JP2023518915A - Angptl3の塩基編集および疾患の処置のためにこれを使用する方法 - Google Patents
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[001]本出願は、2020年4月9日出願の仮出願第63/007,803号、2020年4月9日出願の仮出願第63/007,797号、2021年1月11日出願の仮出願第63/136,087号、2020年6月26日出願の仮出願第63/045,032号、2020年6月26日出願の仮出願第63/045,033号による35 U.S.C.第119条の下での利益を主張する。これらの開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
[002]本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、これにより参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ASCIIコピーは2021年4月8日に作成され、53989_711_601_SL.txtと命名されており、サイズは1,105,762バイトである。
[003]遺伝子の改変または編集のための組成物、ならびに心血管の疾患および状態または糖尿病等のそれに関連する疾患等のある種の状態を処置または防止することができる、組成物を使用する方法が本明細書で提供される。
り、コレステロールがアテローム性硬化プラーク、コレステロールの混合物、動脈硬化をもたらす血管壁の細胞および細胞デブリの進行を促進する。ASCVDの処置および防止における現在の拠り所は、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C、一般に「悪玉」コレステロールとして知られる)および/またはトリグリセリドをできるだけ長い期間、できるだけ低く維持することを目的として血中脂質への累積的な曝露を低下させることである。例えば、十分に長い期間にわたってLDL-Cを十分に低いレベルに維持する個体はASCVDを発症する可能性が実質的に低いことを実証する顕著な証拠がある。LDL-Cの低下とASCVDの低減との関係は、医学における全ての関係の中で最も理解されている。確定したASCVDを有する患者においてLDL-Cを5年間で39mg/dL低下させるとASCVDのリスクが21%低減する一方、生涯にわたるLDL-Cの同じ39mg/dL程度の低減が最初のASCVDの事象を88%低減させることが示されている。現在の標準的治療は、典型的には毎日の多数の錠剤および/または間欠的な注射を必要とする慢性治療モデルであり、LDL-Cへの累積的な曝露を十分に制御できないことが多い。そのような慢性的治療が利用できるにも関わらず、LDL-Cへの累積的な曝露はASCVDを有する多くの患者において十分に制御できないことが多く、確定したASCVDを有する個体の多くの割合は、推奨される目標を上回るLDL-Cレベルを有する。累積するLDL-Cへの曝露が高くなると、心臓または頸動脈におけるコレステロールプラークの集積が加速され、その破裂は心臓麻痺、心臓死、発作、ならびに冠動脈内ステント留置術および冠動脈バイパス手術等の侵襲的な医学手技の必要性をもたらすことがある。
を含む。一部の実施形態では、プロトスペーサー配列は、表1で説明される、ANGPTL3 ABEプロトスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、プロトスペーサーは、配列5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(配列番号14)、5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号15)、5’-GATACCTGAATAACTCTC-3’(配列番号1606)、5’-AGATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号248)、または5’-GATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号249)を含む。一部の実施形態では、塩基エディター融合タンパク質は配列番号2137のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、mRNA配列のGC%含量は50%より大きい。一部の実施形態では、mRNA配列のGC%含量は56%より大きい。一部の実施形態では、mRNA配列のGC%含量は63%以上である。一部の実施形態では、mRNAはアデニンtTNAデアミナーゼ(TadA)領域、Cas9領域、および核局在化配列(NLS)領域を含む。一部の実施形態では、mRNAは、TadA領域とCas9領域を連結する第1のリンカー領域およびCas9領域とNLS領域を連結する第2のリンカー領域をさらに含む。一部の実施形態では、TadA領域のGC%含量は60%より大きい。一部の実施形態では、TadA領域のGC%含量は70%以上である。一部の実施形態では、Cas9領域のGC%含量は56%より大きい。一部の実施形態では、Cas9領域のGC%含量は62%以上である。一部の実施形態では、NLS領域のGC%含量は54%より大きい。一部の実施形態では、NLS領域のGC%含量は63%以上である。一部の実施形態では、第1のリンカー領域のGC%含量は65%より大きい。一部の実施形態では、第1のリンカー領域のGC%含量は79%以上である。一部の実施形態では、第2のリンカー領域のGC%含量は67%より大きい。一部の実施形態では、第2のリンカー領域のGC%含量は83%以上である。一部の実施形態では、TadA領域のGC%含量は60%より大きく、Cas9領域のGC%含量は56%より大きく、NLS領域のGC%含量は54%より大きく、第1のリンカー領域のGC%含量は65%より大きく、第2のリンカー領域のGC%含量は67%より大きい。一部の実施形態では、mRNAは表23から選択されるmRNA配列を含む。一部の実施形態では、mRNAは配列番号2136のmRNA配列を含む。一部の実施形態では、mRNAはポリAテイルを含む。一部の実施形態では、組成物は(i)を封入する脂質ナノ粒子(LNP)をさらに含む。一部の実施形態では、LNPは(ii)をさらに封入する。一部の実施形態では、組成物は(ii)を封入する第2のLNPをさらに含む。一部の実施形態では、ガイドRNAと塩基エディター融合タンパク質をコードするmRNAとの比は重量で約1:10~約10:1である。一部の実施形態では、ガイドRNAと塩基エディター融合タンパク質をコードするmRNAとの比は重量で約1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、1:1.5、1:2、1:3、または1:4である。一部の実施形態では、ガイドRNAと塩基エディター融合タンパク質をコードするmRNAとの比は重量で約1:1である。
[0016]別の態様では、状態の処置または防止を必要とする対象における状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の本明細書で提供される組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、投与は静脈内注入を介する。一部の実施形態では、方法は(i)を封入するLNPおよび(ii)を封入するLNPの逐次投与を含む。一部の実施形態では、方法は(i)を封入するLNPおよび(ii)を封入するLNPの同時投与を含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く1日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く2日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く3日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む。一
部の実施形態では、方法は単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く4日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く5日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く6日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く7日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は単回用量の(i)および(ii)を封入するLNPを投与するステップを含む。一部の実施形態では、LNPの単回用量は約0.3~約3mg/kgである。一部の実施形態では、方法は1つまたは複数の処置の処置コースを対象に投与するステップを含み、1つまたは複数の処置のそれぞれの1つは単回用量のLNPの1つまたは複数を含む。一部の実施形態では、方法は2回から10回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は2回から5回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は2回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は3回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は4回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は5回の処置の処置コースを投与するステップを含む。一部の実施形態では、状態はアテローム硬化性心血管疾患である。一部の実施形態では、状態はアテローム硬化性血管疾患である。一部の実施形態では、対象はヒトである。
(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびPCSK9遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNAを含み、ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてPCSK9遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、第1の組成物、ならびに(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、ま
たはそれをコードするmRNA、(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNAを含み、ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも1mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、第2の組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は第1の組成物および第2の組成物の逐次投与を含む。一部の実施形態では、方法は1つまたは複数の用量の第1の組成物に続いて1つまたは複数の用量の第2の組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は1つまたは複数の用量の第2の組成物に続いて1つまたは複数の用量の第1の組成物を投与するステップを含む。一部の実施形態では、方法は第1の組成物および第2の組成物の同時投与を含む。一部の実施形態では、方法は1つまたは複数の用量の第1の組成物および第2の組成物を含む。
L3遺伝子のスプライス部位を包含する。一部の実施形態では、塩基エディタータンパク質がガイドRNAに作動可能に結合し、ガイドRNAがANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズした場合に、編集ウィンドウはANGPTL3遺伝子のイントロンの領域を包含する。一部の実施形態では、塩基エディタータンパク質がガイドRNAに作動可能に結合し、ガイドRNAがANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズした場合に、編集ウィンドウはANGPTL3遺伝子のイントロン1、イントロン3、またはイントロン4の領域を包含する。一部の実施形態では、塩基エディタータンパク質がガイドRNAに作動可能に結合され、ガイドRNAがANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウはANGPTL3遺伝子のイントロン1の領域を包含する。一部の実施形態では、スペーサー配列は、GA067、GA100、およびGA574として同定されるガイドRNA配列の群から選択されるスペーサー配列と80~100%のヌクレオチド配列同一性を有する。一部の実施形態では、tracr配列は、GA067、GA091、GA098、GA099、GA100、GA101、GA102、GA103、GA347、GA441、GA442、GA472、GA473、GA474、GA475、GA476、GA517、およびGA547として同定されるガイドRNA配列の群から選択されるtracr配列と80~100%のヌクレオチド配列同一性を有する。一部の実施形態では、mRNAは、MA002、MA004、MA040、MA0041、またはMA045として同定されるmRNA配列と80~100%の配列同一性を有する。一部の実施形態では、mRNAは、以下の表:
[0021]一部の実施形態では、mRNAは、以下の表:
[0022]一部の実施形態では、mRNAおよびgRNAは脂質ナノ粒子の中にカプセル化されている。一部の実施形態では、mRNAおよびgRNAは、以下:LNP組成(モル%):
iLipid 40~65%
DSPC 2~20%
PEG 1~5%
残りのモル%バランスがコレステロール;
LNP粒子サイズ:Z平均流体力学的直径 55~120nm、および
動的光散乱によって決定される多分散性指数0.2未満
を有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化されている。
投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも70パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも80パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも70パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも80パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、血漿タンパク質の低減は、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の15日後に決定される。一部の実施形態では、組成物は、サルの体重1kgあたりほぼ0.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたサルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも45パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも45パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも55パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿
中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも45パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも55パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも65パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも45パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも55パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも65パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、トリグリセリドレベルの低減は、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって、投薬の15日後に決定される。一部の実施形態では、トリグリセリドレベルの低減は、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも168日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、トリグリセリドレベルの低減は、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも300日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)をベースラインと比較して平均で少なくとも10パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも15パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、組成物は、カニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgのガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)のレベルをベースラインと比較して平均でほぼ35パーセント低減させることができる。一部の実施形態では、リポタンパク質(a)の低減は、投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって、投薬の15日後に決定される。一部の実施形態では、リポタンパク質(a)の低減は、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも224日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、リポタンパク質(a)の低減は、投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも300日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される。一部の実施形態では、カニクイザルへの投薬がAST、ALT、またはサイトカインの上昇をもたらす限り、組成物の投薬によってもたらされる上昇は一過性であって投薬後3~15日以内にほぼベースラインレベルに戻る。一部の実施形態では、ANGPTL3の編集パーセントは図27に示したように肝組織、脾臓組織、および副腎組織の外部では無視できる。一部の実施形態では、繰り返し投薬の結果はANGPTL3の編集パーセンテージの編集パーセンテージに関して加成性である。一部の実施形態では、繰り返し投薬はサイトカインの活性化も免疫応答も誘発しない。一部の実施形態では、スペーサー配列はANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも80%のヌクレオチド相関を有し、スペーサー配列上のRNAヌクレオチドが同一の順序でプロトスペーサーのDNAヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するならばRNAヌクレオチドはDNAヌクレオチドと相関し、ここで相関を決定する目的のためにウラシル塩基およびチミン塩基は同一のヌクレオチドであるとみなされる。一部の実施形態では、スペーサー配列はANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも85%のヌクレオチド相関を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列はANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも90%のヌクレオチド相関を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列はANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも95%のヌクレオチド相関を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列はANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも99%のヌクレオチド相関を有する。一部の実施形態では、スペーサー配列はANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも100%のヌクレオチド相関を有する。
(a)編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするmRNA、(b)塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および塩基エディタータンパク質をPCSK9遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第1のガイドRNAであって、スペーサー配列がPCSK9遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第1のガイドRNA、および
(c)塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および塩基エディタータンパク質をANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第2のガイドRNAであって、スペーサー配列がANGPTL3遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第2のガイドRNAを対象に投与するステップを含む、方法が本明細書で開示される。一部の実施形態では、方法は(a)を封入する第1のLNPをさらに含む。一部の実施形態では、第1のLNPは(b)および(c)を封入する。一部の実施形態では、第1のLNPは繰り返し投与される。一部の実施形態では、第1のLNPは1~60日の間隔で繰り返し投与される。一部の実施形態では、第1のLNPは7日の間隔で繰り返し投与される。一部の実施形態では、第1のLNPは(b)をさらに封入する。一部の実施形態では、方法は、(a)および(c)を封入する第2のLNPをさらに含む。一部の実施形態では、第1のLNPと第2のLNPは逐次的に投与される。一部の実施形態では、第1のLNPと第2のLNPは1日~12か月の間隔で逐次的に投与される。一部の実施形態では、間隔は1日である。一部の実施形態では、間隔は5日である。一部の実施形態では、間隔は10日である。一部の実施形態では、間隔は15日である。一部の実施形態では、間隔は20日である。一部の実施形態では、間隔は25日である。一部の実施形態では、間隔は1か月である。一部の実施形態では、間隔は2か月である。一部の実施形態では、間隔は3か月である。一部の実施形態では、間隔は5か月である。一部の実施形態では、間隔は8か月である。一部の実施形態では、間隔は10か月である。一部の実施形態では、間隔は12か月である。
[83]本開示の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
[84]本明細書および添付した特許請求の範囲で使用する場合、単数形「1つ(aおよびan)」および「the」は、文脈によって他が明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。
か、即ち測定系の限界に依存することになる。例えば、「約」は、当技術の実施についての標準偏差の1倍以内または1倍を超えることを意味し得る。あるいは、「約」は所与の値の20%まで、10%まで、5%まで、または1%までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システムまたは生物プロセスに関して、この用語はある値の1桁以内、5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味し得る。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合には、他に述べない限り、特定の値の許容される誤差範囲内を意味する用語「約」が仮定されるべきである。
、および「ペプチド」は、特定の順序、例えばタンパク質をコードする遺伝子またはRNAにおけるヌクレオチドの塩基配列によって決定される順序で2つ以上のアミノ酸からなる分子を意味する。タンパク質は生体の細胞、組織、および臓器の構造、機能、および制御のために重要であり、それぞれのタンパク質は特有の機能を有する。その例には、ホルモン、酵素、抗体、およびそれらの任意の断片がある。一部の例では、タンパク質は、タンパク質の一部、例えばタンパク質のドメイン、サブドメイン、またはモチーフであってよい。一部の例では、タンパク質は、タンパク質のバリアント(または変異)であってよく、この場合には1つまたは複数のアミノ酸残基が、天然に存在する(または少なくとも既知の)タンパク質のアミノ酸配列に挿入され、それから欠失し、および/またはそれを置換する。タンパク質またはそのバリアントは天然に存在してもよく、組換えでもよい。生体材料中のポリペプチドの検出および/または測定の方法は当技術で周知であり、それだけに限らないがウェスタンブロット、フローサイトメトリー、ELISA、RIA、および種々のプロテオミクス手法を含む。ポリペプチドを測定または検出する例示的な方法としては、イムノアッセイ、例えばELISAがある。この種のタンパク質定量法は、特定の抗原を捕捉することができる抗体、および捕捉された抗原を検出することができる第2の抗体に基づいてよい。ポリペプチドの検出および/または測定のための例示的なアッセイは、Harlow,E.およびLane,D. Antibodies:A Laboratory Manual,(1988),Cold Spring Harbor
Laboratory Pressに記載されている。
例えば:
A: AAGGCTT
B: AAGGC
C: AAGGCAT
ここで同一性(A,B)=100%(5つの同一ヌクレオチド/min(長さ(A)、長さ(B)))。同一性(B,C)=100%、しかし同一性(A,C)=85%(6つの同一ヌクレオチド/7)。したがって100%の同一性は2つの配列が同一であることを意味しない。
語「トリグリセリド」は、本明細書で使用される場合、3つの脂肪酸分子に結合したグリセロールからなるトリエステルを意味する。一部の実施形態では、脂肪酸は飽和または不飽和の脂肪酸である。
進展を確かにすることを意味する。疾患の進行は検出可能で、当技術で周知の標準的な臨床手法を使用して評価することができる。しかし、進行は検出できないであろう進展も意味する。本開示の目的のため、進行または進展は症状の生物学的経過を意味する。「進行」は、発生、再発、および発症を含む。
[110]「投与する」およびその文法的等価物は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載した医薬組成物を対象または患者に提供することを意味し得る。医薬の技術における当業者には既知の従来の方法を使用し、処置すべき疾患の種類または疾患の部位に応じて、組成物を対象に投与することができる。例えば、組成物は例えば経口で、非経口で、吸入スプレイによって、局所的に、経直腸で、経鼻で、頬側に、経膣で、埋め込みリザーバーを介して、または注入によって、投与することができる。1つまたは複数のそのような経路を採用することができる。
術で一般に考えられている酸または塩基の塩であってよい。そのような塩は、アミン等の塩基性残基の鉱酸または有機酸の塩、ならびにカルボン酸等の酸性残基のアルカリもしくは有機の塩を含む。特定の医薬品の塩は、それだけに限らないが、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、2-ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、2-アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、酢酸等のアルカン酸、nが1~4であるHOOC-(CH2)n-COOH、その他の同種のものの塩を含む。同様に、薬学的に許容されるカチオンは、それだけに限らないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、およびアンモニウムを含む。当業者であれば、本開示および当技術における知識から、さらなる薬学的に許容される塩はRemington’s Pharmaceutical Sciences、17版、Mack Publishing Company、Easton、PA、1418頁(1985)に列挙されたものを含むことを認識することになる。一般に、薬学的に許容される酸または塩基の塩は、塩基性または酸性の部分を含む親化合物から任意の従来の化学的方法によって合成され得る。簡単に述べると、そのような塩は、遊離の酸または塩基の形態のこれらの化合物を化学量論的な量の適切な塩基または酸と適切な溶媒中で反応させることによって調製され得る。
と(例えば神経細胞を使用して)または動物モデル(例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、またはブタ)を使用することによる。用量は、細胞培養で決定したIC50(即ち、症状の阻害の最大半量を達成する組成物の濃度)を含む濃度範囲を達成するように動物モデルで処方されてよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いられ得る。開示した組成物が治療に有効であるための適切な濃度範囲の決定に加えて、動物モデルによって、最大の効果を生じる好ましい投与経路等の他の関連する情報を得ることもできる。上記の方法および他の方法に基づいてヒトにおける最大有効性を達成するための用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
[125]一部の態様では、核酸塩基の改変が可能な塩基エディターシステムが本明細書で提供される。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸、および(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムはガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸を含む。
[128]一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.3%、99.5%、99.7%、99.8%、または99.9%で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の多くとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.3%、99.5%、99.7%、99.8%、または99.9%で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の1%~99.9%、2%~99.9%、3%~99.9%、4%~99.9%、5%~99.9%、6%~99.9%、7%~99.9%、8%~99.9%、9%~99.9%、10%~99.9%、15%~99.9%、20%~99.9%、25%~99.9%、30%~99.9%、35%~99.9%、40%~99.9%、45%~99.9%、50%~99.9%、55%~99.9%、60%~99.9%、65%~99.9%、70%~99.9%、75%~99.9%、80%~99.9%、85%~99.9%、90%~99.9%、または95~99.9%で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の1%~99.5%、1%~99%、1%~98%、1%~97%、1%~96%、1%~95%、1%~90%、1%~85%、1%~80%、1%~75%、1%~70%、1%~65%、1%~60%、1%~55%、1%~50%、1%~45%、1%~40%、1%~35%、1%~30%、1%~25%、1%~20%、1%~15%、1%~10%、1%~9%、1%~8%、1%~7%、1%~6%、1%~5%、1%~4%、1%~3%、または1%~2%で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の1%~90%、5%~85%、10%~80%、15%~75%、20%~70%、25%~65%、30%~60%、35%~55%、または40%~50%で起こる。一部の実施形態では、塩基の変更は、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングで測定して、対象の全肝細胞の100%で起こる。
たはLC-MS/MSによって測定して、投与前と比較して対象における血液ANGPTL3タンパク質レベルの少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ELISA、ウェスタンブロット、またはLC-MS/MSによって測定して、投与前と比較して対象における血液ANGPTL3タンパク質レベルの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、90%、95%、97%、98%、99%、99.3%、99.5%、99.7%、99.8%、または99.9%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ELISA、ウェスタンブロット、またはLC-MS/MSによって測定して、投与前と比較して対象における血液ANGPTL3タンパク質レベルの多くとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、90%、95%、97%、98%、99%、99.3%、99.5%、99.7%、99.8%、または99.9%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ELISA、ウェスタンブロット、またはLC-MS/MSによって測定して、投与前と比較して対象における血液ANGPTL3タンパク質レベルの1%~99.9%、2%~99.9%、3%~99.9%、4%~99.9%、5%~99.9%、6%~99.9%、7%~99.9%、8%~99.9%、9%~99.9%、10%~99.9%、15%~99.9%、20%~99.9%、25%~99.9%、30%~99.9%、31%~99.9%、32%~99.9%、33%~99.9%、34%~99.9%、35%~99.9%、36%~99.9%、37%~99.9%、38%~99.9%、39%~99.9%、40%~99.9%、45%~99.9%、50%~99.9%、55%~99.9%、60%~99.9%、65%~99.9%、70%~99.9%、75%~99.9%、80%~99.9%、85%~99.9%、90%~99.9%、または95~99.9%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ELISA、ウェスタンブロット、またはLC-MS/MSによって測定して、投与前と比較して対象における血液ANGPTL3タンパク質レベルの1%~99.5%、1%~99%、1%~98%、1%~97%、1%~96%、1%~95%、1%~90%、1%~85%、1%~80%、1%~79%、1%~78%、1%~77%、1%~76%、1%~75%、1%~74%、1%~73%、1%~72%、1%~71%、1%~70%、1%~65%、1%~60%、1%~55%、1%~50%、1%~45%、1%~40%、1%~39%、1%~38%、1%~37%、1%~36%、1%~35%、1%~34%、1%~33%、1%~32%、1%~31%、1%~30%、1%~25%、1%~20%、1%~15%、1%~10%、1%~9%、1%~8%、1%~7%、1%~6%、1%~5%、1%~4%、1%~3%、または1%~2%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ELISA、ウェスタンブロット、またはLC-MS/MSによって測定して、投与前と比較して対象における血液ANGPTL3タンパク質レベルの1%~99.9%、5%~99.5%、10%~99%、15%~97%、20%~95%、25%~90%、30%~85%、31%~80%、32%~79%、33%~78%、34%~77%、35%~76%、36%~76%、37%~75%、38%~74%、39%~73%、40%~72%、45%~71%、50%~70%、または55%~65%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ELISA、ウェスタンブロット、またはLC-MS/MSによって測定して、投与前と比較して対象における血液ANGPTL3タンパク質レベルの100%の低減をもたらす。
GUUaAaAuAaggCUaGUCcG UUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3’(配列番号9)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGU UAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(配列番号9)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(配列番号9)(GA346)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAacAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(配列番号10)(GA374)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuuu-3’(配列番号11)(GA385)、5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuUu-3’(配列番号11)(GA386)または5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcuususuuuu-3’(配列番号12)(GA387)を含む。
[154]一部の実施形態では、mRNA配列のGC%含量は、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、または90%以上である。一部の実施形態では、mRNA配列のGC%含量は、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、または80%以上である。
ナノ粒子(LNP)をさらに含む。一部の実施形態では、LNPは、プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸(ii)をさらに封入する。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸(ii)を封入する第2のLNPをさらに含む。
[164]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約1000:1~約1:1000である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2;1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で約1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950、または1:1000である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2;1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950、または1:1000である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2;1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1
:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950、または1:1000である。
3、1:0.2、または1:0.1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1:1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、少なくとも約1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2、または1:0.1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、
58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1:1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2、または1:0.1である。
:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950、または1:1000である。
効率の最適化は、dCas9よりむしろCas9ニッカーゼの使用によって達成された。さらに、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤を添加して、哺乳動物CHO細胞系における塩基編集を増強した。得られたプラットフォームは、PAM配列の上流の18番目のヌクレオチドの3~5塩基以内で一貫して塩基を編集することができた(参照により全体として本明細書に組み込まれるNishida K,Arazoe T,Yachie Nら、「Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems」Science,2016,353頁:aaf8729)。
[180]>splP14739IUNGI_BPPB2 ウラシル-DNA グリコシラーゼ阻害剤
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLT S D APE YKPW ALVIQDS
NGENKIKML(配列番号16)
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD(配列番号1)を含む。
る。一部の実施形態では、第1のアデノシンデアミナーゼは本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかである。一部の実施形態では、第2のアデノシンデアミナーゼは本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかであるが、第1のアデノシンデアミナーゼと同一ではない。一部の実施形態では、第1のアデノシンデアミナーゼはecTadAアデノシンデアミナーゼである。一部の実施形態では、第1のアデノシンデアミナーゼは、配列番号1で説明されるアミノ酸配列または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第2のアデノシンデアミナーゼは、配列番号1で説明されるアミノ酸配列または本明細書で提供されるアデノシンデアミナーゼのいずれかと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第2のアデノシンデアミナーゼは、配列番号1のアミノ酸配列を含む。
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRRVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYS
LFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(配列番号3)を含む融合タンパク質を含む。
ATGAGCGAGGTCGAGTTCTCTCACGAATATTGGATGAGACACGCTCTCACCCTGGCTAAGAGAGCCAGGGACGAAAGAGAGGTGCCAGTTGGCGCTGTCCTGGTGTTGAACAATCGCGTCATCGGAGAAGGATGGAATCGCGCCATTGGCCTGCACGATCCAACCGCACATGCCGAAATTATGGCTCTGCGGCAAGGCGGCCTCGTGATGCAAAATTACAGACTGATCGATGCTACCCTCTACGTCACCTTCGAGCCCTGTGTCATGTGTGCTGGGGCAATGATTCACTCCCGGATTGGCCGCGTGGTGTTTGGAGTGCGGAATGCCAAGACTGGCGCCGCTGGATCTCTGATGGACGTCCTGCACcatCCTGGGATGAACCACCGGGTCGAGATCACAGAGGGAATTCTGGCTGACGAGTGCGCTGCCCTGCTGTGCaggTTCTTTAGAATGCCtAGAaggGTGTTCAACGCCCAGAAAAAAGCTCAGAGCAGCACCGATTCCGGCGGAAGCAGCGGAGGATCTTCTGGAAGCGAAACCCCAGGCACCAGCGAGTCTGCCACACCAGAATCATCTGGCGGTAGCTCCGGCGGCAGCGACAAGAAGTATTCTATCGGACTGGCCATCGGCACCAACTCTGTTGGATGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCACTGCTGTTCGACTCTGGCGAAACAGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACAGCCCGCAGACGGTACACCAGAAGAAAGAACCGGATCTGCTACCTCCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTATCTGGCCCTGGCTCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAATCCTGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGAGTGGATGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCTGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACACCTAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGATCAGTACGCCGACTTGTTTCTGGCCGCCAAGAATCTGAGCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCACCTCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGATCTGACCCTGCTGAAGGCCCTCGTTAGACAGCAGCTGCCAGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTAC
ATTGATGGCGGAGCCAGCCAAGAGGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTCGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCTCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCCATTCTGCGGAGACAAGAGGACTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATCCTGACCTTCAGGATCCCCTACTACGTGGGACCACTGGCCAGAGGCAATAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCTCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCTAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTTCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACAGCGTCGAGATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAATGCCAGCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAGAACGAGGACATCCTTGAGGACATCGTGCTGACACTGACCCTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACATACGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAACTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGTCTCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGATAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTTCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATTCACGACGACAGCCTCACCTTCAAAGAGGATATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATTCTCTGCATGAGCACATTGCCAACCTGGCCGGCTCTCCCGCCATTAAGAAAGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTTGTGAAAGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGACGGGATATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAACAGACTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTCCTGACCAGATCCGACAAGAATCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTGGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGCGGAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAAAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATTCTGGACTCTCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAACGACAAACTGATCCGCGAAGTGAAAGTCATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTCTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCATCACGCCCACGACGCCTACCTGAATGCCGTTGTTGGAACAGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAAGAGAT
TGGCAAGGCAACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACAGAGATCACCCTCGCCAACGGCGAGATCAGAAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGCGAGATTGTGTGGGATAAGGGCAGAGACTTTGCCACAGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAGAAAACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCTAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGATTCTCCTACCGTGGCCTATAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTCAAGAGCGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCGATCGATTTCCTCGAGGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTCCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCTGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCTAGCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAATGAGCAAAAGCAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTTAGCAAGAGAGTGATTCTGGCCGACGCCAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCTATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAACCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACTCTGATCCACCAGTCTATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAACTCGGAGGCGACGAAGGCGCCGATAAGAGAACCGCCGATGGCTCTGAGTTCGAGAGCCCCAAGAAAAAGCGCAAAGTG(配列番号4)によってコードされるポリペプチドを含む融合タンパク質を含む。
[195]ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を編集、改変または変更するための塩基エディターシステムが、本明細書において開示される。
ノシンデアミナーゼは、配列番号1中のH8Y、D108N、N127S、D147YおよびQ154H変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1中のH8Y、R24W、D108N、N127S、D147YおよびE155V変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1中のD108N、D147YおよびE155V変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1中のH8Y、D108NおよびS127S変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1中のA106V、D108N、D147YおよびE155V変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
6つの変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1中のH8X、A106X、D108X、N127XおよびK160Xまたは別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異(単数または複数)からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの変異を含み、Xは、野生型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸の存在を示す。
型アデノシンデアミナーゼ中の対応するアミノ酸以外の任意のアミノ酸を示す。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号1中のR107P、R07K、R107A、R107N、R107W、R107HまたはR107S変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
146C変異または別のアデノシンデアミナーゼ中の対応する変異を含む。
[233]本出願において有用な追加のアデノシンデアミナーゼは、当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。例えば、アデノシンデアミナーゼは、AD ATの相同体であり得る。例示的なAD AT相同体として、限定なく、以下が挙げられる:
[234]黄色ブドウ球菌TadA:
MGSHMTNDIYFMTLAIEEAKKAAQLGEVPIGAIITKDDEVIARAHNLRETLQQPTAH AEHIAIERAAKVLGSWRLEGCTLYVTLEPCVMCAGTIVMSRIPRVVYGADDPKGGCS GS LMNLLQQS NFNHRAIVDKG VLKE AC S TLLTTFFKNLRANKKS TN(配列番号30)
[235]枯草菌(Bacillus subtilis)TadA:
MTQDELYMKEAIKEAKKAEEKGEVPIGAVLVINGEIIARAHNLRETEQRSIAHAEML VIDE AC KALGT WRLEG ATLY VTLEPCPMC AG A V VLS R VEK V VFG AFDPKGGC S GTLMN LLQEERFNHQ AE V VS G VLEEEC
GGMLS AFFRELRKKKK A ARKNLS E(配列番号31)
[236]ネズミチフス菌(S.typhimurium) TadA:
MPPAFITGVTSLSDVELDHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNHRVIGEG WNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVLQNYRLLDTTLYVTLEPCVMCAGAMVHSRIG RVVFGARDAKTGAAGSLIDVLHHPGMNHRVEIIEGVLRDECATLLSDFFRMRRQEIK ALKKADRAEGAGPAV(配列番号32)
[237]シュワネラ・プトレファシエンス(Shewanella putrefaciens)(S.プトレファシエンス)TadA:
MDEYWMQVAMQMAEKAEAAGEVPVGAVLVKDGQQIATGYNLSISQHDPTAHAEILCLRSAGKKLENYRLLDATLYITLEPCAMCAGAMVHSRIARVVYGARDEKTGAAGTVVNLLQHPAFNHQVEVTSGVLAEACSAQLSRFFKRRRDEKKALKLAQRAQQGIE(配列番号33)
[238]インフルエンザ菌F3031(H.インフルエンザエ)TadA:
MDAAKVRSEFDEKMMRYALELADKAEALGEIPVGAVLVDDARNIIGEGWNLSIVQSDPTΑΗAEIIALRNGAKNIQNYRLLNSTLYVTLEPCTMCAGAILHSRIKRLVFGASDYKTGAIGSRFHFFDDYKMNHTLEITSGVLAEECSQKLSTFFQKRREEKKIEKALLKSLSDK(配列番号34)
[239]カウロバクター・クレセンタス(Caulobacter crescentus)(C.クレセンタス)TadA:
MRTDESEDQDHRMMRLALDAARAAAEAGETPVGAVILDPSTGEVIATAGNGPIAAHDPTAHAEIAAMRAAAAKLGNYRLTDLTLVVTLEPCAMCAGAISHARIGRVVFGADDPKGGAVVHGPKFFAQPTCHWRPEVTGGVLADESADLLRGFFRARRKAKI(配列番号35)
[240]ジオバクター・スルフレデュセンス(Geobacter sulfurreducens)(G.スルフレデュセンス)TadA:
MSSLKKTPIRDDAYWMGKAIREAAKAAARDEVPIGAVIVRDGAVIGRGHNLREGSNDPSAHAEMIAIRQAARRSANWRLTGATLYVTLEPCLMCMGAIILARLERVVFGCYDPKGGAAGSLYDLSADPRLNHQVRLSPGVCQEECGTMLSDFFRDLRRRKKAKATPALF IDERKVPPEP(配列番号36)
[241]一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、表23に列記されるアミノ酸配列のうちいずれか1つと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.7%または少なくとも99.9%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、表23に列記されるアミノ酸配列のうちいずれか1つを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼの配列は、表23に列記されるアミノ酸配列のうちいずれか1つである。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号:配列番号2137、2149、2154、2158、2188、2140、40、2146、2152、2156および2160のアミノ酸配列のうちいずれか1つと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.7%または少なくとも99.9%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号2137、2149、2154、2158、2188、2140、40、2146、2152、2156および2160のアミノ酸配列のうちいずれか1つを含む。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼの配列は、配列番号2137、2149、2154、2158および2188のアミノ酸配列のうちいずれか1つである。
[00243]ゲノム内の任意の所望のヌクレオチド配列中のDNA配列を標的とし、結合するようにプログラムされ得るプログラム可能なDNA結合タンパク質が、本明細書で提供される。DNA結合タンパク質を所望のヌクレオチド配列に結合するようにプログラムするために、DNA結合タンパク質を改変して、その結合特異性、例えば、亜鉛フィンガーDNA結合ドメイン、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、CRISPR-Cas9タンパク質または転写アクチベーター様エフェクタータンパク質(TALE)を変更できる。ZFNは、亜鉛フィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって生成された人工制限酵素である。亜鉛フィンガードメインを特定の所望のDNA配列を標的とするように操作することができ、これによって、亜鉛フィンガーが複雑なゲノム内の特有の配列に結合することが可能となる。転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、DNAの特定の配列を切断するように操作され得る操作された制限酵素である。それらは、TALエフェクターDNA結合ドメインをヌクレアーゼドメイン(例えば、Fokl)に融合することによって作製される。転写アクチベーター様エフェクター(TALE)は、実際に任意の所望のDNA配列に結合するように操作され得る。ZFNおよびTALEをプログラムする方法は、当業者にはよく知られている。例えば、このような方法は、Maederら、Mol. Cell 31 (2): 294~301頁、2008; Carrollら、Genetics Society of America、188 (4): 773~782頁、2011; Millerら、Nature Biotechnology 25 (7): 778~785頁、2007; Christianら、Genetics 186 (2): 757~61頁、2008; Liら、Nucleic Acids Res. 39 (1): 359~372頁、2010;およびMoscouら、Science 326 (5959): 1501、2009に記載されており、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
n1またはCsx12としても知られる)、Csn2、Cas4、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13cおよびCas13dタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、Casタンパク質は、II型CRISPR/Cas系に由来する、すなわち、CRISPR/Cas9系由来のCas9タンパク質であるか、またはV型CRISPR/Cas系に由来する、例えば、Cas12aタンパク質である。一部の実施形態では、Casタンパク質は、クラス2CRISPR/Cas系に由来する、すなわち、単一タンパク質Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9タンパク質またはCas12aタンパク質である。
ガイドRNAを設計することによって、それらを所望の核酸標的を切断するように指示できる。クラス2CRISPR/Cas系成分は、II型、IIA型、IIB型、IIC型、V型またはVI型系に由来し得る。クラス2Casヌクレアーゼには、例えば、Cas9(Csn1またはCsx12としても知られる)、Csn2、Cas4、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13cおよびCas13dタンパク質が含まれる。一部の実施形態では、Casタンパク質は、II型CRISPR/Cas系に由来する、すなわち、CRISPR/Cas9系由来のCas9タンパク質であるか、またはV型CRISPR/Cas系に由来する、例えば、Cas12aタンパク質である。一部の実施形態では、Casタンパク質は、クラス2CRISPR/Cas系に由来する、すなわち、単一タンパク質Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9タンパク質またはCas12aタンパク質である。
に対して少なくともまたは少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、100%の配列同一性および/または配列類似性を有するポリペプチドを指す場合がある。Cas9は、野生型例示的Cas9ポリペプチド(例えば、化膿性連鎖球菌由来の)に対して多くともまたは多くとも約50%、60%、70%、80%、90%、100%の配列同一性および/または配列類似性を有するポリペプチドを指す場合がある。Cas9は、野生型または欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラもしくはそれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含み得るCas9タンパク質の改変型を指す場合がある。
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGA
AATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGG
TATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA(配列番号37)
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGN
LIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(配列番号38)
[257]一部の実施形態では、Cas9は、種コリネバクテリウム・ウルセランス(Corynebacterium ulcerans)(NCBI参照:NC_015683.1、NC_017317.1)、コリネバクテリウム・ジフテリア(NCBI参照NC
016782.1、NC_016786.1)、スピロプラズマ・シルフィディコラ(Spiroplasma syrphidicola)(NCBI参照:NC_021284.1)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)(NCBI参照:NC_017861.1)、スピロプラズマ・タイワネンス(Spiroplasma taiwanense)(NCBI参照:NC_021846.1)、ストレプトコッカス・イニアエ(Streptococcus iniae)(NCBI参照:NC_021314.1)、ベリエラ・バルティカ(Belliella baltica)(NCBI参照:NC_018010.1)、サイクロフレクス・トルキシル(Psychroflexus torquisl)(NCBI参照:NC_018721.1)、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)(NCBI参照 NP_472073.1)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)(NCBI参照:YP_002344900.1)または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)(NCBI参照:YP_002342100.1)に由来するCas9タンパク質である。
as9ニッカーゼである場合もある。不活性DNA切断ドメインを有するCas9タンパク質(またはその断片)を生成する方法は、公知である(例えば、各々、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Jinekら、Science. 337:816~821頁(2012);Qiら、(2013) Cell. 28; 152(5): 1173~83を参照されたい。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、2つのサブドメイン、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインを含むと知られている。HNHサブドメインは、gRNAと相補的である鎖を切断するが、RuvC1サブドメインは、非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Cas9のヌクレアーゼ活性を発現停止することができる。例えば、変異D10AおよびH840Aは、化膿性連鎖球菌Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する(Jinekら、Science. 337:816~821頁(2012); Qiら、Cell. 28;152(5): 1173~83頁(2013))。本開示に従う使用に適したCas9ニッカーゼは、活性HNHドメインおよび不活性RuvCドメインを有し、sgRNAによって結合される標的DNAの鎖(シチジン脱アミノ化を介して編集されている鎖の反対の鎖である)のみを切断可能である。本開示のCas9ニッカーゼは、RuvCドメインを不活性化する変異、例えば、D10A変異を含み得る。RuvCドメインを不活性化する任意の変異、例えば、RuvCドメイン中の挿入、欠失または単一もしくは複数のアミノ酸置換が、Cas9ニッカーゼ中に含まれる場合があるということは理解されるべきである。本明細書に記載されるCas9ニッカーゼでは、RuvCドメインが不活性化されながら、HNHドメインは活性のままである。したがって、Cas9ニッカーゼは、RuvCドメインを不活性化するもの(例えば、D10A)以外の変異を含む可能性がありながら、それらの変異はHNHドメインの活性に影響を及ぼさない。限定されないCas9ニッカーゼの例では、840位のヒスチジンは、変更されないままである。
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKS
KLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(配列番号39)
[260]一部の実施形態では、Cas9ニッカーゼは、以下のような例示的な触媒的なCas9 ニッカーゼ(nCas9)のアミノ酸配列を含む:
DKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(配列番号40)
[261]Cas9を不活性化する追加の適した変異は、本開示および当技術分野における知識に基づいて当業者に明らかであり、本開示の範囲内にある。このような追加の例示的
な適したヌクレアーゼ不活性のCas9ドメインは、D839Aおよび/もしくはN863A(例えば、参照により本明細書に組み込まれるPrashantら、Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833~838を参照されたい)、または)またはK603R{例えば、参照により本明細書に組み込まれるChavezら、Nature Methods 12、326~328頁、2015を参照されたい)を含むがそれに限らない。Cas9、dCas9またはCas9バリアントはまた、任意の生物由来のCas9、dCas9またはCas9バリアントも包含する。また、任意の生物由来のdCas9、Cas9ニッカーゼまたは他の適切なCas9バリアントを本開示に従って使用できることも認識される。
[263]一部の実施形態では、プログラム可能なDNA結合タンパク質は、CasXまたはCasYまたはそのバリアントを含み、これらは、例えば、Bursteinら、「New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes.」Cell Res. 2017年2月21日 doi:10.1038/cr.2017.21に記載されており、その全開示内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。ゲノム分解メタゲノミクスを使用して、生命体の古細菌ドメインにおける最初に報告されたCas9を含む、いくつかのCRISPR-Cas系が同定された。この多様なCas9タンパク質は、ほとんど研究されていないナノ古細菌において活性CRISPR-Cas系の一部として見出された。細菌では、2つのこれまでに知られていない系、CRISPR-CasXおよびCRISPR-CasYが発見され、これらは、これまでに発見された中で最もコンパクトな系の1つである。
[270]本明細書で提供される塩基エディターは、塩基エディターの1つまたは複数の構成要素を接続するリンカーを含み得る。特定の実施形態では、リンカーを使用して、本明細書に記載のタンパク質またはタンパク質ドメインのいずれかを連結し得る。リンカーは、共有結合のように単純なものであってもよいし、または原子数が多い高分子リンカーであってもよい。特定の実施形態では、リンカーはポリペプチドであるか、またはアミノ酸に基づく。他の実施形態では、リンカーはペプチド様ではない。一部の実施形態では、リンカーは、炭素結合、ジスルフィド結合、炭素-ヘテロ原子結合などである。特定の実施形態では、リンカーは、アミド結合の炭素-窒素結合である。特定の実施形態では、リンカーは、環状または非環状、置換または非置換の、分枝または非分枝の脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。特定の実施形態では、リンカーはポリマー(例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど)である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸の単量体、二量体、または重合体を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノアルカン酸(例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ-アラニン、3-アミノプロパン酸、4-アミノブタン酸、5-ペンタン酸など)を含む。特定の実施形態では、リンカーは、アミノヘキサン酸(Ahx)の単量体、二量体、または重合体を含む。特定の実施形態では、リンカーは、炭素環部分(例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン)に基づく。他の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール部分(PEG)を含む。他の実施形態では、リンカーは、アミノ酸を含む。特定の実施形態では、リンカーはペプチドを含む。特定の実施形態では、リンカーは、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。特定の実施形態では、リンカーは、フェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤(例えば、チオール、アミノ)の結合を促進する官能化部分を含み得る。リンカーの一部として任意の求電子剤を使用してもよい。例示的な求電子試薬としては、限定するものではないが、活性化エステル、活性化アミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートが挙げられる。
[273]CRISPRクラスターには、スペーサー、先行する移動性エレメントに相補的な配列、および標的侵入核酸が含まれる。CRISPRクラスターは転写され、CRISPR RNA(crRNA)にプロセシングされる。例えば、タイプII CRISPR系では、pre-crRNAの正しいプロセッシングには、トランスコードされた小型R
NA(tracrRNA)、内因性リボヌクレアーゼ3(rnc)、およびCas9タンパク質が必要である。tracrRNAは、pre-crRNAのリボヌクレアーゼ3支援プロセッシングのガイドとして機能する。Cas9は、CRISPR反復配列中の短いモチーフ(PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ)を認識する(例えば、「Complete genome sequence of an Ml strain of
Streptococcus pyogenes」、Ferretti et al,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III」.Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma CM.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.」Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)(そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと)。Cas9オルソログは、S.pyogenesおよびS.thermophilusを含むがこれらに限定されない様々な種で記載されている。
[275]一部の実施形態では、SaCas9は、N579X変異、または野生型SaCas9配列で番号付けされたアミノ酸配列のいずれかに対応する変異を含み、Xは、Nを除く任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、SaCas9は、野生型SaCas9配列で番号が付けられたN579A変異、または別のSaCas9タンパク質の対応する変異を含む。
pCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性SpCas9、ヌクレアーゼ不活性SpCas9(SpCas9d)、またはSpCas9ニッカーゼ(SpCas9n)である。一部の実施形態では、SpCas9は、野生型SpCas9アミノ酸配列で番号付けされたD10X変異、または別のSapCas9タンパク質における対応する変異を含み、ここでXは、Dを除く任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、SpCas9は、野生型SpCas9アミノ酸配列で番号付けされているD10A変異または別のSpCas9タンパク質の対応する変異を含む。一部の実施形態では、SpCas9ドメイン、活性SpCas9ドメイン中のヌクレアーゼ、またはSpCas9ニッカーゼドメインは、非NGG
PAMを有する核酸配列に結合し得る。一部の実施形態では、SpCas9ドメイン、SpCas9ドメイン、活性SpCas9ドメイン中のヌクレアーゼ、またはSpCas9ニッカーゼドメインは、NGG、NGA、またはNGCG PAM配列を有する核酸配列に結合し得る。一部の実施形態では、SpCas9ドメインは、野生型SpCas9アミノ酸配列において番号が付けられたD1135X、R1335X、およびT1337X変異、または別のSpCas9タンパク質における対応する変異のうちの1つまたは複数を含み、ここでXは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、SpCas9ドメインは、野生型SpCas9アミノ酸配列において番号付けされたD1135E、R1335Q、およびT1337R変異または別のSpCas9タンパク質における対応する変異のうちの1つまたは複数を含む。一部の実施形態では、SpCas9ドメインは、野生型Cas9アミノ酸配列において番号付けされたD1134V、R1334Q、およびT1336R変異、またはその対応する変異のうちの1つまたは複数を含む。一部の実施形態では、SpCas9ドメインは、野生型SpCas9アミノ酸配列において番号付けされたD1135V、R1335Q、およびT1337R変異、または別のSpCas9タンパク質における対応する変異を含む。一部の実施形態では、SpCas9ドメインは、野生型SpCas9アミノ酸配列において番号が付けられたD1135X、G1218X、R1335X、およびT1337X変異、または別のSpCas9タンパク質における対応する変異のうちの1つまたは複数を含み、Xは任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、SpCas9ドメインは、野生型SpCas9アミノ酸配列において番号付けされたD1135V、G1218R、R1335Q、およびT1337R変異、または別のSpCas9タンパク質における対応する変異のうちの1つまたは複数を含む。一部の実施形態では、SpCas9ドメインは、野生型SpCas9アミノ酸配列において番号付けされたD1135V、G1218R、R1335Q、およびT1337R変異、または別のSpCas9タンパク質における対応する変異を含む。
CRISPRエフェクターである。Cpf1は、Cas9とは異なる特徴を有する強力なDNA干渉を媒介することが示されている。Cpf1は、tracrRNAを欠く単一のRNA誘導エンドヌクレアーゼであり、Tリッチ プロトスペーサー隣接モチーフ(TTN、TTTN、またはYTN)を利用する。Cpf1タンパク質は、Yamano et
al.,「Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA」。Cell(165)2016,p.949-962に記載されており、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESD
KKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN(配列番号53)
[282]一部の実施形態では、塩基エディターはCpf1タンパク質を含む。一部の実施形態では、Cpf1タンパク質はCpf1ニッカーゼである。一部の実施形態では、Cpf1タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性Cpf1である。一部の実施形態では、Cpf1タンパク質は、本明細書で提供されるFnCpf1配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Cpf1タンパク質は、本明細書に提供される野生型FnCpf1配列において番号付けされたD917A、E1006A、D1255A、D917A/E1006A、D917A/D1255A、E1006A/D1255A、またはD917A/E1006A/D1255Aに対応する変異を含む。他の細菌種由来のCpf1もまた、本開示に従って使用され得ることが理解されるべきである。
BhCas12b(Bacillus hisashii)NCBI参照配列:WP_095142515MAPKKKRKVGIHGVPAAATRSFILKIEPNEEVKKGLWKTHEVLNHGIAYYMNILKLIRQEAIYEHHEQDPKNPKKVSKAEIQAELWDFVLKMQKCNSFTHEVDKDEVFNILRELYEELVPSSVEKKGEANQLSNKFLYPLVDPNSQSGKGTASSGRKPRWYNLKIAGDPSWEEEKKKWEEDKKKDPLAKILGKLAEYGLIPLFIPYTDSNEPIVKEIKWMEKSRNQSVRRLDKDMFIQALERFLSWESWNLKVKEEYEKVEKEYKTLEERIKEDIQALKALEQYEKERQEQLLRDTLNTNEYRLSKRGLRGWREIIQKWLKMDENEPSEKYLEVFKDYQRKHPREAGDYSVYEFLSKKENHFIWRNHPEYPYLYATFCEIDKKKKDAKQQATFTLADPINHPLWVRFEERSGSNLNKYRILTEQLHTEKLKKKLTVQLDRLIYPTESGGWEEKGKVDIVLLPSRQFYNQIFLDIEEKGKHAFTYKDESIKFPLKGTLGGARVQFDRDHLRRYPHKVESGNVGRIYFNMTVNIEPTESPVSKSLKIHRDDFPKVVNFKPKELTEWIKDSKGKKLKSGIESLEIGLRVMSIDLGQRQAAAASIFEVVDQKPDIEGKLFFPIKGTELYAVHRASFNIKLPGETLVKSREVLRKAREDNLKLMNQKLNFLRNVLHFQQFEDITEREKRVTKWISRQENSDVPLVYQDELIQIRELMYKPYKDWVAFLKQLHKRLEVEIGKEVKHWRKSLSDGRKGLYGISLKNIDEIDRTRKFLLRWSLRPTEPGEVRRLEPGQRFAIDQLNHLNALKEDRLKKMANTIIMHALGYCYDVRKKKWQAKNPACQIILFEDLSNYNPYEERSRFENSKLMKWSRREIPRQVALQGEIYGLQVGEVGAQFSSRFHAKTGSPGIRCSVVTKEKLQDNRFFKNLQREGRLTLDKIAVLKEGDLYPDKGGEKFISLSKDRKCVTTHADINAAQNLQKRFWTRTHGFYKVYCKAYQVDGQTVYIPESKDQKQKIIEEFGEGYFILKDGVYEWVNAGKLKIKKGSSKQSSSELVDSDILKDSFDLASELKGEKLMLYRDPSGNVFPSDKWMAAGVFFGKLERILISKLTNQYSISTIEDDSSKQSMKRPAATKKAGQAKKKK(配列番号54)
[285]一部の実施形態では、プログラム可能なDNA結合タンパク質は、アルゴノートタンパク質を含む。このような核酸プログラム可能なDNA結合タンパク質の一例は、ナトロノバクテリウム・グレゴリー(Natronobacterium gregoryi)(NgAgo)由来のアルゴノートタンパク質である。NgAgoは、ssDNA誘導エンドヌクレアーゼである。NgAgoは、約24ヌクレオチドの5’リン酸化ssDNA(gDNA)を結合してその標的部位に誘導し、gDNA 部位でDNA二本鎖切断を行う。Cas9とは対照的に、NgAgo-gDNA系は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要としない。ヌクレアーゼ不活性NgAgo(dNgAgo)を使用すると、標的となる可能性のある塩基を大幅に拡張し得る。NgAgoの特徴付けおよび使用は、Gao et al.,Nat Biotechnol.,2016 Jul;34(7):768-73.PubMed PMID:27136078;Swarts et al.,Nature.507(7491)(2014):258-61;およびSwarts et al.,Nucleic Acids Res.43(10)(2015):5120-9に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
[287]本開示のいくつかの態様は、本明細書において提供される融合タンパク質のいずれか、およびプログラム可能なDNA結合タンパク質、例えば塩基エディターまたは融合タンパク質のCas9ドメインに結合したガイドポリヌクレオチドを含む複合体を提供する。
[289]一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、単一の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、2つの核酸配列を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸(例えば、ガイドRNA)は、15~100ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な少なくとも10個の連続ヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、ガイドRNAは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイドRNAは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40個の連続したヌクレオチドであって、標的配列に相補的である連続ヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、標的配列はDNA配列である。一部の実施形態では、標的配列は、哺乳動物のゲノム中の配列である。一部の実施形態では、標的配列は、ヒトのゲノム中の配列である。一部の実施形態では、標的配列の3’末端は、正規のPAM配列(NGG)に直接隣接している。一部の実施形態では、ガイド核酸(例えば、ガイドRNA)は、疾患または障害に関連する配列に相補的である。一部の実施形態では、ガイド核酸(例えば、ガイドRNA)は、PCSK9遺伝子、ANGPTL3遺伝子、またはAPOC3遺伝子に変異を有する疾患または障害に関連する配列に相補的である。
イドポリヌクレオチドは、二重ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、リンカーによって連結された二重ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、非核酸リンカーによって連結された二重ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、ペプチドリンカーまたは化学リンカーによって連結された二重ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはシングルガイドRNAである。ガイドRNA(gRNA)は、プログラム可能なDNA結合タンパク質、例えば、クラス2 Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9を、標的核酸分子上の標的配列へガイドし得、ここで、gRNAは、プログラム可能なDNA結合タンパク質とハイブリダイズし、標的配列を改変する。一部の実施形態では、gRNAおよび塩基エディター融合タンパク質は、リボ核タンパク質(RNP)、例えば、CRISPR/Cas複合体を形成し得る。一部の実施形態では、CRISPR複合体は、II型CRISPR/Cas9複合体であってもよい。一部の実施形態では、CRISPR/Cas複合体は、Cpf1/ガイドRNA複合体などのV型CRISPR/Cas複合体であり得る。
[298]標準的なCRISPR-Cas9ゲノム編集では、gRNAにエンコードされたプロトスペーサー配列と高度な配列類似性を共有する部位で、オフターゲット変異誘発(
意図した標的部位以外のゲノム部位での編集)が発生し得る。
[306]本明細書に提供される本開示は、任意の一般的なCRISPR/Cas系、例えば、本明細書に記載の塩基エディターシステムと関連して使用され得る、化学的に改変されたCRISPRガイドRNA(gRNA)に関する。gRNA(例えば、sgRNA、短鎖sgRNA、crRNA、tracrRNA、またはdgRNA)は、様々なヌクレオチド位置で改変を含んでもよい。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、(i)ヌクレオチドでの化学的改変および(ii)未改変ヌクレオチドを含むガイドRNA(gRNA)またはシングルガイドRNA(sgRNA)である。一部の実施形態では、gRNAまたはsgRNAは、特定のヌクレオチド位置に改変を含み得る。一部の実施形態では、gRNAまたはsgRNAは、1つまたは複数の特定の位置に1つまたは複数の改変を含み得る。
RNAは、合計100塩基対の長さを含んでもよい。別の実施形態では、化学的に改変されたsgRNAは、合計103塩基対の長さを含んでもよい。
42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、または130塩基対の長さのtracrRNA配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、長さが約30~約130塩基対のtracrRNA配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、約30~約40、約30~約50、約30~約60、約30~約70、約30~約75、約30~約80、約30~約90、約30~約100、約30~約110、約30~約120、約30~約130、約40~約50、約40~約60、約40~約70、約40~約75、約40~約80、約40~約90、約40~約100、約40~約110、約40~約120、約40~約130、約50~約60、約50~約70、約50~約75、約50~約80、約50~約90、約50~約100、約50~約110、約50~約120、約50~約130、約60~約70、約60~約75、約60~約80、約60~約90、約60~約100、約60~約110、約60~約120、約60~約130、約70~約75、約70~約80、約70~約90、約70~約100、約70~約110、約70~約120、約70~約130、約75~約80、約75~約90、約75~約100、約75~約110、約75~約120、約75~約130、約80~約90、約80~約100、約80~約110、約80~約120、約80~約130、約90~約100、約90~約110、約90~約120、約90~約130、約100~約110、約100~約120、約100~約130、約110~約120、約110~約130、または約120~約130塩基対の長さのtracrRNA配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、約30、約40、約50、約60、約70、約75、約80、約90、約100、約110、約120、または長さ約130塩基対のtracrRNA配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、少なくとも約30、約40、約50、約60、約70、約75、約80、約90、約100、約110、または約120塩基対の長さのtracrRNA配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、最大で約40、約50、約60、約70、約75、約80、約90、約100、約110、約120、または約130塩基対の長さのtracrRNA配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、長さ70塩基対のtracrRNA配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、長さ73塩基対のtracrRNA配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、長さが68塩基対のtracrRNA配列を含んでもよい。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、長さ71塩基対のtracrRNA配列を含んでもよい。
されたgRNAまたはsgRNAは、3’末端または5’末端に配列5’-UsUsU-3’を含み、Uはウリジンを示し、sはホスホロチオエート(PS)結合を示す。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、5’末端に3つのホスホロチオエート(PS)結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、3’末端に3つのホスホロチオエート(PS)結合を含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、5’末端に2つのホスホロチオエート結合を含み、この2つのホスホロチオエート(PS)結合は、5’末端の最初の2つのヌクレオチド位置にある2つの隣接するホスホロチオエート(PS)結合である。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、5’末端に2つのホスホロチオエート結合を含み、この2つのホスホロチオエート(PS)結合は、5’末端の最初の3~10ヌクレオチド内にある。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、3’末端に2つのホスホロチオエート(PS)結合を含み、2つのホスホロチオエート(PS)結合は、3’末端の最初の2つのヌクレオチド位置にある2つの隣接するホスホロチオエート(PS)結合である。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、3’末端に2つのホスホロチオエート(PS)結合を含み、この2つのホスホロチオエート(PS)結合は、3’末端の最初の3~10ヌクレオチド内にある。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、3’末端に配列5’-UsUsUs-3’を含み、ここでUはウリジンを示し、sはホスホロチオエート(PS)結合を示す。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、3’末端に配列5’-UsUsU-3’を含み、ここでUはウリジンを示し、sはホスホロチオエート(PS)結合を示す。
の5’末端、3’末端、または内部位置に2’-OMeを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、gRNAまたはsgRNA配列の5’末端、3’末端、および内部位置に2’-OMeを含む。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、gRNAまたはsgRNA配列の5’-3’方向において2、3、4、23、24、25、27、31、もしくは42位、またはそれらの任意の組み合わせに2’-OMeを含まない。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、gRNAまたはsgRNA配列の5’-3’方向において2、3、4、23、24、25、27、31および42位に2’-OMeを含まない。
5’-csasgsGUUCCAUGGGAUGCUCUgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3(配列番号55)
ここで、大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
5’-csasgsGUUCCAUGGGAUGCUCU-3’(配列番号56)
ここで、大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
5’-gUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3’(配列番号57)
ここで、大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
5’-csasgsGUUCCAUGGGAUGCUCUgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(配列番号55)ここで、大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、そして「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
5’-gUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(配列番号57)
[370]別の例示的な化学的に改変されたガイドRNA配列を以下に示す:
5’-cscscsGCACCTTGGCGCAGCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGA
AAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUsususu-3’(配列番号58)、ここで、大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
5’-asasgsAUACCUGAAUAACCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUsususu-3’(配列番号59)(GA091)
[372]別の例示的な化学的に改変されたガイドRNA配列を以下に示す:
5’-asasgsAUACCUGAAUAACCCUCGUUUUAGAgcuagaaauagcAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAacuugaaaaaguggcaccgagucggugcusususu3’(配列番号60)(GA098)
ここで、大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
5’-asasgsAUACCUGAAUAACCCUCgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggCUaGUCcGUUAucAAcuuGaaaaaguGgcaccgAgUCggugcusususu-3’(配列番号59)(GA099)
ここで大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
[00375]5’-asasgsAUACCUGAAUAACCCUCgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususu-3’(配列番号59)(GA100)
ここで大文字A、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuuu-3’(配列番号11)(GA385)
ここで、大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGGgUUUUAGagcuagaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuugaaaaagugGcaccgagucggugcusususuuUu-3’(配列番号11)(GA386)、
ここで、大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
5’-cscscsGCACCUUGGCGCAGCGgUUUUAGagcuaGaaauagcaaGUUaAaAuAaggcuaGUccGUUAucAAcuuGaaaaagugGcaccgagucggugcuususuuuu-3’(配列番号12)、(GA387)
ここで、大文字のA、U、G、またはCは、リボヌクレオチドのアデノシン、ウリジン、グアニン、またはシチジンを示し、小文字のa、u、g、およびcは、2’-O-メチル改変アデニン、ウリジン、グアニン、およびシチジンを示し、および「s」はホスホロチオエート(PS)結合を表す。
[380]一部の実施形態では、化学的改変は、ホスホロチオエート結合(PS)を含む。一部の実施形態では、sgRNAは、5’末端または3’末端にホスホロチオエート結合(PS)を含む。一部の実施形態では、sgRNAは、5’末端または3’末端に2つ以下の連続するホスホロチオエート結合(PS)を含む。一部の実施形態では、sgRNAは、5’末端または3’末端に3つの連続するホスホロチオエート結合(PS)を含む。一部の実施形態では、sgRNAは、3’末端または5’末端に配列5’-UsUsU-3’を含み、ここでUはウリジンを示し、sはホスホロチオエート結合(PS)を示す。
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号61)。一部の実施形態では、化学的に改変されたガイドRNAは、tracrRNA配列
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号61)を含み、これは、1つまたは複数の改変を含む。
[385]一態様では、標的遺伝子のスプライス部位のエクソンとイントロン(スプライス部位)との境界で生じるDNA配列の遺伝子変化を生成することによって標的遺伝子を改変するための塩基エディターシステムおよびそれを使用する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、標的遺伝子のスプライスアクセプター部位で核酸塩基を改変する。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、標的遺伝子のスプライスドナー部位で核酸塩基を改変する。スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位での改変は、選択的転写産物をもたらし得る。一部の実施形態では、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位での改変により、異常な転写物が生じる。一部の実施形態では、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位での改変により、転写時に分解を受けやすい不安定な転写物が生じる。一部の実施形態では、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位での改変により、転写物に未成熟終止コドンが生じる。特定の実施形態では、この方法は、スプライスアクセプター-スプライスドナー(SA-SD)部位または未成熟STOP(pmSTOP)部位を標的とすることによって、遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることを含む。このような方法では、ガイドポリヌクレオチドは、標的ヌクレオチド配列内の1つまたは複数のスライスアクセプター/ドナー部位を破壊するように設計されている。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチド、例えば、シングルガイドRNAは、生物のゲノム中の標的配列に相補的であり、かつ標的塩基対を含む、少なくとも10個の連続するヌクレオチドの配列または17~23個の連続するヌクレオチドの配列を含む。
たはsgRNAと比較して、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、75%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、または1000%向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、gRNAまたはsgRNAの安定性を、in vitro、in vivo、および/またはex vivoで、未改変のgRNAまたはsgRNAと比較して約20%~約300%、約50%~約300%、約100%~約300%、約150%~約300%、約20%~約50%、約20%~約100%、約20%~約150%、約20%~約200%、約20%~約250%、約50%~約100%、約50%~約150%、約50%~約200%、約50%~約250%、約100%~約150%、約100%~約200%、約100%~約250%、約150%~約200%、約150%~約250%、約200%~約250%、少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、または少なくとも約300%向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、gRNAまたはsgRNAの安定性を、in vitro、in vivo、および/またはex vivoで、未改変gRNAまたはsgRNAと比較して約20%~約300%、約50%~約300%、約100%~約300%、約150%~約300%、約20%~約50%、約20%~約100%、約20%~約150%、約20%~約200%、約20%~約250%、約50%~約100%、約50%~約150%、約50%~約200%、約50%~約250%、約100%~約150%、約100%~約200%、約100%~約250%、約150%~約200%、約150%~約250%、約200%~約250%、少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、または少なくとも約300%向上または増大させ得る。一部の実施形態では、本開示の化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、gRNAまたはsgRNAの安定性を、in vitro、in vivo、および/またはex vivoで、未改変gRNAまたはsgRNAと比較して、少なくとも1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍7倍、8倍、9倍、10倍、または10倍超、向上または増大させ得る。
、細胞内のgRNAまたはsgRNAの半減期によって測定される。一部の実施形態では、化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAは、未改変のgRNAまたはsgRNAと比較して、細胞内の半減期の延長を示す。一部の実施形態では、gRNAまたはsgRNAは、未改変のgRNAまたはsgRNAと比較して、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、75%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、または1000%延長した、細胞内の半減期を示す。一部の実施形態では、gRNAまたはsgRNAは、未改変gRNAまたはsgRNAと比較して、約20%~約300%、約50%~約300%、約100%~約300%、約150%~約300%、約20%~約50%、約20%~約100%、約20%~約150%、約20%~約200%、約20%~約250%、約50%~約100%、約50%~約150%、約50%~約200%、約50%~約250%、約100%~約150%、約100%~約200%、約100%~約250%、約150%~約200%、約150%~約250%、約200%~約250%、少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、または少なくとも約300%の、細胞内の半減期の延長を示す。一部の実施形態では、gRNAまたはsgRNAは、未改変のgRNAまたはsgRNAと比較して、少なくとも1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、または10倍超、増大した細胞内の半減期を示す。
[405]いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、それを必要とする対象の状態を処置または予防する方法であって、この方法は、本明細書に記載の化学的に改変されたgRNAまたはsgRNAを含む組成物または脂質ナノ粒子を対象に投与することを含み、このgRNAまたはsgRNAは、対象の細胞中の標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすように塩基エディタータンパク質に指令し、それによってその状態を処置または予防する。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、PCSK9遺伝子内にある。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ANGPTL3遺伝子内にある。一部の実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチドのスプライス部位である。一部の実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチドのスプライスドナー部位にある。一部の実施形態では、改変は、標的ポリヌクレオチドのスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、改変は、対象におけるPCSK9遺伝子によってコードされる機能的PCSK9タンパク質の発現を低下させる。一部の実施形態では、改変は、対象におけるANGPTL3遺伝子によってコードされる機能的ANGPTL3タンパク質の発現を低下させる。一部の実施形態では、この状態はアテローム硬化性血管疾患である。一部の実施形態では、この状態は、アテローム硬化性血管疾患、高トリグリセリド血症、または糖尿病である。一部の実施形態では、対象は、投与前と比較して、低下した血中LDLコレステロールレベルおよび/または低下した血中トリグリセリドレベルを示す。
%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも99%、またはそれ以上低下し得る。一部の実施形態では、機能喪失バリアントは、野生型タンパク質と比較して、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下、5%以下、または1%以下の活性を有する。
[418]一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する改変のための標的遺伝子は、PCSK9をコードする遺伝子である。プロタンパク質転換酵素サブチリシン-ケキシン9型(PCSK9)はまた、神経アポトーシス制御コンバターゼ1(NARC-I)としても知られ、分泌サブチラーゼファミリーの9番目のメンバーとして同定されたプロテイナーゼK様サブチラーゼである。「プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)」とは、PCSK9遺伝子によってコードされる酵
素を指す。PCSK9は、低密度リポタンパク質(LDL)粒子の受容体に結合する。肝臓では、LDL受容体がエンドサイトーシス経路を介してLDL粒子を血液から除去する。PCSK9がLDL受容体に結合すると、受容体はリソソーム経路に向かって導かれ、タンパク質分解酵素によって分解され、特定のLDL受容体が血液からLDL粒子を取り込むことができる回数が制限される。したがって、PCSK9活性をブロックすると、より多くのLDL受容体が再利用されて肝細胞の表面に存在するようになり、血液からより多くのLDLコレステロールが除去されるようになる。
織では、全長タンパク質の約74kDaチモーゲン(前駆体)型が小胞体に見られる。細胞内での最初のプロセッシング中に、約14kDaのプロドメインペプチドが自己触媒的に切断され、触媒ドメインと、しばしばシステイン-ヒスチジンリッチドメイン(CHRD)と呼ばれるC末端ドメインとを含む約60kDaの成熟タンパク質が生成される。この約60kDaのPCSK9型は、肝細胞から分泌される。PCSK9の分泌型は生理活性種のようであるが、約60kDa型の細胞内機能的役割は除外されていない。
al,PNAS,102(6):2069-2074(2005);Benjannet et al,およびLalanne et al)、PCSK9常染色体優性変異は、LDLRレベルの増大、循環LDLのクリアランスの増大、および血漿コレステロールレベルの対応する減少をもたらす。Rashid et al.,PNAS、102(15):5374-5379(2005);Abifadel et al,2003 Nature Genetics 34:154-156;Timms et al.,2004 Hum.Genet.114:349-353;およびLeren、2004 Clin.Cenet.65:419-422(これらは参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。
分野におけるPCSK9タンパク質の任意の公知の生物学的活性を指す。例えば、一部の実施形態では、PCSK9活性は、そのプロテアーゼ活性を指す。一部の実施形態では、PCSK9活性は、細胞分泌経路を介して分泌されるその能力を指す。一部の実施形態では、PCSK9活性は、クラスリン被覆小胞においてタンパク質結合アダプターとして作用するその能力を指す。一部の実施形態では、PCSK9活性は、LDL受容体と相互作用するその能力を指す。一部の実施形態では、PCSK9活性は、LDL受容体の再循環を防止するその能力を指す。これらの例は、限定することを意図したものではない。
GTCCGATGGGGCTCTGGTGGCGTGATCTGCGCGCCCCAGGCGTCAAGCACCCACACCCTAGAAGGTTTCCGCAGCGACGTCGAGGCGCTCATGGTTGCAGGCGGGCGCCGCCGTTCAGTTCAGGGTCTGAGCCTGGAGGAGTGAGCCAGGCAGTGAGACTGGCTCGGGCGGGCCGGGACGCGTCGTTGCAGCAGCGGCTCCCAGCTCCCAGCCAGGATTCCGCGCGCCCCTTCACGCGCCCTGCTCCTGAACTTCAGCTCCTGCACAGTCCTCCCCACCGCAAGGCTCAAGGCGCCGCCGGCGTGGACCGCGCACGGCCTCTAGGTCTCCTCGCCAGGACAGCAACCTCTCCCCTGGCCCTCATGGGCACCGTCAGCTCCAGGCGGTCCTGGTGGCCGCTGCCACTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTCCTGGGTCCCGCGGGCGCCCGTGCGCAGGAGGACGAGGACGGCGACTACGAGGAGCTGGTGCTAGCCTTGCGTTCCGAGGAGGACGGCCTGGCCGAAGCACCCGAGCACGGAACCACAGCCACCTTCCACCGC
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TCCAGGCTGGGGCTTGGGAGGTCTGTGTGACCTTGACAGTCTCTCCCTTCTCCCTTGTCTGTGTAAGGAGGATGACGCCACCTTAAATAGGATTAAATGAGAATGGGGCTCTGAAAGGGCTGTGCAATATTTTCATAACGTGTTTTTATAGAGACAGTTGAGTATGTTCTTTAAGCCCTCCTCTCTCCTACCATGAACTAAAGATTTCTGTGGAGGTCCCCTCACTCCCAGCACCCCCTCCTCATCCCAGGCCCTTTTTGCAGGTTGGCAGCTGTTTTGCAGGACTGTATGGTCAGCACACTCGGGGCCTACACGGATGGCCACAGCCGTCGCCCGCTGCGCCCCAGATGAGGAGCTGCTGAGCTGCTCCAGTTTCTCCAGGAGTGGGAAGCGGCGGGGCGAGCGCATGGAGGTGACTGTACCCCTCCTTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCAGTGCTGGGCCCTCAGGGACCCCCAGCAAGCCCCTCCATCCTCCAGACTCCAGCTCTTCTGTAAGCTTACAGGGCTGGCCAGACCAGGAGTGGGGCACTCCTCACTTCACGCGGCTGGGGGCTGCTGGAGAGAGCCACAGCGGGAAGGGTTTCCTAGAGGCTGCAGGACAGTGCTGGATGGATTTTCAATGCTCACCTGGGTGTGAGCGTGCGGCAGGGCCGCGTGAGGGTCAGCGATCTGCTACTCTGGACTCAGCCATCTCTAGGCCCCTCTCACTCAGGTGCTCCATGGTTCTGGGAGCTGAGAAATCTCAAACCAGCAAAAAAGTGGAATTGATGTTGATGCTACAGGATAGTGCACAGATGCCATCTGGTTGCAGCATTTTGGTGGAAGGGCAGTGCCCAGCTAGGAGAGTGAGGAGGGGCAGGCATTTCTGGCTTGAGGAGATGGGGTCTTAATGCTCGTGTGAGAGGCAGAGTGGGTGGAGTGGAGCTGGCTGGATCCTTGCTTTGGCCTCCTGGATTTCTCTCTATCTCCATTTTGAAACCACTCTGTGTTTGGAAGAACTTTTGAGTATTCAGAGCTGCCCACTGGCAGAACAGTCTTCCTTGGGCAGGAGTGAGCTCCTTGTCCCCAGAAGGCTGGGTCTGGCTGGCCCCTGGCAGGGACACTGATGAGGGTGCTTGAGTTGATCCTGTCTAGTCCCTTTCTGTGTTTTCAAAGCCCATTCTAAAGCAGATTCCCATTTCCGTCTTTGACTCTAAGGCCCAAGGGGGCAAGCTGGTCTGCCGGGCCCACAACGCTTTTGGGGGTGAGGGTGTCTACGCCATTGCCAGGTGCTGCCTGCTACCCCAGGCCAACTGCAGCGTCCACACAGCTCCACCAGCTGAGGCCAGCATGGGGACCCGTGTCCACTGCCACCAACAGGGCCACGTCCTCACAGGTAGGAGGCTGGGCTTGCCCTGGGGTGAGGAGGGGTCTCTTTCTCCTTATGCACCCACTGCCCGCGAGGCTTGGTCCTCACAAGTGTGATCCATGAGACTCAAGCCTGACTTGCAGTTCCATACTCTGGTTCTGCCACTTCCATGCCCTTTGAGCCTGGGCAGGTGACCTTACTTCTCCTCATCTCAGCTTCCTCCTCCATAAGAGGGAAAAAGGTATTACCTGCCTCATTGTGTTGCAAGGAGATGGGCAGCATCTAGGGCACTGGCCTGGAGTATCGCAGGTGCTTTGCCTAAGGTGGTGCAGTCCAGGAGAGGCAGCTCCAGAGAGAGGCCCCCGGCTGGGGCTGAAAGGAGGGCAGACCTCGGTTTGAATTTCACCCTGCCGCTCTATAGCTGTGTGACTTGGGCAAATTACTTAACATCTCTGTATGAGGAAATGATGAGTGCTAAGCACTTAGCTTAGTGCCGGGACAATATAAATTCTAGCTATCGTTACTATTGTTTTCATCACCCGTTGCTTTAAAATCCAGCCTCTGGTATAGGCAACTATTGACGGGCTACCCTGTGTCGAAAACATGCCCAGGCAGGTAGCAGGAAGTCACAGATGGGGACCTCTTGGGGCATCAAGGGATGGTGCCCTGAGGCTGAGCTGTTCTGGTTGGGTGGAGCATGAGAGGTCTGGGAAGACAGTGGGACTCCAGCCTGGAATAAGAGGCTCAGAGTTGATTCTCGTCTGAGCACGTCCAGGGGAACCACTGAGGGTTTGGGAACAGGAGAGTGAGGGTGAGAACCTGGTTCTGGGCACAGCAGGCTGGCATGTAGGATGGATGTTCAGGAAAGATGAGCATAGTCAGGTGGCTGGTGCCCTTGTCCAGGGGAGAGGCTCCGTCAGGTTCAGGGGTCCTGGCTTGGAGGGAAGTCCGCCATGCTCTAATCACGCTCCCCTTTGGAAGTGCTCAGCCGATGAGCTCACAGGCACATGTCAGTTTGAAGTCATGGAATCTGACTCCATGAAGCGCACCTCAAAGAGCACCATTTTGCAGCTAAGGGAACTGCAGGCTGGACATGCTGAGTGGCTGCCCCGAGCCCTTGCAGCTAGGACATAGAGAATGCTAGTAACCACAACCCTACCATGTTCAGAGCACATGCCAGGCTCCATGCTGGGGCTTCGCACGTGTCATCTTCACAGTGTCCCTGTGAGTAGGTGTGGTTTCTCTTTCCATCTTACAAATGAGTAAACAGAGCCTCAGTGTAGCTAAGTAACCACTATTTTAGGTTTCTTAGCCAATGGGTGTGTCTGACTCCTAAGCCCATGGAGGGCATTCTGAGGTGGTTCAGACAGACCCCGGCTTACCCTTGAACTTCTGCCTGCTGGCTGCATAGGGAGGGGCTGGGGGGAGTTTGAGCATCTCAGGCCATAGAGCCCCTGCCTCACTGTCTCCATCTCTGGGTGGAAAGATGGTGTTTTCCCTGAGAAACTAAGGCTCAGAGAGGTTGAATGGCTCTCCCAAGGTCACACAGCTGGTCAGCT
GCAGAGTTGAGAACACAGGAGTCCTGGTGCTCAGGCCAGCATCTCTTTTTTTCTTTGAGTTGTTTCTAGGTTTCCTAGCTCTTGCCTCAGACCTTAAAGAGAGAGGGTCTGATGGGGATGGGCACTGGAGACGGAGCATCCCAGCATTTCACATCTGAGCTGGCTTTCCTCTGCCCCAGGCTGCAGCTCCCACTGGGAGGTGGAGGACCTTGGCACCCACAAGCCGCCTGTGCTGAGGCCACGAGGTCAGCCCAACCAGTGCGTGGGCCACAGGGAGGCCAGCATCCACGCTTCCTGCTGCCATGCCCCAGGTCTGGAATGCAAAGTCAAGGAGCATGGAATCCCGGCCCCTCAGGAGCAGGTGAAGAGGCCCGTGAGGCCGGGTGGGTGGGGTGCTGCGTGTCTCTCCTGCACAGCTTTTCTGTGTCAGTTTGTGCCACCACCATACCGCCATGCATCAGGGTGGCGGTTTGCCAGGTAGATGCTGTGGGCAGCTTCCGCCATTGTGTGGACAGCATGTATATGTGTCTCTGTGTGGCTGGGTCTGTTTTTGCTTTTGTCCAGATCAGTAAGGTTTGCTACCTGGGTACCCCACTCCACTTGGAGTAGAATGTGCATAAATATGGCATAAAGAAATGCAATATGCATGCATTTATTGATTGATCTATTTTTTTCTGAGATGGGGTCTTGCTGTGTTGCCCAGGCTGGTCTCAAATTCCTGGGCTCAAGCAATCCTCTGGTCTCAGCCTCCCCAAGTGTTGGGATTATAGGCATGAGCCGCTGCACCTGGCCTCTCTGATCTATTTAACAAACCTGCTGGGAGGGTCTCAGGGTCAGGAGCAGCACTGGGCTCTGAGGACACAGAGCTCACTCAGCCGTGACCCAGAGGGGGTGCCTGAGCTGCATGCTGAAGGTTGTTAGCATGACCAGCAAGGCAAGAAAAGGCCCTGCCGAGATTAGCAAGGCATGTGCCAAGCCCTGGAATGTGACAGCCGGGCCTTCTAGAAACCTGAGTGTATAACTCTCCTTAAAAGCCAGTAGGAGCTCCTCAAAAGGCAGCCCTAAGGAGTCCACTCTTAAATGAACTCAGAGTCAGTTTTAAAATGCAAGTCTGTGTTGATTCTGGTCTGGATGGTGCATTCCTCGAGAGCAAAAGACAGTCTTGGTCTTGGATCCACTTGCCCTGGGTACACTGAGGGCTGCTAGGTTCCAGGTGCTCTTCCTGGCACTGGGGAGGGATACAGGCCCAAGAGACATGCTGTTCTCCCTCCTGGAGCATCTATTTTAGTGGAGGAAGACAGAAAACAAACCATTAATATAGAGTACTGAAAAGATGCGATGGAGAAAACTATAGCAAGGAAGGGAATGGGGTGGGAGAGAGGTCAGGAGAGGTCTCGCTGACAAGGTGGACGAAACAGGCCATGAGGCAGAGAACATGTTCCAGGCAAAGCAAAGGCCCCCAGGTGGGGATGTGCAGGGAGTACCAGGAAACCAGAGAGGTGGGAATAGTTATGAGATGGGGGGTGCCTCAGAGGGGACAGGGCCAAGTCAGGTGAGACCTGAGGGTCACAGTCAGCAGTGAGCTGGGGCCATGCAGGGGTCTGGCCTCAGAGGAGTGTGGTCTGGCCTGGATCTGAACCTCTCACTGTGGCCTAGCTGCTGAGCTGAGAAGAGATGACAAGGACCTTGGGCAGAAGCAGGGAGACTGGAGGGAGGCGGTGGAGGGTCCAGGCGTTGGGGCGGGGCTCAGGCTGGAGTCTGAAGGGAGCCTGCAGGCCTGGTGGGTGGATGTGGGTGGGAGAGGGGGAGGATGGCACCAAGGCTCGGGCCCCTGGACAGATGGAGTTGCCATTAAGTGGGATGGGGCAGGCTATGGGGCCATCAGTTTCAGAGGGATGAGTTTGGCACTGGCATGGTAGGCATCTGTCTATCTCCACGGCCCTCAAACCAGGCATGAAGCAGGAGCTCACGTGTTTGGTCAGCCATGGTGCAGAACCGCCTGGGTGGGAGGTGCGGGGTGGGAGATACACGGTTGTGTCCCAAATGGGCTCTGAGCCAGCGAGGGCCGTCTGCACTTTGGCCTCACAGAAGGATGTCGGAGGGAGAAATGAAGTGTGGGTGGGGGTCCCGGGCCACGCTAGACATGTGCTTTCTTTTCCTCGGGCTCTGGCAGGTGACCGTGGCCTGCGAGGAGGGCTGGACCCTGACTGGCTGCAGTGCCCTCCCTGGGACCTCCCACGTCCTGGGGGCCTACGCCGTAGACAACACGTGTGTAGTCAGGAGCCGGGACGTCAGCACTACAGGCAGCACCAGCGAAGGGGCCGTGACAGCCGTTGCCATCTGCTGCCGGAGCCGGCACCTGGCGCAGGCCTCCCAGGAGCTCCAGTGACAGCCCCATCCCAGGATGGGTGTCTGGGGAGGGTCAAGGGCTGGGGCTGAGCTTTAAAATGGTTCCGACTTGTCCCTCTCTCAGCCCTCCATGGCCTGGCACGAGGGGATGGGGATGCTTCCGCCTTTCCGGGGCTGCTGGCCTGGCCCTTGAGTGGGGCAGCCTCCTTGCCTGGAACTCACTCACTCTGGGTGCCTCCTCCCCAGGTGGAGGTGCCAGGAAGCTCCCTCCCTCACTGTGGGGCATTTCACCATTCAAACAGGTCGAGCTGTGCTCGGGTGCTGCCAGCTGCTCCCAATGTGCCGATGTCCGTGGGCAGAATGACTTTTATTGAGCTCTTGTTCCGTGCCAGGCATTCAATCCTCAGGTCTCCACCAAGGAGGCAGGATTCTTCCCATGGATAGGGGAGGGGGCGGTAGGGGCTGCAGGGACAAACATCGTTGGGGGGTGAGTGTGAAAGGTGCTGATGGCCCTCATCTCCAGCTAACTGTGGAGAAGCCCCTGGGGGCTCCCTGATTAATGGAGGCTTAGCTTTCTGGATGGCATCTAGCCAGAGGCTGGAGACAGGTGCGCCCCTGGTGGTCACAGGCTGTGCCTTGGTTTCCTGAGCCACCTTTACTCTGCTCTATGCCAGGCTGTGCTAGCAACACCCAAAGGTGGCCTGCGGGGAGCCATCACCTAGGACTGACTCGGCAGTGTGCAGTGGTGCATGCACTGTCTCAGCCAACCCGCTCCACTACCCGGCAGGGTACACATTCGCACCCCTACTTCACAGAGGAAGAAACCTGGAACCAGAGGGGGCGTGCCTGCCAAGCTCACACAGCAGGAACTGAGCCAGAAACGCAGATTGGGCTGGCTCTGAAGCCAAGCCTCTTCTTACTTCACCCGGCTGGGCTCCTCATTTTTACGGGTAACAGTGAGGCTGGGAAGGGGAACACAGACCAGGAAGCTCGGTGAGTGATGGCAGAACGATGCCTGCAGGCATGGAACTTTTTCCGTTATCACCCAGGCCTGATTCACTGGCCTGGCGGAGATGCTTCTAAGGCATGGTCGGGGGAGAGGGCCAACAACTGTCCCTCCTTGAGCACCAGCCCCACCCAAGCAAGCAGACATTTATCTTTTGGGTCTGTCCTCTCTGTTGCCTTTTTACAGCCAACTTTTCTAGACCTGTTTTGCTTTTGTAACTTGAAGATATTTATTCTGGGTTTTGTAGCATTTTTATTAATATGGTGACTTTTTAAAATAAAAACAAACAAACGTTGTCCTAAC(配列番号5)
[441]ヒトPCSK9アミノ酸配列(NP_777596.2)
MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ(配列番号6)
アポリポタンパク質C3(APOC3)
[442]一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する改変のための標的遺伝子は、APOC3をコードする遺伝子である。LDL-R媒介性のコレステロールクリアランス経路には、複数の関係者が関与している。この経路に関与するタンパク質因子の非限定的な例としては、アポリポタンパク質C3(APOC3)、LDL受容体(LDL-R)、およびLDL受容体タンパク質の分解の増大(IDOL)が挙げら
れる。これらのタンパク質因子およびそれらのそれぞれの機能は、当該技術分野で説明されている。さらに、これらの因子の機能喪失バリアントが特定され、特徴付けられており、心臓保護機能を有することが確認されている。例えば、Jorgensen et al.,N Engl J Med 2014;371:32-41 July 3,2014;Scholtzl et al,Hum.Mol.Genet.(1999)8(11):2025-2030;De Castro-Oros et al.,BMC Medical Genomics,20147:17;およびGu et al.,J Lipid Res.2013、54(12):3345-57(これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる)を参照のこと。したがって、本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示される方法および組成物を使用して、APOC3(例えば、A43TおよびR19X)、LDL-R、およびIDOL(例えば、R266X)の機能喪失バリアントの生成を提供する。
[448]NG_008949.1:5000-8165 Homo sapiensアポリポタンパク質C3(APOC3)、第11染色体上のRefSeqGene
CTGCTCAGTTCATCCCTAGAGGCAGCTGCTCCAGGTAATGCCCTCTGGGGAGGGGAAAGAGGAGGGGAGGAGGATGAAGAGGGGCAAGAGGAGCTCCCTGCCCAGCCCAGCCAGCAAGCCTGGAGAAGCACTTGCTAGAGCTAAGGAAGCCTCGGAGCTGGACGGGTGCCCCCCACCCCTCATCATAACCTGAAGAACATGGAGGCCCGGGAGGGGTGTCACTTGCCCAAAGCTACACAGGGGGTGGGGCTGGAAGTGGCTCCAAGTGCAGGTTCCCCCCTCATTCTTCAGGCTTAGGGCTGGAGGAAGCCTTAGACAGCCCAGTCCTACCCCAGACAGGGAAACTGAGGCCTGGAGAGGGCCAGAAATCACCCAAAGACACACAGCATGTTGGCTGGACTGGACGGAGATCAGTCCAGACCGCAGGTGCCTTGATGTTCAGTCTGGTGGGTTTTCTGCTCCATCCCACCCACCTCCCTTTGGGCCTCGATCCCTCGCCCCTCACCAGTCCCCCTTCTGAGAGCCCGTATTAGCAGGGAGCCGGCCCCTACTCCTTCTGGCAGACCCAGCTAAGGTTCTACCTTAGGGGCCACGCCACCTCCCCAGGGAGGGGTCCAGAGGCATGGGGACCTGGGGTGCCCCTCACAGGACACTTCCTTGCAGGAACAGAGGTGCCATGCAGCCCCGGGTACTCCTTGTTGTTGCCCTCCTGGCGCTCCTGGCCTCTGCCCGTAAGCACTTGGTGGGACTGGGCTGGGGGCAGGGTGGAGGCAACTTGGGGATCCCAGTCCCAATGGGTGGTCAAGCAGGAGCCCAGGGCTCGTCCAGAGGCCGATCCACCCCACTCAGCCCTGCTCTTTCCTCAGGAGCTTCAGAGGCCGAGGATGCCTCCCTTCTCAGCTTCATGCAGGGTTACATGAAGCACGCCACCAAGACCGCCAAGGATGCACTGAGCAGCGTGCAGGAGTCCCAGGTGGCCCAGCAGGCCAGGTACACCCGCTGGCCTCCCTCCCCATCCCCCCTGCCAGCTGCCTCCATTCCCACCCGCCCCTGCCCTGGTGAGATCCCAACAATGGAATGGAGGTGCTCCAGCCTCCCCTGGGCCTGTGCCTCTTCAGCCTCCTCTTTCCTCACAGGGCCTTTGTCAGGCTGCTGCGGGAGAGATGACAGAGTTGAGACTGCATTCCTCCCAGGTCCCTCCTTTCTCCCCGGAGCAGTCCTAGGGCGTGCCGTTTTAGCCCTCATTTCCATTTTCCTTTCCTTTCCCTTTCTTTCTCTTT
CTATTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCCTTTCTTTCTTTCCTTTCTTTCTTTCCTTTCTTTCTTTCTTTCCTTTCTTTCTCTTTCTTTCTTTCTTTCCTTTTTCTTTCTTTCCCTCTCTTCCTTTCTCTCTTTCTTTCTTCTTCTTTTTTTTTTAATGGAGTCTCCCTCTGTCACCTAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCCATCTCGGCTCACTGCAACCTCCGTCTCCCGGGTTCAACCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCACGCGCCACCACACCCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGCAGAGATGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGTTGGTCTTGAATTCCTGACCTCAGGGGATCCTCCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACTGCGCCTGGCCCCATTTTCCTTTTCTGAAGGTCTGGCTAGAGCAGTGGTCCTCAGCCTTTTTGGCACCAGGGACCAGTTTTGTGGTGGACAATTTTTCCATGGGCCAGCGGGGATGGTTTTGGGATGAAGCTGTTCCACCTCAGATCATCAGGCATTAGATTCTCATAAGGAGCCCTCCACCTAGATCCCTGGCATGTGCAGTTCACAATAGGGTTCACACTCCTATGAGAATGTAAGGCCACTTGATCTGACAGGAGGCGGAGCTCAGGCGGTATTGCTCACTCACCCACCACTCACTTCGTGCTGTGCAGCCCGGCTCCTAACAGTCCATGGACCAGTACCTATCTATGACTTGGGGGTTGGGGACCCCTGGGCTAGGGGTTTGCCTTGGGAGGCCCCACCTGACCCAATTCAAGCCCGTGAGTGCTTCTGCTTTGTTCTAAGACCTGGGGCCAGTGTGAGCAGAAGTGTGTCCTTCCTCTCCCATCCTGCCCCTGCCCATCAGTACTCTCCTCTCCCCTACTCCCTTCTCCACCTCACCCTGACTGGCATTAGCTGGCATAGCAGAGGTGTTCATAAACATTCTTAGTCCCCAGAACCGGCTTTGGGGTAGGTGTTATTTTCTCACTTTGCAGATGAGAAAATTGAGGCTCAGAGCGATTAGGTGACCTGCCCCAGATCACACAACTAATCAATCCTCCAATGACTTTCCAAATGAGAGGCTGCCTCCCTCTGTCCTACCCTGCTCAGAGCCACCAGGTTGTGCAACTCCAGGCGGTGCTGTTTGCACAGAAAACAATGACAGCCTTGACCTTTCACATCTCCCCACCCTGTCACTTTGTGCCTCAGGCCCAGGGGCATAAACATCTGAGGTGACCTGGAGATGGCAGGGTTTGACTTGTGCTGGGGTTCCTGCAAGGATATCTCTTCTCCCAGGGTGGCAGCTGTGGGGGATTCCTGCCTGAGGTCTCAGGGCTGTCGTCCAGTGAAGTTGAGAGGGTGGTGTGGTCCTGACTGGTGTCGTCCAGTGGGGACATGGGTGTGGGTCCCATGGTTGCCTACAGAGGAGTTCTCATGCCCTGCTCTGTTGCTTCCCCTGACTGATTTAGGGGCTGGGTGACCGATGGCTTCAGTTCCCTGAAAGACTACTGGAGCACCGTTAAGGACAAGTTCTCTGAGTTCTGGGATTTGGACCCTGAGGTCAGACCAACTTCAGCCGTGGCTGCCTGAGACCTCAATACCCCAAGTCCACCTGCCTATCCATCCTGCGAGCTCCTTGGGTCCTGCAATCTCCAGGGCTGCCCCTGTAGGTTGCTTAAAAGGGACAGTATTCTCAGTGCTCTCCTACCCCACCTCATGCCTGGCCCCCCTCCAGGCATGCTGGCCTCCCAATAAAGCTGGACAAGAAGCTGCTATGA(配列番号62)
NP_000031.1 ヒトアポリポタンパク質C-III前駆体
MQPRVLLVVALLALLASARASEAEDASLLSFMQGYMKHAT
KTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA(配列番号63)
アンジオポイエチン様3(ANGPTL3)
[449]一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を使用する改変のための標的遺伝子は、ANGPTL3をコードする遺伝子である。ANGPTL3は、限定するものではないが、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、冠状動脈性心疾患、糖尿病、真性糖尿病、インスリン非依存性真性糖尿病、脂肪肝、高インスリン血症、高脂血症、高トリグリセリド血症、低βリポタンパク血症、炎症、インスリン抵抗性、代謝疾患、肥満、口腔悪性新生物、脂質代謝異常症、口唇・口腔癌腫、脂質異常症、メタボリックシンドロームX、低トリグリセリド血症、オピッツ三角頭症症候群、虚血性脳卒中、高トリグリセリド血症結果、家族性低βリポ蛋白血症2、家族性低βリポ蛋白血症、および虚血性脳血管障害などの疾患および障害に関連している。本明細書に記載の方法のいずれかを使用したANGPTL3遺伝子の編集は、本明細書に記載の疾患および障害の症状を治療、予防および/または緩和するために使用され得る。
にある。
からG・Cへの変更は、ANGPTL3遺伝子によってコードされる異常なANGPTL3転写物をもたらす。一部の実施形態では、A・TからG・Cへの変更は、ANGPTL3遺伝子によってコードされる非機能的ANGPTL3ポリペプチドをもたらす。一部の実施形態では、A・TからG・Cへの変更は、ANGPLT3遺伝子のイントロン6のスプライスドナー部位の5’末端にある。
NG_028169.1 ヒトアンジオポエチン様3(ANGPTL3)、第1染色体上のRefSeqGene
AATGACAAACTGAAAAAATCTATTGTTTGTTATATATATAACAAAGAATTAGTATCCACAATATGTAAATAATTCCTAAAATTAGTCAGAAAGAGACAAACTTAAAAAGAGGGTAACAAGGAGGGGAGCAAATTATGTACATAACCAGATGATTCGCAAAGACGGCAACAGAGATGGCCAGCAAAACAAACTAGATATATACTTGTCTATTAGATTTATCAACATTTTTTGCCTTTTTCATTAAAAGCATTTGTAAAAGGATATAGGAAAAGAGGAACTCTCATATACTCCTGGCAGGGATGTAAATTGGTACAACCCTTTTGAAGGACAATCTGACAAAAGCAATCGTAAGTTACAAGTCAACATCTATGAATGTATATGAAAATATTTATATACATACATCACCACCATAAAAGCATTTTCTATACATACTGTTTATAATTAGAAAATTGGAAACAAATGATTAAAAGGGGGCTGATTAAATTAAGGTTCATCTATATAACAGGATTATGCAGCTATTAAAAAGGACGTGGTAACTCTATAGACATTCATAGGAAAATAAATTTTAAAATACTAAGATCCTGAATGATATATATATCATGAGCTATTATACATAACAAGATCCCACTTGTGTTATAAAAAATTATGTTTAGTCATTCAAAGGGTCTGGTATGATAGACCCAAAATGTTAATAGAGTCGAGATTTTTATTTTTTATAGGTTTTTGAAATACCTGAATTTTCACAATAAGTACTTTGCACATTAAAAATCTTAGCTGGGCATGGTGGCTCACGCTTGTAATCCCAGCACTCTGGGAGGCCAAGGTAGGCAGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGTCTGGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCAGGCTTGGTTGGGGGTGCCTGTAATTCCAGATACTCGGGAAGCTGAGACAGGAGAATCGCTTGAACCCAGGAGGGGGAAGTTGCAGTGAGCTGAGATCACGACGCTGCACTCCAGCCTGGGCAACAAAGAGCAAAACTCCGTCTCAAAAATAAATAAAGAAAAAATCTT
TACATGTCCAAAGATACGGCTGTTCAACTAAAAAATATATATGTATAAAACTTAACATGTTAATAGTGAACACACAAAACAGTAAGATAGATAAAATTATTCCTTCAAAGCTCACTTAACCTCTGGATCTACACTGTCCAAAAAGACGGTCTAATGAGACAATTGAGCACTTGATAGGTGAGTGGTTCTAACTGAGATATGTTCTCAGTATAAAACATACAATAGGATCTTCCTATACAACATTAATTAAAAAACAAACTATTGTAGTTAAAAAGGAAAAAATTAGAGATACTATGTAAAAAAGAGCCAAAATACCTTGTATTTTATTTGAAAGACATATCTCCATAAGATTACACAACCTCGTGTAGGATAAAGGACTTTGCTTTGCTTGGAATTTAAACAATTTAGGCTCTTAAATGTCCTAAAATTCTCTGTAGCTAAGAAATTTTTATATTGGTTCCTAGGAACTAGGAATCCTTAAATTAGGCCCTACATTTGCTTACAAGTTTATTTTCCTTGGCATAAAATTTTTTAGTTTTTACATTACTGGTTATATTTGATCAGGGTTCTATTTAAATAGGCACAAGTTCAAGCAAAGATCAGATTCTGCTTTTAGCAGTGTGTACTCAGACAGGAAGTATTAAAAGGCAGGCAGAAAATCCTTTATAAAATTACTACTTTCAATGCATTTTCCCACGTTGAAATGCTTCTGCAGTTTATAATTAGGCAAATTACTTTAATTATAATCAATAATGCTGTTCAAATTACTATAAGAATTATACAGATATTTATACCAAGAGACAATATACTAGAAACCAAGACTACGTGACCATTACCTCTACTCTGTCAGTGTTATTTGTGAGAAATTGCACAAATTTTGCAAAAAGTGTTAGTATCCTACTACAGTAGGATATAATATAGAAGGAAATAATTTCATAAAGCCTGTCTTTGGTACTAGTGCTCAGTTACTTTCATTAACTAAAAAAGGGGCTACTCTTCAAATTCCCTTCTCTAAAAAGAATGTACTATATCAAAAGGGGGTAAACACTACTACGTATACATTCTGCACTTAGAAATCCCTATATGTTGATTTTATCATTCTCTTATTCAATAAATATTGTTTCTACAATGTGTAAGGCATTACTGTACTAAAGCATTATAAGGAATATAAGTTAAAAACACATACAAATCTTGCCAATCAACAGCTTATAGTGTAATAGGGGAGAGAAGCTGGCCCATCTATATTCTCCCTCAACTAGCAAGTGGATGAAATATCAGGGTCAATAGTTATAAGCCACAAAAGCTGACAGCTTAATTAAGAGAAGTTTTGAAATATGTATTTCATGACCAATAATTACAACTGTAACTTTTCTATTTAAAGAAGGAGAAAATTTGAATTTCTTCTCTAGCTCAACATACACTTCTATAATTCCATTACATGAACCAGAGTAAAGGGTAAGATGGAAATGAAGAATATTTTCTTACCCTTTTGTGGTTCTATATTGGACACTTAAAAATCATACACAACCTAATCAAAAGATGTAATTCTTTAAAAAGGTACGAGACCAAAATTCAGAAAATCTAGACTATAACAAAATTTCTCAATTTACATTATCTTAATATGCAATTAATTTTCACCAGTAAAATACTATAGTATGGGTACAAATGCATTGATTAGTTCTAATTACAAAAATGGCTAATATATAATACTGTGTAGTGTTTATGATACATCAGATAATGTTCTAAGTGCTCTGAAAATATAAACTTTTAATCTTTTATACGACCCTATAAAATAGGTGTTATTCTCACTGGAGAGATGAGAAAACAGGGGTTCAGAGATGTGAAGTAATTTGACCAAAGGTCACAAAGCTGAAGAATATGAAATCCGGGATTCTGATTCAGGCAGTCTTATTCCAGAATCATGCTCTTAACCACTATGGAATACTGCCTCTACTGTAACTATTATACCCAAAACCCTTAATCCTAAGTCATCAAAAGGA
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[460]AAD34156.1ヒトアンジオポイエチン関連タンパク質3
MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE(配列番号8)
リポタンパク質(a)(LPA)
[461]一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法を用いた改変の標的遺伝子は、リポタンパク質a(LPA)をコードする遺伝子である。LPAは、低密度リポタンパク質バリアントである。遺伝学的および疫学的研究により、LPAがアテローム性動脈硬化症および関連疾患、例えば、冠状動脈性心臓病および脳卒中の危険因子であることが確認されている。LPA濃度は、個体間で1000倍以上異なる:<0.2から>200mg/dLまで。この濃度範囲は、これまでに科学者によって研究された全ての集団で観察されている。異なる世界の集団の間の平均および中央濃度は、明確な特殊性を示しており、その主なものは、アジア、オセアニア、またはヨーロッパの人口と比較して、アフリカ系の人口のLPA血漿濃度が2倍から3倍高いことである。血液中の高LPAは、冠状動脈性心疾患(CHD)、心血管疾患(CVD)、アテローム性動脈硬化症、血栓症、および脳卒中と相関している。LPAを持たないか、またはLPAレベルが非常に低い個体は、健康であるように見える。したがって、少なくとも通常の環境条件下では、血漿LPAは重要ではない。apo(a)/LPAは、哺乳動物の進化においてかなり最近になって登場したため(旧世界のサルおよびヒトのみがLPAを保有することが示されている)、その機能は重要ではないかもしれないが、特定の環境条件下、例えば、特定の感染症にさらされた場合では、進化的に有利である。
>sp|P08519|APOA_HUMAN Apolipoprotein(a)OS=Homo sapiens OX=9606 GN=LPA PE=1 SV=1
MEHKEVVLLLLLFLKSAAPEQSHVVQDCYHGDGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHNRTTENYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYH
GNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRD
PGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDPVAAPYCYTRDPSVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTITPIPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYQGTYFITVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPAYYPNAGLIKNYCRNPDPVAAPWCYTTDPSVRWEYCNLTRCSDAEWTAFVPPNVILAPSLEAFFEQALTEETPGVQDCYYHYGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHSRTPENYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCLVTESSVLATLTVVPDPSTEASSEEAPTEQSPGVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGGLTRNYCRNPDAEISPWCYTMDPNVRWEYCNLTQCPVTESSVLATSTAVSEQAPTEQSPTVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCPVMESTLLTTPTVVPVPSTELPSEEAPTENSTGVQDCYRGDGQSYRGTLSTTITGRTCQSWSSMTPHWHRRIPLYYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTRCPVTESSVLTTPTVAPVPSTEAPSEQAPPEKSPVVQDCYHGDGRSYRGISSTTVTGRTCQSWSSMIPHWHQRTPENYPNAGLTENYCRNPDSGKQPWCYTTDPCVRWEYCNLTQCSETESGVLETPTVVPVPSMEAHSEAAPTEQTPVVRQCYHGNGQSYRGTFSTTVTGRTCQSWSSMTPHRHQRTPENYPNDGLTMNYCRNPDADTGPWCFTMDPSIRWEYCNLTRCSDTEGTVVAPPTVIQVPSLGPPSEQDCMFGNGKGYRGKKATTVTGTPCQEWAAQEPHRHSTFIPGTNKWAGLEKNYCRNPDGDINGPWCYTMNPRKLFDYCDIPLCASSSFDCGKPQVEPKKCPGSIVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGKHFCGGTLISPEWVLTAAHCLKKSSRPSSYKVILGAHQEVNLESHVQEIEVSRLFLEPTQADIALLKLSRPAVITDKVMPACLPSPDYMVTARTECYITGWGETQGTFGTGLLKEAQLLVIENEVCNHYKYICAEHLARGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYARVSRFVTWIEGMMRNN(配列番号64)
塩基エディタータンパク質-gRNA複合体
[463]別の態様において、本明細書において提供されるのは、本明細書において提供されるシングルガイドRNAを、塩基エディター融合タンパク質、例えばアデノシン塩基エディター融合タンパク質と複合して含む複合体であって、この複合体が、未改変のシングルガイドRNAおよび塩基エディタータンパク質との複合体と比較して安定性の増大を含み、この安定性が複合体の半減期によってex vivoまたはin vitroで測定される複合体である。
[469]別の態様において、本明細書において提供されるシングルガイドRNAおよび塩基エディタータンパク質または塩基エディタータンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変のための組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態では、この組成
物は、塩基エディタータンパク質をコードする核酸配列を含むベクターをさらに含む。
治療法および処置の方法
[471]いくつかの態様では、治療を必要とする対象の状態を治療または予防する方法が本明細書に提供され、この方法は、治療有効量の(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸、ならびに(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸、を対象に投与すること、を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、塩基エディターシステムは、プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸を含む。
22、23、24、25、26、27、28、29、または30時間の間隔にわたって投与される。一部の実施形態では、第1の組成物および第2の組成物は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30日の間隔にわたって投与される。一部の実施形態では、第1の組成物および第2の組成物は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30週間の間隔にわたって投与される。
6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で少なくとも約1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950、または1:1000である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、17:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2;1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1.0:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸との比は、重量で多くとも約1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450、1:500、1:550、1:600、1:650、1:700、1:750、1:800、1:850、1:900、1:950、または1:1000である。
1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2、または1:0.1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1:1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドと、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:3
7、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2、または1:0.1である。
、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2、または1:0.1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約10000:1、9500:1、9000:1、8500:1、8000:1、7500:1、7000:1、6500:1、6000:1、5500:1、5000:1、4500:1、4000:1、3500:1、3000:1、2500:1、2000:1、1500:1、1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、190:1、180:1、170:1、160:1、150:1、140:1、130:1、120:1、110:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、69:1、68:1、67:1、66:1、65:1、64:1、63:1、62:1、61:1、60:1、59:1、58:1、57:1、56:1、55:1、54:1、53:1、52:1、51:1、50:1、49:1、48:1、47:1、46:1、45:1、44:1、43:1、42:1、41:1、40:1、39:1、38:1、37:1、36:1、35:1、34:1、33:1、32:1、31:1、30:1、29:1、28:1、27:1、26:1、25:1、24:1、23:1、22:1、21:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.4:1、0.3:1、0.2:1、または0.1:1である。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸とのモル比は、多くとも約1:10000、1:9500、1:9000、1:8500、1:8000、1:7500、1:7000、1:6500、1:6000、1:5500、1:5000、1:4500、1:4000、1:3500、1:3000、1:2500、1:2000、1:1500、1:1000、1:950、1:900、1:850、1:800、1:750、1:700、1:650、1:600、1:550、1:500、1:450、1:400、1:350、1:300、1:250、1:200、1:190、1:180、1:170、1:160、1:150、1:140、1:130、1:120、1:110、1:100、1:95、1:90、1:85、1:80、1:75、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1
:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、1:0.9、1:0.8、1:0.7、1:0.6、1:0.5、1:0.4、1:0.3、1:0.2、または1:0.1である。
、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、75%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%低い、対象における血液ANGPTL3タンパク質レベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、ELISA、ウェスタンブロット、またはLC-MS/MSによって測定して、投与前と比較して少なくとも1.1分の1、1.2分の1、1.3分の1、1.4分の1、1.5分の1、1.6分の1、1.7分の1、1.8分の1、1.9分の1、2分の1、2.5分の1、3分の1、3.5分の1、4分の1、4.5分の1、5分の1、6分の1、7分の1、8分の1、9分の1、10分の1以下、または10分の1未満の、対象における血液ANGPTL3タンパク質レベルをもたらす。
[501]一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの少なくとも30%、35%、40%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.3%、99.5%、99.7%、99.8%、または99.9%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの多くとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、99.3%、99.5%、99.7%、99.8%、または99.9%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの1%~99.9%、2%~99.9%、3%~99.9%、4%~99.9%、5%~99.9%、6%~99.9%、7%~99.9%、8%~99.9%、9%~99.9%、10%~99.9%、15%~99.9%、20%~99.9%、25%~99.9%、30%~99.9%、35%~99.9%、40%~99.9%、45%~99.9%、50%~99.9%、55%~99.9%、60%~99.9%、65%~99.9%、70%~99.9%、75%~99.9%、80%~99.9%、85%~99.9%、90%~99.9%、または95~99.9%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの1%~99.5%、1%~99%、1%~98%、1%~97%、1%~96%、1%~95%、1%~90%、1%~85%、1%~80%、1%~75%、1%~70%、1%~65%、1%~60%、1%~55%、1%~50%、1%~45%、1%~40%、1%~35%、1%~30%、1%~25%、1%~20%、1%~15%、1%~10%、1%~9%、1%~8%、1%~7%、1%~6%、1%~5%、1%~4%、1%~3%、または1%~2%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの1%~99.9%、5%~99.5%、10%~99%、15%~97%、20%~95%、25%~90%、30%~85%、35%~80%、40%~75%、45%~70%、50%~65%、または55%~60%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における血液トリグリセリドレベルの100%の低減をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して対象における少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、75%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、250%、260%、270%、280%、290%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%低い、対象における血液トリグリセリドレベルをもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、投与前と比較して少なくとも1.1分の1、1.2分の1、1.3分の1、1.4分の1、1.5分の1、1.6分の1、1.7分の1、1.8分の1、1.9分の1、2分の1、2.5分の1、3分の1、3.5分の1、4分の1、4.5分の1、5分の1、6分の1、7分の1、8分の1、9分の1、10分の1以下、または10分の1未満の、対象における血液トリグリセリドレベルをもたらす。
する対象における状態を処置または予防するための方法は、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを3日後に投与することを含み、この複数回投与は2日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを3日後に投与することを含み、この複数回投与は3日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを3日後に投与することを含み、この複数回投与は4日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを3日後に投与することを含み、この複数回投与は5日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを3日後に投与することを含み、この複数回投与は6日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを3日後に投与することを含み、この複数回投与は7日間隔で施される。
細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを1日後に投与することを含み、この複数回投与は3日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを1日後に投与することを含み、この複数回投与は4日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを1日後に投与することを含み、この複数回投与は5日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを1日後に投与すること、を含み、この複数回投与は6日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを1日後に投与することを含み、この複数回投与は7日間隔で施される。
る状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを2日後に投与することを含み、この複数回投与は5日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを2日後に投与することを含み、この複数回投与は6日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入する複数回用量のLNPを2日後に投与することを含み、この複数回投与は7日間隔で施される。
される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを3日後に投与すること、を含み、この複数回投与は7日間隔で施される。
る単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを5日後に投与すること、を含み、この複数回投与は1日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを5日後に投与すること、を含み、この複数回投与は2日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを5日後に投与すること、を含み、この複数回投与は3日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを5日後に投与すること、を含み、この複数回投与は4日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを5日後に投与すること、を含み、この複数回投与は5日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを5日後に投与すること、を含み、この複数回投与は6日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを5日後に投与すること、を含み、この複数回投与は7日間隔で施される。
デアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを6日後に投与すること、を含み、この複数回投与は3日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを6日後に投与すること、を含み、この複数回投与は4日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを6日後に投与すること、を含み、この複数回投与は5日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを6日後に投与すること、を含み、この複数回投与は6日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを6日後に投与すること、を含み、この複数回投与は7日間隔で施される。
処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを7日後に投与すること、を含み、この複数回投与は5日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを7日後に投与すること、を含み、この複数回投与は6日間隔で施される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、それを必要とする対象における状態を処置または予防するための方法は、(ii)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基編集因子融合タンパク質、またはそれをコードする核酸を封入する単回用量のLNPを投与すること、ならびに複数回用量のLNPであって、(i)ガイドポリヌクレオチドまたはそれをコードする核酸を封入するLNPを7日後に投与すること、を含み、この複数回投与は7日間隔で施される。
g、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4.0mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5.0mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6.0mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7.0mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8.0mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9.0mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、100mg/kg、105mg/kg、110mg/kg、115mg/kg、120mg/kg、125mg/kg、130mg/kg、135mg/kg、140mg/kg、145mg/kg、150mg/kg、155mg/kg、160mg/kg、165mg/kg、170mg/kg、175mg/kg、180mg/kg、185mg/kg、190mg/kg、195mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、または500mg/kgを含む。
位にある。一部の実施形態では、スプライスドナー部位は、配列番号5で参照されるPCSK9イントロン1の5’末端にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、PCSK9遺伝子のスプライスアクセプター部位にある。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、フレームシフト、未成熟終止コドン、PCSK9遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす。一部の実施形態では、核酸塩基の変更は、PCSK9遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす。一部の実施形態では、ガイドポリヌクレオチドはガイドRNAである。一部の実施形態では、ガイドRNAは化学的に改変されている。一部の実施形態では、ガイドRNAはtracrRNA配列を含む。一部の実施形態では、ガイドRNAは表1または表24で説明される化学的改変を含む。
ロトスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、このプロトスペーサーは、配列5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(配列番号13)、AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(配列番号14)または5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号15)を含む。
[535]一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも1つ、2つ、または3つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも1つ、2つ、または3つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも1つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも2つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも3つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも4つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも5つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも6つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも7つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも8つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも9つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、mRNAは、2’-ヒドロキシル基、2’-O-メチル基、もしくはさらなる2’化学的改変、またはそれらの組合せを含む5’末端に少なくとも10個のヌクレオチドを含む。
[537]本明細書に記載の組成物は、高循環コレステロールレベルに関連する状態を処置するために、治療有効量でそれを必要とする対象に投与され得る。本明細書に記載の組成物および方法を使用して処置され得る高循環コレステロールレベルに関連する状態としては、限定するものではないが、以下が挙げられる:高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、低密度リポタンパク質(LDL)レベルの上昇、血中LDLコレステロールレベルの上昇、血中高密度リポタンパク質コレステロール値低下、脂肪肝、冠状動脈性心疾患、血管疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、2型糖尿病、高トリグリセリド血症、高血圧、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、およびそれらの組み合わせ。本明細書に開示される組成物および方法は、対象の循環コレステロールレベルを低下させ、それにより状態を処置するのに有効である。本明細書に開示される組成物および方法は、投与前と比較して、血中LDLコレステロールレベルの低下および/または血中トリグリセリドレベルの低下に有効である。
態に起因する病状を示す疑いのある対象、および疾患または状態に起因する病状を示すリスクのある対象に対して実施され得る。例えば、疾患または状態に対する遺伝的素因を有する対象は、予防的に処置され得る。状態、疾患または障害に関連する症状を示す対象は、症状を処置して軽減するため、または症状のさらなる進行を遅らせるためもしくは予防するために処置され得る。疾患または状態の重症度の増大に関連する身体的変化は、本明細書では進行性であることが示されている。したがって、本開示の実施形態では、状態または疾患に関連する病状の軽度の徴候を示す対象を処置して、症状を改善し、および/または症状のさらなる進行を防止し得る。
[543]一部の実施形態では、投与後、対象は、投与前と比べて少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.9%、または100%低下した血中低密度リポタンパク質(LDL)コレステロールレベルを示す。一部の実施形態では、投与後、対象は、投与前と比較して、少なくとも2分の1、少なくとも3分の1、少なくとも4分の1、少なくとも5分の1、少なくとも10分の1、少なくとも20分の1、少なくとも25分の1、少なくとも30分の1、少なくとも40分の1、少なくとも50分の1、少なくとも60分の1、少なくとも70分の1、少なくとも80分の1、少なくとも90分の1、少なくとも100分の1、少なくとも200分の1、少なくとも300分の1、少なくとも400分の1、少なくとも500分の1、少なくとも600分の1、少なくとも700分の1、少なくとも800分の1、少なくとも900分の1、少なくとも1000分の1、少なくとも2000分の1、少なくとも3000分の1、少なくとも4000分の1、少なくとも5000分の1、少なくとも6000分の1、少なくとも7000分の1、少なくとも8000分の1、少なくとも9000分の1、少なくともまたは10000分の1の血中低密度リポタンパク質(LDL)コレステロールレベルの低下を示す。
、投与時の患者の状態に依存する。正確な量は日常的な実験によって決定し得るが、最終的には、例えば、患者の疾患の兆候を監視し、それに応じて治療を調整することによって、臨床医の判断に委ねられる。
[555]遺伝子改変、特に塩基を直接編集する能力により、DSBを作成する必要なく、ヒトの疾患を治療する方法を改善することもなく、in vivoでの遺伝子の正確な編集、改変、および/または破壊が可能になる。例えば、Chadwickらは、成体マウスのPcsk9遺伝子にナンセンス変異を導入するためにシトシン塩基編集を使用した。アデノウイルスベクターを介したBE3とgRNAの肝臓への送達により、血漿PCSK9レベルが56%低下した。さらに、塩基編集されたマウスのコレステロール値は約30%減少した。その後の研究で、成体マウスのAngptl3遺伝子を破壊するシトシン塩基編集により、血中コレステロールとトリグリセリドのレベルが大幅に低下し、胎児マウスのPcsk9遺伝子またはHpd遺伝子を破壊するシトシン塩基編集により、出生後のコレステロール値の低下または遺伝性チロシン血症1型という疾患の治癒がもたらされた。
内集合および分泌を無効にすることが示されている。
[561]いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される塩基エディターシステムおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
、抗酸化剤、防腐剤、またはそれらの1つまたは複数の組み合わせなどの1つまたは複数の他の化学成分(すなわち、薬学的に許容される成分)との混合物であり得る。この医薬組成物は、本明細書に記載のgRNAまたはsgRNAおよび塩基エディター融合タンパク質またはこの塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸配列の、それを必要とする生物または対象への投与を容易にする。
[569]一部の実施形態では、LNPは、Conway,A.et al.2019 Mol.Ther.27,866-877,およびVilliger,L.et al 2021 Nat.Biomed.Eng.5,179-18に記載されている方法に従って調製され、これらは参照により組み込まれる。一部の実施形態では、LNPは、アミノ脂質、PEG-脂質と呼ばれる脂質にコンジュゲートされた平均分子量2000Daのモノメトキシポリエチレングリコール(またはメトキシポリエチレングリコール)、コレステロール、および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)から構成される。一部の実施形態では、LNPは、独自のイオン化可能なカチオン性脂質、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、コレステロール、およびPEG脂質から構成される。
[576]アミノ脂質、リン脂質、PEG脂質、コレステロールもしくはその誘導体、ペイロード、またはそれらの任意の組み合わせを含むLNP組成物が、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、このLNP組成物はアミノ脂質を含む。一態様において、本明細書に開示されるのは、式(I)の構造を有するアミノ脂質、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、
式中
各々のR1およびR2は独立して、C7-C22アルキル、C7-C22アルケニル、C3-C8シクロアルキル,-C2-C10アルキレン-L-R6、または
各々のX、Y、およびZは独立して、-C(=O)NR4-、-NR4C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NR4C(=O)O-、-OC(=O)NR4-、-NR4C(=O)NR4-、-NR4C(=NR4)NR4-、-C(=S)NR4-、-NR4C(=S)-、-C(=O)O-、-OC(=S)-、OC(=S)O-、-NR4C(=S)O-、-OC(=S)NR4-、-NR4C(=S)NR4-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-OC(=O)S-、-NR4C(=O)S-、-SC(=O)NR4-、-C(=S)S-、-SC(=S)-、-SC(=S)O-、-NR4C(=S)S-、-SC(=S)NR4-、-C(=S)S-、-SC(=S)-、-SC(=O)S-、-SC(=S)S-、-NR4C(=S)S-、-SC(=S)NR4-O、S、または結合であり;
各々のLは独立して、-C(=O)NR4-、-NR4C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)O-、-NR4C(=O)O-、-OC(=O)NR4-、-NR4C(=O)NR4-、-NR4C(=NR4)NR4-、-C(=S)NR4-、-NR4C(=S)-、-C(=O)O-、-OC(=S)-、OC(=S)O-、-NR4C(=S)O-、-OC(=S)NR4-、-NR4C(=S)NR4-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-OC(=O)S-、-NR4C(=O)S-、-SC(=O)NR4-、-C(=S)S-、-SC(=S)-、-SC(=S)O-、-NR4C(=S)S-、-SC(=S)NR4-、-C(=S)S-、-SC(=S)-、-SC(=O)S-、-SC(=S)S-、-NR4C(=S)S-、-SC(=S)NR4-、O、S、-C1-C10アルキレン-O-、-C1-C10アルキレン-C(=O)O-、-C1-C10アルキレン-OC(=O)-、または結合であり、
式中、アルキレンは置換もしくは非置換であり;
R3は、-C0-C10アルキレン-NR7R8、-C0-C10アルキレン-ヘテロシクロアルキル、または-C0-C10アルキレン-ヘテロシクロアリールであり、
ここで、このアルキレン、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアリールは独立して、置換もしくは非置換であり;各々のR4は独立して、水素または置換もしくは非置換のC1-C6アルキルであり;
R5は、水素または置換もしくは非置換のC1-C6アルキルであり;
各々のR6は独立して、置換もしくは非置換のC3-C22アルキルまたは置換もしくは非置換のC3-C22アルケニルであり;
各々のR7およびR8は独立して、水素または置換もしくは非置換のC1-C6アルキルであるか、またはR7およびR8は、それらが結合される窒素と一緒になって、置換もしくは非置換のC2-C6ヘテロシクリルを形成し;
pは、1~10から選択される整数であり;かつ
各々のn、m、およびqは独立して、0、1、2、3、4、または5である。
々の不斉C原子は独立して、ラセミ、キラルに純粋なRおよび/もしくはキラルに純粋なS異性体、またはそれらの組み合わせを表す。
[579]一部の実施形態では、式(I)の化合物は、式(Ia)の構造、またはその薬学的に許容される塩もしくは薬学的に許容される溶媒和物を有し:
各々のR1およびR2は独立して、C7-C22アルキル、C7-C22アルケニル、C3-C8シクロアルキル、-C2-C10アルキレン-L-R6、または
式中、各々のアルキル、アルキレン、アルケニル、およびシクロアルキルは独立して、置換もしくは非置換であり;
各々のX、Y、およびZは独立して、C(=O)NR4-、-NR4C(D)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NR4C(=O)O-、-OC(=O)NR4-、-NR4C=O)NR4-、-NR4C(=NR4)NR4-、-C(=S)NR4-、-NR4C(=S)-、-C(E)O-、-OC(=S)-、OC(=S)O-、-NR4C(=S)O-、-OC(=S)NR4-、-NR4C(=S)NR4-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-OC(=O)S-、-NR4C(=O)S-、-SC(=O)NR4--C(=S)S-、-SC(=S)-、-SC(=S)O-、-NR4C(=S)S-、-SC(=S)NR4-、-C(=S)S-、-SC(=S)-、-SC(=O)S-、-SC(=S)S-、-NR4C(=S)S-、-SC(=S)NR4-、O、S、-C1-C10アルキレン-O-、または結合であり、ここで、このアルキレンは置換もしくは非置換であり;
各々のLは独立して、-C(=O)NR4-、-NR4C(=O)-、-C(=O)O-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NR4C(=O)O-、-OC(=O)NR4-、-NR4C(=O)NR4-、-NR4C(=NR4)NR4-、-C(=S)NR4-、-NR4C(=S)-、-C(=O)O-、-OC(=S)-、OC(=S)O-、-NR4C(=S)O-、-OC(=S)NR4-、-NR4C(=S)NR4-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-OC(=O)S-、-NR4C(=O)S-、-SC(=O)NR4--C(=S)S-、-SC(=S)-、-SC(=S)O-、-NR4C(=S)S-、-SC(=S)NR4-、-C(=S)S-、-SC(=S)
-、-SC(=O)S-、-SC(=S)S-、-NR4C(=S)S-、-SC(=S)NR4-、O、S、-C1-C10アルキレン-O-、-C1-C10アルキレン-C(=O)O-、-C1-C10アルキレン-OC(=O)-、または結合であり、式中、このアルキレンは、置換もしくは非置換であり;
R3は、-C0-C10アルキレン-NR7R8、-C0-C10アルキレン-ヘテロシクロアルキル、または-C0-C10アルキレン-ヘテロシクリルであり、ここでこのアルキレン、ヘテロシクロアルキルおよびヘテロシクロアリールは独立して、置換もしくは非置換であり;
各々のR4は独立して、水素または置換もしくは非置換のC1-C6アルキルであり;
R5は、水素または置換もしくは非置換のC1-C6アルキルであり;
各々のR6は独立して、置換もしくは非置換のC3-C22アルキルまたは置換もしくは非置換のC3-C22アルケニルであり;
各々のR7およびR8は独立して、水素または置換もしくは非置換のC1-C6アルキルであるか、またはR7およびR8は、それらが結合される窒素と一緒になって、置換もしくは非置換のC2-C6ヘテロシクリルを形成し;かつ
pは、1~10から選択される整数である。
式中、各々のアルキル、アルキレン、アルケニル、およびシクロアルキルは独立して、置換または非置換である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のR1およびR2は独立して、C10-C20アルキル、C10-C20アルケニルである。-C8-C7アルキレン-L-R6、または
[582]一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)の各々のLは独立して、O、S、-C1-C10アルキレン-O-、-C1-C10アルキレン-C(=O)O-、-C1-C10アルキレン-OC(=O)-、または結合であり、ここでこのアルキレンは置換または非置換である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)の各々のLは独立して、O、S、-C1-C3アルキレン-O-、-C1-C3アルキレン-C(=O)O-、-C1-C3アルキレン-OC(=O)-、または結合であり、ここでこのアルキレンは置換または非置換である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)の各々のLは独立して、O、S、-C1-C3アルキレン-O-、-C1-C3アルキレン-C(=O)O-、-C1-C3アルキレン-OC(=O)-、または結合であり、ここでこのアルキレンは、直鎖または分岐した非置換のアルキレンである。
[586]一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)の各々のR4は独立して、Hまたは置換もしくは非置換のC1-C4アルキルである。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)の各々のR4は独立して、置換もしくは非置換の直鎖C1-C4アルキルである。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)の各々のR4は、Hである。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)の各々のR4は独立して、H、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、または-CH(CH3)2である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)の各々のR4は独立して、Hまたは-CH3である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)の各々のR4は、CH3である。
NHC(=NH)N(CH3)-、-N(CH3)C(=NH)N(CH3)-、NHC(=NMe)NH-、-N(CH3)C(=NMe)NH-、-NHC(=NMe)N(CH3)-、または-N(CH3)C(=NMe)N(CH3)-である。
[590]一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のYは、-C(=O)O-または-OC(=O)-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のYは、-C(=O)NR4-または-NR4C(=O)-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のYは、-C(=O)N(CH3)-、-N(CH3)C(=O)-、-C(=O)NH-、または-NHC(=O)-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のYは、-OC(=O)O-、-NR4C(=O)O-、-OC(=O)NR4-、または-NR4C(=O)NR4-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のYは、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-、-NHC(=O)NH-、-N(CH3)C(=O)O-、-OC(=O)N(CH3)-、-N(CH3)C(=O)N(CH3)-または-N(CH3)C(=O)NH-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のYは、-OC(=O)O-、-NHC(=O)0-、-OC(=O)NH-、または-NHC(=O)NH-である。
-アルキレン-NR7R8である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のR3は、-C0-C10アルキレン-ヘテロシクロアルキルである。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のR3は、-C1-C6アルキレン-ヘテロシクロアルキルであり、ここでこのヘテロシクロアルキルは、1~3個の窒素および0~2個の酸素である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のR3は、-C1-C6アルキレン-ヘテロシクロアリールである。
[595]一部の実施形態では.式(I)および式(Ia)のR3は
[596]一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のR3は
[597]一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のZは、-C(=O)O-または-OC(=O)-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のZは、-C(=O)NR4-または-NR4C(=O)-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のZは、-C(=O)N(CH3)-、-N(CH3)C(=O)-、-C(=O)NH-、または-NHC(=O)-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のZは、-OC(=O)O-、-NR4C(=O)O-、-OC(O)NR4-、または-NR4C(=O)NR4-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のZは、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-、-NHC(=O)NH-、-N(CH3)C(=O)O-、-OC(=O)N(CH3)-、-N(CH3)C(=O)N(CH3)-、-NHC(=O)N(CH3)-または-N(CH3)C(=O)NH-である。一部の実施形態では、式(I)および式(Ia)のYは、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-、または-NHC(=O)NH-である。
では、第2のアミノ脂質に対する第1のアミノ脂質のモル比は、約0.25、約0.33、約0.5、約1、約2、約3、または約4である。
自然界で通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられている。本脂質に組み込まれてもよい同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄、フッ素、および塩素の同位体、例えば、2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、35S、18F、36Clが挙げられる。一態様では、本明細書に記載の同位体標識脂質、例えば3Hおよび14Cなどの放射性同位体が組み込まれた脂質は、薬物および/または基質組織分布アッセイにおいて有用である。一態様では、重水素などの同位体による置換は、例えば、in vivo半減期の延長または投与量要件の減少など、より大きな代謝安定性に起因する特定の治療上の利点をもたらす。
[611]本明細書で使用される「PEG脂質」または「PEG脂質」は、ポリエチレングリコール成分を含む脂質を指す。
リン脂質
[617]本明細書で使用される場合、「リン脂質」とは、リン酸部分および不飽和脂肪酸鎖などの1つまたは複数の炭素鎖を含む脂質を指す。リン脂質は、1つまたは複数の多重(例えば、二重または三重)結合を含み得る。一部の実施形態では、リン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜(例えば、細胞膜または細胞内膜)の1つまたは複数の負に荷電したリン脂質と相互作用し得る。膜へのリン脂質の融合は、LNPの1つまたは複数の要素が膜を通過すること、すなわち、1つまたは複数の要素の細胞への送達を可能にし得る。
ール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンからなる群から選択される。
[623]一部の実施形態では、LNP組成物は、コレステロールまたはその誘導体を含む。一部の実施形態では、LNP組成物は、構造脂質を含む。構造脂質は、ステロイド、ステロール、アルキルレゾレイノール、コレステロールまたはその誘導体、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファトコフェロール、およびそれらの組み合わせから選択され得る。一部の実施形態では、構造脂質は、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、およびヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイドである。一部の実施形態では、コレステロールまたはその誘導体は、コレステロール、5-ヘプタデシルレゾルシノール、またはコレステロールヘミスクシネートである。一部の実施形態では、コレステロールまたはその誘導体はコレステロールである。
[626]一部の実施形態では、本明細書に記載のLNPは、リン酸塩電荷中和剤を含む。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤は、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、ヒスチジン、カチオン性デンドリマー、ポリアミン、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤は、1つまたは複数の窒素原子を含む。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤は、ポリアミンを含む。一部の実施形態では、ポリアミンは、1,3-プロパンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ノルスペルミジン、トリス(2-アミノエチルダミン、サイクレン、1,4,7-トリアザシクロノナン、1,1,1-トリス(アミノメチル)エタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、ポリアミンは、1,3-プロパンジアミン、1,4-ブタンジアミン、スペルミン、スペルミジン、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のN/P比は、0.01~10である。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のN/P比は、約0.05~約2である。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のN/P比は、約0.1~約1である。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のN/P比は、約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、または、約1である。一部の実施形態では、リン酸塩電荷中和剤のN/P比は、約0.25、0.5、または0.75である。
[627]一部の実施形態では、本明細書に記載のLNPは、1つまたは複数の抗酸化剤を含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の抗酸化剤は、カチオン性脂質、ペイロード
、またはその両方の分解を減少させるように機能する。一部の実施形態では、1つまたは複数の抗酸化剤は、親水性抗酸化剤を含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の抗酸化剤は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)およびクエン酸塩などのキレート剤である。一部の実施形態では、1つまたは複数の抗酸化剤はEDTAである。一部の実施形態では、1つまたは複数の抗酸化剤は親油性抗酸化剤を含む。一部の実施形態では、親油性抗酸化剤は、ビタミンE異性体またはポリフェノールを含む。一部の実施形態では、1つまたは複数の抗酸化剤は、少なくとも1mM、少なくとも10mM、少なくとも20mM、少なくとも50mM、または少なくとも100mMの濃度でLNP組成物中に存在する。一部の実施形態では、1つまたは複数の抗酸化剤は、約20mMの濃度で粒子中に存在する。
[00628]本明細書に記載のLNPは、治療薬または目的の標的などのペイロードを送達するように設計され得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のLNPは、本明細書に記載の塩基エディターシステムの1つまたは複数の構成要素を封入する。例えば、LNPは、ガイドRNA、ガイドRNAをコードする核酸、ガイドRNAをコードするベクター、塩基エディター融合タンパク質、塩基エディター融合タンパク質をコードする核酸、プログラム可能なDNA結合ドメイン、プログラム可能なDNA結合ドメインをコードする核酸、デアミナーゼ、デアミナーゼをコードする核酸のうちの1つまたは複数、またはそれらの全てもしくは任意の組み合わせを封入し得る。一部の実施形態では、核酸はDNAである。一部の実施形態では、核酸はRNA、例えばmRNAである。
[631]一部の実施形態では、開示されたLNP組成物は、ヘルパー脂質を含む。一部の実施形態では、開示されたLNP組成物は中性脂質を含む。一部の実施形態では、開示されたLNP組成物は、ステルス脂質を含む。一部の実施形態では、開示されたLNP組成物は追加の脂質を含む。
テルス脂質およびそのような脂質の生化学に関する情報は、Romberg et al.,Pharmaceutical Research、Vol.25,No.1、2008、55-71頁およびI-Toekstra et al.,Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52に見出され得る。追加の適切なPEG脂質は、例えばWO2006/007712に開示されている。
[637]本明細書に記載のLNPは、1つまたは複数の特定の用途または標的のために設計し得る。ナノ粒子(LNP)組成物の要素または組成物は、特定の用途または標的に基づいて、ならびに/または有効性、毒性、費用、使いやすさ、および入手可能性に基づいて選択され得る。同様に、ナノ粒子組成物の特定の製剤は、1つまたは複数の記載された脂質を含む組成物であり、特定の適用または標的に合わせて選択され得る。製剤に使用される適切なリン酸塩電荷中和剤としては、限定するものではないが、スペルミジンおよび1,3-プロパンジアミンが挙げられる。
および/もしくは適用、または他の特性に依存し得る。例えば、ナノ粒子組成物に含まれるRNAの量は、RNAのサイズ、配列、および他の特徴に依存し得る。ナノ粒子組成物中の治療剤および他の要素(例えば、脂質)の相対量も変化し得る。一部の実施形態では、ナノ粒子組成物中の脂質成分対治療剤のwt/wt比は、約5:1~約60:1、例えば、約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、および60:1であってもよい。例えば、脂質成分対治療剤のwt/wt比は、約10:1~約40:1であり得る。特定の実施形態では、wt/wt比は、約20:1である。ナノ粒子組成物中の治療剤の量は、吸収分光法(例えば、紫外可視分光法)を使用して測定され得る。
を有すると想定されることに留意すべきである。特定の例では、結合点として二重結合(例えば、「オキソ」または「=O」)を有する1つまたは複数の置換基が、置換基内で本明細書に記載、示され、または列挙されてもよく、この構造は、式(I)のコア構造への結合点として単結合のみを示す場合がある。当業者は、単結合のみが示されているが、それらの置換基には二重結合が意図されていることを理解するであろう。
る少なくとも1つのヘテロ原子を含むシクロアルキル基を指す。本明細書で特に断りのない限り、ヘテロシクロアルキルラジカルは単環式または二環式の環系であり得、これは縮合(アリールまたはヘテロイル環と縮合する場合、ヘテロシクロアルキルは非芳香族環原子を介して結合する)または架橋環系を含んでもよい。ヘテロシクリルラジカル中の窒素、炭素または硫黄原子は、任意選択で酸化されていてもよい。窒素原子は、必要に応じて四級化されてもよい。ヘテロシクロアルキルラジカルは部分的または完全に飽和している。ヘテロシクロアルキルラジカルの例としては、限定するものではないが、ジオキソラニル、チエニル[1,3]ジチアニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、デカヒドロキノリル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、2-オキソピペラジニル、2-オキソピペリジニル、2-オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、4-ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、1-オキソチオモルホリニル、1,1-ジオキソ-チオモルホリニルが挙げられる。ヘテロシクロアルキルという用語には、単糖、二糖、およびオリゴ糖を含むがこれらに限定されない炭水化物の全ての環形も含まれる。特に断りのない限り、ヘテロシクロアルキルは、環に2~12個の炭素を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環に2~10個の炭素を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に2~10個の炭素および1個または2個のN原子を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に2~10個の炭素および3または4個のN原子を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に2~12個の炭素、0~2個のN原子、0~2個のO原子、0~2個のP原子、および0~1個のS原子を有する。一部の実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、環内に2~12個の炭素、1~3個のN原子、0~1個のO原子、および0~1個のS原子を有する。ヘテロシクロアルキル中の炭素原子の数に言及するとき、ヘテロシクロアルキル中の炭素原子の数は、ヘテロシクロアルキルを構成する原子(ヘテロ原子を含む)の総数(すなわち、ヘテロシクロアルキル環の骨格原子)と同じではないことが理解される。本明細書において特に断りのない限り、ヘテロシクロアルキル基は、任意選択で置換されてもよい。本明細書で使用される「テトラシクロアルキレン」という用語は、二価のヘテロシクロアルキル基を指し得る。
よい。アミノ脂質は、生理的pHでiLipidまたはcLipidであってもよい。
[656]本開示の一態様は、本明細書で提供されるシングルガイドRNAを含む組成物、本明細書で提供される塩基エディターシステムおよび複合体、本明細書で提供される組成物、または本明細書で提供される脂質ナノ粒子を含む、ある状態の処置または予防のためのキットに関する。キットは、ある状態を処置または予防するための1つまたは複数の追加の治療レジメンまたは薬剤をさらに含んでもよい。
[661]実施形態では、ラベルが容器上にあるか、容器に関連付けられている。一実施形態では、ラベルは、ラベルを形成する文字、数字、または他の文字が容器自体に取り付けられ、成形され、またはエッチングされたときに容器上にある。ラベルは、容器を保持するレセプタクルまたは担体内に存在する場合、例えば添付文書として容器に関連付けられる。一実施形態では、内容物が特定の治療用途に使用されることを示すためにラベルが使用される。ラベルはまた、本明細書に記載されている方法などで、内容物の使用方法も示している。
[662]本開示が特有の実施例によってより詳細に記載される。これらの実施例は、実例的な目的のためにのみ提供され、本明細書において提供される請求項の範囲を限定しない。当業者は、本開示による代替的な実施形態をもたらすために変更または改変され得る様々な不可欠でないパラメーターを容易に認識する。
ールを低減させ、世界中で死の主要な原因である冠動脈心疾患を処置するための一度で終わりのアプローチのための概念実証を提供することに加えて、これらの結果は、CRISPR塩基エディターが肝臓および潜在的に他の臓器において様々な治療標的遺伝子に対してどのように生産的に応用され得るのかを実証する。
のより高いリスクを有する(大きい欠失、ベクターDNA配列の組込み、染色体再編成、p53活性の誘起など)。意図されるオンターゲット効果(小さいインデル突然変異)であっても予測不可能性の要素を有し、それらは、切断されたタンパク質生成物の末端において様々な一連の異常なアミノ酸を付加するフレームシフト突然変異、またはその機能をノックアウトすることなくアミノ酸を付加するかもしくはタンパク質からアミノ酸を除去するインフレーム突然変異をもたらし得る。対照的に、塩基編集は、ゲノム中に精密な、定型的な変化を効率的に行うための手段を与え、遺伝子機能のより再現性のある変更を可能とする。塩基編集は、二本鎖切断を要求せず、その代わりにデアミナーゼドメインを介するDNA塩基の酵素的改変を通して作用するおかげで、意図されないオンターゲット効果を軽減する。
実施例1. PCSK9およびANGPTL3を標的化するためのgRNAの設計
[669]表1および表24に示される全てのプロトスペーサーは、2つの基準により選択された。第1に、それらは遺伝子のヒト、カニクイザル、および/またはマウスオルソログ中の配列にマッチした(または非常に緊密にマッチした)。第2に、それらは、MIT特異性スコア(http://crispor.tefor.net/により算出される;50の最小スコア)により判断される、好都合な予測されるオフターゲットプロファイルを有した。
プライスアクセプターのいずれであれ、スプライス部位を編集することである。スプライス部位妨害は、メッセンジャーRNA(mRNA)中へのイントロン配列の包含(未成熟終止コドンもしくはタンパク質活性を妨害するアミノ酸の挿入/欠失をもたらすナンセンス、フレームシフト、もしくはインフレームインデル突然変異を潜在的に導入する)、またはこれもまたナンセンス、フレームシフト、もしくはインフレームインデル突然変異を導入し得るエクソン配列の除外をもたらし得る。カノニカルなスプライスドナーはセンス鎖上にDNA配列GTを含む一方、カノニカルなスプライスアクセプターはDNA配列AGを含む。配列の変更は正常なスプライシングを妨害する。スプライスドナーは、アンチセンス鎖中の第2の位置における相補的塩基のアデニン塩基編集(GT→GC)により妨害可能であり、スプライスアクセプターは、センス鎖中の第1の位置のアデニン塩基編集(AG→GG)により妨害可能である。遺伝子機能を妨害するためにアデニン塩基エディターが使用され得る第3の戦略は、より低く機能的な、または非機能的なタンパク質の産生をもたらす、遺伝子のコーディング領域にミスセンス突然変異を導入することである。
[674]実験のセットにおいて、PCSK9 gRNAを、同等の量(重量で1:1の比)のTriLink Biotechnologiesから購入したin vitroで転写された商業的に入手可能なSpCas9 mRNA MS002と共に、初代ヒト肝細胞に2500、500、または100ng/RNA/mLで共トランスフェクトし、詳細な方法に記載されるように処理した。抽出されたゲノムDNAを、標的部位の辺りで生成されたPCRアンプリコンの次世代シーケンシングを用いて標的部位における遺伝子編集について分析した。製造業者のプロトコールに従ってNextera XT DNA library preparation kit(Illumina)を使用して試料を調製した。簡潔に述べれば、2ラウンドのPCRを行って、第1に目的の領域を増幅し、第2に次世代シーケンシングおよび初期生成物に対する試料同定のために要求されるDNA配列を付加した。最終アンプリコンを製造業者のプロトコールに従ってIllumina MiSeq機器上でシーケンシングした。広範囲の編集活性(表2)が観察された。実験の第2のセットにおいて、ANGPTL3 gRNAを、同等の量のin vitroで転写されたSpCas9 mRNA(重量で1:1の比)と共に初代ヒト肝細胞に
共トランスフェクトし、同様に処理および分析した(表3)。
[677]ABE8.8によるPCSK9の編集が初代肝細胞において観察された。PCSK9 gRNAを、同等の量のin vitroで転写されたABE8.8 mRNA MA002(重量で1:1の比)と共に初代肝細胞に共トランスフェクトし、詳細な方法に記載されるように処理した。実験の1つのセットにおいて、抽出されたゲノムDNAを、標的スプライス部位の塩基編集について、標的部位の辺りで生成されたPCRアンプリコンの次世代シーケンシングを用いて分析した。製造業者のプロトコールに従ってNextera XT DNA library preparation kit(Illumina)を使用して試料を調製した。簡潔に述べれば、2ラウンドのPCRを行って、第1に目的の領域を増幅し、第2に次世代シーケンシングおよび初期生成物に対する試料
同定のために要求されるDNA配列を付加した。最終アンプリコンを製造業者のプロトコールに従ってIllumina MiSeq機器でシーケンシングした。広範囲の編集活性(表5;図8)が観察され、ガイドGA066、GA073、およびGA074が最良の成績であった。
イザル肝細胞との両方の間で最良の種交差活性を有するとして以下の3つのプロトスペーサー配列:5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(配列番号13)(GA066)、5’-GCTTACCTGTCTGTGGAAGC-3’(配列番号67)(GA073)、および5’-TGCTTACCTGTCTGTGGAAG-3’(配列番号68)(GA074)にマッチするPCSK9標的化gRNAが同定された。GA066配列は、ヒトPCSK9イントロン1の5’末端におけるスプライスドナーを標的化し、エクソン1、続いてイントロン1の始めから翻訳されるいくつかのアミノ酸(エクソン1からイントロン1へと読み飛ばす)、続いて未成熟終止コドンから翻訳される異常なPCSK9タンパク質をもたらすことが予測される(図9)。GA073およびGA074配列は各々、ヒトPCSK9イントロン4の5’末端におけるスプライスドナーを標的化し、エクソン1、2、3、および4、続いてイントロン4の始めから翻訳されるいくつかのアミノ酸(エクソン4からイントロン4へと読み飛ばす)、続いて未成熟終止コドンから翻訳される異常なPCSK9タンパク質をもたらすことが予測される。これらの場合の各々における予測される未熟に切断されたタンパク質は、機能の完全な喪失を有する可能性がある他に、天然に存在する野生型ヒトPCSK9アミノ酸配列の部分に対するほぼ同一のマッチに起因して最小の免疫原性を有する可能性がある。同じプロトスペーサー配列、5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(配列番号13)(GA066)はカニクイザルゲノム中に見出され、同様にカニクイザルPCSK9イントロン1の5’末端におけるスプライスドナーを標的化する。
換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、YをCまたはHで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、KをGで置換することにより遺伝子機能を妨害する。一部の実施形態では、アデニン塩基エディターは、表7に列記されているアミノ酸置換を導入することにより遺伝子機能を妨害する。
[685]in vivoでヒト肝臓におけるPCSK9をノックダウンする塩基編集療法の安全性を確立することを目的として、オフターゲット突然変異誘発分析を評価した。オフターゲット突然変異誘発のためのヒトゲノム中の候補部位のリストを、2つの異なる方法を使用して集めた。第1の方法では、ヒトゲノムのバイオインフォマティクス分析を使用して、ストレプトコッカス・ピオゲネスCas9(およびしたがってABE 8.8)と適合性のPAM配列およびGA066スペーサー配列5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(配列番号13)と最大4つの単一ヌクレオチドミスマッチを有するプロトスペーサー配列を有する全ての部位を同定した。候補部位を生成するための第2の方法では、in vitro生化学的アッセイ、ONE-seqを使用し、ABE8.8塩基エディタータンパク質およびPCSK9 gRNA(5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(配列番号13))を含むリボ核タンパク質の、ライブラリー中のオリゴヌクレオチドを切断する傾向を決定した。参照ヒトゲノム(GRCh38)を、PCSK9 gRNA(5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(配列番号13))により特定されるプロトスペーサー配列に対して最大6つのミスマッチを有する部位について検索し、Cas-Designerを使用して最大4つのミスマッチおよび最大2つのDNAまたはRNAバルジを有する部位を同定した。ONE-seqライブラリー調製、実験プロトコール、およびバイオインフォマティクス分析に関するさらなる詳細は、追加の詳細な方法のセクションにおいて記載されている。
)。Agilent SureSelect技術を使用した次世代シーケンシングで(表11)、オンターゲット部位および候補オフターゲット部位にわたり、対照細胞における観察された塩基編集率を、LNP処理された細胞における観察された塩基編集率から引いた場合に(次世代シーケンシングにおいて本来的なバックグラウンドシーケンシングエラーを説明するため)、認識可能な塩基編集がオンターゲットPCSK9標的部位において観察された。これらの結果は、2人の男性および1人の女性患者からの3つの異なる初代肝細胞ロット(STL、HLY、およびJLP)において複製された。
プロトスペーサー配列に対して最大6つのミスマッチを有する部位について検索し、Cas-Designerを使用して最大4つのミスマッチおよび最大2つのDNAまたはRNAバルジを有する部位を同定した。ONE-seqライブラリー調製、実験プロトコール、およびバイオインフォマティクス分析に関するさらなる詳細は、追加の詳細な方法のセクションにおいて記載されている。
および初代カニクイザル肝細胞に5000、2500、および1250ng/RNA/mLで共トランスフェクトし、記載されるように処理した。
サー配列にマッチするgRNAを含有するLNPを、陽性対照としてこれらの実験のために使用した。このCas9 mRNA/gRNAの組合せは、初代ヒト肝細胞、初代カニクイザル肝細胞、およびカニクイザル肝臓においてin vivoで高いレベルのゲノム編集活性を生成することが以前に観察されているため、選択した。ABE8.8/GA066 LNPは編集に関して対照LNPを実質的に凌ぐことが観察され、ヒトおよびカニクイザルの両方の肝細胞においてはるかにより高い効力を示した(図15)。
SpCas9 mRNAおよび異なるtracr設計を有するマウスPcsk9標的化gRNA(GA052、GA053、GA054、およびGA055)を1:1の重量比で含有するLNPを製剤化した。野生型C57BL/6マウスに2mg/kgのLNP試験物品を投薬した。投薬の7日後に、マウスを安楽死させ、ゲノムDNAをマウス肝臓から採取し、次に標的部位の編集について次世代シーケンシングを用いて評価した。GA052、GA054、およびGA055は全て、以前に開示されたtracr設計を有するGA053を凌いだ(図16)。
[00697]ABE8.8 mRNAおよびマウスPcsk9標的化gRNAを1:1の重量比で含有するLNPを製剤化した。このgRNAは5’-CCCATACCTTGGAGCAACGG-3’(配列番号69)プロトスペーサー配列とマッチし、該配列は、PCSK9イントロン1の5’末端におけるスプライスドナーを標的化するヒト5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(配列番号13)配列(GA066、GA095、GA096、GA097およびGA346がマッチする)のマウスオルソログである。野生型C57BL/6マウスに2mg/kgのLNP試験物品を側尾静脈または後眼窩を介して10ml/kgの総体積で投薬した。投薬の7日後に、マウスを安楽死させ、ゲノムDNAをマウス肝臓から採取し、次に標的スプライス部位の塩基編集について次世代シーケンシングを用いて評価した。標的スプライス部位の約60%の編集が観察され(マウスPcsk9イントロン1スプライスドナー)(図17)、in vivoで肝臓におけるPCSK9をノックダウンする塩基編集療法の概念の前臨床的証明が提供された。
[00700]ABE8.8 mRNAおよびマウスAngptl3標的化gRNA(GA258、GA259、GA260、GA349、GA353)を1:1の重量比で含有するLNPを製剤化した。野生型C57BL/6マウスにLNP試験物品を0.05mg/kgの総RNA用量で投薬した。マウスを後に安楽死させ、ゲノムDNAをマウス肝臓から採取し、次に標的スプライス部位の塩基編集について次世代シーケンシングを用いて評価した(図20)。
実施例8. PCSK9/ABEの評価
[00701]最初に、LNPの投与を通じて特異的なgRNAおよび塩基エディターヌクレアーゼABE 8.8を使用してカニクイザルにおいてPCSK9遺伝子の編集を評価するために2週の研究を行った(図21)。肝臓においてPCSK9遺伝子の高レベルの塩基編集を生成することを意図して、ABE8.8/GA066 LNPをカニクイザルに静脈内注入を介して2つの用量、3mg/kg(n=3匹の動物)および1mg/kg(n=2匹の動物)で投与した。試験物品の投与の2週後に、血液試料を臨床化学アッセイおよびPCSK9 ELISAアッセイのために収集し、動物の検死を、肝臓の4つの葉の各々からの各々2つの試料の肝臓試料の収集物(各々の動物から計8つ)について行った。
[713]ABE/PCSK9ガイドを用いて行ったNHP研究と類似して、肝臓においてANGPTL3の高レベル塩基編集を生成することを意図して、ABE8.8 mRNAおよび5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(配列番号14)(GA067)カニクイザルスペーサーを有するgRNAを用いて製剤化されたLNPをカニクイザルに静脈内注入を介して2つの用量、3mg/kg(n=3匹の動物)および1mg/kg(n=2匹の動物)で投与した。試験物品の投与の2週後に、血液試料を臨床化学アッセイおよびANGPTL3 ELISAアッセイのために収集し、動物を肝臓試料の収集物について検死した。肝臓の各々の葉の中心および末梢からの小さいセグメントを切除し、液体窒素中でフラッシュ凍結させ、-86~-60℃で貯蔵した。スプライス部位の編集を次世代シーケンシングにより分析したところ、塩基変化が起こったことが確認された。最も高い用量(3mg/kg)において、アデニン塩基の平均で61%の編集が肝
臓における標的スプライス部位において観察され;最も低い用量(1mg/kg)において、観察された編集は肝臓における標的スプライス部位において28%であった(表19)。
[717]単一の試験物品を用いてPCSK9およびANGPTL3の同時の塩基編集に影響することができるかどうかを評価するために、2:1:1の重量比で3つの構成要素:ABE8.8 mRNA、PCSK9標的化gRNA(GA095)、およびANGPTL3標的化gRNA(GA098)のミックスを含有するLNPを製剤化した。初代ヒト肝細胞をLNPの様々な希釈液とインキュベートした。インキュベーションの3日後に、ゲノムDNAを肝細胞から採取し、次に標的スプライス部位の塩基編集について次世代シーケンシングを用いて評価した。最も高いLNP濃度において、PCSK9スプライス部位(イントロン1スプライスドナー)の約40%の編集およびANGPTL3スプライス部位(イントロン6スプライスドナー)の約40%の編集が観察され(図42)、単一の試験物品でのヒト肝細胞における二重の遺伝子妨害の実現可能性が実証され、ヒトレシピエントにおいて血中LDLコレステロールレベルおよび血中トリグリセリドレベルの両方を実質的に低減させることが予測される、PCSK9およびANGPTL3を同時にノックダウンする単一塩基編集療法の概念の前臨床的証明が提供された。このアプローチの利点は、標準的なCRISPR-Cas9とは対照的に、塩基エディターは編集のために二本鎖切断(DSB)を要求しないので、ゲノム中の2つの異なる部位の同時の標的化において本来的な染色体再編成または他の構造変化のリスクが実質的により低いことである。
生検後に、gDNAを抽出し、次世代シーケンシングを使用して塩基編集を評価した。この研究からの発見は、PCSK9およびANGPTL3標的の両方の高レベルの編集がLNPの第1および第2の用量後に達成されることを示す(図43)。血液試料を両方の生検時点において収集したところ、1mg/kgのLNPでのその後の投薬後に循環PCSK9およびANGPTL3における約90%の有意な減少を示している(図44)。同じ研究において、ABE8.8 mRNA、PCSK9 gRNA GA346およびANGPTL3 gRNA GA347を1:0.5:0.5の重量比でカプセル化したLNPを2mg/kgの総RNA用量で投与したところ、堅牢な同調したPCSK9およびANGPTL3遺伝子編集がもたらされた(図44、GA346+GA347(D1)と標識された上および下のデータ - 上および下パネルはPSCK9およびANGPTL3の編集を示す)。データは、堅牢な複数遺伝子編集が、哺乳動物(および/または哺乳動物細胞)におけるABE塩基エディターmRNAおよび2つまたはより多くの目的の遺伝子を標的化する2つまたはより多くのgRNAの単回の1用量投与で可能であることを実証する。図44は、ANGPTL3(下)およびPCSK9(上)タンパク質の対応するノックダウンを反映したものである。
A MA004およびPCSK9を標的化するgRNA(GA097)を用いて製剤化されたLNPを繰り返し投薬されたNHPにおいて評価した(図48)。NHPに静脈内注入を介して0.5mg/kgの総RNA用量で0、30、および60日目に投薬を行った。グラフに記載されている複数の時点において血液を収集した。LDHおよびGLDHは投薬で上昇したが、これは一過性の応答であり、数日の期間後に正常に戻った。
非ヒト霊長類におけるANGPTL3またはPCSK9の遺伝子編集を評価した。カニクイザルに、SpCas9 mRNA MS004およびANGPTL3(GA261~GA263)またはPCSK9(GA266~GA271)のいずれかを標的化する1つのgRNAを含むLNP製剤の1.5mg/kgの用量の静脈内注入を与えた。2週後の検死において、各々の肝葉から2つの小片(計8つの小片)を単離し、gDNAを抽出した。詳細な方法のセクションに記載されるように試料を処理した。インデル%を各々の別々の小片について分析し、個々の点としてグラフ化している(図51)。高い編集効率がほとんどのNHP肝臓において観察された。LDL-Cレベルを測定した(図52)。SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNAを含むLNPを与えられた全てのNHPは、循環LDL-Cレベルにおける少なくとも35%の低減を有した。より控えめであったが、SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNAを含むLNPは、循環LDL-Cレベルにおける10~25%の低減を有した。追加的に、SpCas9 mRNA/ANGPTL3 gRNAを含むLNPを与えられたNHPは、トリグリセリドレベルにおける約10~50%の低減を有した(図53)。SpCas9 mRNA/PCSK9 gRNAを含むLNPを与えられたNHPは、トリグリセリドレベルにおける有意な低減を示さなかった。
mLでSpCas9 mRNA MS002およびtracrに対する改変を有するPCSK9を標的化するgRNAをトランスフェクトした。詳細な方法のセクションに記載されるようにゲノムDNAを処理し、シーケンシングし、分析した。GA266を独立して2回トランスフェクトして、2つの陽性対照とした。ほぼ全てのトランスフェクションは、陽性対照と比較して高い編集効率をもたらし、GA405はわずかにより低い編集効率を有した。
することを示す。
[731]初代肝細胞のプレーティング、培養、およびトランスフェクション。BioIVTからの初代ヒト肝細胞(PHH)および初代カニクイザル肝細胞(PCH)を製造業者のプロトコールの通りに培養した。簡潔に述べれば、初代ヒト肝細胞および初代カニクイザル肝細胞を、凍結されたアリコートとしてBioIVTから得た。同定されない個々のドナーに各々が由来する、初代ヒト肝細胞の4つのロットを実験のために使用した:STL(主なドナー)を、スクリーニング実験およびオフターゲット実験を含む、全ての実験のために使用し;HLY、JLP、およびTLYをオフターゲット実験のために使用した。初代カニクイザル肝細胞のHFGロットを実験のために使用した。製造業者の使用説明書に従って、細胞を解凍し、リンスした後に、ウシコラーゲンを終夜被覆した24ウェルプレートに、約350,000細胞/ウェルの密度でTORPEDO抗生物質ミックスを補充したINVITROGRO肝細胞培地(BioIVT)中にプレーティングした。細胞を解凍し、肝細胞解凍培地に再懸濁し、続いて100gで10分間、4℃で遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化された細胞を肝細胞プレーティング培地に再懸濁した。各々のバイアルは約500万個の細胞を含有し、それを1つの24ウェルプレートへのプレーティングのために使用した。プレーティングされた細胞を組織培養インキュベーター中37℃で5%のCO2雰囲気下で4~6h静置して接着させた。インキュベーション後に、細胞を単層形成についてチェックした。インキュベーション培地を次に新鮮な肝細胞維持培地(細胞系提供者、BioIVTから得られた完全INVITROGRO培地)で置き換えた。細胞はそのため、トランスフェクションのために準備ができた。gRNAの各々を、同等の量のin vitroで転写されたABE8.8 mRNA(分子量で1:1の比)と共に初代ヒト肝細胞にMessengerMax試薬(Lipofectamine)を介して、様々な希釈液を使用して共トランスフェクトして、試験物品の異なる濃度での編集活性を評価した。Thermo FisherからのMessengerMAXをトランスフェクションのために使用する。溶液A:所望される量のガイドRNAを1:1の重量比のmRNAとOptiMEM中で混合する。溶液B:OptiMEM中のMessengerMAX。溶液AおよびBを混合した後に、混合物を室温で20分間インキュベートした。60μLのインキュベートされた溶液を滴下で各々の細胞ウェルに加えた。対応するカニクイザルサルPCSK9またはANGPTL3遺伝子配列に完璧にマッチしたプロトスペーサー配列について、各々のgRNAをまた、同等の量のABE8.8 mRNA(分子量で1:1の比)と共に初代カニクイザル肝細胞に共トランスフェクトし、同じトランスフェクションプロトコールに従った。細胞を次に37℃で3日間そのままにした。細胞を採取し、Thermo Kingfisher、またはQiagen
DNEasy blood and Tissue Kitのいずれかを製造業者の使用説明書の通りに使用してゲノムDNA抽出のために調製した。
:「--quantification_window_center -3 --quantification_window_size 5 --min_frequency_alleles_around_cut_to_plot 0.1 --max_rows_alleles_around_cut_to_plot 100」。ABE実験のために、以下のパラメーターを設定した:「--default_min_aln_score 95 --quantification_window_center
-10 --quantification_window_size 10 --base_editor_output --conversion_nuc_from A --conversion_nuc_to G --min_frequency_alleles_around_cut_to_plot 0.1 --max_rows_alleles_around_cut_to_plot 100」。NHP実験のために、追加のパラメーターを設定して、低品質リードを除外した:「--min_single_bp_quality 30」。さらに、全ての場合において、パラメーター「--max_paired_end_reads_overlap」をFLASHの推奨(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)に従って2R-F+0.25*F(ここで、Rはリードの長さであり、Fはアンプリコンの長さである)に設定した。
-k 1 --np 0」と共に用いてPCSK9遺伝子ボディに対してアライメントした。遺伝子アノテーションをEnsembl v98(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.98.gtf.gz)から得た。アライメントをsamtools v1.10でフィルタリングし、BEDフォーマットにbedt
ools v2.25.0のbamtobed機能で変換した。試料当たり最小1000個のマッピングされたリードが要求され、マッピングされたリードの末端位置を集計した。少なくとも1つの処理された試料中の最小10個のリードによりサポートされるPCSK9イントロン1の全体を通じた位置を報告する。
LEADING:0 TRAILING:0 SLIDINGWINDOW:4:30
MINLEN:36」を用いてトリミングした。より低いシーケンシング品質を有する実験(VOL014)のために、これらのパラメーターを「ILLUMINACLIP NEB_custom.fa:2:30:10:1:true LEADING:2 TRAILING:0 SLIDINGWINDOW:30:30 MINLEN:36」に設定した。リードを次に、FLASH v1.2.11(MagocおよびSalzberg,2011)を使用し、パラメーター「--max-mismatch-density=0.25 --max-overlap=160」を用いてマージした。マージされたリードを、一定の配列、各々の部位に独特のバーコードおよびプロトスペーサー配列についてスキャンし、編集ウィンドウ(プロトスペーサーの1~10の最もPAM遠位
の位置として定義される)中のA→G置換の証拠を有するものに対してフィルタリングした。重複したリードを廃棄した。
vitro転写(IVT)である。典型的には、mRNAのIVTは、T7ポリメラーゼプロモーターおよび関連付けられる調節配列、mRNAコード配列(CDS)、3’および5’非翻訳領域(UTR)、ポリAテイル、ならびにmRNA安定性およびin vivo性能を増強するための追加の配列エレメントを含む直線化されたDNA鋳型を使用する。IVTの前に、DNA鋳型は、プラスミド、PCR生成物、合成DNA生成物、または任意の他の二本鎖DNA構築物の形態であり;典型的には制限消化酵素を用いる、DNA鋳型の直鎖化を行って、ランオフ転写を促進する。典型的なIVT反応は、T7ポリメラーゼ、DNA鋳型、RNase阻害剤、capアナログ、無機ピロホスファターゼ、ならびに天然に存在するリボヌクレオチド三リン酸(NTP)、例えばGTP、ATP、CTP、UTP、または改変されたNTP、例えばシュードウリジン、N1-メチルシュードウリジン、5’メチルシチジン、5-メトキシウリジン、N6-メチルアデノシン、およびN4-アセチルシチジンでの天然NTPの置換を含む。capアナログは、転写の間に添加するか、またはキャッピング酵素を使用してIVT反応後に補充することができ;両方の事例において2’-O-メチル基、または追加の2’化学的改変が最初の出発ヌクレオチドに付加されてmRNAのcap-1形態が生成される。一部の事例において、ポリAテイルは、RNAリガーゼ酵素を使用してIVT反応後にmRNAに付加される。IVT後に、一部の場合において、DNaseを転写混合物に加えてDNA鋳型を除去し;代替的に、残留DNAはクロマトグラフィー、沈殿、またはタンジェンシャルフロー濾過で除去される。mRNAの精製および濃縮は、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、沈殿、イオンペアリング逆相クロマトグラフィー、水素結合クロマトグラフィー、セルロースクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、酵素反応、サイズ排除クロマトグラフィー、およびタンジェンシャルフロー濾過などの方法で行われる。類似したIVTおよび精製プロセスが、ルシフェラーゼ、eGFP、SpCas9、Cas12b、CBE、およびABEをコードするmRNAを生成するために使用され;全ての場合においてDNA鋳型、反応条件、および精製パラメーターは、目的の特有の遺伝子のために最適化される。
。
Bio)を使用して溶解した。ゲノムDNAを約20μLのマウスまたはサル肝臓溶解液から、製造業者のプロトコールに従ってKingFisher Flex自動化抽出機器(Thermo-Fisher Scientific)上でビーズベースの抽出キット、MagMAX-96 DNA Multi-Sample Kit(Thermo-Fisher Scientific)を使用して単離した。サル肝生検試料のために、Qiagen DNEasy Blood & Tissue kit抽出を使用して、製造業者の使用説明書に従ってゲノムDNAを抽出した。抽出されたゲノムDNAをさらなる使用まで4℃でまたは長期間の貯蔵のために-80℃で貯蔵した。
グラム)当たりの総RNAのmgに対応するmg/kgで投薬した。用量は、LNPの製剤化後に、mRNAおよびgRNAの量を構成する総RNAに基づいて算出される。動物の体重に基づく適切な体積を、注入ポンプを使用して送達した。対照動物には同じ注入条件下でLNPの代わりにリン酸緩衝食塩水を与えた。同じNHP研究において使用されるアミノ脂質1およびアミノ脂質2から構成される2つのLNPがある場合、試験物品はLNP#1およびLNP#2として同定され、これらのLNPを調製するために使用されるmRNAおよびgRNAは同じである。研究において使用される1つのLNP組成物のみがある場合、試験物品はLNPとして同定される。
Scale Discovery、#N05230)プレートを終夜4℃で、リンカーを連結した捕捉抗体(MCP-1抗体;Meso Scale Discovery、#C26UG-3、IL-6抗体;Meso Scale Discovery、#C21TX-3、IP-10抗体;Meso Scale Discovery、#C21UF-3)とインキュベートした。PBS-T(0.05%のTween 20を含有するPBS)での3回の洗浄後に、試験試料またはキャリブレーター標準品(キャリブレーター1;Meso Scale Discovery、#C0060-2、キャリブレーター2:Meso Scale Discovery、#C0061-2)を、血清、遮断剤および防腐剤を含有するアッセイ希釈剤43(Meso Scale Discovery、#R50AG-2)と室温で1時間インキュベートした。3回の洗浄後に、IL-6(Meso Scale Discovery、#D26TX-3)、MCP-1(Meso Scale Discovery、#D26UG-3)およびIP-10(Meso Scale Discovery、#D21UF-3)のためのSULFO-TAGコンジュゲート検出抗体を個々のウェル中で室温で1時間インキュベートした。3回の洗浄および各々のウェルへのGold(商標)リード緩衝剤B(Meso Scale Discovery、#R60AM-2)の添加後に、プレートをMSD機器(Meso Scale Discovery、#R31QQ-3により分析した。
その他の実施形態
[00762]上の記述から、本明細書に記載した開示に変形および改変を加えて種々の用法および状態に本開示を採用できることが明らかになる。そのような実施形態も、以下の特許請求の範囲内である。
ることが本明細書で意図されていることを認識および理解されたい。したがって、1つの請求項で提示されたいずれの特徴も別の請求項に含まれ得ること、1つの請求項で提示されたいずれの特徴もその特徴のない請求項を構成するためにその請求項から除去され得ること、および1つの請求項で提示されたいずれの特徴も別の請求項中のいずれの特徴とも組み合わされ得ること、そのそれぞれが本明細書で意図されていることを認識されたい。以下に一覧にした項目は、上記の実施形態および実施例の態様および態様の組合せのさらなる説明例である。
1.(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびPCSK9遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてPCSK9遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.05mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、組成物。
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも40%で起こる、項目1に記載の組成物。
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも1mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも45%で起こる、項目1に記載の組成物。
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも1.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも50%で起こる、項目1に記載の組成物。
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも3mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも55%で起こる、項目1に記載の組成物。
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.125mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定してマウスの全肝細胞の少なくとも40%で起こる、項目1に記載の組成物。
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して
マウスの全肝細胞の少なくとも45%で起こる、項目1に記載の組成物。
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも2mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定してマウスの全肝細胞の少なくとも50%で起こる、項目1に記載の組成物。
11.プロトスペーサー相補配列がPCSK9遺伝子のアンチセンス鎖にある、項目1から9のいずれか一項に記載の組成物。
13.塩基の変更がPCSK9遺伝子上のプロトスペーサーの外側(オフターゲット部位)で起こり、表11で説明されるオフターゲット部位の編集パーセンテージがそれぞれ表11で説明される編集パーセンテージ以下である、項目1から12のいずれか一項に記載の組成物。
15.プログラム可能なDNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Cas9またはCas9ニッカーゼを含む、項目1から14のいずれか一項に記載の組成物。
17.核酸塩基の変更がPCSK9遺伝子のスプライスドナー部位にある、項目16に記載の組成物。
19.核酸塩基の変更がPCSK9遺伝子のスプライスアクセプター部位にある、項目16に記載の組成物。
22.ガイドRNAが化学的に改変されている、項目1から21のいずれか一項に記載の組成物。
24.スペーサー配列が、表1で説明されるPCSK9 ABEガイドRNAスペーサ
ー配列を含む、項目1から22のいずれか一項に記載の組成物。
27.プロトスペーサーが配列5’-CCCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(配列番号13)または5’-CCGCACCTTGGCGCAGCGG-3’(配列番号247)を含む、項目26に記載の組成物。
29.mRNA配列のGC%含量が50%より大きい、項目1から28のいずれか一項に記載の組成物。
31.mRNA配列のGC%含量が63%以上である、項目30に記載の組成物。
32.mRNAがアデニンtTNAデアミナーゼ(TadA)領域、Cas9領域、および核局在化配列(NLS)領域を含む、項目29に記載の組成物。
35.TadA領域のGC%含量が70%以上である、項目32または33に記載の組成物。
37.Cas9領域のGC%含量が62%以上である、項目32または33に記載の組成物。
39.NLS領域のGC%含量が63%以上である、項目32または33に記載の組成物。
41.第1のリンカー領域のGC%含量が79%以上である、項目33に記載の組成物。
43.第2のリンカー領域のGC%含量が83%以上である、項目33に記載の組成物。
46.mRNAが配列番号2136のmRNA配列を含む、項目45に記載の組成物。
48.(i)を封入する脂質ナノ粒子(LNP)をさらに含む、項目1から47のいずれか一項に記載の組成物。
50.(ii)を封入する第2のLNPをさらに含む、項目48に記載の組成物。
51.ガイドRNAと塩基エディター融合タンパク質をコードするmRNAとの比が重量で約1:10~約10:1である、項目1から44のいずれか一項に記載の組成物。
54.先行する項目のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
56.投与が静脈内注入を介する、項目55に記載の方法。
58.(i)を封入するtLNPおよび(ii)を封入するLNPの同時投与を含む、項目55または56に記載の方法。
60.単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く2日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、項目57に記載の方法。
62.単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く4日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、項目57に記載の方法。
64.単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く6日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、項目57に記載の方法。
66.単回用量の(i)および(ii)を封入するLNPを投与するステップを含む、項目55または56に記載の方法。
68.1つまたは複数の処置の処置コースを対象に投与するステップを含み、1つまたは複数の処置のそれぞれの1つが単回用量のLNPの1つまたは複数を含む、項目66または67に記載の方法。
70.2回から5回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目68に記載の方法。
72.3回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目68に記載の方法。
73.4回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目68に記載の方法。
75.状態がアテローム硬化性心血管疾患である、項目55から74のいずれか一項に記載の方法。
77.対象がヒトである、項目55から74のいずれか一項に記載の方法。
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびPCSK9遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてPCSK9遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAが表1で説明されるPCSK9 ABEガイドRNA配列を含む、組成物。
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびPCSK9遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてPCSK9遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
mRNAが表23から選択される配列を含む、組成物。
(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびPCSK9遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含み、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてPCSK9遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.05mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、第1の組成物、ならびに
(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含み、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、第2の組成物
を対象に投与するステップを含む、方法。
82.1つまたは複数の用量の第1の組成物に続いて1つまたは複数の用量の第2の組成物を投与するステップを含む、項目81に記載の方法。
84.第1の組成物および第2の組成物の同時投与を含む、項目80に記載の方法。
86.(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびAPOC3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドRNAが、表24で説明されるGA300~303のAPOC3 ABEガイドRNA配列を含む、組成物。
ィター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびPCSK9遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドRNAが、in vitroにおいてPCSK9遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも2.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、組成物。
(b)塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および塩基エディタータンパク質をPCSK9遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、PCSK9遺伝子を編集するための組成物であって、
スペーサー配列がPCSK9遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、組成物。
97.mRNAが、以下の表
98.mRNAおよびgRNAが脂質ナノ粒子の中にカプセル化されている、項目88に記載のPCSK9遺伝子を編集するための組成物。
LNP組成(モル%):
iLipid 40~65%
DSPC 2~20%
PEG 1~5%
残りのモル%バランスがコレステロール;
LNP粒子サイズ:Z平均流体力学的直径55~120nm、および
動的光散乱によって決定される多分散性指数0.2未満
を有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化されている、項目88に記載のPCSK9遺伝子を編集するための組成物。
遺伝子を編集するための組成物。
に、カニクイザルの肝臓におけるPCSK9標的スプライス部位において80パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目88に記載のPCSK9遺伝子を編集するための組成物。
PCSK9遺伝子を編集するための組成物。
に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるPCSK9タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも70パーセント低減させることができる、項目88に記載のPCSK9遺伝子を編集するための組成物。
に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるLDL-Cをベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる、項目88に記載のPCSK9遺伝子を編集するための組成物。
遺伝子を編集するための組成物。
に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる、項目88に記載のPCSK9遺伝子を編集するための組成物。
記載のPCSK9遺伝子を編集するための組成物。
197.スペーサー配列がPCSK9遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも80%のヌクレオチド相関を有し、スペーサー配列上のRNAヌクレオチドが同一の順序でプロトスペーサーのDNAヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するならばRNAヌクレオチドがDNAヌクレオチドと相関し、ここで相関を決定する目的のためにウラシル塩基およびチミン塩基は同一のヌクレオチドであるとみなされる、項目88に記載のPCSK9遺伝子を編集するための組成物。
(a)編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするmRNA、
(b)塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および塩基エディタータンパク質をPCSK9遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第1のガイドRNAであって、スペーサー配列がPCSK9遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第1のガイドRNA、および
(c)塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および塩基エディタータンパク質をANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第2のガイドRNAであって、スペーサー配列が部分的にANGPTL3遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも相補的である、第2のガイドRNA
を対象に投与するステップを含む、方法。
205.第1のLNPが(b)および(c)を包摂する、項目204に記載の方法。
206.第1のLNPが繰り返し投与される、項目204に記載の方法。
208.第1のLNPが7日の間隔で繰り返し投与される、項目204に記載の方法。
210.(a)および(c)を包摂する第2のLNPをさらに含む、項目209に記載の方法。
212.第1のLNPと第2のLNPが1日~12か月の間隔で逐次的に投与される、項目211に記載の方法。
214.間隔が5日である、項目212に記載の方法。
215.間隔が10日である、項目212に記載の方法。
217.間隔が20日である、項目212に記載の方法。
218.間隔が25日である、項目212に記載の方法。
220.間隔が2か月である、項目212に記載の方法。
221.間隔が3か月である、項目212に記載の方法。
223.間隔が8か月である、項目212に記載の方法。
224.間隔が10か月である、項目212に記載の方法。
[00767]以下は、一覧にした項目の第2の例である。
1.(a)(i)1つまたは複数の化学的改変および(ii)選択された位置に1つまたは複数の未改変ヌクレオチドを含むスペーサー配列、および(b)配列番号61と少なくとも70%の同一性を有するtracr配列を含む単一ガイドRNAであって、tracr配列がII型Casタンパク質のための結合スカフォールドとして機能し、tracr配列が(i)1つまたは複数の化学的改変および(ii)選択された位置に1つまたは複数の未改変ヌクレオチドを含む、単一ガイドRNA。
10.配列番号61のtracr配列におけるヌクレオチドの70%超が改変される、項目9に記載の単一ガイドRNA。
13.tracr配列が、配列番号61で番号付けして13位、40位、49位、53位、61位、68位、70位、および71位、またはその対応する位置に未改変ヌクレオチドを含む、項目1から10のいずれか一項に記載の単一ガイドRNA。
17.tracr配列が、配列番号61と少なくとも90%の同一性を含む、項目1から15のいずれか一項に記載の単一ガイドRNA。
19.化学的改変がネブラリンまたはデオキシネブラリンを含む、項目1から17のいずれか一項に記載の単一ガイドRNA。
21.tracr配列が配列番号61を含み、単一ガイドRNAが5’末端、3’末端、選択された内部位置、またはそれらの任意の組合せに1つまたは複数のホスホロチオエート結合をさらに含む、項目1から20のいずれか一項に記載の単一ガイドRNA。
23.5’末端、3’末端、またはその両方に3つの隣接したホスホロチオエート結合をさらに含む、項目21に記載の単一ガイドRNA。
26.3’末端に配列5’-ususuNNn-3’を含み、それぞれのNが独立に未改変リボヌクレオチドを表し、nが改変ヌクレオチドを表し、それぞれのuが2’-O-メチルウリジンを表し、それぞれのsがホスホロチオエート結合を表す、項目1から21のいずれか一項に記載の単一ガイドRNA。
28.(i)スペーサー配列および(ii)tracr配列を含む単一ガイドRNAであって、スペーサー配列が、標的ポリヌクレオチド配列と接触した場合にPCSK9遺伝子またはANGPTL3遺伝子中の標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズし、tracr配列がII型Casタンパク質と接触した場合にII型Casタンパク質に結合し、単一ガイドRNAがネブラリン、デオキシネブラリン、または2’-O-メチルネブラリンを含む、単一ガイドRNA。
31.5’末端に3つのホスホロチオエート結合を含む、項目29に記載の単一ガイドRNA。
RNA。
33.5’末端における2つのホスホロチオエート結合が、5’末端の最初の2つのヌクレオチド位置における隣接する2つのホスホロチオエート結合である、項目29に記載の単一ガイドRNA。
35.3’末端における2つのホスホロチオエート結合が、3’末端の最後の2つのヌクレオチド位置における隣接する2つのホスホロチオエート結合である、項目29に記載の単一ガイドRNA。
37.3’末端に配列5’-UsUsUs-3’を含み、Uがウリジンを表し、sがホスホロチオエート結合を表す、項目29に記載の単一ガイドRNA。
39.tracr配列が、未改変の単一ガイドRNA中のtracr配列と比較して増大した結合親和性でII型Casタンパク質と結合する、項目1から27のいずれか一項に記載の単一ガイドRNA。
41.Cas9タンパク質がストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)のCas9である、項目40に記載の単一ガイドRNA。
45.II型Casタンパク質がCas9である、項目43または44に記載の医薬組成物。
47.項目43から46のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、脂質ナノ粒子。
50.改変が、細胞中のPCSK9遺伝子によってコードされる機能性PCSK9タンパク質の発現を低減させる、項目49に記載の方法。
52.改変が、細胞中のANGPTL3遺伝子によってコードされる機能性ANGPTL3タンパク質の発現を低減させる、項目51に記載の方法。
54.状態の処置または防止を必要とする対象における状態の処置または防止のための方法であって、項目43から46のいずれか一項に記載の医薬組成物または項目47に記載の脂質ナノ粒子を対象に投与するステップを含み、単一ガイドRNAが、対象の細胞中の標的ポリヌクレオチド配列における改変をもたらすようにII型Casタンパク質に指令し、それにより状態を処置または防止する、方法。
56.標的ポリヌクレオチド配列がANGPTL3遺伝子中にある、項目54に記載の方法。
58.改変が、対象中のANGPTL3遺伝子によってコードされる機能性ANGPTL3タンパク質の発現を低減させる、項目56に記載の方法。
60.状態がアテローム硬化性血管疾患、高トリグリセリド血症、または糖尿病である、項目48から58のいずれか一項に記載の方法。
1.(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、組成物。
ガイドRNAおよびmRNAが総量約3mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定してカニクイザルの全肝細胞の少なくとも50%で起こる、項目1に記載の組成物。
5.核酸塩基の変更が、投与前と比較してカニクイザルの血液トリグリセリドレベルの少なくとも50%の低減をもたらす、項目3に記載の組成物。
7.プロトスペーサー相補配列がANGPTL3遺伝子のアンチセンス鎖にある、項目1から5のいずれか一項に記載の組成物。
9.塩基の変更がANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーの外側(オフターゲット部位)で起こり、
表14で説明されるオフターゲット部位の編集パーセンテージがそれぞれ表14で説明される編集パーセンテージ以下である、項目1から8のいずれか一項に記載の組成物。
11.プログラム可能なDNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Cas9またはCas9ニッカーゼを含む、項目1から10のいずれか一項に記載の組成物。
13.核酸塩基の変更がANGPTL3遺伝子のスプライスドナー部位にある、項目12に記載の組成物。
15.核酸塩基の変更がANGPTL3遺伝子のスプライスアクセプター部位にある、項目12に記載の組成物。
18.ガイドRNAが化学的に改変されている、項目1から17のいずれか一項に記載
の組成物。
20.スペーサー配列が、表1で説明されるANGPTL3 ABEガイドRNAスペーサー配列を含む、項目1から19のいずれか一項に記載の組成物。
23.プロトスペーサーが配列5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(配列番号14)、5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号15)、5’-GATACCTGAATAACTCTC-3’(配列番号1606)、5’-AGATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号248)、または5’-GATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号249)を含む、項目22に記載の組成物。
25.mRNA配列のGC%含量が50%より大きい、項目1から24のいずれか一項に記載の組成物。
27.mRNA配列のGC%含量が63%以上である、項目26に記載の組成物。
28.mRNAがアデニンtTNAデアミナーゼ(TadA)領域、Cas9領域、および核局在化配列(NLS)領域を含む、項目25に記載の組成物。
31.TadA領域のGC%含量が70%以上である、項目28または29に記載の組成物。
33.Cas9領域のGC%含量が62%以上である、項目28または29に記載の組成物。
35.NLS領域のGC%含量が63%以上である、項目28または29に記載の組成物。
37.第1のリンカー領域のGC%含量が79%以上である、項目29に記載の組成物。
39.第2のリンカー領域のGC%含量が83%以上である、項目29に記載の組成物。
42.mRNAが配列番号2136のmRNA配列を含む、項目41に記載の組成物。
44.(i)を封入する脂質ナノ粒子(LNP)をさらに含む、項目1から43のいずれか一項に記載の組成物。
46.(ii)を封入する第2のLNPをさらに含む、項目44に記載の組成物。
47.ガイドRNAと塩基エディター融合タンパク質をコードするmRNAとの比が重量で約1:10~約10:1である、項目1から44のいずれか一項に記載の組成物。
50.先行する項目のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
52.投与が静脈内注入を介する、項目51に記載の方法。
54.(i)を封入するLNPおよび(ii)を封入するLNPの同時投与を含む、項目51または52に記載の方法。
56.単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く2日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、項目53に記載の方法。
58.単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く4日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、項目53に記載の方法。
60.単回用量の(ii)を封入するLNPおよびそれに続く6日間隔での時差用量の(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、項目53に記載の方法。
62.単回用量の(i)および(ii)を封入するLNPを投与するステップを含む、項目51または52に記載の方法。
64.1つまたは複数の処置の処置コースを対象に投与するステップを含み、1つまたは複数の処置のそれぞれの1つが単回用量のLNPの1つまたは複数を含む、項目62または63に記載の方法。
66.2回から5回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目64に記載の方法。
68.3回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目64に記載の方法。
69.4回の処置の処置コースを投与するステップを含む、項目64に記載の方法。
71.状態がアテローム硬化性心血管疾患である、項目51から70のいずれか一項に記載の方法。
73.対象がヒトである、項目51から72のいずれか一項に記載の方法。
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAが表1で説明されるANGPTL3 ABEガイドRNA配列を含む、組成
物。
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
mRNAが表23から選択される配列を含む、組成物。
(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびPCSK9遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含み、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてPCSK9遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、第1の組成物、ならびに
(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含み、
ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、第2の組成物
を対象に投与するステップを含む、方法。
78.1つまたは複数の用量の第1の組成物に続いて1つまたは複数の用量の第2の組成物を投与するステップを含む、項目77に記載の方法。
80.第1の組成物および第2の組成物の同時投与を含む、項目76に記載の方法。
載の方法。
82.(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
ガイドRNAが、in vitroにおいてANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように塩基エディター融合タンパク質に指令し、
ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、組成物。
(b)塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および塩基エディタータンパク質をANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、ANGPTL3遺伝子を編集するための組成物であって、
スペーサー配列がANGPTL3遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、組成物。
がANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、編集ウィンドウがANGPTL3遺伝子のイントロンの領域を包含する、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
97.mRNAが、以下の表:
98.mRNAおよびgRNAが脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
LNP組成(モル%):
iLipid 40~65%
DSPC 2~20%
PEG 1~5%
残りのモル%バランスがコレステロール;
LNP粒子サイズ:Z平均流体力学的直径 55~120nm、および
動的光散乱によって決定される多分散性指数0.2未満
を有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
RNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、カニクイザルの肝臓におけるANGPTL3標的スプライス部位において40パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
ーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
RNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
インと比較して平均で少なくとも80パーセント低減させることができる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
びmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
RNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
較して平均で少なくとも65パーセント低減させることができる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
インと比較して平均でほぼ35パーセント低減させることができる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
197.スペーサー配列がANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも80%のヌクレオチド相関を有し、スペーサー配列上のRNAヌクレオチドが同一の順序でプロトスペーサーのDNAヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するならばRNAヌクレオチドがDNAヌクレオチドと相関し、ここで相関を決定する目的のためにウラシル塩基およびチミン塩基は同一のヌクレオチドであるとみなされる、項目88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
(a)編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするmRNA、
(b)塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および塩基エディタータンパク質をPCSK9遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第1のガイドRNAであって、スペーサー配列がPCSK9遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第1のガイドRNA、および
(c)塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および塩基エディタータンパク質をANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第2のガイドRNAであって、スペーサー配列がANGPTL3遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第2のガイドRNA
を対象に投与するステップを含む、方法。
205.第1のLNPが(b)および(c)を包摂する、項目204に記載の方法。
206.第1のLNPが繰り返し投与される、項目204に記載の方法。
208.第1のLNPが7日の間隔で繰り返し投与される、項目204に記載の方法。
210.(a)および(c)を包摂する第2のLNPをさらに含む、項目209に記載の方法。
212.第1のLNPと第2のLNPが1日~12か月の間隔で逐次的に投与される、項目211に記載の方法。
214.間隔が5日である、項目212に記載の方法。
215.間隔が10日である、項目212に記載の方法。
217.間隔が20日である、項目212に記載の方法。
218.間隔が25日である、項目212に記載の方法。
220.間隔が2か月である、項目212に記載の方法。
221.間隔が3か月である、項目212に記載の方法。
223.間隔が8か月である、項目212に記載の方法。
224.間隔が10か月である、項目212に記載の方法。
[00769]本開示を概観することにより、関連する項目の1つもしくははその群において提示した1つもしくは複数の態様または特徴は、他の項目にまたは他の項目における1つもしくは複数の態様もしくは特徴との組合せにも含まれ得ることが意図されていることも認識されよう。
Claims (225)
- (i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
前記ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいて前記ANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
前記ガイドRNAおよび前記mRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、組成物。 - 哺乳動物対象がカニクイザルであり、前記ガイドRNAおよび前記mRNAが全量約1mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して前記カニクイザルの全肝細胞の少なくとも35%で起こる、請求項1に記載の組成物。
- 前記哺乳動物対象がカニクイザルであり、
前記ガイドRNAおよび前記mRNAが全量約3mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して前記カニクイザルの全肝細胞の少なくとも50%で起こる、
請求項1に記載の組成物。 - 前記核酸塩基の変更が、前記投与前と比較して前記カニクイザルにおける血中トリグリセリドレベルの少なくとも20%の低減をもたらす、請求項2に記載の組成物。
- 前記核酸塩基の変更が、前記投与前と比較して前記カニクイザルにおける血中トリグリセリドレベルの少なくとも50%の低減をもたらす、請求項3に記載の組成物。
- 前記プロトスペーサーがスプライス部位に位置する、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- プロトスペーサー相補配列が前記ANGPTL3遺伝子のアンチセンス鎖にある、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- プロトスペーサー相補配列が前記ANGPTL3遺伝子のセンス鎖にある、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記塩基の変更が前記ANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーの外側(オフターゲット部位)で起こり、
表14で説明されるオフターゲット部位の編集パーセンテージがそれぞれ表14で説明される編集パーセンテージ以下である、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記デアミナーゼがアデニンデアミナーゼであり、前記核酸塩基の変更がA・TからG・Cへの変更である、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記プログラム可能なDNA結合ドメインがヌクレアーゼ不活性Cas9またはCas
9ニッカーゼを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記核酸塩基の変更が前記ANGPTL3遺伝子のスプライス部位にある、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記核酸塩基の変更が前記ANGPTL3遺伝子のスプライスドナー部位にある、請求項12に記載の組成物。
- 前記スプライスドナー部位が配列番号7で参照されるANGPTL3イントロン6の5’末端にある、請求項13に記載の組成物。
- 前記核酸塩基の変更が前記ANGPTL3遺伝子のスプライスアクセプター部位にある、請求項12に記載の組成物。
- 前記核酸塩基の変更がフレームシフト、未成熟終止コドン、前記ANGPTL3遺伝子によってコードされる転写物における挿入または欠失をもたらす、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記核酸塩基の変更が前記ANGPTL3遺伝子によってコードされる異常な転写物をもたらす、請求項1から16のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ガイドRNAが化学的に改変されている、請求項1から17のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ガイドRNAの前記tracr配列が、図7に示すスキームに従って化学的に改変されている、請求項16に記載の組成物。
- 前記スペーサー配列が、表1で説明されるANGPTL3 ABEガイドRNAスペーサー配列を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ガイドRNAが、表1で説明される、GA067、GA091、GA098、GA099、GA100、GA101、GA102、GA103、GA347、GA441、GA442、GA472、GA473、GA474、GA475、GA476、GA517、またはGA547のANGPTL3 ABEガイドRNA配列を含む、請求項20に記載の組成物。
- プロトスペーサー配列が、表1で説明されるANGPTL3 ABEプロトスペーサー配列を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の組成物。
- プロトスペーサーが、配列5’-AAGATACCTGAATAACTCTC-3’(配列番号14)、5’-AAGATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号15)、5’-GATACCTGAATAACTCTC-3’(配列番号1606)、5’-AGATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号248)、または5’-GATACCTGAATAACCCTC-3’(配列番号249)を含む、請求項22に記載の組成物。
- 前記塩基エディター融合タンパク質が配列番号2137のアミノ酸配列を含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記mRNA配列のGC%含量が50%より大きい、請求項1から24のいずれか一項
に記載の組成物。 - 前記mRNA配列のGC%含量が56%より大きい、請求項25に記載の組成物。
- 前記mRNA配列のGC%含量が63%以上である、請求項26に記載の組成物。
- 前記mRNAがアデニンtTNAデアミナーゼ(TadA)領域、Cas9領域、および核局在化配列(NLS)領域を含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記mRNAが、前記TadA領域と前記Cas9領域を連結する第1のリンカー領域および前記Cas9領域と前記NLS領域を連結する第2のリンカー領域をさらに含む、請求項28に記載の組成物。
- 前記TadA領域のGC%含量が60%より大きい、請求項28または29に記載の組成物。
- 前記TadA領域のGC%含量が70%以上である、請求項28または29に記載の組成物。
- 前記Cas9領域のGC%含量が56%より大きい、請求項28または29に記載の組成物。
- 前記Cas9領域のGC%含量が62%以上である、請求項28または29に記載の組成物。
- 前記NLS領域のGC%含量が54%より大きい、請求項28または29に記載の組成物。
- 前記NLS領域のGC%含量が63%以上である、請求項28または29に記載の組成物。
- 前記第1のリンカー領域のGC%含量が65%より大きい、請求項29に記載の組成物。
- 前記第1のリンカー領域のGC%含量が79%以上である、請求項29に記載の組成物。
- 前記第2のリンカー領域のGC%含量が67%より大きい、請求項29に記載の組成物。
- 前記第2のリンカー領域のGC%含量が83%以上である、請求項29に記載の組成物。
- 前記TadA領域のGC%含量が60%より大きく、前記Cas9領域のGC%含量が56%より大きく、前記NLS領域のGC%含量が54%より大きく、前記第1のリンカー領域のGC%含量が65%より大きく、前記第2のリンカー領域のGC%含量が67%より大きい、請求項29に記載の組成物。
- 前記mRNAが表23から選択されるmRNA配列を含む、請求項25に記載の組成物。
- 前記mRNAが配列番号2136のmRNA配列を含む、請求項41に記載の組成物。
- 前記mRNAがポリAテイルを含む、請求項25から42のいずれか一項に記載の組成物。
- (i)を封入する脂質ナノ粒子(LNP)をさらに含む、請求項1から43のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記LNPが(ii)をさらに封入する、請求項44に記載の組成物。
- (ii)を封入する第2のLNPをさらに含む、請求項44に記載の組成物。
- 前記ガイドRNAと前記塩基エディター融合タンパク質をコードする前記mRNAとの比が重量で約1:10~約10:1である、請求項1から44のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ガイドRNAと前記塩基エディター融合タンパク質をコードする前記mRNAとの比が重量で約1:1、1.5:1、2:1、3:1、4:1、1:1.5、1:2、1:3、または1:4である、請求項47に記載の組成物。
- 前記ガイドRNAと前記塩基エディター融合タンパク質をコードする前記mRNAとの比が重量で約1:1である、請求項48に記載の組成物。
- 先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
- 状態の処置または防止を必要とする対象における状態を処置または防止する方法であって、治療有効量の請求項1に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
- 前記投与が静脈内注入を介する、請求項51に記載の方法。
- (i)を封入するLNPおよび(ii)を封入するLNPの逐次投与を含む、請求項51または52に記載の方法。
- (i)を封入するtLNPおよび(ii)を封入するLNPの同時投与を含む、請求項51または52に記載の方法。
- 単回用量の前記(ii)を封入するLNPおよびそれに続く1日間隔での時差用量の前記(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、請求項53に記載の方法。
- 単回用量の前記(ii)を封入するLNPおよびそれに続く2日間隔での時差用量の前記(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、請求項53に記載の方法。
- 単回用量の前記(ii)を封入するLNPおよびそれに続く3日間隔での時差用量の前記(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、請求項53に記載の方法。
- 単回用量の前記(ii)を封入するLNPおよびそれに続く4日間隔での時差用量の前記(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、請求項53に記載の方法。
- 単回用量の前記(ii)を封入するLNPおよびそれに続く5日間隔での時差用量の前記(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、請求項53に記載の方法。
- 単回用量の前記(ii)を封入するLNPおよびそれに続く6日間隔での時差用量の前記(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、請求項53に記載の方法。
- 単回用量の前記(ii)を封入するLNPおよびそれに続く7日間隔での時差用量の前記(i)を封入するLNPを投与するステップを含む、請求項53に記載の方法。
- 単回用量の(i)および(ii)を封入するLNPを投与するステップを含む、請求項51または52に記載の方法。
- 前記LNPの単回用量が約0.3~約3mg/kgである、請求項62に記載の方法。
- 1つまたは複数の処置の処置コースを前記対象に投与するステップを含み、前記1つまたは複数の処置のそれぞれの1つが前記単回用量の前記LNPの1つまたは複数を含む、請求項62または63に記載の方法。
- 2回から10回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項64に記載の方法。
- 2回から5回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項64に記載の方法。
- 2回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項64に記載の方法。
- 3回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項64に記載の方法。
- 4回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項64に記載の方法。
- 5回の処置の処置コースを投与するステップを含む、請求項62に記載の方法。
- 前記状態がアテローム硬化性心血管疾患である、請求項51から70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記状態がアテローム硬化性血管疾患である、請求項51から70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項51から72のいずれか一項に記載の方法。
- (i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
前記ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいて前記ANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、前記ガイドRNAが、表1で説明されるANGPTL3 ABEガイドRNA配列を含む、組成物。 - (i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
前記ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいてANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、前記mRNAが、表23から選択される配列を含む、組成物。 - アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における前記疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびPCSK9遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含み、
前記ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいて前記PCSK9遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
前記ガイドRNAおよび前記mRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、第1の組成物、ならびに
(i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含み、
前記ガイドRNAが、哺乳動物対象に投与された場合に、in vivoにおいて前記ANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をもたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
前記ガイドRNAおよび前記mRNAが全量少なくとも1mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、第2の組成物
を前記対象に投与するステップを含む、方法。 - 前記第1の組成物および前記第2の組成物の逐次投与を含む、請求項76に記載の方法。
- 1つまたは複数の用量の前記第1の組成物に続いて1つまたは複数の用量の前記第2の組成物を投与するステップを含む、請求項77に記載の方法。
- 1つまたは複数の用量の前記第2の組成物に続いて1つまたは複数の用量の前記第1の組成物を投与するステップを含む、請求項78に記載の方法。
- 前記第1の組成物および前記第2の組成物の同時投与を含む、請求項76に記載の方法
。 - 1つまたは複数の用量の前記第1の組成物および前記第2の組成物を含む、請求項80に記載の方法。
- (i)プログラム可能なDNA結合ドメインおよびデアミナーゼを含む塩基エディター融合タンパク質、またはそれをコードするmRNA、
(ii)前記塩基エディター融合タンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、およびANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサーに対応するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、遺伝子標的を編集するための組成物であって、
前記ガイドRNAが、in vitroにおいてANGPTL3遺伝子における核酸塩基の変更をももたらすように前記塩基エディター融合タンパク質に指令し、
前記ガイドRNAおよび前記mRNAが全量少なくとも0.5mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも35%で起こる、
組成物。 - ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも1mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも40%で起こる、請求項82に記載の組成物。
- ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも1.5mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも45%で起こる、請求項82に記載の組成物。
- ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも2mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも50%で起こる、請求項82に記載の組成物。
- ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも2.5mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも55%で起こる、請求項82に記載の組成物。
- ガイドRNAおよびmRNAが全量少なくとも3mg/kgで投与された場合に、前記塩基の変更が、次世代シーケンシングまたはSangerシーケンシングによって測定して前記哺乳動物対象の全肝細胞の少なくとも60%で起こる、請求項82に記載の組成物。
- (a)編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするmRNA、および
(b)前記塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および前記塩基エディタータンパク質を前記ANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含むガイドRNA
を含む、前記ANGPTL3遺伝子を編集するための組成物であって、
前記スペーサー配列が前記ANGPTL3遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に
少なくとも部分的に相補的である、組成物。 - 前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドRNAに作動可能に結合され、前記ガイドRNAが前記ANGPTL3遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ANGPTL3遺伝子のスプライス部位を包含する、請求項83に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドRNAに作動可能に結合され、前記ガイドRNAが前記ANGPTL3遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ANGPTL3遺伝子のイントロンの領域を包含する、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドRNAに作動可能に結合され、前記ガイドRNAが前記ANGPTL3遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ANGPTL3遺伝子のイントロン1、イントロン3、またはイントロン4の領域を包含する、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記塩基エディタータンパク質が前記ガイドRNAに作動可能に結合され、前記ガイドRNAが前記ANGPTL3遺伝子上の前記プロトスペーサー配列に相補的な鎖とハイブリダイズされた場合に、前記編集ウィンドウが前記ANGPTL3遺伝子のイントロン1の領域を包含する、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記スペーサー配列が、GA067、GA100、およびGA574として同定されるガイドRNA配列の群から選択されるスペーサー配列と80~100%のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記tracr配列が、GA067、GA091、GA098、GA099、GA100、GA101、GA102、GA103、GA347、GA441、GA442、GA472、GA473、GA474、GA475、GA476、GA517、およびGA547として同定されるガイドRNA配列の群から選択されるtracr配列と80~100%のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記mRNAが、MA002、MA004、MA040、MA0041、またはMA045として同定されるmRNA配列と80~100%の配列同一性を有する、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記mRNAおよびgRNAが脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記mRNAおよびgRNAが、以下:
LNP組成(モル%):
iLipid 40~65%
DSPC 2~20%
PEG 1~5%
残りのモル%バランスがコレステロール;
LNP粒子サイズ:Z平均流体力学的直径 55~120nm、および
動的光散乱によって決定される多分散性指数0.2未満
を有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。 - 前記mRNAおよびgRNAが、50~70nmのZ平均流体力学的直径のLNP粒子サイズを有する脂質ナノ粒子の中にカプセル化される、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において40パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において50パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において30パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において40パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において50パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において60パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において70パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において40パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において50パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において60パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において70パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよ
びmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において80パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。 - 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において40パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において50パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において60パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において70パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記カニクイザルの肝臓における前記ANGPTL3標的スプライス部位において80パーセントより大きな平均編集パーセンテージでアデニン塩基編集を誘起することができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記編集パーセントが、投薬されたカニクイザルの肝臓の分析によって、投薬の15日後に前記サルの肝生検または剖検を介して決定される、請求項87から117に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記編集パーセントが、前記投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも168日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、請求項87から117に記載のANGPTL3遺伝子の編集のための組成物。
- 前記編集パーセントが、前記投薬されたカニクイザルの投薬後少なくとも300日の期間にわたる定期的な肝生検試験によって持続的に維持されていることが決定される、請求項87から117に記載のANGPTL3遺伝子の編集のための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベー
スラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。 - 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がサルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたサルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも70パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも80パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がサルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも70パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも80パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも70パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよ
びmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも80パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。 - 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも70パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるANGPTL3タンパク質をベースラインと比較して平均で少なくとも80パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記血漿タンパク質の低減が、前記投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の15日後に決定される、請求項121から144に記載のANGPTL3遺伝子の編集のための組成物。
- 前記組成物がサルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたサルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ0.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも45パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびm
RNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。 - 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも45パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも55パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラ
インと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。 - 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも45パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも55パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ1.5mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも65パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも40パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも45パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも50パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも55パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも60パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびm
RNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるトリグリセリドレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも65パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。 - 前記トリグリセリドレベルの低減が、前記投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって投薬の15日後に決定される、請求項148から180に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記トリグリセリドレベルの低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも168日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、請求項148から180に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記トリグリセリドレベルの低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも300日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、請求項148から180に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)をベースラインと比較して平均で少なくとも10パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)レベルをベースラインと比較して平均で少なくとも15パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)レベルをベースラインと比較して平均で少なくとも20パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも25パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびmRNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)のレベルをベースラインと比較して平均で少なくとも30パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記組成物がカニクイザルの体重1kgあたりほぼ3mgの前記ガイドRNAおよびm
RNAを合わせた総重量の用量で静脈内注入を介してカニクイザルの群に投与された場合に、前記投薬されたカニクイザルの血漿中におけるリポタンパク質(a)レベルをベースラインと比較して平均で少なくとも35パーセント低減させることができる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。 - 前記リポタンパク質(a)の低減が、前記投薬されたカニクイザルの血液サンプリングおよび分析によって、投薬の15日後に決定される、請求項184から189に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記リポタンパク質(a)の低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも224日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、請求項184から189に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記リポタンパク質(a)の低減が、前記投薬されたカニクイザルの定期的な血液サンプリングおよび分析によって少なくとも300日の期間にわたって持続的に維持されていることが決定される、請求項184から189に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記カニクイザルへの投薬がAST、ALT、またはサイトカインの上昇をもたらす限り、前記組成物の投薬によってもたらされる前記上昇が一過性であって投薬後3~15日以内にほぼベースラインレベルに戻る、請求項101から192に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記ANGPTL3の編集パーセントが図27に示したように肝組織、脾臓組織、および副腎組織の外部では無視できる、請求項101から103、121から126、148から153に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 繰り返し投薬の結果がANGPTL3の編集パーセンテージの前記編集パーセンテージに関して加成性である、請求項101から107、121から132、148から162に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記繰り返し投薬がサイトカインの活性化も免疫応答も誘発しない、請求項195に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記スペーサー配列が前記ANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも80%のヌクレオチド相関を有し、前記スペーサー配列上のRNAヌクレオチドが同一の順序で前記プロトスペーサーのDNAヌクレオチドと同一のヌクレオチドを有するならば前記RNAヌクレオチドが前記DNAヌクレオチドと相関し、ここで相関を決定する目的のためにウラシル塩基およびチミン塩基は同一のヌクレオチドであるとみなされる、請求項88に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記スペーサー配列が前記ANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも85%のヌクレオチド相関を有する、請求項197に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記スペーサー配列が前記ANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも90%のヌクレオチド相関を有する、請求項197に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記スペーサー配列が前記ANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも95%のヌクレオチド相関を有する、請求項197に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記スペーサー配列が前記ANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも99%のヌクレオチド相関を有する、請求項197に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- 前記スペーサー配列が前記ANGPTL3遺伝子上の標的としたプロトスペーサーのヌクレオチド配列と少なくとも100%のヌクレオチド相関を有する、請求項197に記載のANGPTL3遺伝子を編集するための組成物。
- アテローム硬化性心血管疾患の処置または防止を必要とする対象における前記疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の
(a)編集ウィンドウを有するアデニン塩基エディタータンパク質をコードするmRNA、
(b)前記塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および前記塩基エディタータンパク質をPCSK9遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第1のガイドRNAであって、前記スペーサー配列が前記PCSK9遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第1のガイドRNA、および
(c)前記塩基エディタータンパク質のための結合スカフォールドとして機能するtracr配列、および前記塩基エディタータンパク質をANGPTL3遺伝子上のプロトスペーサー配列に導くように機能するスペーサー配列を含む第2のガイドRNAであって、前記スペーサー配列が前記ANGPTL3遺伝子のスプライス部位またはエクソン領域に少なくとも部分的に相補的である、第2のガイドRNA
を前記対象に投与するステップを含む、方法。 - (a)を包摂する第1のLNPをさらに含む、請求項203に記載の方法。
- 前記第1のLNPが(b)および(c)を包摂する、請求項204に記載の方法。
- 前記第1のLNPが繰り返し投与される、請求項204に記載の方法。
- 前記第1のLNPが1~60日の間隔で繰り返し投与される、請求項204に記載の方法。
- 前記第1のLNPが7日の間隔で繰り返し投与される、請求項204に記載の方法。
- 前記第1のLNPが(b)をさらに包摂する、請求項204に記載の方法。
- (a)および(c)を包摂する第2のLNPをさらに含む、請求項209に記載の方法。
- 前記第1のLNPと前記第2のLNPが逐次的に投与される、請求項210に記載の方法。
- 前記第1のLNPと前記第2のLNPが1日~12か月の間隔で逐次的に投与される、請求項211に記載の方法。
- 前記間隔が1日である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が5日である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が10日である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が15日である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が20日である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が25日である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が1か月である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が2か月である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が3か月である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が5か月である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が8か月である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が10か月である、請求項212に記載の方法。
- 前記間隔が12か月である、請求項212に記載の方法。
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