JP2023510352A - Ｐｃｓｋ９の標的化のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
ＰＣＳＫ９遺伝子の改変に有用であるクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲポリペプチドと、ガイド核酸（ｇＮＡ）と、任意選択的にドナー鋳型核酸とを含むシステムが本明細書に提供される。システムはまた、細胞、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子に変異を有する真核生物細胞への導入に有用である。また、かかるＣａｓＸ：ｇＮＡシステムを使用してかかる変異を有する細胞を改変する方法も提供される。
【選択図】図２４
【選択図】図２４
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２，９５９，６８５号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２，９５９，６８５号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
本出願は、ＥＦＳ－ＷＥＢによりＡＳＣＩＩ形式で提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年１月６日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＳＣＲＢ＿０１７＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは４．０７ＭＢである。
本出願は、ＥＦＳ－ＷＥＢによりＡＳＣＩＩ形式で提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年１月６日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＳＣＲＢ＿０１７＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、サイズは４．０７ＭＢである。
哺乳類では、コレステロールは乳化を介してリポタンパク質内で輸送される。リポタンパク質粒子は、それらの密度に基づいて、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、およびカイロミクロンに分類される。表面ＬＤＬ受容体は、コレステロール吸収の際に内在化される。豊富なコレステロールを有する細胞は、ＬＤＬ粒子内に新たなコレステロールが取り込まれるのを防ぐために、そのＬＤＬ受容体合成がブロックされる。逆に、細胞がコレステロールを欠如している場合、ＬＤＬ受容体合成が促進される。プロセスが調節されない場合、過剰なＬＤＬ粒子は、ＬＤＬ受容体に取り込まれることなく血中を移動する。血液中のＬＤＬ粒子は酸化されてマクロファージによって取り込まれ、そして貪食されて泡沫細胞を形成する。これらの泡沫細胞は血管壁内に捕捉されるようになり得、心臓発作、脳卒中、および他の深刻な医学的問題の主な原因のうちの１つであるアテローム硬化性プラーク形成に関与し得る。
肝臓タンパク質プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、ＬＤＬ粒子のエンドサイトーシス中に低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ－Ｒ）に結合する、分泌型で球状の自己活性化セリンプロテアーゼであり、ＬＤＬ－Ｒの細胞表面への再循環を妨げ、ＬＤＬコレステロールクリアランスの低下をもたらす。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ－Ｒに結合し（ＥＧＦ－Ａドメインを介する）、受容体－リガンド複合体の立体構造変化を妨げ、代わりとしてＬＤＬ－Ｒをリソソームに再指向させる。低密度リポタンパク質粒子（ＬＤＬ）の受容体は、典型的には、細胞外液内の粒子当たり数千個の脂肪分子（コレステロールを含む）を輸送するため、ＰＣＳＫ９の機能を遮断または阻害してＬＤＬコレステロールのＬＤＬ－Ｒ媒介性クリアランスを高めると、ＬＤＬ粒子濃度を低下させることができる。ＰＣＳＫ９は主に肝臓、腸、腎臓、および中枢神経系で発現されるが、内皮などの動脈壁、平滑筋細胞、およびマクロファージでも高度に発現され、血管の恒常性およびアテローム性動脈硬化症を調節できる局所効果を有する。
ＰＣＳＫ９は、プロタンパク質転換酵素（ＰＣ）ファミリーのメンバーであり、その遺伝子は、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）を有する個体の約２％～３％で変異している（Ｓｅｐｉｄｅｈ Ｍｉｋａｅｅｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ＰＣＳＫ９ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ａｎｄ ａｒｃｈａｉｃ ｈｕｍａｎｓ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０１９ Ａｕｇ ６．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｆｅｂｓ．１５０３６）、研究者らは、高コレステロール（高コレステロール血症）の遺伝型を引き起こすいくつかのＰＣＳＫ９変異を特定してきている。これらの変異は、ＰＣＳＫ９タンパク質における単一のタンパク質ビルディングブロック（アミノ酸）を変化させる。研究者は、高コレステロール血症に関与する変異は、それらが、ＰＣＳＫ９タンパク質の活性を増強させるか、タンパク質に新たな非定型の機能を与えるように思われるため、「機能獲得型」として報告している（Ｂｌｅｓａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｎｅｗ ＰＣＳＫ９ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｖａｒｉａｎｔ Ａｆｆｅｃｔｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｕｓｅｓ Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．＆ Ｍｅｔａｂ．９３：３５７７（２００８））。過活性のＰＣＳＫ９タンパク質は、肝細胞表面における低密度リポタンパク質受容体の数を大幅に低下させる。血液から低密度リポタンパク質を除去する受容体が少ないため、ＰＣＳＫ９遺伝子に機能獲得型変異を有する人は、非常に高い血中コレステロールレベルを有する。常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）－コレステロールレベルの増加を特徴とする遺伝性疾患であり、早発性心血管疾患の高いリスクをもたらす。ＰＣＳＫ９におけるおよそ１０の変異が、異なる集団で疾患の原因として特定されてきている。高コレステロール血症を引き起こすＰＣＳＫ９における既知のすべての変異は、このプロテアーゼの酵素活性に増加を生じる（Ｂｌｅａｓａ，Ｓ．，２００８）。加えて、ＰＣＳＫ９における変異は、常染色体優性家族性低ベータリポタンパク血症を引き起こし得、脂肪肝、肝硬変、および他の障害をもたらし得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの出現およびこれらの最小システムのプログラム可能な性質は、ゲノム操作および工学における多目的な技術としてのそれらの使用を容易にしてきている。しかしながら、コレステロールレベルを調節するために改変する必要のある細胞が多数あるため、インビボでＰＣＳＫ９保護変異体および機能喪失型変異体を生成する現在の方法は効果的なものではない。他の懸念には、オフターゲット効果、ゲノム不安定性、またはゲノム編集によって引き起こされ得る発がん性改変、ならびに遺伝子編集システムにおける安全な送達モダリティの欠如が含まれる。したがって、ＰＣＳＫ９を調節するための改良された組成物および方法が必要とされ続けている。この必要性に対処するために、ＰＣＳＫ９を標的とするための組成物および方法、ならびに送達ベクターが本明細書に提供される。
本開示は、１つ以上の変異を有するプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子標的核酸配列の編集に使用される改変されたクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイド核酸に関する。クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイド核酸は、標的細胞への受動的侵入のために改変することができる。クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイド核酸は、標的核酸改変のための様々な方法に有用であり、その方法も提供される。
一態様では、本開示は、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイド核酸システム（例えば、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステム）、ならびに細胞におけるＰＣＳＫ９タンパク質をコードする遺伝子（ＰＣＳＫ９遺伝子）を含む標的核酸を変更するために使用される方法に関する。本開示のいくつかの実施形態において、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムは、機能獲得型変異であり得る１つ以上の変異を有するＰＣＳＫ９遺伝子をノックダウンまたはノックアウトする効用を有し、ＰＣＳＫ９障害を有する対象における変異ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現および結果として高められた高コレステロール血症を低下または排除する。他の実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムは、機能獲得型変異を有するＰＣＳＫ９遺伝子の配列を修正する効用を有する。
いくつかの実施形態において、クラス２のＶ型：ｇＮＡシステムｇＮＡは、ｇＲＮＡ、もしくはｇＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラであり、単一分子ｇＮＡまたは二重分子ｇＮＡであり得る。他の実施形態において、システムｇＮＡは、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む標的化配列を有する。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列からなる標的化配列を有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子のエクソン内、またはそれに近位の配列に相補的である。別の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子のイントロン内、またはそれに近位の配列に相補的である。別の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子のイントロン－エクソン接合部内またはそれに近位の配列に相補的である。別の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子の調節要素内またはそれに近位の配列に相補的である。別の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子間領域内、またはそれに近位の配列に相補的である。ｇＮＡは、１４～３０個の連続したヌクレオチドを含む標的化配列を含むことができる。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、２０個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、１９個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、１８個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、１７個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、１６個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、１５個のヌクレオチドからなる。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、表１に示される配列番号４～１６からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムｇＮＡは、表２に示される配列番号２１０１～２２８６からなる群から選択され配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムは、配列番号１～３のうちのいずれか１つを含む参照ＣａｓＸ配列、あるいは表３、５～７、および９に示される配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、もしくは４８８、もしくは４９０の配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントを含む。これらの実施形態において、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して１つ以上の改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、ＣａｓＸタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、およびＣＴＣからなる群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、ＣａｓＸタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、およびＣＴＣからなる群から選択されるＰＡＭ配列に対する配列番号１～３のＣａｓＸタンパク質のうちのいずれか１つの結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍高いＰＡＭ配列に対する結合親和性を有する。
本開示のクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムのいくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ分子とｇＮＡ分子とは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）で一緒に会合する。特定の実施形態において、ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、またはＣＴＣのうちのいずれか１つが、ｇＮＡの標的化配列と同一性を有する非標的鎖配列に対して５’の１つのヌクレオチドに位置する場合、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとを含むＲＮＰが細胞アッセイシステムにおいて、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰの編集効率および／または結合と比較して、標的ＤＮＡにおける標的配列の高い編集効率および／または結合を示す。
いくつかの実施形態では、システムは、ＰＣＳＫ９タンパク質をコードする遺伝子またはＲＮＡ配列の少なくとも一部、ＰＣＳＫ９調節領域、またはコード領域および調節領域の両方を含むドナー鋳型をさらに含み、ＰＣＳＫ９コード遺伝子部分は、ＰＣＳＫ９エクソン、ＰＣＳＫ９イントロン、およびＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部からなる群から選択され、ドナー鋳型を使用してＰＣＳＫ９遺伝子をノックダウンもしくはノックアウトするか、または使用してＰＣＳＫ９遺伝子における変異を修正する。いくつかの実施形態では、システムは、配列番号３３の少なくとも一部をコードする配列を含む核酸を含むドナー鋳型をさらに含む。他の実施形態では、システムは、配列番号３３の野生型ＰＣＳＫ９遺伝子配列に対して１つ以上の変異を有する核酸配列を含む核酸を含むドナー鋳型をさらに含む。いくつかの事例では、ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ鋳型または一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の事例では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのシステムをコードする核酸、ならびに核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される。他の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとｇＮＡとのＲＮＰ、および任意選択的に、ドナー鋳型核酸を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。
他の実施形態では、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子が１つ以上の変異を含む細胞のＰＣＳＫ９標的核酸配列を改変する方法を提供し、当該方法は、細胞に、ａ）第１のｇＮＡを含む本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのクラス２のＶ型：ｇＮＡシステムを含む組成物、ｂ）本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかの核酸、ｃ）本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのベクター、ｄ）本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのＶＬＰ、またはｅ）上記のうちの２つ以上の組み合わせを導入することを含み、第１のｇＮＡによって標的化される細胞のＰＣＳＫ９標的核酸配列は、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、ＣａｓＸ）によって改変される。本方法のいくつかの実施形態において、方法は、細胞集団に第２のｇＮＡまたは第２のｇＮＡをコードする核酸を導入することを含み、第２のｇＮＡは、第１の核酸と比較して、ＰＣＳＫ９標的核酸の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有し、集団の細胞のＰＣＳＫ９標的核酸に追加の切断がもたらす。本方法のいくつかの実施形態において、改変することは、野生型配列と比較して、標的核酸配列に１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含む。いくつかの事例において、方法は、標的核酸を、本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのドナー鋳型核酸と接触させることをさらに含む。本方法のいくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、ＰＣＳＫ９遺伝子の変異を修正する（ノックインすることによる）ためのＰＣＳＫ９遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含むか、または変異体ＰＣＳＫ９をノックアウトするための変異もしくは異種配列を含む配列を含む。改変がＰＣＳＫ９遺伝子のノックダウンをもたらすこれらの事例において、非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現は、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少される。他の事例において、改変は、ＰＣＳＫ９遺伝子のノックアウトをもたらし、細胞集団の標的核酸は、細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が、検出可能なレベルの非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質を発現しないように、改変される。ＰＣＳＫ９タンパク質の発現は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、細胞ベースのアッセイ、ウエスタンブロット、または当技術分野で知られているか、もしくは実施例に記載されている他の方法によって測定することができる。
いくつかの事例において、細胞における標的核酸配列の改変は、インビボで生じる。いくつかの実施形態では、細胞は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される真核生物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、肝細胞、もしくは腸、腎臓、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜細胞、または内皮などの動脈壁の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、眼細胞である。他の実施形態において、本開示は、標的核酸配列を改変する方法を提供し、標的細胞は、ＣａｓＸタンパク質と１つ以上のｇＮＡとをコードするベクターを使用して接触させ、任意選択的にドナー鋳型をさらに含む。いくつかの事例において、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、またはＡＡＶＲｈ１０から選択されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。他の事例において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。他の実施形態において、本開示は、標的細胞を、ベクターが、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとｇＮＡとのＲＮＰ、および任意選択的に、ドナー鋳型核酸を含むウイルス様粒子であるベクターを使用して接触させる方法を提供する。本方法のいくつかの実施形態では、ベクターは、対象に治療有効用量で投与される。対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長目、またはヒトであることができる。用量は、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与することができる。
他の実施形態において、本開示は、ＰＣＳＫ９または関連障害の治療を必要とする対象におけるＰＣＳＫ９または関連障害を治療する方法を提供し、対象の細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子をコードする遺伝子を改変することを含み、改変することは、当該細胞を、治療有効量のｉ）ＣａｓＸと第１のｇＮＡを含む本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのｇＮＡと、任意選択的に、ドナー鋳型と、を含む組成物；ｉｉ）（ｉ）の組成物をコードする核酸；レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、およびＲＮＡベクターからなる群から選択され、ｉｉ）の核酸を含むベクター；（ｉｉｉ）（ｉ）の組成物を含むＶＬＰ；またはｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちの２つ以上の組み合わせと接触させることを含み、第１のｇＮＡによって標的化される細胞のＰＣＳＫ９遺伝子は、ＣａｓＸタンパク質（および任意選択的に、ドナー鋳型）によって改変され、それによってＰＣＳＫ９遺伝子の変異が修正または代償され、機能的ＰＣＳＫ９タンパク質が発現される。対象におけるＰＣＳＫ９関連疾患を治療する上記方法の他の実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされ、それによって非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が減少または排除される。いくつかの実施形態では、対象は、げっ歯類、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される。上記において、ベクターまたはＶＬＰは、対象に、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、または経口経路から選択される投与経路によって投与される。いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９関連障害は、常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、高脂質血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、ＬＤＬコレステロールレベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの事例において、方法は、ＬＤＬコレステロールのベースラインからの変化割合、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の減少（ＡＳＣＶＤ）、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、視力、および不安定な扁桃炎からなる群から選択される少なくとも１つの臨床的に関連するエンドポイントにおける改善をもたらす。他の事例において、方法は、少なくとも２つの臨床的に関連するエンドポイントにおける改善をもたらす。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸と、ベクターと、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、ｇＮＡと、遺伝子編集対と、を含む医薬組成物およびキットを提供する。
別の態様では、遺伝子編集対を含む組成物、またはＰＣＳＫ９関連疾患を有する対象の治療のための医薬品としての使用のための遺伝子編集対を含むか、もしくはコードするベクターの組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステム、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを含む組成物、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを含むか、もしくはコードするベクター、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを含むＶＬＰ、またはＰＣＳＫ９関連疾患の治療のための医薬品としての使用のためのクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを使用して編集される細胞の集団が、本明細書に提供される。
別の態様では、ＰＣＳＫ９関連疾患の治療を必要とする対象におけるＰＣＳＫ９関連疾患の治療の方法における使用のための、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステム、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを含む組成物、またはクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを含むか、もしくはコードするベクター、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを含むＶＬＰ、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを使用して編集される細胞の集団が、本明細書に提供される。
別の態様では、ＰＣＳＫ９関連疾患の治療を必要とする対象におけるＰＣＳＫ９関連疾患の治療のための医薬品の製造における使用のための、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステム、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを含む組成物、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを含むか、もしくはコードするベクター、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを含むＶＬＰ、またはクラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ：ｇＮＡシステムを使用して編集される細胞の集団が、本明細書に提供される。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。ともにＣａｓＸバリアントおよびｇＮＡバリアントを開示する、２０２０年６月５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３６５０５、および２０２０年１２月３日に出願された米国仮出願第６３／１２１，１９６号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。ともにＣａｓＸバリアントおよびｇＮＡバリアントを開示する、２０２０年６月５日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３６５０５、および２０２０年１２月３日に出願された米国仮出願第６３／１２１，１９６号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の発明を実施するための形態、およびその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
例示的な実施形態が本明細書に示され、説明されているが、かかる実施形態がほんの一例として提供されることは当業者には明らかであろう。本明細書で特許請求される本発明から逸脱することなく、当業者には、多数の変形、変更、および置換が現在行われるであろう。本明細書に記載される実施形態の様々な代替案を、本開示の実施形態を実施する際に使用することができることを理解されたい。特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの請求項の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料が、本実施形態の実施または試験に使用され得るが、好適な方法および材料が、以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先することになる。加えて、材料、方法、および実施例は、例証にすぎず、限定するようには意図されていない。本発明から逸脱することなく、当業者であれば、多数の変形、変更、および置き換えを想到するであろう。
定義
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、多本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、多本鎖ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリンおよびピリミジン塩基を含むか、または他の天然、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、多本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、多本鎖ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリンおよびピリミジン塩基を含むか、または他の天然、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
「ハイブリダイズ可能な」または「相補的な」は、互換的に使用され、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、非共有結合的に結合する、すなわち、ワトソン－クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成し、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび／またはインビボ条件下で、配列特異的な逆平行の様式で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズする」（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する）ことを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。特異的にハイブリダイズ可能であるためにポリヌクレオチドの配列がその標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解され、ポリヌクレオチドの配列は、標的核酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の配列同一性を有し、依然として標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つ以上のセグメントを超えてハイブリダイズすることができる（例えば、ループ構造またはヘアピン構造、「バルジ」、「バブル」など）。
本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物（例えば、タンパク質、ＲＮＡ）をコードするＤＮＡ領域、ならびにかかる調節要素配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない調節配列を含み得る。コード配列は、転写または転写および翻訳時に遺伝子産物をコードし、本開示のコード配列は断片を含むことができ、完全長のオープンリーディングフレームを含む必要はない。遺伝子は、転写される鎖、例えば、コード配列を含む鎖と、相補鎖との両方を含むことができる。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して３’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関連している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域または転写開始点の５’側に位置する配列に関連している。例えば、ほとんどのプロモーターは転写開始部位の上流に位置する。
「調節要素」という用語は、本明細書で「調節配列」という用語と互換的に使用され、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナルなどの転写終結シグナルおよびポリＵ配列）を含むよう意図されている。例示的な調節要素には、ＣＭＶ、ＣＭＶ＋イントロンＡ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ－Ｌｔｒ、伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）、ＭＭＬＶ－ｌｔｒなどに限定されない転写プロモーター、ならびに単一の転写物、メタロチオネイン、転写エンハンサー要素、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列からの複数の遺伝子の翻訳を可能にする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、またはＰ２Ａペプチドなどの他の調節要素が含まれる。適切な調節要素の選択が、発現されるコードされた構成要素（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）に依存するか、または核酸が異なるポリメラーゼを必要とするか、または融合タンパク質として発現されるようには意図されていない複数の構成要素を含むかに依存することが理解されよう。
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、ＴＡＴＡボックス、および／またはＢ認識要素を含み、かつ会合した転写可能なポリヌクレオチド配列および／または遺伝子（または導入遺伝子）の転写および発現を支援または促進するＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、合成的に産生することができるか、または既知のもしくは天然に存在するプロモーター配列または別のプロモーター配列から誘導することができる。プロモーターは、転写される遺伝子の近位または遠位にあり得る。プロモーターは、ある特定の特性を付与するために２つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターも含むことができる。本開示のプロモーターは、既知のまたは本明細書に提供される他のプロモーター配列と組成が類似しているが、同一ではないプロモーター配列のバリアントを含むことができる。プロモーターは、構成的、発達的、組織特異的、誘導的などのプロモーターに作動可能に連結された会合したコードまたは転写可能な配列または遺伝子の発現パターンに関する基準に従って分類することができる。
「エンハンサー」という用語は、転写因子と呼ばれる特定のタンパク質が結合すると、関連する遺伝子の発現を調節する調節要素ＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、遺伝子のイントロン、または遺伝子のコード配列の５’もしくは３’に位置し得る。エンハンサーは、遺伝子の近位（すなわち、プロモーターの数十または数百塩基対（ｂｐ）以内）にあり得るか、または遺伝子の遠位に（すなわち、プロモーターから何千ｂｐ、何十万ｂｐ、またはさらには何百万ｂｐも離れて）位置し得る。単一の遺伝子は、２つ以上のエンハンサーによって調節され得るが、それらはすべて本開示の範囲内であると想定される。
本明細書で使用される「組換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、自然系で見つけられる内因性核酸と区別可能な構造的コードまたは非コード配列を有する構築物をもたらすクローニング、制限、および／またはライゲーションステップの様々な組み合わせの産物であることを意味する。一般に、構造的コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞に含まれるか、または無細胞転写および翻訳系に含まれる組換え転写単位から発現することができる合成核酸を提供することができる。かかる配列は、真核生物遺伝子に典型的に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供することができる。関連する配列を含むゲノムＤＮＡは、組換え遺伝子または転写単位の形成にも使用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームの５’側または３’側に存在する場合があり、かかる配列は、コード領域の操作または発現を妨害せず、実際には、様々な機構によって所望の産物の産生を調節する役割を果たし得る（上記の「エンハンサー」および「プロモーター」を参照されたい）。
「組換えポリヌクレオチド」または「組換え核酸」という用語は、天然に存在しないもの、例えば、人間の介入によって２つの別様に分離された配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子工学技術によって達成される。このようなものは、通常、配列認識部位を導入または除去しながら、コドンを同じまたは保存的アミノ酸をコードする冗長なコドンで置き換えるために行われ得る。あるいは、それは所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合して、機能の所望の組み合わせを生成するために実施される。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子操作技術のいずれかによって達成される。
同様に、「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」という用語は、例えば、ヒトの介入によるアミノ配列の２つの他の方法で分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製される、天然に存在しないポリペプチドまたはタンパク質を指す。したがって、例えば、異種アミノ酸配列を含むタンパク質は組換え体である。
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、２つ以上の実体間の物理的結合を確立することを意味する。例えば、標的核酸配列をガイド核酸と接触させることは、標的核酸配列およびガイド核酸が物理的結合を共有するように作製される、例えば、それらの配列が配列類似性を共有する場合、ハイブリダイズすることができることを意味する。
「解離定数」または「Ｋｄ」は互換的に使用され、リガンド「Ｌ」とタンパク質「Ｐ」との間の親和性、すなわち、リガンドが特定のタンパク質にどれくらい密接に結合するかを意味する。これは、式Ｋｄ＝［Ｌ］［Ｐ］／［ＬＰ］を使用して計算することができ、式中、［Ｐ］、［Ｌ］、および［ＬＰ］は、それぞれ、タンパク質、リガンド、および複合体のモル濃度を表す。
本開示は、標的核酸配列を改変するのに有用な組成物および方法を提供する。本明細書で使用される場合、「改変する」には、切断、ニッキング、編集、欠失、ノックイン、ノックアウトなどが含まれるが、これらに限定されない。
「ノックアウト」という用語は、遺伝子の除去または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトされる可能性がある。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係の配列で置き換えることによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子またはその遺伝子産物の発現の低下を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が減弱され得るか、タンパク質レベルが低下するまたは排除され得る。
本明細書で使用される場合、「相同性指向修復」（ＨＤＲ）とは、細胞における二本鎖切断の修復中に起こるＤＮＡ修復の形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、ドナー鋳型を使用して標的ＤＮＡを修復またはノックアウトし、ドナー（例えば、ドナー鋳型など）から標的への遺伝情報の移動をもたらす。ドナー鋳型が標的ＤＮＡ配列とは異なり、ドナー鋳型の配列の一部またはすべてが、正確なゲノム遺伝子座における標的ＤＮＡに組み込まれる場合、相同性指向修復は、挿入、欠失、または変異によって標的核酸配列の配列の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」（ＮＨＥＪ）とは、相同鋳型を必要としない（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同性指向修復とは対照的に）、互いに対する切断末端の直接ライゲーションによるＤＮＡの二本鎖切断の修復を指す。ＮＨＥＪは、多くの場合、インデル、二本鎖切断部位の近くのヌクレオチド配列の喪失（欠失）または挿入をもたらす。
本明細書で使用される場合、「マイクロホモロジー媒介末端結合」（ＭＭＥＪ）は、変異原性ＤＳＢ修復機構を指し、これは、相同鋳型を必要としない（修復を誘導するための相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に）、切断部位に隣接する欠失に常に関連する。ＭＭＥＪは、多くの場合、二本鎖切断部位の近くにヌクレオチド配列の喪失（欠失）をもたらす。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（またはタンパク質）は、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して特定のパーセントの「配列類似性」または「配列同一性」を有し、これは、整列させた場合、そのパーセントの塩基またはアミノ酸が同じであり、２つの配列を比較した場合、同じ相対位置にあることを意味する。配列類似性（互換的に、類似性パーセント、同一性パーセント、または相同性と称される）は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのワールドワイドウェブ上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む、当該技術分野で既知の方法およびコンピュータープログラムを使用して配列を整列させることができる。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性パーセントは、任意の簡便な方法を使用して決定することができる。方法の例には、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局所アライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６）、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）を使用するＧａｐプログラムの使用（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）、例えば、デフォルト設定の使用が含まれる。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、および改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。この用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むが、これに限定されない融合タンパク質を含む。
「ベクター」または「発現ベクター」とは、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、これに別のＤＮＡセグメント、すなわち、「挿入物」が結合して、細胞内に結合したセグメントの複製または発現をもたらすことができる。
核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用される、本明細書で使用される「天然に存在する」または「改変されていない」または「野生型」という用語は、自然界で見つけられる核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。
本明細書で使用される場合、「変異」は、野生型もしくは参照アミノ酸配列または野生型もしくは参照ヌクレオチド配列と比較した、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの挿入、欠失、置換、複製、または反転を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞が天然に存在する環境とは異なる環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を説明するよう意図されている。単離された遺伝子改変された宿主細胞は、遺伝子改変された宿主細胞の混合集団に存在し得る。
本明細書で使用される「宿主細胞」は、真核生物細胞、原核生物細胞、または単細胞実体として培養された多細胞生物（例えば、細胞株）由来の細胞を意味し、これらの真核生物または原核生物細胞は、核酸のレシピエント（例えば、発現ベクター）として使用され、核酸によって遺伝子改変された元の細胞の子孫を含む。単細胞の子孫が、自然、偶発的、または意図的変異のため、形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補体が元の親と必ずしも完全に同一ではなくてもよいことが理解される。「組換え宿主細胞」（「遺伝子改変された宿主細胞」とも称される）とは、異種核酸、例えば、発現ベクターが導入された宿主細胞である。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。
「低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）」という用語は、最も低い密度（低い重量－体積比の粒子）から最も高い密度（高い重量－体積比の粒子）までの５つの主要なリポタンパク質：カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のうちの１つを指す。リポタンパク質は、細胞外流体中の体の周りに脂質（脂肪）を移動させ、それによって受容体媒介性エンドサイトーシスを介した細胞体への脂肪の移動を促進する。ＬＤＬ粒子は、直径が約２２０～２７５オングストロームである。
「低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体」は、コレステロールに富むＬＤＬ粒子のエンドサイトーシスを媒介する８３９個のアミノ酸（２１個のアミノ酸シグナルペプチドの除去後）の受容体タンパク質を指す。これは、カイロミクロンレムナントおよびＶＬＤＬレムナント（ＩＤＬ）に認められるアポタンパク質Ｂ１００およびａｐｏＥタンパク質を認識する細胞表面受容体であり、ＬＤＬコレステロールの結合およびエンドサイトーシスをもたらす。このプロセスは、すべての有核細胞で生じるが、循環からＬＤＬのおよそ７０％を除去する肝臓で主に生じる。ヒトＬＤＬＲ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に参照配列ＮＧ＿００９０６０．１として部分的に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、本明細書で互換的に使用され、治療的利益および／または予防的利益を含むが、これらに限定されない、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療されている基礎障害または疾患の根絶または改善を意味する。治療的利益は、症状のうちの１つ以上の根絶もしくは改善、または対象が依然として基礎障害を患っている可能性があるにもかかわらず対象において改善が観察されるようになる基礎疾患に関連する１つ以上の臨床パラメーターの改善によって達成することもできる。
本明細書で使用される「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、ヒトまたは実験動物などの対象に単回投与または反復投与で投与された場合、病状または状態のいずれかの症状、態様、測定されたパラメーター、または特性にいくらかの検出可能かつ有益な効果をもたらすことができる、薬物または生物学的製剤の、単独でのまたは組成物の一部としての量を指す。かかる効果は、絶対に有益である必要はない。
本明細書で使用される場合、「投与すること」とは、対象にある投薬量の化合物（例えば、本開示の組成物）または組成物（例えば、薬学的組成物）を与える方法を意味する。
「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜、非ヒト霊長類、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、および他のげっ歯類が含まれるが、これらに限定されない。
Ｉ．一般的な方法
本発明の実施は、特に明記しない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技術を使用し、これらは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）およびＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的な教科書に見出され得、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実施は、特に明記しない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技術を使用し、これらは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）およびＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの標準的な教科書に見出され得、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
値の範囲が提供される場合、終点が含まれ、間にある値は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限および下限の間であり、その記載された範囲の他の記載された値および間にある値は、包含されることを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲に含まれることができ、また、記載された範囲において特に除外された限界を条件として、包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されるものに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、別途文脈が明確に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が複数の指示対象を含むことに留意されたい。
明確にするために、別々の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解されるであろう。他の事例において、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本開示の様々な特徴はまた、別々にまたは任意の好適な部分的組み合わせで提供されてもよい。本開示に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、各々およびすべての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示されることが意図される。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素のすべての部分的組み合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、各々およびすべてのそのような部分的組み合わせが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。
ＩＩ．ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子編集のためのシステム
第１の態様において、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現を変更するためにＰＣＳＫ９遺伝子（本明細書では「標的核酸」と称される）を改変または編集する際に使用するための、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質と１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）とを含むシステム、ならびにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸とｇＮＡとを含むシステムを提供する。
第１の態様において、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現を変更するためにＰＣＳＫ９遺伝子（本明細書では「標的核酸」と称される）を改変または編集する際に使用するための、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質と１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）とを含むシステム、ならびにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸とｇＮＡとを含むシステムを提供する。
本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質と本開示の１つ以上のｇＮＡとを含むシステム、ならびにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸とｇＮＡとを含むシステムなどの「システム」は、「組成物」という用語と互換的に使用される。
ＰＣＳＫ９遺伝子は、低密度リポタンパク質粒子（ＬＤＬ）に対する受容体に結合してＬＤＬを細胞に輸送するタンパク質である、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（「ＰＣＳＫ９」）をコードする。ＰＣＳＫ９遺伝子は、ヒトゲノムのｃｈｒ１：５５，０３９，４７６～５５，０６４，８５３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）にまたがる配列を包含する（表記は、第１染色体の５５，０３９，４７６ｂｐで開始して５５，０６４，８５３ｂｐまでである第１染色体（ｃｈｒ１）を指す（ホモサピエンス更新注釈リリース１０９．２０１９０９０５、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）（ＮＣＢＩ）。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、ＮＣＢＩデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に参照配列ＮＧ＿００９０６１．１として部分的に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＣＳＫ９遺伝子座は、１２個のエクソンを有し、６９２個のアミノ酸タンパク質をコードする３６３６ｂｐのｍＲＮＡを生成し、その合成後、プロドメインを切断する自己触媒切断反応を受けて、５４０個のアミノ酸を有する活性化タンパク質を生じる。プロドメインは、触媒ドメインおよびレジスチン様ドメインに結合したままであり、おそらくプロドメインがシャペロンとして機能し、フォールディングおよび分泌を促進するためである（Ｓｅｉｄａｈ，ＮＧ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００（３）：９２８（２００３））。分泌型プロタンパク質転換酵素である神経アポトーシス調節転換酵素１（ＮＡＲＣ－１）：肝臓再生およびニューロン分化（Ｓｅｉｄａｈ ＮＧ，ｅｔ ａｌ．）。このタンパク質はまた、神経アポトーシス調節転換酵素とも呼ばれ、サブチラーゼのプロテアーゼＫサブファミリーに属するセリンプロテアーゼである。
ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（ＨＧＮＣ：２０００１）は、配列ＭＧＴＶＳＳＲＲＳＷＷＰＬＰＬＬＬＬＬＬＬＬＬＧＰＡＧＡＲＡＱＥＤＥＤＧＤＹＥＥＬＶＬＡＬＲＳＥＥＤＧＬＡＥＡＰＥＨＧＴＴＡＴＦＨＲＣＡＫＤＰＷＲＬＰＧＴＹＶＶＶＬＫＥＥＴＨＬＳＱＳＥＲＴＡＲＲＬＱＡＱＡＡＲＲＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡＬＫＬＰＨＶＤＹＩＥＥＤＳＳＶＦＡＱＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰＰＲＹＲＡＤＥＹＱＰＰＤＧＧＳＬＶＥＶＹＬＬＤＴＳＩＱＳＤＨＲＥＩＥＧＲＶＭＶＴＤＦＥＮＶＰＥＥＤＧＴＲＦＨＲＱＡＳＫＣＤＳＨＧＴＨＬＡＧＶＶＳＧＲＤＡＧＶＡＫＧＡＳＭＲＳＬＲＶＬＮＣＱＧＫＧＴＶＳＧＴＬＩＧＬＥＦＩＲＫＳＱＬＶＱＰＶＧＰＬＶＶＬＬＰＬＡＧＧＹＳＲＶＬＮＡＡＣＱＲＬＡＲＡＧＶＶＬＶＴＡＡＧＮＦＲＤＤＡＣＬＹＳＰＡＳＡＰＥＶＩＴＶＧＡＴＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧＴＬＧＴＮＦＧＲＣＶＤＬＦＡＰＧＥＤＩＩＧＡＳＳＤＣＳＴＣＦＶＳＱＳＧＴＳＱＡＡＡＨＶＡＧＩＡＡＭＭＬＳＡＥＰＥＬＴＬＡＥＬＲＱＲＬＩＨＦＳＡＫＤＶＩＮＥＡＷＦＰＥＤＱＲＶＬＴＰＮＬＶＡＡＬＰＰＳＴＨＧＡＧＷＱＬＦＣＲＴＶＷＳＡＨＳＧＰＴＲＭＡＴＡＶＡＲＣＡＰＤＥＥＬＬＳＣＳＳＦＳＲＳＧＫＲＲＧＥＲＭＥＡＱＧＧＫＬＶＣＲＡＨＮＡＦＧＧＥＧＶＹＡＩＡＲＣＣＬＬＰＱＡＮＣＳＶＨＴＡＰＰＡＥＡＳＭＧＴＲＶＨＣＨＱＱＧＨＶＬＴＧＣＳＳＨＷＥＶＥＤＬＧＴＨＫＰＰＶＬＲＰＲＧＱＰＮＱＣＶＧＨＲＥＡＳＩＨＡＳＣＣＨＡＰＧＬＥＣＫＶＫＥＨＧＩＰＡＰＱＥＱＶＴＶＡＣＥＥＧＷＴＬＴＧＣＳＡＬＰＧＴＳＨＶＬＧＡＹＡＶＤＮＴＣＶＶＲＳＲＤＶＳＴＴＧＳＴＳＥＧＡＶＴＡＶＡＩＣＣＲＳＲＨＬＡＱＡＳＱＥＬＱ（配列番号３３）を有するタンパク質（Ｑ８ＮＢＰ７）をコードする。
いくつかの実施形態において、本開示は、機能獲得型変異を有する真核生物細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子を改変するように具体的に設計されたシステムを提供する。いくつかの事例において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＰＣＳＫ９遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするように設計される。他の事例において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＰＣＳＫ９遺伝子における１つ以上の変異を修正するように設計される。一般に、ＰＣＳＫ９遺伝子の任意の部分は、本明細書に提供され、本明細書でより完全に記載される、プログラム可能な組成物および方法を使用して標的化することができる。
他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２のＶ型ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、クラス２のＶ型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２Ｊ、ＣａｓＺ、およびＣａｓＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上のＣａｓＸタンパク質と１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）とをＣａｓＸ：ｇＮＡシステムとして含むシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓＸ：ｇＮＡシステムは、１つ以上のＣａｓＸタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）と、ＰＣＳＫ９遺伝子の一部をコードする核酸を含む１つ以上のドナー鋳型核酸であって、核酸が野生型配列、機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ配列、変異体ＰＣＳＫ９をコードするゲノム核酸配列と比較して１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または変異を含むドナー鋳型核酸と、を含む。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、１つ以上の変異を有する標的核酸配列をノックアウトするかまたはノックダウンする（より完全に以下に記載される）いずれかのための挿入に利用される、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子と比較して１つ以上の変異を含む。他の事例において、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムは、任意選択的に、標的細胞における野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（配列番号３３）の産生のための配列をコードする遺伝子の全部または一部の導入（またはノックイン）のためのドナー鋳型をさらに含むことができる。
ＰＣＳＫ９変異が複数のエクソンにまたがるこれらの事例において、本開示は、ドナー鋳型におけるエクソン間に短縮された長さの合成イントロン配列を含むようにも最適化し得る十分な長さのドナー鋳型を企図して、ＰＣＳＫ９遺伝子座の適切な発現およびプロセシングを確実にする。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約１０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、または少なくとも約２００個、または少なくとも約３００個、または少なくとも約４００個、または少なくとも約５００個、または少なくとも約６００個、または少なくとも約７００個、または少なくとも約８００個、または少なくとも約９００個、または少なくとも約１０００個、または少なくとも約１０，０００個、または少なくとも約１５，０００個、または少なくとも約３０，０００個のヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約１０～約３０，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約１００～約１５，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約４００～約１０，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約６００～約５０００個のヌクレオチド、または少なくとも約１０００～約２０００個のヌクレオチドを含み、ＰＣＳＫ９遺伝子部分は、ＰＣＳＫ９エクソン、ＰＣＳＫ９イントロン、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部、ＰＣＳＫ９調節領域、ＰＣＳＫ９コード領域、ＰＣＳＫ９非コード領域、ＰＣＳＫ９遺伝子の前述の部分のうちのいずれかの組み合わせ、またはＰＣＳＫ９遺伝子の全体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子部分は、ＰＣＳＫ９エクソン配列、ＰＣＳＫ９イントロン配列、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合配列、またはＰＣＳＫ９調節領域配列のうちのいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型または一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子編集に使用する前に一緒に結合することができ、それ故に、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として「予め複合体化」される、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとｇＮＡとの遺伝子編集対を提供する。予め複合体化されたＲＮＰの使用は、標的核酸配列の編集のための細胞または標的核酸配列への系構成要素の送達に利点を与える。いくつかの実施形態では、機能的ＲＮＰは、電気泳動によって、または化学的手段によって、細胞にエクスビボで送達することができる。他の実施形態では、機能的ＲＮＰは、それらの機能的形態でベクターによってエクスビボまたはインビボのいずれかで送達することができる。ｇＮＡは、標的核酸配列の配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する標的化配列（または「スペーサー」）を含むことによって複合体に標的特異性を提供することができ、一方、予め複合体化されたＣａｓＸ：ｇＮＡのＣａｓＸタンパク質は、標的核酸配列内の標的部位にｇＮＡとのその会合によって誘導される（例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子内の標的部位で安定化される）標的配列の切断またはニッキングなどの部位特異的活性を提供する。ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡ成分、ならびにそれらの配列、特性、および機能、ならびにＰＣＳＫ９遺伝子の編集におけるそれらの使用は、以下でより完全に記載される。
ＩＩＩ．遺伝子編集のためのシステムのガイド核酸
別の態様において、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的化配列を含むガイド核酸（ｇＮＡ）に関するものであり、ｇＮＡは、相補的非標的鎖にＴＣモチーフを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に対して特異性を有するＣＲＩＳＰＲタンパク質とともに複合体を形成することができ、ＰＡＭ配列は、標的核酸の標的鎖における標的核酸配列に相補的な非標的鎖における配列の５’の１つのヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼととともに複合体を形成することができる。特定の実施形態において、ｇＮＡは、ＣａｓＸヌクレアーゼとともに複合体を形成することができる。
別の態様において、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的化配列を含むガイド核酸（ｇＮＡ）に関するものであり、ｇＮＡは、相補的非標的鎖にＴＣモチーフを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に対して特異性を有するＣＲＩＳＰＲタンパク質とともに複合体を形成することができ、ＰＡＭ配列は、標的核酸の標的鎖における標的核酸配列に相補的な非標的鎖における配列の５’の１つのヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼととともに複合体を形成することができる。特定の実施形態において、ｇＮＡは、ＣａｓＸヌクレアーゼとともに複合体を形成することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子のゲノム編集に効用を有するＣａｓＸ：ｇＮＡシステムに利用されるガイド核酸（ｇＮＡ）に関する。本開示は、遺伝子編集ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムの構成要素としてＰＣＳＫ９遺伝子に相補的である（それ故に、それにハイブリダイズすることができる）標的化配列を有する特異的に設計されたガイド核酸（「ｇＮＡ」）を提供する。実施形態のｇＮＡに利用することができるＰＣＳＫ９標的核酸への標的化配列の代表的だが非限定的な例は、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１として提供される。いくつかの実施形態において、ｇＮＡはデオキシリボ核酸分子（「ｇＤＮＡ」）であり、一部の実施形態では、ｇＮＡはリボ核酸分子（「ｇＲＮＡ」）であり、他の実施形態では、ｇＮＡはキメラであり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。本明細書で使用される場合、ｇＮＡ、ｇＲＮＡ、およびｇＤＮＡという用語は、天然に存在する分子を含み、配列バリアントも含む。
いくつかの実施形態において、複数のｇＮＡ（例えば、２つ以上）は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同性指向修復（ＨＤＲ、例えば、ＰＣＳＫ９エクソンの全部または一部を置き換えるドナー鋳型の挿入を含むことができる）、相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、または塩基除去修復（ＢＥＲ）などの宿主細胞修復機構によって編集される、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムの使用による標的核酸配列の改変のための方法で送達されることが想定される。例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子の１つ以上の変異体エクソンを削除するように設計された編集事象が所望される場合、ｇＮＡの対を使用して、ＰＣＳＫ９遺伝子内に変異を有するエクソンの異なる２つの部位５’および３’で結合および切断することができる。核酸の文脈において、切断は、ヌクレアーゼによる、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸分子の共有結合骨格の破損を指す。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のＣａｓＸ：ｇＮＡシステムおよび細胞修復システムによって導入される小さなインデルは、変異ＰＣＳＫ９遺伝子のタンパク質リーディングフレームを回復することができる（「リフレーミング」戦略）。リフレーミング戦略を使用する場合、細胞は単一のｇＮＡと接触され得る。参照ｇＮＡおよびｇＮＡバリアント。
いくつかの実施形態では、本開示のｇＮＡは、天然に存在するｇＮＡ（「参照ｇＮＡ」）の配列を含む。他の事例では、本開示の参照ｇＮＡは、ディープミューテーショナルエボルーション（ＤＭＥ）、ディープミューテーショナルスキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、スタガードエクステンションＰＣＲ、遺伝子シャフリング、またはドメインスワッピングを含み得る本明細書に記載の変異誘発などの１つ以上の変異誘発法に供され得、参照ｇＮＡに対して改変された配列を有する１つ以上のｇＮＡバリアントを生じ、参照ｇＮＡに対してｇＮＡバリアントが改善されたか、または変化した特性を示す。ｇＮＡバリアントには、例えば、５’末端もしくは３’末端のいずれかに融合された、または内部に挿入された１つ以上の外因性配列を含むバリアントも含まれる。参照ｇＮＡの活性は、ｇＮＡバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それにより、ｇＮＡバリアントの機能または他の特性の改善を測定することができる。他の実施形態では、参照ｇＮＡは、ｇＮＡバリアント、例えば、合理的に設計されたバリアントを産生するために、１つ以上の意図的な特異的標的化変異に供され得る。
本開示のｇＮＡは、２つのセグメント：標的化配列とタンパク質結合セグメントとを含む。ｇＮＡの標的化セグメントは、標的核酸配列（例えば、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖など）内の特定の配列（標的部位）に相補的である（したがってそれとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（ガイド配列、スペーサー、ターゲッター、または標的化配列として互換的に言及される）を含み、下記により完全に記載される。ｇＮＡの標的化配列は、コード配列、コード配列の相補体、非コード配列を含む標的核酸配列、および調節要素に結合することができる。タンパク質結合セグメント（または「活性化因子」もしくは「タンパク質結合配列」）は、複合体としてのＣａｓＸタンパク質と相互作用し（例えば、結合し）、ＲＮＰを形成する（以下でより完全に記載される）。タンパク質結合セグメントは代替的に、本明細書において「足場」と呼ばれ、これはいくつかの領域からなり、以下でより完全に記載される。
二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）の場合、ターゲッターおよび活性化因子は各々、デュプレックス形成セグメントを有し、ターゲッターのデュプレックス形成セグメントおよび活性化因子のデュプレックス形成セグメントは互いに相補性を有し、互いにハイブリダイズして二本鎖デュプレックス（ｇＲＮＡの場合はｄｓＲＮＡデュプレックス）を形成する。ｇＮＡがｇＲＮＡである場合、「ターゲッター」または「ターゲッターＲＮＡ」という用語は、ＣａｓＸ二重ガイドＲＮＡの（それ故に、例えば、介在ヌクレオチドによって「活性化因子」および「ターゲッター」が一緒に連結された場合、ＣａｓＸ単一ガイドＲＮＡの）ｃｒＲＮＡ様分子（ｃｒＲＮＡ：「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）を指すために本明細書で使用される。ｃｒＲＮＡは、標的化配列のヌクレオチドが続くｔｒａｃｒＲＮＡとアニーリングする５’領域を有する。したがって、例えば、ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、ガイド配列およびｃｒＲＮＡリピートとも呼ばれることがあるｃｒＲＮＡのデュプレックス形成セグメントを含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（活性化因子）も、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスの残りの半分を形成するヌクレオチドのデュプレックス形成ストレッチを含む。したがって、ターゲッターおよび活性化因子は、対応する対として、ハイブリダイズして、本明細書で「二重ガイドＮＡ」、「二重分子ｇＮＡ」、「ｄｇＮＡ」、「二重分子ガイドＮＡ」、または「２分子ガイドＮＡ」と称される二重ガイドＮＡを形成する。ＣａｓＸタンパク質による標的核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合および／または切断は、ｇＮＡの標的化配列と標的核酸配列との間の塩基対形成相補性によって決定される１つ以上の位置（例えば、標的核酸の配列）で起こり得る。そのため、例えば、本開示のｇＮＡは、ＴＣ ＰＡＭモチーフまたはＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、もしくはＴＴＣなどのＰＡＭ配列に隣接する標的核酸に相補的な配列を有し、したがってハイブリダイズすることができる。ガイド配列の標的化配列が標的核酸配列の配列にハイブリダイズするため、ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、ターゲッターは、特定の標的核酸配列にハイブリダイズするように使用者によって改変され得る。したがって、いくつかの事例では、ターゲッターの配列は、天然に存在しない配列であり得る。他の事例では、ターゲッターの配列は、編集される遺伝子に由来する天然に存在する配列であり得る。他の実施形態において、ｇＮＡの活性化因子およびターゲッターは、互いに共有結合し（互いにハイブリダイズするのではなく）、本明細書で「単一分子ｇＮＡ」、「１分子ガイドＮＡ」、「単一ガイドＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「１分子ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＤＮＡ」、「単一分子ＤＮＡ」、または「１分子ガイドＤＮＡ」（「ｓｇＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」、または「ｓｇＤＮＡ」）と称される単一分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＮＡは、「活性化因子」または「ターゲッター」を含み、それ故に、それぞれ、「活性化因子ＲＮＡ」および「ターゲッターＲＮＡ」であり得る。
まとめると、本開示の組み立てたｇＮＡは、本開示の実施形態において標的核酸に特異的であり、ｇＮＡの３’末端に配置される、４つの別個の領域またはドメイン：ＲＮＡトリプレックス、足場ステム、伸長ステム、および標的化配列を含む。ＲＮＡトリプレックス、足場ステム、および伸長ステムは、合わせて、ｇＮＡの「足場」と称される。
ａ．ＲＮＡトリプレックス
本明細書に提供されるガイドＲＮＡ（参照ｓｇＲＮＡを含む）のいくつかの実施形態では、ＲＮＡトリプレックスが存在し、ＲＮＡトリプレックスは、２つの介在ステムループ（足場ステムループおよび伸長ステムループ）の後にＡＡＡＧで終了するＵＵＵ－－ｎＸ（約４～１５）－－ＵＵＵステムループ（配列番号１９）の配列を含み、トリプレックスを越えてデュプレックスシュードノットにも伸長し得るシュードノットを形成する。トリプレックスのＵＵ－ＵＵＵ－ＡＡＡ配列は、標的化配列、足場ステム、および拡張ステムの間のネクサスとして形成される。例示的なＣａｓＸ ｓｇＲＮＡでは、ＵＵＵ－ループ－ＵＵＵ領域が最初にコードされ、次に足場ステムループ、次にテトラループが連結している拡張ステムループ、次に標的化配列になる前にトリプレックスを停止するＡＡＡＧがコードされる。
本明細書に提供されるガイドＲＮＡ（参照ｓｇＲＮＡを含む）のいくつかの実施形態では、ＲＮＡトリプレックスが存在し、ＲＮＡトリプレックスは、２つの介在ステムループ（足場ステムループおよび伸長ステムループ）の後にＡＡＡＧで終了するＵＵＵ－－ｎＸ（約４～１５）－－ＵＵＵステムループ（配列番号１９）の配列を含み、トリプレックスを越えてデュプレックスシュードノットにも伸長し得るシュードノットを形成する。トリプレックスのＵＵ－ＵＵＵ－ＡＡＡ配列は、標的化配列、足場ステム、および拡張ステムの間のネクサスとして形成される。例示的なＣａｓＸ ｓｇＲＮＡでは、ＵＵＵ－ループ－ＵＵＵ領域が最初にコードされ、次に足場ステムループ、次にテトラループが連結している拡張ステムループ、次に標的化配列になる前にトリプレックスを停止するＡＡＡＧがコードされる。
ｂ．足場ステムループ
本開示のｓｇＮＡのいくつかの実施形態では、トリプレックス領域の後に足場ステムループが続く。足場ステムループは、ＣａｓＸタンパク質（ＣａｓＸバリアントタンパク質など）が結合しているｇＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、足場ステムループは、かなり短く安定したステムループである。いくつかの事例では、足場ステムループは多くの変化を許容せず、何らかの形態のＲＮＡバブルを必要とする。いくつかの実施形態では、足場ステムはＣａｓＸ ｓｇＮＡ機能に必要である。重要なステムループであるという点でＣａｓ９のネクサスステムにおそらく類似しているが、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ ｓｇＮＡの足場ステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで見つけられる多くの他のステムループとは異なる必要なバルジ（ＲＮＡバブル）を有する。いくつかの実施形態では、このバルジの存在は、異なるＣａｓＸタンパク質と相互作用するｓｇＮＡにわたって保存されている。ｇＮＡの足場ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧ（配列番号２０）を含む。他の実施形態では、本開示は、足場ステムループが、ＭＳ２、Ｑ β、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、またはＰＰ７ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位５’および３’末端を有する異種ＲＮＡ源からのＲＮＡステムループ配列で置き換えられるｇＮＡバリアントを提供する。いくつかの事例では、ｇＮＡの異種ＲＮＡステムループは、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、または小分子に結合することができる。
本開示のｓｇＮＡのいくつかの実施形態では、トリプレックス領域の後に足場ステムループが続く。足場ステムループは、ＣａｓＸタンパク質（ＣａｓＸバリアントタンパク質など）が結合しているｇＮＡの領域である。いくつかの実施形態では、足場ステムループは、かなり短く安定したステムループである。いくつかの事例では、足場ステムループは多くの変化を許容せず、何らかの形態のＲＮＡバブルを必要とする。いくつかの実施形態では、足場ステムはＣａｓＸ ｓｇＮＡ機能に必要である。重要なステムループであるという点でＣａｓ９のネクサスステムにおそらく類似しているが、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ ｓｇＮＡの足場ステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで見つけられる多くの他のステムループとは異なる必要なバルジ（ＲＮＡバブル）を有する。いくつかの実施形態では、このバルジの存在は、異なるＣａｓＸタンパク質と相互作用するｓｇＮＡにわたって保存されている。ｇＮＡの足場ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧ（配列番号２０）を含む。他の実施形態では、本開示は、足場ステムループが、ＭＳ２、Ｑ β、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、またはＰＰ７ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位５’および３’末端を有する異種ＲＮＡ源からのＲＮＡステムループ配列で置き換えられるｇＮＡバリアントを提供する。いくつかの事例では、ｇＮＡの異種ＲＮＡステムループは、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、または小分子に結合することができる。
ｃ．伸長ステムループ
本開示のＣａｓＸ ｓｇＮＡのいくつかの実施形態では、足場ステムループの後に伸長ステムループが続く。いくつかの実施形態では、伸長ステムは、ＣａｓＸタンパク質の大部分が結合していない合成ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ融合を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、高度に順応性であり得る。いくつかの実施形態では、単一ガイドｇＲＮＡは、伸長ステムループ内のｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間のＧＡＡＡテトラループリンカーまたはＧＡＧＡＡＡリンカーで作製される。いくつかの事例では、ＣａｓＸ ｓｇＮＡのターゲッターおよび活性化因子は、介在ヌクレオチドによって互いに連結されており、リンカーは、３～２０個のヌクレオチド長を有することができる。本開示のＣａｓＸ ｓｇＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムは、リボ核タンパク質複合体のＣａｓＸタンパク質の外側に位置する大きい３２ｂｐループである。ｓｇＮＡの伸長ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣ（配列番号２１）を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、ＧＡＧＡＡＡスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、伸長ステムループが、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、またはＰＰ７ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位５’および３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列で置き換えられるｇＮＡバリアントを提供する。かかる事例では、異種ＲＮＡステムループは、ｇＮＡの安定性を増加させる。他の実施形態において、本開示は、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも１０，０００個のヌクレオチド、または少なくとも１０～１０，０００、少なくとも１０～１０００、または少なくとも１０～１００個のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を有するｇＮＡバリアントを提供する。
本開示のＣａｓＸ ｓｇＮＡのいくつかの実施形態では、足場ステムループの後に伸長ステムループが続く。いくつかの実施形態では、伸長ステムは、ＣａｓＸタンパク質の大部分が結合していない合成ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ融合を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、高度に順応性であり得る。いくつかの実施形態では、単一ガイドｇＲＮＡは、伸長ステムループ内のｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの間のＧＡＡＡテトラループリンカーまたはＧＡＧＡＡＡリンカーで作製される。いくつかの事例では、ＣａｓＸ ｓｇＮＡのターゲッターおよび活性化因子は、介在ヌクレオチドによって互いに連結されており、リンカーは、３～２０個のヌクレオチド長を有することができる。本開示のＣａｓＸ ｓｇＮＡのいくつかの実施形態では、伸長ステムは、リボ核タンパク質複合体のＣａｓＸタンパク質の外側に位置する大きい３２ｂｐループである。ｓｇＮＡの伸長ステムループ配列の例示的な配列は、配列ＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣ（配列番号２１）を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、ＧＡＧＡＡＡスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、伸長ステムループが、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、またはＰＰ７ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位５’および３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列で置き換えられるｇＮＡバリアントを提供する。かかる事例では、異種ＲＮＡステムループは、ｇＮＡの安定性を増加させる。他の実施形態において、本開示は、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも１０，０００個のヌクレオチド、または少なくとも１０～１０，０００、少なくとも１０～１０００、または少なくとも１０～１００個のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を有するｇＮＡバリアントを提供する。
ｄ．標的化配列
本開示のｇＮＡのいくつかの実施形態において、伸長ステムループの後にトリプレックスの一部を形成する領域が続き、その後にｇＮＡの３’末端に標的化配列（または「スペーサー」）が続く。標的化配列は、ＣａｓＸリボ核タンパク質ホロ複合体（すなわち、ＲＮＰ）を、改変される遺伝子の標的核酸配列の特定の領域に標的させる。したがって、例えば、本開示のｇＮＡ標的化配列は、ＴＣ ＰＡＭモチーフ、またはＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、もしくはＣＴＣのうちのいずれか１つが標的配列に相補的な非標的鎖配列の５’の１つのヌクレオチドに位置する場合、ＲＮＰの構成要素として真核生物細胞の核酸（例えば、真核生物染色体、染色体配列、真核生物ＲＮＡなど）におけるＰＣＳＫ９遺伝子の一部分に相補的であり、それ故に、それにハイブリダイズすることができる配列を有する。ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、ｇＮＡが任意の所望の標的核酸配列の所望の配列を標的することができるようにｇＮＡの標的化配列を改変することができる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ足場は、標的化配列の５’にあり、標的化配列は、ｇＮＡの３’末端にある。いくつかの実施形態において、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭモチーフ配列は、ＴＣである。他の実施形態において、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＮＴＣである。
本開示のｇＮＡのいくつかの実施形態において、伸長ステムループの後にトリプレックスの一部を形成する領域が続き、その後にｇＮＡの３’末端に標的化配列（または「スペーサー」）が続く。標的化配列は、ＣａｓＸリボ核タンパク質ホロ複合体（すなわち、ＲＮＰ）を、改変される遺伝子の標的核酸配列の特定の領域に標的させる。したがって、例えば、本開示のｇＮＡ標的化配列は、ＴＣ ＰＡＭモチーフ、またはＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、もしくはＣＴＣのうちのいずれか１つが標的配列に相補的な非標的鎖配列の５’の１つのヌクレオチドに位置する場合、ＲＮＰの構成要素として真核生物細胞の核酸（例えば、真核生物染色体、染色体配列、真核生物ＲＮＡなど）におけるＰＣＳＫ９遺伝子の一部分に相補的であり、それ故に、それにハイブリダイズすることができる配列を有する。ＰＡＭ配列の位置が考慮される限り、ｇＮＡが任意の所望の標的核酸配列の所望の配列を標的することができるようにｇＮＡの標的化配列を改変することができる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ足場は、標的化配列の５’にあり、標的化配列は、ｇＮＡの３’末端にある。いくつかの実施形態において、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭモチーフ配列は、ＴＣである。他の実施形態において、ＲＮＰのヌクレアーゼによって認識されるＰＡＭ配列は、ＮＴＣである。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、１つ以上の変異を含み得る、ＰＣＳＫ９タンパク質をコードする遺伝子の一部に対して相補的である。いくつかの実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、およびエクソン１２からなる群から選択されるＰＣＳＫ９エクソンに相補的である。いくつかの実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９イントロンに対して特異的である。いくつかの実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部に対して特異的である。いくつかの実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子またはその相補体のうちの１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列に対して相補的である。ＰＣＳＫ９コード配列内またはＰＣＳＫ９非コード配列内にあるＳＮＰは、両方とも本開示の範囲内である。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子間領域の配列、またはＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子間領域に相補的である配列に対して相補的である。他の実施形態では、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子の調節要素に相補的である。標的化配列が調節要素に特異的であるそれらの事例では、かかる調節要素には、プロモーター領域、エンハンサー領域、遺伝子間領域、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、保存要素、およびシス調節要素を含む領域が含まれるが、これらに限定されない。プロモーター領域は、コード配列の開始点から５ｋｂ以内のヌクレオチドを包含するよう意図されているか、または遺伝子エンハンサー要素もしくは保存要素の場合、標的核酸の遺伝子のコード配列から何千ｂｐ、何十万ｂｐ、またはさらには何百万ｂｐも離れて位置し得る。前述では、標的は、標的のコード遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされるよう意図されており、これにより、標的化タンパク質が細胞内で発現されないか、または細胞内でより低いレベルで発現されるようになるものである。
いくつかの実施形態において、標的化配列は、１４～３５個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１８、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２０個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５個の連続するヌクレオチドからなり、標的化配列は、標的核酸配列に対して０～５、０～４、０～３、または０～２個のミスマッチを含み、標的化配列を含むｇＮＡを含むＲＮＰが標的核酸に対して相補的結合を形成することができるように十分な結合特異性を保持することができる。
野生型ＰＣＳＫ９核酸に対する標的化配列の代表的であるが非限定的な例は、配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１として提供され、以下に表Ａとして示され、ＰＣＳＫ９標的核酸に対する標的化配列を表す。一実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列からなる。前述の実施形態では、標的化配列のうちのいずれかで、チミン（Ｔ）ヌクレオチドがウラシル（Ｕ）ヌクレオチドのうちの１つ以上またはすべての代わりに使用され、これにより、ｇＮＡが、ｇＤＮＡもしくはｇＲＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラになり得る。いくつかの実施形態では、配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される標的化配列は、ウラシルヌクレオチドについて置換された少なくとも１、２、３、４、５、または６個以上のチミンヌクレオチドを有する。他の実施形態において、本開示のｇＮＡ、ｇＲＮＡ、またはｇＤＮＡは、配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される１、２、３個以上の標的化配列、または配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１のうちの１つ以上の配列に対して少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一である標的化配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から２個のヌクレオチドが除去されている配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から３個のヌクレオチドが除去されている配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から４個のヌクレオチドが除去されている配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から５個のヌクレオチドが除去されている配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、標的化配列は、配列番号３３のＰＣＳＫ９タンパク質の変異またはＰＣＳＫ９タンパク質の機能もしくは発現を破壊する変異をコードする核酸配列に相補的である。いくつかのミスセンス変異（Ｓ１２７Ｒ、Ｄ１２９Ｇ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ３７４Ｈ、およびＤ３７４Ｙ）は、高コレステロール血症および早発性アテローム性動脈硬化症に関連しており、したがって、機能獲得型変異と考えられ（Ｓｈｉｌｐａ Ｐａｎｄｉｔ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ＰＣＳＫ９ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａｓ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４９：１３３３（２００８））、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子におけるこれらの変異をコードするＤＮＡ配列に相補的である標的化配列を企図し、ＡＧＣＡＧＧＵＣＧＣＣＵＣＵＣＡＵＣＵＵ（配列番号２７２）、ＣＡＵＣＵＵＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＧ（配列番号２７３）、ＣＣＵＣＵＣＡＵＣＵＵＣＡＣＣＡＧＧＡＡ（配列番号２７４）、ＵＧＧＵＧＡＡＧＡＵＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣ（配列番号２７５）、ＧＵＧＧＡＧＧＣＧＧＧＵＣＣＣＧＵＣＣＵ（配列番号２８１）、ＡＧＣＣＡＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＵＧＣＵＵ（配列番号２８７）、ＵＵＧＧＵＧＣＣＵＣＣＡＧＣＣＡＣＵＧＣ（配列番号２８８）、ＡＧＣＵＡＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＵＧＣＵＵ（配列番号２８９）、およびＵＵＧＧＵＧＣＣＵＣＣＡＧＣＵＡＣＵＧＣ（配列番号２９０）からなる群から選択される配列が含まれる。
いくつかの変異は、Ｒ４６Ｌ、Ｇ１０６Ｒ、Ｙ１４２Ｘ、Ｎ１５７Ｋ、Ｒ２３７Ｗ、およびＣ６７９Ｘを含む機能喪失型変異であると考えられ、低コレステロール血症に関連しており（Ｂｅｒｋｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｓｓｅｎｓｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ＰＣＳＫ９ Ｇｅｎｅ Ａｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ Ｈｙｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ａｎｄ Ｐｏｓｓｉｂｌｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｓｔａｔｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．２６：１０９４（２００６））、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子におけるこれらの変異をコードするＤＮＡ配列に相補的である標的化配列を企図する。ＰＣＳＫ９変異に特異的である例示的な標的化配列、およびスペーサーによって標的化されるＰＣＳＫ９変異のＣｌｉｎＶａｒ（／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ／）識別子が、以下の表Ｂに提供される。
変異体ＰＣＳＫ９核酸に対する標的化配列の代表的であるが非限定的な例は、上記に表Ｂとして示される配列番号２４７～３０３として提供される。一実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列番号２４７～３０３からなる群から選択される配列に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列番号２４７～３０３からなる群から選択される配列からなる。いくつかの実施形態では、配列番号２４７～３０３からなる群から選択される標的化配列は、ウラシルヌクレオチドについて置換された少なくとも１、２、３、４、５、または６個以上のチミンヌクレオチドを有する。他の実施形態において、本開示は、配列番号２４７～３０３からなる群から選択される標的化配列、または配列番号２４７～３０３のうちの１つ以上の配列に対して少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一である標的化配列を含む、１、２、３個以上のｇＮＡを含むＣａｓＸ：ｇＮＡシステムを提供する。いくつかの実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から２個のヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から３個のヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から４個のヌクレオチドが除去されている配列番号３２４７～３０３からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、配列の３’末端から５個のヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムは、第１のｇＮＡを含み、さらに第２の（および任意選択的に第３、第４、第５、またはそれ以上の）ｇＮＡを含み、第２のｇＮＡまたは追加のｇＮＡは、第１のｇＮＡの標的化配列と比較して標的核酸配列の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有し、それにより、標的核酸内の複数の点が標的化され、例えば、複数の切断がＣａｓＸによって標的核酸内に導入されるようになる。かかる事例では、第２のまたは追加のｇＮＡがＣａｓＸタンパク質の追加のコピーと複合体形成されることが理解されよう。ｇＮＡの標的化配列を選択することにより、標的核酸内の特定の位置を挟む標的核酸配列の定義された領域は、本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡシステムを使用して改変または編集することができ、ドナー鋳型の挿入またはＰＣＳＫ９遺伝子の変異を含む領域もしくはエクソンの切除が含まれる。
ｅ．ｇＮＡ足場
標的化配列ドメインを除いて、ｇＮＡの残りの成分は本明細書では足場と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ足場は、参照ｇＮＡとして以下に記載される、天然に存在する配列に由来する。他の実施形態では、ｇＮＡ足場は、変異、挿入、欠失、またはドメイン置換が導入されて、ｇＮＡに望ましい特性を付与する、参照ｇＮＡのバリアントである。
標的化配列ドメインを除いて、ｇＮＡの残りの成分は本明細書では足場と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡ足場は、参照ｇＮＡとして以下に記載される、天然に存在する配列に由来する。他の実施形態では、ｇＮＡ足場は、変異、挿入、欠失、またはドメイン置換が導入されて、ｇＮＡに望ましい特性を付与する、参照ｇＮＡのバリアントである。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＲＮＡは、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されたまたはそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号２２）およびＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号２３）を含み得る。Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されたまたはそれに由来する例示的なｃｒＲＮＡ配列は、ＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２４）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＮＡは、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒから単離されたまたはそれに由来する配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ガイドＲＮＡは、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたか、またはそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡ（配列番号８）およびＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧ（配列番号９）を含み得る。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたまたはそれに由来する例示的なｃｒＲＮＡ配列は、ＵＣＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２７）の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＮＡは、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されたまたはそれに由来する配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ参照ｇＮＡは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、ＣａｓＸ ｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離された、またはそれに由来する例示的なＣａｓＸ参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＡＧＧＧＵ（配列番号１０）、ＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＡＧＧＵ（配列番号１１）、ＵＵＵＵＡＣＡＵＡＣＣＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＡＵ（配列番号１２）およびＧＵＵＵＡＣＡＣＡＣＵＣＣＣＵＣＵＣＡＵＧＧＧＧＧ（配列番号１３）の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ＣａｓＸ参照ガイドＲＮＡは、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されたか、またはそれに由来する配列と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む。
表１は、参照ｇＲＮＡ ｔｒａｃｒ配列および足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＮＡが表１の配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を有する参照ｇＮＡ配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド改変を有する配列を含む足場を有する、ｇＮＡ配列を提供する。ベクターがｇＮＡのＤＮＡコード配列を含むか、またはｇＮＡがｇＤＮＡもしくはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラであるそれらの実施形態において、チミン（Ｔ）塩基を、表１および表２の配列を含む、本明細書に記載のｇＮＡ配列の実施形態のうちのいずれかのウラシル（Ｕ）塩基の代わりに使用することができることが理解されよう。
ｆ．ｇＮＡバリアント
別の態様では、本開示は、参照ｇＲＮＡ足場と比較して１つ以上の改変を含むガイド核酸バリアント（本明細書では代替的に「ｇＮＡバリアント」または「ｇＲＮＡバリアント」と称される）に関する。本明細書で使用される場合、「足場」とは、スペーサー配列を除くｇＮＡ機能に必要なｇＮＡのすべての部分を指す。
別の態様では、本開示は、参照ｇＲＮＡ足場と比較して１つ以上の改変を含むガイド核酸バリアント（本明細書では代替的に「ｇＮＡバリアント」または「ｇＲＮＡバリアント」と称される）に関する。本明細書で使用される場合、「足場」とは、スペーサー配列を除くｇＮＡ機能に必要なｇＮＡのすべての部分を指す。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントの足場は、配列番号４または配列番号５を含む参照ｇＲＮＡの配列に対して１つ以上の追加の変化を含むバリアントである。参照ｇＲＮＡの足場が配列番号４または配列番号５に由来するそれらの実施形態では、ｇＮＡバリアントの１つ以上の改善または追加された特性は、配列番号４または配列番号５の同じ特性と比較して改善される。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、本開示の参照ｇＲＮＡ配列と比較して１個以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、または交換もしくは置換された領域を含む。いくつかの実施形態では、変異が参照ｇＲＮＡの任意の領域で起こり、ｇＮＡバリアントを産生することができる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアント配列の足場は、配列番号４または配列番号５の配列と少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの特性を改善する、参照ｇＲＮＡの１つ以上の領域内の１つ以上のヌクレオチド変化を含む。例示的な領域には、ＲＮＡトリプレックス、シュードノット、足場ステムループ、および伸長ステムループが含まれる。いくつかの事例では、バリアント足場ステムは、バブルをさらに含む。他の事例では、バリアント足場は、トリプレックスループ領域をさらに含む。さらに他の事例では、バリアント足場は、５’非構造領域をさらに含む。一実施形態では、ｇＮＡバリアント足場は、配列番号１４と少なくとも６０％の配列同一性を有する足場ステムループを含む。別の実施形態では、ｇＮＡバリアントは、ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３２）の配列を有する足場ステムループを含む。別の実施形態では、本開示は、元の６ｎｔループおよび１３個の最もループに近位の塩基対（合計３２個のヌクレオチド）がＵｖｓｘヘアピン（４ｎｔのループおよび５個のループに近位の塩基対、合計１４個のヌクレオチド）に置き換えられ、伸長ステムのループから遠位の塩基がＡ９９の欠失およびＧ６４Ｕの置換により新たなＵｖｓｘヘアピンと隣接する完全に塩基対形成されたステムに変換された、配列番号５と比較して、Ｃ１８Ｇ置換、Ｇ５５挿入、Ｕ１欠失、および改変された伸長ステムループを含むｇＮＡ足場を提供する。前述の実施形態では、ｇＮＡ足場は、配列ＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＵＣＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号２２３８）を含む。
バリアントｇＮＡが本明細書に記載の参照ｇＲＮＡと比較された場合に１つ以上の改善された機能または特性を有するか、または１つ以上の新たな機能を追加するすべてのｇＮＡバリアントは、本開示の範囲内であると想定される。かかるｇＮＡバリアントの代表的な例はガイド１７４（配列番号２２３８）であり、その設計は実施例に記載されている。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、ｇＮＡバリアントを含むＲＮＰに新たな機能を追加する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、改善された安定性、改善された溶解性、ｇＮＡの改善された転写、ヌクレアーゼ活性に対する改善された抵抗性、ｇＮＡの増加したフォールディング率、フォールディング中の減少した副産物形成、増加した生産的フォールディング、ＣａｓＸタンパク質に対する改善された結合親和性、ＣａｓＸタンパク質とともに複合体形成された場合の標的ＤＮＡに対する改善された結合親和性、ＣａｓＸタンパク質とともに複合体形成された場合の改善された遺伝子編集、ＣａｓＸタンパク質とともに複合体形成された場合の改善された編集特異性、およびＣａｓＸタンパク質とともに複合体形成された場合の標的ＤＮＡの編集においてＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、またはＴＴＣ（ＡＴＣＮ、ＣＴＣＮ、ＧＴＣＮ、およびＴＴＣＮ ＰＡＭとも称される）を含む１つ以上のＰＡＭ配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせから選択される改善された特性を有する。いくつかの事例では、ｇＮＡバリアントの改善された特性のうちの１つ以上は、配列番号４または配列番号５の参照ｇＮＡと比較して少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善される。他の事例では、ｇＮＡバリアントの１つ以上の改善された特徴は、配列番号４または配列番号５の参照ｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１００，０００倍以上改善されている。他の事例では、ｇＮＡバリアントの改善された特性のうちの１つ以上は、配列番号４または配列番号５の参照ｇＮＡと比較して約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、または約５０～１００倍改善される。他の事例では、ｇＮＡバリアントの１つ以上の改善された特性は、配列番号４または配列番号５の参照ｇＮＡと比較して約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、または５００倍改善される。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、本開示のｇＮＡバリアントを生成するために、参照ｇＲＮＡを、ディープミューテーショナルエボルーション（ＤＭＥ）、ディープミューテーショナルスキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、スタガードエクステンションＰＣＲ、遺伝子シャフリング、またはドメインスワッピングを含み得る以下の本明細書に記載の変異誘発法などの１つ以上の変異誘発法に供することによって作製することができる。参照ｇＲＮＡの活性は、ｇＮＡバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それにより、ｇＮＡバリアントの機能の改善を測定することができる。他の実施形態では、参照ｇＲＮＡは、ｇＮＡバリアント、例えば、合理的に設計されたバリアントを産生するために、１つ以上の意図的な標的化変異、置換、またはドメイン交換に供され得る。かかる方法によって産生された例示的なｇＲＮＡバリアントは実施例に記載されており、ｇＮＡ足場の代表的な配列は表２に提示される。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ガイド核酸足場配列と比較して１つ以上の改変を含み、１つ以上の改変は、ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１個のヌクレオチド置換、ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１個のヌクレオチド欠失、ｇＮＡバリアントの領域における少なくとも１個のヌクレオチド挿入、ｇＮＡバリアントの領域のすべてもしくは一部分の置換、ｇＮＡバリアントの領域のすべてもしくは一部分の欠失、または前述の任意の組み合わせから選択される。いくつかの事例では、改変は、１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１５個の連続または非連続ヌクレオチドの置換である。他の事例では、改変は、１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１０個の連続または非連続ヌクレオチドの欠失である。他の事例では、改変は、１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１０個の連続または非連続ヌクレオチドの挿入である。他の事例では、改変は、近位５’および３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列での足場ステムループまたは伸長ステムループの置換である。いくつかの事例では、本開示のｇＮＡバリアントは、１つの領域に２つ以上の改変を含む。他の事例では、本開示のｇＮＡバリアントは、２つ以上の領域に改変を含む。他の事例では、ｇＮＡバリアントは、この段落に記載される前述の改変の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、＋１ヌクレオチドがＧである場合、Ｕ６プロモーターからの転写が開始部位に関してより効率的かつより一貫しているため、５’Ｇがインビボでの発現のためにｇＮＡバリアント配列に付加される。他の実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼが＋１位にＧおよび＋２位にプリンを強く好むため、２つの５’Ｇがインビトロ転写のためにｇＮＡバリアント配列に付加されて、産生効率を増加させる。いくつかの事例では、５’Ｇ塩基が表１の参照足場に付加される。他の事例では、５’Ｇ塩基が表２のバリアント足場に付加される。
表２は、例示的なｇＮＡバリアント足場配列を提供する。表２中、（－）は、配列番号５の参照配列に対する指定された位置での欠失を示し、（＋）は、配列番号５に対する指示された位置での指定された塩基の挿入を示し、（：）は、配列番号５に対する欠失または置換の指定された開始：終止座標での塩基の範囲を示し、複数の挿入、欠失、または置換は、例えば、Ａ１４Ｃ、Ｕ１７Ｇのようにコンマで区切られている。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアント足場は、表２に列挙される配列番号２１０１～２２８５のうちのいずれか１つ、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＮＡ変異体足場は、表２に示される配列番号２１０１～２２８５からなる群から選択される配列を含むか、または本質的にそれからなる。ベクターがｇＮＡのＤＮＡコード配列を含むか、またはｇＮＡがｇＤＮＡもしくはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラであるそれらの実施形態では、チミン（Ｔ）塩基を本明細書に記載のｇＮＡ配列の実施形態のうちのいずれかのウラシル（Ｕ）塩基の代わりに使用することができることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列－ＵＵＵ－Ｎ４－２５－ＵＵＵ－（配列番号３４）を含むｔｒａｃｒＲＮＡステムループを含む。例えば、ｇＮＡバリアントは、トリプレックス領域に寄与する２つのトリプレットＵモチーフが隣接する足場ステムループまたはその置換を含む。いくつかの実施形態では、足場ステムループまたはその置換は、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチド、少なくとも６個のヌクレオチド、少なくとも７個のヌクレオチド、少なくとも７個のヌクレオチド、少なくとも８個のヌクレオチド、少なくとも９個のヌクレオチド、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１１個のヌクレオチド、少なくとも１２個のヌクレオチド、少なくとも１３個のヌクレオチド、少なくとも１４個のヌクレオチド、少なくとも１５個のヌクレオチド、少なくとも１６個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも１９個のヌクレオチド、少なくとも２０個のヌクレオチド、少なくとも２１個のヌクレオチド、少なくとも２２個のヌクレオチド、少なくとも２３個のヌクレオチド、少なくとも２４個のヌクレオチド、または少なくとも２５個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、スペーサー領域に対して５’の位置に－ＡＡＡＧ－を有するｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、－ＡＡＡＧ－配列は、スペーサー領域に対してすぐ５’にある。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントを産生するための参照ｇＮＡに対する少なくとも１つのヌクレオチド改変は、参照ｇＲＮＡと比較してＣａｓＸバリアントｇＮＡに少なくとも１つのヌクレオチド欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続または非連続ヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの欠失は、参照ｇＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の連続ヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＮＡと比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上のヌクレオチドの欠失を含み、この欠失は連続ヌクレオチドにはない。参照ｇＲＮＡと比較してｇＮＡバリアントに２つ以上の非連続欠失が存在するそれらの実施形態では、本明細書に記載される、いずれかの長さの欠失、およびいずれかの長さの欠失の組み合わせも、本開示の範囲内であると企図される。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１個のヌクレオチドの第１の欠失および２個のヌクレオチドの第２の欠失を含んでもよく、これらの２つの欠失は連続していない。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの異なる領域に少なくとも２つの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの同じ領域に少なくとも２つの欠失を含む。例えば、領域は、伸長ステムループ、足場ステムループ、足場ステムバブル、トリプレックスループ、シュードノット、トリプレックス、またはｇＮＡバリアントの５’末端であり得る。参照ｇＲＮＡにおけるいずれかのヌクレオチドの欠失も、本開示の範囲内であると企図される。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントを生成するための参照ｇＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド改変は、少なくとも１つのヌクレオチド挿入を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の連続または非連続ヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のヌクレオチドの挿入は、参照ｇＲＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の連続ヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して２つ以上の挿入を含み、これらの挿入は連続していない。参照ｇＲＮＡと比較してｇＮＡバリアントに２つ以上の非連続挿入が存在するそれらの実施形態では、本明細書に記載される、いずれかの長さの挿入、およびいずれかの長さの挿入の組み合わせも、本開示の範囲内であると企図される。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１個のヌクレオチドの第１の挿入および２個のヌクレオチドの第２の挿入を含んでもよく、これらの２つの挿入は連続していない。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの異なる領域に少なくとも２つの挿入を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの同じ領域に少なくとも２つの挿入を含む。例えば、領域は、伸長ステムループ、足場ステムループ、足場ステムバブル、トリプレックスループ、シュードノット、トリプレックス、またはｇＮＡバリアントの５’末端であり得る。参照ｇＲＮＡにおける任意の位置でのＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（または対応するＤＮＡではＴ）、またはそれらの組み合わせのいずれかの挿入も、本開示の範囲内であると企図される。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントを生成するための参照ｇＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチド改変は、少なくとも１つの核酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の連続または非連続置換ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、１～４個のヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの置換は、参照ｇＲＮＡと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以上の連続ヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して２つ以上の置換を含み、これらの置換は連続していない。参照ｇＲＮＡと比較してｇＮＡバリアントに２つ以上の非連続置換が存在するそれらの実施形態では、本明細書に記載される、いずれかの長さの置換ヌクレオチド、およびいずれかの長さの置換ヌクレオチドの組み合わせも、本開示の範囲内であると企図される。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１個のヌクレオチドの第１の置換および２個のヌクレオチドの第２の置換を含んでもよく、これらの２つの置換は連続していない。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの異なる領域に少なくとも２つの置換を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡの同じ領域に少なくとも２つの置換を含む。例えば、領域は、トリプレックス、伸長ステムループ、足場ステムループ、足場ステムバブル、トリプレックスループ、シュードノット、トリプレックス、またはｇＮＡバリアントの５’末端であり得る。参照ｇＲＮＡにおける任意の位置でのＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（または対応するＤＮＡではＴ）、またはそれらの組み合わせのいずれかの置換も、本開示の範囲内であると企図される。
本明細書に記載の置換、挿入、および欠失のうちのいずれかを組み合わせて、本開示のｇＮＡバリアントを生成することができる。例えば、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの置換および少なくとも１つの欠失、参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの置換および少なくとも１つの挿入、参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの挿入および少なくとも１つの欠失、または参照ｇＲＮＡと比較して少なくとも１つの置換、１つの挿入、および１つの欠失を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号４～１６のうちのいずれか１つと少なくとも２０％同一、少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の足場領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号４～１６のうちのいずれか１つと少なくとも６０％相同（または同一）の足場領域を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１４と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一のｔｒａｃｒステムループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１４と少なくとも６０％相同（または同一）のｔｒａｃｒステムループを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１５と少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一の伸長ステムループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号１５と少なくとも６０％相同（または同一）の伸長ステムループを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、以下に記載されるように、外因性伸長ステムループを含み、この点で参照ｇＮＡとは異なる。いくつかの実施形態では、外因性伸長ステムループは、本明細書に開示される参照ステムループ領域（例えば、配列番号１５）と同一性をほとんどまたは全く有しない。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐ、少なくとも２，０００ｂｐ、少なくとも３，０００ｂｐ、少なくとも４，０００ｂｐ、少なくとも５，０００ｂｐ、少なくとも６，０００ｂｐ、少なくとも７，０００ｂｐ、少なくとも８，０００ｂｐ、少なくとも９，０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ、少なくとも１２，０００ｂｐ、少なくとも１５，０００ｂｐ、または少なくとも２０，０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも１０，０００個のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、異種ステムループは、ｇＮＡの安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、異種ＲＮＡステムループは、タンパク質、ＲＮＡ構造、ＤＮＡ配列、または小分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、ステムループを置き換える外因性ステムループ領域は、得られるｇＮＡが増加した安定性を有し、ループの選択に応じて特定の細胞タンパク質またはＲＮＡと相互作用することができるＲＮＡステムループまたはヘアピンを含む。かかる外因性伸長ステムループは、例えば、熱安定性ＲＮＡを含むことができ、ＭＳ２（ＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＵＡＣＣＣＡＵＧＵ（配列番号３５））、Ｑβ（ＵＧＣＡＵＧＵＣＵＡＡＧＡＣＡＧＣＡ（配列番号３６））、Ｕ１ヘアピンＩＩ（ＡＡＵＣＣＡＵＵＧＣＡＣＵＣＣＧＧＡＵＵ（配列番号３７））、Ｕｖｓｘ（ＣＣＵＣＵＵＣＧＧＡＧＧ（配列番号３８））、ＰＰ７（ＡＧＧＡＧＵＵＵＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＣＣＵ（配列番号３９））、ファージ複製ループ（ＡＧＧＵＧＧＧＡＣＧＡＣＣＵＣＵＣＧＧＵＣＧＵＣＣＵＡＵＣＵ（配列番号４０））、キッシングループ＿ａ（ＵＧＣＵＣＧＣＵＣＣＧＵＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号４１））、キッシングループ＿ｂ１（ＵＧＣＵＣＧＡＣＧＣＧＵＣＣＵＣＧＡＧＣＡ（配列番号４２））、キッシングループ＿ｂ２（ＵＧＣＵＣＧＵＵＵＧＣＧＧＣＵＡＣＧＡＧＣＡ（配列番号４３））、ＧクアッドリプレックスＭ３ｑ（ＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧ（配列番号４４））、Ｇクアッドリプレックステロメアバスケット（ＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧＧＵＵＡＧＧ（配列番号４５））、サルシン－リシンループ（ＣＵＧＣＵＣＡＧＵＡＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＣＧＣＡＧ（配列番号４６））、またはシュードノット（ＵＡＣＡＣＵＧＧＧＡＵＣＧＣＵＧＡＡＵＵＡＧＡＧＡＵＣＧＧＣＧＵＣＣＵＵＵＣＡＵＵＣＵＡＵＡＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＵＵＵＵＡＡＡＡＵＧＵＣＵＣＵＡＡＧＵＡＣＡ（配列番号４７））などが挙げられる。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含む。本明細書で使用される場合、ｌｎｃＲＮＡは、およそ２００ｂｐよりも長い非コードＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、外因性ステムループの５’および３’末端が塩基対を形成し、すなわち、それらが相互作用してデュプレックスＲＮＡの領域を形成する。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの５’および３’末端が塩基対を形成し、外因性ステムループの５’末端と３’末端との間の１つ以上の領域は塩基対を形成しない。いくつかの実施形態では、少なくとも１個のヌクレオチド改変は、（ａ）１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１５個の連続もしくは非連続ヌクレオチドの置換、（ｂ）１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１０個の連続もしくは非連続ヌクレオチドの欠失、（ｃ）１つ以上の領域におけるｇＮＡバリアントの１～１０個の連続もしくは非連続ヌクレオチドの挿入、（ｄ）近位５’および３’末端を有する異種ＲＮＡ源由来のＲＮＡステムループ配列での足場ステムループもしくは伸長ステムループの置換、または（ａ）～（ｄ）の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、ＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３２）の足場ステムループ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、それと少なくとも１、２、３、４、または５つのミスマッチを有するＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＧＵＧＧ（配列番号３２）の足場ステムループ配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、３２個未満のヌクレオチド、３１個未満のヌクレオチド、３０個未満のヌクレオチド、２９個未満のヌクレオチド、２８個未満のヌクレオチド、２７個未満のヌクレオチド、２６個未満のヌクレオチド、２５個未満のヌクレオチド、２４個未満のヌクレオチド、２３個未満のヌクレオチド、２２個未満のヌクレオチド、２１個未満のヌクレオチド、または２０個未満のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、３２個未満のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、熱安定性ステムループをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントは、配列番号２２０１～２２８５のうちのいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントは、配列番号２１０６、２２３７、２２３８、２２３９、２２４１、２２４４、２２７５、２２７９、２２８０、および２２８５からなる群から選択される配列を含む。
本開示のｇＮＡバリアントのいくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、少なくとも１つの改変を含み、配列番号５の参照ガイド足場と比較した少なくとも１つの改変は、（ａ）トリプレックスループにおけるＣ１８Ｇ置換、（ｂ）ステムバブルにおけるＧ５５挿入、（ｃ）Ｕ１欠失、（ｄ）伸長ステムループの改変であって、（ｉ）６ｎｔのループおよび１３個のループ近位塩基対がＵｖｓｘヘアピンによって置き換えられ、（ｉｉ）完全に塩基形成されたループ遠位塩基をもたらすＡ９９の欠失およびＧ６５Ｕの置換である、伸長ステムループの改変のうちの１つ以上から選択される。かかる実施形態では、ｇＮＡバリアントは、配列番号２２３６、２２３７、２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、または２２５９～２２８５のうちのいずれか１つの配列を含む。
例示的な実施形態において、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３８（バリアント足場１７４、表２を参照）の配列に対する１つ以上の追加の変更を含む。
例示的な実施形態において、ｓｇＲＮＡバリアントは、配列番号２２３９（バリアント足場１７５、表２を参照）の配列に対する１つ以上の追加の変更を含む。
一部の実施形態では、ｇＮＡバリアントは、上記でより詳細に記載される、ｇＮＡの３’末端に位置するスペーサー（または標的化配列）領域をさらに含み、少なくとも１４～約３５個のヌクレオチドを含み、スペーサーは、標的ＤＮＡに相補的な配列で設計される。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、標的ＤＮＡに相補的な少なくとも１０～３０個のヌクレオチドの標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、２０個のヌクレオチドを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２３個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２２個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２１個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２０個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４個のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントの足場は、表３、５、６、７、および９に示される配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、もしくは４９０のうちのいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むＣａｓＸバリアントタンパク質を有するＲＮＰの一部である。前述の実施形態では、ｇＮＡは、スペーサー配列をさらに含む。
ｇＮＡバリアントの実施形態において、ｇＮＡバリアントは、少なくとも１４～約３５個のヌクレオチドを含む、上記でより完全に記載されている、ｇＮＡの３’末端に位置するスペーサー（または標的化配列）領域をさらに含み、スペーサーは、標的核酸に相補的である配列を用いて設計される。いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントは、標的核酸に相補的な少なくとも１０～３０個のヌクレオチドの標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、２０個のヌクレオチドを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２３個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２２個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、２１個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１８個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１７個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１６個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１５個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１４個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、もしくは２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一である配列を含む、本開示のｇＮＡバリアントにおける包含のための標的化配列を提供する。いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントの標的化配列は、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含み、配列の３’末端から単一ヌクレオチドが除去されている。他の実施形態では、ｇＮＡバリアントの標的化配列は、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含み、配列の３’末端から２個のヌクレオチドが除去されている。他の実施形態では、ｇＮＡバリアントの標的化配列は、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含み、配列の３’末端から３個のヌクレオチドが除去されている。他の実施形態において、ｇＮＡバリアントの標的化配列は、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含み、配列の３’末端から４個のヌクレオチドが除去されている。他の実施形態では、ｇＮＡバリアントの標的化配列は、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含み、配列の３’末端から５個のヌクレオチドが除去されている。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントは、ｇＮＡの３’末端に位置するスペーサー（標的化）領域をさらに含み、スペーサーは、標的核酸に相補的である配列を用いて設計される。いくつかの実施形態において、標的核酸は、スペーサーの第１のヌクレオチドからＰＡＭを分離する少なくとも単一のヌクレオチドを有するスペーサーの５’に位置するＰＡＭ配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは、標的領域の非標的化鎖、すなわち、標的核酸に相補的である鎖に位置する。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列はＡＴＣである。いくつかの実施形態において、ＡＴＣ ＰＡＭに対する標的化配列は、配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～３１８３からなる群から選択される配列、または配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～３１８３に対して少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＴＣ ＰＡＭに対する標的化配列は、配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～３１８３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＣＴＣである。いくつかの実施形態において、ＣＴＣ ＰＡＭに対する標的化配列は、配列番号７２５２～１１５２１からなる群から選択される配列、または配列番号７２５２～１１５２１に対して少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＴＣ ＰＡＭに対する標的化配列は、配列番号７２５２～１１５２１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＧＴＣである。いくつかの実施形態において、ＧＴＣ ＰＡＭに対する標的化配列は、配列番号１１５２２～１３８６１からなる群から選択される配列、または配列番号１１５２２～１３８６１に対して少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＴＣ ＰＡＭに対する標的化配列は、配列番号１１５２２～１３８６１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＴＴＣである。いくつかの実施形態において、ＴＴＣ ＰＡＭに対する標的化配列は、配列番号３１８４～７２５１からなる群から選択される配列、または配列番号３１８４～７２５１に対して少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＴＣ ＰＡＭに対する標的化配列は、配列番号３１８４～７２５１からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントは、ｇＮＡの３’末端に位置する標的化配列を含み、標的化配列は、変異を含む標的核酸配列に相補的であり、変異は、機能獲得型変異である。前述の特定の実施形態において、変異は、配列番号３３の配列に対してＳ１２７Ｒ、Ｄ１２９Ｇ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ３７４Ｈ、およびＤ３７４Ｙからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。別の特定の実施形態において、標的化配列は、表Ｂに示される配列番号２４７～３０３からなる群から選択される配列を含む。前述の別の特定の実施形態において、標的化配列は、ＡＧＣＡＧＧＵＣＧＣＣＵＣＵＣＡＵＣＵＵ（配列番号２７２）、ＣＡＵＣＵＵＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＧ（配列番号２７３）、ＣＣＵＣＵＣＡＵＣＵＵＣＡＣＣＡＧＧＡＡ（配列番号２７４）、ＵＧＧＵＧＡＡＧＡＵＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣ（配列番号２７５）、ＧＵＧＧＡＧＧＣＧＧＧＵＣＣＣＧＵＣＣＵ（配列番号２８１）、ＡＧＣＣＡＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＵＧＣＵＵ（配列番号２８７）、ＵＵＧＧＵＧＣＣＵＣＣＡＧＣＣＡＣＵＧＣ（配列番号２８８）、ＡＧＣＵＡＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＵＧＣＵＵ（配列番号２８９）、およびＵＵＧＧＵＧＣＣＵＣＣＡＧＣＵＡＣＵＧＣ（配列番号２９０）からなる群から選択される配列を含む。前述の別の特定の実施形態において、標的化配列は、ＡＧＣＡＧＧＵＣＧＣＣＵＣＵＣＡＵＣＵＵ（配列番号２７２）、ＣＡＵＣＵＵＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＧ（配列番号２７３）、ＣＣＵＣＵＣＡＵＣＵＵＣＡＣＣＡＧＧＡＡ（配列番号２７４）、ＵＧＧＵＧＡＡＧＡＵＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣ（配列番号２７５）、ＧＵＧＧＡＧＧＣＧＧＧＵＣＣＣＧＵＣＣＵ（配列番号２８１）、ＡＧＣＣＡＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＵＧＣＵＵ（配列番号２８７）、ＵＵＧＧＵＧＣＣＵＣＣＡＧＣＣＡＣＵＧＣ（配列番号２８８）、ＡＧＣＵＡＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＵＧＣＵＵ（配列番号２８９）、およびＵＵＧＧＵＧＣＣＵＣＣＡＧＣＵＡＣＵＧＣ（配列番号２９０）からなる群から選択される配列からなる。他の実施形態において、ｇＮＡバリアントは、ｇＮＡの３’末端に位置する標的化配列を含み、標的化配列は、変異を含む標的核酸配列に相補的であり、変異は、機能喪失型変異である。前述の特定の実施形態において、変異は、配列番号３３の配列に対して、Ｒ４６Ｌ、Ｇ１０６Ｒ、Ｙ１４２Ｘ、Ｎ１５７Ｋ、Ｒ２３７Ｗ、またはＣ６７９Ｘからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
ｇ．ＣａｓＸタンパク質との複合体形成
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、ＣａｓＸタンパク質（参照ＣａｓＸまたはＣａｓＸバリアントタンパク質など）と複合体を形成する改善された能力を有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、ＣａｓＸタンパク質（参照またはバリアントタンパク質など）に対する改善された親和性を有し、それにより、実施例に記載されるように、ＣａｓＸタンパク質とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するその能力を改善する。リボ核タンパク質複合体形成を改善することにより、いくつかの実施形態では、機能的ＲＮＰが組み立てられる効率が改善され得る。いくつかの実施形態において、本開示のｇＮＡバリアント足場とそのスペーサーとを含むＲＮＰの９０％超、９３％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超が、標的核酸の遺伝子編集の能力を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、ＣａｓＸタンパク質（参照ＣａｓＸまたはＣａｓＸバリアントタンパク質など）と複合体を形成する改善された能力を有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して、ＣａｓＸタンパク質（参照またはバリアントタンパク質など）に対する改善された親和性を有し、それにより、実施例に記載されるように、ＣａｓＸタンパク質とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するその能力を改善する。リボ核タンパク質複合体形成を改善することにより、いくつかの実施形態では、機能的ＲＮＰが組み立てられる効率が改善され得る。いくつかの実施形態において、本開示のｇＮＡバリアント足場とそのスペーサーとを含むＲＮＰの９０％超、９３％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超が、標的核酸の遺伝子編集の能力を有する。
ＣａｓＸタンパク質と複合体を形成するｇＮＡバリアントの能力を改善することができる例示的なヌクレオチド変化は、いくつかの実施形態では、足場ステムを熱安定性ステムループで置き換えることを含み得る。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、足場ステムを熱安定性ステムループで置き換えることにより、ＣａｓＸタンパク質とのｇＮＡバリアントの全体的な結合安定性を増加させることができる。あるいは、または加えて、ステムループの大部分を除去することにより、ｇＮＡバリアントのフォールディング動態が変化し、機能的な折り畳まれたｇＮＡが容易かつ迅速に作製され、例えば、ｇＮＡバリアントが自身に「絡まる」可能性の程度を減少させることによって、構造的に組み立てられ得る。いくつかの実施形態では、足場ステムループ配列の選択は、ｇＮＡに利用される異なるスペーサーによって変化し得る。いくつかの実施形態では、足場配列は、スペーサー、ひいては標的配列に合わせて調整され得る。生化学的アッセイを使用して、実施例のアッセイを含む、ＲＮＰを形成するためのｇＮＡバリアントに対するＣａｓＸタンパク質の結合親和性を評価することができる。例えば、当業者であれば、追加の非標識「コールド競合物」ｇＮＡの増加濃度に対する応答として、固定化されたＣａｓＸタンパク質に結合している蛍光標識ｇＮＡの量の変化を測定することができる。あるいは、または加えて、異なる量の蛍光標識ｇＮＡが固定化されたＣａｓＸタンパク質上に流されたときに蛍光シグナルがどのように変化するかを監視または確認することができる。あるいは、ＲＮＰを形成する能力は、定義された標的核酸配列に対するインビトロ切断アッセイを使用して評価することができる。
ｈ．ｇＮＡ安定性
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善された安定性を有する。安定性および効率的なフォールディングの増加は、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントが標的細胞内に存続する程度を増加させることができ、それにより、遺伝子編集などのＣａｓＸ機能を実行することができる機能的ＲＮＰを形成する機会を増加させることができる。ｇＮＡバリアントの安定性の増加は、いくつかの実施形態では、より少ない量のｇＮＡが細胞に送達される同様の結果を可能にすることができ、次いで、遺伝子編集中のオフターゲット効果の機会を低減させることができる。ガイドＲＮＡ安定性は、例えば、インビトロでガイドを組み立てること、細胞内環境を模倣する溶液中で様々な期間インキュベートすること、その後、本明細書に記載のインビトロ切断アッセイにより機能的活性を測定することを含む、様々な方法で評価することができる。あるいは、または加えて、ｇＮＡがｇＮＡの初期トランスフェクション／形質導入後の様々な時点で細胞から収集されて、参照ｇＲＮＡと比較してｇＮＡバリアントがどのくらい存続するかを決定することができる。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善された安定性を有する。安定性および効率的なフォールディングの増加は、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントが標的細胞内に存続する程度を増加させることができ、それにより、遺伝子編集などのＣａｓＸ機能を実行することができる機能的ＲＮＰを形成する機会を増加させることができる。ｇＮＡバリアントの安定性の増加は、いくつかの実施形態では、より少ない量のｇＮＡが細胞に送達される同様の結果を可能にすることができ、次いで、遺伝子編集中のオフターゲット効果の機会を低減させることができる。ガイドＲＮＡ安定性は、例えば、インビトロでガイドを組み立てること、細胞内環境を模倣する溶液中で様々な期間インキュベートすること、その後、本明細書に記載のインビトロ切断アッセイにより機能的活性を測定することを含む、様々な方法で評価することができる。あるいは、または加えて、ｇＮＡがｇＮＡの初期トランスフェクション／形質導入後の様々な時点で細胞から収集されて、参照ｇＲＮＡと比較してｇＮＡバリアントがどのくらい存続するかを決定することができる。
ｉ．溶解性
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善されたＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ ＲＮＰの溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ ＲＮＰの溶解性は、ｇＮＡバリアントの５’または３’末端、例えば、参照ｓｇＲＮＡの５’または３’にリボザイム配列を付加することによって改善される。Ｍ１リボザイムなどのいくつかのリボザイムは、ＲＮＡ媒介性タンパク質フォールディングによりタンパク質の溶解性を増加させることができる。本明細書に記載のｇＮＡバリアントを含むＣａｓＸ ＲＮＰの溶解性の増加は、当業者に既知の様々な手段によって、例えば、ＣａｓＸおよびｇＮＡバリアントが発現される溶解したＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分のゲル上で濃度測定読み取りを行うことによって評価することができる。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善されたＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ ＲＮＰの溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ ＲＮＰの溶解性は、ｇＮＡバリアントの５’または３’末端、例えば、参照ｓｇＲＮＡの５’または３’にリボザイム配列を付加することによって改善される。Ｍ１リボザイムなどのいくつかのリボザイムは、ＲＮＡ媒介性タンパク質フォールディングによりタンパク質の溶解性を増加させることができる。本明細書に記載のｇＮＡバリアントを含むＣａｓＸ ＲＮＰの溶解性の増加は、当業者に既知の様々な手段によって、例えば、ＣａｓＸおよびｇＮＡバリアントが発現される溶解したＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分のゲル上で濃度測定読み取りを行うことによって評価することができる。
ｊ．ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性
いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較してヌクレアーゼ活性に対する改善された抵抗性を有し、例えば、細胞内環境におけるバリアントｇＮＡの持続性を増加させ得、それによって遺伝子編集を改善する。ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性は、当業者に既知の様々な方法によって評価することができる。例えば、ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を測定するインビトロ法は、例えば、参照ｇＮＡおよびバリアントを１つ以上の例示的なＲＮＡヌクレアーゼと接触させることと、分解を測定することとを含み得る。あるいは、または加えて、本明細書に記載の方法を使用して細胞環境におけるｇＮＡバリアントの存続性を測定することにより、ｇＮＡバリアントがヌクレアーゼ抵抗性である程度を示すことができる。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較してヌクレアーゼ活性に対する改善された抵抗性を有し、例えば、細胞内環境におけるバリアントｇＮＡの持続性を増加させ得、それによって遺伝子編集を改善する。ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性は、当業者に既知の様々な方法によって評価することができる。例えば、ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を測定するインビトロ法は、例えば、参照ｇＮＡおよびバリアントを１つ以上の例示的なＲＮＡヌクレアーゼと接触させることと、分解を測定することとを含み得る。あるいは、または加えて、本明細書に記載の方法を使用して細胞環境におけるｇＮＡバリアントの存続性を測定することにより、ｇＮＡバリアントがヌクレアーゼ抵抗性である程度を示すことができる。
ｋ．標的ＤＮＡに対する結合親和性
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善された標的ＤＮＡに対する親和性を有する。ある特定の実施形態では、ｇＮＡバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの親和性と比較して改善された標的ＤＮＡに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに対するＲＮＰの改善された親和性は、標的配列に対する改善された親和性、ＰＡＭ配列に対する改善された親和性、標的配列のＤＮＡを探し出すＲＮＰの改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに対する改善された親和性は、全体的なＤＮＡ結合親和性の増加の結果である。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡと比較して改善された標的ＤＮＡに対する親和性を有する。ある特定の実施形態では、ｇＮＡバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、参照ｇＲＮＡを含むＲＮＰの親和性と比較して改善された標的ＤＮＡに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに対するＲＮＰの改善された親和性は、標的配列に対する改善された親和性、ＰＡＭ配列に対する改善された親和性、標的配列のＤＮＡを探し出すＲＮＰの改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡに対する改善された親和性は、全体的なＤＮＡ結合親和性の増加の結果である。
理論に拘束されることを望むことなく、ＣａｓＸタンパク質におけるＯＢＤの機能に影響を与えるｇＮＡバリアントのヌクレオチド変化は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に結合するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性、ならびにＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、およびＣＴＣからなる群から選択されるＰＡＭ配列を含む、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質によって認識される標準的ＴＴＣ ＰＡＭ以外の増加したスペクトルのＰＡＭ配列に結合するかまたはそれを利用する能力を増加させ得、それにより、標的ＤＮＡ配列に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性および多様性を増加させ、参照ＣａｓＸと比較して、編集および／または結合することができる標的核酸配列の実質的な増加をもたらす。以下でより完全に記載されるように、参照ＣａｓＸと比較して、編集することができる標的核酸の配列の増加は、ＰＡＭおよびプロトスペーサー配列の両方、ならびに非標的鎖の配向に応じたそれらの方向性を指す。これは、標的鎖ではなく非標的鎖のＰＡＭ配列が切断を決定するか、または標的認識に機械的に関与していることを意味するものではない。例えば、ＴＴＣ ＰＡＭを参照する場合、それは、実際には、標的切断に必要な相補的ＧＡＡ配列である場合もあれば、両方の鎖由来のヌクレオチドのある組み合わせである場合もある。本明細書に開示されるＣａｓＸタンパク質の場合、ＰＡＭはプロトスペーサーの５’に位置し、少なくとも単一のヌクレオチドがＰＡＭをプロトスペーサーの第１のヌクレオチドから分離している。あるいは、または加えて、標的ＤＮＡ鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させるヘリカルＩおよび／またはヘリカルＩＩドメインの機能に影響を与えるｇＮＡの変化は、標的ＤＮＡに対するバリアントｇＮＡを含むＣａｓＸ ＲＮＰの親和性を増加させることができる。理論または機構に拘束されることなく、標的ＤＮＡとの増強された結合は、ＲＮＰによる標的ＤＮＡの増強された切断速度をもたらすことができ、ＲＮＰは、参照ＣａｓＸと配列番号４または配列番号５のｇＮＡとのＲＮＰと比較して、インビトロアッセイにおいて、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、また少なくとも３０倍増加した切断速度を有する。
ｌ．ｇＮＡ機能の付加または変化
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡに関してｇＮＡバリアントのトポロジーを変化させるより大きい構造変化を含み、それにより、異なるｇＮＡの機能性を可能にすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡ足場の内因性ステムループを、以前に特定された安定したＲＮＡ構造と、またはタンパク質もしくはＲＮＡ結合パートナーと相互作用してＣａｓＸに追加の部分を動員するか、またはこのＲＮＡ構造への結合パートナーを有するウイルスカプシドの内部などの特定の位置にＣａｓＸを動員するステムループと交換したものである。他の状況では、キッシングループで見られるように、ＲＮＡが互いに動員される場合があり、これにより、２つのＣａｓＸタンパク質が標的ＤＮＡ配列でのより効率的な遺伝子編集のために共局在化されるようになり得る。かかるＲＮＡ構造には、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、ＰＰ７、ファージ複製ループ、キッシングループ＿ａ、キッシングループ＿ｂ１、キッシングループ＿ｂ２、ＧクアッドリプレックスＭ３ｑ、Ｇクアッドリプレックステロメアバスケット、サルシン－リシンループ、またはシュードノットが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡに関してｇＮＡバリアントのトポロジーを変化させるより大きい構造変化を含み、それにより、異なるｇＮＡの機能性を可能にすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、参照ｇＲＮＡ足場の内因性ステムループを、以前に特定された安定したＲＮＡ構造と、またはタンパク質もしくはＲＮＡ結合パートナーと相互作用してＣａｓＸに追加の部分を動員するか、またはこのＲＮＡ構造への結合パートナーを有するウイルスカプシドの内部などの特定の位置にＣａｓＸを動員するステムループと交換したものである。他の状況では、キッシングループで見られるように、ＲＮＡが互いに動員される場合があり、これにより、２つのＣａｓＸタンパク質が標的ＤＮＡ配列でのより効率的な遺伝子編集のために共局在化されるようになり得る。かかるＲＮＡ構造には、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、ＰＰ７、ファージ複製ループ、キッシングループ＿ａ、キッシングループ＿ｂ１、キッシングループ＿ｂ２、ＧクアッドリプレックスＭ３ｑ、Ｇクアッドリプレックステロメアバスケット、サルシン－リシンループ、またはシュードノットが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、末端融合パートナーを含む。例示的な末端融合には、自己切断リボザイムまたはタンパク質結合モチーフへのｇＲＮＡの融合が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「リボザイム」とは、タンパク質酵素と同様の１つ以上の触媒活性を有するＲＮＡまたはそのセグメントを指す。例示的なリボザイム触媒活性には、例えば、ＲＮＡの切断および／もしくはライゲーション、ＤＮＡの切断および／もしくはライゲーション、またはペプチド結合形成が含まれ得る。いくつかの実施形態では、かかる融合は、足場フォールディングを改善するか、またはＤＮＡ修復機構を動員することができる。例えば、ｇＲＮＡは、いくつかの実施形態では、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）アンチゲノムリボザイム、ＨＤＶゲノムリボザイム、ハチェットリボザイム（メタゲノムデータからのもの）、ｅｎｖ２５ピストルリボザイム（Ａｌｉｉｓｔｉｐｅｓ ｐｕｔｒｅｄｉｎｉｓ由来の代表的なもの）、ＨＨ１５最小ハンマーヘッドリボザイム、タバコリングスポットウイルス（ＴＲＳＶ）リボザイム、野生型ウイルスハンマーヘッドリボザイム（および合理的なバリアント）、またはツイステッドシスター１もしくはＲＢＭＸリクルーティングモチーフに融合され得る。ハンマーヘッドリボザイムは、ＲＮＡ分子内の特定の部位で可逆的切断およびライゲーション反応を触媒するＲＮＡモチーフである。ハンマーヘッドリボザイムには、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ハンマーヘッドリボザイムが含まれる。ＨＤＶ、ピストル、およびハチェットリボザイムは、自己切断活性を有する。１つ以上のリボザイムを含むｇＮＡバリアントは、ｇＲＮＡ参照と比較して拡張されたｇＮＡ機能を可能にし得る。例えば、自己切断リボザイムを含むｇＮＡは、いくつかの実施形態では、転写され、ポリシストロン転写物の一部として成熟ｇＮＡに処理され得る。かかる融合は、ｇＮＡの５’または３’末端のいずれかで起こり得る。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、５’および３’末端の両方に融合を含み、これらの融合は各々独立して、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、ファージ複製ループまたはテトラループを含む。いくつかの実施形態では、ｇＮＡは、タンパク質に結合することができるヘアピンループを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、ＭＳ２、Ｑβ、Ｕ１ヘアピンＩＩ、Ｕｖｓｘ、またはＰＰ７ヘアピンループである。リボザイムをコードする例示的な配列は、表１６に記載される、配列番号５９８～６１１からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１つ以上のＲＮＡアプタマーを含む。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡアプタマー」とは、高い親和性および高い特異性で標的に結合するＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１つ以上のリボスイッチを含む。本明細書で使用される場合、「リボスイッチ」とは、小分子に結合すると状態を変化させるＲＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、ｇＮＡバリアントは、１つ以上のタンパク質結合モチーフをさらに含む。本開示の参照ｇＲＮＡまたはｇＮＡバリアントにタンパク質結合モチーフを付加することにより、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸ ＲＮＰが追加のタンパク質と会合することを可能にし得、例えば、それらのタンパク質の機能性をＣａｓＸ ＲＮＰに付加することができる。
ｍ．化学的に改変されたｇＮＡ
いくつかの実施形態では、本開示は、化学的に改変されたｇＮＡに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ機能性を有し、かつヌクレアーゼによる切断に対する低下した感受性を有する化学的に改変されたｇＮＡを提供する。４つの標準的リボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵ以外の任意のヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドを含むｇＮＡは、化学的に改変されたｇＮＡである。いくつかの事例では、化学的に改変されたｇＮＡは、天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合以外の任意の骨格またはヌクレオチド間結合を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸに結合する改変されたｇＮＡの能力を含む。ある特定の実施形態において、保持される機能性は、ＰＣＳＫ９標的核酸配列に結合する改変されたｇＮＡの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、ＣａｓＸタンパク質を標的とすること、または標的核酸配列に結合する予め複合体形成されたＣａｓＸタンパク質－ｇＮＡの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、ＣａｓＸ－ｇＮＡによって標的ポリヌクレオチドをニッキングする能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、ＣａｓＸ－ｇＮＡによって標的核酸配列を切断する能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本開示の実施形態のＣａｓＸタンパク質を有するＣａｓＸシステムにおけるｇＮＡの任意の他の既知の機能である。
いくつかの実施形態では、本開示は、化学的に改変されたｇＮＡに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ機能性を有し、かつヌクレアーゼによる切断に対する低下した感受性を有する化学的に改変されたｇＮＡを提供する。４つの標準的リボヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵ以外の任意のヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドを含むｇＮＡは、化学的に改変されたｇＮＡである。いくつかの事例では、化学的に改変されたｇＮＡは、天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合以外の任意の骨格またはヌクレオチド間結合を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸに結合する改変されたｇＮＡの能力を含む。ある特定の実施形態において、保持される機能性は、ＰＣＳＫ９標的核酸配列に結合する改変されたｇＮＡの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、ＣａｓＸタンパク質を標的とすること、または標的核酸配列に結合する予め複合体形成されたＣａｓＸタンパク質－ｇＮＡの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、ＣａｓＸ－ｇＮＡによって標的ポリヌクレオチドをニッキングする能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、ＣａｓＸ－ｇＮＡによって標的核酸配列を切断する能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本開示の実施形態のＣａｓＸタンパク質を有するＣａｓＸシステムにおけるｇＮＡの任意の他の既知の機能である。
いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチド糖改変が、２′－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、例えば、２′－Ｏ－メチル（２′－ＯＭｅ）、２′－デオキシ（２′－Ｈ）、２′－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、例えば、２′－メトキシエチル（「２′－ＭＯＥ」）、２′－フルオロ（「２′－Ｆ」）、２′－アミノ（「２′－ＮＨ２」）、２′－アラビノシル（「２′－アラビノ」）ヌクレオチド、２′－Ｆ－アラビノシル（「２′－Ｆ－アラビノ」）ヌクレオチド、２′－ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド、２′－アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチド、Ｌ型の糖（「Ｌ－糖」）、および４′－チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択されるｇＮＡに組み込まれている、化学的に改変されたｇＮＡを提供する。他の実施形態では、ガイドＲＮＡに組み込まれるヌクレオチド間結合改変は、ホスホロチオエート「Ｐ（Ｓ）」（Ｐ（Ｓ））、ホスホノカルボキシレート（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、ホスホノアセテート「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、チオホスホノカルボキシレート（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、チオホスホノアセテート「チオＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯ－））、アルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１－３アルキル）、例えば、メチルホスホネート－Ｐ（ＣＨ３）、ボラノホスホネート（Ｐ（ＢＨ３））、およびホスホロジチオエート（Ｐ（Ｓ）２）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、核酸塩基（「塩基」）改変が、２－チオウラシル（「２－チオＵ」）、２－チオシトシン（「２－チオＣ」）、４－チオウラシル（「４－チオＵ」）、６－チオグアニン（「６－チオＧ」）、２－アミノアデニン（「２－アミノＡ」）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（「５－メチルＣ」）、５－メチルウラシル（「５－メチルＵ」）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル（「５－アリルＵ」）、５－アリルシトシン（「５－アリルＣ」）、５－アミノアリルウラシル（「５－アミノアリルＵ」）、５－アミノアリル－シトシン（「５－アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造化核酸（「ＵＮＡ」）、イソグアニン（「イソＧ」）、イソシトシン（「イソＣ」）、５－メチル－２－ピリミジン、ｘ（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）、およびｙ（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）からなる群から選択されるｇＮＡに組み込まれている、化学的に改変されたｇＮＡを提供する。
他の実施形態では、本開示は、１つ以上の同位体改変が、１つ以上の１５Ｎ、１３Ｃ、１４Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ原子、またはトレーサーとして使用される他の原子もしくは元素を含むヌクレオチドを含む、ヌクレオチド糖、核酸塩基、ホスホジエステル結合、および／またはヌクレオチドホスフェートに導入されている、化学的に改変されたｇＮＡを提供する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡに組み込まれる「末端」改変は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、炭化水素リンカー（ヘテロ原子（Ｏ、Ｓ、Ｎ）置換炭化水素スペーサー、ハロ置換炭化水素スペーサー、ケト－、カルボキシル－、アミド－、チオニル－、カルバモイル－、チオノカルバマオイル含有炭化水素スペーサーを含む）、スペルミンリンカー、例えば、６－フルオレセインーヘキシル、クエンチャー（例えば、ダブシル、ＢＨＱ）、および他の標識（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アクリジン、ストレプトアビジン、アビジン、ペプチド、および／またはタンパク質）などのリンカーに結合した蛍光色素を含む色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、「末端」改変は、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミン、および／または他の分子を含む別の分子へのｇＮＡのコンジュゲーション（またはライゲーション）を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、「末端」改変（上記）が、ホスホジエステル結合として組み込まれ、かつｇＮＡ内の２個のヌクレオチド間のどこにでも組み込まれ得る、例えば、２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーなどのリンカーを介してｇＮＡ配列の内部に位置する、化学的に改変されたｇＮＡを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、アミン、チオール（またはスルフヒドリル）、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボニル、チオニル、チオカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、ホスホリル、アルケン、アルキン、ハロゲン、または蛍光色素、非蛍光標識、タグ（１４Ｃの場合、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、または１５Ｎ、１３Ｃ、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉなどの同位体標識を含む部分）、オリゴヌクレオチド（アプタマーを含む、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、およびビタミンからなる群から選択される所望の部分に後にコンジュゲートされ得る官能基末端リンカーなどの末端官能基を含む末端改変を有する化学的に改変されたｇＮＡを提供する。コンジュゲーションは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、ＤＣＣ（またはＤＣＩ）、および／またはＧｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによる“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｅｓｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３ｒｄｅｄ．（２０１３）（この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている任意の他の標準的な方法によるカップリングを含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の標準的な化学を利用する。
ＩＶ．標的核酸を改変するためのタンパク質
本開示は、真核生物細胞のゲノム編集に有用なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む系を提供する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集システムで用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２のＶ型ヌクレアーゼである。クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのメンバーは差異を有するが、それらをＣａｓ９システムと区別するいくつかの共通の特徴を共有する。最初に、クラス２のＶ型ヌクレアーゼは、単一のＲＮＡ誘導性ＲｕｖＣドメイン含有エフェクターを有するがＨＮＨドメインを有さず、それらは、非標的化鎖で標的領域の上流であるＴリッチＰＡＭ５’を認識し、標的配列の３’側にあるＧリッチＰＡＭに依存するＣａｓ９システムとは異なる。タイプＶヌクレアーゼは、Ｃａｓ９とは異なり、ＰＡＭ配列の遠位にねじれた二本鎖切断を生成し、ＰＡＭ配列に近い近位部位に平滑末端を生成する。加えて、タイプＶヌクレアーゼは、シスで標的ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ結合によって活性化されると、ｓｓＤＮＡをトランス分解する。いくつかの実施形態において、実施形態のＶ型ヌクレアーゼは、５’－ＴＣ ＰＡＭモチーフを認識し、ＲｕｖＣドメインによってのみ切断されるねじれた末端を産生する。いくつかの実施形態において、Ｖ型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、ＣａｓＺ、およびＣａｓＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本開示は、真核生物細胞の標的核酸配列を改変するように具体的に設計される、ＣａｓＸタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）とを含むシステムを提供する。
本開示は、真核生物細胞のゲノム編集に有用なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む系を提供する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集システムで用いられるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、クラス２のＶ型ヌクレアーゼである。クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのメンバーは差異を有するが、それらをＣａｓ９システムと区別するいくつかの共通の特徴を共有する。最初に、クラス２のＶ型ヌクレアーゼは、単一のＲＮＡ誘導性ＲｕｖＣドメイン含有エフェクターを有するがＨＮＨドメインを有さず、それらは、非標的化鎖で標的領域の上流であるＴリッチＰＡＭ５’を認識し、標的配列の３’側にあるＧリッチＰＡＭに依存するＣａｓ９システムとは異なる。タイプＶヌクレアーゼは、Ｃａｓ９とは異なり、ＰＡＭ配列の遠位にねじれた二本鎖切断を生成し、ＰＡＭ配列に近い近位部位に平滑末端を生成する。加えて、タイプＶヌクレアーゼは、シスで標的ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ結合によって活性化されると、ｓｓＤＮＡをトランス分解する。いくつかの実施形態において、実施形態のＶ型ヌクレアーゼは、５’－ＴＣ ＰＡＭモチーフを認識し、ＲｕｖＣドメインによってのみ切断されるねじれた末端を産生する。いくつかの実施形態において、Ｖ型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、ＣａｓＺ、およびＣａｓＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本開示は、真核生物細胞の標的核酸配列を改変するように具体的に設計される、ＣａｓＸタンパク質と、１つ以上のガイド核酸（ｇＮＡ）とを含むシステムを提供する。
本明細書で使用される「ＣａｓＸタンパク質」という用語は、タンパク質のファミリーを指し、すべての天然に存在するＣａｓＸタンパク質（「参照ＣａｓＸ」）、天然に存在するＣａｓＸタンパク質に対して少なくとも５０％の同一性を共有するタンパク質、および天然に存在する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して１つ以上の改善された特性を有するＣａｓＸバリアントを包含し、以下でより完全に記載される。
ＣａｓＸバリアント実施形態の例示的な改善された特性には、バリアントの改善されたフォールディング、ｇＮＡに対する改善された結合親和性、標的核酸に対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡの編集および／または結合においてＰＡＭ配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、標的ＤＮＡの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された編集効率、改善された編集特異性、効率的に編集され得る真核生物ゲノムの増加した割合、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、ＤＮＡの非標的鎖の改善された結合、改善された標的核酸配列の切断速度、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ（ＲＮＰ）複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）形成、切断能力のあるＲＮＰの高い割合、改善されたタンパク質：ｇＮＡ（ＲＮＰ）複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、ならびに改善された融合特性が含まれるが、これらに限定されず、以下でより完全に記載される。いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、同等の様式でアッセイされた場合、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と表１のｇＮＡとのＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善される改善した特性のうちの１つ以上を示す。他の事例では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰの１つ以上の改善された特性は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と表１のｇＮＡとのＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１００，０００倍、もしくはそれ以上改善される。他の事例では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰの改善された特性のうちの１つ以上は、同等の様式でアッセイされた場合、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と表１のｇＮＡとのＲＮＰと比較して、約１．１～１００，００倍、約１．１～１０，００倍、約１．１～１，０００倍、約１．１～５００倍、約１．１～１００倍、約１．１～５０倍、約１．１～２０倍、約１０～１００，００倍、約１０～１０，００倍、約１０～１，０００倍、約１０～５００倍、約１０～１００倍、約１０～５０倍、約１０～２０倍、約２～７０倍、約２～５０倍、約２～３０倍、約２～２０倍、約２～１０倍、約５～５０倍、約５～３０倍、約５～１０倍、約１００～１００，００倍、約１００～１０，００倍、約１００～１，０００倍、約１００～５００倍、約５００～１００，００倍、約５００～１０，００倍、約５００～１，０００倍、約５００～７５０倍、約１，０００～１００，００倍、約１０，０００～１００，００倍、約２０～５００倍、約２０～２５０倍、約２０～２００倍、約２０～１００倍、約２０～５０倍、約５０～１０，０００倍、約５０～１，０００倍、約５０～５００倍、約５０～２００倍、もしくは約５０～１００倍改善される。他の事例では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰの１つ以上の改善された特性は、同等の様式でアッセイされた場合、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と表１のｇＮＡとのＲＮＰと比較して、約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、もしくは５００倍改善される。特定の実施形態において、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質と配列番号４または配列番号５の参照ｇＮＡとのＲＮＰと比較して、インビトロアッセイにおいて、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、もしくは少なくとも３０倍増加した切断速度を示す。かかる改善の裏付けデータは、以下の実施例に提供される。
ＣａｓＸバリアントという用語は、融合タンパク質であるバリアントを含み、すなわち、ＣａｓＸは、異種配列に「融合」されている。これには、ＣａｓＸバリアント配列と、ＣａｓＸの異種タンパク質またはそのドメインへのＮ末端、Ｃ末端、または内部融合とを含むＣａｓＸバリアントが含まれる。
本開示のＣａｓＸタンパク質は、以下のドメイン：以下でより詳細に記載される、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン（これらの最後のものは、触媒的に死活化したＣａｓＸバリアントにおいて改変されているか、または欠失している場合がある）のうちの少なくとも１つを含む。加えて、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＲＮＰとしてｇＮＡと複合体化されるとき、参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとのＲＮＰと比較して、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、またはＣＴＣから選択されるＰＡＭ配列を含むＰＡＭ ＴＣモチーフを利用して、標的ＤＮＡを効率的に編集し、かつ／またはそれに結合する増強された能力を有する。前述では、ＰＡＭ配列は、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰの編集効率および／または結合と比較して、アッセイシステムにおいてｇＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖の５’の少なくとも１つのヌクレオチドに位置する。一実施形態では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、同等のアッセイシステムにおいて参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、標的ＤＮＡにおける標的配列のより高い編集効率および／または結合を呈し、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＴＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、同等のアッセイシステムにおいて参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、標的ＤＮＡにおける標的配列のより高い編集効率および／または結合を呈し、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＡＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、同等のアッセイシステムにおいて参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、標的ＤＮＡにおける標的配列のより高い編集効率および／または結合を呈し、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＣＴＣである。別の実施形態では、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとのＲＮＰは、同等のアッセイシステムにおいて参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、標的ＤＮＡにおける標的配列のより高い編集効率および／または結合を呈し、標的ＤＮＡのＰＡＭ配列はＧＴＣである。前述の実施形態において、１つ以上のＰＡＭ配列に対する編集効率および／または結合親和性の増加は、配列番号１～３のＣａｓＸタンパク質のうちのいずれか１つと表１の配列番号４および５のｇＮＡとのＲＮＰのＰＡＭ配列に対する編集効率および／または結合親和性と比較して、少なくとも１．５倍以上高い。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、標的核酸および／または標的核酸と会合したポリペプチド（例えば、ヒストンテイルのメチル化またはアセチル化）に結合するおよび／またはそれを改変する（例えば、切断、ニッキング、メチル化、脱メチル化など）ことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、触媒的に死んでいるが、標的核酸に結合する能力を保持している。例示的な触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの活性部位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号１の残基６７２、７６９、および／または９３５に置換を含む。一実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号１の参照ＣａｓＸタンパク質におけるＤ６７２Ａ、Ｅ７６９Ａ、および／またはＤ９３５Ａ置換を含む。他の実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質におけるアミノ酸６５９、７５６、および／または９２２の置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質におけるＤ６５９Ａ、Ｅ７５６Ａ、および／またはＤ９２２Ａ置換を含む。さらなる実施形態では、触媒的に死んでいるＣａｓＸタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣドメインの全てまたは一部の欠失を含む。同じ前述の置換が本開示のＣａｓＸバリアントに同様に導入されて、ｄＣａｓＸバリアントをもたらすことができることが理解されよう。一実施形態では、ＲｕｖＣドメインの全てまたは一部がＣａｓＸバリアントから欠失され、ｄＣａｓＸバリアントをもたらす。触媒的に不活性なｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、いくつかの実施形態では、塩基編集またはエピジェネティック改変に使用することができる。ＤＮＡに対する親和性が高まるにつれて、いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なｄＣａｓＸバリアントタンパク質は、触媒的に活性なＣａｓＸと比較して、それらの標的核酸をより速く見つけることができ、より長期間にわたって標的核酸に結合したままの状態を保つことができ、より安定した様式で標的核酸に結合することができるか、またはそれらの組み合わせであり、それにより、切断能力を保持するＣａｓＸバリアントと比較して、触媒的に死んでいるＣａｓＸバリアントタンパク質のそれらの機能を改善することができる。
ａ．非標的鎖結合ドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、非標的鎖結合ドメイン（ＮＴＳＢＤ）を含む。ＮＴＳＢＤは、以前にいずれのＣａｓタンパク質でも見つけられなかったドメインであり、例えば、このドメインは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣＡＳＣＡＤＥ、ＣＳＭ、またはＣＳＹなどのＣａｓタンパク質に存在しない。理論または機構に拘束されることなく、ＣａｓＸにおけるＮＴＳＢＤは、非標的ＤＮＡ鎖への結合を可能にし、非標的鎖および標的鎖の巻き戻しを援助し得る。ＮＴＳＢＤは、巻き戻された状態の非標的ＤＮＡ鎖の巻き戻しまたは捕捉に関与していると推定される。ＮＴＳＢＤは、これまでに導出されたＣｒｙｏＥＭモデル構造の非標的鎖と直接接触しており、非標準的ジンクフィンガードメインを含んでいる可能性がある。ＮＴＳＢＤは、巻き戻し中のＤＮＡの安定化、ガイドＲＮＡ侵入、およびＲループ形成に関与している可能性もある。いくつかの実施形態では、例示的なＮＴＳＢＤは、配列番号１のアミノ酸１０１～１９１または配列番号２のアミノ酸１０３～１９２を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のＮＴＳＢＤは、４本鎖ベータシートを含む。
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、非標的鎖結合ドメイン（ＮＴＳＢＤ）を含む。ＮＴＳＢＤは、以前にいずれのＣａｓタンパク質でも見つけられなかったドメインであり、例えば、このドメインは、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣＡＳＣＡＤＥ、ＣＳＭ、またはＣＳＹなどのＣａｓタンパク質に存在しない。理論または機構に拘束されることなく、ＣａｓＸにおけるＮＴＳＢＤは、非標的ＤＮＡ鎖への結合を可能にし、非標的鎖および標的鎖の巻き戻しを援助し得る。ＮＴＳＢＤは、巻き戻された状態の非標的ＤＮＡ鎖の巻き戻しまたは捕捉に関与していると推定される。ＮＴＳＢＤは、これまでに導出されたＣｒｙｏＥＭモデル構造の非標的鎖と直接接触しており、非標準的ジンクフィンガードメインを含んでいる可能性がある。ＮＴＳＢＤは、巻き戻し中のＤＮＡの安定化、ガイドＲＮＡ侵入、およびＲループ形成に関与している可能性もある。いくつかの実施形態では、例示的なＮＴＳＢＤは、配列番号１のアミノ酸１０１～１９１または配列番号２のアミノ酸１０３～１９２を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のＮＴＳＢＤは、４本鎖ベータシートを含む。
ｂ．標的鎖負荷ドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメインを含む。ＴＳＬドメインは、Ｃａｓ９、ＣＡＳＣＡＤＥ、ＣＳＭ、またはＣＳＹなどのある特定のＣａｓタンパク質では見つけられないドメインである。理論または機構に拘束されることを望むことなく、ＴＳＬドメインが、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣ活性部位への標的ＤＮＡ鎖の負荷の援助に関与していると考えられている。いくつかの実施形態では、ＴＳＬは、折り畳まれた状態で標的鎖を配置または捕捉する役割を果たし、これにより、標的鎖ＤＮＡ骨格の切断可能なリン酸がＲｕｖＣ活性部位に配置される。ＴＳＬは、ＴＳＬの大部分によって分離されているｃｙｓ４（ＣＸＸＣ、ＣＸＸＣジンクフィンガー／リボンドメイン（配列番号４８）を含む。いくつかの実施形態では、例示的なＴＳＬは、配列番号１のアミノ酸８２５～９３４または配列番号２のアミノ酸８１３～９２１を含む。
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメインを含む。ＴＳＬドメインは、Ｃａｓ９、ＣＡＳＣＡＤＥ、ＣＳＭ、またはＣＳＹなどのある特定のＣａｓタンパク質では見つけられないドメインである。理論または機構に拘束されることを望むことなく、ＴＳＬドメインが、ＣａｓＸタンパク質のＲｕｖＣ活性部位への標的ＤＮＡ鎖の負荷の援助に関与していると考えられている。いくつかの実施形態では、ＴＳＬは、折り畳まれた状態で標的鎖を配置または捕捉する役割を果たし、これにより、標的鎖ＤＮＡ骨格の切断可能なリン酸がＲｕｖＣ活性部位に配置される。ＴＳＬは、ＴＳＬの大部分によって分離されているｃｙｓ４（ＣＸＸＣ、ＣＸＸＣジンクフィンガー／リボンドメイン（配列番号４８）を含む。いくつかの実施形態では、例示的なＴＳＬは、配列番号１のアミノ酸８２５～９３４または配列番号２のアミノ酸８１３～９２１を含む。
ｃ．ヘリカルＩドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、ヘリカルＩドメインを含む。ＣａｓＸ以外のある特定のＣａｓタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、非ＣａｓＸタンパク質と比較して、１つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、同様の名前を有し得る他のＣａｓタンパク質のドメインと比較して、１つ以上の特有の二次構造を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、他のＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して、配置、数、および長さの点で特有の構造および配列を有する１つ以上のアルファヘリックスを含む。ある特定の実施形態では、ヘリカルＩドメインは、結合したＤＮＡおよびガイドＲＮＡのスペーサーとの相互作用に関与する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、ヘリカルＩドメインがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の結合に寄与し得ると考えられている。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルＩドメインは、配列番号１のアミノ酸５７～１００および１９２～３３２、または配列番号２のアミノ酸５９～１０２および１９３～３３３を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、１つ以上のアルファヘリックスを含む。
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、ヘリカルＩドメインを含む。ＣａｓＸ以外のある特定のＣａｓタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、非ＣａｓＸタンパク質と比較して、１つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、同様の名前を有し得る他のＣａｓタンパク質のドメインと比較して、１つ以上の特有の二次構造を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、他のＣＲＩＳＰＲタンパク質と比較して、配置、数、および長さの点で特有の構造および配列を有する１つ以上のアルファヘリックスを含む。ある特定の実施形態では、ヘリカルＩドメインは、結合したＤＮＡおよびガイドＲＮＡのスペーサーとの相互作用に関与する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、ヘリカルＩドメインがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の結合に寄与し得ると考えられている。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルＩドメインは、配列番号１のアミノ酸５７～１００および１９２～３３２、または配列番号２のアミノ酸５９～１０２および１９３～３３３を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩドメインは、１つ以上のアルファヘリックスを含む。
ｄ．ヘリカルＩＩドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、ヘリカルＩＩドメインを含む。ＣａｓＸ以外のある特定のＣａｓタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩＩドメインは、同様の名前を有し得る他のＣａｓタンパク質のドメインと比較して、１つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、ヘリカルＩＩドメインは、標的ＤＮＡ：ガイドＲＮＡチャネルに沿って整列する１つ以上の特有の構造的アルファヘリカル束を含む。いくつかの実施形態では、ヘリカルＩＩドメインを含むＣａｓＸにおいて、標的鎖およびガイドＲＮＡは、ヘリカルＩＩ（およびいくつかの実施形態では、ヘリカルＩドメイン）と相互作用して、ＲｕｖＣドメインが標的ＤＮＡに接近することを可能にする。ヘリカルＩＩドメインは、ガイドＲＮＡ足場ステムループおよび結合したＤＮＡへの結合に関与する。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルＩＩドメインは、配列番号１のアミノ酸３３３～５０９、または配列番号２のアミノ酸３３４～５０１を含む。
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、ヘリカルＩＩドメインを含む。ＣａｓＸ以外のある特定のＣａｓタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質のヘリカルＩＩドメインは、同様の名前を有し得る他のＣａｓタンパク質のドメインと比較して、１つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、ヘリカルＩＩドメインは、標的ＤＮＡ：ガイドＲＮＡチャネルに沿って整列する１つ以上の特有の構造的アルファヘリカル束を含む。いくつかの実施形態では、ヘリカルＩＩドメインを含むＣａｓＸにおいて、標的鎖およびガイドＲＮＡは、ヘリカルＩＩ（およびいくつかの実施形態では、ヘリカルＩドメイン）と相互作用して、ＲｕｖＣドメインが標的ＤＮＡに接近することを可能にする。ヘリカルＩＩドメインは、ガイドＲＮＡ足場ステムループおよび結合したＤＮＡへの結合に関与する。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルＩＩドメインは、配列番号１のアミノ酸３３３～５０９、または配列番号２のアミノ酸３３４～５０１を含む。
ｅ．オリゴヌクレオチド結合ドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）を含む。ＣａｓＸ以外のある特定のＣａｓタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＢＤは、１つ以上の特有の機能的特徴を含むか、またはＣａｓＸタンパク質に特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、架橋ヘリックス（ＢＨ）、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、およびオリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）が一緒に、ＣａｓＸタンパク質のガイドＲＮＡへの結合に関与する。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、ＯＢＤは、ヘリカルＩドメイン、もしくはヘリカルＩＩドメイン、またはそれらの両方と機能的に相互作用するという点でＣａｓＸタンパク質に特有であり、これらは各々、本明細書に記載のＣａｓＸタンパク質に特有であり得る。具体的には、ＣａｓＸにおいて、ＯＢＤは、ガイドＲＮＡ足場のＲＮＡトリプレックスに主に結合する。ＯＢＤは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）への結合にも関与し得る。例示的なＯＢＤドメインは、配列番号１のアミノ酸１～５６および５１０～６６０、または配列番号２のアミノ酸１～５８および５０２～６４７を含む。
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）を含む。ＣａｓＸ以外のある特定のＣａｓタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＢＤは、１つ以上の特有の機能的特徴を含むか、またはＣａｓＸタンパク質に特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、架橋ヘリックス（ＢＨ）、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、およびオリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）が一緒に、ＣａｓＸタンパク質のガイドＲＮＡへの結合に関与する。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、ＯＢＤは、ヘリカルＩドメイン、もしくはヘリカルＩＩドメイン、またはそれらの両方と機能的に相互作用するという点でＣａｓＸタンパク質に特有であり、これらは各々、本明細書に記載のＣａｓＸタンパク質に特有であり得る。具体的には、ＣａｓＸにおいて、ＯＢＤは、ガイドＲＮＡ足場のＲＮＡトリプレックスに主に結合する。ＯＢＤは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）への結合にも関与し得る。例示的なＯＢＤドメインは、配列番号１のアミノ酸１～５６および５１０～６６０、または配列番号２のアミノ酸１～５８および５０２～６４７を含む。
ｆ．ＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメイン
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、２つの部分的なＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－ＩおよびＲｕｖＣ－ＩＩ）を含む、ＲｕｖＣドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、全ての１２型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の祖先ドメインである。ＲｕｖＣドメインは、トランスポザーゼのようなＴＮＰＢ（トランスポザーゼＢ）に由来する。他のＲｕｖＣドメインと同様に、ＣａｓＸ ＲｕｖＣドメインは、マグネシウム（Ｍｇ）イオンの調整およびＤＮＡの切断に関与するＤＥＤ触媒三連構造を有する。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣは、ＤＮＡの両方の鎖の切断に関与する（１つずつ切断し、最初に標的化配列中の１１～１４ヌクレオチド（ｎｔ）で非標的鎖を切断し、その後、標的配列の後の２～４ヌクレオチドで標的鎖を切断する可能性が高い）ＤＥＤモチーフ活性部位を有する。特にＣａｓＸにおいて、ＲｕｖＣドメインは、ＣａｓＸ機能に重要なガイドＲＮＡ足場ステムループの結合にも関与しているという点で特有である。例示的なＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６１～８２４および９３５～９８６、または配列番号２のアミノ酸６４８～８１２および９２２～９７８を含む。
本開示の参照ＣａｓＸタンパク質は、２つの部分的なＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－ＩおよびＲｕｖＣ－ＩＩ）を含む、ＲｕｖＣドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、全ての１２型ＣＲＩＳＰＲタンパク質の祖先ドメインである。ＲｕｖＣドメインは、トランスポザーゼのようなＴＮＰＢ（トランスポザーゼＢ）に由来する。他のＲｕｖＣドメインと同様に、ＣａｓＸ ＲｕｖＣドメインは、マグネシウム（Ｍｇ）イオンの調整およびＤＮＡの切断に関与するＤＥＤ触媒三連構造を有する。いくつかの実施形態では、ＲｕｖＣは、ＤＮＡの両方の鎖の切断に関与する（１つずつ切断し、最初に標的化配列中の１１～１４ヌクレオチド（ｎｔ）で非標的鎖を切断し、その後、標的配列の後の２～４ヌクレオチドで標的鎖を切断する可能性が高い）ＤＥＤモチーフ活性部位を有する。特にＣａｓＸにおいて、ＲｕｖＣドメインは、ＣａｓＸ機能に重要なガイドＲＮＡ足場ステムループの結合にも関与しているという点で特有である。例示的なＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６１～８２４および９３５～９８６、または配列番号２のアミノ酸６４８～８１２および９２２～９７８を含む。
ｇ．参照ＣａｓＸタンパク質
本開示は、標的化二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）における特定の配列で二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する天然に存在するＣａｓＸタンパク質（本明細書では「参照ＣａｓＸタンパク質」と称される）を提供する。配列特異性は、複合体形成される会合したｇＮＡの標的化配列によって提供され、標的核酸内の標的配列にハイブリダイズする。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ種、またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａ種などの天然に存在する原核生物から単離され得る。参照ＣａｓＸタンパク質（本明細書では参照ＣａｓＸタンパク質とも称される）は、ガイドＮＡと相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができるタンパク質のＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅと称されることもある）ファミリーに属するＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰ複合体は、ｇＮＡの標的化配列（またはスペーサー）と標的核酸内の標的配列との間の塩基対形成により標的核酸内の特定の部位を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、標的ＤＮＡを切断することができる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、標的ＤＮＡをニッキングすることができる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、標的ＤＮＡを編集することができ、例えば、参照ＣａｓＸタンパク質がＤＮＡを切断またはニッキングすることができる実施形態では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同性指向修復（ＨＤＲ）、相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、または塩基除去修復（ＢＥＲ）が続く。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、上でより完全に記載されるように、触媒的に死んでいる（触媒的に不活性であるか、または実質的にいずれの切断活性も有しない）ＣａｓＸタンパク質（ｄＣａｓＸ）であるが、標的ＤＮＡに結合する能力を保持する。
本開示は、標的化二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）における特定の配列で二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する天然に存在するＣａｓＸタンパク質（本明細書では「参照ＣａｓＸタンパク質」と称される）を提供する。配列特異性は、複合体形成される会合したｇＮＡの標的化配列によって提供され、標的核酸内の標的配列にハイブリダイズする。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ種、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ種、またはＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａ種などの天然に存在する原核生物から単離され得る。参照ＣａｓＸタンパク質（本明細書では参照ＣａｓＸタンパク質とも称される）は、ガイドＮＡと相互作用してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成することができるタンパク質のＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅと称されることもある）ファミリーに属するＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰ複合体は、ｇＮＡの標的化配列（またはスペーサー）と標的核酸内の標的配列との間の塩基対形成により標的核酸内の特定の部位を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、標的ＤＮＡを切断することができる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、標的ＤＮＡをニッキングすることができる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、標的ＤＮＡを編集することができ、例えば、参照ＣａｓＸタンパク質がＤＮＡを切断またはニッキングすることができる実施形態では、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、相同性指向修復（ＨＤＲ）、相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、または塩基除去修復（ＢＥＲ）が続く。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰは、上でより完全に記載されるように、触媒的に死んでいる（触媒的に不活性であるか、または実質的にいずれの切断活性も有しない）ＣａｓＸタンパク質（ｄＣａｓＸ）であるが、標的ＤＮＡに結合する能力を保持する。
いくつかの事例において、タイプＶ参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む：
いくつかの事例において、Ｖ型参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む：
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列、またはそれと少なくとも６０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列、またはそれと少なくとも８０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列、またはそれと少なくとも９０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列、またはそれと少なくとも９５％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列からなる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２の配列と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０個の変異を有する配列を含むか、またはそれらからなる。これらの変異は、挿入、欠失、アミノ酸置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの事例では、タイプＶ参照ＣａｓＸタンパク質は、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｕｎｇｂａｃｔｅｒｉａから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、以下の配列と少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一の配列を含む：
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも６０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも８０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも９０％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも９５％の類似性を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列からなる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、配列番号３の配列と比較して少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０個の変異を有する配列を含むか、またはそれらからなる。これらの変異は、挿入、欠失、アミノ酸置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
ｈ．ＣａｓＸバリアントタンパク質
本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質のバリアント（本明細書では互換的に「ＣａｓＸバリアント」または「ＣａｓＸバリアントタンパク質」と称される）を提供し、ＣａｓＸバリアントは、配列番号１～３の配列を含む参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つのドメインに少なくとも１つの配列改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された特性を呈する。本明細書に記載の参照ＣａｓＸタンパク質と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質の１つ以上の機能または特性を改善する全てのバリアントが、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態では、改変は、参照ＣａｓＸの１つ以上のアミノ酸の変異である。他の実施形態では、改変は、異なるＣａｓＸ由来の１つ以上のドメインでの参照ＣａｓＸの１つ以上のドメインの置換である。いくつかの実施形態では、挿入は、異なるＣａｓＸタンパク質由来のドメインの一部または全ての挿入を含む。変異は、参照ＣａｓＸタンパク質のいずれか１つ以上のドメインで起こり得、例えば、１つ以上のドメインの一部もしくは全ての欠失、または参照ＣａｓＸタンパク質の任意のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入を含み得る。ＣａｓＸタンパク質のドメインには、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインが含まれる。ＣａｓＸタンパク質の改善された特性をもたらす参照ＣａｓＸタンパク質のアミノ酸配列のいずれかの変化も、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質とみなされる。例えば、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、もしくはスワップされたドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の特性において、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、それらがＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、またはＣＴＣから選択される多様性のより高いＰＡＭ配列に対して結合親和性を有し、ＣａｓＸバリアントが参照ＣａｓＸタンパク質と比較して標的核酸の有意に大きい部分を編集することができるという、参照ＣａｓＸタンパク質を超える利点を有する。
本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質のバリアント（本明細書では互換的に「ＣａｓＸバリアント」または「ＣａｓＸバリアントタンパク質」と称される）を提供し、ＣａｓＸバリアントは、配列番号１～３の配列を含む参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つのドメインに少なくとも１つの配列改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１つの改善された特性を呈する。本明細書に記載の参照ＣａｓＸタンパク質と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質の１つ以上の機能または特性を改善する全てのバリアントが、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態では、改変は、参照ＣａｓＸの１つ以上のアミノ酸の変異である。他の実施形態では、改変は、異なるＣａｓＸ由来の１つ以上のドメインでの参照ＣａｓＸの１つ以上のドメインの置換である。いくつかの実施形態では、挿入は、異なるＣａｓＸタンパク質由来のドメインの一部または全ての挿入を含む。変異は、参照ＣａｓＸタンパク質のいずれか１つ以上のドメインで起こり得、例えば、１つ以上のドメインの一部もしくは全ての欠失、または参照ＣａｓＸタンパク質の任意のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入を含み得る。ＣａｓＸタンパク質のドメインには、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインが含まれる。ＣａｓＸタンパク質の改善された特性をもたらす参照ＣａｓＸタンパク質のアミノ酸配列のいずれかの変化も、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質とみなされる。例えば、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、もしくはスワップされたドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の特性において、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、それらがＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、またはＣＴＣから選択される多様性のより高いＰＡＭ配列に対して結合親和性を有し、ＣａｓＸバリアントが参照ＣａｓＸタンパク質と比較して標的核酸の有意に大きい部分を編集することができるという、参照ＣａｓＸタンパク質を超える利点を有する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１～３の配列を含む参照ＣａｓＸタンパク質の２つのドメインのうちの少なくとも各々に少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも２つのドメイン、少なくとも３つのドメイン、少なくとも４つのドメイン、または少なくとも５つのドメインに少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに２つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに少なくとも２つの改変、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに少なくとも３つの改変、または参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに少なくとも４つの改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して２つ以上の改変を含み、各改変は、ＮＴＳＢＤ、ＴＳＬＤ、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から独立して選択されるドメインに作製される。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質の少なくとも１つの改変は、配列番号１～３の配列の参照ＣａｓＸタンパク質の１つのドメインの少なくとも一部分の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、ＮＴＳＢＤ、ＴＳＬＤ、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、ＯＢＤ、またはＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインにある。
本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成するための好適な変異誘発法には、例えば、ディープミューテーショナルエボルーション（ＤＭＥ）、ディープミューテーショナルスキャニング（ＤＭＳ）、エラープローンＰＣＲ、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、スタガードエクステンションＰＣＲ、遺伝子シャフリング、またはドメインスワッピングが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、例えば、参照ＣａｓＸにおいて１つ以上の所望の変異を選択することによって設計される。ある特定の実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質の活性は、１つ以上のＣａｓＸバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それにより、ＣａｓＸバリアントの機能の改善を測定する。ＣａｓＸバリアントの例示的な改善には、以下により完全に記載される、バリアントの改善されたフォールディング、ｇＮＡに対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡに対する改善された結合親和性、１つ以上のＰＡＭ配列に対する改変された結合親和性、標的ＤＮＡの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、ＤＮＡの非標的鎖の改善された結合、改善された標的核酸配列の切断速度、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、ならびに改善された融合特性が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のＣａｓＸバリアントのいくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、（ａ）配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３の参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続もしくは非連続アミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントにおける１～１００個の連続もしくは非連続アミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸにおける１～１００個の連続もしくは非連続アミノ酸の挿入、または（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、（ａ）配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３の参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントにおける５～１０個の連続もしくは非連続アミノ酸の置換、（ｂ）参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントにおける１～５個の連続もしくは非連続アミノ酸の欠失、（ｃ）参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸにおける１～５個の連続もしくは非連続アミノ酸の挿入、または（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列と比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０個の変異を有する配列を含むか、またはそれらからなる。これらの変異は、挿入、欠失、アミノ酸置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質の少なくとも１つのドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１～４個のアミノ酸置換、１～１０個のアミノ酸置換、１～２０個のアミノ酸置換、１～３０個のアミノ酸置換、１～４０個のアミノ酸置換、１～５０個のアミノ酸置換、１～６０個のアミノ酸置換、１～７０個のアミノ酸置換、１～８０個のアミノ酸置換、１～９０個のアミノ酸置換、１～１００個のアミノ酸置換、２～１０個のアミノ酸置換、２～２０個のアミノ酸置換、２～３０個のアミノ酸置換、３～１０個のアミノ酸置換、３～２０個のアミノ酸置換、３～３０個のアミノ酸置換、４～１０個のアミノ酸置換、４～２０個のアミノ酸置換、３～３００個のアミノ酸置換、５～１０個のアミノ酸置換、５～２０個のアミノ酸置換、５～３０個のアミノ酸置換、１０～５０個のアミノ酸置換、または２０～５０個のアミノ酸置換を含み、連続的もしくは非連続的か、または異なるドメインにあることができる。本明細書で使用される場合、「連続アミノ酸」とは、ポリペプチドの一次配列において隣接しているアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも約１００個以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的置換である。他の実施形態では、置換は非保存的であり、例えば、極性アミノ酸が非極性アミノ酸に置換されるか、またはその逆も同様である。
本明細書に記載の置換において、任意のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に置換され得る。置換は、保存的置換であり得る（例えば、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換される）。置換は、非保存的置換であり得る（例えば、塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換されるか、またはその逆も同様である）。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質のプロリンは、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのうちのいずれかに置換されて、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１個のアミノ酸欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１～４個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸、１～２０個のアミノ酸、１～３０個のアミノ酸、１～４０個のアミノ酸、１～５０個のアミノ酸、１～６０個のアミノ酸、１～７０個のアミノ酸、１～８０個のアミノ酸、１～９０個のアミノ酸、１～１００個のアミノ酸、２～１０個のアミノ酸、２～２０個のアミノ酸、２～３０個のアミノ酸、３～１０個のアミノ酸、３～２０個のアミノ酸、３～３０個のアミノ酸、４～１０個のアミノ酸、４～２０個のアミノ酸、３～３００個のアミノ酸、５～１０個のアミノ酸、５～２０個のアミノ酸、５～３０個のアミノ酸、１０～５０個のアミノ酸、または２０～５０個のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも約１００個の連続アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００個の連続アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の連続アミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して２個以上の欠失を含み、これらの２個以上の欠失は連続アミノ酸ではない。例えば、第１の欠失は、参照ＣａｓＸタンパク質の第１のドメインにあり得、第２の欠失は、参照ＣａｓＸタンパク質の第２のドメインにあり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の非連続欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも２０個の非連続欠失を含む。各非連続欠失は、本明細書に記載の任意の長さのアミノ酸、例えば、１～４個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸などであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列に対して少なくとも１個のアミノ酸挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、１個のアミノ酸の挿入、２～３個の連続アミノ酸、２～４個の連続アミノ酸、２～５個の連続アミノ酸、２～６個の連続アミノ酸、２～７個の連続アミノ酸、２～８個の連続アミノ酸、２～９個の連続アミノ酸、２～１０個の連続アミノ酸、２～２０個の連続アミノ酸、２～３０個の連続アミノ酸、２～４０個の連続アミノ酸、２～５０個の連続アミノ酸、２～６０個の連続アミノ酸、２～７０個の連続アミノ酸、２～８０個の連続アミノ酸、２～９０個の連続アミノ酸、２～１００個の連続アミノ酸、３～１０個の連続アミノ酸、３～２０個の連続アミノ酸、３～３０個の連続アミノ酸、４～１０個の連続アミノ酸、４～２０個の連続アミノ酸、３～３００個の連続アミノ酸、５～１０個の連続アミノ酸、５～２０個の連続アミノ酸、５～３０個の連続アミノ酸、１０～５０個の連続アミノ酸、または２０～５０個の連続アミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続アミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、少なくとも約１００個の連続アミノ酸の挿入を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して２個以上の挿入を含み、これらの２個以上の挿入は配列の連続アミノ酸ではない。例えば、第１の挿入は、参照ＣａｓＸタンパク質の第１のドメインにあり得、第２の挿入は、参照ＣａｓＸタンパク質の第２のドメインにあり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の非連続挿入を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも１０～約２０個以上の非連続挿入を含む。各非連続挿入は、本明細書に記載の任意の長さのアミノ酸、例えば、１～４個のアミノ酸、１～１０個のアミノ酸などであり得る。
任意のアミノ酸、またはアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に記載の挿入に挿入され得る。例えば、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンもしくはバリン、またはそれらの任意の組み合わせが、本開示の参照ＣａｓＸタンパク質に挿入されて、ＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。
本明細書に記載の置換、挿入、および欠失の実施形態の任意の順列が組み合わせられて、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質を生成することができる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較した少なくとも１つの置換および少なくとも１つの欠失、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較した少なくとも１つの置換および少なくとも１つの挿入、参照ＣａｓＸタンパク質配列と比較した少なくとも１つの挿入および少なくとも１つの欠失、または参照ＣａｓＸタンパク質と比較した少なくとも１つの置換、１つの挿入、および１つの欠失を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のうちの１つと少なくとも約６０％の配列類似性、少なくとも７０％の類似性、少なくとも８０％の類似性、少なくとも８５％の類似性、少なくとも８６％の類似性、少なくとも８７％の類似性、少なくとも８８％の類似性、少なくとも８９％の類似性、少なくとも９０％の類似性、少なくとも９１％の類似性、少なくとも９２％の類似性、少なくとも９３％の類似性、少なくとも９４％の類似性、少なくとも９５％の類似性、少なくとも９６％の類似性、少なくとも９７％の類似性、少なくとも９８％の類似性、少なくとも９９％の類似性、少なくとも９９．５％の類似性、少なくとも９９．６％の類似性、少なくとも９９．７％の類似性、少なくとも９９．８％の類似性、または少なくとも９９．９％の類似性を有する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２またはその一部と少なくとも約６０％の配列類似性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＹ７８９Ｔの置換、配列番号２のＰ７９３の欠失、配列番号２のＹ７８９Ｄの置換、配列番号２のＴ７２Ｓの置換、配列番号２のＩ５４６Ｖの置換、配列番号２のＥ５５２Ａの置換、配列番号２のＡ６３６Ｄの置換、配列番号２のＦ５３６Ｓの置換、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、配列番号２のＹ７９７Ｌの置換、配列番号２のＬ７９２Ｇの置換、配列番号２のＡ７３９Ｖの置換、配列番号２のＧ７９１Ｍの置換、配列番号２の６６１位でのＡの挿入、配列番号２のＡ７８８Ｗの置換、配列番号２のＫ３９０Ｒの置換、配列番号２のＡ７５１Ｓの置換、配列番号２のＥ３８５Ａの置換、配列番号２の６９６位でのＰの挿入、配列番号２の７７３位でのＭの挿入、配列番号２のＧ６９５Ｈの置換、配列番号２の７９３位でのＡＳの挿入、配列番号２の７９５位でのＡＳの挿入、配列番号２のＣ４７７Ｒの置換、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、配列番号２のＣ４７９Ａの置換、配列番号２のＣ４７９Ｌの置換、配列番号２のＩ５５Ｆの置換、配列番号２のＫ２１０Ｒの置換、配列番号２のＣ２３３Ｓの置換、配列番号２のＤ２３１Ｎの置換、配列番号２のＱ３３８Ｅの置換、配列番号２のＱ３３８Ｒの置換、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、配列番号２のＫ３９０Ｒの置換、配列番号２のＬ４８１Ｑの置換、配列番号２のＦ４９５Ｓの置換、配列番号２のＤ６００Ｎの置換、配列番号２のＴ８８６Ｋの置換、配列番号２のＡ７３９Ｖの置換、配列番号２のＫ４６０Ｎの置換、配列番号２のＩ１９９Ｆの置換、配列番号２のＧ４９２Ｐの置換、配列番号２のＴ１５３Ｉの置換、配列番号２のＲ５９１Ｉの置換、配列番号２の７９５位でのＡＳの挿入、配列番号２の７９６位でのＡＳの挿入、配列番号２の８８９位でのＬの挿入、配列番号２のＥ１２１Ｄの置換、配列番号２のＳ２７０Ｗの置換、配列番号２のＥ７１２Ｑの置換、配列番号２のＫ９４２Ｑの置換、配列番号２のＥ５５２Ｋの置換、配列番号２のＫ２５Ｑの置換、配列番号２のＮ４７Ｄの置換、配列番号２の６９６位でのＴの挿入、配列番号２のＬ６８５Ｉの置換、配列番号２のＮ８８０Ｄの置換、配列番号２のＱ１０２Ｒの置換、配列番号２のＭ７３４Ｋの置換、配列番号２のＡ７２４Ｓの置換、配列番号２のＴ７０４Ｋの置換、配列番号２のＰ２２４Ｋの置換、配列番号２のＫ２５Ｒの置換、配列番号２のＭ２９Ｅの置換、配列番号２のＨ１５２Ｄの置換、配列番号２のＳ２１９Ｒの置換、配列番号２のＥ４７５Ｋの置換、配列番号２のＧ２２６Ｒの置換、配列番号２のＡ３７７Ｋの置換、配列番号２のＥ４８０Ｋの置換、配列番号２のＫ４１６Ｅの置換、配列番号２のＨ１６４Ｒの置換、配列番号２のＫ７６７Ｒの置換、配列番号２のＩ７Ｆの置換、配列番号２のＭ２９Ｒの置換、配列番号２のＨ４３５Ｒの置換、配列番号２のＥ３８５Ｑの置換、配列番号２のＥ３８５Ｋの置換、配列番号２のＩ２７９Ｆの置換、配列番号２のＤ４８９Ｓの置換、配列番号２のＤ７３２Ｎの置換、配列番号２のＡ７３９Ｔの置換、配列番号２のＷ８８５Ｒの置換、配列番号２のＥ５３Ｋの置換、配列番号２のＡ２３８Ｔの置換、配列番号２のＰ２８３Ｑの置換、配列番号２のＥ２９２Ｋの置換、配列番号２のＱ６２８Ｅの置換、配列番号２のＲ３８８Ｑの置換、配列番号２のＧ７９１Ｍの置換、配列番号２のＬ７９２Ｋの置換、配列番号２のＬ７９２Ｅの置換、配列番号２のＭ７７９Ｎの置換、配列番号２のＧ２７Ｄの置換、配列番号２のＫ９５５Ｒの置換、配列番号２のＳ８６７Ｒの置換、配列番号２のＲ６９３Ｉの置換、配列番号２のＦ１８９Ｙの置換、配列番号２のＶ６３５Ｍの置換、配列番号２のＦ３９９Ｌの置換、配列番号２のＥ４９８Ｋの置換、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、配列番号２のＶ２５４Ｇの置換、配列番号２のＰ７９３Ｓの置換、配列番号２のＫ１８８Ｅの置換、配列番号２のＱＴ９４５ＫＩの置換、配列番号２のＴ６２０Ｐの置換、配列番号２のＴ９４６Ｐの置換、配列番号２のＴＴ９４９ＰＰの置換、配列番号２のＮ９５２Ｔの置換、配列番号２のＫ６８２Ｅの置換、配列番号２のＫ９７５Ｒの置換、配列番号２のＬ２１２Ｐの置換、配列番号２のＥ２９２Ｒの置換、配列番号２のＩ３０３Ｋの置換、配列番号２のＣ３４９Ｅの置換、配列番号２のＥ３８５Ｐの置換、配列番号２のＥ３８６Ｎの置換、配列番号２のＤ３８７Ｋの置換、配列番号２のＬ４０４Ｋの置換、配列番号２のＥ４６６Ｈの置換、配列番号２のＣ４７７Ｑの置換、配列番号２のＣ４７７Ｈの置換、配列番号２のＣ４７９Ａの置換、配列番号２のＤ６５９Ｈの置換、配列番号２のＴ８０６Ｖの置換、配列番号２のＫ８０８Ｓの置換、配列番号２の７９７位でのＡＳの挿入、配列番号２のＶ９５９Ｍの置換、配列番号２のＫ９７５Ｑの置換、配列番号２のＷ９７４Ｇの置換、配列番号２のＡ７０８Ｑの置換、配列番号２のＶ７１１Ｋの置換、配列番号２のＤ７３３Ｔの置換、配列番号２のＬ７４２Ｗの置換、配列番号２のＶ７４７Ｋの置換、配列番号２のＦ７５５Ｍの置換、配列番号２のＭ７７１Ａの置換、配列番号２のＭ７７１Ｑの置換、配列番号２のＷ７８２Ｑの置換、配列番号２のＧ７９１Ｆの置換、配列番号２のＬ７９２Ｄの置換、配列番号２のＬ７９２Ｋの置換、配列番号２のＰ７９３Ｑの置換、配列番号２のＰ７９３Ｇの置換、配列番号２のＱ８０４Ａの置換、配列番号２のＹ９６６Ｎの置換、配列番号２のＹ７２３Ｎの置換、配列番号２のＹ８５７Ｒの置換、配列番号２のＳ８９０Ｒの置換、配列番号２のＳ９３２Ｍの置換、配列番号２のＬ８９７Ｍの置換、配列番号２のＲ６２４Ｇの置換、配列番号２のＳ６０３Ｇの置換、配列番号２のＮ７３７Ｓの置換、配列番号２のＬ３０７Ｋの置換、配列番号２のＩ６５８Ｖの置換、配列番号２の６８８位でのＰＴの挿入、配列番号２の７９４位でのＳＡの挿入、配列番号２のＳ８７７Ｒの置換、配列番号２のＮ５８０Ｔの置換、配列番号２のＶ３３５Ｇの置換、配列番号２のＴ６２０Ｓの置換、配列番号２のＷ３４５Ｇの置換、配列番号２のＴ２８０Ｓの置換、配列番号２のＬ４０６Ｐの置換、配列番号２のＡ６１２Ｄの置換、配列番号２のＡ７５１Ｓの置換、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、配列番号２のＶ３５１Ｍの置換、配列番号２のＫ２１０Ｎの置換、配列番号２のＤ４０Ａの置換、配列番号２のＥ７７３Ｇの置換、配列番号２のＨ２０７Ｌの置換、配列番号２のＴ６２Ａの置換、配列番号２のＴ２８７Ｐの置換、配列番号２のＴ８３２Ａの置換、配列番号２のＡ８９３Ｓの置換、配列番号２の１４位でのＶの挿入、配列番号２の１３位でのＡＧの挿入、配列番号２のＲ１１Ｖの置換、配列番号２のＲ１２Ｎの置換、配列番号２のＲ１３Ｈの置換、配列番号２の１３位でのＹの挿入、配列番号２のＲ１２Ｌの置換、配列番号２の１３位でのＱの挿入、配列番号２のＶ１５Ｓの置換、配列番号２の１７位でのＤの挿入、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質アミノ酸配列に対して少なくとも２つのアミノ酸変化を含む。少なくとも２つのアミノ酸変化は、参照ＣａｓＸタンパク質アミノ酸配列の置換、挿入、もしくは欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸバリアントタンパク質の配列に対する少なくとも２つのアミノ酸の変化は、配列番号２のＹ７８９Ｔの置換、配列番号２のＰ７９３の欠失、配列番号２のＹ７８９Ｄの置換、配列番号２のＴ７２Ｓの置換、配列番号２のＩ５４６Ｖの置換、配列番号２のＥ５５２Ａの置換、配列番号２のＡ６３６Ｄの置換、配列番号２のＦ５３６Ｓの置換、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、配列番号２のＹ７９７Ｌの置換、Ｌ７９２Ｇ配列番号２の置換、配列番号２のＡ７３９Ｖの置換、配列番号２のＧ７９１Ｍの置換、配列番号２の６６１位でのＡの挿入、配列番号２のＡ７８８Ｗの置換、配列番号２のＫ３９０Ｒの置換、配列番号２のＡ７５１Ｓの置換、配列番号２のＥ３８５Ａの置換、配列番号２の６９６位でのＰの挿入、配列番号２の７７３位でのＭの挿入、配列番号２のＧ６９５Ｈの置換、配列番号２の７９３位でのＡＳの挿入、配列番号２の７９５位でのＡＳの挿入、配列番号２のＣ４７７Ｒの置換、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、配列番号２のＣ４７９Ａの置換、配列番号２のＣ４７９Ｌの置換、配列番号２のＩ５５Ｆの置換、配列番号２のＫ２１０Ｒの置換、配列番号２のＣ２３３Ｓの置換、配列番号２のＤ２３１Ｎの置換、配列番号２のＱ３３８Ｅの置換、配列番号２のＱ３３８Ｒの置換、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、配列番号２のＫ３９０Ｒの置換、配列番号２のＬ４８１Ｑの置換、配列番号２のＦ４９５Ｓの置換、配列番号２のＤ６００Ｎの置換、配列番号２のＴ８８６Ｋの置換、配列番号２のＡ７３９Ｖの置換、配列番号２のＫ４６０Ｎの置換、配列番号２のＩ１９９Ｆの置換、配列番号のＧ４９２Ｐの置換、配列番号２のＴ１５３Ｉの置換、配列番号２のＲ５９１Ｉの置換、配列番号２の７９５位でのＡＳの挿入、配列番号２の７９６位でのＡＳの挿入、配列番号２の８８９位でのＬの挿入、配列番号２のＥ１２１Ｄの置換、配列番号２のＳ２７０Ｗの置換、配列番号２のＥ７１２Ｑの置換、配列番号２のＫ９４２Ｑの置換、配列番号２のＥ５５２Ｋの置換、配列番号２のＫ２５Ｑの置換、配列番号２のＮ４７Ｄの置換、配列番号２の６９６位でのＴの挿入、配列番号２のＬ６８５Ｉの置換、配列番号２のＮ８８０Ｄの置換、配列番号２のＱ１０２Ｒの置換、配列番号２のＭ７３４Ｋの置換、配列番号２のＡ７２４Ｓの置換、配列番号２のＴ７０４Ｋの置換、配列番号２のＰ２２４Ｋの置換、配列番号２のＫ２５Ｒの置換、配列番号２のＭ２９Ｅの置換、配列番号２のＨ１５２Ｄの置換、配列番号２のＳ２１９Ｒの置換、配列番号２のＥ４７５Ｋの置換、配列番号２のＧ２２６Ｒの置換、配列番号２のＡ３７７Ｋの置換、配列番号２のＥ４８０Ｋの置換、配列番号２のＫ４１６Ｅの置換、配列番号２のＨ１６４Ｒの置換、配列番号２のＫ７６７Ｒの置換、配列番号２のＩ７Ｆの置換、配列番号２のＭ２９Ｒの置換、配列番号２のＨ４３５Ｒの置換、配列番号２のＥ３８５Ｑの置換、配列番号２のＥ３８５Ｋの置換、配列番号２のＩ２７９Ｆの置換、配列番号２のＤ４８９Ｓの置換、配列番号２のＤ７３２Ｎの置換、配列番号２のＡ７３９Ｔの置換、配列番号２のＷ８８５Ｒの置換、配列番号２のＥ５３Ｋの置換、配列番号２のＡ２３８Ｔの置換、配列番号２のＰ２８３Ｑの置換、配列番号２のＥ２９２Ｋの置換、配列番号２のＱ６２８Ｅの置換、配列番号２のＲ３８８Ｑの置換、配列番号２のＧ７９１Ｍの置換、配列番号２のＬ７９２Ｋの置換、配列番号２のＬ７９２Ｅの置換、配列番号２のＭ７７９Ｎの置換、配列番号２のＧ２７Ｄの置換、配列番号２のＫ９５５Ｒの置換、配列番号２のＳ８６７Ｒの置換、配列番号２のＲ６９３Ｉの置換、配列番号２のＦ１８９Ｙの置換、配列番号２のＶ６３５Ｍの置換、配列番号２のＦ３９９Ｌの置換、配列番号２のＥ４９８Ｋの置換、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、配列番号２のＶ２５４Ｇの置換、配列番号２のＰ７９３Ｓの置換、配列番号２のＫ１８８Ｅの置換、配列番号２のＱＴ９４５ＫＩの置換、配列番号２のＴ６２０Ｐの置換、配列番号２のＴ９４６Ｐの置換、配列番号２のＴＴ９４９ＰＰの置換、配列番号２のＮ９５２Ｔの置換、配列番号２のＫ６８２Ｅの置換、配列番号２のＫ９７５Ｒの置換、配列番号２のＬ２１２Ｐの置換、配列番号２のＥ２９２Ｒの置換、配列番号２のＩ３０３Ｋの置換、配列番号２のＣ３４９Ｅの置換、配列番号２のＥ３８５Ｐの置換、配列番号２のＥ３８６Ｎの置換、配列番号２のＤ３８７Ｋの置換、配列番号２のＬ４０４Ｋの置換、配列番号２のＥ４６６Ｈの置換、配列番号２のＣ４７７Ｑの置換、配列番号２のＣ４７７Ｈの置換、配列番号２のＣ４７９Ａの置換、配列番号２のＤ６５９Ｈの置換、配列番号２のＴ８０６Ｖの置換、配列番号２のＫ８０８Ｓの置換、配列番号２の７９７位でのＡＳの挿入、配列番号２のＶ９５９Ｍの置換、配列番号２のＫ９７５Ｑの置換、配列番号２のＷ９７４Ｇの置換、配列番号２のＡ７０８Ｑの置換、配列番号２のＶ７１１Ｋの置換、配列番号２のＤ７３３Ｔの置換、配列番号２のＬ７４２Ｗの置換、配列番号２のＶ７４７Ｋの置換、配列番号２のＦ７５５Ｍの置換、配列番号２のＭ７７１Ａの置換、配列番号２のＭ７７１Ｑの置換、配列番号２のＷ７８２Ｑの置換、配列番号２のＧ７９１Ｆの置換、配列番号２のＬ７９２Ｄの置換、配列番号２のＬ７９２Ｋの置換、配列番号２のＰ７９３Ｑの置換、配列番号２のＰ７９３Ｇの置換、配列番号２のＱ８０４Ａの置換、配列番号２のＹ９６６Ｎの置換、配列番号２のＹ７２３Ｎの置換、配列番号２のＹ８５７Ｒの置換、配列番号２のＳ８９０Ｒの置換、配列番号２のＳ９３２Ｍの置換、配列番号２のＬ８９７Ｍの置換、配列番号２のＲ６２４Ｇの置換、配列番号２のＳ６０３Ｇの置換、配列番号２のＮ７３７Ｓの置換、配列番号２のＬ３０７Ｋの置換、配列番号２のＩ６５８Ｖの置換、配列番号２の６８８位でのＰＴの挿入、配列番号２の７９４位でのＳＡの挿入、配列番号２のＳ８７７Ｒの置換、配列番号２のＮ５８０Ｔの置換、配列番号２のＶ３３５Ｇの置換、配列番号２のＴ６２０Ｓの置換、配列番号２のＷ３４５Ｇの置換、配列番号２のＴ２８０Ｓの置換、配列番号２のＬ４０６Ｐの置換、配列番号２のＡ６１２Ｄの置換、配列番号２のＡ７５１Ｓの置換、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、配列番号２のＶ３５１Ｍの置換、配列番号２のＫ２１０Ｎの置換、配列番号２のＤ４０Ａの置換、配列番号２のＥ７７３Ｇの置換、配列番号２のＨ２０７Ｌの置換、Ｔ６２Ａ配列番号２の置換、配列番号２のＴ２８７Ｐの置換、配列番号２のＴ８３２Ａの置換、配列番号２のＡ８９３Ｓの置換、配列番号２の１４位でのＶの挿入、配列番号２の１３位でのＡＧの挿入、配列番号２のＲ１１Ｖの置換、配列番号２のＲ１２Ｎの置換、配列番号２のＲ１３Ｈの置換、配列番号２の１３位でのＹの挿入、配列番号２のＲ１２Ｌの置換、配列番号２の１３位でのＱの挿入、配列番号２のＶ１５Ｓの置換、および配列番号２の１７位でのＤの挿入からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質に対する少なくとも２つのアミノ酸の変化は、表３の配列に開示されたアミノ酸の変化から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質アミノ酸配列の２つ以上の置換、挿入、および／または欠失を含む。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質は、配列番号２を含むか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＳ７９４Ｒの置換およびＹ７９７Ｌの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＫ４１６Ｅの置換およびＡ７０８Ｋの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換およびＰ７９３の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＰ７９３の欠失およびＰ７９３ＡＳの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＱ３６７Ｋの置換およびＩ４２５Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７９３Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＱ３３８Ｒの置換およびＡ３３９Ｅの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＱ３３８Ｒの置換およびＡ３３９Ｋの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＳ５０７Ｇの置換およびＧ５０８Ｒの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７９Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ４８９Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｔの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ７３２Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＧ７９１Ｍの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＹ７９７Ｌの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７９Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ４８９Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｔの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ７３２Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＧ７９１Ｍの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＹ７９７Ｌの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＴ６２０Ｐの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＥ３８６Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＥ３８６Ｒの置換、Ｆ３９９Ｌの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＲ５８１ＩおよびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、この段落の前述の実施形態の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質アミノ酸配列の２つ以上の置換、挿入、および／または欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＴ６２０Ｐの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＭ７７１Ａの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ７３２Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＷ７８２Ｑの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＭ７７１Ｑの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＲ４５８Ｉの置換およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｔの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ４８９Ｓの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＤ７３２Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、この段落の前述の実施形態の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＶ７１１Ｋの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＹ７９７Ｌの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの置換、およびＥ３８６Ｓの置換を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ７９２Ｄの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＧ７９１Ｆの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＡ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＡ７３９Ｖの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＣ４７７Ｋの置換、Ａ７０８Ｋの置換、および７９３位でのＰの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ２４９Ｉの置換およびＭ７７１Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＶ７４７Ｋの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号２のＬ３７９Ｒの置換、Ｃ４７７の置換、Ａ７０８Ｋの置換、７９３位でのＰの欠失、およびＭ７７９Ｎの置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、Ｆ７５５Ｍの置換を含む。
一部の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、４００～２０００個のアミノ酸、５００～１５００個のアミノ酸、７００～１２００個のアミノ酸、８００～１１００個のアミノ酸、または９００～１０００個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＮＡ：標的ＤＮＡ複合体形成が起こるチャネルを形成する非隣接残基の領域を含む１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＮＡに結合する界面を形成する非隣接残基の領域を含む１つ以上の改変を含む。例えば、参照ＣａｓＸタンパク質のいくつかの実施形態では、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、およびＯＢＤドメインはすべて、ｇＮＡ：標的ＤＮＡ複合体と接触するか、またはそれに近接しており、これらのドメインのうちのいずれか内の非隣接残基に対する１つ以上の改変は、ＣａｓＸバリアントタンパク質の機能を改善することができる。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、非標的鎖ＤＮＡに結合するチャネルを形成する非隣接残基の領域を含む１つ以上の改変を含む。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＮＴＳＢＤの非隣接残基に対して１つ以上の改変を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＰＡＭに結合する界面を形成する非隣接残基の領域を含む１つ以上の改変を含む。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ヘリカルＩドメインまたはＯＢＤの非隣接残基に対して１つ以上の改変を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、非隣接表面露出残基の領域を含む１つ以上の改変を含む。本明細書で使用される場合、「表面露出残基」とは、ＣａｓＸタンパク質の表面上のアミノ酸、またはアミノ酸の少なくとも一部分、例えば、骨格もしくは側鎖の一部がタンパク質の表面上にあるアミノ酸を指す。水性細胞内環境に曝露されているＣａｓＸなどの細胞タンパク質の表面露出残基は、正に荷電した親水性アミノ酸、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびスレオニンからしばしば選択される。したがって、例えば、本明細書に提供されるバリアントのいくつかの実施形態では、表面露出残基の領域は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して１つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の正に荷電した残基は、１つ以上の他の正に荷電した残基、もしくは負に荷電した残基、もしくは非荷電残基、またはそれらの任意の組み合わせに置換される。いくつかの実施形態では、置換のための１つ以上のアミノ酸残基は、近くの結合した核酸であり、例えば、標的ＤＮＡと接触するＲｕｖＣドメインもしくはヘリカルＩドメイン内の残基、またはｇＲＮＡに結合するＯＢＤもしくはヘリカルＩＩドメイン内の残基は、１つ以上の正に荷電したアミノ酸または極性アミノ酸に置換され得る。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質のドメインに疎水性パッキングによりコアを形成する非隣接残基の領域を含む１つ以上の改変を含む。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、疎水性パッキングによりコアを形成する領域は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびシステインなどの疎水性アミノ酸が豊富である。例えば、いくつかの参照ＣａｓＸタンパク質では、ＲｕｖＣドメインは、活性部位に隣接する疎水性ポケットを含む。いくつかの実施形態では、その領域の２～１５個の残基は、荷電、極性、または塩基スタッキングである。荷電アミノ酸（互換的に、本明細書では残基と称される）には、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が含まれ得、これらのアミノ酸の側鎖が塩橋を形成し得るが、ただし、架橋パートナーも存在することを条件とする。極性アミノ酸には、例えば、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、およびシステインが含まれ得る。極性アミノ酸は、いくつかの実施形態では、それらの側鎖の同一性に応じて、プロトン供与体または受容体として水素結合を形成することができる。本明細書で使用される場合、「塩基スタッキング」は、アミノ酸残基（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはヒスチジンなど）の芳香族側鎖と、核酸内のスタックされたヌクレオチド塩基との相互作用を含む。ＣａｓＸバリアントタンパク質の機能的部分を形成するために空間的にごく近接している非隣接アミノ酸の領域に対するいずれかの改変も、本開示の範囲内であると想定される。
ｉ．複数の供給源タンパク質由来のドメインを有するＣａｓＸバリアントタンパク質
ある特定の実施形態では、本開示は、２つ以上の異なるＣａｓＸタンパク質、例えば、２つ以上の参照ＣａｓＸタンパク質、または本明細書に記載の２つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質配列由来のタンパク質ドメインを含むキメラＣａｓＸタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラＣａｓＸタンパク質」とは、２つの天然に存在するタンパク質などの異なる供給源から単離されたまたはそれらに由来する少なくとも２つのドメインを含むＣａｓＸを指し、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメインからなる群から選択され、第２のドメインは、前述の第１のドメインとは異なる。例えば、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤドメイン、および配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のＲｕｖＣドメインを含み得、またはその逆も同様である。さらなる例として、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメイン、ならびに配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のヘリカルＩドメインを含み得、またはその逆も同様である。したがって、ある特定の実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメインと、第２のＣａｓＸタンパク質由来のヘリカルＩドメインとを含み得る。キメラＣａｓＸタンパク質のいくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列に由来し、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列に由来し、第１のＣａｓＸタンパク質および第２のＣａｓＸタンパク質は同じではない。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、２つ以上の異なるＣａｓＸタンパク質、例えば、２つ以上の参照ＣａｓＸタンパク質、または本明細書に記載の２つ以上のＣａｓＸバリアントタンパク質配列由来のタンパク質ドメインを含むキメラＣａｓＸタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラＣａｓＸタンパク質」とは、２つの天然に存在するタンパク質などの異なる供給源から単離されたまたはそれらに由来する少なくとも２つのドメインを含むＣａｓＸを指し、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、第１のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメインからなる群から選択され、第２のドメインは、前述の第１のドメインとは異なる。例えば、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤドメイン、および配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のＲｕｖＣドメインを含み得、またはその逆も同様である。さらなる例として、キメラＣａｓＸタンパク質は、配列番号２のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメイン、ならびに配列番号１のＣａｓＸタンパク質由来のヘリカルＩドメインを含み得、またはその逆も同様である。したがって、ある特定の実施形態では、キメラＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、およびＲｕｖＣドメインと、第２のＣａｓＸタンパク質由来のヘリカルＩドメインとを含み得る。キメラＣａｓＸタンパク質のいくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列に由来し、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列に由来し、第１のＣａｓＸタンパク質および第２のＣａｓＸタンパク質は同じではない。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号１に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号２に由来する配列を含み、第２のＣａｓＸタンパク質のドメインは、配列番号３に由来する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１の部分と、第２の異なるＣａｓＸタンパク質由来の第２の部分とを含む少なくとも１つのキメラドメインを含む。本明細書で使用される場合、「キメラドメイン」とは、異なる供給源、例えば、２つの天然に存在するタンパク質から単離されたまたはそれらに由来する少なくとも２つの部分を含む単一ドメイン、または２つの参照ＣａｓＸタンパク質由来のドメインの一部分を指す。少なくとも１つのキメラドメインは、本明細書に記載のＮＴＳＢ、ＴＳＬ、ヘリカルＩ、ヘリカルＩＩ、ＯＢＤ、またはＲｕｖＣドメインのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸドメインの第１の部分は、配列番号１の配列を含み、ＣａｓＸドメインの第２の部分は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸドメインの第１の部分は、配列番号１の配列を含み、ＣａｓＸドメインの第２の部分は、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸドメインの第１の部分は、配列番号２の配列を含み、ＣａｓＸドメインの第２の部分は、配列番号３の配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのキメラドメインは、キメラＲｕｖＣドメインを含む。前述の例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号１のアミノ酸６６１～８２４および配列番号２のアミノ酸９２２～９７８を含む。前述の代替例として、キメラＲｕｖＣドメインは、配列番号２のアミノ酸６４８～８１２および配列番号１のアミノ酸９３５～９８６を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質は、第１のＣａｓＸタンパク質由来の第１のドメインと、第２のＣａｓＸタンパク質由来の第２のドメインと、この段落に記載の実施形態のアプローチを使用して異なるＣａｓＸタンパク質から単離された少なくとも２つの部分を含む少なくとも１つのキメラドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号４９～１６０の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列番号４９～１６０の配列からなる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、表３に示される配列に対して、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、および４９０からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、および４９０からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４９～１６０からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号４９～１６０からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質、例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照タンパク質と比較して、ＣａｓＸタンパク質の１つ以上の改善された特性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの少なくとも１つの改善された特性は、参照タンパク質と比較して少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの少なくとも１つの改善された特性は、参照ＣａｓＸタンパク質よりも少なくとも約１．１～約１０，０００倍改善される、少なくとも約１．１～約１，０００倍改善される、少なくとも約１．１～約５００倍改善される、少なくとも約１．１～約４００倍改善される、少なくとも約１．１～約３００倍改善される、少なくとも約１．１～約２００倍改善される、少なくとも約１．１～約１００倍改善される、少なくとも約１．１～約５０倍改善される、少なくとも約１．１～約４０倍改善される、少なくとも約１．１～約３０倍改善される、少なくとも約１．１～約２０倍改善される、少なくとも約１．１～約１０倍改善される、少なくとも約１．１～約９倍改善される、少なくとも約１．１～約８倍改善される、少なくとも約１．１～約７倍改善される、少なくとも約１．１～約６倍改善される、少なくとも約１．１～約５倍改善される、少なくとも約１．１～約４倍改善される、少なくとも約１．１～約３倍改善される、少なくとも約１．１～約２倍改善される、少なくとも約１．１～約１．５倍改善される、少なくとも約１．５～約３倍改善される、少なくとも約１．５～約４倍改善される、少なくとも約１．５～約５倍改善される、少なくとも約１．５～約１０倍改善される、少なくとも約５～約１０倍改善される、少なくとも約１０～約２０倍改善される、少なくとも１０～約３０倍改善される、少なくとも１０～約５０倍改善される、または少なくとも１０～約１００倍改善される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントの少なくとも１つの改善された特性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して少なくとも約１０～約１０００倍改善される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の少なくとも１つの改善された特性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２５０、少なくとも約５００、または少なくとも約１０００、少なくとも約５，０００、または少なくとも約１０，０００倍改善される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、少なくとも約２．７、少なくとも約２．８、少なくとも約２．９、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約５．５、少なくとも約６、少なくとも約６．５、少なくとも約７．０、少なくとも約７．５、少なくとも約８、少なくとも約８．５、少なくとも約９、少なくとも約９．５、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約５００、少なくとも約１，０００、または少なくとも約１０，０００倍改善される。参照ＣａｓＸタンパク質における同じ特性と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質において改善され得る例示的な特性には、バリアントの改善されたフォールディング、ｇＮＡに対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡに対する改善された結合親和性、１つ以上のＰＡＭ配列に対する変化した結合親和性、標的ＤＮＡの改善された巻き戻し、増加した活性、改善された編集効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、ＤＮＡの非標的鎖の改善された結合、改善された標的核酸配列の切断速度、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）形成、切断能力のあるＲＮＰの高い割合、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体（ＲＮＰ）溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、および改善された融合特性が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも１つの改善された特性を含む。他の実施形態では、バリアントは、少なくとも２つの改善された特性を含む。さらなる実施形態では、バリアントは、少なくとも３つの改善された特性を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも４つの改善された特性を含む。なおさらに別の実施形態では、バリアントは、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、またはそれ以上の改善された特徴を含む。これらの改善された特性は、以下により詳細に記載される。
ｊ．タンパク質安定性
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性は、タンパク質のより高い定常状態の発現をもたらし、これにより、編集効率が改善する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性により、より大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つＣａｓＸタンパク質がもたらされ、編集効率が改善されるか、または製造目的のために精製性が改善される。本明細書で使用される場合、「機能的立体配座」とは、タンパク質がｇＮＡおよび標的ＤＮＡに結合することができる立体配座にあるＣａｓＸタンパク質を指す。ＣａｓＸバリアントを触媒的に死んだ状態にする１つ以上の変異をＣａｓＸバリアントが有しない実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、標的ＤＮＡを切断、ニッキング、または別様に改変することができる。例えば、機能的ＣａｓＸバリアントは、いくつかの実施形態では、遺伝子編集に使用することができ、機能的立体配座は、「編集能力のある」立体配座を指す。ＣａｓＸバリアントタンパク質により大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つＣａｓＸタンパク質がもたらされるそれらの実施形態を含む、いくつかの例示的な実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより低い濃度のＣａｓＸバリアントが遺伝子編集などの用途に必要とされる。したがって、いくつかの実施形態では、改善された安定性を有するＣａｓＸバリアントは、１つ以上の遺伝子編集状況下で参照ＣａｓＸと比較して改善された効率を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性は、タンパク質のより高い定常状態の発現をもたらし、これにより、編集効率が改善する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性により、より大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つＣａｓＸタンパク質がもたらされ、編集効率が改善されるか、または製造目的のために精製性が改善される。本明細書で使用される場合、「機能的立体配座」とは、タンパク質がｇＮＡおよび標的ＤＮＡに結合することができる立体配座にあるＣａｓＸタンパク質を指す。ＣａｓＸバリアントを触媒的に死んだ状態にする１つ以上の変異をＣａｓＸバリアントが有しない実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、標的ＤＮＡを切断、ニッキング、または別様に改変することができる。例えば、機能的ＣａｓＸバリアントは、いくつかの実施形態では、遺伝子編集に使用することができ、機能的立体配座は、「編集能力のある」立体配座を指す。ＣａｓＸバリアントタンパク質により大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つＣａｓＸタンパク質がもたらされるそれらの実施形態を含む、いくつかの例示的な実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより低い濃度のＣａｓＸバリアントが遺伝子編集などの用途に必要とされる。したがって、いくつかの実施形態では、改善された安定性を有するＣａｓＸバリアントは、１つ以上の遺伝子編集状況下で参照ＣａｓＸと比較して改善された効率を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された熱安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、特定の温度範囲でＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された熱安定性を有する。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、いくつかの参照ＣａｓＸタンパク質は、地下水および堆積物に生態学的地位のある生物で本来機能しており、それ故に、いくつかの参照ＣａｓＸタンパク質は、ある特定の用途に望ましくあり得るより低温またはより高温で最適な機能を呈するように進化しているかもしれない。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質のうちの１つの用途は、哺乳動物細胞の遺伝子編集であり、これは、典型的には、約３７℃で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣａｓＸバリアントタンパク質は、少なくとも１６℃、少なくとも１８℃、少なくとも２０℃、少なくとも２２℃、少なくとも２４℃、少なくとも２６℃、少なくとも２８℃、少なくとも３０℃、少なくとも３２℃、少なくとも３４℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４１℃、少なくとも４２℃、少なくとも４４℃、少なくとも４６℃、少なくとも４８℃、少なくとも５０℃、少なくとも５２℃、またはそれ以上の温度で、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された熱安定性および機能性を有し、これにより、ヒト遺伝子編集用途を含み得る哺乳動物遺伝子編集用途などの改善された遺伝子編集機能性がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＮＰが機能的形態のままの状態を保つように、参照ＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ複合体と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質：ｇＮＡ複合体の安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。安定性の改善には、増加した熱安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、増強された薬物動態特性、様々なｐＨ条件、塩条件にわたる安定性、および等張性が含まれ得る。本複合体の改善された安定性は、いくつかの実施形態では、改善された編集効率をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ複合体と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質：ｇＮＡ複合体の熱安定性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質：ｇＮＡ複合体は、少なくとも１６℃、少なくとも１８℃、少なくとも２０℃、少なくとも２２℃、少なくとも２４℃、少なくとも２６℃、少なくとも２８℃、少なくとも３０℃、少なくとも３２℃、少なくとも３４℃、少なくとも３５℃、少なくとも３６℃、少なくとも３７℃、少なくとも３８℃、少なくとも３９℃、少なくとも４０℃、少なくとも４１℃、少なくとも４２℃、少なくとも４４℃、少なくとも４６℃、少なくとも４８℃、少なくとも５０℃、少なくとも５２℃、またはそれ以上の温度で、参照ＣａｓＸタンパク質を含む複合体と比較して改善された熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質：ｇＮＡ複合体と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質：ｇＮＡ複合体の熱安定性を有し、これにより、ヒト遺伝子編集用途を含み得る哺乳動物遺伝子編集用途などの遺伝子編集用途の改善された機能がもたらされる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性および／または熱安定性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより速いＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより遅いＣａｓＸバリアントタンパク質のアンフォールディング動態、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより大きいＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング時の自由エネルギー放出、ＣａｓＸバリアントタンパク質の５０％がアンフォールドされる参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより高い温度（Ｔｍ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。これらの特性は、広範囲の値で改善され得、例えば、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１．１、少なくとも１．５、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、または少なくとも１０，０００倍改善され得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された熱安定性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより高いＣａｓＸバリアントタンパク質のＴｍを含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＴｍは、約２０℃～約３０℃、約３０℃～約４０℃、約４０℃～約５０℃、約５０℃～約６０℃、約６０℃～約７０℃、約７０℃～約８０℃、約８０℃～約９０℃、または約９０℃～約１００℃である。熱安定性は、分子の半分が変性する温度として定義される、「融解温度」（Ｔｍ）を測定することによって決定される。Ｔｍおよびアンフォールディングの自由エネルギーなどのタンパク質安定性の特性を測定する方法は、当業者に知られており、インビトロで標準生化学的技法を使用して測定することができる。例えば、Ｔｍは、試料および参照の温度を増加させるために必要な熱量の差が温度の関数として測定される熱分析技法である示差走査熱量測定を使用して測定され得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２０：１９５２－６０、Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ６８：４７－５２）。あるいは、または加えて、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＴｍは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔシステムなどの市販の方法を使用して測定され得る。あるいは、または加えて、円偏光二色性を使用して、フォールディングおよびアンフォールディングの動態、ならびにＴｍを測定することができる（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｓｃｉ ４０：３４３－９）。円偏光二色性（ＣＤ）は、タンパク質などの非対称分子による左回りおよび右回り円偏光の不均等な吸収に依存する。タンパク質のある特定の構造、例えば、アルファヘリックスおよびベータシートは、特徴的なＣＤスペクトルを有する。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤを使用して、ＣａｓＸバリアントタンパク質の二次構造を決定することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された安定性および／または熱安定性は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約５００、少なくとも約１，０００、少なくとも約２，０００、少なくとも約３，０００、少なくとも約４，０００、少なくとも約５，０００、または少なくとも約１０，０００倍改善される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質のフォールディング動態は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約５ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約１０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約２０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約３０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約４０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約６０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約７０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約８０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約９０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約１００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約１５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約２００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約２５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約３００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約３５０ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約４００ｋＪ／ｍｏｌ、少なくとも約４５０ｋＪ／ｍｏｌ、または少なくとも約５００ｋＪ／ｍｏｌ改善される。
参照ＣａｓＸタンパク質と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質の安定性を増加させることができる例示的なアミノ酸変化には、ＣａｓＸバリアントタンパク質内の水素結合の数を増加させるアミノ酸変化、ＣａｓＸバリアントタンパク質内のジスルフィド架橋の数を増加させるアミノ酸変化、ＣａｓＸバリアントタンパク質内の塩橋の数を増加させるアミノ酸変化、ＣａｓＸバリアントタンパク質の部分間の相互作用を強化するアミノ酸変化、ＣａｓＸバリアントタンパク質の埋められた疎水性表面領域を増加させるアミノ酸変化、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
ｋ．タンパク質収量
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された発現および精製中の収量を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞または真核生物宿主細胞から精製されたＣａｓＸバリアントタンパク質の収量は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善される。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、酵母、植物（例えば、タバコ）、昆虫（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｓｆ９細胞）、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、またはＣＨＯ細胞を含むが、これらに限定されない哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された発現および精製中の収量を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞または真核生物宿主細胞から精製されたＣａｓＸバリアントタンパク質の収量は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善される。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、酵母、植物（例えば、タバコ）、昆虫（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｓｆ９細胞）、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、またはＣＨＯ細胞を含むが、これらに限定されない哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された収量は、コドン最適化によって達成される。細胞は６４個の異なるコドンを使用し、それらのうちの６１個は２０個の標準アミノ酸をコードする一方で、別の３個は終止コドンとして機能する。いくつかの事例では、単一のアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされる。異なる生物は、同じ天然に存在するアミノ酸に対して異なるコドンを使用する傾向を呈する。したがって、タンパク質コード配列におけるコドンの選択、およびタンパク質が発現される生物と一致するコドンの選択は、いくつかの事例では、タンパク質の翻訳、ひいてはタンパク質発現レベルに有意な影響を及ぼす可能性がある。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、コドン最適化された核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質をコードする核酸は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、またはヒトである。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、原核生物および真核生物における翻訳速度を低下させるヌクレオチド配列が除去された核酸によってコードされる。例えば、連続した３つを超えるチミン残基の続きが、ある特定の生物における翻訳速度を低下させることができるか、または内部ポリアデニル化シグナルが翻訳速度を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される溶解性および安定性の改善は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質の収量をもたらす。
発現および精製中の改善されたタンパク質収量は、当該技術分野で既知の方法によって評価することができる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質の量は、ＳＤＳ－ｐａｇｅゲル上でタンパク質を泳動させ、かつＣａｓＸバリアントタンパク質を、量または濃度のいずれかが事前に分かっているコントロールと比較することによって決定して、タンパク質の絶対レベルを決定することができる。あるいは、または加えて、精製されたＣａｓＸバリアントタンパク質を同じ精製プロセスを受けている参照ＣａｓＸタンパク質の隣のＳＤＳ－ｐａｇｅゲル上で泳動させて、ＣａｓＸバリアントタンパク質の収量の相対的改善を決定することができる。あるいは、または加えて、タンパク質のレベルは、ウエスタンブロットもしくはＣａｓＸに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡなどの免疫組織化学的方法を使用して、またはＨＰＬＣにより測定することができる。溶液中のタンパク質の場合、濃度は、タンパク質の固有のＵＶ吸光度を測定することによって、またはローリーアッセイ、スミス銅／ビシンコニンアッセイ、もしくはブラッドフォード色素アッセイなどのタンパク質依存的色変化を使用する方法によって決定することができる。かかる方法を使用して、ある特定の条件下での発現によって得られる総タンパク質（例えば、総可溶性タンパク質など）収量を計算することができる。これは、例えば、同様の発現条件下の参照ＣａｓＸタンパク質のタンパク質収量と比較することができる。
ｌ．タンパク質溶解性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体と比較して改善されたＣａｓＸ：ｇＮＡリボ核タンパク質複合体バリアントの溶解性を有する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体と比較して改善されたＣａｓＸ：ｇＮＡリボ核タンパク質複合体バリアントの溶解性を有する。
いくつかの実施形態では、タンパク質溶解性の改善は、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製などのタンパク質精製技術からのタンパク質のより多い収量をもたらす。タンパク質の溶解性が高いほど細胞内で凝集する可能性が低くなるため、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された溶解性により、細胞内でのより効率的な活性が可能になり得る。タンパク質凝集体は、ある特定の実施形態では、細胞に有害であるか、または厄介である可能性があり、いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性の増加により、タンパク質凝集のこの結果が改善され得る。さらに、ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された溶解性により、例えば、所望の遺伝子編集用途において、より高い有効量の機能性タンパク質の送達を可能にする製剤の増強が可能になり得る。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性により、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約２５０、少なくとも約５００、または少なくとも約１０００倍の収量の、精製中のＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された収量がもたらされる。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性により、細胞におけるＣａｓＸバリアントタンパク質の活性が、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、少なくとも約２．７、少なくとも約２．８、少なくとも約２．９、少なくとも約３、少なくとも約３．５、少なくとも約４、少なくとも約４．５、少なくとも約５、少なくとも約５．５、少なくとも約６、少なくとも約６．５、少なくとも約７．０、少なくとも約７．５、少なくとも約８、少なくとも約８．５、少なくとも約９、少なくとも約９．５、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、または少なくとも約１５倍改善される。
ＣａｓＸタンパク質の溶解性を測定する方法、およびＣａｓＸバリアントタンパク質におけるその改善は、当業者には容易に明らかになるであろう。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性は、いくつかの実施形態では、溶解したＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分のゲル上で濃度測定読み取りを行うことによって測定することができる。あるいは、または加えて、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性の改善は、完全なタンパク質精製の過程を通して可溶性タンパク質産物の維持を測定することによって測定することができる。例えば、可溶性タンパク質産物は、ゲルアフィニティー精製、タグ切断、カチオン交換精製、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムにタンパク質を流すことのうちの１つ以上のステップで測定することができる。いくつかの実施形態では、ゲル上のタンパク質のすべてのバンドの濃度測定は、精製プロセスにおける各ステップの後に読み取られる。改善された溶解性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質が、いくつかの実施形態では、タンパク質精製プロセスにおける１つ以上のステップで参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより高い濃度を維持し得る一方で、不溶性タンパク質バリアントは、緩衝液交換、濾過ステップ、精製カラムとの相互作用などのため、１つ以上のステップで失われ得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性を改善することにより、タンパク質精製中のタンパク質のｍｇ／Ｌの観点で参照ＣａｓＸタンパク質と比較してより高い収量がもたらされる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の溶解性を改善することにより、本明細書に記載のＥＧＦＰ破壊アッセイなどの編集アッセイで評価される場合、より溶解性の低いタンパク質と比較してより多くの量の編集事象が可能になる。
ｍ．ｇＮＡに対するタンパク質親和性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたｇＮＡに対する親和性を有し、リボ核タンパク質複合体の形成をもたらす。ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、例えば、ＲＮＰ複合体の生成のためにより低いＫｄをもたらすことができ、いくつかの事例では、より安定したリボ核タンパク質複合体形成をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質のＫｄは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、約１．１～約１０倍増加したｇＮＡに対する結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたｇＮＡに対する親和性を有し、リボ核タンパク質複合体の形成をもたらす。ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、例えば、ＲＮＰ複合体の生成のためにより低いＫｄをもたらすことができ、いくつかの事例では、より安定したリボ核タンパク質複合体形成をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質のＫｄは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、約１．１～約１０倍増加したｇＮＡに対する結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加は、対象へのインビボ送達を含む、哺乳動物細胞に送達された場合のリボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞内の複合体の機能および有用性に影響を与え得るだけでなく、対象に送達されたときの血液中の薬物動態特性の改善をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の増加、および結果として生じるリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、依然として所望の活性、例えばインビボまたはインビトロ遺伝子編集を有しながら、より低用量のＣａｓＸバリアントタンパク質を対象または細胞に送達することを可能にする。ＲＮＰを形成し、それらを安定な形態に保つ能力の増加は、本明細書における実施例に記載されるインビトロ切断アッセイなどのアッセイを使用して評価することができる。いくつかの実施形態において、本開示のＣａｓＸバリアントを含むＲＮＰは、ＲＮＰとして複合体形成した場合、配列番号１～３の参照ＣａｓＸを含むＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍高いＫ切断速度を達成することができる。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質のより高い親和性（より緊密な結合）は、ＣａｓＸバリアントタンパク質およびｇＮＡの両方がＲＮＰ複合体に留まる場合、より多くの量の編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載のＥＧＦＰ破壊アッセイなどの編集アッセイを使用して評価することができる。
理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの実施形態では、ヘリカルＩドメインにおけるアミノ酸変化が、ｇＮＡ標的化配列に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の結合親和性を増加させることができる一方で、ヘリカルＩＩドメインにおける変化は、ｇＮＡ足場ステムループに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の結合親和性を増加させることができ、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）における変化は、ｇＲＮＡトリプレックスに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の結合親和性を増加させる。
ＣａｓＸ ｇＮＡに対するＣａｓＸタンパク質結合親和性を測定する方法には、精製されたＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡを使用するインビトロ法が含まれる。ｇＮＡまたはＣａｓＸタンパク質がフルオロフォアで標識される場合、参照ＣａｓＸおよびバリアントタンパク質に対する結合親和性は、蛍光偏光によって測定することができる。あるいは、または加えて、結合親和性は、バイオレイヤー干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、またはフィルター結合によって測定することができる。参照ｇＮＡおよびそれらのバリアントなどの特異的なｇＮＡに対する本開示の参照ＣａｓＸおよびバリアントタンパク質などのＲＮＡ結合タンパク質の絶対親和性を定量するための追加の標準技法には、等温熱量測定（ＩＴＣ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ならびに実施例の方法が含まれるが、これらに限定されない。
ｎ．標的核酸に対する親和性
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸に対する参照ＣａｓＸタンパク質の親和性と比較して、標的核酸に対する改善された結合親和性を有する。それらの標的核酸に対してより高い親和性を有するＣａｓＸバリアントは、いくつかの実施形態では、標的核酸に対する親和性が増加していない参照ＣａｓＸタンパク質よりも迅速に標的核酸配列を切断することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸に対する参照ＣａｓＸタンパク質の親和性と比較して、標的核酸に対する改善された結合親和性を有する。それらの標的核酸に対してより高い親和性を有するＣａｓＸバリアントは、いくつかの実施形態では、標的核酸に対する親和性が増加していない参照ＣａｓＸタンパク質よりも迅速に標的核酸配列を切断することができる。
いくつかの実施形態では、標的核酸に対する改善された親和性は、標的核酸の標的配列またはプロトスペーサー配列に対する改善された親和性、ＰＡＭ配列に対する改善された親和性、標的配列についてＤＮＡを探し出す改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせを含む。理論によって拘束されることを望まないが、ＣａｓＸなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質は、ＤＮＡ分子に沿った一次元拡散によってそれらの標的配列を見出すことができると考えられる。このプロセスには、（１）リボ核タンパク質のＤＮＡ分子への結合、それに続く（２）標的配列での停止が含まれると考えられ、それらのいずれも、いくつかの実施形態では、標的核酸配列に対するＣａｓＸタンパク質の改善された親和性によって影響を受け得、これにより、参照ＣａｓＸタンパク質と比較してＣａｓＸバリアントタンパク質の機能が改善する。
いくつかの実施形態では、改善された標的核酸親和性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＤＮＡに対する増加した全体的な親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸親和性が改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、およびＣＴＣからなる群から選択されるＰＡＭ配列を含む、配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質によって認識される標準的ＴＴＣ ＰＡＭ以外の特定のＰＡＭ配列に対する親和性またはそれを利用する能力が増加しており、これにより、野生型ＣａｓＸヌクレアーゼと比較して編集され得る標的ＤＮＡの量が増加する。理論によって拘束されることを望まないが、これらのタンパク質バリアントは、ＤＮＡ全体とより強く相互作用することができ、野生型参照ＣａｓＸのものを超えた追加のＰＡＭ配列を利用する能力のために標的ＤＮＡ内の配列に接近し、編集する能力を増加させることができる可能性があり、これにより、標的配列に対するＣａｓＸタンパク質のより効率的な探索プロセスが可能になる。ＤＮＡに対するより高い全体的な親和性は、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質が結合および巻き戻しステップを効率的に開始および終了することができる頻度も増加させ、それにより、標的鎖の侵入およびＲループ形成を促進し、最終的には、標的核酸配列の切断を促進することができる。
理論に拘束されることを望むことなく、巻き戻された状態の非標的ＤＮＡ鎖の巻き戻しまたはその捕捉の効率を増加させるＮＴＳＢＤにおけるアミノ酸変化が、標的ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる可能性がある。あるいは、または加えて、巻き戻し中にＤＮＡを安定化させるＮＴＳＢＤの能力を増加させるＮＴＳＢＤにおけるアミノ酸変化は、標的ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。あるいは、または加えて、ＯＢＤにおけるアミノ酸変化は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に結合するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させ、それにより、標的核酸配列に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。あるいは、または加えて、標的核酸鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させるヘリカルＩおよび／またはＩＩ、ＲｕｖＣ、およびＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化は、標的核酸配列に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照タンパク質と比較して増加した標的核酸配列に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸分子に対する本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００倍増加する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、標的核酸の非標的鎖に対する改善された結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「非標的鎖」という用語は、ｇＮＡの標的化配列とワトソンおよびクリック塩基対を形成せず、標的ＤＮＡ鎖に相補的であるＤＮＡ標的核酸配列の鎖を指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照タンパク質と比較して、標的核酸の非標的鎖に対して約１．１～約１００倍増加した結合親和性を有する。
標的核酸分子に対するＣａｓＸタンパク質（参照またはバリアントなど）の親和性を測定する方法には、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、フィルター結合、等温熱量測定（ＩＴＣ）、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光偏光、ならびにバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）が含まれ得る。標的に対するＣａｓＸタンパク質の親和性を測定するさらなる方法には、ＤＮＡ切断事象を経時的に測定するインビトロ生化学的アッセイが含まれる。
ｏ．標的部位に対する改善された特異性
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、標的核酸配列に対する改善された特異性を有する。本明細書で使用される場合、互換的に「標的特異性」と称される「特異性」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムリボ核タンパク質複合体が、標的核酸配列と類似しているが、同一ではないオフターゲット配列を切断する程度を指し、例えば、より高度な特異性を有するＣａｓＸバリアントＲＮＰは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、配列のオフターゲット切断の低減を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質の特異性、および潜在的に有害なオフターゲット効果の低減は、哺乳動物対象における使用に許容される治療指数を達成するために極めて重要であり得る。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、標的核酸配列に対する改善された特異性を有する。本明細書で使用される場合、互換的に「標的特異性」と称される「特異性」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムリボ核タンパク質複合体が、標的核酸配列と類似しているが、同一ではないオフターゲット配列を切断する程度を指し、例えば、より高度な特異性を有するＣａｓＸバリアントＲＮＰは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、配列のオフターゲット切断の低減を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質の特異性、および潜在的に有害なオフターゲット効果の低減は、哺乳動物対象における使用に許容される治療指数を達成するために極めて重要であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、配列番号１～３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ｇＮＡの標的化配列に相補的な標的配列内の標的部位に対する改善された特異性を有する。理論によって拘束されることを望まないが、標的核酸鎖に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるヘリカルＩおよびＩＩドメインにおけるアミノ酸変化は、標的核酸全体に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させることができる可能性がある。いくつかの実施形態では、標的核酸に対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させるアミノ酸変化はまた、ＤＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の親和性の減少をもたらし得る。
ＣａｓＸタンパク質（バリアントまたは参照など）の標的特異性を試験する方法には、シークエンシングによる切断効果のインビトロ報告のためのガイドおよび環状化（ｇｕｉｄｅ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ）、または同様の方法が含まれ得る。手短には、ＣＩＲＣＬＥ－ｓｅｑ技法では、ゲノムＤＮＡがステムループアダプターのライゲーションによって剪断および環状化され、このステムループアダプターがステムループ領域でニッキングされて、４ヌクレオチドパリンドロームオーバーハングを露出させる。続いて、分子内ライゲーションおよび残りの直鎖状ＤＮＡの分解が行われる。その後、ＣａｓＸ切断部位を含む環状ＤＮＡ分子がＣａｓＸで線形化され、アダプターアダプターが露出した末端にライゲーションされ、続いて、ハイスループットシークエンシングが行われて、オフターゲット部位に関する情報を含むペアエンド読み取りが生成される。オフターゲット事象、ひいてはＣａｓＸタンパク質特異性を検出するために使用することができる追加のアッセイには、ミスマッチ検出ヌクレアーゼアッセイおよび次世代シークエンシング（ＮＧＳ）などの、選択されたオフターゲット部位で形成されるインデル（挿入および欠失）を検出および定量するために使用されるアッセイが含まれる。例示的なミスマッチ検出アッセイには、ＣａｓＸおよびｓｇＮＡで処理された細胞由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅し、変性させ、再ハイブリダイズして、１つの野生型鎖およびインデルを有する１つの鎖を含むヘテロデュプレックスＤＮＡを形成するヌクレアーゼアッセイが含まれる。ミスマッチは、ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼまたはＴ７エンドヌクレアーゼＩなどのミスマッチ検出ヌクレアーゼによって認識されて切断される。
ｐ．プロトスペーサーおよびＰＡＭ配列
本明細書において、プロトスペーサーは、ガイドＲＮＡの標的化配列に相補的なＤＮＡ配列およびその配列に相補的なＤＮＡとして定義され、それぞれ、標的鎖および非標的鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、ＰＡＭは、プロトスペーサーに近接する５’に位置するヌクレオチド配列であり、ｇＮＡの標的化配列と併せて、プロトスペーサー鎖の潜在的な切断のためのＣａｓＸの配向および配置に役立つ。
本明細書において、プロトスペーサーは、ガイドＲＮＡの標的化配列に相補的なＤＮＡ配列およびその配列に相補的なＤＮＡとして定義され、それぞれ、標的鎖および非標的鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、ＰＡＭは、プロトスペーサーに近接する５’に位置するヌクレオチド配列であり、ｇＮＡの標的化配列と併せて、プロトスペーサー鎖の潜在的な切断のためのＣａｓＸの配向および配置に役立つ。
ＰＡＭ配列は縮重している場合があり、特定のＲＮＰ構築物は、切断の異なる効率を支持する異なる優先的な許容されるＰＡＭ配列を有し得る。別途指示されない限り、慣例に従って、本開示は、ＰＡＭおよびプロトスペーサー配列の両方、ならびに非標的鎖の配向に応じたそれらの方向性に言及している。これは、標的鎖ではなく、非標的鎖のＰＡＭ配列が切断を決定するか、または標的認識に機械的に関与していることを意味するものではない。例えば、ＴＴＣ ＰＡＭを参照する場合、実際には、標的切断に必要な相補的なＧＡＡ配列である場合もあれば、両方の鎖からのヌクレオチドのいくつかの組み合わせである場合もある。本明細書に開示されるＣａｓＸタンパク質の場合、ＰＡＭはプロトスペーサーの５’に位置し、単一のヌクレオチドがＰＡＭをプロトスペーサーの最初のヌクレオチドから分離している。したがって、参照ＣａｓＸの場合、ＴＴＣ ＰＡＭは、式５’－．．．ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ．．．３’（配列番号２１８）に従う配列を意味することが理解されるべきであり、「Ｎ」は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、「（プロトスペーサー）」は、ガイドＲＮＡの標的化配列と同一性を有するＤＮＡ配列である。拡張されたＰＡＭ認識を有するＣａｓＸバリアントの場合、ＴＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、またはＡＴＣ ＰＡＭは、式：
５’－…ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２１８）、
５’－…ＮＮＣＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２１９）、
５’－…ＮＮＧＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２２０）、または
５’－…ＮＮＡＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２２１）に従う配列を意味することが理解されるべきである。代替的に、ＴＣ ＰＡＭは、式：
５’－…ＮＮＮＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２２２）に従う配列を意味することが理解されるべきである。
５’－…ＮＮＴＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２１８）、
５’－…ＮＮＣＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２１９）、
５’－…ＮＮＧＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２２０）、または
５’－…ＮＮＡＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２２１）に従う配列を意味することが理解されるべきである。代替的に、ＴＣ ＰＡＭは、式：
５’－…ＮＮＮＴＣＮ（プロトスペーサー）ＮＮＮＮＮＮ…３’（配列番号２２２）に従う配列を意味することが理解されるべきである。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ＰＡＭ配列の編集が改善されており、ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、またはＣＴＣのうちのいずれか１つが、同等のアッセイシステムにおける編集効率および／または参照ＣａｓＸタンパク質を含むＲＮＰの結合と比較して、細胞アッセイシステムにおけるｇＮＡの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して５’の１つのヌクレオチドに位置する場合、標的ＤＮＡにおいてより大きな編集効率および／または標的配列の結合を示す。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＴＴＣである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＡＴＣである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＣＴＣである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＧＴＣである。
ｑ．ＤＮＡの巻き戻し
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＤＮＡを巻き戻す能力を有する。不十分なｄｓＤＮＡ巻き戻しは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質ＡｎａＣａｓ９またはＣａｓ１４ｓがＤＮＡを切断する能力を損なうかまたは妨げることが以前に示されている。したがって、いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本開示のいくつかのＣａｓＸバリアントタンパク質によるＤＮＡ切断活性の増加は、少なくとも部分的に、標的部位においてｄｓＤＮＡを見つけて巻き戻す能力の増加に起因する可能性が高い。ＤＮＡを巻き戻すＣａｓＸタンパク質（バリアントまたは参照など）の能力を測定する方法には、蛍光偏光またはバイオレイヤー干渉法においてｄｓＤＮＡ標的の速度の増加を観測するインビトロアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＤＮＡを巻き戻す能力を有する。不十分なｄｓＤＮＡ巻き戻しは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムタンパク質ＡｎａＣａｓ９またはＣａｓ１４ｓがＤＮＡを切断する能力を損なうかまたは妨げることが以前に示されている。したがって、いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本開示のいくつかのＣａｓＸバリアントタンパク質によるＤＮＡ切断活性の増加は、少なくとも部分的に、標的部位においてｄｓＤＮＡを見つけて巻き戻す能力の増加に起因する可能性が高い。ＤＮＡを巻き戻すＣａｓＸタンパク質（バリアントまたは参照など）の能力を測定する方法には、蛍光偏光またはバイオレイヤー干渉法においてｄｓＤＮＡ標的の速度の増加を観測するインビトロアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
理論に拘束されることを望むことなく、ＮＴＳＢドメインにおけるアミノ酸変化が、増加したＤＮＡ巻き戻し特性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を産生することができると考えられている。あるいは、または加えて、ＰＡＭと相互作用するＯＢＤまたはヘリカルドメイン領域におけるアミノ酸変化も、増加したＤＮＡ巻き戻し特性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を産生することができる。
ｒ．触媒活性
本明細書に開示されるＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのリボ核タンパク質複合体は、標的核酸配列に結合し、かつ標的核酸配列を切断するＣａｓＸバリアントタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された触媒活性を有する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、標的鎖の切断が、ｄｓＤＮＡ切断を引き起こす際にＣａｓ１２様分子の制限因子になり得ると考えられている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＤＮＡの標的鎖の屈曲およびこの鎖の切断を改善し、その結果、ＣａｓＸリボ核タンパク質複合体によるｄｓＤＮＡ切断の全体的な効率が改善される。
本明細書に開示されるＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのリボ核タンパク質複合体は、標的核酸配列に結合し、かつ標的核酸配列を切断するＣａｓＸバリアントタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善された触媒活性を有する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、標的鎖の切断が、ｄｓＤＮＡ切断を引き起こす際にＣａｓ１２様分子の制限因子になり得ると考えられている。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ＤＮＡの標的鎖の屈曲およびこの鎖の切断を改善し、その結果、ＣａｓＸリボ核タンパク質複合体によるｄｓＤＮＡ切断の全体的な効率が改善される。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して増加したヌクレアーゼ活性を有する。増加したヌクレアーゼ活性を有するバリアントは、例えば、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸変化によって生成することができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼドメインを含む。前述において、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのＣａｓＸニッカーゼは、非標的鎖のＰＡＭ部位の３’の１０～１８個のヌクレオチド内に一本鎖切断を生じる。他の実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼドメインを含む。前述において、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのＣａｓＸは、標的鎖上のＰＡＭ部位の５’の１８～２６個のヌクレオチドおよび非標的鎖上の３’の１０～１８個のヌクレオチド内に二本鎖切断を生じる。ヌクレアーゼ活性は、実施例の方法を含む様々な方法によってアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、参照ＣａｓＸと比較して、少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なくとも７倍、または少なくとも８倍、または少なくとも９倍、または少なくとも１０倍大きいＫ切断定数を有する。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、ｇＮＡとともにＲＮＰを形成する改善された特性を有し、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質とｇＮＡとのＲＮＰと比較して、切断能力のあるＲＮＰの高い割合をもたらす。切断能力があることによって、形成されるＲＮＰは、標的核酸を切断する能力を有することが意味される。いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡとのＲＮＰは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質とｇＮＡとのＲＮＰと比較して、少なくとも２倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも１０倍の切断速度を示す。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸと比較して、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷を有する。増加した標的鎖負荷活性を有するバリアントは、例えば、ＴＬＳドメインにおけるアミノ酸変化によって生成することができる。
理論に拘束されることを望むことなく、ＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化は、改善された触媒活性を有するＣａｓＸバリアントタンパク質をもたらし得る。あるいは、または加えて、ＲＮＡ：ＤＮＡデュプレックスの結合チャネル周辺のアミノ酸変化も、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を改善することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して増加した付随的切断活性を有する。本明細書で使用される場合、「付随的切断活性」とは、標的核酸配列の認識および切断後の核酸の追加の非標的化切断を指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して減少した付随的切断活性を有する。
いくつかの実施形態では、例えば、標的核酸配列の切断が望ましい結果ではない用途を包含するそれらの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を改善することは、ＣａｓＸバリアントタンパク質の触媒活性を変更、低減、または無効にすることを含む。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓＸバリアントタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体は、標的核酸配列に結合し、標的核酸を切断しない。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質を含むＣａｓＸリボ核タンパク質複合体は、標的ＤＮＡに結合するが、標的ＤＮＡに一本鎖ニックを生成する。いくつかの実施形態では、特にＣａｓＸタンパク質がニッカーゼである実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷を有する。減少した標的鎖負荷を有するバリアントは、例えば、ＴＳＬドメインにおけるアミノ酸変化によって生成され得る。
ＣａｓＸタンパク質の触媒活性を特徴付けるための例示的な方法には、以下の実施例の方法を含む、インビトロ切断アッセイが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アガロースゲル上でのＤＮＡ産物の電気泳動は、鎖切断の動態を調べることができる。
ｓ．ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡに対する親和性
いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質またはそのバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＰＣＳＫ９ ＤＮＡに結合し、標的核酸を切断する。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、標的ＰＣＳＫ９ ＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させ、標的ＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の活性を増加させる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して増加した標的ＲＮＡに対する結合親和性または増加した標的ＲＮＡの切断を呈し得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＲＮＡに結合し、および／または標的ＲＮＡを切断する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照タンパク質と比較して、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡに対して少なくとも約２倍～約１０倍増加した結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質またはそのバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＰＣＳＫ９ ＤＮＡに結合し、標的核酸を切断する。いくつかの実施形態では、参照ＣａｓＸタンパク質のバリアントは、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、標的ＰＣＳＫ９ ＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の特異性を増加させ、標的ＲＮＡに対するＣａｓＸバリアントタンパク質の活性を増加させる。例えば、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して増加した標的ＲＮＡに対する結合親和性または増加した標的ＲＮＡの切断を呈し得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体は、標的ＲＮＡに結合し、および／または標的ＲＮＡを切断する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照タンパク質と比較して、ＰＣＳＫ９標的ＲＮＡに対して少なくとも約２倍～約１０倍増加した結合親和性を有する。
ｔ．変異の組み合わせ
本開示は、別個のＣａｓＸバリアントタンパク質由来の変異の組み合わせであるＣａｓＸバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメインに対するいずれのバリアントも、本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメイン内のいずれのバリアントも、同じドメイン内の本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。異なるアミノ酸変化の組み合わせにより、いくつかの実施形態では、機能がアミノ酸変化の組み合わせによってさらに改善される新たな最適化されたバリアントが産生され得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は線形である。本明細書で使用される場合、線形である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計に等しい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は相乗的である。本明細書で使用される場合、相乗的である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計よりも大きい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化を組み合わせることにより、ＣａｓＸタンパク質の２つ以上の機能が参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質が産生される。
本開示は、別個のＣａｓＸバリアントタンパク質由来の変異の組み合わせであるＣａｓＸバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメインに対するいずれのバリアントも、本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメイン内のいずれのバリアントも、同じドメイン内の本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。異なるアミノ酸変化の組み合わせにより、いくつかの実施形態では、機能がアミノ酸変化の組み合わせによってさらに改善される新たな最適化されたバリアントが産生され得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は線形である。本明細書で使用される場合、線形である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計に等しい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は相乗的である。本明細書で使用される場合、相乗的である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計よりも大きい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化を組み合わせることにより、ＣａｓＸタンパク質の２つ以上の機能が参照ＣａｓＸタンパク質と比較して改善されたＣａｓＸバリアントタンパク質が産生される。
ｕ．ＣａｓＸ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸに融合された異種タンパク質を含むＣａｓＸタンパク質を提供する。他の事例では、ＣａｓＸは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸバリアントである。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣａｓＸに融合された異種タンパク質を含むＣａｓＸタンパク質を提供する。他の事例では、ＣａｓＸは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸバリアントである。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、関心対象の異なる活性を有する１つ以上のタンパク質またはそのドメインに融合された配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、または４９０を含み、融合タンパク質をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を阻害する、標的核酸配列を修飾する、または核酸と会合したポリペプチドを改変する（例えば、ヒストン改変）タンパク質（またはそのドメイン）に融合される。
いくつかの実施形態では、異種ポリペプチド（またはシステイン残基または非天然アミノ酸などの異種アミノ酸）がＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入されて、ＣａｓＸ融合タンパク質を生成することができる。他の実施形態では、システイン残基は、ＣａｓＸタンパク質内の１つ以上の位置に挿入され、続いて、以下に記載の異種ポリペプチドのコンジュゲーションが行われ得る。いくつかの代替の実施形態において、異種ポリペプチドまたは異種アミノ酸は、ＣａｓＸバリアントタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加することができる。他の実施形態では、異種ポリペプチドまたは異種アミノ酸は、ＣａｓＸタンパク質の配列の内部に挿入することができる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、ＲＮＡガイド配列特異的標的核酸結合および切断活性を保持する。いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有さない対応するＣａｓＸバリアントタンパク質の５０％以上の活性（例えば、切断および／または結合活性）を有する（保持する）。いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有さない対応するＣａｓＸタンパク質の活性（例えば、切断および／または結合活性）の少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約１００％を保持する。
いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアント融合ポリペプチドは、異種アミノ酸または異種ポリペプチドが挿入されていないＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸結合活性を保持する（有する）。いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するＣａｓＸタンパク質の結合活性の少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約１００％を保持する。
いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアント融合ポリペプチドは、異種アミノ酸または異種ポリペプチドが挿入されていない親ＣａｓＸタンパク質の活性と比較して、標的核酸結合および／または切断活性を保持する（有する）。例えば、いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、対応する親ＣａｓＸタンパク質（挿入を有しないＣａｓＸタンパク質）の結合および／または切断活性の５０％以上を有する（保持する）。例えば、いくつかの事例ではＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、対応するＣａｓＸ親タンパク質（挿入されていないＣａｓＸタンパク質）の結合および／または切断活性の６０％以上（７０％以上、８０％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または１００％）を有する（保持する）。ＣａｓＸタンパク質および／またはＣａｓＸ融合タンパク質の切断および／または結合活性を測定する方法は、当業者に知られており、任意の簡便な方法を使用することができる。
様々な異種ポリペプチドが、本開示の参照ＣａｓＸまたはＣａｓＸバリアント融合タンパク質への包含に好適である。いくつかの事例では、融合パートナーは、標的ＤＮＡの転写を調節する（例えば、転写を阻害する、転写を増加させる）ことができる。例えば、いくつかの事例では、融合パートナーは、転写を阻害するタンパク質（またはタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写抑制因子、転写阻害タンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの改変、ＤＮＡ改変因子の動員、標的ＤＮＡと会合したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化および／またはメチル化を改変するものなどのヒストン改変因子の動員などにより機能するタンパク質）である。いくつかの事例では、融合パートナーは、転写を増加させるタンパク質（またはタンパク質由来のドメイン）（例えば、転写活性化因子、転写活性化タンパク質の動員、脱メチル化などの標的ＤＮＡの改変、ＤＮＡ改変因子の動員、標的ＤＮＡと会合したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化および／またはメチル化を改変するものなどのヒストン改変因子の動員などにより作用するタンパク質）である。
いくつかの事例では、融合パートナーは、標的核酸配列を改変する酵素活性、例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、またはグリコシラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアントは、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、または４９０のうちのいずれか１つと、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を有するポリペプチドと、を含む。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントは、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、または４９０のうちのいずれか１つと、標的核酸と会合するポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性）を有する融合パートナーと、を含む。
転写を増加させるために融合パートナーとして使用することができるタンパク質（またはその断片）の例には、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢから）、ならびにＥＤＬＬの活性化ドメインおよび／またはＴＡＬ活性化ドメイン（例えば、植物での活性のため）；ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３などのヒストンリジンデメチラーゼ；ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなどのヒストンアセチルトランスフェラーゼ；Ｔｅｎ－Ｅｌｅｖｅｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１などのＤＮＡデメチラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
転写を減少させるために融合パートナーとして使用することができるタンパク質（またはその断片）の例には、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）などの転写抑制因子；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦ抑制因子ドメイン（ＥＲＤ）、ＳＲＤＸ抑制ドメイン（例えば、植物における抑制のため）など；Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＲＩＺ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹなどのヒストンリジンデメチラーゼ；ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１などのヒストンリジンデアセチラーゼ；ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）などのＤＮＡメチラーゼ；およびラミンＡ、ラミンＢなどの末梢動員要素が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、または４９０のうちのいずれか１つを含むＣａｓＸバリアントとの融合パートナーは、標的核酸配列（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を改変する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例には、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるものなどのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｈｈａｌ ＤＮＡ ｍ５ｃ－メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．Ｈｈａｌ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）など）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性；デメチラーゼ（例えば、テン－イレブントランスロケーション（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ １ ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１など）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、デアミナーゼ（例えば、シトシンデアミナーゼ酵素、例えば、ラットＡＰＯＢＥＣｌなどのＡＰＯＢＥＣタンパク質）によって提供されるものなどの脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼおよび／またはレゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼの超活性変異、ＧｉｎＨ１０６ＹなどのＧｉｎインベルターゼ；ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）；Ｔｎ３レゾルバーゼなど）によって提供されるものなどのインテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎレコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるものなどのレコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、およびグリコシラーゼ活性）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、転写を増加させるためのドメイン（例えば、ＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４ドメイン）、転写を減少させるためのドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン、例えば、Ｋｏｘ１タンパク質由来のもの）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００）、検出可能なシグナルを提供するタンパク質／ドメイン（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質）、ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｆｏｋｌヌクレアーゼ）、または塩基エディター（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１などのシチジンデアミナーゼ）から選択されるポリペプチドに融合される。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントは、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、または４９０のうちのいずれか１つと、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）と会合するタンパク質（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質など）を改変する酵素活性を有する融合パートナーと、を含む。融合パートナーによって提供され得る酵素活性（標的核酸に関連するタンパク質を改変するもの）の例には、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）（例えば、斑入り３～９ホモログ１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１、別名、ＫＭＴ１Ａ）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、別名、ＫＭＴ１ＣおよびＥＨＭＴ２）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１など、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１～５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１Ｌ、Ｐｒ－ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４－２０Ｈ１、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、別名、ＬＳＤ１）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ－１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３など）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢ０１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなどの触媒コア／断片）によって提供されるものなどのアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１など）によって提供されるものなどのデアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣａｓＸバリアントにおける好適な融合パートナーの追加の例は、（ｉ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）不安定化ドメイン（例えば、化学的に制御可能な対象ＲＮＡガイドポリペプチドまたは条件付きで活性なＲＮＡガイドポリペプチドを生成する）、および（ｉｉ）葉緑体輸送ペプチドである。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸバリアントは、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、または４９０と、以下：ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＣＭＱＶＷＰＰＩＧＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＰＬＴＲＤＳＲＡ（配列番号３１）、ＭＡＳＭＩＳＳＳＡＶＴＴＶＳＲＡＳＲＧＱＳＡＡＭＡＰＦＧＧＬＫＳＭＴＧＦＰＶＲＫＶＮＴＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＫＳ（配列番号３０４）、ＭＡＳＳＭＬＳＳＡＴＭＶＡＳＰＡＱＡＴＭＶＡＰＦＮＧＬＫＳＳＡＡＦＰＡＴＲＫＡＮＮＤＩＴＳＩＴＳＮＧＧＲＶＮＣＭＱＶＷＰＰＩＥＫＫＫＦＥＴＬＳＹＬＰＤＬＴＤＳＧＧＲＶＮＣ（配列番号１３８６３）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＱＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号３０５）、ＭＡＱＶＳＲＩＣＮＧＶＷＮＰＳＬＩＳＮＬＳＫＳＳＱＲＫＳＰＬＳＶＳＬＫＴＱＱＨＰＲＡＹＰＩＳＳＳＷＧＬＫＫＳＧＭＴＬＩＧＳＥＬＲＰＬＫＶＭＳＳＶＳＴＡＣ（配列番号３０６）、ＭＡＱＩＮＮＭＡＱＧＩＱＴＬＮＰＮＳＮＦＨＫＰＱＶＰＫＳＳＳＦＬＶＦＧＳＫＫＬＫＮＳＡＮＳＭＬＶＬＫＫＤＳＩＦＭＱＬＦＣＳＦＲＩＳＡＳＶＡＴＡＣ（配列番号３０７）、ＭＡＡＬＶＴＳＱＬＡＴＳＧＴＶＬＳＶＴＤＲＦＲＲＰＧＦＱＧＬＲＰＲＮＰＡＤＡＡＬＧＭＲＴＶＧＡＳＡＡＰＫＱＳＲＫＰＨＲＦＤＲＲＣＬＳＭＶＶ（配列番号３０８）、ＭＡＡＬＴＴＳＱＬＡＴＳＡＴＧＦＧＩＡＤＲＳＡＰＳＳＬＬＲＨＧＦＱＧＬＫＰＲＳＰＡＧＧＤＡＴＳＬＳＶＴＴＳＡＲＡＴＰＫＱＱＲＳＶＱＲＧＳＲＲＦＰＳＶＶＶＣ（配列番号３０９）、ＭＡＳＳＶＬＳＳＡＡＶＡＴＲＳＮＶＡＱＡＮＭＶＡＰＦＴＧＬＫＳＡＡＳＦＰＶＳＲＫＱＮＬＤＩＴＳＩＡＳＮＧＧＲＶＱＣ（配列番号３１０）、ＭＥＳＬＡＡＴＳＶＦＡＰＳＲＶＡＶＰＡＡＲＡＬＶＲＡＧＴＶＶＰＴＲＲＴＳＳＴＳＧＴＳＧＶＫＣＳＡＡＶＴＰＱＡＳＰＶＩＳＲＳＡＡＡＡ（配列番号１３８６４）、およびＭＧＡＡＡＴＳＭＱＳＬＫＦＳＮＲＬＶＰＰＳＲＲＬＳＰＶＰＮＮＶＴＣＮＮＬＰＫＳＡＡＰＶＲＴＶＫＣＣＡＳＳＷＮＳＴＩＮＧＡＡＡＴＴＮＧＡＳＡＡＳＳ（配列番号３１１）を含むがこれらに限定されない葉緑体輸送ペプチドと、を含む。
いくつかの事例では、本開示のＣａｓＸバリアントタンパク質は、エンドソームエスケープペプチドを含むことができる。いくつかの事例では、エンドソームエスケープポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＸＡＬＬＸＬＬＸＳＬＷＸＬＬＬＸＡ（配列番号３１２）を含み、ここで、各Ｘは独立して、リジン、ヒスチジン、およびアルギニンから選択される。いくつかの事例では、エンドソームエスケープポリペプチドは、アミノ酸配列ＧＬＦＨＡＬＬＨＬＬＨＳＬＷＨＬＬＬＨＡ（配列番号３１３）またはＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号３１４）を含む。
ｓｓＲＮＡ標的核酸配列を標的とする場合にＣａｓＸバリアントタンパク質とともに使用するための融合パートナーの非限定的な例には（限定されないが）、スプライシング因子（例えば、ＲＳドメイン）、タンパク質翻訳構成要素（例えば、翻訳開始、伸長、および／または放出因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）、ＲＮＡメチラーゼ、ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＲＮＡデアミナーゼ、例えば、ＡからＩ、および／またはＣからＵの編集酵素を含む、ＲＮＡ上で作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ））、ヘリカーゼ、ＲＮＡ結合タンパク質などが含まれる。異種ポリペプチドがタンパク質全体を含むことができるか、またはいくつかの事例では、タンパク質の断片（例えば、機能的ドメイン）を含むことができることが理解される。
いくつかの実施形態において、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、または４９０のうちのいずれか１つを含むＣａｓＸバリアントは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＭＧ５およびＳＭＧ６などのタンパク質由来のＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ＣＲＲ２２ ＤＹＷドメイン、Ｄｉｃｅｒ、およびＰＩＮ（ＰｉｌＴ Ｎ末端）ドメイン；ＲＮＡ切断の刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＣＰＳＦ、ＣｓｔＦ、ＣＦＩｍ、およびＣＦＩＩｍ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、ＸＲＮ－１またはエキソヌクレアーゼＴ）；デアデニラーゼ（例えば、ＨＮＴ３）；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３、ＵＰＦ３ｂ、ＲＮＰ ＳＩ、Ｙ１４、ＤＥＫ、ＲＥＦ２、およびＳＲｍ１６０）；ＲＮＡの安定化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＢＰ）；翻訳の抑制に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、Ａｇｏ２およびＡｇｏ４）；翻訳の刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ）；翻訳の調節に関与する（例えば、調節することができる）タンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、伸長因子、放出因子などの翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡのポリアデニル化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＰ１、ＧＬＤ－２、およびＳｔａｒ－ＰＡＰ）；ＲＮＡのポリウリジン化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＣＩ Ｄ１および末端ウリジレートトランスフェラーゼ）；ＲＮＡ局在に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＩＭＰ１、ＺＢＰ１、Ｓｈｅ２ｐ、Ｓｈｅ３ｐ、およびＢｉｃａｕｄａｌ－Ｄ由来）；ＲＮＡの核保持に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、Ｒｒｐ６）；ＲＮＡの核外搬出に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＴＡＰ、ＮＸＦ１、ＴＨＯ、ＴＲＥＸ、ＲＥＦ、およびＡｌｙ）；ＲＮＡスプライシングの抑制に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＰＴＢ、Ｓａｍ６８、およびｈｎＲＮＰ Ａ１）；ＲＮＡスプライシングの刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）ドメイン）；転写効率の低減に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＦＵＳ（ＴＬＳ））；ならびに転写の刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、ＣＤＫ７およびＨＩＶ Ｔａｔ）を含む群から選択されるエフェクタードメインを含むが、これらに限定されない、過渡的であるか不可逆的であるか、直接であるか間接的であるかにかかわらず、ｓｓＲＮＡと相互作用することができる任意のドメイン（本開示の目的のために、分子内および／または分子間二次構造、例えば、ヘアピン、ステムループなどの二本鎖ＲＮＡデュプレックスを含む）の融合パートナーを含む。代替的に、エフェクタードメインは、エンドヌクレアーゼ；ＲＮＡ切断を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；エキソヌクレアーゼ；デアデニラーゼ；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡを安定化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；翻訳を抑制することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；翻訳を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；翻訳を調節することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、伸長因子、放出因子などの翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡをポリアデニル化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡをポリウリジン化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡ局在活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡの核保持が可能なタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡ核外搬出活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを抑制することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；転写効率を低減することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン；ならびに転写を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメインを含む群から選択され得る。別の好適な異種ポリペプチドは、ＷＯ２０１２／０６８６２７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されるＰＵＦ ＲＮＡ結合ドメインである。
ＣａｓＸバリアントとの融合パートナーとして（全体またはその断片として）使用され得るいくつかのＲＮＡスプライシング因子は、別個の配列特異的ＲＮＡ結合モジュールおよびスプライシングエフェクタードメインを有する、モジュール機構を有する。例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーは、エクソン封入を促進するｐｒｅ－ｍＲＮＡおよびＣ末端ＲＳドメインにおいてエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に結合するＮ末端ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を含有する。別の例として、ｈｎＲＮＰタンパク質ｈｎＲＮＰ Ａ１は、そのＲＲＭドメインを介してエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）に結合し、Ｃ末端グリシンリッチドメインを介してエクソン封入を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、２つの代替部位の間の調節配列に結合することによって、スプライス部位（ｓｓ）の代替使用を調節することができる。例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２が、ＥＳＥを認識してイントロン近位部位の使用を促進することができる一方で、ｈｎＲＮＰ Ａ１は、ＥＳＳに結合してスプライシングをイントロン遠隔部位の使用にシフトすることができる。かかる因子の１つの用途は、内因性遺伝子、特に疾患関連遺伝子の選択的スプライシングを調節するＥＳＦを生成することである。例えば、Ｂｃｌ－ｘ ｐｒｅ－ｍＲＮＡは、２つの選択的５’スプライス部位を有する２つのスプライシングアイソフォームを産生して、反対の機能を有するタンパク質をコードする。長いスプライシングアイソフォームＢｃｌ－ｘＬは、長命の分裂終了細胞内で発現される強力なアポトーシス阻害因子であり、多くのがん細胞内で上方調節され、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。短いアイソフォームＢｃｌ－ｘＳは、アポトーシス促進アイソフォームであり、高いターンオーバー率で、細胞内で高レベルで発現される（例えば、リンパ球を分化する）。２つのＢｃｌ－ｘスプライシングアイソフォームの比率は、コアエクソン領域またはエクソン伸長領域のいずれか（すなわち、２つの選択的５’スプライス部位間）に位置する複数のｃｃ要素によって調節される。さらなる例については、ＷＯ２０１０／０７５３０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ＣａｓＸバリアントとの使用のためのさらに好適な融合パートナーには、境界要素（例えば、ＣＴＣＦ）であるタンパク質（またはその断片）、末梢動員を提供するタンパク質およびその断片（例えば、Ｌａｍｉｎ Ａ、Ｌａｍｉｎ Ｂなど）、およびタンパク質ドッキング要素（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌｌ／Ａｂｙｌなど）が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアントで使用するための異種ポリペプチド（融合パートナー）は、細胞内局在化を提供し、すなわち、異種ポリペプチドは、細胞内局在化配列（例えば、核を標的とするための核局在シグナル（ＮＬＳ）、融合タンパク質を核外に維持するための配列、例えば、核外輸送配列（ＮＥＳ）、融合タンパク質を細胞質に保持するための配列、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体を標的とするための葉緑体局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなど）を含む。いくつかの実施形態では、対象ＲＮＡガイドポリペプチドもしくは条件付きで活性なＲＮＡガイドポリペプチドおよび／または対象ＣａｓＸ融合タンパク質がＮＬＳを含まないため、そのタンパク質は核を標的としない（これは、例えば、標的核酸配列が細胞質ゾルに存在するＲＮＡである場合、有利であり得る）。いくつかの実施形態では、融合パートナーは、追跡および／または精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）を提供することができる（すなわち、異種ポリペプチドは、検出可能な標識である）。
いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む（それに融合される）。いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアントタンパク質は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上のＮＬＳに融合される。いくつかの事例では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端および／もしくはＣ末端に、またはその近く（例えば、その５０アミノ酸以内）に配置される。いくつかの事例では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、ＣａｓＸバリアントのＮ末端に、またはその近く（例えば、５０個のアミノ酸以内）に配置される。いくつかの事例では、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、ＣａｓＸバリアントのＣ末端に、またはその近く（例えば、その５０アミノ酸以内）に配置される。いくつかの事例では、１つ以上のＮＬＳ（３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端およびＣ末端の両方に、またはそれらの近く（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に配置される。いくつかの事例では、ＮＬＳはＮ末端に配置され、ＮＬＳはＣ末端に配置される。いくつかの事例では、参照またはＣａｓＸバリアントタンパク質は、１～１０個のＮＬＳ（例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、または２～５個のＮＬＳ）を含む（またはそれらに融合される）。いくつかの事例では、参照またはＣａｓＸバリアントタンパク質は、２～５個のＮＬＳ（例えば、２～４、または２～３個のＮＬＳ）を含む（またはそれらに融合される）。
ＮＬＳの非限定的な例には、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１７）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２２３）を有するヌクレオプラスミン二分ＮＬＳ、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２２４）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１６１）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１６２）を有するｈＲＮＰＡｌ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１６３）、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１６４）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６５）、ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１６７）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号１６８）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１６９）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１７０）、マウスＭｘｌタンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１７１）、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１７２）、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７３）、ボルナ病ウイルスＰタンパク質（ＢＤＶ－Ｐ１）の配列ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１７４）、Ｃ型肝炎ウイルス非構造タンパク質（ＨＣＶ－ＮＳ５Ａ）の配列ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１７５）、ＬＥＦ１の配列ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１７６）、ＯＲＦ５７ ｓｉｍｉｒａｅの配列ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１７７）、ＥＢＶ ＬＡＮＡの配列ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１７８）、Ａ型インフルエンザタンパク質の配列ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１７９）、ヒトＲＮＡヘリカーゼＡ（ＲＨＡ）の配列ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１８０）、核小体ＲＮＡヘリカーゼＩＩの配列ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１８１）、ＴＵＳ－タンパク質の配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１８２）、インポーチン－アルファに関連する配列ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）、ＨＴＬＶ－１のＲｅｘタンパク質由来の配列ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８４）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのＥＧＬ－１３タンパク質由来の配列ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１８５）、ならびに配列ＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８６）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１８７）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１８８）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１８９）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９０）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号１９１）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１９２）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号１９３）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）、およびＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９４）に由来する配列が挙げられる。一般に、ＮＬＳ（または複数のＮＬＳ）は、真核生物細胞の核内での参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有する。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技法によって行われ得る。例えば、検出可能なマーカーは、参照またはＣａｓＸバリアント融合タンパク質に融合されてもよく、これにより、細胞内の位置が可視化されるようになり得る。細胞核が細胞から単離される場合もあり、その後、その内容物が、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイによって分析され得る。核内での蓄積が間接的に決定される場合もある。
いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（別名、ＣＰＰ（細胞透過性ペプチド））を含み、これは、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指す。小さい極性分子から大きい巨大分子に及び得る別の分子および／またはナノ粒子に結合したＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、または細胞質ゾルから細胞小器官内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質のアミノ末端に共有結合している。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質のカルボキシル末端に共有結合している。いくつかの事例では、ＰＴＤは、好適な挿入部位でＣａｓＸバリアント融合タンパク質の配列の内部に挿入される。いくつかの事例では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤ）を含む（それにコンジュゲートされる、それに融合される）。いくつかの事例では、ＰＴＤは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ＰＴＤの例には、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１９５）、ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１９６）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１９７）、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１９８）、およびＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１９９）を含むＨＩＶ ＴＡＴのペプチド形質導入ドメイン；細胞内への直接侵入に十分ないくつかのアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０～５０個のアルギニン（配列番号２００））を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９－９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；切断型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号２０１）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号２０２）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号２０３）；およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２０４）が含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含み、これは正味電荷をほぼ０に低減し、それによって細胞への付着および取り込みを阻害する。リンカーの切断時、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニンおよびその本来の接着性を局所的にアンマスクし、それ故にＡＣＰＰを「活性化」して、膜を横断する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して内部に挿入された異種アミノ酸または異種ポリペプチド（異種アミノ酸配列）に連結されたＣａｓＸタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸバリアント融合タンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介してＣ末端および／またはＮ末端で異種ポリペプチド（融合パートナー）に連結され得る。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。タンパク質は、概ね可動性のスペーサーペプチドによって結合され得るが、他の化学結合は除外されない。好適なリンカーには、４アミノ酸～４０アミノ酸長、または４アミノ酸～２５アミノ酸長のポリペプチドが含まれる。これらのリンカーは、一般に、リンカーをコードする合成オリゴヌクレオチドを使用してタンパク質と共役させることによって生成される。ある程度の可動性を有するペプチドリンカーを使用することができる。好ましいリンカーが概ね可動性のペプチドをもたらす配列を有することを踏まえて、連結ペプチドは、実質的にいずれのアミノ酸配列も有し得る。グリシンおよびアラニンなどの小さいアミノ酸の使用は、可動性ペプチドの作製に有用である。かかる配列の作製は、当業者にとって慣例である。様々な異なるリンカーが市販されており、使用に好適であるとみなされている。リンカーポリペプチドの例には、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号２０５）、ＧＧＳＧＧＳｎ（配列番号２０６）、およびＧＧＧＳｎ（配列番号２０７）を含み、ここで、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、グリシン－プロリンポリマー、プロリンポリマー、およびプロリン－アラニンポリマーが挙げられる。リンカーの例は、ＧＧＳＧ（配列番号２０８）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２０９）、ＧＳＧＳＧ（配列番号２１０）、ＧＳＧＧＧ（配列番号２１１）、ＧＧＧＳＧ（配列番号２１２）、ＧＳＳＳＧ（配列番号２１３）、ＧＰＧＰ（配列番号２１４）、ＧＧＰ、ＰＰＰ、ＰＰＡＰＰＡ（配列番号２１５）、ＰＰＰＧＰＰＰ（配列番号２１６）などを含むが、これらに限定されないアミノ酸配列を含むことができる。当業者であれば、上記のいずれかの要素にコンジュゲートされたペプチドの設計がすべてまたは部分的に可動性のリンカーを含むことができ、これにより、リンカーが、可動性リンカーのみならず、可動性の低い構造を与える１つ以上の部分も含むことができるようになることを認識するであろう。
Ｖ．ＰＣＳＫ９遺伝子の改変のためのシステムおよび方法
本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲタンパク質、ガイド核酸、およびそれらのバリアントは、治療、診断、および研究を含む様々な用途に有用である。いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子を編集するための方法を達成するために、プログラム可能なＣａｓＸ：ｇＮＡシステムが本明細書に提供される。本明細書に提供されるＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのプログラム可能な性質は、ＰＣＳＫ９遺伝子の標的核酸配列内の所定の目的とする１つ以上の領域で所望の効果（ニッキング、切断、修復など）を達成するための正確な標的を可能にする。いくつかの実施形態において、変異、例えば、高コレステロール血症または常染色体優性高コレステロール血症をもたらす優性突然変異を含む対象におけるＰＣＳＫ９タンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトすることが望ましくあり得る。「ノックアウト」という用語は、遺伝子の除去または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトされる可能性がある。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係または異種の配列で置き換えることによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子またはその遺伝子産物の発現の低下を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が減弱され得るか、タンパク質レベルが低下するかまたは排除され得る。かかる実施形態において、ＰＣＳＫ９タンパク質またはＰＣＳＫ９調節領域をコードする遺伝子の一部に対して特異的な標的化配列を有するｇＮＡが使用され得る。使用されるＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡに応じて、その事象が切断事象である場合があり、発現のノックダウン／ノックアウトを可能にし得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子発現は、ランダム挿入または欠失（インデル）を導入することによって、例えば、不正確な非相同ＤＮＡ末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を利用することによって破壊または排除され得る。かかる実施形態では、ＰＣＳＫ９の標的化領域は、ＰＣＳＫ９遺伝子のコード配列（エクソン）を含み、そのためコード配列内でヌクレオチドを挿入または削除することがフレームシフト変異を生成し得る。このアプローチはまた、イントロンなどの非コード領域または調節領域に使用して、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を妨害することができる。他の実施形態において、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子における変異を修正するためのシステムおよび方法を提供し、修正配列は、ｇＮＡの標的化配列の設計で、またはドナー鋳型の導入で、選択された位置に挿入または欠失を導入することによってノックインされ、以下でより完全に記載される。
本明細書に提供されるＣＲＩＳＰＲタンパク質、ガイド核酸、およびそれらのバリアントは、治療、診断、および研究を含む様々な用途に有用である。いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子を編集するための方法を達成するために、プログラム可能なＣａｓＸ：ｇＮＡシステムが本明細書に提供される。本明細書に提供されるＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのプログラム可能な性質は、ＰＣＳＫ９遺伝子の標的核酸配列内の所定の目的とする１つ以上の領域で所望の効果（ニッキング、切断、修復など）を達成するための正確な標的を可能にする。いくつかの実施形態において、変異、例えば、高コレステロール血症または常染色体優性高コレステロール血症をもたらす優性突然変異を含む対象におけるＰＣＳＫ９タンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトすることが望ましくあり得る。「ノックアウト」という用語は、遺伝子の除去または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトされる可能性がある。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係または異種の配列で置き換えることによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子またはその遺伝子産物の発現の低下を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が減弱され得るか、タンパク質レベルが低下するかまたは排除され得る。かかる実施形態において、ＰＣＳＫ９タンパク質またはＰＣＳＫ９調節領域をコードする遺伝子の一部に対して特異的な標的化配列を有するｇＮＡが使用され得る。使用されるＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡに応じて、その事象が切断事象である場合があり、発現のノックダウン／ノックアウトを可能にし得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＫ９遺伝子発現は、ランダム挿入または欠失（インデル）を導入することによって、例えば、不正確な非相同ＤＮＡ末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を利用することによって破壊または排除され得る。かかる実施形態では、ＰＣＳＫ９の標的化領域は、ＰＣＳＫ９遺伝子のコード配列（エクソン）を含み、そのためコード配列内でヌクレオチドを挿入または削除することがフレームシフト変異を生成し得る。このアプローチはまた、イントロンなどの非コード領域または調節領域に使用して、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を妨害することができる。他の実施形態において、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子における変異を修正するためのシステムおよび方法を提供し、修正配列は、ｇＮＡの標的化配列の設計で、またはドナー鋳型の導入で、選択された位置に挿入または欠失を導入することによってノックインされ、以下でより完全に記載される。
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９標的核酸の改変のために本明細書に提供されるＣａｓＸ：ｇＮＡシステムは、表３、５、６、７、もしくは９に示される配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、もしくは４９０、またはそれに対して少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、もしくは少なくとも９９．５％同一のバリアント配列を含み、ｇＮＡ足場は、表２の配列またはそれに対して少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８１％同一、少なくとも８２％同一、少なくとも８３％同一、少なくとも８４％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８６％同一、少なくとも８７％同一、少なくとも８８％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも８９％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一の配列を含み、ｇＮＡは、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、もしくは２２８６～１３８６１の標的化配列、またはそれと少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、もしくは少なくとも９５％同一であり、１５～３０個のアミノ酸を有する配列を含む。
他の実施形態において、本開示は、前述のＣａｓＸバリアントタンパク質およびｇＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの事例では、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムは、ドナー鋳型核酸をさらに含み、ドナー鋳型は、宿主細胞のＨＤＲまたはＨＩＴＩ修復機構によって挿入することができる。実施形態において、ドナー鋳型は、ＰＣＳＫ９エクソン、ＰＣＳＫ９イントロン、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部、およびＰＣＳＫ９調節要素、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるＰＣＳＫ９遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含むことができる。実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号３３の全部または一部をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、例えば、ノックダウン／ノックアウト改変では、ドナー鋳型配列は、組換えが所望されるＰＣＳＫ９ゲノム配列に対して少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性を有し、それによって挿入で、非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が、ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少するように、ＰＣＳＫ９遺伝子産物の発現が減少または排除される。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、ＰＣＳＫ９遺伝子の変異を修正する配列を含み、挿入で、細胞集団による機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現は、ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％増加される。他の実施形態において、修正ドナー鋳型の挿入は、細胞のＰＣＳＫ９遺伝子を改変し、それによって、改変された細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、検出可能なレベルの機能的ＰＣＳＫ９を発現する。いくつかの実施形態において、修正ドナー鋳型の挿入は、細胞のＰＣＳＫ９遺伝子を改変し、それによって、改変された細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が、検出可能なレベルの非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質を発現しない。
他の実施形態において、ドナー鋳型は、ＰＣＳＫ９遺伝子から切除される変異エクソン、例えば、２つ以上の連続するエクソンを短縮する配列を含み、２つ以上の連続するエクソンの間に介在するイントロン、またはエクソンと短縮された合成イントロンとを含むｃＤＮＡをさらに含むことができる。ドナー鋳型は、短い一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、あるいは長い一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであることができる。ドナー鋳型配列は、切断部位の５’および３’側に２つの相同領域（「相同アーム」）によって隣接する配列を含み、これによって、標的ＤＮＡ領域と２つの隣接配列との間の相同性指向修復が、標的領域にドナー鋳型の挿入をもたらす。ＰＣＳＫ９変異が複数のエクソンにまたがるこれらの場合、本開示の方法は、ドナー鋳型におけるエクソン間に短縮された長さの合成イントロン配列を含むようにも最適化し得る十分な長さのドナー鋳型を使用して、ＰＣＳＫ９遺伝子座の適切な発現およびプロセシングを確実にすることを企図する。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約１０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、または少なくとも約２００個、または少なくとも約３００個、または少なくとも約４００個、または少なくとも約５００個、または少なくとも約６００個、または少なくとも約７００個、または少なくとも約８００個、または少なくとも約９００個、または少なくとも約１０００個、または少なくとも約１０，０００個、または少なくとも約１５，０００個のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約１０～約１５，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約１００～約１０，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約４００～約８，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約６００～約５０００個のヌクレオチド、または少なくとも約１０００～約２０００個のヌクレオチドを含む。ドナー鋳型配列は、ゲノム配列と比較してある特定の配列相違、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み得、これらは、切断部位でのドナー核酸の挿入の成功を評価するために使用され得るか、またはいくつかの事例では、他の目的のために（例えば、標的とされたゲノム遺伝子座での発現を示すために）使用され得る。代替的に、これらの配列相違には、マーカー配列の除去のために後に活性化することができる、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などの隣接組換え配列が含まれ得る。
様々な戦略および方法を用いて、本明細書に提供されるＣａｓＸ：ｇＮＡシステムを使用して細胞における標的核酸配列を改変することができる。本明細書で使用される場合、「改変すること」には、切断、ニッキング、編集、削除、ノックイン、ノックアウト、修復／修正、エクソンスキッピングなどが含まれるが、これらに限定されない。利用されるＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡに応じて、編集事象は、切断事象とそれに続くランダムな挿入もしくは欠失（インデル）または他の変異（例えば、１つ以上のヌクレオチドの置換、重複、または逆位）の導入であり得、例えば、不正確な非相同ＤＮＡ末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路を利用することによって、例えば、フレームシフト変異を生じ得る。代替的に、編集事象は、切断事象とそれに続く相同性指向修復（ＨＤＲ）、相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、または塩基除去修復（ＢＥＲ）であり得、標的核酸配列の改変をもたらす。
一実施形態において、本開示は、細胞集団における１つ以上の変異を含むＰＣＳＫ９遺伝子の標的核酸配列を改変する方法を提供し、本方法は、集団の各細胞に、ｉ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つのＣａｓＸとｇＮＡとを含むＣａｓＸ：ｇＮＡシステム、ｉｉ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つのＣａｓＸと、ｇＮＡと、ドナー鋳型とを含むＣａｓＸ：ｇＮＡシステム、ｉｉｉ）ＣａｓＸとｇＮＡとをコードし、任意選択的にドナー鋳型を含む核酸、ｉｖ）レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターからなる群から選択され、上記（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステムを含むＶＬＰ、またはｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合わせを導入することを含み、ｇＮＡによって標的化される細胞の標的核酸配列は、ＣａｓＸタンパク質によって改変される。本方法のいくつかの実施形態において、細胞集団の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、または少なくとも１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、またはそれ以上のＰＣＳＫ９標的核酸が、改変される。本方法のいくつかの実施形態において、細胞集団におけるＰＣＳＫ９遺伝子は、非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が、ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少されるように改変される。本方法の他の実施形態において、細胞集団のＰＣＳＫ９遺伝子が改変され、それによって、改変された細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が検出可能なレベルの非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質を発現しない。
本方法の一実施形態において、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのＣａｓＸおよびｇＮＡは、ＲＮＰとして細胞に導入される。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の従来の方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または化学的に使用して、本明細書に記載のベクター、またはプラスミドとしてのベクターによって改変される細胞に導入することができる。本方法のいくつかの実施形態では、改変される細胞は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される。本方法の他の実施形態では、改変される細胞は、ヒト細胞である。本方法のいくつかの実施形態において、細胞集団の改変は、対象においてインビボで生じ、対象は、げっ歯類、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される。本方法の他の実施形態において、細胞集団の改変は、エクスビボで生じる。本方法のいくつかの実施形態において、改変される細胞集団は、前駆細胞、造血幹細胞、および多能性幹細胞からなる群から選択される。本方法の他の実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞である。本方法のいくつかの実施形態において、改変される細胞は、肝細胞、もしくは腸、腎臓、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、または内皮などの動脈壁の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、当該細胞を投与される対象に対して自己である。本方法の他の実施形態では、細胞集団は、当該細胞を投与される対象に対して同種異系である。
本方法のいくつかの実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列に相補的である。他の実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子のエクソンスプライシングエンハンサーの配列に相補的である。
標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態において、標的核酸配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、改変されるＰＣＳＫ９遺伝子は、配列番号３３の配列の全部または一部をコードするポリヌクレオチドに対応する野生型配列を含むか、またはヒトゲノムのｃｈｒ１：５５，０３９，４７６～５５，０６４，８５３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）にまたがるポリヌクレオチド配列を含む（表記は、第１染色体の５５，０３９，４７６ｂｐで開始して５５，０６４，８５３ｂｐまでである第１染色体（ｃｈｒ１）を指す（ホモサピエンス更新注釈リリース１０９．２０１９０９０５、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）（ＮＣＢＩ）。本方法のいくつかの実施形態において、ｇＮＡの標的化配列は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、およびエクソン１２からなる群から選択されるＰＣＳＫ９エクソンの配列に相補的である。
標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態において、標的核酸配列を改変することは、標的核酸をニッキングして標的核酸配列に一本鎖切断を導入することを含み、ＰＣＳＫ９遺伝子の改変は、変異、挿入、または欠失を導入することを含む。いくつかの実施形態において、改変することは、標的核酸配列を切断して標的核酸に二本鎖切断を導入することを含み、ＰＣＳＫ９遺伝子の改変は、野生型配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの変異、挿入、または欠失を導入することを含む。いくつかの実施形態において、本方法によって修正される変異は、機能獲得型変異である。他の実施形態において、本方法によって修正される変異は、機能喪失型変異である。いくつかの事例において、改変されるＰＣＳＫ９タンパク質は、ＰＣＳＫ９タンパク質の機能を破壊する変異を含む。１つ以上の変異を修正する方法のいくつかの実施形態において、改変することは、細胞集団におけるＰＣＳＫ９遺伝子の変異の修正または代償をもたらし、それによって機能的ＰＣＳＫ９タンパク質が細胞によって発現される。本方法のいくつかの実施形態において、細胞集団による機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現は、ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％増加される。
標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９遺伝子を改変することは、ＣａｓＸ：ｇＮＡ複合体と標的核酸配列との結合を含む。いくつかの実施形態において、ＣａｓＸは、ｇＮＡおよび標的核酸配列に結合する能力を保持する、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質である。例えば、標的核酸配列は、変異を含むＰＣＳＫ９配列を含み、ｄＣａｓＸ：ｇＲＮＡ複合体と標的配列との結合は、変異体ＰＣＳＫ９対立遺伝子の転写を妨害または抑制する。いくつかの実施形態において、ｄＣａｓＸは、配列番号１のＣａｓＸタンパク質に対応する残基Ｄ６７２、Ｅ７６９、および／もしくはＤ９３５、または配列番号２のＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、Ｅ７５６および／もしくはＤ９２２に変異を含む。前述のいくつかの実施形態において、ＣａｓＸ参照タンパク質における変異は、その残基におけるアラニンまたはグリシンの置換である。
核酸（例えば、ドナーポリヌクレオチド配列を含む核酸、ＣａｓＸタンパク質および／もしくはｇＮＡをコードする１つ以上の核酸、またはそれを含むベクター）を細胞に導入する方法は、当技術分野で知られており、任意の都合のよい方法を使用して、核酸（例えば、発現構築物）を細胞に導入することができる。好適な方法には、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、ドナーＤＮＡに融合されるか、またはそれを動員する細胞透過性ＣａｓＸタンパク質による直接付加、細胞圧縮、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などが含まれる。
本方法のいくつかの実施形態において、ＣａｓＸは、ＲＮＡ配列として提供することができる。ＲＮＡは、直接化学合成によって提供することができるか、またはＤＮＡ（例えば、ＣａｓＸタンパク質バリアントをコードする配列を含むｍＲＮＡをコードするＤＮＡ）からインビトロで転写され得る。合成されると、ＲＮＡは、ＣａｓＸタンパク質への翻訳のために、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびトランスフェクションを含むがこれらに限定されない核酸を細胞に導入するための周知の技術のうちのいずれかによって、細胞に導入され得る。
核酸は、十分に開発されたトランスフェクション技術、および市販のＱｉａｇｅｎのＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡトランスフェクションキット、およびＭｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）－ｍＲＮＡトランスフェクションキット、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクション、Ｍａｘａｇｅｎエレクトロポレーションなどを使用して細胞に導入され得る。
本開示のＣａｓＸ：ｇＮＡシステムをコードする配列（および任意選択的にドナー鋳型配列）を含む組換え発現ベクターを細胞にインビトロ条件下で導入することは、任意の好適な培地ならびに細胞の生存およびＣａｓＸ：ｇＮＡの産生を促進する任意の好適な培養条件下で生じることができる。組換え発現ベクターを標的細胞に導入することは、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実行することができる。本方法のいくつかの実施形態において、ベクターは、標的宿主細胞に直接的に提供され得る。例えば、細胞は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとｇＮＡとをコードする核酸を有し、任意選択的に、ベクターが細胞に取り込まれるようなドナー鋳型配列を有する、ベクターと接触させ得る。プラスミドである核酸ベクターと細胞を接触させるための方法には、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、トランスダクション、およびリポフェクションが含まれ、当技術分野で周知である。ウイルスベクター送達では、細胞は、対象ウイルス発現ベクター、およびＣａｓＸとｇＮＡとをコードする核酸、ならびに任意選択的にドナー鋳型を含むウイルス粒子と接触させることができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、またはＡＡＶＲｈ１０から選択される。他の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。レトロウイルス、例えばレンチウイルスは、本開示の方法における使用に好適であり得る。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは「欠陥」があり、例えば、生産的感染に必要であるウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製には、パッケージング細胞株での増殖を必要する。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によってウイルスカプシドにパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質（同種指向性、両種指向性、または異種指向性）を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞のウイルス粒子の特異性（マウスおよびラットでは同種指向性、ヒト、イヌおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型では両種指向性、ならびにマウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型では異種指向性）を決定する。適切なパッケージング細胞株を使用して、細胞がパッケージングされたウイルス粒子によって標的とされることを確実にすることができる。対象ベクター発現ベクターをパッケージング細胞株に導入する方法、およびパッケージング株によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当技術分野で周知であり、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）が含まれる。核酸はまた、直接マイクロインジェクション（例えば、ＲＮＡの注入）によって導入することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、対象に、治療有効用量で投与される。前述において、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される。特定の実施形態において、対象はヒトである。本方法のいくつかの実施形態において、ベクターは、対象に、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。本方法の他の実施形態において、ＶＬＰは、対象に、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で投与される。
ベクターまたはＶＬＰは、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、本開示のＣａｓＸ：ｇＮＡシステムを含むＡＡＶベクターであり、対象の片方または両方の眼への眼内注射を介して送達される。
他の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸ：ｇＮＡシステムを使用して標的核酸配列を改変する方法を提供し、本方法は、標的核酸配列を追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質、または追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのＣａｓＸとは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である。いくつかの実施形態において、追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質ではなく、例えば、追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、またはＣａｓ１３ａであることができる。
本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡシステムおよび方法を使用して、ＰＣＳＫ９における変異が疾患に関連する様々な細胞、例えば、肝臓、腸、腎臓、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、または内皮などの動脈壁の細胞を操作して、変異を含むＰＣＳＫ９が修正またはノックアウトされる１つの細胞または複数の細胞を生じることができる。したがって、このアプローチを使用して、ＰＣＳＫ９関連障害を有する対象における適用のために細胞を改変することができ、例えば、常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、高脂質血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、ＬＤＬコレステロールレベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、またはそれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
ＶＩ．ポリヌクレオチドおよびベクター
別の態様において、本開示は、１つ以上の変異を含むＰＣＳＫ９遺伝子の編集に効用を有するクラス２のＶ型ヌクレアーゼとｇＮＡとをコードするポリヌクレオチドに関する。追加の実施形態において、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子の一部または全部をコードするドナー鋳型ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの事例において、ドナー鋳型のＰＣＳＫ９遺伝子は、標的核酸におけるＰＣＳＫ９遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするための変異または異種配列を含む。他の事例において、ドナー鋳型は、機能的ＰＣＳＫ９遺伝子またはその一部をノックインするための修正配列を含む。なおさらなる実施形態において、本開示は、本明細書に記載のＣａｓＸタンパク質とＣａｓＸ ｇＮＡとをコードするポリヌクレオチド、ならびに実施形態のドナー鋳型を含むベクターを提供する。
別の態様において、本開示は、１つ以上の変異を含むＰＣＳＫ９遺伝子の編集に効用を有するクラス２のＶ型ヌクレアーゼとｇＮＡとをコードするポリヌクレオチドに関する。追加の実施形態において、本開示は、ＰＣＳＫ９遺伝子の一部または全部をコードするドナー鋳型ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの事例において、ドナー鋳型のＰＣＳＫ９遺伝子は、標的核酸におけるＰＣＳＫ９遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするための変異または異種配列を含む。他の事例において、ドナー鋳型は、機能的ＰＣＳＫ９遺伝子またはその一部をノックインするための修正配列を含む。なおさらなる実施形態において、本開示は、本明細書に記載のＣａｓＸタンパク質とＣａｓＸ ｇＮＡとをコードするポリヌクレオチド、ならびに実施形態のドナー鋳型を含むベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号１～３の参照ＣａｓＸをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。他の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を提供し、表３、５、６、７、および９に示される配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、および４９０、または表３、５、６、７、および９に示される配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、および４９０の配列に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列のＣａｓＸタンパク質バリアントを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのｇＮＡ配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、表１もしくは表２に示される配列番号４～１６もしくは２１０１～２２８５のｇＮＡ足場配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号２１０１～２２８５からなる群から選択されるｇＮＡ足場配列、またはそれと少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列をコードする。他の実施形態において、本開示は、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、もしくは２２８６～１３８６１の標的化配列ポリヌクレオチド、またはそれに対して少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列、ならびに標的化配列をコードするＤＮＡを含むｇＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、足場配列をコードするポリヌクレオチドは、ＣａｓＸおよび標的配列に結合することができるｇＮＡがｓｇＮＡまたはｄｇＮＡとして発現され得るように、標的化配列をコードする配列をさらに含む。他の実施形態において、本開示は、１つ以上の変異を含むＰＣＳＫ９遺伝子とハイブリダイズする足場配列と標的化配列とを有するｇＮＡ配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの事例において、ポリヌクレオチド配列は、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、およびエクソン１２からなる群から選択されるＰＣＳＫ９遺伝子エクソンとハイブリダイズする足場配列と標的化配列とのｇＮＡをコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ＰＣＳＫ９イントロンとハイブリダイズする標的化配列を含むｇＮＡ配列をコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部とハイブリダイズする標的化配列を含むｇＮＡ配列をコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子間領域とハイブリダイズする標的化配列を含むｇＮＡ配列をコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ＰＣＳＫ９調節領域とハイブリダイズする標的化配列を含むｇＮＡをコードする。いくつかの事例において、ＰＣＳＫ９調節領域は、ＰＣＳＫ９プロモーターまたはエンハンサーである。いくつかの事例において、ＰＣＳＫ９調節領域は、ＰＣＳＫ９転写開始部位の５’、ＰＣＳＫ９転写開始の３’、またはＰＣＳＫ９イントロンに位置する。いくつかの事例において、ＰＣＳＫ９調節領域は、ＰＣＳＫ９遺伝子のイントロンにある。他の事例において、ＰＣＳＫ９調節領域は、ＰＣＳＫ９遺伝子の５’ＵＴＲを含む。さらに他の事例において、ＰＣＳＫ９調節領域は、ＰＣＳＫ９遺伝子の３’ＵＴＲを含む。いくつかの事例において、ＰＣＳＫ９配列は、野生型配列である。他の事例において、ＰＣＳＫ９配列は、１つ以上の変異を含む。
他の実施形態では、本開示は、ドナー鋳型核酸であって、ドナー鋳型が、遺伝子編集が意図される標的核酸の標的配列と相同性を有するが完全には同一性でないヌクレオチド配列を含む、ドナー鋳型核酸を提供する。ドナー鋳型配列は、典型的には、それが置換するゲノム配列と同一ではなく、ゲノム配列に対して１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位、または転位を含み得るが、但し、相同性指向修復を支援するのに十分な標的配列との相同性を有するか、またはドナー鋳型が相同アームを有することを条件とし、挿入時に、変異を含むエクソンの切り出しをもたらし、それによってＰＣＳＫ９遺伝子のリーディングフレームが回復されるか、またはドナー鋳型が挿入で変異を修正するように野生型配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、タンパク質標的核酸とハイブリダイズし、ＣａｓＸによって導入される切断部位に挿入される配列を有し、遺伝子配列の改変をもたらす。ＰＣＳＫ９変異が複数のエクソンにまたがるこれらの場合、本開示は、ドナー鋳型におけるエクソン間に短縮された長さの合成イントロン配列を含むようにも最適化し得る十分な長さのドナー鋳型が、ＰＣＳＫ９遺伝子座の適切な発現およびプロセシングを確実にすることを企図する。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約１０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、または少なくとも約２００個、または少なくとも約３００個、または少なくとも約４００個、または少なくとも約５００個、または少なくとも約６００個、または少なくとも約７００個、または少なくとも約８００個、または少なくとも約９００個、または少なくとも約１０００個、または少なくとも約１０，０００個、または少なくとも約１５，０００個のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約１０～約１５，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約１００～約１０，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約４００～約８，０００個のヌクレオチド、または少なくとも約６００～約５０００個のヌクレオチド、または少なくとも約１０００～約２０００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖ＤＮＡ鋳型または一本鎖ＲＮＡ鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖ＤＮＡ鋳型である。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡをそれらのバリアントを含めてコードするポリヌクレオチド配列を産生する方法、ならびにポリヌクレオチド配列によって発現またはＲＮＡ転写されるタンパク質を発現させる方法に関する。一般に、方法は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸまたはｇＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を産生することと、コード遺伝子を宿主細胞にとって適切な発現ベクターに組み込むことと、を含む。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのコードされたＣａｓＸまたはｇＮＡの産生では、方法は、適切な宿主細胞を、コードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換することと、宿主細胞を、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの得られるＣａｓＸまたはｇＮＡが形質転換された宿主細胞で発現もしくは転写されることを引き起こすか、または可能にする条件下で培養することと、それによって、本明細書に記載の方法（例えば、後述の実施例）または当該技術分野で既知の標準精製法によって回収されるＣａｓＸまたはｇＮＡを産生することと、を含む。本開示のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製するために、分子生物学における標準組換え技法が使用される。
本開示に従い、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡをコードする核酸配列を使用して、適切な宿主細胞における発現を導く組換えＤＮＡを生成する。いくつかのクローニング戦略が本開示を行う際に好適であり、それらの多くは、本開示の組成物をコードする遺伝子またはその相補体を含む構築物を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、クローニング戦略は、組成物の発現のために宿主細胞を形質転換するために使用される参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡをコードするヌクレオチドを含む構築物をコードする遺伝子を作製するために使用される。
１つのアプローチでは、参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む構築物が最初に調製される。かかる構築物を調製するための例示的な方法は、実施例に記載されている。次いで、構築物を使用して、ＣａｓＸ、またはｇＮＡの場合には、タンパク質構築物の発現および回収のための原核生物または真核生物宿主細胞などの宿主細胞を形質転換するために好適な発現ベクターを作製する。所望される場合、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。他の実施形態において、宿主細胞は、真核生物細胞である。真核生物宿主細胞は、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、酵母細胞、または組換え産物の産生のために好適な当技術分野で知られている他の真核生物細胞から選択することができる。発現ベクターの作製、宿主細胞の形質転換、ならびに参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡの発現および回収のための例示的な方法は、実施例に記載されている。
参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡ構築物をコードする遺伝子は、完全に合成的に、または実施例でより完全に記載されている方法を含む、制限酵素媒介クローニング、ＰＣＲ、およびオーバーラップ伸長などの酵素プロセスと組み合わせた合成のいずれかによる、１つ以上のステップで作製することができる。本明細書に開示される方法を使用して、例えば、所望の配列の様々な構成要素（例えば、ＣａｓＸおよびｇＮＡ）遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列を連結することができる。ポリペプチド組成物をコードする遺伝子は、標準遺伝子合成技法を使用してオリゴヌクレオチドから組み立てられる。
いくつかの実施形態において、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化される。このタイプの最適化は、コードするヌクレオチド配列の変異を伴い、同じＣａｓＸタンパク質をコードしながら、意図する宿主生物または細胞のコドン選択を模倣することができる。したがって、コドンは変化し得るが、コードされたタンパク質は変化しないままである。例えば、ＣａｓＸタンパク質の対象とする標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化ＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を使用することができる。別の非限定的な例として、対象とする宿主細胞がマウス細胞である場合、マウスコドン最適化ＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を生成することができる。別の非限定的な例として、対象とする宿主細胞が植物細胞である場合、植物コドン最適化ＣａｓＸタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列を生成することができる。別の非限定的な例として、対象とする宿主細胞が昆虫細胞である場合、昆虫コドン最適化ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を生成することができる。参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡの産生に利用される宿主細胞に適切なコドン使用頻度およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して遺伝子設計を行うことができる。本開示の一方法では、構築物の構成要素をコードするポリヌクレオチドのライブラリが作製され、その後、上述のように組み立てられる。その後、結果として生じた遺伝子が組み立てられ、結果として生じた遺伝子を使用して、宿主細胞を形質転換し、本明細書に記載されるように、参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡ組成物を産生および回収して、その特性を評価する。
いくつかの実施形態では、ｇＮＡをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に作動可能に連結される。他の事例において、ＣａｓＸおよびｇＮＡをコードするヌクレオチドは連結され、単一の制御要素に操作可能に連結される。いくつかの事例では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。いくつかの事例では、転写制御要素（例えば、プロモーター）は、標的化された細胞型または標的化された細胞集団において機能的である。例えば、いくつかの事例では、転写制御要素は、真核生物細胞、例えば、ニューロン、脊髄運動ニューロン、オリゴデンドロサイト、またはグリア細胞において機能的であり得る。真核生物プロモーター（真核生物細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例には、ＥＦ１アルファプロモーター、ＥＦ１アルファコアプロモーター、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、ならびにマウスメタロチオネイン－Ｉ由来のプロモーターが含まれる。真核生物プロモーターのさらなる非限定的な例には、ＣＭＶプロモーター全長プロモーター、最小ＣＭＶプロモーター、ニワトリβ－アクチンプロモーター、ｈＰＧＫプロモーター、ＨＳＶ ＴＫプロモーター、ミニＴＫプロモーター、ニューロン特異的発現をもたらすヒトシナプシンＩプロモーター、ニューロンでの選択的発現のためのＭｅｃｐ２プロモーター、最小ＩＬ－２プロモーター、ラウス肉腫ウイルスエンハンサー／プロモーター（単一）、脾臓フォーカス形成ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＳＶ４０エンハンサーおよび初期プロモーター、ＴＢＧプロモーター：ヒトチロキシン結合グロブリン遺伝子（肝臓特異的）由来のプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトユビキチンＣプロモーター、ＵＣＯＥプロモーター（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３のプロモーター）、ヒストンＨ２プロモーター、ヒストンＨ３プロモーター、Ｕ１ａ１核内低分子ＲＮＡプロモーター（２２６ｎｔ）、Ｕ１ｂ２核内低分子ＲＮＡプロモーター（２４６ｎｔ）２６、ＴＴＲ最小エンハンサー／プロモーター、ｂ－キネシンプロモーター、ヒトｅＩＦ４Ａ１プロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、およびグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターが挙げられる。
適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルの十分に範囲内であり、それは、例えば、ＰＣＳＫ９遺伝子を改変するために、発現を制御することに関連する。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含み得る。発現ベクターは、発現を増幅するのに適切な配列も含み得る。発現ベクターは、ＣａｓＸタンパク質に融合し、それ故に、キメラＣａｓＸタンパク質をもたらすことができる、精製または検出に使用され得るタンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、血球凝集素タグ、蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
いくつかの実施形態において、ｇＮＡバリアントまたはＣａｓＸタンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、構成的に活性なプロモーター、空間的に制限されるプロモーター（すなわち、転写制御要素、エンハンサー、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）、または時間的に制限されるプロモーターに操作可能に連結される。他の実施形態において、ｇＮＡまたはＣａｓＸをコードする個々のヌクレオチド配列は、前述のプロモーターのカテゴリーのうちの１つに連結され、その後、以下に記載の従来の方法によって改変される細胞に導入される。
ある特定の実施形態では、好適なプロモーターは、ウイルスから得ることができ、したがって、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物もしくは真核生物を含む、任意の生物から得ることができる。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）による発現を駆動することができる。例示的なプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）、増強されたＵ６プロモーター、ヒトＨＩプロモーター（ＨＩ）、ＰＯＬ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸおよびｇＮＡをコードし、かつ任意選択的に、ドナー鋳型を含む１つ以上のヌクレオチド配列は各々、真核生物細胞で作動可能なプロモーターに（その制御下で）操作可能に連結される。誘導性プロモーターの例には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル－ベータ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節プロモーター、ラクトース誘導プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、誘導性プロモーターは、いくつかの実施形態では、ドキシサイクリン、エストロゲンおよび／またはエストロゲン類似体、ＩＰＴＧなどを含むが、これらに限定されない分子によって調節することができる。
ある特定の実施形態では、使用に好適な誘導性プロモーターには、本明細書に記載されるか、または当業者に既知の任意の誘導性プロモーターが含まれ得る。誘導性プロモーターの例には、化学的／生化学的調節型および物理的調節型プロモーター、例えば、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーター、および他のテトラサイクリン応答性プロモーター系、例えば、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、およびテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体に基づくプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーター）、金属調節型プロモーター（例えば、酵母、マウス、およびヒト由来のメタロチオネイン（金属イオンに結合し、封鎖するタンパク質）に由来するプロモーター）、病因調節型プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン、またはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、および光調節型プロモーター（例えば、植物細胞由来の光応答性プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、これにより、多細胞生物において、プロモーターが特定細胞のサブセットで活性（すなわち、「オン」）になる。空間的に制限されたプロモーターは、エンハンサー、転写制御要素、制御配列などとも称され得る。任意の簡便な空間的に制限されたプロモーターが標的とされる宿主細胞（例えば、真核生物細胞、原核生物細胞）において機能的である限り、そのプロモーターを使用することができる。
いくつかの事例では、プロモーターは、可逆的プロモーターである。可逆的誘導性プロモーターを含む好適な可逆的プロモーターは、当該技術分野で既知である。かかる可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物および原核生物から単離され得るか、またはそれらに由来し得る。第２の生物に使用するための第１の生物、例えば、第１の原核生物および第２の真核生物、第１の真核生物および第２の原核生物などに由来する可逆的プロモーターの改変は、当該技術分野で周知である。かかる可逆的プロモーター、およびかかる可逆的プロモーターに基づくが、追加の制御タンパク質も含むシステムには、アルコール調節型プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質（ＡｌｃＲ）に応答性のプロモーターなど）、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、Ｔｅｔ活性化因子、Ｔｅｔオン、Ｔｅｔオフなどを含むプロモーターシステム）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーターシステム、ヒトエストロゲン受容体プロモーターシステム、レチノイドプロモーターシステム、甲状腺プロモーターシステム、エクジソンプロモーターシステム、ミフェプリストンプロモーターシステムなど）、金属調節型プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターシステムなど）、病原体関連調節型プロモーター（例えば、サリチル酸調節型プロモーター、エチレン調節型プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節型プロモーターなど）、温度調節型プロモーター（例えば、ヒートショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、大豆ヒートショックプロモーターなど）、光調節型プロモーター、合成誘導性プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。
本開示の組換え発現ベクターは、本開示のＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡの頑強な発現を促進する要素も含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、ポリアデニル化シグナル（ポリ（Ａ））、イントロン配列、またはウッドチャック肝炎転写後調節要素（ＷＰＲＥ）などの転写後調節要素のうちの１つ以上を含むことができる。例示的なポリ（Ａ）配列には、ｈＧＨポリ（Ａ）シグナル（短い）、ＨＳＶ ＴＫポリ（Ａ）シグナル、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナル、β－グロビンポリ（Ａ）シグナルなどが含まれる。当業者であれば、本明細書に記載の組換え発現ベクターへの包含に好適な要素を選択することができるであろう。
参照ＣａｓＸ、ＣａｓＸバリアント、またはｇＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに個別にクローニングすることができる。ベクターには、細菌プラスミド、ウイルスベクターなどが含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。他の実施形態では、本開示は、ＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびＣａｓＸ ｇＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの事例では、ＣａｓＸタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列および／またはＣａｓＸ ｇＮＡをコードするヌクレオチド配列は、選択した細胞型において作動可能なプロモーターに操作可能に連結される。他の実施形態では、ＣａｓＸタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列およびＣａｓＸ ｇＮＡをコードするヌクレオチド配列は、別個のベクターに提供される。
いくつかの実施形態において、（ｉ）ドナー鋳型が標的核酸（例えば、標的ゲノム）のＰＣＳＫ９配列と相同性を有する、ドナー鋳型核酸のヌクレオチド配列、（ｉｉ）真核生物細胞などの標的細胞で操作可能であるプロモーターに操作可能に連結された標的化ゲノム（例えば、単一または二重ガイドＲＮＡとして構成される）の標的ＰＣＳＫ９遺伝子座の配列とハイプリダイズする、ＣａｓＸ ｇＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）真核生物細胞などの標的細胞で操作可能であるプロモーターに操作可能に連結されたＣａｓＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列、などの配列を含む１つ以上の組換え発現ベクターが、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型を含み、ＣａｓＸ ｇＮＡとＣａｓＸタンパク質とをコードする配列は、異なる組換え発現ベクターにあり、他の実施形態において、１つ、２つ、または３つすべてのポリヌクレオチド配列（ドナー鋳型、ＣａｓＸ、およびｇＮＡ）は、同じ組換え発現ベクターにある。
核酸配列は、様々な手順によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡは、当該技術分野で既知の技法を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター構成要素には、一般に、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。これらの構成要素のうちの１つ以上を含む好適なベクターの構築は、当業者に既知の標準ライゲーション技法を用いる。かかる技法は当該技術分野で周知であり、科学文献および特許文献で十分に説明されている。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得、これらを組換えＤＮＡ手順に好都合に供することができ、ベクターの選択は、多くの場合、それが導入される宿主細胞に依存する。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり得、その複製は、染色体複製とは無関係であり、例えば、プラスミドである。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。好適な宿主細胞に導入されると、ＣａｓＸ ＰＣＳＫ９編集システムの発現は、当該技術分野で既知の任意の核酸またはタンパク質アッセイを使用して決定することができる。例えば、参照ＣａｓＸまたはＣａｓＸバリアントの転写ｍＲＮＡの存在は、ポリヌクレオチドの任意の領域に相補的なプローブを使用して、従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット分析）、増幅手順（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、ＳＡＧＥ（米国特許第５，６９５，９３７号）、およびアレイベースの技術（例えば、米国特許第５，４０５，７８３号、同第５，４１２，０８７号、および同第５，４４５，９３４号を参照されたい）によって検出および／または定量することができる。
本開示は、宿主細胞と適合性があり、宿主細胞によって認識され、かつポリペプチドの制御された発現またはＲＮＡの転写のためにポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結された複製配列および制御配列を含むプラスミド発現ベクターの使用を提供する。かかるベクター配列は、様々な細菌、酵母、ウイルスでよく知られている。使用することができる有用な発現ベクターには、例えば、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列のセグメントが含まれる。「発現ベクター」とは、好適な宿主にポリペプチドをコードするＤＮＡの発現をもたらすことができる好適な制御配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を指す。ベクターが選択した宿主細胞で複製可能であり、かつ実行可能であることが要件である。必要に応じて、低コピー数または高コピー数のベクターを使用することができる。ベクターの制御配列には、転写をもたらすためのプロモーター、かかる転写を制御するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。プロモーターは、選択した宿主細胞で転写活性を示し、かつ宿主細胞に対して相同または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る任意のＤＮＡ配列であり得る。
組換え発現ベクターは、様々な方法によって標的宿主細胞に送達することができ、以下でより完全に記載される。かかる方法には、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、ドナーＤＮＡに融合されるか、またはそれを動員する細胞透過性ＣａｓＸタンパク質による直接付加、細胞圧縮、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などが含まれる。
組換え発現ベクター配列は、エクスビボ、インビトロまたはインビボでの細胞のその後の感染および形質転換のために、ウイルスまたはウイルス様粒子（本明細書では「粒子」または「ビリオン」とも呼ばれる）にパッケージングすることができる。このような粒子またはビリオンは、典型的に、ベクターゲノムをカプシド化またはパッケージングするタンパク質を含む。好適な発現ベクターには、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス）、脾臓壊死ウイルスに基づくウイルス発現ベクター、ならびにルース肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターなどが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレトロウイルスベクターである。
ＡＡＶは、対象に投与するために調製される細胞のインビボまたはエクスビボのいずれかで、真核生物細胞などの細胞への送達のためにウイルスベクターを用いる状況下でヒト疾患を治療するのに役立つ小さい（２０ｎｍ）非病原性ウイルスである。構築物、例えば、本明細書に記載されるＣａｓＸタンパク質および／またはＣａｓＸ ｇＮＡの実施形態のいずれかをコードし、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接する構築物が生成され、それにより、ＡＡＶベクターのＡＡＶウイルス粒子へのパッケージングが可能になる。
「ＡＡＶ」ベクターとは、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指し得る。この用語は、別途要求されない限り、全てのサブタイプ、血清型および偽型、ならびに天然型および組換え型の両方を包含する。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、定義された抗血清とのカプシドタンパク質反応性に基づいて他のＡＡＶによって特定され、かつそれらと区別されるＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶの多くの既知の血清型が存在する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ由来のＡＡＶ）、およびＡＡＶＲｈ１０、ならびにこれらの血清型の改変されたカプシドから選択される。例えば、血清型ＡＡＶ－２は、ＡＡＶ－２のｃａｐ遺伝子からコードされたカプシドタンパク質と、同じＡＡＶ－２血清型由来の５’および３′ＩＴＲ配列を含むゲノムとを含むＡＡＶを指すために使用される。偽型ＡＡＶとは、１つの血清型由来のカプシドタンパク質と、第２の血清型の５′－３′ＩＴＲを含むウイルスゲノムとを含むＡＡＶを指す。偽型ｒＡＡＶは、カプシド血清型の細胞表面結合特性およびＩＴＲ血清型と一致する遺伝的特性を有すると予想されるであろう。偽型組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、当該技術分野で説明されている標準技法を使用して生成される。本明細書で使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清型由来のカプシドタンパク質および５′－３′ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用され得るか、または血清型１由来のカプシドタンパク質と、異なるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ血清型２由来の５′－３′ＩＴＲとを有するＡＡＶを指し得る。本明細書に例示される各例について、ベクター設計および産生についての記述は、カプシドおよび５′－３′ＩＴＲ配列の血清型を説明する。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによる）およびカプシド化されたポリヌクレオチドからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）をさらに含む場合、それは典型的に「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。例示的な異種ポリヌクレオチドは、ＣａｓＸタンパク質および／またはｓｇＲＮＡ、ならびに任意選択的に、本明細書に記載される実施形態のいずれかのドナー鋳型を含むポリヌクレオチドである。
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＤＮＡ複製起点およびウイルスに対するパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能するＡＡＶゲノムの各末端で見つけられる当該技術分野で認識されている領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と一緒に、２つの隣接するＩＴＲ間に挿入されたヌクレオチド配列の効率的な切除およびそれからの救出、ならびに哺乳動物細胞ゲノムへのその組み込みを提供する。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１、Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ” ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照のこと。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ ＩＴＲは、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよい。加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、およびＡＡＶＲｈ１０、ならびにこれらの血清型の改変されたカプシドを含むが、これらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のうちのいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、それらが意図されたとおりに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的とする配列の切除および救出を可能にし、かつＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合、レシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするように機能する限り、必ずしも同一である必要はなく、または同じＡＡＶ血清型もしくは分離株に由来する必要はない。異種配列を宿主細胞に組み込むためのＡＡＶ血清型の使用は、当該技術分野で既知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／１９５５５５Ａ１およびＵＳ２０１８／０２５８４２４Ａ１を参照されたい）。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製起点でのＡＡＶの認識、結合、およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要とされる。「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」は、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはそれらの機能的相同体をコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするのに集合的に必要とされるパッケージング機能を提供する。
いくつかの実施形態では、ＣａｓＸおよびｇＮＡについてのコード配列の送達に利用されるＡＡＶカプシド、ならびに任意選択的に、宿主細胞に対するＰＣＳＫ９ドナー鋳型ヌクレオチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ由来ＡＡＶ）、およびＡＡＶＲｈ１０を含むが、これらに限定されない、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ血清型２に由来する。
ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶ発現ベクターが既知の技法を使用して、例えば、トランスフェクションによって好適な宿主細胞に導入される。パッケージング細胞は、典型的に、ウイルス粒子を形成するために使用され、そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングするＨＥＫ２９３細胞（および当技術分野で知られている他の細胞）が含まれる。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で一般的に知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。特に好適なトランスフェクション法には、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子導入、脂質媒介形質導入、および高速マイクロプロジェクタイルを使用した核酸送達が含まれる。
いくつかの実施形態では、上記のＡＡＶ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲと隣接するヌクレオチド配列を複製およびカプシド化してｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供することができるようになる。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、ＡＡＶ由来のコード配列であり、これは、ＡＡＶ遺伝子産物を提供するように発現され、次いで、生産的ＡＡＶ複製のためにトランスで機能することができる。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターから欠失している必要なＡＡＶ機能を補完するために本明細書で使用される。したがって、ＡＡＶヘルパー機能には、ｒｅｐおよびｃａｐコード領域、またはそれらの機能的相同体をコードする、主要なＡＡＶ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の一方または両方が含まれる。付属機能は、当業者に既知の方法を使用して、宿主細胞に導入され、その後、発現され得る。一般に、付属機能は、無関係のヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。いくつかの実施形態では、付属機能は、付属機能ベクターを使用して提供される。利用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの好適な転写および翻訳制御要素のうちのいずれかが発現ベクターに使用され得る。
他の実施形態では、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本開示のＣａｓＸ：ｇＮＡシステムのコード核酸の送達のためのベクターとしての使用に好適であり得る。一般に使用されるレトロウイルスベクターは、例えば、生産的感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない、「欠陥」であり、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）と呼ばれることがある。むしろ、ベクターの複製には、パッケージング細胞株での増殖を必要する。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によってＶＬＰカプシドにパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質（同種指向性、両種指向性、または異種指向性）を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞のウイルス粒子の特異性（マウスおよびラットでは同種指向性、ヒト、イヌおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型では両種指向性、ならびにマウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型では異種指向性）を決定する。適切なパッケージング細胞株を使用して、細胞がパッケージングされたウイルス粒子によって標的とされることを確実にすることができる。対象ベクター発現ベクターをパッケージング細胞株に導入する方法、およびパッケージング株によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当技術分野で周知である。
他の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとｇＮＡとのＣａｓＸ：ｇＮＡ ＲＮＰ複合体、および任意選択的にドナー鋳型を含む、インビトロで生成されるＶＬＰを提供する。様々なウイルス由来の構造タンパク質の組み合わせを使用して、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アデノ随伴ウイルス）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ＨＩＶ）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ニパ）、およびバクテリオファージ（例えば、Ｑβ、ＡＰ２０５）を含むウイルスファミリー由来の成分を含む、ＶＬＰを作製することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＩＶなどのレンチウイルスを含むレトロウイルスの成分を使用して設計されたＶＬＰシステムを提供し、様々な成分をコードする核酸を含む個々のプラスミドがパッケージング細胞に導入され、次いで、ＶＬＰが生成される。いくつかの実施形態において、ＶＬＰレトロウイルス成分は、Ｏｔｈｏｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ（レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス）、およびＳｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅを含む、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのうちのいずれかに由来することができる。ＣａｓＸ編集システムを含む例示的なＶＬＰは、２０２０年１２月４日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６３４８８に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本開示は、ＣａｓＸ：ｇＮＡ ＲＮＰを含有するレトロウイルスカプシドを有するＶＬＰを提供し、標的細胞への投与および侵入で、ＲＮＰ分子は、細胞の核に輸送されるように遊離する。前述のものは、分裂細胞および非分裂細胞へのウイルス形質導入が効率的であり、かつ別様に外来タンパク質を検出するであろう対象の免疫監視機構を逃れる強力な短命のＲＮＰをＶＬＰが送達するという点で、当該技術分野において他のベクターに勝る利点を提供する。
いくつかの実施形態において、ＶＬＰシステムは、ａ）ｉ）Ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分、ｉｉ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸタンパク質、および任意選択的に、ｉｉｉ）プロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼ切断部位が、ｇａｇポリタンパク質成分と融合タンパク質のＣａｓＸタンパク質との間に位置する、融合ペプチドをコードする配列を含む、第１の核酸と、ｂ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのガイドＮＡをコードする配列を含む、第２の核酸と、ｃ）ＣａｓＸタンパク質とｇａｇポリタンパク質との間のプロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼを含むレンチウイルスｐｏｌポリタンパク質をコードする配列を含む、第３の核酸と、を含む。前述の実施形態において、Ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分は、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１－ｐ６タンパク質、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、ｐ２ペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ６８ Ｇａｇポリペプチド、ｐ３ Ｇａｇポリペプチドからなる群から選択される。前述のいくつかの実施形態において、ＶＬＰシステムは第４の核酸をさらに含み、標的細胞との結合を提供する偽型ウイルスエンベロープタンパク質もしくは糖タンパク質をコードする配列を含むか、あるいは代替的に、核酸は標的細胞との結合を提供する抗体断片をコードするか、または偽型ウイルスエンベロープもしくは糖タンパク質および抗体断片の両方を含む。エンベロープタンパク質または糖タンパク質は、ＶＬＰに向性を付与する当該技術分野で既知の任意のエンベロープウイルスに由来することができ、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サルポックス、モノネガウイルス、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、デュベンハージウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス１、ヨーロッパコウモリウイルス２、オーストラリアコウモリウイルス、エフェメロウイルス、ベシキュロウイルス、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、バリセラ帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、乳頭腫ウイルス、ネズミガンマヘルペスウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、クリミア－コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、マールブルグ出血熱ウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、バリオラメジャーウイルス、バリオラマイナーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、およびウエストナイルウイルスからなる群が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＶＬＰの産生のために使用されるパッケージング細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ａ５４９細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＶＥＲＯ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ｂ－５０）、ＣＨＯ細胞、およびＨＴ１０８０細胞からなる群から選択される。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸ：ｇＮＡ ＲＮＰを含むＶＬＰの産生および回収で、ＶＬＰは、かかるＶＬＰの投与によって対象の標的細胞を編集する方法で使用することができ、以下でより完全に記載される。
ＶＩＩ．治療法
本開示は、ＰＣＳＫ９関連障害の治療を必要とする対象におけるＰＣＳＫ９関連障害を治療する方法を提供し、常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、アテローム性動脈硬化性心血管疾患および冠状動脈疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高い血圧上昇、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、対象のＰＣＳＫ９関連障害を、本開示の組成物を対象に投与することによって、予防、治療、および／または改善することができる。いくつかの実施形態において、対象に投与される組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
本開示は、ＰＣＳＫ９関連障害の治療を必要とする対象におけるＰＣＳＫ９関連障害を治療する方法を提供し、常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、アテローム性動脈硬化性心血管疾患および冠状動脈疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高い血圧上昇、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、対象のＰＣＳＫ９関連障害を、本開示の組成物を対象に投与することによって、予防、治療、および／または改善することができる。いくつかの実施形態において、対象に投与される組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
いくつかの事例において、対象のＰＣＳＫ９遺伝子の一方または両方の対立遺伝子は、変異を含む。いくつかの事例において、ＰＣＳＫ９関連障害変異は、機能獲得型変異であり、配列番号３３の配列に対して、Ｓ１２７Ｒ、Ｄ１２９Ｇ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ３７４Ｈ、およびＤ３７４Ｙからなる群から選択されるアミノ酸置換をコードする変異が含まれるが、これらに限定されない。他の事例において、ＰＣＳＫ９関連障害変異は、機能喪失型変異であり、配列番号３３の配列に対して、Ｒ４６Ｌ、Ｇ１０６Ｒ、Ｙ１４２Ｘ、Ｎ１５７Ｋ、Ｒ２３７Ｗ、およびＣ６７９Ｘからなる群から選択されたアミノ酸置換をコードする変異が含まれるが、これらに限定されない。他の事例において、ＰＣＳＫ９関連障害変異は、表Ｂに開示されるＰＣＫＳ９対立遺伝子を含む。他の事例において、ＰＣＳＫ９遺伝子は、ＰＣＳＫ９タンパク質の機能または発現を変化させる、野生型配列と比較して１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入などに限定されない変異をコードする。
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９または関連する障害の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法を提供し、対象の細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子を改変することを含み、改変することは、当該細胞を、治療有効用量のｉ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとｇＮＡとを含む組成物、ｉｉ）本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとｇＮＡとドナー鋳型とを含む組成物、ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の組成物をコードするか、もしくは含む１つ以上の核酸、ｉｖ）レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターからなる群から選択され、（ｉｉｉ）の核酸を含むベクター、ｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の組成物を含むＶＬＰ、またはｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの２つ以上の組み合わせと接触させることを含み、細胞のＰＣＳＫ９遺伝子は、ＣａｓＸタンパク質、および任意選択的にドナー鋳型によって、野生型または機能的ＰＣＳＫ９タンパク質が発現されるように改変される。本方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの足場を有する第２のｇＮＡが利用され、第２のｇＮＡは、第１のｇＮＡと比較して標的核酸の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有し、対象の細胞のＰＣＳＫ９標的核酸に追加の切断をもたらす。前述において、遺伝子はＮＨＥＪ宿主修復機構によって改変するか、またはＨＤＲもしくはＨＩＴＩ機構によって挿入されるドナー鋳型と組み合わせて利用して、変異を切除もしくは修正して、機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現をもたすことができる。治療される対象の改変される細胞は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される真核生物細胞であることができる。いくつかの実施形態において、治療される対象の真核生物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＬＤＬの産生に関与する細胞であり、肝細胞、もしくは腸、腎臓、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜細胞、または内皮などの動脈壁の細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は、眼細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子の少なくとも１つの改変された対立遺伝子を含み、改変を使用して対象における変異を修正する。いくつかの事例において、対象の変異は、機能獲得型変異である。他の事例において、対象の変異は、機能喪失型変異である。
本治療方法のいくつかの実施形態において、本方法は、対象に、ＣａｓＸタンパク質とｇＮＡと、任意選択的に、ドナー鋳型（上記）とを含むか、またはコードする本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの治療有効用量のベクターを投与することを含み、対象の細胞とベクターとの接触は、ＣａｓＸ：ｇＮＡ複合体による細胞の標的核酸の改変をもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、ＣａｓＸと、ＰＣＳＫ９遺伝子における異なる位置を標的化とする複数のｇＮＡと、を含むか、またはコードするベクターの投与を含み、対象の細胞とＣａｓＸ：ｇＮＡ複合体との接触が、細胞の標的核酸の改変をもたらす。特定の一実施形態において、ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、またはＡＡＶＲｈ１０からなる群から選択されるＡＡＶである。実施形態のベクターは、対象に治療有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、ベクターは、対象に、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。方法の他の実施形態において、ＶＬＰは、対象に、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で投与される。ベクターまたはＶＬＰは、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与することができる。対象におけるＰＣＳＫ９関連障害を治療する方法のいくつかの実施形態において、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される。
治療方法の他の実施形態において、方法は、追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質、または追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドを対象にさらに投与することを含む。前述の実施形態において、追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、本方法の第１のＣａｓＸタンパク質とは異なる配列を有する。いくつかの実施形態において、追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＣａｓＸタンパク質ではなく、すなわち、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、またはＣａｓ１３ａである。いくつかの事例において、治療方法で使用されるｇＮＡは、単一分子ｇＮＡ（ｓｇＮＡ）である。他の事例において、ｇＮＡは、二重分子ｇＮＡ（ｄｇＮＡ）である。さらに他の事例において、方法は、標的核酸配列を、ＰＣＳＫ９遺伝子の異なるか、または重複する配列に標的化された複数のｇＮＡと接触させることを含む。
多くの治療戦略が、ＰＣＳＫ９関連障害を有する対象の治療方法における使用のための組成物を設計するために使用されてきている。いくつかの実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９関連障害を有する対象の治療方法を提供し、方法は、対象に、本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸ：ｇＮＡ組成物またはベクターを、治療有効用量を使用した１回以上の連続用量を含む治療レジメンに従って投与することを含む。治療レジメンのいくつかの実施形態では、組成物またはベクターの治療的に有効な用量は、単回用量として投与される。治療レジメンの他の実施形態では、治療的に有効な用量は、少なくとも２週間、または少なくとも１ヶ月、または少なくとも２ヶ月、または少なくとも３ヶ月、または少なくとも４ヶ月、または少なくとも５ヶ月、または少なくとも６ヶ月の期間にわたって２回以上の用量として対象に投与される。治療レジメンのいくつかの実施形態において、有効用量は、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される経路によって投与される。
ＰＣＳＫ９関連障害を有する対象の治療方法のいくつかの実施形態において、方法は、対象に、本明細書に開示されるＶＬＰ内のＲＮＰとしてＣａｓＸ：ｇＮＡ組成物を、治療有効用量を使用した１回以上の連続用量を含む治療レジメンに従って投与することを含む。
いくつかの実施形態において、ＰＣＳＫ９関連障害を有する対象に、ＣａｓＸタンパク質とガイド核酸とをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、治療有効量のＣａｓＸ：ｇＮＡモダリティを投与して、または本明細書に開示のＣａｓＸ－ｇＮＡ組成物を投与して、ＰＣＳＫ９の発現をノックダウンまたはノックアウトすることは、基礎的なＰＣＳＫ９関連障害の予防または回復をもたらし、それによって、対象は依然として基礎的な障害に罹患している可能性があるにもかかわらず、改善が対象に観察されるいくつかの実施形態では、治療有効量のＣａｓＸ－ｇＮＡモダリティの投与は、ＬＤＬコレステロールのベースラインからの変化割合、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の減少（ＡＳＣＶＤ）、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、不安定な扁桃炎、および視力を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす。いくつかの実施形態において、治療有効量のＣａｓＸ－ｇＮＡモダリティの投与は、少なくとも２つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす。いくつかの実施形態において、対象は、マウス、ラット、ブタ、イヌ、非ヒト霊長類、およびヒトから選択される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、薬剤がＬＤＬレベルを低下させるのに有効である化学療法剤を投与することをさらに含む。かかる薬剤には、スタチン、ナイアシン、フィブラート、または抗ＰＣＳＫ９抗体剤が含まれるが、これらに限定されない。
体液または組織などの治療の有効性を決定する分析のために治療される対象から試料を得る方法、および分析を可能にする試料の調製方法は、当業者によく知られている。ＲＮＡおよびタンパク質レベルの分析のための方法は、上記で考察され、当業者にはよく知られている。治療の効果はまた、当技術分野で知られている定型的な臨床的方法によって、本発明の１つ以上の化合物と接触した動物から収集された、前述の流体、組織、または器官における標的遺伝子発現に関連するバイオマーカーを測定することによって評価することができる。ＰＣＳＫ９障害のバイオマーカーには、ＰＣＳＫ９レベル、低密度リポタンパク質（ＬＤＬコレステロール）、アポリポタンパク質Ｂ、非ＨＤＬコレステロール、トリグリセリドおよびリポタンパク質ａ、可溶性ＣＤ４０リガンド、オステオポンチン（ＯＰＮ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯＰ）が含まれるが、これらに限定されず、マーカーの濃度は、生理学的に正常であることが知られているか、またはＰＣＳＫ９障害を有さない対象における濃度と比較される。
ＰＣＳＫ９の変異型を発現するいくつかのマウスモデルが存在し、治療方法を評価するために好適である。ＰＣＳＫ９関連障害のトランスジェニックマウスモデルには、ｈＰＣＳＫ９を有するノックインマウスモデルが含まれる（Ｃａｒｒｅｒａｓ，Ａ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ＰＣＳＫ９ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．ＭＣ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７：４（２０１９）、Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９ ｕｎｄｅｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．３０（７）：１３３３（２０１０））。
ＶＩＩＩ．医薬組成物、キット、および製造品
いくつかの実施形態において、本開示は、ｉ）ＣａｓＸタンパク質、およびＰＣＳＫ９遺伝子に特異的な標的化配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの１つもしくは複数のｇＮＡ、ｉｉ）（ｉ）のＣａｓＸおよびｇＮＡをコードする１つ以上の核酸、ｉｉｉ）（ｉｉ）の１つ以上の核酸を含むベクター、またはｉｖ）（ｉ）のＣａｓＸとｇＮＡとのＲＮＰを含むＶＬＰ、を１つ以上の薬学的に好適な賦形剤とともに含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路のために製剤化される。一実施形態において、医薬組成物は、液体形態または凍結形態である。別の実施形態において、医薬組成物は、単回注射のためのプレフィルドシリンジ内にある。別の実施形態において、医薬組成物は、固体形態であり、例えば、医薬組成物は、凍結乾燥される。
いくつかの実施形態において、本開示は、ｉ）ＣａｓＸタンパク質、およびＰＣＳＫ９遺伝子に特異的な標的化配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの１つもしくは複数のｇＮＡ、ｉｉ）（ｉ）のＣａｓＸおよびｇＮＡをコードする１つ以上の核酸、ｉｉｉ）（ｉｉ）の１つ以上の核酸を含むベクター、またはｉｖ）（ｉ）のＣａｓＸとｇＮＡとのＲＮＰを含むＶＬＰ、を１つ以上の薬学的に好適な賦形剤とともに含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路のために製剤化される。一実施形態において、医薬組成物は、液体形態または凍結形態である。別の実施形態において、医薬組成物は、単回注射のためのプレフィルドシリンジ内にある。別の実施形態において、医薬組成物は、固体形態であり、例えば、医薬組成物は、凍結乾燥される。
別の実施形態において、ＣａｓＸタンパク質、ＰＣＳＫ９遺伝子に対して特異的な標的化配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの１つもしくは複数のＣａｓＸ ｇＮＡと、好適な容器（例えば、チューブ、バイアル、またはプレート）と、を含むキットが本明細書において提供される。例示的な実施形態において、本開示のキットは、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０のうちのいずれか１つのＣａｓＸバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、キットは、ｇＮＡまたはｇＮＡをコードするベクターを含み、ｇＮＡは、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～～２１００、または２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、配列番号２１０１～２２８５からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＮＡは、配列番号２２３６、２２３７、２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、および２２５９～２２８５からなる群から選択される配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＣａｓＸタンパク質とｇＮＡとの編集対を含むキットが本明細書において提供され、表３、５、６、７および９に示される配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０のＣａｓＸバリアントタンパク質と、本明細書に記載のｇＮＡ（例えば、配列番号２１０１～２２８５）と、を含む。例示的な実施形態において、本開示のキットは、ＣａｓＸとｇＮＡとの編集対を含み、ＣａｓＸバリアントは、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、４９０のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子編集対のｇＮＡは、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子編集対のｇＮＡは、配列番号２１０１～２２８５のうちのいずれか１つの足場配列と、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１のうちのいずれか１つの標的化配列と、を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子編集対のｇＮＡは、配列番号２２３６、２２３７、２２３８、２２４１、２２４４、２２４８、２２４９、または２２５９～２２８５のうちのいずれか１つの足場配列と、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１のうちのいずれか１つの標的化配列と、を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、または前述の任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、キットは、遺伝子改変用途に適切なコントロール組成物および使用説明書を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本開示のＣａｓＸタンパク質をコードする配列、本開示のＣａｓＸ ｇＮＡ、任意選択的にドナー鋳型、またはそれらの組み合わせを含むベクターを含む。
ＩＸ．実施形態の列挙
本記述は、多数の例示的な構成、方法、パラメーターなどを記載する。しかしながら、そのような記載は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、例示的な実施形態の記載として提供されることを認識されたい。上記の本主題の実施形態は、単独で、または１つ以上の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示の特定の非限定的な実施形態を以下に提供する。本開示を読んだ際に当業者に明らかになるように、個別に番号付けされた実施形態は各々、先行または後続の個別に番号付けされた実施形態のうちのいずれかと使用されてもよく、またはそれらと組み合わせられてもよい。これは、すべてのかかる実施形態の組み合わせを支援するよう意図されており、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されない。
本記述は、多数の例示的な構成、方法、パラメーターなどを記載する。しかしながら、そのような記載は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、例示的な実施形態の記載として提供されることを認識されたい。上記の本主題の実施形態は、単独で、または１つ以上の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示の特定の非限定的な実施形態を以下に提供する。本開示を読んだ際に当業者に明らかになるように、個別に番号付けされた実施形態は各々、先行または後続の個別に番号付けされた実施形態のうちのいずれかと使用されてもよく、またはそれらと組み合わせられてもよい。これは、すべてのかかる実施形態の組み合わせを支援するよう意図されており、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されない。
本発明は、以下の列挙される例示的な実施形態を参照することによって定義され得る。
実施形態１．ＣａｓＸタンパク質とガイド核酸（ｇＮＡ）とを含むＣａｓＸ：ｇＮＡシステムであって、ｇＮＡが、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子を含む標的核酸配列に相補的な標的化配列を含む、ＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２．ＰＣＳＫ９遺伝子が、１つ以上の変異を含む、実施形態１のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３．ＰＣＳＫ９遺伝子が、１つ以上の変異を含むＰＣＳＫ９タンパク質をコードする、実施形態１または実施形態２のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４．１つ以上の変異が、配列番号３３の配列に対して、Ｓ１２７Ｒ、Ｄ１２９Ｇ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ３７４Ｈ、およびＤ３７４Ｙからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、実施形態３のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５．変異が、機能獲得型変異である、実施形態２～４のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態６．ｇＮＡが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、先行実施形態のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態７．ｇＮＡが、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である、実施形態１～６のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態８．ｇＮＡが、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むキメラである、実施形態１～６のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態９．ｇＮＡが、単一分子ｇＮＡ（ｓｇＮＡ）である、実施形態１～８のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１０．ｇＮＡが、二重分子ｇＮＡ（ｄｇＮＡ）である、実施形態１～８のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１１．ｇＮＡの標的化配列が、ＰＣＳＫ９遺伝子の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列に相補的である、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１２．ｇＮＡの標的化配列が、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列を含む、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１３．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１４．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から２つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１５．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から３つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１６．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から４つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１７．ｇＮＡの標的化配列が、配列の３’末端から５つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１８．ｇＮＡの標的化配列が、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１からなる群から選択される配列に対して少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態１９．ｇＮＡの標的化配列が、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列と比較して、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を有する配列を含む、実施形態１～１０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２０．ｇＮＡの標的化配列が、ＰＣＳＫ９遺伝子の非コード領域に相補的である、実施形態１～１９のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２１．ｇＮＡの標的化配列が、ＰＣＳＫ９遺伝子のコード領域に相補的である、実施形態１～１９のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２２．ｇＮＡの標的化配列が、ＰＣＳＫ９エクソンの配列に相補的である、実施形態１～１９のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２３．ｇＮＡの標的化配列が、ＰＣＳＫ９イントロンの配列に相補的である、実施形態１～１９のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２４．ｇＮＡの標的化配列が、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部の配列に相補的である、実施形態１～１９のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２５．ｇＮＡの標的化配列が、ＰＣＳＫ９調節領域の配列に相補的である、実施形態１～１９のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２６．ｇＮＡの標的化配列が、ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子間領域の配列に相補的である、実施形態１～１９のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２７．第２のｇＮＡをさらに含み、第２のｇＮＡが、先行実施形態のうちのいずれか１つのｇＮＡの標的化配列と比較して、標的核酸配列の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有する、実施形態１～２６のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２８．ｇＮＡが、配列番号４～１６および２１０１～２２８５からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、実施形態１～２７のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態２９．ｇＮＡが、配列番号４～１６の配列からなる群から選択される参照ｇＮＡ配列と比較して、少なくとも１つの改変を有する配列を含む足場を有する、実施形態１～２８のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３０．参照ｇＮＡの少なくとも１つの改変が、ｇＮＡ配列のヌクレオチドの少なくとも１つの置換、欠失、または挿入を含む、実施形態２９のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３１．ｇＮＡが、化学的に改変されている、実施形態１～３０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３２．ＣａｓＸタンパク質が、配列番号１～３のうちのいずれか１つの配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質、配列番号４９～１６０、４３９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、もしくは４９０の配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を含む、実施形態１～３１のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３３．ＣａｓＸタンパク質が、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、およびＣＴＣからなる群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対する結合親和性を有する、実施形態３２のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３４．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号１～３から選択される配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改変を含む、実施形態３２または実施形態３３のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３５．少なくとも１つの改変が、参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、ＣａｓＸバリアントタンパク質のドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、実施形態３４のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３６．ドメインが、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から選択される、実施形態３５のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３７．ＣａｓＸタンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、実施形態３２～３６のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３８．１つ以上のＮＬＳが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２１７）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２２３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２２４）、ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号１６１）、ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号１６２）、ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号１６３）、ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号１６４）、ＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号１６５）、ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号１６６）、ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号１６７）、ＤＲＬＲＲ（配列番号１６８）、ＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号１６９）、ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号１７０）、ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号１７１）、ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号１７２）、ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号１７３）、ＰＲＰＲＫＩＰＲ（配列番号１７４）、ＰＰＲＫＫＲＴＶＶ（配列番号１７５）、ＮＬＳＫＫＫＫＲＫＲＥＫ（配列番号１７６）、ＲＲＰＳＲＰＦＲＫＰ（配列番号１７７）、ＫＲＰＲＳＰＳＳ（配列番号１７８）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＥＲＫＴＲ（配列番号１７９）、ＰＲＰＰＫＭＡＲＹＤＮ（配列番号１８０）、ＫＲＳＦＳＫＡＦ（配列番号１８１）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号１８２）、ＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ（配列番号１８４）、ＲＲＫＫＲＲＰＲＲＫＫＲＲ（配列番号１８７）、ＰＫＫＫＳＲＫＰＫＫＫＳＲＫ（配列番号１８８）、ＨＫＫＫＨＰＤＡＳＶＮＦＳＥＦＳＫ（配列番号１８９）、ＱＲＰＧＰＹＤＲＰＱＲＰＧＰＹＤＲＰ（配列番号１９０）、ＬＳＰＳＬＳＰＬＬＳＰＳＬＳＰＬ（配列番号１９１）、ＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫ（配列番号１９２）、ＰＫＲＧＲＧＲＰＫＲＧＲＧＲ（配列番号１９３）、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号１８５）、ＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１８３）、およびＰＫＫＫＲＫＶＰＰＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１９４）からなる配列の群から選択される、実施形態３７のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態３９．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＣ末端にある、実施形態３７または実施形態３８のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４０．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端にある、実施形態３７または実施形態３８のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４１．１つ以上のＮＬＳが、ＣａｓＸタンパク質のＮ末端およびＣ末端にある、実施形態３７または実施形態３８のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４２．ＣａｓＸバリアントタンパク質およびｇＮＡが、参照ＣａｓＸタンパク質およびｇＮＡと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特性を示す、実施形態３２～４１のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４３．改善された特性が、ＣａｓＸタンパク質の改善されたフォールディング、ｇＮＡに対するＣａｓＸタンパク質の改善された結合親和性、改善されたリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）形成、切断能力のあるＲＮＰの高い割合、標的核酸配列に対する改善された結合親和性、１つ以上のＰＡＭ配列に対する変更された結合親和性、標的核酸配列の改善された巻き戻し、増加した活性、増加した標的核酸配列率、改善された編集効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、ＤＮＡの非標的鎖の改善された結合、改善されたＣａｓＸタンパク質安定性、改善されたタンパク質：ガイドＲＮＡ複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、および改善された融合特性からなる群から選択される、実施形態４２のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４４．ＣａｓＸバリアントの改善された特性が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１．１～約１００，０００倍改善されている、実施形態４２または実施形態４３のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４５．ＣａｓＸバリアントタンパク質の改善された特性が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１０，０００倍改善されている、実施形態４２または実施形態４３のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４６．改善された特性が、標的核酸配列に対する改善された結合親和性である、実施形態４３～４５のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４７．改善された特性が、増加した標的核酸配列切断速度である、実施形態４３～４５のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４８．改善された特性が、１つ以上のＰＡＭ配列に対する増加した結合親和性であり、１つ以上のＰＡＭ配列が、ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、およびＣＴＣからなる群から選択される、実施形態４３～４５のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態４９．ＣａｓＸバリアントタンパク質とｇＮＡとが、ＲＮＰで一緒に会合している、先行実施形態のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５０．ＲＮＰが、参照ＣａｓＸとｇＮＡとのＲＮＰと比較して、切断能力のあるＲＮＰの高い割合を有する、実施形態４９のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５１．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態３２～５０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５２．ＣａｓＸバリアントが、二本鎖標的核酸分子の１つの鎖のみを切断することができる、実施形態５１のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５３．ＣａｓＸバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態１～５０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５４．ＣａｓＸタンパク質が、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質であり、ｄＣａｓＸとｇＮＡとが、標的核酸配列に結合する能力を保持している、実施形態１～４１のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５５．ｄＣａｓＸが、残基：
（ａ）配列番号１の参照ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、Ｅ７６９、および／もしくはＤ９３５、または
（ｂ）配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、Ｅ７５６、および／もしくはＤ９２２、に変異を含む、実施形態５４のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
（ａ）配列番号１の参照ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、Ｅ７６９、および／もしくはＤ９３５、または
（ｂ）配列番号２の参照ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、Ｅ７５６、および／もしくはＤ９２２、に変異を含む、実施形態５４のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５６．変異が、残基におけるアラニンの置換である、実施形態５５のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５７．ドナー鋳型核酸をさらに含む、実施形態１～５３のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５８．ドナー鋳型が、ＰＣＳＫ９遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含み、ＰＣＳＫ９遺伝子部分が、ＰＣＳＫ９エクソン、ＰＣＳＫ９イントロン、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部、ＰＣＳＫ９調節領域、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態５７のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態５９．ドナー鋳型が、標的核酸における切断部位に隣接する配列に相補的な相同アームを含む、実施形態５７または実施形態５８のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態６０．ドナー鋳型が、１０～１５，０００個のヌクレオチドの範囲のサイズである、実施形態５７～５９のＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態６１．ドナー鋳型が、一本鎖ＤＮＡ鋳型または一本鎖ＲＮＡ鋳型である、実施形態５７～６０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態６２．ドナー鋳型が、二本鎖ＤＮＡ鋳型である、実施形態５７～６０のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態６３．ドナー鋳型が、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子と比較して、１つ以上の変異を含む、実施形態５７～６２のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態６４．ドナー鋳型が、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子と比較して、異種配列を含む、実施形態５７～６２のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態６５．ドナー鋳型が、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子の全部または一部を含む、実施形態５７～６２のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム。
実施形態６６．実施形態１～５６のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステムをコードする配列を含む、核酸。
実施形態６７．ＣａｓＸタンパク質をコードする配列が、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態６６の核酸。
実施形態６８．実施形態６６または実施形態６７の核酸を含む、ベクター。
実施形態６９．ベクターが、プロモーターをさらに含む、実施形態６８のベクター。
実施形態７０．ドナー鋳型を含むベクターであって、ドナー鋳型が、ＰＣＳＫ９遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含み、ＰＣＳＫ９遺伝子部分が、ＰＣＳＫ９エクソン、ＰＣＳＫ９イントロン、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部、およびＰＣＳＫ９調節領域からなる群から選択される、ベクター。
実施形態７１．ドナー鋳型が、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子と比較して、１つ以上の変異を含む、実施形態７０のベクター。
実施形態７２．実施形態６６または実施形態６７の核酸をさらに含む、実施形態７０または実施形態７１のベクター。
実施形態７３．ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミドベクター、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される、実施形態６８～７０のうちのいずれか１つのベクター。
実施形態７４．ベクターが、ＡＡＶベクターである、実施形態７３のベクター。
実施形態７５．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、またはＡＡＶＲｈ１０から選択される、実施形態７４のベクター。
実施形態７６．ベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態７３のベクター。
実施形態７７．ＶＬＰをコードするベクターが、ｇａｇポリタンパク質と、実施形態３２～５６のうちのいずれか１つのＣａｓＸタンパク質と、実施形態１～３１のうちのいずれか１つのｇＮＡと、をコードする１つ以上の核酸を含む、実施形態７３のベクター。
実施形態７８．実施形態３２～５６のうちのいずれか１つのＣａｓＸタンパク質と、実施形態１～３１のうちのいずれか１つのｇＮＡと、を含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
実施形態７９．ＣａｓＸタンパク質とｇＮＡとが、ＲＮＰで一緒に会合している、実施形態７８のＶＬＰ。
実施形態８０．ＰＣＳＫ９標的核酸配列を改変する方法であって、本方法が、標的核酸配列を、ＣａｓＸタンパク質と、標的化配列を含むガイド核酸（ｇＮＡ）と、に接触させることを含み、当該接触させることが、細胞に、
ａ）実施形態１～６５のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム、
ｂ）実施形態６６もしくは実施形態６７の核酸、
ｃ）実施形態６８～７７のうちのいずれか１つのベクター、
ｄ）実施形態７８もしくは実施形態７９のＶＬＰ、または
ｅ）それらの組み合わせを導入することを含む、方法
ａ）実施形態１～６５のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム、
ｂ）実施形態６６もしくは実施形態６７の核酸、
ｃ）実施形態６８～７７のうちのいずれか１つのベクター、
ｄ）実施形態７８もしくは実施形態７９のＶＬＰ、または
ｅ）それらの組み合わせを導入することを含む、方法
実施形態８１．当該接触させることが、ＣａｓＸタンパク質によってＰＣＳＫ９標的核酸配列の改変をもたらす。
実施形態８２．ＣａｓＸタンパク質とｇＮＡとが、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）で一緒に会合している、実施形態８０の方法。
実施形態８３．第２のｇＮＡまたは第２のｇＮＡをコードする核酸をさらに含み、第２のｇＮＡが、標的核酸配列またはその相補体の異なる部分に相補的な標的化配列を有する、実施形態８０または実施形態８１の方法。
実施形態８４．ＰＣＳＫ９遺伝子が、変異を含む、実施形態８０～８２のうちのいずれか１つの方法。
実施形態８５．変異が、機能獲得型変異である、実施形態８３の方法。
実施形態８６．ＰＣＳＫ９遺伝子が、野生型配列を含む、実施形態８０～８２のうちのいずれか１つの方法。
実施形態８７．改変することが、標的核酸配列に二本鎖切断を導入することを含む、実施形態８０～８５のうちのいずれか１つの方法。
実施形態８８．改変することが、標的核酸配列に二本鎖切断を導入することを含む、実施形態８０～８５のうちのいずれか１つの方法。
実施形態８９．改変することが、野生型配列と比較して、標的核酸配列に１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含む、実施形態８０～８７のうちのいずれか１つの方法。
実施形態９０．標的核酸配列の改変が、細胞の内部で生じる、実施形態８０～８８のうちのいずれか１つの方法。
実施形態９１．標的核酸配列の改変が、インビボで生じる、実施形態８０～８９のうちのいずれか１つの方法。
実施形態９２．細胞が、真核生物細胞である、実施形態８０～９０のうちのいずれか１つの方法。
実施形態９３．真核生物細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ブタ細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、実施形態９１の方法。
実施形態９４．真核生物細胞が、ヒト細胞である、実施形態９２の方法。
実施形態９５．細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、実施形態８０～９４のうちのいずれか１つの方法。
実施形態９６．方法が、標的核酸配列を、ＰＣＳＫ９遺伝子の少なくとも一部に相補的なドナー鋳型と接触させることをさらに含み、ドナー鋳型が、標的核酸配列に挿入されて、標的核酸配列の全部または一部を置き換える、実施形態８０～９４のうちのいずれか１つの方法。
実施形態９７．ドナー鋳型が、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子配列と比較して１つ以上の変異を含み、挿入が、ＰＣＳＫ９遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらす、実施形態９６の方法。
実施形態９８．ドナー鋳型が、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子配列の全部または一部を含み、挿入が、ＰＣＳＫ９遺伝子の１つ以上の変異を修正する、実施形態９６の方法。
実施形態９９．ドナー鋳型が、１０～１５，０００個のヌクレオチドの範囲のサイズである、実施形態９６～９８のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１００．ドナー鋳型が、１００～１，０００個のヌクレオチドの範囲のサイズである、実施形態９６～９８のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０１．ドナー鋳型が、一本鎖ＤＮＡ鋳型または一本鎖ＲＮＡ鋳型である、実施形態９６～１００のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０２．ドナー鋳型が、二本鎖ＤＮＡ鋳型である、実施形態９６～１００のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０３．ドナー鋳型が、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって挿入される、実施形態９６～１０２のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０４．ベクターが、対象に、治療有効用量で投与される、実施形態８０～１０３のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０５．対象が、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される、実施形態１０４の方法。
実施形態１０６．対象がヒトである、実施形態１０４の方法。
実施形態１０７．ベクターが、少なくとも約１×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）、または少なくとも約１×１０１１ｖｇ、または少なくとも約１×１０１２ｖｇ、または少なくとも約１×１０１３ｖｇ、または少なくとも約１×１０１４ｖｇ、または少なくとも約１×１０１５ｖｇ、または少なくとも約１×１０１６ｖｇの用量で投与される、実施形態８０～１０６のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０８．ベクターが、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、実施形態８０～１０６のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０９．標的核酸配列を、追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質、または追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドとさらに接触させることを含む、実施形態８０～１０８のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１１０．追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質が、先行実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸタンパク質とは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である、実施形態１０９の方法。
実施形態１１１．追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＣａｓＸタンパク質ではない、実施形態１０９の方法。
実施形態１１２．細胞のＰＣＳＫ９標的核酸配列を変更する方法であって、当該細胞を、
ａ）実施形態１～６５のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム、
ｂ）実施形態６６もしくは実施形態６７の核酸、
ｃ）実施形態６８～７７のうちのいずれか１つのベクター、
ｄ）実施形態７８もしくは実施形態７９のＶＬＰ、または
ｅ）それらの組み合わせと接触させることを含む、方法。
ａ）実施形態１～６５のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム、
ｂ）実施形態６６もしくは実施形態６７の核酸、
ｃ）実施形態６８～７７のうちのいずれか１つのベクター、
ｄ）実施形態７８もしくは実施形態７９のＶＬＰ、または
ｅ）それらの組み合わせと接触させることを含む、方法。
実施形態１１３．細胞が、ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少されるように改変されている、実施形態１１２の方法。
実施形態１１４．細胞が、細胞が検出可能なレベルのＰＣＳＫ９タンパク質を発現しないように改変されている、実施形態１１２または実施形態１１３の方法。
実施形態１１５．実施形態１１２または実施形態１１３の方法によって改変された細胞集団であって、細胞が、改変された細胞の少なくとも１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が、検出可能なレベルのＰＣＳＫ９タンパク質を発現しないように改変されている、細胞集団。
実施形態１１６．細胞が、非霊長類哺乳動物細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、実施形態１１５の細胞集団。
実施形態１１７．細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、実施形態１１５または実施形態１１６の細胞集団。
実施形態１１８．ＰＣＳＫ９関連障害の治療を必要とする対象におけるＰＣＳＫ９関連障害を治療する方法であって、対象の細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子を改変することを含み、改変することが、当該細胞を、
ａ）実施形態１～６５のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム、
ｂ）実施形態６６もしくは実施形態６７の核酸、
ｃ）実施形態６８～７７のうちのいずれか１つのベクター、
ｄ）実施形態７８もしくは実施形態７９のＶＬＰ、または
ｅ）それらの組み合わせ、のいずれかと接触させることを含む、方法。
ａ）実施形態１～６５のうちのいずれか１つのＣａｓＸ：ｇＮＡシステム、
ｂ）実施形態６６もしくは実施形態６７の核酸、
ｃ）実施形態６８～７７のうちのいずれか１つのベクター、
ｄ）実施形態７８もしくは実施形態７９のＶＬＰ、または
ｅ）それらの組み合わせ、のいずれかと接触させることを含む、方法。
実施形態１１９．ＰＣＳＫ９関連障害が、常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）、高コレステロール血症、増加したＬＤＬ、アテローム性動脈硬化性心血管疾患、および冠状動脈疾患からなる群から選択される、実施形態１１８の方法。
実施形態１２０．第２のｇＮＡまたは第２のｇＮＡをコードする核酸をさらに含み、第２のｇＮＡが、標的核酸配列の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有する、実施形態１１８または実施形態１１９の方法。
実施形態１２１．改変することが、ＰＣＳＫ９遺伝子に１つ以上の変異を導入するか、またはＰＣＳＫ９タンパク質の発現が、阻害または抑制される、実施形態１１８～１２０のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１２２．方法が、細胞を実施形態５７～６５のうちのいずれか１つのドナー鋳型と接触させることを含む、実施形態１１８～１２１のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１２３．細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、実施形態１１８～１２２のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１２４．ベクターが、対象に、治療有効用量で投与される、実施形態１１８～１２３のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１２５．対象が、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される、実施形態１２４の方法。
実施形態１２６．対象がヒトである、実施形態１２４の方法。
実施形態１２７．ベクターが、対象に、少なくとも約１×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）、または少なくとも約１×１０１１ｖｇ、または少なくとも約１×１０１２ｖｇ、または少なくとも約１×１０１３ｖｇ、または少なくとも約１×１０１４ｖｇ、または少なくとも約１×１０１５ｖｇ、または少なくとも約１×１０１６ｖｇの用量で投与される、実施形態１１８～１２６のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１２８．ベクターが、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、実施形態１１８～１２７のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１２９．標的核酸配列を、追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質、または追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドとさらに接触させることを含む、実施形態１１８～１２８のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１３０．追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質が、先行実施形態のうちのいずれかのＣａｓＸとは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である、実施形態１２９の方法。
実施形態１３１．追加のＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＣａｓＸタンパク質ではない、実施形態１３０の方法。
実施形態１３２．方法が、化学療法剤を投与することをさらに含む、実施形態１１８～１３１のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１３３．方法が、ＬＤＬコレステロールのベースラインからの変化割合、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の減少（ＡＳＣＶＤ）、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、および不安定な扁桃炎からなる群から選択された少なくとも１つの臨床的に関連するエンドポイントにおける改善をもたらす、実施形態１１８～１３２のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１３４．方法が、ＬＤＬコレステロールのベースラインからの変化割合、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の減少（ＡＳＣＶＤ）、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、または不安定な扁桃炎からなる群から選択された少なくとも２つの臨床的に関連するエンドポイントにおける改善をもたらす、実施形態１１８～１３２のうちのいずれか１つの方法。
以下の実施例は、単に例示的なものであり、本開示のいかなる態様を決して限定することを意図するものではない。
実施例１：ＣａｓＸ Ｓｔｘ２の作製、発現、および精製
１．増殖および発現
Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに由来するＣａｓＸ Ｓｔｘ２（本明細書ではＣａｓＸ２とも称される）の発現構築物（以下の配列番号２のＣａｓＸアミノ酸配列を有し、配列番号４３７の配列によってコードされる）を、Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化した遺伝子断片（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から構築した。組み立てた構築物は、ＴＥＶ切断可能なＣ末端ＴｗｉｎＳｔｒｅｐタグを含み、この構築物を、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２誘導体プラスミド骨格にクローニングした。発現構築物を化学的コンピテントＢＬ２１＊（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、種培養物を、ＵｌｔｒａＹｉｅｌｄフラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）内で、カルベニシリンを補充したＬＢブロス中、３７℃、２００ＲＰＭで一晩増殖させた。翌日、この培養物を使用して、１：１００（種培養物：発現培養物）の比率で発現培養物を播種した。発現培養物はカルベニシリンを補充したＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｎｏｖａｇｅｎ）であり、この発現培養物をＵｌｔｒａＹｉｅｌｄフラスコ内で、３７℃、２００ＲＰＭで増殖させた。培養物が２の光学密度（ＯＤ）に達した時点で、それらを１６℃に冷却し、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加して、１Ｍストックから１ｍＭの最終濃度にした。培養物を１６℃、２００ＲＰＭで２０時間誘発した後、４℃で１５分間にわたる４，０００×ｇでの遠心分離によって回収した。細胞ペーストを秤量し、細胞ペースト１グラム当たり５ｍＬの溶解緩衝液の比率で溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１ｍＭベンズアミジン塩酸塩、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％ＣＨＡＰＳ、１０％グリセロール、ｐＨ８）中に再懸濁した。再懸濁した時点で、精製するまで試料を－８０℃で凍結させた。
１．増殖および発現
Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓに由来するＣａｓＸ Ｓｔｘ２（本明細書ではＣａｓＸ２とも称される）の発現構築物（以下の配列番号２のＣａｓＸアミノ酸配列を有し、配列番号４３７の配列によってコードされる）を、Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化した遺伝子断片（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から構築した。組み立てた構築物は、ＴＥＶ切断可能なＣ末端ＴｗｉｎＳｔｒｅｐタグを含み、この構築物を、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２誘導体プラスミド骨格にクローニングした。発現構築物を化学的コンピテントＢＬ２１＊（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、種培養物を、ＵｌｔｒａＹｉｅｌｄフラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）内で、カルベニシリンを補充したＬＢブロス中、３７℃、２００ＲＰＭで一晩増殖させた。翌日、この培養物を使用して、１：１００（種培養物：発現培養物）の比率で発現培養物を播種した。発現培養物はカルベニシリンを補充したＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｎｏｖａｇｅｎ）であり、この発現培養物をＵｌｔｒａＹｉｅｌｄフラスコ内で、３７℃、２００ＲＰＭで増殖させた。培養物が２の光学密度（ＯＤ）に達した時点で、それらを１６℃に冷却し、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加して、１Ｍストックから１ｍＭの最終濃度にした。培養物を１６℃、２００ＲＰＭで２０時間誘発した後、４℃で１５分間にわたる４，０００×ｇでの遠心分離によって回収した。細胞ペーストを秤量し、細胞ペースト１グラム当たり５ｍＬの溶解緩衝液の比率で溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１ｍＭベンズアミジン塩酸塩、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５％ＣＨＡＰＳ、１０％グリセロール、ｐＨ８）中に再懸濁した。再懸濁した時点で、精製するまで試料を－８０℃で凍結させた。
２．精製
凍結した試料を磁気撹拌しながら４℃で一晩解凍した。結果として得られた溶解物の粘度を超音波処理によって低減させ、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して１７ｋ ＰＳＩで３回通過させて均質化することによって溶解を完了した。溶解物を４℃で３０分間にわたる５０，０００×ｇでの遠心分離によって清澄化し、上清を回収した。清澄化した上清を重力流によりＨｅｐａｒｉｎ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。カラムを、５ＣＶのヘパリン緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄し、その後、５ＣＶのヘパリン緩衝液Ｂ（緩衝液ＡのＮａＣｌ濃度を５００ｍＭに調整したもの）で洗浄した。タンパク質を、５ＣＶのヘパリン緩衝液Ｃ（緩衝液ＡのＮａＣｌ濃度を１Ｍに調整したもの）で溶出し、画分を収集した。画分をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによってタンパク質についてアッセイし、タンパク質含有画分をプールした。プールしたヘパリン溶出液を重力流によってＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＩＢＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。カラムを、５ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄した。タンパク質を、５０ｍＭのＤ－ビオチンを添加した５ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液を使用してカラムから溶出し、画分を収集した。ＣａｓＸ含有画分をプールし、３０ｋＤａのカットオフスピンコンセントレーターを使用して４℃で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。カラムを、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって操作されるＳＥＣ緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ７．２５）で平衡化した。適切な分子量で溶出したＣａｓＸ含有画分をプールし、３０ｋＤａのカットオフスピンコンセントレーターを使用して４℃で濃縮し、アリコートし、液体窒素中で急速凍結した後、－８０℃で保管した。
凍結した試料を磁気撹拌しながら４℃で一晩解凍した。結果として得られた溶解物の粘度を超音波処理によって低減させ、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３（Ａｖｅｓｔｉｎ）を使用して１７ｋ ＰＳＩで３回通過させて均質化することによって溶解を完了した。溶解物を４℃で３０分間にわたる５０，０００×ｇでの遠心分離によって清澄化し、上清を回収した。清澄化した上清を重力流によりＨｅｐａｒｉｎ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。カラムを、５ＣＶのヘパリン緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄し、その後、５ＣＶのヘパリン緩衝液Ｂ（緩衝液ＡのＮａＣｌ濃度を５００ｍＭに調整したもの）で洗浄した。タンパク質を、５ＣＶのヘパリン緩衝液Ｃ（緩衝液ＡのＮａＣｌ濃度を１Ｍに調整したもの）で溶出し、画分を収集した。画分をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによってタンパク質についてアッセイし、タンパク質含有画分をプールした。プールしたヘパリン溶出液を重力流によってＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ ＸＴ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラム（ＩＢＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用した。カラムを、５ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８）で洗浄した。タンパク質を、５０ｍＭのＤ－ビオチンを添加した５ＣＶのＳｔｒｅｐ緩衝液を使用してカラムから溶出し、画分を収集した。ＣａｓＸ含有画分をプールし、３０ｋＤａのカットオフスピンコンセントレーターを使用して４℃で濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。カラムを、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって操作されるＳＥＣ緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ７．２５）で平衡化した。適切な分子量で溶出したＣａｓＸ含有画分をプールし、３０ｋＤａのカットオフスピンコンセントレーターを使用して４℃で濃縮し、アリコートし、液体窒素中で急速凍結した後、－８０℃で保管した。
３．結果
図１および図３に示されるように、精製を通して得られた試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、コロイド状クーマシー染色によって視覚化した。図１では、レーンは、左から右に、分子量標準、ペレット：細胞溶解後の不溶性部分、溶解物：細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー：ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄：洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー：ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎＸＴカラムに結合しなかったタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴカラムから溶出したタンパク質、注入：ｓ２００ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結：濃縮して凍結させたｓ２００溶出からのプールした画分である。図３では、レーンは、右から左に、注入（ゲル濾過カラムに注入したタンパク質の試料）分子量マーカーであり、レーン３～９は、指定した溶出体積からの試料である。ゲル濾過の結果を図２に示す。６８．３６ｍＬのピークは、ＣａｓＸの見かけの分子量に対応し、ＣａｓＸタンパク質の大部分を含有した。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、平均収量は、７５％の純度で培養液１リットル当たり０．７５ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。
図１および図３に示されるように、精製を通して得られた試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、コロイド状クーマシー染色によって視覚化した。図１では、レーンは、左から右に、分子量標準、ペレット：細胞溶解後の不溶性部分、溶解物：細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー：ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄：洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー：ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎＸＴカラムに結合しなかったタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴカラムから溶出したタンパク質、注入：ｓ２００ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結：濃縮して凍結させたｓ２００溶出からのプールした画分である。図３では、レーンは、右から左に、注入（ゲル濾過カラムに注入したタンパク質の試料）分子量マーカーであり、レーン３～９は、指定した溶出体積からの試料である。ゲル濾過の結果を図２に示す。６８．３６ｍＬのピークは、ＣａｓＸの見かけの分子量に対応し、ＣａｓＸタンパク質の大部分を含有した。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、平均収量は、７５％の純度で培養液１リットル当たり０．７５ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。
実施例２：ＣａｓＸ構築物１１９、４３８、および４５７
ＣａｓＸ １１９、４３８、および４５７構築物（表５の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ ３７構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ａ７０８Ｋ置換および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的化配列を有する実施例１のＳｔｘ２構築物に基づく）を、標準クローニング法を使用して、哺乳動物発現プラスミド（ｐＳｔＸ、図４を参照されたい）にクローニングした。ＣａｓＸ １１９を構築するために、ＣａｓＸ ３７構築物ＤＮＡを、それぞれ、プライマーｏＩＣ５３９およびｏＩＣ８８ならびにｏＩＣ８７およびｏＩＣ５４０を使用して、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用した２つの反応でＰＣＲ増幅した（図５を参照されたい）。ＣａｓＸ ４５７を構築するために、ＣａｓＸ ３６５構築物ＤＮＡを、それぞれ、プライマーｏＩＣ５３９およびｏＩＣ２１２、ｏＩＣ２１１およびｏＩＣ３７６、ｏＩＣ３７５およびｏＩＣ５５１、ならびにｏＩＣ５５０およびｏＩＣ５４０を使用して、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用した４つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ ４３８を構築するために、ＣａｓＸ １１９構築物ＤＮＡを、それぞれ、プライマーｏＩＣ５３９およびｏＩＣ６８９、ｏＩＣ６８８およびｏＩＣ３７６、ｏＩＣ３７５およびｏＩＣ５５１、ならびにｏＩＣ５５０およびｏＩＣ５４０を使用して、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用した４つの反応でＰＣＲ増幅した。次に、得られたＰＣＲ増幅産物をＺｙｍｏｃｌｅａｎ ＤＮＡクリーンおよびコンセントレーター（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号４０１４）を使用して精製し、ｐＳｔＸ骨格をＸｂａＩおよびＳｐｅＩを使用して消化した。消化した骨格断片を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製し、次いでギブソンアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用して３つの断片を１つにした。ｐＳｔｘ３４において組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、化学的コンピテントまたは電気的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的化配列ＤＮＡを、標的化配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクでｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップし、得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９コントロールプラスミドを、ｐＳｔＸのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製した。ＣａｓＸ １１９および４５７タンパク質の発現および回収を、実施例１の一般的な方法論を使用して行った（しかしながら、ＤＮＡ配列をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化した）。ＣａｓＸ １１９の分析アッセイの結果を図６～８に示す。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、ＣａｓＸ １１９の平均収量は、７５％の純度で培養液１リットル当たり１．５６ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。図６は、記載されるように、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）ゲル上で視覚化された、精製試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。レーンは、左から右に、ペレット：細胞溶解後の不溶性部分、溶解物：細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー：ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄：洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー：ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎＸＴカラムに結合しなかったタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴカラムから溶出したタンパク質、注入：ｓ２００ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結：濃縮して凍結させたｓ２００溶出からのプールした画分である。
ＣａｓＸ １１９、４３８、および４５７構築物（表５の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ ３７構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードし、Ａ７０８Ｋ置換および融合ＮＬＳによる［Ｐ７９３］欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的化配列を有する実施例１のＳｔｘ２構築物に基づく）を、標準クローニング法を使用して、哺乳動物発現プラスミド（ｐＳｔＸ、図４を参照されたい）にクローニングした。ＣａｓＸ １１９を構築するために、ＣａｓＸ ３７構築物ＤＮＡを、それぞれ、プライマーｏＩＣ５３９およびｏＩＣ８８ならびにｏＩＣ８７およびｏＩＣ５４０を使用して、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用した２つの反応でＰＣＲ増幅した（図５を参照されたい）。ＣａｓＸ ４５７を構築するために、ＣａｓＸ ３６５構築物ＤＮＡを、それぞれ、プライマーｏＩＣ５３９およびｏＩＣ２１２、ｏＩＣ２１１およびｏＩＣ３７６、ｏＩＣ３７５およびｏＩＣ５５１、ならびにｏＩＣ５５０およびｏＩＣ５４０を使用して、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用した４つの反応でＰＣＲ増幅した。ＣａｓＸ ４３８を構築するために、ＣａｓＸ １１９構築物ＤＮＡを、それぞれ、プライマーｏＩＣ５３９およびｏＩＣ６８９、ｏＩＣ６８８およびｏＩＣ３７６、ｏＩＣ３７５およびｏＩＣ５５１、ならびにｏＩＣ５５０およびｏＩＣ５４０を使用して、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼを使用した４つの反応でＰＣＲ増幅した。次に、得られたＰＣＲ増幅産物をＺｙｍｏｃｌｅａｎ ＤＮＡクリーンおよびコンセントレーター（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号４０１４）を使用して精製し、ｐＳｔＸ骨格をＸｂａＩおよびＳｐｅＩを使用して消化した。消化した骨格断片を、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号Ｄ４００２）を使用して１％アガロースゲル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏ、カタログ番号Ａ－２０１－５００）からゲル抽出によって精製し、次いでギブソンアセンブリ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｅ２６２１Ｓ）を使用して３つの断片を１つにした。ｐＳｔｘ３４において組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、化学的コンピテントまたは電気的コンピテントＴｕｒｂｏ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。標的化配列ＤＮＡを、標的化配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文した。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって個別にまたはバルクでｐＳｔＸにクローニングした。Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ産物を、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングした、ＮＥＢ Ｔｕｒｂｏ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｃ２９８４Ｉ）などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップし、得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９コントロールプラスミドを、ｐＳｔＸのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製した。ＣａｓＸ １１９および４５７タンパク質の発現および回収を、実施例１の一般的な方法論を使用して行った（しかしながら、ＤＮＡ配列をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン最適化した）。ＣａｓＸ １１９の分析アッセイの結果を図６～８に示す。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、ＣａｓＸ １１９の平均収量は、７５％の純度で培養液１リットル当たり１．５６ｍｇの精製ＣａｓＸタンパク質であった。図６は、記載されるように、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）ゲル上で視覚化された、精製試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。レーンは、左から右に、ペレット：細胞溶解後の不溶性部分、溶解物：細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー：ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄：洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー：ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎＸＴカラムに結合しなかったタンパク質、溶出：溶出緩衝液を用いてＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ ＸＴカラムから溶出したタンパク質、注入：ｓ２００ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結：濃縮して凍結させたｓ２００溶出からのプールした画分である。
図７は、記載されるように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００ ｐｇゲル濾過のクロマトグラムを示す。溶出体積に対して２８０ｎｍの吸光度としてプロットしたＣａｓＸバリアント１１９タンパク質のゲル濾過泳動。６５．７７ｍＬのピークは、ＣａｓＸバリアント１１９の見かけの分子量に対応し、ＣａｓＸバリアント１１９タンパク質の大部分を含有した。図８は、記載されるように、コロイド状クーマシーで染色したゲル濾過使用のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。指定した画分由来の試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、コロイド状クーマシーで染色した。右から左に、注入：ゲル濾過カラムに注入したタンパク質の試料、分子量マーカー、レーン３～１０：指定した溶出体積からの試料。
実施例３：ＣａｓＸ構築物４８８および４９１
ＣａｓＸ ４８８構築物（表６の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードする実施例１の野生型ＣａｓＸ Ｓｔｘ２構築物に基づいており、Ａ７０８Ｋ置換、Ｌ３７９Ｒ置換、および［Ｐ７９３］欠失を有し、融合したＮＬＳ、ならびに連結したガイド配列および非標的化配列を伴う）を、出発構築物として利用し、実施例２の方法論を使用して生成した。ＣａｓＸ ４９１（表６の配列）を生成するために、ＣａｓＸ ４８４構築物ＤＮＡを、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してＰＣＲ増幅し、出発構築物として利用し、実施例２の方法論を使用して生成した（図５を参照されたい）。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的の遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、実施例２に記載されるように、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９コントロールプラスミドを、ｐＳｔＸのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製した。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の標的化配列は、文献から得たものまたは確立された方法に従って合理的に設計したもののいずれかであった。ＣａｓＸ構築物の発現および回収を、実施例１および実施例２の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
ＣａｓＸ ４８８構築物（表６の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９構築物（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ ＣａｓＸ配列番号２をコードする実施例１の野生型ＣａｓＸ Ｓｔｘ２構築物に基づいており、Ａ７０８Ｋ置換、Ｌ３７９Ｒ置換、および［Ｐ７９３］欠失を有し、融合したＮＬＳ、ならびに連結したガイド配列および非標的化配列を伴う）を、出発構築物として利用し、実施例２の方法論を使用して生成した。ＣａｓＸ ４９１（表６の配列）を生成するために、ＣａｓＸ ４８４構築物ＤＮＡを、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０４９１Ｌ）を使用してＰＣＲ増幅し、出発構築物として利用し、実施例２の方法論を使用して生成した（図５を参照されたい）。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的の遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、実施例２に記載されるように、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９コントロールプラスミドを、ｐＳｔＸのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製した。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の標的化配列は、文献から得たものまたは確立された方法に従って合理的に設計したもののいずれかであった。ＣａｓＸ構築物の発現および回収を、実施例１および実施例２の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
実施例４：ＣａｓＸ構築物２７８～２８０、２８５～２８８、２９０、２９１、２９３、３００、４９２、および４９３の設計および生成
ＣａｓＸ ２７８～２８０、２８５～２８８、２９０、２９１、２９３、３００、４９２、および４９３構築物（表７の配列）を生成するために、哺乳動物発現ベクターにおけるコドン最適化ＣａｓＸ １１９構築物（実施例２のＣａｓＸ Ｓｔｘ３７構築物に基づく）のＮ末端およびＣ末端を操作して、ＮＬＳ配列（表８の配列）を削除または付加した。構築物２７８、２７９、および２８０は、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列のみを使用したＮ末端およびＣ末端の操作物であった。構築物２８０は、Ｎ末端にＮＬＳを有さず、Ｃ末端に２つのＳＶ４０ ＮＬＳ’が付加されており、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列間にトリプルプロリンリンカーを有した。構築物４９２および４９３を生成するために、構築物２８０および２９１を出発構築物として使用した。クローニング方法は、実施例２に記載のように行った。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的の遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計し、実施例２に記載されるように調製した。これらのプラスミドを、実施例１および実施例２の一般的な方法論を利用してＣａｓＸタンパク質を産生および回収するために使用した。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化スペーサー配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。ＣａｓＸ構築物の発現および回収を、実施例１および実施例２の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
ＣａｓＸ ２７８～２８０、２８５～２８８、２９０、２９１、２９３、３００、４９２、および４９３構築物（表７の配列）を生成するために、哺乳動物発現ベクターにおけるコドン最適化ＣａｓＸ １１９構築物（実施例２のＣａｓＸ Ｓｔｘ３７構築物に基づく）のＮ末端およびＣ末端を操作して、ＮＬＳ配列（表８の配列）を削除または付加した。構築物２７８、２７９、および２８０は、ＳＶ４０ ＮＬＳ配列のみを使用したＮ末端およびＣ末端の操作物であった。構築物２８０は、Ｎ末端にＮＬＳを有さず、Ｃ末端に２つのＳＶ４０ ＮＬＳ’が付加されており、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列間にトリプルプロリンリンカーを有した。構築物４９２および４９３を生成するために、構築物２８０および２９１を出発構築物として使用した。クローニング方法は、実施例２に記載のように行った。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的の遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計し、実施例２に記載されるように調製した。これらのプラスミドを、実施例１および実施例２の一般的な方法論を利用してＣａｓＸタンパク質を産生および回収するために使用した。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化スペーサー配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。ＣａｓＸ構築物の発現および回収を、実施例１および実施例２の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
実施例５：ＣａｓＸ構築物３８７、３９５、４８５～４９１、および４９４の設計および生成
ＣａｓＸ ３９５、ＣａｓＸ ４８５、ＣａｓＸ ４８６、ＣａｓＸ ４８７を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９（実施例２のＣａｓＸ ３７構築物に基づく）を出発構築物として使用した。ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４は、同様に、実施例２のＣａｓＸ １１９構築物に同様に基づいて、それ自体のベクターにおけるアミノ酸１９２～３３１からのＣａｓＸ配列番号１ヘリカルＩドメインを増幅するように設計されたギブソンプライマーを用いて、この対応する領域（ａａ１９３～３３２）をそれぞれｐＳｔｘ１におけるＣａｓＸ １１９、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４で置き換えた。ＣａｓＸ ４８８、ＣａｓＸ ４８９、ＣａｓＸ ４９０、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４、およびＣａｓＸ ４９１（表９の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９（実施例２のＣａｓＸ ３７構築物に基づく）をそれぞれ４ｋｂステージングにクローン化し、ギブソンプライマーは、それ自体のベクターにおけるアミノ酸１０１～１９１のＣａｓＸ Ｓｔｘ１ ＮＴＳＢドメインおよびアミノ酸１９２～３３１のヘリカルＩドメインを増幅するように設計され、この類似領域（ａａ１０３～３３２）をそれぞれｐＳｔｘ１におけるＣａｓＸ １１９、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４で置き換えた。これらのプラスミドを、実施例１および実施例２の一般的な方法論を利用してＣａｓＸタンパク質を産生および回収するために使用した。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化スペーサー配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。ＣａｓＸ構築物の発現および回収を、実施例１および実施例２の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
ＣａｓＸ ３９５、ＣａｓＸ ４８５、ＣａｓＸ ４８６、ＣａｓＸ ４８７を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９（実施例２のＣａｓＸ ３７構築物に基づく）を出発構築物として使用した。ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４は、同様に、実施例２のＣａｓＸ １１９構築物に同様に基づいて、それ自体のベクターにおけるアミノ酸１９２～３３１からのＣａｓＸ配列番号１ヘリカルＩドメインを増幅するように設計されたギブソンプライマーを用いて、この対応する領域（ａａ１９３～３３２）をそれぞれｐＳｔｘ１におけるＣａｓＸ １１９、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４で置き換えた。ＣａｓＸ ４８８、ＣａｓＸ ４８９、ＣａｓＸ ４９０、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４、およびＣａｓＸ ４９１（表９の配列）を生成するために、コドン最適化ＣａｓＸ １１９（実施例２のＣａｓＸ ３７構築物に基づく）をそれぞれ４ｋｂステージングにクローン化し、ギブソンプライマーは、それ自体のベクターにおけるアミノ酸１０１～１９１のＣａｓＸ Ｓｔｘ１ ＮＴＳＢドメインおよびアミノ酸１９２～３３１のヘリカルＩドメインを増幅するように設計され、この類似領域（ａａ１０３～３３２）をそれぞれｐＳｔｘ１におけるＣａｓＸ １１９、ＣａｓＸ ４３５、ＣａｓＸ ４３８、およびＣａｓＸ ４８４で置き換えた。これらのプラスミドを、実施例１および実施例２の一般的な方法論を利用してＣａｓＸタンパク質を産生および回収するために使用した。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化スペーサー配列をコードする配列を、ＣａｓＸ ＰＡＭ位置に基づいて設計した。ＣａｓＸ構築物の発現および回収を、実施例１および実施例２の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
実施例６：ＲＮＡガイドの生成
ＲＮＡ単一ガイドおよびスペーサーの生成について、インビトロ転写のための鋳型を、推奨プロトコルに従ってＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ Ｍ０４９１）を用いてＰＣＲを行うことによって生成し、鋳型オリゴは各骨格に対するものであり、増幅プライマーはＴ７プロモーターおよびスペーサー配列を有した。Ｔ７プロモーターに対するＤＮＡプライマー配列、ガイドおよびスペーサーに対するガイドおよびスペーサーを以下の表１０に提示する。各足場に対する「骨格ｆｗｄ」および「骨格ｒｅｖ」とラベル付けした鋳型オリゴは各々、２０ｎＭの最終濃度で含まれ、増幅プライマー（Ｔ７プロモーターおよび特有のスペーサープライマー）は各々、１ｕＭの最終濃度で含まれた。ｓｇ２、ｓｇ３２、ｓｇ６４、およびｓｇ１７４ガイドは、転写効率を増加させるためにｓｇ２、ｓｇ３２、およびｓｇ６４を追加の５’Ｇで改変したことを除いて、それぞれ、配列番号５、２１０４、２１０６、および２２３８に対応する（表１０の配列を表２と比較する）。７．３７スペーサーは、ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を標的とする。ＰＣＲ増幅後、鋳型をフェノール－クロロホルム－イソアミルアルコール抽出により洗浄および単離し、その後、エタノールで沈殿させた。
ＲＮＡ単一ガイドおよびスペーサーの生成について、インビトロ転写のための鋳型を、推奨プロトコルに従ってＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ Ｍ０４９１）を用いてＰＣＲを行うことによって生成し、鋳型オリゴは各骨格に対するものであり、増幅プライマーはＴ７プロモーターおよびスペーサー配列を有した。Ｔ７プロモーターに対するＤＮＡプライマー配列、ガイドおよびスペーサーに対するガイドおよびスペーサーを以下の表１０に提示する。各足場に対する「骨格ｆｗｄ」および「骨格ｒｅｖ」とラベル付けした鋳型オリゴは各々、２０ｎＭの最終濃度で含まれ、増幅プライマー（Ｔ７プロモーターおよび特有のスペーサープライマー）は各々、１ｕＭの最終濃度で含まれた。ｓｇ２、ｓｇ３２、ｓｇ６４、およびｓｇ１７４ガイドは、転写効率を増加させるためにｓｇ２、ｓｇ３２、およびｓｇ６４を追加の５’Ｇで改変したことを除いて、それぞれ、配列番号５、２１０４、２１０６、および２２３８に対応する（表１０の配列を表２と比較する）。７．３７スペーサーは、ベータ２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を標的とする。ＰＣＲ増幅後、鋳型をフェノール－クロロホルム－イソアミルアルコール抽出により洗浄および単離し、その後、エタノールで沈殿させた。
インビトロ転写を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、２ｍＭスペルミジン、２０ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＮＴＰ、０．５μＭ鋳型、および１００μｇ／ｍＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを含有する緩衝液中で行った。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。転写体積１ｍＬ当たり２０単位のＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｍ６１０１））を添加し、１時間インキュベートした。ＲＮＡ産物を変性ＰＡＧＥにより精製し、エタノールで沈殿させ、１倍リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁した。ｓｇＲＮＡを折り畳むために、試料を７０℃で５分間加熱し、その後、室温に冷却した。反応物に１ｍＭの最終ＭｇＣｌ２濃度を補充し、５０℃で５分間加熱し、その後、室温に冷却した。最終ＲＮＡガイド産物を－８０℃で保管した。
実施例７：ＲＮＰアセンブリ
ＣａｓＸの精製した野生型およびＲＮＰならびに単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、実験の直前に調製するか、または後で使用するために調製し、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保管するかのいずれかを行った。ＲＮＰ複合体を調製するために、ＣａｓＸタンパク質をｓｇＲＮＡと１：１．２のモル比でインキュベートした。簡潔には、ｓｇＲＮＡを、緩衝液番号１（２５ｍＭ ＮａＰｉ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭトレハロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に添加し、その後、ＣａｓＸをｓｇＲＮＡ溶液にゆっくり旋回させながら添加し、３７℃で１０分間インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成した。ＲＮＰ複合体を、使用前に、２００μｌの緩衝液番号１で事前に湿らせた０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ ８１６０フィルターに通して濾過した。必要に応じて、ＲＮＰ試料を、所望の体積が得られるまで、０．５ｍｌのＵｌｔｒａ １００－Ｋｄカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＵＦＣ５１００９６）で濃縮した。切断能力のあるＲＮＰの形成を、実施例１２に記載されるように評価した。
ＣａｓＸの精製した野生型およびＲＮＰならびに単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、実験の直前に調製するか、または後で使用するために調製し、液体窒素中で急速凍結し、－８０℃で保管するかのいずれかを行った。ＲＮＰ複合体を調製するために、ＣａｓＸタンパク質をｓｇＲＮＡと１：１．２のモル比でインキュベートした。簡潔には、ｓｇＲＮＡを、緩衝液番号１（２５ｍＭ ＮａＰｉ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭトレハロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に添加し、その後、ＣａｓＸをｓｇＲＮＡ溶液にゆっくり旋回させながら添加し、３７℃で１０分間インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成した。ＲＮＰ複合体を、使用前に、２００μｌの緩衝液番号１で事前に湿らせた０．２２μｍのＣｏｓｔａｒ ８１６０フィルターに通して濾過した。必要に応じて、ＲＮＰ試料を、所望の体積が得られるまで、０．５ｍｌのＵｌｔｒａ １００－Ｋｄカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＵＦＣ５１００９６）で濃縮した。切断能力のあるＲＮＰの形成を、実施例１２に記載されるように評価した。
実施例８：ガイドＲＮＡに対する結合親和性の評価
精製した野生型および改善されたＣａｓＸを、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中で３’Ｃｙ７．５部分を含有する合成単一ガイドＲＮＡとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。ｓｇＲＮＡを１０ｐＭの濃度で維持する一方で、タンパク質を別個の結合反応において１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を、それぞれ、タンパク質および核酸に結合するニトロセルロース膜および正に荷電したナイロン膜を用いた真空マニホールドフィルター結合アッセイにかける。ガイドＲＮＡを特定するために膜を画像化し、結合ＲＮＡの非結合ＲＮＡに対する割合を、タンパク質濃度ごとにナイロン膜に対するニトロセルロース膜上の蛍光量によって決定して、タンパク質－ｓｇＲＮＡ複合体の解離定数を計算する。この実験をｓｇＲＮＡの改善されたバリアントでも行い、これらの変異が野生型および変異タンパク質に対するガイドの親和性にも影響を与えるかを決定する。我々は、電気移動度シフトアッセイを行い、フィルター結合アッセイと定性的に比較し、凝集ではなく可溶性結合がタンパク質－ＲＮＡ会合の主因であることも確認する。
精製した野生型および改善されたＣａｓＸを、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中で３’Ｃｙ７．５部分を含有する合成単一ガイドＲＮＡとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。ｓｇＲＮＡを１０ｐＭの濃度で維持する一方で、タンパク質を別個の結合反応において１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を、それぞれ、タンパク質および核酸に結合するニトロセルロース膜および正に荷電したナイロン膜を用いた真空マニホールドフィルター結合アッセイにかける。ガイドＲＮＡを特定するために膜を画像化し、結合ＲＮＡの非結合ＲＮＡに対する割合を、タンパク質濃度ごとにナイロン膜に対するニトロセルロース膜上の蛍光量によって決定して、タンパク質－ｓｇＲＮＡ複合体の解離定数を計算する。この実験をｓｇＲＮＡの改善されたバリアントでも行い、これらの変異が野生型および変異タンパク質に対するガイドの親和性にも影響を与えるかを決定する。我々は、電気移動度シフトアッセイを行い、フィルター結合アッセイと定性的に比較し、凝集ではなく可溶性結合がタンパク質－ＲＮＡ会合の主因であることも確認する。
実施例９：標的ＤＮＡに対する結合親和性の評価
精製した野生型および改善されたＣａｓＸを、標的核酸に相補的な標的化配列を有する単一ガイドＲＮＡと複合体形成する。ＲＮＰ複合体を、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中でＰＡＭおよび標的鎖に５’Ｃｙ７．５標識を有する適切な標的核酸配列を含有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。標的ＤＮＡを１ｎＭの濃度で維持する一方で、ＲＮＰを別個の結合反応において１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を天然５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させて、結合標的ＤＮＡおよび非結合標的ＤＮＡを分離する。標的ＤＮＡの移動度シフトを特定するためにゲルを画像化し、結合ＤＮＡの非結合ＤＮＡに対する割合をタンパク質濃度ごとに計算して、ＲＮＰ－標的ＤＮＡ三重複合体の解離定数を決定する。実験は、参照ＣａｓＸと参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとを含むＲＮＰの改善された結合親和性を実証することが予期される。
精製した野生型および改善されたＣａｓＸを、標的核酸に相補的な標的化配列を有する単一ガイドＲＮＡと複合体形成する。ＲＮＰ複合体を、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中でＰＡＭおよび標的鎖に５’Ｃｙ７．５標識を有する適切な標的核酸配列を含有する二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。標的ＤＮＡを１ｎＭの濃度で維持する一方で、ＲＮＰを別個の結合反応において１ｐＭから１００μＭまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を天然５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させて、結合標的ＤＮＡおよび非結合標的ＤＮＡを分離する。標的ＤＮＡの移動度シフトを特定するためにゲルを画像化し、結合ＤＮＡの非結合ＤＮＡに対する割合をタンパク質濃度ごとに計算して、ＲＮＰ－標的ＤＮＡ三重複合体の解離定数を決定する。実験は、参照ＣａｓＸと参照ｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、ＣａｓＸバリアントとｇＮＡバリアントとを含むＲＮＰの改善された結合親和性を実証することが予期される。
実施例１０：遺伝子標的ＰＣＳＫ９、ＰＭＰ２２、ＴＲＡＣ、ＳＯＤ１、Ｂ２Ｍ、およびＨＴＴの編集
この試験の目的は、６つの遺伝子標的の核酸配列を編集するＣａｓＸバリアント１１９およびｇＮＡバリアント１７４の能力を評価することであった。
この試験の目的は、６つの遺伝子標的の核酸配列を編集するＣａｓＸバリアント１１９およびｇＮＡバリアント１７４の能力を評価することであった。
材料および方法
Ｂ２ＭおよびＳＯＤ１を除く全ての標的に対するスペーサーを、ＰＡＭ要件（ＴＴＣまたはＣＴＣ）に基づく不偏様式で、目的とする所望の遺伝子座を標的とするように設計した。Ｂ２ＭおよびＳＯＤ１を標的とするスペーサーは、これらの遺伝子に対して行ったレンチウイルススペーサースクリーニングにより、標的とされたエクソン内で以前に特定された。他の標的に対して設計されたスペーサーは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ対としてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から注文したものであった。ｓｓＤＮＡスペーサー対を一緒にアニーリングし、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングにより、以下の構成要素：ＥＦ１Ａプロモーター下のコドン最適化ＣａｓＸ １１９タンパク質＋ＮＬＳ、Ｕ６プロモーター下のガイド足場１７４、カルベニシリンおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含有する基礎哺乳動物発現プラスミド構築物にクローニングした。組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するＬｂ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシング（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりガイド足場領域を通して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。
Ｂ２ＭおよびＳＯＤ１を除く全ての標的に対するスペーサーを、ＰＡＭ要件（ＴＴＣまたはＣＴＣ）に基づく不偏様式で、目的とする所望の遺伝子座を標的とするように設計した。Ｂ２ＭおよびＳＯＤ１を標的とするスペーサーは、これらの遺伝子に対して行ったレンチウイルススペーサースクリーニングにより、標的とされたエクソン内で以前に特定された。他の標的に対して設計されたスペーサーは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ対としてＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から注文したものであった。ｓｓＤＮＡスペーサー対を一緒にアニーリングし、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングにより、以下の構成要素：ＥＦ１Ａプロモーター下のコドン最適化ＣａｓＸ １１９タンパク質＋ＮＬＳ、Ｕ６プロモーター下のガイド足場１７４、カルベニシリンおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含有する基礎哺乳動物発現プラスミド構築物にクローニングした。組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するＬｂ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上にプレーティングし、かつ３７℃でインキュベートした、化学的コンピテントＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシング（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりガイド足場領域を通して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、番号１５００－５００）、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１００×－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、ＧＩＢＣＯ、番号１５１４０－１２２）、ピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１５６３００８０）、および２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号２１９８５０２３）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、番号１０－０１３－ＣＶ）中で増殖させた。細胞を、ＴｒｙｐｌＥを使用して３～５日毎に通過させ、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーター内に維持した。
０日目に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３０ｋ細胞／ウェルで９６ウェル平底プレートに播種した。１日目に、細胞に、製造業者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用して１００ｎｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。２日目に、細胞を、ピューロマイシンを含有するＦＢ培地に切り替えた。３日目に、この培地を、ピューロマイシンを含有する新鮮なＦＢ培地と交換した。この時点以降のプロトコルは、目的とする遺伝子に応じて異なった。ＰＣＳＫ９、ＰＭＰ２２、およびＴＲＡＣについての４日目に、細胞が選択を完了したことを確認し、ピューロマイシンを含まないＦＢ培地に切り替えた。Ｂ２Ｍ、ＳＯＤ１、およびＨＴＴについての４日目：細胞が選択を完了したことを確認し、ピューロマイシンを含まないＦＢ培地を含有する新しいプレートにＴｒｙｐｌＥを使用して１：３で通過させた。ＰＣＳＫ９、ＰＭＰ２２、およびＴＲＡＣについての７日目：細胞をプレートから持ち上げ、ｄＰＢＳ中で洗浄し、カウントし、１０，０００細胞／μｌでＱｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＱＥ０９０５０）中に再懸濁した。ゲノムＤＮＡを製造業者のプロトコルに従って抽出し、－２０℃で保管した。Ｂ２Ｍ、ＳＯＤ１、およびＨＴＴについての７日目に、細胞をプレートから持ち上げ、ｄＰＢＳ中で洗浄し、ゲノムＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＱｕｉｃｋ－ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ、Ｄ４０６８）で抽出し、－２０℃で保管した。
ＮＧＳ分析：各実験試料由来の細胞の編集を、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）分析を使用して評価した。すべてのＰＣＲは、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＫＲ０３７０）を使用して実行した。ゲノムＤＮＡ試料ＰＣＲについての鋳型は、ＰＣＳＫ９、ＰＭＰ２２、およびＴＲＡＣについて１０ｋ細胞／μＬでＱＥ中の５μｌのゲノムＤＮＡであった。ゲノムＤＮＡ試料ＰＣＲについての鋳型は、Ｂ２Ｍ、ＳＯＤ１、およびＨＴＴについて水中の４００ｎｇのゲノムＤＮＡであった。目的とする標的ゲノム位置に特異的なプライマーを設計して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取りおよび読み取り２配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。さらに、それらは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する７ｎｔのランダマー配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５－１５００ｂｐ）を使用して評価した。アンプリコンを、製造業者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。結果として得られた配列決定読み取りを参照配列と整列させ、インデルについて分析した。推定された切断位置と整列しなかった編集を有する試料またはスペーサー領域に予期しない対立遺伝子を有する試料を廃棄した。
結果
様々な遺伝子座でＣａｓＸ：ｇＮＡ １１９．１７４によって達成された編集を検証するために、クローンプラスミドトランスフェクション実験をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に行った。複数のスペーサー（表１１、実際のｇＮＡスペーサーのコードＤＮＡおよびＲＮＡ配列を列記する）を設計し、ＣａｓＸ １１９ヌクレアーゼおよびガイド１７４足場をコードする発現プラスミドにクローニングした。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、ピューロマイシンで選択し、トランスフェクトした６日後にゲノムＤＮＡを回収した。ゲノムＤＮＡを、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により分析し、挿入または欠失（インデル）の分析のために参照ＤＮＡ配列と整列させた。ＣａｓＸ：ｇＮＡ １１９．１７４は、図９および１０に示されるように、６つの標的遺伝子にわたってインデルを効率的に生成することができた。インデル率はスペーサー間で異なったが、編集率中央値は一貫して６０％以上であり、いくつかの事例では、９１％ものインデル率が観察された。加えて、非標準的ＣＴＣ ＰＡＭを有するスペーサーが試験した全ての標的遺伝子でインデルを生成することができることが示された（図１１）。
様々な遺伝子座でＣａｓＸ：ｇＮＡ １１９．１７４によって達成された編集を検証するために、クローンプラスミドトランスフェクション実験をＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に行った。複数のスペーサー（表１１、実際のｇＮＡスペーサーのコードＤＮＡおよびＲＮＡ配列を列記する）を設計し、ＣａｓＸ １１９ヌクレアーゼおよびガイド１７４足場をコードする発現プラスミドにクローニングした。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、ピューロマイシンで選択し、トランスフェクトした６日後にゲノムＤＮＡを回収した。ゲノムＤＮＡを、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）により分析し、挿入または欠失（インデル）の分析のために参照ＤＮＡ配列と整列させた。ＣａｓＸ：ｇＮＡ １１９．１７４は、図９および１０に示されるように、６つの標的遺伝子にわたってインデルを効率的に生成することができた。インデル率はスペーサー間で異なったが、編集率中央値は一貫して６０％以上であり、いくつかの事例では、９１％ものインデル率が観察された。加えて、非標準的ＣＴＣ ＰＡＭを有するスペーサーが試験した全ての標的遺伝子でインデルを生成することができることが示された（図１１）。
結果は、ＣａｓＸバリアント１１９およびｇＮＡバリアント１７４がヒト細胞における多種多様な遺伝子座でインデルを一貫して効率的に生成することができることを示す。本アッセイに使用した多くのスペーサーの不偏選択が、遺伝子座を編集する１１９．１７４ ＲＮＰ分子の全体的な有効性を示す一方で、ＴＴＣ ＰＡＭおよびＣＴＣ ＰＡＭの両方でスペーサーを標的とする能力は、ＴＴＣ ＰＡＭのみで編集する参照ＣａｓＸと比較してその多様性の増加を示す。
実施例１１：インビトロでの差次的ＰＡＭ認識の評価
精製した野生型ＣａｓＸおよび操作したＣａｓＸバリアントを、一定の標的化配列を有する単一ガイドＲＮＡと複合体形成する。ＲＮＰ複合体を、１００ｎＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を含有する緩衝液に添加し、１０ｎＭの濃度で５’Ｃｙ７．５標識二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。標的核酸配列に隣接する異なるＰＡＭを含有する異なるＤＮＡ基質を用いて別個の反応を行う。反応のアリコートを一定の時点で採取し、等体積の５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび９５％ホルムアミドを添加してクエンチする。試料を変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、切断ＤＮＡ基質および非切断ＤＮＡ基質を分離する。結果を可視化し、ＣａｓＸバリアントによる非標準的ＰＡＭの切断速度を決定する。
精製した野生型ＣａｓＸおよび操作したＣａｓＸバリアントを、一定の標的化配列を有する単一ガイドＲＮＡと複合体形成する。ＲＮＰ複合体を、１００ｎＭの最終濃度でＭｇＣｌ２を含有する緩衝液に添加し、１０ｎＭの濃度で５’Ｃｙ７．５標識二本鎖標的ＤＮＡとインキュベートする。標的核酸配列に隣接する異なるＰＡＭを含有する異なるＤＮＡ基質を用いて別個の反応を行う。反応のアリコートを一定の時点で採取し、等体積の５０ｍＭ ＥＤＴＡおよび９５％ホルムアミドを添加してクエンチする。試料を変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、切断ＤＮＡ基質および非切断ＤＮＡ基質を分離する。結果を可視化し、ＣａｓＸバリアントによる非標準的ＰＡＭの切断速度を決定する。
実施例１２：ＣａｓＸ：ｇＮＡのインビトロ切断アッセイ
１．野生型参照ＣａｓＸと比較したタンパク質バリアントの切断能力のある分率を決定する
参照ＣａｓＸと比較して活性なＲＮＰを形成するＣａｓＸバリアントの能力を、インビトロ切断アッセイを使用して決定した。切断アッセイのベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）７．３７標的を以下のように作製した。配列ＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴ（非標的鎖、ＮＴＳ（配列番号５９６））を有するＤＮＡオリゴおよび配列ＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴ（標的鎖、ＴＳ（配列番号５９７））を有するＤＮＡオリゴを、５’蛍光標識（それぞれ、ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ７００および８００）とともに購入した。ｄｓＤＮＡ標的を、１倍切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で１：１の比率でオリゴを混合し、１０分間かけて９５℃に加熱し、溶液を室温に冷却することによって形成した。
１．野生型参照ＣａｓＸと比較したタンパク質バリアントの切断能力のある分率を決定する
参照ＣａｓＸと比較して活性なＲＮＰを形成するＣａｓＸバリアントの能力を、インビトロ切断アッセイを使用して決定した。切断アッセイのベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）７．３７標的を以下のように作製した。配列ＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴ（非標的鎖、ＮＴＳ（配列番号５９６））を有するＤＮＡオリゴおよび配列ＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＴＴＣＧＧＧＣＣＧＡＧＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴ（標的鎖、ＴＳ（配列番号５９７））を有するＤＮＡオリゴを、５’蛍光標識（それぞれ、ＬＩ－ＣＯＲ ＩＲＤｙｅ ７００および８００）とともに購入した。ｄｓＤＮＡ標的を、１倍切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で１：１の比率でオリゴを混合し、１０分間かけて９５℃に加熱し、溶液を室温に冷却することによって形成した。
ＣａｓＸ ＲＮＰを、別途特定されない限り１倍切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で１．５倍過剰の指定したガイドとともに１μＭの最終濃度で指定したＣａｓＸおよびガイド（グラフを参照されたい）で、３７℃で１０分間再構成し、その後、使用する準備が整うまで氷に移した。７．３７標的を、７．３７標的に相補的なスペーサーを有するｓｇＲＮＡとともに使用した。
切断反応物を、１００ｎＭの最終ＲＮＰ濃度および１００ｎＭの最終標的濃度で調製した。反応を３７℃で行い、７．３７標的ＤＮＡの添加によって開始した。アリコートを５、１０、３０、６０、および１２０分時点で採取し、９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡに添加することによってクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。ゲルを、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで画像化し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して定量するか、Ｃｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、Ｃｙｔｉｖａ ＩＱＴＬソフトウェアを使用して定量するかのいずれかを行った。結果として得られたデータを、Ｐｒｉｓｍを使用してプロットして分析した。我々は、半化学量論的量の酵素が延長した時間スケール下でさえも化学量論的量を超える標的を切断することができず、代わりに、存在する酵素の量に対応する定常状態に近づくという観察によって示されるように、ＣａｓＸがアッセイ条件下で単回代謝回転酵素として本質的に作用すると仮定した。したがって、等モル量のＲＮＰによって長時間スケールにわたって切断された標的の分率は、ＲＮＰのどのくらいの分率が適切に形成され、切断に対して活性であるかを示す。切断反応がこの濃度体制下で単相から明らかに逸脱するため、切断追跡を二相速度モデルに適合させ、３つの独立した複製の各々の定常状態を決定した。平均および標準偏差を計算して、活性分率を決定した（表１２）。グラフを図１２に示す。
見かけの活性（切断能力のある）分率を、ＣａｓＸ２＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ１１９＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ４５７＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、ＣａｓＸ４８８＋ガイド１７４＋７．３７スペーサー、およびＣａｓＸ４９１＋ガイド１７４＋７．３７スペーサーに対して形成されたＲＮＰについて決定した。決定した活性分率を表１２に示す。すべてのＣａｓＸバリアントが野生型ＣａｓＸ２よりも高い活性分率を有し、これは、操作したＣａｓＸバリアントが野生型ＣａｓＸと比較して試験した条件下で同一のガイドと有意に活性な安定したＲＮＰを形成することを示す。これは、ｓｇＲＮＡに対する親和性の増加、ｓｇＲＮＡの存在下での安定性もしくは溶解性の増加、または操作したＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡ複合体の切断能力のある立体構造のより高い安定性に起因し得る。ＲＮＰの溶解性の増加は、ＣａｓＸ２と比較してＣａｓＸ４５７、ＣａｓＸ４８８、またはＣａｓＸ４９１をｓｇＲＮＡに添加したときに形成された観察された沈殿物の顕著な減少によって示された。
２．インビトロ切断アッセイ－野生型参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアントのｋ切断を決定する
図１３および表１２に示されるように、同じプロトコルを使用して、ＣａｓＸ２．２．７．３７、ＣａｓＸ２．３２．７．３７、ＣａｓＸ２．６４．７．３７、およびＣａｓＸ２．１７４．７．３７の切断能力のある分率が、１６±３％、１３±３％、５±２％、および２２±５％であると決定した。
図１３および表１２に示されるように、同じプロトコルを使用して、ＣａｓＸ２．２．７．３７、ＣａｓＸ２．３２．７．３７、ＣａｓＸ２．６４．７．３７、およびＣａｓＸ２．１７４．７．３７の切断能力のある分率が、１６±３％、１３±３％、５±２％、および２２±５％であると決定した。
ガイドのＲＮＰ形成への寄与をより良好に分離するために、ガイドの第２のセットを異なる条件下で試験した。７．３７スペーサーを有する１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、２１４、および２１５ガイドを、前述のように過剰なガイドではなく、ガイドの場合に１μＭおよびタンパク質の場合に１．５μＭの最終濃度でＣａｓＸ４９１と混合した。結果を図１２および表１４に示す。これらのガイドの多くは、１７４を超える追加の改善を示し、１８５および１９６は、これらのガイド制限条件下で、１７４の１７％と比較して、それぞれ、４４％および４６％の切断能力のある分率を達成した。
データは、ＣａｓＸバリアントおよびｓｇＲＮＡバリアントの両方が、野生型ＣａｓＸおよび野生型ｓｇＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡとより高度な活性ＲＮＰを形成することができることを示す。
野生型参照ＣａｓＸと比較したＣａｓＸバリアント１１９、４５７、４８８、および４９１の見かけの切断速度を、標的７．３７の切断のためのインビトロ蛍光アッセイを使用して決定した。
ＣａｓＸ ＲＮＰを、１倍切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ、５％グリセロール、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で１．５倍過剰の指定したガイドとともに１μＭの最終濃度で指定したＣａｓＸ（図１５を参照されたい）で、３７℃で１０分間再構成し、その後、使用する準備が整うまで氷に移した。切断反応を、２００ｎＭの最終ＲＮＰ濃度および１０ｎＭの最終標的濃度で設定した。反応を、別途記述されない限り３７℃で行い、標的ＤＮＡの添加により開始した。アリコートを０．２５、０．５、１、２、５、および１０分時点で採取し、９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡに添加することによってクエンチした。試料を、９５℃で１０分間加熱することによって変性させ、１０％尿素－ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。ゲルを、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘで画像化し、ＬＩ－ＣＯＲ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して定量するか、Ｃｙｔｉｖａ Ｔｙｐｈｏｏｎで画像化し、Ｃｙｔｉｖａ ＩＱＴＬソフトウェアを使用して定量した。結果として得られたデータを、Ｐｒｉｓｍを使用してプロットして分析し、各ＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡ組み合わせ複製の非標的鎖切断の見かけの一次速度定数（ｋ切断）を決定した。独立した適合を有する３つの複製の平均および標準偏差を表１２に提示し、切断追跡を図１５に示す。
野生型ＣａｓＸ２、ならびにＣａｓＸバリアント１１９、４５７、４８８、および４９１の見かけの切断速度定数を決定し、ガイド１７４およびスペーサー７．３７を各アッセイで利用した（表１２および図１５を参照されたい）。すべてのＣａｓＸバリアントが野生型ＣａｓＸ２と比較して改善された切断速度を有した。上で決定されたようにより高い切断能力のある分率を有するにもかかわらず、ＣａｓＸ４５７は１１９よりもゆっくりと切断した。ＣａｓＸ４８８およびＣａｓＸ４９１は、大幅に最も速い切断速度を示し、標的は第１の時点でほぼ完全に切断されたため、真の切断速度はこのアッセイの分解能を超え、報告されたｋ切断を下限とみなすべきである。
データは、ＣａｓＸバリアントが野生型ＣａｓＸ２と比較してより高いレベルの活性を有し、少なくとも３０倍高いｋ切断速度に達することを示す。
３．インビトロ切断アッセイ：ガイドバリアントと野生型ガイドとの比較
切断アッセイを、ガイドバリアント３２、６４、および１７４と比較した野生型参照ＣａｓＸ２および参照ガイド２を用いて行い、これらのバリアントが切断を改善したかも決定した。実験を上述のように行った。結果として得られたＲＮＰの多くが試験した時間内に標的の完全な切断に近づかなかったため、我々は、一次速度定数ではなく、初期反応速度（Ｖ０）を決定した。最初の２つの時点（１５秒および３０秒）をＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡ組み合わせおよび複製の各々のラインと適合させた。３つの複製の勾配の平均および標準偏差を決定した。
切断アッセイを、ガイドバリアント３２、６４、および１７４と比較した野生型参照ＣａｓＸ２および参照ガイド２を用いて行い、これらのバリアントが切断を改善したかも決定した。実験を上述のように行った。結果として得られたＲＮＰの多くが試験した時間内に標的の完全な切断に近づかなかったため、我々は、一次速度定数ではなく、初期反応速度（Ｖ０）を決定した。最初の２つの時点（１５秒および３０秒）をＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡ組み合わせおよび複製の各々のラインと適合させた。３つの複製の勾配の平均および標準偏差を決定した。
アッセイした条件下で、ガイド２、３２、６４、および１７４を有するＣａｓＸ２についてのＶ０は、２０．４±１．４ｎＭ／分、１８．４±２．４ｎＭ／分、７．８±１．８ｎＭ／分、および４９．３±１．４ｎＭ／分であった（表１２および図１６～１７を参照のこと）。ガイド１７４は、結果として得られたＲＮＰの切断速度の実質的な改善を示した（２と比較して約２．５倍、図１７を参照されたい）一方で、実施したガイド３２および６４は、ガイド２と同様またはそれよりも劣っていた。注目すべきことに、ガイド６４は、ガイド２よりも遅い切断速度を支持するが、インビボではるかにより良好に機能する（データ示さず）。ガイド６４を生成するための配列変化のうちのいくつかは、トリプレックス形成に関与するヌクレオチドを犠牲にしてインビボ転写を改善する可能性が高い。ガイド６４の改善された発現は、インビボでのその改善された活性を説明する可能性が高いが、その低下した安定性は、インビトロでの不適切なフォールディングをもたらす可能性がある。
相対的切断速度を決定するために、スペーサー７．３７およびＣａｓＸ４９１を有するガイド１７４、１７５、１８５、１８６、１９６、２１４、および２１５を使用して追加の実験を行った。切断速度を我々のアッセイで測定可能な範囲に低下させるために、切断反応物を１０℃でインキュベートした。結果を図１８および表１２に示す。これらの条件下で、２１５は、１７４よりも速い切断速度を支持した唯一のガイドであった。ガイド制限条件下でＲＮＰの最も高い活性分率を呈した１９６は、１７４と本質的に同じ反応速度を有し、異なるバリアントが別個の特性の改善をもたらすことを再び強調する。
データは、本アッセイの条件下で、ＣａｓＸを有するガイドバリアントの大半を使用することにより、野生型ガイドを有するものよりも高いレベルの活性を有するＲＮＰが得られ、初期切断速度の約２倍～６倍超の範囲の改善がもたらされることを裏付ける。表１２の数字は、左から右に、ＲＮＰ構築物のＣａｓＸバリアント、ｓｇＲＮＡ足場、およびスペーサー配列を示す。以下の表のＲＮＰ構築物名では、ＣａｓＸタンパク質バリアント、ガイド足場、およびスペーサーが、左から右に示される。
実施例１３：ＰＣＳＫ９のＣａｓＸ：ｇＮＡ編集
この実施例は、ＰＣＳＫ９遺伝子座を改変することができる組成物を作成して試験するパラメーターを示す。
この実施例は、ＰＣＳＫ９遺伝子座を改変することができる組成物を作成して試験するパラメーターを示す。
実験設計：
Ａ）ＰＣＳＫ９－改変スペーサー選択プロセス
２０ｂｐ ＸＴＣ ＰＡＭスペーサーは、ヒトゲノムにおける以下の領域：
（ａ）ＰＣＳＫ９シスエンハンサー要素
（ｂ）脊椎動物にわたって高度に保存されたＰＣＳＫ９近位非コード化遺伝子要素（ＵＣＳＣゲノムブラウザー）
（ｃ）ＰＣＳＫ９ゲノム遺伝子座、を標的とするように設計される。ＰＣＳＫ９遺伝子は、ヒトゲノムのｃｈｒ１：５５，０３９，４７６～５５，０６４，８５３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）にまたがる配列として定義される（表記は、第１染色体の５５，０３９，４７６ｂｐで開始して５５，０６４，８５３ｂｐまでである第１染色体（ｃｈｒ１）を指す（ホモサピエンス更新注釈リリース１０９．２０１９０９０５、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）（ＮＣＢＩ）。ＰＣＳＫ９標的化スペーサーは、他のゲノムから同様に組み立てられ得る。
Ａ）ＰＣＳＫ９－改変スペーサー選択プロセス
２０ｂｐ ＸＴＣ ＰＡＭスペーサーは、ヒトゲノムにおける以下の領域：
（ａ）ＰＣＳＫ９シスエンハンサー要素
（ｂ）脊椎動物にわたって高度に保存されたＰＣＳＫ９近位非コード化遺伝子要素（ＵＣＳＣゲノムブラウザー）
（ｃ）ＰＣＳＫ９ゲノム遺伝子座、を標的とするように設計される。ＰＣＳＫ９遺伝子は、ヒトゲノムのｃｈｒ１：５５，０３９，４７６～５５，０６４，８５３（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）にまたがる配列として定義される（表記は、第１染色体の５５，０３９，４７６ｂｐで開始して５５，０６４，８５３ｂｐまでである第１染色体（ｃｈｒ１）を指す（ホモサピエンス更新注釈リリース１０９．２０１９０９０５、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３）（ＮＣＢＩ）。ＰＣＳＫ９標的化スペーサーは、他のゲノムから同様に組み立てられ得る。
Ｂ）ＰＣＳＫ９標的化構築物を生成するための方法：
ＰＣＳＫ９標的化構築物を生成するために、表１１のＰＣＳＫ９標的化スペーサーは、以下の構成要素：コドン最適化ＣａｓＸ（構築物ＣａｓＸ １１９分子およびｒＲＮＡガイド１７４（１１９．１７４）、配列について表を参照）＋ＮＬＳ、および哺乳類の選択マーカーであるピューロマイシンからなるベースとなる哺乳類発現プラスミド構築物（ｐＳｔＸ）にクローン化する。スペーサー配列ＤＮＡは、スペーサー配列およびこの配列の逆相補体からなる、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）による一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）として注文する。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドに適切な制限酵素を使用したＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって、個別に、またはバルクで、ｐＳｔＸにクローニングする。組み立てられた生成物を、化学的または電気的にコンピテントな細菌細胞に形質転換させ、カルベニシリンを含有するＬｂ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上に播種し、コロニーが出現するまでインキュベートする。個々のコロニーを採取し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を製造業者のプロトコルに従って使用してミニプレップする。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にする。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９コントロールプラスミドは、Ｃａｓタンパク質特異的ＰＡＭに基づいて選択されるスペーサーを有し、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製される。
ＰＣＳＫ９標的化構築物を生成するために、表１１のＰＣＳＫ９標的化スペーサーは、以下の構成要素：コドン最適化ＣａｓＸ（構築物ＣａｓＸ １１９分子およびｒＲＮＡガイド１７４（１１９．１７４）、配列について表を参照）＋ＮＬＳ、および哺乳類の選択マーカーであるピューロマイシンからなるベースとなる哺乳類発現プラスミド構築物（ｐＳｔＸ）にクローン化する。スペーサー配列ＤＮＡは、スペーサー配列およびこの配列の逆相補体からなる、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）による一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）として注文する。これらの２つのオリゴを一緒にアニーリングし、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０２Ｌ）およびプラスミドに適切な制限酵素を使用したＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによって、個別に、またはバルクで、ｐＳｔＸにクローニングする。組み立てられた生成物を、化学的または電気的にコンピテントな細菌細胞に形質転換させ、カルベニシリンを含有するＬｂ寒天プレート（ＬＢ：Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｌ９３１５、寒天：Ｑｕａｒｔｚｙ、カタログ番号２１４５１０）上に播種し、コロニーが出現するまでインキュベートする。個々のコロニーを採取し、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０４）を製造業者のプロトコルに従って使用してミニプレップする。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にする。ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９コントロールプラスミドは、Ｃａｓタンパク質特異的ＰＡＭに基づいて選択されるスペーサーを有し、上記のｐＳｔＸプラスミドと同様に調製される。
Ｃ）ＰＣＳＫ９レポーター株を生成する方法：
蛍光コードＤＮＡ（例えば、ＧＦＰ）は、ＨＥＰＧ２細胞株における最後のＰＣＳＫ９エクソンの３’末端にノックインされる。改変された細胞は、３～５日ごとに連続継代によって増殖させ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、Ｎｏ．１５００－５００）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｎｏ．１０－０１３－ＣＶ）、または他の適切な培地、ならびに１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１００×－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、ＧＩＢＣＯ Ｎｏ．１５１４０－１２２）からなり、ピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｎｏ．１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｎｏ．１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｎｏ．１５６３００８０）、および２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｎｏ．２１９８５０２３）をさらに含み得る、線維芽細胞（ＦＢ）中に維持する。細胞は、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。１～２週後、単一のＧＦＰ＋細胞を、ＦＢまたは他の適切な培地で選別する。レポーター株クローンを３～５日ごとに連続継代によって増殖させ、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター内でＦＢ培地中に維持する。株は、ゲノム配列決定、およびＰＣＳＫ９標的化分子を使用したＰＣＳＫ９遺伝子座の機能的改変によって特徴付けられる。最適なレポーター株は、ｉ）標的ＰＣＳＫ９遺伝子座に正しく組み込まれた単一コピーのＧＦＰを有するもの、ｉｉ）未改変細胞と同等の倍加時間を維持したもの、ｉｉｉ）後述の方法を使用してアッセイした場合、ＰＣＳＫ９遺伝子の破壊時にＧＦＰ蛍光が減少したもの、として特定される。
蛍光コードＤＮＡ（例えば、ＧＦＰ）は、ＨＥＰＧ２細胞株における最後のＰＣＳＫ９エクソンの３’末端にノックインされる。改変された細胞は、３～５日ごとに連続継代によって増殖させ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、Ｎｏ．１５００－５００）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｎｏ．１０－０１３－ＣＶ）、または他の適切な培地、ならびに１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１００×－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、ＧＩＢＣＯ Ｎｏ．１５１４０－１２２）からなり、ピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｎｏ．１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｎｏ．１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｎｏ．１５６３００８０）、および２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ｎｏ．２１９８５０２３）をさらに含み得る、線維芽細胞（ＦＢ）中に維持する。細胞は、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。１～２週後、単一のＧＦＰ＋細胞を、ＦＢまたは他の適切な培地で選別する。レポーター株クローンを３～５日ごとに連続継代によって増殖させ、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター内でＦＢ培地中に維持する。株は、ゲノム配列決定、およびＰＣＳＫ９標的化分子を使用したＰＣＳＫ９遺伝子座の機能的改変によって特徴付けられる。最適なレポーター株は、ｉ）標的ＰＣＳＫ９遺伝子座に正しく組み込まれた単一コピーのＧＦＰを有するもの、ｉｉ）未改変細胞と同等の倍加時間を維持したもの、ｉｉｉ）後述の方法を使用してアッセイした場合、ＰＣＳＫ９遺伝子の破壊時にＧＦＰ蛍光が減少したもの、として特定される。
Ｄ）ＰＣＳＫ９－ＧＦＰレポーター細胞株におけるＰＣＳＫ９改変活性を評価する方法：
ＰＣＳＫ９レポーター細胞を９６ウェルプレートに１００μｌのＦＢ培地中２０～４０ｋ細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を用いた３７℃のインキュベーターで培養する。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認する。理想的には、細胞はトランスフェクション時に約７５％のコンフルエンスであるべきである。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行する。
ＰＣＳＫ９レポーター細胞を９６ウェルプレートに１００μｌのＦＢ培地中２０～４０ｋ細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を用いた３７℃のインキュベーターで培養する。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認する。理想的には、細胞はトランスフェクション時に約７５％のコンフルエンスであるべきである。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行する。
ＰＣＳＫ９を標的とする適切なスペーサーを有する各ＣａｓＸ構築物（ＣａｓＸ １１９およびガイド１７４）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を製造業者のプロトコルに従って使用し、構築物当たり３ウェルを反復として使用して、ウェル当たり１００～５００ｎｇでトランスフェクトする。ＰＣＳＫ９を標的とするＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９を基準コントロールとして使用する。各Ｃａｓタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用する。
０．３～３μｇ／ｍｌでのピューロマイシン選択の２４～４８時間後、トランスフェクトに成功した細胞を選択するために、続いてＦＢまたは他の適切な培地中で２４～４８時間回収し、トランスフェクトした細胞における蛍光をフローサイトメトリーによって分析する。このプロセスでは、細胞を適切な前方および側方散乱についてゲーティングし、単一細胞を選択し、次にレポーター発現についてゲーティングして（Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、フルオロフォアの発現レベルを定量する。各試料について少なくとも１０，０００の事象を収集する。データを使用して、抗体標識陰性（編集済み）細胞のパーセンテージを計算する。
実施例からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Ｑｕｉｃｋ抽出溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出する。編集は、Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して分析する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、ＰＣＲプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー（例えば、目的の標的の周囲５００ｂｐ領域）を使用して増幅させる。次に、ＰＣＲアンプリコンを、サーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にＴ７エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で３０分間処理する。次に、試料を２％アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析して、ＤＮＡバンドを視覚化する。
実施例１４：ＨＥＰＧ２またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＣＳＫ９改変活性を評価する方法。
ＨＥＰＧ２細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに１００μｌのＦＢ培地中２０～４０ｋ細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を用いた３７℃インキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認する。細胞は、トランスフェクション時に約７５％コンフルエントであるべきである。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行する。
ＨＥＰＧ２細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに１００μｌのＦＢ培地中２０～４０ｋ細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を用いた３７℃インキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認する。細胞は、トランスフェクション時に約７５％コンフルエントであるべきである。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行する。
ガイド１７４を有するＣａｓＸ構築物１１９およびＰＣＳＫ９を標的とする表１１のスペーサーは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を製造業者のプロトコルに従って使用してウェル当たり１００～５００ｎｇでトランスフェクトし、反復として構築物当たり３ウェルに加えた。非標的化プラスミドを、陰性コントロールとして使用した。トランスフェクトに成功した細胞を選択するために１～３μｇ／ｍｌで２４～４８時間ピューロマイシン選択後、ＦＢ培地に２４～４８時間回収した後、以下に説明するように、細胞を上記のＴ７Ｅ１アッセイまたはウエスタンブロッティングによって編集するために分析する。
実施例１５：レンチウイルスベクターにＰＣＳＫ９標的化ＣａｓＸ構築物をパッケージングする方法。
ＰＣＳＫ９を標的とするＰＣＳＫ９標的化ＣａｓＸ：ｇＮＡ構築物をパッケージングするレンチウイルス粒子（例えば、実施例２のＣａｓＸ １１９と、実施例６のガイド１７４と、表１１または配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、もしくは２２８６～１３８６１のうちのいずれか１つをコードするスペーサー）は、ＣａｓＸをコードする導入遺伝子プラスミドと、ガイドＲＮＡと、レンチウイルスパッケージングプラスミドと、ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドと、のポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用して、７０％～９０％のコンフルエンスでＨＥＫ２９３Ｔをトランスフェクトすることによって生成する。レンチウイルス粒子の産生では、培地をトランスフェクションの１２時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの３６～４８時間後に収集する。ウイルス上清を０．４５μｍ膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じて、ＦＢ培地（ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ、１１１４００５０）、ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ、１１３６００７０）、ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、１５６３００８０）、２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、２１９８５０２３）、ウシ胎児血清の体積分率１０％（ＦＢＳ、ＶＷＲ、Ｎｏ．９７０６８－０８５）を添加したペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ、１５１４０１２２）を補充したＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、１０５６６－０１６）添加ＤＭＥＭからなる、線維芽細胞培地）で希釈する。
ＰＣＳＫ９を標的とするＰＣＳＫ９標的化ＣａｓＸ：ｇＮＡ構築物をパッケージングするレンチウイルス粒子（例えば、実施例２のＣａｓＸ １１９と、実施例６のガイド１７４と、表１１または配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、もしくは２２８６～１３８６１のうちのいずれか１つをコードするスペーサー）は、ＣａｓＸをコードする導入遺伝子プラスミドと、ガイドＲＮＡと、レンチウイルスパッケージングプラスミドと、ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドと、のポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用して、７０％～９０％のコンフルエンスでＨＥＫ２９３Ｔをトランスフェクトすることによって生成する。レンチウイルス粒子の産生では、培地をトランスフェクションの１２時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの３６～４８時間後に収集する。ウイルス上清を０．４５μｍ膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じて、ＦＢ培地（ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ、１１１４００５０）、ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ、１１３６００７０）、ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、１５６３００８０）、２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、２１９８５０２３）、ウシ胎児血清の体積分率１０％（ＦＢＳ、ＶＷＲ、Ｎｏ．９７０６８－０８５）を添加したペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ、１５１４０１２２）を補充したＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、１０５６６－０１６）添加ＤＭＥＭからなる、線維芽細胞培地）で希釈する。
実施例１６：レンチウイルススクリーニングを介してＰＣＳＫ９改変を評価する方法。
レンチウイルスプラスミドは、各レンチウイルスプラスミドが、ＣａｓＸ分子（例えば、構築物ＣａｓＸ １１９分子）を有する１つのコドン最適化ＮＬＳと、ＰＣＳＫ９を標的とするスペーサー（表１１のスペーサー配列または配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列のＤＮＡ対応物、すなわち、Ｕ塩基について置換されたＴ）を有するｒＲＮＡガイド１７４（１１９．１７４）とをピューロマイシン選択マーカーとともに有するように、標準的なクローニング手順に従って生成される。クローニングは、最終的な力価が、すべての既知のＰＡＭを標的にするすべての可能なＰＣＳＫ９スペーサーおよびＰＣＳＫ９遺伝子におけるそれらの対応するするスペーサー領域と調節領域とを＞１００×で全ライブラリサイズを包含するように実行される。約５，０００がライブラリサイズの場合、評価されるライブラリは＞５ｘ１０５になる。
レンチウイルスプラスミドは、各レンチウイルスプラスミドが、ＣａｓＸ分子（例えば、構築物ＣａｓＸ １１９分子）を有する１つのコドン最適化ＮＬＳと、ＰＣＳＫ９を標的とするスペーサー（表１１のスペーサー配列または配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列のＤＮＡ対応物、すなわち、Ｕ塩基について置換されたＴ）を有するｒＲＮＡガイド１７４（１１９．１７４）とをピューロマイシン選択マーカーとともに有するように、標準的なクローニング手順に従って生成される。クローニングは、最終的な力価が、すべての既知のＰＡＭを標的にするすべての可能なＰＣＳＫ９スペーサーおよびＰＣＳＫ９遺伝子におけるそれらの対応するするスペーサー領域と調節領域とを＞１００×で全ライブラリサイズを包含するように実行される。約５，０００がライブラリサイズの場合、評価されるライブラリは＞５ｘ１０５になる。
レンチウイルス粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔを、７０％～９０％のコンフルエンスで、スペーサーライブラリを含むプラスミド、レンチウイルスパッケージングプラスミド、およびＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドのポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用してトランスフェクトすることによって生成する。粒子産生では、培地をトランスフェクションの１２時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの３６～４８時間後に収集する。
ウイルス上清を０．４５μｍ膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じてＦＢ培地で希釈し、標的細胞、この場合はＰＣＳＫ９－ＧＦＰレポーター細胞株に添加する。必要に応じて、サプリメントポリベレンを５～２０μｇ／ｍｌで添加して、形質導入効率を高める。形質導入された細胞は、形質導入後、ＦＢ培地中にピューロマイシンを０．３～３μｇ／ｍｌで使用して２４～４８時間選択し、ＦＢまたは他の適切な培地で、５％ＣＯ２を用いた３７℃インキュベーター内で７～１０日間増殖させる。
細胞は、ＳＨ－１００またはＭＡ９００ ＳＯＮＹソーターで選別する。このプロセスでは、細胞は適切な前方および側方散乱でゲーティングして単一細胞について選択し、次にレポーター発現についてゲーティングする。異なる細胞選別ゲートが、蛍光レベル（ＯＦＦ＝完全なＫＯ、Ｍｅｄ＝部分的破壊またはノックダウン（ＫＤ）、Ｈｉｇｈ＝編集なし、Ｖｅｒｙ Ｈｉｇｈ＝エンハンサー）に基づいて確立され、ｉ）高度に機能的なＰＣＳＫ９破壊分子、ｉｉ）発現を低下させるだけの分子、およびｉｉｉ）発現を増加させる分子によって細胞編集間を区別して収集する。このアッセイはまた、２つの色調がヒト患者細胞で使用される場合、対立遺伝子特異的ガイドを特定するために実行することができる。ゲノムＤＮＡは、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）溶液を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して、選別された細胞の各群から収集する。
次いで、収集した各プールからのスペーサーライブラリをゲノムからそのままＰＣＲを介して増幅させ、Ｍｉｓｅｑでのディープ配列決定のために収集した。スペーサーの分析は、特定の活性についてゲートおよび存在量に従って行われ、スペーサーヒットのＮＧＳ分析に関する詳細な方法について、以下を参照されたい。
次に、選別された各群からの選択されたガイドを再クローニングし、個別に活性についてレポーター細胞株および初代ヒト細胞株で、フローサイトメトリーおよびＴ７Ｅ１アッセイおよび／またはウエスタンブロッティングによって検証し、インデルスペクトルをＮＧＳ分析によって評価する。従うステップは、レポーター細胞株におけるＰＣＳＫ９改変活性を評価する方法で提供される説明と同様であり得る。
スペーサーヒットのＮＧＳ分析のための方法
上記のレンチウイルススクリーニングから得られたデータは、次世代（ＮＧＳ）配列決定を使用して分析する。スペーサーは各々、次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用してＰＣＳＫ９遺伝子を破壊する能力について評価する。ＮＧＳライブラリは、スペーサーを含むレンチウイルス骨格の特異的増幅を通して生成される。異なるライブラリが、選別された集団（低、中、高ＰＣＳＫ９発現に対応する、ＧＦＰ高、中、低など）の各々について生成され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑを用いて評価する。
上記のレンチウイルススクリーニングから得られたデータは、次世代（ＮＧＳ）配列決定を使用して分析する。スペーサーは各々、次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用してＰＣＳＫ９遺伝子を破壊する能力について評価する。ＮＧＳライブラリは、スペーサーを含むレンチウイルス骨格の特異的増幅を通して生成される。異なるライブラリが、選別された集団（低、中、高ＰＣＳＫ９発現に対応する、ＧＦＰ高、中、低など）の各々について生成され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑを用いて評価する。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑからの配列読み取りは、アダプター配列および配列決定品質の低い領域についてトリミングする。ペアエンド読み取りは、それらの重複配列に基づいてマージして、配列決定された断片ごとに単一のコンセンサス配列を形成する。コンセンサス配列は、ｂｏｗｔｉｅ２を使用して設計されたスペーサー配列にアラインメントさせる。２つ以上の設計されたスペーサー配列にアラインメントする読み取りは破棄する。
各スペーサー配列の「存在量」は、その配列にアラインする読み取り数として定義される。存在量は、各配列決定ライブラリについて表にされ、各配列決定ライブラリ（すなわち、選別した集団）の各々にわたって各スペーサー配列の存在量を示す数値表を形成する。最後に、存在量の数は、各ライブラリの異なる配列決定深度を、そのライブラリにおける全読み取りによって除し、ライブラリにわたる平均読み取り数を乗じることによって基準化する。基準化された数値表を使用して、各ゲートにおける各スペーサーの活性（高、中、低など）を決定する。
ＰＣＳＫ９－ＧＦＰレポーター株は、内因性ヒトＰＣＳＫ９遺伝子座でＧＦＰをノックインすることによって構築される。ｇＲＮＡスペーサーに相補的なｇＲＮＡ標的化配列に結合したレポーター（例えば、ＧＦＰレポーター）をレポーター細胞株に組み込む。細胞をＣａｓＸタンパク質および／またはｓｇＲＮＡバリアントで形質転換またはトランスフェクトし、ｓｇＲＮＡのスペーサーモチーフはレポーターのｇＲＮＡ標的配列に相補的であり、かつそれを標的とする。標的核酸配列を切断するＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の能力は、ＦＡＣＳによってアッセイする。レポーター発現を失った細胞は、ＣａｓＸ：ｓｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体媒介性切断およびインデル形成の発生を示す。レポートシステムは、フローサイトメトリーによって検出されたＰＣＳＫ９遺伝子座の改変（編集）の成功で低下するＧＦＰ蛍光に基づいている。
スクリーニングの目的では、ｇＮＡの足場に連結された表１１または配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、もしくは２２８６～１３８６１のうちのいずれか１つのＰＣＳＫ９スペーサーを試験する。スペーサーは、レポーター細胞株において、コントロールとしてＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９を使用して、ＣａｓＸタンパク質（ｇＮＡ １７４を有する構築物ＣａｓＸ １１９）を用いて試験する。ＧＦＰ蛍光および編集における減少は、ＰＣＳＫ９－ＧＦＰレポーター細胞で評価し、ピューロマイシンを使用して成功したリポフェクションを選択し、その後にＦＡＣＳを介してＧＦＰ破壊についてアッセイする。ＣａｓＸ １１９およびガイド１７４は、細胞の少なくとも５～１０％を編集することが予測され、ＣａｓＸが内因性ＰＣＳＫ９遺伝子座を改変することができ、ＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９システムよりもそれを効果的に行うことを示す。Ｔ７Ｅ１アッセイまたはウエスタンブロッティングを行って、ＰＣＳＫ９－ＧＦＰレポーター細胞株における遺伝子編集をアッセイする。ＰＣＳＫ９標的化スペーサーを有するＣａｓＸ １１９およびガイド１７４、ならびに非標的化コントロール（ＮＴ）をＰＣＳＫ９－ＧＦＰレポーター細胞にリポフェクトし、ピューロマイシンを使用して成功したリポフェクションについて選択し、その後でＴ７Ｅ１で遺伝子編集のためにアッセイして、ＰＣＳＫ９遺伝子座の成功する編集を実証する。
実施例１７：対立遺伝子特異的な手段でレンチウイルス構築物を使用したＣａｓＸを使用してＰＣＳＫ９遺伝子を編集する方法
実験は、ＣａｓＸがＰＣＳＫ９遺伝子座を編集する能力を示すように設計および実施される。ＰＣＳＫ９関連障害を恒久的に治療する１つの戦略は、野生型（ＷＴ）対立遺伝子を温存しながら、遺伝子の変異コピーを特異的に破壊することである。両方の野生型対立遺伝子を有するＨＥＫ２９３細胞は、表１１または配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、もしくは２２８６～１３８６１のうちのいずれか１つのＷＴ ＣａｓＸスペーサーによって編集可能であるが、変異体ＣａｓＸスペーサー（例えば、結合するのに十分なＷＴ ＰＣＳＫ９遺伝子配列との相同性を有さないスペーサー）よって編集可能ではない。この実施例は、ＣａｓＸスペーサーが、単一ヌクレオチドで異なるオンターゲット対立遺伝子とオフターゲット対立遺伝子との間を区別する能力をさらに示す。ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートに１００μｌのＦＢ培地中２０～４０ｋ細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を用いた３７℃のインキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認して、トランスフェクション時に細胞が約７５％のコンフルエンスであることを確実にする。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションは、実施例１５のウイルス上清（上記のように、ＣａｓＸ １１９とＰＣＳＫ９を標的とするスペーサーを有するガイド１７４とを有する）を使用して、構築物ごとに３つのウェルを反復として使用して実行する。ＰＣＳＫ９を標的とするＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９を基準コントロールとして使用する。各Ｃａｓタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用した。細胞を、０．３～３μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２４～４８時間、成功したトランスフェクションについて選択し、続いてＦＢ培地中で２４～４８時間回収する。実験からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Ｑｕｉｃｋ抽出溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出する。編集は、Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して分析する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、ＰＣＲプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー（例えば、目的の標的の周囲５００ｂｐ領域）を使用して増幅させる。次に、ＰＣＲアンプリコンを、サーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にＴ７エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で３０分間処理する。次に、試料を２％アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析して、ＤＮＡバンドを視覚化する。
実験は、ＣａｓＸがＰＣＳＫ９遺伝子座を編集する能力を示すように設計および実施される。ＰＣＳＫ９関連障害を恒久的に治療する１つの戦略は、野生型（ＷＴ）対立遺伝子を温存しながら、遺伝子の変異コピーを特異的に破壊することである。両方の野生型対立遺伝子を有するＨＥＫ２９３細胞は、表１１または配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、もしくは２２８６～１３８６１のうちのいずれか１つのＷＴ ＣａｓＸスペーサーによって編集可能であるが、変異体ＣａｓＸスペーサー（例えば、結合するのに十分なＷＴ ＰＣＳＫ９遺伝子配列との相同性を有さないスペーサー）よって編集可能ではない。この実施例は、ＣａｓＸスペーサーが、単一ヌクレオチドで異なるオンターゲット対立遺伝子とオフターゲット対立遺伝子との間を区別する能力をさらに示す。ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルプレートに１００μｌのＦＢ培地中２０～４０ｋ細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を用いた３７℃のインキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認して、トランスフェクション時に細胞が約７５％のコンフルエンスであることを確実にする。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションは、実施例１５のウイルス上清（上記のように、ＣａｓＸ １１９とＰＣＳＫ９を標的とするスペーサーを有するガイド１７４とを有する）を使用して、構築物ごとに３つのウェルを反復として使用して実行する。ＰＣＳＫ９を標的とするＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９を基準コントロールとして使用する。各Ｃａｓタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用した。細胞を、０．３～３μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２４～４８時間、成功したトランスフェクションについて選択し、続いてＦＢ培地中で２４～４８時間回収する。実験からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Ｑｕｉｃｋ抽出溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出する。編集は、Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して分析する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、ＰＣＲプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー（例えば、目的の標的の周囲５００ｂｐ領域）を使用して増幅させる。次に、ＰＣＲアンプリコンを、サーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にＴ７エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で３０分間処理する。次に、試料を２％アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析して、ＤＮＡバンドを視覚化する。
実施例１８：常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）患者由来細胞株における対立遺伝子特異的編集を実証する方法。
ＡＤＨ患者に由来する細胞は、供給業者推奨条件下で得て培養する。細胞は、ＣａｓＸ構築物（例えば、ガイド１７４を有するＣａｓＸ １１９と、表１１のＰＣＳＫ９スペーサーまたは配列番号２４７～３０３のスペーサーとのＲＮＰ）で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を製造業者のプロトコルに従って使用してトランスフェクトするか、またはＬｏｎｚａヌクレオフェクターキットを製造業者のプロトコルに従って使用してヌクレオフェクトし、インキュベーションおよび増殖のために９６ウェルプレートに播種する。代替的に、ＣａｓＸ構築物は、実施例１５のようにレンチウイルスにパッケージし、使用して患者由来細胞を形質導入し得る。細胞は、ピューロマイシンを０．３～３μｇ／ｍｌで含有する培地を使用して２～４日以上、成功したリポフェクションもしくはヌクレオフェクション、またはレンチウイルス形質導入について選択し、続いて、ピューロマイシンを含まない培地で２日以上回収させる。ＰＣＳＫ９遺伝子座の編集は、ゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルで評価し得る。選択および回収期間の終わりに、実験からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Ｑｕｉｃｋ ｅｘｔｒａｃｔ（ＱＥ）溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出し、別の細胞のサブセットは、プロテオミクス分析のためにＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液に溶解し、別の細胞のサブセットは、後の時点での分析のために継代させ得る。ＱＥ処理した試料の一部を使用して、Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して編集を評価する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、ＰＣＲプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー（例えば、目的の標的の周囲５００ｂｐ領域）を使用して増幅させる。次に、ＰＣＲアンプリコンをサーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にＴ７エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で３０分間処理する。次に、試料を２％アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析してＤＮＡバンドを視覚化し、ＣａｓＸ構築物がＰＣＳＫ９変異を成功裏に編集できることを確認する。ＱＥ処理した試料の別の一部は、ＮＧＳを使用してＰＣＳＫ９遺伝子座での編集を評価するために使用する。
ＡＤＨ患者に由来する細胞は、供給業者推奨条件下で得て培養する。細胞は、ＣａｓＸ構築物（例えば、ガイド１７４を有するＣａｓＸ １１９と、表１１のＰＣＳＫ９スペーサーまたは配列番号２４７～３０３のスペーサーとのＲＮＰ）で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を製造業者のプロトコルに従って使用してトランスフェクトするか、またはＬｏｎｚａヌクレオフェクターキットを製造業者のプロトコルに従って使用してヌクレオフェクトし、インキュベーションおよび増殖のために９６ウェルプレートに播種する。代替的に、ＣａｓＸ構築物は、実施例１５のようにレンチウイルスにパッケージし、使用して患者由来細胞を形質導入し得る。細胞は、ピューロマイシンを０．３～３μｇ／ｍｌで含有する培地を使用して２～４日以上、成功したリポフェクションもしくはヌクレオフェクション、またはレンチウイルス形質導入について選択し、続いて、ピューロマイシンを含まない培地で２日以上回収させる。ＰＣＳＫ９遺伝子座の編集は、ゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルで評価し得る。選択および回収期間の終わりに、実験からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Ｑｕｉｃｋ ｅｘｔｒａｃｔ（ＱＥ）溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出し、別の細胞のサブセットは、プロテオミクス分析のためにＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液に溶解し、別の細胞のサブセットは、後の時点での分析のために継代させ得る。ＱＥ処理した試料の一部を使用して、Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して編集を評価する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、ＰＣＲプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー（例えば、目的の標的の周囲５００ｂｐ領域）を使用して増幅させる。次に、ＰＣＲアンプリコンをサーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にＴ７エンドヌクレアーゼを用いて３７℃で３０分間処理する。次に、試料を２％アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析してＤＮＡバンドを視覚化し、ＣａｓＸ構築物がＰＣＳＫ９変異を成功裏に編集できることを確認する。ＱＥ処理した試料の別の一部は、ＮＧＳを使用してＰＣＳＫ９遺伝子座での編集を評価するために使用する。
プロテオミクス分析は、ウエスタンブロッティングによって行う。ＲＩＰＡ緩衝液に溶解した試料は、最初に、ＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）またはＢｒａｄｆｏｒｄ（ＢｉｏＲａｄ）などの比色タンパク質定量アッセイを製造業者のプロトコルに従って使用してタンパク質含有量を定量する。定量後、試料をベータメルカプトエタノール添加したＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で希釈し、ウェル当たり２．５～２０μｇの総タンパク質をロードする。試料は９５～１００℃で５～１０分間熱変性させた後、室温に冷却する。次に、試料をポリアクリルアミドゲルにロードして泳動する。ゲルが流れ終えたら、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、室温で少なくとも１時間ブロックし、ＰＣＳＫ９および適切なロードコントロールに対して一次抗体で標識する。ブロットは、室温で、ロッカー上でＰＢＳＴ（０．１ｖ／ｖ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を補充したＰＢＳ）を用いて、１回の洗浄につき５分で３回洗浄する。次に、適切なレポーター標識二次抗体を使用して、室温で１時間一次抗体を標識する。ブロットは、室温で、ロッカー上でＰＢＳＴ（０．１ｖ／ｖ％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を補充したＰＢＳ）を用いて、１回の洗浄につき５分で３回洗浄する。続いて、必要な基質を添加して、必要に応じて急冷し、ゲルイメージャーで画像化する。バンド強度は、適切なソフトウェアを製造業者のプロトコルに従って使用して定量化する。
実施例１９：ＡＡＶを介してＰＣＳＫ９標的化構築物を送達する方法：コードされたＣａｓＸシステムを有するＡＡＶの作成および回収。
この実施例は、ＣａｓＸ分子とガイドとをパッケージングするＡＡＶベクターを産生し、特徴付けるための典型的なプロトコルについて説明する。
この実施例は、ＣａｓＸ分子とガイドとをパッケージングするＡＡＶベクターを産生し、特徴付けるための典型的なプロトコルについて説明する。
材料および方法：
ＡＡＶ産生では、トリプラスミドトランスフェクション法を使用し、３つの必須プラスミドである、ＡＡＶにパッケージングされる目的のＰＣＳＫ９遺伝子を有するｐＴｒａｎｓｇｅｎｅプラスミドと、ｐＲＣと、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドとを必要とする。ＣａｓＸをコードするＤＮＡとガイドＲＮＡとは、ＡＡＶ導入遺伝子カセットにクローニングされ、ＩＴＲ間にｐＴｒａｎｓｇｅｎｅプラスミドを生成する。構築された導入遺伝子プラスミドは、全長プラスミド配列決定、制限消化、および哺乳動物細胞のインビトロトランスフェクションを含む機能試験によって検証する。ＡＡＶ産生に必要な追加のプラスミド（ｐＲＣプラスミドおよびｐＨｅｌｐｅｒプラスミド）は、商業的供給業者（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｔａｋａｒａ）から購入する。
ＡＡＶ産生では、トリプラスミドトランスフェクション法を使用し、３つの必須プラスミドである、ＡＡＶにパッケージングされる目的のＰＣＳＫ９遺伝子を有するｐＴｒａｎｓｇｅｎｅプラスミドと、ｐＲＣと、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドとを必要とする。ＣａｓＸをコードするＤＮＡとガイドＲＮＡとは、ＡＡＶ導入遺伝子カセットにクローニングされ、ＩＴＲ間にｐＴｒａｎｓｇｅｎｅプラスミドを生成する。構築された導入遺伝子プラスミドは、全長プラスミド配列決定、制限消化、および哺乳動物細胞のインビトロトランスフェクションを含む機能試験によって検証する。ＡＡＶ産生に必要な追加のプラスミド（ｐＲＣプラスミドおよびｐＨｅｌｐｅｒプラスミド）は、商業的供給業者（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、Ｔａｋａｒａ）から購入する。
ＡＡＶ産生のために、ＨＥＫ２９３細胞を、５％ＣＯ２を用いた３７℃のインキュベーター内のＦＢ培地で培養する。ＨＥＫ２９３細胞の１０～４０個の１５ｃｍディッシュをウイルス産生の単一バッチで使用する。単一の１５ｃｍディッシュでは、４５～６０μｇのプラスミドを４ｍｌのＦＢ培地で一緒に１：１：１のモル比で混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、すなわち、３ｕｇのＰＥＩ／μｇのＤＮＡを用いて、室温で１０分間複合体化させた。使用した３つのプラスミドの比率は、ウイルス産生を最適化するために変更し得る。次に、ＰＥＩ－ＤＮＡ複合体をＨＥＫ２９３細胞の１５ｃｍプレートにゆっくりと滴下し、トランスフェクトされた細胞のプレートをインキュベーターに戻す。次の日、培地を２％ＦＢＳ添加ＦＢに変更し得る（必要に応じて、１０％ＦＢＳ（ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ、１１１４００５０）、ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ、１１３６００７０）、ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、１５６３００８０）、２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、２１９８５０２３）、ウシ胎児血清の体積分率１０％（ＦＢＳ、ＶＷＲ、Ｎｏ．９７０６８－０８５）を添加したペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ、１５１４０１２２）を補充したＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、１０５６６－０１６）添加ＤＭＥＭからなる、線維芽細胞培地）の代わり）。ＡＡＶは、プラスミドの最初のトランスフェクション後４８～１２０時間の任意の時点で、上清から、もしくは細胞ペレットから、または上清と細胞ペレットとの組み合わせから収集し得る。
ウイルスをトランスフェクションの７２時間後に収集する場合、この時点で細胞からの培地を収集してウイルスの収量を増加し得る。トランスフェクションの２～５日後に、培地および細胞を収集する。回収の時機を変更して、ウイルスの収量を最適化し得る。細胞を遠心分離によってペレット化し、培地を上部から収集する。細胞を高塩分および高塩活性ヌクレアーゼを含む緩衝液中に３７℃で１時間溶解する。細胞はまた、連続凍結融解、または界面活性剤による化学的溶解などの追加の方法を使用して溶解することができる。回収時に収集した培地、および以前の時点で収集した任意の培地を、ＡＡＶを沈殿させるために、４０％のＰＥＧ８０００および２．５ＭのＮａＣｌを含有する溶液の１：５希釈で処理し、氷上で２時間インキュベートする。インキュベーションはまた、４℃で一晩実施することができる。培地からのＡＡＶ沈殿物を遠心分離によってペレット化し、高塩活性ヌクレアーゼを含む高塩含有量の緩衝液中に再懸濁し、溶解した細胞ペレットと合わせる。次に、合わせた細胞溶解物を遠心分離および０．４５μｍフィルターを通す濾過によって清澄化し、ＡＡＶ Ｐｏｒｏｓアフィニティーレジンカラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製する。ウイルスをカラムから中和溶液に溶出する。この段階で、ウイルス調製の質を高めるために、ウイルスを追加のラウンドの精製にかけることができる。次に、溶出したウイルスをｑＰＣＲにより力価測定し、ウイルスの収量を定量する。力価測定では、ウイルスの試料を最初にＤＮＡｓｅで消化して、パッケージングされていないウイルスＤＮＡを除去し、ＤＮＡｓｅを不活性化し、次にプロテイナーゼＫでウイルスカプシドを破壊して、力価測定のためにパッケージングされたウイルスゲノムを露出させる。
約１×１０１２個のウイルスゲノムが、ここに記載の方法を使用して産生されたウイルスの１つのバッチから得られることが予期される。
実施例２０：マウスモデルにおけるＰＣＳＫ９編集のインビボ評価。
最初の一連の実験では、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用して、ＣａｓＸと、ＰＣＳＫ９を標的とするガイドＲＮＡとをコードするＡＡＶ粒子、またはＣａｓＸと、ＰＣＳＫ９を標的とするガイドＲＮＡとのＲＮＰを含むＸＤＰが、マウスＰＣＳＫ９遺伝子をインビボで編集する能力を試験する。（Ｃａｒｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１９ １７：４）．
最初の一連の実験では、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを使用して、ＣａｓＸと、ＰＣＳＫ９を標的とするガイドＲＮＡとをコードするＡＡＶ粒子、またはＣａｓＸと、ＰＣＳＫ９を標的とするガイドＲＮＡとのＲＮＰを含むＸＤＰが、マウスＰＣＳＫ９遺伝子をインビボで編集する能力を試験する。（Ｃａｒｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１９ １７：４）．
材料および方法
スペーサー配列２７．５（ＡＡＶではスペーサー配列ＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＧＣＣＡ（配列番号２２５）、ＸＤＰではＧＡＧＧＣＵＡＧＡＧＧＡＣＵＧＡＧＣＣＡ（配列番号２２６））を使用したマウスＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする、ＣａｓＸ ４９１とｇＲＮＡ １７４とをコードするＡＡＶ（表１３、構築物３Ａ、３６Ａ、および３７Ａを利用）、またはＣａｓＸ ４９１とｇＲＮＡ １７４とのＲＮＰをパッケージングするＸＤＰ（表１５－ｐＸＤＰ００１７、ｐＸＤＰ０００１、ｐＧＰ２、ｐＳｔｘ４２．１７４．２７．５）の構築物を、１０～１４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに尾静脈注射を介して投与する。実験的コントロールとして、マウスゲノムにおけるセーフハーバー部位、例えば、ｍＲｏｓａ２６遺伝子座を標的とするＣａｓＸとｇＲＮＡとをコードするか、もしくはパッケージングするＡＡＶまたはＸＤＰもコントロール群に投与する。それぞれのベクターの投与の１ヶ月および３ヶ月後、血漿中のコレステロールレベルは酵素比色分析を使用して評価し、血漿中のＰＣＳＫ９レベルはＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットアッセイによって評価する。ベクターの投与後１ヶ月および３ヶ月でマウスのサブセットを犠牲にし、組織を、ＮＧＳ、ｑＰＣＲ、および免疫組織学を介したゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルでのＰＣＳＫ９遺伝子編集の評価のために処理する。組織はまた、オフターゲット分析のために確立されたツール、例えば、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを使用して、オフターゲット編集について評価する。加えて、ＣａｓＸの発現はまた、免疫組織学によって目的の組織全体にわたって測定する。結果は、コレステロール値の低下を伴う、マウスにおけるＰＣＳＫ９遺伝子を編集する能力を実証することが予測される。
スペーサー配列２７．５（ＡＡＶではスペーサー配列ＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＧＣＣＡ（配列番号２２５）、ＸＤＰではＧＡＧＧＣＵＡＧＡＧＧＡＣＵＧＡＧＣＣＡ（配列番号２２６））を使用したマウスＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする、ＣａｓＸ ４９１とｇＲＮＡ １７４とをコードするＡＡＶ（表１３、構築物３Ａ、３６Ａ、および３７Ａを利用）、またはＣａｓＸ ４９１とｇＲＮＡ １７４とのＲＮＰをパッケージングするＸＤＰ（表１５－ｐＸＤＰ００１７、ｐＸＤＰ０００１、ｐＧＰ２、ｐＳｔｘ４２．１７４．２７．５）の構築物を、１０～１４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに尾静脈注射を介して投与する。実験的コントロールとして、マウスゲノムにおけるセーフハーバー部位、例えば、ｍＲｏｓａ２６遺伝子座を標的とするＣａｓＸとｇＲＮＡとをコードするか、もしくはパッケージングするＡＡＶまたはＸＤＰもコントロール群に投与する。それぞれのベクターの投与の１ヶ月および３ヶ月後、血漿中のコレステロールレベルは酵素比色分析を使用して評価し、血漿中のＰＣＳＫ９レベルはＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットアッセイによって評価する。ベクターの投与後１ヶ月および３ヶ月でマウスのサブセットを犠牲にし、組織を、ＮＧＳ、ｑＰＣＲ、および免疫組織学を介したゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルでのＰＣＳＫ９遺伝子編集の評価のために処理する。組織はまた、オフターゲット分析のために確立されたツール、例えば、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを使用して、オフターゲット編集について評価する。加えて、ＣａｓＸの発現はまた、免疫組織学によって目的の組織全体にわたって測定する。結果は、コレステロール値の低下を伴う、マウスにおけるＰＣＳＫ９遺伝子を編集する能力を実証することが予測される。
ヒトＰＣＳＫ９の肝臓特異的発現を伴う高コレステロール血症のトランスジェニックマウスモデルを使用して、ＣａｓＸとガイドＲＮＡとをコードするＡＡＶ粒子、またはＣａｓＸとヒトＰＣＳＫ９を標的とするガイドＲＮＡとのＲＮＰをパッケージングするＸＤＰがＰＣＳＫ９遺伝子をインビボで編集する能力を試験する。（Ｃａｒｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１９ １７：４）。
ヒトＰＣＳＫ９遺伝子を標的とする（ＡＡＶではスペーサー配列ＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡ（配列番号５１５）、ＸＤＰではＵＧＧＣＵＵＣＣＵＧＧＵＧＡＡＧＡＵＧＡ（配列番号５５９））、ＣａｓＸ ４９１とｇＲＮＡ １７４とをコードするＡＡＶ（構築物３、３６、および３７における配列を有する表１４）、またはＣａｓＸ ４９１とｇＲＮＡ １７４とのＲＮＰをパッケージングするＸＤＰ（ｐＸＤＰ００１７、ｐＸＤＰ０００１、ｐＧＰ２、ｐＳｔｘ４２．１７４．６．８における配列を有する表１５）の構築物を、１０～１４週齢のトランスジェニックマウスに尾静脈注射を介して投与する。実験的コントロールとして、マウスゲノムにおけるセーフハーバー部位、例えば、ｍＲｏｓａ２６遺伝子座を標的とするＣａｓＸとｇＲＮＡとをパッケージングするＡＡＶまたはＸＤＰ構築物を投与する。それぞれのベクターの投与の１ヶ月および３ヶ月後、血漿中のコレステロールレベルは酵素比色分析を使用して評価し、血漿中のＰＣＳＫ９レベルはＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットアッセイによって評価する。ベクターの投与後１ヶ月および３ヶ月でマウスのサブセットを犠牲にし、ＮＧＳ、ｑＰＣＲ、および免疫組織学を介したゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルでのＰＣＳＫ９遺伝子編集の評価のために組織を処理する。組織はまた、オフターゲット分析のために確立されたツール、例えば、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑを使用して、オフターゲット編集について評価する。加えて、ＣａｓＸの発現はまた、免疫組織学によって目的の組織全体にわたって測定する。結果は、コレステロール値の低下を伴う、マウスにおけるヒトＰＣＳＫ９遺伝子を編集する能力を実証することが予測される。
実施例２１：ｓｇＮＡおよびＣａｓＸタンパク質活性を測定するために使用するアッセイ
いくつかのアッセイを使用して、ＣａｓＸタンパク質ならびにｓｇＮＡディープミューテーショナルエボルーション（ＤＭＥ）ライブラリおよび改変変異の初期スクリーニングを実行し、ＣａｓＸ参照ｓｇＮＡおよびタンパク質と比較した選択タンパク質およびｓｇＮＡバリアントの活性を測定した。
いくつかのアッセイを使用して、ＣａｓＸタンパク質ならびにｓｇＮＡディープミューテーショナルエボルーション（ＤＭＥ）ライブラリおよび改変変異の初期スクリーニングを実行し、ＣａｓＸ参照ｓｇＮＡおよびタンパク質と比較した選択タンパク質およびｓｇＮＡバリアントの活性を測定した。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＲＩＳＰＲｉスクリーニング：
簡潔には、カルベニシリン（Ｃａｒｂ）耐性プラスミド上にＧＦＰ ｇＮＡを有するクロラムフェニコール（ＣＭ）耐性プラスミド上の死んでいるＣａｓＸ ＤＭＥライブラリの生物学的トリプリケートを、遺伝的に組み込まれて構成的に発現されたＧＦＰおよびＲＦＰを有するＭＧ１６５５に（５倍超のライブラリサイズで）形質転換した。細胞を、ＥＺ－ＲＤＭ＋Ｃａｒｂ、ＣＭ、およびアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導物質中で一晩増殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉを、ＲＦＰ抑制ではなくＧＦＰの上位１％のゲートに基づいてＦＡＣＳ分類し、収集し、すぐに再分類して、機能性の高いＣａｓＸ分子についてさらに濃縮した。その後、二重分類したライブラリを増殖させ、ＤＮＡをｈｉｇｈｓｅｑでのディープシークエンシングのために収集した。このＤＮＡもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
簡潔には、カルベニシリン（Ｃａｒｂ）耐性プラスミド上にＧＦＰ ｇＮＡを有するクロラムフェニコール（ＣＭ）耐性プラスミド上の死んでいるＣａｓＸ ＤＭＥライブラリの生物学的トリプリケートを、遺伝的に組み込まれて構成的に発現されたＧＦＰおよびＲＦＰを有するＭＧ１６５５に（５倍超のライブラリサイズで）形質転換した。細胞を、ＥＺ－ＲＤＭ＋Ｃａｒｂ、ＣＭ、およびアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）誘導物質中で一晩増殖させた。Ｅ．ｃｏｌｉを、ＲＦＰ抑制ではなくＧＦＰの上位１％のゲートに基づいてＦＡＣＳ分類し、収集し、すぐに再分類して、機能性の高いＣａｓＸ分子についてさらに濃縮した。その後、二重分類したライブラリを増殖させ、ＤＮＡをｈｉｇｈｓｅｑでのディープシークエンシングのために収集した。このＤＮＡもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
Ｅ．ｃｏｌｉ毒素の選択：
簡潔には、アラビノース誘導性毒素を含むカルベニシリン耐性プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、電気的コンピテントにした。クロラムフェニコール耐性プラスミド上に毒素標的ｇＮＡを有するＣａｓＸ ＤＭＥライブラリの生物学的トリプリケートを、この細胞に（５倍超のライブラリサイズで）形質転換し、ＬＢ＋ＣＭおよびアラビノース誘導物質中で増殖させた。毒素プラスミドを切断したＥ．ｃｏｌｉは誘導培地中で生存し、対数中期まで増殖させ、機能的ＣａｓＸ切断因子を有するプラスミドを回収した。この選択を必要に応じて繰り返した。その後、選択したライブラリを増殖させ、ＤＮＡをｈｉｇｈｓｅｑでのディープシークエンシングのために収集した。このＤＮＡもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析および試験のために採取した。
簡潔には、アラビノース誘導性毒素を含むカルベニシリン耐性プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、電気的コンピテントにした。クロラムフェニコール耐性プラスミド上に毒素標的ｇＮＡを有するＣａｓＸ ＤＭＥライブラリの生物学的トリプリケートを、この細胞に（５倍超のライブラリサイズで）形質転換し、ＬＢ＋ＣＭおよびアラビノース誘導物質中で増殖させた。毒素プラスミドを切断したＥ．ｃｏｌｉは誘導培地中で生存し、対数中期まで増殖させ、機能的ＣａｓＸ切断因子を有するプラスミドを回収した。この選択を必要に応じて繰り返した。その後、選択したライブラリを増殖させ、ＤＮＡをｈｉｇｈｓｅｑでのディープシークエンシングのために収集した。このＤＮＡもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析および試験のために採取した。
レンチウイルスベースのスクリーニングであるＥＧＦＰスクリーニング：
レンチウイルス粒子を、トランスフェクション時に７０％～９０％のコンフルエンスで、ＨＥＫ２９３細胞中で産生した。細胞を、ＣａｓＸ ＤＭＥライブラリを含むプラスミドのポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用してトランスフェクトした。レンチウイルスベクターを、粒子産生のためにレンチウイルスパッケージングプラスミドおよびＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクトした１２時間後に培地を交換し、トランスフェクトした３６～４８時間後にウイルスを収集した。ウイルス上清を、０．４５ｍｍの膜フィルターを使用して濾過し、適切な場合、細胞培養培地中で希釈し、組み込まれたＧＦＰレポーターを有する標的細胞であるＨＥＫ細胞に添加した。必要に応じて、ポリブレンを補充して、形質導入効率を高めた。形質導入細胞を、ピューロマイシンを使用して形質導入後２４～４８時間にわたって選択し、７～１０日間増殖させた。その後、細胞をＧＦＰ破壊について分類し、機能性の高いＣａｓＸ ｓｇＮＡまたはタンパク質バリアントについて収集した（図１９を参照されたい）。その後、ライブラリをゲノムから直接ＰＣＲにより増幅し、ｈｉｇｈｓｅｑでのディープシークエンシングのために収集した。このＤＮＡをプレート上で再クローニングおよび再形質転換することもでき、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
レンチウイルス粒子を、トランスフェクション時に７０％～９０％のコンフルエンスで、ＨＥＫ２９３細胞中で産生した。細胞を、ＣａｓＸ ＤＭＥライブラリを含むプラスミドのポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用してトランスフェクトした。レンチウイルスベクターを、粒子産生のためにレンチウイルスパッケージングプラスミドおよびＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクトした１２時間後に培地を交換し、トランスフェクトした３６～４８時間後にウイルスを収集した。ウイルス上清を、０．４５ｍｍの膜フィルターを使用して濾過し、適切な場合、細胞培養培地中で希釈し、組み込まれたＧＦＰレポーターを有する標的細胞であるＨＥＫ細胞に添加した。必要に応じて、ポリブレンを補充して、形質導入効率を高めた。形質導入細胞を、ピューロマイシンを使用して形質導入後２４～４８時間にわたって選択し、７～１０日間増殖させた。その後、細胞をＧＦＰ破壊について分類し、機能性の高いＣａｓＸ ｓｇＮＡまたはタンパク質バリアントについて収集した（図１９を参照されたい）。その後、ライブラリをゲノムから直接ＰＣＲにより増幅し、ｈｉｇｈｓｅｑでのディープシークエンシングのために収集した。このＤＮＡをプレート上で再クローニングおよび再形質転換することもでき、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
実施例２２：ＨＥＫ ＥＧＦＰレポーターの編集効率のアッセイ
ＣａｓＸ参照ｓｇＮＡおよびタンパク質ならびにそれらのバリアントの編集効率をアッセイするために、ＥＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞を９６ウェルプレートに播種し、製造業者のプロトコルに従って、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ならびに参照またはＣａｓＸバリアントタンパク質、Ｐ２Ａ－ピューロマイシン融合物、および参照またはバリアントｓｇＮＡをコードする１００～２００ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。翌日、細胞を１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２日間にわたって選択し、選択した７日後に蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって分析して、細胞からのＥＧＦＰタンパク質のクリアランスを可能にした。編集によるＥＧＦＰ破壊を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターおよびハイスループットオートサンプラーを使用して追跡した。
ＣａｓＸ参照ｓｇＮＡおよびタンパク質ならびにそれらのバリアントの編集効率をアッセイするために、ＥＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞を９６ウェルプレートに播種し、製造業者のプロトコルに従って、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ならびに参照またはＣａｓＸバリアントタンパク質、Ｐ２Ａ－ピューロマイシン融合物、および参照またはバリアントｓｇＮＡをコードする１００～２００ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。翌日、細胞を１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２日間にわたって選択し、選択した７日後に蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって分析して、細胞からのＥＧＦＰタンパク質のクリアランスを可能にした。編集によるＥＧＦＰ破壊を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターおよびハイスループットオートサンプラーを使用して追跡した。
実施例２３：ＣａｓＸ参照ｓｇＲＮＡの切断効率
配列番号４（下記）の参照ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡは、ＷＯ２０１８／０６４３７１およびＵＳ１０５７０４１５Ｂ２に記載されており、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる：ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号４）。
配列番号４（下記）の参照ＣａｓＸ ｓｇＲＮＡは、ＷＯ２０１８／０６４３７１およびＵＳ１０５７０４１５Ｂ２に記載されており、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる：ＡＣＡＵＣＵＧＧＣＧＣＧＵＵＵＡＵＵＣＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＧＡＧＣＣＡＧＵＣＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧＡＵＡＡＧＵＡＡＡＡＣＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号４）。
配列番号５（下記）を産生するための配列番号４のｓｇＲＮＡ参照配列に対する変化がＣａｓＸ切断効率を改善することができることが見出された。配列は、ＵＡＣＵＧＧＣＧＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＡＵＵＡＣＵＵＵＧＡＧＡＧＣＣＡＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＵＡＵＧＵＣＧＵＡＵＧＧＧＵＡＡＡＧＣＧＣＵＵＡＵＵＵＡＵＣＧＧＡＧＡＧＡＡＡＵＣＣＧＡＵＡＡＡＵＡＡＧＡＡＧＣＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号５）である。
ＣａｓＸ参照ｓｇＲＮＡおよびそのバリアントの編集効率をアッセイするために、ＥＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞を９６ウェルプレートに播種し、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ならびに参照ＣａｓＸタンパク質、Ｐ２Ａ－ピューロマイシン融合物、およびｓｇＲＮＡをコードする１００～２００ｎｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。翌日、細胞を１．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２日間にわたって選択し、選択した７日後に蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって分析して、細胞からのＥＧＦＰタンパク質のクリアランスを可能にした。編集によるＥＧＦＰ破壊を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターおよびハイスループットオートサンプラーを使用して追跡した。
ＣａｓＸ参照およびｓｇＮＡバリアントによるＥＧＦＰレポーターの切断を試験する場合、以下のスペーサー標的配列を使用した。ＣａｓＸ参照およびｓｇＮＡバリアントによるＥＧＦＰレポーターの切断を試験する場合、以下のスペーサー標的配列を使用した：Ｅ６（ＴＧＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＡＧＣＧＧＣＴＧ（配列番号１７））およびＥ７（ＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡ（配列番号１８））。
配列番号４のｓｇＲＮＡと比較して配列番号５のｓｇＲＮＡの切断効率が増加した例を図２０に示す。配列番号５の編集効率は、配列番号４と比較して１７６％改善した。したがって、配列番号５を、以下に記載される、ＤＭＥおよび追加のｓｇＮＡバリアント設計のための参照ｓｇＲＮＡとして選択した。
実施例２４：標的切断が改善されたｇＮＡバリアントの設計、作製、および評価
ガイド核酸（ｇＮＡ）バリアントを、参照ｇＮＡと比較した切断活性の改善を評価するために設計および試験した。これらのガイドを、本明細書に記載されるように、ＤＭＥまたは合理的設計および伸長ステムなどのガイド部品の交換もしくは付加または末端でのリボザイムの付加により発見した。
ガイド核酸（ｇＮＡ）バリアントを、参照ｇＮＡと比較した切断活性の改善を評価するために設計および試験した。これらのガイドを、本明細書に記載されるように、ＤＭＥまたは合理的設計および伸長ステムなどのガイド部品の交換もしくは付加または末端でのリボザイムの付加により発見した。
実験設計：
すべてのガイドを、以下のようにＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｔレポーター株で試験した。哺乳類細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔヒト腎臓細胞およびその誘導体を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、番号１５００－５００）ならびに１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１００×－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、ＧＩＢＣＯ、番号１５１４０－１２２）を補充し、かつピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１５６３００８０）、および２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号２１９８５０２３）をさらに含み得るダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、番号１０－０１３－ＣＶ）中で増殖させた。細胞を９６ウェルプレートに２０，０００～３０，０００細胞／ウェルで播種し、製造業者のプロトコルに従って、０．２５～１ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号Ｌ３０００００８）、レポーターまたは標的遺伝子を標的とするＣａｓＸおよび参照またはバリアントＣａｓＸガイドを含む５０～５００ｎｇのプラスミドを使用してトランスフェクトした。２４～７２時間後、培地を交換し、０．３～３．０ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、番号Ｐ８８３３）を添加して、形質転換を選択した。選択した２４～９６時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、適切な前方および側方散乱についてゲートし、単細胞を選択し、その後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または抗体レポーター発現（Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）についてゲートして、フルオロフォアの発現レベルを定量した。試料毎に少なくとも１０，０００個の事象を収集した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＧＦＰゲノム編集レポーター細胞株の場合、フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ陰性（編集済み）細胞のパーセンテージを定量し、各バリアントのＧＦＰ破壊を伴う細胞数を参照ガイドと比較して、倍率変化測定値を生成した。
すべてのガイドを、以下のようにＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｔレポーター株で試験した。哺乳類細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔヒト腎臓細胞およびその誘導体を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｅｒａｄｉｇｍ、番号１５００－５００）ならびに１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（１００×－Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、ＧＩＢＣＯ、番号１５１４０－１２２）を補充し、かつピルビン酸ナトリウム（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１３６００７０）、非必須アミノ酸（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１１１４００５０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号１５６３００８０）、および２－メルカプトエタノール（１０００×、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、番号２１９８５０２３）をさらに含み得るダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｅｌｌｇｒｏ、番号１０－０１３－ＣＶ）中で増殖させた。細胞を９６ウェルプレートに２０，０００～３０，０００細胞／ウェルで播種し、製造業者のプロトコルに従って、０．２５～１ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号Ｌ３０００００８）、レポーターまたは標的遺伝子を標的とするＣａｓＸおよび参照またはバリアントＣａｓＸガイドを含む５０～５００ｎｇのプラスミドを使用してトランスフェクトした。２４～７２時間後、培地を交換し、０．３～３．０ｕｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、番号Ｐ８８３３）を添加して、形質転換を選択した。選択した２４～９６時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、適切な前方および側方散乱についてゲートし、単細胞を選択し、その後、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または抗体レポーター発現（Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）についてゲートして、フルオロフォアの発現レベルを定量した。試料毎に少なくとも１０，０００個の事象を収集した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＧＦＰゲノム編集レポーター細胞株の場合、フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ陰性（編集済み）細胞のパーセンテージを定量し、各バリアントのＧＦＰ破壊を伴う細胞数を参照ガイドと比較して、倍率変化測定値を生成した。
結果：
ＤＭＥを介して生成されたｓｇＮＡバリアントからの結果を測定し、配列番号４の参照ｇＮＡと比較した。これらの結果は図２２に示され、ほとんどのバリアントは、参照ｇＮＡと比較して、０．１からほぼ１．５倍の改善を示している。合理的設計およびガイド部品の交換または付加（伸長ステムなどまたは末端でのリボザイムの付加）により生成されたバリアントの結果を、それぞれ、図２１および２３に示し、この場合もやはり、多くの構築物で改善が見られた。図２３に番号で示されているバリアントへの追加をそれらのコード配列とともに以下の表１６に列記する。我々は、Ｃ１８Ｇ変異などの単一変異が参照と比較してガイド活性を改善することを観察した。加えて、ＭＳ２、ＱＢ、ＰＰ７、ＵｖｓＸなどの異なるステムループを伸長ステムループと合理的に交換することにより、元の伸長ステムループを切断する場合と同様に、参照ガイドと比較して活性が改善された。最後に、我々は、ほとんどのリボザイムが活性を破壊する一方で、参照ガイドＲＮＡに３’ＨＤＶを付加することにより、活性を最大２０～５０％改善させることができることを実証する。
ＤＭＥを介して生成されたｓｇＮＡバリアントからの結果を測定し、配列番号４の参照ｇＮＡと比較した。これらの結果は図２２に示され、ほとんどのバリアントは、参照ｇＮＡと比較して、０．１からほぼ１．５倍の改善を示している。合理的設計およびガイド部品の交換または付加（伸長ステムなどまたは末端でのリボザイムの付加）により生成されたバリアントの結果を、それぞれ、図２１および２３に示し、この場合もやはり、多くの構築物で改善が見られた。図２３に番号で示されているバリアントへの追加をそれらのコード配列とともに以下の表１６に列記する。我々は、Ｃ１８Ｇ変異などの単一変異が参照と比較してガイド活性を改善することを観察した。加えて、ＭＳ２、ＱＢ、ＰＰ７、ＵｖｓＸなどの異なるステムループを伸長ステムループと合理的に交換することにより、元の伸長ステムループを切断する場合と同様に、参照ガイドと比較して活性が改善された。最後に、我々は、ほとんどのリボザイムが活性を破壊する一方で、参照ガイドＲＮＡに３’ＨＤＶを付加することにより、活性を最大２０～５０％改善させることができることを実証する。
結果は、ＤＭＥおよび合理的設計を使用してｇＮＡのパフォーマンスを向上させることができ、かつこれらのバリアントＲＮＡの多くを本明細書に記載のＣａｓＸ：ｇＮＡシステムの構成要素として標的化配列とともに使用して標的核酸配列を編集することができるという結論を裏付ける。
実施例２５：ＣａｓＸ分子１１９およびガイド足場１７４は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を編集する
実験の目的は、プラスミドトランスフェクションによって送達される場合に、ＣａｓＸ １１９と、ガイド１７４と、ＷＴ配列を標的とするスペーサーとの構築物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＰＣＳＫ９遺伝子座における編集を実証することだった。
実験の目的は、プラスミドトランスフェクションによって送達される場合に、ＣａｓＸ １１９と、ガイド１７４と、ＷＴ配列を標的とするスペーサーとの構築物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＰＣＳＫ９遺伝子座における編集を実証することだった。
材料および方法：
ＰＣＳＫ９を標的とするスペーサーは、活性に関する事前の知識を伴わずに、ＰＡＭの利用可能性に基づいてマニュアルで選択した（表１１の配列）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１００μｌのＦＢ培地中２０～４０ｋ細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を用いた３７℃のインキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認して、トランスフェクション時に細胞が約７５％のコンフルエンスであることを確実にした。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行した。各ＣａｓＸとガイドとの構築物（例えば、ＣａｓＸ １１９の配列について表５を参照、ガイド１７４の配列について表２を参照、およびＰＣＳＫ９スペーサー配列について表１１を参照）を、構築物当たり３ウェルの反復を使用し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を製造業者のプロトコルに従って使用して、ウェル当たり１００～５００ｎｇでＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＰＣＳＫ９を標的とするＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９を基準コントロールとして使用した。各Ｃａｓタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用した。細胞を、０．３～３μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２４～４８時間、成功したトランスフェクションについて選択し、続いてＦＢ培地中で２４～９６時間回収した。実験からの各試料における細胞を溶解し、製造業者のプロトコルおよび標準的な方法に従ってゲノムを抽出した。各実験試料に由来する細胞における編集を、ＮＧＳ分析を使用してアッセイした。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り１および２の配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。さらに、それらは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔのランダム配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５－１５００ｂｐ）を使用して評価した。アンプリコンを、製造業者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した。（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、（２）読み取り１および２からの配列を、プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して単一の挿入配列にマージし、（３）コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの３′末端付近のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）内の改変された読み取りのパーセントを定量する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および／または欠失を含む合計読み取りパーセントとして定量した。
ＰＣＳＫ９を標的とするスペーサーは、活性に関する事前の知識を伴わずに、ＰＡＭの利用可能性に基づいてマニュアルで選択した（表１１の配列）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１００μｌのＦＢ培地中２０～４０ｋ細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を用いた３７℃のインキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認して、トランスフェクション時に細胞が約７５％のコンフルエンスであることを確実にした。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行した。各ＣａｓＸとガイドとの構築物（例えば、ＣａｓＸ １１９の配列について表５を参照、ガイド１７４の配列について表２を参照、およびＰＣＳＫ９スペーサー配列について表１１を参照）を、構築物当たり３ウェルの反復を使用し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を製造業者のプロトコルに従って使用して、ウェル当たり１００～５００ｎｇでＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。ＰＣＳＫ９を標的とするＳａＣａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９を基準コントロールとして使用した。各Ｃａｓタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用した。細胞を、０．３～３μｇ／ｍｌのピューロマイシンで２４～４８時間、成功したトランスフェクションについて選択し、続いてＦＢ培地中で２４～９６時間回収した。実験からの各試料における細胞を溶解し、製造業者のプロトコルおよび標準的な方法に従ってゲノムを抽出した。各実験試料に由来する細胞における編集を、ＮＧＳ分析を使用してアッセイした。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り１および２の配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。さらに、それらは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔのランダム配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５－１５００ｂｐ）を使用して評価した。アンプリコンを、製造業者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した。（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、（２）読み取り１および２からの配列を、プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して単一の挿入配列にマージし、（３）コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの３′末端付近のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）内の改変された読み取りのパーセントを定量する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および／または欠失を含む合計読み取りパーセントとして定量した。
結果：
図２４のグラフは、ＰＣＳＫ９を標的とする１０例の異なるスペーサーを利用する構築物が、平均７０％の編集で、様々なレベルの活性でＰＣＳＫ９遺伝子座を編集することができたことを示す。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のＮＧＳ読み取りの平均測定値である。これらの結果は、アッセイの条件下で、適切なガイドを有するＣａｓＸがＰＣＳＫ９遺伝子座を編集でき、Ｓｐｙ Ｃａｓ９と比較して大幅に編集し（平均編集に基づく）、一方、Ｓａｕ Ｃａｓ９よりもかなり多くの編集を示した。
図２４のグラフは、ＰＣＳＫ９を標的とする１０例の異なるスペーサーを利用する構築物が、平均７０％の編集で、様々なレベルの活性でＰＣＳＫ９遺伝子座を編集することができたことを示す。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のＮＧＳ読み取りの平均測定値である。これらの結果は、アッセイの条件下で、適切なガイドを有するＣａｓＸがＰＣＳＫ９遺伝子座を編集でき、Ｓｐｙ Ｃａｓ９と比較して大幅に編集し（平均編集に基づく）、一方、Ｓａｕ Ｃａｓ９よりもかなり多くの編集を示した。
実施例２６：ＣａｓＸ １１９およびガイド足場１７４は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を編集する
実験は、レンチウイするによって送達される、ＣａｓＸ １１９と、ガイド１７４と、ＷＴ ＰＣＳＫ９配列を標的とするスペーサーとの構築物を使用して、ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を編集する能力を実証するために行った。
実験は、レンチウイするによって送達される、ＣａｓＸ １１９と、ガイド１７４と、ＷＴ ＰＣＳＫ９配列を標的とするスペーサーとの構築物を使用して、ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を編集する能力を実証するために行った。
材料および方法：
レンチウイルス粒子は、ＰＣＳＫ９遺伝子座（表１１の配列６．７、６．８、および６．９）を標的とするスペーサーを含むＣａｓＸプラスミドと、レンチウイルスパッケージングプラスミドと、ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドと、のポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用し、実施例１５の方法を使用してＨＥＫ２９３Ｔを７０％～９０％のコンフルエンスでトランスフェクトすることによって産生した。粒子産生では、培地をトランスフェクションの１２時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの３６～４８時間後に収集した。ウイルス上清を０．４５μｍ膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じて培地で希釈し、ＨｅｐＧ２培地（１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＥＭＥＭ）で培養したＨｅｐＧ２標的細胞に添加した。必要に応じて、補充のポリベレンを５～２０μｇ／ｍｌで添加して、形質導入効率を高めた。形質導入された細胞は、形質導入後、ＨｅｐＧ２培地中でピューロマイシンを０．３～３μｇ／ｍｌで使用して２４～４８時間選択し、ＨｅｐＧ２培地で、５％ＣＯ２を用いた３７℃インキュベーター内で６日間増殖させた。次に細胞を収集し、ＮＧＳを使用して編集を分析した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、目的とする標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り１および読み取り２配列を導入するために５’末端に追加の配列を含んだ。さらに、それらは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔのランダム配列を含んだ。アンプリコンの質および定量を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡアナライザーキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して評価した。アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで製造業者の説明書に従って配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した。（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、（２）読み取り１および２からの配列を、プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して単一の挿入配列にマージし、（３）コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの３′末端付近のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）内の改変された読み取りのパーセントを定量する。ＣａｓＸ分子の編集活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および／または欠失を含んだ合計読み取りパーセントとして定量した。
レンチウイルス粒子は、ＰＣＳＫ９遺伝子座（表１１の配列６．７、６．８、および６．９）を標的とするスペーサーを含むＣａｓＸプラスミドと、レンチウイルスパッケージングプラスミドと、ＶＳＶ－Ｇエンベローププラスミドと、のポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用し、実施例１５の方法を使用してＨＥＫ２９３Ｔを７０％～９０％のコンフルエンスでトランスフェクトすることによって産生した。粒子産生では、培地をトランスフェクションの１２時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの３６～４８時間後に収集した。ウイルス上清を０．４５μｍ膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じて培地で希釈し、ＨｅｐＧ２培地（１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＥＭＥＭ）で培養したＨｅｐＧ２標的細胞に添加した。必要に応じて、補充のポリベレンを５～２０μｇ／ｍｌで添加して、形質導入効率を高めた。形質導入された細胞は、形質導入後、ＨｅｐＧ２培地中でピューロマイシンを０．３～３μｇ／ｍｌで使用して２４～４８時間選択し、ＨｅｐＧ２培地で、５％ＣＯ２を用いた３７℃インキュベーター内で６日間増殖させた。次に細胞を収集し、ＮＧＳを使用して編集を分析した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、目的とする標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り１および読み取り２配列を導入するために５’末端に追加の配列を含んだ。さらに、それらは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔのランダム配列を含んだ。アンプリコンの質および定量を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡアナライザーキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して評価した。アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで製造業者の説明書に従って配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した。（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、（２）読み取り１および２からの配列を、プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して単一の挿入配列にマージし、（３）コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの３′末端付近のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）内の改変された読み取りのパーセントを定量する。ＣａｓＸ分子の編集活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および／または欠失を含んだ合計読み取りパーセントとして定量した。
結果：
図２５のグラフは、ＰＣＳＫ９を標的とする３つの異なるスペーサーを有する構築物が、平均６０％の編集で、様々なレベルの活性でＰＣＳＫ９遺伝子座を編集することができたことを示す。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のＮＧＳ読み取りの平均測定値である。
図２５のグラフは、ＰＣＳＫ９を標的とする３つの異なるスペーサーを有する構築物が、平均６０％の編集で、様々なレベルの活性でＰＣＳＫ９遺伝子座を編集することができたことを示す。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のＮＧＳ読み取りの平均測定値である。
結果は、アッセイの条件下で、適切に標的化したガイドを有するＣａｓＸが、ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を高い効率で編集することができたことを示す。
実施例２７：ＣａｓＸ ４９１およびガイド足場１７４は、ＡＭＬ１２細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を編集する
実験は、トランスフェクションによって送達されたときに、ＡＭＬ１２細胞における野生型ＰＣＳＫ９遺伝子座を編集する能力を実証するために行った。
実験は、トランスフェクションによって送達されたときに、ＡＭＬ１２細胞における野生型ＰＣＳＫ９遺伝子座を編集する能力を実証するために行った。
材料および方法：
ネズミ肝細胞株ＡＭＬ１２細胞を、野生型ネズミＰＣＳＫ９（表１７における配列）を標的にするスペーサー２７．１～２７．７を有するｇＲＮＡ足場１７４とともにＣａｓＸ ４９１をコードする１０００ｎｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、ＡＭＬ１２培地（１０％ウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌインスリン、５．５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレン、４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾンを補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２）中で、５％ＣＯ２を用いた３７℃インキュベーターでインキュベートして６日間増殖させた。次に、細胞を収集し、ＮＧＳを使用して編集分析した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り１および２の配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。さらに、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔのランダム配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡアナライザーキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して評価した。アンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで製造業者の説明書に従って配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した。（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、（２）読み取り１および２からの配列を、プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して単一の挿入配列にマージし、（３）コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの３′末端付近のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）内の改変された読み取りのパーセントを定量する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および／または欠失を含む合計読み取りパーセントとして定量した。
ネズミ肝細胞株ＡＭＬ１２細胞を、野生型ネズミＰＣＳＫ９（表１７における配列）を標的にするスペーサー２７．１～２７．７を有するｇＲＮＡ足場１７４とともにＣａｓＸ ４９１をコードする１０００ｎｇのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、ＡＭＬ１２培地（１０％ウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌインスリン、５．５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレン、４０ｎｇ／ｍｌデキサメタゾンを補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２）中で、５％ＣＯ２を用いた３７℃インキュベーターでインキュベートして６日間増殖させた。次に、細胞を収集し、ＮＧＳを使用して編集分析した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ読み取り１および２の配列を導入するために５’末端に追加の配列を含む。さらに、固有の分子識別子（ＵＭＩ）として機能する１６ｎｔのランダム配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡアナライザーキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、ｄｓＤＮＡ ３５～１５００ｂｐ）を使用して評価した。アンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑで製造業者の説明書に従って配列決定した。配列決定からの生ｆａｓｔｑファイルを以下のように処理した。（１）プログラムｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ．２．１）を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、（２）読み取り１および２からの配列を、プログラムｆｌａｓｈ２（ｖ２．２．００）を使用して単一の挿入配列にマージし、（３）コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２（ｖ ２．０．２９）を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの３′末端付近のウィンドウ（スペーサーの３’末端から－３ｂｐを中心とする３０ｂｐウィンドウ）内の改変された読み取りのパーセントを定量する。ＣａｓＸ分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および／または欠失を含む合計読み取りパーセントとして定量した。
結果：
図２６のグラフは、３つの異なるスペーサーを有する構築物が、少なくとも６～７％の平均編集でＰＣＳＫ９遺伝子座を編集することができ、他のスペーサーがより少ない量の編集をもたらすことを示している。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のＮＧＳ読み取りの平均測定値である。結果は、アッセイの条件下で、適切に標的化したガイドを有するＣａｓＸが、ＡＭＬ１２細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を編集することができたことを示す。
図２６のグラフは、３つの異なるスペーサーを有する構築物が、少なくとも６～７％の平均編集でＰＣＳＫ９遺伝子座を編集することができ、他のスペーサーがより少ない量の編集をもたらすことを示している。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のＮＧＳ読み取りの平均測定値である。結果は、アッセイの条件下で、適切に標的化したガイドを有するＣａｓＸが、ＡＭＬ１２細胞におけるＰＣＳＫ９遺伝子座を編集することができたことを示す。
Claims (192)
- クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、第１のガイド核酸（ｇＮＡ）と、を含む、システムであって、前記ｇＮＡが、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）遺伝子標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、１つ以上の変異を含む、システム。
- 前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、
ａ．ＰＣＳＫ９イントロン、
ｂ．ＰＣＳＫ９エクソン、
ｃ．ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部、
ｄ．ＰＣＳＫ９調節要素、および
ｅ．遺伝子間領域、からなる群から選択される領域に１つ以上の変異を含む、請求項１に記載のシステム。 - 前記変異が、野生型ＰＣＳＫ９遺伝子配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位である、請求項１または２に記載のシステム。
- 前記変異が、機能獲得型変異である、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記１つ以上の変異が、配列番号３３の配列に対して、Ｓ１２７Ｒ、Ｄ１２９Ｇ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ３７４Ｈ、およびＤ３７４Ｙからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項３に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、Ｓ１２７Ｒ、Ｄ１２９Ｇ、Ｆ２１６Ｌ、Ｄ３７４Ｈ、またはＤ３７４Ｙ置換をコードする標的核酸配列に相補的である、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、ＡＧＣＡＧＧＵＣＧＣＣＵＣＵＣＡＵＣＵＵ（配列番号２７２）、ＣＡＵＣＵＵＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＧ（配列番号２７３）、ＣＣＵＣＵＣＡＵＣＵＵＣＡＣＣＡＧＧＡＡ（配列番号２７４）、ＵＧＧＵＧＡＡＧＡＵＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣ（配列番号２７５）、ＧＵＧＧＡＧＧＣＧＧＧＵＣＣＣＧＵＣＣＵ（配列番号２８１）、ＡＧＣＣＡＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＵＧＣＵＵ（配列番号２８７）、ＵＵＧＧＵＧＣＣＵＣＣＡＧＣＣＡＣＵＧＣ（配列番号２８８）、ＡＧＣＵＡＣＵＧＣＡＧＣＡＣＣＵＧＣＵＵ（配列番号２８９）、およびＵＵＧＧＵＧＣＣＵＣＣＡＧＣＵＡＣＵＧＣ（配列番号２９０）からなる群から選択される配列を含む、請求項６に記載のシステム。
- 前記変異が、機能喪失型突然変異である、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記１つ以上の変異が、配列番号３３の配列に対して、Ｒ４６Ｌ、Ｇ１０６Ｒ、Ｙ１４２Ｘ、Ｎ１５７Ｋ、Ｒ２３７Ｗ、およびＣ６７９Ｘからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項８に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、前記Ｒ４６Ｌ、Ｇ１０６Ｒ、Ｙ１４２Ｘ、Ｎ１５７Ｋ、Ｒ２３７Ｗ、またはＣ６７９Ｘ置換をコードする標的核酸配列に相補的である、請求項９に記載のシステム。
- 前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質をコードする、請求項１～１０のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡが、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡが、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、キメラである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡが、単一分子ｇＮＡ（ｓｇＮＡ）である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡが、二重分子ｇＮＡ（ｄｇＮＡ）である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１の配列からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１の配列からなる群から選択される配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から２つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から３つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から４つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から５つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列に対して、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を有する配列を含む、請求項１７～２３のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、ＰＣＳＫ９エクソンの配列に相補的である、請求項１～２４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、ＰＣＳＫ９エクソン１またはエクソン２の配列に相補的である、請求項１～２４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、ＰＣＳＫ９イントロンの配列に相補的である、請求項１～２４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部の配列に相補的である、請求項１～２４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、ＰＣＳＫ９調節要素の配列に相補的である、請求項１～２４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子の１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列に相補的である、請求項１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子の遺伝子間領域の配列に相補的である、請求項１～２４のいずれか一項に記載のシステム。
- 第２のｇＮＡをさらに含み、前記第２のｇＮＡが、前記第１のｇＮＡの前記標的化配列と比較して、前記ＰＣＳＫ９標的核酸配列の異なるかまたは重複する部分に相補的である標的化配列を有する、請求項１～３１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡが、前記第１のｇＮＡによって標的化されるのと同じエクソンに相補的な標的化配列を有する、請求項３２に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡが、前記第１のｇＮＡによって標的化されるのと異なるエクソンに相補的な標的化配列を有する、請求項３２に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡが、前記第１のｇＮＡによって標的化されるイントロンの３’からエクソンまでに相補的な標的化配列を有する、請求項３２に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡの前記標的化配列が、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１の配列からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９５％の同一性を有する配列を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡの前記標的化配列が、配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～１３８６１の配列からなる群から選択される配列を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から２つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から３つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から４つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第２のｇＮＡの前記標的化配列が、配列の３’末端から５つのヌクレオチドが除去されている配列番号２４７～３０３、３１５～４３６、６１２～２１００、または２２８６～１３８６１の配列を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第１および／または第２のｇＮＡが、配列番号２２０１～２２８５からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、請求項１～４２のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第１および／または第２のｇＮＡが、配列番号２２０１～２２８５からなる群から選択される配列を含む足場を有する、請求項１～４２のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第１および／または第２のｇＮＡが、配列番号２２０１～２２８５からなる群から選択される配列からなる足場を有する、請求項１～４２のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第１および／または第２のｇＮＡ足場が、配列番号４～１６からなる群から選択される参照ｇＮＡ配列と比較して、少なくとも１つの改変を有する配列を含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記参照ｇＮＡの前記少なくとも１つの改変が、前記参照ｇＮＡ配列のヌクレオチドの少なくとも１つの置換、欠失、または置換を含む、請求項４６に記載のシステム。
- 前記第１および／または第２のｇＮＡが、化学的に改変される、請求項１～４７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号１～３のうちのいずれか１つの配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質、配列番号４９～１６０、３２９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、もしくは４９０の配列、またはそれに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する配列を有するＣａｓＸバリアントタンパク質を含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、配列番号４９～１６０、３２９、４４１、４４３、４４５、４４７～４６０、４７２、４７４、４７６、４７８、４８０、４８２、４８４、４８６、４８８、または４９０の配列を有するＣａｓＸバリアントタンパク質である、請求項１～４９のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、配列番号１～３から選択される配列を有する参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、少なくとも１つの改変を含む、請求項４９に記載のシステム。
- 前記少なくとも１つの改変が、前記参照ＣａｓＸタンパク質と比較して、前記ＣａｓＸバリアントタンパク質のドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または置換を含む、請求項５１に記載のシステム。
- 前記ドメインが、非標的鎖結合（ＮＴＳＢ）ドメイン、標的鎖負荷（ＴＳＬ）ドメイン、ヘリカルＩドメイン、ヘリカルＩＩドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン（ＯＢＤ）、およびＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインからなる群から選択される、請求項５２に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸタンパク質が、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項４９～５３のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記１つ以上のＮＬＳが、配列番号１６１～１９４、２１７、および２２３～２２４からなる配列の群から選択される、請求項５４に記載のシステム。
- 前記１つ以上のＮＬＳが、前記ＣａｓＸタンパク質のＣ末端で、またはその近くで発現される、請求項５４または５５に記載のシステム。
- 前記１つ以上のＮＬＳが、前記ＣａｓＸタンパク質のＮ末端で、またはその近くで発現される、請求項５４または５５に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸタンパク質のＮ末端に、またはその近くに、かつＣ末端に、またはその近くに位置する１つ以上のＮＬＳを含む、請求項５４または５５に記載のシステム。
- 前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、前記ｇＮＡとともにリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、請求項４９～５８のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸバリアントが、前記ｇＮＡとともにリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成することができる、請求項４９～５８のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸバリアントおよび前記ｇＮＡが、ＲＮＰとして複合体化される、請求項４９～５８のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸバリアントタンパク質と前記ｇＮＡとを含むＲＮＰが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の前記参照ＣａｓＸタンパク質と、配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を含むｇＮＡとを含むＲＮＰと比較して、少なくとも１つ以上の改善された特性を示す、請求項６１に記載のシステム。
- 前記改善された特性が、前記ＣａｓＸバリアントの改善されたフォールディング、ガイド核酸（ｇＮＡ）に対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡに対する改善された結合親和性、標的ＤＮＡの編集においてＡＴＣ、ＣＴＣ、ＧＴＣ、またはＴＴＣを含む１つ以上のＰＡＭ配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、前記標的ＤＮＡの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された編集効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、改善された標的核酸配列切断速度、二本鎖切断のための増加した標識鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標識鎖負荷、減少したオフターゲット切断、非標的ＤＮＡ鎖の改善された結合、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）形成、切断能力のあるＲＮＰの高い割合、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体（ＲＮＰ）安定性、改善されたタンパク質：ｇＮＡ複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、および改善された融合特性からなる群のうちの１つ以上から選択される、請求項６２に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸバリアントタンパク質と前記ｇＮＡバリアントとの前記ＲＮＰの前記改善された特性が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の前記参照ＣａｓＸタンパク質と、配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を含む前記ｇＮＡとの前記ＲＮＰと比較して、少なくとも約１．１～約１００倍以上改善される、請求項６２または６３に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸバリアントタンパク質の前記改善された特性が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の前記参照ＣａｓＸタンパク質および配列番号４～１６のうちのいずれか１つの配列を含む前記ｇＮＡと比較して、少なくとも約１．１、少なくとも約２、少なくとも約１０、少なくとも約１００倍以上改善される、請求項６２または６３に記載のシステム。
- 前記改善された特性が、前記標的核酸配列に対する改善された結合親和性である、請求項６４または６５に記載のシステム。
- 前記ＰＡＭ配列ＴＴＣ、ＡＴＣ、ＧＴＣ、またはＣＴＣのうちのいずれか１つが、前記ｇＮＡの前記標的化配列と同一性を有する非標的鎖配列に対して５’の１つのヌクレオチドに位置する場合、前記ＣａｓＸバリアントと前記ｇＮＡバリアントとを含む前記ＲＮＰが、細胞アッセイシステムにおいて、同等のアッセイシステムにおける参照ＣａｓＸタンパク質と参照ｇＮＡとを含むＲＮＰの編集効率および／または結合と比較して、前記標的核酸における標的化配列の高い編集効率および／または結合を示す、請求項６１～６６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＰＡＭ配列が、ＴＴＣである、請求項６７に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列番号３１８４～７２５１からなる群から選択される配列を含む、請求項６８に記載のシステム。
- 前記ＰＡＭ配列が、ＡＴＣである、請求項６７に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列番号３１５～４３６、６１２～２１００、および２２８６～３１８３からなる群から選択される配列を含む、請求項７０に記載のシステム。
- 前記ＰＡＭ配列が、ＣＴＣである、請求項６７に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列番号７２５２～１１５２１からなる群から選択される配列を含む、請求項７２に記載のシステム。
- 前記ＰＡＭ配列が、ＧＴＣである、請求項６７に記載のシステム。
- 前記ｇＮＡの前記標的化配列が、配列番号１１５２２～１３８６１からなる群から選択される配列を含む、請求項７４に記載のシステム。
- 前記ＲＮＰが、配列番号１～３の前記参照ＣａｓＸタンパク質と配列番号４～１６の前記ｇＮＡとのＲＮＰと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％高いパーセンテージの切断能力のあるＲＮＰを有する、請求項６１～７５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＲＮＰが、配列番号１～３の前記参照ＣａｓＸタンパク質のＲＮＰと比較して、インビトロアッセイにおいて、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも３０倍増加した切断速度を有する、請求項６０～７５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、請求項４９～７７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するＲｕｖＣ ＤＮＡ切断ドメインを含む、請求項４９～７７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＣａｓＸタンパク質が、触媒的に不活性なＣａｓＸ（ｄＣａｓＸ）タンパク質であり、前記ｄＣａｓＸと前記ｇＮＡとのＲＮＰが、前記ＰＣＳＫ９標的核酸に結合する能力を保持する、請求項４９～７５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ｄＣａｓＸが、残基：
ａ．配列番号１の前記ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６７２、Ｅ７６９、および／もしくはＤ９３５、または
ｂ．配列番号２の前記ＣａｓＸタンパク質に対応するＤ６５９、Ｅ７５６、および／もしくはＤ９２２、に変異を含む、請求項８０に記載のシステム。 - 前記変異が、前記残基におけるアラニンの置換である、請求項８１に記載のシステム。
- ドナー鋳型核酸をさらに含む、請求項１～７９のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、ＰＣＳＫ９エクソン、ＰＣＳＫ９イントロン、ＰＣＳＫ９イントロン－エクソン接合部、およびＰＣＳＫ９調節要素、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるＰＣＳＫ９遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含む、請求項８３に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、野生型核酸配列を含む、請求項８４に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、前記野生型ＰＣＳＫ９遺伝子配列と比較して、１つ以上の変異を有する核酸配列を含む、請求項８４に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、１０～１５，０００個のヌクレオチドの範囲のサイズである、請求項８３～８６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、一本鎖ＤＮＡ鋳型または一本鎖ＲＮＡ鋳型である、請求項８３～８７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、二本鎖ＤＮＡ鋳型である、請求項８３～８７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質によって導入された前記ＰＣＳＫ９標的核酸における切断部位に隣接する配列に相補的であるドナー鋳型の５’および３’末端に、またはその近くに相同アームを含む、請求項８３～８９のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的核酸配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の１つのヌクレオチドの３’に位置する非標的鎖配列に相補的である、請求項１～９０のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ＰＡＭ配列が、ＴＣモチーフを含む、請求項９１に記載のシステム。
- 前記ＰＡＭ配列が、ＡＴＣ、ＧＴＣ、ＣＴＣ、またはＴＴＣを含む、請求項９１に記載のシステム。
- 前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＲｕｖＣドメインを含む、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＲｕｖＣドメインが、前記標的核酸配列にねじれた二本鎖切断を生成する、請求項９４に記載のシステム。
- 前記クラス２のＶ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを含まない、請求項９１～９５のいずれか一項に記載のシステム。
- 請求項８３～９０のいずれか一項に記載のドナー鋳型を含む、核酸。
- 請求項４９～８２のいずれか一項に記載のＣａｓＸをコードする配列を含む、核酸。
- 前記ＣａｓＸタンパク質をコードする前記配列が、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項９８に記載の核酸。
- 請求項１～４８のいずれか一項に記載のｇＮＡをコードする配列を含む、核酸。
- 請求項１～４８のいずれか一項に記載のｇＮＡ、請求項４９～８２のいずれか一項に記載のＣａｓＸタンパク質、または請求項９７～１００のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
- 前記ベクターが、プロモーターをさらに含む、請求項１０１に記載のベクター。
- 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、ＤＮＡベクター、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される、請求項１０１または１０２に記載のベクター。
- 前記ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項１０３に記載のベクター。
- 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ－Ｒｈ７４、またはＡＡＶＲｈ１０から選択される、請求項１０４に記載のベクター。
- 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９から選択される、請求項１０５に記載のベクター。
- 前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項１０３に記載のベクター。
- 前記ベクターが、ｇａｇポリタンパク質の１つ以上の成分を含むＶＬＰベクターである、請求項１０３に記載のベクター。
- 前記Ｇａｇポリタンパク質の前記１つ以上の成分が、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、ｐ１－ｐ６タンパク質、ＰＰ２１／２４ペプチド、Ｐ１２／Ｐ３／Ｐ８ペプチド、ｐ２ペプチド、Ｐ１０ペプチド、ｐ６８ Ｇａｇポリペプチド、ｐ３ Ｇａｇポリペプチド、およびプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される、請求項１０８に記載のベクター。
- 前記ＣａｓＸタンパク質と前記ｇＮＡとを含む、請求項１０８または１０９に記載のベクター。
- 前記ＣａｓＸタンパク質および前記ｇＮＡが、ＲＮＰで一緒に会合している、請求項１１０に記載のベクター。
- 前記ドナー鋳型をさらに含む、請求項１０８～１１１のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ＶＬＰと標的細胞との結合および融合を提供する偽型ウイルスエンベロープ糖タンパク質または抗体断片をさらに含む、請求項１０８～１１２のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項１０１～１１３のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＳ０、ＳＰ２／０、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、および酵母細胞からなる群から選択される、請求項１１４に記載の宿主細胞。
- ａ．請求項１～９６のいずれか一項に記載のシステム、
ｂ．請求項９７～１００のいずれか一項に記載の核酸、または
ｃ．請求項１０１～１１３のいずれか一項に記載のベクター、
および１つ以上の薬学的に好適な賦形剤を含む、医薬組成物。 - 前記医薬組成物が、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路のために製剤化される、請求項１１６に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、液体形態または凍結形態である、請求項１１６に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、単回注射のためのプレフィルドシリンジ内にある、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 細胞集団におけるＰＣＳＫ９標的核酸配列を改変する方法であって、前記ＰＣＳＫ９標的核酸が１つ以上の変異を含み、前記方法が、前記集団細胞に、
ａ．請求項１～９６のいずれか一項に記載のシステム、
ｂ．請求項９７～１００のいずれか一項に記載の核酸、
ｃ．請求項１０１～１１３のいずれか一項に記載のベクター、
ｄ．請求項１１６～１１９のいずれか一項に記載の医薬組成物、または
ｅ．（ａ）～（ｄ）のうちの２つ以上の組み合わせを導入することを含み、
前記第１のｇＮＡによって標的化される前記細胞の前記ＰＣＳＫ９標的核酸配列が、前記クラス２タイプＶタンパク質によって改変される、方法。 - 前記改変することが、前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９標的核酸配列に一本鎖切断を導入することを含む、請求項１２０に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９標的核酸配列に二本鎖切断を導入することを含む、請求項１２０に記載の方法。
- 前記細胞集団に第２のｇＮＡまたは前記第２のｇＮＡをコードする核酸を導入することをさらに含み、前記第２のｇＮＡが、前記第１のｇＮＡと比較して、前記ＰＣＳＫ９標的核酸の異なるかまたは重複する部分に相補的な標的化配列を有し、前記集団の前記細胞の前記ＰＣＳＫ９標的核酸に追加の切断をもたらす、請求項１２０～１２２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９標的核酸に１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含む、請求項１２０～１２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、または少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％以上の前記ＰＣＳＫ９標的核酸が改変される、請求項１２０～１２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞集団における前記ＰＣＳＫ９遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらし、それによって、非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少される、請求項１２０～１２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、前記改変された細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が、検出可能なレベルの非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質を発現しないように改変される、請求項１２０～１２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞集団における前記ＰＣＳＫ９遺伝子の前記変異の修正または代償をもたらし、それによって機能的ＰＣＳＫ９タンパク質が前記細胞によって発現される、請求項１２０～１２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団による前記機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％増加される、請求項１２０～１２４および１２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９遺伝子標的核酸配列の前記切断部位への前記ドナー鋳型の配列の挿入を含む、請求項１２０～１２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記配列の前記挿入が、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される、請求項１３０に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記配列の挿入が、前記細胞集団における前記ＰＣＳＫ９遺伝子の修正または代償をもたらし、それによって機能的ＰＣＳＫ９タンパク質が前記細胞によって発現される、請求項１３０または１３１に記載の方法。
- 前記細胞集団による前記機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％増加される、請求項１３０～１３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、前記改変された細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、検出可能なレベルの機能的ＰＣＳＫ９を発現するように改変される、請求項１３０～１３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記配列の挿入が、前記細胞集団における前記ＰＣＳＫ９遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらし、それによって非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少される、請求項１３０または１３１に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、前記改変された細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が、検出可能なレベルの非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質を発現しないように改変される、請求項１３０または１３１に記載の方法。
- 前記細胞が、真核生物のものである、請求項１２０～１３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、請求項１３７に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が、ヒト細胞である、請求項１３７に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜の細胞、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、請求項１３７～１３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９遺伝子標的核酸配列を前記改変することが、インビトロまたはエクスビボで生じる、請求項１２０～１４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９遺伝子標的核酸配列を前記改変することが、対象においてインビボで生じる、請求項１２０～１４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、げっ歯類、マウス、ラット、および非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１４２に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項１４２に記載の方法。
- 前記方法が、治療有効用量のＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含む、請求項１４２～１４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＡＡＶベクターが、前記対象に、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム／ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ体重）、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１４５に記載の方法。
- 前記ＡＡＶベクターが、前記対象に、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１１ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１４５に記載の方法。
- 前記方法が、治療有効用量のＶＬＰを前記対象に投与することを含む、請求項１４２～１４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＶＬＰが、前記対象に、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ体重（粒子／ｋｇ）、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で投与される、請求項１４８に記載の方法。
- 前記ＶＬＰが、前記対象に、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ～約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ～約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ～約１×１０１１粒子／ｋｇの用量で投与される、請求項１４８に記載の方法。
- 前記ベクターまたはＶＬＰが、前記対象に、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、請求項１４２～１５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記ＰＣＳＫ９標的核酸配列を、
ａ．追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、および前記第１のｇＮＡと比較して前記ＰＣＳＫ９標的核酸の異なるかもしくは重複する部分を標的とするｇＮＡ、
ｂ．（ａ）の前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼおよび前記ｇＮＡをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、
ｃ．（ｂ）の前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または
ｄ．（ａ）の前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記ｇＮＡとを含むＶＬＰ、と接触させることをさらに含み、
前記接触させることが、前記第１のｇＮＡによって標的化される前記配列と比較して、前記配列における異なる位置に前記ＰＣＳＫ９遺伝子の改変をもたらす、請求項１４２～１５１のいずれか一項に記載の方法。 - 前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、先行請求項のいずれか一項に記載のＣａｓＸタンパク質とは異なる配列を有するＣａｓＸタンパク質である、請求項１５２に記載の方法。
- 前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＣａｓＸタンパク質ではない、請求項１５２に記載の方法。
- 前記追加のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２Ｊ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、ＣａｓＺ、Ｃａｓ１４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃｌ、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ Ｐｈｉ、およびそれらの配列変異体からなる群から選択される、請求項１５４に記載の方法。
- 請求項１４２～１５５のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞集団であって、前記細胞が、前記改変された細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が検出可能なレベルの非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質を発現しないように改変されている、細胞集団。
- 請求項１４２～１５６のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞集団であって、前記ＰＣＳＫ９標的核酸の前記変異が、前記改変された細胞集団において修正または代償され、前記改変された細胞による機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現をもたらす、細胞集団。
- 機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されてない細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％増加されるように、前記細胞が改変されている、請求項１５７に記載の細胞集団。
- 前記細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜細胞、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、請求項１５６～１５８のいずれか一項に記載の細胞集団。
- ＰＣＳＫ９関連疾患の治療を必要とする対象におけるＰＣＳＫ９関連疾患を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１５６～１５９のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
- 前記ＰＣＳＫ９関連疾患が、常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、高脂質血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、ＬＤＬコレステロールレベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、またはそれらの組み合わせである、請求項１６０に記載の方法。
- 前記対象が、げっ歯類、マウス、ラット、および非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１６０または１６１に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項１６０～１６２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、前記細胞を投与される前記対象に対して自己である、請求項１６０～１６３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、前記細胞を投与される前記対象に対して同種異系である、請求項１６０～１６３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、請求項１６０～１６５のいずれか一項に記載の方法。
- ＰＣＳＫ９関連疾患の治療を必要とする対象におけるＰＣＳＫ９関連疾患を治療する方法であって、前記対象の細胞における１つ以上の変異を有するＰＣＳＫ９遺伝子を改変することを含み、前記改変することが、前記細胞を、治療有効量の
ａ．請求項１～９６のいずれか一項に記載のシステム、
ｂ．請求項９７～１００のいずれか一項に記載の核酸、
ｃ．請求項１０１～１０７のいずれか一項に記載のベクター、
ｄ．請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載のＶＬＰ、
ｅ．請求項１１６～１１９のいずれか一項に記載の医薬組成物、または
ｆ．（ａ）～（ｅ）のうちの２つ以上の組み合わせと接触させることを含み、
前記第１のｇＮＡによって標的化される前記細胞の前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、ＣａｓＸタンパク質によって改変される、方法。 - 前記改変することが、前記細胞の前記ＰＣＳＫ９遺伝子に一本鎖切断を導入することを含む、請求項１６７に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞の前記ＰＣＳＫ９遺伝子に二本鎖切断を導入することを含む、請求項１６７に記載の方法。
- 前記対象の前記細胞に、第２のｇＮＡまたは前記第２のｇＮＡをコードする核酸を導入することをさらに含み、前記第２のｇＮＡが、前記第１のｇＮＡと比較して前記標的核酸の異なるかまたは重複する部分に相補的な標的化配列を有して、前記対象の前記細胞の前記ＰＣＳＫ９標的核酸に追加の切断をもたらす、請求項１６７～１６９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞の前記ＰＣＳＫ９遺伝子における１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含む、請求項１６７～１６９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞の前記ＰＣＳＫ９遺伝子標的核酸配列の前記切断部位への前記ドナー鋳型の配列の挿入を含む、請求項１６７～１７０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記配列の前記挿入が、相同性指向修復（ＨＤＲ）または相同性非依存性標的化組み込み（ＨＩＴＩ）によって媒介される、請求項１７２に記載の方法。
- 前記改変することが、前記対象の前記改変された細胞における前記ＰＣＳＫ９遺伝子の変異の修正または代償をもたらす、請求項１６７～１７３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異の修正が、前記対象の前記改変された細胞による機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現をもたらす、請求項１７４に記載の方法。
- 前記改変された細胞の前記ＰＣＳＫ９遺伝子が、増加したレベルの機能的ＰＣＳＫ９タンパク質を発現し、前記増加が、改変されていないＰＣＳＫ９遺伝子を有する細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である、請求項１７４または１７５に記載の方法。
- 前記改変することが、前記対象の前記改変された細胞における前記ＰＣＳＫ９遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらし、それによって、前記改変された細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％が、検出可能なレベルの非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質を発現しない、請求項１６７～１７３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記対象の前記改変された細胞における前記ＰＣＳＫ９遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらし、それによって、前記対象における非機能的ＰＣＳＫ９タンパク質の発現が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子が改変されていない対象と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少される、請求項１６７～１７３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、げっ歯類、マウス、ラット、および非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項１６７～１７８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項１６７～１７８のいずれか一項に記載の方法。
- 改変される前記細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜の細胞、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、請求項１６７～１８０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＰＣＳＫ９関連疾患が、常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、高脂質血症、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベルの上昇、ＬＤＬコレステロールレベルの上昇である、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、またはそれらの組み合わせである、請求項１６７～１８１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、前記対象に、治療有効用量で投与される、請求項１６７～１８２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、ＡＡＶであり、前記対象に、少なくとも約１×１０５ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１６ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１６７～１８３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、ＡＡＶであり、前記対象に、少なくとも約１×１０５ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１６ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０６ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０７ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０８ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、少なくとも約１×１０９ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ～約１×１０１１ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１６７～１８３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＶＬＰが、前記対象に、治療有効用量で投与される、請求項１６７～１８２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＶＬＰが、前記対象に、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１６粒子／ｋｇの用量で投与される、請求項１８６に記載の方法。
- 前記ＶＬＰが、前記対象に、少なくとも約１×１０５粒子／ｋｇ～約１×１０１６粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０６粒子／ｋｇ～約１×１０１５粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０７粒子／ｋｇ～約１×１０１４粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０８粒子／ｋｇ～約１×１０１３粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０９粒子／ｋｇ～約１×１０１２粒子／ｋｇ、少なくとも約１×１０１０粒子／ｋｇ～約１×１０１１粒子／ｋｇの用量で投与される、請求項１８６に記載の方法。
- 前記ベクターまたはＶＬＰが、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、請求項１８３～１８８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、ＬＤＬ－コレステロールのベースラインからの変化、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）の減少、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、不安定な扁桃炎、または視力からなる群から選択される少なくとも１つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす、請求項１６７～１８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、ＬＤＬ－コレステロールのベースラインからの変化、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）の減少、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、不安定な扁桃炎、または視力からなる群から選択される少なくとも２つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす、請求項１６７～１８９のいずれか一項に記載の方法。
- ＰＣＳＫ９関連疾患の治療のための医薬品としての使用のための、請求項１～９６のいずれか一項に記載のシステム、請求項９７～１００のいずれか一項に記載の核酸、請求項１０１～１０７のいずれか一項に記載のベクター、請求項１０８～１１３のいずれか一項に記載のＶＬＰ、請求項１１６～１１９のいずれか一項に記載の医薬組成物、またはそれらの組み合わせ。
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