JP2024038327A - Ａｎｇｐｔｌ３の塩基編集および疾患の処置のためにこれを使用する方法 - Google Patents

Ａｎｇｐｔｌ３の塩基編集および疾患の処置のためにこれを使用する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＬＤＬ－Ｃを持続的に低下させるために、肝臓で発現される遺伝子標的を安全かつ効果的に編集し、それにより心血管系疾患の主な原因を処置することができる特定の組成物および方法を提供する。【解決手段】（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、（ｉｉ）前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含む、遺伝子標的を編集するための組成物を提供する。【選択図】図４９

Description

関連出願への相互参照
[001]本出願は、２０２０年４月９日出願の仮出願第６３／００７，８０３号、２０２
０年４月９日出願の仮出願第６３／００７，７９７号、２０２１年１月１１日出願の仮出願第６３／１３６，０８７号、２０２０年６月２６日出願の仮出願第６３／０４５，０３２号、２０２０年６月２６日出願の仮出願第６３／０４５，０３３号による３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条の下での利益を主張する。これらの開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
配列表
[002]本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、これにより参照により
全体として本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０２１年４月８日に作成され、５３９８９＿７１１＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名されており、サイズは１，１０５，７６２バイトである。
開示の分野
[003]遺伝子の改変または編集のための組成物、ならびに心血管の疾患および状態また
は糖尿病等のそれに関連する疾患等のある種の状態を処置または防止することができる、組成物を使用する方法が本明細書で提供される。
[004]本明細書で述べる全ての出版物、特許、および特許出願は、それぞれの個別の出
版物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているかのように、同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で具体的にまたは黙示的に参照したいずれの出版物または情報も、先行技術であること、または必ずしも特許請求する主題に関連することを認めるものではない。参照により組み込まれた出版物または特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾しまたは一致しない限り、そのような引用したまたは組み込まれた参照文献は、本明細書がいずれの矛盾する不一致または相反する材料をも置換えおよび／またはそれに優先することを意図するとの理解のもとに、本開示を補助するものと考えられるべきである。
[005]本出願で開示する発明の主題は、ポリヌクレオチドまたは標的遺伝子を編集する
ことができる組成物およびこれらの組成物の使用方法を対象とする。組成物およびその構成成分は、個別におよび組み合わせて、発明の主題の別個の態様とみなされ、この発明の主題は、限定なく任意の組合せで本明細書に記載するそれぞれの物理的および／または機能的な属性によって定義され、特許請求され得る。発明の主題の幅、特異性、および変形形態について、本明細書で要約する特定の態様によってさらに説明する。
[006]本明細書に記載する発明の主題の１つの顕著な態様は、心血管疾患（ＣＶＤ）の
処置を対象とする。ＣＶＤは世界的に主要な死因であり、世界保健機関によれば死亡のほぼ３分の１の原因である。ＣＶＤは平均余命を短縮する主要な原因でもあり、配慮すべき最も費用のかかる健康状態の１つである。疾病対策予防センター（ＣＤＣ）によれば、ＣＶＤは顕著な経済的負荷であり、年間の費用および失われた生産性において、米国のヘルスケアシステムで１年あたり３２００億ドルを超える費用が発生している。ＣＶＤは集合的に心臓および血管の疾患を意味し、これらはとりわけアテローム硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）または心筋症として診断される。ＡＳＣＶＤはＣＶＤの大きなサブセットであ
り、コレステロールがアテローム性硬化プラーク、コレステロールの混合物、動脈硬化をもたらす血管壁の細胞および細胞デブリの進行を促進する。ＡＳＣＶＤの処置および防止における現在の拠り所は、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ、一般に「悪玉」コレステロールとして知られる）および／またはトリグリセリドをできるだけ長い期間、できるだけ低く維持することを目的として血中脂質への累積的な曝露を低下させることである。例えば、十分に長い期間にわたってＬＤＬ－Ｃを十分に低いレベルに維持する個体はＡＳＣＶＤを発症する可能性が実質的に低いことを実証する顕著な証拠がある。ＬＤＬ－Ｃの低下とＡＳＣＶＤの低減との関係は、医学における全ての関係の中で最も理解されている。確定したＡＳＣＶＤを有する患者においてＬＤＬ－Ｃを５年間で３９ｍｇ／ｄＬ低下させるとＡＳＣＶＤのリスクが２１％低減する一方、生涯にわたるＬＤＬ－Ｃの同じ３９ｍｇ／ｄＬ程度の低減が最初のＡＳＣＶＤの事象を８８％低減させることが示されている。現在の標準的治療は、典型的には毎日の多数の錠剤および／または間欠的な注射を必要とする慢性治療モデルであり、ＬＤＬ－Ｃへの累積的な曝露を十分に制御できないことが多い。そのような慢性的治療が利用できるにも関わらず、ＬＤＬ－Ｃへの累積的な曝露はＡＳＣＶＤを有する多くの患者において十分に制御できないことが多く、確定したＡＳＣＶＤを有する個体の多くの割合は、推奨される目標を上回るＬＤＬ－Ｃレベルを有する。累積するＬＤＬ－Ｃへの曝露が高くなると、心臓または頸動脈におけるコレステロールプラークの集積が加速され、その破裂は心臓麻痺、心臓死、発作、ならびに冠動脈内ステント留置術および冠動脈バイパス手術等の侵襲的な医学手技の必要性をもたらすことがある。
[007]本明細書で開示する１つの態様は、肝臓で発現される遺伝子標的を安全かつ効果
的に編集してＬＤＬ－Ｃおよび／またはトリグリセリドを持続的に低下させ、それによりＡＳＣＶＤ等のＣＶＤを処置することができる組成物および方法である。
[008]本明細書で開示する別の態様は、単一のコースまたは用量（一度で終わり（ｏｎ
ｃｅ－ａｎｄ－ｄｏｎｅ））療法として、繰り返しまたは逐次的用量で、および組合せ遺伝子編集療法用量として投与した場合の、本明細書に記載した遺伝子編集組成物の有効性および安全性である。本明細書に記載した組成物の有効性および安全性は、種々の細胞ならびにマウスおよび非ヒト霊長類の実験を含む動物実験を含む本明細書に記載したｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの研究で示され、これらの研究で提示し本明細書で開示する組成物の結果または機能は、それぞれ発明の態様を構成する。
[009]本明細書で開示する組成物および方法の別の態様は、例えばスプライス部位にお
ける遺伝子の編集を対象とする組成物および方法を含む、遺伝子の編集を行なう位置に関する。
[0010]本明細書で開示する組成物および方法の別の態様は、標的遺伝子における二本鎖切断を付与することなく、単一の塩基対において遺伝子を正確に編集することができる組成物を含む成分ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）および塩基エディターである。塩基エディターを発現しコードするヌクレオチドまたはｍＲＮＡ配列を含むこれらのｇＲＮＡおよび塩基エディターの組成物および使用方法は、さらに別の態様を構成する。
[0011]本明細書で開示する別の態様は、ｇＲＮＡおよび塩基エディター薬物物質をカプセル化した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤、ＬＮＰの選択、および薬物物質組成物単独およびＬＮＰの部分としての種々の成分の間の相対比である。
[0012]本明細書で開示する別の態様は、本明細書に記載したような遺伝子編集組成物の投薬、ならびに有効性および安全性のプロファイルの指標に対する投薬および繰り返し投薬の影響を対象とする。
[0013]本明細書で開示する別の態様は、組成物および使用方法が、ＰＣＳＫ９、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ３、および／もしくはＬｐ（ａ）等の特定の遺伝子を標的としまたは編集するように設計されるインプリメンテーションを含み、ならびに／またはこれらの遺伝子によって発現されるタンパク質のタンパク質レベルに対して影響を有するということである。
[0014]一態様では、（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、哺乳動物対象はカニクイザルであり、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量約１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも３５％で起こる。一部の実施形態では、哺乳動物対象はカニクイザルであり、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量約３ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも５０％で起こる。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較してカニクイザルにおける血中トリグリセリドレベルの少なくとも２０％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較してカニクイザルにおける血中トリグリセリドレベルの少なくとも５０％の低減をもたらす。一部の実施形態では、プロトスペーサーはスプライス部位に位置する。一部の実施形態では、プロトスペーサー相補配列はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のアンチセンス鎖にある。一部の実施形態では、プロトスペーサー相補配列はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のセンス鎖にある。一部の実施形態では、塩基の変更はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーの外側（オフターゲット部位）で起こり、表１４で説明されるオフターゲット部位の編集パーセンテージはそれぞれ表１４で説明される編集パーセンテージ以下である。一部の実施形態では、デアミナーゼはアデニンデアミナーゼであり、核酸塩基の変更はＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更である。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼを含む。一部の実施形態では、核酸塩基の変更はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスドナー部位にある。一部の実施形態では、スプライスドナー部位は配列番号７で参照されるＡＮＧＰＴＬ３イントロン６の５’末端にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更はフレームシフト、未成熟終止コドン、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは化学的に改変されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒ配列は、図７に示すスキームに従って化学的に改変されている。一部の実施形態では、スペーサー配列は、表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表１で説明される、ＧＡ０６７、ＧＡ０９１、ＧＡ０９８、ＧＡ０９９、ＧＡ１００、ＧＡ１０１、ＧＡ１０２、ＧＡ１０３、ＧＡ３４７、ＧＡ４４１、ＧＡ４４２、ＧＡ４７２、ＧＡ４７３、ＧＡ４７４、ＧＡ４７５、ＧＡ４７６、ＧＡ５１７、またはＧＡ５４７のＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列
を含む。一部の実施形態では、プロトスペーサー配列は、表１で説明される、ＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥプロトスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、プロトスペーサーは、配列５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）、５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１５）、５’－ＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１６０６）、５’－ＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号２４８）、または５’－ＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号２４９）を含む。一部の実施形態では、塩基エディター融合タンパク質は配列番号２１３７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量は５０％より大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量は５６％より大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量は６３％以上である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはアデニンｔＴＮＡデアミナーゼ（ＴａｄＡ）領域、Ｃａｓ９領域、および核局在化配列（ＮＬＳ）領域を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＴａｄＡ領域とＣａｓ９領域を連結する第１のリンカー領域およびＣａｓ９領域とＮＬＳ領域を連結する第２のリンカー領域をさらに含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量は６０％より大きい。一部の実施形態では、ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量は７０％以上である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量は５６％より大きい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量は６２％以上である。一部の実施形態では、ＮＬＳ領域のＧＣ％含量は５４％より大きい。一部の実施形態では、ＮＬＳ領域のＧＣ％含量は６３％以上である。一部の実施形態では、第１のリンカー領域のＧＣ％含量は６５％より大きい。一部の実施形態では、第１のリンカー領域のＧＣ％含量は７９％以上である。一部の実施形態では、第２のリンカー領域のＧＣ％含量は６７％より大きい。一部の実施形態では、第２のリンカー領域のＧＣ％含量は８３％以上である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量は６０％より大きく、Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量は５６％より大きく、ＮＬＳ領域のＧＣ％含量は５４％より大きく、第１のリンカー領域のＧＣ％含量は６５％より大きく、第２のリンカー領域のＧＣ％含量は６７％より大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは表２３から選択されるｍＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは配列番号２１３６のｍＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはポリＡテイルを含む。一部の実施形態では、組成物は（ｉ）を封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは（ｉｉ）をさらに封入する。一部の実施形態では、組成物は（ｉｉ）を封入する第２のＬＮＰをさらに含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡと塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比は重量で約１：１０～約１０：１である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡと塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比は重量で約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、１：１．５、１：２、１：３、または１：４である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡと塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比は重量で約１：１である。
[0015]別の態様では、本明細書で提供される組成物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
[0016]別の態様では、状態の処置または防止を必要とする対象における状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の本明細書で提供される組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、投与は静脈内注入を介する。一部の実施形態では、方法は（ｉ）を封入するＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの逐次投与を含む。一部の実施形態では、方法は（ｉ）を封入するＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの同時投与を含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く１日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く２日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く３日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む。一
部の実施形態では、方法は単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く４日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く５日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く６日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く７日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の（ｉ）および（ｉｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰの単回用量は約０．３～約３ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、方法は１つまたは複数の処置の処置コースを対象に投与するステップを含み、１つまたは複数の処置のそれぞれの１つは単回用量のＬＮＰの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、方法は２回から１０回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は２回から５回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は２回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は３回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は４回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は５回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、状態はアテローム硬化性心血管疾患である。一部の実施形態では、状態はアテローム硬化性血管疾患である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
[0017]別の態様では、（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、ガイドＲＮＡが表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、組成物が本明細書で提供される。別の態様では、（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、ｍＲＮＡが表２３から選択される配列を含む、組成物が本明細書で提供される。
[0018]別の態様では、アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第１の組成物、ならびに（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、ま
たはそれをコードするｍＲＮＡ、（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含み、ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第２の組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は第１の組成物および第２の組成物の逐次投与を含む。一部の実施形態では、方法は１つまたは複数の用量の第１の組成物に続いて１つまたは複数の用量の第２の組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は１つまたは複数の用量の第２の組成物に続いて１つまたは複数の用量の第１の組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は第１の組成物および第２の組成物の同時投与を含む。一部の実施形態では、方法は１つまたは複数の用量の第１の組成物および第２の組成物を含む。
[0019]別の態様では、（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、ガイドＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも４０％で起こる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも４５％で起こる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも５０％で起こる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも５５％で起こる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも３ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも６０％で起こる。
[0020]別の態様では、（ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、および（ｂ）塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および塩基エディタータンパク質をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを含む、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物であって、スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合し、ガイドＲＮＡがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズした場合に、編集ウィンドウはＡＮＧＰＴ
Ｌ３遺伝子のスプライス部位を包含する。一部の実施形態では、塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合し、ガイドＲＮＡがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズした場合に、編集ウィンドウはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロンの領域を包含する。一部の実施形態では、塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合し、ガイドＲＮＡがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズした場合に、編集ウィンドウはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロン１、イントロン３、またはイントロン４の領域を包含する。一部の実施形態では、塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合され、ガイドＲＮＡがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロン１の領域を包含する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、ＧＡ０６７、ＧＡ１００、およびＧＡ５７４として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるスペーサー配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ＧＡ０６７、ＧＡ０９１、ＧＡ０９８、ＧＡ０９９、ＧＡ１００、ＧＡ１０１、ＧＡ１０２、ＧＡ１０３、ＧＡ３４７、ＧＡ４４１、ＧＡ４４２、ＧＡ４７２、ＧＡ４７３、ＧＡ４７４、ＧＡ４７５、ＧＡ４７６、ＧＡ５１７、およびＧＡ５４７として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるｔｒａｃｒ配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＭＡ００２、ＭＡ００４、ＭＡ０４０、ＭＡ００４１、またはＭＡ０４５として同定されるｍＲＮＡ配列と８０～１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、以下の表：
Figure 2024038327000002
で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する。
[0021]一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、以下の表：
Figure 2024038327000003
で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する。
[0022]一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは脂質ナノ粒子の中にカプセル化されている。一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、以下：ＬＮＰ組成（モル％）：
ｉＬｉｐｉｄ ４０～６５％
ＤＳＰＣ ２～２０％
ＰＥＧ １～５％
残りのモル％バランスがコレステロール；
ＬＮＰ粒子サイズ：Ｚ平均流体力学的直径 ５５～１２０ｎｍ、および
動的光散乱によって決定される多分散性指数０．２未満
を有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化されている。
[0023]一部の実施形態では、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは、５０～７０ｎｍのＺ平均流体力学的直径のＬＮＰ粒子サイズを有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において３０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデ
ニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において８０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において８０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる。一部の実施形態では、編集パーセントは、投薬されたカニクイザルの肝臓の分析によって、投薬の１５日後にそのサルの肝生検または剖検を介して決定される。一部の実施形態では、編集パーセントは、投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも１６８日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、編集パーセントは、投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも３００日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、サルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたサルの血漿中におけるＡＮＧＰ
ＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、サルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、
投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、
組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、血漿タンパク質の低減は、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の１５日後に決定される。一部の実施形態では、組成物は、サルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたサルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合
わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニ
クイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿
中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬
されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、トリグリセリドレベルの低減は、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって、投薬の１５日後に決定される。一部の実施形態では、トリグリセリドレベルの低減は、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも１６８日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、トリグリセリドレベルの低減は、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）をベースラインと比較して平均で少なくとも１０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも１５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザル
の血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均でほぼ３５パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、リポタンパク質（ａ）の低減は、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって、投薬の１５日後に決定される。一部の実施形態では、リポタンパク質（ａ）の低減は、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも２２４日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、リポタンパク質（ａ）の低減は、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、カニクイザルへの投薬がＡＳＴ、ＡＬＴ、またはサイトカインの上昇をもたらす限り、組成物の投薬によってもたらされる上昇は一過性であって投薬後３～１５日以内にほぼベースラインレベルに戻る。一部の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３の編集パーセントは図２７に示したように肝組織、脾臓組織、および副腎組織の外部では無視できる。一部の実施形態では、繰り返し投薬の結果はＡＮＧＰＴＬ３の編集パーセンテージの編集パーセンテージに関して加成性である。一部の実施形態では、繰り返し投薬はサイトカインの活性化も免疫応答も誘発しない。一部の実施形態では、スペーサー配列はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８０％のヌクレオチド相関を有し、スペーサー配列上のＲＮＡヌクレオチドが同一の順序でプロトスペーサーのＤＮＡヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するならばＲＮＡヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドと相関し、ここで相関を決定する目的のためにウラシル塩基およびチミン塩基は同一のヌクレオチドであるとみなされる。一部の実施形態では、スペーサー配列はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８５％のヌクレオチド相関を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド相関を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９５％のヌクレオチド相関を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９９％のヌクレオチド相関を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも１００％のヌクレオチド相関を有する。
[0024]別の態様では、アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
（ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、（ｂ）塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および塩基エディタータンパク質をＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第１のガイドＲＮＡであって、スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第１のガイドＲＮＡ、および
（ｃ）塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および塩基エディタータンパク質をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第２のガイドＲＮＡであって、スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第２のガイドＲＮＡを対象に投与するステップを含む、方法が本明細書で開示される。一部の実施形態では、方法は（ａ）を封入する第１のＬＮＰをさらに含む。一部の実施形態では、第１のＬＮＰは（ｂ）および（ｃ）を封入する。一部の実施形態では、第１のＬＮＰは繰り返し投与される。一部の実施形態では、第１のＬＮＰは１～６０日の間隔で繰り返し投与される。一部の実施形態では、第１のＬＮＰは７日の間隔で繰り返し投与される。一部の実施形態では、第１のＬＮＰは（ｂ）をさらに封入する。一部の実施形態では、方法は、（ａ）および（ｃ）を封入する第２のＬＮＰをさらに含む。一部
の実施形態では、第１のＬＮＰと第２のＬＮＰは逐次的に投与される。一部の実施形態では、第１のＬＮＰと第２のＬＮＰは１日～１２か月の間隔で逐次的に投与される。一部の実施形態では、間隔は１日である。一部の実施形態では、間隔は５日である。一部の実施形態では、間隔は１０日である。一部の実施形態では、間隔は１５日である。一部の実施形態では、間隔は２０日である。一部の実施形態では、間隔は２５日である。一部の実施形態では、間隔は１か月である。一部の実施形態では、間隔は２か月である。一部の実施形態では、間隔は３か月である。一部の実施形態では、間隔は５か月である。一部の実施形態では、間隔は８か月である。一部の実施形態では、間隔は１０か月である。一部の実施形態では、間隔は１２か月である。
[25]本出願の主題の特色、原理、利点、および実例的な実施形態、インプリメンテーション、分析、および例が、添付の特許請求の範囲を含めて本明細書に記載されており、その態様は、添付の図面において図示されている。
[0026]図１Ａ～１Ｃは、「プロトスペーサー」、「ＰＡＭ」、「スペーサー」を含む本出願において使用される関連する学術用語と共に、それぞれＣａｓ９、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）、およびアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の作動のモードを図示する（Ｍａｌｉ， Ｐ．ら ２０１３ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０， ９５７～９６３頁；Ａｎｚａｌｏｎｅ， ＡＶ． ２０２０ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８， ８２４～８４４頁）。 [0026]図１Ａ～１Ｃは、「プロトスペーサー」、「ＰＡＭ」、「スペーサー」を含む本出願において使用される関連する学術用語と共に、それぞれＣａｓ９、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）、およびアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の作動のモードを図示する（Ｍａｌｉ， Ｐ．ら ２０１３ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０， ９５７～９６３頁；Ａｎｚａｌｏｎｅ， ＡＶ． ２０２０ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８， ８２４～８４４頁）。 [0026]図１Ａ～１Ｃは、「プロトスペーサー」、「ＰＡＭ」、「スペーサー」を含む本出願において使用される関連する学術用語と共に、それぞれＣａｓ９、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）、およびアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の作動のモードを図示する（Ｍａｌｉ， Ｐ．ら ２０１３ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０， ９５７～９６３頁；Ａｎｚａｌｏｎｅ， ＡＶ． ２０２０ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８， ８２４～８４４頁）。 図１Ｄは、本明細書に開示されるｍｃＰＣＳＫ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）－Ｔｒａｃｒがどのように設計されたかの概略図表現である。示されるのは、ステムループガイド分子内相互作用（ステムにおけるＷ－Ｃ塩基対合）でのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）－シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）アライメントである。ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ｃａｓタンパク質のための結合スカフォールドとして役立つ。ｇＲＮＡを設計する場合、ループヌクレオチドはタンパク質とアライメント可能であり、糖部分の塩基（Ｈ結合）、２’－ヒドロキシル（２’－ＯＨ）、４’－酸素（環酸素）の相互作用、タンパク質のアミノ酸側鎖への各々のヌクレオチドのリン酸連結はｇＲＮＡ－Ｔｒａｃｒの設計において考慮され得る。ＲＮＰ立体相互作用内のヌクレオチドの空間的構成、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）およびホスホロチオエート（ＰＳ）のようなバルキーな置換を受容するための余地もまた考慮に入れられ得る。図１Ｄは、登場の順にそれぞれ配列番号７０～７１を開示する。 [0027]図２は、構造に基づいて本明細書に開示されるｇＲＮＡの設計との繋がりでＳｐＣａｓ９結晶構造がどのように選択されたのかを記載する２つの表である。上パネルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）ＩＤおよび状態と共にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の異なる構成要素を要約する表である。下パネルは、各々の構造のタンパク質鎖の間のアライメント後の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）値を示す。ＲＮＰ状態（４ＺＴ０）および触媒前三元複合体（５Ｆ９Ｒ）は、ＲＮＰ形成に関する接触および触媒作用に関する接触を決定するために最も関連する。タンパク質の一部の再編成はこれらの２つの状態の間で起こる。大規模な再編成は、タンパク質においてアポ状態とＲＮＰとの間で起こり得る。 [0028]図３は、４ＺＴ０および５Ｆ９Ｒ結晶構造に基づくｓｇＲＮＡのｇＲＮＡ二次構造を描写し、ｓｇＲＮＡは、ＲＮＰ単独またはＤＮＡとの三元複合体の部分のいずれかとしてＳｐＣａｓ９に結合している。二次構造関係性は、ＬｅｏｎｔｉｓおよびＷｅｓｔｈｏｆ命名法において示されている（ＲＮＡ，２００１，７，４９９～５１２頁）（配列番号７２）。 [0029]図４は、ＰＣＳＫ９スペーサーを伴うｇＲＮＡ二次構造を描写し、ＲＮＰ ＰＤＢ ４ＺＴ０（ｓｇＲＮＡ＋ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰ）に基づく予測される接触を示す。１～１０位および８３～１００位は、明確な電子密度の欠如に起因してこの結晶構造においてモデル化しなかった（配列番号７３）。白文字の標識を伴う黒丸：タンパク質接触、黒文字を伴うライトグレー：２’－Ｏ－Ｍｅが組み込まれる場合の立体的衝突または遠位接触、黒文字を伴うダークグレー：ＲＮＡ接触。当業者が理解するように、「衝突」という用語は、本明細書で使用される場合、構造中の物理的にオーバーラップしそうにない原子体積を指す。これらの状況における２’Ｏ－Ｍｅ改変の組込みは、ＲＮＰ機能に対して有害であり得る構造的再編成を潜在的にもたらす。当業者が理解するように、「接触」という用語は、本明細書で使用される場合、２つの官能基の間の安定な、非共有結合性の相互作用、例えば水素結合を意味する。 [0030]図５は、ＰＣＳＫ９スペーサーを伴うｇＲＮＡ二次構造を描写し、ＰＤＢ ５Ｆ９Ｒ（触媒前三元複合体）に基づく予測される接触を示す（配列番号７４）。白文字の標識を伴う黒丸：タンパク質接触、黒文字を伴うライトグレー：２’－Ｏ－Ｍｅが組み込まれる場合の立体的衝突または遠位接触、黒文字を伴うダークグレー：ＲＮＡ接触。 [0031]図６は、構造ベースの設計により決定された２’－ＯＭｅ置換の妥当な位置を描写する（配列番号７３）。白文字の標識を伴う黒丸：２’－ＯＭｅおよびホスホロチオエート置換、黒文字の標識を伴うライトグレーの丸：２’－ＯＭｅ置換のみ、黒文字の標識を伴う白丸：非改変ヌクレオチド。 [0032]図７Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏで堅牢な編集を生成した２’－Ｏ－メチルリボ糖改変の構造ガイド化組込みからのシングルガイドＲＮＡのｔｒａｃｒ領域中で同定された２’－ＯＭｅ位置の３つのパターンを描写する：（１）マウス：図１６、ＧＡ０５４（ｔｒａｃｒ１）およびＧＡ０５５（ｔｒａｃｒ２）ならびに（２）ＮＨＰ：図２８、ＧＡ０９６（ｔｒａｃｒ１）、ＧＡ０９７（ｔｒａｃｒ２）およびＧＡ３４６（ｔｒａｃｒ３）。白文字の標識を伴う黒丸：２’－ＯＭｅおよびホスホロチオエート置換、黒文字の標識を伴うライトグレーの丸：２’－ＯＭｅ置換のみ、黒文字の標識を伴う白丸：非改変ヌクレオチド。（配列番号７３） [0032]図７Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏで堅牢な編集を生成した２’－Ｏ－メチルリボ糖改変の構造ガイド化組込みからのシングルガイドＲＮＡのｔｒａｃｒ領域中で同定された２’－ＯＭｅ位置の３つのパターンを描写する：（１）マウス：図１６、ＧＡ０５４（ｔｒａｃｒ１）およびＧＡ０５５（ｔｒａｃｒ２）ならびに（２）ＮＨＰ：図２８、ＧＡ０９６（ｔｒａｃｒ１）、ＧＡ０９７（ｔｒａｃｒ２）およびＧＡ３４６（ｔｒａｃｒ３）。白文字の標識を伴う黒丸：２’－ＯＭｅおよびホスホロチオエート置換、黒文字の標識を伴うライトグレーの丸：２’－ＯＭｅ置換のみ、黒文字の標識を伴う白丸：非改変ヌクレオチド。（配列番号７３） [0032]図７Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏで堅牢な編集を生成した２’－Ｏ－メチルリボ糖改変の構造ガイド化組込みからのシングルガイドＲＮＡのｔｒａｃｒ領域中で同定された２’－ＯＭｅ位置の３つのパターンを描写する：（１）マウス：図１６、ＧＡ０５４（ｔｒａｃｒ１）およびＧＡ０５５（ｔｒａｃｒ２）ならびに（２）ＮＨＰ：図２８、ＧＡ０９６（ｔｒａｃｒ１）、ＧＡ０９７（ｔｒａｃｒ２）およびＧＡ３４６（ｔｒａｃｒ３）。白文字の標識を伴う黒丸：２’－ＯＭｅおよびホスホロチオエート置換、黒文字の標識を伴うライトグレーの丸：２’－ＯＭｅ置換のみ、黒文字の標識を伴う白丸：非改変ヌクレオチド。（配列番号７３） 図７Ｂは、非改変配列番号６１、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（「Ｌｉｔ Ｔｒａｃｒ」）、ｔｒａｃｒ１、ｔｒａｃｒ２、およびｔｒａｃｒ３の配列アライメントを描写する。（配列番号７３） [0033]図８は、初代ヒト肝細胞におけるＰＣＳＫ９の改変におけるアデノシン塩基エディター系による標的スプライス部位の塩基編集を示す。暗い線は、ＧＡ０６６で同定されるｇＲＮＡを使用して得られたスプライス部位編集パーセントを表す。 [0034]図９は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラムを描写し、ＰＣＳＫ９エクソン１の末端でのスプライスドナーでのアンチセンス鎖中のアデニン塩基の編集（２５００ｎｇ／ｍＬ用量をトランスフェクトされた細胞のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅）を実証し、スプライス部位妨害がどのようにインフレーム終止コドンをもたらすのかを描写する。天然に存在する単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）のヘテロ接合性は編集部位の下流で著明である。スキームは、初代ヒト肝細胞においてＰＣＳＫ９をノックアウトするためのアデノシン塩基エディター系によるＡからＧへの塩基編集を示す。図９は配列番号７５を開示する。 [0035]図１０は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラムを描写し、ＡＮＧＰＴＬ３エクソン６の末端でのスプライスドナーでのアンチセンス鎖中のアデニン塩基の編集（２５００ｎｇ／ｍＬ用量をトランスフェクトされた細胞のゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅）を実証し、スプライス部位妨害がどのようにインフレーム終止コドンをもたらすのかを描写する。初代ヒト肝細胞におけるＡＮＧＰＴＬ３の改変におけるアデノシン塩基エディター系によりもたらされるＡからＧへの塩基編集。図１０は配列番号７６を開示する。 [0036]図１１は、１）非処理の初代肝細胞（上パネル）；２）ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ０９７で処理された初代肝細胞（中央パネル）；３）ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ／ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡで処理された初代肝細胞（下パネル）から単離されたＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡからの３つのＳａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラムを示す。ＰＣＳＫ９－ｇＲＮＡ ＧＡ０９７プロトスペーサー配列は灰色で強調される。矢印は、ＡＢＥ８．８エディターによるＡからＧへの塩基編集のために標的化されるプロトスペーサーの６位を指し示す。鋏は、この標的部位におけるＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼによる切断で起こる二本鎖切断の一般的な部位を描写する。細胞におけるＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびＧＡ０９７送達は、（鋏で表されるような）二本鎖切断の部位における有意な遺伝子編集をもたらしたが、これは細胞におけるＡＢＥ８．８およびＧＡ０９７送達において見られなかった。代わりに、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡと組み合わせた同じｇＲＮＡ ＧＡ０９７は、堅牢なＡからＧへの塩基編集をもたらした。図１１は、登場の順にそれぞれ配列番号７７～７９を開示する。 [0036]図１１は、１）非処理の初代肝細胞（上パネル）；２）ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ０９７で処理された初代肝細胞（中央パネル）；３）ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ／ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡで処理された初代肝細胞（下パネル）から単離されたＰＣＲ増幅ゲノムＤＮＡからの３つのＳａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラムを示す。ＰＣＳＫ９－ｇＲＮＡ ＧＡ０９７プロトスペーサー配列は灰色で強調される。矢印は、ＡＢＥ８．８エディターによるＡからＧへの塩基編集のために標的化されるプロトスペーサーの６位を指し示す。鋏は、この標的部位におけるＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼによる切断で起こる二本鎖切断の一般的な部位を描写する。細胞におけるＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびＧＡ０９７送達は、（鋏で表されるような）二本鎖切断の部位における有意な遺伝子編集をもたらしたが、これは細胞におけるＡＢＥ８．８およびＧＡ０９７送達において見られなかった。代わりに、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡと組み合わせた同じｇＲＮＡ ＧＡ０９７は、堅牢なＡからＧへの塩基編集をもたらした。図１１は、登場の順にそれぞれ配列番号７７～７９を開示する。 [0037]図１２は、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター配列の妨害を伴う潜在的なスプライシングアウトカムを示す概略図を描写する。他のアウトカムが可能であり、これは例えばスプライシング生成物中のイントロン１の部分の包含である。スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位の変更が示される（上パネル）。初代ヒト肝細胞におけるＰＣＳＫ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集のもたらされるＰＣＳＫ９イントロン１内の選択的なスプライスドナー部位が下パネルに示される。＊４つの異なるプライマーペア（表９）が対照／処理された試料のＲＴ－ＰＣＲのために使用された。 [0038]図１３は、初代ヒト肝細胞におけるガイドＲＮＡ依存性ＤＮＡオフターゲット編集の欠如を示す。実施例４に記載されるようにヒト初代肝細胞をｇＲＮＡ（ＧＡ０９７またはＧＡ３４６）およびＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡとインキュベートした。４人の個々のドナーからの初代ヒト肝細胞におけるオンターゲットＰＣＳＫ９部位および５０より多くの候補オフターゲットＰＣＳＫ９部位における正味アデニン編集（非処理細胞と比べたＬＮＰ処理細胞における１つまたは複数のアデニン塩基の変更を伴うシーケンシングリードの割合）としてオフターゲットリーディングを算出した。 [0039]図１４は、ＳｐＣａｓ９処理またはＡＢＥ８．８処理された肝細胞において２日後に評価されたガイドＲＮＡ非依存性ＲＮＡ編集を描写する（ｎ＝４の生物学的複製物）。各々の複製物は、４つの非処理の肝細胞試料の各々に対して比較されて、両方の条件に共通の編集を伴う任意の位置が排除された。ジッタープロットは、処理された試料における編集を伴うトランスクリプトーム座位を描写する（数は、処理された試料において同定された編集された座位の総数を指し示し、ボックスプロットは、試料における全ての編集された座位にわたる編集されたリードの割合のメジアン±四分位数間範囲を指し示す）。ｇＲＮＡ ＧＡ０９７、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ０１０、およびＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４が、実施例４に記載されるようにこの研究において使用された。 [0040]図１５は、初代ヒト肝細胞および初代非ヒト霊長類（ＮＨＰ）肝細胞における、塩基エディター系、ＡＢＥ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの一実施形態を用いて製剤化された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を用いたＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３塩基編集を示す。ヒト特異的ＡＮＧＰＴＬ３ガイドＲＮＡは、評価された濃度内でＮＨＰ肝細胞において低い編集効率を示した一方、ヒトおよびＮＨＰの両方に対して交差反応性のＰＣＳＫ９ガイドＲＮＡは両方の細胞系において高い編集効率を示した。 [0041]図１６は、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００２（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および異なるｔｒａｃｒ設計を有するマウスＰｃｓｋ９標的化ｇＲＮＡ（ＧＡ０５２、ＧＡ０５３、ＧＡ０５４、およびＧＡ０５５）を１：１の重量比で含有するＬＮＰを介するマウス（ｎ＝２～５匹のマウス）におけるＰｃｓｋ９の遺伝子編集を示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ試験物品を投薬した。ｍｇ／ｋｇの用量は総ＲＮＡに基づいて算出され、総ＲＮＡは、製剤化後にＬＮＰ中に存在するｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの定量化された合計である。投薬の７日後に、マウスを安楽死させ、ゲノムＤＮＡをマウス肝臓から採取し、次に次世代シーケンシングを用いて標的部位の塩基編集について評価した。評価された４つ全てのガイドＲＮＡは、同じスペーサーおよび５’末端からの最初の２０ヌクレオチド内の化学的改変の同じパターンを有するが、４つ全ては、１００－ｍｅｒガイドＲＮＡの２１位および１００位のヌクレオチドの間でｔｒａｃｒ内の化学的改変パターンにおいて異なる。 [0042]図１７は、塩基エディター系、ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ガイドＲＮＡ ＧＡ２５６（マウスイントロン１スプライスドナーを標的化する）の一実施形態を用いたＬＮＰを介するマウス（ｎ＝５）におけるＰＣＳＫ９の塩基編集を示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡのＬＮＰ試験物品を投薬した。投薬の７日後に、マウスを安楽死させ、ゲノムＤＮＡをマウス肝臓から採取し、次に次世代シーケンシングを用いて標的部位の塩基編集について評価した。 [0043]図１８は、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰｃｓｋ９ ｇＲＮＡ ＧＡ２５６を含む同じＬＮＰ製剤の異なる用量での処置の１週後に評価された、野生型マウス肝臓におけるＰｃｓｋ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集を描写する（ｎ＝４～５匹のマウス／投薬群、バーは群における平均編集を指し示す）。 [0044]図１９は、異なる比のｇＲＮＡ ＧＡ２５６およびｍＲＮＡ ＭＡ００２を含有する０．０５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量のＬＮＰを投薬された後の、野生型マウス肝臓におけるＰｃｓｋ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集を描写する。異なる化学的改変を有する追加のガイドＧＡ２５５およびＧＡ２５７もまた、ｍＲＮＡ対ｇＲＮＡの１：１の重量比において、塩基編集効率について評価した。 [0045]図２０は、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびマウスＡｎｇｐｔｌ３標的化ｇＲＮＡ（ＧＡ２５８、ＧＡ２５９、ＧＡ２６０、ＧＡ３４９、ＧＡ３５３）を０．０５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で１：１の重量比で含有するＬＮＰのマウスへの投薬からの結果を示す。ＧＡ２５８、ＧＡ２５９およびＧＡ２６０は、３つの異なる構造物ガイド化ｔｒａｃｒ設計を含有する。ＧＡ３４９およびＧＡ３５３ ｔｒａｃｒ設計は、刊行された文献（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１８ ２２， ２２２７～２２３５頁）からのものであった。マウスを後に安楽死させ、ゲノムＤＮＡをマウス肝臓から採取し、次に次世代シーケンシングを用いて標的スプライス部位の塩基編集について評価した。 [0046]図２１は、塩基エディター系、ＡＢＥ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡの一実施形態を用いて製剤化されたＬＮＰを介するＮＨＰにおける標的遺伝子のアデニン塩基編集を導入するための一般的な投薬戦略、ならびに２週後におけるその後の分析を示す概略図である。 [0047]図２２は、静脈内注入を介するカニクイザルへの、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量での、塩基エディター系、ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００２およびＰＣＳＫ９ガイドＲＮＡ ＧＡ０６６の一実施形態を用いて製剤化されたＬＮＰの投与は、カニクイザルの肝臓においてＰＣＳＫ９標的スプライス部位におけるアデニン塩基編集を誘起したことを示す。 [0048]図２３は、静脈内注入を介するカニクイザルへの、塩基エディター系、ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ガイドＲＮＡ ＧＡ０６６の一実施形態を用いて製剤化されたＬＮＰの投与は、投薬の２週後に投薬前レベルと比較して血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベルにおける低減をもたらしたことを示す。 [0049]図２４は、静脈内注入を介するカニクイザルへの、塩基エディター系、ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００２およびＰＣＳＫ９ガイドＲＮＡ ＧＡ０６６の一実施形態を用いて製剤化された３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰの投与は、投薬前レベルと比較して投薬の１および２週後に血中低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの低減をもたらしたことを示す。 [0050]図２５Ａ～２５Ｃは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９の短期アデニン塩基編集を示す。図２５Ａは、処置の２週後（３匹の動物）または２４時間後（２匹の動物）のいずれかにおける検死を伴うＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ０９７を含むＬＮＰ製剤の１ｍｇ／ｋｇ用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集を描写する。各々の動物について、肝臓の全体を通じて分布した部位から収集された試料において編集を評価した（ｎ＝８の試料；バーは動物における平均編集を指し示す）。処置の２週後に検死を受けた３匹の動物における血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベル（図２５Ｂ）または血液ＬＤＬ－Ｃレベル（図２５Ｃ）の低減が、２週時のレベルをベースライン処置前レベルと比較して示されている（動物当たりｎ＝１の血液試料）。 [0050]図２５Ａ～２５Ｃは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９の短期アデニン塩基編集を示す。図２５Ａは、処置の２週後（３匹の動物）または２４時間後（２匹の動物）のいずれかにおける検死を伴うＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ０９７を含むＬＮＰ製剤の１ｍｇ／ｋｇ用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集を描写する。各々の動物について、肝臓の全体を通じて分布した部位から収集された試料において編集を評価した（ｎ＝８の試料；バーは動物における平均編集を指し示す）。処置の２週後に検死を受けた３匹の動物における血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベル（図２５Ｂ）または血液ＬＤＬ－Ｃレベル（図２５Ｃ）の低減が、２週時のレベルをベースライン処置前レベルと比較して示されている（動物当たりｎ＝１の血液試料）。 [0050]図２５Ａ～２５Ｃは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９の短期アデニン塩基編集を示す。図２５Ａは、処置の２週後（３匹の動物）または２４時間後（２匹の動物）のいずれかにおける検死を伴うＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ０９７を含むＬＮＰ製剤の１ｍｇ／ｋｇ用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集を描写する。各々の動物について、肝臓の全体を通じて分布した部位から収集された試料において編集を評価した（ｎ＝８の試料；バーは動物における平均編集を指し示す）。処置の２週後に検死を受けた３匹の動物における血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベル（図２５Ｂ）または血液ＬＤＬ－Ｃレベル（図２５Ｃ）の低減が、２週時のレベルをベースライン処置前レベルと比較して示されている（動物当たりｎ＝１の血液試料）。 [0051]図２６Ａ～２６Ｃは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９のアデニン塩基編集を示す。図２６Ａは、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を含むＬＮＰ製剤の０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇ用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集を描写する。動物についての血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベル（図２６Ｂ）または血中ＬＤＬ－Ｃレベル（図２６Ｃ）の低減が示される。 [0052]図２７は、処置の２週後に検死を受けた３匹の動物におけるＰＣＳＫ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集の組織分布を描写する（肝臓を除く各々の指し示される臓器について動物当たりｎ＝１の試料；肝臓データは、各々８つの肝臓試料からの算出において示される平均を表す）。ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびガイドＲＮＡ ＧＡ３４６を用いて構成されたＬＮＰがこの研究において使用され、投与された用量は０．５ｍｇ／ｋｇであった。 [0053]図２８は、ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００４および同じスペーサーを有するが異なるトレーサー改変を有する異なるガイドＲＮＡを用いて構成された個々の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の静脈内注入後のカニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基編集の編集を図示する。この研究において使用されたガイドＲＮＡは、ＧＡ０６６、ＧＡ０９６、ＧＡ０９７およびＧＡ３４６であった。２つの異なる供給源からのｇＲＮＡ ＧＡ０９７が同じ研究において使用され、供給源は（１）および（２）として同定される。ｔｒａｃｒ比較研究のためにＬＮＰは１ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で投薬され、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡは１：１の重量比で混合された。刊行されたｔｒａｃｒ設計（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１８ ２２， ２２２７～２２３５頁）を有するＧＡ０６６は、全ての他のｔｒａｃｒ設計（図７）（ＧＡ０９５、ＧＡ０９７、およびＧＡ３４６）と比較して同じ実験条件下でサルにおいてより低い塩基編集を生成した。 [0054]図２９は、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９のアデニン塩基編集に対するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼを示す。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ（ＭＳ０１０／ＧＡ０９７）またはＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ（ＭＡ００４／ＧＡ０９７）のいずれかを含有するＬＮＰをカニクイザルの静脈内に注入した。ＭＳ０１０／ＧＡ０９７ ＬＮＰは０．７５および１．５ｍｇ／ｋｇで投薬され、ＭＡ００４／ＧＡ０９７ ＬＮＰは１ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で投薬された。１．５ｍｇ／ｋｇのＭＳ０１０／ＧＡ０９７ ＬＮＰ試験物品はＮＨＰにおいて低い一桁の遺伝子編集を生成した一方、ＡＢＥ／ＧＡ０９７試験物品は１ｍｇ／ｋｇにおいて約４０％のアデニン塩基編集を生成し、ＳｐＣａｓ９系を上回るＡＢＥ塩基エディターの堅牢性を示した。この研究において使用された全てのＬＮＰは、同じ賦形剤および組成を使用して調製された。 [0055]図３０は、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９のアデニン塩基編集を示す。このグラフは、０．５、１．０、１．５、または３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量のＬＮＰ＃１の静脈内注入を与えられたカニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集を描写する（各々のバーは個々の動物であり、編集は複数のサンプリング区画について記録された）。３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡのＬＮＰ＃２は、先行する研究からのベンチマークとして投薬された。両方のＬＮＰ製剤はＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を含有する。 [0056]図３１は、図３０に記載されるものと同じ実験からの、１５日目における基礎からのＰＣＳＫ９タンパク質レベルの低減を示す。 [0057]図３２は、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ０６６を含むＬＮＰ製剤の３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量の静脈内注入を与えられた４匹のカニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９エクソン１スプライスドナーアデニン塩基の編集を描写する。各々の動物について、編集は、処置の２週後に肝生検試料において評価した（動物当たりｎ＝１の試料）。 [0058]図３３は、図３２からの４匹の動物（ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ０６６を含むＬＮＰ製剤の３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量を与えられた動物）ならびにリン酸緩衝食塩水を与えられた２匹の同期間の対照動物における血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの低減を描写し、ベースライン処置前レベルに対して処置後の様々な時点におけるレベルを比較している（各々の時点において、各々の群についての平均±標準偏差、ｎ＝４またはｎ＝２）。点線はベースラインレベルのそれぞれ１００％および１０％を指し示す。 [0059]図３４は、図３２からの４匹の動物（ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ０６６を含むＬＮＰ製剤の３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量を与えられた動物）ならびにリン酸緩衝食塩水を与えられた２匹の同期間の対照動物における血中ＬＤＬ－Ｃレベルの低減を描写し、ベースライン処置前レベルに対して処置後の様々な時点におけるレベルを比較している（各々の時点において、各々の群についての平均±標準偏差、ｎ＝４またはｎ＝２）。点線はベースラインレベルのそれぞれ１００％および４０％を指し示す（上パネル）。個々の動物の絶対値が下パネルに示される。 [0059]図３４は、図３２からの４匹の動物（ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ０６６を含むＬＮＰ製剤の３ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量を与えられた動物）ならびにリン酸緩衝食塩水を与えられた２匹の同期間の対照動物における血中ＬＤＬ－Ｃレベルの低減を描写し、ベースライン処置前レベルに対して処置後の様々な時点におけるレベルを比較している（各々の時点において、各々の群についての平均±標準偏差、ｎ＝４またはｎ＝２）。点線はベースラインレベルのそれぞれ１００％および４０％を指し示す（上パネル）。個々の動物の絶対値が下パネルに示される。 [0060]図３５は、図３２からの４匹の動物およびリン酸緩衝食塩水を与えられた２匹の同期間の対照動物におけるリポタンパク質（ａ）の低減を描写し、ベースライン処置前レベルに対して処置後の様々な時点におけるレベルを比較している（各々の時点において、各々の群についての平均±標準偏差、ｎ＝４またはｎ＝２）。 [0061]図３６は、非ヒト霊長類における肝臓ＰＣＳＫ９塩基編集の長期間の表現型的効果を示す。処置後の様々な時点における図３２において描写される個々の動物（ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９－ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の３ｍｇ／ｋｇの用量で処置されたｎ＝４匹の動物、ならびにリン酸緩衝食塩水で処置されたｎ＝２匹の動物）におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（上パネル）、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）（下パネル）の絶対値。 [0061]図３６は、非ヒト霊長類における肝臓ＰＣＳＫ９塩基編集の長期間の表現型的効果を示す。処置後の様々な時点における図３２において描写される個々の動物（ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９－ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の３ｍｇ／ｋｇの用量で処置されたｎ＝４匹の動物、ならびにリン酸緩衝食塩水で処置されたｎ＝２匹の動物）におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（上パネル）、およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）（下パネル）の絶対値。 [0062]図３７Ａ～３７Ｇは、個々の動物の肝臓機能マーカーを示す。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルからの、投薬後１５日までの、ＡＳＴ（図３７Ａ、図３７Ｂ）、ＡＬＴ（図３７Ａ、図３７Ｃ）、アルカリホスフェート（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（図３７Ａ、図３７Ｄ）、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（図３７Ａ、図３７Ｅ）、総ビリルビン（図３７Ａ、図３７Ｆ）、およびアルブミン（図３７Ａ、図３７Ｇ）。 [0062]図３７Ａ～３７Ｇは、個々の動物の肝臓機能マーカーを示す。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルからの、投薬後１５日までの、ＡＳＴ（図３７Ａ、図３７Ｂ）、ＡＬＴ（図３７Ａ、図３７Ｃ）、アルカリホスフェート（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（図３７Ａ、図３７Ｄ）、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（図３７Ａ、図３７Ｅ）、総ビリルビン（図３７Ａ、図３７Ｆ）、およびアルブミン（図３７Ａ、図３７Ｇ）。 [0062]図３７Ａ～３７Ｇは、個々の動物の肝臓機能マーカーを示す。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルからの、投薬後１５日までの、ＡＳＴ（図３７Ａ、図３７Ｂ）、ＡＬＴ（図３７Ａ、図３７Ｃ）、アルカリホスフェート（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（図３７Ａ、図３７Ｄ）、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（図３７Ａ、図３７Ｅ）、総ビリルビン（図３７Ａ、図３７Ｆ）、およびアルブミン（図３７Ａ、図３７Ｇ）。 [0062]図３７Ａ～３７Ｇは、個々の動物の肝臓機能マーカーを示す。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルからの、投薬後１５日までの、ＡＳＴ（図３７Ａ、図３７Ｂ）、ＡＬＴ（図３７Ａ、図３７Ｃ）、アルカリホスフェート（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（図３７Ａ、図３７Ｄ）、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（図３７Ａ、図３７Ｅ）、総ビリルビン（図３７Ａ、図３７Ｆ）、およびアルブミン（図３７Ａ、図３７Ｇ）。 [0062]図３７Ａ～３７Ｇは、個々の動物の肝臓機能マーカーを示す。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルからの、投薬後１５日までの、ＡＳＴ（図３７Ａ、図３７Ｂ）、ＡＬＴ（図３７Ａ、図３７Ｃ）、アルカリホスフェート（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（図３７Ａ、図３７Ｄ）、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（図３７Ａ、図３７Ｅ）、総ビリルビン（図３７Ａ、図３７Ｆ）、およびアルブミン（図３７Ａ、図３７Ｇ）。 [0062]図３７Ａ～３７Ｇは、個々の動物の肝臓機能マーカーを示す。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルからの、投薬後１５日までの、ＡＳＴ（図３７Ａ、図３７Ｂ）、ＡＬＴ（図３７Ａ、図３７Ｃ）、アルカリホスフェート（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（図３７Ａ、図３７Ｄ）、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（図３７Ａ、図３７Ｅ）、総ビリルビン（図３７Ａ、図３７Ｆ）、およびアルブミン（図３７Ａ、図３７Ｇ）。 [0062]図３７Ａ～３７Ｇは、個々の動物の肝臓機能マーカーを示す。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルからの、投薬後１５日までの、ＡＳＴ（図３７Ａ、図３７Ｂ）、ＡＬＴ（図３７Ａ、図３７Ｃ）、アルカリホスフェート（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（図３７Ａ、図３７Ｄ）、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（図３７Ａ、図３７Ｅ）、総ビリルビン（図３７Ａ、図３７Ｆ）、およびアルブミン（図３７Ａ、図３７Ｇ）。 [0062]図３７Ａ～３７Ｇは、個々の動物の肝臓機能マーカーを示す。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えられたカニクイザルからの、投薬後１５日までの、ＡＳＴ（図３７Ａ、図３７Ｂ）、ＡＬＴ（図３７Ａ、図３７Ｃ）、アルカリホスフェート（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（図３７Ａ、図３７Ｄ）、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ（図３７Ａ、図３７Ｅ）、総ビリルビン（図３７Ａ、図３７Ｆ）、およびアルブミン（図３７Ａ、図３７Ｇ）。 [0063]図３８は、カニクイザルゲノムに対して設計された特有のライブラリーを使用した代表的な候補ＯＮＥ－ｓｅｑ部位の概略図である。ＰＣＳＫ９プロトスペーサーが上部に１．００のＯＮＥ－ｓｅｑスコアと共に描写されている。列記される全ての部位は、同定されたプロトスペーサー配列に対するミスマッチと共に、ＯＮＥ－ｓｅｑスコアを減少させることにより順位付けされる。図３８は、登場の順にそれぞれ配列番号８０、２１９３～２１９６、５６６、２１９７～２２０５、６７５、２２０６～２２２０、５６４、２２２１～２２４、６３８、６４４、５０６、６２１、２２２５～２２２６、６８１、および２２２７～２２３０を開示する。 [0064]図３９は、図３８において同定された部位のｇＲＮＡ依存性ＤＮＡオフターゲット分析を示す。カニクイザル初代肝細胞（上パネル）またはカニクイザル肝臓（下パネル）からの試料を正味Ａ＞Ｇ塩基編集について評価した（ｎ＝３の処理された試料、ｎ＝３の非処理の試料）。 [0064]図３９は、図３８において同定された部位のｇＲＮＡ依存性ＤＮＡオフターゲット分析を示す。カニクイザル初代肝細胞（上パネル）またはカニクイザル肝臓（下パネル）からの試料を正味Ａ＞Ｇ塩基編集について評価した（ｎ＝３の処理された試料、ｎ＝３の非処理の試料）。 [0065]図４０は、０．５、１．０、または１．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰのいずれかを与えられたＮＨＰの肝臓からの、図３９において同定された、１つのオフターゲット部位（Ｃ５）における正味Ａ＞Ｇ塩基編集％を示す。 [0066]図４１は、塩基エディター系、ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＡＮＧＰＴＬ３ガイドＲＮＡ ＧＡ０６７の一実施形態を用いて製剤化されたＬＮＰを介するＮＨＰにおけるＡＮＧＰＴＬ３の塩基編集を示す。肝臓編集（左パネル）、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル（中央パネル）、およびトリグリセリドレベル（右パネル）が３匹のＮＨＰについて示されている。 [0067]図４２は、０～２５００ｎｇ／試験物品／ｍＬの範囲内の濃度でのヒト初代肝細胞における、塩基エディター系、ＡＢＥ ｍＲＮＡ ＭＡ００２およびデュアルガイドＲＮＡ ＧＡ０９５（ｈｃＰＣＳＫ９）およびＧＡ０９８（ｈＡＮＧＰＴＬ３）の一実施形態を用いて製剤化された脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を用いた同時のＡＮＧＰＴＬ３およびＰＣＳＫ９塩基編集を示す。 [0068]図４３は、１５日目および４４日目の肝生検のアデノシン塩基編集結果を示す。０．５～２ｍｇ／ｋｇの範囲内の総ＲＮＡ用量で静脈内注入を介してＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ３４６）またはＡＮＧＰＴＬ３を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ３４７）のいずれかを用いて製剤化されたＬＮＰをＮＨＰに投薬した。試験物品の投与の２週後に、生検を行って塩基編集を評価した。研究の開始から３０日後に、反対のＬＮＰを投与した。追加の２週後の第２の生検後に、ｇＤＮＡを抽出し、次世代シーケンシングを使用して塩基編集を評価した。ＰＣＳＫ９塩基編集（上パネル）およびＡＮＧＰＴＬ３塩基編集（下パネル）についての結果が示される。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ、ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６およびＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡ ＧＡ３４７を１：０．５：０．５の重量比でカプセル化したＬＮＰの２ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量は、堅牢な同期したＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集を生成した（実施例１０）。 [0068]図４３は、１５日目および４４日目の肝生検のアデノシン塩基編集結果を示す。０．５～２ｍｇ／ｋｇの範囲内の総ＲＮＡ用量で静脈内注入を介してＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ３４６）またはＡＮＧＰＴＬ３を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ３４７）のいずれかを用いて製剤化されたＬＮＰをＮＨＰに投薬した。試験物品の投与の２週後に、生検を行って塩基編集を評価した。研究の開始から３０日後に、反対のＬＮＰを投与した。追加の２週後の第２の生検後に、ｇＤＮＡを抽出し、次世代シーケンシングを使用して塩基編集を評価した。ＰＣＳＫ９塩基編集（上パネル）およびＡＮＧＰＴＬ３塩基編集（下パネル）についての結果が示される。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ、ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６およびＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡ ＧＡ３４７を１：０．５：０．５の重量比でカプセル化したＬＮＰの２ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量は、堅牢な同期したＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集を生成した（実施例１０）。 [0069]図４４は、図４３に記載されるＮＨＰからのＰＣＳＫ９（上パネル）およびＡＮＧＰＴＬ３（下パネル）タンパク質レベルにおける対応する変化％を図示する。 [0069]図４４は、図４３に記載されるＮＨＰからのＰＣＳＫ９（上パネル）およびＡＮＧＰＴＬ３（下パネル）タンパク質レベルにおける対応する変化％を図示する。 [0070]図４５は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は、１４日後、４６日後、および７５日後の肝生検において、肝臓における付加的なアデノシン塩基編集を引き起こすことを図示する。０．５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量での静脈内注入を介してＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ０９７）を用いて製剤化されたＬＮＰ＃１またはＬＮＰ＃２のいずれかをＮＨＰに投薬した（投薬間隔に関する詳細および関連する詳細について実施例１０を参照）。 [0071]図４６は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は、９０日にかけて肝臓における付加的な塩基編集を引き起こし、血漿ＰＣＳＫ９タンパク質レベルにおける用量依存的な付加的な減少に翻訳されることを図示する。図４５に記載されるように、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ０９７）を用いて製剤化されたＬＮＰをＮＨＰに繰り返し投薬した。０、３０、および６０日目に０．５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量での静脈内注入を介してＮＨＰに投薬を行った（矢印は、投薬を描写するためにグラフ上に図示される）。ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの分析の説明について、詳細な方法のセクションを参照。 [0072]図４７は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は、一過性に過ぎない肝臓マーカーの増加と共に肝臓における付加的な塩基編集を引き起こし、一過性の肝臓マーカーの増加は、各々の用量の投与の日と良好に相関することを図示する。データは、第１の用量後の７１日のＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびクレアチンキナーゼの肝臓マーカーレベルを示す（詳細について実施例１０、図４５を参照）。 [0072]図４７は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は、一過性に過ぎない肝臓マーカーの増加と共に肝臓における付加的な塩基編集を引き起こし、一過性の肝臓マーカーの増加は、各々の用量の投与の日と良好に相関することを図示する。データは、第１の用量後の７１日のＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびクレアチンキナーゼの肝臓マーカーレベルを示す（詳細について実施例１０、図４５を参照）。 [0072]図４７は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は、一過性に過ぎない肝臓マーカーの増加と共に肝臓における付加的な塩基編集を引き起こし、一過性の肝臓マーカーの増加は、各々の用量の投与の日と良好に相関することを図示する。データは、第１の用量後の７１日のＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびクレアチンキナーゼの肝臓マーカーレベルを示す（詳細について実施例１０、図４５を参照）。 [0072]図４７は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は、一過性に過ぎない肝臓マーカーの増加と共に肝臓における付加的な塩基編集を引き起こし、一過性の肝臓マーカーの増加は、各々の用量の投与の日と良好に相関することを図示する。データは、第１の用量後の７１日のＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、およびクレアチンキナーゼの肝臓マーカーレベルを示す（詳細について実施例１０、図４５を参照）。 [0073]図４８は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は肝臓における付加的な塩基編集を引き起こすことを図示し、一過性に過ぎない肝臓マーカーの増加は、ＮＨＰにおける投薬後７１日までのＬＤＨ、ＧＬＤＨ、ＧＧＴ、およびＡＬＰの肝臓酵素レベルを示す（詳細について実施例１０、図４５を参照）。 [0073]図４８は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は肝臓における付加的な塩基編集を引き起こすことを図示し、一過性に過ぎない肝臓マーカーの増加は、ＮＨＰにおける投薬後７１日までのＬＤＨ、ＧＬＤＨ、ＧＧＴ、およびＡＬＰの肝臓酵素レベルを示す（詳細について実施例１０、図４５を参照）。 [0073]図４８は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は肝臓における付加的な塩基編集を引き起こすことを図示し、一過性に過ぎない肝臓マーカーの増加は、ＮＨＰにおける投薬後７１日までのＬＤＨ、ＧＬＤＨ、ＧＧＴ、およびＡＬＰの肝臓酵素レベルを示す（詳細について実施例１０、図４５を参照）。 [0073]図４８は、ＮＨＰにおける繰り返しのＬＮＰ投薬は肝臓における付加的な塩基編集を引き起こすことを図示し、一過性に過ぎない肝臓マーカーの増加は、ＮＨＰにおける投薬後７１日までのＬＤＨ、ＧＬＤＨ、ＧＧＴ、およびＡＬＰの肝臓酵素レベルを示す（詳細について実施例１０、図４５を参照）。 [0074]図４９Ａおよび図４９Ｂは、ＡＮＧＰＴＬ３の塩基編集は、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡ ＧＡ０６７を用いて構成されたＬＮＰの単回用量後に長期間のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質およびトリグリセリドレベルの減少をもたらすことを図示する。結果は、６か月にかけての非ヒト霊長類におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質（図４９Ａ）およびトリグリセリド（図４９Ｂ）に対するＡＮＧＰＴＬ３の長期間のアデニン塩基編集の効果を図示する。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質（９６％の低減）およびトリグリセリドレベルは、ＬＮＰの単回用量投与で実質的に減少し、１７０日より長きにわたり安定的に低減されたままである（詳細について実施例１０を参照）。 [0075]図５０Ａ～５０Ｅは、サイトカイン活性化および免疫応答に対するＮＨＰにおけるＬＮＰ投薬の効果を図示する。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を含むＬＮＰ製剤の特定された時点（図５０Ａおよび図５０Ｂ）における０．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入をカニクイザルに与えた。特定された時点およびグラフにおいて血液を収集し、ＩＰ－１０およびＭＣＰ－１を分析した。追加の研究において、ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を用いて製剤化されたＬＮＰの１．０ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量の静脈内注入を与えられたＮＨＰから収集された血液から異なる時点においてＩＬ－６、ＭＣＰ－１、およびＳＣ５ｂ－９（それぞれ図５０Ｃ、図５０Ｄ、および図５０Ｅ）を分析した。 [0075]図５０Ａ～５０Ｅは、サイトカイン活性化および免疫応答に対するＮＨＰにおけるＬＮＰ投薬の効果を図示する。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を含むＬＮＰ製剤の特定された時点（図５０Ａおよび図５０Ｂ）における０．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入をカニクイザルに与えた。特定された時点およびグラフにおいて血液を収集し、ＩＰ－１０およびＭＣＰ－１を分析した。追加の研究において、ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を用いて製剤化されたＬＮＰの１．０ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量の静脈内注入を与えられたＮＨＰから収集された血液から異なる時点においてＩＬ－６、ＭＣＰ－１、およびＳＣ５ｂ－９（それぞれ図５０Ｃ、図５０Ｄ、および図５０Ｅ）を分析した。 [0075]図５０Ａ～５０Ｅは、サイトカイン活性化および免疫応答に対するＮＨＰにおけるＬＮＰ投薬の効果を図示する。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を含むＬＮＰ製剤の特定された時点（図５０Ａおよび図５０Ｂ）における０．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入をカニクイザルに与えた。特定された時点およびグラフにおいて血液を収集し、ＩＰ－１０およびＭＣＰ－１を分析した。追加の研究において、ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を用いて製剤化されたＬＮＰの１．０ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量の静脈内注入を与えられたＮＨＰから収集された血液から異なる時点においてＩＬ－６、ＭＣＰ－１、およびＳＣ５ｂ－９（それぞれ図５０Ｃ、図５０Ｄ、および図５０Ｅ）を分析した。 [0075]図５０Ａ～５０Ｅは、サイトカイン活性化および免疫応答に対するＮＨＰにおけるＬＮＰ投薬の効果を図示する。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を含むＬＮＰ製剤の特定された時点（図５０Ａおよび図５０Ｂ）における０．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入をカニクイザルに与えた。特定された時点およびグラフにおいて血液を収集し、ＩＰ－１０およびＭＣＰ－１を分析した。追加の研究において、ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を用いて製剤化されたＬＮＰの１．０ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量の静脈内注入を与えられたＮＨＰから収集された血液から異なる時点においてＩＬ－６、ＭＣＰ－１、およびＳＣ５ｂ－９（それぞれ図５０Ｃ、図５０Ｄ、および図５０Ｅ）を分析した。 [0075]図５０Ａ～５０Ｅは、サイトカイン活性化および免疫応答に対するＮＨＰにおけるＬＮＰ投薬の効果を図示する。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を含むＬＮＰ製剤の特定された時点（図５０Ａおよび図５０Ｂ）における０．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入をカニクイザルに与えた。特定された時点およびグラフにおいて血液を収集し、ＩＰ－１０およびＭＣＰ－１を分析した。追加の研究において、ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を用いて製剤化されたＬＮＰの１．０ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量の静脈内注入を与えられたＮＨＰから収集された血液から異なる時点においてＩＬ－６、ＭＣＰ－１、およびＳＣ５ｂ－９（それぞれ図５０Ｃ、図５０Ｄ、および図５０Ｅ）を分析した。 [0076]図５１は、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡを含有するＬＮＰでの処置の１５日後のＮＨＰにおける肝臓編集を図示する。図５１は、非ヒト霊長類におけるＡＮＧＰＴＬ３またはＰＣＳＫ９の遺伝子編集からの結果を示す。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＡＮＧＰＴＬ３（ＧＡ２６１～ＧＡ２６３）またはＰＣＳＫ９（ＧＡ２６６～ＧＡ２７１）のいずれかを標的化する１つのｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入をカニクイザルに与えた。２週後の検死において、各々の肝葉から２つの小片（計８つの小片）を単離し、ｇＤＮＡを抽出した。詳細な方法のセクションに記載されるように試料を処理した。インデル％を各々の別々の小片について分析し、それを個々の点としてグラフ化している。高い編集効率がほとんどのＮＨＰ肝臓において観察された。 [0077]図５２は、ＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡでの処置の１５日後のＮＨＰにおけるＬＤＬ－Ｃレベルを図示する。図５２は、非ヒト霊長類におけるＡＮＧＰＴＬ３またはＰＣＳＫ９の遺伝子編集からのＬＤＬ－Ｃの低減を示す。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＡＮＧＰＴＬ３（ＧＡ２６１～ＧＡ２６３）またはＰＣＳＫ９（ＧＡ２６６～ＧＡ２７１）のいずれかを標的化する１つのｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入をカニクイザルに与えた。詳細な方法のセクションに記載されるように試料を処理した。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰを与えられた全てのＮＨＰは、循環ＬＤＬ－Ｃレベルにおける少なくとも３５％の低減を有した。より控えめであったが、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡを含むＬＮＰは、循環ＬＤＬ－Ｃレベルにおける１０～２５％の低減を有した。 [0078]図５３は、ＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡでの処置の１５日後のＮＨＰにおけるトリグリセリドレベルを図示する。図５３は、非ヒト霊長類におけるＡＮＧＰＴＬ３またはＰＣＳＫ９の遺伝子編集からのトリグリセリドレベルを示す。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＡＮＧＰＴＬ３（ＧＡ２６１～ＧＡ２６３）またはＰＣＳＫ９（ＧＡ２６６～ＧＡ２７１）のいずれかを標的化する１つのｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入をカニクイザルに与えた。詳細な方法のセクションに記載されるように試料を処理した。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡを含むＬＮＰを与えられたＮＨＰは、トリグリセリドレベルにおける約１０～５０％の低減を有した。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰを与えられたＮＨＰは、トリグリセリドレベルにおける有意な低減を示さなかった。 [0079]図５４Ａおよび図５４Ｂは、ｇＲＮＡに対するＰＡＣＥ改変はオフターゲット編集効率を減少させることを図示する。２５００、１２５０、５００、および２５０ｎｇ／試験物品／ｍＬにおいてＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋから商業的に購入した）およびｔｒａｃｒに対する改変を有するＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡをヒト初代肝細胞にトランスフェクトした。詳細な方法のセクションに記載されるように、ゲノムＤＮＡを処理し、シーケンシングし、分析した。陽性対照として役立つためにＧＡ１５６をトランスフェクトした。ＧＡ２４８およびＧＡ２４９は、オフターゲット編集効率を減少させることが以前に実証されているｇＲＮＡに対するＰＡＣＥ改変を含有する。実際に、ＧＡ２４８およびＧＡ２４９は非改変ｇＲＮＡ、ＧＡ１５６と比較してより低いオンターゲット編集を有したが（図５４Ａ）、ＧＡ２４８およびＧＡ２４９は、同定されたオフターゲット部位においてオフターゲット編集の減少を示した（図５４Ｂ）。 [0080]図５５Ａは、ＡＢＥをコードするヌクレオチド、ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、ＭＡ０２１、およびＡＢＥ８．８ｍ（表２３）のＧＣ比較の他に、ＭＡ００４におけるより詳細な様子を図示する（図５５Ａ、下パネル）。図５５Ｂは、ＡＢＥをコードするヌクレオチド、ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、およびＭＡ０２１（表２３）を使用して得られた編集％を図示する。 [0080]図５５Ａは、ＡＢＥをコードするヌクレオチド、ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、ＭＡ０２１、およびＡＢＥ８．８ｍ（表２３）のＧＣ比較の他に、ＭＡ００４におけるより詳細な様子を図示する（図５５Ａ、下パネル）。図５５Ｂは、ＡＢＥをコードするヌクレオチド、ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、およびＭＡ０２１（表２３）を使用して得られた編集％を図示する。 [0080]図５５Ａは、ＡＢＥをコードするヌクレオチド、ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、ＭＡ０２１、およびＡＢＥ８．８ｍ（表２３）のＧＣ比較の他に、ＭＡ００４におけるより詳細な様子を図示する（図５５Ａ、下パネル）。図５５Ｂは、ＡＢＥをコードするヌクレオチド、ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、およびＭＡ０２１（表２３）を使用して得られた編集％を図示する。 [0080]図５５Ａは、ＡＢＥをコードするヌクレオチド、ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、ＭＡ０２１、およびＡＢＥ８．８ｍ（表２３）のＧＣ比較の他に、ＭＡ００４におけるより詳細な様子を図示する（図５５Ａ、下パネル）。図５５Ｂは、ＡＢＥをコードするヌクレオチド、ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、およびＭＡ０２１（表２３）を使用して得られた編集％を図示する。
[81]種々の実施形態の完全な理解を提供するために、本明細書のある特定の詳細が説明される。しかし、当業者であれば、本開示はこれらの詳細なしに実施できることを理解するであろう。他の例では、実施形態の説明を不必要に分かりにくくすることを避けるために、周知の構造は詳細に図示または記載していない。
[82]他に定義しなければ、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術における当業者によって共通に理解される同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書に記載した方法および材料と類似または等価の方法または材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。さらに、本明細書で提供される見出しは便利さのためだけであって、特許請求する開示の範囲または意味を説明するものではない。本明細書で論じるいずれの実施形態も、本開示の任意の方法または組成物に関して実行することができ、逆もそうであることを意図する。さらに、本開示の組成物を使用して本開示の方法を達成することができる。
定義
[83]本開示の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
[84]本明細書および添付した特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つ（ａおよびａｎ）」および「ｔｈｅ」は、文脈によって他が明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
[85]用語「または」は、文脈によって他が明確に指示されない限り、「および／または」を含むその意味において一般に採用されることにも留意されたい。本明細書で使用される場合、用語「および／または」および「それらの任意の組合せ」およびそれらの文法的同等物は、相互交換可能に使用され得る。これらの用語は、任意の組合せが具体的に意図されることを伝達することができる。説明の目的のためだけでは、以下の語句「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの任意の組合せ」は、「個別にＡ；個別にＢ；個別にＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；ＡおよびＣ；ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味し得る。用語「または」は、文脈によって具体的に離接的な使用が言及されない限り、接続的にまたは離接的に使用され得る。
[86]用語「約」または「ほぼ」は、当業者によって決定される特定の値についての許容される誤差範囲内を意味し得、これは部分的にその値がどのように測定または決定されたか、即ち測定系の限界に依存することになる。例えば、「約」は、当技術の実施についての標準偏差の１倍以内または１倍を超えることを意味し得る。あるいは、「約」は所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システムまたは生物プロセスに関して、この用語はある値の１桁以内、５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合には、他に述べない限り、特定の値の許容される誤差範囲内を意味する用語「約」が仮定されるべきである。
[87]本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の任意の形態、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」等）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「ｈａｖｉｎｇ」の任意の形態、例えば「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」等）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」の任意の形態、例えば「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」等）、または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」の任意の形態、例えば「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」等）は包括的またはオープンエンドであり、引用されていないさらなる要素または方法ステップを除外しない。
[88]本明細書で使用される場合、「一部の実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」、「実施形態（複数）」、または「他の実施形態」は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が本開示の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態には含まれないことを意味する。
[89]本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のどちらかの形態の中に少なくとも２つのヌクレオチド（即ちデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）を含むポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドはリン酸基を通して互いに連結される。「塩基」にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらは天然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然のアナログ、ならびにそれだけに限らないがアミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびアルキルハライド等の新規な反応基を導入する改変を含むがそれに限らないプリン類およびピリミジン類の合成誘導体をさらに含む。核酸は任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含み、６０ヌクレオチドまでを
含む断片は一般にオリゴヌクレオチドと命名され、より長い断片はポリヌクレオチドと命名される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、糖の５’および３’の炭素でリン酸に共有結合で接合されたデオキシリボースと称される５炭糖からなり、枝のない交互のポリマーを形成する。ＤＮＡは、例えばアンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、縮合前ＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体および組合せの形態であってよい。リボオリゴヌクレオチドは類似の繰り返し構造からなっており、５炭糖はリボースである。したがって、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在する塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを意味し得る。さらに、核酸は、合成の、非標準的な、および／または天然に存在せず、参照の核酸と類似の結合特性を有する、既知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは結合を含む核酸を含む。核酸は、塩基部分において（例えば典型的には相補的ヌクレオチドと水素結合を形成するために利用可能な１つまたは複数の原子において、および／または典型的には相補的ヌクレオチドと水素結合を形成することができない１つまたは複数の原子において）、糖部分、またはリン酸骨格において、改変され得る。骨格の改変は、それだけに限らないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデート、およびホスホロジアミデートの結合を含む。ホスホロチオエート結合はリン酸骨格中の非架橋性酸素を硫黄原子に置換してオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ分解を遅延させる。ホスホロジアミデート結合（Ｎ３’→Ｐ５’）はヌクレアーゼの認識および分解の防止を可能にする。骨格の改変には、骨格構造中のリンの代わりにペプチド結合を有すること（例えばペプチド核酸中のペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）グリシン単位）、またはカーバメート、アミド、ならびに線状および環状の炭化水素基を含む基を連結することも含み得る。改変された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄら、「Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ
ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８（１０）：１１５７～７９頁、２００１およびＬｙｅｒら、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１（３）：３４４～３５８頁、１９９９に概説されている。本明細書に記載した核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド中に存在するように、リボースもしくはデオキシリボースを含む糖部分、または改変された糖部分もしくは糖アナログを含み得る。改変された糖部分の例は、それだけに限らないが、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アミノエチル、２’－フルオロ、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホロアミデート、２’ジメチルアミノオキシエトキシ、２’ ２’ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’－グアニジニジウム、２’－Ｏ－グアジニウムエチル、カーバメート改変糖類、および二環式改変糖類を含む。２’－Ｏ－メチルまたは２’－Ｏ－メトキシエチル改変は、オリゴヌクレオチドにおけるＡフォームまたはＲＮＡ様コンフォメーションを促進し、ＲＮＡへの結合親和性を増大させ、増強されたヌクレアーゼ耐性を有する。改変された糖部分は、追加の架橋結合（例えば固定された核酸におけるリボースの２’－Ｏおよび４’－Ｃ原子を接合するメチレン架橋）またはモルホリン環（例えばホスホロジアミデートモルホリノにおけるような）等の糖アナログを有することも含み得る。そのようなアナログおよび／または改変された残基の例は、それだけに限らないが、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン
、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキュエオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリン、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）、その他同種のものを含む。一部の例では、ヌクレオチドは、三リン酸部分に対する改変を含むそれらのリン酸部分における改変を含み得る。そのような改変の非限定的な例は、より長いリン酸鎖（例えば４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）およびチオール部分による改変（例えばアルファ－チオ三リン酸およびベータ－チオ三リン酸）を含む。そのような改変または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば増強された細胞取り込み、低減された免疫原性、およびヌクレアーゼの存在下での増大した安定性等の特性のために、天然の形態より好ましいことが多い。即ち、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同様に機能する天然に存在しないモノマーまたはその部分を含むポリマーまたはオリゴマーも含み得る。
[90]他に指示しない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント（例えば縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、および相補配列も黙示的に包含し、また、明示的に指示された配列を包含する。具体的には、縮重コドン置換は、その中で１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１頁（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５～２６０８頁（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１～９８頁（１９９４））。
[91]本開示は、単離されたまたは実質的に精製された核酸分子およびこれらの分子を含む組成物を包含する。本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、その天然の環境から離れて存在するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。単離されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は精製された形態で存在してよく、または例えばトランスジェニック宿主細胞等の非天然の環境中に存在してよい。例えば、「単離された」もしくは「精製された」核酸分子またはその生物学的に活性な部分は、他の細胞材料もしくは組換え手法によって産生された場合には培地を実質的に含まず、または化学的前駆体もしくは化学合成された場合には他の化学物質を実質的に含まない。一実施形態では、「単離された」核酸は、核酸が誘導された生命体のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する配列（即ちその核酸の５’端および３’端に位置する配列）を含まない。例えば、一部の実施形態では、単離された核酸分子は、核酸が誘導された細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。
[92]用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。一部の例では、ベクターは、それが作動可能に連結された核酸の発現を方向付けることができる発現ベクターである。用語「作動可能に連結された」は、本明細書で使用される場合、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御配列に連結されていることを意味する。用語「制御配列」は、本明細書で使用される場合、それだけに限らないがプロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御エレメントを含む。そのような制御配列は当技術で周知で
あり、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。発現ベクターの例は、それだけに限らないが、プラスミドベクター、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えばマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルスに基づくウイルスベクター、およびレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルス由来のベクター）、ならびにその他の組換えベクターを含む。
[93]本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は相互交換可能に使用され、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基のポリマーを意味し、２つ以上のポリペプチド鎖からなっていてもよい。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、アミド結合を通して互いに接合された少なくとも２つのアミノ酸モノマーのポリマーを意味する。アミノ酸はＬ－光学異性体またはＤ－光学異性体であってよい。より具体的には、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、特定の順序、例えばタンパク質をコードする遺伝子またはＲＮＡにおけるヌクレオチドの塩基配列によって決定される順序で２つ以上のアミノ酸からなる分子を意味する。タンパク質は生体の細胞、組織、および臓器の構造、機能、および制御のために重要であり、それぞれのタンパク質は特有の機能を有する。その例には、ホルモン、酵素、抗体、およびそれらの任意の断片がある。一部の例では、タンパク質は、タンパク質の一部、例えばタンパク質のドメイン、サブドメイン、またはモチーフであってよい。一部の例では、タンパク質は、タンパク質のバリアント（または変異）であってよく、この場合には１つまたは複数のアミノ酸残基が、天然に存在する（または少なくとも既知の）タンパク質のアミノ酸配列に挿入され、それから欠失し、および／またはそれを置換する。タンパク質またはそのバリアントは天然に存在してもよく、組換えでもよい。生体材料中のポリペプチドの検出および／または測定の方法は当技術で周知であり、それだけに限らないがウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および種々のプロテオミクス手法を含む。ポリペプチドを測定または検出する例示的な方法としては、イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡがある。この種のタンパク質定量法は、特定の抗原を捕捉することができる抗体、および捕捉された抗原を検出することができる第２の抗体に基づいてよい。ポリペプチドの検出および／または測定のための例示的なアッセイは、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（１９８８），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
[94]用語「配列同一性」は、本明細書で使用される場合、２つの異なる配列の間で正確に一致するヌクレオチドの量を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡの配列を比較する場合、ウラシル塩基とチミン塩基は同一の塩基とみなされる。ギャップはカウントされず、測定は典型的には２つの配列のうち短い方に関連する。
例えば：
Ａ： ＡＡＧＧＣＴＴ
Ｂ： ＡＡＧＧＣ
Ｃ： ＡＡＧＧＣＡＴ
ここで同一性（Ａ，Ｂ）＝１００％（５つの同一ヌクレオチド／ｍｉｎ（長さ（Ａ）、長さ（Ｂ）））。同一性（Ｂ，Ｃ）＝１００％、しかし同一性（Ａ，Ｃ）＝８５％（６つの同一ヌクレオチド／７）。したがって１００％の同一性は２つの配列が同一であることを意味しない。
[95]用語「配列類似性」は、本明細書で使用される場合、１つの配列をそれと整列させる他の配列の正確なコピーに変換するための編集操作（挿入、欠失、および置換）の最小の数（編集距離）を発見する最適のマッチング課題として記載され得る。これを使用すれば、上記の例の配列類似性のパーセンテージはｓｉｍ（Ａ，Ｂ）＝６０％、ｓｉｍ（Ｂ，Ｃ）＝６０％、ｓｉｍ（Ａ，Ｃ）＝８６％である（セミグローバル、ｓｉｍ＝１－（編集距離／短い方の配列の整列していない長さ））。
[96]それを必要とする「対象」は、疾患、疾患の症状、または疾患への素因を治癒し、治療し、緩和し、軽減し、変更し、救済し、改良し、改善し、または影響する目的で、疾患、疾患の症状、または疾患への素因を有する個体を意味する。一部の実施形態では、対象は高コレステロール血症を有する。一部の実施形態では、対象はアテローム硬化性血管疾患を有する。一部の実施形態では、対象は高トリグリセリド血症を有する。一部の実施形態では、対象は糖尿病を有する。用語「対象」または「患者」は、哺乳動物を包含する。哺乳動物の例は、それだけに限らないが哺乳動物のクラスの任意のメンバー、即ちヒト；チンパンジーならびにその他の類人猿およびサル種等の非ヒト霊長類；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の農場動物；ウサギ、イヌ、およびネコ等の家畜；ラット、マウス、およびモルモット等のげっ歯類を含む実験動物、その他同種のものを含む。
[97]用語「状態」は、本明細書で使用される場合、疾患、障害、および被影響性を含む。一部の実施形態では、状態はアテローム硬化性血管疾患である。一部の実施形態では、状態は高トリグリセリド血症である。一部の実施形態では、状態は糖尿病である。
[98]用語「アテローム性動脈硬化症」または「アテローム硬化性血管疾患」は、本明細書で使用される場合、プラークの集積によって動脈の内側が狭くなる疾患を意味する。一部の実施形態では、これは冠動脈疾患、発作、末梢動脈疾患、または腎の問題をもたらすことがある。
[99]用語「高トリグリセリド血症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）」は、本明細書で使用される場合、ほとんどの生命体において最も豊富な脂質分子であるトリグリセリドの高い（ｈｙｐｅｒ）血中レベル（－ｅｍｉａ）を意味する。一部の実施形態では、上昇したレベルのトリグリセリドは高コレステロール血症（高いコレステロールレベル）がなくてもアテローム性動脈硬化症に関連しており、心血管疾患に罹患する傾向が高くなる。一部の実施形態では、極めて高いトリグリセリドレベルは急性膵炎のリスクを増大させる。一部の実施形態では、高トリグリセリド血症は過食、肥満、糖尿病症およびインスリン抵抗性、過剰のアルコール摂取、腎不全、ネフローゼ症候群、遺伝性素因（例えば家族性複合型高脂血症、即ちＩＩ型高脂血症）、リポタンパク質リパーゼ欠損症、リソソーマル酸リパーゼ欠損症、コレステリルエステル沈着疾患、ある種の医薬（例えばイソトレチノイン、ヒドロクロロチアジド利尿薬、ベータブロッカー、プロテアーゼ阻害薬）、甲状腺機能低下症（不活発な甲状腺）、全身性エリテマトーデスおよび関連する自己免疫反応、１型グリコーゲン沈着疾患、プロポフォール、またはＨＩＶ医薬に関連する。
[100]用語「糖尿病」は、本明細書で使用される場合、長期にわたる高い血糖レベルに
よって特徴付けられる代謝障害の群を意味する。一部の実施形態では、糖尿病はベータ細胞の喪失によってインスリンを十分に産生することができない膵臓の不全に起因する１型糖尿病である。一部の実施形態では、糖尿病はインスリン抵抗性、即ち細胞がインスリンに正しく応答することができない状態によって特徴付けられる２型糖尿病である。一部の実施形態では、糖尿病は、糖尿病の既往歴がない妊娠した女性が高い血糖レベルを発現するときに起こる妊娠性糖尿病である。
[101]用語「低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）」は、本明細書で使用される場合、リポ
タンパク質の外周縁部およびコレステロールの中心部からなる顕微鏡的な球塊を意味する。一部の実施形態では、ＬＤＬはリノール酸エステルとして知られる多不飽和脂肪酸および数百から数千のエステル化されたおよびエステル化されていないコレステロール分子からなる、高度に疎水性のコアを有する。一部の実施形態では、ＬＤＬのコアはトリグリセリドおよびその他の脂肪も有しており、リン脂質およびエステル化されていないコレステロールのシェルによって取り囲まれる。
[102]用語「高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）」は、本明細書で使用される場合、最小
のリポタンパク質粒子を意味する。実施形態では、血漿酵素であるレシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）が遊離コレステロールをコレステリルに変換し、次にこれがリポタンパク質粒子のコアの中に隔離され、球状と仮定する新規に合成されたＨＤＬを最終的に惹起する。実施形態では、ＨＤＬ粒子は、血流を通して循環し、細胞およびその他のリポタンパク質からより多くのコレステロールおよびリン脂質分子を取り込むとともに、サイズを増大させる。
[103]用語「コレステロール」は、本明細書で使用される場合、嵩高なステロイド構造
を形成する連結された４つの炭化水素環からなる特有の構造を有する脂質を意味する。用語「トリグリセリド」は、本明細書で使用される場合、３つの脂肪酸分子に結合したグリセロールからなるトリエステルを意味する。一部の実施形態では、脂肪酸は飽和または不飽和の脂肪酸である。
[104]用語「処置する」、「処置すること」、または「処置」およびその文法的等価物
は、本明細書で使用される場合、疾患または状態の少なくとも１つの症状を緩和すること、減弱させること、または改良させること、さらなる症状を防止すること、疾患または状態を阻止すること、例えば疾患または状態の進行または進展を遅延させ、低下させ、抑制し、減衰させ、消滅させ、停止させ、または安定化させること、疾患または状態を軽減すること、疾患または状態の退行を惹起すること、疾患または状態によって惹起された状態を軽減すること、疾患重症度を低減させること、または疾患または状態の症状を予防的および／または治療的に停止することを含み得る。「処置」は、疾患または状態に関連する任意の症状またはその他の有害な影響の発現もしくは再発、または重症度、および／または疾患もしくは状態に関連する副反応の頻度を低下させることも含む。「処置」は必ずしも治癒的結果を必要としない。障害または状態を処置することは、障害、状態、またはそれに関連する症状が完全に排除されることを起きないようにはしないが必要とはしないことが認識される。用語「処置すること」は「管理」という概念を包含し、これは患者における特定の疾患または障害の重症度を低減すること、またはその再発を遅延させること、例えば疾患に罹患した患者の寛解の期間を長くすることを意味する。「処置すること」は、疾患または状態の発症または発症の疑いの後で、対象に組成物を適用または投与することを意味し得る。
[105]用語「処置すること」は、「防止する」、「防止すること」、および「防止」の
概念をさらに包含する。用語「防止する」、「防止すること」、および「防止」は、本明細書で使用される場合、疾患または状態を有していないが、それを発症するリスクにあるか、発症しやすい対象における状態の病状の発生を低下させることを意味する。防止は完全であって、例えば対象における状態の病状が完全に存在しないことであってよい。防止は部分的であって、それにより対象における状態の病状の発生が、本開示がない場合に生じる発生より少ないものであってもよい。
[106]例えば等価の未処置の対照と比較して、「状態を処置または防止すること」によ
って、障害の症状を緩和することは、任意の標準的な手法で測定して、少なくとも３％、５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９
９％、９９．５％、９９．９％，または１００％の低減または防止の程度を含み得る。一部の実施形態では、障害の症状を緩和することは、等価の未処理の対照と比較して、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００，または１００００分の１の低減または防止の程度を含み得る。
[107]本明細書で使用される場合、疾患の進行を「遅延させる」は、疾患の進行を引き
延ばす、邪魔する、遅くする、妨害する、安定化させる、および／または延期することを意味する。この遅延は、疾患の病歴および／または処置される個体によって期間が変動し得る。疾患の進行を「遅延させる」もしくは緩和する、または疾患の発症を遅延させる方法は、その方法を使用しないことと比較した場合、疾患の１つまたは複数の症状が進行する確率を所与の時間枠で低減させる、および／または所与の時間枠で症状の程度を低減させる方法である。そのような比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるために十分な数の対象を使用する臨床試験に基づく。
[108]疾患の「進行」または「進展」は、疾患の初期の兆候および／またはその疾患の
進展を確かにすることを意味する。疾患の進行は検出可能で、当技術で周知の標準的な臨床手法を使用して評価することができる。しかし、進行は検出できないであろう進展も意味する。本開示の目的のため、進行または進展は症状の生物学的経過を意味する。「進行」は、発生、再発、および発症を含む。
[109]本明細書で使用される場合、疾患の「発症」または「発生」は、初期の発症およ
び／または再発を含む。
[110]「投与する」およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、本明細書
に記載した医薬組成物を対象または患者に提供することを意味し得る。医薬の技術における当業者には既知の従来の方法を使用し、処置すべき疾患の種類または疾患の部位に応じて、組成物を対象に投与することができる。例えば、組成物は例えば経口で、非経口で、吸入スプレイによって、局所的に、経直腸で、経鼻で、頬側に、経膣で、埋め込みリザーバーを介して、または注入によって、投与することができる。１つまたは複数のそのような経路を採用することができる。
[111]用語「非経口」は、本明細書で使用される場合、皮下、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔ
ａｎｅｏｕｓ）、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、動脈内、滑液嚢内、茎内、髄腔内、血管内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入手法を含む。さらに、これは注射可能なデポ投与経路を介して、例えば１、３、または６か月のデポ注射可能なまたは生体分解性の材料および方法を使用して、対象に投与することができる。
[112]「共投与」は、１つまたは複数の追加の治療剤の効果を増強するために、１つま
たは複数の追加の治療レジメンまたは薬剤または処置と本開示の組成物を時間的に十分に近く投与すること、またはその逆を意味する。これに関して、本明細書に記載した本開示の組成物を、１つまたは複数の追加の治療レジメンまたは薬剤または処置と同時に、異なった時間で、または完全に異なった治療スケジュールで（例えば第１の処置を毎日行なう一方、追加の処置を毎週行なう）、投与され得る。例えば、実施形態では、本開示の組成物と同時に、その前に、またはそれに続いて、第２の治療レジメンまたは薬剤または処置が投与される。
[113]用語「医薬組成物」およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、対
象、例えば、治療有効量の活性医薬品成分を薬学的に許容される１つまたは複数の賦形剤、担体、および／または治療剤とともに含む混合物または溶液を必要とするヒトに投与さ
れる、治療有効量の活性医薬品成分を薬学的に許容される１つまたは複数の賦形剤、担体、および／または治療剤とともに含む混合物または溶液を意味し得る。
[114]用語「薬学的に許容される」およびその文法的等価物は、本明細書で使用される
場合、一般に安全で非毒性であり、生物学的にもその他にも有害でなく、獣医ならびにヒトの医薬品用途に許容される、医薬組成物の調製に有用な材料の属性を意味し得る。「薬学的に許容される」は、化合物の生物活性または特性を無効にしない比較的無毒性の担体または希釈剤等の材料を意味し得る。即ち、材料は望ましくない生物学的影響を惹起せず、またはそれが含まれる医薬組成物の成分のいずれとも有害な様式で相互作用せずに、対象に投与され得る。
[115]「薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤」は、薬剤とともに対象に投
与され得、その薬理学的活性を損なわず、治療量の薬剤を送達するために十分な用量で投与した場合に非毒性である、賦形剤、担体、または希釈剤を意味する。
[116]「薬学的に許容される塩」は、過剰の毒性、刺激、アレルギー反応、またはその
他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトまたは動物の組織と接触する使用に適すると当技術で一般に考えられている酸または塩基の塩であってよい。そのような塩は、アミン等の塩基性残基の鉱酸または有機酸の塩、ならびにカルボン酸等の酸性残基のアルカリもしくは有機の塩を含む。特定の医薬品の塩は、それだけに限らないが、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、酢酸等のアルカン酸、ｎが１～４であるＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨ、その他の同種のものの塩を含む。同様に、薬学的に許容されるカチオンは、それだけに限らないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウムを含む。当業者であれば、本開示および当技術における知識から、さらなる薬学的に許容される塩はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１４１８頁（１９８５）に列挙されたものを含むことを認識することになる。一般に、薬学的に許容される酸または塩基の塩は、塩基性または酸性の部分を含む親化合物から任意の従来の化学的方法によって合成され得る。簡単に述べると、そのような塩は、遊離の酸または塩基の形態のこれらの化合物を化学量論的な量の適切な塩基または酸と適切な溶媒中で反応させることによって調製され得る。
[117]用語「治療剤」は、対象に投与された場合に、治療的、診断的、および／もしく
は予防的な効果を有する、ならびに／または所望の生物学的および／もしくは薬理学的な効果を誘発する任意の薬剤を意味し得る。治療剤は「活性剤」または「活性薬剤」とも称され得る。そのような薬剤は、それだけに限らないが、サイトトキシン、放射活性イオン、化学療法剤、小分子薬物、タンパク質、および核酸を含む。
[118]「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは１つもしくは複数
の他の治療剤と組み合わせて、治療効果を対象に付与するために必要な本開示のそれぞれの組成物の量を意味する。したがって、本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、疾患、障害、および／または状態に罹患したまたは罹患しやすい対象に投与された場合に、その疾患、障害、および／または状態を処置し、その症状を改善し、診断し、防止し、および／またはその発症を遅延させるために十分な送達すべき薬剤（例えば核酸、組成物、治療剤、予防剤、その他）の量を意味する。処置に関して、「治療有効量」は、疾
患または状態、例えばアテローム硬化性血管疾患、高トリグリセリド血症、もしくは糖尿病の進展を和らげ、改良し、安定化させ、逆進させ、または遅くするために十分な量である。「治療有効量」は、当業者によって認識されるように、処置される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、大きさ、性別、および体重を含む個別の対象のパラメーター、処置の継続期間、（存在すれば）併用療法の性質、特定の投与経路、ならびに医療従事者の知識および専門技術の中の同様の要素に応じて変動する。これらの要素は当業者には周知であり、日常の実験を超えることなく対処され得る。個別の成分またはその組成物の最大用量、即ち信頼できる医学的判断に従う最大の安全な用量が使用されることが一般に好ましい。しかし、医学的理由、心理的理由、または事実上任意の他の理由によって対象がより低い用量または忍容できる用量に固執するかもしれないことは、当業者には理解できよう。さらに、患者が受けているかもしれない他の医薬は、投与すべき治療剤の治療有効量の決定に影響することになる。半減期等の経験的考察は、一般に投薬量の決定に寄与することになる。「治療有効量」は、単独でまたは状態を処置するために使用される１つまたは複数の薬剤と併せて使用される本開示の組成物のいずれかのものであってよい。治療有効量は、１回または複数回の投与で投与され得る。
[119]「治療有効量」を決定する効果的な初期の方法は、細胞培養アッセイを行なうこ
と（例えば神経細胞を使用して）または動物モデル（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、またはブタ）を使用することによる。用量は、細胞培養で決定したＩＣ５０（即ち、症状の阻害の最大半量を達成する組成物の濃度）を含む濃度範囲を達成するように動物モデルで処方されてよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いられ得る。開示した組成物が治療に有効であるための適切な濃度範囲の決定に加えて、動物モデルによって、最大の効果を生じる好ましい投与経路等の他の関連する情報を得ることもできる。上記の方法および他の方法に基づいてヒトにおける最大有効性を達成するための用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
[120]本明細書で提供される範囲は、範囲内の全ての値の省略表現であることが理解さ
れる。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群の任意の数、数の組合せ、またはサブ範囲、ならびに上記の整数の間に介在する全ての小数値、例えば１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、および１．９等を含むと理解される。サブ範囲に関しては、範囲のいずれかの端点から延長する「入れ子のサブ範囲」が具体的に意図される。例えば、１～５０の例示的な範囲の入れ子のサブ範囲は一方向への１～１０、１～２０、１～３０、および１～４０、またはもう１つの方向への５０～４０、５０～３０、５０～２０、および５０～１０を含み得る。
[121]用語「プロトスペーサー」または「標的配列」、およびそれらの文法的等価物は
、本明細書で使用される場合、標的遺伝子のＤＮＡ配列を意味し得る。自然の状態では、プロトスペーサーはＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に隣接する。用語「スペーサー」は、プロトスペーサーの相補鎖に結合するプロトスペーサーのＲＮＡバージョンであってよい。スペーサーはガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の中にあってよい。ＲＮＡにガイドされたヌクレアーゼによる切断の部位は、プロトスペーサー配列の中にある。説明のために図１Ａを参照されたい。
[122]用語「塩基編集」、「遺伝子編集」、または「遺伝子改変」、およびその文法的
等価物は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数のヌクレオチドが挿入され、置き換えられ、またはゲノムから除去される遺伝子操作を意味し得る。遺伝子編集はヌクレア
ーゼ（例えば天然に存在するヌクレアーゼまたは人工的に操作されたヌクレアーゼ）を使用して実施され得る。遺伝子改変は、二本鎖切断、非センス変異、フレームシフト変異、スプライス部位の変更、またはポリヌクレオチド配列、例えば標的ポリヌクレオチド配列における逆位の導入を含み得る。
[123]用語「塩基エディター（ＢＥ）」または「核酸塩基エディター（ＮＢＥ）」は、
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドに結合し、核酸塩基を改変する活性を有する薬剤を意味し得る。種々の実施形態では、塩基エディターは、核酸塩基を改変するポリペプチド（例えばデアミナーゼ）およびガイドヌクレオチド（例えばガイドＲＮＡ）に連結された核酸プログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン、またはプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインおよびデアミナーゼをコードする核酸を含む。種々の実施形態では、薬剤は、塩基編集活性を有するタンパク質ドメイン、即ち核酸分子（例えばＤＮＡ）中の塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ）を改変することができるドメイン、またはそれをコードする核酸を含む生体分子複合体である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインはデアミナーゼドメインに融合または連結され、塩基エディター融合タンパク質をもたらす。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸、例えば塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。塩基エディター融合タンパク質は１つまたは複数のリンカー、例えばペプチドリンカーを含み得る。一実施形態では、薬剤は、塩基編集活性を有するドメインを含む融合タンパク質である。別の実施形態では、塩基編集活性を有するタンパク質ドメインはガイドＲＮＡに連結される（例えばガイドＲＮＡ上のＲＮＡ結合モチーフおよびデアミナーゼに融合したＲＮＡ結合ドメインを介して）。一部の実施形態では、塩基編集活性を有するドメインは、核酸分子中の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ分子中の１つまたは複数の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ中のアデノシン（Ａ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ中のシトシン（Ｃ）を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターはシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）である。
[124]用語「塩基エディターシステム」は、標的ヌクレオチド配列の核酸塩基を編集す
るためのシステムを意味する。種々の実施形態では、塩基エディターシステムは、（１）ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメイン（例えばＣａｓ９）；（２）前記核酸塩基を脱アミノ化するためのデアミナーゼドメイン（例えばアデノシンデアミナーゼまたはシトシンデアミナーゼ）；および（３）１つまたは複数のガイドポリヌクレオチド（例えばガイドＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、（１）および（２）を含む塩基エディター融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプログラム可能なヌクレオチド結合ドメインはポリヌクレオチドプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、塩基エディターはアデニンまたはアデノシン塩基エディター（ＡＢＥ）である。一部の実施形態では、塩基エディターはシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）である。
核酸塩基エディターシステム
[125]一部の態様では、核酸塩基の改変が可能な塩基エディターシステムが本明細書で
提供される。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸、および（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムはガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なＤ
ＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸を含む。
[126]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、対象に投与された場合に、ｉ
ｎ ｖｉｖｏにおいてＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディターシステムに指令する。
[127]一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒ
シーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる。
[128]一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒ
シーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３５％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の１％～９０％、５％～８５％、１０％～８０％、１５％～７５％、２０％～７０％、２５％～６５％、３０％～６０％、３５％～５５％、または４０％～５０％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の１００％で起こる。
[129]一部の実施形態では、塩基の変更は対象の肝細胞で起こる。一部の実施形態では
、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の少なくとも３０％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は対象の肝細胞で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の少なくとも％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５
％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の多くとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３５％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の１％～９０％、５％～８５％、１０％～８０％、１５％～７５％、２０％～７０％、２５％～６５％、３０％～６０％、３５％～５５％、または４０％～５０％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の１００％で起こる。
[130]一部の実施形態では、対象の全肝細胞で生じた塩基の変更は、次世代シーケンシ
ングによって測定される。一部の実施形態では、対象の全肝細胞で生じた塩基の変更は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって測定される。一部の実施形態では、対象の肝細胞で生じた塩基の変更は、次世代シーケンシングによって測定される。一部の実施形態では、対象の肝細胞で生じた塩基の変更は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって測定される。
[131]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの少なくとも３５％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの少なくとも３５％の低減をもたらす。
[132]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５
％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３１％～９９．９％、３２％～９９．９％、３３％～９９．９％、３４％～９９．９％、３５％～９９．９％、３６％～９９．９％、３７％～９９．９％、３８％～９９．９％、３９％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７９％、１％～７８％、１％～７７％、１％～７６％、１％～７５％、１％～７４％、１％～７３％、１％～７２％、１％～７１％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３９％、１％～３８％、１％～３７％、１％～３６％、１％～３５％、１％～３４％、１％～３３％、１％～３２％、１％～３１％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの１％～９９．９％、５％～９９．５％、１０％～９９％、１５％～９７％、２０％～９５％、２５％～９０％、３０％～８５％、３１％～８０％、３２％～７９％、３３％～７８％、３４％～７７％、３５％～７６％、３６％～７６％、３７％～７５％、３８％～７４％、３９％～７３％、４０％～７２％、４５％～７１％、５０％～７０％、または５５％～６５％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの１００％の低減をもたらす。
[133]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、
８００％、９００％、１０００％低い、対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満の、対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルをもたらす。
[134]一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質
レベルの低減または血液ＰＣＳＫ９レベルは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの低減または血液ＰＣＳＫ９レベルは、ウェスタンブロット解析によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの低減または血液ＰＣＳＫ９レベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析）によって測定される。
[135]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３１％～９９．９％、３２％～９９．９％、３３％～９９．９％、３４％～９９．９％、３５％～９９．９％、３６％～９９．９％、３７％～９９．９％、３８％～９９．９％、３９％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの１％～９９．５％、１％～９
９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７９％、１％～７８％、１％～７７％、１％～７６％、１％～７５％、１％～７４％、１％～７３％、１％～７２％、１％～７１％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３９％、１％～３８％、１％～３７％、１％～３６％、１％～３５％、１％～３４％、１％～３３％、１％～３２％、１％～３１％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの１％～９９．９％、５％～９９．５％、１０％～９９％、１５％～９７％、２０％～９５％、２５％～９０％、３０％～８５％、３１％～８０％、３２％～７９％、３３％～７８％、３４％～７７％、３５％～７６％、３６％～７６％、３７％～７５％、３８％～７４％、３９％～７３％、４０％～７２％、４５％～７１％、５０％～７０％、または５５％～６５％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの１００％の低減をもたらす。
[136]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％低い、対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満の、対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルをもたらす。
[137]一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパ
ク質レベルの低減または血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの低減または血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルは、ウェスタンブロット解析によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの低減または血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析）によって測定される。
[138]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液ま
たは低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの少なくとも３５％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの少なくとも３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６
４％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３５％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの１％～９９．９％、５％～９９．５％、１０％～９９％、１５％～９７％、２０％～９５％、２５％～９０％、３０％～８５％、３５％～８０％、４０％～７５％、４５％～７０％、５０％～６５％、または５５％～６０％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの１００％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％低い、対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満の、対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルをもたらす。
[139]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液ト
リグリセリドレベルの少なくとも３５％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３５％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの１％～９９．９％、５％～９９．５％、１０％～９９％、１５％～９７％、２０％～９５％、２５％～９０％、３０％～８５％、３５％～８０％、４０％～７５％、４５％～７０％、５０％～６５％、または５５％～６０％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの１００％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％低い、対象における血液トリグリセリドレベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満の、対象における血液トリグリ
セリドレベルをもたらす。
[140]一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液トリグリセリドレベル
または血液トリグリセリドレベルの低減は、任意の標準的な手法によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルまたは血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの低減は、任意の標準的な手法によって測定される。例えば、血清試料中の「脂質パネル」を測定するために、コレステロール（総Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ）、および高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）の酵素的な直接測定を伴う臨床アナライザー装置が使用され得る。それぞれの分析物質に固有の試薬キットは、緩衝剤、キャリブレーター、ブランク、および対照を含む。本開示で使用される場合、コレステロール、トリグリセリド、およびＨＤＬ－Ｃは、固有の酵素反応産物の吸光度測定を使用して定量され得る。ＬＤＬ－Ｃは間接的に決定されてよい。一部の例では、循環系のコレステロールの大部分は３種の主要なリポタンパク質分画、即ち超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ＬＤＬ、およびＨＤＬで見出され得る。一部の実施形態では、循環系の総コレステロールは、式［総Ｃ］＝［ＶＬＤＬ－Ｃ］＋［ＬＤＬ－Ｃ］＋［ＨＤＬ－Ｃ］で推定され得る。即ち、ＬＤＬ－Ｃは、関係式：［ＬＤＬ－Ｃ］＝［総Ｃ］－［ＨＤＬ－Ｃ］－［ＴＧ］／５に従って総コレステロール、トリグリセリド、およびＨＤＬ－Ｃの測定値から計算され得る。ここで、［ＴＧ］／５はＶＬＤＬ－コレステロールの推定値である。緩衝剤、キャリブレーター、ブランク、および対照を含むトリグリセリドに固有の試薬キットが使用されてよい。本明細書で使用される場合、研究で得られた血清試料は分析され得、トリグリセリドはカップリングされた一連の酵素反応を使用して測定されてよい。一部の実施形態では、最後の酵素反応の最終生成物としての分析物質およびその５００ｎｍにおける吸光度を定量するためにＨ２Ｏ２が使用されてよく、発色強度はトリグリセリド濃度に比例する。
[141]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドＲＮＡであり、ガイドＲ
ＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に０、１つ、または２つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖にミスマッチなしで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に１つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に２つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に３つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に４つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に５つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。
[142]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドＲＮＡであり、ガイドＲ
ＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に０、１つ、または２つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖にミスマッチなしで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に１つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に２つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に３つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトス
ペーサー配列の相補鎖に４つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に５つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。
[143]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して
、対象における全肝細胞の１％未満のプロトスペーサー配列の外側にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して、対象における肝細胞の１％未満のプロトスペーサー配列の外側にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して、プロトスペーサー配列の内部のみにある。
[144]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して
、対象における全肝細胞の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、８．０％、９．０％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、６５％、８０％、８５％、９０％未満のプロトスペーサー配列の外側にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して、対象における肝細胞の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、８．０％、９．０％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、６５％、８０％、８５％、９０％未満のプロトスペーサー配列の外側にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して、対象における細胞の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、８．０％、９．０％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、６５％、８０％、８５％、９０％未満のプロトスペーサー配列の外側にある。
[145]一部の実施形態では、デアミナーゼはアデニンデアミナーゼである。一部の実施
形態では、核酸塩基の変更は、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更である。一部の実施形態では、デアミナーゼはアデニンデアミナーゼであり、核酸塩基の変更はＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更である。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼを含む。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインはＣａｓ９を含む。
[146]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位に
ある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスドナー部位にある。一部の実施形態では、スプライスドナー部位は、配列番号５で参照されるＰＣＳＫ９イントロン１の５’末端にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、フレームシフト、未成熟終止コドン、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは化学的に改変されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは表１または表２４で説明される化学的改変を含む。
[147]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部
位にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスドナー部位にある。一部の実施形態では、スプライスドナー部位は、配列番号７で参照されるＡＮＧＰＴＬ３イントロン６の５’末端にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、フレームシフト、未成熟終止コドン、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは化学的に改変されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは表１または表２４で説明される化学的改変を含む。
[00148]一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表１または表２４で説明されるガイド
ＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列５’－５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇＣＵａＧＵＣｃＧ ＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕＧｇｃａｃｃｇＡｇＵＣｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号９）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵ ＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号９）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号９）（ＧＡ３４６）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡａｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号１０）（ＧＡ３７４）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕｕｕｕ－３’（配列番号１１）（ＧＡ３８５）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕｕＵｕ－３’（配列番号１１）（ＧＡ３８６）または５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｓｕｓｕｕｕｕ－３’（配列番号１２）（ＧＡ３８７）を含む。
[149]一部の実施形態では、プロトスペーサー配列は、表１または表２４で説明される
プロトスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、プロトスペーサーは、配列５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）、ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）、および５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１５）を含む。
[150]一部の実施形態では、塩基エディター融合タンパク質は配列番号３の配列を含む
。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３で説明されるアミノ酸配列または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼは１つまたは複数の変異（例えば本明細書で提供される変異のいずれか）を含んでもよいことを認識されたい。本開示は、いくらかの同一性パーセントおよび本明細書に記載した変異のいずれかまたはその組合せを有する任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３で説明されるアミノ酸配列または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３で説明されるアミノ酸配列のいずれか１つまたは本明細書で提供されるアデニンデアミナーゼのいずれかと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０の同一の隣接するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
[151]一部の実施形態では、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸はｍＲＮ
Ａである。ｍＲＮＡは、改変、例えばｍＲＮＡの３’または５’末端の改変を含み得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはキャップアナログを含む。
[152]一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基
、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも１つ、２つ、または３つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも１つ、２つ、または３つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも１つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも２つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも３つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも４つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも５つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも６つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも７つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも８つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも９つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もし
くはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。
[153]一部の実施形態では、ｍＲＮＡはポリＡテイルを含む。ポリＡテイルはｍＲＮＡ
の３’末端にあってよい。
[154]一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量は、４０％、４１％、４２％、
４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％以上である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％以上である。
[155]一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列はアデニンｔＴＮＡデアミナーゼ（ＴａｄＡ
）領域を含む。一部の実施形態では、ＴａｄＡ領域のＧＣ％は４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％以上である。一部の実施形態では、ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％以上である。
[156]一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列はＣａｓ９領域を含む。一部の実施形態では
、Ｃａｓ９領域のＧＣ％は、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％以上である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％以上である。
[157]一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列はＮＬＳ領域を含む。一部の実施形態では、
ＮＬＳ領域のＧＣ％は４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％以上である。一部の実施形態では、ＮＬＳ領域のＧＣ％含量は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％以上である。
[158]一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、ＴａｄＡ領域とＣａｓ９領域を連結する
第１のリンカー領域を含む。一部の実施形態では、第１のリンカー領域のＧＣ％は、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０
％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％以上である。一部の実施形態では、第１のリンカー領域のＧＣ％含量は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％以上である。
[159]一部の実施形態では、ｍＲＮＡ配列はＣａｓ９領域とＮＬＳ領域を連結する第２
のリンカー領域を含む。一部の実施形態では、第２のリンカー領域のＧＣ％は、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％以上である。一部の実施形態では、第２のリンカー領域のＧＣ％含量は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％以上である。
[160]一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムは、ガイド
ポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチドをコードする核酸（ｉ）を封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸（ｉｉ）をさらに封入する。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸（ｉｉ）を封入する第２のＬＮＰをさらに含む。
[161]本明細書で提供される塩基エディターシステムは、１つまたは複数のＬＮＰを含
み得る。例えば、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸、例えば塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの両方を封入するＬＮＰを含み得る。別の例では、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡを封入するＬＮＰ、および塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡを封入するＬＮＰを含み得る。ガイドポリヌクレオチドと塩基エディター融合タンパク質または塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを個別に封入するＬＮＰによって、塩基エディターシステムの順応性のある投薬および投与が可能になる。例えば、ガイドＲＮＡを封入するＬＮＰを最初に投与し、続いて塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを封入するＬＮＰを投与することができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡを封入するＬＮＰと、塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを封入する第２のＬＮＰとが、対象に同時に投与される。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡを封入するＬＮＰと、塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡを封入するＬＮＰとが、対象に逐次的に投与される。一部の実施形態では、塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを封入するＬＮＰが対象に投与され、続いて１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、またはそれ以上後に、ガイドＲＮＡを封入する第２のＬＮＰが複数回、投与または投薬される。複数回用量の第２のＬＮＰは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日、またはそれ以上の間隔で投与されてよい。
[162]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク
質をコードする核酸との比は、重量で約１：１０～約１０：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、または４：１と１：４の間の任意の比である。一部の実施形態では、ガイド
ポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との滴定によって決定され得る。
[163]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク
質をコードする核酸とのモル比は、約５００：１～約１：５００である。
[164]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク
質をコードする核酸との比は、重量で約１０００：１～約１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１
：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。
[165]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク
質をコードする核酸とのモル比は、約１００００：１～約１：１００００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１：１００００、１：９５００、１
：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１：１００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４
０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約１：１００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。
[166]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディ
ター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１０：１～約１：１０である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約４：１、３；１、２：１、１．５：１、
１：１、１：１．５、１：２、１：３、または１：４である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、約５００：１～約１：５００である。
[167]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディ
ター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１０００：１～約１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０
、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。
[168]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディ
ター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、約１００００：１～約１：１００００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１：１００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８
０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１：１００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４
０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約１：１００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。
[169]精密ゲノム編集は、工業、農業、および生医学の用途を有する成長分野である。
今日利用可能な主要なゲノム編集システムの１つは、集積した規則的に空間を満たす短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－ＣＲＩＳＰＲ関連９（Ｃａｓ９）である。Ｄ
ＮＡ中の配列ＮＧＧ（Ｎは任意の標準塩基である）を含む特定のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ゲノム中のＤＮＡ（プロトスペーサーとして知られる）の配列のものと相同の配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用により、Ｃａｓ９を使用して標的配列において二本鎖切断（ＤＳＢ）を創成することができる。ＤＳＢにおける非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を用いて、遺伝子座にインデルおよびノックアウト遺伝子を創成することができる。同様に、相同組換え修復（ＨＤＲ）は、導入した鋳型ＤＮＡとともに用いられ、遺伝子を挿入しまたは標的配列を改変することができる。ＤＮＡをメチル化し、より広い配列スペースを認識し、または一本鎖ニックを創成するツールを含む様々なＣａｓ９系ツールが近年開発されている。２０１６年にＫｏｍｏｒらは、鋳型ＤＮＡ鎖を導入せず、またＤＳＢを必要とせずに、シトシン塩基をチミン塩基に変換するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の使用を記載した（参照により全体として本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒ ＡＣ，Ｋｉｍ ＹＢ，Ｐａｃｋｅｒ ＭＳら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５３３：４２０～４頁）。リンカーＸＴＥＮを使用してラットＡＰＯＢＥＣ１のシチジンデアミナーゼドメインが触媒不活性のＣａｓ９（ｄＣａｓ９）のＮ末端に融合（塩基エディター１またはＢＥ１と呼ばれる融合タンパク質をもたらす）された後、ＤＮＡの２０ｎｔのプロトスペーサー領域内の４位と８位の間（または、別の表現ではＰＡＭの１３～１７ヌクレオチド上流）で、シトシンからウラシルへの変換が観察された。注目すべきことに、この「ウィンドウ」の中のいずれのシトシン塩基も編集が容易であり、いくつのおよびどのシトシンが編集されたかに応じて様々な結果が生じた。ＤＮＡの複製または修復の後で、それぞれのウラシルはチミンで置き換えられ、ＣからＴへの塩基編集が完了した。３ 塩基エディターの次のバージョン（ＢＥ２）は、シチジンデアミナーゼ活性（これはさもなければ元のシトシン塩基を復元するように作用する）に起因するウラシル塩基の塩基切除修復の阻害を助けるｄＣａｓ９のＣ末端に融合したウラシルグリコシラーゼ阻害剤を組み込んだ。これは、ＣからＴへの塩基編集の効率を改善した。最後のバージョンであるＢＥ３は、ｄＣａｓ９よりむしろＣａｓ９ニッカーゼを使用した。ニッカーゼは、編集されたＣからＴ塩基に対向する未編集の鎖を切断し、真核性のミスマッチの修復を通して対向するグアニジンの除去を刺激した。ＢＥ２およびＢＥ３塩基編集は、ヒトとマウスの細胞系の両方で観察された。塩基編集の特異性は、Ｃａｓ９ニッカーゼへの変異の付加によってさらに改善されている。同様にして、Ｃａｓ９は編集ウィンドウの幅をほぼ５ヌクレオチドから僅か１～２ヌクレオチドに狭くするように変異されている（それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｒｅｅｓ ＨＡ，Ｋｏｍｏｒ ＡＣ，Ｙｅｈ ＷＨら、「Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１７，８：１５７９０頁；Ｋｉｍ ＹＢ，Ｋｏｍｏｒ ＡＣ，Ｌｅｖｙ ＪＭら、「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９－ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎｓ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１７，３５：３７１～６頁）。
[170]代替のシトシン塩基編集プラットフォームは、活性誘起シトシンデアミナーゼド
メインＰｍＣＤＡ１をｄＣａｓ９（標的－ＡＩＤ）に連結することによるものであり、これらは酵母における標的としたＣからＴへの塩基編集を実証することができた。さらに、代替のＣからＴへの編集戦略も、デアミナーゼドメインをＣａｓ９に融合させることなく実証された。その代わりに、ＳＨ３（Ｓｒｃ ３相同性)ドメインがｄＣａｓ９のＣ末端
に付加された一方、ＳＨＬ（ＳＨ３相互作用リガンド）がＰｍＣＤＡ１に付加された。６
効率の最適化は、ｄＣａｓ９よりむしろＣａｓ９ニッカーゼの使用によって達成された
。さらに、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を添加して、哺乳動物ＣＨＯ細胞系における塩基編集を増強した。得られたプラットフォームは、ＰＡＭ配列の上流の１８番目のヌクレオチドの３～５塩基以内で一貫して塩基を編集することができた（参照により全体として本明細書に組み込まれるＮｉｓｈｉｄａ Ｋ，Ａｒａｚｏｅ Ｔ，Ｙａｃｈｉｅ Ｎら、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ
ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６，３５３頁：ａａｆ８７２９）。
[171]注目すべきシトシン塩基編集プラットフォームは、ＲＮＡにガイドされたエンド
ヌクレアーゼとしてＣａｓ９の代わりにＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても知られる）を使用した。触媒不活性のＣｐｆ１をＡＰＯＢＥＣ１と融合させ（ｄＬｂＣｐｆ１－ＢＥ０）、ヒト細胞系でＣからＴへの変換を生じさせた。Ｃａｓ９塩基エディターバリアントＢＥ３および標的－ＡＩＤはＰＡＭ配列ＮＧＧを認識する一方、ｄＬｂＣｐｆ１－ＢＥ０はＴリッチのＰＡＭ配列ＴＴＴＶを認識する。塩基編集はｄＬｂＣｐｆ１－ＢＥ０でプロトスペーサー配列の８位と１３位の間で観察されたが、さらなる変異をＣｐｆ１に導入することによって、ウィンドウを１０位から１２位に低減することができた。しかし、塩基編集ウィンドウを狭くすることは、編集効率の低下に相関した（参照により全体として本明細書に組み込まれるＬｉ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｌｉｕ Ｙら、「Ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ
ｗｉｔｈ ａ Ｃｐｆ１－ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１８，３６：３２４～７頁）。
[172]シトシン塩基編集は完全に予測可能ではなく、ＣからＴへの編集エディターで観
察されたものよりは低い頻度ではあるが、標的部位においてインデルが起こり得る。さらに、シトシン塩基エディターは、期待されたＣからＴへの編集よりむしろ、時にはＣからＡまたはＣからＧへの編集を惹起することがある。Ｃａｓ９ニッカーゼとラットＡＰＯＢＥＣ１シトシンデアミナーゼドメインとの間に１６アミノ酸から３２アミノ酸にリンカー長さを追加し、Ｃａｓ９ニッカーゼとウラシルグリコシラーゼ阻害剤との間に４アミノ酸から９アミノ酸にリンカーを追加し、また別の９アミノ酸のリンカーを使用して新たなシトシン塩基エディターのＣ末端に付加した第２のウラシルグリコシラーゼ阻害剤を使用することによって、「ＢＥ４」と名付けられるシトシン塩基エディターを改善した（Ｋｏｍｏｒ ＡＣ，Ｚｈａｏ ＫＴ，Ｐａｃｋｅｒ ＭＳら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｍｕ Ｇａｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄｓ Ｃ：Ｇ－ｔｏ－Ｔ：Ａ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｐｕｒｉｔｙ」．Ｓｃｉ Ａｄｖ，２０１７，３：ｅａａｏ４７７４。参照により全体として本明細書に組み込まれる。）。
[173]大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）アデニンｔＴＮＡデアミナーゼＴａｄＡ（ｅｃＴａｄＡ）をｄＣａｓ９に融合することおよびｅｃＴａｄＡドメインの変異生成を編集活性の選択と併用することによって、Ａ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎの変異がＤＮＡ中のアデニンをグアニンに編集することができるＡＢＥ７．１０と命名される塩基エディターを生じることが明らかになった（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ＮＭ，Ｋｏｍｏｒ ＡＣ，Ｒｅｅｓ ＨＡら、「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ・Ｔ ｔｏ Ｇ・Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５５１：４６４～７１頁。参照により全体として本明細書に組み込まれる。）。Ｋｏｂｌａｎらは、核局在化シグナルの改変およびコドン最適化によってＡＢＥ７．１０の効率を改善し、ＡＢＥｍａｘと称するバージョンを得た。同様のアプローチによって、シトシン塩基エディターＢＥ４の効率を改善した。１０ Ｈｕａｎｇらは、代替のＰＡＭを使用し、その編集ウィンドウを拡張してアデニンとシトシ
ンの塩基エディターの両方のさらなる開発を実施し、それによりその標的範囲を増大させた（参照により全体として本明細書に組み込まれる「Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ａｎｄ ａｄｅｎｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１８，３６：８４３～６頁）。
[00174]同じことが塩基エディター１２－１４について真実であることが証明されたが
、同じｇＲＮＡを使用したＣａｓ９、シトシン塩基エディター、およびアデニン塩基エディターの比較により、明らかなオフターゲットプロファイルが示されている。
[00175]様々な研究によって、単離の際に作用するデアミナーゼドメインによって惹起
されるｇＲＮＡによらないオフターゲット塩基編集（Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体によるＤＮＡの関与を必要としない）への関心が高まっている。さらなる研究によって、塩基エディターのｇＲＮＡによらないオフターゲット効果はＤＮＡに限らないことが示された。シトシン塩基エディターまたはアデニン塩基エディターによって処理された細胞のＲＮＡシーケンシングによって、トランスクリプトームに広がるＲＮＡのオフターゲット編集、およびアデニン塩基エディターのデアミナーゼドメインにおけるアミノ酸置換（例えばＲ１０６Ｗ）の導入がオンターゲットのＤＮＡ塩基編集効率を実質的に低減させることなくＲＮＡのオフターゲット編集を低下させることが明らかになった。それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｚｕｏ Ｅ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｗｅｉ Ｗら、「Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９，３６４：２８９～９２頁；Ｊｉｎ Ｓ，Ｚｏｎｇ Ｙ，Ｇａｏ Ｑら、「Ｃｙｔｏｓｉｎｅ， ｂｕｔ ｎｏｔ ａｄｅｎｉｎｅ， ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｉｎｄｕｃｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｉｃｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１９，３６４：２９２～５頁；Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ Ｊ，Ｚｈｏｕ Ｒ，Ｇａｒｃｉａ ＳＰら、「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ」Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５６９：４３３～７頁；Ｇｒｕｎｅｗａｌｄ Ｊ，Ｚｈｏｕ Ｒ，Ｉｙｅｒ Ｓら、「ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ＲＮＡ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｅｄｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１９，３７：１０４１～８頁；Ｚｈｏｕ Ｃ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｙａｎ Ｒら、「Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ
ＲＮＡ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」Ｎａｔｕｒｅ，２０１９，５７１：２７５～８頁；Ｒｅｅｓ ＨＡ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｃ，Ｄｏｍａｎ ＪＬら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＤＮＡ ａｄｅｎｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ」Ｓｃｉ Ａｄｖ，２０１９，５：ｅａａｘ５７１７）。
[176]疾患を惹起する変異の、標準的なＣａｓ９ゲノム編集による精密編集を介する補
正は、主としてＨＤＲを必要としてきた。ＨＤＲは有糸分裂のＳ期またはＧ２期の細胞に限られるので、非有糸分裂細胞の精密編集は困難である。しかし、塩基エディターはＨＤＲに依拠しない。マウスにおける有糸分裂後の蝸牛細胞の編集は、シトシン塩基エディターＢＥ３を用いて実行可能である。予めアセンブルしたリボヌクレオプロテインの形態のＢＥ３およびｇＲＮＡを、カチオン性リポソームを介して注射することによって、ベータカテニンのセリン－３３がフェニルアラニンに編集（ＴＣＴコドンをＴＴＴに編集）され、支持細胞の有毛細胞への分化転換を可能にした。蝸牛組織の塩基編集はシーケンシングを介して確認され、蝸牛の領域に応じて０．７％～３．０％の編集率を示した。対照的に
、ＨＤＲを介する標準的なＣａｓ９編集は、蝸牛細胞において無視できる程度の有効性の兆候を示した。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介して肝臓に送達されたＳａＢＥ３のバリアントは、Ｐａｈ遺伝子における病因性のＴからＣへの変異を２９％という高い編集率で直接補正し、それにより、成体マウスの疾患であるフェニルケトン尿症を治療することが報告された。アデニン塩基編集もマウスで変異を生成することが実証されている。それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｙｅｈ ＷＨ，Ｃｈｉａｎｇ Ｈ，Ｒｅｅｓ ＨＡら、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｐｏｓｔ－ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｅｎｓｏｒｙ ｃｅｌｌｓ」Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１８，９：２１８４頁；Ｖｉｌｌｉｇｅｒ Ｌ，Ｇｒｉｓｃｈ－Ｃｈａｎ ＨＭ，Ｌｉｎｄｓａｙ Ｈら、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ
ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ」Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１８，２４：１５１９～２５頁；Ｒｙｕ
ＳＭ，Ｋｏｏ Ｔ，Ｋｉｍ Ｋら、「Ａｄｅｎｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ａｎ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ
ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１８，３６：５３６～９頁；Ｓｏｎｇ ＣＱ，Ｊｉａｎｇ Ｔ，Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｍら、「Ａｄｅｎｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ａｎ ａｄｕｌｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎａｅｍｉａ」Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ，２０２０，４：１２５～３０頁；Ｐｉｓｃｉｏｔｔａ Ｌ，Ｆａｖａｒｉ Ｅ，Ｍａｇｎｏｌｏ Ｌら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄｒｅｄｓ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｈｙｐｏｌｉｐｉｄｅｍｉａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＡＮＧＰＴＬ３」Ｃｉｒｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｇｅｎｅｔ，２０１２，５：４２～５０頁。
[177]標的ヌクレオチド配列中の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ）を改変
しまたは変換させることができる核酸塩基エディタータンパク質、複合体、または化合物を含む核酸塩基エディターシステムの組成物が、本明細書で提供される。
[178]核酸塩基エディターまたは塩基エディター（ＢＥ）は、核酸配列（例えばＤＮＡ
またはＲＮＡ）中の塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ）を改変させることができるポリペプチドを含む薬剤を意味する。一部の実施形態では、塩基エディターは、核酸中の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ分子中の塩基を脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ中のアデニン（Ａ）を脱アミノ化することができる。
[179]一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合したプ
ログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、Ｃａｓ９タンパク質およびアデノシンデアミナーゼを含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合したＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、Ｃａｓ９タンパク質およびシチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼに融合したヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。一部の実施形態では、塩基エディターは、塩基除去修復の阻害剤、例えばＵＧＩドメインをさらに含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼおよび塩基除去修復の阻害剤、
例えばＵＧＩまたはｄＩＳＮドメインに融合したＣａｓ９ニッカーゼを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質のｄＣａｓ９ドメインは、野生型ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列で番号付けしてＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａの変異を含む。一部の実施形態では、ＵＧＩは以下のアミノ酸配列を含む：
[180]＞ｓｐｌＰ１４７３９ＩＵＮＧＩ＿ＢＰＰＢ２ ウラシル－ＤＮＡ グリコシラ
ーゼ阻害剤
ＭＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴ Ｓ Ｄ ＡＰＥ ＹＫＰＷ ＡＬＶＩＱＤＳ
ＮＧＥＮＫＩＫＭＬ（配列番号１６）
[181]一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムは、塩基エ
ディター融合タンパク質を含む。例えば、塩基エディター融合タンパク質は、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質およびデアミナーゼ、例えばアデノシンデアミナーゼを含み得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは塩基エディターである。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９ドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、ＣａｓＸドメイン、ＣａｓＹドメイン、Ｃａｓ１２ｂドメイン、Ｃ２ｃ２ドメイン、Ｃ２ｃ３ドメイン、またはＡｒｇｏｎａｕｔｅドメインである。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９ドメインである。Ｃａｓ９ドメインは、本明細書で提供されるＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えばヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９もしくはＣａｓ９ニッカーゼ、または任意の種由来のＣａｓ９バリアント）のいずれでもよい。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９タンパク質のいずれも、本明細書で提供されるデアミナーゼのいずれかに融合され得る。一部の実施形態では、塩基エディターは、リンカーを介して接合されたデアミナーゼ、例えばアデノシンデアミナーゼと、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えばＣａｓ９ドメインを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、リンカーを介して接合されたデアミナーゼ、例えばアデノシンデアミナーゼと、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えばＣａｓ９ドメインを含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。一部の実施形態では、リンカーはデアミナーゼドメインとＣａｓ９ドメインとの間に存在する。一部の実施形態では、デアミナーゼとプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、本明細書で提供されるペプチドリンカーのいずれかを介して融合される。例えば、アデノシンデアミナーゼとＣａｓ９ドメインは、１～２００個のアミノ酸を含むリンカーを介して融合され得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼとプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、長さ１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～８０、１～１００、１～１５０、１～２００、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～６０、５～８０、５～１００、５～１５０、５～２００、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～８０、１０～１００、１０～１５０、１０～２００、２０～３０、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～８０、２０～１００、２０～１５０、２０～２００、３０～４０、３０～５０、３０～６０、３０～８０、３０～１００、３０～１５０、３０～２００、４０～５０、４０～６０、４０～８０、４０～１００、４０～１５０、４０～２００、５０～６０、５０～８０、５０～１００、５０～１５０、５０～２００、６０～８０、６０～１００、６０～１５０、６０～２００、８０～１００、８０～１５０、８０～２００、１００～１５０、１００～２００、または１５０～２００のアミノ酸を含むリンカーを介して融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼとプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、長さ４、１６、３２、または１０４のアミノ酸を含むリンカーを介して融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼとプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１７）、ＳＧＧＳ（配列番号１８）、ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号１９）、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２０）、またはＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧ
ＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥ ＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１）のアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼとプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１７）を含むリンカーを介して融合され、これはＸＴＥＮリンカーとも称され得る。一部の実施形態では、リンカーは長さ２４のアミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーはアミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２３）を含む。一部の実施形態では、リンカーは長さ４０のアミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーはアミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２４）を含む。一部の実施形態では、リンカーは長さ６４のアミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーはアミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２５）を含む。一部の実施形態では、リンカーは長さ９２のアミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーはアミノ酸配列ＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ ＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳ（配列番号２６）を含む。
[182]一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムは、塩基修
復の阻害剤を含む融合タンパク質を含む塩基エディターを含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼおよびプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン、例えばＣａｓ９ドメインを含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターは、アデノシンデアミナーゼおよびプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン、例えばＣａｓ９ドメインを含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターまたは融合タンパク質は、塩基修復の阻害剤（ＩＢＲ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＩＢＲはイノシン塩基修復の阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＩＢＲはイノシン塩基除去修復の阻害剤である。一部の実施形態では、イノシン塩基除去修復の阻害剤は、触媒不活性のイノシン特異的ヌクレアーゼ（ｄＩＳＮ）である。一部の実施形態では、ｄＩＳＮは、イノシン除去酵素がＤＮＡからイノシン残基を切除することを（例えば立体障害によって）阻害し得る。例えば、触媒不活性のイノシングリコシラーゼ（例えばアルキルアデニングリコシラーゼ［ＡＡＧ］）はイノシンに結合するが、非塩基性部位を創成したりイノシンを除去することはなく、それにより、新たに形成されたイノシン部分を潜在的なＤＮＡ損傷および／または修復の機構から立体的にブロックする。即ち、本開示は、ｄＩＳＮにさらに融合したプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質およびアデノシンデアミナーゼを含む融合タンパク質を意図する。本開示は、任意のＣａｓ９ドメイン、例えばＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメイン、触媒不活性のＣａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメイン、高忠実度Ｃａｓ９ドメイン、またはＰＡＭ排他性が低減したＣａｓ９ドメインを含む融合タンパク質を意図する。ｄＩＳＮの使用により、ＡからＩへの変化を触媒することができるアデノシンデアミナーゼの編集効率が増大し得ることを理解されたい。例えば、ｄＩＳＮドメインを含む融合タンパク質は、Ａ残基の脱アミノ化において効率的であり得る。
[183]一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターは、１つまたは複数
の核標的配列、例えば核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は多数のＮＬＳを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端およびＣ末端にＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳを含むタンパク質の細胞核への輸入を容易にするアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質のＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質のＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳはプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えばＣａｓ９のＮ末端に融合される。一部の実施
形態ではＮＬＳは、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質のＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳはアデノシンデアミナーゼのＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳはアデノシンデアミナーゼのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは１つまたは複数のリンカーを介して融合タンパク質に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳはリンカーなしに融合タンパク質に融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、本明細書で提供または参照されるＮＬＳ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳはアミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２７）またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号２８）を含む。さらなる核局在化配列は当技術で既知であり、当業者には明らかであろう。例えば、ＮＬＳ配列はＰｌａｎｋら、ＰＣＴ／ＥＰ２０００／０１１６９０に記載されており、その内容は、例示的な核局在化配列の開示について参照により本明細書に組み込まれる。
[184]一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質はリンカーを含まな
い。一部の実施形態では、リンカーはドメインまたはタンパク質（例えばアデノシンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、ＮＬＳ、および／またはＩＢＲ）の１つまたは複数の間に存在する。一部の実施形態では、上記の一般的な構築において使用する「－」は、必要に応じたリンカーの存在を示す。
[185]本開示の一部の態様は、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質および少なくと
も２つのアデノシンデアミナーゼドメインを含む塩基エディターまたは融合タンパク質を提供する。何ら特定の理論に縛られることは望まないが、アデノシンデアミナーゼの二量化（例えばシスまたはトランスでの）によって、核酸塩基を改変する、例えばアデニンを脱アミノ化する融合タンパク質の能力（例えば効率）を改善することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質のいずれかは、２つ、３つ、４つ、または５つのアデノシンデアミナーゼドメインを含み得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、２つのアデノシンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかは、２つだけのアデノシンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは同一である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは異なっている。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼは本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであり、第２のアデノシンデアミナーゼは本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであるが、第１のアデノシンデアミナーゼと同一ではない。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１で番号付けした本明細書で提供される変異のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、第２のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１で番号付けした本明細書で提供される変異のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１で番号付けした本明細書で提供される変異のいずれか１つを含み、第２のアデノシンデアミナーゼは、野生型アデノシンデアミナーゼ配列を含む。一部の実施形態では、第２のアデノシンデアミナーゼは配列番号１で番号付けした本明細書で提供される変異のいずれか１つを含み、第１のアデノシンデアミナーゼは野生型アデノシンデアミナーゼ配列を含む。１つの例として、融合タンパク質は、いずれもｅｃＴａｄＡ（配列番号１）由来のＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異を含む第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼを含み得る。別の例として、融合タンパク質は、ｅｃＴａｄＡ（配列番号１）由来のＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７Ｙ、およびＥ１５５Ｖ変異を含む第１のアデノシンデアミナーゼドメイン、およびｅｃＴａｄＡ（配列番号１）由来のＬ８４Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５Ｖ、およびＩ１５６Ｆ変異を含む第２のアデノシンデアミナーゼを含み得る。
[186]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アミノ酸配列：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤ（配列番号１）を含む。
[187]一部の実施形態では、融合タンパク質は、２つのアデノシンデアミナーゼ（例え
ば第１のアデノシンデアミナーゼおよび第２のアデノシンデアミナーゼ）を含む。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼは、融合タンパク質中の第２のアデノシンデアミナーゼに対してＮ末端である。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼは、融合タンパク質中の第２のアデノシンデアミナーゼに対してＣ末端である。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼと第２のアデノシンデアミナーゼは直接またはリンカーを介して融合される。一部の実施形態では、リンカーは本明細書で提供されるリンカーのいずれか、例えば「リンカー」の節に記載するリンカーのいずれかである。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼは第２のアデノシンデアミナーゼと同一である。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼと第２のアデノシンデアミナーゼは本明細書に記載したアデノシンデアミナーゼのいずれかである。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼと第２のアデノシンデアミナーゼは異なっている。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼは本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかである。一部の実施形態では、第２のアデノシンデアミナーゼは本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであるが、第１のアデノシンデアミナーゼと同一ではない。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼはｅｃＴａｄＡアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、第１のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１で説明されるアミノ酸配列または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１で説明されるアミノ酸配列または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第２のアデノシンデアミナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
[188]一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質はリンカーを含まな
い。一部の実施形態では、リンカーはドメインまたはタンパク質（例えば第１のアデノシンデアミナーゼ、第２のアデノシンデアミナーゼ、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、および／またはＮＬＳ）の１つまたは複数の間に存在する。
[189]本開示の融合タンパク質は、１つまたは複数のさらなる特徴を含み得ることを認
識されたい。例えば一部の実施形態では、融合タンパク質は、細胞質局在化配列、核輸出配列等の輸出配列、またはその他の局在化配列、ならびに融合タンパク質の可溶化、精製、または検出に有用な配列タグを含み得る。本明細書で提供される好適なタンパク質タグは、それだけに限らないが、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも称されるポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、ソフタグ（例えば
ソフタグ１、ソフタグ３）、ストレップタグ、ビオチンリガーセタグ、ＦｌＡｓＨタグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグを含む。さらなる好適な配列は、当業者には明らかであろう。一部の実施形態では、融合タンパク質は１つまたは複数のＨｉｓタグを含む。
[190]一部の実施形態では、融合タンパク質は、表２３に列挙したアミノ酸配列のいず
れか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、表２３に列挙したアミノ酸配列のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質の配列は、表２３に列挙したアミノ酸配列のいずれか１つである。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２１３７、２１４９、２１５４、２１５８、２１８８、２１４０、４０、２１４６、２１５２、２１５６、および２１６０のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２１３７、２１４９、２１５４、２１５８、２１８８、２１４０、４０、２１４６、２１５２、２１５６、および２１６０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質の配列は、配列番号２１３７、２１４９、２１５４、２１５８、および２１８８のアミノ酸配列のいずれか１つである。
[191]一部の実施形態では、融合タンパク質は、表２３に列挙したポリヌクレオチド配
列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、表２３に列挙したポリヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、表２３に列挙したポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によって発現される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、表２３に列挙したポリヌクレオチド配列のいずれか１つによって発現される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７，および２１９０のポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７、および２１９０のポ
リヌクレオチド配列のいずれか１つを含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、および２１８９のポリヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７、２１９０、２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列、またはそれらの組合せによって、発現される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７、２１９０、２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つを含むポリヌクレオチド配列、またはそれらの組合せによってコードされる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、および２１８９のポリヌクレオチド配列のいずれか１つによって発現される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列、またはそれらの組合せをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つ、またはそれらの組合せをさらに含む。
[192]一部の実施形態では、核酸塩基エディターＡＢＥ８．８は、以下に提供する配列
：
ＭＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＶＲＮＡＫＴＧＡＡＧＳＬＭＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＲＦＦＲＭＰＲＲＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＴＤＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶ
ＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ（配列番号３）を含む融合タンパク質を含む。
[193]一部の実施形態では、核酸塩基エディターは、以下に提供するポリヌクレオチド
（本明細書でＭＡ００２とも称する）配列：
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[194]一態様では、本明細書で提供される核酸塩基エディターシステムはガイドポリヌ
クレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは塩基エディター融合
タンパク質と結合して複合体を形成する。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、標的配列において改変をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令する。ガイドポリヌクレオチドは、単一の核酸配列または分離された２つの核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは単一のガイド、例えば単一ガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズすることができるスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えば塩基エディター融合タンパク質のＣａｓ９タンパク質に結合するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、ステムループ構造、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、ｃｒＲＮＡ配列、直接リピート、および／またはアンチリピートを含む。一部の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、化学的改変を含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、「ガイドポリヌクレオチド」の節に記載するように、本明細書で提供されるガイドポリヌクレオチドのいずれか１つである。
デアミナーゼドメイン
[195]ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を編集、改変または変更するための塩
基エディターシステムが、本明細書において開示される。
[196]本明細書で提供される塩基エディターシステムは、プログラム可能なＤＮＡ結合
タンパク質およびデアミナーゼを含み得る。本明細書で使用される場合、デアミナーゼは、分子からのアミン基の除去または例えば、加水分解による脱アミノ化を触媒する酵素を意味し得る。一部の実施形態では、デアミナーゼは、それぞれ、シチジン（Ｃ）のウリジン（Ｕ）への、デオキシシチジン（ｄＣ）のデオキシウリジン（ｄＵ）への、または５－メチル－シチジンのチミジン（Ｔ、５－メチル－Ｕ）への脱アミノ化を触媒するシチジンデアミナーゼである。参照により全体として本明細書に組み込まれるＫｏｍｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ、５３３、４２０～４２４頁（２０１６）に記載されるように、その後のＤＮＡ修復機構によって、ｄＵはＴによって置き換えられることが確実になる。一部の実施形態では、デアミナーゼは、シトシンのウラシル（例えば、ＲＮＡにおいて）またはチミン（例えば、ＤＮＡにおいて）への変換を触媒および促進するシトシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、アデニンのグアニンへの変換を触媒および促進するアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、生物、例えば、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラットまたはマウスに由来する天然に存在するデアミナーゼである。一部の実施形態では、デアミナーゼは、生物に由来する天然に存在するデアミナーゼのバリアントであり、バリアントは、天然に生じない。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物に由来する天然に存在するデアミナーゼと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％ 少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一である。
[197]シチジンデアミナーゼ（またはシトシンデアミナーゼ）は、化学反応「シトシン
＋Ｈ２０－＞ウラシル＋ＮＨ３」または「５－メチル－シトシン＋Ｈ２０－＞チミン＋ＮＨ３」を触媒する酵素を含む。遺伝子との関連では、このようなヌクレオチド変化または変異は、順に、タンパク質におけるアミノ酸変化につながる場合があり、これは、タンパク質の機能、例えば、機能喪失または機能獲得に影響を及ぼす場合がある。Ｋｏｍｏｒら（参照により全体として本明細書に組み込まれるＮａｔｕｒｅ、Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮ
Ａ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ、５３３、４２０～４２４頁（２０１６））に記載されるように、その後のＤＮＡ修復機構によって、ＤＮＡ中のウラシル塩基がＴによって置き換えられることが確実となる。
[198]シトシンデアミナーゼの１つの例示的な適したクラスは、制御されたおよび有益
な方法で突然変異誘発を開始するのに役立つ１１種のタンパク質を包含するシトシンデアミナーゼのアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーである。アポリポタンパク質Ｂ編集複合体３（ＡＰＯＢＥＣ３）酵素は、逆転写されたウイルスのｓｓＤＮＡ中のシトシンの脱アミノ化を介してある特定のＨＩＶ－１株からのヒト細胞に保護を提供する。これらのシトシンデアミナーゼは全て、触媒活性のためにＺｎ配位モチーフ（Ｈｉｓ－Ｘ－Ｇｌｕ－Ｘ２３＿２６－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ｘ２＿４－Ｃｙｓ（配列番号２９））および結合された水分子を必要とする。グルタミン酸残基は、脱アミノ化反応における求核攻撃のために水分子を水酸化亜鉛に活性化するように作用する。各ファミリーメンバーは、その自身の特定の「ホットスポット」、例えば、ｈＡＩＤのＷＲＣ（ＷはＡまたはＴであり、ＲはＡまたはＧである）またはｈＡＰＯＢＥＣ３ＦのＴＴＣで優先的に脱アミノ化する。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの触媒ドメインの最近の結晶構造は、６つのα－ヘリックスが隣接した５本鎖β－シートコアを含む二次構造を示し、これは、全ファミリーにわたって保存されていると考えられている。活性中心ループは、ｓｓＤＮＡ結合および「ホットスポット」同一性の決定の両方に関与することが示されている。これらの酵素の過剰発現は、ゲノム不安定性およびがんと関連付けられており、したがって、配列特異的標的化の重要性が強調される。別の適したシトシンデアミナーゼとして、活性誘起シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）があり、これは、ｓｓＤＮＡ中のシトシンをウラシルに転写依存的に、鎖バイアス様式で変換することによる抗体の成熟に関与している。
[199]アデノシンデアミナーゼ（またはアデニンデアミナーゼ）は、それぞれ、アデノ
シンまたはデオキシアデノシンのイノシンまたはデオキシイノシンへの加水分解性脱アミノ化を触媒する酵素を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のアデニンまたはアデノシンの加水分解性脱アミノ化を触媒する。本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、操作されたアデノシンデアミナーゼ、進化したアデノシンデアミナーゼ）は、任意の生物、例えば、細菌に由来する場合がある。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物に由来する天然に存在するデアミナーゼのバリアントである。一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然には生じない。例えば、一部の実施形態では、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、天然に存在するデアミナーゼと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、細菌、例えば、大腸菌、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．プトレファシエンス（ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）またはＣ．クレセンタス（ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）に由来する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡデアミナーゼである。一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは、大腸菌ＴａｄＡデアミナーゼである。一部の実施形態では、ＴａｄＡデアミナーゼは末端切断型大腸菌ＴａｄＡデアミナーゼである。例えば、末端切断型ｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡと比較して１個または複数のＮ末端アミノ酸を失っている場合がある。一部の実施形態では、末端切断型ｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、６、１７、１８、１９または２０個のＮ末端アミノ酸残基を失っている場合がある。一部の実施形態では、末端切断型ｅｃＴａｄＡは、全長ｅｃＴａｄＡと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５
、６、１７、１８、１９または２０個のＣ末端アミノ酸残基を失っている場合がある。一部の実施形態では、ｅｃＴａｄＡデアミナーゼは、Ｎ末端メチオニンを含まない。
[200]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１で説明されるアミ
ノ酸配列と、または本明細書で提供するアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書で提供するアデノシンデアミナーゼは１つまたは複数の変異（例えば本明細書で提供する変異のいずれか）を含んでもよいことを認識されたい。本開示は、いくらかの同一性パーセントおよび本明細書に記載した変異のいずれかまたはその組合せを有する任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１で説明されるアミノ酸配列または本明細書で提供するアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１で説明されるアミノ酸配列のいずれか１つまたは本明細書で提供するアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０の同一の隣接するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
[201]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中に
Ｄ１０８Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中にＤ１０８Ｇ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１０８Ｖ、Ｄ１０８ＡもしくはＤ１０８Ｙ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含む。しかし、追加のデアミナーゼを同様に整列し、本明細書で提供されるように変異させることができる相同アミノ酸残基を同定することができることを認識されたい。
[202]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中に
Ａ１０６Ｘ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中にＡ１０６Ｖ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含む。
[203]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中にＥ１５５Ｘ変
異を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中にＥ１５５Ｄ、Ｅ１５５ＧもしくはＥ１５５Ｖ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含む。
[204]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中にＤ１４７Ｘ変
異を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施
形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中にＤ１４７Ｙ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含む。
[205]本明細書で提供される変異のいずれも（例えば、配列番号１のｅｃＴａｄＡアミ
ノ酸配列に基づいて）、他のアデノシンデアミナーゼ、例えば、黄色ブドウ球菌ＴａｄＡ（ｓａＴａｄＡ）または他のアデノシンデアミナーゼ（例えば、細菌アデノシンデアミナーゼ）中に導入できることを認識されたい。ｅｃＴａｄＡ中の変異した残基と相同である方法は当業者には明らかであろう。したがって、ｅｃＴａｄＡにおいて同定される変異のいずれも、相同アミノ酸残基を有する他のアデノシンデアミナーゼにおいて行うことができる。本明細書で提供される変異のいずれも、ｅｃＴａｄＡまたは別のアデノシンデアミナーゼにおいて個々に、または任意の組合せで行うことができることも認識されたい。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中にＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ１５５Ｖおよび／またはＤ１４７Ｙ変異を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含有し得る。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中に以下の変異の群（変異の群は、「；」によってわけられる）を、または別のアデノシンデアミナーゼ中に対応する変異を含む：Ｄ１０８ＮおよびＡ１０６Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＥ１５５Ｖ；Ｄ１０８ＮおよびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６ＶおよびＥ１５５Ｖ；Ａ１０６ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｅ１５５ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６ＶおよびＥ５５Ｖ；Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０６ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ｄ１０８Ｎ、Ｅ５５ＶおよびＤ１４７Ｙ；Ａ１０６Ｖ、Ｅ５５ＶおよびＤ１４７Ｙ；ならびにＤ１０８Ｎ、Ａ１０６Ｖ、Ｅ５５ＶおよびＤ１４７Ｙ。しかし、本明細書で提供される対応する変異の任意の組合せを、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ｅｃＴａｄＡ）において行うことができることを認識されたい。
[206]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｘ、Ｔ１
７Ｘ、Ｌ１８Ｘ、Ｗ２３Ｘ、Ｌ３４Ｘ、Ｗ４５Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ａ５６Ｘ、Ｅ５９Ｘ、Ｅ８５Ｘ、Ｍ９４Ｘ、Ｉ９５Ｘ、Ｖ１０２Ｘ、Ｆ１０４Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｋ１１０Ｘ、Ｍ１１８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ａ１３８Ｘ、Ｆ１４９Ｘ、Ｍ１５１Ｘ、Ｒ１５３Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｉ１５６Ｘおよび／もしくはＫ１５７Ｘ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｔ１７Ｓ、Ｌ１８Ｅ、Ｗ２３Ｌ、Ｌ３４Ｓ、Ｗ４５Ｌ、Ｒ５１Ｈ、Ａ５６ＥもしくはＡ５６Ｓ、Ｅ５９Ｇ、Ｅ８５ＫもしくはＥ８５Ｇ、Ｍ９４Ｌ、１９５１、Ｖ１０２Ａ、Ｆ１０４Ｌ、Ａ１０６Ｖ、Ｒ１０７ＣもしくはＲ１０７ＨもしくはＲ１０７Ｐ、Ｄ１０８ＧもしくはＤ１０８ＮもしくはＤ１０８ＶもしくはＤ１０８ＡもしくはＤ１０８Ｙ、Ｋ１１０ｌ、Ｍ１１８Ｋ、Ｎ１２７Ｓ、Ａ１３８Ｖ、Ｆ１４９Ｙ、Ｍ１５１Ｖ、Ｒ１５３Ｃ、Ｑ１５４Ｌ、Ｉ１５６Ｄおよび／もしくはＫ１５７Ｒ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する表２３において示される任意の構築物中の変異（単数または複数）または、別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘおよび／もしくはＮ１２７Ｘ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含み、Ｘは、任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎおよび／もしくはＮ１２７Ｓ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む。
[207]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｘ、Ｒ２
６Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｋ１６１Ｘ、Ｑ１６３Ｘおよび／もしくはＴ１６６Ｘ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｒ２６Ｗ、Ｍ６１Ｉ、Ｌ６８Ｑ、Ｍ７０Ｖ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２Ｃ、Ｑ１５４ＨもしくはＱ１５４Ｒ、Ｅ１５５ＧもしくはＥ１５５ＶもしくはＥ１５５Ｄ、Ｋ１６１Ｑ、Ｑ１６３Ｈおよび／もしくはＴ１６６Ｐ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む。
[208]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｘ、Ｄ１
０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｒ１５２ＸおよびＱ１５４Ｘまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｘ、Ｍ６１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｅ１５５ＸおよびＱ１６３Ｘまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｅ１５５ＸおよびＴ１６６Ｘまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｈ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｌ６８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｄ１４７ＸおよびＥ１５５Ｘまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ａ１０９Ｘ、Ｎ１２７ＸおよびＥ１５５Ｘまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。
[209]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｄ１
０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７Ｙ、Ｒ１５２ＣおよびＱ１５４Ｈまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｍ６１Ｉ、Ｍ７０Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｑ１５４Ｒ、Ｅ１５５ＧおよびＱ１６３Ｈまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つ変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５ＶおよびＴ１６６Ｐまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ
、３つ、４つまたは５つの変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｅ１５５ＤおよびＫ１６１Ｑまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｒ１２６Ｗ、Ｌ６８Ｑ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つの変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ａ１０９Ｔ、Ｎ１２７ＳおよびＥ１５５Ｇまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含む。
[210]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＤ１０８Ｎ、
Ｄ１０８ＧもしくはＤ１０８Ｖ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＡ１０６ＶおよびＤ１０８Ｎ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＲ１０７ＣおよびＤ１０８Ｎまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７ＹおよびＱ１５４Ｈ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｒ２４Ｗ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７Ｓ、Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＤ１０８Ｎ、Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ｄ１０８ＮおよびＳ１２７Ｓ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＡ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[211]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＳ２Ｘ、Ｈ８
Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｌ８４Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｎ１２７Ｘ、Ｉ１５６Ｘおよび／もしくはＫ１６０Ｘ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＳ２Ａ、Ｈ８Ｙ、Ｉ４９Ｆ、Ｌ８４Ｆ、Ｈ１２３Ｙ、Ｎ１２７Ｓ、Ｉ１５６Ｆおよび／もしくはＫ１６０Ｓのうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中の変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応するクローンのいずれか１つの変異（単数または複数）または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）を含む。
[212]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、Ｌ８４Ｘ変異アデノシンデア
ミナーゼを含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＬ８４Ｆ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[213]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｈ１２３Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生
型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ１２３Ｙ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[214]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｉ１５７Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＩ１５７Ｆ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[215]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＬ８４Ｘ、Ａ
１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｈ１２３Ｘ、Ｄ１４７Ｘ、Ｅ１５５ＸおよびＩ１５６Ｘまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つの変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＳ２Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｄ１４７ＸおよびＥ１５５Ｘまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｘ、Ａ１０６Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｎ１２７ＸおよびＫ１６０Ｘまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。
[216]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＬ８４Ｆ、Ａ
１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｈ１２３Ｙ、Ｄ１４７Ｙ、Ｅ１５５ＶおよびＩ１５６Ｆまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つの変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＳ２Ａ、Ｉ４９Ｆ、Ａ１０６Ｖ、Ｄ１０８Ｎ、Ｄ１４７ＹおよびＥ１５５Ｖまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ８Ｙ、Ａ１０６Ｔ、Ｄ１０８Ｎ、Ｎ１２７ＳおよびＫ１６０Ｓまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異（単数または複数）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＥ２５Ｘ、Ｒ２６Ｘ、Ｒ１０７Ｘ、Ａ１４２Ｘおよび／もしくはＡ１４３Ｘ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５Ｓ、Ｅ２５Ｙ、Ｒ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６Ｌ、Ｒ２６Ｋ、Ｒ１０７Ｐ、Ｒ０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７Ｈ、Ｒ１０７Ｓ、Ａ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ、Ａ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑおよび／もしくはＡ１４３Ｒ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する表２３において提供される変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１に対応する表２３において示されるいずれか１つの変異（単数または複数）または別のアデノシンデアミナーゼ
中の対応する変異（単数または複数）を含む。
[217]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｅ２５Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＥ２５Ｍ、Ｅ２５Ｄ、Ｅ２５Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｅ２５Ｖ、Ｅ２５ＳもしくはＥ２５Ｙ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[218]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｒ２６Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＲ２６Ｇ、Ｒ２６Ｎ、Ｒ２６Ｑ、Ｒ２６Ｃ、Ｒ２６ＬもしくはＲ２６Ｋ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[219]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｒ１０７Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＲ１０７Ｐ、Ｒ０７Ｋ、Ｒ１０７Ａ、Ｒ１０７Ｎ、Ｒ１０７Ｗ、Ｒ１０７ＨまたはＲ１０７Ｓ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[220]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ａ１４２Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＡ１４２Ｎ、Ａ１４２Ｄ、Ａ１４２Ｇ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[221]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ａ１４３Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＡ１４３Ｄ、Ａ１４３Ｇ、Ａ１４３Ｅ、Ａ１４３Ｌ、Ａ１４３Ｗ、Ａ１４３Ｍ、Ａ１４３Ｓ、Ａ１４３Ｑおよび／もしくはＡ１４３Ｒ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[222]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ３６Ｘ、Ｎ
３７Ｘ、Ｐ４８Ｘ、Ｉ４９Ｘ、Ｒ５１Ｘ、Ｍ７０Ｘ、Ｎ７２Ｘ、Ｄ７７Ｘ、Ｅ１３４Ｘ、Ｓ １４６Ｘ、Ｑ１５４Ｘ、Ｋ１５７Ｘおよび／もしくはＫ１６１Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含み、Ｘの存在は、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ３６Ｌ、Ｎ３７Ｔ、Ｎ３７Ｓ、Ｐ４８Ｔ、Ｐ４８Ｌ、Ｉ４９Ｖ、Ｒ５１Ｈ、Ｒ５１Ｌ、Ｍ７０Ｌ、Ｎ７２Ｓ、Ｄ７７Ｇ、Ｅ１３４Ｇ、Ｓ １４６Ｒ、Ｓ １４６Ｃ、Ｑ１５４Ｈ、Ｋ１５７Ｎおよび／もしくはＫ１６１Ｔ変異のうち１つもしくは複数または別のアデノシンデアミナーゼ中の１つもしくは複数の対応する変異を含む。
[223]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｈ３６Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施
形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＨ３６Ｌ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中のＮ３７Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＮ３７ＴもしくはＮ３７Ｓ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[224]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｐ４８Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＰ４８ＴまたはＰ４８Ｌ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[225]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｒ５１Ｘ変異、または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＲ５１ＨもしくはＲ５１Ｌ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[226]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｓ１４６Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＳ １４６ＲもしくはＳ
１４６Ｃ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[227]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｋ１５７Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＫ１５７Ｎ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[228]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｐ４８Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＰ４８Ｓ、Ｐ４８ＴもしくはＰ４８Ａ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[229]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ａ１４２Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＡ１４２Ｎ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[230]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｗ２３Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＷ２３ＲもしくはＷ２３Ｌ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[231]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｅｃＴａｄＡ配列番号１中の
Ｒ１５２Ｘ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含み、Ｘは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号１中のＲ１５２ＰもしくはＲ５２Ｈ変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[232]追加のアデノシンデアミナーゼ変異およびバリアントは、参照により全体として
本明細書に組み込まれる特許出願ＷＯ２０１８１１９３５４に記載されている。
[233]本出願において有用な追加のアデノシンデアミナーゼは、当業者に明らかであり
、本開示の範囲内である。例えば、アデノシンデアミナーゼは、ＡＤ ＡＴの相同体であり得る。例示的なＡＤ ＡＴ相同体として、限定なく、以下が挙げられる：
[234]黄色ブドウ球菌ＴａｄＡ：
ＭＧＳＨＭＴＮＤＩＹＦＭＴＬＡＩＥＥＡＫＫＡＡＱＬＧＥＶＰＩＧＡＩＩＴＫＤＤＥＶＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＬＱＱＰＴＡＨ ＡＥＨＩＡＩＥＲＡＡＫＶＬＧＳＷＲＬＥＧＣＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＴＩＶＭＳＲＩＰＲＶＶＹＧＡＤＤＰＫＧＧＣＳ ＧＳ ＬＭＮＬＬＱＱＳ ＮＦＮＨＲＡＩＶＤＫＧ ＶＬＫＥ ＡＣ Ｓ ＴＬＬＴＴＦＦＫＮＬＲＡＮＫＫＳ ＴＮ（配列番号３０）
[235]枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴａｄＡ：
ＭＴＱＤＥＬＹＭＫＥＡＩＫＥＡＫＫＡＥＥＫＧＥＶＰＩＧＡＶＬＶＩＮＧＥＩＩＡＲＡＨＮＬＲＥＴＥＱＲＳＩＡＨＡＥＭＬ ＶＩＤＥ ＡＣ ＫＡＬＧＴ ＷＲＬＥＧ ＡＴＬＹ ＶＴＬＥＰＣＰＭＣ ＡＧ Ａ Ｖ ＶＬＳ Ｒ ＶＥＫ Ｖ ＶＦＧ ＡＦＤＰＫＧＧＣ Ｓ ＧＴＬＭＮ ＬＬＱＥＥＲＦＮＨＱ ＡＥ Ｖ ＶＳ Ｇ ＶＬＥＥＥＣ
ＧＧＭＬＳ ＡＦＦＲＥＬＲＫＫＫＫ Ａ ＡＲＫＮＬＳ Ｅ（配列番号３１）
[236]ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ） ＴａｄＡ：
ＭＰＰＡＦＩＴＧＶＴＳＬＳＤＶＥＬＤＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＷＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＨＮＨＲＶＩＧＥＧ ＷＮＲＰＩＧＲＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＬＱＮＹＲＬＬＤＴＴＬＹＶＴＬＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＧ ＲＶＶＦＧＡＲＤＡＫＴＧＡＡＧＳＬＩＤＶＬＨＨＰＧＭＮＨＲＶＥＩＩＥＧＶＬＲＤＥＣＡＴＬＬＳＤＦＦＲＭＲＲＱＥＩＫ ＡＬＫＫＡＤＲＡＥＧＡＧＰＡＶ（配列番号３２）
[237]シュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｐｕｔｒｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）（Ｓ．プトレファシエンス）ＴａｄＡ：
ＭＤＥＹＷＭＱＶＡＭＱＭＡＥＫＡＥＡＡＧＥＶＰＶＧＡＶＬＶＫＤＧＱＱＩＡＴＧＹＮＬＳＩＳＱＨＤＰＴＡＨＡＥＩＬＣＬＲＳＡＧＫＫＬＥＮＹＲＬＬＤＡＴＬＹＩＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＭＶＨＳＲＩＡＲＶＶＹＧＡＲＤＥＫＴＧＡＡＧＴＶＶＮＬＬＱＨＰＡＦＮＨＱＶＥＶＴＳＧＶＬＡＥＡＣＳＡＱＬＳＲＦＦＫＲＲＲＤＥＫＫＡＬＫＬＡＱＲＡＱＱＧＩＥ（配列番号３３）
[238]インフルエンザ菌Ｆ３０３１（Ｈ．インフルエンザエ）ＴａｄＡ：
ＭＤＡＡＫＶＲＳＥＦＤＥＫＭＭＲＹＡＬＥＬＡＤＫＡＥＡＬＧＥＩＰＶＧＡＶＬＶＤＤＡＲＮＩＩＧＥＧＷＮＬＳＩＶＱＳＤＰＴΑΗＡＥＩＩＡＬＲＮＧＡＫＮＩＱＮＹＲＬＬＮＳＴＬＹＶＴＬＥＰＣＴＭＣＡＧＡＩＬＨＳＲＩＫＲＬＶＦＧＡＳＤＹＫＴＧＡＩＧＳＲＦＨＦＦＤＤＹＫＭＮＨＴＬＥＩＴＳＧＶＬＡＥＥＣＳＱＫＬＳＴＦＦＱＫＲＲＥＥＫＫＩＥＫＡＬＬＫＳＬＳＤＫ（配列番号３４）
[239]カウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕ
ｓ）（Ｃ．クレセンタス）ＴａｄＡ：
ＭＲＴＤＥＳＥＤＱＤＨＲＭＭＲＬＡＬＤＡＡＲＡＡＡＥＡＧＥＴＰＶＧＡＶＩＬＤＰＳＴＧＥＶＩＡＴＡＧＮＧＰＩＡＡＨＤＰＴＡＨＡＥＩＡＡＭＲＡＡＡＡＫＬＧＮＹＲＬＴＤＬＴＬＶＶＴＬＥＰＣＡＭＣＡＧＡＩＳＨＡＲＩＧＲＶＶＦＧＡＤＤＰＫＧＧＡＶＶＨＧＰＫＦＦＡＱＰＴＣＨＷＲＰＥＶＴＧＧＶＬＡＤＥＳＡＤＬＬＲＧＦＦＲＡＲＲＫＡＫＩ（配列番号３５）
[240]ジオバクター・スルフレデュセンス（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄ
ｕｃｅｎｓ）（Ｇ．スルフレデュセンス）ＴａｄＡ：
ＭＳＳＬＫＫＴＰＩＲＤＤＡＹＷＭＧＫＡＩＲＥＡＡＫＡＡＡＲＤＥＶＰＩＧＡＶＩＶＲＤＧＡＶＩＧＲＧＨＮＬＲＥＧＳＮＤＰＳＡＨＡＥＭＩＡＩＲＱＡＡＲＲＳＡＮＷＲＬＴＧＡＴＬＹＶＴＬＥＰＣＬＭＣＭＧＡＩＩＬＡＲＬＥＲＶＶＦＧＣＹＤＰＫＧＧＡＡＧＳＬＹＤＬＳＡＤＰＲＬＮＨＱＶＲＬＳＰＧＶＣＱＥＥＣＧＴＭＬＳＤＦＦＲＤＬＲＲＲＫＫＡＫＡＴＰＡＬＦ ＩＤＥＲＫＶＰＰＥＰ（配列番号３６）
[241]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、表２３に列記されるアミノ酸
配列のうちいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、表２３に列記されるアミノ酸配列のうちいずれか１つを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼの配列は、表２３に列記されるアミノ酸配列のうちいずれか１つである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号：配列番号２１３７、２１４９、２１５４、２１５８、２１８８、２１４０、４０、２１４６、２１５２、２１５６および２１６０のアミノ酸配列のうちいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号２１３７、２１４９、２１５４、２１５８、２１８８、２１４０、４０、２１４６、２１５２、２１５６および２１６０のアミノ酸配列のうちいずれか１つを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼの配列は、配列番号２１３７、２１４９、２１５４、２１５８および２１８８のアミノ酸配列のうちいずれか１つである。
[242]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、表２３に列挙したポリヌクレ
オチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、表２３に列挙したポリヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、表２３に列挙したポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によって発現される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、表２３に列挙したポリヌクレオチド配列のいずれか１つによって発現される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７、および２１９０のポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号２１９２、２１４８、
２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７、および２１９０のポリヌクレオチド配列のいずれか１つを含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、および２１８９のポリヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７、２１９０、２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列、またはそれらの組合せによって、発現される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７、２１９０、２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つを含むポリヌクレオチド配列、またはそれらの組合せによってコードされる。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、および２１８９のポリヌクレオチド配列のいずれか１つによって発現される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列、またはそれらの組合せをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つ、またはそれらの組合せをさらに含む。
プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質
[00243]ゲノム内の任意の所望のヌクレオチド配列中のＤＮＡ配列を標的とし、結合す
るようにプログラムされ得るプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質が、本明細書で提供される。ＤＮＡ結合タンパク質を所望のヌクレオチド配列に結合するようにプログラムするために、ＤＮＡ結合タンパク質を改変して、その結合特異性、例えば、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパク質または転写アクチベーター様エフェクタータンパク質（ＴＡＬＥ）を変更できる。ＺＦＮは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成された人工制限酵素である。亜鉛フィンガードメインを特定の所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、これによって、亜鉛フィンガーが複雑なゲノム内の特有の配列に結合することが可能となる。転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作され得る操作された制限酵素である。それらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｆｏｋｌ）に融合することによって作製される。転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実際に任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作さ
れ得る。ＺＦＮおよびＴＡＬＥをプログラムする方法は、当業者にはよく知られている。例えば、このような方法は、Ｍａｅｄｅｒら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ３１ （２）： ２９４～３０１頁、２００８； Ｃａｒｒｏｌｌら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ、１８８ （４）： ７７３～７８２頁、２０１１； Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５ （７）： ７７８～７８５頁、２００７； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６ （２）： ７５７～６１頁、２００８； Ｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９ （１）：
３５９～３７２頁、２０１０；およびＭｏｓｃｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６ （５９５９）： １５０１、２００９に記載されており、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
[00244]本明細書で提供される塩基エディターシステム中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ま
たはＣａｓタンパク質は、リボ核酸タンパク質複合体を含むクラス１またはクラス２系成分を含み得る。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼファミリーのタンパク質は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素であり、本明細書でさらに記載されるように適切なガイドＲＮＡを設計することによって、それらを所望の核酸標的を切断するように指示できる。クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系成分は、ＩＩ型、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、ＩＩＣ型、Ｖ型またはＶＩ型系に由来し得る。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃおよびＣａｓ１３ｄタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系由来のＣａｓ９タンパク質であるか、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する、例えば、Ｃａｓ１２ａタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する、すなわち、単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ１２ａタンパク質である。
[00245]Ｃａｓタンパク質の他の限定されない例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａ
ｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体またはそれらの改変バージョンを挙げることができる。
[00246]一部の実施形態では、ＤＮＡに結合可能であるガイドヌクレオチド配列－プロ
グラム可能なＤＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ誘導性プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質が、本明細書で提供され、その標的ＤＮＡ配列への結合が、ガイドヌクレオチド配列によって媒介される。したがって、ガイドヌクレオチド配列－プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、ガイドヌクレオチド配列に結合するということは認識される。ガイドヌクレオチドは、標的配列と相補的であり、ＤＮＡ結合タンパク質を標的配列へ導くことができる、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば、一本鎖ＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ分子）であり得る。そのようなものとして、ガイドヌクレオチド配列－プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＡ－プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）またはｓｓＤＮＡ－プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（例えば、アルゴノートタンパク質）であり得る。「プログラム可能な」とは、ＤＮＡ結合タンパク質を、ガイドヌクレオチドが標的とする任意のＤＮＡ配列に結合するようにプログラムできることを意味する。例示的なガイドヌクレオチド配列－プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は
、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、ｓａＣａｓ９（例えば、ｓａＣａｓ９ｄ、ｓａＣａｓ９ｄ、ｓａＫＫＨ Ｃａｓ９）ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、アルゴノートおよび本明細書で記載される任意の他の適したタンパク質、またはそれらのバリアントを含むがそれに限らない。
[00247]一部の実施形態では、ガイドヌクレオチド配列は、単一ヌクレオチド分子とし
て存在し、２つのドメイン：（１）標的核酸と相同性を共有する（例えば、ガイドヌクレオチド配列－プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の標的への結合を指示する）ドメインおよび（２）ガイドヌクレオチド配列－プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質に結合するドメインを含む。一部の実施形態では、ドメイン（１）は、スペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と称される。一部の実施形態では、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして知られる配列に対応し、ステム－ループ構造を含む。例えば、一部の実施形態では、ドメイン（２）は、参照により本明細書に組み込まれるＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１頁（２０１２）において提供されるようなｔｒａｃｒＲＮＡと同一または相同である。ｇＲＮＡ他の例（例えば、ドメイン２を含むもの）は、米国特許出願公開ＵＳ２０１６０２０８２８８および米国特許出願公開ＵＳ２０１６０２００７７９において見出すことができ、それらの各々は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
[00248]部位特異的切断のために（例えば、ゲノムを改変するために）ガイドヌクレオ
チド配列－プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えば、Ｃａｓ９を使用する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｃｏｎｇ，Ｌ．らＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９、８１９～８２３頁（２０１３）； Ｍａｌｉ，Ｐ．らＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９、８２３～８２６頁（２０１３）； Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ら Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１、２２７～２２９頁（２０１３）； Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ら ＲＮＡ－ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． ｅＬｉｆｅ ２、ｅ００４７１ （２０１３）； Ｄｉｃａｒｌｏ，Ｊ．Ｅ．ら Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ （２０１３）； Ｊｉａｎｇ， Ｗ．らＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
３１、２３３～２３９頁（２０１３年）を参照されたい、それらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。
[249]ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝因子（ウイルス、転位因子および接合性プラスミド）
からの保護を提供する適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行する可動因子と相補的である配列および標的侵入核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＤＮＡ（例えば、標的ＤＮＡ配列）に結合する非コーディングＲＮＡ分子（例えば、ガイドＲＮＡ）およびヌクレアーゼ機能性（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）を含む。例えば、Ｓａｎｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３２：３４７～３５５頁（２０１４）を参照されたい；例えば、Ｈｓｕら、Ｃｅｌｌ １５７（６）：１２６２～１２７８頁（２０１４）も参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ系の一般的な機構および最近の進歩は、Ｃｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３９（６１２１）： ８１９～８２３頁（２０１３）；Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１、８２２～８２６頁（２０１３）；Ｃｈｕら、Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３、５４３～５４８頁（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、６０、１～１３頁（２０１５）；Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１３、１～１５頁（２０１５）に論じられている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的ＤＮＡの部位特異的切断を導入できる。部位特異的切断の位置は、１）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と標的ＤＮＡ（プロトスペーサー）の間の塩基対合相補性および２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される標的ＤＮＡ中の短いモチーフの両方によって決定される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を使用して、例えば、標的遺伝子が破壊または変異されている操作された細胞を生成できる。Ｃａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ９）を使用して、ＤＮＡ切断を触媒できる。Ｃａｓ９タンパク質（例えば、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９または任意の密接に関連するＣａｓ９）は、ガイド配列（例えば、ｇＲＮＡ）の約２０ヌクレオチドとハイブリダイズし、標的配列の後ろにプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する標的部位配列での二本鎖切断をもたらす酵素作用を導き出すことができる。
[250]ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、リボ核酸タンパク質複合体を含む、クラス１または
クラス２系成分を含む。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼファミリーのタンパク質は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素であり、本明細書でさらに記載されるように適切なガイドＲＮＡを設計することによって、それらを所望の核酸標的を切断するように指示できる。クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系成分は、ＩＩ型、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、ＩＩＣ型、Ｖ型またはＶＩ型系に由来し得る。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃおよびＣａｓ１３ｄタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系由来のＣａｓ９タンパク質であるか、またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する、例えば、Ｃａｓ１２ａタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する、すなわち、単一タンパク質Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ１２ａタンパク質である。
[251]Ｃａｓタンパク質の他の限定されない例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ
２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９ＨｉＦｉ、それらの相同体またはそれらの改変バージョンを挙げることができる。
[00252]本明細書で提供される塩基エディターシステムは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９ヌ
クレアーゼを含み得る。Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９ヌクレアーゼとは、Ｃａｓ９タンパク質、その断片またはバリアントを含むＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはまた、ｃａｓｎｌヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（集積した規則的に空間を満たす短いパリンドロームリピート）関連ヌクレアーゼとも称されこともある。ＣＲＩＳＰＲは、可動遺伝因子（ウイルス、転位因子および接合性プラスミド）からの保護を提供する適応免疫系である。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、先行する可動因子と相補的である配列および標的侵入核酸を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写され、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へプロセシングされる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系では、プレ－ｃｒＲＮＡの正確なプロセシングには、トランスにコードされた低分子ＲＮＡ
（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）およびＣａｓ９タンパク質が必要である。ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレ－ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼ３によって補助されるプロセシングのガイドとして働く。その後、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーと相補的である線形または環状ｄｓＤＮＡ標的をエンドヌクレアーゼ的に切断する。ｃｒＲＮＡと相補的でない標的鎖がまずエンドヌクレアーゼ的に切断され、次いで、エキソヌクレアーゼ的に３’－５’にトリミングされる。本来、ＤＮＡ結合および切断は、通常、タンパク質および両ＲＮＡを必要とする。しかし、シングルガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単に「ｇＲＮＡ」）は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ両方の側面を単一のＲＮＡ種中に組み込むように操作できる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６～８２１頁（２０１２）を参照されたい。
[00253]「Ｃａｓ９」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片を含むＲＮＡ
誘導性ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９の活性、不活性もしくは部分的に活性のＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を指す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはまた、ＣａｓｎｌヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（集積した規則的に空間を満たす短いパリンドロームリピート）関連ヌクレアーゼとも称される。Ｃａｓ９は、野生型例示的Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９）に対して少なくともまたは少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指す場合がある。Ｃａｓ９は、野生型例示的Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、化膿性連鎖球菌由来の）に対して多くともまたは多くとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指す場合がある。Ｃａｓ９は、野生型または欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラもしくはそれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含み得るＣａｓ９タンパク質の改変型を指す場合がある。
[00254]バリアントＣａｓ９オルソログのＣａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は、種
々の種において記載されている。Ｃａｓ９タンパク質または他の成分が由来する可能性がある例示的な種は、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス属の種、黄色ブドウ球菌、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、ラクトバチルス・ガッセリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ステレラ・ワズワースエンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、ガンマ・プロテオバクテリウム（Ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ
ｊｅｊｕｎｉ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、フィブロバクター・スクシノゲン（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ）、ロドスピリラム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、ノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュードマイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・セレニティレデュセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エキシグオバクテリウム・シビ
リカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、デルブリュッキ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ブフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ミクロシラ・マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒ ｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒ ｏｍｏｎａｓ）の種、クロコスファエラ・ワトソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ）の種、ミクロキスティス・エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）の種、アセトハロビウム・アラバチカム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アモニフェクス・デジェンシー（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルディセルロシルプター・ベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンジダツス・デスルホルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓａ）、ペロトマクラム・サーモプロピオニウム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｕｍ）、アシドチオバシラス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマティウム・ビノサム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）の種、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワトソニー（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクテル・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナバエナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノデュラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）の種、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）の種、リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ）の種、ミクロコレウス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒ ｉａ）の種、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシホ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、ストレプトコッカス・パスツリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、パルビバキュラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）またはアカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）を含むがそれに限らない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する場合がある。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、黄色ブドウ球菌に由来する。
[00255]追加の適したＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者に
は明らかであり、このようなＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列には、参照により本明細書に組み込まれるＣｈｙｌｉｎｓｋｉら、（２０１３） ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５、７２６～７３７頁に開示される生物および遺伝子座に由来するＣａｓ９配列が含まれる。
[256]一部の実施形態では、野生型Ｃａｓ９は、化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９（ＮＣ
ＢＩ参照配列：ＮＣ＿００２７３７．２（以下の通りのヌクレオチド配列）およびＵｎｉｐｒｏｔ参照配列：Ｑ９９ＺＷ２（以下の通りのアミノ酸配列）に対応する。
ＡＴＧＧＡＴＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＴＴＡＧＡＴＡＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＴＡＧＣＧＴＣＧＧＡＴＧＧＧＣＧＧＴＧＡＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＡＧＧＴＴＣＣＧＴＣＴＡＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＡＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＴＡＧＧＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＴＣＴＣＡＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＴＡＣＡＣＧＴＣＧＧＡＡＧＡＡＴＣＧＴＡＴＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＡＧＡＴＧＡＴＡＧＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＧＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＣＴＡＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＡＧＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＧＣＧＣＴＴＡＡＴＣＴＡＴＴＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＧＣＡＴＡＴＧＡＴＴＡＡＧＴＴＴＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＧＧＡＧＡＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＡＣＡＡＡＣＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＡＴＴＡＡＣＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＧＣＧＡＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＴＴＧＡＧＴＡＡＡＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＴＡＴＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＧＧＧＴＴＴＧＡＣＣＣＣＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＴＧＡＴＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＣＴＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＴＴＴＡＧＡＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＧＣＧＣＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＣＡＧＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＴＣＣＴＡＡＧＡＧＴＡＡＡＴＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＣＡＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＧＣＴＡＣＧＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＴＴＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＴＴＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＧＧＧＡＧＣＴＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＣＴＧＡＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＴＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＣＡＡＣＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＴＡＴＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＴＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＡＣＡＡＴＣＧＴＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＡＣＴＴＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＴＴＡＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＴＴＧＧＣＧＣＧＴＧＧＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＣＧＧＡＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＡＴＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＣＧＣＡＴＧＡＣＡＡＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＡＣＴＡＣＣＡＡＡＡＣＡＴＡＧＴＴＴＧＣＴＴＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＴＡＴＡＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣ
ＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＴＴＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＴＡＡＣＣＧＴＴＡＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＡＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＧＴＡＣＣＴＡＣＣＡＴＧＡＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＡＣＣＴＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴＴＡＴＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＴＴＧＴＣＴＣＧＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＡＴＧＧＴＡＴＴＡＧＧＧＡＴＡＡＧＣＡＡＴＣＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＴＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＴＣＡＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＣＣＡＡＴＣＧＣＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＡＡＡＧＣＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＧＡＴＡＧＴＴＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＡＴＴＧＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＴＧＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＴＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＡＴＧＡＡＡＣＧＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＡＧＧＡＡＧＴＣＡＧＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＡＧＣＡＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡＡＧＡＡＴＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＴＣＧＴＴＴＡＡＧＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＧＴＣＧＡＴＣＡＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＡＡＡＧＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＡＧＡＣＡＡＴＡＡＧＧＴＣＴＴＡＡＣＧＣＧＴＴＣＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＧＴＧＧＴＡＡＡＴＣＧＧＡＴＡＡＣＧＴＴＣＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＴＣＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＣＡＣＴＣＡＡＣＧＴＡＡＧＴＴＴＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＣＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＣＧＣＣＡＡＴＴＧＧＴＴＧＡＡＡＣＴＣＧＣＣＡＡＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＡＴＧＴＧＧＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＴＡＣＴＡＡＡＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＧＡＧＡＧＧＴＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＡＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴＣＴＧＡＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＡＣＧＴＧＡＧＡＴＴＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＴＣＴＡＡＡＴＧＣＣＧＴＣＧＴＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＣＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＣＧＧＡＧＴＴＴＧＴＣＴＡＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＴＴＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＧＴＡＡＡＡＴＧＡＴＴＧＣＴＡＡＧＴＣＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＧＣＡＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＡＣＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＴＴＣＧＣＡＡＡＣＧＣＣＣＴＣＴＡＡＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＴＧＧＧＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣＡＧＴＧＣＧＣＡＡＡＧＴＡＴＴＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧＧＡＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＧＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＧＣＴＣＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＴＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＧＴＣＣＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＣＣＧＴＴＡＡＡＧＡＧＴＴＡＣＴＡＧＧＧＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＡＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＡＣＴＡＣＣＴＡＡＡＴＡＴＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＣＧＧＴＣＧＴＡＡＡＣＧＧＡＴＧＣ
ＴＧＧＣＴＡＧＴＧＣＣＧＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧＣＴＡＧＴＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＧＴＴＧＡＡＧＧＧＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＡＡＧＣＡＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＴＧＡＧＣＡＡＡＴＣＡＧＴＧＡＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＣＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＡＡＴＴＴＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＧＣＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＴＡＧＡＧＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴＣＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＡＴＡＣＧＴＣＴＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡＧＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＴＡＴＣＣＡＴＣＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＡＴＧＡＡＡＣＡＣＧＣＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣＴＡＧＧＡＧＧＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号３７）
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＤＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ（配列番号３８）
[257]一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、種コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏ
ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１５６８３．１、ＮＣ＿０１７３１７．１）、コリネバクテリウム・ジフテリア（ＮＣＢＩ参照ＮＣ
０１６７８２．１、ＮＣ＿０１６７８６．１）、スピロプラズマ・シルフィディコラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１２８４．１）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１７８６１．１）、スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１８４６．１）、ストレプトコッカス・イニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０２１３１４．１）、ベリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１８０１０．１）、サイクロフレクス・トルキシル（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓｌ）（ＮＣＢＩ参照：ＮＣ＿０１８７２１．１）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（ＮＣＢＩ参照 ＮＰ＿４７２０７３．１）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿００２３４４９００．１）または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＣＢＩ参照：ＹＰ＿００２３４２１００．１）に由来するＣａｓ９タンパク質である。
[258]一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターは、ヌクレアーゼ活
性が低減したまたは消失したプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。例えば、Ｃａ９タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性である場合も、Ｃａｓ９ニッカーゼである場合もある。不活性ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９タンパク質（またはその断片）を生成する方法は、公知である（例えば、各々、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３３７：８１６～８２１頁（２０１２）；Ｑｉら、（２０１３） Ｃｅｌｌ． ２８； １５２（５）： １１７３～８３を参照されたい。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣ１サブドメインを含むと知られている。ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡと相補的である鎖を切断するが、ＲｕｖＣ１サブドメインは、非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を発現停止することができる。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａは、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ３３７：８１６～８２１頁（２０１２）； Ｑｉら、Ｃｅｌｌ． ２８；１５２（５）： １１７３～８３頁（２０１３））。本開示に従う使用に適したＣａｓ９ニッカーゼは、活性ＨＮＨドメインおよび不活性ＲｕｖＣドメインを有し、ｓｇＲＮＡによって結合される標的ＤＮＡの鎖（シチジン脱アミノ化を介して編集されている鎖の反対の鎖である）のみを切断可能である。本開示のＣａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインを不活性化する変異、例えば、Ｄ１０Ａ変異を含み得る。ＲｕｖＣドメインを不活性化する任意の変異、例えば、ＲｕｖＣドメイン中の挿入、欠失または単一もしくは複数のアミノ酸置換が、Ｃａｓ９ニッカーゼ中に含まれる場合があるということは理解されるべきである。本明細書に記載されるＣａｓ９ニッカーゼでは、ＲｕｖＣドメインが不活性化されながら、ＨＮＨドメインは活性のままである。したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインを不活性化するもの（例えば、Ｄ１０Ａ）以外の変異を含む可能性がありながら、それらの変異はＨＮＨドメインの活性に影響を及ぼさない。限定されないＣａｓ９ニッカーゼの例では、８４０位のヒスチジンは、変更されないままである。
[259]一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９は、以下に提供されるｄＣａ
ｓ９のアミノ酸配列（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）を含む：
ＭＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮ
ＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＡＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ（配列番号３９）
[260]一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、以下のような例示的な触媒的なＣ
ａｓ９ ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）のアミノ酸配列を含む：
ＤＫＫＹＳＩＧＬＡＩＧＴＮＳＶＧＷＡＶＩＴＤＥＹＫＶＰＳＫＫＦＫＶＬＧＮＴＤＲＨＳＩＫＫＮＬＩＧＡＬＬＦＤＳＧＥＴＡＥＡＴＲＬＫＲＴＡＲＲＲＹＴＲＲＫＮＲＩＣＹＬＱＥＩＦＳＮＥＭＡＫＶＤＤＳＦＦＨＲＬＥＥＳＦＬＶＥＥＤＫＫＨＥＲＨＰＩＦＧＮＩＶＤＥＶＡＹＨＥＫＹＰＴＩＹＨＬＲＫＫＬＶＤＳＴＤＫＡＤＬＲＬＩＹＬＡＬＡＨＭＩＫＦＲＧＨＦＬＩＥＧＤＬＮＰＤＮＳＤＶＤＫＬＦＩＱＬＶＱＴＹＮＱＬＦＥＥＮＰＩＮＡＳＧＶＤＡＫＡＩＬＳＡＲＬＳＫＳＲＲＬＥＮＬＩＡＱＬＰＧＥＫＫＮＧＬＦＧＮＬＩＡＬＳＬＧＬＴＰＮＦＫＳＮＦＤＬＡＥＤＡＫＬＱＬＳＫＤＴＹＤＤＤＬＤＮＬＬＡＱＩＧＤＱＹＡＤＬＦＬＡＡＫＮＬＳＤＡＩＬＬＳＤＩＬＲＶＮＴＥＩＴＫＡＰＬＳＡＳＭＩＫＲＹＤＥＨＨＱＤＬＴＬＬＫＡＬＶＲＱＱＬＰＥＫＹＫＥＩＦＦＤＱＳＫＮＧＹＡＧＹＩＤＧＧＡＳＱＥＥＦＹＫＦＩＫＰＩＬＥＫＭＤＧＴＥＥＬＬＶＫＬＮＲＥＤＬＬＲＫＱＲＴＦＤＮＧＳＩＰＨＱＩＨＬＧＥＬＨＡＩＬＲＲＱＥＤＦＹＰＦＬＫＤＮＲＥＫＩＥＫＩＬＴＦＲＩＰＹＹＶＧＰＬＡＲＧＮＳＲＦＡＷＭＴＲＫＳＥＥＴＩＴＰＷＮＦＥＥＶＶＤＫＧＡＳＡＱＳＦＩＥＲＭＴＮＦＤＫＮＬＰＮＥＫＶＬＰＫＨＳＬＬＹＥＹＦＴＶＹＮＥＬＴＫＶＫＹＶＴＥＧＭＲＫＰＡＦＬＳＧＥＱＫＫＡＩＶＤＬＬＦＫＴＮＲＫＶＴＶＫＱＬＫＥＤＹＦＫＫＩＥＣＦＤＳＶＥＩＳＧＶＥＤＲＦＮＡＳＬＧＴＹＨＤＬＬＫＩＩＫＤＫＤＦＬＤＮＥＥＮＥＤＩＬＥＤＩＶＬＴＬＴＬＦＥＤＲＥＭＩＥＥＲＬＫＴＹＡＨＬＦＤＤＫＶＭＫＱＬＫＲＲＲＹＴＧＷＧＲＬＳＲＫＬＩＮＧＩＲＤＫＱＳＧＫＴＩＬＤＦＬＫＳＤＧＦＡＮＲＮＦＭＱＬＩＨＤＤＳＬＴＦＫＥＤＩＱＫＡＱＶＳＧＱＧＤＳＬＨＥＨＩＡＮＬＡＧＳＰＡＩＫＫＧＩＬＱＴＶＫＶＶＤＥＬＶＫＶＭＧＲＨＫＰＥＮＩＶＩ
ＥＭＡＲＥＮＱＴＴＱＫＧＱＫＮＳＲＥＲＭＫＲＩＥＥＧＩＫＥＬＧＳＱＩＬＫＥＨＰＶＥＮＴＱＬＱＮＥＫＬＹＬＹＹＬＱＮＧＲＤＭＹＶＤＱＥＬＤＩＮＲＬＳＤＹＤＶＤＨＩＶＰＱＳＦＬＫＤＤＳＩＤＮＫＶＬＴＲＳＤＫＮＲＧＫＳＤＮＶＰＳＥＥＶＶＫＫＭＫＮＹＷＲＱＬＬＮＡＫＬＩＴＱＲＫＦＤＮＬＴＫＡＥＲＧＧＬＳＥＬＤＫＡＧＦＩＫＲＱＬＶＥＴＲＱＩＴＫＨＶＡＱＩＬＤＳＲＭＮＴＫＹＤＥＮＤＫＬＩＲＥＶＫＶＩＴＬＫＳＫＬＶＳＤＦＲＫＤＦＱＦＹＫＶＲＥＩＮＮＹＨＨＡＨＤＡＹＬＮＡＶＶＧＴＡＬＩＫＫＹＰＫＬＥＳＥＦＶＹＧＤＹＫＶＹＤＶＲＫＭＩＡＫＳＥＱＥＩＧＫＡＴＡＫＹＦＦＹＳＮＩＭＮＦＦＫＴＥＩＴＬＡＮＧＥＩＲＫＲＰＬＩＥＴＮＧＥＴＧＥＩＶＷＤＫＧＲＤＦＡＴＶＲＫＶＬＳＭＰＱＶＮＩＶＫＫＴＥＶＱＴＧＧＦＳＫＥＳＩＬＰＫＲＮＳＤＫＬＩＡＲＫＫＤＷＤＰＫＫＹＧＧＦＤＳＰＴＶＡＹＳＶＬＶＶＡＫＶＥＫＧＫＳＫＫＬＫＳＶＫＥＬＬＧＩＴＩＭＥＲＳＳＦＥＫＮＰＩＤＦＬＥＡＫＧＹＫＥＶＫＫＤＬＩＩＫＬＰＫＹＳＬＦＥＬＥＮＧＲＫＲＭＬＡＳＡＧＥＬＱＫＧＮＥＬＡＬＰＳＫＹＶＮＦＬＹＬＡＳＨＹＥＫＬＫＧＳＰＥＤＮＥＱＫＱＬＦＶＥＱＨＫＨＹＬＤＥＩＩＥＱＩＳＥＦＳＫＲＶＩＬＡＤＡＮＬＤＫＶＬＳＡＹＮＫＨＲＤＫＰＩＲＥＱＡＥＮＩＩＨＬＦＴＬＴＮＬＧＡＰＡＡＦＫＹＦＤＴＴＩＤＲＫＲＹＴＳＴＫＥＶＬＤＡＴＬＩＨＱＳＩＴＧＬＹＥＴＲＩＤＬＳＱＬＧＧＤ（配列番号４０）
[261]Ｃａｓ９を不活性化する追加の適した変異は、本開示および当技術分野における
知識に基づいて当業者に明らかであり、本開示の範囲内にある。このような追加の例示的な適したヌクレアーゼ不活性のＣａｓ９ドメインは、Ｄ８３９Ａおよび／もしくはＮ８６３Ａ（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｒａｓｈａｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１３； ３１（９）： ８３３～８３８を参照されたい）、または）またはＫ６０３Ｒ｛例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｖｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２、３２６～３２８頁、２０１５を参照されたい）を含むがそれに限らない。Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９バリアントはまた、任意の生物由来のＣａｓ９、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９バリアントも包含する。また、任意の生物由来のｄＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは他の適切なＣａｓ９バリアントを本開示に従って使用できることも認識される。
[262]一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、単細胞原核生物微生物のドメインおよび界を
構成する古細菌（例えば、ナノ古細菌）に由来するＣａｓ９を指す。
[263]一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、ＣａｓＸまた
はＣａｓＹまたはそのバリアントを含み、これらは、例えば、Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、「Ｎｅｗ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｂｅｓ．」Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１７年２月２１日 ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１７．２１に記載されており、その全開示内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。ゲノム分解メタゲノミクスを使用して、生命体の古細菌ドメインにおける最初に報告されたＣａｓ９を含む、いくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が同定された。この多様なＣａｓ９タンパク質は、ほとんど研究されていないナノ古細菌において活性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の一部として見出された。細菌では、２つのこれまでに知られていない系、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸおよびＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＹが発見され、これらは、これまでに発見された中で最もコンパクトな系の１つである。
[264]本開示の一部の態様は、本明細書で提供される核酸塩基エディターの高忠実度Ｃ
ａｓ９ドメインを提供する。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９ドメインは、対応する野生型Ｃａｓ９ドメインと比較して、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖－リン酸骨格の間の静電相互作用を減少させる１つまたは複数の変異を含む操作されたＣａｓ９ドメインである。何ら特定の理論に縛られることは望まないが、ＤＮＡの糖－リン酸骨格との静電相互作用が減少した高忠実度Ｃａｓ９ドメインは、少ないオフターゲット効果を有する可能性がある。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖－リン酸骨格の間の会合を減少させる１つまたは複数の変異を含む。一部の実施形態では、
Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖－リン酸骨格の間の会合を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくともｌ０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％またはそれより多く減少させる１つまたは複数の変異を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＣａｓ９融合タンパク質のいずれかは、野生型Ｃａｓ９アミノ酸配列または別のＣａｓ９における対応するアミノ酸において番号付けられるようなＮ４９７Ｘ、Ｒ６６１Ｘ、Ｑ６９５Ｘおよび／またはＱ９２６Ｘ変異のうち１つまたは複数を含み、Ｘは、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＣａｓ９またはＣａｓ９融合タンパク質のいずれかは、野生型Ｃａｓ９アミノ酸配列または別のＣａｓ９における対応するアミノ酸において番号付けられるような、野生型Ｃａｓ９配列において提供されるアミノ酸配列のＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａおよび／もしくはＱ９２６Ａ変異または対応する変異のうち１つまたは複数を含む。高忠実度を有するＣａｓ９ドメインは、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ら、「Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ．」Ｎａｔｕｒｅ ５２９、４９０～４９５頁（２０１６）；およびＳｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ら「Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１、８４～８８ （２０１５）に記載されており、各々の全開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
[265]本明細書で提供される塩基エディターのいずれも、例えば、本明細書で提供され
るアデノシンデアミナーゼ塩基エディターのいずれも、本明細書において記載されるようなＣａｓ９ドメインを改変することによって高忠実度塩基エディターに変換して、高忠実度塩基エディター、例えば、高忠実度アデノシン塩基エディターを生成できることを認識されたい。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインである。一部の実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ニッカーゼドメインである。
[266]一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＣａｓＸまたはＣａｓＹまたはその
バリアントを含み、これらは、例えば、Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、「Ｎｅｗ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｒｏｍ ｕｎｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｂｅｓ．」Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２０１７年２月２１日． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１７．２１に記載されており、その全開示内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。ゲノム分解メタゲノミクスを使用して、生命体の古細菌ドメインにおける最初に報告されたＣａｓ９を含む、いくつかのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が同定された。この多様なＣａｓ９タンパク質は、ほとんど研究されていないナノ古細菌において活性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の一部として見出された。細菌では、２つのこれまでに知られていない系、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＸおよびＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＹが発見され、これらは、これまでに発見された中で最もコンパクトな系の１つである。
[267]化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９に代わるものとして、哺乳動物細胞において切断活性を
示すＣｐｆ１ファミリー由来のＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを挙げることができる。Ｃｐｆ１媒介性ＤＮＡ切断は、短い３’オーバーハングを伴う二本鎖切断であり、Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断とは異なる。Ｃｐｆ１のねじれ型切断パターンは、伝統的な制限酵素クローニングと類似の指向性の遺伝子導入の可能性を広げる可能性があり、これは遺伝子編集の効率を増大する可能性がある。上記のＣａｓ９バリアントおよびオルソログと同様に、Ｃｐｆ１はまた、ＣＲＩＳＰＲによって標的とされ得る部位の数を、ＳｐＣａｓ９によって好まれるＮＧＧ ＰＡＭ部位を欠くＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムに拡張
する可能性がある。
[268]一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、表２３に列記されるアミノ酸配列
のうちいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、表２３に列記されるアミノ酸配列のうちいずれか１つを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の配列は、表２３に列記されるアミノ酸配列のうちいずれか１つである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２１３７、２１４９、２１５４、２１５８、２１８８、２１４０、４０、２１４６、２１５２、２１５６および２１６０のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２１３７、２１４９、２１５４、２１５８、２１８８、２１４０、４０、２１４６、２１５２、２１５６および２１６０のアミノ酸配列のうちいずれか１つを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の配列は、配列番号２１３７、２１４９、２１５４、２１５８および２１８８のアミノ酸配列のうちいずれか１つである。
[269]一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、表２３に列記されるポリヌクレオ
チド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、表２３に列記されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、表２３に列記されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によって発現される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、表２３に列記されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つによって発現される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７および２１９０のポリヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１
８５、２１８７および２１９０のポリヌクレオチド配列のいずれか１つを含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６および２１８９のポリヌクレオチド配列のいずれか１つによってコードされる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７、２１９０、２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つまたはそれらの組合せと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列によって発現される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６、２１８９、２１３９、２１４２、２１４５、２１５１、２１５５、２１５９、２１６２、２１６４、２１６７、２１６９、２１７１、２１７３、２１７５、２１７７、２１７９、２１８１、２１８３、２１８５、２１８７、２１９０、２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つまたはそれらの組合せを含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号２１９２、２１４８、２１５３、２１５７、２１６１、２１６８、２１７４、２１８０、２１８６および２１８９のポリヌクレオチド配列のいずれか１つによって発現される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つまたはそれらの組合せと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％または少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２１３８、２１４７、２１５８のポリヌクレオチド配列のいずれか１つまたはそれらの組合せをさらに含む。
リンカー
[270]本明細書で提供される塩基エディターは、塩基エディターの１つまたは複数の構
成要素を接続するリンカーを含み得る。特定の実施形態では、リンカーを使用して、本明細書に記載のタンパク質またはタンパク質ドメインのいずれかを連結し得る。リンカーは、共有結合のように単純なものであってもよいし、または原子数が多い高分子リンカーであってもよい。特定の実施形態では、リンカーはポリペプチドであるか、またはアミノ酸に基づく。他の実施形態では、リンカーはペプチド様ではない。一部の実施形態では、リンカーは、炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合などである。特定の実施形態では、リンカーは、アミド結合の炭素－窒素結合である。特定の実施形態では、リンカーは、環状または非環状、置換または非置換の、分枝または非分枝の脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。特定の実施形態では、リンカーはポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、または重合体を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノブタン酸、５－ペンタン酸など）を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）の単量体、二量体、または重合体を含む。特定の実施形態では、リンカーは、炭素環部分（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）に基づく。他の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の実施形態では、リンカーは、アミノ酸を含む。
特定の実施形態では、リンカーはペプチドを含む。特定の実施形態では、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。特定の実施形態では、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤（例えば、チオール、アミノ）の結合を促進する官能化部分を含み得る。リンカーの一部として任意の求電子剤を使用してもよい。例示的な求電子試薬としては、限定するものではないが、活性化エステル、活性化アミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートが挙げられる。
[271]一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例えば、ペ
プチドまたはタンパク質）である。一部の実施形態では、リンカーは、結合（例えば、共有結合）、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。一部の実施形態では、リンカーは、長さが５～１００アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、または１５０～２００アミノ酸長である。より長いまたはより短いリンカーも考えられる。一部の実施形態では、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーとも呼ばれ得るアミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１７）を含む。一部の実施形態では、リンカーはアミノ酸配列ＳＧＧＳを含む。一部の実施形態では、リンカーは、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４１）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４２）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４３）、（Ｇ）ｎ（配列番号４４）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号４５）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号４６）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１７）、または（ＸＰ）ｎ（配列番号４７）モチーフ、またはこれらの任意の組み合わせを含み、ｎが独立して１～３０の整数であり、Ｘが任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。一部の実施形態では、リンカーは、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１７）、ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号１９）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２０）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号２１）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、２４アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号２３）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、４０アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２４）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、６４アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２５）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、９２アミノ酸長である。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ ＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳ（配列番号２６）を含む。本明細書で提供されるリンカーのいずれも、第１のアデノシンデアミナーゼと第２のアデノシンデアミナーゼとを；デアミナーゼ（例えば、第１または第２のアデノシンデアミナーゼ）とＲＮＡ誘導型プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質とを；ＲＮＡ誘導プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質とＮＬＳとを；またはデアミナーゼ（例えば、第１または第２のアデノシンデアミナーゼ）とＮＬＳとを；連結するために使用されてもよいことが理解されるべきである。
[272]デアミナーゼ（例えば、操作されたｅｃＴａｄＡ）とＲＮＡ誘導型プログラム可
能ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）との間、および／または第１のアデノシンデアミナーゼと第２のアデノシンデアミナーゼとの間の様々なリンカー長および可塑性（例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２）、および（Ｇ）ｎの形の極めて可塑性のリンカーから、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号４８）、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４９）、および（ＸＰ）ｎ）の形のより剛性のリンカーまでの範囲）を使用して、特定の適用のためのデアミナーゼ活性の最適な長さを達成してもよい。一部の実施形態では、ｎは、３～３０の間の任意の整数である。一部の実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号５１）モチーフを含み、ｎは、１、３、または７である。
プロトスペーサー調節モチーフ
[273]ＣＲＩＳＰＲクラスターには、スペーサー、先行する移動性エレメントに相補的
な配列、および標的侵入核酸が含まれる。ＣＲＩＳＰＲクラスターは転写され、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。例えば、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ系では、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの正しいプロセッシングには、トランスコードされた小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内因性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９タンパク質が必要である。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼ３支援プロセッシングのガイドとして機能する。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ反復配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識する（例えば、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ｍｌ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ」、Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｊ．，ＭｃＳｈａｎ Ｗ．Ｍ．，Ａｊｄｉｃ Ｄ．Ｊ．，Ｓａｖｉｃ Ｄ．Ｊ．，Ｓａｖｉｃ Ｇ．，Ｌｙｏｎ Ｋ．，Ｐｒｉｍｅａｕｘ Ｃ，Ｓｅｚａｔｅ Ｓ．，Ｓｕｖｏｒｏｖ Ａ．Ｎ．，Ｋｅｎｔｏｎ Ｓ．，Ｌａｉ Ｈ．Ｓ．，Ｌｉｎ Ｓ．Ｐ．，Ｑｉａｎ Ｙ．，Ｊｉａ Ｈ．Ｇ．，Ｎａｊａｒ Ｆ．Ｚ．，Ｒｅｎ Ｑ．，Ｚｈｕ Ｈ．，Ｓｏｎｇ Ｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：４６５８－４６６３（２００１）；「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ」．Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ Ｅ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ Ｋ．，Ｓｈａｒｍａ ＣＭ．，Ｇｏｎｚａｌｅｓ Ｋ．，Ｃｈａｏ Ｙ．，Ｐｉｒｚａｄａ Ｚ．Ａ．，Ｅｃｋｅｒｔ
Ｍ．Ｒ．，Ｖｏｇｅｌ Ｊ．，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２－６０７（２０１１）；および「Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．」Ｊｉｎｅｋ Ｍ．，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ Ｋ．，Ｆｏｎｆａｒａ Ｉ．，Ｈａｕｅｒ Ｍ．，Ｄｏｕｄｎａ Ｊ．Ａ．，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ Ｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１（２０１２）（そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。Ｃａｓ９オルソログは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを含むがこれらに限定されない様々な種で記載されている。
[274]本開示のいくつかの態様では、プログラムされたＤＮＡ結合タンパク質ドメイン
、例えば、ＰＡＭの特異性が変更されたＣａｓ９ドメインが提供される。一部の実施形態では、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）は、「ＮＧＧ」の「Ｎ」がアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）であり、Ｇがグアニンである正規のＮＧＧ ＰＡＭ配列を認識する。一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基編集融合タンパク質は、ＰＡＭの約１５塩基上流にある４塩基領域（例えば、「脱アミノ化ウィンドウ」）内の標的核酸塩基を脱アミノ化すること
によって機能する。一部の実施形態では、脱アミノウィンドウは、ＰＡＭの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基上流である。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれも、正規な（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ配列を含まないヌクレオチド配列に結合し得るＣａｓ９ドメインを含み得る。非正規なＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、当該技術分野で記載されており、当業者には明らかであろう。例えば、非正規ＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ ドメインはＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ ５２３，４８１－４８５（２０１５）；およびＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ，「Ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｂｙ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ＰＡＭ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１２９３－１２９８（２０１５）（その各々の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ドメイン（ＳａＣａｓ９）である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ＳａＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９ｄ）、またはＳａＣａｓ９ニッカーゼ（ＳａＣａｓ９ｎ）である。野生型ＳａＣａｓ９アミノ酸配列を以下に示す：ＫＲＮＹＩＬＧＬＤＩＧＩＴＳＶＧＹＧＩＩＤＹＥＴＲＤＶＩＤＡＧＶＲＬＦＫＥＡＮＶＥＮＮＥＧＲＲＳＫＲＧＡＲＲＬＫＲＲＲＲＨＲＩＱＲＶＫＫＬＬＦＤＹＮＬＬＴＤＨＳＥＬＳＧＩＮＰＹＥＡＲＶＫＧＬＳＱＫＬＳＥＥＥＦＳＡＡＬＬＨＬＡＫＲＲＧＶＨＮＶＮＥＶＥＥＤＴＧＮＥＬＳＴＫＥＱＩＳＲＮＳＫＡＬＥＥＫＹＶＡＥＬＱＬＥＲＬＫＫＤＧＥＶＲＧＳＩＮＲＦＫＴＳＤＹＶＫＥＡＫＱＬＬＫＶＱＫＡＹＨＱＬＤＱＳＦＩＤＴＹＩＤＬＬＥＴＲＲＴＹＹＥＧＰＧＥＧＳＰＦＧＷＫＤＩＫＥＷＹＥＭＬＭＧＨＣＴＹＦＰＥＥＬＲＳＶＫＹＡＹＮＡＤＬＹＮＡＬＮＤＬＮＮＬＶＩＴＲＤＥＮＥＫＬＥＹＹＥＫＦＱＩＩＥＮＶＦＫＱＫＫＫＰＴＬＫＱＩＡＫＥＩＬＶＮＥＥＤＩＫＧＹＲＶＴＳＴＧＫＰＥＦＴＮＬＫＶＹＨＤＩＫＤＩＴＡＲＫＥＩＩＥＮＡＥＬＬＤＱＩＡＫＩＬＴＩＹＱＳＳＥＤＩＱＥＥＬＴＮＬＮＳＥＬＴＱＥＥＩＥＱＩＳＮＬＫＧＹＴＧＴＨＮＬＳＬＫＡＩＮＬＩＬＤＥＬＷＨＴＮＤＮＱＩＡＩＦＮＲＬＫＬＶＰＫＫＶＤＬＳＱＱＫＥＩＰＴＴＬＶＤＤＦＩＬＳＰＶＶＫＲＳＦＩＱＳＩＫＶＩＮＡＩＩＫＫＹＧＬＰＮＤＩＩＩＥＬＡＲＥＫＮＳＫＤＡＱＫＭＩＮＥＭＱＫＲＮＲＱＴＮＥＲＩＥＥＩＩＲＴＴＧＫＥＮＡＫＹＬＩＥＫＩＫＬＨＤＭＱＥＧＫＣＬＹＳＬＥＡＩＰＬＥＤＬＬＮＮＰＦＮＹＥＶＤＨＩＩＰＲＳＶＳＦＤＮＳＦＮＮＫＶＬＶＫＱＥＥＮＳＫＫＧＮＲＴＰＦＱＹＬＳＳＳＤＳＫＩＳＹＥＴＦＫＫＨＩＬＮＬＡＫＧＫＧＲＩＳＫＴＫＫＥＹＬＬＥＥＲＤＩＮＲＦＳＶＱＫＤＦＩＮＲＮＬＶＤＴＲＹＡＴＲＧＬＭＮＬＬＲＳＹＦＲＶＮＮＬＤＶＫＶＫＳＩＮＧＧＦＴＳＦＬＲＲＫＷＫＦＫＫＥＲＮＫＧＹＫＨＨＡＥＤＡＬＩＩＡＮＡＤＦＩＦＫＥＷＫＫＬＤＫＡＫＫＶＭＥＮＱＭＦＥＥＫＱＡＥＳＭＰＥＩＥＴＥＱＥＹＫＥＩＦＩＴＰＨＱＩＫＨＩＫＤＦＫＤＹＫＹＳＨＲＶＤＫＫＰＮＲＥＬＩＮＤＴＬＹＳＴＲＫＤＤＫＧＮＴＬＩＶＮＮＬＮＧＬＹＤＫＤＮＤＫＬＫＫＬＩＮＫＳＰＥＫＬＬＭＹＨＨＤＰＱＴＹＱＫＬＫＬＩＭＥＱＹＧＤＥＫＮＰＬＹＫＹＹＥＥＴＧＮＹＬＴＫＹＳＫＫＤＮＧＰＶＩＫＫＩＫＹＹＧＮＫＬＮＡＨＬＤＩＴＤＤＹＰＮＳＲＮＫＶＶＫＬＳＬＫＰＹＲＦＤＶＹＬＤＮＧＶＹＫＦＶＴＶＫＮＬＤＶＩＫＫＥＮＹＹＥＶＮＳＫＣＹＥＥＡＫＫＬＫＫＩＳＮＱＡＥＦＩＡＳＦＹＮＮＤＬＩＫＩＮＧＥＬＹＲＶＩＧＶＮＮＤＬＬＮＲＩＥＶＮＭＩＤＩＴＹＲＥＹＬＥＮＭＮＤＫＲＰＰＲＩＩＫＴＩＡＳＫＴＱＳＩＫＫＹＳＴＤＩＬＧＮＬＹＥＶＫＳＫＫＨＰＱＩＩＫＫＧ（配列番号５２）
[275]一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９は、Ｎ５７９Ｘ変異、または野生型ＳａＣａ
ｓ９配列で番号付けされたアミノ酸配列のいずれかに対応する変異を含み、Ｘは、Ｎを除く任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９は、野生型ＳａＣａｓ９配列で番号が付けられたＮ５７９Ａ変異、または別のＳａＣａｓ９タンパク質の対応する変
異を含む。
[276]一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ヌクレアーゼ不活性ＳａＣａｓ９
ドメイン、またはＳａＣａｓ９ニッカーゼドメインは、非標準ＰＡＭを有する核酸配列に結合し得る。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧであり、Ｒ＝ＡまたはＧである、ＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合し得る。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、野生型ＳａＣａｓ９配列において番号付けされたＥ７８１Ｘ、Ｎ９６７Ｘ、およびＲ１０１４Ｘ、またはＸが任意のアミノ酸である別のＳａＣａｓ９タンパク質における対応する変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、野生型ＳａＣａｓ９配列において番号付けされたＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、およびＲ１０１４Ｈ変異または別のＳａＣａｓ９タンパク質における対応する変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳａＣａｓ９ドメインは、野生型ＳａＣａｓ９配列において番号付けされたＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、もしくはＲ１０１４Ｈ変異、または別のＳａＣａｓ９タンパク質における対応する変異を含む。
[277]一部の実施形態では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙ
ｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ドメイン（ＳｐＣａｓ９）である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ＳｐＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９ｄ）、またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐＣａｓ９ｎ）である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、野生型ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列で番号付けされたＤ１０Ｘ変異、または別のＳａｐＣａｓ９タンパク質における対応する変異を含み、ここでＸは、Ｄを除く任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９は、野生型ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列で番号付けされているＤ１０Ａ変異または別のＳｐＣａｓ９タンパク質の対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメイン、活性ＳｐＣａｓ９ドメイン中のヌクレアーゼ、またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼドメインは、非ＮＧＧ
ＰＡＭを有する核酸配列に結合し得る。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ドメイン、活性ＳｐＣａｓ９ドメイン中のヌクレアーゼ、またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼドメインは、ＮＧＧ、ＮＧＡ、またはＮＧＣＧ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合し得る。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、野生型ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列において番号が付けられたＤ１１３５Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ変異、または別のＳｐＣａｓ９タンパク質における対応する変異のうちの１つまたは複数を含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、野生型ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列において番号付けされたＤ１１３５Ｅ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異または別のＳｐＣａｓ９タンパク質における対応する変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、野生型Ｃａｓ９アミノ酸配列において番号付けされたＤ１１３４Ｖ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異、またはその対応する変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、野生型ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列において番号付けされたＤ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または別のＳｐＣａｓ９タンパク質における対応する変異を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、野生型ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列において番号が付けられたＤ１１３５Ｘ、Ｇ１２１８Ｘ、Ｒ１３３５Ｘ、およびＴ１３３７Ｘ変異、または別のＳｐＣａｓ９タンパク質における対応する変異のうちの１つまたは複数を含み、Ｘは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、野生型ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列において番号付けされたＤ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または別のＳｐＣａｓ９タンパク質における対応する変異のうちの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９ドメインは、野生型ＳｐＣａｓ９アミノ酸配列において番号付けされたＤ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、およびＴ１３３７Ｒ変異、または別のＳｐＣａｓ９タンパク質における対応する変異を含む。
[278]一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかのＣａｓ
９ドメインは、本明細書で提供されるＣａｓ９配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。
[279]一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターは、特定の核酸（例
えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を標的とし、改変するために使用され得るＲＮＡ誘導プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質を含む。核酸プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質としては、限定するものではないが、Ｃａｓ９（例えば、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９およびＣａｓ９ニッカーゼ）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２Ｃ３、およびＡｒｇｏｎａｕｔｅが挙げられる。Ｃａｓ９とは異なるＰＡＭ特異性を有する核酸プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の１つの例は、ＰｒｅｖｏｔｅｌｌａおよびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １（Ｃｐｆ１）由来のＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓである。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１も、クラス２ ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９とは異なる特徴を有する強力なＤＮＡ干渉を媒介することが示されている。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチ プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＴＮ、ＴＴＴＮ、またはＹＴＮ）を利用する。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｙａｍａｎｏ ｅｔ
ａｌ．，「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｐｆ１ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ」。Ｃｅｌｌ（１６５）２０１６，ｐ．９４９－９６２に記載されており、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
[280]一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターは、ヌクレアーゼ不
活性Ｃｐｆ１タンパク質またはそのバリアントを含む。Ｃｐｆ１タンパク質には、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインに似ているが、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを有さないＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを有し、Ｃｐｆ１のＮ末端には、Ｃａｓ９のアルファヘリックス認識ローブは有さない。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１ニッカーゼは、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆ１タンパク質において番号付けされたＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、またはＤ１２５５Ａに対応する１つまたは複数の変異を含む。
[281]野生型フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｄａ）Ｃ
ｐｆ１ アミノ酸配列を以下に示す：
ＭＳＩＹＱＥＦＶＮＫＹＳＬＳＫＴＬＲＦＥＬＩＰＱＧＫＴＬＥＮＩＫＡＲＧＬＩＬＤＤＥＫＲＡＫＤＹＫＫＡＫＱＩＩＤＫＹＨＱＦＦＩＥＥＩＬＳＳＶＣＩＳＥＤＬＬＱＮＹＳＤＶＹＦＫＬＫＫＳＤＤＤＮＬＱＫＤＦＫＳＡＫＤＴＩＫＫＱＩＳＥＹＩＫＤＳＥＫＦＫＮＬＦＮＱＮＬＩＤＡＫＫＧＱＥＳＤＬＩＬＷＬＫＱＳＫＤＮＧＩＥＬＦＫＡＮＳＤＩＴＤＩＤＥＡＬＥＩＩＫＳＦＫＧＷＴＴＹＦＫＧＦＨＥＮＲＫＮＶＹＳＳＮＤＩＰＴＳＩＩＹＲＩＶＤＤＮＬＰＫＦＬＥＮＫＡＫＹＥＳＬＫＤＫＡＰＥＡＩＮＹＥＱＩＫＫＤＬＡＥＥＬＴＦＤＩＤＹＫＴＳＥＶＮＱＲＶＦＳＬＤＥＶＦＥＩＡＮＦＮＮＹＬＮＱＳＧＩＴＫＦＮＴＩＩＧＧＫＦＶＮＧＥＮＴＫＲＫＧＩＮＥＹＩＮＬＹＳＱＱＩＮＤＫＴＬＫＫＹＫＭＳＶＬＦＫＱＩＬＳＤＴＥＳＫＳＦＶＩＤＫＬＥＤＤＳＤＶＶＴＴＭＱＳＦＹＥＱＩＡＡＦＫＴＶＥＥＫＳＩＫＥＴＬＳＬＬＦＤＤＬＫＡＱＫＬＤＬＳＫＩＹＦＫＮＤＫＳＬＴＤＬＳＱＱＶＦＤＤＹＳＶＩＧＴＡＶＬＥＹＩＴＱＱＩＡＰＫＮＬＤＮＰＳＫＫＥＱＥＬＩＡＫＫＴＥＫＡＫＹＬＳＬＥＴＩＫＬＡＬＥＥＦＮＫＨＲＤＩＤＫＱＣＲＦＥＥＩＬＡ
ＮＦＡＡＩＰＭＩＦＤＥＩＡＱＮＫＤＮＬＡＱＩＳＩＫＹＱＮＱＧＫＫＤＬＬＱＡＳＡＥＤＤＶＫＡＩＫＤＬＬＤＱＴＮＮＬＬＨＫＬＫＩＦＨＩＳＱＳＥＤＫＡＮＩＬＤＫＤＥＨＦＹＬＶＦＥＥＣＹＦＥＬＡＮＩＶＰＬＹＮＫＩＲＮＹＩＴＱＫＰＹＳＤＥＫＦＫＬＮＦＥＮＳＴＬＡＮＧＷＤＫＮＫＥＰＤＮＴＡＩＬＦＩＫＤＤＫＹＹＬＧＶＭＮＫＫＮＮＫＩＦＤＤＫＡＩＫＥＮＫＧＥＧＹＫＫＩＶＹＫＬＬＰＧＡＮＫＭＬＰＫＶＦＦＳＡＫＳＩＫＦＹＮＰＳＥＤＩＬＲＩＲＮＨＳＴＨＴＫＮＧＳＰＱＫＧＹＥＫＦＥＦＮＩＥＤＣＲＫＦＩＤＦＹＫＱＳＩＳＫＨＰＥＷＫＤＦＧＦＲＦＳＤＴＱＲＹＮＳＩＤＥＦＹＲＥＶＥＮＱＧＹＫＬＴＦＥＮＩＳＥＳＹＩＤＳＶＶＮＱＧＫＬＹＬＦＱＩＹＮＫＤＦＳＡＹＳＫＧＲＰＮＬＨＴＬＹＷＫＡＬＦＤＥＲＮＬＱＤＶＶＹＫＬＮＧＥＡＥＬＦＹＲＫＱＳＩＰＫＫＩＴＨＰＡＫＥＡＩＡＮＫＮＫＤＮＰＫＫＥＳＶＦＥＹＤＬＩＫＤＫＲＦＴＥＤＫＦＦＦＨＣＰＩＴＩＮＦＫＳＳＧＡＮＫＦＮＤＥＩＮＬＬＬＫＥＫＡＮＤＶＨＩＬＳＩＤＲＧＥＲＨＬＡＹＹＴＬＶＤＧＫＧＮＩＩＫＱＤＴＦＮＩＩＧＮＤＲＭＫＴＮＹＨＤＫＬＡＡＩＥＫＤＲＤＳＡＲＫＤＷＫＫＩＮＮＩＫＥＭＫＥＧＹＬＳＱＶＶＨＥＩＡＫＬＶＩＥＹＮＡＩＶＶＦＥＤＬＮＦＧＦＫＲＧＲＦＫＶＥＫＱＶＹＱＫＬＥＫＭＬＩＥＫＬＮＹＬＶＦＫＤＮＥＦＤＫＴＧＧＶＬＲＡＹＱＬＴＡＰＦＥＴＦＫＫＭＧＫＱＴＧＩＩＹＹＶＰＡＧＦＴＳＫＩＣＰＶＴＧＦＶＮＱＬＹＰＫＹＥＳＶＳＫＳＱＥＦＦＳＫＦＤＫＩＣＹＮＬＤＫＧＹＦＥＦＳＦＤＹＫＮＦＧＤＫＡＡＫＧＫＷＴＩＡＳＦＧＳＲＬＩＮＦＲＮＳＤＫＮＨＮＷＤＴＲＥＶＹＰＴＫＥＬＥＫＬＬＫＤＹＳＩＥＹＧＨＧＥＣＩＫＡＡＩＣＧＥＳＤＫＫＦＦＡＫＬＴＳＶＬＮＴＩＬＱＭＲＮＳＫＴＧＴＥＬＤＹＬＩＳＰＶＡＤＶＮＧＮＦＦＤＳＲＱＡＰＫＮＭＰＱＤＡＤＡＮＧＡＹＨＩＧＬＫＧＬＭＬＬＧＲＩＫＮＮＱＥＧＫＫＬＮＬＶＩＫＮＥＥＹＦＥＦＶＱＮＲＮＮ（配列番号５３）
[282]一部の実施形態では、塩基エディターはＣｐｆ１タンパク質を含む。一部の実施
形態では、Ｃｐｆ１タンパク質はＣｐｆ１ニッカーゼである。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１である。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、本明細書で提供されるＦｎＣｐｆ１配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、本明細書に提供される野生型ＦｎＣｐｆ１配列において番号付けされたＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。他の細菌種由来のＣｐｆ１もまた、本開示に従って使用され得ることが理解されるべきである。
[283]一部の実施形態では、核酸プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ１２
ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃ２ｃ２、もしくはＣ２ｃ３タンパク質、またはそれらのバリアントを含む。Ｃｌａｓｓ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＣａｓタンパク質の追加の特徴は、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５－３９７（その全体の内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。２つの系Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３のエフェクターには、Ｃｐｆ１に関連するＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインが含まれている。３番目の系であるＣ２ｃ２には、２つの基礎にあるＨＥＰＮ ＲＮａｓｅドメインを有するエフェクターが含まれる。Ｃ２ｃ１によるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの生成とは異なり、成熟ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの生成は、ｔｒａｃｒＲＮＡに依存しない。Ｃ２ｃ１は、ＤＮＡ切断のためにＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存する。キメラ単分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と複合体を形成したアリサイクロバチルス・アシドテラストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒａｓｔｒｉｓ）のＣ２ｃ１（ＡａｃＣ２ｃ１）の結晶構造は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｃ２ｃ１－ｓｇＲＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
Ｒｅｖｅａｌｓ ＲＮＡ－Ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１７ Ｊａｎ １９；６５（２）：３１０－３２２；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「ＰＡＭ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ Ｃ２Ｃ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ」（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
[284]例示的なＣａｓ１２ｂアミノ酸配列（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉ Ｃ
ａｓ１２ｂ）は、下に示す：
ＢｈＣａｓ１２ｂ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｓａｓｈｉｉ）ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０９５１４２５１５ＭＡＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡＡＴＲＳＦＩＬＫＩＥＰＮＥＥＶＫＫＧＬＷＫＴＨＥＶＬＮＨＧＩＡＹＹＭＮＩＬＫＬＩＲＱＥＡＩＹＥＨＨＥＱＤＰＫＮＰＫＫＶＳＫＡＥＩＱＡＥＬＷＤＦＶＬＫＭＱＫＣＮＳＦＴＨＥＶＤＫＤＥＶＦＮＩＬＲＥＬＹＥＥＬＶＰＳＳＶＥＫＫＧＥＡＮＱＬＳＮＫＦＬＹＰＬＶＤＰＮＳＱＳＧＫＧＴＡＳＳＧＲＫＰＲＷＹＮＬＫＩＡＧＤＰＳＷＥＥＥＫＫＫＷＥＥＤＫＫＫＤＰＬＡＫＩＬＧＫＬＡＥＹＧＬＩＰＬＦＩＰＹＴＤＳＮＥＰＩＶＫＥＩＫＷＭＥＫＳＲＮＱＳＶＲＲＬＤＫＤＭＦＩＱＡＬＥＲＦＬＳＷＥＳＷＮＬＫＶＫＥＥＹＥＫＶＥＫＥＹＫＴＬＥＥＲＩＫＥＤＩＱＡＬＫＡＬＥＱＹＥＫＥＲＱＥＱＬＬＲＤＴＬＮＴＮＥＹＲＬＳＫＲＧＬＲＧＷＲＥＩＩＱＫＷＬＫＭＤＥＮＥＰＳＥＫＹＬＥＶＦＫＤＹＱＲＫＨＰＲＥＡＧＤＹＳＶＹＥＦＬＳＫＫＥＮＨＦＩＷＲＮＨＰＥＹＰＹＬＹＡＴＦＣＥＩＤＫＫＫＫＤＡＫＱＱＡＴＦＴＬＡＤＰＩＮＨＰＬＷＶＲＦＥＥＲＳＧＳＮＬＮＫＹＲＩＬＴＥＱＬＨＴＥＫＬＫＫＫＬＴＶＱＬＤＲＬＩＹＰＴＥＳＧＧＷＥＥＫＧＫＶＤＩＶＬＬＰＳＲＱＦＹＮＱＩＦＬＤＩＥＥＫＧＫＨＡＦＴＹＫＤＥＳＩＫＦＰＬＫＧＴＬＧＧＡＲＶＱＦＤＲＤＨＬＲＲＹＰＨＫＶＥＳＧＮＶＧＲＩＹＦＮＭＴＶＮＩＥＰＴＥＳＰＶＳＫＳＬＫＩＨＲＤＤＦＰＫＶＶＮＦＫＰＫＥＬＴＥＷＩＫＤＳＫＧＫＫＬＫＳＧＩＥＳＬＥＩＧＬＲＶＭＳＩＤＬＧＱＲＱＡＡＡＡＳＩＦＥＶＶＤＱＫＰＤＩＥＧＫＬＦＦＰＩＫＧＴＥＬＹＡＶＨＲＡＳＦＮＩＫＬＰＧＥＴＬＶＫＳＲＥＶＬＲＫＡＲＥＤＮＬＫＬＭＮＱＫＬＮＦＬＲＮＶＬＨＦＱＱＦＥＤＩＴＥＲＥＫＲＶＴＫＷＩＳＲＱＥＮＳＤＶＰＬＶＹＱＤＥＬＩＱＩＲＥＬＭＹＫＰＹＫＤＷＶＡＦＬＫＱＬＨＫＲＬＥＶＥＩＧＫＥＶＫＨＷＲＫＳＬＳＤＧＲＫＧＬＹＧＩＳＬＫＮＩＤＥＩＤＲＴＲＫＦＬＬＲＷＳＬＲＰＴＥＰＧＥＶＲＲＬＥＰＧＱＲＦＡＩＤＱＬＮＨＬＮＡＬＫＥＤＲＬＫＫＭＡＮＴＩＩＭＨＡＬＧＹＣＹＤＶＲＫＫＫＷＱＡＫＮＰＡＣＱＩＩＬＦＥＤＬＳＮＹＮＰＹＥＥＲＳＲＦＥＮＳＫＬＭＫＷＳＲＲＥＩＰＲＱＶＡＬＱＧＥＩＹＧＬＱＶＧＥＶＧＡＱＦＳＳＲＦＨＡＫＴＧＳＰＧＩＲＣＳＶＶＴＫＥＫＬＱＤＮＲＦＦＫＮＬＱＲＥＧＲＬＴＬＤＫＩＡＶＬＫＥＧＤＬＹＰＤＫＧＧＥＫＦＩＳＬＳＫＤＲＫＣＶＴＴＨＡＤＩＮＡＡＱＮＬＱＫＲＦＷＴＲＴＨＧＦＹＫＶＹＣＫＡＹＱＶＤＧＱＴＶＹＩＰＥＳＫＤＱＫＱＫＩＩＥＥＦＧＥＧＹＦＩＬＫＤＧＶＹＥＷＶＮＡＧＫＬＫＩＫＫＧＳＳＫＱＳＳＳＥＬＶＤＳＤＩＬＫＤＳＦＤＬＡＳＥＬＫＧＥＫＬＭＬＹＲＤＰＳＧＮＶＦＰＳＤＫＷＭＡＡＧＶＦＦＧＫＬＥＲＩＬＩＳＫＬＴＮＱＹＳＩＳＴＩＥＤＤＳＳＫＱＳＭＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号５４）
[285]一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、アルゴノート
タンパク質を含む。このような核酸プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質の一例は、ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ）（ＮｇＡｇｏ）由来のアルゴノートタンパク質である。ＮｇＡｇｏは、ｓｓＤＮＡ誘導エンドヌクレアーゼである。ＮｇＡｇｏは、約２４ヌクレオチドの５’リン酸化ｓｓＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を結合してその標的部位に誘導し、ｇＤＮＡ 部位でＤＮＡ二本鎖切断を行う。Ｃａｓ９とは対照的に、ＮｇＡｇｏ－ｇＤＮＡ系は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要としない。ヌクレアーゼ不活性ＮｇＡｇｏ（ｄＮｇＡｇｏ）を使用すると、標的となる可能性のある塩基を大幅に拡張し得る。ＮｇＡｇｏの特徴付けおよび使用は、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１６ Ｊｕｌ；３４（７）：７６８－７３．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２７１３６０７８；Ｓｗａｒｔｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．５０７（７４９１）（２０１４）：２５８－６１；およ
びＳｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３（１０）（２０１５）：５１２０－９に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
[286]一部の実施形態では、プロトスペーサー配列は、表１または表２４に列挙された
プロトスペーサー配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、プロトスペーサー配列は、表１または表２４に列挙されたプロトスペーサー配列のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、プロトスペーサー配列は、表１または表２４に列挙されるプロトスペーサー配列のいずれか１つである。一部の実施形態では、このプロトスペーサー配列は、配列番号１３～１５、５０、６６～６９、８１～２５２、および１５９４～１６１７の配列のうちいずれか１つに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このプロトスペーサー配列は、配列番号１３～１５、５０、６６～６９、８１～２５２、および１５９４～１６１７の配列のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、このプロトスペーサー配列は、配列番号１３～１５、５０、６６～６９、８１～２５２、および１５９４～１６１７の配列のうちいずれか１つである。
ガイドポリヌクレオチド
[287]本開示のいくつかの態様は、本明細書において提供される融合タンパク質のいず
れか、およびプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えば塩基エディターまたは融合タンパク質のＣａｓ９ドメインに結合したガイドポリヌクレオチドを含む複合体を提供する。
[288]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドポリヌクレオチド、ガ
イドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、またはそれをコードする核酸である。
[289]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、単一の核酸配列を含む。一部
の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、２つの核酸配列を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、１５～１００ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な少なくとも１０個の連続ヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の連続したヌクレオチドであって、標的配列に相補的である連続ヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、標的配列はＤＮＡ配列である。一部の実施形態では、標的配列は、哺乳動物のゲノム中の配列である。一部の実施形態では、標的配列は、ヒトのゲノム中の配列である。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、正規のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に直接隣接している。一部の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、疾患または障害に関連する配列に相補的である。一部の実施形態では、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、ＰＣＳＫ９遺伝子、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはＡＰＯＣ３遺伝子に変異を有する疾患または障害に関連する配列に相補的である。
[290]本開示のいくつかの態様は、融合タンパク質、または本明細書で提供されるガイ
ド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）および核酸塩基エディターを含む複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの態様は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を、本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかと、および少なくとも１つのガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）と接触させることを含む方法を提供し、このガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、約１５～１００ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、正規のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に直接隣接している。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、正規のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に直接隣接していない。一部の実施形態では、標的配列の３’末端は、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、またはＣＡＡ配列に直接隣接している。
[291]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態
では、ガイドポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、改変された人工ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、単一または単一分子のポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、二重ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、リンカーによって連結された二重ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、非核酸リンカーによって連結された二重ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ペプチドリンカーまたは化学リンカーによって連結された二重ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはシングルガイドＲＮＡである。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質、例えば、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を、標的核酸分子上の標的配列へガイドし得、ここで、ｇＲＮＡは、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質とハイブリダイズし、標的配列を改変する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡおよび塩基エディター融合タンパク質は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であってもよい。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体などのＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体であり得る。
[292]ｇＲＮＡは、少なくとも３つの領域、すなわち：染色体配列の標的部位の相補鎖
に結合できる５’末端の第１領域（スペーサー領域）と、ステムループ構造を形成し得る第２の内部領域構造と、一本鎖にし得る３番目の３’領域と、を含んでもよい。各ガイドＲＮＡの第１の領域はまた、各ｇＲＮＡがタンパク質、例えばＣａｓ９を、特定の標的部位に誘導するように異なってもよい。さらに、各ｇＲＮＡの第２および第３の領域は、全てのｇＲＮＡで同一であり得る。ｇＲＮＡの第２の領域は、二次構造を形成し得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡによって形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）およびループを含み得る。ループとステムの長さは異なってもよい。一部の実施形態では、ループは、長さが約３～約１０ヌクレオチドの範囲であり得る。一部の実施形態では、ステムは、長さが約６～約２０ヌクレオチドの範囲であり得る。ステムは、１～１０ヌクレオチドまたは約１０ヌクレオチドのバルジを１つまたは複数含み得る。一部の実施形態では、第２の領域の全長は、長さが約１６から６０ヌクレオチドの範囲であり得る。一部の実施形態では、ループは約４ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、ステムの長さは約１２であり得る。３’末端のｇＲＮＡの第３の領域は、本質的に一本鎖であってもよい。一部の実施形態では、第３の領域は、目的の細胞の任意の染色体配列に相補的でなく、ｇＲＮＡの残りの部分に相補的でない場合がある。さらに、第３の領域の長さは変動してもよい。一部の実施形態では、第３の領域は、長さが３ヌクレオチドを超えても、または４ヌクレオチドを超えてもよい。例えば、第３の領域の長さは、長さが約５～
６０ヌクレオチドの範囲であり得る。
[293]塩基エディターシステム用のｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）
およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含んでもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、標的核酸分子上の標的配列の相補鎖とハイブリダイズする標的化配列（またはスペーサー配列）を含んでもよい。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部に相補的でかつハイブリダイズするフラッグポールも含んでもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、細菌のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写された天然に存在するｃｒＲＮＡの構造に類似し得、ここで標的化配列は、塩基エディターシステムにおいてＣａｓ９のプロトスペーサーとして作用する。ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化配列を介して、目的の任意の配列を標的にし得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列と標的核酸分子上の標的配列との間の相補性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列および標的核酸分子上の標的配列は、１００％相補的であり得る。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列および標的核酸分子上の標的配列は、少なくとも１つのミスマッチを含み得る。例えば、ｇＲＮＡの標的化配列および標的核酸分子上の標的配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のミスマッチを含み得る。
[294]一部の実施形態では、標的化配列の長さは、塩基エディターシステムのＣＲＩＳ
ＰＲ／Ｃａｓ構成要素および使用される構成要素に依存する。例えば、異なる細菌種由来の異なるＣａｓタンパク質は、様々な最適な標的化配列長を有する。したがって、標的化配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、または５０以上のヌクレオチド長を含み得る。一部の実施形態では、標的化配列は、長さ１８～２４ヌクレオチドを含んでいた。一部の実施形態では、標的化配列は、長さ１９～２１ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、長さ２０ヌクレオチドを含む。
[295]一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲ
ＮＡ」である。一部の実施形態では、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１および第２のＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成（例えば、リピートおよびアンチリピート）を介してＲＮＡ二本鎖を形成し得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」である。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに共有結合したｃｒＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合され得る。一部の実施形態では、単分子ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成を介してステムループ構造を含み得る。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を誘導し得る「Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ」である。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と活性複合体を形成し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ改変を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む。「ｇＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」という用語は、本出願全体で同じ意味で使用されている。一部の実施形態では、複数のガイドＲＮＡを使用してもよい。各ガイドＲＮＡには、塩基エディターシステムが複数の標的配列を変更するように、異なる標的化配列が含まれている。一部の実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡが、塩基エディター複合体内の活性または安定性などの同じまたは異なる特性を有し得る。複数のガイドＲＮＡを使用する場合、各ガイドＲＮＡを同じ発現カセットまたは異なる発現カセットにコードしてもよい。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。
[296]一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするｇＲＮＡまたはｍＲＮＡが
改変される。この改変は、化学的変更、合成改変、ヌクレオチド付加、および／またはヌクレオチド除去を含んでもよく、改変ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、ｇＲＮＡに存在し得る。１つまたは複数の改変ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡまたはＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、「改変」ＲＮＡと呼ばれ、標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、およびＵ残基の代わりにまたはその追加で使用される１つまたは複数の非天然および／または天然の構成要素または構成の存在を表す。一部の実施形態では、改変ＲＮＡは、非標準ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成される。改変ヌクレオシドおよび改変ヌクレオチドは、以下のうちの１つまたは複数を含んでもよい：（ｉ）リン酸ジエステル主鎖結合における非連結リン酸塩酸素の一方または両方および／または連結するリン酸塩酸素のうちの１つまたは複数の変更、例えば置き換え（典型的な主鎖改変）；（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えばリボース糖の２’ヒドロキシルの変更、例えば置き換え（例示的な糖改変）；（ｉｉｉ）「脱ホスホ」リンカーによるリン酸部分の大規模な置換（典型的な主鎖改変）；（ｉｖ）非標準核酸塩基を含む、天然に存在する核酸塩基の改変または置換（例示的な塩基改変）；（ｖ）リボース－リン酸主鎖の置き換えまたは改変（典型的な主鎖改変）；（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の改変、例えば、末端リン酸基の除去、付加、改変、もしくは置換、または部分、キャップ、もしくはリンカーのコンジュゲーション（３’または５’キャップ改変などは、糖および／または主鎖改変を含み得る）；ならびに（ｖｉｉ）糖の改変または置き換え（例示的な糖改変）。改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによるゲノム編集を強化し得る。改変は、ｇＲＮＡのキラリティーを変更し得る。場合によっては、改変後にキラリティーは均一であっても、または立体的であってもよい。ガイドＲＮＡを切断することもし得る。短縮は、望ましくないオフターゲット変異誘発を減らすために使用し得る。短縮は、任意の数のヌクレオチド欠失を含んでもよい。例えば、短縮は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０またはそれ以上のヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書で使用される「キャップ」という用語は、１つまたは複数の特別に変更または改変されたヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡの５’末端の特別に変更または改変されたヌクレオチドを指すために使用され得る。一部の実施形態では、キャップは改変グアニン（Ｇ）ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キャップは、７－メチルグアノシン（Ｎ７－メチルグアノシンまたはｍ７Ｇ）の付加によるｍＲＮＡの５’末端改変を指す。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ構造の「キャッピング」は、翻訳開始、スプライシング、細胞内輸送、およびターンオーバーを含む様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。一部の実施形態では、５’キャップは、ｍＲＮＡの安定性および翻訳効率を高める。例示的なキャップアナログとしては、限定するものではないが、標準キャップアナログｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、アンチ・リバース・キャップアナログ（ＡＲＣＡ）ｍ７，３’－ＯＧｐｐｐＧ（または３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）、非メチル化キャップアナログ Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ａ＋１部位ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａのメチル化キャップアナログ、およびＡ＋１部位Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡのＡ＋１部位の非メチル化キャップアナログが挙げられる。ｍＲＮＡキャップアナログを得るさらなる方法は、その全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｏｗａｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ２００８ １４（６）：１１１９－１１３１に記載されている。
[297]一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、表１または表２４に列挙されるガイ
ド配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、表１または表２４に列挙されるガイドＲＮＡ配列のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ
配列は、表１または表２４に列挙されるガイドＲＮＡ配列のいずれか１つである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、配列番号９～１１、５５、５９、２５３～４５２、１６１８～１６３５、１６３７～１８００、１８０２～２１３５および２１９１の配列のうちいずれか１つに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、配列番号９～１１、５５、５９、２５３～４５２、１６１８～１６３５、１６３７～１８００、１８０２～２１３５および２１９１の配列のうちいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、配列番号９～１１、５５、５９、２５３～４５２、１６１８～１６３５、１６３７～１８００、１８０２～２１３５および２１９１の配列のうちいずれか１つである。
オフターゲット効果
[298]標準的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集では、ｇＲＮＡにエンコードされた
プロトスペーサー配列と高度な配列類似性を共有する部位で、オフターゲット変異誘発（意図した標的部位以外のゲノム部位での編集）が発生し得る。
[299]本明細書で使用される場合、オフターゲット効果は、意図された標的部位以外の
ゲノム部位、例えば、ガイドＲＮＡ配列によって認識されるプロトスペーサー配列における、インデルを含む改変を指すために使用され得る。塩基編集の文脈では、オフターゲット編集は、意図した標的部位から離れたゲノム部位でも、または意図した標的部位に近接したゲノム部位でも発生し得る。例えば、塩基編集ウィンドウ内の標的核酸塩基以外の１つまたは複数の塩基を編集し得る（「バイスタンダー編集」）。特定の実施形態では、オフターゲット塩基編集、例えばバイスタンダー編集は、標的遺伝子の発現にも機能にも影響を与えない。
[300]ゲノム内の潜在的なオフターゲット配列候補は、例えば、ＭＩＴ特異性スコア（
ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｏｒ．ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／によって計算；最小スコア５０）を使用して、または、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学アッセイ、例えば、ＯＮＥ－ｓｅｑを用いて、ヒトゲノムのバイオインフォマティクス分析によって予測され得る。
[301]オフターゲット編集は、配列分析によって決定され得る。一部の実施形態では、
オフターゲット編集は、ゲノム内の潜在的なオフターゲット部位での正味の核酸塩基編集を使用して計算される。例えば、正味の核酸塩基編集効率は、無塩基エディターまたは無ガイドＲＮＡを対照として使用して決定し得、ここで正味の核酸塩基編集効率は、予測されたオフターゲット部位で対照の細胞で観察された編集率によって影響を受ける、塩基エディターｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡを封入するＬＮＰと接触させた細胞で観察される編集速度によって得られる。オフターゲット編集を推定および削減するための追加の方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＲｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０１８ １９（１２）：７７０－７８８に記載されている。
[302]ｇＲＮＡおよび標的化配列（またはスペーサー配列）を選択、設計、および検証
する方法は、本明細書に記載されており、当業者に公知である。ソフトウェアツールを使用して、標的核酸配列に対応するｇＲＮＡを最適化してもよく。例えば、ゲノム全体にまたがる総オフターゲット活性を最小限に抑えてもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を使用した可能な標的化ドメインの選択ごとに、ミスマッチ塩基対の特定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）までを含む、ゲノム全体にまたがって、全てのオフターゲット配列（先行する選択されるＰＡＭ、例えば、ＮＡＧま
たはＮＧＧ）が特定され得る。標的部位に相補的なｇＲＮＡの最初の領域を特定し得、全ての第１の領域（例えば、ｃｒＲＮＡ）は、その合計予測オフターゲットスコアに従ってランク付けされ得る。トップランクの標的化ドメインは、最大のオンターゲット活性および最小のオフターゲット活性を有する可能性が高いドメインを表す。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列検索アルゴリズムを使用して、Ｃａｓ９で使用するためのｇＲＮＡのｃｒＲＮＡにおける標的配列を同定し得る。公開ツールｃａｓ－ｏｆｆｉｎｄｅｒ（それらのゲノムワイドオフターゲット特性を算出した後にガイドをスコア付けする）に基づくカスタムｇＲＮＡ設計ソフトウェアも、ｇＲＮＡの設計に使用し得る（Ｂａｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ：Ａ ｆａｓｔ ａｎｄ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｔｈａｔ ｓｅａｒｃｈｅｓ ｆｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｃａｓ９ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０、１４７３－１４７５（２０１４））。一部の実施形態では、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラムを使用して、入力ＤＮＡ配列中の複雑性の低い反復エレメントおよび領域をスクリーニングし得る。さらに、意図せずに標的となる可能性のある残基（例えば、標的核酸遺伝子座内のｓｓＤＮＡ上に潜在的に存在する可能性のあるオフターゲット残基）の数を最小限に抑えて、核酸塩基エディターシステム中のデアミナーゼドメインの潜在的な基質乱雑性の影響を軽減し得る。候補ｇＲＮＡは、当該技術分野で公知の方法および／または本明細書に記載の方法を使用することによって機能的に評価され得る。
[303]一部の実施形態では、塩基エディターシステムにおけるＣａｓ９タンパク質の標
的配列は、１つまたは複数の種における目的の遺伝子の標的配列の存在に基づいて選択され得る。例えば、配列が目的の遺伝子のヒトおよびカニクイザルオルソログの両方における標的配列と一致する場合、その配列を標的配列として選択し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標的配列は、ＭＩＴ特異性スコア（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｏｒ．ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／によって計算）によって判断される、予測されるオフターゲットプロファイルに基づいて選択され得る。例えば、配列が好ましい予測されたオフターゲットプロファイルを有する場合（例えば、ＭＩＴ特異性スコアによって判断される場合、５０の最小スコア）、配列を標的配列として選択し得る。一部の実施形態では、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の標的配列は、標的遺伝子のスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位内のアデニン塩基を編集する能力に基づいて選択され得る。一部の実施形態では、例えば、アデニンがＡＢＥの編集ウィンドウ内にある場合、アデニンの位置に基づいて、ＡＢＥの標的配列を選択し得る。
[304]本明細書に記載のｇＲＮＡは、化学的、酵素的、またはそれらの組み合わせで合
成され得る。例えば、ｇＲＮＡは、標準的なホスホラミダイトベースの固相合成法を使用して合成され得る。あるいは、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、ファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター制御配列に作動可能に連結することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され得る。適切なファージプロモーター配列の例としては、限定するものではないが、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーター配列、またはそれらのバリエーションが挙げられる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２つの別個の分子（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み、一方の分子（例えば、ｃｒＲＮＡ）は化学的に合成されてもよく、他方の分子（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）は酵素的に合成されてもよい。
[305]いくつかの態様では、本明細書に記載のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）お
よび塩基エディター融合タンパク質またはこの塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変のための組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、組成物は、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターをさらに含む。一部の実施形態では、塩基エディター融合タンパク質はＣａｓ９タンパク質を
含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９である。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。薬学的に許容される担体の非限定的な例は、本出願の「医薬組成物および処置の方法」のセクションに列挙されている。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物を、脂質ナノ粒子で提供され得る。
化学的に改変されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
[306]本明細書に提供される本開示は、任意の一般的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、例え
ば、本明細書に記載の塩基エディターシステムと関連して使用され得る、化学的に改変されたＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に関する。ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、短鎖ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｄｇＲＮＡ）は、様々なヌクレオチド位置で改変を含んでもよい。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、（ｉ）ヌクレオチドでの化学的改変および（ｉｉ）未改変ヌクレオチドを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、特定のヌクレオチド位置に改変を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１つまたは複数の特定の位置に１つまたは複数の改変を含み得る。
[00307]一態様では、本明細書で提供される化学的に改変されたＣＲＩＳＰＲガイドＲ
ＮＡは、結晶構造に基づく改変を含む。特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、Ｘ線結晶構造に基づくガイド設計を使用して、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９と複合体のｇＲＮＡ改変を最適化し得る。一部の実施形態では、２’－ＯＨがＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体中のＣａｓ９タンパク質と近接しているヌクレオチドは改変されていない。一部の実施形態では、２’－ＯＨがＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体中のＣａｓ９タンパク質と接触しているヌクレオチドは改変されていない。一部の実施形態では、２’－ＯＨがＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体中の水素結合によりＣａｓ９タンパク質と接触しているヌクレオチドは改変されていない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体は、触媒前三元複合体である。一部の実施形態では、２’－ＯＨがＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体中のｇＲＮＡの別の部分と近接しているヌクレオチドは改変されていない。一部の実施形態では、２’－ＯＨがＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体中のｇＲＮＡの別の部分と接触しているヌクレオチドは改変されていない。一部の実施形態では、２’－ＯＨがＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体中の水素結合によりｇＲＮＡの別の部分と接触しているヌクレオチドは改変されていない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体は触媒前三元複合体である。当業者が理解するとおり、本明細書で使用される「衝突」という用語は、構造内で物理的に起こりそうにない重なり合う原子体積を指す。これらの状況で２’Ｏ－Ｍｅ改変を組み込むと、ＲＮＰ機能に有害な構造的再編成が生じる可能性がある。当業者が理解するとおり、本明細書で使用される用語「接触」は、２つの官能基間の安定した非共有相互作用、例えば、水素結合を意味する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体において２’－ＯＨが２’－ＯＭｅで置換された場合に、ｇＲＮＡの別の部分との衝突が予測されるヌクレオチドは改変されていない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体において２’－ＯＨが２’－ＯＭｅで置換されている場合、ｇＲＮＡにおいて別の２’－ＯＨとの衝突が予測されるヌクレオチドは改変されていない。一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体は触媒前三元複合体である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体中のＣａｓタンパク質残基から溶媒に暴露されているか、そうでなければ溶媒から離れているヌクレオチドは、化学的改変を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体中のｇＲＮＡ中の溶媒に暴露されたか、または別のヌクレオチドから離れたヌクレオチドは、化学的改変を含む。一部の実施形態では、化学的改変は２’－ＯＭｅ改変である。Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ結晶構造の追加説明は、Ｊｉａｎｇ Ｆ、Ｔａｙｌｏｒ ＤＷ、Ｃｈｅｎ ＪＳ、Ｋｏｒｎｆｅｌｄ ＪＥ、Ｚｈｏｕ Ｋ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＡＪ、Ｎｏｇａｌｅｓ Ｅ、Ｄｏｕｄｎａ ＪＡ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ＣＲＩＳＰ
Ｒ－Ｃａｓ９ Ｒ－ｌｏｏｐ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｉｍｅｄ ｆｏｒ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１６ Ｆｅｂ １９；３５１（６２７５）：８６７－７１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に含まれている。
[308]ガイドＲＮＡヌクレオチドへの改変には、限定するものではないが、２’－Ｏ－
メチル改変、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）改変、２’－フルオロ改変、ホスホロチオエート改変、逆脱塩基改変、デオキシリボヌクレオチド、二環式リボースアナログ（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、アンロック核酸（ＵＮＡ））、塩基または核酸塩基改変、ヌクレオシド間結合改変、リボネブラリン、２’－Ｏ－メチルネブラリン、または２’－デオキシネブラリンが挙げられる。改変の他の例としては、限定するものではないが、５’アデニル酸、５’グアノシン三リン酸キャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’改変、５’－５’改変、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンサー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシドアナログプリン、２’デオキシリボヌクレオシドアナログピリミジン、リボヌクレオシドアナログ、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシドアナログ、糖改変アナログ、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエート、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
[309]一部の実施形態では、リボース基（または糖）を改変してもよい。一部の実施形
態では、改変リボース基は、相補鎖に対するオリゴヌクレオチド結合親和性、二本鎖形成、またはヌクレアーゼとの相互作用を制御し得る。リボース基への化学的改変の例としては、限定するものではないが、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、２’－Ｏ－シアノエチル、２’－Ｏ－アセタールエステル、または二環式ヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－（５－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ））、拘束ＭＯＥ、または２’－０，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）が挙げられる。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチル改変は、オリゴヌクレオチドの結合親和性を増大し得る。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチル改変は、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性を増強し得る。一部の実施形態では、２’－フルオロ改変は、オリゴヌクレオチド結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増大し得る。本出願では、ｇＲＮＡ配列の小文字のリボヌクレオチドは、２’－ＯＭｅ改変を表す（例えば、表１または表２４）（小文字のｓは、ホスホロチオエート結合を示す）。
[310]一部の実施形態では、リン酸基は化学的に改変されていてもよい。リン酸基への
化学的改変の例としては、限定するものではないが、ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、またはホスホトリエステル改変が挙げられる。一部の実施形態では、ＰＳ結合は、例えばヌクレオチド間のホスホジエステル結合において、１つの非架
橋リン酸酸素が硫黄で置換されている結合を指してもよい。この出願では、ｇＲＮＡ配列のＰＳ改変を表すために「ｓ」を使用してもよい（例えば、表１または表２４）。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端または３’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端および３’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端または３’末端に１つ、２つ、または３つ、または３つを超えるホスホロチオエート結合を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端または３’末端に３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に３つのホスホロチオエート結合を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端または３’末端に２つおよび２つ以下（すなわち、２つだけ）の連続するホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端または３’末端に３つの連続するホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端または５’末端に配列５’－ＵｓＵｓＵ－３’を含んでもよく、Ｕはウリジンを示し、ｓはホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端または５’末端に配列５’－ｕｓｕｓｕ－３’を含んでもよく、ここで、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジンを示し、ｓはホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端または５’末端に配列５’－ｕｓｕｓｕＵＵＵ－３’を含んでもよく、Ｕおよびｕはそれぞれウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンを示し、ｓは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端または５’末端に配列５’－ｕｓｕｓｕＵｕＵ－３’を含んでもよく、Ｕおよびｕは、それぞれウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンを示し、ここでｓは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に配列５’－ｕｓｕｓｕｓｕＵｕＵ－３’を含んでもよく、Ｕおよびｕは、それぞれウリジンおよび２’－Ｏ－メチルウリジンを示し、ｓは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に配列５’－ｕｓｕｓｕｕｕｕ－３’を含んでもよく、ｕは２’－Ｏ－メチルウリジンを示し、ｓはホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。
[311]一部の実施形態では、核酸塩基は化学的に改変されていてもよい。核酸塩基への
化学的改変の例としては、限定するものではないが、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、またはハロゲン化芳香族基が挙げられる。
[312]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、ネブラリンを含む。ネブ
ラリンは、ベータ－Ｄ－リボースに由来するプリンリボヌクレオシドであり、グリコシド（Ｎ－グリコシル）連結を介して９位でベータ－Ｄ－リボフラノシル残基に結合した９Ｈ－プリンである。ネブラリンは、環外官能基も置換もないプリンリボヌクレオシドである。一部の実施形態では、それはプリンリボヌクレオシドである。一部の実施形態では、それはプリンＤ－リボヌクレオシドである。一部の実施形態では、ネブラリンはさらに化学的に改変される。本出願において、「Ｘ」、「ｘ」、および「ｄＸ」を用いて、それぞれ、ｇＲＮＡ配列（例えば、表１または表２４）において、リボネブラリン改変、２’－Ｏ－メチルネブラリン改変、および２’－デオキシネブラリン改変を描写し得る。一部の実施形態では、ネブラリンによるｇＲＮＡ配列（例えば、スペーサー領域またはｔｒａｃｒ領域）のヌクレオチド（例えば、Ａ）の置換は、ｇＲＮＡ活性に影響を与えることなくオ
フターゲット効果を低減し得る。一部の実施形態では、ネブラリン、デオキシネブラリン、または２’－Ｏ－メチルネブラリンは、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのアデニンを置換する。一部の実施形態では、ネブラリン、デオキシネブラリン、または２’－Ｏ－メチルネブラリンは、スペーサー配列にある。一部の実施形態では、ネブラリン、デオキシネブラリン、または２’－Ｏ－メチルネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、ネブラリン、デオキシネブラリン、または２’－Ｏ－メチルネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のｔｒａｃｒＲＮＡ配列中にある。一部の実施形態では、ネブラリン、デオキシネブラリン、または２’－Ｏ－メチルネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、ネブラリン、デオキシネブラリン、または２’－Ｏ－メチルネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のステムループ構造にある。
[313]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計で５０～１５０塩基
対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計で、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計で約５０～約１４０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計で約５０～約６０、約５０～約７０、約５０～約８０、約５０～約９０、約５０～約１００、約５０～約１１０、約５０～約１２０、約５０～約１３０、約５０～約１４０、約６０～約７０、約６０～約８０、約６０～約９０、約６０～約１００、約６０～約１１０、約６０～約１２０、約６０～約１３０、約６０～約１４０、約７０～約８０、約７０～約９０、約７０～約１００、約７０～約１１０、約７０～約１２０、約７０～約１３０、約７０～約１４０、約８０～約９０、約８０～約１００、約８０～約１１０、約８０～約１２０、約８０～約１３０、約８０～約１４０、約９０～約１００、約９０～約１１０、約９０～約１２０、約９０～約１３０、約９０～約１４０、約１００～約１１０、約１００～約１２０、約１００～約１３０、約１００～約１４０、約１１０～約１２０、約１１０～約１３０、約１１０～約１４０、約１２０～約１３０、約１２０～約１４０、または約１３０～約１４０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、または約１４０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計で少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、最大で合計約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、または約１４０塩基対の長さを含んでもよい。一実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計１００塩基対の長さを含んでもよい。別の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計１０３塩基対の長さを含んでもよい。
[314]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、１～１５０個の化学的に
改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８
、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計約１～約４５個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計約１～約３、約１～約５、約１～約１０、約１～約１５、約１～約２０、約１～約２５、約１～約３０、約１～約３５、約１～約４０、約１～約４５、約３～約５、約３～約１０、約３～約１５、約３～約２０、約３～約２５、約３～約３０、約３～約３５、約３～約４０、約３～約４５、約５～約１０、約５～約１５、約５～約２０、約５～約２５、約５～約３０、約５～約３５、約５～約４０、約５～約４５、約１０～約１５、約１０～約２０、約１０～約２５、約１０～約３０、約１０～約３５、約１０～約４０、約１０～約４５、約１５～約２０、約１５～約２５、約１５～約３０、約１５～約３５、約１５～約４０、約１５～約４５、約２０～約２５、約２０～約３０、約２０～約３５、約２０～約４０、約２０～約４５、約２５～約３０、約２５～約３５、約２５～約４０、約２５～約４５、約３０～約３５、約３０～約４０、約３０～約４５、約３５～約４０、約３５～約４５、約４０個～約４５個、または約４５個～約５０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計約１、約３、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計で少なくとも約１、約３、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、最大で合計約３、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計約５０～約１４０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計で約５０～約６０、約５０～約７０、約５０～約８０、約５０～約９０、約５０～約１００、約５０～約１１０、約５０～約１２０、約５０～約１３０、約５０～約１４０、約６０～約７０、約６０～約８０、約６０～約９０、約６０～約１００、約６０～約１１０、約６０～約１２０、約６０～約１３０、約６０～約１４０、約７０～約８０、約７０～約９０、約７０～約１００、約７０～約１１０、約７０～約１２０、約７０～約１３０、約７０～約１４０、約８０～約９０、約８０～約１００、約８０～約１１０、約８０～約１２０、約８０～約１３０、約８０～約１４０、約９０～約１００、約９０～約１１０、約９０～約１２０、約９０～約１３０、約９０～約１４０、約１００～約１１０、約１００～約１２０、約１００～約１３０、約１００～約１４０、約１１０～約１２０、約１１０～約１３０、約１１０～約１４０、約１２０～約１３０、約１２０～約１４０、または約１３０～約１４０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、または約１４０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計で少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態で
は、化学的に改変されたｇＲＮＡは、最大で合計約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、または約１４０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計５４個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。別の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、合計６２個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[315]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、約１％～約１００％の化
学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、約１％～約１０％、約１％～約２０％、約１％～約３０％、約１％～約４０％、約１％～約５０％、約１％～約６０％、約１％～約７０％、約１％～約８０％、約１％～約９０％、約１％～約９５％、約１％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約９５％、約１０％～約１００％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～約１００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、または約９５％～約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、少なくとも約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、最大で約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[316]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ配列の５’－３
’方向の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０位置のうち１つまたは複数の位置に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[317]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ配列の５’末端
から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、または１４９塩基対である位置のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[318]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ配列の３’末端
から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、または１４９塩基対である１つまたは複数の位置で化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[319]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであってもよい
。「ｇＲＮＡ」および「ｓｇＲＮＡ」という用語は、本出願では互換的に使用される。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つまたは複数の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計で５０～１５０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計約５０～約１４０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計で約５０～約６０、約５０～約７０、約５０～約８０、約５０
～約９０、約５０～約１００、約５０～約１１０、約５０～約１２０、約５０～約１３０、約５０～約１４０、約６０～約７０、約６０～約８０、約６０～約９０、約６０～約１００、約６０～約１１０、約６０～約１２０、約６０～約１３０、約６０～約１４０、約７０～約８０、約７０～約９０、約７０～約１００、約７０～約１１０、約７０～約１２０、約７０～約１３０、約７０～約１４０、約８０～約９０、約８０～約１００、約８０～約１１０、約８０～約１２０、約８０～約１３０、約８０～約１４０、約９０～約１００、約９０～約１１０、約９０～約１２０、約９０～約１３０、約９０～約１４０、約１００～約１１０、約１００～約１２０、約１００～約１３０、約１００～約１４０、約１１０～約１２０、約１１０～約１３０、約１１０～約１４０、約１２０～約１３０、約１２０～約１４０、または約１３０～約１４０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、または約１４０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計で少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、最大で合計約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、または約１４０塩基対の長さを含んでもよい。一実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計１００塩基対の長さを含んでもよい。別の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計１０３塩基対の長さを含んでもよい。
[320]一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計１～１５０個の化
学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計で約１～約４５個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計で約１～約３、約１～約５、約１～約１０、約１～約１５、約１～約２０、約１～約２５、約１～約３０、約１～約３５、約１～約４０、約１～約４５、約３～約５、約３～約１０、約３～約１５、約３～約２０、約３～約２５、約３～約３０、約３～約３５、約３～約４０、約３～約４５、約５～約１０、約５～約１５、約５～約２０、約５～約２５、約５～約３０、約５～約３５、約５～約４０、約５～約４５、約１０～約１５、約１０～約２０、約１０～約２５、約１０～約３０、約１０～約３５、約１０～約４０、約１０～約４５、約１５～約２０、約１５～約２５、約１５～約３０、約１５～約３５、約１５～約４０、約１５～約４５、約２０～約２５、約２０～約３０、約２０～約３５、約２０～約４０、約２０～約４５、約２５～約３０、約２５～約３５、約２５～約４０、約２５～約４５、約３０～約３５、約３０～約４０、約３０～約４５、約３５～約４０、約３５～約４５、約４０個～約４５個、または約４５個～約５０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計約１、約３、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３
０、約３５、約４０、約４５、または約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計で少なくとも約１、約３、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、最大で合計約３、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計約５０～約１４０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計約５０～約６０、約５０～約７０、約５０～約８０、約５０～約９０、約５０～約１００、約５０～約１１０、約５０～約１２０、約５０～約１３０、約５０～約１４０、約６０～約７０、約６０～約８０、約６０～約９０、約６０～約１００、約６０～約１１０、約６０～約１２０、約６０～約１３０、約６０～約１４０、約７０～約８０、約７０～約９０、約７０～約１００、約７０～約１１０、約７０～約１２０、約７０～約１３０、約７０～約１４０、約８０～約９０、約８０～約１００、約８０～約１１０、約８０～約１２０、約８０～約１３０、約８０～約１４０、約９０～約１００、約９０～約１１０、約９０～約１２０、約９０～約１３０、約９０～約１４０、約１００～約１１０、約１００～約１２０、約１００～約１３０、約１００～約１４０、約１１０～約１２０、約１１０～約１３０、約１１０～約１４０、約１２０～約１３０、約１２０～約１４０、または約１３０～約１４０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、または約１４０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計で少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、最大で合計約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、または約１４０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計５４個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。別の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、合計６２個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[321]一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、約１％～約１００％の
化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、約１％～約１０％、約１％～約２０％、約１％～約３０％、約１％～約４０％、約１％～約５０％、約１％～約６０％、約１％～約７０％、約１％～約８０％、約１％～約９０％、約１％～約９５％、約１％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約９５％、約１０％～約１００％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～約１００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、または約９５％～約１００％の化学的に改変され
たヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、少なくとも約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、最大で約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[322]一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’
－３’方向に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０位のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[323]一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’
末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、または１４９塩基対の位置のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[324]一部の実施形態では、化学的に改変されたｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’
末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、
９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、または１４９塩基対の位置のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[325]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、スペー
サーまたはプロトスペーサー領域、すなわち標的配列に１つまたは複数の化学的改変を有し得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが１０から３０塩基対のスペーサー配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対の長さのスペーサー配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが約１０～約３０塩基対のスペーサー配列を含んでもよい。一部の実施形態では、この化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約１０～約１５、約１０～約２０、約１０～約２５、約１０～約３０、約１５～約２０、約１５～約２５、約１５～約３０、約２０～約２５、約２０～約３０、または約２５～約３０塩基対の長さのスペーサー配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが約１０、約１５、約２０、約２５、または約３０塩基対のスペーサー配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが少なくとも約１０、約１５、約２０、または約２５塩基対のスペーサー配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、最大で約１５、約２０、約２５、または約３０塩基対の長さのスペーサー配列を含んでもよい。一実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さ１８塩基対のスペーサー配列を含んでもよい。別の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さ２２塩基対のスペーサー配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さ２０塩基対のスペーサー配列を含んでもよい。
[326]一部の実施形態では、スペーサー配列は、合計で１～３０個の化学的に改変され
たヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー領域は、合計１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、合計約１～約１０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、合計約１～約２、約１～約３、約１～約４、約１～約５、約１～約６、約１～約７、約１～約８、約１～約９、約１～約１０、約２～約３、約２～約４、約２～約５、約２～約６、約２～約７、約２～約８、約２～約９、約２～約１０、約３～約４、約３～約５、約３～約６、約３～約７、約３～約８、約３～約９、約３～約１０、約４～約５、約４～約６、約４～約７、約４～約８、約４～約９、約４～約１０、約５～約６、約５～約７、約５～約８、約５～約９、約５～約１０、約６～約７、約６～約８、約６～約９、約６～約１０、約７～約８、約７～約９、約７～約１０、約８～約９、約８個～約１０個、または約９個～約１０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、合計約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、合計で少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、または約９の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、最大で合計約２、約３、約４、約５、
約６、約７、約８、約９、または約１０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、合計約１０～約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、合計で約１０～約１５、約１０～約２０、約１０～約２５、約１０～約３０、約１５～約２０、約１５～約２５、約１５～約３０、約２０～約２５、約２０～約３０、または約２５～約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、合計で約１０、約１５、約２０、約２５、または約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、合計で少なくとも約１０、約１５、約２０、または約２５個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、最大で合計約１５、約２０、約２５、または約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、スペーサー配列は、合計３つの化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。別の実施形態では、スペーサー配列は、合計５つの化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[327]一部の実施形態では、スペーサー配列は、１％～１００％の化学的に改変された
ヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１％～約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１％～約１０％、約１％～約２０％、約１％～約３０％、約１％～約４０％、約１％～約５０％、約１％～約６０％、約１％～約７０％、約１％～約８０％、約１％～約９０％、約１％～約９５％、約１％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約９５％、約１０％～約１００％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～約１００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、または約９５％～約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、少なくとも約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー配列は、最大で約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[328]一部の実施形態では、化学的に改変されたスペーサー配列は、スペーサー配列の
５’－３’方向に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０の位置のうち１つまたは複数に化学的に改変したヌクレオチドを有してもよい。
[329]一部の実施形態では、化学的に改変されたスペーサー領域は、スペーサー配列の
５’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９塩基対である位置のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[330]一部の実施形態では、化学的に改変されたスペーサー領域は、スペーサー配列の
３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９塩基対である１つまたは複数の位置に、化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[331]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｔｒａ
ｃｒＲＮＡ配列に１つまたは複数の化学的改変を有し得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが３０～１００塩基対のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、または１３０塩基対の長さのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが約３０～約１３０塩基対のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約３０～約４０、約３０～約５０、約３０～約６０、約３０～約７０、約３０～約７５、約３０～約８０、約３０～約９０、約３０～約１００、約３０～約１１０、約３０～約１２０、約３０～約１３０、約４０～約５０、約４０～約６０、約４０～約７０、約４０～約７５、約４０～約８０、約４０～約９０、約４０～約１００、約４０～約１１０、約４０～約１２０、約４０～約１３０、約５０～約６０、約５０～約７０、約５０～約７５、約５０～約８０、約５０～約９０、約５０～約１００、約５０～約１１０、約５０～約１２０、約５０～約１３０、約６０～約７０、約６０～約７５、約６０～約８０、約６０～約９０、約６０～約１００、約６０～約１１０、約６０～約１２０、約６０～約１３０、約７０～約７５、約７０～約８０、約７０～約９０、約７０～約１００、約７０～約１１０、約７０～約１２０、約７０～約１３０、約７５～約８０、約７５～約９０、約７５～約１００、約７５～約１１０、約７５～約１２０、約７５～約１３０、約８０～約９０、約８０～約１００、約８０～約１１０、約８０～約１２０、約８０～約１３０、約９０～約１００、約９０～約１１０、約９０～約１２０、約９０～約１３０、約１００～約１１０、約１００～約１２０、約１００～約１３０、約１１０～約１２０、約１１０～約１３０、または約１２０～約１３０塩基対の長さのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または長さ約１３０塩基対のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、少なくとも約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、または約１２０塩基対の長さのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、最大で約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、
約１２０、または約１３０塩基対の長さのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さ７０塩基対のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さ７３塩基対のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが６８塩基対のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さ７１塩基対のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。
[332]一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計１～１３０個の化学的に改
変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、または１３０個の化学的に改変されたヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計約１～約１０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計約１～約２、約１～約３、約１～約４、約１～約５、約１～約６、約１～約７、約１～約８、約１～約９、約１～約１０、約２～約３、約２～約４、約２～約５、約２～約６、約２～約７、約２～約８、約２～約９、約２～約１０、約３～約４、約３～約５、約３～約６、約３～約７、約３～約８、約３～約９、約３～約１０、約４～約５、約４～約６、約４～約７、約４～約８、約４～約９、約４～約１０、約５～約６、約５～約７、約５～約８、約５～約９、約５～約１０、約６～約７、約６～約８、約６～約９、約６～約１０、約７～約８、約７～約９、約７～約１０、約８～約９、約８個～約１０個、または約９個～約１０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計で、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、または約９の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計で最大で約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計約１０～約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計で約１０～約１５、約１０～約２０、約１０～約２５、約１０～約３０、約１５～約２０、約１５～約２５、約１５～約３０、約２０～約２５、約２０～約３０、または約２５～約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計約１０、約１５、約２０、約２５、または約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計で少なくとも約１０、約１５、約２０、または約２５の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー領域は、最大で合計約１５、約２０、約２５、または約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計で約３０～約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計で約３０～約４０、約３０～約５０、約３０～約６０、約３０
～約７０、約３０～約７５、約３０～約８０、約３０～約９０、約３０～約１００、約３０～約１１０、約３０～約１２０、約３０～約１３０、約４０～約５０、約４０～約６０、約４０～約７０、約４０～約７５、約４０～約８０、約４０～約９０、約４０～約１００、約４０～約１１０、約４０～約１２０、約４０～約１３０、約５０～約６０、約５０～約７０、約５０～約７５、約５０～約８０、約５０～約９０、約５０～約１００、約５０～約１１０、約５０～約１２０、約５０～約１３０、約６０～約７０、約６０～約７５、約６０～約８０、約６０～約９０、約６０～約１００、約６０～約１１０、約６０～約１２０、約６０～約１３０、約７０～約７５、約７０～約８０、約７０～約９０、約７０～約１００、約７０～約１１０、約７０～約１２０、約７０～約１３０、約７５～約８０、約７５～約９０、約７５～約１００、約７５～約１１０、約７５～約１２０、約７５～約１３０、約８０～約９０、約８０～約１００、約８０～約１１０、約８０～約１２０、約８０～約１３０、約９０～約１００、約９０～約１１０、約９０～約１２０、約９０～約１３０、約１００～約１１０、約１００～約１２０、約１００～約１３０、約１１０～約１２０、約１１０～約１３０、または約１２０～約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計で約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計で、少なくとも約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、または約１２０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計で最大で約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計５１個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。別の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、合計５９個の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[333]一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１％～１００％の化学的に改変
されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１％～約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１％～約１０％、約１％～約２０％、約１％～約３０％、約１％～約４０％、約１％～約５０％、約１％～約６０％、約１％～約７０％、約１％～約８０％、約１％～約９０％、約１％～約９５％、約１％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約９５％、約１０％～約１００％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～約１００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、または約９５％～約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも約１％、約１
０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、最大で約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[334]一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒ
ＲＮＡ配列中で５’－３’方向に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、または１３０の位置のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[335]一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒ領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列の５’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、または１２９塩基対である位置のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[336]一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒ領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡ
配列の３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、または１２９塩基対である１つまたは複数の位置に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[337]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ配列の５’末端
に１つまたは複数の化学的改変を有し得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇ
ＲＮＡは、ｇＲＮＡ配列の５’末端に１つまたは複数の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、この化学的に改変されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ配列の３’末端に１つまたは複数の化学的改変を有し得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ配列の３’末端に１つまたは複数の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[338]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含み得る。
一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、１つまたは複数の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、３０～５０塩基対の長さであり得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基対の長さであり得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、約３０～約５０塩基対の長さであり得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、約３０～約３２、約３０～約３４、約３０～約３６、約３０～約３８、約３０～約４０、約３０～約４２、約３０～約４４、約３０～約４６、約３０～約４８、約３０～約５０、約３２～約３４、約３２～約３６、約３２～約３８、約３２～約４０、約３２～約４２、約３２～約４４、約３２～約４６、約３２～約４８、約３２～約５０、約３４～約３６、約３４～約３８、約３４～約４０、約３４～約４２、約３４～約４４、約３４～約４６、約３４～約４８、約３４～約５０、約３６～約３８、約３６～約４０、約３６～約４２、約３６～約４４、約３６～約４６、約３６～約４８、約３６～約５０、約３８～約４０、約３８～約４２、約３８～約４４、約３８～約４６、約３８～約４８、約３８～約５０、約４０～約４２、約４０～約４４、約４０～約４６、約４０～約４８、約４０～約５０、約４２～約４４、約４２～約４６、約４２～約４８、約４２～約５０、約４４～約４６、約４４～約４８、約４４～約５０、約４６～約４８、約４６～約５０、または約４８～約５０塩基対の長さであり得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８、または約５０塩基対の長さであり得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、少なくとも約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、または約４８塩基対の長さであり得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、最大で約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８、または約５０塩基対の長さであり得る。
[339]一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、合計で１～５０の化学的に改変されたヌク
レオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、約１～約１０化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、約１～約２、約１～約３、約１～約４、約１～約５、約１～約６、約１～約７、約１～約８、約１～約９、約１～約１０、約２～約３、約２～約４、約２～約５、約２～約６、約２～約７、約２～約８、約２～約９、約２～約１０、約３～約４、約３～約５、約３～約６、約３～約７、約３～約８、約３～約９、約３～約１０、約４～約５、約４～約６、約４～約７、約４～約８、約４～約９、約４～約１０、約５～約６、約５～約７、約５～約８、約５～約９、約５～約１０、約６～約７、約６～約８、約６～約９、約６～約１０、約７～約８、約７～約９、約７～約１０、約８～約９、約８～約１０、または約９～約１０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で約１、約２、約３、約４、約
５、約６、約７、約８、約９、または約１０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、または約９の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、最大で、合計約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、約１０～約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、約１０～約１５、約１０～約２０、約１０～約２５、約１０～約３０、約１５～約２０、約１５～約２５、約１５～約３０、約２０～約２５、約２０～約３０、または約２５～約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、約１０、約１５、約２０、約２５、または約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、少なくとも約１０、約１５、約２０、または約２５の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、最大で、合計約１５、約２０、約２５、または約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、約３０～約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、約３０～約３２、約３０～約３４、約３０～約３６、約３０～約３８、約３０～約４０、約３０～約４２、約３０～約４４、約３０～約４６、約３０～約４８、約３０～約５０、約３２～約３４、約３２～約３６、約３２～約３８、約３２～約４０、約３２～約４２、約３２～約４４、約３２～約４６、約３２～約４８、約３２～約５０、約３４～約３６、約３４～約３８、約３４～約４０、約３４～約４２、約３４～約４４、約３４～約４６、約３４～約４８、約３４～約５０、約３６～約３８、約３６～約４０、約３６～約４２、約３６～約４４、約３６～約４６、約３６～約４８、約３６～約５０、約３８～約４０、約３８～約４２、約３８～約４４、約３８～約４６、約３８～約４８、約３８～約５０、約４０～約４２、約４０～約４４、約４０～約４６、約４０～約４８、約４０～約５０、約４２～約４４、約４２～約４６、約４２～約４８、約４２～約５０、約４４～約４６、約４４～約４８、約４４～約５０、約４６～約４８、約４６～約５０、または約４８～約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８、または約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、合計で、少なくとも約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、または約４８の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、最大で、合計約３２、約３４、約３６、約３８、約４０、約４２、約４４、約４６、約４８、または約５０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[340]一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、１％～１００％化学的に改変されたヌクレ
オチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、約１％～約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、約１％～約１０％、約１％～約２０％、約１％～約３０％、約１％～約４０％、約１％～約５０％、約１％～約６０％、約１％～約７０％、約１％～約８０％、約１％～約９０％、約１％～約９５％、約１％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約９５％、約１０％～約１００％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、
約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～約１００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、または約９５％～約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、少なくとも約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、最大で約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[341]一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列におい
て５’－３’方向で位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[342]一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列の５’
末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９塩基対である位置のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[343]一部の実施形態では、化学的に改変されたｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列の３’
末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９塩基対である位置のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[344]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含み
得る。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、１つまたは複数の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、５０～１３０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１
２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、または１３０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約３０～約１３０塩基対の長さを含み得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約３０～約４０、約３０～約５０、約３０～約６０、約３０～約７０、約３０～約７５、約３０～約８０、約３０～約９０、約３０～約１００、約３０～約１１０、約３０～約１２０、約３０～約１３０、約４０～約５０、約４０～約６０、約４０～約７０、約４０～約７５、約４０～約８０、約４０～約９０、約４０～約１００、約４０～約１１０、約４０～約１２０、約４０～約１３０、約５０～約６０、約５０～約７０、約５０～約７５、約５０～約８０、約５０～約９０、約５０～約１００、約５０～約１１０、約５０～約１２０、約５０～約１３０、約６０～約７０、約６０～約７５、約６０～約８０、約６０～約９０、約６０～約１００、約６０～約１１０、約６０～約１２０、約６０～約１３０、約７０～約７５、約７０～約８０、約７０～約９０、約７０～約１００、約７０～約１１０、約７０～約１２０、約７０～約１３０、約７５～約８０、約７５～約９０、約７５～約１００、約７５～約１１０、約７５～約１２０、約７５～約１３０、約８０～約９０、約８０～約１００、約８０～約１１０、約８０～約１２０、約８０～約１３０、約９０～約１００、約９０～約１１０、約９０～約１２０、約９０～約１３０、約１００～約１１０、約１００～約１２０、約１００～約１３０、約１１０～約１２０、約１１０～約１３０、または約１２０～約１３０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、少なくとも約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、または約１２０塩基対の長さを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、最大で、合計約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０塩基対の長さを含んでもよい。
[345]一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、１～１
３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、または１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約１～約１０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約１～約２、約１～約３、約１～約４、約１～約５、約１～約６、約１～約７、約１～約８、約１～約９、約１～約１０、約２～約３、約２～約４、約２～約５、約２～約６、約２～約７、約２～約８、約２～約９、約２～約１０、約３～約４、約３～約５、約３～約６、約３～約７、約３～約８、約３～約９、約３～約１０、約４～約５、約４～約６、約４～約７、約４～約８、約４～約９、約４～約１０、約５～約６、約５～約７、約５～約８、約５～約９、約５～約１０、約６～約７、約６～約８、約６～約９、約６～約１０、約７～約８、約
７～約９、約７～約１０、約８～約９、約８～約１０、または約９～約１０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、または約９の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、最大で、合計約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約１０～約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約１０～約１５、約１０～約２０、約１０～約２５、約１０～約３０、約１５～約２０、約１５～約２５、約１５～約３０、約２０～約２５、約２０～約３０、または約２５～約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約１０、約１５、約２０、約２５、または約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で少なくとも約１０、約１５、約２０、または約２５の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、スペーサー領域は最大で、合計約１５、約２０、約２５、または約３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約３０～約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約３０～約４０、約３０～約５０、約３０～約６０、約３０～約７０、約３０～約７５、約３０～約８０、約３０～約９０、約３０～約１００、約３０～約１１０、約３０～約１２０、約３０～約１３０、約４０～約５０、約４０～約６０、約４０～約７０、約４０～約７５、約４０～約８０、約４０～約９０、約４０～約１００、約４０～約１１０、約４０～約１２０、約４０～約１３０、約５０～約６０、約５０～約７０、約５０～約７５、約５０～約８０、約５０～約９０、約５０～約１００、約５０～約１１０、約５０～約１２０、約５０～約１３０、約６０～約７０、約６０～約７５、約６０～約８０、約６０～約９０、約６０～約１００、約６０～約１１０、約６０～約１２０、約６０～約１３０、約７０～約７５、約７０～約８０、約７０～約９０、約７０～約１００、約７０～約１１０、約７０～約１２０、約７０～約１３０、約７５～約８０、約７５～約９０、約７５～約１００、約７５～約１１０、約７５～約１２０、約７５～約１３０、約８０～約９０、約８０～約１００、約８０～約１１０、約８０～約１２０、約８０～約１３０、約９０～約１００、約９０～約１１０、約９０～約１２０、約９０～約１３０、約１００～約１１０、約１００～約１２０、約１００～約１３０、約１１０～約１２０、約１１０～約１３０、または約１２０～約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、合計で、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは合計で少なくとも約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、または約１２０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、最大で、合計約４０、約５０、約６０、約７０、約７５、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、または約１３０の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[346]一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、約１％～約１０
０％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、約１％～約１０％、約１％～約２０％、約１％～約３０％、約１％～約４０％、約１％～約５０％、約１％～約６０％、約１％～約７０％、約１
％～約８０％、約１％～約９０％、約１％～約９５％、約１％～約１００％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約９５％、約１０％～約１００％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～約１００％、約９０％～約９５％、約９０％～約１００％、または約９５％～約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、少なくとも約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、最大で約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％の化学的に改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
[347]一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮ
Ａ配列の５’－３’方向に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、または１３０位のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[348]一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮ
Ａ配列の５’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１
５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、または１２９塩基対の位置のうちの１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[349]一部の実施形態では、化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮ
Ａ配列の３’末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、または１２９塩基対の位置の１つまたは複数に化学的に改変されたヌクレオチドを有してもよい。
[350]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮ
Ａ配列の５’または３’末端にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に０、１、２、３、４、または５個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に０、１、２、３、４、または５個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端および３’末端のそれぞれに、０、１、２、３、４、もしくは５個のＰＳ結合、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端および３’末端のそれぞれに、０、１、２もしくは３個のＰＳ結合、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端および３’末端のそれぞれに１個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端および３’末端のそれぞれに２個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端および３’末端のそれぞれに３個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端および３’末端のそれぞれに４個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端および３’末端のそれぞれに５個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合を含み、３’末端に０個のＰＳ結合（すなわち改変なし）を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合および３’末端に１個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合および３’末端に２個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合および３’末端に４個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合および３’末端に５個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ
結合を含み、３’末端に０個のＰＳ結合（すなわち、改変なし）を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合および３’末端に１個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合および３’末端に３個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合および３’末端に４個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合および３’末端に５個のＰＳ結合を含む。
[351]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末
端に２つ以下の連続するホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に２つ以下の連続するホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端に３つの連続するホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に３つの連続するホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端または５’末端に配列５’－ＵｓＵｓＵ－３’を含み、Ｕはウリジンを示し、ｓはホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端に３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に３つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み、この２つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、５’末端の最初の２つのヌクレオチド位置にある２つの隣接するホスホロチオエート（ＰＳ）結合である。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含み、この２つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、５’末端の最初の３～１０ヌクレオチド内にある。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に２つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み、２つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、３’末端の最初の２つのヌクレオチド位置にある２つの隣接するホスホロチオエート（ＰＳ）結合である。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に２つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含み、この２つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、３’末端の最初の３～１０ヌクレオチド内にある。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に配列５’－ＵｓＵｓＵｓ－３’を含み、ここでＵはウリジンを示し、ｓはホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端に配列５’－ＵｓＵｓＵ－３’を含み、ここでＵはウリジンを示し、ｓはホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。
[352]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮ
ＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置にＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に１個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に２個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に３個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に４個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、
ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に５個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に６個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に７個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に８個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に９個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に１０個のＰＳ結合を含む。
[353]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮ
ＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端、３’末端、または内部位置、またはそれらの任意の組み合わせにＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端、３’末端、もしくは内部位置に、またはその任意の組み合わせに０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＰＳ結合を含む。
[354]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮ
ＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に０個のＰＳ結合（すなわち、改変なし）を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に１個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に２個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に３個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に４個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に５個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に６個のＰＳ結合を含む。
[355]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮ
ＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に０個のＰＳ結合（すなわち、改変なし）を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に１個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に２個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に３個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に４個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に５個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓ
ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に６個のＰＳ結合を含む。
[356]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮ
ＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に０個のＰＳ結合（すなわち、改変なし）を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に１個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に２個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に３個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に４個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に５個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２個のＰＳ結合、３’末端に２個のＰＳ結合、および内部位置に６個のＰＳ結合を含む。
[357]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮ
ＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に０個のＰＳ結合（すなわち、改変なし）を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に１個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に２個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に３個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に４個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に５個のＰＳ結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に３個のＰＳ結合、３’末端に３個のＰＳ結合、および内部位置に６個のＰＳ結合を含む。
[358]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホ
ジエステル結合を有する追加の改変または未改変ヌクレオチド（Ｎ）を含み、ここでＮは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、ｄＡ（デオキシＡ）、ｄＣ（デオキシＣ）、ｄＧ（デオキシＧ）、またはＴ、およびそれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する１、２、３、４、または５個の追加のＮを含み、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｕ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはＴ、およびそれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’または３’末端にホスホジエステル結合を有する１、２、３、４、または５個の追加のＮを含む。一実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端にホスホジエステル結合を有する１、２、３、４、または５個の追加のＮを含む。好ましい実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３
’末端にホスホジエステル結合を有する１、２、３、４、または５個の追加のＮを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する１、２、３、４、または５個の追加のＮを含み、各Ｎは同じ改変または未改変ヌクレオチドである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する４つの追加のＮを含み得、４つの追加のＮのそれぞれのＮは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、またはＴである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する４つの追加のＮを含み得、４つの追加のＮのそれぞれのＮは、Ａである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する３つの追加のＮを含み得、３つの追加のＮの各ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、またはＴである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する３つの追加のＮを含み得、３つの追加のＮの各ＮはＡである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する３つの追加のＮを含み得、３つの追加のＮの各ＮはＣである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する３つの追加のＮを含み得、３つの追加のＮの各ＮはＧである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する３つの追加のＮを含み得、３つの追加のＮの各ＮはＵである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する３つの追加のＮを含み得、３つの追加のＮの各ＮはｄＡである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する３つの追加のＮを含み得、３つの追加のＮの各ＮはｄＣである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する３つの追加のＮを含み得、３つの追加のＮの各ＮはｄＧである。例えば、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合を有する３つの追加のＮを含み得、３つの追加のＮの各ＮはＴである。
[359]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’ま
たは３’末端にホスホジエステル結合を有する追加のウラシル（Ｕ）を含む。一実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端にホスホジエステル結合を有する追加のＵを含む。好ましい実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端にホスホジエステル結合を有する追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’または３’末端にホスホジエステル結合を有する１、２、３、４、または５個の追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端にホスホジエステル結合を有する１つの追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端にホスホジエステル結合を有する１つの追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端にホスホジエステル結合を有する２つの追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端にホスホジエステル結合を有する２つの追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端にホスホジエステル結合を有する３つの追加のＵを含む。好ましい実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端にホスホジエステル結合を有する３つの追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端にホスホジエステル結合を有する４つの追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端にホスホジエステル結合を有する４つの追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端にホスホジエステル結合を有する５つの追加のＵを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３’末端にホスホジエステル結合を有する５つの追加のＵを含む。
[360]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、リボネ
ブラリンを含む（本出願では、例えば、表１または表２４で「Ｘ」として示される）。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、リボネブラリンを含まない。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１つのリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、２つのリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３つのリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、４つのリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５つのリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、６つのリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、７個のリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、８個のリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、９個のリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１０個のリボネブラリンを含む。一部の実施形態では、ネブラリンは、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのアデニンを置換する。一部の実施形態では、ネブラリンはスペーサー配列にある。一部の実施形態では、ネブラリンはｔｒａｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、ネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、ネブラリンはｔｒａｃｒＲＮＡ配列のステムループ構造にある。
[361]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、２’－
Ｏ－メチルネブラリンを含む（本出願では、例えば、表１または表２４で「ｘ」として示される）。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチルネブラリンを含まない。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、２個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、４個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、６個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、７個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、８個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、９個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１０個の２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチルネブラリンは、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ中のアデニンを置換する。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチルネブラリンは、スペーサー配列にある。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチルネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチルネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、２’－Ｏ－メチルネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のステムループ構造にある。
[362]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、２’－
デオキシネブラリン（本出願では、例えば、表１または表２４で「ｄＸ」として示される
）を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、２’－デオキシネブラリンを含まない。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、２個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、３個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、４個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、６個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、７個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、８個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、９個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１０個の２’－デオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、２’－デオキシネブラリンは、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ中のアデニンを置換する。一部の実施形態では、２’－デオキシネブラリンはスペーサー配列にある。一部の実施形態では、２’－デオキシネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、２’－デオキシネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、２’－デオキシネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のステムループ構造にある。
[363]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、２’－
Ｏ－メチルリボヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約０～約７０個の２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０個の２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約０～約７０個の２’－ＯＭｅを含み得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約０～約１０、約０～約２０、約０～約３０、約０～約３５、約０～約４０、約０～約４５、約０～約５０、約０～約５５、約０～約６０、約０～約６５、約０～約７０、約１０～約２０、約１０～約３０、約１０～約３５、約１０～約４０、約１０～約４５、約１０～約５０、約１０～約５５、約１０～約６０、約１０～約６５、約１０～約７０、約２０～約３０、約２０～約３５、約２０～約４０、約２０～約４５、約２０～約５０、約２０～約５５、約２０～約６０、約２０～約６５、約２０～約７０、約３０～約３５、約３０～約４０、約３０～約４５、約３０～約５０、約３０～約５５、約３０～約６０、約３０～約６５、約３０～約７０、約３５～約４０、約３５～約４５、約３５～約５０、約３５～約５５、約３５～約６０、約３５～約６５、約３５～約７０、約４０～約４５、約４０～約５０、約４０～約５５、約４０～約６０、約４０～約６５、約４０～約７０、約４５～約５０、約４５～約５５、約４５～約６０、約４５～約６５、約４５～約７０、約５０～約５５、約５０～約６０、約５０～約６５、約５０～約７０、約５５～約６０、約５５～約６５、約５５～約７０、約６０～約６５、約６０～約７０、または約６５～約７０個の２’－ＯＭｅを含み得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、約０、約１０、約２０、約３０、約３５、約４０
、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、または約７０個の２－ＯＭｅを含み得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、少なくとも約０、約１０、約２０、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、または約６５個の２’－ＯＭｅを含み得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、最大で約１０、約２０、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、または約７０個の２’－ＯＭｅを含み得る。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、２’－ＯＭｅを含まない。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、６２個の２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５４個の２’－ＯＭｅを含む。
[364]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮ
ＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の３’末端に２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の内部位置に２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端、３’末端、または内部位置に２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’末端、３’末端、および内部位置に２’－ＯＭｅを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’－３’方向において２、３、４、２３、２４、２５、２７、３１、もしくは４２位、またはそれらの任意の組み合わせに２’－ＯＭｅを含まない。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の５’－３’方向において２、３、４、２３、２４、２５、２７、３１および４２位に２’－ＯＭｅを含まない。
[365]化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列の例を以下に示す：
５’－ｃｓａｓｇｓＧＵＵＣＣＡＵＧＧＧＡＵＧＣＵＣＵｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇＣＵａＧＵＣｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕＧｇｃａｃｃｇＡｇＵＣｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３（配列番号５５）
ここで、大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[366]化学的に改変されたスペーサー配列の例を以下に示す：
５’－ｃｓａｓｇｓＧＵＵＣＣＡＵＧＧＧＡＵＧＣＵＣＵ－３’（配列番号５６）
ここで、大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[367]化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例を以下に示す：
５’－ｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇＣＵａＧＵＣｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕＧｇｃａｃｃｇＡｇＵＣｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号５７）
ここで、大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[368]別の例示的な化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ配列を以下に示す：
５’－ｃｓａｓｇｓＧＵＵＣＣＡＵＧＧＧＡＵＧＣＵＣＵｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号５５）ここで、大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、そして「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[369]別の例示的な化学的に改変されたｔｒａｃｒＲＮＡ配列を以下に示す：
５’－ｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号５７）
[370]別の例示的な化学的に改変されたガイドＲＮＡ配列を以下に示す：
５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号５８）、ここで、大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[371]別の例示的な化学的に改変されたガイドＲＮＡ配列を以下に示す：
５’－ａｓａｓｇｓＡＵＡＣＣＵＧＡＡＵＡＡＣＣＣＵＣＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号５９）（ＧＡ０９１）
[372]別の例示的な化学的に改変されたガイドＲＮＡ配列を以下に示す：
５’－ａｓａｓｇｓＡＵＡＣＣＵＧＡＡＵＡＡＣＣＣＵＣＧＵＵＵＵＡＧＡｇｃｕａｇａａａｕａｇｃＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ３’（配列番号６０）（ＧＡ０９８）
ここで、大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[373]別の例示的な化学的に改変されたガイドＲＮＡ配列を以下に示す：
５’－ａｓａｓｇｓＡＵＡＣＣＵＧＡＡＵＡＡＣＣＣＵＣｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇＣＵａＧＵＣｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕＧｇｃａｃｃｇＡｇＵＣｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号５９）（ＧＡ０９９）
ここで大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[374]別の例示的な化学的に改変されたガイドＲＮＡ配列を以下に示す：
[00375]５’－ａｓａｓｇｓＡＵＡＣＣＵＧＡＡＵＡＡＣＣＣＵＣｇＵＵＵＵＡＧａｇ
ｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号５９）（ＧＡ１００）
ここで大文字Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[00376]別の例示的な化学的に改変されたガイドＲＮＡ配列を以下に示す：
５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕｕｕｕ－３’（配列番号１１）（ＧＡ３８５）
ここで、大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[00377]別の例示的な化学的に改変されたガイドＲＮＡ配列を以下に示す：
５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕｕＵｕ－３’（配列番号１１）（ＧＡ３８６）、
ここで、大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[00378]別の例示的な化学的に改変されたガイドＲＮＡ配列を以下に示す：
５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｓｕｓｕｕｕｕ－３’（配列番号１２）、（ＧＡ３８７）
ここで、大文字のＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－Ｏ－メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「ｓ」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を表す。
[379]追加の化学的に改変されたガイドＲＮＡ配列および標的遺伝子の情報は、表１ま
たは表２４に示される。
[380]一部の実施形態では、化学的改変は、ホスホロチオエート結合（ＰＳ）を含む。
一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端または３’末端にホスホロチオエート結合（ＰＳ）を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端または３’末端に２つ以下の連続するホスホロチオエート結合（ＰＳ）を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、５’末端または３’末端に３つの連続するホスホロチオエート結合（ＰＳ）を含む。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、３’末端または５’末端に配列５’－ＵｓＵｓＵ－３’を含み、ここでＵはウリジンを示し、ｓはホスホロチオエート結合（ＰＳ）を示す。
[381]いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、（ｉ）スペーサー配列および
（ｉｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むｓｇＲＮＡであり、このスペーサー配列は、標的ポ
リヌクレオチド配列と接触した場合に、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、ここでこのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、塩基エディターシステムと接触したときに塩基エディターシステム中のＣａｓタンパク質に結合し、このｓｇＲＮＡはネブラリンまたはデオキシネブラリンを含む。一部の実施形態では、ネブラリンまたはデオキシネブラリンは、未改変ｓｇＲＮＡのアデニンを置換する。一部の実施形態では、ネブラリンまたはデオキシネブラリンは、スペーサー配列にある。一部の実施形態では、ネブラリンまたはデオキシネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、ネブラリンまたはデオキシネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、ネブラリンまたはデオキシネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のｃｒＲＮＡ配列にある。一部の実施形態では、ネブラリンまたはデオキシネブラリンは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のステムループ構造にある。
[382]いくつかの態様では、表１または表２４から選択される配列を含むシングルガイ
ドＲＮＡが本明細書に提供され、ここでａ、ｕ、ｇ、およびｃは、２’－ＯＭｅ改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、ｓはホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示す。
[383]一部の実施形態では、化学的に改変されたガイドＲＮＡは、改変されていないｔ
ｒａｃｒＲＮＡ配列を含む
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号６１）。一部の実施形態では、化学的に改変されたガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号６１）を含み、これは、１つまたは複数の改変を含む。
[384]一部の実施形態では、化学的に改変されたガイドＲＮＡは、表１または表２４に
列挙される化学的に改変されたガイドＲＮＡのうちいずれか１つに対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたガイドＲＮＡは、表１または表２４に列挙される化学的に改変されたガイドＲＮＡのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたガイドＲＮＡは、表１または表２４に列記された化学的に改変されたガイドＲＮＡのいずれか１つである。一部の実施形態では、化学的に改変されたガイドＲＮＡは、配列番号９～１１、５５、５９、２５３～４５２、１６１８～１６３５、１６３７～１８００、１８０２～２１３５、および２１９１の化学的に改変されたガイドＲＮＡのいずれか１つに対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、または少なくとも９９．９％同一であるオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたガイドＲＮＡは、配列番号９～１１、５５、５９、２５３～４５２、１６１８～１６３５、１６３７～１８００、１８０２～２１３５、および２１９１の化学的に改変されたガイドＲＮＡのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたガイドＲＮＡは、配列番号９～１１、５５、５９、２５３～４５２、１６１８～１６３５、１６３７～１８００、１８０２～２１３５、および２１９１の化学的に改変されたガイドＲＮＡのいずれか１つである。
スプライス部位での塩基編集
[385]一態様では、標的遺伝子のスプライス部位のエクソンとイントロン（スプライス
部位）との境界で生じるＤＮＡ配列の遺伝子変化を生成することによって標的遺伝子を改変するための塩基エディターシステムおよびそれを使用する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、標的遺伝子のスプライスアクセプター部位で核酸塩基を改変する。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、標的遺伝子のスプライスドナー部位で核酸塩基を改変する。スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位での改変は、選択的転写産物をもたらし得る。一部の実施形態では、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位での改変により、異常な転写物が生じる。一部の実施形態では、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位での改変により、転写時に分解を受けやすい不安定な転写物が生じる。一部の実施形態では、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位での改変により、転写物に未成熟終止コドンが生じる。特定の実施形態では、この方法は、スプライスアクセプター－スプライスドナー（ＳＡ－ＳＤ）部位または未成熟ＳＴＯＰ（ｐｍＳＴＯＰ）部位を標的とすることによって、遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることを含む。このような方法では、ガイドポリヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列内の１つまたは複数のスライスアクセプター／ドナー部位を破壊するように設計されている。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチド、例えば、シングルガイドＲＮＡは、生物のゲノム中の標的配列に相補的であり、かつ標的塩基対を含む、少なくとも１０個の連続するヌクレオチドの配列または１７～２３個の連続するヌクレオチドの配列を含む。
[386]ＳＡ－ＳＤ部位での破壊は、コード配列および非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を
終止コドンの読み取りなしでノックアウトできるため、特に有利である。塩基編集の効率は、サンガーシーケンシングトレースのＥｄｉｔＲ解析または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によってゲノムレベルで、またフローサイトメトリーによってタンパク質レベルで決定され得る。スプライスドナー領域およびスプライスアクセプター領域を標的とするスプライスアクセプター－スプライスドナー塩基編集ｇＲＮＡは、少なくとも５％、場合によっては少なくとも８０％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％）の塩基変換効率を示す。場合によっては、ＳＡ－ＳＤｇＲＮＡは、ＣからＴへの変換において、未成熟終止コドン破壊を導入するｇＲＮＡよりも有意に効率的である。
[387]ＳＡ－ＳＤ部位を標的とするためのガイドＲＮＡは、全てのｎｃＲＮＡおよびタ
ンパク質コード遺伝子ＳＡ－ＳＤ部位を標的とするｇＲＮＡを同定するＲベースのプログラムを使用して設計され得る。場合によっては、ユーザーは参照ゲノム、参照配列のＥｎｓｅｍｂｌ 転写ＩＤ、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位、およびエクソン－イントロン境界の上流および下流のサブセットまでの距離を提供する。このプログラムは、エクソンとイントロンの境界の上流にある２０塩基対＋ＰＡＭの長さ、および下流にある１５塩基対の配列、ならびにスプライス部位モチーフを抽出する。一部の実施形態では、ガイド分子は、長さが２０から１２０塩基、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、ガイド分子は、長さが２０から６０塩基、または２０から５０塩基、または３０から５０塩基、または３９から４６塩基であり得る。
[388]場合によっては、哺乳動物細胞にトランスフェクトしたときに安定性が向上した
化学的に改変されたｇＲＮＡを使用することが有利である。例えば、ｇＲＮＡは、各ｇＲＮＡの少なくとも１つの５’ヌクレオチドおよび少なくとも１つの３’ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチルホスホルチオエート改変を含むように化学的に改変されてもよい。場合によっては、３つの末端５’ヌクレオチドおよび３つの末端３’ヌクレオチドを化学的に改変して、２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート改変を含む。
[389]一態様では、塩基編集破壊のために疾患を標的とするための塩基編集システムお
よび方法が本明細書に提供される。標的配列は、当該技術分野で確立されているとおり、任意の疾患関連ポリヌクレオチドまたは遺伝子であり得る。
[390]特定の理論に縛られることなく、目的が治療目的で、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を
破壊することである場合、シトシン塩基エディターを使用して、アンチセンス鎖のシトシンの編集を伴う、グルタミン（ＣＡＧ－ＴＡＧ、ＣＡＡ－ＴＡＡ）、アルギニン（ＣＧＡ－ＴＧＡ）、およびトリプトファン（ＴＧＧ－ＴＡＧ／ＴＡＡ／ＴＧＡ）の特定のコドンを変更することによって、遺伝子のコード配列に終止コドンを直接導入してもよい（ナンセンス変異）。特定の実施形態では、アデニン塩基エディターを使用して、標的遺伝子のスプライス部位で核酸塩基を改変することにより、遺伝子の機能および／または発現を破壊し得る。アデニン塩基エディターのより好ましいオフターゲットプロファイル、特にｇＲＮＡに依存しないオフターゲットＤＮＡ塩基編集に関しては、治療目的でシトシン塩基エディターよりもアデニン塩基エディターを使用することを推奨する。一部の実施形態では、塩基エディター、例えば本明細書に記載のアデノシン核酸塩基エディターを使用して、イントロンの５’末端のスプライスドナーまたはイントロンの３’末端のスプライスアクセプターを破壊し得る。一部の実施形態では、スプライス部位の破壊は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）におけるイントロン配列の包含をもたらし、潜在的にナンセンス、フレームシフト、またはインフレームインデル変異を導入し、未成熟終止コドンまたはタンパク質活性を破壊するアミノ酸の挿入／欠失をもたらすか、またはナンセンス、フレームシフト、もしくはインフレームインデル変異を導入し得るエクソン配列の除外をもたらす。
[391]標準スプライスドナーは、センス鎖上にＤＮＡ配列ＧＴを含むが、標準スプライ
ス受容体はＤＮＡ配列ＡＧを含む。一部の実施形態では、塩基エディター、例えば本明細書に記載のアデノシン核酸塩基エディターを使用して、正常なスプライシングを破壊する配列の改変を生成し得る。一部の実施形態では、アデノシン塩基エディターは、アンチセンス鎖（ＧＴ－ＧＣ）の第２の位置で相補的な塩基を破壊する。一部の実施形態では、アデノシン塩基エディターは、センス鎖の最初の位置（ＡＧ－ＧＧ）を破壊する。
[392]疾患に関連する標的遺伝子の発現を減少または無効にする内因性遺伝子配列の変
異または破壊の有用な適用の例であって、従来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ改変に起因する二本鎖切断に関連するオフターゲット効果、インデル頻度および／または他の意図しない遺伝的遮断が有意に低下している。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ＰＣＳＫ９遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子である。
[393]本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質（
例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９ニッカーゼ）およびガイドＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）などの塩基エディター融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合構成要素の間の結合親和性を向上または増大し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質とｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとの間の結合親和性を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、また
は１０００％向上または増大し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９ニッカーゼと、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとの間の結合親和性を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター融合物またはＣａｓタンパク質とｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとの間の結合親和性を、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質または塩基エディター融合タンパク質の成分とｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとの間の結合親和性を、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、向上または増大させ得る。
[394]本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター融合
タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合構成要素、例えば、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９ニッカーゼ）およびガイドＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）のｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間の結合親和性を向上または増大し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター融合またはＣａｓタンパク質とｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間の結合親和性を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％向上または増大し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター融合またはＣａｓタンパク質と、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間の結合親和性を、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約
１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター融合またはＣａｓタンパク質と、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間の結合親和性を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター融合またはＣａｓタンパク質とｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列との間の結合親和性を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、向上または増大させ得る。
[395]一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、未
改変ｓｇＲＮＡ中のｔｒａｃｒＲＮＡ配列と比較して増大した結合親和性で、Ｃａｓタンパク質などの塩基エディター融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合成分に結合し得る。ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載のシステムまたは塩基エディターとして使用される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、未改変のｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％増大した結合親和性でＩＩ型Ｃａｓタンパク質に結合し得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、未改変のｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列と比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、増大した結合親和性でＩＩ型Ｃａｓタンパク質を含む塩基エディターに結合し得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、未改変のｓｇＲＮＡ中のｔｒａｃｒＲＮＡ配列と比較して増加した結合親和性で、Ｃａｓ９タンパク質を含む塩基エディター融合タンパク質に結合し得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、未改変のｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、または３００％増大した結合親和性で、Ｃａｓ９タンパク質に結合し得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、未改変ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ配列と比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍
、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、増大した結合親和性でＣａｓ９タンパク質を含む塩基エディター融合タンパク質に結合し得る。
[396]本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的配列の遺伝子改
変（例えば、遺伝子またはゲノム編集）におけるオフターゲット効果を低減し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的配列の遺伝子改変におけるオフターゲット効果を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％減少させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的配列の遺伝子改変におけるオフターゲット効果を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％低減し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的配列の遺伝子改変におけるオフターゲット効果を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％低減し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的配列の遺伝子改変におけるオフターゲット効果を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満に低減し得る。
[397]一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列はゲノム内にあり、ｇＲＮＡま
たはｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすように塩基エディター融合タンパク質の構成要素（例えば、Ｃａｓ９）に指令し得、この改変は、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、ゲノム中のオフターゲット効果が少ない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすようにＩＩ型Ｃａｓタンパク質に指令し得、この改変は、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３
００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％低い、ゲノム中のオフターゲット効果をもたらす。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすように塩基エディター融合タンパク質のＩＩ型Ｃａｓタンパク質に指令し得、この改変は、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０倍未満の、ゲノム中のオフターゲット効果をもたらす。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列はゲノム内にあり、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすようにＣａｓ９タンパク質に指令し得、この改変は、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して低い、ゲノム中のオフターゲット効果をもたらす。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすようにＣａｓ９タンパク質に指令し得、この改変は、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７．％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％低い、ゲノム中のオフターゲット効果をもたらす。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９に指令し得る。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列はゲノム内にあり、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し得、この改変は、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して低い、ゲノム中のオフターゲット効果をもたらす。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し得、この改変は、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％低い、ゲノム中のオフターゲット効果をもたらす。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し得、この改変は、標的ポリヌクレオチド配列において、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０未満の、ゲノム中のオフターゲット効果をもたらす。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用する改変は、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％低い、細胞中のオフターゲット効果をもたらす。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを使用する改変は、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して１．１分
の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満の、細胞中のオフターゲット効果をもたらす。
[398]本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、遺伝子改変（例えば
、遺伝子またはゲノム編集）効率を向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、遺伝子改変（例えば、遺伝子またはゲノム編集）効率を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、遺伝子改変（例えば、遺伝子またはゲノム編集）効率を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、遺伝子改変（例えば、遺伝子またはゲノム編集）効率を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、遺伝子改変（例えば、遺伝子またはゲノム編集）効率を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、向上または増大させ得る。
[399]本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディタータン
パク質または構成要素（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）とガイドＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）との複合体の安定性、例えば、塩基エディター複合体の安定性を向上または増大し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質－ｇＲＮＡ複合体の安定性を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２
０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター融合またはＣａｓタンパク質－ｇＲＮＡ複合体の安定性を、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター融合またはＣａｓタンパク質－ｇＲＮＡ複合体の安定性を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター融合またはＣａｓタンパク質－ｇＲＮＡ複合体の安定性を、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、向上または増大させ得る。
[400]一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは
、塩基エディター複合体の安定性を、未改変のｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８．％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％向上または増大し得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター複合体の安定性を、未改変ｓｇＲＮＡｓと比較して約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター複合体の安定性を、未改変のｓｇＲＮＡと比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２０
０％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、塩基エディター－ｓｇＲＮＡまたはＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体の安定性を、未改変のｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、向上または増大させ得る。
[401]本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、
ｉｎ ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ ｖｉｖｏでガイドＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）の安定性を向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ ｖｉｖｏでｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの安定性を、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの安定性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ ｖｉｖｏで、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの安定性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ ｖｉｖｏで、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの安定性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ ｖｉｖｏで、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、向上または増大させ得る。
[402]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変
のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、細胞内の安定性の増大を示す。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％高いかまたは増大した細胞内の安定性を呈する。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、高いかまたは増大した細胞内の安定性を呈する。
[403]一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの安定性は
、細胞内のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの半減期によって測定される。一部の実施形態では、化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、細胞内の半減期の延長を示す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％延長した、細胞内の半減期を示す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％の、細胞内の半減期の延長を示す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、増大した細胞内の半減期を示す。
[404]本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変のｇＲＮＡま
たはｓｇＲＮＡと比較して、分解に対してより耐性であり得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、分解に対して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、また
は１０００％高い耐性であり得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、改変されていないｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、分解に対して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％高い耐性であり得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、分解に対して、約２０％～約３００％、約５０％～約３００％、約１００％～約３００％、約１５０％～約３００％、約２０％～約５０％、約２０％～約１００％、約２０％～約１５０％、約２０％～約２００％、約２０％～約２５０％、約５０％～約１００％、約５０％～約１５０％、約５０％～約２００％、約５０％～約２５０％、約１００％～約１５０％、約１００％～約２００％、約１００％～約２５０％、約１５０％～約２００％、約１５０％～約２５０％、約２００％～約２５０％、少なくとも約２０％、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、または少なくとも約３００％高い耐性であり得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、未改変のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと比較して、分解に対して、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、または１０倍超、高い耐性であり得る。
標的遺伝子改変
[405]いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、それを必要とする対象の状態
を処置または予防する方法であって、この方法は、本明細書に記載の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを含む組成物または脂質ナノ粒子を対象に投与することを含み、このｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、対象の細胞中の標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすように塩基エディタータンパク質に指令し、それによってその状態を処置または予防する。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９遺伝子内にある。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内にある。一部の実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチドのスプライス部位である。一部の実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチドのスプライスドナー部位にある。一部の実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチドのスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、改変は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現を低下させる。一部の実施形態では、改変は、対象におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる機能的ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を低下させる。一部の実施形態では、この状態はアテローム硬化性血管疾患である。一部の実施形態では、この状態は、アテローム硬化性血管疾患、高トリグリセリド血症、または糖尿病である。一部の実施形態では、対象は、投与前と比較して、低下した血中ＬＤＬコレステロールレベルおよび／または低下した血中トリグリセリドレベルを示す。
[406]一部の実施形態では、本開示は、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）タンパ
ク質およびそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを編集するための塩基編集システム、組成物、および方法を提供する。一部の実施形態では、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）およびそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを編集するためのゲノム／塩基編集システム、組成物および方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）およびそのバリ
アントをコードするポリヌクレオチドを編集するためのゲノム／塩基編集システム、組成物、および方法が本明細書で提供される。標的遺伝子を編集するために、標的遺伝子ポリヌクレオチドは、ｓｇＲＮＡおよびアデノシン塩基エディタータンパク質を含む本明細書に開示される組成物と接触し得、このｓｇＲＮＡはスペーサー配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み、このスペーサー配列は、ＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子中の標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、アデノシン塩基エディタータンパク質（例えば、アデノシン塩基エディターのＣａｓ９構成要素）に結合する。したがって、一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、塩基エディタータンパク質を標的ポリヌクレオチド配列に向かわせて、標的遺伝子にＧに向かう改変をもたらす。一部の実施形態では、標的遺伝子または標的ポリヌクレオチドは、ＰＣＳＫ９、ＡＰＯＣ３、ＬＰＡ、およびＡＮＧＰＴＬ３をコードする遺伝子から選択される。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子内にある。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内にある。一部の実施形態では、改変は、細胞内のＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現を減少または無効にする。一部の実施形態では、改変は、細胞内のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる機能的ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を減少または無効にする。一部の実施形態では、導入は、組成物を含む脂質ナノ粒子を介して行われる。
[407]例えば、ｓｇＲＮＡおよびアデノシン塩基エディタータンパク質は、標的遺伝子
編集が望まれる細胞（例えば、肝細胞）で発現され得、それによって、標的遺伝子と本明細書に開示される組成物（例えば、ｓｇＲＮＡおよびアデノシン塩基エディタータンパク質）との接触が可能になる。一部の実施形態では、標的遺伝子中のその標的ポリヌクレオチド配列へのアデノシン塩基エディタータンパク質の結合は、本明細書に開示されるシングルガイドＲＮＡ、例えば、（ｉ）スペーサー配列および（ｉｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡを含むシングルガイドＲＮＡによって指令され、ここで、スペーサー配列は、標的遺伝子中の標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。したがって、ガイドＲＮＡ配列を設計することによって、アデノシン塩基エディタータンパク質は、標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９、ＡＰＯＣ３およびＡＮＧＰＴＬ３をコードする標的遺伝子）中の任意の標的ポリヌクレオチド配列を編集するように指令され得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、編集が望まれる細胞内でアデノシン塩基エディタータンパク質と同時発現される。
[408]一部の実施形態では、本明細書に記載の複数の変異を含む標的遺伝子が企図され
る。例えば、バリアントタンパク質をコードする標的遺伝子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の変異を含む、本明細書に記載の方法を使用して生成され得る。標的遺伝子に複数の変異を作成するために、複数のガイドＲＮＡ配列を使用してもよく、各ガイドＲＮＡ配列は、標的遺伝子内の１つの標的ポリヌクレオチド配列を標的とする。アデノシン塩基エディタータンパク質は、ガイドＲＮＡ配列によって指令されるあらゆる標的ポリヌクレオチド配列を編集し得る。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のガイドＲＮＡ配列を、遺伝子編集反応に使用し得る。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列が使用される（例えば、ｇＲＮＡ）。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ分子も使用してもよい。
[409]一部の実施形態では、複数の標的遺伝子（例えば、ＬＤＬ媒介コレステロールク
リアランス経路における複数の標的遺伝子）への同時改変も本明細書で企図される。例えば、一部の実施形態では、改変は、ＰＣＳＫ９およびＡＰＯＣ３遺伝子に同時に導入されてもよい。一部の実施形態では、改変は、ＰＣＳＫ９およびＬＤＬ－Ｒ遺伝子に同時に導入されてもよい。一部の実施形態では、改変は、ＰＣＳＫ９およびＩＯＤＬ遺伝子に同時に導入されてもよい。一部の実施形態では、改変は、ＰＣＳＫ９およびＬＰＡ遺伝子に同時に導入されてもよい。一部の実施形態では、改変は、ＡＰＯＣ３およびＩＯＤＬ遺伝子に同時に導入されてもよい。一部の実施形態では、改変は、ＬＤＬ－ＲおよびＡＰＯＣ３
遺伝子に同時に導入されてもよい。一部の実施形態では、改変は、ＬＤＬ－ＲおよびＩＤＯＬ遺伝子に同時に導入されてもよい。一部の実施形態では、改変は、ＰＣＳＫ９、ＡＰＯＣ３、ＬＤＬ－ＲおよびＩＤＯＬ遺伝子に同時に導入されてもよい。一部の実施形態では、改変は、ＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に同時に導入されてもよい。複数の標的遺伝子に同時に改変を導入するために、複数のガイドヌクレオチド配列が使用される。
[410]ＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をコードする遺伝子を編集するため
に、その遺伝子を本明細書に記載の組成物と接触させる。一部の実施形態では、標的遺伝子中の標的ポリヌクレオチド配列を、本明細書に開示されるシングルガイドＲＮＡおよびアデノシン塩基エディタータンパク質またはアデノシン塩基エディタータンパク質をコードする核酸配列と接触させ、シングルガイドＲＮＡは、標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９、ＡＰＯＣ３、およびＡＮＧＰＴＬ３をコードする標的遺伝子）における改変をもたらすようにアデノシン塩基エディタータンパク質に指令する。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、細胞のゲノムＤＮＡにおける遺伝子座である。一部の実施形態では、細胞は培養細胞である。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏである。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏである。一部の実施形態では、細胞はｅｘ ｖｉｖｏである。
[411]一部の実施形態では、細胞は哺乳動物由来である。一部の実施形態では、哺乳動
物はヒトである。一部の実施形態では、哺乳動物はげっ歯類である。一部の実施形態では、げっ歯類はマウスである。一部の実施形態では、げっ歯類はラットである。当業者には理解されるように、標的ポリヌクレオチド配列は、コード鎖および相補鎖を含むＤＮＡ分子、例えば、ゲノム中のＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子座であり得る。したがって、標的ポリヌクレオチド配列はまた、コード領域（例えば、エクソン）および非コード領域（例えば、イントロンまたはスプライシング部位）を含み得る。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子（例えば、ＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子座）のコード領域（例えば、エクソン）に位置する。したがって、コード領域における改変は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質におけるアミノ酸変化、すなわち変異をもたらし得る。一部の実施形態では、この変異は機能喪失変異である。一部の実施形態では、この機能喪失変異は、天然に生じる機能喪失変異である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の非コード領域、例えばイントロンまたはスプライシング部位に位置する。一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムは、ＰＣＳＫ９遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位でＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更をもたらす。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる異常なＰＣＳＫ９転写物をもたらす。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、細胞内で発現されると、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる非機能的ＰＣＳＫ９ポリペプチドをもたらす。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子のイントロン１のスプライスドナー部位の５’末端にある。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子のイントロン４のスプライスドナー部位の５’末端にある。一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位でＡ・ＴからＧ・Ｃへの変化をもたらすか、またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスドナー部位での第２のＡ・ＴからＧ・Ｃへの変化をもたらす。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更または第２のＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＡＮＴＰＴＬ３遺伝子のスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更または第２のＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる異常なＡＮＧＰＴＬ３転写物をもたらす。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更または第２のＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によ
ってコードされる非機能的ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドをもたらす。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更または第２のＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＡＮＧＰＬＴ３遺伝子のイントロン６のスプライスドナー部位の５’末端にある。
[412]一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列はスプライシング部位に位置し
、そのような配列の編集は、標的遺伝子のｍＲＮＡの選択的スプライシングを引き起こす。一部の実施形態では、選択的スプライシングは、機能喪失変異体をもたらすことにつながる。一部の実施形態では、選択的スプライシングは、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡへの未成熟終止コドンの導入をもたらし、短縮された不安定なタンパク質をもたらす。一部の実施形態では、折り畳みに欠陥のある変異体が生成される。本明細書に開示される組成物および方法を使用して改変される遺伝子によって生成される機能喪失バリアントは、改変されていない標的遺伝子によってコードされる野生型タンパク質と比較して活性が低下している可能性がある。活性とは、当該技術分野における野生型タンパク質の任意の公知の生物学的活性を指す。
[413]一部の実施形態では、機能喪失バリアントの活性は、少なくとも２０％、少なく
とも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、またはそれ以上低下し得る。一部の実施形態では、機能喪失バリアントは、野生型タンパク質と比較して、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の活性を有する。
[414]一部の実施形態では、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞活性は
、適切に折り畳まれた活性タンパク質のレベルを低下させることによって低下され得る。野生型タンパク質に不安定化変異を導入すると、タンパク質のミスフォールディングまたは不活性化が発生し得る。本明細書に開示される組成物および方法を使用して標的遺伝子を改変することによって生成されるバリアントは、改変されていない標的遺伝子によってコードされる野生型タンパク質と比較して活性が低下している場合がある１つまたは複数の不安定化変異を含む。例えば、１つまたは複数の不安定化変異を含むバリアントの活性は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超えて低下され得る。
[415]一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、標的遺伝子に
よってコードされるタンパク質の発現および／または機能を低減または無効にする。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現および／または機能を、対照に対して、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１、または少なくとも１０分の１に低下させる。
[416]一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、標的遺伝子に
よってコードされるタンパク質の発現および／または機能を、対照と比較して少なくとも２分の１に低減または無効にする。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現および／または機能を、対照と比較して、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１、または少なくとも１０分の１に低下または無効にする。
[417]本開示のいくつかの態様は、産生される全長の機能的タンパク質の量を減少させ
るために標的遺伝子を編集する戦略を提供する。一部の実施形態では、終止コドンは、正
常な終止コドンの上流の標的遺伝子のコード配列に導入され得る（「未成熟終止コドン」と呼ばれる）。未成熟終止コドンは、未成熟翻訳終結を引き起こし、その結果、短縮された非機能的なタンパク質が生じ、ナンセンス媒介性のｍＲＮＡ減衰経路を介してｍＲＮＡの急速な分解が誘導される。例えば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６（３）：２９３－２９９、２００４；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７６：５１－７４、２００７；およびＢｅｈｍ－Ａｎｓｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０（４）：３９１－３９８、２００６年（これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
プロタンパク質転換酵素サブチリシン－ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）
[418]一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する改変の
ための標的遺伝子は、ＰＣＳＫ９をコードする遺伝子である。プロタンパク質転換酵素サブチリシン－ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）はまた、神経アポトーシス制御コンバターゼ１（ＮＡＲＣ－Ｉ）としても知られ、分泌サブチラーゼファミリーの９番目のメンバーとして同定されたプロテイナーゼＫ様サブチラーゼである。「プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）」とは、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる酵素を指す。ＰＣＳＫ９は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子の受容体に結合する。肝臓では、ＬＤＬ受容体がエンドサイトーシス経路を介してＬＤＬ粒子を血液から除去する。ＰＣＳＫ９がＬＤＬ受容体に結合すると、受容体はリソソーム経路に向かって導かれ、タンパク質分解酵素によって分解され、特定のＬＤＬ受容体が血液からＬＤＬ粒子を取り込むことができる回数が制限される。したがって、ＰＣＳＫ９活性をブロックすると、より多くのＬＤＬ受容体が再利用されて肝細胞の表面に存在するようになり、血液からより多くのＬＤＬコレステロールが除去されるようになる。
[419]したがって、ＰＣＳＫ９をブロックすると、血中コレステロール値を下げ得る。
ＰＣＳＫ９オルソログは多くの種に見られる。ＰＣＳＫ９は、ペプチド鎖の一部がその活性をブロックするので、最初に合成されたときは不活性でプレプロ酵素である。プロタンパク質転換酵素はその部分を取り除いて酵素を活性化する。Ｐｒｏ－ＰＣＳＫ９は、分泌型の球状セリンプロテアーゼであり、これは、そのＮ末端プロドメインをタンパク質分解的にオートプロセシングして、その触媒部位をブロックするＰＣＳＫ９の強力な内因性阻害剤にし得る。コレステロール恒常性におけるＰＣＳＫ９の役割は、医学的に利用されている。ＰＣＳＫ９をブロックする薬物は、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）の血中濃度を下げ得る。最初の２つのＰＣＳＫ９阻害剤であるアリロクマブおよびエボロクマブは、２０１５年に米国食品医薬品局によって、スタチンおよび他の薬物では不十分な、コレステロールを下げることが承認された。
[420]ＰＣＳＫ９のヒト遺伝子は、ヒト染色体Ｉｐ３３－ｐ３４．３に局在する。ＰＣ
ＳＫ９は、例えば、肝細胞、腎臓間葉細胞、腸回腸、および結腸上皮ならびに胚性脳終脳ニューロンを含む、増殖および分化が可能な細胞において発現される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．，２００３ ＰＮＡＳ １００：９２８－９３３を参照されたい。
[421]ＰＣＳＫ９の元の合成は、７２ｋＤａの不活性な酵素前駆体、またはチモーゲン
の形であり、小胞体（ＥＲ）で自己触媒的な分子内プロセシングを受けて、その機能を活性化する。この内部プロセシング事象は、ＳＳＶＦＡＱ ｊＳＩＰ モチーフで発生することが報告されており、ＥＲからの退出要件として報告されている。「ｊ」は切断部位を示す。Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５－４８８７５、およびＳｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ，２００３ ＰＮＡＳ １００：９２８－９３３（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）を参照の
こと。その後、切断されたタンパク質が分泌される。切断されたペプチドは、活性化され分泌された酵素と結合したままである。
[422]ヒトＰＣＳＫ９の遺伝子配列は、長さ約２２ｋｂで、１２個のエクソンが６９２
アミノ酸のタンパク質をコードしている。ヒトＰＣＳＫ９のタンパク質配列は、例えば、寄託番号ＮＰ＿７７７５９６．２で見出すことができ、その配列全体が本明細書に組み込まれる。ヒト、マウス、およびラットのＰＣＳＫ９核酸配列が寄託されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：それぞれ、ＡＸ１２７５３０（ＡＸ２０７６８６も）、ＡＸ２０７６８８、およびＡＸ２０７６９０を参照されたい。これらの配列のそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれている。Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓの遺伝子配列は、例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１０２１４２７８８で公開されており、その配列全体が本明細書に組み込まれている。Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型アイソフォームＸ２配列は、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００５５４３３１７．１で公開されており、その配列全体が本明細書に組み込まれている。
[423]翻訳されたタンパク質は、ＮＨ２末端にシグナルペプチドを含み、細胞および組
織では、全長タンパク質の約７４ｋＤａチモーゲン（前駆体）型が小胞体に見られる。細胞内での最初のプロセッシング中に、約１４ｋＤａのプロドメインペプチドが自己触媒的に切断され、触媒ドメインと、しばしばシステイン－ヒスチジンリッチドメイン（ＣＨＲＤ）と呼ばれるＣ末端ドメインとを含む約６０ｋＤａの成熟タンパク質が生成される。この約６０ｋＤａのＰＣＳＫ９型は、肝細胞から分泌される。ＰＣＳＫ９の分泌型は生理活性種のようであるが、約６０ｋＤａ型の細胞内機能的役割は除外されていない。
[424]多数のＰＣＳＫ９バリアントが、限定するものではないが、以下を含むいくつか
の特許刊行物に開示および／または特許請求されている：ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１０３１００７、ＷＯ２００１０５７０８１、ＷＯ２００２０１４３５８、ＷＯ２００１０９８４６８、ＷＯ２００２１０２９９３、ＷＯ２００２１０２９９４、ＷＯ２００２０４６３８３、ＷＯ２００２０９０５２６、ＷＯ２００１０７７１３７、およびＷＯ２００１０３４７６８；米国特許出願公開第２００４／０００９５５３号および米国特許出願公開第２００３／０１１９０３８号、ならびに欧州公開番号 欧州特許第１ ４４０ ９８１、欧州特許第１ ０６７ １８２号、および欧州特許第１ ４７１ １５２号（各々参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
[425]Ｓ１２７Ｒ、Ｎ１５７Ｋ、Ｆ２１６Ｌ、Ｒ２１８Ｓ、およびＤ３７４Ｙを含むＰ
ＣＳＫ９のいくつかの変異型が十分に特徴付けられており、Ｓ１２７Ｒ、Ｆ２１６Ｌ、およびＤ３７４Ｙは常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）に関連している。Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（４７）：４８８６５－４８８７５（２００４））は、Ｓ１２７ＲおよびＤ３７４Ｙ変異が、ＥＲでプロセシングされて活性な分泌型チモーゲンを形成するプロＰＣＳＫ９のレベルの有意な減少をもたらすことを実証した。結果として、野生型ＰＣＳＫ９はＬＤＬ受容体の代謝回転率を増大させ、ＬＤＬクリアランスの阻害を引き起こすと考えられている（Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ
ａｌ，ＰＮＡＳ，１０２（６）：２０６９－２０７４（２００５）；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ，およびＬａｌａｎｎｅ ｅｔ ａｌ）、ＰＣＳＫ９常染色体優性変異は、ＬＤＬＲレベルの増大、循環ＬＤＬのクリアランスの増大、および血漿コレステロールレベルの対応する減少をもたらす。Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ、１０２（１５）：５３７４－５３７９（２００５）；Ａｂｉｆａｄｅｌ ｅｔ ａｌ，２００３ Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３４：１５４－１５６；Ｔｉｍｍｓ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４：３４９－３５３；およびＬｅｒｅｎ、２００４ Ｃｌｉｎ．Ｃｅｎｅｔ．６５：４１９－４２２（これらは参照により本明細書に組み込ま
れる）を参照のこと。
[426]Ａｂｉｆａｄｅｌ ｅｔ ａｌのＳ１２７Ｒ変異に関する後に発表された研究で
は、そのような変異を有する患者は、（１）ａｐｏＢ １００を含むリポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）および中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）の過剰産生、ならびに（２）前記リポタンパク質のクリアランスまたは変換の関連する減少、に起因する血漿中の高い総コレステロールおよびａｐｏＢ１００を示した。まとめると、上記の研究は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬ産生の調節に役割を果たすという事実を証明している。ＰＣＳＫ９の発現または上方制御は、ＬＤＬコレステロールの血漿レベルの増大と関連し、ＰＣＳＫ９の発現の阻害または欠如は、ＬＤＬコレステロールの血漿レベルの低下と関連している。重要なことに、ＰＣＳＫ９の配列変異に関連するＬＤＬコレステロールのレベルが低下すると、冠状動脈性心疾患に対する保護がもたらされる；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ，２００６ Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１２６４－１２７２。
[427]Ｌａｌａｎｎｅらは、ＰＣＳＫ９にＳ１２７Ｒ変異を有する２例の患者において
、ＬＤＬ異化作用が損なわれ、アポリポタンパク質Ｂ含有リポタンパク質合成が増強されたことを示した（Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４６：１３１２－１３１９（２００５））。Ｓｕｎらはまた、ＰＣＳＫ９の変異型が、アポリポタンパク質Ｂ分泌の増加の影響の結果として、異常に重度の優性高コレステロール血症の原因でもあるという証拠を提供した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ、１４（９）：１１６１－１１６９（２００５））。これらの結果は、変異型のＰＣＳＫ９もＬＤＬ受容体のレベルを低下させることを示す結果に加えて（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：５０６３０－５０６３８（２００４））、マウスにおけるＰＣＳＫ９のアデノウイルス媒介性過剰発現が、ＬＤＬ受容体の量の劇的な減少に起因する重度の高コレステロール血症をもたらすことを示した以前の結果（Ｄｕｂｕｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．，２４：１４５４－１４５９（２００４）と一致していた。肝臓由来細胞を含む細胞株、およびｉｎ ｖｉｖｏでのマウスの肝臓におけるＰＣＳＫ９の過剰発現は、ＬＤＬＲのｍＲＮＡレベルの変化なしに、ＬＤＬＲタンパク質レベルおよびＬＤＬＲ機能活性の顕著な低下をもたらす（Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ Ａｍｅｒ．Ｓｅｔ，１０１：７１００－７１０５（２００４）；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７９：４８８６５－４８８７５（２００４））。
[428]ＰＳＣＫ９の阻害に対する様々な治療アプローチが提案されており、これには以
下が挙げられる：遺伝子サイレインシング剤、例えば、ＲＮＡｉによるＰＳＣＫ９合成の阻害；モノクローナル抗体、小ペプチドまたはアドネクチンによるＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合の阻害；および小分子阻害剤によるＰＣＳＫ９自己触媒プロセシングの阻害。これらの戦略は、Ｈｅｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ２００９；１０：９３８－４６；Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ、２０１３；１３：４２９－３５；Ｒｈａｉｎｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｌｉｐｉｄ、２０１２；７：６２１－４０；Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ；，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００９；１３：１９－２８；およびＳｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１２；１１：３６７－８３に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
[429]一部の実施形態では、機能喪失変異は、ＰＣＳＫ９、例えば、Ｇ１０６Ｒ、Ｌ２
５３Ｆ、Ａ４４３Ｔ、Ｒ９３Ｃなどにおいて誘発される。一部の実施形態では、機能喪失変異は、操作される（すなわち、天然に存在しない）、例えば、Ｇ２４Ｄ、Ｓ４７Ｆ、Ｒ
４６Ｈ、Ｓ１５３Ｎ、Ｈ１９３Ｙなど。
[430]本開示において有用であり得るＰＣＳＫ９バリアントは、単独で、または経路に
関与する他の遺伝子、例えば、ＡＰＯＣ３、ＬＤＬ－Ｒ、またはＩｄｏｌと組み合わせて、ＬＤＬコレステロールのＬＤＬ受容体媒介性クリアランスをブーストし得る機能喪失バリアントである。一部の実施形態では、本開示の方法を使用して産生されたＰＣＳＫ９機能喪失バリアントは、細胞内で効率的に発現する。一部の実施形態では、本開示の方法を使用して産生されたＰＣＫＳ９機能喪失バリアントは、活性化され、輸送されて、パラクリンメカニズムで未改変細胞からのクラスリン被覆ピットに係合し、したがって野生型ＰＣＳＫ９タンパク質と競合する。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９機能喪失バリアントは、ＬＤＬ－Ｒタンパク質と直接接触するＬＤＬ－Ｒ結合領域内の残基に変異を含む。一部の実施形態では、ＬＤＬ－Ｒタンパク質と直接接触するＬＤＬ－Ｒ結合領域内の残基は、Ｒ１９４、Ｒ２３７、Ｆ３７９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｄ３７５、Ｄ３７８、Ｒ４６、Ｒ２３７、およびＡ４４３からなる群から選択される。
[431]本明細書に記載されるように、機能喪失ＰＣＳＫ９バリアントは、野生型ＰＣＳ
Ｋ９タンパク質と比較して活性が低下している場合がある。ＰＣＳＫ９活性は、当該技術分野におけるＰＣＳＫ９タンパク質の任意の公知の生物学的活性を指す。例えば、一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、そのプロテアーゼ活性を指す。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、細胞分泌経路を介して分泌されるその能力を指す。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、クラスリン被覆小胞においてタンパク質結合アダプターとして作用するその能力を指す。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬ受容体と相互作用するその能力を指す。一部の実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬ受容体の再循環を防止するその能力を指す。これらの例は、限定することを意図したものではない。
[432]一部の実施形態では、機能喪失ＰＣＳＫ９バリアントの活性は、少なくとも２０
％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、またはそれを超えて低下され得る。一部の実施形態では、機能喪失ＰＣＳＫ９バリアントは、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質と比較して５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下またはそれ未満の活性を有する。ＰＣＳＫ９活性を決定するための非限定的な例示的アッセイは、当該技術分野において、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開ＵＳ２０１２００８２６８０に記載されている。
[433]一部の実施形態では、細胞のＰＣＳＫ９活性は、適切に折り畳まれた活性なＰＣ
ＳＫ９タンパク質のレベルを低下させることによって低下され得る。野生型ＰＣＳＫ９タンパク質に不安定化変異を導入すると、タンパク質のミスフォールディングまたは不活性化が発生し得る。本明細書に記載の１つまたは複数の不安定化変異を含むＰＣＳＫ９バリアントは、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質と比較して活性が低下している場合がある。例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の不安定化変異を含むＰＣＳＫ９バリアントの活性は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれを超えて低下され得る。
[434]一部の実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、標的遺伝子に
よってコードされるタンパク質の発現および／またはその機能を低減または無効にする。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされるＰＣＳＫ９タンパク質の発現および／または機能を、少なくとも対照と比較して、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１、または少なくとも１０分の１に低下
させる。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、ＡＰＯＣ３遺伝子によってコードされるＡＰＯＣ３タンパク質の発現および／または機能を、対照と比較して、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１、または少なくとも１０分の１に低下させる。例えば、本明細書に開示される方法および組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現および／または機能を、対照と比較して、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも６分の１、少なくとも７分の１、少なくとも８分の１、少なくとも９分の１、または少なくとも１０分の１に低下させる。
[435]一部の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変方法および組成物は、細
胞内のＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％減少させ、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％低下させる。一部の実施形態では、改変は、細胞内のＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現を、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも６０分の１、少なくとも７０分の１、少なくとも８０分の１、少なくとも９０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも６００分の１、少なくとも７００分の１、少なくとも８００分の１、少なくとも９００分の１、少なくとも１０００分の１、少なくとも２０００分の１、少なくとも３０００分の１、少なくとも４０００分の１、少なくとも５０００分の１、少なくとも６０００分の１、少なくとも７０００分の１、少なくとも８０００分の１、少なくとも９０００分の１、または少なくとも１００００分の１に低下させる。一部の実施形態では、改変は、細胞内のＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現を無効にする。
[436]本開示のいくつかの態様は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの成熟および産生を防止する
ことによって細胞のＰＣＳＫ９活性を低下させる戦略を提供する。一部の実施形態では、そのような戦略は、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライシング部位の変更を伴う。スプライシング部位の変化は、スプライシングの変更およびＰＣＳＫ９のｍＲＮＡの成熟につながる場合がある。例えば、一部の実施形態では、変更されたスプライシング部位は、エクソンのスキッピングにつながり、その結果、短縮されたタンパク質産物または変更されたリーディングフレームにつながり得る。一部の実施形態では、変更されたスプライシング部位は、イントロン内の翻訳リボソームがインフレーム終止コドンに遭遇したときに、イントロン配列の翻訳および未成熟翻訳終結をもたらし得る。一部の実施形態では、開始コドンが編集され、正しいコードフレームにない可能性がある次のＡＴＧコドンでタンパク質翻訳が開始される。
[437]スプライシング部位は、通常、イントロンドナー部位、ラリアット（Ｌａｒｉａ
ｔ）分岐点、およびイントロンアクセプター部位を含む。スプライシングの機構は、当業者によく知られている。非限定的な例として、イントロンドナー部位は、ＧＧＧＴＲＡＧＴのコンセンサス配列を有し、イントロンドナー部位コンセンサス配列中のＧ塩基と対になったＣ塩基は、本明細書に記載の方法および組成物によって標的され得、それによってイントロンドナー部位を変更する。ラリアット分枝点はまた、コンセンサス配列、例えば
ＹＴＲＡＣを有し、ここでＹはピリミジンであり、Ｒはプリンである。ラリアット分岐点コンセンサス配列のＣ塩基は、本明細書に記載の核酸塩基エディターによって標的にされ、次のエクソンのスキッピングにつながり得る。イントロンアクセプター部位は、ＹＮＣＡＧＧのコンセンサス配列を有し、Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意のヌクレオチドである。イントロンアクセプター部位のコンセンサス配列のＣ塩基、およびイントロンアクセプター部位のコンセンサス配列中のＧ塩基と対になったＣ塩基は、本明細書に記載の核酸塩基エディターによって標的にされ、それによってイントロンアクセプター部位変更し得、順番にエクソンのスキッピングを導き得る。本明細書に記載されるように、ヒトＰＣＳＫ９の遺伝子配列は、長さ約２２ｋｂであり、１２個のエクソンおよび１１個のイントロンを含む。エクソン－イントロン接合部のそれぞれを変更して、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのプロセシングおよび成熟を妨害し得る。
[438]一部の実施形態では、本明細書に開示される塩基エディターシステムによって生
成されるスプライス部位破壊は、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）におけるイントロン配列の包含をもたらし得る。一部の実施形態では、スプライス部位破壊は、ナンセンス、フレームシフト、またはインフレームインデル変異を生成し、その結果、未成熟終止コドンまたはタンパク質活性を破壊するアミノ酸の挿入／欠失が生じる。一部の実施形態では、スプライス部位破壊は、エクソン配列の排除をもたらす。一部の実施形態では、スプライス部位破壊は、ＰＣＳＫ９転写物におけるナンセンス、フレームシフト、またはインフレームインデル変異をもたらすエクソン配列の除外を生じる。標準スプライスドナーは、センス鎖上のＤＮＡ配列ＧＴを含むが、標準スプライスアクセプターは、ＤＮＡ配列ＡＧを含む。配列の変更は、正常なスプライシングを混乱させる。スプライスドナーは、アンチセンス鎖の２番目の位置の相補的塩基のアデニン塩基編集によって破壊され得（ＧＴからＧＣ）、スプライスアクセプターは、センス鎖の１番目の位置のアデニン塩基編集によって破壊され得る（ＡＧからＧＧ）。
[439]さらに、本開示はまた、機能獲得ＰＣＳＫ９バリアントの効果に対抗するための
不安定化変異の使用も企図する。機能獲得型ＰＣＳＫ９バリアント（例えば、機能獲得型バリアントは当該技術分野で説明されており、高コレステロール血症に関連することが見出されている（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００８ Ｊｕｎ；４９（６）：１１５２－１１５６；Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１２ Ｓｅｐ ２８；２８７（４０）：３３７４５－５５；Ａｂｉｆａｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．２０１２ Ａｕｇ；２２３（２）：３９４－４００；およびＣａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１ Ｍａｙ ２００６）１５（９）：１５５１－１５５８、これらの各々は参照によって本明細書に組み込まれる）。これらの機能獲得型ＰＣＳＫ９バリアントに不安定化変異を導入すると、これらの機構獲得型バリアントのミスフォールディングおよび不活性化が生じる場合があり、それによって、機能獲得型変異によって生じる超活性を相殺する。さらに、ＬＤＬ－Ｒを介したコレステロールクリアランス経路における他のいくつかの重要な因子における機能獲得変異、例えば、ＬＤＬ－Ｒ、ＡＰＯＢ、またはＡＰＯＣも当該技術分野で説明されている。したがって、本明細書に記載の組成物および方法を使用して、機能獲得型変異の有害な影響を相殺するこれらの要因の不安定な変異が生じることも、本開示の範囲内である。したがって、本開示はさらに、ＰＣＳＫ９タンパク質のミスフォールディングまたはＰＣＳＫ９タンパク質の構造的不安定化を引き起こす変異を提供する。
[440]ヒト起源のファミリーのＰＣＳＫ９および他のメンバー、ならびに多くの動物の
もののポリペプチドおよびコード核酸配列は、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトまたはＥＮＳＥＭＢＬウェブサイトから公的に入手可能である。例としては、限定するものではないが、以下の配列が挙げられ、これらの配列のそれぞれは、その全体が本明細書に組み込ま
れる。第１染色体上の野生型ＰＣＳＫ９遺伝子（ＮＧ＿００９０６１．１）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ（ＬＲＧ＿２７５）
ＧＴＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＧＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＣＴＡＧＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＣＧＣＴＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＣＧＧＧＣＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＧＣＧＴＣＧＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＴＣＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＡＣＧＧＣＣＴＣＴＡＧＧＴＣＴＣＣＴＣＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＣＧＴＧＣＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＴＴＧＣＧＴＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＧＧＧＴＧＴＡＧＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＣＣＧＧＧＧＣＧＡＡＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＴＣＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＴＴＧＧＣＡＣＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＴＡＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＣＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴＴＴＧＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＧＧＧＧＣＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＴＡＴＴＣＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＴＣＧＣＧＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＣＣＡＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＣＡＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＴＧＡＡＴＧＣＣＴＧＧＡＡＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＴＴＧＣＣＡＴＴＡＴＡＧＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＴＴＴＧＧＴＴＴＧＧＡＡＡＡＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＡＣＣＣＧＡＧＡＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＡＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＡＧＴＡＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧＴＡＴＴＣＴＣＧＡＧＧＣＣＣＡＴＴＧＧＣＧＴＣＣＴＴＴＡＧＧＡＣＴＣＡＧＧＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＴＧＴＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＴＴＴＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＡＣＣＡＣＴＡＧＣＴＴＴＴＴＣＴＡＡＧＴＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＡＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＴＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＴＧＡＣＡＡＧＴＣＡＣＴＴＡＴＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＣＣＡＴＴＧＣＣＴＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＡＧＧＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＴＣＧＴＣＣＣＴＡＣＧＧＣＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＡＣＴＴＡＣＡＡＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧＧＧＧＧＡＴＣＡＣＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＧＴＧＴＧＡＣＣＴＧＴＴＧＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＡＡＡＣＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＴＣＴＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＧＣＴＴＣＴＧＴＣＴＧＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＡＧＴＣＣＴＴＡＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＴＡＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴ
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[441]ヒトＰＣＳＫ９アミノ酸配列（ＮＰ＿７７７５９６．２）
ＭＧＴＶＳＳＲＲＳＷＷＰＬＰＬＬＬＬＬＬＬＬＬＧＰＡＧＡＲＡＱＥＤＥＤＧＤＹＥＥＬＶＬＡＬＲＳＥＥＤＧＬＡＥＡＰＥＨＧＴＴＡＴＦＨＲＣＡＫＤＰＷＲＬＰＧＴＹＶＶＶＬＫＥＥＴＨＬＳＱＳＥＲＴＡＲＲＬＱＡＱＡＡＲＲＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡＬＫＬＰＨＶＤＹＩＥＥＤＳＳＶＦＡＱＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧＳＬＶＥＶＹＬＬＤＴＳＩＱＳＤＨＲＥＩＥＧＲＶＭＶＴＤＦＥＮＶＰＥＥＤＧＴＲＦＨＲＱＡＳＫＣＤＳＨＧＴＨＬＡＧＶＶＳＧＲＤＡＧＶＡＫＧＡＳＭＲＳＬＲＶＬＮＣＱＧＫＧＴＶＳＧＴＬＩＧＬＥＦＩＲＫＳＱＬＶＱＰＶＧＰＬＶＶＬＬＰＬＡＧＧＹＳＲＶＬＮＡＡＣＱＲＬＡＲＡＧＶＶＬＶＴＡＡＧＮＦＲＤＤＡＣＬＹＳＰＡＳＡＰＥＶＩＴＶＧＡＴＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧＴＬＧＴＮＦＧＲＣＶＤＬＦＡＰＧＥＤＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣＦＶＳＱＳＧＴＳＱＡＡＡＨＶＡＧＩＡＡＭＭＬＳＡＥＰＥＬＴＬＡＥＬＲＱＲＬＩＨＦＳＡＫＤＶＩＮＥＡＷＦＰＥＤＱＲＶＬＴＰＮＬ
ＶＡＡＬＰＰＳＴＨＧＡＧＷＱＬＦＣＲＴＶＷＳＡＨＳＧＰＴＲＭＡＴＡＶＡＲＣＡＰＤＥＥＬＬＳＣＳＳＦＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲＭＥＡＱＧＧＫＬＶＣＲＡＨＮＡＦＧＧＥＧＶＹＡＩＡＲＣＣＬＬＰＱＡＮＣＳＶＨＴＡＰＰＡＥＡＳＭＧＴＲＶＨＣＨＱＱＧＨＶＬＴＧＣＳＳＨＷＥＶＥＤＬＧＴＨＫＰＰＶＬＲＰＲＧＱＰＮＱＣＶＧＨＲＥＡＳＩＨＡＳＣＣＨＡＰＧＬＥＣＫＶＫＥＨＧＩＰＡＰＱＥＱＶＴＶＡＣＥＥＧＷＴＬＴＧＣＳＡＬＰＧＴＳＨＶＬＧＡＹＡＶＤＮＴＣＶＶＲＳＲＤＶＳＴＴＧＳＴＳＥＧＡＶＴＡＶＡＩＣＣＲＳＲＨＬＡＱＡＳＱＥＬＱ（配列番号６）
アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）
[442]一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する改変の
ための標的遺伝子は、ＡＰＯＣ３をコードする遺伝子である。ＬＤＬ－Ｒ媒介性のコレステロールクリアランス経路には、複数の関係者が関与している。この経路に関与するタンパク質因子の非限定的な例としては、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬ－Ｒ）、およびＬＤＬ受容体タンパク質の分解の増大（ＩＤＯＬ）が挙げられる。これらのタンパク質因子およびそれらのそれぞれの機能は、当該技術分野で説明されている。さらに、これらの因子の機能喪失バリアントが特定され、特徴付けられており、心臓保護機能を有することが確認されている。例えば、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１４；３７１：３２－４１ Ｊｕｌｙ ３，２０１４；Ｓｃｈｏｌｔｚｌ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９９）８（１１）：２０２５－２０３０；Ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ－Ｏｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４７：１７；およびＧｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２０１３、５４（１２）：３３４５－５７（これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。したがって、本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、ＡＰＯＣ３（例えば、Ａ４３ＴおよびＲ１９Ｘ）、ＬＤＬ－Ｒ、およびＩＤＯＬ（例えば、Ｒ２６６Ｘ）の機能喪失バリアントの生成を提供する。
[443]アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）は、ヒトではＡＰＯＣ３遺伝子に
よってコードされるタンパク質である。ＡＰＯＣ３は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の構成成分である。ＡＰＯＣ３は、リポタンパク質リパーゼと肝臓リパーゼを阻害する。また、ＡＰＯＣ３は、トリグリセリドに富む粒子の肝臓への取り込みを阻害すると考えられている。ＡＰＯＣ３レベルの上昇は、高トリグリセリド血症の発症を誘発する。最近の証拠は、脂質が豊富な条件下で肝細胞からトリグリセリドが豊富なＶＬＤＬ粒子の集合および分泌を促進するＡＰＯＣ３の細胞内の役割を示唆している。しかし、ヒトａｐｏＣ３コード配列、Ａ２３ＴおよびＫ５８Ｅに自然に発生する２つの点変異は、肝細胞からのトリグリセリドに富むＶＬＤＬ粒子の細胞内集合および分泌を無効にすることが示されている。
[444]本明細書に記載の方法および組成物を使用してＡＰＯＣ３遺伝子に作製され得る
機能喪失変異も提供される。機能喪失変異を生成するための戦略は、ＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３に使用されるものと同様である（例えば、未成熟終止コドン、不安定化変異、選択的スプライシングなど）。
[445]一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変方法および組成物は、細胞に
おけるＡＰＯＣ３遺伝子によってコードされる機能的ＡＰＯＣ３タンパク質の発現を低下させる。一部の実施形態では、改変は、コードされる機能的なＡＰＯＣ３タンパク質の発現を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、
少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％低下させる。一部の実施形態では、この改変は、細胞中のＡＰＯＣ３またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる機能的なＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも６０分の１、少なくとも７０分の１、少なくとも８０分の１、少なくとも９０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも６００分の１、少なくとも７００分の１、少なくとも８００分の１、少なくとも９００分の１、少なくとも１０００分の１、少なくとも２０００分の１、少なくとも３０００分の１、少なくとも４０００分の１、少なくとも５０００分の１、少なくとも６０００分の１、少なくとも７０００分の１、少なくとも８０００分の１、少なくとも９０００分の１、または少なくとも１００００分の１に低下させる。一部の実施形態では、この改変は、細胞内のＡＰＯＣ３遺伝子によってコードされる機能的なＡＰＯＣ３タンパク質の発現を無効にする。
[446]ヒトＡＰＯＣ３のタンパク質配列は、例えば、寄託番号ＮＰ＿００００３１．１
で見出され得、その参照はその全体が本明細書に組み込まれる。ヒト核酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＧ＿００８９４９．１で見出され得、その配列全体が本明細書に組み込まれている。マウス、ラット、サルのＡＰＯＣ３核酸配列が寄託されている；例えば、Ｅｎｓｅｍｂｌ受託番号ＥＮＳＭＵＳＧ００００００３２０８１、ＥＮＳＲＮＯＧ００００００４７５０３、およびＥＮＳＭＦＡＧ０００００００１８３７（これらの各配列は、その全体が本明細書に組み込まれている）をそれぞれ参照のこと。
[447]ＡＰＯＣ３およびヒト起源のファミリーの他のメンバー、ならびに多くの動物の
もののポリペプチドおよびコード核酸配列は、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトまたはＥＮＳＥＭＢＬウェブサイトから公的に入手可能である。例としては、以下の配列が挙げられるが、これらに限定されない（これらの配列のそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる）；
[448]ＮＧ＿００８９４９．１：５０００－８１６５ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓアポ
リポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）、第１１染色体上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ
ＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＡＴＣＣＣＴＡＧＡＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＧＡＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＣＣＴＣＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＧＧＴＧＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＴＣＡＴＣＡＴＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＣＣＡＡＡＧＣＴＡＣＡＣＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＧＴＴＣＣＣＣＣＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＡＧＡＣＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＧＧＡＧＡＴＣＡＧＴＣＣＡＧＡＣＣＧＣＡＧＧＴＧＣＣＴＴＧＡＴＧＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＴＣＧＡＴＣＣＣＴＣＧＣＣＣＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＣＧＴＡＴＴＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＡＡＧＧＴＴＣＴＡＣＣＴＴＡＧＧＧＧＣＣＡＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＣＣＴＣＡＣＡＧＧＡＣＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＧＣＣＣＧＴＡＡＧＣＡＣＴＴＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＧＧ
ＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＡＣＴＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＴＣＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＴＴＣＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＧＴＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＡＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡＴＣＣＣＡＡＣＡＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＣＡＧＧＧＣＣＴＴＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＣＣＴＡＧＧＧＣＧＴＧＣＣＧＴＴＴＴＡＧＣＣＣＴＣＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＣＡＣＣＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＣＧＧＧＴＴＣＡＡＣＣＣＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＣＴＧＧＣＴＡＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＴＴＣＴＣＡＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＣＡＡＴＡＧＧＧＴＴＣＡＣＡＣＴＣＣＴＡＴＧＡＧＡＡＴＧＴＡＡＧＧＣＣＡＣＴＴＧＡＴＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＣＴＣＡＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＡＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＧＧＧＣＴＡＧＧＧＧＴＴＴＧＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＣＣＣＣＡＣＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＴＴＣＴＡＡＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＴＣＡＧＴＡＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＴＧＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＧＣＡＴＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＴＴＣＡＴＡＡＡＣＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＣＣＣＡＧＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＧＧＧＴＡＧＧＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＴＣＡＣＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＧＧＣＴＣＡＧＡＧＣＧＡＴＴＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＴＣＡＣＡＣＡＡＣＴＡＡＴＣＡＡＴＣＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣＴＴＴＣＣＡＡＡＴＧＡＧＡＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＡＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＧＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＴＴＧＴＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＴＡＡＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＧＣＴＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＣＡＧＴＧＡＡＧＴＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＴＣＣＴ
ＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＣＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＧＧＴＴＧＣＣＴＡＣＡＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＡＧＧＧＧＣＴＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＣＧＴＴＡＡＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＴＣＴＧＡＧＴＴＣＴＧＧＧＡＴＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＴＣＡＡＴＡＣＣＣＣＡＡＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＴＡＧＧＴＴＧＣＴＴＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＣＣＴＣＡＴＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＡＴＧＡ（配列番号６２）
ＮＰ＿００００３１．１ ヒトアポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ前駆体
ＭＱＰＲＶＬＬＶＶＡＬＬＡＬＬＡＳＡＲＡＳＥＡＥＤＡＳＬＬＳＦＭＱＧＹＭＫＨＡＴＫＴＡＫＤＡＬＳＳＶＱＥＳＱＶＡＱＱＡＲＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫＤＹＷＳＴＶＫＤＫＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥＶＲＰＴＳＡＶＡＡ（配列番号６３）
アンジオポイエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）
[449]一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する改変の
ための標的遺伝子は、ＡＮＧＰＴＬ３をコードする遺伝子である。ＡＮＧＰＴＬ３は、限定するものではないが、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、冠状動脈性心疾患、糖尿病、真性糖尿病、インスリン非依存性真性糖尿病、脂肪肝、高インスリン血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、低βリポタンパク血症、炎症、インスリン抵抗性、代謝疾患、肥満、口腔悪性新生物、脂質代謝異常症、口唇・口腔癌腫、脂質異常症、メタボリックシンドロームＸ、低トリグリセリド血症、オピッツ三角頭症症候群、虚血性脳卒中、高トリグリセリド血症結果、家族性低βリポ蛋白血症２、家族性低βリポ蛋白血症、および虚血性脳血管障害などの疾患および障害に関連している。本明細書に記載の方法のいずれかを使用したＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集は、本明細書に記載の疾患および障害の症状を治療、予防および／または緩和するために使用され得る。
[450]ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、ヒトにおける高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル
の決定因子であるアンジオポエチン様３タンパク質をコードする。これは、血漿トリグリセリドおよびＨＤＬコレステロールと正の相関がある。ＡＮＧＰＴＬ３の活性は主に肝臓で発現する。ＡＮＧＰＴＬ３は、脂質異常症に関連している。脂質異常症は、血液中の脂質レベルの上昇を特徴とする遺伝性疾患で、動脈硬化（アテローム性動脈硬化）の発症原因となる。これらの脂質としては、血漿コレステロール、トリグリセリド、または高密度リポタンパク質が挙げられる。脂質異常症は、心臓発作、脳卒中、またはその他の循環器疾患のリスクを高める。現在の管理には、運動および食事の変更などのライフスタイルの変化、ならびにスタチンなどの脂質低下薬の使用が挙げられる。非スタチン脂質低下薬としては、胆汁酸封鎖剤、コレステロール吸収阻害剤、ホモ接合性家族性高コレステロール血症の薬、フィブラート、ニコチン酸、オメガ－３脂肪酸および／または併用製品が挙げられる。処置の選択肢は通常、特定の脂質異常に依存するが、異なる脂質異常が共存する場合も多い。子供の処置は、食事の変化が困難である可能性があり、脂質低下療法の有効性が証明されていないので、より困難である。
[451]ＡＮＧＰＴＬ３は、低βリポタンパク血症を引き起こすことも公知である。低β
リポタンパク血症は、世界中で１，０００人に１人から３，０００人に１人の割合で発症する遺伝性疾患（常染色体劣性遺伝）である。低ベータリポタンパク血症の一般的な症状としては、ＬＤＬコレステロールまたはアポリポタンパクＢの血漿レベルが５パーセンタイルを下回ることが挙げられ、これは、体が脂肪を吸収および輸送する能力を損ない、網膜変性、神経障害、凝固障害、または脂肪肝と呼ばれる肝臓への脂肪の異常な蓄積を引き起こし得る。重症の患者では、脂肪肝が慢性肝疾患（肝硬変）に進行する場合がある。低
βリポタンパク血症の現在の処置には、脂肪の吸収を改善するために、長鎖脂肪酸を１日あたり１５グラムに厳しく制限することが挙げられる。低βリポタンパク血症の乳児では、中鎖トリグリセリドの短時間の補給が効果的かもしれないが、肝毒性を避けるために量を注意深く監視する必要がある。低βリポタンパク血症を処置するための別の選択肢は、神経学的合併症を防ぐために高用量のビタミンＥを投与することである。あるいは、プロトロンビン時間の上昇がビタミンＫの枯渇を示唆する場合は、ビタミンＡ（１０，０００～２５，０００ＩＵ／日）の補給が有効な場合がある。
[452]一例では、本明細書に記載の組成物および方法の標的組織は肝臓組織である。一
例では、遺伝子は、アンジオポエチン５、ＡＮＧＰＴ５、ＡＮＧ－５、アンジオポエチン様タンパク質３、アンジオポエチン－５、ＦＨＢＬ２、およびＡＮＬ３とも呼ばれるＡＮＧＰＴＬ３である。ＡＮＧＰＴＬ３は、ｌｐ３１．３の細胞遺伝学的位置を有し、ゲノム座標は、位置６２，５９７，４８７～６２，６０６，１５９のフォワード鎖の第１染色体にある。
[453]本明細書に記載の方法および組成物を使用してＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に作製し得
る機能喪失変異も提供される。機能喪失変異を生成するための戦略は、ＰＣＳＫ９に使用されるものと同様である（例えば、限定するものではないが、未成熟終止コドン、変異の不安定化、選択的スプライシングなどを含む）。
[454]一部の実施形態では、改変は、細胞中のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードさ
れる機能的なＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を低下させる。一部の実施形態では、この改変は、コードされた機能的なＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％低下させる。一部の実施形態では、この改変は、細胞中のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる機能的ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも６０分の１、少なくとも７０分の１、少なくとも８０分の１、少なくとも９０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも６００分の１、少なくとも７００分の１、少なくとも８００分の１、少なくとも９００分の１、少なくとも１０００分の１、少なくとも２０００分の１、少なくとも３０００分の１、少なくとも４０００分の１、少なくとも５０００分の１、少なくとも６０００分の１、少なくとも７０００分の１、少なくとも８０００分の１、少なくとも９０００分の１、または少なくとも１００００分の１に低下させる。一部の実施形態では、この改変は、細胞中のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる機能的ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を無効にする。
[455]一部の実施形態では、本明細書に開示される塩基エディターシステムによって生
成されるスプライス部位破壊は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）におけるイントロン配列の包含をもたらし得る。一部の実施形態では、スプライス部位破壊は、ナンセンス、フレームシフト、またはインフレームインデル変異を生成し、その結果、未成熟終止コドンまたはタンパク質活性を破壊するアミノ酸の挿入／欠失が生じる。一部の実施形態では、スプライス部位破壊は、エクソン配列の排除をもたらす。一部の実施形態では、スプライス部位破壊は、ＡＮＧＰＴＬ３転写物にお
けるナンセンス、フレームシフト、またはインフレームインデル変異をもたらすエクソン配列の除外を生じる。標準スプライスドナーは、センス鎖上のＤＮＡ配列ＧＴを含むが、標準スプライスアクセプターは、ＤＮＡ配列ＡＧを含む。配列の変更は、通常のスプライシングを混乱させる。スプライスドナーは、アンチセンス鎖の２番目の位置の相補的塩基のアデニン塩基編集によって破壊されてもよく（ＧＴからＧＣ）、スプライスアクセプターは、センス鎖の１番目の位置のアデニン塩基編集によって破壊され得る（ＡＧからＧＧ）。
[456]一部の実施形態では、本明細書で提供される塩基エディターシステムは、ＡＮＧ
ＰＴＬ３遺伝子と接触すると、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子におけるＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更をもたらす。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスドナー部位にある。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＡＮＴＰＴＬ３遺伝子のスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる異常なＡＮＧＰＴＬ３転写物をもたらす。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる非機能的ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドをもたらす。一部の実施形態では、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更は、ＡＮＧＰＬＴ３遺伝子のイントロン６のスプライスドナー部位の５’末端にある。
[457]ヒトＡＮＧＰＴＬ３のヌクレオチド配列は、例えばＮＧ＿０２８１６９．１に提
供されており、その全体が本明細書に組み込まれている。ヒトＡＮＧＰＴＬ３のタンパク質配列は、例えばＡＡＤ３４１５６．１として提供され、その全体が本明細書に組み込まれる。
[458]マウス、ラット、およびサルのＡＮＧＰＴＬ３核酸配列が寄託されている；例え
ば、Ｅｎｓｅｍｂｌ受託番号ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２８５５３、ＥＮＳＲＮＯＧ０００００００８６３８、およびＥＮＳＭＦＡＧ０００００００７０８３をそれぞれ参照のこと、これらの配列のそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれている。
[459]ＡＮＧＰＴＬ３およびヒト起源のファミリーの他のメンバーのポリペプチドおよ
びコード核酸配列、ならびに多くの動物のものは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトまたはＥＮＳＥＭＢＬウェブサイトから公的に入手可能である。例としては、限定するものではないが、以下の配列が挙げられ、これらの配列のそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる。
ＮＧ＿０２８１６９．１ ヒトアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、第１染色体上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ
ＡＡＴＧＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＴＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＡＧＴＡＴＣＣＡＣＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＴＡＡＣＡＡＧＧＡＧＧＧＧＡＧＣＡＡＡＴＴＡＴＧＴＡＣＡＴＡＡＣＣＡＧＡＴＧＡＴＴＣＧＣＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＴＡＧＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＧＴＣＴＡＴＴＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＴＡＴＡＧＧＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＴＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＣＡＡＣＣＣＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＣＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＣＴＡＴＡＣＡＴＡＣＴＧＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＧＧＴＴＣＡＴＣＴＡＴＡＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＡＡＣＴＣＴＡＴＡＧＡＣＡＴＴＣＡＴＡＧＧＡＡＡＡＴ
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[460]ＡＡＤ３４１５６．１ヒトアンジオポイエチン関連タンパク質３
ＭＦＴＩＫＬＬＬＦＩＶＰＬＶＩＳＳＲＩＤＱＤＮＳＳＦＤＳＬＳＰＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫＩＬＡＮＧＬＬＱＬＧＨＧＬＫＤＦＶＨＫＴＫＧＱＩＮＤＩＦＱＫＬＮＩＦＤＱＳＦＹＤＬＳＬＱＴＳＥＩＫＥＥＥＫＥＬＲＲＴＴＹＫＬＱＶＫＮＥＥＶＫＮＭＳＬＥＬＮＳＫＬＥＳＬＬＥＥＫＩＬＬＱＱＫＶＫＹＬＥＥＱＬＴＮＬＩＱＮＱＰＥＴＰＥＨＰＥＶＴＳＬＫＴＦＶＥＫＱＤＮＳＩＫＤＬＬＱＴＶＥＤＱＹＫＱＬＮＱＱＨＳＱＩＫＥＩＥＮＱＬＲＲＴＳＩＱＥＰＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＦＬＱＬＮＥＩＲＮＶＫＨＤＧＩＰＡＥＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＭＹＡＩＲＰＳＮＳＱＶＦＨＶＹＣＤＶＩＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＶＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＹＩＥＹＳＦＹＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＡＩＴＧＮＶＰＮＡＩＰＥＮＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＧＹＳＧＧＷＷＷＨＤＥＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＡＫＳＫＰＥＲＲＲＧＬＳＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＴＤＳＥＳＦＥ（配列番号８）
リポタンパク質（ａ）（ＬＰＡ）
[461]一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を用いた改変の標
的遺伝子は、リポタンパク質ａ（ＬＰＡ）をコードする遺伝子である。ＬＰＡは、低密度リポタンパク質バリアントである。遺伝学的および疫学的研究により、ＬＰＡがアテローム性動脈硬化症および関連疾患、例えば、冠状動脈性心臓病および脳卒中の危険因子であることが確認されている。ＬＰＡ濃度は、個体間で１０００倍以上異なる：＜０．２から＞２００ｍｇ／ｄＬまで。この濃度範囲は、これまでに科学者によって研究された全ての集団で観察されている。異なる世界の集団の間の平均および中央濃度は、明確な特殊性を示しており、その主なものは、アジア、オセアニア、またはヨーロッパの人口と比較して、アフリカ系の人口のＬＰＡ血漿濃度が２倍から３倍高いことである。血液中の高ＬＰＡは、冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）、心血管疾患（ＣＶＤ）、アテローム性動脈硬化症、血栓症、および脳卒中と相関している。ＬＰＡを持たないか、またはＬＰＡレベルが非常に低い個体は、健康であるように見える。したがって、少なくとも通常の環境条件下では、血漿ＬＰＡは重要ではない。ａｐｏ（ａ）／ＬＰＡは、哺乳動物の進化においてかなり最近になって登場したため（旧世界のサルおよびヒトのみがＬＰＡを保有することが示されている）、その機能は重要ではないかもしれないが、特定の環境条件下、例えば、特定の感染症にさらされた場合では、進化的に有利である。
[462]ヒト参照配列ＮＧ＿０１６１４７．１によってコードされた例示的なＬＰＡアミ
ノ酸配列を以下に示す：
＞ｓｐ｜Ｐ０８５１９｜ＡＰＯＡ＿ＨＵＭＡＮ Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ａ）ＯＳ＝Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＯＸ＝９６０６ ＧＮ＝ＬＰＡ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
ＭＥＨＫＥＶＶＬＬＬＬＬＦＬＫＳＡＡＰＥＱＳＨＶＶＱＤＣＹＨＧＤＧＱＳＹＲＧＴＹＳＴＴＶＴＧＲＴＣＱＡＷＳＳＭＴＰＨＱＨＮＲＴＴＥＮＹＰＮＡＧＬＩＭＮＹＣＲＮＰＤＡＶＡＡＰＹＣＹＴＲＤＰＧＶＲＷＥＹＣＮＬＴＱＣＳＤＡＥＧＴＡＶＡＰＰＴＶＴＰ
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塩基エディタータンパク質－ｇＲＮＡ複合体
[463]別の態様において、本明細書において提供されるのは、本明細書において提供さ
れるシングルガイドＲＮＡを、塩基エディター融合タンパク質、例えばアデノシン塩基エディター融合タンパク質と複合して含む複合体であって、この複合体が、未改変のシングルガイドＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質との複合体と比較して安定性の増大を含み、この安定性が複合体の半減期によってｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される複合体である。
[464]一部の実施形態では、複合体は、未改変のシングルガイドＲＮＡおよびＣａｓ９
タンパク質との複合体と比較して安定性の増大を含む。一部の実施形態では、複合体は、改変されていないシングルガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質との複合体と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％、少なくとも２０００％、少なくとも３０００％、少なくとも４０００％、少なくとも５０００％、少なくとも６０００％、少なくとも７０００％、少なくとも８０００％、少なくとも９０００％、少なくとも１００００％、少なくとも２００００％、少なくとも３００００％、少なくとも４００００％、少なくとも５００００％、少なくとも６００００％、少なくとも７００００％、少なくとも８００００％、少なくとも９００００％、または少なくとも１０００００％、安定性が増大している。一部の実施形態では、複合体は、未改変のシングルガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質との複合体と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも６０分の１、少なくとも７０分の１、少なくとも８０分の１、少なくとも９０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも６００分の１、少なくとも７００分の１、少なくとも８００分の１、少なくとも９００分の１、少なくとも１０００分の１、少なくとも２０００分の１、少なくとも３０００分の１、少なくとも４０００分の１、少なくとも５０００分の１、少なくとも６０００分の１、少なくとも７０００分の１、少なくとも８０００分の１、少なくとも９０００倍、または少なくとも１００００倍の安定性の増大がある。
[465]一部の実施形態では、複合体の安定性は、複合体の半減期によって測定される。
一部の実施形態では、複合体の安定性は、ｅｘ ｖｉｖｏでの複合体の半減期によって測定される。一部の実施形態では、複合体の安定性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複合体の半減期によって測定される。
[466]一部の実施形態では、この複合体は、改変されていないシングルガイドＲＮＡお
よびＣａｓ９タンパク質との複合体と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％、少なくとも２０００％、少なくとも３０００％、少なくとも４０００％、少なくとも５０００％、少なくとも６０００％、少なくとも７０００％、少なくとも８０００％、少なくとも９０００％、少なくとも１００００％、少なくとも２００００％、少なくとも３００００％、少なくとも４００００％、少なくとも５００００％、少なくとも６００００％、少なくとも７００００％、少なくとも８００００％、少なくとも９００００％、または少なくとも１０００００％、半減期が増大しており、この複合体の半減期はｅｘ ｖｉｖｏで測定される。一部の実施形態では、シングルガイドＲＮＡは、未改変シングルガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質との複合体と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも６０分の１、少なくとも７０分の１、少なくとも８０分の１、少なくとも９０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも６００分の１、少なくとも７００分の１、少なくとも８００分の１、少なくとも９００分の１、少なくとも１０００分の１、少なくとも２０００分の１、少なくとも３０００分の１、少なくとも４０００分の１、少なくとも５０００分の１、少なくとも６０００分の１、少なくとも７０００分の１、少なくとも８０００分の１、少なくとも９０００倍、または少なくとも１００００倍の複合体の半減期の増大を示し、この複合体の半減期はｅｘ ｖｉｖｏ で測定される。
[467]一部の実施形態では、その複合体は、未改変のシングルガイドＲＮＡおよびＣａ
ｓ９タンパク質との複合体と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定した場合、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％、少なくとも２０００％、少なくとも３０００％、少なくとも４０００％、少なくとも５０００％、少なくとも６０００％、少なくとも７０００％、少なくとも８０００％、少なくとも９０００％、少なくとも１００００％、少なくとも２００００％、少なくとも３００００％、少なくとも４００００％、少なくとも５００００％、少なくとも６００００％、少なくとも７００００％、少なくとも８００００％、少なくとも９００００％、または少なくとも１０００００％増大した半減期を含み、この複合体の半減期はｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される。一部の実施形態では、シングルガイドＲＮＡは、未改変シングルガイドＲＮＡと Ｃａｓ９ タンパク質との複合体と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも６０分の１、少なくとも７０分の１、少なくとも８０分の１、少なくとも９０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも６００分の１、少なくとも７００分の１、少なくとも８００分の１、少なくとも９００分の１、少なくとも１０００分の１、少なくとも２０００分の１、少なくとも３０００分の１、少なくとも４０００分の１、少なくとも５０００分の１、少なくとも６０００分の１、少なくとも７０００分の１、少なくとも８０００分の１、少なくとも９０００倍、または少なくとも１００００倍の複合体の半減期
の増加を示し、複合体の半減期はｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される。
[468]別の態様において、本明細書において提供されるのは、本明細書において提供さ
れる複合体を含む細胞である。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞はｅｘ ｖｉｖｏ細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｖｏ細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は、単離された細胞であり得る。
遺伝子改変組成物
[469]別の態様において、本明細書において提供されるシングルガイドＲＮＡおよび塩
基エディタータンパク質または塩基エディタータンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変のための組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、この組成物は、塩基エディタータンパク質をコードする核酸配列を含むベクターをさらに含む。
[470]一部の実施形態では、核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ、または改
変核酸配列であり得る。一部の実施形態では、ベクターは発現ベクターであってもよい。一部の実施形態では、核酸は、ベクターのプロモーターに作動可能に連結される。一部の実施形態では、ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。
治療法および処置の方法
[471]いくつかの態様では、治療を必要とする対象の状態を治療または予防する方法が
本明細書に提供され、この方法は、治療有効量の（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸、を対象に投与すること、を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸を含む。
[472]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、対象におけるＡＮＧＰＴＬ３
遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディターシステムに指令する。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディターシステムに指令する。
[473]一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはサンガーシー
ケンシングによって測定して対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こり、それによって対象の状態を治療または予防する。
[474]いくつかの態様では、本明細書では、それを必要とする対象における状態を治療
または予防する方法が提供され、この方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸、および（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を含む、治療有効量の第１の組成物であって、ガイドポリヌクレオチドは、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディターシステムに指令し、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはサンガーシーケンシングによって測定して対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第１の組成物と；（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸、および（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を含む第
２の組成物であって、ガイドポリヌクレオチドは、次世代シーケンシングまたはサンガーシーケンシングによって測定して対象のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディターシステムに指令し、塩基の変更は、対象の肝細胞全体の少なくとも３５％で起こる、第２の組成物とを対象に投与することを含む。
[475]一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は連続して投与される。
一部の実施形態では、第１の組成物を１回または複数回投与し、次いで第２の組成物を１回または複数回投与する。一部の実施形態では、第１の組成物と第２の組成物が散在している。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は同時に投与される。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、１回以上の用量で投与される。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０時間の間隔にわたって投与される。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日の間隔にわたって投与される。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０週間の間隔にわたって投与される。
[476]一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒ
シーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３５％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の１％～９０％、５％～８５％、１０％～８０％、１５％～７５％、２０％～７０％、２５％～６５％、３０％～６０％、３５％～５５％、または４０％～５０％で起こる。一部の実
施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の１００％で起こる。
[477]一部の実施形態では、塩基の変更は対象の肝細胞で起こる。一部の実施形態では
、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の少なくとも３０％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は対象の肝細胞で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の少なくとも３５％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の多くとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３５％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の１％～９０％、５％～８５％、１０％～８０％、１５％～７５％、２０％～７０％、２５％～６５％、３０％～６０％、３５％～５５％、または４０％～５０％で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングで測定して、対象の肝細胞の１００％で起こる。
[478]一部の実施形態では、対象の全肝細胞で生じた塩基の変更は、次世代シーケンシ
ングによって測定される。一部の実施形態では、対象の全肝細胞で生じた塩基の変更は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって測定される。一部の実施形態では、対象の肝細胞で生じた塩基の変更は、次世代シーケンシングによって測定される。一部の実施形態では、対象の肝細胞で生じた塩基の変更は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって測定される。
[479]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を含む。
[480]一部の実施形態では、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸はｍＲＮ
Ａである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、投与後の対象において翻訳されると塩基エディター融合タンパク質を生成する。一部の実施形態では、塩基エディター融合タンパク質は、対象においてＲＮＰ複合体を形成する。
[481]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
治療または予防するための方法は、ガイドポリヌクレオチドまたはこのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）（ｉ）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する第２のＬＮＰ（ｉｉ）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を治療または予防するための方法は、ガイドポリヌクレオチドまたはこのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入するＬＮＰ（ｉ）と、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼ、またはそれをコードする核酸を含む塩基エディター融合タンパク質（ｉｉ）を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＰ複合体は、対象の肝細胞によりＬＮＰまたは第２のＬＮＰが取り込まれると形成される。
[482]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドまたはこのガイドポリヌクレオチ
ドをコードする核酸（ｉ）と、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸（ｉｉ）との比は、重量で約１：１０～約１０：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、１：１．５、１：２、１：３、または１：４である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、約５００：１～約１：５００である。
[483]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク
質をコードする核酸との比は、重量で約１０００：１～約１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１
：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。
[484]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク
質をコードする核酸とのモル比は、約１００００：１～１：１００００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１：１００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：
１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１：１００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約１：１
００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。
[485]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディ
ター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１０：１～約１：１０である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約４：１、３；１、２：１、１．５：１、１：１、１：１．５、１：２、１：３、または１：４である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、約５００：１～約１：５００である。
[486]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディ
ター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１０００：１～約１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０
、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６５：１、６０：１、５５：１、５０：１、４５：１、４０：１、３５：１、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１７：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２；１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１．０：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約１：０．１、１：０．２、１：０．３、１：０．４、１：０．５、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９、１：１．０、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：８５、１：９０、１：９５、１：１００、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、または１：１０００である。
[487]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディ
ター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、約１００００：１～約１：１００００である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１：１００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、
６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約１：１００００，１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約１００００：１、９５００：１、９０００：１、８５００：１、８０００：１、７５００：１、７０００：１、６５００：１、６０００：１、５５００：１、５０００：１、４５００：１、４０００：１、３５００：１、３０００：１、２５００：１、２０００：１、１５００：１、１０００：１、９５０：１、９００：１、８５０：１、８００：１、７５０：１、７００：１、６５０：１、６００：１、５５０：１、５００：１、４５０：１、４００：１、３５０：１、３００：１、２５０：１、２００：１、１９０：１、１８０：１、１７０：１、１６０：１、１５０：１、１４０：１、１３０：１、１２０：１、１１０：１、１００：１、９５：１、９０：１、８５：１、８０：１、７５：１、７０：１、６９：１、６８：１、６７：１、６６：１、６５：１、６４：１、６３：１、６２：１、６１：１、６０：１、５９：１、５８：１、５７：１、５６：１、５５：１、５４：１、５３：１、５２：１、５１：１、５０：１、４９：１、４８：１、４７：１、４６：１、４５：１、４４：１、４３：１、４２：１、４１：１、４０：１、３９：１、３８：１、３７：１、３６：１、３５：１、３４：１、３３：１、３２：１、３１：１、３０：１、２９：１、２８：１、２７：１、２６：１、２５：１、２４：１、２３：１、２２：１、２１：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７：１、０．６：１、０．５：１、０．４：１、０．３：１、０．２：１、または０．１：１である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする
核酸とのモル比は、多くとも約１：１００００、１：９５００、１：９０００、１：８５００、１：８０００、１：７５００、１：７０００、１：６５００、１：６０００、１：５５００、１：５０００、１：４５００、１：４０００、１：３５００、１：３０００、１：２５００、１：２０００、１：１５００、１：１０００、１：９５０、１：９００、１：８５０、１：８００、１：７５０、１：７００、１：６５０、１：６００、１：５５０、１：５００、１：４５０、１：４００、１：３５０、１：３００、１：２５０、１：２００、１：１９０、１：１８０、１：１７０、１：１６０、１：１５０、１：１４０、１：１３０、１：１２０、１：１１０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６９、１：６８、１：６７、１：６６、１：６５、１：６４、１：６３、１：６２、１：６１、１：６０、１：５９、１：５８、１：５７、１：５６、１：５５、１：５４、１：５３、１：５２、１：５１、１：５０、１：４９、１：４８、１：４７、１：４６、１：４５、１：４４、１：４３、１：４２、１：４１、１：４０、１：３９、１：３８、１：３７、１：３６、１：３５、１：３４、１：３３、１：３２、１：３１、１：３０、１：２９、１：２８、１：２７、１：２６、１：２５、１：２４、１：２３、１：２２、１：２１、１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、または１：０．１である。
[488]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定される場合、投与前と比較して、対象における血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの少なくとも３５％の減少をもたらす。
[489]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した場合、投与前と比較して、対象の血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の減少をもたらす。
[490]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９
．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３１％～９９．９％、３２％～９９．９％、３３％～９９．９％、３４％～９９．９％、３５％～９９．９％、３６％～９９．９％、３７％～９９．９％、３８％～９９．９％、３９％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７９％、１％～７８％、１％～７７％、１％～７６％、１％～７５％、１％～７４％、１％～７３％、１％～７２％、１％～７１％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３９％、１％～３８％、１％～３７％、１％～３６％、１％～３５％、１％～３４％、１％～３３％、１％～３２％、１％～３１％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの１％～９９．９％、５％～９９．５％、１０％～９９％、１５％～９７％、２０％～９５％、２５％～９０％、３０％～８５％、３１％～８０％、３２％～７９％、３３％～７８％、３４％～７７％、３５％～７６％、３６％～７６％、３７％～７５％、３８％～７４％、３９％～７３％、４０％～７２％、４５％～７１％、５０％～７０％、または５５％～６５％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの１００％の低減をもたらす。
[491]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％低い、対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して少なくとも１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満の、対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルをもたらす。
[492]一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質
レベルの低減または血液ＰＣＳＫ９レベルは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの低減または血液ＰＣＳＫ９レベルは、ウェスタンブロット解析によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの低減または血液ＰＣＳＫ９レベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグ
ラフィー－タンデム質量分析）によって測定される。
[493]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの少なくとも３５％の低減をもたらす。
[494]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の低減をもたらす。
[495]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３１％～９９．９％、３２％～９９．９％、３３％～９９．９％、３４％～９９．９％、３５％～９９．９％、３６％～９９．９％、３７％～９９．９％、３８％～９９．９％、３９％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７９％、１％～７８％、１％～７７％、１％～７６％、１％～７５％、１％～７４％、１％～７３％、１％～７２％、１％～７１％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３９％、１％～３８％、１％～３７％、１％～３６％、１％～３５％、１％～３４％、１％～３３％、１％～３２％、１％～３１％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％の低減をもたらす。一部の実施形態では、
核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの１％～９９．９％、５％～９９．５％、１０％～９９％、１５％～９７％、２０％～９５％、２５％～９０％、３０％～８５％、３１％～８０％、３２％～７９％、３３％～７８％、３４％～７７％、３５％～７６％、３６％～７６％、３７％～７５％、３８％～７４％、３９％～７３％、４０％～７２％、４５％～７１％、５０％～７０％、または５５％～６５％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの１００％の低減をもたらす。
[496]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ま
たはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％低い、対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定して、投与前と比較して少なくとも１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満の、対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルをもたらす。
[497]一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパ
ク質レベルの低減または血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの低減または血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルは、ウェスタンブロット解析によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの低減または血液ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析）によって測定される。
[498]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して、対象における血中
低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの少なくとも３５％の減少をもたらす。
[499]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低
密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０
％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３５％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの１％～９９．９％、５％～９９．５％、１０％～９９％、１５％～９７％、２０％～９５％、２５％～９０％、３０％～８５％、３５％～８０％、４０％～７５％、４５％～７０％、５０％～６５％、または５５％～６０％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの１００％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％低い、対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して少なくとも１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満の、対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルをもたらす。
[500]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液ト
リグリセリドレベルの少なくとも３５％の低減をもたらす。
[501]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液ト
リグリセリドレベルの少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の低減をもたらす。一部
の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの多くとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．３％、９９．５％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの１％～９９．９％、２％～９９．９％、３％～９９．９％、４％～９９．９％、５％～９９．９％、６％～９９．９％、７％～９９．９％、８％～９９．９％、９％～９９．９％、１０％～９９．９％、１５％～９９．９％、２０％～９９．９％、２５％～９９．９％、３０％～９９．９％、３５％～９９．９％、４０％～９９．９％、４５％～９９．９％、５０％～９９．９％、５５％～９９．９％、６０％～９９．９％、６５％～９９．９％、７０％～９９．９％、７５％～９９．９％、８０％～９９．９％、８５％～９９．９％、９０％～９９．９％、または９５～９９．９％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの１％～９９．５％、１％～９９％、１％～９８％、１％～９７％、１％～９６％、１％～９５％、１％～９０％、１％～８５％、１％～８０％、１％～７５％、１％～７０％、１％～６５％、１％～６０％、１％～５５％、１％～５０％、１％～４５％、１％～４０％、１％～３５％、１％～３０％、１％～２５％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、１％～９％、１％～８％、１％～７％、１％～６％、１％～５％、１％～４％、１％～３％、または１％～２％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの１％～９９．９％、５％～９９．５％、１０％～９９％、１５％～９７％、２０％～９５％、２５％～９０％、３０％～８５％、３５％～８０％、４０％～７５％、４５％～７０％、５０％～６５％、または５５％～６０％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの１００％の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％低い、対象における血液トリグリセリドレベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して少なくとも１．１分の１、１．２分の１、１．３分の１、１．４分の１、１．５分の１、１．６分の１、１．７分の１、１．８分の１、１．９分の１、２分の１、２．５分の１、３分の１、３．５分の１、４分の１、４．５分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１以下、または１０分の１未満の、対象における血液トリグリセリドレベルをもたらす。
[502]一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液トリグリセリドレベル
または血液トリグリセリドレベルの低減は、任意の標準的な手法によって測定される。一部の実施形態では、投与前と比較した対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルまたは血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの低減は、任意の標準的な手法によって測定される。例えば、血清試料中の「脂
質パネル」を測定するために、コレステロール（総Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ）、および高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）の酵素的な直接測定を伴う臨床アナライザー装置が使用され得る。それぞれの分析物質に固有の試薬キットには、緩衝剤、キャリブレーター、ブランク、および対照を含む。本開示で使用される場合、コレステロール、トリグリセリド、およびＨＤＬ－Ｃは、固有の酵素反応産物の吸光度測定を使用して定量され得る。ＬＤＬ－Ｃは間接的に決定されてよい。一部の例では、循環系のコレステロールの大部分は３種の主要なリポタンパク質分画、即ち超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ＬＤＬ、およびＨＤＬで見出され得る。一部の実施形態では、循環系の総コレステロールは、式［総Ｃ］＝［ＶＬＤＬ－Ｃ］＋［ＬＤＬ－Ｃ］＋［ＨＤＬ－Ｃ］で推定され得る。即ち、ＬＤＬ－Ｃは、関係式：［ＬＤＬ－Ｃ］＝［総Ｃ］－［ＨＤＬ－Ｃ］－［ＴＧ］／５に従って総コレステロール、トリグリセリド、およびＨＤＬ－Ｃの測定値から計算され得る。ここで、［ＴＧ］／５はＶＬＤＬ－コレステロールの推定値である。緩衝剤、キャリブレーター、ブランク、および対照を含むトリグリセリドに固有の試薬キット。本明細書で使用される場合、研究で得られた血清試料は分析するされ得、トリグリセリドはカップリングされた一連の酵素反応を使用して測定されてよい。一部の実施形態では、最後の酵素反応の最終生成物としての分析物質およびその５００ｎｍにおける吸光度を定量するためにＨ２Ｏ２が使用されてよく、発色強度はトリグリセリド濃度に比例する。
[503]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡである。一部の
実施形態では、ガイドＲＮＡは、０、１または２つのミスマッチがあって、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖にミスマッチなしで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に１つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に２つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に３つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に４つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に５つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。
[504]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドＲＮＡである。一部の実
施形態では、ガイドＲＮＡは、０、１または２つのミスマッチがある、ＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖にミスマッチなしで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に１つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に２つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に３つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に４つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはＰＣＳＫ９遺伝子のプロトスペーサー配列の相補鎖に５つのミスマッチで結合するスペーサー配列を含む。
[505]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して
、対象における全肝細胞の１％未満のプロトスペーサー配列の外側である。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して、対象における肝細胞
の１％未満のプロトスペーサー配列の外側である。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して、プロトスペーサー配列の内部のみである。
[506]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して
、対象における全肝細胞の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、８．０％、９．０％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、６５％、８０％、８５％、９０％未満のプロトスペーサー配列の外側にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して、対象における肝細胞の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、８．０％、９．０％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、６５％、８０％、８５％、９０％未満のプロトスペーサー配列の外側にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、正味の核酸塩基編集によって測定して、対象における細胞の０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、２．０％、３．０％、４．０％、５．０％、６．０％、７．０％、８．０％、９．０％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、６５％、８０％、８５％、９０％未満のプロトスペーサー配列の外側にある。
[507]一部の実施形態では、投与は、静脈内注入によるものである。一部の実施形態で
は、本明細書に記載のようにその必要な対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入するＬＮＰ、および（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する第２のＬＮＰ、の連続的な投与を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のように、それを必要とする対象の状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入するＬＮＰ、および（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する第２のＬＮＰ、の同時投与を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のように、それを必要とする対象の状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰ、続いて、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入する時差用量のＬＮＰを、１、２、３、４、５、６または７日の間隔にわたって、投与することを含む。
[508]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象の状態を処置ま
たは予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰ、続いて、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入する時差用量のＬＮＰを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０時間の間隔にわたって、投与することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象の状
態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰ、続いて、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入する時差用量のＬＮＰを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日の間隔にわたって、投与することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象の状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰ、続いて、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入する時差用量のＬＮＰを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６か月の間隔にわたって、投与することを含む。
[509]本明細書に記載の方法は、それを必要とする対象の状態を処置または予防するた
めに使用され得る。一部の実施形態では、この方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡ、またはガイドポリヌクレオチドをコードする核酸、および（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質またはこの塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸、例えば、塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを封入する単回用量のＬＮＰを投与することを含む。例えば、この方法は、（ｉ）ガイドＲＮＡおよび（ｉ）塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを封入するＬＮＰを投与することを含み得る。ＬＮＰは、単回用量または複数回用量で投与され得る。他の実施形態では、この方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはこのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入するＬＮＰ、および（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質またはこの塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸を封入する第２のＬＮＰを投与することを含む。ＬＮＰは、単回用量または複数回用量で投与し得る。
[510]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回用量は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回用量は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回用量は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回用量は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対
象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[511]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法
は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[512]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを３日後に投与することを含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを３日後に投与することを含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを３日後に投与することを含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを３日後に投与することを含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを３日後に投与することを含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを３日後に投与することを含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを３日後に投与することを含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[513]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを４日後に投与することを含み、この複
数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを４日後に投与することを含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを４日後に投与することを含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを４日後に投与することを含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを４日後に投与することを含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを４日後に投与することを含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを４日後に投与することを含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[514]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを５日後に投与することを含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを５日後に投与することを含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを５日後に投与することを含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の
実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを５日後に投与することを含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを５日後に投与することを含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを５日後に投与することを含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを５日後に投与することを含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[515]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを６日後に投与することを含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを６日後に投与することを含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを６日後に投与することを含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを６日後に投与することを含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを６日後に投与することを含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それ
を必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを６日後に投与することを含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを６日後に投与することを含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[516]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを７日後に投与することを含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを７日後に投与することを含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを７日後に投与することを含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを７日後に投与することを含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを７日後に投与することを含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを７日後に投与することを含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを７日後に投与することを含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[517]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回用量は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与すること、を含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを１日後に投与することを含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[518]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与
することを含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のＬＮＰを２日後に投与することを含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[519]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを３日後に投与すること、を含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを３日後に投与すること、を含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを３日後に投与すること、を含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする
核酸を封入するＬＮＰを３日後に投与すること、を含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを３日後に投与すること、を含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを３日後に投与すること、を含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを３日後に投与すること、を含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[520]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを４日後に投与すること、を含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを４日後に投与すること、を含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを４日後に投与すること、を含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを４日後に投与すること、を含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを４日後に投与すること、を含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならび
に複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを４日後に投与すること、を含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを４日後に投与すること、を含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[521]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを５日後に投与すること、を含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを５日後に投与すること、を含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを５日後に投与すること、を含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを５日後に投与すること、を含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを５日後に投与すること、を含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを５日後に投与すること、を含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを５日後に投与すること、を含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[522]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを６日後に投与すること、を含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを６日後に投与すること、を含み、この複数回投与は２日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを６日後に投与すること、を含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを６日後に投与すること、を含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを６日後に投与すること、を含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを６日後に投与すること、を含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを６日後に投与すること、を含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[523]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を
処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを７日後に投与すること、を含み、この複数回投与は１日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを７日後に投与すること、を含み、この複数回投与は２日間隔で施
される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを７日後に投与すること、を含み、この複数回投与は３日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを７日後に投与すること、を含み、この複数回投与は４日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを７日後に投与すること、を含み、この複数回投与は５日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを７日後に投与すること、を含み、この複数回投与は６日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに複数回用量のＬＮＰであって、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを７日後に投与すること、を含み、この複数回投与は７日間隔で施される。
[524]一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象の状態を処置ま
たは予防するための方法は、（ｉ）ガイドポリヌクレオチドまたはそのガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を封入する単回用量のＬＮＰを投与すること、ならびに（ｉｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入するＬＮＰを投与することを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰの単回用量は、０．３ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、ＬＮＰの単回用量は、０．５ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、ＬＮＰの単回用量は、１ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、ＬＮＰの単回用量は、１ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、ＬＮＰの単回用量は、約０．３～約３ｍｇ／ｋｇである。
[525]本明細書で提供される状態の処置の方法は、１つまたは複数の処置の処置コース
を含んでもよく、各処置は、単回用量のもしくは複数回用量の塩基エディターシステム、または塩基エディターシステムの１つまたは複数の構成要素を封入するＬＮＰを含む。例えば、それを必要とする対象に、塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡおよび処置のためのガイドＲＮＡを封入する単回用量のＬＮＰを投与してもよい。一部の実施形態では、対象は、１つまたは複数の処置の処置コースを施されてもよく、ここで、各処置は、ＬＮＰの単回用量のうちの１つまたは複数を含み、例えば、対象はまた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０回、またはそれ以上の用量の、塩基エディター融合タン
パク質をコードするｍＲＮＡおよび処置のためのガイドＲＮＡを封入するＬＮＰを投与してもよい。対象は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上の処置という処置コースを受けてもよく、この各用量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、９か月、１２か月、２４か月、４８か月、または離れて投与され得る。本明細書に記載の処置のための単回用量は、ガイドＲＮＡもしくは塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはその両方を封入するＬＮＰを含み得る。
[526]一部の実施形態では、ＬＮＰの単回用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋ
ｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．１ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．３ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．７ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、３．９ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．１ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ、４．３ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、４．６ｍｇ／ｋｇ、４．７ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、４．９ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．１ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、５．３ｍｇ／ｋｇ、５．４ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋｇ、５．７ｍｇ／ｋｇ、５．８ｍｇ／ｋｇ、５．９ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．１ｍｇ／ｋｇ、６．２ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇ、６．４ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ、６．７ｍｇ／ｋｇ、６．８ｍｇ／ｋｇ、６．９ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．１ｍｇ／ｋｇ、７．２ｍｇ／ｋｇ、７．３ｍｇ／ｋｇ、７．４ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、７．６ｍｇ／ｋｇ、７．７ｍｇ／ｋｇ、７．８ｍｇ／ｋｇ、７．９ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．１ｍｇ／ｋｇ、８．２ｍｇ／ｋｇ、８．３ｍｇ／ｋｇ、８．４ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、８．６ｍｇ／ｋｇ、８．７ｍｇ／ｋｇ、８．８ｍｇ／ｋｇ、８．９ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．１ｍｇ／ｋｇ、９．２ｍｇ／ｋｇ、９．３ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、９．６ｍｇ／ｋｇ、９．７ｍｇ／ｋｇ、９．８ｍｇ／ｋｇ、９．９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１０５ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１１５ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１３５ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１４５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１５５ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１６５ｍｇ／ｋｇ、１７０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、１８５ｍｇ／ｋｇ、１９０ｍｇ／ｋｇ、１９５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、または５００ｍｇ／ｋｇを含む。
[527]一部の実施形態では、状態はアテローム硬化性心血管疾患である。一部の実施形
態では、状態は心血管疾患または糖尿病である。一部の実施形態では、状態はアテローム硬化性血管疾患である。
[528]一部の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。一部の実施形態では、対象は
サルである。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、デアミナーゼはアデニンデアミナーゼである。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、Ａ・ＴからＧ・Ｃへの変更である。一部の実施形態では、デアミナーゼはアデニンデアミナーゼであり、核酸塩基変更はＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更である。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９を含む。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９ニッカーゼを含む。一部の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインはＣａｓ９を含む。
[529]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位に
ある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスドナー部位にある。一部の実施形態では、スプライスドナー部位は、配列番号５で参照されるＰＣＳＫ９イントロン１の５’末端にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、フレームシフト、未成熟終止コドン、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは化学的に改変されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは表１または表２４で説明される化学的改変を含む。
[530]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部
位にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスドナー部位にある。一部の実施形態では、スプライスドナー部位は、配列番号７で参照されるＡＮＧＰＴＬ３イントロン６の５’末端にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、フレームシフト、未成熟終止コドン、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドＲＮＡである。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは化学的に改変されている。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは表１または表２４で説明される化学的改変を含む。
[00531]一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、表１または表２４に記載のガイドＲＮ
Ａ配列を含む。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列５’－５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇＣＵａＧＵＣｃＧ ＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕＧｇｃａｃｃｇＡｇＵＣｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号９）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵ ＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号９）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３’（配列番号９）（ＧＡ３４６）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡａｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕ－３（配列番号６５）（ＧＡ３７４）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａ
ｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕｕｕｕ－３’（配列番号１１）（ＧＡ３８５）、５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕｇａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｓｕｓｕｓｕｕＵｕ－３’（配列番号１１）（ＧＡ３８６）または５’－ｃｓｃｓｃｓＧＣＡＣＣＵＵＧＧＣＧＣＡＧＣＧｇＵＵＵＵＡＧａｇｃｕａＧａａａｕａｇｃａａＧＵＵａＡａＡｕＡａｇｇｃｕａＧＵｃｃＧＵＵＡｕｃＡＡｃｕｕＧａａａａａｇｕｇＧｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｓｕｓｕｕｕｕ－３’（配列番号１２）（ＧＡ３８７）を含む。
[532]一部の実施形態では、プロトスペーサー配列は、表１または表２４に示されるプ
ロトスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、このプロトスペーサーは、配列５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）、ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）または５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１５）を含む。
[533]一部の実施形態では、塩基エディター融合タンパク質は配列番号３の配列を含む
。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３で説明されるアミノ酸配列または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼは１つまたは複数の変異（例えば本明細書で提供される変異のいずれか）を含んでもよいことを認識されたい。本開示は、いくらかの同一性パーセントおよび本明細書に記載した変異のいずれかまたはその組合せを有する任意のデアミナーゼドメインを提供する。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３で説明されるアミノ酸配列または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上の変異を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号３で説明されるアミノ酸配列のいずれか１つまたは本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと比較して、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０の同一の隣接するアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
[534]一部の実施形態では、ｍＲＮＡはキャップアナログを含む。
[535]一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基
、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも１つ、２つ、または３つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも１つ、２つ、または３つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも１つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ
－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも２つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも３つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも４つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも５つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも６つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも７つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも８つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも９つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、２’－ヒドロキシル基、２’－Ｏ－メチル基、もしくはさらなる２’化学的改変、またはそれらの組合せを含む５’末端に少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。
[536]一部の実施形態では、ｍＲＮＡはポリＡテイルを含む。
[537]本明細書に記載の組成物は、高循環コレステロールレベルに関連する状態を処置
するために、治療有効量でそれを必要とする対象に投与され得る。本明細書に記載の組成物および方法を使用して処置され得る高循環コレステロールレベルに関連する状態としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、血中ＬＤＬコレステロールレベルの上昇、血中高密度リポタンパク質コレステロール値低下、脂肪肝、冠状動脈性心疾患、血管疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高トリグリセリド血症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、およびそれらの組み合わせ。本明細書に開示される組成物および方法は、対象の循環コレステロールレベルを低下させ、それにより状態を処置するのに有効である。本明細書に開示される組成物および方法は、投与前と比較して、血中ＬＤＬコレステロールレベルの低下および／または血中トリグリセリドレベルの低下に有効である。
[538]別の態様では、本明細書に提供されるのは、それを必要とする対象の状態を処置
または予防する方法であって、本明細書に提供される複合体、本明細書に提供される組成物、または本明細書に提供される脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む方法であって、このｓｇＲＮＡは、対象の細胞内の標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすようにアデノシン塩基エディタータンパク質に指令し、それによってその状態を処置または予防する。
[539]一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子内にある
。一部の実施形態では、改変は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現を低下させる。一部の実施形態では、この状態はアテローム硬化性血管疾患である。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内にある。一部の実施形態では、改変は、対象におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる機能的ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を低下させる。一部の実施形態では、この状態は、アテローム硬化性血管疾患、高トリグリセリド血症、または糖尿病である。
[540]状態、疾患または障害を処置されている患者は、医師がそのような状態を有する
と診断した患者である。診断は、任意の適切な手段によるものであり得る。診断およびモニタリングは、例えば、生物学的サンプル中の病気の、死にかけている、または死んだ細胞の存在の検出（例えば、組織生検、血液検査、または尿検査）、プラークの存在の検出、生物学的サンプルで代理マーカーのレベルの検出、または状態に関連する症状の検出を含み得る。病状の進行が予防されている患者は、そのような診断を受けている場合と受けていない場合がある。当業者は、これらの患者が上記と同じ標準検査を受けた場合があること、または検査なしで、１つまたは複数の危険因子（例えば、家族歴または遺伝的素因）の存在に起因して高リスクであるとして特定される場合があることを理解する。
[541]本開示の治療方法は、疾患または状態に起因する病状を示す対象、疾患または状
態に起因する病状を示す疑いのある対象、および疾患または状態に起因する病状を示すリスクのある対象に対して実施され得る。例えば、疾患または状態に対する遺伝的素因を有する対象は、予防的に処置され得る。状態、疾患または障害に関連する症状を示す対象は、症状を処置して軽減するため、または症状のさらなる進行を遅らせるためもしくは予防するために処置され得る。疾患または状態の重症度の増大に関連する身体的変化は、本明細書では進行性であることが示されている。したがって、本開示の実施形態では、状態または疾患に関連する病状の軽度の徴候を示す対象を処置して、症状を改善し、および／または症状のさらなる進行を防止し得る。
[542]一部の実施形態では、対象は、投与前と比較して、血中ＬＤＬコレステロールレ
ベルの低下および／または血中トリグリセリドレベルの低下を示す。
[543]一部の実施形態では、投与後、対象は、投与前と比べて少なくとも５％、少なく
とも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％低下した血中低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルを示す。一部の実施形態では、投与後、対象は、投与前と比較して、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも６０分の１、少なくとも７０分の１、少なくとも８０分の１、少なくとも９０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも６００分の１、少なくとも７００分の１、少なくとも８００分の１、少なくとも９００分の１、少なくとも１０００分の１、少なくとも２０００分の１、少なくとも３０００分の１、少なくとも４０００分の１、少なくとも５０００分の１、少なくとも６０００分の１、少なくとも７０００分の１、少なくとも８０００分の１、少なくとも９０００分の１、少なくともまたは１００００分の１の血中低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベルの低下を示す。
[00544]一部の実施形態では、投与後、対象は、投与前と比較して、少なくとも５％、
少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％の血中トリグリセリドレベルの低下を示す。
[545]一部の実施形態では、投与後、対象は、投与前と比較して、少なくとも５％、少
なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、または１００％低下した血中トリグリセリドレベルを示す。一部の実施形態では、投与後、対象は、投与前と比較して、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、少なくとも２５分の１、少なくとも３０分の１、少なくとも４０分の１、少なくとも５０分の１、少なくとも６０分の１、少なくとも７０分の１、少なくとも８０分の１、少なくとも９０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも２００分の１、少なくとも３００分の１、少なくとも４００分の１、少なくとも５００分の１、少なくとも６００分の１、少なくとも７００分の１、少なくとも８００分の１、少なくとも９００分の１、少なくとも１０００分の１、少なくとも２０００分の１、少なくとも３０００分の１、少なくとも４０００分の１、少なくとも５０００分の１、少なくとも６０００分の１、少なくとも７０００分の１、少なくとも８０００分の１、少なくとも９０００分の１、または少なくとも１００００分の１の血中トリグリセリドレベルの低下を示す。
[546]哺乳動物に投与される投与量および頻度（単回または複数回投与）は、様々な要
因、例えば、哺乳動物が別の疾患に罹患したか否か、およびその投与経路；レシピエントのサイズ、年齢、性別、健康状態、体重、肥満度指数、および食事；治療中の疾患の症状の性質および程度、同時処置の種類、処置中の疾患による合併症、またはその他の健康関連の問題に応じて変化し得る。確立された投薬量（例えば、頻度および期間）の調整および操作は、十分に当業者の能力の範囲内である。本明細書に開示されるような処置は、毎日、１日２回、隔週、毎月、または治療上有効な任意の適用可能な基準で対象に投与し得る。実施形態では、処置は、必要に応じて、例えば、アテローム硬化性血管疾患、高トリグリセリド血症、または糖尿病などの状態または疾患の徴候または症状の出現時にのみ行われる。
[547]本明細書に記載の組成物は、高循環コレステロールレベルに関連する状態を治療
するために、治療有効量でそれを必要とする対象に投与し得る。本明細書に記載の組成物および方法を使用して治療され得る高循環コレステロールレベルに関連する状態としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、血中ＬＤＬコレステロールレベルの上昇、血中高密度リポタンパク質コレステロール値の低下、脂肪肝、冠状動脈性心疾患、血管疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高トリグリセリド血症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、およびそれらの組み合わせ。本明細書に開示される組成物および方法は、対象の循環コレステロールレベルを低下させ、それにより状態を治療するのに有効である。本明細書に開示される組成物および方法は、投与前と比較して、血中ＬＤＬコレステロールレベルの低下および／または血中トリグリセリドレベルの低下に有効である。
[548]本開示の組成物の毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準
的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％にとって治療的な効果がある用量）を決定することによって決定し得る。毒性と治療効果との間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０比）が治療指数である。高い治療指数を示す薬剤が好ましい。薬剤の投与量は、毒性がほとんどないか、または全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。有毒な副作用を示す薬剤
が使用される可能性があるが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を軽減するために、影響を受けた組織の部位にそのような薬剤を標的とする送達システムを設計するように注意すべきである。
[549]当業者は、特定の要因、例としては、限定するものではないが、疾患または障害
の重症度、以前の処置、対象の健康、性別、体重および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む、対象の一般的な特徴が、対象を効果的に治療するために必要な投与量および投与頻度に影響を与える可能性があることを理解するであろう。さらに、治療有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置を含んでもよく、または好ましくは、一連の処置を含んでもよい。処置に使用される本開示の組成物の有効用量は、特定の処置の過程で増加または減少し得ることも理解されるであろう。本明細書に記載の診断アッセイの結果から、投与量の変化が生じ、明らかになる可能性がある。治療上有効な投与量は、一般に、投与時の患者の状態に依存する。正確な量は日常的な実験によって決定し得るが、最終的には、例えば、患者の疾患の兆候を監視し、それに応じて治療を調整することによって、臨床医の判断に委ねられる。
[550]投与の頻度は、治療の過程で決定および調整されてもよく、必ずしもそうではな
いが、一般に、疾患の治療および／または抑制および／または改善および／または遅延に基づく。あるいは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの徐放製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤およびデバイスが当該技術分野で公知である。一部の実施形態では、投薬量は、毎日、隔日、３日ごと、４日ごと、５日ごと、または６日ごとである。一部の実施形態では、投薬頻度は、毎週、２週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、もしくは１０週間ごとであるか；または毎月１回、２か月ごと、３か月ごと、またはそれ以上である。この治療の進行状況は、従来の技術およびアッセイによって簡単に監視し得る。
[551]投薬レジメン（本明細書に開示される組成物を含む）は、経時的に変化し得る。
一部の実施形態では、正常体重の成人対象について、約０．０１～１０００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与し得る。一部の実施形態では、用量は１～２００ｍｇである。特定の投薬レジメン、すなわち用量、タイミングおよび反復は、特定の対象およびその対象の病歴、ならびにポリペプチドまたはポリヌクレオチドの特性（そのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの半減期および当該技術分野で周知の他の考慮事項など）に依存する。
[552]本開示の目的のために、本明細書に記載の組成物の適切な治療用量は、使用され
る特定の薬剤（またはその組成物）、製剤および投与経路、疾患の種類および重篤度、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが予防目的で投与されるか、または治療目的で投与されるか、以前の治療、対象の病歴およびアンタゴニストに対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する用量に達するまでポリペプチドを投与する。
[553]１つまたは複数の組成物の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与
の目的が治療的か予防的か、および当業者に知られている他の要因に応じて、連続的であっても、または断続的であってもよい。組成物の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよいし、または例えば疾患の発症前、発症中、発症後のいずれかに一連の間隔をあけた投与であってもよい。
[554]本明細書に記載の実施形態を含む本開示の方法および組成物は、哺乳動物に同時
投与され得る１つまたは複数の追加の治療レジメンまたは薬剤または治療とともに投与され得る。
メタボリックシンドロームおよび心血管疾患
[555]遺伝子改変、特に塩基を直接編集する能力により、ＤＳＢを作成する必要なく、
ヒトの疾患を治療する方法を改善することもなく、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子の正確な編集、改変、および／または破壊が可能になる。例えば、Ｃｈａｄｗｉｃｋらは、成体マウスのＰｃｓｋ９遺伝子にナンセンス変異を導入するためにシトシン塩基編集を使用した。アデノウイルスベクターを介したＢＥ３とｇＲＮＡの肝臓への送達により、血漿ＰＣＳＫ９レベルが５６％低下した。さらに、塩基編集されたマウスのコレステロール値は約３０％減少した。その後の研究で、成体マウスのＡｎｇｐｔｌ３遺伝子を破壊するシトシン塩基編集により、血中コレステロールとトリグリセリドのレベルが大幅に低下し、胎児マウスのＰｃｓｋ９遺伝子またはＨｐｄ遺伝子を破壊するシトシン塩基編集により、出生後のコレステロール値の低下または遺伝性チロシン血症１型という疾患の治癒がもたらされた。
[556]心血管疾患、肥満、２型糖尿病、メタボリックシンドロームは、１つまたは複数
の同様の背景的な病因を共有している場合がある。ヒトのＰＣＳＫ９遺伝子は、血流中のコレステロールの量を調節するのに役立つタンパク質をコードしている。ヒトの肝タンパク質プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、分泌型の球状の自動活性化セリンプロテアーゼであり、これは、エンドソーム小胞内でタンパク質結合アダプターとして機能し、ＬＤＬ粒子のエンドサイトーシス中に低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）とのｐＨ依存性相互作用を橋渡しし、ＬＤＬ－Ｒの細胞表面への再循環を防ぎ、ＬＤＬ－コレステロールクリアランスの減少につながる。ＰＣＳＫ９オルソログは、多くの種に見られる。ＰＣＳＫ９タンパク質は、細胞表面に到達する前に低密度リポタンパク質受容体を分解するため、より多くのコレステロールが血流に残り得る。その結果、ＰＣＳＫ９遺伝子およびコードされたＰＣＳＫ９タンパク質は、特に血中コレステロールレベルの低下において、コレステロール代謝を調節するための魅力的な標的となる。
[557]心血管系リスクの有意な低下につながる、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポ
タンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、および高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）の血漿レベルの低下に関連する他の標的も示されている。例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ３は、心血管疾患の処置における重要な新しい薬理学的標的と考えられている。実験的証拠によって、抗ＡＮＧＰＴＬ３療法が重要な抗アテローム性動脈硬化効果を有することが実証されている。モノクローナル抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体（エビナクマブ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いた第Ｉ相臨床試験の結果は、明らかに有意な脂質低下効果を示している。
[558]ヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、染色体１ｐ３１に位置している。ヒトＡＮＧＰＴ
Ｌ３遺伝子の遺伝的バリアントは、異なる血漿脂質プロファイルに関連付けられている。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のホモ接合性機能喪失（ＬＯＦ）バリアントは、全ての血漿リポタンパク質のレベルを大幅に低下させる。ＡＮＧＰＴＬ３は、肝臓でのみ排他的に発現し、循環中に分泌され、肝プロタンパク質転換酵素による切断を経る。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、４６０アミノ酸（ａａ）のポリペプチドであり、特徴的なシグナルペプチド配列、Ｎ末端ヘリックスドメイン、およびＣ末端球状フィブリノーゲン相同ドメインを備えている。Ｎ末端のコイルドコイル領域（１７～２０７ａａ）は、ＬＰＬの触媒活性を可逆的に阻害することによって血漿ＴＧレベルに影響を与え、フィブリノーゲン様ドメイン（２０７～４６０ａａ）は、インテグリンαｖβ３受容体に結合し、血管新生に影響を与え、これは、アンジオポエチンの機能と同様である。Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間の短いリンカー領域（２２１～２２２および２２４～２２５）は特別なゾーンであり、フューリンによって分割されることが確認されている。既存の結果によって、ＡＮＧＰＴＬ３切断の短縮型がＬＰＬおよび内皮リパーゼ（ＥＬ）の阻害活性を強化できるこ
とを示しており、ＡＮＧＰＴＬ３の切断型がより効果的に機能し得ることが示唆されている。
[559]さらに、ヒトアポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）は、別の治療標的に
なる可能性がある。ＡＰＯＣ３は、ヒトではＡＰＯＣ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＡＰＯＣ３は、ＶＬＤＬの構成要素である。ＡＰＯＣ３は、リポタンパク質リパーゼと肝臓リパーゼを阻害する。また、ＡＰＯＣ３は、トリグリセリドに富む粒子の肝臓への取り込みを阻害するとも考えられている。ＡＰＯＣ３レベルの上昇は、高トリグリセリド血症の発症を誘発する。最近の証拠は、脂質が豊富な条件下で肝細胞からのトリグリセリドが豊富なＶＬＤＬ粒子の集合および分泌を促進するＡＰＯＣ３の細胞内役割を示唆している。しかし、ヒトａｐｏＣ３コード配列で自然に発生する２つの点変異である、Ａ２３ＴおよびＫ５８Ｅは、肝細胞からのトリグリセリドに富むＶＬＤＬ粒子の細胞内集合および分泌を無効にすることが示されている。
[00560]Ｃｈａｄｗｉｃｋ ＡＣ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｍｕｓｕｎｕｒｕ Ｋ．Ｉｎ ｖｉ
ｖｏ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ＰＣＳＫ９ （ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ ｔｙｐｅ ９） ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２０１７，３７：１７４１－７；Ｃｈａｄｗｉｃｋ ＡＣ，Ｅｖｉｔｔ ＮＨ，Ｌｖ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｌｏｏｄ ｌｉｐｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｗｉｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ＡＮＧＰＴＬ３．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２０１８，１３７：９７５－７；Ｒｏｓｓｉｄｉｓ ＡＣ，Ｓｔｒａｔｉｇｉｓ ＪＤ，Ｃｈａｄｗｉｃｋ ＡＣ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｕｔｅｒｏ ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１８，２４：１５１３－８に記載のような血管疾患および糖尿病に関与する標的遺伝子を用いた標的塩基編集は、その全体が参照よって本明細書に組み込まれる。ＰＣＳＫ９を含む脂質代謝に関与する遺伝子は、現在の遺伝子編集技術によって標的化されて編集されているが、編集結果を改善するために、これらの遺伝子を標的とする正確な塩基編集が依然として必要である。
医薬組成物
[561]いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される塩
基エディターシステムおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
[562]いくつかの態様では、本明細書に記載のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと、塩基エデ
ィター融合タンパク質またはこの塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸配列と、薬学的に許容される担体とを含む、遺伝子改変のための医薬組成物が、本明細書に提供される。本明細書に記載のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと、塩基エディター融合タンパク質またはこの塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸配列とを含む遺伝子改変のための組成物は、医薬組成物に製剤化され得る。医薬組成物は、薬学的に使用できる調製物への活性化合物の処理を容易にする、１つまたは複数の薬学的に許容される不活性成分を使用して、従来の方法で製剤化される。本開示で使用するのに適した製剤および送達方法は、一般に当該技術分野で周知である。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。本明細書に記載の医薬組成物の要約は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａ
ｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９８０；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（医薬品剤形および薬物送達システム）、第７版。（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９）（そのような開示のために参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
[563]医薬組成物は、本明細書に記載のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと、塩基エディター
融合タンパク質またはこの塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸配列と、担体、賦形剤、結合剤、充填剤、懸濁剤、香料、甘味料、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、湿潤剤、可塑剤、安定剤、浸透促進剤、湿潤剤、消泡剤、抗酸化剤、防腐剤、またはそれらの１つまたは複数の組み合わせなどの１つまたは複数の他の化学成分（すなわち、薬学的に許容される成分）との混合物であり得る。この医薬組成物は、本明細書に記載のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡおよび塩基エディター融合タンパク質またはこの塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸配列の、それを必要とする生物または対象への投与を容易にする。
[564]本開示の医薬組成物は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して対象
に投与され得る。本明細書に記載の医薬組成物は、非経口、静脈内、皮内、筋肉内、結腸、直腸、または腹腔内を含む様々な方法で対象に投与され得る。一部の実施形態では、この医薬組成物は、対象の腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって投与され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口、静脈内、筋肉内、または経口で投与され得る。
[565]吸入による投与のために、本明細書に記載のアデノウイルスは、エアロゾル、ミ
スト、または粉末として使用するために製剤化され得る。頬または舌下投与のために、医薬組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤、トローチ剤、またはゲルの形態で製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のアデノウイルスは、経皮剤形として調製され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のアデノウイルスは、筋肉内、皮下、または静脈内注射に適した医薬組成物に製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のアデノウイルスは、局所投与されてもよく、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、バーム、クリーム、または軟膏などの様々な局所投与可能な組成物に製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のアデノウイルスは、浣腸、直腸ゲル、直腸フォーム、直腸エアロゾル、坐剤、ゼリー坐剤、または保持浣腸などの直腸用組成物に製剤化され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のアデノウイルスは、錠剤、カプセル、または水性経口分散液、エマルジョン、溶液、エリキシル、ジェル、およびシロップを含むがこれらに限定されない群から選択される水性懸濁液もしくは溶液の形態の液体などの経口投与用に製剤化され得る。
[566]一部の実施形態では、本明細書に記載のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと、ＩＩ型Ｃ
ａｓタンパク質またはＩＩ型Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列とを含む遺伝子改変のための医薬組成物は、治療剤をさらに含む。追加の治療剤は、治療される疾患、障害、または状態の様々な側面を調節し、複製可能な組換えアデノウイルスまたは治療剤単独のいずれかの投与よりも大きな全体的な利益を提供し得る。治療剤としては、限定するものではないが、化学療法剤、放射線治療剤、ホルモン治療剤、および／または免疫治療剤が挙げられる。一部の実施形態では、治療剤は放射線治療剤であってもよい。一部の実施形態では、治療剤はホルモン治療剤であってもよい。一部の実施形態では、治療剤は、免疫療法剤であってもよい。一部の実施形態では、治療剤は化学療法剤である。追加の治療薬の調製および投与スケジュールは、製造業者の指示に従って、または熟練した医師によっ
て経験的に決定されたとおりに使用され得る。例えば、化学療法の準備および投薬スケジュールは、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｏｏｋ、第４版、２００８、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ、Ｅｄｉｔｏｒ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡにも記載されている。
[567]本明細書に記載の化学的に改変されたｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの遺伝子改変組
成物、およびＩＩ型Ｃａｓタンパク質またはＩＩ型Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、ならびに本明細書に記載の方法で治療され得る対象は、疾患または状態を有する任意の対象であり得る。例えば、対象は、動物などの真核生物の対象であり得る。一部の実施形態では、対象は哺乳動物、例えばヒトである。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は非ヒト動物である。一部の実施形態では、対象は、胎児、胚、または小児である。一部の実施形態では、対象は、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、ならびに他の類人猿およびサル種；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌ、ネコなどの家畜；ラット、マウス、モルモットなどのげっ歯類を含む実験動物、などである。
[568]一部の実施形態では、対象は、出生前（例えば、胎児）、子供（例えば、新生児
、乳児、幼児、思春期前）、青年期、思春期、または成人（例えば、若年成人、中年成人、高齢者）である。ヒト対象は、約０ヶ月～約１２０歳、またはそれ以上であってもよい。ヒト対象は、生後約０～約１２ヶ月；例えば、生後約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２か月であってもよい。ヒト対象者は、約０歳～１２歳の間；例えば、生後約０～３０日；約１ヶ月～１２ヶ月の間；約１歳～３歳の間；約４歳～５歳の間；約４歳～１２歳の間；１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、または１２歳であってもよい。ヒト対象は、約１３歳～１９歳の間；例えば、約１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９歳であってもよい。ヒト対象は、約２０歳～約３９歳の間；例えば、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または３９歳であってもよい。ヒト対象は、約４０歳～約５９歳の間；例えば、約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９歳であってもよい。ヒト対象者は５９歳超；例えば、約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０歳であってもよい。ヒト対象には、男性対象および／または女性対象が挙げられる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
[569]一部の実施形態では、ＬＮＰは、Ｃｏｎｗａｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｍ
ｏｌ．Ｔｈｅｒ．２７，８６６－８７７，およびＶｉｌｌｉｇｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ ２０２１ Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．５，１７９－１８に記載されている方法に従って調製され、これらは参照により組み込まれる。一部の実施形態では、ＬＮＰは、アミノ脂質、ＰＥＧ－脂質と呼ばれる脂質にコンジュゲートされた平均分子量２０００Ｄａのモノメトキシポリエチレングリコール（またはメトキシポリエチレングリコール）、コレステロール、および１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）から構成される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、独自のイオン化可能なカチオン性脂質、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、コレステロール、およびＰＥＧ脂質から構成される。
[570]一部の実施形態では、ＬＮＰは、約３０～約１６０、約３５～約１６０、約４０
～約１６０、約４５～約１６０、約５０～約１６０、約５５～約１６０、約６０～約１６０、約６５～約１６０、約７０～約１６０、約７５～約１６０、約８０～約１６０、約８５～約１６０、約９０～約１６０、約９５～約１６０、約１００～約１６０、約１０５～約１６０、約１１０～約１６０、約１１５～約１６０、約１２０～約１６０、約１２５～約１６０、約１３０～約１６０、約１３５～約１６０、約１４０～約１６０、約１４５～約１６０、約１５０～約１６０、約３０～約１５５、約３０～約１５０、約３０～約１４５、約３０～約１４０、約３０～約１３５、約３０～約１３０、約３０～約１２５、約３０～約１２０、約３０～約１１５、約３０～約１１０、約３０～約１０５、約３０～約１００、約３０～約９５、約３０～約９０、約３０～約８５、約３０～約８０、約３０～約７５、約３０～約７０、約３０～約６５、約３０～約６０、約３０～約５５、約３０～約５０、約３０～約４５、約３０～約４０、約３０～約４５、約３５～約４５、約３５～約５０、約４０～約５０、約４０～約５５、約４５～約５５、約４５～約６０、約５０～約６０、約５０～約６５、約５５～約６０、約５５～約６５、約５５～約７０、約６０～約７０、約６０～約７５、約６５～約７５、約６５～約８０、約７０～約８０、約７０～約８５、約７５～約８５、約７５～約９０、約８０～約９０、約８０～約９５、約８５～約９５、約８５～約１００、約９０～約１００、約９０～約１０５、約９５～約１０５、約９５～約１１０、約１００～約１１０、約１００～約１１５、約１０５～約１１５、約１０５～約１２０、約１１０～約１２０、約１１０～約１２５、約１１５～約１２５、約１１５～約１３０、約１２０～約１３０、約１２０～約１３５、約１２５～約１３５、約１２５～約１４０、約１３０～約１４０、約１３０～約１４５、約３５～約１４０、約４５～約１３０、約５５～約１２０、約６５～約１１０、約７５～約１００、または約８５～約９０ｎｍの平均流体力学的直径を有する。
[571]一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１～約９７、約５～約９７、約１０～約９７
、約１５～約９７、約１５～約９７、約２０～約９７、約２５～約９７、約３０～約９７、約３５～約９７、約４０～約９７、約４５～約９７、約５０～約９７、約５５～約９７、約６０～約９７、約６５～約９７、約７０～約９７、約７５～約９７、約８０～約９７、約１～約９５、約１～約９０、約１～約８５、約１～約８０、約１～約７５、約１～約７０、約１～約６５、約１～約６０、約１～約５５、約１～約５０、約１～約４５、約１～約４０、約１～約３５、約１～約３０、約１～約２５、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、約１０～約３０、約１０～約３５、約１５～約３５、約１５～約４０、約２０～約４０、約２０～約４５、約２５～約４５、約２５～約５０、約３０～約５０、約３０～約５５、約３５～約５５、約３５～約６０、約４０～約６０、約４０～約６５、約４５～約６５、約４５～約７０、約５０～約７０、約５０～約７５、約５５～約７５、約５５～約８０、または約６０～約８０％のアミノ脂質（ｍｏｌ％）を含む。
[572]一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１～約４０、約１～約３８、約１～約３６、
約１～約３４、約１～約３２、約１～約３０、約１～約２８、約１～約２６、約１～約２４、約１～約２２、約１～約２０、約１～約１８、約１～約１６、約１～約１４、約１～約１２、約１～約１０、約１～約８、約１～約６、約１～約４、約１～約２、約２～約４０、約４～約４０、約６～約４０、約８～約４０、約１０～約４０、約１２～約４０、約１４～約４０、約１６～約４０、約１８～約４０、約２０～約４０、約２２～約４０、約２４～約４０、約２６～約４０、約２８～約４０、約３０～約４０、約３２～約４０、約３４～約４０、約３６～約４０、約３８～約４０、約２～約３５、約２～約３０、約２～約２５、約２～約２０、約２～約１５、約２～約１０、約２～約８、約２～約６、または約２～約４％のＤＳＰＣ（ｍｏｌ％）を含む。
[573]一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１～約２０、約１～約１９、約１～約１８、
約１～約１７、約１～約１６、約１～約１５、約１～約１４、約１～約１３、約１～約１
２、約１～約１１、約１～約１０、約１～約９、約１～約８、約１～約７、約１～約６、約１～約５、約１～約４、約１～約３、約２～約６、約３～約７、約４～約８、約５～約９、約６～約１０、約７～約１１、約８～約１２、約９～約１３、約１０～約１４、約１１～約１５、約１２～約１６、約１３～約１７、約１４～約１８、約１５～約１９、または約１６～約２０％のＰＥＧ－脂質（ｍｏｌ％）を含む。
[574]一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１～約９７、約５～約９７、約１０～約９７
、約１５～約９７、約２０～約９７、約２５～約９７、約３０～約９７、約３５～約９７、約４０～約９７、約４５～約９７、約５０～約９７、約５５～約９７、約６０～約９７、約６５～約９７、約７０～約９７、約７５～約９７、約８０～約９７、約１～約９５、約１～約９０、約１～約８５、約１～約８０、約１～約７５、約１～約７０、約１～約６５、約１～約６０、約１～約５５、約１～約５０、約１～約４５、約１～約４０、約１～約３５、約１～約３０、約１～約２５、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、約１０～約３０、約１０～約３５、約１５～約３５、約１５～約４０、約２０～約４０、約２０～約４５、約２５～約４５、約２５～約５０、約３０～約５０、約３０～約５５、約３５～約５５、約３５～約６０、約４０～約６０、約４０～約６５、約４５～約６５、約４５～約７０、約５０～約７０、約５０～約７５、約５５～約７５、約５５～約８０、または約６０～約８０％のコレステロール（ｍｏｌ％）を含む。
[575]一部の実施形態では、ＬＮＰは、約１～約９７、５～約９７、１０～約９７、１
５～約９７、２０～約９７、２５～約９７、３０～約９７、３５～約９７、４０～約９７、４５～約９７、５０～約９７、５５～約９７、６０～約９７、６５～約９７、７０～約９７、７５～約９７、８０～約９７、１～約９５、１～約９０、１～約８５、１～約８０、１～約７５、１～約７０、１～約６５、１～約６０、１～約５５、１～約５０、１～約４５、１～約４０、１～約３５、１～約３０、１～約２５、１～約２０、１～約１５、１～約１０、１０～約３０、１０～約３５、１５～約３５、１５～約４０、２０～約４０、２０～約４５、２５～約４５、２５～約５０、３０～約５０、３０～約５５、３５～約５５、３５～約６０、４０～約６０、４０～約６５、４５～約６５、４５～約７０、５０～約７０、５０～約７５、５５～約７５、５５～約８０、または６０～約８０％のアミノ脂質；１～約４０、１～約３８、１～約３６、１～約３４、１～約３２、１～約３０、１～約２８、１～約２６、１～約２４、１～約２２、１～約２０、１～約１８、１～約１６、１～約１４、１～約１２、１～約１０、１～約８、１～約６、１～約４、１～約２、２～約４０、４～約４０、６～約４０、８～約４０、１０～約４０、１２～約４０、１４～約４０、１６～約４０、１８～約４０、２０～約４０、２２～約４０、２４～約４０、２６～約４０、２８～約４０、３０～約４０、３２～約４０、３４～約４０、３６～約４０、３８～約４０、２～約３５、２～約３０、２～約２５、２～約２０、２～約１５、２～約１０、２～約８、２～約６、または２～約４％のＤＳＰＣ；１～約２０、１～約１９、１～約１８、１～約１７、１～約１６、１～約１５、１～約１４、１～約１３、１～約１２、１～約１１、１～約１０、１～約９、１～約８、１～約７、１～約６、１～約５、１～約４、１～約３、２～約６、３～約７、４～約８、５～約９、６～約１０、７～約１１、８～約１２、９～約１３、１０～約１４、１１～約１５、１２～約１６、１３～約１７、１４～約１８、１５～約１９、および約１６～約２０％のＰＥＧ－脂質を含み、バランスはコレステロールである（全てｍｏｌ％）。
アミノ脂質
[576]アミノ脂質、リン脂質、ＰＥＧ脂質、コレステロールもしくはその誘導体、ペイ
ロード、またはそれらの任意の組み合わせを含むＬＮＰ組成物が、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、このＬＮＰ組成物はアミノ脂質を含む。一態様において、本明細書に開示されるのは、式（Ｉ）の構造を有するアミノ脂質、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、
Figure 2024038327000004
であり、
式中
各々のＲ１およびＲ２は独立して、Ｃ７－Ｃ２２アルキル、Ｃ７－Ｃ２２アルケニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル，－Ｃ２－Ｃ１０アルキレン－Ｌ－Ｒ６、または
Figure 2024038327000005
であり、各々のアルキル、アルキレン、アルケニル、およびシクロアルキルは独立して、置換もしくは非置換である；
各々のＸ、Ｙ、およびＺは独立して、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝ＮＲ４）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、ＯＣ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）－、－ＳＣ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－Ｏ、Ｓ、または結合であり；
各々のＬは独立して、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝ＮＲ４）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、ＯＣ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）－、－ＳＣ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、Ｏ、Ｓ、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－ＯＣ（＝Ｏ）－、または結合であり、
式中、アルキレンは置換もしくは非置換であり；
Ｒ３は、－Ｃ０－Ｃ１０アルキレン－ＮＲ７Ｒ８、－Ｃ０－Ｃ１０アルキレン－ヘテロシクロアルキル、または－Ｃ０－Ｃ１０アルキレン－ヘテロシクロアリールであり、
ここで、このアルキレン、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアリールは独立して
、置換もしくは非置換であり；各々のＲ４は独立して、水素または置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒ５は、水素または置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ６アルキルであり；
各々のＲ６は独立して、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２２アルキルまたは置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２２アルケニルであり；
各々のＲ７およびＲ８は独立して、水素または置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ６アルキルであるか、またはＲ７およびＲ８は、それらが結合される窒素と一緒になって、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ６ヘテロシクリルを形成し；
ｐは、１～１０から選択される整数であり；かつ
各々のｎ、ｍ、およびｑは独立して、０、１、２、３、４、または５である。
[577]式（Ｉ）の一部の実施形態では、構造が、２つ以上の不斉Ｃ原子を含む場合、各
々の不斉Ｃ原子は独立して、ラセミ、キラルに純粋なＲおよび／もしくはキラルに純粋なＳ異性体、またはそれらの組み合わせを表す。
[578]一部の実施形態では、式（Ｉ）の各々のｎおよびｑは独立して、０、１、２、ま
たは３である。一部の実施形態では、式（Ｉ）の各々のｎ、ｍ、およびｑは１である。
[579]一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉａ）の構造、またはその薬学
的に許容される塩もしくは薬学的に許容される溶媒和物を有し：
Figure 2024038327000006
式中、
各々のＲ１およびＲ２は独立して、Ｃ７－Ｃ２２アルキル、Ｃ７－Ｃ２２アルケニル、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル、－Ｃ２－Ｃ１０アルキレン－Ｌ－Ｒ６、または
Figure 2024038327000007
であり、
式中、各々のアルキル、アルキレン、アルケニル、およびシクロアルキルは独立して、置換もしくは非置換であり；
各々のＸ、Ｙ、およびＺは独立して、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（Ｄ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝ＮＲ４）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｃ（Ｅ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、ＯＣ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ４－－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）－、－ＳＣ（＝Ｓ）
Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、Ｏ、Ｓ、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－Ｏ－、または結合であり、ここで、このアルキレンは置換もしくは非置換であり；
各々のＬは独立して、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝ＮＲ４）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、ＯＣ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ４－－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）－、－ＳＣ（＝Ｓ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ４－、Ｏ、Ｓ、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－ＯＣ（＝Ｏ）－、または結合であり、式中、このアルキレンは、置換もしくは非置換であり；
Ｒ３は、－Ｃ０－Ｃ１０アルキレン－ＮＲ７Ｒ８、－Ｃ０－Ｃ１０アルキレン－ヘテロシクロアルキル、または－Ｃ０－Ｃ１０アルキレン－ヘテロシクリルであり、ここでこのアルキレン、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアリールは独立して、置換もしくは非置換であり；
各々のＲ４は独立して、水素または置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ６アルキルであり；
Ｒ５は、水素または置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ６アルキルであり；
各々のＲ６は独立して、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２２アルキルまたは置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２２アルケニルであり；
各々のＲ７およびＲ８は独立して、水素または置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ６アルキルであるか、またはＲ７およびＲ８は、それらが結合される窒素と一緒になって、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ６ヘテロシクリルを形成し；かつ
ｐは、１～１０から選択される整数である。
[580]式（Ｉａ）の一部の実施形態では、この構造が、２つ以上の不斉Ｃ原子を有する
場合、各々の不斉Ｃ原子は独立して、ラセミの、キラルに純粋なＲおよび／もしくはキラルに純粋なＳ異性体、またはそれらの組み合わせを表す。
[581]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ１およびＲ２は独立して、
Ｃ７－Ｃ２２アルキル、Ｃ７－Ｃ２２アルケニル、－Ｃ２－Ｃ１０アルキレン－Ｌ－Ｒ６、または
Figure 2024038327000008
であり、
式中、各々のアルキル、アルキレン、アルケニル、およびシクロアルキルは独立して、置換または非置換である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ１およびＲ２は独立して、Ｃ１０－Ｃ２０アルキル、Ｃ１０－Ｃ２０アルケニルである。－Ｃ８－Ｃ７アルキレン－Ｌ－Ｒ６、または
Figure 2024038327000009
であり、式中、各々のアルキル、アルキレン、アルケニル、およびシクロアルキルは独立して、置換または非置換である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ１は、
Figure 2024038327000010
である。
[582]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＬは独立して、Ｏ、Ｓ
、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－ＯＣ（＝Ｏ）－、または結合であり、ここでこのアルキレンは置換または非置換である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＬは独立して、Ｏ、Ｓ、－Ｃ１－Ｃ３アルキレン－Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ３アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ３アルキレン－ＯＣ（＝Ｏ）－、または結合であり、ここでこのアルキレンは置換または非置換である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＬは独立して、Ｏ、Ｓ、－Ｃ１－Ｃ３アルキレン－Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ３アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ１－Ｃ３アルキレン－ＯＣ（＝Ｏ）－、または結合であり、ここでこのアルキレンは、直鎖または分岐した非置換のアルキレンである。
[583]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ６は独立して、置換
もしくは非置換の直鎖Ｃ３－Ｃ２２アルキルまたは置換もしくは非置換の直鎖Ｃ３－Ｃ２２アルケニルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ６は独立して、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０アルキルまたは置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ２０アルケニルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ６は独立して、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ１０アルキルまたは置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ１０アルケニルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ６は独立して、置換もしくは非置換のＣ３－Ｃ１０アルキルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ６は独立して、置換もしくは非置換の直鎖Ｃ３－Ｃ１０アルキルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ６は独立して、置換もしくは非置換のｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、またはｎ－ドデシルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ６は独立して、置換もしくは非置換のｎ－オクチルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ６はｎ－オクチルである。
[584]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＬは独立して、－Ｃ（
＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ１－Ｃ１０アルキレン－Ｏ－、またはＯである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＬはＯである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＬは、－Ｃ１－Ｃ３アルキレン－Ｏ－である。一
部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のｐは、１、２、３、４、または５である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のｐは２である。
[585]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ１は
Figure 2024038327000011
である。
[586]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ４は独立して、Ｈま
たは置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ４アルキルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ４は独立して、置換もしくは非置換の直鎖Ｃ１－Ｃ４アルキルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ４は、Ｈである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ４は独立して、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ（ＣＨ３）２である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ４は独立して、Ｈまたは－ＣＨ３である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ４は、ＣＨ３である。
[587]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＸは、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－また
は－ＯＣ（＝Ｏ））－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＸは、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－または－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＸは、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＸは、－Ｃ（＝Ｏ））ＮＨ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｏ
Ｃ（＝Ｏ））－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ））－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ））ＮＨ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ））ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（ＣＨ３）－、ＮＨＣ（＝ＮＭｅ）ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝ＮＭｅ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝ＮＭｅ）Ｎ（ＣＨ３）－、または－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝ＮＭｅ）Ｎ（ＣＨ３）－である。
[588]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ２は、Ｃ７－Ｃ２２アルキ
ル、Ｃ７－Ｃ２２アルケニル、－Ｃ２－Ｃ１０アルキレン－Ｌ－Ｒ６、または
Figure 2024038327000012
であり、式中、各々のアルキル、アルキレン、アルケニル、およびシクロアルキルは独立して、置換または非置換である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ２は、置換もしくは非置換のＣ７－Ｃ２２アルキルまたは置換もしくは非置換のＣ７－Ｃ２２アルケニルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ２は、置換もしくは非置換の直鎖Ｃ７－Ｃ２２アルキルまたは置換もしくは非置換の直鎖Ｃ７－Ｃ２２アルケニルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ２は、置換もしくは非置換のＣ１０－Ｃ２０アルキルまたは置換もしくは非置換のＣ１０－Ｃ２０アルケニルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ２は、非置換Ｃ１０－Ｃ２０アルキルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ２は、非置換Ｃ１０－Ｃ２０アルケニルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ２は、－Ｃ２－Ｃ１０アルキレン－Ｌ－Ｒ６である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ２は、－Ｃ２－Ｃ１０アルキレン－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｒ６または－Ｃ２－Ｃ１０アルキレン－ＯＣ（＝Ｏ）－Ｒ６である。
[589]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ２は、
Figure 2024038327000013
である。
[590]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＹは、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－また
は－ＯＣ（＝Ｏ）－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＹは、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－または－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＹは、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＹは、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ４－、または－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＹは、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－または－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＹは、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）０－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、または－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
[591]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ０－Ｃ１０アル
キレン－ＮＲ７Ｒ８または－Ｃ０－Ｃ１０アルキレン－ヘテロシクロアルキルであり、ここでこのアルキレンおよびヘテロシクロアルキルは独立して、置換または非置換である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ０－Ｃ１０アルキレン－ＮＲ７Ｒ８である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ１－Ｃ６アルキレン－ＮＲ７Ｒ８である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ１－Ｃ４アルキレン－ＮＲ７Ｒ８である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ１－アルキレン－ＮＲ７Ｒ８である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ２－－アルキレン－ＮＲ７Ｒ８である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ３－アルキレン－ＮＲ７Ｒ８である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ４－アルキレン－ＮＲ７Ｒ８である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ５
－アルキレン－ＮＲ７Ｒ８である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ０－Ｃ１０アルキレン－ヘテロシクロアルキルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ１－Ｃ６アルキレン－ヘテロシクロアルキルであり、ここでこのヘテロシクロアルキルは、１～３個の窒素および０～２個の酸素である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は、－Ｃ１－Ｃ６アルキレン－ヘテロシクロアリールである。
[592]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）の各々のＲ７およびＲ８は独立
して、水素または置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、各々のＲ７およびＲ８は独立して、水素または置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ３アルキルである。一部の実施形態では、各々のＲ７およびＲ８は独立して、置換もしくは非置換のＣ１－Ｃ３アルキルである。一部の実施形態では、各々のＲ７およびＲ８は独立して、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ（ＣＨ３）２である。一部の実施形態では、各々のＲおよびＲ８は、ＣＨ３である。一部の実施形態では、各々のＲ７およびＲ８は、－ＣＨ２ＣＨ３である。
[593]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ７およびＲ８は、それらが
結合される窒素と一緒になって、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ６ヘテロシクリルを形成する。一部の実施形態では、Ｒ７およびＲ８は、それらが結合される窒素と一緒になって、置換もしくは非置換のＣ２－Ｃ６ヘテロシクロアルキルを形成する。一部の実施形態では、Ｒ７およびＲ８は、それらが結合される窒素と一緒になって、置換もしくは非置換の３－７員のヘテロシクロアルキルを形成する。
[594]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は
Figure 2024038327000014
である。
[595]一部の実施形態では．式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は
Figure 2024038327000015
である。
[596]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ３は
Figure 2024038327000016
である。
[597]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＺは、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－また
は－ＯＣ（＝Ｏ）－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＺは、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－または－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＺは、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－、または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＺは、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ４－、または－ＮＲ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ４－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＺは、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）－または－Ｎ（ＣＨ３）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＹは、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ－、または－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－である。
[598]一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ５は、水素または置換もし
くは非置換のＣ１－Ｃ３アルキルである。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ５は、Ｈ、－ＣＨ３、－ＣＨ－）ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ（ＣＨ３）２である。一部の実施形態では、式（Ｉ）および式（Ｉａ）のＲ５は、Ｈである。
[599]一部の実施形態では、ＬＮＰは、複数のアミノ脂質を含む。例えば、ＬＮＰ組成
物は、２、３、４、５、６．７、８、９．１０、またはそれ以上のアミノ脂質を含んでもよい。別の例では、ＬＮＰ組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも２０のアミノ脂質を含んでもよい。さらに別の例では、ＬＮＰ組成物は、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大９個、最大１０個、最大２０個、または最大３０個のアミノ脂質を含んでもよい。
[600]一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、第１のアミノ脂質を含む。一部の実施形
態では、ＬＮＰ組成物は、第１のアミノ脂質および第２のアミノ脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、第１のアミノ脂質、第２のアミノ脂質、および第３のアミノ脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、第１のアミノ脂質、第２のアミノ脂質、第３のアミノ脂質、および第４のアミノ脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は第４のアミノ脂質を含まない。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、第３のアミノ脂質を含まない。一部の実施形態では、第２のアミノ脂質に対する第１のアミノ脂質のモル比は、約０．１～約１０である。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質の第２のアミノ脂質に対するモル比は、約０．２０～約５である。一部の実施形態では、第２のアミノ脂質に対する第１のアミノ脂質のモル比は、約０．２５～約４である。一部の実施形態
では、第２のアミノ脂質に対する第１のアミノ脂質のモル比は、約０．２５、約０．３３、約０．５、約１、約２、約３、または約４である。
[601]一部の実施形態では、第１のアミノ脂質：第２のアミノ脂質：第３のアミノ脂質
のモル比は、約４：１：１である。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質：第２のアミノ脂質：第３のアミノ脂質のモル比は、約１：１：１である。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質：第２のアミノ脂質：第３のアミノ脂質のモル比は、約２：１：１である。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質：第２のアミノ脂質：第３のアミノ脂質のモル比は、約２：２：１である。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質：第２のアミノ脂質：第３のアミノ脂質のモル比は、約３：２：１である。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質：第２のアミノ脂質：第３のアミノ脂質のモル比は、約３：１：１である。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質：第２のアミノ脂質：第３のアミノ脂質のモル比は、約５：１：１である。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質：第２のアミノ脂質：第３のアミノ脂質のモル比は、約３：３：１である。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質：第２のアミノ脂質：第３のアミノ脂質のモル比は、約４：４：１である。
[602]一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、１つまたは複数のアミノ脂質を含む。一
部の実施形態では、この１つまたは複数のアミノ脂質は、粒子中に存在する総脂質の約４０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、この１つまたは複数のアミノ脂質は、粒子中に存在する総脂質の約４０ｍｏｌ％、約４１ｍｏｌ％、約４２ｍｏｌ％、約４３ｍｏｌ％、約４４ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％、約４６ｍｏｌ％、約４７ｍｏｌ％、約４８ｍｏｌ％、約４９ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％、約５１ｍｏｌ％、約５２ｍｏｌ％、約５３ｍｏｌ％、約５４ｍｏｌ％、約５５ｍｏｌ％、約５６ｍｏｌ％、約５７ｍｏｌ％、約５８ｍｏｌ％、約５９ｍｏｌ％、約６０ｍｏｌ％、約６１ｍｏｌ％、約６２ｍｏｌ％、約６３ｍｏｌ％、約６４ｍｏｌ％、または、約６５ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質は、粒子中に存在する全アミノ脂質の約１ｍｏｌ％～約９９ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質は、粒子中に存在する総アミノ脂質の約１６．７ｍｏｌ％～約６６．７ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、第１のアミノ脂質は、粒子中に存在する全アミノ脂質の約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成する。
[603]一部の実施形態では、アミノ脂質はイオン化可能な脂質である。イオン性脂質は
、１つまたは複数のイオン性窒素原子を含んでもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のイオン化可能な窒素原子のうちの少なくとも１つは、正に帯電している。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物中のイオン化可能な窒素原子のうち少なくとも１０ｍｏｌ％、２０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％、５０ｍｏｌ％、６０ｍｏｌ％、７０ｍｏｌ％、８０ｍｏｌ％、９０ｍｏｌ％、９５ｍｏｌ％、または９９ｍｏｌ％は、正に荷電される。一部の実施形態では、アミノ脂質は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、イミン、アミド、グアニジン部分、ヒスチジン残基、リシン残基、アルギニン残基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、アミノ脂質は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、グアニジン部分、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、アミノ脂質は第三級アミンを含む。
[604]一部の実施形態では、アミノ脂質はカチオン性脂質である。一部の実施形態では
、アミノ脂質はイオン化可能な脂質である。一部の実施形態では、アミノ脂質は、１つまたは複数の窒素原子を含む。一部の実施形態では、アミノ脂質は、１つまたは複数のイオン化可能な窒素原子を含む。カチオン性および／またはイオン性脂質の例としては、限定するものではないが、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１，Ｎ１，４－トリドデシル－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１４２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，
２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイ１－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイ１－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および（２Ｓ）－２－（｛８－［（３β）－コレステ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－ｌ－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））が挙げられる。
[605]一部の実施形態では、本明細書に記載のアミノ脂質は、薬学的に許容される塩な
どの塩の形態をとり得る。アミノ脂質の薬学的に許容される塩は全て、本開示に包含される。本明細書で使用される場合、アミノ脂質には、その薬学的に許容される塩、およびそのジアステレオマー、エナンチオマー、およびエピマーの形態も含まれる。
[606]一部の実施形態では、本明細書に記載のアミノ脂質は、１つまたは複数の立体中
心を有し、各立体中心は、Ｒ配置またはＳ配置のいずれかで独立して存在する。本明細書に提示される脂質には、全てのジアステレオマー、エナンチオマー、およびエピマー形態、ならびにそれらの適切な混合物が含まれる。本明細書で提供される脂質には、全てのシス、トランス、ｓｙｎ（シン）、ａｎｔｉ（アンチ）、ｅｎｔｇｅｇｅｎ（反対）（Ｅ）、およびｚｕｓａｍｍｅｎ（同じ）（Ｚ）異性体、ならびにそれらの適切な混合物が含まれる。特定の実施形態では、本明細書に記載の脂質は、化合物のラセミ混合物を光学活性分割剤と反応させて一対のジアステレオマー化合物／塩を形成し、ジアステレオマーを分離し、光学的に純粋なエナンチオマーを回収することにより、それらの個々の立体異性体として調製される。一部の実施形態では、エナンチオマーの分割は、本明細書に記載の化合物の共有結合ジアステレオマー誘導体を使用して実施される。別の実施形態では、ジアステレオマーは、溶解度の違いに基づく分離／分割技術によって分離される。他の実施形態では、立体異性体の分離は、クロマトグラフィーによって、またはジアステレオマー塩の形成および再結晶、もしくはクロマトグラフィー、またはそれらの任意の組み合わせによる分離によって行われる。Ｊｅａｎ Ｊａｃｑｕｅｓ、Ａｎｄｒｅ Ｃｏｌｌｅｔ、Ｓａｍｕｅｌ Ｈ．Ｗｉｌｅｎ、「Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ、Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．，１９８１．一態様では、立体異性体は立体選択的合成によって得られる。
[607]一部の実施形態では、アミノ脂質などの脂質は、本明細書に開示される構造に基
づいて置換される。一部の実施形態では、アミノ脂質などの脂質は置換されていない。別の実施形態では、本明細書に記載の脂質は、同位体的に（例えば、放射性同位元素を用いて）標識されるか、または発色団もしくは蛍光部分、生物発光標識、または化学発光標識の使用を含むがこれらに限定されない別の他の手段によって標識される。
[608]本明細書に記載の脂質は、同位体標識化合物を含み、これらは、本明細書に提示
された様々な式および構造で列挙されたものと同一であるが、１つまたは複数の原子が、
自然界で通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられている。本脂質に組み込まれてもよい同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄、フッ素、および塩素の同位体、例えば、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌが挙げられる。一態様では、本明細書に記載の同位体標識脂質、例えば３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた脂質は、薬物および／または基質組織分布アッセイにおいて有用である。一態様では、重水素などの同位体による置換は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の延長または投与量要件の減少など、より大きな代謝安定性に起因する特定の治療上の利点をもたらす。
[609]一部の実施形態では、アミノ脂質の不斉炭素原子は、エナンチオマー的に濃縮さ
れた形態で存在する。特定の実施形態では、アミノ脂質の不斉炭素原子は、少なくとも５０％のエナンチオマー過剰、少なくとも６０％のエナンチオマー過剰、少なくとも７０％のエナンチオマー過剰、少なくとも８０％のエナンチオマー過剰、少なくとも９０％のエナンチオマー過剰、少なくとも９５％のエナンチオマー過剰、または少なくとも９９％のエナンチオマー過剰を（Ｓ）または（Ｒ）配置で有する。
[610]一部の実施形態では、開示されたアミノ脂質を、Ｎ－オキシドに変換してもよい
。一部の実施形態では、Ｎ－オキシドは、酸化剤（例えば、３－クロロペルオキシ安息香酸および／または過酸化水素）による処理によって形成される。したがって、本明細書に開示されるのは、原子価および構造によって許される場合、Ｎ ＯまたはＮ＋－Ｏ－と表すことができる、記載されたアミノ脂質のＮ－オキシド化合物である。一部の実施形態では、本開示の化合物中の窒素は、Ｎ－ヒドロキシまたはＮ－アルコキシに変換され得る。例えば、Ｎ－ヒドロキシ化合物は、ｒａ－ＣＰＢＡなどの酸化剤による親アミンの酸化によって調製され得る。示されて特許請求されている全ての窒素含有化合物も考慮される。したがって、Ｎ－ヒドロキシおよびＮアルコキシ（例えば、Ｒが置換または非置換のＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ１～Ｃ６アルキニル、３～１４員炭素環または３～１４員複素環であるＮ－ＯＲ）誘導体の記載のアミノ脂質も本明細書に開示される。
ＰＥＧ脂質
[611]本明細書で使用される「ＰＥＧ脂質」または「ＰＥＧ脂質」は、ポリエチレング
リコール成分を含む脂質を指す。
[612]一部の実施形態では、記載されたＬＮＰ組成物は、ＰＥＧ脂質を含む。一部の実
施形態では、記載されたＬＮＰ組成物は、２つ以上のＰＥＧ脂質を含む。例示的なＰＥＧ－脂質としては、脂質が含まれるが、これらに限定されない。例示的なＰＥＧ脂質としてはまた、限定するものではないが、ＰＥＧ改変ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ改変ホスファチジン酸、ＰＥＧ改変セラミド、ＰＥＧ改変ジアルキルアミン、ＰＥＧ改変ジアシルグリセロール、ＰＥＧ改変ジアルキルグリセロール、およびそれらの混合物も挙げられる。例えば、１つまたは複数のＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの任意に置換された直鎖状または分枝状ポリマーである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、例えば、１つまたは複数のアルキル、アルコキシ、アシル、ヒドロキシ、またはアリール基によって置換されている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ－ポリウレタンまたはＰＥＧ－ポリプロピレンなどのＰＥＧコポリマーを含む（例えば、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９２）を参照）。一部の実施形態で
は、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧコポリマーを含まず、例えば、ＰＥＧモノポリマーであってもよい。代表的なＰＥＧ脂質としては、限定するものではないが、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステイイルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウィルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール、およびＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－ω－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］）が挙げられる。
[613]一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、
ジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールに結合したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンに結合したＰＥＧ、およびセラミドにコンジュゲートしたＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照）、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート；例えば、ＷＯ２０１０／００６２８２を参照）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、およびそれらの混合物である。
[614]ＰＥＧ脂質は、１つまたは複数のエチレングリコール単位、例えば、少なくとも
１つ、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、少なくとも１２０個、または少なくとも１５０個のエチレングリコール単位を含み得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約２００Ｄａ～約５０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約５００Ｄａ～約３０００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約７５０Ｄａ～約２５００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約７５０Ｄａ～約２５００Ｄａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質の数平均分子量は、約５００Ｄａ、約７５０Ｄａ、約１０００Ｄａ、約１２５０Ｄａ、約１５００Ｄａ、約１７５０Ｄａ、または、約２０００Ｄａである。一部の実施形態では、１つまたは複数のＰＥＧ脂質の多分散性指数（ＰＤＩ）は、２より小さい。一部の実施形態では、１つまたは複数のＰＥＧ脂質のＰＤＩは、最大で１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３。２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。一部の実施形態では、１つまたは複数のＰＥＧ脂質のＰＤＩは、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。
[615]一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、粒子中に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ
％～約１０ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、粒子中に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、粒子中に存在する総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２．０ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１ｍｏｌ％、約１．１ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％、約１．６ｍｏｌ％、約１．７ｍｏｌ％、約１．８ｍｏ
ｌ％、約１．９ｍｏｌ％、約２．０ｍｏｌ％、約２．１ｍｏｌ％、約２．２ｍｏｌ％、約２．３ｍｏｌ％、約２．４ｍｏｌ％、約２．５ｍｏｌ％、約２．６ｍｏｌ％、約２．７ｍｏｌ％、約２．８ｍｏｌ％、約２．９ｍｏｌ％、または、約３．０ｍｏｌ％を構成する。
[616]一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、複数のＰＥＧ脂質、例えば、少なくとも
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるＰＥＧ脂質を含む。
リン脂質
[617]本明細書で使用される場合、「リン脂質」とは、リン酸部分および不飽和脂肪酸
鎖などの１つまたは複数の炭素鎖を含む脂質を指す。リン脂質は、１つまたは複数の多重（例えば、二重または三重）結合を含み得る。一部の実施形態では、リン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。膜へのリン脂質の融合は、ＬＮＰの１つまたは複数の要素が膜を通過すること、すなわち、１つまたは複数の要素の細胞への送達を可能にし得る。
[618]一部の実施形態では、記載のＬＮＰ組成物は、リン脂質を含む。一部の実施形態
では、リン脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミンアミン、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロホスホノ、スフィンゴ脂質、ホスホノ脂質、天然レシチン、および水素化リン脂質からなる群から選択される脂質を含む。一部の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリンを含む。ホスファチジルコリンの例としては、限定するものではないが、大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、２－オレオイル－１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、およびジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、リン脂質はＤＳＰＣである。
[619]一部の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミンアミンを含
む。一部の実施形態では、ホスファチジルエタノールアミンアミンは、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１６－Ｏ－Ｍｏｎｏｍｅ Ｌｅ ＰＥ、１６－Ｏ－ジメチル ＰＥ、１８－１－トランス ＰＥ、パルミトイル オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、または１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）である。一部の実施形態では、リン脂質はグリセロリン脂質を含む。一部の実施形態では、グリセロリン脂質は、プラズマローゲン、ホスファチデート、またはホスファチジルコリンである。一部の実施形態では、グリセロリン脂質は、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、またはリゾホスファチジルコリンである。一部の実施形態では、リン脂質はスフィンゴリン脂質を含む。一部の実施形態では、スフィンゴリン脂質は、スフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、またはセラミドホスホグリセロリン酸である。一部の実施形態では、リン脂質は天然レシチンを含む。一部の実施形態では、天然レシチンは卵黄レシチンまたは大豆レシチンである。一部の実施形態では、リン脂質は水素化リン脂質を含む。一部の実施形態では、水素化リン脂質は、水素化大豆ホスファチジルコリンである。一部の実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルアミンエタノ
ール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンからなる群から選択される。
[620]一部の実施形態では、リン脂質は、以下から選択される脂質を含む：１，２－ジ
ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、２－オレオイル－１－パーニトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラクリドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、およびスフィンゴミエリン。
[621]リン脂質は、リン脂質部分および１つまたは複数の脂肪酸部分を含んでもよい。
リン脂質部分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、またはスフィンゴミエリンを含んでもよい。脂肪酸部分は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸を含み得る。いくつかの特定の実施形態では、リン脂質は、アジドへの曝露時に銅触媒付加環化を受ける場合がある、１つまたは複数のアルキンで官能化またはそれに架橋されてもよい。
[622]一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、複数のリン脂質、例えば、少なくとも２
、３、４、５、またはそれ以上の異なるリン脂質を含む。一部の実施形態では、リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の１ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約８ｍｏｌ％～約１２ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の約９ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％、または１１ｍｏｌ％を構成する。
コレステロール
[623]一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、コレステロールまたはその誘導体を含む
。一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、構造脂質を含む。構造脂質は、ステロイド、ステロール、アルキルレゾレイノール、コレステロールまたはその誘導体、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラ
シカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファトコフェロール、およびそれらの組み合わせから選択され得る。一部の実施形態では、構造脂質は、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、およびヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイドである。一部の実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、またはコレステロールヘミスクシネートである。一部の実施形態では、コレステロールまたはその誘導体はコレステロールである。
[624]一部の実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、コレステロール誘導
体である。一部の実施形態では、コレステロール誘導体は、極性コレステロールアナログである。一部の実施形態では、極性コレステロールアナログは、５α－コレスタノール、５１３－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、または６－ケトコレスタノールである。一部の実施形態では、極性コレステロールアナログは、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルである。一部の実施形態では、コレステロール誘導体は、非極性コレステロールアナログである。一部の実施形態では、非極性コレステロールアナログは、５アコレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５β－コレスタノン、またはデカン酸コレステチルである。
[625]一部の実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総
脂質の２０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％を構成する。一部の実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％、約２１ｍｏｌ％、約２２ｍｏｌ％、約２３ｍｏｌ％、約２４ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％、約２６ｍｏｌ％、約２７ｍｏｌ％、約２８ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、約３６ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％、約３８ｍｏｌ％、約３９ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％、約４１ｍｏｌ％、約４２ｍｏｌ％、約４３ｍｏｌ％、約４４ｍｏｌ％。約４５ｍｏｌ％、約４６ｍｏｌ％、約４７ｍｏｌ％、約４８ｍｏｌ％、または、約５０ｍｏｌ％を構成する。
リン酸塩電荷中和剤
[626]一部の実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、リン酸塩電荷中和剤を含む。
一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、カチオン性デンドリマー、ポリアミン、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤は、１つまたは複数の窒素原子を含む。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤は、ポリアミンを含む。一部の実施形態では、ポリアミンは、１，３－プロパンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ノルスペルミジン、トリス（２－アミノエチルダミン、サイクレン、１，４，７－トリアザシクロノナン、１，１，１－トリス（アミノメチル）エタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、ポリアミンは、１，３－プロパンジアミン、１，４－ブタンジアミン、スペルミン、スペルミジン、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のＮ／Ｐ比は、０．０１～１０である。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のＮ／Ｐ比は、約０．０５～約２である。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のＮ／Ｐ比は、約０．１～約１である。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のＮ／Ｐ比は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、または、約１である。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のＮ／Ｐ比は、約０．２５、０．５、または０．７５である。
酸化防止剤
[627]一部の実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、１つまたは複数の抗酸化剤を
含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、カチオン性脂質、ペイロード
、またはその両方の分解を減少させるように機能する。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、親水性抗酸化剤を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびクエン酸塩などのキレート剤である。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤はＥＤＴＡである。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は親油性抗酸化剤を含む。一部の実施形態では、親油性抗酸化剤は、ビタミンＥ異性体またはポリフェノールを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、または少なくとも１００ｍＭの濃度でＬＮＰ組成物中に存在する。一部の実施形態では、１つまたは複数の抗酸化剤は、約２０ｍＭの濃度で粒子中に存在する。
ペイロード
[00628]本明細書に記載のＬＮＰは、治療薬または目的の標的などのペイロードを送達
するように設計され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、本明細書に記載の塩基エディターシステムの１つまたは複数の構成要素を封入する。例えば、ＬＮＰは、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードする核酸、ガイドＲＮＡをコードするベクター、塩基エディター融合タンパク質、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸、デアミナーゼ、デアミナーゼをコードする核酸のうちの１つまたは複数、またはそれらの全てもしくは任意の組み合わせを封入し得る。一部の実施形態では、核酸はＤＮＡである。一部の実施形態では、核酸はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡである。
[629]さらなる例示的な治療剤としては、限定するものではないが、抗体（例えば、モ
ノクローナル、キメラ、ヒト化、ナノボディ、およびそれらの断片など）、コレステロール、ホルモン、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、および他のタイプの抗腫瘍薬、低分子量の薬物、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイおよびそのアナログ、プラスミドおよび他のタイプの発現ベクター、および低分子核酸分子、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、メッセンジャーリボ核酸（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロ－ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸リボヌクレオチド（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（小型内部セグメント化干渉ＲＮＡ）、ａｉＲＮＡ（非対称干渉ＲＮＡ）、および関連する細胞および／または組織に対するセンス鎖とアンチセンス鎖との間に１つ、２つ、またはそれ以上のミスマッチを有するｓｉＲＮＡ（例えば細胞培養、対象または生物において）が挙げられる。治療剤は、精製されても、または部分的に精製されてもよく、天然に存在してもよく、または合成もしくは化学的に改変されてもよい。一部の実施形態では、治療剤は、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。一部の実施形態では、治療剤はｍＲＮＡである。
[630]一部の実施形態では、ペイロードは、１つまたは複数の核酸（すなわち、１つま
たは複数の核酸分子実体）を含む。一部の実施形態では、核酸は一本鎖核酸である。一部の実施形態では、一本鎖核酸はＤＮＡである。一部の実施形態では、一本鎖核酸はＲＮＡである。一部の実施形態では、核酸は二本鎖核酸である。一部の実施形態では、二本鎖核酸はＤＮＡである。一部の実施形態では、二本鎖核酸はＲＮＡである。一部の実施形態では、二本鎖核酸はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドである。一部の実施形態では、核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、
短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはダイサー基質ｄｓＲＮＡである。
その他の脂質
[631]一部の実施形態では、開示されたＬＮＰ組成物は、ヘルパー脂質を含む。一部の
実施形態では、開示されたＬＮＰ組成物は中性脂質を含む。一部の実施形態では、開示されたＬＮＰ組成物は、ステルス脂質を含む。一部の実施形態では、開示されたＬＮＰ組成物は追加の脂質を含む。
[632]本明細書で使用される場合、本開示の脂質組成物での使用に適した中性脂質とし
ては、例えば、様々な中性、非荷電または双性イオン脂質が挙げられる。本開示での使用に適した中性リン脂質の例としては、限定するものではないが、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル１－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイルｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、２－オレオイル－１－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、中性リン脂質は、ＤＳＰＣおよびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、中性リン脂質はＤＳＰＣである。中性脂質は、ＬＮＰの処理を安定化および改善するために機能し得る。
[633]ヘルパー脂質とは、トランスフェクション（例えば、生物活性剤を含む、本明細
書で提供される組成物を含むナノ粒子（ＬＮＰ）のトランスフェクション）を増強する脂質を指す場合がある。ヘルパー脂質がトランスフェクションを強化する機構には、粒子の安定性の増強が挙げられる。一部の実施形態では、ヘルパー脂質は膜融合性を増強する。ヘルパー脂質としては、ステロイド、ステロール、およびアルキルレゾルシノールが挙げられる。本開示での使用に適したヘルパー脂質としては、限定するものではないが、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、およびコレステロールヘミスクシネートが挙げられ得る。一部の実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールである。一部の実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールヘミスクシネートである。
[634]ステルス脂質は、ナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、血液中）に存在し得る時
間の長さを変える脂質を指す場合がある。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集［凝集］を減らし、粒子サイズを制御することにより、製剤化プロセスを支援し得る。本明細書で使用されるステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。本開示の脂質組成物での使用に適したステルス脂質としては、限定するものではないが、脂質部分に連結された親水性頭部基を有するステルス脂質が含まれ得る。本開示の脂質組成物での使用に適したス
テルス脂質およびそのような脂質の生化学に関する情報は、Ｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１、２００８、５５－７１頁およびＩ－Ｔｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６０（２００４）４１－５２に見出され得る。追加の適切なＰＥＧ脂質は、例えばＷＯ２００６／００７７１２に開示されている。
[635]一部の実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ脂質である。一実施形態では、ス
テルス脂質の親水性頭部基は、ＰＥＧ（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれることもある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸およびポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］に基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含む。ステルス脂質は、脂質部分を含んでもよい。一部の実施形態では、ステルス脂質の脂質部分は、約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものを含む、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドに由来し得、この鎖は、例えば、アミドまたはエステルなどの１つまたは複数の官能基を含み得る。ジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基は、１つまたは複数の置換アルキル基をさらに含んでもよい。
[636]ヘルパー脂質、中性脂質、ステルス脂質、および／または他の脂質の構造および
特性は、ＷＯ２０１７１７３０５４Ａ１、Ｗ０２０１９０６７９９９Ａ１、ＵＳ２０１８０２９０９６５Ａ１、ＵＳ２０１８０１４７２９８Ａ１、ＵＳ２０１６０３７５１３４Ａ１、ＵＳ８２３６７７０、ＵＳ８０２１６８６、ＵＳ８２３６７７０Ｂ２、ＵＳ７３７１４０４Ｂ２、ＵＳ７７８０９８３Ｂ２、ＵＳ７８５８１１７Ｂ２、ＵＳ２０１８０２００１８６Ａ１、ＵＳ２００７００８７０４５Ａ１、Ｗ０２０１８１１９５１４Ａ１、およびＷ０２０１９０６７９９２Ａ１（これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。
ＬＮＰ製剤
[637]本明細書に記載のＬＮＰは、１つまたは複数の特定の用途または標的のために設
計し得る。ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物の要素または組成物は、特定の用途または標的に基づいて、ならびに／または有効性、毒性、費用、使いやすさ、および入手可能性に基づいて選択され得る。同様に、ナノ粒子組成物の特定の製剤は、１つまたは複数の記載された脂質を含む組成物であり、特定の適用または標的に合わせて選択され得る。製剤に使用される適切なリン酸塩電荷中和剤としては、限定するものではないが、スペルミジンおよび１，３－プロパンジアミンが挙げられる。
[638]記載のＬＮＰ製剤は、１つまたは複数の特定の適用または標的のために設計され
得る。例えば、ナノ粒子組成物は、ＲＮＡなどの治療剤を哺乳動物の体内の特定の細胞、組織、器官、またはその系または群に送達するように設計され得る。特定の身体標的に対する選択性を高めるために、ナノ粒子組成物の物理化学的特性を変更してもよい。例えば、異なる臓器の開窓サイズに基づいて粒子サイズを調整し得る。ナノ粒子組成物に含まれる治療剤はまた、所望の送達標的にまたは標的に基づいて選択してもよい。例えば、治療剤は、特定の徴候、状態、疾患、もしくは障害のために、および／あるいは特定の細胞、組織、器官、もしくは系またはそれらの群への送達（例えば、局所送達または特異的送達）について選択され得る。特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、細胞内で翻訳されて目的のポリペプチドを産生し得る目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含み得る。そのような組成物は、特定の臓器に特異的に送達されるように設計され得る。
[639]ＬＮＰ組成物中の治療剤の量は、ナノ粒子組成物のサイズ、組成物、所望の標的
および／もしくは適用、または他の特性に依存し得る。例えば、ナノ粒子組成物に含まれるＲＮＡの量は、ＲＮＡのサイズ、配列、および他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中の治療剤および他の要素（例えば、脂質）の相対量も変化し得る。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の脂質成分対治療剤のｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約６０：１、例えば、約５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、および６０：１であってもよい。例えば、脂質成分対治療剤のｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１～約４０：１であり得る。特定の実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１である。ナノ粒子組成物中の治療剤の量は、吸収分光法（例えば、紫外可視分光法）を使用して測定され得る。
[640]一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡなどの１つまたは複数の核酸を含
む。一部の実施形態では、１つまたは複数のＲＮＡ、脂質、およびその量を選択して、特定のＮＩＰ比を提供してもよい。ＮＩＰ比は、約１～約３０から選択してもよい。Ｎ／Ｐ比は、約２～約１０から選択され得る。一部の実施形態では、ＮＩＰ比は、約０．１～約５０である。一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約２～約８である。一部の実施形態では、ＮＩＰ比は、約２～約１５、約２～約１０、約２～約８、約２～約６、約３～約１５、約３～約１０、約３～約８、約３～約６、約４～約１５、約４～約１０、約４～約８、または、約４～約６である。一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、または、約６．５である。一部の実施形態では、ＮＩＰ比は、約４～約６である。一部の実施形態では、ＮＩＰ比は、約４、約４．５、約５、約５．５、または、約６である。
[641]一部の実施形態では、ＬＮＰは、約５０％～約７０％、約７０％～約９０％、ま
たは、約９０％～約１００％の範囲の平均封入効率で形成される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、約７５％～約９５％の範囲の平均封入効率で形成される。
[642]別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される組成物を含む
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。本明細書で使用される場合、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物またはナノ粒子組成物は、１つまたは複数の記載された脂質を含む組成物である。ＬＮＰ組成物は、通常、マイクロメートル以下のオーダーのサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、およびリポプレックスを含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。一部の実施形態では、ナノ粒子は、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、または２５～６０ｎｍのサイズの範囲であり得る。一部の実施形態では、リポソームは、直径が５００ｎｍ以下の脂質二重層を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰは、約１ｎｍ～約２５００ｎｍ、約１０ｎｍ～約１５００ｎｍ、約２０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、または、約７０ｎｍ～約８０ｎｍの平均直径を有し得る。本明細書に記載のＬＮＰは、約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、１５０ｎｍ、またはそれ以上の平均直径を有し得る。本明細書に記載のＬＮＰは、実質的に非毒性であり得る。
[643]一部の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、または中性脂質から
作製され得る。一部の実施形態では、ＬＮＰは、融合性リン脂質１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）または膜成分コレステロールなどの中性脂質を、トランスフェクション活性およびナノ粒子安定性を増強するためのヘルパー脂質として含んでもよい。一部の実施形態では、ＬＮＰは、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性脂質および親水性脂質の両方を含み得る。当該技術分野で公知の任意の脂質または脂質の組み合わせを使用して、ＬＮＰを生成し得る。ＬＮＰを生成するために使用される脂質の例としては、限定するものではないが、ＤＯＴＭＡ（Ｎ［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（［２－スペルミンカルボキサミド］エチル）－２，３－ビス（ジオレイルオキシ）－１－プロパニミニウム五塩酸塩）、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ－１－プロパンアミニウムブロミド）、ＤＣ－コレステロール（３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール）、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、およびＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ（，２－ビス（ジメチルホスフィノ）エタン）－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。カチオン性脂質の例としては、限定するものではないが、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、および７Ｃ１が挙げられる。中性脂質の例としては、限定するものではないが、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）、ＰＯＰＣ（１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＯＰＥ、およびＳＭ（スフィンゴミエリン）が挙げられる。ＰＥＧ改変脂質の例としては、限定するものではないが、ＰＥＧ－ＤＭＧ（ジミリストイルグリセロール）、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、およびＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０が挙げられる。一部の実施形態では、脂質を任意の数のモル比で組み合わせてＬＮＰを生成し得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを広範囲のモル比で脂質と組み合わせて、ＬＮＰを生成し得る。
[644]「置換された」という用語は、別段の指示がない限り、限定するものではないが
：ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、オキソ、チオキシ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環、および脂肪族基を含む、特定の置換基の基による所与の構造中の１つまたは複数の水素基の置換を指す。置換基はさらに置換されていてもよいことが理解される。例示的な置換基としては、アミノ、アルキルアミノなどが挙げられる。
[645]本明細書で使用される場合、「置換基」という用語は、指定された原子位置で置
換され、指定された原子の１つまたは複数の水素を置換するコア分子の原子上の位置変数を意味し、ただし指定された原子の正常な値が過剰ではないこと、および置換により安定な化合物が得られることという条件である。置換基および／または変数の組み合わせは、そのような組み合わせが安定した化合物をもたらす場合にのみ許容される。当業者は、本明細書に記載または示されているように満たされていないと思われる原子価を有する任意の炭素およびヘテロ原子が、記載または示された原子価を満たすのに十分な数の水素原子
を有すると想定されることに留意すべきである。特定の例では、結合点として二重結合（例えば、「オキソ」または「＝Ｏ」）を有する１つまたは複数の置換基が、置換基内で本明細書に記載、示され、または列挙されてもよく、この構造は、式（Ｉ）のコア構造への結合点として単結合のみを示す場合がある。当業者は、単結合のみが示されているが、それらの置換基には二重結合が意図されていることを理解するであろう。
[646]「アルキル」という用語は、１～２０個の炭素原子を有し、単結合によって分子
の残りの部分に結合している、直鎖または分枝の炭化水素鎖基を指す。１０個までの炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ１０アルキルと呼ばれ、同様に、例えば、６個までの炭素原子を含むアルキルは、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。他の数の炭素原子を含むアルキル（および本明細書で定義される他の部分）も同様に表される。アルキル基としては、限定するものではないが、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ９アルキル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ１～Ｃ７アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ２～Ｃ８アルキル、Ｃ３～Ｃ８アルキルおよびＣ４～Ｃ８アルキルが挙げられる。代表的なアルキル基としては、限定するものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、１－メチルエチル（ｉ－プロピル）、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓ－ブチル、ｎ－ペンチル、１，１－ジメチルエチル（ｔ－ブチル）、３－メチルヘキシル、２－メチルヘキシル、１－エチル－プロピルなどが挙げられる。一部の実施形態では、アルキルはメチルまたはエチルである。一部の実施形態では、アルキルは－ＣＨ（ＣＨ３）２または－Ｃ（ＣＨ３）３である。本明細書において特に断りのない限り、アルキル基は、以下に記載するように置換されていてもよい。「アルキレン」または「アルキレン鎖」は、分子の残りをラジカル基に連結する直鎖または分枝鎖の二価炭化水素鎖を指す。一部の実施形態では、アルキレンは、－Ｃｌ－１２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。一部の実施形態では、アルキレンは－ＣＨ２－である。一部の実施形態では、アルキレンは－ＣＨ２ＣＨ２－である。一部の実施形態では、アルキレンは－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
[647]「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合が存在する
タイプのアルキル基を指す。一実施形態では、アルケニル基は、式－Ｃ（Ｒ）＝ＣＲ２を有し、ここで、Ｒはアルケニル基の残りの部分を指し、これは同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態では、ＲはＨまたはアルキルである。一部の実施形態では、アルケニルは、エテニル（すなわちビニル）、プロペニル（すなわちアリル）、ブテニル、ペンテニル、ペンタジエニルなどから選択される。アルケニル基の非限定的な例としては、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ３、－Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨＣＨ３、および－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２が挙げられる。
[648]「シクロアルキル」という用語は、環を形成する原子（すなわち、骨格原子）の
それぞれが炭素原子である、単環式または多環式の非芳香族ラジカルを指す。一部の実施形態では、シクロアルキルは、飽和または部分不飽和である。一部の実施形態では、シクロアルキルは、スピロ環または架橋化合物である。一部の実施形態では、シクロアルキルは芳香環と縮合している（この場合、シクロアルキルは非芳香環炭素原子を介して結合している）。シクロアルキル基には、３～１０個の環原子を有する基が含まれる。代表的なシクロアルキルとしては、限定するものではないが、３～１０個の炭素原子、３～８個の炭素原子、３～６個の炭素原子、または３～５個の炭素原子を有するシクロアルキルが挙げられる。単環式シクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。一部の実施形態では、単環式シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルである。一部の実施形態では、単環式シクロアルキルは、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルである。一部の実施形態では、単環式シクロアルキルはシクロペンテニルである。多環式ラジカルとしては、例えば、アダマンチル、
１，２－ジヒドロナフタレニル、１，４－ジヒドロナフタレニル、テトライニル、デカリニル、３，４－ジヒドロナフタレニル－１（２Ｈ）－オン、スピロ［２．２］ペンチル、ノルボルニルおよびビシクル［１．１．１］ペンチルが挙げられる。本明細書において特に断りのない限り、シクロアルキル基は置換されていてもよい。構造に応じて、シクロアルキル基は一価であっても、または二価であってもよい（すなわち、シクロアルキレン基）。
[649]「複素環」または「複素環式」という用語は、窒素、酸素および硫黄から選択さ
れる少なくとも１つのヘテロ原子を含むヘテロ芳香族環（ヘテロアリールとしても公知）およびヘテロシクロアルキル環（ヘテロ脂環式基としても公知）を指し、ここで各複素環基は、３～１２個の原子をその環系に有し、ただし、どの環も２つの隣接するＯまたはＳ原子を含まないことを条件とする。「ヘテロシクリル」は、複素環式化合物の任意の環原子から水素原子を除去することによって形成される一価の基である。一部の実施形態では、複素環は、単環式、二環式、多環式、スピロ環式または架橋化合物である。非芳香族複素環基（ヘテロシクロアルキルとしても知られる）は、その環系に３～１２個の原子を有する環を含み、芳香族複素環基は、その環系に５～１２個の原子を有する環を含む。複素環基には、ベンゾ縮合環系が含まれる。非芳香族複素環式基の例は、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、オキサゾリジノニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チオキサニル、ピペラジニル、アジリジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、１，２，３，６－テトラヒドロピリジニル、ピロリン－２－イル、ピロリン－３－イル、インドリニル、２Ｈ－ピラニル、４Ｈピラニル、ジオキサニル、１，３－ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、３－アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル１，３－アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、３ｈ－インドリル、インドリン－２－オニル、イソインドリン－１－オニル、イソインドリン－１，３－ジオニル、３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オニル、３，４－ジヒドロキノリン－２（１Ｈ）－オニル、イソインドリン－１，３－ジチオニル、ベンゾ［ｄ］オキサゾール－２（３Ｈ）－オニル、１Ｈ－ベンゾ［ｄ］イミダゾール－２（３Ｈ）－オニル、ベンゾ［ｄ］チアゾール－２（３Ｈ）－オニル、およびキノリジニルである。芳香族複素環式基の例は、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フチル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、およびフロピリジニルである。前述の基は、可能であればＣ結合（またはＣｌｉｎｋｅｄ）またはＮ結合のいずれかである。例えば、ピロール由来の基としては、ピロール－１－イル（Ｎ結合）またはピロール－３－イル（Ｃ結合）の両方が挙げられる。さらに、イミダゾール由来の基としては、イミダゾール－１－イルまたはイミダゾール－３－イル（両方ともＮ結合）またはイミダゾール－２－イル、イミダゾール－４－イルまたはイミダゾール－５－イル（全てＣ結合）が挙げられる。複素環基としては、ベンゾ縮合環系が挙げられる。非芳香族複素環は、ピロリジン－２－オンなどの１つまたは２つのオキソ（＝Ｏ）部分で任意選択で置換される。一部の実施形態では、二環式複素環の２つの環のうちの少なくとも１つは芳香族である。一部の実施形態では、二環式複素環の両方の環が芳香族である。
[650]「ヘテロシクロアルキル」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択され
る少なくとも１つのヘテロ原子を含むシクロアルキル基を指す。本明細書で特に断りのない限り、ヘテロシクロアルキルラジカルは単環式または二環式の環系であり得、これは縮合（アリールまたはヘテロイル環と縮合する場合、ヘテロシクロアルキルは非芳香族環原子を介して結合する）または架橋環系を含んでもよい。ヘテロシクリルラジカル中の窒素、炭素または硫黄原子は、任意選択で酸化されていてもよい。窒素原子は、必要に応じて四級化されてもよい。ヘテロシクロアルキルラジカルは部分的または完全に飽和している。ヘテロシクロアルキルラジカルの例としては、限定するものではないが、ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、デカヒドロキノリル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２－オキソピペラジニル、２－オキソピペリジニル、２－オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４－ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１－オキソチオモルホリニル、１，１－ジオキソ－チオモルホリニルが挙げられる。ヘテロシクロアルキルという用語には、単糖、二糖、およびオリゴ糖を含むがこれらに限定されない炭水化物の全ての環形も含まれる。特に断りのない限り、ヘテロシクロアルキルは、環に２～１２個の炭素を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環に２～１０個の炭素を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１０個の炭素および１個または２個のＮ原子を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１０個の炭素および３または４個のＮ原子を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１２個の炭素、０～２個のＮ原子、０～２個のＯ原子、０～２個のＰ原子、および０～１個のＳ原子を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に２～１２個の炭素、１～３個のＮ原子、０～１個のＯ原子、および０～１個のＳ原子を有する。ヘテロシクロアルキル中の炭素原子の数に言及するとき、ヘテロシクロアルキル中の炭素原子の数は、ヘテロシクロアルキルを構成する原子（ヘテロ原子を含む）の総数（すなわち、ヘテロシクロアルキル環の骨格原子）と同じではないことが理解される。本明細書において特に断りのない限り、ヘテロシクロアルキル基は、任意選択で置換されてもよい。本明細書で使用される「テトラシクロアルキレン」という用語は、二価のヘテロシクロアルキル基を指し得る。
[651]「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される１つ
または複数の環ヘテロ原子を含むアリール基を指す。ヘテロアリールは単環式または二環式である。単環式ヘテロアリールの具体例としては、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、ピリダジニル、トリアジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、インドリジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、１，８－ナフチリジン、およびプテリジンが挙げられる。単環式ヘテロアリールの具体例としては、ピリジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、ピリダジニル、トリアジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、およびフラザニルが挙げられる。二環式ヘテロアリールの具体例としては、インドリジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、１，８－ナフチリジン、およびプテリジンが挙げられる。一部の実施形態では、ヘテロアリールは、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、チエニル、チアジアゾリルまたはフリルである。一部の実施形態では、ヘテロアリールは、環内に０～６個のＮ原子を含有する。一部の実施形態では、ヘテロアリ
ールは、環内に１～４個のＮ原子を含有する。一部の実施形態では、ヘテロアリールは、環内に４～６個のＮ原子を含有する。一部の実施形態では、ヘテロアリールは、環内に０～４個のＮ原子、０～１個のＯ原子、０～１個のＰ原子、および０～１個のＳ原子を含有する。一部の実施形態では、ヘテロアリールは、環内に１～４個のＮ原子、０～１個のＯ原子、および０～１個のＳ原子を含有する。一部の実施形態では、ヘテロアリールは、Ｃ１～Ｃ９ヘテロアリールである。一部の実施形態では、単環式ヘテロアリールは、Ｃ１～Ｃ５ヘテロアリールである。一部の実施形態では、単環式ヘテロアリールは、５員または６員のヘテロアリールである。一部の実施形態では、二環式ヘテロアリールは、Ｃ６～Ｃ９ヘテロアリールである。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、部分的に還元されて、本明細書で定義されるヘテロシクロアルキル基を形成する。一部の実施形態では、ヘテロアリール基は完全に還元されて、本明細書で定義されるヘテロシクロアルキル基を形成する。
[652]本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」は、脂質（複数可）中のイオン化可能
な（例えば、生理学的ｐＨ範囲における）窒素原子と、核酸分子実体（複数可）中の、例えば、脂質成分とＲＮＡとを含むナノ粒子組成物中の、リン酸基とのモル比である。イオン化可能な窒素原子は、例えば、約ｐＨ１、約ｐＨ２、約ｐＨ３、約ｐＨ４、約ｐＨ５、約ｐＨ６、約ｐＨ７、約ｐＨ７．５、または、約ｐＨ８以上でプロトン化され得る窒素原子を含み得る。生理的ｐＨ範囲は、例えば、異なる細胞区画（器官、組織、および細胞など）および体液（血液、ＣＳＦ、胃液、牛乳、胆汁、唾液、涙、および尿など）のｐＨ範囲を含み得る。ある特定の実施形態では、生理学的ｐＨ範囲とは、哺乳動物における血液のｐＨ範囲、例えば、約７．３５～約７．４５を指す。同様に、１つまたは複数のイオン化可能な窒素原子を有するリン酸塩電荷中和剤の場合、Ｎ／Ｐ比は、リン酸塩電荷中和剤中のイオン化可能な窒素原子と、核酸中のリン酸基とのモル比を指す場合がある。一部の実施形態では、イオン化可能な窒素原子とは、５～１４の間のｐＨ範囲内でイオン化可能な窒素原子を指す。
[653]本明細書に記載のｇＲＮＡおよびｍＲＮＡ原薬をカプセル化するＬＮＰ製剤は、
２０２１年３月４日に出願された共同所有の米国特許出願第１７／１９２，７０９号（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２１／２０９５５出願の並行ＰＣＴが同日に提出された）に開示されている製剤などのＧａｌＮａｃ脂質製剤を含むように改変され得ることがさらに企図される。そのようなＧａｌＮａｃ脂質製剤の採用は、ヘテロ接合性およびホモ接合性の家族性高コレステロール血症患者集団に関連するものなどのＬＤＬ－Ｒ欠損細胞におけるＬＮＰ取り込みを増強し得ると理解される。
[654]リン酸基を含まないペイロードの場合、Ｎ／Ｐ比とは、ペイロード中の総負電荷
に対する、脂質中のイオン化可能な窒素原子のモル比を指す場合がある。例えば、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比とは、組成物中に存在するペイロード中の全負電荷に対するＬＮＰ組成物中の全イオン性窒素原子のモル比を指す場合がある。
[655]本明細書で使用される場合、アミノ脂質は、ｐＨ範囲４から１４の間でプロトン
化可能（またはイオン化可能）である少なくとも１つの第一級、第二級、または第三級アミン部分を含んでもよい。一部の実施形態では、アミン部分は、アミノ脂質の親水性頭部基として機能する。核酸脂質ナノ粒子製剤中のアミノ脂質のアミン部分のほとんどが生理的ｐＨでプロトン化されている場合、ナノ粒子はカチオン性脂質ナノ粒子（ｃＬＮＰ）と呼んでもよい。核酸－脂質ナノ粒子製剤中のアミノ脂質のアミン部分のほとんどが生理的ｐＨではプロトン化されないが、酸性ｐＨではプロトン化できる場合、例えばエンドソームｐＨは、イオン化可能脂質ナノ粒子（ｉＬＮＰ）と呼んでもよい。ｃＬＮＰｓを構成するアミノ脂質は、一般にカチオン性アミノ脂質（ｃＬｉｐｉｄ）と呼んでもよい。ｉＬＮＰｓを構成するアミノ脂質は、イオン化可能なアミノ脂質（ｉＬｉｐｉｄｓ）と呼んでも
よい。アミノ脂質は、生理的ｐＨでｉＬｉｐｉｄまたはｃＬｉｐｉｄであってもよい。
キット
[656]本開示の一態様は、本明細書で提供されるシングルガイドＲＮＡを含む組成物、
本明細書で提供される塩基エディターシステムおよび複合体、本明細書で提供される組成物、または本明細書で提供される脂質ナノ粒子を含む、ある状態の処置または予防のためのキットに関する。キットは、ある状態を処置または予防するための１つまたは複数の追加の治療レジメンまたは薬剤をさらに含んでもよい。
[657]特定の実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数の方法で使用するための
キットおよび製品も本明細書に開示される。そのようなキットは、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器を収容するように区画化された担体、パッケージ、または容器を含み、その容器のそれぞれは、本明細書に記載の方法で使用される別個の要素の１つを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管が挙げられる。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成される。
[658]本明細書で提供される製品は、包装材料を含む。医薬品包装材料の例としては、
ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、および選択された製剤ならびに投与および処置の意図された方式に適した任意の包装材料が挙げられるが、これらに限定されない。
[659]例えば、容器は、本開示の組成物を含み、任意選択で、本明細書に開示される治
療レジメンまたは薬剤を加えて含む。そのようなキットは、本明細書に記載の方法におけるその使用に関連する識別説明またはラベルまたは説明書を任意選択で含む。
[660]キットには通常、内容物および／または使用説明書が列挙されたラベルと、使用
説明書が記載された添付文書とが含まれている。通常、一連の説明書も含まれる。
[661]実施形態では、ラベルが容器上にあるか、容器に関連付けられている。一実施形
態では、ラベルは、ラベルを形成する文字、数字、または他の文字が容器自体に取り付けられ、成形され、またはエッチングされたときに容器上にある。ラベルは、容器を保持するレセプタクルまたは担体内に存在する場合、例えば添付文書として容器に関連付けられる。一実施形態では、内容物が特定の治療用途に使用されることを示すためにラベルが使用される。ラベルはまた、本明細書に記載されている方法などで、内容物の使用方法も示している。
序論
[662]本開示が特有の実施例によってより詳細に記載される。これらの実施例は、実例
的な目的のためにのみ提供され、本明細書において提供される請求項の範囲を限定しない。当業者は、本開示による代替的な実施形態をもたらすために変更または改変され得る様々な不可欠でないパラメーターを容易に認識する。
[00663]ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびＣＲＩＳＰＲ塩基エディターを包
む遺伝子編集技術は、ヒト患者において疾患を引き起こす遺伝子を精密におよび永久的に改変する潜在能力を有する。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の標的臓器における永続性のある編集の実証は、臨床試験における患者への遺伝子エディターのｉｎ ｖｉｖｏ投与の前の重要および必要なステップである。本明細書において提供されるのは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用してｉｎ ｖｉｖｏで送達されるＣＲＩＳＰＲ塩基エディターは、生きたＮＨＰにおいて疾患関連遺伝子を効率的に改変できることの初めての実証である。コレステロ
ールを低減させ、世界中で死の主要な原因である冠動脈心疾患を処置するための一度で終わりのアプローチのための概念実証を提供することに加えて、これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ塩基エディターが肝臓および潜在的に他の臓器において様々な治療標的遺伝子に対してどのように生産的に応用され得るのかを実証する。
[00664]ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集は、患者自身の身体の臓器、例えば肝臓においてＤ
ＮＡ改変を行うための新興の新たな治療アプローチである。遺伝子編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９および－Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲシトシン塩基エディター、ＣＲＩＳＰＲアデニン塩基エディター、ならびにＣＲＩＳＰＲプライムエディターを包む。ヒトＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集のための特に魅力的な潜在的な標的である。原理的に、ＰＣＳＫ９の編集は、血中ＬＤＬ－Ｃレベルにおける永続性のある低減を生成し、それによりＬＤＬ－Ｃに対する累積的な曝露を劇的に低下させ得るものであり、これは、１日毎または数週～数か月毎に行わなければならず、患者の遵守の欠如を被り得る全ての既存の療法（例えば、スタチン、エゼチミブ、またはＰＣＳＫ９阻害剤）とは対照的である。
[00665]肝臓にＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３機能欠失型突然変異を導入できる遺伝
子エディターのｉｎ ｖｉｖｏ送達は、冠動脈心疾患の生涯の処置を与える新たな種類の一度で終わりの療法を与える潜在能力を有する。ＣＲＩＳＰＲ塩基エディターは、この目的のための魅力的な遺伝子編集モダリティーを作り、その理由は、それらは、精密な標的化された変更を導入するために効率的に機能し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９および他の遺伝子編集ヌクレアーゼとは対照的に、二本鎖ＤＮＡ切断を導入する任意の有害な帰結を最小化するからである。
[00666]ＣＲＩＳＰＲアデニン塩基エディターは、ＤＮＡにおいて標的化されたＡ→Ｇ
編集（反対鎖上のＴ→Ｃ）を誘起することができ、開始コドン、エクソン－イントロンもしくはイントロン－エクソン境界におけるスプライスドナー（センス鎖上のカノニカルなＧＴ配列）もしくはスプライスアクセプター（センス鎖上のカノニカルなＡＧ配列）を妨害するか、またはミスセンス突然変異を導入することにより遺伝子を不活性化するために使用され得る。アデニン８．８－ｍ（以後ＡＢＥ８．８として参照される）は、そのコアとなるストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ニッカーゼＣａｓ９（ｎＳｐＣａｓ９）タンパク質をガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共に使用して、その３’末端上でＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列により隣接される二本鎖プロトスペーサーＤＮＡ配列にエンゲージメントする。プロトスペーサー配列は、「標的」ＤＮＡ鎖上の相補配列とのｇＲＮＡの最初の２０塩基のハイブリダイゼーションを介して特定され、Ｒ－ループと呼ばれる露出された一本鎖形態の構造の他の（「非標的」）鎖の部分を残す。ＡＢＥ塩基エディターは、ｎＳｐＣａｓ９に融合した、進化したデオキシアデノシンデアミナーゼドメインを使用して、Ｒ－ループの一本鎖ＤＮＡ部分に含有されるアデノシンヌクレオシドをイノシンに化学的に改変し、Ｒ－ループのＤＮＡ：ＲＮＡヘテロデュプレックス内の標的ＤＮＡ鎖にニックを入れる。このニックは、新たに脱アミノ化された鎖を鋳型として使用するようにＤＮＡ修復機構をバイアスして、標的化された部位における高度に効率的な転移突然変異を可能にする。ＡＢＥ８．８の活性ウィンドウは、典型的には、ｇＲＮＡにより特定されるプロトスペーサーＤＮＡ配列中の３～９位、ＮＧＧ ＰＡＭ（２１～２３位）の１２～１８塩基対５’の範囲内であり、ピーク編集はプロトスペーサーの６位において観察される。ＡＢＥ８．８の作用の機序は二本鎖ＤＮＡ切断を伴わないが、インデル突然変異誘発が低い頻度で起こり得る。
[00667]遺伝子不活性化または他の種類の遺伝子変更のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９
ゲノム編集と比較した塩基編集の利点が留意される。標準的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９編集は、二本鎖切断から発する望ましくないオンターゲット効果およびオフターゲット効果
のより高いリスクを有する（大きい欠失、ベクターＤＮＡ配列の組込み、染色体再編成、ｐ５３活性の誘起など）。意図されるオンターゲット効果（小さいインデル突然変異）であっても予測不可能性の要素を有し、それらは、切断されたタンパク質生成物の末端において様々な一連の異常なアミノ酸を付加するフレームシフト突然変異、またはその機能をノックアウトすることなくアミノ酸を付加するかもしくはタンパク質からアミノ酸を除去するインフレーム突然変異をもたらし得る。対照的に、塩基編集は、ゲノム中に精密な、定型的な変化を効率的に行うための手段を与え、遺伝子機能のより再現性のある変更を可能とする。塩基編集は、二本鎖切断を要求せず、その代わりにデアミナーゼドメインを介するＤＮＡ塩基の酵素的改変を通して作用するおかげで、意図されないオンターゲット効果を軽減する。
[668]本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されたが、そのような実施
形態は例としてのみ提供されていることは当業者に自明である。本発明が本明細書内に提供される特有の例により限定されることは意図されない。本発明が上述の仕様に関して記載されたが、本明細書における実施形態の記載および図示は、限定的な意味で解されることは意味されない。多数のバリエーション、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に想起されるであろう。さらには、本発明の全ての態様は、様々な条件および可変要素に依存する本明細書に記載された特有の描写、構成または相対的な割合に限定されないことが理解される。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が本発明の実施において用いられ得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は任意のそのような代替、改変、バリエーションまたは同等物もカバーすることが想定される。
プロトスペーサーの選択および編集
実施例１． ＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３を標的化するためのｇＲＮＡの設計
[669]表１および表２４に示される全てのプロトスペーサーは、２つの基準により選択
された。第１に、それらは遺伝子のヒト、カニクイザル、および／またはマウスオルソログ中の配列にマッチした（または非常に緊密にマッチした）。第２に、それらは、ＭＩＴ特異性スコア（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｏｒ．ｔｅｆｏｒ．ｎｅｔ／により算出される；５０の最小スコア）により判断される、好都合な予測されるオフターゲットプロファイルを有した。
[670]目標が治療目的のためにｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子を妨害することである場合、シ
トシン塩基エディターは、グルタミン（ＣＡＧ→ＴＡＧ、ＣＡＡ→ＴＡＡ）、アルギニン（ＣＧＡ→ＴＧＡ）、およびトリプトファン（ＴＧＧ→ＴＡＧ／ＴＡＡ／ＴＧＡ、アンチセンス鎖上のシトシンの編集を伴う）について特有のコドンを変更することにより遺伝子のコード配列に終止コドンを直接的に導入すること（ナンセンス突然変異）ができるという利点を有する。対照的に、ナンセンス突然変異をもたらすＡ→Ｇ変化はないため、アデニン塩基エディターは終止コドンを直接的に導入することができない。それにもかかわらず、特にはｇＲＮＡ非依存性オフターゲットＤＮＡ塩基編集に関して、アデニン塩基エディターのより好都合なオフターゲットプロファイルは、治療目的のためにシトシン塩基エディターよりもアデニン塩基エディターの使用を推奨する。類似したアプローチに従って、表１および表２４に列記されるマウス／齧歯類特異的プロトスペーサーを同定および選択した。
[671]遺伝子機能を妨害するためにアデニン塩基エディターが使用され得る１つの戦略
は、開始コドンを編集すること、例えばＡＴＧ→ＧＴＧまたはＡＴＧ→ＡＣＧである。したがって、タンパク質への結果的な翻訳は、カノニカルなＡＴＧ部位において開始されない。遺伝子機能を妨害するためにアデニン塩基エディターが使用され得る第２の戦略は、イントロンの５’末端におけるスプライスドナーまたはイントロンの３’末端におけるス
プライスアクセプターのいずれであれ、スプライス部位を編集することである。スプライス部位妨害は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）中へのイントロン配列の包含（未成熟終止コドンもしくはタンパク質活性を妨害するアミノ酸の挿入／欠失をもたらすナンセンス、フレームシフト、もしくはインフレームインデル突然変異を潜在的に導入する）、またはこれもまたナンセンス、フレームシフト、もしくはインフレームインデル突然変異を導入し得るエクソン配列の除外をもたらし得る。カノニカルなスプライスドナーはセンス鎖上にＤＮＡ配列ＧＴを含む一方、カノニカルなスプライスアクセプターはＤＮＡ配列ＡＧを含む。配列の変更は正常なスプライシングを妨害する。スプライスドナーは、アンチセンス鎖中の第２の位置における相補的塩基のアデニン塩基編集（ＧＴ→ＧＣ）により妨害可能であり、スプライスアクセプターは、センス鎖中の第１の位置のアデニン塩基編集（ＡＧ→ＧＧ）により妨害可能である。遺伝子機能を妨害するためにアデニン塩基エディターが使用され得る第３の戦略は、より低く機能的な、または非機能的なタンパク質の産生をもたらす、遺伝子のコーディング領域にミスセンス突然変異を導入することである。
[672]ドナーまたはアクセプターのいずれであれ、その編集ウィンドウ（ＤＮＡの２０
ｎｔプロトスペーサー領域中のおおよそ３～９位）内のＡ→Ｇ編集を介して、ＡＢＥ８．８（およびストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９を含有する他のＡＢＥバリアント、例えばＡＢＥ７．１０、またはＮＧＧ ＰＡＭを使用できる別のＣａｓタンパク質を含有する他のＡＢＥバリアント）がスプライス部位を妨害することを許容する全てのｇＲＮＡスペーサー配列を同定した。プロトスペーサー配列の各々にマッチするおよび標準的な１００ｎｔストレプトコッカス・ピオゲネスＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ配列に他に適合するガイドＲＮＡを合成し、各々のｇＲＮＡ分子は中程度の化学的改変を有した（例えば、表１）。
Figure 2024038327000017
Figure 2024038327000018
Figure 2024038327000019
Figure 2024038327000020
Figure 2024038327000021
Figure 2024038327000022
Figure 2024038327000023
Figure 2024038327000024
Figure 2024038327000025
Figure 2024038327000026
Figure 2024038327000027
Figure 2024038327000028
Figure 2024038327000029
Figure 2024038327000030
Figure 2024038327000031
Figure 2024038327000032
Figure 2024038327000033
Figure 2024038327000034
Figure 2024038327000035
Figure 2024038327000036
Figure 2024038327000037
Figure 2024038327000038
Figure 2024038327000039
Figure 2024038327000040
Figure 2024038327000041
Figure 2024038327000042
[00673]上記の表１、表２３、および表２４において使用される場合、他に特定されな
ければ、プロトスペーサーにおいて：大文字のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＩおよびＴ）はそれぞれ２’－デオキシリボヌクレオチド、アデニン、グアニン、シトシン、イノシン、およびチミンを指し示し；ガイドＲＮＡ配列において：大文字のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、ＩおよびＵ）はそれぞれリボヌクレオチド、アデニン、グアニン、シトシン、イノシン、およびウラシルを指し示し、小文字のヌクレオチド（ａ、ｇ、ｃ、ｉおよびｕ）は２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド（２’－ＯＭｅ）を指し示す。２’－デオキシリボヌクレオチドを含む他の改変がシングルガイドＲＮＡのスペーサーセクションに導入される場合を除いて、ＤＮＡプロトスペーサーはガイドＲＮＡ設計においてＲＮＡまたはＲＮＡ同等物に変換されることが理解される；ｓ：ホスホロチオエート（ＰＳ）、Ｘ＝リボネブラリン；ｘ＝２’－Ｏ－メチルネブラリン；ｄＸ＝２’－デオキシネブラリン；５’－ＮＮＮ－３’は均一なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｕ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＩ、Ｔ、Ｘ、ｘ、ｄＸ、およびこれらの組合せを指し示す。５’－ｎｎｎ－３’は均一なａ、ｃ、ｇ、ｉ、ｕ、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣまたはＴ、ｘ、ｄＸ、およびこれらの組合せを指し示す。ｍＡＮＧＰＴＬ３：マウスＡＮＧＰＴＬ３；ｈＡＮＧＰＴＬ３：ヒトＡＮＧＰＴＬ３；ｃＡＮＧＰＴＬ３：カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３；ｍｃＡＮＧＰＴＬ３：マウス、カニクイザル交差反応性ＡＮＧＰＴＬ３；ｈｃＡＮＧＰＴＬ３：ヒト、カニクイザル交差反応性ＡＮＧＰＴＬ３；ｍＰＣＳＫ９：マウスＰＣＳＫ９；ｈＰＣＳＫ９：ヒトＰＣＳＫ９；ｃＰＣＳＫ９：カニクイザルＰＣＳＫ９；ｍｃＰＣＳＫ９：マウス、カニクイザル交差反応性ＰＣＳＫ９；ｈｃＰＣＳＫ９：ヒト、カニクイザル交差反応性ＰＣＳＫ９；ｈｃＡＰＯＣ３：ヒト、カニクイザル交差反応性ＡＰＯＣ３。本明細書に開示される場合、ヌクレオチド配列および改変パターンは、全ての長さ、構造、および種類のＲＮＡまたはその断片、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、例えばｓｇＲＮＡ、デュアルガイドＲＮＡ、またはｍＲＮＡを包含する。例えば、上記の表に記載されているヌクレオチド配列および改変パターンは、シングルガイドＲＮＡ、デュアルガイドＲＮＡ、ヌクレアーゼｍＲＮＡ、またはその任意の断片もしくはセグメントにおけるＲＮＡ配列および改変パターンを指し示し得る。表２３において、ｕ’はＮ１－メチルシュードウリジンを指し示す。
実施例２． ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３のＣａｓ９編集
[674]実験のセットにおいて、ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを、同等の量（重量で１：１の比
）のＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された商業的に入手可能なＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００２と共に、初代ヒト肝細胞に２５００、５００、または１００ｎｇ／ＲＮＡ／ｍＬで共トランスフェクトし、詳細な方法に記載されるように処理した。抽出されたゲノムＤＮＡを、標的部位の辺りで生成されたＰＣＲアンプリコンの次世代シーケンシングを用いて標的部位における遺伝子編集について分析した。製造業者のプロトコールに従ってＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して試料を調製した。簡潔に述べれば、２ラウンドのＰＣＲを行って、第１に目的の領域を増幅し、第２に次世代シーケンシングおよび初期生成物に対する試料同定のために要求されるＤＮＡ配列を付加した。最終アンプリコンを製造業者のプロトコールに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器上でシーケンシングした。広範囲の編集活性（表２）が観察された。実験の第２のセットにおいて、ＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡを、同等の量のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（重量で１：１の比）と共に初代ヒト肝細胞に
共トランスフェクトし、同様に処理および分析した（表３）。
Figure 2024038327000043
Figure 2024038327000044
Figure 2024038327000045
Figure 2024038327000046
Figure 2024038327000047
Figure 2024038327000048
[675]それぞれＣａｓ９、シチジン塩基エディター（ＣＢＥ）、およびアデニン塩基エ
ディター（ＡＢＥ）の作動モードが、「プロトスペーサー」、「ＰＡＭ」、「スペーサー」を含む本出願において使用される関連する学術用語と共に、図示されている（図１Ａ～１Ｃ）。スペーサー配列５’－ＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＴＴＧＣＧＴＴＣＣＧ－３’（配列番号６６）を有する、良好に機能するガイドの１つ、ＧＡ１５６について、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対する改変と共に追加のガイドを合成した。追加的に、Ｘ線結晶構造ガイド化アプローチを使用した（図１Ｄ）。構造ガイド化スペーサーおよびｔｒａｃｒ設計は、ｓｇＲＮＡとの複合体中のＳ．ピオゲネスＣａｓ９（Ｊｉａｎｇら，２０１５，ＰＤＢ ＩＤ ４ＺＴ０）および触媒前三元複合体中のＳ．ピオゲネスＣａｓ９（Ｊｉａｎｇら，２０１６，ＰＤＢ ＩＤ ５Ｆ９Ｒ）の結晶構造により情報を与えられた（図２）。所与のヌクレオチドの２’－ＯＨとＣａｓ９タンパク質（またはｓｇＲＮＡの別の部分）との間の水素結合があるらしい結晶構造中のいずれの位置も非改変のままとした。追加的に、立体的衝突が２’－ＯＭｅとタンパク質との間で起こることが予測されるいずれの位置も非改変のままとした。２’－ＯＨが溶媒に露出されるか、または他にタンパク質残基から遠位にある部位において、２’－ＯＭｅ置換を行った。２つの結晶構造が合致しない場合、改変は行わなかった。この戦略は、ｓｇＲＮＡ全体またはｔｒａｃｒ領域のみに対して適用された。例示的な構造が図３～７に示されている。
[676]ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを、同等の量のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＳｐＣａｓ
９ ｍＲＮＡ ＭＳ００２（重量で１：１の比）と共に初代ヒト肝細胞に共トランスフェクトし、詳細な方法に記載されるように処理した。広範囲の編集活性が観察された（表４；ＮＤ＝決定せず）。トランスフェクションの５日後に最も高い編集活性を有したガイドは、ＧＡ００１、ＧＡ００２、ＧＡ００７、およびＧＡ００８であった。構造ガイド化２’－ＯＭｅ重ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）設計ＧＡ００７およびＧＡ００８は、最小に改変された対照ｇＲＮＡ ＧＡ００９を上回る向上された編集を示した。
Figure 2024038327000049
実施例３． ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３塩基編集
[677]ＡＢＥ８．８によるＰＣＳＫ９の編集が初代肝細胞において観察された。ＰＣＳ
Ｋ９ ｇＲＮＡを、同等の量のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００２（重量で１：１の比）と共に初代肝細胞に共トランスフェクトし、詳細な方法に記載されるように処理した。実験の１つのセットにおいて、抽出されたゲノムＤＮＡを、標的スプライス部位の塩基編集について、標的部位の辺りで生成されたＰＣＲアンプリコンの次世代シーケンシングを用いて分析した。製造業者のプロトコールに従ってＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して試料を調製した。簡潔に述べれば、２ラウンドのＰＣＲを行って、第１に目的の領域を増幅し、第２に次世代シーケンシングおよび初期生成物に対する試料
同定のために要求されるＤＮＡ配列を付加した。最終アンプリコンを製造業者のプロトコールに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器でシーケンシングした。広範囲の編集活性（表５；図８）が観察され、ガイドＧＡ０６６、ＧＡ０７３、およびＧＡ０７４が最良の成績であった。
Figure 2024038327000050
[00678]初代ヒト肝細胞からのデータを考慮した場合に、初代ヒト肝細胞と初代カニク
イザル肝細胞との両方の間で最良の種交差活性を有するとして以下の３つのプロトスペーサー配列：５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）（ＧＡ０６６）、５’－ＧＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣ－３’（配列番号６７）（ＧＡ０７３）、および５’－ＴＧＣＴＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＧ－３’（配列番号６８）（ＧＡ０７４）にマッチするＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡが同定された。ＧＡ０６６配列は、ヒトＰＣＳＫ９イントロン１の５’末端におけるスプライスドナーを標的化し、エクソン１、続いてイントロン１の始めから翻訳されるいくつかのアミノ酸（エクソン１からイントロン１へと読み飛ばす）、続いて未成熟終止コドンから翻訳される異常なＰＣＳＫ９タンパク質をもたらすことが予測される（図９）。ＧＡ０７３およびＧＡ０７４配列は各々、ヒトＰＣＳＫ９イントロン４の５’末端におけるスプライスドナーを標的化し、エクソン１、２、３、および４、続いてイントロン４の始めから翻訳されるいくつかのアミノ酸（エクソン４からイントロン４へと読み飛ばす）、続いて未成熟終止コドンから翻訳される異常なＰＣＳＫ９タンパク質をもたらすことが予測される。これらの場合の各々における予測される未熟に切断されたタンパク質は、機能の完全な喪失を有する可能性がある他に、天然に存在する野生型ヒトＰＣＳＫ９アミノ酸配列の部分に対するほぼ同一のマッチに起因して最小の免疫原性を有する可能性がある。同じプロトスペーサー配列、５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）（ＧＡ０６６）はカニクイザルゲノム中に見出され、同様にカニクイザルＰＣＳＫ９イントロン１の５’末端におけるスプライスドナーを標的化する。
[679]ＡＢＥ８．８によるＡＮＧＰＴＬ３の編集が初代肝細胞において観察された。Ａ
ＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡを、同等の量のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４（重量で１：１の比）と共に初代肝細胞に共トランスフェクトし、詳細な方法に記載されるように処理した。以下のプロトスペーサー配列５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１５）にマッチするヒトＡＮＧＰＴＬ３標的化ｇＲＮＡ（ＧＡ０９１）が同定された。ＧＡ０９１配列は、ヒトＡＮＧＰＴＬ３イントロン６の５’末端におけるスプライスドナーを標的化し、エクソン１、２、３、４、５、および６、続いてイントロン６の始めから翻訳されるいくつかのアミノ酸（エクソン６からイントロン６へと読み飛ばす）、続いて未成熟終止コドンから翻訳される異常なＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をもたらすことが予測される（図１０）。顕著なことに、同じスプライスドナーを妨害し、呼称ｒｓ３９８１２２９８５を有する、天然に存在する希少なヒトＤＮＡバリアントがある。１つのヌクレオチドだけ異なり：５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）（ＧＡ０６７）、少なめの化学的改変を有する、オルソロガスなカニクイザルスペーサー配列を有するｇＲＮＡを合成した（表１）。ヒト初代肝細胞におけるＧＡ０９１、およびカニクイザル初代肝細胞におけるＧＡ０６７の両方は、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡと共トランスフェクトされた場合に実質的なスプライス編集に繋がる（プロトコールは詳細な方法のセクションに記載される）（表６）。ＲＮＡを２５００、１２５０、６２５、および３１２．５ｎｇ／試験物品／ｍＬでトランスフェクトし、２つの複製物を報告した（ｒｅｐ１およびｒｅｐ２）。
Figure 2024038327000051
[00680]遺伝子機能を妨害するためにアデニン塩基エディターが使用され得る別の戦略
は、より低く機能的な、または非機能的なタンパク質の産生をもたらす、遺伝子のコーディング領域にミスセンス突然変異を導入することである。ＡＮＧＰＴＬ３エクソン中のプロトスペーサーを標的化するガイドＲＮＡを、ミスセンス突然変異を導入するための塩基編集活性について評価した。ｇＲＮＡの各々を、同等の量のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４（重量で１：１の比）と共に２つの複製物（ｒｅｐ１およびｒｅｐ２）において２５００、１２５０、６２５、および３１２．５ｎｇ／ＲＮＡ／ｍＬで初代ヒト肝細胞に共トランスフェクトし、詳細な方法に記載されるように処理した。もたらされた塩基編集効率の他に、１つの潜在的なアミノ酸置換が表７に列記されている。
[00681]一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、
Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶから選択される任意の１つのアミノ酸を非同一のアミノ酸Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶで置き換えることにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＩをＴまたはＶで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＤをＧで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＥをＧで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＦをＬまたはＰで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＨをＲで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＬをＰで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＳをＰで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＭをＴで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＮをＧで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＱをＲで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＲをＧで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＴをＡで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＶをＡで置
換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＹをＣまたはＨで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、ＫをＧで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、表７に列記されているアミノ酸置換を導入することにより遺伝子機能を妨害する。
Figure 2024038327000052
Figure 2024038327000053
Figure 2024038327000054
Figure 2024038327000055
[00682]５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）（
ＧＡ０６６）プロトスペーサー配列とマッチするが、様々な種類のより大規模な化学的改変を有するｇＲＮＡ ＧＡ０６６／ＧＡ０９５、ＧＡ０９６、Ｇ０９７、ＧＡ３４６（表１）を合成した。同様に、様々な種類のより大規模な化学的改変を有するが、５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１５）（ＧＡ０９１）ヒトプロトスペーサー配列にマッチする３つのｇＲＮＡ（ＧＡ０９８、ＧＡ０９９、ＧＡ１００）の他に、５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）（ＧＡ０６７）カニクイザルプロトスペーサー配列にマッチする４つのｇＲＮＡ（ＧＡ０６７／ＧＡ１０１、ＧＡ１０２、ＧＡ１０３、ＧＡ３４７）を合成した（表１）。ＧＡ０６６およびＧＡ０９５は同じ化学組成および改変パターンを含有し、ＧＡ０６７およびＧＡ１０１も互いに同様である。そのようなｇＲＮＡは、ヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ－塩基エディター複合体に対する安定性を向上させ得ると共に、ｇＲＮＡにトリガーされる免疫反応を低減または抑制し得ることが想定される。表８に記載されるｇＲＮＡの各々を、同等の量のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００２（重量で１：１の比）と共に初代ヒト肝細胞および初代カニクイザル肝細胞に、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ試薬を介して、様々な希釈液を使用して、共トランスフェクトして、試験物品の異なる濃度での編集活性について評価した。トランスフェクションの３日後に、ゲノムＤＮＡを肝細胞から採取し、次に標的スプライス部位の塩基編集について次世代シーケンシングを用いて評価した。ヒト肝細胞およびカニクイザル肝細胞の両方において、６０％～７０％もの高さの標的スプライス部位（ＰＣＳＫ９イントロン１スプライスドナー；ＡＮＧＰＴＬ３イントロン６スプライスドナー）の編集が観察された（表８）。
Figure 2024038327000056
[683]古典的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が最終的にインデルを導入することにより遺伝
子を妨害する方法は、塩基編集とは明確におよび意義深く異なる。特に、塩基編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で日常的に見られるような、ＰＡＭから３～４ｂｐ離れたものとは対照的に、プロトスペーサーの５’領域により近い標的ウィンドウ内に塩基突然変異を導入するために使用される。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集に高度に適する標的領域は、その位置において塩基編集が起こることを必ずしも意味せず、逆もまた同様である。（１）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ０１０および５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）（ＧＡ０９７）プロトスペーサー配列にマッチするｇＲＮＡ；または（２）ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４および５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）（ＧＡ０９７）プロトスペーサー配列にマッチするｇＲＮＡのいずれかを含有するＬＮＰをヒト初代肝細胞にトランスフェクトした。編集されたゲノムＤＮＡのＳａｎｇｅｒシーケンシングを行い、塩基編集と比較してＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で起こった遺伝子編集における差異を図示した（図１１）。矢印は主な塩基編集位置を強調し、鋏はＣａｓ９が切断する一般的な領域を強調する。
[00684]スプライス部位の塩基編集がスプライシングを妨害することを実証するために
、エクソン１およびエクソン２中のプライマーを使用して、処理された初代ヒト肝細胞からのｍＲＮＡの逆転写ＰＣＲを行った。結果は、スプライス部位の妨害は、インフレームＴＡＧ終止コドンの十分に下流の、イントロン１内の選択的なスプライスドナー部位の使用をもたらすことを裏付けた（図１２、表９）。表は、次世代シーケンシングから決定された、各々のスプライス部位ドナーについてのマッピングされたリードの数を報告する。
Figure 2024038327000057
実施例４．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３オフターゲット検証
[685]ｉｎ ｖｉｖｏでヒト肝臓におけるＰＣＳＫ９をノックダウンする塩基編集療法
の安全性を確立することを目的として、オフターゲット突然変異誘発分析を評価した。オフターゲット突然変異誘発のためのヒトゲノム中の候補部位のリストを、２つの異なる方法を使用して集めた。第１の方法では、ヒトゲノムのバイオインフォマティクス分析を使用して、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（およびしたがってＡＢＥ ８．８）と適合性のＰＡＭ配列およびＧＡ０６６スペーサー配列５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）と最大４つの単一ヌクレオチドミスマッチを有するプロトスペーサー配列を有する全ての部位を同定した。候補部位を生成するための第２の方法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学的アッセイ、ＯＮＥ－ｓｅｑを使用し、ＡＢＥ８．８塩基エディタータンパク質およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ（５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３））を含むリボ核タンパク質の、ライブラリー中のオリゴヌクレオチドを切断する傾向を決定した。参照ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）を、ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ（５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３））により特定されるプロトスペーサー配列に対して最大６つのミスマッチを有する部位について検索し、Ｃａｓ－Ｄｅｓｉｇｎｅｒを使用して最大４つのミスマッチおよび最大２つのＤＮＡまたはＲＮＡバルジを有する部位を同定した。ＯＮＥ－ｓｅｑライブラリー調製、実験プロトコール、およびバイオインフォマティクス分析に関するさらなる詳細は、追加の詳細な方法のセクションにおいて記載されている。
[00686]任意の切断されたオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅し、次世代シーケンシング
を行う。より高い配列カウントを有するオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣａｓ９／ｇＲＮＡ切断のより高い傾向を反映し、細胞中でオフターゲット突然変異誘発を被る可能性が最も高い部位を表す。ＯＮＥ－ｓｅｑアッセイにより同定された上位の部位はオンターゲットＰＣＳＫ９部位であった。候補オフターゲット部位のリストは２５０個より多くの部位を含み、さらなる調査を正当化した（表１０）。
[00687]初代ヒト肝細胞を、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９
ｇＲＮＡ（ＧＡ０９７またはＧＡ３４６）を１：１の重量比でカプセル化した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で処理した（ＬＮＰ調製の詳細について脂質ナノ粒子製剤および分析を参照
）。Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ技術を使用した次世代シーケンシングで（表１１）、オンターゲット部位および候補オフターゲット部位にわたり、対照細胞における観察された塩基編集率を、ＬＮＰ処理された細胞における観察された塩基編集率から引いた場合に（次世代シーケンシングにおいて本来的なバックグラウンドシーケンシングエラーを説明するため）、認識可能な塩基編集がオンターゲットＰＣＳＫ９標的部位において観察された。これらの結果は、２人の男性および１人の女性患者からの３つの異なる初代肝細胞ロット（ＳＴＬ、ＨＬＹ、およびＪＬＰ）において複製された。
[00688]追加的に、４人の個々のドナーからの肝細胞（上記に列記される３つのロット
に加えて、女性患者からのロットＴＬＹを含む）を使用して、５０個より多くのオフターゲット部位を、非処理の肝細胞と比べてＬＮＰ処理された肝細胞からの標的化されたＰＣＲアンプリコンの次世代シーケンシングを行うことにより評価した。これらの潜在的なオフターゲット部位のいずれにおいても編集は観察されず、またＰＣＳＫ９標的部位においてオンターゲット編集のみが観察された（図１３）。
Figure 2024038327000058
Figure 2024038327000059
Figure 2024038327000060
Figure 2024038327000061
Figure 2024038327000062
Figure 2024038327000063
Figure 2024038327000064
Figure 2024038327000065
Figure 2024038327000066
Figure 2024038327000067
Figure 2024038327000068
Figure 2024038327000069
Figure 2024038327000070
[00689]アデニン塩基エディターは、デオキシアデノシンデアミナーゼドメインを介し
てｇＲＮＡ非依存性ＲＮＡ編集を誘起することが報告されている。ｇＲＮＡ非依存性ＲＮＡ編集を評価するために、初代ヒト肝細胞をｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ（ｎ＝４の生物学的複製物）、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡ（ｎ＝４）で処理したか、または非処理とした（ｎ＝４）。ＲＮＡを２日後に抽出し、追加の詳細な方法のセクションに記載されるように処理した。ＡＢＥ８．８処理およびＳｐＣａｓ９処理された肝細胞のＲＮＡプロファイルを非処理の肝細胞と比較して、ＡＢＥ８．８処理された肝細胞において実質的なＲＮＡ編集は観察されなかった（図１４）。各々の複製物を４つの非処理の肝細胞試料の各々に対して比較して、両方の条件に共通する編集を伴う任意の位置を排除した。ジッタープロットは、処理された試料における編集を伴うトランスクリプトーム座位を描写する（数は、処理された試料において同定された編集された座位の総数を指し示し、ボックスプロットは、試料における全ての編集された座位にわたる編集されたリードの割合のメジアン±四分位数間範囲を指し示す）。
[00690]ｇＲＮＡのスペーサーまたはｔｒａｃｒ部分のいずれかに対する改変および／
または切断をＧＡ０６６スペーサー（５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３））の変更により評価した（表１２）。ガイドに対する改変は、オンターゲット編集効率を改善するためおよび／またはオフターゲット編集効率を改善するために役立ち得る。ｇＲＮＡの各々を、同等の量のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ（重量で１：１の比）と共に初代ヒト肝細胞および初代カニクイザル肝細胞に共トランスフェクトし、詳細な方法に記載されるように処理した。
Figure 2024038327000071
[691]ｉｎ ｖｉｖｏでヒト肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３をノックダウンする塩基編集
療法の安全性を確立することを目的として、オフターゲット突然変異誘発のためのヒトゲノム中の候補部位のリストを、２つの異なる方法を使用して集めた。第１の方法では、ヒトゲノムのバイオインフォマティクス分析を使用して、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（およびしたがってＡＢＥ ８．８）と適合性のＰＡＭ配列およびＧＡ１００スペーサー配列５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）と最大４つの単一ヌクレオチドミスマッチを有するプロトスペーサー配列を有する全ての部位を同定した。
[692]候補部位を生成するための第２の方法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学的アッセイ
、ＯＮＥ－ｓｅｑを使用し、ＡＢＥ８．８塩基エディタータンパク質およびｇＲＮＡ ＧＡ４４１を含むリボ核タンパク質の、ライブラリー中のオリゴヌクレオチドを切断する傾向を決定した。参照ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）を、ＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡ（５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４））により特定される
プロトスペーサー配列に対して最大６つのミスマッチを有する部位について検索し、Ｃａｓ－Ｄｅｓｉｇｎｅｒを使用して最大４つのミスマッチおよび最大２つのＤＮＡまたはＲＮＡバルジを有する部位を同定した。ＯＮＥ－ｓｅｑライブラリー調製、実験プロトコール、およびバイオインフォマティクス分析に関するさらなる詳細は、追加の詳細な方法のセクションにおいて記載されている。
[693]より高い配列カウントを有するオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣ
ａｓ９／ｇＲＮＡ切断のより高い傾向を反映し、細胞中でオフターゲット突然変異誘発を被る可能性が最も高い部位を表す。上位候補部位が表１３において同定されている。候補部位の検証を、編集されたＡＮＧＰＴＬ３、および非処理のヒト初代肝細胞を使用して行った。次世代シーケンシング（表１４）において、オンターゲット部位および候補オフターゲット部位にわたり、対照細胞における観察された塩基編集率を、ＬＮＰ処理された細胞における観察された塩基編集率から引いた場合に（次世代シーケンシングにおいて本来的なバックグラウンドシーケンシングエラーを説明するため）、認識可能な塩基編集がオンターゲットＡＮＧＰＴＬ３標的部位において観察された。
Figure 2024038327000072
Figure 2024038327000073
Figure 2024038327000074
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Figure 2024038327000090
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Figure 2024038327000092
[00694]ｇＲＮＡのスペーサーまたはｔｒａｃｒ部分のいずれかに対する改変および／
または切断をｇＲＮＡ ＧＡ１００スペーサー（５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１５））の変更により評価した（表１５）。ガイドに対する改変は、オンターゲット編集効率を改善するためおよび／またはオフターゲット編集効率を改善するために役立ち得る。追加的に、４つの異なるＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡを、２つの異なる実験（下記の表において分離されている）において評価した（ＭＡ００４、ＭＡ０４０、ＭＡ０４１、ＭＡ０４５；表２３）。ｇＲＮＡの各々を、同等の量のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ（重量で１：１の比）と共に初代ヒト肝細胞
および初代カニクイザル肝細胞に５０００、２５００、および１２５０ｎｇ／ＲＮＡ／ｍＬで共トランスフェクトし、記載されるように処理した。
Figure 2024038327000093
Figure 2024038327000094
[00695]５，０００ｎｇ／ＲＮＡ／ｍＬの最も高い用量での変更されたｇＲＮＡ／ｍＲ
ＮＡの組合せについてのオフターゲット分析を、オフターゲット編集を示す以前に同定された２つの部位について行った（表１６）。プロトスペーサーにわたる算出された編集パーセンテージを総計し、陰性対照の編集％を引いた。このデータは、ガイドおよび／またはＡＢＥ ｍＲＮＡに対する改変はオフターゲット編集効率を改善することを示す。
Figure 2024038327000095
[696]ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡと、ＰＣＳＫ９イントロン１の５’末端におけるスプラ
イスドナーを標的化するヒト／カニクイザル５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）配列にマッチするｇＲＮＡ（ＧＡ０６６）とを含有する脂質ナノ粒子を、重量で１：１の比で製剤化した。様々な希釈液を使用して、ＬＮＰを初代ヒト肝細胞および初代カニクイザル肝細胞に投与して、試験物品の異なる濃度での編集活性を評価した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび別の遺伝子、ＡＮＧＰＴＬ３中のプロトスペー
サー配列にマッチするｇＲＮＡを含有するＬＮＰを、陽性対照としてこれらの実験のために使用した。このＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡの組合せは、初代ヒト肝細胞、初代カニクイザル肝細胞、およびカニクイザル肝臓においてｉｎ ｖｉｖｏで高いレベルのゲノム編集活性を生成することが以前に観察されているため、選択した。ＡＢＥ８．８／ＧＡ０６６ ＬＮＰは編集に関して対照ＬＮＰを実質的に凌ぐことが観察され、ヒトおよびカニクイザルの両方の肝細胞においてはるかにより高い効力を示した（図１５）。
実施例５． マウスにおけるＰｃｓｋ９遺伝子編集
ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび異なるｔｒａｃｒ設計を有するマウスＰｃｓｋ９標的化ｇＲＮＡ（ＧＡ０５２、ＧＡ０５３、ＧＡ０５４、およびＧＡ０５５）を１：１の重量比で含有するＬＮＰを製剤化した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ試験物品を投薬した。投薬の７日後に、マウスを安楽死させ、ゲノムＤＮＡをマウス肝臓から採取し、次に標的部位の編集について次世代シーケンシングを用いて評価した。ＧＡ０５２、ＧＡ０５４、およびＧＡ０５５は全て、以前に開示されたｔｒａｃｒ設計を有するＧＡ０５３を凌いだ（図１６）。
実施例６． マウスにおけるＰｃｓｋ９塩基編集
[00697]ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびマウスＰｃｓｋ９標的化ｇＲＮＡを１：１の重
量比で含有するＬＮＰを製剤化した。このｇＲＮＡは５’－ＣＣＣＡＴＡＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＡＣＧＧ－３’（配列番号６９）プロトスペーサー配列とマッチし、該配列は、ＰＣＳＫ９イントロン１の５’末端におけるスプライスドナーを標的化するヒト５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）配列（ＧＡ０６６、ＧＡ０９５、ＧＡ０９６、ＧＡ０９７およびＧＡ３４６がマッチする）のマウスオルソログである。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ試験物品を側尾静脈または後眼窩を介して１０ｍｌ／ｋｇの総体積で投薬した。投薬の７日後に、マウスを安楽死させ、ゲノムＤＮＡをマウス肝臓から採取し、次に標的スプライス部位の塩基編集について次世代シーケンシングを用いて評価した。標的スプライス部位の約６０％の編集が観察され（マウスＰｃｓｋ９イントロン１スプライスドナー）（図１７）、ｉｎ ｖｉｖｏで肝臓におけるＰＣＳＫ９をノックダウンする塩基編集療法の概念の前臨床的証明が提供された。
[00698]その後の研究において、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびマウスＰｃｓｋ９標的
化ｇＲＮＡを１：１の重量比で含有するＬＮＰを製剤化し、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０～２．０ｍｇの総ＲＮＡ／ｋｇの範囲内の用量で投薬した。０．０５ｍｇのＲＮＡ／ｋｇの低用量は高い編集（＞４５％）を示したが、塩基編集の飽和が約０．２５ｍｇのＲＮＡ／ｋｇの用量で起こった（図１８）。
[00699]追加の研究において、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびマウスＰｃｓｋ９標的化
ｇＲＮＡを含有するＬＮＰを１：１～１：６および２：１～６：１の範囲内のｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの異なる重量比で製剤化した。このｇＲＮＡは５’－ＣＣＣＡＴＡＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＡＣＧＧ－３’（配列番号６９）プロトスペーサー配列とマッチし、該配列は、ＰＣＳＫ９イントロン１の５’末端におけるスプライスドナーを標的化するヒト５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）配列（ＧＡ０６６、ＧＡ０９５、ＧＡ０９６、ＧＡ０９７およびＧＡ３４６がマッチする）のマウスオルソログである。野生型マウスにＬＮＰを０．０５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で投薬した。追加的に、同じｍＲＮＡならびに５’－ＣＣＣＡＴＡＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＡＣＧＧ－３’（配列番号６９）プロトスペーサー配列とマッチするが安定性を改善するためのｔｒａｃｒに対する改変を有する２つのガイド、ＧＡ２５５およびＧＡ２５７を用いて構成された２つの個々のＬＮＰもまたマウスに注射した。投薬の７日後に、マウスを安楽死させ、ゲノムＤＮＡをマウス肝臓から採取し、次に標的スプライス部位の塩基編集について次世代
シーケンシングを用いて評価した（図１９）。塩基編集は多くの比の間で同等であり、１：６および６：１（ｇＲＮＡ：ｍＲＮＡ）の成績が最も低かった。ｔｒａｃｒに対する改変を有するガイドは、増加した編集効率を有した。
実施例７． マウスにおけるＡｎｇｐｔｌ３塩基編集
[00700]ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびマウスＡｎｇｐｔｌ３標的化ｇＲＮＡ（ＧＡ２
５８、ＧＡ２５９、ＧＡ２６０、ＧＡ３４９、ＧＡ３５３）を１：１の重量比で含有するＬＮＰを製剤化した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＬＮＰ試験物品を０．０５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で投薬した。マウスを後に安楽死させ、ゲノムＤＮＡをマウス肝臓から採取し、次に標的スプライス部位の塩基編集について次世代シーケンシングを用いて評価した（図２０）。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるｉｎ ｖｉｖｏ評価
実施例８． ＰＣＳＫ９／ＡＢＥの評価
[00701]最初に、ＬＮＰの投与を通じて特異的なｇＲＮＡおよび塩基エディターヌクレ
アーゼＡＢＥ ８．８を使用してカニクイザルにおいてＰＣＳＫ９遺伝子の編集を評価するために２週の研究を行った（図２１）。肝臓においてＰＣＳＫ９遺伝子の高レベルの塩基編集を生成することを意図して、ＡＢＥ８．８／ＧＡ０６６ ＬＮＰをカニクイザルに静脈内注入を介して２つの用量、３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３匹の動物）および１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２匹の動物）で投与した。試験物品の投与の２週後に、血液試料を臨床化学アッセイおよびＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡアッセイのために収集し、動物の検死を、肝臓の４つの葉の各々からの各々２つの試料の肝臓試料の収集物（各々の動物から計８つ）について行った。
[00702]肝臓検体の編集分析を次世代シーケンシングにより行った。３ｍｇ／ｋｇの用
量において、肝臓試料中の標的スプライス部位におけるアデニン塩基の平均で５５％の編集が観察され；１ｍｇ／ｋｇの用量において、肝臓試料中の標的スプライス部位におけるアデニン塩基の平均で２４％の編集が観察された（図２２）。ＰＣＳＫ９ ＥＬＩＳＡ分析のために、血液試料を動物から投薬前のＤ－１０、Ｄ－７およびＤ－５（平均を示す）の他に、投薬後Ｄ８およびＤ１５の日に収集した。投薬の２週後に、３ｍｇ／ｋｇの群において投薬前レベルと比較して血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベルにおける平均で７６％の低減（図２３）、および１ｍｇ／ｋｇの群において血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベルにおける平均で３２％の低減があった（表１７）。低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）を、投薬前ならびにＤ８およびＤ１５に採取された血清試料において標準的な臨床分析装置を使用して決定した（表１８）。３ｍｇ／ｋｇの群において血中低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルにおける平均で５７％の低減（図２４）、および１ｍｇ／ｋｇの群において血中ＬＤＬ－Ｃレベルにおける平均で２５％の低減があった。
Figure 2024038327000096
Figure 2024038327000097
[00703]その後の実験において、ＬＮＰをサルに静脈内注入を介して１．０ｍｇ／ｋｇ
の用量で送達した。ＬＮＰ注入の２週後に検死を行った３匹のサルについて、肝臓におけるＰＣＳＫ９スプライス部位アデニンの平均で６３％の塩基編集頻度があり、バイスタンダー塩基編集はプロトスペーサー中の他の場所において観察されず（図２５）；０．５％の平均インデル頻度であった。編集は、血中ＰＣＳＫ９レベルにおける平均で８１％の低減および血中ＬＤＬ－Ｃレベルにおける平均で６５％の低減を伴った。ＬＮＰ注入の２４時間後に検死を行った２匹のサルについて、平均で４８％の編集頻度であった。
[00704]その後の短期用量－応答研究（０．５、１．０、および１．５ｍｇ／ｋｇの用
量、各々３匹のサル、２週時の検死）において、全ての用量は＞５０％の平均塩基編集率を達成し；ＰＣＳＫ９編集ならびにＰＣＳＫ９タンパク質およびＬＤＬ－Ｃにおける低減は≧１．０ｍｇ／ｋｇの用量で飽和するようであった（図２６）。
[00705]これらの研究において、我々は肝臓機能試験を評価し、一部の群においてＡＳ
ＴおよびＡＬＴにおける中等度の上昇が認められ、これらは第１週の終わりまでに概ね消散し、ＬＮＰ注入の２週後までに完全に消散し、有害な健康事象は動物のいずれにおいても観察されなかった。多様な組織における塩基編集のアッセイにおいて、我々は、肝臓は編集の優勢な部位であることを見出し、はるかにより低い編集が脾臓および副腎において観察され、最小の編集が他の場所で観察された（図２７）。
Figure 2024038327000098
[00706]追加の研究において、異なるｔｒａｃｒ設計を評価した。他に特定されなけれ
ば、ＬＮＰをＮＨＰに静脈内注入を介して１．０ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で送達した。肝臓の塩基編集を評価したところ、いくつかのガイドは文献のｔｒａｃｒを有するＧＡ０６６を凌いだ（図２８）。
[707]同じＮＨＰ研究において、１）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよび５’－ＣＣＣＧＣＡＣ
ＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）（ＧＡ０９７）プロトスペーサー配列にマッチするｇＲＮＡ；または２）ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよび５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）（ＧＡ０９７）プロトスペーサー配列にマッチするｇＲＮＡのいずれかを含有するＬＮＰをＮＨＰに静脈内送達した。重要なことに、古典的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が最終的にインデルを導入することにより遺伝子を妨害する方法は、塩基突然変異が起こった塩基編集とは異なる。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集に高度に適する標的領域は、その位置において塩基編集が起こることを必ずしも意味せず、逆もまた同様である。これはＮＨＰ研究において強調され、該研究において、ＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡを含有するＬＮＰはＮＨＰにおいて低い肝臓編集（＜５％）をもたらし、ＡＢＥ８．８／ｇＲＮＡを含有するＬＮＰは、ＳｐＣａｓ９／ｇＲＮＡの用量（１．５ｍｇ／ｋｇ）より低い用量（１ｍｇ／ｋｇ）で４０％に近い有意により高い編集を有した（図２９）。
[00708]別の研究において、２つのＬＮＰを塩基編集活性について、０．５ｍｇ／ｋｇ
～３．０ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量での静脈内注入を介するＮＨＰにおける送達後に比較した。両方のＬＮＰは高い有効性を示し、第１のＬＮＰ（ＬＮＰ＃１）は第２のＬＮＰ（ＬＮＰ＃２）を凌ぎ、０．５ｍｇ／ｋｇもの低い用量において５０％より高い平均編集を
有した（図３０）。過去の実験と類似して、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルは、スプライス部位における高いレベルの塩基編集において有意に減少し、循環ＰＣＳＫ９タンパク質を８０～９０％減少させた（図３１）。
[00709]長期研究（４匹の動物、２週時の肝生検を用いる）において、ＬＮＰを静脈内
注入を介して３．０ｍｇ／ｋｇのより高い用量で導入して、ＰＣＳＫ９タンパク質の薬物忍容性および耐久性ならびにＰＣＳＫ９編集のもたらされるＬＤＬ－Ｃの低減を評価した。肝生検試料は平均で６６％の塩基編集頻度を示した（図３２）。血中ＰＣＳＫ９タンパク質レベルは１週までにトラフに達し、その後少なくとも６か月まで安定なままであり、約９０％の低減に落ち着いた（図３３）。血中ＬＤＬ－Ｃおよびリポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］レベルは、８か月まで持続する安定なトラフを同様に達成し、それぞれ約６０％および約３５％の低減に落ち着いた（図３４、図３５）。
[00710]ＡＳＴおよびＡＬＴにおける一過性の、中等度の上昇があり、それはＬＮＰ注
入の２週後までに完全に消散し（図３６）、いかなる他の肝臓機能試験における変化も、有害な健康事象も現在までに観察されなかった（図３７）。重要なことに、後のＡＳＴおよびＡＬＴの上昇がない８か月間のＰＣＳＫ９およびＬＤＬ－Ｃの低減の持続は、そのような応答は、そのスケールがどのようなものであれ、処置の有効性に不利に影響しないことを実証する。
[00711]初代カニクイザル肝細胞およびサル肝臓試料においてＡＢＥ８．８／ｇＲＮＡ
（ＧＡ３４６にマッチするプロトスペーサー）ＬＮＰ媒介性オフターゲット編集を評価するために、ｇＲＮＡスペーサー配列に対する相同性により選択される合成カニクイザルゲノムライブラリーを用いてＯＮＥ－ｓｅｑを行った。このライブラリーをＡＢＥ８．８タンパク質およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡで処理し、上位４８のＯＮＥ－ｓｅｑノミネート部位（図３８）（これらのうちＰＣＳＫ９標的部位は非常に上位の部位である）を、非処理のＮＨＰ試料と比べたＬＮＰ処理されたＮＨＰ試料からの標的化されたＰＣＲアンプリコンの次世代シーケンシングを用いて評価した（図３９）。
[00712]ＬＮＰ処理された初代カニクイザル肝細胞において、ＰＣＳＫ９標的部位にお
ける編集の他に、ヒトゲノムに対する乏しい相同性を有する、Ｃ５と呼称される１つの部位においてのみ著明なオフターゲット編集（平均＜１％）があった（図３９）。（上述の用量－応答研究からの）１．０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量で処置されたサルからの肝臓試料において同じ４８個の部位を評価したところ、Ｃ５部位においてのみ低レベルのオフターゲット編集（平均＜１％）（図４０）が観察された。０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量でオフターゲット編集は検出されず、１．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量で低レベルのオフターゲット編集（平均＜１％）のみが検出された。
実施例９． ＡＮＧＰＴＬ３／ＡＢＥの評価
[713]ＡＢＥ／ＰＣＳＫ９ガイドを用いて行ったＮＨＰ研究と類似して、肝臓において
ＡＮＧＰＴＬ３の高レベル塩基編集を生成することを意図して、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよび５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）（ＧＡ０６７）カニクイザルスペーサーを有するｇＲＮＡを用いて製剤化されたＬＮＰをカニクイザルに静脈内注入を介して２つの用量、３ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３匹の動物）および１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２匹の動物）で投与した。試験物品の投与の２週後に、血液試料を臨床化学アッセイおよびＡＮＧＰＴＬ３ ＥＬＩＳＡアッセイのために収集し、動物を肝臓試料の収集物について検死した。肝臓の各々の葉の中心および末梢からの小さいセグメントを切除し、液体窒素中でフラッシュ凍結させ、－８６～－６０℃で貯蔵した。スプライス部位の編集を次世代シーケンシングにより分析したところ、塩基変化が起こったことが確認された。最も高い用量（３ｍｇ／ｋｇ）において、アデニン塩基の平均で６１％の編集が肝
臓における標的スプライス部位において観察され；最も低い用量（１ｍｇ／ｋｇ）において、観察された編集は肝臓における標的スプライス部位において２８％であった（表１９）。
[714]追加的に、血液試料を投薬前、投薬後のＤ７およびＤ１５に収集して、血清ＡＮ
ＧＰＴＬ３、およびトリグリセリドを決定した。投薬の２週後に、より高い（３ｍｇ／ｋｇ）およびより低い（１ｍｇ／ｋｇ）投薬群において投薬前レベルと比較して血中ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルにおける平均で９０％および３１％の低減があった（表２０）。
Figure 2024038327000099
Figure 2024038327000100
[715]トリグリセリドを、投薬前ならびにＤ８およびＤ１５に採取された血清試料にお
いて標準的な臨床分析装置を使用して決定した。ＡＢＥ８．８およびＧＡ０６７を用いたＬＮＰ媒介性ＡＮＧＰＴＬ３塩基編集に応答した血清トリグリセリドの低減を表２１に要約している。トリグリセリドのレベルは、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇの塩基エディターＡＢＥ８．８およびＡＮＧＰＴＬ３を標的化するＧＡ０６７の用量に応答して２４％および５９％低減された。
Figure 2024038327000101
[716]別の独立した研究において、肝臓においてＡＮＧＰＴＬ３の高レベル塩基編集を
生成することを意図して、同じＡＢＥ８．８／ＧＡ０６７ ＬＮＰをカニクイザルに静脈内注入を介して３ｍｇ／ｋｇの用量で投与した（ｎ＝３匹の動物）。試験物品の投与の２週後に、血液試料を臨床化学アッセイのために収集し、動物の肝生検を肝臓試料の収集のために行った。３ｍｇ／ｋｇの用量において、標的スプライス部位におけるアデニン塩基の平均で６０％の編集が肝生検試料において達成された。これに一致して、投薬の２週後に、投薬前レベルと比較して血中ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルにおける平均で９５％の低減があり、血中トリグリセリドレベルにおける平均で６４％の低減があった（図４１）。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏで肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３をノックダウンし、ならびに血中ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質およびトリグリセリドレベルにおける低減をもたらす塩基編集療法の概念の追加の前臨床的証明を提供する。
実施例１０． 二重ＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３塩基編集の評価
[717]単一の試験物品を用いてＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３の同時の塩基編集に影
響することができるかどうかを評価するために、２：１：１の重量比で３つの構成要素：ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ、ＰＣＳＫ９標的化ｇＲＮＡ（ＧＡ０９５）、およびＡＮＧＰＴＬ３標的化ｇＲＮＡ（ＧＡ０９８）のミックスを含有するＬＮＰを製剤化した。初代ヒト肝細胞をＬＮＰの様々な希釈液とインキュベートした。インキュベーションの３日後に、ゲノムＤＮＡを肝細胞から採取し、次に標的スプライス部位の塩基編集について次世代シーケンシングを用いて評価した。最も高いＬＮＰ濃度において、ＰＣＳＫ９スプライス部位（イントロン１スプライスドナー）の約４０％の編集およびＡＮＧＰＴＬ３スプライス部位（イントロン６スプライスドナー）の約４０％の編集が観察され（図４２）、単一の試験物品でのヒト肝細胞における二重の遺伝子妨害の実現可能性が実証され、ヒトレシピエントにおいて血中ＬＤＬコレステロールレベルおよび血中トリグリセリドレベルの両方を実質的に低減させることが予測される、ＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３を同時にノックダウンする単一塩基編集療法の概念の前臨床的証明が提供された。このアプローチの利点は、標準的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９とは対照的に、塩基エディターは編集のために二本鎖切断（ＤＳＢ）を要求しないので、ゲノム中の２つの異なる部位の同時の標的化において本来的な染色体再編成または他の構造変化のリスクが実質的により低いことである。
[718]フォローアップＮＨＰ研究を行って：１）投与されたＬＮＰの投与された第２の
用量が標的遺伝子の編集を引き起こすことができるかどうか；２）異なる標的が塩基編集され得るかどうかに取り組んだ。ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ３４６）またはＡＮＧＰＴＬ３を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ３４７）のいずれを用いて製剤化されたＬＮＰを、カニクイザルに静脈内注入を介して０．５～２ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量で投与した。試験物品の投与の２週後に、生検を行って塩基編集を評価した。研究の開始から３０日後に、反対のＬＮＰを投与した。追加の２週後の第２の
生検後に、ｇＤＮＡを抽出し、次世代シーケンシングを使用して塩基編集を評価した。この研究からの発見は、ＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３標的の両方の高レベルの編集がＬＮＰの第１および第２の用量後に達成されることを示す（図４３）。血液試料を両方の生検時点において収集したところ、１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰでのその後の投薬後に循環ＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３における約９０％の有意な減少を示している（図４４）。同じ研究において、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ、ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６およびＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡ ＧＡ３４７を１：０．５：０．５の重量比でカプセル化したＬＮＰを２ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で投与したところ、堅牢な同調したＰＣＳＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子編集がもたらされた（図４４、ＧＡ３４６＋ＧＡ３４７（Ｄ１）と標識された上および下のデータ － 上および下パネルはＰＳＣＫ９およびＡＮＧＰＴＬ３の編集を示す）。データは、堅牢な複数遺伝子編集が、哺乳動物（および／または哺乳動物細胞）におけるＡＢＥ塩基エディターｍＲＮＡおよび２つまたはより多くの目的の遺伝子を標的化する２つまたはより多くのｇＲＮＡの単回の１用量投与で可能であることを実証する。図４４は、ＡＮＧＰＴＬ３（下）およびＰＣＳＫ９（上）タンパク質の対応するノックダウンを反映したものである。
[719]別の研究において、ＮＨＰにＬＮＰを繰り返し投薬した（図４５）。ＮＨＰに、
ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ０９７）を用いて製剤化されたＬＮＰ＃１およびＬＮＰ＃２を静脈内注入を介して０．５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で投薬した。ＮＨＰに追加のＬＮＰ用量を３０日目および６０日目に与えた。１４日目、４６日目、および７５日目からの肝生検をアデノシン塩基編集分析のために抽出した。全てのｇＤＮＡを抽出し、次世代シーケンシングを使用して塩基編集を評価した。これらの結果は、編集効率はＬＮＰの第１の用量の後に３０％近くであり、第３の用量のＬＮＰの後に５０％を上回ったため、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡおよびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含有するＬＮＰの繰り返し投薬は肝臓において付加的な塩基編集を引き起こすことを実証する。付加的な編集の規模はＬＮＰ依存的であることも観察された。
[720]さらに、ＬＮＰの繰り返し投薬はＮＨＰにおいてＰＣＳＫ９タンパク質レベルを
低減させた（図４６）。ＰＣＳＫ９タンパク質レベルを、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ０９７）を用いて製剤化されたＬＮＰを繰り返し投薬されたＮＨＰにおいて９０日にかけてモニターした。ＮＨＰに静脈内注入を介して０．５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で０、３０、および６０日目に投薬を行った（投薬を描写するために矢印がグラフ上に示される）。ＰＣＳＫ９タンパク質レベルの分析の説明のために、詳細な方法のセクションを参照。基礎レベルと比較して、ＰＣＳＫ９タンパク質はＬＮＰの初期用量後に４０％近く低下したが、追加用量でいっそうさらに減少した。
[721]肝臓マーカーをＬＮＰの繰り返し投薬後に評価した（図４７）。ＡＬＴ、ＡＳＴ
、総ビリルビン、およびクレアチンキナーゼレベルを７１日まで、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ０９７）を用いて製剤化されたＬＮＰを繰り返し投薬されたＮＨＰにおいて評価した。ＮＨＰに静脈内注入を介して０．５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で０、３０、および６０日目に投薬を行い、これはグラフ上にそれぞれＤ１、Ｄ２およびＤ３として示される。肝生検を１４および４６日目に行い、これはグラフ上にそれぞれＢ１およびＢ２として示される。グラフ上に記載されている複数の時点において血液を収集した。ＡＬＴおよびＡＳＴは投薬で最小に上昇したが、これは一過性の応答であり、数日の期間後に正常に戻った。同様に、クレアチンキナーゼレベルは投薬で増加し、最大の効果は第１の用量後に見られ、数日の期間後に基礎レベルに戻った。
[722]肝臓酵素、ＬＤＨ、ＧＬＤＨ、ＧＧＴ、およびＡＬＰを、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮ
Ａ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡ（ＧＡ０９７）を用いて製剤化されたＬＮＰを繰り返し投薬されたＮＨＰにおいて評価した（図４８）。ＮＨＰに静脈内注入を介して０．５ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量で０、３０、および６０日目に投薬を行った。グラフに記載されている複数の時点において血液を収集した。ＬＤＨおよびＧＬＤＨは投薬で上昇したが、これは一過性の応答であり、数日の期間後に正常に戻った。
[723]さらに、ＡＮＧＰＴＬ３の長期間アデニン塩基編集を非ヒト霊長類において評価
した（図４９）。カニクイザルにＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡ ＧＡ０６７を含むＬＮＰ製剤の３ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えた。特定される時点およびグラフにおいて血液を収集し、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル（図４９Ａ）およびトリグリセリドレベル（図４９Ｂ）を分析した。対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル（９６％の低減）およびトリグリセリドレベルの両方は遺伝子の塩基編集で実質的に減少し、１７０日より長きにわたり安定的に低減されたままである。
[724]サイトカイン活性化および免疫応答を、ＬＮＰを与えられたＮＨＰにおいて評価
した。研究の１つのセットにおいて、カニクイザルに、ＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を含むＬＮＰ製剤の０．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を３つの特定される時点（図５０Ａおよび図５０Ｂ）において与えた。特定される時点およびグラフにおいて血液を収集し、ＩＰ－１０およびＭＣＰ－１を分析した。これらの結果は、１）ＬＮＰを与えられたＮＨＰは、対照と比較して、サイトカイン活性化の証拠も免疫応答の証拠も有しないこと；および２）同じＬＮＰの繰り返し投薬はサイトカイン活性化も免疫応答も誘発しないことを実証した。
[725]追加の研究において、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、およびＳＣ５ｂ－９（それぞれ図
５０Ｃ、図５０Ｄ、および図５０Ｅ）を、ＭＡ００４およびＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡ ＧＡ３４６を用いて製剤化されたＬＮＰの１．０ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ用量の静脈内注入を与えられたＮＨＰから収集された血液から異なる時点において分析した。これは、対照と比較して、最小のサイトカイン／補体活性化を引き起こし、それは３３６時間まで／その前にベースラインに戻った。
実施例１１． ＳｐＣａ９媒介性オンターゲット編集効率の評価
非ヒト霊長類におけるＡＮＧＰＴＬ３またはＰＣＳＫ９の遺伝子編集を評価した。カニクイザルに、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００４およびＡＮＧＰＴＬ３（ＧＡ２６１～ＧＡ２６３）またはＰＣＳＫ９（ＧＡ２６６～ＧＡ２７１）のいずれかを標的化する１つのｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤の１．５ｍｇ／ｋｇの用量の静脈内注入を与えた。２週後の検死において、各々の肝葉から２つの小片（計８つの小片）を単離し、ｇＤＮＡを抽出した。詳細な方法のセクションに記載されるように試料を処理した。インデル％を各々の別々の小片について分析し、個々の点としてグラフ化している（図５１）。高い編集効率がほとんどのＮＨＰ肝臓において観察された。ＬＤＬ－Ｃレベルを測定した（図５２）。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰを与えられた全てのＮＨＰは、循環ＬＤＬ－Ｃレベルにおける少なくとも３５％の低減を有した。より控えめであったが、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡを含むＬＮＰは、循環ＬＤＬ－Ｃレベルにおける１０～２５％の低減を有した。追加的に、ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＡＮＧＰＴＬ３ ｇＲＮＡを含むＬＮＰを与えられたＮＨＰは、トリグリセリドレベルにおける約１０～５０％の低減を有した（図５３）。ＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ＰＣＳＫ９ ｇＲＮＡを含むＬＮＰを与えられたＮＨＰは、トリグリセリドレベルにおける有意な低減を示さなかった。
[726]カニクイザル初代肝細胞に２５００、１２５０、および６２５ｎｇ／試験物品／
ｍＬでＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００２およびｔｒａｃｒに対する改変を有するＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡをトランスフェクトした。詳細な方法のセクションに記載されるようにゲノムＤＮＡを処理し、シーケンシングし、分析した。ＧＡ２６６を独立して２回トランスフェクトして、２つの陽性対照とした。ほぼ全てのトランスフェクションは、陽性対照と比較して高い編集効率をもたらし、ＧＡ４０５はわずかにより低い編集効率を有した。
Figure 2024038327000102
[00727]ｇＲＮＡに対するＰＡＣＥ改変は、オフターゲット編集効率を低減させること
が以前に実証されている。ヒト初代肝細胞に２５００、１２５０、５００、および２５０ｎｇ／試験物品／ｍＬでＳｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＭＳ００２およびｔｒａｃｒに対する改変を有するＰＣＳＫ９を標的化するｇＲＮＡをトランスフェクトした。詳細な方法のセクションに記載されるようにゲノムＤＮＡを処理し、シーケンシングし、分析した。ＧＡ１５６をトランスフェクトして陽性対照とした。ＧＡ２４８およびＧＡ２４９は、オフターゲット編集効率を減少させることが以前に実証されているｇＲＮＡに対するＰＡＣＥ改変を含有する。実際に、ＧＡ２４８およびＧＡ２４９は、非改変ｇＲＮＡ、ＧＡ１５６と比較してより低いオンターゲット編集を有したが（図５４Ａ）、ＧＡ２４８およびＧＡ２４９は、同定されたオフターゲット部位においてオフターゲット編集の減少を示した（図５４Ｂ）。
[00728]ＡＢＥ ｍＲＮＡ配列（ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、およびＭＡ０
２１）をそれらのＧＣ含量について評価した（図５５Ａ）。一般に、ＭＡ００４配列は、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、ＭＡ０２１、およびＡＢＥ８．８ｍ配列よりも高いＧＣ含量を有する。配列ＭＡ００４中のＧＣレベルはまた、ＡＢＥ配列の全体を通じたある特定の領域、例えばＴａｄＡドメイン、Ｎ末端リンカー、およびＣ末端リンカーの他に、様々なサブ領域において上昇（６０％より高い）している。全ての配列について、６０％より低いＧＣレベルを灰色で影付きにして、上昇したＧＣ領域との対比を提供している。ＧＣ含量は、ｍＲＮＡ配列全体にわたり所与の２５ヌクレオチドストレッチ内のＧおよびＣの相対量を決定することにより算出され、すなわちあらゆる２５ヌクレオチドについて、ＧおよびＣの合計がヌクレオチドの総数により除算される。この比較は、ｍＲＮＡ ＭＡ００４配列は、他のｍＲＮＡ配列と比べてＧおよびＣヌクレオチドの別個の分布および富化を有
することを示す。
[00729]配列ＭＡ００４の領域特異的なＧＣ特徴付けがさらに図示されている（図５５
）。各々の行中のグラフは、全体ＡＢＥコード配列（４，７６７ｎｔ）を構成するあらゆる１，０００ヌクレオチドストレッチ中のＧＣ含量を示す。ＧＣ含量は、ＴａｄＡ領域およびＮ末端リンカーを含む配列の５’末端において特に高い。ＧＣ含量はまた、Ｃａｓ９ニッカーゼの様々な部分およびＡＢＥ配列の３’末端において高く；そこでは高いＧＣ％はＮＬＳの代わりにリンカー領域に集まっている。高いＧＣ含量を有するサブ領域は、ＧＣが６０％の閾値レベルに達する場所により区画化される。各々のサブ領域中のＧＣ含量は、ＧおよびＣヌクレオチドの数を各々のサブ領域のヌクレオチドの総数で除算したものを決定することにより算出される。
Figure 2024038327000103
[00730]これらのｍＲＮＡ構築物の編集効率をマウスにおいて評価した（図５５Ｂ）。
これらのｍＲＮＡ、ＭＡ００４、ＭＡ０１９、ＭＡ０２０、およびＭＡ０２１は、同じＡＢＥタンパク質配列をコードするが異なるヌクレオチド配列最適化を有する。これらの群の間の唯一の差異はｍＲＮＡ配列であり；ｍＲＮＡは同じ塩基改変を有し、各々の群は同じＬＮＰ製剤およびｇＲＮＡを使用した。各々の群をマウスの静脈内に投与し、０．０５ｍｇ／ｋｇの低用量をこの研究において使用して、有効性差異を解消するために肝臓編集の飽和未満レベルを達成した。投薬後５日目に、ｇＤＮＡを単離し、塩基編集を次世代シーケンシングにより評価した。これらの結果は、ｍＲＮＡ配列の変化はｉｎ ｖｉｖｏでアデノシン塩基編集性能に影響し得ることを実証する。
記載される方法の追加の詳細
[731]初代肝細胞のプレーティング、培養、およびトランスフェクション。ＢｉｏＩＶ
Ｔからの初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）および初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）を製造業者のプロトコールの通りに培養した。簡潔に述べれば、初代ヒト肝細胞および初代カニクイザル肝細胞を、凍結されたアリコートとしてＢｉｏＩＶＴから得た。同定されない個々のドナーに各々が由来する、初代ヒト肝細胞の４つのロットを実験のために使用した：ＳＴＬ（主なドナー）を、スクリーニング実験およびオフターゲット実験を含む、全ての実験のために使用し；ＨＬＹ、ＪＬＰ、およびＴＬＹをオフターゲット実験のために使用した。初代カニクイザル肝細胞のＨＦＧロットを実験のために使用した。製造業者の使用説明書に従って、細胞を解凍し、リンスした後に、ウシコラーゲンを終夜被覆した２４ウェルプレートに、約３５０，０００細胞／ウェルの密度でＴＯＲＰＥＤＯ抗生物質ミックスを補充したＩＮＶＩＴＲＯＧＲＯ肝細胞培地（ＢｉｏＩＶＴ）中にプレーティングした。細胞を解凍し、肝細胞解凍培地に再懸濁し、続いて１００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化された細胞を肝細胞プレーティング培地に再懸濁した。各々のバイアルは約５００万個の細胞を含有し、それを１つの２４ウェルプレートへのプレーティングのために使用した。プレーティングされた細胞を組織培養インキュベーター中３７℃で５％のＣＯ２雰囲気下で４～６ｈ静置して接着させた。インキュベーション後に、細胞を単層形成についてチェックした。インキュベーション培地を次に新鮮な肝細胞維持培地（細胞系提供者、ＢｉｏＩＶＴから得られた完全ＩＮＶＩＴＲＯＧＲＯ培地）で置き換えた。細胞はそのため、トランスフェクションのために準備ができた。ｇＲＮＡの各々を、同等の量のｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ（分子量で１：１の比）と共に初代ヒト肝細胞にＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を介して、様々な希釈液を使用して共トランスフェクトして、試験物品の異なる濃度での編集活性を評価した。Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒからのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸをトランスフェクションのために使用する。溶液Ａ：所望される量のガイドＲＮＡを１：１の重量比のｍＲＮＡとＯｐｔｉＭＥＭ中で混合する。溶液Ｂ：ＯｐｔｉＭＥＭ中のＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ。溶液ＡおよびＢを混合した後に、混合物を室温で２０分間インキュベートした。６０μＬのインキュベートされた溶液を滴下で各々の細胞ウェルに加えた。対応するカニクイザルサルＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子配列に完璧にマッチしたプロトスペーサー配列について、各々のｇＲＮＡをまた、同等の量のＡＢＥ８．８ ｍＲＮＡ（分子量で１：１の比）と共に初代カニクイザル肝細胞に共トランスフェクトし、同じトランスフェクションプロトコールに従った。細胞を次に３７℃で３日間そのままにした。細胞を採取し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ、またはＱｉａｇｅｎ
ＤＮＥａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔのいずれかを製造業者の使用説明書の通りに使用してゲノムＤＮＡ抽出のために調製した。
[732]バイオインフォマティクス分析。標的化されたアンプリコンシーケンシングデー
タを、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ ｖ２．０．３１を用いてバッチモードで分析した（ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏＢａｔｃｈ）。Ｃａｓ９実験のために、以下のパラメーターを設定した
：「－－ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ＿ｗｉｎｄｏｗ＿ｃｅｎｔｅｒ －３ －－ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ＿ｗｉｎｄｏｗ＿ｓｉｚｅ ５ －－ｍｉｎ＿ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ＿ａｌｌｅｌｅｓ＿ａｒｏｕｎｄ＿ｃｕｔ＿ｔｏ＿ｐｌｏｔ ０．１ －－ｍａｘ＿ｒｏｗｓ＿ａｌｌｅｌｅｓ＿ａｒｏｕｎｄ＿ｃｕｔ＿ｔｏ＿ｐｌｏｔ １００」。ＡＢＥ実験のために、以下のパラメーターを設定した：「－－ｄｅｆａｕｌｔ＿ｍｉｎ＿ａｌｎ＿ｓｃｏｒｅ ９５ －－ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ＿ｗｉｎｄｏｗ＿ｃｅｎｔｅｒ
－１０ －－ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ＿ｗｉｎｄｏｗ＿ｓｉｚｅ １０ －－ｂａｓｅ＿ｅｄｉｔｏｒ＿ｏｕｔｐｕｔ －－ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ＿ｎｕｃ＿ｆｒｏｍ Ａ －－ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ＿ｎｕｃ＿ｔｏ Ｇ －－ｍｉｎ＿ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ＿ａｌｌｅｌｅｓ＿ａｒｏｕｎｄ＿ｃｕｔ＿ｔｏ＿ｐｌｏｔ ０．１ －－ｍａｘ＿ｒｏｗｓ＿ａｌｌｅｌｅｓ＿ａｒｏｕｎｄ＿ｃｕｔ＿ｔｏ＿ｐｌｏｔ １００」。ＮＨＰ実験のために、追加のパラメーターを設定して、低品質リードを除外した：「－－ｍｉｎ＿ｓｉｎｇｌｅ＿ｂｐ＿ｑｕａｌｉｔｙ ３０」。さらに、全ての場合において、パラメーター「－－ｍａｘ＿ｐａｉｒｅｄ＿ｅｎｄ＿ｒｅａｄｓ＿ｏｖｅｒｌａｐ」をＦＬＡＳＨの推奨（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｂ．ｊｈｕ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＦＬＡＳＨ／）に従って２Ｒ－Ｆ＋０．２５＊Ｆ（ここで、Ｒはリードの長さであり、Ｆはアンプリコンの長さである）に設定した。
[733]編集を「Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ＿ｗｉｎｄｏｗ＿ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
＿ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ＿ｔａｂｌｅ．ｔｘｔ」出力表から、主な編集された位置（プロトスペーサーＤＮＡ配列の６位）において任意のＡ→Ｇ／Ｃ／Ｔ置換をサポートするリードのパーセンテージとして定量化した。インデルを「Ａｌｌｅｌｅｓ＿ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ＿ｔａｂｌｅ＿ａｒｏｕｎｄ＿ｓｇＲＮＡ＿＊．ｔｘｔ」出力表から、３０ｂｐより大きい欠失をサポートするリードを除外して、ニック部位（ＰＡＭ配列の上流－３の位置）のいずれかの側における５ｂｐウィンドウにかけての挿入または欠失をサポートするリードのパーセンテージとして定量化した。候補オフターゲット部位について、編集を「Ａｌｌｅｌｅｓ＿ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ＿ｔａｂｌｅ＿ａｒｏｕｎｄ＿ｓｇＲＮＡ＿＊．ｔｘｔ」出力表から、３０ｂｐより大きい欠失を有するアレルからのリードを除外して、編集ウィンドウ（プロトスペーサーのＰＡＭ遠位側の１～１０位）中のＡ－＞Ｇ置換を有するアレルからのリードのパーセンテージとして定量化した。
[00734]逆転写。収集された細胞をｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥ
Ｎ）で製造業者の使用説明書に従って処理して、大きいＲＮＡ種および小さいＲＮＡ種の両方を単離し、他の部分をゲノムＤＮＡのために採取して、ＰＣＳＫ９編集を確立し、それにより細胞中の塩基エディター活性を確認した。逆転写をｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ試薬を使用して製造業者の使用説明書に従って行い、４つの異なるプライマーペアを、イントロン１の任意の部分のありまたはなしで、エクソン１およびエクソン２にわたる転写物のＰＣＲ増幅のために使用した。上記のように、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍを使用して生成された２５０ｂｐの長さのペアードエンドリードを、ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ０．３９をパラメーター「ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ：ＮｅｘｔｅｒａＰＥ－ＰＥ．ｆａ：２：３０：１０：１：ｔｒｕｅ ＬＥＡＤＩＮＧ：３ ＴＲＡＩＬＩＮＧ：３ ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：４：１５ ＭＩＮＬＥＮ：３６」で使用してアダプターについてトリミングした。リードを次にＦＬＡＳＨ ｖ１．２．１１３４でマージし、Ｂｏｗｔｉｅ２ ｖ２．４．１をパラメーター「－－ｌｏｃａｌ －－ｖｅｒｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ－ｌｏｃａｌ
－ｋ １ －－ｎｐ ０」と共に用いてＰＣＳＫ９遺伝子ボディに対してアライメントした。遺伝子アノテーションをＥｎｓｅｍｂｌ ｖ９８（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｒｅｌｅａｓｅ－９８／ｇｔｆ／ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｈ３８．９８．ｇｔｆ．ｇｚ）から得た。アライメントをｓａｍｔｏｏｌｓ ｖ１．１０でフィルタリングし、ＢＥＤフォーマットにｂｅｄｔ
ｏｏｌｓ ｖ２．２５．０のｂａｍｔｏｂｅｄ機能で変換した。試料当たり最小１０００個のマッピングされたリードが要求され、マッピングされたリードの末端位置を集計した。少なくとも１つの処理された試料中の最小１０個のリードによりサポートされるＰＣＳＫ９イントロン１の全体を通じた位置を報告する。
[00735]候補オフターゲット部位を予測するためのＯＮＥ－ｓｅｑ分析。ＯＮＥ－ｓｅ
ｑライブラリーの設計は、オンターゲットに対して配列相同性を有する参照ゲノム中の部位のコンピュータによる同定と共に開始される。ヒトＯＮＥ－ｓｅｑライブラリーについて、参照ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８、Ｅｎｓｅｍｂｌ ｖ９８、染色体ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｒｅｌｅａｓｅ－９８／ｆａｓｔａ／ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ／ｄｎａ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｈ３８．ｄｎａ．ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．｛１－２２，Ｘ，Ｙ，ＭＴ｝．ｆａおよびｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｒｅｌｅａｓｅ－９８／ｆａｓｔａ／ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ／ｄｎａ／Ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ．ＧＲＣｈ３８．ｄｎａ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ．ｆａ）を、Ｃａｓ－Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｖ１．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ－ｄｅｓｉｇｎｅｒ／）を使用して、上記のプロトスペーサー配列に対して最大６つのミスマッチを有する潜在的なオフターゲット部位、および最大４つのミスマッチと最大２つのＤＮＡまたはＲＮＡバルジとを有する部位についてサーチした。
[00736]カニクイザルに関するＯＮＥ－ｓｅｑライブラリーについて、参照カニクイザ
ルゲノム（ｍａｃＦａｓ５、Ｅｎｓｅｍｂｌ ９８、染色体ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｒｅｌｅａｓｅ－９８／ｆａｓｔａ／ｍａｃａｃａ＿ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ／ｄｎａ／Ｍａｃａｃａ＿ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ．Ｍａｃａｃａ＿ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ＿５．０．ｄｎａ．ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．｛１－２０，Ｘ，ＭＴ｝．ｆａ．ｇｚおよびｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｒｅｌｅａｓｅ－９８／ｆａｓｔａ／ｍａｃａｃａ＿ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ／ｄｎａ／Ｍａｃａｃａ＿ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ．Ｍａｃａｃａ＿ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ＿５．０．ｄｎａ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ．ｆａ．ｇｚ）を、類似したパラメーターを使用してサーチした。
[00737]最大６つのミスマッチを有し、バルジを有しない部位は、Ｘ＜ミスマッチの数
＞＜バルジの数＞コードを使用して参照される。そのため、オンターゲット部位はＸ００として標識され；オンターゲットに対する１つのミスマッチを有し、バルジを有しない部位はＸ１０として標識される、などである。ＤＮＡバルジを有する部位は、類似した命名法、ＤＮＡ＜ミスマッチの数＞＜バルジの数＞を用いて参照される。そのため、オンターゲットに対する４つのミスマッチおよび２つのＤＮＡバルジを有する部位はＤＮＡ４２として標識される。同じ命名法がＲＮＡバルジのために使用されるが、これらはＲＮＡ＜ミスマッチの数＞＜バルジの数＞としてコードされる。
[00738]同定されたプロトスペーサー配列を、それぞれの参照ゲノムから隣接配列と共
に両側に１０ヌクレオチド（ｎｔ）拡張した（これらの領域は本明細書においてゲノムの文脈として参照される）。これらの拡張された配列を次に、異なるヌクレオチド組成および配列長さの６つの予め定義された定常領域；中心プロトスペーサー配列の各々の側に１つの、２コピーの１４ｎｔ部位特異的バーコード；ならびに中心プロトスペーサー配列の各々の側に１つの、２つの別個の１１ｎｔユニーク分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ；ＵＭＩ）を含む、約２００ｎｔの最終長さまで追加の配列によりパディング（嵩上げ）した。ＵＭＩは、ＰＣＲ増幅からのバイアスを訂正するために使用され、バーコードは、分析の間の各々の部位の明瞭な同定を可能とする。バーコードは、配列中にＣＣもＧＧも含有しない６６８，４２０個のバーコードの初期リス
トから選択され、各々のバーコードは、任意の他のバーコードから２のハミング距離を有する。特注のＰｙｔｈｏｎスクリプトを最終ライブラリーの設計のために使用した。
[00739]最終オリゴヌクレオチドライブラリーは商用ベンダー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成される。各々のライブラリーをＰＣＲ増幅し、１．２５×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）に供する。２５℃で１０分間のＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中でのインキュベーション後に、７６９ｎＭの組換えＡＢＥ８．８－ｍタンパク質および１．５４μＭのｇＲＮＡを含むＲＮＰを１００ｎｇの精製されたライブラリーと混合し、３７℃で８時間インキュベートする。ＲＮＰ用量は、過飽和用量である、すなわち生化学的アッセイにおいてオンターゲット編集の最大量を達成する用量を上回ることを報告する分析に由来する。
[00740]Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加
えて反応を３７℃で４５分間クエンチし、続いて２×ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製を行う。反応物を次に、ＥｎｄｏＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と３７℃で３０分間、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と３７℃で３０分間、およびＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ Ｅｎｄ Ｐｒｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と２０℃で３０分間、続いて６５℃で３０分間、各々のインキュベーション後の２× ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製と共に段階的にインキュベートする。反応物に、アニーリングされたアダプターオリゴヌクレオチドデュプレックスを２０℃で１時間ライゲートして、切断されたライブラリー生成物のＰＣＲ増幅を促し、続いて２× ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ精製を行う。ライゲートされた反応物のサイズ選択をＰｉｐｐｉｎＨＴ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で行って、３％のアガロースゲルカセット上で１５０～２００ｂｐのＤＮＡを単離し、続いて２ラウンドのＰＣＲ増幅を行ってバーコード化されたライブラリーを生成し、それを上記のようにＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ上でペアードエンドシーケンシングする。
[00741]２つの切断生成物がＯＮＥ－ｓｅｑ実験において得られる。ＰＲＯＴＯ側は切
断位置の上流のオリゴヌクレオチドの部分を含む一方、ＰＡＭ側は切断位置の下流のオリゴヌクレオチドの部分を含む。ＡＢＥ実験において、ＰＲＯＴＯ側のみが編集活性（Ａ→Ｇ置換）の情報を与え；したがって、この側のみをシーケンシングする。
[00742]ペアードエンドリードをシーケンシングアダプターのためにｔｒｉｍｍｏｍａ
ｔｉｃ ｖ０．３９（Ｂｏｌｇｅｒら，２０１４）を使用し、特注のＮｅｘｔｅｒａアダプター（ＰｒｅｆｉｘＰＥ／１：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ；ＰｒｅｆｉｘＰＥ／２：ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ；ファイル中に特定されている）およびパラメーター「ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ：ＮＥＢ＿ｃｕｓｔｏｍ．ｆａ：２：３０：１０：１：ｔｒｕｅ
ＬＥＡＤＩＮＧ：０ ＴＲＡＩＬＩＮＧ：０ ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：４：３０
ＭＩＮＬＥＮ：３６」を用いてトリミングした。より低いシーケンシング品質を有する実験（ＶＯＬ０１４）のために、これらのパラメーターを「ＩＬＬＵＭＩＮＡＣＬＩＰ ＮＥＢ＿ｃｕｓｔｏｍ．ｆａ：２：３０：１０：１：ｔｒｕｅ ＬＥＡＤＩＮＧ：２ ＴＲＡＩＬＩＮＧ：０ ＳＬＩＤＩＮＧＷＩＮＤＯＷ：３０：３０ ＭＩＮＬＥＮ：３６」に設定した。リードを次に、ＦＬＡＳＨ ｖ１．２．１１（ＭａｇｏｃおよびＳａｌｚｂｅｒｇ，２０１１）を使用し、パラメーター「－－ｍａｘ－ｍｉｓｍａｔｃｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ＝０．２５ －－ｍａｘ－ｏｖｅｒｌａｐ＝１６０」を用いてマージした。マージされたリードを、一定の配列、各々の部位に独特のバーコードおよびプロトスペーサー配列についてスキャンし、編集ウィンドウ（プロトスペーサーの１～１０の最もＰＡＭ遠位
の位置として定義される）中のＡ→Ｇ置換の証拠を有するものに対してフィルタリングした。重複したリードを廃棄した。
[00743]各々の部位について、編集されたリードの総数を、オンターゲット部位に割り
当てられた編集されたリードの総数に対して正規化し、この比は部位についてのＯＮＥ－ｓｅｑスコアを定義する。部位をＯＮＥ－ｓｅｑスコアにより順位付けし、０．００１に等しいかまたはそれより高いスコアを有するものを検証のために選択した。これは、オンターゲット部位の編集と比較して生化学的アッセイにおいて１０００倍まで低い編集活性を有する部位に対するスポンサーフォローアップを含意する。この閾値は、細胞において、１００％のオンターゲット編集がある場合、１／１０００倍低い編集活性は＜０．１％のオフターゲット編集に翻訳され、これはＮＧＳによる編集の検出下限を下回るという前提に基づく。
[00744]ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔパネルを設計し、Ａｇｉｌｅｎ
ｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。３０より低い品質を有する未加工ＦＡＳＴＱファイル中の塩基を、ｓｅｑｔｋ ｖ１．３－ｒ１０６（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｈ３／ｓｅｑｔｋ）を使用してＮにマスクした。ＡｇｉｌｅｎｔのＡＧｅＮＴ ｖ２．０．５ツール中の「Ｔｒｉｍｍｅｒ」スクリプトを使用してアダプターをトリミングした。ＢＷＡ ＭＥＭ ｖ ０．７．１７－ｒ１１８８を使用し、パラメーター「－Ｃ」を用いてリードをＧＲＣｈ３８参照ヒトゲノム（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／ＧＣＡ／０００／００１／４０５／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５＿ＧＲＣｈ３８／ｓｅｑｓ＿ｆｏｒ＿ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＿ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ．ｕｃｓｃ＿ｉｄｓ／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５＿ＧＲＣｈ３８＿ｎｏ＿ａｌｔ＿ａｎａｌｙｓｉｓ＿ｓｅｔ．ｆｎａ）に対してアライメントした。ＡｇｉｌｅｎｔのＡＧｅＮＴ ｖ２．０．５ツール中の「ＬｏｃａｔＩｔ」スクリプトを使用し、パラメーター「－ｉ －Ｒ －ＩＢ －ＯＢ －Ｕ －ｌ ＜ Ｃｏｖｅｒｅｄ．ｂｅｄ ＞」を用いて、アライメントされたリードを処理し、重複を除去した。ｐｅｒｂａｓｅ ｖ０．６．３（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｓｔａｄｉｃｋ／ｐｅｒｂａｓｅ）を使用し、パラメーター「ｂａｓｅ－ｄｅｐｔｈ －Ｆ ３８４８」を用いて編集ウィンドウ（プロトスペーサーのＰＡＭ遠位側の１～１０位）中の各々の位置におけるヌクレオチド分布を決定した。編集ウィンドウ中のＡ→Ｇ置換をサポートするリードのパーセンテージを合計することにより編集を定量化した。
[00745]ガイド非依存性オフターゲット分析のためのＲＮＡ－ｓｅｑ。ＲＮＡ試料を処
理し、ＧＥＮＥＷＩＺによりシーケンシングした；ｒＲＮＡ枯渇後に、ライブラリーを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑシステム上で約５０００万リード／試料で２×１５０ｂｐペアードエンドシーケンシングを行った。ＧＡＴＫ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓを使用して全ての試料のためのＲＮＡ－ｓｅｑバリアントコーリングを実行した。簡潔には、リードを、ＳＴＡＲを使用してＧＲＣｈ３８参照ゲノム（ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ａｌｌ／ＧＣＡ／０００／００１／４０５／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５＿ＧＲＣｈ３８／ｓｅｑｓ＿ｆｏｒ＿ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＿ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ．ｕｃｓｃ＿ｉｄｓ／ＧＣＡ＿０００００１４０５．１５＿ＧＲＣｈ３８＿ｎｏ＿ａｌｔ＿ａｎａｌｙｓｉｓ＿ｓｅｔ．ｆｎａ．ｇｚ）に対してｇｅｎｃｏｄｅ ｖ３４（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｇｅｎｃｏｄｅ／Ｇｅｎｃｏｄｅ＿ｈｕｍａｎ／ｒｅｌｅａｓｅ＿３４／ｇｅｎｃｏｄｅ．ｖ３４．ｐｒｉｍａｒｙ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ．ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｇｔｆ．ｇｚ）を用いてアライメントした。ＧＡＴＫ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓを使用してＰＣＲの重複を除去し、続いてＧＡＴＫ ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを使用してバリアントを同定した。バリアントを次に、ＱＤ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｐｔｈ）＜２．０およびＦＳ（Ｆｉｓｈｅｒ ｓｔｒａｎｄ；鎖バイアスの証拠）＞３０を有するものを
除外することによりフィルタリングした。全てのＧＡＴＫ分析は、ｇａｔｋ４ ｖ４．１．８．１を用いて行った。
[00746]上記の通りに得られたバリアントを、以下のように非処理の対照試料との比較
によりさらにフィルタリングした。（１）ｐｅｒｂａｓｅ ｖ０．５．１（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｓｓｔａｄｉｃｋ／ｐｅｒｂａｓｅ）を使用した各々の非処理の対照試料および各々の処理された試料の処理された細胞における各々の同定されたバリアントにおけるヌクレオチド分布。（２）処理された条件および非処理の条件の両方において少なくとも２０個のリードによりカバーされる全てのバリアントについて、ＲＮＡ編集は、全ての非処理の対照試料においてリードの少なくとも９５％における参照対立遺伝子（ＡまたはＴ）および処理された試料において少なくとも１つのリードにおける交代的な対立遺伝子（ＧまたはＣ）を有するものとして同定した。上記のステップは、ＡＢＥ８．８で処理された試料およびＳｐＣａｓ９で処理された試料の各々を用いて実行した。
[747]ガイドＲＮＡの合成。表１に示されるガイドＲＮＡは、制御されたポアのガラス
支持体ならびに商業的に入手可能なホスホロアミダイトモノマーおよびオリゴヌクレオチド合成試薬を使用して固相オリゴヌクレオチド合成および脱保護条件下で合成した／合成する（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９３， ２０， ８１～１１４頁； ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０１５， １０， １１８１～１１８７頁；参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ガイドＲＮＡのスペーサーセクションを、５’末端からの最初の１～３ヌクレオチドを除いて対応するリボヌクレオチドに変換した。表１に概説されるように、５’末端からの最初の１～３ヌクレオチドを、対応する２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドに変換した。脱保護されたガイドＲＮＡをＨＰＬＣにより精製し、各々のガイドＲＮＡの完全性を質量分析により確認した。各々のガイドＲＮＡの観察された質量を、算出された質量に適合させた。
[748]ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの製造。本明細書に記載される
ｍＲＮＡは、当該技術分野において周知の異なる方法により製造される。そのような方法の１つは、Ｔ７ポリメラーゼまたは追加のＲＮＡポリメラーゼバリアントを使用するｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）である。典型的には、ｍＲＮＡのＩＶＴは、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターおよび関連付けられる調節配列、ｍＲＮＡコード配列（ＣＤＳ）、３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ポリＡテイル、ならびにｍＲＮＡ安定性およびｉｎ ｖｉｖｏ性能を増強するための追加の配列エレメントを含む直線化されたＤＮＡ鋳型を使用する。ＩＶＴの前に、ＤＮＡ鋳型は、プラスミド、ＰＣＲ生成物、合成ＤＮＡ生成物、または任意の他の二本鎖ＤＮＡ構築物の形態であり；典型的には制限消化酵素を用いる、ＤＮＡ鋳型の直鎖化を行って、ランオフ転写を促進する。典型的なＩＶＴ反応は、Ｔ７ポリメラーゼ、ＤＮＡ鋳型、ＲＮａｓｅ阻害剤、ｃａｐアナログ、無機ピロホスファターゼ、ならびに天然に存在するリボヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、例えばＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、または改変されたＮＴＰ、例えばシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５’メチルシチジン、５－メトキシウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、およびＮ４－アセチルシチジンでの天然ＮＴＰの置換を含む。ｃａｐアナログは、転写の間に添加するか、またはキャッピング酵素を使用してＩＶＴ反応後に補充することができ；両方の事例において２’－Ｏ－メチル基、または追加の２’化学的改変が最初の出発ヌクレオチドに付加されてｍＲＮＡのｃａｐ－１形態が生成される。一部の事例において、ポリＡテイルは、ＲＮＡリガーゼ酵素を使用してＩＶＴ反応後にｍＲＮＡに付加される。ＩＶＴ後に、一部の場合において、ＤＮａｓｅを転写混合物に加えてＤＮＡ鋳型を除去し；代替的に、残留ＤＮＡはクロマトグラフィー、沈殿、またはタンジェンシャルフロー濾過で除去される。ｍＲＮＡの精製および濃縮は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、沈殿、イオンペアリング逆相クロマトグラフィー、水素結合クロマトグラフィー、セルロースクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、酵素反応、サ
イズ排除クロマトグラフィー、およびタンジェンシャルフロー濾過などの方法で行われる。類似したＩＶＴおよび精製プロセスが、ルシフェラーゼ、ｅＧＦＰ、ＳｐＣａｓ９、Ｃａｓ１２ｂ、ＣＢＥ、およびＡＢＥをコードするｍＲＮＡを生成するために使用され；全ての場合においてＤＮＡ鋳型、反応条件、および精製パラメーターは、目的の特有の遺伝子のために最適化される。
[749]脂質ナノ粒子の製剤化および分析。使用されたＬＮＰは、以前に記載されたよう
に製剤化し（Ｃｏｎｗａｙ， Ａ．ら ２０１９ Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２７， ８６６～８７７頁； Ｖｉｌｌｉｇｅｒ， Ｌ．ら ２０２１ Ｎａｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． ５， １７９～１８９頁）、（１）個々のペイロードのための一部の最適化と共に製造業者のプロトコールに従ってＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒシステムを使用したマイクロ流体混合または（２）ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの有機溶媒および水性溶液中の脂質賦形剤の溶液の急速インライン混合のいずれかにより生成した。脂質溶液は、４つの製剤賦形剤の混合物、すなわち：エタノール中に予め決定されたモル比で混合された、アミノ脂質、ＰＥＧ－脂質と呼ばれる、脂質にコンジュゲートされた平均分子量２０００Ｄａのモノメトキシポリエチレングリコール（またはメトキシポリエチレングリコール）、コレステロールおよび１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を一般に含む。ＬＮＰ組成物は、４０～６５％のアミノ脂質、２～２０％のＤＳＰＣ、１～５％のＰＥＧ－脂質を、残余のコレステロール（全てｍｏｌ％）と共に含んだ。ＲＮＡ水性溶液は、他に特定されなければ、重量で１：１の、所望されるｍＲＮＡとガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との混合物を含有する。ｍＲＮＡ対ｇＲＮＡ比の影響力を評価するために、所望される重量比のｍＲＮＡおよびｇＲＮＡを含有する水性溶液を、対応するＬＮＰの調製の前に評価のために調製し；例えば、マウスにおいて６：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３および１：６のｍＲＮＡ対ｇＲＮＡ比を評価するためにＬＮＰ試験物品を調製した（実施例６、図１９）。一部の他の事例において、ｍＲＮＡおよび２つのｇＲＮＡを１：０．５：０．５（ｍＲＮＡ：ｇＲＮＡ１：ｇＲＮＡ２）の重量比で混合して、単一の試験物品中に所望されるｍＲＮＡおよび２つのｇＲＮＡを含有するＬＮＰを調製した（実施例１０、図４３）。所望されるｍＲＮＡ対ｇＲＮＡの水性溶液を次にエタノール中の脂質賦形剤とマイクロ流体混合または急速インライン混合により混合した。報告されるＮＨＰ研究のための全てのＬＮＰは、国際公開第２０１９／０３６０２８（Ａ１）号パンフレット、国際公開第２０１５／１９９９５２（Ａ１）号パンフレット、国際公開第２０１７／００４１４３号パンフレット、国際公開第２０２０／０８１９３８（Ａ１）号パンフレットおよび国際公開第２０２０／０６１４２６（Ａ２）号パンフレットに記載されているインライン混合プロトコールに従うことにより調製した。ＮＨＰ ＬＮＰ試験物品の調製のために使用されたＰＥＧ－脂質は、国際公開第２０１９／０３６０２８（Ａ１）号パンフレット、国際公開第２０１５／１９９９５２（Ａ１）号パンフレットから選択した。ＬＮＰ組成物およびイオン化可能なアミノ脂質は、特許文献国際公開第２０１７／００４１４３（Ａ１）号パンフレット、国際公開第２０１７／０７５５３１（Ａ１）号パンフレットおよび国際公開第２０１８／１９１７１９（Ａ１）号パンフレットから選択した。ＬＮＰ＃１およびＬＮＰ＃２の調製（実施例８、図３０＆図４５）のために使用されたイオン化可能なアミノ脂質は、文献国際公開第２０１８／１９１７１９（Ａ１）号パンフレットから選択した。結果として得られたＬＮＰ製剤をその後に試験物品緩衝剤に対して透析し、０．２μｍ無菌フィルターを使用して濾過した。
[750]例として、細胞およびＮＨＰ研究のために使用されたＬＮＰは、動的光散乱によ
り決定される＜０．２の多分散性指数およびＱｕａｎｔ－ｉＴ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙにより測定される８５～９８％の総ＲＮＡカプセル化と共に、５５～６５ｎｍの平均流体力学的直径範囲を有した。ＬＮＰ粒子サイズ（Ｚ－Ａｖｅ、流体力学的直径）、多分散性指数および総ＲＮＡカプセル化を、文献に記載されるように投与の前に測定した
。
[751]例として、細胞およびマウス研究のために使用されたＬＮＰは、動的光散乱（Ｍ
ａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＺＳ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）により決定される＜０．２の多分散性指数およびＱｕａｎｔ－ｉＴ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により測定される８５～１００％の総ＲＮＡカプセル化と共に、５５～１２０ｎｍの粒子サイズ（Ｚ－Ａｖｅ、流体力学的直径）を有した。
[752]ゲノムＤＮＡの抽出。マウスの肝臓全体または１００～２００ｍｇのサル肝臓を
２ｍＬのｌｙｓｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ｔｕｂｅ（ＭＰ Ｂｉｏ）にロードした。肝臓をマウス肝臓のために０．５ｍｌのＰＢＳまたはサル肝臓のために０．２５ｍＬのＰＢＳを用いて、製造業者のプロトコールに従ってＦａｓｔＰｒｅｐ－２４ ｓｙｓｔｅｍ（ＭＰ
Ｂｉｏ）を使用して溶解した。ゲノムＤＮＡを約２０μＬのマウスまたはサル肝臓溶解液から、製造業者のプロトコールに従ってＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ自動化抽出機器（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でビーズベースの抽出キット、ＭａｇＭＡＸ－９６ ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉ－Ｓａｍｐｌｅ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して単離した。サル肝生検試料のために、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ抽出を使用して、製造業者の使用説明書に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。抽出されたゲノムＤＮＡをさらなる使用まで４℃でまたは長期間の貯蔵のために－８０℃で貯蔵した。
[00753]ＥＬＩＳＡにより定量化されたＰＣＳＫ９タンパク質レベル。血液試料を収集
し、採血後に血漿へと処理した。血漿カニクイザルＰＣＳＫ９レベルを、記載されるＥＬＩＳＡを使用してＥＬＩＳＡにより決定し；簡潔に述べれば、アッセイ希釈剤Ｄ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、パート＃ ７６３８４）に希釈された精製されたカニクイザルＰＣＳＫ９の試験試料または標準品を、ヒトＰＣＳＫ９に特異的なモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、パート＃ ７６１５７）で被覆された９６ウェルマイクロプレート中のアッセイ緩衝剤Ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、パート＃ ７８２３２）とインキュベートした。洗浄緩衝剤（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、パート＃ ７８２３３）での４回の洗浄後に、ヒトＰＣＳＫ９に特異的なポリクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、パート＃ ７６１５８）を個々のウェル中でインキュベートした。４回の洗浄後に、アビジン－ＨＲＰ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、パート＃ ７７８９７）を次に個々のウェル中でインキュベートした。６回の洗浄後に、ＴＭＢを含有する基質溶液Ｆ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、パート＃ ７９１３２）を使用してプレートを顕色させた。４５０ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダーを使用して光学密度を決定した。５７０ｎｍでの読取り値を４５０ｎｍでの読取り値から引いて、プレート中の光学的不完全性を訂正した。血液試料を収集し、採血後に血漿へと処理し、－８６～－６０℃で分析まで貯蔵した。
[00754]ＥＬＩＳＡにより定量化されたＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベル。血漿カニク
イザルＡＮＧＰＴＬ３レベルをＥＬＩＳＡにより決定し；簡潔に述べれば、キャリブレーター希釈剤ＲＤ６Ｑ（Ｒ＆Ｄ、パート＃ ８９５１２８）に希釈された精製されたカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３の試験試料または標準品を、ヒトＡＮＧＰＴＬ３に特異的なモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ、パート＃８９３７３４）で被覆された９６ウェルマイクロプレート中のアッセイ希釈剤ＲＤ１－７６（Ｒ＆Ｄ、パート＃８９５８１２）とインキュベートした。洗浄緩衝剤（Ｒ＆Ｄ、パート＃ ８９５００３）での４回の洗浄後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたヒトＡＮＧＰＴＬ３に特異的なポリクローナル抗体を含有するヒトＡＮＧＰＴＬ３コンジュゲート（Ｒ＆Ｄ、パート＃８９３７３５）を次に個々のウェル中でインキュベートした。４回の洗浄後に、ＴＭＢ基質溶液（Ｒ＆Ｄ、パート＃ ８９５０００および８９５００１）を使用してプレートを顕色させた。４５０ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダーを使用して光学密度を決
定した。５４０ｎｍでの読取り値を４５０ｎｍでの読取り値から引いて、プレート中の光学的不完全性を訂正した。
[00755]脂質レベルの定量化。各々のアナライトが試薬、コレステロール、トリグリセ
リドおよびＨＤＬ－Ｃを含有する試薬キットを、特有の酵素反応生成物の吸光度測定を使用して定量化する。ＬＤＬ－Ｃは間接的に決定される。循環コレステロールのほとんどは３つの主要なリポタンパク質画分：超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、ＬＤＬおよびＨＤＬ中に見出される。［総Ｃ］＝［ＶＬＤＬ－Ｃ］＋［ＬＤＬ－Ｃ］＋［ＨＤＬ－Ｃ］。そのためＬＤＬ－Ｃは、総コレステロール、トリグリセリドおよびＨＤＬ－Ｃの測定された値から関係性：［ＬＤＬ－Ｃ］＝［総Ｃ］－［ＨＤＬ－Ｃ］－［ＴＧ］／５（式中、［ＴＧ］／５は発現されたＶＬＤＬ－コレステロールの概算値である）に従って算出され得る。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト肝臓中のＰＣＳＫ９をノックダウンし、血中ＰＣＳＫ９タンパク質およびＬＤＬ－Ｃレベルにおける低減をもたらす塩基編集療法の概念の前臨床的証明を提供する。
[00756]トリグリセリドレベルの直接的な測定。臨床分析装置を使用して血清試料中の
「脂質パネル」を測定する。これは、コレステロール（総Ｃ）、トリグリセリド（ＴＧ）および高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）の直接的な測定を活用する。トリグリセリドに特異的な試薬キットは、緩衝剤、キャリブレーター、ブランクおよび対照を含有する。提供された試薬を使用して、研究からの血清試料を分析する。一連のカップリングされた酵素反応を使用してトリグリセリドを測定する。Ｈ２Ｏ２は、最後のものの最終生成物であり、５００ｎｍでのその吸光度を使用してアナライトを定量化する。色強度はトリグリセリド濃度に比例する。全ての値はｍｇ／ｄＬで報告される。
[00757]マウスのＬＮＰ処置。マウス研究は、研究が行われたＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖ
ｅｒ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌａｂ（ＣＲＡＤＬ）の動物実験委員会により承認された。雌Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得、８～１０週齢で実験のために使用し、様々な実験群に動物をランダムに割り当てた。ＬＮＰをマウスに側尾静脈への注射および／または静脈洞の後眼窩注射を介して（Ｌａｂ Ａｎｉｍ ２０１１； ４０（５）： １５５～１６０頁）、動物体重（キログラム）当たりの総ＲＮＡのｍｇに対応するｍｇ／ｋｇの用量で投与した。用量は、ＬＮＰの製剤化後に、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの量を構成する総ＲＮＡに基づいて算出される。他に記載されなければ、処置の１週後に、マウスを安楽死させ、肝臓試料を検死で得、製造業者の使用説明書に従ってＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで処理してゲノムＤＮＡを単離した。
[00758]ＮＨＰのＬＮＰ処置。ＮＨＰ研究は、Ｅｎｖｏｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌおよ
びＡｌｔａｓｃｉｅｎｃｅｓの動物実験委員会によりそれぞれ承認された。ＮＨＰ研究はＥｎｖｏｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（研究＃ＶＴＰ２００１）ならびにＡｌｔａｓｃｉｅｎｃｅｓ（研究＃１３８８．０２、０４、０５、０９、および１１）で行い、両方の研究においてカンボジア起源のマカカ・ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を使用した。動物は研究開始の時点において２～３歳および２～３キログラムの体重であった。全ての動物をＰＣＳＫ９および／またはＡＮＧＰＴＬ３編集部位において遺伝子型判定して、ＬＮＰを与えられる任意の動物が、ｇＲＮＡ配列に完璧にマッチするプロトスペーサーＤＮＡ配列についてホモ接合性であることを確実にし、動物を様々な実験群に無作為に割り当てた。他に記載されなければ、ＬＮＰ投与の前に動物に１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾン、０．５ｍｇ／ｋｇのファモチジン、および５ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンを前投与した。１時間（＋／－５分）の経過にかけて、プライミングされた注入ラインに接続された末梢静脈に挿入された一時的なカテーテルを使用してＬＮＰを投与した。他に特定されなければ、用量製剤は６ｍｌ／ｋｇの体積で投与し、動物体重（キロ
グラム）当たりの総ＲＮＡのｍｇに対応するｍｇ／ｋｇで投薬した。用量は、ＬＮＰの製剤化後に、ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの量を構成する総ＲＮＡに基づいて算出される。動物の体重に基づく適切な体積を、注入ポンプを使用して送達した。対照動物には同じ注入条件下でＬＮＰの代わりにリン酸緩衝食塩水を与えた。同じＮＨＰ研究において使用されるアミノ脂質１およびアミノ脂質２から構成される２つのＬＮＰがある場合、試験物品はＬＮＰ＃１およびＬＮＰ＃２として同定され、これらのＬＮＰを調製するために使用されるｍＲＮＡおよびｇＲＮＡは同じである。研究において使用される１つのＬＮＰ組成物のみがある場合、試験物品はＬＮＰとして同定される。
[00759]血液化学試料のために、末梢静脈穿刺を介する収集の前に少なくとも４時間、
動物を絶食させた。ＮＨＰ研究は、以下のスケジュール：－１０日目、－７日目、－５日目、１日目（ＬＮＰ注入の６時間後）、２日目、３日目、５日目、８日目、および１５日目の収集に概しては従った。長期研究において、試料を２１日目および２８日目にも収集し、概してその後に２週毎に収集し、研究施設によりＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、総コレステロール、トリグリセリド、ＡＳＴ、およびＡＬＴについて分析した。各々のアナライトについて、－１０日目、－７日目、および－５日目の値の平均をベースライン値とみなした。各々の血液試料の部分を、ＰＣＳＫ９またはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質測定のために研究者に送った。
[00760]サイトカインレベルの分析。血清カニクイザルＩＬ－６、ＭＣＰ－１およびＩ
Ｐ－１０レベルを、製造業者の使用説明書に従ってＵ－ＰＬＥＸ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｇｒｏｕｐ １ （ＮＨＰ） Ａｓｓａｙｓ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｋ１５０６８Ｌ－２）により決定した。簡潔に述べれば、Ｕ－ＰＬＥＸ（Ｍｅｓｏ
Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｎ０５２３０）プレートを終夜４℃で、リンカーを連結した捕捉抗体（ＭＣＰ－１抗体；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｃ２６ＵＧ－３、ＩＬ－６抗体；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｃ２１ＴＸ－３、ＩＰ－１０抗体；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｃ２１ＵＦ－３）とインキュベートした。ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）での３回の洗浄後に、試験試料またはキャリブレーター標準品（キャリブレーター１；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｃ００６０－２、キャリブレーター２：Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｃ００６１－２）を、血清、遮断剤および防腐剤を含有するアッセイ希釈剤４３（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｒ５０ＡＧ－２）と室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄後に、ＩＬ－６（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｄ２６ＴＸ－３）、ＭＣＰ－１（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｄ２６ＵＧ－３）およびＩＰ－１０（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｄ２１ＵＦ－３）のためのＳＵＬＦＯ－ＴＡＧコンジュゲート検出抗体を個々のウェル中で室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄および各々のウェルへのＧｏｌｄ（商標）リード緩衝剤Ｂ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｒ６０ＡＭ－２）の添加後に、プレートをＭＳＤ機器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｒ３１ＱＱ－３により分析した。
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[00761]本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、各々の独立した特許
および刊行物が参照により組み込まれることを特におよび個々に指し示されたのと同じ程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
その他の実施形態
[00762]上の記述から、本明細書に記載した開示に変形および改変を加えて種々の用法
および状態に本開示を採用できることが明らかになる。そのような実施形態も、以下の特許請求の範囲内である。
[00763]本明細書における変数のいずれの定義における要素の列挙の引用も、列挙した
要素の任意の単一の要素またはその組合せ（または下位の組合せ）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の引用は、任意の単独の実施形態、実施形態の任意の部分、または他の任意の実施形態もしくはその任意の部分との組合せとしてのその実施形態を含む。
[00764]本明細書で説明するように、本開示は、塩基編集システム、設計、およびそれ
らの改変を含む組成物を含む、遺伝子における核酸塩基の変更をもたらす塩基編集システム、および疾患の処置のためにこれを使用する方法の特定の実施形態および実施例、ならびに疾患を処置するためおよび記載した条件下で哺乳動物細胞に活性薬剤をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで送達するための医薬組成物としての、単独または組合せでの上記の組成物の合成、製造、使用、および有効性を記載した特定の実施例および実施形態を含むことが認識されよう。
[00765]上記の態様および態様の組合せを説明するために、特定の実施例および数多く
の実施形態を提供してきたが、例示的なまたは開示した実施形態のいずれの態様またはそれらの組合せも、限定なしに別の実施形態を構成するためにそれから排除され得ること、およびそのようないずれの実施形態も個別の独立した請求項を構成し得ることが意図されていることを認識および理解されたい。同様に、１つまたは複数の実施形態のいずれの態様または態様の組合せも、１つまたは複数の実施形態のいずれの態様または態様の組合せに含まれまたはこれと組み合わせされることもできること、およびそれらの全てのそのような組合せは本開示の範囲内に含まれ、限定なしに個別の独立した請求項として提示し得
ることが本明細書で意図されていることを認識および理解されたい。したがって、１つの請求項で提示されたいずれの特徴も別の請求項に含まれ得ること、１つの請求項で提示されたいずれの特徴もその特徴のない請求項を構成するためにその請求項から除去され得ること、および１つの請求項で提示されたいずれの特徴も別の請求項中のいずれの特徴とも組み合わされ得ること、そのそれぞれが本明細書で意図されていることを認識されたい。以下に一覧にした項目は、上記の実施形態および実施例の態様および態様の組合せのさらなる説明例である。
[00766]以下は、一覧にした項目の第１の例である。
１．（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、組成物。
２．哺乳動物対象がカニクイザルであり、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも４０％で起こる、項目１に記載の組成物。
３．哺乳動物対象がカニクイザルであり、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも４５％で起こる、項目１に記載の組成物。
４．哺乳動物対象がカニクイザルであり、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも５０％で起こる、項目１に記載の組成物。
５．哺乳動物対象がカニクイザルであり、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも３ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも５５％で起こる、項目１に記載の組成物。
６．哺乳動物対象がマウスであり、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．１２５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してマウスの全肝細胞の少なくとも４０％で起こる、項目１に記載の組成物。
７．哺乳動物対象がマウスであり、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して
マウスの全肝細胞の少なくとも４５％で起こる、項目１に記載の組成物。
８．哺乳動物対象がマウスであり、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してマウスの全肝細胞の少なくとも５０％で起こる、項目１に記載の組成物。
９．核酸塩基の変更が、投与の前と比較して、対象における血液低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）レベルの少なくとも５０％の低減をもたらす、項目２に記載の組成物。
１０．プロトスペーサーがスプライス部位に位置している、項目１から９のいずれか一項に記載の組成物。
１１．プロトスペーサー相補配列がＰＣＳＫ９遺伝子のアンチセンス鎖にある、項目１から９のいずれか一項に記載の組成物。
１２．プロトスペーサー相補配列がＰＣＳＫ９遺伝子のセンス鎖にある、項目１から９のいずれか一項に記載の組成物。
１３．塩基の変更がＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーの外側（オフターゲット部位）で起こり、表１１で説明されるオフターゲット部位の編集パーセンテージがそれぞれ表１１で説明される編集パーセンテージ以下である、項目１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
１４．デアミナーゼがアデニンデアミナーゼであり、核酸塩基の変更がＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更である、項目１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
１５．プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼを含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
１６．核酸塩基の変更がＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位にある、項目１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
１７．核酸塩基の変更がＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスドナー部位にある、項目１６に記載の組成物。
１８．スプライスドナー部位が配列番号５で参照されるＰＣＳＫ９イントロン１の５’末端にある、項目１７に記載の組成物。
１９．核酸塩基の変更がＰＣＳＫ９遺伝子のスプライスアクセプター部位にある、項目１６に記載の組成物。
２０．核酸塩基の変更がフレームシフト、未成熟終止コドン、ＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす、項目１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
２１．核酸塩基の変更がＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす、項目１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
２２．ガイドＲＮＡが化学的に改変されている、項目１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
２３．ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒ配列が、図７に示すスキームに従って化学的に改変されている、項目１６に記載の組成物。
２４．スペーサー配列が、表１で説明されるＰＣＳＫ９ ＡＢＥガイドＲＮＡスペーサ
ー配列を含む、項目１から２２のいずれか一項に記載の組成物。
２５．ガイドＲＮＡが、表１で説明されるＧＡ０９６、ＧＡ０９７、ＧＡ３４３、ＧＡ３４６、ＧＡ３７５～３７７、ＧＡ３８０～３８９、ＧＡ３９１、ＧＡ４３９またはＧＡ４４０のＰＣＳＫ９ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、項目２４に記載の組成物。
２６．プロトスペーサー配列が、表１で説明されるＰＣＳＫ９ ＡＢＥプロトスペーサー配列を含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
２７．プロトスペーサーが配列５’－ＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号１３）または５’－ＣＣＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧ－３’（配列番号２４７）を含む、項目２６に記載の組成物。
２８．塩基エディター融合タンパク質が配列番号２１３７のアミノ酸配列を含む、項目１から２７のいずれか一項に記載の組成物。
２９．ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が５０％より大きい、項目１から２８のいずれか一項に記載の組成物。
３０．ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が５６％より大きい、項目２９に記載の組成物。
３１．ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が６３％以上である、項目３０に記載の組成物。
３２．ｍＲＮＡがアデニンｔＴＮＡデアミナーゼ（ＴａｄＡ）領域、Ｃａｓ９領域、および核局在化配列（ＮＬＳ）領域を含む、項目２９に記載の組成物。
３３．ｍＲＮＡが、ＴａｄＡ領域とＣａｓ９領域を連結する第１のリンカー領域およびＣａｓ９領域とＮＬＳ領域を連結する第２のリンカー領域をさらに含む、項目３２に記載の組成物。
３４．ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が６０％より大きい、項目３２または３３に記載の組成物。
３５．ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が７０％以上である、項目３２または３３に記載の組成物。
３６．Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が５６％より大きい、項目３２または３３に記載の組成物。
３７．Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が６２％以上である、項目３２または３３に記載の組成物。
３８．ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が５４％より大きい、項目３２または３３に記載の組成物。
３９．ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が６３％以上である、項目３２または３３に記載の組成物。
４０．第１のリンカー領域のＧＣ％含量が６５％より大きい、項目３３に記載の組成物。
４１．第１のリンカー領域のＧＣ％含量が７９％以上である、項目３３に記載の組成物。
４２．第２のリンカー領域のＧＣ％含量が６７％より大きい、項目３３に記載の組成物。
４３．第２のリンカー領域のＧＣ％含量が８３％以上である、項目３３に記載の組成物。
４４．ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が６０％より大きく、Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が５６％より大きく、ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が５４％より大きく、第１のリンカー領域のＧＣ％含量が６５％より大きく、第２のリンカー領域のＧＣ％含量が６７％より大きい、項目３３に記載の組成物。
４５．ｍＲＮＡが表２３から選択されるｍＲＮＡ配列を含む、項目２９に記載の組成物。
４６．ｍＲＮＡが配列番号２１３６のｍＲＮＡ配列を含む、項目４５に記載の組成物。
４７．ｍＲＮＡがポリＡテイルを含む、項目２９から４６のいずれか一項に記載の組成物。
４８．（ｉ）を封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をさらに含む、項目１から４７のいずれか一項に記載の組成物。
４９．ＬＮＰが（ｉｉ）をさらに封入する、項目４８に記載の組成物。
５０．（ｉｉ）を封入する第２のＬＮＰをさらに含む、項目４８に記載の組成物。
５１．ガイドＲＮＡと塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比が重量で約１：１０～約１０：１である、項目１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
５２．ガイドＲＮＡと塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比が重量で約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、１：１．５、１：２、１：３、または１：４である、項目５１に記載の組成物。
５３．ガイドＲＮＡと塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比が重量で約１：１である、項目５１に記載の組成物。
５４．先行する項目のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
５５．状態の処置または防止を必要とする対象における状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の項目１に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
５６．投与が静脈内注入を介する、項目５５に記載の方法。
５７．（ｉ）を封入するＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの逐次投与を含む、項目５５または５６に記載の方法。
５８．（ｉ）を封入するｔＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの同時投与を含む、項目５５または５６に記載の方法。
５９．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く１日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５７に記載の方法。
６０．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く２日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５７に記載の方法。
６１．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く３日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５７に記載の方法。
６２．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く４日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５７に記載の方法。
６３．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く５日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５７に記載の方法。
６４．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く６日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５７に記載の方法。
６５．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く７日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５７に記載の方法。
６６．単回用量の（ｉ）および（ｉｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５５または５６に記載の方法。
６７．ＬＮＰの単回用量が約０．３～約３ｍｇ／ｋｇである、項目６６に記載の方法。
６８．１つまたは複数の処置の処置コースを対象に投与するステップを含み、１つまたは複数の処置のそれぞれの１つが単回用量のＬＮＰの１つまたは複数を含む、項目６６または６７に記載の方法。
６９．２回から１０回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６８に記載の方法。
７０．２回から５回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６８に記載の方法。
７１．２回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６８に記載の方法。
７２．３回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６８に記載の方法。
７３．４回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６８に記載の方法。
７４．５回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６８に記載の方法。
７５．状態がアテローム硬化性心血管疾患である、項目５５から７４のいずれか一項に記載の方法。
７６．状態がアテローム硬化性血管疾患である、項目５５から７４のいずれか一項に記載の方法。
７７．対象がヒトである、項目５５から７４のいずれか一項に記載の方法。
７８．（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡが表１で説明されるＰＣＳＫ９ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、組成物。
７９．（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ｍＲＮＡが表２３から選択される配列を含む、組成物。
８０．アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含み、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．０５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第１の組成物、ならびに
（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含み、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第２の組成物
を対象に投与するステップを含む、方法。
８１．第１の組成物および第２の組成物の逐次投与を含む、項目８０に記載の方法。
８２．１つまたは複数の用量の第１の組成物に続いて１つまたは複数の用量の第２の組成物を投与するステップを含む、項目８１に記載の方法。
８３．１つまたは複数の用量の第２の組成物に続いて１つまたは複数の用量の第１の組成物を投与するステップを含む、項目８２に記載の方法。
８４．第１の組成物および第２の組成物の同時投与を含む、項目８０に記載の方法。
８５．１つまたは複数の用量の第１の組成物および第２の組成物を含む、項目８４に記載の方法。
８６．（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＰＯＣ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドＲＮＡが、表２４で説明されるＧＡ３００～３０３のＡＰＯＣ３ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、組成物。
８７．（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エデ
ィター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、組成物。
８８．（ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、および
（ｂ）塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および塩基エディタータンパク質をＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、ＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物であって、
スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、組成物。
８９．塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合され、ガイドＲＮＡがＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウがＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位を包含する、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９０．塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合され、ガイドＲＮＡがＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウがＰＣＳＫ９遺伝子のイントロンの領域を包含する、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９１．塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合され、ガイドＲＮＡがＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウがＰＣＳＫ９遺伝子のイントロン１、イントロン３、またはイントロン４の領域を包含する、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９２．塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合され、ガイドＲＮＡがＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウがＰＣＳＫ９遺伝子のイントロン１の領域を包含する、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９３．スペーサー配列が、ＧＡ０６６、ＧＡ０７３、およびＧＡ０７４として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるスペーサー配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９４．ｔｒａｃｒ配列が、ＧＡ０６６、ＧＡ０９５、ＧＡ０９６、ＧＡ０９７、ＧＡ３４３、ＧＡ３４６、ＧＡ３７５、ＧＡ３７６、ＧＡ３７７、ＧＡ３８０、ＧＡ３８１、ＧＡ３８２、ＧＡ３８３、ＧＡ３８４、ＧＡ３８５、ＧＡ３８６、ＧＡ３８７、ＧＡ３８８、ＧＡ３８９、ＧＡ４３９、およびＧＡ４４０として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるｔｒａｃｒ配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９５．ｍＲＮＡが、ＭＡ００２、ＭＡ００４、ＭＡ０４０、ＭＡ００４１、またはＭＡ０４５として同定されるｍＲＮＡ配列と８０～１００％の配列同一性を有する、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９６．ｍＲＮＡが、以下の表
Figure 2024038327000288
で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９７．ｍＲＮＡが、以下の表
Figure 2024038327000289
で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９８．ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが脂質ナノ粒子の中にカプセル化されている、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
９９．ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、以下：
ＬＮＰ組成（モル％）：
ｉＬｉｐｉｄ ４０～６５％
ＤＳＰＣ ２～２０％
ＰＥＧ １～５％
残りのモル％バランスがコレステロール；
ＬＮＰ粒子サイズ：Ｚ平均流体力学的直径５５～１２０ｎｍ、および
動的光散乱によって決定される多分散性指数０．２未満
を有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化されている、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１００．ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、５０～７０ｎｍのＺ平均流体力学的直径のＬＮＰ粒子サイズを有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、項目８８に記載のＰＣＳＫ９
遺伝子を編集するための組成物。
１０１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１０２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１０３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において３０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１０４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１０５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１０６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１０７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１０８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１０９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において８０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合
に、カニクイザルの肝臓におけるＰＣＳＫ９標的スプライス部位において８０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１８．編集パーセントが、投薬されたカニクイザルの肝臓の分析によって、投薬の１５日後にサルの肝生検または剖検を介して決定される、項目８７から１１７に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１１９．編集パーセントが、投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも１６８日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、項目８７から１１７に記載のＰＣＳＫ９遺伝子の編集のための組成物。
１２０．編集パーセントが、投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも３００日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、項目８７から１１７に記載のＰＣＳＫ９遺伝子の編集のための組成物。
１２１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１２２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１２３．組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１２４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたサルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１２５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１２６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載の
ＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１２７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１２８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１２９．組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１３９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１４０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１４１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１４２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１４３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合
に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１４４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＰＣＳＫ９タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１４５．血漿タンパク質の低減が、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の１５日後に決定される、項目１２１から１４４に記載のＰＣＳＫ９遺伝子の編集のための組成物。
１４６．組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたサルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１４７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１４８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１４９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１５９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１６０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合
に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１６１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１６２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１６３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１６４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１６５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１６６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１６７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１６８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９
遺伝子を編集するための組成物。
１６９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１７９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＬＤＬ－Ｃをベースラインと比較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８１．ＬＤＬ－Ｃの低減が、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の１５日後に決定される、項目１４８から１８２に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８２．ＬＤＬ－Ｃの低減が、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも１６８日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１４８から１８２に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８３．ＬＤＬ－Ｃの低減が、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１４８から１８２に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）をベースラインと比較して平均で少なくとも１０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも１５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合
に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１８９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均でほぼ３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９０．リポタンパク質（ａ）の低減が、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって、投薬の１５日後に決定される、項目１８６から１９１に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９１．リポタンパク質（ａ）の低減が、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも２２４日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１８６から１９１に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９２．リポタンパク質（ａ）の低減が、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１８６から１９１に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９３．カニクイザルへの投薬がＡＳＴ、ＡＬＴ、またはサイトカインの上昇をもたらす限り、組成物の投薬によってもたらされる上昇が一過性であって投薬後３～１５日以内にほぼベースラインレベルに戻る、項目１０１から１９４に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９４．ＰＣＳＫ９の編集パーセントが図２７に示したように肝組織、脾臓組織、および副腎組織の外部では無視できる、項目１０１から１０３、１２１から１２６、１４８から１５３に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９５．繰り返し投薬の結果がＰＣＳＫ９の編集パーセンテージの編集パーセンテージに関して加成性である、項目１０１から１０７、１２１から１３２、１４８から１６２に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９６．繰り返し投薬がサイトカインの活性化も免疫応答も誘発しない、項目１９５に
記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９７．スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８０％のヌクレオチド相関を有し、スペーサー配列上のＲＮＡヌクレオチドが同一の順序でプロトスペーサーのＤＮＡヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するならばＲＮＡヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドと相関し、ここで相関を決定する目的のためにウラシル塩基およびチミン塩基は同一のヌクレオチドであるとみなされる、項目８８に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９８．スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８５％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
１９９．スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
２００．スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９５％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
２０１．スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９９％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
２０２．スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも１００％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＰＣＳＫ９遺伝子を編集するための組成物。
２０３．アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
（ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、
（ｂ）塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および塩基エディタータンパク質をＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第１のガイドＲＮＡであって、スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第１のガイドＲＮＡ、および
（ｃ）塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および塩基エディタータンパク質をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第２のガイドＲＮＡであって、スペーサー配列が部分的にＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも相補的である、第２のガイドＲＮＡ
を対象に投与するステップを含む、方法。
２０４．（ａ）を包摂する第１のＬＮＰをさらに含む、項目２０３に記載の方法。
２０５．第１のＬＮＰが（ｂ）および（ｃ）を包摂する、項目２０４に記載の方法。
２０６．第１のＬＮＰが繰り返し投与される、項目２０４に記載の方法。
２０７．第１のＬＮＰが１～６０日の間隔で繰り返し投与される、項目２０４に記載の方法。
２０８．第１のＬＮＰが７日の間隔で繰り返し投与される、項目２０４に記載の方法。
２０９．第１のＬＮＰが（ｂ）をさらに包摂する、項目２０４に記載の方法。
２１０．（ａ）および（ｃ）を包摂する第２のＬＮＰをさらに含む、項目２０９に記載の方法。
２１１．第１のＬＮＰと第２のＬＮＰが逐次的に投与される、項目２１０に記載の方法。
２１２．第１のＬＮＰと第２のＬＮＰが１日～１２か月の間隔で逐次的に投与される、項目２１１に記載の方法。
２１３．間隔が１日である、項目２１２に記載の方法。
２１４．間隔が５日である、項目２１２に記載の方法。
２１５．間隔が１０日である、項目２１２に記載の方法。
２１６．間隔が１５日である、項目２１２に記載の方法。
２１７．間隔が２０日である、項目２１２に記載の方法。
２１８．間隔が２５日である、項目２１２に記載の方法。
２１９．間隔が１か月である、項目２１２に記載の方法。
２２０．間隔が２か月である、項目２１２に記載の方法。
２２１．間隔が３か月である、項目２１２に記載の方法。
２２２．間隔が５か月である、項目２１２に記載の方法。
２２３．間隔が８か月である、項目２１２に記載の方法。
２２４．間隔が１０か月である、項目２１２に記載の方法。
２２５．間隔が１２か月である、項目２１２に記載の方法。
[00767]以下は、一覧にした項目の第２の例である。
１．（ａ）（ｉ）１つまたは複数の化学的改変および（ｉｉ）選択された位置に１つまたは複数の未改変ヌクレオチドを含むスペーサー配列、および（ｂ）配列番号６１と少なくとも７０％の同一性を有するｔｒａｃｒ配列を含む単一ガイドＲＮＡであって、ｔｒａｃｒ配列がＩＩ型Ｃａｓタンパク質のための結合スカフォールドとして機能し、ｔｒａｃｒ配列が（ｉ）１つまたは複数の化学的改変および（ｉｉ）選択された位置に１つまたは複数の未改変ヌクレオチドを含む、単一ガイドＲＮＡ。
２．スペーサー配列が、標的ポリヌクレオチド配列と接触した場合に目的の遺伝子中の標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、単一ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、遺伝子における変更をもたらすようにＣａｓタンパク質に指令する、項目１に記載の単一ガイドＲＮＡ。
３．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして２～７位、２３～２５位、２７位、２９位、３１位、３８位、３９位、４２～４５位、４８位、４９位、および６２位、またはその対応する位置に未改変ヌクレオチドを含む、項目１または２に記載の単一ガイドＲＮＡ。
４．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして２～７位、１３位、２３～２５位、２７位、２９位、３１位、３８位、３９位、４２～４５位、４８位、４９位、５３位、および６２位、またはその対応する位置に未改変ヌクレオチドを含む、項目１または２に記載の単一ガイドＲＮＡ。
５．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして２～７位、１３位、２３～２５位、２７位、２９位、３１位、３８位、３９位、４２～４５位、４８位、４９位、５３位、６１位、６８位、７０位、および１１位、またはその対応する位置に未改変ヌクレオチドを含む、項目１または２に記載の単一ガイドＲＮＡ。
６．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして１位、８～２２位、２６位、２８位、３０位、３２～３７位、４０位、４１位、４６位、４７位、５０～６１位、および６３～８０位、またはその対応する位置に改変ヌクレオチドを含む、項目１から３に記載の単一ガイドＲＮＡ。
７．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして、１位、８～１２位、１４～２２位、２６位、２８位、３０位、３２～３７位、４０位、４１位、４６位、４７位、５０～５２位、５４～６１位、および６３～８０位、またはその対応する位置に改変ヌクレオチドを含む、項目１から３のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
８．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして、１位、８～１２位、１４～２２位、２６位、２８位、３０位、３２～３４位、３７位、４１位、４６位、４７位、５０～５２位、５４～６０位、６２～６７位、６９位、および７２～８０位、またはその対応する位置に改変ヌクレオチドを含む、項目１から７のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
９．配列番号６１のｔｒａｃｒ配列におけるヌクレオチドの６０％超が改変される、項目３から８のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１０．配列番号６１のｔｒａｃｒ配列におけるヌクレオチドの７０％超が改変される、項目９に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１１．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして、１３位、４９位、５３位、および６２位、またはその対応する位置に未改変ヌクレオチドを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１２．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして、４９位および６２位、またはその対応する位置に未改変ヌクレオチドを含む、項目１１に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１３．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして１３位、４０位、４９位、５３位、６１位、６８位、７０位、および７１位、またはその対応する位置に未改変ヌクレオチドを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１４．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして１３位、４９位、および５３位、またはその対応する位置に未改変ヌクレオチドを含む、項目１３に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１５．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１で番号付けして、１位、８位、２１位、２２位、２６位、２８位、３０位、３２～３７位、４０位、４１位、４６位、および４７位、またはその対応する位置に改変ヌクレオチドを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１６．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１と少なくとも８０％の同一性を含む、項目１から１５のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１７．ｔｒａｃｒ配列が、配列番号６１と少なくとも９０％の同一性を含む、項目１から１５のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１８．化学的改変が２’－ＯＭｅ改変を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
１９．化学的改変がネブラリンまたはデオキシネブラリンを含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
２０．化学的改変がホスホロチオエート結合を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
２１．ｔｒａｃｒ配列が配列番号６１を含み、単一ガイドＲＮＡが５’末端、３’末端、選択された内部位置、またはそれらの任意の組合せに１つまたは複数のホスホロチオエート結合をさらに含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
２２．５’末端、３’末端、またはその両方に２つおよび２つを超えない隣接したホスホロチオエート結合をさらに含む、項目２１に記載の単一ガイドＲＮＡ。
２３．５’末端、３’末端、またはその両方に３つの隣接したホスホロチオエート結合をさらに含む、項目２１に記載の単一ガイドＲＮＡ。
２４．３’末端に配列５’－ｕｓｕｓｕＮＮＮ－３’を含み、Ｎが独立に未改変リボヌクレオチドを表し、それぞれのｕが２’－Ｏ－メチルウリジンを表し、それぞれのｓがホスホロチオエート結合を表す、項目１から２１のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
２５．それぞれのＮがウリジンである、項目２４に記載の単一ガイドＲＮＡ。
２６．３’末端に配列５’－ｕｓｕｓｕＮＮｎ－３’を含み、それぞれのＮが独立に未改変リボヌクレオチドを表し、ｎが改変ヌクレオチドを表し、それぞれのｕが２’－Ｏ－メチルウリジンを表し、それぞれのｓがホスホロチオエート結合を表す、項目１から２１のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
２７．それぞれのＮがウリジンであり、ｎが２’－Ｏ－メチルウリジンである、項目２６に記載の単一ガイドＲＮＡ。
２８．（ｉ）スペーサー配列および（ｉｉ）ｔｒａｃｒ配列を含む単一ガイドＲＮＡであって、スペーサー配列が、標的ポリヌクレオチド配列と接触した場合にＰＣＳＫ９遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子中の標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、ｔｒａｃｒ配列がＩＩ型Ｃａｓタンパク質と接触した場合にＩＩ型Ｃａｓタンパク質に結合し、単一ガイドＲＮＡがネブラリン、デオキシネブラリン、または２’－Ｏ－メチルネブラリンを含む、単一ガイドＲＮＡ。
２９．（ｉ）スペーサー配列および（ｉｉ）ｔｒａｃｒ配列を含む単一ガイドＲＮＡであって、スペーサー配列が、標的ポリヌクレオチド配列と接触した場合にＰＣＳＫ９遺伝子またはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子中の標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、ｔｒａｃｒ配列がＩＩ型Ｃａｓタンパク質と接触した場合にＩＩ型Ｃａｓタンパク質に結合し、単一ガイドＲＮＡが５’末端または３’末端に２つおよび２つを超えないホスホロチオエート結合を含む、単一ガイドＲＮＡ。
３０．５’末端および３’末端に２つおよび２つを超えないホスホロチオエート結合を含む、項目２９に記載の単一ガイドＲＮＡ。
３１．５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、項目２９に記載の単一ガイドＲＮＡ。
３２．３’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、項目２９に記載の単一ガイド
ＲＮＡ。
３３．５’末端における２つのホスホロチオエート結合が、５’末端の最初の２つのヌクレオチド位置における隣接する２つのホスホロチオエート結合である、項目２９に記載の単一ガイドＲＮＡ。
３４．５’末端における２つのホスホロチオエート結合が、５’末端の最初の３～１０ヌクレオチドの中にある、項目２９に記載の単一ガイドＲＮＡ。
３５．３’末端における２つのホスホロチオエート結合が、３’末端の最後の２つのヌクレオチド位置における隣接する２つのホスホロチオエート結合である、項目２９に記載の単一ガイドＲＮＡ。
３６．３’末端における２つのホスホロチオエート結合が、３’末端の最後の３～１０ヌクレオチドの中にある、項目２９に記載の単一ガイドＲＮＡ。
３７．３’末端に配列５’－ＵｓＵｓＵｓ－３’を含み、Ｕがウリジンを表し、ｓがホスホロチオエート結合を表す、項目２９に記載の単一ガイドＲＮＡ。
３８．３’末端に配列５’－ＵＵＵ－３’を含む、項目２９に記載の単一ガイドＲＮＡ。
３９．ｔｒａｃｒ配列が、未改変の単一ガイドＲＮＡ中のｔｒａｃｒ配列と比較して増大した結合親和性でＩＩ型Ｃａｓタンパク質と結合する、項目１から２７のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
４０．ＩＩ型Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、項目２８から３８のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡ。
４１．Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９である、項目４０に記載の単一ガイドＲＮＡ。
４２．表１から選択されるガイドＲＮＡ配列を含む単一ガイドＲＮＡであって、ａ、ｕ、ｇ、およびｃが２’－ＯＭｅ改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを表し、ｓがホスホロチオエート結合を表し、Ｘがネブラリンを表し、ｘが２’－Ｏ－メチルネブラリンを表し、ｄＸが２’－デオキシネブラリンを表す、単一ガイドＲＮＡ。
４３．項目１から４２のいずれか一項に記載の単一ガイドＲＮＡおよびＩＩ型Ｃａｓタンパク質またはＩＩ型Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含む、遺伝子改変のための医薬組成物。
４４．ＩＩ型Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターをさらに含む、項目４３に記載の医薬組成物。
４５．ＩＩ型Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、項目４３または４４に記載の医薬組成物。
４６．薬学的に許容される担体をさらに含む、項目４３から４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
４７．項目４３から４６のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、脂質ナノ粒子。
４８．項目４３から４６のいずれか一項に記載の医薬組成物を細胞に導入するステップを含む、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列を改変する方法であって、単一ガイドＲＮＡが、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすようにＩＩ型Ｃａｓタンパク質に指令する、方法。
４９．標的ポリヌクレオチド配列がＰＣＳＫ９遺伝子中にある、項目４８に記載の方法。
５０．改変が、細胞中のＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる機能性ＰＣＳＫ９タンパク質の発現を低減させる、項目４９に記載の方法。
５１．標的ポリヌクレオチド配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子中にある、項目５０に記載の方法。
５２．改変が、細胞中のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる機能性ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を低減させる、項目５１に記載の方法。
５３．導入が、組成物を含む脂質ナノ粒子を介して実施される、項目４８から５２のいずれか一項に記載の方法。
５４．状態の処置または防止を必要とする対象における状態の処置または防止のための方法であって、項目４３から４６のいずれか一項に記載の医薬組成物または項目４７に記載の脂質ナノ粒子を対象に投与するステップを含み、単一ガイドＲＮＡが、対象の細胞中の標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすようにＩＩ型Ｃａｓタンパク質に指令し、それにより状態を処置または防止する、方法。
５５．標的ポリヌクレオチド配列がＰＣＳＫ９遺伝子中にある、項目５４に記載の方法。
５６．標的ポリヌクレオチド配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子中にある、項目５４に記載の方法。
５７．改変が、対象中のＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる機能性ＰＣＳＫ９タンパク質の発現を低減させる、項目５５に記載の方法。
５８．改変が、対象中のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる機能性ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を低減させる、項目５６に記載の方法。
５９．状態がアテローム硬化性血管疾患である、項目４８から５８のいずれか一項に記載の方法。
６０．状態がアテローム硬化性血管疾患、高トリグリセリド血症、または糖尿病である、項目４８から５８のいずれか一項に記載の方法。
６１．対象が投与前と比較して低減した血液ＬＤＬコレステロールレベルおよび／または低減した血液トリグリセリドレベルを呈する、項目４８から６０のいずれか一項に記載の方法。
[00768]以下は、一覧にした項目の第３の例である。
１．（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、組成物。
２．哺乳動物対象がカニクイザルであり、ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量ほぼ１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、項目１に記載の組成物。
３．哺乳動物対象がカニクイザルであり、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが総量約３ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも５０％で起こる、項目１に記載の組成物。
４．核酸塩基の変更が、投与前と比較してカニクイザルの血液トリグリセリドレベルの少なくとも２０％の低減をもたらす、項目２に記載の組成物。
５．核酸塩基の変更が、投与前と比較してカニクイザルの血液トリグリセリドレベルの少なくとも５０％の低減をもたらす、項目３に記載の組成物。
６．プロトスペーサーがスプライス部位に位置する、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
７．プロトスペーサー相補配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のアンチセンス鎖にある、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
８．プロトスペーサー相補配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のセンス鎖にある、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
９．塩基の変更がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーの外側（オフターゲット部位）で起こり、
表１４で説明されるオフターゲット部位の編集パーセンテージがそれぞれ表１４で説明される編集パーセンテージ以下である、項目１から８のいずれか一項に記載の組成物。
１０．デアミナーゼがアデニンデアミナーゼであり、核酸塩基の変更がＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更である、項目１から９のいずれか一項に記載の組成物。
１１．プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
１２．核酸塩基の変更がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位にある、項目１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
１３．核酸塩基の変更がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスドナー部位にある、項目１２に記載の組成物。
１４．スプライスドナー部位が配列番号７で参照されるＡＮＧＰＴＬ３イントロン６の５’末端にある、項目１３に記載の組成物。
１５．核酸塩基の変更がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスアクセプター部位にある、項目１２に記載の組成物。
１６．核酸塩基の変更がフレームシフト、未成熟終止コドン、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす、項目１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
１７．核酸塩基の変更がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす、項目１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
１８．ガイドＲＮＡが化学的に改変されている、項目１から１７のいずれか一項に記載
の組成物。
１９．ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒ配列が、図７に示すスキームに従って化学的に改変されている、項目１６に記載の組成物。
２０．スペーサー配列が、表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡスペーサー配列を含む、項目１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
２１．ガイドＲＮＡが、表１で説明されるＧＡ０６７、ＧＡ０９１、ＧＡ０９８、ＧＡ０９９、ＧＡ１００、ＧＡ１０１、ＧＡ１０２、ＧＡ１０３、ＧＡ３４７、ＧＡ４４１、ＧＡ４４２、ＧＡ４７２、ＧＡ４７３、ＧＡ４７４、ＧＡ４７５、ＧＡ４７６、ＧＡ５１７、またはＧＡ５４７のＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、項目２０に記載の組成物。
２２．プロトスペーサー配列が、表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥプロトスペーサー配列を含む、項目１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
２３．プロトスペーサーが配列５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）、５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１５）、５’－ＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１６０６）、５’－ＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号２４８）、または５’－ＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号２４９）を含む、項目２２に記載の組成物。
２４．塩基エディター融合タンパク質が配列番号２１３７のアミノ酸配列を含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
２５．ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が５０％より大きい、項目１から２４のいずれか一項に記載の組成物。
２６．ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が５６％より大きい、項目２５に記載の組成物。
２７．ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が６３％以上である、項目２６に記載の組成物。
２８．ｍＲＮＡがアデニンｔＴＮＡデアミナーゼ（ＴａｄＡ）領域、Ｃａｓ９領域、および核局在化配列（ＮＬＳ）領域を含む、項目２５に記載の組成物。
２９．ｍＲＮＡが、ＴａｄＡ領域とＣａｓ９領域を連結する第１のリンカー領域およびＣａｓ９領域とＮＬＳ領域を連結する第２のリンカー領域をさらに含む、項目２８に記載の組成物。
３０．ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が６０％より大きい、項目２８または２９に記載の組成物。
３１．ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が７０％以上である、項目２８または２９に記載の組成物。
３２．Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が５６％より大きい、項目２８または２９に記載の組成物。
３３．Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が６２％以上である、項目２８または２９に記載の組成物。
３４．ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が５４％より大きい、項目２８または２９に記載の組成物。
３５．ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が６３％以上である、項目２８または２９に記載の組成物。
３６．第１のリンカー領域のＧＣ％含量が６５％より大きい、項目２９に記載の組成物。
３７．第１のリンカー領域のＧＣ％含量が７９％以上である、項目２９に記載の組成物。
３８．第２のリンカー領域のＧＣ％含量が６７％より大きい、項目２９に記載の組成物。
３９．第２のリンカー領域のＧＣ％含量が８３％以上である、項目２９に記載の組成物。
４０．ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が６０％より大きく、Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が５６％より大きく、ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が５４％より大きく、第１のリンカー領域のＧＣ％含量が６５％より大きく、第２のリンカー領域のＧＣ％含量が６７％より大きい、項目２９に記載の組成物。
４１．ｍＲＮＡが表２３から選択されるｍＲＮＡ配列を含む、項目２５に記載の組成物。
４２．ｍＲＮＡが配列番号２１３６のｍＲＮＡ配列を含む、項目４１に記載の組成物。
４３．ｍＲＮＡがポリＡテイルを含む、項目２５から４２のいずれか一項に記載の組成物。
４４．（ｉ）を封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をさらに含む、項目１から４３のいずれか一項に記載の組成物。
４５．ＬＮＰが（ｉｉ）をさらに封入する、項目４４に記載の組成物。
４６．（ｉｉ）を封入する第２のＬＮＰをさらに含む、項目４４に記載の組成物。
４７．ガイドＲＮＡと塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比が重量で約１：１０～約１０：１である、項目１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
４８．ガイドＲＮＡと塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比が重量で約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、１：１．５、１：２、１：３、または１：４である、項目４７に記載の組成物。
４９．ガイドＲＮＡと塩基エディター融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとの比が重量で約１：１である、項目４８に記載の組成物。
５０．先行する項目のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
５１．状態の処置または防止を必要とする対象における状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の項目１に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
５２．投与が静脈内注入を介する、項目５１に記載の方法。
５３．（ｉ）を封入するＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの逐次投与を含む、項目５１または５２に記載の方法。
５４．（ｉ）を封入するＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの同時投与を含む、項目５１または５２に記載の方法。
５５．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く１日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
５６．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く２日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
５７．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く３日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
５８．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く４日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
５９．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く５日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
６０．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く６日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
６１．単回用量の（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く７日間隔での時差用量の（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
６２．単回用量の（ｉ）および（ｉｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５１または５２に記載の方法。
６３．ＬＮＰの単回用量が約０．３～約３ｍｇ／ｋｇである、項目６２に記載の方法。
６４．１つまたは複数の処置の処置コースを対象に投与するステップを含み、１つまたは複数の処置のそれぞれの１つが単回用量のＬＮＰの１つまたは複数を含む、項目６２または６３に記載の方法。
６５．２回から１０回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
６６．２回から５回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
６７．２回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
６８．３回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
６９．４回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
７０．５回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６２に記載の方法。
７１．状態がアテローム硬化性心血管疾患である、項目５１から７０のいずれか一項に記載の方法。
７２．状態がアテローム硬化性血管疾患である、項目５１から７０のいずれか一項に記載の方法。
７３．対象がヒトである、項目５１から７２のいずれか一項に記載の方法。
７４．（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡが表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、組成
物。
７５．（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ｍＲＮＡが表２３から選択される配列を含む、組成物。
７６．アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含み、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第１の組成物、ならびに
（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含み、
ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第２の組成物
を対象に投与するステップを含む、方法。
７７．第１の組成物および第２の組成物の逐次投与を含む、項目７６に記載の方法。
７８．１つまたは複数の用量の第１の組成物に続いて１つまたは複数の用量の第２の組成物を投与するステップを含む、項目７７に記載の方法。
７９．１つまたは複数の用量の第２の組成物に続いて１つまたは複数の用量の第１の組成物を投与するステップを含む、項目７８に記載の方法。
８０．第１の組成物および第２の組成物の同時投与を含む、項目７６に記載の方法。
８１．１つまたは複数の用量の第１の組成物および第２の組成物を含む、項目８０に記
載の方法。
８２．（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、組成物。
８３．ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも４０％で起こる、項目８２に記載の組成物。
８４．ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも４５％で起こる、項目８２に記載の組成物。
８５．ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも５０％で起こる、項目８２に記載の組成物。
８６．ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも５５％で起こる、項目８２に記載の組成物。
８７．ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも３ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも６０％で起こる、項目８２に記載の組成物。
８８．（ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、および
（ｂ）塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および塩基エディタータンパク質をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物であって、
スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、組成物。
８９．塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合され、ガイドＲＮＡがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位を包含する、項目８３に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９０．塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合され、ガイドＲＮＡ
がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロンの領域を包含する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９１．塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合され、ガイドＲＮＡがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロン１、イントロン３、またはイントロン４の領域を包含する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９２．塩基エディタータンパク質がガイドＲＮＡに作動可能に結合され、ガイドＲＮＡがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロン１の領域を包含する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９３．スペーサー配列が、ＧＡ０６７、ＧＡ１００、およびＧＡ５７４として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるスペーサー配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９４．ｔｒａｃｒ配列が、ＧＡ０６７、ＧＡ０９１、ＧＡ０９８、ＧＡ０９９、ＧＡ１００、ＧＡ１０１、ＧＡ１０２、ＧＡ１０３、ＧＡ３４７、ＧＡ４４１、ＧＡ４４２、ＧＡ４７２、ＧＡ４７３、ＧＡ４７４、ＧＡ４７５、ＧＡ４７６、ＧＡ５１７、およびＧＡ５４７として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるｔｒａｃｒ配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９５．ｍＲＮＡが、ＭＡ００２、ＭＡ００４、ＭＡ０４０、ＭＡ００４１、またはＭＡ０４５として同定されるｍＲＮＡ配列と８０～１００％の配列同一性を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９６．ｍＲＮＡが、以下の表：
Figure 2024038327000290
で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９７．ｍＲＮＡが、以下の表：
Figure 2024038327000291
で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９８．ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
９９．ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、以下：
ＬＮＰ組成（モル％）：
ｉＬｉｐｉｄ ４０～６５％
ＤＳＰＣ ２～２０％
ＰＥＧ １～５％
残りのモル％バランスがコレステロール；
ＬＮＰ粒子サイズ：Ｚ平均流体力学的直径 ５５～１２０ｎｍ、および
動的光散乱によって決定される多分散性指数０．２未満
を有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１００．ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、５０～７０ｎｍのＺ平均流体力学的直径のＬＮＰ粒子サイズを有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１０１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１０２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１０３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において３０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１０４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍ
ＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１０５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１０６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１０７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１０８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１０９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において８０パ
ーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において８０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１８．編集パーセントが、投薬されたカニクイザルの肝臓の分析によって、投薬の１５日後にサルの肝生検または剖検を介して決定される、項目８７から１１７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１１９．編集パーセントが、投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも１６８日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、項目８７から１１７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集のための組成物。
１２０．編集パーセントが、投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも３００日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、項目８７から１１７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集のための組成物。
１２１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１２２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１２３．組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１２４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたサルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１２５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１２６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１２７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１２８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１２９．組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍ
ＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラ
インと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１３９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１４０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１４１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１４２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１４３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１４４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１４５．血漿タンパク質の低減が、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の１５日後に決定される、項目１２１から１４４に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集のための組成物。
１４６．組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたサルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１４７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよ
びｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１４８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１４９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比
較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１５９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１６９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７１．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７２．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍ
ＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７３．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１７９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８０．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比
較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８１．トリグリセリドレベルの低減が、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の１５日後に決定される、項目１４８から１８２に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８２．トリグリセリドレベルの低減が、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも１６８日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１４８から１８２に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８３．トリグリセリドレベルの低減が、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１４８から１８２に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８４．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）をベースラインと比較して平均で少なくとも１０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８５．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも１５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８６．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８７．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８８．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１８９．組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇのガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラ
インと比較して平均でほぼ３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９０．リポタンパク質（ａ）の低減が、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって、投薬の１５日後に決定される、項目１８６から１９１に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９１．リポタンパク質（ａ）の低減が、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも２２４日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１８６から１９１に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９２．リポタンパク質（ａ）の低減が、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１８６から１９１に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９３．カニクイザルへの投薬がＡＳＴ、ＡＬＴ、またはサイトカインの上昇をもたらす限り、組成物の投薬によってもたらされる上昇が一過性であって投薬後３～１５日以内にほぼベースラインレベルに戻る、項目１０１から１９４に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９４．ＡＮＧＰＴＬ３の編集パーセントが図２７に示したように肝組織、脾臓組織、および副腎組織の外部では無視できる、項目１０１から１０３、１２１から１２６、１４８から１５３に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９５．繰り返し投薬の結果がＡＮＧＰＴＬ３の編集パーセンテージの編集パーセンテージに関して加成性である、項目１０１から１０７、１２１から１３２、１４８から１６２に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９６．繰り返し投薬がサイトカインの活性化も免疫応答も誘発しない、項目１９５に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９７．スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８０％のヌクレオチド相関を有し、スペーサー配列上のＲＮＡヌクレオチドが同一の順序でプロトスペーサーのＤＮＡヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するならばＲＮＡヌクレオチドがＤＮＡヌクレオチドと相関し、ここで相関を決定する目的のためにウラシル塩基およびチミン塩基は同一のヌクレオチドであるとみなされる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９８．スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８５％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
１９９．スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
２００．スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９５％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
２０１．スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９９％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
２０２．スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも１００％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
２０３．アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
（ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、
（ｂ）塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および塩基エディタータンパク質をＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第１のガイドＲＮＡであって、スペーサー配列がＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第１のガイドＲＮＡ、および
（ｃ）塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および塩基エディタータンパク質をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第２のガイドＲＮＡであって、スペーサー配列がＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第２のガイドＲＮＡ
を対象に投与するステップを含む、方法。
２０４．（ａ）を包摂する第１のＬＮＰをさらに含む、項目２０３に記載の方法。
２０５．第１のＬＮＰが（ｂ）および（ｃ）を包摂する、項目２０４に記載の方法。
２０６．第１のＬＮＰが繰り返し投与される、項目２０４に記載の方法。
２０７．第１のＬＮＰが１～６０日の間隔で繰り返し投与される、項目２０４に記載の方法。
２０８．第１のＬＮＰが７日の間隔で繰り返し投与される、項目２０４に記載の方法。
２０９．第１のＬＮＰが（ｂ）をさらに包摂する、項目２０４に記載の方法。
２１０．（ａ）および（ｃ）を包摂する第２のＬＮＰをさらに含む、項目２０９に記載の方法。
２１１．第１のＬＮＰと第２のＬＮＰが逐次的に投与される、項目２１０に記載の方法。
２１２．第１のＬＮＰと第２のＬＮＰが１日～１２か月の間隔で逐次的に投与される、項目２１１に記載の方法。
２１３．間隔が１日である、項目２１２に記載の方法。
２１４．間隔が５日である、項目２１２に記載の方法。
２１５．間隔が１０日である、項目２１２に記載の方法。
２１６．間隔が１５日である、項目２１２に記載の方法。
２１７．間隔が２０日である、項目２１２に記載の方法。
２１８．間隔が２５日である、項目２１２に記載の方法。
２１９．間隔が１か月である、項目２１２に記載の方法。
２２０．間隔が２か月である、項目２１２に記載の方法。
２２１．間隔が３か月である、項目２１２に記載の方法。
２２２．間隔が５か月である、項目２１２に記載の方法。
２２３．間隔が８か月である、項目２１２に記載の方法。
２２４．間隔が１０か月である、項目２１２に記載の方法。
２２５．間隔が１２か月である、項目２１２に記載の方法。
[00769]本開示を概観することにより、関連する項目の１つもしくはその群において提示した１つもしくは複数の態様または特徴は、他の項目にまたは他の項目における１つもしくは複数の態様もしくは特徴との組合せにも含まれ得ることが意図されていることも認識されよう。本明細書は以下の発明の開示を包含する。
［１］（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、組成物。
［２］哺乳動物対象がカニクイザルであり、前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量約１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記カニクイザルの全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、項目１に記載の組成物。
［３］前記哺乳動物対象がカニクイザルであり、
前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量約３ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記カニクイザルの全肝細胞の少なくとも５０％で起こる、
項目１に記載の組成物。
［４］前記核酸塩基の変更が、前記投与前と比較して前記カニクイザルにおける血中トリグリセリドレベルの少なくとも２０％の低減をもたらす、項目２に記載の組成物。
［５］前記核酸塩基の変更が、前記投与前と比較して前記カニクイザルにおける血中トリグリセリドレベルの少なくとも５０％の低減をもたらす、項目３に記載の組成物。
［６］前記プロトスペーサーがスプライス部位に位置する、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
［７］プロトスペーサー相補配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のアンチセンス鎖にある、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
［８］プロトスペーサー相補配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のセンス鎖にある、項目１から５のいずれか一項に記載の組成物。
［９］前記塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーの外側（オフターゲット部位）で起こり、
表１４で説明されるオフターゲット部位の編集パーセンテージがそれぞれ表１４で説明される編集パーセンテージ以下である、項目１から８のいずれか一項に記載の組成物。
［１０］前記デアミナーゼがアデニンデアミナーゼであり、前記核酸塩基の変更がＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更である、項目１から９のいずれか一項に記載の組成物。
［１１］前記プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９またはＣａｓ
９ニッカーゼを含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
［１２］前記核酸塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位にある、項目１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
［１３］前記核酸塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスドナー部位にある、項目１２に記載の組成物。
［１４］前記スプライスドナー部位が配列番号７で参照されるＡＮＧＰＴＬ３イントロン６の５’末端にある、項目１３に記載の組成物。
［１５］前記核酸塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスアクセプター部位にある、項目１２に記載の組成物。
［１６］前記核酸塩基の変更がフレームシフト、未成熟終止コドン、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす、項目１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
［１７］前記核酸塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす、項目１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
［１８］前記ガイドＲＮＡが化学的に改変されている、項目１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
［１９］前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒ配列が、図７に示すスキームに従って化学的に改変されている、項目１６に記載の組成物。
［２０］前記スペーサー配列が、表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡスペーサー配列を含む、項目１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
［２１］前記ガイドＲＮＡが、表１で説明される、ＧＡ０６７、ＧＡ０９１、ＧＡ０９８、ＧＡ０９９、ＧＡ１００、ＧＡ１０１、ＧＡ１０２、ＧＡ１０３、ＧＡ３４７、ＧＡ４４１、ＧＡ４４２、ＧＡ４７２、ＧＡ４７３、ＧＡ４７４、ＧＡ４７５、ＧＡ４７６、ＧＡ５１７、またはＧＡ５４７のＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、項目２０に記載の組成物。
［２２］プロトスペーサー配列が、表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥプロトスペーサー配列を含む、項目１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
［２３］プロトスペーサーが、配列５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）、５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１５）、５’－ＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１６０６）、５’－ＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号２４８）、または５’－ＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号２４９）を含む、項目２２に記載の組成物。
［２４］前記塩基エディター融合タンパク質が配列番号２１３７のアミノ酸配列を含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
［２５］前記ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が５０％より大きい、項目１から２４のいずれか一項に記載の組成物。
［２６］前記ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が５６％より大きい、項目２５に記載の組成物。
［２７］前記ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が６３％以上である、項目２６に記載の組成物。
［２８］前記ｍＲＮＡがアデニンｔＴＮＡデアミナーゼ（ＴａｄＡ）領域、Ｃａｓ９領域、および核局在化配列（ＮＬＳ）領域を含む、項目２５に記載の組成物。
［２９］前記ｍＲＮＡが、前記ＴａｄＡ領域と前記Ｃａｓ９領域を連結する第１のリンカー領域および前記Ｃａｓ９領域と前記ＮＬＳ領域を連結する第２のリンカー領域をさらに含む、項目２８に記載の組成物。
［３０］前記ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が６０％より大きい、項目２８または２９に記載の組成物。
［３１］前記ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が７０％以上である、項目２８または２９に記載の組成物。
［３２］前記Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が５６％より大きい、項目２８または２９に記載の組成物。
［３３］前記Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が６２％以上である、項目２８または２９に記載の組成物。
［３４］前記ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が５４％より大きい、項目２８または２９に記載の組成物。
［３５］前記ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が６３％以上である、項目２８または２９に記載の組成物。
［３６］前記第１のリンカー領域のＧＣ％含量が６５％より大きい、項目２９に記載の組成物。
［３７］前記第１のリンカー領域のＧＣ％含量が７９％以上である、項目２９に記載の組成物。
［３８］前記第２のリンカー領域のＧＣ％含量が６７％より大きい、項目２９に記載の組成物。
［３９］前記第２のリンカー領域のＧＣ％含量が８３％以上である、項目２９に記載の組成物。
［４０］前記ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が６０％より大きく、前記Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が５６％より大きく、前記ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が５４％より大きく、前記第１のリンカー領域のＧＣ％含量が６５％より大きく、前記第２のリンカー領域のＧＣ％含量が６７％より大きい、項目２９に記載の組成物。
［４１］前記ｍＲＮＡが表２３から選択されるｍＲＮＡ配列を含む、項目２５に記載の組成物。
［４２］前記ｍＲＮＡが配列番号２１３６のｍＲＮＡ配列を含む、項目４１に記載の組成物。
［４３］前記ｍＲＮＡがポリＡテイルを含む、項目２５から４２のいずれか一項に記載の組成物。
［４４］（ｉ）を封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をさらに含む、項目１から４３のいずれか一項に記載の組成物。
［４５］前記ＬＮＰが（ｉｉ）をさらに封入する、項目４４に記載の組成物。
［４６］（ｉｉ）を封入する第２のＬＮＰをさらに含む、項目４４に記載の組成物。
［４７］前記ガイドＲＮＡと前記塩基エディター融合タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡとの比が重量で約１：１０～約１０：１である、項目１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
［４８］前記ガイドＲＮＡと前記塩基エディター融合タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡとの比が重量で約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、１：１．５、１：２、１：３、または１：４である、項目４７に記載の組成物。
［４９］前記ガイドＲＮＡと前記塩基エディター融合タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡとの比が重量で約１：１である、項目４８に記載の組成物。
［５０］先行する項目のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
［５１］状態の処置または防止を必要とする対象における状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の項目１に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
［５２］前記投与が静脈内注入を介する、項目５１に記載の方法。
［５３］（ｉ）を封入するＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの逐次投与を含む、項目５１または５２に記載の方法。
［５４］（ｉ）を封入するｔＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの同時投与を含む、項目５１または５２に記載の方法。
［５５］単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く１日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
［５６］単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く２日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
［５７］単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く３日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
［５８］単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く４日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
［５９］単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く５日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
［６０］単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く６日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
［６１］単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く７日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５３に記載の方法。
［６２］単回用量の（ｉ）および（ｉｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、項目５１または５２に記載の方法。
［６３］前記ＬＮＰの単回用量が約０．３～約３ｍｇ／ｋｇである、項目６２に記載の方法。
［６４］１つまたは複数の処置の処置コースを前記対象に投与するステップを含み、前記１つまたは複数の処置のそれぞれの１つが前記単回用量の前記ＬＮＰの１つまたは複数を含む、項目６２または６３に記載の方法。
［６５］２回から１０回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
［６６］２回から５回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
［６７］２回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
［６８］３回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
［６９］４回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６４に記載の方法。
［７０］５回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目６２に記載の方法。
［７１］前記状態がアテローム硬化性心血管疾患である、項目５１から７０のいずれか一項に記載の方法。
［７２］前記状態がアテローム硬化性血管疾患である、項目５１から７０のいずれか一項に記載の方法。
［７３］前記対象がヒトである、項目５１から７２のいずれか一項に記載の方法。
［７４］（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、前記ガイドＲＮＡが、表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、組成物。
［７５］（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、前記ｍＲＮＡが、表２３から選択される配列を含む、組成物。
［７６］アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における前記疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含み、
前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて前記ＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第１の組成物、ならびに
（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含み、
前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量少なくとも１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第２の組成物
を前記対象に投与するステップを含む、方法。
［７７］前記第１の組成物および前記第２の組成物の逐次投与を含む、項目７６に記載の方法。
［７８］１つまたは複数の用量の前記第１の組成物に続いて１つまたは複数の用量の前記第２の組成物を投与するステップを含む、項目７７に記載の方法。
［７９］１つまたは複数の用量の前記第２の組成物に続いて１つまたは複数の用量の前記第１の組成物を投与するステップを含む、項目７８に記載の方法。
［８０］前記第１の組成物および前記第２の組成物の同時投与を含む、項目７６に記載の方法。
［８１］１つまたは複数の用量の前記第１の組成物および前記第２の組成物を含む、項目８０に記載の方法。
［８２］（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
（ｉｉ）前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
前記ガイドＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をももたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、
組成物。
［８３］ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも４０％で起こる、項目８２に記載の組成物。
［８４］ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも４５％で起こる、項目８２に記載の組成物。
［８５］ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも５０％で起こる、項目８２に記載の組成物。
［８６］ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも５５％で起こる、項目８２に記載の組成物。
［８７］ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも３ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも６０％で起こる、項目８２に記載の組成物。
［８８］（ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、および
（ｂ）前記塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および前記塩基エディタータンパク質を前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
を含む、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物であって、
前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に
少なくとも部分的に相補的である、組成物。
［８９］前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドＲＮＡに作動可能に結合され、前記ガイドＲＮＡが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位を包含する、項目８３に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９０］前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドＲＮＡに作動可能に結合され、前記ガイドＲＮＡが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロンの領域を包含する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９１］前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドＲＮＡに作動可能に結合され、前記ガイドＲＮＡが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロン１、イントロン３、またはイントロン４の領域を包含する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９２］前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドＲＮＡに作動可能に結合され、前記ガイドＲＮＡが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロン１の領域を包含する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９３］前記スペーサー配列が、ＧＡ０６７、ＧＡ１００、およびＧＡ５７４として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるスペーサー配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９４］前記ｔｒａｃｒ配列が、ＧＡ０６７、ＧＡ０９１、ＧＡ０９８、ＧＡ０９９、ＧＡ１００、ＧＡ１０１、ＧＡ１０２、ＧＡ１０３、ＧＡ３４７、ＧＡ４４１、ＧＡ４４２、ＧＡ４７２、ＧＡ４７３、ＧＡ４７４、ＧＡ４７５、ＧＡ４７６、ＧＡ５１７、およびＧＡ５４７として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるｔｒａｃｒ配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９５］前記ｍＲＮＡが、ＭＡ００２、ＭＡ００４、ＭＡ０４０、ＭＡ００４１、またはＭＡ０４５として同定されるｍＲＮＡ配列と８０～１００％の配列同一性を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９６］前記ｍＲＮＡが、以下の表：
Figure 2024038327000292
 で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９７］前記ｍＲＮＡが、以下の表：
Figure 2024038327000293
 で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９８］前記ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［９９］前記ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、以下：
ＬＮＰ組成（モル％）：
ｉＬｉｐｉｄ ４０～６５％
ＤＳＰＣ ２～２０％
ＰＥＧ １～５％
残りのモル％バランスがコレステロール；
ＬＮＰ粒子サイズ：Ｚ平均流体力学的直径 ５５～１２０ｎｍ、および
動的光散乱によって決定される多分散性指数０．２未満
を有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１００］前記ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、５０～７０ｎｍのＺ平均流体力学的直径のＬＮＰ粒子サイズを有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１０１］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１０２］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１０３］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において３０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１０４］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１０５］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１０６］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１０７］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１０８］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１０９］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１０］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１１］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１２］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において８０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１３］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１４］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１５］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１６］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１７］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において８０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１８］前記編集パーセントが、投薬されたカニクイザルの肝臓の分析によって、投薬の１５日後に前記サルの肝生検または剖検を介して決定される、項目８７から１１７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１１９］前記編集パーセントが、前記投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも１６８日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、項目８７から１１７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集のための組成物。
［１２０］前記編集パーセントが、前記投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも３００日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、項目８７から１１７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集のための組成物。
［１２１］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１２２］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１２３］前記組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１２４］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたサルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１２５］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１２６］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１２７］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１２８］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１２９］前記組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３０］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３１］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３２］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３３］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３４］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３５］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３６］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３７］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３８］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１３９］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１４０］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１４１］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１４２］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１４３］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１４４］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１４５］前記血漿タンパク質の低減が、前記投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の１５日後に決定される、項目１２１から１４４に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集のための組成物。
［１４６］前記組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたサルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１４７］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１４８］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１４９］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５０］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５１］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５２］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５３］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５４］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５５］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍ
ＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５６］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５７］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５８］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１５９］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６０］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６１］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６２］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６３］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６４］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６５］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６６］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６７］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６８］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１６９］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７０］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７１］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７２］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７３］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７４］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７５］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７６］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７７］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７８］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１７９］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８０］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８１］前記トリグリセリドレベルの低減が、前記投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の１５日後に決定される、項目１４８から１８０に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８２］前記トリグリセリドレベルの低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも１６８日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１４８から１８０に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８３］前記トリグリセリドレベルの低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１４８から１８０に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８４］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）をベースラインと比較して平均で少なくとも１０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８５］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）レベルをベースラインと比較して平均で少なくとも１５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８６］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）レベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８７］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８８］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１８９］前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）レベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９０］前記リポタンパク質（ａ）の低減が、前記投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって、投薬の１５日後に決定される、項目１８４から１８９に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９１］前記リポタンパク質（ａ）の低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも２２４日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１８４から１８９に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９２］前記リポタンパク質（ａ）の低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、項目１８４から１８９に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９３］前記カニクイザルへの投薬がＡＳＴ、ＡＬＴ、またはサイトカインの上昇をもたらす限り、前記組成物の投薬によってもたらされる前記上昇が一過性であって投薬後３～１５日以内にほぼベースラインレベルに戻る、項目１０１から１９２に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９４］前記ＡＮＧＰＴＬ３の編集パーセントが図２７に示したように肝組織、脾臓組織、および副腎組織の外部では無視できる、項目１０１から１０３、１２１から１２６、１４８から１５３に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９５］繰り返し投薬の結果がＡＮＧＰＴＬ３の編集パーセンテージの前記編集パーセンテージに関して加成性である、項目１０１から１０７、１２１から１３２、１４８から１６２に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９６］前記繰り返し投薬がサイトカインの活性化も免疫応答も誘発しない、項目１９５に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９７］前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８０％のヌクレオチド相関を有し、前記スペーサー配列上のＲＮＡヌクレオチドが同一の順序で前記プロトスペーサーのＤＮＡヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するならば前記ＲＮＡヌクレオチドが前記ＤＮＡヌクレオチドと相関し、ここで相関を決定する目的のためにウラシル塩基およびチミン塩基は同一のヌクレオチドであるとみなされる、項目８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９８］前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８５％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［１９９］前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［２００］前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９５％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［２０１］前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９９％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［２０２］前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも１００％のヌクレオチド相関を有する、項目１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
［２０３］アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における前記疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
（ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、
（ｂ）前記塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および前記塩基エディタータンパク質をＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第１のガイドＲＮＡであって、前記スペーサー配列が前記ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第１のガイドＲＮＡ、および
（ｃ）前記塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および前記塩基エディタータンパク質をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第２のガイドＲＮＡであって、前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第２のガイドＲＮＡ
を前記対象に投与するステップを含む、方法。
［２０４］（ａ）を包摂する第１のＬＮＰをさらに含む、項目２０３に記載の方法。
［２０５］前記第１のＬＮＰが（ｂ）および（ｃ）を包摂する、項目２０４に記載の方法。
［２０６］前記第１のＬＮＰが繰り返し投与される、項目２０４に記載の方法。
［２０７］前記第１のＬＮＰが１～６０日の間隔で繰り返し投与される、項目２０４に記載の方法。
［２０８］前記第１のＬＮＰが７日の間隔で繰り返し投与される、項目２０４に記載の方法。
［２０９］前記第１のＬＮＰが（ｂ）をさらに包摂する、項目２０４に記載の方法。
［２１０］（ａ）および（ｃ）を包摂する第２のＬＮＰをさらに含む、項目２０９に記載の方法。
［２１１］前記第１のＬＮＰと前記第２のＬＮＰが逐次的に投与される、項目２１０に記載の方法。
［２１２］前記第１のＬＮＰと前記第２のＬＮＰが１日～１２か月の間隔で逐次的に投与される、項目２１１に記載の方法。
［２１３］前記間隔が１日である、項目２１２に記載の方法。
［２１４］前記間隔が５日である、項目２１２に記載の方法。
［２１５］前記間隔が１０日である、項目２１２に記載の方法。
［２１６］前記間隔が１５日である、項目２１２に記載の方法。
［２１７］前記間隔が２０日である、項目２１２に記載の方法。
［２１８］前記間隔が２５日である、項目２１２に記載の方法。
［２１９］前記間隔が１か月である、項目２１２に記載の方法。
［２２０］前記間隔が２か月である、項目２１２に記載の方法。
［２２１］前記間隔が３か月である、項目２１２に記載の方法。
［２２２］前記間隔が５か月である、項目２１２に記載の方法。
［２２３］前記間隔が８か月である、項目２１２に記載の方法。
［２２４］前記間隔が１０か月である、項目２１２に記載の方法。
［２２５］前記間隔が１２か月である、項目２１２に記載の方法。

Claims (225)

  1. （ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
    （ｉｉ）前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
    を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
    前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
    前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、組成物。
  2. 哺乳動物対象がカニクイザルであり、前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量約１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記カニクイザルの全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記哺乳動物対象がカニクイザルであり、
    前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量約３ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記カニクイザルの全肝細胞の少なくとも５０％で起こる、
    請求項１に記載の組成物。
  4. 前記核酸塩基の変更が、前記投与前と比較して前記カニクイザルにおける血中トリグリセリドレベルの少なくとも２０％の低減をもたらす、請求項２に記載の組成物。
  5. 前記核酸塩基の変更が、前記投与前と比較して前記カニクイザルにおける血中トリグリセリドレベルの少なくとも５０％の低減をもたらす、請求項３に記載の組成物。
  6. 前記プロトスペーサーがスプライス部位に位置する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. プロトスペーサー相補配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のアンチセンス鎖にある、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  8. プロトスペーサー相補配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のセンス鎖にある、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーの外側（オフターゲット部位）で起こり、
    表１４で説明されるオフターゲット部位の編集パーセンテージがそれぞれ表１４で説明される編集パーセンテージ以下である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記デアミナーゼがアデニンデアミナーゼであり、前記核酸塩基の変更がＡ・ＴからＧ・Ｃへの変更である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９またはＣａｓ
    ９ニッカーゼを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記核酸塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位にある、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記核酸塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスドナー部位にある、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記スプライスドナー部位が配列番号７で参照されるＡＮＧＰＴＬ３イントロン６の５’末端にある、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記核酸塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライスアクセプター部位にある、請求項１２に記載の組成物。
  16. 前記核酸塩基の変更がフレームシフト、未成熟終止コドン、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記核酸塩基の変更が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記ガイドＲＮＡが化学的に改変されている、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記ガイドＲＮＡの前記ｔｒａｃｒ配列が、図７に示すスキームに従って化学的に改変されている、請求項１６に記載の組成物。
  20. 前記スペーサー配列が、表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡスペーサー配列を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記ガイドＲＮＡが、表１で説明される、ＧＡ０６７、ＧＡ０９１、ＧＡ０９８、ＧＡ０９９、ＧＡ１００、ＧＡ１０１、ＧＡ１０２、ＧＡ１０３、ＧＡ３４７、ＧＡ４４１、ＧＡ４４２、ＧＡ４７２、ＧＡ４７３、ＧＡ４７４、ＧＡ４７５、ＧＡ４７６、ＧＡ５１７、またはＧＡ５４７のＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. プロトスペーサー配列が、表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥプロトスペーサー配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  23. プロトスペーサーが、配列５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１４）、５’－ＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号１５）、５’－ＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣ－３’（配列番号１６０６）、５’－ＡＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号２４８）、または５’－ＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣ－３’（配列番号２４９）を含む、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記塩基エディター融合タンパク質が配列番号２１３７のアミノ酸配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が５０％より大きい、請求項１から２４のいずれか一項
    に記載の組成物。
  26. 前記ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が５６％より大きい、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ｍＲＮＡ配列のＧＣ％含量が６３％以上である、請求項２６に記載の組成物。
  28. 前記ｍＲＮＡがアデニンｔＴＮＡデアミナーゼ（ＴａｄＡ）領域、Ｃａｓ９領域、および核局在化配列（ＮＬＳ）領域を含む、請求項２５に記載の組成物。
  29. 前記ｍＲＮＡが、前記ＴａｄＡ領域と前記Ｃａｓ９領域を連結する第１のリンカー領域および前記Ｃａｓ９領域と前記ＮＬＳ領域を連結する第２のリンカー領域をさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が６０％より大きい、請求項２８または２９に記載の組成物。
  31. 前記ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が７０％以上である、請求項２８または２９に記載の組成物。
  32. 前記Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が５６％より大きい、請求項２８または２９に記載の組成物。
  33. 前記Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が６２％以上である、請求項２８または２９に記載の組成物。
  34. 前記ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が５４％より大きい、請求項２８または２９に記載の組成物。
  35. 前記ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が６３％以上である、請求項２８または２９に記載の組成物。
  36. 前記第１のリンカー領域のＧＣ％含量が６５％より大きい、請求項２９に記載の組成物。
  37. 前記第１のリンカー領域のＧＣ％含量が７９％以上である、請求項２９に記載の組成物。
  38. 前記第２のリンカー領域のＧＣ％含量が６７％より大きい、請求項２９に記載の組成物。
  39. 前記第２のリンカー領域のＧＣ％含量が８３％以上である、請求項２９に記載の組成物。
  40. 前記ＴａｄＡ領域のＧＣ％含量が６０％より大きく、前記Ｃａｓ９領域のＧＣ％含量が５６％より大きく、前記ＮＬＳ領域のＧＣ％含量が５４％より大きく、前記第１のリンカー領域のＧＣ％含量が６５％より大きく、前記第２のリンカー領域のＧＣ％含量が６７％より大きい、請求項２９に記載の組成物。
  41. 前記ｍＲＮＡが表２３から選択されるｍＲＮＡ配列を含む、請求項２５に記載の組成物。
  42. 前記ｍＲＮＡが配列番号２１３６のｍＲＮＡ配列を含む、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記ｍＲＮＡがポリＡテイルを含む、請求項２５から４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. （ｉ）を封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をさらに含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 前記ＬＮＰが（ｉｉ）をさらに封入する、請求項４４に記載の組成物。
  46. （ｉｉ）を封入する第２のＬＮＰをさらに含む、請求項４４に記載の組成物。
  47. 前記ガイドＲＮＡと前記塩基エディター融合タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡとの比が重量で約１：１０～約１０：１である、請求項１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  48. 前記ガイドＲＮＡと前記塩基エディター融合タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡとの比が重量で約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、１：１．５、１：２、１：３、または１：４である、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記ガイドＲＮＡと前記塩基エディター融合タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡとの比が重量で約１：１である、請求項４８に記載の組成物。
  50. 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
  51. 状態の処置または防止を必要とする対象における状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の請求項１に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  52. 前記投与が静脈内注入を介する、請求項５１に記載の方法。
  53. （ｉ）を封入するＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの逐次投与を含む、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. （ｉ）を封入するｔＬＮＰおよび（ｉｉ）を封入するＬＮＰの同時投与を含む、請求項５１または５２に記載の方法。
  55. 単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く１日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
  56. 単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く２日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
  57. 単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く３日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
  58. 単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く４日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
  59. 単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く５日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
  60. 単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く６日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
  61. 単回用量の前記（ｉｉ）を封入するＬＮＰおよびそれに続く７日間隔での時差用量の前記（ｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
  62. 単回用量の（ｉ）および（ｉｉ）を封入するＬＮＰを投与するステップを含む、請求項５１または５２に記載の方法。
  63. 前記ＬＮＰの単回用量が約０．３～約３ｍｇ／ｋｇである、請求項６２に記載の方法。
  64. １つまたは複数の処置の処置コースを前記対象に投与するステップを含み、前記１つまたは複数の処置のそれぞれの１つが前記単回用量の前記ＬＮＰの１つまたは複数を含む、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. ２回から１０回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項６４に記載の方法。
  66. ２回から５回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項６４に記載の方法。
  67. ２回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項６４に記載の方法。
  68. ３回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項６４に記載の方法。
  69. ４回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項６４に記載の方法。
  70. ５回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項６２に記載の方法。
  71. 前記状態がアテローム硬化性心血管疾患である、請求項５１から７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記状態がアテローム硬化性血管疾患である、請求項５１から７０のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記対象がヒトである、請求項５１から７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. （ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
    （ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
    を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
    前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、前記ガイドＲＮＡが、表１で説明されるＡＮＧＰＴＬ３ ＡＢＥガイドＲＮＡ配列を含む、組成物。
  75. （ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
    （ｉｉ）塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
    を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
    前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、前記ｍＲＮＡが、表２３から選択される配列を含む、組成物。
  76. アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における前記疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
    （ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
    （ｉｉ）前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
    を含み、
    前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて前記ＰＣＳＫ９遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
    前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第１の組成物、ならびに
    （ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
    （ｉｉ）前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
    を含み、
    前記ガイドＲＮＡが、哺乳動物対象に投与された場合に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
    前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量少なくとも１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、第２の組成物
    を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  77. 前記第１の組成物および前記第２の組成物の逐次投与を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. １つまたは複数の用量の前記第１の組成物に続いて１つまたは複数の用量の前記第２の組成物を投与するステップを含む、請求項７７に記載の方法。
  79. １つまたは複数の用量の前記第２の組成物に続いて１つまたは複数の用量の前記第１の組成物を投与するステップを含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記第１の組成物および前記第２の組成物の同時投与を含む、請求項７６に記載の方法
    。
  81. １つまたは複数の用量の前記第１の組成物および前記第２の組成物を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. （ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするｍＲＮＡ、
    （ｉｉ）前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
    を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
    前記ガイドＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における核酸塩基の変更をももたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
    前記ガイドＲＮＡおよび前記ｍＲＮＡが全量少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも３５％で起こる、
    組成物。
  83. ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも４０％で起こる、請求項８２に記載の組成物。
  84. ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも４５％で起こる、請求項８２に記載の組成物。
  85. ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも５０％で起こる、請求項８２に記載の組成物。
  86. ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも２．５ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも５５％で起こる、請求項８２に記載の組成物。
  87. ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡが全量少なくとも３ｍｇ／ｋｇで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはＳａｎｇｅｒシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも６０％で起こる、請求項８２に記載の組成物。
  88. （ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、および
    （ｂ）前記塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および前記塩基エディタータンパク質を前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ
    を含む、前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物であって、
    前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に
    少なくとも部分的に相補的である、組成物。
  89. 前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドＲＮＡに作動可能に結合され、前記ガイドＲＮＡが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位を包含する、請求項８３に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  90. 前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドＲＮＡに作動可能に結合され、前記ガイドＲＮＡが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロンの領域を包含する、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  91. 前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドＲＮＡに作動可能に結合され、前記ガイドＲＮＡが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロン１、イントロン３、またはイントロン４の領域を包含する、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  92. 前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドＲＮＡに作動可能に結合され、前記ガイドＲＮＡが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のイントロン１の領域を包含する、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  93. 前記スペーサー配列が、ＧＡ０６７、ＧＡ１００、およびＧＡ５７４として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるスペーサー配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  94. 前記ｔｒａｃｒ配列が、ＧＡ０６７、ＧＡ０９１、ＧＡ０９８、ＧＡ０９９、ＧＡ１００、ＧＡ１０１、ＧＡ１０２、ＧＡ１０３、ＧＡ３４７、ＧＡ４４１、ＧＡ４４２、ＧＡ４７２、ＧＡ４７３、ＧＡ４７４、ＧＡ４７５、ＧＡ４７６、ＧＡ５１７、およびＧＡ５４７として同定されるガイドＲＮＡ配列の群から選択されるｔｒａｃｒ配列と８０～１００％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  95. 前記ｍＲＮＡが、ＭＡ００２、ＭＡ００４、ＭＡ０４０、ＭＡ００４１、またはＭＡ０４５として同定されるｍＲＮＡ配列と８０～１００％の配列同一性を有する、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  96. 前記ｍＲＮＡが、以下の表：
    Figure 2024038327000294
     で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  97. 前記ｍＲＮＡが、以下の表：
    Figure 2024038327000295
     で説明されるＧＣヌクレオチド領域パーセンテージの１つまたは複数を有する、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  98. 前記ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  99. 前記ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、以下：
    ＬＮＰ組成（モル％）：
    ｉＬｉｐｉｄ ４０～６５％
    ＤＳＰＣ ２～２０％
    ＰＥＧ １～５％
    残りのモル％バランスがコレステロール；
    ＬＮＰ粒子サイズ：Ｚ平均流体力学的直径 ５５～１２０ｎｍ、および
    動的光散乱によって決定される多分散性指数０．２未満
    を有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  100. 前記ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、５０～７０ｎｍのＺ平均流体力学的直径のＬＮＰ粒子サイズを有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  101. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  102. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  103. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において３０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  104. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  105. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  106. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  107. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  108. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  109. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  110. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  111. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  112. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよ
    びｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において８０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  113. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において４０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  114. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において５０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  115. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において６０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  116. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において７０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  117. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ＡＮＧＰＴＬ３標的スプライス部位において８０パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  118. 前記編集パーセントが、投薬されたカニクイザルの肝臓の分析によって、投薬の１５日後に前記サルの肝生検または剖検を介して決定される、請求項８７から１１７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  119. 前記編集パーセントが、前記投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも１６８日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、請求項８７から１１７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集のための組成物。
  120. 前記編集パーセントが、前記投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも３００日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、請求項８７から１１７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集のための組成物。
  121. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベー
    スラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  122. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  123. 前記組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  124. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたサルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  125. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  126. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  127. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  128. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  129. 前記組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  130. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  131. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  132. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  133. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  134. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  135. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  136. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  137. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  138. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよ
    びｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  139. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  140. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  141. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  142. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  143. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも７０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  144. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも８０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  145. 前記血漿タンパク質の低減が、前記投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の１５日後に決定される、請求項１２１から１４４に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の編集のための組成物。
  146. 前記組成物がサルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたサルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  147. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  148. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  149. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  150. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  151. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ０．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  152. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  153. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  154. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  155. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍ
    ＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  156. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  157. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  158. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  159. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  160. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  161. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  162. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  163. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラ
    インと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  164. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  165. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  166. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  167. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  168. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  169. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  170. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ１．５ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  171. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  172. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  173. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  174. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  175. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  176. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも４５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  177. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  178. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも５５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  179. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  180. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍ
    ＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも６５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  181. 前記トリグリセリドレベルの低減が、前記投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の１５日後に決定される、請求項１４８から１８０に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  182. 前記トリグリセリドレベルの低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも１６８日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、請求項１４８から１８０に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  183. 前記トリグリセリドレベルの低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、請求項１４８から１８０に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  184. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）をベースラインと比較して平均で少なくとも１０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  185. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）レベルをベースラインと比較して平均で少なくとも１５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  186. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）レベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  187. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも２５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  188. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３０パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  189. 前記組成物がカニクイザルの体重１ｋｇあたりほぼ３ｍｇの前記ガイドＲＮＡおよびｍ
    ＲＮＡを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質（ａ）レベルをベースラインと比較して平均で少なくとも３５パーセント低減させることができる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  190. 前記リポタンパク質（ａ）の低減が、前記投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって、投薬の１５日後に決定される、請求項１８４から１８９に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  191. 前記リポタンパク質（ａ）の低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも２２４日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、請求項１８４から１８９に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  192. 前記リポタンパク質（ａ）の低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも３００日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、請求項１８４から１８９に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  193. 前記カニクイザルへの投薬がＡＳＴ、ＡＬＴ、またはサイトカインの上昇をもたらす限り、前記組成物の投薬によってもたらされる前記上昇が一過性であって投薬後３～１５日以内にほぼベースラインレベルに戻る、請求項１０１から１９２に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  194. 前記ＡＮＧＰＴＬ３の編集パーセントが図２７に示したように肝組織、脾臓組織、および副腎組織の外部では無視できる、請求項１０１から１０３、１２１から１２６、１４８から１５３に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  195. 繰り返し投薬の結果がＡＮＧＰＴＬ３の編集パーセンテージの前記編集パーセンテージに関して加成性である、請求項１０１から１０７、１２１から１３２、１４８から１６２に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  196. 前記繰り返し投薬がサイトカインの活性化も免疫応答も誘発しない、請求項１９５に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  197. 前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８０％のヌクレオチド相関を有し、前記スペーサー配列上のＲＮＡヌクレオチドが同一の順序で前記プロトスペーサーのＤＮＡヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するならば前記ＲＮＡヌクレオチドが前記ＤＮＡヌクレオチドと相関し、ここで相関を決定する目的のためにウラシル塩基およびチミン塩基は同一のヌクレオチドであるとみなされる、請求項８８に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  198. 前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも８５％のヌクレオチド相関を有する、請求項１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  199. 前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９０％のヌクレオチド相関を有する、請求項１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  200. 前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９５％のヌクレオチド相関を有する、請求項１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  201. 前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも９９％のヌクレオチド相関を有する、請求項１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  202. 前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも１００％のヌクレオチド相関を有する、請求項１９７に記載のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を編集するための組成物。
  203. アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における前記疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
    （ａ）編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡ、
    （ｂ）前記塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および前記塩基エディタータンパク質をＰＣＳＫ９遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第１のガイドＲＮＡであって、前記スペーサー配列が前記ＰＣＳＫ９遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第１のガイドＲＮＡ、および
    （ｃ）前記塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ配列、および前記塩基エディタータンパク質をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第２のガイドＲＮＡであって、前記スペーサー配列が前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第２のガイドＲＮＡ
    を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  204. （ａ）を包摂する第１のＬＮＰをさらに含む、請求項２０３に記載の方法。
  205. 前記第１のＬＮＰが（ｂ）および（ｃ）を包摂する、請求項２０４に記載の方法。
  206. 前記第１のＬＮＰが繰り返し投与される、請求項２０４に記載の方法。
  207. 前記第１のＬＮＰが１～６０日の間隔で繰り返し投与される、請求項２０４に記載の方法。
  208. 前記第１のＬＮＰが７日の間隔で繰り返し投与される、請求項２０４に記載の方法。
  209. 前記第１のＬＮＰが（ｂ）をさらに包摂する、請求項２０４に記載の方法。
  210. （ａ）および（ｃ）を包摂する第２のＬＮＰをさらに含む、請求項２０９に記載の方法。
  211. 前記第１のＬＮＰと前記第２のＬＮＰが逐次的に投与される、請求項２１０に記載の方法。
  212. 前記第１のＬＮＰと前記第２のＬＮＰが１日～１２か月の間隔で逐次的に投与される、請求項２１１に記載の方法。
  213. 前記間隔が１日である、請求項２１２に記載の方法。
  214. 前記間隔が５日である、請求項２１２に記載の方法。
  215. 前記間隔が１０日である、請求項２１２に記載の方法。
  216. 前記間隔が１５日である、請求項２１２に記載の方法。
  217. 前記間隔が２０日である、請求項２１２に記載の方法。
  218. 前記間隔が２５日である、請求項２１２に記載の方法。
  219. 前記間隔が１か月である、請求項２１２に記載の方法。
  220. 前記間隔が２か月である、請求項２１２に記載の方法。
  221. 前記間隔が３か月である、請求項２１２に記載の方法。
  222. 前記間隔が５か月である、請求項２１２に記載の方法。
  223. 前記間隔が８か月である、請求項２１２に記載の方法。
  224. 前記間隔が１０か月である、請求項２１２に記載の方法。
  225. 前記間隔が１２か月である、請求項２１２に記載の方法。
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