JP2023510352A - Pcsk9の標的化のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年1月10日に出願された米国仮特許出願第62,959,685号の優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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配列表の参照による組み込み
本出願は、EFS-WEBによりASCII形式で提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。2021年1月6日に作成された当該ASCIIコピーは、SCRB_017_01WO_SeqList_ST25.txtと名付けられ、サイズは4.07MBである。
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哺乳類では、コレステロールは乳化を介してリポタンパク質内で輸送される。リポタンパク質粒子は、それらの密度に基づいて、低密度リポタンパク質(LDL)、超低密度リポタンパク質(VLDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、およびカイロミクロンに分類される。表面LDL受容体は、コレステロール吸収の際に内在化される。豊富なコレステロールを有する細胞は、LDL粒子内に新たなコレステロールが取り込まれるのを防ぐために、そのLDL受容体合成がブロックされる。逆に、細胞がコレステロールを欠如している場合、LDL受容体合成が促進される。プロセスが調節されない場合、過剰なLDL粒子は、LDL受容体に取り込まれることなく血中を移動する。血液中のLDL粒子は酸化されてマクロファージによって取り込まれ、そして貪食されて泡沫細胞を形成する。これらの泡沫細胞は血管壁内に捕捉されるようになり得、心臓発作、脳卒中、および他の深刻な医学的問題の主な原因のうちの1つであるアテローム硬化性プラーク形成に関与し得る。
肝臓タンパク質プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)は、LDL粒子のエンドサイトーシス中に低密度リポタンパク質受容体(LDL-R)に結合する、分泌型で球状の自己活性化セリンプロテアーゼであり、LDL-Rの細胞表面への再循環を妨げ、LDLコレステロールクリアランスの低下をもたらす。PCSK9は、LDL-Rに結合し(EGF-Aドメインを介する)、受容体-リガンド複合体の立体構造変化を妨げ、代わりとしてLDL-Rをリソソームに再指向させる。低密度リポタンパク質粒子(LDL)の受容体は、典型的には、細胞外液内の粒子当たり数千個の脂肪分子(コレステロールを含む)を輸送するため、PCSK9の機能を遮断または阻害してLDLコレステロールのLDL-R媒介性クリアランスを高めると、LDL粒子濃度を低下させることができる。PCSK9は主に肝臓、腸、腎臓、および中枢神経系で発現されるが、内皮などの動脈壁、平滑筋細胞、およびマクロファージでも高度に発現され、血管の恒常性およびアテローム性動脈硬化症を調節できる局所効果を有する。
PCSK9は、プロタンパク質転換酵素(PC)ファミリーのメンバーであり、その遺伝子は、家族性高コレステロール血症(FH)を有する個体の約2%~3%で変異している(Sepideh Mikaeeli,S.,et al.Functional analysis of natural PCSK9 mutants in modern and archaic humans.FEBS J.2019 Aug 6.doi:10.1111/febs.15036)、研究者らは、高コレステロール(高コレステロール血症)の遺伝型を引き起こすいくつかのPCSK9変異を特定してきている。これらの変異は、PCSK9タンパク質における単一のタンパク質ビルディングブロック(アミノ酸)を変化させる。研究者は、高コレステロール血症に関与する変異は、それらが、PCSK9タンパク質の活性を増強させるか、タンパク質に新たな非定型の機能を与えるように思われるため、「機能獲得型」として報告している(Blesa,S.,et al.A New PCSK9 Gene Promoter Variant Affects Gene Expression and Causes Autosomal Dominant Hypercholesterolemia.J.Clin.Endocrinol.& Metab.93:3577(2008))。過活性のPCSK9タンパク質は、肝細胞表面における低密度リポタンパク質受容体の数を大幅に低下させる。血液から低密度リポタンパク質を除去する受容体が少ないため、PCSK9遺伝子に機能獲得型変異を有する人は、非常に高い血中コレステロールレベルを有する。常染色体優性高コレステロール血症(ADH)は、低密度リポタンパク質(LDL)-コレステロールレベルの増加を特徴とする遺伝性疾患であり、早発性心血管疾患の高いリスクをもたらす。PCSK9におけるおよそ10の変異が、異なる集団で疾患の原因として特定されてきている。高コレステロール血症を引き起こすPCSK9における既知のすべての変異は、このプロテアーゼの酵素活性に増加を生じる(Bleasa,S.,2008)。加えて、PCSK9における変異は、常染色体優性家族性低ベータリポタンパク血症を引き起こし得、脂肪肝、肝硬変、および他の障害をもたらし得る。
CRISPR/Casシステムの出現およびこれらの最小システムのプログラム可能な性質は、ゲノム操作および工学における多目的な技術としてのそれらの使用を容易にしてきている。しかしながら、コレステロールレベルを調節するために改変する必要のある細胞が多数あるため、インビボでPCSK9保護変異体および機能喪失型変異体を生成する現在の方法は効果的なものではない。他の懸念には、オフターゲット効果、ゲノム不安定性、またはゲノム編集によって引き起こされ得る発がん性改変、ならびに遺伝子編集システムにおける安全な送達モダリティの欠如が含まれる。したがって、PCSK9を調節するための改良された組成物および方法が必要とされ続けている。この必要性に対処するために、PCSK9を標的とするための組成物および方法、ならびに送達ベクターが本明細書に提供される。
本開示は、1つ以上の変異を有するプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)遺伝子標的核酸配列の編集に使用される改変されたクラス2のV型CRISPRタンパク質およびガイド核酸に関する。クラス2のV型CRISPRタンパク質およびガイド核酸は、標的細胞への受動的侵入のために改変することができる。クラス2のV型CRISPRタンパク質およびガイド核酸は、標的核酸改変のための様々な方法に有用であり、その方法も提供される。
一態様では、本開示は、クラス2のV型CRISPRタンパク質およびガイド核酸システム(例えば、CasX:gNAシステム)、ならびに細胞におけるPCSK9タンパク質をコードする遺伝子(PCSK9遺伝子)を含む標的核酸を変更するために使用される方法に関する。本開示のいくつかの実施形態において、CasX:gNAシステムは、機能獲得型変異であり得る1つ以上の変異を有するPCSK9遺伝子をノックダウンまたはノックアウトする効用を有し、PCSK9障害を有する対象における変異PCSK9遺伝子産物の発現および結果として高められた高コレステロール血症を低下または排除する。他の実施形態では、CasX:gNAシステムは、機能獲得型変異を有するPCSK9遺伝子の配列を修正する効用を有する。
いくつかの実施形態において、クラス2のV型:gNAシステムgNAは、gRNA、もしくはgDNA、またはRNAおよびDNAのキメラであり、単一分子gNAまたは二重分子gNAであり得る。他の実施形態において、システムgNAは、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約95%、もしくは100%の配列同一性を有する配列を含む標的化配列を有する。いくつかの実施形態において、gNAは、配列番号247~303、315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列からなる標的化配列を有する。いくつかの実施形態では、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子のエクソン内、またはそれに近位の配列に相補的である。別の実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子のイントロン内、またはそれに近位の配列に相補的である。別の実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子のイントロン-エクソン接合部内またはそれに近位の配列に相補的である。別の実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子の調節要素内またはそれに近位の配列に相補的である。別の実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子の遺伝子間領域内、またはそれに近位の配列に相補的である。gNAは、14~30個の連続したヌクレオチドを含む標的化配列を含むことができる。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、20個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、19個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、18個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、17個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、16個のヌクレオチドからなる。別の実施形態において、標的化配列は、15個のヌクレオチドからなる。
いくつかの実施形態において、gNAは、表1に示される配列番号4~16からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を含む足場を有する。いくつかの実施形態では、CasX:gNAシステムgNAは、表2に示される配列番号2101~2286からなる群から選択され配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を含む足場を有する。
いくつかの実施形態において、CasX:gNAシステムは、配列番号1~3のうちのいずれか1つを含む参照CasX配列、あるいは表3、5~7、および9に示される配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、もしくは488、もしくは490の配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、もしくは少なくとも90%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約96%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を含むCasXバリアントを含む。これらの実施形態において、CasXバリアントは、参照CasXタンパク質と比較して1つ以上の改善された特性を示す。いくつかの実施形態において、CasXタンパク質は、TTC、ATC、GTC、およびCTCからなる群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、CasXタンパク質は、TTC、ATC、GTC、およびCTCからなる群から選択されるPAM配列に対する配列番号1~3のCasXタンパク質のうちのいずれか1つの結合親和性と比較して、少なくとも1.5倍高いPAM配列に対する結合親和性を有する。
本開示のクラス2のV型CRISPR:gNAシステムのいくつかの実施形態において、CRISPR分子とgNA分子とは、リボ核タンパク質複合体(RNP)で一緒に会合する。特定の実施形態において、PAM配列TTC、ATC、GTC、またはCTCのうちのいずれか1つが、gNAの標的化配列と同一性を有する非標的鎖配列に対して5’の1つのヌクレオチドに位置する場合、CasXバリアントとgNAバリアントとを含むRNPが細胞アッセイシステムにおいて、同等のアッセイシステムにおける参照CasXタンパク質と参照gNAとを含むRNPの編集効率および/または結合と比較して、標的DNAにおける標的配列の高い編集効率および/または結合を示す。
いくつかの実施形態では、システムは、PCSK9タンパク質をコードする遺伝子またはRNA配列の少なくとも一部、PCSK9調節領域、またはコード領域および調節領域の両方を含むドナー鋳型をさらに含み、PCSK9コード遺伝子部分は、PCSK9エクソン、PCSK9イントロン、およびPCSK9イントロン-エクソン接合部からなる群から選択され、ドナー鋳型を使用してPCSK9遺伝子をノックダウンもしくはノックアウトするか、または使用してPCSK9遺伝子における変異を修正する。いくつかの実施形態では、システムは、配列番号33の少なくとも一部をコードする配列を含む核酸を含むドナー鋳型をさらに含む。他の実施形態では、システムは、配列番号33の野生型PCSK9遺伝子配列に対して1つ以上の変異を有する核酸配列を含む核酸を含むドナー鋳型をさらに含む。いくつかの事例では、ドナー配列は、一本鎖DNA鋳型または一本鎖RNA鋳型である。他の事例では、ドナー鋳型は、二本鎖DNA鋳型である。
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのシステムをコードする核酸、ならびに核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびRNAベクターからなる群から選択される。他の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXとgNAとのRNP、および任意選択的に、ドナー鋳型核酸を含むウイルス様粒子(VLP)である。
他の実施形態では、本開示は、PCSK9遺伝子が1つ以上の変異を含む細胞のPCSK9標的核酸配列を改変する方法を提供し、当該方法は、細胞に、a)第1のgNAを含む本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのクラス2のV型:gNAシステムを含む組成物、b)本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかの核酸、c)本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのベクター、d)本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのVLP、またはe)上記のうちの2つ以上の組み合わせを導入することを含み、第1のgNAによって標的化される細胞のPCSK9標的核酸配列は、クラス2のV型CRISPRタンパク質(例えば、CasX)によって改変される。本方法のいくつかの実施形態において、方法は、細胞集団に第2のgNAまたは第2のgNAをコードする核酸を導入することを含み、第2のgNAは、第1の核酸と比較して、PCSK9標的核酸の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有し、集団の細胞のPCSK9標的核酸に追加の切断がもたらす。本方法のいくつかの実施形態において、改変することは、野生型配列と比較して、標的核酸配列に1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含む。いくつかの事例において、方法は、標的核酸を、本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのドナー鋳型核酸と接触させることをさらに含む。本方法のいくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、PCSK9遺伝子の変異を修正する(ノックインすることによる)ためのPCSK9遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含むか、または変異体PCSK9をノックアウトするための変異もしくは異種配列を含む配列を含む。改変がPCSK9遺伝子のノックダウンをもたらすこれらの事例において、非機能的PCSK9タンパク質の発現は、改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%減少される。他の事例において、改変は、PCSK9遺伝子のノックアウトをもたらし、細胞集団の標的核酸は、細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%が、検出可能なレベルの非機能的PCSK9タンパク質を発現しないように、改変される。PCSK9タンパク質の発現は、フローサイトメトリー、ELISA、細胞ベースのアッセイ、ウエスタンブロット、または当技術分野で知られているか、もしくは実施例に記載されている他の方法によって測定することができる。
いくつかの事例において、細胞における標的核酸配列の改変は、インビボで生じる。いくつかの実施形態では、細胞は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される真核生物細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、肝細胞、もしくは腸、腎臓、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜細胞、または内皮などの動脈壁の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、眼細胞である。他の実施形態において、本開示は、標的核酸配列を改変する方法を提供し、標的細胞は、CasXタンパク質と1つ以上のgNAとをコードするベクターを使用して接触させ、任意選択的にドナー鋳型をさらに含む。いくつかの事例において、ベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV44.9、AAV-Rh74、またはAAVRh10から選択されるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。他の事例において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。他の実施形態において、本開示は、標的細胞を、ベクターが、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかのCasXとgNAとのRNP、および任意選択的に、ドナー鋳型核酸を含むウイルス様粒子であるベクターを使用して接触させる方法を提供する。本方法のいくつかの実施形態では、ベクターは、対象に治療有効用量で投与される。対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長目、またはヒトであることができる。用量は、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与することができる。
他の実施形態において、本開示は、PCSK9または関連障害の治療を必要とする対象におけるPCSK9または関連障害を治療する方法を提供し、対象の細胞におけるPCSK9遺伝子をコードする遺伝子を改変することを含み、改変することは、当該細胞を、治療有効量のi)CasXと第1のgNAを含む本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのgNAと、任意選択的に、ドナー鋳型と、を含む組成物;ii)(i)の組成物をコードする核酸;レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、DNAベクター、およびRNAベクターからなる群から選択され、ii)の核酸を含むベクター;(iii)(i)の組成物を含むVLP;またはiv)(i)~(iii)のうちの2つ以上の組み合わせと接触させることを含み、第1のgNAによって標的化される細胞のPCSK9遺伝子は、CasXタンパク質(および任意選択的に、ドナー鋳型)によって改変され、それによってPCSK9遺伝子の変異が修正または代償され、機能的PCSK9タンパク質が発現される。対象におけるPCSK9関連疾患を治療する上記方法の他の実施形態では、PCSK9遺伝子がノックダウンまたはノックアウトされ、それによって非機能的PCSK9タンパク質の発現が減少または排除される。いくつかの実施形態では、対象は、げっ歯類、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される。上記において、ベクターまたはVLPは、対象に、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、または経口経路から選択される投与経路によって投与される。いくつかの実施形態において、PCSK9関連障害は、常染色体優性高コレステロール血症(ADH)、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、高脂質血症、低密度リポタンパク質(LDL)レベルの上昇、LDLコレステロールレベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、2型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症(AMD)、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの事例において、方法は、LDLコレステロールのベースラインからの変化割合、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の減少(ASCVD)、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、視力、および不安定な扁桃炎からなる群から選択される少なくとも1つの臨床的に関連するエンドポイントにおける改善をもたらす。他の事例において、方法は、少なくとも2つの臨床的に関連するエンドポイントにおける改善をもたらす。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸と、ベクターと、クラス2のV型CRISPRタンパク質と、gNAと、遺伝子編集対と、を含む医薬組成物およびキットを提供する。
別の態様では、遺伝子編集対を含む組成物、またはPCSK9関連疾患を有する対象の治療のための医薬品としての使用のための遺伝子編集対を含むか、もしくはコードするベクターの組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、クラス2のV型CRISPR:gNAシステム、クラス2のV型CRISPR:gNAシステムを含む組成物、クラス2のV型CRISPR:gNAシステムを含むか、もしくはコードするベクター、クラス2のV型CRISPR:gNAシステムを含むVLP、またはPCSK9関連疾患の治療のための医薬品としての使用のためのクラス2のV型CRISPR:gNAシステムを使用して編集される細胞の集団が、本明細書に提供される。
別の態様では、PCSK9関連疾患の治療を必要とする対象におけるPCSK9関連疾患の治療の方法における使用のための、クラス2のV型CRISPR:gNAシステム、クラス2のV型CRISPR:gNAシステムを含む組成物、またはクラス2のV型CRISPR:gNAシステムを含むか、もしくはコードするベクター、クラス2のV型CRISPR:gNAシステムを含むVLP、クラス2のV型CRISPR:gNAシステムを使用して編集される細胞の集団が、本明細書に提供される。
別の態様では、PCSK9関連疾患の治療を必要とする対象におけるPCSK9関連疾患の治療のための医薬品の製造における使用のための、クラス2のV型CRISPR:gNAシステム、クラス2のV型CRISPR:gNAシステムを含む組成物、クラス2のV型CRISPR:gNAシステムを含むか、もしくはコードするベクター、クラス2のV型CRISPR:gNAシステムを含むVLP、またはクラス2のV型CRISPR:gNAシステムを使用して編集される細胞の集団が、本明細書に提供される。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。ともにCasXバリアントおよびgNAバリアントを開示する、2020年6月5日に出願されたPCT/US2020/036505、および2020年12月3日に出願された米国仮出願第63/121,196号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が各々参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。ともにCasXバリアントおよびgNAバリアントを開示する、2020年6月5日に出願されたPCT/US2020/036505、および2020年12月3日に出願された米国仮出願第63/121,196号の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されている。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の発明を実施するための形態、およびその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
例示的な実施形態が本明細書に示され、説明されているが、かかる実施形態がほんの一例として提供されることは当業者には明らかであろう。本明細書で特許請求される本発明から逸脱することなく、当業者には、多数の変形、変更、および置換が現在行われるであろう。本明細書に記載される実施形態の様々な代替案を、本開示の実施形態を実施する際に使用することができることを理解されたい。特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの請求項の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料が、本実施形態の実施または試験に使用され得るが、好適な方法および材料が、以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先することになる。加えて、材料、方法、および実施例は、例証にすぎず、限定するようには意図されていない。本発明から逸脱することなく、当業者であれば、多数の変形、変更、および置き換えを想到するであろう。
定義
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、一本鎖DNA、二本鎖DNA、多本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、多本鎖RNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、ならびにプリンおよびピリミジン塩基を含むか、または他の天然、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、一本鎖DNA、二本鎖DNA、多本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、多本鎖RNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、ならびにプリンおよびピリミジン塩基を含むか、または他の天然、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
「ハイブリダイズ可能な」または「相補的な」は、互換的に使用され、核酸(例えば、RNA、DNA)が、非共有結合的に結合する、すなわち、ワトソン-クリック塩基対および/またはG/U塩基対を形成し、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび/またはインビボ条件下で、配列特異的な逆平行の様式で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズする」(すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合する)ことを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。特異的にハイブリダイズ可能であるためにポリヌクレオチドの配列がその標的核酸配列に対して100%相補的である必要はないことが理解され、ポリヌクレオチドの配列は、標的核酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%の配列同一性を有し、依然として標的核酸配列にハイブリダイズすることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、1つ以上のセグメントを超えてハイブリダイズすることができる(例えば、ループ構造またはヘアピン構造、「バルジ」、「バブル」など)。
本開示の目的のために、「遺伝子」は、遺伝子産物(例えば、タンパク質、RNA)をコードするDNA領域、ならびにかかる調節要素配列がコード配列および/または転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、遺伝子産物の産生を調節するすべてのDNA領域を含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない調節配列を含み得る。コード配列は、転写または転写および翻訳時に遺伝子産物をコードし、本開示のコード配列は断片を含むことができ、完全長のオープンリーディングフレームを含む必要はない。遺伝子は、転写される鎖、例えば、コード配列を含む鎖と、相補鎖との両方を含むことができる。
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列に対して3’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関連している。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流に位置する。
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の5’側に位置するヌクレオチド配列を指す。ある特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域または転写開始点の5’側に位置する配列に関連している。例えば、ほとんどのプロモーターは転写開始部位の上流に位置する。
「調節要素」という用語は、本明細書で「調節配列」という用語と互換的に使用され、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節要素(例えば、ポリアデニル化シグナルなどの転写終結シグナルおよびポリU配列)を含むよう意図されている。例示的な調節要素には、CMV、CMV+イントロンA、SV40、RSV、HIV-Ltr、伸長因子1アルファ(EF1α)、MMLV-ltrなどに限定されない転写プロモーター、ならびに単一の転写物、メタロチオネイン、転写エンハンサー要素、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列、翻訳開始の最適化のための配列、および翻訳終結配列からの複数の遺伝子の翻訳を可能にする内部リボソーム侵入部位(IRES)、またはP2Aペプチドなどの他の調節要素が含まれる。適切な調節要素の選択が、発現されるコードされた構成要素(例えば、タンパク質またはRNA)に依存するか、または核酸が異なるポリメラーゼを必要とするか、または融合タンパク質として発現されるようには意図されていない複数の構成要素を含むかに依存することが理解されよう。
「プロモーター」という用語は、RNAポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、TATAボックス、および/またはB認識要素を含み、かつ会合した転写可能なポリヌクレオチド配列および/または遺伝子(または導入遺伝子)の転写および発現を支援または促進するDNA配列を指す。プロモーターは、合成的に産生することができるか、または既知のもしくは天然に存在するプロモーター配列または別のプロモーター配列から誘導することができる。プロモーターは、転写される遺伝子の近位または遠位にあり得る。プロモーターは、ある特定の特性を付与するために2つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターも含むことができる。本開示のプロモーターは、既知のまたは本明細書に提供される他のプロモーター配列と組成が類似しているが、同一ではないプロモーター配列のバリアントを含むことができる。プロモーターは、構成的、発達的、組織特異的、誘導的などのプロモーターに作動可能に連結された会合したコードまたは転写可能な配列または遺伝子の発現パターンに関する基準に従って分類することができる。
「エンハンサー」という用語は、転写因子と呼ばれる特定のタンパク質が結合すると、関連する遺伝子の発現を調節する調節要素DNA配列を指す。エンハンサーは、遺伝子のイントロン、または遺伝子のコード配列の5’もしくは3’に位置し得る。エンハンサーは、遺伝子の近位(すなわち、プロモーターの数十または数百塩基対(bp)以内)にあり得るか、または遺伝子の遠位に(すなわち、プロモーターから何千bp、何十万bp、またはさらには何百万bpも離れて)位置し得る。単一の遺伝子は、2つ以上のエンハンサーによって調節され得るが、それらはすべて本開示の範囲内であると想定される。
本明細書で使用される「組換え」とは、特定の核酸(DNAまたはRNA)が、自然系で見つけられる内因性核酸と区別可能な構造的コードまたは非コード配列を有する構築物をもたらすクローニング、制限、および/またはライゲーションステップの様々な組み合わせの産物であることを意味する。一般に、構造的コード配列をコードするDNA配列は、cDNA断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞に含まれるか、または無細胞転写および翻訳系に含まれる組換え転写単位から発現することができる合成核酸を提供することができる。かかる配列は、真核生物遺伝子に典型的に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供することができる。関連する配列を含むゲノムDNAは、組換え遺伝子または転写単位の形成にも使用することができる。非翻訳DNAの配列は、オープンリーディングフレームの5’側または3’側に存在する場合があり、かかる配列は、コード領域の操作または発現を妨害せず、実際には、様々な機構によって所望の産物の産生を調節する役割を果たし得る(上記の「エンハンサー」および「プロモーター」を参照されたい)。
「組換えポリヌクレオチド」または「組換え核酸」という用語は、天然に存在しないもの、例えば、人間の介入によって2つの別様に分離された配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子工学技術によって達成される。このようなものは、通常、配列認識部位を導入または除去しながら、コドンを同じまたは保存的アミノ酸をコードする冗長なコドンで置き換えるために行われ得る。あるいは、それは所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合して、機能の所望の組み合わせを生成するために実施される。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成手段、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子操作技術のいずれかによって達成される。
同様に、「組換えポリペプチド」または「組換えタンパク質」という用語は、例えば、ヒトの介入によるアミノ配列の2つの他の方法で分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製される、天然に存在しないポリペプチドまたはタンパク質を指す。したがって、例えば、異種アミノ酸配列を含むタンパク質は組換え体である。
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、2つ以上の実体間の物理的結合を確立することを意味する。例えば、標的核酸配列をガイド核酸と接触させることは、標的核酸配列およびガイド核酸が物理的結合を共有するように作製される、例えば、それらの配列が配列類似性を共有する場合、ハイブリダイズすることができることを意味する。
「解離定数」または「Kd」は互換的に使用され、リガンド「L」とタンパク質「P」との間の親和性、すなわち、リガンドが特定のタンパク質にどれくらい密接に結合するかを意味する。これは、式Kd=[L][P]/[LP]を使用して計算することができ、式中、[P]、[L]、および[LP]は、それぞれ、タンパク質、リガンド、および複合体のモル濃度を表す。
本開示は、標的核酸配列を改変するのに有用な組成物および方法を提供する。本明細書で使用される場合、「改変する」には、切断、ニッキング、編集、欠失、ノックイン、ノックアウトなどが含まれるが、これらに限定されない。
「ノックアウト」という用語は、遺伝子の除去または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトされる可能性がある。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係の配列で置き換えることによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子またはその遺伝子産物の発現の低下を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が減弱され得るか、タンパク質レベルが低下するまたは排除され得る。
本明細書で使用される場合、「相同性指向修復」(HDR)とは、細胞における二本鎖切断の修復中に起こるDNA修復の形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、ドナー鋳型を使用して標的DNAを修復またはノックアウトし、ドナー(例えば、ドナー鋳型など)から標的への遺伝情報の移動をもたらす。ドナー鋳型が標的DNA配列とは異なり、ドナー鋳型の配列の一部またはすべてが、正確なゲノム遺伝子座における標的DNAに組み込まれる場合、相同性指向修復は、挿入、欠失、または変異によって標的核酸配列の配列の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」(NHEJ)とは、相同鋳型を必要としない(修復を誘導するために相同配列を必要とする相同性指向修復とは対照的に)、互いに対する切断末端の直接ライゲーションによるDNAの二本鎖切断の修復を指す。NHEJは、多くの場合、インデル、二本鎖切断部位の近くのヌクレオチド配列の喪失(欠失)または挿入をもたらす。
本明細書で使用される場合、「マイクロホモロジー媒介末端結合」(MMEJ)は、変異原性DSB修復機構を指し、これは、相同鋳型を必要としない(修復を誘導するための相同配列を必要とする相同組換え修復とは対照的に)、切断部位に隣接する欠失に常に関連する。MMEJは、多くの場合、二本鎖切断部位の近くにヌクレオチド配列の喪失(欠失)をもたらす。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド(またはタンパク質)は、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して特定のパーセントの「配列類似性」または「配列同一性」を有し、これは、整列させた場合、そのパーセントの塩基またはアミノ酸が同じであり、2つの配列を比較した場合、同じ相対位置にあることを意味する。配列類似性(互換的に、類似性パーセント、同一性パーセント、または相同性と称される)は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列類似性を決定するために、ncbi.nlm.nih.gov/BLASTのワールドワイドウェブ上で利用可能なBLASTを含む、当該技術分野で既知の方法およびコンピュータープログラムを使用して配列を整列させることができる。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間の相補性パーセントは、任意の簡便な方法を使用して決定することができる。方法の例には、BLASTプログラム(基本的な局所アライメント検索ツール)およびPowerBLASTプログラム(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410、Zhang and Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)、またはSmith-Watermanアルゴリズム(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489)を使用するGapプログラムの使用(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)、例えば、デフォルト設定の使用が含まれる。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、および改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。この用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むが、これに限定されない融合タンパク質を含む。
「ベクター」または「発現ベクター」とは、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンであり、これに別のDNAセグメント、すなわち、「挿入物」が結合して、細胞内に結合したセグメントの複製または発現をもたらすことができる。
核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用される、本明細書で使用される「天然に存在する」または「改変されていない」または「野生型」という用語は、自然界で見つけられる核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。
本明細書で使用される場合、「変異」は、野生型もしくは参照アミノ酸配列または野生型もしくは参照ヌクレオチド配列と比較した、1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの挿入、欠失、置換、複製、または反転を指す。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞が天然に存在する環境とは異なる環境に存在するポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を説明するよう意図されている。単離された遺伝子改変された宿主細胞は、遺伝子改変された宿主細胞の混合集団に存在し得る。
本明細書で使用される「宿主細胞」は、真核生物細胞、原核生物細胞、または単細胞実体として培養された多細胞生物(例えば、細胞株)由来の細胞を意味し、これらの真核生物または原核生物細胞は、核酸のレシピエント(例えば、発現ベクター)として使用され、核酸によって遺伝子改変された元の細胞の子孫を含む。単細胞の子孫が、自然、偶発的、または意図的変異のため、形態またはゲノムもしくは全DNA相補体が元の親と必ずしも完全に同一ではなくてもよいことが理解される。「組換え宿主細胞」(「遺伝子改変された宿主細胞」とも称される)とは、異種核酸、例えば、発現ベクターが導入された宿主細胞である。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンからなり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンからなる。例示的な保存的アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミンである。
「低密度リポタンパク質(LDL)」という用語は、最も低い密度(低い重量-体積比の粒子)から最も高い密度(高い重量-体積比の粒子)までの5つの主要なリポタンパク質:カイロミクロン、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、中密度リポタンパク質(IDL)、および高密度リポタンパク質(HDL)のうちの1つを指す。リポタンパク質は、細胞外流体中の体の周りに脂質(脂肪)を移動させ、それによって受容体媒介性エンドサイトーシスを介した細胞体への脂肪の移動を促進する。LDL粒子は、直径が約220~275オングストロームである。
「低密度リポタンパク質(LDL)受容体」は、コレステロールに富むLDL粒子のエンドサイトーシスを媒介する839個のアミノ酸(21個のアミノ酸シグナルペプチドの除去後)の受容体タンパク質を指す。これは、カイロミクロンレムナントおよびVLDLレムナント(IDL)に認められるアポタンパク質B100およびapoEタンパク質を認識する細胞表面受容体であり、LDLコレステロールの結合およびエンドサイトーシスをもたらす。このプロセスは、すべての有核細胞で生じるが、循環からLDLのおよそ70%を除去する肝臓で主に生じる。ヒトLDLR遺伝子は、NCBIデータベース(ncbi.nlm.nih.gov)に参照配列NG_009060.1として部分的に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、本明細書で互換的に使用され、治療的利益および/または予防的利益を含むが、これらに限定されない、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療されている基礎障害または疾患の根絶または改善を意味する。治療的利益は、症状のうちの1つ以上の根絶もしくは改善、または対象が依然として基礎障害を患っている可能性があるにもかかわらず対象において改善が観察されるようになる基礎疾患に関連する1つ以上の臨床パラメーターの改善によって達成することもできる。
本明細書で使用される「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、ヒトまたは実験動物などの対象に単回投与または反復投与で投与された場合、病状または状態のいずれかの症状、態様、測定されたパラメーター、または特性にいくらかの検出可能かつ有益な効果をもたらすことができる、薬物または生物学的製剤の、単独でのまたは組成物の一部としての量を指す。かかる効果は、絶対に有益である必要はない。
本明細書で使用される場合、「投与すること」とは、対象にある投薬量の化合物(例えば、本開示の組成物)または組成物(例えば、薬学的組成物)を与える方法を意味する。
「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜、非ヒト霊長類、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、および他のげっ歯類が含まれるが、これらに限定されない。
I.一般的な方法
本発明の実施は、特に明記しない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えDNAの従来の技術を使用し、これらは、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al.,Harbor Laboratory Press 2001)、Short Protocols in Molecular Biology,4 Ed.(Ausubel et al.eds.,John Wiley & Sons 1999)、Protein Methods(Bollag et al.,John Wiley & Sons 1996)、Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds.,Academic Press 1999)、Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds.,Academic Press 1995)、Immunology Methods Manual(I.Lefkovits ed.,Academic Press 1997)およびCell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths,John Wiley & Sons 1998)などの標準的な教科書に見出され得、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実施は、特に明記しない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えDNAの従来の技術を使用し、これらは、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al.,Harbor Laboratory Press 2001)、Short Protocols in Molecular Biology,4 Ed.(Ausubel et al.eds.,John Wiley & Sons 1999)、Protein Methods(Bollag et al.,John Wiley & Sons 1996)、Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds.,Academic Press 1999)、Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds.,Academic Press 1995)、Immunology Methods Manual(I.Lefkovits ed.,Academic Press 1997)およびCell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths,John Wiley & Sons 1998)などの標準的な教科書に見出され得、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
値の範囲が提供される場合、終点が含まれ、間にある値は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、下限の単位の10分の1まで、その範囲の上限および下限の間であり、その記載された範囲の他の記載された値および間にある値は、包含されることを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲に含まれることができ、また、記載された範囲において特に除外された限界を条件として、包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されるものに関連して方法および/または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、別途文脈が明確に示さない限り、単数形「a」、「an」、および「the」が複数の指示対象を含むことに留意されたい。
明確にするために、別々の実施形態の文脈で説明される本開示の特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解されるであろう。他の事例において、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本開示の様々な特徴はまた、別々にまたは任意の好適な部分的組み合わせで提供されてもよい。本開示に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本開示によって具体的に包含され、各々およびすべての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示されることが意図される。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素のすべての部分的組み合わせもまた、本開示によって具体的に包含され、各々およびすべてのそのような部分的組み合わせが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。
II.PCSK9遺伝子の遺伝子編集のためのシステム
第1の態様において、本開示は、PCSK9遺伝子産物の発現を変更するためにPCSK9遺伝子(本明細書では「標的核酸」と称される)を改変または編集する際に使用するための、CRISPRヌクレアーゼタンパク質と1つ以上のガイド核酸(gNA)とを含むシステム、ならびにCRISPRヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸とgNAとを含むシステムを提供する。
第1の態様において、本開示は、PCSK9遺伝子産物の発現を変更するためにPCSK9遺伝子(本明細書では「標的核酸」と称される)を改変または編集する際に使用するための、CRISPRヌクレアーゼタンパク質と1つ以上のガイド核酸(gNA)とを含むシステム、ならびにCRISPRヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸とgNAとを含むシステムを提供する。
本明細書で使用される場合、CRISPRヌクレアーゼタンパク質と本開示の1つ以上のgNAとを含むシステム、ならびにCRISPRヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸とgNAとを含むシステムなどの「システム」は、「組成物」という用語と互換的に使用される。
PCSK9遺伝子は、低密度リポタンパク質粒子(LDL)に対する受容体に結合してLDLを細胞に輸送するタンパク質である、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(「PCSK9」)をコードする。PCSK9遺伝子は、ヒトゲノムのchr1:55,039,476~55,064,853(GRCh38/hg38)にまたがる配列を包含する(表記は、第1染色体の55,039,476bpで開始して55,064,853bpまでである第1染色体(chr1)を指す(ホモサピエンス更新注釈リリース109.20190905、GRCh38.p13)(NCBI)。ヒトPCSK9遺伝子は、NCBIデータベース(ncbi.nlm.nih.gov)に参照配列NG_009061.1として部分的に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。PCSK9遺伝子座は、12個のエクソンを有し、692個のアミノ酸タンパク質をコードする3636bpのmRNAを生成し、その合成後、プロドメインを切断する自己触媒切断反応を受けて、540個のアミノ酸を有する活性化タンパク質を生じる。プロドメインは、触媒ドメインおよびレジスチン様ドメインに結合したままであり、おそらくプロドメインがシャペロンとして機能し、フォールディングおよび分泌を促進するためである(Seidah,NG et al.,Proc Natl Acad Sci USA 100(3):928(2003))。分泌型プロタンパク質転換酵素である神経アポトーシス調節転換酵素1(NARC-1):肝臓再生およびニューロン分化(Seidah NG,et al.)。このタンパク質はまた、神経アポトーシス調節転換酵素とも呼ばれ、サブチラーゼのプロテアーゼKサブファミリーに属するセリンプロテアーゼである。
ヒトPCSK9遺伝子(HGNC:20001)は、配列MGTVSSRRSWWPLPLLLLLLLLLGPAGARAQEDEDGDYEELVLALRSEEDGLAEAPEHGTTATFHRCAKDPWRLPGTYVVVLKEETHLSQSERTARRLQAQAARRGYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELALKLPHVDYIEEDSSVFAQSIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEVYLLDTSIQSDHREIEGRVMVTDFENVPEEDGTRFHRQASKCDSHGTHLAGVVSGRDAGVAKGASMRSLRVLNCQGKGTVSGTLIGLEFIRKSQLVQPVGPLVVLLPLAGGYSRVLNAACQRLARAGVVLVTAAGNFRDDACLYSPASAPEVITVGATNAQDQPVTLGTLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIAAMMLSAEPELTLAELRQRLIHFSAKDVINEAWFPEDQRVLTPNLVAALPPSTHGAGWQLFCRTVWSAHSGPTRMATAVARCAPDEELLSCSSFSRSGKRRGERMEAQGGKLVCRAHNAFGGEGVYAIARCCLLPQANCSVHTAPPAEASMGTRVHCHQQGHVLTGCSSHWEVEDLGTHKPPVLRPRGQPNQCVGHREASIHASCCHAPGLECKVKEHGIPAPQEQVTVACEEGWTLTGCSALPGTSHVLGAYAVDNTCVVRSRDVSTTGSTSEGAVTAVAICCRSRHLAQASQELQ(配列番号33)を有するタンパク質(Q8NBP7)をコードする。
いくつかの実施形態において、本開示は、機能獲得型変異を有する真核生物細胞におけるPCSK9遺伝子を改変するように具体的に設計されたシステムを提供する。いくつかの事例において、CRISPRシステムは、PCSK9遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするように設計される。他の事例において、CRISPRシステムは、PCSK9遺伝子における1つ以上の変異を修正するように設計される。一般に、PCSK9遺伝子の任意の部分は、本明細書に提供され、本明細書でより完全に記載される、プログラム可能な組成物および方法を使用して標的化することができる。
他の実施形態において、CRISPRヌクレアーゼは、クラス2のV型ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、クラス2のV型ヌクレアーゼは、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d(CasY)、Cas12J、CasZ、およびCasXからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本開示は、1つ以上のCasXタンパク質と1つ以上のガイド核酸(gNA)とをCasX:gNAシステムとして含むシステムを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示のCasX:gNAシステムは、1つ以上のCasXタンパク質と、1つ以上のガイド核酸(gNA)と、PCSK9遺伝子の一部をコードする核酸を含む1つ以上のドナー鋳型核酸であって、核酸が野生型配列、機能的PCSK9タンパク質の一部をコードするcDNA配列、変異体PCSK9をコードするゲノム核酸配列と比較して1つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または変異を含むドナー鋳型核酸と、を含む。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、1つ以上の変異を有する標的核酸配列をノックアウトするかまたはノックダウンする(より完全に以下に記載される)いずれかのための挿入に利用される、野生型PCSK9遺伝子と比較して1つ以上の変異を含む。他の事例において、CasX:gNAシステムは、任意選択的に、標的細胞における野生型PCSK9タンパク質(配列番号33)の産生のための配列をコードする遺伝子の全部または一部の導入(またはノックイン)のためのドナー鋳型をさらに含むことができる。
PCSK9変異が複数のエクソンにまたがるこれらの事例において、本開示は、ドナー鋳型におけるエクソン間に短縮された長さの合成イントロン配列を含むようにも最適化し得る十分な長さのドナー鋳型を企図して、PCSK9遺伝子座の適切な発現およびプロセシングを確実にする。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約10個、少なくとも約50個、少なくとも約100個、または少なくとも約200個、または少なくとも約300個、または少なくとも約400個、または少なくとも約500個、または少なくとも約600個、または少なくとも約700個、または少なくとも約800個、または少なくとも約900個、または少なくとも約1000個、または少なくとも約10,000個、または少なくとも約15,000個、または少なくとも約30,000個のヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約10~約30,000個のヌクレオチド、または少なくとも約100~約15,000個のヌクレオチド、または少なくとも約400~約10,000個のヌクレオチド、または少なくとも約600~約5000個のヌクレオチド、または少なくとも約1000~約2000個のヌクレオチドを含み、PCSK9遺伝子部分は、PCSK9エクソン、PCSK9イントロン、PCSK9イントロン-エクソン接合部、PCSK9調節領域、PCSK9コード領域、PCSK9非コード領域、PCSK9遺伝子の前述の部分のうちのいずれかの組み合わせ、またはPCSK9遺伝子の全体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PCSK9遺伝子部分は、PCSK9エクソン配列、PCSK9イントロン配列、PCSK9イントロン-エクソン接合配列、またはPCSK9調節領域配列のうちのいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖DNA鋳型または一本鎖RNA鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖DNA鋳型である。
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子編集に使用する前に一緒に結合することができ、それ故に、リボ核タンパク質複合体(RNP)として「予め複合体化」される、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXとgNAとの遺伝子編集対を提供する。予め複合体化されたRNPの使用は、標的核酸配列の編集のための細胞または標的核酸配列への系構成要素の送達に利点を与える。いくつかの実施形態では、機能的RNPは、電気泳動によって、または化学的手段によって、細胞にエクスビボで送達することができる。他の実施形態では、機能的RNPは、それらの機能的形態でベクターによってエクスビボまたはインビボのいずれかで送達することができる。gNAは、標的核酸配列の配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する標的化配列(または「スペーサー」)を含むことによって複合体に標的特異性を提供することができ、一方、予め複合体化されたCasX:gNAのCasXタンパク質は、標的核酸配列内の標的部位にgNAとのその会合によって誘導される(例えば、PCSK9遺伝子内の標的部位で安定化される)標的配列の切断またはニッキングなどの部位特異的活性を提供する。CasX:gNAシステムのCasXタンパク質およびgNA成分、ならびにそれらの配列、特性、および機能、ならびにPCSK9遺伝子の編集におけるそれらの使用は、以下でより完全に記載される。
III.遺伝子編集のためのシステムのガイド核酸
別の態様において、本開示は、PCSK9遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的化配列を含むガイド核酸(gNA)に関するものであり、gNAは、相補的非標的鎖にTCモチーフを含むプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に対して特異性を有するCRISPRタンパク質とともに複合体を形成することができ、PAM配列は、標的核酸の標的鎖における標的核酸配列に相補的な非標的鎖における配列の5’の1つのヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態において、gNAは、クラス2のV型CRISPRヌクレアーゼととともに複合体を形成することができる。特定の実施形態において、gNAは、CasXヌクレアーゼとともに複合体を形成することができる。
別の態様において、本開示は、PCSK9遺伝子の標的核酸配列に相補的な標的化配列を含むガイド核酸(gNA)に関するものであり、gNAは、相補的非標的鎖にTCモチーフを含むプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に対して特異性を有するCRISPRタンパク質とともに複合体を形成することができ、PAM配列は、標的核酸の標的鎖における標的核酸配列に相補的な非標的鎖における配列の5’の1つのヌクレオチドに位置する。いくつかの実施形態において、gNAは、クラス2のV型CRISPRヌクレアーゼととともに複合体を形成することができる。特定の実施形態において、gNAは、CasXヌクレアーゼとともに複合体を形成することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞におけるPCSK9遺伝子のゲノム編集に効用を有するCasX:gNAシステムに利用されるガイド核酸(gNA)に関する。本開示は、遺伝子編集CasX:gNAシステムの構成要素としてPCSK9遺伝子に相補的である(それ故に、それにハイブリダイズすることができる)標的化配列を有する特異的に設計されたガイド核酸(「gNA」)を提供する。実施形態のgNAに利用することができるPCSK9標的核酸への標的化配列の代表的だが非限定的な例は、配列番号247~303、315~436、612~2100、および2286~13861として提供される。いくつかの実施形態において、gNAはデオキシリボ核酸分子(「gDNA」)であり、一部の実施形態では、gNAはリボ核酸分子(「gRNA」)であり、他の実施形態では、gNAはキメラであり、DNAおよびRNAの両方を含む。本明細書で使用される場合、gNA、gRNA、およびgDNAという用語は、天然に存在する分子を含み、配列バリアントも含む。
いくつかの実施形態において、複数のgNA(例えば、2つ以上)は、非相同末端結合(NHEJ)、相同性指向修復(HDR、例えば、PCSK9エクソンの全部または一部を置き換えるドナー鋳型の挿入を含むことができる)、相同性非依存性標的化組み込み(HITI)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、一本鎖アニーリング(SSA)、または塩基除去修復(BER)などの宿主細胞修復機構によって編集される、CasX:gNAシステムの使用による標的核酸配列の改変のための方法で送達されることが想定される。例えば、PCSK9遺伝子の1つ以上の変異体エクソンを削除するように設計された編集事象が所望される場合、gNAの対を使用して、PCSK9遺伝子内に変異を有するエクソンの異なる2つの部位5’および3’で結合および切断することができる。核酸の文脈において、切断は、ヌクレアーゼによる、DNAまたはRNAのいずれかの核酸分子の共有結合骨格の破損を指す。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、2つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のCasX:gNAシステムおよび細胞修復システムによって導入される小さなインデルは、変異PCSK9遺伝子のタンパク質リーディングフレームを回復することができる(「リフレーミング」戦略)。リフレーミング戦略を使用する場合、細胞は単一のgNAと接触され得る。参照gNAおよびgNAバリアント。
いくつかの実施形態では、本開示のgNAは、天然に存在するgNA(「参照gNA」)の配列を含む。他の事例では、本開示の参照gNAは、ディープミューテーショナルエボルーション(DME)、ディープミューテーショナルスキャニング(DMS)、エラープローンPCR、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、スタガードエクステンションPCR、遺伝子シャフリング、またはドメインスワッピングを含み得る本明細書に記載の変異誘発などの1つ以上の変異誘発法に供され得、参照gNAに対して改変された配列を有する1つ以上のgNAバリアントを生じ、参照gNAに対してgNAバリアントが改善されたか、または変化した特性を示す。gNAバリアントには、例えば、5’末端もしくは3’末端のいずれかに融合された、または内部に挿入された1つ以上の外因性配列を含むバリアントも含まれる。参照gNAの活性は、gNAバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それにより、gNAバリアントの機能または他の特性の改善を測定することができる。他の実施形態では、参照gNAは、gNAバリアント、例えば、合理的に設計されたバリアントを産生するために、1つ以上の意図的な特異的標的化変異に供され得る。
本開示のgNAは、2つのセグメント:標的化配列とタンパク質結合セグメントとを含む。gNAの標的化セグメントは、標的核酸配列(例えば、標的ssRNA、標的ssDNA、二本鎖標的DNAの相補鎖など)内の特定の配列(標的部位)に相補的である(したがってそれとハイブリダイズする)ヌクレオチド配列(ガイド配列、スペーサー、ターゲッター、または標的化配列として互換的に言及される)を含み、下記により完全に記載される。gNAの標的化配列は、コード配列、コード配列の相補体、非コード配列を含む標的核酸配列、および調節要素に結合することができる。タンパク質結合セグメント(または「活性化因子」もしくは「タンパク質結合配列」)は、複合体としてのCasXタンパク質と相互作用し(例えば、結合し)、RNPを形成する(以下でより完全に記載される)。タンパク質結合セグメントは代替的に、本明細書において「足場」と呼ばれ、これはいくつかの領域からなり、以下でより完全に記載される。
二重ガイドRNA(dgRNA)の場合、ターゲッターおよび活性化因子は各々、デュプレックス形成セグメントを有し、ターゲッターのデュプレックス形成セグメントおよび活性化因子のデュプレックス形成セグメントは互いに相補性を有し、互いにハイブリダイズして二本鎖デュプレックス(gRNAの場合はdsRNAデュプレックス)を形成する。gNAがgRNAである場合、「ターゲッター」または「ターゲッターRNA」という用語は、CasX二重ガイドRNAの(それ故に、例えば、介在ヌクレオチドによって「活性化因子」および「ターゲッター」が一緒に連結された場合、CasX単一ガイドRNAの)crRNA様分子(crRNA:「CRISPR RNA」)を指すために本明細書で使用される。crRNAは、標的化配列のヌクレオチドが続くtracrRNAとアニーリングする5’領域を有する。したがって、例えば、ガイドRNA(dgRNAまたはsgRNA)は、ガイド配列およびcrRNAリピートとも呼ばれることがあるcrRNAのデュプレックス形成セグメントを含む。対応するtracrRNA様分子(活性化因子)も、ガイドRNAのタンパク質結合セグメントのdsRNAデュプレックスの残りの半分を形成するヌクレオチドのデュプレックス形成ストレッチを含む。したがって、ターゲッターおよび活性化因子は、対応する対として、ハイブリダイズして、本明細書で「二重ガイドNA」、「二重分子gNA」、「dgNA」、「二重分子ガイドNA」、または「2分子ガイドNA」と称される二重ガイドNAを形成する。CasXタンパク質による標的核酸配列(例えば、ゲノムDNA)の部位特異的結合および/または切断は、gNAの標的化配列と標的核酸配列との間の塩基対形成相補性によって決定される1つ以上の位置(例えば、標的核酸の配列)で起こり得る。そのため、例えば、本開示のgNAは、TC PAMモチーフまたはATC、CTC、GTC、もしくはTTCなどのPAM配列に隣接する標的核酸に相補的な配列を有し、したがってハイブリダイズすることができる。ガイド配列の標的化配列が標的核酸配列の配列にハイブリダイズするため、PAM配列の位置が考慮される限り、ターゲッターは、特定の標的核酸配列にハイブリダイズするように使用者によって改変され得る。したがって、いくつかの事例では、ターゲッターの配列は、天然に存在しない配列であり得る。他の事例では、ターゲッターの配列は、編集される遺伝子に由来する天然に存在する配列であり得る。他の実施形態において、gNAの活性化因子およびターゲッターは、互いに共有結合し(互いにハイブリダイズするのではなく)、本明細書で「単一分子gNA」、「1分子ガイドNA」、「単一ガイドNA」、「単一ガイドRNA」、「単一分子ガイドRNA」、「1分子ガイドRNA」、「単一ガイドDNA」、「単一分子DNA」、または「1分子ガイドDNA」(「sgNA」、「sgRNA」、または「sgDNA」)と称される単一分子を含む。いくつかの実施形態では、sgNAは、「活性化因子」または「ターゲッター」を含み、それ故に、それぞれ、「活性化因子RNA」および「ターゲッターRNA」であり得る。
まとめると、本開示の組み立てたgNAは、本開示の実施形態において標的核酸に特異的であり、gNAの3’末端に配置される、4つの別個の領域またはドメイン:RNAトリプレックス、足場ステム、伸長ステム、および標的化配列を含む。RNAトリプレックス、足場ステム、および伸長ステムは、合わせて、gNAの「足場」と称される。
a.RNAトリプレックス
本明細書に提供されるガイドRNA(参照sgRNAを含む)のいくつかの実施形態では、RNAトリプレックスが存在し、RNAトリプレックスは、2つの介在ステムループ(足場ステムループおよび伸長ステムループ)の後にAAAGで終了するUUU--nX(約4~15)--UUUステムループ(配列番号19)の配列を含み、トリプレックスを越えてデュプレックスシュードノットにも伸長し得るシュードノットを形成する。トリプレックスのUU-UUU-AAA配列は、標的化配列、足場ステム、および拡張ステムの間のネクサスとして形成される。例示的なCasX sgRNAでは、UUU-ループ-UUU領域が最初にコードされ、次に足場ステムループ、次にテトラループが連結している拡張ステムループ、次に標的化配列になる前にトリプレックスを停止するAAAGがコードされる。
本明細書に提供されるガイドRNA(参照sgRNAを含む)のいくつかの実施形態では、RNAトリプレックスが存在し、RNAトリプレックスは、2つの介在ステムループ(足場ステムループおよび伸長ステムループ)の後にAAAGで終了するUUU--nX(約4~15)--UUUステムループ(配列番号19)の配列を含み、トリプレックスを越えてデュプレックスシュードノットにも伸長し得るシュードノットを形成する。トリプレックスのUU-UUU-AAA配列は、標的化配列、足場ステム、および拡張ステムの間のネクサスとして形成される。例示的なCasX sgRNAでは、UUU-ループ-UUU領域が最初にコードされ、次に足場ステムループ、次にテトラループが連結している拡張ステムループ、次に標的化配列になる前にトリプレックスを停止するAAAGがコードされる。
b.足場ステムループ
本開示のsgNAのいくつかの実施形態では、トリプレックス領域の後に足場ステムループが続く。足場ステムループは、CasXタンパク質(CasXバリアントタンパク質など)が結合しているgNAの領域である。いくつかの実施形態では、足場ステムループは、かなり短く安定したステムループである。いくつかの事例では、足場ステムループは多くの変化を許容せず、何らかの形態のRNAバブルを必要とする。いくつかの実施形態では、足場ステムはCasX sgNA機能に必要である。重要なステムループであるという点でCas9のネクサスステムにおそらく類似しているが、いくつかの実施形態では、CasX sgNAの足場ステムは、CRISPR/Casシステムで見つけられる多くの他のステムループとは異なる必要なバルジ(RNAバブル)を有する。いくつかの実施形態では、このバルジの存在は、異なるCasXタンパク質と相互作用するsgNAにわたって保存されている。gNAの足場ステムループ配列の例示的な配列は、配列CCAGCGACUAUGUCGUAUGG(配列番号20)を含む。他の実施形態では、本開示は、足場ステムループが、MS2、Q β、U1ヘアピンII、Uvsx、またはPP7ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位5’および3’末端を有する異種RNA源からのRNAステムループ配列で置き換えられるgNAバリアントを提供する。いくつかの事例では、gNAの異種RNAステムループは、タンパク質、RNA構造、DNA配列、または小分子に結合することができる。
本開示のsgNAのいくつかの実施形態では、トリプレックス領域の後に足場ステムループが続く。足場ステムループは、CasXタンパク質(CasXバリアントタンパク質など)が結合しているgNAの領域である。いくつかの実施形態では、足場ステムループは、かなり短く安定したステムループである。いくつかの事例では、足場ステムループは多くの変化を許容せず、何らかの形態のRNAバブルを必要とする。いくつかの実施形態では、足場ステムはCasX sgNA機能に必要である。重要なステムループであるという点でCas9のネクサスステムにおそらく類似しているが、いくつかの実施形態では、CasX sgNAの足場ステムは、CRISPR/Casシステムで見つけられる多くの他のステムループとは異なる必要なバルジ(RNAバブル)を有する。いくつかの実施形態では、このバルジの存在は、異なるCasXタンパク質と相互作用するsgNAにわたって保存されている。gNAの足場ステムループ配列の例示的な配列は、配列CCAGCGACUAUGUCGUAUGG(配列番号20)を含む。他の実施形態では、本開示は、足場ステムループが、MS2、Q β、U1ヘアピンII、Uvsx、またはPP7ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位5’および3’末端を有する異種RNA源からのRNAステムループ配列で置き換えられるgNAバリアントを提供する。いくつかの事例では、gNAの異種RNAステムループは、タンパク質、RNA構造、DNA配列、または小分子に結合することができる。
c.伸長ステムループ
本開示のCasX sgNAのいくつかの実施形態では、足場ステムループの後に伸長ステムループが続く。いくつかの実施形態では、伸長ステムは、CasXタンパク質の大部分が結合していない合成tracrRNAおよびcrRNA融合を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、高度に順応性であり得る。いくつかの実施形態では、単一ガイドgRNAは、伸長ステムループ内のtracrRNAとcrRNAとの間のGAAAテトラループリンカーまたはGAGAAAリンカーで作製される。いくつかの事例では、CasX sgNAのターゲッターおよび活性化因子は、介在ヌクレオチドによって互いに連結されており、リンカーは、3~20個のヌクレオチド長を有することができる。本開示のCasX sgNAのいくつかの実施形態では、伸長ステムは、リボ核タンパク質複合体のCasXタンパク質の外側に位置する大きい32bpループである。sgNAの伸長ステムループ配列の例示的な配列は、配列GCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAAUCCGAUAAAUAAGAAGC(配列番号21)を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、GAGAAAスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、伸長ステムループが、MS2、Qβ、U1ヘアピンII、Uvsx、またはPP7ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位5’および3’末端を有する異種RNA源由来のRNAステムループ配列で置き換えられるgNAバリアントを提供する。かかる事例では、異種RNAステムループは、gNAの安定性を増加させる。他の実施形態において、本開示は、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、または少なくとも10,000個のヌクレオチド、または少なくとも10~10,000、少なくとも10~1000、または少なくとも10~100個のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を有するgNAバリアントを提供する。
本開示のCasX sgNAのいくつかの実施形態では、足場ステムループの後に伸長ステムループが続く。いくつかの実施形態では、伸長ステムは、CasXタンパク質の大部分が結合していない合成tracrRNAおよびcrRNA融合を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、高度に順応性であり得る。いくつかの実施形態では、単一ガイドgRNAは、伸長ステムループ内のtracrRNAとcrRNAとの間のGAAAテトラループリンカーまたはGAGAAAリンカーで作製される。いくつかの事例では、CasX sgNAのターゲッターおよび活性化因子は、介在ヌクレオチドによって互いに連結されており、リンカーは、3~20個のヌクレオチド長を有することができる。本開示のCasX sgNAのいくつかの実施形態では、伸長ステムは、リボ核タンパク質複合体のCasXタンパク質の外側に位置する大きい32bpループである。sgNAの伸長ステムループ配列の例示的な配列は、配列GCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAAUCCGAUAAAUAAGAAGC(配列番号21)を含む。いくつかの実施形態では、伸長ステムループは、GAGAAAスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、伸長ステムループが、MS2、Qβ、U1ヘアピンII、Uvsx、またはPP7ステムループから選択されるステムループ配列などであるが、これらに限定されない、近位5’および3’末端を有する異種RNA源由来のRNAステムループ配列で置き換えられるgNAバリアントを提供する。かかる事例では、異種RNAステムループは、gNAの安定性を増加させる。他の実施形態において、本開示は、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、または少なくとも10,000個のヌクレオチド、または少なくとも10~10,000、少なくとも10~1000、または少なくとも10~100個のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を有するgNAバリアントを提供する。
d.標的化配列
本開示のgNAのいくつかの実施形態において、伸長ステムループの後にトリプレックスの一部を形成する領域が続き、その後にgNAの3’末端に標的化配列(または「スペーサー」)が続く。標的化配列は、CasXリボ核タンパク質ホロ複合体(すなわち、RNP)を、改変される遺伝子の標的核酸配列の特定の領域に標的させる。したがって、例えば、本開示のgNA標的化配列は、TC PAMモチーフ、またはPAM配列TTC、ATC、GTC、もしくはCTCのうちのいずれか1つが標的配列に相補的な非標的鎖配列の5’の1つのヌクレオチドに位置する場合、RNPの構成要素として真核生物細胞の核酸(例えば、真核生物染色体、染色体配列、真核生物RNAなど)におけるPCSK9遺伝子の一部分に相補的であり、それ故に、それにハイブリダイズすることができる配列を有する。PAM配列の位置が考慮される限り、gNAが任意の所望の標的核酸配列の所望の配列を標的することができるようにgNAの標的化配列を改変することができる。いくつかの実施形態では、gNA足場は、標的化配列の5’にあり、標的化配列は、gNAの3’末端にある。いくつかの実施形態において、RNPのヌクレアーゼによって認識されるPAMモチーフ配列は、TCである。他の実施形態において、RNPのヌクレアーゼによって認識されるPAM配列は、NTCである。
本開示のgNAのいくつかの実施形態において、伸長ステムループの後にトリプレックスの一部を形成する領域が続き、その後にgNAの3’末端に標的化配列(または「スペーサー」)が続く。標的化配列は、CasXリボ核タンパク質ホロ複合体(すなわち、RNP)を、改変される遺伝子の標的核酸配列の特定の領域に標的させる。したがって、例えば、本開示のgNA標的化配列は、TC PAMモチーフ、またはPAM配列TTC、ATC、GTC、もしくはCTCのうちのいずれか1つが標的配列に相補的な非標的鎖配列の5’の1つのヌクレオチドに位置する場合、RNPの構成要素として真核生物細胞の核酸(例えば、真核生物染色体、染色体配列、真核生物RNAなど)におけるPCSK9遺伝子の一部分に相補的であり、それ故に、それにハイブリダイズすることができる配列を有する。PAM配列の位置が考慮される限り、gNAが任意の所望の標的核酸配列の所望の配列を標的することができるようにgNAの標的化配列を改変することができる。いくつかの実施形態では、gNA足場は、標的化配列の5’にあり、標的化配列は、gNAの3’末端にある。いくつかの実施形態において、RNPのヌクレアーゼによって認識されるPAMモチーフ配列は、TCである。他の実施形態において、RNPのヌクレアーゼによって認識されるPAM配列は、NTCである。
いくつかの実施形態において、gNAの標的化配列は、1つ以上の変異を含み得る、PCSK9タンパク質をコードする遺伝子の一部に対して相補的である。いくつかの実施形態において、gNAの標的化配列は、エクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8、エクソン9、エクソン10、エクソン11、およびエクソン12からなる群から選択されるPCSK9エクソンに相補的である。いくつかの実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9イントロンに対して特異的である。いくつかの実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9イントロン-エクソン接合部に対して特異的である。いくつかの実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子またはその相補体のうちの1つ以上の一塩基多型(SNP)を含む配列に対して相補的である。PCSK9コード配列内またはPCSK9非コード配列内にあるSNPは、両方とも本開示の範囲内である。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子の遺伝子間領域の配列、またはPCSK9遺伝子の遺伝子間領域に相補的である配列に対して相補的である。他の実施形態では、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子の調節要素に相補的である。標的化配列が調節要素に特異的であるそれらの事例では、かかる調節要素には、プロモーター領域、エンハンサー領域、遺伝子間領域、5’非翻訳領域(5’UTR)、3’非翻訳領域(3’UTR)、保存要素、およびシス調節要素を含む領域が含まれるが、これらに限定されない。プロモーター領域は、コード配列の開始点から5kb以内のヌクレオチドを包含するよう意図されているか、または遺伝子エンハンサー要素もしくは保存要素の場合、標的核酸の遺伝子のコード配列から何千bp、何十万bp、またはさらには何百万bpも離れて位置し得る。前述では、標的は、標的のコード遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされるよう意図されており、これにより、標的化タンパク質が細胞内で発現されないか、または細胞内でより低いレベルで発現されるようになるものである。
いくつかの実施形態において、標的化配列は、14~35個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、14、15、16、18、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35個の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、20個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、19個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、18個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、17個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、16個の連続するヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、標的化配列は、15個の連続するヌクレオチドからなり、標的化配列は、標的核酸配列に対して0~5、0~4、0~3、または0~2個のミスマッチを含み、標的化配列を含むgNAを含むRNPが標的核酸に対して相補的結合を形成することができるように十分な結合特異性を保持することができる。
野生型PCSK9核酸に対する標的化配列の代表的であるが非限定的な例は、配列番号315~436、612~2100、および2286~13861として提供され、以下に表Aとして示され、PCSK9標的核酸に対する標的化配列を表す。一実施形態において、gNAの標的化配列は、配列番号315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列に対して少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、または少なくとも約95%の同一性を有する配列を含む。別の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列番号315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列からなる。前述の実施形態では、標的化配列のうちのいずれかで、チミン(T)ヌクレオチドがウラシル(U)ヌクレオチドのうちの1つ以上またはすべての代わりに使用され、これにより、gNAが、gDNAもしくはgRNA、またはRNAおよびDNAのキメラになり得る。いくつかの実施形態では、配列番号315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される標的化配列は、ウラシルヌクレオチドについて置換された少なくとも1、2、3、4、5、または6個以上のチミンヌクレオチドを有する。他の実施形態において、本開示のgNA、gRNA、またはgDNAは、配列番号315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される1、2、3個以上の標的化配列、または配列番号315~436、612~2100、および2286~13861のうちの1つ以上の配列に対して少なくとも50%同一、少なくとも55%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一である標的化配列を含む。いくつかの実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から2個のヌクレオチドが除去されている配列番号315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から3個のヌクレオチドが除去されている配列番号315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から4個のヌクレオチドが除去されている配列番号315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から5個のヌクレオチドが除去されている配列番号315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態において、標的化配列は、配列番号33のPCSK9タンパク質の変異またはPCSK9タンパク質の機能もしくは発現を破壊する変異をコードする核酸配列に相補的である。いくつかのミスセンス変異(S127R、D129G、F216L、D374H、およびD374Y)は、高コレステロール血症および早発性アテローム性動脈硬化症に関連しており、したがって、機能獲得型変異と考えられ(Shilpa Pandit,S.,et al.Functional analysis of sites within PCSK9 responsible for hypercholesterolemias.J Lipid Res.,49:1333(2008))、本開示は、PCSK9遺伝子におけるこれらの変異をコードするDNA配列に相補的である標的化配列を企図し、AGCAGGUCGCCUCUCAUCUU(配列番号272)、CAUCUUCACCAGGAAGCCAG(配列番号273)、CCUCUCAUCUUCACCAGGAA(配列番号274)、UGGUGAAGAUGAGAGGCGAC(配列番号275)、GUGGAGGCGGGUCCCGUCCU(配列番号281)、AGCCACUGCAGCACCUGCUU(配列番号287)、UUGGUGCCUCCAGCCACUGC(配列番号288)、AGCUACUGCAGCACCUGCUU(配列番号289)、およびUUGGUGCCUCCAGCUACUGC(配列番号290)からなる群から選択される配列が含まれる。
いくつかの変異は、R46L、G106R、Y142X、N157K、R237W、およびC679Xを含む機能喪失型変異であると考えられ、低コレステロール血症に関連しており(Berke,K.,et al.Missense Mutations in the PCSK9 Gene Are Associated With Hypocholesterolemia and Possibly Increased Response to Statin Therapy.Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biol.26:1094(2006))、本開示は、PCSK9遺伝子におけるこれらの変異をコードするDNA配列に相補的である標的化配列を企図する。PCSK9変異に特異的である例示的な標的化配列、およびスペーサーによって標的化されるPCSK9変異のClinVar(/www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)識別子が、以下の表Bに提供される。
変異体PCSK9核酸に対する標的化配列の代表的であるが非限定的な例は、上記に表Bとして示される配列番号247~303として提供される。一実施形態において、gNAの標的化配列は、配列番号247~303からなる群から選択される配列に対して少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、または少なくとも約95%の同一性を有する配列を含む。別の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列番号247~303からなる群から選択される配列からなる。いくつかの実施形態では、配列番号247~303からなる群から選択される標的化配列は、ウラシルヌクレオチドについて置換された少なくとも1、2、3、4、5、または6個以上のチミンヌクレオチドを有する。他の実施形態において、本開示は、配列番号247~303からなる群から選択される標的化配列、または配列番号247~303のうちの1つ以上の配列に対して少なくとも50%同一、少なくとも55%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一である標的化配列を含む、1、2、3個以上のgNAを含むCasX:gNAシステムを提供する。いくつかの実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号247~303からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から2個のヌクレオチドが除去されている配列番号247~303からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から3個のヌクレオチドが除去されている配列番号247~303からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から4個のヌクレオチドが除去されている配列番号3247~303からなる群から選択される配列を含む。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、配列の3’末端から5個のヌクレオチドが除去されている配列番号247~303からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、CasX:gNAシステムは、第1のgNAを含み、さらに第2の(および任意選択的に第3、第4、第5、またはそれ以上の)gNAを含み、第2のgNAまたは追加のgNAは、第1のgNAの標的化配列と比較して標的核酸配列の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有し、それにより、標的核酸内の複数の点が標的化され、例えば、複数の切断がCasXによって標的核酸内に導入されるようになる。かかる事例では、第2のまたは追加のgNAがCasXタンパク質の追加のコピーと複合体形成されることが理解されよう。gNAの標的化配列を選択することにより、標的核酸内の特定の位置を挟む標的核酸配列の定義された領域は、本明細書に記載のCasX:gNAシステムを使用して改変または編集することができ、ドナー鋳型の挿入またはPCSK9遺伝子の変異を含む領域もしくはエクソンの切除が含まれる。
e.gNA足場
標的化配列ドメインを除いて、gNAの残りの成分は本明細書では足場と呼ばれる。いくつかの実施形態では、gNA足場は、参照gNAとして以下に記載される、天然に存在する配列に由来する。他の実施形態では、gNA足場は、変異、挿入、欠失、またはドメイン置換が導入されて、gNAに望ましい特性を付与する、参照gNAのバリアントである。
標的化配列ドメインを除いて、gNAの残りの成分は本明細書では足場と呼ばれる。いくつかの実施形態では、gNA足場は、参照gNAとして以下に記載される、天然に存在する配列に由来する。他の実施形態では、gNA足場は、変異、挿入、欠失、またはドメイン置換が導入されて、gNAに望ましい特性を付与する、参照gNAのバリアントである。
いくつかの実施形態では、CasX参照gRNAは、Deltaproteobacterから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、CasX tracrRNA配列である。Deltaproteobacterから単離されたまたはそれに由来する例示的なCasX参照tracrRNA配列は、ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(配列番号22)およびACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGG(配列番号23)を含み得る。Deltaproteobacterから単離されたまたはそれに由来する例示的なcrRNA配列は、CCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(配列番号24)の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、CasX参照gNAは、Deltaproteobacterから単離されたまたはそれに由来する配列と少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一、または100%同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、CasX参照ガイドRNAは、Planctomycetesから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、CasX tracrRNA配列である。Planctomycetesから単離されたか、またはそれに由来する例示的なCasX参照tracrRNA配列は、UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA(配列番号8)およびUACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGG(配列番号9)を含み得る。Planctomycetesから単離されたまたはそれに由来する例示的なcrRNA配列は、UCUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAG(配列番号27)の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、CasX参照gNAは、Planctomycetesから単離されたまたはそれに由来する配列と少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一、または100%同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、CasX参照gNAは、Candidatus Sungbacteriaから単離されたまたはそれに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、CasX tracrRNA配列である。Candidatus Sungbacteriaから単離された、またはそれに由来する例示的なCasX参照tracrRNA配列は、GUUUACACACUCCCUCUCAUAGGGU(配列番号10)、GUUUACACACUCCCUCUCAUGAGGU(配列番号11)、UUUUACAUACCCCCUCUCAUGGGAU(配列番号12)およびGUUUACACACUCCCUCUCAUGGGGG(配列番号13)の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、CasX参照ガイドRNAは、Candidatus Sungbacteriaから単離されたか、またはそれに由来する配列と少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一、または100%同一の配列を含む。
表1は、参照gRNA tracr配列および足場配列を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、gNAが表1の配列番号4~16のうちのいずれか1つの配列を有する参照gNA配列と比較して少なくとも1つのヌクレオチド改変を有する配列を含む足場を有する、gNA配列を提供する。ベクターがgNAのDNAコード配列を含むか、またはgNAがgDNAもしくはRNAおよびDNAのキメラであるそれらの実施形態において、チミン(T)塩基を、表1および表2の配列を含む、本明細書に記載のgNA配列の実施形態のうちのいずれかのウラシル(U)塩基の代わりに使用することができることが理解されよう。
f.gNAバリアント
別の態様では、本開示は、参照gRNA足場と比較して1つ以上の改変を含むガイド核酸バリアント(本明細書では代替的に「gNAバリアント」または「gRNAバリアント」と称される)に関する。本明細書で使用される場合、「足場」とは、スペーサー配列を除くgNA機能に必要なgNAのすべての部分を指す。
別の態様では、本開示は、参照gRNA足場と比較して1つ以上の改変を含むガイド核酸バリアント(本明細書では代替的に「gNAバリアント」または「gRNAバリアント」と称される)に関する。本明細書で使用される場合、「足場」とは、スペーサー配列を除くgNA機能に必要なgNAのすべての部分を指す。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントの足場は、配列番号4または配列番号5を含む参照gRNAの配列に対して1つ以上の追加の変化を含むバリアントである。参照gRNAの足場が配列番号4または配列番号5に由来するそれらの実施形態では、gNAバリアントの1つ以上の改善または追加された特性は、配列番号4または配列番号5の同じ特性と比較して改善される。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、本開示の参照gRNA配列と比較して1個以上のヌクレオチド置換、挿入、欠失、または交換もしくは置換された領域を含む。いくつかの実施形態では、変異が参照gRNAの任意の領域で起こり、gNAバリアントを産生することができる。いくつかの実施形態では、gNAバリアント配列の足場は、配列番号4または配列番号5の配列と少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、または少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAの特性を改善する、参照gRNAの1つ以上の領域内の1つ以上のヌクレオチド変化を含む。例示的な領域には、RNAトリプレックス、シュードノット、足場ステムループ、および伸長ステムループが含まれる。いくつかの事例では、バリアント足場ステムは、バブルをさらに含む。他の事例では、バリアント足場は、トリプレックスループ領域をさらに含む。さらに他の事例では、バリアント足場は、5’非構造領域をさらに含む。一実施形態では、gNAバリアント足場は、配列番号14と少なくとも60%の配列同一性を有する足場ステムループを含む。別の実施形態では、gNAバリアントは、CCAGCGACUAUGUCGUAGUGG(配列番号32)の配列を有する足場ステムループを含む。別の実施形態では、本開示は、元の6ntループおよび13個の最もループに近位の塩基対(合計32個のヌクレオチド)がUvsxヘアピン(4ntのループおよび5個のループに近位の塩基対、合計14個のヌクレオチド)に置き換えられ、伸長ステムのループから遠位の塩基がA99の欠失およびG64Uの置換により新たなUvsxヘアピンと隣接する完全に塩基対形成されたステムに変換された、配列番号5と比較して、C18G置換、G55挿入、U1欠失、および改変された伸長ステムループを含むgNA足場を提供する。前述の実施形態では、gNA足場は、配列ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAG(配列番号2238)を含む。
バリアントgNAが本明細書に記載の参照gRNAと比較された場合に1つ以上の改善された機能または特性を有するか、または1つ以上の新たな機能を追加するすべてのgNAバリアントは、本開示の範囲内であると想定される。かかるgNAバリアントの代表的な例はガイド174(配列番号2238)であり、その設計は実施例に記載されている。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、gNAバリアントを含むRNPに新たな機能を追加する。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、改善された安定性、改善された溶解性、gNAの改善された転写、ヌクレアーゼ活性に対する改善された抵抗性、gNAの増加したフォールディング率、フォールディング中の減少した副産物形成、増加した生産的フォールディング、CasXタンパク質に対する改善された結合親和性、CasXタンパク質とともに複合体形成された場合の標的DNAに対する改善された結合親和性、CasXタンパク質とともに複合体形成された場合の改善された遺伝子編集、CasXタンパク質とともに複合体形成された場合の改善された編集特異性、およびCasXタンパク質とともに複合体形成された場合の標的DNAの編集においてATC、CTC、GTC、またはTTC(ATCN、CTCN、GTCN、およびTTCN PAMとも称される)を含む1つ以上のPAM配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせから選択される改善された特性を有する。いくつかの事例では、gNAバリアントの改善された特性のうちの1つ以上は、配列番号4または配列番号5の参照gNAと比較して少なくとも約1.1~約100,000倍改善される。他の事例では、gNAバリアントの1つ以上の改善された特徴は、配列番号4または配列番号5の参照gNAと比較して、少なくとも約1.1、少なくとも約10、少なくとも約100、少なくとも約1000、少なくとも約10,000、少なくとも約100,000倍以上改善されている。他の事例では、gNAバリアントの改善された特性のうちの1つ以上は、配列番号4または配列番号5の参照gNAと比較して約1.1~100,00倍、約1.1~10,00倍、約1.1~1,000倍、約1.1~500倍、1.1~100倍、約1.1~50倍、約1.1~20倍、約10~100,00倍、約10~10,00倍、約10~1,000倍、約10~500倍、約10~100倍、約10~50倍、約10~20倍、約2~70倍、約2~50倍、約2~30倍、約2~20倍、約2~10倍、約5~50倍、約5~30倍、約5~10倍、約100~100,00倍、約100~10,00倍、約100~1,000倍、約100~500倍、約500~100,00倍、約500~10,00倍、約500~1,000倍、約500~750倍、約1,000~100,00倍、約10,000~100,00倍、約20~500倍、約20~250倍、約20~200倍、約20~100倍、約20~50倍、約50~10,000倍、約50~1,000倍、約50~500倍、約50~200倍、または約50~100倍改善される。他の事例では、gNAバリアントの1つ以上の改善された特性は、配列番号4または配列番号5の参照gNAと比較して約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍、200倍、210倍、220倍、230倍、240倍、250倍、260倍、270倍、280倍、290倍、300倍、310倍、320倍、330倍、340倍、350倍、360倍、370倍、380倍、390倍、400倍、425倍、450倍、475倍、または500倍改善される。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、本開示のgNAバリアントを生成するために、参照gRNAを、ディープミューテーショナルエボルーション(DME)、ディープミューテーショナルスキャニング(DMS)、エラープローンPCR、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、スタガードエクステンションPCR、遺伝子シャフリング、またはドメインスワッピングを含み得る以下の本明細書に記載の変異誘発法などの1つ以上の変異誘発法に供することによって作製することができる。参照gRNAの活性は、gNAバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それにより、gNAバリアントの機能の改善を測定することができる。他の実施形態では、参照gRNAは、gNAバリアント、例えば、合理的に設計されたバリアントを産生するために、1つ以上の意図的な標的化変異、置換、またはドメイン交換に供され得る。かかる方法によって産生された例示的なgRNAバリアントは実施例に記載されており、gNA足場の代表的な配列は表2に提示される。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照ガイド核酸足場配列と比較して1つ以上の改変を含み、1つ以上の改変は、gNAバリアントの領域における少なくとも1個のヌクレオチド置換、gNAバリアントの領域における少なくとも1個のヌクレオチド欠失、gNAバリアントの領域における少なくとも1個のヌクレオチド挿入、gNAバリアントの領域のすべてもしくは一部分の置換、gNAバリアントの領域のすべてもしくは一部分の欠失、または前述の任意の組み合わせから選択される。いくつかの事例では、改変は、1つ以上の領域におけるgNAバリアントの1~15個の連続または非連続ヌクレオチドの置換である。他の事例では、改変は、1つ以上の領域におけるgNAバリアントの1~10個の連続または非連続ヌクレオチドの欠失である。他の事例では、改変は、1つ以上の領域におけるgNAバリアントの1~10個の連続または非連続ヌクレオチドの挿入である。他の事例では、改変は、近位5’および3’末端を有する異種RNA源由来のRNAステムループ配列での足場ステムループまたは伸長ステムループの置換である。いくつかの事例では、本開示のgNAバリアントは、1つの領域に2つ以上の改変を含む。他の事例では、本開示のgNAバリアントは、2つ以上の領域に改変を含む。他の事例では、gNAバリアントは、この段落に記載される前述の改変の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、+1ヌクレオチドがGである場合、U6プロモーターからの転写が開始部位に関してより効率的かつより一貫しているため、5’Gがインビボでの発現のためにgNAバリアント配列に付加される。他の実施形態では、T7ポリメラーゼが+1位にGおよび+2位にプリンを強く好むため、2つの5’Gがインビトロ転写のためにgNAバリアント配列に付加されて、産生効率を増加させる。いくつかの事例では、5’G塩基が表1の参照足場に付加される。他の事例では、5’G塩基が表2のバリアント足場に付加される。
表2は、例示的なgNAバリアント足場配列を提供する。表2中、(-)は、配列番号5の参照配列に対する指定された位置での欠失を示し、(+)は、配列番号5に対する指示された位置での指定された塩基の挿入を示し、(:)は、配列番号5に対する欠失または置換の指定された開始:終止座標での塩基の範囲を示し、複数の挿入、欠失、または置換は、例えば、A14C、U17Gのようにコンマで区切られている。いくつかの実施形態では、gNAバリアント足場は、表2に列挙される配列番号2101~2285のうちのいずれか1つ、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、gNA変異体足場は、表2に示される配列番号2101~2285からなる群から選択される配列を含むか、または本質的にそれからなる。ベクターがgNAのDNAコード配列を含むか、またはgNAがgDNAもしくはRNAおよびDNAのキメラであるそれらの実施形態では、チミン(T)塩基を本明細書に記載のgNA配列の実施形態のうちのいずれかのウラシル(U)塩基の代わりに使用することができることが理解されよう。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、配列-UUU-N4-25-UUU-(配列番号34)を含むtracrRNAステムループを含む。例えば、gNAバリアントは、トリプレックス領域に寄与する2つのトリプレットUモチーフが隣接する足場ステムループまたはその置換を含む。いくつかの実施形態では、足場ステムループまたはその置換は、少なくとも4個のヌクレオチド、少なくとも5個のヌクレオチド、少なくとも6個のヌクレオチド、少なくとも7個のヌクレオチド、少なくとも7個のヌクレオチド、少なくとも8個のヌクレオチド、少なくとも9個のヌクレオチド、少なくとも10個のヌクレオチド、少なくとも11個のヌクレオチド、少なくとも12個のヌクレオチド、少なくとも13個のヌクレオチド、少なくとも14個のヌクレオチド、少なくとも15個のヌクレオチド、少なくとも16個のヌクレオチド、少なくとも17個のヌクレオチド、少なくとも18個のヌクレオチド、少なくとも19個のヌクレオチド、少なくとも20個のヌクレオチド、少なくとも21個のヌクレオチド、少なくとも22個のヌクレオチド、少なくとも23個のヌクレオチド、少なくとも24個のヌクレオチド、または少なくとも25個のヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、スペーサー領域に対して5’の位置に-AAAG-を有するcrRNA配列を含む。いくつかの実施形態では、-AAAG-配列は、スペーサー領域に対してすぐ5’にある。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントを産生するための参照gNAに対する少なくとも1つのヌクレオチド改変は、参照gRNAと比較してCasXバリアントgNAに少なくとも1つのヌクレオチド欠失を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gNAと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の連続または非連続ヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの欠失は、参照gNAと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個以上の連続ヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gNAと比較して、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個以上のヌクレオチドの欠失を含み、この欠失は連続ヌクレオチドにはない。参照gRNAと比較してgNAバリアントに2つ以上の非連続欠失が存在するそれらの実施形態では、本明細書に記載される、いずれかの長さの欠失、およびいずれかの長さの欠失の組み合わせも、本開示の範囲内であると企図される。例えば、いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、1個のヌクレオチドの第1の欠失および2個のヌクレオチドの第2の欠失を含んでもよく、これらの2つの欠失は連続していない。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAの異なる領域に少なくとも2つの欠失を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAの同じ領域に少なくとも2つの欠失を含む。例えば、領域は、伸長ステムループ、足場ステムループ、足場ステムバブル、トリプレックスループ、シュードノット、トリプレックス、またはgNAバリアントの5’末端であり得る。参照gRNAにおけるいずれかのヌクレオチドの欠失も、本開示の範囲内であると企図される。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントを生成するための参照gRNAの少なくとも1つのヌクレオチド改変は、少なくとも1つのヌクレオチド挿入を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の連続または非連続ヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1個のヌクレオチドの挿入は、参照gRNAと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個以上の連続ヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して2つ以上の挿入を含み、これらの挿入は連続していない。参照gRNAと比較してgNAバリアントに2つ以上の非連続挿入が存在するそれらの実施形態では、本明細書に記載される、いずれかの長さの挿入、およびいずれかの長さの挿入の組み合わせも、本開示の範囲内であると企図される。例えば、いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、1個のヌクレオチドの第1の挿入および2個のヌクレオチドの第2の挿入を含んでもよく、これらの2つの挿入は連続していない。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAの異なる領域に少なくとも2つの挿入を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAの同じ領域に少なくとも2つの挿入を含む。例えば、領域は、伸長ステムループ、足場ステムループ、足場ステムバブル、トリプレックスループ、シュードノット、トリプレックス、またはgNAバリアントの5’末端であり得る。参照gRNAにおける任意の位置でのA、G、C、U(または対応するDNAではT)、またはそれらの組み合わせのいずれかの挿入も、本開示の範囲内であると企図される。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントを生成するための参照gRNAの少なくとも1つのヌクレオチド改変は、少なくとも1つの核酸置換を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個以上の連続または非連続置換ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して、1~4個のヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの置換は、参照gRNAと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個以上の連続ヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して2つ以上の置換を含み、これらの置換は連続していない。参照gRNAと比較してgNAバリアントに2つ以上の非連続置換が存在するそれらの実施形態では、本明細書に記載される、いずれかの長さの置換ヌクレオチド、およびいずれかの長さの置換ヌクレオチドの組み合わせも、本開示の範囲内であると企図される。例えば、いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、1個のヌクレオチドの第1の置換および2個のヌクレオチドの第2の置換を含んでもよく、これらの2つの置換は連続していない。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAの異なる領域に少なくとも2つの置換を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAの同じ領域に少なくとも2つの置換を含む。例えば、領域は、トリプレックス、伸長ステムループ、足場ステムループ、足場ステムバブル、トリプレックスループ、シュードノット、トリプレックス、またはgNAバリアントの5’末端であり得る。参照gRNAにおける任意の位置でのA、G、C、U(または対応するDNAではT)、またはそれらの組み合わせのいずれかの置換も、本開示の範囲内であると企図される。
本明細書に記載の置換、挿入、および欠失のうちのいずれかを組み合わせて、本開示のgNAバリアントを生成することができる。例えば、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して少なくとも1つの置換および少なくとも1つの欠失、参照gRNAと比較して少なくとも1つの置換および少なくとも1つの挿入、参照gRNAと比較して少なくとも1つの挿入および少なくとも1つの欠失、または参照gRNAと比較して少なくとも1つの置換、1つの挿入、および1つの欠失を含み得る。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、配列番号4~16のうちのいずれか1つと少なくとも20%同一、少なくとも30%同一、少なくとも40%同一、少なくとも50%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の足場領域を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、配列番号4~16のうちのいずれか1つと少なくとも60%相同(または同一)の足場領域を含む。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、配列番号14と少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一のtracrステムループを含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、配列番号14と少なくとも60%相同(または同一)のtracrステムループを含む。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、配列番号15と少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一の伸長ステムループを含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、配列番号15と少なくとも60%相同(または同一)の伸長ステムループを含む。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、以下に記載されるように、外因性伸長ステムループを含み、この点で参照gNAとは異なる。いくつかの実施形態では、外因性伸長ステムループは、本明細書に開示される参照ステムループ領域(例えば、配列番号15)と同一性をほとんどまたは全く有しない。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、少なくとも10bp、少なくとも20bp、少なくとも30bp、少なくとも40bp、少なくとも50bp、少なくとも60bp、少なくとも70bp、少なくとも80bp、少なくとも90bp、少なくとも100bp、少なくとも200bp、少なくとも300bp、少なくとも400bp、少なくとも500bp、少なくとも600bp、少なくとも700bp、少なくとも800bp、少なくとも900bp、少なくとも1,000bp、少なくとも2,000bp、少なくとも3,000bp、少なくとも4,000bp、少なくとも5,000bp、少なくとも6,000bp、少なくとも7,000bp、少なくとも8,000bp、少なくとも9,000bp、少なくとも10,000bp、少なくとも12,000bp、少なくとも15,000bp、または少なくとも20,000bpである。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、少なくとも10、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、または少なくとも10,000個のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、異種ステムループは、gNAの安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、異種RNAステムループは、タンパク質、RNA構造、DNA配列、または小分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、ステムループを置き換える外因性ステムループ領域は、得られるgNAが増加した安定性を有し、ループの選択に応じて特定の細胞タンパク質またはRNAと相互作用することができるRNAステムループまたはヘアピンを含む。かかる外因性伸長ステムループは、例えば、熱安定性RNAを含むことができ、MS2(ACAUGAGGAUUACCCAUGU(配列番号35))、Qβ(UGCAUGUCUAAGACAGCA(配列番号36))、U1ヘアピンII(AAUCCAUUGCACUCCGGAUU(配列番号37))、Uvsx(CCUCUUCGGAGG(配列番号38))、PP7(AGGAGUUUCUAUGGAAACCCU(配列番号39))、ファージ複製ループ(AGGUGGGACGACCUCUCGGUCGUCCUAUCU(配列番号40))、キッシングループ_a(UGCUCGCUCCGUUCGAGCA(配列番号41))、キッシングループ_b1(UGCUCGACGCGUCCUCGAGCA(配列番号42))、キッシングループ_b2(UGCUCGUUUGCGGCUACGAGCA(配列番号43))、GクアッドリプレックスM3q(AGGGAGGGAGGGAGAGG(配列番号44))、Gクアッドリプレックステロメアバスケット(GGUUAGGGUUAGGGUUAGG(配列番号45))、サルシン-リシンループ(CUGCUCAGUACGAGAGGAACCGCAG(配列番号46))、またはシュードノット(UACACUGGGAUCGCUGAAUUAGAGAUCGGCGUCCUUUCAUUCUAUAUACUUUGGAGUUUUAAAAUGUCUCUAAGUACA(配列番号47))などが挙げられる。いくつかの実施形態では、外因性ステムループは、長い非コードRNA(lncRNA)を含む。本明細書で使用される場合、lncRNAは、およそ200bpよりも長い非コードRNAを指す。いくつかの実施形態において、外因性ステムループの5’および3’末端が塩基対を形成し、すなわち、それらが相互作用してデュプレックスRNAの領域を形成する。いくつかの実施形態では、外因性ステムループの5’および3’末端が塩基対を形成し、外因性ステムループの5’末端と3’末端との間の1つ以上の領域は塩基対を形成しない。いくつかの実施形態では、少なくとも1個のヌクレオチド改変は、(a)1つ以上の領域におけるgNAバリアントの1~15個の連続もしくは非連続ヌクレオチドの置換、(b)1つ以上の領域におけるgNAバリアントの1~10個の連続もしくは非連続ヌクレオチドの欠失、(c)1つ以上の領域におけるgNAバリアントの1~10個の連続もしくは非連続ヌクレオチドの挿入、(d)近位5’および3’末端を有する異種RNA源由来のRNAステムループ配列での足場ステムループもしくは伸長ステムループの置換、または(a)~(d)の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、CCAGCGACUAUGUCGUAGUGG(配列番号32)の足場ステムループ配列を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、それと少なくとも1、2、3、4、または5つのミスマッチを有するCCAGCGACUAUGUCGUAGUGG(配列番号32)の足場ステムループ配列を含む。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、32個未満のヌクレオチド、31個未満のヌクレオチド、30個未満のヌクレオチド、29個未満のヌクレオチド、28個未満のヌクレオチド、27個未満のヌクレオチド、26個未満のヌクレオチド、25個未満のヌクレオチド、24個未満のヌクレオチド、23個未満のヌクレオチド、22個未満のヌクレオチド、21個未満のヌクレオチド、または20個未満のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、32個未満のヌクレオチドを含む伸長ステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、熱安定性ステムループをさらに含む。
いくつかの実施形態において、gNAバリアントは、配列番号2201~2285のうちのいずれか1つの配列、またはそれに対して少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、gNAバリアントは、配列番号2106、2237、2238、2239、2241、2244、2275、2279、2280、および2285からなる群から選択される配列を含む。
本開示のgNAバリアントのいくつかの実施形態では、gNAバリアントは、少なくとも1つの改変を含み、配列番号5の参照ガイド足場と比較した少なくとも1つの改変は、(a)トリプレックスループにおけるC18G置換、(b)ステムバブルにおけるG55挿入、(c)U1欠失、(d)伸長ステムループの改変であって、(i)6ntのループおよび13個のループ近位塩基対がUvsxヘアピンによって置き換えられ、(ii)完全に塩基形成されたループ遠位塩基をもたらすA99の欠失およびG65Uの置換である、伸長ステムループの改変のうちの1つ以上から選択される。かかる実施形態では、gNAバリアントは、配列番号2236、2237、2238、2241、2244、2248、2249、または2259~2285のうちのいずれか1つの配列を含む。
例示的な実施形態において、sgRNAバリアントは、配列番号2238(バリアント足場174、表2を参照)の配列に対する1つ以上の追加の変更を含む。
例示的な実施形態において、sgRNAバリアントは、配列番号2239(バリアント足場175、表2を参照)の配列に対する1つ以上の追加の変更を含む。
一部の実施形態では、gNAバリアントは、上記でより詳細に記載される、gNAの3’末端に位置するスペーサー(または標的化配列)領域をさらに含み、少なくとも14~約35個のヌクレオチドを含み、スペーサーは、標的DNAに相補的な配列で設計される。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、標的DNAに相補的な少なくとも10~30個のヌクレオチドの標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、20個のヌクレオチドを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、25個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、24個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、23個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、22個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、21個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、20個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、19個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、18個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、17個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、16個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、15個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、14個のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、gNAバリアントの足場は、表3、5、6、7、および9に示される配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、もしくは490のうちのいずれか1つの配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の同一性を有する配列を含むCasXバリアントタンパク質を有するRNPの一部である。前述の実施形態では、gNAは、スペーサー配列をさらに含む。
gNAバリアントの実施形態において、gNAバリアントは、少なくとも14~約35個のヌクレオチドを含む、上記でより完全に記載されている、gNAの3’末端に位置するスペーサー(または標的化配列)領域をさらに含み、スペーサーは、標的核酸に相補的である配列を用いて設計される。いくつかの実施形態において、gNAバリアントは、標的核酸に相補的な少なくとも10~30個のヌクレオチドの標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、20個のヌクレオチドを有する標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、標的化配列は、25個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、24個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、23個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、22個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、21個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、19個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、18個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、17個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、16個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、15個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的化配列は、14個のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号247~303、315~436、612~2100、もしくは2286~13861からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも50%同一、少なくとも55%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一である配列を含む、本開示のgNAバリアントにおける包含のための標的化配列を提供する。いくつかの実施形態において、gNAバリアントの標的化配列は、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含み、配列の3’末端から単一ヌクレオチドが除去されている。他の実施形態では、gNAバリアントの標的化配列は、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含み、配列の3’末端から2個のヌクレオチドが除去されている。他の実施形態では、gNAバリアントの標的化配列は、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含み、配列の3’末端から3個のヌクレオチドが除去されている。他の実施形態において、gNAバリアントの標的化配列は、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含み、配列の3’末端から4個のヌクレオチドが除去されている。他の実施形態では、gNAバリアントの標的化配列は、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含み、配列の3’末端から5個のヌクレオチドが除去されている。
いくつかの実施形態において、gNAバリアントは、gNAの3’末端に位置するスペーサー(標的化)領域をさらに含み、スペーサーは、標的核酸に相補的である配列を用いて設計される。いくつかの実施形態において、標的核酸は、スペーサーの第1のヌクレオチドからPAMを分離する少なくとも単一のヌクレオチドを有するスペーサーの5’に位置するPAM配列を含む。いくつかの実施形態において、PAMは、標的領域の非標的化鎖、すなわち、標的核酸に相補的である鎖に位置する。一部の実施形態では、PAM配列はATCである。いくつかの実施形態において、ATC PAMに対する標的化配列は、配列番号315~436、612~2100、および2286~3183からなる群から選択される配列、または配列番号315~436、612~2100、および2286~3183に対して少なくとも50%同一、少なくとも55%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ATC PAMに対する標的化配列は、配列番号315~436、612~2100、および2286~3183からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PAM配列はCTCである。いくつかの実施形態において、CTC PAMに対する標的化配列は、配列番号7252~11521からなる群から選択される配列、または配列番号7252~11521に対して少なくとも50%同一、少なくとも55%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、CTC PAMに対する標的化配列は、配列番号7252~11521からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PAM配列はGTCである。いくつかの実施形態において、GTC PAMに対する標的化配列は、配列番号11522~13861からなる群から選択される配列、または配列番号11522~13861に対して少なくとも50%同一、少なくとも55%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、GTC PAMに対する標的化配列は、配列番号11522~13861からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、PAM配列はTTCである。いくつかの実施形態において、TTC PAMに対する標的化配列は、配列番号3184~7251からなる群から選択される配列、または配列番号3184~7251に対して少なくとも50%同一、少なくとも55%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、TTC PAMに対する標的化配列は、配列番号3184~7251からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、gNAバリアントは、gNAの3’末端に位置する標的化配列を含み、標的化配列は、変異を含む標的核酸配列に相補的であり、変異は、機能獲得型変異である。前述の特定の実施形態において、変異は、配列番号33の配列に対してS127R、D129G、F216L、D374H、およびD374Yからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。別の特定の実施形態において、標的化配列は、表Bに示される配列番号247~303からなる群から選択される配列を含む。前述の別の特定の実施形態において、標的化配列は、AGCAGGUCGCCUCUCAUCUU(配列番号272)、CAUCUUCACCAGGAAGCCAG(配列番号273)、CCUCUCAUCUUCACCAGGAA(配列番号274)、UGGUGAAGAUGAGAGGCGAC(配列番号275)、GUGGAGGCGGGUCCCGUCCU(配列番号281)、AGCCACUGCAGCACCUGCUU(配列番号287)、UUGGUGCCUCCAGCCACUGC(配列番号288)、AGCUACUGCAGCACCUGCUU(配列番号289)、およびUUGGUGCCUCCAGCUACUGC(配列番号290)からなる群から選択される配列を含む。前述の別の特定の実施形態において、標的化配列は、AGCAGGUCGCCUCUCAUCUU(配列番号272)、CAUCUUCACCAGGAAGCCAG(配列番号273)、CCUCUCAUCUUCACCAGGAA(配列番号274)、UGGUGAAGAUGAGAGGCGAC(配列番号275)、GUGGAGGCGGGUCCCGUCCU(配列番号281)、AGCCACUGCAGCACCUGCUU(配列番号287)、UUGGUGCCUCCAGCCACUGC(配列番号288)、AGCUACUGCAGCACCUGCUU(配列番号289)、およびUUGGUGCCUCCAGCUACUGC(配列番号290)からなる群から選択される配列からなる。他の実施形態において、gNAバリアントは、gNAの3’末端に位置する標的化配列を含み、標的化配列は、変異を含む標的核酸配列に相補的であり、変異は、機能喪失型変異である。前述の特定の実施形態において、変異は、配列番号33の配列に対して、R46L、G106R、Y142X、N157K、R237W、またはC679Xからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む。
g.CasXタンパク質との複合体形成
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して、CasXタンパク質(参照CasXまたはCasXバリアントタンパク質など)と複合体を形成する改善された能力を有する。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して、CasXタンパク質(参照またはバリアントタンパク質など)に対する改善された親和性を有し、それにより、実施例に記載されるように、CasXタンパク質とリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成するその能力を改善する。リボ核タンパク質複合体形成を改善することにより、いくつかの実施形態では、機能的RNPが組み立てられる効率が改善され得る。いくつかの実施形態において、本開示のgNAバリアント足場とそのスペーサーとを含むRNPの90%超、93%超、95%超、96%超、97%超、98%超、または99%超が、標的核酸の遺伝子編集の能力を有する。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して、CasXタンパク質(参照CasXまたはCasXバリアントタンパク質など)と複合体を形成する改善された能力を有する。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して、CasXタンパク質(参照またはバリアントタンパク質など)に対する改善された親和性を有し、それにより、実施例に記載されるように、CasXタンパク質とリボ核タンパク質(RNP)複合体を形成するその能力を改善する。リボ核タンパク質複合体形成を改善することにより、いくつかの実施形態では、機能的RNPが組み立てられる効率が改善され得る。いくつかの実施形態において、本開示のgNAバリアント足場とそのスペーサーとを含むRNPの90%超、93%超、95%超、96%超、97%超、98%超、または99%超が、標的核酸の遺伝子編集の能力を有する。
CasXタンパク質と複合体を形成するgNAバリアントの能力を改善することができる例示的なヌクレオチド変化は、いくつかの実施形態では、足場ステムを熱安定性ステムループで置き換えることを含み得る。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、足場ステムを熱安定性ステムループで置き換えることにより、CasXタンパク質とのgNAバリアントの全体的な結合安定性を増加させることができる。あるいは、または加えて、ステムループの大部分を除去することにより、gNAバリアントのフォールディング動態が変化し、機能的な折り畳まれたgNAが容易かつ迅速に作製され、例えば、gNAバリアントが自身に「絡まる」可能性の程度を減少させることによって、構造的に組み立てられ得る。いくつかの実施形態では、足場ステムループ配列の選択は、gNAに利用される異なるスペーサーによって変化し得る。いくつかの実施形態では、足場配列は、スペーサー、ひいては標的配列に合わせて調整され得る。生化学的アッセイを使用して、実施例のアッセイを含む、RNPを形成するためのgNAバリアントに対するCasXタンパク質の結合親和性を評価することができる。例えば、当業者であれば、追加の非標識「コールド競合物」gNAの増加濃度に対する応答として、固定化されたCasXタンパク質に結合している蛍光標識gNAの量の変化を測定することができる。あるいは、または加えて、異なる量の蛍光標識gNAが固定化されたCasXタンパク質上に流されたときに蛍光シグナルがどのように変化するかを監視または確認することができる。あるいは、RNPを形成する能力は、定義された標的核酸配列に対するインビトロ切断アッセイを使用して評価することができる。
h.gNA安定性
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して改善された安定性を有する。安定性および効率的なフォールディングの増加は、いくつかの実施形態では、gNAバリアントが標的細胞内に存続する程度を増加させることができ、それにより、遺伝子編集などのCasX機能を実行することができる機能的RNPを形成する機会を増加させることができる。gNAバリアントの安定性の増加は、いくつかの実施形態では、より少ない量のgNAが細胞に送達される同様の結果を可能にすることができ、次いで、遺伝子編集中のオフターゲット効果の機会を低減させることができる。ガイドRNA安定性は、例えば、インビトロでガイドを組み立てること、細胞内環境を模倣する溶液中で様々な期間インキュベートすること、その後、本明細書に記載のインビトロ切断アッセイにより機能的活性を測定することを含む、様々な方法で評価することができる。あるいは、または加えて、gNAがgNAの初期トランスフェクション/形質導入後の様々な時点で細胞から収集されて、参照gRNAと比較してgNAバリアントがどのくらい存続するかを決定することができる。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して改善された安定性を有する。安定性および効率的なフォールディングの増加は、いくつかの実施形態では、gNAバリアントが標的細胞内に存続する程度を増加させることができ、それにより、遺伝子編集などのCasX機能を実行することができる機能的RNPを形成する機会を増加させることができる。gNAバリアントの安定性の増加は、いくつかの実施形態では、より少ない量のgNAが細胞に送達される同様の結果を可能にすることができ、次いで、遺伝子編集中のオフターゲット効果の機会を低減させることができる。ガイドRNA安定性は、例えば、インビトロでガイドを組み立てること、細胞内環境を模倣する溶液中で様々な期間インキュベートすること、その後、本明細書に記載のインビトロ切断アッセイにより機能的活性を測定することを含む、様々な方法で評価することができる。あるいは、または加えて、gNAがgNAの初期トランスフェクション/形質導入後の様々な時点で細胞から収集されて、参照gRNAと比較してgNAバリアントがどのくらい存続するかを決定することができる。
i.溶解性
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して改善されたCasXタンパク質:gNA RNPの溶解性を有する。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質:gNA RNPの溶解性は、gNAバリアントの5’または3’末端、例えば、参照sgRNAの5’または3’にリボザイム配列を付加することによって改善される。M1リボザイムなどのいくつかのリボザイムは、RNA媒介性タンパク質フォールディングによりタンパク質の溶解性を増加させることができる。本明細書に記載のgNAバリアントを含むCasX RNPの溶解性の増加は、当業者に既知の様々な手段によって、例えば、CasXおよびgNAバリアントが発現される溶解したE.coliの可溶性画分のゲル上で濃度測定読み取りを行うことによって評価することができる。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して改善されたCasXタンパク質:gNA RNPの溶解性を有する。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質:gNA RNPの溶解性は、gNAバリアントの5’または3’末端、例えば、参照sgRNAの5’または3’にリボザイム配列を付加することによって改善される。M1リボザイムなどのいくつかのリボザイムは、RNA媒介性タンパク質フォールディングによりタンパク質の溶解性を増加させることができる。本明細書に記載のgNAバリアントを含むCasX RNPの溶解性の増加は、当業者に既知の様々な手段によって、例えば、CasXおよびgNAバリアントが発現される溶解したE.coliの可溶性画分のゲル上で濃度測定読み取りを行うことによって評価することができる。
j.ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性
いくつかの実施形態において、gNAバリアントは、参照gRNAと比較してヌクレアーゼ活性に対する改善された抵抗性を有し、例えば、細胞内環境におけるバリアントgNAの持続性を増加させ得、それによって遺伝子編集を改善する。ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性は、当業者に既知の様々な方法によって評価することができる。例えば、ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を測定するインビトロ法は、例えば、参照gNAおよびバリアントを1つ以上の例示的なRNAヌクレアーゼと接触させることと、分解を測定することとを含み得る。あるいは、または加えて、本明細書に記載の方法を使用して細胞環境におけるgNAバリアントの存続性を測定することにより、gNAバリアントがヌクレアーゼ抵抗性である程度を示すことができる。
いくつかの実施形態において、gNAバリアントは、参照gRNAと比較してヌクレアーゼ活性に対する改善された抵抗性を有し、例えば、細胞内環境におけるバリアントgNAの持続性を増加させ得、それによって遺伝子編集を改善する。ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性は、当業者に既知の様々な方法によって評価することができる。例えば、ヌクレアーゼ活性に対する抵抗性を測定するインビトロ法は、例えば、参照gNAおよびバリアントを1つ以上の例示的なRNAヌクレアーゼと接触させることと、分解を測定することとを含み得る。あるいは、または加えて、本明細書に記載の方法を使用して細胞環境におけるgNAバリアントの存続性を測定することにより、gNAバリアントがヌクレアーゼ抵抗性である程度を示すことができる。
k.標的DNAに対する結合親和性
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して改善された標的DNAに対する親和性を有する。ある特定の実施形態では、gNAバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、参照gRNAを含むRNPの親和性と比較して改善された標的DNAに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的DNAに対するRNPの改善された親和性は、標的配列に対する改善された親和性、PAM配列に対する改善された親和性、標的配列のDNAを探し出すRNPの改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、標的DNAに対する改善された親和性は、全体的なDNA結合親和性の増加の結果である。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAと比較して改善された標的DNAに対する親和性を有する。ある特定の実施形態では、gNAバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、参照gRNAを含むRNPの親和性と比較して改善された標的DNAに対する親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的DNAに対するRNPの改善された親和性は、標的配列に対する改善された親和性、PAM配列に対する改善された親和性、標的配列のDNAを探し出すRNPの改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、標的DNAに対する改善された親和性は、全体的なDNA結合親和性の増加の結果である。
理論に拘束されることを望むことなく、CasXタンパク質におけるOBDの機能に影響を与えるgNAバリアントのヌクレオチド変化は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に結合するCasXバリアントタンパク質の親和性、ならびにTTC、ATC、GTC、およびCTCからなる群から選択されるPAM配列を含む、配列番号2の参照CasXタンパク質によって認識される標準的TTC PAM以外の増加したスペクトルのPAM配列に結合するかまたはそれを利用する能力を増加させ得、それにより、標的DNA配列に対するCasXバリアントタンパク質の親和性および多様性を増加させ、参照CasXと比較して、編集および/または結合することができる標的核酸配列の実質的な増加をもたらす。以下でより完全に記載されるように、参照CasXと比較して、編集することができる標的核酸の配列の増加は、PAMおよびプロトスペーサー配列の両方、ならびに非標的鎖の配向に応じたそれらの方向性を指す。これは、標的鎖ではなく非標的鎖のPAM配列が切断を決定するか、または標的認識に機械的に関与していることを意味するものではない。例えば、TTC PAMを参照する場合、それは、実際には、標的切断に必要な相補的GAA配列である場合もあれば、両方の鎖由来のヌクレオチドのある組み合わせである場合もある。本明細書に開示されるCasXタンパク質の場合、PAMはプロトスペーサーの5’に位置し、少なくとも単一のヌクレオチドがPAMをプロトスペーサーの第1のヌクレオチドから分離している。あるいは、または加えて、標的DNA鎖に対するCasXバリアントタンパク質の親和性を増加させるヘリカルIおよび/またはヘリカルIIドメインの機能に影響を与えるgNAの変化は、標的DNAに対するバリアントgNAを含むCasX RNPの親和性を増加させることができる。理論または機構に拘束されることなく、標的DNAとの増強された結合は、RNPによる標的DNAの増強された切断速度をもたらすことができ、RNPは、参照CasXと配列番号4または配列番号5のgNAとのRNPと比較して、インビトロアッセイにおいて、少なくとも5倍、少なくとも10倍、また少なくとも30倍増加した切断速度を有する。
l.gNA機能の付加または変化
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAに関してgNAバリアントのトポロジーを変化させるより大きい構造変化を含み、それにより、異なるgNAの機能性を可能にすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNA足場の内因性ステムループを、以前に特定された安定したRNA構造と、またはタンパク質もしくはRNA結合パートナーと相互作用してCasXに追加の部分を動員するか、またはこのRNA構造への結合パートナーを有するウイルスカプシドの内部などの特定の位置にCasXを動員するステムループと交換したものである。他の状況では、キッシングループで見られるように、RNAが互いに動員される場合があり、これにより、2つのCasXタンパク質が標的DNA配列でのより効率的な遺伝子編集のために共局在化されるようになり得る。かかるRNA構造には、MS2、Qβ、U1ヘアピンII、Uvsx、PP7、ファージ複製ループ、キッシングループ_a、キッシングループ_b1、キッシングループ_b2、GクアッドリプレックスM3q、Gクアッドリプレックステロメアバスケット、サルシン-リシンループ、またはシュードノットが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNAに関してgNAバリアントのトポロジーを変化させるより大きい構造変化を含み、それにより、異なるgNAの機能性を可能にすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、参照gRNA足場の内因性ステムループを、以前に特定された安定したRNA構造と、またはタンパク質もしくはRNA結合パートナーと相互作用してCasXに追加の部分を動員するか、またはこのRNA構造への結合パートナーを有するウイルスカプシドの内部などの特定の位置にCasXを動員するステムループと交換したものである。他の状況では、キッシングループで見られるように、RNAが互いに動員される場合があり、これにより、2つのCasXタンパク質が標的DNA配列でのより効率的な遺伝子編集のために共局在化されるようになり得る。かかるRNA構造には、MS2、Qβ、U1ヘアピンII、Uvsx、PP7、ファージ複製ループ、キッシングループ_a、キッシングループ_b1、キッシングループ_b2、GクアッドリプレックスM3q、Gクアッドリプレックステロメアバスケット、サルシン-リシンループ、またはシュードノットが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、末端融合パートナーを含む。例示的な末端融合には、自己切断リボザイムまたはタンパク質結合モチーフへのgRNAの融合が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「リボザイム」とは、タンパク質酵素と同様の1つ以上の触媒活性を有するRNAまたはそのセグメントを指す。例示的なリボザイム触媒活性には、例えば、RNAの切断および/もしくはライゲーション、DNAの切断および/もしくはライゲーション、またはペプチド結合形成が含まれ得る。いくつかの実施形態では、かかる融合は、足場フォールディングを改善するか、またはDNA修復機構を動員することができる。例えば、gRNAは、いくつかの実施形態では、デルタ肝炎ウイルス(HDV)アンチゲノムリボザイム、HDVゲノムリボザイム、ハチェットリボザイム(メタゲノムデータからのもの)、env25ピストルリボザイム(Aliistipes putredinis由来の代表的なもの)、HH15最小ハンマーヘッドリボザイム、タバコリングスポットウイルス(TRSV)リボザイム、野生型ウイルスハンマーヘッドリボザイム(および合理的なバリアント)、またはツイステッドシスター1もしくはRBMXリクルーティングモチーフに融合され得る。ハンマーヘッドリボザイムは、RNA分子内の特定の部位で可逆的切断およびライゲーション反応を触媒するRNAモチーフである。ハンマーヘッドリボザイムには、I型、II型、およびIII型ハンマーヘッドリボザイムが含まれる。HDV、ピストル、およびハチェットリボザイムは、自己切断活性を有する。1つ以上のリボザイムを含むgNAバリアントは、gRNA参照と比較して拡張されたgNA機能を可能にし得る。例えば、自己切断リボザイムを含むgNAは、いくつかの実施形態では、転写され、ポリシストロン転写物の一部として成熟gNAに処理され得る。かかる融合は、gNAの5’または3’末端のいずれかで起こり得る。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、5’および3’末端の両方に融合を含み、これらの融合は各々独立して、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、ファージ複製ループまたはテトラループを含む。いくつかの実施形態では、gNAは、タンパク質に結合することができるヘアピンループを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、MS2、Qβ、U1ヘアピンII、Uvsx、またはPP7ヘアピンループである。リボザイムをコードする例示的な配列は、表16に記載される、配列番号598~611からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、1つ以上のRNAアプタマーを含む。本明細書で使用される場合、「RNAアプタマー」とは、高い親和性および高い特異性で標的に結合するRNA分子を指す。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、1つ以上のリボスイッチを含む。本明細書で使用される場合、「リボスイッチ」とは、小分子に結合すると状態を変化させるRNA分子を指す。いくつかの実施形態では、gNAバリアントは、1つ以上のタンパク質結合モチーフをさらに含む。本開示の参照gRNAまたはgNAバリアントにタンパク質結合モチーフを付加することにより、いくつかの実施形態では、CasX RNPが追加のタンパク質と会合することを可能にし得、例えば、それらのタンパク質の機能性をCasX RNPに付加することができる。
m.化学的に改変されたgNA
いくつかの実施形態では、本開示は、化学的に改変されたgNAに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドRNA機能性を有し、かつヌクレアーゼによる切断に対する低下した感受性を有する化学的に改変されたgNAを提供する。4つの標準的リボヌクレオチドA、C、G、およびU以外の任意のヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドを含むgNAは、化学的に改変されたgNAである。いくつかの事例では、化学的に改変されたgNAは、天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合以外の任意の骨格またはヌクレオチド間結合を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXに結合する改変されたgNAの能力を含む。ある特定の実施形態において、保持される機能性は、PCSK9標的核酸配列に結合する改変されたgNAの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、CasXタンパク質を標的とすること、または標的核酸配列に結合する予め複合体形成されたCasXタンパク質-gNAの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、CasX-gNAによって標的ポリヌクレオチドをニッキングする能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、CasX-gNAによって標的核酸配列を切断する能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本開示の実施形態のCasXタンパク質を有するCasXシステムにおけるgNAの任意の他の既知の機能である。
いくつかの実施形態では、本開示は、化学的に改変されたgNAに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ガイドRNA機能性を有し、かつヌクレアーゼによる切断に対する低下した感受性を有する化学的に改変されたgNAを提供する。4つの標準的リボヌクレオチドA、C、G、およびU以外の任意のヌクレオチド、またはデオキシヌクレオチドを含むgNAは、化学的に改変されたgNAである。いくつかの事例では、化学的に改変されたgNAは、天然ホスホジエステルヌクレオチド間結合以外の任意の骨格またはヌクレオチド間結合を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXに結合する改変されたgNAの能力を含む。ある特定の実施形態において、保持される機能性は、PCSK9標的核酸配列に結合する改変されたgNAの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、CasXタンパク質を標的とすること、または標的核酸配列に結合する予め複合体形成されたCasXタンパク質-gNAの能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、CasX-gNAによって標的ポリヌクレオチドをニッキングする能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、CasX-gNAによって標的核酸配列を切断する能力を含む。ある特定の実施形態では、保持される機能性は、本開示の実施形態のCasXタンパク質を有するCasXシステムにおけるgNAの任意の他の既知の機能である。
いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレオチド糖改変が、2′-O-C1-4アルキル、例えば、2′-O-メチル(2′-OMe)、2′-デオキシ(2′-H)、2′-O-C1-3アルキル-O-C1-3アルキル、例えば、2′-メトキシエチル(「2′-MOE」)、2′-フルオロ(「2′-F」)、2′-アミノ(「2′-NH2」)、2′-アラビノシル(「2′-アラビノ」)ヌクレオチド、2′-F-アラビノシル(「2′-F-アラビノ」)ヌクレオチド、2′-ロックド核酸(「LNA」)ヌクレオチド、2′-アンロックド核酸(「ULNA」)ヌクレオチド、L型の糖(「L-糖」)、および4′-チオリボシルヌクレオチドからなる群から選択されるgNAに組み込まれている、化学的に改変されたgNAを提供する。他の実施形態では、ガイドRNAに組み込まれるヌクレオチド間結合改変は、ホスホロチオエート「P(S)」(P(S))、ホスホノカルボキシレート(P(CH2)nCOOR)、例えば、ホスホノアセテート「PACE」(P(CH2COO-))、チオホスホノカルボキシレート((S)P(CH2)nCOOR)、例えば、チオホスホノアセテート「チオPACE」((S)P(CH2)nCOO-))、アルキルホスホネート(P(C1-3アルキル)、例えば、メチルホスホネート-P(CH3)、ボラノホスホネート(P(BH3))、およびホスホロジチオエート(P(S)2)からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、核酸塩基(「塩基」)改変が、2-チオウラシル(「2-チオU」)、2-チオシトシン(「2-チオC」)、4-チオウラシル(「4-チオU」)、6-チオグアニン(「6-チオG」)、2-アミノアデニン(「2-アミノA」)、2-アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、7-デアザグアニン、7-デアザ-8-アザグアニン、7-デアザアデニン、7-デアザ-8-アザアデニン、5-メチルシトシン(「5-メチルC」)、5-メチルウラシル(「5-メチルU」)、5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ヒドロキシメチルウラシル、5,6-デヒドロウラシル、5-プロピニルシトシン、5-プロピニルウラシル、5-エチニルシトシン、5-エチニルウラシル、5-アリルウラシル(「5-アリルU」)、5-アリルシトシン(「5-アリルC」)、5-アミノアリルウラシル(「5-アミノアリルU」)、5-アミノアリル-シトシン(「5-アミノアリルC」)、脱塩基ヌクレオチド、Z塩基、P塩基、非構造化核酸(「UNA」)、イソグアニン(「イソG」)、イソシトシン(「イソC」)、5-メチル-2-ピリミジン、x(A,G,C,T)、およびy(A,G,C,T)からなる群から選択されるgNAに組み込まれている、化学的に改変されたgNAを提供する。
他の実施形態では、本開示は、1つ以上の同位体改変が、1つ以上の15N、13C、14C、重水素、3H、32P、125I、131I原子、またはトレーサーとして使用される他の原子もしくは元素を含むヌクレオチドを含む、ヌクレオチド糖、核酸塩基、ホスホジエステル結合、および/またはヌクレオチドホスフェートに導入されている、化学的に改変されたgNAを提供する。
いくつかの実施形態では、gNAに組み込まれる「末端」改変は、PEG(ポリエチレングリコール)、炭化水素リンカー(ヘテロ原子(O、S、N)置換炭化水素スペーサー、ハロ置換炭化水素スペーサー、ケト-、カルボキシル-、アミド-、チオニル-、カルバモイル-、チオノカルバマオイル含有炭化水素スペーサーを含む)、スペルミンリンカー、例えば、6-フルオレセインーヘキシル、クエンチャー(例えば、ダブシル、BHQ)、および他の標識(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アクリジン、ストレプトアビジン、アビジン、ペプチド、および/またはタンパク質)などのリンカーに結合した蛍光色素を含む色素(例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン)からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、「末端」改変は、デオキシヌクレオチドおよび/またはリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミン、および/または他の分子を含む別の分子へのgNAのコンジュゲーション(またはライゲーション)を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、「末端」改変(上記)が、ホスホジエステル結合として組み込まれ、かつgNA内の2個のヌクレオチド間のどこにでも組み込まれ得る、例えば、2-(4-ブチルアミドフルオレセイン)プロパン-1,3-ジオールビス(ホスホジエステル)リンカーなどのリンカーを介してgNA配列の内部に位置する、化学的に改変されたgNAを提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、アミン、チオール(またはスルフヒドリル)、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボニル、チオニル、チオカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、ホスホリル、アルケン、アルキン、ハロゲン、または蛍光色素、非蛍光標識、タグ(14Cの場合、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、または15N、13C、重水素、3H、32P、125Iなどの同位体標識を含む部分)、オリゴヌクレオチド(アプタマーを含む、デオキシヌクレオチドおよび/またはリボヌクレオチドを含む)、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、およびビタミンからなる群から選択される所望の部分に後にコンジュゲートされ得る官能基末端リンカーなどの末端官能基を含む末端改変を有する化学的に改変されたgNAを提供する。コンジュゲーションは、N-ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、DCC(またはDCI)、および/またはGreg T.Hermansonによる“Bioconjugate Techniques”,Publisher Eslsevier Science,3rded.(2013)(この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている任意の他の標準的な方法によるカップリングを含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の標準的な化学を利用する。
IV.標的核酸を改変するためのタンパク質
本開示は、真核生物細胞のゲノム編集に有用なCRISPRヌクレアーゼを含む系を提供する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集システムで用いられるCRISPRヌクレアーゼは、クラス2のV型ヌクレアーゼである。クラス2のV型CRISPR-Casシステムのメンバーは差異を有するが、それらをCas9システムと区別するいくつかの共通の特徴を共有する。最初に、クラス2のV型ヌクレアーゼは、単一のRNA誘導性RuvCドメイン含有エフェクターを有するがHNHドメインを有さず、それらは、非標的化鎖で標的領域の上流であるTリッチPAM5’を認識し、標的配列の3’側にあるGリッチPAMに依存するCas9システムとは異なる。タイプVヌクレアーゼは、Cas9とは異なり、PAM配列の遠位にねじれた二本鎖切断を生成し、PAM配列に近い近位部位に平滑末端を生成する。加えて、タイプVヌクレアーゼは、シスで標的dsDNAまたはssDNA結合によって活性化されると、ssDNAをトランス分解する。いくつかの実施形態において、実施形態のV型ヌクレアーゼは、5’-TC PAMモチーフを認識し、RuvCドメインによってのみ切断されるねじれた末端を産生する。いくつかの実施形態において、V型ヌクレアーゼは、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d(CasY)、CasZ、およびCasXからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本開示は、真核生物細胞の標的核酸配列を改変するように具体的に設計される、CasXタンパク質と、1つ以上のガイド核酸(gNA)とを含むシステムを提供する。
本開示は、真核生物細胞のゲノム編集に有用なCRISPRヌクレアーゼを含む系を提供する。いくつかの実施形態において、ゲノム編集システムで用いられるCRISPRヌクレアーゼは、クラス2のV型ヌクレアーゼである。クラス2のV型CRISPR-Casシステムのメンバーは差異を有するが、それらをCas9システムと区別するいくつかの共通の特徴を共有する。最初に、クラス2のV型ヌクレアーゼは、単一のRNA誘導性RuvCドメイン含有エフェクターを有するがHNHドメインを有さず、それらは、非標的化鎖で標的領域の上流であるTリッチPAM5’を認識し、標的配列の3’側にあるGリッチPAMに依存するCas9システムとは異なる。タイプVヌクレアーゼは、Cas9とは異なり、PAM配列の遠位にねじれた二本鎖切断を生成し、PAM配列に近い近位部位に平滑末端を生成する。加えて、タイプVヌクレアーゼは、シスで標的dsDNAまたはssDNA結合によって活性化されると、ssDNAをトランス分解する。いくつかの実施形態において、実施形態のV型ヌクレアーゼは、5’-TC PAMモチーフを認識し、RuvCドメインによってのみ切断されるねじれた末端を産生する。いくつかの実施形態において、V型ヌクレアーゼは、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d(CasY)、CasZ、およびCasXからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本開示は、真核生物細胞の標的核酸配列を改変するように具体的に設計される、CasXタンパク質と、1つ以上のガイド核酸(gNA)とを含むシステムを提供する。
本明細書で使用される「CasXタンパク質」という用語は、タンパク質のファミリーを指し、すべての天然に存在するCasXタンパク質(「参照CasX」)、天然に存在するCasXタンパク質に対して少なくとも50%の同一性を共有するタンパク質、および天然に存在する参照CasXタンパク質と比較して1つ以上の改善された特性を有するCasXバリアントを包含し、以下でより完全に記載される。
CasXバリアント実施形態の例示的な改善された特性には、バリアントの改善されたフォールディング、gNAに対する改善された結合親和性、標的核酸に対する改善された結合親和性、標的DNAの編集および/または結合においてPAM配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、標的DNAの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された編集効率、改善された編集特異性、効率的に編集され得る真核生物ゲノムの増加した割合、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、DNAの非標的鎖の改善された結合、改善された標的核酸配列の切断速度、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質:gNA(RNP)複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたリボ核タンパク質(RNP)形成、切断能力のあるRNPの高い割合、改善されたタンパク質:gNA(RNP)複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、ならびに改善された融合特性が含まれるが、これらに限定されず、以下でより完全に記載される。いくつかの実施形態において、CasXバリアントとgNAバリアントとのRNPは、同等の様式でアッセイされた場合、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照CasXタンパク質と表1のgNAとのRNPと比較して、少なくとも約1.1~約100,000倍改善される改善した特性のうちの1つ以上を示す。他の事例では、CasXバリアントとgNAバリアントとのRNPの1つ以上の改善された特性は、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照CasXタンパク質と表1のgNAとのRNPと比較して、少なくとも約1.1、少なくとも約10、少なくとも約100、少なくとも約1000、少なくとも約10,000、少なくとも約100,000倍、もしくはそれ以上改善される。他の事例では、CasXバリアントとgNAバリアントとのRNPの改善された特性のうちの1つ以上は、同等の様式でアッセイされた場合、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照CasXタンパク質と表1のgNAとのRNPと比較して、約1.1~100,00倍、約1.1~10,00倍、約1.1~1,000倍、約1.1~500倍、約1.1~100倍、約1.1~50倍、約1.1~20倍、約10~100,00倍、約10~10,00倍、約10~1,000倍、約10~500倍、約10~100倍、約10~50倍、約10~20倍、約2~70倍、約2~50倍、約2~30倍、約2~20倍、約2~10倍、約5~50倍、約5~30倍、約5~10倍、約100~100,00倍、約100~10,00倍、約100~1,000倍、約100~500倍、約500~100,00倍、約500~10,00倍、約500~1,000倍、約500~750倍、約1,000~100,00倍、約10,000~100,00倍、約20~500倍、約20~250倍、約20~200倍、約20~100倍、約20~50倍、約50~10,000倍、約50~1,000倍、約50~500倍、約50~200倍、もしくは約50~100倍改善される。他の事例では、CasXバリアントとgNAバリアントとのRNPの1つ以上の改善された特性は、同等の様式でアッセイされた場合、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照CasXタンパク質と表1のgNAとのRNPと比較して、約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍、200倍、210倍、220倍、230倍、240倍、250倍、260倍、270倍、280倍、290倍、300倍、310倍、320倍、330倍、340倍、350倍、360倍、370倍、380倍、390倍、400倍、425倍、450倍、475倍、もしくは500倍改善される。特定の実施形態において、CasXバリアントとgNAバリアントとのRNPは、配列番号1~3の参照CasXタンパク質と配列番号4または配列番号5の参照gNAとのRNPと比較して、インビトロアッセイにおいて、少なくとも5倍、少なくとも10倍、もしくは少なくとも30倍増加した切断速度を示す。かかる改善の裏付けデータは、以下の実施例に提供される。
CasXバリアントという用語は、融合タンパク質であるバリアントを含み、すなわち、CasXは、異種配列に「融合」されている。これには、CasXバリアント配列と、CasXの異種タンパク質またはそのドメインへのN末端、C末端、または内部融合とを含むCasXバリアントが含まれる。
本開示のCasXタンパク質は、以下のドメイン:以下でより詳細に記載される、非標的鎖結合(NTSB)ドメイン、標的鎖負荷(TSL)ドメイン、ヘリカルIドメイン、ヘリカルIIドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)、およびRuvC DNA切断ドメイン(これらの最後のものは、触媒的に死活化したCasXバリアントにおいて改変されているか、または欠失している場合がある)のうちの少なくとも1つを含む。加えて、本開示のCasXバリアントタンパク質は、RNPとしてgNAと複合体化されるとき、参照CasXタンパク質と参照gNAとのRNPと比較して、TTC、ATC、GTC、またはCTCから選択されるPAM配列を含むPAM TCモチーフを利用して、標的DNAを効率的に編集し、かつ/またはそれに結合する増強された能力を有する。前述では、PAM配列は、同等のアッセイシステムにおける参照CasXタンパク質と参照gNAとを含むRNPの編集効率および/または結合と比較して、アッセイシステムにおいてgNAの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖の5’の少なくとも1つのヌクレオチドに位置する。一実施形態では、CasXバリアントとgNAバリアントとのRNPは、同等のアッセイシステムにおいて参照CasXタンパク質と参照gNAとを含むRNPと比較して、標的DNAにおける標的配列のより高い編集効率および/または結合を呈し、標的DNAのPAM配列はTTCである。別の実施形態では、CasXバリアントとgNAバリアントとのRNPは、同等のアッセイシステムにおいて参照CasXタンパク質と参照gNAとを含むRNPと比較して、標的DNAにおける標的配列のより高い編集効率および/または結合を呈し、標的DNAのPAM配列はATCである。別の実施形態では、CasXバリアントとgNAバリアントとのRNPは、同等のアッセイシステムにおいて参照CasXタンパク質と参照gNAとを含むRNPと比較して、標的DNAにおける標的配列のより高い編集効率および/または結合を呈し、標的DNAのPAM配列はCTCである。別の実施形態では、CasXバリアントとgNAバリアントとのRNPは、同等のアッセイシステムにおいて参照CasXタンパク質と参照gNAとを含むRNPと比較して、標的DNAにおける標的配列のより高い編集効率および/または結合を呈し、標的DNAのPAM配列はGTCである。前述の実施形態において、1つ以上のPAM配列に対する編集効率および/または結合親和性の増加は、配列番号1~3のCasXタンパク質のうちのいずれか1つと表1の配列番号4および5のgNAとのRNPのPAM配列に対する編集効率および/または結合親和性と比較して、少なくとも1.5倍以上高い。
いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、標的核酸および/または標的核酸と会合したポリペプチド(例えば、ヒストンテイルのメチル化またはアセチル化)に結合するおよび/またはそれを改変する(例えば、切断、ニッキング、メチル化、脱メチル化など)ことができる。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、触媒的に死んでいるが、標的核酸に結合する能力を保持している。例示的な触媒的に死んでいるCasXタンパク質は、CasXタンパク質のRuvCドメインの活性部位に1つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるCasXタンパク質は、配列番号1の残基672、769、および/または935に置換を含む。一実施形態では、触媒的に死んでいるCasXタンパク質は、配列番号1の参照CasXタンパク質におけるD672A、E769A、および/またはD935A置換を含む。他の実施形態では、触媒的に死んでいるCasXタンパク質は、配列番号2の参照CasXタンパク質におけるアミノ酸659、756、および/または922の置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に死んでいるCasXタンパク質は、配列番号2の参照CasXタンパク質におけるD659A、E756A、および/またはD922A置換を含む。さらなる実施形態では、触媒的に死んでいるCasXタンパク質は、CasXタンパク質のRuvCドメインの全てまたは一部の欠失を含む。同じ前述の置換が本開示のCasXバリアントに同様に導入されて、dCasXバリアントをもたらすことができることが理解されよう。一実施形態では、RuvCドメインの全てまたは一部がCasXバリアントから欠失され、dCasXバリアントをもたらす。触媒的に不活性なdCasXバリアントタンパク質は、いくつかの実施形態では、塩基編集またはエピジェネティック改変に使用することができる。DNAに対する親和性が高まるにつれて、いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なdCasXバリアントタンパク質は、触媒的に活性なCasXと比較して、それらの標的核酸をより速く見つけることができ、より長期間にわたって標的核酸に結合したままの状態を保つことができ、より安定した様式で標的核酸に結合することができるか、またはそれらの組み合わせであり、それにより、切断能力を保持するCasXバリアントと比較して、触媒的に死んでいるCasXバリアントタンパク質のそれらの機能を改善することができる。
a.非標的鎖結合ドメイン
本開示の参照CasXタンパク質は、非標的鎖結合ドメイン(NTSBD)を含む。NTSBDは、以前にいずれのCasタンパク質でも見つけられなかったドメインであり、例えば、このドメインは、Cas9、Cas12a/Cpf1、Cas13、Cas14、CASCADE、CSM、またはCSYなどのCasタンパク質に存在しない。理論または機構に拘束されることなく、CasXにおけるNTSBDは、非標的DNA鎖への結合を可能にし、非標的鎖および標的鎖の巻き戻しを援助し得る。NTSBDは、巻き戻された状態の非標的DNA鎖の巻き戻しまたは捕捉に関与していると推定される。NTSBDは、これまでに導出されたCryoEMモデル構造の非標的鎖と直接接触しており、非標準的ジンクフィンガードメインを含んでいる可能性がある。NTSBDは、巻き戻し中のDNAの安定化、ガイドRNA侵入、およびRループ形成に関与している可能性もある。いくつかの実施形態では、例示的なNTSBDは、配列番号1のアミノ酸101~191または配列番号2のアミノ酸103~192を含む。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質のNTSBDは、4本鎖ベータシートを含む。
本開示の参照CasXタンパク質は、非標的鎖結合ドメイン(NTSBD)を含む。NTSBDは、以前にいずれのCasタンパク質でも見つけられなかったドメインであり、例えば、このドメインは、Cas9、Cas12a/Cpf1、Cas13、Cas14、CASCADE、CSM、またはCSYなどのCasタンパク質に存在しない。理論または機構に拘束されることなく、CasXにおけるNTSBDは、非標的DNA鎖への結合を可能にし、非標的鎖および標的鎖の巻き戻しを援助し得る。NTSBDは、巻き戻された状態の非標的DNA鎖の巻き戻しまたは捕捉に関与していると推定される。NTSBDは、これまでに導出されたCryoEMモデル構造の非標的鎖と直接接触しており、非標準的ジンクフィンガードメインを含んでいる可能性がある。NTSBDは、巻き戻し中のDNAの安定化、ガイドRNA侵入、およびRループ形成に関与している可能性もある。いくつかの実施形態では、例示的なNTSBDは、配列番号1のアミノ酸101~191または配列番号2のアミノ酸103~192を含む。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質のNTSBDは、4本鎖ベータシートを含む。
b.標的鎖負荷ドメイン
本開示の参照CasXタンパク質は、標的鎖負荷(TSL)ドメインを含む。TSLドメインは、Cas9、CASCADE、CSM、またはCSYなどのある特定のCasタンパク質では見つけられないドメインである。理論または機構に拘束されることを望むことなく、TSLドメインが、CasXタンパク質のRuvC活性部位への標的DNA鎖の負荷の援助に関与していると考えられている。いくつかの実施形態では、TSLは、折り畳まれた状態で標的鎖を配置または捕捉する役割を果たし、これにより、標的鎖DNA骨格の切断可能なリン酸がRuvC活性部位に配置される。TSLは、TSLの大部分によって分離されているcys4(CXXC、CXXCジンクフィンガー/リボンドメイン(配列番号48)を含む。いくつかの実施形態では、例示的なTSLは、配列番号1のアミノ酸825~934または配列番号2のアミノ酸813~921を含む。
本開示の参照CasXタンパク質は、標的鎖負荷(TSL)ドメインを含む。TSLドメインは、Cas9、CASCADE、CSM、またはCSYなどのある特定のCasタンパク質では見つけられないドメインである。理論または機構に拘束されることを望むことなく、TSLドメインが、CasXタンパク質のRuvC活性部位への標的DNA鎖の負荷の援助に関与していると考えられている。いくつかの実施形態では、TSLは、折り畳まれた状態で標的鎖を配置または捕捉する役割を果たし、これにより、標的鎖DNA骨格の切断可能なリン酸がRuvC活性部位に配置される。TSLは、TSLの大部分によって分離されているcys4(CXXC、CXXCジンクフィンガー/リボンドメイン(配列番号48)を含む。いくつかの実施形態では、例示的なTSLは、配列番号1のアミノ酸825~934または配列番号2のアミノ酸813~921を含む。
c.ヘリカルIドメイン
本開示の参照CasXタンパク質は、ヘリカルIドメインを含む。CasX以外のある特定のCasタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、CasXタンパク質のヘリカルIドメインは、非CasXタンパク質と比較して、1つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、CasXタンパク質のヘリカルIドメインは、同様の名前を有し得る他のCasタンパク質のドメインと比較して、1つ以上の特有の二次構造を含む。例えば、いくつかの実施形態では、CasXタンパク質のヘリカルIドメインは、他のCRISPRタンパク質と比較して、配置、数、および長さの点で特有の構造および配列を有する1つ以上のアルファヘリックスを含む。ある特定の実施形態では、ヘリカルIドメインは、結合したDNAおよびガイドRNAのスペーサーとの相互作用に関与する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、ヘリカルIドメインがプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の結合に寄与し得ると考えられている。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルIドメインは、配列番号1のアミノ酸57~100および192~332、または配列番号2のアミノ酸59~102および193~333を含む。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質のヘリカルIドメインは、1つ以上のアルファヘリックスを含む。
本開示の参照CasXタンパク質は、ヘリカルIドメインを含む。CasX以外のある特定のCasタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、CasXタンパク質のヘリカルIドメインは、非CasXタンパク質と比較して、1つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、CasXタンパク質のヘリカルIドメインは、同様の名前を有し得る他のCasタンパク質のドメインと比較して、1つ以上の特有の二次構造を含む。例えば、いくつかの実施形態では、CasXタンパク質のヘリカルIドメインは、他のCRISPRタンパク質と比較して、配置、数、および長さの点で特有の構造および配列を有する1つ以上のアルファヘリックスを含む。ある特定の実施形態では、ヘリカルIドメインは、結合したDNAおよびガイドRNAのスペーサーとの相互作用に関与する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、ヘリカルIドメインがプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の結合に寄与し得ると考えられている。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルIドメインは、配列番号1のアミノ酸57~100および192~332、または配列番号2のアミノ酸59~102および193~333を含む。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質のヘリカルIドメインは、1つ以上のアルファヘリックスを含む。
d.ヘリカルIIドメイン
本開示の参照CasXタンパク質は、ヘリカルIIドメインを含む。CasX以外のある特定のCasタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、CasXタンパク質のヘリカルIIドメインは、同様の名前を有し得る他のCasタンパク質のドメインと比較して、1つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、ヘリカルIIドメインは、標的DNA:ガイドRNAチャネルに沿って整列する1つ以上の特有の構造的アルファヘリカル束を含む。いくつかの実施形態では、ヘリカルIIドメインを含むCasXにおいて、標的鎖およびガイドRNAは、ヘリカルII(およびいくつかの実施形態では、ヘリカルIドメイン)と相互作用して、RuvCドメインが標的DNAに接近することを可能にする。ヘリカルIIドメインは、ガイドRNA足場ステムループおよび結合したDNAへの結合に関与する。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルIIドメインは、配列番号1のアミノ酸333~509、または配列番号2のアミノ酸334~501を含む。
本開示の参照CasXタンパク質は、ヘリカルIIドメインを含む。CasX以外のある特定のCasタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、CasXタンパク質のヘリカルIIドメインは、同様の名前を有し得る他のCasタンパク質のドメインと比較して、1つ以上の特有の構造的特徴を含むか、または特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、ヘリカルIIドメインは、標的DNA:ガイドRNAチャネルに沿って整列する1つ以上の特有の構造的アルファヘリカル束を含む。いくつかの実施形態では、ヘリカルIIドメインを含むCasXにおいて、標的鎖およびガイドRNAは、ヘリカルII(およびいくつかの実施形態では、ヘリカルIドメイン)と相互作用して、RuvCドメインが標的DNAに接近することを可能にする。ヘリカルIIドメインは、ガイドRNA足場ステムループおよび結合したDNAへの結合に関与する。いくつかの実施形態では、例示的なヘリカルIIドメインは、配列番号1のアミノ酸333~509、または配列番号2のアミノ酸334~501を含む。
e.オリゴヌクレオチド結合ドメイン
本開示の参照CasXタンパク質は、オリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)を含む。CasX以外のある特定のCasタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、OBDは、1つ以上の特有の機能的特徴を含むか、またはCasXタンパク質に特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、架橋ヘリックス(BH)、ヘリカルIドメイン、ヘリカルIIドメイン、およびオリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)が一緒に、CasXタンパク質のガイドRNAへの結合に関与する。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、OBDは、ヘリカルIドメイン、もしくはヘリカルIIドメイン、またはそれらの両方と機能的に相互作用するという点でCasXタンパク質に特有であり、これらは各々、本明細書に記載のCasXタンパク質に特有であり得る。具体的には、CasXにおいて、OBDは、ガイドRNA足場のRNAトリプレックスに主に結合する。OBDは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)への結合にも関与し得る。例示的なOBDドメインは、配列番号1のアミノ酸1~56および510~660、または配列番号2のアミノ酸1~58および502~647を含む。
本開示の参照CasXタンパク質は、オリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)を含む。CasX以外のある特定のCasタンパク質は、同様の方法で命名され得るドメインを有する。しかしながら、いくつかの実施形態では、OBDは、1つ以上の特有の機能的特徴を含むか、またはCasXタンパク質に特有の配列を含むか、またはそれらの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態では、架橋ヘリックス(BH)、ヘリカルIドメイン、ヘリカルIIドメイン、およびオリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)が一緒に、CasXタンパク質のガイドRNAへの結合に関与する。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、OBDは、ヘリカルIドメイン、もしくはヘリカルIIドメイン、またはそれらの両方と機能的に相互作用するという点でCasXタンパク質に特有であり、これらは各々、本明細書に記載のCasXタンパク質に特有であり得る。具体的には、CasXにおいて、OBDは、ガイドRNA足場のRNAトリプレックスに主に結合する。OBDは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)への結合にも関与し得る。例示的なOBDドメインは、配列番号1のアミノ酸1~56および510~660、または配列番号2のアミノ酸1~58および502~647を含む。
f.RuvC DNA切断ドメイン
本開示の参照CasXタンパク質は、2つの部分的なRuvCドメイン(RuvC-IおよびRuvC-II)を含む、RuvCドメインを含む。RuvCドメインは、全ての12型CRISPRタンパク質の祖先ドメインである。RuvCドメインは、トランスポザーゼのようなTNPB(トランスポザーゼB)に由来する。他のRuvCドメインと同様に、CasX RuvCドメインは、マグネシウム(Mg)イオンの調整およびDNAの切断に関与するDED触媒三連構造を有する。いくつかの実施形態では、RuvCは、DNAの両方の鎖の切断に関与する(1つずつ切断し、最初に標的化配列中の11~14ヌクレオチド(nt)で非標的鎖を切断し、その後、標的配列の後の2~4ヌクレオチドで標的鎖を切断する可能性が高い)DEDモチーフ活性部位を有する。特にCasXにおいて、RuvCドメインは、CasX機能に重要なガイドRNA足場ステムループの結合にも関与しているという点で特有である。例示的なRuvCドメインは、配列番号1のアミノ酸661~824および935~986、または配列番号2のアミノ酸648~812および922~978を含む。
本開示の参照CasXタンパク質は、2つの部分的なRuvCドメイン(RuvC-IおよびRuvC-II)を含む、RuvCドメインを含む。RuvCドメインは、全ての12型CRISPRタンパク質の祖先ドメインである。RuvCドメインは、トランスポザーゼのようなTNPB(トランスポザーゼB)に由来する。他のRuvCドメインと同様に、CasX RuvCドメインは、マグネシウム(Mg)イオンの調整およびDNAの切断に関与するDED触媒三連構造を有する。いくつかの実施形態では、RuvCは、DNAの両方の鎖の切断に関与する(1つずつ切断し、最初に標的化配列中の11~14ヌクレオチド(nt)で非標的鎖を切断し、その後、標的配列の後の2~4ヌクレオチドで標的鎖を切断する可能性が高い)DEDモチーフ活性部位を有する。特にCasXにおいて、RuvCドメインは、CasX機能に重要なガイドRNA足場ステムループの結合にも関与しているという点で特有である。例示的なRuvCドメインは、配列番号1のアミノ酸661~824および935~986、または配列番号2のアミノ酸648~812および922~978を含む。
g.参照CasXタンパク質
本開示は、標的化二本鎖DNA(dsDNA)における特定の配列で二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する天然に存在するCasXタンパク質(本明細書では「参照CasXタンパク質」と称される)を提供する。配列特異性は、複合体形成される会合したgNAの標的化配列によって提供され、標的核酸内の標的配列にハイブリダイズする。例えば、参照CasXタンパク質は、Deltaproteobacteria種、Planctomycetes種、またはCandidatus Sungbacteria種などの天然に存在する原核生物から単離され得る。参照CasXタンパク質(本明細書では参照CasXタンパク質とも称される)は、ガイドNAと相互作用してリボ核タンパク質(RNP)を形成することができるタンパク質のCasX(Cas12eと称されることもある)ファミリーに属するV型CRISPR/Casエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質を含むRNP複合体は、gNAの標的化配列(またはスペーサー)と標的核酸内の標的配列との間の塩基対形成により標的核酸内の特定の部位を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質を含むRNPは、標的DNAを切断することができる。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質を含むRNPは、標的DNAをニッキングすることができる。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質を含むRNPは、標的DNAを編集することができ、例えば、参照CasXタンパク質がDNAを切断またはニッキングすることができる実施形態では、非相同末端結合(NHEJ)、相同性指向修復(HDR)、相同性非依存性標的化組み込み(HITI)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、一本鎖アニーリング(SSA)、または塩基除去修復(BER)が続く。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質を含むRNPは、上でより完全に記載されるように、触媒的に死んでいる(触媒的に不活性であるか、または実質的にいずれの切断活性も有しない)CasXタンパク質(dCasX)であるが、標的DNAに結合する能力を保持する。
本開示は、標的化二本鎖DNA(dsDNA)における特定の配列で二本鎖切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する天然に存在するCasXタンパク質(本明細書では「参照CasXタンパク質」と称される)を提供する。配列特異性は、複合体形成される会合したgNAの標的化配列によって提供され、標的核酸内の標的配列にハイブリダイズする。例えば、参照CasXタンパク質は、Deltaproteobacteria種、Planctomycetes種、またはCandidatus Sungbacteria種などの天然に存在する原核生物から単離され得る。参照CasXタンパク質(本明細書では参照CasXタンパク質とも称される)は、ガイドNAと相互作用してリボ核タンパク質(RNP)を形成することができるタンパク質のCasX(Cas12eと称されることもある)ファミリーに属するV型CRISPR/Casエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質を含むRNP複合体は、gNAの標的化配列(またはスペーサー)と標的核酸内の標的配列との間の塩基対形成により標的核酸内の特定の部位を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質を含むRNPは、標的DNAを切断することができる。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質を含むRNPは、標的DNAをニッキングすることができる。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質を含むRNPは、標的DNAを編集することができ、例えば、参照CasXタンパク質がDNAを切断またはニッキングすることができる実施形態では、非相同末端結合(NHEJ)、相同性指向修復(HDR)、相同性非依存性標的化組み込み(HITI)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、一本鎖アニーリング(SSA)、または塩基除去修復(BER)が続く。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質を含むRNPは、上でより完全に記載されるように、触媒的に死んでいる(触媒的に不活性であるか、または実質的にいずれの切断活性も有しない)CasXタンパク質(dCasX)であるが、標的DNAに結合する能力を保持する。
いくつかの事例において、タイプV参照CasXタンパク質は、Deltaproteobacteriaから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、以下の配列と少なくとも50%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一、または100%同一の配列を含む:
いくつかの事例において、V型参照CasXタンパク質は、Planctomycetesから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、以下の配列と少なくとも50%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一、または100%同一の配列を含む:
いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号2の配列、またはそれと少なくとも60%の類似性を含む。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号2の配列、またはそれと少なくとも80%の類似性を含む。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号2の配列、またはそれと少なくとも90%の類似性を含む。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号2の配列、またはそれと少なくとも95%の類似性を含む。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号2の配列からなる。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号2の配列と比較して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、または少なくとも50個の変異を有する配列を含むか、またはそれらからなる。これらの変異は、挿入、欠失、アミノ酸置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの事例では、タイプV参照CasXタンパク質は、Candidatus Sungbacteriaから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、以下の配列と少なくとも50%同一、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一、または100%同一の配列を含む:
いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号3の配列、またはそれと少なくとも60%の類似性を含む。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号3の配列、またはそれと少なくとも80%の類似性を含む。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号3の配列、またはそれと少なくとも90%の類似性を含む。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号3の配列、またはそれと少なくとも95%の類似性を含む。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号3の配列からなる。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、配列番号3の配列と比較して少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、または少なくとも50個の変異を有する配列を含むか、またはそれらからなる。これらの変異は、挿入、欠失、アミノ酸置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
h.CasXバリアントタンパク質
本開示は、参照CasXタンパク質のバリアント(本明細書では互換的に「CasXバリアント」または「CasXバリアントタンパク質」と称される)を提供し、CasXバリアントは、配列番号1~3の配列を含む参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも1つのドメインに少なくとも1つの配列改変を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、参照CasXタンパク質と比較して少なくとも1つの改善された特性を呈する。本明細書に記載の参照CasXタンパク質と比較してCasXバリアントタンパク質の1つ以上の機能または特性を改善する全てのバリアントが、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態では、改変は、参照CasXの1つ以上のアミノ酸の変異である。他の実施形態では、改変は、異なるCasX由来の1つ以上のドメインでの参照CasXの1つ以上のドメインの置換である。いくつかの実施形態では、挿入は、異なるCasXタンパク質由来のドメインの一部または全ての挿入を含む。変異は、参照CasXタンパク質のいずれか1つ以上のドメインで起こり得、例えば、1つ以上のドメインの一部もしくは全ての欠失、または参照CasXタンパク質の任意のドメインにおける1つ以上のアミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入を含み得る。CasXタンパク質のドメインには、非標的鎖結合(NTSB)ドメイン、標的鎖負荷(TSL)ドメイン、ヘリカルIドメイン、ヘリカルIIドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)、およびRuvC DNA切断ドメインが含まれる。CasXタンパク質の改善された特性をもたらす参照CasXタンパク質のアミノ酸配列のいずれかの変化も、本開示のCasXバリアントタンパク質とみなされる。例えば、CasXバリアントは、参照CasXタンパク質配列と比較して、1つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、もしくはスワップされたドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の特性において、本開示のCasXバリアントタンパク質は、それらがTTC、ATC、GTC、またはCTCから選択される多様性のより高いPAM配列に対して結合親和性を有し、CasXバリアントが参照CasXタンパク質と比較して標的核酸の有意に大きい部分を編集することができるという、参照CasXタンパク質を超える利点を有する。
本開示は、参照CasXタンパク質のバリアント(本明細書では互換的に「CasXバリアント」または「CasXバリアントタンパク質」と称される)を提供し、CasXバリアントは、配列番号1~3の配列を含む参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも1つのドメインに少なくとも1つの配列改変を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、参照CasXタンパク質と比較して少なくとも1つの改善された特性を呈する。本明細書に記載の参照CasXタンパク質と比較してCasXバリアントタンパク質の1つ以上の機能または特性を改善する全てのバリアントが、本開示の範囲内であると想定される。いくつかの実施形態では、改変は、参照CasXの1つ以上のアミノ酸の変異である。他の実施形態では、改変は、異なるCasX由来の1つ以上のドメインでの参照CasXの1つ以上のドメインの置換である。いくつかの実施形態では、挿入は、異なるCasXタンパク質由来のドメインの一部または全ての挿入を含む。変異は、参照CasXタンパク質のいずれか1つ以上のドメインで起こり得、例えば、1つ以上のドメインの一部もしくは全ての欠失、または参照CasXタンパク質の任意のドメインにおける1つ以上のアミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入を含み得る。CasXタンパク質のドメインには、非標的鎖結合(NTSB)ドメイン、標的鎖負荷(TSL)ドメイン、ヘリカルIドメイン、ヘリカルIIドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)、およびRuvC DNA切断ドメインが含まれる。CasXタンパク質の改善された特性をもたらす参照CasXタンパク質のアミノ酸配列のいずれかの変化も、本開示のCasXバリアントタンパク質とみなされる。例えば、CasXバリアントは、参照CasXタンパク質配列と比較して、1つ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失、もしくはスワップされたドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。特定の特性において、本開示のCasXバリアントタンパク質は、それらがTTC、ATC、GTC、またはCTCから選択される多様性のより高いPAM配列に対して結合親和性を有し、CasXバリアントが参照CasXタンパク質と比較して標的核酸の有意に大きい部分を編集することができるという、参照CasXタンパク質を超える利点を有する。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号1~3の配列を含む参照CasXタンパク質の2つのドメインのうちの少なくとも各々に少なくとも1つの改変を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質の少なくとも2つのドメイン、少なくとも3つのドメイン、少なくとも4つのドメイン、または少なくとも5つのドメインに少なくとも1つの改変を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質の少なくとも1つのドメインに2つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質の少なくとも1つのドメインに少なくとも2つの改変、参照CasXタンパク質の少なくとも1つのドメインに少なくとも3つの改変、または参照CasXタンパク質の少なくとも1つのドメインに少なくとも4つの改変を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、参照CasXタンパク質と比較して2つ以上の改変を含み、各改変は、NTSBD、TSLD、ヘリカルIドメイン、ヘリカルIIドメイン、OBD、およびRuvC DNA切断ドメインからなる群から独立して選択されるドメインに作製される。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質の少なくとも1つの改変は、配列番号1~3の配列の参照CasXタンパク質の1つのドメインの少なくとも一部分の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、NTSBD、TSLD、ヘリカルIドメイン、ヘリカルIIドメイン、OBD、またはRuvC DNA切断ドメインにある。
本開示のCasXバリアントタンパク質を生成するための好適な変異誘発法には、例えば、ディープミューテーショナルエボルーション(DME)、ディープミューテーショナルスキャニング(DMS)、エラープローンPCR、カセット変異誘発、ランダム変異誘発、スタガードエクステンションPCR、遺伝子シャフリング、またはドメインスワッピングが含まれ得る。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、例えば、参照CasXにおいて1つ以上の所望の変異を選択することによって設計される。ある特定の実施形態では、参照CasXタンパク質の活性は、1つ以上のCasXバリアントの活性が比較されるベンチマークとして使用され、それにより、CasXバリアントの機能の改善を測定する。CasXバリアントの例示的な改善には、以下により完全に記載される、バリアントの改善されたフォールディング、gNAに対する改善された結合親和性、標的DNAに対する改善された結合親和性、1つ以上のPAM配列に対する改変された結合親和性、標的DNAの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、DNAの非標的鎖の改善された結合、改善された標的核酸配列の切断速度、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質:gNA複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたタンパク質:gNA複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、ならびに改善された融合特性が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のCasXバリアントのいくつかの実施形態では、少なくとも1つの改変は、(a)配列番号1、配列番号2、もしくは配列番号3の参照CasXと比較したCasXバリアントにおける1~100個の連続もしくは非連続アミノ酸の置換、(b)参照CasXと比較したCasXバリアントにおける1~100個の連続もしくは非連続アミノ酸の欠失、(c)参照CasXと比較したCasXにおける1~100個の連続もしくは非連続アミノ酸の挿入、または(d)(a)~(c)の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの改変は、(a)配列番号1、配列番号2、もしくは配列番号3の参照CasXと比較したCasXバリアントにおける5~10個の連続もしくは非連続アミノ酸の置換、(b)参照CasXと比較したCasXバリアントにおける1~5個の連続もしくは非連続アミノ酸の欠失、(c)参照CasXと比較したCasXにおける1~5個の連続もしくは非連続アミノ酸の挿入、または(d)(a)~(c)の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の配列と比較して、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、または少なくとも50個の変異を有する配列を含むか、またはそれらからなる。これらの変異は、挿入、欠失、アミノ酸置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質の少なくとも1つのドメインに少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約1~4個のアミノ酸置換、1~10個のアミノ酸置換、1~20個のアミノ酸置換、1~30個のアミノ酸置換、1~40個のアミノ酸置換、1~50個のアミノ酸置換、1~60個のアミノ酸置換、1~70個のアミノ酸置換、1~80個のアミノ酸置換、1~90個のアミノ酸置換、1~100個のアミノ酸置換、2~10個のアミノ酸置換、2~20個のアミノ酸置換、2~30個のアミノ酸置換、3~10個のアミノ酸置換、3~20個のアミノ酸置換、3~30個のアミノ酸置換、4~10個のアミノ酸置換、4~20個のアミノ酸置換、3~300個のアミノ酸置換、5~10個のアミノ酸置換、5~20個のアミノ酸置換、5~30個のアミノ酸置換、10~50個のアミノ酸置換、または20~50個のアミノ酸置換を含み、連続的もしくは非連続的か、または異なるドメインにあることができる。本明細書で使用される場合、「連続アミノ酸」とは、ポリペプチドの一次配列において隣接しているアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して少なくとも約100個以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、保存的置換である。他の実施形態では、置換は非保存的であり、例えば、極性アミノ酸が非極性アミノ酸に置換されるか、またはその逆も同様である。
本明細書に記載の置換において、任意のアミノ酸が他の任意のアミノ酸に置換され得る。置換は、保存的置換であり得る(例えば、塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸に置換される)。置換は、非保存的置換であり得る(例えば、塩基性アミノ酸が酸性アミノ酸に置換されるか、またはその逆も同様である)。例えば、参照CasXタンパク質のプロリンは、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのうちのいずれかに置換されて、本開示のCasXバリアントタンパク質を生成することができる。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して少なくとも1個のアミノ酸欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して、1~4個のアミノ酸、1~10個のアミノ酸、1~20個のアミノ酸、1~30個のアミノ酸、1~40個のアミノ酸、1~50個のアミノ酸、1~60個のアミノ酸、1~70個のアミノ酸、1~80個のアミノ酸、1~90個のアミノ酸、1~100個のアミノ酸、2~10個のアミノ酸、2~20個のアミノ酸、2~30個のアミノ酸、3~10個のアミノ酸、3~20個のアミノ酸、3~30個のアミノ酸、4~10個のアミノ酸、4~20個のアミノ酸、3~300個のアミノ酸、5~10個のアミノ酸、5~20個のアミノ酸、5~30個のアミノ酸、10~50個のアミノ酸、または20~50個のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、参照CasXタンパク質と比較して少なくとも約100個の連続アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、または100個の連続アミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の連続アミノ酸の欠失を含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して2個以上の欠失を含み、これらの2個以上の欠失は連続アミノ酸ではない。例えば、第1の欠失は、参照CasXタンパク質の第1のドメインにあり得、第2の欠失は、参照CasXタンパク質の第2のドメインにあり得る。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の非連続欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して少なくとも20個の非連続欠失を含む。各非連続欠失は、本明細書に記載の任意の長さのアミノ酸、例えば、1~4個のアミノ酸、1~10個のアミノ酸などであり得る。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の配列に対して少なくとも1個のアミノ酸挿入を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して、1個のアミノ酸の挿入、2~3個の連続アミノ酸、2~4個の連続アミノ酸、2~5個の連続アミノ酸、2~6個の連続アミノ酸、2~7個の連続アミノ酸、2~8個の連続アミノ酸、2~9個の連続アミノ酸、2~10個の連続アミノ酸、2~20個の連続アミノ酸、2~30個の連続アミノ酸、2~40個の連続アミノ酸、2~50個の連続アミノ酸、2~60個の連続アミノ酸、2~70個の連続アミノ酸、2~80個の連続アミノ酸、2~90個の連続アミノ酸、2~100個の連続アミノ酸、3~10個の連続アミノ酸、3~20個の連続アミノ酸、3~30個の連続アミノ酸、4~10個の連続アミノ酸、4~20個の連続アミノ酸、3~300個の連続アミノ酸、5~10個の連続アミノ酸、5~20個の連続アミノ酸、5~30個の連続アミノ酸、10~50個の連続アミノ酸、または20~50個の連続アミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の連続アミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、少なくとも約100個の連続アミノ酸の挿入を含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して2個以上の挿入を含み、これらの2個以上の挿入は配列の連続アミノ酸ではない。例えば、第1の挿入は、参照CasXタンパク質の第1のドメインにあり得、第2の挿入は、参照CasXタンパク質の第2のドメインにあり得る。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の非連続挿入を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して少なくとも10~約20個以上の非連続挿入を含む。各非連続挿入は、本明細書に記載の任意の長さのアミノ酸、例えば、1~4個のアミノ酸、1~10個のアミノ酸などであり得る。
任意のアミノ酸、またはアミノ酸の任意の組み合わせが、本明細書に記載の挿入に挿入され得る。例えば、プロリン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンもしくはバリン、またはそれらの任意の組み合わせが、本開示の参照CasXタンパク質に挿入されて、CasXバリアントタンパク質を生成することができる。
本明細書に記載の置換、挿入、および欠失の実施形態の任意の順列が組み合わせられて、本開示のCasXバリアントタンパク質を生成することができる。例えば、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質配列と比較した少なくとも1つの置換および少なくとも1つの欠失、参照CasXタンパク質配列と比較した少なくとも1つの置換および少なくとも1つの挿入、参照CasXタンパク質配列と比較した少なくとも1つの挿入および少なくとも1つの欠失、または参照CasXタンパク質と比較した少なくとも1つの置換、1つの挿入、および1つの欠失を含み得る。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号1、配列番号2、または配列番号3のうちの1つと少なくとも約60%の配列類似性、少なくとも70%の類似性、少なくとも80%の類似性、少なくとも85%の類似性、少なくとも86%の類似性、少なくとも87%の類似性、少なくとも88%の類似性、少なくとも89%の類似性、少なくとも90%の類似性、少なくとも91%の類似性、少なくとも92%の類似性、少なくとも93%の類似性、少なくとも94%の類似性、少なくとも95%の類似性、少なくとも96%の類似性、少なくとも97%の類似性、少なくとも98%の類似性、少なくとも99%の類似性、少なくとも99.5%の類似性、少なくとも99.6%の類似性、少なくとも99.7%の類似性、少なくとも99.8%の類似性、または少なくとも99.9%の類似性を有する。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2またはその一部と少なくとも約60%の配列類似性を有する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のY789Tの置換、配列番号2のP793の欠失、配列番号2のY789Dの置換、配列番号2のT72Sの置換、配列番号2のI546Vの置換、配列番号2のE552Aの置換、配列番号2のA636Dの置換、配列番号2のF536Sの置換、配列番号2のA708Kの置換、配列番号2のY797Lの置換、配列番号2のL792Gの置換、配列番号2のA739Vの置換、配列番号2のG791Mの置換、配列番号2の661位でのAの挿入、配列番号2のA788Wの置換、配列番号2のK390Rの置換、配列番号2のA751Sの置換、配列番号2のE385Aの置換、配列番号2の696位でのPの挿入、配列番号2の773位でのMの挿入、配列番号2のG695Hの置換、配列番号2の793位でのASの挿入、配列番号2の795位でのASの挿入、配列番号2のC477Rの置換、配列番号2のC477Kの置換、配列番号2のC479Aの置換、配列番号2のC479Lの置換、配列番号2のI55Fの置換、配列番号2のK210Rの置換、配列番号2のC233Sの置換、配列番号2のD231Nの置換、配列番号2のQ338Eの置換、配列番号2のQ338Rの置換、配列番号2のL379Rの置換、配列番号2のK390Rの置換、配列番号2のL481Qの置換、配列番号2のF495Sの置換、配列番号2のD600Nの置換、配列番号2のT886Kの置換、配列番号2のA739Vの置換、配列番号2のK460Nの置換、配列番号2のI199Fの置換、配列番号2のG492Pの置換、配列番号2のT153Iの置換、配列番号2のR591Iの置換、配列番号2の795位でのASの挿入、配列番号2の796位でのASの挿入、配列番号2の889位でのLの挿入、配列番号2のE121Dの置換、配列番号2のS270Wの置換、配列番号2のE712Qの置換、配列番号2のK942Qの置換、配列番号2のE552Kの置換、配列番号2のK25Qの置換、配列番号2のN47Dの置換、配列番号2の696位でのTの挿入、配列番号2のL685Iの置換、配列番号2のN880Dの置換、配列番号2のQ102Rの置換、配列番号2のM734Kの置換、配列番号2のA724Sの置換、配列番号2のT704Kの置換、配列番号2のP224Kの置換、配列番号2のK25Rの置換、配列番号2のM29Eの置換、配列番号2のH152Dの置換、配列番号2のS219Rの置換、配列番号2のE475Kの置換、配列番号2のG226Rの置換、配列番号2のA377Kの置換、配列番号2のE480Kの置換、配列番号2のK416Eの置換、配列番号2のH164Rの置換、配列番号2のK767Rの置換、配列番号2のI7Fの置換、配列番号2のM29Rの置換、配列番号2のH435Rの置換、配列番号2のE385Qの置換、配列番号2のE385Kの置換、配列番号2のI279Fの置換、配列番号2のD489Sの置換、配列番号2のD732Nの置換、配列番号2のA739Tの置換、配列番号2のW885Rの置換、配列番号2のE53Kの置換、配列番号2のA238Tの置換、配列番号2のP283Qの置換、配列番号2のE292Kの置換、配列番号2のQ628Eの置換、配列番号2のR388Qの置換、配列番号2のG791Mの置換、配列番号2のL792Kの置換、配列番号2のL792Eの置換、配列番号2のM779Nの置換、配列番号2のG27Dの置換、配列番号2のK955Rの置換、配列番号2のS867Rの置換、配列番号2のR693Iの置換、配列番号2のF189Yの置換、配列番号2のV635Mの置換、配列番号2のF399Lの置換、配列番号2のE498Kの置換、配列番号2のE386Rの置換、配列番号2のV254Gの置換、配列番号2のP793Sの置換、配列番号2のK188Eの置換、配列番号2のQT945KIの置換、配列番号2のT620Pの置換、配列番号2のT946Pの置換、配列番号2のTT949PPの置換、配列番号2のN952Tの置換、配列番号2のK682Eの置換、配列番号2のK975Rの置換、配列番号2のL212Pの置換、配列番号2のE292Rの置換、配列番号2のI303Kの置換、配列番号2のC349Eの置換、配列番号2のE385Pの置換、配列番号2のE386Nの置換、配列番号2のD387Kの置換、配列番号2のL404Kの置換、配列番号2のE466Hの置換、配列番号2のC477Qの置換、配列番号2のC477Hの置換、配列番号2のC479Aの置換、配列番号2のD659Hの置換、配列番号2のT806Vの置換、配列番号2のK808Sの置換、配列番号2の797位でのASの挿入、配列番号2のV959Mの置換、配列番号2のK975Qの置換、配列番号2のW974Gの置換、配列番号2のA708Qの置換、配列番号2のV711Kの置換、配列番号2のD733Tの置換、配列番号2のL742Wの置換、配列番号2のV747Kの置換、配列番号2のF755Mの置換、配列番号2のM771Aの置換、配列番号2のM771Qの置換、配列番号2のW782Qの置換、配列番号2のG791Fの置換、配列番号2のL792Dの置換、配列番号2のL792Kの置換、配列番号2のP793Qの置換、配列番号2のP793Gの置換、配列番号2のQ804Aの置換、配列番号2のY966Nの置換、配列番号2のY723Nの置換、配列番号2のY857Rの置換、配列番号2のS890Rの置換、配列番号2のS932Mの置換、配列番号2のL897Mの置換、配列番号2のR624Gの置換、配列番号2のS603Gの置換、配列番号2のN737Sの置換、配列番号2のL307Kの置換、配列番号2のI658Vの置換、配列番号2の688位でのPTの挿入、配列番号2の794位でのSAの挿入、配列番号2のS877Rの置換、配列番号2のN580Tの置換、配列番号2のV335Gの置換、配列番号2のT620Sの置換、配列番号2のW345Gの置換、配列番号2のT280Sの置換、配列番号2のL406Pの置換、配列番号2のA612Dの置換、配列番号2のA751Sの置換、配列番号2のE386Rの置換、配列番号2のV351Mの置換、配列番号2のK210Nの置換、配列番号2のD40Aの置換、配列番号2のE773Gの置換、配列番号2のH207Lの置換、配列番号2のT62Aの置換、配列番号2のT287Pの置換、配列番号2のT832Aの置換、配列番号2のA893Sの置換、配列番号2の14位でのVの挿入、配列番号2の13位でのAGの挿入、配列番号2のR11Vの置換、配列番号2のR12Nの置換、配列番号2のR13Hの置換、配列番号2の13位でのYの挿入、配列番号2のR12Lの置換、配列番号2の13位でのQの挿入、配列番号2のV15Sの置換、配列番号2の17位でのDの挿入、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質アミノ酸配列に対して少なくとも2つのアミノ酸変化を含む。少なくとも2つのアミノ酸変化は、参照CasXタンパク質アミノ酸配列の置換、挿入、もしくは欠失、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、参照CasXバリアントタンパク質の配列に対する少なくとも2つのアミノ酸の変化は、配列番号2のY789Tの置換、配列番号2のP793の欠失、配列番号2のY789Dの置換、配列番号2のT72Sの置換、配列番号2のI546Vの置換、配列番号2のE552Aの置換、配列番号2のA636Dの置換、配列番号2のF536Sの置換、配列番号2のA708Kの置換、配列番号2のY797Lの置換、L792G配列番号2の置換、配列番号2のA739Vの置換、配列番号2のG791Mの置換、配列番号2の661位でのAの挿入、配列番号2のA788Wの置換、配列番号2のK390Rの置換、配列番号2のA751Sの置換、配列番号2のE385Aの置換、配列番号2の696位でのPの挿入、配列番号2の773位でのMの挿入、配列番号2のG695Hの置換、配列番号2の793位でのASの挿入、配列番号2の795位でのASの挿入、配列番号2のC477Rの置換、配列番号2のC477Kの置換、配列番号2のC479Aの置換、配列番号2のC479Lの置換、配列番号2のI55Fの置換、配列番号2のK210Rの置換、配列番号2のC233Sの置換、配列番号2のD231Nの置換、配列番号2のQ338Eの置換、配列番号2のQ338Rの置換、配列番号2のL379Rの置換、配列番号2のK390Rの置換、配列番号2のL481Qの置換、配列番号2のF495Sの置換、配列番号2のD600Nの置換、配列番号2のT886Kの置換、配列番号2のA739Vの置換、配列番号2のK460Nの置換、配列番号2のI199Fの置換、配列番号のG492Pの置換、配列番号2のT153Iの置換、配列番号2のR591Iの置換、配列番号2の795位でのASの挿入、配列番号2の796位でのASの挿入、配列番号2の889位でのLの挿入、配列番号2のE121Dの置換、配列番号2のS270Wの置換、配列番号2のE712Qの置換、配列番号2のK942Qの置換、配列番号2のE552Kの置換、配列番号2のK25Qの置換、配列番号2のN47Dの置換、配列番号2の696位でのTの挿入、配列番号2のL685Iの置換、配列番号2のN880Dの置換、配列番号2のQ102Rの置換、配列番号2のM734Kの置換、配列番号2のA724Sの置換、配列番号2のT704Kの置換、配列番号2のP224Kの置換、配列番号2のK25Rの置換、配列番号2のM29Eの置換、配列番号2のH152Dの置換、配列番号2のS219Rの置換、配列番号2のE475Kの置換、配列番号2のG226Rの置換、配列番号2のA377Kの置換、配列番号2のE480Kの置換、配列番号2のK416Eの置換、配列番号2のH164Rの置換、配列番号2のK767Rの置換、配列番号2のI7Fの置換、配列番号2のM29Rの置換、配列番号2のH435Rの置換、配列番号2のE385Qの置換、配列番号2のE385Kの置換、配列番号2のI279Fの置換、配列番号2のD489Sの置換、配列番号2のD732Nの置換、配列番号2のA739Tの置換、配列番号2のW885Rの置換、配列番号2のE53Kの置換、配列番号2のA238Tの置換、配列番号2のP283Qの置換、配列番号2のE292Kの置換、配列番号2のQ628Eの置換、配列番号2のR388Qの置換、配列番号2のG791Mの置換、配列番号2のL792Kの置換、配列番号2のL792Eの置換、配列番号2のM779Nの置換、配列番号2のG27Dの置換、配列番号2のK955Rの置換、配列番号2のS867Rの置換、配列番号2のR693Iの置換、配列番号2のF189Yの置換、配列番号2のV635Mの置換、配列番号2のF399Lの置換、配列番号2のE498Kの置換、配列番号2のE386Rの置換、配列番号2のV254Gの置換、配列番号2のP793Sの置換、配列番号2のK188Eの置換、配列番号2のQT945KIの置換、配列番号2のT620Pの置換、配列番号2のT946Pの置換、配列番号2のTT949PPの置換、配列番号2のN952Tの置換、配列番号2のK682Eの置換、配列番号2のK975Rの置換、配列番号2のL212Pの置換、配列番号2のE292Rの置換、配列番号2のI303Kの置換、配列番号2のC349Eの置換、配列番号2のE385Pの置換、配列番号2のE386Nの置換、配列番号2のD387Kの置換、配列番号2のL404Kの置換、配列番号2のE466Hの置換、配列番号2のC477Qの置換、配列番号2のC477Hの置換、配列番号2のC479Aの置換、配列番号2のD659Hの置換、配列番号2のT806Vの置換、配列番号2のK808Sの置換、配列番号2の797位でのASの挿入、配列番号2のV959Mの置換、配列番号2のK975Qの置換、配列番号2のW974Gの置換、配列番号2のA708Qの置換、配列番号2のV711Kの置換、配列番号2のD733Tの置換、配列番号2のL742Wの置換、配列番号2のV747Kの置換、配列番号2のF755Mの置換、配列番号2のM771Aの置換、配列番号2のM771Qの置換、配列番号2のW782Qの置換、配列番号2のG791Fの置換、配列番号2のL792Dの置換、配列番号2のL792Kの置換、配列番号2のP793Qの置換、配列番号2のP793Gの置換、配列番号2のQ804Aの置換、配列番号2のY966Nの置換、配列番号2のY723Nの置換、配列番号2のY857Rの置換、配列番号2のS890Rの置換、配列番号2のS932Mの置換、配列番号2のL897Mの置換、配列番号2のR624Gの置換、配列番号2のS603Gの置換、配列番号2のN737Sの置換、配列番号2のL307Kの置換、配列番号2のI658Vの置換、配列番号2の688位でのPTの挿入、配列番号2の794位でのSAの挿入、配列番号2のS877Rの置換、配列番号2のN580Tの置換、配列番号2のV335Gの置換、配列番号2のT620Sの置換、配列番号2のW345Gの置換、配列番号2のT280Sの置換、配列番号2のL406Pの置換、配列番号2のA612Dの置換、配列番号2のA751Sの置換、配列番号2のE386Rの置換、配列番号2のV351Mの置換、配列番号2のK210Nの置換、配列番号2のD40Aの置換、配列番号2のE773Gの置換、配列番号2のH207Lの置換、T62A配列番号2の置換、配列番号2のT287Pの置換、配列番号2のT832Aの置換、配列番号2のA893Sの置換、配列番号2の14位でのVの挿入、配列番号2の13位でのAGの挿入、配列番号2のR11Vの置換、配列番号2のR12Nの置換、配列番号2のR13Hの置換、配列番号2の13位でのYの挿入、配列番号2のR12Lの置換、配列番号2の13位でのQの挿入、配列番号2のV15Sの置換、および配列番号2の17位でのDの挿入からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質に対する少なくとも2つのアミノ酸の変化は、表3の配列に開示されたアミノ酸の変化から選択される。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質アミノ酸配列の2つ以上の置換、挿入、および/または欠失を含む。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質は、配列番号2を含むか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のS794Rの置換およびY797Lの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のK416Eの置換およびA708Kの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のA708Kの置換およびP793の欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のP793の欠失およびP793ASの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のQ367Kの置換およびI425Sの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のA708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA793Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のQ338Rの置換およびA339Eの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のQ338Rの置換およびA339Kの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のS507Gの置換およびG508Rの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、および793位でのPの欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のC477Kの置換、A708Kの置換、および793位でのPの欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、および793位でのPの欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のC477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびM779Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびM771Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、708Kの置換、793位でのPの欠失、およびD489Sの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Tの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびD732Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびG791Mの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、708Kの置換、793位でのPの欠失、およびY797Lの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびM779Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびM771Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびD489Sの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Tの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびD732Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびG791Mの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびY797Lの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびT620Pの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のA708Kの置換、793位でのPの欠失、およびE386Sの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のE386Rの置換、F399Lの置換、および793位でのPの欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のR581IおよびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、この段落の前述の実施形態の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質アミノ酸配列の2つ以上の置換、挿入、および/または欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のA708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、および793位でのPの欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のC477Kの置換、A708Kの置換、および793位でのPの欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、および793位でのPの欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のC477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739の置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびT620Pの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のM771Aの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびD732Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のW782Qの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のM771Qの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のR458Iの置換およびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびM771Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Tの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびD489Sの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびD732Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、この段落の前述の実施形態の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のV711Kの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびY797Lの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、および793位でのPの欠失を含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびM771Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のA708Kの置換、793位でのPの置換、およびE386Sの置換を含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477Kの置換、A708Kの置換、および793位でのPの欠失を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL792Dの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のG791Fの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のA708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびA739Vの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のC477Kの置換、A708Kの置換、および793位でのPの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL249Iの置換およびM771Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のV747Kの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号2のL379Rの置換、C477の置換、A708Kの置換、793位でのPの欠失、およびM779Nの置換を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、F755Mの置換を含む。
一部の実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、400~2000個のアミノ酸、500~1500個のアミノ酸、700~1200個のアミノ酸、800~1100個のアミノ酸、または900~1000個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、gNA:標的DNA複合体形成が起こるチャネルを形成する非隣接残基の領域を含む1つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、gNAに結合する界面を形成する非隣接残基の領域を含む1つ以上の改変を含む。例えば、参照CasXタンパク質のいくつかの実施形態では、ヘリカルI、ヘリカルII、およびOBDドメインはすべて、gNA:標的DNA複合体と接触するか、またはそれに近接しており、これらのドメインのうちのいずれか内の非隣接残基に対する1つ以上の改変は、CasXバリアントタンパク質の機能を改善することができる。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、非標的鎖DNAに結合するチャネルを形成する非隣接残基の領域を含む1つ以上の改変を含む。例えば、CasXバリアントタンパク質は、NTSBDの非隣接残基に対して1つ以上の改変を含むことができる。いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、PAMに結合する界面を形成する非隣接残基の領域を含む1つ以上の改変を含む。例えば、CasXバリアントタンパク質は、ヘリカルIドメインまたはOBDの非隣接残基に対して1つ以上の改変を含むことができる。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、非隣接表面露出残基の領域を含む1つ以上の改変を含む。本明細書で使用される場合、「表面露出残基」とは、CasXタンパク質の表面上のアミノ酸、またはアミノ酸の少なくとも一部分、例えば、骨格もしくは側鎖の一部がタンパク質の表面上にあるアミノ酸を指す。水性細胞内環境に曝露されているCasXなどの細胞タンパク質の表面露出残基は、正に荷電した親水性アミノ酸、例えば、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびスレオニンからしばしば選択される。したがって、例えば、本明細書に提供されるバリアントのいくつかの実施形態では、表面露出残基の領域は、参照CasXタンパク質と比較して1つ以上の挿入、欠失、または置換を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の正に荷電した残基は、1つ以上の他の正に荷電した残基、もしくは負に荷電した残基、もしくは非荷電残基、またはそれらの任意の組み合わせに置換される。いくつかの実施形態では、置換のための1つ以上のアミノ酸残基は、近くの結合した核酸であり、例えば、標的DNAと接触するRuvCドメインもしくはヘリカルIドメイン内の残基、またはgRNAに結合するOBDもしくはヘリカルIIドメイン内の残基は、1つ以上の正に荷電したアミノ酸または極性アミノ酸に置換され得る。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質のドメインに疎水性パッキングによりコアを形成する非隣接残基の領域を含む1つ以上の改変を含む。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、疎水性パッキングによりコアを形成する領域は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびシステインなどの疎水性アミノ酸が豊富である。例えば、いくつかの参照CasXタンパク質では、RuvCドメインは、活性部位に隣接する疎水性ポケットを含む。いくつかの実施形態では、その領域の2~15個の残基は、荷電、極性、または塩基スタッキングである。荷電アミノ酸(互換的に、本明細書では残基と称される)には、例えば、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が含まれ得、これらのアミノ酸の側鎖が塩橋を形成し得るが、ただし、架橋パートナーも存在することを条件とする。極性アミノ酸には、例えば、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、およびシステインが含まれ得る。極性アミノ酸は、いくつかの実施形態では、それらの側鎖の同一性に応じて、プロトン供与体または受容体として水素結合を形成することができる。本明細書で使用される場合、「塩基スタッキング」は、アミノ酸残基(トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはヒスチジンなど)の芳香族側鎖と、核酸内のスタックされたヌクレオチド塩基との相互作用を含む。CasXバリアントタンパク質の機能的部分を形成するために空間的にごく近接している非隣接アミノ酸の領域に対するいずれかの改変も、本開示の範囲内であると想定される。
i.複数の供給源タンパク質由来のドメインを有するCasXバリアントタンパク質
ある特定の実施形態では、本開示は、2つ以上の異なるCasXタンパク質、例えば、2つ以上の参照CasXタンパク質、または本明細書に記載の2つ以上のCasXバリアントタンパク質配列由来のタンパク質ドメインを含むキメラCasXタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラCasXタンパク質」とは、2つの天然に存在するタンパク質などの異なる供給源から単離されたまたはそれらに由来する少なくとも2つのドメインを含むCasXを指し、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラCasXタンパク質は、第1のCasXタンパク質由来の第1のドメインと、第2の異なるCasXタンパク質由来の第2のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、第1のドメインは、NTSB、TSL、ヘリカルI、ヘリカルII、OBD、およびRuvCドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第2のドメインは、NTSB、TSL、ヘリカルI、ヘリカルII、OBD、およびRuvCドメインからなる群から選択され、第2のドメインは、前述の第1のドメインとは異なる。例えば、キメラCasXタンパク質は、配列番号2のCasXタンパク質由来のNTSB、TSL、ヘリカルI、ヘリカルII、OBDドメイン、および配列番号1のCasXタンパク質由来のRuvCドメインを含み得、またはその逆も同様である。さらなる例として、キメラCasXタンパク質は、配列番号2のCasXタンパク質由来のNTSB、TSL、ヘリカルII、OBD、およびRuvCドメイン、ならびに配列番号1のCasXタンパク質由来のヘリカルIドメインを含み得、またはその逆も同様である。したがって、ある特定の実施形態では、キメラCasXタンパク質は、第1のCasXタンパク質由来のNTSB、TSL、ヘリカルII、OBD、およびRuvCドメインと、第2のCasXタンパク質由来のヘリカルIドメインとを含み得る。キメラCasXタンパク質のいくつかの実施形態では、第1のCasXタンパク質のドメインは、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の配列に由来し、第2のCasXタンパク質のドメインは、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の配列に由来し、第1のCasXタンパク質および第2のCasXタンパク質は同じではない。いくつかの実施形態では、第1のCasXタンパク質のドメインは、配列番号1に由来する配列を含み、第2のCasXタンパク質のドメインは、配列番号2に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のCasXタンパク質のドメインは、配列番号1に由来する配列を含み、第2のCasXタンパク質のドメインは、配列番号3に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のCasXタンパク質のドメインは、配列番号2に由来する配列を含み、第2のCasXタンパク質のドメインは、配列番号3に由来する配列を含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、2つ以上の異なるCasXタンパク質、例えば、2つ以上の参照CasXタンパク質、または本明細書に記載の2つ以上のCasXバリアントタンパク質配列由来のタンパク質ドメインを含むキメラCasXタンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、「キメラCasXタンパク質」とは、2つの天然に存在するタンパク質などの異なる供給源から単離されたまたはそれらに由来する少なくとも2つのドメインを含むCasXを指し、いくつかの実施形態では、異なる種から単離され得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラCasXタンパク質は、第1のCasXタンパク質由来の第1のドメインと、第2の異なるCasXタンパク質由来の第2のドメインとを含む。いくつかの実施形態では、第1のドメインは、NTSB、TSL、ヘリカルI、ヘリカルII、OBD、およびRuvCドメインからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、第2のドメインは、NTSB、TSL、ヘリカルI、ヘリカルII、OBD、およびRuvCドメインからなる群から選択され、第2のドメインは、前述の第1のドメインとは異なる。例えば、キメラCasXタンパク質は、配列番号2のCasXタンパク質由来のNTSB、TSL、ヘリカルI、ヘリカルII、OBDドメイン、および配列番号1のCasXタンパク質由来のRuvCドメインを含み得、またはその逆も同様である。さらなる例として、キメラCasXタンパク質は、配列番号2のCasXタンパク質由来のNTSB、TSL、ヘリカルII、OBD、およびRuvCドメイン、ならびに配列番号1のCasXタンパク質由来のヘリカルIドメインを含み得、またはその逆も同様である。したがって、ある特定の実施形態では、キメラCasXタンパク質は、第1のCasXタンパク質由来のNTSB、TSL、ヘリカルII、OBD、およびRuvCドメインと、第2のCasXタンパク質由来のヘリカルIドメインとを含み得る。キメラCasXタンパク質のいくつかの実施形態では、第1のCasXタンパク質のドメインは、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の配列に由来し、第2のCasXタンパク質のドメインは、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の配列に由来し、第1のCasXタンパク質および第2のCasXタンパク質は同じではない。いくつかの実施形態では、第1のCasXタンパク質のドメインは、配列番号1に由来する配列を含み、第2のCasXタンパク質のドメインは、配列番号2に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のCasXタンパク質のドメインは、配列番号1に由来する配列を含み、第2のCasXタンパク質のドメインは、配列番号3に由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のCasXタンパク質のドメインは、配列番号2に由来する配列を含み、第2のCasXタンパク質のドメインは、配列番号3に由来する配列を含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、第1のCasXタンパク質由来の第1の部分と、第2の異なるCasXタンパク質由来の第2の部分とを含む少なくとも1つのキメラドメインを含む。本明細書で使用される場合、「キメラドメイン」とは、異なる供給源、例えば、2つの天然に存在するタンパク質から単離されたまたはそれらに由来する少なくとも2つの部分を含む単一ドメイン、または2つの参照CasXタンパク質由来のドメインの一部分を指す。少なくとも1つのキメラドメインは、本明細書に記載のNTSB、TSL、ヘリカルI、ヘリカルII、OBD、またはRuvCドメインのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、CasXドメインの第1の部分は、配列番号1の配列を含み、CasXドメインの第2の部分は、配列番号2の配列を含む。いくつかの実施形態では、CasXドメインの第1の部分は、配列番号1の配列を含み、CasXドメインの第2の部分は、配列番号3の配列を含む。いくつかの実施形態では、CasXドメインの第1の部分は、配列番号2の配列を含み、CasXドメインの第2の部分は、配列番号3の配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのキメラドメインは、キメラRuvCドメインを含む。前述の例として、キメラRuvCドメインは、配列番号1のアミノ酸661~824および配列番号2のアミノ酸922~978を含む。前述の代替例として、キメラRuvCドメインは、配列番号2のアミノ酸648~812および配列番号1のアミノ酸935~986を含む。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質は、第1のCasXタンパク質由来の第1のドメインと、第2のCasXタンパク質由来の第2のドメインと、この段落に記載の実施形態のアプローチを使用して異なるCasXタンパク質から単離された少なくとも2つの部分を含む少なくとも1つのキメラドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、表3に示される配列番号49~160の配列を含む。いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、表3に示される配列番号49~160の配列からなる。他の実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、表3に示される配列に対して、少なくとも60%同一、少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、および490からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約96%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、および490からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号49~160からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約96%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号49~160からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質、例えば、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照タンパク質と比較して、CasXタンパク質の1つ以上の改善された特性を有する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントの少なくとも1つの改善された特性は、参照タンパク質と比較して少なくとも約1.1~約100,000倍改善される。いくつかの実施形態では、CasXバリアントの少なくとも1つの改善された特性は、参照CasXタンパク質よりも少なくとも約1.1~約10,000倍改善される、少なくとも約1.1~約1,000倍改善される、少なくとも約1.1~約500倍改善される、少なくとも約1.1~約400倍改善される、少なくとも約1.1~約300倍改善される、少なくとも約1.1~約200倍改善される、少なくとも約1.1~約100倍改善される、少なくとも約1.1~約50倍改善される、少なくとも約1.1~約40倍改善される、少なくとも約1.1~約30倍改善される、少なくとも約1.1~約20倍改善される、少なくとも約1.1~約10倍改善される、少なくとも約1.1~約9倍改善される、少なくとも約1.1~約8倍改善される、少なくとも約1.1~約7倍改善される、少なくとも約1.1~約6倍改善される、少なくとも約1.1~約5倍改善される、少なくとも約1.1~約4倍改善される、少なくとも約1.1~約3倍改善される、少なくとも約1.1~約2倍改善される、少なくとも約1.1~約1.5倍改善される、少なくとも約1.5~約3倍改善される、少なくとも約1.5~約4倍改善される、少なくとも約1.5~約5倍改善される、少なくとも約1.5~約10倍改善される、少なくとも約5~約10倍改善される、少なくとも約10~約20倍改善される、少なくとも10~約30倍改善される、少なくとも10~約50倍改善される、または少なくとも10~約100倍改善される。いくつかの実施形態では、CasXバリアントの少なくとも1つの改善された特性は、参照CasXタンパク質と比較して少なくとも約10~約1000倍改善される。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の少なくとも1つの改善された特性は、参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約100、少なくとも約250、少なくとも約500、または少なくとも約1000、少なくとも約5,000、または少なくとも約10,000倍改善される。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2、少なくとも約1.3、少なくとも約1.4、少なくとも約1.5、少なくとも約1.6、少なくとも約1.7、少なくとも約1.8、少なくとも約1.9、少なくとも約2、少なくとも約2.1、少なくとも約2.2、少なくとも約2.3、少なくとも約2.4、少なくとも約2.5、少なくとも約2.6、少なくとも約2.7、少なくとも約2.8、少なくとも約2.9、少なくとも約3、少なくとも約3.5、少なくとも約4、少なくとも約4.5、少なくとも約5、少なくとも約5.5、少なくとも約6、少なくとも約6.5、少なくとも約7.0、少なくとも約7.5、少なくとも約8、少なくとも約8.5、少なくとも約9、少なくとも約9.5、少なくとも約10、少なくとも約11、少なくとも約12、少なくとも約13、少なくとも約14、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約100、少なくとも約500、少なくとも約1,000、または少なくとも約10,000倍改善される。参照CasXタンパク質における同じ特性と比較してCasXバリアントタンパク質において改善され得る例示的な特性には、バリアントの改善されたフォールディング、gNAに対する改善された結合親和性、標的DNAに対する改善された結合親和性、1つ以上のPAM配列に対する変化した結合親和性、標的DNAの改善された巻き戻し、増加した活性、改善された編集効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、DNAの非標的鎖の改善された結合、改善された標的核酸配列の切断速度、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質:gNA複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたリボ核タンパク質複合体(RNP)形成、切断能力のあるRNPの高い割合、改善されたタンパク質:gNA複合体(RNP)溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、および改善された融合特性が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも1つの改善された特性を含む。他の実施形態では、バリアントは、少なくとも2つの改善された特性を含む。さらなる実施形態では、バリアントは、少なくとも3つの改善された特性を含む。いくつかの実施形態では、バリアントは、少なくとも4つの改善された特性を含む。なおさらに別の実施形態では、バリアントは、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、またはそれ以上の改善された特徴を含む。これらの改善された特性は、以下により詳細に記載される。
j.タンパク質安定性
いくつかの実施形態では、本開示は、参照CasXタンパク質と比較して改善された安定性を有するCasXバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の改善された安定性は、タンパク質のより高い定常状態の発現をもたらし、これにより、編集効率が改善する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の改善された安定性により、より大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つCasXタンパク質がもたらされ、編集効率が改善されるか、または製造目的のために精製性が改善される。本明細書で使用される場合、「機能的立体配座」とは、タンパク質がgNAおよび標的DNAに結合することができる立体配座にあるCasXタンパク質を指す。CasXバリアントを触媒的に死んだ状態にする1つ以上の変異をCasXバリアントが有しない実施形態では、CasXバリアントは、標的DNAを切断、ニッキング、または別様に改変することができる。例えば、機能的CasXバリアントは、いくつかの実施形態では、遺伝子編集に使用することができ、機能的立体配座は、「編集能力のある」立体配座を指す。CasXバリアントタンパク質により大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つCasXタンパク質がもたらされるそれらの実施形態を含む、いくつかの例示的な実施形態では、参照CasXタンパク質と比較してより低い濃度のCasXバリアントが遺伝子編集などの用途に必要とされる。したがって、いくつかの実施形態では、改善された安定性を有するCasXバリアントは、1つ以上の遺伝子編集状況下で参照CasXと比較して改善された効率を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照CasXタンパク質と比較して改善された安定性を有するCasXバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の改善された安定性は、タンパク質のより高い定常状態の発現をもたらし、これにより、編集効率が改善する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の改善された安定性により、より大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つCasXタンパク質がもたらされ、編集効率が改善されるか、または製造目的のために精製性が改善される。本明細書で使用される場合、「機能的立体配座」とは、タンパク質がgNAおよび標的DNAに結合することができる立体配座にあるCasXタンパク質を指す。CasXバリアントを触媒的に死んだ状態にする1つ以上の変異をCasXバリアントが有しない実施形態では、CasXバリアントは、標的DNAを切断、ニッキング、または別様に改変することができる。例えば、機能的CasXバリアントは、いくつかの実施形態では、遺伝子編集に使用することができ、機能的立体配座は、「編集能力のある」立体配座を指す。CasXバリアントタンパク質により大部分が機能的立体配座で折り畳まれたままの状態を保つCasXタンパク質がもたらされるそれらの実施形態を含む、いくつかの例示的な実施形態では、参照CasXタンパク質と比較してより低い濃度のCasXバリアントが遺伝子編集などの用途に必要とされる。したがって、いくつかの実施形態では、改善された安定性を有するCasXバリアントは、1つ以上の遺伝子編集状況下で参照CasXと比較して改善された効率を有する。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照CasXタンパク質と比較して改善された熱安定性を有するCasXバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、特定の温度範囲でCasXバリアントタンパク質の改善された熱安定性を有する。いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、いくつかの参照CasXタンパク質は、地下水および堆積物に生態学的地位のある生物で本来機能しており、それ故に、いくつかの参照CasXタンパク質は、ある特定の用途に望ましくあり得るより低温またはより高温で最適な機能を呈するように進化しているかもしれない。例えば、CasXバリアントタンパク質のうちの1つの用途は、哺乳動物細胞の遺伝子編集であり、これは、典型的には、約37℃で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるCasXバリアントタンパク質は、少なくとも16℃、少なくとも18℃、少なくとも20℃、少なくとも22℃、少なくとも24℃、少なくとも26℃、少なくとも28℃、少なくとも30℃、少なくとも32℃、少なくとも34℃、少なくとも35℃、少なくとも36℃、少なくとも37℃、少なくとも38℃、少なくとも39℃、少なくとも40℃、少なくとも41℃、少なくとも42℃、少なくとも44℃、少なくとも46℃、少なくとも48℃、少なくとも50℃、少なくとも52℃、またはそれ以上の温度で、参照CasXタンパク質と比較して改善された熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善された熱安定性および機能性を有し、これにより、ヒト遺伝子編集用途を含み得る哺乳動物遺伝子編集用途などの改善された遺伝子編集機能性がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本開示は、RNPが機能的形態のままの状態を保つように、参照CasXタンパク質:gNA複合体と比較して改善されたCasXバリアントタンパク質:gNA複合体の安定性を有するCasXバリアントタンパク質を提供する。安定性の改善には、増加した熱安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、増強された薬物動態特性、様々なpH条件、塩条件にわたる安定性、および等張性が含まれ得る。本複合体の改善された安定性は、いくつかの実施形態では、改善された編集効率をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照CasXタンパク質:gNA複合体と比較して改善されたCasXバリアントタンパク質:gNA複合体の熱安定性を有するCasXバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善された熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質:gNA複合体は、少なくとも16℃、少なくとも18℃、少なくとも20℃、少なくとも22℃、少なくとも24℃、少なくとも26℃、少なくとも28℃、少なくとも30℃、少なくとも32℃、少なくとも34℃、少なくとも35℃、少なくとも36℃、少なくとも37℃、少なくとも38℃、少なくとも39℃、少なくとも40℃、少なくとも41℃、少なくとも42℃、少なくとも44℃、少なくとも46℃、少なくとも48℃、少なくとも50℃、少なくとも52℃、またはそれ以上の温度で、参照CasXタンパク質を含む複合体と比較して改善された熱安定性を有する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質:gNA複合体と比較して改善されたCasXバリアントタンパク質:gNA複合体の熱安定性を有し、これにより、ヒト遺伝子編集用途を含み得る哺乳動物遺伝子編集用途などの遺伝子編集用途の改善された機能がもたらされる。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の改善された安定性および/または熱安定性は、参照CasXタンパク質と比較してより速いCasXバリアントタンパク質のフォールディング動態、参照CasXタンパク質と比較してより遅いCasXバリアントタンパク質のアンフォールディング動態、参照CasXタンパク質と比較してより大きいCasXバリアントタンパク質のフォールディング時の自由エネルギー放出、CasXバリアントタンパク質の50%がアンフォールドされる参照CasXタンパク質と比較してより高い温度(Tm)、またはそれらの任意の組み合わせを含む。これらの特性は、広範囲の値で改善され得、例えば、参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも1.1、少なくとも1.5、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1,000、少なくとも5,000、または少なくとも10,000倍改善され得る。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の改善された熱安定性は、参照CasXタンパク質と比較してより高いCasXバリアントタンパク質のTmを含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質のTmは、約20℃~約30℃、約30℃~約40℃、約40℃~約50℃、約50℃~約60℃、約60℃~約70℃、約70℃~約80℃、約80℃~約90℃、または約90℃~約100℃である。熱安定性は、分子の半分が変性する温度として定義される、「融解温度」(Tm)を測定することによって決定される。Tmおよびアンフォールディングの自由エネルギーなどのタンパク質安定性の特性を測定する方法は、当業者に知られており、インビトロで標準生化学的技法を使用して測定することができる。例えば、Tmは、試料および参照の温度を増加させるために必要な熱量の差が温度の関数として測定される熱分析技法である示差走査熱量測定を使用して測定され得る(Chen et al(2003)Pharm Res 20:1952-60、Ghirlando et al(1999)Immunol Lett 68:47-52)。あるいは、または加えて、CasXバリアントタンパク質のTmは、ThermoFisher Protein Thermal Shiftシステムなどの市販の方法を使用して測定され得る。あるいは、または加えて、円偏光二色性を使用して、フォールディングおよびアンフォールディングの動態、ならびにTmを測定することができる(Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)。円偏光二色性(CD)は、タンパク質などの非対称分子による左回りおよび右回り円偏光の不均等な吸収に依存する。タンパク質のある特定の構造、例えば、アルファヘリックスおよびベータシートは、特徴的なCDスペクトルを有する。したがって、いくつかの実施形態では、CDを使用して、CasXバリアントタンパク質の二次構造を決定することができる。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の改善された安定性および/または熱安定性は、参照CasXタンパク質と比較して改善されたCasXバリアントタンパク質のフォールディング動態を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質のフォールディング動態は、参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約50、少なくとも約100、少なくとも約500、少なくとも約1,000、少なくとも約2,000、少なくとも約3,000、少なくとも約4,000、少なくとも約5,000、または少なくとも約10,000倍改善される。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質のフォールディング動態は、参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約1kJ/mol、少なくとも約5kJ/mol、少なくとも約10kJ/mol、少なくとも約20kJ/mol、少なくとも約30kJ/mol、少なくとも約40kJ/mol、少なくとも約50kJ/mol、少なくとも約60kJ/mol、少なくとも約70kJ/mol、少なくとも約80kJ/mol、少なくとも約90kJ/mol、少なくとも約100kJ/mol、少なくとも約150kJ/mol、少なくとも約200kJ/mol、少なくとも約250kJ/mol、少なくとも約300kJ/mol、少なくとも約350kJ/mol、少なくとも約400kJ/mol、少なくとも約450kJ/mol、または少なくとも約500kJ/mol改善される。
参照CasXタンパク質と比較してCasXバリアントタンパク質の安定性を増加させることができる例示的なアミノ酸変化には、CasXバリアントタンパク質内の水素結合の数を増加させるアミノ酸変化、CasXバリアントタンパク質内のジスルフィド架橋の数を増加させるアミノ酸変化、CasXバリアントタンパク質内の塩橋の数を増加させるアミノ酸変化、CasXバリアントタンパク質の部分間の相互作用を強化するアミノ酸変化、CasXバリアントタンパク質の埋められた疎水性表面領域を増加させるアミノ酸変化、またはそれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
k.タンパク質収量
いくつかの実施形態では、本開示は、参照CasXタンパク質と比較して改善された発現および精製中の収量を有するCasXバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞または真核生物宿主細胞から精製されたCasXバリアントタンパク質の収量は、参照CasXタンパク質と比較して改善される。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Escherichia coli細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、酵母、植物(例えば、タバコ)、昆虫(例えば、Spodoptera frugiperda sf9細胞)、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物宿主細胞は、HEK293細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、ハイブリドーマ細胞、NIH3T3細胞、COS、HeLa、またはCHO細胞を含むが、これらに限定されない哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示は、参照CasXタンパク質と比較して改善された発現および精製中の収量を有するCasXバリアントタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞または真核生物宿主細胞から精製されたCasXバリアントタンパク質の収量は、参照CasXタンパク質と比較して改善される。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Escherichia coli細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、酵母、植物(例えば、タバコ)、昆虫(例えば、Spodoptera frugiperda sf9細胞)、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核生物宿主細胞は、HEK293細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、ハイブリドーマ細胞、NIH3T3細胞、COS、HeLa、またはCHO細胞を含むが、これらに限定されない哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の改善された収量は、コドン最適化によって達成される。細胞は64個の異なるコドンを使用し、それらのうちの61個は20個の標準アミノ酸をコードする一方で、別の3個は終止コドンとして機能する。いくつかの事例では、単一のアミノ酸が2つ以上のコドンによってコードされる。異なる生物は、同じ天然に存在するアミノ酸に対して異なるコドンを使用する傾向を呈する。したがって、タンパク質コード配列におけるコドンの選択、およびタンパク質が発現される生物と一致するコドンの選択は、いくつかの事例では、タンパク質の翻訳、ひいてはタンパク質発現レベルに有意な影響を及ぼす可能性がある。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、コドン最適化された核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質をコードする核酸は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、またはヒトである。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化された核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、原核生物および真核生物における翻訳速度を低下させるヌクレオチド配列が除去された核酸によってコードされる。例えば、連続した3つを超えるチミン残基の続きが、ある特定の生物における翻訳速度を低下させることができるか、または内部ポリアデニル化シグナルが翻訳速度を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される溶解性および安定性の改善は、参照CasXタンパク質と比較して改善されたCasXバリアントタンパク質の収量をもたらす。
発現および精製中の改善されたタンパク質収量は、当該技術分野で既知の方法によって評価することができる。例えば、CasXバリアントタンパク質の量は、SDS-pageゲル上でタンパク質を泳動させ、かつCasXバリアントタンパク質を、量または濃度のいずれかが事前に分かっているコントロールと比較することによって決定して、タンパク質の絶対レベルを決定することができる。あるいは、または加えて、精製されたCasXバリアントタンパク質を同じ精製プロセスを受けている参照CasXタンパク質の隣のSDS-pageゲル上で泳動させて、CasXバリアントタンパク質の収量の相対的改善を決定することができる。あるいは、または加えて、タンパク質のレベルは、ウエスタンブロットもしくはCasXに対する抗体を用いたELISAなどの免疫組織化学的方法を使用して、またはHPLCにより測定することができる。溶液中のタンパク質の場合、濃度は、タンパク質の固有のUV吸光度を測定することによって、またはローリーアッセイ、スミス銅/ビシンコニンアッセイ、もしくはブラッドフォード色素アッセイなどのタンパク質依存的色変化を使用する方法によって決定することができる。かかる方法を使用して、ある特定の条件下での発現によって得られる総タンパク質(例えば、総可溶性タンパク質など)収量を計算することができる。これは、例えば、同様の発現条件下の参照CasXタンパク質のタンパク質収量と比較することができる。
l.タンパク質溶解性
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体と比較して改善されたCasX:gNAリボ核タンパク質複合体バリアントの溶解性を有する。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善された溶解性を有する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体と比較して改善されたCasX:gNAリボ核タンパク質複合体バリアントの溶解性を有する。
いくつかの実施形態では、タンパク質溶解性の改善は、E.coliからの精製などのタンパク質精製技術からのタンパク質のより多い収量をもたらす。タンパク質の溶解性が高いほど細胞内で凝集する可能性が低くなるため、いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の改善された溶解性により、細胞内でのより効率的な活性が可能になり得る。タンパク質凝集体は、ある特定の実施形態では、細胞に有害であるか、または厄介である可能性があり、いかなる理論にも拘束されることを望むことなく、CasXバリアントタンパク質の溶解性の増加により、タンパク質凝集のこの結果が改善され得る。さらに、CasXバリアントタンパク質の改善された溶解性により、例えば、所望の遺伝子編集用途において、より高い有効量の機能性タンパク質の送達を可能にする製剤の増強が可能になり得る。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質と比較して改善されたCasXバリアントタンパク質の溶解性により、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約100、少なくとも約250、少なくとも約500、または少なくとも約1000倍の収量の、精製中のCasXバリアントタンパク質の改善された収量がもたらされる。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質と比較して改善されたCasXバリアントタンパク質の溶解性により、細胞におけるCasXバリアントタンパク質の活性が、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2、少なくとも約1.3、少なくとも約1.4、少なくとも約1.5、少なくとも約1.6、少なくとも約1.7、少なくとも約1.8、少なくとも約1.9、少なくとも約2、少なくとも約2.1、少なくとも約2.2、少なくとも約2.3、少なくとも約2.4、少なくとも約2.5、少なくとも約2.6、少なくとも約2.7、少なくとも約2.8、少なくとも約2.9、少なくとも約3、少なくとも約3.5、少なくとも約4、少なくとも約4.5、少なくとも約5、少なくとも約5.5、少なくとも約6、少なくとも約6.5、少なくとも約7.0、少なくとも約7.5、少なくとも約8、少なくとも約8.5、少なくとも約9、少なくとも約9.5、少なくとも約10、少なくとも約11、少なくとも約12、少なくとも約13、少なくとも約14、または少なくとも約15倍改善される。
CasXタンパク質の溶解性を測定する方法、およびCasXバリアントタンパク質におけるその改善は、当業者には容易に明らかになるであろう。例えば、CasXバリアントタンパク質の溶解性は、いくつかの実施形態では、溶解したE.coliの可溶性画分のゲル上で濃度測定読み取りを行うことによって測定することができる。あるいは、または加えて、CasXバリアントタンパク質の溶解性の改善は、完全なタンパク質精製の過程を通して可溶性タンパク質産物の維持を測定することによって測定することができる。例えば、可溶性タンパク質産物は、ゲルアフィニティー精製、タグ切断、カチオン交換精製、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムにタンパク質を流すことのうちの1つ以上のステップで測定することができる。いくつかの実施形態では、ゲル上のタンパク質のすべてのバンドの濃度測定は、精製プロセスにおける各ステップの後に読み取られる。改善された溶解性を有するCasXバリアントタンパク質が、いくつかの実施形態では、タンパク質精製プロセスにおける1つ以上のステップで参照CasXタンパク質と比較してより高い濃度を維持し得る一方で、不溶性タンパク質バリアントは、緩衝液交換、濾過ステップ、精製カラムとの相互作用などのため、1つ以上のステップで失われ得る。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の溶解性を改善することにより、タンパク質精製中のタンパク質のmg/Lの観点で参照CasXタンパク質と比較してより高い収量がもたらされる。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の溶解性を改善することにより、本明細書に記載のEGFP破壊アッセイなどの編集アッセイで評価される場合、より溶解性の低いタンパク質と比較してより多くの量の編集事象が可能になる。
m.gNAに対するタンパク質親和性
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善されたgNAに対する親和性を有し、リボ核タンパク質複合体の形成をもたらす。gNAに対するCasXバリアントタンパク質の親和性の増加は、例えば、RNP複合体の生成のためにより低いKdをもたらすことができ、いくつかの事例では、より安定したリボ核タンパク質複合体形成をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、gNAに対するCasXバリアントタンパク質のKdは、参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2、少なくとも約1.3、少なくとも約1.4、少なくとも1.5、少なくとも約1.6、少なくとも約1.7、少なくとも約1.8、少なくとも約1.9、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約35、少なくとも約40、少なくとも約45、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、または少なくとも約100倍増加する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、配列番号2の参照CasXタンパク質と比較して、約1.1~約10倍増加したgNAに対する結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善されたgNAに対する親和性を有し、リボ核タンパク質複合体の形成をもたらす。gNAに対するCasXバリアントタンパク質の親和性の増加は、例えば、RNP複合体の生成のためにより低いKdをもたらすことができ、いくつかの事例では、より安定したリボ核タンパク質複合体形成をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、gNAに対するCasXバリアントタンパク質のKdは、参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2、少なくとも約1.3、少なくとも約1.4、少なくとも1.5、少なくとも約1.6、少なくとも約1.7、少なくとも約1.8、少なくとも約1.9、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約35、少なくとも約40、少なくとも約45、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、または少なくとも約100倍増加する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、配列番号2の参照CasXタンパク質と比較して、約1.1~約10倍増加したgNAに対する結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、gNAに対するCasXバリアントタンパク質の親和性の増加は、対象へのインビボ送達を含む、哺乳動物細胞に送達された場合のリボ核タンパク質複合体の安定性の増加をもたらす。この安定性の増加は、対象の細胞内の複合体の機能および有用性に影響を与え得るだけでなく、対象に送達されたときの血液中の薬物動態特性の改善をもたらし得る。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の親和性の増加、および結果として生じるリボ核タンパク質複合体の安定性の増加は、依然として所望の活性、例えばインビボまたはインビトロ遺伝子編集を有しながら、より低用量のCasXバリアントタンパク質を対象または細胞に送達することを可能にする。RNPを形成し、それらを安定な形態に保つ能力の増加は、本明細書における実施例に記載されるインビトロ切断アッセイなどのアッセイを使用して評価することができる。いくつかの実施形態において、本開示のCasXバリアントを含むRNPは、RNPとして複合体形成した場合、配列番号1~3の参照CasXを含むRNPと比較して、少なくとも2倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍高いK切断速度を達成することができる。
いくつかの実施形態では、gNAに対するCasXバリアントタンパク質のより高い親和性(より緊密な結合)は、CasXバリアントタンパク質およびgNAの両方がRNP複合体に留まる場合、より多くの量の編集事象を可能にする。編集事象の増加は、本明細書に記載のEGFP破壊アッセイなどの編集アッセイを使用して評価することができる。
理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの実施形態では、ヘリカルIドメインにおけるアミノ酸変化が、gNA標的化配列に対するCasXバリアントタンパク質の結合親和性を増加させることができる一方で、ヘリカルIIドメインにおける変化は、gNA足場ステムループに対するCasXバリアントタンパク質の結合親和性を増加させることができ、オリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)における変化は、gRNAトリプレックスに対するCasXバリアントタンパク質の結合親和性を増加させる。
CasX gNAに対するCasXタンパク質結合親和性を測定する方法には、精製されたCasXタンパク質およびgNAを使用するインビトロ法が含まれる。gNAまたはCasXタンパク質がフルオロフォアで標識される場合、参照CasXおよびバリアントタンパク質に対する結合親和性は、蛍光偏光によって測定することができる。あるいは、または加えて、結合親和性は、バイオレイヤー干渉法、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、またはフィルター結合によって測定することができる。参照gNAおよびそれらのバリアントなどの特異的なgNAに対する本開示の参照CasXおよびバリアントタンパク質などのRNA結合タンパク質の絶対親和性を定量するための追加の標準技法には、等温熱量測定(ITC)および表面プラズモン共鳴(SPR)、ならびに実施例の方法が含まれるが、これらに限定されない。
n.標的核酸に対する親和性
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、標的核酸に対する参照CasXタンパク質の親和性と比較して、標的核酸に対する改善された結合親和性を有する。それらの標的核酸に対してより高い親和性を有するCasXバリアントは、いくつかの実施形態では、標的核酸に対する親和性が増加していない参照CasXタンパク質よりも迅速に標的核酸配列を切断することができる。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、標的核酸に対する参照CasXタンパク質の親和性と比較して、標的核酸に対する改善された結合親和性を有する。それらの標的核酸に対してより高い親和性を有するCasXバリアントは、いくつかの実施形態では、標的核酸に対する親和性が増加していない参照CasXタンパク質よりも迅速に標的核酸配列を切断することができる。
いくつかの実施形態では、標的核酸に対する改善された親和性は、標的核酸の標的配列またはプロトスペーサー配列に対する改善された親和性、PAM配列に対する改善された親和性、標的配列についてDNAを探し出す改善された能力、またはそれらの任意の組み合わせを含む。理論によって拘束されることを望まないが、CasXなどのCRISPR/Casシステムタンパク質は、DNA分子に沿った一次元拡散によってそれらの標的配列を見出すことができると考えられる。このプロセスには、(1)リボ核タンパク質のDNA分子への結合、それに続く(2)標的配列での停止が含まれると考えられ、それらのいずれも、いくつかの実施形態では、標的核酸配列に対するCasXタンパク質の改善された親和性によって影響を受け得、これにより、参照CasXタンパク質と比較してCasXバリアントタンパク質の機能が改善する。
いくつかの実施形態では、改善された標的核酸親和性を有するCasXバリアントタンパク質は、DNAに対する増加した全体的な親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸親和性が改善されたCasXバリアントタンパク質は、TTC、ATC、GTC、およびCTCからなる群から選択されるPAM配列を含む、配列番号2の参照CasXタンパク質によって認識される標準的TTC PAM以外の特定のPAM配列に対する親和性またはそれを利用する能力が増加しており、これにより、野生型CasXヌクレアーゼと比較して編集され得る標的DNAの量が増加する。理論によって拘束されることを望まないが、これらのタンパク質バリアントは、DNA全体とより強く相互作用することができ、野生型参照CasXのものを超えた追加のPAM配列を利用する能力のために標的DNA内の配列に接近し、編集する能力を増加させることができる可能性があり、これにより、標的配列に対するCasXタンパク質のより効率的な探索プロセスが可能になる。DNAに対するより高い全体的な親和性は、いくつかの実施形態では、CasXタンパク質が結合および巻き戻しステップを効率的に開始および終了することができる頻度も増加させ、それにより、標的鎖の侵入およびRループ形成を促進し、最終的には、標的核酸配列の切断を促進することができる。
理論に拘束されることを望むことなく、巻き戻された状態の非標的DNA鎖の巻き戻しまたはその捕捉の効率を増加させるNTSBDにおけるアミノ酸変化が、標的DNAに対するCasXバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる可能性がある。あるいは、または加えて、巻き戻し中にDNAを安定化させるNTSBDの能力を増加させるNTSBDにおけるアミノ酸変化は、標的DNAに対するCasXバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。あるいは、または加えて、OBDにおけるアミノ酸変化は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に結合するCasXバリアントタンパク質の親和性を増加させ、それにより、標的核酸配列に対するCasXバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。あるいは、または加えて、標的核酸鎖に対するCasXバリアントタンパク質の親和性を増加させるヘリカルIおよび/またはII、RuvC、およびTSLドメインにおけるアミノ酸変化は、標的核酸配列に対するCasXバリアントタンパク質の親和性を増加させることができる。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照タンパク質と比較して増加した標的核酸配列に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸分子に対する本開示のCasXバリアントタンパク質の親和性は、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約1.1、少なくとも約1.2、少なくとも約1.3、少なくとも1.4、少なくとも約1.5、少なくとも約1.6、少なくとも約1.7、少なくとも約1.8、少なくとも約1.9、少なくとも約2、少なくとも約3、少なくとも約4、少なくとも約5、少なくとも約6、少なくとも約7、少なくとも約8、少なくとも約9、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約35、少なくとも約40、少なくとも約45、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、または少なくとも約100倍増加する。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、標的核酸の非標的鎖に対する改善された結合親和性を有する。本明細書で使用される場合、「非標的鎖」という用語は、gNAの標的化配列とワトソンおよびクリック塩基対を形成せず、標的DNA鎖に相補的であるDNA標的核酸配列の鎖を指す。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照タンパク質と比較して、標的核酸の非標的鎖に対して約1.1~約100倍増加した結合親和性を有する。
標的核酸分子に対するCasXタンパク質(参照またはバリアントなど)の親和性を測定する方法には、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、フィルター結合、等温熱量測定(ITC)、および表面プラズモン共鳴(SPR)、蛍光偏光、ならびにバイオレイヤー干渉法(BLI)が含まれ得る。標的に対するCasXタンパク質の親和性を測定するさらなる方法には、DNA切断事象を経時的に測定するインビトロ生化学的アッセイが含まれる。
o.標的部位に対する改善された特異性
いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、配列番号1~3の参照CasXタンパク質と比較して、標的核酸配列に対する改善された特異性を有する。本明細書で使用される場合、互換的に「標的特異性」と称される「特異性」は、CRISPR/Casシステムリボ核タンパク質複合体が、標的核酸配列と類似しているが、同一ではないオフターゲット配列を切断する程度を指し、例えば、より高度な特異性を有するCasXバリアントRNPは、参照CasXタンパク質と比較して、配列のオフターゲット切断の低減を示す。CRISPR/Casシステムタンパク質の特異性、および潜在的に有害なオフターゲット効果の低減は、哺乳動物対象における使用に許容される治療指数を達成するために極めて重要であり得る。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、配列番号1~3の参照CasXタンパク質と比較して、標的核酸配列に対する改善された特異性を有する。本明細書で使用される場合、互換的に「標的特異性」と称される「特異性」は、CRISPR/Casシステムリボ核タンパク質複合体が、標的核酸配列と類似しているが、同一ではないオフターゲット配列を切断する程度を指し、例えば、より高度な特異性を有するCasXバリアントRNPは、参照CasXタンパク質と比較して、配列のオフターゲット切断の低減を示す。CRISPR/Casシステムタンパク質の特異性、および潜在的に有害なオフターゲット効果の低減は、哺乳動物対象における使用に許容される治療指数を達成するために極めて重要であり得る。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、配列番号1~3の参照CasXタンパク質と比較して、gNAの標的化配列に相補的な標的配列内の標的部位に対する改善された特異性を有する。理論によって拘束されることを望まないが、標的核酸鎖に対するCasXバリアントタンパク質の特異性を増加させるヘリカルIおよびIIドメインにおけるアミノ酸変化は、標的核酸全体に対するCasXバリアントタンパク質の特異性を増加させることができる可能性がある。いくつかの実施形態では、標的核酸に対するCasXバリアントタンパク質の特異性を増加させるアミノ酸変化はまた、DNAに対するCasXバリアントタンパク質の親和性の減少をもたらし得る。
CasXタンパク質(バリアントまたは参照など)の標的特異性を試験する方法には、シークエンシングによる切断効果のインビトロ報告のためのガイドおよび環状化(guide and Circularization for In vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing)(CIRCLE-seq)、または同様の方法が含まれ得る。手短には、CIRCLE-seq技法では、ゲノムDNAがステムループアダプターのライゲーションによって剪断および環状化され、このステムループアダプターがステムループ領域でニッキングされて、4ヌクレオチドパリンドロームオーバーハングを露出させる。続いて、分子内ライゲーションおよび残りの直鎖状DNAの分解が行われる。その後、CasX切断部位を含む環状DNA分子がCasXで線形化され、アダプターアダプターが露出した末端にライゲーションされ、続いて、ハイスループットシークエンシングが行われて、オフターゲット部位に関する情報を含むペアエンド読み取りが生成される。オフターゲット事象、ひいてはCasXタンパク質特異性を検出するために使用することができる追加のアッセイには、ミスマッチ検出ヌクレアーゼアッセイおよび次世代シークエンシング(NGS)などの、選択されたオフターゲット部位で形成されるインデル(挿入および欠失)を検出および定量するために使用されるアッセイが含まれる。例示的なミスマッチ検出アッセイには、CasXおよびsgNAで処理された細胞由来のゲノムDNAをPCR増幅し、変性させ、再ハイブリダイズして、1つの野生型鎖およびインデルを有する1つの鎖を含むヘテロデュプレックスDNAを形成するヌクレアーゼアッセイが含まれる。ミスマッチは、SurveyorヌクレアーゼまたはT7エンドヌクレアーゼIなどのミスマッチ検出ヌクレアーゼによって認識されて切断される。
p.プロトスペーサーおよびPAM配列
本明細書において、プロトスペーサーは、ガイドRNAの標的化配列に相補的なDNA配列およびその配列に相補的なDNAとして定義され、それぞれ、標的鎖および非標的鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、PAMは、プロトスペーサーに近接する5’に位置するヌクレオチド配列であり、gNAの標的化配列と併せて、プロトスペーサー鎖の潜在的な切断のためのCasXの配向および配置に役立つ。
本明細書において、プロトスペーサーは、ガイドRNAの標的化配列に相補的なDNA配列およびその配列に相補的なDNAとして定義され、それぞれ、標的鎖および非標的鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、PAMは、プロトスペーサーに近接する5’に位置するヌクレオチド配列であり、gNAの標的化配列と併せて、プロトスペーサー鎖の潜在的な切断のためのCasXの配向および配置に役立つ。
PAM配列は縮重している場合があり、特定のRNP構築物は、切断の異なる効率を支持する異なる優先的な許容されるPAM配列を有し得る。別途指示されない限り、慣例に従って、本開示は、PAMおよびプロトスペーサー配列の両方、ならびに非標的鎖の配向に応じたそれらの方向性に言及している。これは、標的鎖ではなく、非標的鎖のPAM配列が切断を決定するか、または標的認識に機械的に関与していることを意味するものではない。例えば、TTC PAMを参照する場合、実際には、標的切断に必要な相補的なGAA配列である場合もあれば、両方の鎖からのヌクレオチドのいくつかの組み合わせである場合もある。本明細書に開示されるCasXタンパク質の場合、PAMはプロトスペーサーの5’に位置し、単一のヌクレオチドがPAMをプロトスペーサーの最初のヌクレオチドから分離している。したがって、参照CasXの場合、TTC PAMは、式5’-...NNTTCN(プロトスペーサー)NNNNNN...3’(配列番号218)に従う配列を意味することが理解されるべきであり、「N」は任意のDNAヌクレオチドであり、「(プロトスペーサー)」は、ガイドRNAの標的化配列と同一性を有するDNA配列である。拡張されたPAM認識を有するCasXバリアントの場合、TTC、CTC、GTC、またはATC PAMは、式:
5’-…NNTTCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号218)、
5’-…NNCTCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号219)、
5’-…NNGTCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号220)、または
5’-…NNATCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号221)に従う配列を意味することが理解されるべきである。代替的に、TC PAMは、式:
5’-…NNNTCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号222)に従う配列を意味することが理解されるべきである。
5’-…NNTTCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号218)、
5’-…NNCTCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号219)、
5’-…NNGTCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号220)、または
5’-…NNATCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号221)に従う配列を意味することが理解されるべきである。代替的に、TC PAMは、式:
5’-…NNNTCN(プロトスペーサー)NNNNNN…3’(配列番号222)に従う配列を意味することが理解されるべきである。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、PAM配列の編集が改善されており、PAM配列TTC、ATC、GTC、またはCTCのうちのいずれか1つが、同等のアッセイシステムにおける編集効率および/または参照CasXタンパク質を含むRNPの結合と比較して、細胞アッセイシステムにおけるgNAの標的化配列と同一性を有するプロトスペーサーの非標的鎖に対して5’の1つのヌクレオチドに位置する場合、標的DNAにおいてより大きな編集効率および/または標的配列の結合を示す。いくつかの実施形態では、PAM配列はTTCである。いくつかの実施形態では、PAM配列はATCである。いくつかの実施形態では、PAM配列はCTCである。いくつかの実施形態では、PAM配列はGTCである。
q.DNAの巻き戻し
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善されたDNAを巻き戻す能力を有する。不十分なdsDNA巻き戻しは、CRISPR/Casシステムタンパク質AnaCas9またはCas14sがDNAを切断する能力を損なうかまたは妨げることが以前に示されている。したがって、いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本開示のいくつかのCasXバリアントタンパク質によるDNA切断活性の増加は、少なくとも部分的に、標的部位においてdsDNAを見つけて巻き戻す能力の増加に起因する可能性が高い。DNAを巻き戻すCasXタンパク質(バリアントまたは参照など)の能力を測定する方法には、蛍光偏光またはバイオレイヤー干渉法においてdsDNA標的の速度の増加を観測するインビトロアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善されたDNAを巻き戻す能力を有する。不十分なdsDNA巻き戻しは、CRISPR/Casシステムタンパク質AnaCas9またはCas14sがDNAを切断する能力を損なうかまたは妨げることが以前に示されている。したがって、いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本開示のいくつかのCasXバリアントタンパク質によるDNA切断活性の増加は、少なくとも部分的に、標的部位においてdsDNAを見つけて巻き戻す能力の増加に起因する可能性が高い。DNAを巻き戻すCasXタンパク質(バリアントまたは参照など)の能力を測定する方法には、蛍光偏光またはバイオレイヤー干渉法においてdsDNA標的の速度の増加を観測するインビトロアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
理論に拘束されることを望むことなく、NTSBドメインにおけるアミノ酸変化が、増加したDNA巻き戻し特性を有するCasXバリアントタンパク質を産生することができると考えられている。あるいは、または加えて、PAMと相互作用するOBDまたはヘリカルドメイン領域におけるアミノ酸変化も、増加したDNA巻き戻し特性を有するCasXバリアントタンパク質を産生することができる。
r.触媒活性
本明細書に開示されるCasX:gNAシステムのリボ核タンパク質複合体は、標的核酸配列に結合し、かつ標的核酸配列を切断するCasXバリアントタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善された触媒活性を有する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、標的鎖の切断が、dsDNA切断を引き起こす際にCas12様分子の制限因子になり得ると考えられている。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、DNAの標的鎖の屈曲およびこの鎖の切断を改善し、その結果、CasXリボ核タンパク質複合体によるdsDNA切断の全体的な効率が改善される。
本明細書に開示されるCasX:gNAシステムのリボ核タンパク質複合体は、標的核酸配列に結合し、かつ標的核酸配列を切断するCasXバリアントタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して改善された触媒活性を有する。理論に拘束されることを望むことなく、いくつかの事例では、標的鎖の切断が、dsDNA切断を引き起こす際にCas12様分子の制限因子になり得ると考えられている。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、DNAの標的鎖の屈曲およびこの鎖の切断を改善し、その結果、CasXリボ核タンパク質複合体によるdsDNA切断の全体的な効率が改善される。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して増加したヌクレアーゼ活性を有する。増加したヌクレアーゼ活性を有するバリアントは、例えば、RuvCヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸変化によって生成することができる。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼドメインを含む。前述において、CasX:gNAシステムのCasXニッカーゼは、非標的鎖のPAM部位の3’の10~18個のヌクレオチド内に一本鎖切断を生じる。他の実施形態では、CasXバリアントは、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼドメインを含む。前述において、CasX:gNAシステムのCasXは、標的鎖上のPAM部位の5’の18~26個のヌクレオチドおよび非標的鎖上の3’の10~18個のヌクレオチド内に二本鎖切断を生じる。ヌクレアーゼ活性は、実施例の方法を含む様々な方法によってアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、参照CasXと比較して、少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも4倍、または少なくとも5倍、または少なくとも6倍、または少なくとも7倍、または少なくとも8倍、または少なくとも9倍、または少なくとも10倍大きいK切断定数を有する。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、gNAとともにRNPを形成する改善された特性を有し、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照CasXタンパク質とgNAとのRNPと比較して、切断能力のあるRNPの高い割合をもたらす。切断能力があることによって、形成されるRNPは、標的核酸を切断する能力を有することが意味される。いくつかの実施形態において、CasXバリアントとgNAとのRNPは、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照CasXタンパク質とgNAとのRNPと比較して、少なくとも2倍、もしくは少なくとも3倍、もしくは少なくとも4倍、もしくは少なくとも5倍、もしくは少なくとも10倍の切断速度を示す。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXと比較して、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷を有する。増加した標的鎖負荷活性を有するバリアントは、例えば、TLSドメインにおけるアミノ酸変化によって生成することができる。
理論に拘束されることを望むことなく、TSLドメインにおけるアミノ酸変化は、改善された触媒活性を有するCasXバリアントタンパク質をもたらし得る。あるいは、または加えて、RNA:DNAデュプレックスの結合チャネル周辺のアミノ酸変化も、CasXバリアントタンパク質の触媒活性を改善することができる。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して増加した付随的切断活性を有する。本明細書で使用される場合、「付随的切断活性」とは、標的核酸配列の認識および切断後の核酸の追加の非標的化切断を指す。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して減少した付随的切断活性を有する。
いくつかの実施形態では、例えば、標的核酸配列の切断が望ましい結果ではない用途を包含するそれらの実施形態では、CasXバリアントタンパク質の触媒活性を改善することは、CasXバリアントタンパク質の触媒活性を変更、低減、または無効にすることを含む。いくつかの実施形態では、dCasXバリアントタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体は、標的核酸配列に結合し、標的核酸を切断しない。
いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質を含むCasXリボ核タンパク質複合体は、標的DNAに結合するが、標的DNAに一本鎖ニックを生成する。いくつかの実施形態では、特にCasXタンパク質がニッカーゼである実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷を有する。減少した標的鎖負荷を有するバリアントは、例えば、TSLドメインにおけるアミノ酸変化によって生成され得る。
CasXタンパク質の触媒活性を特徴付けるための例示的な方法には、以下の実施例の方法を含む、インビトロ切断アッセイが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アガロースゲル上でのDNA産物の電気泳動は、鎖切断の動態を調べることができる。
s.PCSK9標的RNAに対する親和性
いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質またはそのバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、標的PCSK9 DNAに結合し、標的核酸を切断する。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質のバリアントは、参照CasXタンパク質と比較して、標的PCSK9 RNAに対するCasXバリアントタンパク質の特異性を増加させ、標的RNAに対するCasXバリアントタンパク質の活性を増加させる。例えば、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して増加した標的RNAに対する結合親和性または増加した標的RNAの切断を呈し得る。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体は、標的RNAに結合し、および/または標的RNAを切断する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照タンパク質と比較して、PCSK9標的RNAに対して少なくとも約2倍~約10倍増加した結合親和性を有する。
いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質またはそのバリアントを含むリボ核タンパク質複合体は、標的PCSK9 DNAに結合し、標的核酸を切断する。いくつかの実施形態では、参照CasXタンパク質のバリアントは、参照CasXタンパク質と比較して、標的PCSK9 RNAに対するCasXバリアントタンパク質の特異性を増加させ、標的RNAに対するCasXバリアントタンパク質の活性を増加させる。例えば、CasXバリアントタンパク質は、参照CasXタンパク質と比較して増加した標的RNAに対する結合親和性または増加した標的RNAの切断を呈し得る。いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体は、標的RNAに結合し、および/または標的RNAを切断する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照タンパク質と比較して、PCSK9標的RNAに対して少なくとも約2倍~約10倍増加した結合親和性を有する。
t.変異の組み合わせ
本開示は、別個のCasXバリアントタンパク質由来の変異の組み合わせであるCasXバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメインに対するいずれのバリアントも、本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメイン内のいずれのバリアントも、同じドメイン内の本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。異なるアミノ酸変化の組み合わせにより、いくつかの実施形態では、機能がアミノ酸変化の組み合わせによってさらに改善される新たな最適化されたバリアントが産生され得る。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は線形である。本明細書で使用される場合、線形である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計に等しい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は相乗的である。本明細書で使用される場合、相乗的である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計よりも大きい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化を組み合わせることにより、CasXタンパク質の2つ以上の機能が参照CasXタンパク質と比較して改善されたCasXバリアントタンパク質が産生される。
本開示は、別個のCasXバリアントタンパク質由来の変異の組み合わせであるCasXバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメインに対するいずれのバリアントも、本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかのドメイン内のいずれのバリアントも、同じドメイン内の本明細書に記載の他のバリアントと組み合わせることができる。異なるアミノ酸変化の組み合わせにより、いくつかの実施形態では、機能がアミノ酸変化の組み合わせによってさらに改善される新たな最適化されたバリアントが産生され得る。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は線形である。本明細書で使用される場合、線形である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計に等しい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質機能に対するアミノ酸変化を組み合わせる効果は相乗的である。本明細書で使用される場合、相乗的である組み合わせとは、機能に対する効果が単独でアッセイされたときの個々のアミノ酸変化の各々の効果の合計よりも大きい組み合わせを指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化を組み合わせることにより、CasXタンパク質の2つ以上の機能が参照CasXタンパク質と比較して改善されたCasXバリアントタンパク質が産生される。
u.CasX融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、CasXに融合された異種タンパク質を含むCasXタンパク質を提供する。他の事例では、CasXは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXバリアントである。
いくつかの実施形態では、本開示は、CasXに融合された異種タンパク質を含むCasXタンパク質を提供する。他の事例では、CasXは、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXバリアントである。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントタンパク質は、関心対象の異なる活性を有する1つ以上のタンパク質またはそのドメインに融合された配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、または490を含み、融合タンパク質をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、CasXバリアントタンパク質は、転写を阻害する、標的核酸配列を修飾する、または核酸と会合したポリペプチドを改変する(例えば、ヒストン改変)タンパク質(またはそのドメイン)に融合される。
いくつかの実施形態では、異種ポリペプチド(またはシステイン残基または非天然アミノ酸などの異種アミノ酸)がCasXタンパク質内の1つ以上の位置に挿入されて、CasX融合タンパク質を生成することができる。他の実施形態では、システイン残基は、CasXタンパク質内の1つ以上の位置に挿入され、続いて、以下に記載の異種ポリペプチドのコンジュゲーションが行われ得る。いくつかの代替の実施形態において、異種ポリペプチドまたは異種アミノ酸は、CasXバリアントタンパク質のN末端またはC末端に付加することができる。他の実施形態では、異種ポリペプチドまたは異種アミノ酸は、CasXタンパク質の配列の内部に挿入することができる。
いくつかの実施形態では、CasXバリアント融合タンパク質は、RNAガイド配列特異的標的核酸結合および切断活性を保持する。いくつかの事例では、CasXバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有さない対応するCasXバリアントタンパク質の50%以上の活性(例えば、切断および/または結合活性)を有する(保持する)。いくつかの事例では、CasXバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有さない対応するCasXタンパク質の活性(例えば、切断および/または結合活性)の少なくとも約60%、または少なくとも約70%以上、少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または少なくとも約92%、または少なくとも約95%、または少なくとも約98%、または少なくとも約100%を保持する。
いくつかの事例では、CasXバリアント融合ポリペプチドは、異種アミノ酸または異種ポリペプチドが挿入されていないCasXタンパク質の活性と比較して、標的核酸結合活性を保持する(有する)。いくつかの事例では、CasXバリアント融合タンパク質は、異種タンパク質の挿入を有しない対応するCasXタンパク質の結合活性の少なくとも約60%、または少なくとも約70%以上、少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または少なくとも約92%、または少なくとも約95%、または少なくとも約98%、または少なくとも約100%を保持する。
いくつかの事例では、CasXバリアント融合ポリペプチドは、異種アミノ酸または異種ポリペプチドが挿入されていない親CasXタンパク質の活性と比較して、標的核酸結合および/または切断活性を保持する(有する)。例えば、いくつかの事例では、CasXバリアント融合タンパク質は、対応する親CasXタンパク質(挿入を有しないCasXタンパク質)の結合および/または切断活性の50%以上を有する(保持する)。例えば、いくつかの事例ではCasXバリアント融合タンパク質は、対応するCasX親タンパク質(挿入されていないCasXタンパク質)の結合および/または切断活性の60%以上(70%以上、80%以上、90%以上、92%以上、95%以上、98%以上、または100%)を有する(保持する)。CasXタンパク質および/またはCasX融合タンパク質の切断および/または結合活性を測定する方法は、当業者に知られており、任意の簡便な方法を使用することができる。
様々な異種ポリペプチドが、本開示の参照CasXまたはCasXバリアント融合タンパク質への包含に好適である。いくつかの事例では、融合パートナーは、標的DNAの転写を調節する(例えば、転写を阻害する、転写を増加させる)ことができる。例えば、いくつかの事例では、融合パートナーは、転写を阻害するタンパク質(またはタンパク質由来のドメイン)(例えば、転写抑制因子、転写阻害タンパク質の動員、メチル化などの標的DNAの改変、DNA改変因子の動員、標的DNAと会合したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化および/またはメチル化を改変するものなどのヒストン改変因子の動員などにより機能するタンパク質)である。いくつかの事例では、融合パートナーは、転写を増加させるタンパク質(またはタンパク質由来のドメイン)(例えば、転写活性化因子、転写活性化タンパク質の動員、脱メチル化などの標的DNAの改変、DNA改変因子の動員、標的DNAと会合したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化および/またはメチル化を改変するものなどのヒストン改変因子の動員などにより作用するタンパク質)である。
いくつかの事例では、融合パートナーは、標的核酸配列を改変する酵素活性、例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、DNA修復活性、DNA損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポサーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、またはグリコシラーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、CasXバリアントは、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、または490のうちのいずれか1つと、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を有するポリペプチドと、を含む。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントは、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、または490のうちのいずれか1つと、標的核酸と会合するポリペプチド(例えば、ヒストン)を改変する酵素活性(例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性)を有する融合パートナーと、を含む。
転写を増加させるために融合パートナーとして使用することができるタンパク質(またはその断片)の例には、VP16、VP64、VP48、VP160、p65サブドメイン(例えば、NFkBから)、ならびにEDLLの活性化ドメインおよび/またはTAL活性化ドメイン(例えば、植物での活性のため);SET1A、SET1B、MLL1~5、ASH1、SYMD2、NSD1などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ;JHDM2a/b、UTX、JMJD3などのヒストンリジンデメチラーゼ;GCN5、PCAF、CBP、p300、TAF1、TIP60/PLIP、MOZ/MYST3、MORF/MYST4、SRC1、ACTR、P160、CLOCKなどのヒストンアセチルトランスフェラーゼ;Ten-Eleven Translocation(TET)ジオキシゲナーゼ1(TET1CD)、TET1、DME、DML1、DML2、ROS1などのDNAデメチラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
転写を減少させるために融合パートナーとして使用することができるタンパク質(またはその断片)の例には、クルッペル関連ボックス(KRABまたはSKD)などの転写抑制因子;KOX1抑制ドメイン;Mad mSIN3相互作用ドメイン(SID);ERF抑制因子ドメイン(ERD)、SRDX抑制ドメイン(例えば、植物における抑制のため)など;Pr-SET7/8、SUV4-20H1、RIZ1などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ;JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D、JARID1A/RBP2、JARID1B/PLU-1、JARID1C/SMCX、JARID1D/SMCYなどのヒストンリジンデメチラーゼ;HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、SIRT1、SIRT2、HDAC11などのヒストンリジンデアセチラーゼ;HhaI DNA m5c-メチルトランスフェラーゼ(M.HhaI)、DNAメチルトランスフェラーゼ1(DNMT1)、DNAメチルトランスフェラーゼ3a(DNMT3a)、DNAメチルトランスフェラーゼ3b(DNMT3b)、METI、DRM3(植物)、ZMET2、CMT1、CMT2(植物)などのDNAメチラーゼ;およびラミンA、ラミンBなどの末梢動員要素が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、または490のうちのいずれか1つを含むCasXバリアントとの融合パートナーは、標的核酸配列(例えば、ssRNA、dsRNA、ssDNA、dsDNA)を改変する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例には、制限酵素(例えば、FokIヌクレアーゼ)によって提供されるものなどのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ(例えば、Hhal DNA m5c-メチルトランスフェラーゼ(M.Hhal)、DNAメチルトランスフェラーゼ1(DNMT1)、DNAメチルトランスフェラーゼ3a(DNMT3a)、DNAメチルトランスフェラーゼ3b(DNMT3b)、METI、DRM3(植物)、ZMET2、CMT1、CMT2(植物)など)によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性;デメチラーゼ(例えば、テン-イレブントランスロケーション(TET)ジオキシゲナーゼ1(TET 1 CD)、TET1、DME、DML1、DML2、ROS1など)によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、DNA修復活性、DNA損傷活性、デアミナーゼ(例えば、シトシンデアミナーゼ酵素、例えば、ラットAPOBEClなどのAPOBECタンパク質)によって提供されるものなどの脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼおよび/またはレゾルバーゼ(例えば、Ginインベルターゼの超活性変異、GinH106YなどのGinインベルターゼ;ヒト免疫不全ウイルス1型インテグラーゼ(IN);Tn3レゾルバーゼなど)によって提供されるものなどのインテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ(例えば、Ginレコンビナーゼの触媒ドメイン)によって提供されるものなどのレコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、およびグリコシラーゼ活性)が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、本開示のCasXバリアントタンパク質は、転写を増加させるためのドメイン(例えば、VP16ドメイン、VP64ドメイン)、転写を減少させるためのドメイン(例えば、KRABドメイン、例えば、Kox1タンパク質由来のもの)、ヒストンアセチルトランスフェラーゼのコア触媒ドメイン(例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300)、検出可能なシグナルを提供するタンパク質/ドメイン(例えば、GFPなどの蛍光タンパク質)、ヌクレアーゼドメイン(例えば、Foklヌクレアーゼ)、または塩基エディター(例えば、APOBEC1などのシチジンデアミナーゼ)から選択されるポリペプチドに融合される。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントは、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、または490のうちのいずれか1つと、標的核酸(例えば、ssRNA、dsRNA、ssDNA、dsDNA)と会合するタンパク質(例えば、ヒストン、RNA結合タンパク質、DNA結合タンパク質など)を改変する酵素活性を有する融合パートナーと、を含む。融合パートナーによって提供され得る酵素活性(標的核酸に関連するタンパク質を改変するもの)の例には、ヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMT)(例えば、斑入り3~9ホモログ1のサプレッサー(SUV39H1、別名、KMT1A)、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ2(G9A、別名、KMT1CおよびEHMT2)、SUV39H2、ESET/SETDB1など、SET1A、SET1B、MLL1~5、ASH1、SYMD2、NSD1、DOT1L、Pr-SET7/8、SUV4-20H1、EZH2、RIZ1)によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ(例えば、リジンデメチラーゼ1A(KDM1A、別名、LSD1)、JHDM2a/b、JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D、JARID1A/RBP2、JARID1B/PLU-1、JARID1C/SMCX、JARID1D/SMCY、UTX、JMJD3など)によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼトランスフェラーゼ(例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼp300、GCN5、PCAF、CBP、TAF1、TIP60/PLIP、MOZ/MYST3、MORF/MYST4、HB01/MYST2、HMOF/MYST1、SRC1、ACTR、P160、CLOCKなどの触媒コア/断片)によって提供されるものなどのアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ(例えば、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、SIRT1、SIRT2、HDAC11など)によって提供されるものなどのデアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
CasXバリアントにおける好適な融合パートナーの追加の例は、(i)ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)不安定化ドメイン(例えば、化学的に制御可能な対象RNAガイドポリペプチドまたは条件付きで活性なRNAガイドポリペプチドを生成する)、および(ii)葉緑体輸送ペプチドである。
いくつかの実施形態において、CasXバリアントは、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、または490と、以下:MASMISSSAVTTVSRASRGQSAAMAPFGGLKSMTGFPVRKVNTDITSITSNGGRVKCMQVWPPIGKKKFETLSYLPPLTRDSRA(配列番号31)、MASMISSSAVTTVSRASRGQSAAMAPFGGLKSMTGFPVRKVNTDITSITSNGGRVKS(配列番号304)、MASSMLSSATMVASPAQATMVAPFNGLKSSAAFPATRKANNDITSITSNGGRVNCMQVWPPIEKKKFETLSYLPDLTDSGGRVNC(配列番号13863)、MAQVSRICNGVQNPSLISNLSKSSQRKSPLSVSLKTQQHPRAYPISSSWGLKKSGMTLIGSELRPLKVMSSVSTAC(配列番号305)、MAQVSRICNGVWNPSLISNLSKSSQRKSPLSVSLKTQQHPRAYPISSSWGLKKSGMTLIGSELRPLKVMSSVSTAC(配列番号306)、MAQINNMAQGIQTLNPNSNFHKPQVPKSSSFLVFGSKKLKNSANSMLVLKKDSIFMQLFCSFRISASVATAC(配列番号307)、MAALVTSQLATSGTVLSVTDRFRRPGFQGLRPRNPADAALGMRTVGASAAPKQSRKPHRFDRRCLSMVV(配列番号308)、MAALTTSQLATSATGFGIADRSAPSSLLRHGFQGLKPRSPAGGDATSLSVTTSARATPKQQRSVQRGSRRFPSVVVC(配列番号309)、MASSVLSSAAVATRSNVAQANMVAPFTGLKSAASFPVSRKQNLDITSIASNGGRVQC(配列番号310)、MESLAATSVFAPSRVAVPAARALVRAGTVVPTRRTSSTSGTSGVKCSAAVTPQASPVISRSAAAA(配列番号13864)、およびMGAAATSMQSLKFSNRLVPPSRRLSPVPNNVTCNNLPKSAAPVRTVKCCASSWNSTINGAAATTNGASAASS(配列番号311)を含むがこれらに限定されない葉緑体輸送ペプチドと、を含む。
いくつかの事例では、本開示のCasXバリアントタンパク質は、エンドソームエスケープペプチドを含むことができる。いくつかの事例では、エンドソームエスケープポリペプチドは、アミノ酸配列GLFXALLXLLXSLWXLLLXA(配列番号312)を含み、ここで、各Xは独立して、リジン、ヒスチジン、およびアルギニンから選択される。いくつかの事例では、エンドソームエスケープポリペプチドは、アミノ酸配列GLFHALLHLLHSLWHLLLHA(配列番号313)またはHHHHHHHHH(配列番号314)を含む。
ssRNA標的核酸配列を標的とする場合にCasXバリアントタンパク質とともに使用するための融合パートナーの非限定的な例には(限定されないが)、スプライシング因子(例えば、RSドメイン)、タンパク質翻訳構成要素(例えば、翻訳開始、伸長、および/または放出因子、例えば、eIF4G)、RNAメチラーゼ、RNA編集酵素(例えば、RNAデアミナーゼ、例えば、AからI、および/またはCからUの編集酵素を含む、RNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR))、ヘリカーゼ、RNA結合タンパク質などが含まれる。異種ポリペプチドがタンパク質全体を含むことができるか、またはいくつかの事例では、タンパク質の断片(例えば、機能的ドメイン)を含むことができることが理解される。
いくつかの実施形態において、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、または490のうちのいずれか1つを含むCasXバリアントは、エンドヌクレアーゼ(例えば、SMG5およびSMG6などのタンパク質由来のRNase III、CRR22 DYWドメイン、Dicer、およびPIN(PilT N末端)ドメイン;RNA切断の刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、CPSF、CstF、CFIm、およびCFIIm);エキソヌクレアーゼ(例えば、XRN-1またはエキソヌクレアーゼT);デアデニラーゼ(例えば、HNT3);ナンセンス媒介型RNA分解に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、UPF1、UPF2、UPF3、UPF3b、RNP SI、Y14、DEK、REF2、およびSRm160);RNAの安定化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、PABP);翻訳の抑制に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、Ago2およびAgo4);翻訳の刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、Staufen);翻訳の調節に関与する(例えば、調節することができる)タンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、開始因子、伸長因子、放出因子などの翻訳因子、例えば、eIF4G);RNAのポリアデニル化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、PAP1、GLD-2、およびStar-PAP);RNAのポリウリジン化に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、CI D1および末端ウリジレートトランスフェラーゼ);RNA局在に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、IMP1、ZBP1、She2p、She3p、およびBicaudal-D由来);RNAの核保持に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、Rrp6);RNAの核外搬出に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、TAP、NXF1、THO、TREX、REF、およびAly);RNAスプライシングの抑制に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、PTB、Sam68、およびhnRNP A1);RNAスプライシングの刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、セリン/アルギニンリッチ(SR)ドメイン);転写効率の低減に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、FUS(TLS));ならびに転写の刺激に関与するタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、CDK7およびHIV Tat)を含む群から選択されるエフェクタードメインを含むが、これらに限定されない、過渡的であるか不可逆的であるか、直接であるか間接的であるかにかかわらず、ssRNAと相互作用することができる任意のドメイン(本開示の目的のために、分子内および/または分子間二次構造、例えば、ヘアピン、ステムループなどの二本鎖RNAデュプレックスを含む)の融合パートナーを含む。代替的に、エフェクタードメインは、エンドヌクレアーゼ;RNA切断を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン;エキソヌクレアーゼ;デアデニラーゼ;ナンセンス媒介型RNA分解活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン;RNAを安定化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン;翻訳を抑制することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン;翻訳を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン;翻訳を調節することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン(例えば、開始因子、伸長因子、放出因子などの翻訳因子、例えば、eIF4G);RNAをポリアデニル化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン;RNAをポリウリジン化することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン;RNA局在活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン;RNAの核保持が可能なタンパク質およびタンパク質ドメイン;RNA核外搬出活性を有するタンパク質およびタンパク質ドメイン;RNAスプライシングを抑制することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン;RNAスプライシングを刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン;転写効率を低減することができるタンパク質およびタンパク質ドメイン;ならびに転写を刺激することができるタンパク質およびタンパク質ドメインを含む群から選択され得る。別の好適な異種ポリペプチドは、WO2012/068627(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)により詳細に記載されるPUF RNA結合ドメインである。
CasXバリアントとの融合パートナーとして(全体またはその断片として)使用され得るいくつかのRNAスプライシング因子は、別個の配列特異的RNA結合モジュールおよびスプライシングエフェクタードメインを有する、モジュール機構を有する。例えば、セリン/アルギニンリッチ(SR)タンパク質ファミリーのメンバーは、エクソン封入を促進するpre-mRNAおよびC末端RSドメインにおいてエクソンスプライシングエンハンサー(ESE)に結合するN末端RNA認識モチーフ(RRM)を含有する。別の例として、hnRNPタンパク質hnRNP A1は、そのRRMドメインを介してエクソンスプライシングサイレンサー(ESS)に結合し、C末端グリシンリッチドメインを介してエクソン封入を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、2つの代替部位の間の調節配列に結合することによって、スプライス部位(ss)の代替使用を調節することができる。例えば、ASF/SF2が、ESEを認識してイントロン近位部位の使用を促進することができる一方で、hnRNP A1は、ESSに結合してスプライシングをイントロン遠隔部位の使用にシフトすることができる。かかる因子の1つの用途は、内因性遺伝子、特に疾患関連遺伝子の選択的スプライシングを調節するESFを生成することである。例えば、Bcl-x pre-mRNAは、2つの選択的5’スプライス部位を有する2つのスプライシングアイソフォームを産生して、反対の機能を有するタンパク質をコードする。長いスプライシングアイソフォームBcl-xLは、長命の分裂終了細胞内で発現される強力なアポトーシス阻害因子であり、多くのがん細胞内で上方調節され、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。短いアイソフォームBcl-xSは、アポトーシス促進アイソフォームであり、高いターンオーバー率で、細胞内で高レベルで発現される(例えば、リンパ球を分化する)。2つのBcl-xスプライシングアイソフォームの比率は、コアエクソン領域またはエクソン伸長領域のいずれか(すなわち、2つの選択的5’スプライス部位間)に位置する複数のcc要素によって調節される。さらなる例については、WO2010/075303(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
CasXバリアントとの使用のためのさらに好適な融合パートナーには、境界要素(例えば、CTCF)であるタンパク質(またはその断片)、末梢動員を提供するタンパク質およびその断片(例えば、Lamin A、Lamin Bなど)、およびタンパク質ドッキング要素(例えば、FKBP/FRB、Pill/Abylなど)が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、CasXバリアントで使用するための異種ポリペプチド(融合パートナー)は、細胞内局在化を提供し、すなわち、異種ポリペプチドは、細胞内局在化配列(例えば、核を標的とするための核局在シグナル(NLS)、融合タンパク質を核外に維持するための配列、例えば、核外輸送配列(NES)、融合タンパク質を細胞質に保持するための配列、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体を標的とするための葉緑体局在化シグナル、ER保持シグナルなど)を含む。いくつかの実施形態では、対象RNAガイドポリペプチドもしくは条件付きで活性なRNAガイドポリペプチドおよび/または対象CasX融合タンパク質がNLSを含まないため、そのタンパク質は核を標的としない(これは、例えば、標的核酸配列が細胞質ゾルに存在するRNAである場合、有利であり得る)。いくつかの実施形態では、融合パートナーは、追跡および/または精製を容易にするためのタグ(例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、mCherry、tdTomatoなど;ヒスチジンタグ、例えば、6XHisタグ;ヘマグルチニン(HA)タグ;FLAGタグ;Mycタグなど)を提供することができる(すなわち、異種ポリペプチドは、検出可能な標識である)。
いくつかの事例では、CasXバリアントタンパク質は、核局在化シグナル(NLS)を含む(それに融合される)。いくつかの事例では、CasXバリアントタンパク質は、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上、6つ以上、7つ以上、8つ以上のNLSに融合される。いくつかの事例では、1つ以上のNLS(2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のNLS)は、N末端および/もしくはC末端に、またはその近く(例えば、その50アミノ酸以内)に配置される。いくつかの事例では、1つ以上のNLS(2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のNLS)は、CasXバリアントのN末端に、またはその近く(例えば、50個のアミノ酸以内)に配置される。いくつかの事例では、1つ以上のNLS(2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のNLS)は、CasXバリアントのC末端に、またはその近く(例えば、その50アミノ酸以内)に配置される。いくつかの事例では、1つ以上のNLS(3つ以上、4つ以上、または5つ以上のNLS)は、N末端およびC末端の両方に、またはそれらの近く(例えば、それらの50アミノ酸以内)に配置される。いくつかの事例では、NLSはN末端に配置され、NLSはC末端に配置される。いくつかの事例では、参照またはCasXバリアントタンパク質は、1~10個のNLS(例えば、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、または2~5個のNLS)を含む(またはそれらに融合される)。いくつかの事例では、参照またはCasXバリアントタンパク質は、2~5個のNLS(例えば、2~4、または2~3個のNLS)を含む(またはそれらに融合される)。
NLSの非限定的な例には、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号217)を有するSV40ウイルスラージT抗原のNLS、ヌクレオプラスミン由来のNLS(例えば、配列KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号223)を有するヌクレオプラスミン二分NLS、アミノ酸配列PAAKRVKLD(配列番号224)またはRQRRNELKRSP(配列番号161)を有するc-myc NLS、配列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号162)を有するhRNPAl M9 NLS、インポーチン-アルファ由来のIBBドメインの配列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号163)、筋腫Tタンパク質の配列VSRKRPRP(配列番号164)およびPPKKARED(配列番号165)、ヒトp53の配列PQPKKKPL(配列番号166)、マウスc-abl IVの配列SALIKKKKKMAP(配列番号167)、インフルエンザウイルスNS1の配列DRLRR(配列番号168)およびPKQKKRK(配列番号169)、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列RKLKKKIKKL(配列番号170)、マウスMxlタンパク質の配列REKKKFLKRR(配列番号171)、ヒトポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼの配列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号172)、ステロイドホルモン受容体(ヒト)グルココルチコイドの配列RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号173)、ボルナ病ウイルスPタンパク質(BDV-P1)の配列PRPRKIPR(配列番号174)、C型肝炎ウイルス非構造タンパク質(HCV-NS5A)の配列PPRKKRTVV(配列番号175)、LEF1の配列NLSKKKKRKREK(配列番号176)、ORF57 simiraeの配列RRPSRPFRKP(配列番号177)、EBV LANAの配列KRPRSPSS(配列番号178)、A型インフルエンザタンパク質の配列KRGINDRNFWRGENERKTR(配列番号179)、ヒトRNAヘリカーゼA(RHA)の配列PRPPKMARYDN(配列番号180)、核小体RNAヘリカーゼIIの配列KRSFSKAF(配列番号181)、TUS-タンパク質の配列KLKIKRPVK(配列番号182)、インポーチン-アルファに関連する配列PKKKRKVPPPPAAKRVKLD(配列番号183)、HTLV-1のRexタンパク質由来の配列PKTRRRPRRSQRKRPPT(配列番号184)、Caenorhabditis elegansのEGL-13タンパク質由来の配列MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN(配列番号185)、ならびに配列KTRRRPRRSQRKRPPT(配列番号186)、RRKKRRPRRKKRR(配列番号187)、PKKKSRKPKKKSRK(配列番号188)、HKKKHPDASVNFSEFSK(配列番号189)、QRPGPYDRPQRPGPYDRP(配列番号190)、LSPSLSPLLSPSLSPL(配列番号191)、RGKGGKGLGKGGAKRHRK(配列番号192)、PKRGRGRPKRGRGR(配列番号193)、PKKKRKVPPPPAAKRVKLD(配列番号183)、およびPKKKRKVPPPPKKKRKV(配列番号194)に由来する配列が挙げられる。一般に、NLS(または複数のNLS)は、真核生物細胞の核内での参照またはCasXバリアント融合タンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有する。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技法によって行われ得る。例えば、検出可能なマーカーは、参照またはCasXバリアント融合タンパク質に融合されてもよく、これにより、細胞内の位置が可視化されるようになり得る。細胞核が細胞から単離される場合もあり、その後、その内容物が、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイによって分析され得る。核内での蓄積が間接的に決定される場合もある。
いくつかの事例では、CasXバリアント融合タンパク質は、「タンパク質形質導入ドメイン」またはPTD(別名、CPP(細胞透過性ペプチド))を含み、これは、タンパク質、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指す。小さい極性分子から大きい巨大分子に及び得る別の分子および/またはナノ粒子に結合したPTDは、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、または細胞質ゾルから細胞小器官内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの実施形態では、PTDは、CasXバリアント融合タンパク質のアミノ末端に共有結合している。いくつかの実施形態では、PTDは、CasXバリアント融合タンパク質のカルボキシル末端に共有結合している。いくつかの事例では、PTDは、好適な挿入部位でCasXバリアント融合タンパク質の配列の内部に挿入される。いくつかの事例では、CasXバリアント融合タンパク質は、1つ以上のPTD(例えば、2つ以上、3つ以上、4つ以上のPTD)を含む(それにコンジュゲートされる、それに融合される)。いくつかの事例では、PTDは、1つ以上の核局在化シグナル(NLS)を含む。PTDの例には、YGRKKRRQRRR(配列番号195)、RKKRRQRR(配列番号196)、YARAAARQARA(配列番号197)、THRLPRRRRRR(配列番号198)、およびGGRRARRRRRR(配列番号199)を含むHIV TATのペプチド形質導入ドメイン;細胞内への直接侵入に十分ないくつかのアルギニン(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、または10~50個のアルギニン(配列番号200))を含むポリアルギニン配列;VP22ドメイン(Zender et al.(2002)Cancer Gene Ther.9(6):489-96);Drosophila Antennapediaタンパク質形質導入ドメイン(Noguchi et al.(2003)Diabetes 52(7):1732-1737);切断型ヒトカルシトニンペプチド(Trehin et al.(2004)Pharm.Research 21:1248-1256);ポリリジン(Wender et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13003-13008);RRQRRTSKLMKR(配列番号201);トランスポータンGWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(配列番号202);KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA(配列番号203);およびRQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号204)が含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、PTDは、活性化可能なCPP(ACPP)である(Aguilera et al.(2009)Integr Biol(Camb)June;1(5-6):371-381)。ACPPは、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン(例えば、Glu9または「E9」)に接続されたポリカチオン性CPP(例えば、Arg9または「R9」)を含み、これは正味電荷をほぼ0に低減し、それによって細胞への付着および取り込みを阻害する。リンカーの切断時、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニンおよびその本来の接着性を局所的にアンマスクし、それ故にACPPを「活性化」して、膜を横断する。
いくつかの実施形態では、CasXバリアント融合タンパク質は、リンカーポリペプチド(例えば、1つ以上のリンカーポリペプチド)を介して内部に挿入された異種アミノ酸または異種ポリペプチド(異種アミノ酸配列)に連結されたCasXタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、CasXバリアント融合タンパク質は、リンカーポリペプチド(例えば、1つ以上のリンカーポリペプチド)を介してC末端および/またはN末端で異種ポリペプチド(融合パートナー)に連結され得る。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。タンパク質は、概ね可動性のスペーサーペプチドによって結合され得るが、他の化学結合は除外されない。好適なリンカーには、4アミノ酸~40アミノ酸長、または4アミノ酸~25アミノ酸長のポリペプチドが含まれる。これらのリンカーは、一般に、リンカーをコードする合成オリゴヌクレオチドを使用してタンパク質と共役させることによって生成される。ある程度の可動性を有するペプチドリンカーを使用することができる。好ましいリンカーが概ね可動性のペプチドをもたらす配列を有することを踏まえて、連結ペプチドは、実質的にいずれのアミノ酸配列も有し得る。グリシンおよびアラニンなどの小さいアミノ酸の使用は、可動性ペプチドの作製に有用である。かかる配列の作製は、当業者にとって慣例である。様々な異なるリンカーが市販されており、使用に好適であるとみなされている。リンカーポリペプチドの例には、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー(例えば、(GS)n、GSGGSn(配列番号205)、GGSGGSn(配列番号206)、およびGGGSn(配列番号207)を含み、ここで、nは少なくとも1の整数である)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、グリシン-プロリンポリマー、プロリンポリマー、およびプロリン-アラニンポリマーが挙げられる。リンカーの例は、GGSG(配列番号208)、GGSGG(配列番号209)、GSGSG(配列番号210)、GSGGG(配列番号211)、GGGSG(配列番号212)、GSSSG(配列番号213)、GPGP(配列番号214)、GGP、PPP、PPAPPA(配列番号215)、PPPGPPP(配列番号216)などを含むが、これらに限定されないアミノ酸配列を含むことができる。当業者であれば、上記のいずれかの要素にコンジュゲートされたペプチドの設計がすべてまたは部分的に可動性のリンカーを含むことができ、これにより、リンカーが、可動性リンカーのみならず、可動性の低い構造を与える1つ以上の部分も含むことができるようになることを認識するであろう。
V.PCSK9遺伝子の改変のためのシステムおよび方法
本明細書に提供されるCRISPRタンパク質、ガイド核酸、およびそれらのバリアントは、治療、診断、および研究を含む様々な用途に有用である。いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子を編集するための方法を達成するために、プログラム可能なCasX:gNAシステムが本明細書に提供される。本明細書に提供されるCasX:gNAシステムのプログラム可能な性質は、PCSK9遺伝子の標的核酸配列内の所定の目的とする1つ以上の領域で所望の効果(ニッキング、切断、修復など)を達成するための正確な標的を可能にする。いくつかの実施形態において、変異、例えば、高コレステロール血症または常染色体優性高コレステロール血症をもたらす優性突然変異を含む対象におけるPCSK9タンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトすることが望ましくあり得る。「ノックアウト」という用語は、遺伝子の除去または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトされる可能性がある。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係または異種の配列で置き換えることによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子またはその遺伝子産物の発現の低下を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が減弱され得るか、タンパク質レベルが低下するかまたは排除され得る。かかる実施形態において、PCSK9タンパク質またはPCSK9調節領域をコードする遺伝子の一部に対して特異的な標的化配列を有するgNAが使用され得る。使用されるCasXタンパク質およびgNAに応じて、その事象が切断事象である場合があり、発現のノックダウン/ノックアウトを可能にし得る。いくつかの実施形態では、PCSK9遺伝子発現は、ランダム挿入または欠失(インデル)を導入することによって、例えば、不正確な非相同DNA末端結合(NHEJ)修復経路を利用することによって破壊または排除され得る。かかる実施形態では、PCSK9の標的化領域は、PCSK9遺伝子のコード配列(エクソン)を含み、そのためコード配列内でヌクレオチドを挿入または削除することがフレームシフト変異を生成し得る。このアプローチはまた、イントロンなどの非コード領域または調節領域に使用して、PCSK9遺伝子の発現を妨害することができる。他の実施形態において、本開示は、PCSK9遺伝子における変異を修正するためのシステムおよび方法を提供し、修正配列は、gNAの標的化配列の設計で、またはドナー鋳型の導入で、選択された位置に挿入または欠失を導入することによってノックインされ、以下でより完全に記載される。
本明細書に提供されるCRISPRタンパク質、ガイド核酸、およびそれらのバリアントは、治療、診断、および研究を含む様々な用途に有用である。いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子を編集するための方法を達成するために、プログラム可能なCasX:gNAシステムが本明細書に提供される。本明細書に提供されるCasX:gNAシステムのプログラム可能な性質は、PCSK9遺伝子の標的核酸配列内の所定の目的とする1つ以上の領域で所望の効果(ニッキング、切断、修復など)を達成するための正確な標的を可能にする。いくつかの実施形態において、変異、例えば、高コレステロール血症または常染色体優性高コレステロール血症をもたらす優性突然変異を含む対象におけるPCSK9タンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトすることが望ましくあり得る。「ノックアウト」という用語は、遺伝子の除去または遺伝子の発現を指す。例えば、遺伝子は、リーディングフレームの破壊につながるヌクレオチド配列の欠失または付加のいずれかによってノックアウトされる可能性がある。別の例として、遺伝子は、遺伝子の一部を無関係または異種の配列で置き換えることによってノックアウトされ得る。本明細書で使用される「ノックダウン」という用語は、遺伝子またはその遺伝子産物の発現の低下を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能が減弱され得るか、タンパク質レベルが低下するかまたは排除され得る。かかる実施形態において、PCSK9タンパク質またはPCSK9調節領域をコードする遺伝子の一部に対して特異的な標的化配列を有するgNAが使用され得る。使用されるCasXタンパク質およびgNAに応じて、その事象が切断事象である場合があり、発現のノックダウン/ノックアウトを可能にし得る。いくつかの実施形態では、PCSK9遺伝子発現は、ランダム挿入または欠失(インデル)を導入することによって、例えば、不正確な非相同DNA末端結合(NHEJ)修復経路を利用することによって破壊または排除され得る。かかる実施形態では、PCSK9の標的化領域は、PCSK9遺伝子のコード配列(エクソン)を含み、そのためコード配列内でヌクレオチドを挿入または削除することがフレームシフト変異を生成し得る。このアプローチはまた、イントロンなどの非コード領域または調節領域に使用して、PCSK9遺伝子の発現を妨害することができる。他の実施形態において、本開示は、PCSK9遺伝子における変異を修正するためのシステムおよび方法を提供し、修正配列は、gNAの標的化配列の設計で、またはドナー鋳型の導入で、選択された位置に挿入または欠失を導入することによってノックインされ、以下でより完全に記載される。
いくつかの実施形態において、PCSK9標的核酸の改変のために本明細書に提供されるCasX:gNAシステムは、表3、5、6、7、もしくは9に示される配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、もしくは490、またはそれに対して少なくとも60%同一、少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、もしくは少なくとも99.5%同一のバリアント配列を含み、gNA足場は、表2の配列またはそれに対して少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、少なくとも99.5%同一の配列を含み、gNAは、配列番号247~303、315~436、612~2100、もしくは2286~13861の標的化配列、またはそれと少なくとも65%同一、少なくとも70%同一、少なくとも75%同一、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、もしくは少なくとも95%同一であり、15~30個のアミノ酸を有する配列を含む。
他の実施形態において、本開示は、前述のCasXバリアントタンパク質およびgNAをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを提供する。いくつかの事例では、CasX:gNAシステムは、ドナー鋳型核酸をさらに含み、ドナー鋳型は、宿主細胞のHDRまたはHITI修復機構によって挿入することができる。実施形態において、ドナー鋳型は、PCSK9エクソン、PCSK9イントロン、PCSK9イントロン-エクソン接合部、およびPCSK9調節要素、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるPCSK9遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含むことができる。実施形態において、ドナー鋳型は、配列番号33の全部または一部をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、例えば、ノックダウン/ノックアウト改変では、ドナー鋳型配列は、組換えが所望されるPCSK9ゲノム配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、または99.9%の配列同一性を有し、それによって挿入で、非機能的PCSK9タンパク質の発現が、PCSK9遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%減少するように、PCSK9遺伝子産物の発現が減少または排除される。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、PCSK9遺伝子の変異を修正する配列を含み、挿入で、細胞集団による機能的PCSK9タンパク質の発現は、PCSK9遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%増加される。他の実施形態において、修正ドナー鋳型の挿入は、細胞のPCSK9遺伝子を改変し、それによって、改変された細胞の少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が、検出可能なレベルの機能的PCSK9を発現する。いくつかの実施形態において、修正ドナー鋳型の挿入は、細胞のPCSK9遺伝子を改変し、それによって、改変された細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%が、検出可能なレベルの非機能的PCSK9タンパク質を発現しない。
他の実施形態において、ドナー鋳型は、PCSK9遺伝子から切除される変異エクソン、例えば、2つ以上の連続するエクソンを短縮する配列を含み、2つ以上の連続するエクソンの間に介在するイントロン、またはエクソンと短縮された合成イントロンとを含むcDNAをさらに含むことができる。ドナー鋳型は、短い一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、あるいは長い一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドであることができる。ドナー鋳型配列は、切断部位の5’および3’側に2つの相同領域(「相同アーム」)によって隣接する配列を含み、これによって、標的DNA領域と2つの隣接配列との間の相同性指向修復が、標的領域にドナー鋳型の挿入をもたらす。PCSK9変異が複数のエクソンにまたがるこれらの場合、本開示の方法は、ドナー鋳型におけるエクソン間に短縮された長さの合成イントロン配列を含むようにも最適化し得る十分な長さのドナー鋳型を使用して、PCSK9遺伝子座の適切な発現およびプロセシングを確実にすることを企図する。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約10個、少なくとも約50個、少なくとも約100個、または少なくとも約200個、または少なくとも約300個、または少なくとも約400個、または少なくとも約500個、または少なくとも約600個、または少なくとも約700個、または少なくとも約800個、または少なくとも約900個、または少なくとも約1000個、または少なくとも約10,000個、または少なくとも約15,000個のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約10~約15,000個のヌクレオチド、または少なくとも約100~約10,000個のヌクレオチド、または少なくとも約400~約8,000個のヌクレオチド、または少なくとも約600~約5000個のヌクレオチド、または少なくとも約1000~約2000個のヌクレオチドを含む。ドナー鋳型配列は、ゲノム配列と比較してある特定の配列相違、例えば、制限部位、ヌクレオチド多型、選択可能なマーカー(例えば、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など)などを含み得、これらは、切断部位でのドナー核酸の挿入の成功を評価するために使用され得るか、またはいくつかの事例では、他の目的のために(例えば、標的とされたゲノム遺伝子座での発現を示すために)使用され得る。代替的に、これらの配列相違には、マーカー配列の除去のために後に活性化することができる、FLP、loxP配列などの隣接組換え配列が含まれ得る。
様々な戦略および方法を用いて、本明細書に提供されるCasX:gNAシステムを使用して細胞における標的核酸配列を改変することができる。本明細書で使用される場合、「改変すること」には、切断、ニッキング、編集、削除、ノックイン、ノックアウト、修復/修正、エクソンスキッピングなどが含まれるが、これらに限定されない。利用されるCasXタンパク質およびgNAに応じて、編集事象は、切断事象とそれに続くランダムな挿入もしくは欠失(インデル)または他の変異(例えば、1つ以上のヌクレオチドの置換、重複、または逆位)の導入であり得、例えば、不正確な非相同DNA末端結合(NHEJ)修復経路を利用することによって、例えば、フレームシフト変異を生じ得る。代替的に、編集事象は、切断事象とそれに続く相同性指向修復(HDR)、相同性非依存性標的化組み込み(HITI)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、一本鎖アニーリング(SSA)、または塩基除去修復(BER)であり得、標的核酸配列の改変をもたらす。
一実施形態において、本開示は、細胞集団における1つ以上の変異を含むPCSK9遺伝子の標的核酸配列を改変する方法を提供し、本方法は、集団の各細胞に、i)本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか1つのCasXとgNAとを含むCasX:gNAシステム、ii)本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか1つのCasXと、gNAと、ドナー鋳型とを含むCasX:gNAシステム、iii)CasXとgNAとをコードし、任意選択的にドナー鋳型を含む核酸、iv)レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、および単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターからなる群から選択され、上記(iii)の核酸を含むベクター、v)本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステムを含むVLP、またはvi)(i)~(v)のうちの2つ以上の組み合わせを導入することを含み、gNAによって標的化される細胞の標的核酸配列は、CasXタンパク質によって改変される。本方法のいくつかの実施形態において、細胞集団の少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、または少なくとも10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、またはそれ以上のPCSK9標的核酸が、改変される。本方法のいくつかの実施形態において、細胞集団におけるPCSK9遺伝子は、非機能的PCSK9タンパク質の発現が、PCSK9遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%減少されるように改変される。本方法の他の実施形態において、細胞集団のPCSK9遺伝子が改変され、それによって、改変された細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%が検出可能なレベルの非機能的PCSK9タンパク質を発現しない。
本方法の一実施形態において、CasX:gNAシステムのCasXおよびgNAは、RNPとして細胞に導入される。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の従来の方法、例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または化学的に使用して、本明細書に記載のベクター、またはプラスミドとしてのベクターによって改変される細胞に導入することができる。本方法のいくつかの実施形態では、改変される細胞は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される。本方法の他の実施形態では、改変される細胞は、ヒト細胞である。本方法のいくつかの実施形態において、細胞集団の改変は、対象においてインビボで生じ、対象は、げっ歯類、マウス、ラット、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される。本方法の他の実施形態において、細胞集団の改変は、エクスビボで生じる。本方法のいくつかの実施形態において、改変される細胞集団は、前駆細胞、造血幹細胞、および多能性幹細胞からなる群から選択される。本方法の他の実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞である。本方法のいくつかの実施形態において、改変される細胞は、肝細胞、もしくは腸、腎臓、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、または内皮などの動脈壁の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、当該細胞を投与される対象に対して自己である。本方法の他の実施形態では、細胞集団は、当該細胞を投与される対象に対して同種異系である。
本方法のいくつかの実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子の1つ以上の一塩基多型(SNP)を含む配列に相補的である。他の実施形態において、gNAの標的化配列は、PCSK9遺伝子のエクソンスプライシングエンハンサーの配列に相補的である。
標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態において、標的核酸配列は、PCSK9遺伝子の全部または一部を含む。いくつかの実施形態において、改変されるPCSK9遺伝子は、配列番号33の配列の全部または一部をコードするポリヌクレオチドに対応する野生型配列を含むか、またはヒトゲノムのchr1:55,039,476~55,064,853(GRCh38/hg38)にまたがるポリヌクレオチド配列を含む(表記は、第1染色体の55,039,476bpで開始して55,064,853bpまでである第1染色体(chr1)を指す(ホモサピエンス更新注釈リリース109.20190905、GRCh38.p13)(NCBI)。本方法のいくつかの実施形態において、gNAの標的化配列は、エクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8、エクソン9、エクソン10、エクソン11、およびエクソン12からなる群から選択されるPCSK9エクソンの配列に相補的である。
標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態において、標的核酸配列を改変することは、標的核酸をニッキングして標的核酸配列に一本鎖切断を導入することを含み、PCSK9遺伝子の改変は、変異、挿入、または欠失を導入することを含む。いくつかの実施形態において、改変することは、標的核酸配列を切断して標的核酸に二本鎖切断を導入することを含み、PCSK9遺伝子の改変は、野生型配列と比較して、1つ以上のヌクレオチドの変異、挿入、または欠失を導入することを含む。いくつかの実施形態において、本方法によって修正される変異は、機能獲得型変異である。他の実施形態において、本方法によって修正される変異は、機能喪失型変異である。いくつかの事例において、改変されるPCSK9タンパク質は、PCSK9タンパク質の機能を破壊する変異を含む。1つ以上の変異を修正する方法のいくつかの実施形態において、改変することは、細胞集団におけるPCSK9遺伝子の変異の修正または代償をもたらし、それによって機能的PCSK9タンパク質が細胞によって発現される。本方法のいくつかの実施形態において、細胞集団による機能的PCSK9タンパク質の発現は、PCSK9遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%増加される。
標的核酸配列を改変する方法のいくつかの実施形態において、PCSK9遺伝子を改変することは、CasX:gNA複合体と標的核酸配列との結合を含む。いくつかの実施形態において、CasXは、gNAおよび標的核酸配列に結合する能力を保持する、触媒的に不活性なCasX(dCasX)タンパク質である。例えば、標的核酸配列は、変異を含むPCSK9配列を含み、dCasX:gRNA複合体と標的配列との結合は、変異体PCSK9対立遺伝子の転写を妨害または抑制する。いくつかの実施形態において、dCasXは、配列番号1のCasXタンパク質に対応する残基D672、E769、および/もしくはD935、または配列番号2のCasXタンパク質に対応するD659、E756および/もしくはD922に変異を含む。前述のいくつかの実施形態において、CasX参照タンパク質における変異は、その残基におけるアラニンまたはグリシンの置換である。
核酸(例えば、ドナーポリヌクレオチド配列を含む核酸、CasXタンパク質および/もしくはgNAをコードする1つ以上の核酸、またはそれを含むベクター)を細胞に導入する方法は、当技術分野で知られており、任意の都合のよい方法を使用して、核酸(例えば、発現構築物)を細胞に導入することができる。好適な方法には、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介トランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、ドナーDNAに融合されるか、またはそれを動員する細胞透過性CasXタンパク質による直接付加、細胞圧縮、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などが含まれる。
本方法のいくつかの実施形態において、CasXは、RNA配列として提供することができる。RNAは、直接化学合成によって提供することができるか、またはDNA(例えば、CasXタンパク質バリアントをコードする配列を含むmRNAをコードするDNA)からインビトロで転写され得る。合成されると、RNAは、CasXタンパク質への翻訳のために、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびトランスフェクションを含むがこれらに限定されない核酸を細胞に導入するための周知の技術のうちのいずれかによって、細胞に導入され得る。
核酸は、十分に開発されたトランスフェクション技術、および市販のQiagenのTransMessenger(登録商標)試薬、StemgentのStemfect(商標)RNAトランスフェクションキット、およびMirus Bio LLCのTransIT(登録商標)-mRNAトランスフェクションキット、Lonzaヌクレオフェクション、Maxagenエレクトロポレーションなどを使用して細胞に導入され得る。
本開示のCasX:gNAシステムをコードする配列(および任意選択的にドナー鋳型配列)を含む組換え発現ベクターを細胞にインビトロ条件下で導入することは、任意の好適な培地ならびに細胞の生存およびCasX:gNAの産生を促進する任意の好適な培養条件下で生じることができる。組換え発現ベクターを標的細胞に導入することは、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで実行することができる。本方法のいくつかの実施形態において、ベクターは、標的宿主細胞に直接的に提供され得る。例えば、細胞は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXとgNAとをコードする核酸を有し、任意選択的に、ベクターが細胞に取り込まれるようなドナー鋳型配列を有する、ベクターと接触させ得る。プラスミドである核酸ベクターと細胞を接触させるための方法には、エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、トランスダクション、およびリポフェクションが含まれ、当技術分野で周知である。ウイルスベクター送達では、細胞は、対象ウイルス発現ベクター、およびCasXとgNAとをコードする核酸、ならびに任意選択的にドナー鋳型を含むウイルス粒子と接触させることができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであり、AAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV44.9、AAV-Rh74、またはAAVRh10から選択される。他の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。レトロウイルス、例えばレンチウイルスは、本開示の方法における使用に好適であり得る。一般的に使用されるレトロウイルスベクターは「欠陥」があり、例えば、生産的感染に必要であるウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製には、パッケージング細胞株での増殖を必要する。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によってウイルスカプシドにパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質(同種指向性、両種指向性、または異種指向性)を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞のウイルス粒子の特異性(マウスおよびラットでは同種指向性、ヒト、イヌおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型では両種指向性、ならびにマウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型では異種指向性)を決定する。適切なパッケージング細胞株を使用して、細胞がパッケージングされたウイルス粒子によって標的とされることを確実にすることができる。対象ベクター発現ベクターをパッケージング細胞株に導入する方法、およびパッケージング株によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当技術分野で周知であり、米国特許第5,173,414号、Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)、Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)、Hermonat & Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984)、およびSamulski et al.,J.Virol.63:03822-3828(1989)が含まれる。核酸はまた、直接マイクロインジェクション(例えば、RNAの注入)によって導入することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、対象に、治療有効用量で投与される。前述において、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される。特定の実施形態において、対象はヒトである。本方法のいくつかの実施形態において、ベクターは、対象に、少なくとも約1×105ベクターゲノム/kg(vg/kg)、少なくとも約1×106vg/kg、少なくとも約1×107vg/kg、少なくとも約1×108vg/kg、少なくとも約1×109vg/kg、少なくとも約1×1010vg/kg、少なくとも約1×1011vg/kg、少なくとも約1×1012vg/kg、少なくとも約1×1013vg/kg、少なくとも約1×1014vg/kg、少なくとも約1×1015vg/kg、または少なくとも約1×1016vg/kgの用量で投与される。本方法の他の実施形態において、VLPは、対象に、少なくとも約1×105粒子/kg、少なくとも約1×106粒子/kg、少なくとも約1×107粒子/kg、少なくとも約1×108粒子/kg、少なくとも約1×109粒子/kg、少なくとも約1×1010粒子/kg、少なくとも約1×1011粒子/kg、少なくとも約1×1012粒子/kg、少なくとも約1×1013粒子/kg、少なくとも約1×1014粒子/kg、少なくとも約1×1015粒子/kg、または少なくとも約1×1016粒子/kgの用量で投与される。
ベクターまたはVLPは、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、本開示のCasX:gNAシステムを含むAAVベクターであり、対象の片方または両方の眼への眼内注射を介して送達される。
他の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasX:gNAシステムを使用して標的核酸配列を改変する方法を提供し、本方法は、標的核酸配列を追加のCRISPRタンパク質、または追加のCRISPRタンパク質をコードするポリヌクレオチドと接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、追加のCRISPRタンパク質は、CasX:gNAシステムのCasXとは異なる配列を有するCasXタンパク質である。いくつかの実施形態において、追加のCRISPRタンパク質は、CasXタンパク質ではなく、例えば、追加のCRISPRタンパク質は、Cpf1、Cas9、Cas12a、またはCas13aであることができる。
本明細書に記載のCasX:gNAシステムおよび方法を使用して、PCSK9における変異が疾患に関連する様々な細胞、例えば、肝臓、腸、腎臓、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、または内皮などの動脈壁の細胞を操作して、変異を含むPCSK9が修正またはノックアウトされる1つの細胞または複数の細胞を生じることができる。したがって、このアプローチを使用して、PCSK9関連障害を有する対象における適用のために細胞を改変することができ、例えば、常染色体優性高コレステロール血症(ADH)、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、高脂質血症、低密度リポタンパク質(LDL)レベルの上昇、LDLコレステロールレベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、2型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症(AMD)、またはそれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
VI.ポリヌクレオチドおよびベクター
別の態様において、本開示は、1つ以上の変異を含むPCSK9遺伝子の編集に効用を有するクラス2のV型ヌクレアーゼとgNAとをコードするポリヌクレオチドに関する。追加の実施形態において、本開示は、PCSK9遺伝子の一部または全部をコードするドナー鋳型ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの事例において、ドナー鋳型のPCSK9遺伝子は、標的核酸におけるPCSK9遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするための変異または異種配列を含む。他の事例において、ドナー鋳型は、機能的PCSK9遺伝子またはその一部をノックインするための修正配列を含む。なおさらなる実施形態において、本開示は、本明細書に記載のCasXタンパク質とCasX gNAとをコードするポリヌクレオチド、ならびに実施形態のドナー鋳型を含むベクターを提供する。
別の態様において、本開示は、1つ以上の変異を含むPCSK9遺伝子の編集に効用を有するクラス2のV型ヌクレアーゼとgNAとをコードするポリヌクレオチドに関する。追加の実施形態において、本開示は、PCSK9遺伝子の一部または全部をコードするドナー鋳型ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの事例において、ドナー鋳型のPCSK9遺伝子は、標的核酸におけるPCSK9遺伝子をノックダウンまたはノックアウトするための変異または異種配列を含む。他の事例において、ドナー鋳型は、機能的PCSK9遺伝子またはその一部をノックインするための修正配列を含む。なおさらなる実施形態において、本開示は、本明細書に記載のCasXタンパク質とCasX gNAとをコードするポリヌクレオチド、ならびに実施形態のドナー鋳型を含むベクターを提供する。
いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号1~3の参照CasXをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。他の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を提供し、表3、5、6、7、および9に示される配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、および490、または表3、5、6、7、および9に示される配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、および490の配列に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の配列同一性を有する配列のCasXタンパク質バリアントを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのgNA配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、表1もしくは表2に示される配列番号4~16もしくは2101~2285のgNA足場配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%の配列同一性を有する配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号2101~2285からなる群から選択されるgNA足場配列、またはそれと少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%の配列同一性を有する配列をコードする。他の実施形態において、本開示は、配列番号247~303、315~436、612~2100、もしくは2286~13861の標的化配列ポリヌクレオチド、またはそれに対して少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、もしくは少なくとも約95%の同一性を有する配列、ならびに標的化配列をコードするDNAを含むgNAを提供する。いくつかの実施形態では、足場配列をコードするポリヌクレオチドは、CasXおよび標的配列に結合することができるgNAがsgNAまたはdgNAとして発現され得るように、標的化配列をコードする配列をさらに含む。他の実施形態において、本開示は、1つ以上の変異を含むPCSK9遺伝子とハイブリダイズする足場配列と標的化配列とを有するgNA配列をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの事例において、ポリヌクレオチド配列は、エクソン1、エクソン2、エクソン3、エクソン4、エクソン5、エクソン6、エクソン7、エクソン8、エクソン9、エクソン10、エクソン11、およびエクソン12からなる群から選択されるPCSK9遺伝子エクソンとハイブリダイズする足場配列と標的化配列とのgNAをコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、PCSK9イントロンとハイブリダイズする標的化配列を含むgNA配列をコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、PCSK9イントロン-エクソン接合部とハイブリダイズする標的化配列を含むgNA配列をコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、PCSK9遺伝子の遺伝子間領域とハイブリダイズする標的化配列を含むgNA配列をコードする。他の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、PCSK9調節領域とハイブリダイズする標的化配列を含むgNAをコードする。いくつかの事例において、PCSK9調節領域は、PCSK9プロモーターまたはエンハンサーである。いくつかの事例において、PCSK9調節領域は、PCSK9転写開始部位の5’、PCSK9転写開始の3’、またはPCSK9イントロンに位置する。いくつかの事例において、PCSK9調節領域は、PCSK9遺伝子のイントロンにある。他の事例において、PCSK9調節領域は、PCSK9遺伝子の5’UTRを含む。さらに他の事例において、PCSK9調節領域は、PCSK9遺伝子の3’UTRを含む。いくつかの事例において、PCSK9配列は、野生型配列である。他の事例において、PCSK9配列は、1つ以上の変異を含む。
他の実施形態では、本開示は、ドナー鋳型核酸であって、ドナー鋳型が、遺伝子編集が意図される標的核酸の標的配列と相同性を有するが完全には同一性でないヌクレオチド配列を含む、ドナー鋳型核酸を提供する。ドナー鋳型配列は、典型的には、それが置換するゲノム配列と同一ではなく、ゲノム配列に対して1つ以上の単一塩基変化、挿入、欠失、逆位、または転位を含み得るが、但し、相同性指向修復を支援するのに十分な標的配列との相同性を有するか、またはドナー鋳型が相同アームを有することを条件とし、挿入時に、変異を含むエクソンの切り出しをもたらし、それによってPCSK9遺伝子のリーディングフレームが回復されるか、またはドナー鋳型が挿入で変異を修正するように野生型配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型は、タンパク質標的核酸とハイブリダイズし、CasXによって導入される切断部位に挿入される配列を有し、遺伝子配列の改変をもたらす。PCSK9変異が複数のエクソンにまたがるこれらの場合、本開示は、ドナー鋳型におけるエクソン間に短縮された長さの合成イントロン配列を含むようにも最適化し得る十分な長さのドナー鋳型が、PCSK9遺伝子座の適切な発現およびプロセシングを確実にすることを企図する。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約10個、少なくとも約50個、少なくとも約100個、または少なくとも約200個、または少なくとも約300個、または少なくとも約400個、または少なくとも約500個、または少なくとも約600個、または少なくとも約700個、または少なくとも約800個、または少なくとも約900個、または少なくとも約1000個、または少なくとも約10,000個、または少なくとも約15,000個のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも約10~約15,000個のヌクレオチド、または少なくとも約100~約10,000個のヌクレオチド、または少なくとも約400~約8,000個のヌクレオチド、または少なくとも約600~約5000個のヌクレオチド、または少なくとも約1000~約2000個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、一本鎖DNA鋳型または一本鎖RNA鋳型である。他の実施形態では、ドナー鋳型は、二本鎖DNA鋳型である。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの参照CasX、CasXバリアント、またはgNAをそれらのバリアントを含めてコードするポリヌクレオチド配列を産生する方法、ならびにポリヌクレオチド配列によって発現またはRNA転写されるタンパク質を発現させる方法に関する。一般に、方法は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXまたはgNAをコードするポリヌクレオチド配列を産生することと、コード遺伝子を宿主細胞にとって適切な発現ベクターに組み込むことと、を含む。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのコードされたCasXまたはgNAの産生では、方法は、適切な宿主細胞を、コードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換することと、宿主細胞を、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの得られるCasXまたはgNAが形質転換された宿主細胞で発現もしくは転写されることを引き起こすか、または可能にする条件下で培養することと、それによって、本明細書に記載の方法(例えば、後述の実施例)または当該技術分野で既知の標準精製法によって回収されるCasXまたはgNAを産生することと、を含む。本開示のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製するために、分子生物学における標準組換え技法が使用される。
本開示に従い、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの参照CasX、CasXバリアント、またはgNAをコードする核酸配列を使用して、適切な宿主細胞における発現を導く組換えDNAを生成する。いくつかのクローニング戦略が本開示を行う際に好適であり、それらの多くは、本開示の組成物をコードする遺伝子またはその相補体を含む構築物を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、クローニング戦略は、組成物の発現のために宿主細胞を形質転換するために使用される参照CasX、CasXバリアント、またはgNAをコードするヌクレオチドを含む構築物をコードする遺伝子を作製するために使用される。
1つのアプローチでは、参照CasX、CasXバリアント、またはgNAをコードするDNA配列を含む構築物が最初に調製される。かかる構築物を調製するための例示的な方法は、実施例に記載されている。次いで、構築物を使用して、CasX、またはgNAの場合には、タンパク質構築物の発現および回収のための原核生物または真核生物宿主細胞などの宿主細胞を形質転換するために好適な発現ベクターを作製する。所望される場合、宿主細胞は、E.coliである。他の実施形態において、宿主細胞は、真核生物細胞である。真核生物宿主細胞は、BHK細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、Lenti-X HEK293細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、ハイブリドーマ細胞、NIH3T3細胞、COS、HeLa、CHO、酵母細胞、または組換え産物の産生のために好適な当技術分野で知られている他の真核生物細胞から選択することができる。発現ベクターの作製、宿主細胞の形質転換、ならびに参照CasX、CasXバリアント、またはgNAの発現および回収のための例示的な方法は、実施例に記載されている。
参照CasX、CasXバリアント、またはgNA構築物をコードする遺伝子は、完全に合成的に、または実施例でより完全に記載されている方法を含む、制限酵素媒介クローニング、PCR、およびオーバーラップ伸長などの酵素プロセスと組み合わせた合成のいずれかによる、1つ以上のステップで作製することができる。本明細書に開示される方法を使用して、例えば、所望の配列の様々な構成要素(例えば、CasXおよびgNA)遺伝子をコードするポリヌクレオチドの配列を連結することができる。ポリペプチド組成物をコードする遺伝子は、標準遺伝子合成技法を使用してオリゴヌクレオチドから組み立てられる。
いくつかの実施形態において、CasXタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化される。このタイプの最適化は、コードするヌクレオチド配列の変異を伴い、同じCasXタンパク質をコードしながら、意図する宿主生物または細胞のコドン選択を模倣することができる。したがって、コドンは変化し得るが、コードされたタンパク質は変化しないままである。例えば、CasXタンパク質の対象とする標的細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化CasXをコードするヌクレオチド配列を使用することができる。別の非限定的な例として、対象とする宿主細胞がマウス細胞である場合、マウスコドン最適化CasXをコードするヌクレオチド配列を生成することができる。別の非限定的な例として、対象とする宿主細胞が植物細胞である場合、植物コドン最適化CasXタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列を生成することができる。別の非限定的な例として、対象とする宿主細胞が昆虫細胞である場合、昆虫コドン最適化CasXタンパク質をコードするヌクレオチド配列を生成することができる。参照CasX、CasXバリアント、またはgNAの産生に利用される宿主細胞に適切なコドン使用頻度およびアミノ酸組成を最適化するアルゴリズムを使用して遺伝子設計を行うことができる。本開示の一方法では、構築物の構成要素をコードするポリヌクレオチドのライブラリが作製され、その後、上述のように組み立てられる。その後、結果として生じた遺伝子が組み立てられ、結果として生じた遺伝子を使用して、宿主細胞を形質転換し、本明細書に記載されるように、参照CasX、CasXバリアント、またはgNA組成物を産生および回収して、その特性を評価する。
いくつかの実施形態では、gNAをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、CasXタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素に作動可能に連結される。他の事例において、CasXおよびgNAをコードするヌクレオチドは連結され、単一の制御要素に操作可能に連結される。いくつかの事例では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの事例では、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。いくつかの事例では、転写制御要素(例えば、プロモーター)は、標的化された細胞型または標的化された細胞集団において機能的である。例えば、いくつかの事例では、転写制御要素は、真核生物細胞、例えば、ニューロン、脊髄運動ニューロン、オリゴデンドロサイト、またはグリア細胞において機能的であり得る。真核生物プロモーター(真核生物細胞において機能的なプロモーター)の非限定的な例には、EF1アルファプロモーター、EF1アルファコアプロモーター、前初期サイトメガロウイルス(CMV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来の長い末端反復(LTR)、ならびにマウスメタロチオネイン-I由来のプロモーターが含まれる。真核生物プロモーターのさらなる非限定的な例には、CMVプロモーター全長プロモーター、最小CMVプロモーター、ニワトリβ-アクチンプロモーター、hPGKプロモーター、HSV TKプロモーター、ミニTKプロモーター、ニューロン特異的発現をもたらすヒトシナプシンIプロモーター、ニューロンでの選択的発現のためのMecp2プロモーター、最小IL-2プロモーター、ラウス肉腫ウイルスエンハンサー/プロモーター(単一)、脾臓フォーカス形成ウイルスの長い末端反復(LTR)プロモーター、SV40プロモーター、SV40エンハンサーおよび初期プロモーター、TBGプロモーター:ヒトチロキシン結合グロブリン遺伝子(肝臓特異的)由来のプロモーター、PGKプロモーター、ヒトユビキチンCプロモーター、UCOEプロモーター(HNRPA2B1-CBX3のプロモーター)、ヒストンH2プロモーター、ヒストンH3プロモーター、U1a1核内低分子RNAプロモーター(226nt)、U1b2核内低分子RNAプロモーター(246nt)26、TTR最小エンハンサー/プロモーター、b-キネシンプロモーター、ヒトeIF4A1プロモーター、ROSA26プロモーター、およびグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーターが挙げられる。
適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルの十分に範囲内であり、それは、例えば、PCSK9遺伝子を改変するために、発現を制御することに関連する。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターも含み得る。発現ベクターは、発現を増幅するのに適切な配列も含み得る。発現ベクターは、CasXタンパク質に融合し、それ故に、キメラCasXタンパク質をもたらすことができる、精製または検出に使用され得るタンパク質タグ(例えば、6xHisタグ、血球凝集素タグ、蛍光タンパク質など)をコードするヌクレオチド配列も含み得る。
いくつかの実施形態において、gNAバリアントまたはCasXタンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター、構成的に活性なプロモーター、空間的に制限されるプロモーター(すなわち、転写制御要素、エンハンサー、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど)、または時間的に制限されるプロモーターに操作可能に連結される。他の実施形態において、gNAまたはCasXをコードする個々のヌクレオチド配列は、前述のプロモーターのカテゴリーのうちの1つに連結され、その後、以下に記載の従来の方法によって改変される細胞に導入される。
ある特定の実施形態では、好適なプロモーターは、ウイルスから得ることができ、したがって、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物もしくは真核生物を含む、任意の生物から得ることができる。好適なプロモーターを使用して、任意のRNAポリメラーゼ(例えば、pol I、pol II、pol III)による発現を駆動することができる。例示的なプロモーターには、SV40初期プロモーター、マウス乳がんウイルスの長い末端反復(LTR)プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、例えば、CMV前初期プロモーター領域(CMVIE)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、ヒトU6核内低分子プロモーター(U6)、増強されたU6プロモーター、ヒトHIプロモーター(HI)、POL1プロモーター、7SKプロモーター、tRNAプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、CasXおよびgNAをコードし、かつ任意選択的に、ドナー鋳型を含む1つ以上のヌクレオチド配列は各々、真核生物細胞で作動可能なプロモーターに(その制御下で)操作可能に連結される。誘導性プロモーターの例には、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、T3 RNAポリメラーゼプロモーター、イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)調節プロモーター、ラクトース誘導プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、誘導性プロモーターは、いくつかの実施形態では、ドキシサイクリン、エストロゲンおよび/またはエストロゲン類似体、IPTGなどを含むが、これらに限定されない分子によって調節することができる。
ある特定の実施形態では、使用に好適な誘導性プロモーターには、本明細書に記載されるか、または当業者に既知の任意の誘導性プロモーターが含まれ得る。誘導性プロモーターの例には、化学的/生化学的調節型および物理的調節型プロモーター、例えば、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター(例えば、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)応答性プロモーター、および他のテトラサイクリン応答性プロモーター系、例えば、テトラサイクリンリプレッサータンパク質(tetR)、テトラサイクリンオペレーター配列(tetO)、およびテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質(tTA)、ステロイド調節型プロモーター(例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体に基づくプロモーター、およびステロイド/レチノイド/甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーター)、金属調節型プロモーター(例えば、酵母、マウス、およびヒト由来のメタロチオネイン(金属イオンに結合し、封鎖するタンパク質)に由来するプロモーター)、病因調節型プロモーター(例えば、サリチル酸、エチレン、またはベンゾチアジアゾール(BTH)によって誘導される)、温度/熱誘導性プロモーター(例えば、ヒートショックプロモーター)、および光調節型プロモーター(例えば、植物細胞由来の光応答性プロモーター)が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの事例では、プロモーターは、空間的に制限されたプロモーター(すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど)であり、これにより、多細胞生物において、プロモーターが特定細胞のサブセットで活性(すなわち、「オン」)になる。空間的に制限されたプロモーターは、エンハンサー、転写制御要素、制御配列などとも称され得る。任意の簡便な空間的に制限されたプロモーターが標的とされる宿主細胞(例えば、真核生物細胞、原核生物細胞)において機能的である限り、そのプロモーターを使用することができる。
いくつかの事例では、プロモーターは、可逆的プロモーターである。可逆的誘導性プロモーターを含む好適な可逆的プロモーターは、当該技術分野で既知である。かかる可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物および原核生物から単離され得るか、またはそれらに由来し得る。第2の生物に使用するための第1の生物、例えば、第1の原核生物および第2の真核生物、第1の真核生物および第2の原核生物などに由来する可逆的プロモーターの改変は、当該技術分野で周知である。かかる可逆的プロモーター、およびかかる可逆的プロモーターに基づくが、追加の制御タンパク質も含むシステムには、アルコール調節型プロモーター(例えば、アルコールデヒドロゲナーゼI(alcA)遺伝子プロモーター、アルコールトランス活性化因子タンパク質(AlcR)に応答性のプロモーターなど)、テトラサイクリン調節型プロモーター(例えば、Tet活性化因子、Tetオン、Tetオフなどを含むプロモーターシステム)、ステロイド調節型プロモーター(例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーターシステム、ヒトエストロゲン受容体プロモーターシステム、レチノイドプロモーターシステム、甲状腺プロモーターシステム、エクジソンプロモーターシステム、ミフェプリストンプロモーターシステムなど)、金属調節型プロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーターシステムなど)、病原体関連調節型プロモーター(例えば、サリチル酸調節型プロモーター、エチレン調節型プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節型プロモーターなど)、温度調節型プロモーター(例えば、ヒートショック誘導性プロモーター(例えば、HSP-70、HSP-90、大豆ヒートショックプロモーターなど)、光調節型プロモーター、合成誘導性プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。
本開示の組換え発現ベクターは、本開示のCasXタンパク質およびgNAの頑強な発現を促進する要素も含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、ポリアデニル化シグナル(ポリ(A))、イントロン配列、またはウッドチャック肝炎転写後調節要素(WPRE)などの転写後調節要素のうちの1つ以上を含むことができる。例示的なポリ(A)配列には、hGHポリ(A)シグナル(短い)、HSV TKポリ(A)シグナル、合成ポリアデニル化シグナル、SV40ポリ(A)シグナル、β-グロビンポリ(A)シグナルなどが含まれる。当業者であれば、本明細書に記載の組換え発現ベクターへの包含に好適な要素を選択することができるであろう。
参照CasX、CasXバリアント、またはgNA配列をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに個別にクローニングすることができる。ベクターには、細菌プラスミド、ウイルスベクターなどが含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは、CasXタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。他の実施形態では、本開示は、CasXタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびCasX gNAをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの事例では、CasXタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列および/またはCasX gNAをコードするヌクレオチド配列は、選択した細胞型において作動可能なプロモーターに操作可能に連結される。他の実施形態では、CasXタンパク質バリアントをコードするヌクレオチド配列およびCasX gNAをコードするヌクレオチド配列は、別個のベクターに提供される。
いくつかの実施形態において、(i)ドナー鋳型が標的核酸(例えば、標的ゲノム)のPCSK9配列と相同性を有する、ドナー鋳型核酸のヌクレオチド配列、(ii)真核生物細胞などの標的細胞で操作可能であるプロモーターに操作可能に連結された標的化ゲノム(例えば、単一または二重ガイドRNAとして構成される)の標的PCSK9遺伝子座の配列とハイプリダイズする、CasX gNA(例えば、gRNA)をコードするヌクレオチド配列、および(iii)真核生物細胞などの標的細胞で操作可能であるプロモーターに操作可能に連結されたCasXタンパク質をコードするヌクレオチド配列、などの配列を含む1つ以上の組換え発現ベクターが、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ドナー鋳型を含み、CasX gNAとCasXタンパク質とをコードする配列は、異なる組換え発現ベクターにあり、他の実施形態において、1つ、2つ、または3つすべてのポリヌクレオチド配列(ドナー鋳型、CasX、およびgNA)は、同じ組換え発現ベクターにある。
核酸配列は、様々な手順によってベクターに挿入される。一般に、DNAは、当該技術分野で既知の技法を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター構成要素には、一般に、シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列のうちの1つ以上が含まれるが、これらに限定されない。これらの構成要素のうちの1つ以上を含む好適なベクターの構築は、当業者に既知の標準ライゲーション技法を用いる。かかる技法は当該技術分野で周知であり、科学文献および特許文献で十分に説明されている。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得、これらを組換えDNA手順に好都合に供することができ、ベクターの選択は、多くの場合、それが導入される宿主細胞に依存する。したがって、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在するベクターであり得、その複製は、染色体複製とは無関係であり、例えば、プラスミドである。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。好適な宿主細胞に導入されると、CasX PCSK9編集システムの発現は、当該技術分野で既知の任意の核酸またはタンパク質アッセイを使用して決定することができる。例えば、参照CasXまたはCasXバリアントの転写mRNAの存在は、ポリヌクレオチドの任意の領域に相補的なプローブを使用して、従来のハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンブロット分析)、増幅手順(例えば、RT-PCR)、SAGE(米国特許第5,695,937号)、およびアレイベースの技術(例えば、米国特許第5,405,783号、同第5,412,087号、および同第5,445,934号を参照されたい)によって検出および/または定量することができる。
本開示は、宿主細胞と適合性があり、宿主細胞によって認識され、かつポリペプチドの制御された発現またはRNAの転写のためにポリペプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結された複製配列および制御配列を含むプラスミド発現ベクターの使用を提供する。かかるベクター配列は、様々な細菌、酵母、ウイルスでよく知られている。使用することができる有用な発現ベクターには、例えば、染色体、非染色体、および合成DNA配列のセグメントが含まれる。「発現ベクター」とは、好適な宿主にポリペプチドをコードするDNAの発現をもたらすことができる好適な制御配列に作動可能に連結されたDNA配列を含むDNA構築物を指す。ベクターが選択した宿主細胞で複製可能であり、かつ実行可能であることが要件である。必要に応じて、低コピー数または高コピー数のベクターを使用することができる。ベクターの制御配列には、転写をもたらすためのプロモーター、かかる転写を制御するための任意のオペレーター配列、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。プロモーターは、選択した宿主細胞で転写活性を示し、かつ宿主細胞に対して相同または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る任意のDNA配列であり得る。
組換え発現ベクターは、様々な方法によって標的宿主細胞に送達することができ、以下でより完全に記載される。かかる方法には、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介トランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、ドナーDNAに融合されるか、またはそれを動員する細胞透過性CasXタンパク質による直接付加、細胞圧縮、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などが含まれる。
組換え発現ベクター配列は、エクスビボ、インビトロまたはインビボでの細胞のその後の感染および形質転換のために、ウイルスまたはウイルス様粒子(本明細書では「粒子」または「ビリオン」とも呼ばれる)にパッケージングすることができる。このような粒子またはビリオンは、典型的に、ベクターゲノムをカプシド化またはパッケージングするタンパク質を含む。好適な発現ベクターには、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスベクター(例えば、マウス白血病ウイルス)、脾臓壊死ウイルスに基づくウイルス発現ベクター、ならびにルース肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターなどが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の組換え発現ベクターは、組換えレトロウイルスベクターである。
AAVは、対象に投与するために調製される細胞のインビボまたはエクスビボのいずれかで、真核生物細胞などの細胞への送達のためにウイルスベクターを用いる状況下でヒト疾患を治療するのに役立つ小さい(20nm)非病原性ウイルスである。構築物、例えば、本明細書に記載されるCasXタンパク質および/またはCasX gNAの実施形態のいずれかをコードし、AAV逆方向末端反復(ITR)配列が隣接する構築物が生成され、それにより、AAVベクターのAAVウイルス粒子へのパッケージングが可能になる。
「AAV」ベクターとは、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を指し得る。この用語は、別途要求されない限り、全てのサブタイプ、血清型および偽型、ならびに天然型および組換え型の両方を包含する。本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、定義された抗血清とのカプシドタンパク質反応性に基づいて他のAAVによって特定され、かつそれらと区別されるAAVを指し、例えば、霊長類AAVの多くの既知の血清型が存在する。いくつかの実施形態では、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV44.9、AAV-Rh74(Rhesus macaque由来のAAV)、およびAAVRh10、ならびにこれらの血清型の改変されたカプシドから選択される。例えば、血清型AAV-2は、AAV-2のcap遺伝子からコードされたカプシドタンパク質と、同じAAV-2血清型由来の5’および3′ITR配列を含むゲノムとを含むAAVを指すために使用される。偽型AAVとは、1つの血清型由来のカプシドタンパク質と、第2の血清型の5′-3′ITRを含むウイルスゲノムとを含むAAVを指す。偽型rAAVは、カプシド血清型の細胞表面結合特性およびITR血清型と一致する遺伝的特性を有すると予想されるであろう。偽型組換えAAV(rAAV)は、当該技術分野で説明されている標準技法を使用して生成される。本明細書で使用される場合、例えば、rAAV1は、同じ血清型由来のカプシドタンパク質および5′-3′ITRの両方を有するAAVを指すために使用され得るか、または血清型1由来のカプシドタンパク質と、異なるAAV血清型、例えば、AAV血清型2由来の5′-3′ITRとを有するAAVを指し得る。本明細書に例示される各例について、ベクター設計および産生についての記述は、カプシドおよび5′-3′ITR配列の血清型を説明する。
「AAVウイルス」または「AAVウイルス粒子」とは、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質(好ましくは、野生型AAVのカプシドタンパク質の全てによる)およびカプシド化されたポリヌクレオチドからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド(すなわち、哺乳動物細胞に送達される野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド)をさらに含む場合、それは典型的に「rAAV」と呼ばれる。例示的な異種ポリヌクレオチドは、CasXタンパク質および/またはsgRNA、ならびに任意選択的に、本明細書に記載される実施形態のいずれかのドナー鋳型を含むポリヌクレオチドである。
「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」または「AAV ITR」とは、DNA複製起点およびウイルスに対するパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能するAAVゲノムの各末端で見つけられる当該技術分野で認識されている領域を意味する。AAV ITRは、AAV repコード領域と一緒に、2つの隣接するITR間に挿入されたヌクレオチド配列の効率的な切除およびそれからの救出、ならびに哺乳動物細胞ゲノムへのその組み込みを提供する。
AAV ITR領域のヌクレオチド配列は既知である。例えば、Kotin,R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793-801、Berns,K.I.“Parvoviridae and their Replication” in Fundamental Virology,2ndEdition,(B.N.Fields and D.M.Knipe,eds.)を参照のこと。本明細書で使用される場合、AAV ITRは、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されてもよい。加えて、AAV ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-Rh74、およびAAVRh10、ならびにこれらの血清型の改変されたカプシドを含むが、これらに限定されない、いくつかのAAV血清型のうちのいずれかに由来し得る。さらに、AAVベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する5’および3’ITRは、それらが意図されたとおりに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的とする配列の切除および救出を可能にし、かつAAV Rep遺伝子産物が細胞内に存在する場合、レシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするように機能する限り、必ずしも同一である必要はなく、または同じAAV血清型もしくは分離株に由来する必要はない。異種配列を宿主細胞に組み込むためのAAV血清型の使用は、当該技術分野で既知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、WO2018/195555A1およびUS2018/0258424A1を参照されたい)。
「AAV repコード領域」とは、複製タンパク質Rep78、Rep68、Rep52、およびRep40をコードするAAVゲノムの領域を意味する。これらのRep発現産物は、DNA複製起点でのAAVの認識、結合、およびニッキング、DNAヘリカーゼ活性、ならびにAAV(または他の異種)プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されている。Rep発現産物は、AAVゲノムを複製するために集合的に必要とされる。「AAV capコード領域」は、カプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3、またはそれらの機能的相同体をコードするAAVゲノムの領域を意味する。これらのCap発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするのに集合的に必要とされるパッケージング機能を提供する。
いくつかの実施形態では、CasXおよびgNAについてのコード配列の送達に利用されるAAVカプシド、ならびに任意選択的に、宿主細胞に対するPCSK9ドナー鋳型ヌクレオチドは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV44.9、AAV-Rh74(Rhesus macaque由来AAV)、およびAAVRh10を含むが、これらに限定されない、いくつかのAAV血清型のいずれかに由来し得、AAV ITRはAAV血清型2に由来する。
rAAVウイルス粒子を産生するために、AAV発現ベクターが既知の技法を使用して、例えば、トランスフェクションによって好適な宿主細胞に導入される。パッケージング細胞は、典型的に、ウイルス粒子を形成するために使用され、そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングするHEK293細胞(および当技術分野で知られている他の細胞)が含まれる。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で一般的に知られており、例えば、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New Yorkを参照のこと。特に好適なトランスフェクション法には、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子導入、脂質媒介形質導入、および高速マイクロプロジェクタイルを使用した核酸送達が含まれる。
いくつかの実施形態では、上記のAAV発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、AAV ITRと隣接するヌクレオチド配列を複製およびカプシド化してrAAVウイルス粒子を産生するために、AAVヘルパー機能を提供することができるようになる。AAVヘルパー機能は、一般に、AAV由来のコード配列であり、これは、AAV遺伝子産物を提供するように発現され、次いで、生産的AAV複製のためにトランスで機能することができる。AAVヘルパー機能は、AAV発現ベクターから欠失している必要なAAV機能を補完するために本明細書で使用される。したがって、AAVヘルパー機能には、repおよびcapコード領域、またはそれらの機能的相同体をコードする、主要なAAV ORF(オープンリーディングフレーム)の一方または両方が含まれる。付属機能は、当業者に既知の方法を使用して、宿主細胞に導入され、その後、発現され得る。一般に、付属機能は、無関係のヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。いくつかの実施形態では、付属機能は、付属機能ベクターを使用して提供される。利用される宿主/ベクターシステムに応じて、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含む、いくつかの好適な転写および翻訳制御要素のうちのいずれかが発現ベクターに使用され得る。
他の実施形態では、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本開示のCasX:gNAシステムのコード核酸の送達のためのベクターとしての使用に好適であり得る。一般に使用されるレトロウイルスベクターは、例えば、生産的感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない、「欠陥」であり、ウイルス様粒子(VLP)と呼ばれることがある。むしろ、ベクターの複製には、パッケージング細胞株での増殖を必要する。目的の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、核酸を含むレトロウイルス核酸は、パッケージング細胞株によってVLPカプシドにパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質(同種指向性、両種指向性、または異種指向性)を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞のウイルス粒子の特異性(マウスおよびラットでは同種指向性、ヒト、イヌおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物細胞型では両種指向性、ならびにマウス細胞を除くほとんどの哺乳動物細胞型では異種指向性)を決定する。適切なパッケージング細胞株を使用して、細胞がパッケージングされたウイルス粒子によって標的とされることを確実にすることができる。対象ベクター発現ベクターをパッケージング細胞株に導入する方法、およびパッケージング株によって生成されるウイルス粒子を収集する方法は、当技術分野で周知である。
他の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXとgNAとのCasX:gNA RNP複合体、および任意選択的にドナー鋳型を含む、インビトロで生成されるVLPを提供する。様々なウイルス由来の構造タンパク質の組み合わせを使用して、Parvoviridae(例えば、アデノ随伴ウイルス)、Retroviridae(例えば、HIV)、Flaviviridae(例えば、C型肝炎ウイルス)、Paramyxoviridae(例えば、ニパ)、およびバクテリオファージ(例えば、Qβ、AP205)を含むウイルスファミリー由来の成分を含む、VLPを作製することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、HIVなどのレンチウイルスを含むレトロウイルスの成分を使用して設計されたVLPシステムを提供し、様々な成分をコードする核酸を含む個々のプラスミドがパッケージング細胞に導入され、次いで、VLPが生成される。いくつかの実施形態において、VLPレトロウイルス成分は、Othoretrovirinae(レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、ガンマレトロウイルス)、およびSpumaretrovirinaeを含む、Retroviridaeファミリーのうちのいずれかに由来することができる。CasX編集システムを含む例示的なVLPは、2020年12月4日に出願されたPCT/US2020/063488に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本開示は、CasX:gNA RNPを含有するレトロウイルスカプシドを有するVLPを提供し、標的細胞への投与および侵入で、RNP分子は、細胞の核に輸送されるように遊離する。前述のものは、分裂細胞および非分裂細胞へのウイルス形質導入が効率的であり、かつ別様に外来タンパク質を検出するであろう対象の免疫監視機構を逃れる強力な短命のRNPをVLPが送達するという点で、当該技術分野において他のベクターに勝る利点を提供する。
いくつかの実施形態において、VLPシステムは、a)i)Gagポリタンパク質の1つ以上の成分、ii)本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXタンパク質、および任意選択的に、iii)プロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼ切断部位が、gagポリタンパク質成分と融合タンパク質のCasXタンパク質との間に位置する、融合ペプチドをコードする配列を含む、第1の核酸と、b)本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのガイドNAをコードする配列を含む、第2の核酸と、c)CasXタンパク質とgagポリタンパク質との間のプロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼを含むレンチウイルスpolポリタンパク質をコードする配列を含む、第3の核酸と、を含む。前述の実施形態において、Gagポリタンパク質の1つ以上の成分は、マトリックスタンパク質(MA)、ヌクレオカプシドタンパク質(NC)、カプシドタンパク質(CA)、p1-p6タンパク質、PP21/24ペプチド、P12/P3/P8ペプチド、p2ペプチド、P10ペプチド、p68 Gagポリペプチド、p3 Gagポリペプチドからなる群から選択される。前述のいくつかの実施形態において、VLPシステムは第4の核酸をさらに含み、標的細胞との結合を提供する偽型ウイルスエンベロープタンパク質もしくは糖タンパク質をコードする配列を含むか、あるいは代替的に、核酸は標的細胞との結合を提供する抗体断片をコードするか、または偽型ウイルスエンベロープもしくは糖タンパク質および抗体断片の両方を含む。エンベロープタンパク質または糖タンパク質は、VLPに向性を付与する当該技術分野で既知の任意のエンベロープウイルスに由来することができ、インフルエンザA、インフルエンザB、インフルエンザCウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、E型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サルポックス、モノネガウイルス、狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、デュベンハージウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス1、ヨーロッパコウモリウイルス2、オーストラリアコウモリウイルス、エフェメロウイルス、ベシキュロウイルス、小胞性口内炎ウイルス(VSV)、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、バリセラ帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、ヒトヘルペスウイルス(HHV)、ヒトヘルペスウイルス6型、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、乳頭腫ウイルス、ネズミガンマヘルペスウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、クリミア-コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、マールブルグ出血熱ウイルス、キャサヌル森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、バリオラメジャーウイルス、バリオラマイナーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、SARS関連コロナウイルス(SARS-CoV)、およびウエストナイルウイルスからなる群が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、VLPの産生のために使用されるパッケージング細胞は、HEK293細胞、Lenti-X 293T細胞、BHK細胞、HepG2、Saos-2、HuH7、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、A549細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞、ハイブリドーマ細胞、VERO、NIH3T3細胞、COS、WI38、MRC5、A549、HeLa細胞(例えば、B-50)、CHO細胞、およびHT1080細胞からなる群から選択される。本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasX:gNA RNPを含むVLPの産生および回収で、VLPは、かかるVLPの投与によって対象の標的細胞を編集する方法で使用することができ、以下でより完全に記載される。
VII.治療法
本開示は、PCSK9関連障害の治療を必要とする対象におけるPCSK9関連障害を治療する方法を提供し、常染色体優性高コレステロール血症(ADH)、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、低密度リポタンパク質(LDL)レベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、アテローム性動脈硬化性心血管疾患および冠状動脈疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、2型糖尿病、高い血圧上昇、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症(AMD)、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、対象のPCSK9関連障害を、本開示の組成物を対象に投与することによって、予防、治療、および/または改善することができる。いくつかの実施形態において、対象に投与される組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
本開示は、PCSK9関連障害の治療を必要とする対象におけるPCSK9関連障害を治療する方法を提供し、常染色体優性高コレステロール血症(ADH)、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、低密度リポタンパク質(LDL)レベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、アテローム性動脈硬化性心血管疾患および冠状動脈疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、2型糖尿病、高い血圧上昇、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症(AMD)、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、対象のPCSK9関連障害を、本開示の組成物を対象に投与することによって、予防、治療、および/または改善することができる。いくつかの実施形態において、対象に投与される組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
いくつかの事例において、対象のPCSK9遺伝子の一方または両方の対立遺伝子は、変異を含む。いくつかの事例において、PCSK9関連障害変異は、機能獲得型変異であり、配列番号33の配列に対して、S127R、D129G、F216L、D374H、およびD374Yからなる群から選択されるアミノ酸置換をコードする変異が含まれるが、これらに限定されない。他の事例において、PCSK9関連障害変異は、機能喪失型変異であり、配列番号33の配列に対して、R46L、G106R、Y142X、N157K、R237W、およびC679Xからなる群から選択されたアミノ酸置換をコードする変異が含まれるが、これらに限定されない。他の事例において、PCSK9関連障害変異は、表Bに開示されるPCKS9対立遺伝子を含む。他の事例において、PCSK9遺伝子は、PCSK9タンパク質の機能または発現を変化させる、野生型配列と比較して1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入などに限定されない変異をコードする。
いくつかの実施形態において、PCSK9または関連する障害の治療を必要とする対象においてそれを治療する方法を提供し、対象の細胞におけるPCSK9遺伝子を改変することを含み、改変することは、当該細胞を、治療有効用量のi)本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXとgNAとを含む組成物、ii)本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかのCasXとgNAとドナー鋳型とを含む組成物、iii)(i)もしくは(ii)の組成物をコードするか、もしくは含む1つ以上の核酸、iv)レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターからなる群から選択され、(iii)の核酸を含むベクター、v)(i)もしくは(ii)の組成物を含むVLP、またはvi)(i)~(v)のうちの2つ以上の組み合わせと接触させることを含み、細胞のPCSK9遺伝子は、CasXタンパク質、および任意選択的にドナー鋳型によって、野生型または機能的PCSK9タンパク質が発現されるように改変される。本方法のいくつかの実施形態において、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの足場を有する第2のgNAが利用され、第2のgNAは、第1のgNAと比較して標的核酸の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有し、対象の細胞のPCSK9標的核酸に追加の切断をもたらす。前述において、遺伝子はNHEJ宿主修復機構によって改変するか、またはHDRもしくはHITI機構によって挿入されるドナー鋳型と組み合わせて利用して、変異を切除もしくは修正して、機能的PCSK9タンパク質の発現をもたすことができる。治療される対象の改変される細胞は、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される真核生物細胞であることができる。いくつかの実施形態において、治療される対象の真核生物細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、LDLの産生に関与する細胞であり、肝細胞、もしくは腸、腎臓、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜細胞、または内皮などの動脈壁の細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は、眼細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞におけるPCSK9遺伝子の少なくとも1つの改変された対立遺伝子を含み、改変を使用して対象における変異を修正する。いくつかの事例において、対象の変異は、機能獲得型変異である。他の事例において、対象の変異は、機能喪失型変異である。
本治療方法のいくつかの実施形態において、本方法は、対象に、CasXタンパク質とgNAと、任意選択的に、ドナー鋳型(上記)とを含むか、またはコードする本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの治療有効用量のベクターを投与することを含み、対象の細胞とベクターとの接触は、CasX:gNA複合体による細胞の標的核酸の改変をもたらす。いくつかの実施形態において、本方法は、CasXと、PCSK9遺伝子における異なる位置を標的化とする複数のgNAと、を含むか、またはコードするベクターの投与を含み、対象の細胞とCasX:gNA複合体との接触が、細胞の標的核酸の改変をもたらす。特定の一実施形態において、ベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV44.9、AAV-Rh74、またはAAVRh10からなる群から選択されるAAVである。実施形態のベクターは、対象に治療有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、ベクターは、対象に、少なくとも約1×105ベクターゲノム/kg(vg/kg)、少なくとも約1×106vg/kg、少なくとも約1×107vg/kg、少なくとも約1×108vg/kg、少なくとも約1×109vg/kg、少なくとも約1×1010vg/kg、少なくとも約1×1011vg/kg、少なくとも約1×1012vg/kg、少なくとも約1×1013vg/kg、少なくとも約1×1014vg/kg、少なくとも約1×1015vg/kg、または少なくとも約1×1016vg/kgの用量で投与される。方法の他の実施形態において、VLPは、対象に、少なくとも約1×105粒子/kg、少なくとも約1×106粒子/kg、少なくとも約1×107粒子/kg、少なくとも約1×108粒子/kg、少なくとも約1×109粒子/kg、少なくとも約1×1010粒子/kg、少なくとも約1×1011粒子/kg、少なくとも約1×1012粒子/kg、少なくとも約1×1013粒子/kg、少なくとも約1×1014粒子/kg、少なくとも約1×1015粒子/kg、または少なくとも約1×1016粒子/kgの用量で投与される。ベクターまたはVLPは、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与することができる。対象におけるPCSK9関連障害を治療する方法のいくつかの実施形態において、対象は、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される。
治療方法の他の実施形態において、方法は、追加のCRISPRタンパク質、または追加のCRISPRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを対象にさらに投与することを含む。前述の実施形態において、追加のCRISPRタンパク質は、本方法の第1のCasXタンパク質とは異なる配列を有する。いくつかの実施形態において、追加のCRISPRタンパク質は、CasXタンパク質ではなく、すなわち、Cpf1、Cas9、Cas10、Cas12a、またはCas13aである。いくつかの事例において、治療方法で使用されるgNAは、単一分子gNA(sgNA)である。他の事例において、gNAは、二重分子gNA(dgNA)である。さらに他の事例において、方法は、標的核酸配列を、PCSK9遺伝子の異なるか、または重複する配列に標的化された複数のgNAと接触させることを含む。
多くの治療戦略が、PCSK9関連障害を有する対象の治療方法における使用のための組成物を設計するために使用されてきている。いくつかの実施形態において、本発明は、PCSK9関連障害を有する対象の治療方法を提供し、方法は、対象に、本明細書に開示される実施形態のうちのいずれかのCasX:gNA組成物またはベクターを、治療有効用量を使用した1回以上の連続用量を含む治療レジメンに従って投与することを含む。治療レジメンのいくつかの実施形態では、組成物またはベクターの治療的に有効な用量は、単回用量として投与される。治療レジメンの他の実施形態では、治療的に有効な用量は、少なくとも2週間、または少なくとも1ヶ月、または少なくとも2ヶ月、または少なくとも3ヶ月、または少なくとも4ヶ月、または少なくとも5ヶ月、または少なくとも6ヶ月の期間にわたって2回以上の用量として対象に投与される。治療レジメンのいくつかの実施形態において、有効用量は、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される経路によって投与される。
PCSK9関連障害を有する対象の治療方法のいくつかの実施形態において、方法は、対象に、本明細書に開示されるVLP内のRNPとしてCasX:gNA組成物を、治療有効用量を使用した1回以上の連続用量を含む治療レジメンに従って投与することを含む。
いくつかの実施形態において、PCSK9関連障害を有する対象に、CasXタンパク質とガイド核酸とをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、治療有効量のCasX:gNAモダリティを投与して、または本明細書に開示のCasX-gNA組成物を投与して、PCSK9の発現をノックダウンまたはノックアウトすることは、基礎的なPCSK9関連障害の予防または回復をもたらし、それによって、対象は依然として基礎的な障害に罹患している可能性があるにもかかわらず、改善が対象に観察されるいくつかの実施形態では、治療有効量のCasX-gNAモダリティの投与は、LDLコレステロールのベースラインからの変化割合、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の減少(ASCVD)、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、不安定な扁桃炎、および視力を含むがこれらに限定されない、少なくとも1つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす。いくつかの実施形態において、治療有効量のCasX-gNAモダリティの投与は、少なくとも2つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす。いくつかの実施形態において、対象は、マウス、ラット、ブタ、イヌ、非ヒト霊長類、およびヒトから選択される。
いくつかの実施形態において、治療方法は、薬剤がLDLレベルを低下させるのに有効である化学療法剤を投与することをさらに含む。かかる薬剤には、スタチン、ナイアシン、フィブラート、または抗PCSK9抗体剤が含まれるが、これらに限定されない。
体液または組織などの治療の有効性を決定する分析のために治療される対象から試料を得る方法、および分析を可能にする試料の調製方法は、当業者によく知られている。RNAおよびタンパク質レベルの分析のための方法は、上記で考察され、当業者にはよく知られている。治療の効果はまた、当技術分野で知られている定型的な臨床的方法によって、本発明の1つ以上の化合物と接触した動物から収集された、前述の流体、組織、または器官における標的遺伝子発現に関連するバイオマーカーを測定することによって評価することができる。PCSK9障害のバイオマーカーには、PCSK9レベル、低密度リポタンパク質(LDLコレステロール)、アポリポタンパク質B、非HDLコレステロール、トリグリセリドおよびリポタンパク質a、可溶性CD40リガンド、オステオポンチン(OPN)、オステオプロテゲリン(OPG)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、およびミエロペルオキシダーゼ(MPOP)が含まれるが、これらに限定されず、マーカーの濃度は、生理学的に正常であることが知られているか、またはPCSK9障害を有さない対象における濃度と比較される。
PCSK9の変異型を発現するいくつかのマウスモデルが存在し、治療方法を評価するために好適である。PCSK9関連障害のトランスジェニックマウスモデルには、hPCSK9を有するノックインマウスモデルが含まれる(Carreras,A.In vivo genome and base editing of a human PCSK9 knock-in hypercholesterolemic mouse model.MC Biology 17:4(2019)、Herbert B.,et al.Increased secretion of lipoproteins in transgenic mice expressing human D374Y PCSK9 under physiological genetic control.Arterioscler Thromb Vasc Biol.30(7):1333(2010))。
VIII.医薬組成物、キット、および製造品
いくつかの実施形態において、本開示は、i)CasXタンパク質、およびPCSK9遺伝子に特異的な標的化配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの1つもしくは複数のgNA、ii)(i)のCasXおよびgNAをコードする1つ以上の核酸、iii)(ii)の1つ以上の核酸を含むベクター、またはiv)(i)のCasXとgNAとのRNPを含むVLP、を1つ以上の薬学的に好適な賦形剤とともに含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路のために製剤化される。一実施形態において、医薬組成物は、液体形態または凍結形態である。別の実施形態において、医薬組成物は、単回注射のためのプレフィルドシリンジ内にある。別の実施形態において、医薬組成物は、固体形態であり、例えば、医薬組成物は、凍結乾燥される。
いくつかの実施形態において、本開示は、i)CasXタンパク質、およびPCSK9遺伝子に特異的な標的化配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの1つもしくは複数のgNA、ii)(i)のCasXおよびgNAをコードする1つ以上の核酸、iii)(ii)の1つ以上の核酸を含むベクター、またはiv)(i)のCasXとgNAとのRNPを含むVLP、を1つ以上の薬学的に好適な賦形剤とともに含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路のために製剤化される。一実施形態において、医薬組成物は、液体形態または凍結形態である。別の実施形態において、医薬組成物は、単回注射のためのプレフィルドシリンジ内にある。別の実施形態において、医薬組成物は、固体形態であり、例えば、医薬組成物は、凍結乾燥される。
別の実施形態において、CasXタンパク質、PCSK9遺伝子に対して特異的な標的化配列を含む本開示の実施形態のうちのいずれかの1つもしくは複数のCasX gNAと、好適な容器(例えば、チューブ、バイアル、またはプレート)と、を含むキットが本明細書において提供される。例示的な実施形態において、本開示のキットは、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490のうちのいずれか1つのCasXバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、キットは、gNAまたはgNAをコードするベクターを含み、gNAは、配列番号247~303、315~436、612~~2100、または2286~13861からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、gNAは、配列番号2101~2285からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、gNAは、配列番号2236、2237、2238、2241、2244、2248、2249、および2259~2285からなる群から選択される配列を含む。
ある特定の実施形態において、CasXタンパク質とgNAとの編集対を含むキットが本明細書において提供され、表3、5、6、7および9に示される配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490のCasXバリアントタンパク質と、本明細書に記載のgNA(例えば、配列番号2101~2285)と、を含む。例示的な実施形態において、本開示のキットは、CasXとgNAとの編集対を含み、CasXバリアントは、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、490のうちのいずれか1つを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子編集対のgNAは、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861のうちのいずれか1つを含む。いくつかの実施形態において、遺伝子編集対のgNAは、配列番号2101~2285のうちのいずれか1つの足場配列と、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861のうちのいずれか1つの標的化配列と、を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子編集対のgNAは、配列番号2236、2237、2238、2241、2244、2248、2249、または2259~2285のうちのいずれか1つの足場配列と、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861のうちのいずれか1つの標的化配列と、を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、リポソーム、治療剤、標識、標識可視化試薬、または前述の任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、キットは、遺伝子改変用途に適切なコントロール組成物および使用説明書を含む。
いくつかの実施形態において、キットは、本開示のCasXタンパク質をコードする配列、本開示のCasX gNA、任意選択的にドナー鋳型、またはそれらの組み合わせを含むベクターを含む。
IX.実施形態の列挙
本記述は、多数の例示的な構成、方法、パラメーターなどを記載する。しかしながら、そのような記載は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、例示的な実施形態の記載として提供されることを認識されたい。上記の本主題の実施形態は、単独で、または1つ以上の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示の特定の非限定的な実施形態を以下に提供する。本開示を読んだ際に当業者に明らかになるように、個別に番号付けされた実施形態は各々、先行または後続の個別に番号付けされた実施形態のうちのいずれかと使用されてもよく、またはそれらと組み合わせられてもよい。これは、すべてのかかる実施形態の組み合わせを支援するよう意図されており、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されない。
本記述は、多数の例示的な構成、方法、パラメーターなどを記載する。しかしながら、そのような記載は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、例示的な実施形態の記載として提供されることを認識されたい。上記の本主題の実施形態は、単独で、または1つ以上の他の態様もしくは実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示の特定の非限定的な実施形態を以下に提供する。本開示を読んだ際に当業者に明らかになるように、個別に番号付けされた実施形態は各々、先行または後続の個別に番号付けされた実施形態のうちのいずれかと使用されてもよく、またはそれらと組み合わせられてもよい。これは、すべてのかかる実施形態の組み合わせを支援するよう意図されており、以下に明示的に提供される実施形態の組み合わせに限定されない。
本発明は、以下の列挙される例示的な実施形態を参照することによって定義され得る。
実施形態1.CasXタンパク質とガイド核酸(gNA)とを含むCasX:gNAシステムであって、gNAが、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)遺伝子を含む標的核酸配列に相補的な標的化配列を含む、CasX:gNAシステム。
実施形態2.PCSK9遺伝子が、1つ以上の変異を含む、実施形態1のCasX:gNAシステム。
実施形態3.PCSK9遺伝子が、1つ以上の変異を含むPCSK9タンパク質をコードする、実施形態1または実施形態2のCasX:gNAシステム。
実施形態4.1つ以上の変異が、配列番号33の配列に対して、S127R、D129G、F216L、D374H、およびD374Yからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、実施形態3のCasX:gNAシステム。
実施形態5.変異が、機能獲得型変異である、実施形態2~4のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態6.gNAが、ガイドRNA(gRNA)である、先行実施形態のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態7.gNAが、ガイドDNA(gDNA)である、実施形態1~6のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態8.gNAが、DNAおよびRNAを含むキメラである、実施形態1~6のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態9.gNAが、単一分子gNA(sgNA)である、実施形態1~8のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態10.gNAが、二重分子gNA(dgNA)である、実施形態1~8のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態11.gNAの標的化配列が、PCSK9遺伝子の1つ以上の一塩基多型(SNP)を含む配列に相補的である、実施形態1~10のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態12.gNAの標的化配列が、配列番号247~303、315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列を含む、実施形態1~10のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態13.gNAの標的化配列が、配列の3’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、実施形態1~10のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態14.gNAの標的化配列が、配列の3’末端から2つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、実施形態1~10のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態15.gNAの標的化配列が、配列の3’末端から3つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、実施形態1~10のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態16.gNAの標的化配列が、配列の3’末端から4つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、実施形態1~10のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態17.gNAの標的化配列が、配列の3’末端から5つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、実施形態1~10のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態18.gNAの標的化配列が、配列番号247~303、315~436、612~2100、および2286~13861からなる群から選択される配列に対して少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、または少なくとも約95%の同一性を有する配列を含む、実施形態1~10のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態19.gNAの標的化配列が、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列と比較して、1つ以上の一塩基多型(SNP)を有する配列を含む、実施形態1~10のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態20.gNAの標的化配列が、PCSK9遺伝子の非コード領域に相補的である、実施形態1~19のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態21.gNAの標的化配列が、PCSK9遺伝子のコード領域に相補的である、実施形態1~19のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態22.gNAの標的化配列が、PCSK9エクソンの配列に相補的である、実施形態1~19のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態23.gNAの標的化配列が、PCSK9イントロンの配列に相補的である、実施形態1~19のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態24.gNAの標的化配列が、PCSK9イントロン-エクソン接合部の配列に相補的である、実施形態1~19のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態25.gNAの標的化配列が、PCSK9調節領域の配列に相補的である、実施形態1~19のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態26.gNAの標的化配列が、PCSK9遺伝子の遺伝子間領域の配列に相補的である、実施形態1~19のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態27.第2のgNAをさらに含み、第2のgNAが、先行実施形態のうちのいずれか1つのgNAの標的化配列と比較して、標的核酸配列の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有する、実施形態1~26のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態28.gNAが、配列番号4~16および2101~2285からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、実施形態1~27のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態29.gNAが、配列番号4~16の配列からなる群から選択される参照gNA配列と比較して、少なくとも1つの改変を有する配列を含む足場を有する、実施形態1~28のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態30.参照gNAの少なくとも1つの改変が、gNA配列のヌクレオチドの少なくとも1つの置換、欠失、または挿入を含む、実施形態29のCasX:gNAシステム。
実施形態31.gNAが、化学的に改変されている、実施形態1~30のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態32.CasXタンパク質が、配列番号1~3のうちのいずれか1つの配列を有する参照CasXタンパク質、配列番号49~160、439、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、もしくは490の配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を有するCasXバリアントタンパク質を含む、実施形態1~31のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態33.CasXタンパク質が、TTC、ATC、GTC、およびCTCからなる群から選択されるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に対する結合親和性を有する、実施形態32のCasX:gNAシステム。
実施形態34.CasXバリアントタンパク質が、配列番号1~3から選択される配列を有する参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも1つの改変を含む、実施形態32または実施形態33のCasX:gNAシステム。
実施形態35.少なくとも1つの改変が、参照CasXタンパク質と比較して、CasXバリアントタンパク質のドメインに少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む、実施形態34のCasX:gNAシステム。
実施形態36.ドメインが、非標的鎖結合(NTSB)ドメイン、標的鎖負荷(TSL)ドメイン、ヘリカルIドメイン、ヘリカルIIドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)、およびRuvC DNA切断ドメインからなる群から選択される、実施形態35のCasX:gNAシステム。
実施形態37.CasXタンパク質が、1つ以上の核局在化シグナル(NLS)をさらに含む、実施形態32~36のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態38.1つ以上のNLSが、PKKKRKV(配列番号217)、KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号223)、PAAKRVKLD(配列番号224)、RQRRNELKRSP(配列番号161)、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号162)、RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号163)、VSRKRPRP(配列番号164)、PPKKARED(配列番号165)、PQPKKKPL(配列番号166)、SALIKKKKKMAP(配列番号167)、DRLRR(配列番号168)、PKQKKRK(配列番号169)、RKLKKKIKKL(配列番号170)、REKKKFLKRR(配列番号171)、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号172)、RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号173)、PRPRKIPR(配列番号174)、PPRKKRTVV(配列番号175)、NLSKKKKRKREK(配列番号176)、RRPSRPFRKP(配列番号177)、KRPRSPSS(配列番号178)、KRGINDRNFWRGENERKTR(配列番号179)、PRPPKMARYDN(配列番号180)、KRSFSKAF(配列番号181)、KLKIKRPVK(配列番号182)、PKTRRRPRRSQRKRPPT(配列番号184)、RRKKRRPRRKKRR(配列番号187)、PKKKSRKPKKKSRK(配列番号188)、HKKKHPDASVNFSEFSK(配列番号189)、QRPGPYDRPQRPGPYDRP(配列番号190)、LSPSLSPLLSPSLSPL(配列番号191)、RGKGGKGLGKGGAKRHRK(配列番号192)、PKRGRGRPKRGRGR(配列番号193)、MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN(配列番号185)、PKKKRKVPPPPAAKRVKLD(配列番号183)、およびPKKKRKVPPPPKKKRKV(配列番号194)からなる配列の群から選択される、実施形態37のCasX:gNAシステム。
実施形態39.1つ以上のNLSが、CasXタンパク質のC末端にある、実施形態37または実施形態38のCasX:gNAシステム。
実施形態40.1つ以上のNLSが、CasXタンパク質のN末端にある、実施形態37または実施形態38のCasX:gNAシステム。
実施形態41.1つ以上のNLSが、CasXタンパク質のN末端およびC末端にある、実施形態37または実施形態38のCasX:gNAシステム。
実施形態42.CasXバリアントタンパク質およびgNAが、参照CasXタンパク質およびgNAと比較して、少なくとも1つ以上の改善された特性を示す、実施形態32~41のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態43.改善された特性が、CasXタンパク質の改善されたフォールディング、gNAに対するCasXタンパク質の改善された結合親和性、改善されたリボ核タンパク質複合体(RNP)形成、切断能力のあるRNPの高い割合、標的核酸配列に対する改善された結合親和性、1つ以上のPAM配列に対する変更された結合親和性、標的核酸配列の改善された巻き戻し、増加した活性、増加した標的核酸配列率、改善された編集効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、二本鎖切断のための増加した標的鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標的鎖負荷、減少したオフターゲット切断、DNAの非標的鎖の改善された結合、改善されたCasXタンパク質安定性、改善されたタンパク質:ガイドRNA複合体安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたタンパク質:gNA複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、および改善された融合特性からなる群から選択される、実施形態42のCasX:gNAシステム。
実施形態44.CasXバリアントの改善された特性が、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約1.1~約100,000倍改善されている、実施形態42または実施形態43のCasX:gNAシステム。
実施形態45.CasXバリアントタンパク質の改善された特性が、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも約10倍、少なくとも約100倍、少なくとも約1,000倍、または少なくとも約10,000倍改善されている、実施形態42または実施形態43のCasX:gNAシステム。
実施形態46.改善された特性が、標的核酸配列に対する改善された結合親和性である、実施形態43~45のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態47.改善された特性が、増加した標的核酸配列切断速度である、実施形態43~45のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態48.改善された特性が、1つ以上のPAM配列に対する増加した結合親和性であり、1つ以上のPAM配列が、TTC、ATC、GTC、およびCTCからなる群から選択される、実施形態43~45のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態49.CasXバリアントタンパク質とgNAとが、RNPで一緒に会合している、先行実施形態のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態50.RNPが、参照CasXとgNAとのRNPと比較して、切断能力のあるRNPの高い割合を有する、実施形態49のCasX:gNAシステム。
実施形態51.CasXバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態32~50のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態52.CasXバリアントが、二本鎖標的核酸分子の1つの鎖のみを切断することができる、実施形態51のCasX:gNAシステム。
実施形態53.CasXバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼドメインを含む、実施形態1~50のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態54.CasXタンパク質が、触媒的に不活性なCasX(dCasX)タンパク質であり、dCasXとgNAとが、標的核酸配列に結合する能力を保持している、実施形態1~41のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態55.dCasXが、残基:
(a)配列番号1の参照CasXタンパク質に対応するD672、E769、および/もしくはD935、または
(b)配列番号2の参照CasXタンパク質に対応するD659、E756、および/もしくはD922、に変異を含む、実施形態54のCasX:gNAシステム。
(a)配列番号1の参照CasXタンパク質に対応するD672、E769、および/もしくはD935、または
(b)配列番号2の参照CasXタンパク質に対応するD659、E756、および/もしくはD922、に変異を含む、実施形態54のCasX:gNAシステム。
実施形態56.変異が、残基におけるアラニンの置換である、実施形態55のCasX:gNAシステム。
実施形態57.ドナー鋳型核酸をさらに含む、実施形態1~53のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態58.ドナー鋳型が、PCSK9遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含み、PCSK9遺伝子部分が、PCSK9エクソン、PCSK9イントロン、PCSK9イントロン-エクソン接合部、PCSK9調節領域、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態57のCasX:gNAシステム。
実施形態59.ドナー鋳型が、標的核酸における切断部位に隣接する配列に相補的な相同アームを含む、実施形態57または実施形態58のCasX:gNAシステム。
実施形態60.ドナー鋳型が、10~15,000個のヌクレオチドの範囲のサイズである、実施形態57~59のCasX:gNAシステム。
実施形態61.ドナー鋳型が、一本鎖DNA鋳型または一本鎖RNA鋳型である、実施形態57~60のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態62.ドナー鋳型が、二本鎖DNA鋳型である、実施形態57~60のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態63.ドナー鋳型が、野生型PCSK9遺伝子と比較して、1つ以上の変異を含む、実施形態57~62のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態64.ドナー鋳型が、野生型PCSK9遺伝子と比較して、異種配列を含む、実施形態57~62のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態65.ドナー鋳型が、野生型PCSK9遺伝子の全部または一部を含む、実施形態57~62のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム。
実施形態66.実施形態1~56のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステムをコードする配列を含む、核酸。
実施形態67.CasXタンパク質をコードする配列が、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、実施形態66の核酸。
実施形態68.実施形態66または実施形態67の核酸を含む、ベクター。
実施形態69.ベクターが、プロモーターをさらに含む、実施形態68のベクター。
実施形態70.ドナー鋳型を含むベクターであって、ドナー鋳型が、PCSK9遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含み、PCSK9遺伝子部分が、PCSK9エクソン、PCSK9イントロン、PCSK9イントロン-エクソン接合部、およびPCSK9調節領域からなる群から選択される、ベクター。
実施形態71.ドナー鋳型が、野生型PCSK9遺伝子と比較して、1つ以上の変異を含む、実施形態70のベクター。
実施形態72.実施形態66または実施形態67の核酸をさらに含む、実施形態70または実施形態71のベクター。
実施形態73.ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、ウイルス様粒子(VLP)、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミドベクター、およびRNAベクターからなる群から選択される、実施形態68~70のうちのいずれか1つのベクター。
実施形態74.ベクターが、AAVベクターである、実施形態73のベクター。
実施形態75.AAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV-Rh74、またはAAVRh10から選択される、実施形態74のベクター。
実施形態76.ベクターが、レトロウイルスベクターである、実施形態73のベクター。
実施形態77.VLPをコードするベクターが、gagポリタンパク質と、実施形態32~56のうちのいずれか1つのCasXタンパク質と、実施形態1~31のうちのいずれか1つのgNAと、をコードする1つ以上の核酸を含む、実施形態73のベクター。
実施形態78.実施形態32~56のうちのいずれか1つのCasXタンパク質と、実施形態1~31のうちのいずれか1つのgNAと、を含む、ウイルス様粒子(VLP)。
実施形態79.CasXタンパク質とgNAとが、RNPで一緒に会合している、実施形態78のVLP。
実施形態80.PCSK9標的核酸配列を改変する方法であって、本方法が、標的核酸配列を、CasXタンパク質と、標的化配列を含むガイド核酸(gNA)と、に接触させることを含み、当該接触させることが、細胞に、
a)実施形態1~65のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム、
b)実施形態66もしくは実施形態67の核酸、
c)実施形態68~77のうちのいずれか1つのベクター、
d)実施形態78もしくは実施形態79のVLP、または
e)それらの組み合わせを導入することを含む、方法
a)実施形態1~65のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム、
b)実施形態66もしくは実施形態67の核酸、
c)実施形態68~77のうちのいずれか1つのベクター、
d)実施形態78もしくは実施形態79のVLP、または
e)それらの組み合わせを導入することを含む、方法
実施形態81.当該接触させることが、CasXタンパク質によってPCSK9標的核酸配列の改変をもたらす。
実施形態82.CasXタンパク質とgNAとが、リボ核タンパク質複合体(RNP)で一緒に会合している、実施形態80の方法。
実施形態83.第2のgNAまたは第2のgNAをコードする核酸をさらに含み、第2のgNAが、標的核酸配列またはその相補体の異なる部分に相補的な標的化配列を有する、実施形態80または実施形態81の方法。
実施形態84.PCSK9遺伝子が、変異を含む、実施形態80~82のうちのいずれか1つの方法。
実施形態85.変異が、機能獲得型変異である、実施形態83の方法。
実施形態86.PCSK9遺伝子が、野生型配列を含む、実施形態80~82のうちのいずれか1つの方法。
実施形態87.改変することが、標的核酸配列に二本鎖切断を導入することを含む、実施形態80~85のうちのいずれか1つの方法。
実施形態88.改変することが、標的核酸配列に二本鎖切断を導入することを含む、実施形態80~85のうちのいずれか1つの方法。
実施形態89.改変することが、野生型配列と比較して、標的核酸配列に1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含む、実施形態80~87のうちのいずれか1つの方法。
実施形態90.標的核酸配列の改変が、細胞の内部で生じる、実施形態80~88のうちのいずれか1つの方法。
実施形態91.標的核酸配列の改変が、インビボで生じる、実施形態80~89のうちのいずれか1つの方法。
実施形態92.細胞が、真核生物細胞である、実施形態80~90のうちのいずれか1つの方法。
実施形態93.真核生物細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ブタ細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、およびヒト細胞からなる群から選択される、実施形態91の方法。
実施形態94.真核生物細胞が、ヒト細胞である、実施形態92の方法。
実施形態95.細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、実施形態80~94のうちのいずれか1つの方法。
実施形態96.方法が、標的核酸配列を、PCSK9遺伝子の少なくとも一部に相補的なドナー鋳型と接触させることをさらに含み、ドナー鋳型が、標的核酸配列に挿入されて、標的核酸配列の全部または一部を置き換える、実施形態80~94のうちのいずれか1つの方法。
実施形態97.ドナー鋳型が、野生型PCSK9遺伝子配列と比較して1つ以上の変異を含み、挿入が、PCSK9遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらす、実施形態96の方法。
実施形態98.ドナー鋳型が、野生型PCSK9遺伝子配列の全部または一部を含み、挿入が、PCSK9遺伝子の1つ以上の変異を修正する、実施形態96の方法。
実施形態99.ドナー鋳型が、10~15,000個のヌクレオチドの範囲のサイズである、実施形態96~98のうちのいずれか1つの方法。
実施形態100.ドナー鋳型が、100~1,000個のヌクレオチドの範囲のサイズである、実施形態96~98のうちのいずれか1つの方法。
実施形態101.ドナー鋳型が、一本鎖DNA鋳型または一本鎖RNA鋳型である、実施形態96~100のうちのいずれか1つの方法。
実施形態102.ドナー鋳型が、二本鎖DNA鋳型である、実施形態96~100のうちのいずれか1つの方法。
実施形態103.ドナー鋳型が、相同性指向修復(HDR)によって挿入される、実施形態96~102のうちのいずれか1つの方法。
実施形態104.ベクターが、対象に、治療有効用量で投与される、実施形態80~103のうちのいずれか1つの方法。
実施形態105.対象が、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される、実施形態104の方法。
実施形態106.対象がヒトである、実施形態104の方法。
実施形態107.ベクターが、少なくとも約1×1010ベクターゲノム(vg)、または少なくとも約1×1011vg、または少なくとも約1×1012vg、または少なくとも約1×1013vg、または少なくとも約1×1014vg、または少なくとも約1×1015vg、または少なくとも約1×1016vgの用量で投与される、実施形態80~106のうちのいずれか1つの方法。
実施形態108.ベクターが、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、実施形態80~106のうちのいずれか1つの方法。
実施形態109.標的核酸配列を、追加のCRISPRタンパク質、または追加のCRISPRタンパク質をコードするポリヌクレオチドとさらに接触させることを含む、実施形態80~108のうちのいずれか1つの方法。
実施形態110.追加のCRISPRタンパク質が、先行実施形態のうちのいずれかのCasXタンパク質とは異なる配列を有するCasXタンパク質である、実施形態109の方法。
実施形態111.追加のCRISPRタンパク質が、CasXタンパク質ではない、実施形態109の方法。
実施形態112.細胞のPCSK9標的核酸配列を変更する方法であって、当該細胞を、
a)実施形態1~65のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム、
b)実施形態66もしくは実施形態67の核酸、
c)実施形態68~77のうちのいずれか1つのベクター、
d)実施形態78もしくは実施形態79のVLP、または
e)それらの組み合わせと接触させることを含む、方法。
a)実施形態1~65のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム、
b)実施形態66もしくは実施形態67の核酸、
c)実施形態68~77のうちのいずれか1つのベクター、
d)実施形態78もしくは実施形態79のVLP、または
e)それらの組み合わせと接触させることを含む、方法。
実施形態113.細胞が、PCSK9タンパク質の発現が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%減少されるように改変されている、実施形態112の方法。
実施形態114.細胞が、細胞が検出可能なレベルのPCSK9タンパク質を発現しないように改変されている、実施形態112または実施形態113の方法。
実施形態115.実施形態112または実施形態113の方法によって改変された細胞集団であって、細胞が、改変された細胞の少なくとも10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%が、検出可能なレベルのPCSK9タンパク質を発現しないように改変されている、細胞集団。
実施形態116.細胞が、非霊長類哺乳動物細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞である、実施形態115の細胞集団。
実施形態117.細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、実施形態115または実施形態116の細胞集団。
実施形態118.PCSK9関連障害の治療を必要とする対象におけるPCSK9関連障害を治療する方法であって、対象の細胞におけるPCSK9遺伝子を改変することを含み、改変することが、当該細胞を、
a)実施形態1~65のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム、
b)実施形態66もしくは実施形態67の核酸、
c)実施形態68~77のうちのいずれか1つのベクター、
d)実施形態78もしくは実施形態79のVLP、または
e)それらの組み合わせ、のいずれかと接触させることを含む、方法。
a)実施形態1~65のうちのいずれか1つのCasX:gNAシステム、
b)実施形態66もしくは実施形態67の核酸、
c)実施形態68~77のうちのいずれか1つのベクター、
d)実施形態78もしくは実施形態79のVLP、または
e)それらの組み合わせ、のいずれかと接触させることを含む、方法。
実施形態119.PCSK9関連障害が、常染色体優性高コレステロール血症(ADH)、高コレステロール血症、増加したLDL、アテローム性動脈硬化性心血管疾患、および冠状動脈疾患からなる群から選択される、実施形態118の方法。
実施形態120.第2のgNAまたは第2のgNAをコードする核酸をさらに含み、第2のgNAが、標的核酸配列の異なるか、または重複する部分に相補的な標的化配列を有する、実施形態118または実施形態119の方法。
実施形態121.改変することが、PCSK9遺伝子に1つ以上の変異を導入するか、またはPCSK9タンパク質の発現が、阻害または抑制される、実施形態118~120のうちのいずれか1つの方法。
実施形態122.方法が、細胞を実施形態57~65のうちのいずれか1つのドナー鋳型と接触させることを含む、実施形態118~121のうちのいずれか1つの方法。
実施形態123.細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、実施形態118~122のうちのいずれか1つの方法。
実施形態124.ベクターが、対象に、治療有効用量で投与される、実施形態118~123のうちのいずれか1つの方法。
実施形態125.対象が、マウス、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される、実施形態124の方法。
実施形態126.対象がヒトである、実施形態124の方法。
実施形態127.ベクターが、対象に、少なくとも約1×1010ベクターゲノム(vg)、または少なくとも約1×1011vg、または少なくとも約1×1012vg、または少なくとも約1×1013vg、または少なくとも約1×1014vg、または少なくとも約1×1015vg、または少なくとも約1×1016vgの用量で投与される、実施形態118~126のうちのいずれか1つの方法。
実施形態128.ベクターが、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、実施形態118~127のうちのいずれか1つの方法。
実施形態129.標的核酸配列を、追加のCRISPRタンパク質、または追加のCRISPRタンパク質をコードするポリヌクレオチドとさらに接触させることを含む、実施形態118~128のうちのいずれか1つの方法。
実施形態130.追加のCRISPRタンパク質が、先行実施形態のうちのいずれかのCasXとは異なる配列を有するCasXタンパク質である、実施形態129の方法。
実施形態131.追加のCRISPRタンパク質が、CasXタンパク質ではない、実施形態130の方法。
実施形態132.方法が、化学療法剤を投与することをさらに含む、実施形態118~131のうちのいずれか1つの方法。
実施形態133.方法が、LDLコレステロールのベースラインからの変化割合、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の減少(ASCVD)、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、および不安定な扁桃炎からなる群から選択された少なくとも1つの臨床的に関連するエンドポイントにおける改善をもたらす、実施形態118~132のうちのいずれか1つの方法。
実施形態134.方法が、LDLコレステロールのベースラインからの変化割合、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患の減少(ASCVD)、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、または不安定な扁桃炎からなる群から選択された少なくとも2つの臨床的に関連するエンドポイントにおける改善をもたらす、実施形態118~132のうちのいずれか1つの方法。
以下の実施例は、単に例示的なものであり、本開示のいかなる態様を決して限定することを意図するものではない。
実施例1:CasX Stx2の作製、発現、および精製
1.増殖および発現
Planctomycetesに由来するCasX Stx2(本明細書ではCasX2とも称される)の発現構築物(以下の配列番号2のCasXアミノ酸配列を有し、配列番号437の配列によってコードされる)を、E.coli用にコドン最適化した遺伝子断片(Twist Biosciences)から構築した。組み立てた構築物は、TEV切断可能なC末端TwinStrepタグを含み、この構築物を、アンピシリン耐性遺伝子を含むpBR322誘導体プラスミド骨格にクローニングした。発現構築物を化学的コンピテントBL21*(DE3)E.coliに形質転換し、種培養物を、UltraYieldフラスコ(Thomson Instrument Company)内で、カルベニシリンを補充したLBブロス中、37℃、200RPMで一晩増殖させた。翌日、この培養物を使用して、1:100(種培養物:発現培養物)の比率で発現培養物を播種した。発現培養物はカルベニシリンを補充したTerrific Broth(Novagen)であり、この発現培養物をUltraYieldフラスコ内で、37℃、200RPMで増殖させた。培養物が2の光学密度(OD)に達した時点で、それらを16℃に冷却し、IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)を添加して、1Mストックから1mMの最終濃度にした。培養物を16℃、200RPMで20時間誘発した後、4℃で15分間にわたる4,000×gでの遠心分離によって回収した。細胞ペーストを秤量し、細胞ペースト1グラム当たり5mLの溶解緩衝液の比率で溶解緩衝液(50mM HEPES-NaOH、250mM NaCl、5mM MgCl2、1mM TCEP、1mMベンズアミジン塩酸塩、1mM PMSF、0.5%CHAPS、10%グリセロール、pH8)中に再懸濁した。再懸濁した時点で、精製するまで試料を-80℃で凍結させた。
1.増殖および発現
Planctomycetesに由来するCasX Stx2(本明細書ではCasX2とも称される)の発現構築物(以下の配列番号2のCasXアミノ酸配列を有し、配列番号437の配列によってコードされる)を、E.coli用にコドン最適化した遺伝子断片(Twist Biosciences)から構築した。組み立てた構築物は、TEV切断可能なC末端TwinStrepタグを含み、この構築物を、アンピシリン耐性遺伝子を含むpBR322誘導体プラスミド骨格にクローニングした。発現構築物を化学的コンピテントBL21*(DE3)E.coliに形質転換し、種培養物を、UltraYieldフラスコ(Thomson Instrument Company)内で、カルベニシリンを補充したLBブロス中、37℃、200RPMで一晩増殖させた。翌日、この培養物を使用して、1:100(種培養物:発現培養物)の比率で発現培養物を播種した。発現培養物はカルベニシリンを補充したTerrific Broth(Novagen)であり、この発現培養物をUltraYieldフラスコ内で、37℃、200RPMで増殖させた。培養物が2の光学密度(OD)に達した時点で、それらを16℃に冷却し、IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)を添加して、1Mストックから1mMの最終濃度にした。培養物を16℃、200RPMで20時間誘発した後、4℃で15分間にわたる4,000×gでの遠心分離によって回収した。細胞ペーストを秤量し、細胞ペースト1グラム当たり5mLの溶解緩衝液の比率で溶解緩衝液(50mM HEPES-NaOH、250mM NaCl、5mM MgCl2、1mM TCEP、1mMベンズアミジン塩酸塩、1mM PMSF、0.5%CHAPS、10%グリセロール、pH8)中に再懸濁した。再懸濁した時点で、精製するまで試料を-80℃で凍結させた。
2.精製
凍結した試料を磁気撹拌しながら4℃で一晩解凍した。結果として得られた溶解物の粘度を超音波処理によって低減させ、Emulsiflex C3(Avestin)を使用して17k PSIで3回通過させて均質化することによって溶解を完了した。溶解物を4℃で30分間にわたる50,000×gでの遠心分離によって清澄化し、上清を回収した。清澄化した上清を重力流によりHeparin 6 Fast Flowカラム(GE Life Sciences)に適用した。カラムを、5CVのヘパリン緩衝液A(50mM HEPES-NaOH、250mM NaCl、5mM MgCl2、1mM TCEP、10%グリセロール、pH8)で洗浄し、その後、5CVのヘパリン緩衝液B(緩衝液AのNaCl濃度を500mMに調整したもの)で洗浄した。タンパク質を、5CVのヘパリン緩衝液C(緩衝液AのNaCl濃度を1Mに調整したもの)で溶出し、画分を収集した。画分をBradfordアッセイによってタンパク質についてアッセイし、タンパク質含有画分をプールした。プールしたヘパリン溶出液を重力流によってStrep-Tactin XT Superflowカラム(IBA Life Sciences)に適用した。カラムを、5CVのStrep緩衝液(50mM HEPES-NaOH、500mM NaCl、5mM MgCl2、1mM TCEP、10%グリセロール、pH8)で洗浄した。タンパク質を、50mMのD-ビオチンを添加した5CVのStrep緩衝液を使用してカラムから溶出し、画分を収集した。CasX含有画分をプールし、30kDaのカットオフスピンコンセントレーターを使用して4℃で濃縮し、Superdex 200pgカラム(GE Life Sciences)でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。カラムを、AKTA Pure FPLCシステム(GE Life Sciences)によって操作されるSEC緩衝液(25mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、1mM TCEP、10%グリセロール、pH7.25)で平衡化した。適切な分子量で溶出したCasX含有画分をプールし、30kDaのカットオフスピンコンセントレーターを使用して4℃で濃縮し、アリコートし、液体窒素中で急速凍結した後、-80℃で保管した。
凍結した試料を磁気撹拌しながら4℃で一晩解凍した。結果として得られた溶解物の粘度を超音波処理によって低減させ、Emulsiflex C3(Avestin)を使用して17k PSIで3回通過させて均質化することによって溶解を完了した。溶解物を4℃で30分間にわたる50,000×gでの遠心分離によって清澄化し、上清を回収した。清澄化した上清を重力流によりHeparin 6 Fast Flowカラム(GE Life Sciences)に適用した。カラムを、5CVのヘパリン緩衝液A(50mM HEPES-NaOH、250mM NaCl、5mM MgCl2、1mM TCEP、10%グリセロール、pH8)で洗浄し、その後、5CVのヘパリン緩衝液B(緩衝液AのNaCl濃度を500mMに調整したもの)で洗浄した。タンパク質を、5CVのヘパリン緩衝液C(緩衝液AのNaCl濃度を1Mに調整したもの)で溶出し、画分を収集した。画分をBradfordアッセイによってタンパク質についてアッセイし、タンパク質含有画分をプールした。プールしたヘパリン溶出液を重力流によってStrep-Tactin XT Superflowカラム(IBA Life Sciences)に適用した。カラムを、5CVのStrep緩衝液(50mM HEPES-NaOH、500mM NaCl、5mM MgCl2、1mM TCEP、10%グリセロール、pH8)で洗浄した。タンパク質を、50mMのD-ビオチンを添加した5CVのStrep緩衝液を使用してカラムから溶出し、画分を収集した。CasX含有画分をプールし、30kDaのカットオフスピンコンセントレーターを使用して4℃で濃縮し、Superdex 200pgカラム(GE Life Sciences)でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。カラムを、AKTA Pure FPLCシステム(GE Life Sciences)によって操作されるSEC緩衝液(25mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、1mM TCEP、10%グリセロール、pH7.25)で平衡化した。適切な分子量で溶出したCasX含有画分をプールし、30kDaのカットオフスピンコンセントレーターを使用して4℃で濃縮し、アリコートし、液体窒素中で急速凍結した後、-80℃で保管した。
3.結果
図1および図3に示されるように、精製を通して得られた試料をSDS-PAGEによって分離し、コロイド状クーマシー染色によって視覚化した。図1では、レーンは、左から右に、分子量標準、ペレット:細胞溶解後の不溶性部分、溶解物:細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー:ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄:洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出:溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー:StrepTactinXTカラムに結合しなかったタンパク質、溶出:溶出緩衝液を用いてStrepTactin XTカラムから溶出したタンパク質、注入:s200ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結:濃縮して凍結させたs200溶出からのプールした画分である。図3では、レーンは、右から左に、注入(ゲル濾過カラムに注入したタンパク質の試料)分子量マーカーであり、レーン3~9は、指定した溶出体積からの試料である。ゲル濾過の結果を図2に示す。68.36mLのピークは、CasXの見かけの分子量に対応し、CasXタンパク質の大部分を含有した。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、平均収量は、75%の純度で培養液1リットル当たり0.75mgの精製CasXタンパク質であった。
図1および図3に示されるように、精製を通して得られた試料をSDS-PAGEによって分離し、コロイド状クーマシー染色によって視覚化した。図1では、レーンは、左から右に、分子量標準、ペレット:細胞溶解後の不溶性部分、溶解物:細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー:ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄:洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出:溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー:StrepTactinXTカラムに結合しなかったタンパク質、溶出:溶出緩衝液を用いてStrepTactin XTカラムから溶出したタンパク質、注入:s200ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結:濃縮して凍結させたs200溶出からのプールした画分である。図3では、レーンは、右から左に、注入(ゲル濾過カラムに注入したタンパク質の試料)分子量マーカーであり、レーン3~9は、指定した溶出体積からの試料である。ゲル濾過の結果を図2に示す。68.36mLのピークは、CasXの見かけの分子量に対応し、CasXタンパク質の大部分を含有した。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、平均収量は、75%の純度で培養液1リットル当たり0.75mgの精製CasXタンパク質であった。
実施例2:CasX構築物119、438、および457
CasX 119、438、および457構築物(表5の配列)を生成するために、コドン最適化CasX 37構築物(Planctomycetes CasX配列番号2をコードし、A708K置換および融合NLSによる[P793]欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的化配列を有する実施例1のStx2構築物に基づく)を、標準クローニング法を使用して、哺乳動物発現プラスミド(pStX、図4を参照されたい)にクローニングした。CasX 119を構築するために、CasX 37構築物DNAを、それぞれ、プライマーoIC539およびoIC88ならびにoIC87およびoIC540を使用して、Q5 DNAポリメラーゼ(New England BioLabs、カタログ番号M0491L)を使用した2つの反応でPCR増幅した(図5を参照されたい)。CasX 457を構築するために、CasX 365構築物DNAを、それぞれ、プライマーoIC539およびoIC212、oIC211およびoIC376、oIC375およびoIC551、ならびにoIC550およびoIC540を使用して、Q5 DNAポリメラーゼを使用した4つの反応でPCR増幅した。CasX 438を構築するために、CasX 119構築物DNAを、それぞれ、プライマーoIC539およびoIC689、oIC688およびoIC376、oIC375およびoIC551、ならびにoIC550およびoIC540を使用して、Q5 DNAポリメラーゼを使用した4つの反応でPCR増幅した。次に、得られたPCR増幅産物をZymoclean DNAクリーンおよびコンセントレーター(Zymo Research、カタログ番号4014)を使用して精製し、pStX骨格をXbaIおよびSpeIを使用して消化した。消化した骨格断片を、Zymoclean Gel DNA回収キット(Zymo Research、カタログ番号D4002)を使用して1%アガロースゲル(Gold Bio、カタログ番号A-201-500)からゲル抽出によって精製し、次いでギブソンアセンブリ(New England BioLabs、カタログ番号E2621S)を使用して3つの断片を1つにした。pStx34において組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するLB寒天プレート(LB:Teknova、カタログ番号L9315、寒天:Quartzy、カタログ番号214510)上にプレーティングした、化学的コンピテントまたは電気的コンピテントTurbo Competent E.coli細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってQiagen Qiaprep spin Miniprep Kit(Qiagen、カタログ番号27104)を使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、CasX PAM位置に基づいて設計した。標的化配列DNAを、標的化配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖DNA(ssDNA)オリゴ(Integrated DNA Technologies)として注文した。これらの2つのオリゴを一緒にアニーリングし、T4 DNAリガーゼ(New England BioLabs、カタログ番号M0202L)およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してGolden Gateアセンブリによって個別にまたはバルクでpStXにクローニングした。Golden Gate産物を、カルベニシリンを含有するLB寒天プレート(LB:Teknova、カタログ番号L9315、寒天:Quartzy、カタログ番号214510)上にプレーティングした、NEB Turbo competent E.coli(NEB、カタログ番号C2984I)などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、Qiagen Qiaprep spin Miniprep Kit(Qiagen、カタログ番号27104)を使用してミニプレップし、得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。SaCas9およびSpyCas9コントロールプラスミドを、pStXのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のpStXプラスミドと同様に調製した。CasX 119および457タンパク質の発現および回収を、実施例1の一般的な方法論を使用して行った(しかしながら、DNA配列をE.coliにおける発現のためにコドン最適化した)。CasX 119の分析アッセイの結果を図6~8に示す。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、CasX 119の平均収量は、75%の純度で培養液1リットル当たり1.56mgの精製CasXタンパク質であった。図6は、記載されるように、Bio-Rad Stain-Free(商標)ゲル上で視覚化された、精製試料のSDS-PAGEゲルを示す。レーンは、左から右に、ペレット:細胞溶解後の不溶性部分、溶解物:細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー:ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄:洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出:溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー:StrepTactinXTカラムに結合しなかったタンパク質、溶出:溶出緩衝液を用いてStrepTactin XTカラムから溶出したタンパク質、注入:s200ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結:濃縮して凍結させたs200溶出からのプールした画分である。
CasX 119、438、および457構築物(表5の配列)を生成するために、コドン最適化CasX 37構築物(Planctomycetes CasX配列番号2をコードし、A708K置換および融合NLSによる[P793]欠失、ならびに連結したガイド配列および非標的化配列を有する実施例1のStx2構築物に基づく)を、標準クローニング法を使用して、哺乳動物発現プラスミド(pStX、図4を参照されたい)にクローニングした。CasX 119を構築するために、CasX 37構築物DNAを、それぞれ、プライマーoIC539およびoIC88ならびにoIC87およびoIC540を使用して、Q5 DNAポリメラーゼ(New England BioLabs、カタログ番号M0491L)を使用した2つの反応でPCR増幅した(図5を参照されたい)。CasX 457を構築するために、CasX 365構築物DNAを、それぞれ、プライマーoIC539およびoIC212、oIC211およびoIC376、oIC375およびoIC551、ならびにoIC550およびoIC540を使用して、Q5 DNAポリメラーゼを使用した4つの反応でPCR増幅した。CasX 438を構築するために、CasX 119構築物DNAを、それぞれ、プライマーoIC539およびoIC689、oIC688およびoIC376、oIC375およびoIC551、ならびにoIC550およびoIC540を使用して、Q5 DNAポリメラーゼを使用した4つの反応でPCR増幅した。次に、得られたPCR増幅産物をZymoclean DNAクリーンおよびコンセントレーター(Zymo Research、カタログ番号4014)を使用して精製し、pStX骨格をXbaIおよびSpeIを使用して消化した。消化した骨格断片を、Zymoclean Gel DNA回収キット(Zymo Research、カタログ番号D4002)を使用して1%アガロースゲル(Gold Bio、カタログ番号A-201-500)からゲル抽出によって精製し、次いでギブソンアセンブリ(New England BioLabs、カタログ番号E2621S)を使用して3つの断片を1つにした。pStx34において組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するLB寒天プレート(LB:Teknova、カタログ番号L9315、寒天:Quartzy、カタログ番号214510)上にプレーティングした、化学的コンピテントまたは電気的コンピテントTurbo Competent E.coli細菌細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってQiagen Qiaprep spin Miniprep Kit(Qiagen、カタログ番号27104)を使用してミニプレップした。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、CasX PAM位置に基づいて設計した。標的化配列DNAを、標的化配列およびこの配列の逆相補体からなる一本鎖DNA(ssDNA)オリゴ(Integrated DNA Technologies)として注文した。これらの2つのオリゴを一緒にアニーリングし、T4 DNAリガーゼ(New England BioLabs、カタログ番号M0202L)およびプラスミドの適切な制限酵素を使用してGolden Gateアセンブリによって個別にまたはバルクでpStXにクローニングした。Golden Gate産物を、カルベニシリンを含有するLB寒天プレート(LB:Teknova、カタログ番号L9315、寒天:Quartzy、カタログ番号214510)上にプレーティングした、NEB Turbo competent E.coli(NEB、カタログ番号C2984I)などの化学的または電気的コンピテント細胞に形質転換した。個々のコロニーを採取し、Qiagen Qiaprep spin Miniprep Kit(Qiagen、カタログ番号27104)を使用してミニプレップし、得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。SaCas9およびSpyCas9コントロールプラスミドを、pStXのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のpStXプラスミドと同様に調製した。CasX 119および457タンパク質の発現および回収を、実施例1の一般的な方法論を使用して行った(しかしながら、DNA配列をE.coliにおける発現のためにコドン最適化した)。CasX 119の分析アッセイの結果を図6~8に示す。コロイド状クーマシー染色によって評価した場合、CasX 119の平均収量は、75%の純度で培養液1リットル当たり1.56mgの精製CasXタンパク質であった。図6は、記載されるように、Bio-Rad Stain-Free(商標)ゲル上で視覚化された、精製試料のSDS-PAGEゲルを示す。レーンは、左から右に、ペレット:細胞溶解後の不溶性部分、溶解物:細胞溶解後の可溶性部分、フロースルー:ヘパリンカラムに結合しなかったタンパク質、洗浄:洗浄緩衝液中のカラムから溶出したタンパク質、溶出:溶出緩衝液を用いてヘパリンカラムから溶出したタンパク質、フロースルー:StrepTactinXTカラムに結合しなかったタンパク質、溶出:溶出緩衝液を用いてStrepTactin XTカラムから溶出したタンパク質、注入:s200ゲル濾過カラムに注入した濃縮タンパク質、凍結:濃縮して凍結させたs200溶出からのプールした画分である。
図7は、記載されるように、Superdex 200 16/600 pgゲル濾過のクロマトグラムを示す。溶出体積に対して280nmの吸光度としてプロットしたCasXバリアント119タンパク質のゲル濾過泳動。65.77mLのピークは、CasXバリアント119の見かけの分子量に対応し、CasXバリアント119タンパク質の大部分を含有した。図8は、記載されるように、コロイド状クーマシーで染色したゲル濾過使用のSDS-PAGEゲルを示す。指定した画分由来の試料をSDS-PAGEによって分離し、コロイド状クーマシーで染色した。右から左に、注入:ゲル濾過カラムに注入したタンパク質の試料、分子量マーカー、レーン3~10:指定した溶出体積からの試料。
実施例3:CasX構築物488および491
CasX 488構築物(表6の配列)を生成するために、コドン最適化CasX 119構築物(Planctomycetes CasX配列番号2をコードする実施例1の野生型CasX Stx2構築物に基づいており、A708K置換、L379R置換、および[P793]欠失を有し、融合したNLS、ならびに連結したガイド配列および非標的化配列を伴う)を、出発構築物として利用し、実施例2の方法論を使用して生成した。CasX 491(表6の配列)を生成するために、CasX 484構築物DNAを、Q5 DNAポリメラーゼ(New England BioLabs、カタログ番号M0491L)を使用してPCR増幅し、出発構築物として利用し、実施例2の方法論を使用して生成した(図5を参照されたい)。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的の遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、実施例2に記載されるように、CasX PAM位置に基づいて設計した。SaCas9およびSpyCas9コントロールプラスミドを、pStXのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のpStXプラスミドと同様に調製した。SaCas9およびSpyCas9の標的化配列は、文献から得たものまたは確立された方法に従って合理的に設計したもののいずれかであった。CasX構築物の発現および回収を、実施例1および実施例2の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
CasX 488構築物(表6の配列)を生成するために、コドン最適化CasX 119構築物(Planctomycetes CasX配列番号2をコードする実施例1の野生型CasX Stx2構築物に基づいており、A708K置換、L379R置換、および[P793]欠失を有し、融合したNLS、ならびに連結したガイド配列および非標的化配列を伴う)を、出発構築物として利用し、実施例2の方法論を使用して生成した。CasX 491(表6の配列)を生成するために、CasX 484構築物DNAを、Q5 DNAポリメラーゼ(New England BioLabs、カタログ番号M0491L)を使用してPCR増幅し、出発構築物として利用し、実施例2の方法論を使用して生成した(図5を参照されたい)。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的の遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、実施例2に記載されるように、CasX PAM位置に基づいて設計した。SaCas9およびSpyCas9コントロールプラスミドを、pStXのタンパク質およびガイド領域をそれぞれのタンパク質およびガイドと交換して、上記のpStXプラスミドと同様に調製した。SaCas9およびSpyCas9の標的化配列は、文献から得たものまたは確立された方法に従って合理的に設計したもののいずれかであった。CasX構築物の発現および回収を、実施例1および実施例2の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
実施例4:CasX構築物278~280、285~288、290、291、293、300、492、および493の設計および生成
CasX 278~280、285~288、290、291、293、300、492、および493構築物(表7の配列)を生成するために、哺乳動物発現ベクターにおけるコドン最適化CasX 119構築物(実施例2のCasX Stx37構築物に基づく)のN末端およびC末端を操作して、NLS配列(表8の配列)を削除または付加した。構築物278、279、および280は、SV40 NLS配列のみを使用したN末端およびC末端の操作物であった。構築物280は、N末端にNLSを有さず、C末端に2つのSV40 NLS’が付加されており、2つのSV40 NLS配列間にトリプルプロリンリンカーを有した。構築物492および493を生成するために、構築物280および291を出発構築物として使用した。クローニング方法は、実施例2に記載のように行った。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的の遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、CasX PAM位置に基づいて設計し、実施例2に記載されるように調製した。これらのプラスミドを、実施例1および実施例2の一般的な方法論を利用してCasXタンパク質を産生および回収するために使用した。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化スペーサー配列をコードする配列を、CasX PAM位置に基づいて設計した。CasX構築物の発現および回収を、実施例1および実施例2の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
CasX 278~280、285~288、290、291、293、300、492、および493構築物(表7の配列)を生成するために、哺乳動物発現ベクターにおけるコドン最適化CasX 119構築物(実施例2のCasX Stx37構築物に基づく)のN末端およびC末端を操作して、NLS配列(表8の配列)を削除または付加した。構築物278、279、および280は、SV40 NLS配列のみを使用したN末端およびC末端の操作物であった。構築物280は、N末端にNLSを有さず、C末端に2つのSV40 NLS’が付加されており、2つのSV40 NLS配列間にトリプルプロリンリンカーを有した。構築物492および493を生成するために、構築物280および291を出発構築物として使用した。クローニング方法は、実施例2に記載のように行った。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的の遺伝子を標的とする標的化配列をコードする配列を、CasX PAM位置に基づいて設計し、実施例2に記載されるように調製した。これらのプラスミドを、実施例1および実施例2の一般的な方法論を利用してCasXタンパク質を産生および回収するために使用した。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化スペーサー配列をコードする配列を、CasX PAM位置に基づいて設計した。CasX構築物の発現および回収を、実施例1および実施例2の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
実施例5:CasX構築物387、395、485~491、および494の設計および生成
CasX 395、CasX 485、CasX 486、CasX 487を生成するために、コドン最適化CasX 119(実施例2のCasX 37構築物に基づく)を出発構築物として使用した。CasX 435、CasX 438、およびCasX 484は、同様に、実施例2のCasX 119構築物に同様に基づいて、それ自体のベクターにおけるアミノ酸192~331からのCasX配列番号1ヘリカルIドメインを増幅するように設計されたギブソンプライマーを用いて、この対応する領域(aa193~332)をそれぞれpStx1におけるCasX 119、CasX 435、CasX 438、およびCasX 484で置き換えた。CasX 488、CasX 489、CasX 490、CasX 435、CasX 438、およびCasX 484、およびCasX 491(表9の配列)を生成するために、コドン最適化CasX 119(実施例2のCasX 37構築物に基づく)をそれぞれ4kbステージングにクローン化し、ギブソンプライマーは、それ自体のベクターにおけるアミノ酸101~191のCasX Stx1 NTSBドメインおよびアミノ酸192~331のヘリカルIドメインを増幅するように設計され、この類似領域(aa103~332)をそれぞれpStx1におけるCasX 119、CasX 435、CasX 438、およびCasX 484で置き換えた。これらのプラスミドを、実施例1および実施例2の一般的な方法論を利用してCasXタンパク質を産生および回収するために使用した。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化スペーサー配列をコードする配列を、CasX PAM位置に基づいて設計した。CasX構築物の発現および回収を、実施例1および実施例2の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
CasX 395、CasX 485、CasX 486、CasX 487を生成するために、コドン最適化CasX 119(実施例2のCasX 37構築物に基づく)を出発構築物として使用した。CasX 435、CasX 438、およびCasX 484は、同様に、実施例2のCasX 119構築物に同様に基づいて、それ自体のベクターにおけるアミノ酸192~331からのCasX配列番号1ヘリカルIドメインを増幅するように設計されたギブソンプライマーを用いて、この対応する領域(aa193~332)をそれぞれpStx1におけるCasX 119、CasX 435、CasX 438、およびCasX 484で置き換えた。CasX 488、CasX 489、CasX 490、CasX 435、CasX 438、およびCasX 484、およびCasX 491(表9の配列)を生成するために、コドン最適化CasX 119(実施例2のCasX 37構築物に基づく)をそれぞれ4kbステージングにクローン化し、ギブソンプライマーは、それ自体のベクターにおけるアミノ酸101~191のCasX Stx1 NTSBドメインおよびアミノ酸192~331のヘリカルIドメインを増幅するように設計され、この類似領域(aa103~332)をそれぞれpStx1におけるCasX 119、CasX 435、CasX 438、およびCasX 484で置き換えた。これらのプラスミドを、実施例1および実施例2の一般的な方法論を利用してCasXタンパク質を産生および回収するために使用した。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定した。目的とする遺伝子を標的とする標的化スペーサー配列をコードする配列を、CasX PAM位置に基づいて設計した。CasX構築物の発現および回収を、実施例1および実施例2の一般的な方法論を使用して行い、同様の結果が得られた。
実施例6:RNAガイドの生成
RNA単一ガイドおよびスペーサーの生成について、インビトロ転写のための鋳型を、推奨プロトコルに従ってQ5ポリメラーゼ(NEB M0491)を用いてPCRを行うことによって生成し、鋳型オリゴは各骨格に対するものであり、増幅プライマーはT7プロモーターおよびスペーサー配列を有した。T7プロモーターに対するDNAプライマー配列、ガイドおよびスペーサーに対するガイドおよびスペーサーを以下の表10に提示する。各足場に対する「骨格fwd」および「骨格rev」とラベル付けした鋳型オリゴは各々、20nMの最終濃度で含まれ、増幅プライマー(T7プロモーターおよび特有のスペーサープライマー)は各々、1uMの最終濃度で含まれた。sg2、sg32、sg64、およびsg174ガイドは、転写効率を増加させるためにsg2、sg32、およびsg64を追加の5’Gで改変したことを除いて、それぞれ、配列番号5、2104、2106、および2238に対応する(表10の配列を表2と比較する)。7.37スペーサーは、ベータ2-ミクログロブリン(B2M)を標的とする。PCR増幅後、鋳型をフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール抽出により洗浄および単離し、その後、エタノールで沈殿させた。
RNA単一ガイドおよびスペーサーの生成について、インビトロ転写のための鋳型を、推奨プロトコルに従ってQ5ポリメラーゼ(NEB M0491)を用いてPCRを行うことによって生成し、鋳型オリゴは各骨格に対するものであり、増幅プライマーはT7プロモーターおよびスペーサー配列を有した。T7プロモーターに対するDNAプライマー配列、ガイドおよびスペーサーに対するガイドおよびスペーサーを以下の表10に提示する。各足場に対する「骨格fwd」および「骨格rev」とラベル付けした鋳型オリゴは各々、20nMの最終濃度で含まれ、増幅プライマー(T7プロモーターおよび特有のスペーサープライマー)は各々、1uMの最終濃度で含まれた。sg2、sg32、sg64、およびsg174ガイドは、転写効率を増加させるためにsg2、sg32、およびsg64を追加の5’Gで改変したことを除いて、それぞれ、配列番号5、2104、2106、および2238に対応する(表10の配列を表2と比較する)。7.37スペーサーは、ベータ2-ミクログロブリン(B2M)を標的とする。PCR増幅後、鋳型をフェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール抽出により洗浄および単離し、その後、エタノールで沈殿させた。
インビトロ転写を、50mM Tris pH 8.0、30mM MgCl2、0.01%Triton X-100、2mMスペルミジン、20mM DTT、5mM NTP、0.5μM鋳型、および100μg/mL T7 RNAポリメラーゼを含有する緩衝液中で行った。反応物を37℃で一晩インキュベートした。転写体積1mL当たり20単位のDNアーゼI(Promega番号M6101))を添加し、1時間インキュベートした。RNA産物を変性PAGEにより精製し、エタノールで沈殿させ、1倍リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁した。sgRNAを折り畳むために、試料を70℃で5分間加熱し、その後、室温に冷却した。反応物に1mMの最終MgCl2濃度を補充し、50℃で5分間加熱し、その後、室温に冷却した。最終RNAガイド産物を-80℃で保管した。
実施例7:RNPアセンブリ
CasXの精製した野生型およびRNPならびに単一ガイドRNA(sgRNA)を、実験の直前に調製するか、または後で使用するために調製し、液体窒素中で急速凍結し、-80℃で保管するかのいずれかを行った。RNP複合体を調製するために、CasXタンパク質をsgRNAと1:1.2のモル比でインキュベートした。簡潔には、sgRNAを、緩衝液番号1(25mM NaPi、150mM NaCl、200mMトレハロース、1mM MgCl2)に添加し、その後、CasXをsgRNA溶液にゆっくり旋回させながら添加し、37℃で10分間インキュベートして、RNP複合体を形成した。RNP複合体を、使用前に、200μlの緩衝液番号1で事前に湿らせた0.22μmのCostar 8160フィルターに通して濾過した。必要に応じて、RNP試料を、所望の体積が得られるまで、0.5mlのUltra 100-Kdカットオフフィルター(Millipore部品番号UFC510096)で濃縮した。切断能力のあるRNPの形成を、実施例12に記載されるように評価した。
CasXの精製した野生型およびRNPならびに単一ガイドRNA(sgRNA)を、実験の直前に調製するか、または後で使用するために調製し、液体窒素中で急速凍結し、-80℃で保管するかのいずれかを行った。RNP複合体を調製するために、CasXタンパク質をsgRNAと1:1.2のモル比でインキュベートした。簡潔には、sgRNAを、緩衝液番号1(25mM NaPi、150mM NaCl、200mMトレハロース、1mM MgCl2)に添加し、その後、CasXをsgRNA溶液にゆっくり旋回させながら添加し、37℃で10分間インキュベートして、RNP複合体を形成した。RNP複合体を、使用前に、200μlの緩衝液番号1で事前に湿らせた0.22μmのCostar 8160フィルターに通して濾過した。必要に応じて、RNP試料を、所望の体積が得られるまで、0.5mlのUltra 100-Kdカットオフフィルター(Millipore部品番号UFC510096)で濃縮した。切断能力のあるRNPの形成を、実施例12に記載されるように評価した。
実施例8:ガイドRNAに対する結合親和性の評価
精製した野生型および改善されたCasXを、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中で3’Cy7.5部分を含有する合成単一ガイドRNAとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。sgRNAを10pMの濃度で維持する一方で、タンパク質を別個の結合反応において1pMから100μMまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を、それぞれ、タンパク質および核酸に結合するニトロセルロース膜および正に荷電したナイロン膜を用いた真空マニホールドフィルター結合アッセイにかける。ガイドRNAを特定するために膜を画像化し、結合RNAの非結合RNAに対する割合を、タンパク質濃度ごとにナイロン膜に対するニトロセルロース膜上の蛍光量によって決定して、タンパク質-sgRNA複合体の解離定数を計算する。この実験をsgRNAの改善されたバリアントでも行い、これらの変異が野生型および変異タンパク質に対するガイドの親和性にも影響を与えるかを決定する。我々は、電気移動度シフトアッセイを行い、フィルター結合アッセイと定性的に比較し、凝集ではなく可溶性結合がタンパク質-RNA会合の主因であることも確認する。
精製した野生型および改善されたCasXを、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中で3’Cy7.5部分を含有する合成単一ガイドRNAとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。sgRNAを10pMの濃度で維持する一方で、タンパク質を別個の結合反応において1pMから100μMまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を、それぞれ、タンパク質および核酸に結合するニトロセルロース膜および正に荷電したナイロン膜を用いた真空マニホールドフィルター結合アッセイにかける。ガイドRNAを特定するために膜を画像化し、結合RNAの非結合RNAに対する割合を、タンパク質濃度ごとにナイロン膜に対するニトロセルロース膜上の蛍光量によって決定して、タンパク質-sgRNA複合体の解離定数を計算する。この実験をsgRNAの改善されたバリアントでも行い、これらの変異が野生型および変異タンパク質に対するガイドの親和性にも影響を与えるかを決定する。我々は、電気移動度シフトアッセイを行い、フィルター結合アッセイと定性的に比較し、凝集ではなく可溶性結合がタンパク質-RNA会合の主因であることも確認する。
実施例9:標的DNAに対する結合親和性の評価
精製した野生型および改善されたCasXを、標的核酸に相補的な標的化配列を有する単一ガイドRNAと複合体形成する。RNP複合体を、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中でPAMおよび標的鎖に5’Cy7.5標識を有する適切な標的核酸配列を含有する二本鎖標的DNAとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。標的DNAを1nMの濃度で維持する一方で、RNPを別個の結合反応において1pMから100μMまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を天然5%ポリアクリルアミドゲル上で泳動させて、結合標的DNAおよび非結合標的DNAを分離する。標的DNAの移動度シフトを特定するためにゲルを画像化し、結合DNAの非結合DNAに対する割合をタンパク質濃度ごとに計算して、RNP-標的DNA三重複合体の解離定数を決定する。実験は、参照CasXと参照gNAとを含むRNPと比較して、CasXバリアントとgNAバリアントとを含むRNPの改善された結合親和性を実証することが予期される。
精製した野生型および改善されたCasXを、標的核酸に相補的な標的化配列を有する単一ガイドRNAと複合体形成する。RNP複合体を、塩化マグネシウムおよびヘパリンを含有する低塩緩衝液中でPAMおよび標的鎖に5’Cy7.5標識を有する適切な標的核酸配列を含有する二本鎖標的DNAとインキュベートして、非特異的結合および凝集を防止する。標的DNAを1nMの濃度で維持する一方で、RNPを別個の結合反応において1pMから100μMまで滴定する。反応を平衡状態にさせた後、試料を天然5%ポリアクリルアミドゲル上で泳動させて、結合標的DNAおよび非結合標的DNAを分離する。標的DNAの移動度シフトを特定するためにゲルを画像化し、結合DNAの非結合DNAに対する割合をタンパク質濃度ごとに計算して、RNP-標的DNA三重複合体の解離定数を決定する。実験は、参照CasXと参照gNAとを含むRNPと比較して、CasXバリアントとgNAバリアントとを含むRNPの改善された結合親和性を実証することが予期される。
実施例10:遺伝子標的PCSK9、PMP22、TRAC、SOD1、B2M、およびHTTの編集
この試験の目的は、6つの遺伝子標的の核酸配列を編集するCasXバリアント119およびgNAバリアント174の能力を評価することであった。
この試験の目的は、6つの遺伝子標的の核酸配列を編集するCasXバリアント119およびgNAバリアント174の能力を評価することであった。
材料および方法
B2MおよびSOD1を除く全ての標的に対するスペーサーを、PAM要件(TTCまたはCTC)に基づく不偏様式で、目的とする所望の遺伝子座を標的とするように設計した。B2MおよびSOD1を標的とするスペーサーは、これらの遺伝子に対して行ったレンチウイルススペーサースクリーニングにより、標的とされたエクソン内で以前に特定された。他の標的に対して設計されたスペーサーは、一本鎖DNA(ssDNA)オリゴ対としてIntegrated DNA Technologies(IDT)から注文したものであった。ssDNAスペーサー対を一緒にアニーリングし、Golden Gateクローニングにより、以下の構成要素:EF1Aプロモーター下のコドン最適化CasX 119タンパク質+NLS、U6プロモーター下のガイド足場174、カルベニシリンおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含有する基礎哺乳動物発現プラスミド構築物にクローニングした。組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するLb寒天プレート(LB:Teknova、カタログ番号L9315、寒天:Quartzy、カタログ番号214510)上にプレーティングし、かつ37℃でインキュベートした、化学的コンピテントE.coliに形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってQiagen Qiaprep spin Miniprep Kit(Qiagen、カタログ番号27104)を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシング(Quintara Biosciences)によりガイド足場領域を通して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。
B2MおよびSOD1を除く全ての標的に対するスペーサーを、PAM要件(TTCまたはCTC)に基づく不偏様式で、目的とする所望の遺伝子座を標的とするように設計した。B2MおよびSOD1を標的とするスペーサーは、これらの遺伝子に対して行ったレンチウイルススペーサースクリーニングにより、標的とされたエクソン内で以前に特定された。他の標的に対して設計されたスペーサーは、一本鎖DNA(ssDNA)オリゴ対としてIntegrated DNA Technologies(IDT)から注文したものであった。ssDNAスペーサー対を一緒にアニーリングし、Golden Gateクローニングにより、以下の構成要素:EF1Aプロモーター下のコドン最適化CasX 119タンパク質+NLS、U6プロモーター下のガイド足場174、カルベニシリンおよびピューロマイシン耐性遺伝子を含有する基礎哺乳動物発現プラスミド構築物にクローニングした。組み立てた産物を、カルベニシリンを含有するLb寒天プレート(LB:Teknova、カタログ番号L9315、寒天:Quartzy、カタログ番号214510)上にプレーティングし、かつ37℃でインキュベートした、化学的コンピテントE.coliに形質転換した。個々のコロニーを採取し、製造業者のプロトコルに従ってQiagen Qiaprep spin Miniprep Kit(Qiagen、カタログ番号27104)を使用してミニプレップした。結果として得られたプラスミドを、サンガーシークエンシング(Quintara Biosciences)によりガイド足場領域を通して配列決定して、正しいライゲーションを確実にした。
HEK 293T細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS、Seradigm、番号1500-500)、100単位/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシン(100×-Pen-Strep、GIBCO、番号15140-122)、ピルビン酸ナトリウム(100×、Thermofisher、番号11360070)、非必須アミノ酸(100×、Thermofisher、番号11140050)、HEPES緩衝液(100×、Thermofisher、番号15630080)、および2-メルカプトエタノール(1000×、Thermofisher、番号21985023)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Corning Cellgro、番号10-013-CV)中で増殖させた。細胞を、TryplEを使用して3~5日毎に通過させ、37℃および5%CO2でインキュベーター内に維持した。
0日目に、HEK293T細胞を30k細胞/ウェルで96ウェル平底プレートに播種した。1日目に、細胞に、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine 3000を使用して100ngのプラスミドDNAをトランスフェクトした。2日目に、細胞を、ピューロマイシンを含有するFB培地に切り替えた。3日目に、この培地を、ピューロマイシンを含有する新鮮なFB培地と交換した。この時点以降のプロトコルは、目的とする遺伝子に応じて異なった。PCSK9、PMP22、およびTRACについての4日目に、細胞が選択を完了したことを確認し、ピューロマイシンを含まないFB培地に切り替えた。B2M、SOD1、およびHTTについての4日目:細胞が選択を完了したことを確認し、ピューロマイシンを含まないFB培地を含有する新しいプレートにTryplEを使用して1:3で通過させた。PCSK9、PMP22、およびTRACについての7日目:細胞をプレートから持ち上げ、dPBS中で洗浄し、カウントし、10,000細胞/μlでQuick Extract(Lucigen、QE09050)中に再懸濁した。ゲノムDNAを製造業者のプロトコルに従って抽出し、-20℃で保管した。B2M、SOD1、およびHTTについての7日目に、細胞をプレートから持ち上げ、dPBS中で洗浄し、ゲノムDNAを、製造業者のプロトコルに従ってQuick-DNA Miniprep Plus Kit(Zymo、D4068)で抽出し、-20℃で保管した。
NGS分析:各実験試料由来の細胞の編集を、次世代シークエンシング(NGS)分析を使用して評価した。すべてのPCRは、KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit(KR0370)を使用して実行した。ゲノムDNA試料PCRについての鋳型は、PCSK9、PMP22、およびTRACについて10k細胞/μLでQE中の5μlのゲノムDNAであった。ゲノムDNA試料PCRについての鋳型は、B2M、SOD1、およびHTTについて水中の400ngのゲノムDNAであった。目的とする標的ゲノム位置に特異的なプライマーを設計して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Illumina読み取りおよび読み取り2配列を導入するために5’末端に追加の配列を含む。さらに、それらは、固有の分子識別子(UMI)として機能する7ntのランダマー配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Fragment Analyzer DNA analyzer kit(Agilent、dsDNA 35-1500bp)を使用して評価した。アンプリコンを、製造業者の指示に従ってIllumina Miseqで配列決定した。結果として得られた配列決定読み取りを参照配列と整列させ、インデルについて分析した。推定された切断位置と整列しなかった編集を有する試料またはスペーサー領域に予期しない対立遺伝子を有する試料を廃棄した。
結果
様々な遺伝子座でCasX:gNA 119.174によって達成された編集を検証するために、クローンプラスミドトランスフェクション実験をHEK 293T細胞に行った。複数のスペーサー(表11、実際のgNAスペーサーのコードDNAおよびRNA配列を列記する)を設計し、CasX 119ヌクレアーゼおよびガイド174足場をコードする発現プラスミドにクローニングした。HEK 293T細胞にプラスミドDNAをトランスフェクトし、ピューロマイシンで選択し、トランスフェクトした6日後にゲノムDNAを回収した。ゲノムDNAを、次世代シークエンシング(NGS)により分析し、挿入または欠失(インデル)の分析のために参照DNA配列と整列させた。CasX:gNA 119.174は、図9および10に示されるように、6つの標的遺伝子にわたってインデルを効率的に生成することができた。インデル率はスペーサー間で異なったが、編集率中央値は一貫して60%以上であり、いくつかの事例では、91%ものインデル率が観察された。加えて、非標準的CTC PAMを有するスペーサーが試験した全ての標的遺伝子でインデルを生成することができることが示された(図11)。
様々な遺伝子座でCasX:gNA 119.174によって達成された編集を検証するために、クローンプラスミドトランスフェクション実験をHEK 293T細胞に行った。複数のスペーサー(表11、実際のgNAスペーサーのコードDNAおよびRNA配列を列記する)を設計し、CasX 119ヌクレアーゼおよびガイド174足場をコードする発現プラスミドにクローニングした。HEK 293T細胞にプラスミドDNAをトランスフェクトし、ピューロマイシンで選択し、トランスフェクトした6日後にゲノムDNAを回収した。ゲノムDNAを、次世代シークエンシング(NGS)により分析し、挿入または欠失(インデル)の分析のために参照DNA配列と整列させた。CasX:gNA 119.174は、図9および10に示されるように、6つの標的遺伝子にわたってインデルを効率的に生成することができた。インデル率はスペーサー間で異なったが、編集率中央値は一貫して60%以上であり、いくつかの事例では、91%ものインデル率が観察された。加えて、非標準的CTC PAMを有するスペーサーが試験した全ての標的遺伝子でインデルを生成することができることが示された(図11)。
結果は、CasXバリアント119およびgNAバリアント174がヒト細胞における多種多様な遺伝子座でインデルを一貫して効率的に生成することができることを示す。本アッセイに使用した多くのスペーサーの不偏選択が、遺伝子座を編集する119.174 RNP分子の全体的な有効性を示す一方で、TTC PAMおよびCTC PAMの両方でスペーサーを標的とする能力は、TTC PAMのみで編集する参照CasXと比較してその多様性の増加を示す。
実施例11:インビトロでの差次的PAM認識の評価
精製した野生型CasXおよび操作したCasXバリアントを、一定の標的化配列を有する単一ガイドRNAと複合体形成する。RNP複合体を、100nMの最終濃度でMgCl2を含有する緩衝液に添加し、10nMの濃度で5’Cy7.5標識二本鎖標的DNAとインキュベートする。標的核酸配列に隣接する異なるPAMを含有する異なるDNA基質を用いて別個の反応を行う。反応のアリコートを一定の時点で採取し、等体積の50mM EDTAおよび95%ホルムアミドを添加してクエンチする。試料を変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、切断DNA基質および非切断DNA基質を分離する。結果を可視化し、CasXバリアントによる非標準的PAMの切断速度を決定する。
精製した野生型CasXおよび操作したCasXバリアントを、一定の標的化配列を有する単一ガイドRNAと複合体形成する。RNP複合体を、100nMの最終濃度でMgCl2を含有する緩衝液に添加し、10nMの濃度で5’Cy7.5標識二本鎖標的DNAとインキュベートする。標的核酸配列に隣接する異なるPAMを含有する異なるDNA基質を用いて別個の反応を行う。反応のアリコートを一定の時点で採取し、等体積の50mM EDTAおよび95%ホルムアミドを添加してクエンチする。試料を変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させ、切断DNA基質および非切断DNA基質を分離する。結果を可視化し、CasXバリアントによる非標準的PAMの切断速度を決定する。
実施例12:CasX:gNAのインビトロ切断アッセイ
1.野生型参照CasXと比較したタンパク質バリアントの切断能力のある分率を決定する
参照CasXと比較して活性なRNPを形成するCasXバリアントの能力を、インビトロ切断アッセイを使用して決定した。切断アッセイのベータ-2ミクログロブリン(B2M)7.37標的を以下のように作製した。配列TGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCT(非標的鎖、NTS(配列番号596))を有するDNAオリゴおよび配列TGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCT(標的鎖、TS(配列番号597))を有するDNAオリゴを、5’蛍光標識(それぞれ、LI-COR IRDye 700および800)とともに購入した。dsDNA標的を、1倍切断緩衝液(20mM Tris HCl pH 7.5、150mM NaCl、1mM TCEP、5%グリセロール、10mM MgCl2)中で1:1の比率でオリゴを混合し、10分間かけて95℃に加熱し、溶液を室温に冷却することによって形成した。
1.野生型参照CasXと比較したタンパク質バリアントの切断能力のある分率を決定する
参照CasXと比較して活性なRNPを形成するCasXバリアントの能力を、インビトロ切断アッセイを使用して決定した。切断アッセイのベータ-2ミクログロブリン(B2M)7.37標的を以下のように作製した。配列TGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCT(非標的鎖、NTS(配列番号596))を有するDNAオリゴおよび配列TGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCT(標的鎖、TS(配列番号597))を有するDNAオリゴを、5’蛍光標識(それぞれ、LI-COR IRDye 700および800)とともに購入した。dsDNA標的を、1倍切断緩衝液(20mM Tris HCl pH 7.5、150mM NaCl、1mM TCEP、5%グリセロール、10mM MgCl2)中で1:1の比率でオリゴを混合し、10分間かけて95℃に加熱し、溶液を室温に冷却することによって形成した。
CasX RNPを、別途特定されない限り1倍切断緩衝液(20mM Tris HCl pH 7.5、150mM NaCl、1mM TCEP、5%グリセロール、10mM MgCl2)中で1.5倍過剰の指定したガイドとともに1μMの最終濃度で指定したCasXおよびガイド(グラフを参照されたい)で、37℃で10分間再構成し、その後、使用する準備が整うまで氷に移した。7.37標的を、7.37標的に相補的なスペーサーを有するsgRNAとともに使用した。
切断反応物を、100nMの最終RNP濃度および100nMの最終標的濃度で調製した。反応を37℃で行い、7.37標的DNAの添加によって開始した。アリコートを5、10、30、60、および120分時点で採取し、95%ホルムアミド、20mM EDTAに添加することによってクエンチした。試料を、95℃で10分間加熱することによって変性させ、10%尿素-PAGEゲル上で泳動させた。ゲルを、LI-COR Odyssey CLxで画像化し、LI-COR Image Studioソフトウェアを使用して定量するか、Cytiva Typhoonで画像化し、Cytiva IQTLソフトウェアを使用して定量するかのいずれかを行った。結果として得られたデータを、Prismを使用してプロットして分析した。我々は、半化学量論的量の酵素が延長した時間スケール下でさえも化学量論的量を超える標的を切断することができず、代わりに、存在する酵素の量に対応する定常状態に近づくという観察によって示されるように、CasXがアッセイ条件下で単回代謝回転酵素として本質的に作用すると仮定した。したがって、等モル量のRNPによって長時間スケールにわたって切断された標的の分率は、RNPのどのくらいの分率が適切に形成され、切断に対して活性であるかを示す。切断反応がこの濃度体制下で単相から明らかに逸脱するため、切断追跡を二相速度モデルに適合させ、3つの独立した複製の各々の定常状態を決定した。平均および標準偏差を計算して、活性分率を決定した(表12)。グラフを図12に示す。
見かけの活性(切断能力のある)分率を、CasX2+ガイド174+7.37スペーサー、CasX119+ガイド174+7.37スペーサー、CasX457+ガイド174+7.37スペーサー、CasX488+ガイド174+7.37スペーサー、およびCasX491+ガイド174+7.37スペーサーに対して形成されたRNPについて決定した。決定した活性分率を表12に示す。すべてのCasXバリアントが野生型CasX2よりも高い活性分率を有し、これは、操作したCasXバリアントが野生型CasXと比較して試験した条件下で同一のガイドと有意に活性な安定したRNPを形成することを示す。これは、sgRNAに対する親和性の増加、sgRNAの存在下での安定性もしくは溶解性の増加、または操作したCasX:sgRNA複合体の切断能力のある立体構造のより高い安定性に起因し得る。RNPの溶解性の増加は、CasX2と比較してCasX457、CasX488、またはCasX491をsgRNAに添加したときに形成された観察された沈殿物の顕著な減少によって示された。
2.インビトロ切断アッセイ-野生型参照CasXと比較したCasXバリアントのk切断を決定する
図13および表12に示されるように、同じプロトコルを使用して、CasX2.2.7.37、CasX2.32.7.37、CasX2.64.7.37、およびCasX2.174.7.37の切断能力のある分率が、16±3%、13±3%、5±2%、および22±5%であると決定した。
図13および表12に示されるように、同じプロトコルを使用して、CasX2.2.7.37、CasX2.32.7.37、CasX2.64.7.37、およびCasX2.174.7.37の切断能力のある分率が、16±3%、13±3%、5±2%、および22±5%であると決定した。
ガイドのRNP形成への寄与をより良好に分離するために、ガイドの第2のセットを異なる条件下で試験した。7.37スペーサーを有する174、175、185、186、196、214、および215ガイドを、前述のように過剰なガイドではなく、ガイドの場合に1μMおよびタンパク質の場合に1.5μMの最終濃度でCasX491と混合した。結果を図12および表14に示す。これらのガイドの多くは、174を超える追加の改善を示し、185および196は、これらのガイド制限条件下で、174の17%と比較して、それぞれ、44%および46%の切断能力のある分率を達成した。
データは、CasXバリアントおよびsgRNAバリアントの両方が、野生型CasXおよび野生型sgRNAと比較して、ガイドRNAとより高度な活性RNPを形成することができることを示す。
野生型参照CasXと比較したCasXバリアント119、457、488、および491の見かけの切断速度を、標的7.37の切断のためのインビトロ蛍光アッセイを使用して決定した。
CasX RNPを、1倍切断緩衝液(20mM Tris HCl pH7.5、150mM NaCl、1mM TCEP、5%グリセロール、10mM MgCl2)中で1.5倍過剰の指定したガイドとともに1μMの最終濃度で指定したCasX(図15を参照されたい)で、37℃で10分間再構成し、その後、使用する準備が整うまで氷に移した。切断反応を、200nMの最終RNP濃度および10nMの最終標的濃度で設定した。反応を、別途記述されない限り37℃で行い、標的DNAの添加により開始した。アリコートを0.25、0.5、1、2、5、および10分時点で採取し、95%ホルムアミド、20mM EDTAに添加することによってクエンチした。試料を、95℃で10分間加熱することによって変性させ、10%尿素-PAGEゲル上で泳動させた。ゲルを、LI-COR Odyssey CLxで画像化し、LI-COR Image Studioソフトウェアを使用して定量するか、Cytiva Typhoonで画像化し、Cytiva IQTLソフトウェアを使用して定量した。結果として得られたデータを、Prismを使用してプロットして分析し、各CasX:sgRNA組み合わせ複製の非標的鎖切断の見かけの一次速度定数(k切断)を決定した。独立した適合を有する3つの複製の平均および標準偏差を表12に提示し、切断追跡を図15に示す。
野生型CasX2、ならびにCasXバリアント119、457、488、および491の見かけの切断速度定数を決定し、ガイド174およびスペーサー7.37を各アッセイで利用した(表12および図15を参照されたい)。すべてのCasXバリアントが野生型CasX2と比較して改善された切断速度を有した。上で決定されたようにより高い切断能力のある分率を有するにもかかわらず、CasX457は119よりもゆっくりと切断した。CasX488およびCasX491は、大幅に最も速い切断速度を示し、標的は第1の時点でほぼ完全に切断されたため、真の切断速度はこのアッセイの分解能を超え、報告されたk切断を下限とみなすべきである。
データは、CasXバリアントが野生型CasX2と比較してより高いレベルの活性を有し、少なくとも30倍高いk切断速度に達することを示す。
3.インビトロ切断アッセイ:ガイドバリアントと野生型ガイドとの比較
切断アッセイを、ガイドバリアント32、64、および174と比較した野生型参照CasX2および参照ガイド2を用いて行い、これらのバリアントが切断を改善したかも決定した。実験を上述のように行った。結果として得られたRNPの多くが試験した時間内に標的の完全な切断に近づかなかったため、我々は、一次速度定数ではなく、初期反応速度(V0)を決定した。最初の2つの時点(15秒および30秒)をCasX:sgRNA組み合わせおよび複製の各々のラインと適合させた。3つの複製の勾配の平均および標準偏差を決定した。
切断アッセイを、ガイドバリアント32、64、および174と比較した野生型参照CasX2および参照ガイド2を用いて行い、これらのバリアントが切断を改善したかも決定した。実験を上述のように行った。結果として得られたRNPの多くが試験した時間内に標的の完全な切断に近づかなかったため、我々は、一次速度定数ではなく、初期反応速度(V0)を決定した。最初の2つの時点(15秒および30秒)をCasX:sgRNA組み合わせおよび複製の各々のラインと適合させた。3つの複製の勾配の平均および標準偏差を決定した。
アッセイした条件下で、ガイド2、32、64、および174を有するCasX2についてのV0は、20.4±1.4nM/分、18.4±2.4nM/分、7.8±1.8nM/分、および49.3±1.4nM/分であった(表12および図16~17を参照のこと)。ガイド174は、結果として得られたRNPの切断速度の実質的な改善を示した(2と比較して約2.5倍、図17を参照されたい)一方で、実施したガイド32および64は、ガイド2と同様またはそれよりも劣っていた。注目すべきことに、ガイド64は、ガイド2よりも遅い切断速度を支持するが、インビボではるかにより良好に機能する(データ示さず)。ガイド64を生成するための配列変化のうちのいくつかは、トリプレックス形成に関与するヌクレオチドを犠牲にしてインビボ転写を改善する可能性が高い。ガイド64の改善された発現は、インビボでのその改善された活性を説明する可能性が高いが、その低下した安定性は、インビトロでの不適切なフォールディングをもたらす可能性がある。
相対的切断速度を決定するために、スペーサー7.37およびCasX491を有するガイド174、175、185、186、196、214、および215を使用して追加の実験を行った。切断速度を我々のアッセイで測定可能な範囲に低下させるために、切断反応物を10℃でインキュベートした。結果を図18および表12に示す。これらの条件下で、215は、174よりも速い切断速度を支持した唯一のガイドであった。ガイド制限条件下でRNPの最も高い活性分率を呈した196は、174と本質的に同じ反応速度を有し、異なるバリアントが別個の特性の改善をもたらすことを再び強調する。
データは、本アッセイの条件下で、CasXを有するガイドバリアントの大半を使用することにより、野生型ガイドを有するものよりも高いレベルの活性を有するRNPが得られ、初期切断速度の約2倍~6倍超の範囲の改善がもたらされることを裏付ける。表12の数字は、左から右に、RNP構築物のCasXバリアント、sgRNA足場、およびスペーサー配列を示す。以下の表のRNP構築物名では、CasXタンパク質バリアント、ガイド足場、およびスペーサーが、左から右に示される。
実施例13:PCSK9のCasX:gNA編集
この実施例は、PCSK9遺伝子座を改変することができる組成物を作成して試験するパラメーターを示す。
この実施例は、PCSK9遺伝子座を改変することができる組成物を作成して試験するパラメーターを示す。
実験設計:
A)PCSK9-改変スペーサー選択プロセス
20bp XTC PAMスペーサーは、ヒトゲノムにおける以下の領域:
(a)PCSK9シスエンハンサー要素
(b)脊椎動物にわたって高度に保存されたPCSK9近位非コード化遺伝子要素(UCSCゲノムブラウザー)
(c)PCSK9ゲノム遺伝子座、を標的とするように設計される。PCSK9遺伝子は、ヒトゲノムのchr1:55,039,476~55,064,853(GRCh38/hg38)にまたがる配列として定義される(表記は、第1染色体の55,039,476bpで開始して55,064,853bpまでである第1染色体(chr1)を指す(ホモサピエンス更新注釈リリース109.20190905、GRCh38.p13)(NCBI)。PCSK9標的化スペーサーは、他のゲノムから同様に組み立てられ得る。
A)PCSK9-改変スペーサー選択プロセス
20bp XTC PAMスペーサーは、ヒトゲノムにおける以下の領域:
(a)PCSK9シスエンハンサー要素
(b)脊椎動物にわたって高度に保存されたPCSK9近位非コード化遺伝子要素(UCSCゲノムブラウザー)
(c)PCSK9ゲノム遺伝子座、を標的とするように設計される。PCSK9遺伝子は、ヒトゲノムのchr1:55,039,476~55,064,853(GRCh38/hg38)にまたがる配列として定義される(表記は、第1染色体の55,039,476bpで開始して55,064,853bpまでである第1染色体(chr1)を指す(ホモサピエンス更新注釈リリース109.20190905、GRCh38.p13)(NCBI)。PCSK9標的化スペーサーは、他のゲノムから同様に組み立てられ得る。
B)PCSK9標的化構築物を生成するための方法:
PCSK9標的化構築物を生成するために、表11のPCSK9標的化スペーサーは、以下の構成要素:コドン最適化CasX(構築物CasX 119分子およびrRNAガイド174(119.174)、配列について表を参照)+NLS、および哺乳類の選択マーカーであるピューロマイシンからなるベースとなる哺乳類発現プラスミド構築物(pStX)にクローン化する。スペーサー配列DNAは、スペーサー配列およびこの配列の逆相補体からなる、Integrated DNA Technologies(IDT)による一本鎖DNA(ssDNA)として注文する。これらの2つのオリゴを一緒にアニーリングし、T4 DNAリガーゼ(New England BioLabs、カタログ番号M0202L)およびプラスミドに適切な制限酵素を使用したGolden Gateアセンブリによって、個別に、またはバルクで、pStXにクローニングする。組み立てられた生成物を、化学的または電気的にコンピテントな細菌細胞に形質転換させ、カルベニシリンを含有するLb寒天プレート(LB:Teknova、カタログ番号L9315、寒天:Quartzy、カタログ番号214510)上に播種し、コロニーが出現するまでインキュベートする。個々のコロニーを採取し、Qiagen Qiaprep spin Miniprep Kit(Qiagen、カタログ番号27104)を製造業者のプロトコルに従って使用してミニプレップする。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にする。SaCas9およびSpyCas9コントロールプラスミドは、Casタンパク質特異的PAMに基づいて選択されるスペーサーを有し、上記のpStXプラスミドと同様に調製される。
PCSK9標的化構築物を生成するために、表11のPCSK9標的化スペーサーは、以下の構成要素:コドン最適化CasX(構築物CasX 119分子およびrRNAガイド174(119.174)、配列について表を参照)+NLS、および哺乳類の選択マーカーであるピューロマイシンからなるベースとなる哺乳類発現プラスミド構築物(pStX)にクローン化する。スペーサー配列DNAは、スペーサー配列およびこの配列の逆相補体からなる、Integrated DNA Technologies(IDT)による一本鎖DNA(ssDNA)として注文する。これらの2つのオリゴを一緒にアニーリングし、T4 DNAリガーゼ(New England BioLabs、カタログ番号M0202L)およびプラスミドに適切な制限酵素を使用したGolden Gateアセンブリによって、個別に、またはバルクで、pStXにクローニングする。組み立てられた生成物を、化学的または電気的にコンピテントな細菌細胞に形質転換させ、カルベニシリンを含有するLb寒天プレート(LB:Teknova、カタログ番号L9315、寒天:Quartzy、カタログ番号214510)上に播種し、コロニーが出現するまでインキュベートする。個々のコロニーを採取し、Qiagen Qiaprep spin Miniprep Kit(Qiagen、カタログ番号27104)を製造業者のプロトコルに従って使用してミニプレップする。得られたプラスミドを、サンガーシークエンシングを使用して配列決定して、正しいライゲーションを確実にする。SaCas9およびSpyCas9コントロールプラスミドは、Casタンパク質特異的PAMに基づいて選択されるスペーサーを有し、上記のpStXプラスミドと同様に調製される。
C)PCSK9レポーター株を生成する方法:
蛍光コードDNA(例えば、GFP)は、HEPG2細胞株における最後のPCSK9エクソンの3’末端にノックインされる。改変された細胞は、3~5日ごとに連続継代によって増殖させ、10%ウシ胎児血清(FBS、Seradigm、No.1500-500)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Corning Cellgro、No.10-013-CV)、または他の適切な培地、ならびに100単位/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシン(100×-Pen-Strep、GIBCO No.15140-122)からなり、ピルビン酸ナトリウム(100×、Thermofisher、No.11360070)、非必須アミノ酸(100×Thermofisher、No.11140050)、HEPES緩衝液(100×、Thermofisher、No.15630080)、および2-メルカプトエタノール(1000×、Thermofisher、No.21985023)をさらに含み得る、線維芽細胞(FB)中に維持する。細胞は、37℃および5%CO2でインキュベートする。1~2週後、単一のGFP+細胞を、FBまたは他の適切な培地で選別する。レポーター株クローンを3~5日ごとに連続継代によって増殖させ、37℃および5%CO2のインキュベーター内でFB培地中に維持する。株は、ゲノム配列決定、およびPCSK9標的化分子を使用したPCSK9遺伝子座の機能的改変によって特徴付けられる。最適なレポーター株は、i)標的PCSK9遺伝子座に正しく組み込まれた単一コピーのGFPを有するもの、ii)未改変細胞と同等の倍加時間を維持したもの、iii)後述の方法を使用してアッセイした場合、PCSK9遺伝子の破壊時にGFP蛍光が減少したもの、として特定される。
蛍光コードDNA(例えば、GFP)は、HEPG2細胞株における最後のPCSK9エクソンの3’末端にノックインされる。改変された細胞は、3~5日ごとに連続継代によって増殖させ、10%ウシ胎児血清(FBS、Seradigm、No.1500-500)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Corning Cellgro、No.10-013-CV)、または他の適切な培地、ならびに100単位/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシン(100×-Pen-Strep、GIBCO No.15140-122)からなり、ピルビン酸ナトリウム(100×、Thermofisher、No.11360070)、非必須アミノ酸(100×Thermofisher、No.11140050)、HEPES緩衝液(100×、Thermofisher、No.15630080)、および2-メルカプトエタノール(1000×、Thermofisher、No.21985023)をさらに含み得る、線維芽細胞(FB)中に維持する。細胞は、37℃および5%CO2でインキュベートする。1~2週後、単一のGFP+細胞を、FBまたは他の適切な培地で選別する。レポーター株クローンを3~5日ごとに連続継代によって増殖させ、37℃および5%CO2のインキュベーター内でFB培地中に維持する。株は、ゲノム配列決定、およびPCSK9標的化分子を使用したPCSK9遺伝子座の機能的改変によって特徴付けられる。最適なレポーター株は、i)標的PCSK9遺伝子座に正しく組み込まれた単一コピーのGFPを有するもの、ii)未改変細胞と同等の倍加時間を維持したもの、iii)後述の方法を使用してアッセイした場合、PCSK9遺伝子の破壊時にGFP蛍光が減少したもの、として特定される。
D)PCSK9-GFPレポーター細胞株におけるPCSK9改変活性を評価する方法:
PCSK9レポーター細胞を96ウェルプレートに100μlのFB培地中20~40k細胞/ウェルで播種し、5%CO2を用いた37℃のインキュベーターで培養する。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認する。理想的には、細胞はトランスフェクション時に約75%のコンフルエンスであるべきである。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行する。
PCSK9レポーター細胞を96ウェルプレートに100μlのFB培地中20~40k細胞/ウェルで播種し、5%CO2を用いた37℃のインキュベーターで培養する。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認する。理想的には、細胞はトランスフェクション時に約75%のコンフルエンスであるべきである。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行する。
PCSK9を標的とする適切なスペーサーを有する各CasX構築物(CasX 119およびガイド174)は、Lipofectamine 3000を製造業者のプロトコルに従って使用し、構築物当たり3ウェルを反復として使用して、ウェル当たり100~500ngでトランスフェクトする。PCSK9を標的とするSaCas9およびSpyCas9を基準コントロールとして使用する。各Casタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用する。
0.3~3μg/mlでのピューロマイシン選択の24~48時間後、トランスフェクトに成功した細胞を選択するために、続いてFBまたは他の適切な培地中で24~48時間回収し、トランスフェクトした細胞における蛍光をフローサイトメトリーによって分析する。このプロセスでは、細胞を適切な前方および側方散乱についてゲーティングし、単一細胞を選択し、次にレポーター発現についてゲーティングして(Attune Nxt Flow Cytometer、Thermo Fisher Scientific)、フルオロフォアの発現レベルを定量する。各試料について少なくとも10,000の事象を収集する。データを使用して、抗体標識陰性(編集済み)細胞のパーセンテージを計算する。
実施例からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Quick抽出溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出する。編集は、T7E1アッセイを使用して分析する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、PCRプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー(例えば、目的の標的の周囲500bp領域)を使用して増幅させる。次に、PCRアンプリコンを、サーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にT7エンドヌクレアーゼを用いて37℃で30分間処理する。次に、試料を2%アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析して、DNAバンドを視覚化する。
実施例14:HEPG2またはHEK293T細胞におけるPCSK9改変活性を評価する方法。
HEPG2細胞またはHEK293T細胞を、96ウェルプレートに100μlのFB培地中20~40k細胞/ウェルで播種し、5%CO2を用いた37℃インキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認する。細胞は、トランスフェクション時に約75%コンフルエントであるべきである。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行する。
HEPG2細胞またはHEK293T細胞を、96ウェルプレートに100μlのFB培地中20~40k細胞/ウェルで播種し、5%CO2を用いた37℃インキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認する。細胞は、トランスフェクション時に約75%コンフルエントであるべきである。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行する。
ガイド174を有するCasX構築物119およびPCSK9を標的とする表11のスペーサーは、Lipofectamine 3000を製造業者のプロトコルに従って使用してウェル当たり100~500ngでトランスフェクトし、反復として構築物当たり3ウェルに加えた。非標的化プラスミドを、陰性コントロールとして使用した。トランスフェクトに成功した細胞を選択するために1~3μg/mlで24~48時間ピューロマイシン選択後、FB培地に24~48時間回収した後、以下に説明するように、細胞を上記のT7E1アッセイまたはウエスタンブロッティングによって編集するために分析する。
実施例15:レンチウイルスベクターにPCSK9標的化CasX構築物をパッケージングする方法。
PCSK9を標的とするPCSK9標的化CasX:gNA構築物をパッケージングするレンチウイルス粒子(例えば、実施例2のCasX 119と、実施例6のガイド174と、表11または配列番号315~436、612~2100、もしくは2286~13861のうちのいずれか1つをコードするスペーサー)は、CasXをコードする導入遺伝子プラスミドと、ガイドRNAと、レンチウイルスパッケージングプラスミドと、VSV-Gエンベローププラスミドと、のポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用して、70%~90%のコンフルエンスでHEK293Tをトランスフェクトすることによって生成する。レンチウイルス粒子の産生では、培地をトランスフェクションの12時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの36~48時間後に収集する。ウイルス上清を0.45μm膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じて、FB培地(MEM-NEAA(Thermo、11140050)、ピルビン酸ナトリウム(Thermo、11360070)、HEPES(Thermo、15630080)、2-メルカプトエタノール(Gibco、21985023)、ウシ胎児血清の体積分率10%(FBS、VWR、No.97068-085)を添加したペニシリン/ストレプトマイシン(Thermo、15140122)を補充したGlutamax(Gibco、10566-016)添加DMEMからなる、線維芽細胞培地)で希釈する。
PCSK9を標的とするPCSK9標的化CasX:gNA構築物をパッケージングするレンチウイルス粒子(例えば、実施例2のCasX 119と、実施例6のガイド174と、表11または配列番号315~436、612~2100、もしくは2286~13861のうちのいずれか1つをコードするスペーサー)は、CasXをコードする導入遺伝子プラスミドと、ガイドRNAと、レンチウイルスパッケージングプラスミドと、VSV-Gエンベローププラスミドと、のポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用して、70%~90%のコンフルエンスでHEK293Tをトランスフェクトすることによって生成する。レンチウイルス粒子の産生では、培地をトランスフェクションの12時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの36~48時間後に収集する。ウイルス上清を0.45μm膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じて、FB培地(MEM-NEAA(Thermo、11140050)、ピルビン酸ナトリウム(Thermo、11360070)、HEPES(Thermo、15630080)、2-メルカプトエタノール(Gibco、21985023)、ウシ胎児血清の体積分率10%(FBS、VWR、No.97068-085)を添加したペニシリン/ストレプトマイシン(Thermo、15140122)を補充したGlutamax(Gibco、10566-016)添加DMEMからなる、線維芽細胞培地)で希釈する。
実施例16:レンチウイルススクリーニングを介してPCSK9改変を評価する方法。
レンチウイルスプラスミドは、各レンチウイルスプラスミドが、CasX分子(例えば、構築物CasX 119分子)を有する1つのコドン最適化NLSと、PCSK9を標的とするスペーサー(表11のスペーサー配列または配列番号315~436、612~2100、または2286~13861の配列のDNA対応物、すなわち、U塩基について置換されたT)を有するrRNAガイド174(119.174)とをピューロマイシン選択マーカーとともに有するように、標準的なクローニング手順に従って生成される。クローニングは、最終的な力価が、すべての既知のPAMを標的にするすべての可能なPCSK9スペーサーおよびPCSK9遺伝子におけるそれらの対応するするスペーサー領域と調節領域とを>100×で全ライブラリサイズを包含するように実行される。約5,000がライブラリサイズの場合、評価されるライブラリは>5x105になる。
レンチウイルスプラスミドは、各レンチウイルスプラスミドが、CasX分子(例えば、構築物CasX 119分子)を有する1つのコドン最適化NLSと、PCSK9を標的とするスペーサー(表11のスペーサー配列または配列番号315~436、612~2100、または2286~13861の配列のDNA対応物、すなわち、U塩基について置換されたT)を有するrRNAガイド174(119.174)とをピューロマイシン選択マーカーとともに有するように、標準的なクローニング手順に従って生成される。クローニングは、最終的な力価が、すべての既知のPAMを標的にするすべての可能なPCSK9スペーサーおよびPCSK9遺伝子におけるそれらの対応するするスペーサー領域と調節領域とを>100×で全ライブラリサイズを包含するように実行される。約5,000がライブラリサイズの場合、評価されるライブラリは>5x105になる。
レンチウイルス粒子は、HEK293Tを、70%~90%のコンフルエンスで、スペーサーライブラリを含むプラスミド、レンチウイルスパッケージングプラスミド、およびVSV-Gエンベローププラスミドのポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用してトランスフェクトすることによって生成する。粒子産生では、培地をトランスフェクションの12時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの36~48時間後に収集する。
ウイルス上清を0.45μm膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じてFB培地で希釈し、標的細胞、この場合はPCSK9-GFPレポーター細胞株に添加する。必要に応じて、サプリメントポリベレンを5~20μg/mlで添加して、形質導入効率を高める。形質導入された細胞は、形質導入後、FB培地中にピューロマイシンを0.3~3μg/mlで使用して24~48時間選択し、FBまたは他の適切な培地で、5%CO2を用いた37℃インキュベーター内で7~10日間増殖させる。
細胞は、SH-100またはMA900 SONYソーターで選別する。このプロセスでは、細胞は適切な前方および側方散乱でゲーティングして単一細胞について選択し、次にレポーター発現についてゲーティングする。異なる細胞選別ゲートが、蛍光レベル(OFF=完全なKO、Med=部分的破壊またはノックダウン(KD)、High=編集なし、Very High=エンハンサー)に基づいて確立され、i)高度に機能的なPCSK9破壊分子、ii)発現を低下させるだけの分子、およびiii)発現を増加させる分子によって細胞編集間を区別して収集する。このアッセイはまた、2つの色調がヒト患者細胞で使用される場合、対立遺伝子特異的ガイドを特定するために実行することができる。ゲノムDNAは、Quick Extract(Lucigen、カタログ番号QE09050)溶液を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して、選別された細胞の各群から収集する。
次いで、収集した各プールからのスペーサーライブラリをゲノムからそのままPCRを介して増幅させ、Miseqでのディープ配列決定のために収集した。スペーサーの分析は、特定の活性についてゲートおよび存在量に従って行われ、スペーサーヒットのNGS分析に関する詳細な方法について、以下を参照されたい。
次に、選別された各群からの選択されたガイドを再クローニングし、個別に活性についてレポーター細胞株および初代ヒト細胞株で、フローサイトメトリーおよびT7E1アッセイおよび/またはウエスタンブロッティングによって検証し、インデルスペクトルをNGS分析によって評価する。従うステップは、レポーター細胞株におけるPCSK9改変活性を評価する方法で提供される説明と同様であり得る。
スペーサーヒットのNGS分析のための方法
上記のレンチウイルススクリーニングから得られたデータは、次世代(NGS)配列決定を使用して分析する。スペーサーは各々、次世代配列決定(NGS)を使用してPCSK9遺伝子を破壊する能力について評価する。NGSライブラリは、スペーサーを含むレンチウイルス骨格の特異的増幅を通して生成される。異なるライブラリが、選別された集団(低、中、高PCSK9発現に対応する、GFP高、中、低など)の各々について生成され、Illumina Hiseqを用いて評価する。
上記のレンチウイルススクリーニングから得られたデータは、次世代(NGS)配列決定を使用して分析する。スペーサーは各々、次世代配列決定(NGS)を使用してPCSK9遺伝子を破壊する能力について評価する。NGSライブラリは、スペーサーを含むレンチウイルス骨格の特異的増幅を通して生成される。異なるライブラリが、選別された集団(低、中、高PCSK9発現に対応する、GFP高、中、低など)の各々について生成され、Illumina Hiseqを用いて評価する。
Illumina Hiseqからの配列読み取りは、アダプター配列および配列決定品質の低い領域についてトリミングする。ペアエンド読み取りは、それらの重複配列に基づいてマージして、配列決定された断片ごとに単一のコンセンサス配列を形成する。コンセンサス配列は、bowtie2を使用して設計されたスペーサー配列にアラインメントさせる。2つ以上の設計されたスペーサー配列にアラインメントする読み取りは破棄する。
各スペーサー配列の「存在量」は、その配列にアラインする読み取り数として定義される。存在量は、各配列決定ライブラリについて表にされ、各配列決定ライブラリ(すなわち、選別した集団)の各々にわたって各スペーサー配列の存在量を示す数値表を形成する。最後に、存在量の数は、各ライブラリの異なる配列決定深度を、そのライブラリにおける全読み取りによって除し、ライブラリにわたる平均読み取り数を乗じることによって基準化する。基準化された数値表を使用して、各ゲートにおける各スペーサーの活性(高、中、低など)を決定する。
PCSK9-GFPレポーター株は、内因性ヒトPCSK9遺伝子座でGFPをノックインすることによって構築される。gRNAスペーサーに相補的なgRNA標的化配列に結合したレポーター(例えば、GFPレポーター)をレポーター細胞株に組み込む。細胞をCasXタンパク質および/またはsgRNAバリアントで形質転換またはトランスフェクトし、sgRNAのスペーサーモチーフはレポーターのgRNA標的配列に相補的であり、かつそれを標的とする。標的核酸配列を切断するCasX:sgRNAリボ核タンパク質複合体の能力は、FACSによってアッセイする。レポーター発現を失った細胞は、CasX:sgRNAリボ核タンパク質複合体媒介性切断およびインデル形成の発生を示す。レポートシステムは、フローサイトメトリーによって検出されたPCSK9遺伝子座の改変(編集)の成功で低下するGFP蛍光に基づいている。
スクリーニングの目的では、gNAの足場に連結された表11または配列番号315~436、612~2100、もしくは2286~13861のうちのいずれか1つのPCSK9スペーサーを試験する。スペーサーは、レポーター細胞株において、コントロールとしてSaCas9およびSpyCas9を使用して、CasXタンパク質(gNA 174を有する構築物CasX 119)を用いて試験する。GFP蛍光および編集における減少は、PCSK9-GFPレポーター細胞で評価し、ピューロマイシンを使用して成功したリポフェクションを選択し、その後にFACSを介してGFP破壊についてアッセイする。CasX 119およびガイド174は、細胞の少なくとも5~10%を編集することが予測され、CasXが内因性PCSK9遺伝子座を改変することができ、SaCas9およびSpyCas9システムよりもそれを効果的に行うことを示す。T7E1アッセイまたはウエスタンブロッティングを行って、PCSK9-GFPレポーター細胞株における遺伝子編集をアッセイする。PCSK9標的化スペーサーを有するCasX 119およびガイド174、ならびに非標的化コントロール(NT)をPCSK9-GFPレポーター細胞にリポフェクトし、ピューロマイシンを使用して成功したリポフェクションについて選択し、その後でT7E1で遺伝子編集のためにアッセイして、PCSK9遺伝子座の成功する編集を実証する。
実施例17:対立遺伝子特異的な手段でレンチウイルス構築物を使用したCasXを使用してPCSK9遺伝子を編集する方法
実験は、CasXがPCSK9遺伝子座を編集する能力を示すように設計および実施される。PCSK9関連障害を恒久的に治療する1つの戦略は、野生型(WT)対立遺伝子を温存しながら、遺伝子の変異コピーを特異的に破壊することである。両方の野生型対立遺伝子を有するHEK293細胞は、表11または配列番号315~436、612~2100、もしくは2286~13861のうちのいずれか1つのWT CasXスペーサーによって編集可能であるが、変異体CasXスペーサー(例えば、結合するのに十分なWT PCSK9遺伝子配列との相同性を有さないスペーサー)よって編集可能ではない。この実施例は、CasXスペーサーが、単一ヌクレオチドで異なるオンターゲット対立遺伝子とオフターゲット対立遺伝子との間を区別する能力をさらに示す。HEK293細胞を96ウェルプレートに100μlのFB培地中20~40k細胞/ウェルで播種し、5%CO2を用いた37℃のインキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認して、トランスフェクション時に細胞が約75%のコンフルエンスであることを確実にする。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションは、実施例15のウイルス上清(上記のように、CasX 119とPCSK9を標的とするスペーサーを有するガイド174とを有する)を使用して、構築物ごとに3つのウェルを反復として使用して実行する。PCSK9を標的とするSaCas9およびSpyCas9を基準コントロールとして使用する。各Casタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用した。細胞を、0.3~3μg/mlのピューロマイシンで24~48時間、成功したトランスフェクションについて選択し、続いてFB培地中で24~48時間回収する。実験からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Quick抽出溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出する。編集は、T7E1アッセイを使用して分析する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、PCRプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー(例えば、目的の標的の周囲500bp領域)を使用して増幅させる。次に、PCRアンプリコンを、サーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にT7エンドヌクレアーゼを用いて37℃で30分間処理する。次に、試料を2%アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析して、DNAバンドを視覚化する。
実験は、CasXがPCSK9遺伝子座を編集する能力を示すように設計および実施される。PCSK9関連障害を恒久的に治療する1つの戦略は、野生型(WT)対立遺伝子を温存しながら、遺伝子の変異コピーを特異的に破壊することである。両方の野生型対立遺伝子を有するHEK293細胞は、表11または配列番号315~436、612~2100、もしくは2286~13861のうちのいずれか1つのWT CasXスペーサーによって編集可能であるが、変異体CasXスペーサー(例えば、結合するのに十分なWT PCSK9遺伝子配列との相同性を有さないスペーサー)よって編集可能ではない。この実施例は、CasXスペーサーが、単一ヌクレオチドで異なるオンターゲット対立遺伝子とオフターゲット対立遺伝子との間を区別する能力をさらに示す。HEK293細胞を96ウェルプレートに100μlのFB培地中20~40k細胞/ウェルで播種し、5%CO2を用いた37℃のインキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認して、トランスフェクション時に細胞が約75%のコンフルエンスであることを確実にする。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションは、実施例15のウイルス上清(上記のように、CasX 119とPCSK9を標的とするスペーサーを有するガイド174とを有する)を使用して、構築物ごとに3つのウェルを反復として使用して実行する。PCSK9を標的とするSaCas9およびSpyCas9を基準コントロールとして使用する。各Casタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用した。細胞を、0.3~3μg/mlのピューロマイシンで24~48時間、成功したトランスフェクションについて選択し、続いてFB培地中で24~48時間回収する。実験からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Quick抽出溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出する。編集は、T7E1アッセイを使用して分析する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、PCRプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー(例えば、目的の標的の周囲500bp領域)を使用して増幅させる。次に、PCRアンプリコンを、サーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にT7エンドヌクレアーゼを用いて37℃で30分間処理する。次に、試料を2%アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析して、DNAバンドを視覚化する。
実施例18:常染色体優性高コレステロール血症(ADH)患者由来細胞株における対立遺伝子特異的編集を実証する方法。
ADH患者に由来する細胞は、供給業者推奨条件下で得て培養する。細胞は、CasX構築物(例えば、ガイド174を有するCasX 119と、表11のPCSK9スペーサーまたは配列番号247~303のスペーサーとのRNP)で、Lipofectamine 3000を製造業者のプロトコルに従って使用してトランスフェクトするか、またはLonzaヌクレオフェクターキットを製造業者のプロトコルに従って使用してヌクレオフェクトし、インキュベーションおよび増殖のために96ウェルプレートに播種する。代替的に、CasX構築物は、実施例15のようにレンチウイルスにパッケージし、使用して患者由来細胞を形質導入し得る。細胞は、ピューロマイシンを0.3~3μg/mlで含有する培地を使用して2~4日以上、成功したリポフェクションもしくはヌクレオフェクション、またはレンチウイルス形質導入について選択し、続いて、ピューロマイシンを含まない培地で2日以上回収させる。PCSK9遺伝子座の編集は、ゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルで評価し得る。選択および回収期間の終わりに、実験からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Quick extract(QE)溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出し、別の細胞のサブセットは、プロテオミクス分析のためにRIPA細胞溶解緩衝液に溶解し、別の細胞のサブセットは、後の時点での分析のために継代させ得る。QE処理した試料の一部を使用して、T7E1アッセイを使用して編集を評価する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、PCRプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー(例えば、目的の標的の周囲500bp領域)を使用して増幅させる。次に、PCRアンプリコンをサーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にT7エンドヌクレアーゼを用いて37℃で30分間処理する。次に、試料を2%アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析してDNAバンドを視覚化し、CasX構築物がPCSK9変異を成功裏に編集できることを確認する。QE処理した試料の別の一部は、NGSを使用してPCSK9遺伝子座での編集を評価するために使用する。
ADH患者に由来する細胞は、供給業者推奨条件下で得て培養する。細胞は、CasX構築物(例えば、ガイド174を有するCasX 119と、表11のPCSK9スペーサーまたは配列番号247~303のスペーサーとのRNP)で、Lipofectamine 3000を製造業者のプロトコルに従って使用してトランスフェクトするか、またはLonzaヌクレオフェクターキットを製造業者のプロトコルに従って使用してヌクレオフェクトし、インキュベーションおよび増殖のために96ウェルプレートに播種する。代替的に、CasX構築物は、実施例15のようにレンチウイルスにパッケージし、使用して患者由来細胞を形質導入し得る。細胞は、ピューロマイシンを0.3~3μg/mlで含有する培地を使用して2~4日以上、成功したリポフェクションもしくはヌクレオフェクション、またはレンチウイルス形質導入について選択し、続いて、ピューロマイシンを含まない培地で2日以上回収させる。PCSK9遺伝子座の編集は、ゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルで評価し得る。選択および回収期間の終わりに、実験からの各試料における細胞のサブセットを溶解し、Quick extract(QE)溶液を製造業者のプロトコルに従って使用してゲノムを抽出し、別の細胞のサブセットは、プロテオミクス分析のためにRIPA細胞溶解緩衝液に溶解し、別の細胞のサブセットは、後の時点での分析のために継代させ得る。QE処理した試料の一部を使用して、T7E1アッセイを使用して編集を評価する。簡単に説明すると、標的化編集部位でゲノム遺伝子座を、PCRプログラムをサーモサイクラーで使用し、プライマー(例えば、目的の標的の周囲500bp領域)を使用して増幅させる。次に、PCRアンプリコンをサーモサイクラーでハイブリダイゼーションプログラムに従ってハイブリダイズさせ、次にT7エンドヌクレアーゼを用いて37℃で30分間処理する。次に、試料を2%アガロースゲルまたはフラグメントアナライザーで分析してDNAバンドを視覚化し、CasX構築物がPCSK9変異を成功裏に編集できることを確認する。QE処理した試料の別の一部は、NGSを使用してPCSK9遺伝子座での編集を評価するために使用する。
プロテオミクス分析は、ウエスタンブロッティングによって行う。RIPA緩衝液に溶解した試料は、最初に、BCA(Pierce)またはBradford(BioRad)などの比色タンパク質定量アッセイを製造業者のプロトコルに従って使用してタンパク質含有量を定量する。定量後、試料をベータメルカプトエタノール添加したLaemmli緩衝液で希釈し、ウェル当たり2.5~20μgの総タンパク質をロードする。試料は95~100℃で5~10分間熱変性させた後、室温に冷却する。次に、試料をポリアクリルアミドゲルにロードして泳動する。ゲルが流れ終えたら、タンパク質をPVDF膜に転写し、室温で少なくとも1時間ブロックし、PCSK9および適切なロードコントロールに対して一次抗体で標識する。ブロットは、室温で、ロッカー上でPBST(0.1v/v%Triton X100を補充したPBS)を用いて、1回の洗浄につき5分で3回洗浄する。次に、適切なレポーター標識二次抗体を使用して、室温で1時間一次抗体を標識する。ブロットは、室温で、ロッカー上でPBST(0.1v/v%Triton X100を補充したPBS)を用いて、1回の洗浄につき5分で3回洗浄する。続いて、必要な基質を添加して、必要に応じて急冷し、ゲルイメージャーで画像化する。バンド強度は、適切なソフトウェアを製造業者のプロトコルに従って使用して定量化する。
実施例19:AAVを介してPCSK9標的化構築物を送達する方法:コードされたCasXシステムを有するAAVの作成および回収。
この実施例は、CasX分子とガイドとをパッケージングするAAVベクターを産生し、特徴付けるための典型的なプロトコルについて説明する。
この実施例は、CasX分子とガイドとをパッケージングするAAVベクターを産生し、特徴付けるための典型的なプロトコルについて説明する。
材料および方法:
AAV産生では、トリプラスミドトランスフェクション法を使用し、3つの必須プラスミドである、AAVにパッケージングされる目的のPCSK9遺伝子を有するpTransgeneプラスミドと、pRCと、pHelperプラスミドとを必要とする。CasXをコードするDNAとガイドRNAとは、AAV導入遺伝子カセットにクローニングされ、ITR間にpTransgeneプラスミドを生成する。構築された導入遺伝子プラスミドは、全長プラスミド配列決定、制限消化、および哺乳動物細胞のインビトロトランスフェクションを含む機能試験によって検証する。AAV産生に必要な追加のプラスミド(pRCプラスミドおよびpHelperプラスミド)は、商業的供給業者(Aldevron、Takara)から購入する。
AAV産生では、トリプラスミドトランスフェクション法を使用し、3つの必須プラスミドである、AAVにパッケージングされる目的のPCSK9遺伝子を有するpTransgeneプラスミドと、pRCと、pHelperプラスミドとを必要とする。CasXをコードするDNAとガイドRNAとは、AAV導入遺伝子カセットにクローニングされ、ITR間にpTransgeneプラスミドを生成する。構築された導入遺伝子プラスミドは、全長プラスミド配列決定、制限消化、および哺乳動物細胞のインビトロトランスフェクションを含む機能試験によって検証する。AAV産生に必要な追加のプラスミド(pRCプラスミドおよびpHelperプラスミド)は、商業的供給業者(Aldevron、Takara)から購入する。
AAV産生のために、HEK293細胞を、5%CO2を用いた37℃のインキュベーター内のFB培地で培養する。HEK293細胞の10~40個の15cmディッシュをウイルス産生の単一バッチで使用する。単一の15cmディッシュでは、45~60μgのプラスミドを4mlのFB培地で一緒に1:1:1のモル比で混合し、ポリエチレンイミン(PEI)、すなわち、3ugのPEI/μgのDNAを用いて、室温で10分間複合体化させた。使用した3つのプラスミドの比率は、ウイルス産生を最適化するために変更し得る。次に、PEI-DNA複合体をHEK293細胞の15cmプレートにゆっくりと滴下し、トランスフェクトされた細胞のプレートをインキュベーターに戻す。次の日、培地を2%FBS添加FBに変更し得る(必要に応じて、10%FBS(MEM-NEAA(Thermo、11140050)、ピルビン酸ナトリウム(Thermo、11360070)、HEPES(Thermo、15630080)、2-メルカプトエタノール(Gibco、21985023)、ウシ胎児血清の体積分率10%(FBS、VWR、No.97068-085)を添加したペニシリン/ストレプトマイシン(Thermo、15140122)を補充したGlutamax(Gibco、10566-016)添加DMEMからなる、線維芽細胞培地)の代わり)。AAVは、プラスミドの最初のトランスフェクション後48~120時間の任意の時点で、上清から、もしくは細胞ペレットから、または上清と細胞ペレットとの組み合わせから収集し得る。
ウイルスをトランスフェクションの72時間後に収集する場合、この時点で細胞からの培地を収集してウイルスの収量を増加し得る。トランスフェクションの2~5日後に、培地および細胞を収集する。回収の時機を変更して、ウイルスの収量を最適化し得る。細胞を遠心分離によってペレット化し、培地を上部から収集する。細胞を高塩分および高塩活性ヌクレアーゼを含む緩衝液中に37℃で1時間溶解する。細胞はまた、連続凍結融解、または界面活性剤による化学的溶解などの追加の方法を使用して溶解することができる。回収時に収集した培地、および以前の時点で収集した任意の培地を、AAVを沈殿させるために、40%のPEG8000および2.5MのNaClを含有する溶液の1:5希釈で処理し、氷上で2時間インキュベートする。インキュベーションはまた、4℃で一晩実施することができる。培地からのAAV沈殿物を遠心分離によってペレット化し、高塩活性ヌクレアーゼを含む高塩含有量の緩衝液中に再懸濁し、溶解した細胞ペレットと合わせる。次に、合わせた細胞溶解物を遠心分離および0.45μmフィルターを通す濾過によって清澄化し、AAV Porosアフィニティーレジンカラム(Thermofisher Scientific)で精製する。ウイルスをカラムから中和溶液に溶出する。この段階で、ウイルス調製の質を高めるために、ウイルスを追加のラウンドの精製にかけることができる。次に、溶出したウイルスをqPCRにより力価測定し、ウイルスの収量を定量する。力価測定では、ウイルスの試料を最初にDNAseで消化して、パッケージングされていないウイルスDNAを除去し、DNAseを不活性化し、次にプロテイナーゼKでウイルスカプシドを破壊して、力価測定のためにパッケージングされたウイルスゲノムを露出させる。
約1×1012個のウイルスゲノムが、ここに記載の方法を使用して産生されたウイルスの1つのバッチから得られることが予期される。
実施例20:マウスモデルにおけるPCSK9編集のインビボ評価。
最初の一連の実験では、野生型C57BL/6Jマウスを使用して、CasXと、PCSK9を標的とするガイドRNAとをコードするAAV粒子、またはCasXと、PCSK9を標的とするガイドRNAとのRNPを含むXDPが、マウスPCSK9遺伝子をインビボで編集する能力を試験する。(Carreras et al.BMC Biology 2019 17:4).
最初の一連の実験では、野生型C57BL/6Jマウスを使用して、CasXと、PCSK9を標的とするガイドRNAとをコードするAAV粒子、またはCasXと、PCSK9を標的とするガイドRNAとのRNPを含むXDPが、マウスPCSK9遺伝子をインビボで編集する能力を試験する。(Carreras et al.BMC Biology 2019 17:4).
材料および方法
スペーサー配列27.5(AAVではスペーサー配列GAGGCTAGAGGACTGAGCCA(配列番号225)、XDPではGAGGCUAGAGGACUGAGCCA(配列番号226))を使用したマウスPCSK9遺伝子を標的とする、CasX 491とgRNA 174とをコードするAAV(表13、構築物3A、36A、および37Aを利用)、またはCasX 491とgRNA 174とのRNPをパッケージングするXDP(表15-pXDP0017、pXDP0001、pGP2、pStx42.174.27.5)の構築物を、10~14週齢のC57BL/6Jマウスに尾静脈注射を介して投与する。実験的コントロールとして、マウスゲノムにおけるセーフハーバー部位、例えば、mRosa26遺伝子座を標的とするCasXとgRNAとをコードするか、もしくはパッケージングするAAVまたはXDPもコントロール群に投与する。それぞれのベクターの投与の1ヶ月および3ヶ月後、血漿中のコレステロールレベルは酵素比色分析を使用して評価し、血漿中のPCSK9レベルはELISAまたはウエスタンブロットアッセイによって評価する。ベクターの投与後1ヶ月および3ヶ月でマウスのサブセットを犠牲にし、組織を、NGS、qPCR、および免疫組織学を介したゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルでのPCSK9遺伝子編集の評価のために処理する。組織はまた、オフターゲット分析のために確立されたツール、例えば、GUIDE-Seqを使用して、オフターゲット編集について評価する。加えて、CasXの発現はまた、免疫組織学によって目的の組織全体にわたって測定する。結果は、コレステロール値の低下を伴う、マウスにおけるPCSK9遺伝子を編集する能力を実証することが予測される。
スペーサー配列27.5(AAVではスペーサー配列GAGGCTAGAGGACTGAGCCA(配列番号225)、XDPではGAGGCUAGAGGACUGAGCCA(配列番号226))を使用したマウスPCSK9遺伝子を標的とする、CasX 491とgRNA 174とをコードするAAV(表13、構築物3A、36A、および37Aを利用)、またはCasX 491とgRNA 174とのRNPをパッケージングするXDP(表15-pXDP0017、pXDP0001、pGP2、pStx42.174.27.5)の構築物を、10~14週齢のC57BL/6Jマウスに尾静脈注射を介して投与する。実験的コントロールとして、マウスゲノムにおけるセーフハーバー部位、例えば、mRosa26遺伝子座を標的とするCasXとgRNAとをコードするか、もしくはパッケージングするAAVまたはXDPもコントロール群に投与する。それぞれのベクターの投与の1ヶ月および3ヶ月後、血漿中のコレステロールレベルは酵素比色分析を使用して評価し、血漿中のPCSK9レベルはELISAまたはウエスタンブロットアッセイによって評価する。ベクターの投与後1ヶ月および3ヶ月でマウスのサブセットを犠牲にし、組織を、NGS、qPCR、および免疫組織学を介したゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルでのPCSK9遺伝子編集の評価のために処理する。組織はまた、オフターゲット分析のために確立されたツール、例えば、GUIDE-Seqを使用して、オフターゲット編集について評価する。加えて、CasXの発現はまた、免疫組織学によって目的の組織全体にわたって測定する。結果は、コレステロール値の低下を伴う、マウスにおけるPCSK9遺伝子を編集する能力を実証することが予測される。
ヒトPCSK9の肝臓特異的発現を伴う高コレステロール血症のトランスジェニックマウスモデルを使用して、CasXとガイドRNAとをコードするAAV粒子、またはCasXとヒトPCSK9を標的とするガイドRNAとのRNPをパッケージングするXDPがPCSK9遺伝子をインビボで編集する能力を試験する。(Carreras et al.BMC Biology 2019 17:4)。
ヒトPCSK9遺伝子を標的とする(AAVではスペーサー配列TGGCTTCCTGGTGAAGATGA(配列番号515)、XDPではUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA(配列番号559))、CasX 491とgRNA 174とをコードするAAV(構築物3、36、および37における配列を有する表14)、またはCasX 491とgRNA 174とのRNPをパッケージングするXDP(pXDP0017、pXDP0001、pGP2、pStx42.174.6.8における配列を有する表15)の構築物を、10~14週齢のトランスジェニックマウスに尾静脈注射を介して投与する。実験的コントロールとして、マウスゲノムにおけるセーフハーバー部位、例えば、mRosa26遺伝子座を標的とするCasXとgRNAとをパッケージングするAAVまたはXDP構築物を投与する。それぞれのベクターの投与の1ヶ月および3ヶ月後、血漿中のコレステロールレベルは酵素比色分析を使用して評価し、血漿中のPCSK9レベルはELISAまたはウエスタンブロットアッセイによって評価する。ベクターの投与後1ヶ月および3ヶ月でマウスのサブセットを犠牲にし、NGS、qPCR、および免疫組織学を介したゲノム、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスレベルでのPCSK9遺伝子編集の評価のために組織を処理する。組織はまた、オフターゲット分析のために確立されたツール、例えば、GUIDE-Seqを使用して、オフターゲット編集について評価する。加えて、CasXの発現はまた、免疫組織学によって目的の組織全体にわたって測定する。結果は、コレステロール値の低下を伴う、マウスにおけるヒトPCSK9遺伝子を編集する能力を実証することが予測される。
実施例21:sgNAおよびCasXタンパク質活性を測定するために使用するアッセイ
いくつかのアッセイを使用して、CasXタンパク質ならびにsgNAディープミューテーショナルエボルーション(DME)ライブラリおよび改変変異の初期スクリーニングを実行し、CasX参照sgNAおよびタンパク質と比較した選択タンパク質およびsgNAバリアントの活性を測定した。
いくつかのアッセイを使用して、CasXタンパク質ならびにsgNAディープミューテーショナルエボルーション(DME)ライブラリおよび改変変異の初期スクリーニングを実行し、CasX参照sgNAおよびタンパク質と比較した選択タンパク質およびsgNAバリアントの活性を測定した。
E.coli CRISPRiスクリーニング:
簡潔には、カルベニシリン(Carb)耐性プラスミド上にGFP gNAを有するクロラムフェニコール(CM)耐性プラスミド上の死んでいるCasX DMEライブラリの生物学的トリプリケートを、遺伝的に組み込まれて構成的に発現されたGFPおよびRFPを有するMG1655に(5倍超のライブラリサイズで)形質転換した。細胞を、EZ-RDM+Carb、CM、およびアンヒドロテトラサイクリン(aTc)誘導物質中で一晩増殖させた。E.coliを、RFP抑制ではなくGFPの上位1%のゲートに基づいてFACS分類し、収集し、すぐに再分類して、機能性の高いCasX分子についてさらに濃縮した。その後、二重分類したライブラリを増殖させ、DNAをhighseqでのディープシークエンシングのために収集した。このDNAもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
簡潔には、カルベニシリン(Carb)耐性プラスミド上にGFP gNAを有するクロラムフェニコール(CM)耐性プラスミド上の死んでいるCasX DMEライブラリの生物学的トリプリケートを、遺伝的に組み込まれて構成的に発現されたGFPおよびRFPを有するMG1655に(5倍超のライブラリサイズで)形質転換した。細胞を、EZ-RDM+Carb、CM、およびアンヒドロテトラサイクリン(aTc)誘導物質中で一晩増殖させた。E.coliを、RFP抑制ではなくGFPの上位1%のゲートに基づいてFACS分類し、収集し、すぐに再分類して、機能性の高いCasX分子についてさらに濃縮した。その後、二重分類したライブラリを増殖させ、DNAをhighseqでのディープシークエンシングのために収集した。このDNAもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
E.coli毒素の選択:
簡潔には、アラビノース誘導性毒素を含むカルベニシリン耐性プラスミドをE.coli細胞に形質転換し、電気的コンピテントにした。クロラムフェニコール耐性プラスミド上に毒素標的gNAを有するCasX DMEライブラリの生物学的トリプリケートを、この細胞に(5倍超のライブラリサイズで)形質転換し、LB+CMおよびアラビノース誘導物質中で増殖させた。毒素プラスミドを切断したE.coliは誘導培地中で生存し、対数中期まで増殖させ、機能的CasX切断因子を有するプラスミドを回収した。この選択を必要に応じて繰り返した。その後、選択したライブラリを増殖させ、DNAをhighseqでのディープシークエンシングのために収集した。このDNAもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析および試験のために採取した。
簡潔には、アラビノース誘導性毒素を含むカルベニシリン耐性プラスミドをE.coli細胞に形質転換し、電気的コンピテントにした。クロラムフェニコール耐性プラスミド上に毒素標的gNAを有するCasX DMEライブラリの生物学的トリプリケートを、この細胞に(5倍超のライブラリサイズで)形質転換し、LB+CMおよびアラビノース誘導物質中で増殖させた。毒素プラスミドを切断したE.coliは誘導培地中で生存し、対数中期まで増殖させ、機能的CasX切断因子を有するプラスミドを回収した。この選択を必要に応じて繰り返した。その後、選択したライブラリを増殖させ、DNAをhighseqでのディープシークエンシングのために収集した。このDNAもプレート上で再形質転換し、個々のクローンをさらなる分析および試験のために採取した。
レンチウイルスベースのスクリーニングであるEGFPスクリーニング:
レンチウイルス粒子を、トランスフェクション時に70%~90%のコンフルエンスで、HEK293細胞中で産生した。細胞を、CasX DMEライブラリを含むプラスミドのポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用してトランスフェクトした。レンチウイルスベクターを、粒子産生のためにレンチウイルスパッケージングプラスミドおよびVSV-Gエンベローププラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクトした12時間後に培地を交換し、トランスフェクトした36~48時間後にウイルスを収集した。ウイルス上清を、0.45mmの膜フィルターを使用して濾過し、適切な場合、細胞培養培地中で希釈し、組み込まれたGFPレポーターを有する標的細胞であるHEK細胞に添加した。必要に応じて、ポリブレンを補充して、形質導入効率を高めた。形質導入細胞を、ピューロマイシンを使用して形質導入後24~48時間にわたって選択し、7~10日間増殖させた。その後、細胞をGFP破壊について分類し、機能性の高いCasX sgNAまたはタンパク質バリアントについて収集した(図19を参照されたい)。その後、ライブラリをゲノムから直接PCRにより増幅し、highseqでのディープシークエンシングのために収集した。このDNAをプレート上で再クローニングおよび再形質転換することもでき、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
レンチウイルス粒子を、トランスフェクション時に70%~90%のコンフルエンスで、HEK293細胞中で産生した。細胞を、CasX DMEライブラリを含むプラスミドのポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用してトランスフェクトした。レンチウイルスベクターを、粒子産生のためにレンチウイルスパッケージングプラスミドおよびVSV-Gエンベローププラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクトした12時間後に培地を交換し、トランスフェクトした36~48時間後にウイルスを収集した。ウイルス上清を、0.45mmの膜フィルターを使用して濾過し、適切な場合、細胞培養培地中で希釈し、組み込まれたGFPレポーターを有する標的細胞であるHEK細胞に添加した。必要に応じて、ポリブレンを補充して、形質導入効率を高めた。形質導入細胞を、ピューロマイシンを使用して形質導入後24~48時間にわたって選択し、7~10日間増殖させた。その後、細胞をGFP破壊について分類し、機能性の高いCasX sgNAまたはタンパク質バリアントについて収集した(図19を参照されたい)。その後、ライブラリをゲノムから直接PCRにより増幅し、highseqでのディープシークエンシングのために収集した。このDNAをプレート上で再クローニングおよび再形質転換することもでき、個々のクローンをさらなる分析のために採取した。
実施例22:HEK EGFPレポーターの編集効率のアッセイ
CasX参照sgNAおよびタンパク質ならびにそれらのバリアントの編集効率をアッセイするために、EGFP HEK293Tレポーター細胞を96ウェルプレートに播種し、製造業者のプロトコルに従って、lipofectamine 3000(Life Technologies)、ならびに参照またはCasXバリアントタンパク質、P2A-ピューロマイシン融合物、および参照またはバリアントsgNAをコードする100~200ngのプラスミドDNAでトランスフェクトした。翌日、細胞を1.5μg/mlのピューロマイシンで2日間にわたって選択し、選択した7日後に蛍光活性化細胞分類(FACS)によって分析して、細胞からのEGFPタンパク質のクリアランスを可能にした。編集によるEGFP破壊を、Attune NxTフローサイトメーターおよびハイスループットオートサンプラーを使用して追跡した。
CasX参照sgNAおよびタンパク質ならびにそれらのバリアントの編集効率をアッセイするために、EGFP HEK293Tレポーター細胞を96ウェルプレートに播種し、製造業者のプロトコルに従って、lipofectamine 3000(Life Technologies)、ならびに参照またはCasXバリアントタンパク質、P2A-ピューロマイシン融合物、および参照またはバリアントsgNAをコードする100~200ngのプラスミドDNAでトランスフェクトした。翌日、細胞を1.5μg/mlのピューロマイシンで2日間にわたって選択し、選択した7日後に蛍光活性化細胞分類(FACS)によって分析して、細胞からのEGFPタンパク質のクリアランスを可能にした。編集によるEGFP破壊を、Attune NxTフローサイトメーターおよびハイスループットオートサンプラーを使用して追跡した。
実施例23:CasX参照sgRNAの切断効率
配列番号4(下記)の参照CasX sgRNAは、WO2018/064371およびUS10570415B2に記載されており、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる:ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAACCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(配列番号4)。
配列番号4(下記)の参照CasX sgRNAは、WO2018/064371およびUS10570415B2に記載されており、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる:ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAACCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG(配列番号4)。
配列番号5(下記)を産生するための配列番号4のsgRNA参照配列に対する変化がCasX切断効率を改善することができることが見出された。配列は、UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAAUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAG(配列番号5)である。
CasX参照sgRNAおよびそのバリアントの編集効率をアッセイするために、EGFP HEK293Tレポーター細胞を96ウェルプレートに播種し、製造業者のプロトコルに従って、Lipofectamine 3000(Life Technologies)、ならびに参照CasXタンパク質、P2A-ピューロマイシン融合物、およびsgRNAをコードする100~200ngのプラスミドDNAでトランスフェクトした。翌日、細胞を1.5μg/mlのピューロマイシンで2日間にわたって選択し、選択した7日後に蛍光活性化細胞分類(FACS)によって分析して、細胞からのEGFPタンパク質のクリアランスを可能にした。編集によるEGFP破壊を、Attune NxTフローサイトメーターおよびハイスループットオートサンプラーを使用して追跡した。
CasX参照およびsgNAバリアントによるEGFPレポーターの切断を試験する場合、以下のスペーサー標的配列を使用した。CasX参照およびsgNAバリアントによるEGFPレポーターの切断を試験する場合、以下のスペーサー標的配列を使用した:E6(TGTGGTCGGGGTAGCGGCTG(配列番号17))およびE7(TCAAGTCCGCCATGCCCGAA(配列番号18))。
配列番号4のsgRNAと比較して配列番号5のsgRNAの切断効率が増加した例を図20に示す。配列番号5の編集効率は、配列番号4と比較して176%改善した。したがって、配列番号5を、以下に記載される、DMEおよび追加のsgNAバリアント設計のための参照sgRNAとして選択した。
実施例24:標的切断が改善されたgNAバリアントの設計、作製、および評価
ガイド核酸(gNA)バリアントを、参照gNAと比較した切断活性の改善を評価するために設計および試験した。これらのガイドを、本明細書に記載されるように、DMEまたは合理的設計および伸長ステムなどのガイド部品の交換もしくは付加または末端でのリボザイムの付加により発見した。
ガイド核酸(gNA)バリアントを、参照gNAと比較した切断活性の改善を評価するために設計および試験した。これらのガイドを、本明細書に記載されるように、DMEまたは合理的設計および伸長ステムなどのガイド部品の交換もしくは付加または末端でのリボザイムの付加により発見した。
実験設計:
すべてのガイドを、以下のようにHEK293TまたはHEK293Tレポーター株で試験した。哺乳類細胞を、37℃、5%CO2のインキュベーター内で維持した。HEK293Tヒト腎臓細胞およびその誘導体を、10%ウシ胎児血清(FBS、Seradigm、番号1500-500)ならびに100単位/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシン(100×-Pen-Strep、GIBCO、番号15140-122)を補充し、かつピルビン酸ナトリウム(100×、Thermofisher、番号11360070)、非必須アミノ酸(100×、Thermofisher、番号11140050)、HEPES緩衝液(100×、Thermofisher、番号15630080)、および2-メルカプトエタノール(1000×、Thermofisher、番号21985023)をさらに含み得るダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Corning Cellgro、番号10-013-CV)中で増殖させた。細胞を96ウェルプレートに20,000~30,000細胞/ウェルで播種し、製造業者のプロトコルに従って、0.25~1uLのLipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific、番号L3000008)、レポーターまたは標的遺伝子を標的とするCasXおよび参照またはバリアントCasXガイドを含む50~500ngのプラスミドを使用してトランスフェクトした。24~72時間後、培地を交換し、0.3~3.0ug/mlのピューロマイシン(Sigma、番号P8833)を添加して、形質転換を選択した。選択した24~96時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、適切な前方および側方散乱についてゲートし、単細胞を選択し、その後、緑色蛍光タンパク質(GFP)または抗体レポーター発現(Attune Nxt Flow Cytometer、Thermo Fisher Scientific)についてゲートして、フルオロフォアの発現レベルを定量した。試料毎に少なくとも10,000個の事象を収集した。HEK293T-GFPゲノム編集レポーター細胞株の場合、フローサイトメトリーを使用して、GFP陰性(編集済み)細胞のパーセンテージを定量し、各バリアントのGFP破壊を伴う細胞数を参照ガイドと比較して、倍率変化測定値を生成した。
すべてのガイドを、以下のようにHEK293TまたはHEK293Tレポーター株で試験した。哺乳類細胞を、37℃、5%CO2のインキュベーター内で維持した。HEK293Tヒト腎臓細胞およびその誘導体を、10%ウシ胎児血清(FBS、Seradigm、番号1500-500)ならびに100単位/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシン(100×-Pen-Strep、GIBCO、番号15140-122)を補充し、かつピルビン酸ナトリウム(100×、Thermofisher、番号11360070)、非必須アミノ酸(100×、Thermofisher、番号11140050)、HEPES緩衝液(100×、Thermofisher、番号15630080)、および2-メルカプトエタノール(1000×、Thermofisher、番号21985023)をさらに含み得るダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Corning Cellgro、番号10-013-CV)中で増殖させた。細胞を96ウェルプレートに20,000~30,000細胞/ウェルで播種し、製造業者のプロトコルに従って、0.25~1uLのLipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific、番号L3000008)、レポーターまたは標的遺伝子を標的とするCasXおよび参照またはバリアントCasXガイドを含む50~500ngのプラスミドを使用してトランスフェクトした。24~72時間後、培地を交換し、0.3~3.0ug/mlのピューロマイシン(Sigma、番号P8833)を添加して、形質転換を選択した。選択した24~96時間後、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、適切な前方および側方散乱についてゲートし、単細胞を選択し、その後、緑色蛍光タンパク質(GFP)または抗体レポーター発現(Attune Nxt Flow Cytometer、Thermo Fisher Scientific)についてゲートして、フルオロフォアの発現レベルを定量した。試料毎に少なくとも10,000個の事象を収集した。HEK293T-GFPゲノム編集レポーター細胞株の場合、フローサイトメトリーを使用して、GFP陰性(編集済み)細胞のパーセンテージを定量し、各バリアントのGFP破壊を伴う細胞数を参照ガイドと比較して、倍率変化測定値を生成した。
結果:
DMEを介して生成されたsgNAバリアントからの結果を測定し、配列番号4の参照gNAと比較した。これらの結果は図22に示され、ほとんどのバリアントは、参照gNAと比較して、0.1からほぼ1.5倍の改善を示している。合理的設計およびガイド部品の交換または付加(伸長ステムなどまたは末端でのリボザイムの付加)により生成されたバリアントの結果を、それぞれ、図21および23に示し、この場合もやはり、多くの構築物で改善が見られた。図23に番号で示されているバリアントへの追加をそれらのコード配列とともに以下の表16に列記する。我々は、C18G変異などの単一変異が参照と比較してガイド活性を改善することを観察した。加えて、MS2、QB、PP7、UvsXなどの異なるステムループを伸長ステムループと合理的に交換することにより、元の伸長ステムループを切断する場合と同様に、参照ガイドと比較して活性が改善された。最後に、我々は、ほとんどのリボザイムが活性を破壊する一方で、参照ガイドRNAに3’HDVを付加することにより、活性を最大20~50%改善させることができることを実証する。
DMEを介して生成されたsgNAバリアントからの結果を測定し、配列番号4の参照gNAと比較した。これらの結果は図22に示され、ほとんどのバリアントは、参照gNAと比較して、0.1からほぼ1.5倍の改善を示している。合理的設計およびガイド部品の交換または付加(伸長ステムなどまたは末端でのリボザイムの付加)により生成されたバリアントの結果を、それぞれ、図21および23に示し、この場合もやはり、多くの構築物で改善が見られた。図23に番号で示されているバリアントへの追加をそれらのコード配列とともに以下の表16に列記する。我々は、C18G変異などの単一変異が参照と比較してガイド活性を改善することを観察した。加えて、MS2、QB、PP7、UvsXなどの異なるステムループを伸長ステムループと合理的に交換することにより、元の伸長ステムループを切断する場合と同様に、参照ガイドと比較して活性が改善された。最後に、我々は、ほとんどのリボザイムが活性を破壊する一方で、参照ガイドRNAに3’HDVを付加することにより、活性を最大20~50%改善させることができることを実証する。
結果は、DMEおよび合理的設計を使用してgNAのパフォーマンスを向上させることができ、かつこれらのバリアントRNAの多くを本明細書に記載のCasX:gNAシステムの構成要素として標的化配列とともに使用して標的核酸配列を編集することができるという結論を裏付ける。
実施例25:CasX分子119およびガイド足場174は、HEK293T細胞におけるPCSK9遺伝子座を編集する
実験の目的は、プラスミドトランスフェクションによって送達される場合に、CasX 119と、ガイド174と、WT配列を標的とするスペーサーとの構築物を使用して、HEK293T細胞のPCSK9遺伝子座における編集を実証することだった。
実験の目的は、プラスミドトランスフェクションによって送達される場合に、CasX 119と、ガイド174と、WT配列を標的とするスペーサーとの構築物を使用して、HEK293T細胞のPCSK9遺伝子座における編集を実証することだった。
材料および方法:
PCSK9を標的とするスペーサーは、活性に関する事前の知識を伴わずに、PAMの利用可能性に基づいてマニュアルで選択した(表11の配列)。HEK293T細胞を96ウェルプレートに100μlのFB培地中20~40k細胞/ウェルで播種し、5%CO2を用いた37℃のインキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認して、トランスフェクション時に細胞が約75%のコンフルエンスであることを確実にした。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行した。各CasXとガイドとの構築物(例えば、CasX 119の配列について表5を参照、ガイド174の配列について表2を参照、およびPCSK9スペーサー配列について表11を参照)を、構築物当たり3ウェルの反復を使用し、Lipofectamine 3000を製造業者のプロトコルに従って使用して、ウェル当たり100~500ngでHEK293T細胞にトランスフェクトした。PCSK9を標的とするSaCas9およびSpyCas9を基準コントロールとして使用した。各Casタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用した。細胞を、0.3~3μg/mlのピューロマイシンで24~48時間、成功したトランスフェクションについて選択し、続いてFB培地中で24~96時間回収した。実験からの各試料における細胞を溶解し、製造業者のプロトコルおよび標準的な方法に従ってゲノムを抽出した。各実験試料に由来する細胞における編集を、NGS分析を使用してアッセイした。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたPCRを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Illumina読み取り1および2の配列を導入するために5’末端に追加の配列を含む。さらに、それらは、固有の分子識別子(UMI)として機能する16ntのランダム配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Fragment Analyzer DNA analyzer kit(Agilent、dsDNA 35-1500bp)を使用して評価した。アンプリコンを、製造業者の指示に従ってIllumina Miseqで配列決定した。配列決定からの生fastqファイルを以下のように処理した。(1)プログラムcutadapt(v.2.1)を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、(2)読み取り1および2からの配列を、プログラムflash2(v2.2.00)を使用して単一の挿入配列にマージし、(3)コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムCRISPResso2(v 2.0.29)を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの3′末端付近のウィンドウ(スペーサーの3’末端から-3bpを中心とする30bpウィンドウ)内の改変された読み取りのパーセントを定量する。CasX分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および/または欠失を含む合計読み取りパーセントとして定量した。
PCSK9を標的とするスペーサーは、活性に関する事前の知識を伴わずに、PAMの利用可能性に基づいてマニュアルで選択した(表11の配列)。HEK293T細胞を96ウェルプレートに100μlのFB培地中20~40k細胞/ウェルで播種し、5%CO2を用いた37℃のインキュベーターで培養した。翌日、播種した細胞のコンフルエンスを確認して、トランスフェクション時に細胞が約75%のコンフルエンスであることを確実にした。細胞が適切なコンフルエンスにある場合、トランスフェクションを実行した。各CasXとガイドとの構築物(例えば、CasX 119の配列について表5を参照、ガイド174の配列について表2を参照、およびPCSK9スペーサー配列について表11を参照)を、構築物当たり3ウェルの反復を使用し、Lipofectamine 3000を製造業者のプロトコルに従って使用して、ウェル当たり100~500ngでHEK293T細胞にトランスフェクトした。PCSK9を標的とするSaCas9およびSpyCas9を基準コントロールとして使用した。各Casタンパク質型について、非標的化プラスミドを陰性コントロールとして使用した。細胞を、0.3~3μg/mlのピューロマイシンで24~48時間、成功したトランスフェクションについて選択し、続いてFB培地中で24~96時間回収した。実験からの各試料における細胞を溶解し、製造業者のプロトコルおよび標準的な方法に従ってゲノムを抽出した。各実験試料に由来する細胞における編集を、NGS分析を使用してアッセイした。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたPCRを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Illumina読み取り1および2の配列を導入するために5’末端に追加の配列を含む。さらに、それらは、固有の分子識別子(UMI)として機能する16ntのランダム配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Fragment Analyzer DNA analyzer kit(Agilent、dsDNA 35-1500bp)を使用して評価した。アンプリコンを、製造業者の指示に従ってIllumina Miseqで配列決定した。配列決定からの生fastqファイルを以下のように処理した。(1)プログラムcutadapt(v.2.1)を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、(2)読み取り1および2からの配列を、プログラムflash2(v2.2.00)を使用して単一の挿入配列にマージし、(3)コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムCRISPResso2(v 2.0.29)を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの3′末端付近のウィンドウ(スペーサーの3’末端から-3bpを中心とする30bpウィンドウ)内の改変された読み取りのパーセントを定量する。CasX分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および/または欠失を含む合計読み取りパーセントとして定量した。
結果:
図24のグラフは、PCSK9を標的とする10例の異なるスペーサーを利用する構築物が、平均70%の編集で、様々なレベルの活性でPCSK9遺伝子座を編集することができたことを示す。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のNGS読み取りの平均測定値である。これらの結果は、アッセイの条件下で、適切なガイドを有するCasXがPCSK9遺伝子座を編集でき、Spy Cas9と比較して大幅に編集し(平均編集に基づく)、一方、Sau Cas9よりもかなり多くの編集を示した。
図24のグラフは、PCSK9を標的とする10例の異なるスペーサーを利用する構築物が、平均70%の編集で、様々なレベルの活性でPCSK9遺伝子座を編集することができたことを示す。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のNGS読み取りの平均測定値である。これらの結果は、アッセイの条件下で、適切なガイドを有するCasXがPCSK9遺伝子座を編集でき、Spy Cas9と比較して大幅に編集し(平均編集に基づく)、一方、Sau Cas9よりもかなり多くの編集を示した。
実施例26:CasX 119およびガイド足場174は、HepG2細胞におけるPCSK9遺伝子座を編集する
実験は、レンチウイするによって送達される、CasX 119と、ガイド174と、WT PCSK9配列を標的とするスペーサーとの構築物を使用して、HepG2細胞におけるPCSK9遺伝子座を編集する能力を実証するために行った。
実験は、レンチウイするによって送達される、CasX 119と、ガイド174と、WT PCSK9配列を標的とするスペーサーとの構築物を使用して、HepG2細胞におけるPCSK9遺伝子座を編集する能力を実証するために行った。
材料および方法:
レンチウイルス粒子は、PCSK9遺伝子座(表11の配列6.7、6.8、および6.9)を標的とするスペーサーを含むCasXプラスミドと、レンチウイルスパッケージングプラスミドと、VSV-Gエンベローププラスミドと、のポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用し、実施例15の方法を使用してHEK293Tを70%~90%のコンフルエンスでトランスフェクトすることによって産生した。粒子産生では、培地をトランスフェクションの12時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの36~48時間後に収集した。ウイルス上清を0.45μm膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じて培地で希釈し、HepG2培地(10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したEMEM)で培養したHepG2標的細胞に添加した。必要に応じて、補充のポリベレンを5~20μg/mlで添加して、形質導入効率を高めた。形質導入された細胞は、形質導入後、HepG2培地中でピューロマイシンを0.3~3μg/mlで使用して24~48時間選択し、HepG2培地で、5%CO2を用いた37℃インキュベーター内で6日間増殖させた。次に細胞を収集し、NGSを使用して編集を分析した。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、目的とする標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたPCRを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Illumina読み取り1および読み取り2配列を導入するために5’末端に追加の配列を含んだ。さらに、それらは、固有の分子識別子(UMI)として機能する16ntのランダム配列を含んだ。アンプリコンの質および定量を、Fragment Analyzer DNAアナライザーキット(Agilent、dsDNA 35~1500bp)を使用して評価した。アンプリコンは、Illumina Miseqで製造業者の説明書に従って配列決定した。配列決定からの生fastqファイルを以下のように処理した。(1)プログラムcutadapt(v.2.1)を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、(2)読み取り1および2からの配列を、プログラムflash2(v2.2.00)を使用して単一の挿入配列にマージし、(3)コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムCRISPResso2(v 2.0.29)を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの3′末端付近のウィンドウ(スペーサーの3’末端から-3bpを中心とする30bpウィンドウ)内の改変された読み取りのパーセントを定量する。CasX分子の編集活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および/または欠失を含んだ合計読み取りパーセントとして定量した。
レンチウイルス粒子は、PCSK9遺伝子座(表11の配列6.7、6.8、および6.9)を標的とするスペーサーを含むCasXプラスミドと、レンチウイルスパッケージングプラスミドと、VSV-Gエンベローププラスミドと、のポリエチレンイミンベースのトランスフェクションを使用し、実施例15の方法を使用してHEK293Tを70%~90%のコンフルエンスでトランスフェクトすることによって産生した。粒子産生では、培地をトランスフェクションの12時間後に交換し、ウイルスをトランスフェクションの36~48時間後に収集した。ウイルス上清を0.45μm膜フィルターを使用して濾過し、必要に応じて培地で希釈し、HepG2培地(10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したEMEM)で培養したHepG2標的細胞に添加した。必要に応じて、補充のポリベレンを5~20μg/mlで添加して、形質導入効率を高めた。形質導入された細胞は、形質導入後、HepG2培地中でピューロマイシンを0.3~3μg/mlで使用して24~48時間選択し、HepG2培地で、5%CO2を用いた37℃インキュベーター内で6日間増殖させた。次に細胞を収集し、NGSを使用して編集を分析した。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、目的とする標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたPCRを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Illumina読み取り1および読み取り2配列を導入するために5’末端に追加の配列を含んだ。さらに、それらは、固有の分子識別子(UMI)として機能する16ntのランダム配列を含んだ。アンプリコンの質および定量を、Fragment Analyzer DNAアナライザーキット(Agilent、dsDNA 35~1500bp)を使用して評価した。アンプリコンは、Illumina Miseqで製造業者の説明書に従って配列決定した。配列決定からの生fastqファイルを以下のように処理した。(1)プログラムcutadapt(v.2.1)を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、(2)読み取り1および2からの配列を、プログラムflash2(v2.2.00)を使用して単一の挿入配列にマージし、(3)コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムCRISPResso2(v 2.0.29)を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの3′末端付近のウィンドウ(スペーサーの3’末端から-3bpを中心とする30bpウィンドウ)内の改変された読み取りのパーセントを定量する。CasX分子の編集活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および/または欠失を含んだ合計読み取りパーセントとして定量した。
結果:
図25のグラフは、PCSK9を標的とする3つの異なるスペーサーを有する構築物が、平均60%の編集で、様々なレベルの活性でPCSK9遺伝子座を編集することができたことを示す。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のNGS読み取りの平均測定値である。
図25のグラフは、PCSK9を標的とする3つの異なるスペーサーを有する構築物が、平均60%の編集で、様々なレベルの活性でPCSK9遺伝子座を編集することができたことを示す。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のNGS読み取りの平均測定値である。
結果は、アッセイの条件下で、適切に標的化したガイドを有するCasXが、HepG2細胞におけるPCSK9遺伝子座を高い効率で編集することができたことを示す。
実施例27:CasX 491およびガイド足場174は、AML12細胞におけるPCSK9遺伝子座を編集する
実験は、トランスフェクションによって送達されたときに、AML12細胞における野生型PCSK9遺伝子座を編集する能力を実証するために行った。
実験は、トランスフェクションによって送達されたときに、AML12細胞における野生型PCSK9遺伝子座を編集する能力を実証するために行った。
材料および方法:
ネズミ肝細胞株AML12細胞を、野生型ネズミPCSK9(表17における配列)を標的にするスペーサー27.1~27.7を有するgRNA足場174とともにCasX 491をコードする1000ngのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、AML12培地(10%ウシ胎児血清、10μg/mlインスリン、5.5μg/mlトランスフェリン、5ng/mlセレン、40ng/mlデキサメタゾンを補充したDMEM:F12)中で、5%CO2を用いた37℃インキュベーターでインキュベートして6日間増殖させた。次に、細胞を収集し、NGSを使用して編集分析した。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたPCRを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Illumina読み取り1および2の配列を導入するために5’末端に追加の配列を含む。さらに、固有の分子識別子(UMI)として機能する16ntのランダム配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Fragment Analyzer DNAアナライザーキット(Agilent、dsDNA 35~1500bp)を使用して評価した。アンプリコンを、Illumina Miseqで製造業者の説明書に従って配列決定した。配列決定からの生fastqファイルを以下のように処理した。(1)プログラムcutadapt(v.2.1)を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、(2)読み取り1および2からの配列を、プログラムflash2(v2.2.00)を使用して単一の挿入配列にマージし、(3)コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムCRISPResso2(v 2.0.29)を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの3′末端付近のウィンドウ(スペーサーの3’末端から-3bpを中心とする30bpウィンドウ)内の改変された読み取りのパーセントを定量する。CasX分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および/または欠失を含む合計読み取りパーセントとして定量した。
ネズミ肝細胞株AML12細胞を、野生型ネズミPCSK9(表17における配列)を標的にするスペーサー27.1~27.7を有するgRNA足場174とともにCasX 491をコードする1000ngのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、AML12培地(10%ウシ胎児血清、10μg/mlインスリン、5.5μg/mlトランスフェリン、5ng/mlセレン、40ng/mlデキサメタゾンを補充したDMEM:F12)中で、5%CO2を用いた37℃インキュベーターでインキュベートして6日間増殖させた。次に、細胞を収集し、NGSを使用して編集分析した。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、目的の標的ゲノム位置に特異的なプライマーを用いたPCRを介して増幅して、標的アンプリコンを形成した。これらのプライマーは、Illumina読み取り1および2の配列を導入するために5’末端に追加の配列を含む。さらに、固有の分子識別子(UMI)として機能する16ntのランダム配列を含む。アンプリコンの質および定量を、Fragment Analyzer DNAアナライザーキット(Agilent、dsDNA 35~1500bp)を使用して評価した。アンプリコンを、Illumina Miseqで製造業者の説明書に従って配列決定した。配列決定からの生fastqファイルを以下のように処理した。(1)プログラムcutadapt(v.2.1)を使用して、配列を品質およびアダプター配列のためにトリムし、(2)読み取り1および2からの配列を、プログラムflash2(v2.2.00)を使用して単一の挿入配列にマージし、(3)コンセンサス挿入配列について、予測されるアンプリコン配列およびスペーサー配列とともに、プログラムCRISPResso2(v 2.0.29)を介して実行した。このプログラムは、スペーサーの3′末端付近のウィンドウ(スペーサーの3’末端から-3bpを中心とする30bpウィンドウ)内の改変された読み取りのパーセントを定量する。CasX分子の活性を、このウィンドウ内のどこかに挿入および/または欠失を含む合計読み取りパーセントとして定量した。
結果:
図26のグラフは、3つの異なるスペーサーを有する構築物が、少なくとも6~7%の平均編集でPCSK9遺伝子座を編集することができ、他のスペーサーがより少ない量の編集をもたらすことを示している。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のNGS読み取りの平均測定値である。結果は、アッセイの条件下で、適切に標的化したガイドを有するCasXが、AML12細胞におけるPCSK9遺伝子座を編集することができたことを示す。
図26のグラフは、3つの異なるスペーサーを有する構築物が、少なくとも6~7%の平均編集でPCSK9遺伝子座を編集することができ、他のスペーサーがより少ない量の編集をもたらすことを示している。各データポイントは、個々のスペーサーによって生成された編集結果のNGS読み取りの平均測定値である。結果は、アッセイの条件下で、適切に標的化したガイドを有するCasXが、AML12細胞におけるPCSK9遺伝子座を編集することができたことを示す。
Claims (192)
- クラス2のV型CRISPRタンパク質と、第1のガイド核酸(gNA)と、を含む、システムであって、前記gNAが、プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)遺伝子標的核酸配列に相補的な標的化配列を含み、前記PCSK9遺伝子が、1つ以上の変異を含む、システム。
- 前記PCSK9遺伝子が、
a.PCSK9イントロン、
b.PCSK9エクソン、
c.PCSK9イントロン-エクソン接合部、
d.PCSK9調節要素、および
e.遺伝子間領域、からなる群から選択される領域に1つ以上の変異を含む、請求項1に記載のシステム。 - 前記変異が、野生型PCSK9遺伝子配列と比較して、1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位である、請求項1または2に記載のシステム。
- 前記変異が、機能獲得型変異である、請求項1~3のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記1つ以上の変異が、配列番号33の配列に対して、S127R、D129G、F216L、D374H、およびD374Yからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項3に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、S127R、D129G、F216L、D374H、またはD374Y置換をコードする標的核酸配列に相補的である、請求項1~5のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、AGCAGGUCGCCUCUCAUCUU(配列番号272)、CAUCUUCACCAGGAAGCCAG(配列番号273)、CCUCUCAUCUUCACCAGGAA(配列番号274)、UGGUGAAGAUGAGAGGCGAC(配列番号275)、GUGGAGGCGGGUCCCGUCCU(配列番号281)、AGCCACUGCAGCACCUGCUU(配列番号287)、UUGGUGCCUCCAGCCACUGC(配列番号288)、AGCUACUGCAGCACCUGCUU(配列番号289)、およびUUGGUGCCUCCAGCUACUGC(配列番号290)からなる群から選択される配列を含む、請求項6に記載のシステム。
- 前記変異が、機能喪失型突然変異である、請求項1~3のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記1つ以上の変異が、配列番号33の配列に対して、R46L、G106R、Y142X、N157K、R237W、およびC679Xからなる群から選択されるアミノ酸置換を含む、請求項8に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、前記R46L、G106R、Y142X、N157K、R237W、またはC679X置換をコードする標的核酸配列に相補的である、請求項9に記載のシステム。
- 前記PCSK9遺伝子が、非機能的PCSK9タンパク質をコードする、請求項1~10のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAが、ガイドRNA(gRNA)である、請求項1~11のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAが、ガイドDNA(gDNA)である、請求項1~11のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAが、DNAおよびRNAを含む、キメラである、請求項1~11のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAが、単一分子gNA(sgNA)である、請求項1~14のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAが、二重分子gNA(dgNA)である、請求項1~14のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列番号247~303、315~436、612~2100、および2286~13861の配列からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、もしくは少なくとも約95%の同一性を有する配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列番号247~303、315~436、612~2100、および2286~13861の配列からなる群から選択される配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から2つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から3つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から4つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から5つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列に対して、1つ以上の一塩基多型(SNP)を有する配列を含む、請求項17~23のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、PCSK9エクソンの配列に相補的である、請求項1~24のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、PCSK9エクソン1またはエクソン2の配列に相補的である、請求項1~24のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、PCSK9イントロンの配列に相補的である、請求項1~24のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、PCSK9イントロン-エクソン接合部の配列に相補的である、請求項1~24のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、PCSK9調節要素の配列に相補的である、請求項1~24のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、前記PCSK9遺伝子の1つ以上の一塩基多型(SNP)を含む配列に相補的である、請求項1~23のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、前記PCSK9遺伝子の遺伝子間領域の配列に相補的である、請求項1~24のいずれか一項に記載のシステム。
- 第2のgNAをさらに含み、前記第2のgNAが、前記第1のgNAの前記標的化配列と比較して、前記PCSK9標的核酸配列の異なるかまたは重複する部分に相補的である標的化配列を有する、請求項1~31のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2のgNAが、前記第1のgNAによって標的化されるのと同じエクソンに相補的な標的化配列を有する、請求項32に記載のシステム。
- 前記第2のgNAが、前記第1のgNAによって標的化されるのと異なるエクソンに相補的な標的化配列を有する、請求項32に記載のシステム。
- 前記第2のgNAが、前記第1のgNAによって標的化されるイントロンの3’からエクソンまでに相補的な標的化配列を有する、請求項32に記載のシステム。
- 前記第2のgNAの前記標的化配列が、配列番号247~303、315~436、612~2100、および2286~13861の配列からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、もしくは少なくとも約95%の同一性を有する配列を含む、請求項32~35のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2のgNAの前記標的化配列が、配列番号247~303、315~436、612~2100、および2286~13861の配列からなる群から選択される配列を含む、請求項32~35のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2のgNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から単一ヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項32~35のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2のgNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から2つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項32~35のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2のgNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から3つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項32~35のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2のgNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から4つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項32~35のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第2のgNAの前記標的化配列が、配列の3’末端から5つのヌクレオチドが除去されている配列番号247~303、315~436、612~2100、または2286~13861の配列を含む、請求項32~35のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1および/または第2のgNAが、配列番号2201~2285からなる群から選択される配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を含む足場を有する、請求項1~42のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1および/または第2のgNAが、配列番号2201~2285からなる群から選択される配列を含む足場を有する、請求項1~42のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1および/または第2のgNAが、配列番号2201~2285からなる群から選択される配列からなる足場を有する、請求項1~42のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第1および/または第2のgNA足場が、配列番号4~16からなる群から選択される参照gNA配列と比較して、少なくとも1つの改変を有する配列を含む、請求項1~45のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記参照gNAの前記少なくとも1つの改変が、前記参照gNA配列のヌクレオチドの少なくとも1つの置換、欠失、または置換を含む、請求項46に記載のシステム。
- 前記第1および/または第2のgNAが、化学的に改変される、請求項1~47のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記クラス2のV型CRISPRタンパク質が、配列番号1~3のうちのいずれか1つの配列を有する参照CasXタンパク質、配列番号49~160、329、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、もしくは490の配列、またはそれに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約96%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%の配列同一性を有する配列を有するCasXバリアントタンパク質を含む、請求項1~48のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記クラス2のV型CRISPRタンパク質が、配列番号49~160、329、441、443、445、447~460、472、474、476、478、480、482、484、486、488、または490の配列を有するCasXバリアントタンパク質である、請求項1~49のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記CasXバリアントタンパク質が、配列番号1~3から選択される配列を有する参照CasXタンパク質と比較して、少なくとも1つの改変を含む、請求項49に記載のシステム。
- 前記少なくとも1つの改変が、前記参照CasXタンパク質と比較して、前記CasXバリアントタンパク質のドメインに少なくとも1つのアミノ酸置換、欠失、または置換を含む、請求項51に記載のシステム。
- 前記ドメインが、非標的鎖結合(NTSB)ドメイン、標的鎖負荷(TSL)ドメイン、ヘリカルIドメイン、ヘリカルIIドメイン、オリゴヌクレオチド結合ドメイン(OBD)、およびRuvC DNA切断ドメインからなる群から選択される、請求項52に記載のシステム。
- 前記CasXタンパク質が、1つ以上の核局在化シグナル(NLS)をさらに含む、請求項49~53のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記1つ以上のNLSが、配列番号161~194、217、および223~224からなる配列の群から選択される、請求項54に記載のシステム。
- 前記1つ以上のNLSが、前記CasXタンパク質のC末端で、またはその近くで発現される、請求項54または55に記載のシステム。
- 前記1つ以上のNLSが、前記CasXタンパク質のN末端で、またはその近くで発現される、請求項54または55に記載のシステム。
- 前記CasXタンパク質のN末端に、またはその近くに、かつC末端に、またはその近くに位置する1つ以上のNLSを含む、請求項54または55に記載のシステム。
- 前記クラス2のV型CRISPRタンパク質が、前記gNAとともにリボ核タンパク質複合体(RNP)を形成することができる、請求項49~58のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記CasXバリアントが、前記gNAとともにリボ核タンパク質複合体(RNP)を形成することができる、請求項49~58のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記CasXバリアントおよび前記gNAが、RNPとして複合体化される、請求項49~58のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記CasXバリアントタンパク質と前記gNAとを含むRNPが、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の前記参照CasXタンパク質と、配列番号4~16のうちのいずれか1つの配列を含むgNAとを含むRNPと比較して、少なくとも1つ以上の改善された特性を示す、請求項61に記載のシステム。
- 前記改善された特性が、前記CasXバリアントの改善されたフォールディング、ガイド核酸(gNA)に対する改善された結合親和性、標的DNAに対する改善された結合親和性、標的DNAの編集においてATC、CTC、GTC、またはTTCを含む1つ以上のPAM配列のより広範なスペクトルを利用する改善された能力、前記標的DNAの改善された巻き戻し、増加した編集活性、改善された編集効率、改善された編集特異性、増加したヌクレアーゼ活性、改善された標的核酸配列切断速度、二本鎖切断のための増加した標識鎖負荷、一本鎖ニッキングのための減少した標識鎖負荷、減少したオフターゲット切断、非標的DNA鎖の改善された結合、改善されたタンパク質安定性、改善されたタンパク質溶解性、改善されたリボ核タンパク質複合体(RNP)形成、切断能力のあるRNPの高い割合、改善されたタンパク質:gNA複合体(RNP)安定性、改善されたタンパク質:gNA複合体溶解性、改善されたタンパク質収量、改善されたタンパク質発現、および改善された融合特性からなる群のうちの1つ以上から選択される、請求項62に記載のシステム。
- 前記CasXバリアントタンパク質と前記gNAバリアントとの前記RNPの前記改善された特性が、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の前記参照CasXタンパク質と、配列番号4~16のうちのいずれか1つの配列を含む前記gNAとの前記RNPと比較して、少なくとも約1.1~約100倍以上改善される、請求項62または63に記載のシステム。
- 前記CasXバリアントタンパク質の前記改善された特性が、配列番号1、配列番号2、または配列番号3の前記参照CasXタンパク質および配列番号4~16のうちのいずれか1つの配列を含む前記gNAと比較して、少なくとも約1.1、少なくとも約2、少なくとも約10、少なくとも約100倍以上改善される、請求項62または63に記載のシステム。
- 前記改善された特性が、前記標的核酸配列に対する改善された結合親和性である、請求項64または65に記載のシステム。
- 前記PAM配列TTC、ATC、GTC、またはCTCのうちのいずれか1つが、前記gNAの前記標的化配列と同一性を有する非標的鎖配列に対して5’の1つのヌクレオチドに位置する場合、前記CasXバリアントと前記gNAバリアントとを含む前記RNPが、細胞アッセイシステムにおいて、同等のアッセイシステムにおける参照CasXタンパク質と参照gNAとを含むRNPの編集効率および/または結合と比較して、前記標的核酸における標的化配列の高い編集効率および/または結合を示す、請求項61~66のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記PAM配列が、TTCである、請求項67に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列番号3184~7251からなる群から選択される配列を含む、請求項68に記載のシステム。
- 前記PAM配列が、ATCである、請求項67に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列番号315~436、612~2100、および2286~3183からなる群から選択される配列を含む、請求項70に記載のシステム。
- 前記PAM配列が、CTCである、請求項67に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列番号7252~11521からなる群から選択される配列を含む、請求項72に記載のシステム。
- 前記PAM配列が、GTCである、請求項67に記載のシステム。
- 前記gNAの前記標的化配列が、配列番号11522~13861からなる群から選択される配列を含む、請求項74に記載のシステム。
- 前記RNPが、配列番号1~3の前記参照CasXタンパク質と配列番号4~16の前記gNAとのRNPと比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、または少なくとも20%高いパーセンテージの切断能力のあるRNPを有する、請求項61~75のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記RNPが、配列番号1~3の前記参照CasXタンパク質のRNPと比較して、インビトロアッセイにおいて、少なくとも5倍、少なくとも10倍、または少なくとも30倍増加した切断速度を有する、請求項60~75のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記CasXバリアントタンパク質が、ニッカーゼ活性を有するRuvC DNA切断ドメインを含む、請求項49~77のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記CasXバリアントタンパク質が、二本鎖切断活性を有するRuvC DNA切断ドメインを含む、請求項49~77のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記CasXタンパク質が、触媒的に不活性なCasX(dCasX)タンパク質であり、前記dCasXと前記gNAとのRNPが、前記PCSK9標的核酸に結合する能力を保持する、請求項49~75のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記dCasXが、残基:
a.配列番号1の前記CasXタンパク質に対応するD672、E769、および/もしくはD935、または
b.配列番号2の前記CasXタンパク質に対応するD659、E756、および/もしくはD922、に変異を含む、請求項80に記載のシステム。 - 前記変異が、前記残基におけるアラニンの置換である、請求項81に記載のシステム。
- ドナー鋳型核酸をさらに含む、請求項1~79のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、PCSK9エクソン、PCSK9イントロン、PCSK9イントロン-エクソン接合部、およびPCSK9調節要素、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるPCSK9遺伝子の少なくとも一部を含む核酸を含む、請求項83に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、野生型核酸配列を含む、請求項84に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、前記野生型PCSK9遺伝子配列と比較して、1つ以上の変異を有する核酸配列を含む、請求項84に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、10~15,000個のヌクレオチドの範囲のサイズである、請求項83~86のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、一本鎖DNA鋳型または一本鎖RNA鋳型である、請求項83~87のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、二本鎖DNA鋳型である、請求項83~87のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記ドナー鋳型が、前記クラス2のV型CRISPRタンパク質によって導入された前記PCSK9標的核酸における切断部位に隣接する配列に相補的であるドナー鋳型の5’および3’末端に、またはその近くに相同アームを含む、請求項83~89のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的核酸配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列の1つのヌクレオチドの3’に位置する非標的鎖配列に相補的である、請求項1~90のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記PAM配列が、TCモチーフを含む、請求項91に記載のシステム。
- 前記PAM配列が、ATC、GTC、CTC、またはTTCを含む、請求項91に記載のシステム。
- 前記クラス2のV型CRISPRタンパク質が、RuvCドメインを含む、請求項91~93のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RuvCドメインが、前記標的核酸配列にねじれた二本鎖切断を生成する、請求項94に記載のシステム。
- 前記クラス2のV型CRISPRタンパク質が、HNHヌクレアーゼドメインを含まない、請求項91~95のいずれか一項に記載のシステム。
- 請求項83~90のいずれか一項に記載のドナー鋳型を含む、核酸。
- 請求項49~82のいずれか一項に記載のCasXをコードする配列を含む、核酸。
- 前記CasXタンパク質をコードする前記配列が、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項98に記載の核酸。
- 請求項1~48のいずれか一項に記載のgNAをコードする配列を含む、核酸。
- 請求項1~48のいずれか一項に記載のgNA、請求項49~82のいずれか一項に記載のCasXタンパク質、または請求項97~100のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
- 前記ベクターが、プロモーターをさらに含む、請求項101に記載のベクター。
- 前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクター、ウイルス様粒子(VLP)、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、DNAベクター、およびRNAベクターからなる群から選択される、請求項101または102に記載のベクター。
- 前記ベクターが、AAVベクターである、請求項103に記載のベクター。
- 前記AAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV44.9、AAV-Rh74、またはAAVRh10から選択される、請求項104に記載のベクター。
- 前記AAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、またはAAV9から選択される、請求項105に記載のベクター。
- 前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項103に記載のベクター。
- 前記ベクターが、gagポリタンパク質の1つ以上の成分を含むVLPベクターである、請求項103に記載のベクター。
- 前記Gagポリタンパク質の前記1つ以上の成分が、マトリックスタンパク質(MA)、ヌクレオカプシドタンパク質(NC)、カプシドタンパク質(CA)、p1-p6タンパク質、PP21/24ペプチド、P12/P3/P8ペプチド、p2ペプチド、P10ペプチド、p68 Gagポリペプチド、p3 Gagポリペプチド、およびプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される、請求項108に記載のベクター。
- 前記CasXタンパク質と前記gNAとを含む、請求項108または109に記載のベクター。
- 前記CasXタンパク質および前記gNAが、RNPで一緒に会合している、請求項110に記載のベクター。
- 前記ドナー鋳型をさらに含む、請求項108~111のいずれか一項に記載のベクター。
- 前記VLPと標的細胞との結合および融合を提供する偽型ウイルスエンベロープ糖タンパク質または抗体断片をさらに含む、請求項108~112のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項101~113のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、BHK、HEK293、HEK293T、NS0、SP2/0、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER、PER.C6、NIH3T3、COS、HeLa、CHO、および酵母細胞からなる群から選択される、請求項114に記載の宿主細胞。
- a.請求項1~96のいずれか一項に記載のシステム、
b.請求項97~100のいずれか一項に記載の核酸、または
c.請求項101~113のいずれか一項に記載のベクター、
および1つ以上の薬学的に好適な賦形剤を含む、医薬組成物。 - 前記医薬組成物が、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路のために製剤化される、請求項116に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、液体形態または凍結形態である、請求項116に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、単回注射のためのプレフィルドシリンジ内にある、請求項116~118のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 細胞集団におけるPCSK9標的核酸配列を改変する方法であって、前記PCSK9標的核酸が1つ以上の変異を含み、前記方法が、前記集団細胞に、
a.請求項1~96のいずれか一項に記載のシステム、
b.請求項97~100のいずれか一項に記載の核酸、
c.請求項101~113のいずれか一項に記載のベクター、
d.請求項116~119のいずれか一項に記載の医薬組成物、または
e.(a)~(d)のうちの2つ以上の組み合わせを導入することを含み、
前記第1のgNAによって標的化される前記細胞の前記PCSK9標的核酸配列が、前記クラス2タイプVタンパク質によって改変される、方法。 - 前記改変することが、前記細胞集団の前記PCSK9標的核酸配列に一本鎖切断を導入することを含む、請求項120に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞集団の前記PCSK9標的核酸配列に二本鎖切断を導入することを含む、請求項120に記載の方法。
- 前記細胞集団に第2のgNAまたは前記第2のgNAをコードする核酸を導入することをさらに含み、前記第2のgNAが、前記第1のgNAと比較して、前記PCSK9標的核酸の異なるかまたは重複する部分に相補的な標的化配列を有し、前記集団の前記細胞の前記PCSK9標的核酸に追加の切断をもたらす、請求項120~122のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞集団の前記PCSK9標的核酸に1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含む、請求項120~123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、または少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%以上の前記PCSK9標的核酸が改変される、請求項120~124のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞集団における前記PCSK9遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらし、それによって、非機能的PCSK9タンパク質の発現が、前記PCSK9遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%減少される、請求項120~124のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記PCSK9遺伝子が、前記改変された細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%が、検出可能なレベルの非機能的PCSK9タンパク質を発現しないように改変される、請求項120~126のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞集団における前記PCSK9遺伝子の前記変異の修正または代償をもたらし、それによって機能的PCSK9タンパク質が前記細胞によって発現される、請求項120~124のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団による前記機能的PCSK9タンパク質の発現が、前記PCSK9遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%増加される、請求項120~124および128のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞集団の前記PCSK9遺伝子標的核酸配列の前記切断部位への前記ドナー鋳型の配列の挿入を含む、請求項120~123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記配列の前記挿入が、相同性指向修復(HDR)または相同性非依存性標的化組み込み(HITI)によって媒介される、請求項130に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記配列の挿入が、前記細胞集団における前記PCSK9遺伝子の修正または代償をもたらし、それによって機能的PCSK9タンパク質が前記細胞によって発現される、請求項130または131に記載の方法。
- 前記細胞集団による前記機能的PCSK9タンパク質の発現が、前記PCSK9遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%増加される、請求項130~132のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記PCSK9遺伝子が、前記改変された細胞の少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が、検出可能なレベルの機能的PCSK9を発現するように改変される、請求項130~132のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記配列の挿入が、前記細胞集団における前記PCSK9遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらし、それによって非機能的PCSK9タンパク質の発現が、前記PCSK9遺伝子が改変されていない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%減少される、請求項130または131に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記PCSK9遺伝子が、前記改変された細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%が、検出可能なレベルの非機能的PCSK9タンパク質を発現しないように改変される、請求項130または131に記載の方法。
- 前記細胞が、真核生物のものである、請求項120~136のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、および非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、請求項137に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が、ヒト細胞である、請求項137に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜の細胞、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、請求項137~139のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記PCSK9遺伝子標的核酸配列を前記改変することが、インビトロまたはエクスビボで生じる、請求項120~140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記PCSK9遺伝子標的核酸配列を前記改変することが、対象においてインビボで生じる、請求項120~140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、げっ歯類、マウス、ラット、および非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項142に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項142に記載の方法。
- 前記方法が、治療有効用量のAAVベクターを前記対象に投与することを含む、請求項142~144のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVベクターが、前記対象に、少なくとも約1×105ベクターゲノム/kg(vg/kg体重)、少なくとも約1×106vg/kg、少なくとも約1×107vg/kg、少なくとも約1×108vg/kg、少なくとも約1×109vg/kg、少なくとも約1×1010vg/kg、少なくとも約1×1011vg/kg、少なくとも約1×1012vg/kg、少なくとも約1×1013vg/kg、少なくとも約1×1014vg/kg、少なくとも約1×1015vg/kg、または少なくとも約1×1016vg/kgの用量で投与される、請求項145に記載の方法。
- 前記AAVベクターが、前記対象に、少なくとも約1×105vg/kg~約1×1016vg/kg、少なくとも約1×106vg/kg~約1×1015vg/kg、少なくとも約1×107vg/kg~約1×1014vg/kg、少なくとも約1×108vg/kg~約1×1013vg/kg、少なくとも約1×109vg/kg~約1×1012vg/kg、または少なくとも約1×1010vg/kg~約1×1011vg/kgの用量で投与される、請求項145に記載の方法。
- 前記方法が、治療有効用量のVLPを前記対象に投与することを含む、請求項142~144のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VLPが、前記対象に、少なくとも約1×105粒子/kg体重(粒子/kg)、少なくとも約1×106粒子/kg、少なくとも約1×107粒子/kg、少なくとも約1×108粒子/kg、少なくとも約1×109粒子/kg、少なくとも約1×1010粒子/kg、少なくとも約1×1011粒子/kg、少なくとも約1×1012粒子/kg、少なくとも約1×1013粒子/kg、少なくとも約1×1014粒子/kg、少なくとも約1×1015粒子/kg、少なくとも約1×1016粒子/kgの用量で投与される、請求項148に記載の方法。
- 前記VLPが、前記対象に、少なくとも約1×105粒子/kg~約1×1016粒子/kg、少なくとも約1×106粒子/kg~約1×1015粒子/kg、少なくとも約1×107粒子/kg~約1×1014粒子/kg、少なくとも約1×108粒子/kg~約1×1013粒子/kg、少なくとも約1×109粒子/kg~約1×1012粒子/kg、少なくとも約1×1010粒子/kg~約1×1011粒子/kgの用量で投与される、請求項148に記載の方法。
- 前記ベクターまたはVLPが、前記対象に、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、請求項142~150のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集団の前記PCSK9標的核酸配列を、
a.追加のCRISPRヌクレアーゼ、および前記第1のgNAと比較して前記PCSK9標的核酸の異なるかもしくは重複する部分を標的とするgNA、
b.(a)の前記追加のCRISPRヌクレアーゼおよび前記gNAをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
c.(b)の前記ポリヌクレオチドを含むベクター、または
d.(a)の前記追加のCRISPRヌクレアーゼと前記gNAとを含むVLP、と接触させることをさらに含み、
前記接触させることが、前記第1のgNAによって標的化される前記配列と比較して、前記配列における異なる位置に前記PCSK9遺伝子の改変をもたらす、請求項142~151のいずれか一項に記載の方法。 - 前記追加のCRISPRヌクレアーゼが、先行請求項のいずれか一項に記載のCasXタンパク質とは異なる配列を有するCasXタンパク質である、請求項152に記載の方法。
- 前記追加のCRISPRヌクレアーゼが、CasXタンパク質ではない、請求項152に記載の方法。
- 前記追加のCRISPRヌクレアーゼが、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d(CasY)、Cas12J、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、CasX、CasY、CasZ、Cas14、Cpf1、C2cl、Csn2、Cas Phi、およびそれらの配列変異体からなる群から選択される、請求項154に記載の方法。
- 請求項142~155のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞集団であって、前記細胞が、前記改変された細胞の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%が検出可能なレベルの非機能的PCSK9タンパク質を発現しないように改変されている、細胞集団。
- 請求項142~156のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞集団であって、前記PCSK9標的核酸の前記変異が、前記改変された細胞集団において修正または代償され、前記改変された細胞による機能的PCSK9タンパク質の発現をもたらす、細胞集団。
- 機能的PCSK9タンパク質の発現が、前記PCSK9遺伝子が改変されてない細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%増加されるように、前記細胞が改変されている、請求項157に記載の細胞集団。
- 前記細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜細胞、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、請求項156~158のいずれか一項に記載の細胞集団。
- PCSK9関連疾患の治療を必要とする対象におけるPCSK9関連疾患を治療する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項156~159のいずれか一項に記載の細胞を投与することを含む、方法。
- 前記PCSK9関連疾患が、常染色体優性高コレステロール血症(ADH)、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、高脂質血症、低密度リポタンパク質(LDL)レベルの上昇、LDLコレステロールレベルの上昇、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、2型糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症(AMD)、またはそれらの組み合わせである、請求項160に記載の方法。
- 前記対象が、げっ歯類、マウス、ラット、および非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項160または161に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項160~162のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、前記細胞を投与される前記対象に対して自己である、請求項160~163のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、前記細胞を投与される前記対象に対して同種異系である、請求項160~163のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、請求項160~165のいずれか一項に記載の方法。
- PCSK9関連疾患の治療を必要とする対象におけるPCSK9関連疾患を治療する方法であって、前記対象の細胞における1つ以上の変異を有するPCSK9遺伝子を改変することを含み、前記改変することが、前記細胞を、治療有効量の
a.請求項1~96のいずれか一項に記載のシステム、
b.請求項97~100のいずれか一項に記載の核酸、
c.請求項101~107のいずれか一項に記載のベクター、
d.請求項108~113のいずれか一項に記載のVLP、
e.請求項116~119のいずれか一項に記載の医薬組成物、または
f.(a)~(e)のうちの2つ以上の組み合わせと接触させることを含み、
前記第1のgNAによって標的化される前記細胞の前記PCSK9遺伝子が、CasXタンパク質によって改変される、方法。 - 前記改変することが、前記細胞の前記PCSK9遺伝子に一本鎖切断を導入することを含む、請求項167に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞の前記PCSK9遺伝子に二本鎖切断を導入することを含む、請求項167に記載の方法。
- 前記対象の前記細胞に、第2のgNAまたは前記第2のgNAをコードする核酸を導入することをさらに含み、前記第2のgNAが、前記第1のgNAと比較して前記標的核酸の異なるかまたは重複する部分に相補的な標的化配列を有して、前記対象の前記細胞の前記PCSK9標的核酸に追加の切断をもたらす、請求項167~169のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞の前記PCSK9遺伝子における1つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、置換、重複、または逆位を導入することを含む、請求項167~169のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記細胞の前記PCSK9遺伝子標的核酸配列の前記切断部位への前記ドナー鋳型の配列の挿入を含む、請求項167~170のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ドナー鋳型の前記配列の前記挿入が、相同性指向修復(HDR)または相同性非依存性標的化組み込み(HITI)によって媒介される、請求項172に記載の方法。
- 前記改変することが、前記対象の前記改変された細胞における前記PCSK9遺伝子の変異の修正または代償をもたらす、請求項167~173のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変異の修正が、前記対象の前記改変された細胞による機能的PCSK9タンパク質の発現をもたらす、請求項174に記載の方法。
- 前記改変された細胞の前記PCSK9遺伝子が、増加したレベルの機能的PCSK9タンパク質を発現し、前記増加が、改変されていないPCSK9遺伝子を有する細胞と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%である、請求項174または175に記載の方法。
- 前記改変することが、前記対象の前記改変された細胞における前記PCSK9遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらし、それによって、前記改変された細胞の少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%が、検出可能なレベルの非機能的PCSK9タンパク質を発現しない、請求項167~173のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記対象の前記改変された細胞における前記PCSK9遺伝子のノックダウンまたはノックアウトをもたらし、それによって、前記対象における非機能的PCSK9タンパク質の発現が、前記PCSK9遺伝子が改変されていない対象と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または少なくとも約90%減少される、請求項167~173のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、げっ歯類、マウス、ラット、および非ヒト霊長類からなる群から選択される、請求項167~178のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、ヒトである、請求項167~178のいずれか一項に記載の方法。
- 改変される前記細胞が、肝細胞、腸の細胞、腎臓の細胞、中枢神経系の細胞、平滑筋細胞、マクロファージ、網膜の細胞、および動脈内皮細胞からなる群から選択される、請求項167~180のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PCSK9関連疾患が、常染色体優性高コレステロール血症(ADH)、高コレステロール血症、総コレステロールレベルの上昇、高脂質血症、低密度リポタンパク質(LDL)レベルの上昇、LDLコレステロールレベルの上昇である、高密度リポタンパク質レベルの低下、脂肪肝、冠動脈性心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、2型糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、加齢性黄斑変性症(AMD)、またはそれらの組み合わせである、請求項167~181のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、前記対象に、治療有効用量で投与される、請求項167~182のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、AAVであり、前記対象に、少なくとも約1×105ベクターゲノム(vg)/kg、少なくとも約1×106vg/kg、少なくとも約1×107vg/kg、少なくとも約1×108vg/kg、少なくとも約1×109vg/kg、少なくとも約1×1010vg/kg、少なくとも約1×1011vg/kg、少なくとも約1×1012vg/kg、少なくとも約1×1013vg/kg、少なくとも約1×1014vg/kg、少なくとも約1×1015vg/kg、または少なくとも約1×1016vg/kgの用量で投与される、請求項167~183のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、AAVであり、前記対象に、少なくとも約1×105vg/kg~約1×1016vg/kg、少なくとも約1×106vg/kg~約1×1015vg/kg、少なくとも約1×107vg/kg~約1×1014vg/kg、少なくとも約1×108vg/kg~約1×1013vg/kg、少なくとも約1×109vg/kg~約1×1012vg/kg、または約1×1010vg/kg~約1×1011vg/kgの用量で投与される、請求項167~183のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VLPが、前記対象に、治療有効用量で投与される、請求項167~182のいずれか一項に記載の方法。
- 前記VLPが、前記対象に、少なくとも約1×105粒子/kg、少なくとも約1×106粒子/kg、少なくとも約1×107粒子/kg、少なくとも約1×108粒子/kg、少なくとも約1×109粒子/kg、少なくとも約1×1010粒子/kg、少なくとも約1×1011粒子/kg、少なくとも約1×1012粒子/kg、少なくとも約1×1013粒子/kg、少なくとも約1×1014粒子/kg、少なくとも約1×1015粒子/kg、少なくとも約1×1016粒子/kgの用量で投与される、請求項186に記載の方法。
- 前記VLPが、前記対象に、少なくとも約1×105粒子/kg~約1×1016粒子/kg、少なくとも約1×106粒子/kg~約1×1015粒子/kg、少なくとも約1×107粒子/kg~約1×1014粒子/kg、少なくとも約1×108粒子/kg~約1×1013粒子/kg、少なくとも約1×109粒子/kg~約1×1012粒子/kg、少なくとも約1×1010粒子/kg~約1×1011粒子/kgの用量で投与される、請求項186に記載の方法。
- 前記ベクターまたはVLPが、静脈内、門脈内静脈注射、腹腔内、筋肉内、皮下、眼内、および経口経路からなる群から選択される投与経路によって投与される、請求項183~188のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、LDL-コレステロールのベースラインからの変化、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患(ASCVD)の減少、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、不安定な扁桃炎、または視力からなる群から選択される少なくとも1つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす、請求項167~189のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、LDL-コレステロールのベースラインからの変化、プラークアテローム体積の減少、冠状動脈プラークの減少、アテローム性動脈硬化性心血管疾患(ASCVD)の減少、心血管死、非致死性心筋梗塞、虚血性脳卒中、非致死性脳卒中、冠状動脈血管再生、不安定な扁桃炎、または視力からなる群から選択される少なくとも2つの臨床的に関連するエンドポイントの改善をもたらす、請求項167~189のいずれか一項に記載の方法。
- PCSK9関連疾患の治療のための医薬品としての使用のための、請求項1~96のいずれか一項に記載のシステム、請求項97~100のいずれか一項に記載の核酸、請求項101~107のいずれか一項に記載のベクター、請求項108~113のいずれか一項に記載のVLP、請求項116~119のいずれか一項に記載の医薬組成物、またはそれらの組み合わせ。
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