JP2024073552A - 脳卒中治療用組成物、及びそれをスクリーニングする方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】脳卒中治療用組成物、及びそれをスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】炎症細胞におけるＩＬ－１ＲＡ（インターロイキン－１受容体拮抗剤）の発現を増大させる物質を有効成分として含む、脳卒中治療用薬学的組成物、ここで、前記炎症細胞におけるＩＬ－１ＲＡの発現を増大させる物質は臍帯由来間葉幹細胞であり、かつ、該臍帯由来間葉幹細胞は、ＴＧＦ－β－１、ＨＧＦ、及びＩＤＯからなる群より選択される１以上の因子を分泌するものであり、かつ、該因子それぞれの分泌レベルは、ＶＥＧＦの分泌レベルよりも高いレベルである、前記組成物を提供する。【選択図】図８
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り （１）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌｕｍｅ ５０，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ２２，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ａ ｒｏｄｅｎｔ ｓｔｒｏｋｅ ｍｏｄｅｌ 発表日：２０１８年４月１３日
本発明は、脳卒中治療用組成物、及びそれをスクリーニングする方法に関する。
統計庁で２０１０年発表した資料によれば、韓国は、２０１１年、６５歳以上の老齢人口が総人口で占める比重が１１．４％に達し、２０５０年には、３７．４％になり、超高齢化社会に入り込むと見られている。そのように、最近、高齢化問題が社会的なイシューとして話題に上るにつれ、高齢人口の特性、住居、保健、文化、余暇のような老人福祉への国民の関心が高まり、それに対する統計需要も増えている。特に、これまでの５０年余り、死亡の主な原因になっていた急性伝染性疾病に比べ、慢性退行性疾病がさらに大きい問題として注目されている。また、慢性退行性疾病のうち、脳血管疾患は、単一疾患による死亡率のうち２位となっている非常に重要な疾患のうち一つであり、それへの関心が高まっている。
そのような脳血管疾患は、大きく見て、２種形態で分類される。一つは、脳出血などに見られる出血性脳疾患であり、他の一つは、脳血管の閉鎖などによって示される虚血性脳疾患である。出血性脳疾患は、交通事故などによって主に示され、虚血性脳疾患は、主に高齢者にしばしば示される疾患である。
大脳に一時的な脳梗塞または脳出血が誘発される場合、酸素及びブドウ糖の供給が遮断され、神経細胞においては、ＡＴＰ低下及び浮腫（edema）が生じ、結局、脳の広範囲な損傷が誘発される。神経細胞の死滅は、脳梗塞などの発生後、相当な時間が経過した後に示されるのであるが、それを遅延性神経細胞死（delayed neuronal death）と言う。スナネズミ（Mongolian gerbil）を利用した一過性前脳梗塞モデル（transient forebrain ischemic model）を介した実験で見れば、該遅延性神経細胞死は、５分間の脳梗塞誘導４日後、海馬（hippocampus）のＣＡ１領域において、神経細胞死が観察されたと報告されている。
一方、これまで最も広く知られている脳梗塞による神経細胞死メカニズムには、２種が知られている。一つは、脳梗塞により、細胞外に、過度なグルタメート（glutamate）が蓄積され、そのようなグルタメートが細胞内に流入し、結局、過度な細胞内カルシウムの蓄積により、神経細胞死が誘発されるという興奮性神経細胞死メカニズムであり、他の一つは、梗塞再貫流の時、急な酸素供給による生体内ラジカルの増加により、ＤＮＡ及び細胞質に損傷を負って誘発されるという酸化性神経細胞死である。そのようなメカニズム的な研究を基にして、脳梗塞時に示される神経細胞死を効果的に抑制する物質を探索したり、該物質に係わるメカニズムを明らかにする研究が多く行われている。しかし、これまでのところ、効果的に脳卒中を治療することができる物質は、ほとんどないという実情である。
そのような技術的背景下、新たな分子的メカニズムに基づく脳卒中治療用組成物に係わる研究が活発に進められているが（韓国登録特許１０－１５３２２１１）、まだ十分ではない実情である。
一様相は、ＩＬ－１（interleukin－１）受容体拮抗剤を有効成分として含む脳卒中の治療用薬学的組成物を提供することである。
他の様相は、脳卒中治療のための候補物質と接触された個体の試料から、ＩＬ－１ＲＡ（interleukin－１ receptor antagonist）の発現レベルを測定する段階と、前記測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルを、前記候補物質と接触していない対照群個体の試料内ＩＬ－１ＲＡの発現レベルと比較する段階を含む脳卒中治療剤をスクリーニングする方法を提供することである。
さらに他の様相は、臍帯由来間葉基質細胞を含むＩＬ－１受容体拮抗剤を提供することである。
さらに他の様相は、臍帯由来間葉基質細胞を含むＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－response element-binding）タンパク質活性増加剤を提供することである。
一様相は、ＩＬ－１（Interleukin－１）受容体拮抗剤を有効成分として含む、脳卒中の治療用薬学的組成物を提供する。
本明細書で使用される用語「治療」は、一実施例による組成物の投与により、脳卒中に対する症状が好転したり、好ましく変更されたりする全ての行為を意味する。
前記組成物の投与によって治療される対象疾病である「脳卒中（stroke）」は、一般的に中風とも言い、脳に血液を供給している血管が詰まったり破れたりし、損傷を受けた部位の脳細胞が死滅し、それによる意識消失、言語障害、半身マヒのような身体障害を伴う神経学的症状を意味する。前記脳卒中は、虚血性脳卒中及び出血性脳卒中をいずれも含む。
一実施例によれば、脳卒中の急性段階、すなわち、脳梗塞後または脳出血後、約２４時間以内、前記ＩＬ－１受容体拮抗剤の投与は、単に、炎症反応を阻害させるに留まるのではなく、神経損傷の回復及び機能改善に寄与することができ、それを介して、脳卒中の病理学的進行を防ぐだけではなく、それと係わる後遺症を最小化させることができるということを確認することができた。従って、一実施例によるＩＬ－１受容体拮抗剤は、脳卒中治療のための有効物質としても活用される。
一具体例において、前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、細胞に発現されているＩＬ－１受容体とＩＬ－１との結合を妨害することにより、それによる作用の一部または全部を減殺させる役割を行う物質を指称する。前記ＩＬ－１受容体拮抗剤としては、例えば、臍帯由来間葉基質細胞、またはＩＬ－１ＲＡ（Interleukin－１ receptor antagonist）タンパク質でもあり、その以外にも、ＩＬ－１に対する抗体、アプタマー、アンチセンスヌクレオチドでもある。
一具体例において、前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、脳卒中病変組織内炎症細胞に作用し、ＩＬ－１媒介の炎症反応を阻害させるものでもあり、ここで、前記炎症細胞は、病変組織内の小膠細胞または大食細胞でもある。
前記薬学的組成物は、有効成分以外に、薬学的に許容される担体を含んでもよい。そのとき、薬学的に許容される担体は、製剤時、一般的に利用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシア、ゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メティルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含んでもよく、それ以外にも、ウイルスベクター、非ウイルス性ベクター及び生体適合性ポリマーなども含んでもよい。前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤などを追加して含んでもよい。
前記薬学的組成物は、目的とする方法により、経口投与したり非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に対する適用）したりし、投与量は、患者の状態、並びに体重、疾病程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選択されるのである。
前記薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。前記「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率でもって、疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与の経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含んだ要素、並びにその他医学分野に周知の要素によっても決定される。前記薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか、あるいは他の治療剤と併用しても投与され、従来の治療剤とは、順次にも同時にも投与され、単一または多重にも投与される。前記要素をいずれも考慮し、副作用なしに最小限量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、それは、当業者によって容易に決定されるのである。
前記薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内への活性成分吸収度、不活性率及び排泄速度、疾病種類、併用される薬物によっても異なるが、一般的には、体重１ｋｇ当たり１ないし５００ｍｇ、または治療学的に有効量の細胞またはベクターを、毎日または隔日に投与するか、あるいは１日に１回ないし５回に分けて投与することができる。しかし、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などにより、増減されるので、前記投与量が、いかなる方法によっても、本発明の範囲を限定するものではない。
一様態として、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む脳卒中の治療方法を提供する。前記「個体」とは、疾病治療を必要とする対象を意味し、さらに具体的には、ヒト、または非ヒトである霊長類、マウス（mouse）、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類を意味する。
他の様相は、脳卒中治療のための候補物質と接触された個体の試料から、ＩＬ－１ＲＡ（interleukin－１ receptor antagonist）の発現レベルを測定する段階と、
前記測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルを、前記候補物質と接触していない対照群個体の試料内ＩＬ－１ＲＡの発現レベルと比較する段階を含む、脳卒中治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
前記測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルを、前記候補物質と接触していない対照群個体の試料内ＩＬ－１ＲＡの発現レベルと比較する段階を含む、脳卒中治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
前記スクリーニングする方法に係わる説明で言及された用語または要素のうち、すでに言及されたところと同一なものは、前述の通りである。
本明細書で使用される用語「候補物質」は、脳卒中の治療に効果を示すと期待される物質であり、例えば、任意の物質（substance）、分子（molecule）、元素（element）、化合物（compound）、実在物（entity）、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、タンパク質、ポリペプチド、低分子有機化合物（small organic molecule）、多糖類（polysaccharide）、ポリヌクレオチドなどを含んでもよい。また、自然産物（natural product）、合成化合物または化学化合物、または２個以上の物質の組み合わせでもある。
前記方法において、「接触（contacting）」は、一般的な意味であり、２個以上の製剤（例えば、２個のポリペプチド）を結合させたり、製剤及び細胞（例えば、タンパク質及び細胞）を結合させたりすることなどを指することができる。該接触は、試験管内（in vitro）でも起こる。例えば、試験管（test tube）、または他のコンテナ（container）において、２個以上の製剤を結合させたり、試験製剤及び細胞、または細胞溶解物及び試験製剤を結合させることができる。また、該接触は、細胞またはインシト（in situ）でも起こる。例えば、２個のポリペプチドを暗号化する組み換えポリヌクレオチドを細胞内で共同発現（coexpression）させることによち、細胞または細胞溶解物において、２個のポリペプチドを接触させることができる。また、テストしようとするタンパク質が固定相の表面に配列されたタンパク質チップ（protein chip）やタンパク質アレイ（protein array）を利用することもできる。
前記試料は、個体から分離された血液、血漿、血清、尿、大便、唾液、涙、脳脊髄液、細胞、組織、またはその組み合わせでもある。前記試料は、個体の染色体を含むものでもある。前記組織は、脳、脳神経または末梢血管でもある。前記細胞は、炎症細胞、例えば、小膠細胞または大食細胞でもある。
前記試料は、個体から分離された血液、血漿、血清、尿、大便、唾液、涙、脳脊髄液、細胞、組織、またはその組み合わせでもある。前記試料は、個体の染色体を含むものでもある。前記組織は、脳、脳神経または末梢血管でもある。前記細胞は、炎症細胞、例えば、小膠細胞または大食細胞でもある。
前記個体は、哺乳動物でもある。また、前記個体は、そこから分離された組織または細胞を含む意味に使用される。前記哺乳動物は、ヒト、霊長類、マウス、ラット、牛、豚、馬、羊、犬、猫、またはその組み合わせでもある。
前記方法において、個体の試料から測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルが、接触していない対照群に比べて上昇した場合、脳卒中治療剤として決定したり選定したりする段階をさらに含んでもよい。前記発現レベル変化は、個体の発現レベルが、非処理の対照群または陰性対照群に比べ、類似したレベル、または１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％及び１，０００％以上上昇するものを含んでもよい。
前記ＩＬ－１ＲＡの発現レベルを測定する段階は、当業界で公知された多様な方法を介しても遂行され、例えば、ウェスタンブロッティング（western blotting）、ドットブロッティング（dot blotting）、酵素免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay）、放射能免疫分析法（ＲＩＡ）、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫組織化学染色、免疫沈澱法（immunoprecipitation）、補体固定分析法、流細胞分析法（ＦＡＣＳ）またはタンパク質チップ方法などが使用される。
前記方法において、脳卒中治療のための候補物質と接触された個体の試料から、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－response element－binding）タンパク質の活性レベルを測定し、かつ前記測定されたＣＲＥＢタンパク質の活性レベルを、接触していない対照群個体の試料内ＣＲＥＢタンパク質の活性レベルと比較する段階をさらに含んでもよい。ここで、個体の試料から測定されたＣＲＥＢタンパク質の活性レベルが、非処理の対照群に比べて上昇した場合、脳卒中治療剤として決定したり選定したりする段階をさらに含んでもよい。また、例えば、ＩＬ－１ＲＡの発現レベル、及びＣＲＥＢタンパク質の活性レベルが非処理の対照群に比べて上昇した場合、脳卒中治療剤として決定したり選定したりすることができる。
前記ＣＲＥＢタンパク質の活性レベルを測定する段階は、当業界で公知された多様な方法を介しても遂行されし、例えば、逆転写重合酵素連鎖反応（reverse transcriptase－polymerase chain reaction）、リアルタイム重合酵素連鎖反応（real time－polymerase chain reaction）、ウェスタンブロッティング、ノーザンブロッティング、酵素免疫分析法、放射免疫拡散法（radioimmunodiffusion）及び免疫沈澱法などが使用されることができる。
前記スクリーニング方法を介して得た対象試料内ＩＬ－１ＲＡの発現レベルを上昇させ、かつ／またはＣＲＥＢタンパク質の活性レベルを上昇させる候補物質は、脳卒中治療のための有効物質にもなる。そのような脳卒中治療のための候補物質は、その後、脳卒中治療剤の開発過程において、先導物質（leading compound）として作用し、前記先導物質がさらに有効な脳卒中治療効果を示すように、その構造を変形させて最適化させることにより、新たな脳卒中治療剤を開発することができる。
さらに他の様相は、臍帯由来間葉基質細胞を含むＩＬ－１（Interleukin－１）受容体拮抗剤を提供する。
一具体例において、前記臍帯由来間葉基質細胞は、炎症細胞、例えば、小膠細胞内または大食細胞内のＩＬ－１ＲＡの発現を増大させ、それを介して、ＩＬ－１受容体拮抗剤としての役割を遂行するということを確認することができた。従って、前記臍帯由来間葉基質細胞は、標的細胞内分子メカニズムの調節にも使用され、さらに、脳卒中治療のための有効物質としても活用される。
さらに他の様相は、臍帯由来間葉基質細胞を含む、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－response element－binding）タンパク質活性増加剤を提供する。
一具体例において、前記臍帯由来間葉基質細胞は、炎症細胞、例えば、大食細胞内のリン酸化されたＣＲＥＢタンパク質の発現を増大させ、それを介して、ＣＲＥＢタンパク質活性増加剤として役割を遂行するということを確認することができた。従って、前記臍帯由来間葉基質細胞は、標的細胞内分子メカニズムの調節に使用され、さらに、脳卒中治療のための有効物質としても活用される。
一様相による組成物によれば、ＩＬ－１（Interleukin－１）受容体拮抗剤を含み、脳卒中急性段階において、前記組成物の投与は、神経損傷の回復及び機能改善に大きく寄与することができるが、脳卒中の治療にも有用に利用される。
一様相によるスクリーニングする方法によれば、核心的分子メカニズムに基づき、優秀な治療効果を有する脳卒中治療物質を発掘することができる。
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
参考例１．実験準備及び実験過程
（１）ｈＵＭＳＣの準備、及びそれらの特性確認
臍帯由来間葉幹細胞（ｈＵＭＳＣ）を、健康な寄贈者の同意下、チャ盆唐医療センター（城南、大韓民国）に保管中の臍帯（へその緒）から採取した。ｈＵＭＳＣの準備は、ＧＭＰ施設で行われ、ｈＵＭＳＣの分離及び拡張は、Master Cell BankのＧＣＰ（Good Clinical Practice）ガイドラインによって行われた。まず、採取されたｈＵＭＳＣから、臍帯血管を除去した後、Wharton’s jellyを１～５ｍｍの移植片にスライスし、ｈＵＭＳＣｓを分離した。分離されたｈＵＭＳＣｓを、１０％ ＦＢＳ（HyClone、ＩＬ）、ＦＧＦ４（Ｒ＆Ｄ Systems、ＭＮ）、及びヘパリン（Sigma－Aldrich、ＭＯ）が添加されたα－ＭＥＭ（HyClone、ＩＬ）を含む培養プレートに付着させ、それを培養させ、前記培地は３日ごとに交替された。そこから１５日経過後、臍帯切片を捨て、前記ｈＵＭＳＣをＴｒｙｐＬＥ（Invitrogen、ＭＡ）と共に継代培養させ、サブコンフルエント（８０～９０％）に逹するまで拡張させた。前記ｈＵＭＳＣは、低酸素条件（３％ Ｏ２、５％ ＣＯ２及び３７℃）下でインキュベーションされ、７継代のｈＵＭＳＣが本実験に使用された。
参考例１．実験準備及び実験過程
（１）ｈＵＭＳＣの準備、及びそれらの特性確認
臍帯由来間葉幹細胞（ｈＵＭＳＣ）を、健康な寄贈者の同意下、チャ盆唐医療センター（城南、大韓民国）に保管中の臍帯（へその緒）から採取した。ｈＵＭＳＣの準備は、ＧＭＰ施設で行われ、ｈＵＭＳＣの分離及び拡張は、Master Cell BankのＧＣＰ（Good Clinical Practice）ガイドラインによって行われた。まず、採取されたｈＵＭＳＣから、臍帯血管を除去した後、Wharton’s jellyを１～５ｍｍの移植片にスライスし、ｈＵＭＳＣｓを分離した。分離されたｈＵＭＳＣｓを、１０％ ＦＢＳ（HyClone、ＩＬ）、ＦＧＦ４（Ｒ＆Ｄ Systems、ＭＮ）、及びヘパリン（Sigma－Aldrich、ＭＯ）が添加されたα－ＭＥＭ（HyClone、ＩＬ）を含む培養プレートに付着させ、それを培養させ、前記培地は３日ごとに交替された。そこから１５日経過後、臍帯切片を捨て、前記ｈＵＭＳＣをＴｒｙｐＬＥ（Invitrogen、ＭＡ）と共に継代培養させ、サブコンフルエント（８０～９０％）に逹するまで拡張させた。前記ｈＵＭＳＣは、低酸素条件（３％ Ｏ２、５％ ＣＯ２及び３７℃）下でインキュベーションされ、７継代のｈＵＭＳＣが本実験に使用された。
その後、核型分析を介して、前記ｈＵＭＳＣが正常なヒト核型を含んでいることを確認した。また、逆転写重合酵素連鎖反応を使用し、細胞ペレット内ウイルス性病源菌（ヒト免疫欠乏症ウイルス－１及びヒト免疫欠乏症ウイルス－２、サイトメガロウイルス、肝炎Ｂウイルス、肝炎Ｃウイルス、ヒトＴリンパ球ウイルス、エプスタインバールウイルス、及びマイコプラズマ）がないことを確認した。蛍光標識細胞分類器（ＦＡＣＳ）分析を行い、前述のように、ｈＵＭＳＣｓの免疫表現型を確認した。前記ｈＵＭＳＣは、ＭＳＣｓ（ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５）と係わる細胞表面マーカーを高いレベルに発現したが、造血幹細胞（ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４５）及びＨＬＡ－ＤＲに係わるマーカーの発現は、無視してもよいレベルであった。ｈＵＭＳＣｓ（ｎ＝３）が１００％コンフルエントに逹したとき、それらを無血清培地で４８時間培養し、そこからｈＵＭＳＣｓ－ＣＭを得た。その後、ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭに由来したＴＧＦ－β１（Human ＴＧＦ－β１ ＥＬＩＳＡ kit、Ｒ＆Ｄ Systems、ＭＮ）、ＶＥＧＦ（Human ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ kit、Ｒ＆Ｄ Systems、ＭＮ）、ＨＧＦ（Human ＨＧＦ ＥＬＩＳＡ kit、Cloud－Clone Corp.、ＴＸ）及びＩＤＯ（Human ＩＤＯ ＥＬＩＳＡ kit、BlueGene Biotech.、Shanghai、中国）のタンパク質濃度を、商業的に利用可能な酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）キットを使用し、製造社の指針に従って測定した。その結果、図１に示されているように、ｈＵＭＳＣｓは、高レベルのＴＧＦ－β１、ＨＧＦ及びＩＤＯを分泌した。そのような実験データは、ｈＵＭＳＣｓが、ＭＳＣの特性を有し、免疫反応及び組織回復と係わるサトカイン及び栄養因子を分泌することができるということを示すものである。
（２）脳卒中動物モデルの構築
本実験において、２７０～３００ｇの体重を有する総１５１匹の雄Sprague－Dawleyラットが使用され、Longa et al.によって報告されている方法により、前記ラットに、中脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ：middle cerebral artery occlusion）を誘発させた。
（３）統計分析及び倫理的規定
統計分析は、Statistical Analysis System program（Enterprise ４．１；ＳＡＳ Korea）及びＭｅｄＣａｌｃ statistical software（ＭｅｄＣａｌｃ software、ｖｅｒ．１１．６、Mariakerke、ベルギー）を使用して行われた。組織学的、または梗塞サイズ測定において、２グループ間の統計的な有意性は、Mann－Whitney Ｕ testによって分析された。リアルタイムＰＣＲまたはＥＬＩＳＡに対する多重比較の統計的有意性は、下位グループの双対比較に係わるa post hoc Conover’s testと共に、Kruskal－Wallis testを使用して分析された。機能性テストの分析は、分散（混合したＡＮＯＶＡ）テストの双方向混合分析を使用して行われた。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１で考慮され、全ての値は、平均±標準誤差（ＳＥＭ）で示された。マイクロアレイデータの統計学的分析は、以前の実験と同一方法で評価した。
（２）脳卒中動物モデルの構築
本実験において、２７０～３００ｇの体重を有する総１５１匹の雄Sprague－Dawleyラットが使用され、Longa et al.によって報告されている方法により、前記ラットに、中脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ：middle cerebral artery occlusion）を誘発させた。
（３）統計分析及び倫理的規定
統計分析は、Statistical Analysis System program（Enterprise ４．１；ＳＡＳ Korea）及びＭｅｄＣａｌｃ statistical software（ＭｅｄＣａｌｃ software、ｖｅｒ．１１．６、Mariakerke、ベルギー）を使用して行われた。組織学的、または梗塞サイズ測定において、２グループ間の統計的な有意性は、Mann－Whitney Ｕ testによって分析された。リアルタイムＰＣＲまたはＥＬＩＳＡに対する多重比較の統計的有意性は、下位グループの双対比較に係わるa post hoc Conover’s testと共に、Kruskal－Wallis testを使用して分析された。機能性テストの分析は、分散（混合したＡＮＯＶＡ）テストの双方向混合分析を使用して行われた。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１で考慮され、全ての値は、平均±標準誤差（ＳＥＭ）で示された。マイクロアレイデータの統計学的分析は、以前の実験と同一方法で評価した。
また、本実験では、臍帯（umbilical cord）使用のために、チャ盆唐医療センターの臨床試験審査委員会（Institutional Review Board）の承認を受け（ＩＲＢ ｎｏ．：ＢＤ２０１３－００４Ｄ）、全ての実験動物は、チャ医科大学校の実験動物運営委員会から提供されたガイドラインによって操作された。
実験例１．脳卒中動物モデルにおけるｈＵＭＳＣｓによる神経損傷減少及び機能改善効果の確認
本実験例においては、行動学的テスト、梗塞サイズの評価、及びＴＵＮＥＬを実施し、ｈＵＭＳＣｓの静脈投与（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ）による脳梗塞の急性段階において、神経損傷減少及び機能改善効果を確認しようとした。
（１）ｈＵＭＳＣｓの静脈投与
ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓの用量及び投与時点による機能的変化を評価するために、前述の脳卒中動物モデル（ＭＣＡｏが誘発されたラット）を、ｈＵＭＳＣｓの用量及び投与時点によって総５個のグループに分類した。
実験例１．脳卒中動物モデルにおけるｈＵＭＳＣｓによる神経損傷減少及び機能改善効果の確認
本実験例においては、行動学的テスト、梗塞サイズの評価、及びＴＵＮＥＬを実施し、ｈＵＭＳＣｓの静脈投与（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ）による脳梗塞の急性段階において、神経損傷減少及び機能改善効果を確認しようとした。
（１）ｈＵＭＳＣｓの静脈投与
ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓの用量及び投与時点による機能的変化を評価するために、前述の脳卒中動物モデル（ＭＣＡｏが誘発されたラット）を、ｈＵＭＳＣｓの用量及び投与時点によって総５個のグループに分類した。
グループ１（Ｇ１）：ＭＣＡｏ誘発の後２４時間目、生理食塩水を投与したラット
グループ２（Ｇ２）：ＭＣＡｏ誘発の後２４時間目、１×１０５個のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓを投与したラット
グループ３（Ｇ３）：ＭＣＡｏ誘発の後２４時間目、５×１０５個のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓを投与したラット
グループ４（Ｇ４）：ＭＣＡｏ誘発の後２４時間目、１×１０６個のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓを投与したラット
グループ５（Ｇ５）：ＭＣＡｏ誘発の後７日目、１×１０６個のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓを投与したラット
前記それぞれの投与時点（ＭＣＡｏ２４時間目またはＭＣＡｏ７日目）において、５００μｌの生理食塩水と混合したｈＵＭＳＣｓを、当該グループの尾静脈に５分間投与した。投与過程において、激しい出血はなく、全てのラットの生体信号は、手術中、安定していた。全てのラットには、投与前日から細胞投与後８週目まで、シクロスポリンＡ（５ｍｇ／ｋｇ）が腹腔内注射された。
グループ２（Ｇ２）：ＭＣＡｏ誘発の後２４時間目、１×１０５個のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓを投与したラット
グループ３（Ｇ３）：ＭＣＡｏ誘発の後２４時間目、５×１０５個のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓを投与したラット
グループ４（Ｇ４）：ＭＣＡｏ誘発の後２４時間目、１×１０６個のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓを投与したラット
グループ５（Ｇ５）：ＭＣＡｏ誘発の後７日目、１×１０６個のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓを投与したラット
前記それぞれの投与時点（ＭＣＡｏ２４時間目またはＭＣＡｏ７日目）において、５００μｌの生理食塩水と混合したｈＵＭＳＣｓを、当該グループの尾静脈に５分間投与した。投与過程において、激しい出血はなく、全てのラットの生体信号は、手術中、安定していた。全てのラットには、投与前日から細胞投与後８週目まで、シクロスポリンＡ（５ｍｇ／ｋｇ）が腹腔内注射された。
また、ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓの用量及び投与時点による機能的変化を評価した後、それと独立して実験を実施し、ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ投与による治療効果を確認しようとした。脳梗塞を誘発した日から総４週にわたり、ＭＣＡｏ２４時間後から、１×１０６個のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓが投与され（ＩＶ－ｈＵＭＳＣグループ、ｎ＝１０）、対照群としては、生理食塩水が投与された（salineグループ、ｎ＝１０）。
（２）行動学的テスト
行動学的テストは、各グループに係わる情報が盲検である遂行者によって遂行され、ロタロドテスト及びｍＮＳＳテストは、以前と同一方式によって行われた。ロータロッドテストにおいて、それぞれのラットに対して、ＭＣＡｏ誘発前、３日間、１日に３度ずつ事前訓練を実施し、動物間の変異を最小化させた。ロータロッドホイール上に、ラットを位置させ、ホイール上での持久力時間を測定した。ロータロッド装置のロッド速度は、２分間４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで漸進的に増加させた。その後、回転するタイヤからラットが落ちるのにかかる時間を記録し、総３回の実験において、それらの平均時間を計算した。前記テストは、ＭＣＡｏ前１日（pre）、ＭＣＡｏ誘導された日（Ｄ０）、ＭＣＡｏ誘発後２日目（Ｄ２）に実施された。その後、前記テストは、総８週にわたり、１週間に１回ずつ実施された。
（２）行動学的テスト
行動学的テストは、各グループに係わる情報が盲検である遂行者によって遂行され、ロタロドテスト及びｍＮＳＳテストは、以前と同一方式によって行われた。ロータロッドテストにおいて、それぞれのラットに対して、ＭＣＡｏ誘発前、３日間、１日に３度ずつ事前訓練を実施し、動物間の変異を最小化させた。ロータロッドホイール上に、ラットを位置させ、ホイール上での持久力時間を測定した。ロータロッド装置のロッド速度は、２分間４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで漸進的に増加させた。その後、回転するタイヤからラットが落ちるのにかかる時間を記録し、総３回の実験において、それらの平均時間を計算した。前記テストは、ＭＣＡｏ前１日（pre）、ＭＣＡｏ誘導された日（Ｄ０）、ＭＣＡｏ誘発後２日目（Ｄ２）に実施された。その後、前記テストは、総８週にわたり、１週間に１回ずつ実施された。
修正された神経学的重症度点数（ｍＮＳＳ）テストにおいて、それぞれのラットは、ＭＣＡｏ誘発後１日目からテストされ、細胞投与後、総８週にわたって実施された。前記ラットに対して、それぞれの神経学的テスト点数の合計である点数が与えられた。高点数は、最も深刻な状態を示す一方、低点数は、正常状態を意味する。
（３）梗塞サイズの測定及びＴＵＮＥＬ分析
ＭＣＡｏ８週目、クレシルバイオレット染色を使用し、ＭＣＡｏモデルにおいて、梗塞体積を測定した（各グループに対して、ｎ＝７）。独立したin vivo実験グループにおいて、ＭＣＡｏ後７２時間目（ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与４８時間後）、ＩＶ－ｈＵＭＳＣと生理食塩水との投与グループ（各グループに対して、ｎ＝５）の梗塞サイズを、塩化２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムを使用して比較した。細部的な組織の準備方法は、以前と同一方式によって遂行された。その後、梗塞サイズを、損傷されていない対側性半球に対する百分率で評価し、下記数式１を介して算出した。
（３）梗塞サイズの測定及びＴＵＮＥＬ分析
ＭＣＡｏ８週目、クレシルバイオレット染色を使用し、ＭＣＡｏモデルにおいて、梗塞体積を測定した（各グループに対して、ｎ＝７）。独立したin vivo実験グループにおいて、ＭＣＡｏ後７２時間目（ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与４８時間後）、ＩＶ－ｈＵＭＳＣと生理食塩水との投与グループ（各グループに対して、ｎ＝５）の梗塞サイズを、塩化２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムを使用して比較した。細部的な組織の準備方法は、以前と同一方式によって遂行された。その後、梗塞サイズを、損傷されていない対側性半球に対する百分率で評価し、下記数式１を介して算出した。
（数１）
推定された梗塞サイズ（％）＝［１－（残存する同側性半球の部分／損傷されていない対側性半球の部分）］×１００
目的部分（areas of interest）は、ImageＪ ソフトウェア（ImageＪ、National Institutes of Health）によって測定され、前記測定された値は、脳当たり６個の連続的な冠状片について合算した結果を示す。
推定された梗塞サイズ（％）＝［１－（残存する同側性半球の部分／損傷されていない対側性半球の部分）］×１００
目的部分（areas of interest）は、ImageＪ ソフトウェア（ImageＪ、National Institutes of Health）によって測定され、前記測定された値は、脳当たり６個の連続的な冠状片について合算した結果を示す。
細胞死滅に係わるＴＵＮＥＬ分析は、以前と同一方式によって行われた。対象組織は、核マーカー、４’，６－ジアミジン－２９－フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰ６Ｉ）で対照染色された。蛍光標識された試料は、共焦点レーザスキャニング顕微鏡（ＬＳＭ５１０；Carl Zeiss Microimaging Inc．、Munchen、ドイツ）上で観察された。
（４）実験結果
ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓの用量及び投与時点による機能的変化を評価した結果、ロータロッドテスト及びｍＮＳＳテストにおいて、図２のＡに示されているように、ＭＣＡｏ誘発後２４時間目、１×１０６投与用量のｈＵＭＳＣｓを投与したラット（Ｇ４グループ）は、対照群であるＧ１グループ（生理食塩水投与グループ）に比べ、有意的な神経機能の改善効果を示した。また、梗塞サイズの評価においても、図２のＢに示されているように、Ｇ１グループに比べ、Ｇ４グループにおいて、有意的に低下しているということを確認することができた（Ｇ４対Ｇ１：３３．６±３．３％対４９．４±１．５％、ｐ＝０．００４）。ただし、Ｇ４グループと同一用量のｈＵＭＳＣを処理したにもかかわらず、脳卒中の後期段階（Ｇ５グループ）においては、機能的テストなどにおいて、いかなる有意的効果も観察されなかった。
（４）実験結果
ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓの用量及び投与時点による機能的変化を評価した結果、ロータロッドテスト及びｍＮＳＳテストにおいて、図２のＡに示されているように、ＭＣＡｏ誘発後２４時間目、１×１０６投与用量のｈＵＭＳＣｓを投与したラット（Ｇ４グループ）は、対照群であるＧ１グループ（生理食塩水投与グループ）に比べ、有意的な神経機能の改善効果を示した。また、梗塞サイズの評価においても、図２のＢに示されているように、Ｇ１グループに比べ、Ｇ４グループにおいて、有意的に低下しているということを確認することができた（Ｇ４対Ｇ１：３３．６±３．３％対４９．４±１．５％、ｐ＝０．００４）。ただし、Ｇ４グループと同一用量のｈＵＭＳＣを処理したにもかかわらず、脳卒中の後期段階（Ｇ５グループ）においては、機能的テストなどにおいて、いかなる有意的効果も観察されなかった。
また、ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ投与による治療効果を確認した結果、図３のＡ及びＢに示されているように、ＭＣＡｏ誘発後２４時間目、１×１０６投与用量のＩＶ－ｈＵＭＳＣｓを投与したラット（ＩＶ－ｈＵＭＳＣグループ）は、前述の行動学的検査において、４週にわたって有意的な改善効果を示し、ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、梗塞サイズが、対照群に比べ、格段に低減されていることを確認することができた。
最後に、神経細胞死滅に対するＩＶ－ｈＵＭＳＣｓの効果を調査するために、ＴＵＮＥＬ（terminal deoxynucleotidyl transferase ｄＵＴＰ nick－end labeling）アッセイを実施した結果、図４に示されているように、生理食塩水処理グループにおいては、梗塞周囲部分に、多くのＴＵＮＥＬ陽性細胞が存在し、広範囲の神経細胞死滅を観察することができた一方、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループにおいて、ＭＣＡｏ誘導後７２時間目、梗塞周囲部分に存在するＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は、生理食塩水処理グループより有意的に少なく観察された（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ対saline：２２．１±１．９％対３９．５±３．８％、ｐ＝０．００６）。
従って、一連の実験結果は、急性段階の脳梗塞組織に対する約１×１０６個のｈＵＭＳＣｓ静脈投与は、損傷部位、すなわち、梗塞サイズの低減だけではなく、有意的な神経機能の改善をもたらすということを示すものである。
一方、以下の実験例においては、ＭＣＡｏ誘発後２４時間目、１×１０６個のｈＵＭＳＣｓを静脈投与したラット（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ）と、対照群として、生理食塩水のみを処理したラット（salineグループ）とを対象にする生化学的及び／または組織学的な分析を実施した。
実験例２．脳梗塞の急性段階におけるｈＵＭＳＣｓによる炎症緩和効果確認
本実験例においては、免疫組織化学検査、及びリアルタイムＰＣＲなどを実施し、ｈＵＭＳＣｓの静脈投与（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ）による炎症緩和効果を確認しようとした。
（１）免疫組織化学検査及びＭＰＯ分析
ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、免疫組織化学検査を実施し、脳梗塞組織の病理学的変化を観察した（各グループに対してｎ＝５）。大食細胞（macrophages）／小膠細胞（microglia）（Ｉｂａ－１、ｉＮＯＳ及びＣＤ２０６）、好中球（ＥＬＡＮＥ）のような免疫組織化をマーカーを使用し、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与後、梗塞された脳組織内関連因子の変化を評価した。また、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）分析キット（Hycult Biotech、Uden、オランダ）を使用し、ラット脳組織の上澄み液において、ＭＰＯを測定した。ＥＬＩＳＡ手続きは、製造社の指針に従って遂行され、それぞれ異なる日に独立した実験が２回実施された。
（２）リアルタイム重合酵素連鎖反応（real－time polymerase chain reaction）
ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、ＭＣＡｏ処理された同側性半球（ipsilateral hemisphere）を対象に、リアルタイムＰＣＲを実施し、ＩＬ１Ｂ（interleukin－１β coding gene）、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α coding gene）、ＭＭＰ９（matrix metalloproteinase ９ coding gene）を含む脳卒中病態生理と係わる炎症性サトカインの変化を調査した。本実験において、対照群として、生理食塩水が処理されたＭＣＡｏラット脳組織だけではなく、正常ラット脳組織由来のＲＮＡを対象にしても実験を実施し、ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓの投与による脳梗塞組織内の炎症性遺伝子発現の変化を調査した。総ＲＮＡｓは、SuperScript（登録商標） ＩＩ First－Strand Synthesis System（Invitrogen、ＭＡ）を使用し、相補的なＤＮＡ鎖に逆転写された。ｍＲＮＡの発現は、ＣＦＸＴＭ real－time system（Bio-Rad Laboratories、ＣＡ）及びQuantitect（登録商標） ＳＹＢＲ Green ＰＣＲ kit（Qiagen、Hilden、ドイツ）を使用して定量化された。リアルタイムＰＣＲは、各遺伝子に対して２回実施され、それらの平均値が統計分析に使用された。選択された遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨを正規化された。倍数差は、比較臨界（ＣＴ）周期方法によって算術された２－ｄｄＣＴ値で示した。
（３）実験結果
免疫組織化学検査結果、図５のＡに示されているように、ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、対照群（生理食塩水投与グループ）において、ＥＤ－１（ヒトＣＤ６８のラット同族体）陽性細胞、及びイオン化されたカルシウム結合タンパク質アダプダ分子１（Ｉｂａ－１）陽性細胞が、梗塞周囲部分で多量発見されたが、そのようなＥＤ－１陽性細胞（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ対saline：２０．２±２．１％対３９．３±２．９％、ｐ＝０．００６）及びＩｂａ－１陽性細胞（ＩＶｈＵＭＳＣｓ対saline：２５．６±２．１％対３４．９±２．９％、ｐ＝０．０１７）の数は、ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ投与グループにおいて、有意的に減少した。また、図５のＢに示されているように、ＥＤ－１陽性細胞において、誘導性酸化窒素合成酵素陽性細胞（ｉＮＯＳ）の比率は、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループが対照群に比べて低かった一方（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ対saline：４３．７±４．３％対６０．３±５．１％、ｐ＝０．００３）、ＥＤ－１陽性細胞において、ＣＤ２０６陽性細胞の比率は、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループが対照群に比べて高かった（ＩＶｈＵＭＳＣｓ対saline：６６．５±３．３％対３４．１±４．３％、ｐ＜０．００１）。併せて、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与後、梗塞部分に浸潤された好中球の変化を、好中球エラスターゼ（ＥＬＡＮＥ）免疫染色を介して評価した結果、図５のＣに示されているように、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループで観察されたＥＬＡＮＥ陽性細胞の数が、対照群に対して、有意的に少なく観察された（ＩＶｈＵＭＳＣｓ対saline：４．９±０．９％対１６．７±１．９％、ｐ＝０．００１）。
実験例２．脳梗塞の急性段階におけるｈＵＭＳＣｓによる炎症緩和効果確認
本実験例においては、免疫組織化学検査、及びリアルタイムＰＣＲなどを実施し、ｈＵＭＳＣｓの静脈投与（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ）による炎症緩和効果を確認しようとした。
（１）免疫組織化学検査及びＭＰＯ分析
ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、免疫組織化学検査を実施し、脳梗塞組織の病理学的変化を観察した（各グループに対してｎ＝５）。大食細胞（macrophages）／小膠細胞（microglia）（Ｉｂａ－１、ｉＮＯＳ及びＣＤ２０６）、好中球（ＥＬＡＮＥ）のような免疫組織化をマーカーを使用し、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与後、梗塞された脳組織内関連因子の変化を評価した。また、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）分析キット（Hycult Biotech、Uden、オランダ）を使用し、ラット脳組織の上澄み液において、ＭＰＯを測定した。ＥＬＩＳＡ手続きは、製造社の指針に従って遂行され、それぞれ異なる日に独立した実験が２回実施された。
（２）リアルタイム重合酵素連鎖反応（real－time polymerase chain reaction）
ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、ＭＣＡｏ処理された同側性半球（ipsilateral hemisphere）を対象に、リアルタイムＰＣＲを実施し、ＩＬ１Ｂ（interleukin－１β coding gene）、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α coding gene）、ＭＭＰ９（matrix metalloproteinase ９ coding gene）を含む脳卒中病態生理と係わる炎症性サトカインの変化を調査した。本実験において、対照群として、生理食塩水が処理されたＭＣＡｏラット脳組織だけではなく、正常ラット脳組織由来のＲＮＡを対象にしても実験を実施し、ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓの投与による脳梗塞組織内の炎症性遺伝子発現の変化を調査した。総ＲＮＡｓは、SuperScript（登録商標） ＩＩ First－Strand Synthesis System（Invitrogen、ＭＡ）を使用し、相補的なＤＮＡ鎖に逆転写された。ｍＲＮＡの発現は、ＣＦＸＴＭ real－time system（Bio-Rad Laboratories、ＣＡ）及びQuantitect（登録商標） ＳＹＢＲ Green ＰＣＲ kit（Qiagen、Hilden、ドイツ）を使用して定量化された。リアルタイムＰＣＲは、各遺伝子に対して２回実施され、それらの平均値が統計分析に使用された。選択された遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨを正規化された。倍数差は、比較臨界（ＣＴ）周期方法によって算術された２－ｄｄＣＴ値で示した。
（３）実験結果
免疫組織化学検査結果、図５のＡに示されているように、ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、対照群（生理食塩水投与グループ）において、ＥＤ－１（ヒトＣＤ６８のラット同族体）陽性細胞、及びイオン化されたカルシウム結合タンパク質アダプダ分子１（Ｉｂａ－１）陽性細胞が、梗塞周囲部分で多量発見されたが、そのようなＥＤ－１陽性細胞（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ対saline：２０．２±２．１％対３９．３±２．９％、ｐ＝０．００６）及びＩｂａ－１陽性細胞（ＩＶｈＵＭＳＣｓ対saline：２５．６±２．１％対３４．９±２．９％、ｐ＝０．０１７）の数は、ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ投与グループにおいて、有意的に減少した。また、図５のＢに示されているように、ＥＤ－１陽性細胞において、誘導性酸化窒素合成酵素陽性細胞（ｉＮＯＳ）の比率は、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループが対照群に比べて低かった一方（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ対saline：４３．７±４．３％対６０．３±５．１％、ｐ＝０．００３）、ＥＤ－１陽性細胞において、ＣＤ２０６陽性細胞の比率は、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループが対照群に比べて高かった（ＩＶｈＵＭＳＣｓ対saline：６６．５±３．３％対３４．１±４．３％、ｐ＜０．００１）。併せて、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与後、梗塞部分に浸潤された好中球の変化を、好中球エラスターゼ（ＥＬＡＮＥ）免疫染色を介して評価した結果、図５のＣに示されているように、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループで観察されたＥＬＡＮＥ陽性細胞の数が、対照群に対して、有意的に少なく観察された（ＩＶｈＵＭＳＣｓ対saline：４．９±０．９％対１６．７±１．９％、ｐ＝０．００１）。
次に、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）に対するＥＬＩＳＡを実施した結果、図６に示されているように、ＭＣＡｏ誘発後７２時間目ＭＰＯのレベルは、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループが、対照群に比べてさらに低く観察された（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ対saline：７４．１±４．８ｐｇ／ｍｌ対２２５．１±４．７ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）。
最後に、炎症関連遺伝子に対するリアルタイム重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）分析においては、図７に示されているように、脳梗塞組織において、ＩＬ１Ｂ、ＴＮＦ及びＭＭＰ９のいずれの発現も上向き調節されたが、そのような傾向は、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループにおいて、いずれも格段に低減された。
従って、一連の実験結果は、急性段階の脳梗塞組織に対するｈＵＭＳＣｓ静脈投与は、当該部位の炎症を緩和させるのに寄与するということを示すものである。
実験例３．急性段階の脳梗塞組織で内人性ＩＬ－１ｒａの発現変化
本実験例においては、マイクロアレイ分析やリアルタイムＰＣＲなどを実施し、ｈＵＭＳＣｓの静脈投与（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ）による治療効果と密接な関連がある因子を導出しようとした。
（１）マイクロアレイ分析
ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、ＭＣＡｏ処理された同側性半球を、ｍＲＮＡマイクロアレイ分析に使用した。ＲＮＡは、ＭＣＡｏ非誘発のラット（対照グループ、ｎ＝５）内、ＭＣＡｏ誘発後２４時間目、１×１０６ ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓが投与されたラット（ｎ＝６）内、及びＭＣＡｏ誘発後２４時間目、生理食塩水が投与されたＭＣＡｏラット内の同側性半球に対して、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） 試薬（Thermo Fisher Scientific、ＭＡ）及びＲＮｅａｓｙカラム（Qiagen、Hilden）で均質化し、できる限り迅速に分離された。シャム（sham）対照群に追加し、本発明者らは、追加対照群として、ＭＣＡｏ非誘発の正常ラット脳を使用し、脳梗塞組織において、ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ処理後、炎症性遺伝子発現の変化を調査した。ＲＮＡ品質を保証するために、Agilent ２１００ Bioanalyzer（Agilent Technologies、ＣＡ）を使用し、２６０ｎｍ／２８０ｎｍの光学密度が１．０８以上を示す試料だけがマイクロアレイ分析に使用された。ＲＮＡ標識及び精製を行い、前記サンプルは、製造社の指針に従って、AgilentラットｍＲＮＡマイクロアレイチップ（SurePrint Ｇ３ Rat Gene Expression ８Ｘ６０ｋ、Agilent Inc.、ＣＡ）に混成化させた。前記アレイは、Agilent Technologies Ｇ２６００ＤＳＧ１２４９４２６３（Agilent Inc.、ＣＡ）を使用してスキャンされた。アレイデータの送出過程及び分析過程は、Agilent Feature Extraction software（ｖ１００．０．１．１）を使用して遂行された。前記データは、ログの変化及び量子化の正規化を介してフィルタリングされた。前記アレイデータは、それぞれのグループ間の双対比較のために、false discovery rate correction（Benjamini-Hochberg test）を介したStudent’s t-testを使用して統計学的に分析された。差別的に発現された転写体は、複合比較仮説を考慮し、２倍以上の差（ＦＤ）と、補正されたｐ値（ｐ）＜０．０１の有意の差とを有する遺伝子と記述された。差別的に発現された転写体に係わる全てのデータ分析及び視覚化は、Ｒ ３．０．１（www.r-project.org）を使用して行われた。マイクロアレイデータは、ＧＥＯリポジトリに登録された（accession ｎｏ．ＧＳＥ７８７３１）。
（２）免疫組織化学検査など
ＩＬ－１ｒａ上向き調節に寄与する細胞亜集団を確認するために、脳梗塞組織を対象に、ＩＬ－１ｒａ及びＥＤ－１（小膠細胞マーカー）、ＮｅｕＮ（ニューロン性マーカー）またはＲｅｃａ－１（内皮細胞マーカー）に対する抗体を使用し、そのうち免疫化学検査を実施した。また、ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、ＭＣＡｏ処理された同側性半球を対象にリアルタイムＰＣＲを実施し、ＩＬ－１媒介炎症調節因子、すなわち、ＩＬ１ＲＮ及びＩＬ－１ｒａの発現を確認した。一方、具体的な実験は、前記実験例２の（１）及び（２）と同一方式で実施された。
（３）実験結果
ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループ及び生理食塩水投与グループに由来した脳組織を対象に、ｍＲＮＡマイクロアレイを実施した。その結果、図８に示されているように、ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、対照グループと生理食塩水投与グループとの遺伝子発現比較を介して、総５９５個の転写体（そのうち、５５３個の転写体は、上向き調節され、４２個の転写体は、下向き調節される）がＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループにおいて、差別的に発現された。また、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループと生理食塩水投与グループとの遺伝子発現プロファイルを比較したとき、総８５個の転写体（そのうち、７７個の転写体は、上向き調節され、８個の転写体は、下向き調節される）が差別的に発現された。特に、そのうちでも、インターロイキン－１受容体拮抗剤（ＩＬ－１ｒａ）をコーディングする遺伝子であるＩＬ１ＲＮは、生理食塩水投与グループに比べ、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループにおいて、非常に力強く上向き調節された遺伝子のうち一つであった。
実験例３．急性段階の脳梗塞組織で内人性ＩＬ－１ｒａの発現変化
本実験例においては、マイクロアレイ分析やリアルタイムＰＣＲなどを実施し、ｈＵＭＳＣｓの静脈投与（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ）による治療効果と密接な関連がある因子を導出しようとした。
（１）マイクロアレイ分析
ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、ＭＣＡｏ処理された同側性半球を、ｍＲＮＡマイクロアレイ分析に使用した。ＲＮＡは、ＭＣＡｏ非誘発のラット（対照グループ、ｎ＝５）内、ＭＣＡｏ誘発後２４時間目、１×１０６ ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓが投与されたラット（ｎ＝６）内、及びＭＣＡｏ誘発後２４時間目、生理食塩水が投与されたＭＣＡｏラット内の同側性半球に対して、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） 試薬（Thermo Fisher Scientific、ＭＡ）及びＲＮｅａｓｙカラム（Qiagen、Hilden）で均質化し、できる限り迅速に分離された。シャム（sham）対照群に追加し、本発明者らは、追加対照群として、ＭＣＡｏ非誘発の正常ラット脳を使用し、脳梗塞組織において、ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ処理後、炎症性遺伝子発現の変化を調査した。ＲＮＡ品質を保証するために、Agilent ２１００ Bioanalyzer（Agilent Technologies、ＣＡ）を使用し、２６０ｎｍ／２８０ｎｍの光学密度が１．０８以上を示す試料だけがマイクロアレイ分析に使用された。ＲＮＡ標識及び精製を行い、前記サンプルは、製造社の指針に従って、AgilentラットｍＲＮＡマイクロアレイチップ（SurePrint Ｇ３ Rat Gene Expression ８Ｘ６０ｋ、Agilent Inc.、ＣＡ）に混成化させた。前記アレイは、Agilent Technologies Ｇ２６００ＤＳＧ１２４９４２６３（Agilent Inc.、ＣＡ）を使用してスキャンされた。アレイデータの送出過程及び分析過程は、Agilent Feature Extraction software（ｖ１００．０．１．１）を使用して遂行された。前記データは、ログの変化及び量子化の正規化を介してフィルタリングされた。前記アレイデータは、それぞれのグループ間の双対比較のために、false discovery rate correction（Benjamini-Hochberg test）を介したStudent’s t-testを使用して統計学的に分析された。差別的に発現された転写体は、複合比較仮説を考慮し、２倍以上の差（ＦＤ）と、補正されたｐ値（ｐ）＜０．０１の有意の差とを有する遺伝子と記述された。差別的に発現された転写体に係わる全てのデータ分析及び視覚化は、Ｒ ３．０．１（www.r-project.org）を使用して行われた。マイクロアレイデータは、ＧＥＯリポジトリに登録された（accession ｎｏ．ＧＳＥ７８７３１）。
（２）免疫組織化学検査など
ＩＬ－１ｒａ上向き調節に寄与する細胞亜集団を確認するために、脳梗塞組織を対象に、ＩＬ－１ｒａ及びＥＤ－１（小膠細胞マーカー）、ＮｅｕＮ（ニューロン性マーカー）またはＲｅｃａ－１（内皮細胞マーカー）に対する抗体を使用し、そのうち免疫化学検査を実施した。また、ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、ＭＣＡｏ処理された同側性半球を対象にリアルタイムＰＣＲを実施し、ＩＬ－１媒介炎症調節因子、すなわち、ＩＬ１ＲＮ及びＩＬ－１ｒａの発現を確認した。一方、具体的な実験は、前記実験例２の（１）及び（２）と同一方式で実施された。
（３）実験結果
ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループ及び生理食塩水投与グループに由来した脳組織を対象に、ｍＲＮＡマイクロアレイを実施した。その結果、図８に示されているように、ＭＣＡｏ誘発後７２時間目、対照グループと生理食塩水投与グループとの遺伝子発現比較を介して、総５９５個の転写体（そのうち、５５３個の転写体は、上向き調節され、４２個の転写体は、下向き調節される）がＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループにおいて、差別的に発現された。また、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループと生理食塩水投与グループとの遺伝子発現プロファイルを比較したとき、総８５個の転写体（そのうち、７７個の転写体は、上向き調節され、８個の転写体は、下向き調節される）が差別的に発現された。特に、そのうちでも、インターロイキン－１受容体拮抗剤（ＩＬ－１ｒａ）をコーディングする遺伝子であるＩＬ１ＲＮは、生理食塩水投与グループに比べ、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループにおいて、非常に力強く上向き調節された遺伝子のうち一つであった。
一方、ＩＬ－１ｒａは、ＩＬ－１の天然拮抗剤として、脳梗塞組織において、ＩＬ－１媒介炎症を調節すると知られている。従って、前記の実験結果に基づいて、ＩＶ－ｈＵＭＳＣの投与による脳梗塞治療効果は、ＩＬ－１ｒａによって媒介されるとの前提下で、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与後、脳梗塞組織において、ＩＬ１ＲＮ ｍＲＮＡ及びＩＬ－１ｒａタンパク質の発現変化を確認した。その結果、図９に示されているように、ＭＣＡｏ誘発後ＩＶ－ｈＵＭＳＣの投与は、ＩＬ１ＲＮ ｍＲＮＡを上向き調節し、それにより、ＩＬ－１ｒａタンパク質のレベルが有意的に増加されるということを確認することができた（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ対saline：２３７．５±４９．０ｐｇ／ｍｌ対１１９．６±１５．６ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０１）。
前述の実験結果から、ＩＬ－１ｒａは、ｈＵＭＳＣｓの静脈投与（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ）による治療効果と密接な関連性があるということが分かった。
また、ＩＬ－１ｒａ上向き調節に寄与する細胞亜集団を確認するために、免疫組織化学検査を実施した結果、図１０に示されているように、ＩＶ－ｈＵＭＳＣ投与グループのＥＤ－１陽性細胞内ＩＬ－１ｒａ陽性細胞の比率が、生理食塩水投与グループに比べ、有意的に高いということを確認することができた（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ対saline：３４．８±２．５％対２２．１±３．４％、ｐ＝０．０１）。特に、ＭＣＡｏ誘発後の７２時間目及び４週目、脳梗塞組織にＩＶ投与されたｈＵＭＳＣｓがほとんど検出されていないということを、ヒト特異的核抗体を使用した免疫染色によって観察することができ（投与された細胞のうち１％未満）、ＥＬＩＳＡ実験においても、ＩＬ－１ｒａは、ｈＵＭＳＣｓの条件化された培地（ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭ）で検出されなかった（＜３．２ｐｇ／ｍｌ）。
そのような一連の実験結果は、前記ｈＵＭＳＣｓの静脈投与（ＩＶ－ｈＵＭＳＣｓ）によるＩＬ－１ｒａの上向き調節は、移植された細胞に由来するものではなく、小膠細胞及び大食細胞のような脳梗塞組織内炎症細胞から起因したものであるということを提示する。
実験例４．大食細胞でのｈＵＭＳＣｓによるＣＲＥＢ活性及びＩＬ－１ｒａ放出変化
（１）Raw ２６４．７細胞に対するｈＵＭＳＣｓの条件化された培地の処理
マウス大食細胞細胞株（Raw ２６４．７細胞、ＡＴＣＣ、ＶＡ）は、製造社の指針に従って培養された。前記Raw ２６４．７細胞は、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、Sigma－Aldrich、ＭＯ）またはｈＵＭＳＣｓ－ＣＭと共に、ＬＰＳで２４時間処理され、各処理グループから上澄み液を分離した。
（２）ウェスタンブロット分析
Raw ２６４．７細胞を均質化させた後、タンパク質溶解緩衝液（ＰＲＯ－ＰＲＥＰTM Intron Biotechnology、Seongnam、韓国）を使用してタンパク質を分離し、製造社の指針に従って、免疫ブロット分析を実施した。全体タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、一次抗体を使用し、免疫ブロッティングを実施した。使用された一次抗体は、次の通りである：（１）anti－ＣＲＥＢ及びanti－ｐ－ＣＲＥＢ（１：１，０００、Cell Signaling Technology、ＭＡ）、（２）anti－ＮＦ－κＢｐ６５及びanti－ｐ－ＮＦ－κＢｐ６５（１：１，０００、Santa Cruz Biotechnology、ＴＸ）及び（３）anti－ＩＬ－１ｒａ（１：５００、Santa Cruz Biotechnology、ＴＸ）。ＧＡＰＤＨ（１：５，０００、Santa Cruz Biotechnology、ＴＸ）が内部対照群として使用され、バンドの定量化は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪプログラムを使用して行われた。それぞれ異なる日に独立した実験が３回実施された。
（３）ｐ－ＣＲＥＢの阻害
Raw ２６４．７細胞（２×１０５）をプレート上にシーディングした後、それを２４時間インキュベーティングさせた。前記細胞を、ＫＧ５０１（２，５及び１０μＭ、Sigma－Aldrich、ＭＯ）を含む無血清培地に４５分間前処理した。その後、培養皿から上澄み液を除去し、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）存在下で、ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭを前記細胞に処理した。前記上澄み液は、ＩＬ－１ｒａ ＥＬＩＳＡ分析のために使用された。それぞれ異なる日に独立した実験が３回実施された。
（４）ＣＲＥＢのノックダウン
Raw ２６４．７細胞（２Ｘ１０５）を６ウェルプレートにプレーティングした後、製造社の指針に従い、Lipofectamine ３０００ reagent（Invitrogen、ＭＡ）を使用し、１００ｎＭのＣＲＥＢ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＲＥＢ）及び対照群（ｓｉＣｔｒ）で４８時間形質感染させた。前記ｓｉＣＲＥＢ（センス：５’－ＣＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧＡＵＵＡＡＵＵＵＵＵ－３”、アンチセンス：５’－ＡＡＡＵＵＡＡＵＣＵＧＡＵＵＵＧＵＧＧＵＵ－３”）及びｓｉＣｔｒ（センス：５－ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ－３’、アンチセンス：５’－ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ－３”）は、Genolution Pharmaceuticals, Inc.から入手した。形質感染後、前記ＲＮＡ及びタンパク質を分離し、それぞれＰＣＲ及びウェスタンブロットのために使用された。
（５）酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
商業的に利用可能なＥＬＩＳＡキット（ＩＬ－１βQuantikine ＥＬＩＳＡ及びＩＬ－１ｒａQuantikine ＥＬＩＳＡ kits、Ｒ＆Ｄ Systems、ＭＮ）を使用し、Raw ２６４．７細胞の上澄み液でＩＬ－１β及びＩＬ－１ｒａレベルを測定した。
（６）実験結果
中枢神経系の小膠細胞と共に、循環する大食細胞も、脳の実質に侵透し、前炎症性サトカインを放出することにより、脳梗塞後に引き起こされる炎症反応に重要な役割を行う。また、ＭＳＣは、循環する大食細胞を抗炎症性表現型に分極化させ、損傷された組織の治療に寄与する多くの炎症細胞を集めると知られている。従って、マウス大食細胞株（Raw ２６４．７細胞）のＩＬ－１ｒａ発現に対するｈＵＭＳＣｓ－ＣＭの影響を調査した。まず、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の処理は、Raw ２６４．７細胞において、Ｉｌ－１β及びＩＬ－１ｒａのいずれの発現も力強く増大させ、それにより、ＩＬ－１ｒａの発現は、ＩＬ－１β活性化、補償的メカニズムのような炎症性環境下において、炎症反応に関与するＮＦ－κＢ信号により、上向き調節されると予想された。しかし、図１１に示されているように、Raw ２６４．７細胞に、ＬＰＳ及びｈＵＭＳＣｓ－ＣＭと共同処理したとき、ＩＬ－１βのレベルは、低下し一方、ＩＬ－１ｒａレベルは、かえって上昇し、全く異なる傾向を示したが、そのような結果から、ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭの処理によるＩＬ－１ｒａの上向き調節は、ＮＦ－κＢ以外の他のメカニズムが関与するということが分かった。
実験例４．大食細胞でのｈＵＭＳＣｓによるＣＲＥＢ活性及びＩＬ－１ｒａ放出変化
（１）Raw ２６４．７細胞に対するｈＵＭＳＣｓの条件化された培地の処理
マウス大食細胞細胞株（Raw ２６４．７細胞、ＡＴＣＣ、ＶＡ）は、製造社の指針に従って培養された。前記Raw ２６４．７細胞は、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、Sigma－Aldrich、ＭＯ）またはｈＵＭＳＣｓ－ＣＭと共に、ＬＰＳで２４時間処理され、各処理グループから上澄み液を分離した。
（２）ウェスタンブロット分析
Raw ２６４．７細胞を均質化させた後、タンパク質溶解緩衝液（ＰＲＯ－ＰＲＥＰTM Intron Biotechnology、Seongnam、韓国）を使用してタンパク質を分離し、製造社の指針に従って、免疫ブロット分析を実施した。全体タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、一次抗体を使用し、免疫ブロッティングを実施した。使用された一次抗体は、次の通りである：（１）anti－ＣＲＥＢ及びanti－ｐ－ＣＲＥＢ（１：１，０００、Cell Signaling Technology、ＭＡ）、（２）anti－ＮＦ－κＢｐ６５及びanti－ｐ－ＮＦ－κＢｐ６５（１：１，０００、Santa Cruz Biotechnology、ＴＸ）及び（３）anti－ＩＬ－１ｒａ（１：５００、Santa Cruz Biotechnology、ＴＸ）。ＧＡＰＤＨ（１：５，０００、Santa Cruz Biotechnology、ＴＸ）が内部対照群として使用され、バンドの定量化は、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪプログラムを使用して行われた。それぞれ異なる日に独立した実験が３回実施された。
（３）ｐ－ＣＲＥＢの阻害
Raw ２６４．７細胞（２×１０５）をプレート上にシーディングした後、それを２４時間インキュベーティングさせた。前記細胞を、ＫＧ５０１（２，５及び１０μＭ、Sigma－Aldrich、ＭＯ）を含む無血清培地に４５分間前処理した。その後、培養皿から上澄み液を除去し、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）存在下で、ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭを前記細胞に処理した。前記上澄み液は、ＩＬ－１ｒａ ＥＬＩＳＡ分析のために使用された。それぞれ異なる日に独立した実験が３回実施された。
（４）ＣＲＥＢのノックダウン
Raw ２６４．７細胞（２Ｘ１０５）を６ウェルプレートにプレーティングした後、製造社の指針に従い、Lipofectamine ３０００ reagent（Invitrogen、ＭＡ）を使用し、１００ｎＭのＣＲＥＢ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＲＥＢ）及び対照群（ｓｉＣｔｒ）で４８時間形質感染させた。前記ｓｉＣＲＥＢ（センス：５’－ＣＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧＡＵＵＡＡＵＵＵＵＵ－３”、アンチセンス：５’－ＡＡＡＵＵＡＡＵＣＵＧＡＵＵＵＧＵＧＧＵＵ－３”）及びｓｉＣｔｒ（センス：５－ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡ－３’、アンチセンス：５’－ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵ－３”）は、Genolution Pharmaceuticals, Inc.から入手した。形質感染後、前記ＲＮＡ及びタンパク質を分離し、それぞれＰＣＲ及びウェスタンブロットのために使用された。
（５）酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
商業的に利用可能なＥＬＩＳＡキット（ＩＬ－１βQuantikine ＥＬＩＳＡ及びＩＬ－１ｒａQuantikine ＥＬＩＳＡ kits、Ｒ＆Ｄ Systems、ＭＮ）を使用し、Raw ２６４．７細胞の上澄み液でＩＬ－１β及びＩＬ－１ｒａレベルを測定した。
（６）実験結果
中枢神経系の小膠細胞と共に、循環する大食細胞も、脳の実質に侵透し、前炎症性サトカインを放出することにより、脳梗塞後に引き起こされる炎症反応に重要な役割を行う。また、ＭＳＣは、循環する大食細胞を抗炎症性表現型に分極化させ、損傷された組織の治療に寄与する多くの炎症細胞を集めると知られている。従って、マウス大食細胞株（Raw ２６４．７細胞）のＩＬ－１ｒａ発現に対するｈＵＭＳＣｓ－ＣＭの影響を調査した。まず、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）の処理は、Raw ２６４．７細胞において、Ｉｌ－１β及びＩＬ－１ｒａのいずれの発現も力強く増大させ、それにより、ＩＬ－１ｒａの発現は、ＩＬ－１β活性化、補償的メカニズムのような炎症性環境下において、炎症反応に関与するＮＦ－κＢ信号により、上向き調節されると予想された。しかし、図１１に示されているように、Raw ２６４．７細胞に、ＬＰＳ及びｈＵＭＳＣｓ－ＣＭと共同処理したとき、ＩＬ－１βのレベルは、低下し一方、ＩＬ－１ｒａレベルは、かえって上昇し、全く異なる傾向を示したが、そのような結果から、ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭの処理によるＩＬ－１ｒａの上向き調節は、ＮＦ－κＢ以外の他のメカニズムが関与するということが分かった。
それにより、大食細胞内ｈＵＭＳＣｓ媒介ＩＬ－１ｒａ発現に、ｃＡＭＰ反応要素結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）の影響を追加して確認した。ウェスタンブロット分析結果、図１２に示されているように、Raw ２６４．７細胞に、ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭ及びＬＰＳを共同処理したとき、リン酸化されたＣＲＥＢ（ｐ－ＣＲＥＢ）タンパク質の発現が有意的に増大された一方、リン酸化されたＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）は、低減した。また、図１３に示されているように、ｐ－ＣＲＥＢ及びｐ－ＮＦ－κＢに対する免疫組織化学検査結果、Raw ２６４．７細胞において、ＬＰＳとｈＵＭＳＣｓ－ＣＭとの共同処理は、ＬＰＳ単独処理に比べ、ｐ－ＣＲＥＢの発現を力強く増大させるということを示している。
一方、図１４及び図１５に示されているように、ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭを、ＣＲＥＢ阻害剤（ＫＧ５０１）と共に処理した場合、ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭ処理によるＩＬ－１ｒａ発現増大が、ＣＲＥＢ阻害剤の用量依存的に阻害され、ＣＲＥＢｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＲＥＢ）での形質感染は、Raw ２６４．７細胞において、ＩＬ－１ｒａタンパク質の発現を低減させた。また、図１６に示されているように、ＬＰＳに刺激されたRaw ２６４．７細胞において、ＣＲＥＢのノックダウンは、ｈＵＭＳＣｓ－ＣＭの処理によって誘導されたＩＬ１ＲＮの増大された発現を低減させた。
そのような一連の実験結果は、大食細胞を含む炎症細胞内ＩＬ－１ｒａの発現増大は、脳卒中治療に寄与し、前述の発現はＣＲＥＢによって媒介されるということを示すものである。
本開示は以下の配列情報を包含する。
<110> CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation
CHA BIOTECH CO., LTD.
<120> COMPOSITION FOR TREATING STROKE AND METHOD FOR SCREENING THE
SAME
<130> PA24-135
<140>
<141> 2019-04-15
<150> KR10-2018-0095737
<151> 2018-08-16
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siCREB_sense
<400> 1
ccacaaauca gauuaauuuu u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siCREB_antisense
<400> 2
aaauuaaucu gauuuguggu u 21
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siCtr_sense
<400> 3
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siCtr_antisense
<400> 4
uucuccgaac gugucacgu 19
<110> CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation
CHA BIOTECH CO., LTD.
<120> COMPOSITION FOR TREATING STROKE AND METHOD FOR SCREENING THE
SAME
<130> PA24-135
<140>
<141> 2019-04-15
<150> KR10-2018-0095737
<151> 2018-08-16
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siCREB_sense
<400> 1
ccacaaauca gauuaauuuu u 21
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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acgugacacg uucggagaa 19
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<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siCtr_antisense
<400> 4
uucuccgaac gugucacgu 19
そのような一連の実験結果は、大食細胞を含む炎症細胞内ＩＬ－１ｒａの発現増大は、脳卒中治療に寄与し、前述の発現はＣＲＥＢによって媒介されるということを示すものである。
本開示は以下の実施形態を包含する。
[１] ＩＬ－１（Interleukin－１）受容体拮抗剤を有効成分として含む脳卒中治療用薬学的組成物。
[２] 前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、臍帯由来間葉基質細胞（臍帯由来間葉間質細胞）、ＩＬ－１ＲＡ（Interleukin－１ receptor antagonist）タンパク質、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする実施形態１に記載の薬学的組成物。
[３] 前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、ＩＬ－１に対する抗体、アンチセンスヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする実施形態１に記載の薬学的組成物。
[４] 前記組成物は、病変組織内炎症細胞に作用することを特徴とする実施形態１に記載の薬学的組成物。
[５] 前記炎症細胞は、小膠細胞または大食細胞であることを特徴とする実施形態４に記載の薬学的組成物。
[６] 前記組成物は、脳梗塞後２４時間以内に投与されることを特徴とする実施形態１に記載の薬学的組成物。
[７] 脳卒中治療のための候補物質と接触された個体の試料から、ＩＬ－１ＲＡ（Interleukin－１ receptor antagonist）の発現レベルを測定する段階と、
前記測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルを、前記候補物質と接触していない対照群個体の試料内ＩＬ－１ＲＡの発現レベルと比較する段階と、を含む脳卒中治療剤をスクリーニングする方法。
[８] 前記測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルが、接触していない対照群に比べて上昇した場合、前記候補物質を、脳卒中治療剤と決定する段階をさらに含むことを特徴とする実施形態７に記載の方法。
[９] 前記方法は、脳卒中治療のための候補物質と接触された個体の試料から、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－response element－binding）タンパク質の活性レベルを測定し、
前記測定されたＣＲＥＢタンパク質の活性レベルを、接触していない対照群個体の試料内ＣＲＥＢタンパク質の活性レベルと比較する段階をさらに含むことを特徴とする実施形態７に記載の方法。
[１０] 測定されたＣＲＥＢタンパク質の活性レベルが、接触していない対照群に比べて上昇した場合、前記候補物質を脳卒中治療剤と決定する段階をさらに含むことを特徴とする実施形態９に記載の方法。
[１１]前記試料は、脳組織、または前記組織から分離された炎症細胞であることを特徴とする実施形態７に記載の方法。
[１２] 前記炎症細胞は、小膠細胞、大食細胞、及びそれらの組み合わせであることを特徴とする実施形態１１に記載の方法。
[１３] 臍帯由来間葉基質細胞を含むＩＬ－１（Interleukin－１）受容体拮抗剤。
[１４] 前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、脳卒中治療のためであることを特徴とする実施形態１１に記載の拮抗剤。
[１５] 臍帯由来間葉基質細胞を含むＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－response element－binding）タンパク質活性増加剤。
本開示は以下の実施形態を包含する。
[１] ＩＬ－１（Interleukin－１）受容体拮抗剤を有効成分として含む脳卒中治療用薬学的組成物。
[２] 前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、臍帯由来間葉基質細胞（臍帯由来間葉間質細胞）、ＩＬ－１ＲＡ（Interleukin－１ receptor antagonist）タンパク質、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする実施形態１に記載の薬学的組成物。
[３] 前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、ＩＬ－１に対する抗体、アンチセンスヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする実施形態１に記載の薬学的組成物。
[４] 前記組成物は、病変組織内炎症細胞に作用することを特徴とする実施形態１に記載の薬学的組成物。
[５] 前記炎症細胞は、小膠細胞または大食細胞であることを特徴とする実施形態４に記載の薬学的組成物。
[６] 前記組成物は、脳梗塞後２４時間以内に投与されることを特徴とする実施形態１に記載の薬学的組成物。
[７] 脳卒中治療のための候補物質と接触された個体の試料から、ＩＬ－１ＲＡ（Interleukin－１ receptor antagonist）の発現レベルを測定する段階と、
前記測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルを、前記候補物質と接触していない対照群個体の試料内ＩＬ－１ＲＡの発現レベルと比較する段階と、を含む脳卒中治療剤をスクリーニングする方法。
[８] 前記測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルが、接触していない対照群に比べて上昇した場合、前記候補物質を、脳卒中治療剤と決定する段階をさらに含むことを特徴とする実施形態７に記載の方法。
[９] 前記方法は、脳卒中治療のための候補物質と接触された個体の試料から、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－response element－binding）タンパク質の活性レベルを測定し、
前記測定されたＣＲＥＢタンパク質の活性レベルを、接触していない対照群個体の試料内ＣＲＥＢタンパク質の活性レベルと比較する段階をさらに含むことを特徴とする実施形態７に記載の方法。
[１０] 測定されたＣＲＥＢタンパク質の活性レベルが、接触していない対照群に比べて上昇した場合、前記候補物質を脳卒中治療剤と決定する段階をさらに含むことを特徴とする実施形態９に記載の方法。
[１１]前記試料は、脳組織、または前記組織から分離された炎症細胞であることを特徴とする実施形態７に記載の方法。
[１２] 前記炎症細胞は、小膠細胞、大食細胞、及びそれらの組み合わせであることを特徴とする実施形態１１に記載の方法。
[１３] 臍帯由来間葉基質細胞を含むＩＬ－１（Interleukin－１）受容体拮抗剤。
[１４] 前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、脳卒中治療のためであることを特徴とする実施形態１１に記載の拮抗剤。
[１５] 臍帯由来間葉基質細胞を含むＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－response element－binding）タンパク質活性増加剤。
Claims (15)
- ＩＬ－１（Interleukin－１）受容体拮抗剤を有効成分として含む脳卒中治療用薬学的組成物。
- 前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、臍帯由来間葉基質細胞、ＩＬ－１ＲＡ（Interleukin－１ receptor antagonist）タンパク質、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
- 前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、ＩＬ－１に対する抗体、アンチセンスヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物は、病変組織内炎症細胞に作用することを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
- 前記炎症細胞は、小膠細胞または大食細胞であることを特徴とする請求項４に記載の薬学的組成物。
- 前記組成物は、脳梗塞後２４時間以内に投与されることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
- 脳卒中治療のための候補物質と接触された個体の試料から、ＩＬ－１ＲＡ（Interleukin－１ receptor antagonist）の発現レベルを測定する段階と、
前記測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルを、前記候補物質と接触していない対照群個体の試料内ＩＬ－１ＲＡの発現レベルと比較する段階と、を含む脳卒中治療剤をスクリーニングする方法。 - 前記測定されたＩＬ－１ＲＡの発現レベルが、接触していない対照群に比べて上昇した場合、前記候補物質を、脳卒中治療剤と決定する段階をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記方法は、脳卒中治療のための候補物質と接触された個体の試料から、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－response element－binding）タンパク質の活性レベルを測定し、
前記測定されたＣＲＥＢタンパク質の活性レベルを、接触していない対照群個体の試料内ＣＲＥＢタンパク質の活性レベルと比較する段階をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 測定されたＣＲＥＢタンパク質の活性レベルが、接触していない対照群に比べて上昇した場合、前記候補物質を脳卒中治療剤で決める段階をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 前記試料は、脳組織、または前記組織から分離された炎症細胞であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記炎症細胞は、小膠細胞、大食細胞、及びそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
- 臍帯由来間葉基質細胞を含むＩＬ－１（Interleukin－１）受容体拮抗剤。
- 前記ＩＬ－１受容体拮抗剤は、脳卒中治療のためであることを特徴とする請求項１１に記載の拮抗剤。
- 臍帯由来間葉基質細胞を含むＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ－response element－binding）タンパク質活性増加剤。
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