JP2024508696A - Ｒｎａアデノ随伴ウイルス（ｒａａｖ）ベクター及びその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、関心のあるＲＮＡ配列とＲＮＡパッケージングシグナルとを含むＲＮＡ配列を提供した。ＲＮＡ配列を含む組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子をさらに提供し、前記ＲＮＡ配列は、ＤＮＡウイルスのタンパク質シェル内にパッケージングされる、関心のあるＲＮＡ配列とＲＮＡパッケージングシグナルとを含む。
Description
該国際特許出願は、２０２１年２月７日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０７５８７４号の優先権を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及び他霊長類種に感染する小型（直径が約２０ｎｍである）複製欠損ノンエンベロープウイルスである。それは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）デペンドパルボウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に属する。野生型ＡＡＶは、分裂及び非分裂細胞の両方に感染することができ、且つそのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。それは、ライフサイクルがアデノウイルス（ＡｄＶ）のようなヘルパーウイルスの存在に依存することによって命名され分類される。
ＡＡＶは、ヒトと非ヒト霊長類（ＮＨＰ）とを含む複数の脊椎動物種で発見されている。現在のコンセンサスは、ＡＡＶがいかなるヒト疾患も引き起こさず、非常に軽い免疫応答しか引き起こさないということである。それは、直径が約２０～２５ｎｍである二十面体タンパク質カプシド及び約４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノム（それはプラス（センス）鎖であってもマイナス（アンチセンス）鎖であってもよい）からなる。
ＡＡＶカプシドは、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比で合計６０個のコピーのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の三つのタイプのサブユニットを含む。ゲノムの両側末端には、主にウイルス複製始点及びパッケージングシグナルとしての二つのＴ字型末端逆位反復（ＩＴＲ）がある。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製に必要な四種類のタンパク質をコードする。Ｒｅｐタンパク質は、その分子量に因んで、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０と命名される。ｃａｐ遺伝子は、異なる開始コドンからコードされ翻訳される。また、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする第３の遺伝子は、異なる読み取り枠におけるｃａｐコード配列でコードされ、且つウイルス粒子のアセンブルを促進することが示されている。
現在、十三種類のＡＡＶ血清型及び多くの変異体が既に同定され、それらは異なる細胞受容体を認識することによって、異なる組織型及び細胞型向性スペクトルを示す。ＡＡＶ１－１３のインビボ組織向性は、多くの動物モデルにおいても十分に研究されている。
ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、それぞれ１４５個のヌクレオチドを含む。ＩＴＲ配列はセルフプライミングのためにそれぞれヘアピンを形成することができ、これにより第２のＤＮＡ鎖の合成はプライマーゼに依存しない。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡを宿主細胞ゲノム（ヒト１９番染色体）に組み込み、前記宿主細胞ゲノムから救済し、ＡＡＶ ＤＮＡを有効にカプシド化し、完全にアセンブルされたＤＮＡ酵素耐性ＡＡＶ粒子を生成するのに必要であることも示されている。
ＡＡＶ２ ＩＴＲは、複製始点として、大きいステム回文配列（Ａ－Ａ’）埋め込まれた二つのアーム回文配列（即ちＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’）からなる。ＩＴＲは二つの構造（即ちＦｌｉｐ及びＦｌｏｐ）を得ることができる。図１を参照されたい。Ｆｌｉｐ及びＦｌｏｐ構造はそれぞれ、３’末端に最も近いＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’回文配列を有する。２０個のヌクレオチドを有するＤ配列又はＤ領域は、ＡＡＶゲノムの各末端に一回しか現れないため、一本鎖を保持する。
ＩＴＲは、約２２－ｂｐの配列－Ｒｅｐ－結合エレメント（ＲＢＥ）－をさらに含み、それは特定の方向にＡＡＶ Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質に結合する。ＩＴＲが回文配列（ヘアピン）構造にある場合、Ｒｅｐタンパク質はさらに、短回文配列（ＲＢＥ’）の一末端位置の５－塩基配列に接触することによって、Ｒｅｐ ＤＮＡヘリカーゼ及び鎖特異的エンドヌクレアーゼ活性を活性化してＡＡＶ複製及びパッケージングに補助する（図１を参照されたい）。
ＲＢＥは、コンセンサス配列５’－ＧＮＧＣ－３’を有するテトラヌクレオチド反復（例えば、４つの反復）を含む。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８のＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼ活性は、Ａ－Ａ’領域を再構築し、ステムループを生成し、前記ステムループは、一本鎖の形態で末端解離部位（ｔｒｓ又はＴＲＳ）の頂部に位置する。このような構造において、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８の鎖特異的及び部位特異的エンドヌクレアーゼ触媒ドメインは、ｔｒｓ位置に切開を導入した。Ｔ字型構造の頂点にあるヌクレオチドは、追加のＲＢＥ（ＲＢＥ’）に対応し、前記ＲＢＥは、二つの最も大きいＲｅｐタンパク質とＩＴＲとの間の関連性を安定化した。
ＡＡＶライフサイクルにおいて、ＡＡＶ ＤＮＡが細胞核において被覆されていない場合、入力性一本鎖ゲノムのＩＴＲは、第２の鎖の合成のために天然の３’－ＯＨプライマーを提供するヘアピンに嵌め込まれる。これにより、共有結合閉鎖（ヘアピン）末端を有する二本鎖分子が産生される。そして、大きなＲｅｐタンパク質はヘアピン内でＲＢＥ及びＲＢＥ’に結合し、且つ活性化されたエンドヌクレアーゼは、末端解離部位（ｔｒｓ）と呼ばれる認識配列内の特定の部位で鎖を切断する。これにより、新な３’－ＯＨプライマーが産生され、それはＩＴＲを修復して正常な平滑末端二本鎖分子を形成するためのものである。切断中、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８の分子は、チロシン－リン酸エステルリンケージを介して５’－末端リン酸塩に共有結合する。そして、ＩＴＲを二重ヘアピンとして再構成して３’－ＯＨプライマーを産生し、前記プライマーは、細胞複合体を用いてゲノム長さに沿った鎖置換合成をガイドする。これにより、パッケージングされた一本鎖が置換され、一つの末端で共有結合閉鎖された二本鎖分子を改造し、切開、修復及び鎖置換合成を行う新たなサイクルが開始した。このサイクルが繰り返される度に、パッケージングのための新たな一本鎖が生成される。二つの末端が同じであるため、このプロセスは二つの末端から同等に行われ、パッケージングのためのプラス鎖及びマイナス鎖が生成される。
ＡＡＶは、毒性の証拠がなく、複数の種及び組織をインビボ形質導入し、穏やかな自然及び適応性免疫応答を生成することができるため、遺伝子療法に広く用いられている。
ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）に見られるものと同じカプシド配列及び構造からなる。しかしながら、ＡＡＶベクターは、全てのＡＡＶタンパク質コード配列を欠いており、その位置に導入遺伝子発現カセットを設計したゲノムをカプシド化する。ウイルス始点の唯一の配列はＩＴＲであり、前記ＩＴＲによりベクター生産中にゲノム複製及びパッケージングをガイドする必要がある。ウイルスコード配列の完全な除去は、ＡＡＶベクターのパッケージング能力を最大化し、そのインビボ送達時の低い免疫原性及び細胞傷害性に有利である。
ＡＡＶベクターは、４．７ｋｂ以下のゲノムを収容するのに最適であるため、導入遺伝子配列だけでなく、遺伝子発現に必要な調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン及びポリアデニル化シグナル）も考慮するようにペイロードを慎重に設計する必要がある。
流行っているＡＡＶベクター生産方法として、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現するパッケージングプラスミド、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされる導入遺伝子プラスミド及びヘルパー作用を果たす他のＡｄＶ遺伝子（例えば、それぞれ複製、情報ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）処理及び翻訳に非常に重要なＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子）を含むヘルパープラスミドによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞を三重トランスフェクトし、前記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、構成的に発現されるＡｄＶ Ｅ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を含む。幸いなことに、パッケージングプラスミド又はヘルパーウイルスにおけるカプシドコード領域を交換するだけで、ＡＡＶ２ ＩＴＲで構築された導入遺伝子発現カセットを任意の血清型カプシドにパッケージングすることができる。
ＡＡＶベクターは、異なる細胞受容体を認識しそれらに結合し、内在化によって細胞に入る。エンドソームにおける完全なＡＡＶベクター粒子は、細胞骨格ネットワークを介して細胞質ゾルによって形質導入し輸送するのに必要な一連のｐＨ依存性構造変化を経験した。エンドソーム脱出後、ＡＡＶベクターは、核膜孔複合体を介して細胞核に入り、前記細胞核において、前記ＡＡＶベクターはカプシド脱殻を経験してゲノムを放出する。
細胞核において放出された一本鎖ＡＡＶベクターゲノムは、二本鎖形態に変換されるまで直ちに遺伝子発現を行わない－これは転写の要件及び形質導入の律速段階である。
第２の鎖の合成は、ゲノム３’－末端のセルフプライミングＩＴＲから開始する。また、二本鎖ゲノムは、鎖アニーリングによって実現することができ、これにより単独のウイルス粒子にパッケージングされるプラス鎖及びマイナス鎖ゲノムは、細胞核に入ると、ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基ペアリングによってアニーリングされる。そして、二本鎖ゲノムは、ＩＴＲにおける分子内または分子間ゲノム組換えによって環化される。このような環化及びコンカテマー化プロセスは、ＡＡＶベクターゲノムを遊離ＤＮＡに安定化し、有糸分裂後の細胞における持続的な遺伝子発現（図２）をもたらす。
ＣＲＩＳＰＲは、遺伝子療法に新たな原動力をもたらした。ＣＲＩＳＰＲは、強力なゲノム編集ツールであり、遺伝性疾患、後天性疾患及び感染性疾患の治療に可能性を示している。しかし、ＣＲＩＳＰＲ細胞成分の送達は依然としてその臨床的翻訳の主な障碍である。これまでに最も成功したＣＲＩＳＰＲインビボ遺伝子編集は、ＡＡＶを送達ベクターとして用いた。
しかしながら、従来のＡＡＶ送達は、１）延長されたＣａｓ９発現によるオフターゲット効果の増加と、２）Ｃａｓ９特異的免疫応答の刺激と、３）ＣＲＩＳＰＲ誘導性二本鎖切断におけるウイルス組み込みの高頻度とを含む多くの実際的な困難に直面している。最近の研究では、人々の間で広く広がっている、Ｃａｓ９に対する既存の免疫が証明され、Ｃａｓ９の発現が続けば、編集された細胞にさらなる課題をもたらし得る。
そのため、Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集ツールのような従来の遺伝子編集ツールを改良する必要がある。
本発明の一態様は、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされ得るリボヌクレオチド（ＲＮＡ）配列を提供し、前記ＲＮＡ配列は、（１）関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）、例えば、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）をコードするＲＮＡコード配列、タンパク質（例えば、治療用タンパク質、抗原タンパク質、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（「Ｃａｓタンパク質」と略称される）、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質のような遺伝子編集タンパク質）をコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、又は非コード機能性ＲＮＡ（例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）、例えばシングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒ ＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３）システムのＲＮＡ成分）、又はその前駆体と、（２）前記ＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進するＲＰＳ相互作用分子と直接又は間接的に相互作用、例えば、結合することができるＲＮＡパッケージングシグナル（ＲＰＳ）とを含み、任意選択的に、前記ＲＮＡ配列をコードするかもしくはそれに対応するＤＮＡ配列、又は前記ＤＮＡ配列の逆相補的配列は、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされる能力が減少し、減弱し又は実質的にない（例えば、前記ＤＮＡ配列又はその逆相補的配列は、ＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶパッケージングのための機能性ＡＡＶ ＩＴＲを欠いている）。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子は、ＡＡＶウイルス粒子又は腫瘍溶解性ウイルス粒子である。
いくつかの実施形態において、ＲＰＳは、前記ＲＳＩの５’末端もしくはその近傍、前記ＲＳＩの３’末端もしくはその近傍、又は前記ＲＳＩの内部（例えば、ｍＲＮＡのイントロン内）に位置する。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、一つより多い（例えば、１、２、３、又はそれ以上の）同じ又は異なるＲＰＳを含む。
いくつかの実施形態において、前記一つより多いＲＰＳのうちの二つ又はそれ以上（例えば、３つ）は、同じ又は異なるリンカーを介して互いに隣接するか又は直列連結される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、互いに隣接しない（例えば、関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）の一つの末端又はその近傍にそれぞれ位置する）二つ又はそれ以上のＲＰＳを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＰＳは、転写された修飾後のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）を含み、ここで、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、（ａ）転写された機能性Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含み、任意選択的に、転写された機能性ＲＢＥ’をさらに含み、且つ（ｂ）転写された末端解離部位（ＴＲＳ）もしくは転写された逆相補的ＴＲＳ（ｒｃＴＲＳ）、又はその両方を欠いており、任意選択的に、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＤ領域配列（Ｄ配列又はＤ’配列）をさらに含み、及び／又は任意選択的に、前記ＲＰＳ相互作用分子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０である。
いくつかの実施形態において、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記ＲＮＡの３’末端の１０００個のヌクレオチド、８００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、又は２００個のヌクレオチド内にあり、任意選択的に、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ポリＡ配列、ポリＡシグナル配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）、又はＲＮＡ転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）の５’にある。
いくつかの実施形態において、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写された野生型Ｆｌｉｐ又はＦｌｏｐ ＩＴＲに基づいて修飾され、任意選択的に、前記野生型Ｆｌｉｐ又はＦｌｏｐ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３からのものである（任意選択的に、前記野生型Ｆｌｏｐ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のヌクレオチド配列を有する）。
いくつかの実施形態において、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＴＲＳと転写されたｒｃＴＲＳの両方を欠いている。
いくつかの実施形態において、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＤ領域配列を含む（任意選択的に、前記修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のヌクレオチド配列を有する）。
いくつかの実施形態において、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記転写されたＤ領域配列を欠いている（任意選択的に、前記修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のヌクレオチド配列を有する）。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、第２の転写された機能性ＲＢＥ配列を有するが、第２の転写されたＴＲＳもしくは第２の転写されたｒｃＴＲＳ又はその両方を欠いている第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。任意選択的に、前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、第２の転写されたＤ領域配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲと前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは同じである（又は異なる）。
いくつかの実施形態において、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲと前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ（存在すれば）は、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける欠失、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける突然変異、又は対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける挿入を含む。
いくつかの実施形態において、前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記ＲＮＡ配列の５’末端の１０００個のヌクレオチド、８００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、又は１５０個のヌクレオチド内にある。
いくつかの実施形態において、前記ＲＰＳは、ＭＳ２配列、ＰＰ７結合部位、又はｃｏｍ結合部位を含み、且つ前記ＲＰＳ相互作用分子は、ＭＳ２配列にとってのファージ由来のＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７結合部位にとってのＰＰ７ファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、又はｃｏｍ結合部位にとってのファージＣＯＭタンパク質（ＣＯＭ）のような、前記ＲＰＳと直接又は間接的に相互作用、例えば、結合することができるＲＰＳ相互作用タンパク質（ＲＰＳＩＰ）を含む。
いくつかの実施形態において、前記ＲＰＳＩＰは、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分（例えば、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）のＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８、又はアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ））に直接又は間接的に関連する（例えば、それらに融合する）。
いくつかの実施形態において、前記ＲＮＡ配列は、転写されたＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むか又は好ましく含まない（例えば、前記ＲＮＡ配列は、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のＤＮＡパッケージング能力を低下させるように、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列のヌクレオチドの付加、欠失、及び／又は置換を有する、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む）。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、（１）転写された転写エンハンサー、（２）転写されたイントロン配列又はエクソン配列（例えば、タンパク質発現を増強するための転写されたイントロン配列又はエクソン配列）、（３）５’ ＵＴＲ配列、（４）３’ ＵＴＲ配列、（５）ポリＡ配列、又はポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、及び任意選択的に前記ポリＡシグナル配列下流のＧＵリッチ領域、（６）転写後調節エレメント又は配列、例えば、転写されたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、及び／又は（７）転写終結配列（例えばヒストン下流エレメント）をさらに含み、任意選択的に、前記ＲＮＡ配列は、前記転写後調節エレメント又は配列の３’及び前記ポリＡ配列又はポリＡシグナル配列の５’に位置するＲＰＳを含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、５’から３’への方向に、ＲＳＩ、任意選択的な転写されたＷＰＲＥ配列と、ＲＰＳ（例えば、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ、ＭＳ２配列、ＰＰ７結合部位、又はｃｏｍ結合部位）と、ポリＡ配列又はポリＡシグナル配列とを含む。
いくつかの実施形態において、ＧＯＩは、タンパク質（例えば、蛍光タンパク質、治療用タンパク質、抗原タンパク質、又は遺伝子編集タンパク質、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質）、酵素（例えば、Ｃｒｅタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、又はその変異体）、構造タンパク質、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はその前駆体（前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）と一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）とを含む）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、アンチセンス配列又はオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）、例えばシングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒ ＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素用のガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲとを含むＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＲＮＡ成分を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約８，９００個のヌクレオチドより小さく、長さが約８，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約７，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約６，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約５，２００個のヌクレオチドより小さく、長さが約４，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約３，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約２，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約４，７００－５，２００個のヌクレオチドであり、長さが約４，７００－５，０００個のヌクレオチドであり、長さが約４，７００－４，８００個のヌクレオチドであり、又は長さが約４，７００個のヌクレオチドである一本鎖ＲＮＡである。
本発明の別の態様は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明のＲＮＡ配列をコードするカセットを含み、任意選択的に、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列（例えば、ＤＮＡプラスミド）であり、前記ＤＮＡ配列は、任意選択的に、前記ＤＮＡプラスミドの骨格にスタッファー配列が含まれており、及び／又は任意選択的に、機能性ＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲが含まれていない。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、前記カセットによりコードされたＲＮＡ配列に操作可能に連結され、その転写を駆動するプロモーターをさらに含む。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、遍在性プロモーターである。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成型プロモーターである。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導型プロモーターである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーターにより駆動されるＲＮＡ配列の転写を増強するエンハンサーをさらに含む。
本発明の別の態様は、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子を提供し、前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子は、ＤＮＡウイルス（例えば、ＡＡＶウイルス、又は腫瘍溶解性ウイルス）のタンパク質シェル（例えば、カプシド）にパッケージングされるＲＮＡゲノム（例えば、本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ配列）を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡウイルスはＡＡＶであり、且つ組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子は組換えＲＮＡアデノ随伴ウイルス（ｒＲＡＡＶ）粒子であり、前記組換えＲＮＡアデノ随伴ウイルス粒子は、（１）ＡＡＶカプシドと、（２）前記ＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列とを含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ６５ＡＡＰ、ＡＡＶｒｈ７４、又は７ｍ８のＡＡＶからのカプシドを含む。
本発明の別の態様は、複数の本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）を含む組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を提供し、前記集団内の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）のうちの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上は、それにパッケージングされる、本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列を有する。
本発明の別の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明のＲＮＡ配列、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、及び／又は本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を含む。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列のＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進するウイルスパッケージングシステムをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ウイルスパッケージングシステムは、（１）前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の転写を駆動する一つ又は複数のプロモーターの転写制御下にあるＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０のコード配列）及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＡＡＰ、及び／又はＭＡＡＰのコード配列）又はそれらの発現生成物と、（２）ＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の一つ又は複数のコード配列、例えば、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子、又は前記一つ又は複数のタンパク質と、（３）ＲＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、任意選択的に、ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドのサイズを拡大する。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞）である。
本発明の別の態様は、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）又は本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を生成する方法を提供し、前記方法は、ａ）本発明の宿主細胞を十分な時間培養することと、ｂ）前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫することとを含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を単離又は精製することをさらに含む。
本発明の別の態様は、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を生成する方法を提供し、前記方法は、ａ）ウイルスパッケージングシステム（例えば、ＡＡＶパッケージングシステム）を本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列と、前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を産生するのに十分な時間接触させ、ｂ）前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫し、任意選択的に、ｃ）収穫された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を単離又は精製することを含む。
いくつかの実施形態において、ウイルスパッケージングシステム（例えば、ＡＡＶパッケージングシステム）は、（１）前記ＲＮＡ配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は前記ＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、（３）ＲＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、任意選択的に、ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドのサイズを拡大する。
本発明の別の態様は、本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列をＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングするシステムを提供し、前記システムは、（１）前記ＲＮＡ配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は前記ＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、（３）ＲＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、任意選択的に、ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドのサイズを拡大する。
本発明の別の態様は、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）を細胞、植物、又は動物に送達する方法を提供し、前記方法は、前記細胞、植物、又は動物を本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団、又は本発明の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団と接触させることを含み、ここで、前記ＧＯＩは、本発明のＲＮＡ配列によりコードされる。
本発明の別の態様は、関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）を細胞、植物、又は動物に送達する方法を提供し、前記方法は、前記細胞、植物、又は動物を本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団、又は本発明の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団と接触させることを含む。
本発明の別の態様は、それを必要とする被験体における疾患又は障害を診断、予防、又は治療する方法を提供し、前記方法は、治療有効量又は投与量の本発明の又は本発明の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を前記被験体に投与することを含む。
本発明の別の態様は、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団、又は本発明の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団の、それを必要とする被験体の疾患又は障害を診断、予防、又は治療する薬物の製造における用途を提供した。
理解すべきこととして、本明細書に記述されている本発明のいずれか一つの実施形態は、実施例もしくは特許請求の範囲のみ、又は以下の一つの態様／部分のみに記述されているそれらの実施形態を含み、明示的に否定され、又は不当であるとみなされない限り、本発明の他の任意の一つ又は複数の実施形態と組み合わせることができる。
１．概要
本明細書に記載の本発明は、ＤＮＡウイルスタンパク質シェルを含む組換えウイルス粒子、及び（ＤＮＡではなく）一本鎖ＲＮＡのようなＲＮＡを含む「ベクターゲノム」を提供した。「ベクターゲノム」は、以下に記述されているＲＮＡパッケージングシグナル（ＲＰＳ）を除いて、ウイルス起源の配列が（あれば）非常に少ないため、典型的なウイルスＲＮＡではないことがある。つまり、ＤＮＡウイルスは、ＤＮＡウイルスベクターゲノムをタンパク質シェル内に通常又は自然にカプシド化する一方、本明細書に記載のＤＮＡウイルスのウイルス粒子の組換えバージョンはＲＮＡの代わりにカプシド化される。「ＲＮＡ」又は「リーボス核酸」は、それぞれリン酸、リーボス、及び塩基（Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｇ（グアニン）、又はＣ（シトシン））からなるリボヌクレオチドのセグメントを指し、前記リボヌクレオチドのうちのいずれか一つは、修飾（例えば、塩基修飾、グリコシル修飾、リン酸修飾、例えば、酸素修飾、フッ素修飾、硫黄修飾、シュード修飾（例えば、シュードウリジン修飾）、メチル化、ブロック（例えば、５－ブロック））されるか又は修飾されておらずに、及び任意選択的に直接又は間接的に、それぞれリン酸、デオキシリボース、及び塩基（Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、又はＣ（シトシン））からなるデオキシヌクレオチドのセグメントと融合することができ、前記デオキシヌクレオチドのうちのいずれか一つは、修飾（例えば、塩基修飾、グリコシル修飾、リン酸修飾、例えば、酸素修飾、フッ素修飾、硫黄修飾、シュード修飾、メチル化、ブロック（例えば、５－ブロック））されてもよく、又は修飾されていなくてもよく、例えば、ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ、ＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ、ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡキメラである。
本明細書に記載の本発明は、ＤＮＡウイルスタンパク質シェルを含む組換えウイルス粒子、及び（ＤＮＡではなく）一本鎖ＲＮＡのようなＲＮＡを含む「ベクターゲノム」を提供した。「ベクターゲノム」は、以下に記述されているＲＮＡパッケージングシグナル（ＲＰＳ）を除いて、ウイルス起源の配列が（あれば）非常に少ないため、典型的なウイルスＲＮＡではないことがある。つまり、ＤＮＡウイルスは、ＤＮＡウイルスベクターゲノムをタンパク質シェル内に通常又は自然にカプシド化する一方、本明細書に記載のＤＮＡウイルスのウイルス粒子の組換えバージョンはＲＮＡの代わりにカプシド化される。「ＲＮＡ」又は「リーボス核酸」は、それぞれリン酸、リーボス、及び塩基（Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｇ（グアニン）、又はＣ（シトシン））からなるリボヌクレオチドのセグメントを指し、前記リボヌクレオチドのうちのいずれか一つは、修飾（例えば、塩基修飾、グリコシル修飾、リン酸修飾、例えば、酸素修飾、フッ素修飾、硫黄修飾、シュード修飾（例えば、シュードウリジン修飾）、メチル化、ブロック（例えば、５－ブロック））されるか又は修飾されておらずに、及び任意選択的に直接又は間接的に、それぞれリン酸、デオキシリボース、及び塩基（Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）、又はＣ（シトシン））からなるデオキシヌクレオチドのセグメントと融合することができ、前記デオキシヌクレオチドのうちのいずれか一つは、修飾（例えば、塩基修飾、グリコシル修飾、リン酸修飾、例えば、酸素修飾、フッ素修飾、硫黄修飾、シュード修飾、メチル化、ブロック（例えば、５－ブロック））されてもよく、又は修飾されていなくてもよく、例えば、ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ、ＤＮＡ－ＲＮＡ－ＤＮＡキメラ、ＲＮＡ－ＤＮＡ－ＲＮＡキメラである。
このような組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の典型的（非限定的）な例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられ、前記アデノ随伴ウイルスは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ベクターゲノムを通常／天然にカプシド化する。このようなＤＮＡウイルスの別の非限定的例としては、腫瘍溶解性ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス又はＨＳＶ）、腫瘍溶解性アデノウイルス、牛痘ウイルス（ＶＡＣＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などのような腫瘍溶解性ＤＮＡウイルスが挙げられる。
本発明は、ＲＮＡ形態の転写されたＡＡＶ ＩＴＲが、このような転写されたＡＡＶ ＩＴＲを包含する転写されたＲＮＡの従来のＡＡＶウイルス粒子への高効率な直接パッケージングを促進することができるという驚くべき発見に部分的に基づいている。
本明細書に記載の本発明はさらに、転写されたＡＡＶ ＩＴＲ（ＲＮＡ）を加えて、いくつかの人工又は異種ＲＮＡ配列及びその同種／対応する／天然なＲＮＡ結合タンパク質も、ＲＮＡパッケージングシグナル（ＲＰＳ）とＲＰＳ相互作用タンパク質（ＲＰＳＩＰ）のペアとして、野生型パッケージングシグナル配列及びＤＮＡウイルスパッケージングに有用な相互作用タンパク質の機能を置換することによって、ＲＮＡをＤＮＡウイルスタンパク質シェルにパッケージングすることができ、前記ＤＮＡウイルスタンパク質シェルがＤＮＡベクターゲノムを通常／天然にカプシド化するという驚くべき発見に部分的に基づいている。
例えば、野生型ＡＡＶにおいて、ＤＮＡベクターゲノム５’及び３’末端におけるＩＴＲ配列は、Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ７８）と相互作用することができる配列エレメント、例えば、Ｒｅｐ－結合エレメント（ＲＢＥ）及びＲＢＥ’を含む。Ｒｅｐタンパク質は、ＩＴＲに結合し、このようなＩＴＲ配列エレメントを含むＡＡＶ ｓｓＤＮＡベクターゲノムのＡＡＶウイルス粒子へのパッケージングを促進する。
発明者は、転写されたＩＴＲ配列及び／又は人工又は異種ＲＮＡ配列、例えば、ＭＳ２配列をＲＰＳとして関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）に提供することによって、得られた、ＲＰＳ及びＲＳＩからなるＲＮＡ配列を、ＭＳ２に天然に結合するＭＣＰ－細菌ファージ由来のＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）の存在下で、ＡＡＶウイルスタンパク質シェルに有効にパッケージングし得ることを発見した。人工ＲＰＳ／ＲＰＳＩＰペア－例えば、ＭＳ２／ＭＣＰ－がＲＮＡのＤＮＡウイルスタンパク質シェルへのパッケージングを促進する能力は、ＤＮＡパッケージングの天然ＩＴＲパッケージングシグナルの存在に依存しないが、それから独立して機能することができる。ある意味では、異種ＭＳ２－ＭＣＰペアは、ＲＰＳとＲＰＳＩＰペアの人工システムを構成し、前記システムは、天然なＩＴＲ－Ｒｅｐ ＤＮＡパッケージングシステムを有効に置換することができ、前者はＲＮＡパッケージングを有効に促進した。このようなＡＡＶなどのＲＮＡ含有ＤＮＡウイルスは、本明細書において、Ｒ－ＤＮＡウイルス粒子（又はＡＡＶの場合にＲＡＡＶ）、又は組換えＲ－ＤＮＡウイルス粒子（又はＡＡＶの場合にｒＲＡＡＶ）と呼ばれてもよい。
本発明のＲ－ＤＮＡウイルス粒子及びＲＡＡＶウイルス粒子は、適切な長さ（例えば、様々なＤＮＡウイルス又はＡＡＶのパッケージング限度内）の任意の導入遺伝子又は関心のある遺伝子（ＧＯＩ）のＲＮＡ転写物又は任意のガイドＲＮＡを、ＤＮＡウイルスタンパク質シェル又はＡＡＶウイルスカプシドの向性に適合する宿主細胞に送達することに用いることができる。本明細書で使用されるように、組換えＡＡＶベクター、ベクターゲノム及び組換えＡＡＶウイルス粒子又は組換えＡＡＶ粒子のような組換えＤＮＡウイルス粒子は、本明細書において、それぞれｒＲＡＡＶベクター（組換えＲＮＡアデノ随伴ウイルスベクター）、ベクターゲノム及び組換えＲＡＡＶ（ｒＲＡＡＶ）ウイルス粒子又はｒＲＡＡＶ粒子（「ｒＲＡＡＶベクター」と「ｒＲＡＡＶ粒子」は本明細書において同義的に使用される）と呼ばれる。
具体的には、一方で、任意の正常な又は従来のＡＡＶベクターと同様に、被験ＲＡＡＶベクターはまた、ウイルス遺伝物質としてＤＮＡを担持する任意の野生型ＡＡＶから発見された同じカプシドのうちのいずれか一つにより構成されてもよい。そのため、被験ＲＡＡＶベクターは、特異性／広範囲な向性及び低い免疫原性のような、ＡＡＶコートからの全ての一般的な優位性を有する。
しかしながら、他方で、被験ＲＡＡＶベクターのゲノムが寿命の短いＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）で構成され、それによってこのようなＲＮＡ遺伝物質における任意のコードされる遺伝子生成物の瞬時的発現を引き起こす。
このような瞬時的発現は、少なくともいくつかの場合に必要である。例えば、本発明のＲＡＡＶベクターは、ＲＡＡＶによりコードされたＤＮＡ遺伝子エディタ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムエフェクター酵素Ｃａｓ９のｍＲＮＡコード配列及び塩基エディタに融合したその変異体）への時間制限付きの曝露が有効な遺伝子編集を実現することができるため、インビボＤＮＡ遺伝子編集に有利である。従来のＤＮＡベースのＡＡＶベクターで発現された同じＤＮＡ遺伝子エディタの持続的発現に比べて、このような瞬時的発現されるＤＮＡエディタはさらに、オフターゲット遺伝子の標的化を減少させ、免疫原性を低下させることによって遺伝子療法の安全性プロフィールを改善することができる。
また、従来のＤＮＡベースのＡＡＶベクターに比べて、被験ＲＡＡＶベクターは、ＤＮＡベースのＡＡＶベクターによりコードされるＧＯＩの発現に必要なプロモーター（及び必要であり得る任意の非転写エンハンサー配列）を少なくとも排除したため、より長い導入遺伝子を担持することができる。
従来のＤＮＡベースのＡＡＶベクターに比べて、被験ｒＲＡＡＶベクターは、異なる配列エレメント及び組織を有するが、ｒＲＡＡＶウイルス粒子は、従来のＤＮＡベースのＡＡＶベクターと同じ進入及び細胞内輸送プロセスを有する。しかしながら、宿主細胞の細胞核に入ると、それらは非常に異なる運命を有する。細胞核に入った後、被験ＲＡＡＶベクターのｍＲＮＡゲノムを放出し、その後細胞質に輸送し、翻訳を起こす。ｍＲＮＡの寿命は、通常数分から数日と非常に短く、且つ最終的には多くの細胞機構によって分解されることが周知である。しかしながら、依然として、ｍＲＮＡの寿命が限られていることにより、宿主細胞は、通常、ＤＮＡベースのＡＡＶベクターにおける第２鎖ｃＤＮＡの合成で遅延されることなく、タンパク質の合成を完了することができ、コードされたタンパク質が迅速に機能することが可能になる。
多くのこのようなＲＰＳ／ＲＰＳＩＰペアは、ＲＮＡをＤＮＡウイルスにパッケージングすることに用いられてもよい。発明者は、ＰＰ７配列及びＰＰ７細菌ファージコートタンパク質（ＰＣＰ）と、ｃｏｍ配列及びファージＣＯＭタンパク質（ＣＯＭ）とを含む少なくとも二つの追加のこのようなペアが、異種ＲＰＳを含むＲＮＡ（即ち、それぞれＰＰ７及びｃｏｍ配列である）有効にパッケージングし得ることを証明した。ディスプレイされた三ペアのＲＰＳ／ＲＰＳＩＰは、少なくとも二つのクラスを包含する。天然なウイルスパッケージングシステムであるＭＳ２／ＭＣＰ及びＰＰ７／ＰＣＰとは異なり、ｃｏｍ／ＣＯＭは、天然なウイルスパッケージングシステムではなく、細菌ファージＭｕ ｍｏｍ遺伝子の転写開始において機能することが知られている転写調節因子である。多くの転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列も本発明のＲＰＳとして用いられてもよい。
本明細書に記載の本発明は、ＤＮＡウイルスの特定の血清型（例えば、特定のＡＡＶ血清型）に限定されるものではない。発明者は、各場合に適合性ＲＰＳＩＰの使用と組み合わせて、適切なＲＰＳを有するＲＮＡ配列を代表的なＡＡＶウイルス（ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶ－ＤＪを含む）に高効率にパッケージングすることを証明した。
本明細書に記載の本発明はさらに、以下の発見に基づく：いくつかの独立した方法により、望ましくないＤＮＡを天然ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする効率を低下させることができる。
いくつかの実施形態において、関心のあるＲＮＡを転写するＤＮＡベクターの全体的なサイズを増加することによって望ましくないＤＮＡパッケージング効率を低下させることができる。例えば、通常ＡＡＶ生産に用いられる三重トランスフェクト方法において、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）は、第１のプラスミドにより担持され得、必要なＲｅｐ及びＣａｐタンパク質は、第２のプラスミドにおけるｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子によりコードされる一方、他のＡＡＶパッケージングに必要な成分は第３のプラスミドにより提供される。本発明のこの実施形態によれば、ＤＮＡウイルスにパッケージングされるＲＮＡ配列を第１のプラスミドから転写してもよく、且つ前記第１のプラスミドの全体的なサイズは以下によって人工的に増加することができる：長さが少なくとも約１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ又はそれ以上であるスタッファー配列のようなランダムスタッファー配列（例えば、イントロン）、又は第１のプラスミドの全体的なサイズを１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ又はそれ以上増加させるスタッファー配列、例えば、約６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ又はそれ以上に増加させるスタッファー配列などを含む。
いくつかの他の実施形態において、ＤＮＡパッケージングを促進する古典的なエレメントの機能を抑制することによって望ましくないＤＮＡパッケージングの効率を低下させることができる。ＤＮＡパッケージングに用いられるこのような古典的なエレメントは、ＤＮＡ配列（例えば、ｔｒｓ配列、ＲＢＥもしくはＲＢＥ’配列又はＡＡＶのＩＴＲ配列全体を含む、ＤＮＡパッケージングを促進するＡＡＶ ＩＴＲ配列のエレメント）、及び／又はＤＮＡ配列と相互作用するタンパク質（例えば、ｔｒｓ－エンドヌクレアーゼ活性が欠如しているか又は減弱された突然変異型Ｒｅｐ６８又はＲｅｐ ７８タンパク質）のような、ＤＮＡパッケージングに関与するタンパク質エレメントを含んでもよい。
そのため、本発明の一態様は、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ＤＮＡを自然にパッケージングするＤＮＡウイルス）にパッケージングされ得るリボヌクレオチド（ＲＮＡ）配列を提供し、ここで、前記ＲＮＡ配列は、（１）関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）と、（２）ＲＮＡパッケージングシグナル（ＲＰＳ）とを含み、前記ＲＮＡパッケージングシグナルは、ＲＰＳ相互作用分子（例えば、ＲＰＳ相互作用タンパク質又はＲＰＳＩＰ）と直接又は間接的に相互作用、例えば、結合することができ、前記ＲＰＳ相互作用分子は、前記ＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する。
このようなＲＮＡ配列は、任意のＲＳＩ（ＲＮＡ）を含んでもよく、「関心のある遺伝子」又は「ＧＯＩ」（ＤＮＡ）によりコードされ得る。
本明細書で使用されるように、「関心のある遺伝子」又は「ＧＯＩ」は、タンパク質又はポリペプチドの任意のコード配列を含み、イントロン及びエクソン配列、及び／又は任意の非翻訳ＲＮＡ又は非コードＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ又はその前駆体のようなｎｃＲＮＡであり、前駆体ｍｉＲＮＡ及び一次ｍｉＲＮＡ、アンチセンス配列又はオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲなどを含む）のコード配列を含む。
同様に、代表的（非限定的）なＲＳＩは、例えば、タンパク質（例えば、治療用タンパク質、抗原タンパク質、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（「Ｃａｓタンパク質」と略称される）、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質のような遺伝子編集タンパク質）をコードするＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、又は非コード機能性ＲＮＡ（例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移－メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ又はオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３）システムのＲＮＡ成分、例えばシングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒ ＲＮＡ）、もしくはその前駆体、又はＲＩＳＣ複合体もしくはＲＮＡｉ経路のＲＮＡ成分（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ）、調節ＲＮＡ、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）（遺伝子間ｌｉｎｃＲＮＡ、イントロンｎｃＲＮＡ、及びセンス／アンチセンスｌｎｃＲＮＡ）、長鎖介在性／遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、エンハンサーＲＮＡ、細菌小分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲ並びにその前駆体を含む。
本発明のＲＮＡ配列又はＧＯＩは、一つのコード配列又は一つより多い（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の）コード配列を含んでもよい。コード配列の長さ、又は全てのコード配列の組み合わせ長さは、特定の又は選択されたＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ＡＡＶウイルス粒子）にパッケージングされ得るＲＮＡの最大長さを超えなくてもよく、一つの特定のＤＮＡウイルス（例えば、ＡＡＶ）のウイルス粒子と別のＤＮＡウイルスのウイルス粒子との間で異なってもよい。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列をコードするかもしくはそれに対応するＤＮＡ配列、又は前記ＤＮＡ配列の逆相補的配列は、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされる能力が減少し、減弱したか、又は実質的にない。例えば、ＤＮＡ配列は、本発明のＲＮＡ配列をコードすることができる（例えば、前記ＤＮＡ配列は、本発明のＲＮＡ配列の逆相補的配列を有する）。ＤＮＡ配列はまた、本発明のＲＮＡ配列におけるＵではなく、Ｔを有することを除いて、他の態様で、本発明のＲＮＡ配列と同じヌクレオチド配列を有するため、本発明のＲＮＡ配列に対応してもよい。いずれにしても、ＤＮＡ配列又はその逆相補的配列は、ＡＡＶパッケージングのためのＡＡＶ ＩＴＲのような、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子中にパッケージングするための機能性ＤＮＡパッケージングシグナルを欠いており得、それにより前記ＤＮＡ配列又はその逆相補的配列（ＤＮＡ）の、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力が減少し、減弱し又は実質的にない。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ＤＮＡ構築体から転写され、例えば、前記ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡプラスミドから転写され、ここで、前記ＤＮＡ構築体／プラスミドは、本発明のＲＮＡ配列のパッケージングを増強し、及び／又は望ましくないＤＮＡのＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを減少させるように、その骨格配列にはスタッファー配列（例えば、イントロン配列）が含まれている。例えば、本発明のＲＮＡ配列は、ＤＮＡ構築体／プラスミドから転写されてもよく、且つ前記ＤＮＡ構築体／プラスミドの全体的なサイズは以下によって人工的に増加することができる：長さが少なくとも約１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ又はそれ以上のスタッファー配列のようなランダムＤＮＡスタッファー配列、又は前記ＤＮＡ構築体／プラスミドの全体的なサイズを１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ又はそれ以上増加させるスタッファー配列、例えば、約６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ又はそれ以上に増加させるスタッファー配列などを含む。スタッファー配列は、本発明のＲＮＡ配列コード配列を含む転写ユニットの上流（例えば、すぐ上流）に位置してもよい（図９Ａを参照されたく、ここで、＞３ｋｂの長鎖スタッファー配列は、本発明の示例的ＲＮＡ配列の転写を駆動するＣＡＧプロモーターのすぐ上流に挿入される）。いくつかの実施形態において、スタッファー配列は、プロモーターの上流に直接挿入され、前記プロモーターは、本発明のＲＮＡ配列のコドン配列に操作可能に連結される。任意選択的に、いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列のコード配列は、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子の機能性天然ＤＮＡパッケージングシグナルを欠いており、例えば、ＡＡＶウイルス粒子にパッケージングされる機能性ＩＴＲ配列を欠いている。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされ得、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子は、ＡＡＶウイルス粒子である。任意のＡＡＶウイルスは、いずれも本発明のＲＮＡ配列のパッケージングに用いられてもよく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ １２、ＡＡＶ １３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ３２、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ６５ＡＡＰ、ＡＡＶｒｈ７４、又は７ｍ８を含むが、それらに限らない。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされ得、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子は、腫瘍溶解性ウイルス粒子である。例示的（非限定的）な腫瘍溶解性ウイルス粒子は、腫瘍溶解性ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス又はＨＳＶ）、腫瘍溶解性アデノウイルス、牛痘ウイルス（ＶＡＣＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などを含む。
本発明のＲＮＡ配列において、ＲＰＳの位置は柔軟であってもよい。いくつかの実施形態において、ＲＰＳは、本発明のＲＮＡ配列の５’末端もしくはその近傍、本発明のＲＮＡ配列の３’末端もしくはその近傍、又は本発明のＲＮＡ配列の内部に位置する。いくつかの実施形態において、ＲＰＳは、関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）の５’末端もしくはその近傍、関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）の３’末端もしくはその近傍、又は関心のあるＲＮＡ配列の内部（ｍＲＮＡのイントロン内）に位置する。
本発明のＲＮＡ配列には、一つ又は複数のＲＰＳが存在してもよい。いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、一つより多い（例えば、１、２、３、又はそれ以上の）同じ又は実質的に同じＲＰＳを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、一つより多い（例えば、１、２、３、又はそれ以上の）ＲＰＳを含み、且つそのうちの少なくとも二つが互いに異なっている。
本発明のＲＮＡ配列上に一つより多いＲＰＳが存在する場合、前記一つより多いＲＰＳのうちの少なくとも二つは互いに隣接し、例えば、直列連結され、両方の間には任意選択的なリンカー配列がある。任意の二つの隣接するＲＰＳ配列の間のリンカーは、同じであっても、又は異なっていてもよい。リンカー配列は、実質的な二次構造がなく、既知の機能性配列又はエレメントがなく、及び／又はＧＣ含有量が５０％未満であり得る、ランダム化されたＲＮＡ配列であってもよい。リンカーの長さは、１～１ｋｂ、１～５００個の塩基、１～２００個の塩基、１～約１００個の塩基、１～約６０個の塩基、約５～約５５個の塩基、約１０～約３０個の塩基又は約１５～２５個の塩基の間の任意の長さであってもよい。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、互いに隣接する３つのＲＰＳ配列を含み、二つのリンカー配列により分離され、各リンカー配列が独立して約２０又は約５０個の塩基である。例えば、三つの同じＲＰＳ配列のうちの最初の二つは２０個の塩基であるリンカーにより分離されてもよく、及び／又は前記ＲＰＳ配列のうちの最後の二つは５１個の塩基であるリンカーにより分離されてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、一つより多いＲＰＳ（例えば、１、２、３、４、又は５個のＲＰＳ）を含み、ここで、前記一つより多いＲＰＳのうちの少なくとも二つが互いに隣接しない。例えば、ＲＰＳのうちの一つは本発明のＲＮＡ配列の５’末端に位置してもよい一方、別のＲＰＳは本発明のＲＮＡ配列の３’末端に位置してもよく、且つ任意選択的な３番目のＲＰＳは、本発明のＲＮＡ配列内のＲＳＩとして、ｍＲＮＡのイントロン内に位置してもよい。４番目及び／又は５番目のＲＰＳは、１番目、２番目又は３番目のＲＰＳのうちのいずれか一つに近いか又は隣接してもよい。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、互いに隣接しない（例えば、関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）の一つの末端又はその近傍にそれぞれ位置する）少なくとも二つ（例えば、二つ又はそれ以上）のＲＰＳ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＰＳは、転写された修飾後のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）を含み、ここで、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、（ａ）転写された機能性Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含み、任意選択的に、転写された機能性ＲＢＥ’をさらに含み、且つ（ｂ）転写された末端解離部位（ＴＲＳ）もしくは転写された逆相補的ＴＲＳ（ｒｃＴＲＳ）、又はその両方を欠いている。いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＤ領域配列（Ｄ配列又はＤ’配列）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＲＰＳ相互作用分子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０である。
本明細書で使用されるように、「ＡＡＶウイルス粒子」は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（パルボウイルス科に属するデペンドパルボウイルス属に属する）の任意の野生型カプシドを含むウイルス粒子を含み、修飾された配列及び／又は組織もしくは宿主向性を有するエンジニアリングされたもの又は変異体を有する。
本明細書で使用されるように、「イントロン」は、ＤＮＡ又はＲＮＡの非コード断片を指し、通常、スプライシングによって前記非コード断片を転写されたＲＮＡから除去する。しかしながら、本発明のＲＮＡ配列は、ＧＯＩの発現を増強するように、異種遺伝子（関心のある遺伝子又はＧＯＩについての「異種」であり、それは本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子を介して宿主細胞に送達される導入遺伝子として発現する）からのイントロン配列のようなイントロン配列を含んでもよい。本発明ＲＮＡ配列におけるこのようなイントロン配列は、スプライシングによって除去されてもよいし、除去しなくてもよい。また、このようなイントロン配列は、いくつかのエンハンサーがコードＤＮＡのイントロン内に位置してもよいため、転写されたエンハンサー又はその一部をさらに含んでもよい。
本明細書で使用されるように、「エクソン」は、ＤＮＡ又はＲＮＡのコード断片を指し、エクソンはタンパク質配列に翻訳される。しかしながら、いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列内のエクソン配列は、ＧＯＩの一部又は全部をコードすることができ、前記ＧＯＩは、本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子を介して宿主細胞に送達される導入遺伝子として発現する。他の実施形態において、本発明のＲＮＡ配列内のエクソン配列は、異種遺伝子（ＧＯＩについての）に属してもよく、且つこのようなエクソンの存在はＧＯＩの発現を増強することができる。
本明細書で使用されるように、「コード配列」は、生成物をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのポリヌクレオチド配列を含み、前記生成物は、（ａ）タンパク質又はポリペプチド、又は（２）タンパク質又はポリペプチド以外の生成物（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ又はその前駆体のようなｎｃＲＮＡであり、前駆体ｍｉＲＮＡ及び一次ｍｉＲＮＡ、アンチセンス配列又はオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲなどを含む）であってもよい。
ＲＡＡＶウイルス粒子のＲＮＡがＡＡＶカプシドから単離され細胞に放出されると、関心のある遺伝子のリボヌクレオチドコード配列は、細胞内でさらにプロセシングされ得る。コード配列のプロセシングは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡのような一つ又は複数のＲＮＡ生成物を産生することができ、前記生成物は、一つ又は複数のタンパク質生成物にさらに翻訳されてもよく、又はＲＩＳＣ複合体もしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（例えば、クラス２、タイプＩＩ、タイプＶ又はタイプＶＩエフェクター酵素）のような他の細胞機構に組み込まれてもよい。
本明細書で使用されるように、用語「転写された」及びその文法的変形は、リーボス核酸（ＲＮＡ）ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を指し、前記リーボス核酸ヌクレオチドは、ＤＮＡテンプレート（例えば、二本鎖ＤＮＡ及び／又は一本鎖ＤＮＡ）から転写される。転写されたＲＮＡ分子は、ＡＡＶ ｓｓＤＮＡのプラス鎖又はマイナス鎖に対応してもよく、ここで、転写されたプラス鎖ＲＮＡはＤＮＡテンプレートのマイナス鎖から転写され、且つ転写されたマイナス鎖ＲＮＡはＤＮＡテンプレートのプラス鎖から転写される。いくつかの実施形態において、転写されたＲＮＡ分子は、二本鎖ＤＮＡテンプレートのセンス又はアンチセンス鎖から転写されてもよい。例えば、場合によっては、ｄｓＤＮＡ配列が一条鎖の配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）のみによって表される場合、ｄｓＤＮＡをテンプレートとして用いた、転写されたＲＮＡは、センス又はアンチセンス鎖と同じ配列を有してもよい。つまり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される、二本鎖ＤＮＡから転写されたＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又はその逆相補的配列と同じ配列を有してもよく、ただＲＮＡにおけるＵはＤＮＡにおけるＴを置換した。
本発明の転写された修飾後のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）配列は、（ＡＡＶウイルス粒子内でカプシド化された従来のＡＡＶウイルスゲノムにおける一本鎖ＤＮＡ配列と逆である）ＲＮＡ配列である。野生型ＡＡＶ ＩＴＲ ＤＮＡ配列として、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列（ＲＮＡ）は、本発明のＲＮＡ配列とＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質との結合を支持し、且つそのために、本発明のＲＮＡ配列をＡＡＶウイルス粒子に直接パッケージングすることを支持することができる。いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＩＴＲ配列は、転写されたＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）（例えば、転写された機能性ＲＢＥ）、及び任意選択的に、転写されたＲＢＥ’（例えば、転写された機能性ＲＢＥ’）を含み、Ｒｅｐ結合に用いられる。いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＩＴＲ配列は、ＲＮＡ配列のＡＡＶウイルス粒子へのパッケージング又はカプシド化を支持するか又は促進する。
いくつかの実施形態において、修飾後のＩＴＲは、野生型ＲＢＥを含む。
いくつかの実施形態において、修飾後のＩＴＲは、機能性ＲＢＥを含み、前記機能性ＲＢＥは、野生型ＲＢＥがＡＡＶパッケージングを支持する能力（例えば、Ｒｅｐ結合）の少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％又はそれ以上を保持する。いくつかの実施形態において、野生型ＲＢＥに比べて、例えば、ＲＢＥの一つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、及び／又はその他突然変異のため、機能性ＲＢＥは、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％までの配列変異を含む。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲが転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ ＤＮＡテンプレートは、対応する野生型ＡＡＶ ＩＴＲの一つ又は複数の機能、例えば、ＴＲＳ（転写された末端解離部位、以下を参照）で切断することができる機能を欠いているため、ＩＴＲとして欠陥がある。これは、例えば、機能性ＴＲＳを欠いていることが原因であり得る。一実施形態において、野生型ＴＲＳが完全に欠失しているため、修飾後のＩＴＲはＴＲＳがない。一実施形態において、一つ又は複数のヌクレオチド突然変異野生型ＴＲＳの欠失、挿入、置換及び／又は突然変異により、それは、ＡＡＶ複製中にＲｅｐにより認識され切断されないことになる。
いくつかの実施形態において、修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ ＤＮＡテンプレートは、本明細書に記載のＲＢＥ又はその機能性変異体、及び任意選択的に、ＲＢＥ’又はその機能性変異体を保持する。いくつかの実施形態において、ＲＢＥ及び／又はＲＢＥ’は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８／６８に結合する点において機能的である。
本発明の転写された修飾後のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）はさらに、転写された末端解離部位（ＴＲＳ）もしくは転写された逆相補的ＴＲＳ（ｒｃＴＲＳ）、又はその両方を欠いている。いくつかの実施形態において、ＴＲＳは、修飾後のＡＡＶ ＩＴＲの５’末端に位置する。いくつかの実施形態において、ＴＲＳは、Ｄ領域配列とＲＢＥとの間に位置する。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＴＲＳ及び転写されたｒｃＴＲＳの両方を欠いている。
本明細書で使用されるように、「末端解離部位」又は「ＴＲＳ」は、ＡＡＶ複製中に、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質により認識され、切開を産生する一本鎖ＡＡＶベクターゲノム（プラス鎖又はマイナス鎖）における一本鎖ＤＮＡ配列を指す。本明細書で使用されるように、「逆相補的ＴＲＳ（ｒｃＴＲＳ）」は、一本鎖ＡＡＶベクターゲノム（プラス鎖又はマイナス鎖）における一本鎖ＤＮＡ配列を指し、前記一本鎖ＤＮＡ配列はＴＲＳの逆相補的配列である。ｒｃＴＲＳとＴＲＳは、Ａ領域ステムの一末端に二本鎖ＤＮＡ領域を形成するようにペアリングされる。図１Ａ～１Ｃを参照されたい。
ＡＡＶ２ ＩＴＲにおいて、ＴＲＳは、ＴＴＧＧＣの配列を含み、且つＲｅｐ切断部位が二つのＴ’の間に位置し、ｒｃＴＲＳはＧＣＣＡＡの配列を含む。一つのＴＲＳは、Ｄ領域とＡ領域配列の境界に位置し、且つＡ領域配列の５’最末端に位置する（例えば、Ｄ領域配列とＲＢＥとの間に位置する）。代表的なＡＡＶの５’及び３’ ＩＴＲ多配列アライメントにおけるＴＲＳ及びｒｃＴＲＳについては、図１Ｂ及び１Ｃを参照されたい。
本明細書で使用されるように、「転写されたＴＲＳ」は、ＴＲＳ ＤＮＡテンプレート転写により産生された一本鎖ＲＮＡ配列である。ＴＴＧＧＣを含むＡＡＶ２ ＴＲＳについて、転写されたＴＲＳはＧＣＣＡＡを含む。
本明細書で使用されるように、「転写されたｒｃＴＲＳ」は、ｒｃＴＲＳ ＤＮＡテンプレート転写により産生された一本鎖ＲＮＡ配列である。ＧＣＣＡＡを含むＡＡＶ２ ｒｃＴＲＳについて、転写されたｒｃＴＲＳはＵＵＧＧＣを含む。
そのため、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲが、対応する転写された野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲにＧＣＣＡＡ配列が通常現れる位置にＧＣＣＡＡ配列を有しない場合、例えば、ＧＣＣＡＡ配列の完全欠失により、又は前記ＧＣＣＡＡ配列における一つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、置換及び／又はその他の突然変異により、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、「転写されたＡＡＶ２ ＴＲＳを欠いている」。これは、ＴＲＳ（ＴＴＧＧＣ）の完全欠失を有する修飾されたＡＡＶ ＩＴＲの転写、又は野生型ＴＲＳにおける一つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、置換及び／又はその他の突然変異により起こされたものであり得る。
そのため、いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列又は転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写された機能性ＴＲＳを欠いている。
同様に、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲが、対応する転写された野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲにＵＵＧＧＣ配列が通常現れる位置にＵＵＧＧＣ配列を有しない場合、例えば、ＧＣＣＡＡ配列の完全欠失により、又は前記ＧＣＣＡＡ配列における一つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、置換及び／又はその他の突然変異により、前記転写されたその修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、「転写されたＡＡＶ２ ｒｃＴＲＳを欠いている」。これは、ｒｃＴＲＳの完全欠失を有する修飾されたＡＡＶ ＩＴＲの転写、又は野生型ｒｃＴＲＳにおける一つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、置換及び／又はその他の突然変異により起こされたものであり得る。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＤ領域配列（野生型ＡＡＶ ＩＴＲにおけるＤ又はＤ’配列）又は突然変異体Ｄ領域配列（例えば、一つ又は複数のヌクレオチド挿入、欠失、置換、及び／又はその他の突然変異を有する配列）をさらに含み、前記突然変異体Ｄ領域配列は、野生型Ｄ領域配列の機能を実質的に保持した。他の実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＤ領域配列を含まないか、又は突然変異体Ｄ領域配列（例えば、一つ又は複数のヌクレオチド挿入、欠失、置換、及び／又はその他の突然変異を有する配列）を含まず、前記突然変異体Ｄ領域配列は、野生型Ｄ領域配列の機能を実質的に保持した。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写された（機能性）Ｄ領域配列を含む。任意選択的に、修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ ＤＮＡテンプレートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のヌクレオチド配列を有する。任意選択的に、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のＲＮＡ等価物を含む（即ち、前記ＲＮＡ等価物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のＤＮＡ配列と同じ塩基配列を有する）。任意選択的に、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の逆相補的配列のＲＮＡ等価物を含む（即ち、前記ＲＮＡ等価物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の逆相補的配列のＤＮＡ配列と同じ塩基配列を有する）。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写された（機能性）Ｄ領域配列を欠いている。任意選択的に、修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ ＤＮＡテンプレートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のヌクレオチド配列を有する。任意選択的に、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のＲＮＡ等価物を含む（即ち、前記ＲＮＡ等価物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のＤＮＡ配列と同じ塩基配列を有する）。任意選択的に、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の逆相補的配列のＲＮＡ等価物を含む（即ち、前記ＲＮＡ等価物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の逆相補的配列のＤＮＡ配列と同じ塩基配列を有する）。
本明細書で使用されるように、「Ｄ領域配列」は、Ｄ配列又はその逆相補的配列Ｄ’配列を指す。Ｄ領域配列の位置は、ＩＴＲが「Ｆｌｉｐ」又は「Ｆｌｏｐ」のどちらの構造を用いるかに依存する。図１Ａ～１Ｃを参照されたい。例えば、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．［ウイルス学雑誌］４５（２）：５５５－５６４，１９８３の図２を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）において、プラス鎖ｓｓＤＮＡ配列は、５’から３’まで、Ａ、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ａ’、Ｄ、．．．、Ｄ’、Ａ、Ｃ、Ｃ、Ｂ、Ｂ’、及びＡ’と命名される回文配列断片を含み、ここで、Ａ：Ａ’、Ｂ：Ｂ’、Ｃ：Ｃ’及びＤ：Ｄ’は、互いに逆相補的配列であり、且つ（Ｄ及びＤ’配列がｓｓＤＮＡ ＡＡＶベクターゲノムにおいて、実際には互いに塩基ペアリングしないことにもかかわらず）塩基ペアリングされたステム配列を形成することができる。プラス鎖の５’ ＩＴＲのＢ：Ｂ’ステムは、Ｃ：Ｃ’ステムより配列の一つの末端（５’末端）に近く、Ｆｌｉｐ ＩＴＲと呼ばれる。プラス鎖の３’ ＩＴＲのＣ：Ｃ’ステムは、Ｂ：Ｂ’ステムよりも配列の一つの末端（３’末端）に近く、Ｆｌｏｐ ＩＴＲと呼ばれる。
例えば、転写された野生型Ｄ領域配列の一つ又は複数のヌクレオチドに対して欠失、挿入、置換及び／又はその他の突然変異を行うことにより、本発明の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、機能性転写されたＤ領域配列（Ｄ又はＤ’配列）を欠いていてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ又は転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、突然変異した転写されたＤ領域配列及び／又は突然変異した転写されたＴＲＳ配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ又は転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、転写されたＤ領域配列を含まず、及び／又は転写されたＴＲＳ／ｒｃＴＲＳ配列を含まない。
いくつかの実施形態において、転写された野生型Ｆｌｉｐ ＩＴＲ又は野生型Ｆｌｏｐ ＩＴＲに基づいて、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲを修飾する。
いくつかの実施形態において、野生型Ｆｌｉｐ ＩＴＲ又は野生型Ｆｌｏｐ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ １２、ＡＡＶ １３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ３２、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ６５ＡＡＰ、ＡＡＶｒｈ７４、又は７ｍ８からのものである。任意選択的に、野生型Ｆｌｏｐ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態において、転写されたＤ領域配列は、存在し、且つＲＮＡの３’末端の５０個のヌクレオチド（例えば、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２５ｎｔ、又は２０ｎｔ）内にない。
いくつかの実施形態において、転写されたＤ領域配列は、存在し、且つＲＮＡの３’末端の５０個のヌクレオチド（例えば、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２５ｎｔ、又は２０ｎｔ）内にある。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＲＮＡの３’末端の１０００個のヌクレオチド内にある。いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＲＮＡの３’末端の８００個のヌクレオチド内にある。いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＲＮＡの３’末端の５００個のヌクレオチド内にある。いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＲＮＡの３’末端の３００個のヌクレオチド内にある。いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＲＮＡの３’末端の２００個のヌクレオチド内にある。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ポリＡ配列、ポリＡシグナル配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）、又はＲＮＡ転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）の５’にある。
本明細書で使用されるように、「ポリＡ配列」又は「ポリＡテール」は、アデニンリボヌクレオチド又はアデノシン一リン酸のストリングである（例えば、ここで、各塩基はアデニンのＲＮＡのストリングである）。このようなポリＡテールは、ｍＲＮＡの核外搬出、翻訳及び安定性に非常に重要である。ポリＡ配列の長さは、本発明の異なるｍＲＮＡ又はＲＮＡ配列において変化することができ、且つポリＡの約２５０個のヌクレオチド、ポリＡの約２３０個のヌクレオチド、ポリＡの約２００個のヌクレオチド、ポリＡの約１８０個のヌクレオチド、ポリＡの約１６０個のヌクレオチド、ポリＡの約１４０個のヌクレオチド、ポリＡの約１２０個のヌクレオチド、ポリＡの約１００個のヌクレオチド、又はそれ以下であり得る。
本明細書で使用されるように、「ポリＡシグナル配列」は、３’エクソンの最も下流に位置するＲＮＡ配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を指し、ＲＮＡ切断複合体により認識され、前記複合体は、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ ＩＩ）が新たに転写されたＲＮＡの３’末端配列を切断することによって、ポリアデニル化を起こすことができる。そして、ポリアデニルポリメラーゼは、アデノシン一リン酸ユニットをＡＴＰからＲＮＡの新たに切断された３’末端に付加することによって、ポリ（Ａ）テールを付加し伸長させる。初期ＲＮＡ切断は、通常、酵素ＣＰＳＦ（切断／ポリアデニル化特異的因子）によって触媒され、その結合部位－ポリＡシグナル配列（通常、転写されたＲＮＡ上のＡＡＵＡＡＡ）下流の約１０～３０個のヌクレオチドに発生する。ＲＮＡ切断部位５’に位置するか／又はそのすぐ近くの配列は、しばしば（しかし、必ずしもではない）ＣＡである。ＲＮＡ切断複合体により認識されるポリＡシグナル配列は、真核細胞の異なる集団の間で異なり、多くのヒトポリアデニル化部位はＡＡＵＡＡＡ配列を含有するが、このような配列は植物と真菌ｍＲＮＡにおいてあまり見られない。また、ＣＰＳＦにより弱く結合する他の変異体も存在する。ＲＮＡ切断及びそれに続くポリアデニル化を可能にするためにＲＮＡ切断複合体によって認識されるこれらの配列モチーフの全ては、ポリＡシグナル配列の範囲内にある。
さらに、本明細書で使用されるように、「ポリＡ部位下流の転写されたＧＵリッチ領域」は、他のタンパク質（例えば、切断刺激因子又はＣｓｔＦ）により、ＣＰＳＦとポリＡシグナル配列との結合特異性を増強することに用いられ得る配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）である。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、哺乳動物における一組のＵＧＵＡＡ配列のようなＣＦＩ（切断因子Ｉ）の認識配列をさらに含み、前記配列は、ＡＡＵＡＡＡポリＡシグナル配列が欠失していても、ＣＰＳＦを動員することができる。
本明細書で使用されるように、「ＲＮＡ転写終結のための配列」は、転写終結型転写ＲＮＡ（例えば、ポリＡテールを有しない転写ＲＮＡ）の３’末端又はその近傍に位置するＲＮＡ配列モチーフを含む。後生動物複製依存性ヒストンｍＲＮＡを除いて、ほとんど全ての真核ｍＲＮＡをポリアデニル化し、ここで、ｍＲＮＡプロセシングは、高度に保存的なステムループ構造と下流約２０個のヌクレオチドのプリンリッチ領域を有する部位に発生する。これらは、（唯一でなければ）少数の真核ｍＲＮＡであり、ポリ（Ａ）テールを欠いており、ステムループ構造で終わり、次いでリッチプリン配列であり、ヒストン下流エレメント（ＨＤＥ）又はヒストン３’ ＵＴＲステム－ループと呼ばれる。ＨＤＥは、転写中／後にＲＮＡが切断される位置をガイドすることによって、ヒストンｍＲＮＡの３′末端を形成する。ＨＤＥは、ヒストンｍＲＮＡの核細胞質間輸送、及び細胞質における安定性と翻訳効率の調節に関与する。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、本発明の第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写された機能性ＲＢＥ配列を有するが、第２の転写されたＴＲＳもしくは第２の転写されたｒｃＴＲＳ又はその両方を欠いている。任意選択的に、前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、第２の転写されたＤ領域配列をさらに含むか又は欠いている。いくつかの実施形態において、第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、第２の転写された突然変異したＤ領域配列及び／又は第２の転写された突然変異したＴＲＳ配列を含む。
いくつかの実施形態において、二つの転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲを有する本発明のＲＮＡ配列について、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲと第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは同じである。
いくつかの実施形態において、二つの転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲを有する本発明のＲＮＡ配列について、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲと第２の転写修飾的ＡＡＶ ＩＴＲは異なっている。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ、第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ（存在すれば）は、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける欠失、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける突然変異、又は対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける挿入を含む。
いくつかの実施形態において、二つの転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲを有する本発明のＲＮＡ配列について、第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＲＮＡ配列の５’末端の１０００個のヌクレオチド、８００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、又は１５０個のヌクレオチド内にある。
いくつかの実施形態において、ＲＰＳは、ＭＳ２配列、ＰＰ７結合部位、又はｃｏｍ結合部位を含み、且つ前記ＲＰＳ相互作用分子は、ＭＳ２配列にとってのファージ由来のＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７結合部位にとってのＰＰ７ファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、又はｃｏｍ結合部位にとってのファージＣＯＭタンパク質（ＣＯＭ）のような、前記ＲＰＳと直接又は間接的に相互作用、例えば、認識し結合することができるＲＰＳ相互作用タンパク質（ＲＰＳＩＰ）を含む。これらのＲＰＳ／ＲＰＳＩＰペアの配列は、明細書の配列部分に記述されている。
以上に記載の一つ又は複数のＲＰＳ配列のうちのいずれか一つは、転写された修飾後のＩＴＲ配列のうちのいずれか一つ、及びＭＳ２配列、ＰＰ７結合部位、及び／又はｃｏｍ結合部位のうちのいずれか一つを含み、単独で又は組み合わせて、適切な／適合性同種ＲＰＳＩＰの存在下で、本発明のＲＮＡ配列のＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進することができる。
いくつかの実施形態において、ＲＰＳＩＰは、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分であり、又はそれに直接又は間接的に関連する。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＰＳＩＰは、ＤＮＡウイルスのウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分、例えば、ＡＡＶのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０である。例えば、いくつかの実施形態において、ＲＰＳＩＰは、ＤＮＡウイルスのウイルスパッ、ケージングシステムのタンパク質成分と直接融合することができる。ＡＡＶのウイルスパッケージングシステムの例示的タンパク質成分は、Ｒｅｐタンパク質（例えば、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）のＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８）のうちのいずれか一つ、及び／又はアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）のうちのいずれか一つを含む。
いくつかの実施形態において、融合は、Ｎ末端融合であり、ここで、ＲＰＳＩＰ（例えば、ＭＣＰ、ＰＣＰ又はＣＯＭ）は、Ｒｅｐ６８／７８タンパク質及び／又はＡＡＰのＮ末端で融合する。
いくつかの実施形態において、融合は、Ｎ末端融合であり、ここで、ＲＰＳＩＰ（例えば、ＭＣＰ、ＰＣＰ又はＣＯＭ）は、Ｒｅｐ６８／７８タンパク質及び／又はＡＡＰのＣ末端で融合する。
いくつかの実施形態において、融合は直接融合であり、その間にはリンカー配列がない。
いくつかの実施形態において、融合は、Ｇｌｙ及びＳｅｒリッチリンカー又はＧＳリンカーを含み得る柔軟性ペプチドリンカーのような一つ又は複数のリンカー配列によって行われる。代表的なＧＳリンカーは、ＧＳ、ＧＳＳ、ＧＳＳＳ、ＧＳＳＳＳ及びそれらの反復（例えば、（ＧＳｐ）ｎ、ここで、ｐは１～５の整数であり、且つｎは１～２０の整数である）のような、Ｇｌｙ又はＳｅｒの１、２、３、４、５又はそれ以上の反復を含む。典型的なこのようなＧＳリンカーは、ＧＳ３リンカー又はＧＳ４リンカーである。いくつかの実施形態において、ｐは３又は４であり、且つｎは１である。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、転写されたＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含んでもよいが、好ましく含まない。例えば、本発明のＲＮＡ配列は、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含んでもよく、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のＤＮＡパッケージング能力を低下させるように、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列のヌクレオチドの付加、欠失、及び／又は置換を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、（１）タンパク質のコード配列（例えば、治療用タンパク質又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（以下の記述におけるＣａｓエフェクターのうちのいずれか一つ、例えば、Ｃａｓ９又はその変異体を含み、塩基エディタと任意に融合する）をコードするｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、又は機能性ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ＲＮＡｉ試薬又はその前駆体、前駆体ｍｉＲＮＡと一次ｍｉＲＮＡとを含むｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はその前駆体、アンチセンスＲＮＡ（ＡＳＯ）、ｐｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、又はｔｒａｃｒ ＲＮＡのようなＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＲＮＡ成分）、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲなど）、（２）転写された転写エンハンサー、（３）転写されたイントロン配列又はエクソン配列（例えば、タンパク質の発現を増強するための配列）、（４）５’ＵＴＲ配列、（５）３’ ＵＴＲ配列、（６）ポリＡ配列、又は（転写された）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、並びに任意選択的に、転写されたポリＡ部位及び前記ポリＡ部位の転写された下流ＧＵリッチ領域、（７）転写後調節エレメント又は配列、例えば、転写されたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、及び／又は（８）転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）のうちの一つ又は複数をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、転写後調節エレメント又は配列の３’及びポリＡ配列又はポリＡシグナル配列の５’に位置するＲＰＳを含む。
例えば、いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、５’から３’への方向に、ＲＳＩと、任意選択的な転写されたＷＰＲＥ配列（存在する場合もあり存在しない場合もある）と、ＲＰＳ（例えば、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ、ＭＳ２配列、ＰＰ７結合部位、又はｃｏｍ結合部位）と、ポリＡ配列又はポリＡシグナル配列とを含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質のような蛍光タンパク質、治療用タンパク質、抗原タンパク質、又は遺伝子編集タンパク質）、酵素（例えば、Ｃｒｅタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、又はその変異体）、構造タンパク質、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はその前駆体（前駆体ｍｉＲＮＡと一次ｍｉＲＮＡとを含む）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、アンチセンス配列又はオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、シングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、及びｔｒａｃｒ ＲＮＡのようなガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素用のガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲとを含むＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＲＮＡ成分は、本発明のＲＮＡ配列によりコードされるか、又はＧＯＩに含有されている。
本発明のＲＮＡ配列の全体的な長さは、ＡＡＶウイルス粒子のパッケージング能力に依存する。大多数のＡＡＶウイルス粒子のパッケージング能力は、約４，７００～５，２００個のヌクレオチドであるが、ＡＡＶ５粒子のようないくつかのＡＡＶウイルス粒子は、８，９００個までのヌクレオチドをパッケージングすることができる。
そのため、いくつかの実施形態において、ＡＡＶウイルス粒子にパッケージングされる本発明のＲＮＡ配列は、長さが約８，９００個のヌクレオチド未満の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約８，０００個のヌクレオチド未満のｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約７，０００個のヌクレオチド未満のｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約６，０００個のヌクレオチド未満のｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約５，２００個のヌクレオチド未満のｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約４，０００個のヌクレオチド未満のｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約３，０００個のヌクレオチド未満のｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約２，０００個のヌクレオチド未満のｓｓＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約４，７００～５，２００個のヌクレオチドのｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約４，７００～５，０００個のヌクレオチドのｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約４，７００～４，８００個のヌクレオチドのｓｓＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ配列は、長さが約４，７００個のヌクレオチドのｓｓＲＮＡである。
本発明の別の態様は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明のＲＮＡ配列をコード（転写）するカセットを含み、任意選択的に、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列（例えば、ＤＮＡプラスミド）であり、前記ＤＮＡ配列は、任意選択的に、前記ＤＮＡプラスミドの骨格にスタッファー配列が含まれており、及び／又は任意選択的に、機能性ＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲが含まれていない。
いくつかの実施形態において、カセットを含むポリヌクレオチドは、本発明のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡベクターである。このようなＤＮＡベクター及び／又はそのカセットは、例えば、ＡＡＶウイルス粒子にさらにパッケージングするための本発明のＲＮＡ配列を転写し産生することに用いることができる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーターをさらに含み、前記プロモーターは、カセットによりコードされる本発明のＲＮＡ配列に操作可能に連結され、その転写を駆動して本発明のＲＮＡ配列を産生する。
いくつかの実施形態において、プロモーターは遍在性プロモーターである。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成型プロモーターである。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導型プロモーターである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーターにより駆動されるＲＮＡ配列の転写を増強するエンハンサーをさらに含む。
本発明の別の態様は、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子を提供し、前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子は、ＤＮＡウイルス（例えば、ＡＡＶウイルス、又は腫瘍溶解性ウイルス）のタンパク質シェル（例えば、カプシド）にパッケージングされるＲＮＡゲノム（例えば、本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ配列）を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡウイルスはＡＡＶであり、且つ組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子は組換えＲＮＡアデノ随伴ウイルス（ｒＲＡＡＶ）粒子であり、前記組換えＲＮＡアデノ随伴ウイルス粒子は、（１）ＡＡＶカプシドと、（２）前記ＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列とを含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ６５ＡＡＰ、又は７ｍ８のＡＡＶからのカプシドを含む。
本発明の一関連態様は、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を提供し、前記集団は、本発明の複数の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）を含み、ここで、前記集団内の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）のうちの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上は、それにパッケージングされる、本発明のカプシド化されたＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列を有する。
いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団は、少なくとも１×１０４個のウイルス粒子、少なくとも２×１０４個のウイルス粒子、少なくとも５×１０４個のウイルス粒子、少なくとも１×１０５個のウイルス粒子、少なくとも２×１０５個のウイルス粒子、少なくとも５×１０５個のウイルス粒子、少なくとも１×１０６個のウイルス粒子、少なくとも２×１０６個のウイルス粒子、少なくとも５×１０６個のウイルス粒子、少なくとも１×１０７個のウイルス粒子、少なくとも２×１０７個のウイルス粒子、少なくとも５×１０７個のウイルス粒子、少なくとも１×１０８個のウイルス粒子、少なくとも２×１０８個のウイルス粒子、少なくとも５×１０８個のウイルス粒子、少なくとも１×１０９個のウイルス粒子、少なくとも２×１０９個のウイルス粒子、少なくとも５×１０９個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１０個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１０個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１０個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１１個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１１個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１１個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１２個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１２個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１２個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１３個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１３個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１３個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１４個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１４個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１４個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１５個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１５個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１５個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１６個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１６個のウイルス粒子、又は少なくとも５×１０１６個のウイルス粒子を含む。
いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子の集団内の多くとも５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％又はそれ以下は、非ＲＮＡ（例えば、ＤＮＡ）をウイルス粒子内にカプシド化する。
本発明の別の態様は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明的ＲＮＡ配列、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、及び／又は本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の集団を含む。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列のＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進するウイルスパッケージングシステムをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ウイルスパッケージングシステムは、（１）前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の転写を駆動する一つ又は複数のプロモーターの転写制御下にあるＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０のコード配列）及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３、ＡＡＰ、及び／又はＭＡＡＰのコード配列）又はそれらの発現生成物と、（２）ＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の一つ又は複数のコード配列、例えば、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子、又は前記一つ又は複数のタンパク質と、（３）ＲＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含む。
いくつかの実施形態において、ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって来減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドのサイズを拡大する。実施形態において、スタッファー配列（例えば、イントロン）をポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡプラスミド）（の例えば、骨格）に挿入することによって本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドのサイズを拡大する。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子及び／又はＡＡＶパッケージングに必要なタンパク質は、ＤＮＡのＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減弱又は減少する突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡパッケージングに必要なＲｅｐ６８／Ｒｅｐ ７８タンパク質は、突然変異を含み、前記突然変異は、そのｔｒｓ－エンドヌクレアーゼ活性を損なうか又は減弱する。ｔｒｓ－エンドヌクレアーゼ活性は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされる前に、ＡＡＶ ｓｓＤＮＡの単一のユニットを解離することができるように、ｔｒｓ配列又は部位上でＡＡＶ複製（ＤＮＡ）中間体を解離するのに必要であると考えられる。
いくつかの実施形態において、ｔｒｓ－エンドヌクレアーゼ突然変異は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列にＹ１５６Ｆ突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８タンパク質は、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異を含む（以下の配列部分における配列を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８タンパク質は、ＥＫＥ－ｍｕ突然変異を含む（以下の配列部分における配列を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８タンパク質は、Ｙ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異、及びＥＫＥ－ｍｕ突然変異から選択された二つ又はそれ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒｅｐ６８／Ｒｅｐ７８は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ６５ＡＡＰ、ＡＡＶｒｈ７４、又は７ｍ８のＡＡＶのうちのいずれか一つを有し、且つＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異、及び／又はＥＫＥ－ｍｕ突然変異を有する対応するｔｒｓ－エンドヌクレアーゼ突然変異からのものである。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、（１）前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の転写を駆動する一つ又は複数のプロモーターの転写制御下にあるＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子とＡＡＶ ｃａｐ遺伝子的コード配列と、（２）アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子のようなＡＡＶパッケージングに必要なタンパク質的コード配列とをさらに含む。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又はその変異体（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）のような哺乳動物細胞、又はＳｆ９又はＳｆ２１細胞のような昆虫細胞である。
本発明の別の態様は、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を生成する方法を提供し、前記方法は、ａ）本発明の宿主細胞を十分な時間培養することと、ｂ）前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫することとを含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を単離又は精製することをさらに含む。
本発明の別の態様は、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を生成する方法を提供し、前記方法は、ａ）ウイルスパッケージングシステム（例えば、ＡＡＶパッケージングシステム）を本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列と、本発明の前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は本発明の前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を産生するのに十分な時間接触させ、ｂ）本発明の前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は本発明の前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫し、任意選択的に、ｃ）本発明の収穫された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を単離又は精製することを含む。
いくつかの実施形態において、ウイルスパッケージングシステム（例えば、ＡＡＶパッケージングシステム）は、（１）前記ＲＮＡ配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は前記ＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、（３）ＲＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含む。任意選択的に、ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドのサイズを拡大する。
本発明の別の態様は、本発明のＲＮＡ配列又は本発明のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡ配列をＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングするシステムを提供し、前記システムは、（１）前記ＲＮＡ配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は本発明のＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、（３）ＲＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含む。任意選択的に、ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）本発明のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドのサイズを拡大する。
本発明の別の態様は、関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）を細胞、植物、又は動物に送達する方法を提供し、前記方法は、前記細胞、植物、又は動物を本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団、又は本発明の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団と接触させることを含み、ここで、前記ＧＯＩは、任意選択的に、本発明のＲＮＡ配列によりコードされる。
本発明の別の態様は、それを必要とする被験体における疾患又は障害を診断、予防、又は治療する方法を提供し、前記方法は、治療有効量又は投与量の本発明の又は本発明の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を前記被験体に投与することを含む。
本発明の別の態様は、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、本発明の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団、又は本発明の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団の、それを必要とする被験体の疾患又は障害を診断、予防、又は治療する薬物の製造における用途を提供した。
本発明の別の態様は、融合タンパク質又はコンジュゲートを提供し、前記融合タンパク質又はコンジュゲートは、ＤＮＡウイルスのウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分と融合するか又はコンジュゲートする本発明のＲＰＳＩＰを含み、ここで、前記ＲＰＳＩＰは、本発明のＲＮＡ配列におけるＲＰＳと相互作用／結合して、前記ＲＮＡ配列のＤＮＡウイルスへのパッケージングを促進する。
いくつかの実施形態において、ＲＰＳはＭＳ２であり、且つＲＰＳＩＰはＭＣＰである。
いくつかの実施形態において、ＲＰＳはＰＰ７結合部位であり、ＲＰＳＩＰはＰＣＰである。
いくつかの実施形態において、ＲＰＳはｃｏｍであり、ＲＰＳＩＰはファージＣＯＭタンパク質である。
いくつかの実施形態において、融合物又はコンジュゲートは、一つより多いＲＰＳＩＰを含み、前記ＲＰＳＩＰは、それぞれ独立して、本発明のＲＮＡ配列における一つ又は複数のＲＰＳに結合する。いくつかの実施形態において、一つより多いＲＰＳＩＰのうちの少なくとも二つは同じである。いくつかの実施形態において、一つより多いＲＰＳＩＰのうちの少なくとも二つは異なっている。
いくつかの実施形態において、融合物又はコンジュゲートは、直列連結された二つのＭＣＰを含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡウイルスのウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分は、前記ＡＡＶのＲｅｐ６８又はＲｅｐ７８のようなＡＡＶのＲｅｐタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、Ｒｅｐタンパク質は、一つ又は複数の突然変異を含み、前記一つ又は複数の突然変異は、ｔｒｓ－エンドヌクレアーゼ活性を損なうか又は減弱する。いくつかの実施形態において、突然変異は、Ｙ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異、及び／又はＥＫＥ－ｍｕ突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ＤＮＡウイルスのウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分は、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を含む。
いくつかの実施形態において、ＲＰＳＩＰをＤＮＡウイルスのウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分（例えば、Ｒｅｐタンパク質又はＡＡＰ）と直接融合させる。
いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーを介してＲＰＳＩＰをＤＮＡウイルスのウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分（例えば、Ｒｅｐタンパク質又はＡＡＰ）と融合させる。
いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧｌｙとＳｅｒとを含有するリンカーのような柔軟性リンカーである。いくつかの実施形態において、ＧｌｙとＳｅｒとを含有するリンカーは、ＧＳｎの１～２０個の反復（例えば、１～５又は１～３個の反復）を含み、ここで、ｎは１、２、３、４、又は５である。いくつかの実施形態において、ＧＳｎリンカーは、ＧＳ２、ＧＳ３、又はＧＳ４であり、１～４個（例えば、２個）の反復を有する。いくつかの実施形態において、リンカーはＧＳＳＧＳＳである。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＭＣＰとＲｅｐとを含み、ここで、前記Ｒｅｐは、任意選択的に、Ｙ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異、及び／又はＥＫＥ－ｍｕ突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＰは、ＲｅｐのＮ末端で融合する（ＭＣＰ－Ｒｅｐ）。いくつかの実施形態において、ＭＣＰと融合するＲｅｐは、Ｙ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異、及び／又はＥＫＥ－ｍｕ突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＰ－Ｒｅｐ融合物は、ＧＳＳＧＳＳのようなＧＳｎリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、ＭＣＰ－Ｒｅｐは、直列連結される二つのＭＣＰ（例えば、二つのＭＣＰ部分の間にいかなるリンカーもない）を含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＰは、ＧＳＳＧＳＳのような別のＧＳｎリンカーのＣ末端にある。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＰＣＰとＲｅｐとを含み、ここで、前記Ｒｅｐは、任意選択的に、Ｙ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異、及び／又はＥＫＥ－ｍｕ突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＰは、ＲｅｐのＮ末端で融合する（ＰＣＰ－Ｒｅｐ）。いくつかの実施形態において、ＰＣＰと融合するＲｅｐは、Ｙ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異、及び／又はＥＫＥ－ｍｕ突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＰ－Ｒｅｐ融合物は、ＧＳＳＧＳＳのようなＧＳｎリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、ＰＣＰ－Ｒｅｐは、直列連結される二つのＰＣＰ（例えば、二つのＰＣＰ部分の間にいかなるリンカーもない）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＰは、ＧＳＳＧＳＳのような別のＧＳｎリンカーのＣ末端にある。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＣＯＭとＲｅｐとを含み、ここで、前記Ｒｅｐは、任意選択的に、Ｙ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異、及び／又はＥＫＥ－ｍｕ突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＭは、ＲｅｐのＮ末端で融合する（ＣＯＭ－Ｒｅｐ）。いくつかの実施形態において、ＣＯＭと融合するＲｅｐは、Ｙ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ突然変異、及び／又はＥＫＥ－ｍｕ突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＭ－Ｒｅｐ融合物は、ＧＳＳＧＳＳのようなＧＳｎリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、ＣＯＭ－Ｒｅｐは、直列連結される二つのＣＯＭ（例えば、二つのＣＯＭ部分の間にいかなるリンカーもない）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＯＭは、ＧＳＳＧＳＳのような別のＧＳｎリンカーのＣ末端にある。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＭＣＰとＡＡＰとを含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＰは、ＡＡＰのＮ末端で融合する（ＭＣＰ－ＡＡＰ、又はＭＡ）。いくつかの実施形態において、ＭＣＰは、ＡＡＰのＣ末端で融合する（ＡＡＰ－ＭＣＰ、又はＡＭ）。いくつかの実施形態において、ＭＣＰ－ＡＡＰ又はＡＡＰ－ＭＣＰ融合物は、ＧＳＳＧＳＳのようなＧＳｎリンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、ＭＣＰ－ＡＡＰ融合物は、ＧＳＳＧＳＳのような別のＧＳｎリンカーのＣ末端にある。いくつかの実施形態において、ＡＡＰ－ＭＣＰ融合物は、ＧＳＳＧＳＳのような別のＧＳｎリンカーのＮ末端にある。
本発明の別の態様は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明のＲＰＳＩＰとＤＮＡウイルスのウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分（例えば、ＡＡＰ又はＲｅｐタンパク質）との間の融合物のうちのいずれか一つをコードする。
以上に記述されている本発明の一般的な態様について、以下のセクションは、本明細書に記載の本発明の特定のエレメントの追加の詳細を提供した。各特定のエレメントは、エレメントの全ての可能な組み合わせ又は配置が明示的に列挙されていなくても、本発明のいずれか一つ又は複数の追加のエレメントと組み合わせられ得ることが企図される。
２．ＡＡＶ血清型
本発明のリーボスポリヌクレオチドをパッケージングするＡＡＶ粒子は、任意の天然又は組換えＡＡＶ血清型を含むか又はそれに由来し得る。
本発明のリーボスポリヌクレオチドをパッケージングするＡＡＶ粒子は、任意の天然又は組換えＡＡＶ血清型を含むか又はそれに由来し得る。
本開示によれば、ＡＡＶ粒子は、以下の任意の血清型及びその変異体から選択されたいずれか一つの血清型を利用してもよく、又はそれに基づいてもよく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ １２、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．ｌ １、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶｌ－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶｌ－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．ｌ、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ－２－前駆体ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．ｌ７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．ｌ５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．ｌ６、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ４－８／ｒ １１．６４、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ Ａ３．３、ＡＡＶ Ａ３．４、ＡＡＶ Ａ３．５、ＡＡＶ Ａ３．７、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒｌ、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．ｌ、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒｌ．１６、ＡＡＶｈＥｒｌ．１８、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒｌ．３５、ＡＡＶｈＥｒｌ．３６、ＡＡＶｈＥｒｌ．５、ＡＡＶｈＥｒｌ．７、ＡＡＶｈＥｒｌ．８、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈｕ．ｌ、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．ｌ ｌ、ＡＡＶｈｕ．ｌ、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ－ ９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．ｌ、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．ｌ３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒｌ、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＢＡＡＶ、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、日本ＡＡＶ １０、トゥル ータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－ ２、及び／又はＡＡＶ ＳＭ １０－８を含むが、それらに限らない 。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９配列における突然変異、例えば、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４のような、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａにより記述される配列（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ［分子療法］１９（６）：１０７０－１０７８，２０１１）を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ３Ｂ（ＵＳ ６，１５６，３０３におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １及び１０）、ＡＡＶ６（ＵＳ ６，１５６，３０３におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、７及び１１）、ＡＡＶ２（ＵＳ ６，１５６，３０３におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３及び８）、ＡＡＶ３Ａ（ＵＳ ６，１５６，３０３におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４及び９）のような、ＵＳ ６，１５６，３０３に記述されている配列、又はその誘導体を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、血清型は、Ｇｒｉｍｍらにより記述されるＡＡＶＤＪ８（又はＡＡＶ－ＤＪ８）のようなＡＡＶ－ＤＪ又はその変異体であってもよい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ［ウイルス学雑誌］８２（１２）：５８８７－５９１１，２００８）。ＡＡＶ－ＤＪ８のアミノ酸配列は、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために、二つ又はそれ以上の突然変異を含んでもよい。非限定的例として、ＵＳ ７，５８８，７７２においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １として記述されているＡＡＶ－ＤＪ配列は、（１）Ｒ５８７Ｑ（アミノ酸５８７におけるＡｒｇがグルタミンＧｌｎに変わった）、及び（２）Ｒ５９０Ｔの二つの突然変異を含んでもよい。別の非限定的例として、ＡＡＶ－ＤＪ配列は、（１）Ｋ４０６Ｒ、（２）Ｒ５８７Ｑ、及び（３）Ｒ５９０Ｔの三つの突然変異を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、トゥル ータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）（ＷＯ ２０１５／１２１５０１におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）、いわゆるＵＰｅｎｎ ＡＡＶ１０（ＷＯ ２０１５／１２１５０１におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）、又はいわゆる日本ＡＡＶ１０（ＷＯ ２０１５／１２１５０１におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）のような、ＷＯ ２０１５／１２１５０１に記述されている配列、又はその変異体を含んでもよい。
ＡＡＶカプシド血清型は、複数の種からのものを選択又は使用し得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、トリＡＡＶ（ａＡＡＶ）であってもよい。ａＡＡＶ血清型は、ａＡＡＶ（ＵＳ ９，２３８，８００におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、２、４、６、８、１０、１２、及び１４）のような、ＵＳ ９，２３８，８００に記述されている配列、又はその変異体を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ウシＡＡＶ（ｂＡＡＶ）であってもよい。ｂＡＡＶ血清型は、ｂＡＡＶ（ＵＳ ９，１９３，７６９におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １及び６）のような、ＵＳ ９，１９３，７６９に記述されている配列、又はその変異体を含んでもよい。ｂＡＡＶ血清型は、ｂＡＡＶ（ＵＳ ７，４２７，３９６におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５及び６）のような、ＵＳ ７，４２７，３９６に記述されている配列、又はその変異体を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ヤギＡＡＶであってもよい。ヤギＡＡＶ血清型は、ヤギＡＡＶ（ＵＳ ７，４２７，３９６におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）のような、ＵＳ ７，４２７，３９６に記述されている配列、又はその変異体を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶを二つ又はそれ以上の親血清型からのハイブリッドＡＡＶにエンジニアリングしてもよい。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ２Ｇ９であってもよく、それはＡＡＶ２及びＡＡＶ９からの配列を含む。ＡＡＶ２Ｇ９ ＡＡＶ血清型は、ＵＳ ２０１６－００１７００５ Ａ１に記述されている配列を含んでもよい。（参照により本明細書に組込まれる）。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドライブラリーから生成された血清型であってもよく、それは、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ［分子療法］１９（６）：１０７０－１０７８，２０１１、参照により本明細書に組込まれる）により記載されているように、アミノ酸３９０～６２７（ＶＰ１番号）に突然変異を有する。血清型並びに対応するヌクレオチド及びアミノ酸置換は、ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ、Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８Ａ及びＴ１４３６Ｘ、Ｖ４７３Ｄ及びＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ、Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０Ｃ及びＡ１６１７Ｔ、Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ、Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ、Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ、Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ、Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ、Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ、Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ、Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ、Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ、Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ、Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ、Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ、Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ、Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ、Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ、Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ、Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ、Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ、Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ、Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ、Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（Ｃ１５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ、Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ、Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ、Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ、Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ、Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ、Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ、Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ、Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ、Ｇ４８１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ、Ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ）、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ、Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ、Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ、Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ、Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ、Ｍ５５９Ｌ）及びＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ、Ｆ５３５Ｌ）であってもよいが、それらに限らない。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、少なくとも一つのＡＡＶカプシドＣＤ８＋ Ｔ－細胞エピトープを含む血清型であってもよい。非限定的実施例として、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２又はＡＡＶ ８であってもよい。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、Ｄｅｖｅｒｍａｎに記述されているＰＨＰ．Ａ又はＰＨＰ．Ｂ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．［ネイチャー バイオテクノロジー］３４（２）：２０４－２０９，２０１６、参照により本明細書に組込まれる）のような変異体であってもよい。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、Ｄｅｖｅｒｍａｎら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［ネイチャー バイオテクノロジー］３４（２）：２０４－２０９、２０１６、参照により本明細書に組込まれる）により記述される、Ｃｒｅ組換えベースのＡＡＶターゲット進化（ＣＲＥＡＴＥ）によって生成された血清型であってもよい。いくつかの実施形態において、他のＡＡＶ血清型に比べて、このような方式で生成されたＡＡＶ血清型は、改善されたＣＮＳ形質導入及び／又はニューロン及び星状膠細胞向性を有する。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸５８８～５８９の間に７個のアミノ酸挿入を有するＡＡＶ９誘導体であってもよい。これらの７個のアミノ酸挿入の非限定的例としては、ＰＨＰ．Ａ、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．Ｂ２、ＰＨＰ．Ｂ３、ＰＨＰ．Ｎ、ＰＨＰ．Ｓ、Ｇ２Ａ１２、Ｇ２Ａ１５、Ｇ２Ａ３、Ｇ２Ｂ４、及びＧ２Ｂ５が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４，７３４～５，３０２及びＷＯ ２０１８／００２７１９ Ａ１から選択される、表２における任意の血清型（参照により本明細書に組込まれる）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、ＷＯ ２０１８／００２７１９ Ａ１のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４，７３４－５，３０２に記載の配列、断片又は変異体（参照により本明細書に組込まれる）によりコードされてもよい。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＶＰ１カプシド配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ６５ＡＡＰ、又は７ｍ８のうちの一つである。
以下では、上記代表的なＶＰ１カプシドのタンパク質配列を提供した。
３．修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ
本明細書の開示によれば、任意の転写されたＡＡＶ ＩＴＲ配列（ＲＮＡ）は、例えば、ＴＲＳ又はその等価物を除去又は不活化し、及び／又はそのＤ領域配列を除去するために、コード用の修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ ＤＮＡテンプレートをエンジニアリングすることによって修飾され得る。このような修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ ＤＮＡテンプレートを転写することによって得られた、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、本発明のＲＮＡ配列をＡＡＶウイルス粒子にパッケージングする促進能力を保持した。
本明細書の開示によれば、任意の転写されたＡＡＶ ＩＴＲ配列（ＲＮＡ）は、例えば、ＴＲＳ又はその等価物を除去又は不活化し、及び／又はそのＤ領域配列を除去するために、コード用の修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ ＤＮＡテンプレートをエンジニアリングすることによって修飾され得る。このような修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ ＤＮＡテンプレートを転写することによって得られた、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、本発明のＲＮＡ配列をＡＡＶウイルス粒子にパッケージングする促進能力を保持した。
ＡＡＶ ＤＮＡ複製中、ＩＴＲは、末端解離部位（ＴＲＳ）において、ウイルスにコードされたＲｅｐタンパク質によって切開される。このような開始機能は、三つのＤＮＡ配列エレメント、即ちＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）、末端反復（ＲＢＥ’）内の内部ヘアピンの単一の先端を含む小回文配列、及びＴＲＳが必要である。ＴＲＳによる切開形成中、Ｒｅｐは、特定の方向にＲＢＥ（ＤＮＡ）上に繋がっている。このような方向は、ＲｅｐをＡＡＶ ＩＴＲ上に整列させ、特定のヌクレオチドがＲＢＥ’と接触することを可能にし、ＴＲＳに対する切開を指導するように思われる。ＴＲＳに対するＲＢＥの極性又は位置の変化は、Ｒｅｐによる切開の形成を大幅に抑制した。ＲＢＥ’内の置換もＲｅｐ比活性を低下させたが、程度が低い。ＴＲＳによる切開形成中、ＲｅｐとＲＢＥ及びＲＢＥ’との相互作用は、ＲｅｐとＲＢＥとの接触がＤＮＡヘリカーゼ活性及びＴＲＳ切断の両方に必要であるため、機能的に異なっている。それとともに、ＲｅｐとＲＢＥ’との相互作用は、ＴＲＳ切断よりも、主にＩＴＲ巻き戻し及びＴＲＳステムループ構造の形成に必要である。
本発明のＲＮＡ配列上には、少なくとも一つの本発明の転写された修飾後のＩＴＲ配列（ＲＮＡ）が存在する。本発明の転写された修飾後のＩＴＲ配列は、好ましくは、本発明のＲＮＡ配列の３’末端により近い。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、二つの転写された修飾後のＩＴＲ配列を含む。
いくつかの実施形態において、二つの転写された修飾後のＩＴＲ配列は、同じＡＡＶ血清型に由来する可能性がある。
別の実施形態において、二つの転写された修飾後のＩＴＲ配列は、異なる血清型の二つの異なるＡＡＶに由来する可能性がある。
いくつかの実施形態において、一つ又は複数の転写された修飾後のＩＴＲ配列は、挿入、欠失、及び／又は突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のｒＲＡＡＶ ＲＮＡ配列は、一つの転写された修飾後の／突然変異したＩＴＲ配列と、一つの転写された野生型ＩＴＲ配列とを含む。
いくつかの実施形態において、一つ又は複数の転写された修飾後のＩＴＲ配列は、Ｆｌｉｐ方向又はＦｌｏｐ方向の野生型ＩＴＲに基づいている。
当分野既知の野生型ＩＴＲ配列に基づいて、転写された修飾後の被験ＩＴＲ配列又はそのコードＤＮＡ配列を容易に製造することができる。
代表的（非限定的）野生型ＩＴＲ配列（ＤＮＡ）は、少なくとも表１に列挙されている以下の配列を含む。図１Ｂ及び１Ｃは、それぞれＡＡＶ１－ＡＡＶ７の５’ ＩＴＲ配列の多配列アライメント及び３’ ＩＴＲ配列の多配列アライメントを示し、コンセンサス配列と、ＴＲＳと、ＲＢＥと、Ｄ領域配列とを含む。
本明細書で使用されるように、「ＲＢＥ配列」又は「ＲＢＥ」は、Ａ：Ａ’回文ステム配列におけるＡＡＶ ＩＴＲ配列を指し、塩基がペアリングした場合、前記配列はステム（通常、約２１～２３又は約２２ｂｐである二本鎖領域）を形成し、ＩＴＲとＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）との結合を促進する。図１Ａにおいて、代表的なＲＢＥ配列は、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲのＦｌｉｐ及びＦｌｏｐ構造の両方に示された。
当分野既知の多くのＡＡＶ血清型の野生型ＩＴＲ配列は、容易に入手することができ、図１Ｂ及び１Ｃに示すように、いずれも他のＡＡＶ ＩＴＲとアライメントすることができる。アライメント結果は、任意のＡＡＶ ＩＴＲのＲＢＥ配列を同定することに用いることができる。
「転写された（機能性）ＲＢＥ」は、ＲＢＥ ＤＮＡテンプレートに対応する転写されたＲＮＡを指し、前記のＲＢＥ ＤＮＡテンプレートに対応するのは、野生型ＲＢＥ又は一つ又は複数のヌクレオチド挿入、欠失、置換及び／又は他の突然変異を有するその機能性変異体であり、機能性変異体ＲＢＥが、Ｒｅｐに結合する能力を実質的に保持（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は増強された同じ血清型Ｒｅｐとの結合を保持）すればよい。いくつかの実施形態において、ＲＢＥ ＤＮＡテンプレート又は転写されたＲＢＥ ＲＮＡと野生型配列との差は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のヌクレオチド以下である。いくつかの実施形態において、野生型ＲＢＥに比べて、例えば、ＲＢＥの一つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、及び／又はその他突然変異のため、機能性ＲＢＥは、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％までの配列変異を含む。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列の差は、ペアリングした塩基ペアの失いを引き起こさない（例えば、野生型ＲＢＥにおけるＧＣペアは、変異体ＲＢＥにおけるＣＧ、ＡＴ／ＡＵ又はＴＡ／ＵＡに変化し得るが、元のペアリング塩基ペアを失わない）。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＩＴＲ配列（ＲＮＡ）は、Ｒｅｐにより媒介されたパッケージングを促進するために、転写されたＲｅｐ－結合エレメント（転写されたＲＢＥ）又はその機能性変異体を保持する。例えば、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲのＲＢＥ ＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５である。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＩＴＲ配列（ＲＮＡ）は、転写されたＲｅｐ－結合エレメントの（転写されたＲＢＥ’の）配列をさらに保持する。例えば、図１Ａにおいて、Ｆｌｉｐ ＩＴＲのＢ：Ｂ’断片にヘアピン又はループ構造を形成するＣＴＴＴＧ ＤＮＡ配列はＲＢＥ’配列である。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＩＴＲ配列は、転写されたＴＲＳ、及び／又は転写されたｒｃＴＲＳ、又はその両方を欠いている。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、それに対応するＤＮＡ配列が野生型ＴＲＳのいくつかの配列エレメントを欠いているため、転写された（機能性）ＴＲＳ配列を欠いており、それにより野生型ＴＲＳ機能がＤＮＡ中で失われた（例えば、Ａ：Ａ’断片とＤ領域配列との間の野生型ＴＲＳ配列が通常占める配列又は内部鎖は、ＡＡＶ複製中に通常エンドヌクレアーゼにより認識され切断され、ＡＡＶ ＩＴＲのｓｓＤＮＡベクターゲノムに存在すれば、切断されない）。
例えば、いくつかの実施形態において、ＴＲＳの逆相補的配列は、例えば、実施例で使用されるｄＩＴＲ及びｄＩＴＲ－Ｄ配列において、欠失又は突然変異してもよい。
代替的に又は付加的に、通常Ａ：Ａ’断片とＤ領域配列との間にあるＴＲＳは、一つ又は複数のヌクレオチドを欠いているか、又は一つ又は複数のヌクレオチド置換又は突然変異を有してもよい（例えば、例で使用されるｄＩＴＲ配列において４個のヌクレオチドを欠いているか又は置換／突然変異させる）。
いくつかの実施形態において、野生型配列における全て又はほとんど全てのＴＲＳ／ｒｃＴＲＳは欠失しており、それにより得られたＲＮＡ転写物が機能性ＴＲＳ配列を欠いている。
いくつかの実施形態において、例えば、野生型配列に挿入、欠失、置換、及び／又は他の突然変異を有することによって野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳ配列の一部を改変し／突然変異させ、それにより突然変異したＴＲＳ／ｒｃＴＲＳは、転写された機能性ＴＲＳを欠いている対応するＲＮＡ転写物を産生する。例えば、いくつかの実施形態において、１、２、３、４又は５個の連続的又は非連続的ＴＲＳヌクレオチド及び／又はｒｃＴＲＳヌクレオチドは、突然変異した配列において欠失するか又は置換されてもよい。
いくつかの実施形態において、転写された修飾後のＩＴＲ配列は、Ｄ領域配列を欠いているか又は少なくとも機能性Ｄ領域配列（Ｄ配列又はＤ’配列、Ｆｌｉｐ又はＦｌｏｐ構造に依存する）を欠いている修飾後のＩＴＲから転写される。例えば、いくつかの実施形態において、Ｄ領域配列全体が欠失しており、それにより得られたＲＮＡ転写物は、転写された機能性Ｄ領域配列を欠いている。他の実施形態において、Ｄ領域配列の少なくとも一部が突然変異し（例えば、欠失、挿入、置換、及び／又は他の突然変異を有し）、それにより得られたＲＮＡ転写物は、転写された機能性Ｄ領域配列を欠いている。いくつかの実施形態において、突然変異したＤ領域配列は、野生型配列の１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個以下のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、修飾後のＩＴＲ配列（ＤＮＡテンプレート）は、野生型ＩＴＲ配列の最も５’末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のヌクレオチドを欠いている。例えば、野生型ＩＴＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）に比べて、ｄＩＴＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）及びｄＩＴＲ－Ｄ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）の両方は、最も５’末端の８個のヌクレオチドを欠いている。
上記転写されたＲＮＡコード配列（ＧＯＩのＤＮＡコード配列）、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ（修飾されたＡＡＶ ＩＴＲ）、転写された機能性ＲＢＥ（機能性ＲＢＥ）、転写された機能性Ｄ領域配列（機能性Ｄ領域配列）及び転写された機能性ＴＲＳ配列（機能性ＴＲＳ配列）のうちのいずれか一つをコードする対応するＤＮＡ配列は、本発明の範囲内であると明確に考えられる。
４．イントロン、エクソン、ＵＴＲ、エンハンサー、及び他のエレメント
本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子にカプシド化される本発明のＲＮＡ配列は、ＧＯＩ発現を増強又は調節することができる追加の任意選択的な配列エレメント（例えば、発現制御エレメント）をさらに含んでもよい。
本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子にカプシド化される本発明のＲＮＡ配列は、ＧＯＩ発現を増強又は調節することができる追加の任意選択的な配列エレメント（例えば、発現制御エレメント）をさらに含んでもよい。
本発明のＲＮＡ配列に存在する発現制御エレメントは、適切な異種ポリヌクレオチド（例えば、ＧＯＩ）転写及び／又は翻訳を促進し、ｍＲＮＡ及び終結コドンのフレーム内翻訳などを可能にするために、例えば、イントロンのスプライシングシグナルと、遺伝子の正確なリーディングフレームの維持とを含む。
典型的には、発現制御エレメント（いくつかは本発明のＲＮＡ配列に存在するが、他は本発明のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ上に存在する）は、一つ又は複数の核酸配列、例えば、操作可能に連結される異種ポリヌクレオチド（例えば、ＧＯＩ）の発現に影響を与えるプロモーター及びエンハンサーである。これらのエレメントは、典型的には、シスで機能するが、トランスで機能する可能性もある。発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、情報安定性などのレベルで行われ得る。典型的には、転写を調節する発現制御エレメントは、転写されたポリヌクレオチドの５’末端（即ち、「上流」）の近傍に並置されている。発現制御エレメントはさらに、転写された配列の３’末端（即ち「下流」）又は転写物内（例えば、イントロン中）に位置してもよい。発現制御エレメントは、転写された、関心のある遺伝子配列から離れて位置してもよい（例えば、関心のある遺伝子ポリヌクレオチドから１００～５００、５００～１０００、２，０００～５，０００又はそれ以上のヌクレオチド離れる）。しかしながら、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）のポリヌクレオチド長さの制限により、これらの発現制御エレメントは、典型的には、転写された関心のある遺伝子配列から１～１，０００、１～５００、１～２５０又は１～１００個のヌクレオチド離れた範囲内にある。
本発明のＲＮＡ配列又は本発明のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ上に存在し得るいくつかの非限定的発現制御エレメントは、以下でさらに詳しく記述されている。
イントロン
イントロンは、転写後調節エレメントを有し、細胞核からのｍＲＮＡの輸送を効果的に誘導し、ｍＲＮＡ安定性を増強することが知られている。
イントロンは、転写後調節エレメントを有し、細胞核からのｍＲＮＡの輸送を効果的に誘導し、ｍＲＮＡ安定性を増強することが知られている。
いくつかの実施形態において、ｒＲＡＡＶは、一つ又は複数のイントロン又はその断片を含んでもよい。いくつかの実施形態において、一つ又は複数のイントロンは、関心のある遺伝子の断片である。いくつかの実施形態において、一つ又は複数のイントロンは、関心のある遺伝子と異種である。
イントロンは、遺伝子発現レベルに影響を及ぼすことが報告されている。このような作用は、遺伝子発現のイントロン媒介性増強（ＩＭＥ）と呼ばれる（Ｌｕら，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ［分子遺伝学ゲノミクス］２７９：５６３－５７２，２００８）。いくつかの実施形態において、一つ又は複数のイントロンのない配列からの遺伝子発現に比べて、遺伝子発現レベルは、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、約６倍、約６．５倍、約７倍、約７．５倍、約８倍、約８．５倍、約９倍、約９．５倍又は約１０倍増加する。
非限定的イントロンは、ＳＶ４０イントロンと、βグロビンイントロンと、シュートキメライントロン（ＣＩＢ）とを含む。他のイントロンは、Ｌｕら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．［ヒューマン遺伝子治療］２０１７；２８（１）：１２５－１３４に記述されているＣｏｌＥ２－ＲＮＡ－ＯＵＴ、ＯＩＰＲ、及びＲ６Ｋ－ＲＮＡ－ＯＵＴイントロン（参照により組み込まれる）と、ヒトヘモグロビンサブユニットβ（ＨＢＢ２）合成イントロン（Ｓｎｙｄｅｒら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ［ヒューマン遺伝子治療］，８（１９９７），ページ１８９１～１９００、参照により組み込まれる）とを含む。
いくつかの実施形態において、一つ又は複数のイントロンは、２５個のヌクレオチド未満、５０個のヌクレオチド未満、１００個のヌクレオチド未満、１５０個のヌクレオチド未満、２００個のヌクレオチド未満、２５０個のヌクレオチド未満、３００個のヌクレオチド未満、３５０個のヌクレオチド未満、４００個のヌクレオチド未満、４５０個のヌクレオチド未満、又は５００個のヌクレオチド未満であってもよい。
いくつかの実施形態において、一つ又は複数のイントロンは、２５個のヌクレオチド超、５０個のヌクレオチド超、１００個のヌクレオチド超、１５０個のヌクレオチド超、２００個のヌクレオチド超、２５０個のヌクレオチド超、３００個のヌクレオチド超、３５０個のヌクレオチド超、４００個のヌクレオチド超、４５０個のヌクレオチド超、又は５００個のヌクレオチド超であってもよい。
いくつかの実施形態において、一つ又は複数のイントロンは、約５０～約１００個のヌクレオチド、約５０～約２００個のヌクレオチド、約５０～約３００個のヌクレオチド、約５０～約４００個のヌクレオチド、約５０～約５００個のヌクレオチド、約１００～約２００個のヌクレオチド、約１００～約３００個のヌクレオチド、約１００～約４００個のヌクレオチド、約１００～約５００個のヌクレオチド、約２００～約３００個のヌクレオチド、約２００～約４００個のヌクレオチド、約２００～約５００個のヌクレオチド、約３００～約４００個のヌクレオチド、約３００～約５００個のヌクレオチド、又は約４００～約５００個のヌクレオチドであってもよい。
エンハンサー
本明細書で使用されるように、「エンハンサー」という用語は、関心のある遺伝子の近傍に位置する配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的には、本発明のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡにおけるプロモーターエレメントの上流に位置するが、イントロン配列（例えば、関心のある遺伝子）の下流又は内部に位置してもよく、機能を維持する。そのため、エンハンサー又はその一部は、本発明の転写されたＲＮＡ配列に存在してもよい。
本明細書で使用されるように、「エンハンサー」という用語は、関心のある遺伝子の近傍に位置する配列を指すことができる。エンハンサーエレメントは、典型的には、本発明のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡにおけるプロモーターエレメントの上流に位置するが、イントロン配列（例えば、関心のある遺伝子）の下流又は内部に位置してもよく、機能を維持する。そのため、エンハンサー又はその一部は、本発明の転写されたＲＮＡ配列に存在してもよい。
適切なエンハンサーの非限定例としては、ＣＭＶエンハンサーが挙げられる。
いくつかの実施形態において、エンハンサーエレメントは、関心のある遺伝子の上流又は下流の１００個の塩基ペア、２００個の塩基ペア又は３００個又はそれ以上の塩基ペアに位置してもよい（例えば、本発明のＲＮＡ配列又はそのＤＮＡコード配列にある）。エンハンサーエレメントは、典型的には、プロモーターエレメントにより提供される増加した発現まで、関心のある遺伝子の発現を増加させる。
非翻訳領域（ＵＴＲ）
本明細書で使用されるように、「非翻訳領域」（「ＵＴＲ」）は、転写後の翻訳されていないＲＮＡを指す。例えば、５’ ＵＴＲは、関心のある遺伝子開始コドンの上流に位置し、且つ３’ ＵＴＲは、関心のある遺伝子終結コドンの下流に位置する。いくつかの実施形態において、５’及び／又は３’ ＵＴＲは、転写された関心のある遺伝子の安定性を増強するために、挿入、欠失又は修飾を有してもよい。例えば、５’ ＵＴＲは、限定されないが、コザック配列及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）のような翻訳開始配列を含んでもよい。コザック配列は、共通のＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは開始コドン（ＡＵＧ）上流の三つの塩基のプリン（アデニン又はグアニン）であり、その後にもう一つの‘Ｇ’が続く。
本明細書で使用されるように、「非翻訳領域」（「ＵＴＲ」）は、転写後の翻訳されていないＲＮＡを指す。例えば、５’ ＵＴＲは、関心のある遺伝子開始コドンの上流に位置し、且つ３’ ＵＴＲは、関心のある遺伝子終結コドンの下流に位置する。いくつかの実施形態において、５’及び／又は３’ ＵＴＲは、転写された関心のある遺伝子の安定性を増強するために、挿入、欠失又は修飾を有してもよい。例えば、５’ ＵＴＲは、限定されないが、コザック配列及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）のような翻訳開始配列を含んでもよい。コザック配列は、共通のＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは開始コドン（ＡＵＧ）上流の三つの塩基のプリン（アデニン又はグアニン）であり、その後にもう一つの‘Ｇ’が続く。
３′ ＵＴＲには、アデノシン及びウリジンのセグメントが埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチ特徴は、回転率の高い遺伝子で特に一般的である。それらの配列特徴及び機能特性に基づいて、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は三つの種類に分けられてもよい（Ｃｈｅｎら，１９９５）：クラスＩのＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。Ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、クラスＩのＡＲＥを含有する。クラスＩＩのＡＲＥは、二つ又はそれ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）９量体を有する。このようなＡＲＥを含有する分子は、ＧＭ－ＣＳＦとＴＮＦ－ａとを含む。クラスＩＩＩのＡＲＥＳの定義は、あまり明確ではない。これらのＵリッチ領域はＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ｃ－Ｊｕｎ及びミオグロビンは、これらの中で十分に研究された二つの例である。ＡＲＥに結合する大多数のタンパク質はメッセンジャーの安定性を破壊することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、特にＨｕＲはｍＲＮＡの安定性を向上させ得ることが記載されている。ＨｕＲは、全ての三つのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３′ ＵＴＲにエンジニアリングすることは、ＨｕＲ結合を引き起こすことによって、メッセンジャーをインビボで安定させる。これらの５’及び／又は３’ ＵＴＲ配列のうちのいずれか一つは、本発明のＲＮＡ配列に存在し得る。
いくつかの実施形態において、５’ ＵＴＲ及び／又は３’ ＵＴＲは、関心のある遺伝子と異種である配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、５’ ＵＴＲ及び／又は３’ ＵＴＲは、関心のある遺伝子に対して天然である。
いくつかの実施形態において、肺、肝臓、膵臓、内皮細胞、ＣＮＳ、ニューロン、アストロサイト、骨格筋、心筋、平滑筋、血液、造血細胞のような特定の組織又は器官において正常に発現するｍＲＮＡからの５’ ＵＴＲ及び／又は３’ ＵＴＲは、本発明のＲＮＡ配列に用いられてもよく、前記ＲＮＡ配列は、これらの組織のうちの一つ又は複数を標的化するＧＯＩを含む。
ポリアデニル化配列
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲを含み、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ポリＡ配列、ポリＡシグナル配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）、又はＲＮＡ転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）の５’にある。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲを含み、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ポリＡ配列、ポリＡシグナル配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）、又はＲＮＡ転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）の５’にある。
以上では、「ポリＡ配列」、「ポリＡテール」、「ポリＡシグナル配列」及び「ＲＮＡ転写終結のための配列」を定義した。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ポリＡテールを含む。このようなＲＮＡ配列を本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子にパッケージングし、標的細胞に直接送達してもよく、且つ本発明のＲＮＡ配列によりコードされるＧＯＩを直接翻訳してもよい。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ポリＡシグナル配列と、任意のポリＡ部位下流の転写されたＧＵリッチ領域とを含む。このようなＲＮＡ配列を本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子にパッケージングし、標的細胞に直接送達してもよい。標的細胞に入ると、ポリＡシグナル配列は、ポリＡテールを産生するように、細胞質ポリＡ付加酵素により認識され、さらにプロセシングされ得、そして本発明のＲＮＡ配列によりコードされるＧＯＩを翻訳する。
代表的なポリＡシグナル配列及び周辺配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリＡ配列（Ｌｉｕら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ［ヒューマン遺伝子治療］２０：３０８－３１７，２０１３を参照されたく、参照により組み込まれる）と、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）（Ｇｏｏｄｗｉｎ及びＲｏｔｔｍａｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．［生化学雑誌］１９９２年８月１５日；２６７（２３）：１６３３０－４、参照により組み込まれる）と、ＳＶ４０早期又は後期ポリアデニル化シグナルと、Ｃｈｏｉら（Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ．［分子脳］２０１４；７：１７、参照により本明細書に組込まれる）で使用される合成ポリＡシグナルとを含む。
転写エンハンサー
本明細書で使用されるように、「転写エンハンサー」は、関心のある遺伝子の転写を増加できるシス作用性ヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、転写エンハンサーは、本発明の転写されたＲＡＡＶ ＲＮＡ配列のイントロンに位置するか又はエクソン領域に部分的に位置してもよい。
本明細書で使用されるように、「転写エンハンサー」は、関心のある遺伝子の転写を増加できるシス作用性ヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、転写エンハンサーは、本発明の転写されたＲＡＡＶ ＲＮＡ配列のイントロンに位置するか又はエクソン領域に部分的に位置してもよい。
ＷＰＲＥ
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、コードＤＮＡにおけるＷＰＲＥ配列によりコードされる、転写されたＷＰＲＥ配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、コードＤＮＡにおけるＷＰＲＥ配列によりコードされる、転写されたＷＰＲＥ配列を含む。
ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）は、６００ｂｐ程度のＤＮＡ配列であり、転写時、前記ＤＮＡ配列は、発現を増強する三次構造を産生する。
ＷＰＲＥは、ウイルスベクターにより送達される遺伝子の発現を増加させるために、分子生物学によく用いられる。それは、γ、α及びβ成分を有する三連調節エレメントである。α成分の長さは８０ｂｐである：ＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣ ＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９）。単独で使用される場合、α成分の活性は、完全な三連ＷＰＲＥ配列の９％に過ぎず、それは、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＶ８）ゲノムの塩基ペア１０９３～１６８４と１００％の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、転写されたＷＰＲＥ配列又はその一部（例えば、γ、α及びβエレメント、好ましくは所与の順序で）は、本発明ｒＲＡＡＶウイルス粒子にカプシド化された被験ＲＮＡ配列におけるＧＯＩの３’ ＵＴＲ領域に存在し、それにより本発明のＲＮＡ配列の安定性及びタンパク質収量を大幅に向上させる。
いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥ配列は、最小のγエレメントと一部のα－βエレメントを含有するシュートＷＰＲＥ（ＷＰＲＥ２）である（Ｋａｌｅｖ－Ｚｙｌｉｎｓｋａ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．［神経科学雑誌］２００７，２７：１０４５６－１０４６７を参照されたく、参照により組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥ配列は、最小のγ及びαエレメントを含有するシュートＷＰＲＥ（ＷＰＲＥ３）である（Ｃｈｏｉら，Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ［分子脳］７，１７（２０１４）を参照されたく、参照により組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ＷＰＲＥ配列と、イントロンを欠いているＧＯＩとを含む。
プロモーター
本明細書で使用されるように、「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要である、細胞合成機構又は導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列に限定される。
本明細書で使用されるように、「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要である、細胞合成機構又は導入された合成機構により認識されるＤＮＡ配列に限定される。
そのため、本発明のＲＮＡ配列はプロモーターを含まない。別の態様では、本発明のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ（例えば、本発明のＲＮＡ配列をコードする発現カセット又は発現ベクター）は、本発明のＲＮＡ配列を転写するためのプロモーターを含む。
本明細書で使用されるように、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に操作可能に連結される遺伝子生成物を発現するのに必要な核酸配列を指す。いくつかの場合に、このような配列は、コアプロモーター配列であってもよい。他の場合に、このような配列は、エンハンサー配列と、遺伝子生成物を発現するのに必要な他の調節エレメントとをさらに含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織又は細胞タイプ特異的な方式で遺伝子生成物（例えば、本発明のＲＮＡ配列）を発現するプロモーター／調節配列であってもよい。
本明細書で使用されるように、「操作可能な連結」又は「操作可能に連結される」という用語は、このように記述されている成分の物理的並列又は機能的並列を指し、それらが意図された方法で機能することを可能にする。異種ポリヌクレオチドに操作可能に連結される発現制御エレメントの例において、このような関係は、制御エレメントに異種ポリヌクレオチドの発現を調節させる。さらに具体的には、例えば、操作可能に連結される二つのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列のうちの少なくとも一つがもう一つの配列に対して生理的に作用することができるように、二つのＤＮＡがこのような関係で配列される（シス又はトランス）ことを指す。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、構成型プロモーターである。
本明細書で使用されるように、「構成型」プロモーターは、遺伝子生成物をコードするか又は特定するポリヌクレオチドに操作可能に連結される場合、細胞の大多数又は全ての生理的な条件下で細胞において遺伝子生成物の産生を引き起こすヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡからその発現を構成的に駆動することに用いられ得るプロモーターは、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時－早期（Ｉｅ）エンハンサー及び／又はプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター又はその誘導体、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＣＢプロモーター、（ヒト）伸長因子１α－サブユニット（ＥＦ１α）プロモーター、及びユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導型プロモーターである。
本明細書で使用されるように、「誘導型」プロモーターは、遺伝子生成物をコードするか又は特定するポリヌクレオチドに操作可能に連結される場合、実質的には、プロモーターに対応する誘導物が細胞に存在する時のみ、細胞において遺伝子生成物の産生を引き起こすヌクレオチド配列を指す。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、種特異的プロモーター、又は細胞周期特異的プロモーターである。Ｐａｒｒら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．［自然医学］３：１１４５－９，１９９７（全ての内容は、参照により本明細書に組込まれる）を参照されたい。
本明細書で使用されるように、「組織又は細胞タイプ特異的」プロモーターは、ヌクレオチド配列であり、それが、コードされたか又は遺伝子により特定されたポリヌクレオチドに操作可能に連結される場合、好ましくは、例えば、細胞／組織が、それにおいてプロモーターが通常活性を有する細胞タイプ又は組織タイプであるため、特定の細胞タイプ又は特定の細胞において遺伝子生成物の産生を引き起こす。
組織又は細胞タイプ特異的プロモーターは、ニューロン組織特異的プロモーターと、アストロサイト、乏突起膠細胞、又はニューロンプロモーターのような、ＣＮＳ－又はＰＮＳ－特異的プロモーターと、Ｂ細胞プロモーター、Ｔ細胞プロモーター、ＮＫ細胞プロモーター、単球プロモーター、白血球プロモーター、マクロファージプロモーターのような造血系特異的プロモーターと、内皮細胞プロモーターと、膵臓プロモーターと、肝（ｌｉｖｅｒ／ｈｅｐａｔｉｃ）細胞プロモーターと、肺組織プロモーターなどとを含んでもよい。
代表的組織特異的プロモーターは、プリオンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）プロモーター、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ）プロモーター、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、シナプシン１（Ｓｙｎ１）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）、代謝型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）又はニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ）、β－グロビンミニ遺伝子ｎβ２、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）、エンケファリン（Ｅｎｋ）及び興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）プロモーターを含む。
アストロサイト特異的プロモーターは、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）とＥＡＡＴ２プロモーターとを含む。
乏突起膠細胞特異的プロモーターは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターを含む。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、関心のある遺伝子と異種である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、関心のある遺伝子の天然プロモーターである。いくつかの実施形態において、異種プロモーターは、挿入、欠失、置換、及び／又は他の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、天然プロモーターは、挿入、欠失、置換、及び／又は他の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、プロモーターはＰｏｌ ＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｕ６プロモーターのようなＰｏｌ ＩＩＩプロモーターである。
５．ベクター（プラスミド又はバクミド）
本明細書で使用されるように、「ベクター」は、通常、単離された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含み、且つ細胞内部に前記単離された核酸を送達することに用いられ得る物質の組成物を指す。
本明細書で使用されるように、「ベクター」は、通常、単離された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含み、且つ細胞内部に前記単離された核酸を送達することに用いられ得る物質の組成物を指す。
「発現ベクター」という用語は、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指し、前記組換えポリヌクレオチドは、発現されるヌクレオチド配列に操作可能に連結される発現制御配列を含む。発現ベクターは、発現するための十分なシス作用エレメントを含み、発現に用いられる他のエレメントは、宿主細胞により提供されるか又はインビトロ発現システムで提供されてもよい。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチド組込まれたコスミド、プラスミド、バクミド（例えば、露出しているか又はリポソームに含まれる）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、逆転写ウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような当分野既知の全ての発現ベクターを含む。
ＧＯＩを含む本発明のｒＲＡＡＶ ＲＮＡ配列は、ベクターを包むｒＲＡＡＶウイルス粒子によって前記ＧＯＩを標的／宿主細胞に送達するためのベクターである。
いくつかの実施形態において、本発明のｒＲＡＡＶ ＲＮＡ配列は、プラスミド又はバクミド（例えば、昆虫細胞内のバキュロウイルスのように維持又は複製され得るベクター）のようなＤＮＡ発現ベクターによりコードされる。このようなＤＮＡ発現ベクターは、哺乳動物パッケージング細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）又は昆虫パッケージング細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）のような適切な宿主細胞において本発明のＲＮＡ配列を転写することができ、それによってｒＲＡＡＶパッケージングに必要な他のエレメント（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐコード配列）の存在下で被験ｒＲＡＡＶウイルス粒子を産生することができる。
多くのベクターは当分野に既知のものであり、線状ポリヌクレオチド、イオン化合物又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むが、それらに限らない。そのため、「ベクター」という用語は、自己複製プラスミド又はウイルスを含む。前記用語は、核酸の細胞への転移を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、逆転写ウイルスベクターなどを含むが、それらに限らない。
いくつかの実施形態において、ＲＡＡＶはプラスミド又はバクミドから転写される。前記プラスミド又はバクミドは、関心のある遺伝子配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、プロモーターは、関心のある遺伝子に操作可能に連結され、関心のある遺伝子の上流に位置する。いくつかの実施形態において、プロモーターは、転写されたＲＡＡＶに存在しない。
６．ＡＡＶ粒子及びＡＡＶ粒子の集団
いくつかの実施形態において、本発明は、単離されたｒＲＡＡＶウイルス粒子を提供し、前記ウイルス粒子は、本明細書に記載のＡＡＶカプシド又はウイルス粒子のうちのいずれか一つ内にカプシド化される本発明のＲＮＡ配列のうちのいずれか一つを含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、単離されたｒＲＡＡＶウイルス粒子を提供し、前記ウイルス粒子は、本明細書に記載のＡＡＶカプシド又はウイルス粒子のうちのいずれか一つ内にカプシド化される本発明のＲＮＡ配列のうちのいずれか一つを含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド又はウイルス粒子は、本明細書に記載の血清型又は一つもしくは複数の血清型の組み合わせである。
本発明のｒＲＡＡＶベクター又はＲＮＡ配列において、ｒＲＡＡＶゲノム（ＲＮＡ）は、一本鎖（ｓｓ）核酸又は二本鎖（ｄｓ）、自己相補性（ｓｃ）核酸であってもよい。
本発明の一関連態様は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を提供し、前記集団は、本発明の複数の組換えウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）を含み、ここで、前記集団内の組換えウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）のうちの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上は、本発明のカプシド化されたＲＮＡ配列を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＲＡＡＶ粒子の集団は、本発明の複数のｒＲＡＡＶウイルス粒子を含有し、ここで、前記集団内のｒＲＡＡＶ粒子の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上は、本発明のカプシド化されたＲＮＡ配列を有する。
いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団は、少なくとも１×１０４個のウイルス粒子、少なくとも２×１０４個のウイルス粒子、少なくとも５×１０４個のウイルス粒子、少なくとも１×１０５個のウイルス粒子、少なくとも２×１０５個のウイルス粒子、少なくとも５×１０５個のウイルス粒子、少なくとも１×１０６個のウイルス粒子、少なくとも２×１０６個のウイルス粒子、少なくとも５×１０６個のウイルス粒子、少なくとも１×１０７個のウイルス粒子、少なくとも２×１０７個のウイルス粒子、少なくとも５×１０７個のウイルス粒子、少なくとも１×１０８個のウイルス粒子、少なくとも２×１０８個のウイルス粒子、少なくとも５×１０８個のウイルス粒子、少なくとも１×１０９個のウイルス粒子、少なくとも２×１０９個のウイルス粒子、少なくとも５×１０９個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１０個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１０個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１０個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１１個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１１個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１１個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１２個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１２個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１２個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１３個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１３個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１３個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１４個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１４個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１４個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１５個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１５個のウイルス粒子、少なくとも５×１０１５個のウイルス粒子、少なくとも１×１０１６個のウイルス粒子、少なくとも２×１０１６個のウイルス粒子、又は少なくとも５×１０１６個のウイルス粒子を含む。
いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子の集団内の多くとも５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％又はそれ以下は、非ＲＮＡ（例えば、ＤＮＡ）をウイルス粒子内にカプシド化する。
７．宿主細胞及びＡＡＶ生産
ｒＡＡＶ生産の一般的な原理は、当分野に既知のものである。以下の概説、例えば、Ｃａｒｔｅｒ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［バイオテクノロジーの最新視点］，１５３３－５３９，１９９２）、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ［微生物学及び免疫学の現在のトピック］１５８：９７－１２９，１９９２、両方は参照により本明細書に組込まれる）を参照されたい。以下の文献では様々な方法が記述されている：Ｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［分子細胞生物学雑誌］４：２０７２，１９８４、Ｈｅｒｍｏｎａｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国科学アカデミー紀要］８１：６４６６，１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［分子細胞生物学雑誌］５：３２５１，１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ［ウイルス学雑誌］６２：１９６３，１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ［分子細胞生物学雑誌］７：３４９，１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ［ウイルス学雑誌］６３：３８２２－３８２８，１９８９）、Ｕ．Ｓ．５，１７３，４１４、ＷＯ ９５／１３３６５及びＵ．Ｓ．５，６５８，７７６、ＷＯ ９５／１３３９２、ＷＯ ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ ９７／０９４４１、ＷＯ ９７／０８２９８、ＷＯ ９７／２１８２５、ＷＯ ９７／０６２４３、ＷＯ ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎら（Ｖａｃｃｉｎｅ［ワクチン］１３：１２４４－１２５０，１９９５、Ｐａｕｌら（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ［ヒト遺伝子療法］４：６０９－６１５，１９９３）、Ｃｌａｒｋら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ［遺伝子療法］３：１１２４－１１３２，１９９６、Ｕ．Ｓ．５，７８６，２１１、Ｕ．Ｓ．５，８７１，９８２、及びＵ．Ｓ．６，２５８，５９５。
ｒＡＡＶ生産の一般的な原理は、当分野に既知のものである。以下の概説、例えば、Ｃａｒｔｅｒ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［バイオテクノロジーの最新視点］，１５３３－５３９，１９９２）、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ［微生物学及び免疫学の現在のトピック］１５８：９７－１２９，１９９２、両方は参照により本明細書に組込まれる）を参照されたい。以下の文献では様々な方法が記述されている：Ｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［分子細胞生物学雑誌］４：２０７２，１９８４、Ｈｅｒｍｏｎａｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ［米国科学アカデミー紀要］８１：６４６６，１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．［分子細胞生物学雑誌］５：３２５１，１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ［ウイルス学雑誌］６２：１９６３，１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ［分子細胞生物学雑誌］７：３４９，１９８８）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ［ウイルス学雑誌］６３：３８２２－３８２８，１９８９）、Ｕ．Ｓ．５，１７３，４１４、ＷＯ ９５／１３３６５及びＵ．Ｓ．５，６５８，７７６、ＷＯ ９５／１３３９２、ＷＯ ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ ９７／０９４４１、ＷＯ ９７／０８２９８、ＷＯ ９７／２１８２５、ＷＯ ９７／０６２４３、ＷＯ ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎら（Ｖａｃｃｉｎｅ［ワクチン］１３：１２４４－１２５０，１９９５、Ｐａｕｌら（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ［ヒト遺伝子療法］４：６０９－６１５，１９９３）、Ｃｌａｒｋら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ［遺伝子療法］３：１１２４－１１３２，１９９６、Ｕ．Ｓ．５，７８６，２１１、Ｕ．Ｓ．５，８７１，９８２、及びＵ．Ｓ．６，２５８，５９５。
ＡＡＶベクター血清型は、標的細胞タイプと一致し得る。例えば、ＷＯ ２０１８００２７１９ Ａ１の表２には、特定のＡＡＶ血清型により形質導入され得る例示的細胞タイプがリストされている（参照により本明細書に組込まれる）。
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するためのものである。このような細胞は、ＨＥＫ２９３及びＳｆ９細胞を含み、それは、ＡＡＶ及びアデノウイルスをパッケージングするためのものである。
通常、核酸ベクターをウイルス粒子における生産者細胞株にパッケージングすることによって遺伝子療法に使用されるウイルスベクターを生成する。ベクターは、通常、パッケージングされ、且つその後に宿主細胞（適切であれば）に組み込むのに必要な最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置換される。欠失しているウイルス機能は、パッケージング細胞株によりトランス形態で提供され得、通常、これらのウイルス機能／タンパク質（例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）が、パッケージング細胞に組み込まれる導入遺伝子又は前記パッケージング細胞に導入される第２のウイルスベクターもしくは発現ベクターにおける導入遺伝子として発現された結果である。
例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、ＡＡＶゲノムからの末端逆位反復（ＩＴＲ）配列のみを有し、前記配列は、宿主ゲノムにパッケージングされ組み込まれるのに必要である。ウイルスＤＮＡを細胞株にパッケージングし、前記細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、即ちｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する。前記細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染した。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクター複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠いているため、大量にパッケージングされていない。アデノウイルスの汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスの方が高い感受性を有する熱処理を行うことによって低減され得る。
いくつかの実施形態において、三重トランスフェクト方法（米国特許第６，００１，６５０に詳しく記述されている）を用いて組換えＡＡＶを生産することができる。典型的には、ＡＡＶ粒子にパッケージングされる組換えＡＡＶベクター（関心のある遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター及び補助機能ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることによって組換えＡＡＶを産生する。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）をコードし、前記配列は、トランスで機能し、生産的ＡＡＶ複製及びカプシド化に用いられる。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、有効なＡＡＶベクター生産をサポートするが、いかなる検出可能な野生型ＡＡＶウイルス粒子（例えば、機能性ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶウイルス粒子）も生成しない。前記補助機能ベクターは、ＡＡＶがそれに依存して複製する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／又は細胞機能（例えば、「補助機能」）に用いられるヌクレオチド配列をコードする。補助機能は、ＡＡＶ複製に必要な機能を含み、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現生成物合成及びＡＡＶカプシドアセンブルに関与する部分を含むが、それらに限らない。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス－１型を除く）及び牛痘ウイルスのような、既知のヘルパーウイルスのいずれか一つに由来してもよい。
いくつかの実施形態において、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）にパッケージングされるバキュロウイルス発現システムを用いて被験ｒＲＡＡＶを産生する。例えばＷＯ ２００７０４６７０３、ＷＯ ２００７１４８９７１、ＷＯ ２００９０１４４４５、ＷＯ ２００９１０４９６４、ＷＯ ２０１３０３６１１８、ＷＯ ２０１１１１２０８９、ＷＯ ２０１６０８３５６０、ＷＯ ２０１５１３７８０２、及びＷＯ ２０１９０１６３４９を参照されたく、いずれも参照により本明細書に組込まれる。
ベクター力価は、通常、ウイルスゲノム／ｍｌ（ｖｇ／ｍｌ）として表されている。いくつかの実施形態において、ウイルス力価は、１ｘ１０９より高く、５ｘ１０１０より高く、１ｘ１０１１より高く、５ｘ１０１１より高く、１ｘ１０１２より高く、５ｘ１０１２より高く、又は１ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌより高い。
８．関心のある遺伝子（ＧＯＩ）又は関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）
本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子は、任意の関心のある遺伝子（ＧＯＩ）又は関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）を宿主細胞に送達することに用いることができ、任意の目的のために、ＧＯＩが、選択されたＡＡＶウイルスカプシド又はＡＡＶウイルス粒子シェルのパッケージング限度内にあるＲＮＡであればよく、例えば、大多数ＡＡＶウイルス粒子にとって、全長は約４，７００個のヌクレオチドであり、いくつかの大容量ＡＡＶウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ５）にとって、全長は約８，９００個のヌクレオチドに達することができる。
本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子は、任意の関心のある遺伝子（ＧＯＩ）又は関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）を宿主細胞に送達することに用いることができ、任意の目的のために、ＧＯＩが、選択されたＡＡＶウイルスカプシド又はＡＡＶウイルス粒子シェルのパッケージング限度内にあるＲＮＡであればよく、例えば、大多数ＡＡＶウイルス粒子にとって、全長は約４，７００個のヌクレオチドであり、いくつかの大容量ＡＡＶウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ５）にとって、全長は約８，９００個のヌクレオチドに達することができる。
いくつかの実施形態において、代表的（非限定的）関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）は、例えば、タンパク質をコードするＲＮＡ、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移－メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＲＮＡアプタマー、シングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ ＲＮＡ、もしくはＲＩＳＣ複合体のようなＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＲＮＡ成分又はＲＮＡｉ経路のＲＮＡ成分（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｉＲＮＡ）、調節ＲＮＡ、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）（遺伝子間ｌｉｎｃＲＮＡと、イントロンｎｃＲＮＡと、センス／アンチセンスｌｎｃＲＮＡとを含む）、長鎖介在性／遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、エンハンサーＲＮＡ、細菌小分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲ並びにその前駆体を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、タンパク質又はポリペプチドのコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、タンパク質又はポリペプチドは、標的細胞、組織又は生物における欠陥タンパク質を置換することに用いられ得る野生型タンパク質又はその機能性等価物もしくは変異体（例えば、酵素又は構造タンパク質）である。
いくつかの実施形態において、タンパク質又はポリペプチドは、標的細胞、組織又は生物における化合物（脂質、脂肪酸、タンパク質、核酸のような小分子化合物又は大分子）と拮抗することに用いられ得る野生型タンパク質又はその機能性等価物もしくは変異体（例えば、酵素又は構造タンパク質）である。
例えば、いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクター酵素のコード配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムはクラス１システムであり、且つエフェクター酵素はＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ型エフェクター酵素である。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムはクラス２システムであり、且つエフェクター酵素はＩＩ、Ｖ、又はＶＩ型エフェクター酵素である。
例えば、いくつかの実施形態において、エフェクター酵素は、Ｃａｓ９のようなクラス２ＩＩ型酵素であり、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＳｐＣａｓ９）又はＳａＣａｓ９を含む（ＷＯ ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ ２０１３／０７４６６７）を参照されたく、参照により組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓエフェクター酵素は、クラス２Ｖ型Ｃａｓタンパク質であり、Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１と呼ばれ、例えば、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ１２ａ）、Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３を含む。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓエフェクター酵素は、クラス２ＶＩ型Ｃａｓタンパク質であり、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２とも呼ばれる）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆを含む。これらのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ａにおける標的ＤＮＡ配列ではなく、それらのｃｒＲＮＡを用いて標的ＲＮＡ配列を認識する。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓエフェクター酵素は、ＷＯ ２０２０／０２８５５５に記述されているＣａｓエフェクター酵素のうちのいずれか一つ（全ての内容は参照により本明細書に組込まれる）であり、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄなど）、Ｃａｓ１３（例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ（例えば、Ｃａｓ１３ｂ－ｔ１、Ｃａｓ１３ｂ－ｔ２、Ｃａｓ１３ｂ－ｔ３）、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄなど）、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、及びＣａｓＹのうちのいずれか一つを含む。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓエフェクター酵素は、シトシン又はアデニン塩基エディタ（ＣＢＥ又はＡＢＥ）のようなＤＮＡ及び／又はＲＮＡ塩基エディタに融合する。いくつかの実施形態において、塩基エディタは、好ましくは、ＤＮＡ塩基を編集し、且つ任意選択的に、オフターゲットＲＮＡ塩基編集能力が低下したか又は実質的にない。いくつかの実施形態において、塩基エディタは、好ましくは、ＲＮＡ塩基を編集し、且つ任意選択的に、オフターゲットＤＮＡ塩基編集能力が低下したか又は実質的にない。いくつかの実施形態において、塩基エディタは、ＤＮＡとＲＮＡ塩基の両方を編集する。
いくつかの実施形態において、塩基エディタは、第１、第２（ＢＥ２）、第３（ＢＥ３）又は第４世代（ＢＥ４）塩基エディタである。いくつかの実施形態において、塩基エディタは、デュアル塩基エディタである。
いくつかの実施形態において、塩基エディタは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、又はＡＤＡＲ２ＤＤ（Ｅ４８８Ｑ）を含むＡＤＡＲＤＤのようなＲＮＡアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である。
上記任意の実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡ配列をさらに含んでもよく、前記ガイドＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡに相補的な標的ポリヌクレオチド配列に結合するために、コードしたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素にロードされるように設計される。本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子が本発明のＲＮＡ配列を標的宿主細胞に送達した後、このようなｇＲＮＡ配列は、細胞ヌクレアーゼによりプロセシングされ、本発明のＲＮＡ配列から放出／単離され得る。例えば、ｇＲＮＡは、本発明ＲＮＡ配列の一部としての一次ｍｉＲＮＡヘアピン構造のペアリングされていない５’又は３’隣接領域配列に存在してもよく、且つ前記一次ｍｉＲＮＡがＤｒｏｓｈａのような細胞酵素によってプロセシングされた後、初期一次ｍｉＲＮＡ転写物から放出／単離される。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのエフェクター酵素のコード配列を含み、ＤＮＡ又はＲＮＡ塩基編集酵素又はドメインのコード配列をさらに含み、それによりＣａｓエフェクター酵素とＤＮＡ／ＲＮＡ塩基編集酵素／ドメインとの融合物がＲＮＡ配列によりコードされる。いくつかの実施形態において、Ｃａｓエフェクター酵素は、ヌクレアーゼ活性には欠陥があり、それによりそれに結合するガイドＲＮＡを介して標的ポリヌクレオチド配列に結合することができるが、ＤＮＡ／ＲＮＡ標的ポリヌクレオチドを切断することができない。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムエフェクター酵素の変異体又は誘導体のコード配列を含み、ここで、前記変異体は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムエフェクター酵素の欠失（例えば、Ｎ及び／又はＣ末端欠失、例えば、Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆのＮ末端に２１０個以下の残基が欠失しており、及び／又はＣ末端に１８０個以下の残基が欠失している）、挿入又は置換を含むが、前記野生型エフェクター酵素がｇＲＮＡに結合し、及び／又は標的ポリヌクレオチドを切断する能力を実質的に保持する。いくつかの実施形態において、前記変異体は、標的ポリヌクレオチドを切断する活性を欠いている。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列によりコードされる前記ＲＮＡ塩基編集ドメインは、二本鎖ＲＮＡ特異性アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２）、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）、又は活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）のようなアデノシンデアミナーゼである。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列によりコードされる前記ＲＮＡ塩基編集ドメインは、ＲＮＡに作用するシチジンデアミナーゼ（ＣＤＡＲ）、二本鎖ＲＮＡ特異性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）（例えば、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２）のようなアデノシンデアミナーゼ及び／又はシチジンデアミナーゼ、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、及びＡＰＯＢＥＣ４のようなＡＰＯＢＥＣ）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）、又はそれらの突然変異体を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ二重突然変異又はＡＤＡＲ２ＤＤを有する。
いくつかの実施形態において、前記塩基編集ドメインを、ＭＳ２のようなＲＮＡ結合ドメインとさらに融合させる。
いくつかの実施形態において、前記コードされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素の変異体又は誘導体は、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡ脱メチル化酵素、ＲＮＡスプライシング修飾薬、局在化因子又は翻訳修飾因子をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓエフェクター酵素、前記変異体／その誘導体又は機能性断片は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列又は核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓエフェクター酵素、変異体／その誘導体、又はその機能性断片は、異種機能性ドメインと融合する。いくつかの実施形態において、前記異種機能性ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、レポータータンパク質又は検出マーカー（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘ等）、転写激活ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ又はＴＡＤ）、メチル化酵素、脱メチル化酵素、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｓｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、前記異種機能性ドメインを前記融合タンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端又は内部で融合させる。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、ＣａｓＰＲ（クラス１前駆体ｃｒＲＮＡのプロセシングに用いられるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）融合タンパク質のコード配列を含み、前記融合タンパク質は、異種機能性ドメインに融合したＣａｓＰＲ（又はそのホモログ、オルソログ、パラログ、変異体、誘導体又は機能性断片）、又はその機能性変異体を含む。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＰＲは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６、又はＣｓｆ５である。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＰＲは、ＭｔＣａｓ６（Ｉ－Ａ）（配列１）、ＭｍＣａｓ６（Ｉ－Ｂ）（配列２）、ＳｐＣａｓ５ｄ（Ｉ－Ｃ１）（配列３）、ＢｈＣａｓ５ｄ（Ｉ－Ｃ２）（配列４）、ＳａＣａｓ６（Ｉ－Ｄ）（配列５）、ＥｃＣａｓ６ｅ（Ｉ－Ｅ）（配列６）、ＰａＣａｓ６ｆ（Ｉ－Ｆ）（配列７）、ＭｔＣａｓ６（ＩＩＩ－Ａ）（配列８）、ＰｆＣａｓ６（ＩＩＩ－Ｂ）（配列９）、ＰａＣｓｆ５（ＩＶ－Ａ１）（配列１０）、又はＭｔＣｓｆ５（ＩＶ－Ａ２）（配列１１）である。全ての配列は、参照により本明細書に組込まれる。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＰＲに融合した前記異種機能性ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、レポータータンパク質又は検出マーカー（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘなど）、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ又はＴＡＤ）、メチル化酵素、脱メチル化酵素、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｓｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、異種機能性ドメインは、ＲＮＡ塩基エディタを含む。いくつかの実施形態において、前記ＲＮＡ塩基エディタは、Ａ→Ｇ単一塩基変化を編集する。いくつかの実施形態において、前記ＲＮＡ塩基エディタは、Ｃ→Ｕ単一塩基変化を編集する。いくつかの実施形態において、前記ＲＮＡ塩基エディタは、ＡＤＡＲ２ＤＤ又はその誘導体を含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲ２ＤＤ誘導体は、Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ａ二重突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列４５～５５のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記異種機能性ドメインを前記融合タンパク質のＮ－末端、Ｃ－末端又は内部で融合させる。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＰＲ融合物の機能性変異体は、タンパク質を含み、前記タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：（１）配列１～１１のうちのいずれか一つであり、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸置換、付加又は欠失を除き、ここで、前記タンパク質は、配列１～１１のうちの一つがクラス１Ｉ、ＩＩＩ又はＩＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムの同方向反復配列（例えば、配列１２～３３のうちのいずれか一つ）に結合する能力を維持し、又は（２）配列１～１１のうちのいずれか一つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有し、ここで、前記タンパク質は、配列１～１１のＣａｓＰＲのうちの一つがクラス１Ｉ、ＩＩＩ又はＩＶ型ＣＲＩＳＰＲシステムの同方向反復配列（例えば、配列１２～３３のうちのいずれか一つ）に結合する能力を維持し、任意選択的に、条件としては、前記タンパク質が配列１～１１のうちのいずれか一つではない。全ての配列は、参照により本明細書に組込まれる。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡとハイブリダイズすることができるガイド配列を含むＣａｓＰＲガイドＲＮＡ、及び前記ガイド配列３’（又は５’）の同方向反復（ＤＲ）配列をさらにコードする。いくつかの実施形態において、前記ＤＲ配列は、配列１２～３３のうちのいずれか一つの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する。いくつかの実施形態において、前記ＤＲ配列は、配列１２～３３のうちのいずれか一つ又は同種野生型ＣａｓＰＲに結合するその機能部分によりコードされる。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは真核ＤＮＡによりコードされる。いくつかの実施形態において、前記真核ＤＮＡは、非ヒト哺乳動物ＤＮＡ、非ヒト霊長類動物ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ、植物ＤＮＡ、昆虫ＤＮＡ、トリＤＮＡ、爬虫動物ＤＮＡ、齧歯動物ＤＮＡ、サカナＤＮＡ、蠕虫／線虫ＤＮＡ、酵母ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲガイド配列は、１５～１２０個のヌクレオチドの間、２０～１００個のヌクレオチドの間、２５～８０個のヌクレオチドの間、１５～５５個のヌクレオチドの間、２５～３５個のヌクレオチドの間、又は約３０個のヌクレオチドにある。
いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲガイド配列は、前記標的ＲＮＡと９０％～１００％相補的である。いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲガイドＲＮＡは、ＣａｓＰＲによるプレｃｒＲＮＡ転写物に対するプロセシングにより産生され、且つここで、前記前駆体ｃｒＲＮＡは、二つ又はそれ以上のガイドＲＮＡを含み、前記二つ又はそれ以上のガイドＲＮＡは、異なる標的ＲＮＡに対して異なるガイド配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲ融合物の変異体又は誘導体は、配列１～１１のうちのいずれか一つの一つ又は複数の残基の保存的アミノ酸置換を含み、任意選択的に、前記ＣａｓＰＲ融合物の変異体又は誘導体は、保存的アミノ酸置換のみを含む。いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲ融合物の誘導体は、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズされたＣａｓＰＲガイド配列に結合することができるが、前記ＣａｓＰＲのＲＮＡ酵素触媒部位における突然変異のため、ＲＮＡ酵素触媒活性を有しない。いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲ融合物の誘導体は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個以下の残基のＮ末端欠失、及び／又は５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個以下の残基のＣ末端欠失を有する。
いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６、又はＣｓｆ５、例えば、ＭｔＣａｓ６（Ｉ－Ａ）、ＭｍＣａｓ６（Ｉ－Ｂ）、ＳｐＣａｓ５ｄ（Ｉ－Ｃ１）、ＢｈＣａｓ５ｄ（Ｉ－Ｃ２）、ＳａＣａｓ６（Ｉ－Ｄ）、ＥｃＣａｓ６ｅ（Ｉ－Ｅ）、ＰａＣａｓ６ｆ（Ｉ－Ｆ）、ＭｔＣａｓ６（ＩＩＩ－Ａ）、ＰｆＣａｓ６（ＩＩＩ－Ｂ）、ＰａＣｓｆ５（ＩＶ－Ａ１）、又はＭｔＣｓｆ５（ＩＶ－Ａ２）である。
いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲ融合物の異種機能性ドメインは、ＲＮＡ塩基編集ドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記ＲＮＡ塩基編集ドメインは、ＲＮＡに作用するシチジンデアミナーゼ（ＣＤＡＲ）、二本鎖ＲＮＡ特異性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）（例えば、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２）のようなアデノシンデアミナーゼ及び／又はシチジンデアミナーゼ、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ、例えばＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、及びＡＰＯＢＥＣ４）、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、シチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）、又はそれらの突然変異体を含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＡＲは、Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ二重突然変異を含むか又はＡＤＡＲ２ＤＤを含む。いくつかの実施形態において、前記塩基編集ドメインを、ＭＳ２のようなＲＮＡ結合ドメインとさらに融合させる。
いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲ融合物の誘導体は、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡ脱メチル化酵素、ＲＮＡスプライシング修飾薬、局在化因子又は翻訳修飾因子をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記ＣａｓＰＲ、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体、誘導体又は機能性断片は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列又は核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。
いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡの標的化は前記標的ＲＮＡに対する修飾をもたらす。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡ修飾は、前記標的ＲＮＡを切断することである。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡ修飾は、アデノシン（Ａ）が脱アミノ化してイノシン（Ｉ）になり、及び／又はシチジン（Ｃ）が脱アミノ化してウラシル（Ｕ）になることである。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、コドン最適化されたポリヌクレオチドをコードし、前記ポリヌクレオチドは、野生型ＣａｓＰＲ（例えば、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６又はＣｓｆ５）、そのホモログ、そのオルソログ、そのパラログ、その変異体もしくは誘導体、又はそれらの機能性断片をコードし、ここで、前記ポリヌクレオチドは、哺乳動物（例えば、ヒト）発現をコドン最適化し、任意選択的に、前記野生型ＣａｓＰＲは、配列１～１１のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、前記コドン最適化されたポリヌクレオチドは、配列３４～４４のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、前記コドン最適化されたポリヌクレオチドは、異種機能性ドメインをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、異種機能性ドメインは、ＲＮＡ塩基エディタを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、非天然に存在するポリヌクレオチドをコードし、前記非天然に存在するポリヌクレオチドは、配列１２～３３のうちのいずれか一つの誘導体を含み、ここで、前記誘導体は、（ｉ）配列１２～３３のうちのいずれか一つに比べて、一つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のヌクレオチド付加、欠失、置換、及び／又は他の突然変異を有し、（ｉｉ）配列１２～３３のうちのいずれか一つと少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９７％の配列同一性を有し、（ｉｉｉ）厳しい条件下で、配列１２～３３のうちのいずれか一つ又は（ｉ）及び（ｉｉ）のうちのいずれか一つとハイブリダイズし、又は（ｉｖ）は（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか一つの相補的配列であり、条件としては、前記誘導体は配列１２～３３のうちのいずれか一つではなく、且つ前記誘導体はＲＮＡ（又はＲＮＡ）をコードし、前記ＲＮＡは、配列１２～３３によりコードされるいずれか一つのＲＮＡと実質的に同じ二次構造（例えば、ステム、ループ、バルジ、一本鎖領域）を維持する。いくつかの実施形態において、前記誘導体は、本発明のＣａｓＰＲ、そのオルソログ、そのパラログ、その変異体、その誘導体、又はその機能性断片のうちのいずれか一つのＤＲ配列として機能する。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、エンジニアリングされたクラスター化して規則的に間隔を置いて配置された短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ１３エフェクター酵素のコード配列を含み、ここで、前記エンジニアリングされたＣａｓ１３は、（１）対応する野生型Ｃａｓ１３エフェクター酵素のエンドヌクレアーゼ触媒ドメインに空間的に近い領域において突然変異を含み、（２）野生型Ｃａｓ１３の、前記ガイド配列に相補的な標的ＲＮＡのガイド配列に対する特異的エンドヌクレアーゼ切断活性を実質的に保持し、且つ（３）野生型Ｃａｓ１３の、前記ガイド配列に結合しない非標的ＲＮＡのガイド配列に対する非依存性付随的エンドヌクレアーゼ切断活性を実質的に欠いている。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ（ＣａｓＲｘを含む）、Ｃａｓ１３ｅ、又はＣａｓ１３ｆである。
いくつかの実施形態において、前記Ｃａｓ１３ｅは、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のアミノ酸配列を有する（参照により本明細書に組込まれる）。
いくつかの実施形態において、前記領域は、Ｃａｓ１３の一次配列におけるエンドヌクレアーゼ触媒ドメイン（例えば、ＲＸＸＸＸＨドメイン）の任意の残基から１２０、１１０、１００、９０又は８０個のアミノ酸以内離れる残基を含む。
いくつかの実施形態において、前記領域は、Ｃａｓ１３の一次配列におけるエンドヌクレアーゼ触媒ドメインの任意の残基から１００、１１０、１２０又は１３０個の残基超離れる残基を含むが、空間的には、前記エンドヌクレアーゼ触媒ドメインの残基の１～１０又は５オングストローム内に位置する。
いくつかの実施形態において、前記エンドヌクレアーゼ触媒ドメインは、ＨＥＰＮドメインであり、任意選択的に、ＲＸＸＸＸＨモチーフのＨＥＰＮドメインを含む。いくつかの実施形態において、前記ＲＸＸＸＸＨモチーフは、Ｒ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈ配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｒ｛Ｎ／Ｈ／Ｋ｝Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｈ配列において、Ｘ１はＲ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、又はＹであり、Ｘ２はＩ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＬであり、且つＸ３はＬ、Ｆ、Ｎ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、又はＡである。いくつかの実施形態において、前記ＲＸＸＸＸＨモチーフは、Ｎ末端ＲＸＸＸＸＨモチーフであり、前記Ｎ末端ＲＸＸＸＸＨモチーフは、ＲＮ｛Ｙ／Ｆ｝｛Ｆ／Ｙ｝ＳＨ配列のようなＲＮＸＸＸＨ配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｎ末端ＲＸＸＸＸＨモチーフは、ＲＮＹＦＳＨ配列を有する。いくつかの実施形態において、前記Ｎ末端ＲＸＸＸＸＨモチーフは ＲＮＦＹＳＨ配列を有する。いくつかの実施形態において、前記ＲＸＸＸＸＨモチーフは、Ｒ｛Ｎ／Ａ／Ｒ｝｛Ａ／Ｋ／Ｓ／Ｆ｝｛Ａ／Ｌ／Ｆ｝｛Ｆ／Ｈ／Ｌ｝Ｈ配列を含むＣ末端ＲＸＸＸＸＨモチーフである。いくつかの実施形態において、前記Ｃ末端ＲＸＸＸＸＨモチーフは、ＲＮ（Ａ／Ｋ）ＡＬＨ配列を有する。いくつかの実施形態において、前記Ｃ末端ＲＸＸＸＸＨモチーフは、ＲＡＦＦＨＨ又はＲＲＡＦＦＨ配列を有する。
いくつかの実施形態において、前記領域は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の残基２～１８７、２２７～２４２又は６３４～７５５の残基に対応する残基を含み、それらにより実質的に構成されるか又はそれらにより構成される。いくつかの実施形態において、前記領域は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の残基３５～５１、５２～６７、１５６～１７１、６６６～６８２、又は７１２～７２７の残基に対応する残基を含み、それらにより実質的に構成されるか又はそれらにより構成される。
いくつかの実施形態において、前記突然変異は、以下を含み、以下で実質的に構成されるか又は以下で構成され、前記領域内の１５～２０個の連続したアミノ酸セグメント内の一つ又は複数の荷電又は極性残基から荷電の中性短鎖脂肪族残基（例えば、Ａ）への置換。いくつかの実施形態において、前記セグメントは約１６又は１７個の残基である。いくつかの実施形態において、１、２又は３個まで達することを除いて、前記セグメントにおけるほとんど全ての荷電及び極性残基を置換する。いくつかの実施形態において、前記セグメントにおける合計約７、８、９又は１０個の荷電及び極性残基を置換する。いくつかの実施形態において、前記セグメントのＮ－及びＣ－末端の２つの残基を、コード配列が制限酵素認識配列を含有するアミノ酸で置換する。いくつかの実施形態において、Ｎ末端の二つの残基はＶＦであり、Ｃ末端の２つの残基はＥＤであり、制限酵素はＢｐｉＩである。いくつかの実施形態において、前記一つ又は複数の荷電又は極性残基はＮ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｓ及びＴ残基を含む。いくつかの実施形態において、前記一つ又は複数の荷電又は極性残基はＲ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｙ及び／又はＱ残基を含む。いくつかの実施形態において、前記セグメント内の一つ又は複数のＹ残基を置換する。いくつかの実施形態において、前記一つ又は複数のＹ残基は、野生型Ｃａｓ１３ｅ．１のＹ６７２、Ｙ６７６及び／又はＹ７５１（ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）に対応する。いくつかの実施形態において、前記セグメントは、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４の残基３５～５１、５２～６７、１５６～１７１、６６６～６８２又は７１２～７２７である。いくつかの実施形態において、前記突然変異は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７－３９、４５、及び４８のうちのいずれか一つ又は複数に対応する一つ又は複数のＡｌａ置換を含む。いくつかの実施形態において、前記荷電の中性短鎖脂肪族残基はＡｌａ（Ａ）である。いくつかの実施形態において、前記突然変異は、以下を含み、以下で実質的に構成されるか又は以下で構成され、１５～２０個の連続したアミノ酸を有する、前記領域内の２、３、４又は５個のセグメント内の置換。
いくつかの実施形態において、エンジニアリングされたＣａｓ１３は、標的ＲＮＡに対する野生型Ｃａｓ１３のガイド配列特異的エンドヌクレアーゼ切断活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を保持する。
いくつかの実施形態において、エンジニアリングされたＣａｓ１３は、非標的ＲＮＡに対する野生型Ｃａｓ１３のガイド配列非依存性付随的エンドヌクレアーゼ切断活性の少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を欠いている。
いくつかの実施形態において、エンジニアリングされたＣａｓ１３は、標的ＲＮＡに対する野生型Ｃａｓ１３のガイド配列特異的エンドヌクレアーゼ切断活性の少なくとも約８０％～９０％を保持し、且つ非標的ＲＮＡに対する野生型Ｃａｓ１３のガイド配列非依存性付随的エンドヌクレアーゼ切断活性の少なくとも約９５％～１００％を欠いている。
いくつかの実施形態において、本発明のエンジニアリングされたＣａｓ１３は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６～１０のいずれか一つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．８６％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、２０、２４、２８及び３２に定義されたいずれか一つ又は複数の領域を含まない。
いくつかの実施形態において、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７、２１、２５、２９及び３３に比べて、アミノ酸配列は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６、２０、２４、２８及び３２に定義された一つ又は複数の領域のうちのいずれか一つにおいて、それぞれ１、２、３、４又は５個までの差異を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のエンジニアリングされたＣａｓ１３は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６～１０のいずれか一つのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明のエンジニアリングされたＣａｓ１３は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１９５５９（参照により組み込まれる）におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９又は１０のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明のエンジニアリングされたＣａｓ１３は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列又は核外搬出シグナル（ＮＥＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、エンジニアリングされたＣａｓ１３は、Ｎ－及び／又はＣ末端ＮＬＳを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３エフェクター酵素をコードする本発明のＲＮＡ配列は、コドンにより最適化され、真核生物、哺乳動物（例えば、ヒト又は非ヒト哺乳動物）、植物、昆虫、トリ、爬虫動物、齧歯動物（例えば、マウス、ラット）、サカナ、蠕虫／線虫又は酵母で発現するためのものである。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、エンジニアリングされたクラスター化して規則的に間隔を置いて配置された短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ１３エフェクター酵素のコード配列を含み、前記コード配列は、（ｉ）野生型配列に比べて、一つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）のヌクレオチド付加、欠失、置換、及び／又は他の突然変異を有し、（ｉｉ）前記野生型配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９７％の配列同一性を有し、（ｉｉｉ）厳しい条件下で、前記野生型配列又は（ｉ）及び（ｉｉ）のうちのいずれか一つとハイブリダイズし、又は（ｉｖ）は、（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちのいずれか一つの相補的配列である。
いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡ配列は、以下のコード配列を含む：前駆体ｍｉＲＮＡと一次ｍｉＲＮＡとを含む、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ又はその前駆体のような非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、アンチセンス配列又はオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓのガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲなど。
９．使用方法
本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子及びＲＮＡ配列は、任意のＧＯＩ／ＲＳＩを任意の適切な標的細胞、組織又は生物に送達して、任意の遺伝子療法に用いるためのものであり得る。
本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子及びＲＮＡ配列は、任意のＧＯＩ／ＲＳＩを任意の適切な標的細胞、組織又は生物に送達して、任意の遺伝子療法に用いるためのものであり得る。
いくつかの実施形態において、本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子及びＲＮＡ配列は、治療方法に用いられてもよく、ここで、喪失した機能を回復させるために、遺伝子の機能バージョンで機能欠陥又は喪失型疾患遺伝子を置換してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、野生型コード配列又は野生型タンパク質の変異体タンパク質をコードし前記野生型タンパク質の少なくとも一つの所望の機能を保持した変異体コード配列を、前記疾患遺伝子の喪失した機能を補償するために、標的細胞／組織／器官に送達し、それにコードされる野生型変異体を発現してもよい。
いくつかの他の実施形態において、本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子及びＲＮＡ配列は、治療方法に用いられてもよく、ここで、機能欠陥又は機能取得性疾患遺伝子は、前記疾患遺伝子の悪影響を緩和するために、遺伝子標的薬によりノックアウト、ノックダウンされるか又は他の方式で下方制御されてもよい。前記遺伝子標的薬は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（本明細書に記載のエンジニアリングされたＣａｓ９又はＣａｓ１３エフェクター酵素）であってもよく、前記エフェクター酵素は、任意選択的に、同時に（又は単独で）提供されるガイドＲＮＡを有し、前記ガイドＲＮＡは、前記疾患遺伝子を共に標的化する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子標的薬は、ＤＮＡ－ＲＮＡ塩基編集のためのＤＮＡ又はＲＮＡ塩基エディタに連結されるＣａｓエフェクター酵素であってもよい。いくつかの実施形態において、前記遺伝子標的薬は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、本発明は、標的細胞において標的ＲＮＡを修飾する方法を提供し、前記方法は、前記標的細胞を、本明細書に記載のＣａｓＰＲ又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（又はそのオルソログ、パラログ、変異体、誘導体もしくは機能断片）をコードする本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子又はＲＮＡ配列と接触させることを含み、ここで、ＣａｓＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素のガイド配列は、標的ＲＮＡの少なくとも１５個のヌクレオチドと相補的であり、且つここで、前記ＣａｓＰＲ／エンジニアリングされたＣａｓエフェクター酵素は、ガイド配列に関連して、標的ＲＮＡに結合して修飾する複合体を形成する。
いくつかの実施形態において、本発明は、それを必要とする被験体において障害又は疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、被験体に組成物を投与することを含み、前記組成物は、本明細書に記載のＣａｓＰＲ又はエンジニアリングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（又はそのオルソログ、パラログ、変異体、誘導体もしくは機能断片）をコードする本発明のｒＲＡＡＶウイルス粒子又はＲＮＡ配列を含み、ここで、ＣａｓＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素のガイド配列は、標的ＲＮＡの少なくとも１５個のヌクレオチドと相補的であり、且つここで、前記ＣａｓＰＲ／エンジニアリングされたＣａｓエフェクター酵素は、ガイド配列に関連して、標的ＲＮＡに結合して修飾する複合体を形成することによって、前記被験体において前記障害又は疾患を治療する。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＰＲ又はエンジニアリングされたＣａｓエフェクター酵素複合体による切断によって前記標的ＲＮＡを修飾する。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ特異的アデノシン及び／又はシチジンデアミナーゼを含む誘導体による脱アミノ化によって前記標的ＲＮＡを修飾する。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ又は核ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記標的ＲＮＡは細胞内にある。いくつかの実施形態において、前記細胞は癌細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は感染源に感染している。いくつかの実施形態において、前記感染源は、ウイルス、プリオン、原生動物、真菌又は寄生生物である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ニューロン細胞（例えば、アストロサイト、神経膠細胞（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ神経膠細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞、シュワン（Ｓｃｈｗａｎ）細胞、ＮＧ２細胞、又は衛星細胞））である。
いくつかの実施形態において、前記障害又は疾患は、癌症又は感染性疾患である。いくつかの実施形態において、前記癌症は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵臓癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、甲状腺髄様癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髓性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は膀胱癌である。いくつかの実施形態において、前記方法は、インビトロ方法、インビボ方法又はエクスビボ方法である。いくつかの実施形態において、前記複合体が前記標的ＲＮＡに結合後、前記エンジニアリングされたＣａｓ１３は、大量の（又は検出可能な）付随的ＲＮＡ酵素活性を示さない。
いくつかの実施形態において、前記障害又は疾患は、神経障害、例えば、緑内障、加齢性ＲＧＣ喪失、視神経損傷、網膜虚血、レーベル遺伝性視神経症、ＲＧＣニューロン変性に関連する神経障害、それを必要とする被験体の線条体における機能性ニューロン変性に関連する神経障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、うつ病、薬物依存症、舞踏病、舞踏アテトーゼ及びジスキネジアのような運動障害、双極性障害、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、又は機能不全である。
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、以下のうちの一つ又は複数を引き起こす：（ｉ）インビトロ又はインビボでの細胞老化誘導、（ｉｉ）インビトロ又はインビボでの細胞周期停止、（ｉｉｉ）インビトロ又はインビボでの細胞増殖抑制及び／又は細胞増殖抑制、（ｉｖ）インビトロ又はインビトロでのアネルギー誘導、（ｖ）インビトロ又はインビトロでのアポトーシス誘導、及び（ｖｉ）インビトロ又はインビトロでの壊死誘導。
本発明の別の実施形態
１． ポリヌクレオチド配列であって、リーボス核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リーボス構造を有するＬＮＡと、α－Ｌ－リーボス構造を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡの非鏡像異性体）と、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡと、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡとを含む）又はそれらのハイブリッド体を含むが、それらに限らず、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされ得、前記ポリヌクレオチド配列は、
（１）関心のあるポリヌクレオチド配列（ＰＳＩ）、例えば、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）のＲＮＡコード配列、タンパク質（例えば、治療用タンパク質、抗原タンパク質、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（「Ｃａｓタンパク質」と略称される）、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質のような遺伝子編集タンパク質）をコードするＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、又は非コード機能性ＲＮＡ（例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）、例えばシングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒ ＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３）システムのＲＮＡ成分）、又はその前駆体と、
（２）前記ポリヌクレオチド配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進するＰＰＳ相互作用分子と直接又は間接的に相互作用、例えば、結合することができるポリヌクレオチドパッケージングシグナル（ＰＰＳ）とを含み、
任意選択的に、前記ポリヌクレオチド配列をコードするもしくはそれに対応するＤＮＡ配列、又は前記ＤＮＡ配列の逆相補的配列は、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされる能力が減少し、減弱し又は実質的にない（例えば、前記ＤＮＡ配列又はその逆相補的配列は、ＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶパッケージングのための機能性ＡＡＶ ＩＴＲを欠いている）、ポリヌクレオチド配列。
１． ポリヌクレオチド配列であって、リーボス核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リーボス構造を有するＬＮＡと、α－Ｌ－リーボス構造を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡの非鏡像異性体）と、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡと、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡとを含む）又はそれらのハイブリッド体を含むが、それらに限らず、ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされ得、前記ポリヌクレオチド配列は、
（１）関心のあるポリヌクレオチド配列（ＰＳＩ）、例えば、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）のＲＮＡコード配列、タンパク質（例えば、治療用タンパク質、抗原タンパク質、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（「Ｃａｓタンパク質」と略称される）、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質のような遺伝子編集タンパク質）をコードするＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、又は非コード機能性ＲＮＡ（例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）、例えばシングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒ ＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３）システムのＲＮＡ成分）、又はその前駆体と、
（２）前記ポリヌクレオチド配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進するＰＰＳ相互作用分子と直接又は間接的に相互作用、例えば、結合することができるポリヌクレオチドパッケージングシグナル（ＰＰＳ）とを含み、
任意選択的に、前記ポリヌクレオチド配列をコードするもしくはそれに対応するＤＮＡ配列、又は前記ＤＮＡ配列の逆相補的配列は、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされる能力が減少し、減弱し又は実質的にない（例えば、前記ＤＮＡ配列又はその逆相補的配列は、ＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶパッケージングのための機能性ＡＡＶ ＩＴＲを欠いている）、ポリヌクレオチド配列。
２． 前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子はＡＡＶウイルス粒子又は腫瘍溶解性ウイルス粒子である、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
３． 前記ＰＰＳは、前記ＰＳＩの５’末端もしくはその近傍、前記ＰＳＩの３’末端もしくはその近傍、又は前記ＰＳＩの内部（例えば、ｍＲＮＡのイントロン内）に位置する、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
４． 一つより多い（例えば、１、２、３、又はそれ以上の）同じ又は異なるＰＰＳを含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
５． 前記一つより多いＰＰＳのうちの二つ又はそれ以上（例えば、３つ）は、同じ又は異なるリンカーを介して互いに隣接するか又は直列連結される、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
６． 互いに隣接しない（例えば、前記関心のあるポリヌクレオチド配列（ＰＳＩ）の一つの末端又はその近傍にそれぞれ位置する）二つ又はそれ以上のＰＰＳを含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
７． 前記ＰＰＳは、転写された修飾後のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）を含み、ここで、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、
（ａ）転写された機能性Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含み、任意選択的に、転写された機能性ＲＢＥ’をさらに含み、及び
（ｂ）転写された末端解離部位（ＴＲＳ）もしくは転写された逆相補的ＴＲＳ（ｒｃＴＲＳ）、又はその両方を欠いており、
任意選択的に、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＤ領域配列（Ｄ配列又はＤ’配列）をさらに含み、及び／又は
任意選択的に、前記ＰＰＳ相互作用分子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０である、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
（ａ）転写された機能性Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含み、任意選択的に、転写された機能性ＲＢＥ’をさらに含み、及び
（ｂ）転写された末端解離部位（ＴＲＳ）もしくは転写された逆相補的ＴＲＳ（ｒｃＴＲＳ）、又はその両方を欠いており、
任意選択的に、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＤ領域配列（Ｄ配列又はＤ’配列）をさらに含み、及び／又は
任意選択的に、前記ＰＰＳ相互作用分子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０である、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
８． 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記ＲＮＡの３’末端の１０００個のヌクレオチド、８００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、又は２００個のヌクレオチド内にあり、任意選択的に、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ポリＡ配列、ポリＡシグナル配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）、又はＲＮＡ転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）の５’にある、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
９． 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写された野生型Ｆｌｉｐ又はＦｌｏｐ ＩＴＲに基づいて修飾され、任意選択的に、前記野生型Ｆｌｉｐ又はＦｌｏｐ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３からのものである（任意選択的に、前記野生型Ｆｌｏｐ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のヌクレオチド配列を有する）、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１０． 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記転写されたＴＲＳと前記転写されたｒｃＴＲＳの両方を欠いている、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１１． 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記転写されたＤ領域配列を含む（任意選択的に、前記修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のヌクレオチド配列を有する）、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１２． 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記転写されたＤ領域配列を欠いている（任意選択的に、前記修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のヌクレオチド配列を有する）、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１３． 第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲをさらに含み、前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、第２の転写された機能性ＲＢＥ配列を有するが、第２の転写されたＴＲＳもしくは第２の転写されたｒｃＴＲＳ又はその両方を欠いており、任意選択的に、前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、第２の転写されたＤ領域配列をさらに含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１４． 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲと前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは同じである（又は異なる）、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１５． 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲと前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ（存在すれば）は、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける欠失、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける突然変異、又は対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける挿入を含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１６． 前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記ポリヌクレオチド配列の５’末端の１０００個のヌクレオチド、８００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、又は１５０個のヌクレオチド内にある、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１７． 前記ＰＰＳは、ＭＳ２配列、ＰＰ７結合部位、又はｃｏｍ結合部位を含み、且つ前記ＰＰＳ相互作用分子は、ＭＳ２配列にとってのファージ由来のＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７結合部位にとってのＰＰ７ファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、又はｃｏｍ結合部位にとってのファージＣＯＭタンパク質（ＣＯＭ）のような、前記ＰＰＳと直接又は間接的に相互作用、例えば、結合することができるＰＰＳ相互作用タンパク質（ＰＰＳＩＰ）を含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１８． 前記ＰＰＳＩＰは、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分（例えば、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）のＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８、又はアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ））に直接又は間接的に関連する（例えば、それらに融合する）、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
１９． 前記ポリヌクレオチド配列は、転写されたＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むか又は好ましく含まない（例えば、前記ポリヌクレオチド配列は、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のＤＮＡパッケージング能力を低下させるように、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列のヌクレオチドの付加、欠失、及び／又は置換を有する、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む）、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
２０．
（１）転写された転写エンハンサー、
（２）転写されたイントロン配列又はエクソン配列（例えば、タンパク質発現を増強するための転写されたイントロン配列又はエクソン配列）、
（３）５’ ＵＴＲ配列、
（４）３’ ＵＴＲ配列、
（５）ポリＡ配列、又はポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、及び任意選択的に前記ポリＡシグナル配列下流のＧＵリッチ領域、
（６）転写後調節エレメント又は配列、例えば、転写されたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、及び／又は、
（７）転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）をさらに含み、
任意選択的に、前記ポリヌクレオチド配列は、前記転写後調節エレメント又は配列の３’及び前記ポリＡ配列又はポリＡシグナル配列の５’に位置するＰＰＳを含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
（１）転写された転写エンハンサー、
（２）転写されたイントロン配列又はエクソン配列（例えば、タンパク質発現を増強するための転写されたイントロン配列又はエクソン配列）、
（３）５’ ＵＴＲ配列、
（４）３’ ＵＴＲ配列、
（５）ポリＡ配列、又はポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、及び任意選択的に前記ポリＡシグナル配列下流のＧＵリッチ領域、
（６）転写後調節エレメント又は配列、例えば、転写されたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、及び／又は、
（７）転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）をさらに含み、
任意選択的に、前記ポリヌクレオチド配列は、前記転写後調節エレメント又は配列の３’及び前記ポリＡ配列又はポリＡシグナル配列の５’に位置するＰＰＳを含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
２１． ５’から３’への方向に、前記ＰＳＩ、任意選択的な転写されたＷＰＲＥ配列と、前記ＰＰＳ（例えば、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ、前記ＭＳ２配列、前記ＰＰ７結合部位、又は前記ｃｏｍ結合部位）と、前記ポリＡ配列又は前記ポリＡシグナル配列とを含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
２２． 前記ＧＯＩは、タンパク質（例えば、蛍光タンパク質、治療用タンパク質、抗原タンパク質、又は遺伝子編集タンパク質、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質）、酵素（例えば、Ｃｒｅタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、又はその変異体）、構造タンパク質、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はその前駆体（前駆体ｍｉＲＮＡと一次ｍｉＲＮＡとを含む）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、アンチセンス配列又はオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）、例えばシングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒ ＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素用のガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲとを含むＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＲＮＡ成分を含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
２３． 長さが約８，９００個のヌクレオチドより小さく、長さが約８，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約７，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約６，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約５，２００個のヌクレオチドより小さく、長さが約４，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約３，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約２，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約４，７００～５，２００個のヌクレオチドであり、長さが約４，７００～５，０００個のヌクレオチドであり、長さが約４，７００～４，８００個のヌクレオチドであり、又は長さが約４，７００個のヌクレオチドである一本鎖ＲＮＡである、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列。
２４． ポリヌクレオチドであって、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするカセットを含み、任意選択的に、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列（例えば、ＤＮＡプラスミド）であり、前記ＤＮＡ配列は、任意選択的に、前記ＤＮＡプラスミドの骨格にスタッファー配列が含まれており、及び／又は任意選択的に、機能性ＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲが含まれていない、ポリヌクレオチド。
２５． 前記カセットによりコードされたポリヌクレオチド配列に操作可能に連結され、その転写を駆動するプロモーターをさらに含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド。
２６． 前記プロモーターは遍在性プロモーターである、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド。
２７． 前記プロモーターは、組織特異的プロモーターである、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド。
２８． 前記プロモーターは、構成型プロモーターである、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド。
２９． 前記プロモーターは、誘導型プロモーターである、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド。
３０． 前記プロモーターにより駆動される前記ポリヌクレオチド配列の転写を増強するエンハンサーをさらに含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド。
３１． 組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子であって、ＤＮＡウイルス（例えば、ＡＡＶウイルス、又は腫瘍溶解性ウイルス）のタンパク質シェル（例えば、カプシド）にパッケージングされるポリヌクレオチドゲノム（例えば、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドから転写されたポリヌクレオチド配列）を含む、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子。
３２． 前記ＤＮＡウイルスはＡＡＶであり、且つ前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子は組換えポリヌクレオチドアデノ随伴ウイルス（ｒＰＡＡＶ）粒子であり、前記組換えポリヌクレオチドアデノ随伴ウイルス粒子は、
（１）ＡＡＶカプシドと、
（２）前記ＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドから転写されたポリヌクレオチド配列とを含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子。
（１）ＡＡＶカプシドと、
（２）前記ＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドから転写されたポリヌクレオチド配列とを含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子。
３３． 前記ＡＡＶカプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ６５ＡＡＰ、ＡＡＶｒｈ７４、又は７ｍ８のＡＡＶからのカプシドを含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子。
３４． 複数の前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）を含み、ここで、前記集団内の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）のうちの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上は、それにパッケージングされる、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドから転写されたポリヌクレオチド配列を有する、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団。
３５． 前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドから転写されたポリヌクレオチド配列、前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）、及び／又は前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団を含む、宿主細胞。
３６． 前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドから転写されたポリヌクレオチド配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進するウイルスパッケージングシステムをさらに含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載の宿主細胞。
３７． 前記ウイルスパッケージングシステムは、
（１）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０のコード配列）及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＡＡＰ、及び／又はＭＡＡＰのコード配列）又はそれらの発現生成物であって、前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の転写を駆動する一つ又は複数プロモーターの転写制御下にあるものと、
（２）ＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の一つ又は複数のコード配列、例えば、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子、又は前記一つ又は複数のタンパク質と、
（３）前記ＰＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、
任意選択的に、前記ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドのサイズを拡大する、前述のいずれか一つの実施形態に記載の宿主細胞。
（１）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０のコード配列）及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＡＡＰ、及び／又はＭＡＡＰのコード配列）又はそれらの発現生成物であって、前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の転写を駆動する一つ又は複数プロモーターの転写制御下にあるものと、
（２）ＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の一つ又は複数のコード配列、例えば、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子、又は前記一つ又は複数のタンパク質と、
（３）前記ＰＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、
任意選択的に、前記ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドのサイズを拡大する、前述のいずれか一つの実施形態に記載の宿主細胞。
３８． 哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞）である、前述のいずれか一つの実施形態に記載の宿主細胞。
３９． 前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）又は前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団を生成する方法であって、前記方法は、
ａ）前述のいずれか一つの実施形態に記載の宿主細胞を十分な時間培養することと、
ｂ）前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫することとを含む、方法。
ａ）前述のいずれか一つの実施形態に記載の宿主細胞を十分な時間培養することと、
ｂ）前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫することとを含む、方法。
４０． 前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を単離又は精製することをさらに含む、前述のいずれか一つの実施形態に記載の方法。
４１．組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を生成する方法であって、前記方法は、
ａ）ウイルスパッケージングシステム（例えば、ＡＡＶパッケージングシステム）を、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドから転写されたポリヌクレオチド配列と、前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を産生するのに十分な時間接触させ、
ｂ）前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫し、任意選択的に、
ｃ）収穫された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を単離又は精製することを含む、方法。
ａ）ウイルスパッケージングシステム（例えば、ＡＡＶパッケージングシステム）を、前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドから転写されたポリヌクレオチド配列と、前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を産生するのに十分な時間接触させ、
ｂ）前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫し、任意選択的に、
ｃ）収穫された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を単離又は精製することを含む、方法。
４２． 前記ウイルスパッケージングシステム（例えば、ＡＡＶパッケージングシステム）は、
（１）前記ポリヌクレオチド配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、
（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は前記ポリヌクレオチド配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、
（３）前記ＰＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、
任意選択的に、前記ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドのサイズを拡大する、前述のいずれか一つの実施形態に記載の方法。
（１）前記ポリヌクレオチド配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、
（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は前記ポリヌクレオチド配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、
（３）前記ＰＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、
任意選択的に、前記ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドのサイズを拡大する、前述のいずれか一つの実施形態に記載の方法。
４３． 前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドから転写されたポリヌクレオチド配列をＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングするシステムであって、前記システムは、
（１）前記ポリヌクレオチド配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、
（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は前記ポリヌクレオチド配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、
（３）前記ＰＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、
任意選択的に、前記ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドのサイズを拡大する、システム。
（１）前記ポリヌクレオチド配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、
（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は前記ポリヌクレオチド配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、
（３）前記ＰＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、
任意選択的に、前記ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド又は前述のいずれか一つの実施形態に記載のポリヌクレオチドのサイズを拡大する、システム。
４４． 関心のある遺伝子（ＧＯＩ）を細胞、植物、又は動物に送達する方法であって、前記方法は、前記細胞、植物、又は動物を前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）、前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団、又は前述のいずれか一つの実施形態に記載の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団と接触させることを含み、ここで、前記ＧＯＩは、（前述のいずれか一つの実施形態に記載の）前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる、方法。
４５． 関心のあるポリヌクレオチド配列（ＰＳＩ）を細胞、植物、又は動物に送達する方法であって、前記方法は、前記細胞、植物、又は動物を前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）、前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団、又は前述のいずれか一つの実施形態に記載の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団と接触させることを含む、方法。
４６． それを必要とする被験体における疾患又は障害を診断、予防、又は治療する方法であって、前記方法は、治療有効量又は投与量の前述のいずれか一つの実施形態に記載の又は前述のいずれか一つの実施形態に記載の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団を前記被験体に投与することを含む、方法。
４７． 前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）、前述のいずれか一つの実施形態に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団、又は前述のいずれか一つの実施形態に記載の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＰＡＡＶ粒子）の集団の、それを必要とする被験体の疾患又は障害を診断、予防、又は治療するための薬物の製造における用途。
実施例
以下に提供される実施例は、本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明するためのものであり、いかなる態様においても限定するものではない。
以下に提供される実施例は、本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明するためのものであり、いかなる態様においても限定するものではない。
実施例１ ＲＮＡのＲＡＡＶウイルス粒子への高効率なパッケージング
この実施例により、ＲＮＡベクターゲノムは、特に、ＡＡＶカプシド内に直接パッケージングすることに用いられるように設計される修飾後／組換えＲＮＡを用いて、ＡＡＶウイルスカプシドに高効率にパッケージングされ得ることが証明された。
この実施例により、ＲＮＡベクターゲノムは、特に、ＡＡＶカプシド内に直接パッケージングすることに用いられるように設計される修飾後／組換えＲＮＡを用いて、ＡＡＶウイルスカプシドに高効率にパッケージングされ得ることが証明された。
まず、ＡＡＶパッケージングシグナル－ＩＴＲ（ＤＮＡ）は、（ＲＮＡとして）転写する場合、特にいくつかの構造として存在する場合（例えば、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列が本発明の転写されたＲＮＡ配列の３’末端に近い場合）に、本発明のＲＮＡ配列（例えば、ｒＲＡＡＶベクターゲノムＲＮＡ）のＡＡＶ粒子へのパッケージングを促進し得ることが予想外に示されていた。
特に、全ての導入遺伝子転写物（ＲＮＡ）がいずれも候補パッケージングシグナルを含有することを確保するように、ＡＡＶベクターゲノム末端からの野生型及び修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列（ＤＮＡ）をその各該当する導入遺伝子発現カセットに移動させた。ＲＡＡＶ生産過程において、ｓｓＤＮＡゲノムを有する従来のＡＡＶベクターの生産を遮断するために、野生型ＩＴＲの代わりに最適化されたＩＴＲ（ｄＩＴＲ及びｄＩＴＲ－Ｄ）を使用した（表２）。
特定的には、Ｆｌｏｐ構造における野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（ＩＴＲ２）配列において、ＴＲＳ（「ＴＴＧＧＣ」）は、前記ＩＴＲの５’末端に位置し、且つその逆相補的配列ＧＣＣＡＡに二重下線が付けられた。このような配列は、任意の方向にコードプラスミドにクローニングすることができる（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列又はその逆相補的配列は、テンプレートとして本発明のＲＮＡ配列を転写することができる）。本明細書の実験において、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列は、このような方向でクローニングされ、それにより前記転写されたＲＮＡにおけるＴがＵに置換されることを除いて、転写されたＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １（又は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２又は３）と同じ配列を有する。いずれにしても、このような配列又はその逆転写物を転写した後、得られた野生型ＩＴＲ２の転写されたＲＮＡは、回文の転写されたＲＢＥ（灰色陰影）を含む。本明細書の実験において、転写されたＲＮＡは、全てのＴがＵに置換されることを除いて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １と等価な転写された野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の逆相補的配列をＤＮＡテンプレートとして用いる場合、転写されたＲＮＡは、ＧＣＣＡＡによりコードされる転写されたＴＲＳ（ＵＵＧＧＣ）を含む。前記転写されたＴＲＳは、転写されたＲＢＥと転写されたＤ配列との間に位置する。
修飾後のＩＴＲ配列のうちの一つは、「δＩＴＲ」（又は「ｄＩＴＲ」と略称される）であり、一番目のＧを除いて、前記ｄＩＴＲがＤ領域配列（太字イタリック体）、５’末端におけるＴＲＳ及び逆相補的ＴＲＳ配列（「ＧＣＣＡＡ」）を欠いているため、欠陥がある。このような配列の転写後、ｄＩＴＲの転写されたＲＮＡは、回文の転写されたＲＢＥ（灰色陰影）と、ＧＣＣＡＡによりコードされる転写されたＴＲＳ（ＵＵＧＧＣ）を欠いている転写された欠陥ＩＴＲとを含む。しかしながら、本実験において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の逆相補的配列をＤＮＡテンプレートとし、それにより前記転写されたＲＮＡは、全てのＴがＵに置換されることを除いて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２と同じ配列を有する、転写された修飾後のＡＡＶ２ ＩＴＲ（転写されたｄＩＴＲ）を有する。
別の修飾後のＩＴＲ配列は、「ｄＩＴＲ－Ｄ」であり、そのＤ配列（「ＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ」、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）を保持したが、５’末端ＴＲＳ（ＴＴＧＧＣ）を欠いているため、欠陥もある。また、逆相補的ＴＲＳ（ＧＣＣＡＡ）における一番目のＧのみがｄＩＴＲ－Ｄに保持され、且つ残りのＣＣＡＡ配列は関連性のないＡＣＴＡＧ配列に置き換えられる。本実験において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３の逆相補的配列をＤＮＡテンプレートとし、それにより前記転写されたＲＮＡは、全てのＴがＵに置換されることを除いて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３と同じ配列を有する、転写された修飾後のＡＡＶ２ ＩＴＲ（転写されたｄＩＴＲ）を有する。
留意点として、ｄＩＴＲ及びｄＩＴＲ－Ｄ配列は、いずれも陰影回文ＲＢＥ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５（ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧ．．．ＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ）を保持し、且つその該当する転写された修飾後のＩＴＲもＲＢＥ配列を有する。
このような最適化されたＩＴＲコード配列（ＤＮＡ）をｔｄＴｏｍａｔｏ発現カセットの二つの位置に挿入し、一つはプロモーターとｔｄＴｏｍａｔｏコード配列との間に位置し、もう一つは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）とＳＶ４０ポリＡシグナルとの間に位置する。
使用される最適化されたＩＴＲの配列、数及び位置に基づいて、一連の異なるＩＴＲベースのＲＡＡＶベクターを構築した（図３を参照されたい）。
ｓｓＤＮＡベクターゲノムを有し、二つの末端にＩＴＲ配列がない（配列エレメントＣＡＧプロモーター、ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子、ＷＰＲＥ配列及びＳＶ４０ポリＡシグナル配列を代表する「ＣＴＷＳ」）従来のＡＡＶベクターを対照として用いた。この実験に対して、ＡＡＶ血清型ＤＪを選択したことは、使用される培養細胞において優れた形質導入効率を有するためである。ＡＡＶ－ＤＪは、合成血清型であり、ＡＡＶ－２、８及び９のキメラカプシドを有する。そのカプシドにはヘパリン結合ドメインが含有されており、前記カプシドは、複数のタイプの細胞を高効率に形質導入し、免疫中和を回避することができる（Ｇｒｉｍｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．［ウイルス学雑誌］８２：５８８７－５９１１，２００８）。
様々なＲＡＡＶ－ＩＴＲウイルス粒子及び対照ウイルス粒子は、いずれもトリプラスミドトランスフェクトシステムを用いることによって生成される（図４）。
特に、導入遺伝子プラスミド、パッケージングプラスミド及びヘルパープラスミド（重量比が１：１：２である）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによってＲＡＡＶベクターを生成した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコンピテントＤＭＥＭ培地で培養し、且つトランスフェクトの２４時間前に細胞を接種した。トランスフェクト前、培地を、２％ ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭに交換した。ＰＥＩ－ＭＡＸをトランスフェクト試薬として用いた。そして、トランスフェクト後２日目と５日目に上清を収集し、５日目にトランスフェクトされた細胞を収穫した。イオジキサノール密度勾配超遠心分離法によってＲＡＡＶベクターを精製した。
ウイルス力価（ＤＮＡ力価及びＲＮＡ力価）は、それぞれ図５Ａにおける手順を用いてＱ－ＰＣＲ及び逆転写－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＴ）により確定された。
簡単に説明すると、まず、収穫した精製されたＲＡＡＶウイルス粒子を、３７℃でＤＮＡ酵素Ｉ及びＲＮＡ酵素Ｉにより２時間プロセシングして、ウイルス粒子のタンパク質シェル外の全ての核酸を除去した。次に、ヌクレアーゼを１００℃で約３０ｍｉｎ変性させ、そしてＲＡＡＶウイルス粒子を変性させ破裂させて、ＲＡＡＶ核酸内容物を放出して更なる分析を行った。
Ｑ－ＰＣＲを用いてヌクレアーゼ耐性生成物を分析し、ＲＡＡＶウイルス粒子内にカプシド化されたＤＮＡベクターゲノムを滴定した。特に、一組のＱ－ＰＣＲにおいて、プロモーター配列に特異的なプライマーペアを用いて任意の機能性ＤＮＡを検出／定量し、別の組のＱ－ＰＣＲにおいて、ＷＰＲＥ配列に特異的なプライマーペアを用いてＲＡＡＶウイルス粒子にカプシド化された任意のＤＮＡベクターゲノムを検出／定量した。図５Ｂを参照されたい。
それとともに、別の試料において、まずＲＡＡＶカプシド化された任意のＤＮＡをＤＮＡ酵素Ｉ消化によって除去し、そして残りのＲＮＡを逆転写し、且つ得られたｃＤＮＡを、ＲＮＡに転写されたＷＰＲＥ配列を検出／定量するためのＱ－ＰＣＲテンプレートとして用いた。不完全なＤＮＡ除去後に存在し得る任意の残留ＤＮＡを検出／定量するために、ＤＮＡ除去ステップ後の試料をＱ－ＰＣＲで直接増幅させて、前記試料に存在し得る任意のＷＰＲＥ（ＤＮＡ）配列を検出した。図５Ａを参照されたい。
ＣＩＴＷＳ構築体のパッケージング効率（図６Ａを参照されたい）を試験するために、従来のｐｓｓＤＮＡ構築体（両端に野生型ＩＴＲ配列がある）を用いてウイルス粒子を生成する場合、大多数のウイルス粒子は、プロモーター配列及びＷＰＲＥ配列を有する機能性ＤＮＡベクターゲノムを含有する。ごくまれに（２桁、又は約１％の時間）、ＲＮＡベクターゲノムもウイルス粒子にパッケージングされる（「ＲＮＡ」と標識されるバーを参照されたく、「ＤＮＡ」及び「機能性ＤＮＡ」と標識されるバーより約２桁低い）。残留ＤＮＡは、パッケージングされたＲＮＡベクターゲノムより１桁低い。
それとともに、ＡＡＶベクターゲノムの両端からＩＴＲ配列を除去することにより、パッケージングを実質的に取り除き、図６ＡにおけるＣＴＷＳ構築体（ＩＴＲなし）は、パッケージングＤＮＡの２～２．５桁未満、さらに少数のＲＮＡを産生した。
ＣＴＷＳ対照に比べて、プロモーターの３’とＧＯＩコード配列の５’との間に一つの最適化されたＩＴＲ配列（ｄＩＴＲ又はｄＩＴＲ－Ｄ配列）を付加するだけで、ＤＮＡパッケージングがわずかに改善されるように思われるが、ＲＮＡパッケージングを増強することはできない。図６Ａを参照されたい。
興味深いことに、図６Ｂからかなり異なる結果が得られ、ここで、ＣＴＷＩＳ構築体を試験した。特に、パッケージングｐｓｓＤＮＡ構築体（図６Ａと図６Ｂを比較する）に関しては、実質的に同じ結果が得られ－大多数のパッケージングのウイルス粒子は、ＤＮＡ（９９％又はそれ以上）及び無視できる量（１％又はそれ以下）のＲＮＡを含有する。しかしながら、ＷＰＲＥ配列の３’末端とポリＡ配列の５’末端との間に、最適化されたＩＴＲ配列（ｄＩＴＲ）を加えることは、ＤＮＡとＲＮＡとの間のパッケージング効率の差異を有意に低下させ、さらには逆転させた。ｄＩＴＲ－Ｄ配列を用いる場合、大多数のパッケージングされた核酸がＲＮＡ（パッケージングされたＤＮＡより１～２桁高い）である時、このような作用はより顕著である。
ＣＩＴＷＩＳ構築体におけるプロモーターとＧＯＩコード配列との間に追加（即ち２番目）の最適化されたＩＴＲ配列を挿入すれば、実質的に同じ結果が得られる。図６Ｃを参照されたい。
これらの結果により、最適化されたＩＴＲ（ｄＩＴＲ及びｄＩＴＲ－Ｄ）は、従来のＡＡＶベクターの複製を阻害することによって、ＲＡＡＶウイルス粒子にパッケージングされるＤＮＡを減少させることが示唆された。
対照ベクターＣＴＷＳ（ＩＴＲなし）及びＲＡＡＶ－ｄＩＴＲベクターに比べて、ｄＩＴＲ－Ｄ最適化ＩＴＲを有するＲＡＡＶベクターは、特にｄＩＴＲ－Ｄ ＩＴＲがｍＲＮＡコード配列及びＷＰＲＥ配列の下流に位置する（例えば、ちょうどポリＡシグナルの５’にある）場合、転写されたｍＲＮＡをＲＡＡＶ粒子に直接カプシド化する能力がより優れているように思われる。図６Ａ～６Ｃを参照されたい。それに比べて、ｍＲＮＡコード配列の上流に位置するｄＩＴＲ－Ｄ配列（例えば、ちょうど発現構築体におけるプロモーター配列の後にある）は、ｍＲＮＡのＲＡＡＶウイルス粒子への直接パッケージングをほとんど促進しない。それとともに、別のｄＩＴＲ－Ｄ配列をｍＲＮＡコード配列の下流に挿入すれば（例えば、ちょうどポリＡ配列の５’にある）、得られたＲＡＡＶ ｍＲＮＡのパッケージングは同様に高度に増加した（図６Ｃ）。
要するに、そのｍＲＮＡゲノム両端にｄＩＴＲ－Ｄシグナルが担持されているＣＩＴＷＩＳ－Ｄは、その収量（ｍＲＮＡを担持する粒子）が、ｓｓＤＮＡベクターゲノムを有する従来のＡＡＶベクター（ｐｓｓＡＡＶ群）より２０倍低いにもかかわらず、特異的ｍＲＮＡをカプシド化する能力が最も優れている。従来のＡＡＶベクターとは異なり、ＲＡＡＶベクターＣＩＴＷＩＳ－Ｄは、損傷を受けたＤＮＡパッケージングを有し、それが担持するＤＮＡの粒子は、ＲＡＡＶベクター存量の約２０％又はそれ以下を占め、且つ機能性ＤＮＡを担持する粒子のパーセントはさらに低い（例えば、１０％未満）（図６Ａ－６Ｃ）。
ＡＡＶパッケージングの容量が限られている（＜４７００ｎｔ）ため、導入遺伝子プラスミドの大きさを拡大することによって、望ましくないＲＡＡＶ ＤＮＡパッケージングを減少させてもよく、導入遺伝子カセットの長さを増加させ、例えば、シス作用エレメント（例えば、エンハンサー、イントロンなど）又は非機能性スタッファー配列をカセットに挿入することによって、機能性ＤＮＡパッケージングをさらに減少させてもよい。
実施例２ ＲＡＡＶウイルス粒子は機能性を有する
この実施例により、被験ＲＡＡＶ－ｄＩＴＲ－Ｄベクターは、感染性を有し、且つ遺伝子送達ベクターとして機能できることが証明された。
この実施例により、被験ＲＡＡＶ－ｄＩＴＲ－Ｄベクターは、感染性を有し、且つ遺伝子送達ベクターとして機能できることが証明された。
同じ体積の精製ＲＡＡＶ－ｄＩＴＲ－Ｄ（ＣＩＴＷＩＳ－Ｄ）ベクターを用いて、約５０，０００の同じＭＯＩ（ＣＩＴＷＩＳ－ＤベクターのＭＯＩはＤＮＡ粒子数とｍＲＮＡ粒子数との和から計算される）で２×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞をインビトロで感染させた。
特に、感染の約２４時間前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートに接種した。そして、ＲＡＡＶベクターを１ｍＬ ＤＭＥＭ（２％ ＦＢＳ含有）と完全に混合した。そして、細胞の培地を除去し、且つ混合したＲＡＡＶベクターと共に細胞を一晩インキュベートした。感染から３日及び５日後に蛍光写真を撮影した。
その結果、ｔｄＴｏｍａｔｏに対するＣＩＴＷＩＳ－Ｄベクターの発現は他のベクターより速いが、発現も迅速に下方制御された（図７Ｂを参照されたい）。このような迅速な発現及び分解現象は、そのｍＲＮＡゲノムの寿命が短いためである可能性がある（図７Ｂ）。
興味深いことに、いかなるＩＴＲ配列もないＣＴＷＳ構築体は、正確なメカニズムがまだ明らかではないにもかかわらず、明らかにある程度パッケージングされる。ＣＴＷＳベクターを用いた場合、少なくとも二つの可能性は、ｍＲＮＡベクターゲノムのパッケージングを解釈することができ、過剰発現された細胞ｍＲＮＡは、ＲＡＡＶベクターに非特異的パッケージングされてもよく、又はＣＴＷＳ ｍＲＮＡはＲｅｐ２もしくはＣａｐ－ＤＪと相互作用するいくつかのＲＮＡ構造を有し得る。それとともに、ＣＴＷＳ ＤＮＡパッケージングは、ＣＴＷＳプラスミドのサイズが小さく、且つＣＴＷＳプラスミドの増大したサイズがＤＮＡパッケージングを減少させ得るためである可能性がある。
実施例３ ＲＮＡのＲＡＡＶ粒子への高効率なパッケージング
この実施例により、ＲＮＡゲノムは、特に本明細書により設計される、ＡＡＶカプシド内に直接パッケージングするための修飾後／組換えＲＮＡを用いる場合、ＲＡＡＶ粒子を産生するために、ＡＡＶカプシド内に高効率にパッケージングされ得ることが証明された。
この実施例により、ＲＮＡゲノムは、特に本明細書により設計される、ＡＡＶカプシド内に直接パッケージングするための修飾後／組換えＲＮＡを用いる場合、ＲＡＡＶ粒子を産生するために、ＡＡＶカプシド内に高効率にパッケージングされ得ることが証明された。
１． 設計
各発明者は既に一つの戦略を設計し、細菌ファージ由来のＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）とその認識ステムループＭＳ２との間の強力な相互作用を、異種ＲＮＡをＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする斬新なパッケージングシグナルとして利用した。
各発明者は既に一つの戦略を設計し、細菌ファージ由来のＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）とその認識ステムループＭＳ２との間の強力な相互作用を、異種ＲＮＡをＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする斬新なパッケージングシグナルとして利用した。
まず、ＲＡＡＶ生産中に、パッケージングされたｓｓＤＮＡゲノムを有する従来のＡＡＶ粒子の生産を抑制し／減少させるために、従来のＡＡＶパッケージングシグナル－ＩＴＲを除去した。逆に、ＲＮＡパッケージングシグナル（ＲＰＳ）、即ちＭＳ２ステムループ（又は「ＭＳ２」と略称され、そのＲＮＡ配列は以下の配列表にリストされている）の一つのコピー又は三つのコピーをｔｄＴｏｍａｔｏ発現カセットに挿入し、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）とＳＶ４０ポリＡシグナルとの間に位置し、転写された全てのｍＲＮＡがいずれもＲＰＳを有するように確保することによって、結合タンパク質、即ち細菌ファージ由来のＭＳ２コートタンパク質（又は「ＭＣＰ」と略称され、そのアミノ酸配列は以下の表に示される）（ＭＳ２に対応する）により認識される（図８Ａ）。
ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が非構造タンパク質であり、且つそれらが通常ＡＡＶパッケージング中にｓｓＤＮＡゲノムのＩＴＲとＡＡＶカプシドとの間のフリッジとして機能するため、ＭＣＰをＡＡＶ２からのＲｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ６８タンパク質のＮ末端に融合させた（Ｒｅｐ ６８は、Ｒｅｐ ７８のＣ末端短縮、二つの融合物のアミノ酸配列は以下の配列表にリストされている）。これらのＭＣＰ－Ｒｅｐ７８／６８融合物とＲＮＡゲノム内のＭＳ２配列との相互に作用、及びＲＮＡゲノムのＡＡＶカプシド内へのパッケージングを促進する能力を検証した。
従来のＡＡＶベクターｐｓｓＡＡＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（二つの野生型機能性ＩＴＲを有する）及び機能性野生型ＩＴＲを有しないＣＴＷＳ（配列エレメントＣＡＧプロモーター、ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子、ＷＰＲＥ配列及びＳＶ４０ポリＡシグナル配列を代表する「ＣＴＷＳ」）を対照として用いた（図８Ａ）。本実施例において、ＡＡＶ血清型ＤＪ（「ＡＡＶ－ＤＪ」又は「ＤＪ」）が本実施例で使用される培養細胞ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において優れた形質導入効率を有するため、前記ＡＡＶ血清型ＤＪの使用を選択した。ＡＡＶ－ＤＪは、合成血清型であり、ＡＡＶ－２、８及び９のキメラカプシドを有する。
２． ＲＡＡＶパッケージング及び生産
本明細書は、従来のトリプラスミドトランスフェクトシステムを用いて、必要な変化を行い、該当する導入遺伝子プラスミド、パッケージングプラスミド及びヘルパープラスミドを１：１：２の質量比でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、ＲＡＡＶ及び対照ＡＡＶ粒子を産生した。
本明細書は、従来のトリプラスミドトランスフェクトシステムを用いて、必要な変化を行い、該当する導入遺伝子プラスミド、パッケージングプラスミド及びヘルパープラスミドを１：１：２の質量比でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、ＲＡＡＶ及び対照ＡＡＶ粒子を産生した。
特に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコンピテントＤＭＥＭ培地で培養し、且つトランスフェクトの２４時間前に細胞を接種した。トランスフェクトの直前に、培地を、２％ ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭに交換した。ＰＥＩ－ＭＡＸをトランスフェクト試薬として用いた。感染細胞にトランスフェクトした後、ＲＰＳを担持する導入遺伝子プラスミドは、転写してパッケージング対象ＲＮＡゲノムを生成した。そして、トランスフェクト後２日目と５日目に上清を収集し、５日目にトランスフェクトされた細胞を収穫した。イオジキサノール密度勾配超遠心分離法によってＲＡＡＶ及び対照ＡＡＶ粒子を精製した。
３． パッケージングされたゲノムの検出
まず、精製されたＲＡＡＶ及び対照ＡＡＶ粒子を、３７℃でヌクレアーゼ（ＤＮＡ酵素ＩとＲＮＡ酵素Ｉとを含む）により２時間プロセシングして、ウイルス粒子以外の存在し得る核酸を除去した。次に、ヌクレアーゼ及びＲＡＡＶ又は対照ＡＡＶ粒子を、プロテアーゼＫ／ＳＤＳ消化により、６５℃で約３時間変性させて、前記ウイルス粒子を破裂させて、それにパッケージングされたゲノムを放出した。そして、フェノール／クロロホルム抽出により、放出されたウイルスゲノムを含有するヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチドを抽出し精製した。
まず、精製されたＲＡＡＶ及び対照ＡＡＶ粒子を、３７℃でヌクレアーゼ（ＤＮＡ酵素ＩとＲＮＡ酵素Ｉとを含む）により２時間プロセシングして、ウイルス粒子以外の存在し得る核酸を除去した。次に、ヌクレアーゼ及びＲＡＡＶ又は対照ＡＡＶ粒子を、プロテアーゼＫ／ＳＤＳ消化により、６５℃で約３時間変性させて、前記ウイルス粒子を破裂させて、それにパッケージングされたゲノムを放出した。そして、フェノール／クロロホルム抽出により、放出されたウイルスゲノムを含有するヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチドを抽出し精製した。
対照ＡＡＶ及びＲＡＡＶ粒子のＤＮＡゲノム力価を検出するために、Ｑ－ＰＣＲを用いてヌクレアーゼ耐性ポリヌクレオチドを直接分析した。Ｑ－ＰＣＲにおいて、ウイルスゲノムペアにおけるＷＰＲＥ配列に特異的なＷＰＲＥプライマーペア（以下の配列に示される）を用いて、対照ＡＡＶ又はＲＡＡＶ粒子にカプシド化された任意のＤＮＡゲノムを検出し定量した。
対照ＡＡＶ及びＲＡＡＶ粒子のＲＮＡゲノム力価を検出するために、カプシド化されたＲＮＡゲノムを逆転写する前、ＤＮＡ酵素Ｉ消化によってＤＮＡを除去して、任意の対照ＡＡＶ－又はＲＡＡＶカプシド化されたＤＮＡゲノムを除去し、且つ得られたｃＤＮＡをＱ－ＰＣＲテンプレートとして用い、上記同じＷＰＲＥプライマーペアによりＷＰＲＥ配列を検出し定量した。ＤＮＡの不完全な除去のために存在し得る任意の潜在的な残留ＤＮＡを検出し定量するために、ＤＮＡ除去ステップの後、Ｑ－ＰＣＲを用いて試料を直接増幅させ（逆転写なし）、上記同じＷＰＲＥプライマーペアを用いてＷＰＲＥ（ＤＮＡ）配列を検出し、前記プライマーはＷＰＲＥ配列に特異的な全ての他のＰＣＲ反応にも用いられる。
４． パッケージング効率の比較
ｐｓｓＡＡＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ構築体（両端は、野生型ＩＴＲを有する）を含有する従来の導入遺伝子プラスミド及びＡＡＶ－ＤＪのための従来のパッケージングプラスミドを用いて対照ＡＡＶ粒子を生産する場合、大多数の粒子は、ＷＰＲＥ配列を有するＤＮＡゲノムを含有する。ごくまれに、ＲＮＡゲノムも粒子にパッケージングされる（「ＲＮＡ」と標識されるバーを参照されたく、「ＤＮＡ」と標識されるバーより約５桁低い）。残留ＤＮＡの存在がＲＮＡの存在と同等であり、これは、逆転写前、ＤＮＡ酵素ＩによるパッケージングされたＤＮＡゲノムの消化効率が低いためである可能性がある。
ｐｓｓＡＡＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ構築体（両端は、野生型ＩＴＲを有する）を含有する従来の導入遺伝子プラスミド及びＡＡＶ－ＤＪのための従来のパッケージングプラスミドを用いて対照ＡＡＶ粒子を生産する場合、大多数の粒子は、ＷＰＲＥ配列を有するＤＮＡゲノムを含有する。ごくまれに、ＲＮＡゲノムも粒子にパッケージングされる（「ＲＮＡ」と標識されるバーを参照されたく、「ＤＮＡ」と標識されるバーより約５桁低い）。残留ＤＮＡの存在がＲＮＡの存在と同等であり、これは、逆転写前、ＤＮＡ酵素ＩによるパッケージングされたＤＮＡゲノムの消化効率が低いためである可能性がある。
興味深いことに、ＤＪの代わりに組換えパッケージングプラスミドＤＪ－ＭＣＰ（Ｒｅｐ７８及び６８タンパク質Ｎ末端に融合しているＭＣＰ）を用いる場合、ＤＮＡゲノムのパッケージングはわずかに（約０．５桁）低下したが、ウイルスゲノムの分布パターンがほぼ同じであり、ここで、ＤＮＡパッケージングがＲＮＡパッケージングより約５桁高い。この結果により、ＭＣＰをＲｅｐ７８／６８タンパク質のＮ末端に融合させてもそれらの本来の機能を著しく損なうことはないことが示唆されている（図８Ｂ）。
それとともに、ｐｓｓＡＡＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ構築体の両端からＩＴＲを除去することにより、ＣＴＷＳ構築体の産生を引き起こし、ＤＮＡパッケージングを著しく除去した。どのようなパッケージングプラスミド（ＤＪ又はＤＪ－ＭＣＰ）を用いても、ＣＴＷＳ構築体（ＩＴＲなし）により産生されたパッケージングＤＮＡは約４桁低く、あるいはより少ないパッケージングＲＮＡを産生した。
また、ＩＴＲなしのウイルスゲノムにおけるＷＰＲＥの３’とＳＶ４０ポリＡシグナルの５’との間にＲＰＳ（ＭＳ２）の一つ又は三つのコピーを付加することによって、それぞれＲＡＡＶ導入遺伝子プラスミド、ＣＴＷＭＳ及びＣＴＷＭ３Ｓを得た。ＭＣＰがない場合、ＣＴＷＭＳ及びＣＴＷＭ３Ｓ構築体は、ＣＴＷＳのゲノム分布パターンのように、ＤＮＡ又はＲＮＡゲノムとしてカプシド化されることはほとんどない。驚くべきことに、ＤＪの代わりにＤＪ－ＭＣＰをパッケージングプラスミドとして用いることにより、ＤＮＡとＲＮＡゲノムとのパッケージング効率の差を著しく逆転させ、且つ大多数のパッケージングのゲノムがＲＮＡである。
ＣＴＷＳ／ＤＪ－ＭＣＰに比べて、ＣＴＷＭＳ／ＤＪ－ＭＣＰ及びＣＴＷＭ３Ｓ／ＤＪ－ＭＣＰのパッケージングのＲＮＡゲノム数は、それぞれ１００倍及び４００倍高く、三者のＤＮＡパッケージング数には明らかな差異がなかった。この結果により、ＭＣＰ－Ｒｅｐ７８／６８融合物は、ＣＴＷＭＳ及びＣＴＷＭ３ＳプラスミドのＲＮＡ転写物に埋め込まれたＲＰＳ、ＭＳ２を特異的に認識し、それらのＲＮＡのＲＡＡＶ粒子へのパッケージングを促進することができ、且つＣＴＷＭ３Ｓ構築体におけるＲＰＳの三つのコピーが一つのコピーよりもより良好なＲＮＡパッケージング効率を提供したことが示唆されている（図８Ｂ）。
要するに、ＭＳ２／ＭＣＰペアを従来のＡＡＶパッケージングシステムに導入することにより、ＭＣＰ－Ｒｅｐ７８／６８融合物の存在下で、ＭＳ２を担持するＲＮＡゲノムをＡＡＶ粒子にパッケージングすることによってＲＡＡＶ粒子を生成することができる。望ましくないＤＮＡパッケージングは、ＣＴＷＭ３Ｓ／ＤＪ－ＭＣＰを用いて産生したウイルス粒子群全体の約１０％しか占めない。
換言すれば、人工／異種ＲＮＡパッケージングシグナル（ＲＰＳ）－ＭＳ２配列－は、その同種結合タンパク質ＭＣＰと共に使用され、天然ＤＮＡウイルスパッケージングシグナルペア（即ちＩＴＲ及びＲｅｐ）を代替して、ＲＮＡを別のＤＮＡウイルスにパッケージングする効率を著しく増強するとともに、ＤＮＡの同じＤＮＡウイルスへのその固有のパッケージングを抑制することができる。
実施例４ 拡大されたプラスミド骨格は、ＲＡＡＶの望ましくないＤＮＡパッケージングを減少させた
この実施例により、スタッファー配列をプラスミドの骨格に挿入してＡＡＶ導入遺伝子プラスミドの骨格サイズを増加させることによって、望ましくないＤＮＡのＲＡＡＶ粒子へのパッケージングを減少させ得ることが証明された。
この実施例により、スタッファー配列をプラスミドの骨格に挿入してＡＡＶ導入遺伝子プラスミドの骨格サイズを増加させることによって、望ましくないＤＮＡのＲＡＡＶ粒子へのパッケージングを減少させ得ることが証明された。
実施例３においてＲＡＡＶ粒子のためのＣＴＷＭＳ及びＣＴＷＭ３Ｓ構築体にＩＴＲがなく、且つＲＡＡＶ生産に逆方向パッケージングが存在しないが、ＲＡＡＶ導入遺伝子プラスミドの小さいサイズ（５～６ｋｂ）は、依然として望ましくないＤＮＡパッケージングをもたらす可能性があると推測された。
そのため、３２６６ｂｐの非コード配列（スタッファー配列、以下の配列表を参照）をＣＴＷＭ３ＳのｔｄＴｏｍａｔｏ発現カセットの上流に挿入して、ＣＴＷＭ３Ｓ導入遺伝子プラスミドの骨格長さを増加させ、得られた構築体をＬ－ＣＴＷＭ３Ｓと命名した。プラスミドの概略図は図９Ａに示すとおりである。
実施例３で使用される従来のＡＡＶゲノム構築体ｐｓｓＡＡＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＲＡＡＶゲノム構築体ＣＴＷＭ３Ｓを本明細書の対照として用いた。実施例３と同様に、ＣＴＷＭ３Ｓ又はＬ－ＣＴＷＭ３Ｓ導入遺伝子プラスミドを、パッケージングプラスミドＤＪ－ＭＣＰ及びヘルパープラスミドとＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによって、ＲＡＡＶ粒子を製造し、且つ得られたＲＡＡＶ粒子を精製し、ウイルスゲノムを定量した。ＡＡＶ及びＲＡＡＶ粒子にカプシド化されている任意のＤＮＡ及びＲＮＡゲノムを検出し定量するために同一のＷＰＲＥプライマーペアを用い、ウイルスゲノム中のＣＡＧプロモーター配列に特異的な別のＣＡＧプライマーペアをＱ－ＰＣＲに用いて、任意の機能性ＤＮＡ（即ちＣＡＧプロモーター配列を含有し、機能性導入遺伝子タンパク質を発現できるＤＮＡ）を検出し定量した。
パッケージングされたＲＮＡゲノムは、ＣＡＧプロモーターを含まないため、ＣＡＧプライマーで検出することができず、且つＣＡＧプライマーを有する図におけるＲＮＡカラムがバックグラウンドＲＮＡシグナルを代表することに留意されたい（図９Ｂを参照されたい）。
驚くべきことに、Ｑ－ＰＣＲにおいてどのプライマーペアを使用しても、Ｌ－ＣＴＷＭ３Ｓ群のＤＮＡゲノム力価は、ＣＴＷＭ３Ｓ群の力価より約２倍低かった（図９Ｂ及び９Ｃを参照されたい）。ＣＴＷＭ３ＳとＬ－ＣＴＷＭ３Ｓ群のＲＮＡゲノム力価は、実質的に同等である（図９Ｃを参照されたい）。ＣＴＷＭ３Ｓ及びＬ－ＣＴＷＭ３Ｓ導入遺伝子プラスミドからの転写されたＲＮＡにはＣＡＧプロモーター配列がないため、パッケージングされたＲＮＡゲノムは、一ペアのＷＰＲＥプライマーのみで検出することができる（図９Ｃ）。
要するに、導入遺伝子プラスミドの骨格長さを増加することにより、そのＲＮＡパッケージングを妨げることなく、ＲＡＡＶ粒子の望ましくないＤＮＡパッケージングを減少させることができ、これは、ＡＡＶ粒子においてＤＮＡパッケージングシステムの脱構築及びＲＮＡパッケージングシステムの確立が二本の独立したラインであることを示唆しており、且つ前記長いスタッファー配列を後続の実施例におけるＲＡＡＶ導入遺伝子プラスミドに用いた。
実施例５ 追加の導入遺伝子のためのＲＡＡＶ－ＭＳ２／ＭＣＰシステムの使用
追加の導入遺伝子に対するＲＡＡＶ－ＭＳ２／ＭＣＰシステムの一般的適用性を検証し、観察されたＲＮＡパッケージングが使用されるレポーター遺伝子に関連するアーチファクトだけではないことを検証するために、Ｃｒｅ組換え酵素発現カセットを含有する一連のＡＡＶ及びＲＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを生成した。
追加の導入遺伝子に対するＲＡＡＶ－ＭＳ２／ＭＣＰシステムの一般的適用性を検証し、観察されたＲＮＡパッケージングが使用されるレポーター遺伝子に関連するアーチファクトだけではないことを検証するために、Ｃｒｅ組換え酵素発現カセットを含有する一連のＡＡＶ及びＲＡＡＶ導入遺伝子プラスミドを生成した。
従来のｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅ（図８Ａ中のｐｓｓＡＡＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ構築体におけるｔｄＴｏｍａｔｅコード配列をＣｒｅコード配列に置き換える）及び対応するＬ－ＣＣＷＳ構築体（図８Ａ中のＣＴＷＳにおけるｔｄＴｏｍａｔｅコード配列をＣｒｅコード配列に置き換え、実施例４におけるスタッファー配列を挿入する）を対照とし、ここで、２番目のＣは、Ｃｒｅ組換え酵素導入遺伝子を代表する。ｔｄＴｏｍａｔｅコード配列をＣｒｅコード配列に置き換えた後、実施例４におけるＬ－ＣＴＷＭ３Ｓ構築体もＬ－ＣＣＷＭ３Ｓ構築体として再設計された。
Ｃｒｅ導入遺伝子プラスミドを、パッケージングプラスミドＤＪ又はＤＪ－ＭＣＰ及びヘルパープラスミドと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトして、それぞれＡＡＶ及びＲＡＡＶ粒子を産生した。得られたウイルス粒子を精製し、実施例３に記載のようにウイルスゲノムを定量した。
ＡＡＶ－Ｃｒｅ及びＲＡＡＶ－Ｃｒｅの場合、ＡＡＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ及びＲＡＡＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏと同じウイルスゲノム分布結果を得た。ｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅの場合、大多数のウイルス粒子は、ＤＮＡゲノムを含有し、ＤＮＡゲノム力価がＲＮＡゲノム力価より約４～５桁高かった。Ｌ－ＣＣＷＳの場合、ＤＮＡ及びＲＮＡパッケージングシグナルの両方を欠いているため、ＤＮＡ及びＲＮＡゲノムは、ほとんどカプシド化されなかった。Ｌ－ＣＣＷＭ３Ｓの場合、Ｌ－ＣＣＷＳ／ＤＪ－ＭＣＰに比べて、ＤＪ－ＭＣＰ場合のＲＮＡパッケージングは約２００倍著しく向上し、且つＤＮＡを担持する望ましくないウイルス粒子はウイルス粒子集団全体の約１％のみを占めた（図１０Ａ及び１０Ｂ）。
ＤＪ－ＭＣＰ融合物が、ＲＮＡパッケージングに役立つだけでなく、ＤＮＡパッケージング能力を保持したため、ＤＮＡパッケージングシグナル（ＩＴＲ）とＲＮＡパッケージングシグナル（ＭＳ２の３つのコピー）の両方を含有する構築体においてその性能を評価し、前記構築体は、ｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅ構築体のＷＰＲＥとＳＶ４０ポリＡとの間にＭＳ２の３つのコピーを挿入することによって構築され、ｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅ－ＭＳ２Ｘ３と命名された。結果により、ＭＣＰが存在しない場合に、大多数のウイルス粒子がパッケージングされたＤＮＡゲノムを含有し、ＲＮＡパッケージングシグナルがあるか又はない場合に無視できる量のＲＮＡゲノムしかパッケージングされていないことが示唆されている。ＤＪの代わりにＤＪ－ＭＣＰをパッケージングプラスミドとしてＲＮＡ結合シグナルと組み合わせする場合、ＲＮＡパッケージングは著しく改善され、驚くべきことに、増加したＲＮＡパッケージングは、ｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅ－ＭＳ２Ｘ３構築体のＤＮＡパッケージングを著しく防げなかった（図１１Ｂ）。別の見地は、ＤＮＡパッケージングシグナル－ＩＴＲを除去しなくても、ＭＳ２／ＭＣＰペアの導入もＲＮＡパッケージングを著しく増加させることができ、これは、ＡＡＶ粒子においてＤＮＡパッケージングシステムの脱構築及びＲＮＡパッケージングシステムの確立が二本の独立したラインであり、且つＩＴＲの除去が、ＲＰＳ／ＲＢＰペアの導入によるＲＮＡパッケージングの増加に必須の根拠ではないことを示唆している。
要するに、前記被験ＲＡＡＶ－ＭＳ２／ＭＣＰシステムは、通常、以上に示されるＣｒｅ組換え酵素のような任意の導入遺伝子に適用することができる。興味深いことに、ＲＡＡＶ－Ｃｒｅ構築体は、ＲＡＡＶ－ｔｄＴｏｍａｔｏ構築体よりも良好な収量をもたらした。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、これは、ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡに比べて、Ｃｒｅ ｍＲＮＡの二次構造がより単純であるためであり、これは、ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉで発見された予測のようなオンラインＲＮＡ二次構造予測に基づいている。
実施例６ ＲＡＡＶ生産システムの最適化及び最適化されたＲＡＡＶ粒子の特性の同定
Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ７８タンパク質（Ｒｅｐ６８／７８）のエンドヌクレアーゼ活性は、ＡＡＶ粒子の従来のＤＮＡパッケージング過程におけるＤＮＡゲノム複製に極めて重要である。機能性ｔｒｓ－エンドヌクレアーゼがなければ、新たに合成されたウイルスｓｓＤＮＡをパッケージングのために放出することができない。本実施例において、ｔｒｓ－エンドヌクレアーゼの活性を破壊することによってＲＡＡＶ粒子の望ましくないＤＮＡパッケージングをさらに減少させることが可能であるか否かを検討した。
Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ７８タンパク質（Ｒｅｐ６８／７８）のエンドヌクレアーゼ活性は、ＡＡＶ粒子の従来のＤＮＡパッケージング過程におけるＤＮＡゲノム複製に極めて重要である。機能性ｔｒｓ－エンドヌクレアーゼがなければ、新たに合成されたウイルスｓｓＤＮＡをパッケージングのために放出することができない。本実施例において、ｔｒｓ－エンドヌクレアーゼの活性を破壊することによってＲＡＡＶ粒子の望ましくないＤＮＡパッケージングをさらに減少させることが可能であるか否かを検討した。
これを検討するために、三つのｔｒｓ－エンドヌクレアーゼ陰性突然変異体、即ちＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ、ここで、Ｙ１５６Ｆ突然変異はＲｅｐ６８及びＲｅｐ７８タンパク質のコンセンサス配列に位置し、即ちＲｅｐ６８－Ｙ１５６Ｆ及びＲｅｐ７８－Ｙ１５６Ｆ）、ＤＪ－ＭＣＰ（ＫＤＥ－ｍｕ）及びＤＪ－ＭＣＰ（ＥＫＥ－ｍｕ）を構築した（以下の配列表を参照されたい）。
まず、ＤＮＡ及びＲＮＡパッケージングシグナルの両方を含有する導入遺伝子プラスミドｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅ－ＭＳ２Ｘ３（実施例５に記載）を用いて、ＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）のＤＮＡ及びＲＮＡパッケージング効率を評価した。ＤＪ及びＤＪ－ＭＣＰをパッケージングプラスミド対照として設定した。実施例３に記載のように、ウイルス粒子を産生し、精製し、滴定した。
結果により、ＤＪ－ＭＣＰにおけるＹ１５６Ｆ突然変異は、ＲＮＡパッケージングを防げることなく、ＩＴＲ媒介性ｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅ－ＭＳ２Ｘ３のＤＮＡパッケージングを著しく低下させたことが示唆されている。
そのため、以上の実施例に示されるようにＤＮＡパッケージングシグナルＩＴＲを除去することを除いて、さらに、ＤＮＡパッケージング過程に関与する機能性タンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８タンパク質）を修飾し、例えば、突然変異させて、ＤＮＡパッケージングに関連するその機能を弱めるか又は除去することができ、これは、ＡＡＶ粒子の従来のＤＮＡパッケージングを減少させるか又は抑制する別の戦略となり得る（図１３Ａ）。
そして、ｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅ－ＭＳ２Ｘ３の代わりに、実施例５におけるＬ－ＣＣＷＭ３ＳをＲＡＡＶ導入遺伝子プラスミドとして用い、それによりウイルスゲノムを提供した。ｔｒｓ－エンドヌクレアーゼ陽性のＤＪ－ＭＣＰをＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）に対する対照として用いた。実施例３に記載のように、ウイルス粒子を産生し、精製し、滴定した。ここで、ウイルスゲノムを滴定するために二つのペアのプライマーを用い、一つのペアは上記ＷＰＲＥ配列を標的化するためのものであり、もう一つのペア（以下の配列表を参照されたい）はＣｒｅコード配列の５’末端を標的化するためのものである。
結果により、Ｒｅｐ７８／６８タンパク質におけるＹ１５６Ｆ突然変異は、望ましくないＤＮＡパッケージングを約１０倍減少させただけでなく、所望のＲＮＡパッケージングを約５０％増加させたことが示唆されている。Ｑ－ＰＣＲで使用されるプライマーの二つのペア（即ち、ＷＰＲＥプライマーペア及びＣｒｅプライマーペア）の場合、パッケージングされたＤＮＡとＲＮＡゲノムとのパッケージング効率の差のパターンは実質的に同じである（図１２Ａ－１２Ｂ）。
さらに二つの他のｔｒｓ－エンドヌクレアーゼ突然変異体ＤＪ－ＭＣＰ（ＫＤＥ－ｍｕ）及びＤＪ－ＭＣＰ（ＥＫＥ－ｍｕ）を試験し、ＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）と同じ、望ましくないＤＮＡパッケージングを減少させる能力を有することを証明したが、ＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）のみは、改善されたＲＮＡパッケージングを示した（図１３Ｂ）。
ＭＣＰの二つのコピーをＲｅｐ ７８／６８タンパク質のＮ末端（ＭＣＰｘ２－Ｒｅｐ７８及びＭＣＰｘ２－Ｒｅｐ６８）に融合させることもまた、望ましくないＤＮＡパッケージングを減少させる結果を実現することができることがさらに証明された（図１３Ｂ）。
銀染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥによってＡＡＶ及びＲＡＡＶ粒子の組成を分析し、ＲＡＡＶカプシドも三つのＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）で構成され、ここで、ＶＰ１／２／３の比は、従来のＡＡＶ粒子に似ていた（図１２Ｃ）。
ＲＡＡＶ粒子の形態を分析するために、１０μＬの精製されたＡＡＶ及びＲＡＡＶ粒子を、３００μｍ炭素被覆ポリビニルアセタール（Ｐｉｏｌｏｆｏｒｍ）でコーティングされた銅網上に置き、室温下で２ｍｉｎインキュベートした。余分な試料を濾紙で吸引し、直ちに１０μＬの染色剤（３％リンタングステン酸）で置換し、２ｍｉｎ静置し、そして再び吸引した。Ｔａｌｏｓ Ｌ１２０Ｃ透過型電子顕微鏡を用いて試料を可視化した。ＲＡＡＶ粒子は、従来のＡＡＶベクターと形態的に似ており、ここで、ゲノムを包む完全なウイルス粒子は、２５－ｎｍ中実球体と見なされ、ゲノムを包んでいない空のウイルス粒子は２５－ｎｍのドーナツ状構造である（図１２Ｄ）。
要するに、ＡＡＶ生産中のＤＮＡパッケージング過程に関与した機能性タンパク質（Ｒｅｐタンパク質を含む）の突然変異は、そのＤＮＡパッケージングに関連する機能を弱める又は除去し、ＤＮＡパッケージングシグナルＩＴＲを除去し、これは、ＲＡＡＶ粒子の望ましくないＤＮＡパッケージングを減少させるか又は抑制する最適な戦略である。産生されたＲＡＡＶ粒子は、従来のＡＡＶ粒子に似ている組成と形態を有する。
実施例７ 機能性タンパク質を発現するＲＡＡＶベクター
この実施例により、被験ＲＡＡＶベクターは、感染性を有し、且つ遺伝子送達ベクターとして機能できることが証明された。
この実施例により、被験ＲＡＡＶベクターは、感染性を有し、且つ遺伝子送達ベクターとして機能できることが証明された。
Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムは、高度な感受性を有するシステムであり、本発明のＲＡＡＶベクターの感染性を研究するためのものである。ｈｏｍｏ－Ａｉ９（ｌｏｘＰ－ｔｄＴｏｍａｔｏ－レポーター遺伝子システムを担持する）マウスから単離されたマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）及び実施例５において精製されたＡＡＶ（ｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅ／ＤＪ）又はＲＡＡＶ（Ｌ－ＣＣＷＭ３Ｓ／ＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ））ベクターを一晩インキュベートし、感染多重度（ＭＯＩ）（感染中に細胞あたりに付加されたウイルス粒子数）を設定し、従来のＡＡＶベクターに対する７個のＭＯＩと、ＲＡＡＶベクターに対する３個のＭＯＩとを含む。上記５’末端Ｃｒｅプライマーを用いてＣｒｅコード配列を検出することによって定量された優勢なゲノム力価を感染力価として用いた。換言すれば、ＤＮＡゲノム力価を従来のＡＡＶベクターに用いる一方、ＲＮＡゲノム力価をＲＡＡＶベクターに用いた。
特に、感染の約２４時間前に、Ａｉ９－ＭＥＦ細胞を約５×１０４個の細胞／ウェルで４８ウェルプレートに接種した。そして、ＡＡＶベクター又はＲＡＡＶベクターを、０．５ｍＬの２％ ＦＢＳ含有のＤＭＥＭと完全に混合した。接種された細胞の培地を除去し、そして前記細胞を、混合されたＡＡＶ又はＲＡＡＶベクターと共に３７℃下で一晩インキュベートした。感染した細胞を異なる時点で収集し、ＲＮＡ及びＤＮＡ分析を行った。以上に記載のように、Ｃｒｅコード配列５’末端を標的化するプライマーペアは、ベクターに由来する特異的ＣｒｅコードＤＮＡ及びｍＲＮＡを検出するためのものである。感染（ｐ．ｉ）後に蛍光写真を毎日撮り、感染後５日目にフローサイトメトリーによって蛍光陽性細胞を定量した。
ｍＲＮＡ分析結果により、感染２時間後に、ＲＡＡＶに感染した細胞から特異的ｍＲＮＡを検出し、感染６時間後にピークに達し、そして低下することが示唆されている。従来のＡＡＶベクターに感染した細胞において、感染２時間後に明らかな転写が検出されていなかったが、感染６時間～２０時間後に、転写されたｍＲＮＡの迅速な増加を観察し、３０時間にプラトー期に達した。ＲＡＡＶベクターの結果と逆に、従来のＡＡＶベクターで感染した細胞におけるｍＲＮＡレベルは、プラトー期に達した後に低下しなかった。全ての試料において、Ｃｒｅ ｍＲＮＡのコピー数は、ＭＯＩと正の相関を示した（図１４Ａ－１４Ｂ及び図１５Ａ）。それとともに、ｍＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを参照転写物（ハウスキーピング遺伝子）として試験し、予測されるように、全ての試料におけるｍＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに差はなかった（図１５Ｃ）。
ＤＮＡ結果とｍＲＮＡ結果は全く異なる。従来のＡＡＶ及びＲＡＡＶベクターは、実質的に同じＤＮＡコピー数パターンを有し、大部分のＤＮＡゲノムは、感染後２時間に感染した細胞から検出され、そして感染後２時間から２０時間にわずかに増加し、これはＲＡＡＶに感染した細胞におけるｍＲＮＡレベルの傾向に非常に類似していた。その後、ＤＮＡレベルは、プラトー期に達したか又は緩やかに低下した。Ｃｒｅ ＤＮＡのコピー数はさらに全ての試料におけるＭＯＩと正の相関を呈するが、ＲＡＡＶに感染した細胞から検出されたＣｒｅ ＤＮＡ数がはるかに低かった（ＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓ ＭＯＩ＝１００又は３００組のＤＮＡコピー数は、ＡＡＶ－Ｃｒｅ ＭＯＩ＝１組のＤＮＡコピー数より小さく、且つＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓ ＭＯＩ＝１０００組のＤＮＡコピー数は、ＡＡＶ－Ｃｒｅ ＭＯＩ＝３組のＤＮＡコピー数より小さい）（図１４Ｃ及び図１５Ｂ）。同様に、別のハウスキーピング遺伝子３６Ｂ４のＤＮＡレベルを参照遺伝子として定量し、且つ予測されるように、全ての試料の間からＤＮＡレベルの明らかな差が観察されなかった（図１５Ｄ）。
ＡＡＶ－Ｃｒｅ又はＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓベクター感染の成功は、機能性Ｃｒｅ組換え酵素の発現を引き起こし、Ａｉ９－ＭＥＦ細胞中のｔｄＴｏｍａｔｏ発現をレスキューするため、ｔｄＴｏｍａｔｏ赤色蛍光を発散する細胞を計数することによってウイルスベクターの感染性を評価するように、感染した細胞の蛍光写真を撮り、分析した。結果により、ＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓにより生成された蛍光陽性細胞の数が、１０倍低いＭＯＩを有するＡＡＶ－Ｃｒｅにより生成された数と同程度であることが示されている（図１４Ｄ）。ＲＡＡＶに感染した細胞中のｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光強度が低いのは、その中に送達されたＣｒｅ ｍＲＮＡの寿命が短く、限られた量の翻訳されたＣｒｅ組換え酵素がｈｏｍｏ－Ａｉ９－ＭＥＦ細胞中のｔｄＴｏｍａｔｏ発現カセットの二つのコピーをレスキューできないためであり得る（図１６）。
ＤＮＡ力価と細胞計数データを比較した結果により、ＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓに感染した細胞における大部分のｔｄＴｏｍａｔｏ赤色蛍光シグナルが、Ｃｒｅ ｍＲＮＡを担持するＲＡＡＶ粒子により生成されたことが示唆されている。
要するに、本発明のＲＡＡＶベクターは、機能性Ｃｒｅ ｍＲＮＡを細胞に送達し、機能性Ｃｒｅ組換え酵素を発現することができる。
実施例８ ＲＡＡＶ粒子による機能性遺伝子の細胞へのインビトロ瞬時的転移
実施例７においてＡＡＶ－Ｃｒｅ又はＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓ送達により産生されたＣｒｅタンパク質の正確な寿命を確定するために、感染の２４時間前に、５×１０４個の細胞／ウェルの細胞コンフルエンスでＡｉ９－ＭＥＦ細胞を接種し、そして、以上に記載のように、ＡＡＶ－Ｃｒｅ（ＭＯＩ＝３００）又はＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓ（ＭＯＩ＝１０，０００）ベクターと一晩インキュベートした。感染後、いくつかの時点で細胞を収集し、細胞収集前に蛍光写真を撮った。
実施例７においてＡＡＶ－Ｃｒｅ又はＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓ送達により産生されたＣｒｅタンパク質の正確な寿命を確定するために、感染の２４時間前に、５×１０４個の細胞／ウェルの細胞コンフルエンスでＡｉ９－ＭＥＦ細胞を接種し、そして、以上に記載のように、ＡＡＶ－Ｃｒｅ（ＭＯＩ＝３００）又はＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓ（ＭＯＩ＝１０，０００）ベクターと一晩インキュベートした。感染後、いくつかの時点で細胞を収集し、細胞収集前に蛍光写真を撮った。
ＡＡＶ－Ｃｒｅの場合、Ｃｒｅ発現は最初の４日間に増加したが、その後に低下した。これに対して、ＲＡＡＶ－ＣＣＷＭ３Ｓ転移後約２４時間に少量のＣｒｅを検出し、２日間後に消失した。このような迅速な発現及び分解現象は、送達される機能性Ｃｒｅ ｍＲＮＡが直ちに現れ、寿命が短いためであり得る（図１７Ａ及び１７Ｂ）。
実施例９ ＲＡＡＶ粒子による機能性遺伝子のＡｉ９マウスへのインビボ瞬時的転移
この実施例により、ＲＡＡＶ粒子は、インビボ遺伝子伝達のツールであり、機能性Ｃｒｅ組換え酵素を瞬時的発現することが証明された。
この実施例により、ＲＡＡＶ粒子は、インビボ遺伝子伝達のツールであり、機能性Ｃｒｅ組換え酵素を瞬時的発現することが証明された。
ＲＡＡＶ粒子のインビボでの感染性を研究するために、Ａｉ９－マウス（２．５～４月齢）を麻酔し、且つそれぞれ右側海馬に（その座標が以下のとおりである：前後（Ａ／Ｐ）＝－１．７ｍｍ、内外側（Ｍ／Ｌ）＝－１．０ｍｍ、背腹側（Ｄ／Ｖ）＝－２．１ｍｍ）１μＬのＡＡＶ－Ｃｒｅ（ｐｓｓＡＡＶ－Ｃｒｅ／ＤＪ）（高投与量：１Ｅ９ ｖｇ／マウス、低投与量：３Ｅ６ ｖｇ／マウス）又は１μＬのＲＡＡＶ－Ｃｒｅ（Ｌ－ＣＣＷＭ３Ｓ／ＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ））（１Ｅ９ ｖｇ／マウス）をインビボ注射した。また、このアッセイにおいて、ＡＡＶカプシド－ＤＪを対照として用いた。
ＡＡＶ又はＲＡＡＶ注射後六週間に、マウスを麻酔し、室温でｐＨ ７．４のＰＢＳで経心腔的灌流し、そして新鮮に製造された、リン酸塩緩衝液（ＰＢ）における冷たい４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した。脳を４％ ＰＦＡ中で一晩後固定した。固定された脳を脱水後ＯＣＴで包埋し凍結切片に用いた。凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０）を用いて、脳を２０μｍの厚さに切り、切片をスライドガラス上に直接置いた。スライドガラスを６０℃で１～２時間焼成し、その後にＰＢＳ中の５％ ＢＳＡ血清で１ｈ封入した。その後、スライドガラスを抗Ｃｒｅ一次抗体（１０５３６、セルシグナリングテクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１：８００で希釈された）とＰＢＳ（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）中の５％ ＢＳＡにおいて、室温で一晩インキュベートした。ＰＢＳで五回洗浄した後、スライドガラスをＰＢＳ中の１％ ＢＳＡにおいてインキュベートし、前記ＰＢＳは、一次抗体及びＤＡＰＩに対する二次抗体（Ｄ３５７１、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有する。使用される二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ（７１１－５４５－１５２、ジャクソンイムノリサーチ社（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））（１：１０００で希釈された）であった。Ｎｉｋｏｎ Ｃ２ｓｉ＋共焦点顕微鏡で画像を取得した。
得られたｔｄＴｏｍａｔｏ発現システムからの蛍光を示す画像により、ＲＡＡＶ－ＣｒｅがＡｉ９－マウス海馬における細胞を感染させ、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現をレスキューしたことが示唆されている。同じ投与量下で、ＲＡＡＶ－Ｃｒｅ群における感染した細胞の数はＡＡＶ－Ｃｒｅ群より少なかった。しかしながら、ＡＡＶ－Ｃｒｅ感染の低投与量群（３０倍低い投与量）に比べて、ＲＡＡＶ－Ｃｒｅ感染はより多くのｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を生成した。
興味深いことに、ＡＡＶ－Ｃｒｅ感染の高投与量及び低投与量群において、いずれもＣｒｅ発現を容易に検出することができるが、検出されたｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光によりＣｒｅの存在を証明しているにもかかわらず、ＲＡＡＶ－Ｃｒｅ感染の細胞から明らかなＣｒｅ発現を検出しなかった。
全体的には、同じ高投与量の１Ｅ９ ｖｇ／マウスでの両方の蛍光写真（陽性細胞計数）に示すように（図２１Ａ対図２１Ｃ）、ＲＡＡＶ－Ｃｒｅは、形質導入に成功したＡＡＶ ＤＮＡゲノムからタンパク質翻訳のための複数のｍＲＮＡを転写することができるため、従来のＡＡＶ－Ｃｒｅに比べて、形質導入効率が低かった。Ｃｒｅ発現レベルをさらに評価するために、１Ｅ９ ｖｇ／マウスの高投与量ＡＡＶ－Ｃｒｅを３Ｅ６ ｖｇ／マウスの低投与量に低下させ、ＲＡＡＶ－Ｃｒｅの形質導入効率に対してＡＡＶ－Ｃｒｅの形質導入効率を正規化し（図２１Ｂ）、且つその結果、蛍光写真（陽性細胞計数）に示すように、ＲＡＡＶ－Ｃｒｅの形質導入効率がＡＡＶ－Ｃｒｅの低投与量群よりも優れているが、ＡＡＶ－Ｃｒｅ群に比べて、ＲＡＡＶ－Ｃｒｅ感染細胞からＣｒｅ発現が検出されず、これにより、ＲＡＡＶ－Ｃｒｅ群におけるＣｒｅ発現が瞬時的であるが機能的であることが示唆されている。
実施例１０ ＲＡＡＶシステムの追加のＲＰＳ／ＲＢＰペア
実施例３～８で使用されるＭＳ２／ＭＣＰペアに加えて、さらにＲＡＡＶパッケージングに対して、追加のＲＮＡアプタマー／アプタマー－結合タンパク質（又はＲＮＡパッケージングシグナル／ＲＮＡ結合タンパク質、本明細における「ＲＰＳ／ＲＢＰ」）の二つのペアを試験した：（１）ＰＰ７結合部位／ＰＰ７細菌ファージコートタンパク質（「ＰＰ７／ＰＣＰ」又は「ＰＣＰ」又は「Ｐ」、又はＬ－ＣＣＷＰ３Ｓにおける「Ｐ」と略記される）及び（２）Ｃｏｍ結合部位／ファージＣＯＭタンパク質（「ｃｏｍ／ＣＯＭ」又は「ＣＯＭ」、又はＬ－ＣＣＷＣ３Ｓにおける「Ｃ」と略記される）。天然なウイルスパッケージングシステムであるＭＳ２／ＭＣＰ及びＰＰ７／ＰＣＰとは異なり、ｃｏｍ／ＣＯＭは、天然なウイルスパッケージングシステムではなく、細菌ファージＭｕ ｍｏｍ遺伝子の転写開始において機能することが知られている転写調節因子である。
実施例３～８で使用されるＭＳ２／ＭＣＰペアに加えて、さらにＲＡＡＶパッケージングに対して、追加のＲＮＡアプタマー／アプタマー－結合タンパク質（又はＲＮＡパッケージングシグナル／ＲＮＡ結合タンパク質、本明細における「ＲＰＳ／ＲＢＰ」）の二つのペアを試験した：（１）ＰＰ７結合部位／ＰＰ７細菌ファージコートタンパク質（「ＰＰ７／ＰＣＰ」又は「ＰＣＰ」又は「Ｐ」、又はＬ－ＣＣＷＰ３Ｓにおける「Ｐ」と略記される）及び（２）Ｃｏｍ結合部位／ファージＣＯＭタンパク質（「ｃｏｍ／ＣＯＭ」又は「ＣＯＭ」、又はＬ－ＣＣＷＣ３Ｓにおける「Ｃ」と略記される）。天然なウイルスパッケージングシステムであるＭＳ２／ＭＣＰ及びＰＰ７／ＰＣＰとは異なり、ｃｏｍ／ＣＯＭは、天然なウイルスパッケージングシステムではなく、細菌ファージＭｕ ｍｏｍ遺伝子の転写開始において機能することが知られている転写調節因子である。
ＲＰＳの三つのコピーを担持する導入遺伝子プラスミド（Ｌ－ＣＣＷＰ３Ｓ及びＬ－ＣＣＷＣ３Ｓ）及びその対応するパッケージングプラスミド［Ｒｅｐ７８－Ｙ１５６Ｆ及びＲｅｐ６８－Ｙ１５６ＦのＮ末端と融合するＰＰ７細菌ファージコートタンパク質（ＰＣＰ）を有するＤＪ－ＰＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）、並びにＲｅｐ７８－Ｙ１５６Ｆ及びＲｅｐ６８－Ｙ１５６ＦのＮ末端と融合するファージＣＯＭタンパク質（ＣＯＭ）を有するＤＪ－ＣＯＭ（Ｙ１５６Ｆ）］を構築した。実施例３に記載のように、ウイルス粒子を産生し、精製し、滴定した。
結果により、実施例３～８において各態様でよく証明されたＭＳ２／ＭＣＰペアに似ているように、ＰＰ７／ＰＣＰ及びｃｏｍ／ＣＯＭの二つのペアも、ＲＡＡＶ粒子の著しいＲＮＡパッケージングを引き起こす（図１８）ことによって、様々なＲＡＡＶパッケージングシステムの範囲を拡大したことが示唆されている。
実施例１１ ＲＡＡＶシステムによる様々なＡＡＶ血清型の応用
本発明のＲＡＡＶパッケージングシステムによる、実施例３～９で試験されたＡＡＶ－ＤＪ以外の様々なＡＡＶ血清型の応用を研究するために、ＡＡＶ－ＤＪにおいて、ＲＰＳ／ＲＢＰの二つのペア（ＭＳ２／ＭＣＰ及びｃｏｍ／ＣＯＭ）及び他の三つの異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９）を検査した。実施例３に記載のように、ウイルス粒子を産生し、精製し、滴定した。
本発明のＲＡＡＶパッケージングシステムによる、実施例３～９で試験されたＡＡＶ－ＤＪ以外の様々なＡＡＶ血清型の応用を研究するために、ＡＡＶ－ＤＪにおいて、ＲＰＳ／ＲＢＰの二つのペア（ＭＳ２／ＭＣＰ及びｃｏｍ／ＣＯＭ）及び他の三つの異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９）を検査した。実施例３に記載のように、ウイルス粒子を産生し、精製し、滴定した。
ＲＡＡＶ－ＭＳ２／ＭＣＰ及びＲＡＡＶ－ｃｏｍ／ＣＯＭシステムは、全ての四つの血清型において、いずれも良好に動作し、ＲＡＡＶパッケージングシステムによる異なるＡＡＶ血清型（即ち、ＡＡＶ－ＤＪに限らない）に対する一般的適用性を示唆した。ＲＢＰの存在下で、対応するＲＰＳを含有するＣｒｅ ＲＮＡゲノムは、該当するＲＡＡＶ粒子に有効にカプシド化された。ＲＮＡパッケージングのＲＡＡＶ粒子の収量は、血清型によって異なるが、ＲＡＡＶ５、ＲＡＡＶ８及びＲＡＡＶ９粒子において、いずれもＲＡＡＶ－ＤＪより高い収量を有する（図１９）。
実施例１２ ＡＡＰ及びＭＣＰ融合タンパク質によるＲＡＡＶ収量の向上
通常、ＡＡＶは、その天然ウイルスゲノムにおいて、独特なアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードし、前記タンパク質は、カプシドアセンブルに極めて重要である。特に、ＡＡＰは、カプシドタンパク質の安定化及び機能性ＡＡＶ粒子の生成に極めて重要であることが分かった。
通常、ＡＡＶは、その天然ウイルスゲノムにおいて、独特なアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードし、前記タンパク質は、カプシドアセンブルに極めて重要である。特に、ＡＡＰは、カプシドタンパク質の安定化及び機能性ＡＡＶ粒子の生成に極めて重要であることが分かった。
ＡＡＰ－ＭＣＰ（ＡＡＰのＣ末端と融合するＭＣＰを有する）又はＭＣＰ－ＡＡＰ（ＡＡＰのＮ末端と融合するＭＣＰを有する）融合タンパク質発現カセットを実施例６～１０で使用されるパッケージングプラスミドＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）の骨格に逆挿入し、且つ得られた構築体をそれぞれＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）－ＡＭ及びＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）－ＭＡと命名した。そして、これらの構築体は、ＭＣＰ－Ｒｅｐ７８／６８（Ｙ１５６Ｆ）融合物及びＡＡＰ－ＭＣＰ又はＭＣＰ－ＡＡＰ融合物の両方を発現し、単独のＭＣＰ－Ｒｅｐ７８／６８融合物に比べて、ＲＮＡパッケージングに協力するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）の量が増加した。実施例３に記載のように、ウイルス粒子を産生し、精製し、滴定した。
その結果、単独のＭＣＰ－Ｒｅｐ７８／６８融合物に比べて、ＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）－ＭＡ及びＤＪ－ＭＣＰ（Ｙ１５６Ｆ）－ＡＭにおいて、ＲＮＡをパッケージングしたＲＡＡＶ粒子の収量は、それぞれ約６５％及び約３５％（図２０Ａ及び２０Ｂ）向上し、これにより、ＲＢＰは、ＲＡＡＶ粒子のＲＮＡパッケージングを増強するために、ＡＡＶ粒子のパッケージング又はアセンブルに作用する任意の他のタンパク質と追加的に融合するか又は互いに関連することができることが示唆されている。
ＡＡＰ－ＭＣＰ又はＭＣＰ－ＡＡＰを単独で使用し、ＭＣＰ－Ｒｅｐ７８／６８を使用しないことも、本発明の範囲内である。
配列
以下でいくつかの配列を提供し、上記実施例で参照されるそれらの配列を含む。
以下でいくつかの配列を提供し、上記実施例で参照されるそれらの配列を含む。
参照により組込まれる
各特許文献の全ての開示内容は、特許出願書類、科学文献、政府報告書、ウェブサイト及び本明細書に引用された他の参考文献を含み、あらゆる目的のために、全体として参照により本明細書に組み込まれる。用語に矛盾が生じる場合、本明細書に準ずる。本明細書により開示された全ての配列表又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
各特許文献の全ての開示内容は、特許出願書類、科学文献、政府報告書、ウェブサイト及び本明細書に引用された他の参考文献を含み、あらゆる目的のために、全体として参照により本明細書に組み込まれる。用語に矛盾が生じる場合、本明細書に準ずる。本明細書により開示された全ての配列表又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
以下の参考文献は、本明細書に記載された内容を補足する例示的な手順又は他の詳細を提供するという意味で、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
本発明の例示的な実施形態を本明細書で説明したが、本発明は、説明したものに限定されず、且つ当業者は、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、様々な他の変更及び修正を行うことができることを理解されたい。
Claims (47)
- ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされ得るリボヌクレオチド（ＲＮＡ）配列であって、前記ＲＮＡ配列は、
（１）関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）、例えば、関心のある遺伝子（ＧＯＩ）のＲＮＡコード配列、タンパク質（例えば、治療用タンパク質、抗原タンパク質、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素（「Ｃａｓタンパク質」と略称される）、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質のような遺伝子編集タンパク質）をコードするＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、又は非コード機能性ＲＮＡ（例えば、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）、例えばシングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒ ＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３）システムのＲＮＡ成分）、又はその前駆体と、
（２）前記ＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進するＲＰＳ相互作用分子と直接又は間接的に相互作用、例えば、結合することができるＲＮＡパッケージングシグナル（ＲＰＳ）とを含み、
任意選択的に、前記ＲＮＡ配列をコードするかもしくはそれに対応するＤＮＡ配列、又は前記ＤＮＡ配列の逆相補的配列は、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングされる能力が減少し、減弱し又は実質的にない（例えば、前記ＤＮＡ配列又はその逆相補的配列は、ＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶパッケージングのための機能性ＡＡＶ ＩＴＲを欠いている）、ＲＮＡ配列。 - 前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子は、ＡＡＶウイルス粒子又は腫瘍溶解性ウイルス粒子である、請求項１に記載のＲＮＡ配列。
- 前記ＲＰＳは、前記ＲＳＩの５’末端もしくはその近傍、前記ＲＳＩの３’末端もしくはその近傍、又は前記ＲＳＩの内部（例えば、ｍＲＮＡのイントロン内）に位置する、請求項１又は２に記載のＲＮＡ配列。
- 一つより多い（例えば、１、２、３、又はそれ以上の）同じ又は異なるＲＰＳを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- 前記一つより多いＲＰＳのうちの二つ又はそれ以上（例えば、３つ）は、同じ又は異なるリンカーを介して互いに隣接するか又は直列連結される、請求項４に記載のＲＮＡ配列。
- 互いに隣接しない（例えば、前記関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）の一つの末端又はその近傍にそれぞれ位置する）二つ又はそれ以上のＲＰＳを含む、請求項４又は５に記載のＲＮＡ配列。
- 前記ＲＰＳは、転写された修飾後のＡＡＶ末端逆位反復（ＩＴＲ）を含み、ここで、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、
（ａ）転写された機能性Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含み、任意選択的に、転写された機能性ＲＢＥ’をさらに含み、
（ｂ）転写された末端解離部位（ＴＲＳ）もしくは転写された逆相補的ＴＲＳ（ｒｃＴＲＳ）、又はその両方を欠いており、
任意選択的に、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写されたＤ領域配列（Ｄ配列又はＤ’配列）をさらに含み、及び／又は
任意選択的に、前記ＲＰＳ相互作用分子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０である、請求項２～６のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。 - 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記ＲＮＡの３’末端の１０００個のヌクレオチド、８００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、又は２００個のヌクレオチド内にあり、任意選択的に、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ポリＡ配列、ポリＡシグナル配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）、又はＲＮＡ転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）の５’にある、請求項７に記載のＲＮＡ配列。
- 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、転写された野生型Ｆｌｉｐ又はＦｌｏｐ ＩＴＲに基づいて修飾され、任意選択的に、前記野生型Ｆｌｉｐ又はＦｌｏｐ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３からのものである（任意選択的に、前記野生型Ｆｌｏｐ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のヌクレオチド配列を有する）、請求項７又は８に記載のＲＮＡ配列。
- 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記転写されたＴＲＳと前記転写されたｒｃＴＲＳの両方を欠いている、請求項７～９のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記転写されたＤ領域配列を含む（任意選択的に、前記修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のヌクレオチド配列を有する）、請求項７～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記転写されたＤ領域配列を欠いている（任意選択的に、前記修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のヌクレオチド配列を有する）、請求項７～１０のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- 第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲをさらに含み、前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、第２の転写された機能性ＲＢＥ配列を有するが、第２の転写されたＴＲＳもしくは第２の転写されたｒｃＴＲＳ又はその両方を欠いており、任意選択的に、前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、第２の転写されたＤ領域配列をさらに含む、請求項７～１２のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲと前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは同じである（又は異なる）、請求項１３に記載のＲＮＡ配列。
- 前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲと前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ（存在すれば）は、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける欠失、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける突然変異、又は対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ Ｄ領域配列もしくは対応する転写された野生型ＴＲＳ／ｒｃＴＲＳにおける挿入を含む、請求項７～１４のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- 前記第２の転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲは、前記ＲＮＡ配列の５’末端の１０００個のヌクレオチド、８００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチド、２５０個のヌクレオチド、又は１５０個のヌクレオチド内にある、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- 前記ＲＰＳは、ＭＳ２配列、ＰＰ７結合部位、又はｃｏｍ結合部位を含み、且つ前記ＲＰＳ相互作用分子は、ＭＳ２配列にとってのファージ由来のＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７結合部位にとってのＰＰ７ファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、又はｃｏｍ結合部位にとってのファージＣＯＭタンパク質（ＣＯＭ）のような、前記ＲＰＳと直接又は間接的に相互作用、例えば、結合することができるＲＰＳ相互作用タンパク質（ＲＰＳＩＰ）を含む、請求項２～６のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- 前記ＲＰＳＩＰは、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のウイルスパッケージングシステムのタンパク質成分（例えば、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）のＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８、又はアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ））に直接又は間接的に関連する（例えば、それらに融合する）、請求項１７に記載のＲＮＡ配列。
- 前記ＲＮＡ配列は、転写されたＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むか又は好ましく含まない（例えば、前記ＲＮＡ配列は、前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のＤＮＡパッケージング能力を低下させるように、対応する転写された野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列のヌクレオチドの付加、欠失、及び／又は置換を有する、転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む）、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- （１）転写された転写エンハンサー、
（２）転写されたイントロン配列又はエクソン配列（例えば、タンパク質発現を増強するための転写されたイントロン配列又はエクソン配列）、
（３）５’ ＵＴＲ配列、
（４）３’ ＵＴＲ配列、
（５）ポリＡ配列、又はポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、及び任意選択的に前記ポリＡシグナル配列下流のＧＵリッチ領域、
（６）転写後調節エレメント又は配列、例えば、転写されたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、及び／又は、
（７）転写終結配列（例えば、ヒストン下流エレメント）をさらに含み、
任意選択的に、前記ＲＮＡ配列は、前記転写後調節エレメント又は配列の３’及び前記ポリＡ配列又はポリＡシグナル配列の５’に位置するＲＰＳを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。 - ５’から３’への方向に、前記ＲＳＩ、前記任意選択的な転写されたＷＰＲＥ配列と、前記ＲＰＳ（例えば、前記転写された修飾後のＡＡＶ ＩＴＲ、前記ＭＳ２配列、前記ＰＰ７結合部位、又は前記ｃｏｍ結合部位）と、前記ポリＡ配列又は前記ポリＡシグナル配列とを含む、請求項２０に記載のＲＮＡ配列。
- 前記ＧＯＩは、タンパク質（例えば、蛍光タンパク質、治療用タンパク質、抗原タンパク質、又は遺伝子編集タンパク質、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＺＦＮタンパク質、ＴＡＬＥＮタンパク質）、酵素（例えば、Ｃｒｅタンパク質又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素、例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、又はその変異体）、構造タンパク質、ｍＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はその前駆体（前駆体ｍｉＲＮＡと一次ｍｉＲＮＡとを含む）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、アンチセンス配列又はオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ガイドＲＮＡ（又はｇＲＮＡ）、例えばシングルガイドＲＮＡ（又はｓｇＲＮＡ、キメラＲＮＡ、ＲＮＡキメラ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｃｒ ＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクター酵素用のガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、Ｘｉｓｔ、及びＨＯＴＡＩＲとを含むＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＲＮＡ成分を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- 長さが約８，９００個のヌクレオチドより小さく、長さが約８，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約７，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約６，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約５，２００個のヌクレオチドより小さく、長さが約４，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約３，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約２，０００個のヌクレオチドより小さく、長さが約４，７００～５，２００個のヌクレオチドであり、長さが約４，７００～５，０００個のヌクレオチドであり、長さが約４，７００～４，８００個のヌクレオチドであり、又は長さが約４，７００個のヌクレオチドである一本鎖ＲＮＡである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列。
- ポリヌクレオチドであって、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列をコードするカセットを含み、任意選択的に、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列（例えば、ＤＮＡプラスミド）であり、前記ＤＮＡ配列は、任意選択的に、前記ＤＮＡプラスミドの骨格にスタッファー配列が含まれており、及び／又は任意選択的に、機能性ＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲが含まれていない、ポリヌクレオチド。
- 前記カセットによりコードされた前記ＲＮＡ配列に操作可能に連結され、その転写を駆動するプロモーターをさらに含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターは遍在性プロモーターである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターは、組織特異的プロモーターである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターは、構成型プロモーターである、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターは、誘導型プロモーターである、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターにより駆動される前記ＲＮＡ配列の転写を増強するエンハンサーをさらに含む、請求項２５～２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子であって、ＤＮＡウイルス（例えば、ＡＡＶウイルス、又は腫瘍溶解性ウイルス）のタンパク質シェル（例えば、カプシド）内にパッケージングされるＲＮＡゲノム（例えば、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ配列）を含む、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子。
- 前記ＤＮＡウイルスはＡＡＶであり、且つ前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子は組換えＲＮＡアデノ随伴ウイルス（ｒＲＡＡＶ）粒子であり、前記組換えＲＮＡアデノ随伴ウイルス粒子は、
（１）ＡＡＶカプシドと、
（２）前記ＡＡＶカプシド内にパッケージングされる、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ配列とを含む、請求項３１に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子。 - 前記ＡＡＶカプシドは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ ＰＨＰ．ｅＢ、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ６５ＡＡＰ、ＡＡＶｒｈ７４、又は７ｍ８のＡＡＶからのカプシドを含む、請求項３２に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子。
- 複数の請求項３１～３３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）を含む組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団であって、前記集団内の前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）のうちの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上は、それにパッケージングされる、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ配列を有する、組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団。
- 請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列、請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ配列、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、及び／又は請求項３４に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を含む、宿主細胞。
- 請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進するウイルスパッケージングシステムをさらに含む、請求項３５に記載の宿主細胞。
- 前記ウイルスパッケージングシステムは、
（１）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０のコード配列）及びＡＡＶ ｃａｐ遺伝子（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＡＡＰ、及び／又はＭＡＡＰのコード配列）又はそれらの発現生成物であって、前記ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子の転写を駆動する一つ又は複数プロモーターの転写制御下にあるものと、
（２）ＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の一つ又は複数のコード配列、例えば、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子、又は前記一つ又は複数のタンパク質と、
（３）前記ＲＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、
任意選択的に、前記ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の前記一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのサイズを拡大する、請求項３６に記載の宿主細胞。 - 哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞）である、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 請求項３１～３３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）又は請求項３４に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を生成する方法であって、前記方法は、
ａ）請求項３５～３８のいずれか一項に記載の宿主細胞を十分な時間培養することと、
ｂ）前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫することとを含む、方法。 - 前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を単離又は精製することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
- 組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を生成する方法であって、前記方法は、
ａ）ウイルスパッケージングシステム（例えば、ＡＡＶパッケージングシステム）を、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ配列と、前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を産生するのに十分な時間接触させ、
ｂ）前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は前記組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を収穫し、任意選択的に、
ｃ）収穫された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子又は組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子の集団を単離又は精製することを含む、方法。 - 前記ウイルスパッケージングシステム（例えば、ＡＡＶパッケージングシステム）は、
（１）前記ＲＮＡ配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、
（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は前記ＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、
（３）前記ＲＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、
任意選択的に、前記ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのサイズを拡大する、請求項４１に記載の方法。 - 請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドから転写されるＲＮＡ配列をＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングするシステムであって、前記システムは、
（１）前記ＲＮＡ配列をパッケージングするための前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルをアセンブルするための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶカプシドをアセンブルするためのＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）、又はその一つ又は複数のコード配列と、
（２）前記タンパク質シェルのアセンブル及び／又は前記ＲＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子のタンパク質シェルへのパッケージングを促進するための一つ又は複数のタンパク質（例えば、ＡＡＶパッケージングのためのＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及び／又はＲｅｐ４０）、又はその一つ又は複数のコード配列（例えば、アデノウイルスＥ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ遺伝子）と、
（３）前記ＲＰＳ相互作用分子又はそのコード配列とを含み、
任意選択的に、前記ウイルスパッケージングシステムがＤＮＡ配列を前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子にパッケージングする能力は、例えば、以下のことによって減少され、減弱され、又は実質的に除去され、（１）請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにおけるＤＮＡパッケージングシグナル、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲの一部又は全部を除去し、（２）前記ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、前記ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、及び／又はＡＡＶパッケージングに必要な一つ又は複数のタンパク質の一つ又は複数のコード配列を修飾し、例えば、突然変異させて、該当する翻訳されたタンパク質が前記ＤＮＡ配列の前記ＤＮＡウイルスのウイルス粒子へのパッケージングを促進する能力を減少し、減弱し、又は実質的に除去し（例えば、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８タンパク質のコンセンサス配列におけるＹ１５６Ｆ突然変異、ＫＤＥ－ｍｕ、又はＥＫＥ－ｍｕ）、及び／又は（３）請求項１～２３のいずれか一項に記載のＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド又は請求項２４～３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのサイズを拡大する、システム。 - 関心のある遺伝子（ＧＯＩ）を細胞、植物、又は動物に送達する方法であって、前記方法は、前記細胞、前記植物、又は前記動物を請求項３１～３３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、請求項３４に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団、又は請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団と接触させることを含み、ここで、前記ＧＯＩは、前記（請求項１～２３のいずれか一項に記載の）ＲＮＡ配列によりコードされる、方法。
- 関心のあるＲＮＡ配列（ＲＳＩ）を細胞、植物、又は動物に送達する方法であって、前記方法は、前記細胞、前記植物、又は前記動物を請求項３１～３３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、請求項３４に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団、又は請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団と接触させることを含む、方法。
- それを必要とする被験体における疾患又は障害を診断、予防、又は治療する方法であって、前記方法は、治療有効量又は投与量の請求項３４に記載の又は請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団を前記被験体に投与することを含む、方法。
- 請求項３１～３３のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）、請求項３４に記載の組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団、又は請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法によって産生された組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）もしくは組換えＤＮＡウイルスのウイルス粒子（例えば、ｒＲＡＡＶ粒子）の集団の、それを必要とする被験体の疾患又は障害を診断、予防、又は治療するための薬物の製造における用途。
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