JP2024503002A - 皮質興奮性ニューロンの生成方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、皮質興奮性ニューロンを生成するための方法、そのような方法によって生成された皮質興奮性ニューロン、及びそのような細胞を含む組成物を提供する。具体的に、本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞を、少なくとも１つのスモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の阻害剤、少なくとも１つのウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の阻害剤、及び少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得ることであって、分化細胞の少なくとも約５０％が、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する、ことを含む、方法を提供する。本開示はまた、神経変性障害を予防及び／又は治療するための皮質興奮性ニューロン及びそれを含む組成物の使用を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月７日に出願された米国仮出願第６３／１３４，６５１号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、これに対して優先権が主張される。

１．序論
本開示は、皮質興奮性ニューロンを生成するための方法、そのような方法によって生成された皮質興奮性ニューロン、及びそのような皮質興奮性ニューロンを含む組成物を提供する。本開示はまた、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害を予防及び／又は治療するための皮質興奮性ニューロン及びそれを含む組成物の使用を提供する。

２．背景
以前は、胚性幹細胞及び体性幹細胞は、神経変性疾患、神経発達障害、及び／又は精神神経障害の治療薬及びモデル系として使用されていた。胚性幹細胞及び体性幹細胞の指向性分化に関する研究及び技術開発が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、統合失調症、自閉症、うつ病、知的障害、筋萎縮性側索硬化症及び脳卒中等の中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患の分野で行われている。しかしながら、これらの研究の結果は、ニューロン機能を回復させるｉｎ ｖｉｖｏ能力をほとんど示さず、患者において望ましくない腫瘍の成長をしばしばもたらした。

したがって、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害を治療するのに適した皮質ニューロンを生成するための改善された方法が依然として必要とされている。

３．発明の概要
本開示は、皮質興奮性ニューロンを生成するための方法、そのような方法によって生成された皮質興奮性ニューロン、及びそのような細胞を含む組成物を提供する。本開示はまた、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害を予防及び／又は治療するための皮質興奮性ニューロン及びそれを含む組成物の使用を提供する。

特定の実施形態では、本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞を、少なくとも１つのスモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の阻害剤、及び少なくとも１つのウィングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）（Ｗｎｔ）シグナル伝達の阻害剤と接触させることと、細胞を、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得ることとを含み、分化細胞の少なくとも約５０％が、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現し、細胞と少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤との最初の接触が、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日間である、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を含む、方法を提供する。特定の実施形態では、分化細胞の少なくとも約７５％が、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する。特定の実施形態では、分化細胞の少なくとも約９５％が、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する。

特定の実施形態では、細胞は、細胞と少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤との最初の接触が、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との最初の接触から約２０日間である。

特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約１日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、最大約２０日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、約１０日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、約１０日間、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

特定の実施形態では、細胞を、最大約３日間、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤と接触させる。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤は、γ－セクレターゼ阻害剤を含む。

特定の実施形態では、γ－セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴ、その誘導体、又はそれらの混合物を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル（Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ）シグナル伝達の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤、及びそれらの組み合わせから選択される。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、ＡＬＫ５の阻害剤を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２若しくはその誘導体、又はその混合物を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、それらの誘導体、又はそれらの混合物を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＢＭＰの阻害剤は、ＬＤＮ－１９３１８９を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤は、ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２、ＤＫＫ１、ＩＷＲ１、ＩＷＰ Ｌ６、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ＪＷ ５５、それらの誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤は、ＸＡＶ９３９を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーは、ＴＢＲ１（Ｔ－Ｂｏｘ Ｂｒａｉｎ １）、ＭＡＰ２（微小管関連タンパク質２）、ＦＯＸＧ１、ＣＴＩＰ２、ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＰ２、ｖＧｌｕｔ１／２、ＴＬＥ４、及びそれらの組み合わせから選択される。

特定の実施形態では、分化細胞は、ＫＩ６７、ＣＴＩＰ２（ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター転写因子相互作用タンパク質２）、ＳＡＴＢ２（特別なＡＴリッチ配列結合タンパク質２）及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない。

特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の非胚性幹細胞；ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の胚性幹細胞；ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の誘導多能性幹細胞；及びヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の組換え多能性細胞から選択される。

特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。

特定の実施形態では、幹細胞は多能性又は多分化能幹細胞である。

特定の実施形態では、幹細胞は多能性幹細胞である。

特定の実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される。

特定の実施形態では、本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団を提供し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、本開示の方法によって得られる。

特定の実施形態では、本開示は、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９５％の細胞が少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団を提供する。

特定の実施形態では、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーは、ＴＢＲ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＦＯＸＧ１、ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＰ２、ｖＧｌｕｔ１／２、ＴＬＥ４、及びそれらの組み合わせから選択される。

特定の実施形態では、分化細胞の約３０％未満が、ＫＩ６７、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのマーカーを発現する。

特定の実施形態では、本開示は、本開示の細胞集団を含む組成物を提供する。

特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る担体を更に含む医薬組成物である。

特定の実施形態では、本開示は、幹細胞の皮質興奮性ニューロンへの分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤と、
（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤と、
（ｃ）少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と、を含む、キットを提供する。

特定の実施形態では、キットは、（ｄ）少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する分化細胞の集団への幹細胞の分化を誘導するための説明書を更に含む。

特定の実施形態では、本開示は、対象において神経変性障害、神経発達障害及び／又は精神神経障害を予防及び／又は治療する方法であって、本明細書に開示される細胞集団又は本明細書に開示される組成物の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。

特定の実施形態では、神経変性障害、又は神経発達障害、及び／又は精神神経障害は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、統合失調症、自閉症、うつ病、知的障害、筋萎縮性側索硬化症、及び脳卒中から選択される。

特定の実施形態では、本開示は、対象における神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害を予防及び／又は治療における使用のための本開示の細胞集団又は本開示の組成物を提供する。

特定の実施形態では、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、統合失調症、自閉症、うつ病、知的障害、筋萎縮性側索硬化症、及び脳卒中から選択される。
４．図面の簡単な説明

図１Ａ～１Ｃは、ｈＰＳＣからの皮質前駆体細胞の堅固な誘導を示す。図１Ａは、本開示の主題の特定の実施形態に従って皮質興奮性ニューロンを生成する方法を示す。図１Ｂは、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析データを示し、これは、終脳皮質マーカーの漸進的かつ堅固な誘導、及び多能性関連遺伝子の効率的な下方制御を示した。図１Ｃは、皮質特異的遺伝子ＦＯＸＧ１及びＰＡＸ６の均一な誘導、並びに腹側終脳マーカーの最小限の混入を示す。 図１Ａ～１Ｃは、ｈＰＳＣからの皮質前駆体細胞の堅固な誘導を示す。図１Ａは、本開示の主題の特定の実施形態に従って皮質興奮性ニューロンを生成する方法を示す。図１Ｂは、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析データを示し、これは、終脳皮質マーカーの漸進的かつ堅固な誘導、及び多能性関連遺伝子の効率的な下方制御を示した。図１Ｃは、皮質特異的遺伝子ＦＯＸＧ１及びＰＡＸ６の均一な誘導、並びに腹側終脳マーカーの最小限の混入を示す。 図１Ａ～１Ｃは、ｈＰＳＣからの皮質前駆体細胞の堅固な誘導を示す。図１Ａは、本開示の主題の特定の実施形態に従って皮質興奮性ニューロンを生成する方法を示す。図１Ｂは、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析データを示し、これは、終脳皮質マーカーの漸進的かつ堅固な誘導、及び多能性関連遺伝子の効率的な下方制御を示した。図１Ｃは、皮質特異的遺伝子ＦＯＸＧ１及びＰＡＸ６の均一な誘導、並びに腹側終脳マーカーの最小限の混入を示す。 図２Ａ～２Ｄは、前駆体細胞の急速な枯渇及び同期した神経発生を示す。図２Ａは、Ｋｉ６７^＋前駆体細胞が急速に枯渇し、ＭＡＰ２^＋ニューロンの純粋な集団が分化の２５日目までに生成されたことを示す。図２Ｂは、ほぼ同齢のニューロンの生成を確認したＥｄＵ発生日決定研究を提供する。図２Ｃは定量を示す。図２Ｄは、同期した神経発生によるＴＢＲ１＋同一性（＞８０％）を有する非常に純粋なニューロン集団の生成を示す。 図２Ａ～２Ｄは、前駆体細胞の急速な枯渇及び同期した神経発生を示す。図２Ａは、Ｋｉ６７^＋前駆体細胞が急速に枯渇し、ＭＡＰ２^＋ニューロンの純粋な集団が分化の２５日目までに生成されたことを示す。図２Ｂは、ほぼ同齢のニューロンの生成を確認したＥｄＵ発生日決定研究を提供する。図２Ｃは定量を示す。図２Ｄは、同期した神経発生によるＴＢＲ１＋同一性（＞８０％）を有する非常に純粋なニューロン集団の生成を示す。 図２Ａ～２Ｄは、前駆体細胞の急速な枯渇及び同期した神経発生を示す。図２Ａは、Ｋｉ６７^＋前駆体細胞が急速に枯渇し、ＭＡＰ２^＋ニューロンの純粋な集団が分化の２５日目までに生成されたことを示す。図２Ｂは、ほぼ同齢のニューロンの生成を確認したＥｄＵ発生日決定研究を提供する。図２Ｃは定量を示す。図２Ｄは、同期した神経発生によるＴＢＲ１＋同一性（＞８０％）を有する非常に純粋なニューロン集団の生成を示す。 図２Ａ～２Ｄは、前駆体細胞の急速な枯渇及び同期した神経発生を示す。図２Ａは、Ｋｉ６７^＋前駆体細胞が急速に枯渇し、ＭＡＰ２^＋ニューロンの純粋な集団が分化の２５日目までに生成されたことを示す。図２Ｂは、ほぼ同齢のニューロンの生成を確認したＥｄＵ発生日決定研究を提供する。図２Ｃは定量を示す。図２Ｄは、同期した神経発生によるＴＢＲ１＋同一性（＞８０％）を有する非常に純粋なニューロン集団の生成を示す。 図３Ａ～３Ｂは、長期培養において高い生存率での同期した純粋なｈＰＳＣ由来の皮質ニューロンの維持を示す。図３Ａは、長期培養におけるｈＰＳＣ由来の皮質ニューロンの代表的な画像を提供する。図３Ｂ及び３Ｃは、長期培養における同期性及び純度条件の維持を確認した、ＫＩ６７／ＭＡＰ２マーカー発現についてのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する。 図３Ａ～３Ｂは、長期培養において高い生存率での同期した純粋なｈＰＳＣ由来の皮質ニューロンの維持を示す。図３Ａは、長期培養におけるｈＰＳＣ由来の皮質ニューロンの代表的な画像を提供する。図３Ｂ及び３Ｃは、長期培養における同期性及び純度条件の維持を確認した、ＫＩ６７／ＭＡＰ２マーカー発現についてのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を提供する。

５．詳細な説明
本開示は、皮質興奮性ニューロンを生成するための方法、そのような方法によって生成された皮質興奮性ニューロン、及びそのような細胞を含む組成物を提供する。本開示はまた、神経変性障害を予防及び／又は治療するための皮質興奮性ニューロン及びそれを含む組成物の使用を提供する。

本開示は、少なくとも、本開示の方法が高純度の同期した皮質興奮性ニューロンの集団を生成したという発見に基づく。更に、生成された皮質興奮性ニューロンは、長期間、高い生存率及び純度でｉｎ ｖｉｖｏで維持することができる。

本開示の主題の非限定的な実施形態は、本明細書及び実施例によって説明される。

限定ではなく、開示を明確にする目的で、詳細な説明は以下の小項目に分割される。

５．１．定義；
５．２．幹細胞を分化させる方法；
５．３．細胞集団及び組成物；
５．４．神経変性障害を治療する方法；及び
５．５．キット

５．１．定義
本明細書で使用される用語は、一般に、本開示の文脈内及び各用語が使用される特定の文脈内で、当技術分野における通常の意味を有する。特定の用語は、以下又は本明細書のいずれかの箇所で考察され、本開示の組成物及び方法並びにそれらの作製及び使用方法を説明する際に実施者に追加のガイダンスを提供する。

「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が、どのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの制限に一部依存する。例えば、「約」は、当該技術分野における慣例に従って、３以内又は３を超える標準偏差を意味し得る。代替として、「約」は、所与の値の２０％まで、例えば、１０％まで、５％まで、又は１％までの範囲を意味し得る。代替として、特に生体系又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、例えば、５倍以内、又は２倍以内であることを意味し得る。

本明細書で使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」に関して「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質へのリガンド結合又は何らかの他の刺激によって活性化されるか又は他の方法で影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例としては、限定されないが、ＳＭＡＤ、並びにベータ－カテニン、ＮＯＴＣＨ、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦＰ）、アクチビン、ノーダル、及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）タンパク質を含むウィングレス（Ｗｎｔ）複合タンパク質、並びに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が挙げられる。多くの細胞表面受容体又は内部受容体タンパク質の場合、リガンド－受容体相互作用は細胞の応答に直接関連していない。リガンド活性化受容体は、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理学的効果が生じる前に、最初に細胞内の他のタンパク質と相互作用することができる。多くの場合、いくつかの相互作用する一連の細胞タンパク質の挙動は、受容体の活性化又は阻害後に変化する。受容体活性化によって誘導される一連の細胞変化全体は、シグナル伝達機構又はシグナル伝達経路と呼ばれる。

本明細書で使用される場合、「シグナル」という用語は、細胞の構造及び機能の変化を制御する内部因子及び外部因子を指す。それらは、本質的に化学的又は物理的であり得る。

本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子及びタンパク質、例えばトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＦＧＰ）、アクチビン、ノーダル、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）等を指す。

本明細書で使用される場合、「阻害剤」は、分子又は経路のシグナル伝達機能を妨げる（例えば、低減する、減少させる、抑制する、排除する、又は遮断する）化合物又は分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、又は抗体）を指す。阻害剤は、例えば、ＳＭＡＤシグナル伝達を直接接触させること、ＳＭＡＤ ｍＲＮＡを接触させること、ＳＭＡＤの立体構造変化を引き起こすこと、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させること、又はシグナル伝達パートナー（例えば、本明細書に記載されるものを含む）とのＳＭＡＤ相互作用を妨げること、及びＳＭＡＤ標的遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）の発現に影響を及ぼすことを介して、指定されたタンパク質（シグナル伝達分子、指定されたシグナル伝達分子に関与する任意の分子、指定された関連分子、例えばグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β））（例えば、限定されないが、本明細書に記載されるシグナル伝達分子を含む）の任意の活性を変化させる任意の化合物又は分子であり得る。

また、阻害剤としては、上流のシグナル伝達分子を妨害することによって、生物学的活性、例えばＳＭＡＤの生物学的活性を間接的に調節する分子が挙げられる。（例えば、細胞外ドメイン内では、シグナル伝達分子及び効果の例としては、骨形態形成タンパク質を隔離し、ＡＬＫ受容体１、２、３及び６の活性化を阻害し、したがって下流のＳＭＡＤ活性化を防止するノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）が挙げられる。同じく、コーディン（Ｃｈｏｒｄｉｎ）、ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、フォリスタチン（Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）も同様にＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を隔離する。膜貫通タンパク質であるバンビ（Ｂａｍｂｉ）は、細胞外ＴＧＦβシグナル伝達分子を隔離するための偽受容体としても作用する）。上流又は下流のタンパク質を遮断する抗体は、タンパク質シグナル伝達の細胞外活性化因子等を中和するための使用が企図される。阻害剤は、指定されたシグナル伝達分子の上流の分子に結合してそれに影響を及ぼし、次に指定された分子の阻害を引き起こすことによって誘導される阻害に加えて、競合阻害（別の既知の結合化合物の結合を排除又は低減するような様式で活性部位に結合する）及びアロステリック阻害（タンパク質の活性部位への化合物の結合を妨げる様式でタンパク質の立体構造を変化させる様式でタンパク質に結合する）に関して記載される。阻害剤は、シグナル伝達標的、又は実際にシグナル伝達標的に接触させることによってシグナル伝達標的経路を阻害する「直接阻害剤」であり得る。

本明細書で使用される場合、リガンドに関して「ＷＮＴ」又は「ウィングレス」という用語は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ及びＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリーの受容体等のＷＮＴ受容体と相互作用することができる分泌タンパク質（例えば、ヒトにおけるインテグレーション１（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ １））の群を指す。本明細書で使用される場合、「ＷＮＴ又はウィングレスシグナル伝達経路」という用語は、β－カテニンを用いて又は用いずに媒介される、Ｗｎｔファミリーリガンド及びＷｎｔファミリー受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ及びＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体から構成されるシグナル伝達経路を指す。特定の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達経路は、β－カテニン、例えばＷＮＴ／－カテニンによる媒介を含む。

本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、同様のコア構造を有する化合物を指す。

本明細書で使用される場合、「細胞の集団」又は「細胞集団」という用語は、少なくとも２つの細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個の細胞を含み得る。集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団、例えば、皮質興奮性ニューロンの集団、又は未分化幹細胞の集団であり得る。あるいは、集団は、２つ以上の細胞型、例えば混合細胞集団を含み得る。

本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、培養中に無期限に分裂し、特殊化した細胞を生じさせる能力を有する細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」及び「ＥＳＣ」という用語は、移植前段階の胚に由来し、培養中に長期間分化することなく分裂することができ、３つの初代胚葉の細胞及び組織に発達することが知られている原始（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚に由来する胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」又は「ｈＥＳＣ」という用語は、培養中に長期間分化することなく分裂することができ、３つの初代胚葉の細胞及び組織に発達することが知られている、胚盤胞期までの及び胚盤胞期を含む、初期段階のヒト胚に由来する多能性幹細胞のタイプを指す。

本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞株」という用語は、最大数日、数ヶ月から数年にわたって分化なしで増殖を可能にするｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。

本明細書で使用される場合、「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、身体のすべての細胞型に加えて、胎盤等の胚体外組織を構成するすべての細胞型を生じさせる能力を指す。

本明細書で使用される場合、「多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、身体の２つ以上の細胞型に発達する能力を指す。

本明細書で使用される場合、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉を含む生物の３つの発生胚葉に発達する能力を指す。

本明細書で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、特定の胚性遺伝子（例えば、限定されないが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＫＬＦ４導入遺伝子）（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＴａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６，６６３－６７６（２００６）を参照されたい）を体細胞に導入することによって形成される多能性幹細胞の一種を指す。

本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、配偶子（卵又は精子）以外の体内の任意の細胞を指し、「成体」細胞と呼ばれることもある。

本明細書で使用される場合、「体性（成体）幹細胞」という用語は、多くの器官及び分化組織に見られる比較的まれな未分化細胞を指し、自己再生（実験室において）及び分化の両方の能力が限られている。

本明細書で使用される場合、「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体及びその突起－軸索、並びに少なくとも１つの樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスで神経伝達物質を放出することによって、他のニューロン又は細胞に情報を伝達する。

本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞数の増加を指す。

本明細書で使用される場合、「未分化」という用語は、特殊化された細胞型にまだ発達していない細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化されていない胚性細胞が、ニューロン、心臓、肝臓、又は筋肉細胞等の特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。分化は、通常、細胞表面に埋め込まれたタンパク質を含むシグナル伝達経路を介して、細胞の遺伝子と細胞外の物理的及び化学的条件との相互作用によって制御される。

本明細書で使用される場合、「指向性分化」という用語は、神経前駆体、神経堤前駆体、頭部プラコード前駆体及び非神経外胚葉前駆体等の特定の（例えば、望ましい）細胞型への分化を誘導するための幹細胞培養条件の操作を指す。幹細胞に関して、「指向性分化」は、幹細胞の多能性状態からより成熟した又は特殊化した細胞運命への移行を促進するための小分子、増殖因子タンパク質、及び他の成長条件の使用を指す。

本明細書で使用される場合、細胞に関して「分化を誘導する」という用語は、デフォルトの細胞型（遺伝子型及び／又は表現型）を非デフォルトの細胞型（遺伝子型及び／又は表現型）に変更することを指す。したがって、「幹細胞において分化を誘導する」とは、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）が、幹細胞とは異なる特徴、例えば、遺伝子型（例えば、マイクロアレイ等の遺伝子分析によって決定される遺伝子発現の変化）及び／又は表現型（例えば、ＴＢＲ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＦＯＸＧ１、ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＰ２、ｖＧｌｕｔ１／２、及びＴＬＥ４等の皮質興奮性ニューロンのタンパク質マーカーの発現の変化）を有する子孫細胞に分裂するように誘導することを指す。

本明細書で使用される場合、「細胞培養物」という用語は、研究又は医学的治療のための人工培地中でのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。

本明細書で使用される場合、「培養培地」という用語は、ペトリ皿、マルチウェルプレート等の培養容器内の細胞を覆い、細胞に栄養を与えて支持するための栄養素を含む液体を指す。培養培地はまた、細胞に所望の変化を生じさせるために添加される増殖因子を含み得る。

本明細書で使用される場合、細胞（複数可）を化合物（例えば、少なくとも１つの阻害剤、活性化剤及び／又は誘導剤）と「接触させる」という用語は、細胞（複数可）が化合物にアクセスすることを可能にする位置に化合物を提供することを指す。接触は、任意の適切な方法を使用して達成され得る。例えば、接触は、所望の濃度を達成するために、例えば細胞培養物の状況で、濃縮形態の化合物を細胞又は細胞集団に添加することによって達成することができる。接触はまた、配合された培養培地の成分として化合物を含めることによって達成され得る。

本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工環境、及び人工環境内で起こるプロセス又は反応を指す。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境は、試験管及び細胞培養物を例示したが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、動物又は細胞）、及び胚発生、細胞分化、神経管形成等の自然環境内で起こるプロセス又は反応を指す。

本明細書で使用される場合、遺伝子又はタンパク質に関して「発現する」という用語は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイ等のアッセイを使用して観察することができるｍＲＮＡ又はタンパク質を作製することを指す。

本明細書で使用される場合、「マーカー」又は「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞又は細胞型を同定する遺伝子又はタンパク質を指す。細胞のマーカーは、１つのマーカーに限定されなくてもよく、マーカーは、指定されたマーカー群が細胞又は細胞型を別の細胞又は細胞型と識別し得るようなマーカーの「パターン」を指し得る。

本明細書で使用される場合、本明細書に開示される任意の細胞を参照して行う場合の「に由来する」又は「から樹立された」又は「から分化した」という用語は、任意の操作、例えば限定されないが、単一細胞単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染、ＤＮＡ配列によるトランスフェクション（例えばモルフォゲンによる）等を用いた処理及び／又は突然変異誘発、培養された親細胞に含まれる任意の細胞の選択（連続培養等による）を用いて、細胞株の最終的な親細胞、組織（解離した胚等）、又は流体から得られた（例えば、単離、精製等）細胞を指す。誘導された細胞は、増殖因子に対する応答、サイトカイン、サイトカイン処理の選択された進行、接着性、接着性の欠如、選別手順等によって混合集団から選択され得る。

本明細書における「個体」又は「対象」は、脊椎動物、例えばヒト又は非ヒト動物、例えば哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、スポーツ動物、げっ歯類及びペットが挙げられる。非ヒト動物対象の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスター及びモルモット等のげっ歯類；ウサギ；イヌ；ネコ；ヒツジ；ブタ；ヤギ；ウシ；ウマ；及び非ヒト霊長類、例えば類人猿及びサルが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、細胞、組織、又は器官の正常な機能を損なうか又は妨げる任意の状態又は障害を指す。

本明細書で使用される場合、「治療する」又は「治療」という用語は、治療されている個体又は細胞の疾患経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理の過程のいずれかで実行することができる。治療の治療効果としては、限定されないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、並びに寛解又は予後の改善が挙げられる。疾患又は障害の進行を予防することによって、治療は、罹患した若しくは診断された対象、又は障害を有すると疑われる対象における障害による悪化を予防することができるが、治療はまた、障害のリスクがあるか又は障害を有すると疑われる対象における障害又は障害の症状の発症を予防し得る。

本明細書で使用される場合、「皮質興奮性ニューロン」という用語は、グルタミン酸塩等の神経伝達物質を放出することができ、接続されたシナプス後ニューロンが発火する可能性を高めることができる大脳皮質ニューロンのタイプを指す。「皮質興奮性ニューロン」はまた、「皮質投射ニューロン」を指す。皮質興奮性ニューロンの非限定的な例としては、皮質遠心性投射ニューロン及び皮質－皮質投射ニューロンが挙げられる。

５．２．幹細胞を分化させる方法
本開示は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を誘導するため ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を提供する。本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導して皮質ニューロン、例えば皮質興奮性ニューロンを産生するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ 方法を提供する。特定の実施形態では、幹細胞は多能性幹細胞である。特定の実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）、及びそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、幹細胞は多分化能幹細胞である。本開示の方法と共に使用することができる幹細胞の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の非胚性幹細胞、胚性幹細胞、誘導非胚性多能性細胞及び人工多能性細胞が挙げられる。特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ヒト幹細胞の非限定的な例としては、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）（限定されないが、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を含む）、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、エピブラスト幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、癌幹細胞、又は系統特異的分化が可能な任意の他の細胞が挙げられる。特定の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。特定の実施形態では、幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。

本開示は、幹細胞由来皮質ニューロン、例えば、皮質興奮性ニューロンに関する。特定の実施形態では、幹細胞の皮質興奮性ニューロンへの分化には、幹細胞の少なくとも１つの皮質前駆マーカーを発現する細胞（「皮質前駆細胞」とも呼ばれる）へのｉｎ ｖｉｔｒｏ 分化、及び少なくとも１つの皮質前駆マーカーを発現する細胞の少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する細胞（「皮質興奮性ニューロン」とも呼ばれる）へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化が含まれる。

特定の実施形態では、本開示は、幹細胞を、少なくとも１つのスモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の阻害剤（「ＳＭＡＤ阻害剤」と呼ばれる）の阻害剤、及び少なくとも１つのウィングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）（Ｗｎｔ）シグナル伝達の阻害剤（「Ｗｎｔ阻害剤」と呼ばれる）と接触させることと、細胞を、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤（「Ｎｏｔｃｈ阻害剤」と呼ばれる）と接触させて、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する分化細胞を含む細胞集団を得ることと、を含む、幹細胞の分化を誘導するための方法を提供する。

５．２．１．幹細胞の皮質前駆細胞への分化
特定の実施形態では、少なくとも１つの皮質前駆細胞マーカーを発現する細胞は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤及び少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤と接触させることによって幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏ分化される。

皮質前駆細胞マーカーの非限定的な例としては、ＦＯＸＧ１（Ｆｏｒｋｈｅａｄ Ｂｏｘ Ｇ１）、ＰＡＸ６（Ｐａｉｒｅｄ Ｂｏｘ ６）、ＥＭＸ２（Ｅｍｐｔｙ Ｓｐｉｒａｃｌｅｓ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、ＦＥＺＦ２（ＦＥＺ Ｆａｍｉｌｙ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ ２）、ＯＴＸ２、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＨＥＳ５、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

ＳＭＡＤ阻害剤の非限定的な例としては、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン－ノーダルシグナル伝達の阻害剤（「ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤」と呼ばれる）、及び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤が挙げられる。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤は、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、ノーダル（Ｎｏｄａｌ）、及びアクチビンを含むリガンドを中和することができ、及び／又は受容体及び下流エフェクターを遮断することによってそれらのシグナル経路を遮断することができる。ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤の非限定的な例としては、国際公開第２０１０／０９６４９６号、国際公開第２０１１／１４９７６２号、国際公開第２０１３／０６７３６２号、国際公開第２０１４／１７６６０６号、国際公開第２０１５／０７７６４８号、Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９ Ｍａｒ；２７（３）：２７５－８０、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｎｏｖ ６；４８０（７３７８）：５４７－５１、及びＣｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ １；３０（７）：７１５－２０（２０１２）に開示されるものが挙げられ、これらはすべて、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤が、ＡＬＫ５の阻害剤、ＡＬＫ４の阻害剤、ＡＬＫ７の阻害剤、及びそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤はＡＬＫ５の阻害剤を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体及びそれらの混合物から選択される小分子である。「ＳＢ４３１５４２」は、ＣＡＳ ３０１８３６－４１－９の番号、Ｃ_２２Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ_３の分子式、及び４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミドの名称を有する分子を指し、例えば、以下の構造を参照されたい：

特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２の誘導体を含む。特定の実施形態では、ＳＢ４３１５４２の誘導体はＡ８３－０１である。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤は、ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（「ＢＭＰ阻害剤」と呼ばれる）を含む。ＢＭＰ阻害剤の非限定的な例としては、国際公開第２０１１／１４９７６２号、Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９ Ｍａｒ；２７（３）：２７５－８０、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｎｏｖ ６；４８０（７３７８）：５４７－５１、及びＣｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ １；３０（７）：７１５－２０に開示されるものが挙げられ、これらは全て参照によりその全体が組み込まれる。特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、ノギン、ドルソモルフィン、それらの誘導体及びそれらの混合物から選択される小分子である。「ＬＤＮ１９３１８９」は、以下の式を有するＣ_２５Ｈ_２２Ｎ_６の化学式を有する小分子ＤＭ－３１８９、ＩＵＰＡＣ名４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリンを指す。

ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤として機能することができる。ＬＤＮ１９３１８９はまた、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３及びＡＬＫ６、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の非常に強力な小分子阻害剤であり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１及びＡＬＫ３ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７及びアクチビンサイトカインシグナルを含む複数の生物学的シグナルの伝達の阻害、並びにその後のＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５及びＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化をもたらす（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ Ｍｅｄ １４：１３６３－１３６９；Ｃｕｎｙ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８：４３８８－４３９２、参照により本明細書に組み込まれる）。

特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含む。特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）を含む。

特定の実施形態では、幹細胞は、１つのＳＭＡＤ阻害剤、例えば、１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤に曝露される。特定の実施形態では、１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２又はＡ８３－０１である。特定の実施形態では、幹細胞は、２つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露される。特定の実施形態では、２つのＳＭＡＤ阻害剤は、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤である。特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＢ４３１５４２又はＡ８３－０１、及びＬＤＮ１９３１８９又はノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）に曝露される。特定の実施形態では、幹細胞は、ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ１９３１８９に曝露される。

特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約１０日間、又は少なくとも約１５日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露するか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約３日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露するか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、最大約５日間、最大約１０日間、最大約１５日間、又は最大約２０日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、最大約２０日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、約３日間～約２０日間、約３日間～約１５日間、約３日間～約１０日間、約１０日間～約２０日間、又は約１０日間～約１５日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、約３日間～約１５日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、約５日間、約１０日間、約１５日間又は約２０日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、約１０日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、約９日間又は１０日間、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、０日目から９日目まで少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤は、０日目から９日目まで幹細胞を含む細胞培養培地に毎日又は１日おきに添加される。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤は、０日目～９日目まで幹細胞を含む細胞培養培地に毎日（毎日）添加される。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤は、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤を含み、細胞をＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤と接触させるか、またはＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞と接触させられる、又は細胞に曝露されるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤の濃度は、約１μＭ～約２０μＭの間、約１μＭ～約１０μＭの間、約１μＭ～約１５μＭの間、約１０μＭ～約１５μＭの間、約５μＭ～約１０μＭの間、約５μＭ～約１５μＭの間、約５μＭ～約２０μＭの間、又は約１５μＭ～約２０μＭの間である。特定の実施形態では、細胞と接触される、又は細胞に曝露されるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤の濃度は、約５μＭ～約１０μＭの間である。特定の実施形態では、細胞と接触される、又は細胞に曝露されるＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤の濃度は、約１０μＭの間である。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２又はその誘導体（例えば、Ａ８３－０１）を含む。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤は、ＳＢ４３１５４２を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤はＢＭＰ阻害剤を含む。特定の実施形態では、細胞をＢＭＰ阻害剤と接触させるか、又はＢＭＰ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞と接触される又は細胞に曝露されるＢＭＰ阻害剤の濃度は、約１０ｎＭ～約２００ｎＭの間、又は約１０ｎＭ～約５０ｎＭの間、又は約１０ｎＭ～約１５０ｎＭの間、又は約１０ｎＭ～約１００ｎＭの間、又は約５０ｎＭ～約２００ｎＭの間、又は約５０ｎＭ～約１５０ｎＭの間、又は約５０ｎＭ～約１００ｎＭの間、又は約１００ｎＭ～約２００ｎＭの間、又は約１００ｎＭ～約１５０ｎＭの間である。特定の実施形態では、細胞と接触させる又は細胞に曝露するＢＭＰ阻害剤の濃度は、約５０ｎＭ～約１５０ｎＭである。特定の実施形態では、細胞と接触させる又は細胞に曝露するＢＭＰ阻害剤の濃度は、約５０ｎＭ～約１００ｎＭである。特定の実施形態では、細胞と接触させる又は細胞に曝露するＢＭＰ阻害剤の濃度は、約１００ｎＭである。特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９又はその誘導体を含む。特定の実施形態では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤は、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤を含む。特定の実施形態では、細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤と同時に接触させられるか、又はそれらに曝露される。特定の実施形態では、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤と約１０日間接触させるか、又は曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤と約９日間又は１０日間接触させるか、又は曝露する。特定の実施形態では、細胞を、０日目から９日目まで、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤と接触させるか、又はＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤を、毎日（例えば、毎日）又は１日おきに細胞に曝露又は接触させる。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤は、幹細胞を含む細胞培養培地に、０日目から９日目まで毎日又は１日おきに添加される。特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル阻害剤及びＢＭＰ阻害剤は、幹細胞を含む細胞培養培地に、０日目から９日目まで毎日（毎日）に添加される。

「ウィングレス」又は「Ｗｎｔ」は、β－カテニンを用いて又は用いずに媒介される、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ及びＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体等のＷｎｔファミリーリガンド及びＷｎｔファミリー受容体から構成されるシグナル経路を指す。Ｗｎｔタンパク質は、腫瘍形成、及び胚形成中の細胞運命の調節及びパターン形成を含むいくつかの発生過程に関与している。Ｗｎｔ経路は、Ｗｎｔタンパク質活性の下流又は上流のタンパク質のいずれかを含む。例えば、これは、ＬＲＰＳ、ＬＲＰ６、Ｄｋｋ、ＧＳＫ－３、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ３（例えば、Ｗｎｔ ３Ａ）、Ｗｎｔ１、又は本明細書で論じられる他のタンパク質のいずれか、及びこれらのタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。

Ｗｎｔ経路には、ＬＲＰＳ経路又はＨＢＭ経路、Ｄｋｋ経路、ｐ－カテニン経路、ＭＡＰＫＡＰＫ２経路、ＯＰＧ／ＲＡＮＫ経路等、Ｗｎｔの下流にある経路も含まれる。「ＬＲＰ５経路」及び「ＩＢＭ経路」とは、ＬＲＰ５又はＨＢＭ変異体、及びＬＲＰＳ又はＨＢＭ変異体の下流のタンパク質を含む任意のタンパク質／遺伝子を意味する。「β－カテニン経路」とは、β－カテニン及びβ－カテニンの下流のタンパク質を含む任意のタンパク質／遺伝子を意味する。「ＭＡＰＫＡＰＫ２経路」とは、ＭＡＰＫＡＰＫ２及びＭＡＰＫＡＰＫ２の下流のタンパク質を含む任意のタンパク質／遺伝子を意味する。「ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ経路」とは、ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ、並びにＯＰＧ及びＲＡＮＫＬの下流のタンパク質を含む任意のタンパク質／遺伝子を意味する。「Ｄｋｋ経路」とは、Ｗｎｔ経路の一部であるＤｋｋ－１とＬＲＰ５及び／又はＬＲＰ６との相互作用に関与する任意のタンパク質／遺伝子を含むことを意味する。Ｄｋｋ－ＩはＬＲＰ５活性を阻害する。

本明細書で使用される場合、「Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤」又は「Ｗｎｔ阻害剤」という用語は、Ｗｎｔタンパク質の正常な機能を直接阻害することによって作用し得る任意の薬剤だけでなく、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害し、したがってＷｎｔの機能を再現する任意の薬剤も指す。Ｗｎｔ阻害剤としては、例えば、ＸＡＶ９３９（Ｈａｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４６１：６１４－６２０（２００９））、ビタミンＡ（レチノイン酸）、リチウム、フラボノイド、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１（Ｄｋｋ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）（国際公開第２００９／１３１１６６号）、及びβ－カテニンに対するｓｉＲＮＡ等が挙げられる。

Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例としては、ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２、ＤＫＫ１、ＩＷＲ１、ＩＷＰ Ｌ６、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ＪＷ ５５、それらの誘導体、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

更なるＷｎｔ阻害剤としては、限定されないが、国際公開第０９１５５００１号及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５：１００－７（２００９）に記載されているＩＷＲ化合物、ＩＷＰ化合物及び他のＷｎｔ阻害剤が挙げられる。

ＸＡＶ９３９は、タンキラーゼ（ｔａｎｋｙｒａｓｅ）（ＴＮＫＳ）１及び２の強力な小分子阻害剤であり、ＩＣ_５０値はそれぞれ１１ｎＭ及び４ｎＭである。Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：６１４－６２０（２００９）。ＴＮＫＳ活性を阻害することによって、ＸＡＶ９３９は、アキシン－ＧＳＫ３β複合体のタンパク質レベルを増加させ、ＳＷ４８０細胞におけるβ－カテニンの分解を促進する。公知のＷｎｔ阻害剤としては、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質、分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）、Ｗｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ－１）、及びＳｏｇｇｙも挙げられる。Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質ファミリーのメンバー（Ｄｋｋ－１～Ｄｋｋ－４）は、リンカー領域によって分離された２つのシステインリッチドメインを有する分泌タンパク質である。Ｄｋｋ－３及びＤｋｋ－４はまた、１つのプロキネチシンドメインを有する。Ｄｋｋ－１、Ｄｋｋ－２、Ｄｋｋ－３、及びＤｋｋ－４は、ＬＲＰ５／６に結合し、Ｗｎｔ－Ｆｒｉｚｚｌｅｄ複合体とのＬＲＰ５／６相互作用を妨げることによって、カノニカルＷｎｔシグナル伝達のアンタゴニストとして機能する。Ｄｋｋ－１、Ｄｋｋ－２、Ｄｋｋ－３及びＤｋｋ－４はまた、細胞表面Ｋｒｅｍｅｎ－１又はＫｒｅｍｅｎ－２に結合し、ＬＲＰ５／６の内在化を促進する。Ｄｋｋ－３の拮抗活性は実証されていない。Ｄｋｋタンパク質は、成体及び胚組織において異なる発現パターンを有し、組織発生及び形態形成に対して広範囲の効果を有する。

Ｄｋｋファミリーはまた、Ｄｋｋ－３に相同であるが他のファミリーメンバーには相同でないＳｏｇｇｙを含む。ｓＦＲＰは、膜結合Ｆｒｉｚｚｌｅｄに類似する５つのＷｎｔ結合糖タンパク質のファミリーである。Ｗｎｔ阻害剤の最大ファミリーは２つのグループを含み、第１のグループはｓＦＲＰ１、ｓＦＲＰ２及びｓＦＲＰ５からなり、第２のグループはｓＦＲＰ３及びｓＦＲＰ４を含む。いずれも分泌され、ユニークな遺伝子に由来し、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリーの代替スプライス形態はない。各ｓＦＲＰは、Ｎ末端システインリッチドメイン（ＣＲＯ）を含む。他のＷｎｔ阻害剤としては、Ｗｎｔタンパク質に結合し、その活性を阻害する分泌タンパク質であるＷＩＦ－１（Ｗｎｔ阻害因子１）が挙げられる。

「ＩＷＰ２」又は「ＷＮＴ産生の阻害剤－２」は、以下の式を有するＩＵＰＡＣ名Ｎ－（６－メチル－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－２－［（４－オキソ－３－フェニル－６，７－ジヒドロチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］アセトアミドを指す：

ＩＷＰ－２は、経路活性化剤ポーキュピン（Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ）のレベルでＷＮＴ経路を阻害する（ＩＣ_５０＝２７ｎＭ）。ポーキュピンは、ＷＮＴタンパク質をパルミトイル化する膜結合型アシルトランスフェラーゼであり、ＷＮＴ分泌及びシグナル伝達能力をもたらす。

特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、又は少なくとも約５日間、少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と接触させるか、少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞を、最大約１日、最大約５日又は最大約１０日間、少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と最大約５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と最大約３日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と約１日間～約５日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と約２日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と約３日間接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、０日目から２日目まで少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤に曝露するか、又は少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、幹細胞を、毎日（毎日）又は１日おきに、少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤に曝露するか、又は少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤は、０日目から２日目まで幹細胞を含む細胞培養培地に毎日又は１日おきに添加される。特定の実施形態では、少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤は、０日目から２日目まで幹細胞を含む細胞培養培地に毎日（毎日）添加される。

特定の実施形態では、細胞と接触させる又は細胞に曝露する少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤の濃度は、約１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約１５μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約５μＭ、約５μＭ～約１０μＭ、約５μＭ～約１５μＭ、約１５μＭ～約２０μＭ、約５μＭ～約２０μＭ又は約１０μＭ～約１５μＭである。特定の実施形態では、細胞と接触させるか又は細胞に曝露する少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤の濃度は、約１μＭ～約５μＭである。特定の実施形態では、細胞を少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤と約２μＭの濃度で接触させる。特定の実施形態では、Ｗｎｔ阻害剤は、ＸＡＶ９３９又はその誘導体を含む。特定の実施形態では、Ｗｎｔ阻害剤は、ＸＡＶ９３９を含む。

５．２．２．皮質前駆細胞の皮質興奮性ニューロンへの分化
特定の実施形態では、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する細胞は、少なくとも１つの皮質前駆細胞マーカーを発現する細胞（例えば、５．２．１節に記載の方法によって得られるもの）を、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤（「Ｎｏｔｃｈ阻害剤」と呼ばれる）と接触させることによって、少なくとも１つの皮質前駆細胞マーカーを発現する細胞（例えば、５．２．１節に記載の方法によって得られるもの）からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化される。少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤への細胞の曝露は、迅速な細胞周期退出を促進し、同期した神経発生を誘導することができる。特定の実施形態では、細胞を低密度で継代して、同期した及び／又は純粋な皮質興奮性ニューロンを得る。

皮質興奮性ニューロンマーカーの非限定的な例としては、ＴＢＲ１（Ｔ－Ｂｏｘ Ｂｒａｉｎ １）、ＭＡＰ２（微小管関連タンパク質２）、ＦＯＸＧ１、ＣＴＩＰ２、ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＰ２、ｖＧｌｕｔ１／２及びＴＬＥ４が挙げられる。

Ｎｏｔｃｈ阻害剤の非限定的な例としては、ＤＡＰＴ（Ｄｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７６，１７３－１８１（２００１））、ベガセスタット（Ｂｅｇａｃｅｓｔａｔ）（５－クロロ－Ｎ－［（１Ｓ）－３，３，３トリフルオロ－１－（ヒドロキシメチル）－２－（トリフルオロメチル）プロピル］－２－チオフェンスルホンアミド）（Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５１：７３４８（２００８））、ＤＢＺ（Ｎ－［（１Ｓ）－２－［［（７Ｓ）－６，７－ジヒドロ－５－メチル－６－オキソ－５Ｈ－ジベンズ［ｂ，ｄ］アゼピン－７－イル］アミノ］－１－メチル－２－オキソエチル］－３，５－ジフルオロベンゼンアセトアミド）（ｖａｎ Ｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３５：９５９（２００５））、ＢＭＳ ２９９８９７（２－［（１Ｒ）－１－［［（４－クロロフェニル）スルホニル］（２，５－ジフルオロフェニル）アミノ］エチル－５－フルオロベンゼンブタン酸］（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３２３：１０２（２００７））、化合物Ｗ（３，５－ビス（４－ニトロフェノキシ）安息香酸）（Ｏｋｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：７８９０（２００６））、フルリザン（Ｆｌｕｒｉｚａｎ）（（Ｒ）－２－フルオロ－α－メチル［１，１’－ビフェニル］－４－酢酸（Ｅｒｉｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：４４０（２００３））、Ｌ－６８５，４５８（（５Ｓ）－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－６－フェニル－（４Ｒ）－ヒドロキシ－（２Ｒ）－ベンジルヘキサノイル）－Ｌ－ロイシ－Ｌ－フェニルアラニンアミド）（Ｓｈｅａｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：８６９８（２０００））、ＪＬＫ ６（７－アミノ－４－クロロ－３－メトキシ－１Ｈ－２－ベンゾピラン）（Ｐｅｔｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：５０７（２００１））、ＭＲＫ ５６０（Ｎ－［シス－４－［（４－クロロフェニル）スルホニル］－４－（２，５－ジフルオロフェニル）シクロヘキシル］－１，１，１－トリフルオロメタンスルホンアミド）（Ｂｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３１７：７８６（２００６））、ＰＦ ３０８４０１４臭化水素酸塩（（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６，８－ジフルオロ－１，２，３，４－テトラヒドロ－２－ナフタレニル］アミノ］－Ｎ－［１－［２－［（２，２－ジメチルプロピル）アミノ］－１，１－ジメチルエチル］－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］ペンタンアミドジヒドロブロミド）（Ｌａｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３４：２６９（２０１０））、又はそれらの誘導体が挙げられる。

特定の実施形態では、「ＤＡＰＴ」という用語は、ＮＯＴＣＨを阻害するγ－セクレターゼ阻害剤の一例を指し、これは、Ｎ－［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル］ グリシン－１，１－ジメチルエチルエステル；ＬＹ－３７４９７３、Ｎ－－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル）－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル；Ｎ－－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル）－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル（Ｃ_２３Ｈ_２６Ｆ_２Ｎ_２Ｏ_４の化学式を有する）としても知られるジペプチド性γ－セクレターゼ特異的阻害剤として記載される。ＤＡＰＴ誘導体の一例は、光活性化可能なＤＡＰＴ誘導体であるＤＡＰ－ＢｐＢ（Ｎ－－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル）－Ｌ－アラニル］－（Ｓ）－フェニルグリシン－４－（４－（８－ビオチン－アミド）オクチルアミノ）ベンゾイル）ベンジル）メチルアミド）である。特定の実施形態では、ＤＡＰＴは以下の構造を有する：

特定の実施形態では、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤は、ＤＡＰＴ、ＢＭＳ ２９９８９７、化合物Ｅ、化合物Ｗ、ＤＢＺ、Ｌ－６８５、４５８、ＰＦ ３０８４０１４臭化水素酸塩、それらの誘導体、及びそれらの組み合わせから選択される。

本発明者らは、細胞と少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤との最初の接触又は曝露が、例えば、純粋で同期した皮質ニューロン（例えば、皮質興奮性ニューロン）の集団を得るための、皮質ニューロン（例えば、皮質興奮性ニューロン）の純度に影響を及ぼし得ることを発見した。更に、これらの皮質ニューロン（例えば、皮質興奮性ニューロン）は、長期培養で維持することができる。

特定の実施形態では、細胞（例えば、皮質前駆細胞）の少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤との最初の接触又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤への最初の曝露は、細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との最初の接触又は少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への最初の曝露から少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、又は少なくとも約２０日間である。特定の実施形態では、細胞の少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤との最初の接触又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤への最初の曝露は、幹細胞の少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤への最初の曝露から約１５日以内、約２０日以内、又は約２５日以内である。特定の実施形態では、細胞の少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤との最初の接触又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤への最初の曝露は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との最初の接触から約１０日間～約２５日間、約１０日間～約２０日間、約１０日間～約１５日間、又は約１５日間～約２０日間である。特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤との最初の接触は、細胞と少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤との最初の接触から約２０日間である。

特定の実施形態では、細胞（例えば、皮質前駆細胞）を、少なくとも約１日間、少なくとも約５日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、又は少なくとも約３０日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤に曝露するか、又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞（例えば、皮質前駆細胞）を、少なくとも約１日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤に曝露又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させる。特定の実施形態では、細胞を、最大約５日間、約１０日間、最大約１５日間、最大約２０日間、最大約２５日間、又は最大約３０日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、最大約１０日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約１日間～約３０日間、約１日間～約２０日間、約１日間～約１５日間、約１日間～約１０日間、約１日間～約５日間、約１０日間～約１５日間、約１０日間～約２０日間、約２０日間～約３０日間、約１０日間～約３０日間、又は約１５日間～約２０日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約１日間～約１０日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、細胞を、約１０日間、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させるか、又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤に曝露する。特定の実施形態では、幹細胞は、約２０日目から約３０日目まで、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させられるか、又は少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤に曝露され、０日目は、細胞が少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤に最初に曝露された日である。特定の実施形態では、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤を毎日、１日おきに、又は約５日おきに細胞に曝露する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤を、約２０日目から約３０日目まで、細胞（例えば、皮質前駆細胞）を含む細胞培養培地に毎日、１日おきに、又は約５日おきに添加する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤を、約２０日目から約３０日目まで、細胞（例えば、皮質前駆細胞）を含む細胞培養培地に約５日おきに添加する。

特定の実施形態では、細胞（例えば、皮質前駆細胞）と接触させられる、又は細胞に曝露されるＮｏｔｃｈ阻害剤の濃度は、約１μＭ～約２０μＭの間、約１μＭ～約１０μＭの間、約１μＭ～約１５μＭの間、約１０μＭ～約１５μＭの間、約５μＭ～約１０μＭの間、約５μＭ～約１５μＭの間、約５μＭ～約２０μＭの間、又は約１５μＭ～約２０μＭの間である。特定の実施形態では、細胞と接触させる又は細胞に曝露するＮｏｔｃｈ阻害剤の濃度は、約５μＭ～約１０μＭである。特定の実施形態では、細胞と接触させる又は細胞に曝露するＮｏｔｃｈ阻害剤の濃度は、約１０μＭである。特定の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ阻害剤は、ＤＡＰＴ又はその誘導体を含む。特定の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ阻害剤は、ＤＡＰＴを含む。

特定の実施形態では、細胞と少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤との最初の接触の前に、細胞を解離させて再播種する。

５．２．３．細胞培養培地
特定の実施形態では、上記阻害剤は、細胞を含む細胞培養培地に添加される。適切な細胞培養培地としては、限定されないが、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（「ＫＳＲ」）培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地（ＮＢ）、Ｎ２培地、Ｂ－２７培地、及びＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。ＫＳＲ培地、ＮＢ培地、Ｎ２培地、Ｂ－２７培地、Ｅ８／Ｅ６培地は市販されている。ＫＳＲ培地は、培養中の未分化ｈＥＳＣを増殖及び維持するために最適化された、定義された無血清製剤である。

特定の実施形態では、細胞培養培地はＥ８／Ｅ６培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、ヒト多能性幹細胞の成長及び増殖を支援するフィーダーフリー及びゼノフリーの培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、体細胞リプログラミングを支援することが証明されている。更に、Ｅ８／Ｅ６培地は、ＰＳＣの培養のためのカスタム培地の配合のためのベースとして使用することができる。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１ Ｍａｙ；８（５）：４２４－９に記載されており、その全体が参照により組み込まれる。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、国際公開第１５／０７７６４８号に開示されており、その全体が参照により組み込まれる。特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、セレン、インスリン、ＮａＨＣＯ_３、トランスフェリン、ＦＧＦ２及びＴＧＦβを含む。Ｅ８／Ｅ６培地は、Ｅ８／Ｅ６培地が活性ＢＭＰ又はＷｎｔ成分を含まないという点でＫＳＲ培地とは異なる。したがって、特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６培地を使用して、本開示の幹細胞集団を培養して皮質前駆細胞集団に分化させる場合、少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤（例えば、ＢＭＰを阻害するもの）をＥ８／Ｅ６培地に添加する必要はない。特定の実施形態では、幹細胞を皮質前駆細胞（例えば、５．２．１節に記載される）に分化させるための細胞培養培地は、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２、任意にＬＤＮ１９３１８）を含むＥ８／Ｅ６培地である。特定の実施形態では、幹細胞を幹細胞から皮質前駆細胞に分化させるための細胞培養培地（例えば、第５．２．１節に記載されているように）は、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２、任意にＬＤＮ１９３１８）及び少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を含むＥ８／Ｅ６培地である。特定の実施形態では、０日目から２日目までの細胞培養培地は、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２、任意にＬＤＮ１９３１８）及び少なくとも１つのＷｎｔ阻害剤を含むＥ８／Ｅ６培地である。特定の実施形態では、３日目から９日目までの細胞培養培地は、少なくとも１つのＳＭＡＤ阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２、任意にＬＤＮ１９３１８）を含むＥ８／Ｅ６培地である。

特定の実施形態では、幹細胞を皮質前駆細胞（例えば、５．２．１節に記載される）に分化させるための細胞培養培地は、Ｎ２／Ｂ２７培地である。特定の実施形態では、１０日目から２０日目までの細胞培養培地は、Ｂ２７を補充したＮ２培地である。

特定の実施形態では、皮質前駆細胞を皮質興奮性ニューロン（例えば、５．２．２節に記載される）に分化させるための細胞培養培地は、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ）を含むＮＢ培地である。特定の実施形態では、２０日目から２９日目までの細胞培養培地は、少なくとも１つのＮｏｔｃｈ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ）を含むＮ２培地である。特定の実施形態では、Ｎ２培地には、Ｂ２７、Ｌ－グルタミン及びＹ－２７６３２が更に補充される。

特定の実施形態では、皮質興奮性ニューロン（例えば、５．２．２節に記載の方法に従って得られる）は、成熟培地中で培養される。特定の実施形態では、成熟培地はＮＢ培地である。特定の実施形態では、ＮＢ培地は、Ｌ－グルタミン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、及びアスコルビン酸（ＡＡ）から選択される１つ以上の分子を含む。

特定の実施形態では、皮質興奮性ニューロンは、成熟培地中で長期間維持され得る。特定の実施形態では、皮質興奮性ニューロンは、少なくとも約１０日間、少なくとも約５０、少なくとも約１０週間、少なくとも約１５週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２５週間、少なくとも約３０週間、又は少なくとも約４０週間、成熟培地中で維持され得る。特定の実施形態では、皮質興奮性ニューロンは、成熟培地中で約１０週間維持され得る。特定の実施形態では、細胞培養培地はＫＳＲ培地である。ＫＳＲ媒地の成分は、国際公開第２０１１／１４９７６２号に開示されている。特定の実施形態では、ＫＳＲ培地は、ノックアウトＤＭＥＭ、ノックアウト血清代替物、Ｌ－グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ及び１３－メルカプトエタノールを含む。特定の実施形態では、１リットルのＫＳＲ培地は、８２０ｍＬのノックアウトＤＭＥＭ、１５０ｍＬのノックアウト血清代替物、１０ｍＬの２００ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１０ｍＬの１０ｍＭ ＭＥＭ及び５５μＭの１３メルカプトエタノールを含む。

５．３．細胞集団及び組成物
本開示は、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）の分化細胞が少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団を提供する。特定の実施形態では、分化細胞の少なくとも約７５％が、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する。特定の実施形態では、分化細胞の少なくとも約９５％が、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する。

本開示の皮質興奮性ニューロン細胞集団を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで長期間維持することができる。特定の実施形態では、本開示の皮質興奮性ニューロン細胞集団は、少なくとも約１０日間、少なくとも約５０、少なくとも約１０週間、少なくとも約１５週間、少なくとも約２０週間、少なくとも約２５週間、少なくとも約３０週間、又は少なくとも約４０週間、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で維持することができる。

皮質興奮性ニューロンマーカーの非限定的な例としては、ＴＢＲ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＦＯＸＧ１、ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＰ２、ｖＧｌｕｔ１／２及びＴＬＥ４が挙げられる。

本開示はまた、そのような皮質興奮性ニューロン細胞集団を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞は、本明細書中、例えば、５．２節に記載される分化方法によって得られる。

特定の実施形態では、分化細胞の約３０％未満（例えば、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、又は約０．１％未満）が、ＫＩ６７、ＣＴＩＰ２（ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター転写因子相互作用タンパク質２）、ＳＡＴＢ２（特別なＡＴリッチ配列結合タンパク質２）、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのマーカーを発現する。

特定の実施形態では、細胞は、生体適合性足場又はマトリックス、例えば細胞が対象に留置又は移植された場合に組織再生を促進する生体適合性三次元足場を更に含む組成物に含まれる。特定の実施形態では、生体適合性足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチド又はタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロース又はゼラチンを含む多糖類、及び／又はヒドロゲルを含む。（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号及び同第２００８／０２６８０１９号を参照されたい。これらの各々の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。

特定の実施形態では、組成物は、約１×１０^４～約１×１０^１０、約１×１０^４～約１×１０^５、約１×１０^５～約１×１０^９、約１×１０^５～約１×１０^６、約１×１０^５～約１×１０^７、約１×１０^６～約１×１０^７、約１×１０^６～約１×１０^８、約１×１０^７～約１×１０^８、約１×１０^８～約１×１０^９、約１×１０^８～約１×１０^１０、又は約１×１０^９～約１×１０^１０のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化皮質興奮性ニューロンを含む。

特定の実施形態では、当該組成物は凍結される。特定の実施形態では、当該組成物は、少なくとも１つの凍結保護剤、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロース、又はそれらの組み合わせを更に含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、組成物は、生体適合性足場又はマトリックス、例えば、細胞が対象に留置又は移植された場合に組織再生を促進する生体適合性三次元足場を更に含む。特定の実施形態では、生体適合性足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチド又はタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロース又はゼラチンを含む多糖類、及び／又はヒドロゲルを含む。（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号及び同第２００８／０２６８０１９号を参照されたい。これらの各々の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。

特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物である。組成物を、神経変性疾患、神経発達疾患、及び／又は精神神経障害を予防及び／又は治療するために使用することができる。神経変性疾患、神経発達疾患、及び／又は精神神経障害の非限定的な例としては、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、統合失調症、自閉症、うつ病、知的障害、筋萎縮性側索硬化症、及び脳卒中が挙げられる。

本開示の主題はまた、本明細書に開示されるように、分化した皮質興奮性ニューロンを含む装置又はそれを含む組成物を提供する。装置の非限定的な例としては、シリンジ、微細ガラス管、定位針及びカニューレが挙げられる。

５．４．神経変性障害の治療方法
本明細書に開示される細胞集団及び組成物（例えば、第５．３節に開示されているもの）を、神経変性疾患、神経発達障害、及び／又は精神神経障害を予防及び／又は治療するために使用することができる。本開示の主題は、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害を予防及び／又は治療する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、本開示の幹細胞由来の皮質興奮性ニューロン又はその組成物を、神経変性障害、神経発達障害及び／又は精神神経障害に罹患している対象に投与する工程を含む。特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る担体を更に含む医薬組成物である。

神経変性障害の非限定的な例としては、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、統合失調症、自閉症、うつ病、知的障害、筋萎縮性側索硬化症、及び脳卒中が挙げられる。

特定の実施形態では、神経変性疾患、神経発達障害、及び／又は精神神経障害は、パーキンソン病である。パーキンソン病の一次運動徴候としては、限定されないが、例えば、手、腕、脚、顎及び顔の振戦、運動緩慢又は動きの遅さ、四肢及び体幹の硬直又はこわばり、並びに姿勢不安定性又はバランス障害及び協調障害が挙げられる。

特定の実施形態では、パーキンソン病は、運動を制御する脳の一部である基底核におけるドーパミンの不足に関連する疾患を指す。症状としては、振戦、運動緩慢（極端な動きの遅さ）、屈曲姿勢、姿勢不安定性、及び硬直が挙げられる。パーキンソニズム疾患の非限定的な例としては、皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症及び進行性核上性麻痺が挙げられる。

細胞又は組成物は、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害を治療又は予防するために、対象に全身的に又は直接投与又は提供することができる。特定の実施形態では、細胞又は組成物は、目的の器官（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ））に直接注入される。特定の実施形態では、細胞又は組成物は、大脳皮質に直接注射される。

細胞又は組成物は、任意の生理学的に許容され得るビヒクル中で投与することができる。細胞又は組成物は、局所頭蓋内注射、同所性（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、又は非経口投与によって投与することができる。特定の実施形態では、細胞又は組成物は、頭蓋内注射、例えばＣＮＳへの局所頭蓋内注射を介して、神経変性障害に罹患している対象に投与される。

細胞又は組成物は、滅菌液体調製物、例えば、選択されたｐＨに緩衝され得る等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液又は粘性組成物として都合よく提供され得る。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも調製が容易である。更に、液体組成物は、特に注射によって投与するのに幾分便利である。一方、粘性組成物を、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲内で配合することができる。液体又は粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。滅菌注射用溶液を、本開示の主題の組成物、例えば、本開示の幹細胞由来の皮質興奮性ニューロンを含む組成物を、必要に応じて様々な量の他の成分と共に必要な量の適切な溶媒に組み込むことによって調製することができる。そのような組成物を、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等の適切な担体、希釈剤、又は賦形剤と混合していてもよい。組成物を凍結乾燥することもできる。組成物は、投与経路及び所望の調製物に応じて、湿潤剤、分散剤又は乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化又は増粘添加剤、保存剤、香味剤、着色剤等の補助物質を含有することができる。参照により本明細書に組み込まれる”ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ”，１７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５等の標準的なテキストを参照して、過度の実験を行うことなく適切な調製物を調製することができる。

抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート剤、及び緩衝剤を含む、組成物の安定性及び無菌性を高める様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の予防を、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確実にすることができる。注射用医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸ミョウバン及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。

組成物の粘度は、所望であれば、薬学的に許容され得る増粘剤を使用して選択されたレベルに維持することができる。メチルセルロースは、容易かつ経済的に入手可能であり、取り扱いが容易であるため、使用することができる。他の適切な増粘剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が挙げられる。増粘剤の濃度は、選択された薬剤に依存し得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。適切な担体及び他の添加剤の選択は、正確な投与経路及び特定の剤形、例えば液体剤形（例えば、組成物が、溶液、懸濁液、ゲル又は別の液体形態、例えば、時間放出形態又は液体充填形態に製剤化されるかどうか）の性質に依存する。

当業者は、組成物の成分が化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の幹細胞由来前駆体の生存率又は有効性に影響を与えないことを認識するであろう。これは、化学的及び薬学的原理における当業者に問題を提示しないか、又はこの開示及び本明細書に引用された文献から、標準的なテキストを参照することによって、又は単純な実験（過度の実験を含まない）によって問題を容易に回避することができる。

細胞の治療的使用に関する１つの検討事項は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。最適な効果としては、限定されないが、神経変性障害に罹患している対象のＣＮＳ領域の再増殖、及び／又は対象のＣＮＳの機能の改善が挙げられる。

特定の実施形態では、組成物は、有効量の幹細胞由来の皮質興奮性ニューロンを含む。本明細書で使用される場合、「有効量」又は「治療有効量」という用語は、治療時に有益な又は所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量を指す。有効量を、少なくとも１回の用量で対象に投与することができる。治療に関して、有効量は、神経変性障害若しくは下垂体障害の進行を緩和、改善、安定化、逆転若しくは遅延させるか、あるいは神経変性障害の病理学的帰結を軽減するのに十分な量である。有効量は、一般に、症例ごとに医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定する際には、いくつかの因子が通常考慮される。これらの因子としては、対象の年齢、性別及び体重、治療される状態、状態の重症度、並びに投与される細胞の形態及び有効濃度が挙げられる。

特定の実施形態では、細胞の有効量は、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害に罹患している対象のＣＮＳ領域を再増殖させるのに十分な量である。特定の実施形態では、細胞の有効量は、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害に罹患している対象のＣＮＳの機能を改善するのに十分な量であり、例えば、改善された機能は、正常者のＣＮＳの機能の約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％又は約１００％であり得る。

投与される細胞の量は、治療されている対象によって異なるであろう。特定の実施形態では、約１×１０^４～約１×１０^１０、約１×１０^４～約１×１０^５、約１×１０^５～約１×１０^９、約１×１０^５～約１×１０^６、約１×１０^５～約１×１０^７、約１×１０^６～約１×１０^７、約１×１０^６～約１×１０^８、約１×１０^７～約１×１０^８、約１×１０^８～約１×１０^９、約１×１０^８～約１×１０^１０、又は約１×１０^９～約１×１０^１０の細胞が、対象に投与される。特定の実施形態では、約１×１０^５個～約１×１０^７個の細胞が、神経変性障害に罹患している対象に投与される。特定の実施形態では、約１×１０^６個～約１×１０^７個の細胞が、神経変性障害に罹患している対象に投与される。特定の実施形態では、約１×１０^６個～約４×１０^６個の細胞が、神経変性障害に罹患している対象に投与される。有効用量と考えられるものの正確な決定は、特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重及び状態を含む、各対象に個別の因子に基づいてもよい。投与量は、本開示及び当業者の知識から当業者によって容易に確認され得る。

５．５．キット
本開示の主題は、幹細胞の皮質興奮性ニューロンへの分化を誘導するためのキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、（ａ）少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤、（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤、及び（ｃ）少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤を含む。特定の実施形態では、キットは、（ｄ）少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する分化細胞の集団への幹細胞の分化を誘導するための説明書を更に含む。

特定の実施形態では、説明書は、幹細胞を特定の順序で阻害剤と接触させることを含む。

特定の実施形態では、説明書は、５．２節に記載される方法に従って幹細胞を阻害剤と接触させることを含む。

特定の実施形態では、本開示は、有効量の単位剤形の本明細書に開示される細胞集団又は組成物を含むキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、治療用組成物を含有する滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、又は当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は薬剤を保持するのに適した他の材料で作ることができる。

特定の実施形態では、キットは、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害に罹患している対象に細胞集団又は組成物を投与するための説明書を含む。説明書は、神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害を治療及び／又は予防するための細胞又は組成物の使用に関する情報を含み得る。特定の実施形態では、説明書は、以下のうちの少なくとも１つを含む：治療剤の説明；神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害、又はそれらの症状を治療及び／又は予防するための投与スケジュール及び投与；注意；警告；指示；禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒ－ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）；過剰投与量情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；及び／又は参考文献。説明書は、容器に直接（存在する場合）、又は容器に貼付されたラベルとして、又は容器内に若しくは容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カード若しくはフォルダとして印刷することができる。

６．実施例
本開示の主題は、限定ではなく、本開示の主題の例示として提供される以下の実施例を参照することによってよりよく理解されるであろう。
実施例１：ｈＰＳＣからの同期した純粋な皮質興奮性ニューロンの生成

ここに開示される実施例は、２つの工程における非常に高い純度での皮質興奮性ニューロンの同期化された集団に対するｈＰＳＣの指向性分化を記載する。

工程１：ｈＰＳＣを、ＦＯＸＧ１及びＰＡＸ６を含む特異的マーカーを発現する背側皮質前駆体細胞の均一な集団に向かって堅固に分化させた（図１Ａ～１Ｃ）。

工程２：次いで、迅速な細胞周期退出を促進し、長期培養で維持することができる同期したＴＢＲ１^＋皮質興奮性ニューロンの純粋な集団の生成を誘導する条件で、皮質前駆体細胞を継代した（図２Ａ～２Ｄ、図３Ａ～３Ｂ）。

工程１は、皮質前駆体細胞の均一な集団に向けたｈＰＳＣのパターン化を伴った：
－１日目：ｈＰＳＣを単一細胞で解離させ、マトリゲル被覆プレートに３×１０^５細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、細胞を、１０μＭのＹ－２７６３２を含有するＥ８培地で培養した。
□ ０日目～２日目：細胞に、１０μＭ ＳＢ４３１５４２、１００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９及び２μＭ ＸＡＶ９３９を補充したＥ６培地を毎日与えた。
□ ３日目～９日目：細胞に、１０μＭ ＳＢ４３１５４２及び１００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８を補充したＥ６を毎日与えた。
□ １０日目～２０日目：細胞にＮ２／Ｂ２７培地を毎日与えた。
工程２は、継代及び同期された神経発生を伴った：
□ ２０日目～２９日目：前駆体細胞を単一細胞懸濁液に解離させ、ポリ－Ｌ－オルニチン、ラミニン及びフィブロネクチンでコーティングしたプレート上に１～１．５×１０^５細胞／ｃｍ^２の密度で播種した。Ｂ２７、Ｌ－グルタミン、１０ｕＭ Ｙ－２７６３２及び１０ｕＭ ＤＡＰＴを補充したＮＢ培地中で細胞を培養し、各プレートの培地の半分を３０日目まで５日ごとに交換した。
□ ３０日目－エンドポイント：細胞を、Ｂ２７、Ｌ－グルタミン、２０μｇ／ｍｌ ＢＤＮＦ、２０μｇ／ｍｌ ＧＤＮＦ、２００μＭ ｄｂｃＡＭＰ、２００μＭアスコルビン酸（ＡＡ）を補充したＮＢ中で維持した。培地の半分をおよそ４～５日ごとに交換した。

本開示の方法の工程１は、皮質前駆体細胞の均一な集団に向けたｈＰＳＣの分化を堅固に誘導した。多能性関連遺伝子ＮＡＮＯＧ及びＯＣＴ４、並びに終脳皮質マーカーＦＯＸＧ１、Ｅｍｘ２、Ｐａｘ６及びＦｅｚｆ２のｍＲＮＡレベルを決定した。図１Ｂに示すように、終脳皮質マーカーは、進行的かつ堅固に誘導され、多能性関連遺伝子は効率的に減少した。皮質特異的マーカーＦＯＸＧ１及びＰＡＸ６、並びに腹側終脳マーカーＧｓｘ２及びＮｋｘ２．１も評価した。免疫蛍光染色により、皮質特異的遺伝子ＦＯＸＧ１及びＰＡＸ６の均一な誘導、並びに腹側終脳マーカーの最小限の混入が明らかになった（図１Ｃ）。

本開示の方法の工程２は、前駆体細胞を急速に枯渇させ、神経発生を同期させた。Ｋｉ６７＋前駆体細胞は急速に枯渇し、分化の２５日目までにＭＡＰ２＋ニューロンの純粋な集団を生成した（図２Ａ及び２Ｃ）。５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ）発生日決定により、ほぼ同齢のニューロンの生成が確認された（図２Ｂ及び図２Ｃ）。特に、同期した神経発生は、ＴＢＲ１＋同一性（＞８０％）の非常に純粋なニューロン集団を生成した（図２Ｄ）。

本開示の方法は、長期培養において、同期した純粋なｈＰＳＣ由来の皮質ニューロンを高い生存率で維持することができた。長期培養におけるｈＰＳＣ由来の皮質ニューロンの代表的な画像を図３Ａに示した。ＫＩ６７／ＭＡＰ２マーカー発現についてのｑＲＴ－ＰＣＲ分析により、長期培養における同期性及び純度条件の維持が確認された（図３Ｂ）。

本開示の主題及びその利点を詳細に説明してきたが、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書において様々な変更、置換及び変化を行うことができることを理解されたい。更に、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、機械、製造、及び物質の組成物、手段、方法及び工程の特定の実施形態に限定されることを意図するものではない。当業者であれば、現在開示されている主題、プロセス、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、又は工程の本開示から、本明細書に記載される対応する実施形態が現在開示されている主題に従って利用され得るため、実質的に同じ機能を実行するか、又は実質的に同じ結果を達成する、現在存在するか、又は後日開発されるものを容易に理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、その範囲内に、そのようなプロセス、機械、製造、物質の組成物、手段、方法、又は工程を含むことが意図される。

様々な特許、特許出願、刊行物、製品説明、プロトコル、及び配列アクセッション番号は、本出願を通じて引用され、これらの本開示は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (36)

1. 幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
   前記幹細胞を、少なくとも１つのスモールマザーズアゲインストデカペンタプレジック（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ＳＭＡＤ）シグナル伝達の阻害剤、及び少なくとも１つのウィングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）（Ｗｎｔ）シグナル伝達の阻害剤と接触させることと、前記細胞を、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得ることとを含み、前記分化細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９５％が、少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現し、前記細胞と前記少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤との最初の接触が、前記細胞と前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日間である、方法。
2. 前記細胞と前記少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤との前記最初の接触が、前記細胞と前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤との前記最初の接触から約２０日間である、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞を、少なくとも約１日間、前記少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と接触させる、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記細胞を、最大約２０日間、前記少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と接触させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記細胞を約１０日間、前記少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と接触させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記細胞を約１０日間、前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤と接触させる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記細胞を最大約３日間、前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤と接触させる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤がγ－セクレターゼ阻害剤を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記γ－セクレターゼ阻害剤が、ＤＡＰＴ、その誘導体、又はそれらの混合物を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤が、ＴＧＦβ／アクチビン－ノーダル（Ａｃｔｉｖｉｎ－Ｎｏｄａｌ）シグナル伝達の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナル伝達の阻害剤がＡＬＫ５の阻害剤を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナル伝達の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２若しくはその誘導体、又はその混合物を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 前記少なくとも１つのＴＧＦβ／アクチビン－ノーダルシグナル伝達の阻害剤がＳＢ４３１５４２を含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ドルソモルフィン（ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、それらの誘導体、又はそれらの混合物を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記少なくとも１つのＢＭＰの阻害剤がＬＤＮ－１９３１８９を含む、請求項１０又は１４に記載の方法。
16. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤が、ＸＡＶ９３９、ＩＷＰ２、ＤＫＫ１、ＩＷＲ１、ＩＷＰ Ｌ６、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ＪＷ ５５、それらの誘導体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤がＸＡＶ９３９を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーが、ＴＢＲ１（Ｔ－Ｂｏｘ Ｂｒａｉｎ １）、ＭＡＰ２（微小管関連タンパク質２）、ＦＯＸＧ１、ＣＴＩＰ２、ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＰ２、ｖＧｌｕｔ１／２、ＴＬＥ４、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記分化細胞が、ＫＩ６７、ＣＴＩＰ２（ニワトリ卵白アルブミン上流プロモーター転写因子相互作用タンパク質２）、ＳＡＴＢ２（特別なＡＴリッチ配列結合タンパク質２）及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記幹細胞が、ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の非胚性幹細胞；ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の胚性幹細胞；ヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の誘導多能性幹細胞；及びヒト、非ヒト霊長類又はげっ歯類の組換え多能性細胞から選択される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１～２０のいずれか一項記載の方法。
22. 前記幹細胞が多能性又は多分化能幹細胞である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記幹細胞が多能性幹細胞である、請求項１～２２のいずれか一項記載の方法。
24. 前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
25. ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団であって、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ 分化細胞が、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法に従って得られる、細胞集団。
26. 前記細胞の少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約９５％が少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞の細胞集団。
27. 前記少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーが、ＴＢＲ１、ＭＡＰ２、ＦＯＸＧ１、ＣＴＩＰ２、ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＰ２、ｖＧｌｕｔ１／２、ＴＬＥ４、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２６に記載の細胞集団。
28. 前記分化細胞の約３０％未満が、ＫＩ６７、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、及びそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、請求項２６又は２７に記載の細胞集団。
29. 請求項２５～２８のいずれか一項に記載の細胞集団を含む組成物。
30. 薬学的に許容され得る担体を更に含む医薬組成物である、請求項２９に記載の組成物。
31. 幹細胞の皮質興奮性ニューロンへの分化を誘導するためのキットであって、
    （ａ）少なくとも１つのＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤と、
    （ｂ）少なくとも１つのＷｎｔシグナル伝達の阻害剤と、
    （ｃ）少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害剤と、を含む、キット。
32. （ｄ）少なくとも１つの皮質興奮性ニューロンマーカーを発現する分化細胞の集団への前記幹細胞の分化を誘導するための説明書を更に含む、請求項３１に記載のキット。
33. 対象における神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害を予防及び／又は治療する方法であって、有効量の、
    （ａ）請求項２５～２８のいずれか一項に記載の細胞集団、又は
    （ｂ）請求項２９若しくは３０に記載の組成物のうちの１つを前記対象に投与することを含む、方法。
34. 前記神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、統合失調症、自閉症、うつ病、知的障害、筋萎縮性側索硬化症、及び脳卒中から選択される、請求項３３に記載の方法。
35. 対象における神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害の予防及び／又は治療における使用のための、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の細胞集団、又は請求項２９若しくは３０のいずれか一項に記載の組成物。
36. 前記神経変性障害、神経発達障害、及び／又は精神神経障害が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、統合失調症、自閉症、うつ病、知的障害、筋萎縮性側索硬化症、及び脳卒中である、請求項３５に記載の使用のための細胞集団又は組成物。