JP2024505458A - コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む脳疾患を治療するための医薬組成物 - Google Patents

Abstract

本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む脳疾患を治療するための医薬組成物に関する。より詳細には、神経細胞保護および分化促進に相乗効果を示すコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む脳疾患の予防または治療用組成物に関する。

Description

本出願は、２０２１年１月２８日に出願された大韓民国特許出願第１０－２０２１－００１２６５９号を優先権として主張し、上記の明細書全体は本出願の参考文献である。

本発明はコリンエステラーゼ阻害剤（Ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）および抗酸化剤を含む脳疾患を治療するための医薬組成物に関する。より詳細には、神経細胞保護および分化促進に相乗効果を示すコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む脳疾患の予防または治療用複合組成物に関する。

韓国統計庁で２０１０年に発表した資料によると、韓国は２０１１年６５歳以上の老齢人口が総人口に占める割合が１１．４％に達し、２０５０年には３７．４％となって超高齢化社会に参入すると見込まれている。このように最近、高齢化問題が社会的な問題として台頭することにつれて、高齢人口の特性や住居、保健、文化、余暇など老人福祉などに対する国民の関心が高まり、これに対する統計データに関する需要も増えている。

このような変化の核心は、老齢化人口の増加により、過去約５０年間、死亡の主な原因となった急性伝染性疾患よりも、慢性変性性疾患がより大きな問題として台頭しているという点だ。特に、慢性変性疾患の中で脳血管疾患による死亡は、単一疾患による死亡率の中で２位を占めている非常に重要な疾患である。

そのような脳血管疾患は大きく２つの形態に分類することができる。一つは脳出血などで見られる出血性脳疾患であり、もう一つは脳血管の閉鎖などによって現れる虚血性脳疾患である。出血性脳疾患は交通事故などによって主に現れ、虚血性脳疾患は主に高齢者によく現れる疾患である。

大脳に一時的な脳虚血が誘発される場合、酸素とグルコースの供給が遮断され、神経細胞ではＡＴＰ減少および浮腫（ｅｄｅｍａ）が発生し、最終的に脳の広範な損傷が誘発される。神経細胞の死滅は、脳虚血があった後、かなりの時間経過後に現れるが、これを遅発性神経細胞死（ｄｅｌａｙｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅａｔｈ）という。遅発性神経細胞死はモンゴリアン・ジャービル（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ ｇｅｒｂｉｌ）を用いた一過性前脳虚血モデル（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｒｅｂｒａｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｍｏｄｅｌ）による実験から見ると、５分間脳虚血誘導４日後に海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）のＣＡ１領域で神経細胞死が観察されることが報告されている（Ｋｉｒｉｎｏ Ｔ，Ｓａｎｏ Ｋ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，６２：２０１－２０８，１９８４； Ｋｉｒｉｎｏ Ｔ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２３９：５７－６９，１９８２）。

これまでに最も広く知られている脳虚血による神経細胞死の機序には２つがある。一つは、脳虚血によって細胞外に過剰なグルタミン酸が蓄積し、このような増加したグルタミン酸によって過剰な細胞内カルシウムの蓄積で神経細胞死が誘発されるという興奮性神経細胞死（Ｋａｎｇ ＴＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．，３０：９４５－９５５，２００１）であり、もう一つは、虚血再灌流時に突然の酸素供給による体内ラジカルの増加によりＤＮＡおよび細胞質に損傷を与えて誘発されるという酸化性神経細胞死である（Ｗｏｎ ＭＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，８３６：７０－７８，１９９９；Ｓｕｂ ＡＹ．，Ｃｈｅｎ ＹＭ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，５：４０１－４１４，１９９８；ＦｌｏｗｅｒｓＦ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＪＪ．Ｎｅｗ Ｈｏｒｉ
ｚ．６：１６９－１８０、１９９８）。

このような機序研究を基にして脳虚血時に現れる神経細胞死を効果的に抑制する物質を探索したり、物質に対する機序を明らかにする研究が多く行われている。しかし、まだ効果的に脳虚血による神経細胞死を抑制する物質はほとんどない実状である。

これまで唯一の脳虚血治療薬としてＦＤＡ認定市販されている組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）は、血栓溶解剤として脳虚血を引き起こす血栓を溶かし、迅速な酸素およびグルコースの供給を誘導する物質である。したがって、直接的に神経細胞を保護するものではないため、迅速な使用が必要であり、血栓を溶解するという特徴のため過剰に使用または頻繁に使用する場合には血管壁が薄くなり、最終的に出血性脳血管疾患を誘発することになる。異なる例として、初期のカルシウム流入を効果的に抑制するためのカルシウムチャンネル阻害剤（ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ）であるＭＫ－８０１の場合、臨床試験が行われたが、その副作用により薬品を廃棄したことがある。日本では田辺三菱製薬社のエダラボン（ｅｄａｒａｖｏｎｅ）という合成抗酸化剤が日本内で臨床試験に成功することで、全世界一つしかない脳卒中治療剤として日本でのみ処方されており、年間３，０００億ウォンの売り上げを見せているが、副作用が懸念されているにもかかわらずその他の薬の不在により使用されているわけである。

一方、アルツハイマー病のような認知機能障害は、６０歳以上の高齢人口で主に発症されるため、非常に速いペースで進行している、韓国の人口の高齢化問題と、患者本人だけでなく、その家族と社会、国家に深刻な心理的苦痛と経済的負担を与えることを考慮すると、これらの疾患の発症病因の究明のための研究は不可欠である。また、このような研究が先行してこそ、症状の改善や疾患の進行速度を遅らせる程度にとどまっている現時点での疾患の予防や疾患の改善効果剤の緊急性を要する。

アルツハイマー病の原因としては、外部的要因と内部的要因に分けられるが、年齢、遺伝的原因、環境的影響による毒性物質などが外部的原因として挙げられており、内部的原因としてはアセチルコリン（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）濃度の低下による神経伝達の減少、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）などによる神経炎症の発生、アミロイドβおよび過剰にリン酸化されたタウタンパク質（ｔａｕｐｒｏｔｅｉｎ）の凝集による細胞毒性、酸化ストレスによる活性酸素の神経細胞死などが知られている。このような神経細胞の死滅は、いくつかの脳疾患に共通の根本的な病理で指摘されており、細胞死を引き起こす要因と分子機構の研究が深く行われている。しかし、既存に開発されたタンパク分解酵素剤や、広域スペクトラムの細胞死滅抑制剤は副作用とともに臨床効果が減少する現状である。

Ｋｉｒｉｎｏ Ｔ，Ｓａｎｏ Ｋ．Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，６２：２０１－２０８，１９８４； Ｋｉｒｉｎｏ Ｔ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２３９：５７－６９，１９８２ Ｗｏｎ ＭＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，８３６：７０－７８，１９９９；Ｓｕｂ ＡＹ．，Ｃｈｅｎ ＹＭ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．，５：４０１－４１４，１９９８；ＦｌｏｗｅｒｓＦ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＪＪ．Ｎｅｗ Ｈｏｒｉｚ．６：１６９－１８０、１９９８

これにより、本発明者は臨床で安全性が確認された公知の物質の中で虚血性脳疾患と変性神経疾患治療に相乗効果が現れる治療剤の組み合わせを開発するために例の研究を重ねた結果、ドネペジルとＮ－アセチルシステインの組み合わせが、それぞれの薬物単独と比較して著しく改善された神経細胞保護および分化促進効果を示すことを発見し、本発明を完成することになった。

したがって、本発明の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤（ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｒｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）および抗酸化剤を有効成分として含む虚血性脳疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することである。
また、本発明の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤からなる虚血性脳疾患の予防または治療のための医薬組成物を提供することである。
また、本発明の目的はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤で必須になされる虚血性脳疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む変性神経疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤からなる変性神経疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤で必須になされる変性神経疾患の予防または治療用医薬組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む虚血性脳疾患予防または改善用食品組成物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤からなる虚血性脳疾患の予防または改善のための食品組成物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤で必須になされる虚血性脳疾患の予防または改善のための食品組成物を提供する。

本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む変性神経疾患予防または改善用食品組成物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤からなる変性神経疾患予防または改善用食品組成物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤で必須になされる変性神経疾患予防または改善用食品組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｕｓ）、別々に（ｓｅｐａｒａｔｅ）または逐次的（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）で投与する段階を含む、ヒトを除く動物の虚血性脳疾患の治療方法を提供することである。

本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を同時に、別々にまたは逐次的で投与する段階を含む、ヒトを除く動物の変性神経疾患の治療方法を提供することである。

本発明の他の目的は、虚血性脳疾患治療用製剤を製造するためのコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤の使用を提供することである。

本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の有効量を必要とする個体に投与することを含む虚血性脳疾患の治療方法を提供することである。

本発明の他の目的は、変性神経疾患治療用製剤を製造するためのコリンエステラーゼ阻
害剤および抗酸化剤の使用を提供することである。

本発明の他の目的は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを含む変性神経疾患の治療方法を提供することである。

前記の本発明の目的を達成するために、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む虚血性脳疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。
また、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤からなる虚血性脳疾患の予防または治療のための医薬組成物を提供する。
また、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤で必須になされる虚血性脳疾患の予防または治療のための医薬組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む変性神経疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。
また、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤からなる変性神経疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。
また、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤で必須になされる変性神経疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む虚血性脳疾患予防または改善用食品組成物を提供する。
また、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤からなる虚血性脳疾患の予防または改善のための食品組成物を提供する。
また、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤で必須になされる虚血性脳疾患の予防または改善のための食品組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む変性神経疾患予防または改善用食品組成物を提供する。
また、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤からなる変性神経疾患の予防または改善のための食品組成物を提供する。
また、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤で必須になされる変性神経疾患の予防または改善のための食品組成物を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を同時に、別々にまたは逐次的で投与する段階を含む、ヒトを除く動物の虚血性脳疾患の治療方法を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を同時に、別々にまたは逐次的で投与する段階を含む、ヒトを除く動物の変性神経疾患の治療方法を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は虚血性脳疾患治療用製剤を製造するためのコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤の使用を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の有効量を必要とする個体に投与することを含む虚血性脳疾患の治療方法を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明は、変性神経疾患治療用製剤を製造するためのコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤の使用を提供する。

本発明の他の目的を達成するために、本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の有効量を必要とする個体に投与することを含む変性神経疾患の治療方法を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む虚血性脳疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。

本発明はまた、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む変性神経疾患（退行性神経疾患）の予防または治療用医薬組成物を提供する。

本発明における前記の「コリンエステラーゼ阻害剤」とは、神経伝達物質のアセチルコリンの酵素分解を阻害し、したがってシナプス間隙内のアセチルコリンの作用期間およびレベルを増加させる化合物を意味する。２つの酵素がアセチルコリン、アセチルコリンエステラーゼおよびブチリルコリンエステラーゼの分解を主導的に担う。「コリンエステラーゼ阻害剤」には、これらの酵素のうち、一方または両方の作用を阻害したか、または減らす物質が含まれる。

本発明の組成物および方法では、コリンエステラーゼ阻害剤は薬学的に有効であると考えられる。本明細書において、「薬学的に有効な」とは、コリンエステラーゼ阻害剤がヒトにおいて治療的に有用であることを意味する。このため、この用語は殺虫剤として使用されるコリンエステラーゼ阻害剤、例えば、アルジカルブ（２－メチル－２－（メチルチオ）プロピオンアルデヒド－Ｏ－メチルカルバモイルオキシム）、カルボフラン（２，３－ジヒドロ－２，２－ジメチル－７－ベンゾフラニルメチルカルバメート）、およびカルバリル（１－ナフチル メチルカルバメート）、そして化学兵器として使用されるほど人間にとって致命的なコリンエステラーゼ阻害剤、例えばサリン（２－（フルオロ－メチルホスホリル）オキシプロパン）、ＶＸ（Ｓ－［２－（ジイソプロピルアミノ）エチル］－Ｏ－エチルメチルホスホノチオエート）、そして、ソマン（３－（フルオロ－メチル－ホスホリル）オキシ－２，２－ジメチル－ブタン）を排除する。殺虫剤および化学兵器であるほとんどのコリンエステラーゼ阻害剤は、準可逆性（ｑｕａｓｉ－ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）または不可逆性である。薬学的に効果的なほとんどのコリンエステラーゼ阻害剤は可逆性（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ）である。

薬学的に有効なコリンエステラーゼ阻害剤は当分野で広く知られている。例として、７－メトキシタクリン（ｍｅｔｈｏｘｙｔａｃｒｉｎｅ）、アルバメリン（ａｌｖａｍｅｌｉｎｅ）、アンベノニウム（ａｍｂｅｎｏｎｉｕｍ）、アンセクリン（ａｎｓｅｃｕｌｉｎ）、アレコリン（ａｒｅｃｏｌｉｎｅ）、セビメリン（ｃｅｖｉｍｅｌｉｎｅ）、シティコリン（ｃｉｔｉｃｏｌｉｎｅ）、デマカリウム（ｄｅｍａｃａｒｉｕｍ）、ドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）、エドロフォニウム（ｅｄｒｏｐｈｏｎｉｕｍ）、エプタスチグミン（ｅｐｔａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、パスシクリン（ｆａｓｃｉｃｕｌｉｎ）、ヘプチル－ピソスチグミン（ｈｅｐｔｙｌ－ｐｈｙｓｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、フペルジン（ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ）Ａおよびその類似体、イコフェジル（ｉｃｏｐｅｚｉｌ）、イピダクリン（ｉｐｉｄａｃｒｉｎｅ）、リノピリジン（ｌｉｎｏｐｉｒｉｄｉｎｅ）、メトリフォネート（ｍｅｔｒｉｆｏｎａｔｅ）、ミラメリン（ｍｉｌａｍｅｌｉｎｅ）、ネオスチグミン（ｎｅｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、ノメオスチグミン（ｎｏｍｅｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、
ピリドスチグミン（ｐｙｒｉｄｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、ノルピリドスチグミン（ｎｏｒｐｙｒｉｄｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、タクリン（ｔａｃｒｉｎｅ）、ピソスチグミン（ｐｈｙｓｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、リバスチグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、サブコメリン（ｓｕｂｃｏｍｅｌｉｎｅ）、スロナクリン（ｓｕｒｏｎａｃｒｉｎｅ）、タクリン類似体、タクリン、タルサクリジン（ｔａｌｓａｃｌｉｄｉｎｅ）、ベルナクリン（ｖｅｌｎａｃｒｉｎｅ）、ザノメリン（ｘａｎｏｍｅｌｉｎｅ）、ジプロシロン（ｚｉｆｒｏｓｉｌｏｎｅ）、イトプライド（ｉｔｏｐｒｉｄｅ）、アコチアミド（ａｃｏｔｉａｍｉｄｅ）、ヒュフェルジン（ｈｕｐｅｒｚｉｎ）、ガランタミン（ガランタミン）、それらの塩などが含まれるが、これらに限定されるものではなく、最も好ましくは、コリンエステラーゼ阻害剤はドネペジルであり得る。

ドネペジルは下記式（１）の構造を有するアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ；ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として、アルツハイマー病の軽度、重症度以上の認知症治療に用いられる。脳内のコリン作動性神経系障害が報告されているアルツハイマー病において、ドネペジルは脳内のアセチルコリンを増加させ、脳内のコリン作動性神経を活性化する。現在市販されているドネペジルの製剤は錠剤（ｔａｂｌｅｔ）形態であり、経口剤としてアルツハイマー病患者に処方されている。

前記のドネペジルの薬学的に許容される塩としては、薬学的に許容される遊離酸によって形成される酸付加塩が有用である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸または亜リン酸などの無機酸類および脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル置換アルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類などの無毒性有機酸から得られる。これらの薬学的に無毒な塩類として硫酸塩、ピロ硫酸塩、二硫酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、モノヒドロゲンリン酸、ジヒドロゲンリン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物、アセテート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルメート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオレート、シュウ酸、マロネート、コハク酸、スベレート、セバケート、フマレート、マリエート、ブチン－１，４－ジオエート、ヘキサン－１，６－ジオエート、安息香酸、クロロ安息香酸、メチル安息香酸、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホネート、トルエンスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、キシレンスルホネート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルテート、β－ヒドロキシブチレート、グリコレート、マレート、タトレート、メタンスルホネート、プロパンスルホネート、ナフタレン－１－スルホネート、ナフタレン－２－スルホネートまたはマンデレートを使用することができるが、これに限定されるものではない。

本発明において前記「抗酸化剤」は、私たちの体内に生じる活性酸素を除去して酸化的ストレスから人体を防御するよう助ける物質であり、その種類は当業界でよく知られている。例として、抗酸化剤は、Ｎ－アセチルシステイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、α－リポ酸（ａｌｐｈａ－ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ）、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ）、ポルシチン（ホルシチ
ン（ｆｏｒｓｙｔｈｉｎ））、イソフェルリック酸（ｉｓｏｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、ガンマ－オリザノール（ｇａｍｍａ－ｏｒｙｚａｎｏｌ）、トランス－アネゾール（ｔｒａｎｓ－ａｎｅｔｈｏｌ）、チオキサン（ｔｈｉｏｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、システアミン（ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）、ガリク酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、サルビアノール酸（ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ビタミンＥ（ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ）、ラパアコニチン（ｌａｐｐａｃｏｎｉｔｉｎｅ）、Ｌ－セレノメチオニン（Ｌ－ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、セレン、コエンザイムＱ１０、ビタミンＡ、カテキン、ダルトロンなどが含まれるが、これに限定されず、好ましくはＮ－アセチルシステイン、アルファ－リポ酸、ダルトロンまたはその塩であり、最も好ましくは、Ｎ－アセチルシステインまたはその塩であり得る。

前記のＮ－アセチルシステイン（Ｎ－アセチルシステイン）は、約５０年前に開発され、主に去痰剤として使用されたり、鎮痛剤であるアセトアミノフェン中毒の治療に使用されたりする下記式（２）の構造を有する酸化ストレス抑制用薬物である。Ｎ－アセチルシステインは、過酸化物、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルなどと直接反応して酸化ストレスを減らしたり、またはグルタチオン生合成の原料であるシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を提供したりして、間接的にグルタチオン合成を増加させることにより抗酸化効果を示すことが知られている。Ｎ－アセチルシステインは急性呼吸困難症候群の治療、急性肺酸素毒性の治療および造影剤による急性腎不全の予防など、様々な臨床分野で数十年間使用されてきて、副作用を誘発しない安全な薬物として知られている。

本発明の一実施形態によれば、ドネペジルとＮ－アセチルシステインを含む配合製剤は、各単一物質と比較して神経細胞保護および分化促進効果が著しく優れていることが確認された。

したがって、ドネペジルとＮ－アセチルシステインを含む本発明の組成物は、各薬物を単独で使用する場合と比較して、より低い用量でより改善された効果を示すことができるので、副作用が減少し、脳疾患の治療効果が向上するという利点、すなわち、相乗作用（ｓｙｎｅｒｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）の利点がある。

効果ＡとＢを有する２つの単一化合物に対するブリス独立組合せ反応値（Ｂｌｉｓｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｃｏｍｂｉｎｄｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）Ｃは、Ｃ＝Ａ＋Ｂ－Ａ＊Ｂであり、ここで各効果は０～１の分数の阻害値で表される。（文献［Ｂｌｉｓｓ（１９３９）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ］を参照）。実験的反応と計算されたブリス独立値の差として定義されるブリス値は、組み合わせた２つの成分の効果が加算的であるか相乗的であるかを示す。

ブリス値のゼロ（０）は加算的であると見なされる。「加算的」という用語は、２種類の標的製剤を組み合わせた結果が個々の薬物のそれぞれの合計であることを意味する。

「相乗効果」または「相乗」という用語は、２種類の製剤の組み合わせの反応が個々の製剤のそれぞれの反応の合計より大きいことを意味するために使用される。より具体的に
は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの状況では、相乗効果の１つの尺度は「ブリス相乗効果」として知られている。ブリス相乗効果は、先に定義されたブリス値によって決定される「ブリス独立値超過」を意味する。ブリス値がゼロより大きい場合、それは相乗効果の指標と見なされる。勿論、本発明で使用される「相乗効果」の概念には、追加および／または代替方法によって測定されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの相乗効果も含まれる。

本発明におけるコリンエステラーゼ阻害剤と抗酸化剤の組み合わせがｉｎ ｖｉｔｒｏで有する生物学的効果（抗炎症効果を含むが、これに限定されない）がその組み合わせの個々の成分の合計より大きいか又は等しいことは、ブリス値と相関し得る。さらに、本発明で使用される成分の組み合わせが個々の成分の合計と同等またはそれ以上の活性を示す場合を含む「相乗効果」は、追加および／または代替方法によって測定することができる。

本発明の一態様では、本発明の組成物は、脳疾患を治療するためのものとして、有効量のコリンエステラーゼ阻害剤またはその医薬的に有効な塩、誘導体または代謝産物を、有効量の抗酸化剤またはその医薬的に有効な塩と相乗効果を達成するのに十分な量で組み合わせることができる。

本発明の一態様では、コリンエステラーゼ阻害剤と抗酸化剤は、１：０．１～２０００のモル比で組み合わせることができる。好ましくは１：１～１０００のモル比、より好ましくは１：５０～５００のモル比、さらにより好ましくは１：１００～４００のモル比、最も好ましくは、１：１００～３５０のモル比で組み合わせることができる。

本発明において、前記の虚血性脳疾患は脳血管疾患とも呼ばれ、血栓、塞栓、脳血管肥後、脳血管閉塞などにより脳に血流を供給する血管に病理学的異常が生じた疾患であれば、制限なく含めることができる。虚血性脳疾患の非限定的な例として、脳卒中、脳日血、脳梗塞、頭部損傷（ｈｅａｄ ｔｒａｕｍａ）、脳循環代謝障害、血管性認知症および脳機能昏睡を含めることができる。

本発明において、前記の変性神経疾患（神経変性疾患、退行性神経疾患）は、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、認知機能障害、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、オリーブ核－脳橋－小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、シャイ－ドラガー症候群、線条体－黒質変性症、ハンチントン病、筋萎縮性側色硬化症（ＡＬＳ）、本態性進展症、皮質－基底核変性症、レビー小体型 疾患、パーキンス－ＡＬＳ－認知症複合症、ニーマン・ピック病およびピック病からなる群から選択できるが、これに限定されるものではない。

前記の認知機能障害は、老化と深い関連を持ちながら、正常な老化の過程とは異なり、急速に神経系の一部または脳全体に異常な神経細胞の死が起こり、脳と脊髄の機能が失われ、認知能力が低下する疾患であれば、これは制限なく含めることができる。認知機能障害の非限定的な例として、軽度認知障害、アルツハイマー病、前頭側頭認知症、レビー小体型疾患、皮質基底核変性症、学習障害、実証、忘却、失語、失行、およびせん妄が含まれる。

「予防」とは、病理学的現象の発生頻度または程度を減少させるすべての行為を意味する。予防は完全であっても部分的であってもよい。この場合、個体内の発がん症状が前記の組成物を使用しなかった場合と比較して減少する現象を意味し得る。

「治療」とは、治療しようとする対象または細胞の本来のプロセスを変更するために臨床的に介入するすべての行為を意味し、臨床病状が進行している間または予防するために実施できる。

所望の治療効果は、疾患の発生または再発を予防する、症状の軽減、疾患に伴う全ての直接的または間接的な病理学的結果の低下、疾患進行速度の低下、疾患状態の軽減または一時的緩和、または予後の改善を含み得る。

本発明の組成物における前記のドネペジルとＮ－アセチルシステインは同時に、または別々に、または逐次的に投与することができ、ドネペジルとＮ－アセチルシステインは体内での共同作用を介して脳疾患の予防または治療活性を示すことができる。

通常、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤は、組成物として同時に投与されるのが一般的であるが、時差をおいて前記の各有効成分が人体に投与されても、個別に投与された各有効成分が体内で同時に作用することで同等のレベルの治療活性を具現することができる。

具体的には、「同時投与」とは、前記の２つの有効成分を一緒に同じ投与経路を介して投与したり、または実質的に同じ時間（例えば、投与時間間隔が１５分以下）にそれぞれ同じまたは異なる投与経路を介して投与したりすることを意味する。「個別に投与」とは、２つの有効成分を一定の時間間隔（例えば、３日間隔）を置き、同じまたは異なる投与経路を介して投与することを意味する。「逐次的」とは、患者の疾患状態に応じて、両方の有効成分を一定の前後の規則を用いて同一または異なる投与経路を介して投与することを意味する。

投与経路としては経口的または非経口的に投与することができる。非経口的な投与方法としてはこれに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、神経内、脳室内（脳室下領域）、脳血管内、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸内投与であり得る。

本発明による医薬組成物は、薬学的に有効な量のドネペジルおよびＮ－アセチルシステインのみを含んだり、またはさらに薬学的に許容される担体を含み得る。前記の「薬学的に有効な量」とは、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量をいい、好ましくは脳疾患の治療または予防において前記の２つの有効成分を併用投与することにより寿命の増加、運動性の向上、神経炎症の抑制、神経細胞死の抑制、神経細胞の分化促進効果を示すのに十分な量を意味するものである。

本発明の前記の医薬組成物は、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を併用することによる相乗効果を示すために薬学的に許容される担体と共に、当技術分野で公知の方法で投与経路に応じて様々に製剤化することができる。「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される場合、活性成分の作用を阻害せず、一般的に胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応、または同様の反応を引き起こさない非毒性の組成物を指す。担体としては、あらゆる種類の溶媒、分散媒体、水中油または油中水エマルジョン、水性組成物、リポソーム、マイクロビーズおよびマイクロソームが含まれる。前記の組成物に含まれる薬学的に許容される担体は製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されない。他の薬学的に許容される担体としては、当技術分野に知られているものを参考にすることができる。

医薬組成物は、成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保
存剤などをさらに含み得る。具体的には、経口投与時には結合体、滑濁剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素又は香料等を用いることができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤等を混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤等を用いることができる。

さらに、本発明の組成物は一般的な医薬製剤の形態で使用することができる。非経口用製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤または凍結乾燥製剤、注射剤、経皮投入剤、鼻腔吸入剤などで、経口投与時には錠剤、トロッキー、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップまたはウェーハなどの形態で製造することができる。注射剤の場合、単位用量アンプルまたは複数回用量の形態で製造することができる。注射剤の場合は、必ず滅菌し、細菌や真菌などの微生物の汚染から保護する必要がある。注射剤の場合、適切な担体の例はこれに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの混合物および／または植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。より好ましくは、適切な担体としては、ハンクス溶液、リンガー溶液、トリエタノールアミンを含有するホスフェート緩衝化塩（ＰＢＳ）または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコールおよび５％デキストロースなどの等張溶液などを使用できる。注射剤を微生物汚染から保護するために、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような様々な抗菌剤および抗真菌剤をさらに含むことができる。さらに、注射剤は、ほとんどの場合、糖または塩化ナトリウムなどの等張化剤をさらに含み得る。

さらに、本発明の医薬組成物は、活性物質が標的部位に移動することができる任意の装置によって投与することができる。好ましい投与方法および製剤は、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤または点滴注射剤などだ。注射剤は、生理食塩液またはリンゲル液などの水性溶剤、植物油、高級脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、アルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコールまたはグリセリンなど）などの非水性溶剤などを利用して製造でき、変質防止のための安定化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡ等）、乳化剤、ｐＨ調整のための緩衝剤、微生物発育を阻止するための保存剤（例えば、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコールなど）などの医薬担体を含み得る。本発明の組成物を用いて変性神経疾患を治療または予防する方法は、本発明の治療用組成物の有効量（薬学的有効量）をそれを必要とする個体に投与することを含む。前記の薬学的有効量は、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康、性別、患者の薬物に対する感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合または同時使用される薬物など、医学分野で周知である要因に応じて当業者によって容易に決定することができる。

さらに、本発明の医薬組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供することができるように当技術分野で公知の方法を使用して製剤化することができる。

本発明の組成物の総有効量は、単一投与量で患者に投与することができ、複数投与量で長期間投与される分割治療方法によって投与することができる。本発明の医薬組成物は、疾患の程度によって有効成分の含有量を変えることができる。好ましくは、本発明の医薬組成物の好ましい総用量は、１日当たり患者体重１ｋｇ当たり約０．０１μｇ～１０，０００ｍｇ、最も好ましくは０．１μｇ～５００ｍｇであり得る。しかし、前記の医薬組成物の投与量は、製剤化方法、投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食事及び排泄率など様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定する。したがって、これらの点を考慮すると、当技術分野の従来の知識を有
する者であれば、本発明の組成物の適切な有効用量を決定することができる。本発明による医薬組成物は、本発明の効果を示す限り、その製剤、投与経路および投与方法に特に限定されない。

本発明の組成物は、投与方法および投与経路に応じて、構成要素であるドネペジルおよびＮ－アセチルシステインが１つの製剤に同時に含まれるように製剤化することができ、各構成要素は別々に製剤化され、毎日または一回等の投与単位によって一つの包装に含めることができる。個別に製剤化したドネペジルおよびＮ－アセチルシステインの製剤は同じでもそうでなくてもよい。本発明の医薬組成物の具体的な製剤化方法および製剤に含めることのできる薬学的に許容される担体は、前記の医薬組成物で上述した通りであり、当技術分野で公知の内容を参照することができる。

本発明はまた、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む虚血性脳疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。

本発明はまた、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む変性神経疾患予防または改善用食品組成物を提供する。

本発明の食品組成物は、機能性食品、栄養補助食品、健康食品、食品添加物などのすべての形態を含む。

この種の食品組成物は、当技術分野で公知の従来の方法に従って様々な形態で製造することができる。これに限定されないが、例えば、健康食品としてはコリンエステラーゼ阻害剤及び抗酸化剤は、お茶、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用できるように液状化、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取することができる。さらに、ドネペジルおよびＮ－アセチルシステイン感染性疾患に有効であることが知られている公知の活性成分と混合して組成物の形態で製造することができる。また、機能性食品としてはこれに限定されないが、飲料（アルコール性飲料を含む）、果実及びその加工食品（例えば、果物缶詰、瓶詰め、ジャム、ママレード等）、魚類、肉類及びその加工食品（例えば、ハム、ソーセージコンビーフなど）、パン類、麺類（例：うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズなど）、食用植物乳脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例えば、味噌、醤油、ソースなど）などにコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を添加することによって製造することができる。さらに、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を添加剤の形態で使用するためには、粉末または濃縮液の形態で製造して使用することができる。

本発明の食品組成物の中のドネペジルおよびＮ－アセチルシステインの好ましい含有量はこれに限定されないが、好ましくは最終的に製造された食品の０．１～９０重量パーセント濃度［％］である。より好ましくは、本発明のコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含有する食品組成物は、特に、感染性疾患に有効であることが知られている活性成分と混合して健康機能食品または栄養補助食品の形態で製造することができる。

本発明はまた、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を同時に、別々にまたは逐次的で投与する段階を含む、ヒトを除く動物の虚血性脳疾患治療方法を提供する。

本発明はまた、コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を同時に、別々にまたは逐次的で投与する段階を含む、ヒトを除く動物の変性神経疾患治療方法を提供する。

本発明は虚血性脳疾患治療用製剤を製造するためのコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤の使用を提供する。

本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを含む虚血性脳疾患の治療方法を提供する。

本発明は、変性神経疾患治療用製剤を製造するためのコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤の使用を提供する。

本発明はコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを含む変性神経疾患の治療方法を提供する。

本発明の前記の「有効量」とは、個体に投与した場合、虚血性脳疾患及び変性神経疾患の改善、治療、予防、検出、診断又は前記の疾患の抑制、又は減少効果を示す量をいい、前記の「個体」とは動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物であってもよく、動物由来の細胞、組織、器官などであってもよい。個体は効果を必要とする患者であり得る。
本発明の「治療」は、虚血性脳疾患および変性神経疾患または疾患の症状を改善することを包括的に指し、これは、疾患の治癒、実質的予防、または状態の改善を含むことができる。それらは、疾患から生じる１つの症状またはほとんどの症状の軽減、治癒または予防を含むが、これらに限定されない。

本明細書における用語「を含む」とは、「含有する」または「特徴付ける」と同じ意味で使用され、本発明による組成物または方法において、具体的に言及されていない追加の構成成分または方法のステップなどを排除しない。また、用語「からなる」とは、別途記載されていない追加の要素、工程、または成分などを除外することを意味する。用語「必須になされる」とは、組成物または方法の範囲において、記載された材料または工程に加えてその基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない材料または工程などを含み得ることを意味する。

［発明の効果］
本発明による組成物はコリンエステラーゼ阻害剤と抗酸化剤を併用投与することにより、単独投与に比べて上昇した虚血性脳疾患および変性性神経疾患の予防および治療効果を示すことができ、各薬物の過剰投与または長期投与によって引き起こされる可能性のある副作用を軽減できる効果がある。

図１は、神経細胞（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ）に酸化ストレスを誘発した後、ドネペジル単独、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）単独、またはドネペジル＋ＮＡＣ複合処理（ＮＤＣ－００２）後の活性酸素減少量（抗酸化効果）を評価した結果である。 図２は、微小膠細胞（ＢＶ２ ｃｅｌｌ）に炎症反応誘導物質であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）とともにドネペジルまたはＮＡＣを単独または複合処理後に発生するＩＬ－６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６）値を測定して抗炎症効果を評価した結果である。 図３はミクログリア細胞にＬＰＳと共にドデペジル単独、ＮＡＣ単独またはドネペジル＋ＮＡＣ複合処理後に発生するＮＯ濃度を測定した結果である。 図４は微小芽細胞にＬＰＳとともにドネペジルと抗酸化剤系薬物複合処理後に発生するＮＯの量を測定し、ＮＡＣ様系薬物の抗炎症効果を評価した結果である。 図５はミクログリア細胞にＬＰＳと共にドネペジルと抗酸化剤系薬物複合処理後に生きている細胞数を測定し、ＮＡＣ様系薬物の細胞毒性を評価した結果である。 図６は微小芽細胞にＬＰＳとともにドネペジル単独、酸化防止剤系薬物単独またはドネペジル＋抗酸化剤系薬物複合処理後に発生するＮＯ濃度を測定した結果である。 図７は神経前駆細胞（ＲｅＮｃｅｌｌ ＶＭ）にドネペジル単独、ＮＡＣ単独またはドネペジル＋ＮＡＣ複合処理後の運動神経細胞マーカーであるＨＢ９の発現量を評価した結果である。 図８は神経前駆細胞におけるコリンエステルライゼ阻害剤系列薬物とＮＡＣ複合処理後の運動神経細胞マーカーであるＨＢ９の発現量と生きている細胞数を測定し、ドネペジル類似系薬物の分化促進効果および細胞毒性を評価した結果である。 図９は神経前駆細胞にドネペジルと抗酸化剤系薬物複合処理後の運動神経細胞マーカーであるＨＢ９の発現量を測定し、ＮＡＣ様系薬物の分化促進効果を評価した結果である。 図１０は神経前駆細胞にドネペジルと抗酸化剤系薬物複合処理後の生細胞数を測定し、ＮＡＣ様系薬物の細胞毒性を評価した結果である。 図１１はマウス胎児の脳から一次培養した神経細胞にドネペジル単独、ＮＡＣ単独またはドネペジル＋ＮＡＣ複合処理後のシナプス可塑性調節に関与するＰＳＤ－９５とｐＣＲＥＢの発現差を測定した結果である。 図１２は脳卒中－再灌流動物モデル誘導後のドネペジル単独、ＮＡＣ単独またはドネペジル＋ＮＡＣ配合剤を２１日間処理した後、１、３、７、１４、２１日にＲｏｔａｒｏｄ ｌａｔｅｎｃｙ ｔｅｓｔの回復上昇幅を通じて単独対比配合剤の運動機能回復効果を評価した結果である。 図１３は、脳卒中－再灌流動物モデル誘導後すぐにドネペジル単独、ＮＡＣ単独またはドネペジル＋ＮＡＣ配合剤を２１日間処理した後、脳損傷部位程度を定量化して示した結果である。

以下、本発明を以下の実施例により詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明がこれらによって限定されるものではない。

実施例１：ドネペジル＋ＮＡＣ配合剤の抗酸化効果
脳血管疾患の中の虚血性脳卒中の場合、虚血部位に血流が減少しながら遊離酸素基（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）が多量に生産され、その結果、酸化代謝物が蓄積する。このとき発生する遊離酸素基は酸化ストレスを引き起こし、脳細胞を含むさまざまな臓器に影響を与える可能性がある。細胞は、活性酸素から受ける損傷を最小限に抑えるために、抗酸化剤と抗酸化酵素を活性化して中間副産物（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）を除去し、酸化反応を抑制して細胞と体を防御する。

本発明では、神経細胞（ＳＨ－ＳＹ５Ｙ）にＨ_２Ｏ_２を処理して酸化ストレスを誘発させた後、対照群、ドネペジル単独（５ｕＭ）、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）単独（５ｕＭ）およびドネペジル（２．５ｕＭ））＋ＮＡＣ（２．５μＭ）複合処理後の活性酸素（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）発生量を測定した。

その結果、図１に示すように、複合処理群ではＲＯＳが対照群と比較して有意に減少し、複合処理群はドネペジルそしてＮＡＣそれぞれの単独投与群より著しく向上した減少率を示し、抗酸化効果で併用による相乗効果が現れたことが確認できた（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、１元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ））

実施例２：ドネペジル＋ＮＡＣ配合剤の抗炎症効果
本発明では、ミクログリア細胞（ＢＶ２ ｃｅｌｌ）にＬＰＳを処理して炎症反応を起こすと同時にドネペジル単独、ＮＡＣ単独またはドネペジル＋ＮＡＣ複合処理後に発生する一酸化窒素（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｏｘｉｄｅ、ＮＯ）または炎症マーカー（ＩＬ－６）
発現量を測定することにより薬物の神経炎症緩和効果を確認した。

ミクログリア細胞へＬＰＳを処理して炎症反応を起こすと同時に、ドネペジル単独、ＮＡＣ単独またはドネペジル＋ＮＡＣ複合処理後の炎症マーカーＩＬ－６発現量を測定した結果、図２のようにドネペジル＋ＮＡＣ複合処理の際に最も顕著な抗炎症効果が見られることを確認した。（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）

図３に示すように、ミクログリア細胞へＬＰＳ処理と共にドネペジル単独、ＮＡＣ単独またはドネペジル＋ＮＡＣ複合処理後ＮＯ発生量減少を定量化し、ドネペジル＋ＮＡＣ配合剤が同じ濃度の単一薬物と比較して有意に改善された抗炎症効果を示すことを確認した。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）

ドネペジルとＮＡＣの複合処理で見られる抗炎症効果がドネペジルおよびＮＡＣと類似系薬物の組み合わせでも見られることを確認するためミクログリア細胞へＬＰＳと一緒にドネペジル＋ＮＡＣの類似系列である抗酸化剤薬（２２種類）複合処理後に発生するＮＯの量と生細胞数を測定し、類似系の薬物組み合わせにおいて細胞毒性を示さない濃度で抗炎症効果を確認した。

その結果、図４及び図５のようにドネペジル＋抗酸化剤複合処理組み合わせでも、ＬＰＳのみ処理した群に比べて有意にＮＯの減少を見せ、図６と同様に、ドネペジル＋抗酸化剤複合処理時の効果が同濃度の単一薬物と比較して相乗効果を示したことが確認された。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）

実施例３：ドネペジル＋ＮＡＣ配合剤の神経前駆細胞における分化促進効果
ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）と神経膠細胞（Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）に分化できる神経前駆細胞であるＲｅＮｃｅｌｌ不死化ヒト神経前駆細胞株（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）（ＶＭ）にドネペジル単独、ＮＡＣ単独およびドネペジル＋ＮＡＣ複合処理後、運動神経細胞に選択的に特異的な結合ができる抗体（ａｎｔｉ－ＨＢ９ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を用いて免疫染色を進行した。その後、ＨＢ９ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌの数値を分析して運動神経細胞の数を確認することにより、神経前駆細胞が運動神経細胞に分化する程度を測定した。

その結果、図７に示すように複合処理群における各物質単独処理群と比較して神経前駆細胞分化促進に相乗効果が現れたことが確認された。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）

ドネペジル以外のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤＋ＮＡＣの複合処理時そして、ドネペジル＋抗酸化剤の併用投与でも運動神経細胞への分化能を有することを確認するため神経電球細胞へドネペジルの類似系薬であるコリンエステラーゼ阻害薬（８種類）＋ＮＡＣまたはドネペジル＋ＮＡＣの類似系列である抗酸化剤薬（１５種類）複合処理後のＨＢ－９値と生細胞数を測定し、類似系薬物組み合わせの運動神経細胞分化促進効果および細胞毒性を確認した。

その結果、図８のように８種類のドネペジル類似系薬物＋ＮＡＣ複合処理組み合わせでドネペジル＋ＮＡＣ複合処理で示したように、対照群と比較して有意に増加した運動神経細胞への分化促進効果を確認した。また、図９および図１０のようにドネペジル＋ＮＡＣ類似系薬物１５種類の複合処理でもドネペジル＋ＮＡＣ複合治療と同様に、対照群と比較
して有意に増加した運動神経細胞への分化促進効果を確認した。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）

実施例４：ドネペジル＋ＮＡＣ配合剤のシナプス可塑性向上効果
マウス神経細胞（一次ニューロン培養（Ｐｒｉｍａｒｙ ｎｅｕｒｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ））にドネペジル単独、ＮＡＣ単独またはドネペジル＋ＮＡＣ複合処理後、ウェスタンブロットアッセイ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）によりシナプス可塑性のバイオマーカーであるＰＳＤ－９５とｐＣＲＥＢの発現量を測定した。

その結果、図１１のようにドネペジル＋ＮＡＣ複合処理群における対照群比ＰＳＤ－９５発現増加およびｐＣＲＥＢの増加効果に相乗傾向を示し、ドネペジル＋ＮＡＣ複合薬のシナプス可塑性向上効果を確認した。（＊＊Ｐ＜０．０１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）

参考までに、認知能力と記憶力の向上機能性を確認するために、種類別のバイオマーカーが存在する。タイプ別に神経細胞死滅抑制による神経細胞保護効果、ベータアミロイド形成と蓄積抑制、神経炎症の抑制、神経伝達物質の生成、分泌および代謝の調節そしてシナプスの可塑性の調節等がある。

シナプス可塑性調節は神経細胞間のシグナル伝達に関与することによって認知能力効果を見る重要なタイプであり、そのバイオマーカーにはＰｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃｄｅｎｓｉｔｙ－９５（ＰＳＤ－９５）、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦなどがある。

Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ－９５（ＰＳＤ－９５）はシナプス後肥厚（ＰＳＤ）に含まれる必須機能分子群で、ＮＭＤＡ受容体、ＣａＭＫＩＩを含む長期増強（ＬＴＰ）の誘導に不可欠な役割を果たす。ニューロリギン（Ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ）、ＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体、カリウムチャンネルなどに直間接的に結合し、シナプスの可塑性およびＬＴＰ中のシナプス変化の安全性に重要な役割を果たす。（Ｅｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＳＤ－９５ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｄｒｉｖｅｎ ｓｙｎａｐｓｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ， ＰＮＡＳ ２００７．／Ｎａｇｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ，ａｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ ＰＤＺ１ ａｎｄ ＰＤＺ２ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ＰＳＤ－９５ ｋｎｏｃｋｉｎ ｍｉｃｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ，２０１２）
一方、ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＥＢ）は、記憶およびシナプス可塑性に関与する様々な遺伝子のプロモーター部位に結合する転写因子であり、ＣＲＥＢの活性化は記憶形成および増強に関連する遺伝子（ＢＤＮＦなど）の転写を誘導することが知られている。（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，ＣＲＥＢ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ｆｏｒ ｓｐａｔｉａｌ ｌｅａｒｎｉｎｇ．Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２．／Ｋｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＣＲＥＢ ａｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｈａｎ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２０１４）

したがって、ＰＳＤ－９５の発現増加とｐＣＲＥＢ発現増加に相乗効果を示すドネペジル＋ＮＡＣ複合療法は、認知能力と記憶力の改善に相乗効果を示した。

実施例５：ｉｎ ｖｉｖｏ実験モデルでドネペジル＋ＮＡＣ複合薬の単一薬物対シナジー効果の確認
スプラーグドーリーラット（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ、ＳＤ ｒａｔ）を用いた脳梗塞－再灌流モデルを用いて脳卒中モデルを作製した。ドネペジル単独、ＮＡＣ単独、ドネペジル＋ＮＡＣ配合剤（ＮＤＣ－００２）を脳梗塞－再灌流モデルの直後にＩ．Ｖ．で２１日間投与し、実験を進行した。
脳卒中実験動物モデルの代表的な運動調整評価試験は、Ｒｏｔａ－ｒｏｄ ｌａｔｅｎｃｙ検査を通じて動物の運動機能をドネペジル単独、ＮＡＣ単独およびドネペジル＋ＮＡＣ複合薬物投与後１、３、７、１４、２１日目に測定し、１日目の結果に基づいて運動機能の回復率を分析した。

その結果、図１２に示すように、ＮＤＣ－００２投与群のみがＶｅｈｉｃｌｅ投与群に対する有意な回復率増加を示し、ＮＤＣ－００２複合薬物の運動機能回復効果を示すことが確認された（＊＊Ｐ＜０．０１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。

さらに、ドネペジル＋ＮＡＣ複合薬物投与群における運動機能回復率はドネペジル単独、ＮＡＣ単独投与群と比較して有意な回復率の増加を示すＮＤＣ－００２複合薬の運動機能の回復において相乗効果を確認した（＃＃＃Ｐ＜０．００１、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。

脳卒中－再灌流モデル直後からドネペジル単独、ＮＡＣ単独およびドネペジル＋ＮＡＣ複合薬を２１日間投与した後、脳組織を神経細胞（ＮｅｕＮ）、ミクログリア細胞（ＧＦＡＰ）マーカー抗体、細胞核染色液（ＤＡＰＩ）を介して免疫組織染色法で染色し、脳損傷部位程度分析した結果、図１３に示すように、ＮＤＣ－００２複合投与群でのみＶｅｈｉｃｌｅ投与群と比較して有意な脳損傷の程度の減少を確認した（＊Ｐ＜０．０５、ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）。

本発明による組成物はコリンエステラーゼ阻害剤と抗酸化剤を併用投与することにより、単独投与に比べて上昇した脳疾患の予防および治療効果を示し、各薬物の過剰投与または長期投与によって引き起こされる可能性のある副作用を軽減することができる効果があり、産業上利用可能性が高い。

Claims (17)

1. コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む虚血性脳疾患の予防または治療用医薬組成物。
2. 前記の虚血性脳疾患は、脳卒中、脳日血、脳梗塞、頭部損傷、脳循環代謝障害、血管性認知症および脳機能昏睡からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
3. 前記のコリンエステラーゼ阻害剤は、７－メトキシタクリン（ｍｅｔｈｏｘｙｔａｃｒｉｎｅ）、アルバメリン（ａｌｖａｍｅｌｉｎｅ）、アンベノニウム（ａｍｂｅｎｏｎｉｕｍ）、アンセクリン（ａｎｓｅｃｕｌｉｎ）、アレコリン（ａｒｅｃｏｌｉｎｅ）、セビメリン（ｃｅｖｉｍｅｌｉｎｅ）、シティコリン（ｃｉｔｉｃｏｌｉｎｅ）、デマカリウム（ｄｅｍａｃａｒｉｕｍ）、ドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）、エドロフォニウム（ｅｄｒｏｐｈｏｎｉｕｍ）、エプタスチグミン（ｅｐｔａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、パスシクリン（ｆａｓｃｉｃｕｌｉｎ）、ヘプチル－ピソスチグミン（ｈｅｐｔｙｌ－ｐｈｙｓｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、フペルジン（ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ）Ａおよびその類似体、イコフェジル（ｉｃｏｐｅｚｉｌ）、イピダクリン（ｉｐｉｄａｃｒｉｎｅ）、リノピリジン（ｌｉｎｏｐｉｒｉｄｉｎｅ）、メトリフォネート（ｍｅｔｒｉｆｏｎａｔｅ）、ミラメリン（ｍｉｌａｍｅｌｉｎｅ）、ネオスチグミン（ｎｅｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、ノメオスチグミン（ｎｏｍｅｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、ピリドスチグミン（ｐｙｒｉｄｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、ノルピリドスチグミン（ｎｏｒｐｙｒｉｄｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、タクリン（ｔａｃｒｉｎｅ）、ピソスチグミン（ｐｈｙｓｏｓｔｉｇｍｉｎｅ）、リバスチグミン（ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）、サブコメリン（ｓｕｂｃｏｍｅｌｉｎｅ）、スロナクリン（ｓｕｒｏｎａｃｒｉｎｅ）、タクリン類似体、タクリン、タルサクリジン（ｔａｌｓａｃｌｉｄｉｎｅ）、ベルナクリン（ｖｅｌｎａｃｒｉｎｅ）、ザノメリン（ｘａｎｏｍｅｌｉｎｅ）、イトプライド（ｉｔｏｐｒｉｄｅ）、アコチアミド（ａｃｏｔｉａｍｉｄｅ）、ヒュフェルジン（ｈｕｐｅｒｚｉｎ）、ガランタミン（ｇａｌａｎｔｈａｍｉｎｅ）及びジプロシロン（ｚｉｆｒｏｓｉｌｏｎｅ）からなる群から選択される少なくとも１種またはその塩であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
4. 前記の抗酸化剤は、Ｎ－アセチルシステイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、α－リポ酸（ａｌｐｈａ－ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ）、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ）、ポルシチン（ｆｏｒｓｙｔｈｉｎ）、イソフェルリック酸（ｉｓｏｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、ガンマ－オリザノール（ｇａｍｍａ－ｏｒｙｚａｎｏｌ）、トランス－アネゾール（ｔｒａｎｓ－ａｎｅｔｈｏｌ）、チオキサン（ｔｈｉｏｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、システアミン（ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ）、ガリク酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、サルビアノール酸（ｓａｌｖｉａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ビタミンＥ（ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ）、ラパアコニチン（ｌａｐｐａｃｏｎｉｔｉｎｅ）、セレン（ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、コエンザイムＱ１０（ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑ１０）、ビタミンＡ、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）、ダルトロン（ｄａｌｔｒｏｎ）、Ｌ－セレノメチオニン（Ｌ－ｓｅｌｅｎｏｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）からなる群から選択される少なくとも１種またはその塩であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
5. コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む変性神経疾患の予防または治療用医薬組成物。
6. 前記の変性神経疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、認知機能障害、進行性核上麻痺、多系統萎縮症、オリーブ核－脳橋－小脳萎縮症（ＯＰＣＡ）、シャイ－ド
   ラガー症候群、線条体－黒質変性症、ハンチントン病、筋萎縮性側色硬化症（ＡＬＳ）、本態性進展症、皮質－基底核変性症、レビー小体型疾患、パーキンス－ＡＬＳ－認知症複合症、ニーマン・ピッグ病およびピック病からなる群から選択されることを特徴とする請求項５記載の医薬組成物。
7. 前記の組成物は、神経細胞分化促進効果を示すことを特徴とする請求項１～６のいずれか一項記載の医薬組成物。
8. 前記のコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤は同時に、別々にまたは逐次的に投与されることを特徴とする請求項１～６のいずれか一項記載の医薬組成物。
9. コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む虚血性脳疾患の予防または改善用食品組成物。
10. コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を有効成分として含む変性神経疾患の予防または改善用食品組成物。
11. 前記の食品は健康機能性食品であることを特徴とする請求項９または１０記載の食品組成物。
12. コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を同時に、別々にまたは逐次的で投与する段階を含む、ヒト以外の動物の虚血性脳疾患の治療方法。
13. コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を同時に、別々にまたは逐次的で投与する段階を含む、ヒト以外の動物の変性神経疾患の治療方法。
14. 虚血性脳疾患を治療するための製剤を製造するためのコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤の使用。
15. コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の有効量を必要とする個体に投与することを含む虚血性脳疾患の治療方法。
16. 変性神経疾患治療用製剤を製造するためのコリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤の使用。
17. コリンエステラーゼ阻害剤および抗酸化剤を含む組成物の有効量を必要とする個体に投与することを含む変性神経疾患の治療方法。