JP2024503372A - 骨髄異形成症候群の処置における使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩 - Google Patents

Abstract

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の処置における使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。

Description

本発明は、キノリン誘導体タスキニモドの新規使用に関する。さらに詳細には、本発明は、骨髄異形成症候群の処置における使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩に関する。

タスキニモドおよびその調製方法が、ＷＯ ９９／５５６７８として公開された国際出願ＰＣＴ／ＳＥ９９／００６７６号、およびＷＯ ００／０３９９１として公開された国際出願ＰＣＴ／ＳＥ９９／０１２７０号に記載され、それらの出願には、自己免疫に起因する疾患、例えば多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、炎症性腸疾患および乾癬、さらに病的炎症が主要な役割を果たす疾患、例えば喘息、アテローム性動脈硬化症、脳卒中およびアルツハイマー病の処置に対するタスキニモドおよびいくつかの他のキノリンカルボキサミドの有用性も開示された。

タスキニモドを調製する方法は、ＷＯ ０３／１０６４２４として公開された国際出願ＰＣＴ／ＳＥ２００３／０００７８０号、およびＷＯ ２０１２／００４３３８として公開された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０６１４９０号にも開示されている。タスキニモドの重水素化形が、ＷＯ ２０１２／１７５５４１として公開された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６１７９８号に記載された。

がん、さらに詳細には固形がん、例えば前立腺がんや乳がんの処置のためのさまざまなキノリンカルボキサミドの使用が、ＷＯ ０１／３０７５８として公開された国際出願ＰＣＴ／ＳＥ００／０２０５５号に開示されている。これらの化合物の一部は、腫瘍発生を助長し、腫瘍微小環境における抑制性および血管新生促進性細胞に影響を及ぼし、前転移ニッチの確立に関与する免疫調節タンパク質（Ｓ１００Ａ９）に結合し、その相互作用を阻害することが見出された。

ＷＯ ２０１６／０７８９２１として公開された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７５７６９号には、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含めて白血病の処置における使用のためのタスキニモドが開示される。

ＷＯ ２０１６／０４２１１２として公開された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７１３９１号には、多発性骨髄腫の処置における使用のためのタスキニモドが開示される。

ＷＯ ２０１６／１４６３２９として公開された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５３２８８号には、がん、特に膀胱がんの処置におけるＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせた使用のためのタスキニモドが開示される。

骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、症候性血球減少症として現れる無効造血、細胞形態異形成症、および急性骨髄性白血病への進行の相当なリスクに伴う異質スペクトルの慢性骨髄新形成またはクローン性造血幹細胞障害である。

ＭＤＳは、年齢中央値６５～７０歳の高齢者集団において最もよく見られる血液新生物の１つである。しかし、疾患は、いずれの年齢においても発症し得る。明らかなリスク因子が原発性ＭＤＳには存在しないが、続発性ＭＤＳについては、以前の化学または放射線療法によるＤＮＡ損傷が周知のリスク因子である。さらに、小児集団におけるＭＤＳは、遺伝性骨髄機能不全（例えば、ファンコニ貧血症または先天性角化不全症）に付随して生じることがある。

複数の生物学的プロセスが、造血前駆体の増殖および成熟血球への分化を支配する。これらのプロセスのいずれかを妨害する造血幹細胞の分子改変は、ＭＤＳの発症機序に不可欠である。ＭＤＳ患者の約８０～９０％は、造血幹細胞に体細胞突然変異をもつ。体細胞突然変異のタイプおよび発生率は、ＭＤＳにおける機能不全シグナル伝達経路に寄与し、疾患予後およびいくつかの薬物に対する応答性に関連している。造血幹細胞の分子改変に加えて、周辺の骨髄ニッチがＭＤＳ発症機序において中心的役割を果たす。ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を含めて、異常な炎症性シグナル伝達は、悪性ＭＤＳクローンの選択、維持および白血病進展を促進することができる。

ＭＤＳ患者は、診断時に無症候性であり得るが、最大で８０％が貧血に苦しむ。患者は主に、血球減少に関連した症状、例えば、貧血が原因である疲労および脱力、好中球減少に関連した感染症、または血小板減少が原因である出血に冒されている。ＭＤＳ患者の約１／３は、急性骨髄性白血病まで進行する。

ＭＤＳの改定国際予後判定システム（ＩＰＳＳ－Ｒ）は、疾患予後を決定するための最もよく使用される予後判定システムである。モデルは、血球減少の程度、骨髄芽球百分率および細胞遺伝学的サブグループに従った５つのリスクカテゴリーを示す。

ＭＤＳが高齢者集団において最もよく見られる血液新生物の１つであるけれども、限られた処置の選択肢しか利用できない。支持的ケアに加えて、５種の薬物（エリスロポエチン、ルスパテルセプト、鉄キレート剤デフェラシロクス、免疫調節薬レナリドミド、および低メチル化剤アザシチジン）のみ、欧州で承認されている。唯一の根治的治療は、同種造血幹細胞移植であるが、多くの高齢患者において実現可能でない。

支持的ケアとしては、輸血療法、赤血球生成促進剤での処置、および抗生物質療法が挙げられる。輸血療法（輸血）は、疾患または処置によって破壊された血球を置き換えるために赤血球、白血球、または血小板を与える方法である。頻繁な赤血球輸血は、鉄過剰および随伴性臓器毒性を引き起こし、臨床転帰不良を伴う。デフェラシロクスを用いる鉄キレート化療法は、患者の転帰を改善することがある。赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）は、身体によって生成される成熟赤血球の数を増加させ、貧血の効果を和らげるために投与される。顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）をＥＳＡと共に投与して、処置作業をよりよくするのに役立つこともある。最後に、抗生物質療法を使用して、感染症と戦うことができる。

薬物療法としては、例えば、頻繁な赤血球輸血を必要とする、（５ｑ）の単独欠失を染色体異常とする骨髄異形成症候群患者のみを対象に承認されているレナリドミドでの処置が挙げられる。ＥＳＡに不応性であるかまたはＥＳＡに応答する可能性が低い、環状鉄芽球を伴う輸血依存性ＭＤＳ患者は、ルスパテルセプトを使用することができる。低メチル化剤アザシチジンを使用して、骨髄異形成症候群を疾患の進行期に処置して、骨髄異形成症候群の急性骨髄性白血病への進行を遅くすることができる。通常、古典的化学療法は、より高い芽球数を有する患者において幹細胞移植前にのみ使用されて、腫瘍細胞負荷を低減する。

同種幹細胞移植時に、幹細胞（未熟血球）を健常ドナーの血液または骨髄から採取し、条件付け療法の完了後にＭＤＳ患者に再注入する。ドナー造血幹細胞は、患者の元々の骨髄に置き代わり、身体の血球を回復させる（生着と呼ばれる）。

第１の態様は、骨髄異形成症候群の処置における使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩である。

別の態様は、骨髄異形成症候群の処置のための医薬品の製造におけるタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩の使用である。

さらに別の態様は、治療有効量のタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩を含む、骨髄異形成症候群の処置のための医薬品剤形である。

別の態様は、骨髄異形成症候群の処置を必要とする哺乳類における骨髄異形成症候群の処置方法であって、治療有効量のタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩の哺乳類への投与による処置である、方法である。

それらの別の態様および実施形態は、以下の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

それぞれ健常患者（対照）、低いリスクのＭＤＳ（ＬＲ－ＭＤＳ）患者および高いリスクのＭＤＳ（ＨＲ－ＭＤＳ）患者から得られた骨髄中のＳ１００Ａ９濃度（ｐｇ／ｍｌ）を表すグラフである。 Ｓ１００Ａ９またはＳ１００Ａ９およびタスキニモドで４８時間処置した後のＭＤＳ ＭＳＣにおけるリン酸化ＩＲＡＫ１（８０ｋＤａ）、ＮＦ－κＢ－ｐ６５（６５ｋＤａ）およびガスダーミン（５０ｋＤａ）のウェスタンブロットを示す図である。ＧＡＰＤＨ（３８ｋＤａ）は、比較タンパク質となった。レーン１＝無処置対照；レーン２＝Ｓ１００Ａ９で処置；レーン３＝Ｓ１００Ａ９／タスキニモドで処置。 タスキニモドのみ（ＴＡＳＱ）、Ｓ１００Ａ９のみ（Ｓ１００Ａ９）、またはＳ１００Ａ９とタスキニモドの両方（Ｓ１００Ａ９＋ＴＡＳＱ）で４８時間処置した後のＭＤＳ ＭＳＣのリアルタイムＰＣＲによりＩＬ－１β、ＩＬ－１８、Ｃａｓｐ１およびＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡ発現レベルを表す棒グラフである。ＩＬ－１β、ＩＬ－１８、Ｃａｓｐ１およびＰＤ－Ｌ１の増幅産物を内因性ＧＡＰＤＨ発現に正規化し、無処置ＭＳＣを１（＝対照）に設定した。 Ｓ１００Ａ９およびタスキニモドで４８時間処置した後の健常およびＣＭＭＬ ＭＳＣにおけるＰＤ－Ｌ１のウェスタンブロットを示す図である。レーン１＝無処置対照；レーン２＝タスキニモドで処置；レーン３＝Ｓ１００Ａ９で処置；レーン３＝Ｓ１００Ａ９およびタスキニモドで処置。 ＴＮＦ－αおよびタスキニモドで４８時間処置した後のＭＤＳ ＭＳＣにおけるリン酸化ＩＲＡＫ１（８０ｋＤａ）、ＮＦ－κＢ－ｐ６５（６５ｋＤａ）およびガスダーミン（５０ｋＤａ）のウェスタンブロットを示す図である。ＧＡＰＤＨ（３８ｋＤａ）は、比較タンパク質となった。レーン１＝ＴＮＦ－αで処置；レーン２＝ＴＮＦ－αおよびタスキニモドで処置。 Ｓ１００Ａ９もタスキニモドも存在せずに（「存在せず」）、タスキニモドの存在下（ＴＡＳＱ）で、Ｓ１００Ａ９の存在下（Ｓ１００Ａ９）で、ｓ１００Ａ９とタスキニモドの両方の存在下（Ｓ１００Ａ９＋ＴＡＳＱ）で１、２、３および４週間後、ＭＤＳ ＭＳＣを造血前駆細胞と共培養したときのＣＡＦ－Ｃの定量を示す棒グラフである。 ３００個の細胞を組換えサイトカイン（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標） Ｈ４４３５、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で強化されたメチルセルロース培地に播種して、Ｓ１００Ａ９の存在下もしくはＳ１００Ａ９とタスキニモドの両方の存在下で、またはＳ１００Ａ９とタスキニモドの両方の非存在下（「対照」）で１週間共培養した後に回収した造血前駆細胞と共培養したＭＤＳ ＭＳＣ細胞を使用して行われたＣＦＵアッセイにおいて、コロニーの数／３００個の細胞を示す棒グラフである。２週間後、顕微鏡下でまたはＳＴＥＭｖｉｓｉｏｎ（商標）システム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、コロニーを計数し、分類した。 ３００個の細胞を組換えサイトカイン（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標） Ｈ４４３５、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で強化されたメチルセルロース培地に播種して、タスキニモドの存在下（「ＴＡＳＱ」）または非存在下（「存在せず」）で１週間共培養した後に回収したＭＤＳ ＭＳＣ細胞および造血前駆細胞を使用して行われたＣＦＵアッセイにおいて、コロニーの数／３００個の細胞を示す棒グラフである。２週間後に、顕微鏡下でまたはＳＴＥＭｖｉｓｉｏｎ（商標）システム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、コロニーを計数し、分類した。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。

本文において使用される略語および頭字語は、当業者に周知であると考えられるが、はっきりさせるためにこれらのうちのいくつかの意味を本明細書の以下に示す。
ＡＬＰ アルカリホスファターゼ
αＳＭＡ α－平滑筋アクチン
ＢＣＡ ビシンコニン酸アッセイ
ＢＦＵ－Ｅ 赤芽球バースト形成単位
ＢＭ 骨髄
ＣＡＦ－Ｃ 敷石状領域形成細胞
ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ
ＣＦＵ コロニー形成単位
ＣＦＵ－Ｅ 赤芽球コロニー形成単位
ＣＦＵ－ＧＥＭＭ 顆粒球、赤血球、単球、巨核球コロニー形成単位
ＣＦＵ－ＧＭ 顆粒球／マクロファージコロニー形成単位
ＣＭＭＬ 慢性骨髄単球性白血病
Ｃｙ シアニン
ＤＡＰＩ ４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール
ＤＭＥＭ ダルベッコ変法イーグル培地
ｄＴ デオキシチミジン
ＥＣＡＲ 細胞外酸性化速度
ＥＣＬ 増強化学ルミネセンス
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＥＬＩＳＡ 酵素結合性免疫吸着アッセイ
ＦＣＣＰ カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン
ＦＣＳ ウシ胎仔血清
ＦＬＴ３－Ｌ ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド
ＧＡＰＤＨ グリセルアルデヒド３－ホスフェートデヒドロゲナーゼ
ＨＲＰ ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＨＳＡ ヒト血清アルブミン
ＨＳＣ（ｓ） 造血幹細胞（複数可）
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
ＩＬ インターロイキン
ＩＲＡＫ１ インターロイキン－１受容体関連キナーゼ１
ＭＤＳ 骨髄異形成症候群
ＭＤＳ－ＲＳ 環状鉄芽球を伴う骨髄異形成症候群
ＭＳＣ（ｓ） 間葉系幹細胞（複数可）
ＮＦ－κＢ 活性化Ｂ細胞の核内因子κ軽鎖エンハンサー
ＯＣＲ 酸素消費速度
ＰＢＭＣ 末梢血単核球
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＤ－１ プログラム細胞死タンパク質１
ＰＤ－Ｌ１ プログラム死リガンド１
ＲＩＰＡ 放射性免疫沈降法アッセイ
ＲＮＡ リボ核酸
ＲＯＳ 活性酸素種
ＲＯＸ カルボキシ－Ｘ－ローダミン
ＲＴ－ＰＣＲ リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
ＳＣＦ 幹細胞因子
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＬＲ４ トール様受容体４
ＴＮＦ－α 腫瘍壊死因子α

化合物タスキニモド、または４－ヒドロキシ－５－メトキシ－Ｎ，１－ジメチル－２－オキソ－Ｎ－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－１，２－ジヒドロキノリン－３－カルボキサミドは、以下の構造式を有する。

「任意選択の」または「任意選択で」とは、続いて記載される事象または状況が起こる可能性はあるが起こる必要はないこと、記載には、事象または状況が起こる場合と起こらない場合が含まれることを意味する。

「薬学的に許容される」とは、一般に安全で、非毒性であり、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない医薬組成物を調製する際に有用であるものを意味し、獣医学的使用およびヒト用医薬品としての使用に許容されるものを含む。

薬学的に許容される塩の例は、（対イオンとして）アルカリ金属イオン、例えばＬｉ^＋、Ｎａ^＋もしくはＫ^＋との塩、またはアルカリ土類金属イオン、例えばＭｇ^２＋もしくはＣａ^２＋との塩、または他のあらゆる薬学的に許容される金属イオン、例えばＺｎ^２＋もしくはＡｌ^３＋との塩；またはジエタノールアミン、エタノールアミン、Ｎ－メチルグルカミン、トリエタノールアミンもしくはトロメタミンなど有機塩基で形成された薬学的に許容される塩を含む。

「治療有効量」とは、病態（この場合、ＭＤＳ）を処置するために対象に投与されたとき、病態に対してそのような処置をもたらすのに十分な、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩の量を意味する。「治療有効量」は、例えば処置対象の年齢および相対的健康、病態の進行状態、投与経路および形態、他の薬物の、例えば組合せ療法における考え得る追加的使用などに応じて異なる。いくつかの実施形態において、「有効量」は、１つまたは複数の徴候、自覚的症状、他覚的症状、診断検査、バイタルサインなどの統計学的に有意な変化によって測定して、処置効果（例えば、処置する、予防する、阻害する、緩和する、促進する、改善する、増加する、低減するなど）をもたらす。別の実施形態において、「有効量」は、１つまたは複数の徴候、自覚的症状、他覚的症状、診断検査、バイタルサインなどの統計学的に有意な変化の欠如によって測定して、病態を抑制する、管理する、または予防する。

本明細書では用語「処置」または「処置すること」は、臨床結果を含めて有益なまたは所望の結果を得る手法である。有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能にせよ検出不可能にせよ、処置される病態の１つまたは複数の症状の軽減または改善、病態の範囲の縮小、病態の状態の安定化（すなわち、悪化させない）、病態の拡大の予防、病態の進行の遅延または緩徐化、病態の改善または寛解、および（部分寛解にせよ完全寛解にせよ）寛解を挙げることができるが、これらに限定されない。この用語は、処置なしで予想される生存と比較して生存を延長させることを意味することもできる。

ＭＤＳ患者は、主に貧血、血小板減少症、好中球減少症、二系統血球減少症、汎血球減少症ならびにそれらの関連症状、例えば疲労、貧血、脱力、内出血または出血傾向、発熱、骨痛、息切れ、および頻繁な感染症など、血球減少症によって影響される。

用語「哺乳類」は、ヒトまたは任意の哺乳類動物、例えば霊長類、家畜、愛玩動物、または実験動物を指す。好ましくは、哺乳類はヒトである。

本発明に従って好適に処置され得る哺乳類（例えばヒト）対象は、ＭＤＳに苦しむ対象またはＭＤＳを発症する（増加）リスクがある対象とすることができる。

本明細書では「ＭＤＳ」は、末梢血球減少および正形成または過形成骨髄によって特徴づけられる一群の後天性造血器障害を指す。ＭＤＳのサブタイプとしては、一系統（単一系統）に異形成を有するＭＤＳ、多系統に異形成を有するＭＤＳ、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）、（５ｑ）の単独欠失を伴うＭＤＳなど単独欠失を染色体異常とするＭＤＳ、芽球増加を伴うＭＤＳ、および分類不能型ＭＤＳが挙げられる。

ＷＨＯは、以下の通り、さまざまな形態のＭＤＳを、骨髄における骨髄芽球の百分率、骨髄における異常な赤血球前駆体（環状鉄芽球）の存在、骨髄における異形成系統として知られる異常な細胞型の数、および骨髄細胞の遺伝子プロファイルなどの基準に応じて異なるサブタイプに分類した。

単一系統に異形成を有するＭＤＳ（ＭＤＳ－ＳＬＤ）－１または２系統の血球減少；骨髄において、１細胞株の≧１０％に異形成、芽球＜５％
多系統に異形成を有するＭＤＳ（ＭＤＳ－ＭＬＤ）－１～３系統の血球減少、単球＜１×１０^９／Ｌ；骨髄において、≧２造血系統で≧１０％の細胞に異形成、環状鉄芽球＜１５％（またはＳＦ３Ｂ１変異が存在する場合、環状鉄芽球＜５％）、芽球＜５％
環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）－貧血、芽球なし；骨髄において、赤血球前駆体の≧１５％が環状鉄芽球を伴うか、またはＳＦ３Ｂ１変異が存在する場合、環状鉄芽球≧５％
（５ｑ）の単独欠失を伴うＭＤＳ－貧血、血小板正常または減少；骨髄において、一系統の赤血球異形成、（５ｑ）の単独欠失、芽球＜５％±－７／（７ｑ）欠失を除いた１つの他の異常
芽球増加を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＥＢ）－１～３系統の血球減少、０～３異形成骨髄系統、および骨髄において芽球５～９％もしくは血液において芽球２～４％（ＭＤＳ－ＥＢ１）、または骨髄において芽球１０～１９％もしくは血液において芽球５～１９％（ＭＤＳ－ＥＢ２）
分類不能型ＭＤＳ－血球減少、少なくとも２回にわたって芽球±１％；骨髄において、単一系統異形成、または異形成はないが特徴的なＭＤＳ細胞遺伝学的性質、芽球＜５％。

ＷＨＯ分類は、末梢血において、血球減少および芽球が＜２％であり、骨髄において、１～３系統に異形成があり、芽球が＜５％である、小児期の不応性血球減少症の暫定的なカテゴリーも含む。

追加的に、ＷＨＯ分類によれば、ＣＭＭＬ（ＣＭＭＬ－０、ＣＭＭＬ－１、ＣＭＭＬ－２）およびＭＤＳ／ＭＰＮ－ＲＳ－Ｔは、古典的ＭＤＳ／ＭＰＮ重複症候群である。

ＷＨＯによって開発された分類は、本明細書でＭＤＳのさまざまなサブタイプを定義するために使用されるが、別段の指定がない限りまたは文脈から明らかに、本明細書では用語ＭＤＳは、ＭＤＳのいずれのサブタイプも、例えばＣＭＭＬも含めて以上に示したサブタイプのいずれも含むと考えられる。しかし、いくつかの実施形態において、ＭＤＳはさらに詳細には、本明細書で以上に定義するように単一系統に異形成を有するＭＤＳである。いくつかの実施形態において、ＭＤＳはさらに詳細には、本明細書で以上に定義するように多系統に異形成を有するＭＤＳ（ＭＤＳ－ＭＬＤ）である。いくつかの実施形態において、ＭＤＳはさらに詳細には、本明細書で以上に定義するように環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）である。いくつかの実施形態において、ＭＤＳはさらに詳細には、本明細書で以上に定義するように（５ｑ）の単独欠失を伴うＭＤＳである。いくつかの実施形態において、ＭＤＳはさらに詳細には、本明細書で以上に定義するように芽球増加を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＥＢ）である。いくつかの実施形態において、ＭＤＳはさらに詳細には、本明細書で以上に定義するように分類不能型ＭＤＳである。いくつかの実施形態において、ＭＤＳはさらに詳細には、本明細書で以上に定義するように小児期の不応性血球減少症である。いくつかの実施形態において、ＭＤＳはさらに詳細には、ＣＭＭＬを含む。いくつかの別の実施形態において、ＭＤＳは、ＣＭＭＬを含まない。

上記の診断分類体系に加えて、改訂国際予後判定システム（ＩＰＳＳ－Ｒ）と呼ばれる予後体系が開発された。それによれば、ＭＤＳは、非常に低いリスク、低いリスク、中程度のリスクまたは高いリスクまたは非常に高いリスクと分類することができる。Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｔｕｅｃｈｌｅｒ、Ｓｃｈａｎｚらによって出版されたガイダンス、Ｒｅｖｉｓｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＰＳＳ－Ｒ ｆｏｒ Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｂｌｏｏｄ、１２０： ２４５４、２０１２）、およびＳｃｈａｎｚ Ｊら（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２０１２； ３０：８２０）を参照のこと。この体系は、ヘモグロビン数（ｇ／ｄｌ）、好中球絶対数（×１０^９／Ｌ）、血小板（×１０^９／Ｌ）、骨髄芽球（％）、およびＭＤＳの細胞遺伝学的カテゴリーを使用する。細胞遺伝学的カテゴリーは、表１に表すように、いくつかの細胞遺伝学的異常の存在に基づいて非常に良好、良好、中程度、不十分、または非常に不十分と定義される。

細胞遺伝学的予後サブグループ、および患者の上記の基準のそれぞれの決定値（ヘモグロビン数（ｇ／ｄｌ）、好中球絶対数（ＡＮＣ）（×１０^９／Ｌ）、血小板（×１０^９／Ｌ）、骨髄芽球（％））を、表２に示すようにスコア付けする。

得られた総リスクスコアを使用して、表３に示すようにＭＤＳをＩＰＳＳ－Ｒ予後リスクカテゴリーに分類する。

最後に、７０００人を超える患者のデータに基づいて、ＩＰＳＳ－Ｒは、表４に示すように各予後リスクカテゴリーを生存期間中央値（年）および２５％ＡＭＬ進展期間中央値と関係づけた。

いくつかの実施形態において、適応症ＭＤＳには、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、芽球増加を伴う不応性貧血、移行期の芽球増加を伴う不応性貧血および慢性骨髄単球性白血病など、さまざまな形態の貧血が含まれる。いくつかの実施形態において、適応症ＭＤＳは、白血病に発達したＭＤＳを除外する。いくつかの実施形態において、患者は、白血病に罹っていない。

いくつかの実施形態において、タスキニモドは、本明細書に記載のように骨髄異形成症候群の改定国際予後判定システム（ＩＰＳＳ－Ｒ）に従ってリスクスコアに分類されたＭＤＳの処置における使用のためのタスキニモドである。

本明細書において別段の指定がない限り、ＭＤＳは、上記の改定国際予後判定システム（ＩＰＳＳ－Ｒ）の使用により決定して、上記の特定されたリスクカテゴリーのいずれかの範囲内であり得る。

いくつかの実施形態において、ＭＤＳは、非常に低い（１．５以下のリスクスコアを有する）、低い（１．５より高く、３以下のリスクスコアを有する）、または中程度（３より高く、４．５以下のリスクスコアを有する）と定義されるリスクカテゴリーに属する。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＭＤＳは、低いまたは中程度、例えば中程度と定義されるリスクカテゴリーに属する。いくつかの別の実施形態において、ＭＤＳは、非常に低いまたは低い、例えば低いと定義されるリスクカテゴリーに属する。さらに別の実施形態において、ＭＤＳは、非常に低いと定義されるリスクカテゴリーに属する。

いくつかの別の実施形態において、ＭＤＳは、中程度、高い（４．５より高く、６以下のリスクスコアを有する）または非常に高い（６より高いリスクスコアを有する）と定義されるリスクカテゴリーに属する。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＭＤＳは、中程度または高い、例えば高いと定義されるリスクカテゴリーに属する。いくつかの別の実施形態において、ＭＤＳは、高いまたは非常に高い、例えば非常に高いと定義されるリスクカテゴリーに属する。

貧血は、ＭＤＳ患者、特により低いリスクのＭＤＳ（例えば、非常に低いリスク、低いリスク、または中程度のリスクのＭＤＳ）患者における病的状態および生活の質障害の、主要ではないにしろ重要な原因である。したがって、いくつかの実施形態において、タスキニモドは、より低いリスクのＭＤＳ患者における貧血の処置において使用される。いくつかの実施形態において、タスキニモドは、ＭＤＳと関連した貧血の処置において使用される。いくつかの実施形態において、タスキニモドは、貧血をその症状として伴うＭＤＳの処置において使用される。いくつかの実施形態において、貧血は、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、芽球増加を伴う不応性貧血、移行期の芽球増加を伴う不応性貧血および慢性骨髄単球性白血病から選択される。いくつかの実施形態において、貧血は不応性貧血である。いくつかの実施形態において、貧血は、環状鉄芽球を伴う不応性貧血である。いくつかの実施形態において、貧血は、芽球増加を伴う不応性貧血である。いくつかの実施形態において、貧血は、移行期の芽球増加を伴う不応性貧血および慢性骨髄単球性白血病である。

いくつかの実施形態において、タスキニモドは、ヘモグロビン数、好中球絶対数、血小板数、骨髄芽球（％）、および細胞遺伝学的異常から選択される少なくとも１つの臨床パラメータが決定された患者におけるＭＤＳの処置における使用のためのタスキニモドである。

例えば、いくつかの実施形態において、ＭＤＳは、表１に定義するように、「非常に良好」と呼ばれる細胞遺伝学的予後サブグループに属する。いくつかの他の実施形態において、ＭＤＳは、表１に定義するように、「良好」と呼ばれる細胞遺伝学的予後サブグループに属する。さらに他の実施形態において、ＭＤＳは、表１に定義するように、「中程度」と呼ばれる細胞遺伝学的予後サブグループに属する。さらに他の実施形態において、ＭＤＳは、表１に定義するように、「不十分」と呼ばれる細胞遺伝学的予後サブグループに属する。さらに他の実施形態において、ＭＤＳは、表１に定義するように、「非常に不十分」と呼ばれる細胞遺伝学的予後サブグループに属する。

いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、２％未満のＢＭ芽球を有する。いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、２％以上で、５％未満のＢＭ芽球を有する。いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、５％以上で、１０％未満のＢＭ芽球を有する。いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、１０％より高いＢＭ芽球を有する。

いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、１０ｇ／ｄｌ以上のヘモグロビンレベルを有する。いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、８ｇ／ｄｌ以上で、１０ｇ／ｄｌ未満のヘモグロビンレベルを有する。いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、８ｇ／ｄｌ未満のヘモグロビンレベルを有する。

いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、１００×１０^９／Ｌ以上の血小板数を有する。いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、５０×１０^９／Ｌ以上で、１００×１０^９／Ｌ未満の血小板数を有する。いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、５０×１０^９／Ｌ未満の血小板数を有する。

いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、０．８×１０^９／Ｌ以上の好中球絶対数を有する。いくつかの実施形態において、ＭＤＳ患者は、０．８×１０^９／Ｌ未満の好中球絶対数を有する。

いくつかの実施形態において、タスキニモドは、ＭＤＳに苦しむかまたはＭＤＳを発症するリスクがある哺乳類（例えば、ＭＤＳ哺乳類患者）において１つまたは複数の血液学的パラメータを改善するステップを含む処置方法における使用のために提供される。血液学的パラメータのそのような改善は、筋芽細胞の減少、ヘモグロビンの増加、血小板の増加、好中球の増加、ヘプシジンの減少、赤血球輸血単位数の低減、輸血頻度の低減、および輸血依存度の低減から選択することができる。

本明細書の以上に記載したように、タスキニモド、その薬学的に許容される塩、その重水素化形、その結晶塩、および化合物とそれらの塩を含有する医薬組成物、ならびにそのような化合物、それらの塩、重水素化形、および化合物とそれらの塩を含有する医薬組成物を調製する方法が、ＷＯ ９９／５５６７８、ＷＯ ００／０３９９１、ＷＯ ０３／１０６４２４、ＷＯ ２００５／０７４８９９、ＷＯ ２０１２／００４３３８およびＷＯ ２０１２／１７５５４１（上記参照）に記載され、これらの文献は、本明細書によってそれらの全体として参照により本出願に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、タスキニモドへの言及はいずれも、その重水素化形も包含する。本明細書の以上に述べたように、タスキニモドの重水素化形およびそのような形態を調製する方法は、ＷＯ ２０１２／１７５５４１に記載されている。したがって、いくつかの実施形態において、タスキニモドは、カルボキサミド－Ｎメチル基における重水素濃縮が少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％である。

いくつかの実施形態において、タスキニモドは、非重水素化され、重水素の天然存在度に対応する重水素含有量を有する。

本発明は、ＭＤＳの処置における使用のための薬学的に許容される賦形剤、例えば担体と任意選択で一緒に医薬組成物として製剤化された、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩を含む。

いくつかの実施形態において、タスキニモドの薬学的に許容される塩の使用が行われる。

医薬組成物は、哺乳類（特にヒト）への経腸投与、例えば直腸内もしくは経口投与、または非経口投与に適している可能性があり、活性成分として治療有効量のタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩を、任意選択で薬学的に許容される賦形剤、例えば薬学的に許容される担体と一緒に含む。活性成分の治療有効量は、本明細書の以上に定義され、例えば哺乳類の種、体重、年齢、個体の病態、個体の薬物動態データ、および投与様式に依存する。

経腸投与、例えば経口投与の場合、タスキニモドは、多種多様な剤形で製剤化され得る。薬学的に許容される担体は、固体でも、液体でもよい。固体形態の調製剤としては、散剤、錠剤、丸剤、ロゼンジ剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒剤が挙げられる。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料としても作用し得る１種または複数の物質とすることができる。散剤において、担体は、一般に微細活性成分との混合物である微細固体である。錠剤において、活性成分は、一般に必要な結合容量を有する担体と好適な割合で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。好適な担体としては、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバターなどが挙げられるが、これらに限定されない。

経口投与に適した他の形態としては、乳濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、水性液剤、水性懸濁剤を含めて液体形態の調製剤、または使用直前に液体形態の調製剤に変換されるよう意図されている固体形態の調製剤が挙げられる。乳濁剤は、溶液として、例えば水性プロピレングリコール溶液として調製されてもよく、または乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレエート、もしくはアカシアなどを含んでもよい。水性液剤は、活性成分を水に溶解し、好適な着色料、香味料、安定剤、および粘稠化剤を添加することによって調製され得る。水性懸濁剤は、微細活性成分を水に粘性材料、例えば天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および他の周知の懸濁化剤と共に分散することによって調製され得る。固体形態の調製剤としては、液剤、懸濁剤、および乳濁剤が挙げられ、活性成分に加えて、着色料、香味料、安定剤、緩衝剤、人工および天然甘味料、分散剤、粘稠化剤、可溶化剤などを含むことができる。

直腸内投与のための例示的組成物としては、例えば好適な非刺激性賦形剤、例えばカカオバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールを含むことができる坐剤が挙げられ、それらは、常温で固体であるが、直腸腔で液化および／または溶解して、薬物を放出する。

タスキニモドは、例えば注射または点滴によって、例えば静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内、頭蓋内、腫瘍内、皮内および皮下注射または点滴によって非経口投与されることもある。したがって、非経口投与では、医薬組成物は、例えば無菌水性または油性懸濁剤として、無菌注射または点滴調製剤の形をとることができる。この懸濁剤は、当技術分野において公知の技法に従って、好適な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０）、および懸濁化剤を使用して製剤化され得る。無菌注射または点滴調製剤は、非毒性の非経口投与に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射または点滴液剤または懸濁剤とすることもできる。例えば、医薬組成物は、１，３－ブタンジオール中の液剤とすることができる。本発明の組成物において採用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒の他の例としては、マンニトール、水、リンゲル液および等張食塩水が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、無菌不揮発油が溶媒または懸濁化媒体として通常採用されている。このために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めて任意の無刺激性不揮発油が採用され得る。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、注射剤の調製において、オリーブ油またはヒマシ油など薬学的に許容される天然油が、特にそれらのポリオキシエチル化された形で有用であるように有用である。これらの油液剤または懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤も含むことができる。

非経口使用のための液剤は、好適な安定化剤、必要なら緩衝物質も含むことができる。好適な安定化剤としては、抗酸化剤、例えば重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸の単独または組合せ、クエン酸およびその塩、ならびにＥＤＴＡナトリウムが挙げられる。非経口液剤は、保存剤、例えば塩化ベンザルコニウム、メチル－またはプロピル－パラベン、およびクロロブタノールも含むことができる。

好適な医薬品剤形の選択および調製の通常の手順については、例えば「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ － Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｍ．Ｂ． Ａｕｌｔｏｎ， Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ社、第２版、２００２ （ＩＳＢＮ ０４４３０５５１７３， ９７８０４４３０５５１７１）に記載されている。好適な医薬賦形剤、例えば担体、および医薬品剤形を調製する方法については、製剤の技術分野における標準の参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ社にも記載されている。

医薬組成物（本明細書で医薬品剤形または医薬品とも呼ばれることがある）は、治療有効量のタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩を含み、例えば約１％～約９５％、好ましくは約２０％～約９０％のタスキニモドまたはその塩を少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤と一緒に含むことができる。一般に、タスキニモドまたはその塩は、治療有効量が同様の有用性に役立つ作用剤の許容された投与様式のいずれかによって投与される。

例えば、タスキニモドまたはその塩の注射または直腸内投与は必要なら企図されることがあるが、経口投与は、一般に最も好都合であると考えられる。

投与量レベルおよび頻度は、一般に処置対象の性別、年齢、体重および相対的健康、ＭＤＳの重症度、選択された投与経路および形態、他の薬物の、例えば組合せ療法における追加的使用などの因子に当然払うべき配慮をして、処置医によって決定される通りである。

一般に、最低限０．００１ｍｇ／体重１ｋｇ、または０．００２ｍｇ／体重１ｋｇ、または０．００５ｍｇ／体重１ｋｇ、または０．０１ｍｇ／体重１ｋｇから、最大０．２ｍｇ／体重１ｋｇ、または０．１ｍｇ／体重１ｋｇ、または０．０５ｍｇ／体重１ｋｇ、または０．０２ｍｇ／体重１ｋｇの１日投与量が企図される。

一実施形態において、タスキニモドは、０．０５～０．１５ｍｇ／日、または０．０８～０．１ｍｇ／日、例えば０．１ｍｇ／日の量で投与される。

一実施形態において、タスキニモドは、０．１～０．３ｍｇ／日、または０．１５～０．２５ｍｇ／日、例えば０．２ｍｇ／日の量で投与される。

一実施形態において、タスキニモドは、０．１～１ｍｇ／日、または０．２～０．８ｍｇ／日、例えば０．５ｍｇ／日の量で投与される。

一実施形態において、タスキニモドは、０．２～１．５ｍｇ／日、または０．４～１．２ｍｇ／日、例えば０．８ｍｇ／日の量で投与される。

一実施形態において、タスキニモドは、０．５～２ｍｇ／日、または０．８～１．２ｍｇ／日、例えば１ｍｇ／日の量で投与される。

一実施形態において、タスキニモドは、０．８～３ｍｇ／日、または１～２．５ｍｇ／日、例えば２ｍｇ／日の量で投与される。

一実施形態において、タスキニモドは、１～６ｍｇ／日、または２～４ｍｇ／日、例えば３ｍｇ／日の量で投与される。

いくつかの実施形態において、投与量は、最適な結果に達するように徐々に調整され、いわゆる漸増され得る。例えば、投与量漸増は、低い１日投与量、例えば０．２５ｍｇで開始し、この用量レベルを１週間または２週間維持することを含むことができる。用量の上昇を禁忌とする可能性がある著しい副作用に直面しない場合、レベルを、例えば０．５ｍｇ／日に１週間または２週間増加させることができ、その期間後に、１ｍｇの１日投与量などに達するようにもう１回増加が企図され得る。そのような方法では、投与量の漸進的な増加後にいずれか著しい副作用が生じる場合、投与量は、再び以前のレベルに低減され得る。

生じる可能性がある副作用としては、一般にこのタイプの処置において遭遇することがある副作用、例えば胃腸障害、疲労、およびインフルエンザ様症候群が挙げられ、投与量に関連があると考えられる。

タスキニモドは、好ましくは毎日、例えば１日１～３回、または１日１～２回、例えば１日１回投与される。いくつかの実施形態において、薬物は、低い頻繁で、例えば２日ごとに、週１回などで投与される。タスキニモドの薬学的に許容される塩が投与される場合、等価投与量は、指示投与量の非塩の形の化合物を生じる投与量であることにも留意すべきである。

最も広義の意味で、本発明は、ＭＤＳの処置における使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩に関する。いくつかの実施形態において、ＭＤＳは、本明細書の以上に述べたサブタイプのいずれからでも選択される。

生物学的アッセイ
材料と方法
患者
ヘパリン化ＢＭ試料は、標準診断的吸引時に無処置ＭＤＳ患者（低いリスクのＭＤＳ、５ｑの欠失を伴う、低いリスクのＭＤＳ、高いリスクのＭＤＳ、およびＣＭＭＬ）から、および人工股関節置換手術を受ける血液学的健常ドナーから得た。Ｈｕｍａｎ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を製造業者の指示書に従って使用して、試料をＳ１００Ａ９のレベルについて分析した。

細胞培養
ＢＭ単核細胞をパーコール勾配遠心分離により単離し、ＭＳＣを、ＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中で接着単層として成長させた。継代２～５代を実験に使用した。

炎症性病態を模倣するために、インビトロ培養ＭＳＣを、タスキニモド（１０μＭ）の存在下または非存在下に組換えＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９もしくはＳ１００Ａ８／９ヘテロダイマー（それぞれ１．５μｇ／ｍｌ）またはＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍｌ）で、その後の実験に応じて異なる時間処置した。ＣＤ３４抗体－コンジュゲート磁気ビーズを製造業者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）に従って使用して、共培養のための造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）を単離し、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３－ＬおよびＩＬ－３（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＣｅｌｌＧｒｏ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社）に添加した。

末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール－ハイパック密度遠心法によって調製した。

クローン形成アッセイ
前処置した健常またはＭＤＳ ＭＳＣ層を使用して、ＣＡＦ－Ｃアッセイを４週間にわたって行った。１０００個の磁気分離ＣＤ３４＋細胞を、ＳｔｅｍＭＡＣＳ（商標） ＨＳＣ－ＣＦＵ完全培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）に添加した。

３００個の細胞を組換えサイトカインを含む強化メチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標） Ｈ４４３５、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に播種して、１週間共培養した後に採取した細胞を使用して、ＣＦＵアッセイを実施した。コロニーを２週間後に計数し、顕微鏡下でまたはＳＴＥＭｖｉｓｉｏｎ（商標）システム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて分類した。

ＭＳＣ分化アッセイ
脂肪生成および骨形成分化能は、ＭＳＣの重要な機能的特徴であり、ＭＤＳにおいて変化することが多く、骨代謝の変化につながる。したがって、タスキニモドの脂肪生成および骨形成分化に対する効果を、以下の通りアッセイした。

ＭＳＣを６ウェルのプレート（５×１０^３ＭＳＣｓ／ｃｍ^２）に播種し、ＤＭＥＭ中でサブコンフルエントになるまで約４日間培養し、脂肪生成（０．５ｍＭ １－メチル－３－ブチルイソキサンチン、１μＭ デキサメタゾン、１００μＭ インドメタシン、１０μＭ インスリン）分化または骨形成（０．１μＭ デキサメタゾン、０．２ｍＭ アスコルベート－２－ホスフェート、１０ｍＭ β－グリセロホスフェート）分化にかけた。脂質生成を、２１日後にオイルレッドＯ染色によって評価した。分化を鏡検分析に従って以下の通り段階分けした。０＝分化せず；１＝培養ウェルの２５％は分化細胞を含む；２＝培養ウェルの５０％は分化細胞を含む；３＝培養ウェルの７５％は分化細胞を含む；４＝培養ウェルの１００％は分化細胞を含む。骨形成をフォンコッサ染色によって決定し、ＡＬＰの触媒活性を決定した。

活性酸素種（ＲＯＳ）レベルの検出
骨髄異形成骨髄の炎症性微小環境は、ＲＯＳレベルの増加につながり、それによって異常な細胞機能が生じることがある。したがって、タスキニモドのＭＳＣにおけるＲＯＳレベルに対する効果は、ＣｅｌｌＲＯＸ（商標） Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｓｓａｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を製造業者の指示書に従って使用してアッセイされる。

Ｓｅａｈｏｒｓｅメタボリック細胞外フラックスプロフィリング
タスキニモドの細胞代謝への影響は、Ｓｅａｈｏｒｓｅシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用することによって調査される。ＭＳＣは、Ｓｅａｈｏｒｓｅ９６ウェルプレートに播種される。細胞ミトストレステスト（ＸＦ Ｃｅｌｌ Ｍｉｔｏ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が、標準プロトコルに従って行われる。酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、オリゴマイシン（１ｍＭ）、カルボニルシアニド－ｐ－トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ、０．５ｍＭ）、およびロテノンとアンチマイシンの組合せ（Ｒｏｔ／ＡＡ、０．５ｍＭ）の注入後に検出される。ＯＣＲは、ＸＦ９６分析装置およびＷａｖｅソフトウェア（バージョン２．２．０）を用いて測定される。

ウェスタンブロット
プロテイナーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ溶解バッファーを使用して、ホールセル可溶化物を調製した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して決定した。等タンパク質量を、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、それぞれポリビニリデンフルオリドメンブレンに移し、ＩＲＡＫ１、ＮＦ－κＢ－ｐ６５、ガスダーミンに対する一次抗体、およびＯＸＰＨＯＳを４℃で終夜使用し、続いて二次抗体ＨＲＰ－コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはロバ抗ウサギＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して、特異的タンパク質を検出した。ブロットをＥＣＬ Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）と共にインキュベートし、ＬＡＳ３０００イメージングシステムを使用して、シグナルを取得した。

ＲＴ－ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、ＲＮＡをＭＳＣから単離し、オリゴ－ｄＴプライマーを含むＲｅｖｅｒｔＡｉｄ（商標） ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。比較ＣＴ（ΔΔＣＴ）法を用いて、相対標的量を決定した。ＲＴ－ＰＣＲは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ／ＲＯＸ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ社）ならびにハウスキーピング遺伝子としてのカスパーゼ１、ＩＬ１β、ＩＬ１８、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１およびＧＡＰＤＨの標的特異的プライマーを使用して、Ｔａｑｍａｎ（商標） Ｆａｓｔ ３５００サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で行った。増幅産物を内因性ＧＡＰＤＨ対照に正規化した。

免疫組織化学
ＭＤＳ患者および健常ドナーの骨髄組織を、マルチプレックス免疫組織化学によって特徴づけた。この方法では、ＣＤ２７１＋ＭＳＣ、ＣＤ６８＋マクロファージおよびＣＤ６６ｂ＋好中球の配列および空間分布を１種の染色で決定し、ＶＥＣＴＲＡ（登録商標）イメージングシステムを用いて分析した。

免疫蛍光染色および共焦点レーザー走査顕微鏡
Ｓ１００Ａ９／タスキニモド処置ＭＳＣを４％パラホルムアルデヒドで固定した。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ－１００（Ｔ－ＰＢＳ）を含有するＰＢＳを使用して、細胞を透過処理し、１０％ ＦＣＳおよび１％ ＨＳＡを含むＴ－ＰＢＳ（ＩＦ－Ｂｕｆｆｅｒ）でブロックし、αＳＭＡ、ＮＦκＢまたはＰＤ－Ｌ１に対する抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。二次抗体ポリクローナルヒツジ－抗ウサギ－Ｃｙ３またはポリクローナルヤギ－抗マウス－Ｃｙ２を、室温で１時間インキュベートした。細胞核をＤＡＰＩで対比染色した。画像分析を、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ８００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）およびＺＥＮソフトウェアによって行った。

細胞外小胞（ＥＶ）のタスキニモド処置ＭＳＣからの単離および特徴づけ
ＥＶは、細胞間コミュニケーションにとって重要な役割を果たす。これらの膜に囲まれた小粒子は、さまざまな生物活性物質、例えばスモールＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびタンパク質を運ぶ。それらは、エンドソームコンパートメントに由来するか、または細胞膜から直接出芽する。Ｓ１００Ａ９およびタスキニモドのＭＳＣ由来ＥＶに対する影響を試験するために、それらは、ＥｘｏＥａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用することによって無血清培養上清から単離される。ＥＶの濃度およびサイズは、ＺｅｔａＶｉｅｗ（登録商標）機器を使用してナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）により検出される。ｍｉＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）によって単離し、例えばｍｉＲ－１４５およびｍｉＲ－１４６ａのために、特異的プライマーを用いて、Ｔａｑｍａｎアッセイを行う。Ｓ１００Ａ９／タスキニモドでプライミングしたＭＳＣ由来ＥＶの機能的影響は、ＰＢＭＣまたはＨＳＰＣとのインキュベーションおよびその後のフローサイトメトリーにより分析される。

結果
ＭＤＳ患者のＢＭ血漿において、健常対照と比べて高いＳ１００Ａ９レベルが検出され、最高レベルが低い－リスクＭＤＳにおいて測定された（図１）。

インビトロで、関連するＳ１００Ａ９ ｍＲＮＡ発現を、培養されたＭＤＳまたは健常ＭＳＣにおいて検出することはできなかった。それは、この細胞型が、骨髄微小環境における主なＳ１００Ａ９源を表していないことを示唆する。むしろ、ＢＭ組織の染色が、主にＣＤ６６ｂ＋好中球によるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の発現を示し、ＣＤ６８＋マクロファージによる、より小さい範囲の発現が認められた。

ＭＤＳ ＭＳＣのＳ１００Ａ９での処置は、ＩＲＡＫ１およびＮＦ－κＢ－ｐ６５の発現増加によって明らかなようにＴＬＲ４下流のシグナル伝達を誘導した。その上に、ガスダーミンのより高い発現が検出された。ガスダーミンは、Ｓ１００Ａ９処置細胞におけるピロトーシスの誘導原である。タスキニモドの添加により、記載のタンパク質の発現が阻害された。これは、誘導された炎症の軽減を示す（図２）。

炎症性サイトカイン、例えばＩＬ－１βやＩＬ－１８、およびそれらの活性化因子カスパーゼ１のｍＲＮＡ発現によって、Ｓ１００Ａ９での処置後にＭＳＣが増加し、この増加は、タスキニモドの存在下で阻害された（図３）。

ＭＤＳにおいて効率的な造血を阻害する可能性を有する潜在的下流標的としてＰＤ－Ｌ１は、Ｓ１００Ａ９によって誘導され、ｍＲＮＡとタンパク質レベルの両方でタスキニモドによって抑制され得る。ＰＤ－Ｌ１の基本的発現は、健常なＭＳＣにおいてよりＣＭＭＬにおいて明らかに高いと認められた（図４）。驚くべきことに、ＰＤ－Ｌ１の下方制御が、タスキニモドの場合にＳ１００Ａ９の非存在下でさえ、健常志願者からのＭＳＣにおいてもＣＭＭＬ ＭＤＳ患者からのＭＳＣにおいても同様に認められた。これも、以前にタスキニモドがＰＤ－Ｌ１の発現を上方制御すると報告されていたので驚きである（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１６、５巻、６号、ｅ１１４５３３３）。

Ｓ１００Ａ９処置は、ＭＳＣにおけるαＳＭＡの発現を増加させた。これは、腫瘍微小環境中に存在する筋線維芽細胞へのＭＳＣの分化にとって典型的である。同時に、ＮＦ－κＢの核発現の増加が観察された。タスキニモド処置は、αＳＭＡとＮＦ－κＢ発現の両方を低減する。

脂肪生成分化は、ＭＤＳ ＭＳＣにおいて病理学的に増加することが多い。タスキニモドの添加は、分化培地中で１４日培養した後、オイルレッドＯ陽性細胞で検出して、脂肪細胞の数を２５～５０％減少させた。

ＴＮＦ－αのＭＳＣ培養物への添加により、ＩＲＡＫ１、ＮＦ－κＢ－ｐ６５およびガスダーミンの発現が増加した。また、タスキニモドの添加は、これらのタンパク質の発現を阻害した（図５）。これも、ＭＳＣにおけるタスキニモドの効果をＳ１００Ａ９と関係づけることができないことを示す。

インフラマソーム活性化によって誘導されるＭＳＣの機能的変更は、ＭＤＳ進行に著しい影響を与えるので、ストローマ細胞のタスキニモド処置が正常な造血のその後の支持を変更する可能性を調査した。この目的のために、ストローマ層をＳ１００Ａ９とタスキニモドの組合せで前処置した、ＭＳＣ／ＨＳＰＣインビトロ共培養物を使用した。明らかに、Ｓ１００Ａ９での処置は、その後のクローン形成アッセイにおいてＣＡＦ－Ｃの数およびＣＦＵの数を減少させた。これは、ＭＳＣによる造血の支持の妨害を示す。ＣＡＦ－ＣとＣＦＵの両方の数を、タスキニモドによって増加させ得る（図６ａ～ｃ）。

共培養ＨＳＰＣにおけるＰＤ－１（ＰＤ－Ｌ１の受容体）発現を、処置ＭＳＣにおけるそのリガンドと同様に制御した。

上記の知見から、骨髄異形成骨髄における病理学的炎症活性化は、タスキニモドによって、ＮＦ－κＢ－ｐ６５シグナル伝達の阻害およびＭＳＣにおけるＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１発現によって救出することができると思われる。これらの効果によって、ＭＳＣによる造血支持が改善され、それによってＭＤＳ患者における貧血および血球減少が改善される。

最後に、ＭＳＣ分化アッセイの結果から、タスキニモドは、脂肪生成分化を低減し、骨形成分化を改善することができることが示される。ＣｅｌｌＲＯＸ（商標） Ｄｅｅｐ Ｒｅｄフローサイトメトリーアッセイの結果から、タスキニモドは、ＭＳＣにおけるＲＯＳレベルの上昇をブロックすることができることが示される。Ｓｅａｈｏｒｓｅメタボリック細胞外フラックスプロファイリングの結果から、タスキニモドの効果は、細胞ストレスの低減および細胞の代謝適合性の読み取りである予備呼吸能の改善につながることが示される。

インビトロ結果のインビボ検証
有望なインビトロ結果は、異なるマウスモデルにおいてインビボで検証される。これらのモデルでは、ＭＤＳの典型的な症状、例えば貧血や血球減少を発症する遺伝子修飾マウス（例えば、Ｂ６；１２９－Ｔｒｐ５３ｂｐ１^{ｔｍ１Ｊｃ}／ＪおよびＮＵＰ９８／ＨＯＸＤ１３）を、タスキニモドで処置する。末梢血数を毎週記録し、最後に骨髄を２０週間後に分析する。これらの実験から、タスキニモドは、機能性造血を部分回復させることができることが示される。

さらに、上記のように前処置したＭＳＣと共培養したＨＳＰＣを免疫不全ＮＳＧマウスに移植して、タスキニモド前処置共培養物に由来する細胞の可能性のある改善された生着を分析する。レシピエントの末梢血を、後眼窩静脈叢の静脈穿刺によって３～４週間ごとに得て、ヒトＣＤ４５およびＣＤ３４に対する抗体で染色した後フローサイトメトリーにより、ヒト細胞の量を分析する。最終の骨髄分析を２０週間後に行う。

Claims (46)

1. 哺乳類患者における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の処置における使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
2. 処置が、経口投与による処置である、請求項１に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
3. 処置が、１日当たり０．００１ｍｇ～０．２ｍｇの量のタスキニモド／体重１ｋｇ、または対応する量のその薬学的に許容される塩の投与による処置である、請求項１または２に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
4. 処置が、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩の１日１～３回の投与による処置である、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
5. タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩が、固体剤形として投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
6. 固体剤形が、カプセル剤、錠剤または丸剤である、請求項５に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
7. タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩が、液体ビヒクルに溶解または懸濁した形で投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
8. 処置が、放射線療法および／または自家幹細胞移植をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
9. ＭＤＳが、一系統（単一系統）に異形成を有するＭＤＳ、多系統に異形成を有するＭＤＳ、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）、（５ｑ）の単独欠失を伴うＭＤＳなど単独欠失を染色体異常とするＭＤＳ、芽球増加を伴うＭＤＳ、および分類不能型ＭＤＳから選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
10. ＭＤＳが、一系統（単一系統）に異形成を有するＭＤＳである、請求項９に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
11. ＭＤＳが、多系統に異形成を有するＭＤＳである、請求項９に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
12. ＭＤＳが、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）である、請求項９に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
13. ＭＤＳが、単独欠失を染色体異常とするＭＤＳである、請求項９に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
14. ＭＤＳが、芽球増加を伴うＭＤＳである、請求項９に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
15. ＭＤＳが、分類不能型ＭＤＳである、請求項９に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
16. ＭＤＳが、非常に低いリスクのＭＤＳ、低いリスクのＭＤＳ、中程度のリスクのＭＤＳ、高いリスクのＭＤＳまたは非常に高いリスクのＭＤＳである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
17. ＭＤＳが、非常に低いリスクのＭＤＳである、請求項１６に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
18. ＭＤＳが、低いリスクのＭＤＳである、請求項１６に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
19. ＭＤＳが、中程度のリスクのＭＤＳである、請求項１６に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
20. ＭＤＳが、高いリスクのＭＤＳである、請求項１６に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
21. ＭＤＳが、非常に高いリスクのＭＤＳである、請求項１６に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
22. ＭＤＳが、慢性骨髄単球性白血病を含む、請求項１に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
23. 哺乳類患者における１つまたは複数の血液学的パラメータを改善するための、請求項１～２２のいずれか一項に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩であって、改善が、筋芽細胞の減少、ヘモグロビンの増加、血小板の増加、好中球の増加、ヘプシジンの減少、赤血球輸血単位数の低減、輸血頻度の低減、および／または輸血依存度の低減を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の使用のためのタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩。
24. 骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の処置のための医薬品を製造するための、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩の使用。
25. 医薬品が、経口投与に適している、請求項２４に記載の使用。
26. 医薬品が、１日当たり０．００１ｍｇ～０．２ｍｇの量のタスキニモド／体重１ｋｇ、または対応する量のその薬学的に許容される塩の投与に適している、請求項２４または２５に記載の使用。
27. 医薬品が、１日１～３回の投与に適している、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の使用。
28. 医薬品が固体剤形である、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の使用。
29. 固体剤形が、カプセル剤、錠剤または丸剤である、請求項２８に記載の使用。
30. 医薬品が、液体ビヒクルに溶解または懸濁させたタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩を含有する、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の使用。
31. ＭＤＳが、一系統（単一系統）に異形成を有するＭＤＳ、多系統に異形成を有するＭＤＳ、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）、（５ｑ）の単独欠失を伴うＭＤＳなど単独欠失を染色体異常とするＭＤＳ、芽球増加を伴うＭＤＳ、および分類不能型ＭＤＳから選択される、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の使用。
32. ＭＤＳが、非常に低いリスクのＭＤＳ、低いリスクのＭＤＳ、中程度のリスクのＭＤＳ、高いリスクのＭＤＳまたは非常に高いリスクのＭＤＳである、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の使用。
33. ＭＤＳが、慢性骨髄単球性白血病を含む、請求項２４に記載の使用。
34. 医薬品が、哺乳類患者における１つまたは複数の血液学的パラメータを改善するための医薬品であり、改善が、筋芽細胞の減少、ヘモグロビンの増加、血小板の増加、好中球の増加、ヘプシジンの減少、赤血球輸血単位数の低減、輸血頻度の低減、および／または輸血依存度の低減を含む、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の使用。
35. 骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の処置を必要とする哺乳類における骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の処置方法であって、治療有効量のタスキニモドまたはその薬学的に許容される塩の哺乳類への投与による処置である、方法。
36. 処置が、経口投与による処置である、請求項３５に記載の方法。
37. 処置が、１日当たり０．００１ｍｇ～０．２ｍｇの量のタスキニモド／体重１ｋｇ、または対応する量のその薬学的に許容される塩の投与による処置である、請求項３５または３６に記載の方法。
38. 処置が、タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩の１日１～３回の投与による処置である、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩が、固体剤形として投与される、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 固体剤形が、カプセル剤、錠剤または丸剤である、請求項３９に記載の方法。
41. タスキニモドまたはその薬学的に許容される塩が、液体ビヒクルに溶解または懸濁した形で投与される、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
42. 処置が、放射線療法および／または自家幹細胞移植をさらに含む、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. ＭＤＳが、一系統（単一系統）に異形成を有するＭＤＳ、多系統に異形成を有するＭＤＳ、環状鉄芽球を伴うＭＤＳ（ＭＤＳ－ＲＳ）、（５ｑ）の単独欠失を伴うＭＤＳなど単独欠失を染色体異常とするＭＤＳ、芽球増加を伴うＭＤＳ、および分類不能型ＭＤＳから選択される、請求項３５～４２のいずれか一項に記載の方法。
44. ＭＤＳが、非常に低いリスクのＭＤＳ、低いリスクのＭＤＳ、中程度のリスクのＭＤＳ、高いリスクのＭＤＳまたは非常に高いリスクのＭＤＳである、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. ＭＤＳが、慢性骨髄単球性白血病を含む、請求項３５に記載の方法。
46. 哺乳類患者における１つまたは複数の血液学的パラメータを改善するための、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法であって、改善が、筋芽細胞の減少、ヘモグロビンの増加、血小板の増加、好中球の増加、ヘプシジンの減少、赤血球輸血単位数の低減、輸血頻度の低減、および／または輸血依存度の低減を含む、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法。