JP2024508119A - Ｒｎａｉコンジュゲートおよびその使用 - Google Patents

Ｒｎａｉコンジュゲートおよびその使用 Download PDF

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Abstract

本明細書に開示される主題は、患者において原因となっている腫瘍の有益な治療、寛解、または除去に影響を与えるために、癌の増殖および転移を支持する主要な細胞集団に影響を及ぼすことを対象とするｓｉＲＮＡ組成物および方法を使用して、遺伝子発現を調節することを対象とする。【選択図】図１A

Description

相互関連出願
本出願は、２０２１年３月５日に出願された米国仮特許出願第６３／１５７，４６５号、および２０２１年６月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２１４，１５３号の利益を主張する。それらの内容全体は、この参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、患者における癌の阻害、寛解、および／または制御に有用な、オリゴヌクレオチドまたは標的化部分に結合されたオリゴヌクレオチドに関する。特定の実施形態では、本開示は、対象におけるシグナル伝達兼転写活性化因子３（「ＳＴＡＴ３」）発現を阻害する、治療有効量の１個以上のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、または１個以上のＲＮＡｉ分子の投与を必要とする対象において投与する方法に関する。
癌の増殖および進行は、血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、シグナル伝達分子、および細胞外マトリックスを含む、腫瘍発生を制御する、それに影響を及ぼす、またはそれを増強する可能性がある構成要素を含有する、腫瘍微小環境（「ＴＭＥ」）を含む多くの因子によって影響を受ける（非特許文献１）。様々な腫瘍の既存の不均一性にもかかわらず、腫瘍の発生は、ＴＭＥの生理学的状態に大きく依存する。腫瘍は、様々な解剖学的位置および／または細胞集団に由来する可能性があるが、腫瘍自体は、腫瘍の治療プロトコルを導き出すために使用され得る多くの共通する特徴を有する。これは、上皮由来腫瘍のＴＭＥ成熟について特に当てはまる。腫瘍細胞の遺伝子変化は、過形成、制御不能な増殖、アポトーシスに対する抵抗性、および嫌気性解糖への代謝シフト（いわゆる「ワールブルグ効果」）をもたらす。これらの事象は、ＴＭＥ内に低酸素、酸化ストレス、およびアシドーシスを生じさせ、変化した細胞または癌細胞を包囲する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の調節、隣接する間質細胞（例えば、線維芽細胞）ならびに免疫細胞（リンパ球およびマクロファージ）からの応答を誘発し、血管新生を誘導し、最終的には、転移をもたらす。ＴＭＥプロファイル自体も、抗癌療法の有効性に直接的な影響を与える（非特許文献２）。
現在、化学療法は、腫瘍のタイプおよび病期に応じて、手術または手術および放射線療法と組み合わせることが多い、世界的に主要な癌療法である（非特許文献３）。発癌に寄与するいくつかの重要な変異の発見以来（例えば、表皮細胞の変化（非特許文献４）、これら変異およびそれらが表すタンパク質は、癌患者を治療するためのより選択的な薬剤および薬剤の組み合わせの開発の標的として広く使用されている。これらの薬剤の有効性にもかかわらず、多剤耐性（ＭＤＲ）が患者に見られることが多く、これは多くの場合、腫瘍再発、治療選択肢の制限、および患者の生活の質の低下をもたらす。さらに、癌研究は、腫瘍の進行、発生、およびＭＤＲにおいて重要な役割を果たすことが示されているＴＭＥならびにＴＭＥ内の「正常」細胞または非癌細胞の効果にもかかわらず、腫瘍細胞に焦点が当てられていることが多い（非特許文献５）。
固形腫瘍の発生の後期に、腫瘍微小環境は、高度に複雑かつ不均一である（非特許文献６）。癌細胞と、間質細胞および免疫系細胞を含む隣接細胞との間の相互作用（腫瘍位置での炎症によりしばしば現れる）は、ＴＭＥならびに細胞構成要素、細胞外マトリックス、および血管新生系におけるさらなる変化をもたらし、それらは全て、腫瘍の転移に寄与する（非特許文献７）。腫瘍増殖の間、癌細胞およびＴＭＥ構成成分は、環境条件に継続的に適合し、全体的な腫瘍増殖に影響を与える。したがって、腫瘍増殖に寄与するＴＭＥの異なる面を標的とする新規の療法が必要である。
Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（２０１９）１４４（５）：９３３－４６ Ｇｉｒａｌｄｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＲ．Ｊ．ＣＡＮＣＥＲ （２０１９）１２０：４５－５３ Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ／ＩｎｔｅｃｈＯｐｅｎ，２０１８ Ｙａｍａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，ＩＮＴ．Ｊ．ＭＯＬ．ＳＣＩ．（２０１７）１８（１１）：２４２０） Ｋｌｅｍｍ ｅｔ ａｌ．，ＴＲＥＮＤＳ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬ（２０１５）２５（４）：１９８－２１３ Ｒｕｎａ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲ ＭＯＬ ＢＩＯＬ ＲＥＰ（２０１７）３（４）：２１８－２９ Ｒｕｎａ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲ ＭＯＬ ＢＩＯＬ ＲＥＰ（２０１７）３（４）：２１８－２９
ＴＭＥは、腫瘍組織と相互作用する血管、免疫細胞、線維芽細胞、シグナル伝達分子、および細胞外マトリックスの複雑な系である。腫瘍進行は、癌細胞のそれらの環境との相互作用に影響され、これが、最終的に原発腫瘍が根絶されるか、転移するか、または休眠状態の微小転移を確立するかを決定する。ＴＭＥはまた、治療応答および薬剤または治療耐性にも影響を与え得る。癌細胞は、抗腫瘍免疫応答を衰弱させ、免疫抑制環境を作り出す。したがって、この免疫抑制環境を克服し、かつ／または抗癌治療剤に対して癌細胞を感作して、患者の転帰を改善することができる治療剤を開発する継続的な必要性が存在する。
本開示は、治療的介入のためのＴＭＥにおける免疫細胞を標的とするのに有用である、アダマンチルおよび脂質コンジュゲートを含むがこれに限定されない疎水性リガンドなどの標的化リガンドを含む、新規の核酸、オリゴヌクレオチド、またはそれらの類似体を提供する。本開示は、細胞（例えば、腫瘍微小環境中の免疫細胞）における標的遺伝子の発現を調節するように機能する核酸－リガンドコンジュゲートおよびオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、ならびにそれらの調製方法および使用に関する。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの高度に親水性の核酸／オリゴヌクレオチドへの脂肪酸およびアダマンチル基などの親油性／疎水性部分の付着は、血漿タンパク質結合を実質的に増強し、結果として循環半減期が増大する。本明細書で実証されるように、脂質などの疎水性部分の組み込みは、腫瘍微小環境中の免疫細胞集団への新規の核酸、オリゴヌクレオチド、またはそれらの類似体の全身送達を促進する。
好適な核酸－リガンドコンジュゲートおよびオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ｄｓＲＮＡ阻害剤分子、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンタゴミル（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、アプタマー、および一本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子などの核酸阻害剤分子を含む。いくつかの態様では、本開示は、細胞内ＲＮＡレベルの調節因子としての有用性を見出す核酸－脂質コンジュゲート、オリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲート、およびそれらの類似体を提供する。本開示の核酸阻害剤分子は、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるなど、多様な一連の機構を介してＲＮＡ発現を調節する。本明細書で提供される核酸－リガンドコンジュゲート、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、およびそれらの類似体の利点は、細胞内ＲＮＡレベルの調節と一致する広範な薬理活性が可能であることである。加えて、本開示は、細胞内ＲＮＡレベルを調節することによって疾患状態の治療または改善のために、本明細書に記載のコンジュゲートの有効量を使用する方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して、腫瘍微小環境中の免疫細胞における標的遺伝子発現を調節する１つ以上の核酸－リガンドコンジュゲート単位を含む、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートに関する。いくつかの態様では、本開示は、腫瘍微小環境中の免疫細胞における標的遺伝子発現を調節する（例えば、低減または阻害する）脂質部分を含むがこれに限定されない、１個以上の疎水性部分リガンドを含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、前述のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの組成物、ならびにそれらの調製方法および使用に関する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、免疫抑制の調節因子をコードする遺伝子を標的とし、その結果、調節因子の発現の低減または阻害が、免疫抑制腫瘍微小環境を克服する。いくつかの実施形態では、調節因子の発現の低減または阻害は、抗腫瘍免疫応答を誘導または増強する。
本開示は、少なくとも部分的に、腫瘍微小環境内に存在する免疫細胞における標的遺伝子発現を効果的に低減するオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの発見に基づいている。理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載されるように、疎水性部分（例えば、脂質）は、腫瘍微小環境の脂質輸送受容体を発現するものなどの免疫細胞へのＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートの送達および分布を促進し、それによって、遺伝子ノックダウンの有効性および耐久性を高める。したがって、本開示は、本明細書に記載されるように、本開示のオリゴヌクレオチドリガンドコンジュゲート、およびその薬学的に許容可能な組成物を投与することによって、腫瘍微小環境内の免疫細胞における、例えば、免疫抑制の調節因子をコードする遺伝子の標的遺伝子発現を調節することによって、癌を治療し、かつ／または腫瘍増殖を低減する方法を提供する。本開示はさらに、腫瘍微小環境中の免疫細胞における標的遺伝子発現を調節することによって、癌を治療し、かつ／または腫瘍増殖を低減するための医薬品の製造において、オリゴヌクレオチドリガンドコンジュゲートを使用する方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、癌の治療、改善、もしくは予防、および／または癌の転移の予防を必要とする対象においてそれを行う予防する方法を提供する。本開示はさらに、癌および／または免疫抑制腫瘍微小環境に関連する主要な遺伝子の発現を制限、制御、または排除することができるＲＮＡｉオリゴヌクレオチド分子を提供する。そのようなＲＮＡｉオリゴヌクレオチド分子は、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を標的とする様々な二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、方法は、対象におけるＳＴＡＴ３の発現または活性を阻害する治療有効量の組成物を対象に投与することを含む。そのようなＲＮＡｉオリゴヌクレオチド分子は、癌および関連する病理を有する対象を治療するために使用され、それによって、癌、肉腫、黒色腫、リンパ腫、および白血病、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、および膠芽腫を患う対象に治療的に利益をもたらし得る。
ＳＴＡＴ３は、重要な転写因子であり、これは次いで、発癌の維持および抗癌剤に対する化学療法抵抗性に不可欠である。ＳＴＡＴ３は細胞質に見られ、サイトカインからの刺激に応答して活性化される。活性化ＳＴＡＴ３は、細胞生存および増殖を制御する遺伝子の転写を調節し、抗アポトーシス遺伝子および免疫応答遺伝子の発現を調節する。ＳＴＡＴ３の構成的活性化は、異なる癌の増殖および生存に必要である（Ｇｒｏｎｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９（４）：３４１－５０（２００８））。ＳＴＡＴ－３の活性化は、癌細胞の生存に利点をもたらす。ＮＦ－κＢと同様に、異なる癌のタイプにおけるＳＴＡＴ－３の阻害は、細胞のアポトーシスおよび化学感作を誘導することが実証されている（ｄａ Ｈｏｒａ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓｃｏｖ，Ｖｏｌ．５（７２）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４２０－０１９－０１５５－９（２０１９））。ヒトＳＴＡＴ３（ＮＭ＿００１３６９５１２．１）のｍＲＮＡ配列は、配列番号８５または配列番号 １２１７（ＮＭ＿１３９２７６．３）に記載されている。
したがって、一態様では、本開示は、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞における標的ｍＲＮＡの発現を低減するヌクレオチド配列と、１個以上の標的化リガンドとを含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供し、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされたヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオシドは、式Ｉ－ａ：
またはその薬学的に許容可能な塩（式中、各変数は、本明細書に定義および記載されるとおりである）によって表される。
別の態様では、本開示は、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞における標的ｍＲＮＡの発現を低減するヌクレオチド配列と、１個以上の標的化リガンドとを含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供し、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされたヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオシドは、式ＩＩ－ａ：
またはその薬学的に許容可能な塩（式中、各変数は、本明細書に定義および記載されるとおりである）によって表される。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、式ＩＩ－ｂ、ＩＩ－ｃ、ＩＩ－Ｉｂ、もしくはＩＩ－Ｉｃ：
またはその薬学的に許容可能な塩によって表される。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、Ｒ５は、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖のＣ１－Ｃ５０炭化水素鎖である。いくつかの態様では、Ｒ５は、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖のＣ８－Ｃ３０炭化水素鎖である。いくつかの態様では、Ｒ５は、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖のＣ１６炭化水素鎖である。いくつかの態様では、Ｒ５は、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖のＣ１８炭化水素鎖である。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、１５～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖および１５～４０個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞において発現される標的配列に対する相補性の領域を含み、センス鎖は、その３’末端に、４個のヌクレオシドを含むテトラループを含むステム－ループを含み、標的化リガンドとコンジュゲートされた４個のヌクレオシドのうちの１個以上は、式ＩＩ－Ｉｂ：
、
（式中、Ｂは、アデニンおよびグアニン核酸塩基から選択され、Ｒ５は、炭化水素鎖である）によって表される。いくつかの態様では、テトラループの４個のヌクレオシドは、５’から３’に１～４の番号が付けられ、１位は、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。他の態様では、２位は、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。さらに他の態様では、３位は、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。さらなる態様では、４位は、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、標的ｍＲＮＡは、免疫抑制の調節因子をコードする。いくつかの態様では、免疫抑制の調節因子は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドである。いくつかの態様では、免疫抑制の調節因子は、転写因子である。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞は、骨髄細胞である。いくつかの態様では、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、腫瘍微小環境に関連する２個以上の免疫細胞における標的ｍＲＮＡの発現を低減する。いくつかの態様では、免疫細胞は、骨髄細胞またはＴ細胞である。いくつかの態様では、骨髄細胞は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様では、ＭＤＳＣは、顆粒球ＭＤＳＣ（Ｇ－ＭＤＳＣ）または単球ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、Ｇ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡの発現を低減する。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞である。
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞における標的ｍＲＮＡに対する相補性の領域を含む。
別の態様では、本開示は、ＳＴＡＴ３の発現を阻害することができるＲＮＡｉオリゴヌクレオチド分子を提供する。そのような分子は、単独で、または第２の治療剤と組み合わされ使用され得、用量が変化し得る。いくつかの実施形態では、そのようなＲＮＡｉオリゴヌクレオチド分子は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖から成る。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、１５～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖および１５～４０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は、配列番号８５または配列番号１２１７に記載されるＳＴＡＴ３の標的ｍＲＮＡ配列に対する相補性の領域を有し、相補性の領域は、標的配列と３個を超えないヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、相補性の領域は、ＳＴＡＴ３の標的配列に対して完全に相補的である。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８９～２８０から選択される標的配列に対する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さの相補性の領域を含む。いくつかの態様では、相補性の領域は、配列番号８９～２８０から選択される。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、アンチセンス鎖が、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、相補性の領域が、配列番号８９～２８０から選択される、アンチセンス鎖、および
（ｉｉ）アンチセンス鎖に対する相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖、を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称性二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。
いくつかの態様では、センス鎖は、配列番号９、３７、６５、または６９のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個を超えないヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号１０、３８、６６、または７０のヌクレオチド配列と３個を超えないヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９および１０、
（ｂ）それぞれ、配列番号３７および３８、
（ｃ）それぞれ、配列番号６５および６６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号６９または７０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８５７～９４６から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９４７～１０３６から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８６１および９５１、
（ｂ）それぞれ、配列番号８５７および９４７、
（ｃ）それぞれ、配列番号８５８および９４８、
（ｄ）それぞれ、配列番号８５９および９４９、
（ｅ）それぞれ、配列番号８６０および９５０、
（ｆ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｇ）それぞれ、配列番号８６３および９５３、
（ｈ）それぞれ、配列番号８６４および９５４、
（ｉ）それぞれ、配列番号８６５および９５５、
（ｊ）それぞれ、配列番号８６６および９５６、
（ｋ）それぞれ、配列番号８６７および９５７、
（ｌ）それぞれ、配列番号８６８および９５８、
（ｍ）それぞれ、配列番号８６９および９５９、
（ｎ）それぞれ、配列番号８７０および９６０、
（ｏ）それぞれ、配列番号８７１および９６１、
（ｐ）それぞれ、配列番号８７２および９６２、
（ｑ）それぞれ、配列番号８７３および９６３、
（ｒ）それぞれ、配列番号８７４および９６４、
（ｓ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、
（ｔ）それぞれ、配列番号８７６および９６６、
（ｕ）それぞれ、配列番号８７７および９６７、
（ｖ）それぞれ、配列番号８７８および９６８、
（ｗ）それぞれ、配列番号８７９および９６９、
（ｘ）それぞれ、配列番号８８０および９７０、
（ｙ）それぞれ、配列番号８８１および９７１、
（ｚ）それぞれ、配列番号８８２および９７２、
（ａａ）それぞれ、配列番号８８３および９７３、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号８８４および９７４、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号８８５および９７５、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号８８６および９７６、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号８８７および９７７、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号８８８および９７８、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｈｈ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、ならびに
（ｉｉ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号９５２のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号９６５のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号９６６のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号９６６のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、アンチセンス鎖は、１９～２７個のヌクレオチドの長さ、または２１～２７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドの長さである。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、センス鎖は、１９～４０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖は、３６個のヌクレオチドの長さである。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を有する。前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２１個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を有する。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、２０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３に対する相補性の領域は、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３に対する相補性の領域は、少なくとも２１個の連続するヌクレオチドの長さである。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上、その３’末端に、Ｓ１－ループ－Ｓ２として記載されるステム－ループを含み、Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、ループは、Ｓ１とＳ２との間に３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する。
いくつかの実施形態では、癌の治療もしくは予防、および／または癌の転移の予防のための、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、２１～２７個のヌクレオチドの長さであり、配列番号８５または配列番号１２１７に記載されるＳＴＡＴ３の標的ｍＲＮＡ配列に対する相補性の領域を有し、センス鎖は、その３’末端に、Ｓ１－ループ－Ｓ２として記載されるステム－ループを含み、Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、ループは、Ｓ１とＳ２との間に３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成し、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さの二本鎖構造を形成する。
いくつかの実施形態では、ループは、テトラループである。いくつかの実施形態では、ループは、４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループは、配列ＧＡＡＡを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２７個のヌクレオチドの長さであるアンチセンス鎖、および２５個のヌクレオチドの長さであるセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドの長さであるアンチセンス鎖、および３６個のヌクレオチドの長さであるセンス鎖を含む。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示のオリゴヌクレオチドの二本鎖領域は、アンチセンス鎖上に３’オーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖上の３’オーバーハング配列は、２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’－オーバーハング配列は、ＧＧである。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、各々が２１～２３個のヌクレオチドの長さの範囲であるアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１９～２１個のヌクレオチドの長さの範囲の二本鎖構造を含む。いくつかのそのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個以上のヌクレオチドの長さの３’オーバーハング配列を含み、３’オーバーハング配列は、アンチセンス鎖、センス鎖、またはアンチセンス鎖およびセンス鎖上に存在する。いくつかの実施形態では、３’オーバーハング配列が、アンチセンス鎖上にあり、センス鎖が、２１個のヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖が、２３個のヌクレオチドの長さであり、センス鎖およびアンチセンス鎖が、２１個のヌクレオチドの長さの二本鎖を形成する、２個のヌクレオチドの長さの３’オーバーハング配列。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、例えば２’－修飾で修飾されている。いくつかの実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの約１０～１５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、５’から３’に１～３６位を有する３６個のヌクレオチドを含み、８～１１位は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、５’から３’に１～２２位を有する２２個のヌクレオチドを含み、２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位は、２’－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、残りのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合、好ましくは、ホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素は、リン酸類似体、例えば、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、または脂質などの１個以上の標的化リガンドにコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、飽和脂肪酸部分である。いくつかの実施形態では、飽和脂肪酸部分は、Ｃ１０からＣ２４まで長さが異なる。いくつかの実施形態では、飽和脂肪酸部分は、Ｃ１６の長さを有する。いくつかの実施形態では、飽和脂肪酸部分は、Ｃ１８の長さを有する。いくつかの実施形態では、飽和脂肪酸部分は、Ｃ２２の長さを有する。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。いくつかの実施形態では、（ＧａｌＮＡｃ）部分は、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、または四価ＧａｌＮＡｃ部分を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１０４１および１１３１、
（ｂ）それぞれ、配列番号１０３７および１１２７、
（ｃ）それぞれ、配列番号１０３８および１１２８、
（ｄ）それぞれ、配列番号１０３９および１１２９、
（ｅ）それぞれ、配列番号１０４０および１１３０、
（ｆ）それぞれ、配列番号１０４２および１１３２、
（ｇ）それぞれ、配列番号１０４３および１１３３、
（ｈ）それぞれ、配列番号１０４４および１１３４、
（ｉ）それぞれ、配列番号１０４５および１１３５、
（ｊ）それぞれ、配列番号１０４６および１１３６、
（ｋ）それぞれ、配列番号１０４７および１１３７、
（ｌ）それぞれ、配列番号１０４８および１１３８、
（ｍ）それぞれ、配列番号１０４９および１１３９、
（ｎ）それぞれ、配列番号１０５０および１１４０、
（ｏ）それぞれ、配列番号１０５１および１１４１、
（ｐ）それぞれ、配列番号１０５２および１１４２、
（ｑ）それぞれ、配列番号１０５３および１１４３、
（ｒ）それぞれ、配列番号１０５４および１１４４、
（ｓ）それぞれ、配列番号１０５５および１１４５、
（ｔ）それぞれ、配列番号１０５６および１１４６、
（ｕ）それぞれ、配列番号１０５７および１１４７、
（ｖ）それぞれ、配列番号１０５８および１１４８、
（ｗ）それぞれ、配列番号１０５９および１１４９、
（ｘ）それぞれ、配列番号１０６０および１１５０、
（ｙ）それぞれ、配列番号１０６１および１１５１、
（ｚ）それぞれ、配列番号１０６２および１１５２、
（ａａ）それぞれ、配列番号１０６３および１１５３、
（ｂｂ）それぞれ、配列番号１０６４および１１５４、
（ｃｃ）それぞれ、配列番号１０６５および１１５５、
（ｄｄ）それぞれ、配列番号１０６６および１１５６、
（ｅｅ）それぞれ、配列番号１０６７および１１５７、
（ｆｆ）それぞれ、配列番号１０６８および１１５８、
（ｇｇ）それぞれ、配列番号１１２０および１２１０、
（ｈｈ）それぞれ、配列番号１０７６および１１６６、ならびに
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１１００および１１９０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１０８１および１１７１、
（ｂ）それぞれ、配列番号１０９０および１１８０、
（ｃ）それぞれ、配列番号１０７９および１１６９、
（ｄ）それぞれ、配列番号１０７６および１１６６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１０７２および１１６２、
（ｆ）それぞれ、配列番号１０７０および１１６０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号１０６９および１１５９から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１１２０および１２１０、
（ｂ）それぞれ、配列番号１１１７および１２０７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号１１１９および１２０９から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１０９５および１１８５、
（ｂ）それぞれ、配列番号１１０４および１１９４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１０９３および１１８３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１１００および１１９０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０４２のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号１１３２のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０５５のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号１１４５のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０５６のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号１１４６のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの態様では、ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１１００のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号１１９０のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、ステムループのループの１個以上のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ステム－ループのループの最大４個のヌクレオチドは、各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本開示の開示は、１個以上のオリゴヌクレオチド、および薬学的に許容可能な担体、送達剤、または賦形剤を含む、医薬組成物である。
いくつかの態様では、本開示のオリゴヌクレオチドは、癌を治療するためのキットの形態で提供される。さらなる態様では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を治療するためのキットの形態で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、および薬学的に許容可能な担体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、癌を有する対象へのオリゴヌクレオチドの投与のための指示を含む添付文書をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象へのオリゴヌクレオチドの投与のための指示を含む添付文書をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、オリゴヌクレオチドを対象に送達する方法であって、医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞にオリゴヌクレオチドを送達する方法であって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍関連細胞に送達される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、免疫細胞に送達される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、骨髄系由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３を標的とする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３を標的とし、ｓｉＲＮＡはまた、ＰＤ－ＬＩ ｍＲＮＡ発現を調節する。
いくつかの態様では、本開示は、本開示のオリゴヌクレオチドを投与することによって、対象における腫瘍微小環境に関連する細胞、細胞集団における標的ｍＲＮＡの発現を低減する方法を提供する。別の態様では、本開示は、本開示のオリゴヌクレオチドを投与することによって、細胞、細胞集団、または対象におけるＳＴＡＴ３発現を低減する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、または対象におけるＳＴＡＴ３発現を低減する方法は、有効量の本明細書に記載のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはその医薬組成物を細胞もしくは細胞集団と接触させる工程、または対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３発現を低減する方法は、ＳＴＡＴ３およびＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡの量もしくはレベル、ＳＴＡＴ３およびＰＤ－Ｌ１タンパク質の量もしくはレベル、または両方を低減することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、治療剤として使用するための医薬品を提供する。いくつかの実施形態では、治療剤は、単剤療法として投与され、ＳＴＡＴ３発現の阻害剤である。
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ１または抗ＰＤ－Ｌ１療法に対して抵抗性であるヒト対象を治療する方法であって、本明細書に記載のＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個を投与することを含む、方法が提供される。抗ＰＤ１または抗ＰＤ－Ｌ１に対して抵抗性である対象は、抗ＰＤ１または抗ＰＤ－Ｌ１療法からの有益性が、３ヶ月超にわたって非抵抗性対照と比較して、少なくとも１の標準偏差で減少したままであった対象を含む。
いくつかの実施形態では、治療剤は、単剤療法として投与され、ＳＴＡＴ３およびＰＤ－Ｌ１発現の阻害剤である。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも第１のおよび第２の治療剤を含む医薬品を提供し、第１の治療剤は、ＳＴＡＴ３の阻害剤である。いくつかの実施形態では、治療剤は、第２の治療剤の投与の前に、またはそれと断続的に投与される。いくつかの実施形態では、第１の治療剤は、第２の治療剤と並行して、または同時に投与される。いくつかの実施形態では、本開示は、３個以上の治療剤を含む医薬品を提供し、第１の治療剤は、ＳＴＡＴ３の阻害剤である。
いくつかの態様では、本開示は、対象における癌を治療する方法であって、１個以上の追加の治療剤または手順と組み合わせて、本開示によって提供される、免疫抑制の調節因子を標的とする有効量の本明細書に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象における癌を治療する方法であって、１個以上の追加の治療剤または処置と組み合わせて、本開示によって提供される、ＳＴＡＴ３を標的とする有効量のオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様では、第２の治療剤または処置は、化学療法、標的化抗癌療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科処置、放射線処置、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、ワクチン、もしくは細胞免疫療法、遺伝子療法、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の本明細書に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを対象に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、第２の組成物または治療剤と組み合わされ投与される。いくつかの実施形態では、第２の組成物または治療剤は、ＴＧＦＢ、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＡＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＳＯＣＳ１、またはＰＤ－Ｌ１を標的とする。
いくつかの実施形態では、１個以上の追加の治療剤は、ＰＤ－１拮抗薬、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＧＦＢ阻害剤、ＣＸＣＲ２阻害剤、ＣＣＲ２拮抗薬、ＡＲＧ１阻害剤、ＰＴＧＳ２阻害剤、ＳＯＣＳ１調節因子、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、１個以上の追加の治療剤は、ＰＤ－１拮抗薬である。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１拮抗薬は、ＰＤＲ００１、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＲＥＧＮ２８１０、ＴＳＲ－０４２、ＰＦ－０６８０１５９１、およびＡＭＰ－２２４から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１拮抗薬は、ＦＡＺ０５３、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびＢＭＳ－９３６５５９から成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、１個以上の追加の治療剤は、ＣＴＬＡ－４阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはトレメリムマブである。
いくつかの実施形態では、１個以上の追加の治療剤は、ＴＧＦＢ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＧＦＢ阻害剤は、フリソリムマブ、ＬＹ３０２２８５９、またはＰＦ－０３４４６９６２である。
いくつかの実施形態では、１個以上の追加の治療剤は、ＡＲＧ１阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＡＲＧ１阻害剤は、ＣＢ－１１５８である。
図１Ａは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを生成するために、塩基分子にコンジュゲートされたＧａｌＮＡｃ（上）または脂質（下）での化学修飾を有する、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド分子の構造を提供する。 図１Ｂは、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド分子へのコンジュゲーションに適した脂質テールの構造を提供する。 図２Ａは、異なるアシル鎖長および不飽和を有する１０ｍｇ／ｋｇのＡＬＤＨ２ ＲＮＡｉ －ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートを用いた処置の３日後のマウスからの、ヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片上皮において残存するヒトＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡレベルを表すグラフである。 図２Ｂは、ヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片から単離された腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中に残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡレベルを表すグラフである。異なるアシル鎖長および不飽和を有する１０ｍｇ／ｋｇのＡＬＤＨ２－ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートを用いた処置の３日後、マウスからＴＭＥを単離した。 図３Ａは、ヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片上皮における様々な用量のＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２コンジュゲートを用いた処置後の、残存するヒトＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡを示すグラフである。処置後３、７、および１４日目にマウスから試料を採取した。 図３Ｂは、ヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍から採取した腫瘍微小環境中の宿主マウス組織における様々な用量のＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２コンジュゲートを用いた処置後の、残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡを示すグラフである。処置後３、７、および１４日目に試料を採取した。 図４Ａおよび４Ｂは、ヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片担持マウスの腫瘍排出リンパ節（図４Ａ）および腫瘍のないマウスのリンパ節（図４Ｂ）における２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２コンジュゲートを用いた処置後の、残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡを示すグラフである。 図４Ａおよび４Ｂは、ヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片担持マウスの腫瘍排出リンパ節（図４Ａ）および腫瘍のないマウスのリンパ節（図４Ｂ）における２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２コンジュゲートを用いた処置後の、残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡを示すグラフである。 図５Ａは、ヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片における、経時的に非ＴｄＬＮと比較した、マウス腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）におけるＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２コンジュゲートまたはＰＢＳを用いた処置後の、残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。正規化されたｍＲＮＡは、ＰＢＳ処置マウスと比較したものである。 図５Ｂは、ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２で処置したＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片マウスからの非ＴｄＬＮと比較した、マウス腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）におけるＰｄｌ１ ｍＲＮＡレベルを示すグラフを提供する。 図６は、２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２で処置したヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片からの、単離された腫瘍関連ＣＤ１１ｂ＋骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）および正常な脾臓骨髄細胞におけるＡｒｇ１の発現を示すグラフである。処置の３日後、ＭＤＳＣおよび腫瘍細胞をマウスから単離し、ＣＤｌｌｂ ｍＲＮＡを使用して測定した。ＢＬＯＱ＝定量下限未満。 図７Ａおよび７Ｂは、ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２コンジュゲートで処置されたヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片を有するマウスからの、単離されたＣＤｌｌｂ＋ ＭＤＳＣ（図７Ａ）および腫瘍細胞（図７Ｂ）中の残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 図７Ａおよび７Ｂは、ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２コンジュゲートで処置されたヒトＬＳ４１１Ｎ腫瘍異種移植片を有するマウスからの、単離されたＣＤｌｌｂ＋ ＭＤＳＣ（図７Ａ）および腫瘍細胞（図７Ｂ）中の残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 図８Ａおよび８Ｂは、Ｐａｎ０２異種移植片のバルク腫瘍（図８Ａ）および肝臓（図８Ｂ）からの、残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡを示すグラフである。マウスを２５ｍｇ／ｋｇの指定されたＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲートで処置し、３日目にｍＲＮＡを測定した。 図８Ａおよび８Ｂは、Ｐａｎ０２異種移植片のバルク腫瘍（図８Ａ）および肝臓（図８Ｂ）からの、残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡを示すグラフである。マウスを２５ｍｇ／ｋｇの指定されたＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲートで処置し、３日目にｍＲＮＡを測定した。 図８Ｃおよび８Ｄは、２５ｍｇ／ｋｇの指定されたＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲートを用いた処置後７日目および１４日目の、Ｐａｎ０２異種移植片を有するマウスからの、バルク腫瘍（図８Ｃ）および腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）からの残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡを示すグラフである。 図８Ｃおよび８Ｄは、２５ｍｇ／ｋｇの指定されたＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲートを用いた処置後７日目および１４日目の、Ｐａｎ０２異種移植片を有するマウスからの、バルク腫瘍（図８Ｃ）および腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）からの残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡを示すグラフである。 図９は、未処置（対照）ＰＡＮ０２腫瘍のＴＭＥから単離したＧ－ＭＤＳＣにおける、区別するｍＲＮＡマーカー（Ｌｙ６Ｇ、Ｃｘｃｒ２、Ｓｌｃ２７ａ２、およびＰｔｇｓ２）の発現を示すグラフを提供する。 図１０は、ＴＭＥから単離したＭ－ＭＤＳＣにおける、区別するｍＲＮＡマーカー（Ｌｙ６Ｇ、Ｃｘｃｒ２、Ｓｌｃ２７ａ２、およびＰｔｇｓ２）の発現を示すグラフを提供する。 図１１および１２は、未処置（対照）組織におけるＧ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける脂質輸送受容体の差次的発現を示すグラフを提供する。 図１１および１２は、未処置（対照）組織におけるＧ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける脂質輸送受容体の差次的発現を示すグラフを提供する。 図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｐａｎ０２（図１３Ａ）およびＢ１６Ｆ１０（図１３Ｂ）ＴＭＥからの単離されたＧ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける、２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ１８コンジュゲートを用いた処置後の残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡレベルを示すグラフを提供する。腫瘍が３００～５００ｍｍに達すると、マウスを群に無作為化し、次いで１日目に処置し、３日目に分析のために組織を採取した。 図１３Ａおよび１３Ｂは、Ｐａｎ０２（図１３Ａ）およびＢ１６Ｆ１０（図１３Ｂ）ＴＭＥからの単離されたＧ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける、２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ１８コンジュゲートを用いた処置後の残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡレベルを示すグラフを提供する。腫瘍が３００～５００ｍｍに達すると、マウスを群に無作為化し、次いで１日目に処置し、３日目に分析のために組織を採取した。 図１３Ｃおよび１３Ｄは、３日目（図１３Ｃ）および７日目（図１３Ｄ）のマウスのＰａｎ０２ ＴＭＥからのＧ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける、５０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ１８コンジュゲートを用いた処置後の残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡレベルを示すグラフを提供する。 図１３Ｃおよび１３Ｄは、３日目（図１３Ｃ）および７日目（図１３Ｄ）のマウスのＰａｎ０２ ＴＭＥからのＧ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける、５０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ１８コンジュゲートを用いた処置後の残存するマウスＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡレベルを示すグラフを提供する。 図１４Ａ～１４Ｃは、マウスに移植したＰａｎ０２異種移植片からのＧ－ＭＤＳＣ（図１４Ａ）、Ｍ－ＭＤＳＣ（図１４Ｂ）およびＴｄＬＮ（図１４Ｃ）における、Ｓｔａｔ３の相対的発現を示すグラフである。 図１４Ａ～１４Ｃは、マウスに移植したＰａｎ０２異種移植片からのＧ－ＭＤＳＣ（図１４Ａ）、Ｍ－ＭＤＳＣ（図１４Ｂ）およびＴｄＬＮ（図１４Ｃ）における、Ｓｔａｔ３の相対的発現を示すグラフである。 図１４Ａ～１４Ｃは、マウスに移植したＰａｎ０２異種移植片からのＧ－ＭＤＳＣ（図１４Ａ）、Ｍ－ＭＤＳＣ（図１４Ｂ）およびＴｄＬＮ（図１４Ｃ）における、Ｓｔａｔ３の相対的発現を示すグラフである。 図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｓｔａｔ３ ｍＲＮＡの異なる領域を標的とするＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－コンジュゲート（ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）で処置したマウスの肝臓における、残存するマウスＳｔａｔ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。マウスに単回用量（３ｍｇ／ｋｇ）（図１５Ａ）および複数用量を（図１５Ｂ）を投与して、用量応答性を決定した。矢印は、さらなる研究のために選択した構築物を示す。 図１５Ａおよび１５Ｂは、Ｓｔａｔ３ ｍＲＮＡの異なる領域を標的とするＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－コンジュゲート（ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）で処置したマウスの肝臓における、残存するマウスＳｔａｔ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。マウスに単回用量（３ｍｇ／ｋｇ）（図１５Ａ）および複数用量を（図１５Ｂ）を投与して、用量応答性を決定した。矢印は、さらなる研究のために選択した構築物を示す。 図１６Ａおよび１６Ｂは、マウスに移植したＰａｎ０２異種移植片からのＧ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８コンジュゲートを用いた処置後のマウスＳｔａｔ３ ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。腫瘍に２５ｍｇ／ｋｇ（図１６Ａ）および５０ｍｇ／ｋｇ（図１６Ｂ）で投与した。 図１６Ａおよび１６Ｂは、マウスに移植したＰａｎ０２異種移植片からのＧ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８コンジュゲートを用いた処置後のマウスＳｔａｔ３ ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。腫瘍に２５ｍｇ／ｋｇ（図１６Ａ）および５０ｍｇ／ｋｇ（図１６Ｂ）で投与した。 図１７Ａおよび１７Ｂは、バルク腫瘍（ＴＭＥ）（図１７Ａ）およびＴｄＬＮ（図１７Ｂ）における、２５および５０ｍｇ／ｋｇの用量のＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８コンジュゲートを用いたＰａｎ０２異種移植片マウスの処置後の、マウスＳｔａｔ３ ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。 図１７Ａおよび１７Ｂは、バルク腫瘍（ＴＭＥ）（図１７Ａ）およびＴｄＬＮ（図１７Ｂ）における、２５および５０ｍｇ／ｋｇの用量のＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８コンジュゲートを用いたＰａｎ０２異種移植片マウスの処置後の、マウスＳｔａｔ３ ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。 図１８Ａは、２５または５０ｍｇ／ｋｇのコンジュゲートの用量後、３日目の、Ｐａｎ０２異種移植片マウスのＴＭＥおよびＴｄＬＮのＧ／Ｍ－ＭＤＳＣにおける、Ｓｔａｔ３およびＰｄｌ１ ｍＲＮＡレベルに対するＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１２３の効果を示すグラフを提供する。 図１８Ｂは、２５ｍｇ／ｋｇ用量のコンジュゲート後、７日目の、Ｐａｎ０２異種移植片マウスのＴｄＬＮにおける、Ｓｔａｔ３およびＰｄｌ１ ｍＲＮＡレベルに対するＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１２３の効果を示すグラフを提供する。 図１９Ａおよび１９Ｂは、Ｐａｎ０２マウス膵臓腫瘍を担持する免疫応答性マウスにおける腫瘍容積に対する、５０ｍｇ／ｋｇの総用量のＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１２３を用いた皮下処置のインビボ効果を示すグラフである。マウスを、４回の１２．５ｍｇ／ｋｇ（図１９Ａ）または２回の２５ｍｇ／ｋｇ（図１９Ｂ）の用量のコンジュゲートのいずれかで処置した。 図１９Ａおよび１９Ｂは、Ｐａｎ０２マウス膵臓腫瘍を担持する免疫応答性マウスにおける腫瘍容積に対する、５０ｍｇ／ｋｇの総用量のＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１２３を用いた皮下処置のインビボ効果を示すグラフである。マウスを、４回の１２．５ｍｇ／ｋｇ（図１９Ａ）または２回の２５ｍｇ／ｋｇ（図１９Ｂ）の用量のコンジュゲートのいずれかで処置した。 図２０ー１は、ＳＴＡＴ３遺伝子の様々な領域を標的とする１ｎＭのＤｓｉＲＮＡを用いた２４時間の処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を内因的に発現するＨｕｈ７細胞に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。１９２個のＤｓｉＲＮＡを設計およびスクリーニングした。２個のプライマー対を使用した。ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９のハウスキーピング遺伝子を使用して、試料間で発現を正規化した（順方向１－配列番号１２１９、逆方向１－配列番号１２２０；プローブ１－配列番号１２２１；順方向２－配列番号１２２２、逆方向２－配列番号１２２３；プローブ２－配列番号１２２４）。 図２０－２は、ＳＴＡＴ３遺伝子の様々な領域を標的とする１ｎＭのＤｓｉＲＮＡを用いた２４時間の処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を内因的に発現するＨｕｈ７細胞に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。１９２個のＤｓｉＲＮＡを設計およびスクリーニングした。２個のプライマー対を使用した。ＨＰＲＴおよびＳＦＲＳ９のハウスキーピング遺伝子を使用して、試料間で発現を正規化した（順方向１－配列番号１２１９、逆方向１－配列番号１２２０；プローブ１－配列番号１２２１；順方向２－配列番号１２２２、逆方向２－配列番号１２２３；プローブ２－配列番号１２２４）。 図２１Ａおよび２１Ｂは、ＳＴＡＴ３遺伝子の様々な領域を標的とする０．０５ｎＭ、０．３ｎＭ、または１ｎＭのＤｓｉＲＮＡを用いた２４時間の処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を内因的に発現するＨｕｈ７細胞に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。４８個のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを図２１Ａでアッセイし、それらのオリゴヌクレオチドのうちの３４個を、インビボでのさらなる試験のために選択した（図２１Ｂ）。 図２１Ａおよび２１Ｂは、ＳＴＡＴ３遺伝子の様々な領域を標的とする０．０５ｎＭ、０．３ｎＭ、または１ｎＭのＤｓｉＲＮＡを用いた２４時間の処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を内因的に発現するＨｕｈ７細胞に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。４８個のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを図２１Ａでアッセイし、それらのオリゴヌクレオチドのうちの３４個を、インビボでのさらなる試験のために選択した（図２１Ｂ）。 図２２Ａおよび２２Ｂは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を外因的に発現するマウス（流体力学的注射モデル）の肝臓に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。マウスに、ＰＢＳ中で製剤化した１ｍｇ／ｋｇの指示されたＧａｌＮＡｃ－ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与の３日後、マウスにヒトＳＴＡＴ３をコードするＤＮＡプラスミドを流体力学的に注射（ＨＤＩ）した。ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを、注射の１８時間後に採取した肝臓から決定した。矢印は、用量応答分析のために選択したオリゴヌクレオチドを示す。Ｈｓ／Ｍｆ＝ヒト／サル共通配列；Ｈｓ／Ｍｍ＝ヒト／マウス共通配列；Ｈｓ／Ｍｆ／Ｍｍ＝ヒト／サル／マウス三重共通配列。 図２２Ａおよび２２Ｂは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を外因的に発現するマウス（流体力学的注射モデル）の肝臓に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。マウスに、ＰＢＳ中で製剤化した１ｍｇ／ｋｇの指示されたＧａｌＮＡｃ－ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与の３日後、マウスにヒトＳＴＡＴ３をコードするＤＮＡプラスミドを流体力学的に注射（ＨＤＩ）した。ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを、注射の１８時間後に採取した肝臓から決定した。矢印は、用量応答分析のために選択したオリゴヌクレオチドを示す。Ｈｓ／Ｍｆ＝ヒト／サル共通配列；Ｈｓ／Ｍｍ＝ヒト／マウス共通配列；Ｈｓ／Ｍｆ／Ｍｍ＝ヒト／サル／マウス三重共通配列。 図２３は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドの用量応答を示すグラフを提供する。３つの用量（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）のヒトＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を外因的に発現するマウス（ＨＤＩモデル）の肝臓に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を測定した。ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのレベルを、ヒトＳＴＡＴ３をコードするプラスミドを用いた注射の１８時間後に採取した肝臓から決定した。矢印は、用量応答分析のために選択したオリゴヌクレオチドを示す。Ｈｓ／Ｍｆ＝ヒト／サル共通配列、Ｈｓ／Ｍｍ＝ヒト／マウス共通配列。 図２４は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、マウスＳＴＡＴ３を内因的に発現するマウスの肝臓に残存する正規化された（Ｐｐｉｂに対して）相対的マウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを示すグラフを提供する。マウスに、ＰＢＳ中で製剤化した３ｍｇ／ｋｇの指示されたＧａｌＮＡｃ－ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与の５日後に肝臓を採取し、マウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのレベルを決定した。矢印は、上位のオリゴヌクレオチドおよび用量応答研究のために選択したオリゴヌクレオチドを示す。 図２５は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、マウスＳＴＡＴ３を内因的に発現するマウスの肝臓に残存する正規化された（Ｐｐｉｂに対して）相対的マウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを示すグラフを提供する。マウスに、ＰＢＳ中で製剤化した３ｍｇ／ｋｇの指示されたＧａｌＮＡｃ－ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与の５日後に肝臓を採取し、マウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのレベルを決定した。矢印は、用量応答研究のために選択したオリゴヌクレオチドを示す。 図２６Ａおよび２６Ｂは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドの用量応答を示すグラフを提供する。３つの用量（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇ）のヒトＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を内因的に発現するマウスの肝臓に残存するマウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を測定した。マウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのレベルを、５日後に採取した肝臓から決定した。ＴＣ＝三重共通（マウス／ヒト／サル）；Ｈｓ＿Ｍｍ＝ヒト／マウス。 図２６Ａおよび２６Ｂは、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドの用量応答を示すグラフを提供する。３つの用量（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇ）のヒトＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を内因的に発現するマウスの肝臓に残存するマウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を測定した。マウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのレベルを、５日後に採取した肝臓から決定した。ＴＣ＝三重共通（マウス／ヒト／サル）；Ｈｓ＿Ｍｍ＝ヒト／マウス。 図２７は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を外因的に発現するマウス（流体力学的注射モデル）の肝臓に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。マウスに、ＰＢＳ中で製剤化した１ｍｇ／ｋｇの指示されたＧａｌＮＡｃ－ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与の３日後、マウスにヒトＳＴＡＴ３をコードするＤＮＡプラスミドを流体力学的に注射（ＨＤＩ）した。ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを、注射の１８時間後に採取した肝臓から決定した。矢印は、用量応答研究のために選択したオリゴヌクレオチドを示す。 図２８は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドの用量応答を示すグラフを提供する。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を外因的に発現するマウス（流体力学的注射モデル）の肝臓に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）。マウスに、ＰＢＳ中で製剤化した３つの用量（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇ）の指示されたＧａｌＮＡｃ－ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与の３日後、マウスにヒトＳＴＡＴ３をコードするＤＮＡプラスミドを流体力学的に注射（ＨＤＩ）した。ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを、注射の１８時間後に採取した肝臓から決定した。ＴＣ＝三重共通（マウス／ヒト／サル）；Ｈｓ＿Ｍｍ＝ヒト／マウス；Ｈｓ＝ヒト。 図２９は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドの用量応答を示すグラフを提供する。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを用いた処置後の、ヒトＳＴＡＴ３を外因的に発現するマウス（流体力学的注射モデル）の肝臓に残存するヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡのパーセント（％）。マウスに、ＰＢＳ中で製剤化した２つの用量（０．３ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）の指示されたＧａｌＮＡｃ－ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与の３日後、マウスにヒトＳＴＡＴ３をコードするＤＮＡプラスミドを流体力学的に注射（ＨＤＩ）した。ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを、注射の１８時間後に採取した肝臓から決定した。 図３０は、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドで処置した、ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ１を内因的に発現するＨｕｈ７細胞に残存するヒトＳＴＡＴ１ ｍＲＮＡのパーセント（％）を示すグラフを提供する。細胞を、３つの用量（０．０５ｎＭ、０．３ｎＭ、および１ｎＭ）のオリゴヌクレオチドで２４時間処置した。
ここで、本開示は、本開示の例示的な実施形態が示される添付図面を参照して、以下でより詳細に説明される。しかしながら、本開示は、多くの異なる形態で具現化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、本開示が徹底的かつ完全であり、本開示の範囲を当業者に十分に伝達するように、これらの実施形態が提供される。
いくつかの態様では、本開示は、腫瘍微小環境内の免疫細胞における標的遺伝子（例えば、免疫抑制調節因子をコードする）の発現を低減するオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲート）を提供する。他の態様では、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたはその薬学的に許容可能な組成物を使用して、疾患または障害（例えば、癌）を治療する方法を提供する。他の態様では、本開示は、癌を治療するための医薬品の製造において本明細書に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを使用する方法を提供する。他の態様では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍微小環境中の免疫細胞における免疫抑制の調節因子をコードする標的遺伝子の発現を調節（例えば、阻害または低減）することによって、癌を治療するために使用される。いくつかの態様では、本開示は、腫瘍微小環境中の免疫細胞における免疫抑制の調節因子をコードする標的の発現を低減することによって、癌を治療する方法を提供する。
定義
本文全体を通して考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいかなるものも、本発明者らが過去の発明を理由にそのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきでない。
本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１個以上のいずれかおよび全ての組み合わせを含む。さらに、単数形、および冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の明示的な定めのない限り、複数形も含むことが意図されている。さらに、当然のことながら、本明細書で使用される場合、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、および／または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１個以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を除外しない。さらに、当然のことながら、構成要素またはサブシステムを含む要素は、別の要素に接続または結合されていると言及および／または示される場合、それは、他の要素に直接的に接続もしくは結合され得るか、または介在する要素が存在してもよい。
別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を、本開示の方法および組成物の実践において使用することができるが、例示的な方法および材料が本明細書に記載されている。
ベクター、プロモーター、および他の多くの関連トピックの使用を含む、本明細書において有用な分子生物学的技術を記載する一般的なテキストには、Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ １５２，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（”Ｂｅｒｇｅｒ”）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ－－Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）、およびＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９９を通して補足）（”Ａｕｓｕｂｅｌ”）が含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑ．ベータ．－レプリカーゼ増幅、および例えば、本開示の相同核酸の産生のための他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）を含む、インビトロ増幅方法を通して当業者を指示するのに十分なプロトコルの例は、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ、ならびにＭｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）米国特許 第４，６８３，２０２号、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）（”Ｉｎｎｉｓ”）、Ａｒｎｈｅｉｍ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔ．１，１９９０）Ｃａｎｄ ＥＮ ３６－４７、Ｊ．ＮＩＨ Ｒｅｓ．（１９９１）３：８１－９４、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３、Ｇｕａｔｅｌｌｉｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４、Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ ３５：１８２６、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７－８０、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２９１－９４、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ ４：５６０、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７、およびＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５６３－５６４に見られる。インビトロで増幅された核酸をクローニングするための改善された方法は、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．、米国特許 第５，４２６，０３９号に記載されている。ＰＣＲによって大きい核酸を増幅するための改善された方法は、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６８４－８５、およびその中で引用されている参考資料に要約され、そこで、最大４０ｋｂのＰＣＲアンプリコンが生成される。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明確な指示のない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２個以上のそのような担体の混合物、およびこれに類するものを含む。
範囲は、本明細書において「約」ある値から、および／または「約」別の値までとして表され得る。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、一方の値から、および／または他方の値までを含む。同様に、当然のことながら、値が近似値として表される場合、先行する「約」の使用によって、その値は、別の実施形態を形成する。さらに、当然のことながら、範囲の各々の端点は、他方の端点との関連で、および他方の端点とは独立しての両方において重要である。また、本明細書に開示されるいくつかの値が存在すること、および各値が、その値自体に加えて「約」その値としても本明細書に開示されていることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。また、当業者によって適切に理解されるように、値が開示される場合、その値「未満またはそれに等しい」、「その値よりも大きいまたはそれに等しい」、および値の間の可能な範囲も開示されることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０未満またはそれに等しい」ならびに「１０よりも大きいまたはそれに等しい」も開示される。また、本出願全体を通して、データがいくつかの異なる形式で提供されること、およびこのデータが、端点および開始点、ならびにデータ点の任意の組み合わせの範囲を表すことが理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示される場合、１０および１５よりも大きい、１０および１５よりも大きいまたはそれに等しい、１０および１５よりも小さい、１０および１５よりも小さいまたはそれに等しい、ならびに１０および１５に等しいが、１０～１５と同様に開示されるとみなされる。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されることが理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
以下の本明細書および特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義されるものとするいくつかの用語への言及が行われる。
「癌」または「腫瘍」という用語には、固形腫瘍および血液媒介性腫瘍を含まれるが、これらに限定されない。これらの用語には、皮膚、組織、器官、骨、軟骨、血液、および血管の疾患が含まれる。これらの用語はさらに、原発性および転移性の癌を包含する。
「ＰＤ－１」という用語は、免疫応答を抑制し続けるのに役立つＴ細胞上に見られるタンパク質を指す。ＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１と呼ばれる別のタンパク質に結合されると、これは、Ｔ細胞が癌細胞を含む他の細胞を死滅させることを防ぐのに役立つ。免疫チェックポイント阻害剤と呼ばれるいくつかの抗癌剤が、ＰＤ－１を遮断するために使用される。このタンパク質がＴ細胞に作用することを妨げられると、それらは、癌細胞を死滅させるように作用することができる。
「ＳＴＡＴ３」という用語は、ヒトにおいてＳＴＡＴ３遺伝子（ＳＴＡＴ３ヒト（Ｈｓ）ＮＭ＿００１３６９５１２．１ Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列番号またはＮＭ＿１３９２７６．３）によってコードされる転写因子である、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）を指す。ＳＴＡＴ３は、細胞刺激に応答して様々な遺伝子の発現を媒介し、したがって、細胞の増殖およびアポトーシス、ならびに癌の増殖および進行などの多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。
「ＴＧＦ－β」という用語は、免疫および幹細胞の調節および分化に関与するサイトカインである、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）を指す。ＴＧＦ－βは、癌、感染症、および自己免疫を含む多くの病理において特定された役割を有する重要なサイトカインである。腫瘍微小環境中のその免疫抑制機能は、発癌に寄与する（Ｍａｓｓａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０３（２）：２９５－３０９（２０００））。
「ＣＸＣＲ２」という用語は、インターロイキン８（ＩＬ－８）の受容体、およびＧタンパク質共役受容体ファミリーのメンバーである、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）を指す。ＣＸＣＲ２は、炎症領域への好中球遊走を媒介することができる。
「ＣＣＲ２」という用語は、単球走化性タンパク質１の受容体である、Ｃ－Ｃケモカイン受容体２型（ＣＣＲ２）を指す。いくつかの癌における炎症応答は、単球走化性タンパク質１の活性によって部分的に媒介され得る。
「ＡＲＧ１」という用語は、Ｌ－アルギニンを尿素およびＬ－オルニチンに変換する酵素である、アルギナーゼ－１（ＡＲＧ１）を指す。Ｌ－アルギニンおよびその下流代謝産物は、Ｔ細胞活性の調節を通して抑制性腫瘍微小環境に寄与する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，８：６７（２０１８））。
「ＰＴＧＳ２」という用語は、シクロオキシゲナーゼ－２またはＣＯＸ－２としても公知である、プロスタグランジン－エンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）を指す。ＰＴＧＳ２は、プロスタグランジン合成における主要な酵素である。プロスタグランジンは、いくつかの免疫細胞の抗腫瘍活性を阻害し、抑制性腫瘍微小環境に寄与し得る。
「ＣＴＬＡ－４」という用語は、免疫応答を抑制し続けるのに役立つＴ細胞上に見られるタンパク質である、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）または分化抗原群１５２（ＣＤ１５２）を指す。ＣＴＬＡ－４は、最初の免疫チェックポイント標的であり、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、画期的な抗癌治療として開発されてきた。
「ＳＯＣＳ１」という用語は、ＳＴＡＴ誘導性ＳＴＡＴ阻害剤（ＳＳＩ）ファミリーのメンバーである、サイトカインシグナル伝達の抑制因子１（ＳＯＣＳ１）を指す。ＳＯＣＳ１は、サイトカインシグナル伝達のサイトカイン誘導性陰性調節因子である。
本明細書で使用される場合、「冷たい腫瘍」または「非炎症性腫瘍」という用語は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの抗腫瘍免疫細胞の存在が最小限もしくは全くない腫瘍または腫瘍微小環境を指し、かつ／または調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、およびＭ２マクロファージを含む免疫抑制に関連する細胞サブセットを含有する。具体的には、いくつかの実施形態では、冷たい腫瘍は、抗腫瘍免疫細胞の浸潤の数が少ないか、またはさらには浸潤がないことによって特徴付けられ、そのような細胞は存在し得るが、周囲の間質に接着したままであり、したがって腫瘍微小環境をコロニー化してそれらの抗腫瘍機能を提供することができない。
本明細書で使用される場合、「相補的」は、２個のヌクレオチドが互いに塩基対合することを可能にする２個のヌクレオチド間の構造的関係（例えば、２個の対向する核酸上または単一の核酸鎖の対向する領域上）を指す。例えば、対向する核酸のピリミジンヌクレオチドに対して相補的である１個の核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することによって一緒に塩基対合し得る。いくつかの実施形態では、相補的なヌクレオチドは、ワトソン・クリック法または安定な二本鎖の形成を可能にする任意の他の方法で塩基対合することができる。いくつかの実施形態では、２つの核酸は、本明細書に記載されるように、互いに相補的であり、相補性の領域を形成する複数のヌクレオチドの領域を有し得る。
本明細書で使用される場合、「種交差反応性オリゴヌクレオチド」は、２個以上の種における標的ｍＲＮＡの発現を阻害することができるオリゴヌクレオチドを指す。例えば、いくつかの実施形態では、種交差反応性オリゴヌクレオチドは、ヒトおよび非ヒト霊長類における標的ｍＲＮＡの発現を阻害することができる。種の例としては、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、およびラットが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、種交差反応性オリゴヌクレオチドは、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個の種におけるｍＲＮＡを標的とし、かつ阻害することができる。
本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチドと比較すると、そのペントース糖の２’位でヒドロキシルの代わりに水素を有するヌクレオチドを指す。修飾デオキシリボヌクレオチドは、糖、リン酸基、もしくは塩基中またはそれらの修飾あるいは置換を含む、２’位以外の原子の１個以上の修飾または置換を有するデオキシリボヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、実質的に二本鎖形態であるＲＮＡオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの二本鎖領域の相補的な塩基対合は、共有結合的に分離された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの二本鎖領域の相補的な塩基対合は、共有結合された核酸鎖のヌクレオチドの逆平行配列間で形成される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡの二本鎖領域の相補的な塩基対合は、折り畳まれて（例えば、ヘアピンを介して）、一緒に塩基対合するヌクレオチドの相補的な逆平行配列を提供する単一の核酸鎖から形成される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、互いに完全に二本鎖化された２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、部分的に二本鎖化された（例えば、一方または両方の末端にオーバーハングを有する）２つの共有結合的に分離された核酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、部分的に相補的であるヌクレオチドの逆平行配列を含み、したがって、内部ミスマッチまたは末端ミスマッチを含み得る１個以上のミスマッチを有し得る。
本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関する「二本鎖」は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合を通して形成される構造を指す。
本明細書で使用される場合、「賦形剤」は、例えば、所望の稠度もしくは安定化効果を提供または寄与するために、組成物に含まれ得る治療剤ではないものを指す。
本明細書で使用される場合、「熱い腫瘍」または「炎症性腫瘍」という用語は、抗腫瘍免疫細胞、特にＴＩＬのかなりの存在があり、したがって典型的には免疫刺激性である、腫瘍または腫瘍微小環境を指す。
本明細書で使用される「ループ」は、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、細胞内、リン酸緩衝液中）で、不対領域に隣接する２つの逆平行領域がハイブリダイズして二本鎖（「ステム」と呼ばれる）を形成するように、互いに十分に相補的である核酸の２つの逆平行領域に隣接する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の不対領域を指す。ループは、４個のヌクレオチドを含むループをテトラループ（ｔｅｔｒａＬ）と称し得る。ループは、３個のヌクレオチドを含むループをトリループ（ｔｒｉＬ）と称し得る。
本明細書で使用される「修飾ヌクレオチド間結合」は、ホスホジエステル結合を含む参照ヌクレオチド間結合と比較すると、１個以上の化学修飾を有するヌクレオチド間結合を指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、非自然発生の結合である。典型的には、修飾ヌクレオチド間結合は、修飾ヌクレオチド間結合が存在する核酸に１個以上の望ましい特性を与える。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低減などを改善し得る。
本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」は、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド、アデニンデオキシリボヌクレオチド、グアニンデオキシリボヌクレオチド、シトシンデオキシリボヌクレオチド、およびチミジンデオキシリボヌクレオチドから選択される対応する参照ヌクレオチドと比較すると、１個以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、非自然発生のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、その糖、核酸塩基、および／またはリン酸基に１個以上の化学修飾を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、対応する参照ヌクレオチドとコンジュゲートされた１個以上の化学部分を有する。典型的には、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドが存在する核酸に１個以上の望ましい特性を付与する。例えば、修飾ヌクレオチドは、熱安定性、分解に対する耐性、ヌクレアーゼ耐性、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物活性、免疫原性の低減などを改善し得る。
本明細書で使用される「ニックの入ったテトラループ構造」は、センス鎖がアンチセンス鎖と相補的な領域を有し、鎖のうちの少なくとも１つ、一般にはセンス鎖が、少なくとも１つの鎖内に形成された隣接するステム領域を安定化するように構成されたテトラループを有する、別個のセンス（パッセンジャー）およびアンチセンス（ガイド）鎖によって特徴付けられるＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの構造を指す。
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」は、短い核酸（例えば、約１００個未満のヌクレオチドの長さ）を指す。オリゴヌクレオチドは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）であり得る。オリゴヌクレオチドは、二本鎖領域を有していても有していなくてもよい。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオシド、またはその両方の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。一連の非限定的な例として、オリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ダイサー基質干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖ｓｉＲＮＡ、またはｓｓ ｓｉＲＮＡであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドである。
「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲート」および「オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート」という用語は、互換的に使用され、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた１個以上のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、「オーバーハング」は、一方の鎖または領域が二本鎖を形成する相補鎖の末端を越えて延びる一方の鎖または領域から生じる末端非塩基対合ヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、ｄｓＲＮＡの５’末端または３’末端で二本鎖領域から延びる１個以上の不対ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、オーバーハングは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。
本明細書で使用される「リン酸類似体」は、リン酸基の静電特性および／または立体特性を模倣する化学部分を指す。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、５’－リン酸の代わりにオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに位置付けられ、これはしばしば酵素除去の影響を受けやすい。いくつかの実施形態では、５’リン酸類似体は、ホスファターゼ耐性結合を含む。リン酸類似体の例には、５’メチレンホスホネート（５’－ＭＰ）および５’－（Ｅ）－ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）などの５’ホスホネートが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’炭素位置にリン酸類似体（「４’リン酸類似体」と呼ばれる）を５’末端ヌクレオチドに有する。４’－リン酸類似体の例は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’炭素）またはその類似体と結合しているオキシメチルホスホネートである。例えば、米国仮特許出願第６２／３８３，２０７号（２０１６年９月２日出願）および同第６２／３９３，４０１号（２０１６年９月１２日出願）を参照されたい。オリゴヌクレオチドの５’末端に対して他の修飾が開発されている（例えば、国際特許出願第２０１１／１３３８７１号、米国特許第８，９２７，５１３号、およびＰｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３：２９９３－３０１１を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、遺伝子（例えば、ＳＴＡＴ３）の「低減された発現」とは、適切な参照（例えば、参照細胞、参照細胞集団、参照試料、または参照対象）と比較して、細胞、細胞集団、試料、もしくは対象における、ＲＮＡ転写物（例えば、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ）もしくは遺伝子によってコードされるタンパク質の量もしくはレベルの減少、および／または遺伝子の活性の量もしくはレベルの減少を指す。例えば、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを含むヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチド）と細胞を接触させる行為は、ｄｓＲＮＡで処置されていない細胞と比較して、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ、タンパク質、および／または活性の量またはレベルの減少をもたらし得る（例えば、ＲＮＡｉ経路によるＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの分解を介して）。同様に、本明細書で使用される場合、「発現を低減すること」とは、遺伝子（例えば、ＳＴＡＴ３）の発現の低減をもたらす作用を指す。本明細書で使用される「ＳＴＡＴ３発現の低減」とは、適切な参照（例えば、参照細胞、参照細胞集団、参照試料、または参照対象）と比較して、細胞、細胞集団、試料、もしくは対象におけるＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ、ＳＴＡＴ３タンパク質、および／またはＳＴＡＴ３活性の量またはレベルの減少を指す。
本明細書で使用される「相補性の領域」は、ヌクレオチドの逆平行配列と十分に相補的であり、適切なハイブリダイゼーション条件下で（例えば、リン酸緩衝液中、細胞中などで）ヌクレオチドの２つの配列間のハイブリダイゼーションを可能にする核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）のヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的配列に対して相補的な領域を有する標的配列を含む。
本明細書で使用される「リボヌクレオチド」は、その２’位にヒドロキシル基を含む、そのペントース糖としてリボースを有するヌクレオチドを指す。修飾リボヌクレオチドは、リボース、リン酸基、もしくは塩基中またはそれらの修飾あるいは置換を含む、２’位以外の原子の１個以上の修飾または置換を有するリボヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド」は、（ａ）アンチセンス鎖、もしくはアンチセンス鎖の一部が、標的ｍＲＮＡの切断においてアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって使用される、センス鎖（パッセンジャー）およびアンチセンス鎖（ガイド）を有するｄｓＲＮＡ、または（ｂ）アンチセンス鎖（もしくはそのアンチセンス鎖の一部）が、標的ｍＲＮＡの切断においてＡｇｏ２エンドヌクレアーゼによって使用される、単一のアンチセンス鎖を有するｓｓオリゴヌクレオチドのいずれかを指す。
本明細書で使用される場合、「鎖」は、ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合）を通して一緒に結合されたヌクレオチドの単一の連続する配列を指す。いくつかの実施形態では、鎖は、２つの自由末端（例えば、５’末端および３’末端）を有する。
本明細書で使用される場合、「対象」は、マウス、ウサギ、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）、およびヒトを含む、任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒトまたはＮＨＰである。さらに、「個体」または「患者」は、「対象」と互換的に使用され得る。
本明細書で使用される場合、「合成」は、人工的に合成される（例えば、機械（例えば、固体核酸合成器）を使用して）か、もしくは通常、分子を産生する天然源（例えば、細胞または生物）に別様に由来しない、核酸または他の分子を指す。
本明細書で使用される「標的化リガンド」は、目的の組織もしくは細胞の同族分子（例えば、受容体）に選択的に結合し、かつ／または目的の組織もしくは細胞に他の物質を標的とする目的で、別の物質にコンジュゲート可能である、分子または「部分」（例えば、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、または脂質）を指す。例えば、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、目的の特定の組織または細胞にオリゴヌクレオチドを標的とする目的で、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、細胞表面受容体と選択的に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた場合、細胞の表面上に発現された受容体との選択的な結合、ならびにオリゴヌクレオチド、標的化リガンド、および受容体を含む複合体の細胞によるエンドソーム内在化を通じて、特定の細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、オリゴヌクレオチドが細胞内で標的化リガンドから放出されるように、細胞内部移行後または細胞内在化中に切断されるリンカーを介して、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされている。
本明細書で使用される場合、「ループ」、「トリループ」、または「テトラループ」は、ヌクレオチドの隣接する配列のハイブリダイゼーションによって形成される隣接する二本鎖の安定性を増加させるループを指す。安定性の増加は、ランダムに選択されたヌクレオチドの配列から成る同等の長さのループのセットから、平均的に予想される隣接するステム二本鎖の融解温度（Ｔｍ）よりも高い、隣接するステム二本鎖のＴｍの増加として検出可能である。例えば、ループは、少なくとも２塩基対（ｂｐ）の長さの二本鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａＨＰＯ４中で少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５８℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、または少なくとも約７５℃のＴｍを付与することができる。いくつかの実施形態では、ループ（例えば、テトラループ）は、相互作用をスタッキングすることによって、隣接するステム二本鎖のｂｐを安定化することができる。さらに、テトラループ中のヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン・クリック塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、および接触相互作用が含まれるが、これらに限定されない（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４６：６８０－８２、Ｈｅｕｓ ａｎｄ Ｐａｒｄｉ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１９１－９４）。いくつかの実施形態では、ループは、３～６個のヌクレオチドを含むか、またはそれらから成り、典型的には、４～５個のヌクレオチドである。特定の実施形態では、ループは、修飾されていてもされていなくてもよい（例えば、標的化部分にコンジュゲートされていてもいなくてもよい）３、４、５、または６個のヌクレオチドを含むか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態では、テトラループは、３～６個のヌクレオチドを含むかまたはそれらから成り、典型的には４～５個のヌクレオチドである。特定の実施形態では、テトラループは、修飾されていてもされていなくてもよい（例えば、標的化部分にコンジュゲートされていてもいなくてもよい）３、４、５、または６個のヌクレオチドを含むか、またはそれらから成る。一実施形態では、４個のヌクレオチドから成るループは、テトラループである。任意のヌクレオチドが、ループ（例えば、テトラループ）に使用され得、そのようなヌクレオチドの標準的なＩＵＰＡＣ－ＩＵＢシンボルが、Ｃｏｒｎｉｓｈ－Ｂｏｗｄｅｎ（（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３０２１－３０３０）に記載されるように使用され得る。例えば、文字「Ｎ」は、任意の塩基がその位置にあり得ることを意味するために使用され得、文字「Ｒ」は、Ａ（アデニン）またはＧ（グアニン）がその位置にあり得ることを示すために使用され得、「Ｂ」は、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、またはＴ（チミン）がその位置にあり得ることを示すために使用され得る。テトラループの例には、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、ＣＵＵＧテトラループが含まれる（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８４６７－７１、Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５９０１－０５）。ＤＮＡテトラループの例には、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、テトラループのｄ（ＧＴＴＡ）、ｄ（ＧＮＲＡ））ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、およびテトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が含まれる。（例えば、Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：４２８１－９２、Ｓｈｉｎｊｉ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｇａｋｋａｉ Ｋｏｅｎ Ｙｏｋｏｓｈｕ ７８：７３１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、テトラループは、ニックの入ったテトラループ構造内に含まれる。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」は、既存の状態（例えば、疾患、障害）に関して対象の健康および／もしくは福利を改善する、または状態の発生の可能性を予防するか、もしくは減少させる目的で、例えば、対象に治療剤（例えば、本明細書のオリゴヌクレオチド）を投与することによって、治療を必要とする対象にケアを提供する行為を指す。いくつかの実施形態では、治療は、対象が経験する状態（例えば、疾患、障害）の少なくとも１つの徴候、症状、もしくは寄与因子の頻度または重症度を低減することを伴う。
本明細書で使用される場合、「腫瘍微小環境」という用語は、腫瘍間質、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、他の細胞、シグナル伝達分子、およびＥＣＭを含む、任意の所与の腫瘍が存在する細胞環境に関する。腫瘍微小環境が、それが相互作用する腫瘍細胞を内部に持つおよび／または包囲することが理解される。
腫瘍微小環境中の免疫細胞への送達のためのオリゴヌクレオチドコンジュゲート
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍の増殖、浸潤、および最終的には転移の維持において重要な役割を果たす。複合体ＴＭＥは、部分的に免疫細胞、線維芽細胞、および血管によって構成される。ＴＭＥ中の免疫細胞組成物は、典型的には、「冷たい」または「熱い」腫瘍として分類される。冷たい腫瘍は、少なくとも部分的に骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）およびＴ調節細胞（Ｔｒｅｇ）の存在による、減衰した免疫応答を有する。ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇの両方が、腫瘍を浸潤させ、抗腫瘍応答を誘導するＴ細胞の能力を減衰させる。熱い腫瘍は、癌と闘うＴ細胞の浸潤を示し、攻撃的な抗腫瘍応答を示す。冷たい腫瘍は、一般に、熱い腫瘍と比較して免疫療法処置に対する応答性が低い。腫瘍免疫環境を冷たい環境から熱い環境に変換するための療法が必要である。
ｍＲＮＡ標的配列
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、標的化リガンドを介して腫瘍微小環境に関連する免疫細胞におけるｍＲＮＡ標的配列に標的化される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、またはその一部分、断片、もしくは鎖（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）は、標的ｍＲＮＡ配列に結合またはアニールし、それによって標的ｍＲＮＡの発現を低減する。いくつかの実施形態では、インビボでの標的ｍＲＮＡの発現を低減する目的で、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、標的化リガンドを介して腫瘍微小環境に関連する免疫細胞におけるｍＲＮＡ標的配列に標的化される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートによる標的ｍＲＮＡの発現の低減の量または程度は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの効力と相関する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートによる標的ｍＲＮＡの発現の低減の量または程度は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートで治療された癌を有する対象または患者における治療的利益の量または程度と相関する。
複数の異なる種（例えば、ヒト、カニクイザル、マウス、およびラット）のｍＲＮＡを含む、標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の検査を通して、ならびにインビトロおよびインビボ試験の結果として、特定の標的ｍＲＮＡ配列が、他よりもオリゴヌクレオチド媒介性の低減を受けやすく、したがって本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの標的配列として有用であることが発見された。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドーリガンドコンジュゲート（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲート）のセンス鎖、またはその一部分もしくは断片は、標的ｍＲＮＡ配列と類似（例えば、４個を超えないミスマッチを有する）または同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二本鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖の一部分または領域は、標的ｍＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥ中の免疫細胞によって発現される免疫抑制の調節因子をコードするｍＲＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、免疫抑制の調節因子は、免疫調節に直接的または間接的な影響を与える。例えば、いくつかの実施形態では、免疫抑制の調節因子は、調節タンパク質、酵素タンパク質、またはシグナル伝達タンパク質である。いくつかの実施形態では、免疫抑制の調節因子は、免疫シグナル伝達を制御するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫抑制の調節因子は、免疫調節に関与するポリペプチドの処理に関与する酵素である。いくつかの実施形態では、免疫抑制の調節因子は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、免疫抑制の調節因子は、転写因子である。いくつかの実施形態では、免疫抑制の調節因子は、サイトカインである。いくつかの実施形態では、免疫抑制の調節因子は、ケモカイン受容体である。
免疫調節因子をコードする野生型遺伝子および変異遺伝子の両方が、ＴＭＥまたは腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）における免疫応答を修飾することができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥ中の免疫細胞によって発現される免疫抑制の調節因子をコードする野生型ｍＲＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴｄＬＮ中の免疫細胞によって発現される免疫抑制の調節因子をコードする野生型ｍＲＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥ中の免疫細胞によって発現される免疫抑制の調節因子をコードする変異ｍＲＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴｄＬＮ中の免疫細胞によって発現される免疫抑制の調節因子をコードする変異ｍＲＮＡを標的とする。変異ｍＲＮＡ分子は、誤って折り畳まれたタンパク質または超活性タンパク質を産生する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣの抑制機能に寄与するタンパク質の発現を直接的または間接的に低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣの抑制機能に寄与するタンパク質の発現を直接的または間接的に低減する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥの免疫細胞において、標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥの免疫細胞において、免疫抑制の調節因子の発現を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％低減する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴｄＬＮの免疫細胞において、標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴｄＬＮの免疫細胞において、免疫抑制の調節因子の発現を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％低減する。
腫瘍微小環境中の免疫細胞
いくつかの態様では、本開示は、腫瘍および／または腫瘍微小環境に存在する免疫細胞において発現される標的ｍＲＮＡの発現を低減する、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍微小環境中の抑制性免疫細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの標的化リガンドは、腫瘍に存在する免疫細胞にオリゴヌクレオチドを送達する。
健康な個人では、骨髄から産生される未成熟骨髄細胞は、成熟顆粒球、マクロファージ、または樹状細胞に分化し、次に自然免疫系の一部になる（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ．Ｏｃｔ；４（５）（２０１６））。癌などの病理学的状態では、未成熟骨髄細胞の成熟骨髄細胞への分化における部分的な遮断は、未成熟骨髄細胞集団の増殖をもたらす可能性があり（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍａｒ；９（３）：１６２－７４（２００９））、癌のモニタリングおよび除去を補助することができない。癌細胞によって分泌されるＧＭ－ＣＳＦの影響下で、これらの過剰な骨髄細胞は、骨髄から腫瘍部位に動員される（Ｓｃｈｍｉｄ ａｎｄ Ｖａｒｎｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１０））。ＴＭＥ内に入ると、骨髄細胞集団は増殖し、細胞は、異なる機構を介してＴ細胞およびＮＫ細胞を抑制することを可能にする免疫抑制機能を果たし（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１３７１（２０２０））、癌腫瘍に対する応答を直接的に阻害する。
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、抗腫瘍Ｔ細胞の増殖および細胞傷害活性を積極的に阻害すること、ならびに免疫抑制Ｔ調節細胞の増殖を促進することによって、免疫療法抵抗性に寄与する（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ ＲＥＶ ＩＭＭＵＮＯＬ（２００９）９（３）：１６２－７４、Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，ＣＥＬＬＳ（２０２０）９：５６１）。このように、ＭＤＳＣは、腫瘍に対する宿主免疫応答を阻害または減弱化することができる。さらに、これらのＭＤＳＣは、血管新生、ＥＭＴおよびＭＥＴ移行の促進を通した細胞播種、ならびに腫瘍形成因子の分泌を補助することもできる。（Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，ＣＥＬＬＳ（２０２０）９：５６１）。ＭＤＳＣが関連する腫瘍の増殖における発生、維持、および補助の重要性を所与として、ＭＤＳＣは、それらが特異的に攻撃され得る場合、多くの腫瘍型に対する潜在的な治療標的である。ＭＤＳＣは、腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）でも見られ得、それらは、同様に腫瘍排出リンパ節で見られるナイーブＴ細胞に対して抑制効果を有することができる（Ｓｗａｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ ＲＥＶ ＣＡＮＣＥＲ（２０１２）１２：２１０－１９）。次いで、ナイーブＴ細胞の抑制は、腫瘍がリンパ節に、およびそれを超えて転移する準備をすることができる（Ｓｗａｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ ＲＥＶ ＣＡＮＣＥＲ（２０１２）１２：２１０－１９）。集合的に、ＭＤＳＣは、細胞表面またはｍＲＮＡマーカーＣＤ１１ｂ（マクロファージ系統の骨髄細胞のマーカー）およびＧｒ－１（骨髄系統分化抗原のマーカー）の共発現によって特徴付けられ、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞として示される。Ｇｒ－１はさらに、２つの構成要素Ｌｙ６ＧおよびＬｙ６Ｃから成る。ＭＤＳＣは、２つのサブセット：ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃｌｏとしてさらに特徴付けられる顆粒球ＭＤＳＣ（Ｇ－ＭＤＳＣ）、およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃｈｉとして特徴付けられる単球ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）から成る。ｍＲＮＡマーカーであるＬｙ６Ｇ、ＣｘＣｒ２、Ｓｌｃ２７ａ２、およびＰｔｇｓ２は、Ｍ－ＭＤＳＣではなく、Ｇ－ＭＤＳＣによって優先的に発現される。ＣｘＣｒ２、Ｓｃｌ２７ａ２、およびＰｔｇｓ２などの特異的マーカーの発現は、ＴＭＥ中のＧ－ＭＤＳＣの動員および抑制活性を示唆する。同様に、Ｌｙ６Ｃ、Ｓｃａｒｂ１、Ｌｄｌｒ、およびＡｒｇ１は、Ｇ－ＭＤＳＣと比較して、Ｍ－ＭＤＳＣによって高度に発現される。Ｍ－ＭＤＳＣにおけるＳｃａｒｂ１およびＬｄｌｒなどの脂質輸送受容体のより高い発現は、脂質取り込みにおいて重要な役割を果たし得る。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍常在免疫細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）中の免疫細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍常在免疫細胞におけるｍＲＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）中の免疫細胞におけるｍＲＮＡを標的とする。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、抑制性骨髄細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、骨髄系由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣは、顆粒球ＭＤＳＣ（Ｇ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣは、単球ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍常在免疫および／または腫瘍排出リンパ節ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡを低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、腫瘍常在免疫および／または腫瘍排出リンパ節Ｇ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡを低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍常在免疫および／または腫瘍排出リンパ節Ｍ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡを低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍常在免疫および／または腫瘍排出リンパ節Ｔｒｅｇ細胞における標的ｍＲＮＡを低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、２つ以上のタイプの腫瘍常在免疫および／または腫瘍排出リンパ節免疫細胞における標的ｍＲＮＡを低減する。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＭＤＳＣ（例えば、Ｍ－ＭＤＳＣおよび／またはＧ－ＭＤＳＣ）ならびにＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞）における標的ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、ＭＤＳＣまたはＴｒｅｇ細胞）の免疫抑制活性は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートとの接触後に低減される。
免疫抑制活性は、当技術分野で公知の方法を使用して測定される。１つのそのような方法では、アルギナーゼＩレベルは、対照免疫細胞と比較して、単離された腫瘍免疫細胞で測定される。腫瘍常在免疫細胞（例えば、骨髄細胞）における高いアルギナーゼＩのレベルは、免疫抑制環境を示す。さらに、いくつかの実施形態では、免疫抑制腫瘍常在細胞の数は、抑制活性のレベルを示す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞抑制アッセイおよび／またはサイトカイン放出アッセイが、免疫細胞の抑制活性を測定するために使用される。
癌
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍中の免疫細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、腫瘍は、原発腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、転移性腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、難治性腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、またはＩＶ期の腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。固形腫瘍とは、癌が塊を形成する状態を指す。
いくつかの実施形態では、癌は、甲状腺癌、甲状腺乳頭癌、頭頸部癌、肝臓癌、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、癌腫、芽腫、髄芽腫、網膜芽腫、肉腫、脂肪肉腫、滑膜細胞肉腫、神経内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍、ガストリノーマ、膵島細胞癌、中皮腫、神経鞘腫、聴神経腫、髄膜腫、腺癌、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮癌、上皮扁平上皮癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、消化器癌、膠芽腫、子宮頸癌、膀胱癌、肝腫、転移性乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、メルケル細胞癌、精巣癌、食道癌、または胆道腫瘍である。いくつかの実施形態では、癌は、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、および／または抗ＣＴＬＡ４療法に対して難治性である。いくつかの実施形態では、癌は、膵癌または肺癌である。いくつかの実施形態では、癌は、免疫抑制腫瘍微小環境を有する腫瘍を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍に送達され、腫瘍常在免疫細胞における標的ｍＲＮＡの発現を低減する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍容積を低減する。腫瘍容積は、当業者に既知の方法を使用して測定される。例えば、抽出された腫瘍は、キャリパーを使用して手動で測定される。他の方法には、超音波およびＭＲＩなどのイメージ方法が含まれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、未処置の腫瘍と比較して、腫瘍容積を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低減する。
腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）は、一般に、癌の転移の最初の部位である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、腫瘍排出リンパ節中の免疫細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、腫瘍排出リンパ節は、部分区域、区域、葉、葉間、肺門、縦隔、滑車上、三角筋胸筋（ｄｅｌｔｏｉｄｅｏｐｅｃｔｏｒａｌ）、外側、胸部、肩甲下、中間、鎖骨下、浅鼠径、深鼠径、膝窩、頬筋、鼻唇、前立腺、下顎、顎下、後頭、乳突／耳介後、耳下腺、深耳介前、深耳介下、深耳下腺内、深頸部、深前頸、気管前、気管傍、喉頭前、甲状腺、深外側頚、深上頸、下深頸、咽頭後、頸静脈二腹筋、前頸、側頸、鎖骨上、大動脈後、外側大動脈、腹腔、胃、肝、脾、上腸間膜、腸間膜、回結腸、結腸間膜、下腸間膜、または直腸傍のリンパ節である。いくつかの実施形態では、腫瘍排出リンパ節は、原発腫瘍排出リンパ節である。いくつかの実施形態では、腫瘍排出リンパ節は、腫瘍転移を排出するリンパ節である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、非ＴｄＬＮ中の免疫細胞を標的としない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、癌細胞を標的としない。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍および腫瘍排出リンパ節の両方における免疫細胞を標的とする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴｄＬＮ中の免疫細胞における標的ｍＲＮＡを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％低減する。
オリゴヌクレオチド－標的化リガンドの構造
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ヌクレオチド配列および１個以上の標的化リガンドを含み、ヌクレオチド配列は、式Ｉ－ａ：
;
またはその薬学的に許容可能な塩
（式中、
Ｂは、核酸塩基または水素であり、
Ｒ１およびＲ２は独立して、水素、ハロゲン、ＲＡ、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）Ｒ２、もしくは－ＳｉＲ３であるか、または
同じ炭素上のＲ１およびＲ２が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する３～７員の飽和もしくは部分不飽和環を形成し、
各ＲＡは独立して、Ｃ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であり、
各Ｒは独立して、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であるか、あるいは、
同じ原子上の２つのＲ基が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、ケイ素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和、部分不飽和、またはヘテロアリール環を形成し、
各標的化リガンドは、脂質コンジュゲート部分（ＬＣ）、炭水化物、アミノ糖、またはＧａｌＮＡｃから選択され、各ＬＣは独立して、飽和もしくは不飽和、直鎖、または分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖を含む脂質コンジュゲート部分であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
各－Ｃｙ－は独立して、フェニレニル；８～１０員の二環式アリーレニル；４～７員の飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロカルボシクリレニル；８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリーレニル、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１～５個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式ヘテロアリーレニル、から選択される任意選択で置換された二価の環であり、
ｎは、１～１０であり、
Ｌは、共有結合、または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－、－Ｖ１ＣＲ２Ｗ１－、または
によって置き換えられており、
ｍは、１～５０であり、
Ｘ１、Ｖ１、およびＷ１は独立して、－Ｃ（Ｒ）２－、－ＯＲ、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、または－ＮＲ－であり、
Ｙは、水素、好適なヒドロキシル保護基、
であり、
Ｒ３は、水素、好適な保護基、好適なプロドラッグ、またはＣ１－６脂肪族、フェニル、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環、ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される任意選択で置換された基であり、
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＢＨ２－、または共有結合であり、
Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
Ｙ２は、水素、好適な保護基、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
Ｚは、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－、または－ＣＲ２－である）によって表される、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた１個以上のヌクレオシド（核酸）を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、式ＩＩ－ａ：
またはその薬学的に許容可能な塩によって表される、標的化リガンドとコンジュゲートされた１個以上の核酸を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、式ＩＩ－ｂまたはＩＩ－ｃ：
またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
Ｌ１は、共有結合、一価または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－、または
によって置き換えられており、
Ｒ４は、水素、ＲＡ、または好適なアミン保護基であり、
Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲによって置き換えられている）によって表される、標的化リガンドとコンジュゲートされた１個以上の核酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、以下から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、以下から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、式ＩＩ－ＩｂまたはＩＩ－Ｉｃ：
またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
Ｂは、核酸塩基または水素であり、
ｍは、１～５０であり、
Ｘ１は、－Ｏ－、または－Ｓ－であり、
Ｙは、水素、
であり、
Ｒ３は、水素、または好適な保護基であり、
Ｘ２は、Ｏ、またはＳであり、
Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、または共有結合であり、
Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
Ｙ２は、水素、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
Ｒは、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基である）によって表される、標的化リガンドとコンジュゲートされた１個以上の核酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、以下から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、１～１０個の標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、１、２または３個の標的化リガンドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、二本鎖分子である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ分子である。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ステムループを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループ内のヌクレオチドのいずれかにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて、５’から３’の第１のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第２のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第３のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第４のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループ内のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループ内のヌクレオチドのうちの３個にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、５’から３’に１～３６の番号が付けられた位置を有する３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２７位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２８位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２９位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、３６ヌクレオチドセンス鎖の３０位にコンジュゲートされた脂質を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、１５～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および１５～４０個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞において発現される標的配列に対する相補性の領域を含み、センス鎖は、その３’末端に、４個のヌクレオシドを含むテトラループを含むステム－ループを含み、その４個のヌクレオシドのうちの１個以上は、式ＩＩ－Ｉｂ：
、
（式中、Ｂは、アデニンおよびグアニン核酸塩基から選択され、Ｒ５は炭化水素鎖である）によって表される。いくつかの実施形態では、ｍは、１であり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｙ２は、ヌクレオシドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基であり、
Ｙは、
によって表され、Ｙ１、はヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ３は、Ｏであり、およびＲ３は、Ｈである。いくつかの実施形態では、炭化水素鎖は、Ｃ８－Ｃ３０炭化水素鎖である。いくつかの実施形態では、炭化水素鎖は、Ｃ１６炭化水素鎖である。いくつかの実施形態では、Ｃ１６炭化水素鎖は、
によって表される。いくつかの実施形態では、テトラループの４個のヌクレオシドは、５’から３’に１～４の番号が付けられ、１位は、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、２位が、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、３位が、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、４位が、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、センス鎖は、５’から３’に１～３６の番号が付けられた位置を有する３６個のヌクレオチドであり、ステム－ループは、２１～３６位にヌクレオチドを含み、２７～３０位の１個以上のヌクレオシドが、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドである。
いくつかの態様では、本開示は、標的ｍＲＮＡ（例えば、免疫抑制を調節する標的ｍＲＮＡ）を標的とし、（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）標的遺伝子発現を阻害または低減するためのオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供し、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、センス鎖（例えば、本明細書ではパッセンジャー鎖とも呼ばれる）およびアンチセンス鎖（例えば、本明細書ではガイド鎖とも呼ばれる）を含む二本鎖（ｄｓ）核酸分子である。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、別個の鎖であり、共有結合していない。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、共有結合している。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖領域を形成し、センス鎖およびアンチセンス鎖、またはその一部分は、相補的な様式で（例えば、ワトソン・クリック塩基対合によって）互いに結合またはアニールする。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、第１の領域（Ｒ１）および第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｒ２は、第１のサブ領域（Ｓ１）、テトラループ（ｔｅｔｒａＬ）またはトリループ（ｔｒｉＬ）などのループ（Ｌ）、および第２のサブ領域（Ｓ２）を含み、ＬまたはｔｒｉＬは、Ｓ１とＳ２との間に位置し、Ｓ１およびＳ２は、第２の二本鎖（Ｄ２）を形成する。Ｄ２は、様々な長さを有し得る。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、約１～６ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、２～６、３～６、４～６、５～６、１～５、２～５、３～５、または４～５ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、１、２、３、４、５、または６ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、６ｂｐの長さである。
いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖のＲ１は、第１の二本鎖（Ｄ１）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、少なくとも約１５個（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１個）のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、約１２～３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２７、１５～２２、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、または２１～３０個のヌクレオチドの長さ）の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、少なくとも１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか一方または両方の全長に及ぶ。特定の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
当然のことながら、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート）または他の核酸の構造を説明する際に、配列表に提示される配列が参照され得る。そのような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、指定された配列と本質的に同じまたは類似する相補的特性を保持しながら、指定された配列と比較して、１個以上の代替ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ対応物もしくはＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ対応物）、および／または１個以上の修飾ヌクレオチド、および／または１個以上の修飾ヌクレオチド間結合、および／または１個以上の他の修飾を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、２５ヌクレオチドのセンス鎖、および２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ダイサー酵素によって作用されると、成熟ＲＩＳＣに組み込まれるアンチセンス鎖をもたらす。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのセンス鎖は、２７個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのセンス鎖は、２５個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチド）。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、他方の５’末端と比較して熱力学的に安定性がより低い一方の５’末端を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端を含み、アンチセンス鎖の３’末端に３’オーバーハングを含む非対称性オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングは、約１～８個のヌクレオチドの長さ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヌクレオチドの長さ）である。典型的には、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端上に２ヌクレオチドオーバーハングを有する。しかしながら、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６個のヌクレオチド、任意選択で、１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６個のヌクレオチド、または１、２、３、４、５、もしくは６個のヌクレオチドの長さを含む、３’オーバーハングである。しかしながら、いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６個のヌクレオチド、任意選択で、１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６個のヌクレオチド、または１、２、３、４、５、もしくは６個のヌクレオチドの長さを含む、５’オーバーハングである。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端上の２個の末端ヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端上の２個の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ（例えば、免疫抑制を調節する標的ｍＲＮＡ）と相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端上の２個の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのアンチセンス鎖の３’末端上の２個の末端ヌクレオチドは、不対である。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのアンチセンス鎖の３’末端上の２個の末端ヌクレオチドは、不対ＧＧを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのアンチセンス鎖の３’末端上の２個の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの各３’末端上の２個の末端ヌクレオチドは、ＧＧである。典型的には、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドコンジュゲート）の各３’末端上の２個の末端ＧＧヌクレオチドの一方または両方は、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に１個以上（例えば、１、２、３、４、または５個）のミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に２個以上のミスマッチが存在する場合、それらは連続して位置付けられ得る（例えば、２、３個、もしくはそれ以上が並んでいる）か、または相補性の領域全体にわたって散在し得る。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、１個以上のミスマッチを含有する。一実施形態では、２個のミスマッチは、センス鎖の３’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのセンス鎖の３’末端でのセグメントの塩基ミスマッチ、または不安定化は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの効力および／または有効性を改善するか、または増加させる。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、本明細書に記載のＧａｌＮＡｃである。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物である。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、アミノ糖である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、２個以上の標的化リガンドを含み、標的化リガンドは、異なっている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、２個以上の標的化リガンドを含み、標的化リガンドは、同じである。
例示的なオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、脂肪酸とコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、脂質は、炭素鎖である。いくつかの実施形態では、炭素鎖は、飽和している。いくつかの実施形態では、炭素鎖は、不飽和である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１６炭素（Ｃ１６）脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、Ｃ１６脂質は、少なくとも１個の二重結合を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１８炭素（Ｃ１８）脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、Ｃ１８脂質は、少なくとも１個の二重結合を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２２炭素（Ｃ２２）脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、Ｃ２２脂質は、少なくとも１個の二重結合を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２４炭素（Ｃ２４）脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、Ｃ２４脂質は、少なくとも１個の二重結合を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、ループを含み、ループの少なくとも１個のヌクレオチドは、Ｃ１６脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ループの第２のヌクレオチドは、Ｃ１６脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、ループを含み、ループの少なくとも１個のヌクレオチドは、Ｃ１８脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ループの第２のヌクレオチドは、Ｃ１８脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、ループを含み、ループの少なくとも１個のヌクレオチドは、Ｃ２２脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ループの第２のヌクレオチドは、Ｃ２２脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、ループを含み、ループの少なくとも１個のヌクレオチドは、Ｃ２４脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ループの第２のヌクレオチドは、Ｃ２４脂質とコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、テトラループを含み、テトラループの少なくとも１個のヌクレオチドは、Ｃ１６脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、テトラループの第２のヌクレオチドは、Ｃ１６脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、テトラループを含み、テトラループの少なくとも１個のヌクレオチドは、Ｃ１８脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、テトラループの第２のヌクレオチドは、Ｃ１８脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、テトラループを含み、テトラループの少なくとも１個のヌクレオチドは、Ｃ２２脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、テトラループの第２のヌクレオチドは、Ｃ２２脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、テトラループを含み、テトラループの少なくとも１個のヌクレオチドは、Ｃ２４脂質とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、テトラループの第２のヌクレオチドは、Ｃ２４脂質とコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、少なくとも１個の修飾ヌクレオシドを有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、各鎖は、少なくとも１個の修飾ヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、以下の式によって表される。
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－ＴＬ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
または
センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ＃］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、以下の式によって表される。
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－ＴＬ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
または
センス鎖：
［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ＃］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、以下に示すようにＣ１６脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのオリゴヌクレオチドは、以下に示すようにＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥまたはＴｄＬＮの免疫細胞における標的ｍＲＮＡを低減するが、腫瘍上皮細胞におけるｍＲＮＡは低減しない。
使用方法
ｉ．標的遺伝子発現の低減
いくつかの実施形態では、本開示は、標的遺伝子発現を低減する（例えば、免疫抑制の調節因子をコードする標的遺伝子の発現を低減する）ために、有効量の本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのいずれかを、腫瘍微小環境の免疫細胞または免疫細胞集団（例えば、腫瘍常在免疫細胞）に接触させるか、または送達するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、細胞における標的ｍＲＮＡ、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質、または標的遺伝子（ｍＲＮＡもしくはタンパク質）活性の量またはレベルの低減を測定することによって決定される。これらの方法は、本明細書に記載され、当業者に公知であるものを含む。
本明細書で提供される方法は、任意の適切な腫瘍常在免疫細胞型に有用である。いくつかの実施形態では、細胞は、標的ｍＲＮＡを発現する任意の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から取得された初代細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、細胞がその天然の表現型特性を実質的に維持するように限られた数の継代を受けている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートが送達される細胞は、エクスビボまたはインビトロである（すなわち、培養中の細胞または細胞が常在する生物に送達され得る）。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含有する溶液または医薬組成物の注射、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートによって覆われた粒子による衝撃、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含有する溶液への細胞もしくは細胞集団の曝露、またはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の核酸送達方法を使用して、腫瘍微小環境の免疫細胞または免疫細胞集団に送達される。脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、およびリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクション、ならびにその他などのオリゴヌクレオチドを細胞に送達するための当技術分野で公知の他の方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、標的遺伝子発現に関連する細胞もしくは細胞集団の１個以上の分子、特性、もしくは特徴を評価するアッセイもしくは技法によって、または細胞もしくは細胞集団における標的遺伝子発現を直接的に示す分子（例えば、標的ｍＲＮＡもしくはタンパク質）を評価するアッセイもしくは技法によって決定される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートが標的遺伝子発現を低減する（例えば、免疫抑制の調節因子をコードする標的遺伝子の発現を低減する）程度は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと接触した細胞または細胞集団における標的遺伝子発現を、対照細胞または細胞集団（例えば、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと接触していないか、または対照オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと接触した細胞または細胞集団）と比較することによって評価される。いくつかの実施形態では、対照細胞または細胞集団における標的遺伝子発現の対照量またはレベルは、アッセイまたは技法が行われる全ての事例において対照量またはレベルを測定する必要がないように、予め決定される。所定のレベルまたは値は、様々な形態を取ることができる。いくつかの実施形態では、所定のレベルまたは値は、中央値または平均値などの単一のカットオフ値であり得る。
免疫細胞におけるｍＲＮＡの測定は、当業者に公知の技法を使用して行われ得る。例えば、腫瘍が抽出された後、組織は、単一の細胞に手動でまたは化学的に解離される。次いで、ＭＡＣＳソーティングを使用して、ＲＮＡ分析のために採取および調製される目的の細胞（例えば、ＭＤＳＣ）を単離する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＴＭＥまたはＴｄＬＮの免疫細胞における標的ｍＲＮＡ発現を１日から少なくとも４週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥまたはＴｄＬＮの免疫細胞における標的ｍＲＮＡ発現を１日、３日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、または３４日間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥまたはＴｄＬＮの免疫細胞における標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも１～４週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥまたはＴｄＬＮの免疫細胞における標的ｍＲＮＡ発現を最大２週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＴＭＥまたはＴｄＬＮの免疫細胞における標的ｍＲＮＡ発現を最大４週間低減する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡ発現を１日から少なくとも４週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡ発現を１日、３日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、または３４日間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも１～４週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも最大２週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣの免疫細胞における標的ｍＲＮＡ発現を最大４週間低減する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡ発現を１日から少なくとも４週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡ発現を１日、３日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、または３４日間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも１～４週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも最大２週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣの免疫細胞における標的ｍＲＮＡ発現を最大４週間低減する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｔｒｅｇにおける標的ｍＲＮＡ発現を１日から少なくとも４週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｔｒｅｇにおける標的ｍＲＮＡ発現を１日、３日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、または３４日間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣにおける標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも１～４週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｔｒｅｇにおける標的ｍＲＮＡ発現を少なくとも最大２週間低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｔｒｅｇの免疫細胞における標的ｍＲＮＡ発現を最大４週間低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを、腫瘍微小環境の免疫細胞または免疫細胞集団（例えば、腫瘍常在免疫細胞）に接触させるか、または送達することは、標的遺伝子発現の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと接触していない、または対照オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと接触した細胞または細胞集団における標的遺伝子発現の対照量またはレベルと比較したものである。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の低減は、標的遺伝子発現の対照量またはレベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。いくつかの実施形態では、ＴＭＥ中の免疫細胞における標的遺伝子発現の低減は、標的遺伝子発現の対照量またはレベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。いくつかの実施形態では、ＴｄＬＮ中の免疫細胞における標的遺伝子発現の低減は、標的遺伝子発現の対照量またはレベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。いくつかの実施形態では、Ｍ－ＭＤＳＣにおける標的遺伝子発現の低減は、標的遺伝子発現の対照量またはレベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。いくつかの実施形態では、Ｇ－ＭＤＳＣにおける標的遺伝子発現の低減は、標的遺伝子発現の対照量またはレベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇにおける標的遺伝子発現の低減は、標的遺伝子発現の対照量またはレベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現の対照量またはレベルは、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと接触していない細胞または細胞集団における標的ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の量またはレベルである。いくつかの実施形態では、本明細書の方法に従った、腫瘍微小環境の免疫細胞または免疫細胞集団（例えば、腫瘍常在免疫細胞）へのオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの送達の効果は、任意の有限期間または時間量（例えば、分、時間、日、週、月）後に評価される。例えば、いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを細胞または細胞集団に接触させるか、または送達してから、少なくとも約４時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、または少なくとも約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約２１日、約２８日、約３５日、約４２日、約４９日、約５６日、約６３日、約７０日、約７７日、もしくは約８４日以上後に、腫瘍微小環境の免疫細胞または免疫細胞集団（例えば、腫瘍常在免疫細胞）において決定される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子発現は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを細胞または細胞集団と接触させるか、または送達してから、少なくとも約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、もしくは約６ヶ月以上後に、腫瘍微小環境の免疫細胞または免疫細胞集団（例えば、腫瘍常在免疫細胞）において決定される。
ＴｒｅｇｓまたはＭＤＳＣなどの腫瘍における免疫抑制細胞の活性の低減は、冷たい腫瘍を熱い腫瘍に変換するための潜在的な戦略である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、冷たい腫瘍を熱い腫瘍に変換する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、免疫抑制活性を低減することによって、抗腫瘍形成免疫活性を増強する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、免疫抑制細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の活性を低減することによって、抗腫瘍形成Ｔ細胞活性を増強する。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、ＭＤＳＣの免疫抑制活性を低減することによって、抗腫瘍形成活性を増強する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣの免疫抑制活性を低減することによって、抗腫瘍形成活性を増強する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣの免疫抑制活性を低減することによって、抗腫瘍形成活性を増強する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を低減することによって、抗腫瘍形成活性を増強する。いくつかの実施形態では、抗腫瘍形成活性を測定するための方法は、腫瘍中の腫瘍浸潤リンパ球の数を測定することを含むが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣの免疫抑制活性を、冷たい腫瘍を熱い腫瘍に変換するのに十分な量まで低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣの免疫抑制活性を、冷たい腫瘍を熱い腫瘍に変換するのに十分な量まで低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を、冷たい腫瘍を熱い腫瘍に変換するのに十分な量まで低減する。冷たい腫瘍が熱い腫瘍に変換されたかどうかを判断するための方法は、免疫療法（例えば、チェックポイント阻害剤ポリペプチド）に対する腫瘍の応答を測定することを含むが、これに限定されない。
ｉｉ．治療方法および医学的使用
いくつかの態様では、本開示は、標的遺伝子（例えば、免疫抑制の調節因子をコードする標的遺伝子）の低減から利益を得るであろう癌を有する対象（例えば、ヒト）を治療するための、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供する。いくつかの点で、本開示は、癌を有する対象を治療するための、使用のための、または使用に適合されたオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供する。いくつかの点で、本開示は、免疫抑制ＴＭＥに関連する癌を有する対象を治療するための、使用のための、または使用に適合されたオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供する。本開示はまた、癌を治療するための医薬品または医薬組成物の製造における、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、免疫抑制の調節因子（例えば、転写因子またはチェックポイント阻害剤ポリペプチド）を標的とする。いくつかの実施形態では、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、免疫抑制の調節因子を標的とし、調節因子のｍＲＮＡ、または調節因子のタンパク質および／もしくは活性の量またはレベルを低減する。
以下に詳述するように、方法はまた、免疫抑制の調節因子のマーカーのベースライン値を測定または取得する工程、および次いで、そのように得られた値を、オリゴヌクレオチドを投与した後に取得される１個以上の他のベースライン値または値と比較して、治療の有効性を評価する工程などの工程も含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、腫瘍微小環境中の免疫抑制を低減するためのオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、免疫抑制の低減は、腫瘍中の免疫抑制の１個以上の特性または特徴（例えば、ＭＤＳＣなどの抑制細胞の存在）を評価するための適切なアッセイもしくは技法によって、または免疫抑制を直接的に示す分子（例えば、高いＡｒｇ１発現）を評価するアッセイもしくは技法によって決定される。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートが免疫抑制を低減する程度は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと接触したＴＭＥにおける免疫抑制を、適切な対照（例えば、オリゴヌクレオチドと接触していないか、または対照オリゴヌクレオチドと接触した適切な腫瘍）と比較することによって評価される。いくつかの実施形態では、タンパク質へのｍＲＮＡ発現の適切な対照レベルは、所定のレベルまたは値であってもよく、その結果、対照レベルは、毎回測定される必要はない。所定のレベルまたは値は、様々な形態を取ることができる。いくつかの実施形態では、所定のレベルまたは値は、中央値または平均値などの単一のカットオフ値であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの投与は、腫瘍常在免疫細胞における標的ｍＲＮＡの低減をもたらす。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡの低減は、ｍＲＮＡの適切な対照レベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。適切な対照レベルは、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと接触していない細胞または細胞集団におけるｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質翻訳のレベルであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書の方法に従った細胞へのオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの送達の効果は、有限期間の後に評価される。例えば、ｍＲＮＡのレベルは、腫瘍へのオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの導入から、少なくとも約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、もしくは最大１４日後に、細胞において分析されてもよい。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含む鎖（例えば、そのセンス鎖およびアンチセンス鎖）を、細胞において発現するように操作された導入遺伝子の形態で送達される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、本明細書に開示される任意のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを発現するように操作された導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、もしくは単純ヘルペスウイルス）、または非ウイルスベクター（例えば、プラスミドもしくは合成ｍＲＮＡ）を使用して送達され得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、対象に直接的に注射され得る。
いくつかの態様では、本開示は、癌を有するか、癌を有する疑いがあるか、または癌を発症するリスクがある対象を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを使用して、癌の発症または進行を治療または軽減する方法を提供する。本明細書の方法のいくつかの実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートのいずれか１個以上を投与することによって治療される。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書の１個以上のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または１個以上のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含む医薬組成物が、癌を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍における（例えば、腫瘍微小環境中の免疫細胞における）標的ｍＲＮＡを低減する。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の量が、対象において低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、またはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含む医薬組成物は、癌を有する対象に投与され、標的遺伝子（例えば、免疫抑制の調節因子）の発現は、１個以上のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または医薬組成物の投与前の標的の発現と比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは医薬組成物を受けていないか、または対照オリゴヌクレオチ－リガンドドコンジュゲート、医薬組成物、もしくは治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）における標的ｍＲＮＡ発現と比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは複数のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、またはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含む医薬組成物は、癌を有する対象に投与され、その結果、標的ｍＲＮＡ（例えば、免疫抑制の調節因子をコードする遺伝子）の量またはレベルは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたは医薬組成物の投与前の標的ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象の腫瘍常在免疫細胞において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは複数のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、またはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含む医薬組成物は、癌を有する対象に投与され、その結果、標的ｍＲＮＡ（例えば、免疫抑制の調節因子をコードする遺伝子）の量またはレベルは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたは医薬組成物の投与前の標的ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象のＴｄＬＮ免疫細胞において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。いくつかの実施形態では、標的ｍＲＮＡの量またはレベルは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは複数のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または医薬組成物を受けていないか、あるいは対照オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは複数のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、医薬組成物、または治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）における標的ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは複数のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、またはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含む医薬組成物は、免疫抑制環境を有する癌を有する対象に投与され、その結果、免疫抑制を調節する標的タンパク質の量またはレベルは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたは医薬組成物の投与前の免疫抑制を調節するタンパク質の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。いくつかの実施形態では、免疫抑制を調節するタンパク質の量またはレベルは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは医薬組成物を受けていないか、または対照オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、もしくは医薬組成物、もしくは治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）における、免疫抑制を調節するタンパク質の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは複数のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、またはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは複数のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含む医薬組成物は、免疫抑制ＴＭＥを有する癌を有する対象に投与され、その結果、免疫抑制を調節するｍＲＮＡまたはタンパク質の量またはレベルは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたは医薬組成物の投与前の免疫抑制を調節するｍＲＮＡまたはタンパク質の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。いくつかの実施形態では、免疫抑制を調節する標的ｍＲＮＡの量またはレベルは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートもしくは医薬組成物を受けていないか、または対照オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、医薬組成物、もしくは治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）における標的ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％超低減される。
本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、それらの高い特異性のため、疾患細胞および組織の標的遺伝子のｍＲＮＡを特異的に標的とする。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、標的細胞にオリゴヌクレオチドを送達する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、腫瘍微小環境中に見られる免疫細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、免疫抑制腫瘍微小環境に見られる免疫細胞である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、１個以上のＭＤＳＣ細胞集団にオリゴヌクレオチドを送達する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣにオリゴヌクレオチドを送達する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｍ－ＭＤＳＣにオリゴヌクレオチドを送達する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｇ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにオリゴヌクレオチドを送達する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、腫瘍微小環境中のＴ細胞にオリゴヌクレオチドを送達する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、Ｔｒｅｇ細胞にオリゴヌクレオチドヌクレオチドを送達する。
本明細書に記載されるように、免疫抑制の調節因子をコードするｍＲＮＡを標的とするためのオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、冷たい腫瘍を熱い腫瘍に変換することができる。熱い腫瘍は、他の治療アプローチが疾患の治療においてより効果的であることを可能にする。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、第２の治療剤と組み合わされ投与される。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、化学療法、標的化抗癌療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科処置、放射線処置、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、ワクチン、もしくは細胞免疫療法、またはそれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の方法は、典型的には、治療有効量の本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたは複数のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、すなわち、望ましい治療結果をもたらすことができる量を対象に投与することを含む。治療的に許容可能な量は、疾患または障害を治療的に処置することができる量であり得る。いずれか１人の対象に対する適切な用量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の活性成分、投与の時間および経路、一般的な健康状態、ならびに並行して投与される他の薬剤を含む、特定の因子に依存するであろう。
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書の組成物のうちのいずれか１個を、経腸的に（例えば、経口的に、胃栄養管によって、十二指腸栄養管によって、胃瘻造設を介して、もしくは直腸に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射もしくは注入、動脈内注射もしくは注入、骨内注入、筋肉内注射、脳内注射、脳室内注射、くも膜下腔内）、局所的に（例えば、経皮、吸入、点眼薬を介して、もしくは粘膜を介して）、または標的器官（例えば、対象の肝臓）への直接注射によってのいずれかで投与される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートまたはその医薬組成物は、静脈内または皮下に投与される。
非限定的な一連の例として、いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、四半期毎に（３ヶ月に１回）、隔月（２ヶ月に１回）、毎月、または毎週投与される。例えば、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、毎週、または２週間もしくは３週間間隔で投与され得る。あるいは、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、毎日投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの１回以上の負荷用量、続いて、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの１回以上の維持用量が投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、単独でまたは組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、並行して、連続して（任意の順序で）、または断続的に組み合わせて投与される。例えば、２個のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートは、並行して共投与され得る。あるいは、１個のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートが投与され、続いて任意の期間（例えば、１時間、１日、１週間、または１ヶ月）後に、第２のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートが投与され得る。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ヒトもしくは非ヒト霊長類または他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象には、イヌおよびネコなどの家畜化動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜、ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの動物が含まれる。
オリゴヌクレオチドのタイプ
様々なオリゴヌクレオチドのタイプおよび／または構造は、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡなどを含むがこれらに限定されない、本明細書の方法において標的配列を標的とするために有用である。本明細書または他の場所に記載のオリゴヌクレオチドのタイプのいずれかが、本明細書の標的化配列を組み込むためのフレームワークとして使用するために企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ダイサー介入の上流または下流でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に関与することによって、標的配列の発現を阻害する。例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、各鎖が１～５個のヌクレオチドの少なくとも１個の３’オーバーハングを有する約１９～２５個のヌクレオチドのサイズを有するように開発されている（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号を参照されたい）。ダイサーによって処理されて活性ＲＮＡｉ産物を生成する、より長いオリゴヌクレオチドも開発されている（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照されたい）。さらなる研究により、少なくとも１つの鎖の少なくとも１つの末端が、二本鎖標的化領域を超えて伸長され、鎖のうちの一方が熱力学的に安定化するテトラループ構造を含む構造を含む、伸長ｄｓＲＮＡが産生された（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号および同第８，９２７，７０５号、ならびに国際特許出願公開第２０１０／０３３２２５号を参照されたい）。そのような構造は、（分子の片側または両側に）ｓｓ伸長ならびにｄｓ伸長を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ダイサーの介入（例えば、ダイサー切断）の下流でＲＮＡｉ経路に関与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ダイサー基質である。いくつかの実施形態では、内因性ダイサー処理により、標的ｍＲＮＡ発現を低減することができる１９～２３個のヌクレオチドの長さの二本鎖核酸が産生される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の３’末端にオーバーハング（例えば、１、２、または３個のヌクレオチドの長さ）を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡに対してアンチセンスである２１個のヌクレオチドのガイド鎖、および相補的なパッセンジャー鎖を含み、両方の鎖がアニールして、１９ｂｐの二本鎖、およびいずれか一方または両方の３’末端に２個のヌクレオチドのオーバーハングを形成する。２３個のヌクレオチドのガイド鎖および２１個のヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有するオリゴヌクレオチドを含む、より長いオリゴヌクレオチド設計も利用可能であり、分子の右側に平滑末端（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）、分子の左側に２個のヌクレオチドの３’－ガイド鎖オーバーハング（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）が存在する。そのような分子には、２１ｂｐの二本鎖領域が存在する。例えば、米国特許第９，０１２，１３８号、同第９，０１２，６２１号、および同第９，１９３，７５３号を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、両方が約１７～２６個（例えば、１７～２６、２０～２５、または２１～２３個）のヌクレオチドの長さの範囲であるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、両方が約１７～３６個（例えば、１７～３６、２０～２５、または２１～２３個）のヌクレオチドの長さの範囲であるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖、および１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハンド（ｏｖｅｒｈａｎｄ）を有する非対称性二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、両方が約１９～２２個のヌクレオチドの長さの範囲であるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、等しい長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に３’オーバーハングが存在するように、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、両方が約２１～２３個のヌクレオチドの長さの範囲であるセンス鎖およびアンチセンス鎖を有するオリゴヌクレオチドについて、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方での３’オーバーハングは、１または２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドのガイド鎖および２０個のヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有し、分子の右側に平滑末端（パッセンジャー鎖の３’末端／ガイド鎖の５’末端）、分子の左側に２個のヌクレオチドの３’－ガイド鎖オーバーハング（パッセンジャー鎖の５’末端／ガイド鎖の３’末端）が存在する。そのような分子には、２０ｂｐの二本鎖領域が存在する。
本明細書の組成物および方法と併用するための他のオリゴヌクレオチド設計には、１６－ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ（例えば、ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＩＮ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ（ｅｄ．），Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６を参照されたい）、ｓｈＲＮＡ（例えば、１９ｂｐ以下のステムを有する。例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２９：１４１－５８を参照されたい）、平滑ｓｉＲＮＡ（例えば、１９ｂｐの長さの。例えば、Ｋｒａｙｎａｃｋ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ（２００６）ＲＮＡ １２：１６３－７６を参照されたい）、非対称性ｓｉＲＮＡ（ａｉＲＮＡ。例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１３７９－８２を参照されたい）、非対称性のより短い二本鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７：７２５－３２を参照されたい）、フォークｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈｏｈｊｏｈ（２００４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５５７：１９３－９８を参照されたい）、ｓｓ ｓｉＲＮＡ（Ｅｌｓｎｅｒ（２０１２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：１０６３）、ダンベル形状円形ｓｉＲＮＡ（例えば、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９：１５１０８－０９を参照されたい）、および低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：５８８６－９７を参照されたい）が含まれる。ＳＴＡＴ３の発現を低減または阻害するためのいくつかの実施形態で使用され得る、オリゴヌクレオチド構造のさらなる非限定的な例は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および短いｓｉＲＮＡ（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）ＥＭＢＯ Ｊ．２１：４６７１－７９を参照されたい。米国特許出願公開第２００９／００９９１１５号も参照されたい）である。
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書の標的配列の発現を低減または阻害するためのオリゴヌクレオチドは、ｓｓである。そのような構造には、ｓｓ ＲＮＡｉ分子が含まれ得るが、これに限定されない。近年の取り組みにより、ｓｓ ＲＮＡｉ分子の活性が実証されている（例えば、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４：９４６－５５を参照されたい）。しかしながら、いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に記載されるときに、特定の核酸の標的化セグメントの逆相補体を含み、細胞におけるその標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介切断を誘導するように（例えば、ギャップマーとして）、または細胞における標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように（例えばミックスマーとして）好適に修飾される、核酸塩基配列を有するｓｓオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用するためのＡＳＯは、例えば、米国特許第９，５６７，５８７号に示されているものを含む、当技術分野で公知の任意の好適な様式で修飾され得る（例えば、長さ、核酸塩基（ピリミジン、プリン）の糖部分、および核酸塩基の複素環部分の改変を含む）。さらに、ＡＳＯは、特定の標的遺伝子の発現を低減するために数十年間使用されてきた（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：８１－１０５を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補性の領域を共有する。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５～５０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１５～２５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列から１、２、または３個のヌクレオチドで異なる。
二本鎖オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、センス鎖（本明細書ではパッセンジャー鎖とも呼ばれる）およびアンチセンス鎖（本明細書ではガイド鎖とも呼ばれる）を含む、標的配列を標的とし、その発現を（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）阻害するための二本鎖ｄｓＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、別個の鎖であり、共有結合していない。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、共有結合している。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖領域を形成し、センス鎖およびアンチセンス鎖、またはその一部分は、相補的な様式で（例えば、ワトソン・クリック塩基対合によって）互いに結合する。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、第１の領域（Ｒ１）および第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｒ２は、第１のサブ領域（Ｓ１）、テトラループ（ｔｅｔｒａＬ）またはトリループ（ｔｒｉＬ）などのループ（Ｌ）、および第２のサブ領域（Ｓ２）を含み、Ｌ、ｔｅｔｒａＬ、またはｔｒｉＬは、Ｓ１とＳ２との間に位置し、Ｓ１およびＳ２は、第２の二本鎖（Ｄ２）を形成する。Ｄ２は、様々な長さを有し得る。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、約１～６ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、２～６、３～６、４～６、５～６、１～５、２～５、３～５、または４～５ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、１、２、３、４、５、または６ｂｐの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ２は、６ｂｐの長さである。
いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖のＲ１は、第１の二本鎖（Ｄ１）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、少なくとも約１５個（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１個）のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、約１２～３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２７、１５～２２、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、または２１～３０個のヌクレオチドの長さ）の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、少なくとも１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、Ｄ１は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか一方または両方の全長に及ぶ。特定の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＤ１は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
当然のことながら、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の構造を説明する際に、配列表に提示される配列が参照され得る。そのような実施形態では、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、指定された配列と本質的に同じまたは類似する相補的特性を保持しながら、指定された配列と比較して、１個以上の代替ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡヌクレオチドのＲＮＡ対応物もしくはＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡ対応物）、および／または１個以上の修飾ヌクレオチド、および／または１個以上の修飾ヌクレオチド間結合、および／または１個以上の他の修飾を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、２５ヌクレオチドのセンス鎖、および２７ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ダイサー酵素によって作用されると、成熟ＲＩＳＣに組み込まれるアンチセンス鎖をもたらす。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、２７個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、２７個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチド）。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、２５個のヌクレオチドよりも長い（例えば、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチド）。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、他方の５’末端と比較して熱力学的に安定性がより低い一方の５’末端を有する。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端に平滑末端を含み、アンチセンス鎖の３’末端に３’オーバーハングを含む非対称性オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングは、約１～８個のヌクレオチドの長さ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個のヌクレオチドの長さ）である。典型的には、ＲＮＡｉのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス（ガイド）鎖の３’末端上に２個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。しかしながら、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６個のヌクレオチド、任意選択で、１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６個のヌクレオチド、または１、２、３、４、５、もしくは６個のヌクレオチドの長さを含む、３’オーバーハングである。しかしながら、いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１～６個のヌクレオチド、任意選択で、１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６個のヌクレオチド、または１、２、３、４、５、もしくは６個のヌクレオチドの長さを含む、５’オーバーハングである。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端上の２個の末端ヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端上の２個の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端上の２個の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端での２個の末端ヌクレオチドは、不対ＧＧを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の３’末端上の２個（２）の末端ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して相補的ではない。いくつかの実施形態では、ニックの入ったテトラループ構造中のオリゴヌクレオチドの各３’末端での２個の末端ヌクレオチドは、ＧＧである。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドの各３’末端上の２個（２）の末端ＧＧヌクレオチドの一方または両方は、標的ｍＲＮＡに対して相補的ではない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの各３’末端上の２個の末端ＧＧヌクレオチドの一方または両方は、標的と相補的ではない。
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に１個以上（例えば、１、２、３、４、または５個）のミスマッチが存在する。センス鎖とアンチセンス鎖との間に２個以上のミスマッチが存在する場合、それらは連続して位置付けられる（例えば、２、３個以上が並んでいる）か、または相補性の領域全体にわたって散在し得る。いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、１個以上のミスマッチを含有する。一実施形態では、２個のミスマッチは、センス鎖の３’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の３’末端でのセグメントの塩基ミスマッチ、または不安定化は、おそらくダイサーによる処理を促進することによって、ＲＮＡｉにおける合成二本鎖の効力を改善した。
ａ．アンチセンス鎖
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、最大約４０個のヌクレオチドの長さ（例えば、最大４０、最大３５、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、または最大１２個のヌクレオチドの長さ）のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、最大約５０個のヌクレオチドの長さ（例えば、最大５０、最大４０、最大３５、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、または最大１２個のヌクレオチドの長さ）のアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも３８個のヌクレオチドの長さ）のアンチセンス鎖を有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１２～約４０個（例えば、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２２、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０、または３２～４０個）のヌクレオチドの長さの範囲のアンチセンス鎖を有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１５～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を有し得る。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ばれ得る。例えば、アンチセンス鎖が、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に関与し、Ａｇｏ２などのアルゴノートタンパク質に結合するか、または１個以上の類似因子に関与もしくは結合し、標的遺伝子のサイレンシングを指示することができる場合、それは、ガイド鎖と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、ガイド鎖に対して相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ばれ得る。
ｂ．センス鎖
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、最大約４０個のヌクレオチドの長さ（例えば、最大４０、最大３６、最大３０、最大２７、最大２５、最大２１、最大１９、最大１７、または最大１２個のヌクレオチドの長さ）のセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１２個のヌクレオチドの長さ（例えば、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１９、少なくとも２１、少なくとも２５、少なくとも２７、少なくとも３０、少なくとも３６、または少なくとも３８個のヌクレオチドの長さ）のセンス鎖を有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１２～約４０個（例えば、１２～４０、１２～３６、１２～３２、１２～２８、１５～４０、１５～３６、１５～３２、１５～２８、１７～２１、１７～２５、１９～２７、１９～３０、２０～４０、２２～４０、２５～４０、または３２～４０個）のヌクレオチドの長さの範囲のセンス鎖を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、１５～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、１８～３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、３６個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の３’末端にステム－ループ構造を含むセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループは、鎖内塩基対合によって形成される。いくつかの実施形態では、センス鎖は、その５’末端にステム－ループ構造を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、２個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、３個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、４個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、５個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、６個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、７個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、８個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、９個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１０個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１１個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１２個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１３個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。いくつかの実施形態では、ステム－ループのステムは、１４個のヌクレオチドの長さの二本鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ステム－ループは、分解（例えば、酵素分解）に対するオリゴヌクレオチド保護を提供し、標的細胞、組織、もしくは器官（例えば、肝臓）への標的化および／もしくは送達を促進もしくは改善するか、またはその両方である。例えば、いくつかの実施形態では、ステム－ループのループは、標的への標的化、標的遺伝子発現の阻害、および／または標的細胞、組織、もしくは器官（例えば、肝臓）への送達、取り込み、および／もしくは浸透、あるいはそれらの組み合わせを促進するか、改善するか、または増加させる１個以上の修飾を含むヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態では、ステム－ループ自体またはステム－ループへの修飾は、オリゴヌクレオチドの本質的な遺伝子発現阻害活性に影響を与えないか、または実質的に影響を与えないが、安定性（例えば、分解に対する保護を提供する）、ならびに／または標的細胞、組織、もしくは器官へのオリゴヌクレオチドの送達、取り込み、および／もしくは浸透を促進するか、改善するか、または増加させる。特定の実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として記載されるステム－ループを（例えば、その３’末端に）含むセンス鎖を含み、Ｓ１は、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌは、Ｓ１とＳ２との間で最大約１０個のヌクレオチドの長さ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの長さ）の連結ヌクレオチドの一本鎖ループを形成する。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、３個のヌクレオチドの長さ（本明細書では、「トリループ」と呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、４個のヌクレオチドの長さ（本明細書では「テトラループ」と呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ループ（Ｌ）は、１０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、テトラループは、配列５’－ＧＡＡＡ－３’を含む。いくつかの実施形態では、ステムループは、配列５’－ＧＣＡＧＣＣＧＡＡＡＧＧＣＵＧＣ－３’（配列番号８６）を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、その３’末端にステム－ループ構造を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、その５’末端にステム－ループ構造を含む。いくつかの実施形態では、ステムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４ｂｐの長さの二本鎖である。いくつかの実施形態では、ステム－ループは、分解（例えば、酵素分解）に対する分子保護を提供し、標的細胞への送達のための標的化特徴を促進する。例えば、いくつかの実施形態では、ループは、オリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性に実質的に影響を与えることなく修飾が行われ得る、付加ヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書において、センス鎖が、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として記載されるステム－ループを（例えば、その３’末端に）含み、Ｓ１が、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間で最大約１０個のヌクレオチドの長さ（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチドの長さ）のループを形成するものである。図１は、そのようなオリゴヌクレオチドの非限定的な例を示す。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構造Ｓ１－Ｌ－Ｓ２を有するステム－ループのループ（Ｌ）は、トリループである。いくつかの実施形態では、トリループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、リガンド（例えば、送達リガンド）、およびそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ステム－ループのループは、テトラループである（例えば、ニックの入ったテトラループ構造内にある）。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを含有し得る。典型的には、テトラループは、４～５個のヌクレオチドを有する。
二本鎖の長さ
いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１２個（例えば、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、または少なくとも２１個）のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２～３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２７、１２～２２、１５～２５、１８～３０、１８～２２、１８～２５、１８～２７、１８～３０、１９～３０、または２１～３０個のヌクレオチドの長さ）の範囲である。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２１個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２６個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２７個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも２９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、少なくとも３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間に形成される二本鎖は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二本鎖は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の二本鎖は、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の全長に及ぶ。
オリゴヌクレオチド末端
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、いずれかまたは両方の鎖の末端は、平滑末端を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを有する非対称性二本鎖領域を形成する、別個の鎖である。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、いずれかまたは両方の鎖の末端は、１個以上のヌクレオチドを含むオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、オーバーハングを含む１個以上のヌクレオチドは、不対ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端は、平滑末端を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、いずれかまたは両方の鎖の３’末端は、１個以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、１個以上のヌクレオチドを含む３’オーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、約１（１）～１９（１９）、１（１）～１８（１８）、１（１）～１７（１７）、１（１）～１６（１６）、１（１）～１５（１５）、１（１）～１４（１４）、１（１）～１３（１３）、１（１）～１２（１２）、１（１）～１１（１１）、１（１）～１０（１０）、１（１）～９（９）、１（１）～８（８）、１（１）～７（７）、１（１）～６（６）、１（１）～５（５）、１（１）～４（４）、１（１）～３（３）、または約１（１）～２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、（１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、３（３）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、４（４）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、５（５）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、６（６）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、７（７）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、８（８）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、９（９）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１０（１０）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１１（１１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１２（１２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１３（１３）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１４（１４）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１５（１５）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１６（１６）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１７（１７）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１８（１８）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、１９（１９）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、２０（２０）個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、いずれかまたは両方の鎖の５’末端は、１個以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、１個以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、１個以上のヌクレオチドを含む５’オーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、約１（１）～２０（２０）個のヌクレオチドの長さ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または約２０個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、約１（１）～１９（１９）、１（１）～１８（１８）、１（１）～１７（１７）、１（１）～１６（１６）、１（１）～１５（１５）、１（１）～１４（１４）、１（１）～１３（１３）、１（１）～１２（１２）、１（１）～１１（１１）、１（１）～１０（１０）、１（１）～９（９）、１（１）～８（８）、１（１）～７（７）、１（１）～６（６）、１（１）～５（５）、１（１）～４（４）、１（１）～３（３）、または約１（１）～２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、（１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、３（３）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、４（４）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、５（５）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、６（６）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、７（７）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、８（８）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、９（９）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１０（１０）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１１（１１）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１２（１２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１３（１３）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１４（１４）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１５（１５）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１６（１６）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１７（１７）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１８（１８）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、１９（１９）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、５’オーバーハングは、２０（２０）個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、センスおよび／もしくはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端を含む１個以上の（例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上）のヌクレオチドは、修飾されている。例えば、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の１または２個の末端ヌクレオチドは、修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後のヌクレオチドは、それが２’修飾を含むか、またはそれが２’－Ｏ－メトキシエチルを含むように修飾されている。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１または２個の末端ヌクレオチドは、標的と相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端の最後の１または２個のヌクレオチドは、標的と相補的ではない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖の３’末端は、本明細書に記載のステップ－ループを含み、アンチセンス鎖の３’末端は、本明細書に記載の３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、本明細書に記載のニックの入ったテトラループ構造を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖の３’末端は、ステム－ループを含み、ループは、本明細書に記載のテトラループであり、アンチセンス鎖の３’末端は、本明細書に記載の３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、２（２）個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングを含む２（２）個のヌクレオチドは、両方がグアニン（Ｇ）核酸塩基を含む。典型的には、アンチセンス鎖の３’オーバーハングを含むヌクレオチドの一方または両方は、標的ｍＲＮＡと相補的ではない。
オリゴヌクレオチド修飾
ａ．糖修飾
いくつかの実施形態では、修飾糖（本明細書では糖類似体とも呼ばれる）は、例えば、糖の２’、３’、４’、および／または５’炭素位置で１個以上の修飾が生じる、修飾デオキシリボースまたはリボース部分を含む。いくつかの実施形態では、修飾糖はまた、ロックド核酸（「ＬＮＡ」、例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｎ ５４：３６０７－３６３０を参照されたい）、非ロックド核酸（「ＵＮＡ」、例えば、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ－Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ ２：ｅ１０３を参照されたい）、および架橋核酸（「ＢＮＡ」、例えば、Ｉｍａｎｉｓｈｉ ａｎｄ Ｏｂｉｋａ（２００２）Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ）２１：１６５３－１６５９を参照されたい）に存在するものなどの非天然の代替炭素構造も含み得る。
いくつかの実施形態では、糖におけるヌクレオチド修飾は、２’修飾を含む。いくつかの実施形態では、２’－修飾は、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、または２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－Ｆ、２’－ＯＭｅまたは２’－ＭＯＥである。いくつかの実施形態では、糖における修飾は、糖環の１個以上の炭素の修飾を含み得る、糖環の修飾を含む。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の２’－酸素が糖の１’－炭素もしくは４’－炭素と連結すること、または２’－酸素が、エチレンもしくはメチレン架橋を介して１’－炭素もしくは４’－炭素と連結することを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’炭素から３’炭素への結合を欠く非環式糖を有する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、例えば、糖の４’位にチオール基を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０個、またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖は、少なくとも約１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５個、またはそれ以上）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、少なくとも約１個の修飾ヌクレオチド（例えば、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０個、またはそれ以上）を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド（すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方）が修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾（例えば、２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅ、２’－ＭＯＥ、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－修飾（例えば、２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、異なる修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、実施例および配列表に示される修飾パターンを有するセンス鎖と、実施例および配列表に示される修飾パターンを有するアンチセンス鎖と、を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、２’－Ｆで修飾されたヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅで修飾されたヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾されたヌクレオチドを有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆおよび２’－ＯＭｅで修飾されたヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖のヌクレオチドの約１０～１５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％が２’－フルオロ修飾を含む、センス鎖を含む。いくつかの実施形態では、１１％のセンス鎖のヌクレオチドが、２－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス鎖のヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が２’－フルオロ修飾を含む、アンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの約３２％が、２－フルオロ修飾を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１５～２５％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または２５％の２’－フルオロ修飾を含むそのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド中の約１９％のヌクレオチドが、２’－フルオロ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、図１または実施例１２に記載される修飾パターンを有するセンス鎖配列、および図１または実施例１２に記載される修飾パターンを有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドでは、センス鎖の８位、９位、１０位、または１１位のうちの１個以上が、２’－Ｆ基で修飾されている。他の実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドでは、センス鎖における１～７位および１２～２０位のヌクレオチドの各々の糖部分が、２’－ＯＭｅで修飾されている。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、糖部分の２’位において２’－Ｆで修飾された３個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、２位、５位、および１４位の糖部分、ならびに任意選択で、アンチセンス鎖の１位、３位、７位、および１０位のヌクレオチドの最大３個が、２’－Ｆで修飾されている。いくつかの実施形態では、２位、５位、および１４位の糖部分、ならびに任意選択で、アンチセンス鎖の３位、４位、７位、および１０位のヌクレオチドの最大３個が、２’－Ｆで修飾されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖の２位、５位、および１４位の位置の各々の糖部分が、２’－Ｆで修飾されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖の１位、２位、５位、および１４位の位置の各々の糖部分が、２’－Ｆで修飾されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖の２位、４位、５位、および１４位の位置の各々の糖部分が、２’－Ｆで修飾されている。さらに他の実施形態では、アンチセンス鎖の１位、２位、３位、５位、７位、および１４位の位置の各々の糖部分が、２’－Ｆで修飾されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖の２位、３位、４位、５位、７位、および１４位の位置の各々の糖部分が、２’－Ｆで修飾されている。さらに別の実施形態では、アンチセンス鎖の１位、２位、３位、５位、１０位、および１４位の位置の各々の糖部分が、２’－Ｆで修飾されている。他の実施形態では、アンチセンス鎖の２位、３位、４位、５位、１０位、および１４位の位置の各々の糖部分が、２’－Ｆで修飾されている。別の実施形態では、アンチセンス鎖の２位、３位、５位、７位、１０位、および１４位の位置の各々の糖部分が、２’－Ｆで修飾されている。さらに別の実施形態では、アンチセンス鎖の２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位の位置の各々の糖部分が、２’－Ｆで修飾されている。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、または２２位の糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－ＯＭｅで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、または２２位の糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、または２２位の糖部分を有するアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された８～１１位の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された３位、８位、９位、１０位、１２位、１３位、および１７位の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された１～７位および１２～１７位または１２～２０位の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された１～７位、１２～２７位、および３１～３６位の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたセンス鎖の１～７位および１２～１７位または１２～２０位のヌクレオチドの各々の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅで修飾された１～２位、４～７位、１１位、１４～１６位、および１８～２０位の糖部分を有するセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾されたセンス鎖の１～２位、４～７位、１１位、１４～１６位、および１８～２０位のヌクレオチドの各々の糖部分を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位の糖部分を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－ＯＭｅで修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位の糖部分を有するセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－プロパルギル、２’－Ｏ－プロピルアミン、２’－アミノ、２’－エチル、２’－アミノエチル（ＥＡ）、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－［２－（メチルアミノ）－２－オキソエチル］（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸（２’－ＦＡＮＡ）から成る群から選択される修飾で修飾された１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位、２３位、２４位、２５位、２６位、２７位、２８位、２９位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、または３６位の糖部分を有するセンス鎖を含む。
ｂ．５’末端リン酸
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端リン酸基は、Ａｇｏ２との相互作用を増強する。しかしながら、５’－リン酸基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼまたは他の酵素を介した分解の影響を受けやすい場合があり、それにより、インビボでそれらの性能および／またはバイオアベイラビリティが制限され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、そのような分解に耐性のある５’リン酸の類似体を含む。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートであってもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖の１’末端は、天然の５’リン酸基の静電特性および立体特性を模倣する化学的部分（「リン酸模倣物」）に付着している。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖の４’炭素位置におけるリン酸類似体（「４’リン酸類似体」と呼ばれる）を有する。例えば、国際特許出願公開第２０１８／０４５３１７号を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’リン酸類似体を含む。いくつかの実施形態では、リン酸類似体は、オキシメチル基の酸素原子が糖部分（例えば、その４’炭素）またはその類似体と結合しているオキシメチルホスホネートである。他の実施形態では、４’－リン酸類似体は、チオメチルホスホネートまたはアミノメチルホスホネートであり、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子が、糖部分またはその類似体の４’－炭素と結合している。特定の実施形態では、４’－リン酸類似体は、オキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態では、オキシメチルホスホネートは、式－Ｏ－ＣＨ２－ＰＯ（ＯＨ）２または－Ｏ－ＣＨ２－ＰＯ（ＯＲ）２（式中、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ３、アルキル基、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、ＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｉ（ＣＨ３）３、または保護基から選択される）によって表される。特定の実施形態では、アルキル基は、ＣＨ２ＣＨ３である。より典型的には、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ３、またはＣＨ２ＣＨ３から選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドに４’－リン酸類似体を含むアンチセンス鎖を含み、５’末端ヌクレオチドは、以下の構造を含む。
４’－Ｏ－モノメチルホスホネート－２’－Ｏ－メチルウリジンホスホロチオエート［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＵｓ］
化学式１：
ｃ．修飾ヌクレオチド間結合
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、リン酸修飾または置換は、少なくとも約１個（例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも５個）の修飾ヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドをもたらし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個は、約１～約１０個（例えば、１～１０、２～８、４～６、３～１０、５～１０、１～５、１～３、または１～２個）の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾ヌクレオチド間結合を含む。
修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロジチオエート結合、４’－Ｏ－メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオンアルキルホスホトリエステル結合、ホスホルアミダイト結合、ホスホネート結合、またはボラノホスフェート結合であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個の少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個の少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合は、４’－Ｏ－メチレンホスホネート結合である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位および２位、アンチセンス鎖の１位および２位、アンチセンス鎖の２位および３位、アンチセンス鎖の３位および４位、アンチセンス鎖の２０位および２１位、ならびにアンチセンス鎖の２１位および２２位のうちの１つ以上との間にホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、センス鎖の１位および２位、アンチセンス鎖の１位および２位、アンチセンス鎖の２位および３位、アンチセンス鎖の２０位および２１位、ならびにアンチセンス鎖の２１位および２２位の各々の間にホスホロチオエート結合を有する。
ｄ．塩基修飾
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、１個以上の修飾核酸塩基を有する。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、ヌクレオチド糖部分の１’位に結合される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素含有塩基である。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８／０２７４４６２号を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含む。しかしながら、特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含有しない（脱塩基）。
いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部分の１’位、またはヌクレオチド糖部分置換中の同等の位置に位置する複素環部分であり、二本鎖で存在する場合、二本鎖の構造を実質的に改変することなく、１つを超えるタイプの塩基の反対側に位置付けることができる。いくつかの実施形態では、標的核酸と完全に相補的である参照一本鎖核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的な核酸で形成される二本鎖よりも低いＴｍを有する、標的核酸との二本鎖を形成する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基が塩基で置き換えられ、単一のミスマッチを生成する、参照一本鎖核酸と比較すると、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチ塩基を含む核酸で形成される二本鎖よりも高いＴｍを有する標的核酸と二本鎖を形成する。
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例には、イノシン、１－β－Ｄ－リボフラノシル－５－ニトロインドール、および／または１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－ニトロピロールが含まれるが、これらに限定されない（米国特許出願公開第２００７／０２５４３６２号、Ｖａｎ Ａｅｒｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：４３６３－４３７０、Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２３６１－６６、およびＬｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４０３９－４３を参照されたい）。
ｅ．可逆的修飾
標的細胞に到達する前にインビボ環境からオリゴヌクレオチドを保護するための特定の修飾が行われ得るが、それらは、オリゴヌクレオチドが標的細胞の細胞質ゾルに到達すると、オリゴヌクレオチドの効力または活性を低減し得る。分子が細胞の外部で望ましい特性を保持し、次いで、細胞の細胞質環境に入ると除去されるような可逆的修飾が行われ得る。可逆的修飾は、例えば、細胞内酵素の作用によって、または細胞内の化学条件によって（例えば、細胞内グルタチオンによる還元を介して）除去され得る。
いくつかの実施形態では、可逆的に修飾されたヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分を含む。典型的には、核酸分子は、ヌクレオチド間ジホスフェート結合によって作られる負電荷をマスクし、細胞取り込みおよびヌクレアーゼ耐性を改善するように、環状ジスルフィド部分で化学的に修飾されている。米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６９号、国際特許公開第ＷＯ ２０１４／０８８９２０号および同第ＷＯ ２０１５／１８８１９７号、ならびにＭｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：１２５６－６３を参照されたい。ヌクレオチド間ジホスフェート結合のこの可逆的修飾は、細胞質ゾル（例えば、グルタチオン）の還元環境によって細胞内で切断されるように設計されている。先の例には、細胞内で切断可能であると報告された中和ホスホトリエステル修飾が含まれる（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：９４０－５０を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、そのような可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼおよび他の厳しい環境条件（例えば、ｐＨ）に曝露されるインビボ投与（例えば、細胞の血液および／またはリソソーム／エンドソーム区画の通過）中の保護を可能にする。細胞外空間と比較してグルタチオンのレベルがより高い細胞の細胞質ゾル内に放出されると、修飾は逆転し、結果として切断されたオリゴヌクレオチドとなる。不可逆的化学修飾を使用して利用可能な選択肢と比較して、可逆的なグルタチオン感受性部分を使用して、立体的により大きい化学基を目的のオリゴヌクレオチドに導入することが可能である。これは、これらのより大きい化学基が細胞質ゾル内で除去され、したがって、細胞の細胞質ゾル内部のオリゴヌクレオチドの生物学的活性に干渉しないはずであるためである。結果として、これらのより大きい化学基は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ耐性、親油性、荷電、熱安定性、特異性、および低減された免疫原性などの様々な利点を付与するように操作され得る。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分の構造は、その放出の動態を修飾するように操作され得る。
いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、ヌクレオチドの糖に付着している。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、修飾ヌクレオチドの糖の２’－炭素に付着している。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドである場合、糖の５’－炭素に位置する。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドである場合に、糖の３’－炭素に位置する。いくつかの実施形態では、グルタチオン感受性部分は、スルホニル基を含む。例えば、２０１６年８月２３日に出願された、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆと題する米国仮特許出願第６２／３７８，６３５号を参照されたい。
ＳＴＡＴ３のオリゴヌクレオチド阻害剤
いくつかの態様では、本開示は、とりわけ、ＳＴＡＴ３発現を低減または阻害するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書のＳＴＡＴ３発現を阻害するオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを標的とする。ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００１３６９５１２．１）は、配列番号８５またはＮＭ＿１３９２７６．３（配列番号１２１７）として記載される。ＳＴＡＴ３は、従来の癌療法の公知の標的である。
ＭＤＳＣの寛容原性活性は、発癌性転写因子であるシグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）によって制御される（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，，Ｉｎｔ Ｊ．Ｍｏｌ Ｓｃｉ（２０１８）１９（６）：１８０３）。ＳＴＡＴ３はまた、広範囲の癌のタイプにわたって、かつインビトロおよびインビボの前臨床モデルにおいて高度に発現されることが知られている（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴ．ＲＥＶ．ＣＡＮＣＥＲ（２０１９）１９：８２－９６）。ＳＴＡＴ３の阻害は、腫瘍細胞の選択的なアポトーシスおよび下流標的遺伝子の調節を通した腫瘍増殖阻害につながる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５（３）：６６８－７９（２０１９））。ＳＴＡＴ３は、免疫抑制腫瘍微小環境に対するその十分に裏付けられた寄与から、免疫腫瘍学において特に興味深い。ＳＴＡＴ３は、Ｔ細胞によって発現される阻害性受容体を上方制御することによって、かつそのリガンド（ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１）の発現を介して、ＩＦＮ
の分泌を増加させることによって、免疫抑制腫瘍微小環境に寄与する（（Ｂｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９６（９）：１０２７－３４（２０１７））。抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害は、他の寛容原性刺激に応答して抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞のプライミングをもたらすことが長い間知られている（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９：４２５－３６（２００３））。さらに、ＭＤＳＣ上のリン酸化ＳＴＡＴ３は、転写制御を通して、アミノ酸アルギニンなどの抑制構成要素を調節することによって、抑制腫瘍微小環境の調節に直接的に寄与する（Ｖａｓｑｕｅｓ－Ｄｕｎｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１５（３）：６６８－７９（２０１３））。長年にわたり、ＳＴＡＴ３を治療標的とするいくつかの方法論が研究されてきた。タンパク質の直接的な標的化は魅力的であるが、真の標的は、複数のクラスの化合物がその活性を効果的に阻害することができなかったことを示す過去のデータにより、「創薬不可能」な標的の一例として保持されてきたタンパク質間相互作用である（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，ＣＡＮＣＥＲＳ（２０１９）１１（１１）：１６８１，Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬ ＣＡＮＣＥＲ（２０２０）１９：１４５）。さらに、いくつかの組織にわたるＳＴＡＴ３のユビキタスな発現は、重度のオンターゲット毒性についての懸念をもたらした（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ，２６（８）：８８３－８７（２０１７）、（Ｋｏｒｔｙｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＣＡＮＣＥＲ ＩＭＭＵＮＯＬ ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲ（２０１７）６６（８）：９７９－８８）。
ＳＴＡＴ３標的配列
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを含む標的配列に標的化される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその一部分、断片、もしくは鎖（例えば、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはガイド鎖）は、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを含む標的配列に結合またはアニールし、それによってＳＴＡＴ３発現を阻害する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、インビボでＳＴＡＴ３発現を阻害する目的で、ＳＴＡＴ３標的配列に標的化される。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的配列に標的化されるオリゴヌクレオチドによるＳＴＡＴ３発現の阻害の量または程度は、オリゴヌクレオチドの効力と相関する。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的配列に標的化されるオリゴヌクレオチドによるＳＴＡＴ３発現の阻害の量または程度は、オリゴヌクレオチドで治療されるＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象または患者における治療効果の量または程度と相関する。
複数の異なる種（例えば、ヒト、カニクイザル、マウス、およびラット；例えば、実施例１１を参照されたい）のｍＲＮＡを含む、ＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列の検査を通して、ならびにインビトロおよびインビボ試験の結果として（例えば、実施例１２および実施例１３を参照されたい）、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの特定のヌクレオチド配列が、他のものよりもオリゴヌクレオチドに基づく阻害を受けやすく、したがって本明細書のオリゴヌクレオチドの標的配列として有用であることが発見された。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ）のセンス鎖は、ＳＴＡＴ３標的配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｄｓＲＮＡのセンス鎖の一部分または領域は、ＳＴＡＴ３標的配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列は、配列番号８５の配列を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列は、配列番号１２１７の配列を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列は、配列番号８９～２８０の配列のうちのいずれか１つを含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列は、配列番号１０８に記載される配列を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列は、配列番号１４０に記載される配列を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列は、配列番号１４１に記載される配列を含むか、またはそれから成る。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列は、配列番号１４７に記載される配列を含むか、またはそれから成る。
ＳＴＡＴ３標的化配列
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、細胞におけるｍＲＮＡを標的とし、その発現を低減または阻害する目的で、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡに対する相補性の領域（例えば、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの標的配列内）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、相補的な（ワトソン・クリック）塩基対合によってＳＴＡＴ３標的配列に結合またはアニールする相補性の領域を有する、ＳＴＡＴ３標的配列（例えば、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはガイド鎖）を含む。標的化配列または相補性の領域は、概して、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を阻害する目的で、それへのオリゴヌクレオチド（またはその鎖）の結合またはアニーリングを可能にするための好適な長さおよび塩基含有量を有する。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、少なくとも約２１個、少なくとも約２２個、少なくとも約２３個、少なくとも約２４個、少なくとも約２５個、少なくとも約２６個、少なくとも約２７個、少なくとも約２８個、少なくとも約２９個、または少なくとも約３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、約１２～約３０個（例えば、１２～３０個、１２～２２個、１５～２５個、１７～２１個、１８～２７個、１９～２７個、または１５～３０個）のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、１８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２１個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、２４個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８９～２８０のうちのいずれか１つの配列に対して相補的な標的配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、１８個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８９～２８０のうちのいずれか１つの配列に対して相補的な標的配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４７３～６６４のうちのいずれか１つの配列に対して相補的な標的配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４７３～６６４のうちのいずれか１つの配列に対して相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２１個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４７３～６６４のうちのいずれか１つの配列に対して相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４７３～６６４のうちのいずれか１つの配列に対して相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２３個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４７３～６６４のうちのいずれか１つの配列に対して相補的な標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、２４個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３標的配列と完全に相補的である標的化配列または相補性の領域（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖またはガイド鎖）を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、ＳＴＡＴ３標的配列に対して部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３の配列またはＳＴＡＴ３に対して完全に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３の配列またはＳＴＡＴ３に対して部分的に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８９～２８０のうちのいずれか１つの配列に対して完全に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０８、１４０、１４１、および１４７に記載される配列に対して完全に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８９～２８０のうちのいずれか１つの配列に対して部分的に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０８、１４０、１４１、および１４７に記載される配列に対して部分的に相補的である標的化配列または相補性の領域を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、約１２～約３０個のヌクレオチドの長さ（例えば、１２～３０、１２～２８、１２～２６、１２～２４、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１４～２２、１６～２０、１８～２０、または１８～１９個のヌクレオチドの長さ）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを含むヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、１９個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号８９～２８０のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、任意選択で、ヌクレオチドの連続する配列は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０８、１４０、１４１、および１４７のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、１９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４７３～６６４のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、２０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号４９２、５２４、５２５、および５３１のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、ヌクレオチドの連続する配列は、２０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ３標的配列の連続するヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドの標的化配列または相補性の領域は、アンチセンス鎖の全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ３標的配列の連続するヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドの相補性の領域は、アンチセンス鎖の全長の一部分に及ぶ。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３の標的配列またはＳＴＡＴ３のヌクレオチド１～２０に及ぶヌクレオチドの連続する区間に対して少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的である相補性の領域（例えば、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖上）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）の標的化配列または相補性の領域は、配列番号８９～２８０のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列に対して相補的であり、アンチセンス鎖の全長に及ぶ。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの標的化配列または相補性の領域は、配列番号８９～２８０のヌクレオチドの連続する配列に対して相補的であり、アンチセンス鎖の全長の一部分に及ぶ。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、配列番号４７３～６６４のうちのいずれか１つに記載される配列のヌクレオチド１～１９または１～２０に及ぶヌクレオチドの連続する区間に対して少なくとも部分的に（例えば、完全に）相補的である相補性の領域（例えば、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖上）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、対応するＳＴＡＴ３標的配列と１個以上のｂｐミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列または相補性の領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡに結合もしくはアニールする標的化配列もしくは相補性の領域の能力、および／またはＳＴＡＴ３発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力が維持されることを条件として、対応するＳＴＡＴ３標的配列と、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個などのミスマッチを有し得る。あるいは、標的化配列または相補性の領域は、適切なハイブリダイゼーション条件下でＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡに結合もしくはアニールする標的化配列もしくは相補性の領域の能力、および／あるいはＳＴＡＴ３発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力が維持されることを条件として、対応するＳＴＡＴ３標的配列と１個を超えない、２個を超えない、３個を超えない、４個を超えない、または５個を超えないミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と１個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と２個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と３個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と４個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と５個のミスマッチを有する標的化配列または相補性の領域を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、対応する標的配列と２個以上のミスマッチ（例えば、２、３、４、５個、またはそれ以上のミスマッチ）の標的化配列または相補性の領域を含み、ミスマッチのうちの少なくとも２個（例えば、全て）は、連続して位置付けられるか（例えば、２、３、４、５個、もしくはそれ以上のミスマッチが並んでいる）、またはミスマッチは、標的化配列もしくは相補性の領域全体にわたって散在する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８９～２８０のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、対応するＳＴＡＴ３標的配列と最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個などのミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８９～２８０のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、対応するＳＴＡＴ３標的配列と１個を超えない、２個を超えない、３個を超えない、４個を超えない、または５個を超えないミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０８、１４０、１４１、および１４７のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、対応するＳＴＡＴ３標的配列と最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個などのミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０８、１４０、１４１、および１４７のうちのいずれか１つのヌクレオチドの連続する配列に対して相補的である標的化配列または相補性の領域を含み、標的化配列または相補性の領域は、対応するＳＴＡＴ３標的配列と１個を超えない、２個を超えない、３個を超えない、４個を超えない、または５個を超えないミスマッチを有し得る。
標的化リガンド
いくつかの実施形態では、本開示のＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドを、１個以上の細胞または１個以上の器官に標的化することが望ましい。このような戦略は、他の器官における望ましくない影響を回避するか、またはオリゴヌクレオチドから利益を得ないであろう細胞、組織もしくは器官へのオリゴヌクレオチドの必要以上の損失を回避するのに役立ち得る。１個以上の細胞または１個以上の器官へのオリゴヌクレオチドの標的化は、様々なアプローチを通して達成され得る。組織または細胞特異的抗体、小分子、または標的化リガンドへのオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、１個以上の標的細胞または組織への送達を促進し、かつオリゴヌクレオチドの蓄積を改変することができる（Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０：４４４）。例えば、飽和脂肪酸（例えば、Ｃ２２）へのオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、従来のオリゴヌクレオチドリガンドよりも容易にそのようなリガンドを取り込む脂肪組織または免疫細胞のような細胞または組織への送達を促進し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、組織、細胞、または器官への標的化および／または送達を促進するように（例えば、肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を促進するように）修飾される。特定の実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、免疫系の細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進するように修飾される。特定の実施形態では、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、骨髄由来抑制細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進するように修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた少なくとも１個のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６個以上のヌクレオチド）を含む。
いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質の一部分（例えば、抗体もしくは抗体断片）、または脂質を含む。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、アプタマーである。例えば、標的化リガンドは、腫瘍血管系または神経膠腫細胞を標的とするために使用されるＲＧＤペプチド、腫瘍血管系またはストーマを標的とするＣＲＥＫＡペプチド、ＣＮＳ血管系で発現されるトランスフェリン受容体を標的とするためのトランスフェリング（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）、ラクトフェリン、もしくはアプタマー、または神経膠腫細胞上のＥＧＦＲを標的とする抗ＥＧＦＲ抗体であってもよい。特定の実施形態では、標的化リガンドは、１個以上のＧａｌＮＡｃ部分である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）のヌクレオチドは、各々、別個の標的化リガンドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの２～４個のヌクレオチドは、各々、別個の標的化リガンドとコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、標的化リガンドが歯ブラシの毛に似ており、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに似ているように、標的化リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの末端で２～４個のヌクレオチドとコンジュゲートされている（例えば、標的化リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’末端での２～４個のヌクレオチドのオーバーハングまたは伸長部とコンジュゲートされている）。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の５’または３’末端のいずれかにステム－ループを含み得、ステムのループの１、２、３、または４個のヌクレオチドは、個別に標的化リガンドとコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、本開示によって提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、センス鎖の３’末端にステム－ループを含み、ステム－ループのループは、トリループまたはテトラループを含み、トリループまたはテトラループを含む３または４個のヌクレオチドは、丁重に（ｒｅｓｐｅｃｔｆｕｌｌｙ）、標的化リガンドに個別にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、本開示によって提供されるオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド）は、センス鎖の３’末端にステム－ループを含み、ステム－ループのループは、テトラループを含み、テトラループの３個のヌクレオチドは、標的化リガンドと個別にコンジュゲートされている。
ＧａｌＮＡｃは、ＡＳＧＰＲの高親和性リガンドであり、これは主に肝細胞の類洞表面上に発現し、末端ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ残基（アシアロ糖タンパク質）を含む循環糖タンパク質の結合、内在化、およびその後の除去に主要な役割を果たしている。本開示のオリゴヌクレオチドとのＧａｌＮＡｃ部分のコンジュゲーション（間接的または直接的のいずれか）を使用して、これらのオリゴヌクレオチドを細胞上に発現するＡＳＧＰＲに対して標的化することができる。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個以上のＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされ、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドを、ヒト肝臓細胞（例えば、ヒト肝細胞）上に発現するＡＳＧＰＲに対して標的化する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチドを肝臓に対して標的化する。
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、一価ＧａｌＮＡｃ部分と直接的または間接的にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個を超える一価ＧａｌＮＡｃと直接的または間接的にコンジュゲートされている（すなわち、２、３、または４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされ、典型的には、３または４個の一価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされている）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１個以上の二価ＧａｌＮＡｃ、三価ＧａｌＮＡｃ、または四価ＧａｌＮＡｃ部分とコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの１個以上（例えば、１、２、３、４、５、または６個）のヌクレオチドは、各々、ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、テトラループの２～４個のヌクレオチドは、各々、別個のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、トリループの１～３ヌクレオチドは、各々、別個のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分が歯ブラシの毛に似ており、オリゴヌクレオチドが歯ブラシに似ているように、標的化リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の両端で２～４個のヌクレオチドにコンジュゲートされている（例えば、リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’末端上で２～４個のヌクレオチドのオーバーハングまたは伸長部にコンジュゲートされている）。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のヌクレオチドとコンジュゲートされている。例えば、４個のＧａｌＮＡｃ部分は、センス鎖のテトラループ内のヌクレオチドにコンジュゲートされ得、各ＧａｌＮＡｃ部分は、１個のヌクレオチドにコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、テトラループは、アデニンヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、テトラループ（ｔｅｔｒａＬ）は、化学式２（Ｘ＝ヘテロ原子）で以下に示されるように、本明細書に記載の任意のリンカーを介してテトラループのいずれか１個以上のグアニンヌクレオチドに付着した一価ＧａｌＮＡｃ部分を有する。
いくつかの実施形態では、テトラループ（ｔｅｔｒａＬ）は、化学式３（Ｘ＝ヘテロ原子）で以下に示されるように、本明細書に記載の任意のリンカーを介してテトラループのいずれか１個以上のアデニンヌクレオチドに付着した一価ＧａｌＮＡｃ部分を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、化学式４で以下に示されるように、［ａｄｅｍＧ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－グアニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、グアニンヌクレオチドに付着した一価ＧａｌＮＡｃを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、化学式５で以下に示されるように、［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、アデニンヌクレオチドに付着した一価ＧａｌＮＡｃを含む。
そのようなコンジュゲーションの一例は、５’から３’にヌクレオチド配列ＧＡＡＡ（Ｌ＝リンカー、Ｘ＝ヘテロ原子）を含むループについて以下（化学式６）に示され、ステム付着点が示される。そのようなループは、例えば、図１に示されるセンス鎖の２７～３０位に存在し得る。化学式では、
は、オリゴヌクレオチド鎖への付着点を記述するために使用される（化学式６）。
適切な方法または化学（例えば、クリックケミストリ）を使用して、標的化リガンドをヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、アセタール系リンカーを使用して、標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１つのヌクレオチドとコンジュゲートする。アセタール系リンカーは、例えば、国際特許出願公開第２０１６／１００４０１号に開示されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、安定している。ＧａｌＮＡｃ部分がアセタールリンカーを使用してループのヌクレオチドに付着している、５’から３’にヌクレオチドＧＡＡＡを含むループについて、例が以下に示される（化学式７および化学式８）。そのようなループは、例えば、図１に示されるセンス鎖のうちのいずれか１個の２７～３０位に存在し得る。化学式では、
は、オリゴヌクレオチド鎖への付着点である（化学式７および化学式８）。
、または
上述のように、様々な適切な方法または化学合成技術（例えば、クリックケミストリ）を使用して、標的化リガンドをヌクレオチドに結合することができる。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、クリックリンカーを使用してヌクレオチドとコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、アセタール系リンカーを使用して、標的化リガンドを本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個のヌクレオチドとコンジュゲートする。アセタール系リンカーは、例えば、国際特許出願公開第２０１６／１００４０１号に開示されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、不安定リンカーである。しかしながら、他の実施形態では、リンカーは、安定リンカーである。
いくつかの実施形態では、標的化リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分）とｄｓＲＮＡとの間に二本鎖伸長（例えば、最大３、４、５、または６ｂｐの長さ）が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、それにコンジュゲートされたＧａｌＮＡｃを有していない。
コンジュゲートＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドの構造
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を有するヌクレオチド配列と、１個以上の標的化リガンドとを含み、ヌクレオチド配列は、式Ｉ－ａ：
；
またはその薬学的に許容可能な塩
（式中、
Ｂは、核酸塩基または水素であり、
Ｒ１およびＲ２は独立して、水素、ハロゲン、ＲＡ、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）Ｒ２、もしくは－ＳｉＲ３であるか、または
同じ炭素上のＲ１およびＲ２が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する３～７員の飽和もしくは部分不飽和環を形成し、
各ＲＡは独立して、Ｃ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であり、
各Ｒは独立して、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であるか、あるいは、
同じ原子上の２つのＲ基が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、ケイ素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和、部分不飽和、またはヘテロアリール環を形成し、
各標的化リガンドは、脂質コンジュゲート部分（ＬＣ）、炭水化物、アミノ糖、またはＧａｌＮＡｃから選択され、各ＬＣは独立して、飽和もしくは不飽和、直鎖、または分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖を含む脂質コンジュゲート部分であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
各－Ｃｙ－は独立して、フェニレニル；８～１０員の二環式アリーレニル；４～７員の飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロカルボシクリレニル；８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリーレニル、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１～５個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式ヘテロアリーレニル、から選択される任意選択で置換された二価の環であり、
ｎは、１～１０であり、
Ｌは、共有結合、または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－、－Ｖ１ＣＲ２Ｗ１－、または
によって置き換えられており、
ｍは、１～５０であり、
Ｘ１、Ｖ１、およびＷ１は独立して、－Ｃ（Ｒ）２－、－ＯＲ、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、または－ＮＲ－であり、
Ｙは、水素、好適なヒドロキシル保護基、
であり、
Ｒ３は、水素、好適な保護基、好適なプロドラッグ、またはＣ１－６脂肪族、フェニル、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環、ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される任意選択で置換された基であり、
Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲであり、
Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＢＨ２－、または共有結合であり、
Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
Ｙ２は、水素、好適な保護基、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
Ｚは、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－、または－ＣＲ２－である）によって表される１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた１個以上のヌクレオシド（核酸）を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、式ＩＩ－ａ：
またはその薬学的に許容可能な塩によって表される、標的化リガンドとコンジュゲートされた１個以上の核酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、式ＩＩ－ｂまたはＩＩ－ｃ：
またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
Ｌ１は、共有結合、一価または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－または
により置き換えられており、
Ｒ４は、水素、ＲＡ、または好適なアミン保護基であり、
Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲによって置き換えられている）によって表される、標的化リガンドとコンジュゲートされた１個以上の核酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、以下から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、以下から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、式ＩＩ－ＩｂまたはＩＩ－Ｉｃ：
またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
Ｂは、核酸塩基または水素であり、
ｍは、１～５０であり、
Ｘ１は、－Ｏ－、または－Ｓ－であり、
Ｙは、水素、
であり、
Ｒ３は、水素、または好適な保護基であり、
Ｘ２は、Ｏ、またはＳであり、
Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、または共有結合であり、
Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
Ｙ２は、水素、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
Ｒは、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基である）によって表される、標的化リガンドとコンジュゲートされた１個以上の核酸を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、以下から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。
いくつかの実施形態では、Ｒ５は、
である。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、１～１０個の標的化リガンドを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、１、２または３個の標的化リガンドを含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、二本鎖分子である。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ分子である。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化二本鎖オリゴヌクレオチドは、ステムループを含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループ内のヌクレオチドのいずれかにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて、５’から３’の第１のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第２のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第３のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループにおいて５’から３’の第４のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループ内のヌクレオチドのうちの１、２、３、または４個にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、リガンドは、ステムループ内のヌクレオチドのうちの３個にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化二本鎖オリゴヌクレオチドは、ステムループを含み、１個以上の脂質が、ステムループの１個以上のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化二本鎖オリゴヌクレオチドは、ステムループを含み、１個以上のＣ１６脂質が、ステムループの１個以上のヌクレオチドにコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化二本鎖オリゴヌクレオチドは、ステムループを含み、１個以上のＣ１８脂質が、ステムループの１個以上のヌクレオチドにコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、５’から３’に１～３６の番号が付けられた位置を有する３６個のヌクレオチドのセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２７位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２８位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２９位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の３０位にコンジュゲートされた脂質を含む。いくつかの実施形態では、３６ヌクレオチドセンス鎖は、２７～３０位を有するループを有するステムループを形成する。いくつかの実施形態では、脂質は、ループの２個以上の位置（例えば、３６－ヌクレオチドセンス鎖の２７位および２８位）にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２７位にコンジュゲートされたＣ１６脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２８位にコンジュゲートされたＣ１６脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２９位にコンジュゲートされたＣ１６脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の３０位にコンジュゲートされたＣ１６脂質を含む。いくつかの実施形態では、３６ヌクレオチドセンス鎖は、２７～３０位を有するループを有するステムループを形成する。いくつかの実施形態では、Ｃ１６脂質は、ループの２個以上の位置（例えば、３６－ヌクレオチドセンス鎖の２７位および２８位）にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２７位にコンジュゲートされたＣ１８脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２８位にコンジュゲートされたＣ１８脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の２９位にコンジュゲートされたＣ１８脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、３６ヌクレオチドセンス鎖の３０位にコンジュゲートされたＣ１８脂質を含む。いくつかの実施形態では、３６ヌクレオチドセンス鎖は、２７～３０位を有するループを有するステムループを形成する。いくつかの実施形態では、Ｃ１８脂質は、ループの２個以上の位置（例えば、３６－ヌクレオチドセンス鎖の２７位および２８位）にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチドは、１５～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖、および１５～４０個のヌクレオチドのセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二本鎖領域を形成し、アンチセンス鎖は、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞において発現されるＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含み、センス鎖は、その３’末端に、４個のヌクレオシドを含むテトラループを含むステム－ループを含み、その４個のヌクレオシドのうちの１個以上は、式ＩＩ－Ｉｂ：
、
（式中、Ｂは、アデニンおよびグアニン核酸塩基から選択され、Ｒ５は、炭化水素鎖である）によって表される。いくつかの実施形態では、ｍは、１であり、Ｘ１は、Ｏであり、Ｙ２は、ヌクレオシドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基であり、
Ｙは、
によって表され、Ｙ１は、ヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、Ｘ２は、Ｏであり、Ｘ３は、Ｏであり、Ｒ３は、Ｈである。
いくつかの実施形態では、炭化水素鎖は、Ｃ８－Ｃ３０炭化水素鎖である。いくつかの実施形態では、炭化水素鎖は、Ｃ１６炭化水素鎖である。いくつかの実施形態では、Ｃ１６炭化水素鎖は、以下によって表される。
いくつかの実施形態では、炭化水素鎖は、Ｃ１８炭化水素鎖である。いくつかの実施形態では、Ｃ１８炭化水素鎖は、以下によって表される。
。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号８９～２８０から選択される配列を含むセンス鎖を含み、センス鎖は、Ｃ１８脂質を含む。いくつかの実施形態では、テトラループの４ヌクレオシドは、５’から３’に１～４の番号が付けられ、１位は、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、２位は、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、３位は、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、４位は、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、センス鎖は、５’から３’に１～３６番号が付けられた位置を有する３６個のヌクレオチドであり、ステムループは、２１～３６位にヌクレオチドを含み、２７～３０位の１個以上のヌクレオシドは、式ＩＩ－Ｉｂによって表される。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、２２個のヌクレオチドである。
例示的なＳＴＡＴ３標的化オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３を標的とするオリゴヌクレオチドは、表３、４、５、１０、１１、１２、１３、および１４に記載されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドは、約２～６個の塩基対の二本鎖ステムおよび３～４個のヌクレオチドのループを有するステムループ構造を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、図１または実施例１２に記載される修飾パターンを含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３を標的とするオリゴヌクレオチドは、表３、４、５、１０、１１、１２、１３、および１４に記載されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドは、約２～６個の塩基対の二本鎖ステムおよび３～４個のヌクレオチドのループを有するステムループ構造を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖は、図１に記載される修飾パターンを含み、アンチセンス鎖は、５’末端ヌクレオチドの４’炭素においてオキシメチルホスホネートで修飾されている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８６のヌクレオチド配列を含むステムループを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、６個の塩基対の二本鎖ステム、および１個、２個、３個、または４個のＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドを含む４個のヌクレオチドのステムループを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドは、以下に示されるように、［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］または２’－アミノジエトキシメタノール－アデニン－ＧａｌＮＡｃと呼ばれる、アデニンヌクレオチドにコンジュゲートされた一価ＧａｌＮＡｃを含む。
いくつかの実施形態では、ステムループは、６個の塩基対の二本鎖ステム、およびヌクレオチド配列ＧＡＡＡを含むループと含み、各アデニンヌクレオチドは、ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃである。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９および１０、
（ｂ）それぞれ、配列番号３７および３８、
（ｃ）それぞれ、配列番号６５および６６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号６９および７０から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９および１０、
（ｂ）それぞれ、配列番号３７および３８、
（ｃ）それぞれ、配列番号６５および６６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号６９および７０から選択されるヌクレオチド配列を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖およびアンチセンス鎖は、以下のパターンに基づいて修飾されている。
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ＃］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
（キーは、表１に提供される）。いくつかの実施形態では、Ｃ＃は、Ｃ１６またはＣ１８である。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｂ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、
（ｃ）それぞれ、配列番号８７６および９６６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択されるヌクレオチド配列を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖およびアンチセンス鎖は、以下のパターンに基づいて修飾されている。
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ＃］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
（キーは、表１に提供される）。いくつかの実施形態では、Ｃ＃は、Ｃ１６またはＣ１８である。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｂ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、
（ｃ）それぞれ、配列番号８７６および９６６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択されるヌクレオチド配列を含む、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖およびアンチセンス鎖は、以下のパターンに基づいて修飾されている。
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＸ－Ｃ＃］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
（キーは、表１に提供される）。いくつかの実施形態では、Ｃ＃は、Ｃ１６またはＣ１８である。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１１および１２、
（ｂ）それぞれ、配列番号３９および４０、
（ｃ）それぞれ、配列番号６７および６８、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号７１および７２から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８１に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８２に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８３に記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８４に記載される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号８７および６８に記載されるヌクレオチド配列を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、それぞれ、配列番号８８および７１に記載されるヌクレオチド配列を有するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８９～２８０から選択されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８５７～９４６から選択されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８５７～８８８から選択されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８８９～９１２から選択されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９１３～９３４から選択されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９３５～９４６から選択されるセンス鎖配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９４７～１０３６から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９４７～９７８から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９７９～１００２から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１００３～１０２４から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０２５～１０３６から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８５７～９４６から選択されるセンス鎖配列、および配列番号９４７－１０３６から選択されるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８５７～８８８から選択されるセンス鎖配列、および配列番号９４７－９７８から選択されるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８８９～９１２から選択されるセンス鎖配列、および配列番号９７９～１００２から選択されるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９１３～９３４から選択されるセンス鎖配列、および配列番号１００３～１０２４から選択されるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９３５～９４６から選択されるセンス鎖配列、および配列番号１０２５～１０３６から選択されるアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０３７～１１２６から選択されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０３７～１０６８から選択されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０６９～１０９２から選択されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０９３～１１１４から選択されるセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１１１５～１１２６から選択されるセンス鎖配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１１２７～１２１６から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１１２７～１１５８から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１１５９～１１８２から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１１８３～１２０４から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１２０５～１２１６から選択されるアンチセンス鎖配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０３７～１１２６から選択されるセンス鎖配列、および配列番号１１２７～１２１６から選択されるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０３７～１０６８から選択されるセンス鎖配列、および配列番号１１２７～１１８２から選択されるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０６９～１０９２から選択されるセンス鎖配列、および配列番号１１５９～１１８２から選択されるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１０９３～１１１４から選択されるセンス鎖配列、および配列番号１１８３～１２０４から選択されるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号１１１５～１１２６から選択されるセンス鎖配列、および配列番号１２０５～１２１６から選択されるアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８５７および９４７、
（ｂ）それぞれ、配列番号８５８および９４８、
（ｃ）それぞれ、配列番号８５９および９４９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８６０および９５０、
（ｅ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８６７および９５７、
（ｇ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、ならびに
（ｈ）それぞれ、配列番号８７６および９６６から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｂ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、
（ｃ）それぞれ、配列番号８７６および９６６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号８６２の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号９５２の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号８７５の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号９６５の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号８７６の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号９６６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号９２０の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１０１０の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１０３７および１１２７、
（ｂ）それぞれ、配列番号１０３８および１１２８、
（ｃ）それぞれ、配列番号１０３９および１１２９、
（ｄ）それぞれ、配列番号１０４０および１１３０、
（ｅ）それぞれ、配列番号１０４２および１１３２、
（ｆ）それぞれ、配列番号１０４７および１１３７、
（ｇ）それぞれ、配列番号１０５５および１１４５、ならびに
（ｈ）それぞれ、配列番号１０５６および１１４６から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１０８１および１１７１、
（ｂ）それぞれ、配列番号１０９０および１１８０、
（ｃ）それぞれ、配列番号１０７９および１１６９、
（ｄ）それぞれ、配列番号１０７６および１１６６、
（ｅ）それぞれ、配列番号１０７２および１１６２、
（ｆ）それぞれ、配列番号１０７０および１１６０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号１０６９および１１５９からから選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１１２０および１２１０、
（ｂ）それぞれ、配列番号１１１７および１２０７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号１１１９および１２０９から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１０９５および１１８５、
（ｂ）それぞれ、配列番号１１０４および１１９４、
（ｃ）それぞれ、配列番号１０９３および１１８３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１１００および１１９０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１０４２および１１３２、
（ｂ）それぞれ、配列番号１０５５および１１４５、
（ｃ）それぞれ、配列番号１０５６および１１４６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１１００および１１９０から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１０４２の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１１３２の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１０５５の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１１４５の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１０５６の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１１４６の配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１１００の配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１１９０の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号１０４２および１２２５、
（ｂ）それぞれ、配列番号１０５５および１２２６、
（ｃ）それぞれ、配列番号１０５６および１２２７、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号１１００および１２２８から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、最小限のオフターゲット効果を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３発現を低減し、ＳＴＡＴ１発現を低減しないか、またはＳＴＡＴ３発現よりも少なくＳＴＡＴ１発現を低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８６２に記載されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号９５２に記載されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３発現を低減し、ＳＴＡＴ１発現を低減しないか、またはＳＴＡＴ３発現よりも少なくＳＴＡＴ１発現を低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０４２に記載されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号１１３２に記載されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３発現を低減し、ＳＴＡＴ１発現を低減しないか、またはＳＴＡＴ３発現よりも少なくＳＴＡＴ１発現を低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号８７５に記載されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号９６５に記載されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３発現を低減し、ＳＴＡＴ１発現を低減しないか、またはＳＴＡＴ３発現よりも少なくＳＴＡＴ１発現を低減する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１０５５に記載されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖、および配列番号１１４５に記載されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３発現を低減し、ＳＴＡＴ１発現を低減しないか、またはＳＴＡＴ３発現よりも少なくＳＴＡＴ１発現を低減する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも２個の異なる種のＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも２個の異なる種のＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減することができるが、非ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ（例えば、ＳＴＡＴ１）と交差反応しない。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、少なくとも２個の種間で交差反応性である。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３の発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡと交差反応する。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒトおよびマウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡと交差反応する。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒトおよび非ヒト霊長類ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡと交差反応する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいて、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも５０％～少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいて、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいて、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒトおよび非ヒト霊長類において、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも５０％～少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒトおよび非ヒト霊長類において、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒトおよび非ヒト霊長類において、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒトおよびマウスにおいて、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも５０％～少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒトおよびマウスにおいて、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、ヒトおよびマウスにおいて、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択される含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のセンス鎖配列および配列番号９５２のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ヒトおよび非ヒト霊長類においてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のセンス鎖配列および配列番号９６５のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のセンス鎖配列および配列番号９６６のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のセンス鎖配列および配列番号１０１０のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８５７および９４７、
（ｂ）それぞれ、配列番号８５８および９４８、
（ｃ）それぞれ、配列番号８５９および９４９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８６０および９５０、
（ｅ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８６７および９５７、
（ｇ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、ならびに
（ｈ）それぞれ、配列番号８７６および９６６から選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択される含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｂ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、
（ｃ）それぞれ、配列番号８７６および９６６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択される含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のセンス鎖配列および配列番号９５２のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のセンス鎖配列および配列番号９６５のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のセンス鎖配列および配列番号９６６のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のセンス鎖配列および配列番号１０１０のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８５７および９４７、
（ｂ）それぞれ、配列番号８５８および９４８、
（ｃ）それぞれ、配列番号８５９および９４９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８６０および９５０、
（ｅ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８６７および９５７、
（ｇ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、ならびに
（ｈ）それぞれ、配列番号８７６および９６６から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択される含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｂ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、
（ｃ）それぞれ、配列番号８７６および９６６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択される含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のセンス鎖配列および配列番号９５２のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のセンス鎖配列および配列番号９６５のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のセンス鎖配列および配列番号９６６のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のセンス鎖配列および配列番号１０１０のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８５７および９４７、
（ｂ）それぞれ、配列番号８５８および９４８、
（ｃ）それぞれ、配列番号８５９および９４９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８６０および９５０、
（ｅ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８６７および９５７、
（ｇ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、ならびに
（ｈ）それぞれ、配列番号８７６および９６６から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択される含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
（ｂ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、
（ｃ）それぞれ、配列番号８７６および９６６、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のセンス鎖配列および配列番号９５２のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のセンス鎖配列および配列番号９６５のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のセンス鎖配列および配列番号９６６のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のセンス鎖配列および配列番号１０１０のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ヒトおよびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択される含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のセンス鎖配列および配列番号９５２のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ヒトおよび非ヒト霊長類においてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のセンス鎖配列および配列番号９６５のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のセンス鎖配列および配列番号９６６のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のセンス鎖配列および配列番号１０１０のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトおよびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のセンス鎖配列および配列番号９５２のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトおよび非ヒト霊長類においてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のセンス鎖配列および配列番号９６５のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のセンス鎖配列および配列番号９６６のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のセンス鎖配列および配列番号１０１０のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトおよびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択される含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のセンス鎖配列および配列番号９５２のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトおよび非ヒト霊長類においてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のセンス鎖配列および配列番号９６５のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖脂質上のＣ１８にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のセンス鎖配列および配列番号９６６のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のセンス鎖配列および配列番号１０１０のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトおよびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択される含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のセンス鎖配列および配列番号９５２のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトおよび非ヒト霊長類においてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のセンス鎖配列および配列番号９６５のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のセンス鎖配列および配列番号９６６のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のセンス鎖配列および配列番号１０１０のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上の脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
（ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
（ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
（ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
（ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
（ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
（ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒト、非ヒト霊長類、およびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
（ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
（ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトおよびマウスにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、
（ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
（ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
（ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
（ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から選択されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８６２のセンス鎖配列および配列番号９５２のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトおよび非ヒト霊長類においてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する（すなわち、オリゴヌクレオチドは、種交差反応性オリゴヌクレオチドである）。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７５のセンス鎖配列および配列番号９６５のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号８７６のセンス鎖配列および配列番号９６６のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するためのオリゴヌクレオチドは、配列番号９２０のセンス鎖配列および配列番号１０１０のアンチセンス鎖配列を含み、オリゴヌクレオチドは、センス鎖上のＣ１８脂質にコンジュゲートされており、ヒトにおいてＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを少なくとも７５％低減する。
製剤
オリゴヌクレオチドの使用を促進するために、様々な製剤が開発されている。例えば、オリゴヌクレオチドは、分解を最小限にするか、送達および／もしくは取り込みを促進するか、または製剤中のオリゴヌクレオチドに別の有益な特性を提供する製剤を使用して、対象または細胞環境に送達され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造、およびカプシド中に製剤化される。
カチオン性脂質を含むオリゴヌクレオチドの製剤を使用して、オリゴヌクレオチドの細胞へのトランスフェクションを容易にすることができる。例えば、リポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子（例えば、ポリリシンなどのカチオン性脂質が使用され得る。好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＦｕＧｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ）が含まれ、これらは全て、製造業者の指示に従って使用され得る。
したがって、いくつかの実施形態では、製剤は、脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、もしくはナノ粒子を含むか、または投与を必要とする対象の細胞、組織、器官、もしくは身体への投与のために別様に製剤化されてもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１３を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書の製剤は、賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、活性成分の改善された安定性、改善された吸収、改善された溶解度、および／または治療的増強を組成物に付与する。いくつかの実施形態では、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム）、またはビヒクル（例えば、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、もしくは鉱油）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、その保存寿命を延長するために凍結乾燥され、次いで、使用（例えば、対象への投与）前に溶液にされる。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個を含む組成物中の賦形剤は、凍結保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン）、または崩壊温度調節剤（例えば、デキストラン、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）、もしくはゼラチン）であり得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜、および直腸投与が含まれる。
注射使用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散体、および滅菌注射可能溶液または分散体の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。滅菌注射可能溶液は、必要に応じて、上に列挙した成分の１個または組み合わせを含む選択された溶媒に必要な量のオリゴヌクレオチドを組み込み、続いて、濾過滅菌することによって調製することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約０．１％の治療剤またはそれ以上を含有し得るが、活性成分の割合は、全組成物の重量または容積の約１％～約８０％以上であり得る。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品保存寿命などの要因、および他の薬理学的考慮事項は、かかる薬学的製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、様々な用量および治療レジメンが望ましい場合がある。
いくつかの実施形態は、本明細書のオリゴヌクレオチドのいずれかの肝臓標的化送達を対象とするが、他の組織の標的化も企図される。
使用方法
細胞におけるＳＴＡＴ３発現の低減
本開示は、ＳＴＡＴ３発現を低減する目的で、有効量の本明細書のオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個を細胞または細胞集団に接触させるか、または送達する方法を提供する。方法は、本明細書に記載の工程を含むことができ、これらは、記載の配列で実施され得るが、必ずしもそうではない。しかしながら、他の配列も想定される。さらに、個別または複数の工程は、並行して、および／もしくは時間がオーバーラップして、および／もしくは個別に、または複数回繰り返される工程のいずれかで実施され得る。さらに、方法は、追加の不特定の工程を含んでもよい。
本明細書の方法は、任意の適切な細胞型に有用である。いくつかの実施形態では、細胞は、ｍＲＮＡを発現する任意の細胞（例えば、肝細胞、マクロファージ、単球由来細胞、前立腺癌細胞、脳の細胞、内分泌組織、骨髄、リンパ節、肺、胆嚢、肝臓、十二指腸、小腸、膵臓、腎臓、消化管、膀胱、脂肪および軟部組織、ならびに皮膚）である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から取得された初代細胞である。いくつかの実施形態では、初代細胞は、細胞がその天然の表現型特性を実質的に維持するように限られた数の継代を受けている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが送達される細胞は、エクスビボまたはインビトロである（すなわち、培養中の細胞または細胞が常在する生物に送達され得る）。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含有する溶液の注射、オリゴヌクレオチドによって覆われた粒子による衝撃、オリゴヌクレオチドを含む溶液への細胞もしくは細胞集団の曝露、またはオリゴヌクレオチドの存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない、適切な核酸送達方法を使用して送達される。脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、およびリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクション、ならびに他などのオリゴヌクレオチドを細胞に送達するための他の適切な方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３発現の低減は、ＳＴＡＴ３発現に関連する細胞もしくは細胞集団の１個以上の特性もしくは特徴を評価するための適切なアッセイもしくは技術によって（例えば、ＳＴＡＴ３発現バイオマーカーを使用する）、またはＳＴＡＴ３発現を直接的に示す分子（例えば、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡもしくはＳＴＡＴ３タンパク質）を評価するアッセイもしくは技術によって決定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドがＳＴＡＴ３発現を低減する程度は、オリゴヌクレオチドと接触させた細胞または細胞集団におけるＳＴＡＴ３発現を、適切な対照（例えば、オリゴヌクレオチドと接触していないか、または対照オリゴヌクレオチドと接触した適切な細胞または細胞集団）と比較することによって評価される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子の送達後のタンパク質へのｍＲＮＡ発現の適切な対照レベルは、所定のレベルまたは値であってもよく、その結果、対照レベルは、毎回測定される必要はない。所定のレベルまたは値は、様々な形態を取ることができる。いくつかの実施形態では、所定のレベルまたは値は、中央値または平均値などの単一のカットオフ値であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドの投与は、細胞または細胞集団におけるＳＴＡＴ３発現の低減をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ３発現の低減は、ｍＲＮＡの適切な対照レベルと比較して、約１％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約７０％以下、約８０％以下、または約９０％以下である。適切な対照レベルは、本明細書のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞または細胞集団におけるｍＲＮＡ発現および／またはタンパク質翻訳のレベルであってもよい。いくつかの実施形態では、本明細書の方法に従った細胞へのオリゴヌクレオチドの送達の効果は、有限期間の後に評価される。例えば、ｍＲＮＡのレベルは、腫瘍へのオリゴヌクレオチドの導入から、少なくとも約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、もしくは最大１４日後に、細胞において分析されてもよい。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む鎖（例えば、そのセンス鎖およびアンチセンス鎖）を細胞において発現するように操作された導入遺伝子の形態で送達される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される任意のオリゴヌクレオチドを発現するように操作された導入遺伝子を使用して送達される。導入遺伝子は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、もしくは単純ヘルペスウイルス）、または非ウイルスベクター（例えば、プラスミドもしくは合成ｍＲＮＡ）を使用して送達され得る。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、対象に直接的に注射され得る。
医学的使用
本開示はまた、ＳＴＡＴ３発現を低減することから利益を受け得る対象（例えば、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有するヒト）を治療するための使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドも提供する。いくつかの点で、本開示は、ＳＴＡＴ３の発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するための使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドを提供する。本開示はまた、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を治療するための医薬品または医薬組成物の製造における使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを標的とし、ＳＴＡＴ３発現を低減する（例えば、ＲＮＡｉ経路を介して）。いくつかの実施形態では、使用のための、または使用に適合可能なオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを標的とし、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ、またはＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ、ＳＴＡＴ３タンパク質、および／もしくはＳＴＡＴ３活性の量またはレベルを低減する。
さらに、以下の方法は、ＳＴＡＴ３発現に関連するか、またはその傾向がある疾患、障害、または状態を有する対象を選択することを含み得る。いくつかの場合では、方法は、癌または他の慢性リンパ増殖性障害などのＳＴＡＴ３発現に関連する疾患のマーカーを有する個体を選択することを含み得る。
同様に、以下に詳述するように、方法はまた、例えば、ＳＴＡＴ３発現のマーカーのベースライン値を測定または取得する工程、および次いで、そのように取得された値を、１個以上の他のベースライン値またはオリゴヌクレオチドを投与した後に取得された値と比較して、治療の有効性を評価する工程などの工程を含み得る。
治療方法
本開示はまた、本明細書のオリゴヌクレオチドを用いて、疾患、障害、または状態を有する、有する疑いがある、または発症するリスクがある対象を治療する方法を提供する。一部の態様では、本開示は、本明細書のオリゴヌクレオチドを使用して、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態の発症または進行を治療または軽減する方法を提供する。他の態様では、本開示は、本明細書のオリゴヌクレオチドを使用して、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象において１個以上の治療的利益を達成するための方法を提供する。本明細書の方法のいくつかの実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書のオリゴヌクレオチドのうちのいずれか１個以上を投与することによって治療される。いくつかの実施形態では、治療は、ＳＴＡＴ３発現を低減することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、治療的に処置される。いくつかの実施形態では、対象は、予防的に処置される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書の１個以上のオリゴヌクレオチド、または１個以上のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＳＴＡＴ３発現が対象において低減され、それによって対象を治療するように、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの量またはレベルは、対象において低減される。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３および／またはタンパク質の量またはレベルは、対象において低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、１個以上のオリゴヌクレオチド、または医薬組成物の投与前のＳＴＡＴ３発現と比較して、ＳＴＡＴ３発現が、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて、対象において低減されるように、ＳＴＡＴ３に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３発現は、オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、または医薬組成物を受けていないか、あるいは対照オリゴヌクレオチドもしくは複数の対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）におけるＳＴＡＴ３発現と比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、または医薬組成物を受けていないか、あるいは対照オリゴヌクレオチドもしくは複数の対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）におけるＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＳＴＡＴ３タンパク質の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＳＴＡＴ３タンパク質の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３タンパク質の量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、または医薬組成物を受けていないか、あるいは対照オリゴヌクレオチド、複数の対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、または治療を受けている対象（例えば、参照または対照対象）におけるＳＴＡＴ３タンパク質の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドもしくは複数のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、ＳＴＡＴ３活性／発現の量またはレベルが、オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物の投与前のＳＴＡＴ３活性の量またはレベルと比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減されるように、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象に投与される。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＴ３活性の量またはレベルは、オリゴヌクレオチドもしくは医薬組成物を受けていないか、または対照オリゴヌクレオチド、医薬組成物、もしくは治療を受けている対象におけるＳＴＡＴ３活性の量またはレベル（例えば、参照または対照対象）と比較して、対象において少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または９９％を超えて低減される。
本明細書のオリゴヌクレオチドは、それらの高い特異性のため、疾患細胞および組織の標的遺伝子のｍＲＮＡを特異的に標的とする。疾患の予防において、標的遺伝子は、疾患の開始もしくは維持に必要とされるもの、または疾患に罹患するリスクが高いことに関連するとして特定されたものであり得る。疾患の治療において、オリゴヌクレオチドは、疾患を示すか細胞または組織と接触し得る。例えば、ＳＴＡＴ３発現に関連する障害または状態に関連する野生型（すなわち、天然）または変異遺伝子の全てまたは一部と実質的に同一のオリゴヌクレオチドは、肝細胞もしくは他の肝臓細胞などの目的の細胞または組織の種類と接触し得るか、またはそれに導入され得る。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ヒト標的などの任意の哺乳動物由来の標的遺伝子であり得る。本明細書に記載される方法に従って、任意の遺伝子をサイレンシングすることができる。
本明細書に記載の方法は、典型的には、オリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの治療有効量で、すなわち、望ましい治療結果を生じ得る量で対象に投与することを含む。治療上許容される量は、疾患または障害を治療的に治療できる量であり得る。いずれか１人の対象に対する適切な用量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の活性成分、投与の時間および経路、一般的な健康状態、ならびに並行して投与される他の薬剤を含む、特定の因子に依存するであろう。
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書の組成物のうちのいずれか１個を、経腸的に（例えば、経口的に、胃栄養管によって、十二指腸栄養管によって、胃瘻造設を介して、もしくは直腸に）、非経口的に（例えば、皮下注射、静脈内注射もしくは注入、動脈内注射もしくは注入、骨内注入、筋肉内注射、脳内注射、脳室内注射、くも膜下腔内）、局所的に（例えば、経皮、吸入、点眼薬を介して、もしくは粘膜を介して）、または標的器官（例えば、対象の肝臓）への直接注射によってのいずれかで投与される。典型的には、本明細書のオリゴヌクレオチドは、静脈内または皮下に投与される。
非限定的な一連の例として、本明細書のオリゴヌクレオチドは、典型的には、四半期毎に（３ヶ月に１回）、隔月（２ヶ月に１回）、毎月、または毎週投与されるであろう。例えば、オリゴヌクレオチドは、毎週、または２週間もしくは３週間間隔で投与され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、毎日投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、オリゴヌクレオチドの１回以上の負荷用量、続いて、オリゴヌクレオチドの１回以上の維持用量が投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、単独でまたは組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、本明細書のオリゴヌクレオチドは、並行して、連続して（任意の順序で）、または断続的に組み合わせて投与される。例えば、２個のオリゴヌクレオチドは、同時に共投与され得る。代替的に、１個のオリゴヌクレオチドが投与され、続いて任意の期間（例えば、１時間、１日、１週、または１ヶ月）後に、第２のオリゴヌクレオチドが投与され得る。
いくつかの実施形態では、治療される対象は、ヒトもしくは非ヒト霊長類または他の哺乳動物対象である。他の例示的な対象には、イヌおよびネコなどの家畜化動物、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜、ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの動物が含まれる。
併用治療
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１個の追加の組成物または治療剤と組み合わされ使用される。いくつかの態様では、組成物または治療剤は、化学療法、標的化抗癌療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科処置、放射線処置、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、ワクチン、もしくは細胞免疫療法、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物または治療剤は、ＴＧＦＢ、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＡＲＧ１、ＰＴＧＳ２、ＳＯＣＳ１、またはＰＤ－Ｌ１を標的とする。いくつかの実施形態では、組成物または治療剤は、ＴＧＦＢを標的とする。いくつかの実施形態では、組成物または治療剤は、ＣＸＣＲ２を標的とする。いくつかの実施形態では、組成物または治療剤は、ＣＣＲ２を標的とする。いくつかの実施形態では、組成物または治療剤は、ＡＲＧ１を標的とする。いくつかの実施形態では、組成物または治療剤は、ＰＴＧＳ２を標的とする。いくつかの実施形態では、組成物または治療剤は、ＳＯＣＳ１を標的とする。いくつかの実施形態では、組成物または治療剤は、ＰＤ－Ｌ１を標的とする。いくつかの実施形態では、上記標的のいずれかを標的とする組成物または治療剤は、オリゴヌクレオチド（例えば、ｄｓＲＮＡｉ）である。いくつかの実施形態では、上記標的のいずれかを標的とする組成物または治療剤は、抗体またはその抗原結合性断片である。
キット
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書のオリゴヌクレオチドと、使用のための指示とを含む、キットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書のオリゴヌクレオチドと、キットおよび／またはその任意の構成要素の使用のための指示を含む添付文書と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、好適な容器内に、本明細書のオリゴヌクレオチド、１個以上の対照、ならびに当技術分野で公知の様々な緩衝液、試薬、酵素、および他の標準成分を含む。いくつかの実施形態では、容器は、少なくとも１つのバイアル、ウェル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはオリゴヌクレオチドが配置される他の容器手段を含み、一部の事例では、好適にアリコートされる。追加の構成要素が提供されるいくつかの実施形態では、キットは、この構成要素が配置される追加の容器を含む。キットはまた、オリゴヌクレオチドおよび任意の他の試薬を商業販売のために厳重に閉じるための手段を含むことができる。そのような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。容器および／またはキットは、使用のための指示および／または警告を記載したラベルを含むことができる。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物と、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、もしくは状態の治療、またはそれらの進行の遅延を必要とする対象においてそれを行うための指示とを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容可能な担体、またはオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物と、癌の治療またはその進行の遅延を必要とする対象においてそれを行うための指示とを含む。
本開示は、以下の実施例に示される特定の実施形態を参照して記載されているが、本開示の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができ、均等物を代用できることを当業者は理解すべきである。さらに、以下の実施例は、例示として提供され、本開示の範囲をいかなる様式でも制限することを意図するものではない。加えて、状況、材料、物質組成、プロセス、プロセス工程、または複数の工程に、本開示の目的、趣旨、および範囲に適合させるために、修正を加えることができる。こうした全ての修飾は、本開示の範囲内であることが意図される。当技術分野で公知の標準的な技術、または以下に具体的に記載する技術を利用した。
以下の実施例は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）にＲＮＡｉペイロードを送達して、免疫抑制を媒介する遺伝子をサイレンシングするための脂質コンジュゲートｓｉＲＮＡ送達機構の発生を説明する。最初に、代替ＡＬＤＨ２－ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートを使用して、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中のＭＤＳＣ、ならびに腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）中に存在するＭＤＳＣの両方のサブタイプにペイロードを送達して、ＡＬＤＨ２をサイレンシングした。その後、ＳＴＡＴ３－ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートを構築して、ＭＤＳＣにおけるＳＴＡＴ３遺伝子を標的とし、サイレンシングした。標的化ＳＴＡＴ３は、骨髄細胞における免疫抑制活性に関連する主要な転写因子であるため、有望なアプローチであると考えられる。ＳＴＡＴ３活性化は、ＴＭＥ中の寛容原性効果の促進に重要な役割を果たしていることが知られている。ＳＴＡＴ３は腫瘍細胞によって発現されるが、癌細胞におけるＳＴＡＴ３シグナル伝達に影響を与えることなく、ＴＭＥおよびＴｄＬＮ中の腫瘍関連骨髄細胞においてＳＴＡＴ３シグナル伝達を標的とするためのアプローチは、寛容原性効果を阻害し、抗腫瘍免疫を誘導し、様々な固形腫瘍の腫瘍増殖を阻害するのに十分であることが以前に実証されている。（Ｋｏｒｔｙｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００５）。概念実証標的として、ＴＭＥおよびＴｄＬＮ中の両方のＭＤＳＣにおけるＳＴＡＴ３ノックダウンを実証した。これらのデータは、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－脂質コンジュゲート、またはＭＤＳＣまたはＴｄＬＮ特異的標的に調整された別の標的コンジュゲートの組み合わせが、免疫チェックポイント遮断に対して治療抵抗性腫瘍を感作する可能性を有することを示唆している。
本明細書で提供される開示がより完全に理解され得るように、以下の実施例が記載される。本出願に記載される実施例は、本明細書で提供される方法、組成物、およびシステムを例示するために提供され、いかなる形でもその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
略語
Ａｃ：アセチル
ＡｃＯＨ：酢酸
ＡＣＮ：アセトニトリル
Ａｄ：アダマンチル
ＡＩＢＮ：２，２’－アゾビスイソブチロニトリル
Ａｎｈｙｄ：無水
Ａｑ：水性
Ｂ２Ｐｉｎ２：ビス（ピナコラート）ジボロン－４，４，４’，４’，５，５，５’，５’－オクタメチル－２，２’－ビ（１，３，２－ジオキサボロラン）
ＢＩＮＡＰ：２，２’－ビス（ジフェニルホスフィノ）－１，１’－ビナフチル
ＢＨ３：ボラン
Ｂｎ：ベンジル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
Ｂｏｃ２Ｏ：ジ－ｔｅｒｔ－ブチルジカルボネート
ＢＰＯ：過酸化ベンゾイル
ＢｕＯＨ：ｎ－ブタノール
ＣＤＩ：カルボニルジイミダゾール
ＣＯＤ：シクロオクタジエン
ｄ：日
ＤＡＢＣＯ：１，４－ジアゾビシクロ［２．２．２］オクタン
ＤＡＳＴ：ジエチルアミノ硫黄トリフルオリド
ｄｂａ：ジベンジリデンアセトン
ＤＢＵ：１，８－ジアゾビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン
ＤＣＥ：１，２－ジクロロエタン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＥＡ：ジエチルアミン
ＤＨＰ：ジヒドロピラン
ＤＩＢＡＬ－Ｈ：水素化ジイソブチルアルミニウム
ＤＩＰＡ：ジイソプロピルアミン
ＤＩＰＥＡまたはＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド
ＤＭＥ：１，２－ジメトキシエタン
ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＰ：デス－マーチンペルヨージナン
ＤＭＳＯ－ジメチルスルホキシド
ＤＭＴｒ：４，４’－ジメチオキシトリチル
ＤＰＰＡ：ジフェニルホスホリルアジド
ｄｐｐｆ：１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン
ＥＤＣまたはＥＤＣＩ：１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩
ｅｅ：エナンチオマー過剰率
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化
ＥＡ：酢酸エチル
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＥｔＯＨ：エタノール
ＦＡ：ギ酸
ｈまたはｈｒｓ：時間
ＨＡＴＵ：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＣｌ：塩酸
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＯＡｃ：酢酸
ＩＢＸ：２－ヨードキシ安息香酸
ＩＰＡ：イソプロピルアルコール
ＫＨＭＤＳ：カリウムヘキサメチルジシラジド
Ｋ２ＣＯ３：炭酸カリウム
ＬＡＨ：水素化アルミニウムリチウム
ＬＤＡ：リチウムジイソプロピルアミド
Ｌ－ＤＢＴＡ：ジベンゾイル－Ｌ－酒石酸
ｍ－ＣＰＢＡ：メタクロロ過安息香酸
Ｍ：モル
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＭｅＯＨ：メタノール
Ｍｅ２Ｓ：ジメチルスルフィド
ＭｅＯＮａ：ナトリウムメチラート
ＭｅＩ：ヨードメタン
ｍｉｎ：分
ｍＬ：ミリリットル
ｍＭ：ミリモル
ｍｍｏｌ：ミリモル
ＭＰａ：メガパスカル
ＭＯＭＣｌ：メチルクロロメチルエーテル
ＭｓＣｌ：メタンスルホニルクロリド
ＭＴＢＥ：メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ｎＢｕＬｉ：ｎ－ブチルリチウム
ＮａＮＯ２：亜硝酸ナトリウム
ＮａＯＨ：水酸化ナトリウム
Ｎａ２ＳＯ４：硫酸ナトリウム
ＮＢＳ：Ｎ－ブロモスクシンイミド
ＮＣＳ：Ｎ－クロロスクシンイミド
ＮＦＳＩ：Ｎ－フルオロベンゼンスルホンイミド
ＮＭＯ：Ｎ－メチルモルホリンＮ－オキシド
ＮＭＰ：Ｎ－メチルピロリジン
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ｏＣ：セルシウス度
Ｐｄ／Ｃ：パラジウム炭素
Ｐｄ（ＯＡｃ）２：酢酸パラジウム
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥ：石油エーテル
ＰＯＣｌ３：オキシ塩化リン
ＰＰｈ３：トリフェニルホスフィン
ＰｙＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｒｅｌ：相対的
Ｒ．Ｔ．またはｒｔ：室温
ｓまたはｓｅｃ：秒
ｓａｔ：飽和
ＳＥＭＣｌ：クロロメチル－２－トリメチルシリルエチルエーテル
ＳＦＣ：超臨界流体クロマトグラフィー
ＳＯＣｌ２：二塩化硫黄
ｔＢｕＯＫ：カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド
ＴＢＡＢ：臭化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＡＦ：フッ化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＡＩ：ヨウ化テトラブチルアンモニウム
ＴＥＡ：トリエチルアミン
Ｔｆ：トリフルオロメタンスルホン酸塩
ＴｆＡＡ、ＴＦＭＳＡまたはＴｆ２Ｏ：トリフルオロメタンスルホン酸無水物
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＢＳＣｌ：２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド
ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシリル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＨＰ：テトラヒドロピラン
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＴＭＥＤＡ：テトラメチルエチレンジアミン
ｐＴＳＡ：パラ－トルエンスルホン酸
ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィー
ｗｔ：重量
キサントホス：４，５－ビス（ジフェニルホスフィノ）－９，９－ジメチルキサンテン
実施例１：二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの調製
一般的な合成方法
以下の実施例は、本開示を説明することを意図しており、本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。温度は摂氏（Ｃ）で示される。別途言及しない場合、全ての蒸発は、減圧下で、好ましくは約１５ｍｍ Ｈｇ～１００ｍｍ Ｈｇ（＝２０～１３３ｍｂａｒ）で行われる。最終生成物、中間体および出発物質の構造は、標準的な分析方法、例えば、微量分析および分光特性、例えば、ＭＳ、ＩＲ、ＮＭＲによって確認された。使用される略語は、当技術分野では慣用されている略語である。
本開示の核酸またはその類似体を合成するために利用される全ての出発物質、構成ブロック、試薬、酸、塩基、脱水剤、溶媒、および触媒は、市販であるか、または当業者に公知の有機合成法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２１（Ｈｏｕｂｅｎ－Ｗｅｙｌ ４ｔｈ Ｅｄ．１９５２））によって生成され得る。さらに、本開示の核酸またはその類似体は、以下の実施例に示されるように、当業者に公知の有機合成法によって生成することができる。
別段の定めのない限り、全ての反応は窒素またはアルゴン下で実施される。
プロトンＮＭＲ（１Ｈ ＮＭＲ）は、重水素化溶媒中で実施した。本明細書に開示される特定の核酸またはその類似体では、１つ以上の１Ｈシフトが、残留プロテオ溶媒シグナルと重複しており、これらのシグナルは、以下に提供される実験では報告されていない。
以下の実施例に示すように、特定の例示的な実施形態では、核酸またはその類似体を、以下の一般的手順に従って調製した。一般的な方法は、本開示の特定の核酸またはその類似体の合成を示しているが、以下の一般的な方法、および当業者に公知の他の方法は、本明細書に記載されるように、全ての核酸またはその類似体、ならびにこれらの核酸またはその類似体の各々のサブクラスおよび種に適用され得ることが理解されるであろう。
実施例１ａ：２－（２－（（（（６ａＲ，８Ｒ，９Ｒ，９ａＲ）－８－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２，４，４－テトライソプロピルテトラヒドロ－６Ｈ－フルオロ［３，２－ｆ］［１，３，５，２，４］トリオキサジシロシン－９－イル）オキシ）メトキシ）エトキシ）エタン－１－アンモニウムギ酸塩の合成（１－６）
２０ｍＬのＤＭＦ中の化合物１－１（２５．００ｇ、６７．３８ｍｍｏｌ）の溶液を、ピリジン（１１ｍＬ、１３４．６７ｍｍｏｌ）およびテトライソプロピルジシロキサンジクロリド（２２．６３ｍＬ、７０．７５ｍｍｏｌ）で１０℃において処理した。得られた混合物を、２５℃で３時間撹拌し、２０％クエン酸（５０ｍＬ）でクエンチした。水層をＥｔＯＡｃ（３Ｘ５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を真空中で濃縮した。粗残渣を、ＭＴＢＥとｎ－ヘプタンの混合物（１：１５、３２０ｍＬ）から再結晶して、化合物１－２（３７．２０ｇ、９０％）を白色油状固体として得た。
２０ｍＬのＤＭＳＯ中の化合物１－２（３７．００ｇ、６０．３３ｍｍｏｌ）の溶液を、ＡｃＯＨ（２０ｍＬ、３１７．２０ｍｍｏｌ）およびＡｃ２Ｏ（１５ｍＬ、１５６．６８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を２５℃で１５時間攪拌した。反応物を、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和 Ｋ２ＣＯ３（５０ｍＬ）でクエンチした。水層を、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を濃縮し、ＡＣＮ（３０ｍＬ）で再結晶させて、化合物１－３（１５．６５ｇ、３８．４％）を白色固体として得た。
１２０ｍＬのＤＣＭ中の化合物１－３（２０．００ｇ、２９．７２ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｆｍｏｃ－アミノ－エトキシエタノール（１１．６７ｇ、３５．６６ｍｍｏｌ）で２５℃において処理した。混合物を攪拌して、透明な溶液を得、次いで４Åモレキュラーシーブ（２０．０ｇ）、Ｎ－ヨードスクシンイミド（８．０２ｇ、３５．６６ｍｍｏｌ）、およびＴｆＯＨ（５．２５ｍＬ、５９．４４ｍｍｏｌ）で処理した。ＨＰＬＣ分析が化合物１－３の９５％超の消費を示すまで、混合物を３０℃で攪拌した。反応物を、ＴＥＡ（６ｍＬ）でクエンチし、濾過した。濾液を、ＥｔＯＡｃで希釈し、飽和 ＮａＨＣＯ３（２×１００ｍＬ）、飽和 Ｎａ２ＳＯ３（２×１００ｍＬ）、および水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、真空中で濃縮して、粗化合物１－４（２６．３４ｇ、９３．９％）を黄色固体として得、これをさらに精製することなく次の工程に直接使用した。
ＤＣＭ／水（１０：７、１７０ｍＬ）の混合物中の化合物１－４（２６．３４ｇ、２７．６２ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＢＵ（７．００ｍＬ、４５．０８ｍｍｏｌ）で５℃において処理した。混合物を、５～２５℃で１時間攪拌した。次いで、有機層を分離し、水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＤＣＭ（１３０ｍＬ）で希釈した。溶液を、フマル酸（７．０５ｇ、６０．７６ｍｍｏｌ）および４Åモレキュラーシーブ（２６．３４ｇ）で４回に分けて処理した。混合物を１時間攪拌し、濃縮し、ＭＴＢＥおよびＤＣＭ（５：１）の混合物から再結晶させて、化合物１－６（１４．７４ｇ、６２．９％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）８．７３（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｓ，１Ｈ），８．１５－８．０２（ｍ，２Ｈ），７．６５－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），６．５２（ｓ，２Ｈ），６．１５（ｓ，１Ｈ），５．０８－４．９０（ｍ，３Ｈ），４．８３－４．７８（ｍ，１Ｈ），４．１５－３．９０（ｍ，３Ｈ），３．７９－３．６５（ｍ，２Ｈ），２．９８－２．８５（ｍ，６Ｈ），１．２０－０．９５（ｍ，２８Ｈ）。
実施例１ｂ：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－ベンズアミド－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－（（２－（２－［脂質］－アミドエトキシ）エトキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－３－イル（２－シアノエチル）ジイソプロピルホスホラミダイトの合成（２－４ａ～２－４ｅ）
１５０ｍＬの２－メチルテトラヒドロフラン中の化合物１－６（５０．００ｇ、５９．０１ｍｍｏｌ）の溶液を、氷冷Ｋ２ＨＰＯ４水溶液（６％、１００ｍＬ）およびブライン（２０％、２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、ヘキサン酸（１０．３３ｍＬ、８２．６１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３３．６６ｇ、８８．５２ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（１０．８１ｇ、１４７．５２ｍｍｏｌ）で０℃において処理した。得られた混合物を、２５℃に加温し、１時間攪拌した。溶液を、水（２×１００ｍＬ）、食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、真空中で濃縮して、粗残渣を得た。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（１：１ヘキサン／アセトン）により、化合物２－１ａ（３４．９５ｇ、７１．５％）を白色固体として得た。
８０ｍＬのＴＨＦ中の化合物２－１ａ（３４．９５ｇ、４２．１９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（９．２８ｍＬ、１２６．５８ｍｍｏｌ）の混合物を、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（２０．６１ｍＬ、１２６．５８ｍｍｏｌ）を１０℃で滴下して処理した。混合物を、２５℃に加温し、２時間攪拌した。反応物を濃縮し、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に溶解し、飽和 ＮａＨＣＯ３（５×２０ｍＬ）、および食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を真空中で濃縮し、粗化合物２－２ａ（２４．７２ｇ、９９％）を得、これをさらに精製することなく次の工程に直接使用した。
５０ｍＬのＤＣＭ中の化合物２－２ａ（２４．７２ｇ、４２．１８ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｎ－メチルモルホリン（１８．５４ｍＬ、１６８．６７ｍｍｏｌ）およびＤＭＴｒ－Ｃｌ（１５．６９ｇ、４６．３８ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を、２５℃で２時間攪拌し、飽和 ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）でクエンチした。有機層を分離し、水で洗浄し、濃縮して、スラリー粗物を得た。シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（１：１ヘキサン／アセトン）により、化合物２－３ａ（３０．０５ｇ、３３．８ｍｍｏｌ、７９．９％）を白色固体として得た。
５０ｍＬのＤＣＭ中の化合物２－３ａ（２５．００ｇ、２８．１７ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下でＮ－メチルモルホリン（３．１０ｍＬ、２８．１７ｍｍｏｌ）およびテトラゾール（０．６７ｍＬ、１４．０９ｍｍｏｌ）で処理した。ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（９．０２ｇ、３３．８０ｍｍｏｌ）を溶液に滴下で加え、得られた混合物を２５℃で４時間攪拌した。反応物を水（１５ｍＬ）でクエンチし、水層をＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、飽和 ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）で洗浄し、濃縮して、粗固体を得、それをＤＣＭ／ＭＴＢＥ／ｎ－ヘキサン（１：４：４０）の混合物から再結晶させて、化合物２－４ａ（２５．５２ｇ、８３．４％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１１．２５（ｓ，１Ｈ），８．６５－８．６０（ｍ，２ Ｈ），８．０９－８．０２（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８５－６．７９（ｍ，４Ｈ），６．２３－６．２０（ｍ，１Ｈ），５．２３－５．１４（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．３３－４．２３（ｍ，２Ｈ），３．９０－３．７８（ｍ，１Ｈ），３．７５（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５２（ｍ，３Ｈ），３．５０－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８２－２．８０（ｍ，１Ｈ），２．６５－２．６０（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９６（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３９（ｍ，２Ｈ），１．３１－１．１０（ｍ，１４Ｈ），１．０８－１．０５（ｍ，２ Ｈ），０．８５－０．７９（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４３，１４９．１８。
化合物２－４ｂ、２－４ｃ、２－４ｄ、および２－４ｅを、化合物２－４ａについて上述したものと同様の手順を使用して調製した。化合物２－４ｂを、白色固体として得た（２５．５０ｇ、８５．４％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－－ＤＭＳＯ）１１．２３（ｓ，１Ｈ），８．６５－８．６０（ｍ，２ Ｈ），８．０５－８．０２（ｍ，２Ｈ），７．７３－７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．２１－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．２３－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．４０－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５２（ｍ，３Ｈ），３．５０－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８３－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６８－２．６２（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９７（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３１－１．１０（ｍ，１８Ｈ），１．０８－１．０５（ｍ，２Ｈ），０．８５－０．７８（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４３，１４９．１９。
化合物２－４ｃを、オフホワイト固体として得た（３６．６０ｇ、６６．３％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１１．２２（ｓ，１Ｈ），８．６４－８．５９（ｍ，２Ｈ），８．０５－８．００（ｍ，２Ｈ），７．７３－７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．２１－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．２５－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．４０－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５０（ｍ，３Ｈ），３．５０－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８３－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６８－２．６２（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９９（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３３－１．１２（ｍ，３８Ｈ），１．０８－１．０５（ｍ，２Ｈ），０．８６－０．８０（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４２，１４９．１７。
化合物２－４ｄを、オフホワイト固体として得た（２６．６０ｇ、７２．９％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１１．２２（ｓ，１Ｈ），８．６４－８．５９（ｍ，２Ｈ），８．０５－８．００（ｍ，２Ｈ），７．７３－７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３３（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．２１－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．２２－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．４０－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７４（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５２（ｍ，３Ｈ），３．５０－３．２０（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８３－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６８－２．６２（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９９（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３５－１．０８（ｍ，３８Ｈ），１．０８－１．０５（ｍ，２Ｈ），０．８５－０．７９（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４７，１４９．２２。
化合物２－４ｅを、白色固体として得た（３８．１０ｇ、５４．０％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１１．２１（ｓ，１Ｈ），８．６４－８．５９（ｍ，２Ｈ），８．０５－８．００（ｍ，２Ｈ），７．７３－７．７０（ｍ，１Ｈ），７．６７－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５９－７．５１（ｍ，２Ｈ），７．３８－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．２５（ｍ，７Ｈ），６．８９－６．８０（ｍ，４Ｈ），６．２１－６．１５（ｍ，１Ｈ），５．２３－５．１７（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．６９（ｍ，３Ｈ），４．４０－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．９１－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．７４－３．５２（ｍ，３Ｈ），３．４７－３．２２（ｍ，６Ｈ），３．１４－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０９（ｓ，１Ｈ），２．８３－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．６８－２．６２（ｍ，１Ｈ），２．０５－１．９９（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３５－１．０６（ｍ，４６Ｈ），１．０８－１．０６（ｍ，２Ｈ），０．８５－０．７７（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ｄ６－ＤＭＳＯ）１４９．４１，１４９．１５。
実施例２．ＧａｌＸＣ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートの合成
スキーム１．テトラループにコンジュゲートされたモノ脂質（線形および分岐）を有するＧａｌＸＣ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド－脂質コンジュゲートの合成。合成後のコンジュゲーションは、アミドカップリング反応を介して実現された。
Ｒ１ＣＯＯＨ基は、脂肪酸Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１１：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６．０、Ｃ１７：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ２２：５、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０、Ｃ２６：０、Ｃ２２：６、Ｃ２４：１、ジアシルＣ１６：０、またはジアシルＣ１８：１を表す。
合成センス１およびアンチセンス１を、固相合成によって調製した。
コンジュゲートされたセンス１ａ～１ｉの合成
コンジュゲートされたセンス１ａは、ポストシンテニック（ｐｏｓｔ－ｓｙｎｔｅｎｉｃ）のコンジュゲーションアプローチを介して合成された。エッペンドルフ管１では、ＤＭＡ（０．７５ｍＬ）中のオクタン酸（０．５８ｍｇ、４ｕｍｏｌ）の溶液を、室温においてＨＡＴＵ（１．５２ｍｇ、４ｕｍｏｌ）で処理した。エッペンドルフ管２では、Ｈ２Ｏ（０．２５ｍＬ）中のオリゴセンス１（１０．００ｍｇ、０．８ｕｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡ（１．３９ｕＬ、８ｕｍｏｌ）で処理した。エッペンドルフ管１の溶液をエッペンドルフ管２に加え、室温でＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して混合した。ＬＣ－ＭＳ分析により反応の完了が示された後、反応混合物を５ｍＬの水で希釈し、ＡＣＮおよびＨ２Ｏ中の１００ｍＭ ＴＥＡＡの５～９５％の勾配を使用して逆相ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラムにより精製した。生成物画分を、Ｇｅｎｅｖａｃを使用して減圧下で濃縮した。合わせた残留溶媒を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ（３Ｋ）を使用して、水（１×）、生理食塩水（１×）、および水（３×）に対して透析した。Ａｍｉｃｏｎ膜を水（３×２ｍＬ）で洗浄し、次いで合わせた溶媒を凍結乾燥して、コンジュゲートされたセンス１ａの非晶質白色固体（６．４３ｍｇ、収率６４％）を得た。
コンジュゲートされたセンス１ｂ～１ｉを、コンジュゲートされたセンス１ａの合成について記載したものと同様の手順を使用して調製し、収率４２％～６９％で得た。
二本鎖１ａ～１ｊのアニーリング
コンジュゲートされたセンス１ａ（１０ｍｇ、重量で測定）を０．５ｍＬの脱イオン水に溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。アンチセンス１（１０ｍｇ、ＯＤで測定）を０．５ｍＬの脱イオン水に溶解し、２０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、この溶液を、コンジュゲートされたセンスのタイトレーション（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）および二本鎖量の定量に使用した。コンジュゲートされたセンスおよびアンチセンスの両方のモル量の計算に基づいて、必要なアンチセンス１の割合をコンジュゲートセンス１ａ溶液に加えた。得られた混合物を、９５℃で５分間攪拌し、室温まで冷却した。アニーリングの進行を、イオン交換ＨＰＬＣによって監視した。アニーリングの進行状況に基づいて、アニーリングを９５％超の純度で完了させるために、いくつかの割合のアンチセンス１をさらに添加した。溶液を凍結乾燥して、二本鎖１ａ（Ｃ８）を得、その量をアニーリングで消費されたアンチセンスのモル量に基づいて算出した。
二本鎖１ｂ～１ｉは、二本鎖１ａ（Ｃ８）のアニーリングについて記載したものと同じ手順を使用して調製した。
以下のスキーム１－２は、ループ上にモノ脂質を有するニックの入ったテトラループＧａｌＸＣコンジュゲートの合成を示す。合成後のコンジュゲーションは、Ｃｕ－触媒によるアルキン－アジド環化付加反応を介して実現された。
センス１Ｂおよびアンチセンス１Ｂを、固相合成によって調製した。
コンジュゲートされたセンス１ｊの合成
エッペンドルフ管１では、ＤＭＡ／Ｈ２Ｏ（０．５ｍＬ）の３：１混合物中のオリゴ（１０．００ｍｇ、０．８ｕｍｏｌ）の溶液を、脂質リンカーアジド（１１．２６ｍｇ、４ｕｍｏｌ）で処理した。エッペンドルフ管２では、ＣｕＢｒジメチルスルフィド（１．６４ｍｇ、８ｕｍｏｌ）をＡＣＮ（０．５ｍＬ）に溶解した。両方の溶液に、それらを通してＮ２をバブリングすることにより１０分間脱気した。次いで、ＣｕＢｒＳＭｅ２のＡＣＮ溶液を管１に添加し、得られた混合物を４０℃で攪拌した。ＬＣ－ＭＳ分析によって反応の完了が示された後、反応混合物を０．５ＭのＥＤＴＡ（２ｍＬ）で希釈し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ（３Ｋ）を使用して水（２×）に対して透析した。反応粗生成物を、ＡＣＮ（３０％のＩＰＡがスパイクインされた）およびＨ２Ｏ中１００ｍＭのＴＥＡＡの５～９５％の勾配を使用して、逆相ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラムにより精製した。生成物画分を、Ｇｅｎｅｖａｃを使用して減圧下で濃縮した。合わせた残留溶媒を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ（３Ｋ）を使用して、水（１×）、生理食塩水（１×）、および水（３×）に対して透析した。Ａｍｉｃｏｎ膜を水（３×２ｍＬ）で洗浄し、合わせた溶媒を凍結乾燥して、コンジュゲートされたセンス１ｊの非晶質白色固体（６．９０ｍｇ、収率５７％）を得た。
二本鎖１ｊ（ＰＥＧ２Ｋ－ジアシルＣ１８）を、二本鎖１ａ（Ｃ８）のアニーリングについて記載したものと同じ手順を使用して調製した。
以下のスキーム１－３は、合成後コンジュゲーションアプローチを使用する、ループ上にジ脂質（ｄｉ－ｌｉｐｉｄ）を有するニックの入ったテトラループＧａｌＸＣコンジュゲートの合成を示す。
センス２およびアンチセンス２を、固相合成によって調製した。
コンジュゲートされたセンス２ａおよび２ｂを、コンジュゲートされたセンス１ａの合成について記載したものと同様の手順を使用して調製したが、１０当量の脂質、１０当量のＨＡＴＵ、および２０当量のＤＩＰＥＡを使用した。
二本鎖２ａ（２ＸＣ１１）および２ｂ（２ＸＣ２２）を、二本鎖１ａ（Ｃ８）のアニーリングについて記載したものと同じ手順を使用して調製した。
以下のスキーム１－４は、合成後コンジュゲーションアプローチを使用した、モノ脂質とコンジュゲートされた完全にホスホロチオエート化されたステムループのＧａｌＸＣの合成を示す。
センス３およびアンチセンス３を、固相合成によって調製した。
コンジュゲートされたセンス３ａを、コンジュゲートされたセンス１ａの合成について記載したものと同様の手順を使用して調製し、収率６５％で得た。
二本鎖３ａ（ＰＳ－Ｃ２２）を、二本鎖１ａ（Ｃ８）のアニーリングについて記載したものと同じ手順を使用して調製した。
以下のスキーム１－５は、合成後コンジュゲーションアプローチを使用した、モノ脂質とコンジュゲートされたショートセンスのＧａｌＸＣの合成を示す。
センス４およびアンチセンス４を、固相合成によって調製した。
コンジュゲートされたセンス４ａを、コンジュゲートされたセンス１ａの合成について記載したものと同様の手順を使用して調製し、７４％の収率で得た。
二本鎖４ａ（ＳＳ－Ｃ２２）を、二本鎖１ａ（Ｃ８）のアニーリングについて記載したものと同じ手順を使用して調製した。
以下のスキーム１－６は、合成後コンジュゲーションアプローチを使用する、ループ上のトリアダマンタン部分とコンジュゲートされたニックの入ったテトラループＧａｌＸＣの合成を示す。
センス５およびアンチセンス５を、固相合成によって調製した。
コンジュゲートされたセンス５ａおよび５ｂを、コンジュゲートされたセンス１ａの合成について記載したものと同様の手順を使用して調製し、収率４２％～７３％で得た。
二本鎖５ａ（３Ｘアダマンタン）および二本鎖５ｂ（３Ｘアセチルアダマンタン）を、二本鎖１ａ（Ｃ８）のアニーリングについて記載したものと同じ手順を使用して調製した。
以下のスキーム１～７は、ループ上に脂質がコンジュゲートされたニックの入ったテトラループＧａｌＸＣの固相合成の例を示す。
コンジュゲートされたセンス６の合成
コンジュゲートされたセンス６を、市販のオリゴ合成器を使用した固相合成によって調製した。オリゴヌクレオチドは、２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅなどの２’－修飾ヌクレオシドホスホラミダイト、および２’－ジエトキシメタノール結合脂肪酸アミドヌクレオシドホスホラミダイトを使用して合成された。オリゴヌクレオチド合成を、標準的なオリゴヌクレオチド合成プロトコルを使用して、固体支持体上で３’から５’方向に行った。これらのために、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ）を、カップリング反応の活性化剤として使用した。ヨウ素溶液を亜リン酸トリエステル酸化のために使用した。３－（ジメチルアミノメチリデン）アミノ－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ）を、ホスホロチオエート結合の形成に使用した。合成されたオリゴヌクレオチドを、濃アンモニウム水溶液で１０時間処理した。アンモニアを懸濁液から除去し、固形支持体残留物を濾過により除去した。粗オリゴヌクレオチドを、ＴＥＡＡで処理し、分析し、強アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ－ＨＰＬＣ）により精製した。画分を合わせて、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ（３Ｋ）を使用して、水（３×）、生理食塩水（１×）、および水（３×）に対して透析した。次いで、残りの溶媒を凍結乾燥して、所望のコンジュゲートされたセンス６を得た。
二本鎖６を、二本鎖１ａ（Ｃ８）のアニーリングについて記載したものと同じ手順を使用して調製した。
スキーム８．合成後コンジュゲーションアプローチを介した、ループ上の１個のアダマンタン単位がコンジュゲートされたニックの入ったテトラループＧａｌＸＣの合成。
コンジュゲートされたセンス７ａおよび７ｂの合成
コンジュゲートされたセンス７ａおよびセンス７ｂを、コンジュゲートされたセンス５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
二本鎖７ａおよび７ｂの合成例
二本鎖７ａおよび二本鎖７ｂを、二本鎖５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
スキーム９．合成後コンジュゲーションアプローチを介した、ループ上の２個のアダマンタン単位がコンジュゲートされたニックの入ったテトラループＧａｌＸＣの合成。
コンジュゲートされたセンス８ａおよび８ｂの合成
コンジュゲートされたセンス８ａおよびセンス８ｂを、コンジュゲートされたセンス５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
二本鎖８ａおよび８ｂの合成例
二本鎖８ａおよび二本鎖８ｂを、二本鎖５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
以下のスキーム１－１０は、合成後コンジュゲーションアプローチを使用した、モノ脂質とコンジュゲートされたショートセンスおよびショートステムループのＧａｌＸＣの合成を示す。
センス９ａの合成
コンジュゲートされたセンス９ａを、コンジュゲートされたセンス５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
二本鎖９ａの合成例
二本鎖９ａを、二本鎖５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
以下のスキーム１－１１は、合成後コンジュゲーションアプローチを使用した、５’末端でモノ脂質とコンジュゲートされたＧａｌＸＣの合成を示す。
コンジュゲートされたセンス１０ａの合成
コンジュゲートされたセンス１０ａを、コンジュゲートされたセンス５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
二本鎖１０ａの合成例
二本鎖１０ａを、二本鎖５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
以下のスキーム１－１２ａおよび１－１２ｂは、合成後コンジュゲーションアプローチを使用した、３’末端または５’末端でモノ脂質とコンジュゲートされた平滑末端を有するＧａｌＸＣの合成を示す。
コンジュゲートされたセンス１１ａおよび１２ａの合成
コンジュゲートされたセンス１１ａおよび１２ａを、コンジュゲートされたセンス５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
二本鎖１１ａおよび１２ａの合成例
二本鎖１１ａおよび１２ａを、二本鎖５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
コンジュゲート二本鎖８Ｄおよび二本鎖９Ｄを、二本鎖５の合成と同じ方法または実質的に同様の方法を使用して得た。
その後、アシル鎖を、目的の組織において発現される遺伝子であるＳＴＡＴ３遺伝子を標的とする核酸阻害剤分子にコンジュゲートした。２’－アミンリンカー［ａｄｅｍＡ］を有するパッセンジャー鎖を、固相後コンジュゲーションのために使用した。異なるタイプの脂質を、同じ化学を使用してコンジュゲートして、一連のコンジュゲートを生成した（図１Ａおよび１Ｂ）。ＳＡＲ研究を実施して、標的ノックダウンを媒介するために、目的の組織にペイロードを送達するために使用され得る脂質コンジュゲートを特定した。
実施例３：インビボ腫瘍モデル
簡潔に述べると、６～８週齢の免疫不全（Ｎｕｄｅ）／免疫応答性（Ｃ５７ＢＬ／６）マウスの右肩の下に、２×１０６個のＰａｎ０２細胞（マウス膵癌細胞株）、２×１０６個のＢ１６Ｆ１０細胞（マウス黒色腫細胞株）、または５×１０６個のＬＳ４１１Ｎ細胞（ヒト結腸直腸癌細胞株）を皮下注射した。腫瘍が３００～５００ｍｍ３の容積に達したとき、それらを異なるコホートに無作為化し、ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートの投与の供した。各ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートを、１０ｍＬ／ｋｇの総容量で皮下投与した。マウス膵細胞株Ｐａｎ０２は、ＮＣＩから得られ、マウス黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０およびヒト結腸直腸細胞株ＬＳ４１１Ｎは、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られた。全ての細胞を、１０％ ＦＢＳで補充されたＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ培地中で増殖させた。Ｐａｎ０２、Ｂ１６Ｆ１０、およびＬＳ４１１Ｎ腫瘍は、非常に抑制性の、または冷たい腫瘍微小環境を維持することが知られている。
実施例４：腫瘍微小環境の異なる構成要素へのＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートの差次的送達
ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートの差次的送達を解明するために、実施例３に記載されるように、ヒト異種移植片腫瘍（ＬＳ４１１Ｎ細胞）をヌードマウスに移植した。移植の約２週間後、腫瘍容積が約３００～４００ｍｍ３に達したとき、マウスを６群（ｎ＝３）に無作為化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または実施例２のスキーム１に概説されるようなＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲート（ＧａｌＸＣ－Ｃ８、ＧａｌＸＣ－Ｃ１８、ＧａｌＸＣ－Ｃ１８－１、ＧａｌＸＣ－Ｃ１８－２、もしくはＧａｌＸＣ－Ｃ２２）のいずれかの１０ｍｇ／ｋｇの単回投与で処置した。皮下注射の３日後、腫瘍を採取し、ｑＰＣＲによって分析して、ヒトＡＬＤＨ２およびマウスＡｌｄｈ２のｍＲＮＡレベルを決定した。バルク腫瘍組織では、ヒトＡＬＤＨ２遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、全群にわたってベースラインのままであったが、マウスのＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ対照と比較してＣ８を除いて、Ｃ１８、Ｃ１８－１、Ｃ１８－２、およびＣ２２を含むＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲートで処置した全群にわたって約４０～５０％減少した（図２Ａおよび２Ｂ）。これらのデータは、ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲートが、ヒト腫瘍上皮におけるｓｉＲＮＡ送達および標的ノックダウンを媒介しなかったが、標的ノックダウンを促進するために、腫瘍微小環境中の構成要素へのｓｉＲＮＡ送達を媒介したことを示唆している。この観察をさらに確認するために、同じ腫瘍型でフォローアップ研究を実行した。ＬＳ４１１Ｎヒト異種移植片腫瘍を、上述したようにヌードマウスに移植した。１０、２５、および５０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２コンジュゲート、ならびにＰＢＳ対照の１２群への無作為化後、マウスを、それに応じて被験物質の単回皮下投与で処置した。
用量応答および活性の持続時間を、処置後３、７、および１４日目にマウスおよびヒトＡｌｄｈ２／ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡレベルを測定することによって決定した。並行して、非腫瘍担持マウスにおけるＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２の活性も、処置後３および１４日目に２５ｍｇ／ｋｇ用量レベルで調査した（図４Ｂ）。以前に観察されたように、５０ｍｇ／ｋｇの高用量を含む任意の用量レベルでのヒト腫瘍上皮実質において、標的ノックダウンは観察されてなかった（図３Ａ）。しかしながら、マウス宿主組織（腫瘍微小環境）において、Ａｌｄｈ２ ｍＲＮＡの堅牢なノックダウンが観察された（図３Ｂ）。マウスＴＭＥ中のｍＲＮＡノックダウンの最下点は、投与後１週間で観察された。最下点でのＥＤ５０は、１０～２５ｍｇ／ｋｇで観察され、最大ノックダウンは、７５％超であった。堅牢なｍＲＮＡノックダウンは、投与後少なくとも２週間維持された。同じ研究では、マウスからの腫瘍排出リンパ節（腋窩および鼠径）も採取し、マウスＡｌｄｈ２のｍＲＮＡレベルについてｑＰＣＲによって分析した。図４Ａで実証されるように、用量レベルにかかわらず、強力かつ持続的な活性が観察された。腫瘍排出リンパ節（ＴｄＬＮ）中のＥＤ５０は、１０ｍｇ／ｋｇ未満であると決定された。用量関連応答の欠如は、ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２の最低用量レベルでさえも活性の飽和があったことを示唆している。図４Ｂは、ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２で処置した非腫瘍担持マウスのリンパ節（ＬＮ）中で、標的ノックダウンが観察されなかったことを示す。理論に拘束されるものではないが、対照ＬＮ中の活性の欠如が、ＴｄＬＮ中で実証される活性が腫瘍媒介性であること、およびＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ－Ｃ２２コンジュゲートが腫瘍リンパ排液を介してＬＮへのアクセスを得たことを示唆する可能性がある。腫瘍担持マウスの異なるリンパ節タイプにわたっても標的ノックダウンが観察されたかどうかを調べるために、非排出リンパ節（ＴｄＬＮに対して身体の反対側のＬＮ）も採取し、３時点全てで標的ｍＲＮＡレベルについて分析した。図５Ａに示されるように、非ＴｄＬＮ中の標的ｍＲＮＡレベルは、３日目に２０％、７日目に５０％低減し、１４日目にＴｄＬＮで観察されたのと同じレベル（６０％）のノックダウンに達した。細胞集団の免疫抑制特性のレベルを、所与の細胞集団におけるｍＲＮＡマーカーＣＤ１１ｂおよびＰｄｌ１の比を決定することによって評価した。この実験では、これらのマーカーのマウスｍＲＮＡ比は、１４日目のＴｄＬＮと比較して、非ＴｄＬＮ中で有意により低いことがわかり（図５Ｂ）、ＴｄＬＮ中に存在する細胞集団が、非ＴｄＬＮ中に存在する細胞集団よりも抑制性であることを示唆している。
実施例５：ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートは、腫瘍関連骨髄細胞において標的ノックダウンを媒介する
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、腫瘍形成中に増殖し、Ｔ細胞応答を抑制する顕著な能力を有する不均一な細胞集団である。集合的に、ＭＤＳＣは、細胞表面またはｍＲＮＡマーカーＣＤ１１ｂ（マクロファージ系統の骨髄細胞のマーカー）およびＧｒ－１（骨髄系統分化抗原のマーカー）の共発現によって特徴付けられ、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ－１＋細胞として示される。Ｇｒ－１はさらに、２つの構成要素Ｌｙ６ＧおよびＬｙ６Ｃから成る。ＭＤＳＣは、２つのサブセット：ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃｌｏとしてさらに特徴付けられる顆粒球ＭＤＳＣ（Ｇ－ＭＤＳＣ）、およびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃｈｉとして特徴付けられる単球ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）から成る。マウス宿主組織におけるＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートによって媒介される標的ノックダウンの影響を受けやすい細胞集団を解明するために、特にＴＭＥのＣＤ１１ｂ＋ ＭＤＳＣにおける標的ノックダウンを調査するために、実施例３に記載されるように、ＬＳ４１１Ｎヒト異種移植片腫瘍をヌードマウスに移植した。無作為化後、マウスを、２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２コンジュゲートまたはＰＢＳのいずれかの単回投与で処置した。投与後３日目に、マウス宿主ＣＤ１１ｂ＋細胞（骨髄由来抑制細胞またはＭＤＳＣ）およびヒト腫瘍細胞を、ＭＡＣＳ分離技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ、Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して、陽性および陰性の磁気分離方法を通して腫瘍の単一細胞懸濁液からそれぞれ単離した。ＣＤ１１ｂ陽性細胞を単離するために、ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用して、腫瘍の単一細胞懸濁液を作製した。次いで、単一細胞懸濁液中のＣＤ１１ｂ陽性細胞を、ＭＡＣＳマイクロビーズで磁気標識し、ＭＡＣＳカラムを通過させ、その後、保持された標識細胞を、陽性選択された画分としてカラム内に溶出することによって濃縮した（ＣＤ１１ｂ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ、マウスキットカタログ番号１３０－１２６－７２５）。腫瘍細胞分離について、細胞懸濁液中の非標的細胞を、マイクロビーズのカクテルで磁気標識し、ＭＡＣＳカラムを通過させた。このプロセス中、不要な標識細胞をカラム内に保持し、非標識標的細胞（腫瘍細胞）を純粋な画分としてフロースルー中で採取した。（Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ヒトカタログ番号１３０－１０８－３３９）。ＣＤ１１ｂ＋細胞を、正常なマウスの脾臓の単一細胞懸濁液からも単離して、異なる組織型からのＣＤ１１ｂ＋集団の抑制活性を比較した。細胞型間で同程度のＡｌｄｈ２発現を仮定した場合、ＣＤ１１ｂ＋ＭＤＳＣ調製物は、９０％超純粋であることが示された。免疫細胞集団の単離後、ＣＤ１１ｂおよびＡｒｇ１（免疫抑制能力を特徴付けるマーカー）ｍＲＮＡレベルを、両方の集団において測定し、相対的なレベルを決定した。この分析では、ＣＤ１１ｂ ｍＲＮＡを、腫瘍および脾臓部分集団において１００％に設定した。Ａｒｇ１は、単離されたＭＤＳＣにおいて高度に発現されたが、これは、同じ親和性分離プロトコルを使用して脾臓骨髄細胞では発現されず（３５超のＣｔ）、ＴＭＥ中のＭＤＳＣが、腫瘍Ｔ細胞を不活性化して抗腫瘍免疫応答を抑制するためにＭＤＳＣが使用する機構のうちの１つであるため、他の骨髄由来細胞と比較して高い免疫抑制能力を有することを示唆している（図６）。ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ２２媒介標的ノックダウンが単離されたＣＤ１１ｂ＋細胞および／または腫瘍細胞で観察されたかを決定するために、ｑＰＣＲを実施し、Ａｌｄｈ２／ＡＬＤＨ２ ｍＲＮＡレベルを決定した。図７Ａおよび７Ｂで実証されるように、単離されたＣＤ１１ｂ＋細胞において約４２％の標的ノックダウンが観察されたが、単離された腫瘍細胞では、標的ノックダウンは観察されなかった。これらのデータは、バルク腫瘍試料から収集されたデータにおいて以前に行われた観察を裏付ける。
実施例６：ＳＡＲを使用して、腫瘍微小環境および腫瘍排出リンパ節へのｓｉＲＮＡ送達に好ましいＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートを特定する
最も好ましい特性を有する脂質コンジュゲートを特定して、ＴＭＥ中の骨髄細胞に対して最も高い選択性で、ペイロードを送達し、標的ノックダウンを媒介するために、スキーム１で実証された一連のＧａｌＸＣ脂質コンジュゲート（Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２２、およびＣ２４）を生成した。これらの被験物質を調査するために、Ｐａｎ０２マウス膵臓腫瘍細胞をヌードマウスに移植した。腫瘍が３００～４００ｍｍ３の容積に達したとき、マウスを群に無作為化し、ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ脂質コンジュゲート（Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２２、およびＣ２４）の単回投与のいずれかで処置した。標的ノックダウンを、バルク腫瘍および肝臓（図８Ａおよび８Ｂ）において３日目に評価して、正常な肝臓組織と比較して、標的組織（ＭＤＳＣ）に対する選択性を有するＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートを特定する。投与後３日目に、全ての処置群の腫瘍におけるＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡレベルは、同様の程度まで減少した。ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲート群の肝臓中のＡｌｄｈ２レベルにおいて、より低い標的ノックダウンとのより高い脂質アシル鎖長の相関の傾向が観察され（Ｃ２４＞Ｃ２２＞Ｃ１８＞Ｃ１６）、これらのコンジュゲートがＴＭＥ対肝臓への輸送に異なる機構を使用し得ることを示唆している。より短い脂質アシル鎖コンジュゲートＣ１６およびＣ１８は、より長いアシル鎖コンジュゲートＣ２２およびＣ２４と比較して、ＴＭＥ活性を損なうことなく、より肝臓回避であるように見えるため、Ｃ１６／Ｃ１８脂質コンジュゲートを、それらの活性をさらに特徴付けるために別個の研究でさらに調査した。Ｐａｎ０２腫瘍担持マウスを、２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ１６もしくはＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ－Ｃ１８またはＰＢＳの単回皮下投与で処置し、７および１４日目にバルク腫瘍組織およびＴｄＬＮ中で活性をモニタリングした。図８Ｃおよび８Ｄに示されるように、Ｃ１８コンジュゲートは、両方の時点で、バルク腫瘍中の標的ノックダウンにおいてＣ１６よりも優れていた。両方の被験物質が７日目にＴｄＬＮ中で同様の活性を示したが、Ｃ１６コンジュゲート媒介活性が１４日目に有意に低減した一方で、Ｃ１８媒介活性は維持された。これらのデータに基づいて、ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ１８コンジュゲートを、さらなる研究のために選択した。
実施例７：骨髄由来抑制細胞サブセットにおける活性の開始および用量依存性の差
ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲートは、ＣＤ１１ｂ＋細胞において送達を媒介し、Ａｌｄｈ２遺伝子をサイレンシングすることが実証されているが、ノックダウンが細胞型のいずれか、または細胞の両方のサブセットにおいて媒介されるかどうかを決定することが重要である。これらの細胞集団サブセットは、異なる機構を使用して免疫抑制活性を発揮するため、ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートが、適切な治療標的を特定するために活性を示す細胞集団を特定することが重要である。文献で実証されているように、ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ５とともにＧＭ－ＣＳＦを通したシグナル伝達は、顆粒球ＭＤＳＣ（Ｇ－ＭＤＳＣ）をＴＭＥに動員する際に重要な役割を果たし、Ｇ－ＭＤＳＣ上のＦＡＴＰ２受容体（ＳＬＣ２７Ａ２；ＦＡＴＰ２をコードする遺伝子）を増加させ、長鎖脂肪酸の効率的な取り込みを可能にすることによって、それらの増殖および抑制に深く関与する。最近の発見（Ｖｅｇｌｉａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１９）５６９：７３－７８（２０１９）によると、脂肪酸のうちの１つであるアラキドン酸は、ＣＯＸ－２酵素（ＣＯＸ－２をコードする遺伝子；ＰＴＧＳ２）によってＰＧＥ２に代謝されたとき、Ｔ細胞抑制に関与する。一方、単球ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）も骨髄からＴＭＥに動員され、そこで抑制性になる。Ｍ－ＭＤＳＣは、脂質取り込みに関与する可能性が高いＳＣＡＲＢ１およびＬＤＬＲなどの脂質輸送受容体のより高いレベルの発現を有することが知られている。骨髄細胞サブセットの各々が抑制性になると、それらは、ＡＲＧ１、ＴＧＦβ、ＩＤＯ、ＲＯＳ、および多くの他のものなどの抑制関連マーカーを強力に発現する。
ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートが、Ｇ－ＭＤＳＣもしくはＭ－ＭＤＳＣ細胞のいずれか、または両方においてノックダウンを媒介するかどうかを決定するために、ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ磁気分離法を使用して、ＣＤ１１ｂ細胞分離について概説したようにこれらの細胞を単離した。上述のように、腫瘍の単一細胞懸濁液を、ｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒを使用して作製した。次いで、Ｌｙ－６Ｇ＋画分（またはＧ－ＭＤＳＣ）を、Ｌｙ６Ｇ＋細胞をＭＡＣＳマイクロビーズで磁気標識し、ＭＡＣＳカラムを通過させ、その後、標識細胞を陽性選択された画分として溶出することによって、単一細胞懸濁液から単離した。Ｍ－ＭＤＳＣの分離（Ｌｙ６Ｇ－Ｇｒ－１＋）について、Ｌｙ６Ｇ分離後の残りのフロースルーに存在するＧｒ－１＋細胞を、ＭＡＣＳマイクロビーズで磁気標識し、ＭＡＣＳカラムを通過させて、陽性選択によって純粋な画分を単離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ、Ａｕｂｕｒｎ ＣＡ、ＭＤＳＣキットカタログ番号１３０－０９４－５３８）。複数の陽性および陰性選択工程を通して、純粋なＭＤＳＣ部分集団を単離した。これらの単離された集団を、図９および１０で実証されるように、Ｇ－ＭＤＳＣがＭ－ＭＤＳＣと区別されるときに発現される複数の重要なマーカーを測定することによって特徴付けた。ｍＲＮＡマーカーであるＬｙ６Ｇ、ＣｘＣｒ２、Ｓｌｃ２７ａ２、およびＰｔｇｓ２は、Ｍ－ＭＤＳＣではなく、Ｇ－ＭＤＳＣによって優先的に発現される。ＣｘＣｒ２、Ｓｃｌ２７ａ２、およびＰｔｇｓ２などの特異的マーカーの発現は、ＴＭＥ中のＧ－ＭＤＳＣの動員および抑制活性を示唆する。同様に、Ｌｙ６Ｃ、Ｓｃａｒｂ１、Ｌｄｌｒ、およびＡｒｇ１は、Ｇ－ＭＤＳＣと比較して、Ｍ－ＭＤＳＣによって高度に発現される（図１１および１２）。Ｍ－ＭＤＳＣにおけるＳｃａｒｂ１およびＬｄｌｒなどの脂質輸送受容体のより高い発現は、脂質取り込みにおいて重要な役割を果たし得る。単離された細胞部分集団のこれらのｍＲＮＡマーカープロファイルは、文献と一致していることがわかった。
細胞集団ノックダウンが媒介され得る細胞集団を特定するために、Ｐａｎ０２腫瘍を、実施例３に記載されるようにヌードマウスにおいて増殖させた。処置群への無作為化後、マウスは、２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ１８またはＰＢＳ対照のいずれかの単回投与を受けた。処置の３日後、腫瘍を採取し、Ｇ－ＭＤＳＣ集団およびＭ－ＭＤＳＣ集団を単離した。ｑＰＣＲを使用して、標的ｍＲＮＡレベルを決定した。この用量レベルでは、約４０％のＡｌｄｈ２ ｍＲＮＡノックダウンが、Ｍ－ＭＤＳＣサブセットではなく、Ｇ－ＭＤＳＣサブセットのみで観察された。異なる腫瘍モデルであるＢ１６Ｆ１０（マウス黒色腫腫瘍）を用いて同様に行ったフォローアップ研究を実施して、腫瘍型にわたる標的ノックダウンパターンを評価した。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を実施例３にあるようにヌードマウスに移植し、腫瘍が約３００ｍｍ３のサイズの容積に達したとき、マウスを処置群に無作為化し、２５ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－Ｃ１８コンジュゲートまたはＰＢＳの単回投与で処置した。処置の３日後、ｍＲＮＡレベルを前述したように分析した。図１３Ａおよび１３Ｂに示されるように、Ａｌｄｈ２ノックダウンは、Ｐａｎ０２腫瘍およびＢ１６Ｆ１０腫瘍の両方から採取されたＧ－ＭＤＳＣにおいてのみ観察された。ＧａｌＸＣ脂質コンジュゲートの用量レベルが送達においてどのような役割を果たすかをさらに理解するために、５０ｍｇ／ｋｇのより高い用量をＰａｎ０２腫瘍担持マウスに含み、３および７日目に標的ノックダウンをモニタリングした。図１３Ｃに示されるように、より高い用量で、Ｇ－ＭＤＳＣ集団における標的ノックダウンは、２５ｍｇ／ｋｇで観察されたノックダウンと同じままであった。さらに、Ｍ－ＭＤＳＣサブセットでも約５０％のノックダウンが観察された。各細胞サブセットの活性は、投与後１週間維持され（図１３Ｄ）、送達が、おそらくＦＡＴＰ２受容体を通して、Ｇ－ＭＤＳＣに対して最初に起こり得、その集団が飽和状態になると、送達は、この細胞型においてノックダウンを媒介するために、Ｍ－ＭＤＳＣ（Ｓｃａｒｂ１およびＬｄｌｒを通して）へとシフトすることを示唆している。これは、活性の開始および用量依存性が、これら２つのＭＤＳＣ細胞サブセット間で異なり得ることを示唆する。
実施例８：ＭＤＳＣ細胞集団および腫瘍排出リンパ節における組織特異的標的
上記のデータは、２つのＭＤＳＣサブセットが、異なる機構を通して免疫抑制を媒介することを実証する。ＣＸＣＲ２、ＳＣＬ２７Ａ２、およびＰＴＧＳ２が、Ｇ－ＭＤＳＣ上の特異的な潜在的標的として特定され、ＰＤ－Ｌ１が、ＴｄＬＮに常駐する細胞のより特異的な標的であろう一方、ＴＭＥ中のＭＤＳＣ細胞およびＴｄＬＮに常駐する細胞型の両方のサブセット上に発現される標的はほとんどない。ＳＴＡＴ３は、目的の全組織（すなわち、腫瘍微小環境中の腫瘍細胞および免疫細胞）で発現される１つのそのような標的である。ＳＴＡＴ３の発現を、Ｐａｎ０２腫瘍において測定した（図１４Ａ～１４Ｃ）。ＳＴＡＴ３は免疫抑制に関与し、例は文献に多数報告されている。ＲＮＡｉ機構を通してＳＴＡＴ３転写を標的とすることは、薬理学的ＳＴＡＴ３阻害剤の開発における課題を潜在的に克服し得る。これらの理由から、ＳＴＡＴ３を、目的の組織における組織特異的活性を実証するための概念実証標的として選択した。ＳＴＡＴ３配列を、記載された修飾パターンを有するＧａｌＸＣフォーマットで設計し、肝臓組織における標的ノックダウンのスクリーニングを、正常なＣＤ－１マウスにおいて実施した。１８個のＳＴＡＴ３－ＧａｌＸＣコンジュゲート（表３）を、３ｍｇ／ｋｇで１回皮下投与した。
注射の５日後、肝臓を採取し、ｑＰＣＲによるｍＲＮＡ分析に供した。スクリーンの結果として、肝臓において８５％超の標的ノックダウンを示した４つの配列（ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－８３８、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－１４０２、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－４１１０、およびＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－４１２３）を、さらなる評価のために選択した（図１５Ａ）。これらの配列のうち、３つをマウス特異的と特定し、１つをヒト－マウス交差反応性と特定した。これら４つの配列を、３つの異なる用量（０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇ）でＣＤ－１マウスにおいてさらにスクリーニングして、用量応答を評価した。ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－４１１０および４１２３を、用量応答スクリーニング後に最も強力な配列として特定し、各々は、０．３ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を有し、したがって、これらの分子をさらなる研究のために選択した（図１５Ｂ）。概念実証研究のために、Ｃ１８脂質コンジュゲーションを、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－４１１０または４１２３の両方について実施した（表４）。
ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８コンジュゲートの性能を評価するために、Ｐａｎ０２腫瘍をヌードマウスに移植し、十分な腫瘍容積に達すると、マウスを前述のように無作為化に供した。マウスは、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８ ４１１０および４１２３、またはＰＢＳの単回皮下投与のいずれかを受けた。注射の３日後、バルク腫瘍を採取した。ＭＤＳＣサブセットを実施例５に記載されるように単離し、標的ｍＲＮＡをｑＰＣＲによって分析した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。Ｓｔａｔ３ ｍＲＮＡレベルは、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１２３によって、Ｇ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおいて約４０％低減された。ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１１０は、両方のＭＤＳＣサブセットにおいて、Ｓｔａｔ３ ｍＲＮＡレベルを２０％のみ低減した。注目すべきは、Ａｌｄｈ２レベルが、所与の用量および時点でのＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲートによって、Ｇ－ＭＤＳＣにおいてのみ低減され、ノックダウンのレベルが、現在の実験で観察されたＧ－ＭＤＳＣにおけるＳｔａｔ３レベルの低減と同程度であったことである。Ｍ－ＭＤＳＣにおけるＳｔａｔ３レベルは、ＧａｌＸＣ－ＡＬＤＨ２－脂質コンジュゲート処置後のＭ－ＭＤＳＣにおけるＡｌｄｈ２レベルの低減がなかったことと比較して、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８後に低減した。Ｓｔａｔ３レベルと比較して、Ｍ－ＭＤＳＣにおける全体的なＡｌｄｈ２発現レベルがより高いことは、活性の差を説明し得る。
ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８コンジュゲートの用量レベルが、異なる組織および細胞サブセットへのこれらの分子の輸送においてどのような役割を果たすかを理解するために、同じ腫瘍モデルを用いて前述したようにフォローアップ研究を実施した。Ｐａｎ０２腫瘍担持マウスを、５０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１２３またはＰＢＳのいずれかの単回皮下投与で処置し、Ｓｔａｔ３ ｍＲＮＡレベルを３日後に測定した。Ｇ－ＭＤＳＣにおけるＳｔａｔ３ノックダウンは、２５ｍｇ／ｋｇ用量で観察されたノックダウンと比較して有意に変化しなかったが、この同じ用量レベルで、Ｓｔａｔ３サイレンシングの有意な改善が、Ｍ－ＭＤＳＣサブセットにおいて観察された。前述したように実施した並列研究では、Ｓｔａｔ３ノックダウンを、７日目にバルク腫瘍およびＴｄＬＮにおいて評価した（図１７Ａおよび１７Ｂ）。両方のＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８配列を有するバルク腫瘍において、用量依存性Ｓｔａｔ３ ｍＲＮＡノックダウンが観察された。ＴｄＬＮでは、Ｓｔａｔ３ ｍＲＮＡレベルは、療法の用量でのＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１２３によって約６０～６５％、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１１０によって約２５～３０％低減し、これらの用量レベルでの飽和効果を示唆している。データに基づいて、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１２３を、免疫応答性マウスにおけるさらなる有効性評価のために選択した。
実施例９：ＳＴＡＴ３阻害は、ＭＤＳＣにおけるＰＤ－Ｌ１レベルを減少させ、急性腫瘍効果を媒介する
リン酸化ＳＴＡＴ３の転写シグネチャは、腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１発現と正に相関している（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２０２０）、Ｚｅｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒｓ（２０１９）、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ（２０１８）。この相関からＭＤＳＣによって発現されるＳＴＡＴ３を推定するために、ＰＢＳまたはＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３コンジュゲートのいずれかで処置したＭＤＳＣの単離集団を、Ｐｄｌ１ ｍＲＮＡについてアッセイした。Ｐｄｌ１ ｍＲＮＡレベルは、２５または５０ｍｇ／ｋｇのＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３のいずれかで処置したＧ－ＭＤＳＣ集団およびＭ－ＭＤＳＣ集団の両方において約８０％減少した（図１８Ａ）。Ｐｄｌ１レベルも、ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３コンジュゲート、特にＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８－４１２３を用いた処置後に、ＴｄＬＮにおいて劇的に低減された（図１８Ｂ）。これらのデータは、ＳＴＡＴ３のノックダウン後のＰＤ－Ｌ１の下流の免疫調節の可能性を示唆する。
別の研究では、Ｐａｎ０２（マウス膵臓同系モデル）腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群当たりｎ＝４）を、分割投与モデルに続いてＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３－Ｃ１８コンジュゲートを用いて皮下処置し、全動物が、２５ｍｇ／ｋｇ×２用量または１２．５ｍｇ／ｋｇ×４用量のいずれかで投与した５０ｍｇ／ｋｇの総用量を受けた。２５ｍｇ／ｋｇの分割用量を使用して処置した腫瘍は、初回投与後でさえ急性腫瘍退縮を示した（図１９Ｂ）。２５ｍｇ／ｋｇの２回目の投与後、４匹のマウスのうち３匹からの腫瘍は、さらなる処理のために採取するには小さすぎるサイズまで退縮した。ＧａｌＸＣ－ＳＴＡＴ３処置の抗腫瘍効果は、１２．５ｍｇ／ｋｇの分割用量を受けたマウスでも観察された（図１９Ａ）。これらのデータは、ＰＤ－Ｌ１のＳＴＡＴ３媒介調節が、Ｐａｎ０２腫瘍担持免疫応答性マウスにおける腫瘍増殖に対して急性かつ劇的な効果をもたらすことを示唆する。
実施例１０：二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドの合成および精製
前述の実施例に記載の二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）オリゴヌクレオチドを、本明細書に記載の方法を使用して化学的に合成した。概して、ｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、公知のホスホルアミダイト合成（例えば、Ｈｕｇｈｅｓ ａｎｄ Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ（２０１７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．９（１）：ａ０２３８１２、Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ Ｍ．Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖ：Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ－Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８１；２２：１８５９－６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００４０－４０３９（０１）９０４６１－７を参照されたい）を使用することに加えて、１９～２３ｍｅｒのｓｉＲＮＡについて記載される固相オリゴヌクレオチド合成法（例えば、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．．１８：５４３３－４１およびＵｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：ｐ，７８４５を参照されたく、さらに、米国特許第５，８０４，６８３号、同第５，８３１，０７１号、同５，９９８，２０３号、同第６，００８，４００号、同第６，１１１，０８６号、同第６，１１７，６５７号、同第６，３５３，０９８号、同第６，３６２，３２３号、同第６，４３７，１１７号、および同第６，４６９，１５８号も参照されたい）を使用して合成した。１９ｍｅｒのコア配列を有するｄｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを、２５ｍｅｒのセンス鎖および２７ｍｅｒのアンチセンス鎖を有する構築物にフォーマットして、ＲＮＡｉ機構によるプロセシングを可能にした。１９ｍｅｒのコア配列は、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの領域に対して相補的である。
個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣを標準的な方法（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に従って精製した。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、固相ホスホラミダイト化学を使用して合成し、標準的な技術（Ｄａｍｈａ ＆ Ｏｌｇｉｖｉｅ（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：８１－１１４、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７－２６８４）を使用してＮＡＰ－５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で脱保護および脱塩した。オリゴマーを、１５分間のステップ直線勾配を使用して、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ－ＨＰＬＣ）を使用して精製した。勾配は、９０：１０緩衝液Ａ：Ｂから５２：４８緩衝液Ａ：Ｂまで変化し、緩衝液Ａは１００ｍＭトリスｐＨ８．５であり、緩衝液Ｂは１００ｍＭトリスｐＨ８．５、１Ｍ ＮａＣｌである。試料を２６０ｎｍでモニターし、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを収集し、プールされ、ＮＡＰ－５カラム上で脱塩し、凍結乾燥させた。
各オリゴマーの純度を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＰＡＣＥ ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．；Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）上のキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。ＣＥキャピラリーは、１００μｍの内径を有し、ｓｓＤＮＡ １００Ｒ Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含有する。典型的には、約０．６ｎｍｏｌｅのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場で実行し、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出した。変性トリス－ボレート－７Ｍ－尿素ランニング緩衝液を、Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。以下に記載する実験で使用するためのＣＥによって評価されるように、少なくとも９０％純粋であるオリゴリボヌクレオチドを得た。製造元の推奨プロトコルに従って、Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ（商標）Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）質量分析により、化合物同一性を確認した。全てのオリゴマーの相対分子質量を、多くの場合、予想される分子質量の０．２％以内で取得した。
二本鎖の調製
一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５から成る二本鎖緩衝液中に再懸濁した（例えば、１００μＭ濃度で）。相補的なセンス鎖およびアンチセンス鎖を等モル量で混合して、例えば、５０μＭの二本鎖の最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中で５’の１００℃に加熱し、使用前に室温まで冷却させた。ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを－２０℃で貯蔵した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、凍結乾燥させて、またはヌクレアーゼを含まない水中で－８０℃において貯蔵した。
実施例１１：ＳＴＡＴ３標的化二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの生成
ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列の特定
シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、いくつかの発生および疾患機能に関与する転写因子である。ＳＴＡＴ３発現のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害剤を生成するために、コンピュータベースのアルゴリズムを使用して、ＲＮＡｉ経路によるＳＴＡＴ３発現の阻害をアッセイするのに好適なＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列をコンピュータで特定した。アルゴリズムは、各々がヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの好適なＳＴＡＴ３標的配列（例えば、配列番号１２１７；表６）に対する相補性の領域を有する、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドガイド（アンチセンス）鎖配列を提供した。アルゴリズムによって特定したガイド鎖配列のいくつかはまた、サルＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの対応するＳＴＡＴ３標的配列（配列番号１２１８、表６）および／またはマウスＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡに対しても相補的であった。ヌクレオチド配列類似性を有する相同ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含むＳＴＡＴ３ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、相同ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを標的とする能力を有すると予測される。
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（ＤｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとしてフォーマットされた）を、インビトロでの評価のために実施例１０に記載されるように生成した。各ＤｓｉＲＮＡを同じ修飾パターンで生成し、各々は、配列番号８９～２８０によって特定されるＳＴＡＴ３標的配列に対する相補性の領域を有する固有のガイド鎖を有した。センスおよびアンチセンスＤｓｉＲＮＡについての修飾には、以下が含まれた（Ｘ－任意のヌクレオチド；ｍ－２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、ｒ－リボシル修飾ヌクレオチド）：
センス鎖：
ｒＸｍＸｒＸｍＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｍＸｒＸｍＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸＸＸ
アンチセンス鎖：
ｍＸｍＸｍＸｍＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｍＸｒＸｍＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｒＸｍＸｒＸｍＸｍＸｍＸ
表７の修飾ＤｓｉＲＮＡの各々がＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを低減する能力を、インビトロ細胞ベースアッセイを使用して測定した。簡潔に述べると、内因性ヒトＳＴＡＴ３遺伝子を発現するヒト肝細胞（Ｈｕｈ７）に、マルチウェル細胞培養プレートの別々のウェルに１ｎＭで、表７に列挙されるＤｓｉＲＮＡの各々をトランスフェクトした。細胞を、修飾ＤｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後２４時間維持し、次いで、トランスフェクト細胞からの残存するＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの量を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ベースのｑＰＣＲアッセイを使用して決定した。２つのｑＰＣＲアッセイ、３’アッセイおよび５’アッセイ（順方向１－配列番号１２１９）、逆方向１－配列番号１２２０、プローブ１－配列番号 １２２１；順方向２－配列番号 １２２２、逆方向２－配列番号 １２２３、プローブ２－配列番号１２２４）を使用して、６－カルボキシ－フルオレセイン（ＦＡＭ）にコンジュゲートされたＰＣＲプローブを使用して測定されたＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを決定した。表７および図２０に示されるように、各プライマー対を残存するＲＮＡ％についてアッセイした。偽トランスフェクト細胞と比較して、ＤｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞に残存する１０％以下のＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡをもたらすＤｓｉＲＮＡを、ＤｓｉＲＮＡが「ヒット」したとみなした。表７に列挙されるＤｓｉＲＮＡがＳＴＡＴ３発現を阻害する能力を評価するＨｕｈ７細胞ベースのアッセイは、いくつかの候補ＤｓｉＲＮＡを特定した。
まとめると、これらの結果は、ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを標的とするように設計したＤｓｉＲＮＡが、対照細胞と比較してＤｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞中のＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの量の低減によって決定されるように、細胞におけるＳＴＡＴ３発現を阻害することを示す。これらの結果は、ＤｓｉＲＮＡを含むヌクレオチド配列が、ＳＴＡＴ３発現を阻害するＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを生成するのに有用であることを実証する。さらに、これらの結果は、複数のＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列が、ＳＴＡＴ３発現のＲＮＡｉ媒介阻害に好適であることを実証する。
最初のインビトロスクリーニングの後、４８個の構築物を用量研究のために選択した。Ｈｕｈ７細胞を、０．０５ｎＭ、０．３ｎＭ、または１ｎＭのオリゴヌクレオチドで２４時間処理した。ｍＲＮＡを単離し、測定して、有効用量を決定した（図２１Ａ）。試験されたオリゴヌクレオチドのうち、３４個の配列を、インビボでのさらなる試験のために選択した（表８および図２１Ｂ）。
実施例１２：インビボでのＳＴＡＴ３のＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害
実施例１１のインビトロスクリーニングアッセイは、ＳＴＡＴ３標的化ＤｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡをノックダウンする能力を検証した。ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドがインビボでＳＴＡＴ３をノックダウンする能力を確認するために、ＨＤＩマウスモデルを使用した。実施例１１で特定したＤｓｉＲＮＡのサブセットを使用して、３６ｍｅｒパッセンジャー鎖および２２ｍｅｒガイド鎖を有するニックの入ったテトラループＧａｌＮＡｃコンジュゲート構造（本明細書では「ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチド」または「ＧａｌＮＡｃ－ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）を含む、対応する二本鎖ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを生成した（表１０および表１１）。さらに、パッセンジャー鎖およびガイド鎖を含むヌクレオチド配列は、修飾ヌクレオチドおよびホスホロチオエート結合の明確に異なるパターンを有する。テトラループを含むヌクレオチドのうちの３個は、各々、ＧａｌＮＡｃ部分（ＣＡＳ＃１４１３１－６０－３）とコンジュゲートされた。使用した修飾パターンを以下に示す。
パターン１
センス鎖：５’ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｆＸ［－ｍＸ－］１６－［ａｄｅｍＸ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＸ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＸ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ ３’。
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］－Ｓ－ｆＸ－Ｓ－ｆＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ ３’。
または以下のように表される：
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
パターン２
センス鎖：５’ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｆＸ－ｆＸ［－ｍＸ－］１６－［ａｄｅｍＸ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＸ－ＧａｌＮＡｃ］－［ａｄｅｍＸ－ＧａｌＮＡｃ］－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ ３’。
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：５’［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸ］－Ｓ－ｆＸ－Ｓ－ｆＸ－Ｓ－ｆＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｆＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ－Ｓ－ｍＸ ３’。
または以下のように表される：
センス鎖：［ｍＸｓ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ａｄｅｍＡ－ＧａｌＮＡｃ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］
これが、以下にハイブリダイズする：
アンチセンス鎖：［Ｍｅホスホネート－４Ｏ－ｍＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸｓ］［ｆＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｆＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸ］［ｍＸｓ］［ｍＸｓ］［ｍＸ］
表１０および表１１のオリゴヌクレオチドを、マウス肝臓の肝細胞においてヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを一過性に発現するように操作されたマウスで評価した。簡潔に述べると、６～８週齢のメスのＣＤ－１マウス（ｎ＝４～５）に、ＰＢＳ中で製剤化された１ｍｇ／ｋｇの用量で、示されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを皮下投与した。マウスの対照群（ｎ＝３～４）には、ＰＢＳのみを投与した。３日後（７２時間）、ユビキタスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列の制御下で、完全なヒトＳＴＡＴ３遺伝子をコードするＤＮＡプラスミド（２５μｇ）を、マウスに流体力学的に注射（ＨＤＩ）した。ＤＮＡプラスミド導入の１日後、ＨＤＩマウスからの肝臓試料を採取した。これらのＨＤＩマウスからの全ＲＮＡを、実施例１１に記載のように、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析に供して、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを決定した。ｍＲＮＡレベルを、ヒトｍＲＮＡについて測定した。ＤＮＡプラスミドに含まれるＮｅｏＲ遺伝子を使用して、値をトランスフェクション効率について正規化した。異なる修飾パターンを含むベンチマーク対照（ＳＴＡＴ３－１３８８）を、両方のアッセイに使用した（センス鎖配列番号１１００、アンチセンス鎖配列番号１１９０）。
図２２Ａおよび２２Ｂの結果は、ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを標的とするように設計したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドが、ＰＢＳのみで処置した対照ＨＤＩマウスと比較して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドで処置したＨＤＩマウスからの肝臓試料におけるヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ発現の量の低減によって決定されるように、ＨＤＩマウスにおけるヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ発現を阻害したことを示す。
図２２Ａおよび２２Ｂで試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドのサブセットを、用量研究でさらに検証した。具体的には、９個のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチド（ＳＴＡＴ３－７１５、ＳＴＡＴ３－７１６、ＳＴＡＴ３－７１７、ＳＴＡＴ３－７２０、ＳＴＡＴ３－７２１、ＳＴＡＴ３－１１４５、ＳＴＡＴ３－１２８６、ＳＴＡＴ３－１２８６、およびＳＴＡＴ３－１２８７）を使用して用量研究を実施した。マウスに、上述のように流体力学的に注射し、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドで処置した。１日後に肝臓を採取し、ＳＴＡＴ３発現を測定して有効用量を決定した（図２３）。全てのＧａｌＮＡｃ結合ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドが、１ｍｇ／ｋｇ用量でＳＴＡＴ３発現を低減することができ、ＳＴＡＴ３－１２８６は、０．３ｍｇ／ｋｇ用量で発現を低減することができた。全体的に、ＨＤＩ研究では、肝臓におけるＳＴＡＴ３発現を阻害するための、いくつかの有望なＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドが特定された。
実施例１３：インビボでのＳＴＡＴ３の種特異的ＲＮＡｉオリゴヌクレオチド阻害
ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドがインビボでＳＴＡＴ３をノックダウンする能力を確認するために、いくつかの交差種および種特異的ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを生成した。具体的には、三重共通（ヒト、非ヒト霊長類、およびマウス、Ｈｓ／Ｍｆ／Ｍｍ）、ヒト／マウス（Ｈｓ／Ｍｍ）、およびヒト特異的（Ｈｓ）オリゴヌクレオチドを評価した。
Ｈｓ／Ｍｆ／ＭｍおよびＨｓ／Ｍｍ共通
肝臓で内因性マウスＳＴＡＴ３を発現するマウスに、表１２に記載されるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した。５日後に肝臓を採取し、ＳＴＡＴ３発現を測定した。全体的に、研究では、肝臓におけるＳＴＡＴ３発現を阻害するための、いくつかの潜在的なＨｓ／Ｍｆ／Ｍｍ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドが特定された（図２４）。
表１３に記載されるヒト／マウスＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを、マウスＳＴＡＴ３を内因的に発現するマウスにおいて試験した。上述のように、マウスに３ｍｇ／ｋｇの用量でオリゴヌクレオチドを皮下注射した。５日後に肝臓を採取し、マウスＳＴＡＴ３発現を測定した。全体的に、研究では、肝臓におけるＳＴＡＴ３発現を阻害するための、いくつかの潜在的なＨｓ／Ｍｍ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドが特定された（図２５）。
図２４および２５で試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドのサブセットを、用量研究でさらに検証した。具体的には、１０個のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチド（ＳＴＡＴ３－２６２６、ＳＴＡＴ３－２６２７、ＳＴＡＴ３－２４０８、ＳＴＡＴ３－２４１２、ＳＴＡＴ３－２１３９、ＳＴＡＴ３－４９０９、ＳＴＡＴ３－４６１、ＳＴＡＴ３－６７８、ＳＴＡＴ３－２１４８、およびＳＴＡＴ３－２１４４）を使用して用量研究を実施した。マウスＳＴＡＴ３を内因的に発現するマウスに、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドを皮下注射した。５日後に肝臓を採取し、マウスＳＴＡＴ３発現を測定して有効用量を決定した（図２６Ａおよび２６Ｂ）。全体的に、内因性マウスＳＴＡＴ３発現研究では、肝臓におけるマウスＳＴＡＴ３発現を阻害するための、いくつかの潜在的なＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドが特定された。
Ｈｓ特異的
実施例１２に記載のＨＤＩモデルを使用して、ヒト特異的ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを評価した。具体的には、６～８週齢のメスのＣＤ－１マウス（ｎ＝４～５）に、ＰＢＳ中で製剤化した１ｍｇ／ｋｇの用量の指示されたＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチド（表１４）を皮下投与した。マウスの対照群（ｎ＝３～４）には、ＰＢＳのみを投与した。３日後（７２時間）、ユビキタスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列の制御下で、完全なヒトＳＴＡＴ３遺伝子をコードするＤＮＡプラスミド（２５μｇ）を、マウスに流体力学的に注射（ＨＤＩ）した。ＤＮＡプラスミド導入の１日後、ＨＤＩマウスからの肝臓試料を採取した。これらのＨＤＩマウスに由来する総ＲＮＡをｑＲＴ－ＰＣＲ分析に供して、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡレベルを決定した。
図２７の結果は、ヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを標的とするように設計したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドが、ＰＢＳのみで処置した対照ＨＤＩマウスと比較して、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドで処置したＨＤＩマウスからの肝臓試料におけるヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ発現の量の低減によって決定されるように、ＨＤＩマウスにおけるヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ発現を阻害したことを示す。
図２７で試験したＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドのサブセットを、用量研究でさらに検証した。具体的には、５個のＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチド（ＳＴＡＴ３－４２６、ＳＴＡＴ３－４３２、ＳＴＡＴ３－１０６８、ＳＴＡＴ３－１３８８、およびＳＴＡＴ３－２４０４）を使用して用量研究を実施した。マウスに、上述のように流体力学的に注射し、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドで処置した。１日後に肝臓を採取し、ヒトＳＴＡＴ３発現を測定して有効用量を決定した（図２８）。１ｍｇ／ｋｇの用量は、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡを約７５％低減することができ、それによって肝臓におけるＳＴＡＴ３発現を阻害するためのいくつかの潜在的なＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドを特定した。図２３からの最良の２つ配列および図２８からの最良の配列は、最終ＨＤＩスクリーニングで試験される（図２９）。
実施例１４：ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドによる特異的ＳＴＡＴ３阻害
ファミリーメンバー（例えば、ＳＴＡＴ１）ではなくＳＴＡＴ３を阻害するＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドの特異性を測定した。具体的には、内因性ＳＴＡＴ１を発現するＨｕｈ７細胞を、トランスフェクション剤としてリポフェクタミンを使用して、０．０５ｎＭ、０．３ｎＭ、または１ｎＭのＧａｌＮＡｃコンジュゲートＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチド（ＳＴＡＴ３－７２１、ＳＴＡＴ３－１２８６、およびＳＴＡＴ３－１３８８）で２４時間処置した。残存するｍＲＮＡのパーセント（％）を、偽対照（ＰＢＳ；リポフェクタミンまたはｓｉＲＮＡなし）およびＵＴＲ（非トランスフェクト；リポフェクタミンで処置したが、ｓｉＲＮＡでは処置しなかった）と比較して測定した（表１５および図３０）。ＳＴＡＴ３ ７２１および１２８６は、ヒトＳＴＡＴ１を下方制御しなかったが、ＳＴＡＴ３ １３８８は下方制御した（表１５）。オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ１発現を下方制御せず、ＳＴＡＴ３に対する特異性を示し、ＳＴＡＴ１に対するオフターゲット効果は限られていた。

Claims (183)

  1. ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、１５～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖および１５～４０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖が、配列番号８５または配列番号１２１７に記載されるＳＴＡＴ３の標的配列に対する相補性の領域を有し、前記相補性の領域が、３個を超えないヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、オリゴヌクレオチド。
  2. 前記相補性の領域が、前記ＳＴＡＴ３の標的配列に対して完全に相補的である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 前記標的配列が、配列番号８９～２８０のいずれか１つを含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 前記アンチセンス鎖が、１９～２７個のヌクレオチドの長さである、請求項１～３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 前記アンチセンス鎖が、２１～２７個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドの長さである、請求項１～４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 前記センス鎖が、１９～４０個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記センス鎖が、３６個のヌクレオチドの長さである、請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 前記二本鎖領域が、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さである、請求項１～６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 前記二本鎖領域が、少なくとも２１個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記二本鎖領域が、２０個のヌクレオチドの長さである、請求項１～７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  9. ＳＴＡＴ３に対する前記相補性の領域が、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さである、請求項１～８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  10. ＳＴＡＴ３に対する前記相補性の領域が、少なくとも２１個の連続するヌクレオチドの長さである、請求項１～９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  11. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１０、３８、６６、または７０のいずれか１つに記載される配列を含む、請求項１～２および４～１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  12. 前記センス鎖が、配列番号９、３７、６５、または６９のいずれか１つに記載される配列を含む、請求項１～２および４～１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  13. 前記センス鎖が、その３’末端に、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として記載されるステム－ループを含み、Ｓ１が、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間に３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  14. ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、２１～２７個のヌクレオチドの長さであり、配列番号８５または配列番号１２１７に記載されるＳＴＡＴ３の標的配列に対する相補性の領域を有し、前記センス鎖が、その３’末端に、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として記載されるステム－ループを含み、Ｓ１が、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間に３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成し、前記アンチセンス鎖および前記センス鎖が、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さの二本鎖構造を形成する、オリゴヌクレオチド。
  15. ＳＴＡＴ３発現を低減するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、２１～２７個のヌクレオチドの長さであり、配列番号８９～２８０のいずれか１つに記載されるＳＴＡＴ３の標的配列に対する相補性の領域を有し、前記センス鎖が、その３’末端に、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として記載されるステム－ループを含み、Ｓ１が、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間に３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成し、前記アンチセンス鎖および前記センス鎖が、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さの二本鎖構造を形成する、オリゴヌクレオチド。
  16. ＳＴＡＴ３発現を低減するための二本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）１９～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖であって、前記アンチセンス鎖が、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含むヌクレオチド配列を含み、前記相補性の領域が、配列番号８９～２８０から選択される、アンチセンス鎖、および
    （ｉｉ）前記アンチセンス鎖に対する相補性の領域を含む１９～５０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖、を含み、前記アンチセンス鎖およびセンス鎖が、前記アンチセンス鎖の３’末端に１～４個のヌクレオチドのオーバーハングを有する非対称性二本鎖領域を形成する、別個の鎖である、二本鎖オリゴヌクレオチド。
  17. 前記相補性の領域が、ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに対して完全に相補的である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  18. 前記相補性の領域が、前記ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに対して完全に相補的である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  19. Ｌが、テトラループであり、任意選択で、Ｌが、４個のヌクレオチドの長さである、請求項１３～１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  20. Ｌが、ＧＡＡＡとして記載される配列を含む、請求項１３～１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  21. 前記アンチセンス鎖が、２７個のヌクレオチドの長さであり、前記センス鎖が、２５個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドの長さであり、前記センス鎖が、３６個のヌクレオチドの長さである、請求項１～２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  22. 前記アンチセンス鎖およびセンス鎖が、２５個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を形成し、任意選択で、前記二本鎖が、２０個のヌクレオチドの長さである、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
  23. 前記アンチセンス鎖が、１個以上のヌクレオチドの長さの３’オーバーハング配列を含み、任意選択で、前記３’オーバーハング配列が、２個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記３’オーバーハング配列が、ＧＧである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  24. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  25. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－修飾を含む、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
  26. 前記２’－修飾が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド。
  27. 前記センス鎖の前記ヌクレオチドの約１０～１５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  28. 前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  29. 前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  30. 前記センス鎖が、５’から３’に１～３６位を有する３６個のヌクレオチドを含み、８～１１位が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項２４～２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  31. 前記アンチセンス鎖が、３’から５’に１～２２位を有する２２個のヌクレオチドを含み、２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  32. 残りのヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項２７～３１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  33. 前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドの全てが、修飾されている、請求項２４～３２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  34. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  35. 前記少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項３１に記載のオリゴヌクレオチド。
  36. 前記アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素が、リン酸類似体を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  37. 前記リン酸類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートである、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチド。
  38. 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１個のヌクレオチドが、１個以上の標的化リガンドにコンジュゲートされている、請求項１～３７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  39. 前記ヌクレオチドが、２個以上の標的化リガンドにコンジュゲートされており、前記標的化リガンドが、同一であるか、または異なっている、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチド。
  40. 前記１個以上の標的化リガンドが、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド、または脂質から選択される、請求項３８または３９に記載のオリゴヌクレオチド。
  41. 前記１個以上の標的化リガンドが、飽和または不飽和の脂肪酸部分である、請求項３８または３９に記載のオリゴヌクレオチド。
  42. 前記標的化リガンドが、Ｃ１０～Ｃ２４の長さのサイズに及ぶ飽和脂肪酸部分である、請求項３８または３９に記載のオリゴヌクレオチド。
  43. 前記標的化リガンドが、Ｃ１６飽和脂肪酸部分である、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
  44. 前記標的化リガンドが、Ｃ１８飽和脂肪酸部分である、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
  45. 前記標的化リガンドが、Ｃ２２飽和脂肪酸部分である、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド。
  46. 前記標的化リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む、請求項３８または３９に記載のオリゴヌクレオチド。
  47. 前記ＧａｌＮＡｃ部分が、一価ＧａｌＮＡｃ部分、二価ＧａｌＮＡｃ部分、三価ＧａｌＮＡｃ部分、または四価ＧａｌＮＡｃ部分である、請求項４６に記載のオリゴヌクレオチド。
  48. 前記ステム－ループのＬの最大４個のヌクレオチドが、各々、一価ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされている、請求項１３～４７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  49. 前記センス鎖が、配列番号８５７～９４６に記載される配列を含む、請求項１～１０および１３～４８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  50. 前記アンチセンス鎖が、配列番号９４７～１０３６に記載される配列を含む、請求項１～１０および１３～４９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  51. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号９および１０、
    （ｂ）それぞれ、配列番号３７および３８、
    （ｃ）それぞれ、配列番号６５および６６、ならびに
    （ｄ）それぞれ、配列番号６９および７０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～２、４～１４、および１７～４８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  52. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号８６１および９５１、
    （ｂ）それぞれ、配列番号８５７および９４７、
    （ｃ）それぞれ、配列番号８５８および９４８、
    （ｄ）それぞれ、配列番号８５９および９４９、
    （ｅ）それぞれ、配列番号８６０および９５０、
    （ｆ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
    （ｇ）それぞれ、配列番号８６３および９５３、
    （ｈ）それぞれ、配列番号８６４および９５４、
    （ｉ）それぞれ、配列番号８６５および９５５、
    （ｊ）それぞれ、配列番号８６６および９５６、
    （ｋ）それぞれ、配列番号８６７および９５７、
    （ｌ）それぞれ、配列番号８６８および９５８、
    （ｍ）それぞれ、配列番号８６９および９５９、
    （ｎ）それぞれ、配列番号８７０および９６０、
    （ｏ）それぞれ、配列番号８７１および９６１、
    （ｐ）それぞれ、配列番号８７２および９６２、
    （ｑ）それぞれ、配列番号８７３および９６３、
    （ｒ）それぞれ、配列番号８７４および９６４、
    （ｓ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、
    （ｔ）それぞれ、配列番号８７６および９６６、
    （ｕ）それぞれ、配列番号８７７および９６７、
    （ｖ）それぞれ、配列番号８７８および９６８、
    （ｗ）それぞれ、配列番号８７９および９６９、
    （ｘ）それぞれ、配列番号８８０および９７０、
    （ｙ）それぞれ、配列番号８８１および９７１、
    （ｚ）それぞれ、配列番号８８２および９７２、
    （ａａ）それぞれ、配列番号８８３および９７３、
    （ｂｂ）それぞれ、配列番号８８４および９７４、
    （ｃｃ）それぞれ、配列番号８８５および９７５、
    （ｄｄ）それぞれ、配列番号８８６および９７６、
    （ｅｅ）それぞれ、配列番号８８７および９７７、
    （ｆｆ）それぞれ、配列番号８８８および９７８、
    （ｇｇ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
    （ｈｈ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、ならびに
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  53. 前記センス鎖が、配列番号８６２のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号９５２のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  54. 前記センス鎖が、配列番号８７５のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号９６５のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  55. 前記センス鎖が、配列番号８７６のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号９６６のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  56. 前記センス鎖が、配列番号９２０のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１０１０のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  57. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
    （ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
    （ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
    （ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
    （ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
    （ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
    （ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  58. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
    （ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
    （ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  59. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
    （ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
    （ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
    （ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  60. 前記センス鎖が、配列番号１１、３９、６７、および７１のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～２、４～１４、および１７～４８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  61. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１２、４０、６８、および７２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～２、４～１４、１７～４８、および６０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  62. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号１１および１２、
    （ｂ）それぞれ、配列番号３９および４０、
    （ｃ）それぞれ、配列番号６７および６８、ならびに
    （ｄ）それぞれ、配列番号７１および７２から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～２、４～１４、１７～４８、および６０～６１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  63. 前記センス鎖が、配列番号１０４２、１０５５、１０５６、および１１００から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  64. 前記アンチセンス鎖が、配列番号１１３２、１１４５、１１４６、および１１９０から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  65. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号１０４１および１１３１、
    （ｂ）それぞれ、配列番号１０３７および１１２７、
    （ｃ）それぞれ、配列番号１０３８および１１２８、
    （ｄ）それぞれ、配列番号１０３９および１１２９、
    （ｅ）それぞれ、配列番号１０４０および１１３０、
    （ｆ）それぞれ、配列番号１０４２および１１３２、
    （ｇ）それぞれ、配列番号１０４３および１１３３、
    （ｈ）それぞれ、配列番号１０４４および１１３４、
    （ｉ）それぞれ、配列番号１０４５および１１３５、
    （ｊ）それぞれ、配列番号１０４６および１１３６、
    （ｋ）それぞれ、配列番号１０４７および１１３７、
    （ｌ）それぞれ、配列番号１０４８および１１３８、
    （ｍ）それぞれ、配列番号１０４９および１１３９、
    （ｎ）それぞれ、配列番号１０５０および１１４０、
    （ｏ）それぞれ、配列番号１０５１および１１４１、
    （ｐ）それぞれ、配列番号１０５２および１１４２、
    （ｑ）それぞれ、配列番号１０５３および１１４３、
    （ｒ）それぞれ、配列番号１０５４および１１４４、
    （ｓ）それぞれ、配列番号１０５５および１１４５、
    （ｔ）それぞれ、配列番号１０５６および１１４６、
    （ｕ）それぞれ、配列番号１０５７および１１４７、
    （ｖ）それぞれ、配列番号１０５８および１１４８、
    （ｗ）それぞれ、配列番号１０５９および１１４９、
    （ｘ）それぞれ、配列番号１０６０および１１５０、
    （ｙ）それぞれ、配列番号１０６１および１１５１、
    （ｚ）それぞれ、配列番号１０６２および１１５２、
    （ａａ）それぞれ、配列番号１０６３および１１５３、
    （ｂｂ）それぞれ、配列番号１０６４および１１５４、
    （ｃｃ）それぞれ、配列番号１０６５および１１５５、
    （ｄｄ）それぞれ、配列番号１０６６および１１５６、
    （ｅｅ）それぞれ、配列番号１０６７および１１５７、
    （ｆｆ）それぞれ、配列番号１０６８および１１５８、
    （ｇｇ）それぞれ、配列番号１１２０および１２１０、
    （ｈｈ）それぞれ、配列番号１０７６および１１６６、ならびに
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号１１００および１１９０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  66. 前記センス鎖が、配列番号１０４２のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１１３２のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  67. 前記センス鎖が、配列番号１０５５のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１１４５のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  68. 前記センス鎖が、配列番号１０５６のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１１４６のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  69. 前記センス鎖が、配列番号１１００のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１１９０のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  70. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号１０８１および１１７１、
    （ｂ）それぞれ、配列番号１０９０および１１８０、
    （ｃ）それぞれ、配列番号１０７９および１１６９、
    （ｄ）それぞれ、配列番号１０７６および１１６６、
    （ｅ）それぞれ、配列番号１０７２および１１６２、
    （ｆ）それぞれ、配列番号１０７０および１１６０、ならびに
    （ｇ）それぞれ、配列番号１０６９および１１５９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  71. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号１１２０および１２１０、
    （ｂ）それぞれ、配列番号１１１７および１２０７、ならびに
    （ｃ）それぞれ、配列番号１１１９および１２０９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  72. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号１０９５および１１８５、
    （ｂ）それぞれ、配列番号１１０４および１１９４、
    （ｃ）それぞれ、配列番号１０９３および１１８３、ならびに
    （ｄ）それぞれ、配列番号１１００および１１９０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０および１３～５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  73. 腫瘍微小環境に関連する免疫細胞におけるＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するヌクレオチド配列と、１個以上の標的化リガンドとを含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートであって、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた前記ヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオシドが、式Ｉ－ａ：

    またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
    Ｂは、核酸塩基または水素であり、
    Ｒ１およびＲ２は独立して、水素、ハロゲン、ＲＡ、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）Ｒ２、もしくは－ＳｉＲ３であるか、または
    同じ炭素上のＲ１およびＲ２が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する３～７員の飽和もしくは部分不飽和環を形成し、
    各ＲＡは独立して、Ｃ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であり、
    各Ｒは独立して、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であるか、あるいは、
    同じ原子上の２つのＲ基が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、ケイ素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和、部分不飽和、またはヘテロアリール環を形成し、
    各標的化リガンドは、脂質コンジュゲート部分（ＬＣ）、炭水化物、アミノ糖、またはＧａｌＮＡｃから選択され、ＬＣは独立して、飽和もしくは不飽和、直鎖、または分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖を含む脂質コンジュゲート部分であり、前記炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
    各－Ｃｙ－は独立して、フェニレニル；８～１０員の二環式アリーレニル；４～７員の飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロカルボシクリレニル；８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリーレニル、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１～５個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式ヘテロアリーレニル、から選択される任意選択で置換された二価の環であり、
    ｎは、１～１０であり、
    Ｌは、共有結合、または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、前記炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－、－Ｖ１ＣＲ２Ｗ１－、または

    によって置き換えられており、
    ｍは、１～５０であり、
    Ｘ１、Ｖ１、およびＷ１は独立して、－Ｃ（Ｒ）２－、－ＯＲ、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、または－ＮＲ－であり、
    Ｙは、水素、好適なヒドロキシル保護基、

    であり、
    Ｒ３は、水素、好適な保護基、好適なプロドラッグ、またはＣ１－６脂肪族、フェニル、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環、ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される任意選択で置換された基であり、
    Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲであり、
    Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＢＨ２－、または共有結合であり、
    Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
    Ｙ２は、水素、好適な保護基、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
    Ｚは、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－、または－ＣＲ２－である）によって表される、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  74. 腫瘍微小環境に関連する免疫細胞における標的ｍＲＮＡの発現を低減するヌクレオチド配列と、１個以上の標的化リガンドとを含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートであって、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた前記ヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオシドが、式Ｉ－ａ：

    またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
    Ｂは、核酸塩基または水素であり、
    Ｒ１およびＲ２は独立して、水素、ハロゲン、ＲＡ、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）２Ｒ、－Ｓｉ（ＯＲ）Ｒ２、もしくは－ＳｉＲ３であるか、または
    同じ炭素上のＲ１およびＲ２が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する３～７員の飽和もしくは部分不飽和環を形成し、
    各ＲＡは独立して、Ｃ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環式環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であり、
    各Ｒは独立して、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基であるか、あるいは、
    同じ原子上の２つのＲ基が、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、ケイ素、および硫黄から独立して選択される０～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和、部分不飽和、またはヘテロアリール環を形成し、
    各標的化リガンドは、脂質コンジュゲート部分（ＬＣ）、炭水化物、アミノ糖、またはＧａｌＮＡｃから選択され、ＬＣは独立して、飽和もしくは不飽和、直鎖、または分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖を含む脂質コンジュゲート部分であり、前記炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
    各－Ｃｙ－は独立して、フェニレニル；８～１０員の二環式アリーレニル；４～７員の飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロカルボシクリレニル；８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和カルボシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～３個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～１１員の飽和もしくは部分不飽和スピロヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式飽和もしくは部分不飽和ヘテロシクリレニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリーレニル、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１～５個のヘテロ原子を有する８～１０員の二環式ヘテロアリーレニル、から選択される任意選択で置換された二価の環であり、
    ｎは、１～１０であり、
    Ｌは、共有結合、または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、前記炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－、－Ｖ１ＣＲ２Ｗ１－、または

    によって置き換えられており、
    ｍは、１～５０であり、
    Ｘ１、Ｖ１、およびＷ１は独立して、－Ｃ（Ｒ）２－、－ＯＲ、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓｅ－、または－ＮＲ－であり、
    Ｙは、水素、好適なヒドロキシル保護基、

    であり、
    Ｒ３は、水素、好適な保護基、好適なプロドラッグ、またはＣ１－６脂肪族、フェニル、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和または部分不飽和複素環、ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される任意選択で置換された基であり、
    Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲであり、
    Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＢＨ２－、または共有結合であり、
    Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
    Ｙ２は、水素、好適な保護基、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
    Ｚは、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲ－、または－ＣＲ２－である）によって表される、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  75. 前記１個以上のヌクレオシドが、式ＩＩ－ａ：

    またはその薬学的に許容可能な塩によって表される、請求項７３または７４に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  76. 前記１個以上のヌクレオシドが、式ＩＩ－ｂもしくはＩＩ－ｃ：

    またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
    Ｌ１は、共有結合、一価または二価の飽和もしくは不飽和、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、前記炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｃｙ－、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－、または

    によって置き換えられており、
    Ｒ４は、水素、ＲＡ、または好適なアミン保護基であり、
    Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、前記炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲによって置き換えられている）によって表される、請求項７３～７６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  77. Ｒ５が、以下から選択される、請求項７６に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  78. Ｒ５が、以下から選択される、請求項７５に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  79. 腫瘍微小環境に関連する免疫細胞におけるＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減するヌクレオチド配列と、１個以上の標的化リガンドとを含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートであって、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた前記ヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオシドが、ＩＩ－ＩｂもしくはＩＩ－Ｉｃ：

    またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
    Ｂは、核酸塩基または水素であり、
    ｍは、１～５０であり、
    Ｘ１は、－Ｏ－、または－Ｓ－であり、
    Ｙは、水素、

    であり、
    Ｒ３は、水素、または好適な保護基であり、
    Ｘ２は、Ｏ、またはＳであり、
    Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、または共有結合であり、
    Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
    Ｙ２は、水素、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
    Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、前記炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
    Ｒは、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基である）によって表される、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  80. 腫瘍微小環境に関連する免疫細胞における標的ｍＲＮＡの発現を低減するヌクレオチド配列と、１個以上の標的化リガンドとを含むオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートであって、前記標的化リガンドとコンジュゲートされた前記ヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオシドが、式ＩＩ－ＩｂもしくはＩＩ－Ｉｃ：

    またはその薬学的に許容可能な塩（式中、
    Ｂは、核酸塩基または水素であり、
    ｍは、１～５０であり、
    Ｘ１は、－Ｏ－、または－Ｓ－であり、
    Ｙは、水素、

    であり、
    Ｒ３は、水素、または好適な保護基であり、
    Ｘ２は、Ｏ、またはＳであり、
    Ｘ３は、－Ｏ－、－Ｓ－、または共有結合であり、
    Ｙ１は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
    Ｙ２は、水素、ホスホラミダイト類似体；ヌクレオシド、ヌクレオチド、もしくはオリゴヌクレオチドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基、または固体支持体に付着する連結基であり、
    Ｒ５は、アダマンチル、または飽和もしくは不飽和、直鎖、もしくは分岐鎖のＣ１－５０炭化水素鎖であり、前記炭化水素鎖の０～１０個のメチレン単位が独立して、－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）ＯＲ－、または－Ｐ（Ｓ）ＯＲ－によって置き換えられており、
    Ｒは、水素、好適な保護基であるか、またはＣ１－６脂肪族；フェニル；窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～２個のヘテロ原子を有する４～７員の飽和もしくは部分不飽和複素環；ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１～４個のヘテロ原子を有する５～６員のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換された基である）によって表される、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  81. Ｒ５が、以下から選択される、請求項７９または８０に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  82. 前記ヌクレオチド配列が、１～１０個の標的化リガンドを含む、請求項７３～８１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  83. 前記ヌクレオチド配列が、１、２、または３個の標的化リガンドを含む、請求項７３～８２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  84. 前記オリゴヌクレオチドが、１０～５３個のヌクレオチドの長さのセンス鎖および１５～５３個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、前記ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡに対する相補性の領域を有し、前記相補性の領域が、前記ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡと３個を超えないヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個のヌクレオチドの長さである、請求項７３、７５～７９、および８１～８３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  85. 前記相補性の領域が、配列番号８９～２８０から選択される、請求項８４に記載のオリゴヌクレオチド。
  86. 前記オリゴヌクレオチドが、１０～５３個のヌクレオチドの長さのセンス鎖および１５～５３個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、前記ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡに対する相補性の領域を有し、前記相補性の領域が、前記ＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡと３個を超えないヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個のヌクレオチドの長さである、請求項７４～７８および８０～８３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  87. 前記標的ｍＲＮＡが、免疫抑制の調節因子をコードする、請求項７４～７８、８０～８３、および８６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  88. 前記免疫抑制の調節因子が、転写因子である、請求項８７に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  89. 前記腫瘍微小環境に関連する前記免疫細胞が、骨髄細胞である、請求項７３～８８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  90. 前記腫瘍微小環境に関連する前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項７３～８８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
  91. 前記ヌクレオチド配列が、前記腫瘍微小環境に関連する２個以上の免疫細胞における前記標的ｍＲＮＡまたはＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡの発現を低減する、請求項７３～８８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  92. 前記免疫細胞が、骨髄細胞である、請求項９１に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  93. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項９１に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  94. 前記骨髄細胞が、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）である、請求項９０または９３に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  95. 前記ＭＤＳＣが、顆粒球ＭＤＳＣ（Ｇ－ＭＤＳＣ）または単球ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）である、請求項９４に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  96. 前記ヌクレオチド配列が、Ｇ－ＭＤＳＣおよびＭ－ＭＤＳＣにおける前記標的ｍＲＮＡの発現を低減する、請求項９５に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  97. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞である、請求項９１および９３～９６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  98. 前記オリゴヌクレオチドが、一本鎖であり、任意選択で、前記一本鎖オリゴヌクレオチドが、１５～３０個のヌクレオチドの長さである、請求項７３～８３および８７～９７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  99. 前記オリゴヌクレオチドが、二本鎖である、請求項７３～８３および８７～９７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  100. 前記オリゴヌクレオチドが、１５～３０個のヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖および１５～４０個のヌクレオチドの長さのセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖が、前記標的ｍＲＮＡまたはＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡに対する相補性の領域を有し、前記相補性の領域が、前記標的ｍＲＮＡまたはＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡと３個を超えないヌクレオチドで異なる、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドの長さである、請求項９９に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  101. 前記アンチセンス鎖が、１９～２７個のヌクレオチドの長さである、請求項１００に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  102. 前記アンチセンス鎖が、２１～２７個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドの長さである、請求項１００または１０１に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  103. 前記センス鎖が、１９～４０個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記センス鎖が、３６個のヌクレオチドの長さである、請求項１００または１０２に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  104. 前記二本鎖領域が、少なくとも１９個のヌクレオチドの長さである、請求項１００～１０３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  105. 前記二本鎖領域が、少なくとも２１個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記二本鎖領域が、２０個のヌクレオチドの長さである、請求項１００～１０４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  106. 前記標的ｍＲＮＡに対する前記相補性の領域が、少なくとも１９個の連続するヌクレオチドの長さである、請求項１００～１０５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  107. 前記標的ｍＲＮＡに対する前記相補性の領域が、少なくとも２１個の連続するヌクレオチドの長さである、請求項１００～１０６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  108. 前記センス鎖が、その３’末端に、Ｓ１－Ｌ－Ｓ２として記載されるステム－ループを含み、Ｓ１が、Ｓ２に対して相補的であり、Ｌが、Ｓ１とＳ２との間に３～５個のヌクレオチドの長さのループを形成する、請求項１００～１０７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  109. Ｌが、テトラループである、請求項１０８に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  110. Ｌが、ＧＡＡＡとして記載される配列を含む、請求項１０８または１０９に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  111. 前記アンチセンス鎖が、１個以上のヌクレオチドの長さの３’オーバーハング配列を含み、任意選択で、前記３’オーバーハング配列が、２個のヌクレオチドの長さであり、任意選択で、前記３’オーバーハング配列が、ＧＧである、請求項１００～１１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  112. １５～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖および１５～４０個のヌクレオチドのセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートであって、前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖が、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞において発現されるヒトＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡ標的配列に対する相補性の領域を含み、前記センス鎖が、その３’末端に、４個のヌクレオシドを含むテトラループを含むステム－ループを含み、１個以上の標的化リガンドとコンジュゲートされた前記４個のヌクレオシドのうちの１個以上は、式ＩＩ－Ｉｂ：
    、
    （式中、Ｂは、アデニンおよびグアニン核酸塩基から選択され、Ｒ５は、炭化水素鎖である）によって表される、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  113. １５～３０個のヌクレオチドのアンチセンス鎖および１５～４０個のヌクレオチドのセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートであって、前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、二本鎖領域を形成し、前記アンチセンス鎖が、腫瘍微小環境に関連する免疫細胞において発現される標的配列に対する相補性の領域を含み、前記センス鎖が、その３’末端に、４個のヌクレオシドを含むテトラループを含むステム－ループを含み、前記標的化リガンドとコンジュゲートされた前記４個のヌクレオシドのうちの１個以上は、式ＩＩ－Ｉｂ：
    、
    （式中、Ｂは、アデニンおよびグアニン核酸塩基から選択され、Ｒ５は、炭化水素鎖である）によって表される、オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  114. 前記炭化水素鎖が、Ｃ８－Ｃ３０炭化水素鎖である、請求項１１２または１１３に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  115. 前記炭化水素鎖が、Ｃ１６炭化水素鎖である、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  116. 前記Ｃ１６炭化水素鎖が、以下によって表される、請求項１１５に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
    。
  117. 前記炭化水素鎖が、Ｃ１８炭化水素鎖である、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  118. 前記Ｃ１８炭化水素鎖が、以下によって表される、請求項１１７に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
    。
  119. 前記テトラループの前記４個のヌクレオシドが、５’から３’に１～４の番号が付けられ、１位が、式ＩＩ－Ｉｂによって表される、請求項１１２～１１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  120. 前記テトラループの前記４個のヌクレオシドが、５’から３’に１～４の番号が付けられ、２位が、式ＩＩ－Ｉｂによって表される、請求項１１２～１１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  121. 前記テトラループの前記４個のヌクレオシドが、５’から３’に１～４の番号が付けられ、３位が、式ＩＩ－Ｉｂによって表される、請求項１１２～１１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  122. 前記テトラループの前記４個のヌクレオシドが、５’から３’に１～４の番号が付けられ、位置が、式ＩＩ－Ｉｂによって表される、請求項１１２～１１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  123. 前記センス鎖が、５’から３’に１～３６の番号が付けられた位置を有する３６個のヌクレオチドであり、前記ステム－ループが、２１～３６位にヌクレオチドを含み、２７～３０位の１個以上のヌクレオシドが、式ＩＩ－Ｉｂによって表される、請求項１１２～１２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  124. ｍが、１であり、
    Ｘ１が、Ｏであり、
    Ｙ２が、ヌクレオシドの５’末端に付着するヌクレオチド間連結基であり、
    Ｙが、
    によって表され、Ｙ１が、ヌクレオチドの２’または３’末端に付着する連結基であり、
    Ｘ２が、Ｏであり、
    Ｘ３が、Ｏであり、
    Ｒ３が、Ｈである、請求項１１２～１２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  125. 前記アンチセンス鎖が、２２個のヌクレオチドである、請求項１１２～１２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  126. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項７３～１２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  127. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－修飾を含む、請求項１２６に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  128. 前記２’－修飾が、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、および２’－デオキシ－２’－フルオロ－β－ｄ－アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項１２６に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  129. 前記センス鎖の前記ヌクレオチドの約１０～１５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項１２６～１２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  130. 前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項１２６～１２９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  131. 前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドの約２５～３５％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項１２６～１３０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  132. 前記センス鎖が、５’から３’に１～３６位を有する３６個のヌクレオチドを含み、８～１１位が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項１２６～１３１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  133. 前記アンチセンス鎖が、５’から３’に１～２２位を有する２２個のヌクレオチドを含み、２位、３位、４位、５位、７位、１０位、および１４位が、２’－フルオロ修飾を含む、請求項１２６～１３２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  134. 残りのヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾を含む、請求項１２９～１３３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  135. 前記オリゴヌクレオチドの前記ヌクレオチドの全てが修飾されている、請求項１２９～１３３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンド。
  136. 前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項７３～１３５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  137. 前記少なくとも１個の修飾ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオエート結合である、請求項１３６に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  138. 前記アンチセンス鎖の５’－ヌクレオチドの糖の４’－炭素が、リン酸類似体を含む、請求項１００～１３７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  139. 前記リン酸類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、またはマロニルホスホネートである、請求項１３８に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  140. Ｒ５が、以下である、請求項７６～１１３および１１９～１３９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
    。
  141. Ｒ５が、以下である、請求項７６～１１３および１１９～１３９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
    。
  142. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号９および１０、
    （ｂ）それぞれ、配列番号３７および３８、
    （ｃ）それぞれ、配列番号６５および６６、ならびに
    （ｄ）それぞれ、配列番号６９および７０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１００～１４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  143. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号８６１および９５１、
    （ｂ）それぞれ、配列番号８５７および９４７、
    （ｃ）それぞれ、配列番号８５８および９４８、
    （ｄ）それぞれ、配列番号８５９および９４９、
    （ｅ）それぞれ、配列番号８６０および９５０、
    （ｆ）それぞれ、配列番号８６２および９５２、
    （ｇ）それぞれ、配列番号８６３および９５３、
    （ｈ）それぞれ、配列番号８６４および９５４、
    （ｉ）それぞれ、配列番号８６５および９５５、
    （ｊ）それぞれ、配列番号８６６および９５６、
    （ｋ）それぞれ、配列番号８６７および９５７、
    （ｌ）それぞれ、配列番号８６８および９５８、
    （ｍ）それぞれ、配列番号８６９および９５９、
    （ｎ）それぞれ、配列番号８７０および９６０、
    （ｏ）それぞれ、配列番号８７１および９６１、
    （ｐ）それぞれ、配列番号８７２および９６２、
    （ｑ）それぞれ、配列番号８７３および９６３、
    （ｒ）それぞれ、配列番号８７４および９６４、
    （ｓ）それぞれ、配列番号８７５および９６５、
    （ｔ）それぞれ、配列番号８７６および９６６、
    （ｕ）それぞれ、配列番号８７７および９６７、
    （ｖ）それぞれ、配列番号８７８および９６８、
    （ｗ）それぞれ、配列番号８７９および９６９、
    （ｘ）それぞれ、配列番号８８０および９７０、
    （ｙ）それぞれ、配列番号８８１および９７１、
    （ｚ）それぞれ、配列番号８８２および９７２、
    （ａａ）それぞれ、配列番号８８３および９７３、
    （ｂｂ）それぞれ、配列番号８８４および９７４、
    （ｃｃ）それぞれ、配列番号８８５および９７５、
    （ｄｄ）それぞれ、配列番号８８６および９７６、
    （ｅｅ）それぞれ、配列番号８８７および９７７、
    （ｆｆ）それぞれ、配列番号８８８および９７８、
    （ｇｇ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
    （ｈｈ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、ならびに
    （ｉｉ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１００～１４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  144. 前記センス鎖が、配列番号８６２のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号９５２のヌクレオチド配列を含む、請求項１００～１４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  145. 前記センス鎖が、配列番号８７５のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号９６５のヌクレオチド配列を含む、請求項１００～１４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  146. 前記センス鎖が、配列番号８７６のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号９６６のヌクレオチド配列を含む、請求項１００～１４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  147. 前記センス鎖が、配列番号９２０のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号１０１０のヌクレオチド配列を含む、請求項１００～１４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  148. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号９０１および９９１、
    （ｂ）それぞれ、配列番号９１０および１０００、
    （ｃ）それぞれ、配列番号８９９および９８９、
    （ｄ）それぞれ、配列番号８９６および９８６、
    （ｅ）それぞれ、配列番号８９２および９８２、
    （ｆ）それぞれ、配列番号８９０および９８０、ならびに
    （ｇ）それぞれ、配列番号８８９および９７９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１００～１４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  149. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号９４０および１０３０、
    （ｂ）それぞれ、配列番号９３７および１０２７、ならびに
    （ｃ）それぞれ、配列番号９３９および１０２９から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１００～１４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  150. 前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、
    （ａ）それぞれ、配列番号９１５および１００５、
    （ｂ）それぞれ、配列番号９２４および１０１４、
    （ｃ）それぞれ、配列番号９１３および１００３、ならびに
    （ｄ）それぞれ、配列番号９２０および１０１０から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１００～１４１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  151. 請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと、薬学的に許容可能な担体、送達剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
  152. 腫瘍微小環境に関連する免疫細胞にオリゴヌクレオチドを送達するための方法であって、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の組成物を投与し、それによって前記オリゴヌクレオチドを前記免疫細胞に送達することを含む、方法。
  153. 対象における腫瘍微小環境に関連する免疫細胞における標的ｍＲＮＡの発現を低減する方法であって、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の組成物を投与し、それによって前記対象における前記標的ｍＲＮＡの発現を低減することを含む、方法。
  154. 前記免疫細胞が、骨髄細胞および／またはＴ細胞である、請求項１５２または１５３に記載の方法。
  155. 前記骨髄細胞が、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）である、請求項１５４に記載の方法。
  156. 前記ＭＤＳＣが、顆粒球ＭＤＳＣ（Ｇ－ＭＤＳＣ）または単球ＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）である、請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞である、請求項１５４～１５６のいずれか一項に記載の方法。
  158. 免疫応答の増加を必要とする対象において免疫応答を増加させるための方法であって、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の組成物を投与し、それによって前記対象における前記免疫応答を増加させることを含む、方法。
  159. 前記対象が、癌を有する、請求項１５８に記載の方法。
  160. 第２の組成物または治療剤を投与することを含む、請求項１５８または１５９に記載の方法。
  161. 前記第２の組成物または治療剤が、化学療法、標的化抗癌療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科処置、放射線処置、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、ワクチン、もしくは細胞免疫療法、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１６０に記載の方法。
  162. 対象における腫瘍微小環境に関連する免疫細胞にオリゴヌクレオチドを送達するための、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の組成物の使用であって、前記オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを前記対象に投与することを含む、使用。
  163. 対象における腫瘍微小環境に関連する免疫細胞における標的ｍＲＮＡの発現を低減するための、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の組成物の使用であって、前記オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを前記対象に投与することを含む、使用。
  164. 免疫応答の増加を必要とする対象において免疫応答を増加させるための、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の組成物の使用であって、前記オリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを前記対象に投与することを含む、使用。
  165. 前記対象が、癌を有する、請求項１６２～１６４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートの使用。
  166. 請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートと、任意選択の薬学的に許容可能な担体と、ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象への投与のための指示を含む添付文書とを含む、キット。
  167. ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象を治療するための方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  168. 前記ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態が、癌、癌腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、および白血病、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、膵癌、ならびに膠芽腫から成る群から選択される、請求項１６７に記載の方法。
  169. 前記ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態が、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、および膠芽腫である、請求項１６７に記載の方法。
  170. 前記オリゴヌクレオチド、または医薬組成物が、第２の組成物または治療剤と組み合わされ投与される、請求項１６７～１６９のいずれか一項に記載の方法。
  171. 前記第２の組成物または治療剤が、化学療法、標的化抗癌療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科処置、放射線処置、共刺激分子の活性化剤、阻害分子の阻害剤、ワクチン、もしくは細胞免疫療法、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１７０に記載の方法。
  172. 前記オリゴヌクレオチド、または医薬組成物が、少なくとも２つの追加の治療剤と組み合わされ投与される、請求項１６７～１６９のいずれか一項に記載の方法。
  173. 対象における腫瘍増殖を阻害する方法であって、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  174. 対象における癌を治療する、または癌の転移を予防する方法であって、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、腫瘍関連細胞が、ＳＴＡＴ３を発現する、方法。
  175. 治療有効量の請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲートを含む医薬組成物であって、前記オリゴヌクレオチドが、ＳＴＡＴ３の発現、産生、または活性を減少させる、医薬組成物。
  176. 対象における腫瘍微小環境に関連する免疫細胞におけるＳＴＡＴ３発現を低減するための、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の医薬組成物の使用。
  177. 対象における腫瘍微小環境に関連する免疫細胞におけるＳＴＡＴ３発現の低減に使用するための、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  178. ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるＳＴＡＴ３発現を低減するための、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート、または請求項１５１に記載の医薬組成物の使用。
  179. ＳＴＡＴ３発現に関連する前記疾患、障害、または状態が、癌、癌腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、および白血病、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、膵癌、ならびに膠芽腫から成る群から選択される、請求項１７８に記載の使用。
  180. 腫瘍増殖が、低減または阻害される、請求項１７８または１７９に記載の使用。
  181. ＳＴＡＴ３発現に関連する疾患、障害、または状態を有する対象におけるＳＴＡＴ３発現の低減に使用するための、請求項１～１５０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  182. ＳＴＡＴ３発現に関連する前記疾患、障害、または状態が、癌、癌腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、および白血病、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、結腸直腸癌、膵癌、ならびに膠芽腫から成る群から選択される、請求項１８１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
  183. 腫瘍増殖が、低減または阻害される、請求項１８１または１８２に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド－リガンドコンジュゲート。
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