際に、インビボで前記ポリペプチド化合物が経験する前記関連する生理学的条件を指し、
    ただし、前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側の前記アミノ酸配列は、Ｈｉｓタグと、前記条件下で作用させると前記Ｈｉｓタグの消失をもたらすタンパク質切断部位とで構成されていないことを条件とする、単離または組換えポリペプチド。
  2. 前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側の前記アミノ酸配列が、８～４０個の連続したアミノ酸残基酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｃｉｄ）で構成され、そのうちの３～１２個の間のアミノ酸残基は、独立に、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリジン（Ｋ）からなる群から選択される、請求項１に記載の単離または組換えポリペプチド。
  3. 前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側の前記アミノ酸配列のＮ末端が分泌シグナルアミノ酸配列である、請求項１に記載の単離または組換えポリペプチド化合物。
  4. 前記分泌シグナルアミノ酸配列が、フィブロネクチン分泌シグナルドメイン、免疫グロブリン重鎖分泌シグナルドメイン、免疫グロブリンκ軽鎖分泌シグナルドメイン、またはインターロイキン－２シグナルペプチド分泌シグナルドメインである、請求項３に記載の単離または組換えポリペプチド化合物。
  5. 前記フィブロネクチン分泌シグナルドメインが、ＭＬＲＧＰＧＰＧＲＬＬＬＬＡＶＬＣＬＧＴＳＶＲＣＴＥＴＧＫＳＫＲ（配列番号２４）である、請求項４に記載の単離または組換えポリペプチド。
  6. 前記ＡＩＢＰ配列が、ｈＡＩＢＰ（配列番号６）またはｄ２４ｈＡＩＢＰ（配列番号８）である、請求項１に記載の単離または組換えポリペプチド。
  7. 前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側の前記アミノ酸配列が、前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＴＬＲ４結合ドメインのＮ末端側の６個の連続したヒスチジンアミノ酸残基（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号１）で構成される、請求項１に記載の単離または組換えポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチドが、前記ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質配列の前記ＴＬＲ４結合ドメインの前記Ｎ末端間に介在するトロンビン切断ドメインを有し、前記トロンビン切断ドメインが、１またはそれを超えるアミノ酸欠失および／または変異をこのドメイン内に有し、それによりそれを機能的に動作不能にする、請求項７に記載の単離または組換えポリペプチド。
  9. 前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側の前記アミノ酸配列が、
    ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号２）またはＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＤＧＤＤＧＤＤＤＲ（配列番号１９）であり、それぞれがそのトロンビン切断ドメインのアミノ酸変異を有し、それによりそれを機能的に動作不能にする、請求項１に記載の単離または組換えポリペプチド。
  10. 前記ＡＩＢＰアミノ酸配列のＮ末端側の前記アミノ酸配列が、
    ＴＥＴＧＫＳＫＲ（配列番号２６）、
    ＭＤＹＫＤＨＤＧＤＹＫＤＨＤＩＤＹＫＤＤＤＤＫＬＡＡＡＮＳ（配列番号３３）、
    および
    ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＡＡＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号７）
    からなる群から選択される、請求項１に記載の単離または組換えポリペプチド。
  11. 前記ＡＩＢＰアミノ酸配列が哺乳動物ＡＩＢＰアミノ酸配列のＡＩＢＰアミノ酸配列である、請求項１０に記載の単離または組換えポリペプチド化合物。
  12. 前記哺乳動物ＡＩＢＰアミノ酸配列がヒトＡＩＢＰアミノ酸配列のＡＩＢＰアミノ酸配列である、請求項１１に記載の単離または組換えポリペプチド化合物。
  13. 前記ヒトＡＩＢＰアミノ酸配列が、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿６５８９８５．２を含む２８８アミノ酸残基の全長アミノ酸配列である、請求項１２に記載の単離または組換えポリペプチド化合物。
  14. 前記ヒトＡＩＢＰアミノ酸配列が、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿６５８９８５．２を含み、前記ＡＩＢＰアミノ酸配列からアミノ酸１～２４が欠失している、前記ヒトＡＩＢＰアミノ酸配列である、請求項１２に記載の単離または組換えポリペプチド化合物。
  15. 請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物と、非経口投与に適した少なくとも１つの賦形剤とで構成される医薬組成物。
  16. 非経口投与が髄腔内注射または髄腔内インプラントによるものである、請求項１６に記載の医薬組成物。
  17. 前記核酸化合物が、請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物をコードする核酸配列からなる、核酸化合物。
  18. 請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド化合物をコードする核酸配列からなる発現ベクター。
  19. 前記発現ベクターが、組換えアデノウイルスである、請求項１９に記載の発現ベクター。
  20. 以下の症状：
    －神経障害性疼痛、
    －炎症誘発性神経障害性疼痛、
    必要に応じて、前記炎症誘発性神経障害性疼痛は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）媒介性炎症誘発性神経障害性疼痛を含む、
    －神経またはＣＮＳの炎症、
    必要に応じて、前記神経またはＣＮＳの炎症は、ＴＬＲ４媒介性神経またはＣＮＳの炎症を含む、
    －異痛症、
    必要に応じて、前記異痛症は、ＴＬＲ４媒介性異痛症を含む、
    －神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛、
    必要に応じて、前記神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛は、外傷、化学療法、関節炎、糖尿病、またはウイルス感染によって生じるかまたは引き起こされるか、あるいはそれらの後遺症である、
    －術後疼痛または神経障害性疼痛、
    －化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性ＣＩＰＮまたは異痛症）、
    －神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患または状態、必要に応じてアルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、
    －原発性頭痛、必要に応じて片頭痛または群発性頭痛、
    －痛覚過敏、
    －緑内障またはその他の眼の炎症性疾患、
    －肺炎症および喘息、
    －急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、
    －敗血症、
    －ウイルス感染症、必要に応じて前記ウイルスは、インフルエンザもしくはコロナウイルス（必要に応じて、前記コロナウイルスはＣＯＶＩＤ－１９である）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＨＩＶ感染症を引き起こすウイルス、（必要に応じて、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）、または肝炎ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅまたは麻疹ウイルス、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓまたはムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓまたは風疹ウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ウイルス性髄膜炎、ライノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスまたは水痘ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたは痘瘡もしくは天然痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ハンタウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅまたはデングウイルス、ジカウイルス、またはチクングニアウイルス感染症、またはその併存疾患、ならびに／あるいは
    －血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、
    （対象において、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）を添加することによるか、または、ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質のレベルを増加させることによる）、
    前記方法が、
    （ａ）以下を含む製剤または医薬組成物を提供することであって：
    （ｉ）少なくとも約１０個のアミノ酸、または約５～２０個の間のアミノ酸、または約１０～１００個の間のアミノ酸、または約２０～８０個の間のアミノ酸、または約３０～５０個の間のアミノ酸の異種アミノ末端アミノ酸配列を有するか、あるいは、ｗｔ ＡＩＢＰに存在しないかまたは（ＡＩＢＰに対して）非ネイティブであるアミノ酸残基もしくはペプチドである（本明細書で提供されるようにＡＩＢＰバリアントとも呼ばれる）、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個またはそれを超えるアミノ酸残基を前記ＡＩＢＰアミノ末端に有する、組換えもしくは合成ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチド化合物または組成物であって、
    必要に応じて、前記異種アミノ末端アミノ酸配列はペプチドタグを含み、必要に応じて、前記ペプチドタグはマルチヒスチジン（ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓ）タグを含み、必要に応じて、前記ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓタグは６個のヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１））、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個またはそれを超えるヒスチジン残基を含み、
    必要に応じて、前記異種アミノ末端アミノ酸配列は、酵素切断部位を含み、必要に応じて、前記酵素切断部位はトロンビン切断部位を含み、
    必要に応じて、前記異種アミノ末端アミノ酸配列は分泌シグナルを含み、必要に応じて、前記分泌シグナルは、フィブロネクチン分泌シグナル、免疫グロブリン重鎖分泌シグナルまたは免疫グロブリンκ軽鎖分泌ペプチド、またはインターロイキン－２シグナルペプチドを含み、
    必要に応じて、前記異種アミノ末端アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号２）を含み、
    前記バリアントは、ＡＩＢＰのＴＬＲ４への結合を媒介するアミノ酸２５～５１を含む前記ＡＩＢＰ分子中の潜在的なドメインを折り畳むまたは露出させるまたはアクセス可能にすることができる、組換えもしくは合成ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチド化合物または組成物と；
    （ｉｉ）（ｉ）の前記ＡＰＯＡ１ＢＰポリペプチドをコードする組換え核酸であって、
    必要に応じて、ＡＰＯＡ１ＢＰポリペプチドまたはＡＰＯＡ１ＢＰポリペプチド活性を有するポリペプチドを発現するかまたはコードする核酸は、発現ビヒクル、ベクター、組換えウイルス、または同等物に含められ、
    必要に応じて、前記ベクターまたはウイルスは、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルス、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、または合成ベクターであるかまたはこれらを含み、
    必要に応じて、前記ＡＡＶベクターは、以下を含むかまたは以下である：
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはアデノウイルスベクター、
    ＡＡＶ血清型またはバリアントＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪまたはＡＡＶ－ＤＪ／８（商標）（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、
    アカゲザル由来ＡＡＶ、または前記アカゲザル由来ＡＡＶ ＡＡＶｒｈ．１０ｈＣＬＮ２、
    ＡＡＶカプシド変異体またはＡＡＶハイブリッド血清型、
    臓器指向性ＡＡＶ、または心臓指向性ＡＡＶ、または心臓指向性ＡＡＶＭ４１変異体、
    ここで、必要に応じて、前記ＡＡＶは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶに対して非許容性である特定の細胞型を標的とする効率を高め、かつ／または目的の細胞型のみに感染する効率を改善するように操作されており、
    必要に応じて、前記ハイブリッドＡＡＶは、１）トランスカプシド化、２）二重特異性抗体のカプシド表面への吸着、３）モザイクカプシドの操作、および／または４）キメラカプシドの操作：を含む、１またはそれを超える改変によってハイブリッド血清型として再標的化または操作される、組換え核酸と；
    （ｉｉｉ）前記組換えもしくは合成のＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチドまたはタンパク質が、ヒトもしくは哺乳動物のＡＰＯＡ１ＢＰ、またはＡＩＢＰ１またはＡＩＢＰ２配列の全部または一部であるかまたはこれらを含む、（ｉ）～（ｉｉ）のいずれかの前記製剤または医薬組成物と；
    （ｉｖ）インビボ投与のために製剤化された；または経腸もしくは非経口投与用に、または経口、静脈内（ＩＶ）または髄腔内（ＩＴ）投与用に製剤化された（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの製剤または医薬組成物であって、
    必要に応じて、前記製剤もしくは医薬組成物、または前記組換え、ペプチド模倣体もしくは合成ＡＰＯＡ１ＢＰ、またはＡＰＯＡ１ＢＰの生物学的等価体、または前記ＡＰＯＡ１ＢＰをコードする核酸、または前記ＡＰＯＡ１ＢＰをコードする核酸を含有するベクターは、ナノ粒子、粒子、ミセル、またはリポソームもしくはリポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、またはデンドリマー中に担持され、これは、必要に応じて、細胞もしくはＣＮＳ透過性部分もしくはペプチドまたはＣＮＳ標的化部分もしくはペプチドをさらに含むかまたは発現することができる、（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの製剤または医薬組成物と；あるいは
    （ｖ）ナノ粒子、リポソーム、錠剤、丸剤、カプセル剤、ゲル剤、ゲルタブ剤、液剤、粉剤・散剤、乳剤、ローション剤、エアロゾル剤、スプレー剤、ロゼンジ剤、水性もしくは滅菌もしくは注射用液剤、またはインプラント（例えば、髄腔内インプラント）として製剤化された（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかの製剤または医薬組成物とを含む、製剤または医薬組成物を提供することと；
    （ｂ）（ａ）の前記製剤または前記医薬組成物を、投与することを必要とする対象に投与することであって、必要に応じて、前記対象はヒトまたは動物であり、
    それにより、以下の症状：
    －神経障害性疼痛、
    －炎症誘発性神経障害性疼痛、
    必要に応じて、前記炎症誘発性神経障害性疼痛は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）媒介性炎症誘発性神経障害性疼痛を含む、
    －神経またはＣＮＳの炎症、
    必要に応じて、前記神経またはＣＮＳの炎症は、ＴＬＲ４媒介性神経またはＣＮＳの炎症を含む、
    －異痛症、
    必要に応じて、前記異痛症は、ＴＬＲ４媒介性異痛症を含む、
    －神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛、
    必要に応じて、前記神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛は、外傷、化学療法、関節炎、糖尿病、またはウイルス感染によって生じるかまたは引き起こされるか、あるいはそれらの後遺症である、
    －術後疼痛または神経障害性疼痛、
    －化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性ＣＩＰＮまたは異痛症）、
    －神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患または状態、必要に応じてアルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、
    －原発性頭痛、必要に応じて片頭痛または群発性頭痛、
    －痛覚過敏、
    －緑内障またはその他の眼の炎症性疾患、
    －肺炎症および喘息、
    －急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、
    －敗血症、
    －ウイルス感染症、必要に応じて前記ウイルスは、インフルエンザもしくはコロナウイルス（必要に応じて、コロナウイルスはＣＯＶＩＤ－１９である）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＨＩＶ感染症を引き起こすウイルス、（必要に応じて、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）、または肝炎ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅまたは麻疹ウイルス、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓまたはムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓまたは風疹ウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ウイルス性髄膜炎、ライノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスまたは水痘ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたは痘瘡もしくは天然痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ハンタウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅまたはデングウイルス、ジカウイルス、またはチクングニアウイルス感染症、またはその併存疾患、ならびに／あるいは
    －血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患
    を処置する、改善する、防止する、逆転するまたは前記症状の重症度もしくは持続期間を減少させるか、または前記症状の重症度を減少させるための、方法。
  21. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の組換えまたは単離されたポリペプチド、請求項１５または１６に記載の製剤または医薬組成物、あるいは請求項２０で使用されるものを含み、必要に応じて、請求項２０に記載の方法を実施するための指示を含む、キット。
  22. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の組換えまたは単離されたポリペプチド、請求項１５または１６に記載の製剤または医薬組成物、あるいは請求項２０で使用される医薬組成物の、医薬の製造における使用。
  23. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の組換えまたは単離されたポリペプチド、請求項１５または１６に記載の製剤または医薬組成物、請求項１で使用される製剤または医薬組成物の、以下の症状：
    －神経障害性疼痛、
    －炎症誘発性神経障害性疼痛、
    必要に応じて、前記炎症誘発性神経障害性疼痛は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）媒介性炎症誘発性神経障害性疼痛を含む、
    －神経またはＣＮＳの炎症、
    必要に応じて、前記神経またはＣＮＳの炎症は、ＴＬＲ４媒介性神経またはＣＮＳの炎症を含む、
    －異痛症、
    必要に応じて、前記異痛症は、ＴＬＲ４媒介性異痛症を含む、
    －神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛、
    必要に応じて、前記神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛は、外傷、化学療法、関節炎、糖尿病、またはウイルス感染によって生じるかまたは引き起こされるか、あるいはそれらの後遺症である、
    －術後疼痛または神経障害性疼痛、
    －化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性ＣＩＰＮまたは異痛症）、
    －神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患または状態、必要に応じてアルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、
    －原発性頭痛、必要に応じて片頭痛または群発性頭痛、
    －痛覚過敏、
    －緑内障またはその他の眼の炎症性疾患、
    －肺炎症および喘息、
    －急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、
    －敗血症、
    －ウイルス感染症、必要に応じて前記ウイルスは、インフルエンザもしくはコロナウイルス（必要に応じて、前記コロナウイルスはＣＯＶＩＤ－１９である）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＨＩＶ感染症を引き起こすウイルス、（必要に応じて、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）、または肝炎ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅまたは麻疹ウイルス、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓまたはムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓまたは風疹ウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ウイルス性髄膜炎、ライノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスまたは水痘ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたは痘瘡もしくは天然痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ハンタウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅまたはデングウイルス、ジカウイルス、またはチクングニアウイルス感染症、またはその併存疾患、ならびに／あるいは
    －血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患
    を処置する、改善する、防止する、逆転するまたは前記症状の重症度もしくは持続期間を減少させるため、または前記症状の重症度を減少させるための医薬の製造における使用。
  24. 以下の症状：
    －神経障害性疼痛、
    －炎症誘発性神経障害性疼痛、
    必要に応じて、前記炎症誘発性神経障害性疼痛は、トール様受容体４（ＴＬＲ４）媒介性炎症誘発性神経障害性疼痛を含む、
    －神経またはＣＮＳの炎症、
    必要に応じて、前記神経またはＣＮＳの炎症は、ＴＬＲ４媒介性神経またはＣＮＳの炎症を含む、
    －異痛症、
    必要に応じて、前記異痛症は、ＴＬＲ４媒介性異痛症を含む、
    －神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛、
    必要に応じて、前記神経もしくは組織損傷後の疼痛または神経障害性疼痛は、外傷、化学療法、関節炎、糖尿病、またはウイルス感染によって生じるかまたは引き起こされるか、あるいはそれらの後遺症である、
    －術後疼痛または神経障害性疼痛、
    －化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）（例えば、シスプラチン誘発性ＣＩＰＮまたは異痛症）、
    －神経変性疾患または状態、必要に応じて慢性または進行性の神経変性疾患または状態、必要に応じてアルツハイマー病または慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）または関連するタウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、外傷後ストレス障害、外傷性戦争神経症、または外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＳ）、
    －原発性頭痛、必要に応じて片頭痛または群発性頭痛、
    －痛覚過敏、
    －緑内障またはその他の眼の炎症性疾患、
    －肺炎症および喘息、
    －急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、
    －敗血症、
    －ウイルス感染症、必要に応じて前記ウイルスは、インフルエンザもしくはコロナウイルス（必要に応じて、前記コロナウイルスはＣＯＶＩＤ－１９である）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＨＩＶ感染症を引き起こすウイルス、（必要に応じて、インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）、または肝炎ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅまたは麻疹ウイルス、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓまたはムンプスウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）、Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓまたは風疹ウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、ウイルス性髄膜炎、ライノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスまたは水痘ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓまたは痘瘡もしくは天然痘ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、ハンタウイルス、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅまたはデングウイルス、ジカウイルス、またはチクングニアウイルス感染症、またはその併存疾患、ならびに／あるいは
    －血管炎症、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患、
    を処置する、改善する、防止する、逆転するまたは前記症状の重症度もしくは持続期間を減少させるため、または前記症状の重症度を減少させるための方法に使用するための製剤、医薬組成物または治療的組合せであって、
    前記製剤または前記治療的組合せは、請求項１から１４のいずれかに記載の組換えまたは単離されたポリペプチド、請求項１５または１６に記載の製剤または医薬組成物、あるいは請求項２０に記載の製剤または治療的組合せを含み、
    前記製剤または治療的組合せは、投与することを必要とする個体または患者に投与される、製剤、医薬組成物または治療的組合せ。
  25. ＡｐｏＡ－Ｉ結合タンパク質（ＡＰＯＡ１ＢＰ、ＡＩＢＰ、またはＡＩ－ＢＰ）ポリペプチドの前記潜在的な（または隠れた、露出していない、アクセス不可能な）Ｎ末端ＴＬＲ４結合ドメインを露出させるための方法であって、ネイティブＡＩＢＰポリペプチドに、少なくとも約１０アミノ酸、または約５～５０個の間のアミノ酸、または約１０～１００個の間のアミノ酸の異種アミノ末端アミノ酸配列を付加すること、あるいは約２０～８０個のアミノ酸、または約３０～５０個の間のアミノ酸を付加すること、あるいは、ｗｔ ＡＩＢＰに存在しないかまたは非ネイティブ（非ＡＩＢＰ）であるアミノ酸残基もしくはペプチドである５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個またはそれを超えるアミノ酸残基を前記アミノ末端に付加することを含み、
    必要に応じて、前記異種アミノ末端アミノ酸配列は、ペプチドタグを含み、必要に応じて、前記ペプチドタグは、マルチヒスチジン（ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓ）タグを含み、必要に応じて、前記ｍｕｌｔｉ－ｈｉｓタグは、少なくとも６個のヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１））、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個またはそれを超えるヒスチジン残基を含み、
    必要に応じて、前記異種アミノ末端アミノ酸配列は、酵素切断部位を含み、必要に応じて、前記酵素切断部位は、トロンビン切断部位を含み、
    必要に応じて、前記異種アミノ末端アミノ酸配列は、分泌シグナルを含み、必要に応じて、前記分泌シグナルは、フィブロネクチン分泌シグナル、免疫グロブリン重鎖分泌シグナルもしくは免疫グロブリンκ軽鎖分泌ペプチド、またはインターロイキン－２シグナルペプチドを含み、
    必要に応じて、前記異種アミノ末端アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列
    ＭＳＰＩＤＰＭＧＨＨＨＨＨＨＧＲＲＲＡＳＶＡＡＧＩＬＶＰＲＧＳＰＧＬＤＧＩＣＳＲ（配列番号２）
    を含む方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8513702D0 (en) 1985-05-30 1985-07-03 Gill S S Expansible trocar
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5846743A (en) 1995-02-22 1998-12-08 Brigham And Women's Hospital, Inc. Polyphoshoinositide binding peptides for intracellular drug delivery
US5874268A (en) 1996-09-23 1999-02-23 Duke University Method of introducing exogenous compounds into cells by electroporation and apparatus for same
SE9704076D0 (sv) 1997-11-06 1997-11-06 Holdingbolaget Vid Goeteborgs Method for permeabilisation of cell structures and use thereof
US6589503B1 (en) 1998-06-20 2003-07-08 Washington University Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy
US7343205B1 (en) 2002-08-20 2008-03-11 Boston Scientific Neuromodulation Corp. System and method for insertion of a device into the brain
US7371225B2 (en) 2002-09-24 2008-05-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method for convection enhanced delivery of therapeutic agents
US20050142141A1 (en) 2002-11-27 2005-06-30 Pardridge William M. Delivery of enzymes to the brain
US20040151766A1 (en) 2003-01-30 2004-08-05 Monahan Sean D. Protein and peptide delivery to mammalian cells in vitro
US20050026823A1 (en) 2003-06-20 2005-02-03 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
US20050136121A1 (en) 2003-12-22 2005-06-23 Shear/Kershman Laboratories, Inc. Oral peptide delivery system with improved bioavailability
KR20060123384A (ko) 2003-12-24 2006-12-01 가부시키가이샤 엘티티 바이오파마 약물을 함유하는 나노 입자 및 그 제조 방법, 그리고 당해나노 입자로 이루어지는 비경구 투여용 제제
US8658203B2 (en) 2004-05-03 2014-02-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for drug delivery to the brain
US20070082042A1 (en) 2004-08-06 2007-04-12 Deok-Hoon Park Multiple-layered liposome and preparation method thereof
DE602005025676D1 (de) 2004-10-18 2011-02-10 Nitto Denko Corp Intrazelluläre peptidabgabe
US20060129126A1 (en) 2004-11-19 2006-06-15 Kaplitt Michael G Infusion device and method for infusing material into the brain of a patient
EP1937213B1 (en) 2005-07-27 2017-10-25 Protiva Biotherapeutics Inc. Systems and methods for manufacturing liposomes
WO2008067183A1 (en) 2006-11-30 2008-06-05 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education A device for cell delivery into the brain or body
WO2008070769A1 (en) 2006-12-06 2008-06-12 Medtronic, Inc. Intrathecal catheter
US10364275B2 (en) * 2013-05-27 2019-07-30 The Regents Of The University Of California Methods for treating inflammatory responses or diseases caused by inflammation using ApoA-I binding protein (APOA1BP)
PL3386527T3 (pl) * 2015-12-10 2022-01-31 The Regents Of The University Of California Kompozycje do zastosowania w leczeniu lub łagodzeniu neurozapalenia, neurodegeneracji, bólu neuropatycznego i migreny

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