JP2024509055A - 抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる抗体と、ＣＯＶＩＤ－１９を含む、コロナウイルス感染症並びにコロナウイルス感染症と関連する疾患及び／又は合併症の予防、処置及び／又は診断の方法及びその使用とに関する。
Description
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９を含む、コロナウイルス感染症並びにコロナウイルス感染症と関連する疾患及び／又は合併症の予防、処置及び／又は診断に有用な抗体に関する。
ＣＯＶＩＤ－１９という名称のウイルスの重症急性呼吸器症候群は、中国の武漢で２０１９年１２月に最初に報告された。ウイルスは、全世界にわたって迅速に広まり、１２ヵ月以内で２億人超の感染及び４千４百万人超の死亡を確認するパンデミックに至った。病原体であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、両方とも重度の呼吸症候群を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＭＥＲＳコロナウイルスに関係するベータコロナウイルスである。
ＣＯＶＩＤ－１９の病原体としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の同定から数ヶ月以内に疾患及びウイルスの理解に相当な進歩があった。現在、デキサメタゾン及びトシリズマブ並びにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含むいくつかの立証された処置が存在し、これらは、予防的背景及び治療的背景の両方に用いられた場合に有効であることが示されている（非特許文献１）。これらの進歩にも関わらず、パンデミックは、決して制御下にはなく、感染の波が継続している。
コロナウイルスは、４つの構造タンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、膜タンパク質及びスパイク（Ｓ）タンパク質を有する。スパイクタンパク質は、最も顕著な表面タンパク質である。スパイクタンパク質は、細長い三量体構造を有し、標的細胞の係合並びにウイルス膜及び宿主膜の融合のトリガーを担う。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の両方に由来するスパイクタンパク質は、細胞表面受容体としてアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を用いる。ＡＣＥ２は、上下気道の上皮細胞を含むいくつかの組織で発現される。
Ｓタンパク質は、２つのサブユニット、受容体結合を媒介するＳ１並びにウイルス膜及び宿主細胞膜の融合を担うＳ２からなる。Ｓタンパク質は、受容体結合又はトリプシン処理に従うＳ１及びＳ２間の切断により、融合後状態に移行することができる動的構造である。一部のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列では、フーリンプロテアーゼ切断部位がＳ１サブユニットとＳ２サブユニットとの間に挿入されており、切断部位の変異は、動物モデルで疾患を軽減する。Ｓ１断片は、Ｓの膜遠位先端を占有し、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に再分割され得る。両方の領域は、免疫原性である一方、ＲＢＤは、ＡＣＥ２結合のための相互作用表面を含有する。通常、Ｓ２の最上部に対して詰め込まれているが、ＲＢＤは、上方に向きを変えてＡＣＥ２に係合することができる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、「アップ」及び「ダウン」高次構造の一方又は両方を認識する。Ｓタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１との間で比較的保存される（７６％）が、ＲＢＤ及びＮＴＤは、Ｓ２ドメイン（９０％）よりも保存されない（それぞれ７４％及び５０％）。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及び季節性ヒトコロナウイルスによる保存は、かなり低い（１９～２１％）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体全体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１とでも交差反応性の制限を示す。
ＡＣＥ２への結合は、Ｓ１受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）において、Ｓの先端の小さい２５アミノ酸パッチによって媒介される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染個体から生成されるｍＡｂの大きいパネルの分析により、Ｓ１及びＳ２にわたるマルチエピトープに結合するｍＡｂが明らかとなっている。大部分のｍＡｂは、高い親和性でＳに結合することができるが、中和活性をほとんど又は全く示さない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムサーベーランスにより、構造タンパク質及び非構造タンパク質内で何千もの変異が特定されている。しかしながら、２０２０年の終わり頃、局所的に優占株に迅速になったウイルスバリアントが記載され、懸念されるバリアント（ＶｏＣ）の世界的な蔓延及びその命名に至った。
伝染性が高いアルファ（Ｂ．１．１．７）は、最初に英国で特定された。Ｂ．１．１．７は、スパイク内において、ＡＣＥ２相互作用表面にＮ５０１Ｙを含む９アミノ酸変化を保有する。ベータ（Ｂ．１．３５１としても知られている５０１Ｙ．Ｖ２）は、南アフリカで最初に報告された。スパイクタンパク質内に１０及び１２アミノ酸変化をそれぞれ有するガンマ（Ｐ．１、５０１Ｙ．Ｖ２）は、ブラジルで最初に報告された。デルタが最初にインドから報告されて、現在全世界にわたって広がっており、いくつかの国でアウトブレイクを引き起こした。
これらのバリアントの全ては、Ｓ内に多重変異を含有し、ＲＢＤ、ＮＴＤ及び場合によりＳ１とＳ２との間のフーリン切断部位内に変化を含む。アルファ（Ｎ５０１Ｙ）、ベータ（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、ガンマ（Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）及びデルタ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）に見出されるＲＢＤ変異は、ＡＣＥ２相互作用表面内に又はその表面に密に隣接して位置し、そこで、ＲＢＤ変異は、中和抗体の結合を損なわせるＡＣＥ２相互作用を調節する潜在性を有する。ＡＣＥ２相互作用の親和性の増大は、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ（それぞれ７、１９、１９、２倍）について際立っており、ウイルス伝染性を増大させる役割を果たす可能性がある。
モノクローナル抗体を用いるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キットも開発されている。例として、例えばＩｎｎｏｖａ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒａｐｉｄ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｔｅｓｔ）及びＱｕｉｄｅｌ（Ｓｏｆｉａ ２ ＳＡＲＳ Ａｎｔｉｇｅｎ ＦＩＡ）によるラテラルフロー試験が挙げられる。しかしながら、これらの試験は、非常に不正確であることが報告されている。
現在認可されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの全ては、Ｓに対する抗体（及びＴ細胞）応答を誘導し、起源の武漢株に見出されるＳ配列を含有するように設計されている。したがって、ＶｏＣ内のＳ変異が免疫回避を引き起こして、ワクチン不全又は以前に感染した個体における反復感染に対する感受性の原因となり得るかに関して、特定の懸念が存在する。
ベータに対するワクチンの有効性は、いくつかの研究において、引き下げられることが報告されており、これは、初期のパンデミック症例から得られた血清又はワクチンを用いて、初期のパンデミック株の中和と比較した場合、ベータに対する有意に引き下げられた中和力価と一致する（非特許文献２）。ベータにおいて存在するＲＢＤ変異（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）は、臨床用途用及びおそらくＮＴＤ内の変化と共に開発されたいくつかのものを含む、いくつかの強力な中和ｍＡｂの結合を損なわせ、ベータと初期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間の抗原性距離を説明する。
Ｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６９，１０１４－１０１８
Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１
本発明の目的は、ＣＯＶＩＤ－１９、とりわけベータ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質内のＲＢＤにおいてさらなる変異を有する、依然として特定されていないバリアントを含むコロナウイルス感染症並びにコロナウイルス感染症と関連する疾患及び／又は合併症を予防、処置及び／又は診断するのに有用なさらなる改善された抗体を特定することである。
本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を認識する２８個のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を特定した（表２を参照されたい）。これらの抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して強力な中和活性を示した。表２の抗体のいくつかは、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株並びに種々の系統由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、例えばＡ．２３．１、Ｂ．１．１．７（アルファ）、Ｂ．１．３５１（ベータ）、Ｂ．１．２５８、Ｂ．１．５２６．２、Ｂ．１．６１６、Ｂ．１．６１７．１（カッパ）、Ｂ．１．６１７．２（デルタ）、Ｃ３６．３、Ｃ．３７（ラムダ）、Ｐ．１（ガンマ）及び／又はＢ．１．１．５２９（オミクロン）株に対して広く有効である強力な中和効果を実証した。さらに、表２の抗体のいくつかは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＲＢＤ内の特定の変異、例えば５０１Ｙ、４８４Ｋ、４１７Ｎ／Ｔに対して強力な中和効果を実証した。
表２のｍＡｂの多くは、パブリックＶ遺伝子（大部分の集団によって共有されるＶ遺伝子）を用いており、生殖細胞系と比較してほとんど変異を有しない。本発明者らは、同じパブリックＶ遺伝子に由来する表１及び２の抗体の軽鎖及び重鎖を交換することにより、さらなる抗体を生成した。同じパブリックＶ遺伝子に由来する抗体は、特に有用な混合鎖抗体を提供することが見出された。例えば、結果として生じる混合鎖抗体のいくつかは、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株並びに種々の系統由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、例えばＡ．２３．１、Ｂ．１．３５１（ベータ）、Ｂ．１．２５８、Ｂ．１．５２６．２、Ｂ．１．６１６、Ｂ．１．６１７．１（カッパ）、Ｃ３６．３及び／又はＣ．３７（ラムダ）株に対して広く有効である強力な中和効果を示した。
特に、本発明者らは、抗体ベータ－２７、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－５６、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／１６５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／２５３Ｌ、ベータ－４７Ｈ／３１８Ｌ、２５３Ｈ／ベータ－４７Ｌ、ベータ－２７Ｈ／１５０Ｌ、ベータ－２７Ｈ／２２２Ｌ、ベータ－２７Ｈ／２６９Ｌ及び１５０Ｈ／ベータ－２７Ｌが、ビクトリア、南アフリカ（Ｂ．１．３５１；ベータ）及びデルタ株に対して広く有効である強力な中和効果を効力の消失なく示すことを見出した。
さらに、本発明者らは、強力な交差系統中和抗体ベータ－４９及びベータ－５０が、以前に観察されなかったスパイクタンパク質の高次構造に結合することを特定した。この高次構造は、本明細書中で「ダウンアンドアウト」高次構造と称される。「ダウンアンドアウト高次構造」は、従来のダウン（アクセス不能な受容体）高次構造に類似している。ただし、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、アミノ酸位置３４３でのＮ－グリコシル化部位との接触を除いて、スパイクタンパク質三量体内の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）間の直接的接触は、存在しない。ベータ－４９及びベータ－５０によって結合したエピトープは、スパイクタンパク質三量体の２つのサブユニットの全体に広がることで、抗体は、アクセス不能な受容体である「ダウンアンドアウト高次構造」の三量体をロックすることが可能となる。ベータ－４９及びベータ－５０によって結合したエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の種々の系統の全体にわたって十分に保存されている。抗体ベータ－４９及びベータ－５０によって結合したエピトープ、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント内に変異が観察されたが、これらの変異は、驚くべきことに、抗体ベータ－４９及びベータ－５０の中和特性に影響しない。したがって、ベータ－４９及びベータ－５０と同じエピトープに結合する抗体は、広い交差系統中和特性を有すると予想される。
したがって、本発明の態様は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる抗体を提供し、（ａ）抗体は、抗体ベータ－４７又は表２内の２７個の抗体のいずれか１つの少なくとも３つのＣＤＲを含むか；（ｂ）抗体は、スパイクタンパク質上における、抗体ベータ－４９若しくはベータ－５０と同じエピトープに結合することができるか、又は抗体ベータ－４９若しくはベータ－５０と競合するか；或いは（ｃ）抗体は、ダウンアンドアウト高次構造でスパイクタンパク質をロックすることができ、ダウンアンドアウト高次構造は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、アミノ酸位置３４３のＮ－グリコシル化部位を介することを除いて、３つのスパイクタンパク質であって、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）間の直接的接触を有しない３つのスパイクタンパク質を含むスパイク三量体によって特徴付けられる。
本発明は、本発明に従う２つ以上の抗体を含む抗体の組合せも提供する。
本発明は、（ａ）本発明に従う抗体と；（ｂ）表１内の抗体の少なくとも３つのＣＤＲを含む抗体とを含む抗体の組合せも提供する。例えば、（ｂ）の抗体は、（ｉ）表１内の抗体の少なくとも４つ、５つ若しくは６つ全てのＣＤＲ；（ｉｉ）表１内の抗体の重鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン；（ｉｉｉ）表１内の抗体の軽鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる軽鎖可変ドメイン；並びに／又は（ｉｖ）表１内の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖ドメインに対してそれぞれ少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。
本発明は、本発明に従う抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター又は前記ベクターを含む宿主細胞も提供する。
本発明は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる抗体を生成する方法であって、本発明の宿主細胞を培養することと、前記培養から抗体を単離することとを含む方法も提供する。
本発明は、（ａ）本発明に従う抗体又は抗体の組合せと、（ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容される希釈剤又は担体とを含む医薬組成物も提供する。
本発明は、治療によってヒト又は動物の身体を処置する方法に使用される、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物も提供する。
本発明は、コロナウイルス感染と関連する疾患又は合併症を処置又は予防する方法に使用される、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物も提供する。
本発明は、対象においてコロナウイルス感染症又はコロナウイルス感染症と関連する疾患若しくは合併症を処置又は予防する方法であって、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物の治療的に有効な量を前記対象に投与することを含む方法も提供する。
本発明は、試料におけるコロナウイルス又はその断片の存在を特定する方法であって、（ｉ）試料を、本発明に従う抗体又は抗体の組合せと接触させることと、（ｉｉ）抗体－抗原複合体の存在又は不在を検出することとを含み、抗体－抗原複合体の存在は、試料におけるコロナウイルス又はその断片の存在を示す、方法も提供する。
本発明は、対象においてコロナウイルス感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症を処置又は予防する方法であって、本発明の方法に従ってコロナウイルスの存在を特定することと、対象を、本発明に従う抗体又は組合せ、抗ウイルス剤又は抗炎症剤で処置することとを含む方法も提供する。
本発明は、対象においてコロナウイルス感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症を処置又は予防する方法に使用される抗ウイルス剤又は抗炎症剤も提供し、この方法は、本発明の方法に従ってコロナウイルスの存在を特定することと、対象を、抗ウイルス剤又は抗炎症剤の治療的に有効な量で処置することとを含む。
本発明は、コロナウイルス感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症を予防、処置及び／又は診断するための、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物の使用も提供する。
本発明は、コロナウイルス感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症を処置又は予防するための薬剤の製造における、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物の使用も提供する。
本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７、４８４、５０１、４５２及び／又は４７８に置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を予防、処置又は診断する方法に使用される、本発明の抗体、組合せ又は医薬組成物も提供し、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、系統アルファ、ベータ、ガンマ又はデルタのメンバーである。
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる抗体を生成する方法であって、ダウンアンドアウト高次構造でロックされた修飾スパイクタンパク質に対して抗体を高めることを含み、ダウンアンドアウト高次構造は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、アミノ酸位置３４３のＮ－グリコシル化部位との接触を除いて、スパイクタンパク質三量体の３つの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）間の直接的接触の欠如によって特徴付けられる、方法も提供する。
本発明の抗体
本発明の抗体は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に特異的に結合する。特に、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）又はＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）等のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットに特異的に結合する。
本発明の抗体は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に特異的に結合する。特に、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）又はＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）等のスパイクタンパク質のＳ１サブユニットに特異的に結合する。
本発明の抗体は、表２内の抗体の少なくとも３つのＣＤＲを含み得る。抗体は、表２内の抗体の少なくとも４つ、５つ又は６つ全てのＣＤＲを含み得る。抗体は、表２内の抗体の重鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、表２内の抗体の軽鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、表２内の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖ドメインに対してそれぞれ少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、表２内の抗体のいずれか１つであり得る。
表２は、回収したベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＯＶＩＤ－１９患者から特定した２８個の個々の抗体を記載している。表１は、回収したＣＯＶＩＤ－１９患者から以前に特定した４２個の個々の抗体を記載している［Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４（８）（２０２１）：２１８３－２２００；Ｓｕｐａｓａ，Ｐｉｙａｄａ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７ ｖａｒｉａｎｔ ｂｙ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４（８）（２０２１）：２２０１－２２１１；Ｚｈｏｕ，Ｄａｍｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｒｉａｎｔ Ｂ．１．３５１ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４（９）（２０２１）：２３４８－２３６１；Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４（１１）（２０２１）：２９３９－２９５４；Ｌｉｕ，Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．６１７ ｂｙ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｓｅｒｕｍ．”Ｃｅｌｌ １８４（１６）（２０２１）：４２２０－４２３６．］。表１内の抗体は、本明細書中でプレフィックス「ＣＯＶＯＸ」と共に、例えばＣＯＶＯＸ－２２２とも称される。表１及び２は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列並びに各抗体の可変鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）についての配列番号を記載している。
表２内の抗体は、以下からなる群から選択され得る：ベータ－２２、ベータ－２７、ベータ－２９、ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５３、ベータ－５４、ベータ－５５及びベータ－５６。これらの抗体は、驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントオミクロンの中和を保持していることが見出された（例えば、オミクロンに対してＩＣ５０≦５μｇ／ｍｌ）。
表２内の抗体は、以下からなる群から選択され得る：ベータ－２２、ベータ－２９、ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５３、ベータ－５４、ベータ－５５及びベータ－５６。これらの抗体は、驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントオミクロンの強い中和を保持していることが見出された（例えば、オミクロンに対してＩＣ５０≦０．４μｇ／ｍｌ）。
表２内の抗体は、以下からなる群から選択され得る：ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５４及びベータ－５５。これらの抗体は、驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントオミクロンの強い中和を保持していることが見出され（例えば、オミクロンに対してＩＣ５０≦０．１１μｇ／ｍｌ）、さらに、試験した全ての他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント（ビクトリア、アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ）に対して強い中和を保持していた。
表２内の抗体は、以下からなる群から選択され得る：ベータ－２７、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３及びベータ－５６。これらの抗体は、驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント、ビクトリア、Ｂ．１．１．７（アルファ）、Ｂ．１．３５１（ベータ）、Ｐ．１（ガンマ）、Ｂ．１．６１７．２（デルタ）、Ｂ．１．１．７＋Ｅ４８４Ｑ、Ｂ．１．５２５、Ｂ１．６１７．１、Ｃ．３７、Ｂ．１．６１６、Ｂ．１．２５８、Ｃ．３６．３、Ｂ．１．５２６．２及びＡ．２３．１＋Ｅ４８４Ｋ株の強い中和を保持していることが見出され、例えば、試験した、全てではないとしても大多数の株に対してＩＣ５０≦０．０２μｇ／ｍｌであった（例えば、表１０、１２及び１３を参照されたい）。
表２内の抗体は、以下からなる群から選択され得る：ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－５５及びベータ－５６。これらの抗体は、強力な交差系統中和効果を有することが見出され、例えば、ビクトリア、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、アルファ＋４８４Ｋ及びＢ．１．５２５株に対して有効である（例えば、表１０内に示されるＩＣ５０が０．１μｇ／ｍｌ未満）。
表２内の抗体は、ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６及びベータ－４４のいずれか１つであり得る。これらの抗体は、驚くべきことに、ＲＢＤの位置５０１に変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の強い中和を示すことが見出された。
表２内の抗体は、ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５、ベータ－５１及びベータ－４４のいずれか１つであり得る。これらの抗体は、驚くべきことに、ＲＢＤの位置４８４に変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の強い中和を示すことが見出された。
表２内の抗体は、ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－２０、ベータ－２２、ベータ－２９及びベータ－４４のいずれか１つであり得る。これらの抗体は、驚くべきことに、ＲＢＤの位置４１７に変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の強い中和を示すことが見出された。
表２内の抗体は、ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６及びベータ－４４のいずれか１つであり得る。これらの抗体は、驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アルファ株の強い中和を示すことが見出された。
表２内の抗体は、ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３；ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５、ベータ－５１；ベータ－２０、ベータ－２２、ベータ－２９及びベータ－４４のいずれか１つであり得る。これらの抗体は、驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマ株の強い中和を示すことが見出された。
表２内の抗体は、ベータ－２０、ベータ－２４、ベータ－２６及びベータ－２７のいずれか１つであり得る。これらの抗体は、驚くべきことに、マウスにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の強い中和を示すことが見出された。
したがって、一実施形態において、表２内の抗体はベータ－２７であり得る。ベータ－２７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを中和することが見出された（表１５、図２２を参照されたい）。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４８５、４８６及び４８７において指定されるアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号４８８、４８９及び４９０において指定されるアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－２７の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４８２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－２７の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４８４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－２７の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号４８２及び４８４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－２７の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ３－５３ ｖ－領域に由来し、本発明者らは、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に特に有用である抗体が生じる（さらに以下を参照して説明される）ことを見出した。そのため、本発明の抗体は、ベータ－２７の重鎖を含み得、ベータ－２７の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号４８５、４８６及び４８７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－２７の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４８２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８２を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－２７の軽鎖を含み得、ベータ－２７の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号４８８、４８９及び４９０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－２７の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４８４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－４７であり得る。ベータ－４７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを強く中和する（ＩＣ５０≦０．１μｇ／ｍｌ；表１５、図２２を参照されたい）ことを見出した。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５９５、５９６及び５９７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号５９８、５９９及び６００で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４７の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５９２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４７の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５９４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４７の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（それぞれ配列番号５９２及び５９４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－４７の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ１－５８ ｖ－領域に由来し、本発明者らは、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に特に有用である抗体が生じる（さらに以下を参照して説明される）ことを見出した。そのため、本発明の抗体は、ベータ－４７の重鎖を含み得、ベータ－４７の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号５９５、５９６及び５９７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－４７の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５９２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含む。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－４７の軽鎖を含み得、ベータ－４７の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号５９８、５９９及び６００で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－４７の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５９４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－４８であり得る。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６０５、６０６及び６０７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６０８、６０９及び６１０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４８の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６０２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４８の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６０４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４８の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（それぞれ配列番号６０２及び６０４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－４８の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ３－２１ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に特に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－４８の重鎖を含み得、ベータ－４８の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６０５、６０６及び６０７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－４８の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６０２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６０２を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。
本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－４８の軽鎖を含み得、ベータ－４８の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６０８、６０９及び６１０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－４８の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６０４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６０４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－４９であり得る。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６１５、６１６及び６１７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６１８、６１９及び６２０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４９の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６１２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４９の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６１４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４９の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号６１２及び６１４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－４９の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ １－６９ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に特に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－４９の重鎖を含み得、ベータ－４９の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６１５、６１６及び６１７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－４９の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６１２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６１２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－４９の軽鎖を含み得、ベータ－４９の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６１８、６１９及び６２０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－４９の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６１４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６１４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－５０であり得る。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６２５、６２６及び６２７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６２８、６２９及び６３０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５０の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６２２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５０の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６２４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５０の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号６２２及び６２４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－５０の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ １－６９ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－５０の重鎖を含み得、ベータ－５０の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６２５、６２６及び６２７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５０の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６２２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６２２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－５０の軽鎖を含み得、ベータ－５０の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６２８、６２９及び６３０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５０の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６２４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６２４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－４９又はベータ－５０であり得る。本明細書中及び実施例において考察されるように、ベータ－５０のＣＤＲＨ２は、スパイクタンパク質結合に必要とされない。したがって、一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６１５及び６１７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６１８、６１９及び６２０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６２５及び６２７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６２８、６２９及び６３０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。
一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４９の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６１２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得るが、配列番号６１２の位置１、３、５、２３～２８、３０～３３、５２、５４～５５、５７、７５～７７及び９９～１０５の残基に対応する重鎖可変ドメインの残基が、配列番号６１２の位置１、３、５、２３～２８、３０～３３、５２、５４～５５、５７、７５～７７及び９９～１０５の残基と同一である場合に限る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４９の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６１４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得るが、配列番号６１４の位置３０、３２～３３、５０～５１、５３～５４及び９４～９５の残基に対応する軽鎖可変ドメインの残基が、配列番号６１４の位置３０、３２～３３、５０～５１、５３～５４及び９４～９５の残基と同一である場合に限る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４９の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号６１２及び６１４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得るが、配列番号６１２の位置１、３、５、２３～２８、３０～３３、５２、５４～５５、５７、７５～７７及び９９～１０５の残基に対応する重鎖可変ドメインの残基が、配列番号６１２の位置１、３、５、２３～２８、３０～３３、５２、５４～５５、５７、７５～７７及び９９～１０５の残基と同一である場合並びに配列番号６１４の位置３０、３２～３３、５０～５１、５３～５４及び９４～９５の残基に対応する軽鎖可変ドメインの残基が、配列番号６１４の位置３０、３２～３３、５０～５１、５３～５４及び９４～９５の残基と同一である場合に限る。
一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５０の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６２２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得るが、配列番号６２２の位置３、５、２３～２８、３０～３３、７５～７７及び１００～１０５の残基に対応する重鎖可変ドメインの残基が、配列番号６２２の位置３、５、２３～２８、３０～３３、７５～７７及び１００～１０５の残基と同一である場合に限る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５０の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６２４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得るが、配列番号６２４の位置３１、３３、５０～５１、５３～５４及び９４～９５の残基に対応する軽鎖可変ドメインの残基が、配列番号６２４の位置３１、３３、５０～５１、５３～５４及び９４～９５の残基と同一である場合に限る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５０の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号６２２及び６２４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得るが、配列番号６２２の位置３、５、２３～２８、３０～３３、７５～７７及び１００～１０５の残基に対応する重鎖可変ドメインの残基が、配列番号６２２の位置３、５、２３～２８、３０～３３、７５～７７及び１００～１０５の残基と同一である場合並びに配列番号６２４の位置３１、３３、５０～５１、５３～５４及び９４～９５の残基に対応する軽鎖可変ドメインの残基が、配列番号６２４の位置３１、３３、５０～５１、５３～５４及び９４～９５の残基と同一である場合に限る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－５３であり得る。ベータ－５３は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを強く中和する（ＩＣ５０≦０．４μｇ／ｍｌ；表１５、図２２を参照されたい）ことを見出した。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６４５、６４６及び６４７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６４８、６４９及び６５０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５３の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６４２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５３の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６４４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５３の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（それぞれ配列番号６４２及び６４４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－５３の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ ５－１０ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－５３の重鎖を含み得、ベータ－５３の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６４５、６４６及び６４７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５３の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６４２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６４２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－５３の軽鎖を含み得、ベータ－５３の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６４８、６４９及び６７０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５３の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６４４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６４４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－５６であり得る。ベータ－５６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを強く中和する（ＩＣ５０≦０．２μｇ／ｍｌ；表１５、図２２を参照されたい）ことを見出した。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６７５、６７６及び６７７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６７８、６７９及び６７０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５６の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６７２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５６の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６７４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５６の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号６７２及び６７４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－５６の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ ４－３１ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－５６の重鎖を含み得、ベータ－５６の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６７５、６７６及び６７７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５６の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６７２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６７２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－５６の軽鎖を含み得、ベータ－５６の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６７８、６７９及び６８０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５６の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６７４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６７４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
抗体ベータ－３２は、驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント、ビクトリア、Ｂ．１．１．７（アルファ）、Ｂ．１．３５１（ベータ）、Ｐ．１（ガンマ）、Ｂ．１．６１７．２（デルタ）、Ｂ．１．１．７＋Ｅ４８４Ｑ及びＢ．１．５２５の強い中和を保持していることが見出された。
したがって、一実施形態において、表２内の抗体はベータ－３２であり得る。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５１５、５１６及び５１７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号５１８、５１９及び５２０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－３２の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５１２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－３２の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５１４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－３２の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号５１２及び５１４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－３２の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ １－２ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－３２の重鎖を含み得、ベータ－３２の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号５１５、５１６及び５１７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－３２の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５１２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５１２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－３２の軽鎖を含み得、ベータ－３２の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号５１８、５１９及び５２０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－３２の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５１４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５１４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－２２であり得る。ベータ－２２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを強く中和する（ＩＣ５０≦０．４μｇ／ｍｌ）ことと、アルファ、ベータ及びガンマバリアントを強く中和することとを見出した（表１５、図２２を参照されたい）。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４３５、４３６及び４３７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号４３８、４３９及び４４０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－２２の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４３２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－２２の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４３４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－２２の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号４３２及び４３４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－２２の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ ３－３０ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－２２の重鎖を含み得、ベータ－２２の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号４３５、４３６及び４３７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－２２の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４３２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４３２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－２２の軽鎖を含み得、ベータ－２２の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号４３８、４３９及び４４０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－２２の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４３４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４３４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－２７であり得る。ベータ－２７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを中和する（ＩＣ５０≦５μｇ／ｍｌ）こと、試験した他の全てのバリアントを強く中和することを見出した（表１５、図２２を参照されたい）。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４８５、４８６及び４８７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号４８８、４８９及び４９０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－２７の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４８２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－２７の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４８４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－２７の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号４８２及び４８４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－２７の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ ３－３０ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－２７の重鎖を含み得、ベータ－２７の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号４８５、４８６及び４８７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－２７の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４８２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－２７の軽鎖を含み得、ベータ－２７の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号４８８、４８９及び４９０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－２７の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号４８４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－４０であり得る。ベータ－４０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを極めて強く中和する（０．０１２μｇ／ｍｌのＩＣ５０）ことと、試験した他の全てのバリアントを強く中和することとを見出した（表１５、図２２を参照されたい）。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５５５、５５６及び５５７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号５５８、５５９及び５６０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４０の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５５２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４０の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５５４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－４０の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号５５２及び５５４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－４０の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ ４－３９ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－４０の重鎖を含み得、ベータ－４０の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号５５５、５５６及び５５７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－４０の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５５２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５５２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－４０の軽鎖を含み得、ベータ－４０の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号５５８、５５９及び５６０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－４０の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号５５４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５５４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－５４であり得る。ベータ－５４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを強く中和する（０．０２μｇ／ｍｌのＩＣ５０）ことと、試験した他の全てのバリアントを強く中和することとを見出した（表１５、図２２を参照されたい）。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６５５、６５６及び６５７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６５８、６５９及び６６０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５４の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６５２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５４の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６５４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５４の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号６５２及び６５４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－５４の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ ４－３９ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－５４の重鎖を含み得、ベータ－５４の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６５５、６５６及び６５７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５４の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６５２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６５２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－５４の軽鎖を含み得、ベータ－５４の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６５８、６５９及び６６０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５４の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６５４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６５４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
一実施形態において、表２内の抗体は、ベータ－５５であり得る。ベータ－５５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを強く中和する（０．１０９μｇ／ｍｌのＩＣ５０）ことと、試験した他の全てのバリアントを強く中和することとを見出した（表１５、図２２を参照されたい）。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号６６５、６６６及び６６７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６６８、６６９及び６７０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５５の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６６２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５５の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６６４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。一実施形態において、本発明の抗体は、抗体ベータ－５５の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（すなわちそれぞれ配列番号６６２及び６６４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得る。
ベータ－５５の重鎖ドメインは、ＩＧＨＶ ４－３９ ｖ－領域に由来し、同じｖ－領域に由来する抗体間での重鎖及び軽鎖の入換えにより、本発明に有用であり得る抗体が生じる。そのため、本発明の抗体は、ベータ－５５の重鎖を含み得、ベータ－５５の軽鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６６５、６４６及び６６７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５５の重鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６６２）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６６２を含み得るか又はそれからなり得る。
代わりに、本発明の一実施形態において、抗体は、ベータ－５５の軽鎖を含み得、ベータ－５５の重鎖を含み得ない。例えば、抗体は、配列番号６６８、６６９及び６７０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、抗体ベータ－５５の軽鎖可変ドメイン（すなわち配列番号６６４）に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号６６４を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。
本発明の混合鎖抗体
本発明の抗体は、表１又は２内の第１の抗体由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン並びに表１又は２内の第２の抗体由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメインを含み得るが、第１及び第２の抗体は、異なることを条件とする。そのような抗体は、本明細書中で混合鎖抗体と称される。
本発明の抗体は、表１又は２内の第１の抗体由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメイン並びに表１又は２内の第２の抗体由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメインを含み得るが、第１及び第２の抗体は、異なることを条件とする。そのような抗体は、本明細書中で混合鎖抗体と称される。
本発明に有用な混合鎖抗体の例が、表３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８及び９に記載されている。表３Ａは、同じ生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ３－５３に由来する表１及び表２内の抗体から生成される混合鎖抗体の例を示す。表３Ｂは、同じ生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ３－５３及びＩＧＨＶ３－６６に由来する表１及び表２内の抗体から生成される混合鎖抗体の例を示す。表４は、同じ生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ１－５８に由来する表１及び表２内の抗体から生成される混合鎖抗体の例を示す。表５は、同じ生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ４－３９に由来する表１及び表２内の抗体から生成される混合鎖抗体の例を示す。表６は、同じ生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ３－３０に由来する表１及び表２内の抗体から生成される混合鎖抗体の例を示す。表７は、同じ生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ５－５１に由来する抗体から生成される混合鎖抗体の例を示す。表８は、同じ生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ１－０２に由来する表１及び表２内の抗体から生成される混合鎖抗体の例を示す。表９は、同じ生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ３－３３に由来する表１及び表２内の抗体から生成される混合鎖抗体の例を示す。同じ生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ１－６９に由来する混合鎖抗体の例として、ベータ－４９Ｈ／５０Ｌ及びベータ－５０Ｈ／４９Ｌがある。
混合鎖抗体ベータ２７Ｈ／１５０Ｌ、ベータ－２７Ｈ／１５８Ｌ、ベータ－２７Ｈ／１７５Ｌ、ベータ－２７Ｈ／２２２Ｌ、ベータ－２７Ｈ／２６９Ｌ、１５０Ｈ／ベータ－２７Ｌ、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／１６５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／２５３Ｌ、ベータ－４７Ｈ／３１８Ｌ、ベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌ、５５Ｈ／ベータ－４７Ｌ、１６５Ｈ／４７Ｌ、２５３Ｈ／ベータ－４７Ｌ、ベータ－２５Ｈ／ベータ－４７Ｌは、本発明に特に有用である。これらの抗体は、実施例で実証されるように、特に強力な交差系統中和効果を有することが見出された。例えば、表１２及び１３を参照されたい。
混合鎖抗体１５０Ｈ／２２２Ｌ、２５３Ｈ／５５Ｌ、２５３Ｈ／１６５Ｌは、実施例で実証されるように、特に強力な交差系統中和効果を有することも見出された。例えば、表１２及び１３を参照されたい。
混合鎖抗体１６５Ｈ／４７Ｌ、２５３Ｈ／ベータ－４７Ｌ、ベータ－２５Ｈ／ベータ－４７Ｌは、本発明に特に有用である。これらの抗体は、実施例で実証されるように、特に強力な交差系統中和効果を有することが見出された。例えば、表１２及び１３を参照されたい。
混合鎖抗体ベータ－４９Ｈ／５０Ｌ及びベータ－５０Ｈ／４９Ｌは、本発明に特に有用である。これらの抗体は、実施例で実証されるように、特に強力な交差系統中和効果を有することが見出された。例えば、表１２及び１３を参照されたい。
混合鎖抗体ベータ２７Ｈ／１５０Ｌ、ベータ－２７Ｈ／２２２Ｌ、ベータ－２７Ｈ／２６９Ｌ、１５０Ｈ／ベータ－２７Ｌ、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／１６５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／２５３Ｌ、ベータ－４７Ｈ／３１８Ｌ、ベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌ及び２５３Ｈ／ベータ－４７Ｌは、本発明に特に有用である。これらの抗体は、強力な交差系統中和効果を有し、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のビクトリア、ベータ及びデルタ株に対してＩＣ５０が≦０．１μｇ／ｍｌであることが見出された（表１２を参照されたい）。
混合鎖抗体ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ又はベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌは、本発明に特に有用である。これらの抗体は、強力な交差系統中和効果を有し、例えば、試験した全ての株の大部分に対してＩＣ５０が≦０．０１μｇ／ｍｌであることが見出された（表１２及び１３を参照されたい）。
そのため、一実施形態において、本発明の抗体は、表１又は２内の第１の抗体由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変ドメイン並びに表１又は２内の第２の抗体由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変ドメインを含むが、第１及び第２の抗体は、異なることを条件とする。抗体は、表１又は２内の第１の抗体由来の重鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び表１又は２内の第２の抗体由来の軽鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含み得るが、第１及び第２の抗体は、異なることを条件とする。例えば、抗体は、表１又は２内の抗体の重鎖可変ドメインに対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び表１又は２内の抗体の軽鎖可変ドメインに対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得るが、第１及び第２の抗体が異なることを条件とする。
第１の抗体は表２内にあり得、第２の抗体は表２内にあり得る。第１の抗体は表２内にあり得、第２の抗体は表１内にあり得る。第１の抗体は表１内にあり得、第２の抗体は表２内にあり得る。第１の抗体は表１内にあり得、第２の抗体は表１内にあり得る。
一実施形態において、第１及び第２の抗体の少なくとも１つが、表２由来の抗体である。
一実施形態において、第１及び第２の抗体は、両方とも表１内にあるわけではない。
一実施形態において、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの少なくとも１つが、表２由来である。
表２内の抗体は、以下からなる群から選択され得る：ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－５５及びベータ－５６。例えば、表２内の抗体は、以下からなる群から選択されるあらゆる抗体であり得る：ベータ－２７、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３及びベータ－５６。
一実施形態において、第１の抗体及び第２の抗体は、以下からなる群から両方とも選択される：ベータ－２７、抗体１５０、抗体１５８、抗体１７５、抗体２２２及び抗体２６９。これらの抗体の重鎖可変ドメインは、ＩＧＨＶ３－５３に由来する。結果として生じる混合鎖抗体は、表３Ａ内に記載されている。そのため、本発明の抗体は、６つ全てのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１－３及びＣＤＲＬ１－３）並びに／又は重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得、各々は、表３Ａ内に記載される混合鎖抗体のいずれか１つの対応する可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
ＩＧＨＶ３－５３に由来する抗体を用いて、ＩＧＨＶ３－６６由来の抗体（例えば、表１内の抗体４０及び３９８）との混合鎖抗体が生成され得る（例えば、Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４（８）（２０２１）：２１８３－２２００；Ｓｕｐａｓａ，Ｐｉｙａｄａ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７ ｖａｒｉａｎｔ ｂｙ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４（８）（２０２１）：２２０１－２２１１；Ｚｈｏｕ，Ｄａｍｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｒｉａｎｔ Ｂ．１．３５１ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４（９）（２０２１）：２３４８－２３６１；Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４（１１）（２０２１）：２９３９－２９５４；Ｌｉｕ，Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．６１７ ｂｙ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｓｅｒｕｍ．”Ｃｅｌｌ １８４（１６）（２０２１）：４２２０－４２３６）を参照されたい）。したがって、一実施形態において、第１の抗体及び第２の抗体は、以下からなる群から両方とも選択される：ベータ－２７、抗体１５０、抗体１５８、抗体１７５、抗体２２２、抗体２６９、抗体４０及び抗体３９８。これらの抗体の重鎖可変ドメインは、ＩＧＨＶ３－５３及びＩＧＶＨ３－６６に由来する。結果として生じる混合鎖抗体は、表３Ｂ内に記載されている。そのため、本発明の抗体は、６つ全てのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１－３及びＣＤＲＬ１－３）並びに／又は重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得、各々は、表３Ｂ内に記載される混合鎖抗体のいずれか１つの対応する可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
一実施形態において、第１の抗体及び第２の抗体は、以下からなる群から両方とも選択される：ベータ－４７、ベータ－２５、抗体５５、抗体１６５、抗体２５３及び抗体３１８。これらの抗体の重鎖可変ドメインは、ＩＧＨＶ １－５８に由来する。結果として生じる混合鎖抗体は、表４内に記載されている。そのため、本発明の抗体は、６つ全てのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１－３及びＣＤＲＬ１－３）並びに／又は重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得、各々は、表４内に記載される混合鎖抗体のいずれか１つの対応する可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
一実施形態において、第１の抗体及び第２の抗体は、以下からなる群から両方とも選択される：ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－４０、ベータ－５４及びベータ－５５。これらの抗体の重鎖可変ドメインは、ＩＧＨＶ ４－３９に由来する。結果として生じる混合鎖抗体は、表５内に記載されている。そのため、本発明の抗体は、６つ全てのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１－３及びＣＤＲＬ１－３）並びに／又は重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得、各々は、表５内に記載される混合鎖抗体のいずれか１つの対応する可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
一実施形態において、第１の抗体及び第２の抗体は、以下からなる群から両方とも選択される：ベータ－２２、ベータ－２９及び抗体１５９。これらの抗体の重鎖可変ドメインは、ＩＧＨＶ ３－３０に由来する。結果として生じる混合鎖抗体は、表６内に記載されている。そのため、本発明の抗体は、６つ全てのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１－３及びＣＤＲＬ１－３）並びに／又は重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得、各々は、表６内に記載される混合鎖抗体のいずれか１つの対応する可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
一実施形態において、第１の抗体及び第２の抗体は、以下からなる群から両方とも選択される：ベータ－３８及び抗体１７０。これらの抗体の重鎖可変ドメインは、ＩＧＨＶ ５－５１に由来する。結果として生じる混合鎖抗体は、表７内に記載されている。そのため、本発明の抗体は、６つ全てのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１－３及びＣＤＲＬ１－３）並びに／又は重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得、各々は、表７内に記載される混合鎖抗体のいずれか１つの対応する可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
一実施形態において、第１の抗体及び第２の抗体は、以下からなる群から両方とも選択される：ベータ－３０、ベータ－３２、ベータ－３３及び抗体３１６。これらの抗体の重鎖可変ドメインは、ＩＧＨＶ １－０２に由来する。結果として生じる混合鎖抗体は、表８内に記載されている。そのため、本発明の抗体は、６つ全てのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１－３及びＣＤＲＬ１－３）並びに／又は重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得、各々は、表８内に記載される混合鎖抗体のいずれか１つの対応する可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
一実施形態において、第１の抗体及び第２の抗体は、以下からなる群から両方とも選択される：ベータ－２０及びベータ－４３。これらの抗体の重鎖可変ドメインは、ＩＧＨＶ ３－３３に由来する。結果として生じる混合鎖抗体は、表９内に記載されている。そのため、本発明の抗体は、６つ全てのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１－３及びＣＤＲＬ１－３）並びに／又は重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含み得、各々は、表９内に記載される混合鎖抗体のいずれか１つの対応する可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
一実施形態において、第１の抗体は、表２由来のベータ－４７であり、第２の抗体は、表１由来の５５である。そのため、本発明の抗体は、配列番号５９５、５９６及び５９７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号６８、６９及び７０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号５９２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号６４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号６４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン、配列番号６４からなる軽鎖可変ドメイン及びＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌである。
ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ抗体は、抗体ベータ－４７及び抗体５５の組合せから生成される。これらの抗体は個々に、比較的強力であった。しかしながら、抗体ベータ－４７由来の重鎖及び抗体５５由来の軽鎖が組み合わされると、結果として生じる抗体は予想外に、中和及び抗原結合が向上した。例えば、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌは、表１３内に記載される株の最も強い中和を実現した。抗体ベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌを、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌと同様の方法で特定した。
一実施形態において、第１の抗体は、表２由来のベータ－４７であり、第２の抗体は、表２由来のベータ－２５である。そのため、本発明の抗体は、配列番号５９５、５９６及び５９７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号４６８、４６９及び４７０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号５９２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号４６４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号４６４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン、配列番号４６４からなる軽鎖可変ドメイン及びＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、ベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌである。
一実施形態において、第１の抗体は、表２由来のベータ－４７であり、第２の抗体は、表１由来の１６５である。そのため、本発明の抗体は、配列番号５９５、５９６及び５９７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号１８８、１８９及び１９０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号５９２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号１８４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号１８４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン、配列番号４６４からなる軽鎖可変ドメイン及びＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、ベータ－４７Ｈ／１６５Ｌである。
一実施形態において、第１の抗体は、表２由来のベータ－４７であり、第２の抗体は、表１由来の２５３である。そのため、本発明の抗体は、配列番号５９５、５９６及び５９７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号２６８、２６９及び２７０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号５９２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２６４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２６４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン、配列番号２６４からなる軽鎖可変ドメイン及びＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、ベータ－４７Ｈ／２５３Ｌである。
一実施形態において、第１の抗体は、表２由来のベータ－４７であり、第２の抗体は、表１由来の３１８である。そのため、本発明の抗体は、配列番号５９５、５９６及び５９７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号３３８、３３９及び３４０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号５９２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号３３４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号３３４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号５９２からなる重鎖可変ドメイン、配列番号３３４からなる軽鎖可変ドメイン及びＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、ベータ－４７Ｈ／３１８Ｌである。
一実施形態において、第１の抗体は、表１由来の２５３であり、第２の抗体は、表２由来のベータ－４７である。そのため、本発明の抗体は、配列番号２６５、２６６及び２６７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号５９８、５９９及び６００で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号２６２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号５９４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号２６２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号５９４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号２６２からなる重鎖可変ドメイン、配列番号５９４からなる軽鎖可変ドメイン及びＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、２５３Ｈ／ベータ－４７Ｌである。
一実施形態において、第１の抗体は、表２由来のベータ－２７であり、第２の抗体は、表１由来の１５０である。そのため、本発明の抗体は、配列番号４８５、４８６及び４８７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号１５８、１５９及び１６０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号４８２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号１５４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号１５４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８２からなる重鎖可変ドメイン、配列番号１５４からなる軽鎖可変ドメイン及びＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、ベータ－２７Ｈ／１５０Ｌである。
一実施形態において、第１の抗体は、表２由来のベータ－２７であり、第２の抗体は、表１由来の２２２である。そのため、本発明の抗体は、配列番号４８５、４８６及び４８７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号２５８、２５９及び２６０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号４８２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２５４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２５４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８２からなる重鎖可変ドメイン、配列番号２５４からなる軽鎖可変ドメイン及びＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、ベータ－２７Ｈ／２２２Ｌである。
一実施形態において、第１の抗体は、表２由来のベータ－２７であり、第２の抗体は、表１由来の２６９である。そのため、本発明の抗体は、配列番号４８５、４８６及び４８７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号２７８、２７９及び２８０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号４８２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２７４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号２７４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号４８２からなる重鎖可変ドメイン、配列番号２７４からなる軽鎖可変ドメイン及びＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、ベータ－２７Ｈ／２６９Ｌである。
一実施形態において、第１の抗体は、表１由来の１５０であり、第２の抗体は、表２由来のベータ－２７である。そのため、本発明の抗体は、配列番号１５５、１５６及び１５７で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに配列番号４８８、４８９及び４９０で指定されたアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含み得る。抗体は、配列番号１５２に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号４８４に対して≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号１５２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号４８４からなる軽鎖可変ドメインを含み得る。抗体は、配列番号１５２からなる重鎖可変ドメイン及び配列番号４８４からなる軽鎖可変ドメイン並びにＩｇＧ定常領域を含み得、すなわち、抗体は、１５０Ｈ／ベータ－２７Ｌである。
表１及び２内の第１及び第２の抗体は、同じ生殖細胞系重鎖又は軽鎖ｖ－領域（以下でさらに説明される）に由来し得る。重鎖ｖ－領域は、ＩＧＨＶ３－５３、ＩＧＨＶ１－５８、ＩＧＨＶ４－３９、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ５－５１、ＩＧＨＶ１－０２又はＩＧＨＶ３－３３であり得る。例えば、重鎖ｖ－領域は、ＩＧＨＶ３－５３、ＩＧＨＶ１－５８又はＩＧＨＶ４－３９であり得る。例えば、重鎖ｖ－領域は、ＩＧＨＶ３－５３又はＩＧＨＶ１－５８であり得る。軽鎖ｖ－領域は、ＩＧκＶ３－２０、ＩＧκＶ１－９、ＩＧκＶ３－１、ＩＧκＶ１－５、ＩＧκＶ３－２５、ＩＧκＶ１－１２又はＩＧκＶ１－１７であり得る。例えば、軽鎖ｖ－領域は、ＩＧκＶ３－２０又はＩＧκＶ１－９、例えばＩＧκＶ３－２０であり得る。
先の実施形態のいずれにおいても、表１及び２内の第１又は第２の抗体は、抗体５８、２２２、２５３、２５３Ｈ／５５Ｌ、ベータ－２２、ベータ－２７、ベータ－２９、ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５３、ベータ－５４、ベータ－５５及びベータ－５６から選択され得る。例えば、これらの抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを中和するのに特に有効である。
本発明の特定の抗体
本発明は、表２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８又は９内の抗体のいずれか１つの完全長抗体である抗体も提供する。換言すると、本発明の抗体は、表２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８又は９内の抗体のいずれか１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインからそれぞれなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン並びにＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）定常領域を含む。
本発明は、表２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８又は９内の抗体のいずれか１つの完全長抗体である抗体も提供する。換言すると、本発明の抗体は、表２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８又は９内の抗体のいずれか１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインからそれぞれなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン並びにＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）定常領域を含む。
例えば、本発明の抗体は、完全長ベータ－２７、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－５６、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／１６５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／２５３Ｌ、ベータ－４７Ｈ／３１８Ｌ、２５３Ｈ／ベータ－４７Ｌ、ベータ－２７Ｈ／１５０Ｌ、ベータ－２７Ｈ／２２２Ｌ、ベータ－２７Ｈ／２６９Ｌ又は１５０Ｈ／ベータ－２７Ｌ抗体であり得る。これらの抗体は、全てとりわけ少なくともビクトリア、南アフリカ（Ｂ．１．３５１；ベータ）及びデルタ株を、効力の消失なく中和することが示された高度に強力な中和ｍＡｂである。
本発明の抗体は、完全長ベータ－２７、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－５６、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ又はベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌ抗体であり得る。
本発明の抗体は、完全長ベータ－２７、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５６、ベータ－４７ＨＣ／５５ＬＣ、ベータ－４７ＨＣ／ベータ２５ＬＣ又はベータ－５３抗体であり得る。これらの抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して強力な中和効果を示す。例えば、表１３を参照されたい。
本発明の抗体は、完全長ベータ－２７、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－５６、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ又はベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌ抗体であり得る。これらの抗体は、強力な交差系統中和効果を有することが見出され、例えば、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．６１７．１、Ｃ．３７、Ｂ．１．６１６、Ｂ．１．２５８、Ｃ．３６．３、Ｂ．１．５２６．２及びＡ．２３．１＋Ｅ４８４Ｋ株に対して有効である（例えば、ＩＣ５０が０．１μｇ／ｍｌ未満、表１２及び１３を参照されたい）。
本発明の抗体は、例えば、ＩｇＧ１定常領域を含む完全長ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ又はベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌ抗体であり得る。
本発明の抗体は、例えば、ＩｇＧ１定常領域を含む完全長ベータ－４９又はベータ－５０抗体であり得る。
本発明の抗体は、完全長抗体ベータ－２２、ベータ－２７、ベータ－２９、ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５３、ベータ－５４、ベータ－５５又はベータ－５６であり得る。例えば、これらの抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントを中和するのに特に有効である。
本発明の抗体の特性
本発明の抗体は、表１～９内の抗体のアミノ酸配列であり得るか又はこれからの修飾を含み得る一方、抗体の活性及び／又は機能を維持し得る。修飾は、置換、欠失及び／又は付加であり得る。例えば、修飾は、１、２、３、４、５、最大１０、最大２０、最大３０又はそれを超える、表１～９内の抗体のアミノ酸配列由来のアミノ酸置換及び／又は欠失を含み得る。例えば、修飾は、類似した特性を有する代替のアミノ酸により置換されたアミノ酸を含み得る。適切な置換基を選択するのに用いることができる２０個の主要なアミノ酸のいくつかの特性は、以下の通りである：
本発明の抗体は、表１～９内の抗体のアミノ酸配列であり得るか又はこれからの修飾を含み得る一方、抗体の活性及び／又は機能を維持し得る。修飾は、置換、欠失及び／又は付加であり得る。例えば、修飾は、１、２、３、４、５、最大１０、最大２０、最大３０又はそれを超える、表１～９内の抗体のアミノ酸配列由来のアミノ酸置換及び／又は欠失を含み得る。例えば、修飾は、類似した特性を有する代替のアミノ酸により置換されたアミノ酸を含み得る。適切な置換基を選択するのに用いることができる２０個の主要なアミノ酸のいくつかの特性は、以下の通りである：
修飾は、抗体の機能が大きく悪影響を受けない場合、誘導体化されたアミノ酸、例えば標識されたか又は非天然のアミノ酸を含み得る。
先に記載される本発明の抗体の修飾は、抗体の合成中に若しくは生成後修飾により、或いは抗体が核酸の部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発若しくは酵素的切断及び／又はライゲーションの知られている技術を用いて組換え形態である場合に調製され得る。
本発明の抗体は、前記抗体の効力を向上させるか、又は前記抗体を新しいＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに適応させるように（例えば、先に記載されるようにして）修飾され得る。修飾は、抗体をウイルスバリアント内の置換に適応させるようなアミノ酸置換であり得る。例えば、抗体の、スパイクタンパク質への知られている結合モード（例えば、結晶構造決定又はモデリングによる）が用いられて、ウイルスバリアント内の置換と相互作用する抗体のアミノ酸が特定され得る。続いて、この情報を用いて、エピトープ特徴の変化を補償することとなる抗体の考えられる置換を特定することができる。例えば、スパイクタンパク質内の疎水性アミノ酸の、負に変化するアミノ酸への置換は、スパイクタンパク質内の前記アミノ酸と相互作用する抗体由来のアミノ酸を、正に荷電するアミノ酸に置換することによって補償され得る。本開示により、例えば本明細書中に記載される抗体－抗原複合体の構造を決定することにより、置換され得る抗体の残基を特定する方法が包含される。
本発明の抗体は、交差系統中和特性を増大させるような１つ以上の修飾を含有し得る。例えば、ＡＣＥ２との相互作用を媒介する重要な残基である、スパイクタンパク質のＥ４８４は、いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株において変異して（例えば、ビクトリア株は、Ｅ４８４を含有するが、Ｐ．１及びＢ．１．３５１株は、Ｅ４８４Ｋを含有する）、抗体の異なる中和効果が生じる（実施例２４を参照されたい）。そのため、Ｅ４８４に結合する抗体は、スパイクタンパク質のＥ４８４の変化を補償するように修飾され得る。例えば、Ｅ４８４は、元の株と比較した場合、Ｂ．１．３５１又はＰ．１系統のＳＡＲ－ＣｏＶ－２株において、正に荷電するアミノ酸から負に荷電するアミノ酸に変異されている。Ｅ４８４又はその近くに結合する抗体のアミノ酸残基は、電荷の変化を補償するように変異され得る。そのようなアミノ酸残基の例が、抗体８８の配列番号１０２内のＧ１０４及び／若しくはＫ１０８又は抗体３８４の配列番号３７２内のＲ５２であり得る（実施例２４を参照されたい）。
本発明の抗体は、単離された抗体であり得る。単離された抗体は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体である。
本明細書中で用いられる用語「抗体」は、抗体全体（すなわちジスルフィド結合によって相互に連結されている２本の重鎖及び２本の軽鎖の要素を含む）及びその抗原結合断片に関し得る。抗体は、典型的に、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、すなわち抗原に特異的に結合する（と免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子の免疫学的に活性のある部分を含む。「特異的に結合する」又は「と免疫反応する」とは、抗体が、所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応し、且つ他のポリペプチドと反応しないことを意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＨＣＶＲ又はＶＨと省略される）及び少なくとも１つの重鎖定常領域で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲ又はＶＬと省略される）及び軽鎖定常領域で構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化され得、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域がその中に散在する。抗体として、以下に限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ並びにＦａｂ発現ライブラリが挙げられ得る。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体であり得る。本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論を含む種々の技術によって生成され得、例えば“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（Ｚｏｌａ Ｈ，１９８７，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）及び“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（Ｈｕｒｒｅｌｌ ＪＧＲ，１９８２ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）に開示されるものがある。
本発明の抗体は、多重特異性、例えば二重特異性であり得る。本発明の二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合する。エピトープは、同じタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質内の２つのエピトープ）又は異なるタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質内の１つのエピトープ及び別のタンパク質（コードタンパク質等）内の１つのエピトープ）内にあり得る。
一実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質上の２つの別々のエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、スパイクタンパク質のＮＴＤ及びスパイクタンパク質のＲＢＤに結合し得る。二重特異性抗体は、スパイクタンパク質のＲＢＤ内の２つの異なるエピトープに結合し得る。
本発明の１つ以上（例えば、２つ）の抗体は、カップリングされて、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を形成することができる。多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体を調製する方法が当技術分野で周知である。
抗体は、単鎖抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変断片（Ｆｖ）、断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、組換え抗体、モノクローナル抗体、自然抗体の抗原結合ドメイン又はアプタマーを含む融合タンパク質、ＶＨＨ抗体としても知られているシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ（ラクダ科動物由来のシングルドメイン抗体）、ＶＮＡＲと呼ばれるサメＩｇＮＡＲ由来のシングルドメイン抗体断片、ダイアボディ、トリアボディ、アンチカリン、アプタマー（ＤＮＡ又はＲＮＡ）及びそれらの活性部分又は断片からなる群から選択され得る。
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の候補機能、特に必要とされ得るエフェクタ機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであり得る。典型的には、定常領域は、ヒト起源のものである。特に、ヒトＩｇＧ（すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）定常領域ドメインが用いられ得る。典型的には、ヒトＩｇＧ１定常領域。
軽鎖定常領域は、ラムダ又はカッパであり得る。
本発明の抗体は、単一特異性又は多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。多重特異性抗体は、通常、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別々の抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合することができる。
本発明の抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ナノボディ、ヒト又はヒト化抗体であり得る。典型的には、抗体は、ヒト抗体である。完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域及び定常領域（存在する場合）が全てヒト起源のものであるか、又はヒト起源の配列と実質的に同一であるが、必ずしも同じ抗体由来とは限らない抗体である。
本発明の抗体は、完全長抗体であり得る。
本発明の抗体は、抗原結合断片であり得る。本発明の抗原結合断片は、親抗体、すなわち抗原結合断片が由来する抗体の同じエピトープに結合する。本発明の抗原結合断片は、典型的に、エピトープと相互作用する親抗体の部分を保持している。抗原結合断片は、典型的に、抗原と相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、１、２、３、４、５又は６つのＣＤＲを含む。一部の実施形態において、抗原結合断片は、親抗体のＣＤＲ、例えば重鎖及び／又は軽鎖の可変領域ドメインを囲む構造スカフォールドをさらに含む。典型的には、抗原結合断片は、親抗体と同じ又は類似する、抗原への結合親和性を保持している。
抗原結合断片が、親抗体と必ずしも同一の配列を有するわけではない。一実施形態において、抗原結合断片は、親抗体のそれぞれのＣＤＲと、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有し得る。一実施形態において、抗原結合断片は、親抗体のそれぞれの可変領域ドメインと、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、１００％の配列同一性を有し得る。典型的には、可変領域の非同一アミノ酸は、ＣＤＲ内にない。
本発明の抗体の抗原結合断片は、抗原に選択的に結合する能力を保持している。抗体の抗原結合断片として、単鎖抗体（すなわち完全長重鎖及び軽鎖）；Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、シングルドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖが挙げられる。
抗体の抗原結合機能が、完全長抗体の断片によって実行され得る。これらの抗体断片を作製且つ製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５－１８１を参照されたい）。
所望の特異性、親和性及び機能活性を有する、本明細書中に開示される抗体の１つと１００％のアミノ酸配列同一性を共有しない本発明の抗体をスクリーニングする方法として、本明細書中に記載される方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、ｂｉａｃｏｒｅ、フォーカス減少中和アッセイ（ＦＲＮＴ）及び当技術分野で知られている他の技術が挙げられる。
機能に関して、本発明の抗体は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２（中和抗体）の少なくとも１つの生物活性を中和する、特にウイルス伝染性を中和することができる。
中和は、ＩＣ５０値又はＩＣ９０値を用いても判定され得る。例えば、抗体は、ＩＣ５０値が≦０．１μｇ／ｍｌ、≦０．０５μｇ／ｍｌ、≦０．０１μｇ／ｍｌ、≦０．００５μｇ／ｍｌ又は≦０．００２μｇ／ｍｌであり得る。場合により、本発明の抗体は、ＩＣ５０値が０．０００１μｇ／ｍｌ～０．１μｇ／ｍｌ、ときに０．０００１μｇ／ｍｌ～０．０５μｇ／ｍｌ又は０．０００１μｇ／ｍｌ～０．００１μｇ／ｍｌであり得る。
例えば、表２～９（すなわち表２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８及び９）の抗体のいくつかのＩＣ５０値は、表１０、１２及び１３に記載されている。
ウイルス伝染性を中和する抗体の能力は、実施例に示されるように、適切なアッセイを用いて、特に細胞ベースの中和アッセイを用いて測定され得る。例えば、中和能力は、抗体の存在下での、ウイルスに感染している細胞（例えばヒト細胞）数の引下げ（例えば、３７℃で２時間）が、抗体が加えられなかったネガティブ対照と比較されるフォーカス減少中和アッセイ（ＦＲＮＴ）により測定され得る。
本発明の抗体は、例えば、直接ブロッキングにより又はスパイクタンパク質のプレ融合高次構造を崩壊させることにより、標的細胞の細胞表面受容体、アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）とのＳＡＲ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の相互作用をブロックし得る。
スパイクとＡＣＥ２との相互作用のブロッキングは、全体的又は部分的であり得る。例えば、本発明の抗体は、スパイク－ＡＣＥ２形成を≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９９％又は１００％引き下げ得る。スパイク－ＡＣＥ２形成のブロッキングは、当技術分野で知られている適切なあらゆる手段、例えばＥＬＩＳＡによって測定され得る。
中和を示すほとんどの抗体は、スパイクタンパク質とＡＣＥ２との相互作用のブロッキングも示した（図１Ｇを参照されたい）。さらに、いくつかの非中和抗体が良好なＡＣＥ２ブロッカーであった。
結合動力学の観点から、本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質についての親和性定数（ＫＤ）値が≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．４ｎＭ、≦０．３ｎＭ、≦０．２ｎＭ又は≦０．１ｎＭであり得る。
ＫＤ値は、当技術分野で知られている適切なあらゆる手段、例えばＥＬＩＳＡ又は２５℃での表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって測定することができる。
結合親和性（ＫＤ）は、抗体及びその標的についての解離定数（Ｋｄ）及び結合定数（Ｋａ）を求めることによって定量化され得る。例えば、抗体は、結合定数（Ｋａ）が≧１００００Ｍ－１ｓ－１、≧５００００Ｍ－１ｓ－１、≧１０００００Ｍ－１ｓ－１、≧２０００００Ｍ－１ｓ－１若しくは≧５０００００Ｍ－１ｓ－１であり得、且つ／又は解離定数（Ｋｄ）が≦０．００１ｓ－１、≦０．０００５ｓ－１、≦０．００４ｓ－１、≦０．００３ｓ－１、≦０．００２ｓ－１若しくは≦０．０００１ｓ－１であり得る。
本発明の抗体は、好ましくは、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染した動物においてインビボ保護を実現することができる。例えば、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染した動物への本発明の抗体の投与は、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、≧９５％又は１００％の生存率をもたらし得る。生存率は、常法を用いて求められ得る。
本発明の抗体は、先の特性の１つ以上のあらゆる組合せを有し得る。
本発明の抗体は、本明細書中に記載される抗体（すなわち特に上述の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体）のいずれか１つと同じエピトープに結合し得るか、又はそれとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質への結合について競合し得る。同じエピトープに結合するか又は互いに交差競合する抗体を特定する方法が実施例において用いられており、以下でさらに議論される。
Ｆｃ領域
本発明の抗体は、Ｆｃドメインを含んでも又は含まなくてもよい。
本発明の抗体は、Ｆｃドメインを含んでも又は含まなくてもよい。
本発明の抗体は、その安定性を向上させるようにＦｃ領域内で修飾され得る。そのような修飾は、当技術分野で知られている。修飾は、抗体の保存中の抗体の安定性を向上させ得る。抗体のインビボ半減期は、Ｆｃ－領域の修飾によって向上し得る。
例えば、システイン残基がＦｃ領域中に導入されることにより、この領域内での鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。このように生成されたホモ二量体抗体は、内部移行能力が向上し、且つ／又は補体媒介細胞死滅及び／若しくは抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）が増大し得る（Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１７６：１１９１－１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８－２９２２（１９９２）を参照されたい）。代わりに、二重Ｆｃ領域を有することによって補体溶解及びＡＤＣＣ能力が増強し得る抗体を設計することができる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９－２３０（１９８９）を参照されたい）。
例えば、本発明の抗体は、ＦｃＲｎとのＦｃドメインの相互作用を促進するように修飾され得る。Ｆｃドメインは、例えば、エンドソーム内において、低ｐＨでＦｃ及びＦｃＲｎ相互作用に影響を与えることによって抗体の安定性を向上させるように修飾され得る。Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）変異は、ＩｇＧ１抗体の半減期を向上させるのに用いられ得る。
抗体は、他の受容体、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃαＲとの抗体の相互作用に影響を与えるように修飾され得る。そのような修飾は、抗体のエフェクタ機能に影響を与えるのに用いられ得る。
一実施形態において、本発明の抗体は、以下で本明細書中に記載される変更されたＦｃドメインを含む。別の好ましい実施形態において、本発明の抗体は、Ｆｃドメインを含むが、Ｆｃドメインの配列は、１つ以上のＦｃエフェクタ機能を修飾するように変更されている。
一実施形態において、本発明の抗体は、「サイレンシングされた」Ｆｃ領域を含む。例えば、一実施形態において、本発明の抗体は、エフェクタ機能又は標準的なＦｃ領域と関連する機能を示さない。本発明の抗体のＦｃ領域は、１つ以上のＦｃ受容体に結合しない。
一実施形態において、本発明の抗体は、ＣＨ２ドメインを含まない。一実施形態において、本発明の抗体は、ＣＨ３ドメインを含まない。一実施形態において、本発明の抗体は、追加のＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含む。
一実施形態において、本発明の抗体は、Ｆｃ受容体に結合しない。一実施形態において、本発明の抗体は、補体に結合しない。代替の実施形態において、本発明の抗体は、ＦｃγＲに結合しないが、補体に結合する。
一実施形態において、本発明の抗体は、一般に、抗体の血清半減期を改変する修飾を含み得る。そのため、別の実施形態において、本発明の抗体は、抗体の半減期を改変するＦｃ領域修飾を有する。そのような修飾及びＦｃ機能を改変する修飾が存在し得る。好ましい一実施形態において、本発明の抗体は、抗体の血清半減期を改変する修飾を有する。
一実施形態において、本発明の抗体は、ヒト定常領域、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインを含み得る。特に、抗体エフェクタ機能が必要とされる治療用途に抗体分子が意図される場合、とりわけＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ３アイソタイプの、ヒトＩｇＧ定常領域ドメインが用いられ得る。代わりに、抗体分子が治療目的に意図され、且つ抗体エフェクタ機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２アイソタイプ及びＩｇＧ４アイソタイプが用いられ得る。
一実施形態において、抗体重鎖は、ＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖は、ＣＬドメイン（カッパ又はラムダ）を含む。一実施形態において、抗体重鎖は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、抗体軽鎖は、ＣＬドメイン（カッパ又はラムダ）を含む。
４つのヒトＩｇＧアイソタイプは、親和性が異なる活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害ＦｃγＲＩＩｂ受容体及び補体の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）に結合して、非常に異なるエフェクタ機能をもたらす（Ｂｒｕｈｎｓ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｆｃγ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ．１１３（１６）：３７１６－２５）。Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｂ．Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００７ Ｓｅｐ １５；６７（１８）：８８８２－９０も参照されたい。一実施形態において、本発明の抗体は、Ｆｃ受容体に結合しない。本発明の別の実施形態において、抗体は、Ｆｃ受容体の１つ以上のタイプに結合する。
一実施形態において、使用されるＦｃ領域は、変異している（特に本明細書中に記載される変異）。一実施形態において、Ｆｃ変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃ領域の結合を除去又は増強するような変異、エフェクタ機能を増大させるか又は除去するような変異、抗体の半減期を延長又は短縮するような変異及びこれらの組合せを含む群から選択される。修飾のインパクトに言及する一実施形態において、Ｆｃ変異は、等しいが修飾を欠いている抗体との比較によって実証され得る。
ｐＨ７．４ではなく、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに選択的に結合するいくつかの抗体は、種々の動物モデルにおいてより長い半減期を示す。ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間のインターフェースに位置するいくつかの変異、例えばＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ ＰＲ．ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｌｏｎｇｅｒ ｓｅｒｕｍ ｈａｌｆ－ｌｉｖｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３－６）及びＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ（Ｖａｃｃａｒｏ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｃ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｅｖｅｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１０）：１２８３－８）が、インビボで、ＦｃＲｎへの結合親和性を増大させ、且つＩｇＧ１の半減期を延長することが示された。そのため、血清半減期を改変する修飾がＭ２５２／Ｓ２５４／Ｔ２５６＋Ｈ４４／Ｎ４３４に存在し得、特にＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ＋Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆが存在し得る。一実施形態において、半減期を延長することが所望される。別の実施形態において、抗体の血清半減期を短縮することが実際に所望され得、血清半減期を短縮する修飾が存在し得る。
多数の変異が、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン内に形成されて、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに及ぼす影響がインビトロで試験されてきた（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ＥＥ．ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｒｅｃｒｕｉｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（４）：２５７１－５）。目に見えて、位置３３３でのアラニン置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を増大させることが報告された。そのため、一実施形態において、位置３３３での修飾、特に補体を動員する能力を改変するものが存在し得る。Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性がより高く、且つＦｃγＲＩＩｂに対する親和性がより低くて、ＡＤＣＣの増強をもたらす三重ミュータント（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ）を記載した（Ｌａｚａｒ ＧＡ．ｅｔ ａｌ．，２００６）。そのため、Ｓ２３９／Ｉ３３２／Ａ３３０の修飾、特にＦｃ受容体に対する親和性を改変するもの、特にＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌが存在し得る（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＰＮＡＳ １０３（１１）：４００５－４０１０）。同じ変異を用いて、ＡＤＣＣが増大した抗体を生成した（Ｒｙａｎ ＭＣ．ｅｔ ａｌ．，２００７．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｂ－ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，６：３００９－３０１８）。Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．は、ＦｃγＲＩＩＩａ親和性が向上した僅かに異なる三重ミュータント（Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ）及びマクロファージによって標的細胞のファゴサイトーシスの増強を媒介するＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比を研究した（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＪＯ ｅｔ ａｌ ２００８．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｃｇａｍｍａ ＲＩＩａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７－２７）。したがって、一実施形態において、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ修飾が存在し得る。
別の実施形態において、本発明の抗体は、修飾ヒンジ領域及び／又はＣＨ１領域を有し得る。代わりに、使用されるアイソタイプは、特定のヒンジ領域を有するように選択され得る。
主要なパブリックＶ領域
本明細書中でパブリックＶ－遺伝子とも記載されるパブリックＶ領域は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体応答の大集団に見出される生殖細胞系重鎖及び軽鎖領域のＶ領域（集団内で見出される）である。この用途において、Ｖ領域は、ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する特異的応答である。つまり、多くの個体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する免疫応答を生成する場合、生殖細胞系ｖ領域レパートリーから同じｖ領域を利用する。
本明細書中でパブリックＶ－遺伝子とも記載されるパブリックＶ領域は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体応答の大集団に見出される生殖細胞系重鎖及び軽鎖領域のＶ領域（集団内で見出される）である。この用途において、Ｖ領域は、ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する特異的応答である。つまり、多くの個体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する免疫応答を生成する場合、生殖細胞系ｖ領域レパートリーから同じｖ領域を利用する。
本明細書中で用いられる、特定のｖ領域に「由来する」抗体は、その生殖細胞系ｖ領域配列を用いるＶ（Ｄ）Ｊ組換えによって生成された抗体を指す。例えば、生殖細胞系ＩＧＨＶ３－５３ ｖ領域配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に特異的に結合する抗体に到達するような体細胞組換え及び体細胞変異を受け得る。抗体をコードするヌクレオチド配列は、ＩＧＨＶ３－５３生殖細胞系配列と同一の配列を含みそうにないが、それでもやはり、抗体は依然として、このｖ領域に由来する。本発明の抗体は、典型的には、生殖細胞系配列と比較した場合、ｖ領域内に２０個以下の非サイレント変異、例えば１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つ以下の非サイレント変異を含む。本発明の抗体は、典型的には、生殖細胞系配列と比較した場合、ｖ領域内に２～２０個の非サイレント変異、例えば３～１５個、４～１０個、５～９個の非サイレント変異を含まない。生殖細胞系ｖ領域配列は、当技術分野で周知であり、抗体の特定の領域が特定の生殖細胞系ｖ領域配列に由来するかを特定する方法も当技術分野で周知である。
一実施形態において、本発明の抗体は、ＩＧＨＶ３－５３、ＩＧＨＶ１－５８、ＩＧＨＶ３－６６、ＩＧＨＶ４－３９、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ５－５１、ＩＧＨＶ１－０２又はＩＧＨＶ３－３３から選択されるｖ領域に由来する。本発明者らは、本明細書中で特定される強力な中和抗体が、これらのｖ領域のＣＤＲ内に比較的少ない変異を含むことを見出した。そのため、一実施形態において、本発明の抗体は、ＩＧＨＶ３－５３、ＩＧＨＶ１－５８、ＩＧＨＶ３－６６、ＩＧＨＶ４－３９、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ５－５１、ＩＧＨＶ１－０２又はＩＧＨＶ３－３３から選択されるｖ領域によってコードされ、天然に存在する生殖細胞系配列と比較した場合、３～１０個の非サイレントヌクレオチド変異又は２～５個の非サイレント変異、例えば、１０個以下、９つ以下、８つ以下、７つ以下、６つ以下、５つ以下、４つ以下、３つ以下又は２つの非サイレント変異を有する。本明細書中で定義されるサイレント変異は、ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列の変化がないヌクレオチド配列の変化である。したがって、非サイレント変異は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の変化の原因となる変異である。
本発明者らは、驚くべきことに、同じ重鎖ｖ領域を有する２つの抗体の軽鎖可変領域が交換されて、第１の抗体の重鎖可変領域及び第２の抗体の軽鎖可変領域を含む混合鎖抗体が生成され得ることを見出した。例えば、２つの抗体は、ＩＧＨＶ３－５３に由来する重鎖可変領域を両方とも含み得る。好ましくは、両方の抗体は、同じ軽鎖ｖ領域に由来する軽鎖可変領域も含むが、これは、必須でない。なぜなら、例えば、抗体２２２の軽鎖が、ＩＧＨＶ３－５３に由来するあらゆる重鎖可変領域と合致して、強力な中和抗体に至り得るからである。上記において及び実施例７に記載されるように、２つの抗体は、ＩＧＨＶ３－５３及び／又はＩＧＨＶ３－６６に由来する重鎖可変領域を含み得る。
一実施形態において、本発明の抗体は、ＩＧＨＶ３－５３、ＩＧＨＶ１－５８、ＩＧＨＶ３－６６、ＩＧＨＶ４－３９、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ５－５１、ＩＧＨＶ１－０２又はＩＧＨＶ３－３３から選択される主要なパブリックｖ領域に由来する抗体、例えば、ＩＧＨＶ３－５３について抗体ベータ－２７、１５０、１５８、１７５、２２２及び２６９、ＩＧＨＶ１－５８について抗体ベータ－４７、ベータ－２５、５５、１６５、２５３及び３１８、ＩＧＨＶ１－５８について抗体ベータ－４７、ベータ－２５、５５、１６５、２５３及び３１８、ＩＧＨＶ３－６６について抗体４０及び３９８、ＩＧＨＶ４－３９について抗体ベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－４０、ベータ－５４及びベータ－５５、ＩＧＨＶ３－３０について抗体ベータ－２２、ベータ－２９及び１５９、ＩＧＨＶ５－５１について抗体ベータ－３８及び１７０、ＩＧＨＶ１－０２について抗体ベータ－３０、ベータ－３２、ベータ－３３及び３１６又はＩＧＨＶ３－３３について抗体ベータ－２０及びベータ－４３の重鎖可変ドメインのＣＤＲを含む。これらの抗体の各々のＣＤＲに対応する配列番号を表１及び２に示す。
一実施形態において、本発明の抗体は、ＩＧＨＶ３－５３、ＩＧＨＶ１－５８、ＩＧＨＶ３－６６、ＩＧＨＶ４－３９、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ５－５１、ＩＧＨＶ１－０２又はＩＧＨＶ３－３３から選択される主要なパブリックｖ領域に由来する抗体、例えば、ＩＧＨＶ３－５３について抗体ベータ－２７、１５０、１５８、１７５、２２２及び２６９、ＩＧＨＶ１－５８について抗体ベータ－４７、ベータ－２５、５５、１６５、２５３及び３１８、ＩＧＨＶ１－５８について抗体ベータ－４７、ベータ－２５、５５、１６５、２５３及び３１８、ＩＧＨＶ３－６６について抗体４０及び３９８、ＩＧＨＶ４－３９について抗体ベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－４０、ベータ－５４及びベータ－５５、ＩＧＨＶ３－３０について抗体ベータ－２２、ベータ－２９及び１５９、ＩＧＨＶ５－５１について抗体ベータ－３８及び１７０、ＩＧＨＶ１－０２について抗体ベータ－３０、ベータ－３２、ベータ－３３及び３１６又はＩＧＨＶ３－３３について抗体ベータ－２０及びベータ－４３の重鎖可変ドメインを含む。これらの抗体の各々の重鎖可変ドメインに対応する配列番号を、表１及び２に示す。
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５９５～５９７にそれぞれ示される重鎖ＣＤＲ１～３を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５９２に示される抗体ベータ－４７の重鎖可変ドメインを含む。
より初期のセットの抗体（表１及び１４）において特定されたｖ領域から、ベータ感染した個体由来の新しいセットの抗体（表２）由来の１つの強力な中和抗体のみが、ＩＧＨＶ３－５３に由来した（ベータ－２７）。さらに、ベータ感染した個体由来の新しいセットの抗体（表２）由来の１つの強力な中和抗体のみが、ＩＧＨＶ１－５８に由来した（ベータ－４７）が、このｖ領域に由来する、より強力でないさらなる中和抗体（ベータ－２５）も可変ドメインスワッピングに選択された。ＩＧＨＶ４－３９ ｖ領域は、本明細書中に記載される新しいセットの抗体においてかなり表された：ベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－４０、ベータ－５４及びベータ－５５。表６～９に記載される他のｖ領域は、新しいセットの抗体及び／又はより初期のセットの抗体内の共有ｖ領域も示した。これらのセット内の軽鎖を入れ換えることにより、抗体は、代替の軽鎖を用いることにより、例えばベータ－４７の重鎖可変ドメインをベータ－２５又は５５の軽鎖可変ドメインと組み合わせることにより、機能的に１桁向上し得る。
さらに、実施例に記載されるように、驚くべきことに、特定のパブリックＶ領域に由来する抗体は、ベータ株と比較した場合、広い範囲の株に対する中和を維持するか又は向上させ得ることが示された。特に、本発明の抗体は、ＩＧＨＶ３－５３ ｖ領域に由来する（抗体ベータ－２７）。特に、本発明の抗体は、ＩＧＨＶ１－５８ ｖ領域に由来する（抗体ベータ－４７）。一実施形態において、ＩＧＨＶ１－５８に由来する重鎖を有する抗体の軽鎖は、同じ重鎖Ｖ領域に由来する第２の抗体の軽鎖と交換され得る。一実施形態において、ＩＧＨＶ３－５３に由来する重鎖を有する抗体の軽鎖は、同じ重鎖Ｖ領域に由来する第２の抗体の軽鎖と交換され得る。抗体の鎖を交換する場合、各抗体の軽鎖及び重鎖は好ましくは、同じＶ領域に由来する。例えば、抗体５５、１６５及び２５３は、全てＩＧＨＶ１－５８ ｖ領域に由来する重鎖及びカッパ３－２０に由来する軽鎖を有する。本発明者らは、５５又は１６５の軽鎖を２５３の重鎖と組み合わせることにより、中和力価が＞１ｌｏｇ増大することを見出した。他の組合せが想定される。なぜなら、ＲＢＤ又はスパイクを有する２５３、２５３／５５及び２５３／１６５の構造は、同じエピトープにほぼ同様に結合し、Ｂ．１．３５１バリアント内の３つの変異部位残基のいずれにも接触しないことを示したからである。
したがって、一実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（例えば、アルファ、ベータ、ガンマ及び／又はデルタ系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株）のスパイクタンパク質に特異的に結合する抗体を生成する方法であって、同じ軽鎖及び／又は重鎖ｖ領域に由来する２つ以上の抗体を特定することと、第１の抗体の軽鎖を第２の抗体の軽鎖と置換することにより、第１の抗体の重鎖及び第２の抗体の軽鎖を含む混合鎖抗体を生成することとを含む方法を提供する。一実施形態において、方法は、混合鎖抗体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する親和性及び／又はその中和を判定することをさらに含む。方法は、混合鎖抗体の親和性を第１及び／又は第２の抗体のものと比較することをさらに含み得る。方法は、第１及び／又は第２の抗体と親和性が同じであるか、又はそれを超える混合鎖抗体を選択することをさらに含み得る。一部の実施形態において、重鎖ｖ領域は、ＩＧＨＶ １－５８であり、且つ／又は軽鎖ｖ領域は、ＩＧＬＶカッパ３－２０である。
別の実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のベータバリアントに特異的に結合する抗体を提供し、抗体は、ＩＧＨＶ４－３９に由来するｖ領域を有する。より詳細には、本発明は、スパイクタンパク質内にアミノ酸５０１Ｙを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントに特異的な抗体を提供し、抗体は、ＩＧＨＶ４－３９に由来するｖ領域を有する。驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のベータバリアントによる感染に対する抗体応答が、ＩＧＨＶ４－３９由来の重鎖可変領域を有する抗体に向けてかなり偏ることが発見された。これらの抗体の大部分が、スパイクタンパク質の位置５０１のチロシンに特異的であることが示された。例示的な抗体として、ベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５が挙げられる。一実施形態において、そのような抗体は、スパイクタンパク質内に５０１Ｙを含む将来のバリアントを中和するのに有用である。抗体重鎖がＩＧＨＶ４－３９に由来する一実施形態において、本発明の抗体は、ベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－４０、ベータ－５４又はベータ－５５由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びにベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－４０、ベータ－５４又はベータ－５５由来のＣＤＲＬ３を含む。実施例６で説明されるように、ＩＧＨＶ４－３９に由来する抗体によるスパイクタンパク質との相互作用の大部分は、重鎖内にあり、軽鎖相互作用は、軽鎖ＣＤＲＬ３に由来するものに制限されることが示された。さらに、ＩＧＨＶ４－３９に由来する抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のオミクロンバリアントに結合する抗体、すなわちベータ－４０、ベータ－５４及びベータ－５５の群において強く表されることが示された。
スパイクタンパク質「ダウンアンドアウト」高次構造に結合する抗体
ＩｇＶＨ１－６９クラスの抗体、ベータ－４９及びベータ－５０は、スパイクタンパク質の以前に特定されていない高次構造（ＲＢＤはダウン構成であり（図１５）、重鎖は、２つのＲＢＤとの相互作用をなして（図１６Ｃ）、スパイクタンパク質のＲＢＤは、スパイク三量体の周辺部に向けて変換／回転される（「アウト」構成）（図１６Ｄ））に結合する（実施例１８を参照されたい）。スパイクタンパク質は、本明細書中でスパイク三量体と称される三量体として天然に存在する。スパイクタンパク質の「ダウン」高次構造が、受容体アクセス不能状態を表すことが知られている（Ｃａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，２０２０．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６９（６５１１），ｐｐ．１５８６－１５９２）。抗体ベータ－４９及びベータ－５０は、スパイクタンパク質を、新しいタイプの受容体アクセス不能状態である「ダウンアンドアウト」高次構造に「ロックする」とみなされる。驚くべきことに、スパイクタンパク質のダウンアンドアウト高次構造に結合する抗体は、現在まで試験されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの全てを強く中和する。したがって、スパイクタンパク質のダウンアンドアウト高次構造に結合する抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの強力な交差系統中和抗体として有用であり得る。
ＩｇＶＨ１－６９クラスの抗体、ベータ－４９及びベータ－５０は、スパイクタンパク質の以前に特定されていない高次構造（ＲＢＤはダウン構成であり（図１５）、重鎖は、２つのＲＢＤとの相互作用をなして（図１６Ｃ）、スパイクタンパク質のＲＢＤは、スパイク三量体の周辺部に向けて変換／回転される（「アウト」構成）（図１６Ｄ））に結合する（実施例１８を参照されたい）。スパイクタンパク質は、本明細書中でスパイク三量体と称される三量体として天然に存在する。スパイクタンパク質の「ダウン」高次構造が、受容体アクセス不能状態を表すことが知られている（Ｃａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ，２０２０．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６９（６５１１），ｐｐ．１５８６－１５９２）。抗体ベータ－４９及びベータ－５０は、スパイクタンパク質を、新しいタイプの受容体アクセス不能状態である「ダウンアンドアウト」高次構造に「ロックする」とみなされる。驚くべきことに、スパイクタンパク質のダウンアンドアウト高次構造に結合する抗体は、現在まで試験されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの全てを強く中和する。したがって、スパイクタンパク質のダウンアンドアウト高次構造に結合する抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの強力な交差系統中和抗体として有用であり得る。
典型的な「ダウン」高次構造において、スパイク三量体内の２つの隣接するＲＢＤ間の直接的接触が存在する。本明細書中で特定されるダウンアンドアウト高次構造において、ＲＢＤは十分に分離されており、それらの間で、Ｎ３４３グリカンでの他に、いかなる直接的接触もない。用語「直的接接触」は、ジスルフィド結合、共有結合、塩架橋及び水素結合を指す（例えば、「直接的接触の欠如」は、ジスルフィド結合、共有結合、塩架橋及び水素結合の欠如を指す）。
したがって、本発明は、ダウンアンドアウト高次構造でロックされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の修飾スパイクタンパク質を提供する。修飾スパイクタンパク質が受容体アクセス不能状態にある場合及びスパイク三量体内のあるスパイクタンパク質のＲＢＤドメインが、Ｎグリコシル化Ａｓｎ３４３を介すること以外でスパイク三量体内の別のスパイクタンパク質のＲＢＤドメインに接触しない場合、修飾スパイクタンパク質は、ダウンアンドアウト高次構造でロックされている。一部の実施形態において、修飾スパイクタンパク質は、ダウンアンドアウト高次構造において近接しているＲＢＤドメイン及び／又はＮＴＤドメインのアミノ酸においてシステイン置換を、ジスルフィド結合がシステイン残基間に形成されるように含む。ジスルフィド結合をタンパク質中に入れる操作をするか、又はジスルフィド結合を形成させることにより、タンパク質高次構造を安定させることを可能にする位置でのアミノ酸配列中へのシステイン残基の導入に適した残基を特定する方法が当技術分野で周知である（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ，１０（１），ｐｐ．１－９及びＤｏｍｂｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１４．ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，５８８（２），ｐｐ．２０６－２１２を参照されたい）。一部の実施形態において、修飾スパイクタンパク質は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質の位置１９８及び４６３に対応する位置においてシステインを、ジスルフィド結合がシステイン残基間に形成されるように含む。一実施形態において、修飾スパイクタンパク質は、アミノ酸置換Ｄ１９８Ｃ及びＰ４６３Ｃを、ジスルフィド結合がシステイン残基間に形成されるように含み、アミノ酸ナンバリングは、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質のアミノ酸ナンバリングに対応する。一部の実施形態において、本発明は、配列番号６８１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を含む修飾スパイクタンパク質を提供し、修飾スパイクタンパク質は、置換Ｄ１９８Ｃ及びＰ４６３Ｃを含む。結果として生じるスパイクタンパク質は、配列番号６８１の１９８及び４６３に相当する位置においてアミノ酸間にジスルフィド結合を形成し、これがスパイクタンパク質を「ダウンアンドアウト」高次構造でロックする。
ダウンアンドアウト高次構造でロックされたスパイクタンパク質は、抗体ベータ－４９及びベータ－５０として同エピトープを標的とする抗体を生成するのに用いられ得る。このエピトープに結合する抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを強く中和し得る。したがって、本明細書中で提供されるのは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる抗体を生成する方法であって、ダウンアンドアウト高次構造でロックされた修飾スパイクタンパク質に対して抗体を高めることを含む方法である。抗体を生成する方法は、当技術分野で周知である。例えば、スパイクタンパク質に対して抗体を高めることは、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術によって又はスパイクタンパク質で動物を免疫化することによって実行され得る。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。
本発明は、抗体ベータ－４９及び／又はベータ－５０と同じエピトープに結合することができる抗体の有無に関してスクリーニングする方法も提供する。方法は、抗体ベータ－４９及び／又はベータ－５０との競合研究を実行することを含み得る。競合研究は、当業者に知られているあらゆる手段、例えば実施例５に例示されるバイオレイヤーインターフェロメトリ研究によって実行され得る。本発明は、この方法によって得られる抗体も提供する。同様に、本発明は、この方法によって獲得可能な抗体を提供する。本発明は、スパイクタンパク質上の同じエピトープに結合することができる抗体も抗体ベータ４９又はベータ５０として提供する。本発明は、スパイクタンパク質に結合する抗体ベータ４９又はベータ５０と競合する抗体も提供する。
当業者であれば、標準的な技術、例えば用途の実施例に記載されるものを用いて、抗体の結合部位（エピトープ）を容易に決定することができる。当業者であれば、抗体が、本明細書中に記載される抗体と同じエピトープに結合するか、又はそれとの結合について競合するかを、当技術分野で公知の常法を用いることによって容易に判定することもできる。
例えば、試験抗体（すなわち試験抗体が抗原に結合する他の抗体と競合するかが知られていない）が、本明細書中に記載される抗体（以下の段落で「参照抗体」と称される）と同じエピトープに結合するかを判定するために、参照抗体は、飽和条件下でタンパク質又はペプチドに結合し得るようにされる。次に、試験抗体の、タンパク質又はペプチドに結合する能力が評価される。参照抗体との結合が飽和した後、試験抗体がタンパク質又はペプチドに結合することができる場合、試験抗体は、参照抗体と異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方では、参照抗体との結合が飽和した後、試験抗体がタンパク質又はペプチドに結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合し得る。
抗体が参照抗体との結合について競合するかを判定するために、先に記載された結合方法論を２つの方針で実行する：第１の方針では、飽和条件下で参照抗体をタンパク質／ペプチドに結合させた後、タンパク質／ペプチド分子への試験抗体の結合性を評価する。第２の方針において、飽和条件下で試験抗体をタンパク質／ペプチドに結合させた後、タンパク質／ペプチドへの参照抗体の結合を評価する。両方の方針において、第１の（飽和）抗体のみがタンパク質／ペプチドに結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体は、タンパク質／ペプチドへの結合について競合すると結論される。当業者に理解される通り、参照抗体による結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合し得るわけではなく、重複しているか又は隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的にブロックしている場合がある。
他方が抗原に結合するのをそれぞれ競合的に阻害（ブロック）する場合、２つの抗体は、同じ又は重複するエピトープに結合する。代わりに、本質的に、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原内の全てのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は、同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減又は排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は、重複するエピトープを有する。
次いで、追加の日常的実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を実行して、試験抗体の結合の観察される欠如が、実際、参照抗体と同じエピトープに結合することに起因するものであるか、又は立体配置によるブロッキング（又は別の現象）が、観察される結合の欠如を担うかを確認することができる。この種の実験は、当技術分野で利用可能なＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴法、フローサイトメトリ又は他のあらゆる定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを用いて実行することができる。
交差競合抗体は、当技術分野における適切なあらゆる方法を用いて、例えば競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（スパイクタンパク質上の特定のエピトープへの交差競合抗体の結合が本発明の抗体の結合を妨げるか又はその逆も同じである）を用いることによって特定することができる。一実施形態において、抗体は、本明細書中で開示される特異性抗体の結合の≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％又は１００％の引下げをもたらす。
実施例において後述する抗体は、参照抗体として用いられ得る。
抗体エピトープを決定するのに用いられ得る他の技術として、水素／ジュウテリウム交換、Ｘ線結晶解析及びペプチドディスプレイライブラリ（実施例に記載）が挙げられる。これらの技術の組合せを用いて、試験抗体のエピトープが決定され得る。
本明細書中で用いられるアプローチ、例えば表面プラズモン共鳴又はＥＬＩＳＡは、他のデータに等しく利用され得、高度に冗長な競合実験から位置を迅速に決定する一般的な方法を提供する。
スパイクタンパク質、例えば本明細書中で提供される修飾スパイクタンパク質のナンバリングは、特に明記しない限り、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）株（本明細書中で配列番号６８１としても提供される）のナンバリングに関する（図２０Ｂを参照されたい）。本明細書中で用いられるスパイクタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のいかなるバリアントに由来し得る。配列番号６８１の参照は、完全ナンバリングが異なるバリアントにおけるアミノ酸位置の特定のためのナンバリングシステムを提供することとなる。例えば、ベータバリアントにおいて、３残基欠失がＮＴＤ内に存在するが、それでも、ＷＩＶ０４の位置５０１に相当するアミノ酸位置（Ａｓｎ）のナンバリングは、ベータのスパイクタンパク質配列内の５０１番目のアミノ酸でないにも関わらず、ベータの同じ位置におけるアミノ酸（Ｔｙｒ）のナンバリングと同一である。一部の実施形態において、スパイクタンパク質は、配列番号６８１に示されるアミノ酸配列である。配列アラインメントツールを用いて配列番号６８１と比較する場合、様々なバリアント由来のスパイクタンパク質のアミノ酸配列をアラインして、バリアント内のアミノ酸の対応する位置を決定することは、当業者の手段の範囲内である。したがって、スパイクタンパク質は、配列番号６８１と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性、例えば、配列番号６８１と少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。
抗体ベータ－４９及びベータ－５０は、以前に観察されていない新しいエピトープに結合する。ベータ－４９は、総計１１０５Å２フットプリントを形成し、スパイク三量体の一ＲＢＤについて９０５Å２及び第２のＲＢＤについて２００Å２である。ベータ－４９重鎖の残基２７～２８、３０～３３、５２、５４～５５、５７及び９９－１０５並びにベータ－４９軽鎖の残基３０、３２～３３、５０～５１、５３～５４及び９４～９５は、第１のＲＢＤの３３２～３４０、３４２～３４６、３６２～３６８、５２７及び５２９と相互作用し；ベータ－４９重鎖の残基１、３、５、２３～２６及び７５～７７は、第２のＲＢＤの４７６～４７８、４８６～４８７及び４８９と相互作用する。本明細書中で用いられるベータ－４９におけるアミノ酸のナンバリングは、配列番号６１２及び６１４の完全ナンバリングである。
ベータ－５０ Ｆａｂは、総計１１６５Å２フットプリントを形成し、スパイク三量体の一ＲＢＤについて９００Å２及び第２のＲＢＤについて２６５Å２である。ベータ－５０重鎖の残基２７～２８、３０～３３及び１００～１０５並びにベータ－５０軽鎖の３１、３３、５０、５３～５４及び９４～９５は、第１のＲＢＤの残基３３２～３４０、３４２～３４５、３６２～３６５、３６７～３６８、５０４及び５２６～５２９と相互作用し；ベータ－５０重鎖の残基３、５、２３～２７及び７５～７７は、第２のＲＢＤの４７５～４７８、４８６～４８７及び４８９の残基と相互作用する。本明細書中で用いられるベータ－４９におけるアミノ酸のナンバリングは、配列番号６２２及び６２４の完全ナンバリングである。
特に、抗体ベータ－４９及びベータ－５０は、スパイクタンパク質の位置３４３においてＮ－グリカンと、スパイクタンパク質の位置３６４においてアスパルタートと多数相互作用する。これらの特徴の両方は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスにおいて十分に保存されている（図２０を参照されたい）（Ｓｚｔａｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０２１．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（１０），ｐｐ．９６３－９６８）。さらに、スパイクタンパク質の残基３３５～３３６、３３８～３４２、３６３、３６５及び３６７－３６８は、重鎖ＣＤＲ３の結合に重要である疎水性ポケットを形成する。ＲＢＤのＮ末端残基３３３～３３４及びＣ末端残基５２７～５２９は、以前に観察されなかったエピトープの一部を形成する。第２のＲＢＤの残基４７７及び４８６～４８７も結合に必要とされる。
そのため、本発明は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のエピトープに結合することができる抗体を提供し、エピトープは、スパイクタンパク質のＮ３４３及びＤ３６４を含み、Ｎ３４３はＮグリコシル化されている。
本発明は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のエピトープに結合することができる抗体も提供し、エピトープは、（第１の）スパイクタンパク質の残基３３５～３３６、３３８～３４２、３６３、３６５及び３６７～３６８によって形成される疎水性ポケットを含む。エピトープは、加えて、第２のスパイクタンパク質の残基４７７及び４８６～４８７を含み得る（すなわち、抗体は、スパイク三量体内の２つのスパイクタンパク質モノマーによって形成されるエピトープに結合する）。エピトープは、加えて、（第１の）スパイクタンパク質の残基３３３～３３４及び５２７～５２９を含み得る。エピトープは、第１のスパイクタンパク質の残基３３２～３４０、３４２～３４５、３６２～３６５、３６７～３６８、５２７及び５２９並びに第２のスパイクタンパク質の残基４７６～４７８、４８６～４８７及び４８９を含み得る（すなわち、抗体は、スパイク三量体に結合する）。これらの抗体のいずれにおいても、位置３４３のアミノ酸は、Ａｓｎであり得、且つＮグリコシル化されている。
したがって、本発明は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる抗体も提供し、スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）は、「ダウンアンドアウト高次構造」にある。
スパイクタンパク質と抗体との間の相互作用の多くが、骨格相互作用を介している。したがって、明示的に定義されていない位置でのスパイクタンパク質における変異が、十分許容される。ベータ－４９及びベータ－５０が、ダウン（アクセス不能な受容体）からアップ（アクセス可能な受容体）高次構造へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクの変換に必要とされる不変の残基を含む、以前に特定されていないエピトープに結合するため、抗体ベータ－４９及びベータ－５０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ての知られているバリアントを強力に中和する。本明細書中で実施例及び表に示されるように、上述のエピトープは、Ｔ４７８及びＳ４７７等の残基を含むと特定されたにしても、これらは抗体結合に重要でない。なぜなら、抗体ベータ－４９及びベータ－５０が各々、これらの位置に置換（例えば、デルタにおいてＴ４７８Ｋ及びＢ．１．５２６．２においてＳ４７７Ｎ）を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに結合するからである。したがって、図１６Ｆ及びＧに示すように又は図２０Ｂに示すように、先に考察したもの等の同じ重要な残基に結合するあらゆる抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の種々の系統を強力に中和し得る。
抗体コンジュゲート
本発明は、細胞毒性剤、例えば毒素（例えば、細菌、菌類、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はその断片）にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は放射性同位元素を含む免疫コンジュゲート（すなわち放射性コンジュゲート）にも関する。抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは、当技術分野で知られている種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて形成され得る。
本発明は、細胞毒性剤、例えば毒素（例えば、細菌、菌類、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はその断片）にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は放射性同位元素を含む免疫コンジュゲート（すなわち放射性コンジュゲート）にも関する。抗体及び細胞毒性剤のコンジュゲートは、当技術分野で知られている種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて形成され得る。
本発明の抗体は、血清半減期を調節又は変更する分子にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、例えば、血清半減期を調節するために、アルブミンに結合し得る。一実施形態において、本発明の抗体は、アルブミンに特異的な結合領域も含むこととなる。別の実施形態において、本発明の抗体は、アルブミン結合ペプチドであるペプチドリンカーを含み得る。アルブミン結合ペプチドの例は、国際公開第２０１５／１９７７７２号パンフレット及び国際公開第２００７／１０６１２０号パンフレット（それらの全体が参照によって組み込まれる）に挙げられている。
ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明は、本発明の抗体をコードする１つ以上の単離ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）も提供する。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、複数のポリヌクレオチド上にまとまって存在するが、本発明の抗体をまとめて一緒にコードすることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、本発明の抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードし得る。ポリヌクレオチドは、本発明の抗体の完全長重鎖及び／又は軽鎖をコードし得る。典型的には、１つのポリヌクレオチドが、重鎖及び軽鎖の各々をコードする。
本発明は、本発明の抗体をコードする１つ以上の単離ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）も提供する。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、複数のポリヌクレオチド上にまとまって存在するが、本発明の抗体をまとめて一緒にコードすることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、本発明の抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードし得る。ポリヌクレオチドは、本発明の抗体の完全長重鎖及び／又は軽鎖をコードし得る。典型的には、１つのポリヌクレオチドが、重鎖及び軽鎖の各々をコードする。
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体重鎖及び軽鎖の一部又は全てをコードするＤＮＡ配列は、必要に応じて、対応するアミノ酸配列から合成され得る。
ベクターが構築され得る一般的な方法、形質移入方法及び培養方法は、当業者に周知である。この点において、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇが参照される。
挿入された配列に作動可能に連結される調節配列を含むことで、本発明の抗体のインビボ発現を可能にする発現カセットの形態で、本発明のポリヌクレオチドが提供され得る。そのため、本発明は、本発明の抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドをコードする１つ以上の発現カセットも提供する。これらの発現カセットは典型的に、今度は、ベクター（例えば、プラスミド又は組換えウイルスベクター）内に提供される。そのため、一実施形態において、本発明は、本発明の抗体をコードするベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体をまとめてコードするベクターを提供する。ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。適切なベクターとして、十分な量の遺伝的情報を有することができ、本発明のポリペプチドの発現を可能にするあらゆるベクターがあり得る。
本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターは、例えば、形質移入によって宿主細胞中に導入される。そのため、本発明は、本発明の１つ以上のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターを含む宿主細胞も提供する。本発明のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターは、宿主細胞中に一過的に又は恒久的に導入されて、１つ以上のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターからの抗体の発現を可能にし得る。そのような宿主細胞として、一過性の又は好ましくは安定した高等真核細胞株、例えば哺乳動物細胞若しくは昆虫細胞、下等真核細胞、例えば酵母又は原核細胞、例えば細菌細胞が挙げられる。細胞の特定の例として、哺乳動物のＨＥＫ２９３、例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｓ若しくはＨＥＫ Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＳ０及びＣＯＳ細胞又は本明細書中で用いられる他のあらゆる細胞株、例えば実施例に用いられているものが挙げられる。好ましくは、選択される細胞株は、安定しているだけでなく、成熟したグリコシル化を可能にするものである。
本発明は、本発明の抗体の生成プロセスであって、本発明の１つ以上のベクターを含有する宿主細胞を、本発明の１つ以上のポリヌクレオチドからの抗体の発現に適した条件の下で培養することと、前記培養から抗体を単離することとを含むプロセスも提供する。
抗体の組合せ
本発明者らは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに起因する活性の消失を最小限に抑え、治療効果を最大にし、且つ／又は診断力を増大させるために、組み合わせて用いられる場合の特定の表２の抗体並びに表２及び表１の抗体の特定の組合せが特に有効であることを見出した。有用な組合せとして、互いと交差競合せず、且つ／又は非重複エピトープに結合しない抗体が挙げられる。
本発明者らは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに起因する活性の消失を最小限に抑え、治療効果を最大にし、且つ／又は診断力を増大させるために、組み合わせて用いられる場合の特定の表２の抗体並びに表２及び表１の抗体の特定の組合せが特に有効であることを見出した。有用な組合せとして、互いと交差競合せず、且つ／又は非重複エピトープに結合しない抗体が挙げられる。
そのため、本発明は、本発明の抗体の組合せを提供し、各抗体は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができ、各抗体は、表２内の２８個の抗体のいずれか１つの少なくとも３つのＣＤＲを含む。
組合せは、以下の少なくとも２つを含み得る：
（ａ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置５０１のチロシンと相互作用する抗体、例えばベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５又はベータ－５６；
（ｂ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置４８４のリシンと相互作用する抗体、例えばベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５又はベータ－５１；
（ｃ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置４１７のアスパラギン又はトレオニンと相互作用する抗体、例えばベータ－２０、ベータ－３３、ベータ－２２又はベータ－２９；並びに
（ｄ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置４５２及び４７８のそれぞれロイシン及びトレオニンと相互作用する抗体、例えばベータ－４４。
（ａ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置５０１のチロシンと相互作用する抗体、例えばベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５又はベータ－５６；
（ｂ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置４８４のリシンと相互作用する抗体、例えばベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５又はベータ－５１；
（ｃ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置４１７のアスパラギン又はトレオニンと相互作用する抗体、例えばベータ－２０、ベータ－３３、ベータ－２２又はベータ－２９；並びに
（ｄ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置４５２及び４７８のそれぞれロイシン及びトレオニンと相互作用する抗体、例えばベータ－４４。
一実施形態において、組合せは、以下を含み得る：（ａ）本発明に従う抗体、例えば、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができ、且つ表２内の２８個の抗体のいずれか１つの少なくとも３つのＣＤＲを含む抗体；並びに（ｂ）コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができ、且つ表１内の抗体の少なくとも３つのＣＤＲを含む抗体。例えば、（ｂ）の抗体は、以下を含み得る：
（ｉ）表１内の抗体の少なくとも４つ、５つ若しくは６つ全てのＣＤＲ；
（ｉｉ）表１内の抗体の重鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）表１内の抗体の軽鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる軽鎖可変ドメイン；並びに／又は
（ｉｖ）表１内の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖ドメインに対してそれぞれ少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン。
（ｉ）表１内の抗体の少なくとも４つ、５つ若しくは６つ全てのＣＤＲ；
（ｉｉ）表１内の抗体の重鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）表１内の抗体の軽鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる軽鎖可変ドメイン；並びに／又は
（ｉｖ）表１内の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖ドメインに対してそれぞれ少なくとも８０％（例えば、≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン。
本発明は、表２に記載される抗体のいずれか及び表１内の抗体のいずれかの組合せも提供する。
一実施形態において、組合せは、以下を含み得る：（ａ）本発明の抗体、及び（ｂ）表２由来の１つ以上の抗体。表２の抗体は、以下であり得る：
－ （ｉ）抗体５５、及び（ｉｉ）抗体５８若しくは２７８；
－ （ｉ）抗体５８、及び（ｉｉ）抗体８８、１３２、１５０、１５８、１６５、１７５、２２２若しくは２８２；
－ （ｉ）抗体２７８、及び（ｉｉ）抗体８８、１３２、１５０、１５８、１６５、１７５、２２２若しくは２８２；
－ （ｉ）抗体５５；（ｉｉ）抗体５８若しくは２７８；及び（ｉｉｉ）１５９；
－ （ｉ）抗体５８、（ｉｉ）抗体８８、１３２、１５０、１５８、１６５、１７５、２２２若しくは２８２、及び（ｉｉｉ）１５９；
－ （ｉ）抗体２７８、（ｉｉ）抗体８８、１３２、１５０、１５８、１６５、１７５、２２２若しくは２８２、及び（ｉｉｉ）１５９；
－ ３８４、１５９、２５３Ｈ５５Ｌ、２５３Ｈ１６５Ｌ、２５３、８８、４０及び３１６からなる群から選択される２つ以上のあらゆる抗体；
－ ２５３、２５３Ｈ５５Ｌ、２５３Ｈ１６５Ｌ、２２２、３１８、５５及び１６５からなる群から選択される２つ以上のあらゆる抗体；
－ １５８Ｈ２２２Ｌ、２２２、１５０Ｈ２２２Ｌ、３８４、１５９、２５３Ｈ５５Ｌ、２５３Ｈ１６５Ｌ、２５３、８８、４０及び３１６からなる群から選択される２つ以上のあらゆる抗体；又は
－ １５８Ｈ２２２Ｌ、２２２、１５０Ｈ２２２Ｌ、２５３、２５３Ｈ５５Ｌ、２５３Ｈ１６５Ｌ、２２２、３１８、５５及び１６５からなる群から選択される２つ以上のあらゆる抗体。
－ （ｉ）抗体５５、及び（ｉｉ）抗体５８若しくは２７８；
－ （ｉ）抗体５８、及び（ｉｉ）抗体８８、１３２、１５０、１５８、１６５、１７５、２２２若しくは２８２；
－ （ｉ）抗体２７８、及び（ｉｉ）抗体８８、１３２、１５０、１５８、１６５、１７５、２２２若しくは２８２；
－ （ｉ）抗体５５；（ｉｉ）抗体５８若しくは２７８；及び（ｉｉｉ）１５９；
－ （ｉ）抗体５８、（ｉｉ）抗体８８、１３２、１５０、１５８、１６５、１７５、２２２若しくは２８２、及び（ｉｉｉ）１５９；
－ （ｉ）抗体２７８、（ｉｉ）抗体８８、１３２、１５０、１５８、１６５、１７５、２２２若しくは２８２、及び（ｉｉｉ）１５９；
－ ３８４、１５９、２５３Ｈ５５Ｌ、２５３Ｈ１６５Ｌ、２５３、８８、４０及び３１６からなる群から選択される２つ以上のあらゆる抗体；
－ ２５３、２５３Ｈ５５Ｌ、２５３Ｈ１６５Ｌ、２２２、３１８、５５及び１６５からなる群から選択される２つ以上のあらゆる抗体；
－ １５８Ｈ２２２Ｌ、２２２、１５０Ｈ２２２Ｌ、３８４、１５９、２５３Ｈ５５Ｌ、２５３Ｈ１６５Ｌ、２５３、８８、４０及び３１６からなる群から選択される２つ以上のあらゆる抗体；又は
－ １５８Ｈ２２２Ｌ、２２２、１５０Ｈ２２２Ｌ、２５３、２５３Ｈ５５Ｌ、２５３Ｈ１６５Ｌ、２２２、３１８、５５及び１６５からなる群から選択される２つ以上のあらゆる抗体。
本発明の抗体の組合せは、治療カクテルとして有用であり得る。そのため、本発明は、以下でさらに説明されるように、本発明の抗体の組合せを含む医薬組成物も提供する。
本発明の抗体の組合せは、診断に有用であり得る。そのため、本発明は、本発明の抗体の組合せを含む診断キットも提供する。本明細書中で提供されるのは、以下でさらに説明されるように、対象においてコロナウイルス感染と関連する疾患又は合併症を診断する方法でもある。
例えば、本発明の抗体の組合せは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の試料のスパイクタンパク質への、群（ａ）～（ｄ）内の抗体の結合の引下げに基づいて、Ｙ５０１、Ｋ４８４、Ｎ／Ｔ４１７及び／又はＬ４５２＋Ｔ４７８の存在を特定するのに用いられ得る。完全交差中和抗体、例えばベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及び／又はベータ－５３は、試料内でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在及び／又は量を確認するための参照として用いられ得る。例えば、群（ａ）内の抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の試料への結合の引下げを示す場合、スパイクタンパク質は、Ｙ５０１を含みそうにない。これは、当業者に知られているあらゆる方法により、例えば免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ又は免疫クロマトグラフィアッセイを介して判定され得る。結合の引下げは、参照に対する比較及び／若しくは正規化並びに／又はポジティブ／ネガティブ対照試料若しくはデータとの比較によって判定され得る。
医薬組成物
本発明は、本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、本発明の抗体の組合せ（例えば、２、３又は４つ）を含み得る。医薬組成物は、薬学的に許容される担体も含み得る。
本発明は、本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、本発明の抗体の組合せ（例えば、２、３又は４つ）を含み得る。医薬組成物は、薬学的に許容される担体も含み得る。
本明細書の組成物は、１つ以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持し、且つ不所望のいかなる毒性効果も与えない塩を指す。そのような塩の例として、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。
薬学的に許容される適切な担体は、水性担体又は希釈剤を含む。適切な水性担体の例として、水、緩衝水及び生理食塩水が挙げられる。
薬学的に許容される他の適切な担体として、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール類、例えば、マンニトール、ソルビトール又は塩化ナトリウムを組成物中に含めることが所望されるであろう。
医薬組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で無菌且つ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム又は高薬物濃度に適切な他の秩序構造として製剤化することができる。
本発明の医薬組成物は、追加の治療剤、例えば抗ウイルス剤を含み得る。抗ウイルス剤は、コロナウイルスに結合し、且つウイルス活性を阻害し得る。代わりに、抗ウイルス剤は、コロナウイルスに直接結合し得ないが、ウイルス活性／伝染性に依然として影響を与え得る。抗ウイルス剤は、さらなる抗コロナウイルス抗体であり得、これは、スパイクタンパク質以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２上のどこかに結合する。本発明に有用な抗ウイルス剤の例として、レムデシビル、ロピナビル、リトナビル、ＡＰＮ０１及びＦａｖｉｌａｖｉｒが挙げられる。
追加の治療剤は、抗炎症剤、例えば副腎皮質ステロイド（例えば、デキサメタゾン）又は非ステロイド抗炎症薬（例えば、トシリズマブ）であり得る。
追加の治療剤は、抗コロナウイルスワクチンであり得る。
医薬組成物は、皮下投与、静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与又は経口投与され得る。
本発明の範囲内にあるのは、本発明の抗体又は他の組成物及び使用説明書を含むキットでもある。キットは、１つ以上の追加の試薬、例えば本明細書中で考察される追加の治療剤又は予防剤をさらに含有し得る。
本発明の方法及び使用
本発明は、例えば、治療によるヒト若しくは動物の身体の処置方法又は診断法における、本明細書中に記載される抗体、抗体の組合せ及び医薬組成物の使用にさらに関する。処置の方法は、治療的又は予防的であり得る。
本発明は、例えば、治療によるヒト若しくは動物の身体の処置方法又は診断法における、本明細書中に記載される抗体、抗体の組合せ及び医薬組成物の使用にさらに関する。処置の方法は、治療的又は予防的であり得る。
例えば、本発明は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症、例えばＣＯＶＩＤ－１９を処置する方法に関する。この方法は、本発明の抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物の治療的に有効な量を投与することを含み得る。方法は、対象由来の試料中のコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はその断片の存在を特定することをさらに含み得る。本発明は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症、それと関連する疾患又は合併症、例えばＣＯＶＩＤ－１９を処置する方法に使用される、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物にも関する。
本発明は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症、それと関連する疾患又は合併症、例えばＣＯＶＩＤ－１９を処置するための組成物を製剤化する方法にも関し、前記方法は、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物を許容可能な担体と混合して、前記組成物を調製することを含む。
本発明は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症、例えばＣＯＶＩＤ－１９を処置するための、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物の使用にも関する。
本発明は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症、例えばＣＯＶＩＤ－１９を処置又は予防するための薬剤の製造ための、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物の使用にも関する。
本発明は、あらゆるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症の予防、処置又は診断にも関する。コロナウイルス感染症は、いかなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株によっても引き起こされ得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、最も初期に同定された武漢株（ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）；ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）及びそのバリアントであり得る。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、系統Ａ、Ａ．１、Ａ．２、Ａ．３、Ａ．５、Ｂ、Ｂ．１、Ｂ．１．１、Ｂ．２、Ｂ．３、Ｂ．４、Ｂ．１．１．７（アルファ）、Ｂ．１．３５１（ベータ）、Ｐ．１（ガンマ）、デルタ、カッパ及び／又はラムダのメンバーであり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、系統Ａ．２３．１、Ｂ．１．１．７（アルファ）、Ｂ．１．３５１（ベータ）、Ｂ．１．２５８、Ｂ．１．５２６．２、Ｂ．１．６１６、Ｂ．１．６１７．１（カッパ）、Ｂ．１．６１７．２（デルタ）、Ｃ３６．３、Ｃ．３７（ラムダ）、Ｐ．１（ガンマ）及び／又はＢ．１．１．５２９（オミクロン）のメンバーであり得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）（ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）と比較して、例えばスパイクタンパク質内に、１つ以上の変異を含み得る。換言すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、例えばスパイクタンパク質内に、１つ以上の修飾を含む修飾ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）株であり得る。
変異は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）（ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７での変異（例えば置換）であり得る。例えば、変異は、リシンから別のアミノ酸残基、例えばアスパラギン（Ｎ）又はトレオニン（Ｔ）への置換であり得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、変異Ｋ４１７Ｎ、例えばベータ（Ｂ．１．３５１）株又はそれに由来する系統のメンバーを含み得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、変異Ｋ４１７Ｔ、例えば、Ｐ．１（ガンマ）株又はそれに由来する系統のメンバーを含み得る。
抗体ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－２０、ベータ－２２、ベータ－２９及び／又はベータ－４４は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株を中和するのに特に有効である。そのため、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられるこれらの抗体に関し得る。同様に、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
変異は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）（ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置５０１の変異であり得る。例えば、変異は、アスパラギン（Ｎ）から別のアミノ酸残基、例えばチロシン（Ｙ）への置換であり得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、変異Ｎ５０７Ｙ、例えば、Ｂ．１．１．７（アルファ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー、Ｂ．１．３５１（ベータ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー又はＰ．１（ガンマ）株若しくはそれに由来する系統のメンバーを含み得る。
抗体ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６及び／又はベータ－４４は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置５０１に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株を中和するのに特に有効である。そのため、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置５０１に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられるこれらの抗体に関し得る。同様に、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置５０１に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
変異は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）（ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４８４の変異であり得る。例えば、変異は、グルタミン酸（Ｅ）から別のアミノ酸残基、例えばリシン（Ｋ）への置換であり得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、変異Ｅ４８４Ｋ、例えば、Ｂ．１．３５１（ベータ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー、Ｐ．１（ガンマ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー又はＢ．１．６１７．１（カッパ）株若しくはそれに由来する系統のメンバーを含み得る。
抗体ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３、ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５、ベータ－５１及び／又はベータ－４４は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４８４に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株を中和するのに特に有効である。そのため、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４８４に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられるこれらの抗体に関し得る。同様に、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４８４に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
変異は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）（ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４５２の変異であり得る。例えば、変異は、ロイシン（Ｌ）から別のアミノ酸残基、例えばアルギニン（Ｒ）又はグルタミン（Ｑ）への置換であり得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、変異Ｌ４５２Ｒ、例えば、Ｂ．１．６１７．２（デルタ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー、Ｂ．１．６１７．１（カッパ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー又はＣ．３６．３株若しくはそれに由来する系統のメンバーを含み得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、変異Ｌ４５２Ｑ、例えばＣ．３７（ラムダ）株又はそれに由来する系統のメンバーを含み得る。
抗体ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４５２に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株を中和するのに特に有効である。そのため、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４５２に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられるこれらの抗体に関し得る。同様に、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４５２に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
変異は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）（ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４７８の変異であり得る。例えば、変異は、トレオニン（Ｔ）から別のアミノ酸残基、例えばリシン（Ｋ）への置換であり得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、変異Ｔ４７８Ｋ、例えばＢ．１．６１７．２（デルタ）株又はそれに由来する系統のメンバーを含み得る。
抗体ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４７８に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株を中和するのに特に有効である。そのため、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４７８に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられるこれらの抗体に関し得る。同様に、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４７８に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
変異は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）（ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７、４８４及び／又は５０１の変異であり得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、変異Ｋ４１７Ｎ／Ｔ、Ｅ４８４Ｋ及びＮ５０１Ｙ、例えばＢ．１．３５１（ベータ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー又はＰ．１（ガンマ）株若しくはそれに由来する系統のメンバーを含み得る。
抗体ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３、ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６、ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５、ベータ－５１及び／又はベータ－４４は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７、４８４及び５０１に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株を中和するのに特に有効である。そのため、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７、４８４及び５０１に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられるこれらの抗体に関し得る。同様に、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７、４８４及び５０１に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
変異は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）（ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置６１４の変異であり得る。例えば、変異は、アスパラギン酸（Ｄ）から別のアミノ酸残基、例えばグリシン（Ｇ）への置換であり得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、変異Ｄ６１４Ｇ、例えば、ベータ（Ｂ．１．３５１）株若しくはそれに由来する系統のメンバー、Ｂ．１．６１７．１（カッパ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー、Ｃ．３７（ラムダ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー、Ｂ．１．６１６株若しくはそれに由来する系統のメンバー、Ｂ．１．２５８株若しくはそれに由来する系統のメンバー、Ｃ．３６．３株若しくはそれに由来する系統のメンバー又はＢ．１．５２６．２株若しくはそれに由来する系統のメンバーを含み得る。
抗体ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及び／又はベータ－５３は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置６１４に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株を中和するのに特に有効である。そのため、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置６１４に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられるこれらの抗体に関し得る。同様に、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置６１４に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
変異は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）（ＧＩＳＡＩＤ受託ｎｏ．ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４０２１２４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置３３９、３７１、３７３、３７５、４１７、４４０、４４６、４７７、４７８、４８４、４９３、４９６、４９８、５０１及び／又は５０５の変異であり得る。例えば、変異は、トレオニン（Ｔ）から別のアミノ酸残基、例えばリシン（Ｋ）への置換であり得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株は、置換Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ、例えばＢ．１．１．５２９（オミクロン）株又はそれらに由来する系統のメンバーを含み得る。
抗体ベータ－２２、ベータ－２７、ベータ－２９、ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５３、ベータ－５４、ベータ－５５及びベータ－５６は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置３３９、３７１、３７３、３７５、４１７、４４０、４４６、４７７、４７８、４８４、４９３、４９６、４９８、５０１、５０５に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株を中和するのに特に有効である。そのため、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置３３９、３７１、３７３、３７５、４１７、４４０、４４６、４７７、４７８、４８４、４９３、４９６、４９８、５０１、５０５に変異を含むＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられるこれらの抗体に関し得る。同様に、本発明は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９（ＷＩＶ０４）のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置３３９、３７１、３７３、３７５、４１７、４４０、４４６、４７７、４７８、４８４、４９３、４９６、４９８、５０１、５０５のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２株変異によって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
本発明は、Ｂ．１．１．７（アルファ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられる抗体ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６及び／又はベータ－４４にも関し得る。同様に、本発明は、Ｂ．１．１．７（アルファ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
本発明は、Ｂ．１．３５１（ベータ）株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられる抗体ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６及びベータ－４４にも関し得る。同様に、本発明は、Ｂ．１．３５１（ベータ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
本発明は、Ｐ．１（ガンマ）株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられる抗体ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３、ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５、ベータ－５１、ベータ－２０、ベータ－２２、ベータ－２９及びベータ－４４にも関し得る。同様に、本発明は、Ｐ．１（ガンマ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
本発明は、Ｂ．１．６１７．２（デルタ）株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられる抗体ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３にも関し得る。同様に、本発明は、Ｂ．１．６１７．２（デルタ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
本発明は、Ｂ．１．６１７．２（デルタ）株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するために用いられる抗体ベータ－２２、ベータ－２７、ベータ－２９、ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５３、ベータ－５４、ベータ－５５及びベータ－５６にも関し得る。同様に、本発明は、Ｂ．１．１．５２９（オミクロン）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株又はそれに由来する系統のメンバーによって引き起こされるコロナウイルス感染症を処置、予防又は診断するのにこれらの抗体を用いる方法及び処置、予防又は診断する際のこれらの抗体の使用に関する。
本発明の方法及び使用は、疾患状態（例えばＣＯＶＩＤ－１９）を阻害すること、例えばその進行を抑えること；及び／又は疾患状態（例えばＣＯＶＩＤ－１９）を軽減すること、例えば、所望のエンドポイントに達するまで、疾患状態の緩解を引き起こすことを含み得る。
本発明の方法及び使用は、疾患状態（例えばＣＯＶＩＤ－１９）の徴候の重症度、期間又は頻度の改善又は引下げ（例えば、痛み又は不快感を小さくすること）を含み得、そのような改善は、疾患に直接影響を与えることとなっても又はならなくてもよい。徴候又は合併症は、発熱、頭痛、疲労感、食欲不振、筋肉痛、下痢、嘔吐、腹痛、脱水、呼吸管感染症、サイトカインストーム、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）敗血症及び／又は臓器不全（例えば、心臓、腎臓、肝臓、ＧＩ、肺）であり得る。
本発明の方法及び使用は、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のウイルス量の、例えば、前処置と比較して≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％又は１００％の低下に至り得る。ウイルス量を求める方法は、当技術分野で周知であり、例えば感染アッセイである。
本発明の方法及び使用は、特に対象（例えば、ヒト）が、コロナウイルス感染と関連する合併症に罹りやすい素因を有する場合、そのような対象においてコロナウイルス感染症が発生することを予防することを含み得る。
本発明は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるコロナウイルス感染症を有する対象を特定することにも関する。例えば、本発明の方法及び使用は、試料におけるコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）又はそのタンパク質若しくは断片の存在を特定することを含み得る。検出は、インビトロ又はインビボで実行され得る。特定の実施形態において、本発明は、集団スクリーニングに関する。
本発明は、本明細書中に記載されるようなあらゆるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を同定することに関する。
本明細書中の抗体の多くは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と交差反応し得ることも特定された。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明に従う抗体、抗体の組合せ又は医薬組成物を用いて、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症の診断に用いられる、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の存在を特定することに関する。
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエスケープミュータントを特定する方法であって、試料を本発明の抗体の組合せと接触させることと、各抗体がウイルスに結合するかを特定することとを含む方法にも関し得る。用語「エスケープミュータント」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の既存の処置の有効性に影響を与え得る非サイレント変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを指す。典型的には、非サイレント変異は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエピトープに特異的に結合する先行技術の抗体及び／又は本明細書中に記載される抗体によって認識されるエピトープ上に、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質上にある。抗体が標的に結合しなければ、これは、標的が、既存のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２処置の有効性を変更し得る変異を含むことを示し得る。
本発明の方法及び使用は、試料を本発明の抗体又は抗体の組合せと接触させることと、抗体－抗原複合体の存在又は不在を検出することとを含み得、抗体－抗原複合体の存在は、対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していることを示す。
例えば、抗体ベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５及び／又はベータ－５６が用いられる場合、抗体－抗原複合体の存在は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン内のチロシン５０１の存在を示す。
別の例として、抗体ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５及び／又はベータ－５１が用いられる場合、抗体－抗原複合体の存在は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン内のリシン４８４の存在を示す。
別の例として、抗体ベータ－２０、ベータ－３３、ベータ－２２及び／又はベータ－２９が用いられる場合、抗体－抗原複合体の存在は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン内の位置４１７でのアスパラギン又はトレオニンの存在を示す。
別の例として、抗体ベータ－２９が用いられる場合、抗体－抗原複合体の存在は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン内の位置４５２及び４７８でのそれぞれロイシン及びトレオニンの存在を示す。
抗体－抗原複合体の存在を判定する方法が当技術分野で知られている。例えば、インビトロ検出技術として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光が挙げられる。インビボ技術は、対象中に標識付き抗分析物タンパク質抗体を導入することを含む。例えば、抗体は、対象内の存在及び位置を標準的な撮像技術によって検出することができる放射性マーカーにより標識することができる。検出技術は、使用されるアッセイに応じて、定性的リードアウト又は定量的リードアウトを提供し得る。
典型的には、本発明は、ヒト対象のための方法及び使用に関し、ヒト対象はそれを必要とする。しかしながら、非ヒト動物、例えばラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ又はイヌも意図される。
対象、例えば医療従事者又は感染個体と接触した人は、コロナウイルス感染症に曝されている危険な状態にあり得る。対象は、コロナウイルスアウトブレイクがあったことが知られているか又は疑われる国を訪問したか又は訪問する予定になっている場合がある。対象、例えば免疫不全個体、例えば免疫抑制療法を受けている個体又はヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）若しくは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を患っている個体もより危険な状態にあり得る。
対象は、無症状であり得るか又は発症前であり得る。
対象は、疾患の初期、中期又は後期のフェーズにあり得る。
対象は、入院しているか若しくは最初の発現時のコミュニティにいる場合があり、且つ／又はその後に入院している場合がある。
対象は、男性又は女性であり得る。特定の実施形態において、対象は、典型的に男性である。
対象は、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していなくてもよい。
対象は、コロナウイルス感染と関連するより重度の徴候又は合併症になりやすい素因を有し得る。本発明の方法又は使用は、患者が、コロナウイルスと関連するより重度の徴候又は合併症を発達させる危険な状態にあるか否かを特定する工程を含み得る。
予防又は処置に関する本発明の実施形態において、対象は、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していると診断されていても又はされていなくてもよい。
本発明は、対象由来の試料を分析することに関する。試料は、対象並びに対象内に存在する組織、細胞及び流体から単離された組織、細胞及び生体液であり得る。試料は、血液及び血清、血漿又はリンパを含む血液の画分又は構成要素であり得る。典型的には、試料は、喉スワブ、鼻スワブ又は唾液に由来する。
抗体－抗原複合体検出アッセイは、インサイチュで実行され得、その場合、試料は、対象由来の生検又は切除物から得られる組織の（固定された及び／又は凍結した）組織切片である。
抗体医薬組成物及び組合せが投与される本発明の実施形態において、これらは、皮下、静脈内、皮内、経口的、鼻腔内、筋肉内に又は頭蓋内に投与され得る。典型的には、抗体医薬組成物及び組合せは、静脈内又は皮下に投与される。
抗体の用量は、対象の年齢及びサイズ並びに疾患、投与の条件及び経路に応じて変動し得る。抗体は、約０．１ｍｇ／体重ｋｇの用量～約１００ｍｇ／体重ｋｇの用量、例えば約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。抗体は、約５０ｍｇ／体重ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は約５ｍｇ／ｋｇの用量でも投与され得る。
本発明の組合せは、例えば、抗体毎に約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量又は抗体毎に約１０ｍｇ／ｋｇ若しくは約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。代わりに、組合せは、合計約５ｍｇ／ｋｇの用量（例えば、３つの抗体組合せで各抗体の１．６７ｍｇ／ｋｇの用量）で投与され得る。
本発明の抗体又は抗体の組合せは、複数回投与計画で投与され得る。例えば、初回用量は、第２の又は複数の以降の用量の投与が後に続き得る。第２以降の用量は、適切な時間で分割され得る。
前述したように、本発明の抗体は、典型的には、単一の医薬組成物／組合せに用いられている（共製剤化されている）。しかしながら、本発明は、一般に、別々の製剤／組成物での本発明の抗体の併用も含む。本発明は、先に記載されるように、追加の治療剤との抗体の併用も含む。
２つ以上の剤及び／又は抗体の併用投与が、いくつかの異なる方法で達成され得る。一実施形態において、全ての構成要素は、単一の組成物により一緒に投与され得る。別の実施形態において、各構成要素は、併用療法の一部とは別に投与され得る。
例えば、本発明の抗体は、本発明の別の抗体又はその結合断片の前、後又はそれと並行して投与され得る。特に有用な組合せは、例えば、先に記載されている。
例えば、本発明の抗体は、抗ウイルス剤又は抗炎症剤の前、後又はそれと並行して投与され得る。
本発明が、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのタンパク質若しくは断片の、試料における存在を検出することに関する実施形態において、抗体は、検出可能な標識を含有する。例えば、検出可能な物質を抗体にカップリングする（すなわち物理的に連結する）ことによる抗体の直接的標識により、標識を抗体に付着させる方法が当技術分野で知られている。代わりに、抗体は、例えば、直接標識されている別の試薬との反応性によって間接的に標識され得る。間接的標識の例として、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出及び蛍光標識されたストレプトアビジンにより検出することができるようなビオチン付きＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。
検出は、（ｉ）コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はそのタンパク質若しくは断片の存在を検出するのに有用であることが知られている剤、例えばスパイクタンパク質の他のエピトープに対する抗体又はコロナウイルの他のスタンパク質、例えば抗ヌクレオカプシド抗体；及び／或いは（ｉｉ）コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はその断片の存在を検出することができない、すなわちネガティブ対照を提供することが知られている剤をさらに含み得る。
特定の実施形態において、抗体は、安定性が増大するように修飾されている。適切な修飾が、先に説明されている。
本発明は、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の、試料における存在を検出するためのキットも包含する。例えば、キットは、本発明の標識付き抗体又は標識付き抗体の組合せ；試料中のコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の量を判定するための手段；及び試料中のコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の量を標準と比較するための手段を含み得る。標識付き抗体又は標識付き抗体の組合せは、適切なコンテナ内にパッケージングすることができる。キットは、試料中でコロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットの使用説明書をさらに含み得る。キットは、先に示されるように、コロナウイルスの存在を検出するのに有用であることが知られている他の剤をさらに含み得る。
例えば、本発明の抗体又は抗体の組合せは、ラテラルフロー試験に用いられる。典型的には、ラテラルフロー試験キットは、一連のキャピラリベッド、例えば多孔性紙のピース、微細構造ポリマー又は焼結ポリマーをベースにした吸収パッドを備えるハンドヘルドデバイスである。試験は、反応性分子を有するパッドの表面に沿って液体試料を走らせて、目に見えるポジティブ又はネガティブ結果を示す。試験は、抗ヌクレオカプシド抗体等の、先に示されるような、コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はその断片の存在を検出するのに有用であることが知られている他の剤を用いることをさらに含み得る。
その他
本発明の開示される抗体組合せ又は医薬組成物の様々な使用は、当技術分野における具体的な必要性に合わせて調整され得ることが理解されるべきである。本明細書中で用いられる専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明するためのみのものであり、限定であることを意図されないことも理解されたい。
本発明の開示される抗体組合せ又は医薬組成物の様々な使用は、当技術分野における具体的な必要性に合わせて調整され得ることが理解されるべきである。本明細書中で用いられる専門用語は、本発明の特定の実施形態を説明するためのみのものであり、限定であることを意図されないことも理解されたい。
加えて、本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、内容がそうではないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。そのため、例えば、「抗体」への言及は、２つ以上の「抗体」を含む。
さらに、本明細書中で「≧ｘ」に言及する場合、これはｘ以上であることを意味する。本明細書中で「≦ｘ」に言及する場合、これはｘ以下であることを意味する。
表２～９の参照は、表２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８及び９が参照されることを意味する。同様に、表１～９の参照は、表１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、６、７、８及び９が参照されることを意味する。
本発明の目的で、２つの配列（例えば２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチド配列）の同一性パーセントを求めるために、配列は、最適な比較目的でアラインされる（例えば、ギャップを、第１の配列内に、第２の配列との最適なアラインメントのために導入することができる）。続いて、各位置のヌクレオチド又はアミノ酸残基が比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチド又はアミノ酸によって占められている場合、ヌクレオチド又はアミノ酸は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち同一性％＝同一の位置の数／参照配列内の位置の総数×１００）。
典型的には、配列比較は、参照配列の全長にわたって実行される。例えば、所与の（「試験」）配列が、配列番号３に対して９５％同一であるかをユーザーが判定したければ、配列番号３を参照配列とすることとなる。配列が配列番号３（参照配列の例）と少なくとも９５％同一であるかを評価するために、当業者であれば、配列番号３の全長にわたってアラインメントを実行して、試験配列内のどの程度の数の位置が配列番号３の位置と同一であるかを特定することとなる。位置の少なくとも９５％が同一であれば、試験配列は、配列番号３と少なくとも９５％同一である。配列が配列番号３よりも短ければ、ギャップ又はミッシング位置は、非同一位置であると考えられるべきである。
当業者であれば、２つの配列間の相同性又は同一性を求めるのに利用可能な様々なコンピュータープログラムを知っている。例えば、２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。一実施形態において、２つのアミノ酸又は核酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか並びに１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップウェイト及び１、２、３、４、５又は６のレングスウェイトを用いる、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）内のＧＡＰプログラム中に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）アルゴリズムを用いて求められる。
重鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＣＤＲＨ）及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（ＣＤＲＬ）は、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って、各鎖の残基２７～３８（ＣＤＲ１）、残基５６～６５（ＣＤＲ２）及び残基１０５～１１７（ＣＤＲ３）に位置する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰ，１９９７，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８，５０９）。そうでないと示される場合を除き、このナンバリングシステムが本明細書中で用いられている。
上記又は下記を問わず、本明細書中で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
以下の例は、本発明を例示する。
実施例１ ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染した症例からのｍＡｂの生成
血漿及びＰＢＭＣを、ウイルス配列決定によって証明したベータによる感染症を以前に患ったか又はベータを患っていると推測した１８人のボランティアから収集した（なぜなら、そのボランティアは、立証したベータ感染症例との接触後に単離した後に感染したからである）。試料を、ベータ感染の４～８週後にとって、全長ベータＳタンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイ及びフォーカス減少中和アッセイ（ＦＲＮＴ）を実行して、力価が最も高い５つの症例をさらなる研究に選択した（図１Ａ）。これらの選択した症例について、予想されるように、ＦＲＮＴ５０力価は、ベータについて、ビクトリア（初期の武漢関連ウイルス単離物）よりも高かった（図１Ｂ）。
血漿及びＰＢＭＣを、ウイルス配列決定によって証明したベータによる感染症を以前に患ったか又はベータを患っていると推測した１８人のボランティアから収集した（なぜなら、そのボランティアは、立証したベータ感染症例との接触後に単離した後に感染したからである）。試料を、ベータ感染の４～８週後にとって、全長ベータＳタンパク質に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイ及びフォーカス減少中和アッセイ（ＦＲＮＴ）を実行して、力価が最も高い５つの症例をさらなる研究に選択した（図１Ａ）。これらの選択した症例について、予想されるように、ＦＲＮＴ５０力価は、ベータについて、ビクトリア（初期の武漢関連ウイルス単離物）よりも高かった（図１Ｂ）。
メモリＢ細胞を単離するために、ＰＢＭＣを全長ダブルＳｔｒｅｐタグ付きベータＳ－三量体（ベータ－Ｓ）で染色して、ＩｇＧ＋Ｂ細胞結合ベータ－Ｓをシングルセルソートした（図１Ｃ、Ｄ）。ＩｇＶＨ配列及びＩｇＶＬ配列をＲＴ－ＰＣＲによって単離して、全長重鎖発現プラスミド及び軽鎖発現プラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応を用いて作製した。Ｇｉｂｓｏｎアセンブリの生成物を、９６ウェルプレート内のＨＥＫ－２９３Ｔ細胞中に形質移入して、上清を収集して、ベータウイルスに対する中和アッセイにおいて０．１～１μｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。この最初のアッセイにおいて＞９０％の中和を達成するｍＡｂのみをさらなる研究に選択した。合計で、６７４個のベータ特異的ｍＡｂ ＩｇＧを得た。これらのうち、ＲＢＤ特異的ｍＡｂの２２％がＲＢＤに結合し、７８％が非ＲＢＤエピトープに結合し、１８％が＞９０％の中和を達成し、さらなる研究に選択した（図１Ｅ、Ｆ）。これらの抗体の、ＳへのＡＣＥ２結合をブロックする能力が見られた。ほとんどのｍＡｂは、例外はあったが、予想されるｍＡｂベータ－４３として、ＡＣＥ２相互作用をブロックすることができ、単一の非ＲＢＤ結合中和抗体（ＮＴＤに結合する、図８Ａ）は、ＡＣＥ２ブロックを示さなかった一方、極めて強力なＲＢＤ結合ｍＡｂベータ－５３もＡＣＥ２ブロッキング活性を示さなかった（図１Ｇ）。
６７４個のベータ特異的ｍＡｂから、ＦＲＮＴ５０力価が＜１００ｎｇ／ｍｌの最も強力な２７個及び重鎖Ｖ遺伝子をベータ－４７と共有する抗体ベータ－２５をさらなる研究に選択した。最も強力な抗体のうち、ベータ－４３のみがＮＴＤに結合した一方、残りの２６個はＲＢＤに結合し、これらの２５個がＡＣＥ２との相互作用をブロックした。ベータ－５３を、明らかな例外として以下で考察する（図１Ｇ）。
強力であるが、非常に弱々しいＲＢＤ結合抗体ベータ－４９及びベータ－５０は、ＡＣＥ２ブロッキング活性も示さなかった（図１２）。
実施例２．ベータ反応性ｍＡｂの交差反応性。
生きているウイルスの中和アッセイを、ＲＢＤ内の示す変化を含有する以下のウイルスを用いて実行した：ビクトリア、初期の武漢関連株、アルファ（Ｎ５０１Ｙ）、ベータ（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、ガンマ（Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、デルタ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）、アルファ＋Ｅ４８４Ｋ（Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、Ｂ．１．５２５（Ｅ４８４Ｋ）（図２Ａ～Ｆ及び表１０）。
生きているウイルスの中和アッセイを、ＲＢＤ内の示す変化を含有する以下のウイルスを用いて実行した：ビクトリア、初期の武漢関連株、アルファ（Ｎ５０１Ｙ）、ベータ（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、ガンマ（Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、デルタ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）、アルファ＋Ｅ４８４Ｋ（Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、Ｂ．１．５２５（Ｅ４８４Ｋ）（図２Ａ～Ｆ及び表１０）。
多くのｍＡｂは、５０％フォーカス減少中和力価（ＦＲＮＴ５０）が最低１ｎｇ／ｍｌの、ベータの極めて強力な中和を示した（表１０）。様々なウイルスバリアント間の交差反応性を混合し、ベータ－２７、３２、４７、４８、４９、５０及び５３等の一部のｍＡｂは、ＦＲＮＴ５０間の差が＜１０倍の完全交差反応性を示した（図２Ａ）。大きい群のｍＡｂ（ベータ－６、１０、２３、２４、３０、４０、５４、５５、５６）は、アルファ、ベータ、ガンマ及びアルファ＋ウイルスの良好な中和を示し、ビクトリア、Ｂ．１．５２５（Ｅ４８４Ｋ）及びデルタウイルスの中和は、引き下げられていたか又は完全に不在であった（図２Ｂ）。アルファ、ベータ及びガンマは、共通する単一変異、Ｎ５０１Ｙを有し、Ｎ５０１Ｙ変異の存在は、新しい免疫優性エピトープを創出するという説が出されている。
Ｅ４８４Ｋ変異は、初期のパンデミックウイルスに感染している症例から生成された多くの強力なｍＡｂの結合を崩壊させ、Ｌｙｓ－４８４は、ベータ中和ｍＡｂにおいて重要な役割を果たすと予想される。６つのｍＡｂは、Ｌｙｓ－４８４相互作用の証拠を示し（ベータ－２６、３３、３４、３８、４５、５１）、アルファに対する活性が引き下げられているが、アルファ＋４８４Ｋに及ぶ活性が回復している（図２Ｃ）。３つのｍＡｂ、ベータ－２０、２２及び２９は、ベータ及びガンマに向けた最大の活性を示し、このことはこれらが、ベータ及びガンマにおけるそれぞれＫ４１７Ｎ／Ｔ変化に関連するエピトープを認識することを示唆している。抗体ベータ－２２及び２９は、アルファ及びアルファ＋４８４Ｋのいくらかの中和を示し、このことはこれらが、Ａｓｎ／Ｔｈｒ ４１７＋Ｔｙｒ－５０１で構成されるエピトープを認識することを示唆している（図２Ｄ）。４つのｍＡｂ（ベータ－２６、３４、４４、５１）は、デルタに対する中和の選択的消失を示した（ＦＲＮＴ５０＞１０μｇ／ｍｌ）。ベータ－４４は、Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ変異に感受性である一方、ベータ－２６、３４及び５１は、Ｇｌｕ－４８４＋Ｌｅｕ－４５２／Ｔｈｒ－４７８で構成されるエピトープを認識するという説が出されている（図２Ｃ、Ｅ）。最後に、単一の強力なＮＴＤ結合ｍＡｂベータ－４３は、ベータに対して完全に特異的であった（図２Ｆ、８Ａ）。
ベータ感染後、初期のパンデミック株による感染症と比較して、抗体応答のプロファイルにかなりのシフトが存在する。ベータに対する応答は、ベータに見出される３つのＲＢＤアミノ酸変化；Ｋ４１７Ｎ（３／２７個のｍＡｂ）、Ｅ４８４Ｋ（６／２７個のｍＡｂ）及びとりわけＮ５０１Ｙ（１１／２７個のｍＡｂ）を選択した多くの強力な抗体によりゆがめられる。この特異性は、ベータと、他のＶｏＣと、初期のパンデミック株／ワクチン間の抗原差異を支持している。２７個のｍＡｂのうち、力価は、ベータと比較して、ビクトリア（１８、１５、１０）；アルファ（１０、６、５）；ガンマ（２、１、１）；デルタ（１８、１６、１４）についてそれぞれ１ｌｏｇ、２ｌｏｇ引き下げられたか又はノックアウト（ＫＯ）された。ベータ特異的ｍＡｂの中和能のこれらの重大な引下げは、ベータと初期のパンデミック株間の抗原距離を強調しており（１０／２７個のｍＡｂ ＫＯ）、これは、デルタでさらに極端である（１４／２７個のｍＡｂ ＫＯ）。デルタはベータと、ＲＢＤ内の５つのアミノ酸（Ｋ４１７、Ｌ４５２、Ｔ４７８、Ｅ４８４、Ｎ５０１）が異なる一方、ベータ及びガンマは抗原的に近く（１／２７個のｍＡｂ ＫＯ）、最後にアルファ（単一のＮ５０１Ｙ変異を含有する）は中程度の位置を占める（５／２７個のｍＡｂ ＫＯ）。これらのデータは、デルタについての中和能力をかなり引き下げて多くがデルタを完全に中和できない、ベータ及びガンマ血清を用いる中和データと一致している（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。
実施例３．抗体遺伝子使用。
２７個の強力なベータ反応性ｍＡｂについてのＩｇＶＨ及びＩｇＶＬ遺伝子使用を図３Ａ及び表１１に示す。７つの完全交差反応性ｍＡｂは、１－６９＊０１重鎖ｖ領域を介して互いに関連するベータ－４９及び５０を別として、多様なＩｇＶＨファミリーに由来した。ベータ－２７は、ＩｇＶＨ３－５３遺伝子ファミリーに由来し、これは、ＲＢＤに対するパブリック応答を生成し、初期のパンデミック株に感染した個体から単離したレパートリーにおいて高度に表される（本発明者らの以前の研究において、５／２０個の強力なｍＡｂ ＦＲＮＴ５０＜１００ｎｇ／ｍｌ（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４（８）（２０２１）：２１８３－２２００；Ｓｕｐａｓａ，Ｐｉｙａｄａ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７ ｖａｒｉａｎｔ ｂｙ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４（８）（２０２１）：２２０１－２２１１；Ｚｈｏｕ，Ｄａｍｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｒｉａｎｔ Ｂ．１．３５１ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４（９）（２０２１）：２３４８－２３６１；Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４（１１）（２０２１）：２９３９－２９５４；Ｌｉｕ，Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．６１７ ｂｙ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｓｅｒｕｍ．”Ｃｅｌｌ １８４（１６）（２０２１）：４２２０－４２３６））が、このシリーズにおいて一回表されるのみであった。同様に、ベータ－４７は、初期のパンデミック感染症から単離したいくつかのｍＡｂに見出されたパブリック遺伝子ファミリー、ＩｇＶＨ１－５８に属する（本発明者らの以前の研究において、４／２０個）。
２７個の強力なベータ反応性ｍＡｂについてのＩｇＶＨ及びＩｇＶＬ遺伝子使用を図３Ａ及び表１１に示す。７つの完全交差反応性ｍＡｂは、１－６９＊０１重鎖ｖ領域を介して互いに関連するベータ－４９及び５０を別として、多様なＩｇＶＨファミリーに由来した。ベータ－２７は、ＩｇＶＨ３－５３遺伝子ファミリーに由来し、これは、ＲＢＤに対するパブリック応答を生成し、初期のパンデミック株に感染した個体から単離したレパートリーにおいて高度に表される（本発明者らの以前の研究において、５／２０個の強力なｍＡｂ ＦＲＮＴ５０＜１００ｎｇ／ｍｌ（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４（８）（２０２１）：２１８３－２２００；Ｓｕｐａｓａ，Ｐｉｙａｄａ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７ ｖａｒｉａｎｔ ｂｙ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４（８）（２０２１）：２２０１－２２１１；Ｚｈｏｕ，Ｄａｍｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｒｉａｎｔ Ｂ．１．３５１ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４（９）（２０２１）：２３４８－２３６１；Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４（１１）（２０２１）：２９３９－２９５４；Ｌｉｕ，Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．６１７ ｂｙ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｓｅｒｕｍ．”Ｃｅｌｌ １８４（１６）（２０２１）：４２２０－４２３６））が、このシリーズにおいて一回表されるのみであった。同様に、ベータ－４７は、初期のパンデミック感染症から単離したいくつかのｍＡｂに見出されたパブリック遺伝子ファミリー、ＩｇＶＨ１－５８に属する（本発明者らの以前の研究において、４／２０個）。
Ｔｙｒ－５０１反応性抗体を最も広げ、１１／２７個の例とした。これらのうちの９つにおいて、Ｔｙｒ－５０１は、優性であり（図２Ｂ）、さらなる２つ（ベータ－２２、２９）において、Ｔｙｒ－５０１は、Ａｓｎ－４１７に加えて役割を果たした（図２Ｄ）。Ｔｙｒ－５０１反応性ｍＡｂの６／１１個が、ＩｇＶＨ ４－３９（ベータ－６、１０、２３、４０、５４、５５）を用いて、ＩｇＶＨ ４－３９を、スパイクタンパク質内にＴｙｒ－５０１を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して応答する免疫優性中和パブリック抗体にした。これは、初期のパンデミック株と比較して、ベータ感染後に応答をゆがめることを部分的に説明する。６つのＬｙｓ－４８４反応性ｍＡｂは、多様なＩｇＶＨバックグラウンドに由来したが、Ａｓｎ／Ｔｈｒ－４１７＋Ｔｙｒ－５０１反応性ｍＡｂの２／３個は、ＶＨ３－３０であった。
２７個のベータ反応性ｍＡｂは、ＩｇＶＨ及びＩｇＶＬにおいてメジアンで７つの変化を有する比較的低いレベルの体細胞変異を示した（図３Ｂ）。これは、初期のパンデミック株による感染後にｍＡｂを分析した場合に見られる低レベルの超変異（メジアンでＩｇＶＨ＝５、ＩｇＶＬ＝３）と一致している（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８；２０２１：２１８３－２２００）。
要約すれば、ベータ感染症例に由来する強力なｍＡｂは、初期の回復期の症例から単離されたｍＡｂと比較して、バリアントウイルス間で、それらの交差反応性がかなり異なる。Ｔｙｒ－５０１及びＧｌｕ－４８４エピトープは、前記エピトープを欠いているビクトリア及びデルタに対する一部の抗体による中和の引下げに至る応答を支配しており、これらのウイルスとベータ間の抗原距離を明白に示している（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。デルタの中和は、デルタにおけるＲＢＤ変異に対して感受性であるｍＡｂのサブセットによってさらに損なわれ、これは、ベータ及びデルタ（及びガンマ／デルタ）が抗原性マップ上の最も遠い位置を占める理由を説明している（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。
一部のｍＡｂは、ＶｏＣのサブセットに対して特異性を示すベータ症例に由来した。７／２７個のｍＡｂは、試験した全てのＶｏＣの強力な中和（＜１００ｎｇ／ｍｌ）を示した（ベータ－２７、－４７、－４８、－４９、－５０、－５３及び－５６）。さらに、ベータ－５５は、ｍＡｂが、現在蔓延している流通株ではないビクトリア株（１０８ｎｇ／ｍｌ）を除いて、試験した全てのＶｏＣの強力な中和（＜１００ｎｇ／ｍｌ）を示すことを示した。これらのｍＡｂの２つが、何度となく単離されてきたパブリック応答に属している（ｍＡｂ ２７ ＩｇＶＨ３－５３及びｍＡｂ ４５ ＩｇＶＨ１－５８）。ＩｇＨＶ３－５３遺伝子ファミリーの継続的な、しかしかなり減少した使用法は、通常、Ｔｙｒ－５０１を有するＲＢＤとの相互作用をブロックし（図７Ａ）、且つこの変異に対するレジリエンス機構として以前に実証された（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４．１１（２０２１）：２９３９－２９５４）ＣＤＲ１内の稀な変異の使用を結び付けることとなる軽鎖ＣＤＲ１におけるシフトに起因する。
アルファに感染した症例から収集した血清を用いて、懸念のバリアントのパネルの中和を見た以前の研究（Ｓｕｐａｓａ ｅｔ ａｌ．，２０２１）は、アルファ感染後、形成された応答がバリアントウイルス間でかなり交差反応性であることを見出した。アルファ血清が、ビクトリアをアルファと同程度に有効に中和することが見出された。これは、アルファ感染におけるＴｙｒ５０１に対する応答がベータ感染で見られるものと類似している場合、予想されなかったであろう。しかしながら、アルファは、変異Ｄ６１４Ｇも含有し、これは、ビクトリア／武漢に見出されておらず、したがって、本発明者らは、追加のＤ６１４Ｇ変異を含有する初期のパンデミックウイルス（Ｂ．１）に遡って、そのバージョンの中和を、１７個のアルファ血清を用いて試験した。アルファ血清によるＢ．１の中和力価は、アルファ血清を用いたアルファの中和力価と比較して１．８倍引き下げられ（Ｐ＝０．０２０８）（図１３）、これは、アルファ血清における一部のＴｙｒ５０１応答と一致している。
実施例４．強力なｍＡｂは、マウスにおいてベータ感染から保護する。
ベータに対して誘発されたｍＡｂの活性をインビボ試験するために、ヒトＡＣＥ２遺伝子導入マウスモデルを利用した（ＭｃＣｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。異なるエピトープクラス由来の４つの代表的なｍＡｂ；Ｋ４１７Ｎ／Ｔ変異を認識して、ベータを、且つそれほどではないにせよガンマを強力に中和することができるベータ－２０；アルファ、ベータ及びガンマにおいて存在するＮ５０１Ｙ変異に対して特異的なベータ－２４；ベータ及びガンマに見出されるＥ４８４Ｋ変異を認識するベータ－２６；ＩｇＶＨ３－５３完全交差反応性ｍＡｂであるベータ－２７（全てのバリアントを同様に中和する）を選択した。
ベータに対して誘発されたｍＡｂの活性をインビボ試験するために、ヒトＡＣＥ２遺伝子導入マウスモデルを利用した（ＭｃＣｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。異なるエピトープクラス由来の４つの代表的なｍＡｂ；Ｋ４１７Ｎ／Ｔ変異を認識して、ベータを、且つそれほどではないにせよガンマを強力に中和することができるベータ－２０；アルファ、ベータ及びガンマにおいて存在するＮ５０１Ｙ変異に対して特異的なベータ－２４；ベータ及びガンマに見出されるＥ４８４Ｋ変異を認識するベータ－２６；ＩｇＶＨ３－５３完全交差反応性ｍＡｂであるベータ－２７（全てのバリアントを同様に中和する）を選択した。
マウスに、１０３ＦＦＵのベータを接種して、接種後２４時間目に、ｍＡｂの単回１０ｍｇ／ｋｇ用量を、ｉ．ｐ．注射を介して投与した。アイソタイプ対照ｍＡｂ（ｈＥ１６）以外の４つ全てのベータ誘発ｍＡｂが、接種後６日にわたって体重減少を妨げて、鼻洗浄液ではなく肺及び脳においてウイルス量を引き下げた（図３Ｃ～Ｆ）。これらの結果は、試験したｍＡｂの各々が感染症の重症度を効率的に引き下げて、全身性疾患を予防することができるが、上気道においてウイルス感染を予防しないことを実証している。
実施例５．バイオレイヤーインターフェロメトリを用いたｍＡｂ結合のマッピング。
バイオレイヤーインターフェロメトリ（ＢＬＩ）競合マトリックスが、以前に、ＲＢＤに結合する初期のパンデミックｍＡｂの高解像度３Ｄマップを構築するのに用いられた（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８（２０２１）：２１８３－２２００）。結果は、以降のＸ線構造決定と一致し、最も強力な中和ｍＡｂがＡＣＥ２フットプリント上又はその間近に結合することを示した（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８；２０２１：２１８３－２２００）。
バイオレイヤーインターフェロメトリ（ＢＬＩ）競合マトリックスが、以前に、ＲＢＤに結合する初期のパンデミックｍＡｂの高解像度３Ｄマップを構築するのに用いられた（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８（２０２１）：２１８３－２２００）。結果は、以降のＸ線構造決定と一致し、最も強力な中和ｍＡｂがＡＣＥ２フットプリント上又はその間近に結合することを示した（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８；２０２１：２１８３－２２００）。
ペアワイズＢＬＩ測定値のマトリックスを、２６個の最も強力なＲＢＤ結合ベータｍＡｂ及び知られている結合位置の一部のパンデミック前ｍＡｂについて得た。ＢＬＩデータを正確な構造情報（主にＸ線結晶解析由来）と組み合わせて、信頼性が高いマッピング情報を提供した（８つのｍＡｂベータ－６、２２、２４、２７、４４、５３及び５４についての予測は、平均で５Å誤っていた）。抗体は、明らかに別個のエピトープに嵌らず、むしろクラスター分析（実施例１６を参照されたい）は、マッピングしたほぼ全ての抗体がアークに嵌ることを示している（図９）。ＲＢＤの表面にマッピングした場合、このアークは、首領域及び肩領域にまたがることが分かる（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８（２０２１）：２１８３－２２００）（図４）。
先になされた重要な残基割当てとの詳細な相関を図４に示しており、優れた相関がある。例えば、Ｌ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｋ変異に対して感受性のベータ－４４は、残基４７８に隣接して位置する一方、残基４１７に関連するエピトープを認識することが示唆されている３つのｍＡｂ、ベータ－２０、２２及び２９は、この残基の上に密集する。ｍＡｂベータ－４９及び５０は、ベータＲＢＤに対して非常に低い親和性を示したが、全長Ｓに強固に結合した（図１２）ため、それらの位置は、ＢＬＩ競合によってマッピングすることができなかった。結合モードを、実施例において後述する。
実施例６．抗ベータＦａｂ／ＲＢＤ複合体の構造
強力な抗ベータ抗体についての構造－機能関係を理解するために、代表的な選択対象の構造分析を、その血清学的特性に基づいて実行した。合計で、高解像度結晶構造を１１個のＲＢＤ／Ｆａｂ複合体、ベータ－６、２２、２４、２７、２９、３８、４０、４４、４７、５３及び５４について（図５Ａ）並びにまたＦａｂベータ－３２（図５Ｂ）について１．７～４．０Åの解像度で決定した（実施例１６を参照されたい）。加えて、略低い解像度クライオＥＭ構造情報を、より以前に特定された交差反応性ｍＡｂ ２２２のＦａｂと複合体形成されたベータ－Ｓに加えて、ベータ－６、２６、３２、４４及び５３についてＦａｂと複合体形成されたベータ－Ｓについて得た（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４．１１（２０２１）：２９３９－２９５４）（図５Ｃ、実施例１６、図１０）。
強力な抗ベータ抗体についての構造－機能関係を理解するために、代表的な選択対象の構造分析を、その血清学的特性に基づいて実行した。合計で、高解像度結晶構造を１１個のＲＢＤ／Ｆａｂ複合体、ベータ－６、２２、２４、２７、２９、３８、４０、４４、４７、５３及び５４について（図５Ａ）並びにまたＦａｂベータ－３２（図５Ｂ）について１．７～４．０Åの解像度で決定した（実施例１６を参照されたい）。加えて、略低い解像度クライオＥＭ構造情報を、より以前に特定された交差反応性ｍＡｂ ２２２のＦａｂと複合体形成されたベータ－Ｓに加えて、ベータ－６、２６、３２、４４及び５３についてＦａｂと複合体形成されたベータ－Ｓについて得た（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４．１１（２０２１）：２９３９－２９５４）（図５Ｃ、実施例１６、図１０）。
Ｔｙｒ－５０１ ＲＢＤに対するパブリック抗体の構造解像力
ベータ－６及びベータ－５４は、ＩｇＶＨ４－３９遺伝子ファミリーの２つの例である。ベータ－６は、Ｔｙｒ－５０１と強く相互作用する。Ｆａｂは本質的に、ＲＢＤの右肩の上に位置し（図５Ａ）、主な接触が重鎖によって与えられる（５２０Å２）一方、軽鎖は、非常に少ない接触をもたらし（１２４Å２）、これはＣＤＲ Ｌ３に限定される（図６Ａ）。全体として、相互作用領域はそれでも比較的小さく、相互作用は、残基Ｔｙｒ－５０１の周りにかなり集中しており（図６Ａ）、右肩の周りに３つのＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２及びＨ３のラッピングが存在する。特に、Ｔｙｒ－５０１のヒドロキシル基は、Ｈ３主鎖への水素結合を形成する（図６Ａ）。
ベータ－６及びベータ－５４は、ＩｇＶＨ４－３９遺伝子ファミリーの２つの例である。ベータ－６は、Ｔｙｒ－５０１と強く相互作用する。Ｆａｂは本質的に、ＲＢＤの右肩の上に位置し（図５Ａ）、主な接触が重鎖によって与えられる（５２０Å２）一方、軽鎖は、非常に少ない接触をもたらし（１２４Å２）、これはＣＤＲ Ｌ３に限定される（図６Ａ）。全体として、相互作用領域はそれでも比較的小さく、相互作用は、残基Ｔｙｒ－５０１の周りにかなり集中しており（図６Ａ）、右肩の周りに３つのＣＤＲ：Ｈ１、Ｈ２及びＨ３のラッピングが存在する。特に、Ｔｙｒ－５０１のヒドロキシル基は、Ｈ３主鎖への水素結合を形成する（図６Ａ）。
ベータ－５４は、ＲＢＤと相互作用し、ベータ－６と比較して、攻撃の角度は大きく異なり（図６Ｂ）、Ｆａｂは、ＲＢＤ上で３２°回転して、ＲＢＤ上で残基５０１の周りを本質的に枢動する。ベータ－６と５４間の結合姿勢の顕著な変化の理由は、重鎖ＣＤＲ３の顕著な差異に由来すると思われる。ベータ－６ Ｈ３は１５残基長である一方、ベータ－５４は１８残基とより長い。攻撃の角度の変化により、異なる長さのＨ３ループが類似の接触をするのを可能にする（図６Ｃ）一方、Ｈ１及びＨ２接触領域は、円を描いて枢動する。重鎖のＩｇＶＨ部分の重ね合せ（図６Ｄ）は、Ｈ３を除いて、重鎖可変ドメインが非常に類似していることを示す。相互作用の詳細の調査は、詳細が異なることを示している（図６Ａ及びＥ）。残基Ｔｙｒ－３５（Ｈ１）及びＴｙｒ－５４（Ｈ２）は、中心にあると思われ、これにより枢動が可能となり、ＩｇＶＨ４－３９遺伝子ファミリーに特有である（これらは、他の一部のＩｇＶＨファミリーにおいても見出されるため、この結合モードをもたらすのに十分ではない、図６Ｅ、表Ｓ３）。全体として、相互作用領域は、ベータ－５４について、ベータ－６よりも僅かに少ない（ベータ－５４の重鎖及び軽鎖についてそれぞれ４６１及び５４Å２）。
ＩｇＶＨ４－３９抗体についてのＨ３ループ長は、２つのカテゴリー（１つは、１５残基のＨ３であり、及びより小さいサブセットは、１８又は１９残基のＨ３長である）に入る。これは、これらのパブリック抗体がＨ３の２つの異なったクラスに対応することを可能にするＨ１及びＨ２相互作用において、若干の縮重が存在し得る一方、ＩｇＶＨ４－３９部分において関連する相互作用をそれでも維持している（抗原及び抗体の両方の全ての相互作用残基を考慮して、ベータ－６において２８個及びベータ－５４において３４個のうち、２２個が２つの抗体間で共通している）ことを示唆している。
ＩｇＨＶ４－３９抗体についてＣＤＲ３長が結合姿勢を調節するという提案の試験として、さらなる低解像度Ｘ線構造を、ベータＲＢＤに結合したベータ－４０ Ｆａｂについて決定した。ベータ－４０は、ベータ－６を含むＩｇＶＨ４－３９抗体の４つに見出される標準的な１５残基重鎖ＣＤＲ３を有する。予測されるように、ベータ－４０の攻撃の角度は、ベータ－６と本質的に同一であり、重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２の位置決めは、非常に類似している（図６Ｆ）。モデルは、ベータ－ＲＢＤ／ベータ－２４複合体の構造によってさらに支持される。ベータ－２４は、密接に関連するＩｇＶＨ４－３０遺伝子ファミリーに属し、Ｈ１及びＨ２領域はＩｇＶＨ４－３９に非常に類似し、標準的なＨ３長は１５残基である。したがって、ベータ－２４は、１５－残基重鎖ＣＤＲ３内の顕著に異なる配列を有するにも関わらず、ベータ－６と本質的に同一の係合モードを有する（図５Ａ）。詳細な相互作用は、部分的には、ベータ－６のものも再現するが、それでもやはり、ベータ－６及び２４間に差異が存在し、軽鎖相互作用領域は、ベータ－２４について二倍を超える（～２８４Å２）一方、重鎖接触は、僅かに低下する（４５８Å２）。
ベータ－６とベータ－２４間の相互作用の詳細におけるこれらの変化にも関わらず、結合の共通のモードを定義する共通の重鎖相互作用が存在する。これは、重要な残基が示されている図６Ｈにおいて概説されている。詳細には、Ｔｙｒ－３５のヒドロキシル基は、Ｖａｌ－４４５のＲＢＤカルボニル酸素と水素結合を形成し、残基Ｖａｌ－１０２のカルボニルは、Ｔｈｒ－５００のＲＢＤヒドロキシル基と相互作用する。それでもやはり、Ｔｙｒ－５０１との相互作用は異なるが、水素結合がベータ－６内に形成され、ベータ－２４において、相互作用は、疎水性スタッキング相互作用によって主に形成されると思われる。興味深いことに、軽鎖相互作用は、相同でない。そのため、両方の抗体において、水素結合がＧｌｙ－４４６のカルボニルに形成される。しかしながら、ベータ－６において、これは、Ａｒｇ－９１のグアニジウム基によって与えられる（図６Ａ）一方、ベータ－２４において、水素ドナーはＴｙｒ－９１のヒドロキシル基である。
そのような抗体とのスパイク相互作用の全体的見地を調査するために、アップ構成内の２つのＲＢＤとの標準的方法による付着を示す、ベータ－６ Ｆａｂを有するベータ－ＳのクライオＥＭ構造を決定した。しかしながら、全３つのＲＢＤは、結合したＦａｂを有する（図５Ｃ）。要約すれば、ＩｇＶＨ４－３９の繰返し使用は、抗体が広範な異なるＩｇＶＬ遺伝子ファミリーを保有するにも関わらず、頻繁なパブリック結合モードのシグナルを出して残基Ｔｙｒ－５０１を標的とすると思われる（表１１）。
実施例７．ＩｇＶＨ３－５３／３－６６遺伝子ファミリーの交差反応性メンバーの使用の制限。
Ｔｙｒ－５０１を標的とする新規のパブリックＩｇＶＨ遺伝子ファミリーの広範囲にわたる使用と対照的に、初期のパンデミックウイルスによって高頻度で誘発される周知のＩｇＶＨ３－５３／３－６６パブリック抗体クラスは、最も強力なベータニュートラライザのセットにおいて、単一のｍＡｂ（ベータ－２７）のみによって表される。これは、これらの抗体が、ＲＢＤの残基５０１での変異に対して大部分が感受性であるという本発明者らの以前の観察によって説明される。しかしながら、軽鎖ＣＤＲ１における変化は、レジリエンスを付与することができる。これの一例が、初期のパンデミック株により感染した個体から単離されたｍＡｂ ２２２であり、これは、残基３０にプロリンを含有し（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ｂ）、且つ全てのバリアントを効果的に中和することができる。Ｆａｂ ２２２のクライオＥＭ構造を、ベータ－Ｓとの複合体において決定して、全長スパイクとの係合モードを調査した。三量体スパイクの粒子の大部分は、「２つのＲＢＤアップ」構成であり、両方とも上向きにＲＢＤが２２２ Ｆａｂと、初期のＲＢＤ／Ｆａｂ複合体構造から予想されるモードで係合していた（図５Ｃ）（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４．１１（２０２１）：２９３９－２９５４）。これは、他のＩｇＶＨ３－５３スパイク複合体について見られるＲＢＤ「アップ」係合パターンと合致する（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８（２０２１）：２１８３－２２００）。
Ｔｙｒ－５０１を標的とする新規のパブリックＩｇＶＨ遺伝子ファミリーの広範囲にわたる使用と対照的に、初期のパンデミックウイルスによって高頻度で誘発される周知のＩｇＶＨ３－５３／３－６６パブリック抗体クラスは、最も強力なベータニュートラライザのセットにおいて、単一のｍＡｂ（ベータ－２７）のみによって表される。これは、これらの抗体が、ＲＢＤの残基５０１での変異に対して大部分が感受性であるという本発明者らの以前の観察によって説明される。しかしながら、軽鎖ＣＤＲ１における変化は、レジリエンスを付与することができる。これの一例が、初期のパンデミック株により感染した個体から単離されたｍＡｂ ２２２であり、これは、残基３０にプロリンを含有し（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ｂ）、且つ全てのバリアントを効果的に中和することができる。Ｆａｂ ２２２のクライオＥＭ構造を、ベータ－Ｓとの複合体において決定して、全長スパイクとの係合モードを調査した。三量体スパイクの粒子の大部分は、「２つのＲＢＤアップ」構成であり、両方とも上向きにＲＢＤが２２２ Ｆａｂと、初期のＲＢＤ／Ｆａｂ複合体構造から予想されるモードで係合していた（図５Ｃ）（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４．１１（２０２１）：２９３９－２９５４）。これは、他のＩｇＶＨ３－５３スパイク複合体について見られるＲＢＤ「アップ」係合パターンと合致する（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８（２０２１）：２１８３－２２００）。
ベータ－２７は、代わりの機構をｍＡｂ ２２２に用いて、全てのバリアントに対して強力な、同じ結果を達成する。ベータ－２７重鎖ＣＤＲ３ループは、通常の９つから１１個の残基に長くされて、軽鎖ＣＤＲ１を置き換えて、アルファ、ベータ及びガンマバリアント内に見出される５０１での大きいチロシン側鎖を許容するのに十分な空間をもたらし、これは、ｍＡｂ ２２２について見られるものと非常に類似した結果であり（図７Ａ、図１６Ｈ及びＩ）、Ｔｙｒ－５０１は、残基２９～３０での主鎖ペプチド相互作用によって安定している。これにより、全てのバリアントに対して強く交差反応性のベータ－２７が生じる。標準的なＩｇＨＶ３－５３抗体のように、ベータ－２７は、肩間の主に首領域におけるＲＢＤとの広範囲にわたる相互作用を形成し（図５Ａ）、重鎖で７１８Å２及び軽鎖で２６２Å２である（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８（２０２１）：２１８３－２２００）。全３つの重鎖ＣＤＲは、接していない残基４１７と４８４間の領域内でＲＢＤ表面と接触する。軽鎖Ｌ１は、残基２８～３０の領域において、５０１の周りでＲＢＤ主鎖との相互作用を形成するが、Ｔｙｒ－５０１の側鎖との特異的相互作用を形成しないため、この残基での変異に感受性でない。
実施例８．他の遺伝子ファミリーは、５０１の周りで右肩に強く付着する一方、交差反応性であることができる。
ベータ－３２は、試験した全てのバリアントに対して高度に強力である。相互作用のモードを特定するために、Ｆａｂの高解像度結晶構造及びベータ－Ｓとの複合体におけるＦａｂのクライオＥＭ構造を決定した（図５Ｂ及び４Ｃ）。２つのＲＢＤに付着したＦａｂがアップ構成で観察された。若干の曖昧さがＦａｂの結合モードに存在するが、強い相互作用が、残基５０１の中央に置かれていることが明らかである。ベータ－３２の結合モードは、上述の可変遺伝子ファミリーＩｇＶＨ４－３９及びＩｇＶＨ３－５３の両方について観察されるものと元来異なる。そのため、相互作用は、ＩｇＶＨ３－５３抗体について見られるように、軽鎖の代わりに重鎖を介しており、ベータ－６と比較したベータ－３２の攻撃の角度は、ＲＢＤの後方に向けて約９０°回転している（図７Ｂ）。そのため、ベータ－３２は、ＲＢＤの右肩との係合の新規の交差反応性モードを見出した。
ベータ－３２は、試験した全てのバリアントに対して高度に強力である。相互作用のモードを特定するために、Ｆａｂの高解像度結晶構造及びベータ－Ｓとの複合体におけるＦａｂのクライオＥＭ構造を決定した（図５Ｂ及び４Ｃ）。２つのＲＢＤに付着したＦａｂがアップ構成で観察された。若干の曖昧さがＦａｂの結合モードに存在するが、強い相互作用が、残基５０１の中央に置かれていることが明らかである。ベータ－３２の結合モードは、上述の可変遺伝子ファミリーＩｇＶＨ４－３９及びＩｇＶＨ３－５３の両方について観察されるものと元来異なる。そのため、相互作用は、ＩｇＶＨ３－５３抗体について見られるように、軽鎖の代わりに重鎖を介しており、ベータ－６と比較したベータ－３２の攻撃の角度は、ＲＢＤの後方に向けて約９０°回転している（図７Ｂ）。そのため、ベータ－３２は、ＲＢＤの右肩との係合の新規の交差反応性モードを見出した。
実施例９．Ｌｙｓ－４８４に対する優れた特異性を、塩架橋及び疎水性ケージの組合せによって達成することができる。
ベータ－３８は、血清学的に及びＢＬＩ競合マッピングにより、Ｌｙｓ－４８４を必要とすると分類される（図４、表１１）。ベータ－３８／ベータＲＢＤ複合体の構造は、これを確認し（図５Ａ）、抗体は、正面の首／左肩領域を正面から攻撃し、特異性が与えられる方法をすっきりと実証している。Ｌｙｓ－４８４は、重鎖と軽鎖のＣＤＲ３ループ間に埋まっている（図７Ｃ）。リシン側鎖の疎水性ステムは、Ｐｈｅ－４９０（ＲＢＤ）、Ｔｙｒ－１０８（重鎖）及びＴｒｐ－９２（軽鎖）で構成される疎水性ケージ内に含有される。ケージの末端において、Ａｓｐ－９４（軽鎖）は、残基４８４のリシン側鎖のアミノ基と塩架橋（図７Ｃ）を、且つＡｓｎ－３２と水素結合を形成する。結晶学的非対称ユニット内に２つのＦａｂ－ＲＢＤ複合体が存在し、異なる結晶充填力が攻撃の角度の１３°の差異を導入し、これは、この高度に集中した抗体の付着における若干のフレキシビリティを示す。
ベータ－３８は、血清学的に及びＢＬＩ競合マッピングにより、Ｌｙｓ－４８４を必要とすると分類される（図４、表１１）。ベータ－３８／ベータＲＢＤ複合体の構造は、これを確認し（図５Ａ）、抗体は、正面の首／左肩領域を正面から攻撃し、特異性が与えられる方法をすっきりと実証している。Ｌｙｓ－４８４は、重鎖と軽鎖のＣＤＲ３ループ間に埋まっている（図７Ｃ）。リシン側鎖の疎水性ステムは、Ｐｈｅ－４９０（ＲＢＤ）、Ｔｙｒ－１０８（重鎖）及びＴｒｐ－９２（軽鎖）で構成される疎水性ケージ内に含有される。ケージの末端において、Ａｓｐ－９４（軽鎖）は、残基４８４のリシン側鎖のアミノ基と塩架橋（図７Ｃ）を、且つＡｓｎ－３２と水素結合を形成する。結晶学的非対称ユニット内に２つのＦａｂ－ＲＢＤ複合体が存在し、異なる結晶充填力が攻撃の角度の１３°の差異を導入し、これは、この高度に集中した抗体の付着における若干のフレキシビリティを示す。
実施例１０．ＲＢＤ残基４１７での変異の間接的影響。
ベータ－２２は、ＩｇＶＨ３－３０を用いており、残基４１７を標的とすると血清学的に分類される（表１１）。４１７フォーカスは、抗体をこの残基の最上部にほぼ正確に置くＢＬＩマッピングによって補強され、複合体の結晶構造は、これを確認する（図４及び５Ａ）。しかしながら、結合は、重鎖にほぼ完全に制限されるが、非常に広範囲にわたっており、全３つのＣＤＲが総計５９７Å２のインターフェース面積を与える（対照的に、軽鎖は、１１０Å２のみを与える）。重鎖ＣＤＲは、Ｈ１が残基Ｔｙｒ－５０１に近くなり、Ｈ２がＡｓｎ－４１７の全体を包み込み、Ｈ３が残基Ｌｙｓ－４８４に向けて延びるように配置されている（図７Ｄ）。
ベータ－２２は、ＩｇＶＨ３－３０を用いており、残基４１７を標的とすると血清学的に分類される（表１１）。４１７フォーカスは、抗体をこの残基の最上部にほぼ正確に置くＢＬＩマッピングによって補強され、複合体の結晶構造は、これを確認する（図４及び５Ａ）。しかしながら、結合は、重鎖にほぼ完全に制限されるが、非常に広範囲にわたっており、全３つのＣＤＲが総計５９７Å２のインターフェース面積を与える（対照的に、軽鎖は、１１０Å２のみを与える）。重鎖ＣＤＲは、Ｈ１が残基Ｔｙｒ－５０１に近くなり、Ｈ２がＡｓｎ－４１７の全体を包み込み、Ｈ３が残基Ｌｙｓ－４８４に向けて延びるように配置されている（図７Ｄ）。
血清学的データの詳細な調査は、それとの良好な相関を示し、Ｈ３は、Ｌｙｓ－４８４に到達できないため、この変異は、結合に大きい影響を及ぼさないのに対して、Ｎ５０１Ｙ変異は、結合に及ぼすポジティブな影響を有するが、Ｋ４１７Ｎ／Ｔも有効な中和に必要とされる。Ａｓｎ－４１７は、Ｈ２との直接的接触を形成しないが、リシンの追加のサイズ及び陽静電荷の濃度は、おそらく抗体親和性に及ぼす大きい影響を有するように組み合わされる。ベータ－２２は、軽鎖ＣＤＲ１内の残基Ａｓｎ－３５においてグリコシル化されており、糖は、以前に観察されるように、左肩の近くに存在する（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）。異なるドナーから単離された２つのＩｇＨＶ３－３０抗体が存在し（表１１）、強力なβＲＢＤバインダーのセットにおいて、２番目がベータ－２９である。血清学的結果及びＢＬＩマッピングの結果は、ベータ－２９がベータ－２２に類似していることを示唆している。ベータＲＢＤとの複合体の結晶構造を決定した。結果は、結合モードが本質的には２つの抗体について同一であることを確認した（図７Ｅ）。興味深いことに、これらの２つの抗体は、ＩｇＶＬ４－１も共有する。構造情報は、これらの血清学的特性を共有する第３の強力なｍＡｂ、ベータ－２０について入手可能でないが、ＢＬＩ競合マッピングは、このｍＡｂを同一の位置内に置いており、重鎖遺伝子ファミリーＩｇＨＶ３－３３は、ＩｇＨＶ３－３０に密接に関連しているため、係合モードは、類似し得る（しかし、ＮＴＤバインダーベータ－４３もＩｇＨＶ３－３０である）。要約すれば、Ａｓｎ－４１７に対する特異性は、間接的に達成されるようであり、残基は、軽鎖ＣＤＲ２と重鎖ＣＤＲ３のループ間の抗体結合部位の中心に位置しているが、高い特異的親和性相互作用はない。全体として、ベータ－２０及びベータ－２９による４１７の特異性は、間接的に達成されると思われ、パラトープに対して中心の残基を置くことで、アルファ、ベータ及びガンマのバリアントに特有の４１７での静電荷の変化に対して感受性となり、また残基に依存しないのは、アスパラギン又はトレオニンである。ベータ－２０は、Ｔｈｒ－４１７に対して感受性であり、この抗体がＡｓｎ－４１７との直接的接触を形成することがあり得る。
実施例１１．左肩を標的として、デルタに対する感受性を、残基４７８を介して導入することができる。
ベータ－４４は、デルタバリアントを中和しない。このｍＡｂは、重鎖及び軽鎖の両方を介して比較的小さい接触を形成し（それぞれ４０８及び１２３Å２）、抗体は、左肩上に位置し、重鎖は、残基４７８を越える（図５Ａ）。ＣＤＲ Ｌ１及びＬ３は、ＲＢＤの残基４８４の近くにあり、Ｔｙｒ－９０のＬ３のヒドロキシル基からＬｙｓ－４８４のカルボニル酸素への水素結合を形成する一方、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３は、残基Ｔｈｒ－４７８を囲む（図７Ｆ）。ＲＢＤの残基Ｌｅｕ－４５２の近くで接触が全く存在しないため、デルタに対する感受性が、残基４７８との接触により生じ、これはおそらく、残基４７８がＬｙｓに変異している場合の、Ｈ３残基Ｔｙｒ－９０との側鎖原子ＣＧ１間の疎水性相互作用の消失に起因する（図７Ｆ）。ベータ－Ｓとの複合体におけるベータ－４４ ＦａｂのクライオＥＭ分析は、Ｆａｂが付着したアップ構成において、スパイクが２つのＲＢＤを有することを実証している（図５Ｃ）。
ベータ－４４は、デルタバリアントを中和しない。このｍＡｂは、重鎖及び軽鎖の両方を介して比較的小さい接触を形成し（それぞれ４０８及び１２３Å２）、抗体は、左肩上に位置し、重鎖は、残基４７８を越える（図５Ａ）。ＣＤＲ Ｌ１及びＬ３は、ＲＢＤの残基４８４の近くにあり、Ｔｙｒ－９０のＬ３のヒドロキシル基からＬｙｓ－４８４のカルボニル酸素への水素結合を形成する一方、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３は、残基Ｔｈｒ－４７８を囲む（図７Ｆ）。ＲＢＤの残基Ｌｅｕ－４５２の近くで接触が全く存在しないため、デルタに対する感受性が、残基４７８との接触により生じ、これはおそらく、残基４７８がＬｙｓに変異している場合の、Ｈ３残基Ｔｙｒ－９０との側鎖原子ＣＧ１間の疎水性相互作用の消失に起因する（図７Ｆ）。ベータ－Ｓとの複合体におけるベータ－４４ ＦａｂのクライオＥＭ分析は、Ｆａｂが付着したアップ構成において、スパイクが２つのＲＢＤを有することを実証している（図５Ｃ）。
実施例１２．左肩－首領域に結合するが、バリアント変異を回避することにより、交差反応性を得ることができる。
ベータ－４７は、全てのバリアントに対して交差反応性であり、左肩－首インターフェースの後方と強く相互作用する（接触面積は、重鎖及び軽鎖についてそれぞれ５８２及び２３４Å２である）（図５Ａ及び７Ｇ）。ＣＤＲ Ｈ３は、ループベアリング４８４の後方に対して部分的に最も大きい接触を形成するが、軽鎖接触は、残基４７８の近くに、しかしそれに接触することなく、左肩の遠端部に対している（図７Ｇ）。ベータ－４７は、このとき、重鎖ＣＤＲ３の残基Ａｓｎ－１０２でもグリコシル化されている。なぜなら、ベータ－２２について、糖が左肩の近くに存在するが、ＲＢＤとの特異的接触をほとんど形成しないからである。ベータ－４７は、以前に特定されたｍＡｂ ２５３（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）に非常に類似しており、重鎖ＣＤＲ３において同じ可変遺伝子、グリコシル化及びジスルフィドを共有する。
ベータ－４７は、全てのバリアントに対して交差反応性であり、左肩－首インターフェースの後方と強く相互作用する（接触面積は、重鎖及び軽鎖についてそれぞれ５８２及び２３４Å２である）（図５Ａ及び７Ｇ）。ＣＤＲ Ｈ３は、ループベアリング４８４の後方に対して部分的に最も大きい接触を形成するが、軽鎖接触は、残基４７８の近くに、しかしそれに接触することなく、左肩の遠端部に対している（図７Ｇ）。ベータ－４７は、このとき、重鎖ＣＤＲ３の残基Ａｓｎ－１０２でもグリコシル化されている。なぜなら、ベータ－２２について、糖が左肩の近くに存在するが、ＲＢＤとの特異的接触をほとんど形成しないからである。ベータ－４７は、以前に特定されたｍＡｂ ２５３（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）に非常に類似しており、重鎖ＣＤＲ３において同じ可変遺伝子、グリコシル化及びジスルフィドを共有する。
実施例１３．左肩を標的として、残基４８４及び４７８での変化に対する感受性を生じさせることができる。
ＭＡｂベータ－２６は、強力な中和のためにベータＥ４８４Ｋ変異を必要とするが、デルタに見出されるＬ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｎ変異に対して絶妙に感受性である。これを調査するために、ベータ－２６ Ｆａｂとの複合体におけるベータ－ＳのクライオＥＭ構造を決定した。珍しく、スパイクは、Ｆａｂが全３つのＲＢＤに付着した３つのＲＢＤアップ構成で見出された（図５Ｃ）。実験上の構造は、原子的詳細において直接的にＦａｂ構造を構築するのに十分な解像度でなかったため、Ａｌｐｈａｆｏｌｄ－２を用いてモデルを構築し（Ｊｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２１）、これを密度にフィットするように調整した（実施例１６を参照されたい）。主要な接触は、全３つのＣＤＲが寄与している重鎖を介しており、ＣＤＲ２は、残基４８４との密接な相互作用を形成している（図７Ｇ）。加えて、強い相互作用が、軽鎖ＣＤＲ３と４７８との間に存在する（図７Ｇ）。これらの相互作用は、観察された血清学的結果を説明する（図２／表１０）。
ＭＡｂベータ－２６は、強力な中和のためにベータＥ４８４Ｋ変異を必要とするが、デルタに見出されるＬ４５２Ｒ／Ｔ４７８Ｎ変異に対して絶妙に感受性である。これを調査するために、ベータ－２６ Ｆａｂとの複合体におけるベータ－ＳのクライオＥＭ構造を決定した。珍しく、スパイクは、Ｆａｂが全３つのＲＢＤに付着した３つのＲＢＤアップ構成で見出された（図５Ｃ）。実験上の構造は、原子的詳細において直接的にＦａｂ構造を構築するのに十分な解像度でなかったため、Ａｌｐｈａｆｏｌｄ－２を用いてモデルを構築し（Ｊｕｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２１）、これを密度にフィットするように調整した（実施例１６を参照されたい）。主要な接触は、全３つのＣＤＲが寄与している重鎖を介しており、ＣＤＲ２は、残基４８４との密接な相互作用を形成している（図７Ｇ）。加えて、強い相互作用が、軽鎖ＣＤＲ３と４７８との間に存在する（図７Ｇ）。これらの相互作用は、観察された血清学的結果を説明する（図２／表１０）。
実施例１４．ＡＣＥ２結合について競合しないが強力に中和することとなる交差反応性抗体結合部位。
ＢＬＩ競合分析は、ベータ－５３をＲＢＤの上部右脇腹に置き、ＥＬＩＳＡデータは、結合がＡＣＥ２結合と独立していることを示した（図１Ｇ）。ベータ－Ｓとの複合体におけるベータ－５３のクライオＥＭ分析は、全３つのＲＢＤへの付着を示しており、２つのＲＢＤがアップであり、１つがダウンである（図５Ｃ）。ベータ－５３／ベータＲＢＤ複合体の結晶学的分析は、抗体が、以前に特定された抗体Ｓ３０９と強く重複するエピトープにおいて付着することを確認する（図５Ａ及び７Ｈ）。実施例１８に記載されるベータ－４９及びベータ－５０の「腰」結合抗体との若干の重複も存在する（図２０Ａ）。Ｓ３０９のように、ＲＢＤ上の残基Ｎ３４３においてＮ結合グリカンとの実質的な相互作用が存在する（図７Ｈ、１６Ｂ、Ｆ及びＧ）。Ｓ３０９と比較して、ベータ－５３は、ＡＣＥ２結合部位に向けて、さらにＲＢＤ上に大体１０Åで位置するため、ベータ－５３は、Ｓ３０９におけるＨ３及びＬ２の代わりにＨ１及びＨ３を介してグリカンに接触している。これは、ベータ－４９／ベータ－５０の「腰」エピトープにさらに由来する。である。Ｆａｂは、ＡＣＥ２部位にアプローチして、Ｎ５３ ＡＣＥ２グリカンに対してかすりそうである（図７Ｉ）。しかしながら、ＥＬＩＳＡ競合データは、ＡＣＥ２との大きい競合が存在しないことを確認する（図１Ｇ）。重鎖及び軽鎖は、両方とも実質的な接触を形成している（それぞれ４６６及び２７０Å２）。
ＢＬＩ競合分析は、ベータ－５３をＲＢＤの上部右脇腹に置き、ＥＬＩＳＡデータは、結合がＡＣＥ２結合と独立していることを示した（図１Ｇ）。ベータ－Ｓとの複合体におけるベータ－５３のクライオＥＭ分析は、全３つのＲＢＤへの付着を示しており、２つのＲＢＤがアップであり、１つがダウンである（図５Ｃ）。ベータ－５３／ベータＲＢＤ複合体の結晶学的分析は、抗体が、以前に特定された抗体Ｓ３０９と強く重複するエピトープにおいて付着することを確認する（図５Ａ及び７Ｈ）。実施例１８に記載されるベータ－４９及びベータ－５０の「腰」結合抗体との若干の重複も存在する（図２０Ａ）。Ｓ３０９のように、ＲＢＤ上の残基Ｎ３４３においてＮ結合グリカンとの実質的な相互作用が存在する（図７Ｈ、１６Ｂ、Ｆ及びＧ）。Ｓ３０９と比較して、ベータ－５３は、ＡＣＥ２結合部位に向けて、さらにＲＢＤ上に大体１０Åで位置するため、ベータ－５３は、Ｓ３０９におけるＨ３及びＬ２の代わりにＨ１及びＨ３を介してグリカンに接触している。これは、ベータ－４９／ベータ－５０の「腰」エピトープにさらに由来する。である。Ｆａｂは、ＡＣＥ２部位にアプローチして、Ｎ５３ ＡＣＥ２グリカンに対してかすりそうである（図７Ｉ）。しかしながら、ＥＬＩＳＡ競合データは、ＡＣＥ２との大きい競合が存在しないことを確認する（図１Ｇ）。重鎖及び軽鎖は、両方とも実質的な接触を形成している（それぞれ４６６及び２７０Å２）。
未解決の問題は、中和の機構にあり、先に言及される２０℃で３０分間のインキュベーション後に決定されるベータ－Ｓを有するベータ－５３のクライオＥＭ構造は、これを解明し得る。生理的に予想される未満のインキュベーション温度にも関わらず、かなりの画分のスパイクタンパク質が、非三量体形態に分解する証拠が存在した。このことは、中和のための潜在的機構としてスパイク破壊を示唆している。
ベータ－５３は、謎のままであり、ＡＣＥ２と競合せず、Ｓ３０９のエピトープと重複するエピトープに結合し（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、Ｓ３０９のようにＲＢＤの残基Ｎ３４３においてＮ結合グリカンと相互作用する。中和の機構は、不明であるが、三量体Ｓタンパク質とのベータ－５３ Ｆａｂの複合体のクライオ電子顕微鏡観察から、室温において、Ｆａｂは、スパイクの融合前状態を不安定にし得るという示唆が存在する。
実施例１５．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体に対して選択した抗体のさらなる中和データ
さらなる中和実験を実行して、選択した抗体によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの中和を判定した。上述の詳細な説明で考察されるように、同じ重鎖Ｖ遺伝子に由来する抗体は、軽鎖を交換して、第１の抗体の重鎖可変領域及び第２の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体を生じさせ得、そのような新しい抗体は、「親」抗体と比較した場合に中和及び／又は他の特徴が向上し得る。
さらなる中和実験を実行して、選択した抗体によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの中和を判定した。上述の詳細な説明で考察されるように、同じ重鎖Ｖ遺伝子に由来する抗体は、軽鎖を交換して、第１の抗体の重鎖可変領域及び第２の抗体の軽鎖可変領域を含む抗体を生じさせ得、そのような新しい抗体は、「親」抗体と比較した場合に中和及び／又は他の特徴が向上し得る。
表３～９は、同じ重鎖Ｖ遺伝子に由来する抗体間の軽鎖を交換することによって増やすことができるそのような抗体の例を提供する。
表１２～１３は、選択した抗体及び同じ重鎖Ｖ遺伝子に由来する抗体間で軽鎖を交換することによって作製した抗体についてのさらなる中和データを提供する。同じ重鎖Ｖ遺伝子に由来する抗体間で軽鎖を交換することによって作製したほぼ全ての抗体は、「親」抗体と比較した場合に中和の向上を示す。図１１Ａ内のデータは、Ｗｕｈａｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質配列と比較した場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのスパイクタンパク質のＮＴＤ、ＲＢＤ及びＣＴＤにおける変異を説明する。図１１Ｂ内のデータは、表１３内に示されるデータに対応する。
表１４は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ビクトリア、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１及びＰ．１に対して選択した初期のセットの抗体の中和及びＲＢＤ結合を記載する。これは、表１２及び１３内のデータが比較され得る参照として用いることができる（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．”Ｃｅｌｌ １８４．８（２０２１）：２１８３－２２００；Ｓｕｐａｓａ，Ｐｉｙａｄａ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．７ ｖａｒｉａｎｔ ｂｙ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４．８（２０２１）：２２０１－２２１１；Ｚｈｏｕ，Ｄａｍｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｖａｒｉａｎｔ Ｂ．１．３５１ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｒａ．”Ｃｅｌｌ １８４．９（２０２１）：２３４８－２３６１；Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ，Ｗａｎｗｉｓａ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｐ．１ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２．”Ｃｅｌｌ １８４．１１（２０２１）：２９３９－２９５４；Ｌｉｕ，Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．６１７ ｂｙ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ ｓｅｒｕｍ．”Ｃｅｌｌ １８４．１６（２０２１）：４２２０－４２３６も参照されたい）。
実施例１６．実施例１～１５についての材料及び方法。
ウイルス株
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ｈｕｍａｎ／ＡＵＳ／ＶＩＣ０１／２０２０（Ｃａｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ベータ（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄによって提供される）の両方をベロー（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）細胞内で増殖させた。細胞に、０．０００１のＭＯＩを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを感染させた。ウイルス含有上清を８０％ＣＰＥで収集して、２０００ｒｐｍ、４℃でスピンしてから－８０℃で保存した。ウイルス力価をベロー細胞でフォーカス形成アッセイによって判定した。ビクトリア継代５株及びベータ継代４株の両方を配列決定して、予想されるスパイクタンパク質配列を含有し、且つフーリン切断部位に対する変化を含有しないことを確認した。これらの研究に用いたベータウイルスは、以下の変異を含有した：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２～２４４の欠失、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ。
ウイルス株
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ｈｕｍａｎ／ＡＵＳ／ＶＩＣ０１／２０２０（Ｃａｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ベータ（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄによって提供される）の両方をベロー（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）細胞内で増殖させた。細胞に、０．０００１のＭＯＩを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを感染させた。ウイルス含有上清を８０％ＣＰＥで収集して、２０００ｒｐｍ、４℃でスピンしてから－８０℃で保存した。ウイルス力価をベロー細胞でフォーカス形成アッセイによって判定した。ビクトリア継代５株及びベータ継代４株の両方を配列決定して、予想されるスパイクタンパク質配列を含有し、且つフーリン切断部位に対する変化を含有しないことを確認した。これらの研究に用いたベータウイルスは、以下の変異を含有した：Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２～２４４の欠失、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ。
細菌株及び細胞培養体
ベロー（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ，３５０５００６１）及び１００ Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃において培養した。ヒトｍＡｂを、３７℃、５％ＣＯ２においてＵｌｔｒａＤＯＭＡ ＰＦタンパク質フリー培地（Ｃａｔ＃１２－７２７Ｆ、ＬＯＮＺＡ）中で培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ＤＨ５α細菌を、プラスミドｐＮＥＯ－ＲＢＤ Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙの形質転換に用いた。単一のコロニーを選択して、シェーカー内の５０μｇ ｍＬ－１カナマイシン入りＬＢブロス中で３７℃、２００ｒｐｍにおいて一晩培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）細胞を、１０％ＦＢＳ、１％１００Ｘ Ｍｅｍ Ｎｅａａ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％１００Ｘ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃、５％ＣＯ２において培養した。ＲＢＤ、ＲＢＤ Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ及びＡＣＥ２を発現させるために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、形質移入のための、２％ＦＢＳ、１％１００Ｘ Ｍｅｍ Ｎｅａａ及び１％１００Ｘ Ｌ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｓｉｇｍａ）中で３７℃において培養した。
ベロー（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ，３５０５００６１）及び１００ Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）高グルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃において培養した。ヒトｍＡｂを、３７℃、５％ＣＯ２においてＵｌｔｒａＤＯＭＡ ＰＦタンパク質フリー培地（Ｃａｔ＃１２－７２７Ｆ、ＬＯＮＺＡ）中で培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ＤＨ５α細菌を、プラスミドｐＮＥＯ－ＲＢＤ Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙの形質転換に用いた。単一のコロニーを選択して、シェーカー内の５０μｇ ｍＬ－１カナマイシン入りＬＢブロス中で３７℃、２００ｒｐｍにおいて一晩培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）細胞を、１０％ＦＢＳ、１％１００Ｘ Ｍｅｍ Ｎｅａａ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％１００Ｘ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃、５％ＣＯ２において培養した。ＲＢＤ、ＲＢＤ Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ及びＡＣＥ２を発現させるために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、形質移入のための、２％ＦＢＳ、１％１００Ｘ Ｍｅｍ Ｎｅａａ及び１％１００Ｘ Ｌ－グルタミンを補充したＤＭＥＭ高グルコース（Ｓｉｇｍａ）中で３７℃において培養した。
ベータ感染症例由来の血清
ＵＫ感染症例由来のベータ試料を、ＯｘｆｏｒｄのＧａｓｔｒｏ－ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｌｌｎｅｓｓに属する「Ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｗｏｒｋｅｒ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ ｍｅｍｂｅｒｓ」プロトコール：先に考察し、且つＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたＣＯＶＩＤサブ研究に従って収集した。全ての個体は、配列確認されたベータ感染症又はＰＣＲ確認された症候的疾患を患っていた。これらは、単離中及びベータ配列確認症例と直接的に接触して存在した。追加のベータ感染血清（配列は確認した）を南アフリカから得た。スワブ収集時、患者は、データ及び連続血液試料の収集に同意するインフォームドコンセントに署名した。研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＷｉｔｗａｔｅｒｓｒａｎｄのＨｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され（参照番号２００３１３）、Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅガイドラインに従って行った。
ＵＫ感染症例由来のベータ試料を、ＯｘｆｏｒｄのＧａｓｔｒｏ－ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｌｌｎｅｓｓに属する「Ｉｎｎａｔｅ ａｎｄ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｗｏｒｋｅｒ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｈｏｕｓｅｈｏｌｄ ｍｅｍｂｅｒｓ」プロトコール：先に考察し、且つＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたＣＯＶＩＤサブ研究に従って収集した。全ての個体は、配列確認されたベータ感染症又はＰＣＲ確認された症候的疾患を患っていた。これらは、単離中及びベータ配列確認症例と直接的に接触して存在した。追加のベータ感染血清（配列は確認した）を南アフリカから得た。スワブ収集時、患者は、データ及び連続血液試料の収集に同意するインフォームドコンセントに署名した。研究は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＷｉｔｗａｔｅｒｓｒａｎｄのＨｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され（参照番号２００３１３）、Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅガイドラインに従って行った。
マウス実験
動物試験を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの推奨事項に従って実行した。プロトコールは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された（保証書番号Ａ３３８１－０１）。ウイルス接種を、ケタミン塩酸塩及びキシラジンによって導入且つ維持される麻酔下で実行し、動物の苦痛を最小限にするあらゆる努力を行った。
動物試験を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ ＨｅａｌｔｈのＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓの推奨事項に従って実行した。プロトコールは、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された（保証書番号Ａ３３８１－０１）。ウイルス接種を、ケタミン塩酸塩及びキシラジンによって導入且つ維持される麻酔下で実行し、動物の苦痛を最小限にするあらゆる努力を行った。
ヘテロ接合Ｋ１８－ｈＡＣＥ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（株：２Ｂ６．Ｃｇ－ｔｇ．（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ）。動物を群で収容して、標準的なｃｈｏｗ ｄｉｅｔを与えた。異なる年齢及び両方の性別のマウスに、鼻腔内投与を介して１０３ＦＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を投与した。
マウス実験のために、ベロー－ｈＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２（Ａ．Ｃｒｅａｎｇａ及びＢ．Ｇｒａｈａｍ、ＮＩＨの贈与）及びベロー－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１×非必須アミノ酸及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において培養した。
加えて、ベロー－ＴＭＰＲＳＳ２及びベロー－ｈＡＣＥ２－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を、それぞれ５μｇ／ｍＬのブラストサイジン又はピューロマイシンの存在下で培養した。ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を、鼻咽頭単離物（Ｍ．Ｓｕｔｈａｒ，Ｅｍｏｒｙの贈与）から得た。感染性株を、ベロー－ＴＭＰＲＳＳ２細胞に接種することによって増殖させた。上清を収集して、分注して、－８０℃で保存した。感染性のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による全ての研究を、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認ＢＳＬ３及びＡ－ＢＳＬ３施設内で、陽圧エアレスピレータ及び保護装置を用いて実行した。ウイルス配列を、ＲＮＡ抽出後のディープシーケンシングによって確認して、予想される置換の存在を確認した。
ベータＳタンパク質
ベータのＳタンパク質のための発現プラスミドを構築するために、武漢株の三量体Ｓの構築体を鋳型として用いて（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）、且つＳの９対のプライマー（Ｌ１８Ｆフォワードプライマー５’－ＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧ－３’（配列番号６８２）、Ｌ１８Ｆリバースプライマー５’－ＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣ－３’（配列番号６８３）；Ｄ８０Ａフォワードプライマー５’－ＧＣＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣ－３’（配列番号６８４）及びＤ８０Ａリバースプライマー５’－ＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＧＣ－３’（配列番号６８５）；Ｄ２１５Ｇフォワードプライマー５’－ＡＴＴＡＡＴＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＴＴＣ－３’（配列番号６８６）、Ｄ２１５Ｇリバースプライマー５’－ＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＧＡＴＴＡＡＴ－３’（配列番号６８７）；２４２～２４４欠失及びＲ２４６Ｉフォワードプライマー５’－ＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＡＣＡＣＣＡＧ－３’（配列番号６８８）、２４２～２４４欠失及びＲ２４６Ｉリバースプライマー５’－ＴＧＧＴＧＴＡＡＧＡＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧ－３’（配列番号６８９）；Ｋ４１７Ｎフォワードプライマー５’－ＣＡＧＧＧＣＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＴＴＡＣ－３’（配列番号６９０）、Ｋ４１７Ｎリバースプライマー５’－ＧＴＡＡＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧ－３’（配列番号６９１）；Ｅ４８４Ｋフォワードプライマー５’－ＣＡＣＣＧＴＧＴＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＡＣ－３’（配列番号６９２）、Ｅ４８４Ｋリバースプライマー５’－ＧＴＡＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＡＣＡＣＧＧＴＧ－３’（配列番号６９３）；Ｎ５０１Ｙフォワードプライマー５’－ＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＡＴＧＧＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣ－３’（配列番号６９４）、Ｎ５０１Ｙリバースプライマー５’－ＧＴＡＧＣＣＣＡＣＧＣＣＡＴＡＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣ－３’（配列番号６９５）；Ｄ６１４Ｇフォワードプライマー５’－ＧＣＣＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＣＣＧＡＧ－３’（配列番号６９６）、Ｄ６１４Ｇリバースプライマー５’－ＣＴＣＧＧＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＣＧＧＣ－３’（配列番号６９７）；Ａ７０１Ｖフォワードプライマー５’－ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号６９８）、Ａ７０１Ｖリバースプライマー５’－ＧＧＣＣＡＣＧＣＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧ－３’（配列番号６９９））及びｐＨＬｓｅｃベクターの２つのプライマー（ｐＨＬｓｅｃフォワードプライマー５’－ＣＣＴＣＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＧＴＡＴＣＧＣＧ－３’（配列番号７００）、ｐＨＬｓｅｃリバースプライマー５’－ＣＧＣＧＡＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＡＧＧ－３’（配列番号７０１））を用いてＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ断片を、Ｇｉｂｓｏｎ反応（Ｇｉｂｓｏｎ，２０１１）によって一緒にジョイントした。新しい構築体を完全に配列決定した。
ベータのＳタンパク質のための発現プラスミドを構築するために、武漢株の三量体Ｓの構築体を鋳型として用いて（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）、且つＳの９対のプライマー（Ｌ１８Ｆフォワードプライマー５’－ＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＡＡＴＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧ－３’（配列番号６８２）、Ｌ１８Ｆリバースプライマー５’－ＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＡＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣ－３’（配列番号６８３）；Ｄ８０Ａフォワードプライマー５’－ＧＣＡＣＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣ－３’（配列番号６８４）及びＤ８０Ａリバースプライマー５’－ＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＧＡＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＧＣ－３’（配列番号６８５）；Ｄ２１５Ｇフォワードプライマー５’－ＡＴＴＡＡＴＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＴＴＣ－３’（配列番号６８６）、Ｄ２１５Ｇリバースプライマー５’－ＧＡＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＧＡＴＴＡＡＴ－３’（配列番号６８７）；２４２～２４４欠失及びＲ２４６Ｉフォワードプライマー５’－ＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＡＴＣＡＴＡＴＣＴＴＡＣＡＣＣＡＧ－３’（配列番号６８８）、２４２～２４４欠失及びＲ２４６Ｉリバースプライマー５’－ＴＧＧＴＧＴＡＡＧＡＴＡＴＧＡＴＡＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧ－３’（配列番号６８９）；Ｋ４１７Ｎフォワードプライマー５’－ＣＡＧＧＧＣＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＴＴＡＣ－３’（配列番号６９０）、Ｋ４１７Ｎリバースプライマー５’－ＧＴＡＡＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧ－３’（配列番号６９１）；Ｅ４８４Ｋフォワードプライマー５’－ＣＡＣＣＧＴＧＴＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＡＣ－３’（配列番号６９２）、Ｅ４８４Ｋリバースプライマー５’－ＧＴＡＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＡＣＡＣＧＧＴＧ－３’（配列番号６９３）；Ｎ５０１Ｙフォワードプライマー５’－ＧＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＡＣＣＴＡＴＧＧＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣ－３’（配列番号６９４）、Ｎ５０１Ｙリバースプライマー５’－ＧＴＡＧＣＣＣＡＣＧＣＣＡＴＡＧＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＡＧＣ－３’（配列番号６９５）；Ｄ６１４Ｇフォワードプライマー５’－ＧＣＣＧＴＧＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＣＣＧＡＧ－３’（配列番号６９６）、Ｄ６１４Ｇリバースプライマー５’－ＣＴＣＧＧＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＴＡＣＡＧＣＡＣＧＧＣ－３’（配列番号６９７）；Ａ７０１Ｖフォワードプライマー５’－ＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＴＣＧＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号６９８）、Ａ７０１Ｖリバースプライマー５’－ＧＧＣＣＡＣＧＣＴＡＴＴＣＴＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧ－３’（配列番号６９９））及びｐＨＬｓｅｃベクターの２つのプライマー（ｐＨＬｓｅｃフォワードプライマー５’－ＣＣＴＣＡＡＴＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＧＴＡＴＣＧＣＧ－３’（配列番号７００）、ｐＨＬｓｅｃリバースプライマー５’－ＣＧＣＧＡＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＡＧＧ－３’（配列番号７０１））を用いてＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ断片を、Ｇｉｂｓｏｎ反応（Ｇｉｂｓｏｎ，２０１１）によって一緒にジョイントした。新しい構築体を完全に配列決定した。
ＡＣＥ２及びＲＢＤ Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙのクローニング
ＡＣＥ２及びＲＢＤ Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙを、前述のように構築した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。簡潔には、ＡＣＥ２を、画像クローン（Ｓｏｕｒｃｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＩＤ：５２９７３８０）から、フォワードプライマー５’－ＧＣＧＴＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣ－３’（配列番号７０２）及びリバースプライマー５’－ＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＴＣ－３’（配列番号７０３）を用いて、ヒトＡＣＥ２のアミノ酸１９～６１５を増幅することによって構築して、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを組み込んでいるベクターｐＯＰＩＮＴＴＧｎｅｏ中に挿入した。
ＡＣＥ２及びＲＢＤ Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙを、前述のように構築した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。簡潔には、ＡＣＥ２を、画像クローン（Ｓｏｕｒｃｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，クローンＩＤ：５２９７３８０）から、フォワードプライマー５’－ＧＣＧＴＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣ－３’（配列番号７０２）及びリバースプライマー５’－ＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＴＣ－３’（配列番号７０３）を用いて、ヒトＡＣＥ２のアミノ酸１９～６１５を増幅することによって構築して、Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを組み込んでいるベクターｐＯＰＩＮＴＴＧｎｅｏ中に挿入した。
ＲＢＤ Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙを構築するために、ＲＢＤ Ｎ５０１Ｙ構築体を鋳型として用いて、且つＫ４１７Ｎプライマー（フォワード５’－ＣＡＧＧＧＣＡＧＡＣＣＧＧＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＴＴＡＣ－３’（配列番号６９０）、リバース５’－ＧＴＡＡＴＴＧＴＡＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧ－３’（配列番号６９１））、Ｅ４８４Ｋプライマー（フォワード５’－ＣＡＣＣＧＴＧＴＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＡＣ－３’（配列番号６９２）、リバース５’－ＧＴＡＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＡＣＡＣＧＧＴＧ－３’（配列番号６９３））及びｐＮＥＯベクターのプライマー（フォワード５’－ＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴ－３’（配列番号７０４）及びリバース５’－ＣＧＴＡＡＡＡＧＧＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧ－３’（配列番号７０５））を用いてＤＮＡ断片を増幅させた。３つのＰＣＲ断片を鋳型として用いて、ここでも、ｐＮＥＯベクタープライマーを用いて増幅させた。最終ＰＣＲ断片を制限酵素ＡｇｅＩ及びＫｐｎＩによって消化して、消化されたｐＮＥＯベクター中にライゲートした。この構築体を配列決定によって確認した。
タンパク質生成
タンパク質の発現及び精製を以前に記載されるように行った（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。簡潔には、プラスミドコーディングタンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）細胞内で一過的に発現させた。条件培地を、５ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐニッケルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により透析且つ精製して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨｉＬｏａｄ １６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに洗練した。
タンパク質の発現及び精製を以前に記載されるように行った（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。簡潔には、プラスミドコーディングタンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１１２６８）細胞内で一過的に発現させた。条件培地を、５ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐニッケルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により透析且つ精製して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨｉＬｏａｄ １６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに洗練した。
ＦＡＣＳによるベータＳ特異的単Ｂ細胞の単離
ベータＳ特異的単Ｂ細胞のソーティングを以前に記載されるように実行した（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）。簡潔には、ＰＢＭＣを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色してから、ベータの組換え三量体Ｓ－ツイン－Ｓｔｒｅｐを続けた。続いて細胞を、ＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ１４－ＦＩＴＣ、ＣＤ１６－ＦＩＴＣ、ＣＤ５６－ＦＩＴＣ、ＩｇＭ－ＦＩＴＣ、ＩｇＡ－ＦＩＴＣ、ＩｇＤ－ＦＩＴＣ、ＩｇＧ－ＢＶ７８６及びＣＤ１９－ＢＵＶ３９５と、ｓｔｒｅｐ－ＭＡｂ－ＤＹ５４９と共にインキュベートして、Ｓタンパク質のツインｓｔｒｅｐタグを染色した。ＩｇＧ＋メモリＢ細胞を、ＣＤ１９＋、ＩｇＧ＋、ＣＤ３－、ＣＤ１４－、ＣＤ５６－、ＣＤ１６－、ＩｇＭ－、ＩｇＡ－及びＩｇＤ－としてゲーティングして、Ｓ＋をさらに選択して、単一細胞を、１０μｌの捕捉バッファ（トリス、ヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ及びＲＮａｓｅ阻害剤）入り９６ウェルＰＣＲプレート中にソートした。プレートを２０００×ｇで１分間簡単に遠心分離して、ドライアイス上に置いてから－８０℃で保存した。
ベータＳ特異的単Ｂ細胞のソーティングを以前に記載されるように実行した（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）。簡潔には、ＰＢＭＣを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色してから、ベータの組換え三量体Ｓ－ツイン－Ｓｔｒｅｐを続けた。続いて細胞を、ＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ１４－ＦＩＴＣ、ＣＤ１６－ＦＩＴＣ、ＣＤ５６－ＦＩＴＣ、ＩｇＭ－ＦＩＴＣ、ＩｇＡ－ＦＩＴＣ、ＩｇＤ－ＦＩＴＣ、ＩｇＧ－ＢＶ７８６及びＣＤ１９－ＢＵＶ３９５と、ｓｔｒｅｐ－ＭＡｂ－ＤＹ５４９と共にインキュベートして、Ｓタンパク質のツインｓｔｒｅｐタグを染色した。ＩｇＧ＋メモリＢ細胞を、ＣＤ１９＋、ＩｇＧ＋、ＣＤ３－、ＣＤ１４－、ＣＤ５６－、ＣＤ１６－、ＩｇＭ－、ＩｇＡ－及びＩｇＤ－としてゲーティングして、Ｓ＋をさらに選択して、単一細胞を、１０μｌの捕捉バッファ（トリス、ヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ及びＲＮａｓｅ阻害剤）入り９６ウェルＰＣＲプレート中にソートした。プレートを２０００×ｇで１分間簡単に遠心分離して、ドライアイス上に置いてから－８０℃で保存した。
ベータＳ特異的ヒトｍＡｂのクローニング及び発現
以前に記載されるように、ベータＳ特異的ヒトｍＡｂをクローニングして、発現させた（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）。簡潔には、Ｉｇ ＶＨ、Ｉｇ Ｖκ及びＩｇ Ｖλについての遺伝子を、ＲＴ－ＰＣＲによってポジティブウェルから回収した。続いて、Ｉｇ ＶＨ、Ｉｇ Ｖκ及びＩｇ Ｖλをコードする遺伝子を、ヒトＩｇＧに特異的なプライマーのカクテルによるネストＰＣＲを用いて増幅させた。重鎖及び軽鎖のＰＣＲ産物を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ，２０１１）により、ヒトＩｇＧ１又は免疫グロブリンκ－鎖若しくはλ－鎖の発現ベクター中にライゲートした。ｍＡｂ発現のために、重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドを、ＰＥＩ－形質移入によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞株中に同時形質移入して、ｍＡｂを含有する上清を、形質移入の４～５日後に収集且つ濾過して、上清をさらに特徴付けたか又は精製した。
以前に記載されるように、ベータＳ特異的ヒトｍＡｂをクローニングして、発現させた（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）。簡潔には、Ｉｇ ＶＨ、Ｉｇ Ｖκ及びＩｇ Ｖλについての遺伝子を、ＲＴ－ＰＣＲによってポジティブウェルから回収した。続いて、Ｉｇ ＶＨ、Ｉｇ Ｖκ及びＩｇ Ｖλをコードする遺伝子を、ヒトＩｇＧに特異的なプライマーのカクテルによるネストＰＣＲを用いて増幅させた。重鎖及び軽鎖のＰＣＲ産物を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ，２０１１）により、ヒトＩｇＧ１又は免疫グロブリンκ－鎖若しくはλ－鎖の発現ベクター中にライゲートした。ｍＡｂ発現のために、重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドを、ＰＥＩ－形質移入によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞株中に同時形質移入して、ｍＡｂを含有する上清を、形質移入の４～５日後に収集且つ濾過して、上清をさらに特徴付けたか又は精製した。
Ｆａｂ発現プラスミドの構築
特異的ｍＡｂを発現する重鎖を鋳型として用いて、可変領域及びＣＨ１を含む重鎖ベクターをＦａｂプライマーによって増幅させた（フォワード５’－ＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＡＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣ－３’（配列番号７０６）、リバース５’－ＧＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧ－３’（配列番号７０７））。Ｆａｂ断片と重複する、トロンビン切断部位及びツイン－ｓｔｒｅｐタグを有する断片も増幅させた（フォワード５’－ＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＡＴＡＧＧＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧ－３’（配列番号７０８）、リバース５’－ＣＴＴＧＣＣＧＧＣＣＧＴＣＧＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧ－３’（配列番号７０９））。Ｆａｂ断片及びタグ断片をＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ，２０１１）によって結び付けて、完全プラスミドを配列決定した。
特異的ｍＡｂを発現する重鎖を鋳型として用いて、可変領域及びＣＨ１を含む重鎖ベクターをＦａｂプライマーによって増幅させた（フォワード５’－ＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＡＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＣＡＣ－３’（配列番号７０６）、リバース５’－ＧＴＧＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧ－３’（配列番号７０７））。Ｆａｂ断片と重複する、トロンビン切断部位及びツイン－ｓｔｒｅｐタグを有する断片も増幅させた（フォワード５’－ＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＡＧＡＡＡＴＡＧＧＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧ－３’（配列番号７０８）、リバース５’－ＣＴＴＧＣＣＧＧＣＣＧＴＣＧＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＧＡＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧ－３’（配列番号７０９））。Ｆａｂ断片及びタグ断片をＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ，２０１１）によって結び付けて、完全プラスミドを配列決定した。
ＩｇＧ ｍＡｂ及びＦａｂ精製
全長ＩｇＧ ｍＡｂを精製するために、ｍＡｂ発現の上清を、真空濾過器系によって収集且つ濾過して、プロテインＡ／Ｇビーズ上に４℃で一晩ロードした。ビーズをＰＢＳで３回洗浄して、０．１ＭグリシンｐＨ２．７を用いてＩｇＧを溶出した。溶出液を、トリスＨＣｌ ｐＨ８バッファで中和して、最終ｐＨ＝７にした。ＩｇＧ濃度を分光測光法によって求めて、ＰＢＳにバッファ交換した。
全長ＩｇＧ ｍＡｂを精製するために、ｍＡｂ発現の上清を、真空濾過器系によって収集且つ濾過して、プロテインＡ／Ｇビーズ上に４℃で一晩ロードした。ビーズをＰＢＳで３回洗浄して、０．１ＭグリシンｐＨ２．７を用いてＩｇＧを溶出した。溶出液を、トリスＨＣｌ ｐＨ８バッファで中和して、最終ｐＨ＝７にした。ＩｇＧ濃度を分光測光法によって求めて、ＰＢＳにバッファ交換した。
Ｆａｂを発現且つ精製するために、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖発現プラスミドを、Ｆｒｅｅ－スタイル２９３培地においてＰＥＩによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時形質移入した。５％ＣＯ２で３７℃において５日間培養した後、培養上清を、０．２２ｍｍポリエーテルスルホンフィルタを用いて収集且つ濾過した。Ｆａｂを、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴ精製系を用いて精製した。
ＩｇＧからのＦａｂの調製
Ｐｉｅｒｃｅ Ｆａｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、精製ＩｇＧからパパインによりＦａｂ断片を消化した。
Ｐｉｅｒｃｅ Ｆａｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、精製ＩｇＧからパパインによりＦａｂ断片を消化した。
ＥＬＩＳＡによる組換えＳ又はＲＢＤに結合するｍＡｂの判定
ベータについて、ＭＡＸＩＳＯＲＰイムノプレート（４４２４０４；ＮＵＮＣ）を、炭酸－重炭酸バッファによって４℃で一晩希釈した２．５μｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐＭＡＢ－Ｃｌａｓｓｉｃ（２－１５９７－００１；ｉｂａ）でコーティングした。プレートを、ＰＢＳによって溶解した２％ＢＳＡで１時間ブロックしてから、５０μｌの５μｇ／ｍｌデュアルＳｔｒｅｐ－タグ付きＳを各ウェルに加えて、室温で１時間インキュベートした。５０μｌのｍＡｂ発現上清又は段階希釈血漿に続いて、ＡＬＰ－コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ａ９５４４；Ｓｉｇｍａ）を１：１０，０００の希釈で加えた。プレートを、ＰＮＰＰ基質を加えることによって進めた。４０分後、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
ベータについて、ＭＡＸＩＳＯＲＰイムノプレート（４４２４０４；ＮＵＮＣ）を、炭酸－重炭酸バッファによって４℃で一晩希釈した２．５μｇ／ｍｌのＳｔｒｅｐＭＡＢ－Ｃｌａｓｓｉｃ（２－１５９７－００１；ｉｂａ）でコーティングした。プレートを、ＰＢＳによって溶解した２％ＢＳＡで１時間ブロックしてから、５０μｌの５μｇ／ｍｌデュアルＳｔｒｅｐ－タグ付きＳを各ウェルに加えて、室温で１時間インキュベートした。５０μｌのｍＡｂ発現上清又は段階希釈血漿に続いて、ＡＬＰ－コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ａ９５４４；Ｓｉｇｍａ）を１：１０，０００の希釈で加えた。プレートを、ＰＮＰＰ基質を加えることによって進めた。４０分後、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
組換えベータＲＢＤへの結合を判定するために、ＭＡＸＩＳＯＲＰイムノプレートを、５μｇ／ｍｌの精製組換えＲＢＤ－Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙで４℃において一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳによって溶解した２％ＢＳＡで１時間ブロックした。５０μｌのｍＡｂ発現上清又は段階希釈血漿の添加後の残りの手順は、Ｓ結合アッセイと同じである。
フォーカス減少中和（ＦＲＮＴ）
フォーカス減少中和試験を以前に記載されるように実行した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。簡潔には、段階希釈したＡｂを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ビクトリア、アルファ、ベータ、ガンマ、アルファ＋Ｅ４８４Ｋ、デルタ又はＢ．１．５２５と混合して、３７℃で１時間インキュベートした。混合液を、コンフルエントベロー細胞単層を含有する９６ウェル、細胞培養マイクロプレートに二反復で移して、２時間インキュベートしてから、１．５％半固体カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）オーバレイ培地を加えた。続いて、一次抗体としてのヒト抗ＮＰ ｍＡｂ（ｍＡｂ２０６）及び二次抗体としてのペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ａ０１７０；Ｓｉｇｍａ）でベロー細胞を染色することにより、フォーカス形成アッセイを実行した。最後に、ＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質を各ウェルに加えて、フォーカス（感染細胞）を視覚化した。ウイルス感染細胞フォーカスを、ＡＩＤ ＥＬＩＳｐｏｔソフトウェアを用いて、ｃｌａｓｓｉｃ ＡＩＤ ＥｌｉＳｐｏｔリーダーによりカウントした。
フォーカス減少中和試験を以前に記載されるように実行した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。簡潔には、段階希釈したＡｂを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ビクトリア、アルファ、ベータ、ガンマ、アルファ＋Ｅ４８４Ｋ、デルタ又はＢ．１．５２５と混合して、３７℃で１時間インキュベートした。混合液を、コンフルエントベロー細胞単層を含有する９６ウェル、細胞培養マイクロプレートに二反復で移して、２時間インキュベートしてから、１．５％半固体カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）オーバレイ培地を加えた。続いて、一次抗体としてのヒト抗ＮＰ ｍＡｂ（ｍＡｂ２０６）及び二次抗体としてのペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ａ０１７０；Ｓｉｇｍａ）でベロー細胞を染色することにより、フォーカス形成アッセイを実行した。最後に、ＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質を各ウェルに加えて、フォーカス（感染細胞）を視覚化した。ウイルス感染細胞フォーカスを、ＡＩＤ ＥＬＩＳｐｏｔソフトウェアを用いて、ｃｌａｓｓｉｃ ＡＩＤ ＥｌｉＳｐｏｔリーダーによりカウントした。
定量化及び統計分析。
統計分析を、結果及び図の説明に報告する。中和を、ＦＲＮＴによって測定した。フォーカス減少のパーセンテージを算出して、ＩＣ５０（ＦＲＮＴ５０）を、ＳＰＳＳパッケージのプロビットプログラムを用いて求めた。Ｗｉｌｃｏｘｏｎのマッチドペア符号順位検定を分析に用いて、両側Ｐ値を、幾何平均値に基づいて算出した。ＢＬＩデータを、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、１：１のフィッティングモデルで分析した。
統計分析を、結果及び図の説明に報告する。中和を、ＦＲＮＴによって測定した。フォーカス減少のパーセンテージを算出して、ＩＣ５０（ＦＲＮＴ５０）を、ＳＰＳＳパッケージのプロビットプログラムを用いて求めた。Ｗｉｌｃｏｘｏｎのマッチドペア符号順位検定を分析に用いて、両側Ｐ値を、幾何平均値に基づいて算出した。ＢＬＩデータを、Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、１：１のフィッティングモデルで分析した。
ＥＬＩＳＡによるＡＣＥ２結合阻害アッセイ
ＭＡＸＩＳＯＲＰイムノプレートを、５μｇ／ｍｌの精製ＡＣＥ２－Ｈｉｓタンパク質で４℃において一晩コーティングしてから、ＰＢＳ中２％ＢＳＡによってブロックした。一方、ｍＡｂを段階希釈して、２．５μｇ／ｍｌの組換えベータ三量体Ｓ－ツイン－Ｓｔｒｅｐと混合した。抗体－Ｓタンパク質混合液を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、混合液を、ＡＣＥ２でコーティングしたプレート中に移して、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＳｔｒｅｐＭＡＢ－Ｃｌａｓｓｉｃ（２－１５０７－００１，ｉｂａ）を、２％ＢＳＡによって０．２μｇ／ｍｌに希釈して一次抗体として、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ－ＡＰ（＃Ａ１６０９３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：２０００の希釈で用いた。反応を、ＰＮＰＰ基質を加えることによって進めて、ＮａＯＨにより止めた。吸光度を４０５ｎｍで測定した。ＡＣＥ２／Ｓ結合阻害を、抗体フリーの対照ウェルと比較することによって算出した。ＩＣ５０を、ＳＰＳＳパッケージのＰｒｏｂｉｔプログラムを用いて求めた。
ＭＡＸＩＳＯＲＰイムノプレートを、５μｇ／ｍｌの精製ＡＣＥ２－Ｈｉｓタンパク質で４℃において一晩コーティングしてから、ＰＢＳ中２％ＢＳＡによってブロックした。一方、ｍＡｂを段階希釈して、２．５μｇ／ｍｌの組換えベータ三量体Ｓ－ツイン－Ｓｔｒｅｐと混合した。抗体－Ｓタンパク質混合液を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、混合液を、ＡＣＥ２でコーティングしたプレート中に移して、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＳｔｒｅｐＭＡＢ－Ｃｌａｓｓｉｃ（２－１５０７－００１，ｉｂａ）を、２％ＢＳＡによって０．２μｇ／ｍｌに希釈して一次抗体として、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ－ＡＰ（＃Ａ１６０９３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１：２０００の希釈で用いた。反応を、ＰＮＰＰ基質を加えることによって進めて、ＮａＯＨにより止めた。吸光度を４０５ｎｍで測定した。ＡＣＥ２／Ｓ結合阻害を、抗体フリーの対照ウェルと比較することによって算出した。ＩＣ５０を、ＳＰＳＳパッケージのＰｒｏｂｉｔプログラムを用いて求めた。
ウイルス負荷の測定。
組織を計量して、２％の熱不活化ＦＢＳを補充した１，０００μＬのＤＭＥＭ培地中で、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ機器（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）によりジルコニアビーズとホモジナイズした。組織ホモジネートを、１０，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって清澄化して、－８０℃で保存した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ抽出ロボット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ＭａｇＭａｘ ｍｉｒＶａｎａ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡを抽出した。ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ＲＮＡを逆転写して増幅させた。逆転写を、４８℃で１５分間に続いて９５℃で２分間実行した。増幅を以下のように５０サイクルにわたって達成した：９５℃１５秒間及び６０℃１分間。試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子ＲＮＡのコピーを、以前に公開されたアッセイ（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）を用いて判定した。簡潔には、ＴａｑＭａｎアッセイを、Ｎ遺伝子の高度に保存された領域を標的とするように設計した（フォワードプライマー：ＡＴＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡ（配列番号７１０）；リバースプライマー：ＧＡＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣ（配列番号７１１）；プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＴＣＡＡＧＧＡＡＣ／ＺＥＮ／ＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号７１２））。この領域をＲＮＡ標準に含めて、１反応あたり最少１０コピーのコピー数決定を可能にした。反応混合液は、それぞれ５００及び１００ｎＭの最終濃度のプライマー及びプローブを含有した。
組織を計量して、２％の熱不活化ＦＢＳを補充した１，０００μＬのＤＭＥＭ培地中で、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ機器（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）によりジルコニアビーズとホモジナイズした。組織ホモジネートを、１０，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって清澄化して、－８０℃で保存した。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ抽出ロボット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ＭａｇＭａｘ ｍｉｒＶａｎａ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡを抽出した。ＴａｑＭａｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、ＲＮＡを逆転写して増幅させた。逆転写を、４８℃で１５分間に続いて９５℃で２分間実行した。増幅を以下のように５０サイクルにわたって達成した：９５℃１５秒間及び６０℃１分間。試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｎ遺伝子ＲＮＡのコピーを、以前に公開されたアッセイ（Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｈａｓｓａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）を用いて判定した。簡潔には、ＴａｑＭａｎアッセイを、Ｎ遺伝子の高度に保存された領域を標的とするように設計した（フォワードプライマー：ＡＴＧＣＴＧＣＡＡＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡ（配列番号７１０）；リバースプライマー：ＧＡＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣ（配列番号７１１）；プローブ：／５６－ＦＡＭ／ＴＣＡＡＧＧＡＡＣ／ＺＥＮ／ＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／（配列番号７１２））。この領域をＲＮＡ標準に含めて、１反応あたり最少１０コピーのコピー数決定を可能にした。反応混合液は、それぞれ５００及び１００ｎＭの最終濃度のプライマー及びプローブを含有した。
Ｐ値がＰｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて＜０．０５であった場合、統計学的有意性を割り付けた。試験、動物の数、メジアン値及び統計学的比較群を、各図の説明において示す。体重変化の分析を、ＡＮＯＶＡ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｏｃｓｃｉｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｔｅｓｔｓ／ａｎｏｖａ／ｄｅｆａｕｌｔ２．ａｓｐｘによって判定した。ウイルス負荷の変化を、対照抗体処理動物と比較して、多重比較試験による一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した。
バイオレイヤーインターフェロメトリ（ＢＬＩ）
ＢＬＩ実験をＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６ｅ機械（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）で実行した。抗ベータＲＢＤ抗体の競合アッセイを、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｎｉ－ＮＴＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒで実行した。ランニングバッファ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に溶解したＨｉｓタグ付きベータＲＢＤをリガンドとして用いて、バイオセンサー上に最初に固定した。続いて、バイオセンサーをランニングバッファで洗浄して、結合していないＲＢＤを除去した。各バイオセンサーを、異なる飽和抗体（Ａｂ１）中に浸して、結合したＲＢＤを飽和させたが、一バイオセンサーを、この工程において参照としての機能を果たすランニングバッファ中に浸すことを除く。続いて、全てのバイオセンサーを、ここでも、ランニングバッファで洗浄して、同じ競合抗体（Ａｂ２）を含有するウェル中に浸した。この工程における異なる飽和抗体のシグナルのｙ軸値を、参照チャンネルの値で除して、様々なＡｂ１－Ａｂ２対の比率結果を得た。０に近い比率結果は完全な競合を示した一方、１は競合なしを示した。
ＢＬＩ実験をＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６ｅ機械（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）で実行した。抗ベータＲＢＤ抗体の競合アッセイを、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｎｉ－ＮＴＡ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒで実行した。ランニングバッファ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に溶解したＨｉｓタグ付きベータＲＢＤをリガンドとして用いて、バイオセンサー上に最初に固定した。続いて、バイオセンサーをランニングバッファで洗浄して、結合していないＲＢＤを除去した。各バイオセンサーを、異なる飽和抗体（Ａｂ１）中に浸して、結合したＲＢＤを飽和させたが、一バイオセンサーを、この工程において参照としての機能を果たすランニングバッファ中に浸すことを除く。続いて、全てのバイオセンサーを、ここでも、ランニングバッファで洗浄して、同じ競合抗体（Ａｂ２）を含有するウェル中に浸した。この工程における異なる飽和抗体のシグナルのｙ軸値を、参照チャンネルの値で除して、様々なＡｂ１－Ａｂ２対の比率結果を得た。０に近い比率結果は完全な競合を示した一方、１は競合なしを示した。
ベータＲＢＤとのｍＡｂの結合親和性を測定するために、ＲＢＤを、ＡＲ２Ｇバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）上に固定して、ｍＡｂを分析物として用いた。全ての実験を３０℃で実行した。データを、ソフトウェアＤａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ １１．１（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）及びＤａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ １１．１（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて記録し、１：１のフィッティングモデルを分析に用いた。
バイオレイヤーインターフェロメトリ競合データに基づく抗体マッピング
手順は、以前に記載される（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）プログラムＭａｂｓｃａｐｅを用いた。手短に言えば：競合値を、０～１の全ての競合値をキャッピングすることによって用意した。抗体ｉとｊ間の競合値は、両方とも入手可能であった場合、ｊ及びｉについての競合値で平均をとった。受容体結合ドメインの表面を、ＰＤＢコード６ＹＬＡの鎖Ｅから、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １．２ｒ３ｐｒｅ，Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）により生成した。メッシュを生成して、ＲＢＤの表面に対して繰り返し縮小且つ制約して、Ｍａｂｓｃａｐｅでより滑らかな表面を提供した。知られている構造の抗体について固定した位置を、原子座標から客観的に算出して、以前に記載されるように（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）、メッシュ上の最も近い頂点（ＦＤ５Ｄ（未発表）、ＥＹ６Ａ（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、Ｓ３０９（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０）並びにｍＡｂ ４５、７５、１５０及び２５３）にロックした。加えて、ｍＡｂ ５５、５８及び６１（以前の研究から与えられた予測位置）をこれらの予測位置に固定して、ベータ抗体のマッピングを促進した。
手順は、以前に記載される（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）プログラムＭａｂｓｃａｐｅを用いた。手短に言えば：競合値を、０～１の全ての競合値をキャッピングすることによって用意した。抗体ｉとｊ間の競合値は、両方とも入手可能であった場合、ｊ及びｉについての競合値で平均をとった。受容体結合ドメインの表面を、ＰＤＢコード６ＹＬＡの鎖Ｅから、ＰｙＭＯＬ（Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １．２ｒ３ｐｒｅ，Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ）により生成した。メッシュを生成して、ＲＢＤの表面に対して繰り返し縮小且つ制約して、Ｍａｂｓｃａｐｅでより滑らかな表面を提供した。知られている構造の抗体について固定した位置を、原子座標から客観的に算出して、以前に記載されるように（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）、メッシュ上の最も近い頂点（ＦＤ５Ｄ（未発表）、ＥＹ６Ａ（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、Ｓ３０９（Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０）並びにｍＡｂ ４５、７５、１５０及び２５３）にロックした。加えて、ｍＡｂ ５５、５８及び６１（以前の研究から与えられた予測位置）をこれらの予測位置に固定して、ベータ抗体のマッピングを促進した。
構造が知られているベータ抗体も原子座標（ＳＡ０６、ＳＡ２２、ＳＡ２４、ＳＡ２７、ＳＡ４４、ＳＡ４７、ＳＡ５３、ＳＡ５４）に従ってロックした。目的関数は、競合推定値とＳＰＲデータ由来の競合値との間の二乗差の合計であった。最小化を、ＬＢＦＧＳリファインメントを用いる１０００マクロサイクルによって全体的に実行した。抗体についての出発位置を、ＲＢＤメッシュ上の出発頂点を無作為割付けすることによって生成して、目標関数を、少なくとも１つの固定抗体との対についてのデータポイントを考慮する２０サイクルに続く、全てのデータポイントについての４０サイクルについて、最小にした。各サイクル間で、抗体位置を、最も近いメッシュ頂点上にロックした。抗体毎の平均位置を、他の試料収集した位置毎に対して最低二乗平均距離を有する試料収集した位置として選択して、ＲＭＳＤを、抗体位置に寄与する全てから算出した（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ；Ｇｉｎｎ，２０２０）。
結晶化
エンドグリコシダーゼＨ１を、精製したベータＲＢＤに添加して、グリカンを除去した。ベータＲＢＤを、ベータ－２２、２４、２７、３８、４０及び４７のＦａｂと、１：１のモル比で別々に混合して、最終濃度を１３．０ｍｇ ｍｌ－１にした。ベータＲＢＤを、ベータ－６及びＣＯＶＯＸ－４５ Ｆａｂ、ベータ－５３及びベータ－２９ Ｆａｂ、ベータ－５４及びベータ－３７ Ｆａｂ並びにベータ－５４及びベータ－４４ Ｆａｂと、１：１：１のモル比で組み合わせて、全て最終濃度を別々に７ｍｇ ｍｌ－１にした。これらの複合体を室温で３０分間別々にインキュベートした。３５ｍｇ ｍｌ－の濃度のベータ－３２ Ｆａｂも結晶化に用いた。以前に記載されるように（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、結晶の最初のスクリーニングを、ナノリットルシッティング－ドロップ蒸気拡散法を用いるＣａｒｔｅｓｉａｎ ＲｏｂｏｔによるＣｒｙｓｔａｌｑｕｉｃｋ ９６ウェルＸプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）においてセットアップし、各ドロップにおいて、１００ｎＬのタンパク質プラス１００ｎＬのリザーバーを有した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－２２ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．２Ｍ硫酸リチウム、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０及び２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ４０００を含有するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ Ｐｒｏｐｌｅｘ条件１－２８で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－２４ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．２Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ＭトリスｐＨ７．５及び２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ５０００ ＭＭＥを含有するＰｒｏｐｌｅｘ条件１－４０で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－２７ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．２Ｍヨウ化カリウム、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５及び２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ４０００を含有するＰｒｏｐｌｅｘ条件１－３６で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－３８ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．８Ｍリン酸ナトリウム／カリウムｐＨ７．５を含有するＰｒｏｐｌｅｘ条件２－３２で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－４０ Ｆａｂ複合体の結晶を、１２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ １０００、１２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３３５０、１２．５％（ｖ／ｖ）ＭＰＤ、０．０２Ｍの各カルボン酸及び０．１Ｍ ＭＥＳ／イミダゾールｐＨ６．５を含有するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ Ｍｏｒｐｈｅｕｓ ２－２８条件で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－４７ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．１Ｍ塩化カリウム、０．１Ｍ トリスｐＨ８．０及び１５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ２０００ ＭＭＥを含有するＰｒｏｐｌｅｘ条件１－１０で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－６／ＣＯＶＯＸ－４５複合体の結晶を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム三塩基二水和物ｐＨ５．０及び１８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ２００００を含有するＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＥＧＲｘ条件１－４６で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－５３／ベータ－２９複合体の結晶を、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ ＢＩＳ－ＴＲＩＳ ｐＨ６．５及び１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含有するＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｄｅｘ条件３０で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－５４／ベータ－３７複合体の結晶を、０．１５Ｍ硫酸リチウム一水和物、０．１Ｍクエン酸ｐＨ３．５及び１８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ６０００を含有するＰＥＧＲｘ条件２－３５で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－５４／ベータ－４４複合体の結晶を、０．１Ｍクエン酸ｐＨ３．５及び２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３３５０を含有するＰＥＧＲｘ条件１－２８で形成した。ベータ－３２ Ｆａｂの結晶を、２．１Ｍ ＤＬ－リンゴ酸ｐＨ７．０を含有するＩｎｄｅｘ条件２３で形成した。
エンドグリコシダーゼＨ１を、精製したベータＲＢＤに添加して、グリカンを除去した。ベータＲＢＤを、ベータ－２２、２４、２７、３８、４０及び４７のＦａｂと、１：１のモル比で別々に混合して、最終濃度を１３．０ｍｇ ｍｌ－１にした。ベータＲＢＤを、ベータ－６及びＣＯＶＯＸ－４５ Ｆａｂ、ベータ－５３及びベータ－２９ Ｆａｂ、ベータ－５４及びベータ－３７ Ｆａｂ並びにベータ－５４及びベータ－４４ Ｆａｂと、１：１：１のモル比で組み合わせて、全て最終濃度を別々に７ｍｇ ｍｌ－１にした。これらの複合体を室温で３０分間別々にインキュベートした。３５ｍｇ ｍｌ－の濃度のベータ－３２ Ｆａｂも結晶化に用いた。以前に記載されるように（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、結晶の最初のスクリーニングを、ナノリットルシッティング－ドロップ蒸気拡散法を用いるＣａｒｔｅｓｉａｎ ＲｏｂｏｔによるＣｒｙｓｔａｌｑｕｉｃｋ ９６ウェルＸプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ）においてセットアップし、各ドロップにおいて、１００ｎＬのタンパク質プラス１００ｎＬのリザーバーを有した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－２２ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．２Ｍ硫酸リチウム、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．０及び２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ４０００を含有するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ Ｐｒｏｐｌｅｘ条件１－２８で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－２４ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．２Ｍ硫酸アンモニウム、０．１ＭトリスｐＨ７．５及び２０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ５０００ ＭＭＥを含有するＰｒｏｐｌｅｘ条件１－４０で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－２７ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．２Ｍヨウ化カリウム、０．１Ｍ ＭＥＳ ｐＨ６．５及び２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ４０００を含有するＰｒｏｐｌｅｘ条件１－３６で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－３８ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．８Ｍリン酸ナトリウム／カリウムｐＨ７．５を含有するＰｒｏｐｌｅｘ条件２－３２で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－４０ Ｆａｂ複合体の結晶を、１２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ １０００、１２．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３３５０、１２．５％（ｖ／ｖ）ＭＰＤ、０．０２Ｍの各カルボン酸及び０．１Ｍ ＭＥＳ／イミダゾールｐＨ６．５を含有するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ Ｍｏｒｐｈｅｕｓ ２－２８条件で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－４７ Ｆａｂ複合体の結晶を、０．１Ｍ塩化カリウム、０．１Ｍ トリスｐＨ８．０及び１５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ２０００ ＭＭＥを含有するＰｒｏｐｌｅｘ条件１－１０で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－６／ＣＯＶＯＸ－４５複合体の結晶を、０．１Ｍクエン酸ナトリウム三塩基二水和物ｐＨ５．０及び１８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ２００００を含有するＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＥＧＲｘ条件１－４６で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－５３／ベータ－２９複合体の結晶を、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ ＢＩＳ－ＴＲＩＳ ｐＨ６．５及び１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含有するＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｄｅｘ条件３０で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－５４／ベータ－３７複合体の結晶を、０．１５Ｍ硫酸リチウム一水和物、０．１Ｍクエン酸ｐＨ３．５及び１８％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ６０００を含有するＰＥＧＲｘ条件２－３５で形成した。ベータ－ＲＢＤ／ベータ－５４／ベータ－４４複合体の結晶を、０．１Ｍクエン酸ｐＨ３．５及び２５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ３３５０を含有するＰＥＧＲｘ条件１－２８で形成した。ベータ－３２ Ｆａｂの結晶を、２．１Ｍ ＤＬ－リンゴ酸ｐＨ７．０を含有するＩｎｄｅｘ条件２３で形成した。
Ｘ線データ収集、構造決定及びリファインメント
結晶を環状にマウントして、２５％グリセロール及び７５％母液を含有する溶液中に一瞬浸してから、液体窒素中で凍結させた。回折データを、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ，ＵＫのビームラインＩ０３で１００Ｋにおいて収集した。全てのデータを、管理されてない自動化データ収集を可能にする自動化キュー系の一部として収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｉａｍｏｎｄ．ａｃ．ｕｋ／Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｍｘ／Ｉ０３／Ｉ０３－Ｍａｎｕａｌ／Ｕｎａｔｔｅｎｄｅｄ－Ｄａｔａ－Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌ）。０．１°回転の回折像を、Ｅｉｇｅｒ２ Ｘｅ １６Ｍディテクタ（１画像あたり０．００４～０．０１ｓの露光時間、ビームサイズ８０×２０μｍ、３０％のビーム透過率及び０．９７６３Åの波長）により記録した。データにインデックスを付して、集積して、スケール化した。３６０°のデータを各結晶から収集した。ベータ－３２ Ｆａｂのデータセットを４つの結晶から統合し、ベータ－２２及びベータ－２４とのベータＲＢＤ複合体についてのデータセットをそれぞれ３つの結晶から統合し、ベータ－２７及びベータ－２９－ベータ－５３をそれぞれ２つの結晶から統合し、残りをそれぞれ単結晶から統合した。構造を、分子置換によって決定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ－ＲＢＤ－ＥＹ６Ａ－２２２複合体（ＰＤＢ ＩＤ ７ＮＸＡ）（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ｂ；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）のベータ－ＲＢＤ、以前に決定したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ／Ｆａｂ構造（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ；Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ｂ；Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｓｕｐａｓａ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）に対して配列類似性が最大のＶｈＶｌ及びＣｈＣｌドメインを、現在の構造決定毎の検索モデルとして用いた。モデル再建及びリファインメントを、全ての構造に用いた。
結晶を環状にマウントして、２５％グリセロール及び７５％母液を含有する溶液中に一瞬浸してから、液体窒素中で凍結させた。回折データを、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ，ＵＫのビームラインＩ０３で１００Ｋにおいて収集した。全てのデータを、管理されてない自動化データ収集を可能にする自動化キュー系の一部として収集した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｉａｍｏｎｄ．ａｃ．ｕｋ／Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｍｘ／Ｉ０３／Ｉ０３－Ｍａｎｕａｌ／Ｕｎａｔｔｅｎｄｅｄ－Ｄａｔａ－Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌ）。０．１°回転の回折像を、Ｅｉｇｅｒ２ Ｘｅ １６Ｍディテクタ（１画像あたり０．００４～０．０１ｓの露光時間、ビームサイズ８０×２０μｍ、３０％のビーム透過率及び０．９７６３Åの波長）により記録した。データにインデックスを付して、集積して、スケール化した。３６０°のデータを各結晶から収集した。ベータ－３２ Ｆａｂのデータセットを４つの結晶から統合し、ベータ－２２及びベータ－２４とのベータＲＢＤ複合体についてのデータセットをそれぞれ３つの結晶から統合し、ベータ－２７及びベータ－２９－ベータ－５３をそれぞれ２つの結晶から統合し、残りをそれぞれ単結晶から統合した。構造を、分子置換によって決定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ベータ－ＲＢＤ－ＥＹ６Ａ－２２２複合体（ＰＤＢ ＩＤ ７ＮＸＡ）（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ｂ；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）のベータ－ＲＢＤ、以前に決定したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ／Ｆａｂ構造（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ；Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ｂ；Ｈｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｓｕｐａｓａ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）に対して配列類似性が最大のＶｈＶｌ及びＣｈＣｌドメインを、現在の構造決定毎の検索モデルとして用いた。モデル再建及びリファインメントを、全ての構造に用いた。
クライオＥＭグリッド調製
ｆａｂと共にＳ約１．２μｍ（６：１のモル比）の３μＬアリコートを調製して、アスピレートして、フレッシュにグロー放電されたＡｕｆｌａｔ２／２－２００メッシュホーリーグリッド（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ、ｍＡｂ ２２２の場合にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓが供給）又は残りのｆａｂ－Ｓ複合体の場合にはＣ－フラット２００メッシュ２／１グリッドにほぼ直ちにアプライした（高強度、２０秒、Ｐｌａｓｍａ Ｃｌｅａｎｅｒ ＰＤＣ－００２－ＣＥ，Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ）。過剰な液体を、４．５℃、１００％と報告される湿度でｖｉｔｒｏｂｏｔ濾紙（グレード５９５、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）を用いて－１の力で５秒間のブロッティングによって除去してから、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて液体エタン中にプランジ凍結させた。Ｆａｂ／スパイク複合体を、グリッドへのアプリケーション及びプランジ凍結の前に、１０～３０分間インキュベートした。
ｆａｂと共にＳ約１．２μｍ（６：１のモル比）の３μＬアリコートを調製して、アスピレートして、フレッシュにグロー放電されたＡｕｆｌａｔ２／２－２００メッシュホーリーグリッド（Ｐｒｏｔｏｃｈｉｐｓ、ｍＡｂ ２２２の場合にはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓが供給）又は残りのｆａｂ－Ｓ複合体の場合にはＣ－フラット２００メッシュ２／１グリッドにほぼ直ちにアプライした（高強度、２０秒、Ｐｌａｓｍａ Ｃｌｅａｎｅｒ ＰＤＣ－００２－ＣＥ，Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ）。過剰な液体を、４．５℃、１００％と報告される湿度でｖｉｔｒｏｂｏｔ濾紙（グレード５９５、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）を用いて－１の力で５秒間のブロッティングによって除去してから、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて液体エタン中にプランジ凍結させた。Ｆａｂ／スパイク複合体を、グリッドへのアプリケーション及びプランジ凍結の前に、１０～３０分間インキュベートした。
クライオＥＭデータ収集
ベータ－Ｓ／ベータ－４４ Ｆａｂ及びベータ－Ｓ／ｍＡｂ ２２２
Ｆａｂデータを、ｓｅｌｅｃｔｒｉｓエネルギーフィルタによるＦａｌｃｏｎ－ＩＶディテクタを備える３００ｋＶ Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ顕微鏡上のＥＰＵを用いてＥＥＲフォーマットで収集した。ベータ－４４について、５０μｍアパーチャ、１００ｍ対物レンズを使用した。総計２０Ｋの動画を、ＥＥＲフォーマットでフリンジフリー照明により４５ｅ／Å２の総用量で記録し、ピクセルサイズは０．５Å／ｐｉｘであった。
ベータ－Ｓ／ベータ－４４ Ｆａｂ及びベータ－Ｓ／ｍＡｂ ２２２
Ｆａｂデータを、ｓｅｌｅｃｔｒｉｓエネルギーフィルタによるＦａｌｃｏｎ－ＩＶディテクタを備える３００ｋＶ Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ顕微鏡上のＥＰＵを用いてＥＥＲフォーマットで収集した。ベータ－４４について、５０μｍアパーチャ、１００ｍ対物レンズを使用した。総計２０Ｋの動画を、ＥＥＲフォーマットでフリンジフリー照明により４５ｅ／Å２の総用量で記録し、ピクセルサイズは０．５Å／ｐｉｘであった。
ベータ－Ｓ／ベータ－６、２６、３２、５３
圧縮したｔｉｆフォーマット動画を、２０ｅＶスリット（Ｇａｔａｎ）を備えるＫ２ディテクタにより３００ｋＶで作動するＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、１６５ｋＸの名目上の倍率（０．８２Å／ｐｉｘの較正ピクセルサイズに相当）及び０．８～２．６μｍの焦点はずし範囲で得た。ＳＡ０２６、ＳＡ０３２及びＳＡ０５３について、動画を、１０ｅＶスリット及び７０μｍ Ｃ２アパーチャを別にして、ＳＡ００６についてのＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によっても得た。
圧縮したｔｉｆフォーマット動画を、２０ｅＶスリット（Ｇａｔａｎ）を備えるＫ２ディテクタにより３００ｋＶで作動するＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により、１６５ｋＸの名目上の倍率（０．８２Å／ｐｉｘの較正ピクセルサイズに相当）及び０．８～２．６μｍの焦点はずし範囲で得た。ＳＡ０２６、ＳＡ０３２及びＳＡ０５３について、動画を、１０ｅＶスリット及び７０μｍ Ｃ２アパーチャを別にして、ＳＡ００６についてのＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によっても得た。
クライオＥＭデータ分析
Ｂ．１．１３５ ａｐｏを別として全てのデータセットについて、収集した動画を４タイムビンして、モーション及びｃｔｆを補正した。粒子を最初に、ｂｌｏｂ－ピッカーモジュールにより選択してから、この最初のセットの２Ｄ分類由来のスパイク様粒子を鋳型ベースの選抜のための鋳型として用いた。
Ｂ．１．１３５ ａｐｏを別として全てのデータセットについて、収集した動画を４タイムビンして、モーション及びｃｔｆを補正した。粒子を最初に、ｂｌｏｂ－ピッカーモジュールにより選択してから、この最初のセットの２Ｄ分類由来のスパイク様粒子を鋳型ベースの選抜のための鋳型として用いた。
ｍＡｂ ２２２ Ｆａｂを有するベータＳ
２－タイムビンした動画をモーション補正して、５×５パッチベースのアラインメントによりアラインした。続いて、アラインした動画をプロセシングした。ＣｏＶＯｘ－２２２について、ｆａｂ／ＲＢＤ位置と、より高い解像度の結晶構造のものとの間で、強い一致を観察した。大部分の粒子は、「２アップ」構成であり、両方の上向きＲＢＤが２２２ ｆａｂと係合していた。ＲＢＤ／２２２複合体の結晶学的構造の優れた解像度を考えると、原子レベルの詳細を、代わりにこの構造により評価した。
２－タイムビンした動画をモーション補正して、５×５パッチベースのアラインメントによりアラインした。続いて、アラインした動画をプロセシングした。ＣｏＶＯｘ－２２２について、ｆａｂ／ＲＢＤ位置と、より高い解像度の結晶構造のものとの間で、強い一致を観察した。大部分の粒子は、「２アップ」構成であり、両方の上向きＲＢＤが２２２ ｆａｂと係合していた。ＲＢＤ／２２２複合体の結晶学的構造の優れた解像度を考えると、原子レベルの詳細を、代わりにこの構造により評価した。
最初のモデルを生成するために、堆積したクライオＥＭベータ２－ＲＢＤアップスパイクモデル（ＰＤＢ：７ｌｙｋ）を、局所的にフィルタリングしたマップに剛体フィットさせてから、Ｎ５０１Ｙ－ｍＡｂ ２２２（ＰＤＢ：７ｎｘ９）の結晶構造を最初に、マップへの剛体フィッティング前の上向きＲＢＤ上に重ね合わせた。続いて、ＳＡ０２２を有する結晶構造（残基３３４～５１５）由来のベータＲＢＤのみのモデルを、Ｎ５０１Ｙ－ｍＡｂ－２２２ ＲＢＤ構造とアラインして、ｍＡｂ ２２２ ｆａｂと組み合わせた。続いて、このＲＢＤ／ｆａｂモデルを、マップに剛体フィットさせてから、スパイクモデルと統合した。
ベータ－６を有するベータＳ
クライオｓｐａｒｃのＮｕリファインモジュールを用いて、６９１０枚の顕微鏡写真由来の総計７９９０５個の粒子を、最終３Ｄ再建に用いた（４．６Å解像度（ＦＳＣ＝０．１４３、クライオｓｐａｒｃ）まで、推定ｂ因子－１７５．５）。スパイク／Ｆａｂ間及び隣接するＦａｂ間のインターフェースをさらに解像するために、追加の局所的変動性及び局所的リファインメントプロセシングを実行した。加えて、粒子を、３Ｄ分類のために、アラインメントなしで、Ｆａｂ／ＲＢＤ領域周りのマスクと共にエクスポートした。結果として生じた５つのクラスは、３Ｄ変動性分析に従って、Ｆａｂ／ＲＢＤ間で少量の移動を示した。
クライオｓｐａｒｃのＮｕリファインモジュールを用いて、６９１０枚の顕微鏡写真由来の総計７９９０５個の粒子を、最終３Ｄ再建に用いた（４．６Å解像度（ＦＳＣ＝０．１４３、クライオｓｐａｒｃ）まで、推定ｂ因子－１７５．５）。スパイク／Ｆａｂ間及び隣接するＦａｂ間のインターフェースをさらに解像するために、追加の局所的変動性及び局所的リファインメントプロセシングを実行した。加えて、粒子を、３Ｄ分類のために、アラインメントなしで、Ｆａｂ／ＲＢＤ領域周りのマスクと共にエクスポートした。結果として生じた５つのクラスは、３Ｄ変動性分析に従って、Ｆａｂ／ＲＢＤ間で少量の移動を示した。
完全スパイクマップについて、本発明者らの結晶構造をベータ２－アップスパイクのもの（ＰＤＢ：７ｌｙｋ）と組み合わせることによってモデルを作製し、各々、局所的にフィルタリングしたクライオＥＭマップに剛体フィットさせた。続いて、これらのモデルをｃｏｏｔで組み合わせてから、さらに剛体フィットさせた。
良好な一致が、ベータ－Ｓのみ及びベータ－６ Ｆａｂの結晶構造と、ＦａｂデコレートＲＢＤダウン隣接、またデコレートＲＢＤアップ領域（このループの僅かなリパッキングを両方のＦａｂについて観察した４７２～４９２間の領域を除く）にフォーカスした、局所的にリファインしたマップとの間で見出された。しかしながら、マップの質は、この領域において、マップのこの領域の処理の際に、ループ内の明らかな僅かなねじれを確実にリモデル化するにはあまりに悪かった（とりわけＦａｂ ＣＤＲループが十分にモデル化されていないためである）。
結晶学的構造分析から推測されるＲＢＤプラスベータ－６間の記載される接触に加えて、ｆａｂ－デコレートＲＢＤダウンの定常重ドメインの残基Ｓ２０２／２０３は、隣接重可変ドメインの残基Ｓ６６／Ｇ６７に「キスしている」ように見える。この相互作用は、当然のことながら、完全抗体に対してｆａｂの比較的小さいサイズの人為結果であるが、架橋ｆａｂのための潜在的部位となり得、これによりこれらの２つの部位にＳ→Ｃ変異が挿入され得る。
ベータ－２６粒子を有するベータＳを最初にクライオｓｐａｒｃフレームワーク内でｂｌｏｂ－ピッカーモジュールにより選択してから、鋳型を選択し、そこで総計２２４，６０９個の粒子を選択した。続いて、露光をさらに管理して、選択した粒子を２回分類して、明確な「枝角」様拡張部が、Ｆａｂデコレートされたスパイクと一致した一セットの粒子が生じた。初めから、続く３つのクラスへの異種リファインメントにより、インタクトＦａｂデコレートスパイクを有する５０，８７８個の粒子を含有する一クラスが産出された。
４．０４Åにリファインした最終的な分類粒子セットは、解像度（－１０１．１のｂ因子）、Ｃ１左右対称を、且つ３．６３Åでは解像度（－１１０．３のｂ因子）、Ｃ３左右対称を報告した。明確な３アップスパイク構成を見ることができ、ＲＢＤは、抗ビクトリアｍＡｂ ８８（Ｄｅｊｎｉｒａｔｔｉｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１ａ）のものと類似する「ストレートアップ」位置に配置され、密度は、首－左肩ＲＢＤ領域のｆａｂ可変ドメインと同程度であった。Ｃ１及びＣ３対称マップの両方について、Ｆａｂ密度は、低い等高線レベルで明確であったが、２つのＦａｂは、左右対称が課されなかった場合、３つ目よりも良好に明確に示されて、重鎖のＮ末端領域に接触しているように見えた。「単独の」ＲＢＤ－ｆａｂは、その隣から離れてさらに後方に位置しており、最も近いＮ末端ドメインから離れてねじられていた。これは、クラスターが３つ目よりも近くで一緒の状態にあるように２つのＦａｂを示すクラスター分析と一致していた。
ＲＢＤ／Ｆａｂインターフェースをより十分に解像するために、局所的リファインメントを、２つのキスＦａｂ、交差ＮＴＤ及び関連ＲＢＤにより、且つまた１つのＦａｂ／ＲＢＤ／ＮＴＤ単独に実行した（このためのマスク生成の手順を以下のベータ－３２サブセクションで説明する）。ｆａｂ／ＲＢＤインターフェースの質を幾分向上させるが（補足を参照されたい）、これは、ＲＢＤとＣＤＲのループ間の重要な相互作用をモデル化して評価するには、依然として不十分であった。
ベータ－３２を有するベータ－Ｓ
総計８５６１９２個の粒子を、総計８１７７個のアラインした動画からｂｌｏｂ－ピック由来の鋳型を従来通り用いて選択した。続いて、粒子を、（初めにモデルを用いて）４つのクラスへの３ｄ分類の前に２ｄによってフィルタリングして、明確なｆａｂデコレーションを支持する５４，９３２個のスパイク様粒子のサブセットが生じた。この粒子セットをアラインすると、困難に直面した。これは、強いｆａｂシグナルに潜在的に起因する。最初の非均一リファインメントを（５．２Åの解像度まで）実行した。続いて、これを用いて、スパイク（４．５Å）のより整った内部部分上での集中的リファインメントを実行してから、これを以降の局所的変動性分析及び局所的リファインメントの基礎として用いた。初めのモデルの有無によるさらなる全体的な分類は、個々のスパイク集団を抽出できなかった。
総計８５６１９２個の粒子を、総計８１７７個のアラインした動画からｂｌｏｂ－ピック由来の鋳型を従来通り用いて選択した。続いて、粒子を、（初めにモデルを用いて）４つのクラスへの３ｄ分類の前に２ｄによってフィルタリングして、明確なｆａｂデコレーションを支持する５４，９３２個のスパイク様粒子のサブセットが生じた。この粒子セットをアラインすると、困難に直面した。これは、強いｆａｂシグナルに潜在的に起因する。最初の非均一リファインメントを（５．２Åの解像度まで）実行した。続いて、これを用いて、スパイク（４．５Å）のより整った内部部分上での集中的リファインメントを実行してから、これを以降の局所的変動性分析及び局所的リファインメントの基礎として用いた。初めのモデルの有無によるさらなる全体的な分類は、個々のスパイク集団を抽出できなかった。
ベータ－３２について、ブラスト検索を、Ｈ鎖及びＬ鎖について行って、最初のモデルを、とりわけループ領域について、配列カバー率に基づいて選択した。Ｈ鎖について、単一のチロシン置換が残基１１４に存在する５Ｕ１５が最も適切であることが見出された。最初のマスキングについて、これを、アップ位置においてＲＢＤと係合した２つのＦａｂについて、残基１～１３０Ｈ及び１～１１３Ｌに削減した（多くの変動性が、最終ｆａｂについて観察された）。局所的リファインメントのためのマスクを生成するために、キメラカラーゾーンモジュールを用いて、マスキングのための注目する領域をマップから抽出し、２つのＦａｂ可変ドメイン及び関連ＲＢＤ、２つのＦａｂ間の交差点のＮＴＤ並びに中心へリックスバンドルの先端をカバーするように半径１５Åにセットした。続いて、この抽出した領域をガウスフィルタリングして、Ｃｒｙｏｓｐａｒｃ内のマスクに対して正規化した。初期ラウンドの５Å及び５ｏシフトによる局所的リファインメント並びに角度検索（この領域を減算密度からマスキングする）により、Ｆａｂ／ＲＢＤインターフェースでより良好ではあるが、さらに低い解像度のマップが生じた（判定して、報告解像度６．９Å、ＡｕＦＳＣ＝０．１４３）。続いて、このマップの局所的変動性分析を実行して、達成される解像度を悪化させることとなり得る潜在的可撓性領域を判定した。続いて、ベータ－３２の結晶構造を、局所マップに続いてｃｏｏｔに剛体フィットさせてから、単回ラウンドの剛体リファインメントを続けた。一ＲＢＤは、Ｆａｂの可変ドメインの端部と相互作用して、隣接するＲＢＤをデコレートすると思われる。
ベータ－４４とのベータ－Ｓ
従来と同じ手順を用いて粒子を選択（最初に４１８４００個）してから、２ラウンドの２Ｄ分類を続けた。続いて、これらの１４９２７２個の粒子を用いて、初めの３つのモデルを生成し、これらを続いて３ｄ分類に用いた。続いて、デコレートされたスパイクが明確である単一のクラス由来の粒子を、非均一リファインメントに通してから、さらなる初めのモデル生成及び３つのクラスへの分類を続けた。ここでも、１つのクラスのみが明確なスパイクを示し、続いて１５７１０個の動画由来のこの最終セットの６１６０３個の粒子をオリジナルボックスに抽出した。以降の非均一リファインメントにより、３．９Å解像度への再建をもたらした。しかしながら、広範囲にわたる分類にも関わらず、ＦａｂデコレートされたＲＢＤに対応する密度は悪かった。ＲＢＤ／Ｆａｂインターフェースをより十分に解像するために、１つのＲＢＤ及びＦａｂ以外の全てのスパイクを減算して、集中的リファインメントを、ＲＢＤ／Ｆａｂインターフェースに対するフルクラムセットにより試用した。しかしながら、Ｆａｂシグナルは依然として非常に弱く、これはデコレートされていないスパイクの集団による可能性が高い。Ｆａｂデコレートされたスパイクの集団を単離するために、「クラスターモード」の局所的変動性分析を使用した。２１８８６個の粒子に対応する５つのクラスターからの２つがＦａｂで明確にデコレートされていることが見出され、Ｆａｂシグナルは、最終の３つについて、目に見えてより弱かった。この最終セットの２１８８６個の粒子を局所的にリファインして、８Åの分解度の最終低分解度再建をもたらした。
従来と同じ手順を用いて粒子を選択（最初に４１８４００個）してから、２ラウンドの２Ｄ分類を続けた。続いて、これらの１４９２７２個の粒子を用いて、初めの３つのモデルを生成し、これらを続いて３ｄ分類に用いた。続いて、デコレートされたスパイクが明確である単一のクラス由来の粒子を、非均一リファインメントに通してから、さらなる初めのモデル生成及び３つのクラスへの分類を続けた。ここでも、１つのクラスのみが明確なスパイクを示し、続いて１５７１０個の動画由来のこの最終セットの６１６０３個の粒子をオリジナルボックスに抽出した。以降の非均一リファインメントにより、３．９Å解像度への再建をもたらした。しかしながら、広範囲にわたる分類にも関わらず、ＦａｂデコレートされたＲＢＤに対応する密度は悪かった。ＲＢＤ／Ｆａｂインターフェースをより十分に解像するために、１つのＲＢＤ及びＦａｂ以外の全てのスパイクを減算して、集中的リファインメントを、ＲＢＤ／Ｆａｂインターフェースに対するフルクラムセットにより試用した。しかしながら、Ｆａｂシグナルは依然として非常に弱く、これはデコレートされていないスパイクの集団による可能性が高い。Ｆａｂデコレートされたスパイクの集団を単離するために、「クラスターモード」の局所的変動性分析を使用した。２１８８６個の粒子に対応する５つのクラスターからの２つがＦａｂで明確にデコレートされていることが見出され、Ｆａｂシグナルは、最終の３つについて、目に見えてより弱かった。この最終セットの２１８８６個の粒子を局所的にリファインして、８Åの分解度の最終低分解度再建をもたらした。
広範囲にわたる分類後、３．８Åの解像度まで、上向き条件において２つのＲＢＤ（各々、弱いＦａｂ密度でデコレートした）を有するスパイクの種を観察した。Ｆａｂ／ＲＢＤインターフェースは、１つのＦａｂ／ＲＢＤ領域に集中したさらなる分類及び局所的リファインメント後に僅かに向上し、これは、かなり高解像度の結晶構造と一致したためにさらにリファインしなかった。
ベータ－５３とのベータ－Ｓ
３つのＦａｂによりデコレートしたスパイクの大集団を予備プロセシング後に観察した。３つのＦａｂが、スパイクタンパク質の３つのＲＢＤの各々をデコレートしたことが見出され、これらについての密度は高かった。
３つのＦａｂによりデコレートしたスパイクの大集団を予備プロセシング後に観察した。３つのＦａｂが、スパイクタンパク質の３つのＲＢＤの各々をデコレートしたことが見出され、これらについての密度は高かった。
分裂性であるベータ－５３の証拠が、２Ｄクラス平均で観察され、そこでは単一のＲＢＤプラスＦａｂが、およそ２０分のインキュベーション後に観察された。抗体の不在下でのインキュベーションとのスパイク分布の比較により、一部のＦａｂ媒介破壊を確認した。
ＰＤＢのブラスト検索により、８３％の配列ＩＤで重鎖可変領域に最も近いマッチとして３ＮＡＢ＿Ｈが生じた一方、９４％の配列同一性で、７ＤＫ０＿Ｂが、軽鎖について最も近いマッチであることが見出された。続いて、これを、従来通り、マップのｆａｂ部分に剛体フィットさせてから、Ｐｈｅｎｉｘにより一ラウンドの剛体リファインメントを続けた。
Ａｌｐｈａｆｏｌｄ
ベータ－２６についてのｆａｂモデルを生成するために、２つの戦略を試用した。第一に、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を別々に提出して、結果として生じるモデルを独立して、局所的にリファインされたマップに剛体フィットさせた。しかしながら、マップ密度は、確信的モデリングにとってあまりに悪く、大きいクラッシュがＨ／Ｌインターフェースに存在した。Ｈ及びＬ鎖の、最も近いＰＤＢ配列マッチとのアラインメントは、ｆａｂ密度における不十分なフィットの原因となった。より良好であった第２の戦略は、Ｈ及びＬ可変ドメイン配列を、１９残基Ｓｅｒ／Ｇｌｙリンカー［ＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号：７１３）］と共に提出することを包含した。リンカー長及び含量を、一緒のＨ及びＬ配列によるＢＬＡＳＴ検索に基づいて決定した。続いて、５つのａｌｐｈａｆｏｌｄ２モデルの中のベストフィットを、密度及び除去したリンカー領域に剛体フィットさせた。一部のクラッシュがモデル内に残り、マップ密度は、確信をもってこれらを解像するにはあまりに悪かった。
ベータ－２６についてのｆａｂモデルを生成するために、２つの戦略を試用した。第一に、重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を別々に提出して、結果として生じるモデルを独立して、局所的にリファインされたマップに剛体フィットさせた。しかしながら、マップ密度は、確信的モデリングにとってあまりに悪く、大きいクラッシュがＨ／Ｌインターフェースに存在した。Ｈ及びＬ鎖の、最も近いＰＤＢ配列マッチとのアラインメントは、ｆａｂ密度における不十分なフィットの原因となった。より良好であった第２の戦略は、Ｈ及びＬ可変ドメイン配列を、１９残基Ｓｅｒ／Ｇｌｙリンカー［ＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳ（配列番号：７１３）］と共に提出することを包含した。リンカー長及び含量を、一緒のＨ及びＬ配列によるＢＬＡＳＴ検索に基づいて決定した。続いて、５つのａｌｐｈａｆｏｌｄ２モデルの中のベストフィットを、密度及び除去したリンカー領域に剛体フィットさせた。一部のクラッシュがモデル内に残り、マップ密度は、確信をもってこれらを解像するにはあまりに悪かった。
クライオＥＭモデルリファインメント
ｆａｂ－ＲＢＤ領域は、全てのクライオＥＭマップについてそれほど十分に解像されていなかったため、ＲＢＤ、ｆａｂ及びＲＢＤなしのＳのモデルを最終マップに剛体フィットさせた。局所的リファインマップが入手可能であった構造について、ＲＢＤ－ｆａｂモデルを剛体ボディとして処理した。それぞれの場合において、ＲＢＤと残りのＳモデルとの間のインターフェースをｃｏｏｔによりチェックしてから、Ｐｈｅｎｉｘによる最終ラウンドの剛体リファインメントを続けることにより、Ｓ－ｆａｂ複合体モデル全体（又は局所的リファインメントの場合にはＲＢＤ－ｆａｂモデル）を剛体ボディとして処理した。ＳＡ００６鎖Ｂについて、鎖Ｂ（残基３８～３０５）についてＮＴＤに、且つＲＢＤ領域（３３３－５２４）を省略した領域３２０～５９１に別々に剛体フィットさせることが必須であった。これは、用いたＳモデルと比較したこの領域内の重要なねじれに負っている。
ｆａｂ－ＲＢＤ領域は、全てのクライオＥＭマップについてそれほど十分に解像されていなかったため、ＲＢＤ、ｆａｂ及びＲＢＤなしのＳのモデルを最終マップに剛体フィットさせた。局所的リファインマップが入手可能であった構造について、ＲＢＤ－ｆａｂモデルを剛体ボディとして処理した。それぞれの場合において、ＲＢＤと残りのＳモデルとの間のインターフェースをｃｏｏｔによりチェックしてから、Ｐｈｅｎｉｘによる最終ラウンドの剛体リファインメントを続けることにより、Ｓ－ｆａｂ複合体モデル全体（又は局所的リファインメントの場合にはＲＢＤ－ｆａｂモデル）を剛体ボディとして処理した。ＳＡ００６鎖Ｂについて、鎖Ｂ（残基３８～３０５）についてＮＴＤに、且つＲＢＤ領域（３３３－５２４）を省略した領域３２０～５９１に別々に剛体フィットさせることが必須であった。これは、用いたＳモデルと比較したこの領域内の重要なねじれに負っている。
実施例１７．ｍＡｂ応答の類似性及び差異の定量的精査。
２７個の強力なＲＢＤ結合ベータｍＡｂは、初期のパンデミック株による感染後に生成した２０個の強力なｍＡｂと比較して、かなり異なるようであった。それらがどの程度異なるかを客観的に判断するために、７つのウイルス株に対する抗体についての中和結果を、４７個の強力なｍＡｂの全ての考えられる対間で比較する中和－相関方法を考案した。比較のための測定基準は、２つの抗体についての中和結果間の相関係数であった（実施例１６を参照されたい）。結果を、ベータと初期の抗体間の明確な差異を明らかにするヒートマトリックスとして図１４Ａに示す。クラスター分析は、２つのセットの分離（ほぼ例外なし、図１４Ｂ）を明らかにした、すなわち株中和のパターンは、初期のパンデミックｍＡｂ及びベータｍＡｂ内で類似しているが、２つのセット間で異なる傾向がある。この分離は、高度に有意であり（Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定について、Ｐ＜０．００００１）、これは、誘発ウイルスに特異的な株中和のパターンが一致するが異なっている抗体の集団を示している。同じ方法を用いて、ベータ抗体をさらに精査した。図１４Ｃは、２７個のベータｍＡｂのクラスター分析を示しており、そこでは一般に、抗体は、図２Ａ～Ｆに記載される個々のＲＢＤ変異への特異性に基づいて、グループに分離することが分かる。
２７個の強力なＲＢＤ結合ベータｍＡｂは、初期のパンデミック株による感染後に生成した２０個の強力なｍＡｂと比較して、かなり異なるようであった。それらがどの程度異なるかを客観的に判断するために、７つのウイルス株に対する抗体についての中和結果を、４７個の強力なｍＡｂの全ての考えられる対間で比較する中和－相関方法を考案した。比較のための測定基準は、２つの抗体についての中和結果間の相関係数であった（実施例１６を参照されたい）。結果を、ベータと初期の抗体間の明確な差異を明らかにするヒートマトリックスとして図１４Ａに示す。クラスター分析は、２つのセットの分離（ほぼ例外なし、図１４Ｂ）を明らかにした、すなわち株中和のパターンは、初期のパンデミックｍＡｂ及びベータｍＡｂ内で類似しているが、２つのセット間で異なる傾向がある。この分離は、高度に有意であり（Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定について、Ｐ＜０．００００１）、これは、誘発ウイルスに特異的な株中和のパターンが一致するが異なっている抗体の集団を示している。同じ方法を用いて、ベータ抗体をさらに精査した。図１４Ｃは、２７個のベータｍＡｂのクラスター分析を示しており、そこでは一般に、抗体は、図２Ａ～Ｆに記載される個々のＲＢＤ変異への特異性に基づいて、グループに分離することが分かる。
実施例１８．ＩｇＶＨ１－６９抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と２との間で保存されている、以前に観察されなかった中和エピトープを標的とする。
ベータ－４９及びベータ－５０は、試験したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ての株を強力に中和し、完全Ｓ－三量体に強固に結合するが、ＲＢＤに非常に弱々しくのみ結合し、ＡＣＥ２の結合をブロックしなかった（図１Ｇ及び１２）。両方ともＩｇＶＨ１－６９遺伝子ファミリーに属している。両方の抗体についてのＦａｂ／ＲＢＤ複合体及びクライオＥＭ Ｆａｂ／Ｓ複合体の結晶構造が決定され（図１５）、ベータ－４９ Ｆａｂ／Ｓ三量体の構造を含み（図１５）、その比較的高い解像度（２．８Å）は、複合体がむしろ剛体であることを示唆した。両方の抗体は、ＶＨドメイン単独における１９個のアミノ酸差異の存在にも関わらず、本質的に同じ構成で付着する（図１６Ａ及び表Ｓ３）。それらのエピトープは、大部分はＲＢＤ上にあるが、ＲＢＤの、Ｓ１の残りとのＮ及びＣ末端接合を有する「腰」領域（トルソーアナロジー、図５、図２０Ａ）を含み、且つＲＢＤ構築体のＮ及びＣ末端残基を含む（図２０Ｂ）。ＲＢＤの残基３４３に付着したＮ結合グリカンは、エピトープの一部も形成し、糖は、Ｎ３４３の側鎖を、好適でない高次構造にねじるプロセスにおいてその通常の位置から転置されている（図１６Ｂ）。２つの抗体間の配列変異にも関わらず、ＲＢＤ相互作用は非常に類似しており、保存残基を含む。重鎖相互作用領域の大部分が、Ｈ３ループによって形成されている（ベータ－４９について、６３２のうちの３７５Å２）。Ｆａｂ結合Ｓ三量体は、全３つのＲＢＤをダウン構成で示し（図１５）、重鎖は、２つのＲＢＤとの相互作用を形成し（図１６Ｃ）、これによりＲＢＤは、三量体の周辺部に向けて幾分変換／回転される（図１６Ｄ）。この「ダウンアンドアウト」配向は、本発明者らの知識の及ぶ限りでは、以前に見られていない。第２のＲＢＤ（二次又は四次エピトープを形成する）に対する密充填は、大体２１０Å２の接触面積を包含する（図１６Ｃ及びＥ並びに２０Ｂ）。この四次エピトープの、１つのＦａｂ：２つのＲＢＤによる作製は、可溶性の単量体ＲＢＤに対するベータ－４９及び５０の低い親和性を、発現タグを除外して、可溶性のＲＢＤ構築体の一番末端まで腰残基との接触がなされるという事実と共に説明し得る（図２０Ｂ）。一次（二次ではない）エピトープを含む残基（図１６Ｆ及びＧ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と－２間で保存されている（図２０Ｂ）ため、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｓに結合する能力を試験した（図１８）。両方の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｓに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓと類似の程度で結合する。
ベータ－４９及びベータ－５０は、試験したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全ての株を強力に中和し、完全Ｓ－三量体に強固に結合するが、ＲＢＤに非常に弱々しくのみ結合し、ＡＣＥ２の結合をブロックしなかった（図１Ｇ及び１２）。両方ともＩｇＶＨ１－６９遺伝子ファミリーに属している。両方の抗体についてのＦａｂ／ＲＢＤ複合体及びクライオＥＭ Ｆａｂ／Ｓ複合体の結晶構造が決定され（図１５）、ベータ－４９ Ｆａｂ／Ｓ三量体の構造を含み（図１５）、その比較的高い解像度（２．８Å）は、複合体がむしろ剛体であることを示唆した。両方の抗体は、ＶＨドメイン単独における１９個のアミノ酸差異の存在にも関わらず、本質的に同じ構成で付着する（図１６Ａ及び表Ｓ３）。それらのエピトープは、大部分はＲＢＤ上にあるが、ＲＢＤの、Ｓ１の残りとのＮ及びＣ末端接合を有する「腰」領域（トルソーアナロジー、図５、図２０Ａ）を含み、且つＲＢＤ構築体のＮ及びＣ末端残基を含む（図２０Ｂ）。ＲＢＤの残基３４３に付着したＮ結合グリカンは、エピトープの一部も形成し、糖は、Ｎ３４３の側鎖を、好適でない高次構造にねじるプロセスにおいてその通常の位置から転置されている（図１６Ｂ）。２つの抗体間の配列変異にも関わらず、ＲＢＤ相互作用は非常に類似しており、保存残基を含む。重鎖相互作用領域の大部分が、Ｈ３ループによって形成されている（ベータ－４９について、６３２のうちの３７５Å２）。Ｆａｂ結合Ｓ三量体は、全３つのＲＢＤをダウン構成で示し（図１５）、重鎖は、２つのＲＢＤとの相互作用を形成し（図１６Ｃ）、これによりＲＢＤは、三量体の周辺部に向けて幾分変換／回転される（図１６Ｄ）。この「ダウンアンドアウト」配向は、本発明者らの知識の及ぶ限りでは、以前に見られていない。第２のＲＢＤ（二次又は四次エピトープを形成する）に対する密充填は、大体２１０Å２の接触面積を包含する（図１６Ｃ及びＥ並びに２０Ｂ）。この四次エピトープの、１つのＦａｂ：２つのＲＢＤによる作製は、可溶性の単量体ＲＢＤに対するベータ－４９及び５０の低い親和性を、発現タグを除外して、可溶性のＲＢＤ構築体の一番末端まで腰残基との接触がなされるという事実と共に説明し得る（図２０Ｂ）。一次（二次ではない）エピトープを含む残基（図１６Ｆ及びＧ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と－２間で保存されている（図２０Ｂ）ため、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｓに結合する能力を試験した（図１８）。両方の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｓに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓと類似の程度で結合する。
中和の機構は、普通でない「ダウンアンドアウト」高次構造のＲＢＤをロックすることとなり得ると考えられる。
実施例１９．ベータ特異的ＮＴＤ結合抗体。
ベータ－４３は、本明細書に記載される強力な抗ベータ抗体のセットにおける唯一の非ＲＢＤ ｍＡｂであり、ベータ－Ｓに対して高度に特異的である（図８）。結晶構造及びクライオＥＭ分析により、いわゆる「超部位（ｓｕｐｅｒｓｉｔｅ）」の領域において、ＮＴＤとの直接的相互作用が確認される（図１５、１７、２１）。ＮＴＤ（Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ及びＲ２４６Ｉ）内の点変異のうち、Ｌ１８Ｆのみがエピトープの一部である。
ベータ－４３は、本明細書に記載される強力な抗ベータ抗体のセットにおける唯一の非ＲＢＤ ｍＡｂであり、ベータ－Ｓに対して高度に特異的である（図８）。結晶構造及びクライオＥＭ分析により、いわゆる「超部位（ｓｕｐｅｒｓｉｔｅ）」の領域において、ＮＴＤとの直接的相互作用が確認される（図１５、１７、２１）。ＮＴＤ（Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ及びＲ２４６Ｉ）内の点変異のうち、Ｌ１８Ｆのみがエピトープの一部である。
エピトープがベータ特有の３残基（２４２～２４４）ＮＴＤ欠失の部位から僅かに除去されているが、ベータ－ＮＴＤ構造の、初期のパンデミックＮＴＤとの比較は、欠失がノックオン変化を下流側ポリペプチド鎖内に導入して、ベータ－４３エピトープの部分を大きくシフトさせて、ベータ特異性を付与していることを示す（図２１）。このバリアント特異的高次構造変化に加えて、ベータ－ＮＴＤと他の報告されるＮＴＤ構造との間に、他の多数の差異が存在する（図２１）。これら及び他のＮＴＤ構造間で見られる変動性は、この高度に変異しやすいドメインの固有の可撓性を実証している。
実施例２０．ｍＡｂの交差反応性。
生きているウイルスの中和アッセイを、ＲＢＤ内の示す変化を含有する以下のウイルスを用いて実行した：ビクトリア、初期の武漢関連株、アルファ（Ｎ５０１Ｙ）、ベータ（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、ガンマ（Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、デルタ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）及びオミクロン（Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ）（図２２及び表１５）。
生きているウイルスの中和アッセイを、ＲＢＤ内の示す変化を含有する以下のウイルスを用いて実行した：ビクトリア、初期の武漢関連株、アルファ（Ｎ５０１Ｙ）、ベータ（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、ガンマ（Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）、デルタ（Ｌ４５２Ｒ、Ｔ４７８Ｋ）及びオミクロン（Ｇ３３９Ｄ、Ｓ３７１Ｌ、Ｓ３７３Ｐ、Ｓ３７５Ｆ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｇ４４６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｔ４７８Ｋ、Ｅ４８４Ａ、Ｑ４９３Ｒ、Ｇ４９６Ｓ、Ｑ４９８Ｒ、Ｎ５０１Ｙ、Ｙ５０５Ｈ）（図２２及び表１５）。
ベータ感染症例由来のｍＡｂベータ－２２、２７、２９、４０、４７、５３、５４、５５及び５６は、オミクロンの中和を示す。特に、ベータ－２２、ベータ－２９、ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５３、ベータ－５４、ベータ－５５及びベータ－５６は、オミクロンの強力な中和を保持している。ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５４及びベータ－５５は、試験した全ての株を強力に中和する。
ベータ抗体：ベータ－５５、ベータ－２４及びベータ－４０の、オミクロンのＲＢＤとの相互作用を図２３に示す。
表１２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに対する選択した抗体のＩＣ５０力価
以下の表は、示されるウイルスに対して示されるモノクローナル抗体について５０％のフォーカス減少中和力価（ＦＲＮＴ５０）を示す。Ｓｕｐｐは、精製した抗体をアッセイに用いた他の抗体とは対照的に、組織培養上清を表す。ベータ接頭辞は、ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の症例から単離したＢ細胞から形成した抗体を表すが、ベータ接頭辞のないものは、初期のパンデミック株に感染した症例から単離した。ある抗体由来の重鎖（ＨＣ）を別の抗体の軽鎖（ＬＣ）と組み合わせているキメラ抗体を以下のように示す。β４７ＨＣ／５５ＬＣは、抗体５５の軽鎖と組み合わせた抗体ベータ－４７由来の重鎖を表す。
以下の表は、示されるウイルスに対して示されるモノクローナル抗体について５０％のフォーカス減少中和力価（ＦＲＮＴ５０）を示す。Ｓｕｐｐは、精製した抗体をアッセイに用いた他の抗体とは対照的に、組織培養上清を表す。ベータ接頭辞は、ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の症例から単離したＢ細胞から形成した抗体を表すが、ベータ接頭辞のないものは、初期のパンデミック株に感染した症例から単離した。ある抗体由来の重鎖（ＨＣ）を別の抗体の軽鎖（ＬＣ）と組み合わせているキメラ抗体を以下のように示す。β４７ＨＣ／５５ＬＣは、抗体５５の軽鎖と組み合わせた抗体ベータ－４７由来の重鎖を表す。
表１３．Ｗｕｈａｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質配列と比較した場合の、スパイクタンパク質内の示す変異を含有する偽ウイルス構築体のパネルの中和についてのＩＣ５０％値。
ＩＣ５０値を、示される抗体について示す。ベータ接頭辞は、ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の症例から単離したＢ細胞から形成した抗体を表すが、ベータ接頭辞のないものは、初期のパンデミック株に感染した症例から単離した。ある抗体由来の重鎖（ＨＣ）を別の抗体の軽鎖（ＬＣ）と組み合わせている混合鎖抗体を以下のように示す。β４７ＨＣ／５５ＬＣは、抗体５５の軽鎖と組み合わせた抗体ベータ－４７由来の重鎖を表す。
ＩＣ５０値を、示される抗体について示す。ベータ接頭辞は、ベータＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の症例から単離したＢ細胞から形成した抗体を表すが、ベータ接頭辞のないものは、初期のパンデミック株に感染した症例から単離した。ある抗体由来の重鎖（ＨＣ）を別の抗体の軽鎖（ＬＣ）と組み合わせている混合鎖抗体を以下のように示す。β４７ＨＣ／５５ＬＣは、抗体５５の軽鎖と組み合わせた抗体ベータ－４７由来の重鎖を表す。
配列表
配列番号６８１－ＷＩＶ０４単離物のスパイク糖タンパク質アミノ酸配列
Ｇｅｎｂａｎｋ Ｒｅｆ．ＱＨＲ６３２６０．２
Ｇｅｎｂａｎｋ Ｒｅｆ．ＱＨＲ６３２６０．２
Claims (35)
- コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる抗体であって、
（ａ）抗体ベータ－４７又は表２内の２７個の抗体のいずれか１つの少なくとも３つのＣＤＲを含むか；
（ｂ）前記スパイクタンパク質上における、抗体ベータ－４９若しくはベータ－５０と同じエピトープに結合することができるか、又は抗体ベータ－４９若しくはベータ－５０と競合するか；或いは
（ｃ）ダウンアンドアウト高次構造で前記スパイクタンパク質をロックすることができ、前記ダウンアンドアウト高次構造は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、アミノ酸位置３４３のＮ－グリコシル化部位を介することを除いて、３つのスパイクタンパク質であって、前記スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）間の直接的接触を有しない３つのスパイクタンパク質を含むスパイク三量体によって特徴付けられる、抗体。 - （ａ）表２内の抗体の少なくとも４つ、５つ若しくは６つ全てのＣＤＲ；
（ｂ）表２内の抗体の重鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン；
（ｃ）表２内の抗体の軽鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる軽鎖可変ドメイン；並びに／又は
（ｄ）表２内の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖ドメインに対してそれぞれ少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１に記載の抗体。 - 表２内の前記抗体は、
（ａ）ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－５５及びベータ－５６；
（ｂ）ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３；
（ｃ）ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６及びベータ－４４；
（ｄ）ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５、ベータ－５１及びベータ－４４；
（ｅ）ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－２０、ベータ－２２、ベータ－２９及びベータ－４４；
（ｆ）ベータ－４４；
（ｇ）ベータ－４３；
（ｈ）ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６及びベータ－４４；
（ｉ）ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３、ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５、ベータ－５１、ベータ－２０、ベータ－２２、ベータ－２９及びベータ－４４；
（ｊ）ベータ－２０、ベータ－２４、ベータ－２６及びベータ－２７；
（ｋ）ベータ－２７、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５６、ベータ－５５、ベータ－２５及びベータ－５３；
（ｌ）ベータ－２７、ベータ－４７、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５６、ベータ－４７Ｈ／５５Ｌ、ベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌ及びベータ－５３；
（ｍ）ベータ－４９及びベータ－５０；
（ｎ）ベータ－２２、ベータ－２７、ベータ－２９、ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５３、ベータ－５４、ベータ－５５及びベータ－５６；
（ｏ）ベータ－２２、ベータ－２９、ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５３、ベータ－５４、ベータ－５５及びベータ－５６；又は
（ｐ）ベータ－４０、ベータ－４７、ベータ－５４及びベータ－５５
からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抗体。 - 表１又は２内の第１の抗体由来のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３並びに表１又は２内の第２の抗体由来のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含むが、前記第１の抗体及び前記第２の抗体は、異なることを条件とする、請求項１に記載の抗体。
- 表１又は表２内の第１の抗体由来の重鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインアミノ酸配列及び表１又は表２内の第２の抗体由来の軽鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体。
- 前記第１の抗体及び前記第２の抗体は、同じ生殖細胞系重鎖ｖ領域に由来し、任意選択的に、前記重鎖ｖ領域は、ＩＧＨＶ３－５３、ＩＧＨＶ１－５８、ＩＧＨＶ３－６６、ＩＧＨＶ４－３９、ＩＧＨＶ３－３０、ＩＧＨＶ５－５１、ＩＧＨＶ１－０２又はＩＧＨＶ１－６９である、請求項４又は５に記載の抗体。
- 前記第１の抗体及び前記第２の抗体は、
（ａ）任意選択的に、表３Ａに記載される抗体の１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、ベータ－２７、抗体１５０、抗体１５８、抗体１７５、抗体２２２及び抗体２６９；
（ｂ）任意選択的に、表４に記載される抗体の１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、ベータ－４７、ベータ－２５、抗体５５、抗体１６５、抗体２５３及び抗体３１８；
（ｃ）任意選択的に、表５に記載される抗体の１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－４０、ベータ－５４及びベータ－５５；
（ｄ）任意選択的に、表６に記載される抗体の１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、ベータ－２２、ベータ－２９及び抗体１５９；
（ｅ）任意選択的に、表７に記載される抗体の１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、ベータ－３８及び抗体１７０；
（ｆ）任意選択的に、表８に記載される抗体の１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、ベータ－３０、ベータ－３２、ベータ－３３及び抗体３１６；
（ｇ）任意選択的に、表９に記載される抗体の１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、ベータ－２０及びベータ－４３；
（ｈ）任意選択的に、表３Ｂに記載される抗体の１つの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、ベータ－２７、抗体１５０、抗体１５８、抗体１７５、抗体２２２、抗体２６９、抗体４０及び抗体２９８；
（ｉ）ベータ－４９及びベータ－５０；
（ｊ）ベータ－２７及び抗体２２２；
（ｋ）ベータ－２２及びベータ－２９；
（ｌ）ベータ－４０、ベータ－５４及びベータ－５５；又は
（ｍ）ベータ－４７及び抗体２５３
からなる群から両方とも選択される、請求項４～６のいずれか一項に記載の抗体。 - 表２～９内の前記抗体は、ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０、ベータ－５３、ベータ－５５、ベータ－５６、ベータ－４７Ｈ／ベータ－２５Ｌ又はベータ－４７Ｈ／５５Ｌである、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記エピトープは、
（ａ）コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＮ３４３及び／若しくはＤ３６４であって、Ｎ３４３は、グリコシル化されている、Ｎ３４３及び／若しくはＤ３６４；並びに／又は
（ｂ）（ｉ）第１のスパイクタンパク質の残基３３５～３３６、３３８～３４２、３６３、３６５及び３６７～３６８；
（ｉｉ）第２のスパイクタンパク質の残基４７７及び４８６～４８７；並びに／若しくは
（ｉｉｉ）第１のスパイクタンパク質の残基３３３～３３４及び５２７～５２９
によって形成される疎水性ポケット
を含む、請求項１（ｂ）に記載の抗体。 - 前記エピトープは、第１のスパイクタンパク質の残基３３２～３４０、３４２～３４５、３６２～３６５、３６７～３６８、５２７及び５２９並びに第２のスパイクタンパク質の残基４７６～４７８、４８６～４８７及び４８９を含む、請求項１（ｂ）に記載の抗体。
- 例えば、ＩｇＧ１定常領域を含む全長抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体。
- 血清半減期が延長されるような少なくとも１つの修飾を含むＦｃ領域を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の２つ以上の抗体を含む抗体の組合せ。
- （ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体と；
（ｂ）表１内の抗体の少なくとも３つのＣＤＲを含む抗体であって、例えば、
（ｉ）表１内の抗体の少なくとも４つ、５つ若しくは６つ全てのＣＤＲ；
（ｉｉ）表１内の抗体の重鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）表１内の抗体の軽鎖可変ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる軽鎖可変ドメイン；並びに／又は
（ｉｖ）表１内の抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖ドメインに対してそれぞれ少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン
を含む抗体と
を含む抗体の組合せ。 - 請求項１～１２のいずれか一項に記載の２つ、３つ又は４つの抗体を含む、請求項１３又は１４に記載の抗体の組合せ。
- （ａ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置５０１のチロシンと相互作用する抗体、例えばベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５又はベータ－５６；
（ｂ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置４８４のリシンと相互作用する抗体、例えばベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５又はベータ－５１；
（ｃ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置４１７のアスパラギン又はトレオニンと相互作用する抗体、例えばベータ－２０、ベータ－３３、ベータ－２２又はベータ－２９；並びに
（ｄ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインの位置４５２及び４７８のそれぞれロイシン及びトレオニンと相互作用する抗体、例えばベータ－４４
の少なくとも２つを含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の抗体の組合せ。 - 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクター又は前記ベクターを含む宿主細胞。
- コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる抗体を生成する方法であって、請求項１７に記載の宿主細胞を培養することと、前記培養から前記抗体を単離することとを含む方法。
- （ａ）請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１３～１６のいずれか一項に記載の抗体の組合せと、（ｂ）少なくとも１つの薬学的に許容される希釈剤又は担体とを含む医薬組成物。
- 治療によってヒト又は動物の身体を処置する方法に使用される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組合せ又は請求項１９に記載の医薬組成物。
- コロナウイルス感染症又はコロナウイルス感染症と関連する疾患若しくは合併症を処置又は予防する方法に使用される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組合せ又は請求項１９に記載の医薬組成物。
- 対象においてコロナウイルス感染症又はコロナウイルス感染症と関連する疾患若しくは合併症を処置又は予防する方法であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組合せ又は請求項１９に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を前記対象に投与することを含む方法。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症、例えばＣＯＶＩＤ－１９を処置するためのものである、請求項２１又は２２に記載の方法。
- 試料におけるコロナウイルス又はそのタンパク質断片の存在を特定する方法であって、
（ｉ）前記試料を、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体又は請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組合せと接触させることと、
（ｉｉ）抗体－抗原複合体の存在又は不在を検出することと
を含み、前記抗体－抗原複合体の存在は、前記試料におけるコロナウイルス又はその断片の存在を示す、方法。 - （ａ）前記抗体は、ベータ－６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５及び／又はベータ－５６であり；及び抗体－抗原複合体の存在は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインにおけるチロシン５０１の存在を示し；
（ｂ）前記抗体は、ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５及び／又はベータ－５１であり；及び抗体－抗原複合体の存在は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインにおけるリシン４８４の存在を示し；
（ｃ）前記抗体は、ベータ－２０、ベータ－３３、ベータ－２２及び／又はベータ－２９であり；及び抗体－抗原複合体の存在は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインにおける位置４１７のアスパラギン又はトレオニンの存在を示し；並びに
（ｄ）前記抗体は、ベータ－２９であり；及び抗体－抗原複合体の存在は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のスパイクタンパク質の受容体結合ドメインにおける位置４５２及び４７８のそれぞれロイシン及びトレオニンの存在を示す、請求項２４に記載の方法。 - 対象においてコロナウイルス感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症を処置又は予防する方法であって、請求項２４又は２５に記載の方法に従って試料におけるコロナウイルスの存在を特定することと、前記対象を、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体若しくは組合せ、抗ウイルス薬又は抗炎症剤で処置することとを含む方法。
- コロナウイルス感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症を予防、処置及び／又は診断するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組合せ又は請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
- コロナウイルス感染症又はそれと関連する疾患若しくは合併症を処置又は予防するための薬剤の製造のための、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組合せ又は請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
- 前記コロナウイルス感染症は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７、４８４、５０１、４５２及び／又は４７８に置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株によって引き起こされ、例えば、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、系統アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ又はオミクロンのメンバーである、請求項２０若しくは２１に記載の使用のための抗体、請求項２２、２３若しくは２６のいずれか一項に記載の方法又は請求項２７若しくは２８に記載の使用。
- 前記コロナウイルス感染症は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置５０１に置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株によって引き起こされ、例えば、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、Ｂ．１．１．７（アルファ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー、Ｂ．１．３５１（ベータ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー又はＰ．１（ガンマ）株若しくはそれに由来する系統のメンバーであり；任意選択的に、前記抗体は、ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６及び／又はベータ－４４である、請求項２９に記載の使用のための抗体、方法又は使用。
- 前記コロナウイルス感染症は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４１７、４８４及び５０１に置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株によって引き起こされ、例えば、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、Ｂ．１．３５１（ベータ）株若しくはそれに由来する系統のメンバー又はＰ．１（ガンマ）株若しくはそれに由来する系統のメンバーであり；任意選択的に、前記抗体は、ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及びベータ－５３、ベータ－０６、ベータ－１０、ベータ－２３、ベータ－２４、ベータ－３０、ベータ－４０、ベータ－５４、ベータ－５５、ベータ－５６、ベータ－２６、ベータ－３３、ベータ－３４、ベータ－３８、ベータ－４５、ベータ－５１及び／又はベータ－４４である、請求項２９に記載の使用のための抗体、方法又は使用。
- 前記コロナウイルス感染症は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、スパイクタンパク質内の位置４５２及び４７８に置換を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株によって引き起こされ、例えば、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株は、系統デルタのメンバーであり；任意選択的に、前記抗体は、ベータ－４７、ベータ－２７、ベータ－３２、ベータ－４８、ベータ－４９、ベータ－５０及び／又はベータ－５３である、請求項２９に記載の使用のための抗体、方法又は使用。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に結合することができる抗体を生成する方法であって、ダウンアンドアウト高次構造でロックされた修飾スパイクタンパク質に対して抗体を高めることを含み、前記ダウンアンドアウト高次構造は、ｈＣｏＶ－１９／Ｗｕｈａｎ／ＷＩＶ０４／２０１９株のスパイクタンパク質と比較して、アミノ酸位置３４３のＮ－グリコシル化部位を介することを除いて、３つのスパイクタンパク質であって、前記スパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）間の直接的接触を有しない３つのスパイクタンパク質を含むスパイク三量体によって特徴付けられる、方法。
- 前記修飾スパイクタンパク質は、前記スパイクタンパク質の位置１９８及び４６３としてシステイン残基を含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記抗体を前記高めることは、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術によって又は前記修飾スパイクタンパク質で動物を免疫化することによって実行される、請求項３３又は３４に記載の方法。
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