JP2024502620A - リボザイムで活性化されたｒｎａ構築物及びその使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、誘導性遺伝子発現システム、遺伝子治療、及びコンビナトリアルスクリーニングを含む様々な用途で使用するための、リボザイムで媒介された融合構築物及びシステム、及びその方法を提供する。

Description

関連出願への相互参照

本願は、35 U.S.C.§119に基づき、2021年1月11日に出願された仮出願第63/136,201号の優先権を主張する。その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

政府援助に関する陳述

本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号R01GM123313、R01CA222826、及びR01HG009285の政府援助を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

本開示は、誘導性遺伝子発現システム、遺伝子治療、及びコンビナトリアルスクリーニングを含む様々な用途で使用するための、リボザイムで媒介された融合構築物及びシステム、及びその方法を提供する。

背景

リボザイム(リボ核酸酵素)は、タンパク質酵素の作用と同様に、遺伝子発現におけるcRNAスプライシング等の特定の生化学反応を触媒する能力を有するRNA分子である。リボザイムは、RNAスプライシング、ウイルス複製、伝達RNA生合成等の様々なRNA処理反応に関与する。リボザイムの例は、ハンマーヘッド リボザイム、VSリボザイム、リードザイム、及びヘアピンリボザイムを含む。リボザイムは、遺伝子治療による疾患の治療に提案され、開発されてきた。

概要

本開示は、コンビナトリアル遺伝子相互作用スクリーン及び誘導性遺伝子発現のためのRNAベースの読み取りに利用できる連結されたRNA融合構築物を作製するための内因性RNA処理機構の革新的なエンジニアリングを提供する。本明細書の実施例に示されるように、互いに相補性を有する別々に転写された配列は、自己切断リボザイムに融合される。転写されると、転写物がリボザイムの自己触媒活性によって切断され、固有の末端が作製される。相補的領域により、2つの転写物は、ハイブリダイズし、切断端が並置され、内因性RNAリガーゼによって認識され、連結された融合構築物が作製される。本明細書ではさらに、細胞に送達された2つの転写物を異なるライブラリー要素上で連結するこのアプローチの適用可能性が実証される。イントロン配列に連結すると、リボザイムで媒介されたRNA融合構築物を全長遺伝子産物の制御可能な発現に利用することができる。RNAの融合物（環状化を含む）は、RNAi、ASO、ADARリクルート ガイドRNA、CRISPR-Cas におけるガイドRNA等のトランスクリプトーム及びゲノム操作様式においてさらなる有用性を有した。

本開示は、１つ以上のリボザイム及び少なくとも１つの目的のポリペプチドに対する１つ以上のRNAコーディング配列を含むリボザイムで活性化されたRNA構築物を提供し、ここで、記少なくとも１つの目的のポリペプチドに対する前記1つ以上のRNAコーディング配列の転写は、前記1つ以上のリボザイムの活性によって活性化されるか依存する。一実施形態では、前記リボザイムで活性化されたRNA構築物は、任意のプライマー領域、任意のバーコード領域、目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、及び第2人工RNA要素の配列に対する相補的配列を含む第1人工RNA要素、ならびに第1自己切断リボザイム、及び任意のプライマー領域、任意のバーコード領域、目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、及び第1人工RNA要素の配列に対する相補的配列を含む第2人工RNA要素、ならびに第2自己切断リボザイムをさらに含み、ここで、前記第1及び第2自己切断リボザイムによる前記第1及び第2人工RNA要素の切断は、それぞれ共にハイブリダイズされるコメンタリ配列からのdsRNAの領域を含むハイブリダイゼーション構築物を提供し、ここで、前記ハイブリダイゼーション構築物は、RNAリガーゼによってさらに連結され、RNA融合構築物を形成することができ、またここで、前記RNA融合構築物からの発現は、前記少なくとも1つの目的のポリペプチドを産生する。さらなる実施形態では、前記第1人工RNA要素は、バーコード配列または特異的分子同一性（UMI）配列を含み、かつ／または前記第2人工RNA要素は、バーコード配列またはUMI配列を含む。またさらなる実施形態では、前記第1人工RNA要素の前記バーコード配列またはUMI配列は、前記第2人工RNA要素からの前記バーコード領域またはUMI配列とは異なる配列を有する。別の実施形態では、前記第1人工RNA要素は、プライマー配列を含み、かつ／または前記第2人工RNA要素は、プライマー配列を含む。さらなる実施形態では、前記第1人工RNA要素の前記プライマー配列は、前記第2人工RNA要素からの前記プライマー配列と異なる。別の実施形態では、前記第1及び第2相補的配列の長さが30～60 bpである。さらなる実施形態では、前記第1及び第2相補的配列の長さが40～50 bpである。別の実施形態では、前記第1及び第2リボザイムは、ツイスター リボザイムである。さらなる実施形態では、前記第1リボザイムは、P3ツイスター リボザイムである。またさらなる実施形態では、前記第2リボザイムは、P1ツイスター リボザイムである。別の実施形態では、前記RNAリガーゼは、RtcBである。前記実施形態のいずれかの別のまたはさらなる実施形態では、ベクターまたはプラスミドは、前記第1人工要素を含み；ここで、該第1人工要素は、第1 RNAプロモーター及び第1摂動要素の下流に位置し、かつ／またはベクターまたはプラスミドは、第2人工要素を含み；ここで、該第2人工要素は、第2 RNAプロモーター及び第2摂動要素の下流に位置する。さらなる実施形態では、前記第1 RNAプロモーター及び／または第2 RNAプロモーターは、ポリメラーゼIIIプロモーターである。またさらなる実施形態では、前記ポリメラーゼIIIプロモーターは、hU6プロモーターである。別の実施形態では、前記第1摂動要素及び／または第2摂動要素は、CRISPRノックアウトスクリーンで利用されるsgRNAである。別の実施形態では、前記リボザイムで活性化されたRNA構築物は、目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、イントロン配列、第2人工RNA要素の配列及び3'アプタマーに対する相補的配列、及び第1自己切断リボザイムを含み、前記3'アプタマーは、第1自己切断リボザイムを安定化させるために該第1自己切断リボザイムと相互作用する、第1人工RNA要素、及び目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、イントロン配列、第1人工RNA要素の配列に対する相補的配列、及び3'アプタマーを含み、前記第2人工RNAテンプレートは、第2自己切断リボザイムに繋留され、前記3'アプタマーは、第2自己切断リボザイムを安定化させるために該第2自己切断リボザイムと相互作用する、第2人工RNA要素を含み、ここで、前記第1及び第2自己切断リボザイムによる前記第1及び第2人工RNA要素の切断は、それぞれ共にハイブリダイズされるコメンタリ配列からのdsRNAの領域を含むハイブリダイゼーション構築物を提供し、ここで、前記ハイブリダイゼーション構築物は、RNAリガーゼによってさらに連結されることができ、前記イントロン配列は、スプライソソームによって除去されてRNA融合構築物を形成し、ここで、前記RNA融合構築物からの発現は、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドを産生する。さらなる実施形態では、前記イントロン配列は、ジヒドロ葉酸還元酵素に由来する。別の実施形態では、目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列は、前記イントロン配列のそれぞれに隣接している。別の実施形態では、目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列は、インスリン、凝固因子IX、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節タンパク質、及びジストロフィンタンパク質から選択されるポリペプチド／タンパク質をコードする。別の実施形態では、前記リボザイムで活性化されたRNA構築物は、1つ以上のプロモーター配列、少なくとも１つの目的のポリペプチドに対する1つ以上のRNAコーディング配列、1つ以上のアプタザイム ベースのリボスイッチであるリボザイム、該アプタザイム ベースのリボスイッチを含む3'UTR配列、及びポリ(A)配列を含み、ここで、前記アプタザイム ベースのリボスイッチは、標的リガンドに結合しないときに、前記リボザイムで活性化されたRNA構築物を不安定化させ、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドの発現の減少をもたらし、ここで、前記アプタザイム ベースのリボスイッチは、標的リガンドに結合するときに、前記リボザイムで活性化されたRNA構築物を安定化させ、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドの発現の増加をもたらす。別の実施形態では、前記アプタザイム ベースのリボスイッチは、ハンマーヘッドアプタザイムである。さらに別の実施形態では、前記標的リガンドは、テトラサイクリン、テオフィリン、及びグアニンから選択される。別の実施形態では、前記少なくとも1つの目的のポリペプチドは、プロドラッグ活性化酵素、生物学的応答修飾因子、受容体リガンド、免疫グロブリン由来の結合ポリペプチド、非免疫グロブリン結合ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、ゲノム編集酵素、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、ここで、複数のポリペプチドは、2Aまたは2A様ペプチドによって分離される。さらなる実施形態では、前記生物学的応答修飾因子は、免疫増強サイトカインである。またさらなる実施形態では、前記免疫増強サイトカインは、インターロイキン1～38、インターフェロン、腫瘍壊死因子（TNF）、及び顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子（GM-CSF）からなる群から選択される。 別の実施形態では、前記2Aまたは2A様ペプチドは、GSGリンカー部分をさらに含む。さらに別の実施形態では、前記ゲノム編集酵素は、ジンク フィンガー ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター ヌクレアーゼ（TALEN）、人工メガヌクレアーゼ、及びRNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼ（Cas）ポリペプチドからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、前記1つ以上のプロモーター配列は、ポリメラーゼII（pol-II）プロモーター配列である。別の実施形態では、前記1つ以上のプロモーター配列は、EF1α、hU6、SV40、CMV、RSV、NEUROD2、及び／またはTBX20に対する配列を有する。別の実施形態では、前記ポリ(A)配列は、bGHポリ(A)配列である。

本開示はまた、上記のリボザイムで活性化されたRNA構築物を含む医薬組成物を提供し、ここで、該リボザイムで活性化されたRNA構築物は、直線化され、かつ5'リボザイム、5'連結配列、内部リボソーム侵入部位(IRES) 配列、少なくとも１つの目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、3'連結配列、3'リボザイム配列、及び薬剤的に許容される担体を含む。さらなる実施形態では、前記直線状のリボザイムで活性化されたRNA構築物は、ポリメラーゼ結合領域を欠いている。さらに別の実施形態では、前記5'及び3'リボザイムは、ツイスター リボザイム、ハンマーヘッド リボザイム、手斧リボザイム、デルタ型肝炎ウイルスのリボザイム、リガーゼ リボザイム、ピストル リボザイム、ツイスター姉妹リボザイム、Vg1リボザイム、VSリボザイム、及び前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される。別の実施形態では、前記5'及び3'連結配列は、in situで天然リガーゼの基質である。さらなる実施形態では、前記天然リガーゼは、RtcBである。別の実施形態では、前記IRESは、配列番号：1～1328の配列及びそのTがUである場合の配列のいずれか1つの配列を含む。別の実施形態では、前記少なくとも1つの目的のポリペプチドは、自己切断ペプチドによって分離された2つ以上の目的のポリペプチドを含む。またさらなる実施形態では、前記自己切断ペプチドは、2Aまたは2A様ペプチドを含む。別の実施形態では、前記少なくとも1つの目的のポリペプチドは、プロドラッグ活性化酵素、生物学的応答修飾因子、受容体リガンド、免疫グロブリン由来の結合ポリペプチド、非免疫グロブリン結合ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、ゲノム編集酵素、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、ここで、複数のポリペプチドは、2Aまたは2A様ペプチドによって分離される。さらに別の実施形態では、前記生物学的応答修飾因子は、免疫増強サイトカインである。さらなる実施形態では、前記免疫増強サイトカインは、インターロイキン1～38、インターフェロン、腫瘍壊死因子（TNF）、及び顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子（GM-CSF）からなる群から選択される。別の実施形態では、前記2Aまたは2A様ペプチドは、GSGリンカー部分をさらに含む。さらに別の実施形態では、前記ゲノム編集酵素は、ジンク フィンガー ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター ヌクレアーゼ（TALEN）、人工メガヌクレアーゼ、及びRNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼ（Cas）ポリペプチドからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、前記5'及び3'リボザイム配列は、5'-GCCATCAGTCGCCGGTCCCAAGCCCGGATAAAATGGGAGGGGGCGGGAAACCGCCT-3'(配列番号：1354) または5'-AACACTGCCAATGCCGGTCCCAAGCCCGGATAAAAGTGGAGGGTACAGTCCACGC-3'(配列番号：1355)、及びTがUである場合の前記配列のいずれかと少なくとも85～100%同一である配列から独立して選択される。別の実施形態では、前記5'及び3'連結配列は、5'-AACCATGCCGACTGATGGCAG-3'(配列番号：1356)または5'-CTGCCATCAGTCGGCGTGGACTGTAG-3'(配列番号：1357)、及びTがUである場合の前記配列のいずれかと少なくとも85～100%同一である配列から独立して選択される。別の実施形態では、前記IRES配列は、5'-gcggccgcgtcgacgggcccgcggaattccgccccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaacc-3'(配列番号：1358) 及びTがUである場合の該配列と少なくとも85～100%同一である。

本開示はまた、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物を含むワクチン組成物を提供し、ここで、該リボザイムで活性化されたRNA構築物は、直線化され、5'リボザイム、5'連結配列、内部リボソーム侵入部位(IRES)配列、少なくとも1つの抗原性ポリペプチドに対するRNAコーディング配列、3'連結配列、3'リボザイム配列、及び薬剤的に許容される担体を含む。さらなる実施形態では、前記直線化されたリボザイムで活性化されたRNA構築物は、ポリメラーゼ結合領域を欠いている。別の実施形態では、前記5'及び3'リボザイムは、ツイスター リボザイム、ハンマーヘッド リボザイム、手斧リボザイム、デルタ型肝炎ウイルスのリボザイム、リガーゼ リボザイム、ピストル リボザイム、ツイスター姉妹リボザイム、Vg1リボザイム、VSリボザイム、及び前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される。別の実施形態では、前記5'及び3'連結配列は、in situで天然リガーゼの基質である。さらなる実施形態では、前記天然リガーゼは、RtcBである。別の実施形態では、前記IRESは、配列番号：1～1328の配列及びそのTがUである場合の配列のいずれか1つの配列を含む。別の実施形態では、前記少なくとも1つの抗原性ポリペプチドは、自己切断ペプチドによって分離された2つ以上の抗原性ポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、前記自己切断ペプチドは、2Aまたは2A様ペプチドを含む。さらなる実施形態では、前記2Aまたは2A様ペプチドは、GSGリンカー部分をさらに含む。さらに別の実施形態では、前記5'及び3'リボザイム配列は、5'-GCCATCAGTCGCCGGTCCCAAGCCCGGATAAAATGGGAGGGGGCGGGAAACCGCCT-3'(配列番号：1354)または5'-AACACTGCCAATGCCGGTCCCAAGCCCGGATAAAAGTGGAGGGTACAGTCCACGC-3'(配列番号：1355)、及びTがUである場合の前記配列のいずれかと少なくとも85～100%同一である配列から独立して選択される。別の実施形態では、前記5'及び3'連結配列は、5'-AACCATGCCGACTGATGGCAG-3'(配列番号：1356)または5'-CTGCCATCAGTCGGCGTGGACTGTAG-3'(配列番号：1357) 、及びTがUである場合の前記配列のいずれかと少なくとも85～100%同一である配列から独立して選択される。別の実施形態では、前記IRES配列は、5'-gcggccgcgtcgacgggcccgcggaattccgccccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaacc-3' (配列番号：1358) 及びTがUである場合の該配列と少なくとも85～100%同一である。別の実施形態では、前記抗原性ポリペプチドは、SARS-CoV-2スパイク タンパク質を含む。別の実施形態では、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドは、自己増幅RNA構築物内に含まれる。さらなる実施形態では、前記自己増幅RNA構築物は、アルファウイルスまたはパラミクソウイルスを含む。

本開示はまた、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物を含むプラスミドまたはキャプシドを提供する。一実施形態では、前記プラスミドまたはキャプシドは、AAVベースのプラスミドまたはキャプシドである。別の実施形態では、前記プラスミドは、Cas9タンパク質及びgRNAを発現する。

本発明はまた、前記実施形態のいずれかのリボザイムで活性化されたRNA構築物を含むコンビナトリアル スクリーンを提供する。

特定の実施形態では、本開示は、プライマー領域、バーコード領域、及び第2人工RNA要素の配列に対する相補的配列を含む第1人工RNA要素（ここで、第1人工RNAテンプレートは、第1自己切断リボザイムに繋留される）及びプライマー領域、バーコード領域、及び第1人工RNA要素の配列に対する相補的配列を含む第2人工RNA要素（ここで、第2人工RNAテンプレートは、第2自己切断リボザイムに繋留される）を含むリボザイムで媒介されたRNA融合構築物またはシステムを提供し、ここで、前記第1及び第2自己切断リボザイムによるそれぞれ第1及び第2人工RNA要素の切断は、共にハイブリダイズされるコメンタリ配列からのdsRNAの領域を含むハイブリダイゼーション構築物を提供し、またここで、前記ハイブリダイゼーション構築物は、RNAリガーゼによってさらに連結され、RNA融合構築物を形成することができる。さらなる実施形態では、前記第1人工RNA要素は、前記第2人工RNA要素からのバーコード領域とは異なる配列を有するバーコード領域を含む。またさらなる実施形態では、前記第1人工RNA要素は、前記第2人工RNA要素からのプライマー領域とは異なる配列を有するプライマー領域を含む。別の実施形態では、前記第1及び第2相補的配列は、長さが30～60 bpである。さらに別の実施形態では、前記第1及び第2相補的配列は、長さが40～50 bpである。さらなる実施形態では、前記第1及び第2リボザイムは、ツイスター リボザイムである。またさらなる実施形態では、前記第1リボザイムは、P3ツイスター リボザイムである。別の実施形態では、前記第2リボザイムは、P1ツイスター リボザイムである。さらなる実施形態では、前記RNAリガーゼは、RtcBである。

別の実施形態では、本開示はまた、本明細書に記載の第1人工要素を含むベクターまたはプラスミドを提供し、 ここで、前記第1人工要素は、第1 RNAプロモーター及び第1摂動要素の下流に位置する。さらに別の実施形態では、本開示はまた、本明細書に記載の第2人工要素を含むベクターまたはプラスミドを提供し、ここで、前記第2人工要素は、第2 RNAプロモーター及び第2摂動要素の下流に位置する。さらなる実施形態では、前記第1 RNAプロモーター及び／または第2 RNAプロモーターは、ポリメラーゼIIIプロモーターである。またさらなる実施形態では、前記ポリメラーゼIIIプロモーターは、hU6プロモーターである。特定の実施形態では、前記第1摂動要素及び／または第2摂動要素は、CRISPRノックアウトスクリーニングで利用されるsgRNAである。

特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のベクターまたはプラスミドを含むコンビナトリアル スクリーンをさらに提供する。

特定の実施形態では、本開示は、イントロン配列、第2人工RNA要素の配列に対する相補的配列、及び3'アプタマーを含む第1人工RNA要素（ここで、第1人工RNAテンプレートは、第1自己切断リボザイムに繋留され、またここで、前記3'アプタマーは、第1自己切断リボザイムと相互作用し、それを安定化させる）及びイントロン配列、第1人工RNA要素の配列に対する相補的配列、及び3'アプタマーを含む第2人工RNA要素（ここで、第2人工RNAテンプレートは、第2自己切断リボザイムに繋留され、またここで、前記3'アプタマーは、第2自己切断リボザイムと相互作用し、それを安定化させる）を含む誘導性リボザイムで媒介されたRNA融合構築物またはシステムを提供し、ここで、前記第1及び第2自己切断リボザイムによるそれぞれ第1及び第2人工RNA要素の切断は、共にハイブリダイズされるコメンタリ配列からのdsRNAの領域を含むハイブリダイゼーション構築物を提供し、またここで、前記ハイブリダイゼーション構築物は、RNAリガーゼによってさらに連結されて、RNA融合構築物を形成することができる。さらなる実施形態では、前記イントロン配列は、ジヒドロ葉酸還元酵素に由来する。さらに別の実施形態では、治療用遺伝子またはタンパク質の一部が、イントロン配列のそれぞれに融合される。別の実施形態では、前記治療用遺伝子またはタンパク質は、ヒトインスリン遺伝子、凝固因子IX、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節タンパク質、及びジストロフィンタンパク質から選択される。

図1A～Cは、予備試験からの結果を提供する。(A) RNAレベルでの異種バーコードの融合を示す概略図。(B) fragL及びfragRの単独または組み合わせでのプラスミド遺伝子導入のRT-PCR後のゲル電気泳動画像。(C) 予想される融合物(配列番号：1347)と比較した、パネルBに示された精製されたPCR産物のサンガー配列決定トレース。

図2A～Eは、以下を提供する：(A) リボザイム、相補的リンカー、リボザイムで媒介されたRNA融合構築物のバーコードとプライマーが、CRISPRノックアウトスクリーニングで利用されるsgRNA等の摂動の下流にクローン化されるコンビナトリアル スクリーンのためのプラスミド設計を示す概略図。(B) sgRNA_fragL及びsgRNA_fragR構築物の単独または組み合わせでの HEK293T細胞のプラスミド 遺伝子導入後のRT-PCRのゲル電気泳動。(C) アンチセンス_fragL及びアンチセンス_fragR構築物(配列番号：1348)の単独または組み合わせでのHEK293T細胞のプラスミド遺伝子導入後のRT-PCRのゲル電気泳動。(D～E) アンチセンス指向性RNA融合物（配列番号：1349）からの精製されたPCXR産物のサンガー配列決定トレース。

図3は、誘導性遺伝子発現のためのリボザイムで媒介されたRNA融合アプローチを示す概略図を提供する。治療用ペイロードは、2つの構築物の間に分割される。fragL構築物は、イントロン配列に融合したタンパク質のN末端、相補的領域、自己切断リボザイム、相補的領域、 イントロン配列、及び治療用タンパク質のC末端を含む。アプタマー結合リガンドを添加すると、アプタマーとリボザイムの間の三次相互作用が破壊され、転写物の自己触媒的な切断が可能になる。前記相補的領域は、互いにハイブリダイズし、生成された末端は、内在性RNAリガーゼRtcB によって連結される。前記イントロン配列が互いに並置されると、細胞のスプライシング機構がスプライス部位を認識することができ、完全長の機能性タンパク質を作製する。

図4は、PoIIIプロモーターからのRNA融合の概略図を示す。2つの構築物が、緑色蛍光タンパク質(GFP)の2つの半分を含むpx600 AAV主鎖にクローン化される。各GFPは、DHFRイントロンに連結され、RNA融合リンカー(45 bp の相補的領域)及びP3(GFP-L)またはP1(GFP-R)ツイスター リボザイムのいずれかを含有する。転写時に、前記リボザイムは、自己切断を受けて、5'ヒドロキシル末端と2',3'-環状リン酸末端を生成する。次に、相補的リンカー領域がハイブリダイズし、RtcBによって連結され、イントロン配列を互いに接近させる。そして、内在性スプライソソーム機構が、イントロンを刺激し、蛍光GFP 分子を生成する。

図5A～Cは、以下を示す：(A) GFPの1つの半分（GFP-左またはGFP-右）とスプライソソームによって認識されるイントロン配列に結合したRNA融合機構を含むプラスミドをHEK293FT細胞に遺伝子導入してから48時間後に撮影した蛍光画像。(B) パネルAに示されるHEK293FT細胞からRNAを単離し、プライマーを用いてGFP転写物の両方の半分についてRT-PCRを実施した。(C) 前記PCR産物を精製し、サンガー配列決定し（配列番号：1350）、完全長タンパク質の適切な連結を確認した。

図6A～Eは、以下を示す：(A) GFPの1つの半分（GFP-左またはGFP-右）及び異なるイントロン配列に結合したRNA融合機構を含むプラスミドをHEK293FT細胞に遺伝子導入してから48時間後に撮影した蛍光画像。(B) 48時間後に遺伝子導入された細胞についてフローサイトメトリーを行い、GFP+細胞のパーセントを定量した。(C) 48時間後のDHFRイントロンを使用したGFPのRT-qPCR相対発現。(D) 48時間後のpCI構築物を使用したGFPのRT-qPCR相対発現。(E) 相補的配列が存在する場合の相対的なGFP発現レベルを比較するqPCRから活性化率を計算した。

図7は、遺伝子導入の48時間後に単離され、フローサイトメトリーによって分析された細胞の結果を示す。存在する全細胞中のGFP+細胞の割合が示されている。

図8A～Bは、以下を示す：(A) ポリメラーゼ II 及びポリメラーゼ III 様 H1プロモーターによって駆動されるリボザイムで媒介されたRNAバーコード融合構築物のプラスミド設計の概略図；(B) 陰性対照(lentiCRISPRv2プラスミド主鎖)、またはU6またはH1プロモーターによって駆動されるfragL及びfragR構築物の両方で遺伝子導入された細胞のRNA融合構築物の定量的RT-PCR(qRT-PCR) (GAPDHに正規化)によって測定された相対発現。

図9A～B は、以下を提供する：(A) リボザイムで媒介された環状化RNAバーコードの設計を示す概略図。fragL構築物の3'末端は、「デザイナー エクソン」とイントロンで修飾されるが、一方、fragR構築物の5'末端は、イントロンとそれに続く「デザイナー エクソン」によって媒介される。転写されると、前記リボザイムは、自己切断し、相補的配列がハイブリダイズし、前記デザイナー エクソンとイントロンが互いに並置される。これは、スプライスソームによって認識され、バックスパイシング反応が起こり、イントロンがスプライスアウトされ、エクソンが結合されて、完全に環状化された構築物が形成される。(B) circ-fragL及びcirc-fragR構築物で遺伝子導入された細胞に対するパネル(A)に示されるプライマー対を利用したRT-PCRアッセイからのアガロースゲル画像。

図10は、エクソン スプライシング促進因子(ESE)要素が表示されたデザイナー エクソンの配列及び重要な特徴が強調表示されたfragL及びfragR構築物と共に使用されるイントロン配列(配列番号：1351～1353)を示す。

図11A～Bは、(A) GFP-pCI-L構築物がU6プロモーターによって駆動され、GFP-pCI-R構築物がCMVプロモーターによって駆動される二重プロモーター システムのプラスミド設計を示す概略図、及び(B) qRT-PCTによって測定されたGFP RNA転写物の相対発現を示す。全長と、リボザイム及び相補的配列を含まない連鎖無しの構築物との間の活性化倍率を2つのグラフの上に示す。

図12A～Cは、以下を示す：(A) 目的の遺伝子(GOI)の3'UTRに埋め込まれたテトラサイクリン応答性ハンマーヘッド アプタザイムを使用した誘導性遺伝子発現のメカニズムを示す概略図、(B)遺伝子導入の4～6時間後にDMEM(-)またはテトラサイクリン(+)を添加し、その48時間後に採取された細胞培養上清からのインスリンELISA吸光度値、及び(C) 遺伝子導入の48時間後に採取された細胞培養上清からのインスリンELISA吸光度値。遺伝子導入の4～6時間後に、より高濃度のテトラサイクリンを添加した。

図13A～Bは、(A) 遺伝子発現誘導に対する効果が評価された様々なリボザイム位置の概略図、及び(B) HEK293T細胞における遺伝子導入の48時間後の、パネル(A)に示されるプラスミド設計についての細胞培養上清のインスリンELISAレベルを示す。

図14A～Eは、以下を示す：(A) リボザイムで媒介された誘導性SaCas9構築物のプラスミド設計の概略図、(B) HEK293T細胞における遺伝子導入の48時間後に定量的PCRによって測定されたSaCas9 mRNAレベル、(C) Pcsk9遺伝子のテトラサイクリン誘導性Cas9で媒介された編集を評価するために実施された実験の予定表。矢印は、血液が採取された時点(B)、テトラサイクリンが連続3日間投与された時点(T)、または肝臓が採取された時点(H)を示す。(D) AAV8投与後の様々な時点で測定されたPCSK9血清レベル、及び(E) 5週間及び7週間の時点で、AAV8-SaCas9-Ribo構築物を注射されたマウスの肝臓で測定された編集率。

図15は、直線状のRNA構築物がin situで環状化されるin vitroで転写されたRNA送達システムを概略的に示す。該実施形態では、in vitroで直線状のRNAが生成され、該直線状のRNAが細胞内に送達され、これがin situで環状化する。いくつかの実施形態では、これは、in situでのみ環状化する。

図16A～Dは、(A) 環状RNA(配列番号：1329)を操作するための一般的なテンプレート（ここで、ペイロードは、GFPとして提供されるが、任意の目的のポリペプチドであり得る）、(B) 前記環状のRNA構築物及び結果として生じる、1、2、及び 3 日目の直線状及び環状の構築物を比較するGFP発現の概略図、(C) 蛍光発現及び発現の顕微鏡写真、及び(D) 経時的な相対GFP RNA発現を提供する。

図17A～Cは、(A) 例示的なCRISPR/ZF/TALE/遺伝子のペイロードを含む環状フォーマットの概略図、(B) ジンク フィンガー(ZF)タンパク質を含む直線状対環状の構築物の編集効率を示すグラフ、及び(C) Cas9タンパク質を含む構築物の編集効率を示すグラフを提供する。

図18は、自己増幅RNA構築物(配列番号：1330)を含む環状化RNAをin situで生成するための構築物の設計を示す。

図19は、本開示の方法及び組成物において有用なIRESの配列(表2)を提供する。

図20は、本開示の方法及び組成物において有用な環状の構築物(配列番号：1331～1346)の配列を提供する。

詳細な説明

本明細書及び添付の請求項で使用されるように、単数形の「１つ」及び「該」は、文脈中に明記されない限り、複数の参照物を含む。従って、例えば、「プロドラッグ」への言及は、複数のそのようなプロドラッグを含み、「化学療法剤」への言及は、1種以上の化学療法剤及び当業者に公知のそれらの等価物への言及を含む、等。

また、「または」の使用は、特に明記されていない限り、「及び／または」を意味する。同様に、「含む」、「含んでいる」、「包含する」、及び「包含している」は、交換可能であり、限定することを意図するものではない。

理解されることとして、様々な実施形態の記述が用語「含む」を使用する場合、当業者は、いくつかの特定の例において、実施形態が「本質的にからなる」または「からなる」という表現を用いて代替的に説明できることを理解するであろう。

特に限定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。多くの方法及び試薬は、本明細書に記載されたものと類似または同等であるが、本明細書には例示的な方法及び材料が開示されている。

本明細書に言及される全ての刊行物は、本明細書の記載と関連して使用され得る方法論を記載し、開示するために、参照により本明細書に完全に組み込まれる。さらに、本開示に明示的に定義されている用語と類似または同一である1つ以上の刊行物に提示される任意の用語に関して、本開示に明示的に提供される用語の定義は、全ての点において制御するであろう。

理解されるべきこととして、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬等に限定されず、従って、変化し得る。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、請求項のみによって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例、または他に示された場合を除いて、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、本発明を説明するために使用される場合、割合に関連して±1%を意味する。

本明細書で使用される「アルファウイルス」という用語は、当技術分野における従来の意味を有し、ベネズエラ馬脳炎(VEE)ウイルス、東部馬脳炎(EEE)ウイルス、エバーグレーズ ウイルス(EVE)、ムカンボ ウイルス((MUC)、ピクスナウイルス(PIX)、及び西部馬脳炎ウイルス等の様々な種を含む。これらは全て、アルファウイルスのVEE/EEEグループのメンバーである。他のアルファウイルスには、例えば、セムリキ フォレスト ウイルス(SFV)、シンドビス、ロス リバー ウイルス、チクングニア ウイルス、S.A. AR86、バーマ フォレスト ウイルス、ミドルバーグ ウイルス、オニョンニョン ウイルス、ゲタ ウイルス、サギヤマ ウイルス、ベバル ウイルス、マヤロ ウイルス、ウナ ウイルス、オーラ ウイルス、ワタロア ウイルス、バンバンキ ウイルス、キジルガハ ウイルス、ハイランズJウイルス、フォート モーガン ウイルス、ンドゥム ウイルス、及びバギー クリーク ウイルスが含まれる。本明細書に記載の構築物及び方法において特に有用なアルファウイルスは、VEE/EEEグループのアルファウイルスである。

「アルファウイルスRNAレプリコン」、「アルファウイルス レプリコンRNA」、「アルファウイルスRNAベクター レプリコン」、「ベクター レプリコンRNA」、及び「自己複製RNA構築物」という用語は、非構造タンパク質遺伝子を発現するRNA分子を指すために互換的に使用され、これにより、これは、自身の複製（増幅）を指示することができ、少なくとも5'及び3'アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質のコーディング配列、及びポリアデニル化トラクトを含む。これは、目的のコーディング配列の発現、即ち、転写及び翻訳を指示するための１つ以上の要素（例えば、IRES配列、コアまたはミニプロモーター、2Aペプチド配列等）をさらに含んでもよい。本開示のアルファウイルスレプリコンは、一実施形態では、5'及び 3'アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質のコーディング配列、ポリアデニル化トラクトを含むことができる。

本明細書で使用されるように、用語「アデノ随伴ウイルス」または「AAV」は、該名称に関連し、パルボウイルス科の属依存性パルボウイルスに属するウイルスクラスのメンバーを指す。該ウイルスの複数の血清型は、遺伝子送達に適し得る。いくつかの場合では、血清型が、様々な組織型からの細胞に感染することができる。AAV血清型の例は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、 及びAAV11である。本明細書に開示される目的に有用な血清型の非限定的な例は、前記11種の血清型のいずれか、例えば、AAV2及びAAV8を含む。

本明細書で使用されるように、核酸分子（例えば、人工ガイドRNA)の文脈で使用される用語「環状化された」及び／または「環状の」は、一般に、次々にヌクレオチドを有する環状の二次元フォーマットのポリヌクレオチド配列として表現できる核酸分子を指すことができる。ここで、該表現されるポリヌクレオチドが環状のまたは閉鎖されたループである。いくつかの実施形態では、環状の核酸分子は、溶媒に暴露できる5'還元性ヒドロキシル、3'還元性ヒドロキシル、またはこれらの両方を含まない。

本明細書で使用される「相補的」という用語は、ヌクレオチド間のワトソン・クリック塩基対形成を指し、特に、2つの水素結合によってアデニン残基に結合したチミンまたはウラシル残基及び3つの水素結合で結合したシトシン残基とグアニン残基で互いに水素結合したヌクレオチドを指すために用いられる。一般に、核酸には、特定の第2のヌクレオチド配列に対して「パーセント相補性」または「パーセント相同性」を有すると説明されるヌクレオチド配列が含まれる。例えば、ヌクレオチド配列は、特定の第2のヌクレオチド配列に対して80%、90%、または100%の相補性を有し得る。これは、ある配列の10ヌクレオチドのうち8ヌクレオチド、10ヌクレオチドのうち9ヌクレオチド、または10ヌクレオチドのうち10ヌクレオチドが、該特定の第2のヌクレオチド配列に対して相補的であることを示す。

用語「コードする」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、その天然状態または操作された場合、ポリペプチドをコードすると言われ、転写及び／または翻訳でき、ポリペプチドのmRNA及び／またはその断片を産生するポリヌクレオチドを指すことができる。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、それからコーディング配列を推定することができる。

「等価物」または「生物学的等価物」という用語は、所望の構造または機能性を維持しながら、最小の相同性を有する特定の分子、生物学的または細胞性の材料を参照するときに交換可能に使用される。

本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写されるプロセス及び／または転写されたmRNAがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指すことができる。前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAから誘導される場合、発現は、真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含むことができる。

「相同性」、「同一性」、または「類似性」は、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性を指すことができる。相同性は、比較のために整列され得る各配列内の位置を比較することで測定できる。例えば、比較される配列における位置が同一の塩基またはアミノ酸で占められている場合、分子が該位置で相同である。配列間の相同性の程度は、該配列によって共有される一致または相同の位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同の」配列は、本開示の配列の1つと40%未満の同一性、あるいは25%未満の同一性を共有する。

相同性は、参照配列と百分率(%)の配列同一性を指すことができる。実際問題として、特定の配列が、本明細書に記載の任意の配列(これは、本明細書に記載の特定の核酸配列に対応し得る)と少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であろうと、このような特定のペプチド、ポリペプチド、または核酸配列は、従来公知のコンピュータプログラム、例えば、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) を用いて測定することができる。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が参照配列と例えば95%同一であるかどうかを測定する場合、同一性の百分率が参照配列の全長にわたって計算され、全参照配列の5%までの同一性のギャップが許容されるようにパラメータを設定することができる。

例えば、特定の実施形態では、参照配列(問い合わせ配列、本開示の配列)と、グローバル配列整列とも呼ばれる対象配列との間の同一性は、FASTDBコンピュータプログラムを用いて測定できる。いくつかの場合では、同一性が狭く構築された特定の実施形態のための、FASTDBアミノ酸整列において使用されるパラメータは、以下を含むことができる：スコアリング スキーム=PAM(許容される突然変異の百分率)0、k-tuple=2、ミスマッチ ペナルティ=l、結合ペナルティ=20、ランダム化グループ長さ=0、カットオフ スコア=1、ウィンドウ サイズ=配列長、ギャップ ペナルティ=5、ギャップ サイズ ペナルティ=0.05、ウィンドウ サイズ=500、またはより短い対象配列の長さ。該実施形態によれば、対象配列は、内部欠失ではなく、N-またはC-末端の欠失により、問い合わせ配列よりも短いであれば、グローバル百分率同一性を計算するときに、FASTDBプログラムが対象配列のN末端及びC末端の切り捨てを考慮しないという事実を考慮して、結果を手動で補正することができる。N-及びC-末端で切断された対象配列に対して、問い合わせ配列に対して、対応する対象残基と一致／整列されていない、対象配列のN-及びC-末端に対して横方向である問い合わせ配列の残基の数を、問い合わせ配列の全塩基の百分率として計算することによって、百分率同一性を補正することができる。該FASTDB配列整列の結果により、残基が一致／整列しているか否かの測定を行うことができる。次いで、該百分率は、特定のパラメータを用いてFASTDBプログラムによって計算された百分率同一性から減算され、最終の百分率同一性スコアを得ることができる。該最終百分率同一性スコアは、本実施形態の目的に使用することができる。いくつかの場合では、問い合わせ配列と一致／整列されていない対象配列のN-及びC-末端への残基のみが、百分率同一性スコアを手動で調節する目的のために考慮される。即ち、この手動補正のために、対象配列の最も遠いN末端残基の外側の問い合わせ残基位置のみが考慮される。例えば、90個の残基の対象配列を100残基の問い合わせ配列と整列させて、百分率同一性を測定することができる。この欠失は、対象配列のN末端で起こるので、FASTDB整列は、該N末端の最初の10個の残基の整合／整列を示さない。10個の不対残基は、配列の10％を表す（一致しないN末端とC末端の残基数／問い合わせ配列の残基の総数）ので、FASTDBプログラムによって計算された百分率同一性スコアから10％が差し引かれる。残りの90個の残基が完全に一致した場合、最終の百分率同一性は90%とすることができる。別の例では、90個の残基の対象配列は、100個の残基の問い合わせ配列と比較される。今回は、欠失が内部欠失であるため、該問い合わせ配列と一致／整列されていない対象配列のN-またはC-末端に残基が存在しない。この場合、FASTDBにより算出された同一性百分率は手動で補正されない。繰り返すと、問い合わせ配列と整合／整列されていない対象配列のN-及びC-末端の外側に位置する残基のみが、FASTDB整列に表示されるように手動で補正される。

「ハイブリダイゼーション」は、1つ以上のポリヌクレオチドが反応し、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指すことができる。前記水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成やホーグシュタイン結合によって、または他の任意の配列特異的な方法で生じることができる。前記複合体は、二本鎖構造を形成する2本鎖、多本鎖複合体を形成する3本以上の鎖、単一の自己ハイブリッド化鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。ハイブリダイゼーション反応は、PC反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のような、より広範なプロセスにおいて工程を構成することができる。

厳密なハイブリダイゼーション条件の例として、以下が含まれる：インキュベーション温度:約25℃～約37℃、ハイブリダイゼーション緩衝液の濃度:約6x SSC～約10x SSC、ホルムアミドの濃度:約0%～約25%、及び洗浄溶液:約4x SSC～約8x SSC。適度なハイブリダイゼーション条件の例として、以下が含まれる：インキュベーション温度：約40℃～約50℃、緩衝液の濃度：約9x SSC～約2x SSC、ホルムアミドの濃度：約30%～約50%、及び洗浄溶液：約5x SSC～約2x SSC。高度に厳密なハイブリダイゼーション条件の例として、以下が含まれる：インキュベーション温度：約55℃～約68℃、緩衝液の濃度:約lx SSC～約0.1x SSC、ホルムアミドの濃度：約55%～約75%、及び洗浄溶液：約lx SSC、0.lx SSC、または脱イオン水。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、1つ、2つまたはそれ以上の洗浄工程で、5分間～24時間であり、また、洗浄のインキュベーション時間は、約1、2または15分間である。SSCは、0.15 M NaCl及び15 mMクエン酸塩緩衝液である。理解されることとして、他の緩衝系を用いたSSCに相当する物を利用することができる。

本明細書で使用されるように、用語「単離された」は、他の材料を実質的に含まない分子、生物学的または細胞性の材料を指すことができる。一態様では、用語「単離された」は、DNAまたはRNAのような核酸、またはタンパク質またはポリペプチド(例えば、抗体またはその誘導体)、または他のDNAまたはRNAから分離された細胞または細胞小器官、または組織または器官、または自然源に存在するタンパク質またはポリペプチド、または細胞または細胞小器官、または組織または器官を指すことができる。用語「単離された」はまた、細胞材料、ウイルス材料、または組換えDNA技術によって産生された場合の培地、化学的に合成された場合の化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指すことができる。また、「単離された核酸」は、断片として自然に存在せず、かつ自然な状態では発見できない核酸断片を含むことを意味する。いくつかの場合では、用語「単離された」はまた、他の細胞タンパク質から単離され、精製された及び組換えのポリペプチドの両方を包含することを意味するポリペプチドを指すために使用される。いくつかの場合では、用語「単離された」はまた、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すために使用され、培養及び人工の細胞または組織の両方を包含することを意味する。

「連結配列」とは、ワトソン・クリック塩基対形成を可能にし、リガーゼ、例えばRNAリガーゼのようなリガーゼによる連結に適した基質を形成する別の配列に相補的な配列を指す。一実施形態では、5'連結配列及び3'連結配列は、RtcB等（これに限定されない）のRNAリガーゼのための基質である。前記5'及び3'連結配列は、連結されると、本開示のRNA分子を環状化する。このような環状化により、RNA分解が減少し、in vivoでの持続性が改善される。

「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素が通常の機能を実行するように構成されている要素の配置を指す。従って、コーディング配列に作動可能に連結された制御配列は、コーディング配列の転写、場合によっては翻訳に影響を与えることができる。前記制御配列は、コーディング配列の発現を指示するように機能する限り、コーディング配列と連続している必要はない。

用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体または組み合わせいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、任意の機能を実行することができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、RNAi、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体のような修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの組み立ての前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との抱合による重合の後にさらに修飾することができる。該用語はまた、二本鎖及び一本鎖分子の両方を指すことができる。特に明記または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施態様は、二本鎖形態及び二本鎖形態を構成することが知られているかまたは予測される2つの相補的な一本鎖形態の両方を包含することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、RNAヌクレオチド及びDNAヌクレオチドの両方を含むことができる。

用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現であり得る。該アルファベット表現は、中央処理装置を有するコンピュータ内のデータベースに入力することができ、機能的ゲノミクス及び相同性検索のような生物情報学的な用途に使用することができる。いずれのアルファベット表現においても、本開示は、RNA及びDNA（即ち、「T」は「U」に置換され、またはその逆) の両方を意図している。

特定の実施形態では、「プロモーター」は、作動可能に連結された核酸の転写を駆動するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「プロモーター」とは、RNAポリメラーゼの結合部位を含み、下流の核酸配列の転写を開始させるDNA配列を指す。本開示で使用するためのプロモーターは、構成的で、誘導でき、または組織に特異的であり、または経時的なプロモーターであり得る。適切なプロモーターは、ウイルス、原核生物、及び真核生物に由来し得る。適切なプロモーターを使用して、任意のRNAポリメラーゼによる発現を駆動できる。誘導性プロモーターの例には、T7 RNAポリメラーゼ プロモーター、T3 RNAポリメラーゼ プロモーター、イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で調節されるプロモーター、乳糖に誘導されるプロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリンで調節されるプロモーター、ステロイドで調節されるプロモーター、金属で調節されるプロモーター、エストロゲン受容体で調節されるプロモーター等が含まれるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン等の様々な分子で調節され得る。一実施形態では、前記プロモーターは、T7、T3、SP6、及びそれらの誘導体からなる群から選択される原核生物プロモーターである。

本明細書で使用される場合、「リボザイム」（リボ核酸酵素）は、生化学反応を触媒できるRNA分子である。「自己切断リボザイム」は、それ自体を切断できるリボザイムである。本開示で使用されるリボザイムは、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、デルタ型肝炎ウイルス、ヴァルクッド サテライト、ツイスター、ツイスター姉妹、ピストル、及び手斧を含む標的細胞型において自己切断する任意の小さなエンドヌクレオチド分解性リボザイムであり得る。例えば、Roth et al., Nat Chem Biol. 10(1):56-60及びWeinberg et al., Nat Chem Biol. 2015 August; 11(8):606-10を参照されたい。その両方とも参照により本明細書に組み込まれる。U.S. 2015/0056174は、ヌクレオチド鎖切断活性が増強された修飾ハンマーヘッド リボザイムを提供している。リボザイムは、基質切断部位で配列特異的な方法で基質RNAを切断する。通常、リボザイムは 2つの結合領域が隣接する触媒領域を含む。前記リボザイム結合領域は、基質RNAにハイブリダイズし、一方、触媒領域は、基質切断部位で基質RNAを切断し、切断されたRNA産物を産生する。様々な実施形態では、様々な構築物の5'または3'は、ツイスター リボザイムまたはツイスター姉妹リボザイムであり得る。例えば、様々な構築物の 5'及び3'リボザイムは、P3または P1ツイスター リボザイムのいずれかであるが、両方ともP3または両方とも P1ではない。

本明細書で使用されるように、用語「形質転換」及び「遺伝子導入」は、外来核酸を宿主細胞に導入するための様々な当技術分野で認められた技術を指すことを意図している。該技術には、例えば、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、DEAE-デキストランで媒介された遺伝子導入、リポフェクション（例えば、LIPOFECTIN(登録商標) (Invitrogen Corp., San Diego, CA)、LIPOFECTAMINE(登録商標)(Invitrogen)、FUGENE(登録商標)(Roche Applied Science, Basel, Switzerland)、JETPEI(登録商標)(Polyplus-transfection Inc., New York, NY)、EFFECTENE(登録商標)(Qiagen, Valencia, CA)、DREAMFECT(登録商標)(OZ Biosciences, France)等のような市販の試薬を使用)、または電気穿孔法が含まれる。宿主細胞を変換または遺伝子導入するのに適した方法は、Sambrookら(「分子クローン化：実験マニュアル」、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y., 1989)及び他の実験マニュアルに見出すことができる。本明細書で使用される標準的な組換えDNA及び分子クローン化技術は、当業界で周知され、Sambrook, J., Fritsch, E.F.とManiatis, T.による「分子クローン化：実験マニュアル」、第二版; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.,(1989)、Silhavy, T.J., Bennan, M.L.とEnquist, L.W.による「遺伝子融合実験」; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y., (1984); 及びAusubel, F.M.らによる「分子生物学における最新プロトコル」、Greene Publishing and Wiley-Interscience (1987)に記載されている。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらなる有用な方法は、「先進細菌遺伝学」(Davis, RothとBotstein, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980)、「遺伝子融合実験」(Silhavy, BermanとEnquist, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984)、「分子遺伝学実験」(Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972)、「細菌遺伝学における実験技術」(Maloy, in JonesとBartlett, 1990)、及び「細菌遺伝学に関する短期コース」(Miller, Cold Spring Harbor Laboratory 1992)を含むマニュアルに記載されている。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用されるように、用語「治療する」、「治療している」、及び「治療」は、疾患または障害に関連する症状を改善することを指す。また、用語「治療する」、「治療している」、及び「治療」は、前記疾患または障害の発症を予防するまたは遅延させること、及び／または前記疾患または障害の症状の重症度または頻度を低減させることを含む。

本明細書で使用されるように、用語「ベクター」は、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）等を含むがこれらに限定されない、異なる宿主間での伝達のために設計された核酸構築物を指すことができる。いくつかの実施形態では、「ウイルス ベクター」は、in vivo、ex vivoまたはin vitroのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換えで産生されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。いくつかの実施形態では、プラスミド ベクターは、市販のベクターから調製することができる。他の実施形態では、ウイルス ベクターは、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びAAVから製造することができる。一実施形態では、前記ウイルス ベクターは、レンチウイルス ベクターである。ウイルス ベクターの例としては、レトロウイルス ベクター、アデノウイルス ベクター、アデノ関連ウイルス ベクター、アルファウイルス ベクター等が含まれる。感染性タバコモザイク ウイルス(TMV)ベースのベクターは、タンパク質の製造に使用でき、また、タバコ葉においてグリフィスシンを発現することが報告されている。セムリキフォレストウイルス ベースのベクター及びシンドビスウイルス ベースのベクターのようなアルファウイルス ベクターも、遺伝子治療及び免疫療法での使用のために開発されている。遺伝子導入がレトロウイルス ベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、前記レトロウイルス ゲノムまたはその一部、及び目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドを指すことができる。

本開示は、コンビナトリアル遺伝子相互作用スクリーン及び誘導性遺伝子発現のためのRNAベースの読み取りに利用できる連結されたRNA融合構築物を作製するための、人工内因性RNA処理機構の実装について記載する。別々に転写された配列は、互いに相補性を持ち、自己切断リボザイムに融合される。転写されると、前記リボザイムの自己触媒活性によって転写物が切断され、固有の末端が作製される。相補的領域により、前記2つの転写物は、ハイブリダイズし、切断された末端が並置され、内因性RNAリガーゼによって認識され、連結された融合構築物が作製される。本開示はさらに、細胞に送達された2つの転写物を異なるライブラリー要素上で連結するこのアプローチの適用可能性を実証し、イントロン配列に連結された場合、前記RNA融合構築物は、全長遺伝子産物の制御可能な発現に利用することができる。

本開示は、複数の内因性処理事象を受けて、コンビナトリアル遺伝子スクリーンまたは誘導性遺伝子発現を含む様々な用途に使用できる連結されたRNA融合構築物を作製する、人工RNA要素の使用について記載する。左側断片(fragL)及び右側断片(fragR)と呼ばれるこれらの要素は、ポリメラーゼII及びポリメラーゼIIIのプロモーターの両方から発現されるように操作されている。特定の実施形態では、前記RNA要素は、隣接する増幅プライマー及び／または可変バーコード領域をさらに含むことができる。図1Aに示されるように、前記RNA要素は、互いに45塩基対（bp）の相補的領域を含み、P3及びP1自己切断ツイスター リボザイムに繋留している。転写時に、前記P3ツイスター リボザイムは、自己切断し、前記fragL構築物上に5'ヒドロキシル基を生成し、一方、前記P1ツイスター リボザイムは、前記fragR構築物の3'末端に2',3'-環状リン酸基を生成する。前記断片の相補的領域により、次に、前記2つの転写物は、ハイブリダイズし、これら2つの末端が並置され、内因性リガーゼRtcBによる認識が可能になり、連結された融合構築物が作製される。これらの構築物の内因性処理を使用することにより、追加因子を加える必要はない。細胞に個別に送達されるが、下流で共に分析され、融合される2つの異なるライブラリー要素を連結することは、様々な用途に非常に役立つ。さらに、前記ツイスター リボザイムは、転写時に、数十秒から数分以内に急速に自己触媒的な自己切断を受け、連結された構築物の半減期は、個々の転写物よりも長いため、このアプローチは、複数の時間スケールにわたって頑強なものになる。

融合構築物の選択は、完全に調整可能であり、さらなるクラスのリボザイムまたは転移RNAを異なるリガーゼ及びRNA処理酵素と組み合わせて使用して、高次元の融合結合を作製することが可能である。

fragL及びfragRをU6プロモーターの下流のlentiCRISPRv2主鎖にクローン化する単純なプラスミド遺伝子導入実験を通じて、このアプローチの実現可能性を実証する。これらを個別にまたは組み合わせて細胞に送達し、48時間後にRNAを単離した。隣接する増幅プライマーを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実施した。図1Bに示されるように、生成されたRNA融合物は、両方のプラスミドが共に遺伝子導入された場合のみに観察された。次いで、該PCR産物を精製し、サンガー配列決定して、予想される融合物配列を確認した（図1C）。

遺伝子相互作用スクリーンの従来の実施に関する主な制限として、遺伝子型から表現型へのマッピングを可能にするために、同じライブラリー要素上の複数の摂動を物理的に連結する必要性がある。これにより、ライブラリーの生成が複雑になり、異なるクラスのゲノム及びトランスクリプトーム エンジニアリング ツールセットを容易に組み合わせることができなくなる。

本開示は、複数のライブラリー(例えば、CRISPRノックアウト、CRISPR活性化／阻害、翻訳領域、shRNA等)を個別に細胞に送達できるが、共に読み取るように、RNAレベルで遺伝子型と表現型の結合を可能にするRNA融合構築物の操作を記載した。このアプローチは、lentiCRISPRv2主鎖におけるU6に駆動されるsgRNA配列の下流にリボザイム-RNA融合構築物(sgRNA fragL及びsgRNA fragRと呼ばれる)をクローン化することによって実証される(図2A)。図2Bに示されるように、前記RNA融合構築物の5'位に非標的化sgRNA転写物が存在しても、前記連結された融合物を生成するRNA処理機構は変化しない。さらに、図2Cに示されるsgRNA fragR構築物上のEcoRI制限部位は、RNA配列決定を用いて摂動マッピングのためにこの位置に配置された理論上のバーコードを識別する能力を強調している。

本開示のリボザイムで媒介されたRNA融合構築物は、RNAレベルでの遺伝子型と表現型の連結を可能にし、その結果、複数のライブラリー(例えば、CRISPRノックアウト、CRISPR活性化／阻害、翻訳領域、shRNA等)を個別に細胞に送達することができるが、共に読み出すことができる。このアプローチを本開示のリボザイムで媒介されたRNA融合構築物と共に使用することによって、遺伝子相互作用スクリーンを高度に多重化することができる。このアプローチにより、CRISPRノックアウトsgRNAライブラリーや翻訳領域過剰発現ライブラリー等の異種ライブラリーの連結が可能になる。さらに、細胞機能を決定する制御ネットワークへの前例のない洞察は、本明細書に開示されるRNA融合構築物を使用して、細胞におけるCRISPR活性化及びCRISPR阻害等のシステムを介して遺伝子の活性化と阻害の組み合わせを観察するスクリーンを使用することによって実現することができる。RNA融合物でのスクリーニング戦略は、フィットネス測定に限定されず、表現型、タンパク質発現、または生物科学全体に広く適用できるその他の機能エンドポイント等の他の読み取り値を使用したスクリーンと組み合わせることができる。

本開示のRNA融合構築物は、誘導性遺伝子発現システムで使用することができる。誘導性遺伝子発現システムは、機能性ゲノミクス、組織工学、生物医薬品タンパク質の生産、及び遺伝子治療を含む、幅広い基礎及び応用研究分野にとって強力なツールである。テトラサイクリンで制御されるオペロン、タンパク質間相互作用キメラ システム、及びタモキシフェンで制御される組換え酵素システムのような、これらのシステムの中で最も一般的なものは、全て外因性タンパク質の添加を必要とする。これはin vivoで免疫原性反応を引き起こす可能性があり、これらの大きなサイズのプラスミドの送達及び遺伝子導入は負担となり得る。本明細書に記載のイントロン配列を用いたリボザイムで媒介されたRNA融合アプローチは、幅広い用途を有する。本開示のシステムは、テトラサイクリン、テオフィリン、またはグアニンのような分子に応答するいずれかの断片にアプタザイムを添加することにより、遺伝子発現を強力に制御することができる（図3を参照）。

本開示のRNA融合構築物は、広範な疾患を治療するための遺伝子治療分野において大きな有用性を有する。1型糖尿病と2型糖尿病の両方で、インスリン産生が制限されているため、患者は通常、血糖値が上昇したときに体外からインスリンを投与する必要がある。本明細書に記載の誘導性のリボザイムで媒介されたRNA融合システムは、イントロン配列に融合されたインスリン遺伝子の2つの半分を含むように適合させることができる。該2つの構築物は、筋肉組織に構成的に存在するが、1つの半分は、合成糖等のアプタマー結合リガンドが添加された場合にのみ転写される。これにより、リボザイムで媒介されるハイブリダイゼーションとスプライシングが急速に増加し、全長の機能的なインスリンタンパク質が生成される。誘導因子が分解されると、1つの融合断片が抑制され、より多くのリガンドが投与されるまでインスリンは産生されなくなる。従って、痛みを伴い面倒な体外からのインスリン投与の必要性を、正確な時間制御を備えた内因性システムに置き換えることができる。

本明細書に記載の誘導性リボザイムで媒介されたRNA融合システムは、血友病患者のための凝固因子IX、嚢胞性線維症患者のための嚢胞性線維症膜貫通透過性調節タンパク質、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者のためのジストロフィン タンパク質のための誘導性遺伝子発現システムの生成に適用することができる。概して、発現が不十分なタンパク質または突然変異したタンパク質に起因するあらゆる疾患は、本明細書に開示される誘導性リボザイムで媒介されたRNA融合システムから恩恵を受け得る。これは、β-サラセミア、重度な複合免疫不全症、脊髄筋萎縮症、及び加齢に関連する黄斑変性症のような疾患を含むが、これらに限定されない。

本明細書に記載の誘導性リボザイムで媒介されたRNA融合システムは、CRISPR/Casツールセットを使用する遺伝子治療に広く適用することができる。CRISPR/Casゲノム編集は、適応性が高く、遺伝性疾患、癌、免疫性疾患、及び感染症の研究と治療のために設計されている。これらの治療法の導入における主な制限として、Casタンパク質の発現をin vivoで制御できない。本明細書に記載の誘導性リボザイムで媒介されたRNA融合システムは、Casタンパク質の2つの部分をfragL及びfragR構築物におけるイントロン配列に融合することによって、この制限を克服することができる。これらのうちの１つとして、本明細書に記載の誘導因子の制御下で、Casタンパク質の発現及びその後のその機能を完全に誘導することができる。これにより、前記CRISPR/Casシステムによって媒介されるゲノム編集を精確に制御できるようになる。これは、遺伝子ノックアウトに限定されず、制御及び誘導可能な非相同末端結合、相同性指向性修復、単一塩基交換、転写制御、塩基エディター、PRIMEエディター、及びRNA編集を補助するために広く適応し得る。

また、前記システムを利用して（例えば、図12Aを参照）、Oct3/4、Sox2、Klf4、及びc-Myc（OSKM）を含む山中因子の発現をin vivoで制御する実験を実施することができる。OSK及びc-MycをAAV発現ベクターにクローン化し、選択したアプタザイムを3'UTRにクローン化することができる。前記Oct3/4、Sox2、及び Klf4は、ポリシストロン性ベクターにクローン化し、自己切断2Aペプチドによって分離することができる。既知の癌遺伝子であるc-Mycは、独自のアプタザイム制御要素を持つ別のプラスミドにクローン化することができる。次に、これらのプラスミドをAAVベクターに一括して、手元の再プログラミング アプリケーションに基づいて個別にまたは共に送達することができる。

リボザイムは転写時に3'-ポリ(A)尾部を急速に切断するため、OSKMのバックグラウンド発現は低く、iAAVを介した形質導入は、ベースライン発現時の細胞状態を変化させない。アプタマーに特異的なリガンドが送達されると、リボザイムは安定化し、形質導入された細胞は、送達されたリガンドの用量に基づいてより高いOSKM発現レベルを示すようになる。mRNA転写物の代謝回転が速いため、リボザイムの安定化とその結果として生じる遺伝子発現レベルは、送達されるリガンドの半減期と選択された投与計画に直接依存し、従って、OSKM 発現の動力学的、拍動的、及び一時的な制御が可能になる。これらの転写因子は、それらの発現レベルに基づいて多能性状態を誘導するために徹底的に研究されている。前記システムは、in vivoで細胞を動力学的に再プログラムするために利用できる。

また、過剰発現を介して細胞表現型を方向付けることに関与している他の「再プログラミング因子」も多数存在する。OSKMと同様に、これらの因子は、細胞状態に対する効果を効果的かつ安全に発揮するために一時的な制御を必要とする。従って、前記リボザイムで媒介された制御システムを使用して、細胞同一性を再プログラムする能力を有する広範な遺伝子の発現をin vivoで動力学的に制御することができる。前記システムが適用し得るこれらの遺伝子には、表1にリストされている遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。

発現プラスミドを変更する必要なく、使用されるAAV血清型を変更できるため、該システムはさらに調整可能である。肝臓のAAV8、骨格筋のAAV9、中枢神経系のAAV-PHP.B等、組織を特異的に標的とする様々な血清型を使用することができる。さらに、部分的な再プログラミング システムの特異性をさらに向上させるために、既に利用可能な広範囲の血清型に加えて、異なる細胞型を特異的に標的とする人工組換えAAVも利用することができる。

表1

再プログラミング因子のin vivo制御のために本明細書に記載のシステムを利用することにより、前記システムを広範囲の用途に利用することができる。

一般に、in vivoでの山中因子の一過性発現は、老化の特徴を改善することが実証されている。OSKM及び3'-UTRアプタザイムを含む本開示のシステムは、体全体に広範な指向性を有するようにまたは人工AAVを介して特定の器官を標的とするように設計されたAAVに一括することができる。次に、これを被験者に投与し、短期間その標的臓器に形質導入させることができる。続いて、OSKMの周期的発現を達成するために、アプタマー配列に特異的なリガンドを所望の用量及び治療計画で投与することができる。このアプローチによって引き起こされる生理学的変化には、加齢に伴うDNA損傷反応の低下、老化及びストレスに関連する遺伝子の発現低下、及び加齢に伴って生じるエピジェネティックな修飾の変化が含まれ得る。細胞レベルでのこれらの分子変化は、体系的な老化の軽減に重要な意味を有する。さらに、ハッチンソン・ギルフォード早老症症候群等、老化に関連する特定の疾患の場合、この戦略は、老化の生理学的特徴を体系的に軽減し、同時に罹患者の寿命を延ばすための重要な治療選択肢となり得る。

組織特異的レベルでは、本開示のシステムは、AAVキャプシドの操作が誘導性再プログラミング戦略の細胞特異的標的化に利用できるため、重要な治療効果を実証することができる。中枢神経系では、OSKの一過性発現を利用して網膜神経節細胞の若いDNAメチル化パターンとトランスクリプトームを回復し、損傷後の軸索再生を促進し、高齢者や緑内障等の視覚障害に苦しむ人々の視力回復を促進し得る。同様に、本開示のシステムを特定の脳領域（例えば、海馬）に標的化することは、歯状回細胞の特異的標的化を通じて記憶力を改善するための重要なツールとなり得る。心臓血管系では、本開示のシステムを心筋細胞に標的化すると、これらの有糸分裂後細胞の脱分化を引き起こし得る。この可能になった再生能力は、心機能を幅広く改善し、心筋梗塞等の外傷性事象後の心筋細胞の回復を大幅に改善し得る。本明細書に記載の誘導性OSKM構築物の投与、次いで誘導性リガンドで罹患個体を治療することにより、心血管事象からの回復を劇的に改善し得る。さらに、本開示のシステムによって媒介される筋線維及び肝臓特異的な一過性発現は、in vivoでの筋肉再生を促進する能力を有する。これは、老化及び疾患両方の状況に広範な影響を与える。

OSKMの、誘導され、AAV-アプタザイムで媒介される発現とは別に、本開示の方法及び組成物は、他の再プログラミング転写因子(TF)にも同様に適用することができる(表1)。望ましい結果に応じて、TFを個別に、または一致するアプタザイム配列または個別のアプタザイムと組み合わせて送達して、遺伝子発現の一時的な制御を可能にすることができる。これらの人工TFは、健康及び疾患の状況に適用でき、再生医療の分野全体にさらに広範な影響を及ぼす。本開示のiAAV部分再プログラミングアプローチは、多様な器官系及び疾患の状況にわたって広範な用途を有する。

RNAは、本質的に一過性であり、この一過性は、相互作用部分としてもテンプレートとしてもその活性に影響を与える。RNAの環状化により持続性が向上するが、これを達成するための簡単で拡張可能なアプローチが不足している。本開示は、本明細書に記載の自己触媒的RNA環状化を利用して、持続的なタンパク質翻訳のためのin situ環状化RNA（icRNA）の組成物及び方法を提供する。具体的には、目的のメッセンジャーRNAに結合した内部リボソーム侵入部位を有し、次いでリボザイムが隣接する、in vitroで転写された直線状のRNAが提供される。これらの直線状のRNAを細胞に送達すると、リボザイムの自己触媒的切断により in situ 環状分子が生成され、内因性RNAリガーゼによって連結される末端が残る（例えば、遍在する内在性RNAリガーゼRtcB）（例えば、図15を参照）。この拡張可能なicRNAシステムは、基礎科学及び治療用途で幅広い用途がある。

前記icRNAシステムは、本明細書では3つの状況で例示される：第１に、試験タンパク質としてGFPを使用する前記システムを介した持続的なタンパク質発現（図16A～D）；第2に、ジンク フィンガー ヌクレアーゼを介した、改善されたゲノム ターゲティング；及び第3に、脱免疫化されたCas9タンパク質を含むCRISPRを介したゲノム ターゲティング（図17A～C）。

本明細書の組成物は、被験者における疾患または状態を治療するために使用することができる。例えば、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物は、本明細書に記載の疾患を治療するために投与することができる。

医薬組成物は、第1活性成分を含むことができる。該第1活性成分は、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物を含むことができる。前記医薬組成物は、単位用量形態で製剤化することができる。前記医薬組成物は、薬剤的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含むことができる。前記医薬組成物は、第2、第3、または第4活性成分を含むことができる。

本明細書に記載の組成物は、賦形剤を含むことができる。いくつかの場合では、賦形剤は、薬剤的に許容される賦形剤を含むことができる。賦形剤は、DMSO、グリセロール、ポリビニルピロリドン(PVP)、またはそれらの任意の組み合わせのような凍結保存剤を含むことができる。賦形剤は、スクロース、トレハロース、デンプン、これらのいずれかの塩、これらのいずれかの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせのような凍結保存剤を含むことができる。賦形剤は、（前記組成物の成分の酸化または分解を最小限に抑えるための）pH剤、（前記組成物の成分の変性または分解を防ぐための）安定化剤、（温度安定性を向上させるための）緩衝剤、（タンパク質の溶解度を向上させるための）可溶化剤、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。賦形剤は、界面活性剤、糖、アミノ酸、抗酸化剤、塩、非イオン性界面活性剤、可溶化剤、トリグリセリド、アルコール、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。賦形剤は、炭酸ナトリウム、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ポリエチレングリコール（PEG）、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ポリソルベート80、リン酸ナトリウム、スクロース、リン酸二ナトリウム、マンニトール、ポリソルベート20、ヒスチジン、クエン酸塩、アルブミン、ナトリウム水酸化物、グリシン、クエン酸ナトリウム、トレハロース、アルギニン、酢酸ナトリウム、酢酸塩、HCl、エデト酸二ナトリウム、レシチン、グリセリン、キサンタンゴム、大豆イソフラボン、ポリソルベート80、エチルアルコール、水、テプレノン、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合では、担体または希釈剤は、賦形剤を含むことができる。いくつかの場合では、担体または希釈剤は、水、塩の溶液（例えば、生理食塩水）、アルコール、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

適切な賦形剤の非限定的な例は、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、滑沢剤、キレート剤、分散促進剤、崩壊剤、香味料、甘味料、及び着色剤を含むことができる。

いくつかの場合では、賦形剤は、緩衝剤であってもよい。適切な緩衝剤の非限定的な例は、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、及び重炭酸カルシウムを含むことができる。緩衝剤として、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、及び他のカルシウム塩またはそれらの組み合わせは、医薬製剤に使用することができる。

いくつかの場合では、賦形剤は、防腐剤を含むことができる。適切な防腐剤の非限定的な例は、α-トコフェロールやアスコルビン酸塩等の抗酸化剤、及びパラベン、クロロブタノール、フェノール等の抗菌剤を含むことができる。抗酸化剤は、EDTA、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、亜硫酸ナトリウム、p-アミノ安息香酸、グルタチオン、没食子酸プロピル、システイン、メチオニン、エタノール、及びN-アセチルシステインをさらに含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、防腐剤は、バリダマイシンA、TL-3、オルトバナジン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、N-a-トシル-Phe-クロロメチルケトン、N-a-トシル-Lys-クロロメチルケトン、アプロチニン、フッ化フェニルメチルスルホニル、ジイソプロピルフルオロリン酸、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、グランザイム阻害剤、細胞接着阻害剤、細胞分裂阻害剤、細胞周期阻害剤、脂質シグナル伝達阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、還元剤、アルキル化剤、抗菌剤、オキシダーゼ阻害剤、または他の阻害剤を含むことができる。

いくつかの場合では、医薬製剤は、賦形剤として結合剤を含むことができる。適切な結合剤の非限定的な例は、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、C12～C18脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、及びそれらの組み合わせを含むことができる。

医薬製剤に使用できる結合剤は、ジャガイモデンプン、コーンスターチ、小麦デンプン等のデンプン類；スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、マルトデキストリン等の糖類；天然及び合成ゴム;ゼラチン;微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルピロリドン(ポビドン）;ポリエチレングリコール(PEG);ワックス;炭酸カルシウム;リン酸カルシウム;ソルビトール、キシリトール、マンニトール等のアルコール類;及び水;またはそれらの組み合わせから選択することができる。

いくつかの場合では、医薬製剤は、賦形剤として滑沢剤を含むことができる。適切な滑沢剤の非限定的な例は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、硬化植物油、ステロテックス、モノステアリン酸ポリオキシエチレン、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、及び軽鉱油を含むことができる。医薬製剤に使用できる滑沢剤は、金属ステアリン酸塩（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム等）、脂肪酸エステル（フマル酸ステアリルナトリウム等）、脂肪酸（ステアリン酸等）、脂肪族アルコール、ベヘン酸グリセリル、鉱物油、パラフィン、硬化植物油、ロイシン、ポリエチレングリコール（PEG）、金属ラウリル硫酸塩（ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等）、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及びタルク、またはそれらの組み合わせから選択することができる。

いくつかの場合では、医薬製剤は、賦形剤として分散促進剤を含むことができる。適切な分散促進剤の非限定的な例は、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製された木材セルロース、グリコール酸デンプンナトリウム、同形ケイ酸塩、及び高HLB乳化剤界面活性剤としての微結晶セルロースを含むことができる。

いくつかの場合では、医薬製剤は、賦形剤として崩壊剤を含むことができる。いくつかの場合では、崩壊剤は、非発泡性の崩壊剤であってもよい。適切な非発泡性の崩壊剤の非限定的な例は、コーンスターチ、ジャガイモデンプン等のデンプン、それらのアルファ化デンプン及び加工デンプン、甘味料、ベントナイト等の粘土、微結晶セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、及びトラガカント等のガムを含むことができる。いくつかの場合では、崩壊剤は、発泡性の崩壊剤であってもよい。適切な発泡性の崩壊剤の非限定的な例は、重炭酸ナトリウムとクエン酸の組み合わせ及び重炭酸ナトリウムと酒石酸の組み合わせを含むことができる。

いくつかの場合では、賦形剤は、香味料を含むことができる。外層に組み込まれる香味料は、合成の香味油及び香味芳香族；天然油；植物、葉、花、果実からの抽出物；及びそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの場合では、香味料は、シナモン油;ウィンターグリーンのオイル；ペパーミント油;クローバー油;干し草油;アニス油;ユーカリ;バニラ;レモン油、オレンジ油、グレープ油、グレープフルーツ油等の柑橘油；リンゴ、桃、洋ナシ、イチゴ、ラズベリー、チェリー、プラム、パイナップル、及びアプリコット含むフルーツエッセンスからなる群から選択することができる。

いくつかの場合では、賦形剤は、甘味料を含むことができる。適切な甘味料の非限定的な例は、グルコース（コーンシロップ）、ブドウ糖、転化糖、フルクトース、及びそれらの混合物（担体として使用しない場合）；サッカリン及びそのナトリウム塩等の各種塩；アスパルテーム等のジペプチド甘味料；ジヒドロカルコン化合物、グリチルリチン；ステビア レバウディアナ(ステビオシド);スクラロース等スクロースのクロロ誘導体；及びソルビトール、マンニトール、シリトール等糖アルコールを含むことができる。

組成物は、活性剤（例えば、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物、化合物または組成物）と不活性（例えば、検出可能な試薬または標識）または活性（アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバント等）の天然に存在するまた存在しない担体との組み合わせを含んでもよく、薬剤的に許容される担体を含んでいてもよい。担体は、医薬品賦形剤及び添加物のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖、二、三、四オリゴ糖、及びオリゴ糖を含む糖；アルジトール、アルドール酸、エステル化糖等の誘導体化糖；及び多糖または糖ポリマー）も含み、これらは、単独または組み合わせて存在することができ、単独または組み合わせて1～99.99重量%または体積%で含む。例示的なタンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン（HSA）、組換えヒトアルブミン（rHA）、ゼラチン、及びカゼイン等のような血清アルブミンを含む。緩衝力としても機能する代表的なアミノ酸／抗体成分は、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びアスパルテーム等を含む。炭水化物の賦形剤も本技術の範囲内に含まれると意図され、その例は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボース等の単糖類；乳糖、スクロース、トレハロース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖類；マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、及びミオイノシトール等のアルジトール類を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ミリグラム（mg）、ミリグラム／キログラム（mg/Kg）、コピー数、または分子数で製剤化することができる。いくつかの場合では、組成物は、約0.01 mg～約2000 mgの前記活性剤を含むことができる。いくつかの場合では、組成物は、約0.01 mg、0.1 mg、1 mg、10 mg、100 mg、500 mg、1000 mg、1500 mg、または約2000 mgの前記活性剤を含むことができる。

本明細書では、被験者、宿主、個体、及び患者は、真核生物または原核生物のいずれかの生物を指すために互換的に使用されてもよい。いくつかの場合では、被験者は、哺乳類等の動物を指してもよい。哺乳動物には、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物または本明細書に記載の組成物を投与することができる。哺乳動物の非限定的な例は、ヒト、ヒト以外の霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等）、家畜（例えば、犬や猫）、農場動物（例えば、馬、牛、ヤギ、羊、豚）、及び実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発達段階（例えば、成人、十代、子供、幼児、または子宮内の哺乳動物）のものであり得る。哺乳類は、雄または雌であり得る。哺乳動物は、妊娠中の雌であり得る。いくつかの実施形態では、被験者は、ヒトである。いくつかの実施形態では、被験者は、癌または腫瘍性疾患を有するか、またはそれを有すると疑われる。他の実施形態では、被験者は、異常なタンパク質発現に関連する疾患または障害を有するか、またはそれを有すると疑われる。いくつかの場合では、ヒトは、約生後1日～約10ヶ月、約9ヵ月～約24ヵ月、約1歳～約8歳、約5歳～約25歳、約20歳～約50歳、約1歳～約130歳、または約30歳～約100歳以上であり得る。ヒトは、約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、または120歳以上であり得る。ヒトは、約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、または130歳未満であり得る。

いくつかの実施形態では、それを必要とするヒトを治療する方法は、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物を該ヒトに投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書の組成物は、疾患及び症状を治療するために使用することができる。疾患または状態は、神経変性疾患、筋肉障害、代謝障害、眼障害、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。前記疾患または状態は、嚢胞性線維症、白皮症、α-1-アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、喘息、βサラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、遠位脊髄性筋萎縮症（DSMA）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、ジストロフィー性表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第V因子ライデン関連疾患、家族性腺腫、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘマトクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（IBD）、遺伝性多凝集症候群、レバー先天性黒内障、レシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィーI型及びII型、神経線維腫症、ニーマンピック病A、B、C型、NY-eso1関連癌、パーキンソン病、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体疾患、プロトロンビンG20210A変異等のプロトロンビン変異関連疾患、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合型免疫不全症候群（SCID）、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮症、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、X連鎖免疫不全、様々な形態の癌（例えば、BRCA1及び2に関連する乳癌及び卵巣癌）を含むことができる。いくつかの場合では、疾患または状態は、I型ムコポサッカリドーシス(MPSI)を含むことができる。いくつかの場合では、前記MPSIは、ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群、シャイエ症候群、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。前記疾患または状態は、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、網膜色素変性症、乳癌、卵巣癌、アルツハイマー病、疼痛、シュタルガルト黄斑ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、レット症候群、またはそれらの組み合わせを含むことができる。組成物の投与は、(a)投与前の遺伝子の発現と比較して遺伝子の発現を減少させるのに、(b)被験者（例えば、それを必要とする被験者）における少なくとも1つの点変異を編集するのに、(c)前記被験者における少なくとも1つの終止コドンを編集して、終止コドンのリードスルーを産生するのに、(d)前記被験者におけるエクソンスキップを産生するのに、または(e)それらの任意の組み合わせに十分であり得る。疾患または状態は、筋ジストロフィーを含み得る。筋ジストロフィーは、筋強直性、デュシェンヌ型、ベッカー型、肢帯型、顔面肩甲上腕型、先天型、眼咽頭型、遠位型、エメリー・ドレイファス型、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。疾患または状態は、慢性痛等の疼痛を含み得る。疼痛は、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、またはそれらの組み合わせを含み得る。侵害受容性疼痛は、内臓痛、体性痛、またはそれらの組み合わせを含み得る。

本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物を送達するために、ベクターを利用することができる。ベクターは、二本鎖DNAまたは一本鎖DNAのようなDNAを含むことができる。ベクターは、RNAを含むことができる。いくつかの場合では、前記RNAは、1つ以上の塩基修飾を含むことができる。前記ベクターは、組換えベクターを含むことができる。いくつかの場合では、前記ベクターは、天然に存在するベクターから改変されたベクターであってもよい。前記ベクターは、非天然ベクターの少なくとも一部を含むことができる。任意のベクターを利用することができる。いくつかの場合では、前記ベクターは、ウイルス ベクター、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、細胞外小胞、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、プラスミド ベクターは、市販のベクターから調製することができる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、AAV、またはそれらの組み合わせから製造することができる。一実施形態では、前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。ウイルスベクターの例は、レトロウイルス ベクター、アデノウイルス ベクター、アデノ随伴ウイルス ベクター、及びアルファウイルス ベクター等を含む。感染性タバコモザイクウイルス（TMV）ベースのベクターは、タンパク質の製造に使用でき、タバコの葉にグリフィスシンを発現することが報告されている。セムリキ フォレスト ウイルス ベースのベクター及びシンドビス ウイルス ベースのベクターのようなアルファウイルス ベクターも、遺伝子治療や免疫療法で使用するために開発されている。遺伝子導入がレトロウイルス ベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、レトロウイルス ゲノムまたはその一部及び目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドを指すことができる。いくつかの場合では、ベクターは、プロモーター及びポリヌクレオチドが機能的に結合できるクローン化部位の両方を含むことができる。このようなベクターは、in vitroまたはin vivoでRNAを転写することができ、市販されている。いくつかの場合では、ウイルス ベクターは、アデノウイルス ベクター、アデノ随伴ウイルス ベクター(AAV)、レンチウイルス ベクター、レトロウイルス ベクター、これらのいずれかの一部、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合では、ナノ粒子ベクターは、ポリマー ベースのナノ粒子、アミノ脂質ベースのナノ粒子、金属ナノ粒子（金ベースのナノ粒子等）、これらのいずれかの一部、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合では、ベクターは、AAVベクターを含むことができる。ベクターを修飾し、修飾されたVP1タンパク質（例えば、VP1タンパク質を含むように修飾されたAAVベクター）を含むようにすることができる。AAVは、AAV1血清型、AAV2血清型、AAV3血清型、AAV4血清型、AAV5血清型、AAV6血清型、AAV7血清型、AAV8血清型、AAV9血清型、AAV10血清型、AAV11血清型、これらのいずれかの誘導体、またはそれらの任意の組み合わせのような血清型を含むことができる。

いくつかの実施形態では、ベクターは、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物の直線状の前駆体をコードする核酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸は、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物の直線状の前駆体を含むことができる。いくつかの場合では、前記核酸は、二本鎖であり得る。いくつかの場合では、前記核酸は、DNAまたはRNAであり得る。いくつかの場合では、核酸は、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物の複数のコピーを含むことができる。例えば、核酸は、本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物の2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のコピーを含むことができる。いくつかの場合では、前記核酸は、U6プロモーター、CMVプロモーター、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞（例えば、細菌の複製起点を持つ細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）の中で自律複製することができる。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターを本明細書では「発現ベクター」と称する。一般に、組換え DNA 技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は、互換的に使用することができる。しかし、本開示は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）等の発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。典型的には、ベクターまたはプラスミドは、関連遺伝子の転写及び翻訳を指示する配列、選択マーカー、及び自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を有する遺伝子の5'領域、及び転写終結を制御するDNA断片の3'領域を含む。両方の制御領域は、形質転換された宿主細胞と相同な遺伝子に由来し得るが、そのような制御領域は、産生宿主として選択された種に固有ではない遺伝子に由来し得ることも理解されるべきである。

典型的には、前記ベクターまたはプラスミドは、遺伝子断片の転写及び翻訳を指示する配列、選択マーカー、及び自律複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を有する遺伝子の5'領域、及び転写終結を制御するDNA断片の3'領域を含む。両方の制御領域は、形質転換された宿主細胞と相同な遺伝子に由来し得るが、そのような制御領域は、産生宿主として選択された種に固有ではない遺伝子に由来し得ることも理解されるべきである。

所望の宿主細胞において関連するコーディング領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者には周知されている。これらの遺伝要素を駆動できる実質的に任意のプロモーターが本開示での使用に適している。例えば、pol IIIプロモーター、U6プロモーター、CMVプロモーター、T7プロモーター、及びH1プロモーターを使用して発現を駆動することができる。終結制御領域は、好ましい宿主に固有の様々な遺伝子に由来し得る。

本開示のリボザイムで活性化されたRNA構築物の投与は、治療過程全体を通じて1回の用量で連続的または断続的に行うことができる。最も有効な手段及び投与量を決める方法は、治療に使用される組成物、治療の目的、治療される標的細胞、及び治療される被験者によって変化し得る。単回または複数回の投与は、治療する医師が選択した用量レベル及びパターンで行うことができる。適切な剤形及び薬剤の投与方法は、変化し、疾患または状態に依存し得る。投与経路は、治療に使用される組成物、治療の目的、治療される被験者の健康状態または疾患段階、及び標的の細胞または組織によって変化し得る。投与経路の非限定的な例は、経口投与、経鼻投与、注射、及び局所適用を含む。

投与は、生物学的作用の所望の部位への化合物または組成物（DNA構築物、ウイルスベクター等）の送達を可能にするために使用できる方法を指すことができる。これらの方法は、皮膚等の表面の外表面への局所投与（ローション、クリーム、軟膏等）を含むことができる。これらの方法は、非経口投与（静脈内、皮下、くも膜下腔内、腹腔内、筋肉内、血管内または注入を含む）、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、及び直腸投与を含むことができる。いくつかの場合では、被験者は、監督なしで組成物を投与することができる。いくつかの場合では、被験者は、医療専門家（例えば、医師、看護師、医師助手、勤務医、ホスピス従事者等）の監督下で組成物を投与することができる。いくつかの場合では、医療専門家は、前記組成物を投与することができる。いくつかの場合では、美容専門家は、前記組成物を投与することができる。

本明細書に開示された組成物の投与または適用は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100日間の治療期間にわたって連続または非連続的に実施することができる。いくつかの場合では、治療期間は、約1～30日間、約2～30日間、約3～30日間、約4～30日間、約5～30日間、約6～30日間、約7～30日間、約8～30日間、約9～30日間、約10～30日間、約11～30日間、約12～30日間、約13～30日間、約14～30日間、約15～30日間、約16～30日間、約17～30日間、約18～30日間、約19～30日間、約20～30日間、約21～30日間、約22～30日間、約23～30日間、約24～30日間、約25～30日間、約26～30日間、約27～30日間、約28～30日間、または約29～30日であり得る。

本明細書に開示される組成物の投与または適用は、1日に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24回に実施することができる。いくつかの場合では、本明細書に開示される組成物の投与または適用は、1週間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または 21回行うことができる。いくつかの場合では、本明細書に開示される組成物の投与または適用は、1ヶ月間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、または90回行うことができる。

いくつかの場合では、組成物は、単回用量または分割用量として投与または適用することができる。いくつかの場合では、本明細書に記載の組成物は、第1時点及び第2時点で投与することができる。いくつかの場合では、組成物は、最初の投与が他の投与の1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、16時間、20時間、1日、2日、4日、7日、2週間、4週間、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、1年、またはそれ以上の投与時間差で投与されるように投与することができる。

本明細書に記載のリボザイムで媒介されたRNA融合構築物または誘導性リボザイムで媒介されたRNA融合システムを含むキット及びメーカーの文書も本明細書に記載される。このようなキットは、担体、パッケージ、またはバイアルやチューブ等の1つ以上の容器を受け入れるために区画化された容器を含むことができ、各容器は、本明細書に記載の方法で使用される別個の要素の1つを含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、注射器、及び試験管を含む。前記容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成することができる。

例えば、前記容器は、本明細書に記載される1つ以上のRNA融合構築物を、場合により組成物中に、または本明細書に開示される別の試薬と組み合わせて、含むことができる。任意選択で、前記容器は、滅菌アクセスポートを備える（例えば、前記容器は、静脈内用溶液バッグまたは皮下注射針で穿孔可能なストッパーを備えたバイアルであり得る）。任意選択で、このようなキットは、本明細書に開示される化合物を、本明細書に記載の方法におけるその使用に関する識別可能な説明書、ラベル、または指示書と共に含む。

キットは通常、1種以上の、本明細書に記載の化合物の使用に商業的及びユーザーの観点から望ましい様々な材料(例えば、試薬、任意選択で、濃縮された形でのもの、及び／または装置)をそれぞれ含む1つ以上の他の容器を含む。このような材料の非限定的な例は、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、担体、パッケージ、容器、内容物及び／または指示が記載されたバイアル及び／またはチューブのラベル、及び使用説明が記載された添付文書を含むが、これらに限定されない。

ラベルは、容器上に付けることもでき、容器に関連付けることもできる。ラベルは、該ラベルを形成する文字、数字、その他のキャラクターが容器自体に取り付けられたり、成形されたり、エッチングされたりする場合、容器に貼り付けることができる。 ラベルは、前記容器を保持する器物またはキャリアの中にある場合、例えば添付文書として容器に関連付けることができる。ラベルは、その内容物が特定の治療用途に使用されることを示すために使用することができる。前記ラベルは、その内容物の使用方法、例えば本明細書に記載の方法を示すこともできる。これらの他の治療薬は、例えば、「医師用卓上参考書」 (PDR)に示される量で、または当業者によって他の方法で決められる量で使用することができる。

以下の実施例は、本開示を説明することと目的とするが、本発明を限定するものではない。これらは、典型的な使用され得るものであるが、当業者に知られている他の手順を代替的に使用することもできる。

プラスミドを使用したRNA融合構築物の生成
fragL及びfragRをU6プロモーターの下流のlentiCRISPRv2主鎖にクローン化した簡単なプラスミド遺伝子導入実験を実施した。これらを、個別にまたは組み合わせて細胞に送達し、48時間後にRNAを単離した。隣接増幅プライマーを用いて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実施した。図1Bに示されるように、両方のプラスミドを単独ではなく共に遺伝子導入した場合にRNA融合が観察された。次いで、予想される融合物配列を確認するため、PCR産物を精製し、サンガー配列決定した（図1Cを参照）。

低分子RNA及びポリメラーゼIIIプロモーター ポリメラーゼIII（pol-III）プロモーターを有するRNA融合構築物
リボザイム-RNA融合構築物をlentiCRISPRv2主鎖におけるU6で駆動されるsgRNA配列の下流 (sgRNA fragL及びsgRNA fragRと称する)にクローン化した(図2Aを参照)。図2Bに示されるように、前記RNA融合構築物の5'位に非標的化sgRNA転写物が存在しても、連結融合物を生成するRNA処理機構は変化しなかった。さらに、図2Cに示されるsgRNA fragR構築物上のEcoRI制限部位は、RNA配列決定を使用した摂動マッピングのために該位置に配置された理論上のバーコードを識別できる能力を強調している。

コンビナトリアル スクリーニングのためのRNA融合構築物
fragL配列とfragR 配列がレンチウイルスの5'長末端反復プロモーターで制御される転写物(anti_fragL及びanti_fragRと称される)に対するアンチセンス方向になるように配向することで、コンビナトリアル スクリーニングに適するように、前記構築物を設計した。該設計は、システムに実装されているツイスター リボザイムの切断速度が速いため、レンチウイルス生産中の転写物の分解を防止する。RT-PCR及びサンガー配列決定によって、アンチセンス方向での正しい連結RNA融合構築物配列を確認した(図2D～Eを参照)。さらに、anti_fragL及びanti_fragR構築物を、蛍光レポーターを含有するプラスミドにクローン化し、RNA融合が生成される細胞の迅速な選択を可能にした。両方のプラスミドを受け取った細胞を蛍光によって簡単に識別し、蛍光で活性化される細胞選別を受けて、前記RNA融合構築物が生成できる両方の断片を受け取った細胞のみをスクリーニングした。

前記RNA融合システムが様々なポリメラーゼIIIプロモーターにわたってモジュラーであることが望ましいため、これらの構築物は、ポリメラーゼII とポリメラーゼIIIの両方の活性を示したH1プロモーターによって駆動される場合に互いに融合できることを実証した（図8A）。図8Bに示されるように、前記H1プロモーターによって駆動される場合、前記RNA融合構築物の存在を検出することができる。該システムは柔軟性があり、様々な目的のゲノム工学構築物に存在し得る様々なプロモーターに適していることが示される。

コンビナトリアル スクリーニングのためのRNA融合構築物の使用
EcoRI制限部位の使用(図2Cを参照)により、可変バーコードを各sgRNAまたは他の摂動にクローン化することができ、その結果、該構築物をバーコードによって識別することができる。これにより、スクリーン内の各細胞が固有の分子識別子(UMI)として機能する固有のバーコード ペアを確実に受け取り、下流のカウントでは全てのUMIが崩壊する。このライブラリーは、さらに次世代シーケンシング(NGS)を受けて、バーコードと摂動を照合するルックアップ テーブルを生成する。このライブラリーは、ほとんどの細胞が2つのライブラリー要素を受け取るように、中間の感染多重度で形質導入される。次に、GFP/tdTomatoダブルポジティブな蛍光について細胞を選別し、2つのバーコードを受け取る細胞をスクリーニングする。細胞を収集し、スクリーニングの複数の時点(3日目、14日目、21日目、及び28日目)でRNAを単離し、確実に堅牢なフィットネス測定値が得られるようにした。次に、収集されたRNAからのUMIを選択的に逆転写し、増幅し、配列決定した。そして、各時点で識別されたバーコードを、最初に生成されたルックアップ テーブルにマッピングし、実験全体にわたって、遺伝子型から表現型へマッピングした。

高分子RNA及びポリメラーゼIIプロモーターを用いたリボザイムで媒介されたRNA融合
リボザイムで媒介されたRNA融合アプローチの広範囲の有用性をさらに探索するために、次にポリメラーゼII（pol-II）プロモーターによって駆動される融合発現を調べた。RNAポリメラーゼIIは、EF1α、SV40、CMV、及びRSV、並びに効果的な遺伝子治療の翻訳に重要なCNS中のNEUROD2や大動脈中のTBX20等の組織特異的プロモーターのような、ほとんどの細胞遺伝子(mRNA)とpol-IIプロモーターの転写を担当する。リボザイムで媒介されたRNA融合アプローチをAAV主鎖の中に操作し、様々な遺伝子治療様式の発現を精確に制御できると仮定した。該アプローチの全体的な概略図を図3に示す。リガンド応答性アプタマー配列をfragLの3'末端とfragR構築物の5'末端に結合する。これらのアプタマーは、リボザイムと三次の相互作用し、自己切断が起こらないように触媒ループを安定化する。切断が存在しない場合、2つの断片は、決してハイブリダイズせず、連結されたRNA融合転写物は生成されない。リガンドを追加すると、前記アプタマーの構造的立体配座が破壊され、前記リボザイムを安定化できなくなる。次に、前記リボザイムは、自己切断を受け、固有の末端を生成し、前記2つの断片の相補的領域が互いにハイブリダイズし、RtcBリガーゼによって連結する。

前記誘導システムが追加の特徴を持たない全長転写物及びその後のタンパク質を生成できるようにするために、イントロン配列を治療用ペイロードと前記リボザイムで媒介された融合構築物との間で融合させた（図3を参照）。2つの断片がハイブリダイズして連結されると、5'及び 3'スプライス部位、分岐点、及びポリピリミジントラクトのような2つのイントロンの特徴が細胞スプライシング機構によって認識される。次に、トランススプライシングを行い、イントロン配列を除去し、2つのエクソンを融合して、全長の機能的な転写物を生成する。その概念の概要を図4に示す。個別に発現させても蛍光を発しない緑色蛍光タンパク質(GFP-L及びGFP-R)の2つの半分をイントロン配列に抱合させた。次に、前記リボザイムで媒介されたRNA融合構築物をpx600 AAV主鎖にクローン化した。2-イントロン モデルを、連結されると効率的なスプライシングを受けることが以前に示されている、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子に由来のより長いイントロン配列(それぞれ>250 bp)で最初に利用した。

各イントロンを、GFP転写物の1つの半分とリボザイムで媒介されたRNA融合ペアの一方の構築物との間でクローン化し、HEK293T細胞に遺伝子導入した場合、両方の配列が互いに組み合わせて送達された場合にのみ蛍光が観察された（図5Aを参照）。これらの細胞からRNAを単離した。RT-PCR及びサンガー配列決定を使用して、前記イントロンが効率的にスプライスアウトされ、完全長GFP転写物が2つの半分から生成されたことを示した(図5B～Cを参照)。フローサイトメトリーを通じて機能的蛍光タンパク質を生成する能力は、図7にさらに示した。

リボザイムで媒介されたエキソヌクレアーゼ耐性及び環状RNA融合構築物
この融合バーコード アプローチは、RNAレベルで媒介されるため、様々なRNA 処理機構を使用して、前記構築物をさらに操作して望ましい特性を得ることができる。前記リボザイムで媒介された融合バーコードは、ウイルス ゲノムに由来する短い「エキソヌクレアーゼ耐性」RNA（xrRNA）構造を含むように操作することができる（図4）。これらのRNA要素は、転写されると、RNAの進行性の細胞外ヌクレオチド分解を防ぐ働きをする。これらを前記融合バーコードに統合することにより、細胞環境におけるバーコード構造の堅牢性と持続性を向上させることができる。

細胞環境におけるRNAバーコードの持続性をさらに向上させるために、環状化RNAバーコード設計を図9Aに示す。この設計では、前記構築物の3'末端に「デザイナー エクソン」とキメラ イントロンを含むように左側断片の設計を修飾した(circ-fragL)。前記デザイナー エクソンは、イントロンからのスプライシングを促進するために、様々なエクソンス プライシング促進因子（ESE）要素を用いて適切な長さに最適化することができる（配列を図10に示す）。右側断片も、その5'末端に添加されたイントロン、そして別のデザイナー エクソン、その後図1に示される元のfragR構築物で修飾した (circ-fragR)。転写されると、前記リボザイムは、自己切断することができ、相補的配列が互いにハイブリダイズできるようになる。リボザイム切断によって生成された末端を内在性RNAリガーゼRtcBで認識し、1つの融合された末端を形成する。

エクソンとイントロンが互いに接近すると、スプライソソーム機構は、様々なイントロン要素を認識し、前記2つのイントロンをスプライスアウトし、このバックスプライシング機構を介して2つのデザイナー エクソンを互いに結合する。これにより、もう一方の末端が融合し、環状構造が形成される。該構築物は、前記circ-fragL及びcirc-fragRをHEK293T細胞に遺伝子導入することによって細胞内で環状化する。RNAを遺伝子導入の48時間後に単離し、逆転写した。PCRを実施して、環状RNAが存続するかどうかを判定した。2つの方向性プライマー対を利用することにより、前記RNAバーコードを環状化し、細胞RNAのプールから回収することができた（図9B）。これらの構築物を使用すると、前記バーコードは、複雑な細胞環境でも堅牢であり、このため、より幅広い種類のスクリーニング プラットフォームで使用できるようになる。

遺伝子発現のためのキメラ イントロン アプローチの使用
GFP-Lが、5'スプライス部位を含むβヘモグロビン遺伝子由来のイントロンの5’末端に融合され；GFP-Rが、分岐点、ポリピリミジント ラクト、及び3'スプライス部位を含むヒトIgG遺伝子由来のイントロンの3'末端に融合されたキメラ イントロン(pCI)アプローチを利用して、遺伝子発現システムを試験した(図11)。前記リボザイムで媒介されたRNA融合構築物を含むpCIベクターを使用すると、両方のプラスミドの遺伝子導入時にGFPの強力な発現が観察された。蛍光レベルは、個別に発現された全長GFP転写産物に匹敵し、機能性タンパク質を生成するこのアプローチの強い能力を実証した(図6Aを参照)。GFP総蛍光をフローサイトメトリーで定量したところ、pCIシステムは、37%の細胞GFP+を生成し、一方、px600 AAV主鎖における完全なGFP転写物は、67%の細胞GFP+を生成した（図6B参照）。前記pCIアプローチにおいて各細胞が2つのプラスミドで遺伝子導入されなければならないことを考慮すると、これは印象的である。

次に、前記イントロンの効率的なスプライシングを得るために、前記pCIシステムを使用したGFPの高い発現レベルにより、fragL構築物及びfragR構築物からのRNAの相補的領域が互いにハイブリダイズする必要性を調べた。この調査のために、イントロンとGFP半分のみを含み、相補的領域とリボザイムを欠いた構築物(「LinkFree」と称する) を生成した。これらの構築物とその全長対応物を用いて、HEK293T細胞を遺伝子導入した。48時間後にRNAを単離し、RT-qPCRを実施して、GAPDHに対して正規化したGFP転写物の相対発現を分析した。図6Cに示されるように、前記LinkFreeシステムでは相対発現があまり変化しないため、GFP-DHFRイントロン配列は、ハイブリダイゼーションの必要なしにスプライスアウトすることができた。あるいは、前記pCIシステムは、活性化比（全長発現／連鎖無し発現）が>6のハイブリダイゼーションに対するはるかに高い必要性を示した（図6D～Eを参照）。

様々な治療様式を送達するために、1つのウイルス ベクターを投与し、目的の遺伝子を送達することが有利な場合がある。従って、全体の機構を単一のAAVベクターにパッケージ化できるように、1つのプラスミドに含まれる誘導性遺伝子発現システムを使用して構築物をさらに操作した。これを達成するために、GFP-pCI-LがU6プロモーターによって駆動され、GFP-pCI-RがCMVプロモーターによって駆動される二重プロモーター ベースのシステムを使用した（図11A）。HEK293T細胞における該二重プロモーター プラスミド構築物の遺伝子導入は、二重プロモーター連鎖無しの設計と比較した場合、活性化比>80倍でGFPの発現をもたらした（図11B）。

従って、リボザイムを利用するRNA融合の概念を使用して、別々に送達された要素を集めて全長の機能性タンパク質を生成することができる。pCI イントロン配列を使用すると、リボザイムで生成された相補的領域のハイブリダイゼーションによる発現が大幅に増加した高い発現レベルが実現された。個々のAAVキャプシドにパッケージ化して単一のベクターとして送達できるように、該構築物をさらに操作して、1つのプラスミドにパッケージ化した。一方または両方の構築物に合成リボスイッチまたは他の誘導性要素を追加したエフェクターの制御された誘導性発現も利用できることが期待される。

本開示は、目的の遺伝子（GOI）の3'非翻訳領域（UTR）に埋め込まれたテトラサイクリン応答性リボザイムを含むリボザイム ベースのアプローチを使用することの実現可能性を実証する。該システムでは、ベースラインレベルでハンマーヘッド リボザイムが転写時に自己切断し、3'-ポリ(A)テールを切断し、前記RNA転写物を不安定化させ、遺伝子発現を比較的低くする。前記テトラサイクリンリガンドを添加すると、リガンドがテトラサイクリン応答性アプタマーに高い親和性で結合する。これにより、RNA分子の二次構造の立体構造変化が誘導され、ハンマーヘッド リボザイムの三次ループ-ループ相互作用が破壊され、ポリ(A)テールの切断が防止され、前記mRNA転写物が安定化し、前記GOIの発現増加が可能になる(図12A）。

本開示は、テトラサイクリン ハンマーヘッド アプタザイムを修飾されたインスリン構築物の3'UTRにクローン化することによる、テトラサイクリン誘導性インスリン発現を例示する。プロインスリン配列をH10D、K29R、R31K、及びL62R変異で修飾し、プロインスリンの処理を可能にし、膵臓の外側の器官におけるフリン プロテアーゼによりインスリンを成熟させた。図12Bに示されるように、in vitroでのHEK293T細胞へ遺伝子導入する際に、テトラサイクリン（125μM）の添加により、細胞培養上清へのインスリン分泌の誘導が達成された。陽性対照（AAV-インスリン）が分泌されたインスリンの発現におけるテトラサイクリンで誘発された倍率変化を示さないため、この効果は、テトラサイクリン ハンマーヘッド アプタザイムの存在に依存することが示された。インスリンの発現を患者ごとに制御することが有利であるため、本開示はさらに、テトラサイクリンで誘発された成熟インスリンの発現がテトラサイクリン用量に依存して起こることを実証する（図12C）。このリボザイム ベースのアプローチによるインスリン発現動態の調整可能性を実証するために、いくつかのバージョンのインスリン リボスイッチ設計を生成し、pZac AAV主鎖にクローン化した。前記テトラサイクリン ハンマーヘッド アプタザイムの数及び位置（図13A）、次に、遺伝子導入の4～6時間後にDMEMまたはテトラサイクリン（125 μM）を添加した際に、遺伝子導入の48時間後にHEK293T細胞の細胞培養上清中に分泌されたインスリンの量を定量した。図13Bに示されるように、複数のアプタザイムの添加により、インスリンのバックグラウンド発現（テトラサイクリン無し）が低下した。これらのバックグラウンド レベルが低いため、テトラサイクリンを添加すると、前記構築物の1つで分泌されたインスリンが20倍以上誘導された。

前記3'UTRアプタザイムに基づくアプローチを通じて、本開示は、糖尿病患者のインスリン需要に対処するために該アプローチを利用する実現可能性を実証する。本開示は、in vitroで、成熟インスリン発現レベルが用量に依存し、前記構築物の操作によって調整可能であることを示す。

本開示の実現可能性は、図12Aに示されるように、3'UTRテトラサイクリン ハンマーヘッド アプタザイムを用いたその有効性を最初に実証することによっても示される。前記px601プラスミド主鎖を使用し、前記アプタザイム リボスイッチをSaCas9タンパク質とbGHポリ(A)配列の間の3'UTRにクローン化した(図14A)。HEK293T細胞にプラスミドを遺伝子導入し、遺伝子導入の4～6時間後に培地を単独のDMEMまたは125 μMテトラサイクリンを含むDMEMに交換することで、in vitroでSaCas9の発現がテトラサイクリンに誘導されることが実証した。遺伝子導入の48時間後にRNAを単離し、逆転写し、qPCRアッセイにより、GAPDHに対して該SaCas9転写物の相対発現を定量した。図14Bに示されるように、バックグラウンドの低減が観察され、テトラサイクリンを含有する培地の添加による発現の増加（約6倍）を伴うリガンド条件は存在しなかった。

本開示は、図14Bの構築物を有するAAV8キャプシドを使用した、in vivoでのSaCas9によるテトラサイクリンで誘導されるゲノム編集を実証する。これらのin vivo実験のために、マウスPcsk9遺伝子を標的とするSaCas9特異的シングルガイドRNAを前記ベクターにクローン化した。次に、これらのキャプシドを6～8週齢のC57Bl/6マウスに、1匹あたり5E12ウイルス ゲノムの用量で眼窩後注射により投与した。血清を毎週採取し、2週目及び5週目の時点でテトラサイクリン投与（30 mg/Kg）を実施した。また、5週目及び7週目の時点で、マウスのサブセットから肝臓を採取し、DNAを単離し、Synthegoの CRISPR 編集推論(ICE)ツールを用いて、Cas9で誘導されるPcsk9ゲノム編集を定量した（図14C）。図14Dに示されるように、最初の3日間のテトラサイクリン投与後に、マウスPCSK9 ELISAキットで測定した血清PCSK9タンパク質レベルの減少が観察された。これは、Cas9で媒介される遺伝子ノックダウンによって誘導された遺伝子編集がリガンドに依存することを示唆した。肝臓を採取し、Pcsk9遺伝子座で編集されたDNAの割合を定量したところ、マウス群が受けたテトラサイクリン療法に基づいたDNA編集の効果が観察された。3日間のテトラサイクリン療法の1ラウンド後の5週間の時点で、Pcsk9遺伝子座の5%未満の編集が定量されたが、さらに3日間のテトラサイクリン療法では、編集されたDNAの割合が約7%に増加した（図14E）。本実験を通じて、AAV-Cas9-リボスイッチ ベースのアプローチを利用する場合、SaCas9で媒介されるDNA編集のレベルは、テトラサイクリン レジメンに基づいて調整可能であることが示された。

RNA構築物の持続性
5'P3ツイスター リボザイム、5'連結配列、GFPのコーディング配列に作動可能に連結されたIRES、リンカー、3'連結配列、3'ツイスター リボザイム、そしてポリTテールをコードするDNA構築物に作動可能に連結されたT7プロモーターを有するDNA核酸を転写することによって、RNA構築物を生成し、直線状のRNA構築物を得た（図16Aを参照）。

293Tを25%の培養密度で12ウェルに播種し、1 μgの変異された環状または環状GFP RNA及び3.5 μLのリポフェクタミン メッセンジャーマックスからなる脂質-RNA複合体を遺伝子導入した。Qiagen RNeasyキットを用いてRNAを3日間かけて細胞から単離し、qPCRを行って、環状化されたRNAの量を測定した。** 各日内のp<0.01 t検定比較(図16B～Dを参照)。

293Tを25%の培養密度で12ウェルに播種し、1 μgの変異された環状または環状GFP RNA及び3.5 μLのリポフェクタミン メッセンジャーマックスからなる脂質-RNA複合体を遺伝子導入した。Qiagen RNeasyキットを用いてRNAを3日間かけて細胞から単離し、qPCRを行って、GFP RNAの量を測定した。* 各日内のp<0.05 t検定比較。

293Tを25%の培養密度で12ウェルに播種し、1 μgの変異された環状または環状ジンク フィンガーRNA及び3.5 μLのリポフェクタミン メッセンジャーマックスからなる脂質-RNA複合体を遺伝子導入した。Qiagen DNeasy血液＆組織キットを用いてDNAを単離し、編集された領域を増幅し、サンガー配列決定し、Synthego ICE CRISPR分析ツールを用いて編集効率を定量した。293Tを25%の培養密度で12ウェルに播種し、1 μg のCas野生型または変異型RNA、1 μgのT2ガイドRNA、及び3.5 μLのリポフェクタミン メッセンジャーマックスからなる脂質-RNA複合体を遺伝子導入した。3日後、Qiagen DNeasy血液＆組織キットを用いてゲノムDNAを単離し、編集された領域を増幅し、サンガー配列決定し、Synthego ICE CRISPR分析ツールを用いて編集効率を定量した(図17A～Cを参照)。

ワクチン用の環状フォーマットを生成するために、アルファ ウイルスに関連するもの等の自己増幅RNAシステムを前記IRESの下流で使用した（図18A～Bを参照）。

理解されるように、本開示の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更が加えられ得る。従って、他の実施形態は、以下の請求項の範囲内に含まれる。

Claims (66)

1. リボザイムで活性化されたRNA構築物をであって、
   1つ以上のリボザイム、及び
   少なくとも１つの目的のポリペプチドに対する1つ以上のRNAコーディング配列を含む、
   前記少なくとも１つの目的のポリペプチドに対する前記1つ以上のRNAコーディング配列の転写は、前記1つ以上のリボザイムの活性によって活性化されるか依存する、
   リボザイムで活性化されたRNA構築物。
2. 任意のプライマー領域、任意のバーコード領域、目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、及び第2人工RNA要素の配列に対する相補的配列を含む第1人工RNA要素、ならびに第1自己切断リボザイム、及び
   任意のプライマー領域、任意のバーコード領域、目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、及び第1人工RNA要素の配列に対する相補的配列を含む第2人工RNA要素、ならびに第2自己切断リボザイム
   をさらに含み、
   前記第1及び第2自己切断リボザイムによる前記第1及び第2人工RNA要素の切断は、それぞれ共にハイブリダイズされるコメンタリ配列からのdsRNAの領域を含むハイブリダイゼーション構築物を提供し、
   前記ハイブリダイゼーション構築物は、RNAリガーゼによってさらに連結され、RNA融合構築物を形成することができ、
   前記RNA融合構築物からの発現は、前記少なくとも1つの目的のポリペプチドを産生する、
   請求項１に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
3. 前記第1人工RNA要素が、バーコード配列または特異的分子同一性（UMI）配列を含み、かつ／または前記第2人工RNA要素が、バーコード配列またはUMI配列を含む、請求項２に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
4. 前記第1人工RNA要素の前記バーコード配列または前記UMI配列が、前記第2人工RNA要素からの前記バーコード領域または前記UMI配列とは異なる配列を有する、請求項３に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
5. 前記第1人工RNA要素が、プライマー配列を含み、かつ／または前記第2人工RNA要素が、プライマー配列を含む、請求項２に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
6. 前記第1人工RNA要素の前記プライマー配列が、前記第2人工RNA要素からの前記プライマー配列と異なる、請求項５に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
7. 前記第1及び第2相補的配列の長さが30～60 bpである、請求項２に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
8. 前記第1及び第2相補的配列の長さが40～50 bpである、請求項７に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
9. 前記第1及び第2リボザイムが、ツイスター リボザイムである、請求項２に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
10. 前記第1リボザイムが、P3ツイスター リボザイムである、請求項９に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
11. 前記第2リボザイムが、P1ツイスター リボザイムである、請求項１０に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
12. 前記RNAリガーゼが、RtcBである、請求項２に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
13. ベクターまたはプラスミドは、前記第1人工要素を含み、該第1人工要素は、第1 RNAプロモーター及び第1摂動要素の下流に位置し、かつ／またはベクターまたはプラスミドは、前記第2人工要素を含み、該第2人工要素は、第2 RNAプロモーター及び第2摂動要素の下流に位置する、請求項２～１２のいずれか１項に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
14. 前記第1 RNAプロモーター及び／または前記第2 RNAプロモーターが、ポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項１３に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
15. 前記ポリメラーゼIIIプロモーターが、hU6プロモーターである、請求項１４に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
16. 前記第1摂動要素及び／または前記第2摂動要素が、CRISPRノックアウトスクリーンで利用されるsgRNAである、請求項１３に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
17. 請求項１３～１６のいずれか１項に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物を含む、コンビナトリアル スクリーン。
18. 目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、イントロン配列、第2人工RNA要素の配列及び3'アプタマーに対する相補的配列、及び第1自己切断リボザイムを含み、前記3'アプタマーは、第1自己切断リボザイムを安定化させるために該第1自己切断リボザイムと相互作用する、第1人工RNA要素、及び
    目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、イントロン配列、第1人工RNA要素の配列に対する相補的配列、及び3'アプタマーを含み、前記第2人工RNAテンプレートは、第2自己切断リボザイムに繋留され、前記3'アプタマーは、第2自己切断リボザイムを安定化させるために該第2自己切断リボザイムと相互作用する、第2人工RNA要素
    を含み、
    前記第1及び第2自己切断リボザイムによる前記第1及び第2人工RNA要素の切断は、それぞれ共にハイブリダイズされるコメンタリ配列からのdsRNAの領域を含むハイブリダイゼーション構築物を提供し、
    前記ハイブリダイゼーション構築物は、RNAリガーゼによってさらに連結されることができ、前記イントロン配列は、スプライソソームによって除去されてRNA融合構築物を形成し、
    前記RNA融合構築物からの発現は、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドを産生する、
    請求項１に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
19. 前記イントロン配列が、ジヒドロ葉酸還元酵素に由来する、請求項１８に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
20. 目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列が、前記イントロン配列のそれぞれに隣接している、請求項１８に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
21. 目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列が、インスリン、凝固因子IX、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節タンパク質、及びジストロフィンタンパク質から選択されるポリペプチド／タンパク質をコードする、請求項１８に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
22. 請求項１に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物を含む、医薬組成物であって、該リボザイムで活性化されたRNA構築物が、直線化され、かつ
    5'リボザイム、
    5'連結配列、
    内部リボソーム侵入部位(IRES) 配列、
    少なくとも１つの目的のポリペプチドに対するRNAコーディング配列、
    3'連結配列、
    3'リボザイム配列、及び
    薬剤的に許容される担体を含む、
    医薬組成物。
23. 前記直線状のリボザイムで活性化されたRNA構築物が、ポリメラーゼ結合領域を欠いている、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. 前記5'及び3'リボザイムが、ツイスター リボザイム、ハンマーヘッド リボザイム、手斧リボザイム、デルタ型肝炎ウイルスのリボザイム、リガーゼリボザイム、ピストル リボザイム、ツイスター姉妹リボザイム、Vg1リボザイム、VSリボザイム、及び前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
25. 前記5'及び3'連結配列が、in situで天然リガーゼの基質である、請求項２２に記載の医薬組成物。
26. 前記天然リガーゼが、RtcBである、請求項２５に記載の医薬組成物。
27. 前記IRESが、配列番号：1～1328の配列のいずれかを含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
28. 前記少なくとも1つの目的のポリペプチドが、自己切断ペプチドによって分離された2つ以上の目的のポリペプチドを含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
29. 前記自己切断ペプチドが、2Aまたは2A様ペプチドを含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
30. 前記少なくとも1つの目的のポリペプチドが、プロドラッグ活性化酵素、生物学的応答修飾因子、受容体リガンド、免疫グロブリン由来の結合ポリペプチド、非免疫グロブリン結合ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、ゲノム編集酵素、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、複数のポリペプチドが、2Aまたは2A様ペプチドによって分離される、請求項２２、２８または２９に記載の医薬組成物。
31. 前記生物学的応答修飾因子が、免疫増強サイトカインである、請求項３０に記載の医薬組成物。
32. 前記免疫増強サイトカインが、インターロイキン1～38、インターフェロン、腫瘍壊死因子（TNF）、及び顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子（GM-CSF）からなる群から選択される、請求項３１に記載の医薬組成物。
33. 前記2Aまたは2A様ペプチドが、GSGリンカー部分をさらに含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
34. 前記ゲノム編集酵素が、ジンク フィンガー ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター ヌクレアーゼ（TALEN）、人工メガヌクレアーゼ、及びRNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼ（Cas）ポリペプチドからなる群から選択される、請求項３０に記載の医薬組成物。
35. 前記5'及び3'リボザイム配列が、5'-GCCATCAGTCGCCGGTCCCAAGCCCGGATAAAATGGGAGGGGGCGGGAAACCGCCT-3'(配列番号：1354) または5'-AACACTGCCAATGCCGGTCCCAAGCCCGGATAAAAGTGGAGGGTACAGTCCACGC-3'(配列番号：1355)のいずれかと少なくとも85～100%同一である配列から独立して選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
36. 前記5'及び3'連結配列が、5'-AACCATGCCGACTGATGGCAG-3'(配列番号：1356)または5'-CTGCCATCAGTCGGCGTGGACTGTAG-3'(配列番号：1357)のいずれかと少なくとも85～100%同一である配列から独立して選択される、請求項２２に記載の医薬組成物。
37. 前記IRES配列が、5'-gcggccgcgtcgacgggcccgcggaattccgccccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaacc-3'(配列番号：1358)と少なくとも85～100%同一である、請求項２２に記載の医薬組成物。
38. 請求項１に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物を含む、ワクチン組成物であって、該リボザイムで活性化されたRNA構築物は、直線化され、かつ
    5'リボザイム、
    5'連結配列、
    内部リボソーム侵入部位(IRES)配列、
    少なくとも1つの抗原性ポリペプチドに対するRNAコーディング配列、
    3'連結配列、
    3'リボザイム配列、及び
    薬剤的に許容される担体を含む、
    ワクチン組成物。
39. 前記直線化されたリボザイムで活性化されたRNA構築物が、ポリメラーゼ結合領域を欠いている、請求項３８に記載のワクチン組成物。
40. 前記5'及び3'リボザイムが、ツイスター リボザイム、ハンマーヘッド リボザイム、手斧リボザイム、デルタ型肝炎ウイルスのリボザイム、リガーゼリボザイム、ピストル リボザイム、ツイスター姉妹リボザイム、Vg1リボザイム、VSリボザイム、及び前記のいずれかの誘導体からなる群から選択される、請求項３８に記載のワクチン組成物。
41. 前記5'及び3'連結配列が、in situで天然リガーゼの基質である、請求項３８に記載のワクチン組成物。
42. 前記天然リガーゼが、RtcBである、請求項４１に記載のワクチン組成物。
43. 前記IRESが、配列番号：1～1328の配列のいずれかを含む、請求項３８に記載のワクチン組成物。
44. 前記少なくとも1つの抗原性ポリペプチドが、自己切断ペプチドによって分離された2つ以上の抗原性ポリペプチドを含む、請求項３８に記載のワクチン組成物。
45. 前記自己切断ペプチドが、2Aまたは2A様ペプチドを含む、請求項４４に記載のワクチン組成物。
46. 前記2Aまたは2A様ペプチドが、GSGリンカー部分をさらに含む、請求項４５に記載のワクチン組成物。
47. 前記5'及び3'リボザイム配列が、5'-GCCATCAGTCGCCGGTCCCAAGCCCGGATAAAATGGGAGGGGGCGGGAAACCGCCT-3'(配列番号：1354)または5'-AACACTGCCAATGCCGGTCCCAAGCCCGGATAAAAGTGGAGGGTACAGTCCACGC-3'(配列番号：1355)と少なくとも85～100%同一である配列から独立して選択される、請求項３８に記載のワクチン組成物。
48. 前記5'及び3'連結配列が、5'-AACCATGCCGACTGATGGCAG-3'(配列番号：1356)または5'-CTGCCATCAGTCGGCGTGGACTGTAG-3'(配列番号：1357)と少なくとも85～100%同一である配列から独立して選択される、請求項３８に記載のワクチン組成物。
49. 前記IRES配列が、5'-gcggccgcgtcgacgggcccgcggaattccgccccccccccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaacc-3' (配列番号：1358)と少なくとも85～100%同一である、請求項３８に記載のワクチン組成物。
50. 前記抗原性ポリペプチドが、SARS-CoV-2スパイク タンパク質を含む、請求項３８に記載のワクチン組成物。
51. 前記少なくとも１つの目的のポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドが、自己増幅RNA構築物内に含まれる、請求項３８に記載のワクチン組成物。
52. 前記自己増幅RNA構築物が、アルファウイルスまたはパラミクソウイルスを含む、請求項５１に記載のワクチン組成物。
53. 請求項１に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物であって、該リボザイムで活性化されたRNA構築物は、
    1つ以上のプロモーター配列、
    少なくとも1つの目的のポリペプチドに対する1つ以上のRNAコーディング配列、
    1つ以上のアプタザイム ベースのリボスイッチであるリボザイム、
    該アプタザイム ベースのリボスイッチを含む3'UTR配列、及び
    ポリ(A)配列
    を含み、
    前記アプタザイム ベースのリボスイッチは、標的リガンドに結合しないときに、前記リボザイムで活性化されたRNA構築物を不安定化させ、前記少なくとも1つの目的のポリペプチドの発現の減少をもたらし、
    前記アプタザイム ベースのリボスイッチは、標的リガンドに結合するときに、前記リボザイムで活性化されたRNA構築物を安定化させ、前記少なくとも1つの目的のポリペプチドの発現の増加をもたらす、
    リボザイムで活性化されたRNA構築物。
54. 前記アプタザイム ベースのリボスイッチが、ハンマーヘッドアプタザイムである、請求項５３に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
55. 前記標的リガンドが、テトラサイクリン、テオフィリン、及びグアニンから選択される、請求項５３に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
56. 前記少なくとも１つの目的のポリペプチドが、プロドラッグ活性化酵素、生物学的応答修飾因子、受容体リガンド、免疫グロブリン由来の結合ポリペプチド、非免疫グロブリン結合ポリペプチド、抗原性ポリペプチド、ゲノム編集酵素、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、複数のポリペプチドは、2Aまたは2A様ペプチドによって分離される、請求項５３に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
57. 前記生物学的応答修飾因子が、免疫増強サイトカインである、請求項５６に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
58. 前記免疫増強サイトカインが、インターロイキン1～38、インターフェロン、腫瘍壊死因子（TNF）、及び顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子（GM-CSF）からなる群から選択される、請求項５７に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
59. 前記2Aまたは2A様ペプチドが、GSGリンカー部分をさらに含む、請求項５６に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
60. 前記ゲノム編集酵素が、ジンク フィンガー ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター ヌクレアーゼ（TALEN）、人工メガヌクレアーゼ、及びRNA誘導性DNAエンドヌクレアーゼ（Cas）ポリペプチドからなる群から選択される、請求項５６に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
61. 前記1つ以上のプロモーター配列が、ポリメラーゼII（pol-II）プロモーター配列である、請求項５３に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
62. 前記1つ以上のプロモーター配列が、EF1α、hU6、SV40、CMV、RSV、NEUROD2、及び／またはTBX20に対する配列を有する、請求項５３に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
63. 前記ポリ(A)配列が、bGHポリ(A)配列である、請求項５３に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物。
64. 請求項５３～６３のいずれか１項に記載のリボザイムで活性化されたRNA構築物を含む、プラスミドまたはキャプシド。
65. 前記プラスミドまたはキャプシドが、AAVベースのプラスミドまたはキャプシドである、請求項６４に記載のプラスミドまたはキャプシド。
66. 前記プラスミドが、Cas9タンパク質及びgRNAを発現する、請求項６４に記載のプラスミドまたはキャプシド。
    
    
    
    
    

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