JP2023552374A - 操作されたクラス２ ｖ型ｃｒｉｓｐｒシステム - Google Patents

操作されたクラス２ ｖ型ｃｒｉｓｐｒシステム Download PDF

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Abstract

本明細書において、標的核酸の編集に有用な操作されたクラス２、Ｖ型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが提供される。核酸を改変するために、そのようなバリアントを作製及び使用する方法も提供される。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６３／１２１，１９６号、２０２１年３月１７日に出願された同第６３／１６２，３４６号、及び２０２１年６月９日に出願された同第６３／２０８，８５５号の優先権を主張し、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
配列表の参照による援用
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に援用される：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＳＣＲＢ＿０３１＿０３ＷＯ＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５、記録日：２０２１年１２月１日、ファイルサイズ：５．６１メガバイト）。
細菌及び古細菌のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ファージ及びウイルスに対する獲得免疫の形態を付与する。過去１０年間にわたる集中的な研究により、これらのシステムの生化学が明らかになった。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、外来ＤＮＡ又はＲＮＡの獲得、標的化、及び切断に関与するＣａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質をそれらの標的に誘導する短いスペーサー配列に隣接する直列反復を含むＣＲＩＳＰＲアレイと、からなる。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、ＲＮＡに結合した単一のＣａｓタンパク質が標的配列への結合及びその切断に関与する合理化されたバージョンである。これらの最小システムのプログラム可能な性質は、ゲノム操作の分野に大変革をもたらす多用途技術としてのそれらの使用を容易にした。
今日まで、広く使用されてきたクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはごく少数しか発見されていない。これらのうち、Ｖ型は、Ｃａｓ９によって認識される３’ＰＡＭ配列とは異なる５’ＰＡＭ配列を認識し、５、７、又は１０ｎｔの５’オーバーハングを有する標的核酸において互い違いの切断を形成する、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼ（ＲｕｖＣ）ドメインを利用するという点で独特である（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＡＭ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ Ｃ２ｃ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ １６７：１８１４（２０１６））。しかしながら、Ｖ型の野生型Ｃａｓ及びガイド配列は、低い編集効率を有する。したがって、当該技術分野では、様々な治療用途、診断用途、及び研究用途における利用のために、最適化された、かつ／又は以前の世代のシステムを上回る改善を提供する、更なるクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの組み合わせ）が必要とされている。
本開示は、真核細胞において遺伝子の標的核酸を改変するために使用される、ガイドリボ核酸（guide ribonucleic acid、ｇＲＮＡ）、操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、並びに操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）のシステムに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸのドメインに対して１つ以上の改変を含み、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して１つ以上の改善された特徴を示す、操作されたクラス２、Ｖ型タンパク質を提供する。他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ４９１（配列番号３３６）又はＣａｓＸ５１５（配列番号４１６）などのＣａｓＸバリアントタンパク質の操作された配列バリアントを提供し、クラス２、Ｖ型タンパク質は、ＣａｓＸバリアントのドメインに対して少なくとも１つの改変を含み、ＣａｓＸバリアントタンパク質と比較して１つ以上の改善された特徴を示す。いくつかの実施形態では、クラス２、Ｖ型バリアントは、ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）と複合体を形成することができ、複合体は、標的核酸に結合及び切断することができ、標的核酸は、非標的鎖及び標的鎖を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、クラス２、Ｖ型バリアントタンパク質に結合することができる、シングルガイド組成物を含むガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）を提供し、ｇＲＮＡは、配列番号２２３８又は配列番号２２３９のｇＲＮＡと比較して、ある領域に少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの足場の改変領域は、（ａ）伸長ステムループと、（ｂ）足場ステムループと、（ｃ）三重鎖と、（ｄ）シュードノットと、を含む。場合によっては、バリアントｇＲＮＡの足場伸長ステムは、バブルに対する改変を更に含む。他の場合では、ｇＲＮＡの足場は、三重鎖ループ領域に対する改変を更に含む。他の場合には、バリアントｇＲＮＡの足場は、ヘアピン配列を含む伸長ステム中に異種ＲＮＡを更に含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかの操作されたクラス２、Ｖ型タンパク質及びｇＲＮＡバリアントを含む遺伝子編集ペアを提供し、遺伝子編集ペアが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡを含む遺伝子編集ペアと比較して、少なくとも１つの改善された特徴を示す。特定の実施形態では、操作されたクラス２、Ｖ型タンパク質は、表３に示される配列番号２４７～５９２及び１１４７～１２３１の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含み、ｇＲＮＡは、表２に示される配列番号２１０１～２３３２及び２３５３～２３９８の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列である。特定の実施形態では、操作されたクラス２、Ｖ型タンパク質は、配列番号２７０～５９２及び１１４７～１２３１の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含み、ｇＲＮＡは、配列番号２２３８～２３３２及び２３５３～２３９８の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列である。特定の実施形態では、操作されたクラス２、Ｖ型タンパク質は、配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含み、ｇＲＮＡは、配列番号２２８１～２３３２及び２３５３～２３９８の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の操作されたクラス２、Ｖ型バリアントタンパク質、ｇＲＮＡバリアント、及び遺伝子編集ペアをコードするポリヌクレオチド及びベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（Adeno-Associated Viral、ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターである。他の実施形態では、ベクターは、遺伝子編集ペアのＲＮＰを含むＸＤＰと呼ばれるＣａｓＸ送達粒子である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、操作されたクラス２、Ｖ型タンパク質及びｇＲＮＡを含む細胞を提供する。他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の編集の実施形態の方法によって編集された標的核酸を含む細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、操作されたクラス２、Ｖ型タンパク質、ｇＲＮＡ、及び遺伝子編集ペアを含むキットを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、標的核酸を編集する方法を提供し、標的核酸を、本明細書に記載のクラス２、Ｖ型タンパク質及びｇＲＮＡバリアントと接触させることを含み、接触させることが、標的核酸の編集又は改変をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞集団における標的核酸を編集する、方法を提供し、細胞を、本明細書に記載の遺伝子編集ペアのうちの１つ以上と接触させることを含み、接触させることが、細胞集団における標的核酸の編集又は修飾をもたらす。
他の実施形態では、本開示は、治療を必要とする対象の治療方法を提供し、本明細書に記載の実施形態のいずれかの遺伝子編集ペア、又は遺伝子編集ペアを含む若しくはコードするベクターの投与を含む。
別の態様では、医薬品として使用するための、遺伝子編集ペア、遺伝子編集ペアを含む組成物、又は遺伝子編集ペアを含む若しくはコードするベクターが本明細書に提供される。
別の態様では、治療方法で使用するための、遺伝子編集ペア、遺伝子編集ペアを含む組成物、又は遺伝子編集ペアを含む若しくはコードするベクターが本明細書に提供され、本方法は、標的核酸を編集又は修飾することを含み、任意選択的に、編集が、遺伝子のアレルに変異を有する対象において行われ、変異が、対象において疾患又は障害を引き起こし、好ましくは、編集が、変異を遺伝子の野生型アレルに変化させるか、又は対象において疾患若しくは障害を引き起こす遺伝子のアレルをノックダウン若しくはノックアウトする。
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアント、並びにそれらを送達する方法を開示する国際公開第２０２０／２４７８８２号、国際公開第２０２０／２４７８８３号、及び国際公開第２０２１／１１３７７２号の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
添付の特許請求の範囲に本発明の新規特徴を詳細に示す。本発明の原理を利用する例示的な実施形態について示す以下の詳細な説明、並びに添付の図面を参照することによって、本発明の特徴及び利点がより良く理解されるであろう。
実施例８に記載されるように、ｓｇＲＮＡ１７４（配列番号２２３８）並びにＣａｓＸバリアント１１９、４５７、４８８、及び４９１によって形成されたＲＮＰの活性画分を定量化するためのアッセイの結果のグラフである。ｓｇＲＮＡ及びＣａｓＸバリアントに対応する配列を、それぞれ表２及び表３に提供する。等モル量のＲＮＰ及び標的を共インキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた複製物の二相適合を示す。「２」は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質を指す。 実施例８に記載されるように、ＣａｓＸ２（配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質）及び改変ｓｇＲＮＡによって形成されたＲＮＰの活性画分の定量化を示す。等モル量のＲＮＰ及び標的を共インキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた複製物の二相適合を示す。 実施例８に記載されるように、ガイド制限条件下でＣａｓＸ４９１及び改変ｓｇＲＮＡによって形成されたＲＮＰの活性画分の定量化を示す。等モル量のＲＮＰ及び標的を共インキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。データの二相適合を示す。 実施例８に記載されるように、ｓｇＲＮＡ１７４及びＣａｓＸバリアントによって形成されたＲＮＰの切断速度の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰとインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一の反復が示される４８８及び４９１を除いて、３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた反復の単相適合を示す。 実施例８に記載されるように、ＣａｓＸ２及びｓｇＲＮＡバリアントによって形成されたＲＮＰの切断速度の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰとインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた反復の単相適合を示す。 実施例８に記載されるように、ＣａｓＸ２及びｓｇＲＮＡバリアントによって形成されたＲＮＰの初速度の定量化を示す。先の切断実験の最初の２つの時点を線形モデルに適合して、切断初速度を決定した。 実施例８に記載されるように、ＣａｓＸ４９１及びｓｇＲＮＡバリアントによって形成されたＲＮＰの切断速度の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰと１０℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。時点の単相適合を示す。 実施例８に記載されるように、等モル量の示されたＲＮＰ及び相補標的を使用して、ｇＲＮＡ ２と複合体化した参照ＣａｓＸ ２のＲＮＰと比較した、ｇＲＮＡバリアント１７４と複合体化したＣａｓＸバリアント５１５及び５２６のＲＮＰのコンピテント画分の定量化を示す。各時間経過又は組み合わせた複製のセットについての二相適合を示す。 実施例８に記載されるように、２０倍過剰の示されたＲＮＰを使用して、ｇＲＮＡ ２と複合体化した参照ＣａｓＸ ２のＲＮＰと比較した、ｇＲＮＡバリアント１７４と複合体化したＣａｓＸバリアント５１５及び５２６のＲＮＰの切断速度の定量化を示す。 実施例５に記載されるように、ＴＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアントの切断速度の定量化を示す。同一のスペーサー及び示されたＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡ基質を、２０倍過剰の示されたＲＮＰと３７℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一反復の単相適合を示す。 実施例５に記載されるように、ＣＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアントの切断速度の定量化を示す。同一のスペーサー及び示されたＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡ基質を、２０倍過剰の示されたＲＮＰと３７℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一反復の単相適合を示す。 実施例５に記載されるように、ＧＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアントの切断速度の定量化を示す。同一のスペーサー及び示されたＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡ基質を、２０倍過剰の示されたＲＮＰと３７℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一反復の単相適合を示す。 実施例５に記載されるように、ＡＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアントの切断速度の定量化を示す。同一のスペーサー及び示されたＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡ基質を、２０倍過剰の示されたＲＮＰと３７℃でインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。単一反復の単相適合を示す。 実施例５に記載されるように、ＮＴＣ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアント４９１及びガイド１７４のＲＮＰの切断速度の定量化を示す。時点を、２分間にわたって取得し、切断された画分を各標的及び時点についてグラフ化したが、明確にするために、時間経過の最初の２分間のみを示す。 実施例５に記載されるように、ＮＴＴ ＰＡＭに対するＣａｓＸバリアント４９１及びガイド１７４のＲＮＰの切断速度の定量化を示す。時点を、１０分間にわたって取得し、切断された画分を、各標的及び時点についてグラフ化した。 実施例９に記載されるように、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長のスペーサーを使用して、ｓｇＲＮＡ１７４及びＣａｓＸバリアント５１５によって形成されたＲＮＰによる切断の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰとインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた反復の単相適合を示す。 実施例９に記載されるように、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長のスペーサーを使用して、ｓｇＲＮＡ１７４及びＣａｓＸバリアント５２６によって形成されたＲＮＰによる切断の定量化を示す。標的ＤＮＡを、２０倍過剰の示されたＲＮＰとインキュベートし、切断された標的の量を、示された時点で決定した。３回の独立した反復の平均値及び標準偏差を、各時点について示す。組み合わせた反復の単相適合を示す。 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）におけるパッケージングのためのＣａｓＸタンパク質及び足場ＤＮＡ配列の例を示す概略図である。ＣａｓＸをコードするＤＮＡ及びそのプロモーター、並びに足場をコードするＤＮＡ及びそのプロモーターから構成される、ＡＡＶ逆位末端反復（inverted terminal repeat、ＩＴＲ）間のＤＮＡセグメントは、ＡＡＶ産生中にＡＡＶカプシド内にパッケージングされる。 実施例２１に記載されるように、Ａｉ９－ｔｄｔｏｍａｔｏトランスジェニックマウスから単離されたマウス神経前駆細胞（mouse neural progenitor cell、ｍＮＰＣ）におけるｇＲＮＡ足場２２９～２３７を足場１７４と比較する編集アッセイの結果を示す図である。細胞を、ＣａｓＸ４９１、足場、及びｍＲＨＯを標的化するスペーサー１１．３０（５’ＡＡＧＧＧＧＣＵＣＣＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣ３’、配列番号１７）をコードする示された用量のｐ５９プラスミドでヌクレオフェクトした。ｍＲＨＯ遺伝子座での編集を、トランスフェクションの５日後にＮＧＳによって評価し、足場２３０、２３１、２３４、及び２３５を有する構築物による編集が、両方の用量で足場１７４を有する構築物と比較して、より大きな編集を実証したことを示す。 実施例２１に記載されるように、ｍＮＰＣ細胞においてｇＲＮＡ足場２２９～２３７と足場１７４を比較する編集アッセイの結果を示す。細胞を、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タンパクの発現を防止する反復エレメントを標的化する、ＣａｓＸ４９１、足場、及びスペーサー１２．７（５’ＣＵＧＣＡＵＵＣＵＡＧＵＵＧＵＧＧＵＵＵ ３’、配列番号１１４６）をコードする示された用量のｐ５９プラスミドでヌクレオフェクトした。トランスフェクションの５日後、編集を、ＦＡＣＳによって評価して、ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞の割合を定量化した。足場２３１～２３５をヌクレオフェクトした細胞は、足場１７４を有する構築物と比較して、高用量では約３５％より大きい編集を示し、低用量では約２５％より大きい編集を示した。 網羅的変異進化（Deep Mutational Evolution、ＤＭＥ）を使用して本開示のＣａｓＸタンパク質及びガイドＲＮＡバリアントを作製する例示的な方法を示す図である。いくつかの例示的な実施形態では、ＤＭＥは、生体分子及びその組み合わせ／複数におけるほぼ全ての可能な変異、挿入、及び欠失を構築及び試験し、生体分子の適合性ランドスケープ及び所望の結果に向けた配列空間における経路の、ほぼ包括的で偏りのない評価を提供する。本明細書に記載されるように、ＤＭＥは、ＣａｓＸタンパク質及びガイドＲＮＡの両方に適用することができる。 実施例１３に記載されるように、２つのステムループ、シュードノット、及び三重鎖を含むＤｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ＣａｓＸタンパク質： ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体（ＰＤＢ ＩＤ：６ＹＮ２）のＣｒｙｏＥＭ構造を示す。 ツールＲＮＡＰＤＢｅｅ２．０（ｒｎａｐｄｂｅｅ．ｃｓ．ｐｕｔ．ｐｏｚｎａｎ．ｐｌ／、ツール３ＤＮＡＳ／ＤＳＳＲ、及びＶＡＲＮＡ可視化ツールを使用）を使用して、（Ａ）に示される構造から同定された配列番号４のｓｇＲＮＡの二次構造を示す。ＲＮＡ領域が示されている。ＰＤＢ結晶構造ファイルにおいて明らかでなかった残基は、プレーンテキスト文字（すなわち、丸で囲まれていない）によって示され、残基番号付けに含まれていない。 実施例１３に記載されるように、足場ライブラリを設計するために使用したガイドＲＮＡの領域及びドメインの概略図である。 実施例１３に記載されるように、示された偏りのない変異（二重変異及び単一変異）並びに標的化変異（三重鎖、足場ステムバブル、シュードノット、並びに伸長ステム及びループに対する）の両方を有する足場ライブラリの相対分布及び設計の円グラフである。 実施例１３に記載されるように、交互の三重鎖形成塩基対を三重鎖に特異的に組み込むように設計された三重鎖変異誘発の概略図である。実線は、三重鎖におけるワトソン－クリック対を示す。第３鎖のヌクレオチドは、二重鎖のプリンとの非正準相互作用を表す点線として示されている。ライブラリにおいて、示された５つの位置の各々は、全ての可能な三重鎖モチーフ（Ｇ： ＧＣ、Ｔ： ＡＴ、Ｇ： ＧＣ）＝２４３配列で置換された。ＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＮＮＮＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号１０２２）の配列。 実施例１３に記載されるように、各スクリーニングにおける参照ガイド足場１７４及び１７５の濃縮値の結果を伴う棒グラフである。 実施例１３に記載されるように、ガイド足場１７４及び１７５についての変異体ライブラリの２つの独立したスクリーニングの各々において測定された、各測定された単一ヌクレオチド置換、欠失、又は挿入についてのｌｏｇ２濃縮値を示す散布図である。 実施例１３に記載されるように、配列にわたる足場における特定の変異可能領域を示す、ガイド足場１７４及び１７５における単一変異体についてのヒートマップである。黄色の影は、参照足場と同様の濃縮を有する値を反映する。赤色の影は、参照足場と比較した濃縮（したがって、活性）の増加を示す。青色の影は、野生型足場と比較した活性の喪失を示す。白色は、欠損データ（又は野生型配列をもたらす置換）を示す。 実施例１３に記載されるように、参照ガイド足場１７４及び１７５上の単一ヌクレオチド変異のｌｏｇ２濃縮を比較する散布図である。１７４及び１７５の間で類似した位置への変異のみが示されている。結果は、全体として、ガイド足場１７４が１７５よりも変化に対して耐性があることを示唆している。 実施例１３に記載されるように、各新しいシュードノットが塩基対の同じ組成を有するが、ステム内で異なる順序であるように、シュードノット対がシャフルされた足場のセットについての平均（及び９５％信頼区間）ｌｏｇ２濃縮値を示す棒グラフである。各バーは、示されたＧ： Ａ（又はＡ： Ｇ）対の位置（右の図を参照）を有する足場のセットを表す。２９１個のシュードノットステムを試験した。バーの上の数字は、各位置でＧ： Ａ（又はＡ： Ｇ）対を有するステムの数を示す。 図５５及び図５６のシュードノット配列（５’から３’へ与えられている）の概略図であり、２つの鎖配列は下線によって分離されている。 実施例１３に記載されるように、シュードノットステム領域の予測された二次構造の安定性によって分けた、足場についての平均（及び９５％信頼区間）ｌｏｇ２濃縮値を示す棒グラフである。非常に安定なステム（例えば、ΔＧ＜－７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有する足場は、平均して高い濃縮値を有したが、不安定化されたステム（ΔＧ≧－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有する足場は、平均して低い濃縮値を有した。 実施例１３に記載されるように、足場１７５における位置７及び２９の全ての二重変異体のヒートマップである。シュードノット配列は、右側に、５’から３’へ与えられている。 Ｒｈｏ遺伝子座のＰ２３部位を標的化する（ＣａｓＸ４９１を有する）１１．１スペーサーを有する１７４と比較した、操作されたガイド２３５を使用したＡＲＰＥ－１９ヌクレオフェクト細胞における編集結果を示し、実施例２１に記載されるように、変異体ＲＨＯレポーター遺伝子におけるオフターゲット切断（非標的化スペーサーによる）を伴わずにＷＴ外因性ＲＨＯでのオンターゲット活性が増加した、２３５バリアントによる活性の改善を実証する。 実施例２１に記載されるように、１０００ｎｇの各プラスミドでヌクレオフェクトされたＡＲＰＥ－１細胞におけるベンチマークｐ５９．４９１．１７４．１１．１レベル（値１．０に設定）に対して正規化されたｐ５９．４９１．２３５．１１．１の編集レベルの倍率変化を示す棒グラフである。 実施例１７に記載されるように、カスタムＨＥＫ２９３細胞株ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１におけるＣａｓヌクレアーゼ２、１１９、４９１、５１５、５２７、５２８、５２９、５３０、及び５３１を比較する編集アッセイの結果を示す。細胞を、示されたＣａｓタンパク質をコードする２μｇのｐ６７プラスミドでリポフェクトした。５日後、細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ増幅及び次世代配列決定を実施して、カスタム設計されたオンターゲット編集部位で編集された細胞の画分を単離及び定量化した。各試料について、以下のＰＡＭ配列からなる標的部位（個々の点）で編集を評価した：４８個のＴＴＣ、１４個のＡＴＣ、２２個のＣＴＣ、１１個のＧＴＣの個々の部位、及び編集の割合（％）を、ビヒクル対照に対して正規化した。任意のヌクレアーゼでリポフェクトされた細胞は、Ｃａｓ５２８を除く野生型ヌクレアーゼＣａｓ２のものよりも高い、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位（水平バー）での平均編集を示した。また、４つの異なるＰＡＭ配列に対する任意の所与のヌクレアーゼの相対優先度が、バイオリンプロットで表されている。特に、Ｃａｓヌクレアーゼ５２７、５２８、及び５２９は、野生型ヌクレアーゼＣａｓ２のものとは実質的に異なるＰＡＭ優先度を示す。 実施例１８に記載されるように、カスタムＨＥＫ２９３細胞株ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１において、改良型Ｃａｓヌクレアーゼ４９１と改良型ヌクレアーゼ５３２及び５３３を比較する編集アッセイの結果を示す。細胞を、示されたＣａｓタンパク質及びピューロマイシン耐性遺伝子をコードする２μｇのｐ６７プラスミドで二連でリポフェクトし、ピューロマイシン選択下で増殖させた。３日後、細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ増幅及び次世代配列決定を実施して、カスタム設計されたオンターゲット編集部位で編集された細胞の画分を単離及び定量化した。各試料について、以下のＰＡＭ配列からなる標的部位で編集を評価した：４８個のＴＴＣ、１４個のＡＴＣ、２２個のＣＴＣ、１１個のＧＴＣの個々の部位、及び編集の割合を、ビヒクル対照に対して正規化した。ＣａｓＸ５３２又は５３３でリポフェクトされた細胞は、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位におけるＰＡＭ配列の各々で、ＣａｓＸ５３３を除いて、Ｃａｓ４９１よりも高い平均編集を示した。エラーバーは、ｎ＝２の生物学的試料についての平均値の標準誤差を表す。 実施例１４に記載されるように、ＣａｓＸタンパク質５１５及び足場１７４によって標的化された場合、異なるスペーサーに対するＣｃｄＢ選択の選択的ストリンジェンシーを決定するための生存アッセイのグラフである。 実施例１４に記載されるように、３つのスペーサーの平均として、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、３つのスペーサーの平均として、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、３つのスペーサーの平均として、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、３つのスペーサーの平均として、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、３つのスペーサーの平均として、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生化学的切断を実証する（biological replicates）の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生化学的切断を実証する（biological replicates）の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生化学的切断を実証する（biological replicates）の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生化学的切断を実証する（biological replicates）の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生化学的切断を実証する（biological replicates）の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＣＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＡＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＡＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＡＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＡＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 実施例１４に記載されるように、単一のスペーサーにおける３つの生物学的反復の平均として、ＡＴＣ ＰＡＭ標的部位における各変異体についての中立的な又は改善された生化学的切断を実証するＣａｓＸ５１５のバリアントのヒートマップである。図は、ＣａｓＸ５１５配列の全長にわたる結果を示す。 スペーサー１５．３について、実施例１５に記載されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＲＮＰを用いて標的核酸を編集する能力に対するスペーサー長の効果を示すグラフである。 スペーサー１５．５について、実施例１５に記載されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＲＮＰを用いて標的核酸を編集する能力に対するスペーサー長の効果を示すグラフである。 実施例１６に記載されるように、複製試料についての４つの異なるＰＡＭ配列（ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、及びＧＴＣ）における選択ＣａｓＸバリアントタンパク質及びそれらの編集効率の棒グラフである。データを、編集の割合（％）＋／－標準偏差として示す。 実施例１９に記載されるように、４８個の異なるＴＴＣ ＰＡＭ標的部位における選択ＣａｓＸヌクレアーゼのＣａｓＸ４９１と比較した平均編集効率を示す棒グラフである。２つの実験の平均の伝搬標準誤差をエラーバーとしてプロットした。アスタリスクは、ＣａｓＸ５２７及びＣａｓＸ４９１の間の有意差を示す（ｐ＝０．００００６３５、Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定による）。 実施例１９に記載されるように、標的ＤＮＡ ＰＡＭ配列、ＰＡＭ相互作用ループ、ＮＴＳＢドメイン、及びアミノ酸位置２６の物理的位置を示す、相同的な参照ＣａｓＸ１（配列番号１：タンパク質データバンク識別番号：６ＮＹ２）の公開されたＣｒｙｏＥＭ構造に基づく図である。 実施例１９に記載される、選択ＣａｓＸバリアントタンパク質及び４８個のＴＴＣ ＰＡＭ標的部位におけるそれらの編集効率のバイオリンプロットである。 実施例１９に記載されるように、選択されたＣａｓＸバリアントタンパク質及び４８個のＴＴＣ ＰＡＭ標的部位におけるＣａｓＸ４９１と比較したそれらの編集効率の棒グラフである。データは、平均の相対編集効率として提示され、ＣａｓＸ４９１編集が１．０に等しい。灰色の破線は、ＣａｓＸ１１９の編集効率を示す。複製試料について、誤差は、＋／－伝搬ＳＥＭである。 実施例２０に記載されるように、ＣａｓＸ４９１と比較した平均編集効率並びに選択ＣａｓＸヌクレアーゼの平均特異度（average specificity ratio）を示す棒グラフである。 実施例２１に記載されるように、試験した変異の組み合わせと、得られたＣａｓＸバリアントの活性及び特異性の両方に対するそれらの効果との間の定性的関係を示すフローチャートである。 実施例２１に記載されるように、ＭＯＩの範囲にわたってｍＮＰＣにおける内因性マウスＲｈｏエキソン１遺伝子座でｇＲＮＡ足場２３５と足場１７４、及びガイド１１．３０と１１．３１とを比較するＡＡＶ媒介性編集アッセイの結果を示す。 実施例２１に記載されるように、５．０ｅ＋５ＭＯＩで感染させた細胞における、スペーサー１１．３０を有するガイド１７４（１．０に設定）と比較した足場２３５の編集レベルの倍率変化としての編集結果を示す。 ｇＲＮＡバリアント２３５に組み込まれたｇＲＮＡバリアント１７５における伸長ステムループにおいてなされた改変を示す概略図である。ｓｇＲＮＡ１７５の伸長ステムループ：配列番号１２８５、ｓｇＲＮＡ３２５の伸長ステムループ：配列番号１２８６。 ｇＲＮＡバリアント２３５の概略図であり、ｇＲＮＡバリアント１７４及び１７５と比較して、三重鎖、足場ステムバブル、及び伸長ステムループにおける改変を示している。シュードノット及び三重鎖ループ：配列番号１２８７、足場ステム及び伸長ステム：配列番号１２８８。 実施例２３に記載されるように、ＭＳ２ヘアピン内の塩基の位置を示す概略図である。図中のＭＳ２配列：配列番号１２８９。 実施例２３に記載されるように、ｇＲＮＡ足場１８８及び２５１が塩基バリアントとして機能する、示された足場バリアントとともにパッケージングされたＸＤＰについて、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光によって測定されたｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子座での編集の割合（％）のグラフである。２つのＭＳ２バージョン（ＭＳ２ ３５３及びＭＳ２ ＷＴ）を使用した。 実施例２３に記載されるように、示されたｇＲＮＡ足場バリアントとともにパッケージングされたＸＤＰについて、力価と比較した（足場１８８及び２５１は基本対照として機能する）、ＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子座での編集についての、ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用して決定されたＥＣ５０値の改善を示す。２つのＭＳ２バージョン、ＭＳ２ ３５３及びＭＳ２野生型（wild type、ＷＴ）を使用した。 実施例２３に記載されるように、示されたｇＲＮＡ足場バリアントとともにパッケージングされたＸＤＰについての、ＭＳ２ヘアピン親和性（ＫＤ）とＥＣ５０との間の相関を示す。 実施例２３に記載されるように、示されたｇＲＮＡ足場バリアントとともにパッケージングされたＸＤＰについての、ＭＳ２ヘアピン親和性（ＫＤ）と力価との間の相関を示す。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、かかる実施形態は、単なる例として提供されることが当業者には明らかであろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を想起するであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明を実施する際に用いられ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本実施形態の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が優先される。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、限定することを意図するものではない。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換を想起するであろう。
定義
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書において互換的に使用され、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、多重鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、多重鎖ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、並びにプリン及びピリミジン塩基又は他の天然の、化学的若しくは生化学的に改変された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
「ハイブリダイズ可能」又は「相補的」は、互換的に使用され、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、温度及び溶液のイオン強度の適切なインビトロ及び／又はインビボ条件下で、配列特異的な逆平行様式で、別の核酸に非共有結合する（すなわち、ワトソン－クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成する）、「アニールする」又は「ハイブリダイズする」（すなわち、核酸が相補的な核酸に特異的に結合する）ことを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが理解される。それは、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有し、それでもなお標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与することなく、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる（例えば、ループ構造又はヘアピン構造、「バルジ」、「バブル」など）。
本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子産物（例えば、タンパク質、ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ領域、並びにかかる調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、アクセサリエレメントを含み得、これには、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。コード配列は、転写又は転写及び翻訳の際に遺伝子産物をコードする。本開示のコード配列は、オープンリーディングフレームの断片を含んでもよく、全長を含む必要はない。遺伝子は、転写される鎖並びにアンチコドンを含む相補鎖の両方を含み得る。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域又は転写開始点の５’側に位置する配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写開始部位の上流に位置する。
ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して「に隣接する」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドにおいて互いに隣にある又は隣接する配列を指す。当業者は、２つの配列が互いに隣接していると考えることができ、それでも限定された量の介在配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチド又はアミノ酸を包含することを理解するであろう。
「アクセサリエレメント」という用語は、本明細書において「アクセサリ配列」という用語と互換的に使用され、とりわけ、ポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ）シグナル）、エンハンサーエレメント、イントロン、転写後調節エレメント（posttranscriptional regulatory element、ＰＴＲＥ）、核局在化シグナル（nuclear localization signal、ＮＬＳ）、デアミナーゼ、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤、更なるプロモーター、ＣＲＩＳＰＲ媒介性相同組換え修復を刺激する因子（例えば、シス又はトランス）、転写のアクチベーター又はリプレッサー、自己切断配列、及び融合ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質に融合した融合ドメイン）を含むことが意図される。適切な１つ又は複数のアクセサリエレメントの選択は、発現されるコードされた成分（例えば、タンパク質若しくはＲＮＡ）に依存するか、又は核酸が異なるポリメラーゼを必要とする複数の成分を含むか若しくは融合タンパク質として発現するように意図されていないかに依存することが理解される。
「プロモーター」という用語は、転写開始部位、並びにポリメラーゼの結合及び転写を容易にするための更なる配列を含むＤＮＡ配列を指す。例示的な真核生物プロモーターとしては、ＴＡＴＡボックス及び／又はＢ認識エレメント（B recognition element、ＢＲＥ）などのエレメントが挙げられ、関連する転写可能なポリヌクレオチド配列及び／又は遺伝子（若しくは導入遺伝子）の転写及び発現を補助又は促進する。プロモーターは、合成的に産生され得るか、又は既知の若しくは天然に存在するプロモーター配列若しくは別のプロモーター配列に由来し得る。プロモーターは、転写される遺伝子に対して近位又は遠位であり得る。プロモーターはまた、特定の特性を付与するための２つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターを含み得る。本開示のプロモーターは、組成が類似しているが、既知の又は本明細書に提供される他のプロモーター配列と同一ではないプロモーター配列のバリアントを含み得る。プロモーターは、プロモーター（例えば、構成的、発生的、組織特異的、誘導性など）に作動可能に連結された関連するコード配列若しくは転写可能配列又は遺伝子の発現パターンに関する基準に従って分類され得る。プロモーターはまた、その強度に従って分類され得る。プロモーターの文脈で使用される場合、「強度」は、プロモーターによって制御される遺伝子の転写速度を指す。「強い」プロモーターは、転写速度が高いことを意味し、「弱い」プロモーターは、転写速度が比較的低いことを意味する。
本開示のプロモーターは、ポリメラーゼＩＩ（Polymerase II、Ｐｏｌ ＩＩ）プロモーターであり得る。ポリメラーゼＩＩは、全てのタンパク質コード及び多くの非コード遺伝子を転写する。代表的なＰｏｌ ＩＩプロモーターは、転写開始部位を取り囲む約１００塩基対の配列であるコアプロモーターを含み、Ｐｏｌ ＩＩポリメラーゼ及び関連する一般的な転写因子のための結合プラットフォームとして機能する。プロモーターは、１つ以上のコアプロモーターエレメント（例えば、ＴＡＴＡボックス、ＢＲＥ、イニシエーター（Initiator、ＩＮＲ）、モチーフ１０エレメント（motif ten element、ＭＴＥ）、下流コアプロモーターエレメント（downstream core promoter element、ＤＰＥ）、下流コアエレメント（downstream core element、ＤＣＥ））を含み得るが、これらのエレメントを欠くコアプロモーターは、当該技術分野で既知である。
本開示のプロモーターは、ポリメラーゼＩＩＩ（Polymerase III、Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターであり得る。Ｐｏｌ ＩＩＩは、ＤＮＡを転写して、５ＳｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び他の低分子ＲＮＡなどの低分子リボソームＲＮＡを合成する。代表的なＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、転写を支持するために内部制御配列（遺伝子の転写された部分内の配列）を使用するが、ＴＡＴＡボックスなどの上流エレメントも使用されることもある。全てのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、本開示の範囲内として想定される。
「エンハンサー」という用語は、転写因子と呼ばれる特定のタンパク質が結合した場合に、関連する遺伝子の発現を調節する、調節ＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、遺伝子のイントロン、又は遺伝子のコード配列の５’若しくは３’に位置し得る。エンハンサーは、遺伝子の近位（すなわち、プロモーターの数十若しくは数百塩基対（base pair、ｂｐ）内）にあってもよく、又は遺伝子の遠位（すなわち、プロモーターから数千ｂｐ、数十万ｂｐ、若しくは更に数百万ｂｐ離れている）に位置してもよい。単一の遺伝子は、２つ以上のエンハンサーによって調節されてもよく、これらの全ては、本開示の範囲内であると想定される。
本明細書で使用される場合、「転写後調節エレメント（post-transcriptional regulatory element、ＰＲＥ）」（例えば、肝炎ＰＲＥ）とは、転写された場合、それに作動可能に連結された関連遺伝子の発現を増強又は促進する転写後活性を示し得る三次構造を生成するＤＮＡ配列を指す。
本明細書で使用される場合、「転写後調節エレメント（ＰＴＲＥ）」（例えば、肝炎ＰＴＲＥ）とは、転写された場合、それに作動可能に連結された関連遺伝子の発現を増強又は促進する転写後活性を示し得る三次構造を生成するＤＮＡ配列をいう。
本明細書で使用される場合、「組換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）が、クローニングステップ、制限ステップ、及び／又は連結ステップの様々な組み合わせの産物であり、その結果、天然のシステムで見出される内因性核酸から識別可能な構造的なコード配列又は非コード配列を有する構築物が得られることを意味する。一般に、構造コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカー、又は一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができ、細胞又は無細胞転写及び翻訳システムに含まれる組換え転写単位から発現され得る合成核酸を提供する。かかる配列は、典型的には、真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供され得る。関連配列を含むゲノムＤＮＡはまた、組換え遺伝子又は転写単位の形成において使用され得る。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’に存在し得、ここで、かかる配列は、コード領域の操作又は発現を妨害せず、実際に、様々な機構によって所望の産物の産生を調節するように作用し得る（上記の「エンハンサー」及び「プロモーター」を参照）。
「組換えポリヌクレオチド」又は「組換え核酸」という用語は、天然に存在しないもの、例えば、ヒトの介入を介して、そうでなければ分離された配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作（例えば、遺伝子操作技術）のいずれかによって達成される。これは、典型的には、配列認識部位を導入又は除去しながら、コドンを、同じアミノ酸又は保存的アミノ酸をコードする縮重コドン（redundant codon）で置換するように行うことができる。代替的には、所望の機能の核酸セグメントを一緒に連結して、所望の機能の組み合わせを生成するように行われる。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、又は核酸の単離されたセグメントの人工的操作（例えば、遺伝子操作技術）のいずれかによって達成される。
同様に、「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」という用語は、天然に存在しないポリペプチド又はタンパク質、例えば、ヒトの介入を介して、そうでなければ分離されたアミノ配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。したがって、例えば、異種アミノ酸配列を含むタンパク質は組換え体である。
本明細書で使用される場合、「接触する」という用語は、２つ以上の実体間に物理的接続を確立することを意味する。例えば、標的核酸をガイド核酸と接触させることは、標的核酸及びガイド核酸が、物理的接続を共有するようになされることを意味する（例えば、それらの配列が配列類似性を共有する場合、ハイブリダイズすることができる）。
「解離定数」又は「Ｋｄ」は、互換的に使用され、リガンド「Ｌ」とタンパク質「Ｐ」との間の親和性を意味する（すなわち、リガンドが特定のタンパク質にどの程度強く結合するかである）。解離定数は、式Ｋｄ＝［Ｌ］［Ｐ］／［ＬＰ］を用いて計算することができ、式中、［Ｐ］、［Ｌ］、及び［ＬＰ］は、それぞれ、タンパク質、リガンド、及び複合体のモル濃度を表す。
本開示は、標的核酸配列を編集するために有用なシステム及び方法を提供する。本明細書で使用される場合、「編集」は、「改変」と互換的に使用され、切断、ニッキング、欠失、ノックイン、ノックアウトなどを含むが、これらに限定されない。
「切断」とは、標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）の共有結合骨格の破壊を意味する。切断は、様々な方法によって開始することができ、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を含むが、これらに限定されない。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。
「ノックアウト」という用語は、遺伝子又は遺伝子の発現の排除を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊をもたらすヌクレオチド配列の欠失又は付加のいずれかによってノックアウトされ得る。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係な配列で置換することによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子又はその遺伝子産物の発現の低減を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質活性若しくは機能が減弱され得るか、又はタンパク質レベルが低減若しくは排除され得る。
本明細書で使用される場合、「相同組換え修復」（homology-directed repair、ＨＤＲ）とは、細胞における二本鎖切断の修復中に起こるＤＮＡ修復の形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、ドナー鋳型を使用して標的ＤＮＡを修復又はノックアウトし、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらす。相同組換え修復は、ドナー鋳型が標的ＤＮＡ配列と異なり、ドナー鋳型の配列の一部又は全部が標的ＤＮＡに組み込まれる場合、挿入、欠失、又は変異による標的配列の配列の改変をもたらすことができる。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」（non-homologous end joining、ＮＨＥＪ）は、（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に）相同鋳型を必要とせずに、切断末端を互いに直接ライゲーションすることによる、ＤＮＡにおける二本鎖切断の修復を指す。ＮＨＥＪは、多くの場合、二本鎖切断部位付近のヌクレオチド配列の喪失（欠失）をもたらす。
本明細書で使用される場合、「マイクロホモロジー媒介末端結合」（micro-homology mediated end joining、ＭＭＥＪ）は、（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に）相同鋳型を必要とせずに、切断部位に隣接する欠失と常に関連する、変異原性ＤＳＢ修復機構を指す。ＭＭＥＪは、多くの場合、二本鎖切断部位付近のヌクレオチド配列の喪失（欠失）をもたらす。ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、別のポリヌクレオチド又はポリペプチドと特定のパーセント「配列類似性」又は「配列同一性」を有し、これは、２つの配列を比較した場合（整列させた場合）、同じ相対位置にある同じ塩基又はアミノ酸の割合を意味する。配列類似性（パーセント類似性、パーセント同一性、又は相同性とも称される）は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む、当該技術分野で既知の方法及びコンピュータプログラムを使用して整列させることができる。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間のパーセント相補性は、任意の便利な方法を使用して決定することができる。例示的な方法としては、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所整列検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）が挙げられる（又はＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することによって、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）を使用するデフォルト設定を使用して）。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、コードアミノ酸及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、並びに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、融合タンパク質（異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むが、これに限定されない）を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドなどのレプリコンであり、これに別のＤＮＡセグメント（すなわち、「インサート」）を結合させて、細胞において結合されたセグメントの複製又は発現をもたらすことができる。
本明細書で使用される「天然に存在する」又は「未改変」又は「野生型」という用語は、核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物に適用される場合、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、又は生物を指す。
本明細書で使用される場合、「変異」とは、野生型若しくは参照アミノ酸配列と比較して、又は野生型若しくは参照ヌクレオチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞が天然に存在する環境とは異なる環境にあるポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は細胞を表すことを意味する。単離された遺伝子改変宿主細胞は、遺伝子改変宿主細胞の混合集団中に存在してもよい。
本明細書で使用される「宿主細胞」とは、真核細胞、原核細胞、又は多細胞生物由来の細胞（例えば、細胞株）を意味し、真核細胞又は原核細胞は、核酸（例えば、発現ベクター）のレシピエントとして使用され、核酸によって遺伝子改変された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、天然の、偶発的な、又は意図的な変異に起因して、形態において、又はゲノム若しくは全ＤＮＡの相補体において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。「組換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも称される）は、異種核酸（例えば、発現ベクター）が導入された宿主細胞である。
本明細書で使用される「トロピズム」という用語は、ウイルス様粒子（ＸＤＰ、本明細書ではＸＤＰと称されることもある）の特定の細胞型若しくは組織型への優先的な侵入、及び／又は特定の細胞型若しくは組織型への侵入を促進する細胞表面との優先的な相互作用、続いて、任意選択的に及び好ましくは、ＸＤＰによって細胞に運ばれる配列の発現（例えば、転写及び任意選択的に翻訳）を指す。
本明細書で使用される「シュードタイプ」又は「シュードタイピング」という用語は、好ましい特徴を有する別のウイルスのエンベロープタンパク質で置換されたウイルスエンベロープタンパク質を指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（vesicular stomatitis virus G-protein、ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質（とりわけ、本明細書において以下に記載される）でシュードタイプ化され得、これは、ＨＩＶエンベロープタンパク質がウイルスを主にＣＤ４＋提示細胞に標的化するので、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することを可能にする。
本明細書で使用される「トロピズム因子」という用語は、特定の細胞型又は組織型に対するトロピズムを提供する、ＸＤＰの表面に組み込まれた成分を指す。トロピズム因子の非限定的な例としては、糖タンパク質、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、ナノボディ、直鎖状抗体など）、受容体、及び標的細胞マーカーに対するリガンドが挙げられる。
「標的細胞マーカー」は、標的細胞によって発現される分子を指し、細胞表面受容体、サイトカイン受容体、抗原、腫瘍関連抗原、糖タンパク質、オリゴヌクレオチド、酵素基質、抗原決定基、又は結合部位（抗体断片若しくは糖タンパク質トロピズム因子のリガンドとして機能し得る標的組織若しくは細胞の表面に存在し得る）が含まれるが、これらに限定されない。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、タンパク質における、類似の側鎖を有するアミノ酸残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換群は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンである。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、様々な抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ナノボディ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ抗体）、及び抗体断片（それらが所望の抗原結合活性又は免疫学的活性を示す限り）が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＥなどのいくつかのタイプの分子を含む分子の大きなファミリーを表す。
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、かつインタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、直鎖状抗体、単一ドメイン抗体、単一ドメインラクダ抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体分子、及び多重特異性抗体（抗体断片から形成される）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療すること」は、本明細書で互換的に使用され、治療的利益及び／又は予防的利益を含むがこれらに限定されない有益な結果若しくは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療される基礎となる障害又は疾患の根絶又は改善を意味する。治療的利益はまた、対象が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるような、基礎疾患に関連する１つ以上の症状の根絶若しくは改善、あるいは１つ以上の臨床パラメータの改善により達成することができる。
「治療有効量」及び「治療有効用量」という用語は、本明細書で使用される場合、対象（例えば、ヒト又は実験動物）に単回用量又は反復用量で投与した場合、疾患状態又は病状の任意の症状、態様、測定されたパラメータ、又は特徴に対して任意の検出可能な有益な効果を有することができる、単独での又は組成物の一部としての薬物又は生物製剤の量を指す。かかる効果は、有益であるために絶対的である必要はない。
本明細書で使用される場合、「投与すること」は、化合物（例えば、本開示の組成物）又は組成物（例えば、薬学的組成物）の投与量を対象に与える方法を意味する。
「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、及び他のげっ歯類が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。
Ｉ．一般的な方法
本発明の実施は、別段の指示がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、及び組換えＤＮＡの先行技術を使用し、これらは、標準的な教科書であるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ （Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）；及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）に見出すことができる（それらの開示は、参照により本明細書に援用される）。
値の範囲が提供される場合、終点が含まれること、及びその範囲の上限と下限との間の各介在値が、文脈が別途明確に指示しない限り、下限の単位の１０分の１まで、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値が包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界に従って包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に援用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形である「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに別段の指示がない限り、その複数の指示対象が含まれることに留意されたい。
明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供されてもよいことが理解されるであろう。他の場合では、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本開示の様々な特徴は、別個に又は任意の好適な部分的な組み合わせで提供されてもよい。本開示に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、あたかもありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示されることが意図される。加えて、様々な実施形態及びその要素の全ての部分的な組み合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、ありとあらゆるかかる部分的な組み合わせが本明細書に個別にかつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。
ＩＩ．遺伝子編集及び遺伝子編集ペアのためのシステム
第１の態様では、本開示は、システムを提供し、遺伝子の標的核酸（コード領域及び非コード領域を含む）を改変又は編集するのに使用するためのクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）と、を含む。一般に、遺伝子の任意の部分は、本明細書に提供されるプログラム可能なシステム及び方法を使用して標的化され得る。本明細書で使用される場合、遺伝子編集ペアとしての本開示のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質及び１つ以上のｇＲＮＡ、並びにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡをコードする核酸、並びに本開示の核酸又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質及び１つ以上のｇＲＮＡを含むベクターを含むシステムなどの「システム」は、用語「組成物」と互換的に使用される。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象において、インビトロ、エクスビボ、又はインビボのいずれかで、真核細胞における遺伝子の標的核酸を改変するように特別に設計されたシステムを提供する。一般に、遺伝子の任意の部分は、本明細書に提供されるプログラム可能なシステム及び方法を使用して標的化され得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２、Ｖ型ヌクレアーゼである。クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼのメンバーには相違点があるが、それらは、それらをＣａｓ９システムと区別するいくつかの共通の特徴を共有する。まず、Ｖ型ヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインを含むがＨＮＨドメインを含まないＲＮＡ誘導型の単一エフェクターを有し、非標的鎖上の標的領域の５’上流のＴＣモチーフのＰＡＭを認識する。これは、標的配列の３’側でＧ－リッチＰＡＭに依存するＣａｓ９システムとは異なる。Ｖ型ヌクレアーゼは、ＰＡＭに近い近位部位に平滑末端を生成するＣａｓ９とは異なり、ＰＡＭ配列に対して遠位にずれた二本鎖切断を生成する。加えて、Ｖ型ヌクレアーゼは、シスで結合する標的ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡによって活性化された場合、トランスでｓｓＤＮＡを分解する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、Ｃ２ｃ９、ＣａｓＺ、及びＣａｓＸからなる群から選択されるクラス２、Ｖ型ヌクレアーゼを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質及び１つ以上のガイド核酸（ｇＲＮＡ）バリアントをＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムとして含むシステムを提供する。
本明細書で遺伝子編集ペアと称される、クラス２、Ｖ型タンパク質及びｇＲＮＡバリアントを含むシステムが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、クラス２、Ｖ型バリアントは、ＣａｓＸバリアント（例えば、限定されないが、配列番号４１６の配列）である。ＣａｓＸバリアントタンパク質及びＣａｓＸバリアントという用語は、本明細書において互換的に使用される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、別のｇＲＮＡのバリアント（例えば、限定されないが、配列番号２２３８及び２２３９の配列）である。ｇＲＮＡ及びＣａｓＸタンパク質は、非共有結合性相互作用を介して一緒に結合して、遺伝子編集ペア複合体（本明細書においてリボ核タンパク質（ribonucleoprotein、ＲＮＰ）複合体と称される）を形成することができる。いくつかの実施形態では、予め複合体化されたＣａｓＸ： ｇＲＮＡ ＲＮＰの使用は、標的核酸の編集のための細胞又は標的核酸へのシステム成分の送達において利点を付与する。ＲＮＰにおいて、ｇＲＮＡは、標的核酸配列の配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する標的化配列（又は「スペーサー」）を含むことによって、ＲＮＰ複合体に標的特異性を提供することができる。ＲＮＰにおいて、予め複合体化されたＣａｓＸ： ｇＲＮＡのＣａｓＸタンパク質は、特異的活性を提供し、ｇＲＮＡとのその会合によって、改変される標的核酸配列内の標的部位に誘導される（例えば、標的部位で更に安定化される）。ＲＮＰ複合体のＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質による標的配列の結合、切断、又はニッキングなどの複合体の部位特異的活性を提供する。本明細書において、本明細書に記載の実施形態のＣａｓＸバリアントタンパク質、ｇＲＮＡバリアント、及びＣａｓＸバリアントとｇＲＮＡバリアントとの任意の組み合わせのＣａｓＸ： ｇＲＮＡ遺伝子編集ペア、並びにＣａｓＸ： ｇＲＮＡを含む送達様式、を含むシステム及び細胞が提供される。これらの成分の各々及び遺伝子の標的核酸の編集におけるそれらの使用は、以下で本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、本開示は、表３のＣａｓＸバリアントタンパク質（配列番号２４７～５９２及び１１４７～１２３１、又はそれと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列のうちのいずれか１つから選択されるＣａｓＸバリアントタンパク質を含む遺伝子編集ペアのシステムを提供し、一方、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるｇＲＮＡバリアント（例えば、表２に示される配列番号２１０１～２３３２及び２３５３～２３９８）、又はそれと少なくとも６０％、若しくは少なくとも７０％、少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列バリアントであり、ｇＲＮＡが、標的核酸に相補的な標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、表３のＣａｓＸバリアントタンパク質（配列番号２７０～５９２及び１１４７～１２３１）のうちのいずれか１つから選択されるＣａｓＸバリアントタンパク質を含む遺伝子編集ペアのシステムを提供し、一方、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるｇＲＮＡバリアント（例えば、配列番号２２３８～２３３２及び２３５３～２３９８）であり、ｇＲＮＡが、標的核酸に相補的な標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、表３のＣａｓＸバリアントタンパク質（配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１）のうちのいずれか１つから選択されるＣａｓＸバリアントタンパク質を含む遺伝子編集ペアのシステムを提供し、一方、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるｇＲＮＡバリアント（例えば、配列番号２２８１～２３３２及び２３５３～２３９８）であり、ｇＲＮＡが、標的核酸に相補的な標的化配列を含む。他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸバリアントタンパク質、標的化配列を有する本明細書に記載される第１のｇＲＮＡバリアント（例えば、表２に示される配列番号２１０１～２３３２又は２３５３～２３９８）、及び第２のｇＲＮＡバリアントを含む遺伝子編集ペアのシステムを提供し、第２のｇＲＮＡバリアントが、第１のｇＲＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する。他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸバリアントタンパク質、標的化配列を有する本明細書に記載される第１のｇＲＮＡバリアント（例えば、配列番号２１０１～２３３２又は２３５３～２３９８）、及び第２のｇＲＮＡバリアントを含む遺伝子編集ペアのシステムを提供し、第２のｇＲＮＡバリアントが、第１のｇＲＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する。他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸバリアントタンパク質、標的化配列を有する本明細書に記載される第１のｇＲＮＡバリアント（例えば、配列番号２２８１～２３３２又は２３５３～２３９８）、及び第２のｇＲＮＡバリアントを含む遺伝子編集ペアのシステムを提供し、第２のｇＲＮＡバリアントが、第１のｇＲＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する。本開示のＣａｓＸ： ｇＲＮＡ遺伝子編集ペアのいくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３のＣａｓＸバリアントタンパク質５１５、５２８、５２９、５３４～５３９、６６８、６７２、及び６７８（配列番号４１６、４２８、４３４～４３９、５６７、５７０、及び５７６）からなる群から選択され、ｓｇＲＮＡバリアントは、表２のｇＲＮＡバリアント２２９～２３７（配列番号２２８６～２２９４）からなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝子編集ペアは、ＣａｓＸバリアントタンパク質６６８（配列番号５６７）、６７２（配列番号５７０）、又は６７６（配列番号５７４）のうちのいずれか１つから選択されるＣａｓＸバリアントタンパク質と、ｇＲＮＡバリアント２３５（配列番号２２９２）と、を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集ペアは、一緒に会合してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる。他の実施形態では、遺伝子編集ペアは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中で一緒に会合している。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ペアのＲＮＰは、コード配列、コード配列の相補体、非コード配列、及び調節エレメントを含む標的核酸の二本鎖に結合し、切断することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ペアのＲＮＰは、標的核酸に結合し、標的核酸において１つ以上の一本鎖ニックを生成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ペアのＲＮＰは、標的核酸に結合することができるが、標的核酸を切断することはできない。
いくつかの実施形態では、バリアント遺伝子編集ペアは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と、配列番号５又は配列番号４の参照ｇＲＮＡと、を含む参照遺伝子編集ペアと比較して、１つ以上の改善された特徴を有する。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのバリアント遺伝子編集ペアは、そのバリアントが由来したＣａｓＸバリアント（例えば、ＣａｓＸ５１５、配列番号４１６）と、そのバリアントが由来したｇＲＮＡバリアント（例えば、ｇＲＮＡ足場１７４（配列番号２２３８）又は１７５（配列番号２２３９））と、を含む遺伝子編集ペアと比較して、１つ以上の改善された特徴を有する。前述の実施形態では、１つ以上の改善された特徴は、遺伝子編集ペア並びに参照ＣａｓＸ及び参照ｇＲＮＡについて同等の条件下でインビトロアッセイにおいてアッセイすることができる。本明細書に記載されるように、例示的な改善された特徴としては、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体の安定性、ＣａｓＸとｇＲＮＡとの間の結合親和性の増加、ＲＮＰ複合体形成の動態の改善、より高い割合の切断コンピテントＲＮＰ、標的核酸に対するＲＮＰ結合親和性の増加、標的核酸の巻き戻し、編集活性の増加、編集効率の増加、標的核酸に対する編集特異性の増加、オフターゲット編集若しくは切断の減少、ヌクレアーゼの活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の増加、又はヌクレアーゼ活性に対する耐性の増加を挙げることができる。前述の実施形態では、改善は、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡペアの特徴、又は遺伝子編集ペアが由来したＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントの特徴と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約１０，０００倍、又は少なくとも約１００，０００倍である。他の場合では、改善された特徴のうちの１つ以上は、参照遺伝子編集ペア、又は遺伝子編集ペアが由来したＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントの特徴と比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍改善され得る。他の場合では、改善された特徴のうちの１つ以上は、参照遺伝子編集ペア、又は遺伝子編集ペアが由来したＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントの特徴と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、若しくは５００倍、又はそれ以上改善され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集ペアが、本明細書に記載されるＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントの両方を含み、遺伝子編集ペアの１つ以上の特徴は、ＣａｓＸタンパク質又はｇＲＮＡ単独を変化させることによって達成され得るものを超えて改善されている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントは、相加的に作用して、遺伝子編集ペアの１つ以上の特徴を改善する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントは、相乗的に作用して、遺伝子編集ペアの１つ以上の特徴を改善する。前述の実施形態では、改善は、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡペアの特徴、又は遺伝子編集ペアが由来したＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントの特徴と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約１０，０００倍、又は少なくとも約１００，０００倍である。
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患を有する対象の治療のための医薬品として使用するための、本明細書に開示される実施形態のいずれかの遺伝子編集ペアの組成物を提供する。
他の実施形態では、本開示のシステムは、１つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（ｇＲＮＡ）と、遺伝子の一部をコードする核酸を含む１つ以上のドナー鋳型核酸と、を含み、ドナー鋳型核酸が、変異を修正するための野生型配列を含むか、又は遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトするための野生型ゲノム核酸配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、若しくは変異を含む。
他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸバリアント、ｇＲＮＡバリアント、並びに任意選択的にＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムの産生及び／又は送達のためのドナー鋳型をコードする若しくは含むベクターを提供する。また、遺伝子編集方法及び治療方法を含む、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントを作製する方法、並びにＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントを使用する方法も本明細書に提供される。ＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムのＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアント成分、及びそれらの特徴、並びに送達様式及びシステムを使用する方法が、以下でより詳細に記載される。
ＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムのドナー鋳型は、標的遺伝子における変異を修正するために利用されるか、ゲノムにおいて異なる遺伝子座で導入遺伝子を挿入する（「ノックイン」する）ために利用されるか、又は異常である遺伝子産物（例えば、遺伝子産物の発現を減少させる若しくはタンパク質を機能不全にする１つ以上の変異を含む）の発現を破壊する（「ノックダウン」若しくは「ノックアウト」する）ために利用されるかに応じて設計される。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型又は一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。いくつかの実施形態では、標的核酸の編集において利用されるＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムは、欠陥タンパク質を修正するための修正野生型配列の挿入のための、標的核酸における遺伝子のオープンリーディングフレームの全て又は少なくとも一部を有するドナー鋳型を含む。他の場合では、ドナー鋳型は、遺伝子産物の発現のためにゲノムにおける異なる遺伝子座に挿入するための野生型遺伝子の全部又は一部を含む。更に他の場合では、遺伝子の一部は、標的核酸における変異の上流（’５）に挿入され得、ドナー鋳型遺伝子部分は、遺伝子のＣ末端又は変異を有する配列の３’末端まで広がり、標的核酸へのその挿入の際に、機能的遺伝子産物の発現をもたらす。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型配列は、標的核酸の切断部位に対して５’側及び３’側の２つの相同領域（すなわち、相同アーム）に隣接する非相同配列を含み、標的領域での、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同性非依存性標的化組み込み（homology-independent targeted integration、ＨＩＴＩ）によって媒介され得る非相同配列の挿入を容易にする。ＨＩＴＩによって挿入される外因性ドナー鋳型は、任意の長さ、例えば、１０～５０ヌクレオチド長の比較的短い配列、又は約５０～１０００ヌクレオチド長のより長い配列であり得る。相同性の欠如は、例えば、２０～５０％以下の配列同一性を有すること、及び／又は低い厳密性での特異的なハイブリダイゼーションを欠くことであり得る。他の場合では、相同性の欠如は、５、６、７、８、又は９ｂｐ以下の同一性を有するという基準を更に含み得る。このような場合、相同アームの使用は、ヌクレアーゼによって導入される切断部位での非相同配列の挿入を容易にする。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型ポリヌクレオチドは、少なくとも約１０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、又は少なくとも約２００、又は少なくとも約３００、又は少なくとも約４００、又は少なくとも約５００、又は少なくとも約６００、又は少なくとも約７００、又は少なくとも約８００、又は少なくとも約９００、又は少なくとも約１０００、又は少なくとも約１０，０００、又は少なくとも約１５，０００ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも約１０～約１５，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約１００～約１０，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約４００～約８，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約６００～約５０００ヌクレオチド、又は少なくとも約１０００～約２０００ヌクレオチドを含む。ドナー鋳型配列は、ゲノム配列と比較して、特定の配列例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などの差異を含み得、これらは、切断部位でのドナー核酸の挿入の成功を評価するために使用され得るか、又は場合によっては、他の目的のために（例えば、標的ゲノム遺伝子座における発現を示すために）使用され得る。代替的に、これらの配列の差異は、マーカー配列の除去のために後で活性化され得る、隣接する組換え配列（例えば、ＦＬＰ配列、ｌｏｘＰ配列など）を含み得る。
ＩＩＩ．遺伝子編集のためのシステムのガイド核酸
別の態様では、本開示は、特別に設計されたガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）に関し、遺伝子の標的核酸配列に相補的な（したがって、それとハイブリダイズすることができる）標的化配列（本明細書においてスペーサーとも称される）を含み、これは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化した場合、細胞における標的核酸のゲノム編集において有用である。いくつかの実施形態では、複数のｇＲＮＡが、標的核酸の改変のためにシステムにおいて送達されることが想定される。例えば、遺伝子内の２つの異なる部位又は重複する部位で結合及び切断するために、各々がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化する場合、標的核酸配列の異なる領域又は重複する領域に対する標的化配列を有する一対のｇＲＮＡを使用することができ、次いで、遺伝子は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同組換え修復（ＨＤＲ）、相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（single strand annealing、ＳＳＡ）、又は塩基除去修復（base excision repair、ＢＥＲ）によって編集される。
いくつかの実施形態では、本開示は、システムにおいて利用されるｇＲＮＡを提供し、これは、真核細胞における遺伝子のゲノム編集において有用性を有する。特定の実施形態では、システムのｇＲＮＡは、以下でより詳細に記載される、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体（リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体）を形成することができる。
ａ．参照ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡバリアント
本明細書で使用される場合、「参照ｇＲＮＡ」は、天然に存在するｇＲＮＡの野生型配列を含むＣＲＩＳＰＲガイド核酸を指す。いくつかの実施形態では、本開示の参照ｇＲＮＡは、参照ｇＲＮＡと比較して、特性が強化された又は変化した１つ以上のガイド核酸バリアント（本明細書において「ｇＲＮＡバリアント」と称される）を生成するために、１つ以上の変異誘発方法、例えば、実施例において本明細書に記載の変異誘発方法（例えば、実施例１３、並びに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０／３６５０６号及び国際公開第２０２０２４７８８３（Ａ２）号（参照により本明細書に組み込まれる））に供され得、変異誘発方法としては、網羅的変異進化（Deep Mutational Evolution、ＤＭＥ）、網羅的変異スキャニング（deep mutational scanninｇ、ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、付着伸長ＰＣＲ（staggered extension PCR）、遺伝子シャフリング、又はドメインスワッピングが挙げられる。ｇＲＮＡバリアントはまた、例えば、５’末端若しくは３’末端のいずれかに融合された又は内部に挿入された、１つ以上の外因性配列を含むバリアントも含む。参照ｇＲＮＡ又はそれが由来するバリアントの活性は、それに対してｇＲＮＡバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用されてもよく、それによって、ｇＲＮＡバリアントの機能又は他の特徴の改善が測定される。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡバリアント（例えば、合理的に設計されたバリアント）を産生するために、１つ以上の意図的な特異的に標的化された変異に供され得る。
本開示のｇＲＮＡは、２つのセグメントである標的化配列及びタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡの標的化セグメントは、以下でより詳細に記載される標的核酸配列（例えば、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的ＤＮＡの鎖など）内の特定の配列（標的部位）に相補的である（したがって、それとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（互換的に、ガイド配列、スペーサー、ターゲッター、又は標的化配列と称される）を含む。ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸配列（コード配列、コード配列の相補体、非コード配列を含む）及び調節エレメントに結合することができる。タンパク質結合セグメント（又は「アクチベーター」若しくは「タンパク質結合配列」）は、ＲＮＰを形成する複合体として、ＣａｓＸタンパク質と相互作用（例えば、結合）する（以下でより詳細に記載される）。代替的には、タンパク質結合セグメントは、本明細書で「足場（scaffold）」と呼ばれ、これは、いくつかの領域から構成される（以下でより詳細に記載される）。
デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）の場合、ターゲッター部分及びアクチベーター部分は各々、二重鎖形成セグメントを有し、ターゲッターの二重鎖形成セグメント及びアクチベーターの二重鎖形成セグメントは、互いに相補性を有し、互いにハイブリダイズして二本鎖の二重鎖（ｇＲＮＡについてはｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する。ｇＲＮＡがｇＲＮＡである場合、「ターゲッター」又は「ターゲッターＲＮＡ」という用語は、本明細書において、ＣａｓＸデュアルガイドＲＮＡの（したがって、「アクチベーター」及び「ターゲッター」が、例えば、介在ヌクレオチドによって一緒に連結されている場合、ＣａｓＸシングルガイドＲＮＡの）ｃｒＲＮＡ様分子（ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）を指すために使用される。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとアニーリングする５’領域、続いて、標的化配列のヌクレオチドを有する。したがって、例えば、ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）は、ガイド配列と、ｃｒＲＮＡの二重鎖形成セグメント（ｃｒＲＮＡリピートとも称され得る）と、を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーター）はまた、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の他の半分を形成するヌクレオチドの二重鎖形成ストレッチも含む。したがって、ターゲッター及びアクチベーターは、対応する対としてハイブリダイズして、デュアルガイドＲＮＡ（本明細書において「二種分子ｇＲＮＡ」、「ｄｇＲＮＡ」、「二重分子ガイドＲＮＡ」、又は「２分子ガイドＲＮＡ」と称される）を形成する。ＣａｓＸタンパク質による標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合及び／又は切断は、ｇＲＮＡの標的化配列と標的核酸配列との間の塩基対形成の相補性によって決定される１つ以上の位置（例えば、標的核酸の配列）で起こり得る。したがって、例えば、本開示のｇＲＮＡは、ＴＣ ＰＡＭモチーフ又はＰＡＭ配列（ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣなどに相補的な配列に隣接する標的核酸に相補的な配列を有し、したがって、標的核酸とハイブリダイズすることができる。ガイド配列の標的化配列は標的核酸配列の配列とハイブリダイズするので、ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、特定の標的核酸配列とハイブリダイズするように、使用者によってターゲッターが改変され得る。したがって、場合によっては、ターゲッターの配列は、天然に存在しない配列に相補的であり得る。他の場合では、ターゲッターの配列は、編集される遺伝子に対する相補体に由来する天然に存在する配列であり得る。他の実施形態では、ｇＲＮＡのアクチベーター及びターゲッターは、（互いにハイブリダイズするのではなく）互いに共有結合しており、単一分子（本明細書において、「単一分子ｇＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「１分子ガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」と称される）を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、「アクチベーター」又は「ターゲッター」を含み、したがって、それぞれ「アクチベーターＲＮＡ」及び「ターゲッターＲＮＡ」であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、リボ核酸分子（「ｇＲＮＡ」）であり、他の実施形態では、ｇＲＮＡは、キメラであり、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡという用語は、天然に存在する分子、並びに配列バリアントを（例えば、天然に存在しない改変されたヌクレオチド）包含する。
まとめると、本開示の構築されたｇＲＮＡは、４つの別個の領域又はドメイン、すなわち、ＲＮＡ三重鎖、足場ステム、伸長ステム、及び標的化配列（本開示の実施形態では標的核酸に特異的であり、ｇＲＮＡの３’末端に位置する）を含む。ＲＮＡ三重鎖、足場ステム、及び伸長ステムは、合わせて、ｇＲＮＡの「足場」（ｇＲＮＡ足場）と称される。本開示のｇＲＮＡ足場は、ＲＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡを含み得る。ｇＲＮＡ足場は、ウラシル（Ｕ）を含むことができ、１つ以上のウラシルが、チミン（Ｔ）によって置き換えられ得る。
ｂ．ＲＮＡ三重鎖
本明細書に提供されるガイドＲＮＡのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡが、ＲＮＡ三重鎖を含み、ＲＮＡ三重鎖が、場合によっては、２つの介在ステムループ（足場ステムループ及び伸長ステムループ）の後にＡＡＡＧで終わるＵＵＵ－ＮＸ（約４～１５）－ＵＵＵステムループ（配列番号２４１）の配列を含み、三重鎖を越えて二重鎖シュードノットへと伸長してもよいシュードノットを形成する。三重鎖のＵＵ－ＵＵＵ－ＡＡＡ配列は、標的化配列と、足場ステムと、伸長ステムとの間のネクサスとして形成される。例示的なｇＲＮＡでは、ＵＵＵ－ループ－ＵＵＵ領域が最初にコードされ、次いで、足場ステムループがコードされ、次いで、テトラループによって連結された伸長ステムループがコードされ、次いで、ＡＡＡＧが三重鎖を閉じてから標的化配列になる。
ｃ．足場ステムループ
本開示のｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、三重鎖領域の後に足場ステムループが続く。足場ステムループは、ＲＮＰが形成される場合、ＣａｓＸタンパク質（例えば、参照又はＣａｓＸバリアントタンパク質）が結合するｇＲＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、足場ステムループは、かなり短く安定なステムループであり、ｇＲＮＡの全体的な安定性を増加させる。場合によっては、足場ステムループは、多くの変化を許容せず、何らかの形態のＲＮＡバブルを必要とする。いくつかの実施形態では、足場ステムは、ｇＲＮＡの機能に必要である。これは、おそらく、重要なステムループであるＣａｓ９ガイドのネクサスステムに類似しているが、ｇＲＮＡの足場ステムは、いくつかの実施形態では、必要なバルジ（ＲＮＡバブル）を有し、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで見出される多くの他のステムループとは異なる。いくつかの実施形態では、このバルジの存在は、異なるＣａｓＸタンパク質と相互作用するｇＲＮＡにわたって保存されている。ｇＲＮＡの足場ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧ（配列番号２４２）を含む。
ｄ．伸長ステムループ
本開示のｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、足場ステムループの後に伸長ステムループが続く。いくつかの実施形態では、伸長ステムは、主にＣａｓＸタンパク質が結合していない合成ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ融合体を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、高度に可鍛性であり得る。いくつかの実施形態では、シングルガイドｇＲＮＡは、伸長ステムループ中のｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間にＧＡＡＡテトラループリンカー又はＧＡＧＡＡＡリンカーを用いて作製される。場合によっては、ｓｇＲＮＡのターゲッター及びアクチベーターは、介在ヌクレオチドによって互いに連結され、リンカーは、３～２０ヌクレオチドの長さを有し得る。本開示のｓｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムは、リボ核タンパク質複合体中のＣａｓＸタンパク質の外側に位置する大きな３２ｂｐのループである。参照ｇＲＮＡの伸長ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣ（配列番号１５）を含む。
ｅ． 標的化配列
本開示のｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムループの後に、三重鎖の一部を形成する領域が続き、次いで、ｇＲＮＡの３’末端に標的化配列（又は「スペーサー」）が続く。標的化配列は、ＣａｓＸリボ核タンパク質ホロ複合体を、改変される遺伝子の標的核酸配列の特定の領域に標的化する。したがって、例えば、本開示のｇＲＮＡ標的化配列は、ＴＣ ＰＡＭモチーフ又はＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＣＴＣのうちのいずれか１つが、標的配列に相補的な非標的鎖配列に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、ＲＮＰの成分として、真核細胞の標的核酸（例えば、真核生物の染色体、染色体配列など）における遺伝子の一部に相補的な（したがって、それにハイブリダイズすることができる）配列を有する。ｇＲＮＡの標的化配列は、ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、ｇＲＮＡが任意の所望の標的核酸配列の所望の配列を標的化することができるように改変することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、標的配列の５’側にあり、標的化配列が、ｇＲＮＡの３’末端にある。いくつかの実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭモチーフ配列は、ＴＣである。他の実施形態では、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＮＴＣ（すなわち、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣ）である。
いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡを提供し、ｇＲＮＡの標的化配列は、改変される遺伝子の標的核酸配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、遺伝子の標的核酸配列に相補的であり、変異を含む配列を本開示のＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムで編集する目的で、野生型遺伝子配列と比較して１つ以上の変異を含む。このような場合、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムによってもたらされる改変は、変異を修正若しくは補償することができるか、又は変異遺伝子産物の発現をノックダウン若しくはノックアウトすることができる。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、遺伝子をノックダウン又はノックアウトするために、本開示のＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムで変異を導入する配列を編集する目的で、野生型遺伝子の標的核酸配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のエキソンに特異的であるように設計される。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のイントロンに特異的であるように設計される。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子のイントロン－エキソン接合部に特異的であるように設計される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、遺伝子の調節エレメントに特異的であるように設計される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、遺伝子における１つ以上の一塩基多型（single nucleotide polymorphism、ＳＮＰ）を含む配列に相補的であるように設計される。コード配列内又は非コード配列内にあるＳＮＰは、両方とも本開示の範囲内である。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、標的核酸の遺伝子の遺伝子間領域の配列に相補的であるように設計される。
いくつかの実施形態では、標的化配列は、遺伝子産物の発現を調節する調節エレメントに特異的であるように設計される。かかる調節エレメントとしては、プロモーター領域、エンハンサー領域、遺伝子間領域、５’非翻訳領域（5’ untranslated region、５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（3’ untranslated region、３’ＵＴＲ）、保存されたエレメント、及びシス調節エレメントを含む領域が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーター領域は、コード配列の開始点から５ｋｂ以内のヌクレオチドを包含することが意図され、又は遺伝子エンハンサーエレメント若しくは保存されたエレメントの場合、標的核酸の遺伝子のコード配列から数千ｂｐ、数十万ｂｐ、又は更に数百万ｂｐ離れていてもよい。前述において、標的は、遺伝子産物が細胞において発現されない又はより低いレベルで発現されるように、標的のコード遺伝子がノックアウト又はノックダウンされることが意図される標的である。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、１４～３５個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、１０～３０個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の連続したヌクレオチドを有する。他の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化配列は、２０個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５個の連続したヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の連続したヌクレオチドを有し、標的化配列は、標的核酸配列に対して０～５、０～４、０～３、又は０～２個のミスマッチを含むことができ、標的化配列を含むｇＲＮＡを含むＲＮＰが標的核酸に対して相補的な結合を形成することができるように十分な結合特異性を保持することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムは、第１のｇＲＮＡを含み、第２（及び任意選択的に、第３、第４、第５、又はそれ以上）のｇＲＮＡを更に含み、第２のｇＲＮＡ又は追加のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸配列の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有し、その結果、標的核酸において複数の点が標的化され、例えば、ＣａｓＸによって標的核酸において複数の切断が導入される。そのような場合、第２の又は追加のｇＲＮＡは、ＣａｓＸタンパク質の追加のコピーと複合体化されることが理解されるであろう。ｇＲＮＡの標的化配列の選択によって、変異を囲む標的核酸配列の規定された領域を、本明細書に記載のＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムを使用して改変又は編集することができ、例えば、変異反復が生じる場合、又は場合によっては、変異を含むエキソンの除去がそれでも機能的な遺伝子産物の発現をもたらす場合、ドナー鋳型の挿入又は切断部位間のＤＮＡの切除を容易にすることが含まれる。
ｆ．ｇＲＮＡ足場
標的化配列領域を除いて、ｇＲＮＡの残りの領域は、本明細書において足場と称される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、参照ｇＲＮＡとして以下に記載される天然に存在する配列に由来する。他の実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、他のｇＲＮＡバリアントのバリアントであり、変異、挿入、欠失、又はドメイン置換が導入されて、ｇＲＮＡに望ましい特性を付与する。
いくつかの実施形態では、参照ｇＲＮＡは、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａから単離又は誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、配列はＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａから単離又は誘導された例示的な参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号６）及びＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号７）を含み得る。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａから単離又は誘導された例示的なｃｒＲＮＡ配列は、ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２４３）の配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、参照ガイドＲＮＡは、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離又は誘導された配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡである。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離又は誘導された例示的な参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号８）及び
ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号９）を含み得る。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離又は誘導された例示的なｃｒＲＮＡ配列は、ＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２４４）の配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、参照ｇＲＮＡは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離又は誘導された配列を含む。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離又は誘導された例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＡＧＧＧＵ（配列番号１０）、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＡＧＧＵ（配列番号１１）、ＵＵＵＵＡＣＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵ（配列番号１２）及びＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＧＧ（配列番号１３）の配列を含み得る。
表１は、参照ｇＲＮＡ ｔｒａｃｒ、ｃｒの配列及び足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡバリアント配列を提供し、ｇＲＮＡが、表１の配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を有する参照ｇＲＮＡ配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド改変を有する配列を含む足場を有する。ベクターがｇＲＮＡの配列をコードするＤＮＡを含むか又はｇＲＮＡがＲＮＡ及びＤＮＡのキメラである実施形態では、チミン（Ｔ）塩基が、本明細書に記載のｇＲＮＡ配列の実施形態のいずれかのウラシル（Ｕ）塩基に置換され得ることが理解されるであろう。
ｇ．ｇＲＮＡバリアント
別の態様では、本開示は、ｇＲＮＡバリアントに関し、参照ｇＲＮＡ足場に対して１つ以上の改変を含むか、又は別のｇＲＮＡバリアントに由来する。本明細書で使用される場合、「足場」とは、標的化配列を除いて、ｇＲＮＡの機能に必要なｇＲＮＡの全ての部分を指す。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、本開示の参照ｇＲＮＡ配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、又はスワップ若しくは置換された領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、ｇＲＮＡバリアントを生成するために、参照ｇＲＮＡ足場の任意の領域において生じ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント配列の足場は、配列番号４又は配列番号５の配列と少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。他の実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、本開示のｇＲＮＡバリアント配列と比較して、１つ以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、又はスワップ若しくは置換された領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント配列の足場は、配列番号２２３８又は配列番号２２３９の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡ足場の１つ以上の領域内に、参照ｇＲＮＡの特徴を改善する１つ以上のヌクレオチド変化を含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、そのｇＲＮＡと比較して特徴を改善する、それが由来するｇＲＮＡバリアント足場の１つ以上の領域内に１つ以上のヌクレオチド変化を含む。例示的な領域としては、ＲＮＡ三重鎖、シュードノット、足場ステムループ、及び伸長ステムループが挙げられる。場合によっては、バリアント足場ステムは、バブルを更に含む。他の場合では、バリアント足場は、三重鎖ループ領域を更に含む。更に他の場合では、バリアント足場は、５’非構造化領域を更に含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号１４と少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する足場ステムループを含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号２４５）の配列を有する足場ステムループを含む。他の実施形態では、本開示は、配列番号５に対して、Ｃ１８Ｇ置換、Ｇ５５挿入、Ｕ１欠失、並びに改変された伸長ステムループ（元の６ｎｔループ及びループに対して最も近位の（most-loop-proximal）１３塩基対（合計３２ヌクレオチド）が、Ｕｖｓｘヘアピン（４ｎｔループ及びループに対して最も近位の５塩基対；合計１４ヌクレオチド）に置換され、伸長ステムのループに対して遠位の（loop-distal）塩基が、Ａ９９欠失及びＧ６５Ｕ置換によって新しいＵｖｓｘヘアピンに隣接する完全に塩基対合したステムに変換された）を提供する。前述の実施形態では、ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡバリアント１７４であり、配列ＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＵＣＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２２３８）を含む。
バリアントｇＲＮＡを参照ｇＲＮＡ又は本明細書に記載の新しいｇＲＮＡバリアントを生成するために変異誘発されたｇＲＮＡバリアントと比較した場合、１つ以上の改善された特徴を有する又１つ以上の新しい機能を追加する全てのｇＲＮＡバリアントは、本開示の範囲内であると想定される。かかるｇＲＮＡバリアントの代表例は、ガイド２３５（配列番号２２９２）であり、その設計は、実施例に記載されている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡバリアントを含むＲＮＰに新たな機能を追加する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、以下から選択される改善された特徴を有する：安定性の増加、ｇＲＮＡの転写の増加、ヌクレアーゼ活性に対する耐性の増加、ｇＲＮＡのフォールディング率の増加、フォールディング中の副生成物形成の減少、生産的なフォールディングの増加、ＣａｓＸタンパク質に対する結合親和性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸に対する結合親和性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の遺伝子編集の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸の編集の特異性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合のオフターゲット編集の減少、及びＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸の編集におけるＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の増加、又はそれらの任意の組み合わせ。場合によっては、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、配列番号４若しくは配列番号５の参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアント１７４若しくは１７５と比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍増加している。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、配列番号４若しくは配列番号５の参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアント１７４若しくは１７５と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、又はそれ以上増加している。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアント１７４若しくは１７５と比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍増加している。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアント１７４若しくは１７５と比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、又は５００倍増加している。
いくつかの実施形態では、新しいｇＲＮＡバリアントは、本開示のｇＲＮＡバリアントを生成するために、参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアントを１つ以上の変異誘発方法、例えば、以下の実施例で本明細書に記載される変異誘発方法に供することによって作製することができ、これには、網羅的変異進化（ＤＭＥ）、網羅的変異スキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、付着伸長ＰＣＲ、遺伝子シャフリング、又はドメインスワッピングが含まれ得る。参照ｇＲＮＡの活性又は変異誘発を受けるｇＲＮＡバリアントの活性は、ｇＲＮＡバリアントの活性に対するベンチマークとして使用することができ、それによって、ｇＲＮＡバリアントの機能の改善を測定することができる。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡは、ｇＲＮＡバリアント（例えば、合理的に設計されたバリアント）を産生するために、１つ以上の意図的に標的化された変異、置換、又はドメインスワップに供され得る。かかる方法によって産生される例示的なｇＲＮＡバリアントは、実施例に記載されており、ｇＲＮＡ足場の代表的な配列は、表２に提示されている。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアント足場配列と比較して１つ以上の改変を含み、１つ以上の改変は、以下から選択される：ｇＲＮＡの領域における少なくとも１つのヌクレオチド置換、ｇＲＮＡの領域における少なくとも１つのヌクレオチド欠失、ｇＲＮＡの領域における少なくとも１つのヌクレオチド挿入、ｇＲＮＡの領域の全部若しくは一部の置換、ｇＲＮＡの領域の全部若しくは一部の欠失、又は上記の任意の組み合わせ。場合によっては、改変は、ｇＲＮＡの１つ以上の領域における１～１５個の連続した又は連続していないヌクレオチドの置換である。他の場合では、改変は、ｇＲＮＡの１つ以上の領域における１～１０個の連続した又は連続していないヌクレオチドの欠失である。他の場合では、改変は、ｇＲＮＡの１つ以上の領域における１～１０個の連続した又は連続していないヌクレオチドの挿入である。他の場合では、改変は、足場ステムループ又は伸長ステムループの、近位の５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列による置換である。場合によっては、本開示のｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡバリアントと比較して、１つの領域に２つ以上の改変を含む。他の場合では、本開示のｇＲＮＡバリアントは、２つ以上の領域に改変を含む。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントは、この段落に記載されている前述の改変の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、＋１ヌクレオチドがＧである場合、Ｕ６プロモーターからの転写がより効率的であり、開始部位に関してより一貫性があるので、インビボでの発現のために、元のｇＲＮＡと比較して、５’ＧがｇＲＮＡバリアント配列に付加される。他の実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼが＋１位のＧ及び＋２位のプリンを強く好むので、インビトロでの転写で生産効率を増加させるために、２つの５’ＧがｇＲＮＡバリアント配列に付加される。場合によっては、５’Ｇ塩基が、表１の参照足場に付加される。他の場合では、５’Ｇ塩基が、表２のバリアント足場に付加される。
表２は、例示的なｇＲＮＡバリアント足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、表２に列挙される配列番号２１０１～２３３２若しくは２３５３～２３９８の配列のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号２２３８～２３３２若しくは２３５３～２３９８の配列のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント足場は、配列番号２２８１～２３３２若しくは２３５３～２３９８の配列のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。ベクターがｇＲＮＡの配列をコードするＤＮＡを含むか又はｇＲＮＡがＲＮＡ及びＤＮＡのキメラである実施形態では、チミン（Ｔ）塩基が、本明細書に記載のｇＲＮＡ配列の実施形態のいずれかのウラシル（Ｕ）塩基に置換され得ることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、表２の配列番号２２３８、配列番号２２３９、配列番号２２４０、配列番号２２４１、配列番号２２４３、配列番号２２５６、配列番号２２７４、配列番号２２７５、配列番号２２７９、配列番号２２８１、配列番号２２８５、配列番号２２８９、配列番号２２９２、又は配列番号２３０８の配列に対する１つ以上の追加の改変を含む。
本開示のｇＲＮＡバリアントのいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号５の参照ガイド足場と比較して少なくとも１つの改変を含み、少なくとも１つの改変が、以下のうちの１つ以上から選択される：（ａ）三重鎖ループ内のＣ１８Ｇ置換、（ｂ）ステムバブルにおけるＧ５５挿入、（ｃ）Ｕ１欠失、（ｄ）（ｉ）６ｎｔループ及びループに対して近位の１３塩基対がＵｖｓｘヘアピンによって置換されており、（ｉｉ）Ａ９９の欠失及びＧ６５Ｕの置換により、ループに対して遠位の塩基が完全に塩基対合している、伸長ステムループの改変。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を有する外因性ステムループを含む。本明細書で使用されるｌｎｃＲＮＡは、長さが約２００ｂｐよりも長い非コードＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの５’末端及び３’末端は、塩基対合している（すなわち、二重鎖ＲＮＡの領域を形成するように相互作用する）。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの５’末端及び３’末端は、塩基対合しており、外因性ステムループの５’末端と３’末端との間の１つ以上の領域は、塩基対合しておらず、ループを形成する。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ｇＲＮＡと比較して、ヌクレオチドの改変を有するｇＲＮＡバリアントを提供し、（ａ）ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１５個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの置換、（ｂ）ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの欠失、（ｃ）ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの挿入、（ｄ）足場ステムループ若しくは伸長ステムループの、近位の５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列による置換、又は（ａ）～（ｄ）の任意の組み合わせ、を有する。本明細書に記載の置換、挿入及び欠失のうちのいずれかを組み合わせて、本開示のｇＲＮＡバリアントを生成することができる。例えば、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの欠失、参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの挿入、参照ｇＲＮＡと比較して、少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの欠失、又は参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの置換、１つの挿入、及び１つの欠失、を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡバリアントは、以前に生成されたバリアントの配列に対する１つ以上の改変を含み、以前に生成されたバリアント自体が、改変される配列として機能する。場合によっては、１つ以上の改変が、足場のシュードノット領域に導入される。他の場合では、１つ以上の改変が、足場の三重鎖領域に導入される。他の場合では、１つ以上の改変が足場バブルに導入される。他の場合では、１つ以上の改変が、足場の伸長ステム領域に導入される。更に他の場合では、改変の１つは、前述の領域の２つ以上に導入される。このような改変は、前述の領域における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、若しくは置換、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。改変を生成及び評価するための例示的な方法は、実施例１５に記載される。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８、配列番号２２３９、配列番号２２４０、配列番号２２４１、配列番号２２４１、配列番号２２７４、配列番号２２７５、配列番号２２７９、又は配列番号２２８５、配列番号２２８９、配列番号２２９２、又は配列番号２３０８の配列に対する１つ以上の改変を含む。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４（配列番号２２３８）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７４と比較して機能的特徴の改善を示す。他の例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント１７５（配列番号２２３９）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７５と比較して機能的特徴の改善を示す。例えば、ｇＲＮＡバリアント１７５の三重ループに対して改変を有するバリアントは、特にＣ１５又はＣ１７に対する変異は、１７５足場と比較して高い濃縮を示す。追加的に、Ｇ７とＡ２９との間のシュードノットステムにおける予測されるペアのいずれかのメンバーに対する変化は、１７５足場と比較して、両方とも高度に濃縮され、Ａ２９をＣ又はＴに変換して、正準ワトソン－クリック対合（Ｇ７： Ｃ２９）を形成し、その２つ目は、ＧＵゆらぎ対（Ｇ７： Ｕ２９）を形成し、その両方とも、Ｇ： Ａ対と比較して、ヘリックスの安定性を増加させることが予想され得る。加えて、ガイド足場１７５における５４位でのＣの挿入は、濃縮された改変をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示は、表１９の改変からなる群から選択されるｇＲＮＡ足場バリアント１７４（配列番号２２３８）に対する１つ以上の改変を含むｇＲＮＡバリアントを提供し、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７４と比較して、機能的特徴の改善を示す。いくつかの実施形態では、改善された機能的特徴は、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、足場ステム安定性の増加、伸長ステム安定性、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である。前述の実施形態では、表１６の改変からなる群から選択されるｇＲＮＡ足場バリアント１７４に対する１つ以上の改変を含むｇＲＮＡ（連結された標的化配列を有し、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体化する）は、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３８のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい、改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す。
いくつかの実施形態では、本開示は、表２０の改変からなる群から選択されるｇＲＮＡ足場バリアント１７５（配列番号２２３９）に対する１つ以上の改変を含むｇＲＮＡバリアントを提供し、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親１７５と比較して、機能的特徴の改善を示す。いくつかの実施形態では、改善された機能的特徴は、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、足場ステム安定性の増加、伸長ステム安定性、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である。前述の実施形態では、表１６の改変からなる群から選択されるｇＲＮＡ足場バリアント１７５に対する１つ以上の改変を含むｇＲＮＡ（連結された標的化配列を有し、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体化する）は、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３９のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約１．２、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい、改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４の１つ以上の改変は、ヌクレオチド位置Ｕ１１、Ｕ２４、Ａ２９、Ｕ６５、Ｃ６６、Ｃ６８、Ａ６９、Ｕ７６、Ｇ７７、Ａ７９、及びＡ８７からなる群から選択される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４の改変は、Ｕ１１Ｃ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、Ｕ６５Ｃ、Ｃ６６Ｇ、Ｃ６８Ｕ、６９位でのＡＣＧＧＡの挿入、７６位でのＵＣＣＧＵの挿入、Ｇ７７Ａ、７９位でのＧＡの挿入、Ａ８７Ｇである。別の特定の実施形態では、ｇＲＮＡ足場バリアント１７５の改変は、ヌクレオチド位置Ｃ９、Ｕ１１、Ｃ１７、Ｕ２４、Ａ２９、Ｇ５４、Ｃ６５、Ａ８９、及びＡ９６からなる群から選択される。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ足場バリアント１７４の改変は、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位でのＧの挿入、６５位でのＣの挿入、Ａ８９Ｇ、及びＡ９６Ｇである。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２１５（配列番号２２７５）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２１５と比較して機能的特徴の改善を示す。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２２１（配列番号２２８１）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２２１と比較して機能的特徴の改善を示す。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２２５（配列番号２２８５）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２２５と比較して機能的特徴の改善を示す。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２３５（配列番号２２９２）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２２５と比較して機能的特徴の改善を示す。
例示的な実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ足場バリアント２５１（配列番号２３０８）に対する１つ以上の改変を含み、得られたｇＲＮＡバリアントは、同等の条件下でインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価した場合、親２５１と比較して機能的特徴の改善を示す。
前述の実施形態では、改善された機能的特徴は、安定性の増加、ｇＲＮＡの転写の増加、ヌクレアーゼ活性に対する耐性の増加、ｇＲＮＡのフォールディング率の増加、フォールディング中の副生成物形成の減少、生産的なフォールディングの増加、ＣａｓＸタンパク質に対する結合親和性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸に対する結合親和性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の遺伝子編集の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の編集の特異性の増加、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合のオフターゲット編集の減少、及びＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸の改変におけるＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の増加のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。場合によっては、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、それが由来するｇＲＮＡと比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、それが由来するｇＲＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、又はそれ以上改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、それが由来するｇＲＮＡと比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍改善されている。他の場合では、ｇＲＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、それが由来するｇＲＮＡと比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、又は５００倍改善されている。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、外因性伸長ステムループを含み、参照ｇＲＮＡとのかかる差異は、以下の通りである。いくつかの実施形態では、外因性伸長ステムループは、本明細書に開示される参照ステムループ領域（例えば、配列番号１５）とほとんど又は全く同一性を有しない。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐ、少なくとも２，０００ｂｐ、少なくとも３，０００ｂｐ、少なくとも４，０００ｂｐ、少なくとも５，０００ｂｐ、少なくとも６，０００ｂｐ、少なくとも７，０００ｂｐ、少なくとも８，０００ｂｐ、少なくとも９，０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１５，０００ｂｐ、又は少なくとも２０，０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、又は少なくとも１０，０００ヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、異種ステムループは、ｇＲＮＡの安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、異種ＲＮＡステムループは、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、又は小分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、ステムループを置換する外因性ステムループ領域は、ＲＮＡステムループ又はヘアピンを含み、得られるｇＲＮＡは、安定性が増加しており、ループの選択に応じて、特定の細胞タンパク質又はＲＮＡと相互作用することができる。かかる外因性伸長ステムループは、例えば、熱安定性ＲＮＡ、例えば、ＭＳ２ヘアピン（ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵ（配列番号１１３７））、Ｑβヘアピン（ＵＧＣＡＵＧＵＣＵＡＡＧＡＣＡＧＣＡ（配列番号３２））、Ｕ１ヘアピンＩＩ（ＡＡＵＣＣＡＵＵＧＣＡＣＵＣＣＧＧＡＵＵ（配列番号３３））、Ｕｖｓｘ（ＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧ（配列番号３４））、ＰＰ７ヘアピン（ＡＧＧＡＧＵＵＵＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＣＣＵ（配列番号３５））、ファージ複製ループ（ＡＧＧＵＧＧＧＡＣＧＡＣＣＵＣＵＣＧＧＵＣＧＵＣＣＵＡＵＣＵ（配列番号３６））、キッシングループ＿ａ（ＵＧＣＵＣＧＣＵＣＣＧＵＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号３７））、キッシングループ＿ｂ１（ＵＧＣＵＣＧＡＣＧＣＧＵＣＣＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号３８））、キッシングループ＿ｂ２（ＵＧＣＵＣＧＵＵＵＧＣＧＧＣＵＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号３９））、Ｇ三重鎖Ｍ３ｑ（ＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ（配列番号４０））、Ｇ四重鎖テロメアバスケット（ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧ（配列番号４１））、サルシン－リシンループ（ＣＵＧＣＵＣＡＧＵＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧ（配列番号４２））、又はシュードノット（ＵＡＣＡＣＵＧＧＧＡＵＣＧＣＵＧＡＡＵＵＡＧＡＧＡＵＣＧＧＣＧＵＣＣＵＵＵＣＡＵＵＣＵＡＵＡＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＵＵＵＵＡＡＡＡＵＧＵＣＵＣＵＡＡＧＵＡＣＡ（配列番号４３））を含み得る。いくつかの実施形態では、前述のヘアピン配列のうちの１つは、ステムループに組み込まれて、対応するリガンドがＸＤＰのＧａｇポリタンパク質に組み込まれる場合、ｇＲＮＡ（及びＲＮＰ複合体中の関連するＣａｓＸ）の出芽ＸＤＰへの組み込みを輸送するのを助ける（以下でより詳細に記載される）。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、末端融合パートナーを含む。ｇＲＮＡバリアントという用語は、末端融合又は内部挿入などの外因性配列を含むバリアントを包含する。例示的な末端融合は、自己切断リボザイム又はタンパク質結合モチーフへのｇＲＮＡの融合を含み得る。本明細書中で使用される場合、「リボザイム」とは、タンパク質酵素に類似する１つ以上の触媒活性を有するＲＮＡ又はそのセグメントを指す。例示的なリボザイムの触媒活性としては、例えば、ＲＮＡの切断及び／若しくはライゲーション、ＤＮＡの切断及び／若しくはライゲーション、又はペプチド結合形成が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、このような融合は、足場のフォールディングを改善するか、又はＤＮＡ修復機構を動員するかのいずれかであり得る。例えば、ｇＲＮＡは、いくつかの実施形態では、δ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）アンチゲノムリボザイム、ＨＤＶゲノムリボザイム、ハチェットリボザイム（メタゲノムデータから）、ｅｎｖ２５ピストルリボザイム（Ａｌｉｉｓｔｉｐｅｓ ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ由来の代表）、ＨＨ１５最小ハンマーヘッドリボザイム、タバコ輪斑ウイルス（ＴＲＳＶ）リボザイム、ＷＴウイルスハンマーヘッドリボザイム（及び合理的バリアント）、又はツイステッド・シスター１若しくはＲＢＭＸ動員モチーフに融合され得る。ハンマーヘッドリボザイムは、ＲＮＡ分子内の特定の部位で可逆的な切断及びライゲーション反応を触媒するＲＮＡモチーフである。ハンマーヘッドリボザイムには、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ハンマーヘッドリボザイムが含まれる。ＨＤＶ、ピストル、及びハチェットリボザイムは、自己切断活性を有する。１つ以上のリボザイムを含むｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ参照と比較して拡張されたｇＲＮＡ機能を可能にし得る。例えば、自己切断リボザイムを含むｇＲＮＡは、いくつかの実施形態では、転写され、ポリシストロン性転写物の一部として成熟ｇＲＮＡへとプロセシングされ得る。このような融合は、ｇＲＮＡの５’末端又は３’末端のいずれかで起こり得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、５’末端と３’末端の両方に融合を含み、各融合は、独立して、本明細書に記載の通りである。
ｇＲＮＡバリアントの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、ｇＲＮＡの３’末端に位置し、標的核酸とハイブリダイズすることができるスペーサー（又は標的化配列）領域を更に含み、スペーサーが、少なくとも１４～約３５ヌクレオチドを含み、標的核酸に相補的である配列を用いて設計される。いくつかの実施形態では、コードされたｇＲＮＡバリアントは、標的核酸に相補的な少なくとも１０～２０ヌクレオチドの標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、コードされたｇＲＮＡバリアントは、２０ヌクレオチドを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２５ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２４ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２３ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２２ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２１ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４ヌクレオチドを有する。
ｈ．クラス２、Ｖ型タンパク質との複合体形成
いくつかの実施形態では、発現時に、ｇＲＮＡバリアントは、表３の配列番号２４７～５９２若しくは１１４７～１２３１の配列のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質を含むクラス２、Ｖ型タンパク質とＲＮＰとして複合体化される。いくつかの実施形態では、発現時に、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号２７０～５９２若しくは１１４７～１２３１の配列のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質とＲＮＰとして複合体化される。いくつかの実施形態では、発現時に、ｇＲＮＡバリアントは、配列番号４１５～５９２若しくは１１４７～１２３１の配列のうちのいずれか１つ、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質とＲＮＰとして複合体化される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較した場合、ＣａｓＸバリアントタンパク質と複合体を形成する改善された能力を有し、それによって、実施例に記載されるように、ＣａｓＸタンパク質と切断コンピテントリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するその能力を改善する。リボ核タンパク質複合体の形成を改善することは、いくつかの実施形態では、機能的なＲＮＰが構築される効率を改善することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡバリアント及びその標的化配列を含むＲＮＰの９０％超、９３％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又は９９％超が、標的核酸の遺伝子編集に適格である。
ＣａｓＸタンパク質と複合体を形成するｇＲＮＡバリアントの能力を改善することができる例示的なヌクレオチド変化は、いくつかの実施形態では、足場ステムを熱安定性ステムループで置換することを含み得る。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、足場ステムを熱安定性ステムループで置換することによって、ｇＲＮＡバリアントとＣａｓＸタンパク質との全体的な結合安定性を増加させることができる。代替的に、又は追加的に、ステムループの大部分を除去することによって、ｇＲＮＡバリアントのフォールディング動態が変化し、例えば、ｇＲＮＡバリアントがそれ自体で「もつれ」得る程度を減少させることによって、機能的にフォールディングされたｇＲＮＡがより容易にかつ迅速に構造的に構築成され得る。いくつかの実施形態では、足場ステムループ配列の選択は、ｇＲＮＡのために利用される異なる標的化配列によって変化し得る。いくつかの実施形態では、足場配列は、標的化配列、したがって、標的配列に合わせて調整することができる。実施例のアッセイを含む生化学的アッセイを使用して、ＲＮＰを形成するためのｇＲＮＡバリアントに対するＣａｓＸタンパク質の結合親和性を評価することができる。例えば、当業者は、追加の非標識「コールド競合（cold competitor）」ｇＲＮＡの濃度の増加に対する応答として、固定化ＣａｓＸタンパク質に結合している蛍光タグ付きｇＲＮＡの量の変化を測定することができる。代替的に、又は追加的に、異なる量の蛍光標識されたｇＲＮＡが固定化ＣａｓＸタンパク質上を流れる際に、蛍光シグナルがどのように変化するのかを監視又は観察することができる。代替的に、ＲＮＰを形成する能力は、実施例に記載されるように、規定された標的核酸配列に対するインビトロ切断アッセイを使用して評価され得る。
ｉ．化学的に改変されたｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本開示は、化学的に改変されたｇＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドＮＡ機能性を有し、ヌクレアーゼによる切断に対する感受性が低減された、化学的に修飾されたｇＲＮＡを提供する。４つの正準リボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ）以外の任意のヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、化学的に改変されたｇＲＮＡである。場合によっては、化学的に改変されたｇＲＮＡは、天然のホスホジエステルヌクレオチド間結合以外の任意の骨格又はヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、保持された機能性は、改変されたｇＲＮＡが本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸに結合する能力を含む。特定の実施形態では、保持された機能性は、改変されたｇＲＮＡが標的核酸配列に結合する能力を含む。特定の実施形態では、保持された機能性は、ＣａｓＸタンパク質を標的化すること、又は予め複合体化されたＲＮＰが標的核酸配列に結合する能力を含む。特定の実施形態では、保持された機能性は、ＣａｓＸ－ｇＲＮＡが標的ポリヌクレオチドにニックを入れる能力を含む。特定の実施形態では、保持された機能性は、ＣａｓＸ－ｇＲＮＡが標的核酸配列を切断する能力を含む。特定の実施形態では、保持された機能性は、本開示の実施形態のＣａｓＸキメラタンパク質を有する組換えシステムにおけるｇＲＮＡの任意の他の既知の機能である。
いくつかの実施形態では、本開示は、化学的に改変されたｇＲＮＡを提供し、２’－Ｏ－Ｃ１～４アルキル、例えば、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－デオキシ（２’－Ｈ）、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、例えば、２’－メトキシエチル（「２’－ＭＯＥ」）、２’－フルオロ（「２’－Ｆ」）、２’－アミノ（「２’－ＮＨ２」）、２’－アラビノシル（「２’－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノシル（「２’－Ｆ－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド、２’－アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチド、Ｌ型の糖（「Ｌ－糖」）、及び４’－チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチド糖の改変が、ｇＲＮＡに組み込まれる。他の実施形態では、ホスホロチオエート「Ｐ（Ｓ）」（Ｐ（Ｓ））、ホスホノカルボキシレート（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、ホスホノアセテート「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、チオホスホノカルボキシレート（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、チオホスホノアセテート「ｔｈｉｏＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯ－））、アルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１－３アルキル）、例えば、メチルホスホネート－Ｐ（ＣＨ３）、ボラノホスホネート（Ｐ（ＢＨ３））、及びホスホロジチオエート（Ｐ（Ｓ）２）からなる群から選択されるヌクレオチド間結合の改変が、ガイドＲＮＡに組み込まれる。
特定の実施形態では、本開示は、化学的に改変されたｇＲＮＡを提供し、２－チオウラシル（「２－チオＵ」）、２－チオシトシン（「２－チオＣ」）、４－チオウラシル（「４－チオＵ」）、６－チオグアニン（「６－チオＧ」）、２－アミノアデニン（「２－アミノＡ」）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（「５－メチルＣ」）、５－メチルウラシル（「５－メチルＵ」）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル（「５－アリルＵ」）、５－アリルシトシン（「５－アリルＣ」）、５－アミノアリルウラシル（「５－アミノアリルＵ」）、５－アミノアリル－シトシン（「５－アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、不定形核酸（「ＵＮＡ」）、イソグアニン（「ｉｓｏＧ」）、イソシトシン（「ｉｓｏＣ」）、５－メチル－２－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、及びｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）からなる群から選択される核酸塩基（「塩基」）の改変が、ｇＲＮＡに組み込まれる。
他の実施形態では、本開示は、化学的に改変されたｇＲＮＡを提供し、１つ以上の１５Ｎ、１３Ｃ、１４Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ原子又はトレーサーとして使用される他の原子若しくは元素を含むヌクレオチドを含む、ヌクレオチド糖、核酸塩基、ホスホジエステル結合、及び／又はヌクレオチドリン酸に１つ以上の同位体改変が導入される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに組み込まれる「末端」の改変は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、炭化水素リンカー（ヘテロ原子（Ｏ，Ｓ，Ｎ）置換炭化水素スペーサー、ハロ置換炭化水素スペーサー、ケト－、カルボキシル－、アミド－、チオニル－、カルバモイル－、チオノカルバマオイル－含有炭化水素スペーサー）、スペルミンリンカー、リンカーに結合した蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン）などの色素、例えば、６－フルオレセイン－ヘキシル、クエンチャー（例えば、ダブシル、ＢＨＱ）、並びに他の標識（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アクリジン、ストレプトアビジン、アビジン、ペプチド、及び／又はタンパク質））からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、「末端」の改変は、デオキシヌクレオチド及び／若しくはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミン、並びに／又は他の分子を含む別の分子へのｇＲＮＡのコンジュゲーション（若しくはライゲーション）を含む。特定の実施形態では、本開示は、化学的に改変されたｇＲＮＡを提供し、「末端」の改変（上記）が、例えば、２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーなどのリンカーを介してｇＲＮＡ配列の内部に位置し、リンカーが、ホスホジエステル結合として組み込まれ、ｇＲＮＡにおける２つのヌクレオチド間のどこにでも組み込まれ得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、末端の改変を有する化学的に改変されたｇＲＮＡを提供し、末端官能基、例えば、アミン、チオール（又はスルフヒドリル）、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボニル、チオニル、チオカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、ホスホリル、アルケン、アルキン、ハロゲン、又は官能基末端リンカーなどの末端官能基を含み、これらは続いて、蛍光色素、非蛍光標識、タグ（１４Ｃについては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、又は１５Ｎ、１３Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉなどの同位体標識を含有する部分）、オリゴヌクレオチド（アプタマーを含むデオキシヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを含む）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、及びビタミンからなる群から選択される所望の部分にコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションには、当該技術分野で周知の標準的な化学が使用され、限定されないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、ＤＣＣ（若しくはＤＣＩ）を介したカップリング、及び／又は任意の他の標準的な方法（その内容が参照によりその全体が本明細書に援用される”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｅｓｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３ｒｄ ｅｄ．（２０１３）に記載されている）が挙げられる。
ＩＶ．標的核酸を改変するためのクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質
本開示は、真核細胞のゲノム編集において有用であるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含むシステムを提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム編集システムにおいて用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２、Ｖ型ヌクレアーゼである。クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのメンバーには相違点があるが、それらは、それらをＣａｓ９システムと区別するいくつかの共通の特徴を共有する。まず、クラス２、Ｖ型ヌクレアーゼは、単一のＲＮＡ誘導ＲｕｖＣドメイン含有エフェクターを有するが、ＨＮＨドメインを有さず、非標的鎖上の標的領域の５’上流のＴＣモチーフのＰＡＭを認識し、これは、標的配列の３’側でＧ－リッチＰＡＭに依存するＣａｓ９システムとは異なる。Ｖ型ヌクレアーゼは、ＰＡＭに近い近位部位に平滑末端を生成するＣａｓ９とは異なり、ＰＡＭ配列に対して遠位にずれた二本鎖切断を生成する。加えて、Ｖ型ヌクレアーゼは、シスで結合する標的ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡによって活性化された場合、トランスでｓｓＤＮＡを分解する。いくつかの実施形態では、本実施形態のＶ型ヌクレアーゼは、５’－ＴＣ ＰＡＭモチーフを認識し、ＲｕｖＣドメインによってのみ切断される付着末端を生成する。いくつかの実施形態では、Ｖ型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１２ｋ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、Ｃ２ｃ９、ＣａｓＺ、及びＣａｓＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸバリアントタンパク質と、１つ以上のｇＲＮＡバリアントとを含むシステム（ＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステム）を提供し、これは、真核細胞において標的核酸配列を改変するように特別に設計されている。
本明細書で使用される「ＣａｓＸタンパク質」という用語は、タンパク質のファミリーを指し、全ての天然に存在するＣａｓＸタンパク質、天然に存在するＣａｓＸタンパク質と少なくとも５０％の同一性を共有するタンパク質、並びに天然に存在する参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアントと比較して１つ以上の改善された特徴を有するＣａｓＸバリアントを包含する。
本開示のＣａｓＸタンパク質は、以下のドメインのうちの少なくとも１つを含む：非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖装填（target strand loading、ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン（ヘリックスＩ－Ｉ及びＩ－ＩＩサブドメインに更に分割される）、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ、ＯＢＤ－Ｉ及びＯＢＤ－ＩＩサブドメインに更に分割される）、並びにＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ及びＩＩサブドメインに更に分割される）。ＲｕｖＣドメインは、以下でより詳細に記載される触媒的に不活性な（catalytically-dead）ＣａｓＸバリアントにおいて改変又は欠失され得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、標的核酸配列内の配列にハイブリダイズする関連するｇＲＮＡによって標的化される特定の配列において標的核酸に結合する及び／又はそれを改変する（例えば、ニックを入れる、二本鎖切断を触媒する、メチル化する、脱メチル化するなど）ことができる。
ａ．参照ＣａｓＸタンパク質
本開示は、天然に存在するＣａｓＸタンパク質（本明細書において「参照ＣａｓＸタンパク質」と称される）を提供し、これはその後、本開示のＣａｓＸバリアントを作製するために改変された。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、又はＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａ種などの天然に存在する原核生物から単離することができる。参照ＣａｓＸタンパク質は、ガイドＲＮＡと相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するタンパク質のＣａｓＸ（互換的に、Ｃａｓ１２ｅと称される）ファミリーに属するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。
場合によっては、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されるか又はそれに由来し、以下の配列を有する：
１ ＭＥＫＲＩＮＫＩＲＫ ＫＬＳＡＤＮＡＴＫＰ ＶＳＲＳＧＰＭＫＴＬ ＬＶＲＶＭＴＤＤＬＫ ＫＲＬＥＫＲＲＫＫＰ ＥＶＭＰＱＶＩＳＮＮ
６１ ＡＡＮＮＬＲＭＬＬＤ ＤＹＴＫＭＫＥＡＩＬ ＱＶＹＷＱＥＦＫＤＤ ＨＶＧＬＭＣＫＦＡＱ ＰＡＳＫＫＩＤＱＮＫ ＬＫＰＥＭＤＥＫＧＮ
１２１ ＬＴＴＡＧＦＡＣＳＱ ＣＧＱＰＬＦＶＹＫＬ ＥＱＶＳＥＫＧＫＡＹ ＴＮＹＦＧＲＣＮＶＡ ＥＨＥＫＬＩＬＬＡＱ ＬＫＰＥＫＤＳＤＥＡ
１８１ ＶＴＹＳＬＧＫＦＧＱ ＲＡＬＤＦＹＳＩＨＶ ＴＫＥＳＴＨＰＶＫＰ ＬＡＱＩＡＧＮＲＹＡ ＳＧＰＶＧＫＡＬＳＤ ＡＣＭＧＴＩＡＳＦＬ
２４１ ＳＫＹＱＤＩＩＩＥＨ ＱＫＶＶＫＧＮＱＫＲ ＬＥＳＬＲＥＬＡＧＫ ＥＮＬＥＹＰＳＶＴＬ ＰＰＱＰＨＴＫＥＧＶ ＤＡＹＮＥＶＩＡＲＶ
３０１ ＲＭＷＶＮＬＮＬＷＱ ＫＬＫＬＳＲＤＤＡＫ ＰＬＬＲＬＫＧＦＰＳ ＦＰＶＶＥＲＲＥＮＥ ＶＤＷＷＮＴＩＮＥＶ ＫＫＬＩＤＡＫＲＤＭ
３６１ ＧＲＶＦＷＳＧＶＴＡ ＥＫＲＮＴＩＬＥＧＹ ＮＹＬＰＮＥＮＤＨＫ ＫＲＥＧＳＬＥＮＰＫ ＫＰＡＫＲＱＦＧＤＬ ＬＬＹＬＥＫＫＹＡＧ
４２１ ＤＷＧＫＶＦＤＥＡＷ ＥＲＩＤＫＫＩＡＧＬ ＴＳＨＩＥＲＥＥＡＲ ＮＡＥＤＡＱＳＫＡＶ ＬＴＤＷＬＲＡＫＡＳ ＦＶＬＥＲＬＫＥＭＤ
４８１ ＥＫＥＦＹＡＣＥＩＱ ＬＱＫＷＹＧＤＬＲＧ ＮＰＦＡＶＥＡＥＮＲ ＶＶＤＩＳＧＦＳＩＧ ＳＤＧＨＳＩＱＹＲＮ ＬＬＡＷＫＹＬＥＮＧ
５４１ ＫＲＥＦＹＬＬＭＮＹ ＧＫＫＧＲＩＲＦＴＤ ＧＴＤＩＫＫＳＧＫＷ ＱＧＬＬＹＧＧＧＫＡ ＫＶＩＤＬＴＦＤＰＤ ＤＥＱＬＩＩＬＰＬＡ
６０１ ＦＧＴＲＱＧＲＥＦＩ ＷＮＤＬＬＳＬＥＴＧ ＬＩＫＬＡＮＧＲＶＩ ＥＫＴＩＹＮＫＫＩＧ ＲＤＥＰＡＬＦＶＡＬ ＴＦＥＲＲＥＶＶＤＰ
６６１ ＳＮＩＫＰＶＮＬＩＧ ＶＤＲＧＥＮＩＰＡＶ ＩＡＬＴＤＰＥＧＣＰ ＬＰＥＦＫＤＳＳＧＧ ＰＴＤＩＬＲＩＧＥＧ ＹＫＥＫＱＲＡＩＱＡ
７２１ ＡＫＥＶＥＱＲＲＡＧ ＧＹＳＲＫＦＡＳＫＳ ＲＮＬＡＤＤＭＶＲＮ ＳＡＲＤＬＦＹＨＡＶ ＴＨＤＡＶＬＶＦＥＮ ＬＳＲＧＦＧＲＱＧＫ
７８１ ＲＴＦＭＴＥＲＱＹＴ ＫＭＥＤＷＬＴＡＫＬ ＡＹＥＧＬＴＳＫＴＹ ＬＳＫＴＬＡＱＹＴＳ ＫＴＣＳＮＣＧＦＴＩ ＴＴＡＤＹＤＧＭＬＶ
８４１ ＲＬＫＫＴＳＤＧＷＡ ＴＴＬＮＮＫＥＬＫＡ ＥＧＱＩＴＹＹＮＲＹ ＫＲＱＴＶＥＫＥＬＳ ＡＥＬＤＲＬＳＥＥＳ ＧＮＮＤＩＳＫＷＴＫ
９０１ ＧＲＲＤＥＡＬＦＬＬ ＫＫＲＦＳＨＲＰＶＱ ＥＱＦＶＣＬＤＣＧＨ ＥＶＨＡＤＥＱＡＡＬ ＮＩＡＲＳＷＬＦＬＮ ＳＮＳＴＥＦＫＳＹＫ
９６１ ＳＧＫＱＰＦＶＧＡＷ ＱＡＦＹＫＲＲＬＫＥ ＶＷＫＰＮＡ（配列番号１）。
場合によっては、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されるか又はそれに由来し、以下の配列を有する：
１ ＭＱＥＩＫＲＩＮＫＩ ＲＲＲＬＶＫＤＳＮＴ ＫＫＡＧＫＴＧＰＭＫ ＴＬＬＶＲＶＭＴＰＤ ＬＲＥＲＬＥＮＬＲＫ ＫＰＥＮＩＰＱＰＩＳ
６１ ＮＴＳＲＡＮＬＮＫＬ ＬＴＤＹＴＥＭＫＫＡ ＩＬＨＶＹＷＥＥＦＱ ＫＤＰＶＧＬＭＳＲＶ ＡＱＰＡＰＫＮＩＤＱ ＲＫＬＩＰＶＫＤＧＮ
１２１ ＥＲＬＴＳＳＧＦＡＣ ＳＱＣＣＱＰＬＹＶＹ ＫＬＥＱＶＮＤＫＧＫ ＰＨＴＮＹＦＧＲＣＮ ＶＳＥＨＥＲＬＩＬＬ ＳＰＨＫＰＥＡＮＤＥ
１８１ ＬＶＴＹＳＬＧＫＦＧ ＱＲＡＬＤＦＹＳＩＨ ＶＴＲＥＳＮＨＰＶＫ ＰＬＥＱＩＧＧＮＳＣ ＡＳＧＰＶＧＫＡＬＳ ＤＡＣＭＧＡＶＡＳＦ
２４１ ＬＴＫＹＱＤＩＩＬＥ ＨＱＫＶＩＫＫＮＥＫ ＲＬＡＮＬＫＤＩＡＳ ＡＮＧＬＡＦＰＫＩＴ ＬＰＰＱＰＨＴＫＥＧ ＩＥＡＹＮＮＶＶＡＱ
３０１ ＩＶＩＷＶＮＬＮＬＷ ＱＫＬＫＩＧＲＤＥＡ ＫＰＬＱＲＬＫＧＦＰ ＳＦＰＬＶＥＲＱＡＮ ＥＶＤＷＷＤＭＶＣＮ ＶＫＫＬＩＮＥＫＫＥ
３６１ ＤＧＫＶＦＷＱＮＬＡ ＧＹＫＲＱＥＡＬＬＰ ＹＬＳＳＥＥＤＲＫＫ ＧＫＫＦＡＲＹＱＦＧ ＤＬＬＬＨＬＥＫＫＨ ＧＥＤＷＧＫＶＹＤＥ
４２１ ＡＷＥＲＩＤＫＫＶＥ ＧＬＳＫＨＩＫＬＥＥ ＥＲＲＳＥＤＡＱＳＫ ＡＡＬＴＤＷＬＲＡＫ ＡＳＦＶＩＥＧＬＫＥ ＡＤＫＤＥＦＣＲＣＥ
４８１ ＬＫＬＱＫＷＹＧＤＬ ＲＧＫＰＦＡＩＥＡＥ ＮＳＩＬＤＩＳＧＦＳ ＫＱＹＮＣＡＦＩＷＱ ＫＤＧＶＫＫＬＮＬＹ ＬＩＩＮＹＦＫＧＧＫ
５４１ ＬＲＦＫＫＩＫＰＥＡ ＦＥＡＮＲＦＹＴＶＩ ＮＫＫＳＧＥＩＶＰＭ ＥＶＮＦＮＦＤＤＰＮ ＬＩＩＬＰＬＡＦＧＫ ＲＱＧＲＥＦＩＷＮＤ
６０１ ＬＬＳＬＥＴＧＳＬＫ ＬＡＮＧＲＶＩＥＫＴ ＬＹＮＲＲＴＲＱＤＥ ＰＡＬＦＶＡＬＴＦＥ ＲＲＥＶＬＤＳＳＮＩ ＫＰＭＮＬＩＧＩＤＲ
６６１ ＧＥＮＩＰＡＶＩＡＬ ＴＤＰＥＧＣＰＬＳＲ ＦＫＤＳＬＧＮＰＴＨ ＩＬＲＩＧＥＳＹＫＥ ＫＱＲＴＩＱＡＡＫＥ ＶＥＱＲＲＡＧＧＹＳ
７２１ ＲＫＹＡＳＫＡＫＮＬ ＡＤＤＭＶＲＮＴＡＲ ＤＬＬＹＹＡＶＴＱＤ ＡＭＬＩＦＥＮＬＳＲ ＧＦＧＲＱＧＫＲＴＦ ＭＡＥＲＱＹＴＲＭＥ
７８１ ＤＷＬＴＡＫＬＡＹＥ ＧＬＰＳＫＴＹＬＳＫ ＴＬＡＱＹＴＳＫＴＣ ＳＮＣＧＦＴＩＴＳＡ ＤＹＤＲＶＬＥＫＬＫ ＫＴＡＴＧＷＭＴＴＩ
８４１ ＮＧＫＥＬＫＶＥＧＱ ＩＴＹＹＮＲＹＫＲＱ ＮＶＶＫＤＬＳＶＥＬ ＤＲＬＳＥＥＳＶＮＮ ＤＩＳＳＷＴＫＧＲＳ ＧＥＡＬＳＬＬＫＫＲ
９０１ ＦＳＨＲＰＶＱＥＫＦ ＶＣＬＮＣＧＦＥＴＨ ＡＤＥＱＡＡＬＮＩＡ ＲＳＷＬＦＬＲＳＱＥ ＹＫＫＹＱＴＮＫＴＴ ＧＮＴＤＫＲＡＦＶＥ
９６１ ＴＷＱＳＦＹＲＫＫＬ ＫＥＶＷＫＰＡＶ（配列番号２）。
場合によっては、参照ＣａｓＸタンパクは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されるか又はそれに由来し、以下の配列を有する：
１ ＭＤＮＡＮＫＰＳＴＫ ＳＬＶＮＴＴＲＩＳＤ ＨＦＧＶＴＰＧＱＶＴ ＲＶＦＳＦＧＩＩＰＴ ＫＲＱＹＡＩＩＥＲＷ ＦＡＡＶＥＡＡＲＥＲ
６１ ＬＹＧＭＬＹＡＨＦＱ ＥＮＰＰＡＹＬＫＥＫ ＦＳＹＥＴＦＦＫＧＲ ＰＶＬＮＧＬＲＤＩＤ ＰＴＩＭＴＳＡＶＦＴ ＡＬＲＨＫＡＥＧＡＭ
１２１ ＡＡＦＨＴＮＨＲＲＬ ＦＥＥＡＲＫＫＭＲＥ ＹＡＥＣＬＫＡＮＥＡ ＬＬＲＧＡＡＤＩＤＷ ＤＫＩＶＮＡＬＲＴＲ ＬＮＴＣＬＡＰＥＹＤ
１８１ ＡＶＩＡＤＦＧＡＬＣ ＡＦＲＡＬＩＡＥＴＮ ＡＬＫＧＡＹＮＨＡＬ ＮＱＭＬＰＡＬＶＫＶ ＤＥＰＥＥＡＥＥＳＰ ＲＬＲＦＦＮＧＲＩＮ
２４１ ＤＬＰＫＦＰＶＡＥＲ ＥＴＰＰＤＴＥＴＩＩ ＲＱＬＥＤＭＡＲＶＩ ＰＤＴＡＥＩＬＧＹＩ ＨＲＩＲＨＫＡＡＲＲ ＫＰＧＳＡＶＰＬＰＱ
３０１ ＲＶＡＬＹＣＡＩＲＭ ＥＲＮＰＥＥＤＰＳＴ ＶＡＧＨＦＬＧＥＩＤ ＲＶＣＥＫＲＲＱＧＬ ＶＲＴＰＦＤＳＱＩＲ ＡＲＹＭＤＩＩＳＦＲ
３６１ ＡＴＬＡＨＰＤＲＷＴ ＥＩＱＦＬＲＳＮＡＡ ＳＲＲＶＲＡＥＴＩＳ ＡＰＦＥＧＦＳＷＴＳ ＮＲＴＮＰＡＰＱＹＧ ＭＡＬＡＫＤＡＮＡＰ
４２１ ＡＤＡＰＥＬＣＩＣＬ ＳＰＳＳＡＡＦＳＶＲ ＥＫＧＧＤＬＩＹＭＲ ＰＴＧＧＲＲＧＫＤＮ ＰＧＫＥＩＴＷＶＰＧ ＳＦＤＥＹＰＡＳＧＶ
４８１ ＡＬＫＬＲＬＹＦＧＲ ＳＱＡＲＲＭＬＴＮＫ ＴＷＧＬＬＳＤＮＰＲ ＶＦＡＡＮＡＥＬＶＧ ＫＫＲＮＰＱＤＲＷＫ ＬＦＦＨＭＶＩＳＧＰ
５４１ ＰＰＶＥＹＬＤＦＳＳ ＤＶＲＳＲＡＲＴＶＩ ＧＩＮＲＧＥＶＮＰＬ ＡＹＡＶＶＳＶＥＤＧ ＱＶＬＥＥＧＬＬＧＫ ＫＥＹＩＤＱＬＩＥＴ
６０１ ＲＲＲＩＳＥＹＱＳＲ ＥＱＴＰＰＲＤＬＲＱ ＲＶＲＨＬＱＤＴＶＬ ＧＳＡＲＡＫＩＨＳＬ ＩＡＦＷＫＧＩＬＡＩ ＥＲＬＤＤＱＦＨＧＲ
６６１ ＥＱＫＩＩＰＫＫＴＹ ＬＡＮＫＴＧＦＭＮＡ ＬＳＦＳＧＡＶＲＶＤ ＫＫＧＮＰＷＧＧＭＩ ＥＩＹＰＧＧＩＳＲＴ ＣＴＱＣＧＴＶＷＬＡ
７２１ ＲＲＰＫＮＰＧＨＲＤ ＡＭＶＶＩＰＤＩＶＤ ＤＡＡＡＴＧＦＤＮＶ ＤＣＤＡＧＴＶＤＹＧ ＥＬＦＴＬＳＲＥＷＶ ＲＬＴＰＲＹＳＲＶＭ
７８１ ＲＧＴＬＧＤＬＥＲＡ ＩＲＱＧＤＤＲＫＳＲ ＱＭＬＥＬＡＬＥＰＱ ＰＱＷＧＱＦＦＣＨＲ ＣＧＦＮＧＱＳＤＶＬ ＡＡＴＮＬＡＲＲＡＩ
８４１ ＳＬＩＲＲＬＰＤＴＤ ＴＰＰＴＰ（配列番号３）。
ｂ．クラス２、Ｖ型ＣａｓＸバリアントタンパク質
本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質のクラス２、Ｖ型、ＣａｓＸバリアント又は他のＣａｓＸバリアントに由来するバリアントを提供し（例えば、図４４を参照）（本明細書において互換的に「クラス２、Ｖ型ＣａｓＸバリアント」、「ＣａｓＸバリアント」、又は「ＣａｓＸバリアントタンパク質」と称される）、クラス２、Ｖ型ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１つのドメインに少なくとも１つの改変を含むか（配列番号１～３の配列を含むが、これらに限定されない）、又は別のＣａｓＸバリアントと比較して少なくとも１つの改変を含む。ＣａｓＸタンパク質の改善された特徴をもたらす参照ＣａｓＸタンパク質又は別のＣａｓＸバリアントタンパク質のアミノ酸配列における任意の変化は、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質とみなされる。例えば、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、若しくはスワップされたドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
本開示のＣａｓＸバリアントは、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、又はそれが由来するバリアント（例えば、ＣａｓＸ４９１（配列番号３３６）若しくはＣａｓＸ５１５（配列番号４１６）と比較して、１つ以上の改善された特徴を有する。ＣａｓＸバリアントの実施形態の例示的な改善された特徴としては、バリアントのフォールディングの改善、ｇＲＮＡに対する結合親和性の増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、標的核酸の編集及び／又は結合においてより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、標的核酸に対する編集特異性の改善、オフターゲット編集若しくは切断の減少、効率的に編集され得る真核生物ゲノムの割合の増加、ヌクレアーゼの活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填（target strand loading）の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の増加、タンパク質安定性の改善、タンパク質： ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の安定性の改善、並びに改善された融合体特徴が挙げられるが、これらに限定されない。前述の実施形態では、ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上は、同等の様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、又はＣａｓＸ４９１（配列番号３３６）若しくはＣａｓＸ５１５（配列番号４１６）と比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善されている。他の実施形態では、改善は、同等の様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、又はＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約１０，０００倍、又は少なくとも約１００，０００倍である。他の場合では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの１つ以上の改善された特徴は、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表１のｇＲＮＡのＲＮＰ、又はＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５とｇＲＮＡ１７４のＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１００，０００倍、又はそれ以上改善されている。他の場合では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの改善された特徴のうちの１つ以上は、同等の様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表１のｇＲＮＡ、又はＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５とｇＲＮＡ１７４のＲＮＰと比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、又は約５０～１００倍改善されている。他の場合では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰの１つ以上の改善された特徴は、同等の様式でアッセイした場合、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表１のｇＲＮＡのＲＮＰ、又はＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５とｇＲＮＡ１７４のＲＮＰと比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、又は５００倍改善されている。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの改変は、参照ＣａｓＸの１つ以上のアミノ酸における変異である。他の実施形態では、改変は、異なるＣａｓＸタンパク質由来のドメインの一部又は全部の挿入又は置換を含む。特定の実施形態では、配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１のＣａｓＸバリアントは、本明細書に記載の選択ドメインにおける個々の改変に加えて、配列番号１のＮＴＳＢ及びヘリックス１Ｂドメインを有するが、他のドメインは、配列番号２に由来する。変異は、参照ＣａｓＸタンパク質又はＣａｓＸバリアントの任意の１つ以上のドメインに導入され得、例えば、参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来するＣａｓＸバリアントの任意のドメインにおける１つ以上のドメインの一部若しくは全部の欠失、又は１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、若しくは挿入を含み得る。ＣａｓＸタンパク質のドメインは、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖装填（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む。理論又は機構に束縛されるものではないが、ＣａｓＸにおけるＮＴＳＢドメインは、非標的核酸鎖への結合を可能にし、非標的鎖及び標的鎖の巻き戻しを助けることができる。ＮＴＳＢドメインは、巻き戻された状態の非標的核酸鎖の巻き戻し又は捕捉に関与すると推定される。例示的なＮＴＳＢドメインは、配列番号１のアミノ酸１００～１９０又は配列番号２のアミノ酸１０２～１９１を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のＮＴＳＢドメインは、４本鎖のβシートを含む。いくつかの実施形態では、ＴＳＬは、標的鎖ＤＮＡ骨格の切断可能なリン酸をＲｕｖＣ活性部位に配置するフォールディングした状態の標的鎖を配置又は捕捉するように作用する。例示的なＴＳＬは、配列番号１のアミノ酸８２４～９３３又は配列番号２のアミノ酸８１１～９２０を含む。理論に束縛されることを望むものではないが、場合によっては、ヘリックスＩドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ（protospacer adjacent motif、ＰＡＭ）の結合に寄与し得ると考えられている。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のヘリックスＩドメインは、１つ以上のアルファヘリックスを含む。例示的なヘリックスＩ－Ｉ及びＩ－ＩＩドメインは、それぞれ配列番号１のアミノ酸５６～９９及び１９１～３３１、又はそれぞれ配列番号２のアミノ酸５８～１０１及び１９２～３３２を含む。ヘリックスＩＩドメインは、ガイドＲＮＡ足場ステムループ並びに結合したＤＮＡへの結合に関与する。例示的なヘリックスＩＩドメインは、配列番号１のアミノ酸３３２～５０８、又は配列番号２のアミノ酸３３３～５００を含む。ＯＢＤは、主にガイドＲＮＡ足場のＲＮＡ三重鎖に結合する。ＯＢＤはまた、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）への結合に関与し得る。例示的なＯＢＤ Ｉ及びＩＩドメインは、それぞれ配列番号１のアミノ酸１～５５及び５０９～６５９、又はそれぞれ配列番号２のアミノ酸１～５７及び５０１～６４６を含む。ＲｕｖＣは、ＤＮＡの両方の鎖を切断することに関与するＤＥＤモチーフ活性部位を有する（１つずつ、まず、非標的鎖が標的化配列へ１１～１４ヌクレオチド（ｎｔ）で切断され、次に、標的鎖が標的配列の２～４ヌクレオチド後で切断される可能性が最も高く、その結果、ずれた切断が生じる）。特にＣａｓＸでは、ＲｕｖＣドメインが、ＣａｓＸの機能に重要なガイドＲＮＡ足場ステムループの結合にも関与するという点で独特である。例示的なＲｕｖＣ Ｉ及びＩＩドメインは、それぞれ配列番号１のアミノ酸６６０～８２３及び９３４～９８６、又はそれぞれ配列番号２のアミノ酸６４７～８１０及び９２１～９７８を含み、一方、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２に対してＩ６５８位及びＡ７０８位における変異、又は以下に記載されるＣａｓＸ５１５の変異を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１～３の配列を含む参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて、少なくとも２つのドメインの各々において、少なくとも３つのドメインの各々において、少なくとも４つのドメインの各々において、又は少なくとも５つのドメインの各々において、少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて２つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて少なくとも２つの改変、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて少なくとも３つの改変、又は参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインにおいて少なくとも４つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸと比較して２つ以上の改変を含み、各改変は、独立して、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から選択されるドメインにおいて行われる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントが参照ＣａｓＸタンパク質と比較して２つ以上の改変を含み、改変が、２つ以上のドメインにおいて行われる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の少なくとも１つの改変は、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質の１つのドメインの少なくとも一部の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、ＮＴＳＢドメイン、ＴＳＬドメイン、ヘリックスＩドメイン、ヘリックスＩＩドメイン、ＯＢＤ、又はＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインにある。
場合によっては、本開示のＣａｓＸバリアントは、１つ以上のドメインを包含し得る構造領域における改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ｇＲＮＡ： ＣａｓＸバリアントとの標的核酸複合体化が起こるチャネルを形成する、ＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ｇＲＮＡと結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、非標的鎖ＤＮＡと結合するチャネルを形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、標的核酸のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＣａｓＸバリアントの連続していない表面露出アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＣａｓＸバリアントのドメインにおける疎水性パッキングを介してコアを形成する非隣接アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む。本段落の前述の実施形態では、領域の改変は、領域の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、若しくは置換のうちの１つ以上を含み得るか、又はＣａｓＸバリアントの領域の２～１５アミノ酸残基が帯電アミノ酸で置換されるか、又はＣａｓＸバリアントの領域の２～１５アミノ酸残基が、極性アミノ酸で置換されるか、又はＣａｓＸバリアントの領域の２～１５アミノ酸残基が、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの塩基とスタッキングするか又は親和性を有するアミノ酸で置換される。
他の実施形態では、本開示は、別のＣａｓＸバリアントと比較して少なくとも１つの改変を含むＣａｓＸバリアントを提供する。例えば、ＣａｓＸバリアント５１５及び５２７は、ＣａｓＸバリアント４９１のバリアントであり、ＣａｓＸバリアント６６８及び６７２は、ＣａｓＸ５３５のバリアントである（図４４を参照）。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、アミノ酸の挿入、欠失、又は置換からなる群から選択される。本明細書に記載の参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来するバリアントと比較した場合、ＣａｓＸバリアントタンパク質の１つ以上の機能又は特徴を改善する全てのバリアントは、本開示の範囲内であると想定される。実施例に記載されるように、ＣａｓＸバリアントは、別のＣａｓＸバリアントを生成するために変異誘発され得る。特定の実施形態では、本開示は、実施例１４において、１つ以上のドメインにおける１つ以上の位置でのアミノ酸の置換、欠失、又は挿入をもたらす改変をコード配列に導入することによって生成されたＣａｓＸ５１５（配列番号４１６）のバリアントを提供する。
本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成するための好適な変異誘発法には、例えば、網羅的変異進化（ＤＭＥ）、網羅的変異スキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、付着伸長ＰＣＲ、遺伝子シャフリング、又はドメインスワッピングが含まれ得る（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０／３６５０６及び国際公開第２０２０２４７８８３（Ａ２）号に記載されており、参照により本明細書に援用さる）。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、例えば、実施例に記載のアッセイを使用して同定されたＣａｓＸバリアントにおける複数の所望の変異を選択することによって設計される。特定の実施形態では、参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアントタンパク質の活性は、変異誘発前、それに対して１つ以上の得られたＣａｓＸバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それによって、新しいＣａｓＸバリアントの機能の改善が測定される。
本明細書に記載のＣａｓＸバリアントのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、以下を含む：（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３の参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント４９１（配列番号３３６）、若しくはＣａｓＸバリアント５１５（配列番号４１６）と比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した若しくは連続していないアミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸ若しくはそれが由来するバリアントと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した若しくは連続していないアミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸ若しくはそれが由来するバリアントと比較した、ＣａｓＸにおける１～１００個の連続した若しくは連続していないアミノ酸の挿入、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、以下を含む：（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３の参照ＣａｓＸ、又はそれが由来するバリアントと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～１０個の連続した又は連続していないアミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸ又はそれが由来するバリアントと比較した、ＣａｓＸバリアントにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸ又はそれが由来するバリアントと比較した、ＣａｓＸにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の挿入、又は（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、ＣａｓＸ４９１、又はＣａｓＸ５１５の配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００個の改変を有する配列を含むか又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＣａｓＸ４９１又は配列番号３３６と比較して１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＣａｓＸ５１５又は配列番号４１６と比較して１つ以上の置換を含む。これらの改変は、アミノ酸の挿入、欠失、置換、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。改変は、ＣａｓＸバリアントの１つのドメイン、又はいずれかのドメイン、又はドメインのいずれかの組み合わせにあり得る。本明細書に記載の置換において、任意のアミノ酸は、任意の他のアミノ酸と置換され得る。置換は、保存的置換であり得る（例えば、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換される）。置換は、非保存的置換であってもよい（例えば、塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換されるか、又はその逆も同様である）。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質におけるプロリンを、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、又はバリンのうちのいずれかに置換して、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。
本明細書に記載の実施形態の置換、挿入、及び欠失の任意の順列を組み合わせて、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質配列又はＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５の配列と比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの欠失を含むことができ、参照ＣａｓＸタンパク質配列又はＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５の配列と比較して、少なくとも１つの置換及び少なくとも１つの挿入を含むことができ、参照ＣａｓＸタンパク質配列又はＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５の配列と比較して、少なくとも１つの挿入及び少なくとも１つの欠失を含むことができ、あるいは参照ＣａｓＸタンパク質配列又はＣａｓＸ４９１若しくはＣａｓＸ５１５の配列と比較して、少なくとも１つの置換、少なくとも１つの挿入、及び少なくとも１つの欠失を含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、４００～２０００アミノ酸、５００～１５００アミノ酸、７００～１２００アミノ酸、８００～１１００アミノ酸、又は９００～１０００アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号２４７～５９２又は１１４７～１２３１の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号２４７～５９２又は１１４７～１２３１の配列からなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号２４７～５９２及び１１４７～１２３１の配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２７０～５９２又は１１４７～１２３１の配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２７０～５９２又は１１４７～１２３１の配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４１５～５９２又は１１４７～１２３１の配列を含むか、又はそれからなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４１６～５９２又は１１４７～１２３１の配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。（ＮＤ＝記載されていないか、又はそうでなければ提供されていない）。
ｃ．複数の供給源のタンパク質由来のドメインを有するＣａｓＸバリアントタンパク質
特定の実施形態では、本開示は、２つ以上の異なるＣａｓＸタンパク質（例えば、２つ以上の天然に存在するＣａｓＸタンパク質又は本明細書に記載される２つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質配列）由来のタンパク質ドメインを含むキメラＣａｓＸタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラＣａｓＸタンパク質」とは、異なる供給源（例えば、２つの天然に存在するタンパク質）から単離又は誘導された少なくとも２つのドメインを含むＣａｓＸを指し、これは、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され、第２のドメインは、前述の第１のドメインとは異なる。特定の実施形態では、５１４～７９１（配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１）のＣａｓＸバリアントは、配列番号１の配列に由来するＮＴＳＢドメイン及びヘリックス１Ｂドメインを有し、一方、他のドメインは、配列番号２に由来し、このバリアントは、選択位置で更なるアミノ酸変化を有することが理解される。
ｄ．ｇＲＮＡに対するタンパク質親和性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ｇＲＮＡに対する改善された親和性を有し、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成をもたらす。ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、例えば、ＲＮＰ複合体の形成についてより低いＫｄをもたらし得、これは、場合によっては、より安定なリボ核タンパク質複合体の形成をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、ヒト細胞に送達された場合、リボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞における複合体の機能及び有用性に影響を及ぼし得、並びに対象に送達された場合、血液における改善された薬物動態学特性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加、及び得られるリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、所望の活性、例えば、インビボ又はインビトロでの遺伝子編集を依然として有しながら、対象又は細胞に送達されるＣａｓＸバリアントタンパク質の用量がより低くなる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のｇＲＮＡに対するより高い親和性（より強い結合）は、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡの両方がＲＮＰ複合体中に残っている場合、より多くの編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載のｔｄＴｏｍ編集アッセイなどの編集アッセイを使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質のＫｄは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ｇＲＮＡに対して約１．１～約１０倍増加した結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、対象へのインビボ送達を含む、哺乳動物細胞に送達された場合、リボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞における複合体の機能及び有用性に影響を及ぼし得、並びに対象に送達された場合、血液における改善された薬物動態学特性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加、及び得られるリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、所望の活性（例えば、インビボ又はインビトロ遺伝子編集）を依然として有しながら、対象又は細胞に送達されるＣａｓＸバリアントタンパク質の用量をより低くする。ＲＮＰを形成し、それらを安定な形態に保つ能力の増加は、アッセイ（例えば、本明細書の実施例に記載のインビトロ切断アッセイ）を使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰは、ＲＮＰとして複合体化した場合、配列番号１～３の参照ＣａｓＸを含むＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍高いｋ切断速度を達成することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のｇＲＮＡに対するより高い親和性（より強い結合）は、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡの両方がＲＮＰ複合体中に残っている場合、より多くの編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載のアッセイなどの編集アッセイを使用して評価することができる。
理論に束縛されることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、ヘリックスＩドメインにおけるアミノ酸変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ標的化配列との結合親和性を増加させることができ、ヘリックスＩＩドメインにおける変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ足場ステムループとの結合親和性を増加させることができ、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）における変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ三重鎖との結合親和性を増加させる。
ｇＲＮＡに対するＣａｓＸタンパク質の結合親和性を測定する方法は、精製されたＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡを使用するインビトロの方法を含む。参照ＣａｓＸ及びバリアントタンパク質に対する結合親和性は、ｇＲＮＡ又はＣａｓＸタンパク質がフルオロフォアでタグ付けされている場合、蛍光偏光によって測定することができる。代替的に、又は追加的に、結合親和性は、バイオレイヤー干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assay、ＥＭＳＡ）、又は膜結合によって測定することができる。参照ｇＲＮＡ及びそのバリアントなどの特定のｇＲＮＡに対する、参照ＣａｓＸ及び本開示のバリアントタンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質の絶対親和性を定量化するための更なる標準的な技術としては、等温熱量測定（isothermal calorimetry、ＩＴＣ）及び表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）、並びに実施例の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
触媒的に不活性ないくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＲＮＡ：標的核酸複合体化が起こるチャネルを形成する連続していない残基の領域に１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＲＮＡと結合する界面を形成する連続していない残基の領域を含む１つ以上の改変を含む。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質のいくつかの実施形態では、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、及びＯＢＤドメインは全て、ｇＲＮＡ：標的核酸複合体に接触又は近接しており、これらのドメインのうちのいずれかのドメイン内の連続していない残基に対する１つ以上の改変が、ＣａｓＸバリアントタンパク質の機能を改善し得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、非標的鎖ＤＮＡと結合するチャネルを形成する連続していない残基の領域に１つ以上の改変を含む。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＮＴＳＢドメインの連続していない残基に対する１つ以上の改変を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＰＡＭと結合する界面を形成する連続していない残基の領域に１つ以上の改変を含む。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ヘリックスＩドメイン又はＯＢＤの連続していない残基に対する１つ以上の改変を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、連続していない表面露出残基の領域を含む１つ以上の改変を含む。本明細書で使用される場合、「表面露出残基」は、ＣａｓＸタンパク質の表面上のアミノ酸、又はアミノ酸の少なくとも一部（例えば、骨格若しくは側鎖の一部）がタンパク質の表面上にあるアミノ酸を指す。水性の細胞内環境に露出した細胞タンパク質（例えば、ＣａｓＸ）の表面露出残基は、多くの場合、正に帯電した親水性アミノ酸、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、及びスレオニンから選択される。したがって、例えば、本明細書に提供されるバリアントのいくつかの実施形態では、表面露出残基の領域は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１つ以上の挿入、欠失、又は置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の正に帯電した残基は、１つ以上の他の正に帯電した残基、又は負に帯電した残基、又は帯電していない残基、又はそれらの任意の組み合わせと置換される。いくつかの実施形態では、置換のための１つ以上のアミノ酸残基は、近くに結合した核酸（例えば、標的核酸に接触するＲｕｖＣドメイン若しくはヘリックスＩドメインにおける残基、又はｇＲＮＡに結合するＯＢＤ若しくはヘリックスＩＩドメインにおける残基）であり、１つ以上の正に帯電したアミノ酸若しくは極性アミノ酸と置換され得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質のドメインにおける疎水性パッキングを介してコアを形成する連続していない残基の領域に１つ以上の改変を含む。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、疎水性パッキングを介してコアを形成する領域は、疎水性アミノ酸（例えばバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びシステイン）に富む。例えば、いくつかの参照ＣａｓＸタンパク質において、ＲｕｖＣドメインは、活性部位に隣接する疎水性ポケットを含む。いくつかの実施形態では、領域の２～１５個の残基は、帯電残基、極性残基、又は塩基スタッキング残基である。帯電アミノ酸（本明細書において残基と称されることもある）としては、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸を挙げることができ、これらのアミノ酸の側鎖は、架橋パートナーも存在することを条件として、塩橋を形成することができる（図１４参照）。極性アミノ酸としては、例えば、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、及びシステインを挙げることができる。極性アミノ酸は、いくつかの実施形態では、それらの側鎖の同一性に応じて、プロトンドナー又はアクセプターとして水素結合を形成することができる。本明細書で使用される場合、「塩基スタッキング」は、アミノ酸残基（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、又はヒスチジンなど）の芳香族側鎖と、核酸においてスタッキングされたヌクレオチド塩基との相互作用を含む。ＣａｓＸバリアントタンパク質の機能的部分を形成するために空間的に近接している連続していないアミノ酸の領域に対する任意の修飾は、本開示の範囲内であると想定される。
ｅ．複数の供給源のタンパク質由来のドメインを有するＣａｓＸバリアントタンパク質
特定の実施形態では、本開示は、２つ以上の異なるＣａｓＸタンパク質（例えば、２つ以上の天然に存在するＣａｓＸタンパク質又は本明細書に記載される２つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質配列）由来のタンパク質ドメインを含むキメラＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラＣａｓＸタンパク質」とは、異なる供給源（例えば、２つの天然に存在するタンパク質）から単離又は誘導された少なくとも２つのドメインを含むＣａｓＸを指し、これは、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択され、第２のドメインは、前述の第１のドメインとは異なる。例えば、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤドメイン、及び配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のＲｕｖＣドメインを含み得るか、又はその逆であり得る。更なる例として、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメイン、並びに配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のヘリックスＩドメインを含み得るか、又はその逆であり得る。したがって、特定の実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメイン、並びに第２のＣａｓＸタンパク質由来のヘリックスＩドメインを含み得る。キメラＣａｓＸタンパク質のいくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の配列に由来し、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の配列に由来し、第１のＣａｓＸタンパク質と第２のＣａｓＸタンパク質は同じではない。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第３のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第３のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含む。前述の例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６０～８２３及び配列番号２のアミノ酸９２１～９７８を含む。前述の代替例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号２のアミノ酸６４７～８１０及び配列番号１のアミノ酸９３４～９８６を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキメラドメインは、キメラヘリックスＩドメインを含み、キメラヘリックスＩドメインが、配列番号１のアミノ酸５６～９９及び配列番号２のアミノ酸１９２～３３２を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸバリアントは、更に改変され、配列番号２７０、配列番号３２８、配列番号３３６、配列番号７８０、配列番号４１２、配列番号４１３、配列番号４１４、配列番号４１６、配列番号４３５、配列番号３２９、配列番号７８１、配列番号３３０、配列番号７８２、配列番号３３１、配列番号７８３、配列番号３３２、配列番号７８４、配列番号３３３、配列番号７８５、配列番号３３４、配列番号７８６、配列番号３３５、配列番号５６７、配列番号５７０、配列番号５７４、配列番号７８７、及び配列番号７８８の配列からなる群から選択されるＣａｓＸバリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の改変は、本明細書に記載の挿入、置換又は欠失を含む。
ヘリックスＩ、ＲｕｖＣ、及びＯＢＤなどの分割又は非連続ドメインの場合、非連続ドメインの一部を任意の他の供給源由来の対応する部分で置換することができる。例えば、配列番号２におけるヘリックスＩ－Ｉドメイン（ヘリックスＩ－ａと称されることもある）は、配列番号１由来の対応するヘリックスＩ－Ｉ配列などで置換され得る。表４に、参照ＣａｓＸタンパク質由来のドメイン配列及びそれらの座標を示す。キメラＣａｓＸタンパク質の代表的な例としては、ＣａｓＸ４７２～４８３、４８５～４９１、及び５１５のバリアントが挙げられ、表３に、その配列を示す。

＊ＯＢＤＩ及びＩＩ、ヘリックスＩ－Ｉ及びＩ－ＩＩ、並びにＲｕｖＣ Ｉ及びＩＩは、本明細書において、ＯＢＤａ及びｂ、ヘリックスＩａ及びｂ、並びにＲｕｖＣａ及びｂとも称される。
例示的なドメイン配列を、以下の表５に提供する。
更なる例示的なヘリックスＩＩドメイン配列が、配列番号２３５１として提供され、更なる例示的なＲｕｖＣａドメイン配列が、配列番号２３５２として提供される。
他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号２４７～５９２又は１１４７～１２３１の配列を含み、Ｎ末端、Ｃ末端、若しくはその両方のいずれかに、又はその近くに、本明細書に開示される１つ以上のＮＬＳを更に含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２７０～５９２及び１１４７～１２３１の配列を含み、Ｎ末端、Ｃ末端、若しくはその両方のいずれかに、又はその近くに、本明細書に開示される１つ以上のＮＬＳを更に含む。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１の配列を含み、Ｎ末端、Ｃ末端、若しくはその両方のいずれかに、又はその近くに、本明細書に開示される１つ以上のＮＬＳを更に含む。場合によっては、表のＣａｓＸバリアントのＮ末端メチオニンは、翻訳後修飾の間に、発現されたＣａｓＸバリアントから除去されることが理解されるであろう。当業者は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端近くのＮＬＳが、Ｎ末端又はＣ末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、又は２０アミノ酸以内であり得ることを理解するであろう。
ｆ．他のＣａｓＸバリアントに由来するＣａｓＸバリアント
バリアントタンパク質の生成の更なる反復において、バリアントタンパク質を利用して、本開示の更なるＣａｓＸバリアントを生成することができる。例えば、図４４に示されるように、ＣａｓＸ１１９（配列番号２７０）、ＣａｓＸ４９１（配列番号３３６）、及びＣａｓＸ５１５（配列番号４１６）は、それらが由来する参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアントと比較して改善を有する若しくは追加の特性を有する本開示の追加のＣａｓＸバリアントを生成するように改変された例示的なバリアントタンパク質である。ＣａｓＸ１１９は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、及び７９３位のＰの欠失を含む。ＣａｓＸ４９１は、配列番号１由来のＮＴＳＢ及びヘリックス１Ｂスワップを含む。ＣａｓＸ５１５は、７９３位（配列番号２に対して）にＰを挿入することによってＣａｓＸ４９１から誘導され、実施例１３及び１４に記載のＣａｓＸバリアントを作製するために使用された。例えば、ＣａｓＸ６６８は、ＣａｓＸ５１５と比較して、２６位にＲの挿入及びＧ２２３Ｓの置換を有する。ＣａｓＸ６７２は、ＣａｓＸ５１５と比較して、Ｌ１６９Ｋ及びＧ２２３Ｓの置換を有する。ＣａｓＸ６７６は、ＣａｓＸ５１５と比較して、Ｌ１６９Ｋ及びＧ２２３Ｓの置換並びに２６位にＲの挿入を有する。
他のＣａｓＸバリアントに由来するＣａｓＸバリアントを生成及び評価するために使用される例示的な方法は、実施例に記載されており、これは、ＣａｓＸバリアントの１つ以上のドメインにおける１つ以上の位置でのアミノ酸の置換、欠失、又は挿入をもたらす改変をコード配列に導入することによって生成された。特に、実施例１４及び実施例１５は、ＣａｓＸ５１５（配列番号４１６）のバリアントを生成するために使用される方法を記載しており、これらは、次いで、アミノ酸の挿入、欠失、又は置換によって改変された場合、アッセイにおいて濃縮又は改善をもたらす配列における位置を決定するためにアッセイされた。場合によっては、アッセイの結果を使用して、図３４～図３６のヒートマップを生成した。これらは、本方法によって改変された所与のアミノ酸位置における定性的及び定量的データを提供する。本開示の目的のために、ＣａｓＸ５１５のドメインの配列を表４に提供し、配列番号２３４２の配列を有するＯＢＤ－Ｉドメイン、配列番号２３４７の配列を有するＯＢＤ－ＩＩドメイン、配列番号２３３５の配列を有するＮＴＳＢドメイン、配列番号２３４３の配列を有するヘリックスＩ－Ｉドメイン、配列番号２３３６の配列を有するヘリックスＩ－ＩＩドメイン、配列番号２３５１の配列を有するヘリックスＩＩドメイン、配列番号２３５２の配列を有するＲｕｖＣ－Ｉドメイン、配列番号２３５０の配列を有するＲｕｖＣ－ＩＩドメイン、及び配列番号２３４９の配列を有するＴＳＬドメインを含む。本開示の方法によって、ＣａｓＸ５１５のドメインにおける個々の位置を改変し、アッセイし、各ドメイン又はサブドメインにおけるそれらの位置と比較して、得られた位置及びその後の濃縮又は改善をもたらす例示的な改変を提供する。場合によっては、そのような位置は、実施例の表２１～２４に開示されている。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントを提供し、配列番号２３３５と比較して、Ｐ２、Ｓ４、Ｑ９、Ｅ１５、Ｇ２０、Ｇ３３、Ｌ４１、Ｙ５１、Ｆ５５、Ｌ６８、Ａ７０、Ｅ７５、Ｋ８８、及びＧ９０からなる群から選択される、ＮＴＳＢドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で１つ以上の改変（すなわち、挿入、欠失、又は置換）を含み、改変が、ＣａｓＸ５１５と比較して、改善された特徴をもたらす。特定の実施形態では、配列番号２３３５と比較して、ＮＴＳＢドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置における１つ以上の改変は、＾Ｇ２、＾Ｉ４、＾Ｌ４、Ｑ９Ｐ、Ｅ１５Ｓ、Ｇ２０Ｄ、［Ｓ３０］、Ｇ３３Ｔ、Ｌ４１Ａ、Ｙ５１Ｔ、Ｆ５５Ｖ、Ｌ６８Ｄ、Ｌ６８Ｅ、Ｌ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ａ７０Ｓ、Ｅ７５Ａ、Ｅ７５Ｄ、Ｅ７５Ｐ、Ｋ８８Ｑ、及びＧ９０Ｑからなる群から選択される（ここで、「＾」はその位置での挿入を表し、「［］」はその位置での欠失を表す）。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントを提供し、配列番号２３３６と比較して、Ｉ２４、Ａ２５、Ｙ２９、Ｇ３２、Ｇ４４、Ｓ４８、Ｓ５１、Ｑ５４、Ｉ５６、Ｖ６３、Ｓ７３、Ｌ７４、Ｋ９７、Ｖ１００、Ｍ１１２、Ｌ１１６、Ｇ１３７、Ｆ１３８、及びＳ１４０からなる群から選択される、ヘリックスＩ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変を含み、改変が、ＣａｓＸ５１５と比較して、改善された特徴をもたらす。特定の実施形態では、ヘリックスＩ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変は、＾Ｔ２４、＾Ｃ２５、Ｙ２９Ｆ，Ｇ３２Ｙ、Ｇ３２Ｎ、Ｇ３２Ｈ、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ３２Ａ、Ｇ３２Ｖ、［Ｇ３２］、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ４４Ｌ、Ｇ４４Ｈ、Ｓ４８Ｈ、Ｓ４８Ｔ、Ｓ５１Ｔ、Ｑ５４Ｈ、Ｉ５６Ｔ、Ｖ６３Ｔ、Ｓ７３Ｈ、Ｌ７４Ｙ、Ｋ９７Ｇ、Ｋ９７Ｓ、Ｋ９７Ｄ、Ｋ９７Ｅ、Ｖ１００Ｌ、Ｍ１１２Ｔ、Ｍ１１２Ｗ、Ｍ１１２Ｒ、Ｍ１１２Ｋ、Ｌ１１６Ｋ、Ｇ１３７Ｒ、Ｇ１３７Ｋ、Ｇ１３７Ｎ、＾Ｑ１３８、及びＳ１４０Ｑからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントを提供し、配列番号２３５１と比較して、Ｌ２、Ｖ３、Ｅ４、Ｒ５、Ｑ６、Ａ７、Ｅ９、Ｖ１０、Ｄ１１、Ｗ１２、Ｗ１３、Ｄ１４、Ｍ１５、Ｖ１６、Ｃ１７、Ｎ１８、Ｖ１９、Ｋ２０、Ｌ２２、Ｉ２３、Ｅ２５、Ｋ２６、Ｋ３１、Ｑ３５、Ｌ３７、Ａ３８、Ｋ４１、Ｒ４２、Ｑ４３、Ｅ４４、Ｌ４６、Ｋ５７、Ｙ６５、Ｇ６８、Ｌ７０、Ｌ７１、Ｌ７２、Ｅ７５、Ｇ７９、Ｄ８１、Ｗ８２、Ｋ８４、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｄ８７、Ｉ９３、Ｋ９５、Ｋ９６、Ｅ９８、Ｌ１００、Ｋ１０２、Ｉ１０４、Ｋ１０５、Ｅ１０９、Ｒ１１０、Ｄ１１４、Ｋ１１８、Ａ１２０、Ｌ１２１、Ｗ１２４、Ｌ１２５、Ｒ１２６、Ａ１２７、Ａ１２９、Ｉ１３３、Ｅ１３４、Ｇ１３５、Ｌ１３６、Ｅ１３８、Ｄ１４０、Ｋ１４１、Ｄ１４２、Ｅ１４３、Ｆ１４４、Ｃ１４５、Ｃ１４７、Ｅ１４８、Ｌ１４９、Ｋ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｋ１５３、Ｌ１５８、Ｅ１６６、及びＡ１６７からなる群から選択される、ヘリックスＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で１つ以上の改変を含み、改変が、ＣａｓＸ５１５と比較して、改善された特徴をもたらす。特定の実施形態では、ヘリックスＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変は、＾Ａ２、＾Ｈ２、［Ｌ２］＋［Ｖ３］、Ｖ３Ｅ、Ｖ３Ｑ、Ｖ３Ｆ、［Ｖ３］、＾Ｄ３、Ｖ３Ｐ、Ｅ４Ｐ、［Ｅ４］、Ｅ４Ｄ、Ｅ４Ｌ、Ｅ４Ｒ、Ｒ５Ｎ、Ｑ６Ｖ、＾Ｑ６、＾Ｇ７、＾Ｈ９、＾Ａ９、ＶＤ１０、＾Ｔ１０、［Ｖ１０］、＾Ｆ１０、＾Ｄ１１、［Ｄ１１］、Ｄ１１Ｓ、［Ｗ１２］、Ｗ１２Ｔ、Ｗ１２Ｈ、＾Ｐ１２、＾Ｑ１３、＾Ｇ１２、＾Ｒ１３、Ｗ１３Ｐ、Ｗ１３Ｄ、＾Ｄ１３、Ｗ１３Ｌ、＾Ｐ１４、＾Ｄ１４、［Ｄ１４］＋［Ｍ１５］、［Ｍ１５］、＾Ｔ１６、＾Ｐ１７、Ｎ１８Ｉ、Ｖ１９Ｎ、Ｖ１９Ｈ、Ｋ２０Ｄ、Ｌ２２Ｄ、Ｉ２３Ｓ、Ｅ２５Ｃ、Ｅ２５Ｐ、＾Ｇ２５、Ｋ２６Ｔ、Ｋ２７Ｅ、Ｋ３１Ｌ、Ｋ３１Ｙ、Ｑ３５Ｄ、Ｑ３５Ｐ、＾Ｓ３７、［Ｌ３７］＋［Ａ３８］、Ｋ４１Ｌ、＾Ｒ４２、［Ｑ４３］＋［Ｅ４４］、Ｌ４６Ｎ、Ｋ５７Ｑ、Ｙ６５Ｔ、Ｇ６８Ｍ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ７１Ｃ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｗ、Ｌ７２Ｙ、Ｅ７５Ｆ、Ｅ７５Ｌ、Ｅ７５Ｙ、Ｇ７９Ｐ、＾Ｅ７９、＾Ｔ８１、＾Ｒ８１、＾Ｗ８１、＾Ｙ８１、＾Ｗ８２、＾Ｙ８２、Ｗ８２Ｇ、Ｗ８２Ｒ、Ｋ８４Ｄ、Ｋ８４Ｈ、Ｋ８４Ｐ、Ｋ８４Ｔ、Ｖ８５Ｌ、Ｖ８５Ａ、＾Ｌ８５、Ｙ８６Ｃ、Ｄ８７Ｇ、Ｄ８７Ｍ、Ｄ８７Ｐ、Ｉ９３Ｃ、Ｋ９５Ｔ、Ｋ９６Ｒ、Ｅ９８Ｇ、Ｌ１００Ａ、Ｋ１０２Ｈ、Ｉ１０４Ｔ、Ｉ１０４Ｓ、Ｉ１０４Ｑ、Ｋ１０５Ｄ、＾Ｋ１０９、Ｅ１０９Ｌ、Ｒ１１０Ｄ、［Ｒ１１０］、Ｄ１１４Ｅ、＾Ｄ１１４、Ｋ１１８Ｐ、Ａ１２０Ｒ、Ｌ１２１Ｔ、Ｗ１２４Ｌ、Ｌ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｄ、Ａ１２７Ｅ、Ａ１２７Ｌ、Ａ１２９Ｔ、Ａ１２９Ｋ、Ｉ１３３Ｅ、＾Ｃ１３３、＾Ｓ１３４、＾Ｇ１３４、＾Ｒ１３５、Ｇ１３５Ｐ、Ｌ１３６Ｋ、Ｌ１３６Ｄ、Ｌ１３６Ｓ、Ｌ１３６Ｈ、［Ｅ１３８］、Ｄ１４０Ｒ、＾Ｄ１４０、＾Ｐ１４１、＾Ｄ１４２、［Ｅ１４３］＋［Ｆ１４４］、＾Ｑ１４３、Ｆ１４４Ｋ、［Ｆ１４４］、［Ｆ１４４］＋［Ｃ１４５］、Ｃ１４５Ｒ、＾Ｇ１４５、Ｃ１４５Ｋ、Ｃ１４７Ｄ、＾Ｖ１４８、Ｅ１４８Ｄ、＾Ｈ１４９、Ｌ１４９Ｒ、Ｋ１５０Ｒ、Ｌ１５１Ｈ、Ｑ１５２Ｃ、Ｋ１５３Ｐ、Ｌ１５８Ｓ、Ｅ１６６Ｌ、及び＾Ｆ１６７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントを提供し、配列番号２３５２と比較して、Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択される、ＲｕｖＣ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で１つ以上の改変を含み、改変が、ＣａｓＸ５１５と比較して、改善された特徴をもたらす。特定の実施形態では、ＲｕｖＣ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変は、＾Ｉ４、＾Ｓ５、＾Ｔ６、＾Ｎ６、＾Ｒ７、＾Ｋ７、＾Ｈ８、＾Ｓ８、Ｖ１２Ｌ、Ｇ４９Ｗ、Ｇ４９Ｒ、Ｓ５１Ｒ、Ｓ５１Ｋ、Ｋ６２Ｓ、Ｋ６２Ｔ、Ｋ６２Ｅ、Ｖ６５Ａ、Ｋ８０Ｅ、Ｎ８３Ｇ、Ｒ９０Ｈ、Ｒ９０Ｇ、Ｍ１２５Ｓ、Ｍ１２５Ａ、Ｌ１３７Ｙ、＾Ｐ１３７、［Ｌ１４１］、Ｌ１４１Ｒ、Ｌ１４１Ｄ、＾Ｑ１４２、＾Ｒ１４３、＾Ｎ１４３、Ｅ１４４Ｎ、＾Ｐ１４６、Ｌ１４６Ｆ、Ｐ１４７Ａ、Ｋ１４９Ｑ、Ｔ１５０Ｖ、＾Ｒ１５２、＾Ｈ１５３、Ｔ１５５Ｑ、＾Ｈ１５５、＾Ｒ１５５、＾Ｌ１５６、［Ｌ１５６］、＾Ｗ１５６、＾Ａ１５７、＾Ｆ１５７、Ａ１５７Ｓ、Ｑ１５８Ｋ、［Ｙ１５９］、Ｔ１６０Ｙ、Ｔ１６０Ｆ、＾Ｉ１６１、Ｓ１６１Ｐ、Ｔ１６３Ｐ、＾Ｎ１６３、Ｃ１６４Ｋ、及びＣ１６４Ｍからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントを提供し、配列番号２３４２と比較して、Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択される、ＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で１つ以上の改変を含み、改変が、ＣａｓＸ５１５と比較して、改善された特徴をもたらす。特定の実施形態では、ＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変は、＾Ｇ３、Ｉ３Ｇ、Ｉ３Ｅ、＾Ｇ４、Ｋ４Ｇ、Ｋ４Ｐ、Ｋ４Ｓ、Ｋ４Ｗ、Ｋ４Ｗ、Ｒ５Ｐ、＾Ｐ５、＾Ｇ５、Ｒ５Ｓ、＾Ｓ５、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｐ、Ｒ５Ｇ、Ｒ５Ｌ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｌ、＾Ｇ６、Ｎ７Ｑ、Ｎ７Ｌ、Ｎ７Ｓ、Ｋ８Ｇ、Ｋ１５Ｆ、Ｄ１６Ｗ、＾Ｆ１６、＾Ｆ１８、＾Ｐ２７、Ｍ２８Ｐ、Ｍ２８Ｈ、Ｖ３３Ｔ、Ｒ３４Ｐ、Ｍ３６Ｙ、Ｒ４１Ｐ、Ｌ４７Ｐ、＾Ｐ４８、Ｅ５２Ｐ、＾Ｐ５５、［Ｐ５５］＋［Ｑ５６］、Ｑ５６Ｓ、Ｑ５６Ｐ、＾Ｄ５６、＾Ｔ５６、及びＱ５６Ｐからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントを提供し、配列番号２３４７と比較して、Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択される、ＯＢＤ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で１つ以上の改変を含み、改変が、ＣａｓＸ５１５と比較して、改善された特徴をもたらす。特定の実施形態では、ＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変は、［Ｓ２］、Ｉ３Ｒ、Ｉ３Ｋ、［Ｉ３］＋［Ｌ４］、［Ｌ４］、Ｋ１１Ｔ、＾Ｐ２４、Ｋ３７Ｇ、Ｒ４２Ｅ、＾Ｓ５３、＾Ｒ５８、［Ｋ６３］、Ｍ７０Ｔ、Ｉ８２Ｔ、Ｑ９２Ｉ、Ｑ９２Ｆ、Ｑ９２Ｖ、Ｑ９２Ａ、＾Ａ９３、Ｋ１１０Ｑ、Ｒ１１５Ｑ、Ｌ１２１Ｔ、＾Ａ１２４、＾Ｒ１４１、＾Ｄ１４３、＾Ａ１４３、＾Ｗ１４４、及び＾Ａ１４５からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５に由来するＣａｓＸバリアントを提供し、配列番号２３４９と比較して、Ｓ１、Ｎ２、Ｃ３、Ｇ４、Ｆ５、Ｉ７、Ｋ１８、Ｖ５８、Ｓ６７、Ｔ７６、Ｇ７８、Ｓ８０、Ｇ８１、Ｅ８２、Ｓ８５、Ｖ９６、及びＥ９８からなる群から選択される、ＴＳＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で１つ以上の改変を含み、改変が、ＣａｓＸ５１５と比較して、改善された特徴をもたらす。特定の実施形態では、ＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変は、＾Ｍ１、［Ｎ２］、＾Ｖ２、Ｃ３Ｓ、＾Ｇ４、＾Ｗ４、Ｆ５Ｐ、＾Ｗ７、Ｋ１８Ｇ、Ｖ５８Ｄ、＾Ａ６７、Ｔ７６Ｅ、Ｔ７６Ｄ、Ｔ７６Ｎ、Ｇ７８Ｄ、［Ｓ８０］、［Ｇ８１］、＾Ｅ８２、＾Ｎ８２、Ｓ８５Ｉ、Ｖ９６Ｃ、Ｖ９６Ｔ、及びＥ９８Ｄからなる群から選択される。段落の同じ前述の改変のうちのいずれかの組み合わせを、本開示のＣａｓＸバリアントに同様に導入することができ、改善された特徴を有するＣａｓＸバリアントがもたらされることが理解されるであろう。例えば、一実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５と比較してＧ２２３Ｓの単一変異を有するＣａｓＸバリアント５３５（配列番号４３５）を提供する。別の実施形態
では、本開示は、ＣａｓＸ５１５と比較して２６位にＲの挿入及びＧ２２３Ｓの置換を有するＣａｓＸバリアント６６８（配列番号５６７）を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５と比較してＬ１６９Ｋ及びＧ２２３Ｓの置換を有するＣａｓＸ６７２（配列番号５７０）を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸ５１５と比較して２６にＬ１６９Ｋ及びＧ２２３Ｓの置換並びにＲの挿入を有するＣａｓＸ６７６（配列番号５７４）を提供する。ＣａｓＸ５１５と比較して改善された特徴を有するＣａｓＸバリアントは、表３のバリアントを含む。
参照ＣａｓＸタンパク質における同じ特徴と比較して、又それらが由来するＣａｓＸバリアントと比較して、ＣａｓＸバリアントタンパク質において改善され得る例示的な特徴としては、バリアントのフォールディングの改善、ｇＲＮＡに対する結合親和性の改善、標的核酸に対する結合親和性の改善、標的核酸の編集及び／又は結合においてより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、標的核酸に対する編集特異性の改善、オフターゲット編集若しくは切断の減少、効率的に編集され得る真核生物ゲノムの割合の増加、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の改善、タンパク質安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の安定性の改善、並びに改善された融合体特徴が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、実施例に記載されるように、このような改善された特徴としては、ＴＴＣ、ＡＴＣ、及びＣＴＣ ＰＡＭ配列を有する標的核酸における切断活性の改善、標的核酸配列の切断に対する特異性の増加、並びに標的核酸のオフターゲット切断の減少が挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書に記載の実施形態のＣａｓＸバリアントは、本明細書に開示されるｇＲＮＡとＲＮＰ複合体を形成する能力を有する。いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡを含むＲＮＰは、２０ｐＭ以下の濃度で、少なくとも８０％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる。いくつかの実施形態では、２０ｐＭ以下の濃度のＲＮＰは、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる。いくつかの実施形態では、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、又は５ｐＭ以下の濃度のＲＮＰは、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の効率で二本鎖ＤＮＡ標的を切断することができる。これらの改善された特徴は、以下により詳細に記載される。
ｇ．タンパク質安定性
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、改善された安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性は、より高い定常状態のタンパク質の発現をもたらし、編集効率を改善する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性は、機能的なコンフォメーションにフォールディングされたままであるより大きな割合のＣａｓＸタンパク質をもたらし、編集効率を改善するか、又は製造目的のための精製可能性を改善する。本明細書で使用される場合、「機能的なコンフォメーション」は、タンパク質がｇＲＮＡ及び標的核酸に結合することができるコンフォメーションにあるＣａｓＸタンパク質を指す。ＣａｓＸバリアントがそれを触媒的に失活させる１つ以上の変異を有しない実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、標的核酸とハイブリダイズすることができる標的化配列を有するｇＲＮＡと複合体化した場合、標的核酸を切断、ニッキング、又は他の方法で改変することができる。ＣａｓＸの機能的なコンフォメーションは、「切断コンピテント（cleavage competent）」なコンフォメーションを指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質が機能的なコンフォメーションにフォールディングされたままであるより大きな割合のＣａｓＸタンパク質をもたらすそれらの実施形態を含めて、遺伝子編集などの適用には、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、より低い濃度のＣａｓＸバリアントが必要とされる。したがって、いくつかの実施形態では、改善された安定性を有するＣａｓＸバリアントは、１つ以上の遺伝子編集状況において、参照ＣａｓＸと比較して改善された効率を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＮＰが機能的な形態のままであるように、参照ＣａｓＸタンパク質：ｇＲＮＡ複合体と比較して、ＣａｓＸバリアントタンパク質：ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体の改善された安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。安定性の改善は、熱安定性の増加、タンパク質分解に対する耐性、薬物動態特性の増強、ある範囲のｐＨ条件にわたる安定性、塩条件、及び張性を含み得る。複合体の安定性の改善は、いくつかの実施形態では、編集効率の改善をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、表１の配列番号１～３の参照ＣａｓＸ及び配列番号４又は５のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍高い割合の切断コンピテントＲＮＰを有する。増加した切断コンピテントＲＮＰの例示的なデータは、実施例において提供されている。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約２，０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、少なくとも約５，０００倍、又は少なくとも約１０，０００倍改善されている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約５ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約１０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約２０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約３０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約４０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約６０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約７０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約８０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約９０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約１００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約１５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約２００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約２５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約３００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約３５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約４００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約４５０ｋＪ／ｍｏｌ、又は少なくとも約５００ｋＪ／ｍｏｌ改善されている。
参照ＣａｓＸタンパク質と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質の安定性を増加させることができる例示的なアミノ酸変化としては、ＣａｓＸバリアントタンパク質内の水素結合の数を増加させる、ＣａｓＸバリアントタンパク質内のジスルフィド架橋の数を増加させる、ＣａｓＸバリアントタンパク質内の塩橋の数を増加させる、ＣａｓＸバリアントタンパク質の部分間の相互作用を強化する、ＣａｓＸバリアントタンパク質の埋もれた疎水性表面を増加させるアミノ酸変化、又はそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
ｈ．ｇＲＮＡに対するタンパク質親和性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアントと比較して、ｇＲＮＡに対する親和性が改善されており、リボ核タンパク質複合体の形成をもたらす。ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、例えば、ＲＮＰ複合体の形成についてより低いＫｄをもたらし得、これは、場合によっては、より安定なＲＮＰ複合体形成をもたらす。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、ヒト細胞に送達された場合、ＲＮＰ複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞における複合体の機能及び有用性に影響を及ぼし得、並びに対象に送達された場合、血液における改善された薬物動態学特性をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加、及び得られるＲＮＰ複合体の安定性の増加は、所望の活性、例えば、インビボ又はインビトロでの遺伝子編集を依然として有しながら、対象又は細胞に送達されるＣａｓＸバリアントタンパク質の用量がより低くなる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のｇＲＮＡに対するより高い親和性（より強い結合）は、ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡの両方がＲＮＰ複合体中に残っている場合、より多くの編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載の編集アッセイを使用して評価することができる。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質のＫｄは、参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアントと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ｇＲＮＡに対して約１．１～約１０倍増加した結合親和性を有する。
理論に束縛されることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、ヘリックスＩドメインにおけるアミノ酸変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ標的化配列との結合親和性を増加させることができ、ヘリックスＩＩドメインにおける変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ足場ステムループとの結合親和性を増加させることができ、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）における変化は、ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＲＮＡ三重鎖との結合親和性を増加させる。
ｇＲＮＡに対するＣａｓＸタンパク質の結合親和性を測定する方法は、精製されたＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡを使用するインビトロの方法を含む。参照ＣａｓＸ及びバリアントタンパク質に対する結合親和性は、ｇＲＮＡ又はＣａｓＸタンパク質がフルオロフォアでタグ付けされている場合、蛍光偏光によって測定することができる。代替的に、又は追加的に、結合親和性は、バイオレイヤー干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、又は膜結合によって測定することができる。参照ｇＲＮＡ及びそのバリアントなどの特定のｇＲＮＡに対する、参照ＣａｓＸ及び本開示のバリアントタンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質の絶対親和性を定量化するための更なる標準的な技術としては、等温熱量測定（ＩＴＣ）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、並びに実施例の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
ｉ．標的核酸に対する親和性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸に対する参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアントの親和性と比較して、標的核酸に対する改善された結合親和性を有する。それらの標的核酸に対してより高い親和性を有するＣａｓＸバリアントは、いくつかの実施形態では、標的核酸に対して増加した親和性を有しない参照ＣａｓＸタンパク質よりも迅速に標的核酸配列を切断することができる。
いくつかの実施形態は、標的核酸に対する改善された親和性は、標的核酸の標的配列若しくはプロトスペーサー配列に対する親和性の改善、ＰＡＭ配列に対する親和性の改善、標的配列についてＤＮＡを検索する能力の改善、又はそれらの任意の組み合わせを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、ＣａｓＸなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのタンパク質は、ＤＮＡ分子に沿った一次元的な拡散によってそれらの標的配列を見出すことができると考えられている。このプロセスは、（１）リボ核タンパク質のＤＮＡ分子への結合、続いて、（２）標的配列での停止、を含むと考えられており、いくつかの実施形態では、これらはいずれも、標的核酸配列に対するＣａｓＸタンパク質の改善された親和性によって影響され得、それによって、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ＣａｓＸバリアントタンパク質の機能を改善する。
いくつかの実施形態では、改善された標的核酸親和性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、及びＣＴＣからなる群から選択されるＰＡＭ配列を含む、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質によって認識される正準ＴＴＣ ＰＡＭ以外の特異的ＰＡＭ配列に対する親和性又はそれを利用する能力が増加しており、それによって、野生型ＣａｓＸヌクレアーゼ又はＣａｓＸ１９９若しくは４９１のヌクレアーゼと比較して、編集され得る標的核酸の量が増加する。理論に束縛されることを望むものではないが、これらのタンパク質バリアントは、全体的にＤＮＡとより強く相互作用し得、野生型参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸ１９９若しくは４９１のヌクレアーゼのＰＡＭ配列を超える更なるＰＡＭ配列を利用する能力に起因して、標的核酸内の配列にアクセスし、それを編集する増大した能力を有し得、それによって、標的配列についてのＣａｓＸタンパク質のより効率的な検索プロセスを可能にすることが可能である。ＤＮＡに対するより高い全体的な親和性はまた、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質が結合及び巻き戻しステップを効果的に開始及び終了することができる頻度を増加させることができ、それによって、標的鎖侵入及びＲループ形成、並びに最終的に標的核酸配列の切断を促進する。
理論に束縛されるものではないが、ＮＴＳＢドメインにおけるアミノ酸変化は、巻き戻された状態の非標的核酸鎖の巻き戻し又は捕捉の効率を増加させ、標的核酸に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる可能性がある。代替的に、又は追加的に、ＮＴＳＢドメインにおけるアミノ酸変化は、巻き戻し中にＤＮＡを安定化するＮＴＳＢドメインの能力を増大させ、標的核酸に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。代替的に、又は追加的に、ＯＢＤにおけるアミノ酸変化は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）へのＣａｓＸバリアントタンパク質結合の親和性を増加させ、それによって、標的核酸に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させ得る。代替的に、又は追加的に、ヘリックスＩ及び／又はヘリックスＩＩ、ＲｕｖＣ、並びにＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化は、標的核酸鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させ、標的核酸に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、標的核酸分子に対する本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質の結合親和性は、参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアントと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照タンパク質、又はＣａｓＸ４９１及び５１５バリアントと比較して、標的核酸に対して約１．１～約１００倍増加した結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸の非標的鎖に対する増加した結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「非標的鎖」という用語は、ｇＲＮＡにおける標的化配列とワトソン及びクリック塩基対を形成せず、標的核酸鎖に相補的であるＤＮＡ標的核酸配列の鎖を指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照タンパク質、又は配列番号２７０若しくは配列番号３３６のＣａｓＸバリアントと比較して、標的核酸の非標的鎖に対して約１．１～約１００倍増加した結合親和性を有する。
標的核酸分子及び／又は非標的核酸分子に対するＣａｓＸタンパク質（例えば、参照若しくはバリアント）の親和性を測定する方法は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、膜結合、等温熱量測定（ＩＴＣ）、及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光偏光、及びバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を含み得る。標的に対するＣａｓＸタンパク質の親和性を測定する更なる方法は、経時的にＤＮＡ切断事象を測定するインビトロ生化学的アッセイを含む。
ｊ．標的部位に対する改善された特異性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアントと比較して、標的核酸配列に対して改善された特異性を有する。本明細書で使用される場合、「特異性」（互換的に「標的特異性」と称されることもある）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムリボ核タンパク質複合体が、標的核酸配列に類似するが同一ではないオフターゲット配列を切断する程度を指す。例えば、より高い程度の特異性を有するＣａｓＸバリアントＲＮＰは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、配列のオフターゲット切断の低減を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質の特異性、及び潜在的に有害なオフターゲット効果の低減は、哺乳動物対象における使用のための許容される治療指数を達成するために極めて重要であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパクは、ｇＲＮＡの標的化配列に相補的である標的配列内の標的部位に対して改善された特異性を有する。上記のように、特異性の改善と相関するものは、オフターゲット編集の低減である。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＲＮＰとしてＣａｓＸバリアントと複合体化したｇＲＮＡの標的化配列に１００％相補的ではない標的配列内の標的部位に対するオフターゲット編集又は切断の低減を示す。理論に束縛されることを望むものではないが、標的核酸鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるヘリックスＩ及びＩＩドメインにおけるアミノ酸変化は、標的核酸全体に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させることができる可能性がある。いくつかの実施形態では、標的核酸に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるアミノ酸変化はまた、ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の減少をもたらし得る。
ＣａｓＸタンパク質（例えば、バリアント又は参照）の標的特異性を試験する方法は、ガイド及び配列決定による切断効果のインビトロ報告のための環状化（Circularization for In vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing）（ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ）、又は同様の方法を含み得る。簡潔に、ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ技術では、ゲノムＤＮＡを剪断し、ステム・ループアダプターのライゲーションによって環状化し、ステム・ループ領域にニックを入れて、４ヌクレオチドのパリンドロームオーバーハングを露出させる。これに続いて、残りの直鎖ＤＮＡの分子内ライゲーション及び分解が行われる。続いて、ＣａｓＸ切断部位を含む環状ＤＮＡ分子をＣａｓＸで線状化し、アダプターアダプターを、露出した末端にライゲーションした後、ハイスループット配列決定を行って、オフターゲット部位についての情報を含むペアエンドリードを生成する。オフターゲット事象（したがって、ＣａｓＸタンパク質の特異性）を検出するために使用することができる更なるアッセイとしては、それらの選択されたオフターゲット部位で形成されたインデル（挿入及び欠失）を検出及び定量化するために使用されるアッセイ（例えば、ミスマッチ検出ヌクレアーゼアッセイ及び次世代配列決定（next generation sequencing、ＮＧＳ）が挙げられる。例示的なミスマッチ検出アッセイとしては、ヌクレアーゼアッセイが挙げられ、これは、ＣａｓＸ及びｓｇＲＮＡで処理した細胞由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、変性させ、再ハイブリダイズして、１つの野生型鎖と１つのインデルを有する鎖とを含むヘテロ二重鎖ＤＮＡを形成する。ミスマッチは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩなどのミスマッチ検出ヌクレアーゼによって認識及び切断される。ＣａｓＸバリアントの特異性を評価するための方法は、ＣａｓＸバリアントの実施形態の改善された特異性を実証する支持データとともに、実施例に記載されている。
ｋ．プロトスペーサー及びＰＡＭ配列
本明細書において、プロトスペーサーは、ガイドＲＮＡの標的化配列に相補的なＤＮＡ配列及びその配列に相補的なＤＮＡとして定義され、それぞれ標的鎖及び非標的鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、ＰＡＭは、プロトスペーサーに近位のヌクレオチド配列であり、これは、ｇＲＮＡの標的化配列と併せて、プロトスペーサー鎖の潜在的な切断のためのＣａｓＸの配向及び位置決めを助ける。
ＰＡＭ配列は縮重していてもよく、特定のＲＮＰ構築物は、異なる切断効率を支持する異なる好ましい許容されるＰＡＭ配列を有していてもよい。慣例に従って、別段の記載がない限り、本開示は、ＰＡＭ及びプロトスペーサー配列の両方、並びに非標的鎖の配向に従ったそれらの方向性について言及する。これは、標的鎖ではなく非標的鎖のＰＡＭ配列が切断の決定因子であるか、又は標的認識に機構的に関与することを意味するものではない。例えば、ＴＴＣ ＰＡＭに言及する場合、実際には、標的切断に必要な相補的なＧＡＡ配列であってもよく、又は両方の鎖からのヌクレオチドの何らかの組み合わせであってもよい。本明細書に開示されるＣａｓＸタンパク質の場合、ＰＡＭは、プロトスペーサーの５’側に位置し、単一のヌクレオチドがＰＡＭをプロトスペーサーの第１のヌクレオチドから分離する。したがって、参照ＣａｓＸの場合、ＴＴＣ ＰＡＭは、式５’－．．．ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’（配列番号１９）（式中、「Ｎ」は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、「（プロトスペーサー）」は、ガイドＲＮＡの標的化配列と同一性を有するＤＮＡ配列である）に従う配列を意味すると理解されるべきである。拡張されたＰＡＭ認識を有するＣａｓＸバリアントの場合、ＴＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＡＴＣ ＰＡＭは、以下の式に従う配列を意味すると理解されるべきである：５’－．．．ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’（配列番号１９）、５’－．．．ＮＮＣＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’（配列番号２０）；５’－．．．ＮＮＧＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’（配列番号２１）；又は５’－．．．ＮＮＡＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’（配列番号２２）。代替的に、ＴＣ ＰＡＭは、式５’－．．．ＮＮＮＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’（配列番号２３）に従う配列を意味すると理解されるべきである。
追加的に、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣ（５’から３’の配向で）から選択されるＰＡＭ配列を含むＰＡＭ ＴＣモチーフを利用して、ＲＮＰとしてｇＲＮＡと複合体化した場合、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡのＲＮＰ、又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアント（例えば、ＣａｓＸ４９１及びｇＲＮＡ１７４）のＲＮＰと比較して、標的核酸を効率的に編集及び／又はそれと結合する能力が増強されている。前述において、ＰＡＭ配列は、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、アッセイシステムにおけるｇＲＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して少なくとも１ヌクレオチド５’側に位置する。一実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列がＴＴＣである、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアントのＲＮＰ、例えば、ＣａｓＸ４９１及びｇＲＮＡ１７４）と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸における標的配列の結合を示す。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列がＡＴＣである、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（又は、それが由来する別のＣａｓＸバリアントのＲＮＰ、例えば、ＣａｓＸ４９１及びｇＲＮＡ１７４）と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸における標的配列の結合を示す。ＣａｓＸバリアントがＡＴＣ ＰＡＭによる編集の増強を示す前述の特定の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、５２８（配列番号４２８）である。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列がＣＴＣである、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（又は、それが由来する別のＣａｓＸバリアントのＲＮＰ、例えば、ＣａｓＸ４９１及びｇＲＮＡ１７４）と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸における標的配列の結合を示す。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのＲＮＰは、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列がＧＴＣである、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰ（又は、それが由来する別のＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡ１７４のＲＮＰ）と比較して、より高い編集効率及び／又は標的核酸における標的配列の結合を示す。前述の実施形態では、１つ以上のＰＡＭ配列に対する増加した編集効率及び／又は結合親和性は、ＰＡＭ配列についての配列番号１～３のうちのいずれか１つのＣａｓＸタンパク質及び表１のｇＲＮＡのＲＮＰの編集効率及び／又は結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、若しくは少なくとも４０倍、又はそれ以上大きい。改善された編集を実証する例示的なアッセイは、本明細書の実施例に記載されている（例えば、図４１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、標的核酸及び／又は標的核酸に会合するポリペプチド（例えば、ヒストンテールのメチル化又はアセチル化）に結合及び／又は改変（例えば、切断、ニッキング、メチル化、脱メチル化など）することができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパクは、触媒的に不活性（ｄＣａｓＸ）であるが、標的核酸に結合する能力を保持する。
ｌ．ＤＮＡの巻き戻し
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、改善されたＤＮＡを巻き戻す能力を有する。不十分なｄｓＤＮＡ巻き戻しは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質ＡｎａＣａｓ９又はＣａｓ１４のＤＮＡを切断する能力を損なうか又は妨げることが以前に示されている。したがって、いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、本開示のいくつかのＣａｓＸバリアントタンパク質によるＤＮＡ切断活性の増加は、少なくとも部分的に、標的部位でｄｓＤＮＡを見つけて巻き戻す能力の増加に起因する可能性が高い。ＣａｓＸタンパク質（例えば、バリアント又は参照）がＤＮＡを巻き戻す能力を測定する方法としては、蛍光偏光又はバイオレイヤー干渉法におけるｄｓＤＮＡ標的のオン速度の増加を観察するインビトロアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
理論に束縛されることを望むものではないが、ＮＴＳＢドメインにおけるアミノ酸変化は、ＤＮＡ巻き戻し特徴が増加したＣａｓＸバリアントタンパク質を産生することができると考えられる。代替的に、又は追加的に、ＯＢＤ又はＰＡＭと相互作用するヘリックスドメイン領域におけるアミノ酸変化はまた、ＤＮＡ巻き戻し特徴が増加したＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。
ＣａｓＸタンパク質（例えば、バリアント又は参照）がＤＮＡを巻き戻す能力を測定する方法としては、蛍光偏光又はバイオレイヤー干渉法におけるｄｓＤＮＡ標的のオン速度の増加を観察するインビトロアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
ｍ．触媒活性
本明細書に開示されるＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムのリボ核タンパク質複合体は、標的核酸に結合し、場合によっては標的核酸を切断するｇＲＮＡバリアントと複合体化したＣａｓＸバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質、又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアントと比較して、改善された触媒活性を有する。理論に束縛されることを望むものではないが、場合によっては、標的鎖の切断が、ｄｓＤＮＡ切断の生成におけるＣａｓ１２様分子の制限因子であり得ると考えられる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＤＮＡの標的鎖の屈曲及びこの鎖の切断を改善し、ＣａｓＸリボ核タンパク質複合体によるｄｓＤＮＡ切断の全体的な効率の改善をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、又はそれが由来する別のＣａｓＸバリアントと比較して、増加したヌクレアーゼ活性を有する。ヌクレアーゼ活性が増加したバリアントは、例えば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸変化を介して生成することができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ニッカーゼ活性を有するＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含む。前述において、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムのＣａｓＸニッカーゼは、非標的鎖におけるＰＡＭ部位の３’側の１０～１８ヌクレオチド内に一本鎖切断を生成する。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、二本鎖切断活性を有するＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含む。前述において、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムのＣａｓＸは、標的鎖上のＰＡＭ部位の５’側１８～２６ヌクレオチド及び非標的鎖上の３’側１０～１８ヌクレオチド内に二本鎖切断を生成する。ヌクレアーゼ活性は、実施例の方法を含む様々な方法によってアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸと比較して、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも６倍、又は少なくとも７倍、又は少なくとも８倍、又は少なくとも９倍、又は少なくとも１０倍大きいｋ切断定数を有する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＲＮＡを有するＲＮＰを形成する改善された特徴を有し、実施例に記載されるように、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、より高い割合の切断コンピテントＲＮＰをもたらす。切断コンピテント（cleavage competent）とは、形成されるＲＮＰが標的核酸を切断する能力を有することを意味する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡのＲＮＰは、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質及び表２のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の切断速度を示す。前述の実施形態では、改善されたコンピテンシー率は、実施例に記載されているようなインビトロアッセイにおいて実証することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸと比較して、二本鎖切断のための増加した標的鎖装填を有する。増加した標的鎖装填活性を有するバリアントは、例えば、ＴＬＳドメインにおけるアミノ酸変化を介して生成され得る。理論に束縛されることを望むものではないが、ＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化は、改善された触媒活性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質をもたらし得る。代替的に、又は追加的に、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の結合チャネル周囲のアミノ酸変化はまた、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性も改善することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、増加した付随的な切断活性を有する。本明細書で使用される場合、「付随的な切断活性」とは、標的核酸配列の認識及び切断に続く、核酸の更なる非標的化切断をいう。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、減少した付随的な切断活性を有する。
ＣａｓＸタンパク質の触媒活性を特徴付けるための例示的な方法としては、以下の実施例の方法を含むインビトロ切断アッセイが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アガロースゲル上でのＤＮＡ産物の電気泳動は、鎖切断の動態を調べることができる。
ｎ．標的ＲＮＡに対する親和性
いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質又はそのバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＲＮＡに結合し、標的核酸を切断する。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較した場合、標的ＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させ、標的ＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の活性を増加させる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較した場合、標的ＲＮＡに対する結合親和性の増加又は標的ＲＮＡの切断の増加を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパクを含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＲＮＡに結合し、かつ／又は標的ＲＮＡを切断する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照タンパク質、又は配列番号２７０若しくは配列番号３３６のＣａｓＸバリアントと比較して、少なくとも約２倍～約１０倍増加した標的核酸に対する結合親和性を有する。
ｏ．触媒的に不活性なＣａｓＸバリアント
いくつかの実施形態、例えば、標的核酸配列の切断が所望の結果ではない適用を包含する実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を改善することは、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を変化、低下、又は消失させることを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、標的核酸に相補的な標的化配列を有するｇＲＮＡと複合体化した場合、標的核酸に結合することができるが、標的核酸を切断することができない、触媒的に不活性なＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。例示的な触媒的に不活性なＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの活性部位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１と比較して、残基６７２、７６９、及び／又は９３５に置換を含む。一実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、Ｄ６７２Ａ、Ｅ７６９Ａ、及び／又はＤ９３５Ａの置換を含む。他の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、アミノ酸６５９、７５６、及び／又は９２２における置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、Ｄ６５９Ａ、Ｅ７５６Ａ、及び／又はＤ９２２Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓＸバリアント５２７、６６８、及び６７６タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を消失させるＤ６６０Ａ、Ｅ７５７Ａ、及びＤ９２２Ａの改変を含む。更なる実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの全部又は一部の欠失を含む。同じ前述の置換を、同様に本開示のＣａｓＸバリアントに導入することができ、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）バリアントをもたらすことが理解されるであろう。一実施形態では、ＲｕｖＣドメインの全部又は一部がＣａｓＸバリアントから欠失され、ｄＣａｓＸバリアントをもたらす。触媒的に不活性なｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、いくつかの実施形態では、塩基編集又はエピジェネティック改変のために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡに対してより高い親和性を有する触媒的に不活性なｄＣａｓＸバリアントタンパクは、触媒的に活性なＣａｓＸと比較して、それらの標的核酸をより速く見つけることができ、標的核酸により長い期間結合したままであり得、標的核酸により安定した様式で結合することができ、又はそれらの組み合わせであり得、それによって、その切断能力を保持するＣａｓＸバリアントと比較して、触媒的に不活性なＣａｓＸバリアントタンパク質のこれらの機能を改善する。例示的なｄＣａｓＸバリアント配列は、表７に示される配列番号４４～６２及び１２３２～１２３５として開示される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントは、配列番号４４～６２又は１２３２～１２３５の配列と少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、又は少なくとも９９％同一であり、ｄＣａｓＸバリアントタンパクの機能特性を保持している。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントは、配列番号４４～６２又は１２３２～１２３５の配列を含む。
ｐ．ＣａｓＸ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアントを含む、ＣａｓＸに融合された異種タンパク質を含むＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。これは、異種タンパク質若しくはそのドメインへのＣａｓＸのＮ末端融合、Ｃ末端融合、又は内部融合を含むＣａｓＸバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ融合タンパク質は、融合タンパク質をもたらす、目的の異なる活性を有する１つ以上のタンパク質又はそのドメインに融合された、配列番号２４７～５９２若しくは１１４７～１２３１のバリアント、又は表３の配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ融合タンパク質は、目的の異なる活性を有する１つ以上のタンパク質又はそのドメインに融合された、配列番号２７０～５９２又は１１４７～１２３１のバリアントのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ融合タンパク質は、目的の異なる活性を有する１つ以上のタンパク質又はそのドメインに融合された、配列番号４１５～５９２又は１１４７～１２３１のバリアントのうちのいずれか１つを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を阻害する、標的核酸を改変する、又は核酸に会合するポリペプチドを改変する（例えば、ヒストン改変）タンパク質（又はそのドメイン）に融合される。
いくつかの実施形態では、異種ポリペプチド（又はシステイン残基若しくは非天然アミノ酸などの異種アミノ酸）をＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入して、ＣａｓＸ融合タンパク質を生成することができる。他の実施形態では、システイン残基をＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入し、続いて、以下に記載する異種ポリペプチドをコンジュゲートすることができる。いくつかの代替的な実施形態では、異種ポリペプチド又は異種アミノ酸は、参照又はＣａｓＸバリアントタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加され得る。他の実施形態では、異種ポリペプチド又は異種アミノ酸は、ＣａｓＸタンパク質の配列内に内部挿入され得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型の配列特異的な標的核酸結合及び切断活性を保持する。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸバリアントタンパク質の活性（例えば、切断活性及び／又は結合活性）の５０％以上を有する（保持する）。場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸタンパク質の活性（例えば、切断活性及び／又は結合活性）の少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約１００％を保持する。
場合によっては、参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、挿入された異種アミノ酸又は異種ポリペプチドを有しないＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸の結合活性を保持する（有する）。場合によっては、参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸタンパク質の結合活性の少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９２％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９８％、又は約１００％を保持する。
場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、挿入された異種アミノ酸又は異種ポリペプチドを有しない親ＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸の結合活性及び／又は切断活性を保持する（有する）。例えば、場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、対応する親ＣａｓＸタンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合活性及び／又は切断活性の５０％以上を有する（保持する）。例えば、場合によっては、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、対応するＣａｓＸ親タンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合活性及び／又は切断活性の６０％以上（７０％以上、８０％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、又は１００％）を有する（保持する）。ＣａｓＸタンパク質及び／又はＣａｓＸ融合タンパク質の切断活性及び／又は結合活性を測定する方法は、当業者に既知であり、任意の便利な方法を使用することができる。
様々な異種ポリペプチドが、本開示のＣａｓＸバリアント融合タンパク質に含めるのに好適である。場合によっては、融合パートナーは、標的核酸の転写を調節する（例えば、転写を阻害する、転写を増加させる）ことができる。例えば、場合によっては、融合パートナーは、転写を抑制するタンパク質（又はタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写リプレッサー、転写抑制タンパク質の動員、メチル化などの標的核酸の改変、ＤＮＡモディファイヤーの動員、標的核酸に会合するヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／又はメチル化を改変するものなどのヒストンモディファイヤーの動員などを介して機能するタンパク質）である。場合によっては、融合パートナーは、転写を増加させるタンパク質（又はタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写アクチベーター、転写アクチベータータンパク質の動員、脱メチル化などの標的核酸の改変、ＤＮＡモディファイヤーの動員、標的核酸に会合するヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／又はメチル化を改変するものなどのヒストンモディファイヤーの動員などを介して機能するタンパク質）である。
場合によっては、融合パートナーは、標的核酸配列を改変する酵素活性、例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、又はグリコシラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２４７～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つと、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、又は脱ミリストイル化活性を有するポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２７０～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つと、上記のポリペプチドと、を含む。いくつかの実施形態、ＣａｓＸバリアントは、配列番号４１５～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つと、上記のポリペプチドと、を含む。
転写を増加させるための融合パートナーとして使用することができるタンパク質（又はその断片）の例としては、転写アクチベーター（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢ由来）、及び（例えば、植物における活性の）ＥＤＬＬの活性化ドメイン及び／又はＴＡＬ活性化ドメイン）；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１など）；ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）；ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなど）；並びにＤＮＡデメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）が挙げられるが、これらに限定されない。
転写を減少させるための融合パートナーとして使用され得るタンパク質（又はその断片）の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：転写リプレッサー（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ又はＳＫＤ））；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＦ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｄｏｍａｉｎ、ＥＲＤ）、（例えば、植物における抑制のための）ＳＲＤＸ抑制ドメインなど；ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＲＩＺ１など）；ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹなど）；ヒストンリジンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１など）；ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）など）；及び末梢動員エレメント（例えば、Ｌａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂなど）。
場合によっては、ＣａｓＸバリアントに対する融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を改変する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例としては、ヌクレアーゼ活性（例えば、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるもの）、メチルトランスフェラーゼ活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．Ｈｈａｌ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）などによって提供されるもの）、デメチラーゼ活性（例えば、デメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）によって提供されるもの）、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性（例えば、デアミナーゼ（例えば、シトシンデアミナーゼ酵素、例えば、ラットアポリポタンパク質ＢのｍＲＮＡ編集酵素、触媒ペプチド１｛ＡＰＯＢＥＣ１｝などのＡＰＯＢＥＣタンパク質）によって提供されるもの）、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性（例えば、インテグラーゼ及び／又はリゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼ（例えば、ＧｉｎインベルターゼＧｉｎＨ１０６Ｙの高活性変異体））、ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）、Ｔｎ３リゾルバーゼなどによって提供されるもの）、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性（例えば、リコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎリコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるもの）、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性が挙げられるが、これらに限定されない。
場合によっては、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を増加させるためのドメイン（例えば、ＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４ドメイン）、転写を減少させるためのドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン（例えば、Ｋｏｘ１タンパク質由来））、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００）、検出可能なシグナルを提供するタンパク質／ドメイン（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）、又は塩基エディター（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１などのシチジンデアミナーゼ）から選択されるポリペプチドに融合される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、転写を減少させるためのドメイン、酵素活性を有するドメイン、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン、検出可能なシグナルを提供するタンパク質／ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、及び塩基エディターからなる群から選択されるポリペプチドに融合された、配列番号２４７～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号２７０～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号４１５～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は表３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、転写を減少させるためのドメイン、酵素活性を有するドメイン、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン、検出可能なシグナルを提供するタンパク質／ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、及び塩基エディターからなる群から選択されるポリペプチドに融合された、配列番号２４７～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、上記のポリペプチドに融合された配列番号２７０～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、上記のポリペプチドに融合された配列番号４１５～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、転写を減少させるためのドメイン、酵素活性を有するドメイン、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン、検出可能なシグナルを提供するタンパク質／ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、及び塩基エディターからなる群から選択されるポリペプチドに融合された、配列番号７６０～７８９のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、転写を減少させるためのドメイン、酵素活性を有するドメイン、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン、検出可能なシグナルを提供するタンパク質／ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、及び塩基エディターからなる群から選択されるポリペプチドに融合された、配列番号４１１～５９２のうちのいずれか１つを含む。
場合によっては、本開示の参照ＣａｓＸタンパク質又はＣａｓＸバリアントは、塩基エディターに融合される。塩基エディターには、ヌクレオシド又はヌクレオチド上のグアニン、アデニン、シトシン、チミン、又はウラシル塩基を改変することができるものが含まれる。塩基エディターとしては、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１）、及びグアニンオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本明細書に提供されるＣａｓＸバリアントのいずれかは、塩基エディターを含み得る（すなわち、それに融合され得る）。例えば、本開示のＣａｓＸバリアントは、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、又はグアニンオキシダーゼに融合され得る。例示的な実施形態では、配列番号２４７～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つを含む本開示のＣａｓＸバリアントは、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、又はグアニンオキシダーゼに融合される。更なる例示的な実施形態では、配列番号２７０～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つを含む本開示のＣａｓＸバリアントは、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、又はグアニンオキシダーゼに融合される。更なる例示的な実施形態では、配列番号４１５～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つを含む本開示のＣａｓＸバリアントは、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、又はグアニンオキシダーゼに融合される。
場合によっては、ＣａｓＸバリアントに対する融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）に会合するタンパク質（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質など）を改変する酵素活性を有する。ＣａｓＸバリアントとの融合パートナーによって提供され得る（標的核酸に会合するタンパク質を改変する）酵素活性の例としては、メチルトランスフェラーゼ活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ（histone methyltransferase、ＨＭＴ）（例えば、斑入り３－９ホモログ１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１、ＫＭＴ１Ａとしても知られる）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、ＫＭＴ１Ｃ及びＥＨＭＴ２としても知られる）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１など、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＭＹＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１様ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＤＯＴ１Ｌ）、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、リジンメチルトランスフェラーゼ５Ｂ（ＳＵＶ４－２０Ｈ１）、ｚｅｓｔｅ２ポリコーム抑制複合体２サブユニットのエンハンサー（ＥＺＨ２）、ＰＲ／ＳＥＴドメイン２（ＲＩＺ１）によって提供されるもの）、デメチラーゼ活性（例えば、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、ＬＳＤ１としても知られる）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）によって提供されるもの）、アセチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００の触媒コア／断片、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢ０１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなど）によって提供されるもの）、デアセチラーゼ活性（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１など）によって提供されるもの）、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、及び脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣａｓＸバリアントに対する好適な融合パートナーの更なる例としては、（ｉ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase、ＤＨＦＲ）不安定化ドメイン（例えば、化学的に制御可能な対象のＲＮＡ誘導型ポリペプチドを生成するため）、及び（ｉｉ）葉緑体移行ペプチド、が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２４７～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号２７０～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号４１５～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は表３の配列と、葉緑体移行ペプチド（ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲ ＶＫＣＭＱＶＷＰＰＩＧＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＰＬＴＲＤＳＲＡ（配列番号３３８）；ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＳ（配列番号３３９）；ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＴＭＶＡＳＰＡＱＡＴＭＶＡＰＦＮＧＬＫＳＳＡＡＦＰＡＴＲＫＡＮＮＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＮＣＭＱＶ ＷＰＰＩＥＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＤＬＴＤＳＧＧＲＶＮＣ（配列番号３４０）；ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＱＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧ ＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号３４１）；ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＷＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧ ＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号３４２）；ＭＡＱＩＮＮＭＡＱＧＩＱＴＬＮＰＮＳＮＦＨＫＰＱＶＰＫＳＳＳＦＬＶＦＧＳＫＫＬＫＮＳＡＮＳＭＬＶＬＫＫＤＳＩＦＭＱＬＦ ＣＳＦＲＩＳＡＳＶＡＴＡＣ（配列番号３４３）；ＭＡＡＬＶＴＳＱＬＡＴＳＧＴＶＬＳＶＴＤＲＦＲＲＰＧＦＱＧＬＲＰＲＮＰＡＤＡＡＬＧＭＲＴＶＧＡＳＡＡＰＫＱＳＲＫＰＨ ＲＦＤＲＲＣＬＳＭＶＶ（配列番号３４４）；ＭＡＡＬＴＴＳＱＬＡＴＳＡＴＧＦＧＩＡＤＲＳＡＰＳＳＬＬＲＨＧＦＱＧＬＫＰＲＳＰＡＧＧＤＡＴＳＬＳＶＴＴＳＡＲＡＴＰＫＱ ＱＲＳＶＱＲＧＳＲＲＦＰＳＶＶＶＣ（配列番号３４５）；ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号３４６）；ＭＥＳＬＡＡＴＳＶＦＡＰＳＲＶＡＶＰＡＡＲＡＬＶＲＡＧＴＶＶＰＴＲＲＴＳＳＴＳＧＴＳＧＶＫＣＳＡＡＶＴＰＱＡＳＰＶＩＳ ＲＳＡＡＡＡ（配列番号３４７）；及びＭＧＡＡＡＴＳＭＱＳＬＫＦＳＮＲＬＶＰＰＳＲＲＬＳＰＶＰＮＮＶＴＣＮＮＬＰＫＳＡＡＰＶＲＴＶＫＣＣＡＳＳＷＮＳＴＩＮＧＡＡＡＴＴＮＧＡＳＡＡＳＳ（配列番号３４８）が含まれるが、これらに限定されない）と、を含む。
場合によっては、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、エンドソームエスケープペプチドを含んでもよい。場合によっては、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡ（配列番号３４９）を含み、各Ｘは、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される。場合によっては、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＨＡＬＬＨＬＬＨＳＬＷＨＬＬＬＨＡ（配列番号３５０）又はＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号３５１）を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２４７～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号２７０～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号４１５～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つの配列、又は表３の配列と、エンドソーム脱出ポリペプチドと、を含む。
ｓｓＲＮＡ標的核酸配列を標的化する場合、使用のためのＣａｓＸバリアントのための融合パートナーの非限定的な例としては（限定されないが）、スプライシング因子（例えば、ＲＳドメイン）；タンパク質翻訳成分（例えば、翻訳開始、伸長、及び／又は終結因子；例えば、真核生物翻訳開始因子４γ｛ｅＩＦ４Ｇ｝）；ＲＮＡメチラーゼ；ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＲＮＡデアミナーゼ（例えば、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase acting on RNA、ＡＤＡＲ））、ＡからＩ及び／又はＣからＵの編集酵素を含む）；ヘリカーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質などが挙げられる。異種ポリペプチドは、タンパク質全体を含み得るか、又は場合によっては、タンパク質の断片（例えば、機能的ドメイン）を含み得ることが理解される。
いくつかの実施形態では、配列番号２４７～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号２７０～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号４１５～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、あるいは表３の配列のＣａｓＸバリアントは、ｓｓＲＮＡと相互作用することができる任意のドメインの融合パートナーを含む（本開示の目的のために、分子内及び／又は分子間二次構造を含む、例えば、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（例えば、ヘアピン、ステムループなど）が含まれる）。これには、一過的か不可逆的か、直接的か又は間接的かにかかわらず、以下を含む群から選択されるエフェクタードメインが含まれるが、これらに限定されない：エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＣＲＲ２２ ＤＹＷドメイン、Ｄｉｃｅｒ、並びにＳＭＧ５及びＳＭＧ６などのタンパク質由来のＰＩＮ（ＰｉｌＴ Ｎ末端）ドメイン）；ＲＮＡ切断の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、切断及びポリアデニル化特異的因子｛ＣＰＳＦ｝、切断刺激因子｛ＣｓｔＦ｝、ＣＦＩｍ、及びＣＦＩＩｍ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、クロマチン結合エキソヌクレアーゼＸＲＮ１（ＸＲＮ－１）又はエキソヌクレアーゼＴ）；デアデニラーゼ（例えば、ＤＮＡ ５’－アデノシン一リン酸ヒドロラーゼ｛ＨＮＴ３｝）；ナンセンス媒介ＲＮＡ分解に関与する因子及びタンパク質ドメイン（例えば、ＵＰＦ１ ＲＮＡヘリカーゼ及びＡＴＰアーゼ｛ＵＰＦ１｝、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３、ＵＰＦ３ｂ、ＲＮＰ ＳＩ、ＲＮＡ結合モチーフタンパク質８Ａ｛Ｙ１４｝、ＤＥＫがん原遺伝子｛ＤＥＫ｝、ＲＮＡプロセシングタンパク質ＲＥＦ２｛ＲＥＦ２｝、及びセリン－アルギニン反復マトリックス１｛ＳＲｍ１６０｝）；ＲＮＡの安定化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、細胞質ポリ（Ａ）結合タンパク質１｛ＰＡＢＰ｝）；翻訳の抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、アルゴノートＲＩＳＣ触媒成分２｛Ａｇｏ２｝及びＡｇｏ４）；翻訳の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ）；翻訳の調節に関与する（例えば、翻訳を調節することができる）タンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、翻訳因子（例えば、開始因子、伸長因子、終結因子など、例えば、ｅＩＦ４Ｇ））；ＲＮＡのポリアデニル化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ１）、ＰＡＰ関連ドメイン含有タンパク質；ポリ（Ａ）ＲＮＡポリメラーゼｇｌｄ－２｛ＧＬＤ－２｝、及びＳｔａｒ－ＰＡＰ）；ＲＮＡのポリウリジニル化に関与するタンパク及びタンパクドメイン（例えば、末端ウリジリルトランスフェラーゼ｛ＣＩＤ１｝及び末端ウリジル酸トランスフェラーゼ）；ＲＮＡ局在に関与するタンパク及びタンパクドメイン（例えば、インスリン様増殖因子２ ｍＲＮＡ結合タンパク質１｛ＩＭＰ１｝、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１｛ＺＢＰ１｝、Ｓｈｅ２ｐ、Ｓｈｅ３ｐ、及びＢｉｃａｕｄａｌ－Ｄ由来）；ＲＮＡの核内保持に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｒｒｐ６）；ＲＮＡの核外輸送に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、核ＲＮＡ輸送因子１｛ＴＡＰ｝、核ＲＮＡ輸送因子１｛ＮＸＦ１｝、ＴＨＯ複合体｛ＴＨＯ｝、ＴＲＥＸ、ＲＥＦ、及びＡｌｙ／ＲＥＦ輸送因子｛Ａｌｙ｝）；ＲＮＡスプライシングの抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ポリピリミジントラクト結合タンパク質１｛ＰＴＢ｝、ＫＨ ＲＮＡ結合ドメイン含有、シグナル伝達関連１ Ｓａｍ６８｝、及びヘテロ核リボ核タンパク質Ａ１｛ｈｎＲＮＰ Ａ１｝）；ＲＮＡスプライシングの刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、セリン／アルギニンリッチ（ｓｅｒｉｎｅ／ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｒｉｃｈ、ＳＲ）ドメイン）；転写効率の低下に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＦＵＳ ＲＮＡ結合タンパク質｛ＦＵＳ（ＴＬＳ））；並びに転写の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、サイクリン依存性キナーゼ７｛ＣＤＫ７｝及びＨＩＶ Ｔａｔ）。代替的に、エフェクタードメインは、以下を含む群から選択することができる：エンドヌクレアーゼ；ＲＮＡ切断を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；エキソヌクレアーゼ；デアデニラーゼ；ナンセンス媒介ＲＮＡ分解活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡを安定化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を調節することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、翻訳因子（例えば、開始因子、伸長因子、終結因子など、例えば、ｅＩＦ４Ｇ））；ＲＮＡをポリアデニル化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡをポリウリジニル化することができるタンパク及びタンパクドメイン；ＲＮＡ局在化活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡを核内保持することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡ核外輸送活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；転写効率を低下させることができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；並びに転写を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン。別の好適な異種ポリペプチドは、ＰＵＦ ＲＮＡ結合ドメインであり、これは、国際公開第２０１２／０６８６２７号（その全体が参照により本明細書に援用される）により詳細に記載されている。
ＣａｓＸバリアントとの融合パートナーとして（全体又はその断片で）使用することができるいくつかのＲＮＡスプライシング因子は、別個の配列特異的なＲＮＡ結合モジュール及びスプライシングエフェクタードメインを有するモジュール構成を有する。例えば、セリン／アルギニンリッチ（serine/arginine-rich、ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーは、プレｍＲＮＡにおけるエキソンスプライシングエンハンサー（exonic splicing enhancer、ＥＳＥ）に結合するＮ末端ＲＮＡ認識モチーフ（RNA recognition motif、ＲＲＭ）及びエキソン封入を促進するＣ末端ＲＳドメインを含む。別の例として、ｈｎＲＮＰタンパク質ｈｎＲＮＰ Ａ１は、そのＲＲＭドメインを介してエキソンスプライシングサイレンサー（exonic splicing silencer、ＥＳＳ）に結合し、Ｃ末端グリシンリッチドメインを介してエキソン封入を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、２つの選択的部位の間の調節配列に結合することによって、スプライス部位（splice site、ｓｓ）の選択的使用を調節することができる。例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２は、ＥＳＥを認識し、イントロン近位部位の使用を促進することができるが、ｈｎＲＮＰ Ａ１は、ＥＳＳに結合し、スプライシングをイントロン遠位部位の使用にシフトさせることができる。かかる因子の１つの適用は、内因性遺伝子（特に、疾患関連遺伝子）の選択的スプライシングを調節するＥＳＦを作製することである。例えば、ＢＣＬ２様１（Ｂｃｌ－ｘ）プレｍＲＮＡは、反対の機能のタンパク質をコードする２つの選択的５’スプライス部位を有する２つのスプライシングアイソフォームを産生する。長いスプライシングアイソフォームのＢｃｌ－ｘＬは、長寿命の有糸分裂後細胞において発現される強力なアポトーシス阻害剤であり、多くのがん細胞において上方制御され、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。短いアイソフォームのＢｃｌ－ｘＳは、アポトーシス促進性アイソフォームであり、高い代謝率を有する細胞（例えば、発生中のリンパ球）において高レベルで発現される。２つのＢｃｌ－ｘスプライシングアイソフォームの比は、コアエキソン領域又はエキソン伸長領域（すなわち、２つの選択的５’スプライス部位間）のいずれかに位置する複数のｃｃエレメントによって調節される。更なる例については、国際公開第２０１０／０７５３０３号を参照されたい（その全体が参照により本明細書に援用される）。
ＣａｓＸバリアントとともに使用するための更なる好適な融合パートナーとしては、境界エレメント（例えば、ＣＴＣＦ）であるタンパク質（又はその断片）、末梢動員を提供するタンパク質及びその断片（例えば、ラミンＡ、ラミンＢなど）、並びにタンパク質ドッキングエレメント（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌｌ／Ａｂｙｌなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
追加的に、又は代替的に、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、細胞による取り込みを促進するために、ポリペプチド透過性ドメインに融合され得る。いくつかの透過性ドメインが当該技術分野で既知であり、ペプチド、ペプチド模倣物、及び非ペプチド担体を含む本開示の非組み込み型ポリペプチドにおいて使用され得る。例えば、国際公開第２０１７／１０６５６９号及び米国特許出願公開第２０１８／０３６３００９（Ａ１）号（参照によりその全体が本明細書に援用される）は、Ｃａｓタンパク質と細胞取り込みを促進するための１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）との融合体を記載している。他の実施形態では、透過性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３９８）を含む、ペネトラチンと呼ばれるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子アンテナペディアの３番目のαヘリックスに由来し得る。別の例として、透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含み、例えば、天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸４９～５７を含み得る。他の透過性ドメインとしては、ポリアルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ－１ ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４～５６の領域、ノナアルギニン、オクタアルギニンなどが挙げられる。融合がなされる部位は、ポリペプチドの生物学的活性、分泌、又は結合特徴を最適化するために選択され得る。最適な部位は、日常的な実験によって決定される。
場合によっては、ＣａｓＸバリアントとともに使用するための異種ポリペプチド（融合パートナー）は、細胞内局在化を提供する。すなわち、異種ポリペプチドは、細胞内局在化配列（例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（nuclear localization signal、ＮＬＳ）、融合タンパク質を核外に保持するための配列（例えば、核外輸送配列（nuclear export sequence、ＮＥＳ））、融合タンパク質を細胞質に保持するための配列、ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなど）を含む。いくつかの実施形態では、対象のＲＮＡガイドポリペプチド若しくは条件的活性型ＲＮＡガイドポリペプチド及び／又は対象のＣａｓＸ融合タンパク質は、タンパク質が核に標的化されないように、ＮＬＳを含まない（これは、例えば、標的核酸が細胞質ゾルに存在するＲＮＡである場合に有利であり得る）。いくつかの実施形態では、融合パートナーは、追跡及び／又は精製を容易にするためのタグを提供することができる。すなわち、異種ポリペプチドが検出可能な標識である（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein、ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（red fluorescent protein、ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein、CFP) 、mCherry、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ヒスチジンタグ、例えば、６×Ｈｉｓタグ；赤血球凝集素（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号ＸＸ～ＸＸのうちのいずれか１つ及び細胞内局在化配列又はタグを含む。
場合によっては、参照タンパク質又はＣａｓＸバリアントタンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む（に融合される）。ＣａｓＸバリアントとともに使用するのに好適なＮＬＳの非限定的な例としては、以下に由来する配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％の同一性を有するか、又はそれと同一である配列が挙げられる：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３５２）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３５３）を有するヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３５４）又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３５５）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３５６）を有するｈＲＮＰＡｌ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンアルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３５７）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３５８）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３５９）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号３６０）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３６１）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号３６２）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３６３）；ヘルペスウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３６４）；マウスＭｘｌタンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３６５）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３６６）；ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３６７）；ボルナ病ウイルスＰタンパク質（Borna disease virus P protein、ＢＤＶ－Ｐ１）の配列ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３６８）；Ｃ型肝炎ウイルス非構造タンパク質（ＨＣＶ－ＮＳ５Ａ）の配列ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３６９）；ＬＥＦ１の配列ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３７０）；ＯＲＦ５７ ｓｉｍｉｒａｅの配列ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３７１）；ＥＢＶ ＬＡＮＡの配列ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３７２）；インフルエンザＡタンパク質の配列ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３７３）；ヒトＲＮＡヘリカーゼＡ（ｈｕｍａｎ ＲＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ Ａ、ＲＨＡ）の配列ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３７４）；核小体ＲＮＡヘリカーゼＩＩの配列ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３７５）；ＴＵＳ－タンパク質の配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３７６）；インポーチンαに関連する配列ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３７７）；ＨＴＬＶ－１のＲｅｘタンパク質由来の配列ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３７８）；Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのＥＧＬ－１３タンパク由来の配列ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３７９）；並びに配列ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３８０）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３８１）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３８２）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３８３）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３８４）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３８５）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３８６）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３８７）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３８８）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３８９）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号６３）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号６４）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号６５）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号６６）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号６７）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号６８）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号７０）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号７１）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号７２）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号７３）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７４）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７５）。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、リンカーペプチドを用いて、ＣＲＩＳＰＲタンパク質又は隣接するＮＬＳに連結され、リンカーペプチドが、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号１０２３）、（ＧＳ）ｎ（配列番号１０２４）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３９９）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４００）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０１）、ＧＧＳＧ（配列番号４０２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号４０３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号４０４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号４０５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号４０６）、ＧＳＳＳＧ（配列番号４０７）、ＧＰＧＰ（配列番号４０８）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号４０９）、ＰＰＰＧ（配列番号２４）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号４１０）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号２６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１０２５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号２７）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される。一般に、ＮＬＳ（又は複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核におけるＣａｓＸバリアント融合タンパク質の蓄積を駆動するのに十分強力なものである。核における蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施され得る。例えば、検出可能なマーカーは、細胞内の位置が可視化され得るように、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質に融合され得る。細胞核はまた、細胞から単離され得、次いで、その内容物が、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス（例えば、免疫組織化学、ウェスタンブロット、又は酵素活性アッセイ）によって分析され得る。核における蓄積はまた、間接的に決定され得る。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質への連結のための様々な構成での複数のＮＬＳのアセンブリを企図する。いくつかの実施形態では、１、２、３、４個又はそれ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドによってＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端に連結される。他の実施形態では、１、２、３、４個又はそれ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドによってＣＲＩＳＰＲタンパク質のＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端に連結されたＮＬＳは、Ｃ末端に連結されたＮＬＳと同一である。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端に連結されたＮＬＳは、Ｃ末端に連結されたＮＬＳとは異なる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＮ末端に連結されたＮＬＳは、表８に示されるＮ末端配列からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のＣ末端に連結されたＮＬＳは、表８に示されるＣ末端配列からなる群から選択される。核における蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施され得る。例えば、検出可能なマーカーは、細胞内の位置が可視化され得るように、参照又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質に融合され得る。細胞核はまた、細胞から単離され得、次いで、その内容物が、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス（例えば、免疫組織化学、ウェスタンブロット、又は酵素活性アッセイ）によって分析され得る。核における蓄積はまた、間接的に決定され得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号６３～７５、２１９～２３６、２３９、３５２～３８９、９８３～１０２１、１２３７～１２７８のうちのいずれか１つ又は表８の配列のいずれかの１つ以上のＮＬＳに融合された、配列番号２４７～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号２７０～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号４１５～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は表３の配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸバリアントのＮ末端又はその近傍に融合される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸバリアントのＣ末端又はその近傍に融合される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸバリアントのＮ末端及びＣ末端の両方に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、リンカーによって別のＮＬＳに連結される。
場合によっては、参照又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、「タンパク質形質導入ドメイン」又はＰＴＤ（ＣＰＰ細胞透過ペプチドとしても知られる）を含み、これは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、又は小胞膜の横断を促進するタンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機若しくは無機化合物を指す。別の分子（これは、小さな極性分子から大きな高分子及び／又はナノ粒子の範囲であり得る）に結合したＰＴＤは、分子が膜を横断すること、例えば、細胞外空間から細胞内空間へ、又はサイトゾルから細胞小器官内へ移行することを容易にする。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、参照又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質のアミノ末端に共有結合される。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、参照又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質のカルボキシル末端に共有結合される。場合によっては、ＰＴＤは、好適な挿入部位で参照又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質の配列の内部に挿入される。場合によっては、参照又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤを含む（にコンジュゲートされている、に融合されている）。場合によっては、ＰＴＤは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ＰＴＤの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３９０）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号３９１）を含むＨＩＶ ＴＡＴのペプチド形質導入ドメイン；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号３９２）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号３９３）；及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号３９４）；細胞への侵入を指示するのに十分な数のアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０～５０個のアルギニン）を含むポリアルギニン配列（配列番号１０２６）；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）： ４８９－９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａアンテナペディアタンパク形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；短縮型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号３９５）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号３９６）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号３９７）；並びにＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３９８）。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能ＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９又は「Ｅ９」）に切断コンピテントリンカーを介して連結されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９又は「Ｒ９」）を含み、これは、正味電荷をほぼ０に減少させ、それによって、細胞への接着及び取り込みを阻害する。リンカーが切断されると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその固有の接着性を局所的にアンマスクし、したがって、ＡＣＰＰを「活性化」して膜を通過させる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２４７～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号２７０～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は配列番号４１５～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれか１つ、又は表３の配列及びＰＴＤを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して内部に挿入された異種アミノ酸又は異種ポリペプチド（異種アミノ酸配列）に連結されたＣａｓＸタンパク質を含むことができる。いくつかの実施形態では、参照又はＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、Ｃ末端及び／又はＮ末端において、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して異種ポリペプチド（融合パートナー）に連結され得る。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。タンパク質は、一般的に柔軟な性質のスペーサーペプチドによって連結され得るが、他の化学結合は除外されない。好適なリンカーには、４アミノ酸～４０アミノ酸長、又は４アミノ酸～２５アミノ酸長のポリペプチドが含まれる。これらのリンカーは、一般に、合成のリンカーをコードするオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質をカップリングすることによって生成される。ある程度の柔軟性を有するペプチドリンカーを使用することができる。連結ペプチドは、好ましいリンカーが一般的に柔軟なペプチドをもたらす配列を有するであろうことを考慮して、実質的に任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシン及びアラニンなどの小アミノ酸の使用は、柔軟なペプチドの生成において有用である。かかる配列の生成は、当業者にとって日常的である。様々な異なるリンカーが市販されており、使用に好適であると考えられる。例示的なリンカーポリペプチドとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号１０２４）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３９９）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４００）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０１）を含み（式中、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、グリシン－プロリンポリマー、プロリンポリマー、及びプロリン－アラニンポリマーが挙げられる。例示的なリンカーは、ＲＳ、（Ｇ）ｎ、（ＧＳ）ｎ（配列番号１０２４）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３９９）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４００）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０１）、ＧＧＳＧ（配列番号４０２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号４０３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号４０４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号４０５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号４０６）、ＧＳＳＳＧ（配列番号４０７）、ＧＰＧＰ（配列番号４０８）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号４０９）、ＰＰＰＧ（配列番号２４）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号４１０）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号２６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１０２５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号２７）（式中、ｎは１～５である）を含むがこれらに限定されないアミノ酸配列を含むことができる。当業者であれば、上記の任意のエレメントにコンジュゲートされたペプチドの設計は、リンカーが、柔軟なリンカー、並びにあまり柔軟ではない構造を付与する１つ以上の部分を含むことができるように、全て又は部分的に柔軟なリンカーを含むことができることを認識するであろう。
Ｖ．ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントを作製する方法
本明細書に記載されるＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントは、様々な方法によって構築することができる。そのような方法は、例えば、以下及び実施例、並びに国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０／３６５０６及び国際公開第２０２０２４７８８３（Ａ２）号（参照により本明細書に援用される）に記載されている網羅的変異進化（ＤＭＥ）を含むことができる。
ａ．網羅的変異進化（ＤＭＥ）
いくつかの実施形態では、ＤＭＥは、改善された機能を有するＣａｓＸタンパク質及びｓｇＲＮＡ足場バリアントを同定するために使用される。ＤＭＥ法は、いくつかの実施形態では、生体分子バリアントのライブラリ（例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントのライブラリ）を生成するために、開始生体分子に対する変異の包括的なセットを構築及び試験することを含む。ＤＭＥは、開始生体分子に対して、アミノ酸（タンパク質の場合）又はヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡの場合）の全ての可能な置換、並びに全ての可能な小さな挿入、及び全ての可能な欠失を作製することを包含し得る。図１６に、ＤＭＥ法を示す概略図を示す。いくつかの実施形態では、ＤＭＥは、そのような全ての可能な置換、挿入、及び欠失のサブセットを含む。ＤＭＥの特定の実施形態では、バリアントの１つ以上のライブラリが構築され、機能的な変化について評価され、この情報が１つ以上の追加のライブラリを構築するために使用される。バリアントのそのような反復的な構築及び評価は、例えば、特定の方法で変異した場合に１つ以上の改善された機能をもたらすタンパク質又はＲＮＡの領域など、特定の機能的な結果につながる変異テーマの同定をもたらし得る。次いで、このような同定された変異の層化は、例えば、相加的又は相乗的相互作用を介して、機能を更に改善することができる。ＤＭＥは、ライブラリ設計、ライブラリ構築、及びライブラリスクリーニングを含む。いくつかの実施形態では、複数ラウンドの設計、構築、及びスクリーニングが行われる。
ｂ．ライブラリ設計
ＤＭＥ法は、多くのモノマーのポリマーである生体分子のバリアントを生成する。いくつかの実施形態では、生体分子は、タンパク質又はリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み、モノマー単位は、それぞれアミノ酸又はリボヌクレオチドである。生体分子変異の基本単位は、（１）あるモノマーを異なる同一性の別のモノマーに交換すること（置換）、（２）生体分子に１つ以上の追加のモノマーを挿入すること（挿入）、又は（３）生体分子から１つ以上のモノマーを除去すること（欠失）、のいずれかを含む。本明細書に記載の任意の生体分子内の任意の１つ以上のモノマーに対する置換、挿入、及び欠失を単独で又は組み合わせて含むＤＭＥライブラリは、本発明の範囲内であると考えられる。
いくつかの実施形態では、ＤＭＥは、全ての可能な置換、並びにアミノ酸（タンパク質の場合）又はヌクレオチド（ＲＮＡの場合）の小さな挿入及び欠失を包含する、生体分子に対する変異の包括的なセットを構築及び試験するために使用される。これらの変異の構築及び機能的読み出しは、確立された様々な分子生物学の方法を用いて達成され得る。いくつかの実施形態では、ライブラリは、モノマーに対する全ての可能な改変のサブセットを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ライブラリは集合的に、生体分子における総モノマー位置の少なくとも１０％について、１つのモノマーの単一の改変を表し、各単一の改変は、置換、単一の挿入、及び単一の欠失からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ライブラリは、集合的に、出発生体分子における総モノマー位置の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は最大１００％の、１つのモノマーの単一の改変を表す。特定の実施形態では、出発生体分子における総モノマー位置の特定の割合について、ライブラリは、集合的に、１つのモノマーの各可能な単一の改変、例えば、１９個の他の天然に存在するアミノ酸（タンパク質の場合）若しくは３個の他の天然に存在するリボヌクレオチド（ＲＮＡの場合）による全ての可能な置換、２０個の天然に存在するアミノ酸（タンパク質場合）若しくは４個の天然に存在するリボヌクレオチド（ＲＮＡ場合）の各々の挿入、又はモノマーの欠失を表す。なお更なる実施形態では、各位置での挿入は、独立して、１つよりも多いモノマー、例えば、２つ以上、３つ以上、若しくは４つ以上のモノマーの挿入、又は１～４つ、２～４つ、若しくは１～３つのモノマーの挿入である。いくつかの実施形態では、位置での欠失は、独立して、１つよりも多いモノマー、例えば、２つ以上、３つ以上、若しくは４つ以上のモノマーの欠失、又は１～４つ、２～４つ、若しくは１～３つのモノマーの欠失である。ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントのそのようなライブラリの例は、それぞれ実施例１４及び実施例１５に記載されている。
いくつかの実施形態では、生体分子は、タンパク質であり、個々のモノマーは、アミノ酸である。生体分子がタンパク質である実施形態では、タンパク質における各モノマー（アミノ酸）位置での可能なＤＭＥ変異の数は、１９個のアミノ酸置換、２０個のアミノ酸挿入、及び１個のアミノ酸欠失を含み、タンパク質において１アミノ酸当たり合計４０個の可能な変異をもたらす。
いくつかの実施形態では、挿入を含むＣａｓＸバリアントタンパク質のＤＭＥライブラリは、１アミノ酸挿入ライブラリ、２アミノ酸挿入ライブラリ、３アミノ酸挿入ライブラリ、４アミノ酸挿入ライブラリ、５アミノ酸挿入ライブラリ、６アミノ酸挿入ライブラリ、７アミノ酸挿入ライブラリ、８アミノ酸挿入ライブラリ、９アミノ酸挿入ライブラリ、又は１０アミノ酸挿入ライブラリである。いくつかの実施形態では、挿入を含むＣａｓＸバリアントタンパク質のＤＭＥライブラリは、１～４個のアミノ酸挿入を含む。
いくつかの実施形態では、生体分子は、ＲＮＡである。生体分子がＲＮＡである実施形態では、ＲＮＡにおける各モノマー（リボヌクレオチド）位置での可能なＤＭＥ変異の数は、３個のヌクレオチド置換、４個のヌクレオチド挿入、及び１個のヌクレオチド欠失を含み、１ヌクレオチド当たり合計８個の可能な変異をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＤＭＥライブラリの設計は、生体分子における１つ以上の標的モノマーの各々についての全ての可能な変異を列挙することを含む。本明細書で使用される場合、「標的モノマー」とは、本明細書に記載の置換、挿入、及び欠失を有するＤＭＥを標的化する生体分子ポリマーにおけるモノマーを指す。例えば、標的モノマーは、タンパク質における特定の位置のアミノ酸、又はＲＮＡにおける特定の位置のヌクレオチドであり得る。生体分子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、又はそれ以上の標的モノマーを有することができ、これらは、生体分子バリアントのＤＭＥライブラリを生成するために体系的に変異される。いくつかの実施形態では、生体分子における全てのモノマーが、標的モノマーである。例えば、２つの標的アミノ酸が存在するタンパク質のＤＭＥでは、ＤＭＥライブラリの設計は、２つの標的アミノ酸の各々で、４０の可能なＤＭＥ変異を列挙することを含む。更なる例では、４つの標的ヌクレオチドが存在するＲＮＡのＤＭＥでは、ＤＭＥライブラリの設計は、４つの標的ヌクレオチドの各々で、８つの可能なＤＭＥ変異を列挙することを含む。いくつかの実施形態では、生体分子の各標的モノマーは、独立してランダムに選択されるか、又は意図的な設計によって選択される。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＭＥライブラリは、ランダムバリアント、又は設計されたバリアント、又は単一の生体分子内のランダム変異及び設計された変異を含むバリアント、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
ＤＭＥ法のいくつかの実施形態では、ＤＭＥ変異は、生体分子をコードする二本鎖ＤＮＡに組み込まれる。このＤＮＡは、標準的なクローニングベクター（例えば、本明細書において標的プラスミドと称される細菌プラスミド）において維持及び複製され得る。例示的な標的プラスミドは、ＤＭＥに供される出発生体分子をコードするＤＮＡ配列、細菌の複製起点、及び好適な抗生物質耐性発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性カセットは、カナマイシン、アンピシリン、スペクチノマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性カセットは、カナマイシンに対する耐性を付与する。
当該バリアントを含むライブラリは、様々な方法で構築することができる。特定の実施形態では、プラスミド組換え操作を使用してライブラリが構築される。そのような方法は、１つ以上の変異をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、参照生体分子をコードするプラスミドに当該変異を組み込むことができる。複数の変異を有する生体分子バリアントの場合、いくつかの実施形態では、２つ以上のオリゴヌクレオチドが使用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、１つ以上の変異をコードし、変異領域は、変異に対して５’及び３’の両方で、標的プラスミドに相同な１０～１００ヌクレオチドに隣接する。このようなオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、商業的に合成され得、ＰＣＲ増幅において使用され得る。変異をコードするオリゴヌクレオチドの例示的な鋳型を以下に提供する。
５’－（Ｎ）１０－１００－変異－（Ｎ’）１０－１００－３’
この例示的なオリゴヌクレオチド設計では、Ｎは、標的プラスミドと同一の配列（本明細書においてホモロジーアームと称される）を表す。生体分子における特定のモノマーが変異を標的化する場合、これらのホモロジーアームは、標的プラスミドのモノマーをコードするＤＮＡに直接隣接する。ＤＭＥを受ける生体分子がタンパク質であるいくつかの例示的な実施形態では、同じセットの相同アームを使用する４０個の異なるオリゴヌクレオチドが、ＤＭＥを標的化するタンパク質における各アミノ酸残基について列挙された４０個の異なるアミノ酸変異をコードするように使用される。変異が単一アミノ酸の変異である場合、１つ又は複数の所望の変異をコードする領域は、アミノ酸をコードする３つのヌクレオチド（置換又は単一の挿入の場合）又は０ヌクレオチド（欠失の場合）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つよりも多いアミノ酸の挿入をコードする。例えば、オリゴヌクレオチドがＸアミノ酸の挿入をコードする場合、所望の変異をコードする領域は、Ｘアミノ酸をコードする３×Ｘヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、変異領域は、２つ以上の変異、例えば、近接している（例えば、互いに隣接しているか、又は互いの１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個、又はそれ以上のモノマー内にある）生体分子の２つ以上のモノマーに対する変異をコードする。
ＤＭＥを受ける生体分子がＲＮＡであるいくつかの例示的な実施形態では、８つの異なるオリゴヌクレオチドが、同じセットのホモロジーアームを使用して、ＤＭＥを標的化するＲＮＡにおける各ヌクレオチドに対する８つの異なる単一ヌクレオチド変異をコードする。変異が単一のリボヌクレオチドの変異である場合、変異をコードするオリゴの領域は、以下のヌクレオチド配列からなり得る：ヌクレオチドを指定する１つのヌクレオチド（置換又は挿入の場合）、又は０ヌクレオチド（欠失の場合）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドとして合成される。いくつかの実施形態では、ＤＭＥに供される生体分子の特定のアミノ酸又はヌクレオチドを標的化する全てのオリゴヌクレオチドがプールされる。いくつかの実施形態では、ＤＭＥに供される生体分子を標的化する全てのオリゴヌクレオチドがプールされる。ＤＭＥライブラリにおいて同時に生成され得る変異の種類又は数に制限はない。
ｃ．ライブラリスクリーニング
ＤＭＥライブラリをスクリーニング又は選択するための任意の適切な方法は、本発明の範囲内であり、以下のように想定される。ハイスループット法を使用して、数千の個々の変異を有する大きなライブラリを評価することができる。いくつかの実施形態では、ライブラリのスクリーニング又は選択アッセイのスループットは、数百万個の個々の細胞におけるスループットを有する。いくつかの実施形態では、表現型及び遺伝子型は、生細胞を利用するアッセイが好ましく、それは、同じ脂質二重層内に含まれる性質によって生細胞において物理的に関連付けられるためである。生細胞を使用して、ライブラリ全体の亜集団を直接増幅することもできる。他の実施形態では、例えば、複数ラウンドの変異及び評価を通して開発されたフォーカスされたライブラリをスクリーニングするために、より小さなアッセイが、ＤＭＥ法において使用される。ライブラリをスクリーニングする例示的な方法は、実施例１４及び１５に記載されている。
いくつかの実施形態では、高度に機能的なバリアントについてスクリーニング又は選択されたＤＭＥライブラリが、更に特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＤＭＥライブラリを更に特徴付けることは、配列決定（例えば、サンガー配列決定）によってＤＭＥバリアントを個別に分析して、高度に機能的なバリアントを生じた１つ又は複数の特定の変異を同定することを包含する。生体分子の個々の変異体バリアントは、後の機能分析のために、標準的な分子生物学の技術によって単離することができる。いくつかの実施形態では、ＤＭＥライブラリを更に特徴付けることは、Ｉライブラリと高度に機能的なバリアントの１つ以上のライブラリとの両方のハイスループット配列決定を含む。このアプローチは、いくつかの実施形態では、ナイーブなＤＭＥライブラリと比較して、高度に機能的なバリアントの１つ以上のライブラリにおいて過剰提示された変異の迅速な同定を可能にし得る。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、高度に機能的なバリアントの１つ以上のライブラリにおいて過剰提示された変異は、高度に機能的なバリアントの活性に関連する可能性が高い。いくつかの実施形態では、ＤＭＥライブラリを更に特徴付けることは、個々のバリアントの配列決定と、ナイーブなライブラリ及び高度に機能的なバリアントの１つ以上のライブラリの両方のハイスループット配列決定との両方を含む。
ハイスループット配列決定は、ライブラリメンバーの機能的効果を示すハイスループットデータを生成することができる。１つ以上のライブラリが、全てのモノマー位置の全ての可能な変異を表す実施形態では、このようなハイスループット配列決定は、全ての可能なＤＭＥ変異の機能的効果を評価することができる。このような配列決定はまた、所与のライブラリの１つ以上の高度に機能的な亜集団を評価するために使用することができ、これは、いくつかの実施形態では、改善された機能をもたらす変異の同定につながり得る。網羅的変異スキャニング
いくつかの実施形態では、網羅的変異スキャニング（ＤＭＳ）が、改善された機能を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を同定するために使用される。網羅的変異スキャニングは、機能に関連するタンパク質の可塑性を評価する。ＤＭＳ法では、タンパク質の全てのアミノ酸を他の全てのアミノ酸に変更し、絶対的なタンパク質機能をアッセイする。例えば、ＣａｓＸタンパク質における全てのアミノ酸を他の全てのアミノ酸に変化させることができ、変異したＣａｓＸタンパク質がＤＮＡに結合又はそれを切断するそれらの能力についてアッセイすることができる。ＤＭＳ ＣａｓＸバリアントタンパク質のコレクションを特徴付けるために使用することができるＣＲＩＳＰＲｉアッセイ又は細菌ベースの切断アッセイなどの例示的なアッセイは、Ｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１６）“Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｏｔｓｐｏｔｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａｎ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｗｉｔｃｈ”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４（６）： ６４６－５１及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）“ＣａｓＸ ｅｎｚｙｍｅｓ ｃｏｍｐｒｉｓｅ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｏｒｓ”Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－０９０８に記載されている（これらの内容は、参照により本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態では、ＤＭＳは、改善されたＤＮＡ結合活性を有するＣａｓＸタンパク質を同定するために使用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合活性は、ＣＲＩＳＰＲｉアッセイを使用してアッセイされる。ＣＲＩＳＰＲｉアッセイの非限定的な例示的な実施形態では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質を発現する細胞を、ＦＡＣＳを使用してアッセイして、ｓｇＲＮＡ依存的な様式で蛍光タンパク質の発現を抑制することができるＣａｓＸバリアントを同定する。この例では、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）を使用して、アッセイされるＤＭＳ変異体のコレクションが生成される。野生型ＣａｓＸタンパク質は、その同族ｓｇＲＮＡに結合し、タンパク質－ＲＮＡ複合体を形成する。この複合体は、ｓｇＲＮＡとＤＮＡ標的との間のワトソンクリック塩基対合によって特定のＤＮＡ標的（この場合、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列）に結合する。野生型ＣａｓＸの場合、ＤＮＡは、ＣａｓＸタンパク質のヌクレアーゼ活性により切断される。しかしながら、理論に束縛されることを望むものではないが、ｄＣａｓＸは、依然としてｓｇＲＮＡと複合体を形成し、特異的なＤＮＡ標的に結合することができる可能性が高い。ｄＣａｓＸの標的化がタンパク質コード領域で生じる場合、それは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ並びに転写開始及び／又は伸長を遮断し、ＦＡＣによって検出され得る蛍光タンパク質の発現の減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＤＭＳは、改善されたＤＮＡ切断活性を有するＣａｓＸタンパク質を同定するために使用される。ＣａｓＸバリアントタンパク質のＤＮＡ切断効率をアッセイする方法は、当業者には明らかであろう。例えば、特定の標的核酸配列に相補的なスペーサーを有するｓｇＲＮＡと複合体化したＣａｓＸタンパク質を使用して、好適な細胞型においてＤＮＡ標的配列をインビトロ又はインビボで切断し、切断部位における挿入及び欠失の頻度をアッセイすることができる。理論に束縛されることを望むものではないが、ＣａｓＸによる切断又はニッキングは、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を生成し、その後の非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ）による修復が、二本鎖切断部位で小さな挿入又は欠失（インデル）を生じさせる。ＣａｓＸ切断部位におけるインデルの頻度は、標的配列のハイスループット配列決定又はサンガー配列決定を使用して測定することができる。代替的に、又は追加的に、標的配列のＣａｓＸ切断によるインデル生成の頻度は、ミスマッチアッセイ（例えば、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（T7 Endonuclease I、T7EI）又はＳｕｒｖｅｙｏｒミスマッチアッセイ）を使用して測定することができる。
いくつかの実施形態では、ＤＭＳに続いて、それらの得られた表現型と関連付けられたＤＭＳ変異体の遺伝子型のマップ（例えば、ヒートマップ）が生成され、タンパク質の基本原理を特徴付けるために使用される。全ての可能な変異は、そのタンパク質の機能的ランドスケープを確立するために、機能的又は非機能的なタンパク質産物をもたらすものとして特徴付けられる。
ｄ．エラープローンＰＣＲ
いくつかの実施形態では、エラープローンＰＣＲを使用して、改善された機能を有するＣａｓＸタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントを生成する。ＤＮＡを複製するポリメラーゼは、異なるレベルの忠実度を有する。ランダム変異を遺伝子に導入する１つの方法は、ある範囲の頻度で誤ったヌクレオチドを組み込むであろうエラープローンポリメラーゼによるものである。この頻度は、所望の結果に応じて調節することができる。いくつかの実施形態では、タンパク質配列において平均ｎ １～４個のアミノ酸変化を生成するヌクレオチド変化の頻度をもたらすポリメラーゼ及びポリメラーゼ活性の条件が選択される。例示的なエラープローンポリメラーゼには、ＡｇｉｌｅｎｔのＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩキットが含まれる。ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩキットは、製造者のプロトコルに従って、野生型ＣａｓＸタンパク質（例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のタンパク質）をコードするＤＮＡ配列を増幅するために使用することができ、それによって、タンパク質を偏りのないランダム変異誘発に供し、ＣａｓＸバリアントタンパク質の多様な集団を生成する。次いで、ＣａｓＸバリアントタンパク質のこの多様な集団は、どのように遺伝子型の変化が表現型の変化に関連するかを観察するために、ＤＭＳについて上に記載した同じアッセイを使用してアッセイすることができる。
ｅ．カセット変異誘発
いくつかの実施形態では、カセット変異誘発を使用して、改善された機能を有するＣａｓＸバリアントタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントを生成する。カセット変異誘発は、ＣａｓＸタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場などの目的の遺伝子の選択領域において多様性の高い小領域を作製するために、縮重ヌクレオチドによって置換される固有の制限酵素部位を利用する。例示的なカセット変異誘発プロトコルでは、制限酵素を使用して、好適なベクターに含まれるＣａｓＸタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場をコードするＤＮＡ分子上の変異誘発のために標的化された配列の近くを切断する。このステップは、変異誘発のために標的化された配列及び制限部位間の全てを除去する。次いで、所望の変異及び制限消化末端に相補的な末端を含む合成二本鎖ＤＮＡ分子が、制限消化によって除去された配列の代わりに連結され、連結されたベクターで、好適な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）が形質転換される。いくつかの実施形態では、カセット変異誘発を使用して、ＣａｓＸタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場において１つ以上の特異的変異を生成することができる。いくつかの実施形態では、カセット変異誘発を使用して、本明細書に記載の方法を使用して改善された機能についてスクリーニング又は選択することができるＣａｓＸバリアントタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントのライブラリを生成することができる。例えば、カセット変異誘発を使用してＣａｓＸバリアントを生成する際に、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメインの一部を、縮重ヌクレオチドの配列で置換することができる。縮重ヌクレオチドの配列は、ＣａｓＸタンパク質の領域（例えば、それらが高度に可動性のエレメントであるか又はそれらがＤＮＡと直接接触することから関心対象であるＮＴＳＢの領域）に高度に局在化し得る。次いで、カセット変異誘発を介して生成されたＣａｓＸバリアントタンパク質のライブラリは、ＤＭＥ、ＤＭＳ、及びエラープローンＰＣＲについて本明細書に記載のアッセイを使用してスクリーニングされ得、バリアントが、改善された機能について選択され得る。
ｆ．ランダム変異誘発
いくつかの実施形態では、ランダム変異誘発を使用して、改善された機能を有するＣａｓＸバリアントタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントを生成する。ランダム変異誘発は、ＤＮＡを変化させる偏りのない方法である。ランダム変異誘発の例示的な方法は、当業者に既知であり、化学物質、ＵＶ光、Ｘ線への曝露、又は不安定細胞株の使用を含む。異なる変異誘発剤は、異なるタイプの変異を生成する。当業者は、適切な薬剤を選択して、所望のタイプの変異を生成することができる。例えば、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）及びＮ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア（ＥＮＵ）は、単一塩基対変化を生成するために使用され得るが、Ｘ線は、しばしば、欠失及び全体的な染色体再編成をもたらす。ＵＶ光曝露は、ＤＮＡにおける隣接するピリミジン間に二量体を生成し、これは点変異、欠失、及び再編成をもたらし得る。エラープローン細胞株を使用して、例えば、本開示のＣａｓＸタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場を含むプラスミド上に変異を導入することもできる。ＣａｓＸタンパク質（例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３のタンパク質）又はｓｇＲＮＡ足場をコードするＤＮＡ分子の集団を変異原に曝露して、ＣａｓＸバリアントタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントのコレクションを生成することができ、これらのコレクションを、本明細書に記載のアッセイのうちのいずれかを使用して、改善された機能についてアッセイすることができる。
ｇ．付着伸長プロセス（ＳｔＥＰ）
いくつかの実施形態では、付着伸長プロセス（staggered extension process）（ＳｔＥＰ）を使用して、改善された機能を有するＣａｓＸバリアントタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントを生成する。付着伸長プロセスは、ＰＣＲ反応中にタンパク質の複数のバリアントの育種を可能にする特殊なＰＣＲプロトコルである。ＳｔＥＰは、低い処理能力を有するポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ又はＶｅｎｔポリメラーゼ）を利用して、有意なレベルの配列類似性を有する２つ以上の異なる鋳型鎖から短いプライマーを生成する。次いで、短いプライマーは、鋳型鎖のシャフリングを可能にする短い時間間隔で伸長される。この方法は、ＤＭＥバリアントをスタックする手段としても使用することができる。例示的なＳｔＥＰプロトコルは、Ｚｈａｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ（ＳｔＥＰ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：２５８－２６１によって記載されている（その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）。ＳｔＥＰは、ＣａｓＸバリアントタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントのコレクションを生成するために使用することができ、これらのコレクションは、本明細書に記載のアッセイのいずれかを使用して、改善された機能についてアッセイすることができる。
ｈ．遺伝子シャフリング
いくつかの実施形態では、遺伝子シャフリングを使用して、改善された機能を有するＣａｓＸバリアントタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントを生成する。いくつかの実施形態は、遺伝子シャフリングを使用して、プラスミド組換え操作などの本明細書に記載の他の方法によって産生されたバリアントを組み合わせる（本明細書において「スタックする」と称されることもある）。例示的な遺伝子シャフリングプロトコルでは、親遺伝子のセットを５０～１００塩基対（ｂｐ）の長さの小片に剪断するために、ＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ）が使用される。いくつかの実施形態では、これらの親遺伝子は、本明細書に記載の方法を使用して生成及び単離された、機能が改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、これらの親遺伝子は、本明細書に記載の方法を使用して生成及び単離された、機能が改善されたｓｇＲＮＡ足場バリアントを含む。次いで、Ｄｎａｓｅ断片化後、プライマーを用いないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が続く。十分に重複する相同配列を有するＤＮＡ断片は、互いにアニールし、次いで、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。異なる変異を含む異なる断片がアニールする場合、これらの２つの変異を組み合わせた新しいバリアントが得られる。いくつかの実施形態では、プライマーを用いないＰＣＲ後、ＰＣＲ伸長、及び親遺伝子（例えば、ＣａｓＸタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場をコードする配列）のサイズに達した、シャフリングされたＤＮＡ分子の精製が続く。次いで、これらの遺伝子は、別のＰＣＲを用いて（例えば、シャフリングを受ける遺伝子の５’末端及び３’末端に相補的なＰＣＲプライマーを添加することによって）増幅され得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、クローニングベクターへのライゲーションに必要な制限酵素認識部位のための配列などの、それらの５’末端に付加される追加の配列を有してもよい。
ｉ．ドメインスワッピング
いくつかの実施形態では、ドメインスワッピングを使用して、改善された機能を有するＣａｓＸバリアントタンパク質又はｓｇＲＮＡ足場バリアントを生成する。ＣａｓＸバリアントタンパク質を生成するために、操作されたドメインスワッピングを使用して、部分を他のタンパク質及びＣＲＩＳＰＲ分子と混合し、マッチさせることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、保存されたＲｕｖＣドメインを有するので、ＣａｓＸ ＲｕｖＣドメインを他のＣＲＩＳＰＲタンパク質のドメインとスワップすることができ、得られたタンパク質を、本明細書に記載のアッセイを使用して、改善されたＤＮＡ切断についてアッセイすることができる。ｓｇＲＮＡの場合、足場ステム、伸長ステム又はループは、他のＲＮＡにおいて見出される構造と交換することができ、例えば、ｓｇＲＮＡの足場ステム及び伸長ステムは、他のＲＮＡ由来の熱安定性ステムループと交換することができ、得られたバリアントは、本明細書に記載のアッセイを使用して、改善された機能についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、ドメインスワッピングを使用して、新しいドメインをＣａｓＸタンパク質又はｓｇＲＮＡに挿入することができる。ドメインスワッピングがタンパク質に適用される一部の例示的な実施形態では、挿入されたドメインは、第２のタンパク質全体を含む。
ｊ．ＣａｓＸ及びｇＲＮＡバリアントの産生
本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、標準的なクローニング及び分子生物学の技術を使用して、又は実施例に記載されるように、コードするベクター（下記）で形質転換された真核細胞又は原核細胞によってインビトロで産生され得る。特定の配列及び調製の様式は、利便性、経済性、必要とされる純度などによって決定される。いくつかの実施形態では、まず、ＣａｓＸバリアントをコードするＤＮＡ配列を含む構築物が調製される。かかる構築物の調製のための例示的な方法は、実施例に記載されている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、意図された宿主細胞のためにコドン最適化される。次いで、構築物を使用して、タンパク質の発現及び回収のための宿主細胞（例えば、原核宿主細胞又は真核宿主細胞）を形質転換するのに好適な発現ベクターを生成する。所望であれば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。他の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。真核宿主細胞は、ベビーハムスター腎線維芽細胞（Baby Hamster Kidney、ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＳＶ４０遺伝物質を有するＣＶ－１（サル）起源（ＣＯＳ）細胞、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）、若しくは酵母細胞、又は組換え産物の産生に好適な当該技術分野で既知の他の真核細胞から選択することができる。
所望により、他の分子又は表面への連結を可能にする様々な基を、合成中又は発現中に配列に導入することができる。したがって、システインは、チオエーテルを作製するために使用され得、ヒスチジンは、金属イオン錯体への連結のために使用され得、カルボキシル基は、アミド又はエステルを形成するために使用され得、アミノ基は、アミドを形成するために使用され得るなどである。本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質はまた、組換え合成の従来の方法に従って単離及び精製され得る。発現宿主の溶解物を調製し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術を使用して溶解物を精製することができる。ほとんどの場合、使用される組成物は、生成物の調製及びその精製の方法に関連する夾雑物に対して、８０重量％以上、より通常は９０重量％以上、好ましくは９５重量％以上、そして治療目的の場合、通常９９．５重量％以上の所望の生成物を含む。
本開示のｇＲＮＡの産生の場合、ｇＲＮＡをコードする組換え発現ベクターは、ｇＲＮＡを産生するために、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用してインビトロで転写され得、次いで、これは、従来の方法（例えば、実施例に記載されるゲル電気泳動による精製）によって回収され得る。合成されると、ｇＲＮＡは、標的核酸に直接接触させるために遺伝子編集ペアにおいて利用され得、又は核酸を細胞に導入するための周知の技術（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクションなど）のいずれかによって細胞に導入され得る。
ＶＩ．ポリヌクレオチド及びベクター
別の態様では、本開示は、細胞における標的核酸の編集において有用であるクラス２、Ｖ型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムのｇＲＮＡのポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を提供し、表３に記載される配列番号２４７～５９２若しくは１１４７～１２３１のＣａｓＸタンパク質バリアント、又は表３の配列番号２４７～５９２及び１１４７～１２３１の配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２７０～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれかのＣａｓＸバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４１５～５９２若しくは１１４７～１２３１のうちのいずれかのＣａｓＸバリアントをコードするポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのｇＲＮＡバリアント配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供し、表２の配列番号２１０１～２３３２及び２３５３～２３９８の配列とともに、改変される標的核酸とハイブリダイズすることができる標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２２３８～２３３２又は２３５３～２３９８のうちのいずれか１つのｇＲＮＡバリアント配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列とともに、改変される標的核酸とハイブリダイズすることができる標的化配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号２２８１～２３３２又は２３５３～２３９８のうちのいずれか１つのｇＲＮＡバリアント配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列とともに、改変される標的核酸とハイブリダイズすることができる標的化配列を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変される遺伝子の一部又は全部をコードするドナー鋳型ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムと併せて遺伝子編集を目的とし、改変される遺伝子の少なくとも一部を含む。他の実施形態では、ドナー配列は、改変される遺伝子のエキソンの少なくとも一部をコードする配列を含む。他の実施形態では、ドナー鋳型は、改変される遺伝子のイントロンの少なくとも一部をコードする配列を有する。他の実施形態では、ドナー鋳型は、改変される遺伝子のイントロン－エキソン接合部の少なくとも一部をコードする配列を有する。他の実施形態では、ドナー鋳型は、改変される遺伝子の遺伝子間領域の少なくとも一部をコードする配列を有する。他の実施形態では、ドナー鋳型は、改変される遺伝子の調節エレメントの少なくとも一部をコードする配列を有する。場合によっては、ドナー鋳型は、改変される遺伝子の少なくとも一部をコードする野生型配列である。他の場合では、ドナー鋳型配列は、ノックダウン又はノックアウトされる野生型遺伝子と比較して、１つ以上の変異を含む。そのような場合、ドナー鋳型は、野生型配列と比較して、少なくとも１～５つ又はそれ以上の変異を有する。前述の実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも６，０００ヌクレオチド、少なくとも７，０００ヌクレオチド、少なくとも８，０００ヌクレオチド、少なくとも９，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも１２，０００ヌクレオチド、又は少なくとも１５，０００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも約１０～約１５，０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、遺伝子を編集するためのシステムにおいて裸の核酸として提供され得、ベクターに組み込まれる必要はない。他の実施形態では、ドナー鋳型をベクターに組み込んで（例えば、ウイルスベクターで）、細胞へのその送達を容易にすることができる。
他の態様では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡ（その相同バリアントを含む）をコードするポリヌクレオチド配列を産生するための方法、並びにポリヌクレオチド配列によって発現されるタンパク質又は転写されるＲＮＡを発現させるための方法に関する。概して、本方法は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を産生することと、コード遺伝子を宿主細胞に適した発現ベクターに組み込むことと、を含む。分子生物学における標準的な組換え技術を使用して、本開示のポリヌクレオチド及び発現ベクターを作製することができる。本明細書に記載の実施形態のいずれかのコードされた参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、又はｇＲＮＡの産生のために、本方法は、適切な宿主細胞をコードポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換することと、得られる本明細書に記載の実施形態のいずれかの参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、又はｇＲＮＡが形質転換された宿主細胞において発現又は転写されることを引き起こすか又は可能にする条件下で宿主細胞を培養し、それによって、ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡを産生することと、を含み、それは、本明細書に記載の方法によって、又は当該技術分野で既知の標準的な精製方法によって、又は実施例に記載されるように回収される。
本開示によれば、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡ（又はそれらの相補体）をコードする核酸配列を使用して、適切な宿主細胞における発現を指示する組換えＤＮＡ分子を生成する。いくつかのクローニング戦略が本開示を実施するのに好適であり、その多くは、本開示の組成物をコードする遺伝子又はその相補体を含む構築物を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、クローニング戦略を使用して、組成物の発現のために宿主細胞を形質転換するために使用される、ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡをコードするヌクレオチドを含む構築物をコードする遺伝子を生成する。
いくつかのアプローチでは、まず、ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む構築物が調製される。かかる構築物の調製のための例示的な方法は、実施例に記載されている。次いで、構築物を使用して、宿主細胞（例えば、ＣａｓＸ又はｇＲＮＡの場合、タンパク質構築物の発現及び回収のための原核宿主細胞又は真核宿主細胞）を形質転換するのに好適な発現ベクターを生成する。所望であれば、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。他の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。真核宿主細胞は、ベビーハムスター腎線維芽細胞（Baby Hamster Kidney、ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＳＶ４０遺伝物質を有するＣＶ－１（サル）起源（ＣＯＳ）細胞、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）、若しくは酵母細胞、又は組換え産物の産生に好適な当該技術分野で既知の他の真核細胞から選択することができる。発現ベクターの生成、宿主細胞の形質転換、並びにＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡの発現及び回収のための例示的な方法は、実施例に記載されている。
ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡ構築物をコードする遺伝子は、完全に合成的に、又は実施例でより詳細に記載される方法を含む、制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲ、及び重複伸長などの酵素プロセスと組み合わせた合成によって、１つ以上のステップで作製することができる。本明細書に開示される方法は、例えば、所望の配列の様々な成分（例えば、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列をライゲーションするために使用することができる。ポリペプチド組成物をコードする遺伝子は、遺伝子合成の標準的な技術を使用して、オリゴヌクレオチドから構築される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、意図された宿主細胞のためにコドン最適化される。このタイプの最適化は、同じＣａｓＸタンパク質をコードしながら、意図された宿主生物又は細胞のコドン選好性を模倣するために、コードヌクレオチド配列の変異を伴い得る。したがって、コドンを変化させることはできるが、コードされるタンパク質又はｇＲＮＡは変化しないままである。例えば、ＣａｓＸタンパク質の意図された標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化ＣａｓＸコードヌクレオチド配列を使用することができる。別の非限定的な例として、意図された宿主細胞がマウス細胞である場合、マウスコドン最適化ＣａｓＸコードヌクレオチド配列を生成することができる。遺伝子設計は、参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアントの産生において利用される宿主細胞に適切なコドン使用頻度及びアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して行うことができる。本開示の１つの方法において、構築物の成分をコードするポリヌクレオチドのライブラリが作製され、次いで、上記のように構築される。次いで、本明細書に記載されるように、得られた遺伝子を組み立て、得られた遺伝子を使用して宿主細胞を形質転換し、その特性を評価するために、ＣａｓＸバリアント又はｇＲＮＡ組成物を産生及び回収する。
本開示は、宿主細胞と適合し、宿主細胞によって認識され、ポリペプチドの制御された発現又はＲＮＡの転写のためにポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されている複製配列及び制御配列を含むプラスミド発現ベクターの使用を提供する。様々な細菌、酵母、及びウイルスについてのかかるベクター配列はよく知られている。使用され得る有用な発現ベクターには、例えば、染色体、非染色体、及び合成ＤＮＡ配列のセグメントが含まれる。「発現ベクター」とは、好適な宿主においてポリペプチドをコードするＤＮＡの発現をもたらすことができる好適な制御配列に作動可能に連結されているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指す。必要条件は、選択された宿主細胞において、ベクターが複製可能かつ生存可能であることである。低コピー数ベクター又は高コピー数ベクターを、所望に応じて使用することができる。ベクターの制御配列は、転写をもたらすプロモーター、かかる転写を制御する任意選択的なオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント（例えば、プロモーターなどの転写制御エレメント）に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント（例えば、プロモーターなどの転写制御エレメント）に作動可能に連結される。他の場合では、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡをコードするヌクレオチドは連結され、単一の制御エレメントに作動可能に連結される。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってもよく、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。例示的な調節エレメントとしては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、単一の転写物から複数の遺伝子の翻訳を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）又はＰ２Ａペプチド、下流の転写終結を促進するポリアデニル化配列、翻訳の開始の最適化のための配列、及び翻訳終結配列が挙げられる。場合によっては、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。場合によっては、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。場合によっては、プロモーターは、誘導性プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。場合によっては、転写制御エレメント（例えば、プロモーター）は、標的化細胞型又は標的化細胞集団において機能的である。例えば、場合によっては、転写制御エレメントは、真核細胞（例えば、ウイルス又はＸＤＰベクターのためのパッケージング細胞、造血幹細胞（hematopoietic stem cell、ＨＳＣ）、造血前駆細胞（hematopoietic progenitor cell、ＨＰＣ）、ＣＤ３４＋細胞、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell、ＭＳＣ）、胚性幹細胞（embryonic stem、ＥＳ）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell、ｉＰＳＣ）、骨髄系共通前駆細胞、前赤芽球細胞、及び赤芽球細胞）において機能的であり得る。
ｐｏｌ ＩＩプロモーターの非限定的な例としては、ＥＦ－１α、ＥＦ－１αコアプロモーター、Ｊｅｎｓ Ｔｏｒｎｏｅ（ＪｅＴ）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）由来のプロモーター、ＣＭＶ最初期（CMV immediate early、ＣＭＶＩＥ）、ＣＭＶエンハンサー、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus、ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期サルウイルス４０（simian virus 40、ＳＶ４０）、ＳＶ４０エンハンサー、レトロウイルス由来の長鎖末端反復（long terminal repeat、ＬＴＲ）、マウスメタロチオネイン－Ｉ、アデノウイルス主要後期プロモーター（adenovirus major late promoter、Ａｄ ＭＬＰ）、ＣＭＶプロモーター全長プロモーター、最小ＣＭＶプロモーター、ニワトリ
（ＣＢＡ）、ＣＢＡハイブリッド（CBA hybrid、ＣＢｈ）、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリ
（ＣＢ７）、ニワトリβ－アクチンプロモーター及びウサギβ－グロビンスプライスアクセプター部位融合体（ＣＡＧ）、ラウス肉腫ウイルス（rous sarcoma virus、ＲＳＶ）プロモーター、ＨＩＶ－Ｌｔｒプロモーター、ｈＰＧＫプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、７ＳＫプロモーター、Ｍｉｎｉ－ＴＫプロモーター、ニューロン特異的発現を付与するヒトシナプシンＩ（ＳＹＮ）プロモーター、スーパーコアプロモーター１（super core promoter 1、ＳＣＰ１）、ニューロンにおける選択的発現のためのＭｅｃｐ２プロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ラウス肉腫ウイルスエンハンサー／プロモーター（単一）、脾臓病巣形成ウイルス長鎖末端反復（long terminal repeat、ＬＴＲ）プロモーター、ＴＢＧプロモーター、ヒトチロキシン結合グロブリン遺伝子由来のプロモーター（肝臓特異的）、ＰＧＫプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター（ubiquitin C、ＵＢＣ）、ＵＣＯＥプロモーター（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３のプロモーター）、合成ＣＡＧプロモーター、ヒストンＨ２プロモーター、ヒストンＨ３プロモーター、Ｕ１ａ１核内低分子ＲＮＡプロモーター（２２６ｎｔ）、Ｕ１ａ１核内低分子ＲＮＡプロモーター（２２６ｎｔ）、Ｕ１ｂ２核内低分子ＲＮＡプロモーター（２４６ｎｔ）２６、ＧＵＳＢプロモーター、ＣＢｈプロモーター、ロドプシン（rhodopsin、Ｒｈｏ）プロモーター、サイレンシングプローン脾臓病巣形成ウイルス（spleen focus forming virus、ＳＦＦＶ）プロモーター、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）、ＰＯＬ１プロモーター、ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、ｂ－キネシンプロモーター、マウス乳がんウイルス長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ヒト真核生物翻訳開始因子４Ａ（eukaryotic initiation factor 4A、ＥＩＦ４Ａ１）プロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase、ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、並びに前述の短縮型バージョン及び配列バリアントが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、ＥＦ－１αであり、プロモーターが、トランスフェクション効率、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの導入遺伝子の転写又は発現、発現陽性クローンの割合、及び長期培養におけるエピソームベクターのコピー数を増強する。
ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６、ミニＵ６、Ｕ６短縮型プロモーター、７ＳＫ、及びＨ１バリアント、ＢｉＨ１（双方向性Ｈ１プロモーター）、ＢｉＵ６、Ｂｉ７ＳＫ、ＢｉＨ１（双方向性Ｕ６、７ＳＫ、及びＨ１プロモーター）、ゴリラＵ６、アカゲザルＵ６、ヒト７ＳＫ、ヒトＨ１プロモーター、及びそれらの配列バリアントが挙げられるが、これらに限定されない。前述の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ｇＲＮＡの転写を増強する。
適切なベクター及びプロモーターの選択は、発現の制御に関連するので（例えば、遺伝子を改変するための）、十分に当業者のレベルの範囲内である。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含み得る。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。発現ベクターはまた、ＣａｓＸタンパク質に融合され得るタンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、赤血球凝集素タグ、蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み、したがって、精製又は検出のために使用されるキメラＣａｓＸタンパク質を得ることができる。
本開示の組換え発現ベクターはまた、本開示のＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡの強力な発現を促進するエレメントを含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、１つ以上のポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ））、イントロン配列、又は転写後調節エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element、ＷＰＲＥ））を含むことができる。例示的なポリ（Ａ）配列としては、ｈＧＨポリ（Ａ）シグナル（短鎖）、ＨＳＶ ＴＫポリ（Ａ）シグナル、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル、β－グロビンポリ（Ａ）シグナルなどが挙げられる。当業者は、本明細書に記載の組換え発現ベクターに含まれる好適なエレメントを選択することができるであろう。
いくつかの実施形態では、以下のうちの１つ以上を含む１つ以上の組換え発現ベクターが本明細書に提供される：（ｉ）ドナー鋳型が標的核酸（例えば、標的ゲノム）の標的遺伝子座の配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ドナー鋳型核酸のヌクレオチド配列、（ｉｉ）真核細胞などの標的細胞において作動可能であるプロモーターに作動可能に連結された標的ゲノムの遺伝子座の標的配列にハイブリダイズする（例えば、シングル又はデュアルガイドＲＮＡとして構成される）、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）真核細胞などの標的細胞において作動可能であるプロモーターに作動可能に連結された、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型、ｇＲＮＡ、及びＣａｓＸタンパク質をコードする配列は、異なる組換え発現ベクター中にあり、他の実施形態では、１つ以上の（ドナー鋳型、ＣａｓＸ、及びｇＲＮＡの）ポリヌクレオチド配列は、同じ組換え発現ベクター中にある。
ポリヌクレオチド配列は、様々な手順によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡは、当該技術分野で既知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。これらの成分のうちの１つ以上を含む好適なベクターの構築は、当業者に既知の標準的なライゲーション技術を使用する。かかる技術は、当該技術分野で周知であり、科学文献及び特許文献に詳細に記載されている。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、組換えＤＮＡ手順に都合よく供され得るプラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であり得、ベクターの選択は、しばしば、ベクターが導入される宿主細胞に依存する。したがって、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立しているベクター（例えば、プラスミド）であってもよい。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入された場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。好適な宿主細胞に導入されると、抗原プロセシング、抗原提示、抗原認識、及び／又は抗原応答に関与するタンパク質の発現は、当該技術分野で既知の任意の核酸アッセイ又はタンパク質アッセイを使用して決定され得る。例えば、参照ＣａｓＸ又はＣａｓＸバリアントの転写されたｍＲＮＡの存在は、ポリヌクレオチドの任意の領域に相補的なプローブを使用して、従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）、増幅手順（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ（米国特許第５，６９５，９３７号）、及びアレイベース技術（例えば、米国特許第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、及び同第５，４４５，９３４号を参照）によって検出及び／又は定量化され得る。
ポリヌクレオチド及び組換え発現ベクターは、様々な方法によって標的宿主細胞に送達することができる。かかる方法としては、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、ヌクレオフェクション、ドナーＤＮＡに融合された若しくはそれを動員する細胞透過性ＣａｓＸタンパク質による直接添加、細胞圧搾、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達、並びにＱｉａｇｅｎから市販されているＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｆｅｃｔＴＭ ＲＮＡトランスフェクションキット、及びＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣからのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション、Ｍａｘａｇｅｎエレクトロポレーションなどを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。
組換え発現ベクター配列は、その後のエクスビボ、インビトロ、又はインビボでの細胞の感染及び形質転換のために、ウイルス又はウイルス様粒子（本明細書では「粒子」又は「ビリオン」とも称される）にパッケージングされ得る。かかる粒子又はビリオンは、典型的には、ベクターゲノムをカプシド化又はパッケージングするタンパク質を含む。好適な発現ベクターとしては、以下に基づくウイルス発現ベクターが挙げられ得る：ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス）、脾臓壊死ウイルス、並びにレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳がんウイルス）に由来するベクターなど。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレトロウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレトロウイルスベクターである。
ＡＡＶは、対象に投与するために調製される細胞のためにインビボ又はエクスビボのいずれかで、真核細胞などの細胞への送達のためにウイルスベクターを用いる状況において、ヒト疾患を治療するのに有用である小さな（２０ｎｍ）非病原性ウイルスである。構築物（例えば、本明細書に記載される実施形態のＣａｓＸタンパク質及び／又はＣａｓＸ ｇＲＮＡのいずれかをコードする構築物）が生成され、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接し、それによって、ＡＡＶベクターのＡＡＶウイルス粒子へのパッケージングが可能になる。
「ＡＡＶ」ベクターは、天然に存在する野生型ウイルス自体又はその誘導体を指し得る。この用語は、別途必要とされる場合を除いて、全てのサブタイプ、血清型、及び偽型、並びに天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含する。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、規定の抗血清とのカプシドタンパク質の反応性に基づいて他のＡＡＶによって同定されかつそれと区別されるＡＡＶを指す。例えば、霊長類ＡＡＶの多くの既知の血清型が存在する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）、及びＡＡＶＲｈ１０、並びにこれらの血清型の改変カプシドから選択される。例えば、血清型ＡＡＶ－２は、ＡＡＶ－２のｃａｐ遺伝子からコードされるカプシドタンパク質と、同じＡＡＶ－２血清型由来の５’及び３’ＩＴＲ配列を含むゲノムと、を含むＡＡＶを指すために使用される。偽型ＡＡＶは、１つの血清型由来のカプシドタンパク質と、第２の血清型の５’－３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムと、を含むＡＡＶを指す。偽型ｒＡＡＶは、カプシド血清型の細胞表面結合特性と、ＩＴＲ血清型と一致する遺伝的特性と、を有することが予想される。偽型組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、当該技術分野で記載される標準的な技術を使用して産生される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清型由来のカプシドタンパク質及び５’－３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用され得るか、又はそれは、血清型１由来のカプシドタンパク質及び異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ血清型２）由来の５’－３’ＩＴＲを有するＡＡＶを指し得る。本明細書に例示される各実施例について、ベクター設計及び産生の記載は、カプシド及び５’－３’ＩＴＲ配列の血清型を記載する。
「ＡＡＶウイルス」又は「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによるもの）と、カプシド化されたポリヌクレオチドと、から構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を更に含む場合、それは、典型的には「ｒＡＡＶ」と称される。例示的な異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸタンパク質及び／又はｓｇＲＮＡ、並びに任意選択的にドナー鋳型を含むポリヌクレオチドである。
「アデノ随伴ウイルス逆位末端反復」又は「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＡＡＶゲノムの各末端に見出される当該技術分野で認識される領域を意味し、これは、ＤＮＡの複製起点として及びウイルスのパッケージングシグナルとして、シスで一緒に機能する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域とともに、哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切除及び救出、並びに哺乳動物細胞ゲノムへの２つの隣接ＩＴＲ間に挿入されたヌクレオチド配列の組み込みを提供する。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ． Ｉ．”Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照されたい。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ ＩＴＲは、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって改変され得る。追加的に、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、及びＡＡＶＲｈ１０が挙げられるが、これらに限定されない）、並びにこれらの血清型の改変カプシドのうちのいずれかに由来し得る。更に、ＡＡＶベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、それらが意図されるように機能する（すなわち、宿主細胞ゲノム又はベクターからの目的の配列の切除及び救出を可能にし、かつＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合、レシピエント細胞のゲノムへの異種配列の組み込みを可能にする限り、必ずしも同一である必要はないか、又は同じＡＡＶ血清型若しくは分離株に由来する必要はない。宿主細胞への異種配列の組み込みのためのＡＡＶ血清型の使用は、当該技術分野において既知である（例えば、国際公開第２０１８／１９５５５５（Ａ１）号及び米国特許出願公開第２０１８／０２５８４２４（Ａ１）号を参照）。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合、及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、まとめて、ＡＡＶゲノムを複製するために必要とされる。「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」とは、カプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、又はそれらの機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、まとめて、ウイルスゲノムをパッケージングするために必要とされるパッケージング機能を供給する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡ、並びに任意選択的にＤＭＰＫドナー鋳型ヌクレオチドのコード配列を宿主に送達するために利用されるＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）、及びＡＡＶＲｈ１０を含むがこれらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来することができ、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ血清型２に由来する。特定の実施形態では、ＡＡＶ１、ＡＡＶ７、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９は、ＣａｓＸ、ｇＲＮＡ、及び任意選択的にドナー鋳型ヌクレオチドの宿主筋細胞への送達のために利用される。
ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶ発現ベクターは、既知の技術（例えば、トランスフェクション）を使用して好適な宿主細胞に導入される。パッケージング細胞は、典型的には、ウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングするＨＥＫ２９３細胞（及び当該技術分野で既知の他の細胞）が含まれる。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で一般的に既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。特に好適なトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性遺伝子導入、脂質媒介性形質導入、及び高速微粒子銃を使用する核酸送達が挙げられる。
本開示のｒＡＡＶ構築物の利点では、より小さいサイズのクラス２、ＣＲＩＳＰＲ Ｖ型ヌクレアーゼ（例えば、本実施形態のＣａｓＸバリアント）は、単一のｒＡＡＶ粒子が、これらの成分を、標的細胞の標的核酸を効果的に改変することができるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの発現をもたらす形態で標的細胞に送達及び形質導入することができるように、全ての必要な編集及び補助的発現成分を導入遺伝子に含めることを可能にする。このような構築物の代表的な概略図を、図１３に示す。これは、Ｃａｓ９などの他のＣＲＩＳＰＲ系とは著しく対照的であり、典型的には、二粒子システムを用いて、必要な編集成分を標的細胞に送達する。したがって、ｒＡＡＶシステムのいくつかの実施形態では、本開示は、ｉ）ＩＴＲ、ＣａｓＸバリアントをコードする配列、１つ以上のｇＲＮＡをコードする配列、ＣａｓＸに作動可能に連結された第１のプロモーター及びｇＲＮＡに作動可能に連結された第２のプロモーター、並びに任意選択的に１つ以上のエンハンサーエレメントを含む、第１のプラスミド、ｉｉ）ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む、第２のプラスミド、並びにｉｉｉ）ヘルパー遺伝子を含む、第３のプラスミド、を提供し、適切なパッケージング細胞のトランスフェクション時、細胞が、ＣａｓＸヌクレアーゼを発現することができる配列及び標的細胞の標的核酸を編集する能力を有するｇＲＮＡを単一粒子で標的細胞に送達する能力を有するｒＡＡＶを産生することができる。ｒＡＡＶシステムのいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列及び少なくとも第１のｇＲＮＡをコードする配列は、約３１００未満、約３０９０未満、約３０８０未満、約３０７０未満、約３０６０未満、約３０５０未満、又は約３０４０未満のヌクレオチド長であり、それにより、第１のプロモーター及び第２のプロモーター並びに任意選択的に１つ以上のエンハンサーエレメントをコードする配列が、合わせて、少なくとも約１３００、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００ヌクレオチド長を有することができる。ｒＡＡＶシステムのいくつかの実施形態では、第１及のプロモーター及び少なくとも１つのアクセサリエレメントをコードする配列は、合わせて、少なくとも約１３００、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００超のヌクレオチド長を有する。ｒＡＡＶシステムのいくつかの実施形態では、第１及び第２のプロモーター並びに少なくとも１つのアクセサリエレメントをコードする配列は、合わせて、少なくとも約１３００、少なくとも約１３５０、少なくとも約１３６０、少なくとも約１３７０、少なくとも約１３８０、少なくとも約１３９０、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００ヌクレオチド、少なくとも１６５０、少なくとも約１７００、少なくとも約１７５０、少なくとも約１８００、少なくとも約１８５０、又は少なくとも約１９００超のヌクレオチド長を有する。
いくつかの実施形態では、上記のＡＡＶ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するヌクレオチド配列を複製及びカプシド化してｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供することができるようにされる。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、ＡＡＶ由来コード配列であり、これが発現してＡＡＶ遺伝子産物を提供し、それは次に、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能することができる。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書において、ＡＡＶ発現ベクターに欠けている必要なＡＡＶ機能を補完するために使用される。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、ｒｅｐ及びｃａｐのコード領域をコードする主要なＡＡＶ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の一方又は両方、又はその機能的ホモログを含む。アクセサリ機能は、当業者に既知の方法を使用して宿主細胞に導入され、次いで、宿主細胞で発現され得る。通常、アクセサリ機能は、無関係なヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。いくつかの実施形態では、アクセサリ機能は、アクセサリ機能ベクターを使用して提供される。利用される宿主／ベクター系に依存して、構成的プロモーター及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示される実施形態のＡＡＶベクターを含む宿主細胞を提供する。
他の実施形態では、好適なベクターは、ウイルス様粒子（virus-like particle、ＶＬＰ）を含み得る。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ウイルスに非常に似ているが、ウイルス性遺伝物質を含まず、したがって、非感染性である粒子である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、１つ以上のウイルス構造タンパク質とともにパッケージングされた、目的の導入遺伝子（例えば、実施形態のＣａｓＸタンパク質及び／又はｇＲＮＡのいずれか）をコードするポリヌクレオチド、並びに任意選択的に本明細書に記載のドナー鋳型ポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、本開示は、インビトロで産生されたＣａｓＸ送達粒子（ＸＤＰ）を提供し、ＸＤＰが、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体と、任意選択的に、ドナー鋳型と、を含む。異なるウイルス由来の構造タンパク質の組み合わせを使用して、ＸＤＰを作製することができる。それには、パルボウイルス科（例えば、アデノ随伴ウイルス）、レトロウイルス科（例えば、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、又はレンチウイルス）、フラビウイルス科（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、Ｎｉｐａｈ）、及びバクテリオファージ（例えば、Ｑβ、ＡＰ２０５）を含むウイルス科由来の成分が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、レトロウイルス（レンチウイルス（ＨＩＶなど）及びアルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルスを含む）の成分を使用して設計されたＸＤＰシステムを提供し、様々な成分をコードするポリヌクレオチドを含む個々のプラスミドが、パッケージング細胞に導入され、これが次に、ＸＤＰを産生する。いくつかの実施形態、本開示は、ｉ）プロテアーゼ、ｉｉ）プロテアーゼ切断部位、ｉｉｉ）以下から選択されるＧａｇポリタンパク質の１つ以上の成分：マトリックスタンパク質（matrix protein、ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（nucleocapsid protein、ＮＣ）、カプシドタンパク質（capsid protein、ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｐ２Ｂペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、及びＰ２０ペプチド、ｖ）ＣａｓＸ、ｖｉ）ｇＲＮＡ、並びにｖｉ）標的化糖タンパク質又は抗体断片、のうちの１つ以上の成分を含むＸＤＰを提供し、得られたＸＤＰ粒子が、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ ＲＮＰをカプシド化する。Ｇａｇ、ＣａｓＸ、及びｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞の核から成分の輸送を補助し、複合体化したＣａｓＸ： ｇＲＮＡの出芽ＸＤＰの動員を容易にするように設計された対の成分を更に含む。このような成分の非限定的な例としては、ヘアピンＲＮＡ（例えば、ＭＳ２ヘアピン、ＰＰ７ヘアピン、Ｑβヘアピン、並びにＵ１ヘアピンＩＩ（それぞれパッケージングリクルーターＭＳ２コートタンパク質、ＰＰ７コートタンパク質、Ｑβコートタンパク質、及びＵ１Ａシグナル認識粒子に対する結合親和性を有する結合パートナーとしてｇＲＮＡに組み込まれ、Ｇａｇポリタンパク質に融合されている）を含む。ガイドＲＮＡに挿入された結合パートナー及びパッケージングリクルーターの、Ｇａｇポリペプチドを含む核酸への組み込みは、ｇＲＮＡに対するＣａｓＸの親和性に部分的に起因して、ＸＤＰ粒子のパッケージングを容易にし、ＲＮＰをもたらし、それにより、ｇＲＮＡ及びＣａｓＸの両方が、ＸＤＰのカプシド形成プロセス中にＧａｇと会合し、結合パートナー及びパッケージングリクルーターを欠く構築物と比較して、ＲＮＰを含むＸＤＰの割合を増加させることが発見された。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）又はＲｅｖに対する結合親和性を有するその部分を含むことができ、これはＧａｇポリタンパク質に連結することができる。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上のＲＲＥと、１つ以上のＭＳ２ヘアピン配列と、を含むことができる。ＲＲＥは、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）のステムＩＩＢ、ＲＲＥのステムＩＩ～Ｖ、ＲＲＥのステムＩＩ、ステムＩＩＢのＲｅｖ結合エレメント（Ｒｅｖ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ、ＲＢＥ）、及び全長ＲＲＥからなる群から選択され得る。前述の実施形態では、成分は、ＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡ（ステムＩＩＢ、配列番号１２８０）、ＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣ（ステムＩＩ、配列番号１２８１）、ＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧ（ステムＩＩ－Ｖ、配列番号１２８２）、ＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣ（ＲＢＥ、配列番号１２８４）、及びＡＧＧＡＧＣＵＵＵＧＵＵＣＣＵＵＧＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＡＡＡＧＡＵＡＣＣＵＡＡＡＧＧＡＵＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＵ（全長ＲＲＥ、配列番号１２８３）の配列を含む。他の実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上のＲＲＥと、１つ以上のＭＳ２ヘアピン配列と、を含むことができる。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＭＳ２ヘアピンバリアントを含み、これは、ＭＳ２コートタンパク質に対する結合親和性を増加させ、それによって、出芽ＸＤＰへのｇＲＮＡ及び会合したＣａｓＸの組み込みを増強するように最適化される。いくつかの実施形態では、ＭＳ２ヘアピンバリアント及びＲＲＥを含むｇＲＮＡバリアントは、表３６に示されるＭＳ２配列を含むｇＲＮＡバリアント２７５～３１５（配列番号２３５３～２３９３）を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のＭＳ２ヘアピン配列バリアントを含むｇＲＮＡバリアントを提供し、バリアントは、そのＭＳ２コートタンパク質リガンドに対して１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、３５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、３ｎＭ未満、又は２ｎＭ未満のＫＤを示し、ｇＲＮＡバリアントを含むＸＤＰは、インビトロ細胞アッセイにおいて標的核酸に対する改善された編集活性を示し、５０％の細胞における編集を達成するＥＣ５０は、１０８未満、又は１０７未満、又は１０６未満である。表面上の標的化糖タンパク質又は抗体断片は、標的細胞へのＸＤＰのトロピズムを提供し、標的細胞への投与及び侵入の際、ＲＮＰ分子が、細胞の核内に自由に輸送される。エンベロープ糖タンパク質は、ＸＤＰにトロピズムを付与することが当該技術分野で既知である任意の以下のエンベロープウイルスに由来し得る：アルゼンチン出血熱ウイルス、オーストラリアコウモリウイルス、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、ボルナ病ウイルス、ブレダウイルス、ブニヤムウェラウイルス、チャンディプラウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、デング熱ウイルス、ドゥベンヘイグウィルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、エボラ・ザイールウイルス、腸管アデノウイルス、エフェメロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（Epstein-Bar virus、ＥＢＶ）、ヨーロッパコウモリウイルス１、ヨーロッパコウモリウイルス２、Ｆｕｇ合成ｇＰ融合体、テナガザル白血病ウイルス、ハンタウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス（ＧＢウイルスＣ）、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス（human cytomegalovirus、ＨＨＶ５）、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトヘルペスウイルス（human herpesvirus、ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス７型、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒト免疫不全ウイルス１型（human immunodeficiency virus 1、ＨＩＶ－１）、ヒトメタニューモウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス、日本脳炎ウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus、ＨＨＶ８）、キャサヌール森林病ウイルス、ラクロスウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（lymphocytic choriomeningitis virus、ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マールブルグ出血熱ウイルス、麻疹ウイルス、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス、モコラウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、サル痘、マウス乳がんウイルス、おたふく風邪ウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オムスク出血熱ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、仮性狂犬病ウイルス、クアランフィルウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＤ１１４ネコ内在性レトロウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、リフトバレー熱ウイルス、ロスリバーウイルス、ｒロタウイルス、ラウス肉腫ウイルス、風疹ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（SARS-associated coronavirus、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、センダイウイルス、タカリベウイルス、ソゴトウイルス、ダニ媒介性脳炎原因ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（varicella zoster virus、ＨＨＶ３）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＨＨＶ３）、大痘瘡ウイルス、小痘瘡ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus、ＶＳＶ）、ＶＳＶ－Ｇ、ベシクロウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、及びジカウイルス。
他の実施形態では、本開示は、前述のＸＤＰを提供し、ｐｏｌポリタンパク質の１つ以上の成分（例えば、プロテアーゼ）、及び任意選択的に、第２のＣａｓＸ又はドナー鋳型を更に含む。本開示は、コード化された成分のいくつかの複製を含む、コード化された成分の配置の複数の構成を企図する。前述のことは、分裂細胞及び非分裂細胞へのウイルス形質導入が効率的であり、ＸＤＰが、さもなければ外来タンパク質を検出する対象の免疫監視機構を回避する強力で短寿命のＲＮＰを送達するという点で、当該技術分野における他のベクターに対する利点を提供する。非限定的な例示的なＸＤＰ系は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０／６３４８８号及び国際公開第２０２１／１１３７７２（Ａ１）号に記載されている（参照により本明細書に援用される）。いくつかの実施形態では、本開示は、前述のＸＤＰの実施形態のいずれかをコードするポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ：ｇＲＮＡ ＲＮＰを含むＸＤＰを生成及び回収する際、ＸＤＰは、以下でより詳細に記載されるように、かかるＸＤＰの投与によって対象の標的細胞を編集するための方法において使用され得る。
非ウイルス送達の場合、ベクターも送達することができ、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡをコードする１つの又は複数のベクターが、ナノ粒子中に製剤化され、企図されるナノ粒子としては、ナノスフェア、リポソーム、脂質ナノ粒子、量子ドット、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられるが、これらに限定されない。脂質ナノ粒子は、一般に、イオン化可能なカチオン性脂質と、コレステロール、ＤＯＰＥ、ポリ乳酸－コ－グリコール酸、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有脂質などの３つ以上の追加成分と、から構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される実施形態のＣａｓＸバリアントは、脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示される実施形態のｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｇＲＮＡと複合体化したＣａｓＸバリアントのＲＮＰを含む。いくつかの実施形態では、システムは、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡ、並びに任意選択的にドナー鋳型核酸をコードする核酸を含む脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムの成分は、細胞への送達のために、又はそれを必要とする対象への投与のために、別個の脂質ナノ粒子中に製剤化される。
ＶＩＩ．標的核酸の改変のための方法
本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲタンパク質、ガイド、核酸、及びそれらのバリアントは、治療、診断、及び研究を含む様々な用途に有用である。
いくつかの実施形態では、細胞における標的核酸の遺伝子編集及び改変のための本開示の方法を実施するために、プログラム可能なクラス２、Ｖ型ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアント編集ペア（ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ）が本明細書に提供される。本明細書に提供されるペアのプログラム可能な性質は、遺伝子の標的核酸における所定の目的の１つ以上の領域で所望の改変を達成するための正確な標的化を可能にする。本明細書に提供されるシステムを使用して細胞における標的核酸配列を改変するために、様々な戦略及び方法を使用することができる。本明細書で使用される場合、「改変」としては、切断、ニッキング、編集、欠失、ノックアウト、ノックダウン、変異誘発、修復、エキソンスキッピングなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるように、標的核酸の二本鎖切断を導入するＣａｓＸバリアントは、標的鎖上のＰＡＭ部位の５’側の１８～２６ヌクレオチド内及び非標的鎖上の３’側の１０～１８ヌクレオチド内に二本鎖切断を生成する。得られた改変は、非相同ＤＮＡ末端結合（ＮＨＥＪ）修復機構によって、それらの領域における１つ以上のヌクレオチドのランダムな挿入、又は欠失（インデル）、又は置換、重複、フレームシフト、又は逆位をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞における標的核酸を改変する方法を提供し、本方法は、細胞の標的核酸を、ｉ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのＣａｓＸ及びｇＲＮＡを含むクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びｇＲＮＡ（ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ）編集ペア、ｉｉ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのＣａｓＸ： ｇＲＮＡ編集ペアとドナー鋳型、ｉｉｉ）ＣａｓＸ及びｇＲＮＡの編集ペアをコードし、任意選択的にドナー鋳型を含む核酸、ｉｖ）上記の（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）本明細書に記載の実施形態のいずれか１つのＣａｓＸ： ｇＲＮＡ編集ペアを含むＸＤＰ、又はｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合わせ、と接触させることを含み、標的核酸をＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡの遺伝子編集ペア並びに任意選択的にドナー鋳型と接触させることにより、標的核酸が改変される。
場合によっては、改変は、細胞における変異の修正又は補償をもたらし、それによって、機能的な遺伝子産物の発現が起こり得るように編集された細胞が作製される。本方法の他の実施形態では、改変は、遺伝子のノックダウン又はノックアウトによって遺伝子産物の発現を抑制又は排除することを含む。
細胞における標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態では、本方法は、細胞の標的核酸配列を、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ編集ペアと接触させることを含み、編集ペアが、表３に示される配列番号２４７～５９２及び１１４７～１２３１からなる群から選択されるＣａｓＸバリアント、配列番号２７０～５９２及び１１４７～１２３１からなる群から選択されるＣａｓＸバリアント、配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１からなる群から選択されるＣａｓＸバリアント、又はそれと少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、若しくは少なくとも９９．５％同一のバリアント配列を含み、ｇＲＮＡ足場が、表２に示される配列番号２１０１～２３３２及び２３５３～２３９８からなる群から選択される配列を含み、ｇＲＮＡ足場が、配列番号２２３８～２３３２及び２３５３～２３９８からなる群から選択される配列を含み、ｇＲＮＡ足場が、配列番号２２８１～２３３２及び２３５３～２３９８からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含み、ｇＲＮＡが、標的核酸に相補的であり、標的核酸とハイブリダイズすることができる標的化配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ遺伝子編集ペアは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合することができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ遺伝子編集ペアは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合している。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、標的核酸に結合し、標的核酸において二本鎖切断を生成することができ、標的核酸において永続的なインデル又は変異をもたらす。他の実施形態では、ＲＮＰは、標的核酸に結合し、標的核酸において１つ以上の一本鎖ニックを生成することができ、標的核酸において永続的なインデル又は変異をもたらす。他の実施形態では、ＲＮＰは、標的核酸に結合することができるが、標的核酸を切断することができない（すなわち、ｄＣａｓＸバリアントを含有する）。本方法のいくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、任意選択的に、生成物の溶解度を増加させるポリペプチドドメインに融合され得るポリペプチドとして、細胞に提供され得る。ドメインは、規定のプロテアーゼ切断部位、（例えば、ＴＥＶプロテアーゼによって切断されるＴＥＶ配列）を介してポリペプチドに連結され得る。リンカーはまた、１つ以上の柔軟な配列、（例えば、１～１０個のグリシン残基）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の切断は、産物の溶解度を維持する緩衝液中で行われる、（例えば、０．５～２Ｍの尿素の存在下、溶解性を増加させるポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの存在下など）。目的のドメインは、エンドソーム分解性（endosomolytic）ドメイン、（例えば、インフルエンザＨＡドメイン）及び産生を補助する他のポリペプチド（例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメインなど）を含み得る。ポリペプチドは、改善された安定性のために製剤化され得る。例えば、ペプチドは、ＰＥＧ化されてもよく、ポリエチレンオキシ基が血流中での寿命の延長をもたらす。
細胞において標的核酸配列を改変する方法の他の実施形態では、本方法は、標的核酸配列を、遺伝子の異なる部分又は重複する部分を標的化する第１及び第２のｇＲＮＡ又は複数のｇＲＮＡを有する複数のＲＮＰと接触させることを含み、ＣａｓＸタンパク質は、本明細書に記載されるように、標的核酸における永続的なインデル若しくは変異をもたらす複数の切断を標的核酸に導入するか、又は対応する遺伝子産物の発現の調節若しくはその機能の変更を伴う切断間の介在配列の切除を導入し、それによって、改変された細胞が作製される。
いくつかの実施形態では、標的核酸を改変する方法は、標的核酸を、本明細書に記載されるＣａｓＸ： ｇＲＮＡ遺伝子編集ペア及びドナー鋳型と接触させることを含む。したがって、場合によっては、本明細書に提供される方法は、標的核酸をドナーポリヌクレオチドと接触させること（例えば、ドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することによって）を含み、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、標的核酸に組み込まれる。例えば、外因性ドナー鋳型は、細胞における標的核酸配列に導入される上流配列及び下流配列に隣接して組み込まれる修正配列を含んでもよい。他の場合では、ドナー鋳型は、ゲノム配列に関して１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位又は再編成を含んでもよい。但し、フレームシフト若しくは他の変異をもたらすことができる、標的核酸へのその組み込み、又は細胞における欠陥遺伝子の対応するノックダウン若しくはノックアウトによる、標的核酸配列のその部分の置換を支持するための標的核酸配列との十分な相同性が存在することを条件とする。切断部位に対して上流及び下流の配列は、標的核酸における組み込み部位のいずれかの側と配列類似性を共有し（すなわち、相同アーム）、挿入を容易にする。他の場合では、外因性ドナー鋳型は、相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）機構によるＣａｓＸ切断によって生成された末端間に挿入される。ＨＩＴＩによって挿入される外因性配列は、任意の長さ、例えば、１０～５０ヌクレオチド長の比較的短い配列、又は約５０～１０００ヌクレオチド長のより長い配列であり得る。相同性の欠如は、例えば、２０～５０％以下の配列同一性を有すること、及び／又は低い厳密性での特異的なハイブリダイゼーションを欠くことであり得る。他の場合では、相同性の欠如は、５、６、７、８、又は９ｂｐ以下の同一性を有するという基準を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型ポリヌクレオチドは、少なくとも約１０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、又は少なくとも約２００、又は少なくとも約３００、又は少なくとも約４００、又は少なくとも約５００、又は少なくとも約６００、又は少なくとも約７００、又は少なくとも約８００、又は少なくとも約９００、又は少なくとも約１０００、又は少なくとも約１０，０００、又は少なくとも約１５，０００ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ドナー鋳型は、少なくとも約１０～約１５，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約１００～約１０，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約４００～約８，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約６００～約５０００ヌクレオチド、又は少なくとも約１０００～約２０００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型又は一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。ドナー鋳型配列は、ゲノム配列と比較して、特定の配列の差異、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、切断部位でのドナー核酸の挿入の成功を評価するために使用され得るか、又は場合によっては、他の目的のために（例えば、標的ゲノム遺伝子座における発現を示すために）使用され得る。代替的に、これらの配列の差異は、隣接する組換え配列（例えば、ＦＬＰ配列、ｌｏｘＰ配列など）を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞の標的核酸配列を改変する方法を提供し、当該細胞の標的核酸を、本明細書に記載の実施形態のいずれかの１つ以上のポリヌクレオチドと接触させることを含み、ポリヌクレオチドが、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ遺伝子編集ペアをコードし、ｇＲＮＡが、標的核酸配列に相補的であり、したがって、それとハイブリダイズすることができる標的化配列を含み、接触させることが、標的核酸の改変をもたらす。核酸（例えば、ドナーポリヌクレオチド配列を含む核酸、本明細書に記載されるＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアントをコードする１つ以上の核酸）を細胞に導入する方法は、当該技術分野で既知であり、任意の好都合な方法を使用することができる。好適な方法としては、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、ドナーＤＮＡに融合された又はそれを動員する細胞透過性ＣａｓＸタンパク質による直接添加、細胞圧搾、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、及びナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。核酸は、十分に開発されたトランスフェクション技術、並びに市販のＱｉａｇｅｎからのＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡトランスフェクションキット、及びＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣからのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション、Ｍａｘａｇｅｎエレクトロポレーションなどを使用して細胞に提供され得る。ＣａｓＸバリアントタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、場合によっては、ＲＮＡである。したがって、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＲＮＡとして細胞に導入され得る。ＲＮＡを細胞に導入する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、直接注入、トランスフェクション、又はＤＮＡの導入に使用される任意の他の方法を含み得る。
他の実施形態では、本開示は、細胞の標的核酸配列を改変する方法を提供し、当該細胞を、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＲＮＡバリアント並びに任意選択的にドナー鋳型を含むＣａｓＸ： ｇＲＮＡ遺伝子編集ペアと接触させることを含み、ｇＲＮＡが、標的核酸配列に相補的であり、したがって、それとハイブリダイズすることができる標的化配列を含み、接触させることが、標的核酸の改変をもたらす。組換え発現ベクターの細胞への導入は、任意の適切な培養培地中で、細胞の生存を促進する任意の適切な培養条件下で行うことができる。組換え発現ベクターの標的細胞への導入は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで行うことができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、標的宿主細胞に直接提供され得る。例えば、細胞は、ベクターが細胞によって取り込まれるように、対象核酸を含むベクター（例えば、ドナー鋳型配列を有し、ｇＲＮＡバリアント及びＣａｓＸバリアントタンパク質をコードする組換え発現ベクター）と接触させることができる。細胞をプラスミドである核酸ベクターと接触させるための方法は、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、及びリポフェクションを含み、当該技術分野で周知である。ウイルスベクター送達の場合、細胞を、対象ウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子と接触させることができる。例えば、ベクターは、ウイルス粒子、例えば、ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ成分をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ又はＶＬＰである。非ウイルス送達の場合、ベクター又はＣａｓＸ： ｇＲＮＡ成分はまた、脂質ナノ粒子中での送達のために製剤化することができ、企図される脂質ナノ粒子としては、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、標的核酸の編集は、インビトロで、細胞内で、例えば、細胞培養システムで起こる。いくつかの実施形態では、編集は、インビボで、対象の細胞内で、例えば、動物の細胞で起こる。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。例示的な真核細胞は、マウス細胞、ラット細胞、ブタ細胞、イヌ細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。細胞の非限定的な例としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、生殖細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血幹細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、網膜細胞、がん細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植増殖心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、又は出生後幹細胞が挙げられる。代替的な実施形態では、細胞は、原核細胞である。
標的核酸に対する切断又は任意の所望の改変を誘導するために、細胞の標的核酸をインビトロ又はエクスビボで改変する方法のいくつかの実施形態では、本開示のｇＲＮＡバリアント及びＣａｓＸバリアントタンパク質、並びに任意選択的にドナー鋳型配列は、核酸又はポリペプチド、複合体化ＲＮＰ、ベクター、又はＸＤＰとして導入されるかどうかにかかわらず、約３０分～約２４時間、又は少なくとも約１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、又は約３０分～約２４時間の任意の他の期間、細胞に提供され、これは、約毎日～約４日毎の頻度、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎、又は約毎日～約４日毎の任意の他の頻度で繰り返され得る。薬剤は、対象細胞に、１回以上、例えば、１回、２回、３回、又は３回超提供され得、細胞は、各接触事象後に一定の時間（例えば、３０分～約２４時間）、薬剤とインキュベートされ得る。インビトロベースの方法の場合、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡ（及び任意選択的にドナー鋳型）とのインキュベーション期間後、培地を新鮮な培地と交換し、細胞を更に培養する。
いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子の変異を修正又は補償するように改変された細胞集団の治療有効用量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、改変された細胞の投与は、対象における野生型又は機能的遺伝子産物の発現をもたらす。本方法のいくつかの実施形態では、全細胞の用量は、約１０４～約１０９細胞／キログラム（ｋｇ）体重、例えば、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重、例えば、約１×１０５細胞／ｋｇ、１．５×１０５細胞／ｋｇ、２×１０５細胞／ｋｇ、又は１×１０６細胞／ｋｇ体重の範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、約１０４～約１０９細胞／キログラム（ｋｇ）体重、例えば、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重、例えば、約１×１０５細胞／ｋｇ、１．５×１０５細胞／ｋｇ、２×１０５細胞／ｋｇ、若しくは１×１０６細胞／ｋｇ体重で、又はその誤差の特定の範囲内で投与される。一実施形態では、細胞は、細胞を投与される対象に対して同種である。別の実施形態では、細胞は、細胞を投与される対象に対して同種である。場合によっては、対象は、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される。他の場合では、対象は、ヒトである。
ＶＩＩＩ．治療方法
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において疾患又は障害を治療する方法に関する。いくつかの治療戦略が、遺伝子変異に関連する疾患又は障害を有する対象の治療方法で使用するためのシステムを設計するために使用されている。いくつかの実施形態では、標的核酸の改変は、遺伝子のアレルに変異を有する対象において起こり、変異が、対象において疾患又は障害を引き起こす。いくつかの実施形態では、標的核酸の改変は、遺伝子の野生型アレルへの変異を変化させるか、又は機能的遺伝子産物の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、標的核酸の改変は、対象において疾患又は障害を引き起こす遺伝子のアレルの発現をノックダウン又はノックアウトする。
いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼバリアント及びガイドＲＮＡバリアントの遺伝子編集ペアを含む治療有効用量のシステムを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療方法は、対象に、治療有効用量のｉ）本明細書に記載の実施形態のいずれかの第１のＣａｓＸバリアントと、（改変される標的核酸に相補的な標的化配列を有する）第１のｇＲＮＡバリアントと、を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉ）第１のＣａｓＸタンパク質と、標的核酸に相補的な標的化配列を有する第１のｇＲＮＡと、ドナー鋳型と、を含むＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステム、ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムをコードする核酸、ｉｖ）本明細書に記載の実施形態のいずれかのＡＡＶであり得る、（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のＣａｓＸ：ｇＲＮＡシステムを含むＸＤＰ、又はｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合せ、を投与することを含み、１）第１のｇＲＮＡによって標的化される対象の細胞の遺伝子が、ＣａｓＸタンパク質（及び任意選択的にドナー鋳型）によって改変され（例えば、ノックダウン若しくはノックアウトされ）、又は２）第１のｇＲＮＡによって標的化される対象の細胞の遺伝子が、機能的な遺伝子産物が発現され得るように、ＣａｓＸタンパク質（及び任意選択的にドナー鋳型）によって修正若しくは改変される。いくつかの実施形態では、治療方法は、第２のｇＲＮＡ若しくは複数のｇＲＮＡ、又は第２のｇＲＮＡ若しくは複数のｇＲＮＡをコードする核酸を投与することを更に含み、第２のｇＲＮＡ若しくは複数のｇＲＮＡが、第１のｇＲＮＡと比較して、標的核酸配列の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する。前述において、各異なるｇＲＮＡは、ＣａｓＸタンパク質と対になることが理解されるであろう。２つ以上の遺伝子編集ペアが細胞に提供される（例えば、同じ又は異なる標的核酸内の異なる配列に相補的である２つ以上の異なるスペーサーを含む２つのｇＲＮＡを含む）実施形態では、遺伝子ペアが、同時に提供されてもよく（例えば、２つのＲＮＰ及び／若しくはベクターとして）、又は同時に送達されてもよい。代替的に、それらは連続して提供されてもよく、例えば、まず、第１の遺伝子編集ペアが提供され、続いて、第２の遺伝子編集ペアが提供されるか、又はその逆であってもよい。
いくつかの実施形態では、治療方法は、対象に、治療有効用量のＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムをコードするＡＡＶベクターを、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で投与することを含む。本方法の他の実施形態では、ＡＡＶベクターは、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。前述において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される。他の実施形態では、治療方法は、対象に、治療有効用量のＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムのＲＮＰを含むＸＤＰを投与することを含む。一実施形態では、ＸＤＰは、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＸＤＰは、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される。ベクター又はＸＤＰは、実質内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、脳室内、大槽内、髄腔内、頭蓋内、硝子体内、網膜下、嚢内、及び腹腔内経路、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される投与経路によって投与することができ、投与方法は、注射、輸血、又は移植である。投与は、１回、２回であり得るか、又は毎週、２週間毎、毎月、四半期毎、６ヶ月毎、年１回、又は２年毎若しくは３年毎に１回のレジメンスケジュールを使用して、複数回投与され得る。場合によっては、対象は、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される。他の場合では、対象は、ヒトである。
本方法のいくつかの実施形態では、改変することは、対象の標的細胞の標的核酸において一本鎖切断を導入することを含む。他の場合では、改変することは、対象の標的細胞の標的核酸において二本鎖切断を導入することを含む。いくつかの実施形態では、改変することは、遺伝子における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、又は逆位などの、標的核酸における１つ以上の変異を導入し、対象の改変された細胞における遺伝子産物の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％減少する。場合によっては、対象の改変された細胞の遺伝子は、改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が検出可能なレベルの遺伝子産物を発現しないように改変される。いくつかの実施形態では、疾患を有する対象に、遺伝子産物の発現をノックダウン又はノックアウトするための、治療有効量のＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムの投与は、対象が依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、対象において改善が観察されるように、基礎疾患の予防又は改善をもたらす。他の実施形態では、遺伝子は、ＮＨＥＪ宿主修復機構によって改変され得るか、又はＨＤＲ若しくはＨＩＴＩ機構によって挿入されるドナー鋳型と併せて利用されて、改変された細胞における野生型又は機能的遺伝子産物の発現が、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％増加するように、対象の細胞における変異を切除、修正、又は補償することができる。いくつかの実施形態では、治療有効量のＣａｓＸ－ｇＲＮＡシステムの投与は、疾患の少なくとも１つの臨床的に関連するパラメータの改善をもたらす。
一部の場合では、本開示の核酸（例えば、本開示の組換え発現ベクター）又はＣａｓＸバリアント若しくはｇＲＮＡバリアントは、ミセル、リポソーム、又は脂質ナノ粒子のような組織化された構造の脂質で覆われ得る。組織化された構造がＤＮＡと複合体化する場合、それはリポプレックスと呼ばれる。アニオン性（負に帯電）、中性、又はカチオン性（正に帯電）の３つのタイプの脂質が存在する。カチオン性脂質を利用するリポプレックスは、遺伝子導入に有用であることが証明されている。カチオン性脂質は、その正電荷のために、負に帯電したＤＮＡと自然に複合体を形成する。また、それらの電荷の結果として、それらは細胞膜と相互作用する。次いで、リポプレックスのエンドサイトーシスが起こり、ＤＮＡが細胞質に放出される。カチオン性脂質はまた、細胞によるＤＮＡの分解から保護する。
場合によっては、本開示の核酸（例えば、発現ベクター）は、目的のガイド配列の挿入部位を含む。例えば、核酸は、目的のガイド配列のための挿入部位を含むことができ、挿入部位は、ガイド配列が所望の標的配列にハイブリダイズするように変更された場合に変化しないｇＲＮＡバリアントの部分（例えば、足場領域）をコードするヌクレオチド配列に直接隣接する。したがって、場合によっては、発現ベクターは、ｇＲＮＡのスペーサー配列部分をコードする部分が挿入配列（挿入部位）であることを除いて、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。挿入部位は、所望の配列にスペーサーを挿入するために使用される任意のヌクレオチド配列である。様々な技術で使用するための「挿入部位」は、当業者に既知であり、任意の好都合な挿入部位を使用することができる。挿入部位は、核酸配列を操作するための任意の方法のためのものであり得る。例えば、場合によっては、挿入部位は、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）（例えば、１つ以上の制限酵素認識配列を含む部位）、ライゲーション非依存的クローニングのための部位、組換えベースのクローニング（例えば、ＡＴＴ部位に基づく組換え）のための部位、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）ベースの技術によって認識されるヌクレオチド配列などである。
ＩＸ．細胞
なお更なる実施形態では、本明細書に記載のＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムのいずれかの成分を含む細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される実施形態のｇＲＮＡバリアントのいずれかを含み、標的核酸に相補的であるスペーサーを更に含む。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるＣａｓＸバリアント（例えば、表３及び表７の配列）を更に含む。他の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の実施形態のＣａｓＸ： ｇＲＮＡのいずれかのＲＮＰを含む。他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムをコードするベクターを含む細胞を提供する。更に他の実施形態では、細胞は、変異を修正する（ノックインする）ために、又は欠陥遺伝子をノックダウン若しくはノックアウトするために、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ： ｇＲＮＡによって編集された標的核酸を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む改変された細胞（例えば、遺伝子改変細胞）である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＣａｓＸバリアントタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡで遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、細胞は、ａ）本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びｂ）本開示のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、を含み、任意選択的に、ドナー鋳型を含むヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターで遺伝子改変されている。場合によっては、このような細胞は、標的核酸の編集に使用するためのＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムの個々の成分又はＲＮＰを産生するために使用される。他の場合では、このように遺伝子改変された細胞は、遺伝子療法などの目的のために、（例えば、遺伝子変異又は遺伝子欠陥によって引き起こされる疾患又は状態を治療するために）使用され得る。
本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質及び／若しくはｇＲＮＡ、並びに／又はＣａｓＸバリアントタンパク質及び／若しくはｇＲＮＡバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む核酸のレシピエントとして機能し得る細胞は、例えば、インビトロ細胞、インビボ細胞、エクスビボ細胞、初代細胞、不死化細胞株の細胞、がん細胞、動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞などを含む様々な細胞のうちのいずれかであり得る。細胞は、本開示のＣａｓＸ ＲＮＰのレシピエントであり得る。細胞は、本開示のＣａｓＸシステムの単一成分のレシピエントであり得る。細胞は、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＣａｓＸ、ｇＲＮＡ、及び任意選択的にＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムをコードするベクターのレシピエントであり得る。
本明細書に記載のＣａｓＸ： ｇＲＮＡシステムの産生のための宿主細胞として機能し得る細胞の非限定的な例としては、原核細胞（例えば、Ｅ ｃｏｌｉ）及び真核細胞（例えば、ベビーハムスター腎線維芽（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＳＶ４０遺伝物質を有するＣＶ－１（サル）起源（ＣＯＳ）細胞、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、若しくは酵母細胞、又は組換え産物の産生に好適な当該技術分野で既知の他の真核細胞）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示は、疾患又は障害の治療のための、対象に投与するために改変された細胞集団を提供する。そのような細胞は、当該細胞を投与される対象に対して自己由来であり得る。他の実施形態では、細胞は、当該細胞を投与される対象に対して同種である。細胞は、動物細胞であってもよく、動物細胞に由来してもよい。細胞は、哺乳動物細胞であってもよく、又は哺乳動物細胞に由来してもよい。細胞は、げっ歯類細胞（例えば、ラット若しくはマウス）であってもよく、又はげっ歯類細胞に由来してもよい。細胞は、非ヒト霊長類細胞であってもよく、又は非ヒト霊長類細胞に由来してもよい。細胞は、ヒト細胞であってもよく、又はヒト細胞に由来してもよい。好適な細胞としては、いくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞）、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞など）、体細胞（例えば、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血幹細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、網膜細胞、がん細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植増殖心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、又は出生後幹細胞）を挙げることができる。いくつかの実施形態では、細胞は免疫細胞である。いくつかの場合では、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、又はマクロファージである。場合によっては、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。場合によっては、免疫細胞は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。場合によっては、細胞は、キメラ抗原受容体（Ｃａｒ－Ｔ）を発現する。場合によっては、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、成体幹細胞を含み得る。成体幹細胞は、体性幹細胞とも称され得る。いくつかの実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、神経幹細胞、又は間葉系幹細胞である。他の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。ＭＳＣは、元々、胚性中胚葉に由来し、成体の骨髄から単離され、これが分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄間質、及び腱を形成することができる。ＭＳＣを単離する方法は、当該技術分野で既知であり、任意の既知の方法を使用してＭＳＣを得ることができる。
Ｘ．キット及び製造品
別の態様では、本開示の実施形態のいずれかのＣａｓＸタンパク質及び１つ以上のｇＲＮＡ、並びに好適な容器（例えば、チューブ、バイアル、又はプレート）を含むキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本開示のｇＲＮＡバリアント、又は配列番号５若しくは配列番号４の参照ｇＲＮＡを含む。含まれ得る例示的なｇＲＮＡバリアントは、表２に示される配列番号２２３８～ＸＸのうちのいずれか１つの配列を含む。
いくつかの実施形態は、キットは、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質（例えば、表３及び表７の配列）、又は配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質を含む。例示的な実施形態では、本開示のキットは、配列番号２４７～５９２及び１１４７～１２３１のうちのいずれか１つのＣａｓＸバリアントを含む。更なる例示的な実施形態では、本開示のキットは、配列番号２７０～５９２及び１１４７～１２３１のうちのいずれか１つのＣａｓＸバリアントを含む。更なる例示的な実施形態では、本開示のキットは、配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１のうちのいずれか１つのＣａｓＸバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードするベクターを含み、ｇＲＮＡが、配列番号２１０１～２３３２及び２３５３～２３９８からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２２３８～２３３２及び２３５３～２３９８からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２２８１～２３３２及び２３５３～２３９８からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２２３６、２２３７、２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、及び２２５９～２２８０からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、表２に示される配列のうちのいずれか１つからなる群から選択される配列を含む。
特定の実施形態では、表３及び表７のＣａｓＸバリアントタンパク質並びに本明細書に記載されるｇＲＮＡバリアント（例えば、表２の配列）を含むＣａｓＸタンパク質及びｇＲＮＡの編集ペアを含むキットが本明細書に提供される。例示的な実施形態では、本開示のキットは、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡの編集ペアを含み、ＣａｓＸバリアントが、配列番号２４７～５９２又は１１４７～１２３１のうちのいずれか１つを含む。更なる例示的な実施形態では、本開示のキットは、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡの編集ペアを含み、ＣａｓＸバリアントが、配列番号２７０～５９２及び１１４７～１２３１のうちのいずれか１つを含む。更なる例示的な実施形態では、本開示のキットは、ＣａｓＸ及びｇＲＮＡの編集ペアを含み、ＣａｓＸバリアントが、配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ペアのｇＲＮＡは、配列番号２１０１～２３３２又は２３５３～２３９８のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ペアのｇＲＮＡは、配列番号２２３８～２３３２及び２３５３～２３９８のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ペアのｇＲＮＡは、配列番号２２８１～２３３２又は２３５３～２３９８のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集ペアのｇＲＮＡは、配列番号２２３６、２２３７、２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、又は２２５９～２２８０のうちのいずれか１つを含む。
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む。
いくつかの実施形態では、キットは、遺伝子編集用途のための適切な対照組成物、及び使用説明書を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ベクターを含み、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質をコードする配列、本開示のｇＲＮＡバリアント、任意選択的にドナー鋳型、又はそれらの組み合わせを含む。
本明細書は、多数の例示的な構成、方法、パラメータなどを記載する。しかしながら、かかる説明は、本開示の範囲に対する限定として意図されるものではなく、代わりに例示的な実施形態の説明として提供されることを認識されたい。上記の本主題の実施形態は、単独で、又は１つ以上の他の態様若しくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示の特定の非限定的な実施形態が以下に提供される。本開示を読めば当業者には明らかであるように、個々に番号付けされた実施形態の各々は、先行する若しくは後続する個々に番号付けされた実施形態のいずれかとともに使用され得るか、又はそれと組み合わされ得る。これは、実施形態の全てのそのような組み合わせに対するサポートを提供することを意図しており、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されない。
列挙された実施形態
本発明は、以下に列挙された例示的な実施形態を参照することによって定義され得る。
セットＩ
実施形態１．参照ＣａｓＸタンパク質のバリアント（ＣａｓＸバリアント）であって、
ａ．ＣａｓＸバリアントが、参照ＣａｓＸタンパク質において少なくとも１つの改変を含み、
ｂ．ＣａｓＸバリアントが、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された特徴を示し、任意選択的に、バリアントが、表３及び表８に提供される配列から選択される配列を含む、ＣａｓＸバリアント。
実施形態２．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴が、ＣａｓＸバリアントのフォールディングの改善、ガイド核酸（ｇＮＡ）に対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡに対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡの編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、非標的ＤＮＡ鎖の結合の改善、タンパク質安定性の改善、タンパク質溶解度の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ複合体の溶解度の改善、タンパク質収量の改善、タンパク質発現の改善、融合体特徴の改善、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３．少なくとも１つの改変が、
ａ．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、
ｂ．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸欠失、
ｃ．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸挿入、
ｄ．異なるＣａｓＸからのドメインの全部若しくは一部の置換、
ｅ．ＣａｓＸバリアントのドメインの全部若しくは一部の欠失、又は
ｆ．（ａ）～（ｅ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態１又は２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４．参照ＣａｓＸタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２７０、又は配列番号３３６の配列を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５．少なくとも１つの改変が、
ａ．非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、
ｂ．標的鎖装填（ＴＳＬ）ドメイン、
ｃ．ヘリックスＩドメイン、
ｄ．ヘリックスＩＩドメイン、
ｅ．オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、又は
ｆ．ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン、から選択されるドメインにある、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態６．ＮＴＳＢドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態７．ＴＳＬドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態８．ヘリックスＩドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態９．ヘリックスＩＩドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５～８のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１０．ＯＢＤドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１１．ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１２．改変が、標的ＤＮＡを編集する能力の増加をもたらす、実施形態５～１１のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１３．ＣａｓＸバリアントが、ガイド核酸（ｇＮＡ）とリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４．少なくとも１つの改変が、
ａ．ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した又は連続していないアミノ酸の置換、
ｂ．ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した又は連続していないアミノ酸の欠失、
ｃ．ＣａｓＸにおける１～１００個の連続した又は連続していないアミノ酸の挿入、又は
ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５．少なくとも１つの改変が、
ａ．ＣａｓＸバリアントにおける５～１０個の連続した又は連続していないアミノ酸の置換、
ｂ．ＣａｓＸバリアントにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の欠失、
ｃ．ＣａｓＸにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の挿入、又は
ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態１４に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１６．ＣａｓＸバリアントが、１つのドメインに２つ以上の改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１７．ＣａｓＸバリアントが、２つ以上のドメインに改変を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１８．ｇＮＡ：標的ＤＮＡのＣａｓＸバリアントとの複合体化が起こるチャネルを形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１９．ｇＮＡと結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２０．非標的鎖ＤＮＡと結合するチャネルを形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２１．標的ＤＮＡのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２２．ＣａｓＸバリアントの連続していない表面露出アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２３．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける疎水性パッキングを介してコアを形成する連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２４．改変が、領域の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換のうちの１つ以上である、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２５．ＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基が、帯電アミノ酸で置換されている、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２６．ＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基が、極性アミノ酸で置換されている、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２７．ＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基が、ＤＮＡ又はＲＮＡ塩基とスタッキングするアミノ酸で置換されている、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２８．ＣａｓＸバリアントが、表３の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有する、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２９．異なるＣａｓＸ由来のＮＴＳＢ及び／又はヘリックス１ｂドメインの置換を更に含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３０．置換されたＮＴＳＢドメイン及び／又はヘリックス１ｂドメインが、配列番号１の参照ＣａｓＸに由来する、実施形態２９のＣａｓＸバリアント。
実施形態３１．１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３２．１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３５２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３５３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３５４）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３５５）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３５６）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３５７）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３５８）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３５（）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号３６０）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３６１）、ＤＲＬＲＲ（配列番号３６２）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３６３）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３６４）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３６５）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３６６）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３６７）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３６８）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３６９）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３７０）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３７１）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３７２）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３７３）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３７４）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３７５）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３７６）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３７７）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３７８）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３７９）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３８０）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３８１）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３８２）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３８３）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３８４）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３８５）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３８６）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３８７）、及びＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３８９）からなる配列の群から選択される、実施形態３１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３３．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＣ末端又はその近くに位置する、実施形態３１又は実施形態３２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３４．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端又はその近くに位置する、実施形態３１又は実施形態３２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３５．少なくとも２つのＮＬＳを含み、少なくとも２つのＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端又はその近く及びＣ末端又はその近くに位置する、実施形態３１又は実施形態３２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３６．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態２～３５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３７．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２７０、又は配列番号３３６の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態２～３５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３８．改善された特徴が、編集効率を含み、ＣａｓＸバリアントが、配列番号２７０又は配列番号３３６の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１．１～１００倍の編集効率の改善を含む、実施形態２～３７のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３９．ＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰが、ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのうちのいずれか１つが、細胞アッセイシステムにおいてｇＲＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパクを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、標的ＤＮＡにおけるより高い編集効率及び／又は標的配列の結合を示す、実施形態１～３８のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４０．ＰＡＭ配列が、ＴＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４１．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４２．ＰＡＭ配列が、ＣＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４３．ＰＡＭ配列が、ＧＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４４．ＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰの改善された編集効率及び／又は標的ＤＮＡへの結合が、参照ＣａｓＸを含むＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍改善されている、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４５．ＣａｓＸバリアントが、４００～２０００個のアミノ酸を含む、実施形態１～４４のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４６．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４７．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４８．ＣａｓＸタンパクが、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質であり、ｄＣａｓＸ及びｇＮＡが、標的ＤＮＡに結合する能力を保持する、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４９．ｄＣａｓＸが、残基：
ａ．配列番号１のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、及び／若しくはＥ７６９、及び／若しくはＤ９３５、又は
ｂ．配列番号２のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、及び／若しくはＥ７５６、及び／若しくはＤ９２２、に変異を含む、実施形態４８に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５０．変異が、残基のアラニンへの置換である、実施形態４９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５１．第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第１のＣａｓＸタンパク質とは異なる第２のＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、を含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５２．第１のドメインが、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択される、実施形態５１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５３．第２のドメインが、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択される、実施形態５１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５４．第１及び第２のドメインが、同じドメインではない、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５５．ＣａｓＸバリアントが、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１の部分と、第１のＣａｓＸタンパク質とは異なる第２のＣａｓＸタンパク質由来の第２の部分と、を含む少なくとも１つのキメラドメインを含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５６．少なくとも１つのキメラドメインが、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択される、実施形態５５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５７．少なくとも１つのキメラドメインが、キメラＲｕｖＣドメインを含む、実施形態５６に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５８．ＣａｓＸに融合された異種タンパク質又はそのドメインを含む、実施形態１～５７のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５９．異種タンパク質又はそのドメインが、塩基エディターである、実施形態５８に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態６０．塩基エディターが、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、又はグアニンオキシダーゼである、実施形態５９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態６１．参照ＣａｓＸタンパク質又はＣａｓＸバリアントに結合することができる参照ガイド核酸足場のバリアント（ｇＮＡバリアント）であって、
ａ．ｇＮＡバリアントが、参照ガイド核酸足場配列と比較して、少なくとも１つの改変を含み、
ｂ．ｇＮＡバリアントが、参照ガイド核酸足場と比較して、１つ以上の改善された特徴を示す、ｇＮＡバリアント。
実施形態６２．１つ以上の改善された特徴が、安定性の改善、溶解度の改善、ｇＮＡの転写の改善、ヌクレアーゼ活性に対する耐性の改善、ｇＮＡのフォールディング率の増加、フォールディング中の副生成物形成の減少、生産的なフォールディングの増加、ＣａｓＸタンパク質に対する結合親和性の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的ＤＮＡに対する結合親和性の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の遺伝子編集の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の編集の特異性の改善、及びＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的ＤＮＡの編集におけるＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善からなる群から選択される、実施形態６１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６３．参照ガイド足場が、配列番号４～１６又は配列番号２２３８又は配列番号２２３９の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態６１又は６２に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６４．少なくとも１つの改変が、
ａ．ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド置換、
ｂ．ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド欠失、
ｃ．ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド挿入、
ｄ．ｇＮＡバリアントの領域の全部若しくは一部の置換、
ｅ．ｇＮＡバリアントの領域の全部若しくは一部の欠失、又は
ｆ．（ａ）～（ｅ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６５．ｇＮＡバリアントの領域が、伸長ステムループ、足場ステムループ、三重鎖、及びシュードノットからなる群から選択される、実施形態６４に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６６．足場ステムが、バブルを更に含む、実施形態６５に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６７．足場が、三重鎖ループ領域を更に含む、実施形態６５又は実施形態６６に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６８．足場が、５’非構造化領域を更に含む、実施形態６５～６７のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６９．少なくとも１つの改変が、
ａ．ｇＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１５個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの置換、
ｂ．ｇＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの欠失、
ｃ．ｇＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの挿入、
ｄ．足場ステムループ若しくは伸長ステムループの、近位の５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列による置換、又は
ｅ．（ａ）～（ｄ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態６４～６８のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７０．少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、又は少なくとも１０，０００ヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む、実施形態６１～６９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７１．異種ＲＮＡステムループ配列が、ｇＮＡの安定性を増加させる、実施形態６９に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７２．異種ＲＮＡステムループが、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、又は小分子に結合することができる、実施形態７１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７３．異種ＲＮＡステムループ配列が、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、又はＰＰ７ステムループから選択される、実施形態７１又は実施形態７２に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７４．ｇＮＡバリアントが、１つの領域に２つ以上の改変を含む、実施形態６１～７３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７５．ｇＮＡバリアントが、２つ以上の領域に改変を含む、実施形態６１～７４のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７６．ｇＮＡバリアントが、標的化配列を更に含み、標的化配列が、標的ＤＮＡ配列に相補的である、実施形態６１～７５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７７．標的化配列が、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチドを有する、実施形態７６に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７８．標的化配列が、２０ヌクレオチドを有する、実施形態７６又は実施形態７７に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７９．ｇＮＡが、標的化配列に連結された足場配列を含むシングルガイドｇＮＡである、実施形態７６～７８のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８０．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態６１～７９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８１．ｇＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号４、配列番号５、配列番号２２３８、配列番号２２３９、バリアント足場１７４（表２）、又はバリアント足場１７５（表２）の参照ｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、若しくは少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態６１～７９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８２．伸長ステム領域を除いて、配列番号４又は配列番号５と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場領域を含む、実施形態６１～８１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８３．配列番号１４と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場ステムループを含む、実施形態６１～８１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８４．ｇＮＡバリアント配列の足場が、配列番号４、配列番号５、配列番号２２３８、配列番号２２３９、バリアント足場１７４（表２）、又はバリアント足場１７５（表２）の配列と少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する、実施形態６１～８１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８５．ｇＮＡバリアント配列の足場が、配列番号２１０１～２２８５若しくは４４３３～４４３７の配列の群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態６１～８１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８６．ｇＮＡバリアント配列の足場が、配列番号２１０１～２２８５又は４４３３～４４３７の配列の群から選択される配列からなる、実施形態８５に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８７．１つ以上のリボザイムを更に含む、実施形態６１～８６のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８８．１つ以上のリボザイムが、独立して、ｇＮＡバリアントの末端に融合されている、実施形態８７に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８９．１つ以上のリボザイムのうちの少なくとも１つが、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ピストルリボザイム、ハチェットリボザイム、又はタバコ輪斑ウイルス（ＴＲＳＶ）リボザイムである、実施形態８７又は実施形態８８に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９０．タンパク質結合モチーフを更に含む、実施形態６１～８９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９１．熱安定性ステムループを更に含む、実施形態６１～９０のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９２．ｇＮＡが、化学的に改変されている、実施形態６１～９１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９３．ｇＮＡが、第１のｇＮＡ由来の第１の領域と、第１のｇＮＡとは異なる第２のｇＮＡ由来の第２の領域と、を含む、実施形態６１～９２のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９４．第１の領域が、三重鎖領域、足場ステムループ、及び伸長ステムループからなる群から選択される、実施形態９３に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９５．第２の領域が、三重鎖領域、足場ステムループ、及び伸長ステムループからなる群から選択される、実施形態９３又は実施形態９４に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９６．第１の領域と第２の領域とが、同じ領域ではない、実施形態９３～９５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９７．第１のｇＮＡが、配列番号４の配列を含み、第２のｇＮＡが、配列番号５の配列を含む、実施形態９３～９５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９８．第１のｇＮＡ由来の第１の部分と、第２のｇＮＡ由来の第２の部分と、を含む少なくとも１つのキメラ領域を含む、実施形態６１～９７のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９９．少なくとも１つのキメラ領域が、三重鎖領域、足場ステムループ、及び伸長ステムループからなる群から選択される、実施形態９８に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態１００．配列番号２１０１～２２８５のうちのいずれか１つのいずれか１つの配列を含む、実施形態６１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態１０１．ＣａｓＸタンパク質及び第１のｇＮＡを含む、遺伝子編集ペア。
実施形態１０２．ＣａｓＸ及びｇＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中で一緒に会合することができる、実施形態１０１に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０３．ＣａｓＸ及びｇＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合している、実施形態１０１に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０４．第１のｇＮＡが、実施形態７６～１００のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアントと、標的ＤＮＡに相補的である標的化配列と、を含む、実施形態１０１～１０３のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０５．ＣａｓＸが、実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアントを含む、実施形態１０１～１０４のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０６．
ａ．実施形態７６～１００のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアントと、
ｂ．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアントと、を含む、実施形態１０１～１０５のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０７．ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントの遺伝子編集ペアが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２７０、又は配列番号３３６の参照ＣａｓＸタンパク質、及び配列番号４、５、２２３８、又は２２３９の参照ガイド核酸を含む遺伝子編集ペアと比較して、１つ以上の改善された特徴を有する、実施形態１０６に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０８．１つ以上の改善された特徴が、ＣａｓＸ： ｇＮＡ（ＲＮＰ）複合体安定性の改善、ＣａｓＸとｇＮＡとの間の結合親和性の改善、ＲＮＰ複合体形成の動態の改善、より高い割合の切断コンピテントＲＮＰ、標的ＤＮＡに対するＲＮＰ結合親和性の改善、増加した範囲のＰＡＭ配列を利用する能力、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の改善、又はヌクレアーゼ活性に対する耐性の改善、を含む、実施形態１０７に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０９．改善された特徴のうちの少なくとも１つ以上が、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸の遺伝子編集ペアと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態１０７又は実施形態１０８に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１０．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸の遺伝子編集ペアと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、若しくは少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態１０７又は１０８に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１１．改善された特徴が、配列番号２及び配列番号５の参照編集ペアと比較して、４～９倍の編集活性の増加を含む、実施形態１０７又は実施形態１０８に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１２．実施形態１０１～１１１のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペアを含む組成物であって、
ａ．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアントを含む第２の遺伝子編集ペアと、
ｂ．実施形態６１～１００のいずれか１つに記載の第２のｇＮＡバリアントと、を含み、第２のｇＮＡバリアントが、第１のｇＮＡの標的化配列と比較して、標的ＤＮＡの異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する、組成物。
実施形態１１３．ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントのＲＮＰが、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸のＲＮＰと比較して、より高い割合の切断コンピテントＲＮＰを有する、実施形態１０１～１１２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１４．ＲＮＰが、標的ＤＮＡに結合して切断することができる、実施形態１０１～１１３のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１５．ＲＮＰが、標的ＤＮＡに結合することができるが、標的ＤＮＡを切断することができない、実施形態１０１～１１２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１６．ＲＮＰが、標的ＤＮＡに結合し、標的ＤＮＡにおける１つ以上の一本鎖ニックを生成することができる、実施形態１０１～１１２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１７．配列番号４４１６～４４３２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ＣａｓＸバリアント。
実施形態１１８．配列番号４４３３～４４３７のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ｇＮＡバリアント。
セットＩＩ
実施形態１．参照ＣａｓＸタンパク質のバリアント（ＣａｓＸバリアント）であって、
ａ．ＣａｓＸバリアントが、参照ＣａｓＸタンパク質において少なくとも１つの改変を含み、
ｂ．ＣａｓＸバリアントが、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された特徴を示し、任意選択的に、バリアントが、表３及び表８に提供される配列から選択される配列を含む、ＣａｓＸバリアント。
実施形態２．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴が、ＣａｓＸバリアントのフォールディングの改善、ガイド核酸（ｇＮＡ）に対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡに対する結合親和性の改善、標的ＤＮＡの編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、非標的ＤＮＡ鎖の結合の改善、タンパク質安定性の改善、タンパク質溶解度の改善、タンパク質：ｇＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の改善、タンパク質：ｇＮＡ複合体の溶解度の改善、タンパク質収量の改善、タンパク質発現の改善、融合体特徴の改善、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３．少なくとも１つの改変が、
ａ．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、
ｂ．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸欠失、
ｃ．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸挿入、
ｄ．異なるＣａｓＸからのドメインの全部若しくは一部の置換、
ｅ．ＣａｓＸバリアントのドメインの全部若しくは一部の欠失、又は
ｆ．（ａ）～（ｅ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態１又は２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４．参照ＣａｓＸタンパク質が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の配列を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５．少なくとも１つの改変が、
ａ．非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、
ｂ．標的鎖装填（ＴＳＬ）ドメイン、
ｃ．ヘリックスＩドメイン、
ｄ．ヘリックスＩＩドメイン、
ｅ．オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、又は
ｆ．ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン、から選択されるドメインにある、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態６．ＮＴＳＢドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態７．ＴＳＬドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態８．ヘリックスＩドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態９．ヘリックスＩＩドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５～８のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１０．ＯＢＤドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１１．ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態 改変が、標的ＤＮＡを編集する能力の増加をもたらす、実施形態５～１１のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１３．ＣａｓＸバリアントが、ガイド核酸（ｇＮＡ）とリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１４．少なくとも１つの改変が、
ａ．ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した又は連続していないアミノ酸の置換、
ｂ．ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した又は連続していないアミノ酸の欠失、
ｃ．ＣａｓＸにおける１～１００個の連続した又は連続していないアミノ酸の挿入、又は
ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１５．少なくとも１つの改変が、
ａ．ＣａｓＸバリアントにおける５～１０個の連続した又は連続していないアミノ酸の置換、
ｂ．ＣａｓＸバリアントにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の欠失、
ｃ．ＣａｓＸにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の挿入、又は
ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態１４に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１６．ＣａｓＸバリアントが、１つのドメインに２つ以上の改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１７．ＣａｓＸバリアントが、２つ以上のドメインに改変を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１８．ｇＮＡ：標的核酸のＣａｓＸバリアントとの複合体化が起こるチャネルを形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１９．ｇＮＡと結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２０．非標的鎖ＤＮＡと結合するチャネルを形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２１．標的ＤＮＡのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２２．ＣａｓＸバリアントの連続していない表面露出アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２３．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける疎水性パッキングを介してコアを形成する連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２４．改変が、領域の１つ以上のアミノ酸の１つ以上の欠失、挿入、又は置換のうちの１つ以上である、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２５．ＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基が、帯電アミノ酸で置換されている、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２６．ＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基が、極性アミノ酸で置換されている、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２７．ＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基が、ＤＮＡ又はＲＮＡ塩基とスタッキングするアミノ酸で置換されている、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２８．ＣａｓＸバリアントが、表３の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有する、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２９．異なるＣａｓＸ由来のＮＴＳＢ及び／又はヘリックス１ｂドメインの置換を更に含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３０．置換されたＮＴＳＢドメイン及び／又はヘリックス１ｂドメインが、配列番号１の参照ＣａｓＸに由来する、実施形態２９のＣａｓＸバリアント。
実施形態３１．１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３２．１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３５２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３５３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３５４）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３５５）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３５６）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３５７）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３５８）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３５（）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号３６０）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３６１）、ＤＲＬＲＲ（配列番号３６２）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３６３）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３６４）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３６５）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３６６）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３６７）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３６８）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３６９）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３７０）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３７１）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３７２）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３７３）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３７４）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３７５）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３７６）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３７７）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３７８）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３７９）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３８０）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３８１）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３８２）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３８３）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３８４）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３８５）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３８６）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３８７）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３８９）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号４５９９）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号４６００）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号４６０１）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号４６０２）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４６０３）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号４６０４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４６０５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号４６０６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号４６０７）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号４６０８）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号４６０９）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４６１０）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４６１１）からなる配列の群から選択される、実施形態３１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３３．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＣ末端又はその近くに位置する、実施形態３１又は実施形態３２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３４．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端又はその近くに位置する、実施形態３１又は実施形態３２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３５．少なくとも２つのＮＬＳを含み、少なくとも２つのＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端又はその近く及びＣ末端又はその近くに位置する、実施形態３１又は実施形態３２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３６．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態２～３５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３７．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２７０、又は配列番号３３６のＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態２～３５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３８．改善された特徴が、編集効率を含み、ＣａｓＸバリアントが、配列番号２７０又は配列番号３３６のＣａｓＸタンパク質と比較して、１．１～１００倍の編集効率の改善を含む、実施形態２～３７のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３９．ＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰが、ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのうちのいずれか１つが、細胞アッセイシステムにおいてｇＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパクを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、標的ＤＮＡにおけるより高い編集効率及び／又は標的配列の結合を示す、実施形態１～３８のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４０．ＰＡＭ配列が、ＴＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４１．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４２．ＰＡＭ配列が、ＣＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４３．ＰＡＭ配列が、ＧＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４４．ＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰの改善された編集効率及び／又は標的ＤＮＡへの結合が、参照ＣａｓＸを含むＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍改善されている、実施形態３９のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４５．ＣａｓＸバリアントが、４００～２０００個のアミノ酸を含む、実施形態１～４４のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４６．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４７．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４８．ＣａｓＸタンパクが、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質であり、ｄＣａｓＸ及びｇＮＡが、標的ＤＮＡに結合する能力を保持する、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４９．ｄＣａｓＸが、残基：
ａ．配列番号１のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、及び／若しくはＥ７６９、及び／若しくはＤ９３５、又は
ｂ．配列番号２のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、及び／若しくはＥ７５６、及び／若しくはＤ９２２、に変異を含む、実施形態４８に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５０．変異が、残基のアラニンへの置換である、実施形態４９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５１．第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第１のＣａｓＸタンパク質とは異なる第２のＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、を含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５２．第１のドメインが、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択される、実施形態５１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５３．第２のドメインが、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択される、実施形態５１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５４．第１及び第２のドメインが、同じドメインではない、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５５．ＣａｓＸバリアントが、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１の部分と、第１のＣａｓＸタンパク質とは異なる第２のＣａｓＸタンパク質由来の第２の部分と、を含む少なくとも１つのキメラドメインを含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５６．少なくとも１つのキメラドメインが、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択される、実施形態５５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５７．少なくとも１つのキメラドメインが、キメラＲｕｖＣドメインを含む、実施形態５６に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５８．ＣａｓＸに融合された異種タンパク質又はそのドメインを含む、実施形態１～５７のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５９．異種タンパク質又はそのドメインが、塩基エディターである、実施形態５８に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態６０．塩基エディターが、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、又はグアニンオキシダーゼである、実施形態５９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態６１．参照ＣａｓＸタンパク質又はＣａｓＸバリアントに結合することができる参照ガイド核酸足場のバリアント（ｇＮＡバリアント）であって、
ａ．ｇＮＡバリアントが、参照ガイド核酸足場配列と比較して、少なくとも１つの改変を含み、
ｂ．ｇＮＡバリアントが、参照ガイド核酸足場と比較して、１つ以上の改善された特徴を示す、ｇＮＡバリアント。
実施形態６２．１つ以上の改善された特徴が、安定性の改善、溶解度の改善、ｇＮＡの転写の改善、ヌクレアーゼ活性に対する耐性の改善、ｇＮＡのフォールディング率の増加、フォールディング中の副生成物形成の減少、生産的なフォールディングの増加、ＣａｓＸタンパク質に対する結合親和性の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的ＤＮＡに対する結合親和性の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の遺伝子編集の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の編集の特異性の改善、及びＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的ＤＮＡの編集におけるＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善からなる群から選択される、実施形態６１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６３．参照ガイド足場が、配列番号４～１６の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態６１又は６２に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６４．少なくとも１つの改変が、
ａ．ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド置換、
ｂ．ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド欠失、
ｃ．ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド挿入、
ｄ．ｇＮＡバリアントの領域の全部若しくは一部の置換、
ｅ．ｇＮＡバリアントの領域の全部若しくは一部の欠失、又は
ｆ．（ａ）～（ｅ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６５．ｇＮＡバリアントの領域が、伸長ステムループ、足場ステムループ、三重鎖、及びシュードノットからなる群から選択される、実施形態６４に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６６．足場ステムが、バブルを更に含む、実施形態６５に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６７．足場が、三重鎖ループ領域を更に含む、実施形態６５又は実施形態６６に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６８．足場が、５’非構造化領域を更に含む、実施形態６５～６７のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６９．少なくとも１つの改変が、
ａ．ｇＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１５個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの置換、
ｂ．ｇＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの欠失、
ｃ．ｇＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの挿入、
ｄ．足場ステムループ若しくは伸長ステムループの、近位の５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列による置換、又は
ｅ．（ａ）～（ｄ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態６４～６８のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７０．少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、又は少なくとも１０，０００ヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む、実施形態６１～６９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７１．異種ＲＮＡステムループ配列が、ｇＮＡの安定性を増加させる、実施形態６９に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７２．異種ＲＮＡステムループが、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、又は小分子に結合することができる、実施形態７１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７３．異種ＲＮＡステムループ配列が、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、又はＰＰ７ステムループから選択される、実施形態７１又は実施形態７２に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７４．ｇＮＡバリアントが、１つの領域に２つ以上の改変を含む、実施形態６１～７３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７５．ｇＮＡバリアントが、２つ以上の領域に改変を含む、実施形態６１～７４のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７６．ｇＮＡバリアントが、標的化配列を更に含み、標的化配列が、標的ＤＮＡ配列に相補的である、実施形態６１～７５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７７．標的化配列が、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチドを有する、実施形態７６に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７８．標的化配列が、２０ヌクレオチドを有する、実施形態７６又は実施形態７７に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７９．ｇＮＡが、標的化配列に連結された足場配列を含むシングルガイドｇＮＡである、実施形態７６～７８のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８０．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態６１～７９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８１．ｇＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号４の参照ｇＮＡ、配列番号５の参照ｇＮＡ、配列番号２２３８のバリアント足場、又は配列番号２２３９のバリアント足場と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、若しくは少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態６１～７９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８２．伸長ステム領域を除いて、配列番号４又は配列番号５と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場領域を含む、実施形態６１～８１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８３．配列番号１４と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場ステムループを含む、実施形態６１～８１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８４．ｇＮＡバリアント配列の足場が、配列番号４、配列番号５、配列番号２２３８、又は配列番号２２３９の配列と少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する、実施形態６１～８１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８５．ｇＮＡバリアント配列の足場が、配列番号２１０１～２２８０若しくは４４３３～４４４６の配列の群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態６１～８１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８６．ｇＮＡバリアント配列の足場が、配列番号２１０１～２２８０又は４４３３～４４４６の配列の群から選択される配列からなる、実施形態８５に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８７．１つ以上のリボザイムを更に含む、実施形態６１～８６のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８８．１つ以上のリボザイムが、独立して、ｇＮＡバリアントの末端に融合されている、実施形態８７に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８９．１つ以上のリボザイムのうちの少なくとも１つが、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ピストルリボザイム、ハチェットリボザイム、又はタバコ輪斑ウイルス（ＴＲＳＶ）リボザイムである、実施形態８７又は実施形態８８に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９０．タンパク質結合モチーフを更に含む、実施形態６１～８９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９１．熱安定性ステムループを更に含む、実施形態６１～９０のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９２．ｇＮＡが、化学的に改変されている、実施形態６１～９１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９３．ｇＮＡが、第１のｇＮＡ由来の第１の領域と、第１のｇＮＡとは異なる第２のｇＮＡ由来の第２の領域と、を含む、実施形態６１～９２のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９４．第１の領域が、三重鎖領域、足場ステムループ、及び伸長ステムループからなる群から選択される、実施形態９３に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９５．第２の領域が、三重鎖領域、足場ステムループ、及び伸長ステムループからなる群から選択される、実施形態９３又は実施形態９４に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９６．第１の領域と第２の領域とが、同じ領域ではない、実施形態９３～９５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９７．第１のｇＮＡが、配列番号４の配列を含み、第２のｇＮＡが、配列番号５の配列を含む、実施形態９３～９５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９８．第１のｇＮＡ由来の第１の部分と、第２のｇＮＡ由来の第２の部分と、を含む少なくとも１つのキメラ領域を含む、実施形態６１～９７のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９９．少なくとも１つのキメラ領域が、三重鎖領域、足場ステムループ、及び伸長ステムループからなる群から選択される、実施形態９８に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態１００．配列番号２１０１～２２８０又は４４３３～４４４６のうちのいずれか１つの配列を含む、実施形態６１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態１０１．ＣａｓＸタンパク質及び第１のｇＮＡを含む、遺伝子編集ペア。
実施形態１０２．ＣａｓＸ及びｇＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中で一緒に会合することができる、実施形態１０１に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０３．ＣａｓＸ及びｇＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合している、実施形態１０１に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０４．第１のｇＮＡが、実施形態７６～１００のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアントと、標的ＤＮＡに相補的である標的化配列と、を含む、実施形態１０１～１０３のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０５．ＣａｓＸが、実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアントを含む、実施形態１０１～１０４のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０６．
ａ．実施形態７６～１００のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアントと、
ｂ．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアントと、を含む、実施形態１０１～１０５のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０７．ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントの遺伝子編集ペアが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、及び配列番号４又は５の参照ガイド核酸を含む遺伝子編集ペアと比較して、１つ以上の改善された特徴を有する、実施形態１０６に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０８．１つ以上の改善された特徴が、ＣａｓＸ： ｇＮＡ（ＲＮＰ）複合体安定性の改善、ＣａｓＸとｇＮＡとの間の結合親和性の改善、ＲＮＰ複合体形成の動態の改善、より高い割合の切断コンピテントＲＮＰ、標的ＤＮＡに対するＲＮＰ結合親和性の改善、増加した範囲のＰＡＭ配列を利用する能力、標的ＤＮＡの巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の改善、又はヌクレアーゼ活性に対する耐性の改善、を含む、実施形態１０７に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０９．改善された特徴のうちの少なくとも１つ以上が、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸の遺伝子編集ペアと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態１０７又は実施形態１０８に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１０．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸の遺伝子編集ペアと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、若しくは少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態１０７又は１０８に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１１．改善された特徴が、配列番号２及び配列番号５の参照編集ペアと比較して、４～９倍の編集活性の増加を含む、実施形態１０７又は実施形態１０８に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１２．実施形態１０１～１１１のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペアを含む組成物であって、
ａ．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアントを含む第２の遺伝子編集ペアと、
ｂ．実施形態６１～１００のいずれか１つに記載の第２のｇＮＡバリアントと、を含み、第２のｇＮＡバリアントが、第１のｇＮＡの標的化配列と比較して、標的ＤＮＡの異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する、組成物。
実施形態１１３．ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントのＲＮＰが、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸のＲＮＰと比較して、より高い割合の切断コンピテントＲＮＰを有する、実施形態１０１～１１２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１４．ＲＮＰが、標的ＤＮＡに結合して切断することができる、実施形態１０１～１１３のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１５．ＲＮＰが、標的ＤＮＡに結合することができるが、標的ＤＮＡを切断することができない、実施形態１０１～１１２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１６．ＲＮＰが、標的ＤＮＡに結合し、標的ＤＮＡにおける１つ以上の一本鎖ニックを生成することができる、実施形態１０１～１１２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１７．配列番号４４１６～４４３２又は４５９７～４５９８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ＣａｓＸバリアント。
実施形態１１８．配列番号４４３３～４４４６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ｇＮＡバリアント。
セットＩＩＩ
実施形態１．参照ＣａｓＸタンパク質のバリアント（ＣａｓＸバリアント）であって、
ａ．ＣａｓＸバリアントが、参照ＣａｓＸタンパク質において少なくとも１つの改変を含み、
ｂ．ＣａｓＸバリアントが、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改善された特徴を示し、
任意選択的に、バリアントが、配列番号８９～１０１、２４７～３３７、４１１～５９２、及び７６０～９８２からなる群から選択される配列を含む、ＣａｓＸバリアント。
実施形態２．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴が、ＣａｓＸバリアントのフォールディングの改善、ガイド核酸（ｇＮＡ）に対する結合親和性の改善、標的核酸に対する結合親和性の改善、標的核酸の編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的核酸の巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、非標的核酸鎖の結合の改善、タンパク質安定性の改善、タンパク質溶解度の改善、タンパク質：ｇＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の改善、タンパク質：ｇＮＡ複合体の溶解度の改善、タンパク質収量の改善、タンパク質発現の改善、融合体特徴の改善、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３．少なくとも１つの改変が、
ａ．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、
ｂ．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸欠失、
ｃ．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸挿入、
ｄ．異なるＣａｓＸからのドメインの全部若しくは一部の置換、
ｅ．ＣａｓＸバリアントのドメインの全部若しくは一部の欠失、又は
ｆ．（ａ）～（ｅ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態１又は２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４．参照ＣａｓＸタンパク質が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の配列を含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５．少なくとも１つの改変が、
ａ．非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、
ｂ．標的鎖装填（ＴＳＬ）ドメイン、
ｃ．ヘリックスＩドメイン、
ｄ．ヘリックスＩＩドメイン、
ｅ．オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、又は
ｆ．ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン、から選択されるドメインにある、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態６．ＮＴＳＢドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態７．ＴＳＬドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態８．ヘリックスＩドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態９．ヘリックスＩＩドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５～８のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１０．ＯＢＤドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１１．ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１２．改変が、標的核酸を編集する能力の増加をもたらす、実施形態５～１１のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１３．ＣａｓＸバリアントが、ガイド核酸（ｇＮＡ）とリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１４．少なくとも１つの改変が、
ａ．ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した又は連続していないアミノ酸の置換、
ｂ．ＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続した又は連続していないアミノ酸の欠失、
ｃ．ＣａｓＸにおける１～１００個の連続した又は連続していないアミノ酸の挿入、又は
ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１５．少なくとも１つの改変が、
ａ．ＣａｓＸバリアントにおける５～１０個の連続した又は連続していないアミノ酸の置換、
ｂ．ＣａｓＸバリアントにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の欠失、
ｃ．ＣａｓＸにおける１～５個の連続した又は連続していないアミノ酸の挿入、又は
ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態１４に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１６．ＣａｓＸバリアントが、１つのドメインに２つ以上の改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１７．ＣａｓＸバリアントが、２つ以上のドメインに改変を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１８．ｇＮＡ：標的ＤＮＡのＣａｓＸバリアントとの複合体化が起こるチャネルを形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態１９．ｇＮＡと結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２０．非標的鎖ＤＮＡと結合するチャネルを形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２１．標的核酸のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と結合する界面を形成するＣａｓＸバリアントの連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２２．ＣａｓＸバリアントの連続していない表面露出アミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２３．ＣａｓＸバリアントのドメインにおける疎水性パッキングを介してコアを形成する連続していないアミノ酸残基の領域の少なくとも１つの改変を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２４．改変が、領域の１つ以上のアミノ酸の１つ以上の欠失、挿入、又は置換のうちの１つ以上である、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２５．ＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基が、帯電アミノ酸で置換されている、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２６．ＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基が、極性アミノ酸で置換されている、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２７．ＣａｓＸバリアントの領域の２～１５個のアミノ酸残基が、ＤＮＡ又はＲＮＡ塩基とスタッキングするアミノ酸で置換されている、実施形態１８～２３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２８．異なるＣａｓＸ由来のＮＴＳＢ及び／又はヘリックス１ｂドメインの置換を更に含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態２９．置換されたＮＴＳＢドメイン及び／又はヘリックス１ｂドメインが、配列番号１の参照ＣａｓＸに由来する、実施形態２８のＣａｓＸバリアント。
実施形態３０．ＣａｓＸバリアントが、配列番号８９～１０１、２４７～３３７、４１１～５９２、及び７６０～９８２からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有する、実施形態１～２９のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３１．１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３２．１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３５２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３５３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３５４）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３５５）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３５６）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３５７）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３５８）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号（３５９）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号３６０）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３６１）、ＤＲＬＲＲ（配列番号３６２）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３６３）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３６４）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３６５）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３６６）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３６７）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３６８）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３６９）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３７０）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３７１）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３７２）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３７３）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３７４）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３７５）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３７６）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３７７）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３７８）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３７９）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３８０）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３８１）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３８２）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３８３）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３８４）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３８５）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３８６）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３８７）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３８９）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号６３）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号６４）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号６５）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号６６）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号６７）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号６８）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号７０）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号７１）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号７２）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号７３）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７４）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７５）からなる配列の群から選択され、任意選択的に、１つ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドを用いて、ＣａｓＸバリアント又は隣接するＮＬＳに連結され、リンカーペプチドが、（Ｇ）ｎ（配列番号１０２３）、（ＧＳ）ｎ（配列番号１０２４）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３９９）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４００）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０１）、ＧＧＳＧ（配列番号４０２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号４０３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号４０４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号４０５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号４０６）、ＧＳＳＳＧ（配列番号４０７）、ＧＰＧＰ（配列番号４０８）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号４０９）、ＰＰＰＧ（配列番号２４）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号４１０）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号２６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１０２５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号２７）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される、実施形態３１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３３．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＣ末端又はその近くに位置する、実施形態３１又は実施形態３２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３４．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端又はその近くに位置する、実施形態３１又は実施形態３２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３５．少なくとも２つのＮＬＳを含み、少なくとも２つのＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端又はその近く及びＣ末端又はその近くに位置する、実施形態３１又は実施形態３２に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３６．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、同等の条件下でインビトロで比較した場合、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態２～３５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３７．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、同等の条件下でインビトロアッセイにおいて比較した場合、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号２７０、又は配列番号３３６のＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態２～３５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３８．改善された特徴が、編集効率を含み、ＣａｓＸバリアントが、同等の条件下でインビトロアッセイにおいて比較した場合、配列番号２７０又は配列番号３３６のＣａｓＸタンパク質と比較して、標的核酸の編集効率における１．１～１００倍の改善を含む、実施形態２～３７のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態３９．ＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰが、ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのうちのいずれか１つが、インビトロ細胞アッセイシステムにおいてｇＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパクを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、標的核酸における配列のより高い編集効率及び／又は結合を示す、実施形態１～３８のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４０．ＰＡＭ配列が、ＴＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４１．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４２．ＰＡＭ配列が、ＣＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４３．ＰＡＭ配列が、ＧＴＣである、実施形態３９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４４．ＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰによる改善された編集効率及び／又は標的核酸への結合が、参照ＣａｓＸを含むＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍改善されている、実施形態３９～４３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４５．ＣａｓＸバリアントが、４００～２０００個のアミノ酸を含む、実施形態１～４４のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４６．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４７．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４８．ＣａｓＸタンパクが、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパクであり、ｄＣａｓＸ及びｇＮＡが、標的核酸に結合する能力を保持しており、任意選択的に、ｄＣａｓＸタンパクが、配列番号４４～６２の配列を含む、実施形態１～３７のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態４９．ｄＣａｓＸが、残基：
ａ．配列番号１のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、及び／若しくはＥ７６９、及び／若しくはＤ９３５、又は
ｂ．配列番号２のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、及び／若しくはＥ７５６、及び／若しくはＤ９２２、に変異を含む、実施形態４８に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５０．変異が、残基のアラニンへの置換である、実施形態４９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５１．第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第１のＣａｓＸタンパク質とは異なる第２のＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、を含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５２．第１のドメインが、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択される、実施形態５１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５３．第２のドメインが、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択される、実施形態５１に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５４．第１及び第２のドメインが、同じドメインではない、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５５．ＣａｓＸバリアントが、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１の部分と、第１のＣａｓＸタンパク質とは異なる第２のＣａｓＸタンパク質由来の第２の部分と、を含む少なくとも１つのキメラドメインを含む、実施形態１～５０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５６．少なくとも１つのキメラドメインが、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、ＯＢＤ、及びＲｕｖＣドメインからなる群から選択される、実施形態５５に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５７．少なくとも１つのキメラドメインが、キメラＲｕｖＣドメインを含む、実施形態５６に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５８．ＣａｓＸに融合された異種タンパク質又はそのドメインを含む、実施形態１～５７のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態５９．異種タンパク質又はそのドメインが、塩基エディターである、実施形態５８に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態６０．塩基エディターが、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、又はグアニンオキシダーゼである、実施形態５９に記載のＣａｓＸバリアント。
実施形態６１．参照ＣａｓＸタンパク質又はＣａｓＸバリアントに結合することができる参照ガイド核酸足場のバリアント（ｇＮＡバリアント）であって、
ａ．ｇＮＡバリアントが、参照ガイド核酸足場配列と比較して、少なくとも１つの改変を含み、
ｂ．ｇＮＡバリアントが、参照ガイド核酸足場と比較して、１つ以上の改善された特徴を示し、
任意選択的に、バリアントが、配列番号２１０１～２３３２からなる群から選択される配列を含む、ｇＮＡバリアント。
実施形態６２．１つ以上の改善された特徴が、安定性の改善、溶解度の改善、ｇＮＡの転写の改善、ヌクレアーゼ活性に対する耐性の改善、ｇＮＡのフォールディング率の増加、フォールディング中の副生成物形成の減少、生産的なフォールディングの増加、ＣａｓＸタンパク質に対する結合親和性の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の標的核酸に対する結合親和性の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の遺伝子編集の改善、ＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の編集の特異性の改善、及びＣａｓＸタンパク質と複合体化した場合の切断コンピテントＲＮＰを形成する能力の改善からなる群から選択される配列を含む、実施形態６１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６３．参照ガイド足場が、配列番号４～１６の配列からなる群から選択される配列を含む、実施形態６１又は６２に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６４．少なくとも１つの改変が、
ａ．ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド置換、
ｂ．ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド欠失、
ｃ．ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１つのヌクレオチド挿入、
ｄ．ｇＮＡバリアントの領域の全部若しくは一部の置換、
ｅ．ｇＮＡバリアントの領域の全部若しくは一部の欠失、又は
ｆ．（ａ）～（ｅ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６５．ｇＮＡバリアントの領域が、伸長ステムループ、足場ステムループ、三重鎖、及びシュードノットからなる群から選択される、実施形態６４に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６６．足場ステムが、バブルを更に含む、実施形態６５に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６７．足場が、三重鎖ループ領域を更に含む、実施形態６５又は実施形態６６に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６８．足場が、５’非構造化領域を更に含む、実施形態６５～６７のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態６９．少なくとも１つの改変が、
ａ．ｇＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１５個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの置換、
ｂ．ｇＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの欠失、
ｃ．ｇＮＡバリアントの１つ以上の領域における１～１０個の連続した若しくは連続していないヌクレオチドの挿入、
ｄ．足場ステムループ若しくは伸長ステムループの、近位の５’末端及び３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列による置換若しくは挿入、又は
ｅ．（ａ）～（ｄ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態６４～６８のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７０．ｇＮＡバリアントが、１つの領域に２つ以上の改変を含む、実施形態６１～６９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７１．ｇＮＡバリアントが、２つ以上の領域に改変を含む、実施形態６１～６９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７２．少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、又は少なくとも１０，０００ヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む、実施形態６１～７１のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７３．異種ＲＮＡステムループ配列が、ｇＮＡの安定性を増加させる、実施形態７２に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７４．異種ＲＮＡステムループが、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、又は小分子に結合することができる、実施形態７２又は実施形態７３に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７５．伸長ステムループに挿入された異種ＲＮＡステムループ配列が、ＭＳ２ヘアピン、Ｑβヘアピン、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘヘアピン、又はＰＰ７ヘアピンから選択され、異種ステムループが、それぞれ、ＭＳ２コートタンパク質、Ｑβコートタンパク質、Ｕ１Ａシグナル認識粒子、Ｔ４ファージのＵｖｓｘタンパク質、又はＰＰ７コートタンパク質に結合することができる、実施形態７４に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７６．改変が、伸長ステムループにおける、
ａ．Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）のステムＩＩＢ、
ｂ．ＲＲＥのステムＩＩ－Ｖ、
ｃ．ＲＲＥのステムＩＩ、
ｄ．ステムＩＩＢのＲｅｖ結合エレメント（ＲＢＥ）、及び
ｅ．全長ＲＲＥ、からなる群から選択される１つ以上の成分の挿入を含み、
１つ以上の成分が、Ｒｅｖに結合することができる、実施形態６１～７５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７７．ｇＮＡバリアントが、標的化配列を更に含み、標的化配列が、標的核酸配列に相補的である、実施形態６１～７６のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７８．標的化配列が、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチドを有する、実施形態７７に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態７９．標的化配列が、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、実施形態７８に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８０．１８ヌクレオチドの標的化配列を有するｇＮＡバリアントを含むＲＮＰが、同等の条件下でインビトロ細胞ベースアッセイにおいてアッセイした場合、２０ヌクレオチドの標的化配列を有するｇＮＡバリアントを含むＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍大きい編集効率を示す、実施形態７９に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８１．１９ヌクレオチドの標的化配列を有するｇＮＡバリアントを含むＲＮＰが、同等の条件下でインビトロ細胞ベースアッセイにおいてアッセイした場合、２０ヌクレオチドの標的化配列を有するｇＮＡバリアントを含むＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍大きい編集効率を示す、実施形態７９に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８２．標的化配列が、２０ヌクレオチドを有する、実施形態７７～７９のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８３．ｇＮＡが、標的化配列に連結された足場配列を含むシングルガイドｇＮＡである、実施形態７７～８０のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８４．ｇＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号４又は配列番号５の参照ｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態６１～８３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８５．ｇＮＡバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、配列番号４の参照ｇＮＡ、配列番号５の参照ｇＮＡ、配列番号２２３８のバリアント足場、配列番号２２３９のバリアント足場、バリアント足場１７４（配列番号２２３８）、又はバリアント足場１７５（配列番号２２３９）と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、若しくは少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態６１～８３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８６．伸長ステム領域を除いて、配列番号４又は配列番号５と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場領域を含む、実施形態６１～８５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８７．配列番号１４と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場ステムループを含む、実施形態６１～８５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８８．ｇＮＡバリアント配列の足場が、配列番号４、配列番号５、配列番号２２３８、又は配列番号２２３９の配列と少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有する、実施形態６１～８５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態８９．ｇＮＡバリアント配列の足場が、配列番号２１０１～２３３２の配列の群から選択される配列、又はそれと少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態６１～８５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９０．ｇＮＡバリアント配列の足場が、配列番号２１０１～２３３２からなる群から選択される配列からなる、実施形態８９に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９１．１つ以上のリボザイムを更に含む、実施形態６１～９０のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９２．１つ以上のリボザイムが、独立して、ｇＮＡバリアントの末端に融合されている、実施形態９１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９３．１つ以上のリボザイムのうちの少なくとも１つが、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ピストルリボザイム、ハチェットリボザイム、又はタバコ輪斑ウイルス（ＴＲＳＶ）リボザイムである、実施形態９１又は実施形態９２に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９４．熱安定性ステムループを更に含む、実施形態６１～９３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９５．ｇＮＡが、化学的に改変されている、実施形態６１～９４のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９６．ｇＮＡが、第１のｇＮＡ由来の第１の領域と、第１のｇＮＡとは異なる第２のｇＮＡ由来の第２の領域と、を含む、実施形態６１～９５のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９７．第１の領域が、三重鎖領域、足場ステムループ、及び伸長ステムループからなる群から選択される、実施形態９６に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９８．第２の領域が、三重鎖領域、足場ステムループ、及び伸長ステムループからなる群から選択される、実施形態９６又は実施形態９７に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態９９．第１の領域と第２の領域とが、同じ領域ではない、実施形態９６～９８のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態１００．第１のｇＮＡが、配列番号４の配列を含み、第２のｇＮＡが、配列番号５の配列を含む、実施形態９６～９８のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態１０１．第１のｇＮＡ由来の第１の部分と、第２のｇＮＡ由来の第２の部分と、を含む少なくとも１つのキメラ領域を含む、実施形態６１～１００のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアント。
実施形態１０２．少なくとも１つのキメラ領域が、三重鎖領域、足場ステムループ、及び伸長ステムループからなる群から選択される、実施形態１０１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態１０３．配列番号２１０１～２３３２のうちのいずれか１つのいずれか１つの配列を含む、実施形態６１に記載のｇＮＡバリアント。
実施形態１０４．ＣａｓＸバリアントタンパク質及び第１のｇＮＡバリアントを含む、遺伝子編集ペア。
実施形態１０５．ＣａｓＸバリアントタンパク質及びｇＮＡバリアントが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中で一緒に会合することができる、実施形態１０４に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０６．ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合している、実施形態１０４に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０７．第１のｇＮＡが、実施形態７７～１０３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアントと、標的核酸に相補的である標的化配列と、を含む、実施形態１０４～１０７のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０８．ＣａｓＸバリアントが、実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアントを含む、実施形態１０４～１０７のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１０９．
ａ．実施形態７７～１０３のいずれか１つに記載のｇＮＡバリアントと、
ｂ．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアントと、を含む、実施形態１０４～１０８のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１０．ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントの遺伝子編集ペアが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、及び配列番号４又は５の参照ガイド核酸を含む遺伝子編集ペアと比較して、１つ以上の改善された特徴を有する、実施形態１０９に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１１．１つ以上の改善された特徴が、ＣａｓＸ： ｇＮＡ（ＲＮＰ）複合体安定性の改善、ＣａｓＸとｇＮＡとの間の結合親和性の改善、ＲＮＰ複合体形成の動態の改善、より高い割合の切断コンピテントＲＮＰ、標的核酸に対するＲＮＰ結合親和性の改善、増加した範囲のＰＡＭ配列を利用する能力、標的核酸の巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、編集特異性の改善、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、オフターゲット切断の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の改善、又はヌクレアーゼ活性に対する耐性の改善、を含む、実施形態１１０に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１２．改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質、又はＣａｓＸバリアント１１９若しくは４９１、及び配列番号４若しくは５の参照ガイド核酸、又は１７４のｇＮＡバリアント（配列番号２２３８）を含む遺伝子編集ペアと比較して、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣの非標準ＰＡＭ配列を利用する標的核酸の編集効率の増強である、実施形態１１０又は実施形態１１１に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１３．改善された特徴のうちの少なくとも１つ以上が、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸の遺伝子編集ペアと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上改善されている、実施形態１１０に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１４．ＣａｓＸバリアントの改善された特徴のうちの１つ以上が、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸又は１７４のｇＮＡバリアント（配列番号２２３８）の遺伝子編集ペアと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６倍、少なくとも約１０倍、若しくは少なくとも約１００倍、又はそれ以上改善されている、実施形態１１０に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１５．改善された特徴が、同等の条件下でインビトロアッセイにおいてアッセイした場合、配列番号２及び配列番号５又は１７４のｇＮＡバリアント（配列番号２２３８）の参照編集ペアと比較して、編集効率の４～９倍の増加を含む、実施形態１１０に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１６．ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントのＲＮＰが、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸のＲＮＰと比較して、より高い割合の切断コンピテントＲＮＰを有する、実施形態１０４～１１５のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１７．ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントのＲＮＰが、参照ＣａｓＸタンパク質及び参照ガイド核酸のＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも５倍高い割合の切断コンピテントＲＮＰを有する、実施形態１１６に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１８．ＲＮＰが、標的核酸に結合して切断することができる、実施形態１０４～１１７のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１１９．ＣａｓＸバリアント及びｇＮＡバリアントのＲＮＰが、同等の条件下でオンターゲット／オフターゲット編集についてのインビトロアッセイにおいてアッセイした場合、配列番号２及び配列番号５又は１７４のｇＮＡバリアント（配列番号２２３８）の参照編集ペアと比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％以内の特異度を示す、実施形態１０４～１１８のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１２０．ＲＮＰが、標的核酸に結合することができるが、標的核酸を切断することができない、実施形態１０４～１１１のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１２１．ＲＮＰが、標的核酸に結合し、標的核酸において１つ以上の一本鎖ニックを生成することができる、実施形態１０４～１１７のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態１２２．実施形態１０４～１１９のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペアを含む組成物であって、
ａ．実施形態１～６０のいずれか１つに記載のＣａｓＸバリアントを含む第２の遺伝子編集ペアと、
ｂ．実施形態６１～１０３のいずれか１つに記載の第２のｇＮＡバリアントと、を含み、第２のｇＮＡバリアントが、第１のｇＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸の異なる部分又は重複する部分に相補的な標的化配列を有する、組成物。
実施形態１２３．配列番号８９～１０１、２４７～３３７、４１１～５９２、又は７６０～９８２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ＣａｓＸバリアント。
実施形態１２４．配列番号２１０１～２３３２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ｇＮＡバリアント。
実施形態１２５．疾患を有する対象の治療のための医薬品として使用するための、実施形態１０４～１２１のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
セットＩＶ
実施形態１．配列番号２２９２、２２９１、２３０７、２２８１～２２９０、２２９３～２３０６、２３０８～２３３２、及び２３５３０～２３９８からなる群から選択される配列のうちのいずれかと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）足場。
実施形態２．配列番号２２９２、２２９１、２３０７、２２８１～２２９０、２２９３～２３０６、２３０８～２３３２、及び２３５３０～２３９８からなる群から選択される配列を含む、実施形態１に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態３．配列番号２２３８に対して１つ以上の改変を有する配列を含み、１つ以上の改変が、改善された特徴をもたらす、実施形態１に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態４．１つ以上の改変が、表１９に示される１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、及び／又は欠失を含む、実施形態３に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態５．改善された特徴が、任意選択的にインビトロアッセイにおける、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、足場ステム安定性の増加、伸長ステム安定性、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である、実施形態３又は実施形態４に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態６．ｇＲＮＡ足場が、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３８のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す、実施形態３～５のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態７．配列番号２２３９に対して１つ以上の改変を有する配列を含み、１つ以上の改変が、改善された特徴をもたらす、実施形態１に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態８．１つ以上の改変が、表２０に示される１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、及び／又は欠失を含む、実施形態７に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態９．改善された特徴が、任意選択的にインビトロアッセイにおける、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、足場ステム安定性の増加、伸長ステム安定性、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である、実施形態７又は実施形態８に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１０．ｇＲＮＡ足場が、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３９のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約１．２、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す、実施形態７～９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１１．配列番号２２３９の配列に対して、Ｃ９、Ｕ１１、Ｃ１７、Ｕ２４、Ａ２９、Ｕ５４、Ｇ６４、Ａ８８、及びＡ９５からなる群から選択される位置に１つ以上の改変を含む、実施形態１に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１２．配列番号２２３９の配列に対して、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位でのＧの挿入、６４位でのＣの挿入、Ａ８８Ｇ、及びＡ９５Ｇからなる群から選択される１つ以上の改変を含む、実施形態１１に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１３．配列番号２２３９の配列に対して、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位でのＧの挿入、６４位でのＣの挿入、Ａ８８Ｇ、及びＡ９５Ｇからなる改変を含む、実施形態１２に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１４．改善された特徴が、シュードノットステム安定性、三重鎖領域安定性、足場バブル安定性、伸長ステム安定性、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性からなる群から選択される、実施形態７～１３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１５．配列番号２２３９の配列に対する６４位でのＣの挿入及びＡ８８Ｇの置換が、伸長ステムの非対称バルジエレメントを解消し、ｇＲＮＡ足場の伸長ステムの安定性を増強する、実施形態１４に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１６．Ｕ１１Ｃ、Ｕ２４Ｃ、及びＡ９５Ｇの置換が、ｇＲＮＡ足場の三重鎖領域の安定性を増加させる、実施形態１４に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１７．Ａ２９Ｃの置換が、シュードノットステムの安定性を増加させる、実施形態１４に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１８．ｇＲＮＡ足場が、伸長ステムにおいて１つ以上の異種ＲＮＡ配列を含む、実施形態１又は実施形態２に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態１９．異種ＲＮＡが、ＭＳ２ヘアピン、Ｑβヘアピン、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘヘアピン、及びＰＰ７ステムループ、又はそれらの配列バリアントからなる群から選択される、実施形態１８に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態２０．異種ＲＮＡ配列が、ｇＲＮＡの安定性を増加させる、実施形態１８又は実施形態１９に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態２１．異種ＲＮＡが、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は小分子に結合することができる、実施形態１８又は実施形態１９に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態２２．ｇＲＮＡ足場が、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）又はその一部を含む、実施形態１８～２１のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態２３．ＲＲＥ又はその一部が、配列ＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡ（配列番号１２８０）を有するＲＲＥのステムＩＩＢ、配列ＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧ（配列番号１２８２）を有するＲＲＥのステムＩＩ－Ｖ、配列ＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣ（配列番号１２８１）を有するＲＲＥのステムＩＩ、配列ＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣ（配列番号１２８４）を有するステムＩＩＢのＲｅｖ結合エレメント（ＲＢＥ）、及び配列ＡＧＧＡＧＣＵＵＵＧＵＵＣＣＵＵＧＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＡＡＡＧＡＵＡＣＣＵＡＡＡＧＧＡＵＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＵ（配列番号１２８３）を有する全長ＲＲＥからなる群から選択される、実施形態２２に記載のｇＲＮＡ足場。
実施形態２４．ｇＲＮＡ足場が、１つ以上のチミン（Ｔ）を含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態２５．実施形態１～２４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ足場と、ｇＲＮＡ足場の３’末端の、標的核酸配列に相補的である標的化配列と、を含む、ｇＲＮＡ。
実施形態２６．標的化配列が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドを有する、実施形態２５に記載のｇＲＮＡ。
実施形態２７．標的化配列が、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、実施形態２６に記載のｇＲＮＡ。
実施形態２８．ｇＲＮＡが、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
実施形態２９．操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質であって、
ａ．ＱＰＡＳＫＫＩＤＱＮＫＬＫＰＥＭＤＥＫＧＮＬＴＴＡＧＦＡＣＳＱＣＧＱＰＬＦＶＹＫＬＥＱＶＳＥＫＧＫＡＹＴＮＹＦＧＲＣＮＶＡＥＨＥＫＬＩＬＬＡＱＬＫＰＥＫＤＳＤＥＡＶＴＹＳＬＧＫＦＧＱ（配列番号２３３５）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＮＴＳＢドメインと、
ｂ．ＲＡＬＤＦＹＳＩＨＶＴＫＥＳＴＨＰＶＫＰＬＡＱＩＡＧＮＲＹＡＳＧＰＶＧＫＡＬＳＤＡＣＭＧＴＩＡＳＦＬＳＫＹＱＤＩＩＩＥＨＱＫＶＶＫＧＮＱＫＲＬＥＳＬＲＥＬＡＧＫＥＮＬＥＹＰＳＶＴＬＰＰＱＰＨＴＫＥＧＶＤＡＹＮＥＶＩＡＲＶＲＭＷＶＮＬＮＬＷＱＫＬＫＬＳＲＤＤＡＫＰＬＬＲＬＫＧＦＰＳＦ（配列番号２３３６）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩ－ＩＩドメインと、
ｃ．ＰＬＶＥＲＱＡＮＥＶＤＷＷＤＭＶＣＮＶＫＫＬＩＮＥＫＫＥＤＧＫＶＦＷＱＮＬＡＧＹＫＲＱＥＡＬＲＰＹＬＳＳＥＥＤＲＫＫＧＫＫＦＡＲＹＱＬＧＤＬＬＬＨＬＥＫＫＨＧＥＤＷＧＫＶＹＤＥＡＷＥＲＩＤＫＫＶＥＧＬＳＫＨＩＫＬＥＥＥＲＲＳＥＤＡＱＳＫＡＡＬＴＤＷＬＲＡＫＡＳＦＶＩＥＧＬＫＥＡＤＫＤＥＦＣＲＣＥＬＫＬＱＫＷＹＧＤＬＲＧＫＰＦＡＩＥＡＥ（配列番号２３５１）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩＩドメインと、
ｄ．ＳＳＮＩＫＰＭＮＬＩＧＶＤＲＧＥＮＩＰＡＶＩＡＬＴＤＰＥＧＣＰＬＳＲＦＫＤＳＬＧＮＰＴＨＩＬＲＩＧＥＳＹＫＥＫＱＲＴＩＱＡＫＫＥＶＥＱＲＲＡＧＧＹＳＲＫＹＡＳＫＡＫＮＬＡＤＤＭＶＲＮＴＡＲＤＬＬＹＹＡＶＴＱＤＡＭＬＩＦＥＮＬＳＲＧＦＧＲＱＧＫＲＴＦＭＡＥＲＱＹＴＲＭＥＤＷＬＴＡＫＬＡＹＥＧＬＰＳＫＴＹＬＳＫＴＬＡＱＹＴＳＫＴＣ（配列番号２３５２）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＲｕｖＣ－Ｉドメインと、を含む、操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３０．ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＱＥＩＫＲＩＮＫＩＲＲＲＬＶＫＤＳＮＴＫＫＡＧＫＴＧＰＭＫＴＬＬＶＲＶＭＴＰＤＬＲＥＲＬＥＮＬＲＫＫＰＥＮＩＰＱ（配列番号２３４２）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＯＢＤ－Ｉドメインを含む、実施形態２９に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３１．ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＮＳＩＬＤＩＳＧＦＳＫＱＹＮＣＡＦＩＷＱＫＤＧＶＫＫＬＮＬＹＬＩＩＮＹＦＫＧＧＫＬＲＦＫＫＩＫＰＥＡＦＥＡＮＲＦＹＴＶＩＮＫＫＳＧＥＩＶＰＭＥＶＮＦＮＦＤＤＰＮＬＩＩＬＰＬＡＦＧＫＲＱＧＲＥＦＩＷＮＤＬＬＳＬＥＴＧＳＬＫＬＡＮＧＲＶＩＥＫＴＬＹＮＲＲＴＲＱＤＥＰＡＬＦＶＡＬＴＦＥＲＲＥＶＬＤ（配列番号２３４７）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＯＢＤ－ＩＩドメインを含む、実施形態２９又は実施形態３０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３２．ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＰＩＳＮＴＳＲＡＮＬＮＫＬＬＴＤＹＴＥＭＫＫＡＩＬＨＶＹＷＥＥＦＱＫＤＰＶＧＬＭＳＲＶＡ（配列番号２３４３）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩ－Ｉドメインを含む、実施形態２９～３１のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３３．ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＳＮＣＧＦＴＩＴＳＡＤＹＤＲＶＬＥＫＬＫＫＴＡＴＧＷＭＴＴＩＮＧＫＥＬＫＶＥＧＱＩＴＹＹＮＲＹＫＲＱＮＶＶＫＤＬＳＶＥＬＤＲＬＳＥＥＳＶＮＮＤＩＳＳＷＴＫＧＲＳＧＥＡＬＳＬＬＫＫＲＦＳＨＲＰＶＱＥＫＦＶＣＬＮＣＧＦＥＴＨ（配列番号２３４９）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＴＳＬドメインを含む、実施形態２９～３２のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３４．ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＡＤＥＱＡＡＬＮＩＡＲＳＷＬＦＬＲＳＱＥＹＫＫＹＱＴＮＫＴＴＧＮＴＤＫＲＡＦＶＥＴＷＱＳＦＹＲＫＫＬＫＥＶＷＫＰＡＶ（配列番号２３５０）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＲｕｖＣ－ＩＩドメインを含む、実施形態２９～３３のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３５．配列番号４１６の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態３４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３６．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、１つ以上のドメインに少なくとも１つの改変を含む、実施形態２９～３５のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３７．少なくとも１つの改変が、
ａ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、
ｂ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸欠失、
ｃ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸挿入、又は
ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせ、を含む、実施形態３６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３８．配列番号２３３５に対して、Ｐ２、Ｓ４、Ｑ９、Ｅ１５、Ｇ２０、Ｇ３３、Ｌ４１、Ｙ５１、Ｆ５５、Ｌ６８、Ａ７０、Ｅ７５、Ｋ８８、及びＧ９０からなる群から選択されるＮＴＳＢドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、実施形態３６又は実施形態３７に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態３９．ＮＴＳＢドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号２３３５に対する、２位でのＧの挿入、４位でのＩの挿入、４位でのＬの挿入、Ｑ９Ｐ、Ｅ１５Ｓ、Ｇ２０Ｄ、３０位でのＳの欠失、Ｇ３３Ｔ、Ｌ４１Ａ、Ｙ５１Ｔ、Ｆ５５Ｖ、Ｌ６８Ｄ、Ｌ６８Ｅ、Ｌ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ａ７０Ｓ、Ｅ７５Ａ、Ｅ７５Ｄ、Ｅ７５Ｐ、Ｋ８８Ｑ、及びＧ９０Ｑからなる群から選択される、実施形態３８に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４０．配列番号２３３６に対して、Ｉ２４、Ａ２５、Ｙ２９Ｇ３２、Ｇ４４、Ｓ４８、Ｓ５１、Ｑ５４、Ｉ５６、Ｖ６３、Ｓ７３、Ｌ７４、Ｋ９７、Ｖ１００、Ｍ１１２、Ｌ１１６、Ｇ１３７、Ｆ１３８、及びＳ１４０からなる群から選択されるヘリックスＩ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、実施形態３６～３９のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４１．ヘリックスＩ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号２３３６に対する、２４位でのＴの挿入、２５位でのＣの挿入、Ｙ２９Ｆ、Ｇ３２Ｙ、Ｇ３２Ｎ、Ｇ３２Ｈ、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ３２Ａ、Ｇ３２Ｖ、３２位でのＧの欠失、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ４４Ｌ、Ｇ４４Ｈ、Ｓ４８Ｈ、Ｓ４８Ｔ、Ｓ５１Ｔ、Ｑ５４Ｈ、Ｉ５６Ｔ、Ｖ６３Ｔ、Ｓ７３Ｈ、Ｌ７４Ｙ、Ｋ９７Ｇ、Ｋ９７Ｓ、Ｋ９７Ｄ、Ｋ９７Ｅ、Ｖ１００Ｌ、Ｍ１１２Ｔ、Ｍ１１２Ｗ、Ｍ１１２Ｒ、Ｍ１１２Ｋ、Ｌ１１６Ｋ、Ｇ１３７Ｒ、Ｇ１３７Ｋ、Ｇ１３７Ｎ、１３８位でのＱの挿入、及びＳ１４０Ｑからなる群から選択される、実施形態４０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４２．配列番号２３５１に対して、Ｌ２、Ｖ３、Ｅ４、Ｒ５、Ｑ６、Ａ７、Ｅ９、Ｖ１０、Ｄ１１、Ｗ１２、Ｗ１３、Ｄ１４、Ｍ１５、Ｖ１６、Ｃ１７、Ｎ１８、Ｖ１９、Ｋ２０、Ｌ２２、Ｉ２３、Ｅ２５、Ｋ２６、Ｋ３１、Ｑ３５、Ｌ３７、Ａ３８、Ｋ４１、Ｒ ４２、Ｑ４３、Ｅ４４、Ｌ４６、Ｋ５７、Ｙ６５、Ｇ６８、Ｌ７０、Ｌ７１、Ｌ７２、Ｅ７５、Ｇ７９、Ｄ８１、Ｗ８２、Ｋ８４、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｄ８７、Ｉ９３、Ｋ９５、Ｋ９６、Ｅ９８、Ｌ１００、Ｋ１０２、Ｉ１０４、Ｋ１０５、Ｅ１０９、Ｒ１１０、Ｄ１１４、Ｋ１１８、Ａ１２０、Ｌ１２１、Ｗ１２４、Ｌ１２５、Ｒ１２６、Ａ１２７、Ａ１２９、Ｉ１３３、Ｅ１３４、Ｇ１３５、Ｌ１３６、Ｅ１３８、Ｄ１４０、Ｋ１４１、Ｄ１４２、Ｅ１４３、Ｆ１４４、Ｃ１４５、Ｃ１４７、Ｅ１４８、Ｌ１４９、Ｋ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｋ１５３、Ｌ１５８、Ｅ１６６、及びＡ１６７からなる群から選択されるヘリックスＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、実施形態３６～４１のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４３．ヘリックスＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号２３５１に対する、２位でのＡの挿入、２位でのＨの挿入、２位でのＬの欠失、及び３位でのＶの欠失、Ｖ３Ｅ、Ｖ３Ｑ、Ｖ３Ｆ、３位でのＶの欠失、３位でのＤの挿入、Ｖ３Ｐ、Ｅ４Ｐ、４位でのＥの欠失、Ｅ４Ｄ、Ｅ４Ｌ、Ｅ４Ｒ、Ｒ５Ｎ、Ｑ６Ｖ、６位でのＱの挿入、７位でのＧの挿入、９位でのＨの挿入、９位でのＡの挿入、ＶＤ１０、０位でのＴ１の挿入、１０位でのＶの欠失、１０位でのＦの挿入、１１位でのＤの挿入、１１位でのＤの欠失、Ｄ１１Ｓ、１２位でのＷの欠失、Ｗ１２Ｔ、Ｗ１２Ｈ、１２位でのＰの挿入、１３位でのＱの挿入、１２位でのＧの挿入、１３位でのＲの挿入、Ｗ１３Ｐ、Ｗ１３Ｄ、１３位でのＤの挿入、Ｗ１３Ｌ、１４位でのＰの挿入、１４位でのＤの挿入、１４位でのＤの欠失、及び１５位でのＭの欠失、１５位でのＭの欠失、１６位でのＴの挿入、１７位でのＰの挿入、Ｎ１８Ｉ、Ｖ１９Ｎ、Ｖ１９Ｈ、Ｋ２０Ｄ、Ｌ２２Ｄ、Ｉ２３Ｓ、Ｅ２５Ｃ、Ｅ２５Ｐ、２５位でのＧの挿入、Ｋ２６Ｔ、Ｋ２７Ｅ、Ｋ３１Ｌ、Ｋ３１Ｙ、Ｑ３５Ｄ、Ｑ３５Ｐ、３７位でのＳの挿入、３７位でのＬの欠失、及び３８位でのＡの欠失、Ｋ４１Ｌ、４２位でのＲの挿入、４３位でのＱの欠失、及び４４位でのＥの欠失、Ｌ４６Ｎ、Ｋ５７Ｑ、Ｙ６５Ｔ、Ｇ６８Ｍ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ７１Ｃ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｗ、Ｌ７２Ｙ、Ｅ７５Ｆ、Ｅ７５Ｌ、Ｅ７５Ｙ、Ｇ７９Ｐ、７９位でのＥの挿入、８１位でのＴの挿入、８１位でのＲの挿入、８１位でのＷの挿入、８１位でのＹの挿入、８２位でのＷの挿入、８２位でのＹの挿入、Ｗ８２Ｇ、Ｗ８２Ｒ、Ｋ８４Ｄ、Ｋ８４Ｈ、Ｋ８４Ｐ、Ｋ８４Ｔ、Ｖ８５Ｌ、Ｖ８５Ａ、８５位でのＬの挿入、Ｙ８６Ｃ、Ｄ８７Ｇ、Ｄ８７Ｍ、Ｄ８７Ｐ、Ｉ９３Ｃ、Ｋ９５Ｔ、Ｋ９６Ｒ、Ｅ９８Ｇ、Ｌ１００Ａ、Ｋ１０２Ｈ、Ｉ１０４Ｔ、Ｉ１０４Ｓ、Ｉ１０４Ｑ、Ｋ１０５Ｄ、１０９位でのＫの挿入、Ｅ１０９Ｌ、Ｒ１１０Ｄ、１１０位でのＲの欠失、Ｄ１１４Ｅ、１１４位でのＤの挿入、Ｋ１１８Ｐ、Ａ１２０Ｒ、Ｌ１２１Ｔ、Ｗ１２４Ｌ、Ｌ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｄ、Ａ１２７Ｅ、Ａ１２７Ｌ、Ａ１２９Ｔ、Ａ１２９Ｋ、Ｉ１３３Ｅ、１３３位でのＣの挿入、１３４位でのＳの挿入、１３４位でのＧの挿入、１３５位でのＲの挿入、Ｇ１３５Ｐ、Ｌ１３６Ｋ、Ｌ１３６Ｄ、Ｌ１３６Ｓ、Ｌ１３６Ｈ、１３８位でのＥの欠失、Ｄ１４０Ｒ、１４０位でのＤの挿入、１４１位でのＰの挿入、１４２位でのＤの挿入、１４３＋位でのＥの欠失、１４４位でのＦの欠失、１４３位でのＱの挿入、Ｆ１４４Ｋ、１４４位でのＦの欠失、１４４位でのＦの欠失、及び１４５位でのＣの欠失、Ｃ１４５Ｒ、１４５位でのＧの挿入、Ｃ１４５Ｋ、Ｃ１４７Ｄ、１４８位でのＶの挿入、Ｅ１４８Ｄ、１４９位でのＨの挿入、Ｌ１４９Ｒ、Ｋ１５０Ｒ、Ｌ１５１Ｈ、Ｑ１５２Ｃ、Ｋ１５３Ｐ、Ｌ１５８Ｓ、Ｅ１６６Ｌ、及び１６７位でのＦの挿入からなる群から選択される、実施形態４２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４４．配列番号２３５２に対して、Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択されるＲｕｖＣ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、実施形態３６～４３のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４５．ＲｕｖＣ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号２３５１に対する、４位でのＩの挿入、５位でのＳの挿入、６位でのＴの挿入、６位でのＮの挿入、７位でのＲの挿入、７位でのＫの挿入、８位でのＨの挿入、８位でのＳの挿入、Ｖ１２Ｌ、Ｇ４９Ｗ、Ｇ４９Ｒ、Ｓ５１Ｒ、Ｓ５１Ｋ、Ｋ６２Ｓ、Ｋ６２Ｔ、Ｋ６２Ｅ、Ｖ６５Ａ、Ｋ８０Ｅ、Ｎ８３Ｇ、Ｒ９０Ｈ、Ｒ９０Ｇ、Ｍ１２５Ｓ、Ｍ１２５Ａ、Ｌ１３７Ｙ、１３７位でのＰの挿入、１４１位でのＬの欠失、Ｌ１４１Ｒ、Ｌ１４１Ｄ、１４２位でのＱの挿入、１４３位でのＲの挿入、１４３位でのＮの挿入、Ｅ１４４Ｎ、１４６位でのＰの挿入、Ｌ１４６Ｆ、Ｐ１４７Ａ、Ｋ１４９Ｑ、Ｔ１５０Ｖ、１５２位でのＲの挿入、Ｈ１５３の挿入、Ｔ１５５Ｑ、１５５位でのＨの挿入、１５５位でのＲの挿入、１５６位でのＬの挿入、１５６位でのＬの欠失、１５６位でのＷの挿入、１５７位でのＡの挿入、１５７位でのＦの挿入、Ａ１５７Ｓ、Ｑ１５８Ｋ、１５９位でのＹの欠失、Ｔ１６０Ｙ、Ｔ１６０Ｆ、１６１位でのＩの挿入、Ｓ１６１Ｐ、Ｔ１６３Ｐ、１６３位でのＮの挿入、Ｃ１６４Ｋ、及びＣ１６４Ｍからなる群から選択される、実施形態４４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４６．配列番号２３４２に対して、Ｉ３、Ｋ４、Ｒ５、Ｉ６、Ｎ７、Ｋ８、Ｋ１５、Ｄ１６、Ｎ１８、Ｐ２７、Ｍ２８、Ｖ３３、Ｒ３４、Ｍ３６、Ｒ４１、Ｌ４７、Ｒ４８、Ｅ５２、Ｐ５５、及びＱ５６からなる群から選択されるＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、実施形態３６～４５のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４７．ＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号２３４２に対する、３位でのＧの挿入、Ｉ３Ｇ、Ｉ３Ｅ、４位でのＧの挿入、Ｋ４Ｇ、Ｋ４Ｐ、Ｋ４Ｓ、Ｋ４Ｗ、Ｋ４Ｗ、Ｒ５Ｐ、５位でのＰの挿入、５位でのＧの挿入、Ｒ５Ｓ、５位でのＳの挿入、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｐ、Ｒ５Ｇ、Ｒ５Ｌ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｌ、６位でのＧの挿入、Ｎ７Ｑ、Ｎ７Ｌ、Ｎ７Ｓ、Ｋ８Ｇ、Ｋ１５Ｆ、Ｄ１６Ｗ、１６位でのＦの挿入、Ｆ１８の挿入、２７位でのＰの挿入、Ｍ２８Ｐ、Ｍ２８Ｈ、Ｖ３３Ｔ、Ｒ３４Ｐ、Ｍ３６Ｙ、Ｒ４１Ｐ、Ｌ４７Ｐ、４８位でのＰの挿入、Ｅ５２Ｐ、５５位でのＰの挿入、５５位でのＰの欠失、及び欠失５６位でのＱの欠失、Ｑ５６Ｓ、Ｑ５６Ｐ、５６位でのＤの挿入、５６位でのＴの挿入、及びＱ５６Ｐからなる群から選択される、実施形態４６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４８．配列番号２３４７に対して、Ｓ２、Ｉ３、Ｌ４、Ｋ１１、Ｖ２４、Ｋ３７、Ｒ４２、Ａ５３、Ｔ５８、Ｋ６３、Ｍ７０、Ｉ８２、Ｑ９２、Ｇ９３、Ｋ１１０、Ｌ１２１、Ｒ１２４、Ｒ１４１、Ｅ１４３、Ｖ１４４、及びＬ１４５からなる群から選択されるＯＢＤ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、実施形態３６～４７のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態４９．ＯＢＤ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号２３４２に対する、２位でのＳの欠失、Ｉ３Ｒ、Ｉ３Ｋ、３位でのＩの欠失、及びＬ４の欠失、４位でのＬの欠失、Ｋ１１Ｔ、２４位でのＰの挿入、Ｋ３７Ｇ、Ｒ４２Ｅ、５３位でのＳの挿入、５８位でのＲの挿入、６３位でのＫの欠失、Ｍ７０Ｔ、Ｉ８２Ｔ、Ｑ９２Ｉ、Ｑ９２Ｆ、Ｑ９２Ｖ、Ｑ９２Ａ、９３位でのＡの挿入、Ｋ１１０Ｑ、Ｒ１１５Ｑ、Ｌ１２１Ｔ、１２４位でのＡの挿入、１４１位でのＲの挿入、１４３位でのＤの挿入、１４３位でのＡの挿入、１４４位でのＷの挿入、及び１４５位でのＡの挿入からなる群から選択される、実施形態４８に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５０．配列番号２３４９に対して、Ｓ１、Ｎ２、Ｃ３、Ｇ４、Ｆ５、Ｉ７、Ｋ１８、Ｖ５８、Ｓ６７、Ｔ７６、Ｇ７８、Ｓ８０、Ｇ８１、Ｅ８２、Ｓ８５、Ｖ９６、及びＥ９８からなる群から選択されるＴＳＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、実施形態３６～４９のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５１．ＯＢＤ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での１つ以上の改変が、配列番号２３４９に対する、１位でのＭの挿入、２位でのＮの欠失、２位でのＶの挿入、Ｃ３Ｓ、４位でのＧの挿入、４位でのＷの挿入、Ｆ５Ｐ、７位でのＷの挿入、Ｋ１８Ｇ、Ｖ５８Ｄ、６７位でのＡの挿入、Ｔ７６Ｅ、Ｔ７６Ｄ、Ｔ７６Ｎ、Ｇ７８Ｄ、８０位でのＳの欠失、８１位でのＧの欠失、８２位でのＥの挿入、８２位でのＮの挿入、Ｓ８５Ｉ、Ｖ９６Ｃ、Ｖ９６Ｔ、及びＥ９８Ｄからなる群から選択される、実施形態５０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５２．配列番号２と比較して改善された特徴を示し、改善された特徴が、ｇＲＮＡに対する結合親和性の増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、標的核酸の編集においてより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的核酸の巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、標的核酸の切断に対する編集特異性の改善、オフターゲット編集又は標的核酸の切断の減少、編集され得る真核生物ゲノムの割合の増加、ヌクレアーゼの活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、ＤＮＡの非標的鎖の結合の増加、タンパク質安定性の改善、タンパク質： ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の安定性の増加、並びに改善された融合体特徴を含む、実施形態２９～５１のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５３．改善された特徴が、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列での切断活性の増加を含む、実施形態５２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５４．改善された特徴が、配列番号４１６の配列の切断活性と比較して、ＡＴＣ又はＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列での切断活性の増加を含む、実施形態５３に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５５．改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号４１６の配列のスコアと比較して、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、実施形態５４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５６．改善された特徴が、配列番号４１６の配列と比較して、ＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列での切断活性の増加を含む、実施形態５４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５７．改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号４１６の配列のスコアと比較して、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、若しくは少なくとも約６、又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、実施形態５６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５８．改善された特徴が、配列番号４１６の配列と比較して、ＴＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列での切断活性の増加を含む、実施形態５３に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態５９．改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号４１６の配列と比較して、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、若しくは少なくとも約６、又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、実施形態５８に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６０．改善された特徴が、配列番号４１６の配列と比較して、標的核酸配列の切断に対する特異性の増加を含む、実施形態５２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６１．増加した特異性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号４１６の配列と比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、若しくは少なくとも約６、又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、実施形態６０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６２．改善された特徴が、標的核酸配列のオフターゲット切断の減少を含む、実施形態５２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６３．クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、表３に示される配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有する、実施形態２９～６２のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６４．表３に示される配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１からなる群から選択される配列を含む、実施形態２９～６２のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６５．１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、実施形態２９～６４のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６６．１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３５２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３５３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３５４）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３５５）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３５６）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３５７）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３５８）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３５９）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号３６０）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３６１）、ＤＲＬＲＲ（配列番号３６２）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３６３）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３６４）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３６５）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３６６）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３６７）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３６８）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３６９）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３７０）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３７１）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３７２）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３７３）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３７４）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３７５）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３７６）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３７７）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３７８）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３７９）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３８０）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３８１）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３８２）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３８３）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３８４）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３８５）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３８６）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３８７）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３８９）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号６３）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号６４）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号６５）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号６６）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号６７）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号６８）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号７０）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号７１）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号７２）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号７３）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７４）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７５）からなる配列の群から選択され、任意選択的に、１つ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドを用いて、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質又は隣接するＮＬＳに連結され、リンカーペプチドが、ＳＲ、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号１０２３）、（ＧＳ）ｎ（配列番号１０２４）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３９９）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４００）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０１）、ＧＧＳＧ（配列番号４０２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号４０３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号４０４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号４０５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号４０６）、ＧＳＳＳＧ（配列番号４０７）、ＧＰＧＰ（配列番号４０８）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号４０９）、ＰＰＰＧ（配列番号２４）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号４１０）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号２６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１０２５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号２７）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される、実施形態６５に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６７．１つ以上のＮＬＳが、タンパク質のＣ末端又はその近くに位置する、実施形態６５又は実施形態６６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６８．１つ以上のＮＬＳが、タンパク質のＮ末端又はその近くに位置する、実施形態６５又は実施形態６６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態６９．少なくとも２つのＮＬＳを含み、少なくとも２つのＮＬＳが、タンパク質のＮ末端又はその近く及びＣ末端又はその近くに位置する、実施形態６５又は実施形態６６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態７０．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ｇＲＮＡとリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、実施形態２９～６９のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態７１．ＲＮＰが、配列番号１～３のうちのいずれか１つの参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特徴を示す、実施形態７０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態７２．改善された特徴が、ガイド核酸（ｇＲＮＡ）に対する結合親和性の増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、標的核酸の編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、若しくはＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、標的核酸の巻き戻しの増加、編集活性の増加、編集効率の増加、標的核酸の編集特異性の増加、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、標的核酸のオフターゲット切断の減少、非標的核酸鎖の結合の増加、及びタンパク質： ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の増加からなる群から選択される、実施形態７１に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態７３．ＲＮＰの改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍増加している、実施形態７１又は実施形態７２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態７４．ＲＮＰの改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１，０００倍、又は少なくとも約１０，０００倍増加している、実施形態７１又は実施形態７２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態７５．ＲＮＰの改善された特徴が、配列番号２の参照タンパク質、及び配列番号４又は５を含むｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、編集効率の１．１～１００倍の改善を含む、実施形態７１～７４のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態７６．ｇＲＮＡ及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む遺伝子編集ペアであって、ペアが、
ａ．実施形態２５～２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡと、
ｂ．実施形態２９～７５のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、を含む、遺伝子編集ペア。
実施形態７７．ｇＲＮＡ及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、実施形態７６に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態７８．ｇＲＮＡ及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として一緒に会合している、実施形態７６又は実施形態７７に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態７９．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＰが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５の配列を含むｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特徴を示す、実施形態７７又は実施形態７８に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８０．改善された特徴が、ｇＲＮＡに対するクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の結合親和性の増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、標的核酸の編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の増加、標的核酸の巻き戻しの増加、編集活性の増加、編集効率の増加、標的核酸の編集特異性の増加、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、標的核酸のオフターゲット切断の減少、非標的核酸鎖の結合の増加、タンパク質： ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の増加、及び融合体特徴の増加からなる群のうちの１つ以上から選択される、実施形態７９に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８１．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びｇＲＮＡのＲＮＰの改善された特徴が、同等のインビトロアッセイシステムにおいて、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５の配列を含むｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上増加している、実施形態７９又は実施形態８０に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８２．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の改善された特徴が、同等のインビトロアッセイシステムにおいて、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５の配列を含むｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上増加している、実施形態７９又は実施形態８０に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８３．ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのうちのいずれか１つが、細胞アッセイシステムにおいてｇＲＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びｇＲＮＡを含むＲＮＰが、同等のアッセイシステムにおいて、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質、及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、標的核酸におけるより高い編集効率及び／又は標的核酸配列の結合を示す、実施形態７７～８２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８４．ＰＡＭ配列が、ＴＴＣである、実施形態８３に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８５．ＰＡＭ配列が、ＡＴＣである、実施形態８３に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８６．ＰＡＭ配列が、ＣＴＣである、実施形態８３に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８７．ＰＡＭ配列が、ＧＴＣである、実施形態８３に記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８８．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及びｇＲＮＡを含むＲＮＰが、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合、配列番号１～３の参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰの結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍大きい、１つ以上のＰＡＭ配列に対する結合親和性の増加を示す、実施形態８３～８７のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態８９．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及びｇＲＮＡを含むＲＮＰが、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合、配列番号１～３の参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰの編集効率と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍高い編集効率の増加を示す、実施形態７７～８８のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態９０．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及びｇＲＮＡが、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合、配列番号１～３の参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％高い割合の切断コンピテントコンフォメーションを有するＲＮＰを形成することができる、実施形態７７～８９のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態９１．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及びｇＲＮＡを含むＲＮＰが、時限インビトロアッセイにおいて、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合の配列番号１～３の参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰと比較して、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は少なくとも約２０倍高い標的核酸の切断速度を示す、実施形態７７～９０のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態９２．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及びｇＲＮＡを含むＲＮＰが、時限インビトロアッセイにおいて、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合の配列番号１～３の参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰと比較して、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、又は少なくとも約１００倍高い標的核酸のより高い割合の編集を示す、実施形態７７～９１のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア。
実施形態９３．表７に示される配列番号４４～６２及び１２３２～１２３５からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を有する配列を含む、触媒的に不活性なクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態９４．表７に示される配列番号４４～６２及び１２３２～１２３５からなる群から選択される配列を含む、触媒的に不活性なクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態９５．触媒的に不活性なクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び実施形態２５～２８のいずれか１つ記載のｇＲＮＡのＲＮＰが、標的核酸に結合する能力を保持する、実施形態９３又は実施形態９４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態９６．実施形態１～２４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ足場又は実施形態２５～２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡをコードする配列を含む、核酸。
実施形態９７．実施形態２９～７５のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を含む、核酸。
実施形態９８．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態９７に記載の核酸。
実施形態９９．実施形態２５～２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ、実施形態２９～７５のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、又は実施形態９６～９８のいずれか１つに記載の核酸を含む、ベクター。
実施形態１００．ベクターが、プロモーターを含む、実施形態９９に記載のベクター。
実施形態１０１．ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ＣａｓＸ送達粒子（ＸＤＰ）、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、及びＲＮＡベクターからなる群から選択される、実施形態９９又は実施形態１００に記載のベクター。
実施形態１０２．ベクターが、ＡＡＶベクターである、実施形態１０１に記載のベクター。
実施形態１０３．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される、実施形態１０２に記載のベクター。
実施形態１０４．ベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態１０１に記載のベクター。
実施形態１０５．ベクターが、ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分を含むＸＤＰである、実施形態１０１に記載のベクター。
実施形態１０６．ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分が、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｐ２Ｂペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、Ｐ２０ペプチド、及びプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される、実施形態１０５に記載のベクター。
実施形態１０７．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及びｇＲＮＡが、ＲＮＰにおいて一緒に会合している、実施形態１０５又は実施形態１０６に記載のベクター。
実施形態１０８．糖タンパク質トロピズム因子を含む、実施形態１０５～１０７のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１０９．糖タンパク質トロピズム因子が、標的細胞の細胞表面マーカーに対する結合親和性を有し、ＸＤＰの標的細胞への侵入を促進する、実施形態１０８に記載のベクター。
実施形態１１０．ドナー鋳型を更に含む、実施形態９９～１０９のいずれか１つに記載のベクター。
実施形態１１１．実施形態９９～１１０のいずれか１つに記載のベクターを含む、宿主細胞。
実施形態１１２．宿主細胞が、ベビーハムスター腎線維芽細胞（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＳＶ４０遺伝物質を有するＣＶ－１（サル）起源（ＣＯＳ）細胞、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は酵母細胞からなる群から選択される、実施形態１１１に記載の宿主細胞。
実施形態１１３．細胞における標的核酸を改変する方法であって、細胞の標的核酸を、ｉ）実施形態７６～９２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペア、ｉｉ）実施形態７６～９２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペアとドナー鋳型、ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の遺伝子編集ペアをコードする１つ以上の核酸、ｉｖ）（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の遺伝子編集ペアを含むＸＤＰ、又はｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合わせ、と接触させることを含み、標的核酸の接触が、標的核酸を改変する、方法。
実施形態１１４．標的を、標的核酸の異なる領域又は重複する領域に相補的な標的化配列を含む第１及び第２のｇＲＮＡ又は複数のｇＲＮＡを含む複数の遺伝子編集ペアと接触させることを含む、実施形態１１３に記載の方法。
実施形態１１５．標的を、標的核酸の異なる領域又は重複する領域に相補的な標的化配列を含む第１及び第２のｇＲＮＡ又は複数のｇＲＮＡを含む遺伝子編集ペアをコードする複数の核酸と接触させることを含む、実施形態１１３に記載の方法。
実施形態１１６．標的を、標的核酸の異なる領域又は重複する領域に相補的な標的化配列を含む第１及び第２のｇＲＮＡ又は複数のｇＲＮＡを含む遺伝子編集ペアを含む複数のＸＤＰと接触させることを含む、実施形態１１３に記載の方法。
実施形態１１７．接触させることが、標的核酸を遺伝子編集ペアと結合させることと、標的核酸に１つ以上の一本鎖切断を導入することと、を含み、改変することが、標的核酸に変異、挿入、又は欠失を導入することを含む、実施形態１１３に記載の方法。
実施形態１１８．接触させることが、標的核酸を結合させることと、標的核酸に１つ以上の二本鎖切断を導入することと、を含み、改変することが、標的核酸に変異、挿入、又は欠失を導入することを含む、実施形態１１３～１１６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１９．標的核酸をドナー鋳型核酸のヌクレオチド配列と接触させることを含み、ドナー鋳型が、標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１１３～１１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２０．ドナー鋳型が、ドナー鋳型の５’末端及び３’末端に相同アームを含む、実施形態１１９に記載の方法。
実施形態１２１．ドナー鋳型が、相同組換え修復によって切断部位で標的核酸に挿入される、実施形態１１９又は実施形態１２０に記載の方法。
実施形態１２２．ドナー鋳型が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又はマイクロホモロジー末端結合（ＭＭＥＪ）によって切断部位で標的核酸に挿入される、実施形態１２１に記載の方法。
実施形態１２３．細胞の改変が、インビトロで起こる、実施形態１１３～１２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２４．細胞の改変が、インビボで起こる、実施形態１１３～１２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２５．細胞が、真核細胞である、実施形態１１３～１２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２６．真核細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７．真核細胞が、ヒト細胞である、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２８．細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、生殖細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血幹細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、網膜細胞、がん細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植増殖心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、自己細胞、又は出生後幹細胞からなる群から選択される、実施形態１１３～１２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２９．細胞が、対象内にある、実施形態１２４～１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３０．改変が、遺伝子のアレルに変異を有する対象の細胞において起こり、変異が、対象において疾患又は障害を引き起こす、実施形態１２９に記載の方法。
実施形態１３１．改変が、変異を遺伝子の野生型アレルに変化させるか、又は機能的遺伝子産物の発現をもたらす、実施形態１３０に記載の方法。
実施形態１３２．改変が、対象において疾患又は障害を引き起こす遺伝子のアレルをノックダウン又はノックアウトする、実施形態１３０に記載の方法。
実施形態１３３．細胞が、対象に対して自己由来である、実施形態１２９～１３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３４．細胞が、対象に対して同種自己由来である、実施形態１２９～１３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３５．ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態１１３～１３４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３６．ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０である、実施形態１３５に記載の方法。
実施形態１３７．ベクターが、レンチウイルスベクターである、実施形態１１３に記載の方法。
実施形態１３８．ベクターが、治療有効用量を使用して、必要とする対象に投与される、実施形態１１３～１３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３９．対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、実施形態１３８に記載の方法。
実施形態１４０．対象が、ヒトである、実施形態１３８に記載の方法。
実施形態１４１．ベクターが、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４２．ベクターが、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１３８～１４０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４３．ベクターが、ＸＤＰである、実施形態１１３に記載の方法。
実施形態１４４．ＸＤＰが、治療有効用量を使用して、必要とする対象に投与される、実施形態１４３に記載の方法。
実施形態１４５．ＸＤＰが、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１４４に記載の方法。
実施形態１４６．ＸＤＰが、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で対象に投与される、実施形態１４３に記載の方法。
実施形態１４７．ベクターが、実質内、静脈内、動脈内、脳室内、大槽内、髄腔内、頭蓋内、及び腹腔内経路からなる群から選択される投与経路によって投与され、投与方法が、注射、輸血、又は移植である、実施形態１３８～１４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４８．ベクターが、治療有効用量のベクターを使用して、１回以上の連続用量を含む治療レジメンに従って対象に投与される、実施形態１４１～１４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４９．治療有効用量が、少なくとも２週間、又は少なくとも１ヶ月間、若しくは少なくとも２ヶ月間、若しくは少なくとも３ヶ月間、若しくは少なくとも４ヶ月間、若しくは少なくとも５ヶ月間、若しくは少なくとも６ヶ月間の期間にわたって、あるいは年１回、又は２年毎若しくは３年毎に１回、２回以上の用量として対象に投与される、実施形態１４８に記載の方法。
実施形態１５０．実施形態７６～９２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペアによって改変された標的核酸を含む、細胞。
実施形態１５１．実施形態１１３～１４９のいずれか１つに記載の方法によって編集された、細胞。
実施形態１５２．細胞が、原核細胞である、実施形態１５０又は１５１に記載の細胞。
実施形態１５３．細胞が、真核細胞である、実施形態１５０又は１５１に記載の細胞。
実施形態１５４．真核細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、実施形態１５３に記載の細胞。
実施形態１５５．真核細胞が、ヒト細胞である、実施形態１５３に記載の細胞。
実施形態１５６．実施形態２９～７５のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む、組成物。
実施形態１５７．実施形態２５～２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡを含む、実施形態１５６に記載の組成物。
実施形態１５８．タンパク質及びｇＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合している、実施形態１５７に記載の組成物。
実施形態１５９．ドナー鋳型核酸を含み、ドナー鋳型が、標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１５６～１５８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６０．緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、実施形態１５６～１５９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６１．実施形態１～２４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ足場、又は実施形態２５～２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡを含む、組成物。
実施形態１６２．実施形態２９～７５のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む、実施形態１６１に記載の組成物。
実施形態１６３．クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及びｇＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合している、実施形態１６２に記載の組成物。
実施形態１６４．ドナー鋳型核酸を含み、ドナー鋳型が、標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１６１～１６３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６５．緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、実施形態１６１～１６４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１６６．実施形態７６～９２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペアを含む、組成物。
実施形態１６７．ドナー鋳型核酸を含み、ドナー鋳型が、標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１６６に記載の組成物。
実施形態１６８．緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、実施形態１６６又は実施形態１６７に記載の組成物。
実施形態１６９．実施形態２９～７５のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び容器を含む、キット。
実施形態１７０．実施形態１～２４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ足場、又は実施形態２５～２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡを含む、実施形態１６９に記載のキット。
実施形態１７１．ドナー鋳型核酸を含み、ドナー鋳型が、標的核酸の標的核酸配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１６９又は実施形態１７０に記載のキット。
実施形態１７２．緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、実施形態１６９～１７１のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１７３．実施形態１～２４のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ足場、又は実施形態２５～２８のいずれか１つに記載のｇＲＮＡを含む、キット。
実施形態１７４．実施形態２９～７５のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む、実施形態１７３に記載のキット。
実施形態１７５．ドナー鋳型核酸を含み、ドナー鋳型が、標的核酸の標的核酸配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１７３又は実施形態１７４に記載のキット。
実施形態１７６．緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、実施形態１７３～１７５のいずれか１つに記載のキット。
実施形態１７７．実施形態７６～９２のいずれか１つに記載の遺伝子編集ペアを含む、キット。
実施形態１７８．ドナー鋳型核酸を含み、ドナー鋳型が、標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１７７に記載のキット。
実施形態１７９．緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、実施形態１７７又は実施形態１７８に記載のキット。
実施形態１８０．表３に列挙される配列のうちのいずれか１つを含む、操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
実施形態１８１．表２に列挙されるｇＲＮＡ足場バリアント配列のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡ。
実施形態１８２．表２の配列のｇＲＮＡ足場バリアントの１つ以上のウラシル（Ｕ）が、チミン（Ｔ）で置換されている、実施形態１８１に記載のｇＲＮＡ。
実施形態１８３．標的核酸に相補的な少なくとも１０～３０ヌクレオチドの標的化配列を含む、実施形態１８２に記載のｇＲＮＡ。
実施形態１８４．標的化配列が、２０ヌクレオチドを有する、実施形態１８３に記載のｇＲＮＡ。
実施形態１８５．標的化配列が、１９ヌクレオチドを有する、実施形態１８３に記載のｇＲＮＡ。
実施形態１８６．標的化配列が、１８ヌクレオチドを有する、実施形態１８３に記載のｇＲＮＡ。
実施形態１８７．標的化配列が、１７ヌクレオチドを有する、実施形態１８３に記載のｇＲＮＡ。
実施形態１８８．標的化配列が、１６ヌクレオチドを有する、実施形態１８３に記載のｇＲＮＡ。
実施形態１８９．標的化配列が、１５ヌクレオチドを有する、実施形態１８３に記載のｇＲＮＡ。
実施形態１９０．疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の、（ａ）実施形態２９～７５及び１８０のいずれか１つに記載の操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、（ｂ）実施形態２５～２８及び１８１～１８９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡと、を含む組成物を、対象に投与することを含む、方法。
実施形態１９１．疾患を有する対象の治療のための医薬品として使用するための、（ａ）実施形態２９～７５及び１８０のいずれか１つに記載の操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、（ｂ）実施形態２５～２８及び１８１～１８９のいずれか１つに記載のｇＲＮＡと、を含む、組成物。
以下の実施例は、単に例示的なものであり、本開示のいかなる態様をいかなる形でも限定することを意味するものではない。
実施例１：ＣａｓＸバリアント構築物の生成
ＣａｓＸ４８８構築物（表９の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ１１９構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ（配列番号２）をコードし、アミノ酸置換及び欠失を有するＣａｓＸ Ｓｔｘ２構築物に基づく）を、標準的なクローニング方法を使用して目的のプラスミド（ｐＳｔＸ）にクローニングした。ＣａｓＸ４９１構築物（表９の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ４８４構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、特定のアミノ酸の置換及び欠失を有し、ＮＬＳに融合され、ガイド配列及び非標的化配列に連結された、ＣａｓＸ Ｓｔｘ２構築物に基づく）を、標準的なクローニング方法を使用して目的のプラスミド（ｐＳｔＸ）にクローニングした。標準的なクローニング方法を使用して、構築物ＣａｓＸ １（ＣａｓＸ配列番号１）を目的のベクターにクローニングした。ＣａｓＸ４８８を構築するために、ＣａｓＸ １１９構築物ＤＮＡを、適切なユニバーサルプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ４９１を構築するために、コドン最適化ＣａｓＸ４８４構築物ＤＮＡを、適切なプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ １構築物を、適切なユニバーサルプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。各ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ カタログ番号Ａ－２０１－５００）からのゲル抽出によって精製した。次いで、製造業者のプロトコルに従って、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用して、対応する断片をつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ１において構築された産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換し、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しい構築を確認した。次いで、正しいクローンを、制限酵素クローニングを使用して、哺乳動物発現ベクターｐＳｔｘ３４にサブクローニングした。ｐＳｔｘ１におけるｐＳｔｘ３４骨格、並びにＣａｓＸ４８８及び４９１クローンを、それぞれＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した。消化した骨格及びそれぞれの挿入断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏカタログ番号Ａ－２０１－５００）からのゲル抽出によって精製した。次いで、製造業者のプロトコルに従ってＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）を使用して、きれいな骨格及びインサートを一緒にライゲーションした。ライゲーション産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換し、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しい構築を確認した。
ＣａｓＸ５１５（表９の配列）を構築するために、ＣａｓＸ４９１構築物ＤＮＡを、適切なプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ５２７（表９の配列）を構築するために、ＣａｓＸ４９１構築物ＤＮＡを、適切なプライマーを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲルからのゲル抽出によって精製した。ｐＳｔＸ骨格を、プラスミドｐＳｔｘ５６における２部位間のＤＮＡの２９３１塩基対断片を除去するために、ＸｂａＩ及びＳｐｅＩを使用して消化した。消化した骨格断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲルからのゲル抽出によって精製した。次いで、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用して、挿入断片及び骨格断片をつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ５６において構築された産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換し、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しい構築を確認した。ｐＳｔＸ３４は、タンパク質マーカー並びにピューロマイシン及びカルベニシリンの両方の選択マーカーのためのＥＦ－１αプロモーターを含む。ｐＳｔＸ５６は、タンパク質マーカー並びにピューロマイシン及びカナマイシンの両方の選択マーカーのためのＥＦ－１αプロモーターを含む。目的の遺伝子を標的化する標的化配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭの位置に基づいて設計した。標的配列及びこの配列の逆相補体からなる、一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Integrated DNA Technologies）としての標的配列ＤＮＡを注文した。これらの２つのオリゴを、一緒にアニールし、プラスミドのためのＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び適切な制限酵素を使用して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって、個々に又はバルクで、ｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、ＮＥＢ ＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的又は電気的にコンピテントな細胞に形質転換し、適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレートにプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｐｒｅｐスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しいライゲーションを確認した。
ＣａｓＸ５３５～５３７（表９の配列）を構築するために、ＣａｓＸ５１５構築物ＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、各構築物について２つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ５３５については、適切なプライマーを増幅に使用した。ＣａｓＸ５３６については、適切なプライマーを使用した。ＣａｓＸ５３７については、適切なプライマーを使用した。ＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲルからのゲル抽出によって精製した。ｐＳｔＸ骨格を、プラスミドｐＳｔｘ５６における２部位間のＤＮＡの２９３１塩基対断片を除去するために、ＸｂａＩ及びＳｐｅＩを使用して消化した。消化した骨格断片を、製造業者のプロトコルに従ってＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キットを使用して、１％アガロースゲルからのゲル抽出によって精製した。次いで、製造業者のプロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎアセンブリを使用して、挿入断片及び骨格断片をつなぎ合わせた。ｐＳｔｘ５６において構築された産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換し、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しい構築を確認した。ｐＳｔＸ３４は、タンパク質マーカー並びにピューロマイシン及びカルベニシリンの両方の選択マーカーのためのＥＦ－１αプロモーターを含む。ｐＳｔＸ５６は、タンパク質マーカー並びにピューロマイシン及びカルベニシリンの両方の選択マーカーのためのＥＦ－１αプロモーターを含む。目的の遺伝子を標的化する標的化配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭの位置に基づいて設計した。標的配列及びこの配列の逆相補体からなる、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Integrated DNA Technologies）としての標的配列ＤＮＡを注文した。これらの２つのオリゴを、一緒にアニールし、プラスミドのためのＴ４ ＤＮＡリガーゼ及び適切な制限酵素を使用して、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって、個々に又はバルクで、ｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、ＮＥＢ ＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉなどの化学的又は電気的にコンピテントな細胞に形質転換し、適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレートにプレーティングした。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｐｒｅｐスピンミニプレップキットを使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガー配列決定を使用して配列決定して、正しいライゲーションを確認した。
全てのその後のＣａｓＸバリアント、例えば、ＣａｓＸ５４４及びＣａｓＸ６６０～６６４、６６８、６７０、６７２、６７６、及び６７７を、変異特異的内部プライマー並びにユニバーサルフォワード及びリバースプライマー（設計された変異特異的プライマー並びに使用されたＣａｓＸ基本構築物がそれらの間の違いであった）を用いるＧｉｂｓｏｎアセンブリを使用して、上記と同じ方法論を使用してクローニングした。ＳａＣａｓ９及びＳｐｙＣａｓ９対照プラスミドを、ｐＳｔＸのタンパク質及びガイド領域をそれぞれのタンパク質及びガイドに交換して、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製した。ＳａＣａｓ９及びＳｐｙＣａｓ９の標的化配列は、文献から得たか、又は確立された方法に従って合理的に設計した。
ＣａｓＸ構築物の発現及び回収を、標準的な方法論を使用して実施し、以下のように要約する。
精製
凍結試料を、磁気撹拌しながら４℃で一晩解凍した。得られた溶解物の粘度を音波処理によって低下させ、ＮａｎｏＤｅＢＥＥ（ＢＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、２０，０００ＰＳＩで２回通してホモジナイズすることによって溶解を完了させた。溶解物を、５０，０００×ｇ、４℃で３０分間の遠心分離によって清澄化し、上清を回収した。清澄化した上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、ヘパリン６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に適用した。カラムを、５カラム体積（ＣＶ）のヘパリン緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄し、次いで、３ＣＶのヘパリン緩衝液Ｂ（ＮａＣｌ濃度を５００ｍＭに調整した緩衝液Ａ）で洗浄した。タンパク質を、１．７５ＣＶのヘパリン緩衝液Ｃ（ＮａＣｌ濃度を１Ｍに調整した緩衝液Ａ）で溶出した。溶出液を、ＦＰＬＣを使用して、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ）に適用した。カラムを、１０ ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄した。タンパク質を、２．５ｍＭデスチオビオチンを添加した１．６５ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液を使用して、カラムから溶出した。ＣａｓＸ含有画分をプールし、５０ｋＤａカットオフの遠心濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して４℃で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（Ｃｙｔｉｖａ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。カラムを、ＳＥＣ緩衝液（２５ｍＭ リン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ７．２５）で平衡化し、ＦＰＬＣによって操作した。適切な分子量で溶出したＣａｓＸ含有画分をプールし、５０ｋＤａカットオフ遠心濃縮器を使用して４℃で濃縮し、アリコートし、液体窒素中で急速凍結した後、－８０℃で保存した。
ＣａｓＸバリアント４８８：平均収量は、コロイドクーマシー染色によって評価して、９８．８％純度で、培養物１リットル当たり２．７ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。
ＣａｓＸバリアント４９１：平均収量は、コロイドクーマシー染色によって評価して、９９．４％純度で、培養物１リットル当たり１２．４ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。
ＣａｓＸバリアント５１５：平均収量は、コロイドクーマシー染色によって評価して、純度９０％で培養物１リットル当たり７．８ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。
ＣａｓＸバリアント５２６：平均収量は、９３％純度で、培養物１リットル当たり１３．７９ｍｇであった。純度は、コロイドクーマシー染色によって評価した。
ＣａｓＸバリアント６６８：平均収量は、９３％純度で、培養物１リットル当たり３．３２ｍｇであった。純度は、コロイドクーマシー染色によって評価した。
ＣａｓＸバリアント６７２：平均収量は、８８％純度で、培養物１リットル当たり６．５０ｍｇであった。純度は、コロイドクーマシー染色によって評価した。
ＣａｓＸバリアント６７６：平均収量は、９２％純度で、培養物１リットル当たり５．０５ｍｇであった。純度は、コロイドクーマシー染色によって評価した。
ＣａｓＸバリアント６７７：平均収量は、８１％純度で、培養物１リットル当たり２．９３ｍｇであった。純度は、コロイドクーマシー染色によって評価した。
実施例２：ＲＮＡガイドの生成
ＲＮＡシングルガイド及び標的化配列を生成するために、Ｑ５ポリメラーゼ、各骨格に対する鋳型プライマー、並びにＴ７プロモーター及び標的化配列を有する増幅プライマーを用いてＰＣＲを行うことによって、インビトロ転写のための鋳型を生成した。Ｔ７プロモーターに対するＤＮＡプライマー配列、ガイド及び標的化配列のためのガイド及び標的化配列を、以下の表１０に示す。ｓｇ１、ｓｇ２、ｓｇ３２、ｓｇ６４、ｓｇ１７４、及びｓｇ２３５は、それぞれ配列番号４、５、２１０４、２１０６、２２３８、及び２２９２に対応するが、但し、ｓｇ２、ｓｇ３２、及びｓｇ６４は、転写効率を増加させるために追加の５’Ｇで改変した（表１０の配列を表２と比較されたい）。７．３７標的化配列は、β２－ミクログロブリン（beta2-microglobulin、Ｂ２Ｍ）を標的化する。ＰＣＲ増幅後、鋳型をきれいにし、フェノール－クロロホルム－イソアミルアルコール抽出によって単離し、続いて、エタノール沈殿を行った。
インビトロ転写を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２ｍＭスペルミジン、２０ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＮＴＰ、０．５μＭ鋳型、及び１００μｇ／ｍＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有する緩衝液中で行った。反応物を、３７℃で一晩インキュベートした。１ｍＬの転写容量当たり２０単位のＤＮａｓｅ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｍ６１０１）を添加し、１時間インキュベートした。ＲＮＡ産物を、変性ＰＡＧＥによって精製し、エタノール沈殿し、１×リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。ｓｇＲＮＡをフォールディングするために、試料を、５分間７０℃に加熱し、次いで、室温に冷却した。反応物に最終濃度が１ｍＭになるようにＭｇＣｌ２を補充し、５分間５０℃に加熱し、次いで、室温に冷却した。最終ＲＮＡガイド産物を、－８０℃で保存した。
実施例３：ガイドＲＮＡに対する結合親和性の評価
精製された野生型及び改良型ＣａｓＸを、塩化マグネシウム並びに非特異的結合及び凝集を防止するためのヘパリンを含有する低塩緩衝液中で、３’側にＣｙ７．５部分を含有する合成シングルガイドＲＮＡとインキュベートする。ｓｇＲＮＡは、１０ｐＭの濃度で維持し、タンパク質は、別個の結合反応で、１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡に到達させた後、試料を、それぞれタンパク質及び核酸に結合するニトロセルロース膜及び正に荷電したナイロン膜を用いた真空マニホールド膜結合アッセイにかける。膜を画像化して、ガイドＲＮＡを同定し、結合ＲＮＡ対非結合ＲＮＡの割合を、各タンパク質濃度についてニトロセルロース膜対ナイロン膜上の蛍光量によって決定して、タンパク質－ｓｇＲＮＡ複合体の解離定数を計算する。実験はまた、これらの変異が野生型及び変異体タンパク質に対するガイドの親和性にも影響を及ぼすかどうかを判定するために、ｓｇＲＮＡの改良型バリアントを用いて実施される。本発明者らはまた、電気移動度シフトアッセイを実施して、膜結合アッセイと定性的に比較し、凝集ではなく可溶性結合が、タンパク質－ＲＮＡ会合への主要な寄与因子であることを確認する。
実施例４：標的ＤＮＡに対する結合親和性の評価
精製された野生型及び改良ＣａｓＸは、標的核酸に相補的な標的化配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体化する。ＲＮＰ複合体を、塩化マグネシウム並びに非特異的結合及び凝集を防止するためのヘパリンを含有する低塩緩衝液中で、ＰＡＭ及び標的鎖上の５’側にＣｙ７．５部分を有する適切な標的核酸配列を含有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。標的ＤＮＡは、１ｎＭの濃度で維持し、一方、ＲＮＰは、別個の結合反応で、１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡に到達させた後、試料を、未変性５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動して、結合及び非結合標的ＤＮＡを分離する。ゲルを画像化して、標的ＤＮＡの移動度シフトを同定し、結合対非結合ＤＮＡの割合を、各タンパク質濃度について計算して、ＲＮＰ－標的ＤＮＡ三元複合体の解離定数を決定する。
実施例５：インビトロでの差次的ＰＡＭ認識の評価。［図の番号にはＳＣＲＢ－０３８を使用］
１．参照バリアント及びＣａｓＸバリアントの比較
本質的に実施例８に記載されるように、インビトロ切断アッセイを、ｓｇ１７４．７．３７と複合体化したＣａｓＸ２、ＣａｓＸ１１９、及びＣａｓＸ４３８を使用して実施した。７．３７スペーサー及びＴＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＡＴＣ ＰＡＭのいずれかを有する蛍光標識されたｄｓＤＮＡ標的を使用した（配列は表１１）。０．２５、０．５、１、２、５、１０、３０、及び６０分の時点をとった。ゲルをＣｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、ＩＱＴＬ ８．２ソフトウェアを使用して定量化した。各標的上の各ＣａｓＸ： ｓｇＲＮＡ複合体について、非標的鎖切断の見かけの一次速度定数（ｋ切断－）を決定した。非ＴＴＣ ＰＡＭを有する標的についての速度定数を、ＴＴＣ ＰＡＭ標的と比較して、各ＰＡＭについての相対優先度が所与のタンパク質バリアントにおいて変化したかどうかを決定した。
全てのバリアントについて、ＴＴＣ標的が最も高い切断速度を支持し、続いてＡＴＣ標的、次いでＣＴＣ標的、最後にＧＴＣ標的であった（図１０Ａ～図１０Ｄ、表１２）。ＣａｓＸバリアント及びＮＴＣ ＰＡＭの各組み合わせについての切断速度ｋ切断を示す。全ての非ＮＴＣ ＰＡＭについて、そのバリアントのＴＴＣ速度と比較した相対切断速度を括弧内に示す。全ての非ＴＴＣ ＰＡＭは、切断速度の大幅な減少（全てについて＞１０倍）を示した。特定のバリアントについての所与の非ＴＴＣ ＰＡＭの切断速度とＴＴＣ ＰＡＭの切断速度との間の比は、全てのバリアントにわたって概して一貫したままであった。ＣＴＣ標的は、ＴＴＣ標的の３．５～４．３％の速さで切断を支持し、ＧＴＣ標的は、１．０～１．４％の速さで切断を支持し、ＡＴＣ標的は、６．５～８．３％の速さで切断を支持した。例外は４９１であり、ここでは、ＴＴＣ ＰＡＭでの切断速度が速すぎて正確な測定ができず、これは、ＴＴＣと非ＴＴＣ ＰＡＭとの間の見かけの差を人為的に減少させる。測定可能な範囲内に入るＧＴＣ、ＣＴＣ、及びＡＴＣ ＰＡＭに対する４９１の相対速度を比較すると、非ＴＴＣ ＰＡＭ間で比較した場合、他のバリアントのものと同等の比が得られ、これは、タンデムで増加する速度と一致する。全体として、バリアント間の差異は、様々なＮＴＣ ＰＡＭに対する相対優先度が変化していることを示唆するほど大きくはない。しかしながら、バリアントの基底切断速度がより高いため、ＡＴＣ又はＣＴＣ ＰＡＭを有する標的が１０分以内にほぼ完全に切断され、見かけのｋ切断は、ＴＴＣ ＰＡＭ上のＣａｓＸ２のｋ切断と同等か、又はそれよりも大きい（表１２）。この切断速度の増加は、ヒト細胞における有効なゲノム編集に必要な閾値を超えている可能性があり、これらのバリアントに対するＰＡＭの柔軟性が明らかに増加していることを説明する。
＊各々のＰＡＭ配列は太字である。ＴＳ－標的鎖。ＮＴＳ－非標的鎖。
２．単一ＣａｓＸバリアントを使用したＰＡＭ認識の比較
材料及び方法：７．３７スペーサー及びＴＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、ＡＴＣ、ＴＴＴ、ＣＴＴ、ＧＴＴ、又はＡＴＴ ＰＡＭのいずれかを有する蛍光標識されたｄｓＤＮＡ標的を使用した（配列は表１３）。５’アミノ改変を有するオリゴを注文し、標的鎖オリゴについてはＣｙ７．５ ＮＨＳエステルで標識し、非標的鎖オリゴについてはＣｙ５．５ ＮＨＳエステルで標識した。オリゴを１：１の比で１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で混合し、１０分間９５℃に加熱し、溶液を室温に冷却することによって、ｄｓＤＮＡ標的を形成した。
ＣａｓＸバリアント４９１を、ｓｇ１７４．７．３７と複合体化した。ガイドを、１×切断緩衝液で１．５μＭの最終濃度に希釈し、次いで、タンパク質を、１μＭの最終濃度に添加した。ＲＮＰを、３７°Ｃで１０分間インキュベートし、次いで、氷上に置いた。
切断アッセイは、ＲＮＰを切断緩衝液で２００ｎＭの最終濃度に希釈し、ｄｓＤＮＡ標的を１０ｎＭの最終濃度に添加することによって行った。０．２５、０．５、１、２、５、及び１０分の時点をとり、等量の９５％ホルムアミド及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによってクエンチした。切断産物を、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動することによって分離した。ゲルをＡｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、ＩＱＴＬ ８．２ソフトウェアを使用して定量化した。非標的鎖切断の見かけの一次速度定数（ｋ切断－）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して各標的について決定した。
結果：
様々なＰＡＭに対する４９１．１７４ ＲＮＰの相対切断速度を調べた。細胞における標的及び潜在的なオフターゲットの切断効率の予測を助けることに加えて、これらのデータにより、合成標的の切断速度を調整することが可能になる。自己標的化を可能にするために新しいプロトスペーサーをベクター内に加えることができる自己制限ＡＡＶベクターの場合、本発明者らは、ＰＡＭを変化させることによってエピソームの切断速度を上下に調節することができると推論した。
本発明者らは、ＰＡＭを除いて配列が同一である様々なｄｓＤＮＡ基質に対するＲＮＰの切断速度を試験した。この実験設定は、ＰＡＭ認識をスペーサー配列及びゲノムの状況から生じる効果を複雑にするのではなく、ＰＡＭ自体の効果の単離を可能にするはずである。全てのＮＴＣ及びＮＴＴ ＰＡＭを試験した。予想通り、ＲＮＰは、ＴＴＣ ＰＡＭを有する標的を最も迅速に切断し、第１の時点までに本質的に全てを生成物に変換した（図１１Ａ）。ＣＴＣは、およそ半分の速さで切断されたが、ＴＴＣの急速な切断により、より幅広い切断速度を捕捉するように最適化されたこれらのアッセイ条件下で、正確なｋ切断を決定することが困難になる（図１１Ａ、表１４）。ＧＴＣ標的は、ＮＴＣ ＰＡＭの中で最もゆっくりと切断され、切断速度はＴＴＣ標的よりもおよそ６倍遅かった。全てのＮＴＴ ＰＡＭは、全てのＮＴＣ ＰＡＭよりもゆっくりと切断され、ＴＴＴが最も効率的に切断され、ＧＴＴがそれに続いた（図１１Ｂ、表１４）。全てのＮＴＣ ＰＡＭと比較して低いＧＴＣの切断速度と比較した、全てのＮＴＴ ＰＡＭ間のＧＴＴ切断の相対的な効率は、個々のＰＡＭヌクレオチドの認識が状況依存的であり、ＰＡＭにおけるある位置でのヌクレオチド同一性が、他の位置での配列優先度に影響を及ぼすことを実証する。
ここで試験したＰＡＭ配列は、同じスペーサー配列で切断活性を依然として維持しながら、３桁にわたる切断速度を生じる。これらのデータは、所与の合成標的における切断速度が、関連するＰＡＭを変化させることによって容易に改変され得、自己切断活性の調節を可能にして、ＡＡＶエピソームの切断及び排除の前にゲノム標的の効率的な標的化を可能にすることを実証する。
＊各ｄｓＤＮＡ基質を生成するために使用したＤＮＡ配列を示す。各々のＰＡＭ配列は太字である。ＴＳ－標的鎖。ＮＴＳ－非標的鎖。

＊ＴＴＣ切断の速度は、このアッセイの分解能を超えるので、得られたｋ－切断は、下限として解釈されるべきである。
実施例６：二本鎖切断についてのヌクレアーゼ活性の評価
精製された野生型及び操作されたＣａｓＸバリアントは、固定されたＨＲＳ標的化配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体化する。ＲＮＰ複合体を、１００ｎＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を含む緩衝液に添加し、１０ｎＭの濃度で標的鎖又は非標的鎖のいずれかの５’側にＣｙ７．５標識を有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。反応物のアリコートを固定された時点で採取し、等量の５０ｍＭ ＥＤＴＡ及び９５％ホルムアミドの添加によってクエンチする。試料を、変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動して、切断されたＤＮＡ基質と切断されていないＤＮＡ基質とを分離する。結果を可視化し、野生型及び操作されたバリアントによる標的及び非標的鎖の切断速度を決定する。標的結合に対する変化と核酸分解反応自体の触媒速度との間をより明確に区別するために、タンパク質濃度を１０ｎＭ～１ｕＭの範囲にわたって滴定し、切断速度を各濃度で決定して、偽ミカエリス－メンテン適合を生成し、ｋｃａｔ＊及びＫＭ＊を決定する。ＫＭ＊の変化は変化した結合を示し、ｋｃａｔ＊の変化は変化した触媒を示す。
実施例７：ＰＡＳＳアッセイによる異なるＰＡＭ配列特異性のＣａｓＸタンパク質バリアントの同定。
ＣａｓＸタンパク質２（配列番号２）、４９１、５１５、５３３、５３５、６６８、及び６７２のＰＡＭ配列特異性を同定するために実験を実施した。これを達成するために、ＨＥＫ２９３細胞株であるＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１又はＰＡＳＳ＿Ｖ１．０２を、少なくとも２回の反復実験で、上記のＣａｓＸタンパク質で処理し、次世代配列決定（ＮＧＳ）を実施して、意図された標的部位で様々なスペーサーを使用して、編集の割合（％）を計算した。
材料及び方法：ＰＡＳＳシステムを使用してクローンタンパク質バリアントをアッセイするために、多重化プールアプローチをとった。簡潔には、２つのプールされたＨＥＫ２９３細胞株を生成し、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１及びＰＡＳＳ＿Ｖ１．０２と名付けた。プール内の各細胞は、特定の標的部位と対になったゲノムに組み込まれたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含んでいた。タンパク質発現構築物のトランスフェクション後、特定のスペーサーによる特定の標的での編集を、ＮＧＳによって定量化することができる。各ガイド－標的対は、ＣａｓＸ－ガイドＲＮＰ複合体の活性、特異性、及び標的化能に関するデータを提供するように設計された。
対のスペーサー－標的配列は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成され、等モルプールのオリゴヌクレオチドとして入手した。このプールを、ＰＣＲによって増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによってクローニングして、ｐ７７と名付けられたプラスミドの最終ライブラリを生成した。各プラスミドは、ＧＦＰ発現エレメントとともに、ｓｇＲＮＡ発現エレメント及び標的部位を含んでいた。ｓｇＲＮＡ発現エレメントは、ｇＲＮＡ足場１７４（配列番号２２３８）の転写を駆動するＵ６プロモーター、続いて、ガイド及びＣａｓＸバリアントのＲＮＰを意図された標的部位に標的化するスペーサー配列からなった。２５０個の可能な固有の、対のスペーサー－標的合成配列を設計及び合成した。次いで、レンチウイルスのプールを、製造業者の説明書に従ってＬｅｎｔｉＸ産生システム（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を使用して、このプラスミドライブラリから産生した。次いで、得られたウイルス調製物を、ｑＰＣＲによって定量化し、単一コピーの組み込みを生成するように、低い感染多重度で標準ＨＥＫ２９３細胞株に形質導入した。次いで、得られた細胞株を、蛍光活性化細胞選別（fluorescence-activated cell sorting、ＦＡＣＳ）によって精製して、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１又はＰＡＳＳ＿Ｖ１．０２の産生を完了した。次いで、細胞株を、６ウェルプレート形式で播種し、２連で、水で処理するか、又は２μｇのプラスミドｐ６７でトランスフェクトし、製造業者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって送達した。プラスミドｐ６７は、ＳＶ４０核局在化配列でタグ付けされたＣａｓＸタンパク質の発現を駆動するＥＦ－１αプロモーターを含む。２日後、処理した細胞を回収し、溶解させ、ゲノムＤＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、ゲノムＤＮＡをカスタムプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳと適合性のアンプリコンを生成し、ＮｅｘｔＳｅｑ機器で配列決定した。試料リードを逆多重化し、品質についてフィルタリングした。次いで、編集結果メトリック（インデルを有するリードの割合）を、処理された試料にわたって、各スペーサー－標的合成配列について定量化した。
ＣａｓＸタンパク質に対するＰＡＭ配列特異性を評価するために、４つの異なるＰＡＭ配列に対する編集結果メトリックを分類した。ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位について、４８個の異なるスペーサー－標的対を定量化した（ＡＴＣ ＰＡＭ、ＣＴＣ ＰＡＭ、及びＧＴＣ ＰＡＭ標的部位について、１４、２２、及び１１個の個々の標的部位をそれぞれ定量化した）。いくつかのＣａｓＸタンパク質については、反復実験を数ヶ月間にわたって数十回繰り返した。これらの実験の各々について、平均編集効率を上記のスペーサーの各々について計算した。次いで、ＰＡＭ配列の４つのカテゴリにわたる平均編集効率を、これらの測定値の標準偏差とともに、全てのかかる実験から計算した。
結果：表１５は、ＰＡＭカテゴリにわたる平均編集効率及びＣａｓＸタンパク質バリアントにわたる平均編集効率を、これらの測定値の標準偏差とともに列挙する。各カテゴリの測定回数も示されている。これらのデータは、操作されたＣａｓＸバリアント４９１及び５１５が、正準ＰＡＭ配列ＴＴＣに特異的である一方、ＣａｓＸの他の操作されたバリアントが、試験したＰＡＭ配列において多かれ少なかれ効率的に機能したことを示す。特に、ＣａｓＸ４９１についてのＰＡＭ優先度の平均順位は、ＣａｓＸ５１５についてＴＴＣ＞＞ＡＴＣ＞ＣＴＣ＞ＧＴＣ、又はＴＴＣ＞＞ＡＴＣ＞ＧＴＣ＞ＣＴＣであるが、野生型ＣａｓＸ２は、ＴＴＣ＞＞ＧＴＣ＞ＣＴＣ＞ＡＴＣの平均順位を示す。より低い編集のＰＡＭ配列については、これらの平均測定値の誤差が大きいことに留意されたい。対照的に、ＣａｓＸバリアント５３５、６６８、及び６７２は、ＴＴＣ＞ＣＴＣ＞ＡＴＣ＞ＧＴＣの順位で、かなり広いＰＡＭ認識を有する。最後に、ＣａｓＸ５３３は、ＷＴ ＣａｓＸと比較して、完全に並べ替えられた順位ＡＴＣ＞ＣＴＣ＞＞ＧＴＣ＞ＴＴＣを示す。これらのデータを使用して、目的の標的ＤＮＡ配列に対して最大限に活性な治療用ＣａｓＸ分子を操作することができる。
実験の条件下で、配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのＰＡＭに関連する標的ＤＮＡ配列でのヒト細胞における二本鎖ＤＮＡ切断について改善されたＣａｓＸタンパク質のセットが同定された。これは、ＣａｓＸバリアントが、比較して、ＰＡＭ特異性の範囲が変化したことを支持している。
実施例８：ＣａｓＸ： ｇＲＮＡインビトロ切断アッセイ
１．ＲＮＰの構築
精製された野生型並びにＣａｓＸ及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のＲＮＰを、実験の直前に調製するか、又は調製して後で使用するために液体窒素中で瞬間凍結し、－８０℃で保存した。ＲＮＰ複合体を調製するために、ＣａｓＸタンパク質をｓｇＲＮＡと１：１．２のモル比でインキュベートした。簡潔には、ｓｇＲＮＡを、緩衝液＃１（２５ｍＭ ＮａＰｉ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭトレハロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に添加し、次いで、ＣａｓＸを、ｓｇＲＮＡ溶液にゆっくりとかき混ぜながら添加し、３７°Ｃで１０分間インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成する。ＲＮＰ複合体を、使用前に２００μＬの緩衝液＃１で予め湿らせた０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ ８１６０フィルターを通して濾過した。必要に応じて、ＲＮＰ試料を、０．５ｍＬ Ｕｌｔｒａ １００－Ｋｄカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ パーツ番号ＵＦＣ５１００９６）を用いて、所望の容量が得られるまで濃縮した。コンピテントＲＮＰの形成を以下に記載するように評価した。
２．野生型参照ＣａｓＸと比較したタンパク質バリアントの切断コンピテント画分の決定
参照ＣａｓＸと比較して活性ＲＮＰを形成するＣａｓＸバリアントの能力を、インビトロ切断アッセイを使用して決定した。切断アッセイのためのβ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）７．３７標的を以下のように生成した。５’蛍光標識（それぞれ、ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ７００及び８００）を有する配列ＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴ（非標的鎖、ＮＴＳ（配列番号１０６９））及びＡＧＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＡ（標的鎖、ＴＳ（配列番号１０６８））を有するＤＮＡオリゴを購入した。オリゴを１：１の比で１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で混合し、９５℃に１０分間加熱し、溶液を室温に冷却することによって、ｄｓＤＮＡ標的を形成させた。
ＣａｓＸ ＲＮＰを、１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で、最終濃度が１μＭの示されたＣａｓＸ及びガイド（グラフを参照されたい）（特に明記しない限り、１．５倍過剰の示されたガイド）を用いて、３７℃で１０分間再構成した後、使用するまで氷に移した。７．３７標的を、７．３７標的に相補的なスペーサーを有するｓｇＲＮＡとともに使用した。
切断反応物を、１００ｎＭの最終ＲＮＰ濃度及び１００ｎＭの最終標的濃度で調製した。反応を３７℃で行い、７．３７標的ＤＮＡを添加することによって反応を開始した。アリコートを、５、１０、３０、６０、及び１２０分で採取し、９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡに添加することによってクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動した。ゲルを、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで画像化し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して定量化するか、又はＣｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、Ｃｙｔｉｖａ ＩＱＴＬソフトウェアを使用して定量化した。得られたデータをプロットし、Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。本発明者らは、化学量論量未満の酵素が、延長された時間スケール下であっても化学量論量を超える量の標的を切断することができず、代わりに、存在する酵素の量に比例するプラトーに近づくという観察によって示されるように、ＣａｓＸが、アッセイ条件下で、本質的に単一代謝回転酵素として作用すると仮定した。したがって、等モル量のＲＮＰによって長い時間スケールにわたって切断された標的の画分は、ＲＮＰのどの画分が適切に形成され、切断に対して活性であるかを示す。切断反応がこの濃度レジーム下で単相性から明らかに逸脱するので、切断トレースを二相性速度モデルに適合させ、３つの独立した反復の各々についてプラトーを決定した。平均値及び標準偏差を計算して、活性画分を決定した（表１６）。
図１に示されるように、ＣａｓＸ２＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ１１９＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ４５７＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ４８８＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、及びＣａｓＸ４９１＋ガイド１７４＋７．３７スペーサーについて形成されたＲＮＰについて、見かけの活性（コンピテント）画分を決定した。表１６に、得られた活性画分を示す。全てのＣａｓＸバリアントは、野生型ＣａｓＸ２よりも高い活性画分を有し、これは、操作されたＣａｓＸバリアントが、野生型ＣａｓＸと比較して、試験条件下で同一のガイドを有する有意により活性で安定なＲＮＰを形成することを示している。これは、ｓｇＲＮＡに対する親和性の増加、ｓｇＲＮＡの存在下での安定性若しくは溶解度の増加、又は操作されたＣａｓＸ： ｓｇＲＮＡ複合体の切断コンピテント立体構造の安定性の増加に起因する可能性がある。ＲＮＰの溶解度の増加は、ＣａｓＸ２と比較して、ＣａｓＸ４５７、ＣａｓＸ４８８、又はＣａｓＸ４９１がｓｇＲＮＡに添加された場合、形成される観察された沈殿物の顕著な減少によって示された。
３．インビトロ切断アッセイ－参照シングルガイドと比較したシングルガイドバリアントについての切断コンピテント画分の決定
図２及び表１６に示されるように、ＣａｓＸ２．２．７．３７、ＣａｓＸ２．３２．７．３７、ＣａｓＸ２．６４．７．３７、及びＣａｓＸ２．１７４．７．３７についても同じプロトコルを使用して切断コンピテント画分を決定したところ、１６±３％、１３±３％、５±２％、及び２２±５％であった。
ガイドの第２のセットを異なる条件下で試験して、ＲＮＰの形成に対するガイドの寄与をより良好に単離した。７．３７スペーサーを有するガイド１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、２１４、及び２１５を、以前のように過剰なガイドではなく、ガイドについて１μＭ及びタンパク質について１．５μＭの最終濃度でＣａｓＸ４９１と混合した。図３及び表１６に、その結果を示す。これらのガイド制限条件下で、これらのガイドの多くは、１７４を上回る更なる改善を示し、１７４の場合の８０±９％と比較して、１８５及び１９６は、それぞれ９１±４％及び９１±１％のコンピテント画分を達成した。
これらのデータは、ＣａｓＸバリアント及びｓｇＲＮＡバリアントの両方が、野生型ＣａｓＸ及び野生型ｓｇＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡを有するより高度の活性ＲＮＰを形成できることを示す。
野生型参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアント１１９、４５７、４８８、及び４９１の見かけの切断速度を、標的７．３７の切断についてのインビトロ蛍光アッセイを使用して決定した。
４．インビトロ切断アッセイ－野生型参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントのｋ切断の決定
ＣａｓＸ ＲＮＰを、１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で、最終濃度が１μＭの示されたＣａｓＸ（図４を参照）及び１．５倍過剰の示されたガイドを用いて、３７℃で１０分間再構成した後、使用するまで氷に移した。切断反応を、２００ｎＭの最終ＲＮＰ濃度及び１０ｎＭの最終標的濃度で設定した。反応を、特に断りのない限り、３７℃で行い、標的ＤＮＡを添加することによって反応を開始した。アリコートを、０．２５、０．５、１、２、５、及び１０分で採取し、９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡに添加することによってクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動した。ゲルを、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで画像化し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して定量化するか、又はＣｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、Ｃｙｔｉｖａ ＩＱＴＬソフトウェアを使用して定量化した。得られたデータをプロットし、Ｐｒｉｓｍを使用して分析し、各ＣａｓＸ： ｓｇＲＮＡの組み合わせの個別の反復について、非標的鎖切断の見かけの一次速度定数（ｋ切断）を決定した。表１６に、独立した適合による３回の反復の平均値及び標準偏差を示し、図５に、切断トレースを示す。
見かけの切断速度定数を、野生型ＣａｓＸ２、並びに各アッセイで利用したガイド１７４及びスペーサー７．３７を有するＣａｓＸバリアント１１９、４５７、４８８、及び４９１について決定した（表１６及び図４を参照）。全てのＣａｓＸバリアントは、野生型ＣａｓＸ２と比較して、改善された切断速度を有した。ＣａｓＸ４５７は、上で決定されたように、より高いコンピテント画分を有するにもかかわらず、１１９よりもゆっくりと切断した。ＣａｓＸ４８８及びＣａｓＸ４９１は、かなりの差で最も高い切断速度を有した。標的は最初の時点でほぼ完全に切断され、真の切断速度はこのアッセイの分解能を超えるので、報告されたｋ切断は下限として解釈されるべきである。
これらのデータは、ＣａｓＸバリアントがより高いレベルの活性を有し、ｋ切断速度が、野生型ＣａｓＸ２と比較して少なくとも３０倍高くなることを示す。
５．インビトロ切断アッセイ：野生型ガイドとガイドバリアントとの比較。
また、野生型参照ＣａｓＸ２及び参照ガイド２を用いて切断アッセイを実施し、ガイドバリアント３２、６４、及び１７４と比較して、バリアントが切断を改善したかどうかを決定した。実験は上記のように実施した。得られたＲＮＰの多くは、試験した時間内に標的の完全な切断に近づかなかったので、本発明者らは、一次速度定数ではなく初期反応速度（Ｖ０）を決定した。最初の２つの時点（１５秒及び３０秒）を、各ＣａｓＸｓｇＲＮＡの組み合わせ及び反復について線形適合した。３回の反復について、傾きの平均値及び標準偏差を決定した。
アッセイ条件下で、ガイド２、３２、６４、及び１７４を有するＣａｓＸ２のＶ０は、２０．４±１．４ｎＭ／分、１８．４±２．４ｎＭ／分、７．８±１．８ｎＭ／分、及び４９．３±１．４ｎＭ／分であった。（表１６、並びに図５及び図６を参照）。ガイド１７４は、得られたＲＮＰの切断速度の大幅な改善（２に対して約２．５倍、図６を参照のこと）を示したが、ガイド３２及び６４は、ガイド２と同様の又はそれよりも劣る機能を示した。注目すべきことに、ガイド６４は、ガイド２のものよりも低い切断速度を支持するが、インビボでは、はるかに良好に機能する（データは示さず）。ガイド６４を生成するためのいくつかの配列の改変は、三重鎖形成に関与するヌクレオチドを犠牲にして、インビボで転写を改善する可能性が高い。ガイド６４の改善された発現は、インビボでのその改善された活性を説明する可能性が高く、一方、その減少した安定性は、インビトロで不適切なフォールディングを導く可能性がある。
スペーサー７．３７を有するガイド１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、２１４、及び２１５、並びにＣａｓＸ４９１を用いて更なる実験を実施して、相対切断速度を決定した。本発明者らのアッセイで測定可能な範囲まで切断速度を減少させるために、切断反応物を１０℃でインキュベートした。結果を図７及び表１６に示す。これらの条件下では、２１５は、１７４よりも速い切断速度を支持する唯一のガイドであった。１９６は、ガイド制限条件下でＲＮＰの最も高い活性画分を示し、１７４と本質的に同じ動態を有し、異なるバリアントが異なる特徴の改善をもたらすことを再度強調した。
これらのデータは、アッセイの条件下で、ガイドバリアントをＣａｓＸとともに使用すると、その大部分が、野生型ガイドを有するものよりも高いレベルの活性を有するＲＮＰをもたらし、約２倍～６倍超の範囲の切断初速度の改善を伴うことを支持する。表１６の番号は、左から右に、ＲＮＰ構築物のＣａｓＸバリアント、ｓｇＲＮＡ足場、及びスペーサー配列を示す。以下の表で、ＲＮＰ構築物名は、左から右に、ＣａｓＸタンパク質バリアント、ガイド足場、及びスペーサーが示されている。
６．インビトロ切断アッセイ：参照２．２に対する５１５．１７４及び５２６．１７４の切断速度及びコンピテント画分の比較。
本発明者らは、操作されたシングルガイドバリアント１７４と複合体化した操作されたタンパク質ＣａｓＸバリアント５１５及び５２６を、参照野生型タンパク質２（配列番号２）及び最小限に操作されたガイドバリアント２（配列番号５）と比較したいと考えた。１．５倍過剰のガイドを用いて、上記のようにＲＮＰ複合体を構築した。ｋ切断及びコンピテント画分を決定するための切断アッセイを上記のように実施し（両方とも３７℃で実施）、異なる時点を使用して、反応がほぼ完了するのに必要な時間が有意に異なるため、野生型対操作されたＲＮＰについてのコンピテント画分を決定した。
得られたデータは、タンパク質及びガイドの両方を操作することによって、ＲＮＰの活性が劇的に改善したことを明らかに実証する。５１５．１７４及び５２６．１７４のＲＮＰは、２．２の１６％と比較して、それぞれ７６％及び９１％のコンピテント画分を有した（図８、表１６）。動態アッセイにおいて、５１５．１７４及び５２６．１７４の両方は、第１の時点までに本質的に全ての標的ＤＮＡを切断し、アッセイの分解能を超え、それぞれ１７．１０及び１９．８７分－１の推定切断速度をもたらした（図９、表１６）。対照的に、２．２のＲＮＰは、最後の１０分の時点までに平均６０％未満の標的ＤＮＡを切断し、操作されたＲＮＰよりもほぼ２桁低い推定ｋ切断を有する。タンパク質及びガイドに対して行われた改変は、より安定であり、活性粒子を形成する可能性がより高く、粒子毎にはるかに効率的にＤＮＡを切断するＲＮＰをもたらした。

＊平均値及び標準偏差
＊＊速度がアッセイの分解能を超えている
実施例９：インビトロでの切断動態に対するスペーサー長の効果の試験
様々な長さのスペーサーを有する２つのＣａｓＸバリアント及びガイドＲＮＡのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を、インビトロでの切断活性について試験して、どのスペーサー長が標的核酸の最も効率的な切断を支持するか、及びスペーサー長の優先度がタンパク質によって変化するかどうかを決定した。
方法：
様々な長さのスペーサーを有するＣａｓＸ及びガイドＲＮＡのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を、インビトロでの切断活性について試験して、どのスペーサー長が標的核酸の最も効率的な切断を支持するかを決定した。
ＣａｓＸバリアント５１５及び５２６を上記のように精製した。足場１７４（配列番号２２３８）を有するガイドを、インビトロ転写（in vitro transcription、ＩＶＴ）によって調製した。ＩＶＴ鋳型は、推奨プロトコルに従って、Ｑ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ Ｍ０４９１）、各足場骨格のための鋳型オリゴ、並びにＴ７プロモーター及び７．３７スペーサーを有する２０ヌクレオチドの増幅プライマー（ＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧ（配列番号１０８４）；ｔｄＴｏｍａｔｏ）又は３’末端から短縮された１８若しくは１９ヌクレオチドの増幅プライマーを使用して、ＰＣＲによって生成した。表１７に、スペーサー配列並びに各鋳型を生成するために使用したオリゴヌクレオチドを示す。次いで、得られた鋳型は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、標準的なプロトコルに従ってＲＮＡガイドを生成した。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してガイドを精製し、使用前にリフォールディングした。
ＣａｓＸ ＲＮＰは、ＣａｓＸを１μＭになるように１×切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に希釈し、ｓｇＲＮＡを１．２μＭになるように添加し、３７℃で１０分間インキュベートすることによって再構成した後、使用するまで氷に移す。蛍光標識された７．３７標的ＤＮＡを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから個々のオリゴヌクレオチドとして購入し（配列は表１７）、ｄｓＤＮＡ標的を、１×切断緩衝液中の２つの相補鎖の等モル混合物を加熱し、室温までゆっくりと冷却することによって調製した。
ＲＮＰを、最終濃度が２００ｎＭになるように切断緩衝液に希釈し、振盪せずに１０℃でインキュベートした。７．３７標的ＤＮＡを、最終濃度が１０ｎＭになるように添加することによって、切断反応を開始した。０．２５、０．５、１、２、５、１０、及び３０分の時点をとった。等量の９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって、時点をクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動した。ゲルをＡｍｅｒｓｈａｍ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、ＩＱＴＬソフトウェアで分析した。得られたデータをプロットし、Ｐｒｉｓｍを使用して分析した。非標的鎖の切断を単一の指数関数に適合させて、見かけの一次速度定数（ｋ切断）を決定した。
結果：
１８、１９、又は２０ヌクレオチドのスペーサーを有するｓｇＲＮＡと複合体化したＣａｓＸバリアント５１５及び５２６の切断速度を比較して、どのスペーサー長が各タンパク質バリアントについて最も効率的な切断をもたらすかを決定した。インビトロ転写されたｓｇＲＮＡを用いて実施した他の実験と一致して、１８ｎｔスペーサーガイドは、両方のタンパク質バリアントについて最も良好に機能した（図１２Ａ及び図１２Ｂ、表１８）。１８ｎｔスペーサーは、タンパク質５１５の場合、２０ｎｔスペーサーよりも１．４倍速く、タンパク質５２６の場合、２０ｎｔスペーサーよりも３倍速かった。１９ｎｔスペーサーは、両方のタンパク質に対して中間の活性を有したが、ここでも、差異はバリアント５２６に対してより顕著であった。一般に、２０ｎｔよりも短いスペーサーは、様々なタンパク質、スペーサー、及び送達方法にわたって増加した活性を有することが観察されているが、改善の程度及び最適なスペーサー長は異なっている。これらのデータは、配列が非常に類似している（２残基のみが異なる）２つの操作されたタンパク質が、方向は類似しているが程度が大幅に異なるスペーサー長の結果として、活性の変化を有し得ることを示す。
実施例１０：ガイドＲＮＡに対する結合親和性の評価
精製された野生型及び改良型ＣａｓＸを、塩化マグネシウム並びに非特異的結合及び凝集を防止するためのヘパリンを含有する低塩緩衝液中で、３’側にＣｙ７．５部分を含有する合成シングルガイドＲＮＡとインキュベートする。ｓｇＲＮＡは、１０ｐＭの濃度で維持し、タンパク質は、別個の結合反応で、１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡に到達させた後、試料を、それぞれタンパク質及び核酸に結合するニトロセルロース膜及び正に荷電したナイロン膜を用いた真空マニホールド膜結合アッセイにかける。膜を画像化して、ガイドＲＮＡを同定し、結合ＲＮＡ対非結合ＲＮＡの割合を、各タンパク質濃度についてニトロセルロース膜対ナイロン膜上の蛍光量によって決定して、タンパク質－ｓｇＲＮＡ複合体の解離定数を計算する。実験はまた、これらの変異が野生型及び変異体タンパク質に対するガイドの親和性にも影響を及ぼすかどうかを判定するために、ｓｇＲＮＡの改良型バリアントを用いて実施される。本発明者らはまた、電気移動度シフトアッセイを実施して、膜結合アッセイと定性的に比較し、凝集ではなく可溶性結合が、タンパク質－ＲＮＡ会合への主要な寄与因子であることを確認する。
実施例１１：標的ＤＮＡに対する結合親和性の評価
精製された野生型及び改良ＣａｓＸは、標的核酸に相補的な標的化配列を有するシングルガイドＲＮＡと複合体化する。ＲＮＰ複合体を、塩化マグネシウム並びに非特異的結合及び凝集を防止するためのヘパリンを含有する低塩緩衝液中で、ＰＡＭ及び標的鎖上の５’側にＣｙ７．５部分を有する適切な標的核酸配列を含有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。標的ＤＮＡは、１ｎＭの濃度で維持し、一方、ＲＮＰは、別個の結合反応で、１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡に到達させた後、試料を、未変性５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動して、結合及び非結合標的ＤＮＡを分離する。ゲルを画像化して、標的ＤＮＡの移動度シフトを同定し、結合対非結合ＤＮＡの割合を、各タンパク質濃度について計算して、ＲＮＰ－標的ＤＮＡ三元複合体の解離定数を決定する。実験は、参照ＣａｓＸ及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰと比較して、ＣａｓＸバリアント及びｇＲＮＡバリアントを含むＲＮＰの改善された結合親和性を実証すると予想される。
実施例１２：ＲＮＰ産生のためのＣａｓＸバリアントの改善された発現及び溶解度特徴の評価
野生型及び改変型ＣａｓＸバリアントを、同一条件下で、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉで発現させる。全てのタンパク質は、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの制御下にある。細胞を、ＴＢ培地で、３７℃で０．６のＯＤまで増殖させ、その時点で増殖温度を１６℃に低下させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって発現を誘導する。発現の１８時間後、細胞を回収する。可溶性タンパク質画分を抽出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分析する。可溶性ＣａｓＸの発現の相対レベルを、クーマシー染色によって同定する。タンパク質を上記のプロトコルに従って並行して精製し、純粋なタンパク質の最終収量を比較する。精製されたタンパク質の溶解度を決定するために、タンパク質が沈殿し始めるまで、構築物を保存緩衝液中で濃縮する。沈殿したタンパク質を遠心分離によって除去し、可溶性タンパク質の最終濃度を測定して、各バリアントの最大溶解度を決定する。最後に、ＣａｓＸバリアントを、シングルガイドＲＮＡと複合体化し、沈殿が始まるまで濃縮する。沈殿したＲＮＰを遠心分離によって除去し、可溶性ＲＮＰの最終濃度を測定して、ガイドＲＮＡに結合した場合の各バリアントの最大溶解度を決定する。
実施例１３：ガイドＲＮＡガイド足場プラットフォーム進化
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断について改善された活性を示すガイドＲＮＡガイド足場バリアントを同定するために実験を実施した。これを達成するために、足場バリアントの大規模ライブラリを設計し、ヒト細胞におけるレポーター遺伝子の機能的ノックアウトについてプール様式で試験した。ノックアウトの改善につながる足場バリアントは、プール内の機能的エレメントを配列決定し、その後コンピュータで分析することによって決定した。
材料及び方法
ライブラリ設計
ＲＮＡ二次構造の安定性の評価
ＲＮＡｆｏｌｄ（ｖ２．４．１４）（Ｌｏｒｅｎｚ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｐａｃｋａｇｅ ２．０．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．６：２６（２０１１））を使用して、Ｊａｒｍｏｓｋａｉｔｅ Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｐｕｍｉｌｉｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．７４（５）： ９６６（２０１９）において行われたものと同様に、ＲＮＡ配列の二次構造の安定性を予測した。ΔΔＧ＿ＢＣ値を評価するために、制約のないアンサンブルのアンサンブル自由エネルギー（ΔＧ）を計算し、次いで、制約のあるアンサンブルのアンサンブル自由エネルギー（ΔＧ）を計算した。ΔΔＧ＿ＢＣは、制約のあるΔＧ値と制約のないΔＧ値との差である。シュードノットステム、足場ステム、及び伸長ステムの塩基形成を反映し、三重鎖の塩基が対合しないことを必要とする制約ストリングを使用した。
シュードノットステム二次構造安定性の計算
シュードノットの構造安定性を、ガイド足場１７５由来の三重鎖ループ配列を使用して、３～３３位にわたるステムループ全体について計算した。更に、シュードノット塩基の対形成及び三重鎖ループにおける塩基対解消を強制する制約ストリングを生成した。したがって、安定性の変化は、シュードノットステムの配列の違いのみによる可能性がある。例えば、シュードノット配列ＡＡＡＡＣＧ＿ＣＧＴＴＴＴは、三重ループ配列ＣＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡ（配列番号１５８）を挿入することによってステムループ配列に変えられ、その結果、最終配列はＡＡＡＡＣＧＣＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＣＧＴＴＴＴ（配列番号１５９）となり、制約ストリングは、「（（（（（（ｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘ））））））」（配列番号１６０、式中、ｘ＝ｎ）であった。
分子生物学
ライブラリ構築の分子生物学
ガイドＲＮＡ足場バリアントの設計されたライブラリを合成し、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手し、次いで、ライブラリに特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。これらのプライマーは、制限酵素ＳａｐＩの配列認識部位を導入するために、ライブラリの５’末端及び３’末端の追加の配列を増幅する。ＰＣＲは、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて行い、製造業者の説明書に従って行った。典型的なＰＣＲ条件は、５０μＬの反応中、１０ｎｇの鋳型ライブラリＤＮＡ、１×Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、３００ｎＭ ｄＮＴＰ、３００ｎＭの各プライマー、０．２５μＬのＱ５ ＤＮＡポリメラーゼであった。サーマルサイクラーでは、典型的なプログラムは、次のサイクルである：９５℃で５分間；次いで、９８℃で１５秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で１分間を２０サイクル；７２℃で２分間の最終伸長。増幅したＤＮＡ産物を、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で精製した。次いで、このＰＣＲアンプリコン並びにプラスミドｐＫＢ４を、制限酵素ＳａｐＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、両方を、独立して、製造業者の説明書に従って、アガロースゲル電気泳動、続いて、ゲル抽出（Ｚｙｍｏ）によってゲル精製した。次いで、ライブラリを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してライゲーションし、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）で精製し、ＭｅｇａＸ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１Ｒエレクトロポレーション細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に形質転換した（全て製造業者の説明書に従った）。形質転換したライブラリを、ＳＯＣ培地中で１時間回復させ、次いで、５ｍＬの２ｘｙｔ培地で、振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。次いで、培養物から、プラスミドＤＮＡをミニプレップした（ＱＩＡＧＥＮ）。次いで、プラスミドＤＮＡを、制限酵素Ｅｓｐ３Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化することによって更にクローニングし、続いて、相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハング及びＧＦＰを標的化するための所望のスペーサー配列を有するアニールしたオリゴヌクレオチドとライゲーションした。５’リン酸化修飾を有するオリゴヌクレオチドを、９５℃で１分間加熱した後、２５℃の最終温度に達するまで、１分当たり２度温度を下げることによってアニールした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリ反応として連結を行った。ここで、典型的な反応条件は、総体積４０μＬの水中、１μｇの予め消化したプラスミドライブラリ、１μＭのアニールしたオリゴヌクレオチド、２μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、２μＬのＥｓｐ３Ｉ、及び１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液からなった。反応を、３７℃で３分間と１６℃で５分間との間で、２５サイクル行った。上記のように、ライブラリを精製し、形質転換し、一晩増殖させ、ミニプレップした。次いで、得られたプラスミドのライブラリを、レンチウイルスの産生に使用した。
ライブラリのスクリーニング
ＬＶの産生
レンチウイルス粒子は、２４時間前に播種した７０～９０％コンフルエントのＬｅｎｔｉＸ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトすることによって生成した。プールしたライブラリを含むプラスミドを、無血清培地中で、ポリエチレンイミンを用いて、パッケージング及びＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドを含む第２世代レンチウイルスシステムに導入した。粒子を産生するために、トランスフェクションの１２時間後に培地を交換し、トランスフェクションの３６～４８時間後にウイルスを回収する。ウイルス上清を、０．４５μｍのＰＥＳ膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じて、標的細胞に添加する前に細胞培養培地に希釈した。
濾過の７２時間後、レンチウイルス上清のアリコートを、ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲによって滴定した。ウイルスゲノムＲＮＡを、フェノール－クロロホルム抽出（ＴＲＩｚｏｌ）、続いて、アルコール沈殿を使用して単離した。抽出の品質及び量を、ナノドロップ読み取りによって評価した。次いで、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素によるｃＤＮＡ産生の直前に、あらゆる残留プラスミドＤＮＡをＤＮａｓｅ Ｉで消化した。ウイルスｃＤＮＡを、１：１０００の段階希釈に供し、ＷＰＲＥベースのプライマー及びＴａｑＭａｎマスターミックスと組み合わせた後、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６によるｑＰＣＲを行った。全ての試料希釈液を、二連で添加し、平均した後、既知のプラスミドベースの標準曲線に対して力価を計算する。常に水を陰性対照として測定する。
ＬＶのスクリーニング（形質導入、維持、ゲーティング、選別、ｇＤＮＡ単離）
細胞分裂が確実に起こるように、形質導入の２４～４８時間前に、標的レポーター細胞を継代する。形質導入の時点で、細胞をトリプシン処理し、カウントし、適切な密度に希釈した。細胞を、二重のレンチウイルス組み込みを最小化するために、低いＭＯＩ（０．１～５、ウイルスゲノムによる）で、無処理のライブラリ又は対照を含むニートレンチウイルス上清で再懸濁した。レンチウイルス－細胞混合物を、４０～６０％コンフルエントで播種した後、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。形質導入の４８時間後、形質導入が上手くいった細胞を、４～６日で１～３μｇ／ｍＬのピューロマイシンで選択し、その後、ＨＥＫで、又はＦｂ培地中で回収した。
選択後、細胞を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した。次いで、細胞を、ＣｏｒｎｉｎｇストレーナーキャップＦＡＣＳチューブ（製品３５２２３５）により濾過し、Ｓｏｎｙ ＭＡ９００で選別した。標準的な方法による単一の生細胞のゲーティングに加えて、蛍光レポーターのノックダウンについて細胞を選別した。実験からの選別した細胞を、溶解し、製造業者のプロトコルに従って、Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡミニプレッププラスを使用してゲノムを抽出した。
次世代配列決定（ＮＧＳ）のための処理
ゲノムＤＮＡを、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡに特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａリード及び２つの配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。典型的なＰＣＲ条件は、５０μＬの反応中、２μｇのｇＤＮＡ、１×Ｋａｐａ Ｈｉｆｉ緩衝液、３００ｎＭ ｄＮＴＰ、３００ｎＭの各プライマー、０．７５μｌのＫａｐａ ＨｉｆｉホットスタートＤＮＡポリメラーゼである。サーマルサイクラーで、９５℃で５分間、次いで、９８℃で１５秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で１分間を１５サイクル、７２℃で２分間の最終伸長のサイクルを行う。増幅されたＤＮＡ産物を、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡクリーンアップキットで精製する。第２のＰＣＲステップは、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム上での多重化を可能にするために、インデックス化アダプターを用いて行った。前のステップからの２０μＬの精製産物を、５０μＬの反応中、１×Ｋａｐａ ＧＣ緩衝液、３００ｎＭ ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、０．７５μＬのＫａｐａ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせた。サーマルサイクラーで、９５℃で５分間、次いで、９８℃で１５秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間を５～１６サイクル、７２℃で２分間の最終伸長のサイクルを行う。増幅されたＤＮＡ産物を、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡクリーンアップキットで精製する。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ（ｖ３、１５０サイクルのシングルエンド配列決定）で配列決定した。
ＮＧＳ分析（試料処理及びデータ分析）
リードを、ｃｕｔａｄａｐｔ（バージョン２．１）を用いてアダプター配列についてトリミングし、ガイド配列（足場配列及びスペーサー配列を含む）を、各リードについて抽出した（また、ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ２．１連結アダプターを使用して、上流アンプリコン配列と下流アンプリコン配列との間の配列を抽出した）。固有のガイドＲＮＡ配列をカウントし、次いで、各足場配列を、設計された配列のリスト並びにガイド足場１７４（配列番号２２３８）及び１７５（配列番号２２３９）の配列と比較して、それぞれの同一性を決定した。
各固有のガイドＲＮＡ配列についてのリードカウントを、平均正規化を使用して、配列決定深度について正規化した。濃縮は、各ＧＦＰ試料における正規化リードカウントを、関連するナイーブ試料における正規化リードカウントで割ることによって、各配列について計算した。両方の選択（Ｒ２及びＲ４）について、ＧＦＰ集団及びナイーブ集団を、３回の別々の日にＮＧＳのために処理し、各足場の濃縮値を３連で形成した。三連にわたってナイーブ試料及びＧＦＰ試料についてのリードカウントを合計した後、足場当たりの全体的な濃縮スコアを計算した。
異なる選択からの２つの濃縮スコアを、ナイーブ集団内のそれらの相対提示によって重み付けされた個々のｌｏｇ２濃縮スコアの加重平均によって組み合わせた。
ｌｏｇ２濃縮スコアの誤差を推定し、三連の試料にわたる平均濃縮スコアの９５％信頼区間を計算した。これらの誤差は、２つの別個の選択に対する濃縮値を組み合わせる場合に伝播する。
結果及び考察
ライブラリ設計、注文、及びクローニング
ＲＮＡ足場に対する変動を試験するために、偏りのない様式、及びＲＮＡ足場内の重要なモジュールに焦点を当てた標的を絞った様式の両方で、ガイドＲＮＡバリアントのライブラリを設計した。
ライブラリの偏りのない部分では、ガイド足場１７４（配列番号２２３８）及び１７５（配列番号２２３９）配列番号）及び（配列番号）（約２８００個の個々の配列）の各残基に対して設計した。二重変異体は、相互作用している可能性がある領域に特に焦点を当てるように設計した。従って、ＣｒｙｏＥＭ構造（ＰＤＢｉｄ：６ＮＹ２）において、２つの残基が正準又は非正準塩基対形成相互作用に関与するか、又は２つの残基がＲＮＡｆｏｌｄ（ｖ２．４．１４）によって予測された最低エネルギーの構造において対形成すると予測された場合、ガイド足場１７４及び１７４における対応する残基を変異させた（両方の残基の全ての可能な置換、挿入、及び欠失を含む）。これらの「相互作用」残基に隣接する残基も変異させた。しかしながら、これらについては、２つの残基の各々の置換のみが含まれた。最終ライブラリでは、ガイド足場１７４又は１７５に対して２つの変異を有する約２７，０００配列を設計した。
ＲＮＡ足場の重要な領域の特異的変異誘発に充てられたライブラリの部分において、シュードノット領域、三重鎖領域、足場バブル、及び伸長ステムに対して改変を設計した（領域の識別については図１８を参照）。ライブラリのこれらの標的化されたセクションの各々において、仮説駆動型の様式で、全ドメインを変異誘発した（図１９）。例として、三重鎖領域について、三重鎖を含む塩基トリプレットの各々を、異なる三重鎖形成モチーフに変異誘発した（図２０を参照されたい）。このタイプの変異誘発は、バブルを取り囲む塩基の全ての可能な置換が変異誘発された（すなわち、ガイド配列１７４又は１７５に対して最大５つの変異を有する）足場ステムバブルにおいて用いられたものとは異なる。これに対して、シュードノットステムを含む５塩基対は、別のワトソン－クリック対形成配列で完全に置換された（最大１０個の異なる塩基が変異誘発された）。
ライブラリの最終標的化セクションは、タンパク質の結合に適した二次構造を形成する可能性がより高い配列について最適化することを意味した。要するに、配列の二次構造の安定性は、１）任意の制約の不在下、２）シュードノットステム、足場ステム、及び伸長ステムなどの重要な二次構造エレメントが形成されるように制約された、２つの条件下で予測された（材料及び方法を参照）。本発明者らの仮説は、これらの２つの条件間の安定性の差（本明細書において、ΔΔＧ＿ＢＣと呼ばれる）が、タンパク質の結合により適した配列について最小であり、したがって、この差が最小である配列を探索する必要があるというものであった。
設計されたライブラリを、Ｔｗｉｓｔ（約４０，０００個の異なる配列）から注文し、タンパク質ＳＴＸ１１９も発現するレンチウイルスプラスミド骨格にクローニングするためのｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ部位を含むように合成した（材料及び方法を参照）。ＧＦＰ遺伝子を標的化するスペーサー配列をライブラリベクターにクローニングし、ＧＦＰ遺伝子を標的化するために各ＲＮＡ足場バリアントから単一ガイドＲＮＡを効果的に生成した。設計したライブラリバリアントの提示を、次世代配列決定を用いて評価した（材料及び方法を参照）。
ライブラリのスクリーニング及び評価
ガイドＲＮＡバリアント及び単一ＣａｓＸタンパク質（バージョン１１９）を含有するプラスミドライブラリをレンチウイルス粒子に作製した（材料及び方法を参照）。ｑＰＣＲアッセイ（材料及び方法を参照）を使用して、ウイルスゲノムのコピー数に基づいて、粒子を滴定した。ＧＦＰを安定して発現する細胞株に、レンチウイルス粒子のライブラリを低い感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入して、各細胞が多くても１つのライブラリメンバーを組み込むことを強制した。細胞プールは、ゲノム組み込みを有する細胞のみを保持するように選択した。最後に、細胞集団をＧＦＰ発現について選別し、ＧＦＰ陰性細胞の集団を得た。これらのＧＦＰ陰性細胞は、ＣａｓＸ ＲＮＰをＧＦＰタンパク質に効果的に標的化するライブラリメンバーを含み、インデル及びその後の機能喪失を引き起こした。
選別されていない（「ナイーブ」）細胞集団及びＧＦＰ陰性集団からのゲノムＤＮＡを処理して、各細胞においてガイドＲＮＡライブラリメンバーの配列を単離した。ナイーブ集団及びＧＦＰ陰性集団におけるガイドＲＮＡの提示を決定するために、次世代配列決定を行った。濃縮スコアは、ＧＦＰ集団におけるライブラリメンバーの提示をナイーブ集団におけるその提示で割ることによって、各ライブラリメンバーについて計算した：高い濃縮スコアは、開始プールよりも活性なＧＦＰ陰性集団においてはるかに頻度が高く、したがって、ＧＦＰ遺伝子内でインデルを効果的に生成することができる活性バリアントである（濃縮値＞１、ｌｏｇ２濃縮＞０）ライブラリメンバーを示す。低い濃縮スコアは、ナイーブと比較して活性ＧＦＰ集団において枯渇しており、したがって、インデルの形成において効果的でない（濃縮値＜１、ｌｏｇ２濃縮＜０）ライブラリメンバーを示す。比較のための最終統計として、相対濃縮値を、（ＧＦＰ陰性対ナイーブ集団における）ライブラリメンバーの濃縮を（ＧＦＰ陰性対ナイーブ集団における）参照足場配列の濃縮で割ったものとして計算した。（対数空間では、これらの値は単に差し引かれる）。図２１に、参照骨格配列の濃縮値を示す。
レンチウイルス粒子の独立した産生、細胞の形質導入、ナイーブ集団及びＧＦＰ陰性集団を得るための選択及び選別、並びに各ライブラリメンバーの濃縮値を知るための配列決定を用いて、スクリーニングを複数回行った。これらのスクリーニングはＲ２及びＲ４と呼ばれ、ガイド足場１７４及び１７５上の単一ヌクレオチドバリアントについて得られた濃縮値を主に再現する（図２２）。スクリーニングは、機能的ＧＦＰ集団において濃縮された変異の多くの可能な組み合わせを同定することができ、したがって、機能的ＲＮＰをもたらし得る。対照的に、非標的化スペーサーを含むガイドは濃縮されておらず、濃縮が選択的カットオフであることが確認された（データは示さず）。ガイド足場１７４及び１７５上の濃縮された変異の完全なセットを、それぞれ表１９及び２０に示す。これらのリストは、標的化された機能的ＲＮＰを依然として達成することができる配列多様性を明らかにする。
単一ヌクレオチド変異は、足場の変異可能領域を示す。
ガイド足場１７４及び１７５と比較して類似の活性又は改善された活性をもたらす足場変異を決定するために、単一ヌクレオチド置換、挿入、又は欠失の濃縮値をプロットした（図２３）。概して、１７４上の単一ヌクレオチド変化は、１７５よりも耐性であり、おそらく、この状況における１７４のより高い活性、したがって、活性を弱める変異に対するより高い耐性を反映している（図２１及び図２４）。有利であった１７５上の単一ヌクレオチド変異はまた、大多数の場合において１７４の状況においても有利であり（図２４）、したがって、足場１７５上の変異についての値は、変異効果のより厳密な読み出しであると解釈された。以下の段落に記載されるように、この分析によって重要な変異可能領域が明らかになった。
最も注目すべき特徴は、伸長ステムであり、これは、参照配列１７４又は１７５と同様の濃縮値を示した。これは、足場が、過去に見られたものと同様に、この領域における変化を許容することができ、ＣａｓＸ ＲＮＰの構造解析によって、伸長ステムがタンパク質とほとんど接触しないように見られると予測されることを示唆している。
三重ループは、特にガイド足場１７５（例えば、特にＣ１５又はＣ１７への変異）において作製された場合、参照足場と比較して高い濃縮を示した別の領域であった。特に、１７５におけるＣ１７位は、足場１７４において既にＧに変異しており、これは、足場１７５に対するこの位置での２つの高度に濃縮された変異のうちの１つである。
Ｇ７とＡ２９との間のシュードノットステムにおける予測された対のいずれかのメンバーに対する変化は、特にガイド足場１７５において、参照と比較して両方とも高度に濃縮された。この対は、非正準Ｇである。ガイド足場１７４及び１７５の両方における対形成。足場１７５におけるこれらの位置で最も強く濃縮された変異は、Ａ２９をＣ又はＴに変換した。その１つ目は、正準ワトソン－クリック対（Ｇ７： Ｃ２９）を形成し、その２つ目は、ＧＵゆらぎ対（Ｇ７： Ｕ２９）を形成する。これらは両方とも、Ｇと比較してヘリックスの安定性を増加させることが予想され得る。Ａ対と比較して、ヘリックスの安定性を増加させることが予想され得る。Ｇ７のＴへの変換も高度に濃縮された。これは、この位置で正準対（Ｕ７： Ａ２９）を形成する。明らかに、これらの位置は、より安定な対形成に有利である。概して、５’末端は変異可能であり、脱濃縮をもたらす変化はほとんどなかった。
最後に、ガイド足場１７５における５４位でのＣの挿入は、高度に濃縮されたが、ガイド足場１７４における類似の位置でのＡ又は挿入されたＧのいずれかの欠失は、両方とも参照と同様の濃縮値を有した。総合すると、ガイド足場は、この足場ステムバブル中に２つのヌクレオチドを有することを好む可能性があるが、それは強い優先度ではない可能性がある。これらの結果を、以下のセクションで更に検討する。
シュードノットステムの安定性は、足場の活性に不可欠である。
足場活性に対するシュードノットステムの効果を更に調査するために、シュードノットステムを以下の方法で改変した：（１）ステム内の塩基対をシャフルして、それぞれの新しいシュードノットが同じ組成の塩基対を有するが、ステム内の順序が異なるようにし、（２）塩基対をランダムなＷＣ対配列で完全に置換した。２９１個のシュードノットステムを試験した。第１のセットの配列の分析は、Ｇ－Ａ対が、他の可能な位置（２～６；野生型配列において、それは５位にある；図２５）と比較して、シュードノットステムの第１の位置にあることに対する強い優先度を示すが、結果は、シュードノットステムにおける２～６位の各々にＧＡ対を有することが一般的に好ましくなく、平均濃縮度が低いことを実証する。１位にＧ－Ａ塩基を有することは、ヘリックスの残りがスタッキング（ワトソン－クリック対のみ）から形成することを可能にすることによって、シュードノットステムを安定化する可能性がある。この結果は、足場が完全に対形成したシュードノットステムを好むことを更に支持する。
かなりの数のシュードノット配列が正のｌｏｇ２濃縮を有しており、この配列を別の塩基対で置換することが概して許容されることを示唆した（図２６のシュードノット構造）。シュードノットステムにおけるより安定なヘリックスがより活性な足場をもたらすという仮説を更に試験するために、各シュードノットステムの二次構造安定性を計算した（材料及び方法）。シュードノット安定性と濃縮（したがって、活性）との間に強い関係が観察され（図２７：より活性な足場が安定なシュードノットステムを有する）、安定なシュードノットステム（＜－７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有するガイド足場は高い濃縮を有し、不安定化したシュードノットステム（≧－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を有するガイド足場は非常に低い濃縮を有した。
二重変異は、ガイド足場の変異可能領域を示す。
各参照ガイド足場に対する二重変異を調べて、足場内の変異可能領域、及び足場活性を改善するための潜在的な変異を更に同定した。非正準Ｇを形成すると予測される７位及び２９位の単一対のみに焦点を当てる。シュードノットステムにおける対は、変異誘発を支持する（上記のセクションを参照）－本発明者らは、この位置の対について全６４個の二重変異をプロットすることができる（図２８）。正準対は、これらの２つの位置で有利である（例えば、７位でのＣの置換及び２９位でのＧの置換は、Ｇ： Ｃ対を生成し、濃縮される；７位でのＣの置換及び２９位でのＧの挿入は、同様にＧ： Ｃ対を生じる、７位でのＡの置換及び２９位でのＵの置換は、Ａ： Ｕ対を生成する）。挿入の対は濃縮されなかった。それはおそらく、ヘリックスにおいてＧ：Ａ対が１つ上の位置に移動し、完全に除去されていないことを考慮すると、ここに正準対を挿入しても、ヘリックスを安定化するには十分ではないためである。驚くべきことに、いくつかの濃縮された二重変異、例えば、７位でのＵの置換及び２９位でのＣの置換（非標準Ｕ： Ｃ対を形成する）、７位でのＵの置換及び２９位でのＵの置換（Ｕ： Ｕ対を形成する）、並びに他のいくつかは、正準対を形成していなかった（図２８）。プリン： プリン対は、他の非正準対よりもヘリックスに対して実質的により破壊的である。実際、７位でのＡの置換及び２９位でのＧの置換は、再びＡ： Ｇ対を形成し、この位置では濃縮されていないＧ対。
ガイド足場１７５の重要な構造エレメントの各々内の二重置換の濃縮値を、各位置が最大３つの置換を有し得るヒートマップから決定した。足場ステムが変異に対して最も耐性が低いことが決定され、この領域における配列が強く制約されていることを示唆した。
これらの結果は、ガイド足場に実質的な変更を加えることができ、編集アッセイで利用される場合でも機能的遺伝子のノックアウトを引き起こし得ることを示している。特に、結果は、足場内のシュードノットステムの二次構造安定性の増加を含む、ガイド足場における改変を通して活性を改善するために利用され得る重要な位置を実証する。

＊変異配列は、「；」で区切られており、配列毎の複数の変異は、「，」で区切られている。

＊変異配列は、「；」で区切られており、配列毎の複数の変異は、「，」で区切られている。
実施例１４：ＣｃｄＢ選択アッセイは、ＴＴＣ、ＡＴＣ、及びＣＴＣ ＰＡＭ配列での改善されたｄｓＤＮＡ切断又は改善されたスペーサー特異性を有するＣａｓＸタンパク質バリアントを同定する
生化学的にコンピテントであり、ＴＴＣ又はＡＴＣ又はＣＴＣのいずれかのＰＡＭ配列に関連する標的ＤＮＡ配列での二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断についてＣａｓＸ５１５と比較して改善された活性又は改善されたスペーサー特異性を示す、ＣａｓＸ５１５（配列番号４１６）に由来するバリアントのセットを同定するために実験を行った。これを達成するために、まず、ＣａｓＸ５１５及びガイド足場１７４を使用したＣｃｄＢ選択実験において、バックグラウンドレベルを上回る生存を有するスペーサーのセットを同定した。第二に、これらのスペーサーを用いてＣｃｄＢ選択を実施して、正準の「野生型」ＰＡＭ配列であるＴＴＣでのｄｓＤＮＡ切断に対して生化学的にコンピテントであるＣａｓＸ５１５に由来するバリアントのセットを決定した。第三に、ＣｃｄＢ選択実験を行って、ＡＴＣ型又はＣＴＣ型のいずれかのＰＡＭ配列での改善されたｄｓＤＮＡ切断を可能にするＣａｓＸ５１５のバリアントのセットを決定した。第四に、プラスミド対抗選択実験を行って、スペーサー特異性の改善をもたらすＣａｓＸ５１５に由来するバリアントのセットを決定した。
材料及び方法：
ＣｃｄＢ選択実験の場合、示されたＣａｓＸタンパク質（又はライブラリ）及びｓｇＲＮＡを発現する３００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（ｐ７３）を、ＣｃｄＢ毒性タンパク質を発現するプラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ株ＢＷ２５１１３にエレクトロポレーションした。形質転換後、培養物を、グルコースリッチ培地中で、３７℃で２０分間回復させた。その後、ＩＰＴＧを、最終濃度が１ｍＭになるように添加し、培養物を、更に４０分間更にインキュベートした。次いで、回収した培養物を、プラスミドに選択的な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ カタログ番号Ｌ９３１５）で滴定した。細胞を、グルコース（ＣｃｄＢ毒素が発現されない）又はアラビノース（ＣｃｄＢ毒素が発現される）のいずれかを含有するプレートで滴定し、相対生存率を計算し、図３２に示されるようにプロットした。次に、培養物をエレクトロポレーションし、上記のように回収し、回収物の画分を、滴定用に保存した。回収した培養物の残りを、回復期間後に分割し、グルコース又はアラビノースのいずれかを含有する培地で増殖させて、プールされたライブラリの試料を、それぞれ選択なしで又は強い選択で回収した。これらの培養物を回収し、製造業者の説明書に従ってプラスミドミニプレップキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、生存プラスミドプールを抽出した。合計３ラウンドの選択について、全プロセスを繰り返した。
最終的なプラスミドプールを単離し、固有分子識別子（unique molecular identifier、ＵＭＩ）に特異的なプライマーを使用して、ｐ７３プラスミドのＰＣＲ増幅を行った。これらのＵＭＩ配列は、各特異的ＵＭＩがＣａｓＸ５１５タンパク質のただ１つの変異と関連するように設計された。網羅的変異進化（ＤＭＥ）と呼ばれるアプローチにおける多くの可能なアミノ酸の置換並びに可能な挿入及び単一のアミノ酸置換を含むＣａｓＸ５１５のバリアントのプールの増幅には、典型的なＰＣＲ条件を使用した。増幅されたＤＮＡ産物を、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡクリーンアップキットを用いて精製し、３０μＬの水に溶出した。次いで、アンプリコンを第２のＰＣＲによる配列決定のために調製して、製造業者の説明書に従ってＭｉＳｅｑ機器又はＮｅｘｔＳｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のいずれかで、次世代配列決定（ＮＧＳ）に適合するアダプター配列を付加した。調製した試料のＮＧＳを行った。返された生データファイルを以下のように処理した：（１）配列を品質及びアダプター配列についてトリミングし、（２）リード１及びリード２からの配列を単一挿入配列に重ね合わせ、（３）各配列を、ＣａｓＸ５１５の参照配列に対する変異に関連するＵＭＩを含んでいることについて定量した。ＣａｓＸ５１５に対する個々の変異の発生率をカウントした。選択後の変異カウントを、選択前の変異カウントで割り、１０の偽カウントを使用して「濃縮スコア」を生成した。このスコアの２を底とする対数（ｌｏｇ２）を計算し、図３３～図３６に示されるヒートマップとしてプロットした。単一のスペーサーについての生物学的反復を示す。これらの反復の平均値を計算し、全体の濃縮スコアとしてプロットした。図３３に示される実験では、ライブラリを、３回実施した２つのＴＴＣ ＰＡＭスペーサー（スペーサー２３．２ ＡＧＡＧＣＧＴＧＡＴＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴ、配列番号１６１、及び２３．１３ ＣＣＣＴＴＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＧＴＣＣＡ、配列番号１６２）及び２回実施した１つのＴＴＣ ＰＡＭスペーサー（スペーサー２３．１１ ＴＣＣＣＣＧＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧ、配列番号１５４）を用いたＣｃｄＢ選択に通し、３回の測定の平均値を、ＣａｓＸ５１５の測定されたバリアントのヒートマップとしてｌｏｇ２濃縮スケール上にプロットした。ＣａｓＸ５１５と比較して、完全な切断コンピテンスを保持したＣａｓＸ５１５のバリアントは、約０のｌｏｇ２濃縮値を示し、切断機能の喪失を有するバリアントは、０未満のｌｏｇ２値を示した。一方、この選択を使用して改善された切断を有するバリアントは、ＣａｓＸ５１５の値と比較して、０を超えるｌｏｇ２値をもたらした。図３４～図３６のヒートマップを生成するための実験は、選択性のための以下の単一スペーサー（１１．２ ＡＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＣＡＣＣ、配列番号１６３；２３．２７ ＧＴＡＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＣＧＡ、配列番号１６４；及び２３．１９ ＣＣＧＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＣＣＧＧＧＴＡ、配列番号１５７）を使用して実施した。
プラスミド対抗選択実験の場合、ＴＴＣ ＰＡＭスペーサーを用いたＣｃｄＢ選択から得られた最終プラスミドプールに対して追加のラウンドの細菌選択を行った。対抗選択の全体的なスキームは、プラスミドの２つの集団を同時に含むＥ．ｃｏｌｉ細胞のみの複製を可能にすることである。第１のプラスミド（ｐ７３）は、ＣａｓＸタンパク質（ＡＴｃによる誘導性発現下）及びｓｇＲＮＡ（構成的に発現される）、並びに抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコール）を発現する。このプラスミドはまた、ＣｃｄＢのような標準的な順方向選択アッセイのために使用され得、また、スペーサー配列は、実験者が望むように完全に自由に変更できることに留意されたい。第２のプラスミド（ｐ７４）は、抗生物質耐性遺伝子（カナマイシン）を発現するためにのみ機能するが、ｐ７３にコードされるスペーサーに一致する標的部位を含む（又は含まない）ように改変されている。更に、これらの標的部位は、スペーサーのＲＮＡと標的部位のＤＮＡとの間の非正準ワトソン－クリック塩基対形成からなる、スペーサー配列に対する「ミスマッチ」を組み込むように設計することができる。ｐ７３から発現されるＲＮＰがｐ７４における標的部位を切断することができる場合、細胞はクロラムフェニコールに対してのみ耐性のままである。対照的に、ＲＮＰが標的部位を切断できない場合、細胞はクロラムフェニコール及びカナマイシンの両方に対して耐性のままである。最後に、上記の二重プラスミド複製システムは２つの方法で達成することができる。連続法では、いずれかのプラスミドを最初に細胞に送達することができ、その後、株をエレクトロコンピテントにし、第２のプラスミドを送達する（両方ともエレクトロポレーションによって）。以前の研究は、プラスミド送達のいずれかの順序が、成功裏の対抗選択のために十分であることを示し、そして両方のスキームを実施した：スクリーン５と名付けられた実験では、ｐ７３は、ｐ７４を保有するコンピテント細胞にエレクトロポレーションされるが、スクリーン６では、その逆が当てはまる。培養物を、上記のように、エレクトロポレーションし、回収し、滴定し、選択条件下で１回増殖させ、プラスミドを回収し、続いて、上記のように、増幅、ＮＧＳ、及び濃縮計算も行った。
最後に、追加のＣｃｄＢ選択を同様の様式で行ったが、ガイド足場２３５並びに代替プロモーターＷＧＡＮ４５、Ｒａｎ２、及びＲａｎ４を用いて、全てスペーサー２３．２を有する毒性ＣｃｄＢプラスミドを標的とした。これらのプロモーターは、上記のＣｃｄＢ選択と比較してガイドＲＮＡをより弱く発現することが予想され、したがって、細菌細胞中のＣａｓＸ ＲＮＰの総濃度を減少させることが予想される。この生理学的効果は、選択的アッセイにおける細菌細胞の全生存を減少させるはずであり、したがって、濃縮スコアのダイナミックレンジを増加させ、ＴＴＣ ＰＡＭスペーサー２３．２におけるＲＮＰヌクレアーゼ活性とより正確に相関する。各プロモーターについて、上記のように、３ラウンドの選択を３回で行い、各ラウンドの実験により、上記のような濃縮データが得られた。以下、これらの実験をスクリーン７と称する。
結果：
図３２に示される結果は、ガイド足場１７４と複合体化したＣａｓＸ５１５が、ＴＴＣ ＰＡＭ配列に関連するＤＮＡ配列を標的化するスペーサー（以下に列挙される）を使用して標的化した場合、ＣｃｄＢ発現プラスミドを切断することができることを実証する。対照的に、代替的なＰＡＭ配列を利用するスペーサーは、はるかに変動的な生存を示した。ＡＴＣ ＰＡＭスペーサー（以下に列挙）は、数％から０．１％未満の生存に及んだが、ＣＴＣ ＰＡＭスペーサー（以下に列挙）は、５０％超から１％未満の範囲の生存を可能にした。最後に、ＧＴＣ ＰＡＭスペーサー（以下に列挙）のみが、０．１％以下の生存を可能にした。これらのベンチマークデータは、この選択パイプラインの実験設計を支持し、ＣｃｄＢ細菌アッセイの強力な選択力を実証する。具体的には、二本鎖ＤＮＡを切断することができないＣａｓＸタンパク質は、少なくとも４桁脱濃縮されるが、切断に対して生化学的にコンピテントなＣａｓＸタンパク質は、アッセイに生き残るであろう。
図３３のヒートマップを使用して、ＴＴＣ ＰＡＭ配列に関連する標的ＤＮＡ配列でのｄｓＤＮＡ切断に対して生化学的にコンピテントであるＣａｓＸ５１５のバリアントのセットを同定した。図３４及び図３５のヒートマップを使用して、ＣＴＣのＰＡＭ配列に関連する標的ＤＮＡ配列（スペーサー１１．２及び２３．２７）でのｄｓＤＮＡ切断について改善を示すバリアントを同定した。一方、図３６のヒートマップは、ＡＴＣのＰＡＭ配列に関連するスペーサー（スペーサー（２３．１９））についての同じバリアントのセットから生成された。
図３３Ａ～図３３Ｅの結果は、３つのＴＴＣ ＰＡＭ標的部位での編集にコンピテントなＣａｓＸ５１５のバリアントを同定し、分類する。これらの３つのデータセットは、個々に又は組み合わせてのいずれかで、バリアント間の基礎となる生化学的差異を表し、ヒトゲノム編集用の改善されたＣａｓＸ治療剤の将来の操作のための目的の領域を同定する。この証拠として、タンパク質全体にわたる各位置での停止コドンの存在など、内部対照をナイーブライブラリの一部として均一に含まれた。これらの終止コドンは、選択ラウンド全体を通して失われることが一貫して観察され、部分的に短縮されたＣａｓＸ５１５がｄｓＤＮＡ切断を可能にしないはずであるという予想と一致した。同様に、ヒートマップデータに反映された活性の喪失を有するバリアントは、選択中に枯渇していることが観察され、したがって、このアッセイにおける二本鎖ＤＮＡ切断に対する適合性の重度の喪失を有する。しかしながら、１以上の濃縮値（及び０以上の対応するｌｏｇ２濃縮値）を有するバリアントは、少なくとも、生化学的切断に関して中立である。重要なことに、バリアントのこの特定のサブセットにおいて同定された変異のうちの１つ以上が、治療用分子に対して望ましい特性を示す場合、これらの変異は、生化学的機能と適合性であることが示された構造－機能相関を確立する。より具体的には、これらの変異は、ＣａｓＸタンパク質の転写、翻訳、フォールディング、安定性、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）形成、ＰＡＭ認識、二本鎖ＤＮＡ巻き戻し、非標的鎖切断、及び標的鎖切断などの特性に影響を及ぼし得る。
図３４Ａ～図３４Ｅ、図３５Ａ～図３５Ｅ、及び図３６Ａ～図３６Ｅを使用して、ＣＴＣ及びＡＴＣ ＰＡＭ配列に関連する配列での切断に対してコンピテントなバリアントを同定し、分類した。これらのデータセットにおける濃縮されたバリアント（濃縮＞１、およそ０の値のｌｏｇ２濃縮に等しい）は、ＣＴＣ又はＡＴＣ ＰＡＭ標的部位の切断を特に改善する変異を表す。これらの基準を満たす変異は、変異がＰＡＭの認識を改善することによって切断速度を改善する（１型）か、又は変異がＰＡＭ配列にかかわらず分子の全体的な切断速度を改善するか（２型）のいずれかの２つの一般的な方法で更に下位分類することができる。
１型の例として、２２３位での置換変異は、試験した全ての試料において数百倍濃縮されていることが見出された。この位置は、野生型参照ＣａｓＸタンパク質ＣａｓＸ１及び２の両方でグリシンをコードする。これは、ＣａｓＸ１の公開されたＣｒｙｏＥＭ構造（ＰＤＢ ＩＤ：６ＮＹ２）におけるＤＮＡ非標的鎖の－４ヌクレオチド位置から６．３４オングストロームであると測定されている。したがって、２２３位におけるこれらの置換変異は、新規のＰＡＭの変化したヌクレオチドに物理的に近位であり、ＤＮＡと直接相互作用する可能性が高い。この結論を更に支持するものとして、濃縮された置換の多くは、置換されたアミノ酸（グリシン）と比較して、更なる水素結合を形成することができるアミノ酸をコードしていた。これらの知見は、特にＰＡＭ ＤＮＡ配列に物理的に近接している場合（１０オングストローム以内）、ＤＮＡ鎖の一方又は両方と相互作用する変異を導入することによって、ＣａｓＸタンパク質において新規のＰＡＭ配列の認識の改善を達成することができることを実証する。図３４～図３６におけるヒートマップの更なる特徴は、非正準ＰＡＭ配列の認識の増加を可能にする変異を表し得るが、それらの作用機序はまだ調べられていない。
２型の変異の例として、図３４Ａ～図３４Ｅ、３５Ａ～図３５Ｅ、及び３６Ａ～図３６Ｅのヒートマップの結果を使用して、ＣａｓＸ５１５と比較して全体的な切断速度を改善するが、必ずしもＤＮＡのＰＡＭ配列を特異的に認識しない変異を同定した。例えば、２７位でのアルギニンの挿入からなるＣａｓＸ５１５のバリアントは、スペーサー１１．２（ＣＴＣ ＰＡＭ）及びスペーサー２３．１９（ＡＴＣ ＰＡＭ）による選択において、１より大きい濃縮値を有することが測定された。このバリアントは、ＣＴＣ ＰＡＭスペーサー上での同等の選択によって以前に同定されており、ここで、この変異は桁違いに濃縮された（データは示さず）。このアミノ酸変異の位置は、上記の構造モデルにおける－１位のＤＮＡ標的鎖に物理的に近位（９．２９オングストローム）である。これらの洞察は、二本鎖ＤＮＡを有するＣａｓＸ ＲＮＰによって形成される成熟したＲループが、アルギニンの側鎖によって、おそらく、正に帯電した側鎖と負に帯電したＤＮＡ標的鎖の骨格とのイオン相互作用によって安定化される機構を示唆する。このような相互作用は、ＰＡＭの特異性を変化させることなく、全体的な切断動態に有益である。これらのデータは、図３４Ａ～図３４Ｅ、３５Ａ～図３５Ｅ、及び３６Ａ～図３６Ｅに示されるいくつかの濃縮された変異が、ＤＮＡ鎖に近位（１０オングストローム以内）である場合、ＤＮＡ鎖のいずれか又は両方と物理的に相互作用することによって、ＣａｓＸ５１５の全体的な切断活性を改善するバリアントを表すという結論を支持する。
データは、図３４Ａ～図３４Ｅ、３５Ａ～図３５Ｅ、及び３６Ａ～図３６Ｅにおけるヒートマップから同定されたＣＴＣ又はＡＴＣ ＰＡＭ配列に関連する配列での切断を改善するために測定された変異の多くが、上で指定された２つの型の変異のいずれかとして分類され得るという結論を支持する。１型の変異について、ＣＴＣ ＰＡＭで試験したスペーサーのうちの少なくとも１つにおいて大きな濃縮スコアを有する２２３位に対する変異からなるバリアントを、関連する最大濃縮スコアとともに表２１に列挙する。２型の変異について、数千の濃縮されたバリアントの中から、変異のより小さなリストを体系的に選択した。ＣａｓＸ５１５と比較して全体的な切断活性を改善する可能性が高い変異を同定するために、以下のアプローチをとった。第一に、ＣＴＣ又はＡＴＭ ＰＡＭスペーサーにわたって最も一貫して濃縮された変異をフィルタリングした。各スペーサーについての各変異の濃縮スコアについて、下限（lower bound、ＬＢ）を定義した。ＬＢは、生物学的な３回の反復にわたる組み合わせたｌｏｇ２濃縮スコアから、個々の反復についてのｌｏｇ２濃縮スコアの標準偏差を引いたものとして定義された。第二に、３つの独立した実験データセット（１つのＡＴＣ ＰＡＭ選択及び２つのＣＴＣ ＰＡＭ選択）のうちの少なくとも２つについてＬＢ＞１であるこれらの変異のサブセットをとった。第三に、変異のこのサブセットは、３つのＴＴＣ ＰＡＭ選択のいずれかにおいて負のｌｏｇ２濃縮が測定されたものを除外することによって更に減少した。最後に、少なくとも１つの実験における構造的特徴及び強い濃縮スコアの組み合わせに基づいて、個々の変異を手動で選択した。これらの基準を満たす得られた２７４個の変異を、図３４Ａ～図３４Ｅ、３５Ａ～図３５Ｅ、及び３６Ａ～図３６Ｅのヒートマップに表される２つのＣＴＣ ＰＡＭ実験又は１つのＡＴＣ ＰＡＭ実験から観察された最大ｌｏｇ２濃縮スコア、並びに変異が位置するドメインとともに、表２２に列挙する。
クラスＩ変異とは対照的に、クラスＩＩと呼ばれる別のカテゴリの変異が存在する。これは、スペーサー配列によって決定されるゲノムＤＮＡにおけるオンターゲット部位とオフターゲット部位とを識別するＣａｓＸ ＲＮＰの能力を改善し、ＣａｓＸタンパク質のヌクレアーゼ活性のスペーサー特異性を改善する。クラスＩＩ変異を特に同定するために、２つの更なる実験を実施した。これらの実験は、プラスミド対抗選択からなり、ＣａｓＸ５１５と比較して、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と意図された標的ＤＮＡとの間の単一ミスマッチに対する、生成されたバリアントの感受性を表す濃縮スコアが得られた。得られた濃縮スコアを、実験データにわたって観察された全ての変異についてランク付けし、以下の分析を実施して、所望のオンターゲット部位でのヌクレアーゼ活性を大幅に低下させることなくＣａｓＸタンパク質のスペーサー特異性を改善する可能性が高い変異のサブセットを同定した。まず、スクリーニング５からの変異を、スペーサー２３．２を使用して、３つの技術的反復にわたるそれらの平均濃縮スコアによってランク付けした。標的部位（ＰＤＢ ＩＤ：６ＮＹ２）に結合したＣａｓＸ ＲＮＰの公開されたモデルから推測されるように、ヌクレオチドミスマッチに物理的に近位であった変異を除去して、スペーサー全体にわたって普遍的というよりも、スペーサー２３．２のみで特異性に改善を付与する可能性があるクラスＩＩ変異を廃棄した。最後に、３つのＴＴＣ ＰＡＭ ＣｃｄＢ選択からのそれらの平均ｌｏｇ２濃縮が０未満であったときに、オンターゲットＴＴＣ ＰＡＭ部位でのそれらの切断活性が変異によって負の影響を受けた場合、これらのクラスＩＩ変異を廃棄した。これらの基準を満たす得られた変異を、スクリーニング５から観察された最大ｌｏｇ２濃縮スコア及び変異が位置するドメインとともに表２３に列挙する。追加的に、クラスＩＩ変異は、スクリーン６の対抗選択実験から同定された。これらの変異は、それらの平均濃縮スコアによって同様にランク付けされたが、異なるフィルタリングステップが適用された。特に、以下のカテゴリの各々から変異を同定した：スペーサー２３．２、スペーサー２３．１１、若しくはスペーサー２３．１３のいずれかからの最高の平均濃縮スコアを有するもの；スペーサー２３．２及びスペーサー２３．１１からの最高の組み合わせた平均濃縮スコアを有するもの；スペーサー２３．１１及びスペーサー２３．１３からの最高の組み合わせた平均濃縮スコアを有するもの；又はスクリーン５におけるスペーサー２３．２及びスクリーン６におけるスペーサー２３．２からの最高の組み合せた平均濃縮スコアを有するもの。これらの得られた変異を、スクリーン６からの観察された最大ｌｏｇ２濃縮スコア及び変異が位置するドメインとともに、表２３に列挙する。
クラスＩ又はクラスＩＩ変異に加えて、ＴＴＣ ＰＡＭ配列でのｄｓＤＮＡ編集活性を改善することが直接観察された別のカテゴリの変異が存在する。これらの変異は、クラスＩＩＩ変異と呼ばれ、スクリーン７においてスペーサー２３．２を使用してＣｃｄＢプラスミドを標的化する場合にＣａｓＸ５１５の濃縮スコアを上回る濃縮スコアを示すことによって、ヌクレアーゼ活性の改善を実証した。コンピュータによるフィルタリングステップを使用して、特に興味深いこれらの濃縮された変異のサブセットを同定した。具体的には、試験した３つのプロモーターの各々について０を超える３つの反復にわたる平均濃縮値を有する変異を同定した。最後に、アミノ酸配列にわたる濃縮スコアの特徴を使用して、濃縮された位置での更なる変異を同定した。目的の特徴の例としては、以下のものが挙げられる：トポロジカルな変化を容易にするための、タンパク質ドメインの接合部における挿入又は欠失；ポリペプチド骨格をねじるためのプロリンへのアミノ酸の置換；タンパク質と、ガイドＲＮＡ又は標的ＤＮＡのいずれかの鎖の負に帯電した核酸骨格との間にイオン結合を追加するための、正に帯電したアミノ酸へのアミノ酸の置換；連続した欠失の両方が高度に濃縮されているアミノ酸の欠失；多くの高度に濃縮された置換を含む位置への置換；タンパク質の最Ｎ末端における高度に濃縮されたアミノ酸へのアミノ酸の置換。これらの得られた変異を、スクリーン６からの観察された最大ｌｏｇ２濃縮スコア及び変異が位置するドメインとともに、表２４に列挙する。
実施例１５：ＲＮＰとして送達された場合の細胞における編集に対するスペーサー長の評価
実験の目的は、細胞内に送達されたＣａｓＸ及びガイドのＲＮＰによる標的核酸の編集に対するスペーサー（標的化配列）長の効果を決定することであった。
ＣａｓＸバリアント４９１を上記のように精製した。足場１７４を有するガイドＲＮＡを、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって調製した。ＩＶＴ鋳型は、推奨プロトコルに従ってＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ Ｍ０４９１）、各足場骨格の鋳型オリゴ、並びにＴ７プロモーター及び全長（２０ヌクレオチド）の１５．３（ＣＡＡＡＣＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＣＡＡＡＧ、配列番号１６５）スペーサー若しくは１５．５（ＧＧＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＧＡＡ、配列番号１６６）スペーサーのいずれかを有する増幅プライマー、又はそれぞれのスペーサーの３’末端から１若しくは２ヌクレオチド短縮された増幅プライマー（表２６の配列）を使用して、ＰＣＲによって生成した。ＩＶＴ鋳型を生成するために使用したプライマーの配列を表２５に示す。次いで、得られた鋳型は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して、標準的なプロトコルに従ってＲＮＡガイドを生成した。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してガイドを精製し、使用前にリフォールディングした。２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭトレハロースを含有する緩衝液中で、タンパク質を１．２倍過剰のモル濃度のガイドと混合することによって、個々のＲＮＰを構築した。ＲＮＰを、３７℃で１０分間インキュベートし、次いで、サイズ排除クロマトグラフィーを介して精製し、２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭトレハロースを含有する緩衝液（緩衝液１）に交換した。精製後、ＲＮＰの濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍタンパク質アッセイを使用して決定した。
精製されたＲＮＰを、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、Ｔ細胞受容体α（ＴＣＲα）遺伝子座での編集について試験した。ＲＮＰを、Ｌｏｎｚａ４－Ｄヌクレオフェクターシステムを使用して、エレクトロポレーションによって送達した。７００，０００細胞を、２０μＬのＬｏｎｚａ緩衝液ＳＥに再懸濁し、適切な濃度に緩衝液１に希釈したＲＮＰに添加し、最終体積を２μＬとした。細胞を、プロトコルＣＬ－１２０を使用して、Ｌｏｎｚａ９６ウェルシャトルシステムを使用して、エレクトロポレーションした。細胞を、予め平衡化したＲＰＭＩ中に、３７°Ｃで回収した。次いで、各エレクトロポレーション条件を、９６ウェルプレートの３つのウェルに分けた。ヌクレオフェクションの１日後、細胞を、新鮮なＲＰＭＩに交換した。ヌクレオフェクション後の３日目、細胞を、ＴＣＲα／β（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗体で染色し、表面ＴＣＲα／βの喪失について、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔフローサイトメーターを使用して評価した。Ｊｕｒｋａｔ細胞の一部は、編集の不在下、ＴＣＲα／βに対して陽性染色されない。これを説明し、編集によりＴＣＲαがノックアウトされた細胞の実際の割合（％）を推定するために、式ＴＣＲＫＯ＝（ＴＣＲ－ｏｂｓ－ＴＣＲ－ｎｅｇ）／（１－ＴＣＲ－ｎｅｇ）を適用した。式中、ＴＣＲＫＯは、ＴＣＲαの推定ノックアウト率であり、ＴＣＲ－ｏｂｓは、実験試料中のＴＣＲ染色に対して陰性の細胞の観察された割合であり、ＴＣＲ－ｎｅｇは、ＲＮＰを含まない対照試料中のＴＣＲ染色に対して陰性の細胞の割合である。この式は、ＴＣＲα／βを発現する細胞及び発現しない細胞が同等の割合で編集されると仮定している。補正された割合のＴＣＲαノックアウト細胞を、Ｐｒｉｓｍを使用して、ＲＮＰの濃度に対してプロットした。各スペーサーについて、３つのスペーサー長を、ＥＣ５０を除く共通のパラメータを使用して、用量反応曲線に適合した。報告されたｐ値は、２０ｎｔスペーサーについての用量曲線及び比較される短縮型スペーサーの用量曲線が、同じＥＣ５０パラメータでモデル化され得る確率である。
結果：ＣａｓＸ ＲＮＰは、ＣａｓＸバリアント４９１と、１５．３又は１５．５（いずれもＴＣＲα遺伝子の定常領域を標的化するスペーサー）のいずれかを有する足場１７４から構成されるガイドとを使用して構築された。予め構築されたＲＮＰがエクスビボ編集のためにヌクレオフェクトされる場合、より短いスペーサーの使用が編集の増加を支持するかどうかを決定するために、全長２０ｎｔスペーサー並びに短縮型１９ｎｔ及び１８ｎｔスペーサーを有するガイドを試験した。ＲＮＰは、２２μＬのヌクレオフェクション反応中、０．３１２５μＭ～２．５μＭの範囲の２倍希釈で試験した。編集は、ヌクレオフェクションの３日後にフローサイトメトリーによって評価した。両方のスペーサー配列について、短縮型スペーサーを有するＲＮＰは、用量範囲にわたって、２０ｎｔスペーサーを有するものよりも大幅に効率的に編集された（図３７Ａ～図３７Ｂ、用量反応曲線）。スペーサー１５．３については、２０ｎｔスペーサーの１．４１４μＭと比較して、１８ｎｔ及び１９ｎｔスペーサーは、それぞれ０．２２５μＭ及び０．２９９μＭのＥＣ５０値を有した（両方の切断についてｐ＜０．０００１；余分平方和Ｆ検定）。スペーサー１５．５については、１８ｎｔスペーサーの０．５１９μＭに対して２０ｎｔスペーサーでは０．９３８μＭ（ｐ＝０．０００１）のＥＣ５０を有した。一方、１９ｎｔスペーサーは、０．８０８μＭ（ｐ＝０．０７６２）のＥＣ５０を有し、２０ｎｔスペーサーにより類似していた。１９ｎｔの１５．３スペーサーが１８ｎｔスペーサーと同様の編集を有し、１９ｎｔの１５．５スペーサーが対応する２０ｎｔスペーサーにより密接に類似しているという事実にもかかわらず、試験した両方のスペーサーについて、傾向の方向性は一貫したままであり、ＣａｓＸ編集分子が予め構築されたＲＮＰとして送達される場合、１８ｎｔスペーサーを有するガイドを使用することが、編集を増加させるための一般化可能な戦略であり得ることを示唆し、１８又は１９のより短いスペーサーが、ＲＮＰによるエクスビボ編集において２０塩基のスペーサーと比較して増加した活性を支持することを実証する。
実施例１６：新規のＰＡＭ配列特異性を有するＣａｓＸタンパク質バリアントのアッセイによる同定
実験の目的は、ＣａｓＸタンパク質５１５（配列番号４１６）の配列バリアントのＰＡＭ配列特異性を同定することであった。これを達成するために、ＨＥＫ２９３細胞株ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１を、ガイド１７４（配列番号２２３８）と一緒に、ＣａｓＸタンパク質４９１（配列番号３３６）又はＣａｓＸタンパク質５１５若しくは５１５のバリアントで処理し、次世代配列決定（ＮＧＳ）を実施して、様々なスペーサー及び関連する標的部位での編集の割合（％）を計算した。
材料及び方法：ＰＡＳＳシステムを使用してクローンタンパク質バリアントをアッセイするために、多重化プールアプローチをとった。簡潔には、プールされたＨＥＫ細胞株を生成し、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１と名付けた。プール内の各細胞は、特定の標的部位と対になったゲノムに組み込まれたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含んでいた。タンパク質発現構築物のトランスフェクション後、特定のスペーサーによる特定の標的での編集を、ＮＧＳによって定量化することができる。各ガイド－標的対は、ＣａｓＸ－ガイドＲＮＰ複合体の活性、特異性、及び標的化能に関するデータを提供するように設計された。
対のスペーサー－標的配列は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成され、等モルプールのオリゴヌクレオチドとして入手した。このプールを、ＰＣＲによって増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによってクローニングして、ｐ７７と名付けられたプラスミドの最終ライブラリを生成した。各プラスミドは、ＧＦＰ発現エレメントとともに、ｓｇＲＮＡ発現エレメント及び標的部位を含んでいた。ｓｇＲＮＡ発現エレメントは、ｇＲＮＡ足場１７４（配列番号２２３８）の転写を駆動するＵ６プロモーター、続いて、ガイド及びＣａｓＸバリアントのＲＮＰを対形成した標的部位に標的化するスペーサー配列からなった。２５０個の可能な固有の、対のスペーサー・標的合成配列を設計及び合成した。次いで、レンチウイルスのプールを、製造業者の説明書に従ってＬｅｎｔｉＸ産生システム（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を使用して、このプラスミドライブラリから産生した。次いで、得られたウイルス調製物を、ｑＰＣＲによって定量化し、単一コピーの組み込みを生成するように、低い感染多重度で標準ＨＥＫ２９３細胞株に形質導入した。次いで、得られた細胞株を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって精製して、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１の産生を完了した。次いで、この細胞株を、６ウェルプレート形式で播種し、２連で、水で処理するか、又は２μｇのプラスミドｐ６７でトランスフェクトし、製造業者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって送達した。プラスミドｐ６７は、ＳＶ４０核局在化配列でタグ付けされたＣａｓＸタンパク質の発現を駆動するＥＦ－１ａプロモーターを含む。２日後、処理したＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１細胞を回収し、溶解させ、ゲノムＤＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、ゲノムＤＮＡをカスタムプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳと適合性のアンプリコンを生成し、ＮｅｘｔＳｅｑ機器で配列決定した。試料リードを逆多重化し、品質についてフィルタリングした。次いで、編集結果メトリック（インデルを有するリードの割合）を、処理された試料にわたって、各スペーサー－標的合成配列について定量化した。
分子に対するＰＡＭ配列特異性を評価するために、４つの異なるＰＡＭ配列に対する編集結果メトリックを分類した。ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位について、４８個の異なるスペーサー・標的対を定量化した（ＡＴＣ ＰＡＭ、ＣＴＣ ＰＡＭ、及びＧＴＣ ＰＡＭ標的部位について、１４、２２、及び１１個の個々の標的部位をそれぞれ定量化した）。２つの生物学的反復についての平均編集効率及び平均の標準誤差を、これらのスペーサーの各々について計算した。次いで、ＰＡＭ配列の４つのカテゴリにわたる平均編集効率を、測定値の標準偏差とともに計算した。
結果：表２７は、２回の実験の平均として計算された、ＣａｓＸタンパク質バリアント５１５で標的化された場合の上記のスペーサーについての平均編集効率を列挙する。スペーサー名及び関連するＰＡＭ配列を示す。表２８は、ＣａｓＸタンパク質バリアント５３４についての同じデータを列挙する。追加的に、平均編集効率を、ＰＡＭ配列の４つのカテゴリの各々について計算した。

図３８は、ＰＡＭカテゴリにわたる、及びＣａｓＸタンパク質バリアントにわたる平均編集効率を示す棒グラフであり、２つの実験の平均の標準誤差がエラーバーとしてプロットされている。これらのデータは、ＣａｓＸバリアント４９１及び５１５の両方が、正準ＰＡＭ配列ＴＴＣに特異的である一方、ＣａｓＸの他のバリアントが、試験したＰＡＭ配列において多かれ少なかれ効率的に機能したことを示す。特に、ＣａｓＸの２２３位で置換された異なるアミノ酸は、ＰＡＭヌクレオチド配列のすぐ５’の位置に異なる塩基を好むことが観察された。表２９に、これらの４つのＰＡＭ配列の各々についての最も高い編集活性を有するＣａｓＸバリアントを列挙する。バリアント名及びアミノ酸置換、並びに示されたＰＡＭ配列についてのＣａｓＸ５１５と比較した編集の改善倍率が指定されている。これらのデータは、この位置のアミノ酸の側鎖の同一性がＰＡＭ認識に重要であることを示唆している。４つのヌクレオチドの各々は、ＣａｓＸタンパク質のこの領域における異なる結合ネットワーク又は化学的環境に最も相補的である可能性が高い。これらのデータを使用して、目的の標的ＤＮＡ配列に対して最大限に活性な治療用ＣａｓＸ分子を操作することができる。
実験の条件下で、配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのＰＡＭに関連する標的ＤＮＡ配列でのヒト細胞における二本鎖ＤＮＡ切断について改善されたＣａｓＸタンパク質５１５のバリアントのセットが同定された。これは、ＣａｓＸバリアントが、野生型ＣａｓＸと比較して、増加した範囲のＰＡＭ特異性を生成することができることを支持している。
実施例１７：ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのＰＡＭ配列での改善された編集効率を有するＣａｓＸタンパク質バリアントのＰＡＳＳアッセイによる比較
実験の目的は、ＣａｓＸタンパク質２（配列番号２）の操作されたバリアント及び新規のバリアントを利用して、ヒト細胞におけるゲノム編集効率を比較することであった。これを達成するために、ＨＥＫ２９３細胞株ＰＡＳＳ＿Ｖ１．００を、野生型参照ＣａｓＸタンパク質２又は操作されたバリアント１１９（配列番号２７０）、４９１（配列番号３３６）、及び５１５（配列番号４１６）、又は５１５の配列バリアントで処理し、次世代配列決定（ＮＧＳ）を実施して、様々なスペーサー及び関連する標的部位での編集の割合（％）を計算した。
材料及び方法：ＰＡＳＳシステムを使用してクローンタンパク質バリアントをアッセイするために、多重化プールアプローチをとった。簡潔には、プールされたＨＥＫ細胞株を生成し、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．００と名付けた。プール内の各細胞は、特定の標的部位と対になったゲノムに組み込まれたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；配列番号２２３８）を含んでいた。タンパク質発現構築物のトランスフェクション後、特定のスペーサーによる特定の標的での編集を、ＮＧＳによって定量化することができる。各ガイド－標的対は、ＣａｓＸ－ガイドＲＮＰ複合体の活性、特異性、及び標的化能に関するデータを提供するように設計された。
対のスペーサー－標的配列は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成され、等モルプールのオリゴヌクレオチドとして入手した。このプールを、ＰＣＲによって増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによってクローニングして、ｐ６６と名付けられたプラスミドの最終ライブラリを生成した。各プラスミドは、ＧＦＰ発現エレメント及びハイグロマイシン発現エレメントとともに、ｓｇＲＮＡ発現エレメント及び標的部位を含んでいた。ｓｇＲＮＡ発現エレメントは、ｇＲＮＡ足場１７４（配列番号２２３８）の転写を駆動するＵ６プロモーター、続いて、ガイド及びＣａｓＸバリアントのＲＮＰを対形成した標的部位に標的化するスペーサー配列からなった。２５０個の可能な固有の、対のスペーサー・標的合成配列を設計及び合成した。次いで、レンチウイルスのプールを、製造業者の説明書に従ってＬｅｎｔｉＸ産生システム（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を使用して、このプラスミドライブラリから産生した。次いで、得られたウイルス調製物を、ｑＰＣＲによって定量化し、単一コピーの組み込みを生成するように、低い感染多重度で標準ＨＥＫ２９３細胞株に形質導入した。次いで、得られた細胞株を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって精製して、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．００の産生を完了した。次いで、この細胞株を、６ウェルプレート形式で播種し、水で処理するか、又は２μｇのプラスミドｐ６７でトランスフェクトし、製造業者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって送達した。プラスミドｐ６７は、ＳＶ４０核局在化配列でタグ付けされたＣａｓＸタンパク質の発現を駆動するＥＦ－１ａプロモーターを含む。５日後、処理した細胞を回収し、溶解させ、ゲノムＤＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、ゲノムＤＮＡをカスタムプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳと適合性のアンプリコンを生成し、ＮｅｘｔＳｅｑ機器で配列決定した。試料リードを逆多重化し、品質についてフィルタリングした。次いで、編集結果メトリック（インデルを有するリードの割合）を、処理された試料にわたって、各スペーサー－標的合成配列について定量化した。
分子に対する編集効率を評価するために、４つの異なるＰＡＭ配列に対する編集結果メトリックを分類した。ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位について、４８個の異なるスペーサー・標的対を定量化した（ＡＴＣ ＰＡＭ、ＣＴＣ ＰＡＭ、及びＧＴＣ ＰＡＭ標的部位について、１４、２２、及び１１個の個々の標的部位をそれぞれ定量化した）。編集効率を、これらのスペーサーの各々について計算し、水処理試料において観察された編集を差し引くことによって、バックグラウンドシグナル対して正規化した。
結果：図３０は、ＰＡＭカテゴリにわたる、及びＣａｓＸタンパク質バリアントにわたる編集効率を示すバイオリンプロットである。個々のスペーサーの編集効率をドットで示し、平均編集効率を水平バーで示す。任意のヌクレアーゼでリポフェクトされた細胞は、ＣａｓＸ５２８を除く野生型ヌクレアーゼＣａｓＸ２の平均編集よりも高い、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位（水平バー）での平均編集を示した。また、４つの異なるＰＡＭ配列に対する任意の所与のヌクレアーゼの相対優先度が、バイオリンプロットで表されている。ＣａｓＸヌクレアーゼ５２７（配列番号４２７）、５２８（配列番号４２８）、及び５２９（配列番号４２９）は、野生型ヌクレアーゼＣａｓＸ２のＰＡＭ優先度とは大幅に異なるＰＡＭ優先度を示す。これらのデータは、ＣａｓＸアミノ酸配列の特定の領域がＰＡＭ認識に重要であることを示唆しており、これらのデータを使用して、目的の標的ＤＮＡ配列に対して最大限に活性な治療用ＣａｓＸ分子を操作することができる。
実験の条件下で、操作されたＣａｓＸバリアント１１９、４９１、及び５１５、又は５１５の配列バリアントを同定した。これらは、ＷＴ ＣａｓＸ２タンパク質と比較して、配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのＰＡＭに関連する標的ＤＮＡ配列でのヒト細胞における二本鎖ＤＮＡ切断について改善されている。これらのデータは、野生型参照ＣａｓＸと比較して、ＰＡＭ特異性の範囲が増加したＣａｓＸバリアントを生成することができることを支持する。
実施例１８：ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのＰＡＭ配列での改善された最大編集効率を有するＣａｓＸタンパク質バリアントのＰＡＳＳアッセイによる比較
実験の目的は、ＣａｓＸタンパク質バリアントを比較して、選択標的核酸配列についてのＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのＰＡＭ配列での最大編集効率を決定することであった。これを達成するために、ＨＥＫ２９３細胞株ＰＡＳＳ＿Ｖ１．００を、操作されたＣａｓＸタンパク質４９１（配列番号３３６）又は更に操作されたバリアント５３２（配列番号４３２）若しくは５３３（配列番号４３３）で処理し、次世代配列決定（ＮＧＳ）を実施して、様々なスペーサー及び関連する標的核酸部位での編集の割合（％）を計算した。
材料及び方法：ＰＡＳＳシステムを使用してクローンタンパク質バリアントをアッセイするために、多重化プールアプローチをとった。簡潔には、プールされたＨＥＫ細胞株を生成し、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．００と名付けた。プール内の各細胞は、特定の標的部位と対になったゲノムに組み込まれたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含んでいた。タンパク質発現構築物のトランスフェクション後、特定のスペーサーによる特定の標的での編集を、ＮＧＳによって定量化することができる。各ガイド－標的対は、ＣａｓＸ－ガイドＲＮＰ複合体の活性、特異性、及び標的化能に関するデータを提供するように設計された。
対のスペーサー－標的配列は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成され、等モルプールのオリゴヌクレオチドとして入手した。このプールを、ＰＣＲによって増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによってクローニングして、ｐ６６と名付けられたプラスミドの最終ライブラリを生成した。各プラスミドは、ＧＦＰ発現エレメント及びハイグロマイシン発現エレメントとともに、ｓｇＲＮＡ発現エレメント及び標的部位を含んでいた。ｓｇＲＮＡ発現エレメントは、ｇＲＮＡ足場１７４（配列番号２２３８）の転写を駆動するＵ６プロモーター、続いて、ガイド及びＣａｓＸバリアントのＲＮＰを対形成した標的部位に標的化するスペーサー配列からなった。２５０個の可能な固有の、対のスペーサー・標的合成配列を設計及び合成した。次いで、レンチウイルスのプールを、製造業者の説明書に従ってＬｅｎｔｉＸ産生システム（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を使用して、このプラスミドライブラリから産生した。次いで、得られたウイルス調製物を、ｑＰＣＲによって定量化し、単一コピーの組み込みを生成するように、低い感染多重度で標準ＨＥＫ２９３細胞株に形質導入した。次いで、得られた細胞株を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって精製して、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．００の産生を完了した。次いで、この細胞株を、６ウェルプレート形式で播種し、２連で、水で処理するか、又は２μｇのプラスミドｐ６７でトランスフェクトし、製造業者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって送達した。プラスミドｐ６７は、ＳＶ４０核局在化配列でタグ付けされたＣａｓＸタンパク質の発現を駆動するＥＦ－１ａプロモーターを含む。５日後、処理したＰＡＳＳ＿Ｖ１．００細胞を回収し、溶解させ、ゲノムＤＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、ゲノムＤＮＡをカスタムプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳと適合性のアンプリコンを生成し、ＮｅｘｔＳｅｑ機器で配列決定した。試料リードを逆多重化し、品質についてフィルタリングした。次いで、編集結果メトリック（インデルを有するリードの割合）を、処理された試料にわたって、各スペーサー－標的合成配列について定量化した。
分子に対する編集効率を評価するために、４つの異なるＰＡＭ配列に対する編集結果メトリックを分類した。ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位について、４８個の異なるスペーサー・標的対を定量化した（ＡＴＣ ＰＡＭ、ＣＴＣ ＰＡＭ、及びＧＴＣ ＰＡＭ標的部位について、１４、２２、及び１１個の個々の標的部位をそれぞれ定量化した）。編集効率を、これらのスペーサーの各々について計算し、水処理試料において観察された編集を差し引くことによって、バックグラウンドシグナル対して正規化した。次いで、２回の生物学的反復の平均、並びに平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。最後に、ＰＡＭの各カテゴリ（ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣ）について、全てのスペーサーについての平均編集効率、並びに伝搬ＳＥＭを計算した。
結果：図３１は、ＰＡＭカテゴリ及びＣａｓＸタンパク質バリアントにわたる編集効率を示す棒グラフである。Ｃａｓ５３２又は５３３でリポフェクトされた細胞は、ＴＴＣ ＰＡＭ標的部位におけるＰＡＭ配列の各々で、Ｃａｓ５３３を除いて、ＣａｓＸ４９１よりも高い平均編集を示した。これらのデータは、ＣａｓＸバリアント５３２又は５３３が、目的の治療標的で編集活性を改善し得ることを示唆する。
操作されたＣａｓＸバリアント５３２及び５３３は、標的ＤＮＡ配列が配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのＰＡＭと関連している場合、ＣａｓＸ４９１と比較して、ヒト細胞において改善された編集効率を有することが同定された。これらのデータは、ＣａｓＸバリアント５３２及び５３３が、ＣａｓＸ４９１と比較して、特に非正準ＰＡＭ配列に関連するそれらの標的に対して、目的の治療標的での編集効率を改善し得ることを支持する。
実施例１９：ＣａｓＸ４９１又はＣａｓＸ１１９と比較して増強された編集活性を有するＣａｓＸタンパク質バリアントのＰＡＳＳアッセイによる同定
実験の目的は、ＣａｓＸ４９１又は１１９と比較して、ヒト細胞において改善された編集を有するＣａｓＸのバリアントを同定することであった。これを達成するために、ＨＥＫ２９３細胞株ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１を、野生型ＣａｓＸタンパク質２、又は操作されたＣａｓＸタンパク質バリアント１１９若しくは４９１（配列番号３３６）、又は別のＣａｓＸタンパク質バリアントで処理し、次世代配列決定（ＮＧＳ）を実施して、様々なスペーサー及び関連する標的部位での編集の割合（％）を計算した。
材料及び方法：ＰＡＳＳシステムを使用してクローンタンパク質バリアントをアッセイするために、多重化プールアプローチをとった。簡潔には、プールされたＨＥＫ細胞株を生成し、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１と名付けた。プール内の各細胞は、特定の標的部位と対になったゲノムに組み込まれたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ：配列番号２２３８）を含んでいた（表３０に列挙）。タンパク質発現構築物のトランスフェクション後、特定のスペーサーによる特定の標的での編集を、ＮＧＳによって定量化することができる。各ガイド－標的対は、ＣａｓＸ－ガイドＲＮＰ複合体の活性、特異性、及び標的化能に関するデータを提供するように設計された。
対のスペーサー－標的配列は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成され、等モルプールのオリゴヌクレオチドとして入手した。このプールを、ＰＣＲによって増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによってクローニングして、ｐ７７と名付けられたプラスミドの最終ライブラリを生成した。各プラスミドは、ＧＦＰ発現エレメントとともに、ｓｇＲＮＡ発現エレメント及び標的部位を含んでいた。ｓｇＲＮＡ発現エレメントは、ｇＲＮＡ足場１７４（配列番号２２３８）の転写を駆動するＵ６プロモーター、続いて、ガイド及びＣａｓＸバリアントのＲＮＰを対形成した標的部位に標的化するスペーサー配列からなった。２５０個の可能な固有の、対のスペーサー・標的合成配列を設計及び合成した。次いで、レンチウイルスのプールを、製造業者の説明書に従ってＬｅｎｔｉＸ産生システム（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ，Ｉｎｃ）を使用して、このプラスミドライブラリから産生した。次いで、得られたウイルス調製物を、ｑＰＣＲによって定量化し、単一コピーの組み込みを生成するように、低い感染多重度で標準ＨＥＫ２９３細胞株に形質導入した。次いで、得られた細胞株を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって精製して、ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１の産生を完了した。次いで、この細胞株を、６ウェルプレート形式で播種し、２連又は単一試料のいずれかで、水で処理するか、又は２μｇのプラスミドｐ６７でトランスフェクトし、製造業者の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって送達した。プラスミドｐ６７は、ＳＶ４０核局在化配列でタグ付けされたＣａｓＸタンパク質の発現を駆動するＥＦ－１ａプロモーター、並びにピューロマイシン耐性遺伝子を含む。１日後、細胞を、ピューロマイシン耐性に選択的な培地（Ｓｉｇｍａ）に移した。更に４日後、処理したＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１細胞を回収し、溶解させ、ゲノムＤＮＡ単離キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。次いで、ゲノムＤＮＡをカスタムプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳと適合性のアンプリコンを生成し、ＮｅｘｔＳｅｑ機器で配列決定した。試料リードを逆多重化し、品質についてフィルタリングした。次いで、編集結果メトリック（インデルを有するリードの割合）を、処理された試料にわたって、各スペーサー－標的合成配列について定量化した。
ヒト標的部位でのＣａｓＸヌクレアーゼの編集活性を評価するために、４８個のＴＴＣ ＰＡＭ標的部位を定量化した。２つの生物学的反復についての平均編集効率及び平均の標準誤差を、示されている場合、これらのスペーサーの各々について計算した。４８個のスペーサーにわたる平均編集効率も、示されている場合、平均の伝搬標準誤差とともに計算した。
結果：図３９は、ヒト細胞における４８個の異なるＴＴＣ ＰＡＭ標的部位での選択ＣａｓＸヌクレアーゼの、ＣａｓＸ４９１と比較した平均編集効率を示す棒グラフである。２つの実験の平均の伝搬標準誤差をエラーバーとしてプロットした。これらのデータは、ＣａｓＸ１１９及び４９１の両方が野生型ＣａｓＸ２よりも大幅に効率的であることを示す。更に、ＣａｓＸ５１５は、ＣａｓＸ４９１の編集効率と比較して有意に異ならない。驚くべきことに、ＣａｓＸ５２７は、４９１と比較して、ＴＴＣ ＰＡＭ配列で改善された効率を示した（Ｗｅｌｃｈの両側ｔ検定によりｐ＝０．００００６３５）。ＣａｓＸヌクレアーゼ５２７は、潜在的に、非標準ＰＡＭ配列を有する二本鎖ＤＮＡ標的部位を有するＣａｓＸリボ核タンパク質（ＲＮＰ）のＲループ構造を安定化することによって、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのＰＡＭ配列での改善された編集効率を示すように操作された。ＣａｓＸ５２７は、ＣａｓＸ４９１の２６位に挿入されたアルギニンアミノ酸からなる。この位置は、ＣａｓＸ ＰＡＭ認識ループ（アミノ酸位置２２３）とＤＮＡの非標的鎖（ＮＴＳ）のＰＡＭヌクレオチドとの相互作用に物理的に近位である。
図４０は、相同な参照ＣａｓＸタンパク質１（配列番号１；タンパク質データバンク識別番号：６ＮＹ２）の公開されたＣｒｙｏＥＭ構造上のＰＡＭ認識ループの位置及びＣａｓＸ５２７変異の位置（２６位）を図示する。挿入されたアルギニンとＤＮＡ ＮＴＳとの間の更なるイオン相互作用は、ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＣＴＣ、又はＧＴＣのいずれかでの安定性の改善を促進し、これらのスペーサーにおける全体的な編集効率の改善をもたらす可能性が高い。
図４１は、ＣａｓＸ２及びＣａｓＸ５２７の編集効率を、４８個のＴＴＣ ＰＡＭスペーサーでのＣａｓＸ５１５の選択バリアントと比較したバイオリンプロットであり、編集効率の中央値は水平バーとして表されている。上で考察したように、ＣａｓＸ５２７は、ＣａｓＸ４９１と同等以上の編集効率を有することが以前に観察されており、いくつかの新規のＣａｓＸバリアントは、ＣａｓＸ５２７と比較して、更に改善された編集効率を有することがここで観察された。意外にも、ＣａｓＸ５８３についての編集率は、特に均一かつ高かった。これは、Ｒループ構造の安定性における大きな改善の結果である可能性があり、それにより、スペーサー間で典型的に観察される編集のばらつきがほとんど克服された。この仮説を支持するように、ＣａｓＸ５８３は、タンパク質の非標的鎖結合ドメイン（ＮＴＳＢ）における１６８位の疎水性ロイシンの正に帯電したリジンへの置換によってＣａｓＸ５１５とは異なり、これは、標的ＤＮＡのＮＴＳへの更なるイオン結合を容易にする可能性がある。この領域は、上で考察したＣｒｙｏＥＭ構造では非構造化されており、明確にするために、ＮＴＳＢドメインが標識されている。表３０は、ＣａｓＸタンパク質バリアント５２７又は５８３で標的化した場合の４８個のＴＴＣ ＰＡＭスペーサーに対する編集効率を列挙する。これは、アッセイの条件下で、標的の大部分でＣａｓＸ５８３の編集効率の増強を実証する。スペーサー名及び関連するＰＡＭ配列を示す。
図４２は、ヒト細胞における４８個の異なるＴＴＣ ＰＡＭ標的部位での選択ＣａｓＸヌクレアーゼのＣａｓＸ４９１に対する平均編集効率を示す棒グラフである。２つの実験の平均の伝搬標準誤差をエラーバーとしてプロットした。灰色の破線は、ＣａｓＸ１１９の編集活性を示す。これらのデータは、ＣａｓＸバリアント４２９～４５８が、ＣａｓＸ１１９と比較して変動的な編集効率を示し、場合によっては、ＣａｓＸ１１９と比較して改善された編集効率を示し、これは、ＣａｓＸ４９１と比較して７０．８％で編集することを示す。特に、ＣａｓＸ４５０は、ＣａｓＸ１１９よりも大幅に効率的であり、ＣａｓＸ４９１と比較して９５．９％で編集し、ＣａｓＸ１１９配列と比較して４つの置換変異からなる。これらの４つの置換変異は、以下の通りである：Ｄ７３２Ｎ、Ｅ３８５Ｐ、Ｙ８５７Ｒ、Ｉ６５８Ｖ。重要なことに、ＣａｓＸ４４９は、Ｉ６５８Ｖの置換を除いて同じ配列からなり、かなり効率が低く、ＣａｓＸ４９１と比較して、わずか５８．１％で編集する。この比較は、この変異が活性の増加に非常に重要であることを示す。これらのデータは、置換変異の組み合わせがＣａｓＸ１１９に対して行われる場合に、改善された編集活性が達成可能であることを実証する。注目すべきことに、活性に対するこれらの増強は、相同なＣａｓＸタンパク質配列間のドメイン交換から生じることが観察された増強とは別である。特に、ＣａｓＸ４８４は、ＣａｓＸ２ドメイン（ＮＴＳＢ及びヘリックスＩｂ）がＣａｓＸ１に見出されるドメインで置換されていることによってのみＣａｓＸ４９１とは異なり、対応する活性の増加は６２．０％～１００．０％である。これらのデータは、ＣａｓＸ１１９ヌクレアーゼ活性が、個々の置換変異の組み合わせによって、又は相同なＣａｓＸタンパク質とのドメイン交換によって増強され得ることを示す。
実験の条件下で、ＣａｓＸタンパク質４９１又は５１５のバリアントのセットが同定された。これらは、配列ＴＴＣのＰＡＭに関連する標的ＤＮＡ配列でのヒト細胞における二本鎖ＤＮＡ切断について改善されており、目的の標的ＤＮＡ配列について増強された活性を有するＣａｓＸバリアント分子を更に操作するために使用され得る変異についての特定の位置又は位置の組み合わせの証拠を提供する。
実施例２０：ＣａｓＸ４９１と比較して増強された特異性を有するＣａｓＸタンパク質バリアントのＰＡＳＳアッセイによる同定
実験の目的は、ヒト細胞におけるオフターゲット部位対オンターゲット部位での切断に対して改善された特異性を有するＣａｓＸのバリアントを同定することであった。これを達成するために、ＨＥＫ２９３細胞株ＰＡＳＳ＿Ｖ１．０１を、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ；配列番号２２３８）とともに、野生型ＣａｓＸタンパク質２、又は操作されたＣａｓＸタンパク質バリアント１１９若しくは４９１（配列番号３３６）、又は別のＣａｓＸタンパク質バリアントで処理し、次世代配列決定（ＮＧＳ）を実施して、様々なスペーサー及び関連する標的部位における編集の割合（％）を計算した。
材料及び方法：ＰＡＳＳシステムを使用してクローンタンパク質バリアントをアッセイするために、実施例１９に記載のように、多重化プールアプローチをとった。
ヒト標的部位におけるＣａｓＸヌクレアーゼの編集活性並びに特異性を評価するために、２セットの標的部位を定量化した。まず、４８個のＴＴＣ ＰＡＭ標的部位を定量化し、２つの生物学的反復についての平均編集効率及び平均の標準誤差を、これらのスペーサーの各々について計算した。４８個のスペーサーにわたる平均編集効率も、平均の伝搬標準誤差とともに計算した。第二に、２８セットの２つのＴＴＣ ＰＡＭスペーサー・標的部位対を定量化した。スペーサー・標的対の各セットは、固定されたスペーサー配列と、２つの異なる標的部位と、からなった。２つの標的部位は、標的部位の２０個の位置のうちの１つで単一ヌクレオチドのミスマッチによって異なっていた。一方の標的部位（オンターゲットスペーサー・標的対）は、スペーサー配列に完全に相補的であり、他方（オフターゲットスペーサー・標的対）は、スペーサーのＲＮＡとＤＮＡ標的鎖との間のミスマッチからなる。２つの生物学的反復についての平均編集効率及び平均の標準誤差を、これらのスペーサーの各々について計算した。これらの２８セットの標的部位の各々について、オフターゲット部位とオンターゲット部位との間の編集効率の比、並びに平均の伝搬標準誤差を計算した。このメトリックは、特異度として定義される。最後に、２８セットの標的部位にわたる平均特異度、並びに平均の伝搬標準誤差を計算した。
結果：図４３は、ＣａｓＸ４９１と比較した平均編集効率並びに選択ＣａｓＸヌクレアーゼの平均特異度を示す棒グラフである。２つの実験の平均の伝搬標準誤差をエラーバーとしてプロットした。これらのデータは、ＣａｓＸ１１９及び４９１の両方が野生型ＣａｓＸ２よりも大幅に効率的であること、及びＣａｓＸ１１９がＣａｓＸ２と比較してスペーサー内の単一ヌクレオチドミスマッチに対して特異的なままであること（低い特異度）を示す（平均特異度がＣａｓＸ２では０．１７１であるのに対してＣａｓＸ１１９では０．１８２）。対照的に、ＣａｓＸ４９１は、これらの条件下で単一ヌクレオチドミスマッチに対するかなりの量の特異性を喪失した（平均特異度が０．４４６）。ＣａｓＸ５１５を生成するためのＣａｓＸ４９１への更なる変異（７９３位でのプロリンの挿入）は、分子の特異性をわずかに改善するが、この結果は統計的に有意ではない。更に、ＣａｓＸ５２７を生成するためのＣａｓＸ４９１の２６位でのアルギニンの挿入は、分子の特異性を有意かつ大幅に悪化させる（平均特異度が０．８３９）。しかしながら、重要なことに、ＣａｓＸ５１５に対する更なる単一変異は、分子の特異性を更に改善する。ＣａｓＸ５３５、５３７、５４２、５４３、及び５４４は全て、特異性を有意に改善する。ＣａｓＸ５４４は、特異性を最も改善し、平均特異度は０．１８３であり、これは野生型ＣａｓＸ２のものと有意に異ならない。同時に、ＣａｓＸ５４４は、ＣａｓＸ４９１の平均編集効率と比較して、９７．７％の平均編集効率を維持し、有意に異ならない。これらのデータは、ＣａｓＸ４９１又は５１５に対して行われた単一変異が、ヒト細胞において標的化ＤＮＡ配列を編集する場合、ヌクレアーゼの活性若しくは特異性のいずれか、又は両方を変化させ得ることを実証する。図６８は、試験した変異の組み合わせと、活性及び特異性の両方に対するそれらの効果との間の定性的関係を示すフローチャートである。表３１は、２８セットのオンターゲット・標的対又はオフターゲットスペーサー・標的対のＣａｓＸ４９１の平均の編集の割合（％）を定量化し、オンターゲット編集効率対オフターゲット編集効率の平均比を示す。表３２は、ＣａｓＸ２又はＣａｓＸバリアント４９１と比較した、選択ＣａｓＸバリアントの平均編集活性、並びに０～１の絶対値としての各バリアントの平均特異度を定量化する。全ての場合において、操作されたバリアントは、参照ＣａｓＸ２（配列番号２）と比較して、改善された編集効率を示し、アッセイの条件下で４倍～ほぼ７倍多い編集を有したが、ＣａｓＸ５２７（配列番号４２７）及び５３２（配列番号４３２）は、ＣａｓＸ４９１（配列番号３３６）と比較して改善を示した。ＣａｓＸ５４２（配列番号４４２）、５４３（配列番号４４３）、及び５４４（配列番号４４４）は、本質的にＣａｓＸ４９１と同程度に活性であったが、参照ＣａｓＸ２と同等の特異性を保持していた。
実験の条件下で、ＣａｓＸタンパク質４９１又は５１５のバリアントのセットを同定した。これらは、配列ＴＴＣのＰＡＭに関連する標的ＤＮＡ配列でのヒト細胞における二本鎖ＤＮＡ切断について改善されている。加えて、これらのタンパク質バリアントの特異性を、オンターゲット部位対オフターゲット部位での編集を測定することによって定量化した。これらのデータを使用して、目的の標的ＤＮＡ配列に対して最大限に活性で、最大限に特異的な治療用ＣａｓＸバリアント分子を操作することができる。
実施例２１：改善されたガイドＲＮＡバリアントによる、インビトロでのマウス及びヒトＲＨＯエキソン１遺伝子座での増強されたオンターゲット活性の実証
実験を実施して、治療的に関連するマウス及びヒトＲｈｏエキソン１を含む異なるゲノム標的での増加した活性を有する新規の操作されたガイドＲＮＡバリアントを同定した。以前のアッセイは、編集効率並びに特異性を有意に増加させる可能性を保持する足場配列内の多くの異なる「ホットスポット」領域（例えば、ステムループ）を同定した（表３３の配列）。追加的に、スクリーニングを実施して、オフターゲット編集又は非特異的編集を引き起こすことなく、複数の異なるＰＡＭ－スペーサーの組み合わせにわたって、ＡＡＶベクターにおける本発明者らのＣＲＩＳＰＲシステムの全体的な活性を増加させるであろう足場バリアントを同定した。現在のベンチマークベクターと比較して増加した編集効率を達成することで、インビボ研究で使用されるウイルスベクターの用量の低減が可能になり、ＡＡＶ媒介性ＣａｓＸガイドシステムの安全性が改善される。
材料及び方法：
新たなＣａｓＸバリアント配列及びｇＲＮＡ足場バリアントを、プラスミド及びウイルスベクターによる検証のためにＡＡＶ導入遺伝子構築物に挿入した。本発明者らは、ＩＴＲ間のＡＡＶ導入遺伝子を、概念的に異なる部分に分割した。これらは、本発明者らの治療用カーゴ（ＣａｓＸ及びｇＲＮＡバリアント＋スペーサー）と、哺乳動物細胞における発現に関連するアクセサリエレメント（例えば、プロモーター、ＮＬＳ、ポリ（Ａ））と、からなる。ＡＡＶゲノムにおける各部分を制限酵素部位によって分離して、モジュラークローニングができるようにした。部分を、Ｔｗｉｓｔから遺伝子断片として注文し、ＰＣＲ増幅し、対応する制限酵素で消化し、きれいにし、次いで、同じ酵素で消化したベクターにライゲーションした。次いで、新しいＡＡＶ構築物を化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｔｕｒｂｏｓ又はＳｔｂｌ３ｓ）に形質転換し、３７℃で１時間回復させた後、カナマイシンＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。単一コロニーを採取し、ミニプレップし、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を行った。次いで、配列を検証した構築物を、スペーサー１２．７（ｔｄＴｏｍａｔｏを標的化：ＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴ、配列番号１９４）を有するＢｂｓＩ Ｇｏｌｄｅｎ－Ｇａｔｅアセンブリにクローニングした。スペーサーは、２つのオリゴをアニーリングし、水で希釈することによって作製した。次いで、形質転換及びミニプレップのプロトコルを繰り返し、スペーサーがクローニングされたベクターを、再度、配列を検証した。検証した構築物をマキシプレップした。マキシプレップの品質を評価するために、構築物を、ＸｍａＩ（ＩＴＲの各々においていくつかの部位を切断する）及びＸｈｏＩ（ＡＡＶゲノムを１箇所切断する）による２つの別個の消化物において処理した。次いで、これらの消化物及び未切断構築物を、１％アガロースゲル上で泳動し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ上で画像化した。プラスミドが、９０％超がスーパーコイルで、正しいサイズであり、ＩＴＲがインタクトである場合、構築物を、ヌクレオフェクションによる試験に移し、その後、ＡＡＶベクターの産生に使用した。
レポーター細胞株：
Ａｉ９－ｔｄＴｏｍａｔｏから単離された不死化神経前駆細胞株を、予め平衡化したｍＮＰＣ培地（ＧｌｕｔａＭＡａｘ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１：１０００ ２－メルカプトエタノール、１×Ｂ－２７サプリメント（ビタミンＡを含まない）、増殖因子ｂＦＧＦ及びＥＧＦを補充した１×Ｎ２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）で浮遊培養した。試験前に、ａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を持ち上げ、穏やかに再懸濁し、ニューロスフェアの完全な分離を監視した。次いで、細胞を、培地でクエンチし、スピンダウンし、新鮮な培地に再懸濁した。細胞をカウントし、ヌクレオフェクションに直接使用するか、又はＡＡＶ形質導入の２日前に、１０，０００個の細胞をＰＬＦ（１×ポリ－ＤＬ－オルニチン臭化水素酸塩、滅菌脱イオン水中１０ｍｇ／ｍＬ、１×ラミニン、及び１×フィブロネクチン）でコーティングされた９６ウェルプレート中でインキュベートした。
ＨＥＫ２９３Ｔ二重レポーター細胞株を、ＧＦＰに連結されたヒトＲＨＯ遺伝子のエキソン１及びｍｓｃａｒｌｅｔに連結されたヒトＰ２３Ｈ．ＲＨＯ遺伝子のエキソン１を構成的に発現する２つの導入遺伝子カセットをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にノックインすることによって生成した。改変された細胞を、３～５日毎の連続継代によって増殖させ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｅｒａｄｉｇｍ，＃１５００－５００）並びに１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（１００ｘ－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ；ＧＩＢＣＯ ＃１５１４０－１２２）を補充された、ピルビン酸ナトリウム（１００×，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、及び２－メルカプトエタノール（１０００×，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃２１９８５０２３）を更に含み得る、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ，＃１０－０１３－ＣＶ）からなる線維芽細胞（ＦＢ）培地で維持した。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。１～２週間後、ＧＦＰ＋／ｍｓｃａｒｌｅｔ＋細胞を、ＦＢ培地にバルク選別した。レポーター株を３～５日毎の連続継代によって増殖させ、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内のＦＢ培地で維持した。レポータークローンを、限界希釈法によって生成した。クローン株を、フローサイトメトリー、ゲノム配列決定、及び以前に検証されたＲＨＯ標的化ＣａｓＸ分子を使用するＲＨＯ遺伝子座の機能的改変を介して特徴付けた。最適なレポーター株は、ｉ）細胞当たり単一コピーのＷＴＲＨＯ．ＧＦＰ及びｍｕｔＲＨＯ．ｍｓｃａｒｌｅｔが正しく組み込まれ、ｉｉ）未改変細胞と同等の倍加時間を維持し、ｉｉｉ）以下に記載の方法を使用してアッセイした場合にＲＨＯ遺伝子の破壊時にＧＦＰ及びｍｓｃａｒｌｅｔ蛍光の減少をもたらしたものを同定した。
ヌクレオフェクション：
ＣａｓＸ足場ガイドシステムの発現を駆動するＡＡＶシスプラスミドを、Ｌｏｎｚａ Ｐ３初代細胞９６ウェルＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用してｍＮＰＣにヌクレオフェクトした。ＡＲＰＥ－１９株については、Ｌｏｎｚａ ＳＦ溶液及びサプリメントを使用した。プラスミドを、２００ｎｇ／μｌ、１００ｎｇ／μＬの濃度に希釈した。構築物当たり５μＬのＤＮＡを、それぞれ２００，０００個のｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣ又はＡＲＰＥ－１９細胞を含むＰ３又はＳＦ溶液に添加した。製造業者のガイドラインに従ってＬｏｎｚａ ４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを使用して、合わせた溶液をヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、溶液を、適切な培養培地でクエンチした。次いで、この溶液を、９６ウェルプレートに３連でアリコートした（１ウェル当たり約６７，０００細胞）。トランスフェクションの４８時間後、処理した細胞に、増殖因子を含有する新鮮なｍＮＰＣ培地を補充した。トランスフェクションの５日後、ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣを持ち上げ、活性をＦＡＣＳによって評価した。
ＡＡＶの産生：
懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、親ＨＥＫ２９３Ｔから適応させ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地で増殖させた。スクリーニング目的のために、小規模培養物（２０～３０ｍＬ、１２５ｍＬ三角フラスコで培養し、１１０ｒｐｍで撹拌した）を、トランスフェクションの日に１．５ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に希釈した。ＩＴＲリピートに隣接する導入遺伝子を有するエンドトキシンフリーｐＡＡＶプラスミドを、複製のためのアデノウイルスヘルパー遺伝子及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐゲノムを供給するプラスミドと、無血清ＯＰＴＩＭＥＭ培地中でＰＥＩＭａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して共トランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、培養物に、１０％ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充した。３日後、培養物を、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上清を細胞ペレットから分離した。上清を、４０％ ＰＥＧ、２．５Ｍ ＮａＣｌ（最終濃度８％）と混合し、氷上で少なくとも２時間インキュベートして、ＡＡＶウイルス粒子を沈殿させた。ＡＡＶベクターの大部分を含む細胞ペレットを、溶解培地（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、氷上で超音波処理し（１５秒、３０％振幅）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５０Ｕ／μＬ、Ｎｏｖａｇｅｎ）で、３７℃で３０分間処理した。次いで、粗溶解物及びＰＥＧ処理上清を、４℃で、４０００ｒｐｍで２０分間スピンして、ＰＥＧ沈殿したＡＡＶ（ペレット）を、細胞デブリを含まない粗溶解物（上清）で再懸濁し、０．４５μｍフィルターを使用して更に清澄化した。
ウイルスゲノムの力価を決定するために、１μＬの粗溶解物ウイルスをＤＮａｓｅ及びＰｒｏｔＫで消化し、続いて、定量的ＰＣＲを行った。５μＬの消化されたウイルスを、ＩＤＴ ｐｒｉｍｅｔｉｍｅマスターミックス並びにＣＭＶプロモーター領域（フォワード ５’－ＣＡＴＣＴＡＣＧＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＣＡ－３’（配列番号７５２）；リバース ５’－ＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＴＧＡＧＴＣＡＡＡＣＣ－３’（配列番号７５３）、プローブ５’－ＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧ－３’（配列番号７５４））又はＡＡＶ２－ＩＴＲ内に位置する６２ｂｐ断片（フォワード ５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号７５５）；リバース ５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号７５６）、プローブ５’－ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧ－３’（配列番号７５７））を増幅するように設計されたプライマー及び６’ＦＡＭ／Ｚｅｎ／ＩＢＦＱプローブ（ＩＤＴ）のセットから構成された２５μＬのｑＰＣＲ反応で使用した。ＡＡＶ ＩＴＲプラスミドの１０倍段階希釈液（各５μＬの２ｅ＋９～２ｅ＋４ ＤＮＡコピー／ｍＬ）を参照標準として使用して、ウイルス試料の力価（ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬ）を計算した。ＱＰＣＲプログラムを、以下のように設定した：９５℃で５分間の初期変性ステップ、続いて、９５℃で１分間の変性及び６０℃で１分間のアニーリング／伸長の４０サイクル。
ＡＡＶ形質導入：
１０，０００細胞／ウェルのｍＮＰＣを、ＡＡＶ形質導入の４８時間前に、９６ウェルプレートのＰＬＦでコーティングされたウェル上に播種した。ウイルス感染条件は全て、実験ベクター間でｖｇ数を正規化して、約１．０ｅ＋６～１．０ｅ＋４ｖｇ／細胞の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）の一連の３倍希釈で、３連で行った。計算は、トランスフェクション時の１ウェル当たり２０，０００個の細胞の推定数に基づいた。ｂＦＧＦ／ＥＧＦ増殖因子（最終濃度２０ｎｇ／ｍＬ）を補充した予め平衡化したｍＮＰＣ培地に希釈した最終体積が５０μＬのＡＡＶベクターを各ウェルに適用した。トランスフェクションの４８時間後、増殖因子を補充した新鮮な培地で、完全な培地交換を行った。トランスフェクションの５日後、編集活性（ｔｄｔ＋細胞定量）を、ＦＡＣＳによって評価した。
ＦＡＣＳによる編集活性の評価：
トランスフェクションの５日後、９６ウェルプレート中の処理されたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣ又はＡＲＰＥ－１９細胞を、ｄＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＴｒｙｐＬＥ及びトリプシン（０．２５％）で、それぞれ１５分間及び５分間処理した。細胞解離後、処理したウェルを、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地でクエンチした。再懸濁した細胞を、丸底９６ウェルプレートに移し、１０００ｇで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、１×ＤＡＰＩを含有するｄＰＢＳで再懸濁し、プレートをＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターのオートサンプラーに装填した。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを、以下のゲーティングパラメータを使用して実行した：細胞を選択するためのＦＳＣ－Ａ×ＳＳＣ－Ａ、単一細胞を選択するためのＦＳＣ－Ｈ×ＦＳＣ－Ａ、ＤＡＰＩ陰性生存細胞を選択するためのＦＳＣ－Ａ×ＶＬ１－Ａ、及びｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞を選択するためのＦＳＣ－Ａ×ＹＬ１－Ａ。
ｍＲＨＯエキソン１遺伝子座におけるインデルのＮＧＳ分析：
トランスフェクションの５日後、９６ウェルプレート中の処理されたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＮＰＣを、ｄＰＢＳで洗浄し、５０μＬのＴｒｙｐＬＥ及びトリプシン（０．２５％）で、それぞれ１５分間及び５分間処理した。細胞解離後、処理したウェルを、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地でクエンチした。次いで、細胞をスピンダウンし、得られた細胞ペレットをＰＢＳで洗浄した後、製造業者の説明書に従ってＺｙｍｏミニＤＮＡキットを使用して、ｇＤＮＡ抽出のために処理した。マウスＲＨＯエキソン１遺伝子座で生じる編集レベルを評価するために、アンプリコンを、プライマーのセット（フォワード ５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＧ－３’（配列番号７５８）；リバース ５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＡＣＣ－３’（配列番号７５９））を用いて２００ｎｇのｇＤＮＡから増幅し、ビーズ精製し（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ）、次いで、再増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列及び１６ｎｔの固有分子識別子（ＵＭＩ）を組み込んだ。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価した。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した：（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ２．１）を使用して、配列を品質及びアダプター配列についてトリミングし、（２）プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して、リード１及びリード２の配列を単一の挿入配列に重ね合わせ、（３）コンセンサス挿入配列を、予想されるアンプリコン配列及びスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ２．０．２９）を実行した。このプログラムは、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において改変されたリードの割合（％）を定量化する。ＣａｓＸの活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入、置換、及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化した。
結果：
異なる編集実験を実施して、複数の目的のゲノム遺伝子座を標的化する異なるスペーサーを有する、新規ｇＲＮＡ足場バリアント（ガイド１７４及び２２９～２３７）と対になったＣａｓＸ４９１によって媒介されるオンターゲット切断を定量化した。構築物を、ＩＴＲ２配列に隣接するＡＡＶ骨格ｐ５９にクローニングした。タンパク質Ｃａｓ ４９１の発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下で駆動され、並びに足場－スペーサーの発現は、ヒトＵ６プロモーターの制御下で駆動される。ｍＮＰＣ－ｔｄＴレポーター細胞株を使用して、ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子座での単一スペーサーによって媒介される二重切断効率（スペーサー１２．７、ＴＴＣ ＰＡＭ）、並びに内因性マウスＲＨＯエキソン１遺伝子座での単一切断効率（スペーサー１１．３０、ＣＴＣＮ ＰＡＭ）を評価した。ＡＲＰＥ－１９由来細胞株に組み込まれた二重レポーターシステムもまた、外因的に発現されたヒトＷＴ Ｒｈｏ遺伝子座でのオンターゲット編集を評価するために使用した（スペーサー１１．１、ＣＴＣ ＰＡＭ）。
スペーサー１２．７及び１１．３０を有するｇＲＮＡ足場バリアントを、それぞれ図１４及び図１５に示される２つの異なる用量で、マウスＮＰＣ細胞株において、ヌクレオフェクションによって試験した。構築物を、現在のベンチマークであるｇＲＮＡ足場１７４活性と比較した。両方の標的遺伝子座において、ガイド足場バリアント２３１、２３３、２３４、及び２３５の構築物は、足場１７４を含む構築物よりも高いレベルで機能した。足場２３５は、足場１７４と比較して、ｍＲＨＯエキソン１遺伝子座で、活性の２倍の増加を示した。本発明者らは更に、二重レポーターＡＲＰＥ－１９細胞株を構築物ｐ５９．４９１．１７４．１１．１及びｐ５９．４９１．２３５．１１．１並びに非標的スペーサー対照でヌクレオフェクションすることによって、足場２３５が、オフターゲット切断を増加させることなく、活性を一貫して改善することを検証した。スペーサー１１．１は、外因的に発現されたｍＲＨＯ－ＧＦＰ遺伝子を標的とした。足場２３５は、１７４と比較して、３倍増加した活性を示した（それぞれ、Ｒｈｏ－ＧＦＰ細胞の９％対３％）。アレル特異性を、配列がＷＴと１ｂｐ異なるＰ２３Ｈ－ＲＨＯ－Ｓｃａｒｌｅｔｔ細胞集団の割合を調べることによって評価した。
最後に、本発明者らは、これらの足場バリアントがＡＡＶに効率的にパッケージングされ、ウイルスで送達された場合でも強力なままであることを実証しようとした。スペーサー１１．３０（オンターゲット、マウスＷＴ ＲＨＯ）及び１１．３１（オフターゲット、マウスＰ２３ ＲＨＯ）を有するガイド足場バリアント１７４及び２３５を発現するＡＡＶベクターで形質導入されたｍＮＰＣは、足場１７４と比較して、３．０ｅ＋５ＭＯＩで、オンターゲット遺伝子座で２３５足場バリアントを含む構築物の活性の増加を示したが（５倍超の増加、図４５Ａ及び図４５Ｂ）、オフターゲットインデルは検出不可能であった。
これらの結果は、治療的に関連するゲノム標的（例えば、マウス及びヒトＲＨＯエキソン１遺伝子座）を有する二重レポーターシステムにおいて、足場バリアントを新規の構造変異を用いて操作して、活性を増加させることができることを支持する。更に、新たに特徴付けられた足場は、全体的に２倍を超える活性の増加を示したが、１ｂｐミスマッチスペーサー領域によるオフターゲット切断は検出されなかった。これは、スペーサー１１．３１によって標的化される、変異アレルがＷＴ配列と１ヌクレオチド異なる、ａｄＲＰ Ｐ２３Ｈ Ｒｈｏなどのアレル特異的治療戦略に関連する。この研究は、Ｐ２３Ｈ ＲＨＯの救出及び遺伝毒性研究、並びに他の治療標的のために設計されたＡＡＶベクターにおけるガイド足場２３５の使用を更に検証する。
実施例２２：触媒的に不活性なＣａｓＸがインビトロで内因性Ｂ２Ｍ遺伝子座で編集しないことの実証
触媒的に不活性なＣａｓＸがインビトロで内因性遺伝子β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を編集することができないことを実証するために実験を行う。
材料及び方法：
触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）構築物の生成及びクローニング：
足場バリアント１７４を有するＣａｓＸバリアント４９１、５２７、６６８、及び６７６をこれらの実験で使用する。Ｃａｓ９の陽性対照及び適切なガイドも含まれる。触媒的に不活性なＣａｓＸ４９１（ｄＣａｓＸ４９１；ＣＡＳ０９６；配列番号１１０７）及び触媒的に不活性なＣａｓＸ５２７（ｄＣａｓＸ５２７；ＣＡＳ１４２；配列番号１１０９）を生成するために、ＣａｓＸバリアント４９１のＲｕｖＣドメインのＤ６５９、Ｅ７５６、Ｄ９２１触媒残基、並びにＣａｓＸバリアント５２７のＲｕｖＣドメインのＤ６６０、Ｅ７５７、及びＤ９２２触媒残基を、アラニンに変異させて、エンドヌクレアーゼ活性を消失させる。同様に、ＣａｓＸバリアント６６８及び６７６のＲｕｖＣドメイン内の触媒残基でのＤ６６０、Ｅ７５７、Ｄ９２３からアラニンへの変異を、触媒的に不活性なＣａｓＸ６６８（ｄＣａｓＸ６６８；ＣＡＳ４０１；（配列番号ＸＸ）及び触媒的に不活性なＣａｓＸ６７６（ｄＣａｓＸ６７６；ＣＡＳ４０２；配列番号ＸＸ）を生成するために設計する。得られたプラスミド（表７に列挙されたｄＣａｓＸバリアントアミノ酸配列）は、以下の構成を有する構築物を含む：Ｅｆ１α－ＳＶ４０ＮＬＳ－ｄＣａｓＸバリアント－ＳＶ４０ＮＬＳ。プラスミドはまた、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的化するスペーサー（スペーサー。７．３７；ＧＧＣＣＧＡＧＡＵＧＵＣＵＣＧＣＵＣＣＧ；配列番号１１０５）又は非標的化対照（スペーサー０．０；ＣＧＡＧＡＣＧＵＡＡＵＵＡＣＧＵＣＵＣＧ；配列番号１１０６）のいずれかを有するｇＲＮＡ足場バリアント１７４をコードする配列を含む。
ｄＣａｓＸ４９１、ｄＣａｓＸ５２７、ｄＣａｓＸ６６８、及びｄＣａｓＸ６７６をコードする配列を含む構築物を、オリゴヌクレオチドとして注文し、重複伸長ＰＣＲ、続いて、等温アセンブリによって構築し、触媒的に不活性なＣａｓＸバリアントをコードするプラスミドを構築する。等温アセンブリ後、得られたプラスミドを、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、３７℃で１時間回復させた後、カナマイシンＬＢ寒天プレート上にプレーティングする。単一コロニーを採取して、コロニーＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒ配列決定を行う。配列を検証した構築物を、その後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションのためにミディプレップする。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのプラスミドトランスフェクション：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに３０，０００細胞の密度で播種する。翌日、各ウェルを、リポフェクタミンを使用して、Ｂ２Ｍ遺伝子座に対する非標的化スペーサー０．０又は標的化スペーサー７．３７のいずれかを有するｇＲＮＡとともに、ＣａｓＸバリアント４９１、ｄＣａｓＸ４９１、ｄＣａｓＸ５２７、ｄＣａｓＸ６６８、又はｄＣａｓＸ６７６（表７の配列）をコードするＣａｓＸ： ｇＲＮＡ構築物を含む１００ｎｇの触媒的に不活性なバリアントプラスミドで一過的にトランスフェクトする。各構築物を３連で試験する。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、２μｇ／ｍＬのピューロマイシンで選択する。トランスフェクションの６日後、次世代配列決定（ＮＧＳ）による編集分析、及びＢ２Ｍ免疫染色、続いて、フローサイトメトリーによるＢ２Ｍタンパク質の発現分析のために、細胞を採取する。Ｂ２Ｍの発現は、細胞表面に発現されるＢ２Ｍ依存性ＨＬＡタンパク質を検出する抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用することによって決定される。ＨＬＡ＋細胞を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターを使用して測定する。
ＮＧＳ処理及び分析：
回収した細胞からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、製造業者の説明書に従ってＺｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ－ＤＮＡミニプレッププラスキットを使用して抽出する。標的アンプリコンは、ヒトＢ２Ｍ遺伝子座に特異的なプライマーのセットを用いて、２００ｎｇの抽出されたｇＤＮＡから目的の領域を増幅することによって形成される。これらの遺伝子特異的プライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及び１６ヌクレオチドの固有分子識別子を導入するために、５’末端に追加の配列を含む。増幅されたＤＮＡ産物を、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ ＤＮＡクリーンアップキットで精製する。Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ分析キット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して、アンプリコンの品質及び定量化を評価する。アンプリコンを、製造業者の説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定する。配列決定からの生のｆａｓｔｑファイルを品質管理し、ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ２．１、ｆｌａｓｈ２ ｖ２．２．００、及びＣＲＩＳｐＥＳｓｏ２ ｖ２．０．２９を使用して処理する。各配列は、スペーサーの３’末端周辺のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）において、参照配列と比較して挿入又は欠失（インデル）を含むことについて定量化する。ＣａｓＸ活性を、各試料について、このウィンドウ内のどこかに挿入、置換、及び／又は欠失を含むリードの割合の合計として定量化する。
結果：
この実験では、触媒的に活性なＣａｓＸ４９１によって媒介されるＢ２Ｍ遺伝子座での編集が実証され、Ｂ２Ｍタンパク質の発現の減少をもたらすことが予想される。一方、ｄＣａｓＸ４９１、ｄＣａｓＸ５２７、ｄＣａｓＸ６６８、又はｄＣａｓＸ６７６のいずれも、Ｂ２Ｍ遺伝子座での編集を示すとは予想されない。Ｂ２Ｍ遺伝子座の転写開始部位での触媒的に不活性なＣａｓＸ分子の予想される立体障害を考慮すると、酵素的に不活性なＣａｓＸ分子のいずれかによるＢ２Ｍタンパク質の発現のわずかな抑制が予想される。
実施例２３：ＭＳ２ヘアピン結合親和性の改善によるＸＤＰ編集効力の増強
ＣａｓＸ： ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体のｇＲＮＡがＧａｇ－ＭＳ２ ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）に対して高い親和性を有するＭＳ２ヘアピンを有する官能化ＲＮＡ伸長ステムを含む動員戦略を使用して、ＸＤＰの編集効力を改善することができるかどうかを決定するために実験を実施した。ＲＮＡヘアピンがＭＳ２ ＲＢＰに結合すると、ＸＤＰ粒子へのＣａｓＸ ＲＮＰカーゴの動員が可能になる。編集のためにＸＤＰが標的細胞に送達されると、このＲＮＡヘアピン－ＭＳ２ ＲＢＰが解離して、ＣａｓＸが核に移行できるようになると予想される。したがって、ＭＳ２タンパク質－ＲＮＡ複合体の安定性の増加は、ＸＤＰの形成を支持する。これは、ＭＳ２ ＲＮＡ結合タンパク質又はＲＮＡヘアピン配列を変化させて、これらの成分間の結合親和性を増加させることによって達成され得る。
この原理を更に調査するため、ＭＳ２ ＲＢＰに対する様々な親和性を有するＲＮＡヘアピンバリアントを組み込んだｇＲＮＡを、ハイスループットのインビトロ生化学アッセイを使用して評価し、平衡結合及び解離動態を評価した（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ａ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ａｒｒａｙ ｒｅｖｅａｌｓ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（６）： ５６２（２０１４））。表３４に、ｇＲＮＡヘアピンバリアント及びそれらの関連するＫＤ（解離定数）値を列挙する。表３５に、異なるＭＳ２ ＲＮＡヘアピンバリアントをコードするガイドプラスミドの配列を提供する。表３６に、ＭＳ２ヘアピンの配列を提供する。改善された結合親和性を有するＭＳ２ヘアピンバリアントを含むｇＲＮＡが、ＸＤＰ形成又は編集効力を増強するかどうかを調べるために、実験を実施した。具体的には、様々な平衡結合親和性を有する複数のＭＳ２ヘアピンバリアントを、ＸＤＰの効力及び力価に対するそれらの効果について評価した。いくつかの非結合バリアントもこれらの実験に含まれた。
材料及び方法：
ＣａｓＸタンパク質をコードする全てのプラスミドは、ＣａｓＸバリアント４９１に属する。全てのＸＤＰを、１０％のＶＳＶ－Ｇ（他のＸＤＰ構造プラスミドに対するＶＳＶ－Ｇプラスミドの割合）でシュードタイプ化した。ＲＮＡフォールド構造を、ＲＮＡｆｏｌｄウェブサーバー及びＶＡＲＮＡソフトウェアを用いて生成した。ＸＤＰを産生するための方法は、本明細書並びに国際公開第２０２１１１３７７２（Ａ１）号（その全体が参照により援用される）に記載されている。
構造プラスミドのクローニング：
簡潔には、ＸＤＰ構造プラスミドを生成するために、Ｇａｇ－ｐｏｌ配列をｐＸＤＰ１（ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）から除去し、増幅し、ＣａｓＸ４９１、ＨＩＶ－１、又はＭＳ２ ＣＰ成分をコードする精製された断片を、製造業者のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を使用して、プラスミド骨格にクローニングした。構築された産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、３７℃で回復させた後、アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。個々のコロニーを採取し、ミニプレップし、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を行い、アセンブリを検証した。表３５に、プラスミドの配列を列挙する。
ガイドプラスミドのクローニング：
ＭＳ２ ＲＮＡヘアピンバリアントを含む全てのガイドプラスミドには、ｔｄＴｏｍａｔｏ標的化スペーサー１２．７（ＣＵＧＣＡＵＵＣＵＡＧＵＵＧＵＧＧＵＵＵ；配列番号１１４６）が組み込まれた。ｔｄＴｏｍａｔｏ標的化スペーサーを、前述のようにクローニングした。簡潔には、スペーサーを、２つのオリゴをアニーリングすることによって作製し、適切な制限酵素を用いたＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって、別の足場を有するｐＳＧプラスミドにクローニングした。クローニングしたスペーサーを、検証のために、形質転換、ミニプレップ、及びＳａｎｇｅｒ配列決定に供した。
ｐＧＰ２糖タンパク質のプラスミドクローニング：
簡潔には、ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質及びＣＭＶプロモーターをコードする配列、並びにカナマイシン耐性プラスミドから得られた骨格を、前述のように増幅及び精製した。これらの構築物を、製造業者のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｔａｋａｒａ）を使用して、プラスミド骨格にクローニングした。構築された産物を、化学的にコンピテントなＴｕｒｂｏコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃でインキュベートした。個々のコロニーを採取し、ミニプレップし、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を行い、アセンブリを検証した。
ＸＤＰの産生：
簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ Ｌｅｎｔｉ－Ｘ細胞を、７０～９０％コンフルエントに達するように、トランスフェクションの２４時間前に、１皿当たり２０×１０６細胞で１５ｃｍ皿に播種した。翌日、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ細胞を、ＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｐｕｓ）を使用して、以下のプラスミドでトランスフェクトした：ＸＤＰ構造プラスミド（ＣａｓＸバリアントもコードする）、ガイドプラスミドバリアント、及びＸＤＰシュードタイプ化のためのｐＧＰ２。トランスフェクションの２４時間後、培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と交換した。トランスフェクションの７２時間後、ＸＤＰ含有培地を回収し、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。上清を濃縮し、遠心分離によって精製した。ＸＤＰを、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＥＰＥＳ、ＮＥＡＡ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２－メルカプトエタノール、Ｂ－２７（ビタミンＡを含まない）、及びＮ２を補充した５００μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２に再懸濁した。
ｔｄＴｏｍａｔｏ神経前駆細胞（ＮＰＣ）のＸＤＰ形質導入：
ｔｄＴｏｍａｔｏ ＮＰＣを、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＥＰＥＳ、ＮＥＡＡ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、２－メルカプトエタノール、Ｂ－２７（ビタミンＡを含まない）、及びＮ２を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２で増殖させた。細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ細胞解離試薬を使用して回収し、ＰＬＦでコーティングされた９６ウェルプレートに播種した。４８時間後、細胞を、ｔｄＴｏｍａｔｏ標的化スペーサーを含むＸＤＰで形質導入し、ニートの再懸濁したウイルスから始めて、５つの半対数希釈を行った。次いで、細胞を、１０００×ｇで１５分間遠心分離した。形質導入されたＮＰＣを、９６時間増殖させた後、フローサイトメトリーによって、ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子座での編集のマーカーとしてのｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を分析した。フローサイトメトリーによって決定されるように、５０％の細胞における編集を達成するために必要なＸＤＰ粒子の数として、ＥＣ５０を決定した。アッセイは、各試料について２～３回実行し、同様の結果を得た。
結果：
Ｇａｇ－ＭＳ２、Ｇａｇ－ｐｒｏ、ＣａｓＸ、ｇＲＮＡ足場バリアント、及びＶＳＶ－Ｇから構成されるＸＤＰを、元のＭＳ２（ＭＳ２ ＷＴ）又はＭＳ２高親和性バリアント（ＭＳ２ ３５３）のいずれかを用いて産生した。その後、産生されたＸＤＰを、ＮＰＣにおけるｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子座でのそれらの編集効率について評価した。図４９は、０．００７μＬの濃縮ＸＤＰ調製物を使用してＮＰＣに形質導入した場合の、フローサイトメトリーを使用してｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光によって測定したｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子座での編集の割合（％）を示す。基本対照ｇＲＮＡ足場１８８及び２５１に加えて、高親和性足場バリアント２９６及び２９８は、ＭＳ２ ＷＴ及びＭＳ２ ３５３の両方で増強された効力を示し、ＫＤ値が１．８～２．１ｎＭの範囲であった。更に、中親和性足場バリアント３０３、３０４、３０５、３０７、３１０及び３１３は、９．２～３６．９ｎＭの範囲のＫＤ値を有し、有望な編集効率をもたらした。図５０は、ＭＳ２ ＷＴ及びＭＳ ３５３構成を組み込んだ異なるｇＲＮＡ足場にわたるＥＣ５０の結果を示す。足場バリアント２９６、２９７、及び３０５は、足場１８８と比較して、わずかに高い効力を示し、この利点は、ＭＳ２ ３５３構成でより明らかであった。図５１は、ｇＲＮＡ ＭＳ２ヘアピンの親和性（ＫＤ）と得られたＸＤＰ効力（ＥＣ５０）との間の明らかな相関を示し、Ｒ２値が０．８１である（ｐ＜０．００１）。３５ｎＭ未満の親和性を有するＭＳ２を含むＸＤＰは、ＸＤＰへのＣａｓＸ ＲＮＰの効率的な動員及びパッケージングをもたらした。しかしながら、これらの実験の条件下では、ｇＲＮＡ ＭＳ２ヘアピンの親和性Ｋと得られたＸＤＰ力価との間に相関関係は観察されなかった（図５２）。

Claims (191)

  1. 配列番号２２９２、２２９１、２３０７、２２８１～２２９０、２２９３～２３０６、２３０８～２３３２、及び２３５３０～２３９８からなる群から選択される配列のうちのいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）足場。
  2. 配列番号２２９２、２２９１、２３０７、２２８１～２２９０、２２９３～２３０６、２３０８～２３３２、及び２３５３０～２３９８からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ足場。
  3. 配列番号２２３８に対して１つ以上の改変を有する配列を含み、前記１つ以上の改変が、改善された特徴をもたらす、請求項１に記載のｇＲＮＡ足場。
  4. 前記１つ以上の改変が、表１９に示される１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、及び／又は欠失を含む、請求項３に記載のｇＲＮＡ足場。
  5. 前記改善された特徴が、任意選択的にインビトロアッセイにおける、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、足場ステム安定性の増加、伸長ステム安定性、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である、請求項３又は請求項４に記載のｇＲＮＡ足場。
  6. 前記ｇＲＮＡ足場が、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３８のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す、請求項３～５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ足場。
  7. 配列番号２２３９に対して１つ以上の改変を有する配列を含み、前記１つ以上の改変が、改善された特徴をもたらす、請求項１に記載のｇＲＮＡ足場。
  8. 前記１つ以上の改変が、表２０に示される１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入、及び／又は欠失を含む、請求項７に記載のｇＲＮＡ足場。
  9. 前記改善された特徴が、任意選択的にインビトロアッセイにおける、編集活性の増加、シュードノットステム安定性の増加、三重鎖領域安定性の増加、足場ステム安定性の増加、伸長ステム安定性、オフターゲットフォールディング中間体の減少、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性の増加からなる群から選択される１つ以上の機能特性である、請求項７又は請求項８に記載のｇＲＮＡ足場。
  10. 前記ｇＲＮＡ足場が、インビトロアッセイにおいて、配列番号２２３９のｇＲＮＡ足場のスコアと比較して、少なくとも約１．２、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、又は少なくとも約３．５大きい改善された濃縮スコア（ｌｏｇ２）を示す、請求項７～９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ足場。
  11. 配列番号２２３９の配列に対して、Ｃ９、Ｕ１１、Ｃ１７、Ｕ２４、Ａ２９、Ｕ５４、Ｇ６４、Ａ８８、及びＡ９５からなる群から選択される位置に１つ以上の改変を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ足場。
  12. 配列番号２２３９の配列に対して、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位でのＧの挿入、６４位でのＣの挿入、Ａ８８Ｇ、及びＡ９５Ｇからなる群から選択される１つ以上の改変を含む、請求項１１に記載のｇＲＮＡ足場。
  13. 配列番号２２３９の配列に対して、Ｃ９Ｕ、Ｕ１１Ｃ、Ｃ１７Ｇ、Ｕ２４Ｃ、Ａ２９Ｃ、５４位でのＧの挿入、６４位でのＣの挿入、Ａ８８Ｇ、及びＡ９５Ｇからなる改変を含む、請求項１２に記載のｇＲＮＡ足場。
  14. 前記改善された特徴が、シュードノットステム安定性、三重鎖領域安定性、足場バブル安定性、伸長ステム安定性、及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する結合親和性からなる群から選択される、請求項７～１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ足場。
  15. 配列番号２２３９の配列に対する前記６４位でのＣの挿入及び前記Ａ８８Ｇの置換が、前記伸長ステムの非対称バルジエレメントを解消し、前記ｇＲＮＡ足場の前記伸長ステムの安定性を増強する、請求項１４に記載のｇＲＮＡ足場。
  16. Ｕ１１Ｃ、Ｕ２４Ｃ、及びＡ９５Ｇの置換が、前記ｇＲＮＡ足場の前記三重鎖領域の安定性を増加させる、請求項１４に記載のｇＲＮＡ足場。
  17. 前記Ａ２９Ｃの置換が、前記シュードノットステムの安定性を増加させる、請求項１４に記載のｇＲＮＡ足場。
  18. 前記ｇＲＮＡ足場が、前記伸長ステムにおいて１つ以上の異種ＲＮＡ配列を含む、請求項１又は請求項２に記載のｇＲＮＡ足場。
  19. 前記異種ＲＮＡが、ＭＳ２ヘアピン、Ｑβヘアピン、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘヘアピン、及びＰＰ７ステムループ、又はそれらの配列バリアントからなる群から選択される、請求項１８に記載のｇＲＮＡ足場。
  20. 前記異種ＲＮＡ配列が、前記ｇＲＮＡの安定性を増加させる、請求項１８又は請求項１９に記載のｇＲＮＡ足場。
  21. 前記異種ＲＮＡが、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は小分子に結合することができる、請求項１８又は請求項１９に記載のｇＲＮＡ足場。
  22. 前記ｇＲＮＡ足場が、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）又はその一部を含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ足場。
  23. 前記ＲＲＥ又はその一部が、配列ＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡ（配列番号１２８０）を有する前記ＲＲＥのステムＩＩＢ、配列ＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧ（配列番号１２８２）を有する前記ＲＲＥのステムＩＩ－Ｖ、配列ＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣ（配列番号１２８１）を有する前記ＲＲＥのステムＩＩ、配列ＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣ（配列番号１２８４）を有するステムＩＩＢのＲｅｖ結合エレメント（ＲＢＥ）、及び配列ＡＧＧＡＧＣＵＵＵＧＵＵＣＣＵＵＧＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＡＣＵＡＵＧＧＧＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＡＵＧＡＣＧＣＵＧＡＣＧＧＵＡＣＡＧＧＣＣＡＧＡＣＡＡＵＵＡＵＵＧＵＣＵＧＧＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＡＡＵＵＵＧＣＵＧＡＧＧＧＣＵＡＵＵＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＡＧＣＡＵＣＵＧＵＵＧＣＡＡＣＵＣＡＣＡＧＵＣＵＧＧＧＧＣＡＵＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＵＣＣＵＧＧＣＵＧＵＧＧＡＡＡＧＡＵＡＣＣＵＡＡＡＧＧＡＵＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＵ（配列番号１２８３）を有する全長ＲＲＥからなる群から選択される、請求項２２に記載のｇＲＮＡ足場。
  24. 前記ｇＲＮＡ足場が、１つ以上のチミン（Ｔ）を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ足場と、前記ｇＲＮＡ足場の３’末端の、標的核酸配列に相補的である標的化配列と、を含む、ｇＲＮＡ。
  26. 前記標的化配列が、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドを有する、請求項２５に記載のｇＲＮＡ。
  27. 前記標的化配列が、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを有する、請求項２６に記載のｇＲＮＡ。
  28. 前記ｇＲＮＡが、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができる、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ。
  29. 操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質であって、
    ａ．ＱＰＡＳＫＫＩＤＱＮＫＬＫＰＥＭＤＥＫＧＮＬＴＴＡＧＦＡＣＳＱＣＧＱＰＬＦＶＹＫＬＥＱＶＳＥＫＧＫＡＹＴＮＹＦＧＲＣＮＶＡＥＨＥＫＬＩＬＬＡＱＬＫＰＥＫＤＳＤＥＡＶＴＹＳＬＧＫＦＧＱ（配列番号２３３５）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＮＴＳＢドメインと、
    ｂ．ＲＡＬＤＦＹＳＩＨＶＴＫＥＳＴＨＰＶＫＰＬＡＱＩＡＧＮＲＹＡＳＧＰＶＧＫＡＬＳＤＡＣＭＧＴＩＡＳＦＬＳＫＹＱＤＩＩＩＥＨＱＫＶＶＫＧＮＱＫＲＬＥＳＬＲＥＬＡＧＫＥＮＬＥＹＰＳＶＴＬＰＰＱＰＨＴＫＥＧＶＤＡＹＮＥＶＩＡＲＶＲＭＷＶＮＬＮＬＷＱＫＬＫＬＳＲＤＤＡＫＰＬＬＲＬＫＧＦＰＳＦ（配列番号２３３６）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩ－ＩＩドメインと、
    ｃ．ＰＬＶＥＲＱＡＮＥＶＤＷＷＤＭＶＣＮＶＫＫＬＩＮＥＫＫＥＤＧＫＶＦＷＱＮＬＡＧＹＫＲＱＥＡＬＲＰＹＬＳＳＥＥＤＲＫＫＧＫＫＦＡＲＹＱＬＧＤＬＬＬＨＬＥＫＫＨＧＥＤＷＧＫＶＹＤＥＡＷＥＲＩＤＫＫＶＥＧＬＳＫＨＩＫＬＥＥＥＲＲＳＥＤＡＱＳＫＡＡＬＴＤＷＬＲＡＫＡＳＦＶＩＥＧＬＫＥＡＤＫＤＥＦＣＲＣＥＬＫＬＱＫＷＹＧＤＬＲＧＫＰＦＡＩＥＡＥ（配列番号２３５１）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩＩドメインと、
    ｄ．ＳＳＮＩＫＰＭＮＬＩＧＶＤＲＧＥＮＩＰＡＶＩＡＬＴＤＰＥＧＣＰＬＳＲＦＫＤＳＬＧＮＰＴＨＩＬＲＩＧＥＳＹＫＥＫＱＲＴＩＱＡＫＫＥＶＥＱＲＲＡＧＧＹＳＲＫＹＡＳＫＡＫＮＬＡＤＤＭＶＲＮＴＡＲＤＬＬＹＹＡＶＴＱＤＡＭＬＩＦＥＮＬＳＲＧＦＧＲＱＧＫＲＴＦＭＡＥＲＱＹＴＲＭＥＤＷＬＴＡＫＬＡＹＥＧＬＰＳＫＴＹＬＳＫＴＬＡＱＹＴＳＫＴＣ（配列番号２３５２）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＲｕｖＣ－Ｉドメインと、を含む、操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  30. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＱＥＩＫＲＩＮＫＩＲＲＲＬＶＫＤＳＮＴＫＫＡＧＫＴＧＰＭＫＴＬＬＶＲＶＭＴＰＤＬＲＥＲＬＥＮＬＲＫＫＰＥＮＩＰＱ（配列番号２３４２）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＯＢＤ－Ｉドメインを含む、請求項２９に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  31. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、
    ＮＳＩＬＤＩＳＧＦＳＫＱＹＮＣＡＦＩＷＱＫＤＧＶＫＫＬＮＬＹＬＩＩＮＹＦＫＧＧＫＬＲＦＫＫＩＫＰＥＡＦＥＡＮＲＦＹＴＶＩＮＫＫＳＧＥＩＶＰＭＥＶＮＦＮＦＤＤＰＮＬＩＩＬＰＬＡＦＧＫＲＱＧＲＥＦＩＷＮＤＬＬＳＬＥＴＧＳＬＫＬＡＮＧＲＶＩＥＫＴＬＹＮＲＲＴＲＱＤＥＰＡＬＦＶＡＬＴＦＥＲＲＥＶＬＤ（配列番号２３４７）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＯＢＤ－ＩＩドメインを含む、請求項２９又は請求項３０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  32. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＰＩＳＮＴＳＲＡＮＬＮＫＬＬＴＤＹＴＥＭＫＫＡＩＬＨＶＹＷＥＥＦＱＫＤＰＶＧＬＭＳＲＶＡ（配列番号２３４３）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むヘリックスＩ－Ｉドメインを含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  33. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＳＮＣＧＦＴＩＴＳＡＤＹＤＲＶＬＥＫＬＫＫＴＡＴＧＷＭＴＴＩＮＧＫＥＬＫＶＥＧＱＩＴＹＹＮＲＹＫＲＱＮＶＶＫＤＬＳＶＥＬＤＲＬＳＥＥＳＶＮＮＤＩＳＳＷＴＫＧＲＳＧＥＡＬＳＬＬＫＫＲＦＳＨＲＰＶＱＥＫＦＶＣＬＮＣＧＦＥＴＨ（配列番号２３４９）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＴＳＬドメインを含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  34. 前記ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、
    ＡＤＥＱＡＡＬＮＩＡＲＳＷＬＦＬＲＳＱＥＹＫＫＹＱＴＮＫＴＴＧＮＴＤＫＲＡＦＶＥＴＷＱＳＦＹＲＫＫＬＫＥＶＷＫＰＡＶ（配列番号２３５０）の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含むＲｕｖＣ－ＩＩドメインを含む、請求項２９～３３のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  35. 配列番号４１６の配列、又はそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項３４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  36. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、１つ以上のドメインに少なくとも１つの改変を含む、請求項２９～３５のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  37. 前記少なくとも１つの改変が、
    ａ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸置換、
    ｂ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸欠失、
    ｃ．ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸挿入、又は
    ｄ．（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせを含む、請求項３６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  38. 配列番号２３３５に対して、Ｐ２、Ｓ４、Ｑ９、Ｅ１５、Ｇ２０、Ｇ３３、Ｌ４１、Ｙ５１、Ｆ５５、Ｌ６８、Ａ７０、Ｅ７５、Ｋ８８、及びＧ９０からなる群から選択される前記ＮＴＳＢドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、請求項３６又は請求項３７に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  39. 前記ＮＴＳＢドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号２３３５に対する、２位でのＧの挿入、４位でのＩの挿入、４位でのＬの挿入、Ｑ９Ｐ、Ｅ１５Ｓ、Ｇ２０Ｄ、３０位でのＳの欠失、Ｇ３３Ｔ、Ｌ４１Ａ、Ｙ５１Ｔ、Ｆ５５Ｖ、Ｌ６８Ｄ、Ｌ６８Ｅ、Ｌ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ａ７０Ｓ、Ｅ７５Ａ、Ｅ７５Ｄ、Ｅ７５Ｐ、Ｋ８８Ｑ、及びＧ９０Ｑからなる群から選択される、請求項３８に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  40. 配列番号２３３６に対して、Ｉ２４、Ａ２５、Ｙ２９ Ｇ３２、Ｇ４４、Ｓ４８、Ｓ５１、Ｑ５４、Ｉ５６、Ｖ６３、Ｓ７３、Ｌ７４、Ｋ９７、Ｖ１００、Ｍ１１２、Ｌ１１６、Ｇ１３７、Ｆ１３８、及びＳ１４０からなる群から選択される前記ヘリックスＩ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、請求項３６～３９のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  41. 前記ヘリックスＩ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号２３３６に対する、２４位でのＴの挿入、２５位でのＣの挿入、Ｙ２９Ｆ、Ｇ３２Ｙ、Ｇ３２Ｎ、Ｇ３２Ｈ、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ３２Ａ、Ｇ３２Ｖ、３２位でのＧの欠失、Ｇ３２Ｓ、Ｇ３２Ｔ、Ｇ４４Ｌ、Ｇ４４Ｈ、Ｓ４８Ｈ、Ｓ４８Ｔ、Ｓ５１Ｔ、Ｑ５４Ｈ、Ｉ５６Ｔ、Ｖ６３Ｔ、Ｓ７３Ｈ、Ｌ７４Ｙ、Ｋ９７Ｇ、Ｋ９７Ｓ、Ｋ９７Ｄ、Ｋ９７Ｅ、Ｖ１００Ｌ、Ｍ１１２Ｔ、Ｍ１１２Ｗ、Ｍ１１２Ｒ、Ｍ１１２Ｋ、Ｌ１１６Ｋ、Ｇ１３７Ｒ、Ｇ１３７Ｋ、Ｇ１３７Ｎ、１３８位でのＱの挿入、及びＳ１４０Ｑからなる群から選択される、請求項４０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  42. 配列番号２３５１に対して、Ｌ２、Ｖ３、Ｅ４、Ｒ５、Ｑ６、Ａ７、Ｅ９、Ｖ１０、Ｄ１１、Ｗ１２、Ｗ１３、Ｄ１４、Ｍ１５、Ｖ１６、Ｃ１７、Ｎ１８、Ｖ１９、Ｋ２０、Ｌ２２、Ｉ２３、Ｅ２５、Ｋ２６、Ｋ３１、Ｑ３５、Ｌ３７、Ａ３８、Ｋ４１、Ｒ ４２、Ｑ４３、Ｅ４４、Ｌ４６、Ｋ５７、Ｙ６５、Ｇ６８、Ｌ７０、Ｌ７１、Ｌ７２、Ｅ７５、Ｇ７９、Ｄ８１、Ｗ８２、Ｋ８４、Ｖ８５、Ｙ８６、Ｄ８７、Ｉ９３、Ｋ９５、Ｋ９６、Ｅ９８、Ｌ１００、Ｋ１０２、Ｉ１０４、Ｋ１０５、Ｅ１０９、Ｒ１１０、Ｄ１１４、Ｋ１１８、Ａ１２０、Ｌ１２１、Ｗ１２４、Ｌ１２５、Ｒ１２６、Ａ１２７、Ａ１２９、Ｉ１３３、Ｅ１３４、Ｇ１３５、Ｌ１３６、Ｅ１３８、Ｄ１４０、Ｋ１４１、Ｄ１４２、Ｅ１４３、Ｆ１４４、Ｃ１４５、Ｃ１４７、Ｅ１４８、Ｌ１４９、Ｋ１５０、Ｌ１５１、Ｑ１５２、Ｋ１５３、Ｌ１５８、Ｅ１６６、及びＡ１６７からなる群から選択される前記ヘリックスＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  43. 前記ヘリックスＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号２３５１に対する、２位でのＡの挿入、２位でのＨの挿入、２位でのＬの欠失、及び３位でのＶの欠失、Ｖ３Ｅ、Ｖ３Ｑ、Ｖ３Ｆ、３位でのＶの欠失、３位でのＤの挿入、Ｖ３Ｐ、Ｅ４Ｐ、４位でのＥの欠失、Ｅ４Ｄ、Ｅ４Ｌ、Ｅ４Ｒ、Ｒ５Ｎ、Ｑ６Ｖ、６位でのＱの挿入、７位でのＧの挿入、９位でのＨの挿入、９位でのＡの挿入、ＶＤ１０、０位でのＴ１の挿入、１０位でのＶの欠失、１０位でのＦの挿入、１１位でのＤの挿入、１１位でのＤの欠失、Ｄ１１Ｓ、１２位でのＷの欠失、Ｗ１２Ｔ、Ｗ１２Ｈ、１２位でのＰの挿入、１３位でのＱの挿入、１２位でのＧの挿入、１３位でのＲの挿入、Ｗ１３Ｐ、Ｗ１３Ｄ、１３位でのＤの挿入、Ｗ１３Ｌ、１４位でのＰの挿入、１４位でのＤの挿入、１４位でのＤの欠失、及び１５位でのＭの欠失、１５位でのＭの欠失、１６位でのＴの挿入、１７位でのＰの挿入、Ｎ１８Ｉ、Ｖ１９Ｎ、Ｖ１９Ｈ、Ｋ２０Ｄ、Ｌ２２Ｄ、Ｉ２３Ｓ、Ｅ２５Ｃ、Ｅ２５Ｐ、２５位でのＧの挿入、Ｋ２６Ｔ、Ｋ２７Ｅ、Ｋ３１Ｌ、Ｋ３１Ｙ、Ｑ３５Ｄ、Ｑ３５Ｐ、３７位でのＳの挿入、３７位でのＬの欠失、及び３８位でのＡの欠失、Ｋ４１Ｌ、４２位でのＲの挿入、４３位でのＱの欠失、及び４４位でのＥの欠失、Ｌ４６Ｎ、Ｋ５７Ｑ、Ｙ６５Ｔ、Ｇ６８Ｍ、Ｌ７０Ｖ、Ｌ７１Ｃ、Ｌ７２Ｄ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｗ、Ｌ７２Ｙ、Ｅ７５Ｆ、Ｅ７５Ｌ、Ｅ７５Ｙ、Ｇ７９Ｐ、７９位でのＥの挿入、８１位でのＴの挿入、８１位でのＲの挿入、８１位でのＷの挿入、８１位でのＹの挿入、８２位でのＷの挿入、８２位でのＹの挿入、Ｗ８２Ｇ、Ｗ８２Ｒ、Ｋ８４Ｄ、Ｋ８４Ｈ、Ｋ８４Ｐ、Ｋ８４Ｔ、Ｖ８５Ｌ、Ｖ８５Ａ、８５位でのＬの挿入、Ｙ８６Ｃ、Ｄ８７Ｇ、Ｄ８７Ｍ、Ｄ８７Ｐ、Ｉ９３Ｃ、Ｋ９５Ｔ、Ｋ９６Ｒ、Ｅ９８Ｇ、Ｌ１００Ａ、Ｋ１０２Ｈ、Ｉ１０４Ｔ、Ｉ１０４Ｓ、Ｉ１０４Ｑ、Ｋ１０５Ｄ、１０９位でのＫの挿入、Ｅ１０９Ｌ、Ｒ１１０Ｄ、１１０位でのＲの欠失、Ｄ１１４Ｅ、１１４位でのＤの挿入、Ｋ１１８Ｐ、Ａ１２０Ｒ、Ｌ１２１Ｔ、Ｗ１２４Ｌ、Ｌ１２５Ｃ、Ｒ１２６Ｄ、Ａ１２７Ｅ、Ａ１２７Ｌ、Ａ１２９Ｔ、Ａ１２９Ｋ、Ｉ１３３Ｅ、１３３位でのＣの挿入、１３４位でのＳの挿入、１３４位でのＧの挿入、１３５位でのＲの挿入、Ｇ１３５Ｐ、Ｌ１３６Ｋ、Ｌ１３６Ｄ、Ｌ１３６Ｓ、Ｌ１３６Ｈ、１３８位でのＥの欠失、Ｄ１４０Ｒ、１４０位でのＤの挿入、１４１位でのＰの挿入、１４２位でのＤの挿入、１４３＋位でのＥの欠失、１４４位でのＦの欠失、１４３位でのＱの挿入、Ｆ１４４Ｋ、１４４位でのＦの欠失、１４４位でのＦの欠失、及び１４５位でのＣの欠失、Ｃ１４５Ｒ、１４５位でのＧの挿入、Ｃ１４５Ｋ、Ｃ１４７Ｄ、１４８位でのＶの挿入、Ｅ１４８Ｄ、１４９位でのＨの挿入、Ｌ１４９Ｒ、Ｋ１５０Ｒ、Ｌ１５１Ｈ、Ｑ１５２Ｃ、Ｋ１５３Ｐ、Ｌ１５８Ｓ、Ｅ１６６Ｌ、及び１６７位でのＦの挿入からなる群から選択される、請求項４２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  44. 配列番号２３５２に対して、Ｉ４、Ｋ５、Ｐ６、Ｍ７、Ｎ８、Ｌ９、Ｖ１２、Ｇ４９、Ｋ６３、Ｋ８０、Ｎ８３、Ｒ９０、Ｍ１２５、及びＬ１４６からなる群から選択される前記ＲｕｖＣ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、請求項３６～４３のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  45. 前記ＲｕｖＣ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号２３５１に対する、４位でのＩの挿入、５位でのＳの挿入、６位でのＴの挿入、６位でのＮの挿入、７位でのＲの挿入、７位でのＫの挿入、８位でのＨの挿入、８位でのＳの挿入、Ｖ１２Ｌ、Ｇ４９Ｗ、Ｇ４９Ｒ、Ｓ５１Ｒ、Ｓ５１Ｋ、Ｋ６２Ｓ、Ｋ６２Ｔ、Ｋ６２Ｅ、Ｖ６５Ａ、Ｋ８０Ｅ、Ｎ８３Ｇ、Ｒ９０Ｈ、Ｒ９０Ｇ、Ｍ１２５Ｓ、Ｍ１２５Ａ、Ｌ１３７Ｙ、１３７位でのＰの挿入、１４１位でのＬの欠失、Ｌ１４１Ｒ、Ｌ１４１Ｄ、１４２位でのＱの挿入、１４３位でのＲの挿入、１４３位でのＮの挿入、Ｅ１４４Ｎ、１４６位でのＰの挿入、Ｌ１４６Ｆ、Ｐ１４７Ａ、Ｋ１４９Ｑ、Ｔ１５０Ｖ、１５２位でのＲの挿入、Ｈ１５３の挿入、Ｔ１５５Ｑ、１５５位でのＨの挿入、１５５位でのＲの挿入、１５６位でのＬの挿入、１５６位でのＬの欠失、１５６位でのＷの挿入、１５７位でのＡの挿入、１５７位でのＦの挿入、Ａ１５７Ｓ、Ｑ１５８Ｋ、１５９位でのＹの欠失、Ｔ１６０Ｙ、Ｔ１６０Ｆ、１６１位でのＩの挿入、Ｓ１６１Ｐ、Ｔ１６３Ｐ、１６３位でのＮの挿入、Ｃ１６４Ｋ、及びＣ１６４Ｍからなる群から選択される、請求項４４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  46. 配列番号２３４２に対して、Ｉ３、Ｋ４、Ｒ５、Ｉ６、Ｎ７、Ｋ８、Ｋ１５、Ｄ１６、Ｎ１８、Ｐ２７、Ｍ２８、Ｖ３３、Ｒ３４、Ｍ３６、Ｒ４１、Ｌ４７、Ｒ４８、Ｅ５２、Ｐ５５、及びＱ５６からなる群から選択される前記ＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、請求項３６～４５のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  47. 前記ＯＢＤ－Ｉドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号２３４２に対する、３位でのＧの挿入、Ｉ３Ｇ、Ｉ３Ｅ、４位でのＧの挿入、Ｋ４Ｇ、Ｋ４Ｐ、Ｋ４Ｓ、Ｋ４Ｗ、Ｋ４Ｗ、Ｒ５Ｐ、５位でのＰの挿入、５位でのＧの挿入、Ｒ５Ｓ、５位でのＳの挿入、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｐ、Ｒ５Ｇ、Ｒ５Ｌ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｌ、６位でのＧの挿入、Ｎ７Ｑ、Ｎ７Ｌ、Ｎ７Ｓ、Ｋ８Ｇ、Ｋ１５Ｆ、Ｄ１６Ｗ、１６位でのＦの挿入、Ｆ１８の挿入、２７位でのＰの挿入、Ｍ２８Ｐ、Ｍ２８Ｈ、Ｖ３３Ｔ、Ｒ３４Ｐ、Ｍ３６Ｙ、Ｒ４１Ｐ、Ｌ４７Ｐ、４８位でのＰの挿入、Ｅ５２Ｐ、５５位でのＰの挿入、５５位でのＰの欠失、及び５６位でのＱの欠失、Ｑ５６Ｓ、Ｑ５６Ｐ、５６位でのＤの挿入、５６位でのＴの挿入、及びＱ５６Ｐからなる群から選択される、請求項４６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  48. 配列番号２３４７に対して、Ｓ２、Ｉ３、Ｌ４、Ｋ１１、Ｖ２４、Ｋ３７、Ｒ４２、Ａ５３、Ｔ５８、Ｋ６３、Ｍ７０、Ｉ８２、Ｑ９２、Ｇ９３、Ｋ１１０、Ｌ１２１、Ｒ１２４、Ｒ１４１、Ｅ１４３、Ｖ１４４、及びＬ１４５からなる群から選択される前記ＯＢＤ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、請求項３６～４７のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  49. 前記ＯＢＤ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号２３４２に対する、２位でのＳの欠失、Ｉ３Ｒ、Ｉ３Ｋ、３位でのＩの欠失、及びＬ４の欠失、４位でのＬの欠失、Ｋ１１Ｔ、２４位でのＰの挿入、Ｋ３７Ｇ、Ｒ４２Ｅ、５３位でのＳの挿入、５８位でのＲの挿入、６３位でのＫの欠失、Ｍ７０Ｔ、Ｉ８２Ｔ、Ｑ９２Ｉ、Ｑ９２Ｆ、Ｑ９２Ｖ、Ｑ９２Ａ、９３位でのＡの挿入、Ｋ１１０Ｑ、Ｒ１１５Ｑ、Ｌ１２１Ｔ、１２４位でのＡの挿入、１４１位でのＲの挿入、１４３位でのＤの挿入、１４３位でのＡの挿入、１４４位でのＷの挿入、及び１４５位でのＡの挿入からなる群から選択される、請求項４８に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  50. 配列番号２３４９に対して、Ｓ１、Ｎ２、Ｃ３、Ｇ４、Ｆ５、Ｉ７、Ｋ１８、Ｖ５８、Ｓ６７、Ｔ７６、Ｇ７８、Ｓ８０、Ｇ８１、Ｅ８２、Ｓ８５、Ｖ９６、及びＥ９８からなる群から選択される前記ＴＳＬドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置で改変を含む、請求項３６～４９のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  51. 前記ＯＢＤ－ＩＩドメインにおける１つ以上のアミノ酸位置での前記１つ以上の改変が、配列番号２３４９に対する、１位でのＭの挿入、２位でのＮの欠失、２位でのＶの挿入、Ｃ３Ｓ、４位でのＧの挿入、４位でのＷの挿入、Ｆ５Ｐ、７位でのＷの挿入、Ｋ１８Ｇ、Ｖ５８Ｄ、６７位でのＡの挿入、Ｔ７６Ｅ、Ｔ７６Ｄ、Ｔ７６Ｎ、Ｇ７８Ｄ、８０位でのＳの欠失、８１位でのＧの欠失、８２位でのＥの挿入、８２位でのＮの挿入、Ｓ８５Ｉ、Ｖ９６Ｃ、Ｖ９６Ｔ、及びＥ９８Ｄからなる群から選択される、請求項５０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  52. 配列番号２と比較して改善された特徴を示し、前記改善された特徴が、ｇＲＮＡに対する結合親和性の増加、前記標的核酸に対する結合親和性の増加、前記標的核酸の前記編集においてより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、前記標的核酸の巻き戻しの改善、編集活性の増加、編集効率の改善、前記標的核酸の切断に対する編集特異性の改善、オフターゲット編集又は前記標的核酸の切断の減少、編集され得る真核生物ゲノムの割合の増加、ヌクレアーゼの活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、ＤＮＡの前記非標的鎖の結合の増加、タンパク質安定性の改善、タンパク質：ｇＲＮＡ（ＲＮＰ）複合体の安定性の増加、並びに改善された融合体特徴を含む、実施形態２９～５１のいずれか１つに記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  53. 前記改善された特徴が、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列での切断活性の増加を含む、請求項５２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  54. 前記改善された特徴が、配列番号４１６の配列の切断活性と比較して、ＡＴＣ又はＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列での切断活性の増加を含む、請求項５３に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  55. 前記改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号４１６の配列のスコアと比較して、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、請求項５４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  56. 前記改善された特徴が、配列番号４１６の配列と比較して、ＣＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列での切断活性の増加を含む、請求項５４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  57. 前記改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号４１６の配列のスコアと比較して、少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、若しくは少なくとも約６、又はそれ以上大きい濃縮スコア（ｌｏｇ２）である、請求項５６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  58. 前記改善された特徴が、配列番号４１６の配列と比較して、ＴＴＣ ＰＡＭ配列を含む標的核酸配列での切断活性の増加を含む、請求項５３に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  59. 前記改善された切断活性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号４１６の配列と比較して、少なくとも約１．５、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、若しくは少なくとも約６ｌｏｇ２、又はそれ以上大きい濃縮スコアである、請求項５８に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  60. 前記改善された特徴が、配列番号４１６の配列と比較して、前記標的核酸配列の切断に対する特異性の増加を含む、請求項５２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  61. 前記増加した特異性が、インビトロアッセイにおいて、配列番号４１６の配列と比較して、少なくとも約２．０、少なくとも約２．５、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、若しくは少なくとも約６ｌｏｇ２、又はそれ以上大きい濃縮スコアである、請求項６０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  62. 前記改善された特徴が、前記標的核酸配列のオフターゲット切断の減少を含む、請求項５２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  63. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、表３に示される配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１の配列からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、若しくは少なくとも約９５％、若しくは少なくとも約９６％、若しくは少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有する、請求項２９～６２のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  64. 表３に示される配列番号４１５～５９２及び１１４７～１２３１からなる群から選択される配列を含む、請求項２９～６２のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  65. １つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項２９～６４のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  66. 前記１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３５２）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号３５３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３５４）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号３５５）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号３５６）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号３５７）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号３５８）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３５９）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号３６０）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３６１）、ＤＲＬＲＲ（配列番号３６２）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３６３）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３６４）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３６５）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３６６）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３６７）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号３６８）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号３６９）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号３７０）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号３７１）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号３７２）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号３７３）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号３７４）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号３７５）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号３７６）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３７７）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３７８）、ＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号３７９）、ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号３８０）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号３８１）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号３８２）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号３８３）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号３８４）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号３８５）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号３８６）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号３８７）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３８９）、ＰＡＫＲＡＲＲＧＹＫＣ（配列番号６３）、ＫＬＧＰＲＫＡＴＧＲＷ（配列番号６４）、ＰＲＲＫＲＥＥ（配列番号６５）、ＰＹＲＧＲＫＥ（配列番号６６）、ＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号６７）、ＰＬＲＫＲＰＲＲＧＳＰＬＲＫＲＰＲＲ（配列番号６８）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６９）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＧＩＨＧＶＰＡＡ（配列番号７０）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号７１）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＰＧ（配列番号７２）、ＫＲＫＧＳＰＥＲＧＥＲＫＲＨＷ（配列番号７３）、ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７４）、及びＰＫＫＫＲＫＶＧＧＳＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７５）からなる配列の群から選択され、任意選択的に、前記１つ以上のＮＬＳが、リンカーペプチドを用いて、クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質又は隣接するＮＬＳに連結され、前記リンカーペプチドが、ＳＲ、ＲＳ、（Ｇ）ｎ（配列番号１０２３）、（ＧＳ）ｎ（配列番号１０２４）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３９９）、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４００）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０１）、ＧＧＳＧ（配列番号４０２）、ＧＧＳＧＧ（配列番号４０３）、ＧＳＧＳＧ（配列番号４０４）、ＧＳＧＧＧ（配列番号４０５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号４０６）、ＧＳＳＳＧ（配列番号４０７）、ＧＰＧＰ（配列番号４０８）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号４０９）、ＰＰＰＧ（配列番号２４）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号４１０）、ＰＰＰ（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＳ）ｎＰＰＰ（配列番号２６）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ（配列番号１０２５）、及びＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥ（配列番号２７）（式中、ｎは１～５である）からなる群から選択される、請求項６５に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  67. 前記１つ以上のＮＬＳが、前記タンパク質のＣ末端又はその近くに位置する、請求項６５又は請求項６６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  68. 前記１つ以上のＮＬＳが、前記タンパク質のＮ末端又はその近くに位置する、請求項６５又は請求項６６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  69. 少なくとも２つのＮＬＳを含み、前記少なくとも２つのＮＬＳが、前記タンパク質のＮ末端又はその近く及びＣ末端又はその近くに位置する、請求項６５又は請求項６６に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  70. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ｇＲＮＡとリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、請求項２９～６９のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  71. 前記ＲＮＰが、配列番号１～３のうちのいずれか１つの参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５のｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特徴を示す、請求項７０に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  72. 前記改善された特徴が、ガイド核酸（ｇＲＮＡ）に対する結合親和性の増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、標的核酸の前記編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の改善、前記標的核酸の巻き戻しの増加、編集活性の増加、編集効率の増加、前記標的核酸の編集特異性の増加、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、前記標的核酸のオフターゲット切断の減少、非標的核酸鎖の結合の増加、及びタンパク質：ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の増加からなる群から選択される、実施形態７１に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  73. 前記ＲＮＰの前記改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５の前記ｇＲＮＡの前記ＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍増加している、請求項７１又は請求項７２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  74. 前記ＲＮＰの前記改善された特徴が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の前記参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５の前記ｇＲＮＡの前記ＲＮＰと比較して、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１，０００倍、又は少なくとも約１０，０００倍増加している、請求項７１又は請求項７２に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  75. 前記ＲＮＰの前記改善された特徴が、配列番号２の前記参照タンパク質、及び配列番号４又は５を含む前記ｇＲＮＡの前記ＲＮＰと比較して、編集効率の１．１～１００倍の改善を含む、請求項７１～７４のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  76. ｇＲＮＡ及びクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む遺伝子編集ペアであって、前記ペアが、
    ａ．請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡと、
    ｂ．請求項２９～７５のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、を含む、遺伝子編集ペア。
  77. 前記ｇＲＮＡ及び前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、請求項７６に記載の遺伝子編集ペア。
  78. 前記ｇＲＮＡ及び前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として一緒に会合している、請求項７６又は請求項７７に記載の遺伝子編集ペア。
  79. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び前記ｇＲＮＡのＲＮＰが、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５の配列を含むｇＲＮＡのＲＮＰと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特徴を示す、請求項７７又は請求項７８に記載の遺伝子編集ペア。
  80. 前記改善された特徴が、前記ｇＲＮＡに対する前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の結合親和性の増加、標的核酸に対する結合親和性の増加、標的核酸の前記編集において、ＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、又はＴＴＣを含む１つ以上のより広範囲のＰＡＭ配列を利用する能力の増加、前記標的核酸の巻き戻しの増加、編集活性の増加、編集効率の増加、前記標的核酸の編集特異性の増加、ヌクレアーゼ活性の増加、二本鎖切断のための標的鎖装填の増加、一本鎖ニッキングのための標的鎖装填の減少、前記標的核酸のオフターゲット切断の減少、非標的核酸鎖の結合の増加、タンパク質：ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）の安定性の増加、及び融合体特徴の増加からなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項７９に記載の遺伝子編集ペア。
  81. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び前記ｇＲＮＡの前記ＲＮＰの前記改善された特徴が、同等のインビトロアッセイシステムにおいて、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５の配列を含む前記ｇＲＮＡの前記ＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍又はそれ以上増加している、請求項７９又は請求項８０に記載の遺伝子編集ペア。
  82. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の前記改善された特徴が、同等のインビトロアッセイシステムにおいて、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の前記参照タンパク質、及び配列番号４又は配列番号５の配列を含む前記ｇＲＮＡと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、又はそれ以上増加している、請求項７９又は請求項８０に記載の遺伝子編集ペア。
  83. 前記ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、又はＣＴＣのうちのいずれか１つが、細胞アッセイシステムにおいて前記ｇＲＮＡの前記標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの前記非標的鎖に対して１ヌクレオチド５’側に位置する場合、前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び前記ｇＲＮＡを含む前記ＲＮＰが、同等のアッセイシステムにおいて、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の参照タンパク質、及び参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの編集効率及び／又は結合と比較して、前記標的核酸におけるより高い編集効率及び／又は標的核酸配列の結合を示す、請求項７７～８２のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペア。
  84. 前記ＰＡＭ配列が、ＴＴＣである、請求項８３に記載の遺伝子編集ペア。
  85. 前記ＰＡＭ配列が、ＡＴＣである、請求項８３に記載の遺伝子編集ペア。
  86. 前記ＰＡＭ配列が、ＣＴＣである、請求項８３に記載の遺伝子編集ペア。
  87. 前記ＰＡＭ配列が、ＧＴＣである、請求項８３に記載の遺伝子編集ペア。
  88. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及び前記ｇＲＮＡを含む前記ＲＮＰが、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合、配列番号１～３の前記参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５の前記ｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰの結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍大きい、前記１つ以上のＰＡＭ配列に対する結合親和性の増加を示す、請求項８３～８７のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペア。
  89. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及び前記ｇＲＮＡを含む前記ＲＮＰが、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合、配列番号１～３の前記参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５の前記ｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰの編集効率と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、又は少なくとも４０倍高い編集効率の増加を示す、請求項７７～８８のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペア。
  90. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及び前記ｇＲＮＡが、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合、配列番号１～３の前記参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５の前記ｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％高い割合の切断コンピテントコンフォメーションを有するＲＮＰを形成することができる、請求項７７～８９のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペア。
  91. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及び前記ｇＲＮＡを含む前記ＲＮＰが、時限インビトロアッセイにおいて、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合の配列番号１～３の前記参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５の前記ｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰと比較して、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、又は少なくとも約２０倍高い前記標的核酸の切断速度を示す、請求項７７～９０のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペア。
  92. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ及び前記ｇＲＮＡを含む前記ＲＮＰが、時限インビトロアッセイにおいて、同等のインビトロアッセイシステムで評価した場合の配列番号１～３の前記参照タンパク質及び配列番号４又は配列番号５の前記ｇＲＮＡのうちのいずれか１つのＲＮＰと比較して、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、又は少なくとも約１００倍高い前記標的核酸のより高い割合の編集を示す、請求項７７～９１のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペア。
  93. 表７に示される配列番号４４～６２及び１２３２～１２３５からなる群から選択される配列、又はそれと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を有する配列を含む、触媒的に不活性なクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  94. 表７に示される配列番号４４～６２及び１２３２～１２３５からなる群から選択される配列を含む、触媒的に不活性なクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  95. 前記触媒的に不活性なクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡのＲＮＰが、標的核酸に結合する能力を保持する、請求項９３又は請求項９４に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  96. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ足場又は請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡをコードする配列を含む、核酸。
  97. 請求項２９～７５のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列を含む、核酸。
  98. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする前記配列が、真核細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項９７に記載の核酸。
  99. 請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ、請求項２９～７５のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質、又は請求項９６～９８のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
  100. 前記ベクターが、プロモーターを含む、請求項９９に記載のベクター。
  101. 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ＣａｓＸ送達粒子（ＸＤＰ）、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、及びＲＮＡベクターからなる群から選択される、請求項９９又は請求項１００に記載のベクター。
  102. 前記ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１０１に記載のベクター。
  103. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０から選択される、請求項１０２に記載のベクター。
  104. 前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１０１に記載のベクター。
  105. 前記ベクターが、ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分を含むＸＤＰである、請求項１０１に記載のベクター。
  106. 前記ｇａｇポリタンパク質の前記１つ以上の成分が、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１ペプチド、ｐ６ペプチド、Ｐ２Ａペプチド、Ｐ２Ｂペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ１２ペプチド、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、Ｐ２０ペプチド、及びプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される、請求項１０５に記載のベクター。
  107. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び前記ｇＲＮＡが、ＲＮＰにおいて一緒に会合している、請求項１０５又は請求項１０６に記載のベクター。
  108. 糖タンパク質トロピズム因子を含む、請求項１０５～１０７のいずれか一項に記載のベクター。
  109. 前記糖タンパク質トロピズム因子が、標的細胞の細胞表面マーカーに対する結合親和性を有し、前記ＸＤＰの前記標的細胞への侵入を促進する、請求項１０８に記載のベクター。
  110. ドナー鋳型を含む、請求項９９～１０９のいずれか一項に記載のベクター。
  111. 請求項９９～１１０のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  112. 前記宿主細胞が、ベビーハムスター腎線維芽細胞（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＳＶ４０遺伝物質を有するＣＶ－１（サル）起源（ＣＯＳ）細胞、ＨｅＬａ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は酵母細胞からなる群から選択される、請求項１１１に記載の宿主細胞。
  113. 細胞における標的核酸を改変する方法であって、前記細胞の前記標的核酸を、ｉ）請求項７６～９２のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペア、ｉｉ）請求項７６～９２のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペアとドナー鋳型、ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の前記遺伝子編集ペアをコードする１つ以上の核酸、ｉｖ）（ｉｉｉ）の前記核酸を含むベクター、ｖ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の前記遺伝子編集ペアを含むＸＤＰ、又はｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合わせ、と接触させることを含み、前記標的核酸の前記接触が、前記標的核酸を改変する、方法。
  114. 前記標的を、前記標的核酸の異なる領域又は重複する領域に相補的な標的化配列を含む第１及び第２のｇＲＮＡ又は複数のｇＲＮＡを含む複数の遺伝子編集ペアと接触させることを含む、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記標的を、前記標的核酸の異なる領域又は重複する領域に相補的な標的化配列を含む第１及び第２のｇＲＮＡ又は複数のｇＲＮＡを含む遺伝子編集ペアをコードする複数の核酸と接触させることを含む、請求項１１３に記載の方法。
  116. 前記標的を、前記標的核酸の異なる領域又は重複する領域に相補的な標的化配列を含む第１及び第２のｇＲＮＡ又は複数のｇＲＮＡを含む遺伝子編集ペアを含む複数のＸＤＰと接触させることを含む、請求項１１３に記載の方法。
  117. 前記接触させることが、前記標的核酸を前記遺伝子編集ペアと結合させることと、前記標的核酸に１つ以上の一本鎖切断を導入することと、を含み、前記改変することが、前記標的核酸に変異、挿入、又は欠失を導入することを含む、請求項１１３に記載の方法。
  118. 前記接触させることが、前記標的核酸を結合させることと、前記標的核酸に１つ以上の二本鎖切断を導入することと、を含み、前記改変することが、前記標的核酸に変異、挿入、又は欠失を導入することを含む、請求項１１３～１１６のいずれか一項に記載の方法。
  119. 前記標的核酸をドナー鋳型核酸のヌクレオチド配列と接触させることを含み、前記ドナー鋳型が、前記標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１３～１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記ドナー鋳型が、前記ドナー鋳型の５’末端及び３’末端に相同アームを含む、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記ドナー鋳型が、相同組換え修復によって切断部位で前記標的核酸に挿入される、請求項１１９又は請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記ドナー鋳型が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又はマイクロホモロジー末端結合（ＭＭＥＪ）によって切断部位で前記標的核酸に挿入される、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記細胞の前記改変が、インビトロで起こる、請求項１１３～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記細胞の改変が、インビボで起こる、請求項１１３～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記細胞が、真核細胞である、請求項１１３～１２４のいずれか１項に記載の方法。
  126. 前記真核細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項１２５に記載の方法。
  128. 前記細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、生殖細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血幹細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、網膜細胞、がん細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植増殖心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体幹細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、自己細胞、又は出生後幹細胞からなる群から選択される、請求項１１３～１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記細胞が、対象内にある、請求項１２４～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記改変が、遺伝子のアレルに変異を有する前記対象の前記細胞において起こり、前記変異が、前記対象において疾患又は障害を引き起こす、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記改変が、前記変異を前記遺伝子の野生型アレルに変化させるか、又は機能的遺伝子産物の発現をもたらす、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記改変が、前記対象において前記疾患又は障害を引き起こす前記遺伝子の前記アレルをノックダウン又はノックアウトする、請求項１３０に記載の方法。
  133. 前記細胞が、前記対象に対して自己由来である、請求項１２９～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記細胞が、前記対象に対して同種自己由来である、請求項１２９～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１３～１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、又はＡＡＶＲｈ１０である、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１１３に記載の方法。
  138. 前記ベクターが、治療有効用量を使用して、必要とする対象に投与される、請求項１１３～１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記対象が、マウス、ラット、ブタ、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記対象が、ヒトである、請求項１３８に記載の方法。
  141. 前記ベクターが、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１３８～１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記ベクターが、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１３８～１４０のいずれか一項に記載の方法。
  143. 前記ベクターが、ＸＤＰである、請求項１１３に記載の方法。
  144. 前記ＸＤＰが、治療有効用量を使用して、必要とする前記対象に投与される、請求項１４３に記載の方法。
  145. 前記ＸＤＰが、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１４４に記載の方法。
  146. 前記ＸＤＰが、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、又は少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項１４３に記載の方法。
  147. 前記ベクターが、実質内、静脈内、動脈内、脳室内、大槽内、髄腔内、頭蓋内、及び腹腔内経路からなる群から選択される投与経路によって投与され、前記投与方法が、注射、輸血、又は移植である、請求項１３８～１４６のいずれか一項に記載の方法。
  148. 前記ベクターが、治療有効用量の前記ベクターを使用して、１回以上の連続用量を含む治療レジメンに従って前記対象に投与される、請求項１４１～１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 前記治療有効用量が、少なくとも２週間、又は少なくとも１ヶ月間、若しくは少なくとも２ヶ月間、若しくは少なくとも３ヶ月間、若しくは少なくとも４ヶ月間、若しくは少なくとも５ヶ月間、若しくは少なくとも６ヶ月間の期間にわたって、あるいは年１回、又は２年毎若しくは３年毎に１回、２回以上の用量として前記対象に投与される、請求項１４８に記載の方法。
  150. 請求項７６～９２のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペアによって改変された標的核酸を含む、細胞。
  151. 請求項１１３～１４９のいずれか一項に記載の方法によって編集された、細胞。
  152. 前記細胞が、原核細胞である、請求項１５０又は１５１に記載の細胞。
  153. 前記細胞が、真核細胞である、請求項１５０又は１５１に記載の細胞。
  154. 前記真核細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、及び非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、請求項１５３に記載の細胞。
  155. 前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項１５３に記載の細胞。
  156. 請求項２９～７５のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む、組成物。
  157. 請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む、請求項１５６に記載の組成物。
  158. 前記タンパク質及び前記ｇＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合している、請求項１５７に記載の組成物。
  159. ドナー鋳型核酸を含み、前記ドナー鋳型が、標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１５６～１５８のいずれか一項に記載の組成物。
  160. 緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、請求項１５６～１５９のいずれか一項に記載の組成物。
  161. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ足場、又は請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む、組成物。
  162. 請求項２９～７５のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む、請求項１６１に記載の組成物。
  163. 前記クラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び前記ｇＲＮＡが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）において一緒に会合している、請求項１６２に記載の組成物。
  164. ドナー鋳型核酸を含み、前記ドナー鋳型が、標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１６１～１６３のいずれか一項に記載の組成物。
  165. 緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、請求項１６１～１６４のいずれか一項に記載の組成物。
  166. 請求項７６～９２のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペアを含む、組成物。
  167. ドナー鋳型核酸を含み、前記ドナー鋳型が、標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１６６に記載の組成物。
  168. 緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、請求項１６６又は請求項１６７に記載の組成物。
  169. 請求項２９～７５のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び容器を含む、キット。
  170. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ足場、又は請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む、請求項１６９に記載のキット。
  171. ドナー鋳型核酸を含み、前記ドナー鋳型が、標的核酸の標的核酸配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１６９又は請求項１７０に記載のキット。
  172. 緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、請求項１６９～１７１のいずれか一項に記載のキット。
  173. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ足場、又は請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡを含む、キット。
  174. 請求項２９～７５のいずれか一項に記載のクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む、請求項１７３に記載のキット。
  175. ドナー鋳型核酸を含み、前記ドナー鋳型が、標的核酸の標的核酸配列と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１７３又は請求項１７４に記載のキット。
  176. 緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、請求項１７３～１７５のいずれか一項に記載のキット。
  177. 請求項７６～９２のいずれか一項に記載の遺伝子編集ペアを含む、キット。
  178. ドナー鋳型核酸を含み、前記ドナー鋳型が、標的核酸と相同性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１７７に記載のキット。
  179. 緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、又は前述の任意の組み合わせを含む、請求項１７７又は請求項１７８に記載のキット。
  180. 表３に列挙される配列のうちのいずれか１つを含む、操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質。
  181. 表２に列挙されるｇＲＮＡ足場バリアント配列のうちのいずれか１つを含む、ｇＲＮＡ。
  182. 前記表２の配列の前記ｇＲＮＡ足場バリアントの１つ以上のウラシル（Ｕ）が、チミン（Ｔ）で置換されている、請求項１８１に記載のｇＲＮＡ。
  183. 標的核酸に相補的な少なくとも１０～３０ヌクレオチドの標的化配列を含む、請求項１８２に記載のｇＲＮＡ。
  184. 前記標的化配列が、２０ヌクレオチドを有する、請求項１８３に記載のｇＲＮＡ。
  185. 前記標的化配列が、１９ヌクレオチドを有する、請求項１８３に記載のｇＲＮＡ。
  186. 前記標的化配列が、１８ヌクレオチドを有する、請求項１８３に記載のｇＲＮＡ。
  187. 前記標的化配列が、１７ヌクレオチドを有する、請求項１８３に記載のｇＲＮＡ。
  188. 前記標的化配列が、１６ヌクレオチドを有する、請求項１８３に記載のｇＲＮＡ。
  189. 前記標的化配列が、１５ヌクレオチドを有する、請求項１８３に記載のｇＲＮＡ。
  190. 疾患の治療を必要とする対象においてそれを行う方法であって、治療有効量の、（ａ）請求項２９～７５及び１８０のいずれか一項に記載の操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、（ｂ）請求項２５～２８及び１８１～１８９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡと、を含む組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
  191. 疾患を有する対象の前記治療のための医薬品として使用するための、（ａ）請求項２９～７５及び１８０のいずれか一項に記載の操作されたクラス２、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、（ｂ）請求項２５～２８及び１８１～１８９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡと、を含む、組成物。
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