JP2023551513A - 代替プロモータを含むｄｎａ構築物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生体分子コンピュータ処理及び／又は合成生物学の分野に関する。特に、本発明は、第一プロモータと、少なくとも一つのさらなるプロモータと、出力配列とを含むＤＮＡ構築物に関し、前記プロモータの各々は、転写開始部位を含む、及び／又は転写を開始するのに適し、第一プロモータからの転写の開始は、第一転写調節状態によって可能となり、前記さらなるプロモータの各々からの転写の開始は、各々のさらなる転写調節状態によって可能となり、前記第一転写調節状態及び／又は各々のさらなる転写調節状態のいずれかが前記細胞中に存在する場合、前記ＤＮＡ構築物が真核細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、前記出力ＲＮＡは前記出力配列に対応する配列を含む。さらに、本発明は、例えば、対象及び／又は組織サンプル中の様々なタイプの真核標的細胞を検出、殺滅、及び／又は操作するための、本発明のＤＮＡ構築物の医学的及び／又は診断的使用に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、生体分子コンピュータ処理及び／又は合成生物学の分野に関する。特に、本発明は、第一プロモータと、少なくとも一つのさらなるプロモータと、出力配列とを含むＤＮＡ構築物に関し、前記プロモータのそれぞれは、転写開始部位を含み、及び／又は転写を開始するのに適し、第一プロモータからの転写の開始は、第一転写調節状態によって可能となり、前記さらなるプロモータのそれぞれからの転写の開始は、各々のさらなる転写調節状態によって可能となり、前記第一転写調節状態及び／又は各々のさらなる転写調節状態のいずれかが前記細胞中に存在する場合、前記ＤＮＡ構築物が真核細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、前記出力ＲＮＡは前記出力配列に対応する配列を含む。さらに、本発明は、例えば、対象及び／又は組織サンプル中の様々なタイプの真核標的細胞を検出、殺滅、及び／又は操作するための、本発明のＤＮＡ構築物の医学的及び／又は診断的使用に関する。
生分子コンピュータ処理及び合成生物学における研究（Ｂａｓｈｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，２０１２；Ｅｌｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｌｅｉｂｌｅｒ，２０００；Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｘｉｅ ａｎｄ Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，２０１８；Ｙｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００４）により、過去二十年で、哺乳動物細胞において複雑な論理を実装できる様々な遺伝子回路構造が可能になってきた。ＯＲ論理プログラムは、プログラムに対する入力の少なくとも一つがアクティブである場合に高出力を生成し、不均一細胞集団に対処するために重要である。例えば、がんの種類ごとにいくつかのサブタイプがある。同じ出力を生成しつつ、複数のがんサブタイプを標的とする治療用遺伝子分類子回路が望ましい。このため、特にサブタイプを識別する分子入力がプロモータレベルで直接的又は間接的に作用できる場合、転写及び／又は転写後レベルでＯＲ論理を実装できる遺伝子分類子回路が非常に有用であり得る。
これまでのところ、転写入力間のＯＲ論理は、それぞれが独自の入力セットを受け取る２つの異なる遺伝子構築物を用いて明らかに実装されることが多かった（Ｂｕｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ただし、実験的には、この結果として、単一のアクティブな構築物と比べて、両方の構築物がアクティブな場合に得られる出力が２倍の出力になる多値論理になることが多い（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ，２００４；Ｒｉｎａｕｄｏ ｅｔ ａｌ，２００７）。そのため、望ましくないことが多い出力発現の不均衡が、さまざまな入力条件で起こる。
さらに、冗長な遺伝子フットプリントが大きいため（Ｌａｐｉｑｕｅ ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，２０１８）、臨床的に関連するウイルスベクターへの翻訳は非現実的となる。実際、冗長な情報が存在すると、ペイロードサイズが大きくなり、そのような構築物のウイルスベクターへのパッケージングや、治療用製品としての使用が妨げられる。冗長性の問題は、リコンビナーゼの使用によって対処されてきたが、少なくとも安全性の理由から、現時点では治療にとって望ましくない（Ｌａｐｉｑｕｅ ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，２０１８）。前述のｍｉＲＮＡ入力による転写後ＯＲ論理は、単一ゲートとして機能するのではなく、ＮＯＲゲートとＮＯＴゲートの重ね合わせとして機能する（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＲＮＡ干渉は、転写因子間の論理演算をサポートすることも示されたが、代償として回路が複雑になる（Ｌｅｉｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
また、生細胞において、普遍的で、潜在的に無限にスケーラブルな論理に向けた探求が進行中である。しかしながら、おそらく細胞状態に関する最も多くの情報を有し、したがって応用に関連する遺伝子回路に対する入力として最も有望である、複数の転写入力に関しては、最新技術と望ましい機能性との間のギャップは特に深刻である。
当初は簡単であると考えられていたが（Ｂｕｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）、異なる転写入力間の二次相互作用、すなわち相乗効果が例外ではなくルールであるという事実のために、単一プロモータレベルで転写ＯＲゲートを実装することは困難である（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｄｏｎａｈｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０；Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。原核生物でも同様の観察結果が得られ（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，２００７）、最終的に、異なるＲＮＡポリメラーゼ結合部位から同じコード配列を発現させる「デュアルプロモータ」によって、強固な原核生物ＯＲゲートが設計された（Ｔａｍｓｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかしながら、例えば、一般的に観察される転写入力の二次相互作用のために、デュアルプロモータが真核生物において機能的であるか否かは全くわからない。興味深いことに、高等真核生物は、多くの異なる細胞系列において、又は異なる誘導性条件セットの下で同じ遺伝子を発現させる場合、ＯＲ論理を実装する独自の要件に直面することが多い。これは、遺伝子の選択的にスプライシングされた第一エクソンを調節する複数の代替プロモータによって自然に実装されることが多い。通常、自然界では、これらのプロモータのうちの一つだけが任意の所与の時点で遺伝子を積極的に転写し、第一エクソンが異なる以外は同じである転写物を生成し、これは、例えば、ＡＢＬ１又はＣＩＩＴＡにおいて、タンパク質をコードし（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）、タンパク質アイソフォームを生成するもの；又は非コードであり、その結果、まったく同じタンパク質、例えばＦＵＲＩＮ遺伝子が得られるもの（Ａｙｏｕｂｉ ａｎｄ ＶａｎＤｅＶｅｎ，１９９６）のいずれかであり得る。しかしながら、細胞挙動の非常に複雑な制御の一部であるこの自然現象が、合成ＤＮＡ構築物、すなわち技術応用のためのツールで利用できるか否かは調査されてこなかった。
さらに、ＯＲ論理は、リコンビナーゼを使用してＤＮＡレベルで実装されてきた（Ｂｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）が、一方向性であり、つまり、論理回路が入力と遭遇すると、出力が定義され、入力シグナルが除去されても、出力はそのままの状態である。これにより、そのようなアプローチの多用途性が明らかに大きく低下する。
要約すると、ＯＲ論理を転写及び／又は転写後レベルで実装する、つまり複雑さが軽減された、実用的な方法はまだ利用可能でない。好適なツールがないことは、例えば、治療及び／又は診断用途において不均一細胞集団に対処しようとする場合の大きな障害となる。
したがって、真核細胞を分析及び／又は操作するため、特に、異なる真核細胞のタイプ及び／又は状態を検出及び／又は操作するための、改善された手段及び方法が依然として必要とされている。
したがって、本発明は、５’→３’方向に以下のＤＮＡ配列エレメント：
第一プロモータ（Ｐ１）；
ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）、ただしｎ≧１、例えば、Ｐ２とＰ２とＰ３、又はＰ２とＰ３とＰ４；及び
出力配列
を含むＤＮＡ構築物であって、
前記プロモータのそれぞれが、転写開始部位を含み、及び／又は転写を開始するのに適し、
Ｐ１からの転写の開始が、第一転写調節状態（ＴＳ１）によって可能となり、前記さらなるプロモータ（Ｐｎ）のそれぞれからの転写の開始が、各々のさらなる転写調節状態（ＴＳｎ）によって可能となり、例えば、Ｐ２はＴＳ２によって可能となり、
前記ＴＳ１及び／又は各々のＴＳｎのいずれか（例えば、Ｐ１およびＰ２の場合：ＴＳ１、ＴＳ２、又はＴＳ１とＴＳ２）が前記細胞中に存在する場合、前記ＤＮＡ構築物は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、
前記出力ＲＮＡが、前記出力配列に対応する配列を含む、
ＤＮＡ構築物に関する。
第一プロモータ（Ｐ１）；
ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）、ただしｎ≧１、例えば、Ｐ２とＰ２とＰ３、又はＰ２とＰ３とＰ４；及び
出力配列
を含むＤＮＡ構築物であって、
前記プロモータのそれぞれが、転写開始部位を含み、及び／又は転写を開始するのに適し、
Ｐ１からの転写の開始が、第一転写調節状態（ＴＳ１）によって可能となり、前記さらなるプロモータ（Ｐｎ）のそれぞれからの転写の開始が、各々のさらなる転写調節状態（ＴＳｎ）によって可能となり、例えば、Ｐ２はＴＳ２によって可能となり、
前記ＴＳ１及び／又は各々のＴＳｎのいずれか（例えば、Ｐ１およびＰ２の場合：ＴＳ１、ＴＳ２、又はＴＳ１とＴＳ２）が前記細胞中に存在する場合、前記ＤＮＡ構築物は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、
前記出力ＲＮＡが、前記出力配列に対応する配列を含む、
ＤＮＡ構築物に関する。
特に、転写がＰ１から開始された場合、前記出力ＲＮＡの第一タイプ（ＲＮＡ１）を得ることができ（ＴＳ１が存在するため）、転写が各々のＰｎ、例えばＰ２から開始される場合、前記出力ＲＮＡの各々のさらなるタイプ（ＲＮＡｎ、例えばＲＮＡ２）を得ることができ（すなわち、各々のＴＳｎ、例えばＴＳ２が存在するため）、前記出力ＲＮＡの各タイプは、前記出力配列に対応する配列を含む。
特に、細胞中に存在する出力ＲＮＡの量は、特に、出力ＲＮＡの各タイプが同じ配列、すなわち前記出力配列に対応する配列を含むため、前記細胞中に存在する全てのタイプ、少なくとも本明細書中に記載する全ての有用な出力ＲＮＡタイプの合計（すなわち、累積）量を指す。
好ましくは、前記ＤＮＡ構築物は、前記細胞中にＴＳ１もＴＳｎのいずれも存在しない場合、有効量の前記出力ＲＮＡを産生しない。
本発明は、少なくとも部分的には、所望の出力タンパク質をコード化するｍＲＮＡを、同じＤＮＡ構築物中に含まれる二つ以上の代替プロモータのうちのそれぞれによって、哺乳動物細胞において独立して産生できるという驚くべき発見に基づいている。添付の実施例に示されるように、どのプロモータが対応する転写活性化因子によって活性化されたかに関係なく、多量の出力タンパク質が得られた。
真核細胞において動作するＯＲゲート様論理を単一のＤＮＡ構築物によって実現できることは全く予想外であった。複数の構築物又は非常に複雑で嵩高い構築物と比べて強固かつ簡単な本発明の単一ＤＮＡ構築物でＯＲゲート様論理を実現できることは非常に有利である。特に、本明細書中で提供される単一の本発明のＤＮＡ構築物は、異なるベクターにパッケージングされなければならない複数の構築物又はウイルスベクターに全く効率的にパッケージングされない非常に大きな構築物と比較して、例えば、ウイルスベクター中により容易にパッケージングすることができるため、標的細胞中により容易に組込むことができ、それでもなおＯＲゲート様論理演算を可能にする。したがって、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物は、ＤＮＡベースの用途のペイロードサイズを低減することを可能にする。特に、本発明は、ＤＮＡベースの治療及び／又は診断用途に有利である。なぜなら、遺伝物質の細胞中への送達は、依然としてそのような用途の主なボトルネックであることが多いからである。
さらに、とりわけがんなどの多くの疾患を治療及び／又は診断するためには、異なる状態の細胞及び／又は異なるサブタイプの細胞を認識することが重要である。これは、本発明のＤＮＡ構築物が、かなりコンパクトなサイズであるために、より多くの標的細胞中により容易に組込むことができ、代替プロモータが存在するために、異なる細胞型及び／又は状態を認識できることに少なくとも起因して、本発明のＤＮＡ構築物により大いに促進される。
したがって、本発明のＤＮＡ構築物は、標的細胞（例えば、異常及び／又は悪性細胞）を非標的細胞（例えば、正常又は良性細胞）から区別するための分類子として使用できる。特に、本発明のＤＮＡ構築物は、ＯＲゲート様論理演算が可能であり、これにより、とりわけ異なるサブタイプのがんなどの異なる細胞型及び／又は状態を認識することが可能になることに少なくとも起因して、改善された分類を提供する。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物は、添付の実施例に示されるように、本明細書中で記載するようなさらなる論理演算を提供できるスケーラブルで拡張可能なプラットフォームを提供する。
特に、本明細書中に記載され、添付の実施例に示されるように、単一の代替プロモータは、二つ以上の条件（例えば、転写活性化因子）が存在する場合にのみ転写が開始されるように、ＡＮＤゲートとして機能することができる。
さらに、本明細書中に記載され、添付の実施例に示されるように、本発明のＤＮＡ構築物は、異なる転写後調節メカニズム及び／又は因子に供される、異なるタイプの出力ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡアイソフォーム）の産生を可能にする。これにより、「ＡＮＤ ＮＯＴ」などのさらなる論理演算が可能になる。特に、本発明のＤＮＡ構築物は、本明細書中で記載するように、望ましくない介在配列を出力ＲＮＡから除去することができ、これにより柔軟性や選択肢を増大させることに少なくとも起因して、「ＡＮＤ ＮＯＴ」論理演算の実装をさらに改善する選択的スプライシングを可能にする特徴を含み得る。選択的スプライシングの実装は、本明細書中で記載するように、各々のプロモータの活性に基づいて、異なるタイプの出力タンパク質（例えば、異なる各々のｍＲＮＡアイソフォームから翻訳された異なるタンパク質アイソフォーム）を産生する可能性をさらに提供する。したがって、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物は、添付の実施例に示されるように、中央ＯＲゲート様論理演算に加えて、さらなるＡＮＤゲート論理演算及び／又はＡＮＤ ＮＯＴゲート様論理演算を可能にできる。したがって、本発明のＤＮＡ構築物は、標準形様論理回路、例えば論理和標準形様（ＡＮＤ－ＯＲ）論理回路を形成し得る。
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書中で記載されるＤＮＡ構築物は、（ＴＳ１ａ ＡＮＤ ＴＳ１ｂ ＡＮＤ ＮＯＴ ＰＴＳ１）ＯＲ（ＴＳ２ａ ＡＮＤ ＴＳ２ｂ ＡＮＤ ＮＯＴ ＰＴＳ２）などの複雑な論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡを生じる。しかしながら、この例は、単なる例示であり、本明細書中で提示される本発明のＤＮＡ構築物は、本明細書中で記載するように、どのＤＮＡ配列エレメントを含むかによって、多くの異なる論理演算を提供することができる。
本発明のＤＮＡ構築物はまた、当該技術分野で通常理解されるように、「ＤＮＡカセット」とみなすことができる。したがって、「ＤＮＡ構築物」及び「ＤＮＡカセット」という用語は、本明細書では交換可能に使用できる。特に、ＤＮＡ構築物又はＤＮＡカセットは、本明細書中や本発明の文脈で使用される場合、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の配列（又はＤＮＡヌクレオチドの配列）を指し、したがって、ＤＮＡポリヌクレオチドとみなすこともできる。さらに、本発明のＤＮＡ構築物は、少なくとも前記ＤＮＡ構築物が本明細書中で記載するような所望の機能性を有する限り、ＤＮＡアナログ及び／又は修飾ＤＮＡ（例えば、とりわけ、メチル化ＤＮＡなどの化学的に修飾されたＤＮＡ）を含み得るか、またはこれらからなるものであってよい。好ましくは、本発明のＤＮＡ構築物は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％、好ましくは少なくとも９０％のデオキシリボ核酸から構成される。好ましくは、本発明のＤＮＡ構築物は二本鎖（ｄｓＤＮＡ）である。しかしながら、本発明のＤＮＡ構築物は、例えば、ＤＮＡ構築物のコード鎖（ｓｔａｎｄ）又はアンチセンス鎖がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに含まれる場合、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）である可能性がある。さらに、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物に対応する配列を含むＲＮＡ、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物の配列に対して相補的な配列を含むＲＮＡ、例えば、レトロウイルス、例えばレンチウイルスベクター中に含まれるＲＮＡを包含する。
したがって、本発明の二本鎖ＤＮＡ構築物は、本発明のＤＮＡ構築物に対応する配列を含むｓｓＤＮＡ又はＲＮＡベクターを細胞へ送達することにより、細胞中で形成することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、細胞中で二本鎖ＤＮＡに変換される部分的一本鎖ＤＮＡを含み、レンチウイルスベクターは、逆転写により細胞中でＤＮＡ配列に変換されるＲＮＡペイロードをパッケージングしている。
本発明のＤＮＡ構築物は、５’→３’方向に配列されたＤＮＡ配列エレメントを含み、特に、本発明のＤＮＡ構築物の配列は、前記ＤＮＡ構築物のコード鎖（センス鎖）に対応する。特に、本発明のＤＮＡ構築物は、ある特定のタイプの複数のＤＮＡ配列エレメントを含み得る。例えば、本発明のＤＮＡ構築物は、少なくとも二つのプロモータ（Ｐ）、すなわち、第一プロモータ（Ｐ１）と、ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）とを含み、ただしｎ≧１である。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物は、真核細胞において機能的である、すなわち、ある特定の条件下の真核細胞中、例えば、ある特定のタイプ及び／又はある特定の状態の細胞中で、有効量の出力ＲＮＡを産生する。明らかに、この機能性は、本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞、例えば、本発明のＤＮＡ構築物が導入された細胞で分析できる。
特に、添付の実施例に示されるように、本発明のＤＮＡ構築物は、複数の条件下、例えば、ある特定のタイプの複数の条件下（例えば、一つ以上の転写調節状態が存在する場合）の真核細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生できる。例えば、少なくとも二つの転写調節状態（ＴＳ）、すなわち、第一転写調節状態（ＴＳ１）及びｎ個のさらなる転写調節状態（ＴＳｎ）は、有効量の出力ＲＮＡが得られるように転写の開始を可能にし得る。
特に本明細書では、ある特定のタイプの個々の特徴は、異なるタイプの少なくとも一つの他の個々の特徴と関連する可能性がある。そのような関連づけられた特徴は、本明細書では「各々の」特徴とも呼ぶ。例えば、ある特定のタイプの個々のＤＮＡ配列エレメント（例えば、個々のプロモータ）は、異なるタイプ（例えば、個々の代替第一エクソン）及び／又はある特定のタイプの個々の細胞状態（例えば、個々の転写調節状態）の他の個々のＤＮＡ配列エレメントと関連する可能性がある。
本明細書中及び本発明の文脈で使用する場合、個々の特徴はそれぞれ、同じ番号（例えば、１、２、３等）、対応する文字（例えば、ａ、ｂ、ｃ等）又はｎによって指定され、ここで、「ｎ」は、少なくともさらなる一つ（ｎ≧１、１又はａに加えて）を意味し、したがって、「ｎ」は１より大きな数、例えば、２、３、４、５等、又はａ以降のラテンアルファベットの文字、例えば、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ等を表す場合がある。例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０、好ましくは１、２、３、又は４、より好ましくは１又は２であってよく、このことは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１、好ましくは２、３、４、又は５、より好ましくは２又は３のある特定のタイプの特徴（例えば、プロモータ、代替第一エクソン、５’スプライス部位、転写調節状態、及び／又は転写後調節状態など）が存在及び／又は関与し得ることを意味する。
通常、数字は文字の前で使用され、例えば、個々のプロモータは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３等、又はＰｎであり得る。しかしながら、一つの特徴（又はその略語）がすでに一つの数字を含む場合（例えば、代替第一エクソン（Ｅ１）、同じタイプの個々の特徴を指定するために複数の文字が使用される（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ１ｃ等、又はＥ１ｎ）。さらに、同じタイプの特徴（例えば、転写因子（ＴＦ））がまず個々の群（例えば、ＴＦ１、ＴＦ２、ＴＦ３等）に分類される場合、個々の群の個々のエレメントは数字によって指定される（例えば、ＴＦの第一群（ＴＦ１）の個々のＴＦはＴＦ１ａ、ＴＦ１ｂ、ＴＦ１ｃ等であり得る）。
実例として、Ｅ１ａ及び／又はＴＦ１ａ（又はＴＦ１ｎ）は、Ｐ１の各々の特徴であり得；Ｅ１ｎ及び／又はＴＦｎａ（又はＴＦｎｎ）は、Ｐｎの各々の特徴であり得る。
上述のように、ある特定のタイプの特徴は、複数の個々の特徴（エレメント）を含み得る。さらに上述したように、ある特定のタイプの特徴は、（ｉ）本発明のＤＮＡ構築物中に含まれ得るＤＮＡ配列エレメント又は（ｉｉ）本発明のＤＮＡ構築物を含む真核細胞において得られる出力ＲＮＡの量を制御し得る細胞状態に関連し得る。
例えば、本発明のＤＮＡ構築物中に含まれる可能性がある異なるタイプのＤＮＡ配列エレメントであって、そのいずれも複数のエレメントを含み得るものは：プロモータ（Ｐ）、スペーサ、ユニーク配列（ＵＳ）、代替第一エクソン（Ｅ１）、代替５’スプライス部位（５’ｓｓ）、及び／又はさらなるイントロン配列であり得る。特に、本明細書において、すなわち、（代替）プロモータ、（代替）第一エクソン、及び（代替）５’スプライス部位などの表現の関連では、表現の意味を変えることなく、「代替」という語を省略できる。
さらに、真核細胞において得られる出力ＲＮＡの量を制御し得る異なるタイプの細胞状態であって、そのいずれもが複数のエレメントを含み得るものは、例えば：転写調節状態（ＴＳ）、転写後調節状態（ＴＳ）、転写因子（ＴＦ）、アンチセンスＲＮＡ、並びに／又は異常及び／若しくは悪性細胞型及び／若しくは状態（ＡＣ）であり得る。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物によって産生及び／又は得られる出力ＲＮＡは、本明細書中でさらに記載するように、また添付の実施例で例示するように、複数タイプの出力ＲＮＡを含み得る。したがって、出力ＲＮＡはまた、各々の特徴とみなすこともでき、例えば、各々のプロモータ及び／又は各々の転写後調節状態と関連付けることができる。しかしながら、本明細書中でさらに記載するように、出力ＲＮＡの量（例えば、出力ＲＮＡの有効量）は、特に、本明細書中でさらに記載するように、細胞において得られるすべてのタイプの出力ＲＮＡの合計（すなわち、累積）量を指す。
例えば、ある特定のプロモータ（Ｐ）からの転写の開始は、各々の転写調節状態（ＴＳ）によって可能となる。したがって、第一プロモータ（Ｐ１）からの転写開始は、ＴＳ１によって可能となり、さらなるプロモータ（Ｐｎ）、例えばＰ２からの転写開始は、各々のさらなる転写調節状態（ＴＳｎ）、例えばＴＳ２によって可能となる。
したがって、Ｐ１は、各々の出力ＲＮＡ（ＲＮＡ１）を産生する可能性があり、さらなるプロモータ（Ｐｎ、例えば、Ｐ２）は、さらなる各々の出力ＲＮＡ（ＲＮＡｎ、例えば、ＲＮＡ２）を産生する可能性がある。それにもかかわらず、本発明の文脈では、少なくともＲＮＡ１及び／若しくはもう一つ別のＲＮＡｎ、例えばＲＮＡ２の有効量が細胞中に存在する場合、並びに／又は細胞中の全てのタイプの出力ＲＮＡの合計（すなわち、累積）量が有効量に対応する場合に有効量の出力ＲＮＡが得られると通常考えられ、特に、この場合、本明細書中に記載するように、ＲＮＡ１及びＲＮＡｎのいずれか、例えば、ＲＮＡ２は、共通の出力配列（又は共通の第二エクソン）を含む。
各々の特徴のこの原則は、本明細書の任意の各々の特徴に適用できる。
例えば、ある特定のプロモータ、例えばＰ１は、ＴＦの各々の群、例えばＴＦ１からの少なくとも一つのＴＦ又はある特定の数のＴＦ、例えばＴＦ１ａ及び／ＴＦ１ｂの少なくとも一つの結合部位を含み得る。別の例として、ある特定のプロモータ、例えばＰ１は、各々の代替第一エクソン（例えば、Ｅ１ａ）及び各々の５‘スプライス部位（例えば、５’ｓｓ１）の上流の次のプロモータであってよく、前記プロモータは、各々の転写調節状態（例えば、ＴＳ１）が存在する場合に各々の第一の代替第一エクソンに対応する配列を含む各々の出力配列を産生し、本明細書中に記載するように、前記出力ＲＮＡは、各々の転写後調節状態（例えば、ＰＴＳ１）によって制御することができる。
プロモータは、本明細書中で使用する場合、プロモータの下流及び／又はプロモータと重なるＤＮＡから、すなわち転写開始部位（ＴＳＳ）からＲＮＡの転写を開始するタンパク質が結合できるＤＮＡの配列であり、転写開始部位（ＴＳＳ）は、転写されたＲＮＡの第一ヌクレオチドに対応する。本明細書中で使用する場合、プロモータによって産生されるＲＮＡ（例えば、ある特定のタイプの出力ＲＮＡ）とは、特に、前記プロモータの活性により転写されるＲＮＡを指す。
特に、ＴＳＳは、プロモータの下流、好ましくはプロモータの近くに位置し、又はより好ましくは、本発明の文脈では、ＴＳＳはプロモータ内に含まれ、特に前記ＴＳＳはプロモータの３’末端付近若しくは３’末端にある。したがって、場合によっては、プロモータの配列の一部はＴＳＳの３’（下流）にあり得るが、いずれの場合も、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始できるプロモータ領域（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位）はＴＳＳの５’（上流）である。プロモータのＲＮＡポリメラーゼ結合部位の上流にある任意のＴＳＳは、本発明の文脈では、当該プロモータに属する、及び／又は当該プロモータに含まれるＴＳＳとはみなされない。ＴＳＳがプロモータの下流（すなわち、プロモータ付近）にあるか否か、又はＴＳＳがプロモータに含まれる（すなわち、３’末端付近若しくはプロモータの３’末端にある）か否かは、技術的な違いを生じさせず、特に定義の問題である。本発明の文脈では、プロモータは転写を開始させるのに適していなければならず、転写はＴＳＳで開始されるので、プロモータは、好ましくは、本明細書中で記載されるように、ＴＳＳを含むように定義される。しかしながら、本発明のＤＮＡ構築物が各プロモータの下流の各々のＴＳＳ、例えば、Ｐ１の下流（ただし、Ｐ２などの全Ｐｎの上流）のＴＳＳ１、及びＰ２の下流のＴＳＳ２などを含み得ることを明記することも好適であろう。
しかし、本発明の文脈では、また直前に記載したように、プロモータは、好ましくはＴＳＳを含み、特に、前記ＴＳＳは、プロモータの３’末端付近又は３’末端にある。プロモータのサイズは、特に限定されないが、約１５～２０００ｂｐであってよい。本発明の異なるプロモータに属する、及び／又は異なるプロモータに含まれる転写開始部位（ＴＳＳ）は、構造的に同一であっても、類似していても、又は異なっていてもよい。特に、ＴＳＳは、前記ＴＳＳが属する、及び／又は前記ＴＳＳが含まれるプロモータによって産生される出力ＲＮＡの各々のタイプの第一（すなわち、最も５’の）ヌクレオチドに対応し、前記第一ヌクレオチドは、前記出力ＲＮＡタイプの５’未翻訳領域の第一ヌクレオチド又は前記出力ＲＮＡタイプによってコード化される少なくとも一つの出力タンパク質の開始コドンの第一ヌクレオチドであり得る。
少なくとも、各プロモータがそれ自体の転写開始部位（ＴＳＳ）を含み、及び／又は原則として、転写を開始して出力ＲＮＡを産生するのに適しているため、すなわち、本明細書中に記載するように、タンパク質の結合を可能にし得るため、本発明のＤＮＡ構築物に含まれるプロモータは、代替プロモータとみなすことができる。好ましくは、前記プロモータの少なくとも一つ、好ましくは前記プロモータの各々は、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位を含む。本明細書中で好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩである。
しかしながら、各プロモータが転写を開始して出力ＲＮＡを産生するのに適している可能性があるという事実は、いかなる状態でもプロモータが構成的に転写を開始又は出力ＲＮＡを産生することを意味するものではない。それどころか、プロモータの活性（すなわち、転写の開始）は、本発明の文脈では調節される、すなわち、本明細書中で記載するように、各々の転写調節状態（ＴＳ）によって可能となる。
さらに、プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼの動員に寄与する転写因子（ＴＦ）と呼ばれるタンパク質の確実な初期結合部位を提供する応答エレメント（結合部位）などの特定のＤＮＡ配列を含み得る。
プロモータは、ＤＮＡの他の調節領域（例えば、エンハンサー又はインシュレータ）と協力してさらに機能して、転写開始及び／又はＲＮＡ転写（産生）量を制御できる。前記の他の調節領域は本発明のＤＮＡ構築物に含まれていてもよく、又は、特に、（例えば、ウイルスベクター又はトランスポゾンシステムによって）本発明のＤＮＡ構築物を組込むことができる細胞のゲノムに含まれていてもよい。
例えば、プロモータはコアプロモータを含んでもよく、前記コアプロモータは、転写開始部位（ＴＳＳ）、及びその上流にＲＮＡポリメラーゼ、特にＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位（例えば、メッセンジャーＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡを産生するため）、及び少なくとも一つの一般的な転写因子結合部位（応答エレメント）、例えば、ＴＡＴＡボックス、及び／又はＢ認識エレメント、好ましくは、本明細書中に記載するように、コアプロモータの上流に、特定の転写因子の少なくとも一つの結合部位を含む。特に、ＴＡＴＡボックス及び／又はＢ認識エレメントは、ＴＳＳの約２～約５０ｂｐ内にあり得る。
特に本明細書では、プロモータの活性は、前記プロモータからの転写の開始を指す。さらに、プロモータが活性であると、すなわち、前記プロモータからの転写が開始されると、出力ＲＮＡが前記プロモータによって産生される、すなわち、本明細書中に記載するように、出力ＲＮＡが、各々のＴＳＳ（例えば、前記プロモータ内）及び少なくとも出力配列を含むＴＳＳのすぐ下流のＤＮＡ配列から転写される。したがって、本明細書中に記載するように、ある特定のプロモータは、ユニーク配列と、その下流に異なる出力ＲＮＡタイプ（すなわち、本発明のＤＮＡ構築物の出力配列又は第二エクソンに対応する配列）間で共有される共通の配列（又は第二エクソン）とを含む、ある特定のタイプの出力ＲＮＡを産生し得る。さらに、本明細書中に記載するように、ある特定のプロモータからの転写の開始は、各々の転写調節状態によって可能となる。
本発明の文脈では、転写調節状態は、本発明のＤＮＡ構築物を含む、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物がその中で機能的である真核細胞の特徴であり得る。したがって、ある特定の転写調節状態、例えばＴＳ１、又はＴＳ２若しくはＴＳ３などのＴＳｎのいずれかは、ある特定の細胞型及び／又は細胞状態と関連し得る、並びに／あるいはそれらを反映し得る。したがって、ある特定の転写調節状態を含む細胞は、本発明のＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータからの転写の開始を可能にする。換言すれば、前記プロモータは前記細胞において活性である。
したがって、本発明のＤＮＡ構築物に含まれるある特定のプロモータは、ある特定の細胞型及び／又は状態で活性であり得、このことは、出力ＲＮＡが前記タイプ及び／又は前記状態の細胞において産生され得ることを意味する。したがって、本発明のＤＮＡ構築物に含まれるプロモータの少なくとも一つ又はそれぞれは、細胞型及び／又は細胞状態特異的プロモータであり得る。
細胞型及び／又は状態並びに関連する転写調節状態は、本明細書中及び本発明の文脈で使用される場合、特に限定されない。例えば、ある特定の細胞型及び／又は状態は、なかでも、分化した細胞状態；幹細胞状態；疾患細胞状態；なかでもリンパ球又はＢ細胞などのある特定の一般的細胞型；なかでも、白血病性細胞などのある特定の一般的異常及び／又は悪性細胞型；なかでも非悪性又は良性リンパ球などのある特定の一般的健常細胞型；なかでも、ある特定の遺伝子変異を有するＢ細胞又はある特定のバイオマーカー若しくはバイオマーカーの組み合わせを示すＢ細胞などの特定の分子的特徴を有する細胞型；なかでも、造血幹細胞などの特定の幹細胞型、或いは、なかでも造血性内皮細胞などの発生中の特定の細胞型を指す場合がある。このリストは、単なる例示であり、決して網羅的ではない。実際、ある特定の細胞型及び／又は状態は、実質的にあらゆる組織のある一般的若しくは特定の細胞、及び／又はあらゆるタイプの細胞のあらゆる特定の細胞状態に関連し得る。
好ましくは、ある特定の転写調節状態、すなわち、ある特定の転写調節状態の存在は、細胞、例えば、ある特定の組織タイプの細胞の疾患細胞状態、すなわち、異常及び／又は悪性タイプ及び／又は状態と関連し得る、及び／又はそれらを反映し得る。したがって、本発明のＤＮＡ構築物に含まれるある特定のプロモータは、ある特定のタイプの異常及び／又は悪性細胞において活性であり得る。このことは、本明細書中、すなわち、本発明のＤＮＡ構築物の発明の医学的及び／又は診断的使用の文脈でさらに説明する。
さらに、転写調節状態は、本明細書中及び本発明の文脈で使用される場合、各々のプロモータからの転写の開始に寄与できる、及び／又は好ましくは調節できる任意のメカニズム及び／又は因子を含み得る。個々のメカニズム及び／又は因子は、前記転写開始を促進又は阻害し得る。しかし、本明細書では、各々のプロモータの開始が可能になり、特に、有効量の各々の出力ＲＮＡが産生される（すなわち、転写される）場合、ある特定の転写調節状態が存在すると考えられる。したがって、ある特定の転写調節状態が存在すると考えられる場合、対応するメカニズム及び／又は因子は、全体的に（全体で、及び／又は組み合わせで）、各々のプロモータからの転写開始を可能にするはずである。そうでない場合、前記のある特定の転写調節状態は、本明細書では通常、存在しないと考えられる。
プロモータからの転写の開始に寄与及び／又はこれを調節するメカニズム及び／又は因子には、本明細書中に記載するような、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）、一般的転写因子（例えば、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＥ及び／又はＴＦＩＩＨ）、細胞型及び／又は状態特定の転写因子（例えば、各々のＴＦ群からのＴＦが含まれ；実例には、赤血球系統特異的ＴＦ（例えば、とりわけ、ＧＡＴＡ１）；多能性幹細胞特異的ＴＦ（例えば、とりわけ、ＯＣＴ４）、又は肝臓特異的ＴＦ（例えば、とりわけ、ＨＮＦ４）、エピジェネティック修飾因子（例えば、ヒストンアセチラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ等）、細胞中のプロモータ（及びＤＮＡ構築物）の位置（例えば、エピソーム、或いは全体的な転写活性若しくは不活性染色体領域、及び／又はある特定のトポロジー的に関連するドメイン中）並びに各々のプロモータ配列及び／又は関連エンハンサー配列でのエピジェネティック修飾（例えば、とりわけ、Ｈ３Ｋ４、Ｈ３Ｋ２７又はＨ３Ｋ９のモノ－、ジ－若しくはトリメチル化又はアセチル化などのヒストン修飾、及び／或いはＤＮＡメチル化又はＤＮＡヒドロキシメチル化などのＤＮＡ修飾）が含まれる。
ある特定の転写調節状態、転写後調節状態並びに／又は細胞型及び／若しくは状態は、細胞の過去のある特定の転写調節状態及び／又は転写後調節状態、例えば、細胞及び／又は前記細胞が由来する細胞の以前の細胞型及び／又は状態に関連し、及び／又はこれを反映する可能性もある。これは、ある特定のメカニズム及び／又は因子、例えば、エピジェネティックメカニズム及び／又はエピジェネティック修飾因子は、多くの細胞分裂にわたって持続する可能性がある記憶（並びに転写及び／又は転写後調節と関連する可能性がある記憶）を細胞に付与できるために可能である。
ある特定の細胞型及び／若しくは状態並びに／又はある特定の転写調節メカニズム及び／若しくは因子の存在（例えば、ある特定の転写因子の存在）は、当該技術分野で公知の任意の手段によって、例えば、バイオマーカー（例えば、ＤＮＡバリアント若しくは変異、ある特定の特徴的なタンパク質、ＲＮＡ、及び／又は機能的特徴、例えば、ある特定の酵素反応などのある特定の生物学的機能の存在の発現）の分析、ゲノミクス及び／又はトランスクリプトミクス（例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡシークエンシング、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡマイクロアッセイ、マルチプレクスインサイツハイブリダイゼーション）、プロテオミクス（例えば、質量分析、フローサイトメトリー及び／又はマスサイトメトリー）、エピゲノミクス（例えば、５’ｍＣ ＤＮＡシークエンシング及び／又はＣｈＩＰ－ｓｅｑ）生細胞画像化、及び／又は機能的インビトロ及び／又はインビボアッセイによって、当業者が参照目的で容易に決定及び／又は定義することができる。インビボアッセイは必要な場合にのみ、とりわけ、マウス、ラット、魚、ハエ、及び／又はサルなどの好適な動物モデルにおいてのみ実施すべきである。
したがって、当業者であれば、参照転写調節プログラム並びに／又は参照細胞型及び／若しくは状態を定義するのは困難ではない。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物（或いは本発明のＤＮＡ構築物のセンス（コード）及び／若しくはアンチセンス（非コード）鎖に対応するＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）は、参照細胞及び／又は関心対象の細胞中に、例えば、本明細書中に記載及び／又は添付の実施例に例示するような当該技術分野で公知の手段によって、例えば、ウイルス導入（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター及び／又はアデノウイルスベクターによる）、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、エレクトロポレーション、及び／又はトランスポゾン（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ及び／又はスリーピングビューティー）の使用によって、難なく、一時的又は安定的に導入することができる。
さらに、出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質の存在は、例えば、本明細書中に記載及び／又は添付の実施例に例示するような、当該技術分野で公知の手段によって、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、ＲＮＡマイクロアッセイ、インサイツハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、質量分析等によって容易に決定できる。さらに、蛍光又は発光出力タンパク質の存在は、光学的方法、例えば、フローサイトメトリー及び／又は画像化（例えば、顕微鏡法）によってさらに決定できる。
したがって、ある特定の転写調節状態を含むある特定の参照細胞（例えば、ある特定のタイプ及び／又はある特定の状態の参照細胞）においてある特定のプロモータが活性であるか否かは、通常の手段によって容易に決定できる。
したがって、当業者は、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物のプロモータを、各々の転写調節状態が存在する場合に前記プロモータが活性であるように、ルーチン的な実験によって選択及び／又は修飾できる。
さらに、合理的な設計原理は、プロモータの選択及び／又は修飾に適用できる。例えば、ある特定の転写調節状態が、ある特定の転写因子、たとえば、本明細書中に記載する、ある特定の転写因子群からのＴＦを含むことが望まれるか又は期待される場合、本発明のＤＮＡ構築物の各々のプロモータは、前記ＴＦが結合できる各々の結合部位（応答エレメント）を含み得る。
したがって、ある特定の転写調節状態、すなわち、ある特定の転写調節状態の存在は、転写因子の各々の群からの少なくとも一つの転写因子の存在を含んでもよく、例えば、ＴＳ１は、ＴＦの第一群（ＴＦ１）からの少なくとも一つのＴＦ、例えばＴＦ１ａ及び／又はＴＦ１の存在を含み、及び／又はＴＳｎ、例えばＴＳ２は、ＴＦのさらなる群（ＴＦｎ、例えばＴＦ２）からの少なくとも一つのＴＦ、例えばＴＦｎａ及び／又はＴＦｎｂ、例えばＴＦ２ａ及び／又はＴＦ２ｂの存在を含む。
しかしながら、個々の転写因子は、ＴＦの前記群の一つ以上に含まれる可能性がある。
特に、ある特定のＴＦは、前記ＴＦを発現しない対照細胞よりも多量のＴＦが存在する場合、及び／又は（例えば、プラスミドからの強制発現により）同様の量のＴＦを添加することが、産生された各々のＲＮＡの量に影響を及ぼす場合（陽性対照実験）、存在するとみなされる。
特に、第一転写調節状態（ＴＳ１）は、ＴＦの第一群（ＴＦ１）からの少なくともある特定の数の、例えば二つのＴＦ、例えば、ＴＦ１ａ及びＴＦ１ｂの存在を含み得、並びに／又はさらなる転写調節状態のいずれか（ＴＳｎ）は、各々のさらなる転写因子群（ＴＦｎ、例えば、ＴＦ２）からの少なくともある特定の数の、例えば二つのＴＦ、例えば、ＴＦｎａ及びＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａ及びＴＦ２ｂの存在を含み得る。
したがって、Ｐ１は、ＴＦ１からの少なくとも一つのＴＦ若しくはある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ１ａ、若しくはＴＦ１ａとＴＦ１ｂに対する少なくとも一つの結合部位を含み得、及び／又はＰｎのいずれか、例えば、Ｐ２は、各々のＴＦｎからの少なくとも一つのＴＦ若しくはある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ２、例えば、ＴＦｎａ、若しくはＴＦｎａとＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａ、若しくはＴＦ２ａとａＴＦ２ｂに対する少なくとも一つの結合部位を含み得る。
したがって、添付の実施例に示されるように、本発明のＤＮＡ構築物のプロモータは、複数、例えば、２、３、又は４のＴＦが存在する場合、例えば、前記プロモータが前記ＴＦのそれぞれに対して少なくとも一つの結合部位を含む場合、転写が前記プロモータから開始されるように設計することができる。換言すれば、プロモータは複数のＴＦによって相乗的に活性化される可能性がある。
しかしながら、この原則はＴＦに限定されず、本明細書中に記載するように、任意の二つ以上のメカニズム及び／又は因子は、相乗的に作用して、ＤＮＡ構築物のある特定のプロモータを活性化する可能性がある。
したがって、（例えば、同じ各々の転写調節状態の二つ以上のメカニズム及び／又は因子、例えば、同じ各々のＴＦ群からの二つ以上のＴＦを含むものによる）本発明のＤＮＡ構築物のプロモータのいずれか一つの活性化は、ＡＮＤゲート様論理に従う可能性がある。
しかしながら、本明細書中に記載するように、（例えば、異なる各々の転写調節状態、例えば、異なる各々のＴＦ群を含むものによって活性化される）本発明のＤＮＡ構築物の異なる（代替）プロモータによる出力ＲＮＡの産生は、むしろＯＲゲート様論理に従う。
したがって、個々のプロモータレベルのＡＮＤゲート様論理をＤＮＡ構築物レベルのＯＲゲート様論理と組み合わせる場合（すなわち、代替プロモータに基づいて）、論理和標準形様論理演算（ＡＮＤのＯＲ）、例えばとりわけ（ＴＦ１ａ ＡＮＤ ＴＦ１ｂ）ＯＲ（ＴＦ２ａ ＡＮＤ ＴＦ２ｂ）を実現できる。
さらに、添付の実施例に示されるように、本発明のＤＮＡ構築物は、ＡＮＤ ＮＯＴゲート様論理演算がさらに可能になるように設計することができる。特に本明細書では、ＮＯＴ論理は、転写後レベルで、すなわち産生されたｍＲＮＡのレベルで、例えば、本明細書中に記載するアンチセンスＲＮＡによって実装される。特に本明細書で、ＡＮＤ ＮＯＴ論理とは、本明細書中に記載するように、各々の転写後調節状態によって阻害及び／又は分解されないある特定のタイプの出力ＲＮＡの産生を指す。
さらに、ＮＯＴゲート様論理は、任意の産生された出力ＲＮＡが同じ転写後調節状態によって制御されるように、すなわち、前記転写後調節状態（例えば、一つ以上のアンチセンスＲＮＡを含むもの）が、本明細書中に記載するように、本発明のＤＮＡ構築物の共通の出力配列（例えば、３’ＵＴＲ）に含まれる配列に対応する出力ＲＮＡ中の配列を標的とする場合に、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物において実装され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物は、少なくとも一つ、好ましくはそれぞれの、プロモータ対（例えば、Ｐ１とＰ２、及び／又はＰ２とＰ３）の間に、各々のスペーサ配列（スペーサ）を含む。特に、前記スペーサは、好ましくは、添付の実施例に例示するように、転写を相乗的に開始しないように、又は下流プロモータが活性な上流プロモータによって阻害されないように、プロモータ間の相互作用を破壊又は抑止することができる。したがって、スペーサは、本発明のＤＮＡ構築物のＯＲゲート様論理をさらに改善し得る。
さらに、各スペーサは、各々のユニーク配列（ＵＳ）を含んでもよく、例えばＰ１とＰ２との間のスペーサ（第一スペーサ）は第一ユニーク配列（ＵＳ１）を含んでもよく、Ｐ２とＰ３との間のスペーサ（第二スペーサ）はＵＳ２を含んでもよい、などである。
そのようなＤＮＡ構築物は、例えば、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡのみが、ＵＳ１に対応する配列を含む（例えば、５’ＵＴＲにおいて）、異なるタイプの出力ＲＮＡを産生することができる。したがって、異なるタイプの出力ＲＮＡは、異なる各々の転写後調節状態（ＰＴＳ）に供することができる。換言すれば、スペーサ中のユニーク配列は、特定のＮＯＴゲート様論理演算を可能にし得る。
例えば、転写がＰ１から開始されると、例えばＵＳ１とＵＳ２などの、ＵＳ１を含むすべてのユニーク配列に対応する配列を含む出力ＲＮＡが産生される。しかしながら、Ｐ２から転写が開始されると、例えばＵＳ２などの、ＵＳ１を除くすべてのユニーク配列に対応する配列を含む出力ＲＮＡが産生される。したがって、この例では、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡのみが、ＵＳ１を標的とする各々の転写後調節状態（例えば、ＰＴＳ１）に供される一方で、Ｐ１又はＰ２によって産生される出力ＲＮＡは、ＵＳ２を標的とする各々のＰＴＳ（例えば、ＰＴＳ２）に供される。本明細書中に記載するように、転写後調節状態は、好ましくは、各々の（標的）出力ＲＮＡの分解をもたらす、及び／又は各々の（標的）出力ＲＮＡによってコード化されるタンパク質の翻訳を阻害する。
したがって、５’→３’方向で、Ｐ１、ＵＳ１、Ｐ２、ＵＳ２、及び出力配列を含むＤＮＡ構築物は、以下の条件下で有効量の出力ＲＮＡを産生し得る：（ｉ）ＴＳ１が存在し、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在しない；又は（ｉｉ）ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ２が存在しない。
したがって、そのようなＤＮＡ構築物は、少なくともいくつかの複雑な論理演算が可能である。
しかしながら、そのようなＤＮＡ構築物の柔軟性はさらに改善できる。特に、ある特定のプロモータ（例えば、Ｐ１）によって産生される各々の出力ＲＮＡが、他のプロモータ及び／又は前記プロモータの下流にあるユニーク配列（例えば、Ｐ２及び／又はＵＳ２）を含まないことが望ましい場合がある。
したがって、本発明のＤＮＡ構築物は、前記第一プロモータ（Ｐ１）と前記さらなるプロモータの最後のプロモータ（Ｐｎ）との間に、５’→３’方向で、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）および第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）、並びに前記最後のプロモータと前記出力配列との間に、分岐点（ＢＰ）及び３’スプライス部位（３’ｓｓ）をさらに含んでもよく、前記出力配列は、第二エクソン（Ｅ２）であるか又は第二エクソン（Ｅ２）を含む。
前記ＤＮＡ構築物は、少なくとも一つの５’ｓｓ、ＢＰ及び３’ｓｓを含み、したがってＲＮＡスプライシングに供される出力ＲＮＡ（すなわち、ｐｒｅ－ｍＲＮＡなどのｐｒｅ－ＲＮＡ）を産生できるので、前記ＤＮＡ構築物は、したがってさらに、より具体的には本明細書中で「スプライシングＤＮＡ構築物」と呼ばれる。したがって、本明細書中で提供される本発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、特に、本発明のＤＮＡ構築物の好ましい実施形態を指す。
「スプライス部位」及び「スプライスシグナル」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。さらに、「分岐点」及び「分岐部位」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
特に、前記５’ｓｓ１、ＢＰ及び３’ｓｓは、Ｐ１によって産生される各々の出力ＲＮＡに含まれる５’ｓｓ２と３’ｓｓとの間の配列（Ｐ２に対応する配列を含む）の除去を可能にする。したがって、その例では、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡは、５’→３’方向で、Ｅ１ａ及びＥ２に対応する配列を含み（ただし、Ｐ２も、ＵＳ２などのＰ２と３’ｓｓとの間の配列も含まない）、その一方で、Ｐ２によって産生される出力ＲＮＡは、Ｅ１ａを含まない共通の出力配列（Ｅ２）に対応する配列を含む。
一般に、本発明のＤＮＡ構築物（スプライシングＤＮＡ構築物及び非スプライシングＤＮＡ構築物を含む）は、本明細書中に記載するような、ある特定の条件下で、すなわち、（ｉ）ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータの少なくとも一つからの転写の開始が可能となる場合、及び（ｉｉ）各々の産生された出力ＲＮＡが分解されない、及び／又は各々の産生された出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の翻訳が阻害されない場合、真核細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生する。
「出力ＲＮＡ」という用語は、本明細書中及び本発明の文脈で使用される場合、本発明のＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかによって産生できる出力ＲＮＡを指す。特に、「出力ＲＮＡ」は、本明細書中に記載するように、（「第二エクソン」（Ｅ２）であり得るか又は「第二エクソン」（Ｅ２）を含み得る）出力配列に対応する配列を含むすべてのＲＮＡ分子（すなわち、異なるタイプの出力ＲＮＡ）を包含する。したがって、細胞において得られる出力ＲＮＡの量は、特に、また本明細書中に記載するように、少なくとも、細胞において得られるすべての有用な出力ＲＮＡタイプのうち、すなわち、出力ＲＮＡが産生されるプロモータに関係なく、あらゆるタイプの出力ＲＮＡの合計（すなわち、累積）量を指す。さらに、出力ＲＮＡは、（スプライシングされていないか、又は完全にはスプライシングされていない）転写されたｐｒｅ－ＲＮＡ、各々のスプライシングされたＲＮＡ、少なくとも、本明細書中に記載するような、有用なｐｒｅ－ＲＮＡ及び／又はスプライシングされたＲＮＡ、例えばｐｒｅ－ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質をコード化する（すなわち、インフレーム）スプライシングされたＲＮＡを含み得る。
本発明の文脈では、例えば、各々の第一代替第一エクソン（例えば、Ｅ１ａ）に対応する配列を含むある特定の出力ＲＮＡが、どのように産生されるか（すなわち、各々のプロモータ；例えばＰ１によって）及び／又は制御されるか（すなわち、各々の転写後調節状態、例えばＰＴＳ１によって）が明記され得る。しかしながら、「有効量の出力ＲＮＡ」（すなわち、ＤＮＡ構築物の出力）は、本明細書中に記載するように、たとえ対応するＣＤＳが出力配列中に完全に含まれていても（又は第二エクソン単独）又は代替第一エクソン中に部分的に、また第二エクソン及び／又はそれ自体が機能的である出力ＲＮＡ中に部分的に（例えば、細胞挙動及び／又は状態を制御し得るアンチセンスＲＮＡとして）含まれていても、特に、有用な細胞中に存在するあらゆるタイプの出力ＲＮＡ、例えば、出力タンパク質をコード化する（すなわち、インフレーム）配列（コード配列（ＣＤＳ））を含む出力ＲＮＡを包含する。
本明細書中及び本明細書の文脈で好ましくは、出力ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり、ｐｒｅ－ＲＮＡはｐｒｅ－ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、出力ＲＮＡは、非コードＲＮＡ、例えば長鎖非コードＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ含有ＲＮＡである。
特に本明細書中及び本発明の文脈では、（本発明のＤＮＡ構築物を含む）細胞中の有効量の出力ＲＮＡの収量は、有効量の出力ＲＮＡが得られない条件（例えば、対照細胞及び／又は対照条件）で、例えば、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータからのいずれかからの転写を開始する各々の転写調節状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する出力ＲＮＡの量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い出力ＲＮＡ量が前記細胞中に存在することに対応し得る。
さらに、出力ＲＮＡの有効量は、少なくとも一つの出力タンパク質、すなわち、前記出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つのレポータタンパク質及び／又はエフェクタータンパク質の有効量に対応し得る（及び／又は言い換えられる）。
したがって、（本発明のＤＮＡ構築物を含む）細胞中の有効量の（少なくとも一つの出力タンパク質をコード化する）出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質の収量は、有効量の前記出力ＲＮＡが得られない条件（例えば、対照細胞及び／又は対照条件）、例えば前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかからの転写を開始する各々の転写調節状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力タンパク質の量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力タンパク質が前記細胞中に存在することにさらに対応し得る。
対照細胞及び／又は条件は、本明細書中に記載するように、本発明のＤＮＡ構築物が有効量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を産生しないことが知られている参照細胞及び／又は条件を指す場合がある。
本発明のＤＮＡ構築物が少なくとも一つの出力タンパク質をコード化する出力ＲＮＡを（ある特定の条件下で）産生できる場合、本発明の前記ＤＮＡ構築物を含む）細胞中の有効量の出力ＲＮＡの収量は、例えば前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかからの転写を開始する各々の転写調節状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力タンパク質の量と比較して、好ましくは、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の、前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が前記細胞中に存在することに対応し得る。
さらに、例えば、添付の実施例に示すように、また本明細書中でさらに記載するように、例えば各々の論理式にしたがって、有効量の出力ＲＮＡが産生される条件と、有効量の出力ＲＮＡが産生されない条件とで、本発明のＤＮＡ構築物をどれだけうまく区別できるかを判定するためにも同様の概念を適用できる。例えば、本発明のＤＮＡ構築物は、（例えば、各々の論理式にしたがって）有効量の出力ＲＮＡが産生されない条件の少なくとも一つ、好ましくはそれぞれと比較して、有効量の出力ＲＮＡが産生される条件の少なくとも一つ、好ましくはそれぞれで、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を産生し得る。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物は、出力配列（又は第二エクソン）の下流、又は出力配列（又は第二エクソン）の３’末端付近若しくは３’末端に転写終結配列を含み得る。特に、前記転写終結配列はポリアデニル化シグナルを含む。転写終結配列は当該技術分野で周知であり、添付の実施例に示す。例えば、転写終結配列はウサギβグロビンポリアデニル化シグナルを含み得る。
したがって、本発明のＤＮＡ構築物によって産生及び／又は得られる出力ＲＮＡ（異なるタイプの出力ＲＮＡを含む）は、３’末端にポリＡ尾部を含み得る。
本明細書中で使用する場合、本発明のＤＮＡ構築物に含まれる配列（すなわち、ＤＮＡ配列）に対応する出力ＲＮＡに含まれる配列（すなわち、ＲＮＡ配列）は、通常、対応するＤＮＡ配列中の任意のチミン（Ｔ）が前記ＲＮＡ配列中ではウラシル（Ｕ）であることを除いて、前記ＤＮＡ配列（すなわち、そのコード鎖）と同じ配列である。反対の場合、例えば、出力ＲＮＡ中の配列に対応するＤＮＡ構築物中のＤＮＡ配列についても同様である。さらに、当業者は、文脈から、ある特定の配列が、ＤＮＡ又はＲＮＡに含まれるか否か、したがって、任意のＴをＵで置換する必要があるか否か、又はその逆を直ちに理解する。
ＤＮＡ及びＲＮＡ配列は、本発明の文脈では、５’→３’方向で解読すべきである。さらに、例えば、ＤＮＡ構築物又は出力ＲＮＡの別の配列の５’である配列は、本明細書中の前記の他の配列の「上流」と指定される場合もある。さらに、例えば、ＤＮＡ構築物又は出力ＲＮＡの別の配列の３’である配列は、本明細書中の前記他の配列の「下流」と指定される場合もある。
本明細書中では「非スプライシングＤＮＡ構築物」とも呼ばれる、本明細書中に記載するような少なくとも一つの５’ｓｓ、ＢＰ及び３’ｓｓを含まない本発明のＤＮＡ構築物は、典型的なエクソン／イントロン構造を有さない。したがって、非スプライシングＤＮＡ構築物における二つのプロモータ間の配列は、「スペーサ」と呼ばれ、スペーサは、本明細書中に記載するようにユニーク配列（ＵＳ）を含み得、非スプライシングＤＮＡ構築物（共通配列）に含まれる任意のプロモータによって産生される任意の出力ＲＮＡに含まれる配列は、本明細書では「出力配列」と呼ばれる。
本明細書中に記載するような、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物では、二つのプロモータ間の配列は、本明細書中に記載するような、ユニーク配列（ＵＳ）を含み得、及び／又はプロモータ間の相互作用を破壊若しくは抑止し得る「スペーサ」とみなすこともできるが、通常、本明細書中、例えば以下の、スプライシングＤＮＡ構築物の文脈では、より正確な用語が使用される。スプライシングＤＮＡ構築物のスペーサは、特に、５’→３’方向で、代替第一エクソン（Ｅ１）、各々の代替５’ｓｓ、及び任意選択的に各々のさらなるイントロン配列を含み、代替第一エクソン（Ｅ１）はユニーク配列（ＵＳ）を含み得る。スプライシングＤＮＡ構築物中の「出力配列」は３’ｓｓの下流であるので、特に、スプライシングＤＮＡ構築物に含まれる任意のプロモータによって産生される任意の出力ＲＮＡに含まれる共通の第二エクソンを指すか、又は含む。
本明細書中及び本発明の文脈で使用する場合、第二エクソンは、当該技術分野で通常理解されるような通常のエクソン（すなわち、内部イントロン配列がない）であり得るか、又は中間（すなわち、末端ではない）に一つ以上のイントロン配列を含み得、したがって、「スプリットエクソン」であり得、これはエクソンの集まりとみなすこともできる。さらに、本明細書中及び本発明の文脈で使用される出力配列は、（本明細書中で提供される本発明のスプライシングＤＮＡ構築物の文脈で）当該技術分野で通常理解されるような通常の第二エクソン、スプリット第二エクソン（その中にイントロン配列を含む）、又はスプリット第二エクソンのエクソン部分を指し得るか、又は含み得る。本明細書中及び本発明の文脈で好ましくは、第二エクソンは通常のエクソンであり、出力配列は通常の第二エクソンであるか又は通常の第二エクソンを含む。
同様に、本明細書中及び本発明の文脈で使用する場合、代替第一エクソンは、当該技術分野で通常理解されるような通常のエクソン（すなわち、内部イントロン配列がない）であり得るか、又は中間（すなわち、末端ではない）に一つ以上のイントロン配列を含み得、したがって、「スプリットエクソン」であり得、これはエクソンの集まりとみなすこともできる。本明細書中及び本発明の文脈で好ましくは、代替第一エクソンは通常のエクソンである。
さらに、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ構築物が本明細書中で記載するように機能的である限り、さらなるエクソン、イントロン、分岐点及び／又はスプライス部位をさらに含み得る。したがって、代替第一エクソンは、本明細書中で使用する場合、好ましくは５’→３’方向で「第一エクソン」であるが、必ずしもそうである必要はない。例えば、代替第一エクソンは、少なくとも一つのさらなる別のエクソンが先行する場合があり、したがって、中間エクソンであり得る。さらに、第二エクソンは、本明細書中で使用する場合、５’→３’方向で「第二」エクソンである必要はなく、例えば、最後のエクソンであってよい。したがって、「第一エクソン」及び「第二エクソン」という用語は、本明細書中及び本発明の文脈では、厳密及び／又は狭義に理解されるべきではない。しかしながら、本明細書中及び本発明の文脈では、第二エクソンは、特に、全ての代替第一エクソンの下流である。
さらに、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、前記最後のプロモータと前記分岐点（ＢＰ）との間に５’→３’方向で、ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）の最後の代替第一エクソン及びｎ個の各々のさらなる５’スプライス部位（５’ｓｓｎ）の最後の代替５’スプライス部位をさらに含み得る。
さらに、前記発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、前記第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）と前記最後のプロモータとの間に５’→３’方向で、少なくとも一つのさらなるエレメント群をさらに含み得、前記エレメント群の各々は、５’→３’方向で：
前記ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）のさらなる一つ、
前記ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）のさらなる一つ、及び
前記ｎ個の各々の代替５’スプライス部位（５’ｓｓｎ）のさらなる一つ
を含む。
前記ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）のさらなる一つ、
前記ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）のさらなる一つ、及び
前記ｎ個の各々の代替５’スプライス部位（５’ｓｓｎ）のさらなる一つ
を含む。
本明細書中で好ましくは、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物中の最後の代替５’スプライス部位は、前記ＤＮＡ構築物に含まれる別の５’スプライス部位よりも弱く、より好ましくは、前記最後の代替５’スプライス部位は、前記ＤＮＡ構築物に含まれるすべての５’スプライス部位の中で最も弱いものである。
当業者は、スプライス部位、例えば５’スプライスの強度、並びに５’スプライス部位強度を調節する効果を、例えば、添付の実施例（例えば、表５を参照）で示すように、得られる異なるタイプの出力ＲＮＡ及び／又は対応するタンパク質の量に関して、容易に決定できる。
さらに、スプライシングエンハンサー配列は、本発明のＤＮＡ構築物の少なくとも一つの５’ｓｓと３’ｓｓとの間（すなわち、イントロン）に挿入することができ、好ましくは少なくとも一つのさらなるイントロン配列に挿入することができる。好ましくは、スプライシングエンハンサー配列は、最後のイントロンとは別のイントロンに挿入できる。例えば、スプライシングエンハンサー配列は、最も５’のイントロンに挿入することができる。好適なスプライシングエンハンサー配列は、当該技術分野で周知であり、添付の実施例に示されている。さらに、ある特定のスプライシングエンハンサー及び／又はある特定のスプライシングエンハンサーの機能性は、本明細書中に記載するように、ある特定の転写調節状態、ある特定の転写後調節状態、並びに／又はある特定の細胞型及び／若しくは状態と関連してもよいし、関連しなくてもよい。
さらに、任意の５’ｓｓと３’ｓｓとの間（すなわち、イントロン）の長さは、例えば、中間プロモータ及び／又は、好ましくは、さらなるイントロン配列のサイズを変更することによって、調整できる。これは、出力ＲＮＡのスプライシング、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物の性能をさらに改善できる。特に、ＤＮＡ配列エレメント、とりわけさらなるイントロン配列などの長さを変更するためのガイドラインは、本明細書中、例えば、添付の実施例で開示されている。
さらに、終止コドンは、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物の任意の（又はそれぞれの）５’ｓｓと次の下流プロモータとの間、例えば、５’ｓｓ１とＰ２との間、及び／又は５’ｓｓ２とＰ３との間に挿入できる。特に、終止コドンは、添付の実施例に示すように、ミススプライシングされたＲＮＡからの望ましくないタンパク質の翻訳を防止できる。
特に本明細書では、すなわち、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物の文脈で、分岐点（ＢＰ）及び３’スプライス部位（３’ｓｓ）は、本明細書中で提供される本発明のスプライシングＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかによって産生される、出力ＲＮＡ、すなわち、ｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる少なくとも一つの５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と３’スプライス部位との間の配列の除去を可能にする。好ましくは、前記ＢＰ及び３’ｓｓは、少なくとも、出力ＲＮＡにおいて最も５’（「上流」）である５’ｓｓと前記３’ｓｓの間の配列の除去を可能にする、及び／又は前記ＢＰ及び３’ｓｓは、出力ＲＮＡにおける各５’ｓｓと３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にする。換言すれば、本発明の文脈で使用されるＢＰ及び３’ｓｓは、ＲＮＡスプライシングに関与できるはずである。
特に本明細書では、すなわち、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物の文脈では、第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）は、本明細書中で提供される本発明のスプライシングＤＮＡ構築物に含まれるＰ１によって産生される出力ＲＮＡ、すなわち、ｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる前記５’ｓｓ１と３’ｓｓとの間（すなわち、イントロン）の配列の除去を可能にし、特に、さらなる代替５’スプライス部位（存在する場合）のそれぞれ（例えば、５’ｓｓ２）は、前記さらなる５’スプライス部位の５’（「上流」）であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち、前記５’スプライス部位の５’（「上流」）に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される、出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる各々のさらなる５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と３’ｓｓとの間（すなわち、イントロン）の配列の除去を可能にする。換言すれば、本発明の文脈で使用される５’ｓｓは、ＲＮＡスプライシングに関与できるはずである。
５’スプライス及び３’スプライス部位が、通常、前記５’ｓｓと前記３’ｓｓとの間（すなわち、イントロン）をスプライシングすることによって除去される配列を特定することは当該技術分野では周知であり、ここで、５’ｓｓ及び３’ｓｓはイントロンの境界を形成する。特に、５’ｓｓと３’ｓｓとの間の除去される配列は、５’末端に５’ｓｓの一部（５’ｓｓのイントロン部分）と３’ｓｓに３’ｓｓの一部（３’ｓｓのイントロン部分）とを含み得る。したがって、本発明文脈において５’ｓｓと３’ｓｓとの間の除去される配列は、５’ｓｓの一部と３’ｓｓの一部とを含む。
さらに、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、分岐点と３’ｓｓとの間にポリピリミジントラクトを含み得る。
したがって、すなわち、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物の文脈で、出力ＲＮＡは、特に、第二エクソン（Ｅ２）に対応する配列の５’に、
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、各々のさらなる代替第一エクソンの５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち、前記さらなる代替第一エクソンの５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、前記さらなる代替第一エクソンのうちの一つ、例えばＥ１ｂに対応する配列
をさらに含み得る。
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、各々のさらなる代替第一エクソンの５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち、前記さらなる代替第一エクソンの５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、前記さらなる代替第一エクソンのうちの一つ、例えばＥ１ｂに対応する配列
をさらに含み得る。
好ましくは、すなわち、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物の文脈で、出力ＲＮＡは
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、５’ｓｓ１と３’ｓｓとの間の配列に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、前記さらなる５’スプライス部位の５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち、前記５’スプライス部位の５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、さらなる５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’ｓｓとの間の配列に対応する配列
を（少なくとも大量及び／又は望ましくない程度では）含まない。
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、５’ｓｓ１と３’ｓｓとの間の配列に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、前記さらなる５’スプライス部位の５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち、前記５’スプライス部位の５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、さらなる５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’ｓｓとの間の配列に対応する配列
を（少なくとも大量及び／又は望ましくない程度では）含まない。
本明細書中で提供される本発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、添付の実施例に示されるように、異なるタイプの出力ＲＮＡが前記ＤＮＡ構築物に含まれる異なる代替プロモータによって産生でき、ある特定のタイプの出力ＲＮＡは、ある特定のタイプの出力タンパク質の産生を可能にし得るというさらなる利点を有する。
本発明の非スプライシングＤＮＡ構築物において、開始コドンを含む出力タンパク質（ＣＤＳ）をコード化する配列全体は、中間プロモータ（又は他の望ましくない中間配列）が共翻訳され、潜在的に望ましくない融合タンパク質が出力タンパク質として得られることを回避するために、最後のプロモータの下流でなければならない。したがって、どのプロモータから、前記出力タンパク質をコード化する出力ＲＮＡが産生されるにしても、同じ出力タンパク質は、通常、非スプライシングＤＮＡ構築物で得られる。
所望により、そのような方法で、本明細書中で提供される本発明のスプライシングＤＮＡ構築物を用いて同じ出力タンパク質を得ることもできるが、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、より柔軟であり、異なる有用なタイプの出力タンパク質の産生をさらに可能にする。
特に、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、各代替第一エクソン中に開始コドンを含み得、終止コドンは共通の第二エクソンに含まれる。ある特定の出力ＲＮＡ（すなわち、上流プロモータによって産生されるｐｒｅ－ＲＮＡ）中の５’ｓｓ（すなわち、最も上流の５’ｓｓ）と３’ｓｓとの間の配列がスプライシングによって除去される場合、代替第一エクソン中の開始コドン及び第二エクソン中の終止コドンは、ある特定の出力タンパク質に翻訳されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を形成し得る。得られる出力ＲＮＡは、異なるタイプの出力ＲＮＡを包含し、各タイプは、どのプロモータによって産生されたかに応じて、ある特定の代替第一エクソンを含むので、異なるＯＲＦを生成させることができ、したがって、異なる出力タンパク質を得ることができる。これは、どのプロモータが細胞中で活性であったか（したがって、どの転写調節状態が存在していたか）を理解するため、及び／又はどのプロモータが活性であったかに応じて、修飾された出力タンパク質（異なる機能性を有し得るもの）を生成させるために、特に有用である。
したがって、本発明の文脈では、出力ＲＮＡは、少なくとも一つの出力タンパク質をコード化する少なくとも一つの配列を含み得、前記少なくとも一つの出力タンパク質のコード配列（ＣＤＳ）は、出力配列に部分的又は完全に含まれる（すなわち、第二エクソン中のスプライシングＤＮＡ構築物の文脈で）。前記少なくとも一つの出力タンパク質は、レポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素、及び／或いはエフェクタータンパク質、例えば毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含み得る。
さらに、少なくとも一つのコード配列を含む本発明のＤＮＡ構築物は、少なくとも一つ又は各コード配列の上流に（すなわち、直接隣接して）コザック配列をさらに含み得る。好適なコザック配列は、当該技術分野で周知であり、添付の実施例に示されている。
したがって、特に、本発明の非スプライシングＤＮＡ構築物の文脈では、ＣＤＳのそれぞれは、出力配列に完全に含まれる。
したがって、特に、すなわち本発明のスプライシングＤＮＡ構築物の文脈で、第二エクソンに部分的に含まれるＣＤＳは、少なくとも一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部に対応するか又は少なくとも一つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部であり、ＯＲＦの開始コドンは、ＤＮＡ構築物に含まれる代替第一エクソンの少なくとも一つ、好ましくはそれぞれに含まれ、前記ＯＲＦの共通の終止コドンは、第二エクソンに含まれる。この結果、様々な有用な出力融合タンパク質を得ることができる（どのプロモータが活性であったかに応じて）。特に、前記融合タンパク質のそれぞれは、共通の第二エクソンによってコード化される、基本的出力タンパク質、例えば、本明細書中に記載するレポータタンパク質及び／又はエフェクタータンパク質を含み得、前記基本的出力タンパク質は、ある特定のペプチド（例えば、タグ）にＮ末端で融合し、異なるペプチド／タグは異なる代替第一エクソンによってコード化される。例えば、代替第一エクソンは、それが融合したタンパク質の局在化を制御するペプチドをコード化する配列（局在化タグ、例えば核局在化配列）、及び／又はそれが融合したタンパク質の安定性を制御するペプチドをコード化する配列（安定性タグ、例えば、ＰＥＳＴ配列、又は誘導性デグロン）を含み得る。さらに、代替第一エクソンは、それが融合するタンパク質の機能、安定性及び／又は機能に影響を及ぼすことが知られている任意の他のタグ又は部位をコード化する配列、例えば、プロテアーゼ切断部位をコード化する配列を含み得る。
添付の実施例に示されるように、共通の第二エクソンが、出力タンパク質のＣ末端部分をコード化するＣＤＳを含む可能性もあり、前記Ｃ末端部分は前記出力タンパク質の異なるバリアント、例えば蛍光タンパク質に共通であり、代替第一エクソンのそれぞれは、前記出力タンパク質のＮ末端部分をコード化するＣＤＳの一部のある特定のバリアントを含み、前記Ｎ末端部分は、前記バリアントで異なり、好ましくは、前記出力タンパク質バリアントの特徴を規定する。例えば、ＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ２、Ｃｅｒｕｌｅａｎ３、Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ、Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ＢＦＰ、ＳＢＦＰ２、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ｅＧＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２等の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の誘導体（バリアント）は、共通又は類似のＣ末端部分と可変Ｎ末端部分とを含み得る。これらの異なるＧＦＰバリアントは異なる蛍光特性（例えば、ＳＢＦＰ２、Ｃｅｒｕｌｅａｎ及びＣｉｔｒｉｎｅ）を含み得るので、どのプロモータが活性であったかを分析するのに適している。例えば、Ｅ１ａが、ＳＢＦＰ２のＮ末端部分をコード化するＣＤＳの一部を含み、Ｅ１ｂが、ＣｅｒｕｌｅａｎのＮ末端部分をコード化するＣＤＳの一部を含み、Ｅ１ｃが、ＣｉｔｒｉｎｅのＮ末端部分をコード化するＣＤＳの一部を含み、Ｅ２が、ＳＢＦＰ２、Ｃｅｒｕｌｅａｎ及びＣｉｔｒｉｎｅの共通部分をコード化するＣＤＳを含む場合、Ｐ１は、ＳＢＦＰ２をコード化する出力ＲＮＡを産生することができ、Ｐ２は、Ｃｅｒｕｌｅａｎをコード化する出力ＲＮＡを産生することができ、Ｐ３は、Ｃｉｔｒｉｎｅをコード化する出力ＲＮＡを産生することができる。
明らかに、一つ以上の出力タンパク質のＣＤＳが異なるエクソンに分割される場合、少なくともスプライシングに際して、所望の出力タンパク質が産生されるように、完全ＣＤＳはインフレームでなければならない。
本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物に含まれる共通の出力配列（又は第二エクソン）が、本明細書中に記載するようなある特定のペプチド（例えば、タグ）、例えば、それが融合されるタンパク質の局在化を制御するペプチド（局在化タグ、例えば、核局在化配列）をコード化する配列、及び／又はそれが融合するタンパク質の安定性を制御するペプチド（例えば、誘導性デグロン）をコード化する配列を含む可能性もある。これは、得ることができるすべての出力タンパク質タイプに対してさらなる共通の機能性を付与するのに有用であり得る。
本明細書中で提供される本発明のスプライシングＤＮＡ構築物の文脈で、代替第一エクソンは、本明細書中に記載するように、５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、その下流に、コード配列又はコード配列（ＣＤＳ）の一部とを含み得る。
好ましくは、本明細書中に記載するような、各々の転写後調節状態によって標的とされ得る各々の出力ＲＮＡの配列に対応する配列、例えば、ユニーク配列、アンチセンスＲＮＡ結合部位、及び／又はＲＮＡ結合タンパク質結合部位は、各々の代替第一エクソンの５’ＵＴＲに含まれる。
好ましくは、本明細書中に記載するような、各々の転写後調節状態によって標的とされ得る各々の出力ＲＮＡの配列に対応する配列、例えば、ユニーク配列、アンチセンスＲＮＡ結合部位、及び／又はＲＮＡ結合タンパク質結合部位は、各々の代替第一エクソンの５’ＵＴＲに含まれる。
さらに、５’ＵＴＲは、ある特定の二次構造を有し得る、及び／又は前記５’ＵＴＲを含む出力ＲＮＡに対してある特定の二次構造を付与し得る。ＲＮＡの二次構造が、ＲＮＡ及び／又は翻訳効率の安定性に影響を及ぼし得ることは、当該技術分野で知られている。したがって、異なるタイプの出力ＲＮＡ（各々のプロモータによって産生される）は、出力ＲＮＡ及び／又は得られる出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質（及び／又はある特定のタイプの出力ＲＮＡ若しくは対応する出力タンパク質）の量をさらに制御することを可能にする、異なる二次構造を有し得る。
本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物に含まれる共通の出力配列（又は第二エクソン）が、本明細書中に記載するように、ある特定の転写後調節状態、例えば、アンチセンスＲＮＡ結合部位、及び／又はＲＮＡ結合タンパク質結合部位によって標的とされ得る、出力ＲＮＡの（すなわち、出力ＲＮＡの全タイプの）配列に対応する配列を含む可能性もある。これは、どのプロモータが活性であるか、及び／又はどの転写調節状態が細胞中に存在するかに関係なく、全てのタイプの出力ＲＮＡが、ある特定の転写後調節状態によって分解及び／又は翻訳阻害されることが望ましい場合に有用であり得る。特に、ある特定の転写後調節状態によって標的とされ得る配列は、共通の出力配列（又は第二エクソン）内のコード配列の下流又はコード配列（ＣＤＳ）の３’部分にあり得、したがって、３’未翻訳領域（３’ＵＴＲ）に含まれ得る。
本発明の文脈では、出力ＲＮＡが、出力タンパク質をコード化する配列を含むことが好ましいが、必ずしもそうである必要はない。例えば、出力ＲＮＡ自体は、当該技術分野で公知の手段によって、例えばとりわけ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡシーケンシング、ＦＩＳＨ、インサイツハイブリダイゼーション及び／又はノーザンブロットによって細胞中で検出できる。さらに、出力ＲＮＡは非コードであり得、それ自体が、細胞挙動及び／又は状態を制御でき、例えば、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり得、アンチセンスＲＮＡとして作用でき、及び／又はある特定の遺伝子の転写を調節でき、ある特定のｍＲＮＡの翻訳を調節でき、及び／又はある特定のタンパク質の活性を調節できる。
しかしながら、少なくとも一つの出力タンパク質を採用することは、本明細書中に記載するように、さらなる柔軟性及び選択肢を提供することができ、特に、生細胞用途、例えば、本明細書中に記載するように、標的細胞を選択的に操作及び／若しくは殺滅するため、並びに／又はインビボで標的細胞を検出するためにより適している。
本明細書中に記載するように、各々の代替第一エクソンを含み、すなわち、特に本発明のＤＮＡ構築物の各々のプロモータによって産生されるある特定のタイプの出力ＲＮＡは、各々の転写後状態によって制御され得る。したがって、添付の実施例に示されるように、本発明のＤＮＡ構築物は、異なる分子層で実装されるＡＮＤゲート様論理、又は好ましくは、ＡＮＤ ＮＯＴゲート様論理を可能にし得る：第一「入力」は、本明細書中に記載するように、各々の転写調節状態及び対応する出力ＲＮＡの産生によって可能となる、ある特定のプロモータからの転写の開始であり、第二「入力」は、各々の出力ＲＮＡの安定性及び／又は各々の転写後調節状態によって制御される各々の出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の翻訳である。本明細書中及び本発明の文脈で好ましくは、転写後調節状態は、各々の出力ＲＮＡを分解する、及び／又は各々の出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の翻訳を阻害する。したがって、この実装の結果、好ましくは、各々の転写調節状態の存在により可能となる各々のプロモータによる、ある特定のタイプの出力ＲＮＡの産生ＡＮＤ ＮＯＴ各々の転写調節の存在による前記出力ＲＮＡの分解及び／又は翻訳阻害によって、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が生じ、したがって、有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質一般が得られるという、ＡＮＤ ＮＯＴゲート様論理が得られる。この原理は、抽象化及び／又は簡略化された（例えば、Ｂｏｏｌｅａｎ論理様）方法とみなすこともできる。一つのタイプの出力ＲＮＡのレベルで、次のように記載できる：ＴＳ（１）ＡＮＤ ＮＯＴ各々のＰＴＳ（１）＝各々の出力ＲＮＡ及び／又はタンパク質（１）；ここで、１は「存在」を意味し、０は「非存在」を意味する。したがって、同じことは次のように記載できる：ＴＳ（１）ＡＮＤ各々のＰＴＳ（０）＝各々の出力ＲＮＡ及び／又はタンパク質（１）
したがって、本発明のＤＮＡ構築物のレベルで、例えば次のように記載できる：ＴＳ１
（１）ＡＮＤ ＮＯＴ ＰＴＳ１
（１）ＯＲ ＴＳ２
（１）ＡＮＤ ＮＯＴ ＰＴＳ２
（１）＝出力ＲＮＡ及び／又はタンパク質（１）。
同じことは次のように記載できる：ＴＳ１
（１）ＡＮＤ ＰＴＳ１
（０）ＯＲ ＴＳ２
（１）ＡＮＤ ＰＴＳ２
（０）＝出力ＲＮＡ及び／又はタンパク質（１）。
さらに、このタイプのＡＮＤゲート様論理又、好ましくは、ＡＮＤ ＮＯＴゲート様論理は、本明細書中に記載するように、ある特定のプロモータからの転写開始のレベルで、ＡＮＤゲート様論理と組み合わせることができる。
様々な論理演算を本明細書中でさらに詳細に記載する。
したがって、本明細書中で提供される本発明のスプライシングＤＮＡ構築物の文脈で、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列を含む出力ＲＮＡ、すなわち、Ｅ２に対応する配列の５’は、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって制御され得、及び／又はさらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ、例えば、Ｅ１２）に対応する配列を含む出力ＲＮＡ、すなわち、Ｅ２に対応する配列の５’は、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＳ２）によって制御され得る。
特に、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列を含む出力ＲＮＡは、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって翻訳阻害及び／若しくは分解され得、並びに／又はさらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ、例えば、Ｅ１２）に対応する配列を含む出力ＲＮＡは、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＳ２）によって翻訳阻害及び／若しくは分解され得る。したがって、本発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、例えば、いくつかの実施形態において、
（ｉ）少なくとも一つの転写調節状態、すなわち、ＴＳ１及び／又はＴＳｎのいずれか、例えばＴＳ１が、前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つの各々のプロモータ、例えばＰ１から出力ＲＮＡが産生されるように、前記細胞中で存在する場合；並びに
（ｉｉ）各々の代替第一エクソン（例えば、Ｅ１ａ）を含む産生された出力ＲＮＡが翻訳阻害又は分解されないように、例えば、全ての異なるタイプの出力ＲＮＡ（異なる各々のプロモータによって産生される）が翻訳阻害又は分解されるわけではなく、したがって有効量の少なくとも一つのタイプの出力ＲＮＡが得られるように、前記細胞において存在する各々の転写後調節状態（例えば、ＰＴＳ１）がない場合、真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生し得る。
（ｉ）少なくとも一つの転写調節状態、すなわち、ＴＳ１及び／又はＴＳｎのいずれか、例えばＴＳ１が、前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つの各々のプロモータ、例えばＰ１から出力ＲＮＡが産生されるように、前記細胞中で存在する場合；並びに
（ｉｉ）各々の代替第一エクソン（例えば、Ｅ１ａ）を含む産生された出力ＲＮＡが翻訳阻害又は分解されないように、例えば、全ての異なるタイプの出力ＲＮＡ（異なる各々のプロモータによって産生される）が翻訳阻害又は分解されるわけではなく、したがって有効量の少なくとも一つのタイプの出力ＲＮＡが得られるように、前記細胞において存在する各々の転写後調節状態（例えば、ＰＴＳ１）がない場合、真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生し得る。
好ましくは、例えば前記実施形態における前記発明のスプライシングＤＮＡ構築物は、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータ、例えばＰ１及びＰ２からの転写を誘導できる転写状態が細胞中に存在せず、例えばＴＳ１もＴＳ２も存在しない場合、並びに／或いは
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータ、例えばＰ１及びＰ２からの転写を誘導できる転写状態が細胞中に存在せず、例えばＴＳ１もＴＳ２も存在しない場合、並びに／或いは
（ｉｉ）例えば、（異なる各々のプロモータによって産生される、及び／又は各々の代替第一エクソンに対応する異なる配列を含む）すべての異なるタイプの出力ＲＮＡが、翻訳阻害されるか又は分解され、したがって、有効量の出力ＲＮＡが得られないように、前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータ、例えば、Ｐ１及びＰ２によって産生される出力ＲＮＡを翻訳阻害及び／又は分解できる各転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１及びＰＴＳ２が前記細胞中に存在する場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生しない場合がある。
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生しない場合がある。
本発明の文脈では、転写後調節状態は、本発明のＤＮＡ構築物を含む、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物がその中で機能的である真核細胞の特徴であり得る。したがって、ある特定の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１、又はＰＴＳ２若しくはＰＴＳ３などのＰＴＳｎのいずれかは、ある特定の細胞型及び／又は細胞状態と関連し得、並びに／あるいはそれらを反映し得る。したがって、ある特定の転写後調節状態（ｉ）を含む細胞は、各々の出力ＲＮＡの安定性及び／若しくは各々の出力ＲＮＡからの出力タンパク質の翻訳を促進し得るか、又は好ましくは、各々の出力ＲＮＡの分解を引き起こし得る、及び／若しくは各々の出力ＲＮＡからの出力タンパク質の翻訳を阻害し得る。換言すれば、例えば（ｉｉ）の場合、前記出力ＲＮＡが分解され、及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の翻訳が前記細胞において阻害される。
細胞型及び／又は状態並びに関連する転写後調節状態は、本明細書中及び本発明の文脈で使用される場合、本明細書中に記載するように、例えば、細胞型及び／又は状態並びに関連する転写調節状態の文脈で本明細書中に記載するように、特に限定されない。
しかしながら、ある特定の転写調節状態が各々のプロモータからの転写開始を可能にし（すなわち、正の調節因子である）、また各々の転写後調節状態が、好ましくは、各々の産生されたＲＮＡを分解する、及び／又は各々の産生されたＲＮＡの出力タンパク質の翻訳を阻害する（すなわち、好ましくは負の調節因子である）ため、ある特定の転写調節状態、例えばＴＳ１、及び各々の転写後調節状態、例えばＰＴＳ１は、本発明の文脈では、好ましくは、有効量の出力ＲＮＡが得られることが望まれる同じ細胞型及び／又は細胞状態（例えば、標的細胞）に含まれない。したがって、有効量のＲＮＡ出力が得られることが望まれるある特定の細胞型及び／又は細胞状態（例えば、標的細胞）は、本明細書中及び本発明の文脈で使用される場合、好ましくは、ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１の存在、及び各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１の存在を含まない。
逆に、ある特定の細胞型及び／又は細胞状態、例えば、有効量のＲＮＡ出力が得られることが望まれるもの（例えば、標的細胞）は、本明細書中及び本発明の文脈で使用される場合、好ましくは、
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えばＴＳ１の存在、例えば、転写因子（ＴＦ）の各々の群からの少なくとも一つ若しくはある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ１、若しくはＴＦ１とＴＦ２の存在；及び／又は
（ｉｉ）ある特定の、すなわち各々の転写後調節状態、例えばＰＴＳ１の非存在、例えば、アンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）の各々の群からの少なくとも一つ若しくはある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ１、若しくはＡＲ１及びＡＲ２の非存在
を含み得る。
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えばＴＳ１の存在、例えば、転写因子（ＴＦ）の各々の群からの少なくとも一つ若しくはある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ１、若しくはＴＦ１とＴＦ２の存在；及び／又は
（ｉｉ）ある特定の、すなわち各々の転写後調節状態、例えばＰＴＳ１の非存在、例えば、アンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）の各々の群からの少なくとも一つ若しくはある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ１、若しくはＡＲ１及びＡＲ２の非存在
を含み得る。
例えば、ある特定の転写後調節状態の非存在は、疾患細胞状態、すなわち細胞、例えば、ある特定の組織タイプの異常及び／又は悪性状態と関連し得、及び／又はこれを反映し得る。
したがって、ある特定の転写後調節状態の存在は、非疾患（健常）細胞状態、すなわち、細胞、例えば、ある特定の組織タイプの細胞の正常及び／又は良性状態と関連し得、及び／又はこれを反映し得る。このことは、本明細書中、すなわち、本発明のＤＮＡ構築物の発明の医学的及び／又は診断的使用の文脈でさらに説明する。
さらに、転写後調節状態は、本明細書中及び本発明の文脈で使用される場合、各々の出力ＲＮＡの安定性及び／又は各々の出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の翻訳の翻訳に寄与でき、及び／又は好ましくは調節できる任意のメカニズム及び／又は因子を含み得る。個々のメカニズム及び／又は因子は、出力ＲＮＡの安定性及び／又は対応する出力タンパク質の翻訳を促進又は阻害し得る。しかし、ある特定の転写後調節状態は、各々の出力ＲＮＡが分解され、及び／又は各々の出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の翻訳が阻害され、特に、有効量の各々の出力ＲＮＡ及び／又は各々の出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が得られない（すなわち、各々の出力ＲＮＡの分解及び／又は翻訳阻害のために）場合、好ましくは、本明細書では存在すると考えられる。したがって、ある特定の転写後調節状態が存在すると考えられる場合、対応するメカニズム及び／又は因子は、好ましい実施形態では、全体として（合計で、及び／又は組み合わせで）、各々の出力ＲＮＡを分解し、及び／又は各々の出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の翻訳を阻害するはずである。そうでない場合、前記のある特定の転写調節状態は、本明細書では、好ましくは非存在と考えられる。特に、このことは、転写後調節状態が、各々の出力ＲＮＡの安定性を促進し、及び／又は各々の出力ＲＮＡからの出力タンパク質の翻訳を促進するいくつかの実施形態では、異なる、すなわち、逆転する可能性がある。
特に、本明細書中で使用する場合、各々の出力ＲＮＡからの「一つの」タンパク質の翻訳は、特に、各々の出力ＲＮＡからの「少なくとも一つ」又は「各」タンパク質出力タンパク質、すなわち、各々の出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の少なくとも一つ又はそれぞれの翻訳を含む。
出力ＲＮＡの安定性及び／又は出力ＲＮＡからの出力タンパク質の翻訳に寄与し、及び／又はこれを調節するメカニズム及び／又は因子には、アンチセンスＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ；実例は、ｍｉＲ－１であり得る）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；実例は、ＦＦ４であり得る）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（例えば、本明細書中に記載するような、各々のＡＲ群からのＡＲ）が含まれ、特に、前記アンチセンスＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）は細胞型及び／又は状態特異的一般的ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、とりわけ、ヒトｐｕｍｉｌｉｏ１、及びＳＦ２／ＡＳＦタンパク質）、細胞型及び／又は状態特異的ＲＮＡ結合タンパク質、及び／又はリボスイッチ（すなわち、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスＲＮＡによるリボスイッチの活性化又は阻害）であり得る。
ある特定の細胞型及び／若しくは状態並びに／又はある特定の転写後調節メカニズム及び／若しくは因子の存在（例えば、ある特定のアンチセンスＲＮＡの存在）は、参照目的で、当業者により、ある特定の細胞型及び／若しくは状態並びに／又はある特定の転写調節メカニズム及び／若しくは因子の存在の決定の文脈で本明細書においてさらに記載するような、当該技術分野で公知の任意の手段によって、容易に決定及び／又は定義することができる。例えば、アンチセンスＲＮＡ、例えば、ｍｉＲＮＡ、及び／又はＲＮＡ結合タンパク質の検出は、特に困難を伴わず、当該技術分野で公知の方法、及び／又は本明細書中に記載する方法によっても容易に実施できる。
したがって、当業者であれば、参照転写後調節プログラム並びに／又は参照細胞型及び／若しくは状態を定義するのは困難ではない。
したがって、ある特定のプロモータが、ある特定の転写調節状態を含むある特定の参照細胞（例えば、ある特定のタイプ及び／又はある特定の状態の参照細胞）において活性であるか否かを通常の手段により容易に決定できるだけでなく、ある特定の出力ＲＮＡが分解されるか否か、及び／又は出力タンパク質のある特定の出力ＲＮＡからの翻訳がある特定の転写後調節状態を含むある特定の参照細胞において阻害されるか否かも容易に決定できる。
したがって、当業者は、各々の転写後調節状態が存在する場合、前記ユニーク配列に対応する配列を含む各々の出力ＲＮＡが分解され、及び／又は翻訳阻害されるように、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物（例えば、ある特定の代替第一エクソンにおいて、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）に含まれるユニーク配列を、ルーチン的実験によって選択及び／又は修飾できる。
さらに、合理的な設計原理は、（例えば、代替第一エクソンにおいて）ユニーク配列の選択及び／又は修飾に適用できる。例えば、ある特定の転写後調節状態がある特定のアンチセンスＲＮＡ、例えば、本明細書中に記載するようなアンチセンスＲＮＡのある特定の群からのＡＲを含むことが望まれるか又は期待される場合、本発明のＤＮＡ構築物に含まれる各々のユニーク配列及び／又は代替第一エクソンは、前記ＡＲが結合できる各々の結合部位（標的部位）を含み得る。
したがって、ある特定の転写後調節状態、すなわち、ある特定の転写調節状態の存在は、アンチセンスＲＮＡの各々の群からの少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）の存在を含み得、例えば、
ＰＴＳ１は、ＡＲの第一群（ＡＲ１）からの少なくとも一つのＡＲ、例えばＡＲ１ａ及び／又はＡＲ１ｂの存在を含む、並びに／或いは
ＰＴＳｎ、例えばＰＴＳ２は、ＡＲのさらなる群（ＡＲｎ、例えば、ＡＲ２）からの少なくとも一つのＡＲ、例えば、ＡＲｎａ及び／又はＡＲｎｂ、例えばＡＲ２ａ及び／又はＡＲ２ｂの存在を含み得る。
ＰＴＳ１は、ＡＲの第一群（ＡＲ１）からの少なくとも一つのＡＲ、例えばＡＲ１ａ及び／又はＡＲ１ｂの存在を含む、並びに／或いは
ＰＴＳｎ、例えばＰＴＳ２は、ＡＲのさらなる群（ＡＲｎ、例えば、ＡＲ２）からの少なくとも一つのＡＲ、例えば、ＡＲｎａ及び／又はＡＲｎｂ、例えばＡＲ２ａ及び／又はＡＲ２ｂの存在を含み得る。
しかしながら、個々のＡＲは、ＡＲの前記群の一つ以上に含まれる可能性がある。
例えば、アンチセンスＲＮＡは、少なくとも１０、１５又は２０の連続した塩基の配列を含み得、前記配列は、各々の標的部位（結合部位）、例えば、出力ＲＮＡに含まれる各々の代替第一エクソンの標的部位の相補配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の配列同一性を有する。
二つの配列間の配列同一性のパーセンテージを提供する適切なツールは当該技術分野において周知である。例えば、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ（例えば、ＮＣＢＩウェブページ）を使用して、配列が、各々の標的部位の相補的配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の配列同一性を有する少なくとも１０、１５又は２０の連続した塩基を有するか否かを確認することができる。
アンチセンスＲＮＡは、本明細書中及び本発明の文脈では、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。好ましくは、前記アンチセンスＲＮＡはｍｉＲＮＡである。特に、アンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）は、本明細書中に記載するように、前記ＡＲ用の、少なくとも一つの標的部位（結合部位）を含む出力ＲＮＡの翻訳阻害及び／又は分解を促進し得る。特に、出力ＲＮＡの翻訳阻害とは、本明細書中で使用する場合、本明細書中に記載されているように、レポータ及び／又はエフェクタータンパク質などの前記出力ＲＮＡによってコード化された少なくとも一つの出力タンパク質の産生、すなわち、翻訳の阻害を指す。
さらに、ある特定の転写後調節状態、すなわちある特定の転写調節状態の存在は、少なくとも一つのＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢ）の存在を含み得る。
特に、ある特定のＡＲは、前記ＡＲを含まない、及び／又は発現しない対照細胞よりも多量のＡＲが存在する場合、及び／又は同様の量のＡＲを添加すること（例えば、プラスミドからの強制発現、及び／又は細胞への注入による）が、得られる各々のＲＮＡの量に影響を及ぼす場合（陽性対照実験）、存在するとみなすことができる。
同様に、ある特定のＲＢは、前記ＲＢを発現しない対照細胞よりも多量のＲＢが存在する場合、及び／又は同様の量のＲＢを添加すること（例えば、プラスミドからの強制発現による）が、得られる各々のＲＮＡの量に影響を及ぼす場合（陽性対照実験）、存在するとみなすことができる。
特に、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）は、ＡＲ１からの少なくとも一つのＡＲ又はある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ１ａ、又はＡＲ１ａとＡＲ１ｂに対する少なくとも一つの標的部位、すなわち、結合部位に対応する少なくとも一つの配列（例えば、ユニーク配列）を含み得、すなわち、前記少なくとも一つの標的部位は、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡにおけるＥ１ａに対応する配列に含まれ；及び／又は
前記さらなる代替第一エクソンのいずれか（Ｅ１ｎ）、例えば、Ｅ１ｂは、各々のＡＲｎからの少なくとも一つのＡＲ又はある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ２、例えば、ＡＲｎａ、又はＡＲｎａとＡＲｎｂ、例えば、ＡＲ２ａ、又はＡＲ２ａとＡＲ２ｂ用の少なくとも一つの標的部位、すなわち、結合部位に対応する少なくとも一つの配列（例えば、ユニーク配列）を含み得、すなわち、前記少なくとも一つの標的部位は、前記Ｅ１ｎの５’であるプロモータ、すなわち、前記Ｅ１ｎの５’に最も近いプロモータによって産生される出力ＲＮＡにおける前記Ｅ１ｎに対応する配列に含まれる。
前記さらなる代替第一エクソンのいずれか（Ｅ１ｎ）、例えば、Ｅ１ｂは、各々のＡＲｎからの少なくとも一つのＡＲ又はある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ２、例えば、ＡＲｎａ、又はＡＲｎａとＡＲｎｂ、例えば、ＡＲ２ａ、又はＡＲ２ａとＡＲ２ｂ用の少なくとも一つの標的部位、すなわち、結合部位に対応する少なくとも一つの配列（例えば、ユニーク配列）を含み得、すなわち、前記少なくとも一つの標的部位は、前記Ｅ１ｎの５’であるプロモータ、すなわち、前記Ｅ１ｎの５’に最も近いプロモータによって産生される出力ＲＮＡにおける前記Ｅ１ｎに対応する配列に含まれる。
したがって、本発明のＤＮＡ構築物に含まれるユニーク配列（例えば、ある特定の代替第一エクソン内）は、複数、例えば、２、３、又は４個のＡＲが存在する場合、例えば、前記ユニーク配列（及び／又は代替第一エクソン）が前記ＡＲの各々に対して少なくとも一つの結合部位を含む場合、各々の産生されたＲＮＡが分解され、及び／又は翻訳阻害されるように設計することができる。換言すれば、ある特定の出力ＲＮＡが複数のＡＲによって相乗的に分解及び／又は翻訳阻害される可能性がある。
しかしながら、この原理はＡＲに限定されず、本明細書中に記載するように、任意の二つ以上のメカニズム及び／又は因子は、相乗的に作用して、ある特定の出力ＲＮＡを分解及び／又は翻訳阻害することができる。
したがって、（例えば、同じ各々の転写後調節状態の二つ以上のメカニズム及び／又は因子、例えば、ＡＲの同じ各々の群からの二つ以上のＡＲを含むものによる）本発明のＤＮＡ構築物によって産生される出力ＲＮＡのいずれか一つの分解は、ＡＮＤゲート様論理に従う可能性がある。したがって、本明細書中に記載する論理演算は、転写後レベルで前記さらなるＡＮＤゲート様論理とさらに組み合わせることができる。
例えば、とりわけ（ＴＦ１ａ ＡＮＤ ＴＦ１ｂ ＡＮＤ ＮＯＴ ＡＲ１ａ ＡＮＤ ＮＯＴ ＡＲ１ｂ）ＯＲ（ＴＦ２ａ ＡＮＤ ＴＦ２ｂ ＡＮＤ ＮＯＴ ＡＲ２ａ ＡＮＤ ＮＯＴ ＡＲ２ｂ）などのさらに複雑演算を実現できる。
したがって、本発明のＤＮＡ構築物は、複数のプロモータを選択的スプライシングと組み合わせることができ、遺伝子発現のほぼ完全な制御を得るため（すなわち、どの条件で有効量の出力ＲＮＡが得られるかを制御するため）の強力なアプローチを提供できる。
本明細書中に記載するように、本発明のＤＮＡ構築物は、少なくとも一つ、好ましくはそれぞれの、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生されない条件と比較して、有効量の出力ＲＮＡの少なくとも一つ、好ましくはそれぞれが産生される条件で、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を産生し得る。
一例では、本発明のＤＮＡ構築物は、
（ｉ）二つの代替プロモータ（Ｐ１及びＰ２）であって、
Ｐ１は、各々の転写調節状態（ＴＳ１）によって活性化され、
Ｐ２は、各々の転写調節状態（ＴＳ２）によって活性化される、二つの代替プロモータ；
及び
（ｉｉ）二つの各々の代替第一エクソン（Ｅ１ａ及びＥ１ｂ）であって、
Ｅ１ａに対応する配列を含む出力ＲＮＡ（Ｐ１によって産生されるもの；ＲＮＡ１）は、各々の転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって分解及び／又は翻訳阻害され、
Ｅ１ｂに対応する配列を含む出力ＲＮＡ（Ｐ２によって産生されるもの；ＲＮＡ２）は、各々の転写後調節状態（ＰＴＳ２）によって分解及び／又は翻訳阻害される、二つの各々の代替第一エクソン
を含む。
（ｉ）二つの代替プロモータ（Ｐ１及びＰ２）であって、
Ｐ１は、各々の転写調節状態（ＴＳ１）によって活性化され、
Ｐ２は、各々の転写調節状態（ＴＳ２）によって活性化される、二つの代替プロモータ；
及び
（ｉｉ）二つの各々の代替第一エクソン（Ｅ１ａ及びＥ１ｂ）であって、
Ｅ１ａに対応する配列を含む出力ＲＮＡ（Ｐ１によって産生されるもの；ＲＮＡ１）は、各々の転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって分解及び／又は翻訳阻害され、
Ｅ１ｂに対応する配列を含む出力ＲＮＡ（Ｐ２によって産生されるもの；ＲＮＡ２）は、各々の転写後調節状態（ＰＴＳ２）によって分解及び／又は翻訳阻害される、二つの各々の代替第一エクソン
を含む。
したがって、前記実例の論理式は：（ＴＳ１ ＡＮＤ ＮＯＴ ＰＴＳ２）ＯＲ（ＴＳ２ ＡＮＤ ＮＯＴ ＰＴＳ２）である。
したがって、前記論理式によると、前記例示的ＤＮＡ構築物は、
（１）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（２）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（３）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在する場合；
（４）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（５）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在する場合；
（６）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在しない場合；又は
（７）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在しない場合、真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ産生するはずであり；
（８）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在する場合；
（９）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（１０）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在する場合；
（１１）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在する場合；
（１２）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在する場合；
（１３）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在する場合；
（１４）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（１５）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在する場合；又は
（１６）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在しない場合、真核細胞において、有効量の出力ＲＮＡを産生しないはずである。
（１）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（２）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（３）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在する場合；
（４）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（５）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在する場合；
（６）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在しない場合；又は
（７）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在しない場合、真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ産生するはずであり；
（８）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在する場合；
（９）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（１０）ＴＳ１が存在し、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在する場合；
（１１）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在する場合；
（１２）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在し、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在する場合；
（１３）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在する場合；
（１４）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在し、ＰＴＳ２が存在しない場合；
（１５）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在する場合；又は
（１６）ＴＳ１が存在せず、ＴＳ２が存在せず、ＰＴＳ１が存在せず、ＰＴＳ２が存在しない場合、真核細胞において、有効量の出力ＲＮＡを産生しないはずである。
明らかに、本明細書では、「無い」は、「非存在」と同じ意味であり；「有効量を産生しない（ｎｏｔ ｙｉｅｌｄｉｎｇ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、「有効量を産生しない（ｙｉｅｌｄｉｎｇ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」と同じ意味である。
前記例において考えられる１６の状態は、真理値表の形態でさらに書き留めることができ、ここで、「１」は「存在する」又は「真」を意味し、「０」は「非存在」又は「偽」を意味する。
前記例示的ＤＮＡ構築物の真理値表は以下のとおりである：
前記例示的ＤＮＡ構築物の真理値表は以下のとおりである：
したがって、前記例示的ＤＮＡ構築物は、条件８～１６のうちの少なくとも一つ、好ましくは少なくとも五つ、さらに好ましくは全てと比較して、条件１～７ののうちの少なくとも一つ、好ましくは少なくとも五つ、さらに好ましくは全てにおいて、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を産生し得る。
換言すれば、前記例示的ＤＮＡ構築物は、条件８～１６のうちの少なくとも一つ、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは全てと比較して、条件１～７ののうちの少なくとも一つ、好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは全てにおいて、例えば、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を産生し得る。
当業者は、添付の実施例を含む本開示及びさらなる周知の一般常識に基づいて、本明細書中で提供する任意の本発明のＤＮＡ構築物の論理式を容易に決定できる。さらに、当業者は、本開示及びさらなる周知の一般常識に基づいて、本明細書中で提供する任意の本発明のＤＮＡ構築物の真理値表も容易に決定できる。
さらに、本明細書中に記載するように、当業者は、当該技術分野で周知、本明細書中に記載、及び／又は添付の実施例に例示する手段によって、真核細胞中に存在する出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質の量を容易に決定できる。
したがって、当業者はさらに、各々の転写調節状態及び／又は転写後調節状態を含むか否かがわかっている参照真核細胞において、本発明のＤＮＡ構築物が有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を産生するか否かを容易に判定できる。
したがって、当業者は、本発明のＤＮＡ構築物の性能を試験及び検証でき、例えば、当業者は、本発明のＤＮＡ構築物が、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生される条件と有効量の出力ＲＮＡが産生されない条件とをどの程度区別できるかを判定できる。
したがって、本発明はさらに、主に転写入力に依存する哺乳動物細胞における複雑な多入力調節プログラムに対するスケーラブルなアプローチを提供する。添付の実施例を含む本開示は、三つの異なるメカニズムによって引き起こされる可能性がある複雑さを克服することを可能にし、ＤＮＡ構築物の定量性能を決定し得る、多プロモータＯＲゲート並びにＡＮＤ及びＮＯＴ論理でのそれらの拡張に対する設計ガイドラインを提供する：（ｉ）選択的５’スプライシング部位配列の選択とイントロンの長さ（例えば、二つの代替第一エクソン間の長さ）の選択によって影響を受ける選択的スプライシング自体；（ｉｉ）異なるプロモータ間の転写干渉であって、これによって上流プロモータは、転写全体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｕｎ－ｔｈｒｏｕｇｈ）のメカニズムにより活性化された下流プロモータからの発現を阻害し得る；及び（ｉｉｉ）異なるプロモータへの転写入力間の長期転写効果であって、この結果、上流プロモータへのＴＦ結合に際して下流プロモータからの発現が増大し得る。さらに、ＮＯＴ論理は、５’－ＵＴＲ標的部位を介した遺伝子発現の効率的ノックダウンに依存する可能性があり、これは３’－ＵＴＲに対する結合ほど強固ではない可能性がある（Ｇａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。さらに、上記メカニズムは互いに独立したものではなく、例えば、イントロンの長さは、スプライシングだけでなく、相乗効果の程度などにも影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、本明細書中及び本発明の文脈で記載するガイドライン及び設計原理は、そのような複雑さを克服することを可能にし、好ましくは、少なくとも許容可能な性能を有する、有用な構築物の生成を可能にする。さらに、最も重要な遺伝的決定因子のそのような複雑な構築物の論理性能への完全マッピングさえも、例えば、機械学習によるビッグデータ収集及び解析によって行うことができ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、したがって、現在利用可能な技術の射程圏内であり、本発明の範囲内である。
最終的に、本発明は、形式（ＴＦ１（１） ａｎｄ ＴＦ２（１） ａｎｄ … ｎｏｔ （ｍｉＲＮＡ－ａ（１）） ａｎｄ ＮＯＴ（ｍｉＲＮＡ－ｂ（１））…） ＯＲ （ＴＦ１（２） ａｎｄ ＴＦ２（２） ａｎｄ … ｎｏｔ （ｍｉＲＮＡ－ａ（２）） ａｎｄ ＮＯＴ（ｍｉＲＮＡ－ｂ（２））…）や、例えば、添付の実施例に示されるように、ウイルスベクターにおいてそれをコード化し、したがって、本発明のＤＮＡ構築物を遺伝子治療に適合させることができることの論理制御を可能にすることができ、これは非常に大きなＤＮＡフットプリントのためにゲートを実装する複数のＤＮＡ構築物では不可能であったことである。したがって、本発明は、治療用途における特定の細胞状態のターゲティングのための細胞分類の能力を十分に発揮し得るＤＮＡ構築物及び対応するガイドラインを提供する。
好ましくは、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物は、少なくとも許容可能な性能を有する。
特に、本発明のＤＮＡ構築物の性能は、前記論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生されない条件の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくはそれぞれと比較して、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生される条件の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくはそれぞれで、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を前記ＤＮＡ構築物が産生する場合に許容可能であるとみなすことができる。
例えば、本発明のＤＮＡ構築物の性能は、前記論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生されない条件の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくはそれぞれと比較して、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生される条件の少なくとも一つ、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは各々で、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を前記ＤＮＡ構築物が産生する場合に許容可能であるとみなすことができる。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物の性能は、前記論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生されない条件の少なくとも５０％と比較して、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生される条件の少なくとも７０％で、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を前記ＤＮＡ構築物が産生する場合に許容可能であるとみなすことができる。
好ましくは、本発明のＤＮＡ構築物の性能は、前記論理式にしたがって有効量のＲＮＡが産生されないすべての条件と比較して、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生される条件の少なくとも７０％で、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を前記ＤＮＡ構築物が産生する場合に許容可能であるとみなすことができる。
例えば、本発明のＤＮＡ構築物の性能は、前記論理式にしたがって有効量のＲＮＡが産生されないすべての条件と比較して、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生される条件の少なくとも７０％で、少なくとも４倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を前記ＤＮＡ構築物が産生する場合に許容可能であるとみなすことができる。
より好ましくは、本発明のＤＮＡ構築物の性能は、前記論理式にしたがって有効量のＲＮＡが産生されないすべての条件と比較して、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生されるすべての条件で、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を前記ＤＮＡ構築物が産生する場合に許容可能であるとみなすことができる。
例えば、本発明のＤＮＡ構築物の性能は、前記論理式にしたがって有効量のＲＮＡが産生されないすべての条件と比較して、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡが産生されるすべての条件で、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも４倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は対応する出力タンパク質を前記ＤＮＡ構築物が産生する場合に許容可能であるとみなすことができる。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物は、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡを産生する二つ以上、例えばすべての条件は、例えば、添付の実施例で示すように、同様の量の出力ＲＮＡを産生するように設計することができる。例えば、二つの条件間の出力ＲＮＡの量は、倍率差が４倍未満、好ましくは２倍未満、より好ましくは１．５倍未満である場合に、類似しているとみなすことができる。
しかしながら、本発明のＤＮＡ構築物は、各々の論理式にしたがって有効量の出力ＲＮＡを産生する二つ以上の条件が、異なる量の出力ＲＮＡを産生するようにさらに設計できる。例えば、二つの条件間の出力ＲＮＡの量は、倍率差が少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも４倍である場合に、異なるとみなすことができる。これにより、例えば、本明細書中で提供される医学的用途に関連し得る、異なる細胞状態に対する応答をさらに微調整することが可能になり得る。
しかしながら、有効量の出力ＲＮＡを産生する二つ以上の条件（論理式に従う）間の倍率差は、好ましくは、有効量の出力ＲＮＡ（論理式に従う）が産生されない条件と比較して、これらの条件のいずれかの差よりも低い。したがって、その場合、有効量の出力ＲＮＡを産生する条件と、有効量の出力ＲＮＡを産生しない条件との間の差は、好ましくは、少なくとも６倍、又はより好ましくは、少なくとも１０倍である。
本発明のＤＮＡ構築物の最大長さは、特に限定されない。しかしながら、好ましくは、本発明のＤＮＡ構築物は、せいぜい１５０ｋｂ、好ましくはせいぜい１２ｋｂの長さを有する。そのような小さな長さ又はサイズは、例えば、本明細書中に記載するように、本発明のＤＮＡ構築物を含むウイルスベクターを産生するため、及び／又は治療及び／又は診断用途のために、有利であり得る。
本発明のＤＮＡ構築物は、当該技術分野で公知の方法及び本明細書中に記載するように、例えば、添付の実施例に示されるように、例えば、クローニング、オリゴヌクレオチド合成及び／又はそれらの組み合わせによって、容易にアセンブル及び／又は合成できる。
したがって、本発明はさらに、本発明のＤＮＡ構築物を産生する方法に関し、前記方法は、
（ａ）ＤＮＡ構築物に含まれるＤＮＡ配列エレメントを、例えば、コンピュータで選択し、配列させるステップと、
（ｂ）前記選択し配列させたＤＮＡ配列エレメントをアセンブル及び／又は合成し、それによって前記ＤＮＡ構築物を産生するステップと、を含む。
（ａ）ＤＮＡ構築物に含まれるＤＮＡ配列エレメントを、例えば、コンピュータで選択し、配列させるステップと、
（ｂ）前記選択し配列させたＤＮＡ配列エレメントをアセンブル及び／又は合成し、それによって前記ＤＮＡ構築物を産生するステップと、を含む。
さらに、本明細書中で提供する本発明の産生方法は、ステップ（ａ）の前に、本明細書中に記載するように、例えば、標的細胞及び／又は非標的細胞中の少なくとも一つのプロモータの前記活性を測定すること、及び／又は標的細胞及び／又は非標的細胞中のバイオマーカー、特定の転写因子、ｍｉＲＮＡなどのアンチセンスＲＮＡ、トランスクリプト―ム及び／又はプロテオームの存在を決定することによって、標的細胞及び／又は非標的細胞の転写調節状態及び／又は転写後調節状態を分析することを含んでもよい。
これにより、ＤＮＡ構築物に含まれるすべてのＤＮＡ配列エレメントを選択し配列させる前に、すなわち、合理的な方法で、ＤＮＡ構築物のある特定の配列エレメント（例えば、プロモータ、アンチセンスＲＮＡ結合部位、転写因子結合部位等）を設計及び／又は試験することが可能になる。
さらに、本明細書中で提供する本発明の産生方法は、
（ｃ）ＤＮＡ構築物（すなわち、ステップ（ａ）及び（ｂ）によって産生された）が、標的細胞及び／又は非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生するか否かを分析するステップと、
（ｄ）前記ＤＮＡ構築物が、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、好ましくは非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生しない場合、ＤＮＡ構築物を選択し、任意選択的に増幅又は再合成するステップと、をさらに含み得る。
（ｃ）ＤＮＡ構築物（すなわち、ステップ（ａ）及び（ｂ）によって産生された）が、標的細胞及び／又は非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生するか否かを分析するステップと、
（ｄ）前記ＤＮＡ構築物が、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、好ましくは非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生しない場合、ＤＮＡ構築物を選択し、任意選択的に増幅又は再合成するステップと、をさらに含み得る。
これにより、産生されたＤＮＡ構築物が所望の機能性を有すること、例えば、非標的細胞から標的細胞を識別できることをさらに確実にできる。
標的細胞及び／又は非標的細胞に関して、本明細書中、例えば、本発明のＤＮＡ構築物の本発明の医学的及び／又は診断的使用の文脈で記載されているのと同じことが当てはまる。
したがって、本発明のＤＮＡ構築物は、本明細書中で提供される本発明の産生方法によって得ることができ、及び／又は産生できる。
さらに、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドに関する。当該技術分野において、クローニングのために、及び／又は発現ベクターとして使用される任意のプラスミド（すなわち、環状ＤＮＡ分子）は、本発明の文脈で好適である。本発明のプラスミドは、例えば、添付の実施例に記載するように、当該技術分野で公知の方法によって、例えば、ＤＮＡ構築物を既存のプラスミドにクローニングすることによって、容易に産生できる。
さらに、本発明は、二本鎖ＤＮＡ若しくは一本鎖ＤＮＡ（すなわち、本発明のＤＮＡ構築物のコード鎖）であり得る本発明のＤＮＡ構築物、本発明のＤＮＡ構築物の配列に対して相補的な配列（すなわち、本発明のＤＮＡ構築物のアンチセンス鎖）を含む一本鎖ＤＮＡ、又は本発明のＤＮＡ構築物に対応する（すなわち、ＤＮＡ構築物のコード鎖に対応する）配列及び／若しくは本発明のＤＮＡ構築物の配列に対して相補的な（すなわち、本発明のＤＮＡ構築物のアンチセンス鎖に対応する）配列を含むＲＮＡ（好ましくは、一本鎖ＲＮＡ）を含むウイルスに関する。特に、前記ウイルスは、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はＶＳＶベクターであり、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである。本発明のウイルス及び／又はウイルスベクターは、例えば、添付の実施例に示すように、当該技術分野で公知の方法によって容易に産生できる。そのような方法は、例えば、本発明のプラスミドであって、対応するウイルス及び／又はウイルスベクターを産生するのに適している前記プラスミドを産生し、前記ウイルス及び／又はウイルスベクターを産生するのに適した宿主細胞（例えば、ＨＥＫ細胞）に前記プラスミドを導入することを含み得る。
明らかに、本発明のプラスミド及び／又は本発明のウイルス若しくはウイルスベクターは、当該技術分野で周知のように、そして本明細書の添付の実施例に記載するように、本発明のＤＮＡ構築物に加えてさらなる配列を含み得る。これらのさらなる配列は、とりわけ、細菌細胞におけるプラスミドの増幅を可能にし、インビトロ（例えば、真核細胞）におけるウイルスの産生を促進し、本発明のウイルスが導入された真核細胞における本発明のＤＮＡ構築物を含む二本鎖ＤＮＡの形成を可能にし、及び／又は本発明のウイルスが導入された真核細胞のゲノムへの本発明のＤＮＡ構築物の組込みを促進し得る。
したがって、本発明はさらに、本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド及び／又はウイルスを含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞は、本発明のプラスミドを増幅するのに適した細菌（例えば、大腸菌）である。いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞は、本発明のウイルス及び／又はウイルスベクターを産生するのに適している、及び／又は産生するために使用される。他の実施形態において、本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の医学的及び／又は診断的使用の文脈では、ＤＮＡ構築物、プラスミド、ウイルス及び／又はウイルスベクターが（例えば、トランスフェクション及び／形質導入により）一時的若しくは安定的に導入された標的細胞である。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド、及び／又はウイルス（例えば、ウイルスベクター）は、対象における疾患の治療、インビボでの対象における疾患の診断、並びに／又は真核細胞の細胞型及び／若しくは状態を決定するインビトロ法で使用できる。
本明細書中で使用する場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ又はｔｒｅａｔｉｎｇ）などのその文法的変異）は、治療される個体の自然経過を変更しようとする臨床的介入を指す。望ましい治療効果としては、限定されるものではないが、予防、疾患又は疾患に関連する症状の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的病理学的帰結の軽減、疾患進行速度の減少、疾患状態の寛解又は緩和、予後改善及び治癒が挙げられる。
したがって、本発明はさらに、対象における疾患の治療で使用するための本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド、ウイルス又は宿主細胞に関する。
したがって、本発明はまた、対象における疾患を治療する方法に関し、前記方法は、治療を必要とする前記対象に対して、有効量の本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド、ウイルス及び／又は宿主細胞を投与することを含む。
したがって、本発明はさらに、本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド、ウイルス又は宿主細胞、及び少なくとも一つのさらなる薬剤的に許容される物質を含む医薬組成物に関する。
本明細書中及び本発明の文脈で好ましくは、真核細胞、例えば標的及び／又は非標的細胞は哺乳動物細胞であり、好ましくはヒト細胞である。
したがって、本明細書中及び本発明の文脈で好ましくは、対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
例えば、真核細胞及び／又は対象は、ヒト、マウス、ウマ、ウシ、ネコ、イヌ等であり得、好ましくはヒトであり得る。
本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド、及び／又はウイルスは、例えば、本明細書中で提供される本発明の医学的用途の文脈では、対象における複数の細胞に導入することができ、特に、前記複数の細胞は、標的細胞及び非標的細胞を含み得る。
特に、本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド、及び／又はウイルスは、前記対象に対する全身的又は局所領域的送達によって、対象における複数の細胞、例えば標的細胞及び／又は非標的細胞に導入することができる。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド、及び／又はウイルスは、単回投与又は反復投与で対象に送達することができる。
本明細書中、及び本発明の文脈において、疾患は、標的細胞の不均一混合物（例えば、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞）と関連し得、及び／又はこれによって引き起こされ得る。特に、標的細胞は、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただし、本明細書中に記載するようにｎ≧１である。
本明細書中、及び本発明の文脈では、疾患の治療は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ又はいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、標的細胞を殺滅及び／又は操作することを含み得る。特に、本明細書中及び本発明の文脈では、操作された標的細胞は、対象に対して無毒になるか、毒性が低くなるか、又は有益になる可能性がある。
本発明のＤＮＡ構築物が、医療介入を必要とする対象において一つ又は異なるタイプの異常及び／又は悪性標的細胞（例えば、がんの異なるサブタイプ）が存在する場合に臨床的に有効であり得ることは有利である。
例えば、ＡＣ１に対応する標的細胞の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％、及び別のＡＣ（ＡＣｎ）、例えばＡＣ２に対応する標的細胞の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％を殺滅及び／又は操作することができる。
好ましくは、ＡＣ１及び／又はＡＣｎ（例えば、ＡＣ２及び／又はＡＣ３）のいずれかに対応する標的細胞の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％、例えば、約１％～約９９％、約１０％～約９９％又は約１０％～約５０％を殺滅及び／又は操作することができる。
本明細書中、すなわち医学的用途の文脈で好ましくは、非標的細胞、すなわち正常及び／又は良性細胞は、殺滅及び／又は操作されない。
例えば、非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞の３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、又は０．０１％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．１％未満が殺滅／操作される。
特に本明細書では、すなわち、本明細書中で提供される本発明の医学的及び／又は診断的使用の文脈で、真核細胞、例えば、標的細胞及び／又は非標的細胞は、本明細書中に記載するように、本発明のＤＮＡ構築物を含み、及び／又は本発明のＤＮＡ構築物がその中で機能的である、真核細胞であり得る。
特に、本明細書中及び本発明の文脈では、（ｉ）ＡＣ１は、本明細書中で記載するＴＳ１の存在を含み、任意選択的に、本明細書中に記載するＰＴＳ１が非存在を含んでもよい、及び／又は（ｉｉ）ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２は、本明細書中に記載するように、各々のＴＳｎ、例えばＴＳ２の存在を含み、、本明細書中に記載するように、任意選択的に、各々のＰＴＳｎ、例えばＰＴＰ２が非存在を含んでもよい。
特に、転写調節状態、及び転写後調節状態に関して、例えば、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物の文脈で、本明細書中に記載するのと同じことが当てはまる。
本明細書中に記載するように、異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ）は、本明細書中に記載するように、本発明のＤＮＡ構築物の特徴（例えば、プロモータ、５’スプライス部位及び／又は代替第一エクソン）及び／又は細胞状態（例えば、転写調節状態及び／又は転写後調節状態）の特徴に関する各々の特徴であり得る。例えば、２、３、若しくは４の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態を、（例えば、本明細書中で提供する本発明の医学的用途にしたがって）殺滅及び／又は操作、並びに／或いは（例えば、本明細書中で提供する本発明のインビトロ及び／又はインビボ診断用途にしたがって）検出しなければならない場合、本発明のＤＮＡ構築物は、２、３、又は４の各々のプロモータを含み得、任意選択的に２、３、又は４の各々の５’ｓｓ及び各々の代替第一エクソンであって、２、３、又は４の各々のユニーク配列を含み得るものを含んでもよい。
特に本明細書中及び本発明の文脈では、有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つの出力タンパク質は、
（ｉ）第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞において、並びに／或いは
（ｉｉ）さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態のいずれか（ＡＣｎ、例えばＡＣ２）に対応する標的細胞において、得ることができる。
（ｉ）第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞において、並びに／或いは
（ｉｉ）さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態のいずれか（ＡＣｎ、例えばＡＣ２）に対応する標的細胞において、得ることができる。
さらに、好ましくは、有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質は非標的細胞では得られない。
有効量の出力ＲＮＡに関して、本明細書中で、例えば、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物の文脈で記載されるのと同じことが当てはまる。
本明細書中で、例えば、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物の医学的用途の文脈で、出力ＲＮＡ、例えば、少なくとも一つ又はそれぞれのタイプの出力ＲＮＡは、本明細書中で記載するように、真核細胞、例えば標的細胞を殺滅及び／又は操作するのに適している長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり得る。
好ましくは、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物の医学的用途の文脈で、出力ＲＮＡは、少なくとも一つのエフェクタータンパク質、例えば、毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターをコード化する配列を含み得る。
好ましくは、本明細書中で提供されるＤＮＡ構築物の医学的用途の文脈で、少なくとも一つの出力タンパク質は、少なくとも一つのエフェクタータンパク質、例えば、毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含む。
特に、エフェクタータンパク質は、本明細書中で記載するように、真核細胞、例えば、標的細胞を殺滅及び／又は操作するのに適している。
本明細書中及び本発明の文脈では、疾患は、がん、神経変性疾患、免疫不全、及び／又は遺伝性疾患であり得る。好ましくは、前記疾患は、がん、例えば、とりわけ肝細胞がんなどの肝臓がん、とりわけ黒色腫などの皮膚がん、とりわけ白血病などの血液がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、とりわけ神経膠芽腫などの脳がんである。
特に、がんは、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞と、前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞とを含み得る。
さらに、本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド及び／又はウイルス（例えば、ウイルスベクター）は、真核細胞を分析するため、すなわち、本明細書中に記載するように、真核細胞の細胞型及び／又は状態を決定するために使用できる。
したがって、本発明はさらに、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞の細胞型及び／又は状態を決定するためのインビトロ法に関し、前記方法は、
（ａ）本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド又はウイルスをインビトロで前記真核細胞に導入し、
（ｂ）前記細胞において出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
（ｃ）（ｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在する場合、前記細胞はある特定の細胞型及び／又は状態を有すること、及び／又は
（ｉｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在する場合、前記細胞は前記細胞型及び／又は状態を有さないこと
を判定すること
を含む。
（ａ）本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド又はウイルスをインビトロで前記真核細胞に導入し、
（ｂ）前記細胞において出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
（ｃ）（ｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在する場合、前記細胞はある特定の細胞型及び／又は状態を有すること、及び／又は
（ｉｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在する場合、前記細胞は前記細胞型及び／又は状態を有さないこと
を判定すること
を含む。
明らかに、本明細書中で提供する本発明のインビトロ法の文脈では、例えば、組織サンプル中の真核細胞は、本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド及び／又はウイルスが、例えば前記組織サンプル中の前記細胞に導入される場合に生きていなければならない（すなわち、ステップａ）において）。さらに、細胞は、ＤＮＡ構築物が機能的であるように、すなわち、通常、有効量の出力ＲＮＡを産生する条件下で有効量の出力ＲＮＡを産生することができるように、充分長く生きていなければならない（すなわち、これは、ステップａ）とステップｂ）との間のさらなるステップであり得る）。しかしながら、出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質の量を測定するために（すなわち、ステップｂ）において）、細胞を殺滅（例えば、固定若しくは溶解）できるか、又はそれらを生きたままにできる（例えば、出力タンパク質が本明細書中で記載するようにレポータタンパク質である場合）。
有効量の出力ＲＮＡに関して、本明細書中、例えば、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物の文脈で記載されているのと同じことがあてはまる。
特に、例えば、本明細書中で提供する本発明のインビトロ法の文脈では、ある特定の細胞型及び／又は状態は、
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１の存在、例えば、各々のＴＦ群からの少なくとも一つ又はある特定の数の転写因子（ＴＦ）、例えば、ＴＦ１ａ、又はＴＦ１ａとＴＦ１ｂの存在を含み得、また任意選択肢的に
（ｉｉ）各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１の非存在、例えば、各々のＡＲ群からの少なくとも一つ又はある特定の数のアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）、例えば、ＡＲ１、又はＡＲ１及びＡＲ２の非存在を含み得る。
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１の存在、例えば、各々のＴＦ群からの少なくとも一つ又はある特定の数の転写因子（ＴＦ）、例えば、ＴＦ１ａ、又はＴＦ１ａとＴＦ１ｂの存在を含み得、また任意選択肢的に
（ｉｉ）各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１の非存在、例えば、各々のＡＲ群からの少なくとも一つ又はある特定の数のアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）、例えば、ＡＲ１、又はＡＲ１及びＡＲ２の非存在を含み得る。
細胞型及び／又は状態、転写調節状態、並びに転写後調節状態に関して、本明細書中、例えば、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物の文脈で記載するのと同じことが当てはまる。
さらに、本発明は、対象における疾患を診断するためのインビトロ法に関し、前記方法は、
ａ）本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド又はウイルスを前記対象からの組織サンプルに導入し、
ｂ）前記組織サンプル中の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
ｃ）前記対象が前記疾患を有しているか否かを診断すること
を含み、
前記組織サンプル中に有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在している場合、診断は陽性であり、及び／又は
前記組織サンプル中に有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在しない場合、診断は陰性である。
ａ）本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド又はウイルスを前記対象からの組織サンプルに導入し、
ｂ）前記組織サンプル中の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
ｃ）前記対象が前記疾患を有しているか否かを診断すること
を含み、
前記組織サンプル中に有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在している場合、診断は陽性であり、及び／又は
前記組織サンプル中に有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在しない場合、診断は陰性である。
有効量の出力ＲＮＡに関して、本明細書中、例えば、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物の文脈で記載されているのと同じことが当てはまる。
特に、前記疾患は、例えば、本発明のインビトロ及び／又はインビボ診断用途の文脈では、標的細胞の不均一混合物（例えば、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞）と関連する可能性があり、及び／又はこれによって引き起こされる可能性がある。特に、標的細胞は、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただし、本明細書中で記載するように、ｎ≧１である。
特に、前記組織サンプルは、前記標的細胞を含む疑いがあり得る。さらに、前記組織サンプルは、非標的細胞、すなわち正常及び／又は良性細胞を含み得る。
特に、（インビトロ及び／又はインビボでの）疾患の診断は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態（ＡＣ１）、並びに／或いは別の一つ若しくはいずれかの前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、前記組織サンプル中の標的細胞を検出することを含み得る。
例えば、ＡＣ１に対応する標的細胞の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％、及び別のＡＣ（ＡＣｎ）、例えばＡＣ２に対応する標的細胞の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％が検出され得る。
好ましくは、ＡＣ１及び／又はＡＣｎのいずれか（例えば、ＡＣ２及び／又はＡＣ３）に対応する標的細胞の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％、例えば、約１％～約９９％、約１０％～約９９％又は約１０％～約５０％が検出され得る。
好ましくは、非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞は検出されない場合がある。
例えば、非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞の３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、又は０．０１％未満、好ましくは１０％、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．１％未満が検出される。
特に、例えば本発明のインビトロ及び／又はインビボ診断用途の文脈で、
（ｉ）ＡＣ１は、前記ＴＳ１の存在、及び任意選択的に前記ＰＴＳ１の非存在を含んでもよく、及び／又は
（ｉｉ）ＡＣｎ、例えばＡＣ２は、各々のＴＳｎ、例えばＴＳ２の存在、及び任意選択的に各々のＰＴＳｎ、例えばＰＴＰ２の非存在を含んでもよい。
（ｉ）ＡＣ１は、前記ＴＳ１の存在、及び任意選択的に前記ＰＴＳ１の非存在を含んでもよく、及び／又は
（ｉｉ）ＡＣｎ、例えばＡＣ２は、各々のＴＳｎ、例えばＴＳ２の存在、及び任意選択的に各々のＰＴＳｎ、例えばＰＴＰ２の非存在を含んでもよい。
細胞型及び／又は状態、転写調節状態、並びに転写後調節状態に関して、本明細書中、例えば、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物の文脈で記載するのと同じことが当てはまる。
特に、例えば、本発明のインビトロ及び／又はインビボ診断用途の文脈では、
（ｉ）前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞、及び／又は
（ｉｉ）前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態のいずれか（ＡＣｎ、例えばＡＣ２）に対応する標的細胞
において、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が得られる可能性がある。
（ｉ）前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞、及び／又は
（ｉｉ）前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態のいずれか（ＡＣｎ、例えばＡＣ２）に対応する標的細胞
において、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が得られる可能性がある。
好ましくは、非標的細胞では、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が得られない可能性がある。
さらに、本明細書中で提供される本発明の診断法のステップｂ）は、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する細胞の前記組織細胞中のパーセンテージを測定することをさらに含み得、並びに／或いは
ステップｃ）における診断は、前記組織サンプル中の細胞の少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陽性とみなすことができ、並びに／或いは
ステップｃ）における診断は、前記組織サンプル中の細胞の０．０１％未満、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陰性とみなすことができる。
ステップｃ）における診断は、前記組織サンプル中の細胞の少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陽性とみなすことができ、並びに／或いは
ステップｃ）における診断は、前記組織サンプル中の細胞の０．０１％未満、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陰性とみなすことができる。
好ましくは、本明細書中で提供される本発明のＤＮＡ構築物の診断（インビトロ及び／又はインビボ）用途の文脈で、出力ＲＮＡは、少なくとも一つのレポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素をコード化する配列を含み得る。
したがって、好ましくは、本明細書中で提供される診断（インビトロ及び／又はインビボ）用途及び／又は方法の文脈で、出力タンパク質は、少なくとも一つのレポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素を含み得る。
好ましくは、レポータタンパク質は、得られる出力ＲＮＡの量を決定するため、及び／又は標的細胞を検出するために適している。
特に、例えば、本発明のインビトロ及び／又はインビボ診断用途の文脈で、疾患は、神経変性疾患、免疫不全、及び／又は遺伝性疾患であり、好ましくはがんであり得る。
がんに関して、本明細書中、例えば、本発明のＤＮＡ構築物の医学的用途の文脈で記載されているのと同じことが当てはまる。例えば、前記がんは、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する細胞と、前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞とを含み得る。
インビボで及び／又は生細胞において（例えば、本発明のインビトロ法で）対象における疾患を診断するために使用できることは、本発明のＤＮＡ構築物のさらなる利点である。これにより、対象、組織サンプル、及び／又は単細胞における出力ＲＮＡ及び／又はタンパク質の量を経時的にモニタリングすることが可能になる。さらに、これにより、対象及び／又は組織サンプルにおける標的細胞の数を経時的にモニタリングすることが可能になる。例えば、対象における出力ＲＮＡ及び／若しくは出力タンパク質の量並びに／又は標的細胞の数を、数日間、数週間、数カ月、又はさらには数年にわたり、例えば、本明細書中に記載するように、例えば、インビボ測定により（例えば、光学的方法により）、体液を分析することにより（例えば、出力タンパク質が体液中に分泌される場合）、及び／又は組織の逐次サンプリングとそれに続くインビトロ測定により、モニタリングすることができる。したがって、本発明のＤＮＡ構築物は、多くの診断用途に有利であり得る。
したがって、本発明はさらに、インビボで対象における疾患の診断で使用するための、すなわち、インビボ診断法で使用するための、本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド、ウイルス又は宿主細胞に関する。
特に、例えば、本発明のインビボ診断用途及び／又は方法の文脈で、本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド、及び／又はウイルスは、対象（例えば、組織）における複数の細胞へ導入することができ、前記複数の細胞は、標的細胞と非標的細胞とを含み得る。
特に、例えば、本発明のインビボ診断用途及び／又は方法の文脈で、疾患は、標的細胞（例えば、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞）の不均一混合物と関連する可能性があり、及び／又はこれによって引き起こされる可能性がある。特に、標的細胞は、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つもしくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただし、本明細書中で記載するようにｎ≧１である。
さらに、例えば、本発明のインビボ診断用途及び／又は方法の文脈で、前記複数の細胞のサンプル（例えば、組織サンプル）は、一つ以上の時点で得ることができる。前記細胞及び／又は組織サンプルを次にインビトロで、例えば、本明細書中に提供する本発明のインビトロ法によって、例えば、本明細書中に提供する本発明のインビトロ診断法によって分析することができる。
例えば、インビボ診断法は：
ａ）本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド又はウイルスを対象の組織に導入し、
ｂ）前記組織における出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
ｃ）前記対象が前記疾患を有するか否かを診断することを含み、
前記組織において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在する場合、診断は陽性であり、及び／又は
前記組織において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在しない場合、診断は陰性である。
ａ）本発明のＤＮＡ構築物、プラスミド又はウイルスを対象の組織に導入し、
ｂ）前記組織における出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
ｃ）前記対象が前記疾患を有するか否かを診断することを含み、
前記組織において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在する場合、診断は陽性であり、及び／又は
前記組織において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在しない場合、診断は陰性である。
疾患、がん、標的細胞、非標的細胞、異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態、出力ＲＮＡの有効量、標的細胞の検出、転写調節状態、転写後調節状態、出力タンパク質、レポータタンパク質、及び診断に関して、本明細書中、例えば、本明細書中で提供する本発明のＤＮＡ構築物及び／又は本発明の診断法の文脈で記載するのと同じことが準用される。
例えば、インビボでの疾患の診断は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、前記組織中の標的細胞を検出することを含み得る。好ましくは、非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞は、検出されない場合がある。
例えば、インビボ診断法は、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する前記組織中の細胞のパーセンテージを測定することをさらに含み得、並びに／或いは前記組織中の細胞の少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合、診断は陽性とみなすことができ、並びに／或いは前記組織中の細胞の０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．５％未満、１％未満、５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満又は５０％未満が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合、診断は陰性とみなすことができる。
したがって、本発明のＤＮＡ構築物は、多くの治療及び／又は診断用途に特に有利である。特に、本発明のＤＮＡ構築物は、例えば、対象及び／又は組織サンプルにおける異なるタイプの真核標的細胞（例えば、とりわけ、がんの異なるサブタイプなどの標的細胞の不均一集団）の検出、殺滅及び／又は操作に特に有用である。
さらに、本発明は、以下の項目に関する：
項目１
５’→３’方向で以下のＤＮＡ配列エレメント：
第一プロモータ（Ｐ１）；
ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）、ただし、ｎ≧１；及び
出力配列
を含むＤＮＡ構築物であって、
前記プロモータのそれぞれは、転写開始部位を含み、及び／又は転写を開始するのに適し；
Ｐ１からの転写の開始は、第一転写調節状態（ＴＳ１）によって可能となり、前記さらなるプロモータ（Ｐｎ）のそれぞれからの転写の開始は、各々のさらなる転写調節状態（ＴＳｎ）によって可能となり、ＴＳ２によって可能となり；
前記ＴＳ１及び／又は各々のＴＳｎのいずれかが前記細胞中に存在する場合、前記ＤＮＡ構築物は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、前記出力ＲＮＡは前記出力配列に対応する配列を含み；
特に、転写がＰ１から開始される場合に前記出力ＲＮＡ（ＲＮＡ１）の第一タイプが得られ、転写が各々のＰｎから開始される場合に前記出力ＲＮＡの各々のさらなるタイプ（ＲＮＡｎ）が得られ、前記出力ＲＮＡの各タイプは、前記出力配列に対応する配列を含み、前記出力ＲＮＡの量は、全てのタイプの前記出力ＲＮＡの合計量に対応し；
好ましくは、前記ＤＮＡ構築物は、前記細胞中にＴＳ１もＴＳｎのいずれも存在しない場合、有効量の前記出力ＲＮＡを産生しない、
ＤＮＡ構築物。
項目１
５’→３’方向で以下のＤＮＡ配列エレメント：
第一プロモータ（Ｐ１）；
ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）、ただし、ｎ≧１；及び
出力配列
を含むＤＮＡ構築物であって、
前記プロモータのそれぞれは、転写開始部位を含み、及び／又は転写を開始するのに適し；
Ｐ１からの転写の開始は、第一転写調節状態（ＴＳ１）によって可能となり、前記さらなるプロモータ（Ｐｎ）のそれぞれからの転写の開始は、各々のさらなる転写調節状態（ＴＳｎ）によって可能となり、ＴＳ２によって可能となり；
前記ＴＳ１及び／又は各々のＴＳｎのいずれかが前記細胞中に存在する場合、前記ＤＮＡ構築物は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、前記出力ＲＮＡは前記出力配列に対応する配列を含み；
特に、転写がＰ１から開始される場合に前記出力ＲＮＡ（ＲＮＡ１）の第一タイプが得られ、転写が各々のＰｎから開始される場合に前記出力ＲＮＡの各々のさらなるタイプ（ＲＮＡｎ）が得られ、前記出力ＲＮＡの各タイプは、前記出力配列に対応する配列を含み、前記出力ＲＮＡの量は、全てのタイプの前記出力ＲＮＡの合計量に対応し；
好ましくは、前記ＤＮＡ構築物は、前記細胞中にＴＳ１もＴＳｎのいずれも存在しない場合、有効量の前記出力ＲＮＡを産生しない、
ＤＮＡ構築物。
項目２
５’→３’方向で、
前記第一プロモータ（Ｐ１）と前記さらなるプロモータの最後のプロモータ（Ｐｎ）との間に、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）及び第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）、並びに
前記最後のプロモータと前記出力配列との間に、ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソンの最後の代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）、ｎ個の各々のさらなる５’スプライス部位の最後の代替５’スプライス部位（５’ｓｓｎ）、分岐点（ＢＰ）及び３’スプライス部位（３’ｓｓ）
をさらに含み、
前記出力配列は第二エクソン（Ｅ２）であり、
好ましくは、前記最後の代替５’スプライス部位は、ＤＮＡ構築物に含まれる別の一つ又は任意の他の５’スプライス部位よりも弱い、
項目１に記載のＤＮＡ構築物。
５’→３’方向で、
前記第一プロモータ（Ｐ１）と前記さらなるプロモータの最後のプロモータ（Ｐｎ）との間に、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）及び第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）、並びに
前記最後のプロモータと前記出力配列との間に、ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソンの最後の代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）、ｎ個の各々のさらなる５’スプライス部位の最後の代替５’スプライス部位（５’ｓｓｎ）、分岐点（ＢＰ）及び３’スプライス部位（３’ｓｓ）
をさらに含み、
前記出力配列は第二エクソン（Ｅ２）であり、
好ましくは、前記最後の代替５’スプライス部位は、ＤＮＡ構築物に含まれる別の一つ又は任意の他の５’スプライス部位よりも弱い、
項目１に記載のＤＮＡ構築物。
項目３
前記出力ＲＮＡが少なくとも一つの出力タンパク質をコード化する少なくとも一つの配列を含み、前記少なくとも一つの出力タンパク質のコード配列が、前記出力配列、例えば前記第二エクソンに部分的又は完全に含まれ、
好ましくは、前記少なくとも一つの出力タンパク質は、レポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素、及び／或いはエフェクタータンパク質、例えば毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含み得る、
項目１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
前記出力ＲＮＡが少なくとも一つの出力タンパク質をコード化する少なくとも一つの配列を含み、前記少なくとも一つの出力タンパク質のコード配列が、前記出力配列、例えば前記第二エクソンに部分的又は完全に含まれ、
好ましくは、前記少なくとも一つの出力タンパク質は、レポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素、及び／或いはエフェクタータンパク質、例えば毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含み得る、
項目１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
項目４
ある特定の転写調節状態が、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／又は細胞状態、例えば、疾患細胞状態、分化した細胞状態、若しくは幹細胞状態と関連及び／又は反映する；並びに／或いは
（ｉｉ）転写因子の各々の群からの少なくとも一つの転写因子（ＴＦ）の存在を含み、
特に、第一転写調節状態（ＴＳ１）は、ＴＦの第一群からの少なくとも二つのＴＦの存在を含み、及び／又はさらなる転写調節状態のいずれか（ＴＳｎ）は、転写因子の各々のさらなる群からの少なくとも二つのＴＦの存在を含み、
好ましくは、Ｐ１は、ＴＦの第一群からの少なくとも二つのＴＦの結合部位を含み、及び／又はＰｎのいずれかは、転写因子の各々のさらなる群からの少なくとも二つのＴＦの結合部位を含む、
項目１～３のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物。
ある特定の転写調節状態が、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／又は細胞状態、例えば、疾患細胞状態、分化した細胞状態、若しくは幹細胞状態と関連及び／又は反映する；並びに／或いは
（ｉｉ）転写因子の各々の群からの少なくとも一つの転写因子（ＴＦ）の存在を含み、
特に、第一転写調節状態（ＴＳ１）は、ＴＦの第一群からの少なくとも二つのＴＦの存在を含み、及び／又はさらなる転写調節状態のいずれか（ＴＳｎ）は、転写因子の各々のさらなる群からの少なくとも二つのＴＦの存在を含み、
好ましくは、Ｐ１は、ＴＦの第一群からの少なくとも二つのＴＦの結合部位を含み、及び／又はＰｎのいずれかは、転写因子の各々のさらなる群からの少なくとも二つのＴＦの結合部位を含む、
項目１～３のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物。
項目５
第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって翻訳阻害及び／又は分解され、
さらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ）によって翻訳阻害及び／又は分解される、
項目３～６のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物。
第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって翻訳阻害及び／又は分解され、
さらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ）によって翻訳阻害及び／又は分解される、
項目３～６のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物。
項目６
前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つの各々のプロモータからの出力ＲＮＡが産生されるように、少なくとも一つの転写調節状態が前記細胞中に存在する場合；及び
（ｉｉ）各々の代替第一エクソンを含む各々の産生された出力ＲＮＡが翻訳阻害又は分解されないように、各々の転写後調節状態が前記細胞中に存在しない場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生し；
好ましくは、前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータから転写を誘導できる転写調節状態が前記細胞中に存在しない場合、及び／又は
（ｉｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータによって産生される各々の出力ＲＮＡを翻訳阻害及び／又は分解できる各転写後調節状態が前記細胞中に存在する場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生しない、
項目５に記載のＤＮＡ構築物。
前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つの各々のプロモータからの出力ＲＮＡが産生されるように、少なくとも一つの転写調節状態が前記細胞中に存在する場合；及び
（ｉｉ）各々の代替第一エクソンを含む各々の産生された出力ＲＮＡが翻訳阻害又は分解されないように、各々の転写後調節状態が前記細胞中に存在しない場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生し；
好ましくは、前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータから転写を誘導できる転写調節状態が前記細胞中に存在しない場合、及び／又は
（ｉｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータによって産生される各々の出力ＲＮＡを翻訳阻害及び／又は分解できる各転写後調節状態が前記細胞中に存在する場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生しない、
項目５に記載のＤＮＡ構築物。
項目７
ある特定の転写後調節状態が、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／又は細胞状態と関連し、及び／又はこれを反映し；
（ｉｉ）アンチセンスＲＮＡの各々の群からの少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）の存在を含み、
特に、ＰＴＳ１がＡＲの第一群からの少なくとも一つのＡＲ（ＡＲ１）の存在を含み、及び／又はＰＴＳｎがＡＲのさらなる群からの少なくとも一つのＡＲ（ＡＲｎ）の存在を含み、
好ましくは、前記Ｅ１ａが、ＡＲ１からの少なくとも一つのＡＲの少なくとも一つの標的部位に対応する少なくとも一つの配列を含み、及び／又は前記Ｅ１ｎのいずれかが、各々のＡＲｎからの少なくとも一つのＡＲの少なくとも一つの標的部位に対応する少なくとも一つの配列を含み；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）少なくとも一つのＲＮＡ結合タンパク質の存在を含む、
項目５又は６に記載のＤＮＡ構築物。
ある特定の転写後調節状態が、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／又は細胞状態と関連し、及び／又はこれを反映し；
（ｉｉ）アンチセンスＲＮＡの各々の群からの少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）の存在を含み、
特に、ＰＴＳ１がＡＲの第一群からの少なくとも一つのＡＲ（ＡＲ１）の存在を含み、及び／又はＰＴＳｎがＡＲのさらなる群からの少なくとも一つのＡＲ（ＡＲｎ）の存在を含み、
好ましくは、前記Ｅ１ａが、ＡＲ１からの少なくとも一つのＡＲの少なくとも一つの標的部位に対応する少なくとも一つの配列を含み、及び／又は前記Ｅ１ｎのいずれかが、各々のＡＲｎからの少なくとも一つのＡＲの少なくとも一つの標的部位に対応する少なくとも一つの配列を含み；
並びに／或いは
（ｉｉｉ）少なくとも一つのＲＮＡ結合タンパク質の存在を含む、
項目５又は６に記載のＤＮＡ構築物。
項目８
細胞中の有効量の出力ＲＮＡが、
有効量の前記出力ＲＮＡが得られない条件、例えば、前記ＤＮＡ構築物に含まれる任意のプロモータからの転写を開始する各々の転写状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質の量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が前記ＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在することに対応する、
項目１～７のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物。
細胞中の有効量の出力ＲＮＡが、
有効量の前記出力ＲＮＡが得られない条件、例えば、前記ＤＮＡ構築物に含まれる任意のプロモータからの転写を開始する各々の転写状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質の量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が前記ＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在することに対応する、
項目１～７のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物。
項目９
前記ウイルスに含まれるＤＮＡ構築物が二本鎖又は一本鎖であり、一本鎖ＤＮＡ構築物が、前記項目のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物のセンス又はアンチセンス鎖に対応する配列を含み、特に、前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はＶＳＶベクターである、
項目１～８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物或いは前記ＤＮＡ構築物に対応する配列及び／又は前記ＤＮＡ構築物の配列に対して相補的な配列を含むＲＮＡを含むウイルス。
前記ウイルスに含まれるＤＮＡ構築物が二本鎖又は一本鎖であり、一本鎖ＤＮＡ構築物が、前記項目のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物のセンス又はアンチセンス鎖に対応する配列を含み、特に、前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はＶＳＶベクターである、
項目１～８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物或いは前記ＤＮＡ構築物に対応する配列及び／又は前記ＤＮＡ構築物の配列に対して相補的な配列を含むＲＮＡを含むウイルス。
項目１０
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患、例えばがんの治療での使用のための項目１～８のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物又は項目９に記載のウイルス。
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患、例えばがんの治療での使用のための項目１～８のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物又は項目９に記載のウイルス。
項目１１
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物は、対象における複数の細胞へ導入されるものであり、前記複数の細胞は標的細胞と非標的細胞とを含み得る；
（ｉｉ）前記疾患は、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞と関連し、及び／又はこれによって引き起こされ、標的細胞は、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１であり、
特に、ある特定の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態は、ある特定の転写調節状態の存在を含み、任意選択的に各々の転写後調節状態が非存在を含んでもよく；
（ｉｉｉ）前記疾患の治療は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、標的細胞の殺滅及び／又は操作を含み、
好ましくは、非標的細胞は殺滅及び／又は操作されず；
特に、
（ｉｖ）有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つの出力タンパク質が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞において、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞において得られ、
好ましくは、有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が非標的細胞では得られない、
項目１０に記載の使用のためのＤＮＡ構築物又はウイルス。
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物は、対象における複数の細胞へ導入されるものであり、前記複数の細胞は標的細胞と非標的細胞とを含み得る；
（ｉｉ）前記疾患は、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞と関連し、及び／又はこれによって引き起こされ、標的細胞は、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１であり、
特に、ある特定の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態は、ある特定の転写調節状態の存在を含み、任意選択的に各々の転写後調節状態が非存在を含んでもよく；
（ｉｉｉ）前記疾患の治療は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、標的細胞の殺滅及び／又は操作を含み、
好ましくは、非標的細胞は殺滅及び／又は操作されず；
特に、
（ｉｖ）有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つの出力タンパク質が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞において、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞において得られ、
好ましくは、有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が非標的細胞では得られない、
項目１０に記載の使用のためのＤＮＡ構築物又はウイルス。
項目１２
真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞の細胞型及び／又は状態を決定するインビトロ法であって、
（ａ）項目１～８のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物又は項目９に記載のウイルスをインビトロで前記真核細胞に導入し、
（ｂ）前記細胞において出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
（ｃ）（ｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在する場合、前記細胞はある特定の細胞型及び／又は状態を有すること、及び／又は
（ｉｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在しない場合、前記細胞は前記細胞型及び／又は状態を有さないことを判定すること
を含む、方法。
真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞の細胞型及び／又は状態を決定するインビトロ法であって、
（ａ）項目１～８のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物又は項目９に記載のウイルスをインビトロで前記真核細胞に導入し、
（ｂ）前記細胞において出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
（ｃ）（ｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在する場合、前記細胞はある特定の細胞型及び／又は状態を有すること、及び／又は
（ｉｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在しない場合、前記細胞は前記細胞型及び／又は状態を有さないことを判定すること
を含む、方法。
項目１３
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患、例えばがんを診断するためのインビトロ法であって、
前記方法は、
ａ）項目１～８のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物又は項目９に記載のウイルスを前記対象からの組織サンプルに導入し、
ｂ）前記組織サンプルにおいて出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
ｃ）前記対象が前記疾患を有するか否かを診断すること
を含み、
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在する場合、診断は陽性であり、及び／又は
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在しない場合、診断は陰性である、方法。
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患、例えばがんを診断するためのインビトロ法であって、
前記方法は、
ａ）項目１～８のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物又は項目９に記載のウイルスを前記対象からの組織サンプルに導入し、
ｂ）前記組織サンプルにおいて出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
ｃ）前記対象が前記疾患を有するか否かを診断すること
を含み、
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在する場合、診断は陽性であり、及び／又は
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在しない場合、診断は陰性である、方法。
項目１４
前記疾患が
（ｉ）少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞と関連し、及び／又はこれにより引き起こされ、標的細胞は、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１であり；
（ｉｉ）前記組織サンプルは、前記標的細胞を含む疑いがあり、非標的細胞を含む可能性があり、
特に、ある特定の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態は、ある特定の転写調節状態の存在を含み、任意選択的に各々の転写後調節状態が非存在を含んでもよく；
（ｉｉｉ）前記疾患の診断は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、前記組織サンプル中の標的細胞を検出することを含み、
好ましくは、非標的細胞は検出されず；
特に、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質は、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞において、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞において得られ、
好ましくは、非標的細胞では、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が得られない、
項目１３に記載の方法。
前記疾患が
（ｉ）少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞と関連し、及び／又はこれにより引き起こされ、標的細胞は、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１であり；
（ｉｉ）前記組織サンプルは、前記標的細胞を含む疑いがあり、非標的細胞を含む可能性があり、
特に、ある特定の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態は、ある特定の転写調節状態の存在を含み、任意選択的に各々の転写後調節状態が非存在を含んでもよく；
（ｉｉｉ）前記疾患の診断は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、前記組織サンプル中の標的細胞を検出することを含み、
好ましくは、非標的細胞は検出されず；
特に、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質は、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞において、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞において得られ、
好ましくは、非標的細胞では、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が得られない、
項目１３に記載の方法。
項目１５
インビボで、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患、例えばがんの診断での使用のための項目１～８のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物又は項目９に記載のウイルス。
インビボで、対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患、例えばがんの診断での使用のための項目１～８のいずれか一つに記載のＤＮＡ構築物又は項目９に記載のウイルス。
本発明はまた、以下の図面、図面の説明文、及び以下の非限定的実施例によっても特徴づけられる。
本開示で使用するための方法および材料は本明細書に記載されているが、当技術分野で公知の他の好適な方法および材料も使用できる。材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定することを意図したものではない。
実施例１：材料及び方法
実験モデル及び対象の詳細
三つの異なる細胞株：ＨＥＫ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６３１－０１７）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１１２６８）、及びＨｅＬａ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ－２、ロット番号５８９３０５７１）で実験を実施した。安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むすべての細胞株を、３７℃、５％ＣＯ２にて、１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０２７０－１０６）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２ＣＩ）を追加した、０．２μ（ＴＰＰ、カタログ番号９９５００）ろ過ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４１９６６０２９）中で培養した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２５２００－０７２）を使用して３～４日おきに分割を実施した。マイコプラズマ試験は４週間に１回実施した。マイコプラズマ検出のために、ＰＣＲマイコプラズマ試験キット（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ、カタログ番号ＰＫ－ＣＡ９１－１０２４）からのプロトコルを汚染マイコプラズマに特異的なプライマーと共に使用した（Ｕｐｈｏｆｆ ａｎｄ Ｄｒｅｘｌｅｒ，２０１１）。検出に使用したサーモサイクラープログラムは以下の通りであった：９５℃で７分、７２℃で３分、及び６５℃で２分を１サイクル；９５℃で４秒、５０℃で８秒、及び６８℃で４５秒を３２サイクル。プライマー：ＰＲ１８４３、ＰＲ１８４４、ＰＲ１８４５、ＰＲ１８４６、ＰＲ１８４７及びＰＲ１８４８を検出反応のために使用した（表２を参照）。陽性対照については、上記のものとは別に追加のプライマーセット（ＰＲ０６７３及びＰＲ０６７４）を使用した。細胞培養物を最大２カ月間増殖した後、新鮮な細胞ストックと置換した。
実験モデル及び対象の詳細
三つの異なる細胞株：ＨＥＫ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６３１－０１７）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１１２６８）、及びＨｅＬａ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ－２、ロット番号５８９３０５７１）で実験を実施した。安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３細胞を含むすべての細胞株を、３７℃、５％ＣＯ２にて、１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０２７０－１０６）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２ＣＩ）を追加した、０．２μ（ＴＰＰ、カタログ番号９９５００）ろ過ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号４１９６６０２９）中で培養した。０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号２５２００－０７２）を使用して３～４日おきに分割を実施した。マイコプラズマ試験は４週間に１回実施した。マイコプラズマ検出のために、ＰＣＲマイコプラズマ試験キット（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ、カタログ番号ＰＫ－ＣＡ９１－１０２４）からのプロトコルを汚染マイコプラズマに特異的なプライマーと共に使用した（Ｕｐｈｏｆｆ ａｎｄ Ｄｒｅｘｌｅｒ，２０１１）。検出に使用したサーモサイクラープログラムは以下の通りであった：９５℃で７分、７２℃で３分、及び６５℃で２分を１サイクル；９５℃で４秒、５０℃で８秒、及び６８℃で４５秒を３２サイクル。プライマー：ＰＲ１８４３、ＰＲ１８４４、ＰＲ１８４５、ＰＲ１８４６、ＰＲ１８４７及びＰＲ１８４８を検出反応のために使用した（表２を参照）。陽性対照については、上記のものとは別に追加のプライマーセット（ＰＲ０６７３及びＰＲ０６７４）を使用した。細胞培養物を最大２カ月間増殖した後、新鮮な細胞ストックと置換した。
方法の詳細
ＤＮＡカセット設計及び構造
ＤＮＡカセットはいくつかのモジュールに分割されている（図１０）。各モジュールに関連する配列は表１に列挙されている。クローニングや他の手順で使用されるプライマーは表２に記載されている。クローニングに使用される遺伝子フラグメント／合成ＤＮＡ配列／ｇＢｌｏｃｋは表３に記載されている。全てのプラスミドとそれらの関連するクローニング手順は表４に記載されている。
ＤＮＡカセット設計及び構造
ＤＮＡカセットはいくつかのモジュールに分割されている（図１０）。各モジュールに関連する配列は表１に列挙されている。クローニングや他の手順で使用されるプライマーは表２に記載されている。クローニングに使用される遺伝子フラグメント／合成ＤＮＡ配列／ｇＢｌｏｃｋは表３に記載されている。全てのプラスミドとそれらの関連するクローニング手順は表４に記載されている。
ポリクロマティックレポータ構築物
ＧＦＰ由来の蛍光タンパク質（ＳＢＦＰ２、ＣＦＰ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ及びｍＣｉｔｒｉｎｅ）を使用してポリクロマティックレポータを構築した。これらの蛍光タンパク質を、第二エクソンが同じままであるように二つのエクソン（エクソン１：２１０アミノ酸、エクソン２：２９アミノ酸）に分割した。三つの結合部位を有するプリスチナマイシンＩ依存性トランス活性化因子（ＰＩＴ）２／プリスチナマイシンＩ抑制プロモータ（ＰＩＲ）システム（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、三つの結合部位を有するエリスロマイシン依存性トランス活性化因子プロモータシステム（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）、及び六つの結合部位を有するテトラサイクリン依存性トランス活性化因子プロモータシステムは、それぞれ、ＳＢＦＰ２、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎ及びｍＣｉｔｒｉｎｅ蛍光タンパク質の発現を駆動するためにＴＡＴＡ－ＹＢ最小配列（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）の前に配置した。５’－ＵＴＲ配列は、マウスＣｉｉｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ＃ＮＣ００００８２．６）から入手したか、又は二次構造の形成を防止し、それによって異なる調節調節因子によって占有されることを可能にするように設計した。プロモータ及び５’－ＵＴＲ配列を交互エクソン配列（ＳＢＦＰ２ Ｅｘ１、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎ Ｅｘ１及びｍＣｉｔｒｉｎｅ Ｅｘ１）の上流に配置した。コザック配列を一部のカセットでは開始コドンの前に挿入した。長さが異なるイントロン配列（５０～５１６ｂｐ）をマウスＣｉｉｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ＃ＮＣ００００８２．６）から得た。５’スプライス部位配列は異なるポリクロマティック構築物では異なっていた。使用した３’スプライス部位配列は、マウスＣｉｉｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ＃ＮＣ００００８２．６）からのもの、又は以下のもののいずれかであった：５’－ｔｔｔｔｔｔａａｃｔｔｃｃｔｔｔａｔｔｔｔｃｃｔｔａｃａｇ－３’（配列番号１）。スプライシングエンハンサー配列（Ｍｉｙａｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）をｐＪＤ５２及びｐＪＤ１２５のＳＢＦＰ２エクソン１の下流のイントロン配列内に挿入した。終止コドンの下流に配置されたウサギグロビンポリアデニル化シグナルを転写の終結に使用した。初期多色カセットｐＫＢ０１はＧｅｎｅｗｉｚによって新たに合成された。
ＧＦＰ由来の蛍光タンパク質（ＳＢＦＰ２、ＣＦＰ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ及びｍＣｉｔｒｉｎｅ）を使用してポリクロマティックレポータを構築した。これらの蛍光タンパク質を、第二エクソンが同じままであるように二つのエクソン（エクソン１：２１０アミノ酸、エクソン２：２９アミノ酸）に分割した。三つの結合部位を有するプリスチナマイシンＩ依存性トランス活性化因子（ＰＩＴ）２／プリスチナマイシンＩ抑制プロモータ（ＰＩＲ）システム（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、三つの結合部位を有するエリスロマイシン依存性トランス活性化因子プロモータシステム（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）、及び六つの結合部位を有するテトラサイクリン依存性トランス活性化因子プロモータシステムは、それぞれ、ＳＢＦＰ２、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎ及びｍＣｉｔｒｉｎｅ蛍光タンパク質の発現を駆動するためにＴＡＴＡ－ＹＢ最小配列（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）の前に配置した。５’－ＵＴＲ配列は、マウスＣｉｉｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ＃ＮＣ００００８２．６）から入手したか、又は二次構造の形成を防止し、それによって異なる調節調節因子によって占有されることを可能にするように設計した。プロモータ及び５’－ＵＴＲ配列を交互エクソン配列（ＳＢＦＰ２ Ｅｘ１、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎ Ｅｘ１及びｍＣｉｔｒｉｎｅ Ｅｘ１）の上流に配置した。コザック配列を一部のカセットでは開始コドンの前に挿入した。長さが異なるイントロン配列（５０～５１６ｂｐ）をマウスＣｉｉｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ＃ＮＣ００００８２．６）から得た。５’スプライス部位配列は異なるポリクロマティック構築物では異なっていた。使用した３’スプライス部位配列は、マウスＣｉｉｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ＃ＮＣ００００８２．６）からのもの、又は以下のもののいずれかであった：５’－ｔｔｔｔｔｔａａｃｔｔｃｃｔｔｔａｔｔｔｔｃｃｔｔａｃａｇ－３’（配列番号１）。スプライシングエンハンサー配列（Ｍｉｙａｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）をｐＪＤ５２及びｐＪＤ１２５のＳＢＦＰ２エクソン１の下流のイントロン配列内に挿入した。終止コドンの下流に配置されたウサギグロビンポリアデニル化シグナルを転写の終結に使用した。初期多色カセットｐＫＢ０１はＧｅｎｅｗｉｚによって新たに合成された。
ＯＲ論理構築物
プロモータ、５’－ＵＴＲ、イントロン及び転写終結配列を上記セクションで記載したように使用した。プロモータ及び５’－ＵＴＲ配列を交互エクソン配列の上流に配置した。代替第一エクソン配列（Ｉａ、Ｉｂ、及びＩｃ）はマウスＣｉｉｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ＃ＮＣ００００８２．６）から得た。交互エクソンの最後のコドンは、交互部分に第一塩基を配置し、共有される第二エクソンに二つの塩基を配置することによって分割された。このため、コード配列がフレーム内にあり、したがってタンパク質が機能的であるために、スプライシングが起こる必要がある。それ以外、第二エクソンは、リンカー（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）とそれに続くｍＣｉｔｒｉｎｅ ＣＤＳで構成されていた。
第一（最も上流の）’スプライス部位の下流５０ｂｐ以内に挿入されたイントロンスプライシングエンハンサー（５’－ｇｔｔｇｇｔｇｇｔｔ－３’；配列番号２）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を使用して、全てのＯＲ論理構築物におけるエクソン１（Ｉａ）とエクソン２（ｍＣｉｔｒｉｎｅとのリンカー）との間の配列のスプライシングを促進した。
プロモータ、５’－ＵＴＲ、イントロン及び転写終結配列を上記セクションで記載したように使用した。プロモータ及び５’－ＵＴＲ配列を交互エクソン配列の上流に配置した。代替第一エクソン配列（Ｉａ、Ｉｂ、及びＩｃ）はマウスＣｉｉｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ＃ＮＣ００００８２．６）から得た。交互エクソンの最後のコドンは、交互部分に第一塩基を配置し、共有される第二エクソンに二つの塩基を配置することによって分割された。このため、コード配列がフレーム内にあり、したがってタンパク質が機能的であるために、スプライシングが起こる必要がある。それ以外、第二エクソンは、リンカー（Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）とそれに続くｍＣｉｔｒｉｎｅ ＣＤＳで構成されていた。
第一（最も上流の）’スプライス部位の下流５０ｂｐ以内に挿入されたイントロンスプライシングエンハンサー（５’－ｇｔｔｇｇｔｇｇｔｔ－３’；配列番号２）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を使用して、全てのＯＲ論理構築物におけるエクソン１（Ｉａ）とエクソン２（ｍＣｉｔｒｉｎｅとのリンカー）との間の配列のスプライシングを促進した。
標準形様論理構築物
代替相乗プロモータを使用して、ＡＮＤ－ＯＲ論理回路を設計した。構築物の構造は、プロモータ構造において若干の変更があるがＯＲ論理構築物に類似したままであった。相乗プロモータは以前に記載されているように設計した（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＳＯＸ１０転写因子の応答エレメント（結合部位）は、ＰＩＴ－ＶＰ１６トランス活性化因子の応答エレメント（結合部位）との相乗効果で配置し、一方、ＨＮＦ１Ａ転写因子の応答エレメント（結合部位）はＥＴトランス活性化因子の応答エレメント（結合部位）との相乗効果で配置した。ＰＩＴトランス活性化因子には二つ又は三つの応答エレメントを使用した。ＥＴトランス活性化因子には（ＯＲ論理構築物において）三つではなく一つの応答エレメントを使用した。トランス活性化因子に関する各転写因子の応答エレメントの配列及び配置を表１に示す。ＮＯＴ論理の場合、ｓｉＲＮＡ－ＦＦ４についての２ｘ標的部位とｓｉＲＮＡ－ＦＦ５についての３ｘ標的部位を代替第一エクソンの５’－ＵＴＲにクローンした（表１）。
代替相乗プロモータを使用して、ＡＮＤ－ＯＲ論理回路を設計した。構築物の構造は、プロモータ構造において若干の変更があるがＯＲ論理構築物に類似したままであった。相乗プロモータは以前に記載されているように設計した（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＳＯＸ１０転写因子の応答エレメント（結合部位）は、ＰＩＴ－ＶＰ１６トランス活性化因子の応答エレメント（結合部位）との相乗効果で配置し、一方、ＨＮＦ１Ａ転写因子の応答エレメント（結合部位）はＥＴトランス活性化因子の応答エレメント（結合部位）との相乗効果で配置した。ＰＩＴトランス活性化因子には二つ又は三つの応答エレメントを使用した。ＥＴトランス活性化因子には（ＯＲ論理構築物において）三つではなく一つの応答エレメントを使用した。トランス活性化因子に関する各転写因子の応答エレメントの配列及び配置を表１に示す。ＮＯＴ論理の場合、ｓｉＲＮＡ－ＦＦ４についての２ｘ標的部位とｓｉＲＮＡ－ＦＦ５についての３ｘ標的部位を代替第一エクソンの５’－ＵＴＲにクローンした（表１）。
表１ 遺伝的論理回路を構築するために使用されるモジュールのＤＮＡ配列。図１～６、及び８～１２に関連。モジュールタイプによって分類した、論理ゲート構築物の様々な構造モジュールのＤＮＡ配列を以下に記載する。表１のモジュールの連結として示された完全な構築物の概略図は、図１０を参照のこと。
注：ｉ）構築物を再構築するために、５’スプライス部位配列のエクソン部分は、すでにＣＤＳエクソン配列に含まれているので、連結されない。ｉｉ）完全コザック配列を作製するために、５’－ＵＴＲとエクソン１ ＣＤＳとの間にＧＣＣ（Ｇ／Ａ）ＣＣヌクレオチドが追加される。ｉｉｉ）また、３’スプライス部位配列は常にイントロン配列の一部である。したがって、構築物を再構築するために、配列を別に追加しない。
注：ｉ）構築物を再構築するために、５’スプライス部位配列のエクソン部分は、すでにＣＤＳエクソン配列に含まれているので、連結されない。ｉｉ）完全コザック配列を作製するために、５’－ＵＴＲとエクソン１ ＣＤＳとの間にＧＣＣ（Ｇ／Ａ）ＣＣヌクレオチドが追加される。ｉｉｉ）また、３’スプライス部位配列は常にイントロン配列の一部である。したがって、構築物を再構築するために、配列を別に追加しない。
組換えＤＮＡ法
使用した様々なキットについて、特に断りのない限り、製造業者の指示に従った。標準的クローニング技術を使用してプラスミドを作製した。ＤＮＡ増幅は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０５３０）を使用して実施した。脱塩プライマー／オリゴヌクレオチド（表２）はＩＤＴ／Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから取り寄せた。脱塩遺伝子フラグメント／合成ＤＮＡ配列／ｇＢｌｏｃｋ（表３）はＩＤＴ／Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから取り寄せた。消化フラグメントは、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００６）又はＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０６）を使用して精製した。ゲル抽出及び精製は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８６０６）又はＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０６）を使用して実施した。制限消化は、ＢｓｔＢＩについては６５℃で、ＳｆｉＩについては５０℃で、ＢｔｇＺＩについては７０℃で、他の全ての酵素については３７℃で実施した。ライゲーション反応はＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０２）を使用して実施した。ケミカルコンピテントセル－Ｔｏｐ１０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ４０４０１０）及びＪＭ１０９（Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｔ３００３）を調製するために、Ｍｉｘ ａｎｄ Ｇｏ Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換キット（Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｔ３００１）を使用した。また、社内で調製したＭａｃｈ１エレクトロコンピテントセル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ８６２００３）及びケミカルコンピテントＳｔｂｌ３セル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ７３７３０３）をクローニングに使用した。陽性クローンのスクリーニングは、制限消化を用いるか、又はＱｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ Ｔａｑ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２７１）を用いたコロニーＰＣＲを実施するかのいずれかで実施した。陽性クローンからのプラスミド単離は、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＰＬＮ３５０－１ＫＴ）を使用して実施した。全てのプラスミドは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（スイス国）が提供するＳａｎｇｅｒシークエンシングサービスを用いて検証した。形質転換細菌は、適切な抗生物質（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９５１８）及びカナマイシン５０μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｋ４０００））を追加したＤｉｆｃｏ ＬＢブロス、Ｍｉｌｌｅｒ（ＢＤ、カタログ番号２４４６１０）中で培養した。ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ－ｐｒｅｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ２１００１４）をプラスミド単離及び精製に使用した。精製したプラスミドからエンドトキシンを除去するためにＥｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｎｏｒｇｅｎ、カタログ番号５２２００）を使用した。ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）は、１ｘギブソンアセンブリ緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．０１Ｍ ＤＴＴ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－８０００、１ｍＭ ＮＡＤ）、０．０４単位のＴ５エクソヌクレアーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０３６３）、０．２５単位のＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０５３０）及び４０単位のＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０８）中でベクター（５０ｎｇ）及びインサート（５モル当量）を混合することによって、５０℃で１時間、２０μＬの最終体積で実施した。ギブソンアセンブリ用の負の対照にはベクターだけが含まれていた。オリゴクローニングには、主鎖フラグメントとのライゲーション前にオリゴヌクレオチドのリン酸化とアニーリングが含まれていた。３μＬのオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（１００μＭ）、５μＬの１０ｘＰＮＫ緩衝液、５μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）、１．５μＬのＴ４ ＰＮＫ（１０Ｕ／μＬ）（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０１）及び３４μＬのｄｄＨ２Ｏを一緒に添加し、続いて３７℃で３０分間インキュベーションすることによって、オリゴヌクレオチドのリン酸化を実施した。それぞれ２５μＬのリン酸化オリゴヌクレオチドを混合し、次にサーモサイクラー中で９５℃にて３分間、その後、次の１７０分間は１分ごとに０．５℃低下させてインキュベートすることによってアニーリングを実施した。１μＬの１：２０希釈（ｄｄＨ２Ｏで）し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドをライゲーション反応に使用した。
使用した様々なキットについて、特に断りのない限り、製造業者の指示に従った。標準的クローニング技術を使用してプラスミドを作製した。ＤＮＡ増幅は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０５３０）を使用して実施した。脱塩プライマー／オリゴヌクレオチド（表２）はＩＤＴ／Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから取り寄せた。脱塩遺伝子フラグメント／合成ＤＮＡ配列／ｇＢｌｏｃｋ（表３）はＩＤＴ／Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから取り寄せた。消化フラグメントは、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００６）又はＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８１０６）を使用して精製した。ゲル抽出及び精製は、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８６０６）又はＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０６）を使用して実施した。制限消化は、ＢｓｔＢＩについては６５℃で、ＳｆｉＩについては５０℃で、ＢｔｇＺＩについては７０℃で、他の全ての酵素については３７℃で実施した。ライゲーション反応はＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０２）を使用して実施した。ケミカルコンピテントセル－Ｔｏｐ１０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ４０４０１０）及びＪＭ１０９（Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｔ３００３）を調製するために、Ｍｉｘ ａｎｄ Ｇｏ Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換キット（Ｚｙｍｏ、カタログ番号Ｔ３００１）を使用した。また、社内で調製したＭａｃｈ１エレクトロコンピテントセル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ８６２００３）及びケミカルコンピテントＳｔｂｌ３セル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ７３７３０３）をクローニングに使用した。陽性クローンのスクリーニングは、制限消化を用いるか、又はＱｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ Ｔａｑ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２７１）を用いたコロニーＰＣＲを実施するかのいずれかで実施した。陽性クローンからのプラスミド単離は、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ－ｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＰＬＮ３５０－１ＫＴ）を使用して実施した。全てのプラスミドは、Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（スイス国）が提供するＳａｎｇｅｒシークエンシングサービスを用いて検証した。形質転換細菌は、適切な抗生物質（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９５１８）及びカナマイシン５０μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｋ４０００））を追加したＤｉｆｃｏ ＬＢブロス、Ｍｉｌｌｅｒ（ＢＤ、カタログ番号２４４６１０）中で培養した。ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉ－ｐｒｅｐキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ２１００１４）をプラスミド単離及び精製に使用した。精製したプラスミドからエンドトキシンを除去するためにＥｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｎｏｒｇｅｎ、カタログ番号５２２００）を使用した。ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）は、１ｘギブソンアセンブリ緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．０１Ｍ ＤＴＴ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ－８０００、１ｍＭ ＮＡＤ）、０．０４単位のＴ５エクソヌクレアーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０３６３）、０．２５単位のＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０５３０）及び４０単位のＴａｑ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０８）中でベクター（５０ｎｇ）及びインサート（５モル当量）を混合することによって、５０℃で１時間、２０μＬの最終体積で実施した。ギブソンアセンブリ用の負の対照にはベクターだけが含まれていた。オリゴクローニングには、主鎖フラグメントとのライゲーション前にオリゴヌクレオチドのリン酸化とアニーリングが含まれていた。３μＬのオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（１００μＭ）、５μＬの１０ｘＰＮＫ緩衝液、５μＬのＡＴＰ（１０ｍＭ）、１．５μＬのＴ４ ＰＮＫ（１０Ｕ／μＬ）（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０２０１）及び３４μＬのｄｄＨ２Ｏを一緒に添加し、続いて３７℃で３０分間インキュベーションすることによって、オリゴヌクレオチドのリン酸化を実施した。それぞれ２５μＬのリン酸化オリゴヌクレオチドを混合し、次にサーモサイクラー中で９５℃にて３分間、その後、次の１７０分間は１分ごとに０．５℃低下させてインキュベートすることによってアニーリングを実施した。１μＬの１：２０希釈（ｄｄＨ２Ｏで）し、アニーリングしたオリゴヌクレオチドをライゲーション反応に使用した。
トランスフェクション
全てのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１６６８－０２７）を使用し、提案されたガイドラインに従って実施した。２４ウェルプレート（カタログ番号１４２４７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）又は６ウェルプレート（カタログ番号１４０６７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（ＲＮＡシーケンシング用）のいずれかでトランスフェクションを実施した。トランスフェクション時に７０～８０％程度ノコンフルエンシーとなるように、トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェルプレート中のＨＥＫ２９３、安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３については７．５＊１０４、６ウェルプレート中のＨＥＫ２９３については３．５＊１０５、２４ウェルプレート中のＨｅＬａについては５．５＊１０４の密度で、細胞を各ウェル中に播種した。１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を追加したＤＭＥＭをＨＥＫ２９３細胞の播種に使用し、１０％ＦＢＳを追加し、抗生物質を追加しないＤＭＥＭをＨｅＬａ細胞の播種に使用した。各トランスフェクションについて使用した適切な量のプラスミドを混合し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１９８５－０６２）を使用して５０μＬ（２４ウェル）又は２５０μＬ（６ウェル）（ＤＮＡ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックス）の最終体積にした。ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞に使用したＤＮＡ（μｇ）のリポフェクタミン２０００（μＬ）に対する比は、それぞれ１：３及び１：２．５であった。適切な体積のリポフェクタミン２０００を取り、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを使用して最終体積を５０μＬ（２４ウェル）又は２５０μＬ（６ウェル）（ｌｉｐｏ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックス）にした。リポフェクタミン２０００ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスを室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、ミックスをＤＮＡ－ＯｐｔｉＭＥＭミックスに添加し、１５～２０分間インキュベートした後、細胞に滴下した。図１～４、８、９、１１に示す実験は、ＨＥＫ２９３細胞で実施した。また、図４及び１１には、安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３細胞に対する実験から得られたデータが示されている。図５、６及び１２に示す実験はＨｅＬａ細胞で実施した。
全てのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００トランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１６６８－０２７）を使用し、提案されたガイドラインに従って実施した。２４ウェルプレート（カタログ番号１４２４７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）又は６ウェルプレート（カタログ番号１４０６７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）（ＲＮＡシーケンシング用）のいずれかでトランスフェクションを実施した。トランスフェクション時に７０～８０％程度ノコンフルエンシーとなるように、トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェルプレート中のＨＥＫ２９３、安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３については７．５＊１０４、６ウェルプレート中のＨＥＫ２９３については３．５＊１０５、２４ウェルプレート中のＨｅＬａについては５．５＊１０４の密度で、細胞を各ウェル中に播種した。１０％のＦＢＳ及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液を追加したＤＭＥＭをＨＥＫ２９３細胞の播種に使用し、１０％ＦＢＳを追加し、抗生物質を追加しないＤＭＥＭをＨｅＬａ細胞の播種に使用した。各トランスフェクションについて使用した適切な量のプラスミドを混合し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１９８５－０６２）を使用して５０μＬ（２４ウェル）又は２５０μＬ（６ウェル）（ＤＮＡ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックス）の最終体積にした。ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞に使用したＤＮＡ（μｇ）のリポフェクタミン２０００（μＬ）に対する比は、それぞれ１：３及び１：２．５であった。適切な体積のリポフェクタミン２０００を取り、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを使用して最終体積を５０μＬ（２４ウェル）又は２５０μＬ（６ウェル）（ｌｉｐｏ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックス）にした。リポフェクタミン２０００ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスを室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、ミックスをＤＮＡ－ＯｐｔｉＭＥＭミックスに添加し、１５～２０分間インキュベートした後、細胞に滴下した。図１～４、８、９、１１に示す実験は、ＨＥＫ２９３細胞で実施した。また、図４及び１１には、安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３細胞に対する実験から得られたデータが示されている。図５、６及び１２に示す実験はＨｅＬａ細胞で実施した。
図１、２、８及び９の出力発現値を得るために、２００ｎｇの適切なプラスミドを５０ｎｇのトランスフェクション対照（ｐＫＨ０２６、Ｅｆ１ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ）及び必要に応じて５０ｎｇのインデューサプラスミド（ｐＭＦ２０６ ＣＭＶ－ＰＩＴ２（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）；ｐＥＬ１９０ＣＭＶ－ＥＴ１（Ｐｒｏｃｈａｚｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）；ｐＢＡ１６６ ＣＭＶ－ｔＴＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、カタログ番号６３１０７０））でトランスフェクトした。トランス活性化因子を含まないウェル中（「入力無し」の条件）で、５０ｎｇのジャンクＤＮＡ（ｐＢＨ２６５（Ｈａｅｆｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６））を使用した。
図３、４及び１１の一時的構築物の出力発現値を得るために、１００ｎｇの適切なプラスミド（ｐＪＤ１３９又はｐＪＤ１４５又はｐＪＤ１４０又はｐＪＤ８０又はｐＪＤ８３）を、５０ｎｇのトランスフェクション対照（ｐＫＨ０２６、Ｅｆ１ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ）及び必要に応じて５０ｎｇのインデューサプラスミド（ｐＭＦ２０６ ＣＭＶ－ＰＩＴ２；ｐＥＬ１９０ ＣＭＶ－ＥＴ１；ｐＢＡ１６６ ＣＭＶ－ｔＴＡ）でトランスフェクトした。図４及び１１の安定な構築物の出力発現値を得るために、５０ｎｇのトランスフェクション対照（ｐＫＨ０２６、Ｅｆ１ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ）を、必要に応じて５０ｎｇのインデューサプラスミド（ｐＭＦ２０６ ＣＭＶ－ＰＩＴ２；ｐＥＬ１９０ ＣＭＶ－ＥＴ１；ｐＢＡ１６６ ＣＭＶ－ｔＴＡ）でトランスフェクトした。図５、１２及び６について、１００ｎｇの適切なプラスミド（ｐＪＤ２１９又はｐＪＤ１９８又はｐＪＤ１７８又はｐＪＤ２０４）を、必要に応じて適切な量のインデューサプラスミド（５．５ｎｇのｐＪＤ７０ ＣＭＶ－ＰＩＴ－ＶＰ１６；５０ｎｇのｐＢＡ４１７ ｍＣｈｅｒｒｙ－ＴＲＥ二方向－ＳＯＸ１０（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）；２２ｎｇのｐＥＬ１９０ ＣＭ－ＥＴ１；５０ｎｇのｐＥＭ００３ ｍＣｈｅｒｒｙ－ＴＲＥ二方向－ＳＯＸ１０（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６））でトランスフェクトした。適切な量のジャンクＤＮＡ（ｐＢＨ２６５）を添加して、上記実験において様々な入力条件にわたってトランスフェクトされるＤＮＡの量を一定に保った。
ＲＮＡシーケンシング実験に関して、１０００ｎｇの適切なプラスミド（ｐＫＢ０１又はｐＪＤ４９）を、２５０ｎｇのトランスフェクション対照（ｐＫＨ０２６、Ｅｆ１ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ）及び必要に応じて２５０ｎｇのインデューサプラスミド（ｐＭＦ２０６ ＣＭＶ－ＰＩＴ２；ｐＥＬ１９０ ＣＭＶ－ＥＴ１；ｐＢＡ１６６ ＣＭＶ－ｔＴＡ）でトランスフェクトした。トランス活性化因子を含まないウェル中（「入力無し」の条件）で、２５０ｎｇのジャンクＤＮＡ（ｐＢＨ２６５）を使用した。
５ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ ＦＦ４（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）及び１０ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡ ＦＦ５（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を必要に応じてトランスフェクションミックスに添加した。５／１０ｐｍｏｌのｍｉＲＩＤＩＡＮ陰性対照＃２（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、カタログ番号ＣＮ－００２０００－０１－０５）を添加して、様々な入力条件にわたってｓｉＲＮＡの量を一定に保った。ｓｉＲＮＡの配列は表２に記載されている。ｓｉＲＮＡをＤＮＡ－ＯｐｔｉＭＥＭミックスに添加した。ｓｉＲＮＡには、適切な量のリポフェクタミン２０００を添加した。ｓｉＲＮＡを含むウェルのトランスフェクションについては、あらかじめ温めた新鮮な培地を使用して、トランスフェクション後１２～１５時間に既存の培地を置換した。
フローサイトメトリー
トランスフェクションの４８時間後に細胞をフローサイトメータで分析した。ＨＥＫ２９３細胞は、培地を除去し、細胞にＰＢＳ１ｘ、ｐＨ７．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１００１０－０１５）及びＡｃｃｕｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１１１０５－０１）の１：１ミックスを合計体積１００μＬで追加することによってフローサイトメトリー用に調製し、ＨｅＬａ細胞は、培地を除去し、細胞に１００μＬのＡｃｃｕｔａｓｅを供給することによって調製した。細胞を５～８分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
細胞を再懸濁し、氷上に保持した微量希釈チューブ（カタログ番号０２－１４１２－００００、Ｌｉｆｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｓｉｇｎ）に移した。この後、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＩＩ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分析した。機械は、使用前にＳｐｈｅｒｏ Ｒａｉｎｂｏｗ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ８ピークビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＰＣＰ－３０－５Ａ）で較正した。各々の蛍光タンパク質測定に使用した励起レーザ（Ｅｘ）及び発光フィルター（Ｅｍ）は以下のとおりである：ＳＢＦＰ２（Ｅｘ：４０５ｎｍ、Ｅｍ：４４５／２０ｎｍ）、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ／ＣＦＰ（Ｅｘ：４４５ｎｍ、Ｅｍ：４７３／１０ｎｍ）、ｍＣｉｔｒｉｎｅ（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０／１１ｎｍ、ロングパスフィルタ―５０５ｎｍ）、及びｍＣｈｅｒｒｙ（Ｅｘ：５６１ｎｍ、Ｅｍ：６１０／２０ｎｍ、ロングパスフィルタ―６００ｎｍ）。異なる蛍光チャネルの光電子増倍管（ＰＭＴ）電圧は、８ピークビーズの平均値が様々な実験にわたって一定に保たれるように調節した。参考を提供するために、ｍＣｉｔｒｉｎｅについては２００ｍＶ、ｍＣｈｅｒｒｙ（トランスフェクション対照）については２２０ｍＶ、ＳＢＦＰ２については２５０ｍＶ、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎについては２１０ｍＶで、ポリクロマティックレポータ及びＯＲ論理構築物の測定を実施した。ＤＮＦ様論理試験の場合、測定は、ｍＣｉｔｒｉｎｅについては２３０ｍＶ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ（トランスフェクション対照）については２２５ｍＶで実施した。
トランスフェクションの４８時間後に細胞をフローサイトメータで分析した。ＨＥＫ２９３細胞は、培地を除去し、細胞にＰＢＳ１ｘ、ｐＨ７．４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号１００１０－０１５）及びＡｃｃｕｔａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１１１０５－０１）の１：１ミックスを合計体積１００μＬで追加することによってフローサイトメトリー用に調製し、ＨｅＬａ細胞は、培地を除去し、細胞に１００μＬのＡｃｃｕｔａｓｅを供給することによって調製した。細胞を５～８分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
細胞を再懸濁し、氷上に保持した微量希釈チューブ（カタログ番号０２－１４１２－００００、Ｌｉｆｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｅｓｉｇｎ）に移した。この後、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＩＩ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分析した。機械は、使用前にＳｐｈｅｒｏ Ｒａｉｎｂｏｗ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ８ピークビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＰＣＰ－３０－５Ａ）で較正した。各々の蛍光タンパク質測定に使用した励起レーザ（Ｅｘ）及び発光フィルター（Ｅｍ）は以下のとおりである：ＳＢＦＰ２（Ｅｘ：４０５ｎｍ、Ｅｍ：４４５／２０ｎｍ）、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ／ＣＦＰ（Ｅｘ：４４５ｎｍ、Ｅｍ：４７３／１０ｎｍ）、ｍＣｉｔｒｉｎｅ（Ｅｘ：４８８ｎｍ、Ｅｍ：５３０／１１ｎｍ、ロングパスフィルタ―５０５ｎｍ）、及びｍＣｈｅｒｒｙ（Ｅｘ：５６１ｎｍ、Ｅｍ：６１０／２０ｎｍ、ロングパスフィルタ―６００ｎｍ）。異なる蛍光チャネルの光電子増倍管（ＰＭＴ）電圧は、８ピークビーズの平均値が様々な実験にわたって一定に保たれるように調節した。参考を提供するために、ｍＣｉｔｒｉｎｅについては２００ｍＶ、ｍＣｈｅｒｒｙ（トランスフェクション対照）については２２０ｍＶ、ＳＢＦＰ２については２５０ｍＶ、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎについては２１０ｍＶで、ポリクロマティックレポータ及びＯＲ論理構築物の測定を実施した。ＤＮＦ様論理試験の場合、測定は、ｍＣｉｔｒｉｎｅについては２３０ｍＶ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ（トランスフェクション対照）については２２５ｍＶで実施した。
データ解析
棒グラフのフローサイトメトリーデータ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。本研究で、本発明者等は、フローサイトメトリーから得られた蛍光値を表すために相対的発現単位及びプロモータ正規化単位を使用した。プロモータ正規化単位は、ポリクロマティックレポータカセットの棒グラフで利用する。相対的発現単位は、ＯＲ論理及びＤＮＦ様論理（ＡＮＤ－ＯＲ、ＡＮＤ－ＯＲ－ＮＯＴ）構築物の棒グラフで利用する。ＦｌｏｗＪｏを使用して実施されるゲーティング戦略を図１３に示す。
棒グラフのフローサイトメトリーデータ解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。本研究で、本発明者等は、フローサイトメトリーから得られた蛍光値を表すために相対的発現単位及びプロモータ正規化単位を使用した。プロモータ正規化単位は、ポリクロマティックレポータカセットの棒グラフで利用する。相対的発現単位は、ＯＲ論理及びＤＮＦ様論理（ＡＮＤ－ＯＲ、ＡＮＤ－ＯＲ－ＮＯＴ）構築物の棒グラフで利用する。ＦｌｏｗＪｏを使用して実施されるゲーティング戦略を図１３に示す。
以下のステップは、両測定基準の算出について同じである。
（ｉ）生細胞は、前方散乱面積対側方散乱面積プロットに基づいてゲーティングした。
（ｉｉ）生細胞集団内で、単細胞を前方散乱面積対前方散乱幅に基づいてゲーティングした。
（ｉｉｉ）蛍光タンパク質チャネル間のクロストークを説明するために、構成的に発現された蛍光タンパク質－ＳＢＦＰ２、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ及びｍＣｈｅｒｒｙで個々にトランスフェクトされた細胞に基づいて補償マトリックスを定義した。一つの蛍光チャネルから他の蛍光チャネルへのクロストークが観察され、手動で補償された。結果として得られたマトリックスを次にすべてのサンプルに適用した。
（ｉｖ）単細胞集団内で、所与の蛍光チャネルに対して陽性の細胞を、陰性対照（トランスフェクトされていない）サンプルに基づいて、対照細胞の９９．９％が選択されたゲートの外側になるようにゲーティングした。
（ｖ）所与の蛍光チャネル中の各陽性細胞集団について、Ｆｌｏｗｊｏを使用して、蛍光の平均値及び陽性細胞の頻度を算出した。これら二つの値を乗算して、蛍光タンパクシグナルの直接的尺度である絶対強度を得る。
（ｖｉ）所与の蛍光タンパク質（Ｙ）の絶対強度を、当該サンプル中のトランスフェクション対照の陽性細胞の頻度によって正規化すると、相対的発現単位（ｒｅｌ．ｕ．）が得られる。これは、次式で表すことができる：
（ｉ）生細胞は、前方散乱面積対側方散乱面積プロットに基づいてゲーティングした。
（ｉｉ）生細胞集団内で、単細胞を前方散乱面積対前方散乱幅に基づいてゲーティングした。
（ｉｉｉ）蛍光タンパク質チャネル間のクロストークを説明するために、構成的に発現された蛍光タンパク質－ＳＢＦＰ２、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ及びｍＣｈｅｒｒｙで個々にトランスフェクトされた細胞に基づいて補償マトリックスを定義した。一つの蛍光チャネルから他の蛍光チャネルへのクロストークが観察され、手動で補償された。結果として得られたマトリックスを次にすべてのサンプルに適用した。
（ｉｖ）単細胞集団内で、所与の蛍光チャネルに対して陽性の細胞を、陰性対照（トランスフェクトされていない）サンプルに基づいて、対照細胞の９９．９％が選択されたゲートの外側になるようにゲーティングした。
（ｖ）所与の蛍光チャネル中の各陽性細胞集団について、Ｆｌｏｗｊｏを使用して、蛍光の平均値及び陽性細胞の頻度を算出した。これら二つの値を乗算して、蛍光タンパクシグナルの直接的尺度である絶対強度を得る。
（ｖｉ）所与の蛍光タンパク質（Ｙ）の絶対強度を、当該サンプル中のトランスフェクション対照の陽性細胞の頻度によって正規化すると、相対的発現単位（ｒｅｌ．ｕ．）が得られる。これは、次式で表すことができる：
プロモータ正規化単位を計算するために行われる追加のステップは次のとおりである：
ｖｉｉ）異なるポリクロマティックレポータカセット間で蛍光タンパク質の発現値を比較し、またスプライシングの実際の効果を観察するために、プロモータ強度や他の調節機能（５’－ＵＴＲ及びリボソーム結合部位）から生じる蛍光タンパク質の発現強度差の正規化を実施した。この目的のために、一連の「対照」構築物（ｐＫＢ０２、ｐＪＤ２０７、ｐＪＤ２０９、ｐＪＤ２１０、ｐＫＢ０３、ｐＪＤ１５７、ｐＪＤ２０８及びｐＫＢ０４）を生成し、正規化に利用した（図８Ｃ）。蛍光タンパク質発現値は、これらの「対照」構築物でトランスフェクトされた細胞から測定した。さらに、相対的発現単位は上述のように求めた。
ｖｉｉｉ）各蛍光タンパク質の各ポリクロマティックレポータカセットの相対的発現単位は上述のように計算した。プロモータ正規化単位（ｎｏｒｍ．ｕ．）は以下の式により求めた：
ｖｉｉ）異なるポリクロマティックレポータカセット間で蛍光タンパク質の発現値を比較し、またスプライシングの実際の効果を観察するために、プロモータ強度や他の調節機能（５’－ＵＴＲ及びリボソーム結合部位）から生じる蛍光タンパク質の発現強度差の正規化を実施した。この目的のために、一連の「対照」構築物（ｐＫＢ０２、ｐＪＤ２０７、ｐＪＤ２０９、ｐＪＤ２１０、ｐＫＢ０３、ｐＪＤ１５７、ｐＪＤ２０８及びｐＫＢ０４）を生成し、正規化に利用した（図８Ｃ）。蛍光タンパク質発現値は、これらの「対照」構築物でトランスフェクトされた細胞から測定した。さらに、相対的発現単位は上述のように求めた。
ｖｉｉｉ）各蛍光タンパク質の各ポリクロマティックレポータカセットの相対的発現単位は上述のように計算した。プロモータ正規化単位（ｎｏｒｍ．ｕ．）は以下の式により求めた：
上記式において、分子と分母はどちらも標準偏差値を有している。したがって、以下の式を使用して誤差伝播を実施した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｏａｓ．ｕｂｃ．ｃａ／ｃｏｕｒｓｅｓ／ｅｏｓｃ２５２／ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ－ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ－ｆｊ．ｈｔｍ）。Ｒａ及びＲｂの標準偏差値をＳＤａ及びＳＤｂとする。
顕微鏡法
蛍光タンパク質発現は、トランスフェクションの４８時間後に蛍光顕微鏡法を用いて画像化した。機械化されたステージと３７℃に保持された温度制御チャンバーとを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡を使用して画像を取得した。励起光はＮｉｋｏｎ ＩｎｔｅｎｓｉＬｉｇｈｔ Ｃ－ＨＧＦＩ水銀ランプ又はＬＥＤ光源によって生成させ、最適化Ｓｅｍｒｏｃｋフィルターキューブのセットを通してフィルタリングした。結果として得られる画像は、１０Ｘ対物レンズを用いてＨａｍｍａｍａｔｓｕ、ＯＲＣＡ Ｒ２又はＦｌａｓｈ４カメラによって収集した。以下の最適励起（Ｅｘ）、発光（Ｅｍ）及びダイクロイック（Ｄｃ）フィルターを使用して、異なる蛍光チャネルｍＣｉｔｒｉｎｅ間のクロストークを最小限に抑えた（２０％強度のＥｘ５００／２４ｎｍ又は５１３ｎｍＬＥＤ、Ｅｍ５４２／２７ｎｍ、Ｄｃ５２０ｎｍ）、ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｅｘ５６２／４０ｎｍ、Ｅｍ６２４／４０ｎｍ、Ｄｃ５９３ｎｍ）、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎ（２０％強度のＥｘ４３８／２４又は４３８ｎｍＬＥＤ、Ｅｍ４８３／３２ｎｍ、Ｄｃ４５８ｎｍ）及びＳＢＦＰ２（Ｅｘ３７０／３６ｎｍ、Ｅｍ４８３／３２ｎｍ、Ｄｃ４５８ｎｍ）。全ての実験の露光時間、ルックアップテーブル（ＬＵＴ）及び倍率は、図の説明文に示されている。図面作成用の画像処理は、Ｆｉｊｉソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｅｔ／）を使用して実施した。
蛍光タンパク質発現は、トランスフェクションの４８時間後に蛍光顕微鏡法を用いて画像化した。機械化されたステージと３７℃に保持された温度制御チャンバーとを備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡を使用して画像を取得した。励起光はＮｉｋｏｎ ＩｎｔｅｎｓｉＬｉｇｈｔ Ｃ－ＨＧＦＩ水銀ランプ又はＬＥＤ光源によって生成させ、最適化Ｓｅｍｒｏｃｋフィルターキューブのセットを通してフィルタリングした。結果として得られる画像は、１０Ｘ対物レンズを用いてＨａｍｍａｍａｔｓｕ、ＯＲＣＡ Ｒ２又はＦｌａｓｈ４カメラによって収集した。以下の最適励起（Ｅｘ）、発光（Ｅｍ）及びダイクロイック（Ｄｃ）フィルターを使用して、異なる蛍光チャネルｍＣｉｔｒｉｎｅ間のクロストークを最小限に抑えた（２０％強度のＥｘ５００／２４ｎｍ又は５１３ｎｍＬＥＤ、Ｅｍ５４２／２７ｎｍ、Ｄｃ５２０ｎｍ）、ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｅｘ５６２／４０ｎｍ、Ｅｍ６２４／４０ｎｍ、Ｄｃ５９３ｎｍ）、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎ（２０％強度のＥｘ４３８／２４又は４３８ｎｍＬＥＤ、Ｅｍ４８３／３２ｎｍ、Ｄｃ４５８ｎｍ）及びＳＢＦＰ２（Ｅｘ３７０／３６ｎｍ、Ｅｍ４８３／３２ｎｍ、Ｄｃ４５８ｎｍ）。全ての実験の露光時間、ルックアップテーブル（ＬＵＴ）及び倍率は、図の説明文に示されている。図面作成用の画像処理は、Ｆｉｊｉソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｅｔ／）を使用して実施した。
レンチウイルス産生及び形質導入
レンチウイルス産生プロトコルはＡｄｄｇｅｎｅ （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ／）から適合させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６０ｃｍ２のプレート（カタログ番号９３１００、ＴＰＰ）あたり３．８＊１０６細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で約２０時間インキュベートした。１０％ＦＢＳが追加され、抗生物質は追加されていないＤＭＥＭをレンチウイルス産生のための細胞培養で使用した。
２０時間後、培地を静かに吸引し、１０μＬの２５ｍＭクロロキン二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ６６２８－２５Ｇ）を含む、あらかじめ温めた１０ｍＬの培地を供給した。細胞を５時間インキュベートした後、クロロキン二リン酸を含まない培地と置換した。以下の成分：１５μｇのトランスファープラスミド（ｐＪＤ１６３又はｐＪＤ１６４又はｐＪＤ１６５）、１０μｇのｐＪＤ１４、２μｇのｐＪＤ１５、１μｇのｐＪＤ１６を混合することによってＤＮＡ－Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスを調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを用いて最終体積を５００μＬにした。別に、ＤＮＡ（μｇ）：ＰＥＩ（μｇ）比が１：３のままであるように８４μｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２４７６５－１）をＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加することによって、５００μＬのＰＥＩ－Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスを調製した。次いで、ＰＥＩ－Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスをＤＮＡ－Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスに静かに滴下し、室温で１５～２０分間インキュベートした。トランスフェクションミックスをＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞に滴下し、１８時間インキュベートした。次いで、培地を静かに吸引し、１５ｍＬのあらかじめ温めた新鮮な培地を供給した。上清（培地）中に存在するレンチウイルスを４８時間で収集し、細胞に１５ｍＬのあらかじめ温めた新鮮な培地を供給した。トランスフェクションの７２時間後で同様に繰り返した。４８及び７２時間のレンチウイルス収集物を一緒にプールした。プールしたレンチウイルスを５００ｘｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号１６５５５－Ｋ）を使用しろ過した。製造業者の指示に従うことによる濃縮及び緩衝液交換のために、ウイルス上清をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心ろ過機（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９１００９６）にロードした。レンチウイルス滴定は、製造業者の指示に従うことによって、ｑＰＣＲレンチウイルス完全滴定キット（ａｂｍ、カタログ番号ＬＶ９００－Ｓ）を使用して実施した。三つのレンチウイルスの１ｍＬ当たりの感染単位（ＩＵ／ｍＬ）は以下のとおりである：ｐＪＤ１６３－１．２１Ｅ＋０８ＩＵ／ｍＬ、ｐＪＤ１６４－１．２６Ｅ＋０８ＩＵ／ｍＬ及びｐＪＤ１６５－１．８９Ｅ＋０８ＩＵ／ｍＬ。ウイルスを等分（２００μＬアリコート）し、－８０℃で保存した。
レンチウイルス産生プロトコルはＡｄｄｇｅｎｅ （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ／）から適合させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６０ｃｍ２のプレート（カタログ番号９３１００、ＴＰＰ）あたり３．８＊１０６細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で約２０時間インキュベートした。１０％ＦＢＳが追加され、抗生物質は追加されていないＤＭＥＭをレンチウイルス産生のための細胞培養で使用した。
２０時間後、培地を静かに吸引し、１０μＬの２５ｍＭクロロキン二リン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ６６２８－２５Ｇ）を含む、あらかじめ温めた１０ｍＬの培地を供給した。細胞を５時間インキュベートした後、クロロキン二リン酸を含まない培地と置換した。以下の成分：１５μｇのトランスファープラスミド（ｐＪＤ１６３又はｐＪＤ１６４又はｐＪＤ１６５）、１０μｇのｐＪＤ１４、２μｇのｐＪＤ１５、１μｇのｐＪＤ１６を混合することによってＤＮＡ－Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスを調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを用いて最終体積を５００μＬにした。別に、ＤＮＡ（μｇ）：ＰＥＩ（μｇ）比が１：３のままであるように８４μｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号２４７６５－１）をＯｐｔｉ－ＭＥＭに添加することによって、５００μＬのＰＥＩ－Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスを調製した。次いで、ＰＥＩ－Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスをＤＮＡ－Ｏｐｔｉ－ＭＥＭミックスに静かに滴下し、室温で１５～２０分間インキュベートした。トランスフェクションミックスをＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞に滴下し、１８時間インキュベートした。次いで、培地を静かに吸引し、１５ｍＬのあらかじめ温めた新鮮な培地を供給した。上清（培地）中に存在するレンチウイルスを４８時間で収集し、細胞に１５ｍＬのあらかじめ温めた新鮮な培地を供給した。トランスフェクションの７２時間後で同様に繰り返した。４８及び７２時間のレンチウイルス収集物を一緒にプールした。プールしたレンチウイルスを５００ｘｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号１６５５５－Ｋ）を使用しろ過した。製造業者の指示に従うことによる濃縮及び緩衝液交換のために、ウイルス上清をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心ろ過機（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ９１００９６）にロードした。レンチウイルス滴定は、製造業者の指示に従うことによって、ｑＰＣＲレンチウイルス完全滴定キット（ａｂｍ、カタログ番号ＬＶ９００－Ｓ）を使用して実施した。三つのレンチウイルスの１ｍＬ当たりの感染単位（ＩＵ／ｍＬ）は以下のとおりである：ｐＪＤ１６３－１．２１Ｅ＋０８ＩＵ／ｍＬ、ｐＪＤ１６４－１．２６Ｅ＋０８ＩＵ／ｍＬ及びｐＪＤ１６５－１．８９Ｅ＋０８ＩＵ／ｍＬ。ウイルスを等分（２００μＬアリコート）し、－８０℃で保存した。
形質導入のために、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレート（カタログ番号ＮＣ１４０６７５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にウェルあたり３＊１０５細胞の密度で播種した。あらかじめ解凍したレンチウイルス（２００μＬ）を播種後の細胞に直ちに添加して、構築物ｐＪＤ１６３、ｐＪＤ１６４及びｐＪＤ１６５から生成したレンチウイルスに対してそれぞれ８０、８４及び１２６のＭＯＩを得た。１０％ＦＢＳが追加され、抗生物質が追加されていないＤＭＥＭを細胞の培地として使用した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で培養した。必要な場合、細胞を分割した。細胞が分割されたら、抗生物質を含む培地を使用した。トランスフェクションとさらなる分析のために、形質導入された未選別の細胞をウェルあたり７．５＊１０４細胞で播種した。
ゲノム組込み後の導入遺伝子完全性はＰＣＲを用いてチェックした。まず、製造業者の指示に従ってＤＮＥａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号６９５０４）を使用して、形質導入細胞及び非形質導入細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。プライマーＰＲ３１６３及びＰＲ６１２９を使用して、抽出されたゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）サンプルに対してＰＣＲを実施した。サーモサイクラープログラムは以下のとおりであった：９８℃で４５秒；９８℃で１０秒、５７℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル；７２℃で５分。ＰＣＲ産物を分析のために１％アガロースゲルにロートした。４０ｎｇのプラスミド－ｐＪＤ１６３、ｐＪＤ１６４、ｐＪＤ１６５を陽性対照のテンプレートとして使用し、非形質導入細胞のゲノムＤＮＡを負の対照のテンプレートとして使用した。
ＲＮＡ－ｓｅｑサンプル調製及びデータ解析
簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートにウェルあたり３．５＊１０５細胞の密度で播種した。２４時間後、細胞を関連入力（ＰＩＴ、ＥＴ、ｔＴＡ）での３プロモータポリクロマティックレポータ（ｐＫＢ０１又はｐＪＤ４９）でトランスフェクトした。ＤＮＡ量及び他の関連情報は「トランスフェクション」の項に記載されている。非形質転換細胞もサンプルとして実験に含めた。この実験では生物学的複製を作製しなかった。トランスフェクションの４８時間後に、ウェルから培地を除去し、細胞にＰＢＳ１ｘ、ｐＨ７．４及びトリプシンの１：１ミックスを合計体積５００μＬで供給することによって細胞をウェル表面から剥がした。細胞を５～８分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。５００μＬの培地を添加することによってトリプシンを不活性化した。細胞を再懸濁し、サンプルごとに計数した。細胞質ＲＮＡ抽出プロセスのために、各サンプルについて同数（１．５４＊１０６）の細胞を採取した。抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）を製造業者の指示どおりに使用して実施した。以下の成分：５ｍＬのＴｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ８．０（ＡＭＲｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１９９－５００ＭＬ）、０．８１ｇのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３０１４－１ＫＧ）、３ｍＬの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１３５１２）、２．５ｍＬのＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０（１０％）を混合することによって細胞質ＲＮＡ抽出用に１００ｍＬのＲＬＮ緩衝液を調製した。０．２μフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号１６５３４－Ｋ）を使用して緩衝液をろ過した。１０％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０調製のために、ＩＧＥＰＡＬボトル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｉ８８９６）を３７℃であらかじめ温めた。次に、１０ｍＬの１００％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０を９０ｍＬのｄｄＨ２Ｏと混合した。激しく混合することによって溶解させた。オンカラムＤＮａｓｅ消化も、製造業者の指示に従ってＲＮａｓｅフリーＤＮＡｓｅセットキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９２５４）を使用して実施した。ＲＮＡ抽出後、各サンプルの１００ｎｇのＲＮＡをライブラリー調製のために使用した。次世代シークエンシングはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（スイス国）によって実施した。ＴｒｕＳｅｑ鎖ＲＮＡライブラリー調製方法をポリＡ濃縮ステップで使用した。７５ｂｐペアエンドシークエンシングをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ プラットフォームで実施して、サンプルあたり（１０＋１０）百万リードを得た。
簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートにウェルあたり３．５＊１０５細胞の密度で播種した。２４時間後、細胞を関連入力（ＰＩＴ、ＥＴ、ｔＴＡ）での３プロモータポリクロマティックレポータ（ｐＫＢ０１又はｐＪＤ４９）でトランスフェクトした。ＤＮＡ量及び他の関連情報は「トランスフェクション」の項に記載されている。非形質転換細胞もサンプルとして実験に含めた。この実験では生物学的複製を作製しなかった。トランスフェクションの４８時間後に、ウェルから培地を除去し、細胞にＰＢＳ１ｘ、ｐＨ７．４及びトリプシンの１：１ミックスを合計体積５００μＬで供給することによって細胞をウェル表面から剥がした。細胞を５～８分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。５００μＬの培地を添加することによってトリプシンを不活性化した。細胞を再懸濁し、サンプルごとに計数した。細胞質ＲＮＡ抽出プロセスのために、各サンプルについて同数（１．５４＊１０６）の細胞を採取した。抽出は、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）を製造業者の指示どおりに使用して実施した。以下の成分：５ｍＬのＴｒｉｓ．Ｃｌ ｐＨ８．０（ＡＭＲｅｓｃｏ、カタログ番号Ｅ１９９－５００ＭＬ）、０．８１ｇのＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３０１４－１ＫＧ）、３ｍＬの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１３５１２）、２．５ｍＬのＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０（１０％）を混合することによって細胞質ＲＮＡ抽出用に１００ｍＬのＲＬＮ緩衝液を調製した。０．２μフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号１６５３４－Ｋ）を使用して緩衝液をろ過した。１０％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０調製のために、ＩＧＥＰＡＬボトル（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｉ８８９６）を３７℃であらかじめ温めた。次に、１０ｍＬの１００％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０を９０ｍＬのｄｄＨ２Ｏと混合した。激しく混合することによって溶解させた。オンカラムＤＮａｓｅ消化も、製造業者の指示に従ってＲＮａｓｅフリーＤＮＡｓｅセットキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７９２５４）を使用して実施した。ＲＮＡ抽出後、各サンプルの１００ｎｇのＲＮＡをライブラリー調製のために使用した。次世代シークエンシングはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ（スイス国）によって実施した。ＴｒｕＳｅｑ鎖ＲＮＡライブラリー調製方法をポリＡ濃縮ステップで使用した。７５ｂｐペアエンドシークエンシングをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ プラットフォームで実施して、サンプルあたり（１０＋１０）百万リードを得た。
デマルチプレクシングのリードとＩｌｌｕｍｉｎａアダプター残差のトリミングはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈによって実施された。ＲＮＡ－ｓｅｑデータから結論を引き出すために、また代替転写物の配列がエクソン領域で極めて相同性であり、これによって転写物コーリングの標準的ツールの実装が困難になるという事実のために、本発明者等はＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）スクリプトを使用してデータ解析用手順を開発した。全ての可能な未解明のエクソン－イントロンジャンクションを表す５０ヌクレオチドの配列（合計で６）及び正しいスプライシングジャンクションを表す配列（合計で３）をプラスミドｐＫＢ０１及びｐＪＤ４９に対して選択した。全ての配列はジャンクションの両側で２５塩基に及んでいた。ｆａｓｔｑファイルを、これらの配列を全体として含むリードについて検索し、ジャンクションを含むリードの総数を決定した。これらの数値を各データセットにおけるリードの総数に対して正規化して、サンプル間の比較を可能にした。さらに、全ての条件について、ジャンクションにマッピングされたすべてのカウントを、それらの合計が１に等しくなるように正規化した。ジャンクションは互いに排他的ではないが、これにより比較が促進される。
以下のジャンクション配列をｐＫＢ０１に使用した：
Ｊ１（ＥｘＩａ－イントロンジャンクション）：
ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＧＴＣＡＡ（配列番号２１９）
Ｊ２（イントロン－ＥｘＩｂジャンクション）：
ＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴ（配列番号２２０）；
転写物中にこれらのジャンクションが存在することは、第一イントロンの除去の失敗を意味する。
Ｊ３（ＥｘＩｂ－イントロンジャンクション）：
ＧＡＧＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＧ（配列番号２２１）
Ｊ４（イントロン－ＥｘＩｃジャンクション）：
ＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧ（配列番号２２２）；
転写物中にこれらのジャンクションが存在することは、第二イントロンの除去の失敗を意味する。
Ｊ５（ＥｘＩｃ－イントロンジャンクション）：
ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧ（配列番号２２３）
Ｊ６（イントロン－ＥｘＩＩジャンクション）：
ＴＡＴＣＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２２４）；
Ｊ５が存在することは、第三イントロンのスプライスの失敗を意味し、Ｊ６が存在することは、三つのイントロンのいずれかの除去の失敗を意味する。
Ｊ７：ＥｘＩｃ－ＥｘＩＩジャンクション：
ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２２５）；
Ｊ７は第三イントロンの正しいスプライシングを示す。
Ｊ８：ＥｘＩａ－ＥｘＩＩジャンクション：
ＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２２６）；
Ｊ８は第一イントロンの正しいスプライシングを示す。
Ｊ９：ＥｘＩｂ－ＥｘＩＩジャンクション：
ＧＡＧＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２２７）；
Ｊ９は第二イントロンの正しいスプライシングを示す。
ｐＪＤ４９の対応するジャンクション配列は以下のとおりである：
Ｊ１：ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＧＴＣＡＡ（配列番号２２８）；
Ｊ２：ＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴ（配列番号２２９）；
Ｊ３：ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＧＴ（配列番号２３０）；
Ｊ４：ＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧ（配列番号２３１）；
Ｊ５：ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧ（配列番号２３２）；
Ｊ６：ＴＡＴＣＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２３３）；
Ｊ７：ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２３４）；
Ｊ８：ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２３５）；
Ｊ９：ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２３６）
Ｊ１（ＥｘＩａ－イントロンジャンクション）：
ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＧＴＣＡＡ（配列番号２１９）
Ｊ２（イントロン－ＥｘＩｂジャンクション）：
ＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴ（配列番号２２０）；
転写物中にこれらのジャンクションが存在することは、第一イントロンの除去の失敗を意味する。
Ｊ３（ＥｘＩｂ－イントロンジャンクション）：
ＧＡＧＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＴＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＧ（配列番号２２１）
Ｊ４（イントロン－ＥｘＩｃジャンクション）：
ＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧ（配列番号２２２）；
転写物中にこれらのジャンクションが存在することは、第二イントロンの除去の失敗を意味する。
Ｊ５（ＥｘＩｃ－イントロンジャンクション）：
ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＡＧＧＴＧＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧ（配列番号２２３）
Ｊ６（イントロン－ＥｘＩＩジャンクション）：
ＴＡＴＣＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２２４）；
Ｊ５が存在することは、第三イントロンのスプライスの失敗を意味し、Ｊ６が存在することは、三つのイントロンのいずれかの除去の失敗を意味する。
Ｊ７：ＥｘＩｃ－ＥｘＩＩジャンクション：
ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２２５）；
Ｊ７は第三イントロンの正しいスプライシングを示す。
Ｊ８：ＥｘＩａ－ＥｘＩＩジャンクション：
ＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２２６）；
Ｊ８は第一イントロンの正しいスプライシングを示す。
Ｊ９：ＥｘＩｂ－ＥｘＩＩジャンクション：
ＧＡＧＣＡＣＴＣＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２２７）；
Ｊ９は第二イントロンの正しいスプライシングを示す。
ｐＪＤ４９の対応するジャンクション配列は以下のとおりである：
Ｊ１：ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＧＴＣＡＡ（配列番号２２８）；
Ｊ２：ＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＡＴ（配列番号２２９）；
Ｊ３：ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＴＡＴＣＴＧＣＴＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＧＴ（配列番号２３０）；
Ｊ４：ＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＴＧ（配列番号２３１）；
Ｊ５：ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＴＡＧＡＣＧＴＣＴＣＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＴＴＴＧ（配列番号２３２）；
Ｊ６：ＴＡＴＣＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２３３）；
Ｊ７：ＧＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２３４）；
Ｊ８：ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２３５）；
Ｊ９：ＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＡＡＧ｜ＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号２３６）
定量及び統計分析
ポリクロマティックレポータ構築物（図１、２、３、８、９）の各生物学的複製（ｎ＝３）を別の実験から得た。図４、５、６、１１、１２の実験は、少なくとも一回反復した。実験に使用した生物学的複製の数（ｎ）は対応する図の説明文に表示されている。データを表示されているような平均±ＳＤとしてプロットする。
ポリクロマティックレポータ構築物（図１、２、３、８、９）の各生物学的複製（ｎ＝３）を別の実験から得た。図４、５、６、１１、１２の実験は、少なくとも一回反復した。実験に使用した生物学的複製の数（ｎ）は対応する図の説明文に表示されている。データを表示されているような平均±ＳＤとしてプロットする。
開示されたＤＮＡ構築物を用いて得られる実験結果を以下の実施例でさらに説明する。
実施例２ 代替プロモータベースの多入力ＯＲ回路
限定と理解されるものではない一例では、代替プロモータベースの多入力ＯＲ回路は、それぞれは独自の調節プログラム、Ｐｏｌ ＩＩ結合部位、及び転写開始部位を有する、複数の個別に制御されるプロモータ配列を含み；すべてのプロモータは、このプロモータに特有の第一エクソンと、それに続く５’－スプライスシグナル、イントロン配列、下流プロモータ領域及び代替第一エクソン等を含むｍＲＮＡ、共有される第二エクソン及び転写終結部位に到達するまで転写する。プロモータの転写プログラムはｍＲＮＡの産生を制御する。さらに、各ｍＲＮＡアイソフォームは、アイソフォーム特異的第一エクソン配列に向けられたそれ自体の転写後プログラムによって制御することもできる。
限定と理解されるものではない一例では、代替プロモータベースの多入力ＯＲ回路は、それぞれは独自の調節プログラム、Ｐｏｌ ＩＩ結合部位、及び転写開始部位を有する、複数の個別に制御されるプロモータ配列を含み；すべてのプロモータは、このプロモータに特有の第一エクソンと、それに続く５’－スプライスシグナル、イントロン配列、下流プロモータ領域及び代替第一エクソン等を含むｍＲＮＡ、共有される第二エクソン及び転写終結部位に到達するまで転写する。プロモータの転写プログラムはｍＲＮＡの産生を制御する。さらに、各ｍＲＮＡアイソフォームは、アイソフォーム特異的第一エクソン配列に向けられたそれ自体の転写後プログラムによって制御することもできる。
この例では、所与のプロモータからの個々の転写物は、このプロモータでの転写プログラムが転写を誘導し、例えば、産生されたｍＲＮＡが分解又は阻害されないために、第一エクソンでの転写後プログラムが高い転写物濃度と一致する場合にのみ高レベルで生成され；換言すれば、両プログラムの出力（高いｍＲＮＡ収量）が「Ｏｎ」である場合、単一の転写物レベルでＡＮＤ論理を含む（図１Ａ）。転写物のリボソーム結合部位の調節等を介して、翻訳段階でさらなる発現微調整を実施できる。異なる転写物の調節プログラム間の「ＯＲ」論理関係について仮説を立てることはできるが、推測的仮定ではない。
代替的にスプライシングされたｍＲＮＡバリアントの存在は、原則として、先行技術の知識のみに基づき、「代替的」という語によって示されるように、転写物間の相互排除又は相互阻害をもたらす可能性がある。相互排除は、ＯＲ論理ではなく、「排他的ＯＲ」（ＸＯＲ）を意味する（Ｃｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
代替的にスプライシングされたｍＲＮＡバリアントの存在は、原則として、先行技術の知識のみに基づき、「代替的」という語によって示されるように、転写物間の相互排除又は相互阻害をもたらす可能性がある。相互排除は、ＯＲ論理ではなく、「排他的ＯＲ」（ＸＯＲ）を意味する（Ｃｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
いくつかの真核生物遺伝子は自然界では代替プロモータによって調節されるが（Ａｙｏｕｂｉ ａｎｄ ＶａｎＤｅＶｅｎ，１９９６）、この設計原理は、調節論理に関して評価されておらず、合成ＤＮＡ構築物の産生並びに／或いはＤＮＡカセット及び／又は合成遺伝子回路の設計のためのインスピレーションとして使用されることもない。したがって、以下の実施例でさらに詳細に記載するように、代替プロモータ及び／又は選択的スプライシングを用いて、ＯＲゲート及び／又は標準形論理回路として機能するＤＮＡ構築物を生成できるということは、驚くべき発見であった。
実施例３ 複数の代替プロモータ構造を可視化し、微調整するためのポリクロマティックレポータシステム
本発明者等は、実施例１に記載するマウスＣｉｉｔａ遺伝子に基づいてモデル化された遺伝子スカフォールドを作製した。本発明者等は、ＧＦＰ由来の蛍光タンパク質（ＳＢＦＰ２、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎ及びｍＣｉｔｒｉｎｅ）を利用し、これらはすべて互いにわずかに異なり、それらのＣ末端（２９アミノ酸）では同じであった。Ｃ末端配列は第二（共有）エクソン（図７Ａ）を形成し、各タンパク質の２１０のＮ末端アミノ酸配列はユニークな第一エクソンを形成する。代替第一エクソンは、実施例１（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＥＴ（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）及びｔＴＡ（Ｂｏｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９９）に記載されているように、それぞれトランス活性化因子ＰＩＴ２によって調節される誘導性プロモータ、ＰＩＲ、ＥＴＲ及びＴＲＥによって駆動された。マウスＣｉｉｔａ遺伝子座の構築は、可能であれば「ミニ遺伝子」アプローチ（Ｇａｉｌｄｒａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に従った：代替第一エクソンの５’－ＵＴＲは代替Ｃｉｉｔａエクソンの５’－ＵＴＲと同一であった。さらに、代替第一エクソンに続くイントロン配列は、Ｃｉｉｔａ遺伝子の対応するゲノム配列の２５０～４５０塩基対のどこかと同じであり；全てのイントロンと共通する３’領域も同様にＣｉｉｔａ遺伝子の第二（共通）エクソンの上流の２００塩基対のゲノム配列と同じであった（図７Ｂ）。転写終結のためには、実際的理由のために、また複数のポリアデニル化部位に起因する可能性のある潜在的な効果を回避するために、Ｃｉｉｔａ遺伝子の約２，０００ｎｔ長の３’－ＵＴＲの代わりに、ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（Ｇｉｌ ａｎｄ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，１９８７）を３’－ＵＴＲで使用した。
本発明者等は、実施例１に記載するマウスＣｉｉｔａ遺伝子に基づいてモデル化された遺伝子スカフォールドを作製した。本発明者等は、ＧＦＰ由来の蛍光タンパク質（ＳＢＦＰ２、ＣＦＰ／ｍＣｅｒｕｌｅａｎ及びｍＣｉｔｒｉｎｅ）を利用し、これらはすべて互いにわずかに異なり、それらのＣ末端（２９アミノ酸）では同じであった。Ｃ末端配列は第二（共有）エクソン（図７Ａ）を形成し、各タンパク質の２１０のＮ末端アミノ酸配列はユニークな第一エクソンを形成する。代替第一エクソンは、実施例１（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＥＴ（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）及びｔＴＡ（Ｂｏｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９９）に記載されているように、それぞれトランス活性化因子ＰＩＴ２によって調節される誘導性プロモータ、ＰＩＲ、ＥＴＲ及びＴＲＥによって駆動された。マウスＣｉｉｔａ遺伝子座の構築は、可能であれば「ミニ遺伝子」アプローチ（Ｇａｉｌｄｒａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に従った：代替第一エクソンの５’－ＵＴＲは代替Ｃｉｉｔａエクソンの５’－ＵＴＲと同一であった。さらに、代替第一エクソンに続くイントロン配列は、Ｃｉｉｔａ遺伝子の対応するゲノム配列の２５０～４５０塩基対のどこかと同じであり；全てのイントロンと共通する３’領域も同様にＣｉｉｔａ遺伝子の第二（共通）エクソンの上流の２００塩基対のゲノム配列と同じであった（図７Ｂ）。転写終結のためには、実際的理由のために、また複数のポリアデニル化部位に起因する可能性のある潜在的な効果を回避するために、Ｃｉｉｔａ遺伝子の約２，０００ｎｔ長の３’－ＵＴＲの代わりに、ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（Ｇｉｌ ａｎｄ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，１９８７）を３’－ＵＴＲで使用した。
様々なプロモータのそれらの同族トランス活性化因子による活性化に際して、ＤＮＡカセットは、ＰＩＴ２によるＰＩＲ誘導に際してはＳＢＦＰ２を、ＥＴによるＥＴＲ誘導に際してはＣＦＰ（又はｍＣｅｒｕｌｅａｎ）を、そしてｔＴＡによるＴＲＥ誘導に際してはｍＣｉｔｒｉｎｅを発現することが予想される（図１Ｂ）。
複数のトランス活性化因子による同時誘導は、ＯＲ様挙動から予想されるように、異なる蛍光タンパク質の同時発現をもたらすはずである。ミススプライシングに際して蛍光タンパク質が発現されないことを確実にするために、全てのイントロン中にはインフレーム終止コドンが存在していた。三つのトランス活性化因子の全ての可能なサブセットに対応する八つの異なる入力組み合わせを試験して、回路応答を評価した。構築物／カセット設計、例えば、スプライス部位を最適化するために使用されるポリクロマティック構築物による蛍光出力発現のための完全に機能するスプライシングの要件を確認するために、多くの対照実験を実施した。しかしながら、注目すべきことに、本明細書中で開示される他の構築物は、例えば、第一及び第二エクソンを含まず、単に共通の出力配列（例えば、一つの共通のエクソン）を含む場合、完全に機能的なスプライシング又はスプライシングを全く必要としない（すなわち、非スプライシングＤＮＡ構築物）可能性がある。
複数のトランス活性化因子による同時誘導は、ＯＲ様挙動から予想されるように、異なる蛍光タンパク質の同時発現をもたらすはずである。ミススプライシングに際して蛍光タンパク質が発現されないことを確実にするために、全てのイントロン中にはインフレーム終止コドンが存在していた。三つのトランス活性化因子の全ての可能なサブセットに対応する八つの異なる入力組み合わせを試験して、回路応答を評価した。構築物／カセット設計、例えば、スプライス部位を最適化するために使用されるポリクロマティック構築物による蛍光出力発現のための完全に機能するスプライシングの要件を確認するために、多くの対照実験を実施した。しかしながら、注目すべきことに、本明細書中で開示される他の構築物は、例えば、第一及び第二エクソンを含まず、単に共通の出力配列（例えば、一つの共通のエクソン）を含む場合、完全に機能的なスプライシング又はスプライシングを全く必要としない（すなわち、非スプライシングＤＮＡ構築物）可能性がある。
ポリクロマティック構築物の関連で、まず、各蛍光出力は、その５’－及び３’－スプライシング配列が３プロモータ構築物と同じである介在するイントロンを用いて個別にクローン化された場合、適切に発現されたが、３’－スプライシングシグナル及び第二エクソンが欠如した構築物では蛍光は観察されなかった（図８Ａ）。第二に、第二エクソンが３プロモータカセットにおいて変異した場合、蛍光レポータの活性化因子依存性誘導は観察されなかった（図８Ｂ）。したがって、この関連で、ＧＦＰが蛍光を妨害することなくＣ末端で最大１５のアミノ酸のトランケーションだけを許容できるという事実（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７）と一致して、三つのタンパク質全てについて出力蛍光が観察されるためには、正しいスプライシングが必要かつ十分であった。プロモータ強度とリボソーム結合部位などの翻訳に影響を及ぼす特徴との間の本質的相違からスプライシングの効果を解き放つために、本発明者等は、実施例１（図８Ｃ）に記載するように、これらのプロモータからイントロン無しの蛍光タンパク質の発現レベルを測定し、正規化目的でこれらの値を使用した。報告された「プロモータ正規化」単位は、これによって、スプライシングの非存在下で同じプロモータからの出力の発現によって蛍光出力の発現が正規化されるものであり、主に複数のプロモータ及び選択的スプライシングの存在による発現の相違を強調する（実施例１を参照）。
ポリクロマティック回路の性能基準は以下の通りであった：ｉ）単一入力プロモータ活性化に際して、得られる蛍光タンパク質出力発現レベルは、好ましくは、他の蛍光出力の同時活性化は最小限に抑えつつ、スプライシングの非存在下でプロモータ－レポータカセットを用いて生成される発現（後者は１プロモータ正規化単位に対応する）に近く；ｉｉ）複数のプロモータ活性化に対してさらなる発現を回避する。さらに、本発明者等は全ての出力の強力な絶対発現を確実にすることに努めた。本発明者等は、いくつかの設計要素が性能に影響を及ぼし得るという仮説を立てた：ｉ）選択的スプライシングの過程でのこれらの部位間の競合による、５’スプライス部位配列の強度；ｉｉ）３’－スプライス部位、ポリピリミジントラクト及び３’－ＵＴＲ配列；ｉｉｉ）イントロン配列、特に、スプライシングエンハンサー／サイレンサー配列の存在；ｉｖ）スプライシングに関連しない長期相互作用を介して互いに増強し阻害し得るという事実による、プロモータタイプ及び配列、並びにプロモータ間の距離；ｖ）転写物安定性及び翻訳開始効率に影響を及ぼし、したがって絶対出力発現に影響するエクソン配列。なお、ポリクロマティックレポータシステムは、複数の出力を生成するので、厳密な意味では真のＯＲゲートではない。これは主に、単一出力タンパク質の真のＯＲ論理回路を構築する次のステップで実装される設計変数を調査するモデルシステムとして機能する。上記基準及びそれらの調節方法にもかかわらず、実際の所望の性能の明細は、用途に応じて変わる可能性があり、レポータシステムは用途関連カセットとは異なって挙動する。ＯＲゲートの特定の用途は不均一細胞集団に対処できるので、異なる細胞型での所望の出力発現は必ずしも同じであるとは限らない。その後の結果は、所望の性能目標を達成するためのガイドラインとして使用できるいくつかの傾向を示す。本明細書中で提供されるガイドラインとさらなる一般常識的知識とに基づいて、当業者は、本明細書中で記載される所望の特性を有するように、ＤＮＡ構築物／カセットをルーチン的に生成及び／又は修飾することができる。したがって、いずれか又はすべての所望の特性を直接有さない本明細書中で記載される構築物／カセットは、本開示及びさらなる一般常識的知識に基づいて、所望の特性を容易に修飾できる。
例えば、初期の３プロモータカセットは、ＨＥＫ２９３細胞においてＴＲＥ誘導後にｍＣｉｔｒｉｎｅを発現できるだけであった（図１Ｃ、ｐＫＢ０１）。ＰＩＲ又はＥＴＲを誘導することで有意なレベルのＳＢＦＰ２及びＣＦＰを生成することはできなかったが、ＴＲＥと並行してＰＩＲを誘導することで、ｍＣｉｔｒｉｎｅの発現は３倍減少し、このことは、異なる転写フレームが互いに干渉しあったことを示唆する。Ｃｉｉｔａ遺伝子構造に従うにもかかわらずＳＢＦＰ２もＣＦＰも発現されなかったのは、おそらく、（ｉ）ネイティブのＣｉｉｔａ中のイントロン配列がはるかに長い、及び／又は（ｉｉ）造血系におけるＣｉｉｔａ遺伝子の適切なスプライシングを支援する細胞型特異性トランス因子がＨＥＫ２９３細胞中に存在しなかったためである。本発明者等は、ｍＣｉｔｒｉｎｅの下流の５’スプライス部位が強力すぎて、上流スプライス部位の結合を妨げていると考えた。様々なサポートモデルを用いたＭａｘＥｎｔスキャンツール（Ｙｅｏ ａｎｄ Ｂｕｒｇｅ，２００４）を使用して５’－スプライス部位の強度を評価して、コンパウンドスコアを得た（表５；より高いスコアはより強力な部位に対応する。ｍＣｉｔｒｉｎｅ第一エクソンの下流の第三イントロンの５’スプライス部位を様々な程度に弱めることによって、本発明者等は、ＰＩＴ駆動転写物の正しいスプライシングがＳＢＦＰ２発現をもたらすことを観察した（図８Ｄ、ｐＫＷ１７及びｐＪＤ２３；図９、ｐＪＤ２３２、ｐＪＤ２３３）。しかしながら、転写干渉は依然として観察され、ＣＦＰ発現は非常に低いままであった。したがって、本発明者等は、ＣＦＰをより明るいｍＣｅｒｕｌｅａｎ（Ｒｉｚｚｏ ａｎｄ Ｐｉｓｔｏｎ，２００５）と置換し、コザック配列（Ｋｏｚａｋ，１９８６）をｍＣｅｒｕｌｅａｎの第一エクソンに導入し、このエクソンの下流のイントロンの５’スプライス部位を強めた。これらの修飾の結果、定性的には予想される発現と一致するが、定量的には不均一なレベルの、全ての出力の有意な発現を生成するカセットが得られた（図１Ｄ、ｐＪＤ３１；図８Ｅ、ｐＪＤ３０）。これは、例えば、様々な５’スプライス部位強度を修飾すること、及び／又はコザック配列を添加することによって、当初は最適以下の構築物を如何に改善できるかをすでに示している。
興味深いことに、ｐＫＢ０１では、第一及び第三イントロンの５’－スプライス部位（表５中のｓｓ８及びｓｓ４、ＳＢＦＰ２及びｍＣｉｔｒｉｎｅ出力に対応）は類似したスプライシング「能力」を有していたが、ＳＢＦＰ２は全くスプライシングできなかったのは、おそらく、３’－スプライス部位までの距離が長かったためで、近位の５’スプライス部位が二つの類似した強度の代替５’－スプライス部位の中から選択されるという以前の観察と一致する（Ｅｐｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。本実施例では、ＰＩＲプロモータからの転写にもかかわらず、第三の（ｍＣｉｔｒｉｎｅ）５’スプライス部位が結合し、ＳＢＦＰ２もｍＣｉｔｒｉｎｅも翻訳できないｍＲＮＡが得られた（図２Ｄを参照）。したがって、ｐＪＤ３１では、第三イントロンの５’－スプライスシグナル（表５のｓｓ３）を１．５倍程度弱め、これによって、ＳＢＥＰは、ｍＣｉｔｒｉｎｅ発現を３倍減少させつつ、ｍＣｉｔｒｉｎｅに匹敵するレベルでスプライスが可能になり、近位の部位が弱い場合に遠位の５’－部位を選択できるという観察（Ｅｐｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）と一致する。
ｍＣｉｔｒｉｎｅ発現の減少は、ＰＩＲプロモータをＴＲＥと共に活性化した場合、ＳＢＦＰ２タンパク質の発現と関係なく起こり、したがって、翻訳負荷によるものではなかった（Ｃｅｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。スプライシングに関連したものではなく、上流から下流プロモータへの転写干渉のあらわれである（Ｅｓｚｔｅｒｈａｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかしながら、実際は、そのような阻害干渉は、同時多入力活性化に際しての加算的出力発現を防止するので、ＯＲゲートの関連で有利である。本発明者等はまた、アクセプタ―スプライス部位の強度を増加させることで、発現レベルは有意に変化しなかったことに着目した（図９、ｐＪＤ４２）。
複数のスプライス部位構造をさらに評価するために、本発明者等は、異なるモジュールの配列を変えることによって設計空間をマッピングした（図１０Ａ、表１）。最初の課題は、ｍＣｅｒｕｌｅａｎエクソンにより強力なスプライス部位が提供されると低下するＳＢＦＰ２の発現を増加させることであった（例えば、図９のｐＪＤ２３をｐＪＤ３１と比較）。本発明者等は、ＳＢＦＰ２ ５’－スプライス部位の強度を増加させ、ｍＣｅｒｕｌｅａｎの５’スプライス部位を弱め（図２Ａ及び９、ｐＪＤ３５－３７、ｐＪＤ４０、ｐＪＤ５３－５５）、カノニカルコザック配列をＳＢＦＰ２エクソンの前に追加し、ＳＢＦＰ２ドナースプライス部位（図９、ｐＪＤ５２）に近いイントロンスプライシングエンハンサー（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を含む、その５’－ＵＴＲ（図２Ａ、ｐＪＤ４７－４９）を修飾することによってこれを達成しようとした。
この小さなライブラリーでは、カセットｐＪＤ４７－４９及びｐＪＤ５３は他のものよりも優れた性能基準を満たしていた（ｐＪＤ４８性能の可視化については図２Ｂを参照）。ｍＣｅｒｕｌｅａｎドナースプライス部位の弱化によるＳＢＦＰ２の増加は、ｐＪＤ５５におけるように、部位間の相違が非常に強い場合にのみ観察されたが、これはｍＣｅｒｕｌｅａｎ発現を弱めることとなった。
この小さなライブラリーでは、カセットｐＪＤ４７－４９及びｐＪＤ５３は他のものよりも優れた性能基準を満たしていた（ｐＪＤ４８性能の可視化については図２Ｂを参照）。ｍＣｅｒｕｌｅａｎドナースプライス部位の弱化によるＳＢＦＰ２の増加は、ｐＪＤ５５におけるように、部位間の相違が非常に強い場合にのみ観察されたが、これはｍＣｅｒｕｌｅａｎ発現を弱めることとなった。
これは、例えば、５’－スプライス部位をさらに修飾し、及び／又はスプライシングエンハンサーを導入することによって、ＤＮＡ構築物をどのようにしてさらに最適化できるかをさらに示す。
追加の操作を行っても、性能の実質的な改善は得られなかった。例えば、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ及びＳＢＦＰ２ 第一エクソンの下流の同じイントロン及び５’－スプライスシグナルの使用（図９、ｐＪＤ１５４）は、ｍＣｉｔｒｉｎｅ及びｍＣｅｒｕｌｅａｎの両方を増加させつつ、ＳＢＦＰ２には影響を及ぼさなかった。ｍＣｉｔｒｉｎｅエクソンの下流の５’－スプライスシグナル強度の体系的な増加の結果、ｐＫＢ０１で行われた観察と一致して、ＳＢＦＰ２及びｍＣｅｒｕｌｅａｎの両方が減少した（図９、ｐＪＤ１１５、ｐＪＤ１２５、ｐＪＤ１２７、ｐＪＤ１２８）。最後に、スプライシングエンハンサー（Ｍｉｙａｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）をＳＢＦＰ２エクソンの下流のイントロンに埋め込むことで、その発現が救済されることはなかった（ｐＪＤ１２５、図９）。
様々な調査したパラメータのうち、ｍＣｉｔｒｉｎｅエクソンの下流の５’－スプライシングシグナルの絶対強度出力レベルに対して最大の影響を与えた。
この部位の強度を低下させると、第一及び第二プロモータの両方からの発現が増加し、第三プロモータからの発現が減少するという傾向が観察される（図２Ｃ）。これは重要なパラメータであるので、本発明者等は、この弱化が、性能目標を満たしつつ、どの程度まで持続できるかを確認した。本発明者等は、ｐＪＤ４８におけるｍＣｉｔｒｉｎｅエクソンの下流のドナースプライス部位の強度を７．２から６．３及び１．９へ低下させた。６．３へ低下させることで、「１」に近いＳＢＦＰ２レベル（ｐＪＤ２３５、図９）となり、ｍＣｉｔｒｉｎｅにおける低下はごくわずかであった。しかしながら、１．９に弱化することで（ｐＪＤ２３７、図９）、ｍＣｉｔｒｉｎｅ発現が大幅に減少した。したがって、この程度まで弱化することは、性能目標の観点から好ましくない。効果を現す様々なプロセスをさらに理解するために、本発明者等は、ｐＫＢ０１及び最適化ｐＪＤ４９からのトランスクリプト―ムのディープシークエンシングを実施し、スプライシングされていないエクソン－イントロンジャンクション並びに適切にスプライシングされたジャンクションの存在を評価した。簡単に説明すると（図２Ｄ）、ディープシークエンシングデータにより、ｐＫＢ０１におけるＰＩＴ又はＥＴ活性化の結果、これらのプロモータからの転写に至るが、予想されるスプライシングは得られないことが確認された。
その代わり、第三イントロンがスプライシングされ、その結果、適切に形成されたｍＣｉｔｒｉｎｅコード配列が得られ、しかしこれは、ｍＲＮＡキャップからの距離が長いことと、先行するイントロンにおけるインフレーム終止コドンの存在のために、翻訳できなかった。ｐＪＤ４９における第三エクソンの５’スプライス部位の弱化の結果、第三イントロンのプロセッシングの効率が低下し、それに伴って、第一及び第二イントロンの正しいスプライシングが増加した。特に、ｐＪＤ４９においてさえも、失敗したスプライシングはトランスクリプト―ムの実質的な部分を構成していたが、細胞質ｍＲＮＡを単離する努力にもかかわらず、核ｐｒｅ－ｍＲＮＡの一部がサンプルに当てはまるか否かは不明である。たとえ不完全なスプライシングであっても、ＤＮＡ構築物の機能性に問題はなく、これらのスプライシングされていないｍＲＮＡは機能的タンパク質を生成しないので、せいぜい所望の出力タンパク質の量が多少減少するだけであり得る。さらに、図２Ｄにおけるデータは、絶対的なマッピング頻度が非常に配列依存性であり、絶対的な存在量について請求するために使用できないので、相対的な用語（ｐＫＢ０１対ｐＪＤ４９）に置き換えるにとどめるべきである。
この部位の強度を低下させると、第一及び第二プロモータの両方からの発現が増加し、第三プロモータからの発現が減少するという傾向が観察される（図２Ｃ）。これは重要なパラメータであるので、本発明者等は、この弱化が、性能目標を満たしつつ、どの程度まで持続できるかを確認した。本発明者等は、ｐＪＤ４８におけるｍＣｉｔｒｉｎｅエクソンの下流のドナースプライス部位の強度を７．２から６．３及び１．９へ低下させた。６．３へ低下させることで、「１」に近いＳＢＦＰ２レベル（ｐＪＤ２３５、図９）となり、ｍＣｉｔｒｉｎｅにおける低下はごくわずかであった。しかしながら、１．９に弱化することで（ｐＪＤ２３７、図９）、ｍＣｉｔｒｉｎｅ発現が大幅に減少した。したがって、この程度まで弱化することは、性能目標の観点から好ましくない。効果を現す様々なプロセスをさらに理解するために、本発明者等は、ｐＫＢ０１及び最適化ｐＪＤ４９からのトランスクリプト―ムのディープシークエンシングを実施し、スプライシングされていないエクソン－イントロンジャンクション並びに適切にスプライシングされたジャンクションの存在を評価した。簡単に説明すると（図２Ｄ）、ディープシークエンシングデータにより、ｐＫＢ０１におけるＰＩＴ又はＥＴ活性化の結果、これらのプロモータからの転写に至るが、予想されるスプライシングは得られないことが確認された。
その代わり、第三イントロンがスプライシングされ、その結果、適切に形成されたｍＣｉｔｒｉｎｅコード配列が得られ、しかしこれは、ｍＲＮＡキャップからの距離が長いことと、先行するイントロンにおけるインフレーム終止コドンの存在のために、翻訳できなかった。ｐＪＤ４９における第三エクソンの５’スプライス部位の弱化の結果、第三イントロンのプロセッシングの効率が低下し、それに伴って、第一及び第二イントロンの正しいスプライシングが増加した。特に、ｐＪＤ４９においてさえも、失敗したスプライシングはトランスクリプト―ムの実質的な部分を構成していたが、細胞質ｍＲＮＡを単離する努力にもかかわらず、核ｐｒｅ－ｍＲＮＡの一部がサンプルに当てはまるか否かは不明である。たとえ不完全なスプライシングであっても、ＤＮＡ構築物の機能性に問題はなく、これらのスプライシングされていないｍＲＮＡは機能的タンパク質を生成しないので、せいぜい所望の出力タンパク質の量が多少減少するだけであり得る。さらに、図２Ｄにおけるデータは、絶対的なマッピング頻度が非常に配列依存性であり、絶対的な存在量について請求するために使用できないので、相対的な用語（ｐＫＢ０１対ｐＪＤ４９）に置き換えるにとどめるべきである。
実施例４ 代替プロモータ構造を用いたＯＲ論理の実施
ＯＲ論理ゲートの構築に向けて、本発明者等はまずシステムを二つのプロモータに低減した。最初の二色カセットは、ＴＲＥプロモータ及びその下流エクソン、並びにそれと関連するイントロンの一部を除去すること（図３Ａ）によって、ｐＪＤ４９（図２Ａ）から得られた。近位５’スプライス部位は遠位部位よりも強力であり、ｐＪＤ４９（図３Ｂ）と比較して第一プロモータからの発現が２倍減少した。さらに、ＥＴプロモータがＰＩＴと共に活性化されると、ＳＢＦＰ２発現はさらに１．６倍減少した。ちなみに、ＰＩＲ活性化に際してｍＣｅｒｕｌｅａｎの弱い発現が観察されたが、実施例３に記載されている３プロモータ前駆カセットでは起こらなかったことである。カセットサイズを縮小し、ウイルスベクターパッケージングにさらに適したものにするために、約６５塩基もの短いイントロンでも効率的にスプライシングできるとして、ＥＴＲプロモータの上流の第一イントロンから２２０ｂｐを除去し、約５００ｂｐを第二イントロンから除去した（Ｐｉｏｖｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓａｓａｋｉ－Ｈａｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。短いイントロンは、ミススプライシングされた転写物又はスプライシングされていない転写物が形成される場合に備えて、依然としてインフレーム終止コドンを輸していた。さらに、ＳＢＦＰ２発現を増加させるために、近位スプライス部位を弱めるかわりに、本発明者等は、遠位５’－スプライス部位の下流にイントロンスプライシングエンハンサー配列（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を導入した。これらの修飾の結果、ＳＢＦＰ２発現が４倍程度増加し、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ発現の漏れが１．６倍程度増加し（図３Ｃ）、二つの出力の全体的によりバランスの取れた発現が得られた。特に、この文脈では、ＰＩＲプロモータの活性化の結果、以前に観察されたマイナスの影響とは逆に、ＥＴＲ単独と比較してＥＴＲプロモータからの発現が増加した。本発明者等は、これが、スプライシング関連効果ではなく、プロモータ間の距離の減少による、二つのプロモータ間の転写相乗効果（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）と関係があると考えている。当業者は、本明細書中に提供されている設計ガイドライン、及びさらなる一般常識的知識に基づいて、例えば、プロモータ間の距離を増加させることによって、相乗効果が全く起こらないかまたはごくわずかしか起こらない方法で、プロモータ及びその位置を容易に選択できる。
ＯＲ論理ゲートの構築に向けて、本発明者等はまずシステムを二つのプロモータに低減した。最初の二色カセットは、ＴＲＥプロモータ及びその下流エクソン、並びにそれと関連するイントロンの一部を除去すること（図３Ａ）によって、ｐＪＤ４９（図２Ａ）から得られた。近位５’スプライス部位は遠位部位よりも強力であり、ｐＪＤ４９（図３Ｂ）と比較して第一プロモータからの発現が２倍減少した。さらに、ＥＴプロモータがＰＩＴと共に活性化されると、ＳＢＦＰ２発現はさらに１．６倍減少した。ちなみに、ＰＩＲ活性化に際してｍＣｅｒｕｌｅａｎの弱い発現が観察されたが、実施例３に記載されている３プロモータ前駆カセットでは起こらなかったことである。カセットサイズを縮小し、ウイルスベクターパッケージングにさらに適したものにするために、約６５塩基もの短いイントロンでも効率的にスプライシングできるとして、ＥＴＲプロモータの上流の第一イントロンから２２０ｂｐを除去し、約５００ｂｐを第二イントロンから除去した（Ｐｉｏｖｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓａｓａｋｉ－Ｈａｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。短いイントロンは、ミススプライシングされた転写物又はスプライシングされていない転写物が形成される場合に備えて、依然としてインフレーム終止コドンを輸していた。さらに、ＳＢＦＰ２発現を増加させるために、近位スプライス部位を弱めるかわりに、本発明者等は、遠位５’－スプライス部位の下流にイントロンスプライシングエンハンサー配列（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）を導入した。これらの修飾の結果、ＳＢＦＰ２発現が４倍程度増加し、ｍＣｅｒｕｌｅａｎ発現の漏れが１．６倍程度増加し（図３Ｃ）、二つの出力の全体的によりバランスの取れた発現が得られた。特に、この文脈では、ＰＩＲプロモータの活性化の結果、以前に観察されたマイナスの影響とは逆に、ＥＴＲ単独と比較してＥＴＲプロモータからの発現が増加した。本発明者等は、これが、スプライシング関連効果ではなく、プロモータ間の距離の減少による、二つのプロモータ間の転写相乗効果（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）と関係があると考えている。当業者は、本明細書中に提供されている設計ガイドライン、及びさらなる一般常識的知識に基づいて、例えば、プロモータ間の距離を増加させることによって、相乗効果が全く起こらないかまたはごくわずかしか起こらない方法で、プロモータ及びその位置を容易に選択できる。
次に、本発明者等は、構造を真のＯＲ－ゲートに適合させて、両プロモータから同じ機能的出力を生成した。本発明者等は、コドンの中央でイントロンにより分割されているので、インフレーム翻訳に適切なスプライシングを必要とする代替コーディング第一エクソンを選択した。しかしながら、非コーディングエクソンを代わりに代替５’－ＵＴＲとして利用することも可能であり、ただし、これにより、スプライシングが失敗した場合でも第二エクソンからのタンパク質翻訳が起こる可能性がある。Ｃｉｉｔａ遺伝子のゲノムテンプレートに戻ると、本発明者等はその代替第一エクソンからのコード配列を使用した。第二エクソンには、分割されたコドンの残りの塩基とそれに続くＧＳリンカー、及びｍＣｉｔｒｉｎｅコード配列が含まれていた。この２入力ＯＲゲートはｐＪＤ１４５に基づいていたが（図３Ｃ）、エクソンの構造は実質的に変更され、第二（共有）エクソンは大幅に長くなり、代替第一エクソンは大幅に短くなり、スプライシングシグナル間の距離並びにプロモータ間の距離が変わった。二つのカセット間の関係の概略を図１１Ａに示す。
結果として得られるＯＲ－ゲート構築物を、レンチウイルス導入による一時的トランスフェクション及び安定な組込みの二つの構成で評価した（図４Ａ）。後者を構築するために、レンチウイルストランスファープラスミドに関して逆方法で構築物を埋め込み、ウイルスｍＲＮＡ転写プロセスとの緩衝を回避した（Ｐｏｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。安定な組込み体の分析から、もとの構築物は組込み後に無傷であったことが示された（図１１Ｂ）。インデューサプラスミドも安定なセットアップでトランスフェクトした。フローサイトメトリーデータ及び蛍光顕微鏡写真から、２入力ＯＲ回路が一時的及び安定バージョンで定性的に類似しており（図４Ａ）、ＯＲ論理挙動と一致している。安定集積回路については、平均発現値は、ｍＣｉｔｒｉｎｅ陽性集団のヒストグラムで見られるように様々な入力条件にわたって一貫したままであった。安定なセットアップにおける陽性細胞のパーセンテージの変動は、選別されていない細胞の使用及びプロモータ強度の差に起因し得る。なお、この場合、単一の出力タンパク質が存在していたため、プロモータ強度の正規化は実施できなかった。ＰＩＴ及びｔＴＡ入力を使用する別の２入力構築物を操作し、特徴づけ、定性的に類似したデータを生成した（図１１Ｃ～Ｅ）。全体として、異なるプロモータの組み合わせを使用する二つの構築物は、同様に挙動することが示されており、一時的設定及び安定な設定でＯＲ論理を実装するこのアプローチの実現可能性を示す。
最後に、本発明者等は、システムを３入力にスケールアップした（図４Ｂ）。多少のばらつきはあるが、全体として、データはＯＲ論理とも一致していた。一時的及び安定な設定のどちらにおいても、多入力条件下のピークｍＣｉｔｒｉｎｅ値は、非加算的ＯＲ様応答を含む、単一入力条件でのピーク値を超えなかった。驚くべきことに、安定的に組込まれたカセットを有する細胞における平均出力レベルは非常に一貫し、わずかに約２倍の範囲内で変動した。要約すると、このデータセットは多プロモータ構造をプラスミド及びレンチウイルスベクターの両方に関するＯＲ論理の基礎としてさらに支持する。プロモータ強度による正規化はできなくなったので、さらに均一な出力を得るためにプロモータ強度のバランスはより重要になる。さらに、正確な出力レベルはまた、特に、イントロンサイズ及び相互の距離が減少するにつれて、選択的スプライシング、転写干渉、並びに隣接するプロモータ間の相乗効果の間の複雑な相互作用に依存する。本明細書中に開示されている設計原理に基づいて、満足のいくＯＲ様応答を達成できる。
実施例５ 標準形論理回路
次のステップで、本発明者らは、実施例５に記載した基本的ＯＲ構造を拡張して図１Ａ及び実施例２で想定されるような複雑なＢｏｏｌｅａｎ論理を実施できなるかどうか訊ねた。転写プログラムへの入力について、本発明者等は以前に開発されたＡＮＤ－ゲートアプローチに依存した（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者等は、このアプローチをＯＲ構造とカップリングさせ、論理和標準形様（ＡＮＤ－ＯＲ）論理回路（図５Ａ）を設計した。ＰＩＴ及びＥＴ入力の両方はある特定の設計制約下で個々のプロモータに対するＡＮＤ－ゲート入力として機能することが示されたので（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、本発明者等は、それぞれＳＯＸ１０及びＨＮＦ１Ａ転写因子（ＴＦ）入力を使用して、図４Ａからの単一入力ＰＩＲ及びＥＴＲプロモータを２入力ＡＮＤゲートへ変換した。このために、本発明者等は、ＰＩＲの下流のＳＯＸ１０結合部位、及びＥＴＲの下流のＨＮＦ１Ａ／Ｂ部位をクローニングした。ＥＴ結合部位の数を３から１に減少させた。したがって、この回路の論理プログラムは、（ＰＩＴ ＡＮＤ ＳＯＸ１０）ＯＲ（ＥＴ ＡＮＤ ＨＮＦ１Ａ）（図５Ｂ）であった。Ｏｎ対Ｏｆｆ比を増加させるために、ＰＩＴ２をＰＩＴ－ＶＰ１６と置換した（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。全ての可能な入力組み合わせは、構成的プロモータ（ＰＩＴ及びＥＴ）又はｔＴＡ誘導プロモータ（ＳＯＸ１０及びＨＮＦ１Ａ）のいずれかからトランスで提供され、回路応答はＳＯＸ１０もＨＮＦ１Ａ／Ｂも発現しないＨｅＬａ細胞で測定された。短いイントロンを含む最初の構築物では、第一プロモータ（ＰＩＴ又はＳＯＸ１０）へのいずれかの入力は第二プロモータ（ＥＴ又はＨＮＦ１Ａ）へのいずれかの入力と相乗的活性化を示した。活性化は、ＰＩＴ＋ＨＮＦ１Ａの組み合わせで最も強く、この実施例で最悪のケースのＯＦＦ状態（図１２Ａ）となり、相乗効果スコア（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）は３．３であった。この問題に対抗するために、二つのプロモータ間の距離は、２００塩基のイントロン配列を追加することによって増加し、相乗効果スコアを２．４に減少させた（図１２Ｂ）。さらに、ＰＩＴ結合部位を３から２に減少させることで、相乗効果は１．６になった。定性的に、微調整された回路の応答（図５Ｃ）は論理審理値表と一致していた。しかしながら、ＯＮ出力とＯＦＦ出力の間にはばらつきがあり、ダイナミックレンジのメジアンは約２２倍であり、最悪のケースは６．６倍であった（図５Ｃ）。ちなみに、入力組み合わせＨＮＦ１Ａ＋ＥＴ＋ＳＯＸ１０について、出力はＥＴ＋ＨＮＦ１Ａと比較して減少し、ＥＴ及びＨＮＦ１Ａの存在下でＰＩＴを追加すると反対のことが観察された。ＴＦ入力ＳＯＸ１０又はＨＮＦ１Ａの存在は、反対のプロモータブランチの出力レベルに対して影響を及ぼしたが、構築物は満足できる標準形論理様挙動を達成した。特に、イントロン長さ及び個々のＡＮＤプロモータ組成に関して、本明細書中で開示された設計原理に基づいてさらなる微調整を実施して、様々な効果のバランスを取り、標準形論理性能をさらに改善することができる。
次のステップで、本発明者らは、実施例５に記載した基本的ＯＲ構造を拡張して図１Ａ及び実施例２で想定されるような複雑なＢｏｏｌｅａｎ論理を実施できなるかどうか訊ねた。転写プログラムへの入力について、本発明者等は以前に開発されたＡＮＤ－ゲートアプローチに依存した（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。本発明者等は、このアプローチをＯＲ構造とカップリングさせ、論理和標準形様（ＡＮＤ－ＯＲ）論理回路（図５Ａ）を設計した。ＰＩＴ及びＥＴ入力の両方はある特定の設計制約下で個々のプロモータに対するＡＮＤ－ゲート入力として機能することが示されたので（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、本発明者等は、それぞれＳＯＸ１０及びＨＮＦ１Ａ転写因子（ＴＦ）入力を使用して、図４Ａからの単一入力ＰＩＲ及びＥＴＲプロモータを２入力ＡＮＤゲートへ変換した。このために、本発明者等は、ＰＩＲの下流のＳＯＸ１０結合部位、及びＥＴＲの下流のＨＮＦ１Ａ／Ｂ部位をクローニングした。ＥＴ結合部位の数を３から１に減少させた。したがって、この回路の論理プログラムは、（ＰＩＴ ＡＮＤ ＳＯＸ１０）ＯＲ（ＥＴ ＡＮＤ ＨＮＦ１Ａ）（図５Ｂ）であった。Ｏｎ対Ｏｆｆ比を増加させるために、ＰＩＴ２をＰＩＴ－ＶＰ１６と置換した（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。全ての可能な入力組み合わせは、構成的プロモータ（ＰＩＴ及びＥＴ）又はｔＴＡ誘導プロモータ（ＳＯＸ１０及びＨＮＦ１Ａ）のいずれかからトランスで提供され、回路応答はＳＯＸ１０もＨＮＦ１Ａ／Ｂも発現しないＨｅＬａ細胞で測定された。短いイントロンを含む最初の構築物では、第一プロモータ（ＰＩＴ又はＳＯＸ１０）へのいずれかの入力は第二プロモータ（ＥＴ又はＨＮＦ１Ａ）へのいずれかの入力と相乗的活性化を示した。活性化は、ＰＩＴ＋ＨＮＦ１Ａの組み合わせで最も強く、この実施例で最悪のケースのＯＦＦ状態（図１２Ａ）となり、相乗効果スコア（Ａｎｇｅｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）は３．３であった。この問題に対抗するために、二つのプロモータ間の距離は、２００塩基のイントロン配列を追加することによって増加し、相乗効果スコアを２．４に減少させた（図１２Ｂ）。さらに、ＰＩＴ結合部位を３から２に減少させることで、相乗効果は１．６になった。定性的に、微調整された回路の応答（図５Ｃ）は論理審理値表と一致していた。しかしながら、ＯＮ出力とＯＦＦ出力の間にはばらつきがあり、ダイナミックレンジのメジアンは約２２倍であり、最悪のケースは６．６倍であった（図５Ｃ）。ちなみに、入力組み合わせＨＮＦ１Ａ＋ＥＴ＋ＳＯＸ１０について、出力はＥＴ＋ＨＮＦ１Ａと比較して減少し、ＥＴ及びＨＮＦ１Ａの存在下でＰＩＴを追加すると反対のことが観察された。ＴＦ入力ＳＯＸ１０又はＨＮＦ１Ａの存在は、反対のプロモータブランチの出力レベルに対して影響を及ぼしたが、構築物は満足できる標準形論理様挙動を達成した。特に、イントロン長さ及び個々のＡＮＤプロモータ組成に関して、本明細書中で開示された設計原理に基づいてさらなる微調整を実施して、様々な効果のバランスを取り、標準形論理性能をさらに改善することができる。
最後に、本発明者等は、ＯＲゲートの個々の転写物の論理制御を、例えば、マイクロＲＮＡ入力及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して、転写後レベルでのＮＯＴ操作によって拡張できるか否かを調査した（図６Ａ）。第一及び第二プロモータ－駆動転写物のユニークな５’－ＵＴＲは、転写物特異的ＲＮＡｉのアクセスポイントとして機能できることが企図された；例えば、マイクロＲＮＡは、それらの５’－ＵＴＲにおける標的部位を介して遺伝子発現を調節できることが示された（Ｌｙｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。この可能性を分析するために、第一転写物の５’－ＵＴＲは人工ｓｉＲＮＡ－ＦＦ４の標的部位で増強され、第二のものは、ｓｉＲＮＡ－ＦＦ５の標的部位で増強された（Ｌｅｉｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。フル回路（図６Ｂ）は６入力を受け取り、６４の可能な入力組み合わせに対応する。６４の入力組み合わせすべてを試験する代わりに、本発明者等は、回路応答に対する寄与に焦点を当て、最も有益なものを試験した。ｓｉＲＮＡ入力（四つの組み合わせ）を転写入力組み合わせと重ね合わせ、その結果、プロモータブランチがどれも活性化されないか、一つ活性化されるか、又は両方活性化され（四つの条件）、合計で１６の入力セットが得られた。ｍＣｉｔｒｉｎｅ発現（図６Ｃ）パターンは真理値表と定性的に一致した。転写物のうちの一つのプロモータが活性化されたが、ｓｉＲＮＡ入力が別の転写物を標的とする場合、出力発現に対する影響はなかった。しかしながら、ｓｉＲＮＡ入力が、その指定されたプロモータブランチによって生成された転写物を標的とした場合、出力発現の明らかなノックダウンがあった。効果は、ｓｉＲＮＡ－ＦＦ４（条件９対条件１０、１０ｘの相違）の場合で特に強く、ｓｉＲＮＡ－ＦＦ５（条件５対条件７、２．５～３ｘの相違）の場合は若干弱かった。両転写物が活性化されたが、ｓｉＲＮＡ入力の一つだけが存在する場合、論理式及び／又は真理値表から予測されるように、出力が強力に発現され（条件１４及び１５）、両ｓｉＲＮＡ入力が存在した場合だけ、出力が阻止された（条件１６）。しかしながら、ｓｉＲＮＡ－ＦＦ５の効率が低いことは、より実質的なノックダウンの達成を妨げるボトルネックとして作用した。それにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ－ＦＦ４の強力な効果によって例示されるような５’－ＵＴＲによる阻止は効率的であり、例えば、ｓｉＲＮＡ結合効率をさらに改善することによるなど、さらなる最適化への明確な道筋を示す。
参考文献
以下の詳細な参考文献は、本明細書において省略形で示した参考文献に関する。
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Ｅｐｅｒｏｎ，Ｉ．Ｃ．，Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｄ．Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｙｅｄａ，Ａ．，ａｎｄ Ｋｒａｉｎｅｒ，Ａ．Ｒ．（１９９３）．Ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ５’ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅｓ ｂｙ Ｕ１ ＳＮＲＮＰＳ ａｎｄ ＳＦ２／ＡＳＦ．Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ １２，３６０７－３６１７．
Ｅｓｚｔｅｒｈａｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ，Ｅ．Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ．Ｉ．Ｋ．，ａｎｄ Ｆｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．（２００２）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｃｃｕｒｓ ｉｎ ａｎｙ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２，４６９－４７９．
Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｒ．Ｐ．，Ｆｕｘ，Ｃ．，Ｒｉｍａｎｎ，Ｍ．，ｖｏｎ Ｓｔｏｃｋａｒ，Ｂ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．（２０００）．Ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８，１２０３－１２０８．
Ｇａｉｌｄｒａｔ，Ｐ．，Ｋｉｌｌｉａｎ，Ａ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ａ．，Ｔｏｕｒｎｉｅｒ，Ｉ．，Ｆｒｅｂｏｕｒｇ，Ｔ．，ａｎｄ Ｔｏｓｉ，Ｍ．（２０１０）．Ｕｓｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｍｉｎｉｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍ．Ｗｅｂｂ，ｅｄ．（Ｔｏｔｏｗａ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ），ｐｐ．２４９－２５７．
Ｇａｍ，Ｊ．Ｊ．，Ｂａｂｂ，Ｊ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．（２０１８）．Ａ ｍｉｘｅｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ／ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｍｉＲＮＡ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｅｎａｂｌｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｉｎｐｕｔ ｍｉＲＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ｖｏｌ ９，２４３０，２０１８）．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９．
Ｇａｏ，Ｘ．Ｊ．，Ｃｈｏｎｇ，Ｌ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ Ｅｌｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｂ．（２０１８）．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６１，１２５２－１２５８．
Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｔ．Ｓ．，Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．（２０００）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｇｇｌｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ ４０３，３３９－３４２．
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｒ．Ｙ．，Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｏ．（２００９）．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３４３－Ｕ３４１．
Ｇｉｌ，Ａ．，ａｎｄ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎ．Ｊ．（１９８７）．Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＡＡＵＡＡＡ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｂｂｉｔ ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ－ｒｎａ ３’ ｅｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ４９，３９９－４０６．
Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｍａ，Ｄ．，Ｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｓ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｙｉｎ，Ｐ．（２０１７）．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｇｉｃ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５４８，１１７－＋．
Ｈａｅｆｌｉｇｅｒ，Ｂ．，Ｐｒｏｃｈａｚｋａ，Ｌ．，Ａｎｇｅｌｉｃｉ，Ｂ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２０１６）．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７，１２．
Ｈａｍ，Ｔ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｋ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．（２００８）．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｏｕｂｌｅ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｍｏｒｙ．Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ３，９．
Ｋｏｚａｋ，Ｍ．（１９８６）．Ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｄｅｆｉｎｅ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｔｈｅ ＡＵＧ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｃｏｄｏｎ ｔｈａｔ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ ４４，２８３－２９２．
Ｋｒａｍｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．（２００４）．ＢｉｏＬｏｇｉｃ ｇａｔｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８７，４７８－４８４．
Ｌａｐｉｑｕｅ，Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２０１８）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｃａｎ ｂｅ ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｄｅｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，３０９－３１５．
Ｌｅｉｓｎｅｒ，Ｍ．，Ｂｌｅｒｉｓ，Ｌ．，Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｘｉｅ，Ｚ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２０１０）．Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｌｏｇｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５，６６６－６７０．
Ｌｉ，Ｘ．Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｇ．Ｈ．，Ｎｇｏ，Ｎ．，Ｚｈａｏ，Ｘ．Ｎ．，Ｋａｉｎ，Ｓ．Ｒ．，ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．（１９９７）．Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｆｉｎｅ ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２，２８５４５－２８５４９．
Ｌｉｎ，Ｙ．Ｓ．，Ｃａｒｅｙ，Ｍ．，Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．（１９９０）．Ｈｏｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｃａｎ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｌｙ．Ｎａｔｕｒｅ ３４５，３５９－３６１．
Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ａｒｍｅｌ，Ｔ．Ｚ．，ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．（２０１２）．Ａ ｔｕｎａｂｌｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ－ｂａｓｅｄ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂｏｏｌｅａｎ ｌｏｇｉｃ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０，５１８０－５１８７．
Ｌｏｉｓ，Ｃ．，Ｈｏｎｇ，Ｅ．Ｊ．，Ｐｅａｓｅ，Ｓ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｊ．，ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．（２００２）．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，８６８－８７２．
Ｌｙｔｌｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｙａｒｉｏ，Ｔ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ，Ｊ．Ａ．（２００７）．Ｔａｒｇｅｔ ｍＲＮＡｓ ａｒｅ ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ５ ’ ＵＴＲ ａｓ ｉｎ ｔｈｅ ３ ’ ＵＴＲ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０４，９６６７－９６７２．
Ｍａｔｈｕｒ，Ｍ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｍ．，Ｍｕｎｒｏ，Ｓ．Ａ．，Ｒｕｄｉｎａ，Ｓ．Ｓ．，Ｓａｗｙｅｎ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｍｏｌｋｅ，Ｃ．Ｄ．（２０１９）．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｍｕｔｕａｌｌｙ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０，１３．
Ｍｉｓｉｒｌｙ，Ｇ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｊ．Ａ．，Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ，Ｐ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｓ．，Ｄｅｎｓｍｏｒｅ，Ｄ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｃ．，ａｎｄ Ｗｉｐａｔ，Ａ．（２０１９）．Ａ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｆｌｏｗ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｅｓｉｇｎｓ．Ａｃｓ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８，１５４８－１５５９．
Ｍｉｙａｓｏ，Ｈ．，Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｍ．，Ｋｏｎｄｏ，Ｓ．，Ｈｉｇａｓｈｉｄｅ，Ｓ．，Ｍｉｙａｊｉｍａ，Ｈ．，ａｎｄ Ｉｍａｉｚｕｍｉ，Ｋ．（２００３）．Ａｎ ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ （ＳＭＮ） ｐｒｅ－ｍＲＮＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７８，１５８２５－１５８３１．
Ｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｐ．，Ｂｅｅｒｅｎｗｉｎｋｅｌ，Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２０１７）．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｗｏ－ｓｔｅｐ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ４，２０７－２１８．
Ｍｕｈｌｅｔｈａｌｅｒ－Ｍｏｔｔｅｔ，Ａ．，Ｏｔｔｅｎ，Ｌ．Ａ．，Ｓｔｅｉｍｌｅ，Ｖ．，ａｎｄ Ｍａｃｈ，Ｂ．（１９９７）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｕｓａｇｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＩＩＴＡ．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １６，２８５１－２８６０．
Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｋ．，Ｓｉｓｋ，Ｔ．Ｊ．，Ｉｎｏｈａｒａ，Ｎ．，Ｙｅｅ，Ｃ．Ｓ．Ｋ．，Ｋｅｎｎｅｌｌ，Ｊ．，Ｃｈｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｙａｎｎｉｅ，Ｐ．Ｊ．，Ｎｕｎｅｚ，Ｇ．，ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｈ．（２００１）．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｃａｓｐａｓｅ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｄｏｍａｉｎ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｅｒｓ ｐｏｔｅｎｔ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６，１９０８９－１９０９３．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ａ．Ａ．Ｋ．，Ｄｅｒ，Ｂ．Ｓ．，Ｓｈｉｎ，Ｊ．，Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ，Ｐ．，Ｐａｒａｌａｎｏｖ，Ｖ．，Ｓｔｒｙｃｈａｌｓｋｉ，Ｅ．Ａ．，Ｒｏｓｓ，Ｄ．，Ｄｅｎｓｍｏｒｅ，Ｄ．，ａｎｄ Ｖｏｉｇｔ，Ｃ．Ａ．（２０１６）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２，１１．
Ｐｉｏｖｅｓａｎ，Ａ．，Ｃａｒａｃａｕｓｉ，Ｍ．，Ｒｉｃｃｉ，Ｍ．，Ｓｔｒｉｐｐｏｌｉ，Ｐ．，Ｖｉｔａｌｅ，Ｌ．，ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｒｉ，Ｍ．Ｃ．（２０１５）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｔｒｏｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＧｅｎｅＢａｓｅ，ａ ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｐａｒｓｉｎｇ ｔｈｅ ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｎｋ．ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２，４９５－５０３．
Ｐｏｌｉｎｇ，Ｂ．Ｃ．，Ｔｓａｉ，Ｋ．，Ｋａｎｇ，Ｄ．，Ｒｅｎ，Ｌ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｅ．Ｍ．，ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．（２０１７）．Ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｂｅａｒｉｎｇ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｔｒｏｎ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｒｎａ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４，１５７０－１５７９．
Ｐｒｏｃｈａｚｋａ，Ｌ．，Ａｎｇｅｌｉｃｉ，Ｂ．，Ｈａｅｆｌｉｇｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２０１４）．Ｈｉｇｈｌｙ ｍｏｄｕｌａｒ ｂｏｗ－ｔｉｅ ｇｅｎｅ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５，１２．
Ｒｉｎａｕｄｏ，Ｋ．，Ｂｌｅｒｉｓ，Ｌ．，Ｍａｄｄａｍｓｅｔｔｉ，Ｒ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２００７）．Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡｉ－ｂａｓｅｄ ｌｏｇｉｃ ｅｖａｌｕａｔｏｒ ｔｈａｔ ｏｐｅｒａｔｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，７９５－８０１．
Ｒｉｚｚｏ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｐｉｓｔｏｎ，Ｄ．Ｗ．（２００５）．Ｈｉｇｈ－ｃｏｎｔｒａｓｔ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＦＲＥＴ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ８８，Ｌ１４－Ｌ１６．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｂ．，Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓｅｅｌｉｇ，Ｇ．（２０１５）．Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｍｉｌｌｉｏｎｓ ｏｆ Ｒａｎｄｏｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｃｅｌｌ １６３，６９８－７１１．
Ｓａｓａｋｉ－Ｈａｒａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｍ．Ｋ．，Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｉ．，Ｏｈｎｏ，Ｍ．，ａｎｄ Ｍａｙｅｄａ，Ａ．（２０１２）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｈｕｍａｎ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｕｌｔｒａ－ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｒｏｎｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｎｕｓｕａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｇ－ｒｉｃｈ ｉｎｔｒｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４２３，２８９－２９４．
Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｊ．，Ａｒｔｅｒ，Ｍ．，Ｌａｐｉｑｕｅ，Ｎ．，Ｈａｅｆｌｉｇｅｒ，Ｂ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２０１６）．Ｍｏｄｅｌ－ｇｕｉｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２，１４．
Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ，Ｄ．Ｍ．，Ｂａｌｏｂａｎ，Ｍ．，Ｅｍｅｌｙａｎｏｖ，Ａ．Ｖ．，Ｂｒｅｎｏｗｉｔｚ，Ｍ．，Ｇｕｏ，Ｐ．，ａｎｄ Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ，Ｖ．Ｖ．（２０１６）．Ｂｒｉｇｈｔ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ｔａｇｓ ａｎｄ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７，１２．
Ｔａｍｓｉｒ，Ａ．，Ｔａｂｏｒ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｖｏｉｇｔ，Ｃ．Ａ．（２０１１）．Ｒｏｂｕｓｔ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ＮＯＲ ｇａｔｅｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ’ｗｉｒｅｓ’．Ｎａｔｕｒｅ ４６９，２１２－２１５．
Ｕｐｈｏｆｆ，Ｃ．Ｃ．，ａｎｄ Ｄｒｅｘｌｅｒ，Ｈ．Ｇ．（２０１１）．Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉ．Ａ．Ｃｒｅｅ，ｅｄ．（Ｔｏｔｏｗａ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ），ｐｐ．９３－１０３．
Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｍａ，Ｍ．，Ｘｉａｏ，Ｘ．Ｓ．，ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｆ．（２０１２）．Ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ，ｃｏｇｎａｔｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｅｘｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｒｕｌｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９，１０４４－Ｕ１１０４．
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Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｂ．Ｈ．，Ｐｈａｍ，Ｎ．Ｔ．Ｈ．，Ｃａｒａｂａｌｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｌｏｚａｎｏｓｋｉ，Ｔ．，Ｅｎｇｅｌ，Ａ．，Ｂｈａｔｉａ，Ｓ．，ａｎｄ Ｗｏｎｇ，Ｗ．Ｗ．（２０１７）．Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｒｏｂｕｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｐｕｔｓ ａｎｄ ｏｕｔｐｕｔｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３５，４５３－＋．
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以下の詳細な参考文献は、本明細書において省略形で示した参考文献に関する。
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Ｃｅｒｏｎｉ，Ｆ．，Ｂｏｏ，Ａ．，Ｆｕｒｉｎｉ，Ｓ．，Ｇｏｒｏｃｈｏｗｓｋｉ，Ｔ．Ｅ．，Ｂｏｒｋｏｗｓｋｉ，Ｏ．，Ｌａｄａｋ，Ｙ．Ｎ．，Ａｗａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｃ．，Ｓｔａｎ，Ｇ．Ｂ．，ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，Ｔ．（２０１８）．Ｂｕｒｄｅｎ－ｄｒｉｖｅｎ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５，３８７－＋．
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Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｐ．Ｓ．，Ｄｒａｕｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｍｕｌｄｏｏｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｉ．，Ｂａｇｈｅｒｉ，Ｎ．，ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．Ｎ．（２０２０）．Ｔｈｅ ＣＯＭＥＴ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｓｉｎｇ ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １１．
Ｄｕｌｌ，Ｔ．，Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，Ｒ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｍ．，Ｍａｎｄｅｌ，Ｒ．Ｊ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．，Ｔｒｏｎｏ，Ｄ．，ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．（１９９８）．Ａ ｔｈｉｒｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，８４６３－８４７１．
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Ｅｐｅｒｏｎ，Ｉ．Ｃ．，Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｄ．Ｃ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｙｅｄａ，Ａ．，ａｎｄ Ｋｒａｉｎｅｒ，Ａ．Ｒ．（１９９３）．Ｐａｔｈｗａｙｓ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ５’ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅｓ ｂｙ Ｕ１ ＳＮＲＮＰＳ ａｎｄ ＳＦ２／ＡＳＦ．Ｅｍｂｏ Ｊｏｕｒｎａｌ １２，３６０７－３６１７．
Ｅｓｚｔｅｒｈａｓ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ，Ｅ．Ｅ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ．Ｉ．Ｋ．，ａｎｄ Ｆｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．（２００２）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｃｃｕｒｓ ｉｎ ａｎｙ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２，４６９－４７９．
Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｒ．Ｐ．，Ｆｕｘ，Ｃ．，Ｒｉｍａｎｎ，Ｍ．，ｖｏｎ Ｓｔｏｃｋａｒ，Ｂ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．，ａｎｄ Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．（２０００）．Ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８，１２０３－１２０８．
Ｇａｉｌｄｒａｔ，Ｐ．，Ｋｉｌｌｉａｎ，Ａ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ａ．，Ｔｏｕｒｎｉｅｒ，Ｉ．，Ｆｒｅｂｏｕｒｇ，Ｔ．，ａｎｄ Ｔｏｓｉ，Ｍ．（２０１０）．Ｕｓｅ ｏｆ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｍｉｎｉｇｅｎｅ ａｓｓａｙ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍ．Ｗｅｂｂ，ｅｄ．（Ｔｏｔｏｗａ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ），ｐｐ．２４９－２５７．
Ｇａｍ，Ｊ．Ｊ．，Ｂａｂｂ，Ｊ．，ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．（２０１８）．Ａ ｍｉｘｅｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ／ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｍｉＲＮＡ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｅｎａｂｌｅｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｉｎｐｕｔ ｍｉＲＮＡ ｓｅｎｓｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ （ｖｏｌ ９，２４３０，２０１８）．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９．
Ｇａｏ，Ｘ．Ｊ．，Ｃｈｏｎｇ，Ｌ．Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ Ｅｌｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｂ．（２０１８）．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６１，１２５２－１２５８．
Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｔ．Ｓ．，Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．（２０００）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｇｇｌｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎａｔｕｒｅ ４０３，３３９－３４２．
Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｒ．Ｙ．，Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｏ．（２００９）．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，３４３－Ｕ３４１．
Ｇｉｌ，Ａ．，ａｎｄ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎ．Ｊ．（１９８７）．Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｏｆ ＡＡＵＡＡＡ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｂｂｉｔ ｂｅｔａ－ｇｌｏｂｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ－ｒｎａ ３’ ｅｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ４９，３９９－４０６．
Ｇｒｅｅｎ，Ａ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｍａ，Ｄ．，Ｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｓ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｙｉｎ，Ｐ．（２０１７）．Ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｇｉｃ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｒｉｂｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５４８，１１７－＋．
Ｈａｅｆｌｉｇｅｒ，Ｂ．，Ｐｒｏｃｈａｚｋａ，Ｌ．，Ａｎｇｅｌｉｃｉ，Ｂ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２０１６）．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ７，１２．
Ｈａｍ，Ｔ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｋ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．（２００８）．Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｏｕｂｌｅ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｍｏｒｙ．Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ３，９．
Ｋｏｚａｋ，Ｍ．（１９８６）．Ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｄｅｆｉｎｅ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｔｈｅ ＡＵＧ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｃｏｄｏｎ ｔｈａｔ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ ４４，２８３－２９２．
Ｋｒａｍｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｃ．，ａｎｄ Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．（２００４）．ＢｉｏＬｏｇｉｃ ｇａｔｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｌｏｇｉｃａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８７，４７８－４８４．
Ｌａｐｉｑｕｅ，Ｎ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２０１８）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｃａｎ ｂｅ ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｄｅｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｌｉｖｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，３０９－３１５．
Ｌｅｉｓｎｅｒ，Ｍ．，Ｂｌｅｒｉｓ，Ｌ．，Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｘｉｅ，Ｚ．，ａｎｄ Ｂｅｎｅｎｓｏｎ，Ｙ．（２０１０）．Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｌｏｇｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５，６６６－６７０．
Ｌｉ，Ｘ．Ｑ．，Ｚｈａｎｇ，Ｇ．Ｈ．，Ｎｇｏ，Ｎ．，Ｚｈａｏ，Ｘ．Ｎ．，Ｋａｉｎ，Ｓ．Ｒ．，ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．（１９９７）．Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｆｉｎｅ ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７２，２８５４５－２８５４９．
Ｌｉｎ，Ｙ．Ｓ．，Ｃａｒｅｙ，Ｍ．，Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．（１９９０）．Ｈｏｗ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｃａｎ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓｌｙ．Ｎａｔｕｒｅ ３４５，３５９－３６１．
Ｌｏｈｍｕｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ａｒｍｅｌ，Ｔ．Ｚ．，ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．（２０１２）．Ａ ｔｕｎａｂｌｅ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ－ｂａｓｅｄ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂｏｏｌｅａｎ ｌｏｇｉｃ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０，５１８０－５１８７．
Ｌｏｉｓ，Ｃ．，Ｈｏｎｇ，Ｅ．Ｊ．，Ｐｅａｓｅ，Ｓ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｊ．，ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．（２００２）．Ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，８６８－８７２．
Ｌｙｔｌｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｙａｒｉｏ，Ｔ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ，Ｊ．Ａ．（２００７）．Ｔａｒｇｅｔ ｍＲＮＡｓ ａｒｅ ｒｅｐｒｅｓｓｅｄ ａｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ５ ’ ＵＴＲ ａｓ ｉｎ ｔｈｅ ３ ’ ＵＴＲ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０４，９６６７－９６７２．
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Ｍｉｓｉｒｌｙ，Ｇ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｊ．Ａ．，Ｖａｉｄｙａｎａｔｈａｎ，Ｐ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｓ．，Ｄｅｎｓｍｏｒｅ，Ｄ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｃ．，ａｎｄ Ｗｉｐａｔ，Ａ．（２０１９）．Ａ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｆｌｏｗ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｅｓｉｇｎｓ．Ａｃｓ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８，１５４８－１５５９．
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本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
５’→３’方向に以下のＤＮＡ配列エレメント：
第一プロモータ（Ｐ１）；
ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）、ただし、ｎ≧１、例えば、Ｐ２、Ｐ２とＰ３、又はＰ２とＰ３とＰ４；及び
出力配列
を含むＤＮＡ構築物であって、
前記プロモータのそれぞれは、転写開始部位を含み、及び／又は転写を開始するのに適し、
Ｐ１からの転写の開始は、第一転写調節状態（ＴＳ１）によって可能となり、前記さらなるプロモータ（Ｐｎ）のそれぞれからの転写の開始は、さらなる転写調節状態（ＴＳｎ）のそれぞれによって可能となり、例えば、Ｐ２はＴＳ２によって可能となり、
前記ＴＳ１及び／又は各々のＴＳｎのいずれか、例えば、Ｐ１及びＰ２について：ＴＳ１、ＴＳ２、又はＴＳ１及びＴＳ２が前記細胞中に存在する場合、前記ＤＮＡ構築物は、真核細胞において、好ましくは哺乳動物細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、
前記出力ＲＮＡは、前記出力配列に対応する配列を含み、
特に、転写がＰ１から開始される場合に前記出力ＲＮＡの第一タイプ（ＲＮＡ１）が得られ、転写が各々のＰｎ、例えばＰ２から開始される場合に各々のさらなるタイプの前記出力ＲＮＡ（ＲＮＡｎ、例えば、ＲＮＡ２）が得られ、前記出力ＲＮＡの各タイプは前記出力配列に対応する配列を含み、特に、前記出力ＲＮＡの量は前記出力ＲＮＡの全タイプの合計量に対応する、ＤＮＡ構築物。
（項目２）
前記細胞中に、ＴＳ１もＴＳｎのうちのいずれも存在しない場合、前記ＤＮＡ構築物は有効量の前記出力ＲＮＡを産生しない、項目１に記載のＤＮＡ構築物。
（項目３）
前記第一プロモータ（Ｐ１）と前記さらなるプロモータの最後のプロモータ（Ｐｎ）との間に、５’→３’方向で、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）および第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）、並びに前記最後のプロモータと前記出力配列との間に、分岐点（ＢＰ）及び３’スプライス部位（３’ｓｓ）をさらに含み、前記出力配列が、第二エクソン（Ｅ２）であるか又は第二エクソン（Ｅ２）を含む、
項目１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
（項目４）
前記最後のプロモータと前記分岐点（ＢＰ）との間に５’→３’方向で、ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソンの最後の代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）及びｎ個の各々のさらなる５’スプライス部位の最後の代替５’スプライス部位（５’ｓｓｎ）をさらに含み、
好ましくは、前記最後の代替５’スプライス部位は、前記ＤＮＡ構築物に含まれる別の５’スプライス部位よりも弱く、より好ましくは、前記最後の代替５’スプライス部位は、前記ＤＮＡ構築物に含まれるすべての５’スプライス部位の中で最も弱いものである、
項目３に記載のＤＮＡ構築物。
（項目５）
前記第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）と前記最後のプロモータとの間に５’→３’方向で、少なくとも一つのさらなるエレメント群をさらに含み、
前記エレメント群のそれぞれが、５’→３’方向で：
前記ｎ個のさらなるプロモータのさらなる一つ（Ｐｎ）、
前記ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）のさらなる一つ、及び
前記ｎ個の各々の代替５’スプライス部位のさらなる一つ（５’ｓｓｎ）
を含む、
項目４に記載のＤＮＡ構築物。
（項目６）
前記分岐点（ＢＰ）及び前記３’スプライス部位（３’ｓｓ）は、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかによって産生される出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる少なくとも一つの５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’スプライス部位との間の配列の除去を可能にし、
好ましくは、前記ＢＰ及び３’ｓｓは、少なくとも、前記出力ＲＮＡにおいて最も５’である前記５’ｓｓと前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にし、及び／又は
好ましくは、前記ＢＰ及び３’ｓｓは、前記出力ＲＮＡにおける各５’ｓｓと前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にする、
項目３～５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目７）
前記第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）は、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる前記５’ｓｓ１と前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にし、
特に、前記さらなる代替５’スプライス部位のそれぞれ（例えば、５’ｓｓ２）は、前記さらなる５’スプライス部位の５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち前記５’スプライス部位の５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる前記各々のさらなる５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にする、
項目３～６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目８）
前記出力ＲＮＡは、前記第二エクソン（Ｅ２）に対応する配列の５’に、
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、前記第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、前記各々のさらなる代替第一エクソンの５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち前記さらなる代替第一エクソンの５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、前記さらなる代替第一エクソンの一つ、例えばＥ１ｂに対応する配列
をさらに含む、
項目４～７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目９）
前記出力ＲＮＡが、
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、前記５’ｓｓ１と前記３’ｓｓとの間の配列に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、前記さらなる５’スプライス部位の５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち、前記５’スプライス部位の５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、さらなる５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’ｓｓとの間の配列に対応する配列
を含まない、
項目４～８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１０）
前記出力ＲＮＡが少なくとも一つの出力タンパク質をコード化する少なくとも一つの配列を含み、前記少なくとも一つの出力タンパク質のＣＤＳが、前記出力配列、例えば、前記第二エクソンに部分的又は完全に含まれる、
項目１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１１）
前記少なくとも一つの出力タンパク質が、レポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素、及び／或いはエフェクタータンパク質、例えば毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含む、
項目１０に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１２）
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物が第一エクソン及び第二エクソンを含まない場合、前記ＣＤＳのそれぞれが前記出力配列に完全に含まれ；
（ｉｉ）第二エクソンに部分的に含まれるＣＤＳが、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部に対応するか又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部であり、前記ＯＲＦの開始コドンが、前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つ、好ましくはそれぞれの代替第一エクソンに含まれ、前記ＯＲＦの終止コドンが、第二エクソンに含まれる、
項目１０又は１１に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１３）
前記プロモータの少なくとも一つ、好ましくは、前記プロモータのそれぞれが、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含む、
項目１～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１４）
ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１、又はＴＳ２若しくはＴＳ３などのＴＳｎのいずれかが、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／若しくは細胞状態、例えば、分化した細胞状態、幹細胞状態、及び／又は疾患細胞状態と関連し、及び／又は反映し；並びに／或いは
（ｉｉ）各々の転写因子群からの少なくとも一つの転写因子（ＴＦ）の存在を含み、例えば、
ＴＳ１は、ＴＦの第一群（ＴＦ１）からの少なくとも一つのＴＦ、例えば、ＴＦ１ａ及び／又はＴＦ１ｂの存在を含み、並びに／或いは
ＴＳｎ、例えば、ＴＳ２は、さらなるＴＦ群（ＴＦｎ、例えば、ＴＦ２）からの少なくとも一つのＴＦ、例えば、ＴＦｎａ及び／又はＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａ及び／又はＴＦ２ｂの存在を含み、
個々の転写因子は、前記ＴＦ群の一つ以上に含まれ得る、
項目１～１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１５）
第一転写調節状態（ＴＳ１）が、少なくともある特定の数の、例えば、二つの、第一ＴＦ群（ＴＦ１）からのＴＦ、例えば、ＴＦ１ａとＴＦ１ｂの存在を含み、及び／又はさらなる転写調節状態（ＴＳｎ）のいずれかが、少なくともある特定の数の、例えば、二つの、各々のさらなる転写因子群（ＴＦｎ、例えば、ＴＦ２）からのＴＦ、例えば、ＴＦｎａとＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａとＴＦ２ｂの存在を含む、
項目１～１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１６）
Ｐ１が、ＴＦ１からの少なくとも一つのＴＦ又はある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ１ａ、又はＴＦ１ａとＴＦ１ｂに対する少なくとも一つの結合部位を含み、及び／又は
Ｐｎのいずれか、例えば、Ｐ２が、各々のＴＦｎからの少なくとも一つのＴＦ又はある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ２、例えば、ＴＦｎａ、又はＴＦｎａとＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａ、又はＴＦ２ａとＴＦ２ｂに対する少なくとも一つの結合部位を含む、
項目３～１５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１７）
第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列、すなわち、Ｅ２に対応する配列の５’を含む出力ＲＮＡが、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって制御され、
特に、さらなる第一代替第一エクソン（Ｅ１ｎ、例えば、Ｅ１２）に対応する配列、すなわち、Ｅ２に対応する配列の５’を含む出力ＲＮＡが、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＳ２）によって制御される、
項目３～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１８）
第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって翻訳阻害及び／又は分解され、
特に、さらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ、例えば、Ｅ１２）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＳ２）によって翻訳阻害及び／又は分解される、
項目３～１７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１９）
前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つの各々のプロモータ、例えば、Ｐ１からの出力ＲＮＡが産生されるように、少なくとも一つの転写調節状態、すなわちＴＳ１及び／又はＴＳｎのいずれか、例えば、ＴＳ１が前記細胞中に存在する場合；並びに
（ｉｉ）各々の代替第一エクソン（例えば、Ｅ１ａ）を含む産生された出力ＲＮＡが翻訳阻害又は分解されないように、各々の転写後調節状態（例えば、ＰＴＳ１）が前記細胞中に存在しない場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生する、
項目１８に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２０）
前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータ、例えば、Ｐ１及びＰ２から転写を誘導できる転写状態が前記細胞中に存在しない、例えば、ＴＳ１もＴＳ２も前記細胞中に存在しない場合、及び／又は
（ｉｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータ、例えば、Ｐ１及びＰ２によって産生される出力ＲＮＡを翻訳阻害及び／又は分解できる各転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１及びＰＴＳ２が前記細胞中に存在する場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生しない、
項目１８又は１９に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２１）
ある特定の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１、又はＰＴＳ２若しくはＰＴＳ３などのＰＴＳｎのいずれかが、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／又は細胞状態と関連し、及び／又は反映し；並びに／或いは
（ｉｉ）各々のアンチセンスＲＮＡ群からの少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）の存在を含み、例えば、
この場合、ＰＴＳ１は、ＡＲの第一群（ＡＲ１）からの少なくとも一つのＡＲ、例えばＡＲ１ａ及び／又はＡＲ１ｂの存在を含み、ＰＴＳｎ、例えばＰＴＳ２は、ＡＲのさらなる群（ＡＲｎ、例えば、ＡＲ２）からの少なくとも一つのＡＲ、例えば、ＡＲｎａ及び／又はＡＲｎｂ、例えばＡＲ２ａ及び／又はＡＲ２ｂの存在を含み、
個々のＡＲは、前記Ａｒ群の一つ以上に含まれていてもよい、並びに／或いは
（ｉｉｉ）少なくとも一つのＲＮＡ結合タンパク質の存在を含む、
項目１７～２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２２）
ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１、及び各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１が、有効量の出力ＲＮＡが得られることが望まれるのと同じ細胞型及び／又は細胞状態、例えば標的細胞に含まれない、
項目２１に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２３）
ある特定の細胞型及び／又は細胞状態が、
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１の存在、例えば、各々のＴＦ群からの少なくとも一つ又はある特定の数の転写因子（ＴＦ）、例えば、ＴＦ１、又はＴＦ１とＴＦ２の存在、並びに／或いは
（ｉｉ）ある特定の、すなわち、各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１の非存在、例えば、各々のＡＲ群からの少なくとも一つ又はある特定の数のアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）、例えば、ＡＲ１、又はＡＲ１とＡＲ２の非存在を含む、
項目２１又は２２に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２５）
前記Ｅ１ａが、ＡＲ１からの少なくとも一つのＡＲ又はある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ１ａ、又はＡＲ１ａとＡＲ１ｂに対する少なくとも一つの標的部位、すなわち結合部位に対応する少なくとも一つの配列を含み、すなわち、前記少なくとも一つの標的部位は、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡにおけるＥ１ａに対応する配列に含まれ；及び／又は
特に、前記Ｅ１ｎのいずれか、例えば、Ｅ１ｂが、各々のＡＲｎからの少なくとも一つのＡＲ又はある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ２、例えば、ＡＲｎａ、又はＡＲｎａとＡＲｎｂ、例えば、ＡＲ２ａ、又はＡＲ２ａとＡＲ２ｂに対する少なくとも一つの標的部位、すなわち、結合部位に対応する少なくとも一つの配列を含み、すなわち、前記少なくとも一つの標的部位が、前記Ｅ１ｎの５’であるプロモータ、すなわち、前記Ｅ１ｎの５’に最も近いプロモータによって産生される出力ＲＮＡにおける前記Ｅ１ｎに対応する配列に含まれる、
項目１７～２３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２６）
アンチセンスＲＮＡが、少なくとも１０、１５又は２０の連続した塩基の配列を含み、前記配列が、出力ＲＮＡに含まれる各々の代替第一エクソンにおける、各々の標的部位、すなわち、結合部位の相補配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の配列同一性を有する、
項目２５に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２７）
前記アンチセンスＲＮＡがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、
項目２１～２６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２８）
アンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）が、前記ＡＲに対する標的部位、すなわち、結合部位を含む出力ＲＮＡの翻訳阻害及び／又は分解を促進し、すなわち、出力ＲＮＡの前記翻訳阻害は、前記出力ＲＮＡによってコード化されたレポータ及び／又はエフェクタータンパク質の産生、すなわち翻訳の阻害に対応する、
項目２１～２７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物
（項目２９）
細胞中の有効量の出力ＲＮＡの収量は、
有効量の出力ＲＮＡが得られない条件、例えば、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかからの転写を開始するための各々の転写状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力ＲＮＡの量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡが前記ＤＮＡ構築物を含む前記細胞中に存在することに対応する、
項目１～２８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目３０）
出力ＲＮＡの前記有効量が、少なくとも一つの出力タンパク質、すなわち、前記出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つのレポータタンパク質及び／又はエフェクタータンパク質の有効量に対応する、すなわち、言い換えられる、
項目１～２９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。
（項目３１）
細胞中の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質の有効量の収量が、有効量の前記出力ＲＮＡが得られない条件、例えば、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかからの転写を開始するための各々の転写調節状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力タンパク質の量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の、前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が、前記ＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在することに対応する、
項目１～３０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目３２）
最大でも１５０ｋｂ、好ましくは最大でも１２ｋｂの長さを有する、
項目１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目３３）
項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むプラスミド。
（項目３４）
前記ウイルスに含まれるＤＮＡ構築物が二本鎖又は一本鎖であり、前記一本鎖ＤＮＡ構築物が、項目１～３３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物のセンス又はアンチセンス鎖に対応する配列を含み、特に、前記ウイルスが、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はＶＳＶベクターである、
項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物或いは前記ＤＮＡ構築物に対応する配列及び／又は前記ＤＮＡ構築物の配列に対して相補的な配列を含むＲＮＡを含む、ウイルス。
（項目３５）
項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド、及び／又は項目３４に記載のウイルスを含む、宿主細胞。
（項目３６）
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患の治療で使用するための、項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド、項目３４に記載のウイルス又は項目３５に記載の宿主細胞。
（項目３７）
前記ＤＮＡ構築物が、対象における複数の細胞へ導入されるものであり、前記複数の細胞が、標的細胞と非標的細胞とを含み得る、項目３６に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目３８）
前記疾患が、例えば、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞の不均一混合物と関連し、及び／又はこれにより引き起こされ、標的細胞が、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１である、項目３６又は３７に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目３９）
前記疾患の治療は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、標的細胞を殺滅及び／又は操作することを含み；すなわち操作された標的細胞が対象に対して無毒になるか、毒性が低くなるか、又は有益になる、
項目３７又は３８に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４０）
非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞が、殺滅及び／又は操作されない、項目３８又は３９に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４１）
（ｉ）前記ＡＣ１が、前記ＴＳ１の存在を含み、任意選択的に前記ＰＴＳ１の非存在を含んでもよく、及び／又は
（ｉｉ）ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２が、各々のＴＳｎ、例えば、ＴＳ２の存在を含み、任意選択的に、各々のＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＰ２の非存在を含んでもよい、
項目３８～４０のいずれか一項に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４２）
有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つの出力タンパク質が、
（ｉ）前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞、並びに／或いは
（ｉｉ）前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２）に対応する標的細胞
において得られる、
項目３７～４１のいずれか一項に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４３）
有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が非標的細胞では得られない、
項目３７～４２のいずれか一項に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４４）
前記少なくとも一つの出力タンパク質が、少なくとも一つのエフェクタータンパク質、例えば、毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含む、
項目４２又は４３に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４５）
前記疾患が、がん、神経変性疾患、免疫不全、及び／又は遺伝性疾患であり、好ましくはがんである、
項目３６～４４のいずれか一項に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、ウイルス、又は宿主細胞。
（項目４６）
前記疾患が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞と、前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞とを含む、
項目４５に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４７）
インビボでの対象における疾患の診断で使用するための、項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド、項目３４に記載のウイルス、又は項目３５に記載の宿主細胞。
（項目４８）
真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞の細胞型及び／又は状態を決定するインビトロ法であって、
（ａ）項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド又は項目３４に記載のウイルスをインビトロで前記真核細胞に導入し、
（ｂ）前記細胞において出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
（ｃ）（ｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在する場合、前記細胞はある特定の細胞型及び／又は状態を有すること、及び／又は
（ｉｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在しない場合、前記細胞は前記細胞型及び／又は状態を有さないことを判定すること
を含む、インビトロ法。
（項目４９）
ある特定の細胞型及び／又は状態が、
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１の存在、例えば、各々のＴＦ群からの少なくとも一つ又はある特定の数の転写因子（ＴＦ）、例えば、ＴＦ１ａ、又はＴＦ１ａとＴＦ１ｂの存在を含み、任意選択的に、
（ｉｉ）各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１の非存在、例えば、各々のＡＲ群からの少なくとも一つ又はある特定の数のアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）、例えば、ＡＲ１、又はＡＲ１とＡＲ２の非存在を含んでもよい、
項目４８に記載の方法。
（項目５０）
対象における疾患を診断するためのインビトロ法であって、
ａ）項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド又は項目３４に記載のウイルスを前記対照からの組織サンプルに導入し、
ｂ）前記組織サンプルにおいて出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
ｃ）前記対象が前記疾患を有するか否かを診断すること
を含み、
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在する場合、診断は陽性であり、及び／又は
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在しない場合、診断は陰性である、インビトロ法。
（項目５１）
前記疾患が、例えば、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞の不均一混合物と関連し、及び／又はこれにより引き起こされ、標的細胞が、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１である、
項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記組織サンプルが前記標的細胞を含む疑いがあり、非標的細胞、すなわち正常及び／又は良性細胞を含む可能性がある、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記疾患の診断は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、前記組織サンプル中の標的細胞を検出することを含む、
項目５１又は５２に記載の方法。
（項目５４）
非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞検出されない、
項目５２又は５３に記載の方法。
（項目５５）
（ｉ）前記ＡＣ１が、前記ＴＳ１の存在を含み、任意選択的に前記ＰＴＳ１の非存在を含んでもよく、及び／又は
（ｉｉ）ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２が、各々のＴＳｎ、例えば、ＴＳ２の存在を含み、任意選択的に、各々のＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＰ２の非存在を含んでもよい、
項目５１～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質は、
（ｉ）前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞、並びに／或いは
（ｉｉ）前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２）に対応する標的細胞において得られる、
項目５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
非標的細胞では、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が得られない、項目５１～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記ステップｂ）が、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する細胞の前記組織細胞中のパーセンテージを測定することをさらに含み、
ステップｃ）において、診断は、前記組織サンプル中の細胞の少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陽性であり、並びに／或いは
診断は、前記組織サンプル中の細胞の０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．５％未満、１％未満、５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満若しくは５０％未満が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陰性である、項目５１～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記出力タンパク質が、少なくとも一つのレポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素を含む、項目５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記疾患が、がん、神経変性疾患、免疫不全、及び／又は遺伝性疾患であり、好ましくはがんである、項目５０～５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記疾患が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞と、前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞とを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記対象が哺乳動物であり、好ましくはヒトである、項目３６～４７のいずれか一項に記載の使用のためのＤＮＡ構築物、プラスミド、若しくはウイルス、又は項目５０～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を産生する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡ構築物中に含まれる前記ＤＮＡ配列エレメントを選択し、配列させるステップと、
（ｂ）選択し配列させたＤＮＡ配列エレメントをアセンブル及び／又は合成し、それによって前記ＤＮＡ構築物を産生するステップと、を含む、方法。
（項目６４）
ステップ（ａ）の前に、例えば、標的細胞及び／又は非標的細胞中の少なくとも一つのプロモータの活性を測定すること、並びに／或いはバイオマーカー、特定の転写因子、ｍｉＲＮＡなどのアンチセンスＲＮＡ、トランスクリプト―ム及び／又はプロテオームの標的細胞及び／又は非標的細胞における存在を判定することによって、標的細胞及び／又は非標的細胞の転写調節状態及び／又は転写後調節状態を分析する、
項目６３に記載の方法。
（項目６５）
（ｃ）ＤＮＡ構築物が、標的細胞及び／又は非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生するか否かを分析するステップと、
（ｄ）前記ＤＮＡ構築物が、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、好ましくは非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生しない場合、前記ＤＮＡ構築物を選択し、任意選択的に増幅又は再合成するステップと、
をさらに含む、項目６３又は６４に記載の方法。
（項目６６）
前記ＤＮＡ構築物が、項目６３～６５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１）
５’→３’方向に以下のＤＮＡ配列エレメント：
第一プロモータ（Ｐ１）；
ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）、ただし、ｎ≧１、例えば、Ｐ２、Ｐ２とＰ３、又はＰ２とＰ３とＰ４；及び
出力配列
を含むＤＮＡ構築物であって、
前記プロモータのそれぞれは、転写開始部位を含み、及び／又は転写を開始するのに適し、
Ｐ１からの転写の開始は、第一転写調節状態（ＴＳ１）によって可能となり、前記さらなるプロモータ（Ｐｎ）のそれぞれからの転写の開始は、さらなる転写調節状態（ＴＳｎ）のそれぞれによって可能となり、例えば、Ｐ２はＴＳ２によって可能となり、
前記ＴＳ１及び／又は各々のＴＳｎのいずれか、例えば、Ｐ１及びＰ２について：ＴＳ１、ＴＳ２、又はＴＳ１及びＴＳ２が前記細胞中に存在する場合、前記ＤＮＡ構築物は、真核細胞において、好ましくは哺乳動物細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、
前記出力ＲＮＡは、前記出力配列に対応する配列を含み、
特に、転写がＰ１から開始される場合に前記出力ＲＮＡの第一タイプ（ＲＮＡ１）が得られ、転写が各々のＰｎ、例えばＰ２から開始される場合に各々のさらなるタイプの前記出力ＲＮＡ（ＲＮＡｎ、例えば、ＲＮＡ２）が得られ、前記出力ＲＮＡの各タイプは前記出力配列に対応する配列を含み、特に、前記出力ＲＮＡの量は前記出力ＲＮＡの全タイプの合計量に対応する、ＤＮＡ構築物。
（項目２）
前記細胞中に、ＴＳ１もＴＳｎのうちのいずれも存在しない場合、前記ＤＮＡ構築物は有効量の前記出力ＲＮＡを産生しない、項目１に記載のＤＮＡ構築物。
（項目３）
前記第一プロモータ（Ｐ１）と前記さらなるプロモータの最後のプロモータ（Ｐｎ）との間に、５’→３’方向で、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）および第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）、並びに前記最後のプロモータと前記出力配列との間に、分岐点（ＢＰ）及び３’スプライス部位（３’ｓｓ）をさらに含み、前記出力配列が、第二エクソン（Ｅ２）であるか又は第二エクソン（Ｅ２）を含む、
項目１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
（項目４）
前記最後のプロモータと前記分岐点（ＢＰ）との間に５’→３’方向で、ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソンの最後の代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）及びｎ個の各々のさらなる５’スプライス部位の最後の代替５’スプライス部位（５’ｓｓｎ）をさらに含み、
好ましくは、前記最後の代替５’スプライス部位は、前記ＤＮＡ構築物に含まれる別の５’スプライス部位よりも弱く、より好ましくは、前記最後の代替５’スプライス部位は、前記ＤＮＡ構築物に含まれるすべての５’スプライス部位の中で最も弱いものである、
項目３に記載のＤＮＡ構築物。
（項目５）
前記第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）と前記最後のプロモータとの間に５’→３’方向で、少なくとも一つのさらなるエレメント群をさらに含み、
前記エレメント群のそれぞれが、５’→３’方向で：
前記ｎ個のさらなるプロモータのさらなる一つ（Ｐｎ）、
前記ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）のさらなる一つ、及び
前記ｎ個の各々の代替５’スプライス部位のさらなる一つ（５’ｓｓｎ）
を含む、
項目４に記載のＤＮＡ構築物。
（項目６）
前記分岐点（ＢＰ）及び前記３’スプライス部位（３’ｓｓ）は、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかによって産生される出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる少なくとも一つの５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’スプライス部位との間の配列の除去を可能にし、
好ましくは、前記ＢＰ及び３’ｓｓは、少なくとも、前記出力ＲＮＡにおいて最も５’である前記５’ｓｓと前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にし、及び／又は
好ましくは、前記ＢＰ及び３’ｓｓは、前記出力ＲＮＡにおける各５’ｓｓと前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にする、
項目３～５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目７）
前記第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）は、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる前記５’ｓｓ１と前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にし、
特に、前記さらなる代替５’スプライス部位のそれぞれ（例えば、５’ｓｓ２）は、前記さらなる５’スプライス部位の５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち前記５’スプライス部位の５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる前記各々のさらなる５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にする、
項目３～６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目８）
前記出力ＲＮＡは、前記第二エクソン（Ｅ２）に対応する配列の５’に、
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、前記第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、前記各々のさらなる代替第一エクソンの５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち前記さらなる代替第一エクソンの５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、前記さらなる代替第一エクソンの一つ、例えばＥ１ｂに対応する配列
をさらに含む、
項目４～７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目９）
前記出力ＲＮＡが、
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、前記５’ｓｓ１と前記３’ｓｓとの間の配列に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、前記さらなる５’スプライス部位の５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち、前記５’スプライス部位の５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、さらなる５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’ｓｓとの間の配列に対応する配列
を含まない、
項目４～８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１０）
前記出力ＲＮＡが少なくとも一つの出力タンパク質をコード化する少なくとも一つの配列を含み、前記少なくとも一つの出力タンパク質のＣＤＳが、前記出力配列、例えば、前記第二エクソンに部分的又は完全に含まれる、
項目１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１１）
前記少なくとも一つの出力タンパク質が、レポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素、及び／或いはエフェクタータンパク質、例えば毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含む、
項目１０に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１２）
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物が第一エクソン及び第二エクソンを含まない場合、前記ＣＤＳのそれぞれが前記出力配列に完全に含まれ；
（ｉｉ）第二エクソンに部分的に含まれるＣＤＳが、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部に対応するか又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部であり、前記ＯＲＦの開始コドンが、前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つ、好ましくはそれぞれの代替第一エクソンに含まれ、前記ＯＲＦの終止コドンが、第二エクソンに含まれる、
項目１０又は１１に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１３）
前記プロモータの少なくとも一つ、好ましくは、前記プロモータのそれぞれが、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含む、
項目１～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１４）
ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１、又はＴＳ２若しくはＴＳ３などのＴＳｎのいずれかが、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／若しくは細胞状態、例えば、分化した細胞状態、幹細胞状態、及び／又は疾患細胞状態と関連し、及び／又は反映し；並びに／或いは
（ｉｉ）各々の転写因子群からの少なくとも一つの転写因子（ＴＦ）の存在を含み、例えば、
ＴＳ１は、ＴＦの第一群（ＴＦ１）からの少なくとも一つのＴＦ、例えば、ＴＦ１ａ及び／又はＴＦ１ｂの存在を含み、並びに／或いは
ＴＳｎ、例えば、ＴＳ２は、さらなるＴＦ群（ＴＦｎ、例えば、ＴＦ２）からの少なくとも一つのＴＦ、例えば、ＴＦｎａ及び／又はＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａ及び／又はＴＦ２ｂの存在を含み、
個々の転写因子は、前記ＴＦ群の一つ以上に含まれ得る、
項目１～１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１５）
第一転写調節状態（ＴＳ１）が、少なくともある特定の数の、例えば、二つの、第一ＴＦ群（ＴＦ１）からのＴＦ、例えば、ＴＦ１ａとＴＦ１ｂの存在を含み、及び／又はさらなる転写調節状態（ＴＳｎ）のいずれかが、少なくともある特定の数の、例えば、二つの、各々のさらなる転写因子群（ＴＦｎ、例えば、ＴＦ２）からのＴＦ、例えば、ＴＦｎａとＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａとＴＦ２ｂの存在を含む、
項目１～１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１６）
Ｐ１が、ＴＦ１からの少なくとも一つのＴＦ又はある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ１ａ、又はＴＦ１ａとＴＦ１ｂに対する少なくとも一つの結合部位を含み、及び／又は
Ｐｎのいずれか、例えば、Ｐ２が、各々のＴＦｎからの少なくとも一つのＴＦ又はある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ２、例えば、ＴＦｎａ、又はＴＦｎａとＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａ、又はＴＦ２ａとＴＦ２ｂに対する少なくとも一つの結合部位を含む、
項目３～１５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１７）
第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列、すなわち、Ｅ２に対応する配列の５’を含む出力ＲＮＡが、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって制御され、
特に、さらなる第一代替第一エクソン（Ｅ１ｎ、例えば、Ｅ１２）に対応する配列、すなわち、Ｅ２に対応する配列の５’を含む出力ＲＮＡが、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＳ２）によって制御される、
項目３～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１８）
第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって翻訳阻害及び／又は分解され、
特に、さらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ、例えば、Ｅ１２）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＳ２）によって翻訳阻害及び／又は分解される、
項目３～１７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目１９）
前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つの各々のプロモータ、例えば、Ｐ１からの出力ＲＮＡが産生されるように、少なくとも一つの転写調節状態、すなわちＴＳ１及び／又はＴＳｎのいずれか、例えば、ＴＳ１が前記細胞中に存在する場合；並びに
（ｉｉ）各々の代替第一エクソン（例えば、Ｅ１ａ）を含む産生された出力ＲＮＡが翻訳阻害又は分解されないように、各々の転写後調節状態（例えば、ＰＴＳ１）が前記細胞中に存在しない場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生する、
項目１８に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２０）
前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータ、例えば、Ｐ１及びＰ２から転写を誘導できる転写状態が前記細胞中に存在しない、例えば、ＴＳ１もＴＳ２も前記細胞中に存在しない場合、及び／又は
（ｉｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータ、例えば、Ｐ１及びＰ２によって産生される出力ＲＮＡを翻訳阻害及び／又は分解できる各転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１及びＰＴＳ２が前記細胞中に存在する場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生しない、
項目１８又は１９に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２１）
ある特定の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１、又はＰＴＳ２若しくはＰＴＳ３などのＰＴＳｎのいずれかが、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／又は細胞状態と関連し、及び／又は反映し；並びに／或いは
（ｉｉ）各々のアンチセンスＲＮＡ群からの少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）の存在を含み、例えば、
この場合、ＰＴＳ１は、ＡＲの第一群（ＡＲ１）からの少なくとも一つのＡＲ、例えばＡＲ１ａ及び／又はＡＲ１ｂの存在を含み、ＰＴＳｎ、例えばＰＴＳ２は、ＡＲのさらなる群（ＡＲｎ、例えば、ＡＲ２）からの少なくとも一つのＡＲ、例えば、ＡＲｎａ及び／又はＡＲｎｂ、例えばＡＲ２ａ及び／又はＡＲ２ｂの存在を含み、
個々のＡＲは、前記Ａｒ群の一つ以上に含まれていてもよい、並びに／或いは
（ｉｉｉ）少なくとも一つのＲＮＡ結合タンパク質の存在を含む、
項目１７～２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２２）
ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１、及び各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１が、有効量の出力ＲＮＡが得られることが望まれるのと同じ細胞型及び／又は細胞状態、例えば標的細胞に含まれない、
項目２１に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２３）
ある特定の細胞型及び／又は細胞状態が、
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１の存在、例えば、各々のＴＦ群からの少なくとも一つ又はある特定の数の転写因子（ＴＦ）、例えば、ＴＦ１、又はＴＦ１とＴＦ２の存在、並びに／或いは
（ｉｉ）ある特定の、すなわち、各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１の非存在、例えば、各々のＡＲ群からの少なくとも一つ又はある特定の数のアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）、例えば、ＡＲ１、又はＡＲ１とＡＲ２の非存在を含む、
項目２１又は２２に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２５）
前記Ｅ１ａが、ＡＲ１からの少なくとも一つのＡＲ又はある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ１ａ、又はＡＲ１ａとＡＲ１ｂに対する少なくとも一つの標的部位、すなわち結合部位に対応する少なくとも一つの配列を含み、すなわち、前記少なくとも一つの標的部位は、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡにおけるＥ１ａに対応する配列に含まれ；及び／又は
特に、前記Ｅ１ｎのいずれか、例えば、Ｅ１ｂが、各々のＡＲｎからの少なくとも一つのＡＲ又はある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ２、例えば、ＡＲｎａ、又はＡＲｎａとＡＲｎｂ、例えば、ＡＲ２ａ、又はＡＲ２ａとＡＲ２ｂに対する少なくとも一つの標的部位、すなわち、結合部位に対応する少なくとも一つの配列を含み、すなわち、前記少なくとも一つの標的部位が、前記Ｅ１ｎの５’であるプロモータ、すなわち、前記Ｅ１ｎの５’に最も近いプロモータによって産生される出力ＲＮＡにおける前記Ｅ１ｎに対応する配列に含まれる、
項目１７～２３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２６）
アンチセンスＲＮＡが、少なくとも１０、１５又は２０の連続した塩基の配列を含み、前記配列が、出力ＲＮＡに含まれる各々の代替第一エクソンにおける、各々の標的部位、すなわち、結合部位の相補配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の配列同一性を有する、
項目２５に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２７）
前記アンチセンスＲＮＡがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、
項目２１～２６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目２８）
アンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）が、前記ＡＲに対する標的部位、すなわち、結合部位を含む出力ＲＮＡの翻訳阻害及び／又は分解を促進し、すなわち、出力ＲＮＡの前記翻訳阻害は、前記出力ＲＮＡによってコード化されたレポータ及び／又はエフェクタータンパク質の産生、すなわち翻訳の阻害に対応する、
項目２１～２７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物
（項目２９）
細胞中の有効量の出力ＲＮＡの収量は、
有効量の出力ＲＮＡが得られない条件、例えば、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかからの転写を開始するための各々の転写状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力ＲＮＡの量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡが前記ＤＮＡ構築物を含む前記細胞中に存在することに対応する、
項目１～２８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目３０）
出力ＲＮＡの前記有効量が、少なくとも一つの出力タンパク質、すなわち、前記出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つのレポータタンパク質及び／又はエフェクタータンパク質の有効量に対応する、すなわち、言い換えられる、
項目１～２９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。
（項目３１）
細胞中の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質の有効量の収量が、有効量の前記出力ＲＮＡが得られない条件、例えば、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかからの転写を開始するための各々の転写調節状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力タンパク質の量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の、前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が、前記ＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在することに対応する、
項目１～３０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目３２）
最大でも１５０ｋｂ、好ましくは最大でも１２ｋｂの長さを有する、
項目１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
（項目３３）
項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むプラスミド。
（項目３４）
前記ウイルスに含まれるＤＮＡ構築物が二本鎖又は一本鎖であり、前記一本鎖ＤＮＡ構築物が、項目１～３３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物のセンス又はアンチセンス鎖に対応する配列を含み、特に、前記ウイルスが、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はＶＳＶベクターである、
項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物或いは前記ＤＮＡ構築物に対応する配列及び／又は前記ＤＮＡ構築物の配列に対して相補的な配列を含むＲＮＡを含む、ウイルス。
（項目３５）
項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド、及び／又は項目３４に記載のウイルスを含む、宿主細胞。
（項目３６）
対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患の治療で使用するための、項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド、項目３４に記載のウイルス又は項目３５に記載の宿主細胞。
（項目３７）
前記ＤＮＡ構築物が、対象における複数の細胞へ導入されるものであり、前記複数の細胞が、標的細胞と非標的細胞とを含み得る、項目３６に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目３８）
前記疾患が、例えば、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞の不均一混合物と関連し、及び／又はこれにより引き起こされ、標的細胞が、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１である、項目３６又は３７に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目３９）
前記疾患の治療は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、標的細胞を殺滅及び／又は操作することを含み；すなわち操作された標的細胞が対象に対して無毒になるか、毒性が低くなるか、又は有益になる、
項目３７又は３８に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４０）
非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞が、殺滅及び／又は操作されない、項目３８又は３９に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４１）
（ｉ）前記ＡＣ１が、前記ＴＳ１の存在を含み、任意選択的に前記ＰＴＳ１の非存在を含んでもよく、及び／又は
（ｉｉ）ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２が、各々のＴＳｎ、例えば、ＴＳ２の存在を含み、任意選択的に、各々のＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＰ２の非存在を含んでもよい、
項目３８～４０のいずれか一項に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４２）
有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つの出力タンパク質が、
（ｉ）前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞、並びに／或いは
（ｉｉ）前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２）に対応する標的細胞
において得られる、
項目３７～４１のいずれか一項に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４３）
有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が非標的細胞では得られない、
項目３７～４２のいずれか一項に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４４）
前記少なくとも一つの出力タンパク質が、少なくとも一つのエフェクタータンパク質、例えば、毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含む、
項目４２又は４３に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４５）
前記疾患が、がん、神経変性疾患、免疫不全、及び／又は遺伝性疾患であり、好ましくはがんである、
項目３６～４４のいずれか一項に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、ウイルス、又は宿主細胞。
（項目４６）
前記疾患が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞と、前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞とを含む、
項目４５に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
（項目４７）
インビボでの対象における疾患の診断で使用するための、項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド、項目３４に記載のウイルス、又は項目３５に記載の宿主細胞。
（項目４８）
真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞の細胞型及び／又は状態を決定するインビトロ法であって、
（ａ）項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド又は項目３４に記載のウイルスをインビトロで前記真核細胞に導入し、
（ｂ）前記細胞において出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
（ｃ）（ｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在する場合、前記細胞はある特定の細胞型及び／又は状態を有すること、及び／又は
（ｉｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在しない場合、前記細胞は前記細胞型及び／又は状態を有さないことを判定すること
を含む、インビトロ法。
（項目４９）
ある特定の細胞型及び／又は状態が、
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１の存在、例えば、各々のＴＦ群からの少なくとも一つ又はある特定の数の転写因子（ＴＦ）、例えば、ＴＦ１ａ、又はＴＦ１ａとＴＦ１ｂの存在を含み、任意選択的に、
（ｉｉ）各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１の非存在、例えば、各々のＡＲ群からの少なくとも一つ又はある特定の数のアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）、例えば、ＡＲ１、又はＡＲ１とＡＲ２の非存在を含んでもよい、
項目４８に記載の方法。
（項目５０）
対象における疾患を診断するためのインビトロ法であって、
ａ）項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、項目３３に記載のプラスミド又は項目３４に記載のウイルスを前記対照からの組織サンプルに導入し、
ｂ）前記組織サンプルにおいて出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
ｃ）前記対象が前記疾患を有するか否かを診断すること
を含み、
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在する場合、診断は陽性であり、及び／又は
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在しない場合、診断は陰性である、インビトロ法。
（項目５１）
前記疾患が、例えば、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞の不均一混合物と関連し、及び／又はこれにより引き起こされ、標的細胞が、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１である、
項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記組織サンプルが前記標的細胞を含む疑いがあり、非標的細胞、すなわち正常及び／又は良性細胞を含む可能性がある、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記疾患の診断は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、前記組織サンプル中の標的細胞を検出することを含む、
項目５１又は５２に記載の方法。
（項目５４）
非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞検出されない、
項目５２又は５３に記載の方法。
（項目５５）
（ｉ）前記ＡＣ１が、前記ＴＳ１の存在を含み、任意選択的に前記ＰＴＳ１の非存在を含んでもよく、及び／又は
（ｉｉ）ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２が、各々のＴＳｎ、例えば、ＴＳ２の存在を含み、任意選択的に、各々のＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＰ２の非存在を含んでもよい、
項目５１～４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質は、
（ｉ）前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞、並びに／或いは
（ｉｉ）前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２）に対応する標的細胞において得られる、
項目５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
非標的細胞では、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が得られない、項目５１～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記ステップｂ）が、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する細胞の前記組織細胞中のパーセンテージを測定することをさらに含み、
ステップｃ）において、診断は、前記組織サンプル中の細胞の少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陽性であり、並びに／或いは
診断は、前記組織サンプル中の細胞の０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．５％未満、１％未満、５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満若しくは５０％未満が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陰性である、項目５１～５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記出力タンパク質が、少なくとも一つのレポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素を含む、項目５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記疾患が、がん、神経変性疾患、免疫不全、及び／又は遺伝性疾患であり、好ましくはがんである、項目５０～５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記疾患が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞と、前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞とを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記対象が哺乳動物であり、好ましくはヒトである、項目３６～４７のいずれか一項に記載の使用のためのＤＮＡ構築物、プラスミド、若しくはウイルス、又は項目５０～５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を産生する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡ構築物中に含まれる前記ＤＮＡ配列エレメントを選択し、配列させるステップと、
（ｂ）選択し配列させたＤＮＡ配列エレメントをアセンブル及び／又は合成し、それによって前記ＤＮＡ構築物を産生するステップと、を含む、方法。
（項目６４）
ステップ（ａ）の前に、例えば、標的細胞及び／又は非標的細胞中の少なくとも一つのプロモータの活性を測定すること、並びに／或いはバイオマーカー、特定の転写因子、ｍｉＲＮＡなどのアンチセンスＲＮＡ、トランスクリプト―ム及び／又はプロテオームの標的細胞及び／又は非標的細胞における存在を判定することによって、標的細胞及び／又は非標的細胞の転写調節状態及び／又は転写後調節状態を分析する、
項目６３に記載の方法。
（項目６５）
（ｃ）ＤＮＡ構築物が、標的細胞及び／又は非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生するか否かを分析するステップと、
（ｄ）前記ＤＮＡ構築物が、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、好ましくは非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生しない場合、前記ＤＮＡ構築物を選択し、任意選択的に増幅又は再合成するステップと、
をさらに含む、項目６３又は６４に記載の方法。
（項目６６）
前記ＤＮＡ構築物が、項目６３～６５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、項目１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
Claims (65)
- ５’→３’方向に以下のＤＮＡ配列エレメント：
第一プロモータ（Ｐ１）；
ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）、ただし、ｎ≧１、例えば、Ｐ２、Ｐ２とＰ３、又はＰ２とＰ３とＰ４；及び
出力配列
を含むＤＮＡ構築物であって、
前記プロモータのそれぞれは、転写開始部位を含み、及び／又は転写を開始するのに適し、
Ｐ１からの転写の開始は、第一転写調節状態（ＴＳ１）によって可能となり、前記さらなるプロモータ（Ｐｎ）のそれぞれからの転写の開始は、さらなる転写調節状態（ＴＳｎ）のそれぞれによって可能となり、例えば、Ｐ２はＴＳ２によって可能となり、
前記ＴＳ１及び／又は各々のＴＳｎのいずれか、例えば、Ｐ１及びＰ２について：ＴＳ１、ＴＳ２、又はＴＳ１及びＴＳ２が前記細胞中に存在する場合、前記ＤＮＡ構築物は、真核細胞において、好ましくは哺乳動物細胞において有効量の出力ＤＮＡを産生し、
前記出力ＲＮＡは、前記出力配列に対応する配列を含み、
特に、転写がＰ１から開始される場合に前記出力ＲＮＡの第一タイプ（ＲＮＡ１）が得られ、転写が各々のＰｎ、例えばＰ２から開始される場合に各々のさらなるタイプの前記出力ＲＮＡ（ＲＮＡｎ、例えば、ＲＮＡ２）が得られ、前記出力ＲＮＡの各タイプは前記出力配列に対応する配列を含み、特に、前記出力ＲＮＡの量は前記出力ＲＮＡの全タイプの合計量に対応する、ＤＮＡ構築物。 - 前記細胞中に、ＴＳ１もＴＳｎのうちのいずれも存在しない場合、前記ＤＮＡ構築物が有効量の前記出力ＲＮＡを産生しない、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
- 前記第一プロモータ（Ｐ１）と前記さらなるプロモータの最後のプロモータ（Ｐｎ）との間に、５’→３’方向で、第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）および第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）、並びに前記最後のプロモータと前記出力配列との間に、分岐点（ＢＰ）及び３’スプライス部位（３’ｓｓ）をさらに含んでもよく、前記出力配列が、第二エクソン（Ｅ２）であるか又は第二エクソン（Ｅ２）を含む、請求項１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
- 前記最後のプロモータと前記分岐点（ＢＰ）との間に５’→３’方向で、ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）の最後の代替第一エクソン及びｎ個の各々のさらなる５’スプライス部位（５’ｓｓｎ）の最後の代替５’スプライス部位をさらに含み、
好ましくは、前記最後の代替５’スプライス部位は、前記ＤＮＡ構築物に含まれる別の５’スプライス部位よりも弱く、より好ましくは、前記最後の代替５’スプライス部位は、前記ＤＮＡ構築物に含まれるすべての５’スプライス部位の中で最も弱いものである、
請求項３に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）と前記最後のプロモータとの間に５’→３’方向で、少なくとも一つのさらなるエレメント群をさらに含み、
前記エレメント群のそれぞれが、５’→３’方向で：
前記ｎ個のさらなるプロモータ（Ｐｎ）のさらなる一つ、
前記ｎ個の各々のさらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ）のさらなる一つ、及び
前記ｎ個の各々の代替５’スプライス部位（５’ｓｓｎ）のさらなる一つ
を含む、
請求項４に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記分岐点（ＢＰ）及び前記３’スプライス部位（３’ｓｓ）は、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかによって産生される出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる少なくとも一つの５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’スプライス部位との間の配列の除去を可能にし、
好ましくは、前記ＢＰ及び３’ｓｓは、少なくとも、前記出力ＲＮＡにおいて最も５’である前記５’ｓｓと前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にする、及び／又は
好ましくは、前記ＢＰ及び３’ｓｓは、前記出力ＲＮＡにおける各５’ｓｓと前記３’ｓｓとの配列の除去を可能にする、
請求項３～５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記第一代替５’スプライス部位（５’ｓｓ１）は、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる前記５’ｓｓ１と前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にし、
特に、前記さらなる代替５’スプライス部位のそれぞれ（例えば、５’ｓｓ２）は、前記さらなる５’スプライス部位の５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち前記５’スプライス部位の５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される出力ＲＮＡ、すなわちｐｒｅ－ＲＮＡに含まれる前記各々のさらなる５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’ｓｓとの間の配列の除去を可能にする、
請求項３～６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記出力ＲＮＡは、前記第二エクソン（Ｅ２）に対応する前記配列の５’に、
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、前記第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、前記各々のさらなる代替第一エクソンの５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち前記さらなる代替第一エクソンの５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、前記さらなる代替第一エクソンの一つ、例えばＥ１ｂに対応する配列
をさらに含む、
請求項４～７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記出力ＲＮＡが、
（ｉ）前記出力ＲＮＡがＰ１によって産生される場合、前記５’ｓｓ１と前記３’ｓｓとの間の配列に対応する配列、及び／又は
（ｉｉ）前記出力ＲＮＡが、前記さらなる５’スプライス部位の５’であるプロモータ（例えば、Ｐ１又はＰ２）、すなわち、前記５’スプライス部位の５’に最も近いプロモータ（例えば、Ｐ２）によって産生される場合、さらなる５’スプライス部位（例えば、５’ｓｓ２）と前記３’ｓｓとの間の配列に対応する配列
を含まない、
請求項４～８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記出力ＲＮＡが少なくとも一つの出力タンパク質をコード化する少なくとも一つの配列を含み、前記少なくとも一つの出力タンパク質のＣＤＳが、前記出力配列、例えば、前記第二エクソンに部分的又は完全に含まれる、
請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記少なくとも一つの出力タンパク質が、レポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素、及び／或いはエフェクタータンパク質、例えば毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含む、
請求項１０に記載のＤＮＡ構築物。 - （ｉ）前記ＤＮＡ構築物が第一エクソン及び第二エクソンを含まない場合、前記ＣＤＳのそれぞれが前記出力配列に完全に含まれ；
（ｉｉ）第二エクソンに部分的に含まれるＣＤＳが、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部に対応するか又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の一部であり、前記ＯＲＦの開始コドンが、前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つ、好ましくはそれぞれの代替第一エクソンに含まれ、前記ＯＲＦの終止コドンが、第二エクソンに含まれる、
請求項１０又は１１に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記プロモータの少なくとも一つ、好ましくは、前記プロモータのそれぞれが、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合部位を含む、
請求項１～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１、又はＴＳ２若しくはＴＳ３などのＴＳｎのいずれかが、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／若しくは細胞状態、例えば、分化した細胞状態、幹細胞状態、及び／又は疾患細胞状態と関連し、及び／又は反映し；並びに／或いは
（ｉｉ）各々の転写因子群からの少なくとも一つの転写因子（ＴＦ）の存在を含み、例えば、
ＴＳ１は、ＴＦの第一群（ＴＦ１）からの少なくとも一つのＴＦ、例えば、ＴＦ１ａ及び／又はＴＦ１ｂの存在を含み、並びに／或いは
ＴＳｎ、例えば、ＴＳ２は、さらなるＴＦ群（ＴＦｎ、例えば、ＴＦ２）からの少なくとも一つのＴＦ、例えば、ＴＦｎａ及び／又はＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａ及び／又はＴＦ２ｂの存在を含み、
個々の転写因子は、前記ＴＦ群の一つ以上に含まれ得る、
請求項１～１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 第一転写調節状態（ＴＳ１）が、少なくともある特定の数の、例えば、二つの、第一ＴＦ群（ＴＦ１）からのＴＦ、例えば、ＴＦ１ａとＴＦ１ｂの存在を含み、及び／又はさらなる転写調節状態（ＴＳｎ）のいずれかが、少なくともある特定の数の、例えば、二つの、各々のさらなる転写因子群（ＴＦｎ、例えば、ＴＦ２）からのＴＦ、例えば、ＴＦｎａとＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａとＴＦ２ｂの存在を含む、
請求項１～１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - Ｐ１が、ＴＦ１からの少なくとも一つのＴＦ又はある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ１ａ、又はＴＦ１ａとＴＦ１ｂに対する少なくとも一つの結合部位を含み、及び／又は
Ｐｎのいずれか、例えば、Ｐ２が、各々のＴＦｎからの少なくとも一つのＴＦ又はある特定の数のＴＦ、例えば、ＴＦ２、例えば、ＴＦｎａ、又はＴＦｎａとＴＦｎｂ、例えば、ＴＦ２ａ、又はＴＦ２ａとＴＦ２ｂに対する少なくとも一つの結合部位を含む、
請求項３～１５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列、すなわち、Ｅ２に対応する配列の５’を含む出力ＲＮＡが、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって制御され、
特に、さらなる第一代替第一エクソン（Ｅ１ｎ、例えば、Ｅ１２）に対応する配列、すなわち、Ｅ２に対応する配列の５’を含む出力ＲＮＡが、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＳ２）によって制御される、
請求項３～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 第一代替第一エクソン（Ｅ１ａ）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、第一転写後調節状態（ＰＴＳ１）によって翻訳阻害及び／又は分解され、
特に、さらなる代替第一エクソン（Ｅ１ｎ、例えば、Ｅ１２）に対応する配列を含む出力ＲＮＡが、各々のさらなる転写後調節状態（ＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＳ２）によって翻訳阻害及び／又は分解される、
請求項３～１７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる少なくとも一つの各々のプロモータ、例えば、Ｐ１からの出力ＲＮＡが産生されるように、少なくとも一つの転写調節状態、すなわちＴＳ１及び／又はＴＳｎのいずれか、例えば、ＴＳ１が前記細胞中に存在する場合；並びに
（ｉｉ）各々の代替第一エクソン（例えば、Ｅ１ａ）を含む産生された出力ＲＮＡが翻訳阻害又は分解されないように、各々の転写後調節状態（例えば、ＰＴＳ１）が前記細胞中に存在しない場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生する、
請求項１８に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記ＤＮＡ構築物が、
（ｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータ、例えば、Ｐ１及びＰ２から転写を誘導できる転写状態が前記細胞中に存在しない、例えば、ＴＳ１もＴＳ２も前記細胞中に存在しない場合、及び／又は
（ｉｉ）前記ＤＮＡ構築物に含まれる各々のプロモータ、例えば、Ｐ１及びＰ２によって産生される出力ＲＮＡを翻訳阻害及び／又は分解できる各転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１及びＰＴＳ２が前記細胞中に存在する場合、
前記真核細胞において有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質を産生しない、
請求項１８又は１９に記載のＤＮＡ構築物。 - ある特定の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１、又はＰＴＳ２若しくはＰＴＳ３などのＰＴＳｎのいずれかが、
（ｉ）ある特定の細胞型及び／又は細胞状態と関連し、及び／又は反映し；並びに／或いは
（ｉｉ）各々のアンチセンスＲＮＡ群からの少なくとも一つのアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）の存在を含み、例えば、
この場合、ＰＴＳ１は、ＡＲの第一群（ＡＲ１）からの少なくとも一つのＡＲ、例えばＡＲ１ａ及び／又はＡＲ１ｂの存在を含み、ＰＴＳｎ、例えばＰＴＳ２は、ＡＲのさらなる群（ＡＲｎ、例えば、ＡＲ２）からの少なくとも一つのＡＲ、例えば、ＡＲｎａ及び／又はＡＲｎｂ、例えばＡＲ２ａ及び／又はＡＲ２ｂの存在を含み、
個々のＡＲは、前記Ａｒ群の一つ以上に含まれていてもよい、並びに／或いは
（ｉｉｉ）少なくとも一つのＲＮＡ結合タンパク質の存在を含む、
請求項１７～２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１、及び各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１が、有効量の出力ＲＮＡが得られることが望まれるのと同じ細胞型及び／又は細胞状態、例えば標的細胞に含まれない、
請求項２１に記載のＤＮＡ構築物。 - ある特定の細胞型及び／又は細胞状態が、
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１の存在、例えば、各々のＴＦ群からの少なくとも一つ又はある特定の数の転写因子（ＴＦ）、例えば、ＴＦ１、又はＴＦ１とＴＦ２の存在、並びに／或いは
（ｉｉ）ある特定の、すなわち、各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１の非存在、例えば、各々のＡＲ群からの少なくとも一つ又はある特定の数のアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）、例えば、ＡＲ１、又はＡＲ１とＡＲ２の非存在を含む、
請求項２１又は２２に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記Ｅ１ａが、ＡＲ１からの少なくとも一つのＡＲ又はある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ１ａ、又はＡＲ１ａとＡＲ１ｂに対する少なくとも一つの標的部位、すなわち結合部位に対応する少なくとも一つの配列を含み、すなわち、前記少なくとも一つの標的部位は、Ｐ１によって産生される出力ＲＮＡにおけるＥ１ａに対応する配列に含まれ；及び／又は
特に、前記Ｅ１ｎのいずれか、例えば、Ｅ１ｂが、各々のＡＲｎからの少なくとも一つのＡＲ又はある特定の数のＡＲ、例えば、ＡＲ２、例えば、ＡＲｎａ、又はＡＲｎａとＡＲｎｂ、例えば、ＡＲ２ａ、又はＡＲ２ａとＡＲ２ｂに対する少なくとも一つの標的部位、すなわち、結合部位に対応する少なくとも一つの配列を含み、すなわち、前記少なくとも一つの標的部位が、前記Ｅ１ｎの５’であるプロモータ、すなわち、前記Ｅ１ｎの５’に最も近いプロモータによって産生される出力ＲＮＡにおける前記Ｅ１ｎに対応する配列に含まれる、
請求項１７～２３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - アンチセンスＲＮＡが、少なくとも１０、１５又は２０の連続した塩基の配列を含み、前記配列が、出力ＲＮＡに含まれる各々の代替第一エクソンにおける各々の標的部位、すなわち、結合部位の相補配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の配列同一性を有する、
請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。 - 前記アンチセンスＲＮＡがマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、
請求項２１～２５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - アンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）が、前記ＡＲに対する標的部位、すなわち、結合部位を含む出力ＲＮＡの翻訳阻害及び／又は分解を促進し、すなわち、出力ＲＮＡの前記翻訳阻害は、前記出力ＲＮＡによってコード化されたレポータ及び／又はエフェクタータンパク質の産生、すなわち翻訳の阻害に対応する、
請求項２１～２６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 細胞中の有効量の出力ＲＮＡの収量は、
有効量の出力ＲＮＡが得られない条件、例えば、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかからの転写を開始するための各々の転写状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力ＲＮＡの量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の出力ＲＮＡが前記ＤＮＡ構築物を含む前記細胞中に存在することに対応する、
請求項１～２７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 出力ＲＮＡの前記有効量が、少なくとも一つの出力タンパク質、すなわち、前記出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つのレポータタンパク質及び／又はエフェクタータンパク質の有効量に対応する、すなわち、言い換えられる、
請求項１～２８のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。 - 細胞中の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質の有効量の収量が、有効量の前記出力ＲＮＡが得られない条件、例えば、前記ＤＮＡ構築物に含まれるプロモータのいずれかからの転写を開始するための各々の転写調節状態が存在しない場合、同じＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在する前記出力タンパク質の量と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍、１００倍、１５０倍、又は２００倍、好ましくは少なくとも１０倍高い量の、前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が、前記ＤＮＡ構築物を含む細胞中に存在することに対応する、
請求項１～２９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。 - 最大でも１５０ｋｂ、好ましくは最大でも１２ｋｂの長さを有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
- 請求項１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含むプラスミド。
- 前記ウイルスに含まれるＤＮＡ構築物が二本鎖又は一本鎖であり、前記一本鎖ＤＮＡ構築物が、請求項１～３２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物のセンス又はアンチセンス鎖に対応する配列を含み、特に、前記ウイルスが、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、又はＶＳＶベクターである、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物或いは前記ＤＮＡ構築物に対応する配列及び／又は前記ＤＮＡ構築物の配列に対して相補的な配列を含むＲＮＡを含む、ウイルス。
- 請求項１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項３２に記載のプラスミド、及び／又は請求項３３に記載のウイルスを含む、宿主細胞。
- 対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける疾患の治療で使用するための、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項３２に記載のプラスミド、請求項３３に記載のウイルス又は請求項３４に記載の宿主細胞。
- 前記ＤＮＡ構築物が、対象における複数の細胞へ導入されるものであり、前記複数の細胞が、標的細胞と非標的細胞とを含み得る、請求項３５に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
- 前記疾患が、例えば、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞の不均一混合物と関連し、及び／又はこれにより引き起こされ、標的細胞が、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１である、請求項３５又は３６に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
- 前記疾患の治療は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、標的細胞を殺滅及び／又は操作することを含み；すなわち操作された標的細胞が対象に対して無毒になるか、毒性が低くなるか、又は有益になる、請求項３６又は３７に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
- 非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞が、殺滅及び／又は操作されない、請求項３７又は３８に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
- （ｉ）前記ＡＣ１が、前記ＴＳ１の存在を含み、任意選択的に前記ＰＴＳ１の非存在を含んでもよく、及び／又は
（ｉｉ）ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２が、各々のＴＳｎ、例えば、ＴＳ２の存在を含み、任意選択的に、各々のＰＴＳｎ、例えば、ＰＴＰ２の非存在を含んでもよい、
請求項３７～３９のいずれか一項に記載の使用のためのＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。 - 有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される少なくとも一つの出力タンパク質が、
（ｉ）前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞、並びに／或いは
（ｉｉ）前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２）に対応する標的細胞
において得られる、
請求項３６～４０のいずれか一項に記載の使用のためのＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。 - 有効量の出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質が非標的細胞では得られない、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の使用のためのＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
- 前記少なくとも一つの出力タンパク質が、少なくとも一つのエフェクタータンパク質、例えば、毒性タンパク質、酵素、サイトカイン、免疫調節物質、膜タンパク質及び／又は膜結合レセプターを含む、請求項４１又は４２に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
- 前記疾患が、がん、神経変性疾患、免疫不全、及び／又は遺伝性疾患であり、好ましくはがんである、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、ウイルス、又は宿主細胞。
- 前記疾患が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞と、前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞とを含む、請求項４４に記載の使用のための、ＤＮＡ構築物、プラスミド、又はウイルス。
- インビボでの対象における疾患の診断で使用するための、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項３２に記載のプラスミド、請求項３３に記載のウイルス、又は請求項３４に記載の宿主細胞。
- 真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞の細胞型及び／又は状態を決定するインビトロ法であって、
（ａ）請求項１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項３２に記載のプラスミド又は請求項３３に記載のウイルスをインビトロで前記真核細胞に導入し、
（ｂ）前記細胞において出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
（ｃ）（ｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在する場合、前記細胞はある特定の細胞型及び／又は状態を有すること、及び／又は
（ｉｉ）有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が前記細胞中に存在しない場合、前記細胞は前記細胞型及び／又は状態を有さないことを判定すること
を含む、インビトロ法。 - ある特定の細胞型及び／又は状態が、
（ｉ）ある特定の転写調節状態、例えば、ＴＳ１の存在、例えば、各々のＴＦ群からの少なくとも一つ又はある特定の数の転写因子（ＴＦ）、例えば、ＴＦ１ａ、又はＴＦ１ａとＴＦ１ｂの存在を含み、任意選択的に、
（ｉｉ）各々の転写後調節状態、例えば、ＰＴＳ１の非存在、例えば、各々のＡＲ群からの少なくとも一つ又はある特定の数のアンチセンスＲＮＡ（ＡＲ）、例えば、ＡＲ１、又はＡＲ１とＡＲ２の非存在を含んでもよい、
請求項４７に記載の方法。 - 対象における疾患を診断するためのインビトロ法であって、
ａ）請求項１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、請求項３２に記載のプラスミド又は請求項３３に記載のウイルスを前記対照からの組織サンプルに導入し、
ｂ）前記組織サンプルにおいて出力ＲＮＡ及び／又は前記出力ＲＮＡによってコード化される出力タンパク質の量を測定し、
ｃ）前記対象が前記疾患を有するか否かを診断すること
を含み、
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在する場合、診断は陽性であり、及び／又は
前記組織サンプルにおいて有効量の出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が存在しない場合、診断は陰性である、インビトロ法。 - 前記疾患が、例えば、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞の不均一混合物と関連し、及び／又はこれにより引き起こされ、標的細胞が、第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）、並びに／或いはｎ個のさらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する可能性があり、ただしｎ≧１である、
請求項４９に記載の方法。 - 前記組織サンプルが、前記標的細胞を含む疑いがあり、非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞を含む可能性がある、請求項５０に記載の方法。
- 前記疾患の診断は、標的細胞が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態（ＡＣ１）、並びに／或いは前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は細胞状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応するか否かに関係なく、前記組織サンプル中の標的細胞を検出することを含む、請求項５０又は５１に記載の方法。
- 非標的細胞、すなわち、正常及び／又は良性細胞が検出されない、請求項５１又は５２に記載の方法。
- （ｉ）前記ＡＣ１が、前記ＴＳ１の存在を含み、任意選択的に前記ＰＴＳ１の非存在を含んでもよく、及び／又は
（ｉｉ）ＡＣｎ、例えばＡＣ２が、各ＴＳｎ、例えばＴＳ２の存在を含み、任意選択的に各ＰＴＳｎ、例えばＰＴＰ２の非存在を含んでもよい、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。 - 有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質は、
（ｉ）前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞、並びに／或いは
（ｉｉ）前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ、例えば、ＡＣ２）に対応する標的細胞において得られる、
請求項５０～５４のいずれか一項に記載の方法。 - 有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質が非標的細胞中で得られない、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップｂ）が、有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する細胞の前記組織細胞中のパーセンテージを測定することをさらに含み、
ステップｃ）において、診断は、前記組織サンプル中の細胞の少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％若しくは５０％が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陽性であり、並びに／或いは
診断は、前記組織サンプル中の細胞の０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．５％未満、１％未満、５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満若しくは５０％未満が有効量の前記出力ＲＮＡ及び／又は出力タンパク質を有する場合に陰性である、
請求項５０～５５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記出力タンパク質が、少なくとも一つのレポータタンパク質、例えば、蛍光タンパク質又は発光性若しくは発色性酵素を含む、請求項４９～５７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患が、がん、神経変性疾患、免疫不全、及び／又は遺伝性疾患であり、好ましくはがんである、請求項４９～５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患が、前記第一の異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態（ＡＣ１）に対応する標的細胞と、前記さらなる異常及び／又は悪性細胞型及び／又は状態の別の一つ若しくはいずれか（ＡＣｎ）に対応する標的細胞とを含む、請求項５９に記載の方法。
- 前記対象が哺乳動物であり、好ましくはヒトである、請求項３５～４６のいずれか一項に記載の使用のためのＤＮＡ構築物、プラスミド、若しくはウイルス、又は請求項４９～６０のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を産生する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡ構築物中に含まれる前記ＤＮＡ配列エレメントを選択し、配列させるステップと、
（ｂ）選択し配列させたＤＮＡ配列エレメントをアセンブル及び／又は合成し、それによって前記ＤＮＡ構築物を産生するステップと、を含む、方法。 - ステップ（ａ）の前に、例えば、標的細胞及び／若しくは非標的細胞中の少なくとも一つのプロモータの活性を決定すること、並びに／又は標的細胞及び／若しくは非標的細胞中のバイオマーカー、特定の転写因子、ｍｉＲＮＡなどのアンチセンスＲＮＡ、トランスクリプト―ム及び／若しくはプロテオームの存在を決定することによって、標的細胞及び／又は非標的細胞の転写調節状態及び／又は転写後調節状態を分析する、請求項６２に記載の方法。
- （ｃ）前記ＤＮＡ構築物が、標的細胞及び／又は非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生するか否かを分析するステップと、
（ｄ）前記ＤＮＡ構築物が、少なくとも二つの異なるタイプの標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生し、好ましくは非標的細胞において有効量の出力ＲＮＡを産生しない場合、前記ＤＮＡ構築物を選択し、任意選択的に増幅又は再合成するステップと、
をさらに含む、請求項６２又は６３に記載の方法。 - 前記ＤＮＡ構築物が、請求項６２～６４のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、請求項１～３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
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