JP2023553110A - 生物工学による神経上皮組織及び３ｄ神経上皮管の制御誘導方法 - Google Patents

Abstract

本明細書で記載されるのは、ヒト多能性幹細胞、神経・中胚葉前駆体、及び神経幹細胞の、分極神経上皮細胞の単一ロゼットを含み、インビボ発生中のヒト神経管の物に類似のマイクロスケール細胞構成を有する生物工学による楕円形神経上皮組織及び生物工学による神経上皮管神経上皮管への誘導分化のための方法、組成物、及びキットである。【選択図】なし

Description

連邦政府支援研究又は開発に関する陳述
本発明は、環境保護局より認可されたＲＤ－８３５７３７０１－０号に基づいて、及び米国国立衛生研究所により認可されたＮＳ０８２６１８号に基づいて、及び全米科学財団により認可された１６５１６４５号に基づいて、政府の支援によりなされた。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。

ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、組織／臓器移植のバイオマニュファクチャリング及び多種多様の組織、臓器、及び胚芽モデルを設計し、インビトロでヒト発生、生理学、及び疾患をインビトロで調査するための無制限の出発物質を提供する脳、腎臓、肝臓、前立腺、更に原腸形成胚様組織のインビトロモデルを生成するために懸濁液胚様体培養手法を用いて多くの進展があったが；それらの構造的及び組成物的変動は、オルガノイドを規模拡大可能なインビトロスクリーニングプラットフォームとしての、又は組織／臓器移植バイオマニュファクチャリングに対しての、オルガノイドの使用を制限する。

脳及び脊髄は、中空管状の分極神経上皮細胞（神経幹細胞とも呼ばれる）である神経管から組成する。インビトロで、分化している神経上皮細胞の２Ｄ及び３Ｄ培養は、神経管のスライスのように機能する、神経ロゼットの自然発生的分極化を介してオルガノイド形成を開始できる。神経幹細胞分化プロトコル、ならびに単一神経ロゼット構造の制御形成のための微細パターン化インビトロ培養プロトコルは、以前に開示された。このような神経ロゼットは、発生中の神経管の横断スライスをモデル化するが、それらの小さいサイズは、さらなる生物工学のための基材としてのそれらの使用を制限し、例えば、直径は、細胞培養物因子の意味のあるマイクロ流体勾配を生成するにはあまりにも小さい。従って、より生物模倣型神経管形態であり、マイクロ流体プラットホームを用いて形態形成生物工学を更に促進する、より大きなロゼット組織の形成の制御誘導のための改善された方法及び組成物に対する継続しているニーズが存在する。

本明細書で記載されるのは、より生物模倣型の神経管形態であり、マイクロ流体プラットホームを用いて形態形成生物工学を更に促進する、より大きな神経上皮組織及び神経上皮管の生物工学による製造のための方法、組成物、及びキットである。

第１の態様では、本明細書で提供されるのは、効率的で、再現性よく、及び確実に、単一の神経上皮ロゼットコアを有する生物工学による神経上皮組織を製造するためのインビトロ法であり、組織は、楕円形態（例えば、最大１ｍｍを超える長軸及び約２５０～３００μｍの短軸）を有し、これは、更に培養されて、生物模倣型楕円形神経上皮組織から新生神経管の特性を有する３Ｄ管状構造を形成できる。
特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、インビトロで単一のロゼット構造を有する生物模倣型楕円形神経上皮組織の製造方法であり、次の工程を含む：（ａ）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、その上で培養される細胞の生物模倣型神経形態形成を誘導する微細パターン化基材上に播種する工程であって、微細パターン化基材が細胞接着ブリッジにより連結された少なくとも２つの細胞接着性円形領域を含む工程；（ｂ）播種された微細パターン化基材を多能性維持基本培地の存在下で約１～２日間の第１の培養期間の間培養し、第１の細胞集団を得る工程であって、多能性維持基本培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む工程；（ｃ）神経分化基本培地中で接着条件下、その微細パターン化基材を約２～６日間の第２の期間にわたり培養しそれにより、分極神経上皮細胞を含み、インビボ発生ヒト神経管の横断切片と類似するのマイクロスケール細胞構成を有する生物模倣型楕円形神経上皮組織が得られる工程；及び（ｄ）約５日～約７日の第２の培養期間にわたり接着性微細パターン化培養物の表面をヒドロゲルで覆って、楕円形神経上皮組織を基材から遊離させ、それを３Ｄ神経上皮組織にすると同時に、ヒト神経管のインビボ発生に類似の単独分極環状構造を維持する工程。
特定の実施形態では、上記方法は、得られた生物工学による神経上皮組織をヒドロゲル層で表面を覆う工程、生物工学による神経上皮組織を約２４時間にわたり培養し、それにより、組織を生物工学による神経上皮管に変え、ヒドロゲル層で包み込む工程、及び包み込まれた神経上皮管を含むヒドロゲルを微細パターン化基材から取り出して生物工学による神経上皮管を得る工程を更に含む。

別の態様では、従って、本開示は、生物工学による神経上皮組織をインビトロで得るために、本明細書で記載の微細パターン化基材を含むマイクロ流体技術装置を提供する。本明細書で使用される場合、「モルフォゲン」という用語は、神経の前駆細胞などの細胞の分化及び／又は増殖を誘導する分子又は分子の混合物を意味する。一実施形態では、モルフォゲンは、神経組織の分化のパターニングに影響を与え得る濃度勾配を介して空間的情報を提供する。いくつかの実施形態では、モルフォゲンは、拡散性タンパク質、サイトカイン、又は成長因子である。

別の態様では、本明細書で提供されるのは、インビトロ生物模倣型神経上皮組織又は生物工学による神経上皮管を得るために有用な一種以上の成分を含むキットである。キットの成分には、本明細書で記載の一種以上の微細パターン化基材を含むことができる。キットはまた、合成培地(chemically defined medium)及び一種以上の培地添加物（例えば、成長因子、小分子化合物、培地補充物質）も含むことができる。キットは、微細パターン化基材の播種に有用な前駆細胞及び細胞播種及び培養のための説明書を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の一種以上の微細パターン化基材及び神経上皮組織を更に分化させて様々な種類の神経細胞（ニューロン）を得るために有用な一種以上の薬剤（例えば、成長因子、小分子薬剤、モルフォゲン勾配を作成するための薬剤）をキットに含めることは好都合であろう。このような実施形態では、キットはまた、例えば、所定の方式でパターニング薬剤を生物工学による神経上皮組織に送るために、マイクロ流体技術装置又はその構成要素を含めることも可能である。いくつかの実施形態では、キットは、生物模倣型楕円形神経上皮組織上を覆って、本開示の方法により包み込まれた生物工学による神経上皮管を得るために使用に好適するヒドロゲルを更に含む。

別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で開示される方法の１つにより得られた設計されたインビトロ生物工学による神経上皮組織であり、分極神経上皮細胞の単一ロゼットを含み、インビボ発生中のヒト神経管の横断切片と類似するのマイクロスケール細胞構成を有する。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、その上で培養される細胞の生物模倣型神経形態形成が可能な一種以上の微細パターン化基材を含む組成物であり、微細パターン化基材は、少なくとも２つの円形の細胞接着ブリッジにより連結された細胞接着性マイクロスケール領域を含む。

第１の特定の態様では、本開示は、インビトロで単一ロゼット構造を有する生物模倣型楕円形神経上皮組織を製造する方法を提供する。方法は、：（ａ）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、その上で培養される細胞の生物模倣型神経形態形成ができる微細パターン化基材上に播種する工程であって、微細パターン化基材が細胞接着ブリッジにより連結された少なくとも２つの円形有界領域（ｂｏｕｎｄｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）を含む工程；（ｂ）工程（ａ）の播種細胞を微細パターン化基材上で多能性維持培地の存在下、約１～２日間の第１の培養期間にわたり培養し、第１の細胞凝集体を得る工程であって、多能性維持培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む工程； 及び（ｃ）神経分化基本培地中で接着培養条件下、工程（ｂ）で得られた細胞を、約３～６日間の第２の期間にわたり培養し、それにより、単一のロゼット構造を有する生物模倣型楕円形神経上皮組織が得られる工程を含む。組織は、分極神経上皮細胞を含み、インビボ発生中のヒト神経管の横断切片と類似するのマイクロスケール細胞構成を有する。

第１の特定の態様の一実施形態では、少なくとも２つの円形有界領域のそれぞれは、約１００μｍ～約３００μｍの直径を有する。第１の特定の態様の一実施形態では、細胞接着ブリッジは、約２５μｍ～約１２５μｍの長さを有し、約１０μｍ～約５０μｍの幅を有する。第１の特定の態様の一実施形態では、細胞接着ブリッジは、約５０μｍ～約１００μｍの長さを有し、約２５μｍの幅を有する。第１の特定の態様の一実施形態では、ｈＰＳＣは、約７５ｘ１０³細胞／ｃｍ²～約２．５ｘ１０⁵細胞／ｃｍ²の密度で微細パターン化基材上に播種される。第１の特定の態様の一実施形態では、ｈＰＳＣは、約１６５，０００細胞／ｃｍ²の密度で微細パターン化基材上に播種される。第１の特定の態様の一実施形態では、多能性維持培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、アスコルビン酸、重炭酸ナトリウム、セレン、インスリン、トランスフェリン、ＦＧＦ２、及びＴＧＦβ１を含む合成培地である。
第１の特定の態様の一実施形態では、多能性維持培地は、Ｅ８培地である。
第１の特定の態様の一実施形態では、神経分化基本培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、アスコルビン酸、重炭酸ナトリウム、セレン、インスリン、及びトランスフェリンを含む合成培地である。
第１の特定の態様の一実施形態では、神経分化基本培地は、Ｅ６培地である。
第１の特定の態様の一実施形態では、神経分化基本培地は、β－カテニン経路シグナル伝達の活性化剤を含む又は含まない、ＦＧＦの一種以上を更に含む。第１の特定の態様の一実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ｆ、ＦＧＦ１７、又はＦＧＦ１８である。第１の特定の態様の一実施形態では、β－カテニン経路シグナル伝達の活性化剤は、ＧＳＫ３キナーゼ阻害剤である。第１の特定の態様の一実施形態では、ＧＳＫ３キナーゼ阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。第１の特定の態様の一実施形態では、神経分化基本培地は、約１００ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂ及び約３μＭ～約９μＭのＣＨＩＲ９９０２１を更に含む。
第１の特定の態様の一実施形態では、第２の培養期間は約５日である。

第１の特定の態様の一実施形態では、方法は、微細パターン化基材上にプレーティング後約２４～７２時間(about 24-72 hours after plating)、微細パターン化基材上の細胞をＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の活性化剤に一過性に曝露することを更に含む。
第１の特定の態様の一実施形態では、方法は、細胞を微細パターン化基材上に播種後約２４～７２時間(about 24-72 hours after seeding)、播種細胞をＲＡ及びソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）又はＳＨＨシグナル伝達アゴニストに約１～約５日間(for about 1 to about 5 days)にわたり曝露することを更に含み、それにより、ロゼット構造がＯｌｉｇ２⁺運動ニューロン前駆細胞（ｐＭＮ）を含む。
第１の特定の態様の一実施形態では、微細パターン化基材は、ユーザー定義の有界幾何（ｂｏｕｎｄｅｄ ｇｅｏｍｅｔｒｙ）に配置された単一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブラシ又はペプチド固定化ＰＥＧブラシを含む。

第１の特定の態様の一実施形態では、方法は、第１の特定の態様の工程（ｃ）で得られた神経上皮組織をヒドロゲル層で表面を覆う工程；及びヒドロゲル層を含む神経上皮組織を約２４時間にわたり培養し、それにより、組織を生物工学による神経上皮管に変え、ヒドロゲル層で包み込む工程を更に含む。
第１の特定の態様の一実施形態では、方法は、包み込まれた生物工学による神経上皮管を含むヒドロゲルを微細パターン化基材から取り出す工程を更に含む。第１の特定の態様の一実施形態では、方法は、分析のために、取り出されたヒドロゲルを固定し、切片化する工程を更に含む。一実施形態では、ヒドロゲルはマトリゲルである。

第２の特定の態様では、本開示は、第１の特定の態様の方法により得られたインビトロ生物工学による神経上皮組織を提供し、組織は、分極神経上皮細胞の単一ロゼットを含み、インビボ発生中のヒト神経管の横断切片と類似するのマイクロスケール細胞構成を有する。

第３の特定の態様では、本開示は、第１の特定の態様又はそのいずれかの実施形態の方法により得られたインビトロ生物工学による神経上皮管を提供する。管は、分極神経上皮の単一ロゼットを含み、インビボ発生中のヒト神経管と類似するのマイクロスケール細胞構成を有する。

第４の特定の態様では、本開示は、その上で培養される細胞の生物模倣型神経形態形成を指示できる一種以上の微細パターン化基材を含む組成物を提供する。一種以上の微細パターン化基材は、細胞接着ブリッジにより連結された、少なくとも２つの円形の細胞接着マイクロスケール領域を含む。
第４の特定の態様では、本開示は、第４の特定の態様の組成物を含むキットを提供し、これは、一種以上の前駆細胞のバイアル、多能性基本培地、神経分化基本培地、マイクロ流体装置、及びモルフォゲン勾配を作製する試薬を更に含む。

第５の特定の態様では、本開示は、インビトロで生物工学による神経上皮管を製造する方法を提供する。方法は：（ａ）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、その上で培養される細胞の生物模倣型神経形態形成ができる微細パターン化基材上に播種する工程であって、微細パターン化基材が細胞接着ブリッジにより連結された少なくとも２つの円形有界領域を含む工程；（ｂ）工程（ａ）の播種細胞を微細パターン化基材上で多能性維持培地の存在下、約１～２日間の第１の培養期間にわたり培養し、第１の細胞凝集体を得る工程であって、多能性維持培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む工程；（ｃ）神経分化基本培地中で接着培養条件下、工程（ｂ）の細胞を、約３～６日間の第２の期間にわたり培養し、それにより、生物工学による神経上皮組織が得られる工程；（ｄ）工程（ｃ）で得られた生物工学による神経上皮組織の表面をヒドロゲル層で覆う工程；（ｅ）工程（ｄ）の生物工学による神経上皮組織を約２４時間培養し、それにより、組織を生物工学による神経上皮管に変え、ヒドロゲル層で包み込む工程；及び（ｆ）包み込まれた神経上皮管を含むヒドロゲルを微細パターン化基材から取り出し、生物工学による神経上皮管を得る工程を含む。

第６の特定の態様では、本開示は、第５の特定の態様の方法により得られたインビトロ生物工学による神経上皮管を提供する。管は、分極神経上皮の単一ロゼットを含み、インビボ発生中のヒト神経管と類似するのマイクロスケール細胞構成を有する。

本発明のこれら及びその他の特徴、目的、及び利点は、以下の説明からより良く理解されるであろう。記述では、本発明の一部を構成する、実例として非限定的に本発明の実施形態が示される、添付の図面を参照する。特定の実施形態に記述は、本発明を限定する意図も、全ての変形物、等価物及び代替物を包含する意図もない。従って、本発明の範囲を解釈するためには、参照は本明細書で詳述される特許請求の範囲に対しなされるべきである。
本発明についての下記の発明を実施するための形態を考慮すれば、本発明が更に良く理解されるであろうし、また上述したもの以外の特徴、外観及び利点的が明らかになるであろう。このような発明を実施するための形態では、以下の図面を参照する。

カスタム培養基材のミクロ接触プリンティングに使用されるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スタンプ上に提示された特徴のコンピューター支援デザインを示す：（上段）ブリッジのない対を形成した円微細パターン配置及び（下段）ブリッジにより連結された対の円を含む、あるいは、「ノード」と呼ばれる微細パターン。円の直径は、１５０～２５０μｍで変化し、変動するエッジ間距離を有する。ブリッジ厚さは２５ミクロンである。 （上段）ブリッジのない場合の２５、５０、及び７５μｍのエッジ間距離での培養の全日数にわたる微細パターン化組織対の代表的画像を示す（Ｎ－カドヘリン＝破線矢印、Ｐａｘ６＝中実矢印）。中段のグラフは、対間で融合した微細パターン化組織のパーセンテージの定量化を示す（グラフバーは、各エッジ間距離に対し、左から右へ、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、及びＤ６である）。下段のグラフは、融合され、全ての融合微細パターン化組織対から単一ロゼット分極化を形成した微細パターン化組織対のパーセンテージを示す（グラフバーは、各エッジ間距離に対し、左から右へ、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、及びＤ６である）。実験群当り、Ｎ＝５６回の技術的反復。 （上段）ブリッジを有する場合の２５、５０、７５、１００、及び１２５μｍのエッジ間距離での培養の全日数にわたる微細パターン化組織対の代表的画像を示す（Ｎ－カドヘリン＝破線矢印、Ｐａｘ６＝中実矢印）。中段のグラフは、対間で融合した微細パターン化組織のパーセンテージの定量化を示す（グラフバーは、各エッジ間距離に対し、左から右へ、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、及びＤ６である）。下段のグラフは、融合され、全ての融合微細パターン化組織対から単一ロゼット分極化を形成した微細パターン化組織対のパーセンテージを示す（グラフバーは、各エッジ間距離に対し、左から右へ、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、及びＤ６である）。実験群当り、Ｎ＝５６回の技術的反復。 （上段）単一行の微細パターンデザインを示す（Ｎ－カドヘリン＝破線矢印、Ｐａｘ６＝中実矢印）。上段の中部の画像モンタージュは、ブリッジを有する場合の５０μｍのエッジ間距離での全ての培養日数にわたる微細パターン化神経上皮組織の代表的画像を示す。上段のグラフは、ブリッジを有する場合の２５、５０、７５、１００、及び１２５μｍのエッジ間距離での全横列にわたり融合された微細パターン化組織のパーセンテージの定量化を示す（グラフバーは、各エッジ間距離に対し、左から右へ、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、及びＤ６である）。下段のグラフは、融合され、全ての融合微細パターン化組織横列から単一ロゼット分極化を形成した微細パターン化組織横列のパーセンテージを示す（グラフバーは、各エッジ間距離に対し、左から右へ、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、及びＤ６である）。実験群当り、Ｎ＝４回の技術的反復。 ５日目までに、微細パターン化神経組織融合が微細パターン化アレイ上の全横列に及ぶことを示す。Ｎ－カドヘリン＝破線矢印、Ｐａｘ６＝中実矢印。 （上段）５０μｍのエッジ間距離及びブリッジで分離された円形微細パターンは、全微細パターン化横列にわたり単一Ｎ－カドヘリン⁺ロゼット分極化を有する近接融合組織の形成を可能にし、頂端面Ｎ－カドヘリン（破線矢印）発現を培養の５日間にわたり有する三次元管になり始め（中段）、これは、共焦点Ｚ－スタックによる画像（下段）で示される。Ｎ－カドヘリン＝破線矢印、ラミニン＝中実矢印、ＤＡＰＩ＝複合矢印。 （上段）微細パターン化前脳神経上皮管を誘導するための（中段の上部）、及び５日目に２４時間にわたりマトリゲルヒドロゲルで表面を覆うための（中段の底部）実験プロトコルを示す。 マトリゲル被覆の２４時間後の前脳神経上皮管の代表的横断切片を示す。切片は、全１４組織にわたるｎ＝１７３切片の８８％で単一の神経上皮形成を示す分極Ｎ－カドヘリン発現の中央環（上段）を示し、及びラミニン細胞外マトリックスタンパク質の基底堆積（下段）を示す。Ｎ－カドヘリン＝破線矢印、ラミニン＝中実矢印、ＤＡＰＩ＝複合矢印。

本発明は種々の修正及び代替形態を許容できるが、その例示的実施形態が例として図面により示され、また、本明細書で詳細に記載される。しかし、例示的実施形態の記述は、本発明を特定の開示形態に限定することを意図するものではなく、その逆に、添付の特許請求の範囲により定められる発明の趣旨及び範囲内に包含されるすべての修正物、等価物、及び代替物を網羅することを意図するものであることが理解されるべきである。
参照による組み込み
本明細書で挙げた刊行物、特許及び特許出願はすべて、個々の刊行物、特許及び特許出願のそれぞれがあたかも具体的に、個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

中枢神経系（ＣＮＳ）では、脳及び脊髄は、分極神経上皮細胞（ＮＥＣ）（神経幹細胞とも呼ばれる）の神経管と呼ばれる中空管から発生する。インビトロでは、ＮＥＣは、分化中に自然発生的に分極し、二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）の両培養で、類似の神経上皮管類似体、すなわち、神経ロゼット構造体を形成する。本発明は、神経ロゼット形成を制御し、それにより、調整可能なアスペクト比を備えた楕円形態を有する神経上皮組織を製造する方法を提供する。これらの楕円形神経上皮組織は、一次神経管形成を日常的に模倣し、以前に報告された神経オルガノイド誘導法により得られるものよりも、発生中の神経管により大きく類似する構造的特性を示す３Ｄ神経上皮管を再現性よく形成する。

Ｉ．定義
特に断らない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術における通常の知識を有する者が共通に解釈するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験のために使用することが可能であるが、有利な方法及び材料が本明細書で記載される。
本発明の実施形態及び特許請求の範囲の請求の記述では、以下の用語は、以下の定義に従って用いられることになる。

本明細書で使用される場合、「ヒト多能性幹細胞」（ｈＰＳＣ）という用語は、連続して自己複製でき、及び適切な条件下で、３つ全ての胚性胚葉の細胞へ分化できる細胞を意味する。ｈＰＳＣは、ＳＯＸ２⁺及びＯＣＴ４⁺を含む遺伝子発現プロファイルを示す。ｈＰＳＣの例には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）が含まれる。本明細書で開示される方法での使用に好適するｈＥＳＣは、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５－１１４７に記載されている。この文献は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される場合、「ｉＰＳ細胞」は、それらそれぞれの元の分化体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、本明細書で記載のＥＳ細胞などの、より強力な細胞に類似の特性を示す細胞を意味する。細胞は、非多能性（例えば、多能性又は体）細胞をリプログラミングすることにより得ることができる。
本明細書で使用される場合、「多能性」は、細胞の３つ全ての胚葉の細胞に分化する能力を意味する。
本明細書で使用される場合、「神経幹細胞」（ＮＳＣ）は、ＰＡＸ６⁺／ＳＯＸ２⁺であり、ＣＮＳ又は末梢神経系（ＰＮＳ）のニューロン又はグリアに分化できる多能性幹細胞を意味する。本明細書で使用される場合、神経上皮細胞（ＮＥＣ）は、神経ロゼット構造内で頂底極性を示す分極上皮細胞である神経幹細胞を意味する。
本明細書で使用される場合、「神経・中胚葉前駆体」（ＮＭＰ）という用語は、次の遺伝子発現プロファイル：ＳＯＸ２⁺／ＯＣＴ４^-／Ｔ⁺／ＰＡＸ６^-を有するヒト多能性幹細胞由来細胞を意味する。ＮＭＰは、後部外側エピブラストとも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「楕円形」という用語は、伸長された円形で、楕円形に引き延ばされた、楕円形状又は楕円様形状を有することを意味する。楕円形状は、理想的円形から逸脱し、形状の中心から、形状の端部までの距離が変動する（円の中心から端部に沿った任意の位置までの距離は、一定のままである円形とは異なる）。用語の「楕円形」、「楕円形」又は「概ね楕円形」は、本明細書では同じ意味で用いられ、基材、組織、又は本開示の他の物質が正確な楕円形状を有するということが必須であるとは見なされない。
本明細書で使用される場合、「神経ロゼット」という用語は、二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）培養でヒト多能性幹細胞を神経分化させる場合に形成される神経上皮細胞（ＮＥＣ）を含む神経上皮管類似体を意味する。神経ロゼット形態は、頂底極性を有する構成細胞膜に沿った頂端面Ｎ－カドヘリン局在化により解明できる。
本発明で使用される「生体分子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」又は「生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、実質的に生物学的起源を有する分子を意味する。このような分子には、天然起源成分を模倣する非天然起源成分、例えば、非天然起源アミノ酸が含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「合成」及び「設計された」という用語は、同じ意味で用いられ、人間の手で作成又は改変された（例えば、人工材料を用いて形成された）又はこのような物質（例えば、設計された物質を含む装置又は組成物）を用いて誘導された非天然起源組織物質を意味する。
本明細書で使用される場合、「オルガノイド」という用語は、発生中の臓器に似ており、別々に添加することにより、及び限定されないが、多能性幹細胞又は神経幹細胞を含む細胞型の自己組織化によりインビトロで構築される組織様構造体（すなわち、特定の組織型の構造的特性を示す）を意味する。例えば、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ ａｎｄ Ｋｎｏｂｌｉｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５（６１９４）：１２４７１２５（２０１４）を参照されたい。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書では同じ意味で用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１個又は複数のアミノ酸残基が対応する天然起源のアミノ酸、ならびに天然起源のアミノ酸ポリマー、修飾残基を含むもの、及び非天然起源のアミノ酸ポリマーの人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーに適用される。
本明細書で使用される場合、用語「細胞培地」（本明細書においては、「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」又は「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」又は「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」としても参照される）は、細胞生存率を維持し、増殖を支援する栄養素を含む、細胞を培養するための培地である。
本明細書で使用される場合、用語「合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）」又は「合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）」は、各培地成分に化学構造及び量が具体的に既知又は特定可能であり、個別に調節できることを意味する。従って、培地は、（１）全ての培地成分の化学的及び構造的固有の特性が既知ではない、（２）培地が未知の量のいずれかの成分を含む、又は（３）これらの両方である場合、合成培地ではない。
本明細書で使用される場合、「から基本的になる培地」は、特定の成分及びその基本特性に実質的に影響を及ぼさない成分を含む培地を意味する。
本明細書で使用される場合、「補充された」は、組成物、例えば、補充成分（例えば、レチノイン酸又は繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ））を含む培地を意味する。例えば、レチノイン酸（ＲＡ）又はＦＧＦで「さらなる補充された」培地は、ＲＡ又はＦＧＦを含むが、ＲＡ又はＦＧＦを培地に導入する行為を意味しない。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、本発明により特定細胞効果を誘起するのに十分な薬剤の量を意味する。
本明細書で使用される場合、「ゼノゲンフリー」及び「ゼノフリー」という用語は同じ意味で用いられ、非ヒト起源に由来する異種物質又は未定義の成分を不含又は実質的に不含である物質を意味する。
本明細書で使用される場合、「神経分化基本培地」は、ヒト多能性幹細胞を神経系統、例えば、神経外胚葉及び神経上皮に向けた分化を促進及び支援できる培地を意味する。本明細書及び米国特許出願公開第２０１４／０１３４７３２号に記載のように、神経分化基本培地には、限定されないが、Ｅ６培地を含むことができる。この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
用語「精製された」又は「濃縮された」細胞集団は、本明細書では同じ意味で用いられ、より高い比率の特定の細胞型又はインビボで認められる特性より高い指定特性を有する細胞を含むエクスビボ細胞集団を意味する。
本明細書で使用される場合、「無血清」は、培地が血清又は血清置換物を含まないこと、又は実質的に血清又は血清置換物を含まないことを意味する。例えば、実質的に無血清培地は、約１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％又は０．１％未満の血清を含むことができ、培地のコンピテント培養能力がまだ観察される。
本明細書で使用される場合、「実質的に不含」は、培地又は他の組成物又は溶液が特定の成分を不含又はほぼ不含であることを意味する。例えば、「プトレシンを実質的に不含」は、基本培地、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に存在する任意のプトレシンに加えて、プトレシンが細胞培地に添加されないことを意味する。あるいは、「プトレシンを実質的に不含」は、０．０８ｍｇ／ｌ以下の最終プトレシン濃度を意味する。
本明細書で使用される場合、「生存率」は、実質的な細胞死のない状態を意味する。生存可能な多能性細胞は、表面に付着し、膜破壊がなければ、色素ヨウ化プロピジウムで染色されない。短期生存率は、培養での細胞の播種後の最初の２４時間に関係する。通常、細胞はその時間で増殖しない。
本明細書で使用される場合、「架橋」又は「架橋した」という用語は、１つのポリマー鎖を別のポリマー鎖に連結して、特にヒドロゲルを形成する結合を意味する。これらの連結は、共有結合又はイオン結合であってよい。

用語「約（ａｂｏｕｔ）」及び「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、一般に、測定値の性質又は精度を考慮して、測定された量に対して、許容可能な程度の過誤を意味するものとする。通常の例示的過誤の程度は、値又は値の範囲の１０％以内、好ましくは５％以内である。あるいは、特に生体系では、用語「約（ａｂｏｕｔ）」及び「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、特定の値の１０倍以内の範囲、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内である値を意味し得る。本明細書で示された数値の量は、近似値であり、特に断りのない限り、明示的に示されない場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」及び「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が推定され得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであって、追加の、記載されていないメンバー、要素又は方法の工程を排除するものではない。本明細書で使用される表現及び用語は、説明を目的とするものであり、限定するものと見なされるべきではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」及びこれらの変形の使用は、それらの後に列記される項目及び追加の項目を包含することを意味する。請求要素を修飾するための「第１の」、「第２の」、「第３の」、などの順序数項の特許請求の範囲における使用は、それ単独で、何らかの優先権、先行、又は１つの請求項要素の別の要素に対する順序又は方法の作用が実施される一時的順序を暗示するものではない。順序数項は、特定の名称を有する１つの請求項要素を、同じ名称を有する（順序数項の使用を別にすれば）別の要素から識別する標識として請求項要素を区別するために使用されるに過ぎない。
本明細書及び添付された特許請求の範囲において用いられるとき、単数形（「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」）は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数の指示物を含む。本明細書で「又は」へのいずれの言及も、別に定める場合を除き、「及び／又は」を包含することが意図されている。

ＩＩ．方法、組成物、及びオルガノイド
本明細書で記載される本発明は、非円形形態を有する神経上皮組織及び組織全体にわたる単一分極ロゼット構造の形成を誘導できる細胞接着ブリッジにより連結された複数円形領域を含む微細パターンデザインを開示する。更に、図３及び４で示すように、連結された一連の複数円を有する微細パターンの作成は、無制限に拡大できる実質的に楕円形態（例えば、最大１ｍｍを超える長軸及び約２５０～３００μｍの短軸）を有する単一神経上皮ロゼット組織の形成を可能にする。比較すると、細胞接着ブリッジを欠く個々の円（図２参照）のみが希に融合組織又は単一ロゼットを生成した。限定条件を用いて、特定のデザインの微細パターン化基材上で幹細胞の分化の方向付けにより、より高い模倣性のインビボ神経管構造及び形態のインビトロオルガノイドを得ることができる。また、本明細書で記載される本発明により提供されるのは、生物模倣型インビトロヒトモデルでの神経発生及び疾患を研究するために、及びインビトロ組織工学のための物質及び組み合わせ戦略を特定するために、インビトロ３ＤモデルにおけるヒトＣＮＳのパターニングをモデル化する条件である。更に、このような微細パターン化組織の拡大培養は、３Ｄ神経上皮管を形成するための一次神経管形成様組織フォールディング／融合イベントを反復することが本明細書で示される（図６）。この能力は、生物を模倣した、再現可能な解剖学的組織を有する神経オルガノイドの生物工学に向けた重要な工程を提供する。類似の上皮管形成は、他のヒト臓器（例えば、心臓及び消化器系）の発生過程を特徴付け、それにより、本明細書で記載される微細パターン化培養方法は、他の組織／臓器系の生物工学に適用し得る。

従って、第１の態様では、本明細書で提供されるのは、生物模倣型楕円形神経上皮組織から、効率的で、再現性よく、及び確実に、単一の神経上皮ロゼットコアを有する神経上皮管を生物工学により製造するためのインビトロ法であり、組織は、楕円形態（例えば、最大１ｍｍを超える長軸及び約２５０～３００μｍの短軸）を有し、これは、更に培養されて、新生神経管の特性を有する３Ｄ管状構造体を形成できる。本明細書で使用される場合、用語「生物模倣型楕円形神経上皮組織」は、細長い細胞凝集体又は本開示の微細パターン化基材上に生成された単一神経ロゼット構造体を含み、天然で見つかる組織に構造的類似性を有する、即ち、胚性神経管又はその横断切片の解剖学的構造及び細胞構造を有する組織を意味する（図３）。それから作製された生物工学による神経上皮管は、図６及び８に示すように、分極３Ｄ神経管細胞構造を模倣し、分極ＮＳＣが頂端面Ｎ－カドヘリン発現及び３Ｄ円筒形組織凝集体の全体軸に沿って基底細胞外マトリックスタンパク質堆積を示す、インビトロ生成（例えば、設計された）細胞凝集体である。

特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、インビトロ単一ロゼット構造を有する生物模倣型楕円形神経上皮組織を製造する方法であり、次の工程を含む：Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、その上で培養される細胞の生物模倣型神経形態形成ができる微細パターン化基材上に播種する工程であって、微細パターン化基材が細胞接着ブリッジにより連結された少なくとも２つの円形有界領域を含む工程；播種された微細パターン化基材を、多能性維持培地の存在下、約１～２日間の第１の培養期間にわたり培養し、第１の細胞集団を得る工程であって、多能性維持基本培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む工程； 及びその培養された微細パターン化基材を、神経分化基本培地中で接着培養条件下、約２～６日間の第２の期間にわたり培養し、それにより、分極神経上皮細胞を含み、インビボ発生中のヒト神経管の横断切片と類似するのマイクロスケール細胞構成を有する生物模倣型楕円形神経上皮組織が得られる工程。図１を参照すると、特定の実施形態では、微細パターン化基材は、細胞接着ブリッジにより連結された少なくとも２つの円形有界領域を含み、いくつかの実施形態では、一連の相互接続円形有界領域を含む。円形有界領域の数は、少なくとも２つでなければならないが、一連の相互接続円形有界領域の数は、所定の配置を基材上に作製する能力によってのみ制限される（例えば、微細パターン化基材それ自体の寸法により制限される）。

いくつかの実施形態では、微細パターン化基材は、グラフトポリマーブラシなしで、アルカンチオールの単純なマイクロプリンティングにより作製でき、本明細書で開示される方法で使用できる。Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５：２９２８－２９３５，ｔｈｅ ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｌｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｈｅｒｅｉｎ ｉｎ ｉｔｓ ｅｎｔｉｒｅｔｙを参照されたい。いくつかの実施形態では、微細パターン化基材は、一種以上の表面グラフトポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）ブラシの設計された所定の（すなわち、ユーザー定義の）配置を含み、これは、タンパク質吸着を確実に防止し、それにより、細胞接着を防止する。このような実施形態では、微細パターン化基材は、固体支持体（例えば、組織培養ポリスチレン、スライド・ガラス、ガラス、又はシリカ基材）上にグラフト化された一種以上のＰＥＧブラシのユーザー定義の配置を含む。細胞接着を妨げる微細パターン化領域は、全ての細胞接着ペプチド又は細胞接着を促進する他の部分を欠く、単一又は複数の表面グラフト化ＰＥＧブラシを含み得る。その上で培養される細胞の接着を促進する細胞微細パターン化領域は、ペプチド固定化部分を有する単一又は複数のＰＥＧブラシを含み得る。このような実施形態では、単一又は複数のペプチド固定化ＰＥＧブラシの配置は、細胞接着を制御でき、それにより、得られる組織の接着細胞凝集体の形態を制御できるユーザー定義の調整可能な基材を提供する。更に、ＰＥＧブラシは、化学的に修飾して、ペプチドのインサイツ結合を可能にし、その配列は、細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）タンパク質から誘導される。例えば、微細パターン化基材は、一種以上のＲＧＤ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）配列モチーフを有するペプチドを含むＰＥＧブラシの配置を含むことができ、これは、細胞接着を促進するインテグリン結合モチーフとしても既知である。ＲＧＤ配列モチーフは、多数の接着性ＥＣＭ及び細胞表面タンパク質の細胞接着部位に対応する。ＲＧＤ配列は、フィブロネクチン、コラーゲン、及びラミニンなどのインテグリン－結合接着タンパク質で共通である。このような接着タンパク質のインテグリン結合活性は、ＲＧＤ配列を含む短い合成ペプチドにより模倣できる。従って、微細パターン化基材の特定の領域への細胞の付着を促進するために、これらの領域は、ＲＧＤ含有ペプチドに結合した一種以上のＰＥＧブラシを含み得る。細胞接着を妨げる領域に対しては、どの細胞接着分子（例えば、細胞連結部分）も欠くＰＥＧブラシの使用が好ましい。

いくつかの実施形態では、微細パターン化基材は、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５１：５２３８－５２４１により記載された合成プロトコルにより得られる。この文献は、参照により、あたかもその全体が記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。そこに記載のように、微細パターン化基材は、アジド官能化ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）グラフト化基材であり得る。これは、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）などの高歪み分子に結合されたペプチドにより１，３－双極子環化付加「クリック」反応を起こすことができる。他のペプチド固定化ＰＥＧブラシは、Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １４（９）：３２９４－３３０３により記載されている。この文献は、あたかもその全体が記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。そこに記載のように、ＰＥＧブラシは、汎用性銅不含クリック反応を介したリガンド（例えば、ペプチド）固定化のために、二重直交化学（すなわち、アジド及びアセチレン基）を示し、これは、細胞培養物中のインサイツ表面修飾に有用であり、それにより、接着組織形態の時空間的制御に有用である。

いくつかの実施形態では、微細パターン化基材は、約１００μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、又はそれ超の直径を有する相互接続円のアレイを除いて全体を通して、一種以上のＰＥＧブラシ又はポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）－アジドブラシを含み、これらの円は、細胞接着ブリッジにより連結される。このような実施形態では、細胞外マトリックスタンパク質で被覆され、ｈＰＳＣ、ＮＭＰ、又はＮＳＣを播種された場合、細胞は、ブラシ不含領域内に付着する。更に培養されると、細胞は、不活性ＰＥＧ又はＰＥＧＭＡ－アジドブラシを取り囲むことにより閉じ込められた成形組織に分化する。好都合にも、本明細書で提供される微細パターン化基材は、化学的に修飾して、ユーザー定義の調整可能な空間的パラメーターに従って配置された複数の細胞接着ペプチドを提示できる。ユーザー定義パラメーターには、間隔、直径（本明細書においては、「幅」と称することもある）、高さ（本明細書においては、「長さ」と称することもある）、及び単位表面積当りの細胞接着ペプチドの数（本明細書においては、「細胞接着ペプチド表面積密度」としても参照される）が挙げられる。

従って、本明細書で提供されるのは、その上で培養される細胞の付着を促進する領域を含む微細パターン化基材であり、これらの領域は、マトリックス上で培養された、又はマトリックスに動員された、神経・中胚葉前駆体（ＮＭＰ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、又はヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化及び形態形成を促進する有界幾何を有するように設計（すなわち、構成）される。本明細書で示すように、少なくとも２つの円形有界領域を含み、細胞接着ブリッジにより連結された微細パターン化基材の有界幾何は、培養基材上でのｈＰＳＣ、ＮＳＣ、又はＮＭＰの細胞分化及び形態形成の間に、マクロスケール構造化を制御し、楕円形態を有する単一神経上皮ロゼット組織形成するために使用できる。有界幾何形状は、形状により規定される寸法（例えば、直径、幅、長さ、など）を有する種々の二次元（２Ｄ）形状（例えば、規則的又は不規則形状）であってよいが、微細パターン化基材のためには、所定の距離により互いに分離され、同じ細胞接着性物質のブリッジにより連結されている種々の寸法（例えば、３６μｍ、１００μｍ、４９０μｍ、４．８ｍｍ、及び１２．６ｍｍの直径；典型的には、１５０～３００μｍ）の少なくとも２つの円形領域の所定の二次元パターンを含むのが好都合である。特定の実施形態では、それぞれの少なくとも２つの円の有界幾何形状は、約１００μｍ、１５０μｍ、１８０μｍ、２００μｍ、約３００μｍ、又は約４００μｍ（例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００μｍ（両端の値を含む））の直径を有する。いくつかの実施形態では、１００μｍ未満、いくつかの実施形態では、５０μｍ程度（例えば、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００μｍ（両端の値を含む））の直径を有する円又は他の形状を使用できるが、より小さい微細パターン化表面（すなわち、１００μｍ未満の直径を有する表面）上で成育された増殖細胞は、細胞の凝集体又は球体として表面から離れる傾向がある。従って、実用的な制約条件として、微細パターン化表面寸法に対し下限値を設定できる。

少なくとも２つの円形有界領域間の間隔（細胞接着ブリッジによる間隔）に関して、領域は、好ましくは、約２５μｍ～約１２５μｍ（例えば、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５μｍ（両端の値を含む））の距離をあけて、より好ましくは約５０μｍ～約１００μｍの距離をあけて配置される。従って、少なくとも２つの円形有界領域を連結する細胞接着ブリッジの長さは、好ましくは、約１０μｍ～約１００μｍ（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００μｍ（両端の値を含む））、より好ましくは約２０μｍ～約６０μｍである。

いくつかの実施形態では、微細パターン化基材は、例えば、一連の所定の二次元パターンの複数相互接続円を含み、各円は、ほぼ同じ直径を有し、いずれか２つの隣接円のそれぞれは、ほぼ同じエッジ間間隔を共有する。各円の直径及び円間の間隔は、変わってもよいが、発明者らは、約２５μｍ～約１２５μｍの、より好ましくは約２５μｍ～約５０μｍ（図３及び４）の相互接続円間のエッジ間間隔を有する特定の微細パターンが好都合な配置であると結論付けた。
少なくとも２つの円形有界領域を連結する細胞接着ブリッジ幅に関して、ブリッジ幅は、好都合にも、約１０μｍ～約１００μｍ、より具体的には２５μｍである。
細胞接着ブリッジの配置は変わってもよいが、本発明者らは、中央部に位置するブリッジを使用するのが好都合であると結論付けた。細胞接着ブリッジの配置は、本開示の範囲内に入るために、円の各対の正確な中心点である必要はない。

任意の適切な微細パターン化基材の作製手段を使用できる。いくつかの実施形態では、微細パターン化基材は、マニュアルでペプチド固定化ＰＥＧブラシ及び細胞接着ペプチドを固体支持体上に堆積させることにより作製できる。他の実施形態では、微細パターン化基材は、自動化（例えば、ロボットによる）技術、ミクロ接触プリンティング、マイクロ流体エッチング、又は種々の物質の堆積を用いて作製される。他の実施形態では、フォトリソグラフィベース微細加工技術を使用できる。例えば、フォトリソグラフィベース微細加工技術を用いて、細胞接着性物質でコートした細胞接着を妨げる物質（例えば、非接着性寒天）の基材（例えば、スライドガラス、ガラスカバーガラス、又はエラストマー系ポリマー（例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）））上へのマイクロメートルレベルパターニングのためのテンプレート又はモールドを作製できる。この方式では、本明細書で開示される方法により、明確な接着性及び非接着性ドメインを含む微細パターン化基材が得られる。

当該技術分野において知られているように、本明細書で開示の微細パターン化基材は、静的（例えば、組織培養プレート）及び流体フローリアクターシステム（例えば、マイクロ流体デバイス）を含む任意の培養システムで使用できる。このようなマイクロ流体デバイスは、小さい流速及び少ない試薬量が必要な場合の薬剤の迅速スクリーニングに有用である。マイクロ流体デバイスはまた、神経分化に指示または影響を与えることができる転写因子又は他の因子（例えば、神経組織の形態形成パターニングのためのモルフォゲン勾配を生成する薬剤）の一種以上の勾配への微細パターン化基材のインビトロ曝露のためにも有用である。別の態様では、従って、本開示は、生物工学による神経上皮組織をインビトロで得るために、本明細書で記載の微細パターン化基材を含むマイクロ流体技術装置を提供する。本明細書で使用される場合、「モルフォゲン」という用語は、神経の前駆細胞などの細胞の分化及び／又は増殖を誘導する分子又は分子の混合物を意味する。一実施形態では、モルフォゲンは、神経組織の分化のパターニングに影響を与え得る濃度勾配を介して空間的情報を提供する。いくつかの実施形態では、モルフォゲンは、拡散性タンパク質、サイトカイン、又は成長因子である。

得られた生物工学による神経上皮組織は、対応するインビボ発生中の臓器のものと類似のナノスケール又はマイクロスケール細胞構成を有し得る。本明細書で使用される場合、「マイクロスケール細胞構成」という用語は、生物模倣型３Ｄオルガノイドの細胞成分の構造構成（「細胞構造」としても知られる）は、マイクロスケールレベルの対応するインビボ組織に類似であり、１０００μｍ未満、より好ましくは１００μｍ未満のオーダーのサイズを意味する。

任意の好適な前駆細胞は、微細パターン化基材に播種するために使用できる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む多能性幹細胞（ＰＳＣ）を使用できる。生物工学による神経上皮管を作製するために、好適な前駆細胞は、分極神経ロゼット構造（例えば、ラミニン及びＮ－カドヘリンの偏光染色）を形成できるものであり、限定されないが、ｈＰＳＣ、神経幹細胞（ＮＳＣ）、又は神経・中胚葉前駆体（ＮＭＰ）が特に含まれる。

図７及び８を参照すると、いくつかの実施形態では、本明細書で記載される方法のために、得られた生物模倣型楕円形神経上皮組織の表面を覆うヒドロゲル物質を更に含むことが好都合であろう。この方式では、生物模倣型楕円形神経上皮組織は、微細パターン化基材からヒドロゲル中に封入された三次元構造体として離脱する。ヒドロゲルに包み込まれた生物工学による神経上皮管は、例えば、発生中のインビボ神経管に類似の３Ｄ構造を有する生物工学神経オルガノイドを含む、様々な用途に有用である。ヒドロゲルに包み込まれた生物工学による神経上皮管は、拡大バイオリアクター培養又は限定されないが、固定、切片作成、免疫組織化学的検査（図８参照）、イメージング、及びインサイツハイブリダイゼーションを含むさらなる発生及び分析に適用可能である。いくつかの実施形態では、表面を被覆方法は、本開示の方法により得られた生物模倣型楕円形神経上皮組織をヒドロゲル層で表面被覆すること；上に重ねて配置したヒドロゲル層を含む組織を約２０～５２時間（例えば、約２０、２２、２４、２６、２８、４８、５０又は５２時間）にわたり培養することを含み、それにより、生物模倣型楕円形神経上皮組織は、ヒドロゲル層中に包み込まれて、安定な生物工学による神経上皮管が得られる。いくつかの実施形態では、包み込まれた生物工学による神経上皮管を含むヒドロゲルは、その後の使用又は分析のために、微細パターン化基材から取り出される。本開示は、ヒドロゲル表面被覆のためにマトリゲルを使って例示するが、限定されないが、商業的に入手できるマトリゲル基材に対する既知組成の代替物を含む任意の柔軟なヒドロゲルが使用できることは理解されよう。

いくつかの実施形態では、取り外された生物工学による神経上皮管を含むヒドロゲルを固定又は凍結することは、組織又は顕微鏡観察のためには好都合であり得る。例えば、取り外された生物工学による神経上皮管を含むヒドロゲルは、定型的方法を用いて切片作成するためにホルマリン又はパラホルムアルデヒド中で固定できる。必要に応じ、組織を除去して、透明にし、光ベース顕微鏡を用いた画像処理をより適用し易くできる。特に、ライトシートイメージング及び走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、生物工学による神経上皮管中の分極を検出及び分析するために有用である。例示的実施形態では、共焦点又はライトシート顕微鏡は、本発明の方法に従って作製された生物工学による神経上皮管の全体を通して細胞型の分布を明らかにできる。いくつかの実施形態では、共焦点又はライトシート顕微鏡により得られた画像の三次元アセンブリを用いて、種々の細胞及びその中の構造の分布及び構成が分析される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するための神経幹細胞は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の誘導分化により得られる。本明細書で使用するために好適な多能性細胞には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒトｉＰＳＣが挙げられる。これらの細胞は、Ｏｃｔ－４、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０及びＴＲＡ－１－８１を発現し、高い核対細胞質比率及び重要な核小体を有するコンパクトコロニーとして現れる。ＥＳＣは、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給源から商業的に入手できる。本明細書で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳ細胞」は、それらそれぞれの元の分化体細胞に対し変わることができる、特定のセットの効力決定因子に対して変わることができる、及びそれらを単離するために使用される培養条件に対して変わることができるが、それにもかかわらず、それらそれぞれの分化した元の体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、本明細書で記載のＥＳＣなどの、より強力な細胞に類似の特性を示す、多能性細胞又は多能性細胞集団を意味する。例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７－１９２０を参照されたい。本開示は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。

誘導多能性幹細胞は、ＥＳＣと類似の形態学的特性（例えば、丸い形状、大きな核小体及びわずかな細胞質）及び成長特性（例えば、約１７～１８時間の倍加時間）を示す。加えて、ｉＰＳ細胞は、多能性細胞特異的マーカー（例えば、Ｏｃｔ－４、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０又はＴｒａ－１－８１を発現するが、ＳＳＥＡ－１は発現しない）を発現する。しかし、誘導多能性幹細胞は、胚芽から直接に誘導されない。本明細書で使用される場合、「胚芽から直接に誘導されない」は、ｉＰＳ細胞を作製するための出発細胞型は、多能性細胞などの非多能性細胞、又は体細胞などであり、出生後の個体から得られる体細胞などの最終分化細胞であることを意味する。

ヒトｉＰＳ細胞を、本明細書で記載の方法に従って使用して、特定のヒト対象の遺伝的相補体を有する原始マクロファージ及びミクログリア細胞を得ることができる。例えば、特定の哺乳動物対象の特定の疾患又は障害に付随する又はそれから生じた一種以上の特定の表現型を示す生物模倣型楕円形神経上皮組織を得ることは好都合であり得る。このような実施形態では、ｉＰＳ細胞は、当該技術分野において既知の方法に従って特定のヒト対象の体細胞をリプログラミングすることにより得られる。例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４：７９７－８０１；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８（５）：４２４－９；Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎａｔｕｒｅ ４５７：２７７－８０；Ｈｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０８（１６）：６５３７－４２を参照されたい。これらの文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。

播種前に、ｈＰＳＣ（例えば、ｈＥＳＣ又はｈｉＰＳＣ）がフィーダー層（例えば、線維芽細胞層）の非存在下、ｈＰＳＣの増殖に好適する基材、例えば、マトリゲル（商標）、ビトロネクチン、ビトロネクチンフラグメント、又はビトロネクチンペプチド、又はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）上で培養できる。特定の実施形態では、ｈＰＳＣは、フィーダー層の非存在下で、少なくとも１回～少なくとも約５回継代培養される。好適なｈＰＳＣの継代及び維持用培地には、限定されないが、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．からＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８として、又はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＴｅＳＲ－Ｅ８として入手可能な、ｍＴｅＳＲ（登録商標）及びＥ８（商標）培地が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｈＰＳＣは、ゼノフリー状態下で維持及び継代培養され、細胞培地は、Ｅ８又はｍＴｅＳＲなどの合成培地であるが、細胞は、ビトロネクチン又はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）（又は別のタイプの自己コーティング基材）などの完全に明確なゼノフリー基材上で維持される。特定の実施形態では、ｈＰＳＣは、Ｅ８培地中、ビトロネクチン、ビトロネクチンフラグメント、又はビトロネクチンペプチド又はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）などの自己コーティング基材上で維持及び継代培養される。

特定の実施形態では、培養プレート中の接着単層中で培養された多能性幹細胞は、微細パターン化表面上に継代培養され、その後、明確な組成の多能性維持培地中で約１～２日間の第１の培養期間にわたり培養され、続けて、ヒト多能性幹細胞の神経幹細胞への分化を支援する明確な組成の培地中で３日～約６日間の第２の培養期間にわたり培養され、それにより、ＰＡＸ６陽性神経幹細胞が得られる。
播種されると、ｈＰＳＣは、オルガノイドヘ分化させるために好適な分化培地中で培養できる。ｈＰＳＣ又は他の前駆細胞をオルガノイド組織へインビトロで分化させるための好適な培地状態は、当技術分野において既知である。一例では、培地は、ｈＰＳＣの設計された神経上皮管オルガノイドへの自己組織化及び自然発生的形態形成をインビトロで促進するために十分である。好適な培地には、例えば、神経分化培地が挙げられる。好ましくは、細胞を播種されたヒドロゲルは、十分な時間、例えば、少なくとも４日間、少なくとも６日間、少なくとも８日間、又は少なくとも１６日間にわたり培養され、３Ｄオルガノイド構造が形成される。本明細書で使用される場合、「神経分化培地」は、ヒト多能性幹細胞を神経系統、例えば、神経外胚葉及び神経上皮に向けた分化を促進及び支援できる培地を意味する。本明細書及び米国特許出願公開第２０１４／０１３４７３２号に記載のように、神経分化基本培地には、限定されないが、Ｅ６培地を挙げることができる。この特許出願公開は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、神経分化法で使用される神経分化培地は、「Ｅ４」培地であり、これは、水、塩、アミノ酸、ビタミン、炭素源、及び緩衝剤、更にセレン及びインスリンを含む基本培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又は本明細書で記載の類似の基本培地）から基本的になる。必要に応じ、神経分化培地はまた、アスコルベート（前記培地は、本明細書では、「Ｅ５」培地とも呼ばれる）も含み得る。いくつかの実施形態では、神経分化法で使用される神経分化培地は、「Ｅ６」培地であり、これは、炭酸塩緩衝Ｅ５培地＋トランスフェリンから基本的になる。

本明細書で使用される、「Ｅ６培地」及び「Ｅ６」という用語は、同じ意味で用いられ、インスリン（２０μｇ／ｍＬ）及び／又はトランスフェリン（１０．６７ｎｇ／ｍＬ）を更に含むように補充されたＤＦ３Ｓを含む又はそれから基本的になる合成培地を意味する。培地は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．８（４），４２４－４２９中の式に基づいて調製できる。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。類似の培地は、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．からＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６として、又はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＴｅＳＲ－Ｅ６として入手できる。本明細書で使用される場合、「Ｅ８培地」及び「Ｅ８」という用語は、同じ意味で用いられ、インスリン（２０μｇ／ｍＬ）及び／又はトランスフェリン（１０．６７ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＦＧＦ２（１００ｎｇ／ｍＬ）、及びヒトＴＧＦβ１（形質転換増殖因子β１）（１．７５ｎｇ／ｍＬ）の添加により補充されたＤＦ３Ｓを含む又はそれから基本的になる合成培地を意味する。培地は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，同上文献の式に基づいて調製できる。別の方法として、培地はまた、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．からＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８として、又はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＴｅＳＲ－Ｅ８として入手できる。

他の実施形態では、有用な培地は、前述の神経分化培地と少なくともと同じ成分を含むが、培地はＴＧＦβスーパーファミリーアゴニスト（例えば、Ｎｏｄａｌ）；アルブミン、及び少なくとも１種のプトレシン及びプロゲステロンを実質的に不含である。必要に応じ、繊維芽細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ２）も、培地に含めることができる。別の実施形態では、培地は、繊維芽細胞増殖因子を含まない。いくつかの実施形態では、レチノイン酸受容体アゴニストも含み、使われるレチノイドの濃度に応じて、特定の神経系統への神経分化を促進する。例示的な種類の好適なレチノイン酸受容体アゴニストは、レチノイド及びレチノイド類似体であり、これには、次記が挙げられる：オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、酢酸レチノール、ＥＣ２３（４－［２－（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル）エチニル）安息香酸；ＣＡＳ番号：１０４５６１－４１－３）、ＢＭＳ４５３（４－［（１Ｅ）－２－（５，６－ジヒドロ－５，５－ジメチル－８－フェニル－２－ナフタレニル）エチニル］－安息香酸；ＣＡＳ番号：１６６９７７－４３－１０）、フェンレチニド（Ｎ－（４－ヒドロキシフェニル）レチンアミド；ＣＡＳ番号：６５６４６－６８－６）、ＡＭ５８０（４－［（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸；ＣＡＳ番号：１０２１２１－６０－８）、タザロテン（６－［２－（３，４－ジヒドロ－４，４－ジメチル－２Ｈ－１－ベンゾチオピラン－６－イル）エチニル］－３－ピリジンカルボン酸エチルエステル；ＣＡＳ番号：１１８２９２－４０－３）、及びＴＴＮＰＢ（４－［（Ｅ）－２－（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル）－１－プロペニル］安息香酸；ＣＡＳ番号：７１４４１－２８－６）。使用可能な他の例示的レチノイン酸受容体アゴニストには、 次記が挙げられる：ＡＣ２６１０６６（４－［４－（２－ブトキシエトキシ－）－５－メチル－２－チアゾリル］－２－フルオロ安息香酸；ＣＡＳ番号：８７０７７３－７６－５）、ＡＣ５５６４９（４’－オクチル－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボン酸；ＣＡＳ番号：５９６６２－４９－６）、アダパレン（６－（４－メトキシ－３－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカ－１－イルフェニル）－２－ナフタレンカルボン酸；ＣＡＳ番号：１０６６８５－４０－９）、ＡＭ８０（４－［［（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル）アミノ］カルボニル］安息香酸；ＣＡＳ番号：９４４９７－５１－５）、ＢＭＳ７５３（４－［［（２，３－ジヒドロ－１，１，３，３－テトラメチル－２－オキソ－１Ｈ－インデン－５－イル）カルボニル］アミノ］安息香酸；ＣＡＳ番号：２１５３０７－８６－１）、ＢＭＳ９６１（３－フルオロ－４－［［２－ヒドロキシ－２－（５，５，８，８－テトラメチル－５，６，７，８－テトラヒドロ－２－ナフタレニル）アセチル］アミノ］－安息香酸；ＣＡＳ番号：１８５６２９－２２－５）、ＣＤ１５３０（４－（６－ヒドロキシ－７－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカ－１－イル－２－ナフタレニル）安息香酸；ＣＡＳ番号：１０７４３０－６６－０）、ＣＤ２３１４（５－（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－アントラセニル）－３－チオフェンカルボン酸；ＣＡＳ番号：１７０３５５－３７－０）、ＣＤ４３７（６－（４－ヒドロキシ－３－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカ－１－イルフェニル）－２－ナフタレンカルボン酸；ＣＡＳ番号：１２５３１６－６０－１）、及びＣｈ５５（４－［（１Ｅ）－３－［３，５－ビス（１，１－ジメチルエチル）フェニル］－３－オキソ－１－プロペニル］安息香酸；ＣＡＳ番号：１１０３６８－３３－７）。いくつかの実施形態では、レチノイン酸受容体アゴニスト（例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））の濃度は、約０．１μＭ～約１．０μＭである。レチノイン酸受容体アゴニストの好適な濃度は、約０．１μＭ～約２０μＭの範囲、例えば、約０．２μＭ、０．３μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、３．５μＭ、４．０μＭ、５μＭ、７μＭ、１０μＭ、１２μＭ、１５μＭ、１７μＭであり、又は別のＡＴＲＡの濃度は、約０．１μＭ～約２０μＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＡＴＲＡの濃度は、約３．０μＭである。

多能性幹細胞の神経幹細胞への誘導分化のための手引きは、「Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」という名称の米国特許出願第１３／７９５，４８５号、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｉｓｅ Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」という名称の米国特許出願第１４／４９６，７９６号及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ Ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｓｉｎｇｕｌａｒ Ｒｏｓｅｔｔｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」という名称の米国特許出願第１６／０４４，２３６号で見つけることができる。これらの特許出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

心管又は腸上皮管を形成することができる好適な前駆細胞及び培養条件は意図的に設計されている。例えば、心臓前駆細胞又は腸上皮前駆細胞は、微細パターン化基材上に播種され、上述のように、支持されたヒドロゲルをその上に配置できる。

本発明の方法により作製して得られた生物工学による神経上皮管は、対応するインビボ発生中の臓器のものと類似のマイクロスケール細胞構成を有する。例えば、生物工学による神経上皮管の場合、生物模倣型オルガノイドは、単一の近接し、分極した、いくつかの実施形態では、オルガノイドの長さの７５％に沿って伸びる、神経ロゼット構造（例えば、神経上皮管内のラミニン及びＮ－カドヘリン偏光染色により示されるように）を有する。いくつかの実施形態では、近接した分極神経ロゼット構造は、オルガノイドの長さの、少なくとも７５％、８０％、９０％、又は９９％伸長する。本明細書で使用される場合、「分極」という用語は、双極（又は三極もしくはそれ超の）形態を有する細胞を意味し、その中で、特定の細胞成分が細胞の２つ（例えば、頂端及び基底極）以上の極間で不均一に分布する。いくつかの実施形態では、分極細胞は、Ｎ－カドヘリンの発現に対して、頂底極性を示す神経上皮細胞である。例えば、Ｎ－カドヘリン焦点(foci)の頂端極性の存在は、神経ロゼット形成の代用マーカーである。分極神経上皮組織は、神経上皮管及び外表面上で神経上皮管を取り囲み、ヒドロゲルに接触している基底膜タンパク質のラミニンの中心に向いたコヒーレントカドヘリン環構造（Ｎ－カドヘリンの頂端局在化により形成される）の存在を特徴とする。図８の画像は、本開示の方法に従って調製された生物工学による神経上皮管の種々の免疫染色された横断切片を示す。基底緑色蛍光は、組織切片／染色のアーチファクトであり、各切片の中央内の頂端Ｎ－カドヘリン染色と同じではない。

本明細書で提供される方法は、効率的に及び確実に設計された生物模倣型楕円形神経上皮組織及び細長い組織全体に単一ロゼットを有する（管の断面でわかるように）生物工学による神経上皮管を作製するためのインビトロ法であり、設計された生物模倣型楕円形神経上皮組織は、発生中のヒト神経上皮管と類似するのマイクロスケール細胞構成（すなわち、細胞構造）を示す。設計された神経上皮組織との関連で使用される用語「生物模倣型」は、好ましくは、楕円形の管状、又は実質的に管状構造を有し、インビボ胚性神経上皮管（例えば、神経ロゼット様断面構造）又はその横断切片の解剖学的構造及び細胞構造に対し類似性を有する単一の細長い組織を意味する。本明細書で記載の生物模倣型楕円形神経上皮組織は、分極神経の細胞構造を模倣するインビトロ生成（例えば、設計された）組織又は管であり、分極ＮＳＣは、頂端Ｎ－カドヘリン発現及び胚性神経管の基底細胞外マトリックスタンパク質堆積を示す。本明細書で使用される場合、「実質的に管状」という用語は、構造が全体として管状配置を有するが、完全な円柱である必要がないことを意味する。いくつかの実施形態では、構造は、全体として楕円形又は円形断面形状を有する管状配置を有する。

いくつかの実施例では、本明細書で開示される方法は、好ましくは、分極ロゼット様断面構造を示し、分極ロゼット構造の細胞の少なくとも６０％がＰａｘ６⁺／Ｎ－カドヘリン⁺神経上皮細胞である、生物工学による神経上皮組織オルガノイドを生成し、生物工学による３Ｄ神経上皮組織の約７５％超が、発生中のヒト神経上皮管に匹敵する単一の近接ロゼット構造を示す。

多数の細胞型関連マーカーの発現（又はその欠如）を使用して、本明細書記載の方法の実施の間のｈＰＳＣ又はＮＭＰの神経幹細胞への分化を特徴付けることができる。例えば、ｈＰＳＣの多能性に関連するいくつかのマーカーの発現は、ｈＰＳＣの神経幹細胞への分化の間に低下する。このような多能性マーカーには、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、及びＴＲＡ－１－８１が挙げられる。神経・中胚葉前駆体（ＮＭＰ）は、次の発現プロファイルを有する：ＳＯＸ２⁺／ＯＣＴ４^-／Ｔ⁺／ＰＡＸ６^-。ＮＭＰの神経幹細胞又はニューロン細胞型への分化の間、これらのＮＭＰマーカー及び中胚葉又は内胚葉に関連する他のマーカー、例えば、Ｔ（ブラキュリ）及びＳＯＸ１７の発現も、同様に、時間と共に低下するか、又は存在しなくなる。逆に、神経幹細胞関連するマーカーの発現は、分化の間に増大する。神経幹細胞及び神経分化に好適なマーカー（ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの）には、限定されないが、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、ネスチン、Ｎ－カドヘリン、及びＳＯＸ１が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される分化法は、例えば、米国特許出願第１４／４９６，７９６号（あたかもその全体が記載されるかのように参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、培養細胞（例えば、培養ｈＰＳＣ）を、培養の約７２時間後に、培養ｈＰＳＣ細胞をＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達アゴニストに一過性に曝露することにより、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の一過性増大又は「ブースト」に曝露することを更に含む。いくつかの実施形態では、培養ＮＭＰ細胞は、培養の約７２時間後に（すなわち、微細パターン化基材上への播種後約７２時間）Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達「ブースト」に曝露される。当業者により理解されるように、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路に関与してβ－カテニン発現レベル又は活性、ＴＣＦ及びＬＥＦ発現レベル、又はβ－カテニン／ＴＣＦ／ＬＥＦ誘導転写活性を高める一種以上のタンパク質の機能を調節することにより活性化できる。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の活性化は、Ｇｓｋ３ホスホトランスフェラーゼ活性又はＧｓｋ３結合相互作用を阻害することにより達成される。理論に束縛されるものではないが、β－カテニンのＧｓｋ３リン酸化の阻害は、β－カテニンのトニック（tonic）分解を抑制し、それにより、β－カテニンレベル及び活性を高め、多能性幹細胞の分化を促進すると考えられている。Ｇｓｋ３阻害は、限定されないが、Ｇｓｋ３ホスホトランスフェラーゼ活性、Ｇｓｋ３のＲＮＡ干渉ノックダウン、及びドミナントネガティブ形態のＧｓｋ３の過剰発現を阻害する小分子を提供すること、を含む様々な方法で達成できる。ドミナントネガティブ形態のＧｓｋ３は、例えば、Ｒ９６Ａ変異を含むＧｓｋ３について記載するＨａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：２３３３０－２３３３５にあるように、当技術分野において既知である。この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、Ｇｓｋ３は、Ｇｓｋ３ホスホトランスフェラーゼ又はＧｓｋ３結合相互作用を抑制する小分子と細胞を接触させることにより阻害される。好適な小分子Ｇｓｋ３阻害剤には、限定されないが、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＢＩＯ－アセトキシム、ＢＩＯ、ＬｉＣｌ、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＡＲ Ａ０１４４１８、１－アザケンパウロン、ビス－７－インドリルマレイミド、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、及びＢＩＯ－アセトキシムのいずれかは、本明細書で記載の分化法において、多能性幹細胞中のＧｓｋ３を阻害するために使用される。一実施形態では、小分子Ｇｓｋ３阻害剤は、約３μＭ～約１２μＭの範囲、例えば、約３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１又は約３μＭ～約１２μＭの別の濃度のＣＨＩＲ９９０２１である。 別の実施形態では、小分子Ｇｓｋ３阻害剤は、約０．１μＭ～約１μＭの範囲、例えば、約０．１μＭ、約０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭの濃度のＣＨＩＲ９８０１４、約０．１μＭ～約１μＭの別の濃度のＣＨＩＲ９８０１４である。別の実施形態では、小分子Ｇｓｋ３阻害剤は、約０．１μＭ～約１μＭの範囲、例えば、約０．１μＭ、約０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭの濃度のＢＩＯ－アセトキシム、約０．１μＭ～約１μＭの別の濃度のＢＩＯ－アセトキシムである。

他の実施形態では、Ｇｓｋ３活性は、Ｇｓｋ３のＲＮＡ干渉ノックダウンにより阻害される。例えば、Ｇｓｋ３発現レベルは、商業的に入手できるＧｓｋ３に対するｓｉＲＮＡ、例えば、ＳｉｇｎａｌＳｉｌｅｎｃｅ（登録商標）ＧＳＫ－３α／β ｓｉＲＮＡ（カタログ＃６３０１ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標），Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡより）、又はＧｓｋ３のための誘導性発現カセットを有するレトロウイルスベクター、例えば、商業的に入手できるＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，カタログ番号６３０９２６）からのＴｅｔ－誘導性レトロウイルスＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）システム、又はＳｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）からのｃｕｍａｔｅ－誘導システム、例えば、ＳｐａｒＱ（登録商標）システム、カタログ番号ＱＭ２００ＰＡ－２、を用いてノックダウンできる。

他の実施形態では、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路は、過剰発現β－カテニンそれ自体、例えば、ヒトβ－カテニン（例示的ヌクレオチド及びアミノ酸配列アミノ酸配列は、それぞれ、ジェンバンク受入番号：Ｘ８７８３８及びＣＡＡ６１１０７．１で見つけられる）により活性化される。一実施形態では、β－カテニン過剰発現は、誘導性発現、例えば、前述の誘導性発現のいずれかを用いて、達成される。あるいは、常時活性型のβ－カテニンの安定化アイソフォームが使用され、これは、例えば、Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３（６）：５９９－６０９で記載のように、点変異Ｓ３３Ａ、Ｓ３７Ａ、Ｔ４１Ａ、及びＳ４５Ａを含む。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

更に他の実施形態では、多能性幹細胞におけるＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達経路活性化は、細胞を、β－カテニンと、β－カテニンとβ－カテニン破壊複合体のメンバーであるアキシンとの相互作用を破壊する薬剤とを接触させることにより達成される。アキシン／β－カテニン相互作用の破壊は、β－カテニンが破壊複合体による分解を回避することを可能にし、それにより、正味β－カテニンレベルを増大させて、β－カテニンシグナル伝達を促進する。例えば、アキシン／β－カテニン相互作用は、多能性細胞中で、細胞を化合物５－（フラン－２－イル）－Ｎ－（３－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）プロピル）－１，２－オキサゾール－３－カルボキサミド（「ＳＫＬ２００１」）（カタログ番号６８１６６７としてＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから商業的に入手できる）と接触させることにより、破壊できる。Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達を活性化するＳＫＬ２００１の有効濃度は、約１０μＭ～約１００μＭの範囲の濃度であり、約２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭの濃度、又は約１０μＭ～約１００μＭの範囲の別のＳＫＬ２００１の濃度である。

任意の適切な方法は、本明細書で提供される生物模倣型楕円形神経上皮組織の均一性又は特定の成分の存在又は非存在を確認するために使用できる。生物学的マーカーの存在又は非存在を検出する好適な方法は、当該技術分野において周知であり、限定されないが、ＲＮＡレベルで遺伝子発現を評価するための、免疫組織化学的検査、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ塩基配列決定、などが挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫組織化学的検査などの方法を使用して、生物模倣型楕円形神経上皮組織内の細胞型又は生体分子が検出及び特定される。例えば、全オルガノイド又はそれらの部分は、特異的分化マーカー用として免疫組織化学的検査により染色できる。いくつかの実施形態では、二重標識免疫蛍光法を実施して、個別のマーカータンパク質の相対発現を評価する、又は構築物内の複数前駆細胞又は分化細胞型を検出することは、好都合であろう。適切な一次及び二次抗体が既知であり、当該技術分野において活動している人に利用可能である。加えて、マイクロアレイ技術又は核酸塩基配列決定（例えば、ＲＮＡ塩基配列決定）を用いて、本発明の生物模倣型楕円形神経上皮組織の遺伝子発現プロファイルを得ることができる。神経上皮細胞のための生物学的マーカーには、例えば、Ｐａｘ６及びＮ－カドヘリンが挙げられる。タンパク質レベルでマーカーの発現を評価するための定量的方法は、当該技術分野において同様に既知である。例えば、フローサイトメトリーを用いて、所与の細胞集団中の目的の生物学的マーカーを発現している又は発現していない細胞の画分が決定される。

任意の適切な方法を使用して、本開示の方法に従って得られた、設計された神経上皮組織及び管の構造を解析できる。特定の実施形態では、分析方法は、生物工学による神経上皮組織又は管中の神経細胞（ニューロン）及びニューロン支持細胞（例えば、グリア）の存在を検出し、特定するために有用である。例えば、共焦点顕微鏡及び他の顕微鏡ベースイメージング方法を使用できる。このような実施形態では、共焦点顕微鏡を用いて、ヒト神経管の特定の発生段階に存在する種々の細胞型に対する特異性を有する検出可能なように標識された抗体又は染料で処理された生物模倣型楕円形神経上皮組織又は生物工学による神経上皮管神経上皮管複数画像の断面の複数の画像を収集できる以下の実施例で記載のように、Ｎ－カドヘリン発現を検出するために蛍光標識された生物模倣型楕円形神経上皮組織又は生物工学による神経上皮管の共焦点画像を得ることができる（図３、６、及び９）。例えば、生物模倣型楕円形神経上皮組織構成を検出及び分析するための例示的プロトコルは、６０Ｘ対物レンズを１０２４ｘ１０２４ピクセルで用いて、生物模倣型楕円形神経上皮組織又は生物工学による神経上皮管神経上皮管を通してユーザー定義の増分又は工程で走査して一種以上の（例えば、一連の画像）共焦点画像を取得すること、及び例えば、画像分類のために機械学習プログラムを使用して、多量の取得共焦点画像を分析し、細胞構造中に、又は細胞構造に隣接して存在する細胞型を検出することを含む。

誘導多能性幹細胞由来設計された生物模倣型楕円形神経上皮組織は、例えば、特定の遺伝的背景又は検出可能な表現型を有する個体中で神経の発生を反復する３Ｄ構造中の薬物応答のモデル化を可能にする。従って、対象特異的ヒトｉＰＳ細胞由来生物模倣型楕円形神経上皮組織は、既知の又は未知の薬物の神経発生／神経分化に与える変動する効果の一因となる遺伝的要因及びエピジェネティックな影響を特定するために有用である。

誘導多能性幹細胞へのリプログラミングのための患者特異的体細胞は、生検又は他の組織サンプリング法により目的の標的組織から得ることができるか、又は単離できる。いくつかの実施形態では、対象特定細胞は、本発明の神経上皮組織構築物中での使用の前にインビトロで操作される。例えば、対象特異的細胞は、微細パターン化基材上に播種する前に、増殖、分化、遺伝子改変、ポリペプチド、核酸又は他の因子への接触、凍結保存、あるいは、修飾して、本明細書で記載の生物工学による神経上皮組織を得ることができる。

合成培地の使用による培養条件の標準化は、細胞培養物中に細胞が曝露される物質のロット間又はバッチ間の変動の可能性を最小化する。従って、種々の分化因子の効果は、既知組成の条件下で培養された細胞及び組織に添加される場合、より高度に予測可能である。本明細書で使用される場合、「無血清」という用語は、動物（例えば、ウシ胎児）血液から得られた血清を不含又は実質的に不含である細胞培養物を意味する。一般に、動物由来物質の非存在下（すなわち、異種物質不含の条件下）での細胞又は組織の培養は、異種間ウイルス又はプリオン伝染の可能性を減らす又は除く。

本明細書で提供される生物模倣型楕円形神経上皮組織の用途には、限定されないが、インビボ神経管形成又はＣＮＳ発生を調節する用途に対する薬剤のインビトロスクリーニングが含まれる。例えば、インビトロ生成生物模倣型楕円形神経上皮組織は、候補薬剤の高スループットスクリーニングのために使用できる。生物模倣型楕円形神経上皮組織の標準化された再現可能な作製は、個別化された神経科学試験を行うための革命的な実験パラダイムを提供できる。例えば、神経上皮オルガノイド組織は、発生及びヒトＣＮＳ全域の機能に対する遺伝子変異の影響の試験、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来の神経幹細胞を用いた個別化された神経科学試験の実施、及び種々の薬剤の神経毒性又は神経の発生に与える他の影響の評価に有用である。いくつかの実施形態では、本発明の設計された神経上皮組織は、代謝安定性、薬物－薬物相互作用、毒性及び感染性疾患のためのスクリーニングを含む薬物の発見及び開発に有用である。例示的試験薬剤には、限定されないが、感染病原体、タンパク質、ペプチド、抗体、小分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド模倣体、細胞傷害薬、医薬品、及び生体異物（例えば、環境毒素、化学的／生物学的兵器剤、天然化合物、及び栄養補助食品）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の生物模倣型楕円形神経上皮組織は、神経管発生及びヒトＣＮＳの発生を調節する試薬を特定するためにスクリーニングできる。スクリーニング方法は、試験薬剤をインビトロ由来生物工学による神経上皮組織に対し接触させること；及び薬剤の生物工学による神経上皮組織に対する効果（例えば、生物模倣型楕円形神経上皮組織の発生又は生物模倣型楕円形神経上皮組織内の神経細胞型の分化を妨害するあるいは変える効果）を検出することを含む、又はそれから基本的になり得る。いくつかの実施形態では、スクリーニング法には、候補化合物をスクリーニングして、ヒトＣＮＳの発生を促進する試験薬剤を特定することが含まれる。他の実施形態では、候補化合物は、ヒト神経細胞型又は組織に対する毒性に関しスクリーニングできる。いくつかの実施形態では、検出は、このような細胞及び組織の形態又は寿命に与える薬剤の少なくとも１種の正の又は負の効果を検出することを含み、それにより、ヒト神経細胞型又は組織の寿命を伸ばす又は短くする薬剤、又はヒト神経細胞型又は組織の形態に対し正の又は負の影響を有する薬剤は、ヒト神経上皮管又は神経組織に発生に対する効果を有すると特定される。いくつかの実施形態では、検出は、限定されないが、ＲＮＡ塩基配列決定、遺伝子発現プロファイリング、トランスクリプトーム分析、細胞増殖アッセイ、メタボローム分析、レポーター又はセンサーの検出、タンパク質発現プロファイリング、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、代謝プロファイリング、及び微小透析を含む方法を実施することを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、遺伝子発現に対する効果に関しスクリーニングでき、検出は、未接触生物模倣型楕円形神経上皮組織と比べた差次的遺伝子発現をアッセイすることを含み得る。加えて、いくつかの実施形態では、本開示の生物模倣型楕円形神経上皮組織は、組織再生及び修復のための直接移植片として好適する。

例示的実施形態では、試験化合物の一種以上の生物模倣型楕円形神経上皮組織への曝露（例えば、接触）後の少なくとも１種の遺伝子の発現レベルの正又は負の変化を検出及び／又は測定することは、例えば、ＲＮＡ塩基配列決定を用いた、全トランスクリプトーム分析を含む。このような実施形態では、遺伝子発現は、例えば、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅ、ＲＳＥＭ（期待値最大化によるＲＮＡ－Ｓｅｑ）、Ｅｘｃｅｌ、及びＰｒｉｓｍなどのデータ処理ソフトウェアプログラムを用いて計算される。Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．９：ｅ１００２９３６（２０１３）を参照されたい。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。適切な場合には、統計の比較は、ＡＮＯＶＡ分析、ボンフェローニの補正を使った分散分析、又は両側スチューデントのｔ検定を用いて実施でき、値は、Ｐ＜０．０５で、優位性ありと判定される。任意の適切な方法を用いて、神経構築物からＲＮＡ又はタンパク質を単離できる。例えば、全ＲＮＡを単離し、逆転写して、塩基Ｈ決定のためのｃＤＮＡを得ることができる。
試験化合物は、例えば、本明細書で提供される一種以上の生物工学による神経上皮組織に接触させる前に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの溶媒中に溶解できる。いくつかの実施形態では、薬剤の特定は、接触生物工学による神経上皮組織の、限定されないが、遺伝子発現、タンパク質発現、細胞生存率、及び細胞増殖を含む生物活性の正又は負の変化を分析することを含む。例えば、マイクロアレイ法を用いて、複数の試験化合物を生物工学による神経上皮組織に接触させる前、接触の間、又は接触後に、遺伝子発現プロファイルを解析できる。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、代謝アッセイ及びタンパク質発現プロファイリングなどの追加の分析を更に含む。

別の態様では、本明細書で提供されるのは、インビトロ生物模倣型楕円形神経上皮組織又は生物工学による神経上皮管を得るために有用な一種以上の成分を含む細胞培養基材である。細胞培養基材の成分には、本明細書で記載の一種以上の微細パターン化基材を含むことができる。細胞培養基材は、組織培養皿、ウェルプレート（例えば、マルチウェルプレート）、マイクロ流体装置、又は一種以上の微細パターン化基材上で細胞を培養し、インビトロ生物模倣型神経上皮組織を得るために好適な任意の他の基材であってよい。

別の態様では、本明細書で提供されるのは、インビトロ生物模倣型神経上皮組織又は生物工学による神経上皮管を得るために有用な一種以上の成分を含むキットである。キットの成分には、本明細書で記載の一種以上の微細パターン化基材を含むことができる。キットはまた、合成培地及び一種以上の培地添加物（例えば、成長因子、小分子化合物、培地補充物質）も含むことができる。キットは、微細パターン化基材の播種に有用な前駆細胞及び細胞播種及び培養のための説明書を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の一種以上の微細パターン化基材及び更に神経上皮組織を分化させて様々な種類の神経細胞（ニューロン）を得るために有用な一種以上の薬剤（例えば、成長因子、小分子薬剤、モルフォゲン勾配を作成するための薬剤）をキットに含めることは好都合であろう。このような実施形態では、キットはまた、例えば、所定の方式でパターニング薬剤を生物工学による神経上皮組織に送るために、マイクロ流体技術装置又はその構成要素を含めることも可能である。いくつかの実施形態では、キットは、生物模倣型楕円形神経上皮組織上を覆って、本開示の方法により包み込まれた生物工学による神経上皮管を得るために使用するヒドロゲルを更に含む。
本発明は、以下の非限定的な実施例を考慮することにより完全に理解されるであろう。

実施例
この実施例は、組織の長さにわたる単一分極ロゼット構造を含む生物模倣型楕円形神経上皮組織のインビトロ作製を示す（図３、４、５、及び６を参照）。図８に示すように、それから作製された生物工学による神経上皮管の断面は、組織の長さにわたる分極Ｎ－カドヘリン発現細胞のよく組織された単一神経ロゼットを示した。

材料及び方法
微細パターン化アレイ基材の作製：微細パターン化アレイ細胞培養基材は、当該技術分野において既知の方法の組み合わせを用いて作製された（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５１：５２３８－２４１；Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １４：３２９４－３３０３、これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ポストとマイクロウェル機構のアレイを備えたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スタンプをシリコンウエハのレリーフモールドとして生成した（図 １）。ウェハをオートキャドで設計し、ＦｌｏｗＪＥＭ（ｆｌｏｗｊｅｍ．ｃｏｍで利用可能）から購入した。ＰＤＭＳスタンプをω－メルカプトウンデシルブロモイソブチレート（１００％エタノール中の２ｍＭ）でコートし、不活性ガス下で乾燥した後、３０ｎｍのチタン（Ｔｉ）の上に１８０ｎｍの金（Ａｕ）でコートしたカバーガラスと等角接触させた。次に、微細パターン化スライドを１００％エタノール中で１０分間インキュベートした後、窒素下で乾燥し、減圧下でシュレンクフラスコに移した。ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧ－ＭＥＭＡ）マクロモノマー（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の水、メタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから得た）、銅（ＩＩ）臭化物（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２’，２’－ビピリジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）との溶液を、脱気して、反応フラスコに移した。ＰＥＧ高分子の表面開始原子移動ラジカル重合（ＳＩ－ＡＴＲＰ）を、脱イオン水中のＬ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の反応フラスコへの注入により開始した。ＡＴＲＰを室温で１６時間継続させ、微細パターン化ＰＥＧブラシを生成した。重合を空気の添加により終止させ、続けて、エタノールと水で濯いだ後、不活性ガス中で乾燥させた。無菌フード中で、基材を無菌ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で５回濯ぎ、１２ウェル組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）プレートの個別ウェルに移し、そこで、それらは、３７℃の一晩のインキュベーションを介して、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中の０．０８３ｍｇ／ｍＬのマトリゲル（ＷｉＣｅｌｌ）の吸着により細胞接着性にされた（図２）。

神経上皮管を含む単一融合神経ロゼット組織及び神経上皮組織の生成を示す結果は、以下で詳細に、及び以下に提供されるように、対応する図２～８で記載される。
微細パターン化前脳神経上皮組織の生成：ＷＡ０９（Ｈ９）ｈＥＳＣは、ＷｉＣｅｌｌから取得し、ＷｉＣｅｌｌにより核型正常（ｋａｒｙｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｎｏｒｍａｌ）であると立証され、マイコプラズマ試験で陰性であった。全ての多能性株は、マトリゲルコートプレート上のＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｅ８）中で維持され、Ｖｅｒｓｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて通常の方法で１０回継代培養された。ｈＰＳＣからのＮＥＣ誘導を、Ｅ６プロトコル（Ｌｉｐｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３２：１０３２－１０４２、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に従って実施した。ｈＰＳＣ由来微細パターン化組織を生成するために、約８５％集密度のｈＰＳＣ培養物をＰＢＳで濯ぎ、アクターゼを用いて３７℃で５分間解離させ、１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により収集した（図２～３）。次に，単細胞化したｈＰＳＣを１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤と共にＥ８培地に懸濁し、微細パターン化基材上に、１２ウェルプレートのウェル当り２ｍＬの培地中に１６５，０００細胞／ｃｍ²で播種した。次の日、培地を２ｍＬのＥ６培地と置換し、その後、５０％の培地交換を毎日実施した（図４）。５日目までに、微細パターン化神経組織融合が微細パターン化アレイ上の全横列に及んだ（図５）。５０μｍのエッジ間距離及びブリッジで分離された円形微細パターンは、微細パターン化アレイの全横列にわたり単一Ｎ－カドヘリン⁺ロゼット分極化を有する近接融合組織を形成し、頂端面Ｎ－カドヘリン発現を培養の５日間にわたり有する三次元管を形成し始めた（図６）。

微細パターン化前脳神経上皮組織のマトリゲル包み込み：組織融合及びロゼット整列時に（５又は６日目）、７５０μＬの神経上皮組織培地をＰ１０００マイクロピペットの使用で取り出し、４℃で７５０μＬのマトリゲルで置換した（図７）。その後、３７℃で２０分間インキュベートすることにより、マトリゲルのゲル化を行った（図７）。ゲル化すると、１ｍＬのＥ６培地を各ウェル中にピペットで移し、インキュベーター中に戻した。次の日、無菌鉗子を用いて、マトリゲル層を組織培養プレートの壁から剥離させた（図８）。新しいＥ６培地をピペット操作でゲルの下に入れ、マトリゲル層を微細パターン化基材から分離させた（図８）。その後、基材をピンセットで静かに除去し、廃棄した。５０％のＥ６培地交換をその後毎日、目的の実験時点まで実施した（図８）。

本発明を、現在最も実用的で、特有の実施形態であると考えれられるものに関連して記載してきた。しかし、本発明は、例示として提示されたものであり、開示実施形態に限定されることを意図するものではない。従って、当業者は、本発明が、添付請求項で記載の本発明の趣旨及び範囲内で、全ての変形例及び代替配置を包含することを意図していることを理解するであろう。

Claims (29)

1. インビトロで単一ロゼット構造を有する生物模倣型楕円形神経上皮組織を製造する方法であって、
   （ａ）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、その上で培養される細胞の生物模倣型神経形態形成ができる微細パターン化基材上に播種する工程であって、前記微細パターン化基材が細胞接着ブリッジにより連結された少なくとも２つの円形有界領域を含む工程と、
   （ｂ）工程（ａ）の前記播種細胞を前記微細パターン化基材上で多能性維持培地の存在下、約１～２日間の第１の培養期間にわたり培養して、第１の細胞凝集体を得る工程であって、前記多能性維持培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む工程と、
   （ｃ）工程（ｂ）で得られた前記細胞を、接着培養条件下で約３～約６日間の第２の培養期間にわたり、神経分化基本培地中で培養する工程と、
   を有し、それにより、単一ロゼット構造を有する生物模倣型楕円形神経上皮組織が得られ、前記組織が、分極神経上皮細胞を含み、インビボ発生ヒト神経管の横断切片と類似するのマイクロスケール細胞構成を有することを特徴とする方法。
2. 前記少なくとも２つの円形有界領域のそれぞれが、約１００μｍ～約３００μｍの直径を有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞接着ブリッジが、約２５μｍ～約１２５μｍの長さを有し、約１０μｍ～約５０μｍの幅を有する、請求項１に記載の方法。
4. 前記細胞接着ブリッジが、約５０μｍ～約１００μｍの長さを有し、約２５μｍの幅を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記ｈＰＳＣが、約７５ｘ１０³細胞／ｃｍ²～約２．５ｘ１０⁵細胞／ｃｍ²の密度で前記微細パターン化基材上に播種される、請求項１に記載の方法。
6. ｈＰＳＣが、約１６５，０００細胞／ｃｍ²の密度で前記微細パターン化基材上に播種される、請求項５に記載の方法。
7. 前記多能性維持培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、アスコルビン酸、重炭酸ナトリウム、セレン、インスリン、トランスフェリン、ＦＧＦ２、及びＴＧＦβ１を含む合成培地である、請求項１に記載の方法。
8. 前記多能性維持培地が、Ｅ８培地である、請求項１に記載の方法。
9. 前記神経分化基本培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２、アスコルビン酸、重炭酸ナトリウム、セレン、インスリン、及びトランスフェリンを含む合成培地である、請求項１に記載の方法。
10. 前記神経分化基本培地が、Ｅ６培地である、請求項１に記載の方法。
11. 前記神経分化基本培地が、β－カテニン経路シグナル伝達の活性化剤を含む又は含まない、ＦＧＦの一種以上を更に含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＦＧＦが、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８ａ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ｆ、ＦＧＦ１７、又はＦＧＦ１８である、請求項１１に記載の方法。
13. β－カテニン経路シグナル伝達の前記活性化剤が、ＧＳＫ３キナーゼ阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記ＧＳＫ３キナーゼ阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記神経分化基本培地が、約１００ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ８ｂ及び約３μＭ～約９μＭのＣＨＩＲ９９０２１を更に含む請求項９に記載の方法。
16. 前記第２の培養期間が、約５日間である、請求項１に記載の方法。
17. 前記微細パターン化基材上にプレーティングの約２４～７２時間後に、前記微細パターン化基材上の細胞をＷｎｔ／β－カテニンシグナル伝達の活性化剤に一過性に曝露することを更に含む、請求項１に記載の方法。
18. 細胞を前記微細パターン化基材上に播種の約２４～７２時間後に、前記播種細胞をＲＡ及びソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）又はＳＨＨシグナル伝達アゴニストに約１～約５日間にわたり曝露することを更に含み、それにより、前記ロゼット構造が、Ｏｌｉｇ２⁺運動ニューロン前駆細胞（ｐＭＮ）を含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記微細パターン化基材が、ユーザー定義の有界幾何に配置された単一又は複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ブラシ又はペプチド固定化ＰＥＧブラシを含む、請求項１に記載の方法。
20. ヒドロゲル層で請求項１に記載の工程（ｃ）で得られた前記神経上皮組織の表面を覆う工程、及び
    前記ヒドロゲル層を含む神経上皮組織を約２４時間にわたり培養し、それにより、前記組織を生物工学による神経上皮管に変え、前記ヒドロゲル層で包み込む工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
21. 前記包み込まれた生物工学による神経上皮管を含む前記ヒドロゲルを前記微細パターン化基材から取り出す工程を更に含む、請求項２０に記載の方法。
22. 分析のために、前記取り出されたヒドロゲルを固定し、切片化する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ヒドロゲルが、マトリゲルである、請求項２０に記載の方法。
24. 前記組織が、分極神経上皮細胞の単一ロゼットを含み、インビボ発生中のヒト神経管の横断切片と類似するマイクロスケール細胞構成を有する、請求項１に記載の方法により得られるインビトロ生物工学による神経上皮組織。
25. 分極神経上皮の単一ロゼットを含み、インビボ発生中のヒト神経管と類似するのマイクロスケール細胞構成を有する、請求項２０に記載の方法により得られるインビトロ生物工学による神経上皮管。
26. 微細パターン化基材であって、その上で培養される細胞の生物模倣型神経形態形成を指示できる一種以上の微細パターン化基材を含む組成物であって、前記一種以上の微細パターン化基材が、細胞接着ブリッジにより連結された少なくとも２つの円形細胞接着性マイクロスケール領域を含む、組成物。
27. 請求項２６に記載の組成物を含み、１種以上の前駆細胞のバイアル、多能性基本培地、神経分化基本培地、マイクロ流体装置、及びモルフォゲン勾配を作製する試薬を更に含む、キット。
28. インビトロで生物工学による神経上皮管を製造する方法であって、
    （ａ）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の存在下で、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を、その上で培養される細胞の生物模倣型神経形態形成ができる微細パターン化基材上に播種する工程であって、前記微細パターン化基材が、細胞接着ブリッジにより連結された少なくとも２つの円形有界領域を含む工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の前記播種細胞を前記微細パターン化基材上で多能性維持培地の存在下、約１～２日間の第１の培養期間にわたり培養し、第１の細胞凝集体を得る工程であって、前記多能性維持培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を含む工程と、
    （ｃ）工程（ｂ）で得られた前記細胞を、接着培養条件下で約３～約６日間の第２の培養期間にわたり、神経分化基本培地中で培養し、それにより、生物工学による神経上皮組織を得る工程と、
    （ｄ）ヒドロゲル層で、工程（ｃ）で得られた前記生物工学による神経上皮組織の表面を覆う工程と、
    （ｅ）工程（ｄ）の生物工学による神経上皮組織を約２４時間にわたり培養し、それにより、前記組織を生物工学による神経上皮管に変え、前記ヒドロゲル層で包み込む工程と、
    （ｆ）前記包み込まれた神経上皮管を含む前記ヒドロゲルを前記微細パターン化基材から取り出して生物工学による神経上皮管を得る工程、
    を含むことを特徴とする方法。
29. 分極神経上皮の単一ロゼットを含み、インビボ発生ヒト神経管と類似するのマイクロスケール細胞構成を有する、請求項２８に記載の方法により得られるインビトロ生物工学による神経上皮管。