JP2023550627A - 多糖封入酸素ナノバブル - Google Patents

Abstract

特有のクラスのパーフルオロカーボンフリーのデキストランベースの酸素ナノバブル（ＤＯＮＢ）及びその製剤。製剤における非常に重要な成分は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認した化合物の中から選ばれ、これは、医薬品を組み込むための生体適合性環境を提供する。更に、ナノバブルは、現在の優良製造規範（ｃＧＭＰ）要件を容易に満たす単純な超音波処理及び均質化方法を用いて作製され、これは、商業的製造のためのスケールアップ生産を促進する。製剤化されたＤＯＮＢは、長期間にわたって酸素を放出して、網膜内層内の酸素分圧を高く保ち、したがって、虚血から網膜組織を温存する。【選択図】図２

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１１月２５日に出願された、米国仮特許出願第６３／１１８，２２１号（参照により本明細書に組み込まれる）に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下での優先権を主張する。

網膜中心動脈閉塞（ＣＲＡＯ）は、眼科的緊急事態であり、後天的不可逆的失明の重要な原因である。塞栓又は血栓からの網膜中枢動脈の閉塞は、虚血性脳卒中の病態生理学に類似している。解剖学的には、網膜中心動脈は眼動脈の分枝であり、視神経内の篩状板レベル又は視神経の出口で閉塞されたとき、網膜外層に血流を供給する脈絡膜循環がなお存在する。したがって、網膜外層は酸素供給され、一方、網膜内層は酸素供給されない。それにもかかわらず、閉塞は灌流の欠乏に起因して不可逆的視覚欠損を引き起こし、これは、失明をもたらす網膜内層への損傷をもたらす低酸素状態を生じさせる。ＣＲＡＯは通常、頸動脈及び心臓弁疾患などの１つ以上の全身疾患に続発する。冒された眼の約１７％のみが、永久的な損傷の発症前のいかなる治療もなしで視力の有意義な改善を有するが、自然消散率は１～８％である。ＣＲＡＯのおよその発生率は、種々の研究において米国人口中１：１，０００、１：１０，０００、及び１．９：１００，０００と報告されている。これは、１年当たり３，２５０～３２，５００人の患者が苦しむことを意味する。現在、ＣＲＡＯのための一貫して有効な治療は存在しない。全国調査（米国における）において、前房穿刺（症例の４２％）及び眼球マッサージ（症例の６６％）が、動脈灌流圧を増加させ、閉塞を下流に移動させるという期待を持って眼圧（ＩＯＰ）を低下させるために使用されている。高圧酸素療法は当時の７％に与えられ、一方、大学病院の９％はしばしばまったく治療を与えない。試みられた他の治療は、化学的線維素溶解及びレーザー支援血栓除去を含み、これもまためったに機能しない。

ＣＲＡＯの大部分は、塞栓性現象又は、それほど頻繁ではないが、血栓性、若しくは高血圧性事象のいずれかに起因する。約７２時間後、ＣＲＡＯの大部分は、フルオレセイン血管造影によって検査されたときに再灌流されているように見え、これは時折塞栓の通過又は種々の網膜吻合の引き継ぎに起因する。高齢のアテローム性動脈硬化症のアカゲザルを用いた古典的な実験は、９７分で、網膜への損傷は存在しなかったが、その後の閉塞が長ければ長いほど、最終的に失明を導く損傷が広範であることを示した。４時間後、不可逆的細胞死が示され、いくつかの例では、おそらく血管の不完全な封鎖及び脈絡膜から網膜外層への酸素のいくらかの拡散に起因して、介入の８～２４時間の遅延の後でさえ視力回復が可能であった。

１００％酸素の吸気が、急性網膜中心動脈閉塞の存在下で、脈絡膜からの拡散を介して網膜の表面における正常な酸素分圧（ｐＯ_２）を生成し得ることが示されているが、しかし、黄斑領域は２つの神経節層を有してずっとより厚く、脈絡膜循環から十分な酸素を得ることができない。時には、酸素供給が、吸気された酸素の最も高い画分の迅速な設定を用いて又は高圧酸素を用いて達成されている。複数のケーススタディは、この治療を受けている特定の患者における視力の改善を示している。しかし、いかにして高圧酸素が網膜組織の温存を助け得るかの作用メカニズムは、脈絡膜循環におけるｐＯ_２の推定される増加であり、これは、今度は網膜外層中に拡散し、時折網膜内層組織の酸素供給を保ち得る。

高圧酸素は、網膜内層における治療レベルの酸素を達成し得ない。更に、高圧酸素治療へのアクセスは、困難であり、しばしば高圧酸素療法センターへの照会、保険手続きを必要とし、患者集団の大部分には容易にアクセス可能でない。酸素欠損に起因する発作の重症度を軽減すること（特に最初のかけがえのない数時間の間に）は、永久的な損傷の発生の前に、極めて重要である。ＣＲＡＯ及び他の眼の虚血状態の現在の治療オプション及び病態生理学の理解を考慮し、本発明者らは、集中的な酸素送達が、網膜組織に対する時間依存性の虚血発作の時間かせぎ及び緩和をすることによって網膜組織を温存し得ることを提唱する。

パーフルオロカーボン（ＰＦＣ）担持酸素ナノバブルに関する既存の研究は、固形腫瘍の治療において治療成績の著しい改善をもたらした。しかし、（ＰＦＣ）ナノエマルジョンの臨床治験は、心肺停止及びＰＦＣ誘発性微小血管収縮に対する有害な脳血管効果などの種々の安全性の問題の結果として最終的に失敗した。あるいは、セルロースベースの酸素ナノバブルは、がん治療のための本発明者らの先の研究において合成されたが、なお少量のＰＦＣを含有し、これは、眼治療のためのその実用性使用を制限している。超音波造影剤及び酸素カーゴ担体として臨床的に証明されている、脂質コート酸素マイクロバブル（ＬＯＭ）は、それがその高い酸素負荷能力（すなわち＞７０％ｖ／ｖ）を前提として他の酸素送達方法を上回る利益を提供することから、新たな有望な二成分薬剤として実体化されている。ＬＯＭの超音波造影増大は、酸素送達に方向性及びリアルタイムモニタリングをもたらした。しかし、ＬＯＭは、大きな直径（典型的には１～２μｍ２８）に起因して血管外漏出のためにがん腫における脈管構造の内皮ギャップ（すなわち、４００～８００ｎｍ）を通って移動することができず、したがって、それは、脈管構造における酸素の放出及び放出された酸素のがん腫中への分布をトリガーするために外部刺激（例えば、超音波）に依存しなければならない。他の酸素送達システムと同様に、ＬＯＭはまた、ＬＯＭの脂質シェルを越えたガス拡散に起因する、標的部位に入る前の循環血液における酸素の早期の放出に直面し得る。

したがって、網膜低酸素などの医学的緊急事態のための安全かつ有効な治療の必要性が存在する。

本開示は、特有のクラスのパーフルオロカーボンフリーのデキストランベースの酸素ナノバブル（ＤＯＮＢ）製剤を提供する。製剤における非常に重要な成分は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認した化合物の中から選ばれ、これは、医薬品を組み込むための生体適合性環境を提供する。更に、ナノバブルは、現在の優良製造規範（ｃＧＭＰ）要件を容易に満たす単純な超音波処理及び均質化方法を用いて作製され、これは、生産の容易なスケールアップを容易にする。製剤化されたＤＯＮＢは、２～３時間虚血から網膜組織を温存するのに十分に高い網膜内層内の酸素分圧を維持するために２時間にわたって酸素を放出する潜在力を有する。したがって、網膜低酸素を軽減する安全なナノバブル製剤が開発された。

したがって、本開示は、組成物であって、
多糖ナノバブルであって、ナノバブルは、内部カーゴを封入する自己組織化コロイドシェルを含み、
シェルは、デキストラン、トレハロース、レシチン、パルミチン酸、及びトコフェロールを含む、多糖ナノバブルと、
電解質と、を含み、
ナノバブルは、約２００ｎｍ以上の平均直径を有し、組成物は、０ｍＶ未満のゼータ電位を有する、組成物を提供する。

本開示はまた、眼虚血を治療するための方法であって、
眼虚血のための療法を必要とする対象の虚血性眼の内部に、有効用量の本明細書に開示される組成物を投与することを含み、
組成物は、酸素ガスの内部カーゴを含有する複数のナノバブルを含み、
ナノバブルは、投与後に崩壊して、酸素を放出し、それによって対象における眼虚血を治療する、方法を提供する。

本発明は、医学的療法における使用のための、本明細書に記載の組成物の使用を提供する。医学的療法は、眼の障害、例えば、眼虚血又は網膜低酸素を治療することであり得る。本発明はまた、哺乳動物における疾患、例えば、眼疾患を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載の組成物の使用を提供する。医薬は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含み得る。

以下の図面は、明細書の一部を形成し、本発明の特定の実施形態又は種々の態様を更に実証するために含まれる。いくつかの場合では、本発明の実施形態は、本明細書に提示される詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することによって最もよく理解され得る。説明及び添付の図面は、本発明の特定の具体例、又は特定の態様を強調し得る。しかし、当業者は、例又は態様の一部が、本発明の他の例又は態様と組み合わせて使用され得ることを理解する。

網膜中心動脈閉塞において酸素を網膜細胞に及び基礎をなす機能メカニズムにも供給するためのデキストラン封入酸素ナノバブルの硝子体内投与のスキーム。 デキストラン酸素ナノバブル（ＤＯＮＢ）及びその特徴付けの模式図。（ａ）、ＤＯＮＢの１模式図は、酸素を封入するための４℃のデキストランシェル（０．８１８ｍｇのデキストラン／ｍＬ及び０．２９０ｍｇのリン脂質／ｍｌからなる。（ｂ）ＮＴＡ（Ｎａｎｏ Ｓｉｇｈｔ ＮＳ３００）を使用して得たＤＯＮＢの濃度及びサイズ分布／ｍｌ。（ｃ）ＮＴＡ（Ｎａｎｏ Ｓｉｇｈｔ ＮＳ３００）を使用した浮遊ＤＯＮＢの画像。（ｄ）様々なｐＨ媒質におけるＤＯＮＢのゼータ電位。（ｅ、ｆ、及びｇ）ＤＯＮＢのクライオＴＥＭ。 デキストラン酸素ナノバブル（ＤＯＮＢ）及びその特徴付けの模式図。（ｂ）ＮＴＡ（Ｎａｎｏ Ｓｉｇｈｔ ＮＳ３００）を使用して得たＤＯＮＢの濃度及びサイズ分布／ｍｌ。（ｃ）ＮＴＡ（Ｎａｎｏ Ｓｉｇｈｔ ＮＳ３００）を使用した浮遊ＤＯＮＢの画像。 デキストラン酸素ナノバブル（ＤＯＮＢ）及びその特徴付けの模式図。（ｄ）様々なｐＨ媒質におけるＤＯＮＢのゼータ電位。（ｅ、ｆ、及びｇ）ＤＯＮＢのクライオＴＥＭ。 デキストラン酸素ナノバブル（ＤＯＮＢ）及びその特徴付けの模式図。（ｅ、ｆ、及びｇ）ＤＯＮＢのクライオＴＥＭ。 様々な温度及び貯蔵容器でのＤＯＮＢの安定性研究。ａ及びｂ、５℃での透明及び黄褐色バイアルにおける貯蔵寿命。ｃ及びｄ、２５℃での透明及び黄褐色バイアル並びに６０％の相対湿度における貯蔵寿命。ｅ及びｆ、３０℃での透明バイアル及び黄褐色バイアルにおける６０％の相対湿度での貯蔵寿命。ｇ及びｈ、４０℃での透明及び黄褐色バイアルにおける７５％の相対湿度での貯蔵寿命。 様々な温度及び貯蔵容器でのＤＯＮＢの安定性研究。ａ及びｂ、５℃での透明及び黄褐色バイアルにおける貯蔵寿命。ｃ及びｄ、２５℃での透明及び黄褐色バイアル並びに６０％の相対湿度における貯蔵寿命。ｅ及びｆ、３０℃での透明バイアル及び黄褐色バイアルにおける６０％の相対湿度での貯蔵寿命。ｇ及びｈ、４０℃での透明及び黄褐色バイアルにおける７５％の相対湿度での貯蔵寿命。 様々な温度及び貯蔵容器でのＤＯＮＢの安定性研究。ａ及びｂ、５℃での透明及び黄褐色バイアルにおける貯蔵寿命。ｃ及びｄ、２５℃での透明及び黄褐色バイアル並びに６０％の相対湿度における貯蔵寿命。ｅ及びｆ、３０℃での透明バイアル及び黄褐色バイアルにおける６０％の相対湿度での貯蔵寿命。ｇ及びｈ、４０℃での透明及び黄褐色バイアルにおける７５％の相対湿度での貯蔵寿命。 様々な温度及び貯蔵容器でのＤＯＮＢの安定性研究。ａ及びｂ、５℃での透明及び黄褐色バイアルにおける貯蔵寿命。ｃ及びｄ、２５℃での透明及び黄褐色バイアル並びに６０％の相対湿度における貯蔵寿命。ｅ及びｆ、３０℃での透明バイアル及び黄褐色バイアルにおける６０％の相対湿度での貯蔵寿命。ｇ及びｈ、４０℃での透明及び黄褐色バイアルにおける７５％の相対湿度での貯蔵寿命。 一定の圧力２気圧でのＤＯＮＢ製剤中への酸素封入に対するデキストラン濃度の効果。ガス封入を、圧力を解放した後に測定した。圧力の増加は、酸素捕捉の直線的な増加を導いた。０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｍｇのデキストラン／ｍｌは、それぞれ、１８３７、１１４９２．２０９９２．４６３１６．５９３１２、６２７６０ｎｌ／２５０μｌＤＯＮＢｎｌの酸素のＤＯＮＢ中への捕捉を導いた。平均±ＳＤ、ｎ＝３。＊＊＊＊ｐ＜０．００００１対対照としてマンニトール溶液のみ。 ＤＯＮＢからの酸素放出プロファイル、（Ａ）模擬房水におけるＤＯＮＢからの酸素放出プロファイル、酸素飽和模擬房水を対照として使用した。（Ｂ）模擬硝子体液におけるＤＯＮＢからの酸素放出プロファイル及び酸素飽和硝子体液を対照として使用する。（Ｃ）ブタ血清におけるＤＯＮＢからの酸素放出プロファイル及び酸素飽和ブタ血清を対照として使用した。全ての実験セットにおいて、本発明者らは、窒素飽和房水／硝子体を使用し、及びブタ血清をベースラインとして使用し、温度を３５℃に維持した（ｎ＝３）。（ｐ＜０．０００１）。 ＤＯＮＢからの酸素放出プロファイル、（Ａ）模擬房水におけるＤＯＮＢからの酸素放出プロファイル、酸素飽和模擬房水を対照として使用した。（Ｂ）模擬硝子体液におけるＤＯＮＢからの酸素放出プロファイル及び酸素飽和硝子体液を対照として使用する。（Ｃ）ブタ血清におけるＤＯＮＢからの酸素放出プロファイル及び酸素飽和ブタ血清を対照として使用した。全ての実験セットにおいて、本発明者らは、窒素飽和房水／硝子体を使用し、及びブタ血清をベースラインとして使用し、温度を３５℃に維持した（ｎ＝３）。（ｐ＜０．０００１）。 （ａ～ｆ）２４時間後の、本発明者らの製剤の合成において使用した様々な濃度範囲の賦形剤とともにインキュベートしたＲ－２８及びＡＲＰＥ－１９細胞株の細胞生存率。（＊Ｐ＜０．０５は、未治療の対照群と比較して統計的に有意な差である、ｎ＝３）。 （ａ～ｆ）２４時間後の、本発明者らの製剤の合成において使用した様々な濃度範囲の賦形剤とともにインキュベートしたＲ－２８及びＡＲＰＥ－１９細胞株の細胞生存率。（＊Ｐ＜０．０５は、未治療の対照群と比較して統計的に有意な差である、ｎ＝３）。 （ａ～ｆ）２４時間後の、本発明者らの製剤の合成において使用した様々な濃度範囲の賦形剤とともにインキュベートしたＲ－２８及びＡＲＰＥ－１９細胞株の細胞生存率。（＊Ｐ＜０．０５は、未治療の対照群と比較して統計的に有意な差である、ｎ＝３）。 （ａ）網膜前駆細胞（Ｒ２８）及び（ｂ）網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）におけるＤＯＮＢでの低酸素回復。細胞を、３つの対照（培養培地、酸素供給した培養培地、及びナノバブルシェル）と一緒にデキストラン封入酸素ナノバブルで処理し、生存率について評価した。結果は、ＤＯＮＢ処理細胞におけるより高い生存率を示す（ｎ＝３）。 Ｒ－２８及びＡＲＰＥ－１９細胞株におけるハイパースペクトル暗視野顕微鏡法を通じたＤＯＮＢの細胞取り込み。（ａ及びｄ）対照Ｒ－２８及びＡＲＰＥ－１９細胞のハイパースペクトル画像（ｂ及びｅ）は、それぞれ、ＤＯＮＢに曝露したＲ－２８及びＡＲＰＥ－１９のハイパースペクトル画像である。（ｃ及びｆ）画像を、それぞれ、これらの細胞株によるＤＯＮＢの取り込みを見出すために、スペクトル角マッピングアルゴリズムを通じて処理する。 対照、低酸素、及び治療モードにおける網膜層の厚さ及び細胞数。図（Ａ）対照網膜の組織学的染色、網膜神経節細胞層（ＧＣＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）及び外顆粒層の全ての層は細胞に満ちており、網膜全体の厚さも良好な健康にある。図（Ｂ）は、ＤＯＮＢでのいかなる治療もなしの低酸素網膜を示す。組織学的研究は、本発明者らの低酸素モデルが良好に機能し、大部分の冒された細胞が赤い矢印で示す上部の後における神経節細胞であることを確認する。網膜の全体的な厚さもまた、図（Ａ）における対照と比較して低下した。図（Ｃ）は、ＤＯＮＢを用いた低酸素後の神経節細胞の回復を示す。ＤＯＮＢは細胞数を回復及び維持し、また、網膜の厚さ全体は維持される。 ＤＯＮＢを用いた低酸素回復。図（Ａ）対照、低酸素、及び治療眼における酸素分圧ｐＯ２、ｎ＝６、３匹の雄性及び３匹の雌性。ＤＯＮＢの投与後６時間及び２４時間での対照及び治療ラットにおける、図（Ｂ）は、ＥＲＧのａ波であり、（Ｃ）は、ｂ波である。 ＤＯＮＢを用いた低酸素回復。図（Ａ）対照、低酸素、及び治療眼における酸素分圧ｐＯ２、ｎ＝６、３匹の雄性及び３匹の雌性。ＤＯＮＢの投与後６時間及び２４時間での対照及び治療ラットにおける、図（Ｂ）は、ＥＲＧのａ波であり、（Ｃ）は、ｂ波である。 ＤＯＮＢを用いた低酸素回復。図（Ａ）対照、低酸素、及び治療眼における酸素分圧ｐＯ２、ｎ＝６、３匹の雄性及び３匹の雌性。ＤＯＮＢの投与後６時間及び２４時間での対照及び治療ラットにおける、図（Ｂ）は、ＥＲＧのａ波であり、（Ｃ）は、ｂ波である。 非変換モデルについてのＢｏｘ－Ｃｏｘプロット。 非変換モデルについてのＢｏｘ－Ｃｏｘプロット。 酸素放出に対する独立変数の影響を示す二次元相互作用応答曲面グラフ。 酸素放出に対する独立変数の影響を示す二次元相互作用応答曲面グラフ。 酸素放出に対する独立変数の影響を示す二次元相互作用応答曲面グラフ。 ナノバブルのサイズに対する独立変数の影響を示す二次元相互作用応答。 ナノバブルのサイズに対する独立変数の影響を示す二次元相互作用応答。 ナノバブルのサイズに対する独立変数の影響を示す二次元相互作用応答。 ナノバブルのゼータ電位に対する独立変数の影響を示す二次元相互作用応答。 ナノバブルのゼータ電位に対する独立変数の影響を示す二次元相互作用応答。 ナノバブルのゼータ電位に対する独立変数の影響を示す二次元相互作用応答。 全ての群における気候順応期間後のラットにおける眼圧。 典型的な酸素濃度曲線。酸素濃度の増加は、主にＯＮＢからの酸素放出に起因する。グラフは、ナノバブルから、それが懸濁される媒質中に放出された典型的なＯ_２を示す。酸素は、バブルから媒質中に放出される（媒質の濃度の増加を測定する）。対照は、ＯＮＢと同じ条件で貯蔵した、酸素を水中に１時間吹きつけることによる酸素飽和水である。 貯蔵に際しての測定における６時間での酸素濃度。０．６ｍｌのＥｐｉｋｕｒｏｎを含むＯＮＢは、様々な期間で貯蔵した試料における６時間の放出後に同様の酸素濃度を維持する。対照的に、同じ条件で貯蔵した対照の酸素飽和水についての試料の酸素濃度はずっとより低い。これは、ＯＮＢが酸素飽和水よりもずっと良好に酸素を保持し得ることを示す。凡例は、実施例３における製剤Ａ～Ｇを指す。 ３７℃の低酸素チャンバーにおけるＯＮＢからのＯ_２放出。ＯＮＢ試料と対照との間の差は、ＯＮＢが、試験試料におけるより高い酸素濃度を維持し得ることを示し、これは、ＯＮＢの酸素放出を明確に示す。３７℃の低酸素チャンバーにおけるＯ_２放出。対照は、そのＯ_２濃度がＯＮＢ試料と同様であるように調整されているＯＮＢなしの水であり、一方、ＯＮＢ試料は、ＯＮＢ及び低酸素水の混合物である（４：６）。１２時間までの放出曲線を示す。 様々なｐＨでのＯＮＢからのＯ_２放出。低ｐＨは、ＯＮＢからのＯ_２放出により長い期間影響を及ぼすが、最初の数時間では差は著しくない。ｐＨ２及び１２の溶液を、それぞれＮａＯＨ及びＨＣｌを添加して調製した。ｐＨ４．５はＭＥＳ緩衝液中にある。ｐＨ８．３は、Ｔｒｉｓ／グリシン緩衝液中にある。 様々なｐＨでのＯＮＢからのＯ_２放出。低ｐＨは、ＯＮＢからのＯ_２放出により長い期間影響を及ぼすが、最初の数時間では差は著しくない。ｐＨ２及び１２の溶液を、それぞれＮａＯＨ及びＨＣｌを添加して調製した。ｐＨ４．５はＭＥＳ緩衝液中にある。ｐＨ８．３は、Ｔｒｉｓ／グリシン緩衝液中にある。 ＰＢＳにおけるＯＮＢからのＯ_２放出。高イオン強度は、酸素濃度を、最初の数時間では、水におけるものよりも高くするが、長時間の後、より低くする。高イオン強度は、酸素放出速度を増加させるが、放出される酸素の総量を制限する。 振盪後のＯＮＢからのＯ_２放出。振盪はＯＮＢにおける酸素に影響を及ぼし、これは、試験の間の酸素濃度のより少ない増加を誘起する。対照試料は、振盪なしで貯蔵したＯＮＢである。 ３７℃の模擬硝子体液におけるＯＮＢからのＯ_２放出。Ｏ_２濃度に基づくと、０．３９ｍｌのＯＮＢ溶液（試験試料の総体積の１０％）を用いて、酸素濃度は、６時間の放出後に模擬硝子体液において２．２ｍｇ／Ｌ、水において約１．８ｍｇ／Ｌ増加する。Ｏ_２量（重量）に基づくと、６時間にわたる試験試料における酸素レベルの増加は、模擬硝子体液において約８．４ｍｇ、水において約６．９ｍｇであり、これは、主に約０．３９ｍｌのＯＮＢ溶液に起因する。試験試料の体積は約３．９ｍｌであり、これは約０．３９ｍｌのＯＮＢを含有する。

網膜への酸素の連続的な供給は、その完全性及び機能を維持するために極めて重要である。網膜中心動脈閉塞（ＣＲＡＯ）に起因する酸素の欠乏は、網膜細胞、特に網膜神経節細胞を冒した。これは、動脈閉塞に起因する低酸素が８時間以内に対処されない場合、最終的に失明を引き起こし得、その人は永遠に失明し得る。この疾患を治療するために、本発明者らは、有効でない、既存の高圧治療と比較して有効な標的化療法となる潜在力を有する酸素ナノバブルシステムの多糖ベースの硝子体内送達を作製する。本報告において、本発明者らは、デキストランベースの硝子体内酸素送達ナノバブル（ＤＯＮＢ）の作製を記載する。ＤＯＮＢは、調整可能なナノポーラスシェルを有する、薄壁中空ポリマーナノカプセルである。本発明者らは、ＤＯＮＢが、容易に酸素ガスを充填され、生理学的条件に曝露されたときのみにその酸素ペイロードを放出するように調整されることを示す。インビトロ及びインビボ研究の全てにおいて使用された最終的な最適化された製剤のサイズ分布及び濃度は、２１８．７１±５１．０５ｎｍであった。最終的な最適化された製剤のζ電位は、－５８．８±１．３ｍＶであった。本発明者らは、ＤＯＮＢからの酸素放出が持続され、それが模擬房水／硝子体液及びブタ血清において酸素を２時間送達することを実証する。安定性研究は、ＤＯＮＢが、黄褐色及び透明バイアル容器において５℃±３℃で４．５２及び４．２６ヶ月間安定であることを示した。賦形剤濃度ベースの毒性研究は、対照群と比較して見出される有意な毒性が存在しないことを示した。細胞生存率研究は、ＤＯＮＢが、低酸素後１２時間までＲ－２８細胞株の生存に対する有意な効果を有することを示すが、しかし、細胞生存率研究は、ＡＲＰＥ－１９細胞株の場合、この細胞株がＲ－２８細胞株と比較して低酸素に対してより安定であることから、観察される低酸素の有意な効果は存在しないことを示す。インビボ低酸素モデルの結果は、５μｌのＤＯＮＢが、本発明者らの低酸素モデルによって誘発された低酸素を回復させ、眼圧が６時間以内に正常に戻ることを示した。これは、次の用量の助けになる（必要とされる場合）。組織学研究は、神経節細胞層における神経節細胞のほぼ完全な回復を示し、厚さもまたＤＯＮＢ治療を用いて維持された。まとめると、これらの結果は、本発明者らのＤＯＮＢ製剤の有効性が、インビトロ及びインビボ両方の研究について完全であることを示す。

本明細書に記載の酸素ナノバブル（ＯＮＢ）は、生体適合性材料の複合体である。ＯＮＢは、おおよそ１００ｎｍ～２００ｎｍの小さなサイズの直径にあり、これは、より大きなＯＮＢと比較して眼疾患の治療により適している。他の脂質多層シェルベースの酸素含有ナノ構造と比較して、眼疾患の治療のために製剤化された、デキストランベースの多機能シェルを有する本発明者らのＯＮＢは、媒質中への長期間の酸素放出及びＯＮＢが貯蔵されるときの酸素の長時間貯蔵の能力を提供する。

本発明を支持する追加の情報及びデータは、本発明者らによる以下の刊行物において見出され得る。ＡＣＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎａｎｏ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ２０２１，４，６５８３－６５９３及びその補足情報（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

定義
以下の定義は、明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫性のある理解を提供するために含まれる。本明細書で使用される場合、記載される用語は以下の意味を有する。本明細書で使用される全ての他の用語及び語句は、当業者が理解するようなそれらの通常の意味を有する。そのような通常の意味は、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ １４^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１などの技術辞書を参照することによって得られ得る。

明細書における「一実施形態」、「実施形態」などへの言及は、記載される実施形態が特定の態様、特色、構造、部分、又は特徴を含み得るが、全ての実施形態がその態様、特色、構造、部分、又は特徴を必ずしも含むわけではないことを示す。更に、そのような語句は、必ずしもそうではないが、明細書の他の部分において言及される同じ実施形態に言及し得る。更に、特定の態様、特色、構造、部分、又は特徴が実施形態に関連して記載されるとき、明示的に記載されるか否かにかかわらず、そのような態様、特色、構造、部分、又は特徴に、他の実施形態を用いて影響を及ぼすか、又は他の実施態様を関連付けることは、当業者の知識の範囲内である。

単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、化合物Ｘが複数の化合物Ｘを含むように、複数のそのような化合物を含む。特許請求の範囲は、いかなる任意選択の要素をも除外するように起草され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、本明細書に記載の任意の要素、及び／若しくは特許請求の範囲の要素の記載に関連しての、「単独」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、又は「否定的」な限定の使用のための先行詞として作用することが意図される。

「及び／又は」という用語は、この用語が関連する項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、又は項目の全てを意味する。「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という語句は、特にその使用の文脈で読まれるときに、当業者によって容易に理解される。例えば、この語句は、１、２、３、４、５、６、１０、１００、又は記載される下限よりもおよそ１０倍、１００倍、若しくは１０００倍高い任意の上限を意味し得る。例えば、フェニル環上の１つ以上の置換基は、例えばフェニル環が二置換されている場合、１～５、又は１～４を指す。

当業者によって理解されるように、全ての数（成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表すものを含む）は、近似であり、「約」という用語によって全ての場合に任意選択で修飾されるものとして理解される。これらの値は、本明細書の記載の教示を利用して当業者によって得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る。そのような値は、そのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる変動性を本来的に含有することも理解されたい。先行詞「約」の使用によって、値が近似として表されるとき、修飾語「約」なしの特定の値もまた更なる態様を形成することを理解されたい。

「約」及び「およそ」という用語は互換的に使用される。両方の用語は、特定される値の±５％、±１０％、±２０％、又は±２５％の変動を指し得る。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態では、４５～５５パーセントの、又は特定の特許請求の範囲によって別に定義されるような変動を伴い得る。整数範囲について、「約」という用語は、範囲の各末端にある記載される整数より大きな及び／又は小さな１又は２の整数を含み得る。本明細書で別段示されない限り、「約」及び「およそ」という用語は、個別の成分、組成物、又は実施形態の機能性の点で同等である、記載される範囲に近接する値、例えば、重量パーセンテージを含むことが意図される。「約」及び「およそ」という用語はまた、この段落で上述されるように、記載される範囲の終点を修飾し得る。

当業者によって理解されるように、任意の及び全ての目的のために、特に書面による説明の提供の点で、本明細書に記載される全ての範囲はまた、任意の及び全ての可能な部分範囲及びその部分範囲の組み合わせ、並びに範囲を作り上げる個別の値、特に整数値を包含する。したがって、２つの特定の単位の間の各々の単位もまた開示されることを理解されたい。例えば、１０～１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４もまた、個別に、そして範囲の一部として開示される。記載される範囲（例えば、重量パーセンテージ又は炭素基）は、範囲内の各々の特定の値、整数、小数、又は単位元を含む。任意の列挙される範囲は、同じ範囲が少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、又は１０分の１に分解されることを十分に説明し、それを可能にするものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で考察される各範囲は、下位３分の１、中位３分の１、及び上位３分の１などに容易に分解することができる。これもまた当業者によって理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より大きな」、「未満」、「より多い」、「以上」などの全ての言葉は、記載される数を含み、そのような用語は、上述されるように引き続いて部分範囲に分解され得る範囲を指す。同様に、本明細書に記載される全ての比率は、より広い比率内に入る全ての部分比率も含む。したがって、ラジカル、置換基、及び範囲について記載される特定の値は、例示のみのためであり、それは、ラジカル及び置換基についての規定された範囲内の他の規定された値又は他の値を除外しない。更に、範囲の各終点は、他の終点と関連して、及び他の終点とは独立して、両方とも重要であることが理解されよう。

本開示は、体積、質量、パーセンテージ、比率などの変数に対する範囲、限界、及び偏差を提供する。「数１」～「数２」などの範囲は、整数及び分数を含む数の連続的な範囲を意味することが当業者によって理解される。例えば、１～１０は、１、２、３、４、５、．．．９、１０を意味する。それは、１．０、１．１、１．２、１．３、．．．、９．８、９．９、１０．０もまた意味し、１．０１、１．０２、１．０３なども意味する。開示される変数が「数１０」よりも小さな数である場合、それは、上述されるように、数１０よりも小さな整数及び分数を含む連続的な範囲を意味する。同様に、開示される変数が「数１０」より大きな数である場合、それは、数１０より大きな整数及び分数を含む連続的な範囲を意味する。これらの範囲は、「約」という用語によって修飾され得、その意味は上記されている。

当業者はまた、メンバーが、マーカッシュグループなどの共通の方法で一緒にグループ化される場合、本発明が、列挙されるグループ全体を全体として包含するだけでなく、グループの各メンバーを個別に、そして主要なグループの全ての可能なサブグループを包含することを容易に認識する。加えて、全ての目的のために、本発明は、主要なグループだけでなく、グループメンバーのうちの１つ以上が不在である主要なグループも包含する。したがって、本発明は、記載されるグループのメンバーのうちの任意の１つ以上の明示的な除外を想定している。したがって、ただし書きを、開示されるカテゴリ又は実施形態のいずれかに適用し得、それによって、記載される要素、種、又は実施形態のうちの任意の１つ以上が、そのようなカテゴリ又は実施形態から除外され得る（例えば、明示的な否定的な限定における使用のために）。

「接触」という用語は、細胞レベル又は分子レベルでのものを含む、触る、接する、又は密接若しくは近接する行為、例えば、生理学的反応、化学的反応、又は物理的変化を、例えば、溶液中で、反応混合物中で、インビトロで、又はインビボでもたらすことを指す。

「有効量」は、疾患、障害、及び／若しくは状態を治療する、又は記載される効果をもたらすのに有効な量を指す。例えば、有効量は、治療される状態又は症状の進行又は重症度を低下させるのに有効な量であり得る。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、例えば、宿主における、疾患若しくは障害を治療若しくは予防する、又は疾患若しくは障害の症状を治療するのに有効である、本明細書に記載の化合物の量、又は本明細書に記載の化合物の組み合わせの量を含むことが意図される。したがって、「有効量」は、一般に、所望の効果を提供する量を意味する。

あるいは、本明細書で使用される「有効量」又は「治療有効量」という用語は、治療される疾患又は状態の症状のうちの１つ以上をある程度緩和する、投与される薬剤又は組成物又は組成物の組み合わせの十分な量を指す。結果は、疾患の徴候、症状、若しくは原因の低下及び／若しくは軽減、又は生物学的システムの任意の他の所望の変更であり得る。例えば、治療的使用のための「有効量」は、疾患症状の臨床的に有意な減少を提供するために必要とされる、本明細書に開示される化合物を含む組成物の量である。任意の個別の場合での適切な「有効」量は、用量漸増研究などの技術を使用して決定され得る。用量は、１つ以上の投与で投与され得る。しかし、有効用量と見なされるものの正確な決定は、患者の年齢、サイズ、疾患の型又は程度、疾患のステージ、組成物の投与経路、使用される補足療法の型又は程度、進行中の疾患プロセス、及び所望される治療の型（例えば、積極療法対通常療法）を含むがこれらに限定されない、各患者に個別の要因に基づき得る。

「治療すること」、「治療する」、及び「治療」という用語は、（ｉ）疾患、病理学的又は医学的状態が生じることを防止すること（例えば、予防）、（ｉｉ）疾患、病理学的若しくは医学的状態を阻害すること、又はその発達を停止すること、（ｉｉｉ）疾患、病理学的又は医学的状態を緩和すること、及び／あるいは（ｉｖ）疾患、病理学的又は医学的状態に関連する症状を減少させることを含む。したがって、「治療する」、「治療」、及び「治療すること」という用語は、予防に広がり得、治療される状態又は症状の進行又は重症度を予防する、予防、予防すること、低下させること、止めること又は逆転させることを含み得る。したがって、「治療」という用語は、必要に応じて、医学的、治療的、及び／又は予防的投与を含み得る。

本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」は、疾患又は他の悪性病変の症状を有するか、又はその危険にさらされている個体を意味する。患者は、ヒト又は非ヒトであり得、例えば、本明細書に記載のマウスモデルなどの研究目的のために「モデルシステム」として使用される動物系統又は種を含み得る。同様に、患者は、成体又は幼若体（例えば、小児）のいずれかを含み得る。更に、患者は、本明細書で企図される組成物の投与から利益を受け得る任意の生体、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト又は非ヒト）を意味し得る。哺乳類の例には、哺乳綱の任意のメンバー：ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、並びに他の類人猿及びサル種；農場家畜、例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；飼育家畜、例えば、ウサギ、イヌ、及びネコ；実験動物（例えば、ラット、マウス及びモルモットなどのげっ歯類を含む）などが含まれるが、これらに限定されない。非哺乳動物の例には、鳥類、魚類などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で提供される方法の一実施形態では、哺乳動物はヒトである。

本明細書で使用される場合、「提供」、「投与」、「導入」という用語は、本明細書で互換的に使用され、所望の部位への化合物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路による、本開示の化合物の対象中への配置を指す。化合物は、対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。

本明細書に記載の化合物及び組成物は、組成物の安定性及び活性を延長するための追加の組成物とともに、又は他の治療薬物と組み合わせて投与され得る。

「阻害する」、「阻害すること」、及び「阻害」という用語は、疾患、感染、状態、又は細胞の群の成長又は進行を遅らせる、停止させる、又は逆転させることを指す。阻害は、例えば、治療又は接触の非存在下で生じる成長又は進行と比較して、約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％より大きくあり得る。

本明細書で使用される「実質的に」という用語は、広義の用語であり、限定するものではないが、特定されるものの必ずしも全体ではないが大方を含む、その通常の意味で使用される。例えば、この用語は、完全な数値の１００％ではない場合がある数値を指し得る。完全な数値は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、又は約２０％だけ少なくあり得る。

本明細書で「含む」という用語が使用される場合はいつも、「からなる」又は「から本質的になる」という用語が代わりに使用されるオプションが企図される。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的又は制限なしであり、追加の記載されていない要素又は方法ステップを除外しない。本明細書で使用される場合、「からなる」は、態様要素において特定されていないいかなる要素、ステップ、又は成分をも除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、態様の基本的かつ新規な特徴に大きくは影響を及ぼさない材料又はステップを除外しない。本明細書における各々の場合では、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかに置き換えられ得る。本明細書に例示的に記載される開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の単数又は複数の要素、限定の非存在下で好適に実行され得る。

酸素ナノバブル（ＯＮＢ）の体積は、ＯＮＢの半径（すなわち、直径の１／２）及び数式Ｖ＝４／３πｒ^３（式中、ｒはＯＮＢの半径である）から推定され得る。

発明の実施形態
本開示は、組成物であって、
多糖ナノバブルであって、ナノバブルは、内部カーゴを封入する自己組織化コロイドシェルを含み、
シェルは、デキストラン、トレハロース、レシチン、パルミチン酸、及びトコフェロールを含む、多糖ナノバブルと、
電解質又は塩と、を含み、
ナノバブルは、約２００ｎｍ以上の平均直径を有し、組成物は、０ｍＶ未満のゼータ電位を有する、組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン又はグリセロリン脂質である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、レシチン（例えば、Ｅｐｉｋｕｒｏｎ１７０（商標））などの乳化剤である。他の実施形態では、脂肪酸は、飽和脂肪酸である。他の実施形態では、脂肪酸は、Ｃ_１６－脂肪酸又は（Ｃ_１２－Ｃ_２０）脂肪酸である。いくつかの実施形態では、酸化防止剤は、脂溶性酸化防止剤である。いくつかの実施形態では、酸化防止剤は、クロマン環又はヒドロキシ置換クロマン環を含む。いくつかの実施形態では、シェルは、中空内部、中空コア、又は空隙内部を含み、ここで、当該内部又はコアは、任意選択でカーゴで満たされる。

種々の実施形態では、組成物は、約２×１０^－２重量％～約２０×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、組成物は、約０．５×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、組成物は、約０．１×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、組成物は、約０．５×１０^－３重量％～約１２×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、組成物は、約１×１０^－４重量％～約４０×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、組成物は、約１×１０^－４重量％～約２５×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

種々の実施形態では、組成物は、約２×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、組成物は、約０．５×１０^－２重量％～約５×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、組成物は、約０．５×１０^－２重量％～約５×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、組成物は、約１×１０^－３重量％～約１０×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、組成物は、約３×１０^－４重量％～約３０×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、組成物は、約２×１０^－４重量％～約２０×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

種々の実施形態では、組成物は、約５×１０^－２重量％～約８×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、組成物は、約０．５×１０^－２重量％～約２．５×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、組成物は、約０．５×１０^－２重量％～約２×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、組成物は、約３．５×１０^－３重量％～約６×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、組成物は、約７×１０^－４重量％～約１０×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、組成物は、約５．５×１０^－４重量％～約８．５×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、約６．９８×１０^－２重量％のデキストラン、約１．２４×１０^－２重量％のトレハロース、約１．０７×１０^－２重量％のレシチン、約４．４２×１０^－３重量％のパルミチン酸、約８．６８×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。他の実施形態では、組成物は、約６．９８×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

また、本開示は、多糖ナノバブルであって、
内部カーゴを封入する自己組織化コロイドシェルであって、
シェルは、デキストラン、トレハロース、レシチン、パルミチン酸、及びトコフェロールを含む、自己組織化コロイドシェルを含み、
ナノバブルは、約２５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約２５０ｎｍ、又は約２００ｎｍ．～約２５０ｎｍ未満の直径を有する、多糖ナノバブルを提供する。

いくつかの実施形態では、多糖ナノバブルは、濾過又は単離された多糖ナノバブルである。

種々の実施形態では、シェルは、約２×１０^－２重量％～約２０×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、シェルは、約０．５×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、シェルは、約０．１×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、シェルは、約０．５×１０^－３重量％～約１２×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、シェルは、約１×１０^－４重量％～約４０×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、シェルは、約１×１０^－４重量％～約２５×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

種々の実施形態では、シェルは、約２×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、シェルは、約０．５×１０^－２重量％～約５×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、シェルは、約０．５×１０^－２重量％～約５×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、シェルは、約１×１０^－３重量％～約１０×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、シェルは、約３×１０^－４重量％～約３０×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、シェルは、約２×１０^－４重量％～約２０×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

種々の実施形態では、シェルは、約５×１０^－２重量％～約８×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、シェルは、約０．５×１０^－２重量％～約２．５×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、シェルは、約０．５×１０^－２重量％～約２×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、シェルは、約３．５×１０^－３重量％～約６×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、シェルは、約７×１０^－４重量％～約１０×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、シェルは、約５．５×１０^－４重量％～約８．５×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

いくつかの実施形態では、シェルは、約６．９８×１０^－２重量％のデキストラン、約１．２４×１０^－２重量％のトレハロース、約１．０７×１０^－２重量％のレシチン、約４．４２×１０^－３重量％のパルミチン酸、約８．６８×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。他の実施形態では、シェルは、約６．９８×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

種々の実施形態では、ナノバブルは、パーフルオロカーボンフリーである。いくつかの実施形態では、ナノバブルは、電解質を更に含む。いくつかの実施形態では、ナノバブルは、約２００ｎｍ以上、好ましくは約１６５ｎｍ～約２７０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、０ｍＶ未満のゼータ電位。いくつかの実施形態では、電解質は、７未満のｐＨ、又は７より高いｐＨを有するＯＮＢの懸濁液中にある。種々の実施形態では、カーゴは、酸素（Ｏ_２）である。他の実施形態では、カーゴは、ガスである。種々の他の実施形態では、デキストランは、約２００ｋＤａの平均分子量を有する。他の実施形態では、デキストランは、約１００ｋＤａ～約３００ｋＤａの平均分子量を有する。他の実施形態では、レシチンは、ダイズ又はキャノーラレシチンである。他の実施形態では、トコフェロールは、アルファ－トコフェロールである。

他の実施形態では、電解質は、鉱物塩又はリン酸塩を含む溶液又は電解質混合物中にある。他の実施形態では、鉱物塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウム、又は塩化リチウムである。種々の実施形態では、直径は、約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、約１６５ｎｍ～約２７０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１２０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約２２５ｎｍ～約２１５ｎｍ、約２２０ｎｍ、約２１９ｎｍ、又は約２１８ｎｍである。種々の実施形態では、直径の分散は、±７５ｎｍ以下、±６０ｎｍ、±５０ｎｍ、又は±２５ｎｍである。

他の実施形態では、ゼータ電位は、約－７５ｍＶ～約－５０ｍＶ、約－６５ｍＶ～約－５５ｍＶ、約－３５ｍＶ～約－２５ｍＶ、約－６０ｍＶ、又は約－５９ｍＶである。他の実施形態では、ゼータ電位の分散は、±１０ｍＶ以下、±５ｍＶ、±３ｍＶ、±２ｍＶ、又は±１ｍＶである。他の実施形態では、ｐＨは、約５．５～約５．７５である。他の実施形態では、ｐＨは、約９未満、約８未満、約６未満、約５未満、約４未満、約３未満、又は約４～約８である。

他の実施形態では、試料は、約６．９８×１０^－２重量％のデキストラン、約１．２４×１０^－２重量％のトレハロース、約１．０７×１０^－２重量％のレシチン、約４．４２×１０^－３重量％のパルミチン酸、約８．６８×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を有し、電解質は、約６．９８×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

加えて、本開示は、眼虚血を治療するための方法であって、
眼虚血のための療法を必要とする対象の虚血性眼の内部に、有効用量の本明細書に開示される組成物を投与することを含み、
組成物は、酸素ガスの内部カーゴを含有する複数のナノバブルを含み、
ナノバブルは、投与後に崩壊して、酸素を放出し、それによって対象における眼虚血を治療する、方法を提供する。

種々の実施形態では、ナノバブルは、濾過される。種々の実施形態では、組成物は、濾過されたナノバブルを含む。種々の実施形態では、濾過されたナノバブルは、緩衝液と混合される。種々の実施形態では、ナノバブルは、緩衝液を含む。いくつかの他の実施形態では、放出される酸素の量は、１分当たり１マイクロリットルの組成物当たり少なくとも５００ナノリットルである。いくつかの他の実施形態では、１分当たり１マイクロリットルの組成物当たりの放出される酸素の量は、約４００ナノリットル、約６００ナノリットル、約８００ナノリットル、約１０００ナノリットル、又は約１５００ナノリットルである。

他の実施形態では、有効用量は、少なくとも５マイクロリットルの組成物である。他の実施形態では、組成物の有効用量は、約１マイクロリットル～約１００マイクロリットル、約１０マイクロリットル、約２０マイクロリットル、又は約５０マイクロリットルである。他の実施形態では、治療は、１つより多い有効用量を含む。他の実施形態では、眼虚血は、網膜低酸素である。追加の実施形態では、開示される酸素ナノバブルは、他の既知の眼疾患、又は他の眼の虚血状態、例えば、網膜静脈分枝閉塞、網膜動脈分枝閉塞、糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞、網膜中心動脈閉塞（ＣＲＡＯ）、虚血性視神経症、眼虚血症候群、加齢黄斑変性及び類似の疾患を治療し得る。

更に、本開示は、酸素含有ナノバブルの組成物を形成するための方法であって、デキストラン、トレハロース、レシチン、パルミチン酸、トコフェロールの水性混合物、及び電解質に酸素供給し、それによって酸素含有ナノバブル（ＯＮＢ）を形成することを含む、方法を提供する。種々の実施形態では、混合物は、酸素供給の間に超音波処理される。他の実施形態では、ＯＮＢは、濾過によって単離される。

種々の実施形態では、混合物は、約２×１０^－２重量％～約２０×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、混合物は、約０．５×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、混合物は、約０．１×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、混合物は、約０．５×１０^－３重量％～約１２×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、混合物は、約１×１０^－４重量％～約４０×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、混合物は、約１×１０^－４重量％～約２５×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

種々の実施形態では、混合物は、約２×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、混合物は、約０．５×１０^－２重量％～約５×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、混合物は、約０．５×１０^－２重量％～約５×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、混合物は、約１×１０^－３重量％～約１０×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、混合物は、約３×１０^－４重量％～約３０×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、混合物は、約２×１０^－４重量％～約２０×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

種々の実施形態では、混合物は、約５×１０^－２重量％～約８×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、混合物は、約０．５×１０^－２重量％～約２．５×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、混合物は、約０．５×１０^－２重量％～約２×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、混合物は、約３．５×１０^－３重量％～約６×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、混合物は、約７×１０^－４重量％～約１０×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、混合物は、約５．５×１０^－４重量％～約８．５×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

いくつかの実施形態では、混合物は、約６．９８×１０^－２重量％のデキストラン、約１．２４×１０^－２重量％のトレハロース、約１．０７×１０^－２重量％のレシチン、約４．４２×１０^－３重量％のパルミチン酸、約８．６８×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。他の実施形態では、混合物は、約６．９８×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

種々の実施形態では、組成物、シェル、又は混合物は、約４×１０^－２重量％～約９×１０^－２重量％のデキストランを含む。種々の実施形態では、組成物、シェル、又は混合物は、約０．７５×１０^－２重量％～約２×１０^－２重量％のトレハロースを含む。種々の実施形態では、組成物、シェル、又は混合物は、約０．５×１０^－２重量％～約２×１０^－２重量％のレシチンを含む。種々の実施形態では、組成物、シェル、又は混合物は、約３×１０^－３重量％～約７×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む。種々の実施形態では、組成物、シェル、又は混合物は、約６×１０^－４重量％～約１２×１０^－４重量％のトコフェロール（ＴＰＧＳ）を含む。種々の実施形態では、組成物、シェル、又は混合物は、約５×１０^－４重量％～約１０×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む。

本明細書に開示される全ての報告される重量％は、あるいは％ｗ／ｖとして解釈され、逆もまた同様である。本明細書に開示される全ての報告される％ｗ／ｖは、あるいは重量％として解釈され、逆もまた同様である。

結果及び考察
ここで、本発明者らは、超音波処理及び均質化方法によって作製されたパーフルオロカーボンフリーのデキストランベースの酸素ナノバブル（ＤＯＮＢ）プラットフォームを報告する。製剤を、回転可能性中心複合計画（ＲＣＣＤ）データ分析、実験計画を使用して最適化し、モデルビルディングを、ソフトウェアＤｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ（登録商標）（バージョン１１．１．１．０，Ｓｔａｔｅ－Ｅａｓｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を介して行った。回転可能性中心複合計画（ＲＣＣＤ）、応答曲面法ＲＳＭ、Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ、及びＤｏｅｈｌｅｒｔ計画は、製剤の最適化及び開発のために薬品製造工学において使用される中でも主な応答曲面法である。現在の製剤では、４因子ＲＣＣＤ計画を使用して、４つの操作変数、すなわち、デキストラン（Ｘ_１）、塩化カリウム（Ｘ_２）、超音波出力（Ｘ_３）、及びｐＨ（Ｘ_４）の間の機能関係を確立し、応答は、２時間での平均酸素放出（Ｙ_１）、酸素ナノバブルのサイズ（Ｙ_２）、及びζ電位（Ｙ_３）である。３０個の様々な製剤を成功裏に最適化した後、本発明者らは、本発明者らが各変数について設定する、所望応答の点で最良の結果に基づいて１つの製剤を選択する。

ＲＣＣＤの目的は、頻繁な相互作用を分析して、選ばれた独立パラメータの、酸素ナノバブルのサイズ及び平均酸素放出との間の数学的関連を生成することであった。実験を三連で実施し、平均値を応答として使用した。観察された応答を予測に対して検証するために、数学的最適化を、全てのパラメータ値が範囲内に設定されたときに応答を「最大」に設定することによって実行した。（表１）は、製剤最適化のための計画概要を提供する。独立変数の低値及び高値を、最良の実験データフィッティングを伴う数学モデルの適切かつ信頼性の高い開発の構築のために設定した。入力条件に基づいて、ＲＣＣＤモデルによって提唱された条件について３０回の実験ランのリストを実行した。本研究において使用したＲＣＣＤモデルのためのＢｏｘ－Ｃｏｘプロットを実施例において考察し、グラフ表示を（図１１）に示す。

簡潔に述べると、使用したデキストランの濃度は（０．９％ｗ／ｖ）及び（０．２３％ｗ／ｖ）のリン脂質であった。リン脂質及び（０．１９％ｗ／ｖ）のパルミチン酸は、製剤において乳化剤として作用する。塩化カリウムを、超音波処理及びキャビテーションの間にナノバブルのサイズを低下させるのを助けるための電解質として使用する。Ｄ－α－トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸（ＴＰＧＳ）は、ナノバブルの表面張力を低下させ、製剤化の間のナノバブルの自己組織化を助ける。トレハロースを、デキストランコアの安定性を増加させるために使用する。本発明者らは、ＴＰＧＳを界面活性剤として選んだ。なぜなら、それは、ＡＴＰ依存性Ｐ糖タンパク質の活性を阻害することによってナノバブルが網膜層に入るのを助け、多剤耐性を克服し、網膜細胞からのナノバブルの流出を防止するための強力な賦形剤として作用するからである。本研究において使用する賦形剤は、非常に低い程度の細胞毒性を有するとしてＦＤＡによって生体適合性化合物として指定されている。酸素を封入しているＤＯＮＢの模式図を（図２ａ）に示す。プロセスは、塩化カリウムの、４℃の注射用無菌水の超音波処理された分散相中への添加を含む。最適な塩化カリウム（この量であるもの）及び超音波出力は、ナノバブルサイズを最小化すると考えられた。最適化研究の詳細を実施例に提示する。ナノバブルのコアシェルとして使用するデキストラン硫酸ナトリウム２００ｋＤａ（０．７～１．０ｍｇ）は、酸素放出との直接的な関係を示す（図１２）。塩化カリウム及び超音波出力は、ナノバブルのサイズを制御する。電解質としての塩化カリウム及び超音波出力のナノバブルサイズに対する効果を実施例に記載する（図１３）。超音波エネルギー及び周波数によるナノバブルサイズ低下の同様のパターンが、Ｙａｓｕｄａ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１９，１９５，４５５）によって研究された。媒質のｐＨは、ナノバブルのζ電位の制御における極めて重要な役割を果たし、最適化を実施例に記載する（図１４）。

ｐＨをアルカリ性からわずかに酸性にシフトさせることによる本発明者らの製剤化において、ζ電位は負電荷に向けてシフトする。ζ測定は、酸素ナノバブルが、水／ガス境界における負のＯＨ－イオンの吸着に見かけ上起因して、電気二重層で負に荷電することを示す。最終的な最適化された製剤のζ電位は、（図２ｄ）に提示するように－５８．８±１．３ｍＶであった。水溶液における安定なナノバブルの作製における非常に重要な二重の役割を果たす電気二重層は、斥力を提供して、バブル間の蓄積及び合体を回避するだけでなく、水／ガス境界における表面張力を減少させて、各バブルの内側の内部圧力を低下させる［参考文献を提供されたい］。このメカニズムは、製剤の安定性を改善するのを助け、２つの方法で毒性を減少させる。第一は、コロイド安定性を増加させることであり、第二は、わずかに酸性のｐＨに起因し、最終的な製剤は防腐剤を含まない。これは、水溶液におけるナノバブルの安定性に対するｐＨ及びイオン強度の効果についての同様の結果を含むＪｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ２００７，１１１（４０），１１７４５）よって観察されたとおりである。わずかに酸性のｐＨはまた、微生物増殖から保護する。微生物活性を低下させる潜在力を有する。

ＤＯＮＢのサイズ分布及び濃度／ｍｌを、ＮＴＡ（Ｎａｎｏ Ｓｉｇｈｔ ＮＳ３００）を使用して測定した。インビトロ及びインビボ研究の全てにおいて使用した最終的な最適化された製剤のサイズ分布及び濃度は、２１８．７１±５１．０５ｎｍであった。結果を（図２ｂ）に提示する。ナノバブルの構造及び形態を、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＪＥＭ－２１００Ｆ，ＪＥＯＬ，Ｊａｐａｎ）によって検査した。ＴＥＭ画像（図２ｅ、図２ｆ及び図２ｇ）は、ナノバブルのコア－シェル構造を示し、ナノバブルのサイズは、ＮＴＡを用いたサイズ分布測定と一致する。

最適化された製剤を、ＩＣＨ Ｑ１Ｅ及びＦＤＡ基準による安定性研究に供した。形成されたナノバブルは、容器及び貯蔵条件に応じて、液体状態で比較的短期及び長期の安定性を示し（図３）、これは、安定なナノバブル製剤の特徴である。ナノバブルを室温及び加速温度（１／Ｔ）に、そして様々な相対湿度（％ＲＨ）条件に置き、ナノバブルの貯蔵寿命及び統計分析はＳｉｇｍａプロットバージョン１４．０を利用した。結果は、５℃±３℃での黄褐色及び透明バイアル容器におけるナノバブルの貯蔵寿命が、４．５２及び４．２６ヶ月であったことを示す。２５℃±２℃、ＲＨ６０％±５％ＲＨでのナノバブルの貯蔵寿命は、３．６８及び３．１４ヶ月であった。しかし、３０℃±２℃、ＲＨ６０％±５％ＲＨでのナノバブルの貯蔵寿命は、２．８２及び１．９６ヶ月であった。極度の加速温度及び湿度４０℃±２℃、ＲＨ７５％±５％ＲＨにおいて、２．２４及び２．５８ヶ月であった。貯蔵寿命分析研究から、本発明者らは、理想的な温度及び容器は、黄褐色のバイアルにおける、５℃±３℃であったと結論付ける。

デキストランナノバブルにおける酸素の封入パーセントを、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ２００８，３４（８），１２７２）による以前に報告された方法を使用することによって、ＤＯＮＢ製剤中への酸素封入に対するデキストランの様々な濃度の効果を評価するための実験の別々のセットを計画することによって評価し、合計５００μｌのＤＯＮＢを、光感受性試料を保護するための米国薬局方（ＵＳＰ）タイプＩ要件に適合する２ｍｌ黄褐色血清低抽出物ホウケイ酸ガラスバイアル７ｘ１３ｍｍに移した。酸素を、３０ゲージ針を取り付けたＴｅｆｌｏｎチューブを通してバイアル中に導入した。加圧酸素ガス／ＤＯＮＢ分散液を３０分間室温でインキュベートした。（図４）に示すように、様々な濃度のデキストランの存在下での酸素の捕捉は、関連した体積での酸素捕捉を開始し（実質的に。一連のデキストラン濃度変動にわたって直線的に）、本発明者らは一定の酸素ガス圧力２気圧を使用し、１８３７、１１４９２．２０９９２．４６３１６．５９３１２、６２７６０ｎｌ／２５０μｌＤＯＮＢの捕捉を導いた。本発明者らはまた、０．８ｍｇのデキストランと１．０ｍｇのデキストランとの間に有意な酸素捕捉の差が存在しないことを観察した。これらの現象はまた、中心複合計画分析による本発明者らの最適化研究を支持する。

封入酸素の量を、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．による以前に報告された方法を使用して測定した。ナノバブルシェルの非常に重要な成分である、デキストランの濃度を増加させることによって、捕捉された酸素の体積もまた増加し、これは、直接的な関係を示す。酸素体積の量を、水を５マイクロリットルシリンジから２５０μｌリットルシリンジに置換することによって記録した。封入ガスによって置き換えられた流体の体積を、マイクロリットルシリンジスケールで容易に測定した。

製剤において使用したＤＯＮＢ及び賦形剤のバイオセーフティを、網膜前駆細胞Ｒ－２８及び網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）に対して評価した。以下の細胞株の懸濁液（１００μＬ、約６００００細胞／ｍＬ）を、９６ウェルプレートの各ウェル中に播種し、一晩培養した。細胞を２４時間暗所において培養した。調製した賦形剤ＤＯＮＢのバイオセーフティをＲ－２８及びＡＲＰＥ－１９細胞細胞に対して評価し、結果は、賦形剤が広範囲の賦形剤濃度にわたって優れた生体適合性を持つことを示した。細胞生存率に対して毒性効果をもたらす濃度を、研究から除外し、使用しないは、（図６）に示すように最適化及び最終的な製剤である。ｌ１７５、塩化カリウムＴＰＧＳ、及びトレハロースは、それぞれ、０．４～０．４５，０．００８、０．０４～０．０４５及び０．６～０．７ｍｇでいくらかの毒性効果をもたらす。

ＤＯＮＢの酸素放出プロファイルを、３５℃の人工流体における酸素放出速度をモニターすることによって測定した。ＤＯＮＢを、３５℃で窒素環境において房水、硝子体液、及びブタ血清に添加し、最終混合物の溶存酸素濃度を経時的に光ファイバーＯｘｙｌｉｔｅ（商標）Ｏｘｆｏｒｄオプトロニック酸素プローブを用いて測定した（図５）。３つ全ての模擬媒質について、ＤＯＮＢの添加後、溶存酸素濃度はゆっくりと増加した。最も高い酸素濃度は、模擬流体中での７５～９０分でプラトー状態を達成し、次いで、溶存酸素が窒素環境中に拡散したことから、適度に定常的なレベルにわずかに低下した。特に、房水における酸素の放出は、硝子体及びブタ血清よりも少し高いプラトーを達成した。これは、硝子体液及び血清のより高い粘度が、硝子体及びブタ血清における酸素の放出をゆっくりと持続するのを助けるからである。本発明者らは、各々の実験セットにおいて、媒質としての０．５ｍｌの模擬房水／硝子体及びブタ血清、並びに０．２５ｍｌのＤＯＮＢを使用する。

低酸素回復のために、本発明者らは、低酸素チャンバーにおいて細胞株をインキュベートする。本発明者らは、低酸素を作製するためにガスの混合物２％Ｏ_２、１０％ＣＯ_２、８８％Ｎ_２を使用し、細胞培養のための低酸素環境を作製するために利用したプロトコルを、幹、細胞技術から採用し、同じベンダーからの低酸素チャンバーもまた使用した。ＤＯＮＢを６～１２時間インキュベートし、細胞生存率を、確立されたプロトコルを使用するＭＴＴアッセイによって評価して、ナノバブルが非細胞毒性であることを確認する。結果を、Ｒ－２８細胞株について（図７ａ）に示し、これは、ナノバブルが低酸素における細胞の生存を１２時間まで有意に改善することを示すが、しかし、（図７ｂ）において、結果は、ナノバブル有り及び無しで細胞生存のそのような有意な改善が存在しないことを示す。これは、ＡＲＰＥ－１９細胞株自体が非常に耐性であり、低酸素条件で生存することができるからである。細胞生存率は、本発明者らのＤＯＮＢの全体的な性能にアクセスするのを助ける。なぜなら、低酸素によってより冒される細胞の大部分は網膜神経節細胞であり、本発明者らのナノバブルはＲ－２８細胞株において良好に機能し、細胞生存を改善するからである。賦形剤毒性試験及びインビトロ細胞生存率研究からの結果を成功裏に行った後、本発明者らは動物研究に向けて進む。

ＡＲＰＥ－１９及びＲ－２８細胞株による細胞取り込み研究を、（図８）に与えるハイパースペクトル暗視野顕微鏡法技術を使用して実施した。ハイパースペクトル暗視野顕微鏡法（ＨＳ－ＤＦＭ）は、汎用コンピュータアルゴリズムを用いて、その様々な光学的シグネチャから粒子を認識し得る、非破壊的な技術である。この非破壊的な技術は、粒子の細胞内生体内分布を追跡し、蓄積パターンの正確な観察を可能にする。ハイパースペクトルイメージングを、生物学的標本における所望の物質の存在及び位置を明らかにするための画像「マップ」を作成するためにも使用し得る。

本発明者らの実験のために、ＡＲＰＥ－１９、及びＲ－２８細胞株を、２時間ＤＯＮＢとともに３７℃及び５％二酸化炭素環境でインキュベートした。細胞を、正に荷電したスライド上で固定し、ハイパースペクトル暗視野顕微鏡（ＣｙｔｏＶｉｖａ，Ａｕｂｕｒｎ，ＡＬ）を用いて画像化し、結果を（図８ａ及び図８ｄ）に示し、それはＲ－２８及びＡＲＰＥ－１９細胞株についての対照画像のハイパースペクトル画像である。ＤＯＮＢを細胞内で同定するために、本発明者らは、ＤＯＮＢのスペクトルライブラリを構築し、スペクトルライブラリメモリフォルダ中に保存し、（図８ｇ）は、ＤＯＮＢのスペクトルライブラリを示す。次いで、スペクトルライブラリを、対照画像をブランクとして使用して各画像についてフィルタリングして、（ＥＮＶＩ４．８ソフトウェア）スペクトル角マッパー（ＳＡＭ）アルゴリズムを使用して、曝露された細胞の画像におけるＤＯＮＢを同定した。マッピング後、Ｒ－２８及びＡＲＰＥ－１９細胞株によるＤＯＮＢ取り込みを、それぞれ、（図８ｃ及び図８ｆ）に示す。図８ｂ及び図８ｅは、ナノバブルを含むＲ－２８及びＡＲＰＥ－１９細胞株の画像である。ハイパースペクトル技術は、ＤＯＮＢがＡＲＰＥ－１９及びＲ－２８細胞株によって容易に取り込まれることを示す。

インビボ研究のために、本発明者らは、１２週齢のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を、１０／２０１８に承認されたＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ａｔ Ｕｒｂａｎａ－Ｃｈａｍｐａｉｇｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）プロトコル＃１０８０７７により使用した。本発明者らは、既知の眼虚血モデルを使用し、ここで、実験全体を通して、動物の右眼を対照として使用し、左眼を実験眼として使用した。３０ゲージをラットの前房に挿入し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）ボトルを上昇させて、眼圧（ＩＯＰ）を＞６０ｍｍＨｇに９０分間増加させた。

ＤＯＮＢを、３１ゲージＫｅｌ－Ｆ Ｈｕｂ針１．０インチ、ポイントスタイル１２°（部品＃７７５０－２２，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｒｅｎｏ，ＮＪ，ＵＳＡ）とともに気密シリンジ（モデル１７０２ ＬＴねじ付きプランジャーシリンジ、部品＃８０２６６）を使用し、角膜縁からおよそ１ｍｍ後方の毛様体扁平部を通して、虹彩面に垂直に向けて、硝子体腔中に投与する（図１ａ）。ねじ付きプランジャーシリンジは、制御された方法でＤＯＮＢを送達して、ＩＯＰの不要な上昇を回避するのを助ける。投与した１回転当たりのＤＯＮＢの体積は、０．３３μｌであった。シリンジを、０．０１ｕｍの分解能を有する手動マイクロマニピュレーター（Ｍａｒｚｈａｕｓｅｒ Ｗｅｔｚｌａｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、モデルＨＳ６）ＨＳに取り付けた。実験の間、ＩＯＰレベルをモニターし、５μｌのＤＯＮＢを本発明者らの研究の全てにおいて用量として使用した。これは、２～２０μｌの報告された範囲内にある。ＤＯＮＢを、虚血の誘発の１時間前に治療群において注射して、網膜内層中への拡散のための時間を与えた。Ｏｘｙｌｉｔｅ（商標）Ｏｘｆｏｒｄオプトロニック酸素プローブを使用して、研究眼の硝子体腔における酸素濃度を決定し、未治療の眼と比較する。更に、本発明者らはまた、治療対未治療の虚血性眼において網膜への低酸素性損傷が軽減されたかどうかを評価する。

本発明者らの第１の実験セットにおいて、本発明者らは、治療当たり６匹のラット、３匹の雄性及び３匹の雌性（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用する。眼圧（ＩＯＰ）は、眼の健康の不可欠な測定である。到着に際して、動物を、少なくとも２週間気候順応させた。気候順応期間の後、右及び左眼における眼圧を７日間測定した。４～５個の連続した値の平均が５％未満の変動係数を有するレベルに達するまでＩＯＰ測定を繰り返し、値は７日間の平均±ＳＤである。各値及びエラーバーは、毎日１２個の右眼及び１２個の左眼についての平均ＩＯＰ±ＳＤ．を表し、平均をｇｒａｐｈ ｐａｄ ｐｒｉｓｍにプロットする。ＩＯＰのデータを２つの動物群で提示する。なぜなら、本発明者らは、合計２４匹の動物、各注文において１２匹の動物、６匹の雄性及び６匹の雌性を購入するからである。（図１５）（ｐ＜０．０５、対応のないスチューデントｔ検定）。全てのＩＯＰ測定を、１日の同じ時間（午前１０時～正午１２時）に同じ観察者によって実施した。ＩＯＰ測定を麻酔の誘発の５分以内に開始し、動物はＩＯＰ測定の３０分の内に覚醒していた。（図１５）に示すように、５μＬのＯＮＢ溶液の硝子体内注射の後、ＩＯＰは１６ｍｍＨｇにのみ増加したが、６時間以内に正常レベルに戻った。これはまた、以前に報告されたものと一致しているか又はおそらくそれより良好である。５μｌのナノバブルの注射に際して、１６ｍｍＨｇほどの高さが示された。図１５において、ＩＯＰを、注射後２４時間までモニターした。全ての注射を左（実験）眼に対して行った。両方の眼の間の最も大きな差には、１．５時間までに達した、１６．００±１．４５ｍｍＨｇ対１３．５４±１．００ｍｍＨｇ、ｐ＜０．００５。眼圧は６時間で正常に戻り（１３．６４±１．０６ｍｍＨｇ対１４．２８±１．２０ｍｍＨｇ、ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定）、これは、第２の用量が投与され得ることを示す（必要とされる場合）。

各実験セットの後、両眼を摘出し、組織学的検査のために使用して、酸素ナノバブル治療有り及び無しの両方での比較のために他所で報告された確立されたプロトコルに従って、網膜の形態変化を同定した。ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片を使用して、網膜損傷及び網膜層の厚さを評価した。各切片について、網膜のデジタル化画像を捕え、記録した。本発明者らはまた、第２の実験セットを行い、ここで、本発明者らは、合計１２匹の動物を使用し、同じ戦略を適用し、同じ６匹の動物の左眼使用実験眼、対照としての右。残りの６個の動物の眼を低酸素対照として使用した。局在化酸素測定に適した、可撓性低侵襲性センサー（ＮＸ－ＢＦ／Ｏ／Ｅ Ｏｘｙｌｉｔｅ（商標），Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ，ＵＫ）を使用して、対照、低酸素及びＯＮＢ治療眼における酸素分布を測定した。プローブを、特注のＣＭＡ１１カニューレを使用して、角膜縁のちょうど後側に配置した小さな穴を通してラット眼中に挿入した。平凹コンタクトレンズを角膜上に配置し、これは、手術顕微鏡（ＳＭ－３ＴＺ－５４Ｓ－５Ｍ，Ａｍｓｃｏｐｅ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに、眼底の高品質立体視をもたらした。

局在化酸素測定に適した、可撓性低侵襲性センサー（ＮＸ－ＢＦ／Ｏ／Ｅ Ｏｘｙｌｉｔｅ（商標），Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ，ＵＫ）を使用して、対照、低酸素及びＯＮＢ治療眼における酸素分布を測定した。プローブを、特注のＣＭＡ１１カニューレを使用して、角膜縁のちょうど後側に配置した小さな穴を通してラット眼中に挿入した。平凹コンタクトレンズを角膜上に配置し、これは、手術顕微鏡（ＳＭ－３ＴＺ－５４Ｓ－５Ｍ，Ａｍｓｃｏｐｅ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに、網膜における電極チップの配置を決定するための、眼底及び電極の高品質立体視をもたらした。全ての測定を、暗赤色光（λ＞６００ｎｍ）下で行った。酸素電極をＯｘｙｌｉｔｅ（商標）モニターにつなぎ、Ｏｘｙｌｉｔｅ（商標）モニターのアナログ出力をＰｏｗｅｒＬａｂ１６ＳＰ（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）と接続した。実験眼における測定を、酸素ナノバブル治療の６時間後に行った。網膜における酸素拡散についてのＴｍａｘは４時間であったことから、この時点を選んだ。（図１０ａ）は、対照、低酸素、及び治療ラットの眼からの網膜内ｐＯ^２プロファイルを示し、合計６匹のラット、３匹の雄性及び３匹の雌性を使用した。ＯＮＢ治療低酸素眼は、硝子体（２５～２０ｍｍＨｇ）、網膜内層（５～２０ｍｍＨｇ）、網膜外層（１５～５ｍｍＨｇ）、及び脈絡膜（約４５ｍｍＨｇ）においてほぼ典型的なｐＯ_２プロファイルを有し、値は対照眼と合致し、以前の報告と一致しているという初期の証拠が存在する。低酸素眼は、全ての組織についてずっとより低いｐＯ_２値を有する。

本発明者らの虚血モデルは、全虚血のより多くを引き起こし、これは、網膜動脈閉塞とは対照的に眼動脈閉塞に似ている。いくらかの酸素供給が存在することから、虚血は完全であってはならないが、著しい低酸素状態が予期される。更に、最も決定的に酸素供給を必要とする網膜の面積は約２２．７％である（ヒト眼における網膜直径全体が２２ｍｍである一方で、５ｍｍの黄斑直径）。ＣＲＡＯ及び類似の虚血状態の臨床評価のために、視覚の大部分を温存するための網膜表面全体とは対照的に、黄斑の内層を維持する必要がある。より全体的な虚血にもかかわらず、提唱するＯＮＢ技術は、低酸素の軽減における優れた有望さを示す。この趣旨で、ラット網膜内層における酸素消費は、組織１００ｇ当たり２．３ｍｌの酸素である。

ラット網膜の酸素要求量は２^６～３^６ｎｌ／１００ｇｍであり、ヒトは１０^７ｎｌ／１００ｇ／分を必要とする。別の研究は、網膜内層酸素消費が重量調整ベースでおよそ１２００ナノモル／時であることを確立した。０．５ｍｌ用量での合成ＤＯＮＢからの最大酸素放出は、模擬房水中で３．６８ｍｌ／分、模擬硝子体液中で３．５１３ｍｌ／分、及び血清中で３．３５５ｍｌ／分であった。ＤＯＮＢ酸素放出を、Ｏｘｙｌｉｔｅ（商標）プローブを用いて測定し、ＰｏｗｅｒＬａｂ ＳＰ１６データ収集デバイスを用い、Ｃｈａｒｔ５．１ソフトウェアを使用して記録した。記録したデータを、ヘンリーの法則及び市販のオンライン計算機Ｌｏｌｉｇｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｊｅｌｅに従って分析した。模擬房水、硝子体液、及び血清におけるインビトロ放出研究によれば、ＤＯＮＢは、低酸素状態で失明を最も引き起こしやすいラット及びヒトにおける網膜内層のための酸素消費の要件を満たす。ヒトの場合、総網膜酸素要求量は１０ｍｌ／分である。網膜内層は網膜全体のおよそ２５％であり、これは、２．５ｍｌ／分が網膜内層によって必要とされることを意味する。光受容体及び基礎をなす網膜色素上皮を含む網膜外層は、長及び短後毛様体動脈に由来する脈絡膜循環によって酸素を供給され、純粋なＣＲＡＯにおいて梗塞されない。したがって、本発明者らの主な標的は、低酸素の場合の網膜内層回復である。

網膜機能を、治療対未治療の眼における生存動物の網膜電図（ＥＲＧ）記録を用いて評価した。網膜は、光を検出する、光受容体（杆体及び錐体）並びに脳に画像を伝達する神経節細胞を含む、特殊化された細胞の層で構成されている。具体的には、ＥＲＧは、光受容体、並びに光受容体と神経節細胞との間の媒介として作用する他の細胞（ミュラー細胞及び双極細胞）からの電気シグナルを拾い上げる。ここで、より低いａ及びｂ波振幅（図１０ｂ及び図１０ｃ）は、網膜光受容体機能における低酸素障害を示す。これら及び他の低酸素エンドポイントにおいて、非低酸素眼は、低酸素誘発損傷の相対評価のための堅牢な陰性対照として作用する。本発明者らは、６つの眼からのＥＲＧデータを観察し、ＯＮＢが低酸素発作を軽減するという請求を更に支持する。低酸素眼は、障害された機能を示す、ａ及びｂ波の減少を明確に示す。６及び２４時間での治療眼は、ａ及びｂ波の両方のほぼ正常な応答を有する。

以下の実施例は、上記の発明を例示することを意図しており、その範囲を狭めるものとして解釈されるべきではない。当業者は、実施例が、それにおいて本発明が実行され得る多くの他の方法を示唆することを容易に認識する。多数の変形及び変更が本発明の範囲内にとどまりながらなされ得ることを理解されたい。

実施例１．一般的な方法
材料。デキストラン硫酸ナトリウム塩（２００ｋＤａ）（Ｓｉｇｍａ６７５７８－５Ｇ）、Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物（Ｓｉｇｍａ Ｔ５２５１－１０Ｇ）、塩化カリウム（Ｓｉｇｍａ Ｐ９５４１－５００Ｇ）、Ｄ－α－トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸（Ｓｉｇｍａ５７６６８－５Ｇ）ステアリン酸、硫酸ナトリウムＨＰＬＣグレード（Ｓｉｇｍａ ８０９８４）を、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡの子会社であるＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）。Ｅｐｉｋｕｒｏｎ（商標）１７０リン脂質脱脂ダイズレシチンは、Ｃａｒｇｉｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙからの好意の寄贈品であった。注射用無菌水、ＵＳＰ／ＥＰ（ＲＭＢＩＯ１０８３７－１８４）。ＨＰＬＣグレード水。全ての化学物質をいかなる修飾もなしで受け取ったまま使用した。Ｄｕｒａｎ Ｗｈｅａｔｏｎ Ｋｉｍｂｌｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）から購入した、透明血清バイアル７ｘ１３ｍｍ（カタログ＃２３６８３）及び黄褐色血清バイアル７ｘ１３ｍｍ（カタログ＃２２３６９３）。ＯｘｙＬｉｔｅ（商標）ベアファイバータイプ酸素センサー、製品コード「ＮＸ－ＢＦ／Ｏ／Ｅ」（Ｏｘｆｏｒｄ Ｏｐｔｒｏｎｉｘ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）。

ナノバブルの合成。ＤＯＮＢを、超音波キャビテーション及び高速均質化方法を使用して合成した。簡潔に述べると、５０ｍｌの注射用無菌水（ＵＳＰ）を、酸素供給及び超音波処理し、１ｍｌの０．０４５％塩化カリウムを添加して、Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）ＳＦＸ２５０を使用して１秒当たり５０ワットで５分間連続的な酸素供給及び超音波処理下でバブルのサイズを低下させ、酸素供給レベルを分圧＞２００ｍｍＨｇに維持した。５分後、３ｍｌの０．２３％Ｅｐｉｋｕｒｏｎ（商標）１７０、２ｍｌの０．０１８％Ｄ－α－トコフェロールポリエチレングリコール１０００コハク酸（ＴＰＧＳ）を溶液に添加した。溶液を、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ Ｔ１８ホモジナイザー（ＩＫＡ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによる１８０００ｒｐｍでの均質化に切り替えた。均質化の間、５ｍｌの０．９％デキストランを添加し、均質化速度を２２０００ｒｐｍに５分間増加させた。得られた溶液を１秒当たり５０ワットで５分間超音波処理した。次に、１．５ｍｌの０．１９％パルミチン酸を添加し、続いて２ｍｌの０．４０％トレハロース溶液を添加した。製剤化全体を氷浴上で行い、溶液の内部温度を４℃に維持した。ＤＯＮＢ生成物を、０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、特徴付け研究のために透明及び黄褐色ホウケイ酸ガラスバイアル中で貯蔵した。

安定性研究。ＤＯＮＢの貯蔵寿命を、「ＩＣＨ，Ｑ１Ｅ Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｄａｔａ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ」に基づいて推定した。ＤＯＮＢ製剤を、ＦＤＡ及びＩＣＨガイドラインによる様々な温度及び湿度条件で貯蔵した。単一バッチのＤＯＮＢの安定性データを、ＳｉｇｍａＰｌｏｔバージョン１４（ＳＹＳＴＡＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析した。ナノバブルを、透明及び黄褐色バイアル中、６０％及び４０％の制御された相対湿度で、５、２５、３０、及び４０℃に置いた。特定した温度及び相対湿度での６ヶ月の後、本発明者らは、酸素濃度を測定し、それをナノバブル調製時の濃度酸素と比較する。

ＡＲＰＥ－１９及びＲ２８細胞株に対する賦形剤毒性研究。ナノバブル賦形剤での処理に応答しての、細胞生存率を、ＡＲＰＥ－１９及びＲ２８細胞株を用いて、［３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド］（ＭＴＴ）アッセイを使用して実施した。ＭＴＴ試薬（カタログ番号Ｍ６４９４，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（カタログ番号２１－０４０－ＣＶ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）当たり５ｍｇのＭＴＴを溶解することによって調製し、０．２２μｍフィルターを使用して濾過滅菌し、暗所において４℃で貯蔵した。黄色のＭＴＴは、生細胞のミトコンドリアにおいて紫色のホルマザンに還元される。細胞をＴ－２５フラスコ中で８０～９０％コンフルエンスまで増殖させ、トリプシンを使用して解離させ、１ウェル当たり１００００個の細胞の密度で９６ウェルプレート中に播種した。細胞を、３７℃でインキュベートし、２４時間接着させ、次いで、４８時間３７℃で種々の濃度の賦形剤（デキストラン、０．２～１．６％ｗ／ｖ、パルミチン酸、０．０６～０．２４％ｗ／ｖ、Ｅｐｉｋｕｒｏｎ（商標）１７０、０．０５～０．４５％ｗ／ｖ、塩化カリウム、０．００５～０．０８％ｗ／ｖ、ＴＰＧＳ、０．００５～０．０４５％ｗ／ｖ、トレハロース、０．０５～０．７％ｗ／ｖ）で処理した。対照ウェルを含めて、各ウェルに、２０μｌの試薬を添加し、４時間３７℃でインキュベートした。次いで、１５０μｌのＭＴＴ溶媒（イソプロパノール中０．１％の酸性化ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０）を各ウェルに添加し、アルミ箔で覆い、オービタルシェーカー上で１５分間攪拌した。吸光度を、６２０ｎｍのリファレンスフィルターを用いて５９０ｎｍで測定した。結果を、いかなる賦形剤もの非存在下で同時に増殖させた細胞についての対照値に対するパーセンテージとして図６に提示する。

酸素ナノバブルの細胞毒性を、網膜色素上皮（ＡＲＰＥ－１９）及び１２Ｓ Ｅ１Ａ不死化ラット網膜細胞（Ｒ２８）細胞株に対して評価した。細胞懸濁液（１００μＬ、約６００００細胞／ｍＬ）を、９６ウェルプレートの各ウェル中に播種し、一晩培養した。その結果として、培養培地を、０．０３～４ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＯＮＢ溶液を含む、新鮮な培地に置き換えた。細胞を２４時間暗所において培養した。その後、１０μＬのＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８，Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｊａｐａｎ）を含有する１００μＬの新鮮な培地を添加して、以前の培養培地を置き換え、細胞を更に４時間インキュベートした。細胞生存率を評価するために、９６ウェルプレートにおける各ウェルの吸光度を、マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで測定した。

ナノ粒子トラッキング分析。ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）（ＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を、青色レーザー光源（λ＝４８８ｎｍ）とともに使用して、ナノバブルの水力学的サイズ及び濃度を測定した。それは、２０倍倍率の顕微鏡及び高速カメラを備えた。レーザー光が粒子を打つと、散乱白斑が形成された。散乱白斑の軌跡を、高速カメラによって記録した。各々の結果を５つの測定の平均から集め、動画は６０秒間最後であり、それを２５．０フレーム／秒で捕えた。カメラレベルを通常１０に設定し、閾値を３に設定し、溶液粘度は１ＣＰであった。光学視野は固定され（およそ１００μｍ×８０μｍ）、深さであった。

ゼータ電位。電気泳動移動度及び光散乱方法を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用するゼータ電位測定のために使用した。分散技術ソフトウェアバージョン７．１３を使用して、ゼータ電位の測定及び分析を記録した。ＩＳＯ１３０９９によって提唱されるように、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉモデルを使用して、水性媒質におけるナノ粒子のゼータ電位値を計算した。ゼータ電位実験を、２５℃での１０～１００スキャンの３回のランから平均した。

デキストランナノバブル中への酸素ガスの量の測定。合計５００μＬのＤＯＮＢを、光感受性試料を保護するための米国薬局方（ＵＳＰ）タイプＩ要件に適合する２ｍｌ黄褐色血清低抽出物ホウケイ酸ガラスバイアル７×１３ｍｍに移し（カタログ＃２２３６９３ Ｗｈｅａｔｏｎ Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）た。次いで、これらのガラスバイアルを、ストレートプラグウルトラピュアストッパー７×１３ｍｍでキャップした（カタログ＃Ｗ２２４１００－４００ Ｗｈｅａｔｏｎ Ｍｉｌｌｖｉｌｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）。ウルトラピュアシールシールストッパーは、Ｗｈｅａｔｏｎクリンパー（カタログ＃Ｗ２２５７１１）を使用したオープントップラインドアルミニウムシールだった。酸素を、３０ゲージ針を取り付けたＴｅｆｌｏｎチューブを通してバイアル中に導入し、圧力を、Ｍｉｌｌｅｒ Ｓｍｉｔｈ３０－１０００－５４０Ｏｘｙｇｅｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｄｕｔｙ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒを用いて制御及び記録した。注入した酸素ガス体積によって作製された圧力を、ボイルの法則並びにバイアル及びシリンジの体積から計算した。使用したウルトラピュアストッパーを、本発明者らの研究において必要とされる最も高い圧力での漏れについて試験し、研究した少なくとも４８時間検出可能な量の酸素を放出しないことが見出された。加圧酸素ガス／ＤＮＢ分散液を３０分間室温でインキュベートした。圧力を、３０分後直ちにアルミニウムキャップを取り外すことによって解放した。酸素ガス及びカルセイン封入を室温で測定した。

封入ガスの量を、以前に報告された方法を使用して決定した（１８）。簡潔に述べると、０．８１８デキストラン／ｍＬ及び０．２９０ｍｇリン脂質／ｍＬを含有する０．５～１ｍＬのＤＯＮＢを５ｍＬシリンジ中に入れる。２方ルアーロック活栓をシリンジにつなぎ、プランジャーを押し下げることによって空気をシリンジ及び活栓から置換する。活栓を閉じ、プランジャーなしであるが３０μＬの体積の水を含有する２５０μＬシリンジをつなぐ。大シリンジのプランジャーを引き抜いて、ＤＯＮＢから酸素を放出する真空を生成する。活栓を回転させて、大及び小シリンジ胴体を接続し、ＤＮＢが底部になる（活栓から離れて）ように大シリンジを保持した後、プランジャーを押し下げて、放出された酸素を小シリンジ中に移し、ここで、周囲圧力でのその体積を３０μＬのボーラスの水の置換に従って測定する。

ラットにおける眼虚血モデルの調製。低酸素モデルを、報告された方法に従って開発した（ＪｏＶＥ２０１６，（１１３），ｅ５４０６５）。実験を、合計２４匹のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット、体重２５０～３５０ｇに対して行った。ラットを、本質的にケージ当たり２匹で１２：１２時間の明暗サイクルで収容した。周囲光レベルは平均して２９０ｌｘであり、これは、正常な光受容体密度を確実にした。ラットを、ケタミン／キシラジン／アセプロマジン、５０：１０：１．５ｍｇ／ｍｌのカクテルの腹腔内注射を用いて麻酔した。投与したカクテルの用量は、０．１ｍｌ／１００ｇラット重量であった。ケタミン０．１ｍｌ／１００ｇ、２５ｍｇ／ｍｌを使用して、麻酔を維持した。麻酔後、ラットを外科用顕微鏡下に置き、角膜に焦点を合わせる。手術用顕微鏡の下で、鉗子を使用して眼を柔らかく保持する。３０ゲージ針を、小帯線維と角膜の頂端との間のほぼ中央の前房中に穏やかに挿入、虹彩、水晶体、又は角膜内表面の引っ掻き又は突き刺しを回避し、また、角膜の複数回又は１回より多い突き刺しを回避するよう注意。針と角膜との間の圧倒される抵抗への穏やかなひねり運動、針を前房に深く挿入。外科用テープの助けを借りて、チューブをテーブルに保持する。挿入した針の動きを減少させるために、チューブをテーブルトップに対して押す。その後、手術開始時を記録する。顕微鏡を使用することによって、チェックはの漏れ、漏れが存在する、ヒプロメロースを適用する、ヒプロメロースは漏れ領域をシールする。外科用顕微鏡の助けを借りて、眼球膨張の存在を検証し、この膨張は眼圧の成功裏の上昇を実証する。眼圧はトノメーターの助けを借りて検証し、ＩＯＰを＞９０ｍｍＨｇに９０分間維持する。

眼圧測定。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの眼の眼圧（ＩＯＰ）を測定して、２週間の気候順応後のこの動物モデルにおける正常なＩＯＰを確立した。全ての測定を１週間概日リズムに起因するＩＯＰ変動を低下させるために午前１０：００～午後１２：００に行った。全ての動物の体重は２５０～３００ｇｍであり、２４匹のラットは雄性であり、２４匹は雌性であった。ＩＯＰ決定の前に、１滴の０．５％塩酸プロパラカインを各々の眼に投与した。偽性のＩＯＰの上昇を回避するために、眼は開いていたことから、瞼にストレスを及ぼさなかった。ＩＯＰを、リバウンドトノメーター（Ｉｃａｒｅ（登録商標）Ｔｏｎｏｌａｂ，Ｆｉｎｌａｎｄ Ｏｙ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して測定した。平均測定の統計的信頼性（ＳＲＡＭ）が＜５％であったときに、適切な分析の３つの自動化手段をトノメーター上に表示した。ＳＲＡＭが＞５％であった場合、別の測定を取った。標準偏差を伴う平均ＩＯＰを推定して、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙについての正常ＩＯＰの範囲を決定した。

Ｈ＆Ｅ染色。ＤＯＮＢでの治療後、眼を１２時間後に摘出し、注入体積は５μｌであり、使用したナノバブルを希釈なしであり、網膜を他所で報告された確立されたプロトコルに従って分離した。網膜損傷を評価するために、網膜層の厚さ及び細胞数をヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片に対して測定した。各切片について、網膜のデジタル化画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡ＢＸ５１（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を備えたデジタルイメージングシステムＯｌｙｍｐｕｓ Ｑ－ｃｏｌｏｒ５ＲＴＶ（５メガピクセル）を使用して、２０倍の倍率で捕えた。カメラを、Ｑ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｒｏ７ソフトウェア（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ｄｉｇｉｔａｌ ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ Ｓｕｒｒｅｙ ＢＣ Ｃａｎａｄａ）を用いて操作した。

ＤＯＮＢの細胞取り込み。Ｒ－２８及びＡＲＰＥ－１９ｃ細胞株によるＤＯＮＢ取り込みの定量化を、（図８）に与えるハイパースペクトル暗視野顕微鏡法技術を使用して実施した。イメージングのために、細胞を、正に荷電したスライド上で培養し、接着させた。２４時間後、培地を、別々に、ＤＯＮＢに置き換え、２時間３７℃でインキュベートした。次いで、スライドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。本発明者らが同定及び定量化のために使用する方法は、強化暗視野照明システム（ＣｙｔｏＶｉｖａ，Ａｕｂｕｒｎ，ＡＬ）を使用して他所で公開された本発明者らのグループによって開発されたものであった。簡潔に述べると、方法は、ハイパースペクトル暗視野画像の研究のために高度な光学及びアルゴリズムを使用して、細胞と投与した化合物との間の境界面を分析する。この非破壊的な技術は、ナノバブルの細胞内生体内分布を定量的に追跡し、蓄積パターンの正確な観察を可能にする。２時間のインキュベーション後の細胞内空間におけるＤＯＮＢの取り込み／蓄積を、数回の反復実験の後に採用した。まず、細胞におけるＤＯＮＢを同定及び定量化するために、本発明者らは、ＤＯＮＢのスペクトルライブラリを作成し、それをスペクトルライブラリフォルダ中に保存する。ＤＯＮＢ投与なしで正に荷電したスライド上で増殖させた細胞をスキャンし、対照画像として捕えた。

スペクトルデータを、ＣｙｔｏＶｉｖａソフトウェアプログラム（ＥＮＶＩ４．８及びＩＴＴ Ｖｉｓｕａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用することによって分析した。ハイパースペクトル情報を通常、Ｘ－Ｙ平面で得られた空間情報、及びＺ方向で描写されたスペクトルデータとともにデータキューブとして組み立てる（そして描写する）。画像の処理及びデータ解釈は、スペクトルライブラリを作成するために不可欠であるいくつかのステップを含んだ。スペクトルライブラリを、スキャンした標本から関心領域（ＲＯＩ）を規定することによって収集した。ＲＯＩの選択は、細胞の形態状態を最もよく描写するピクセルの選択を可能にする。必要とされる特定のスペクトルライブラリが認識されたとき、それを、他の標本のハイパースペクトル画像のその後のスペクトルマッピングのために、ＣｙｔｏＶｉｖａ ＥＮＶＩソフトウェアによってスペクトルライブラリフォルダ中に保管した。ライブラリ中に含まれる各スペクトルを、４０倍の対物レンズを用いて画像化した単一ピクセルから収集した。

最終的に、標準的なスペクトル角マッパー（ＳＡＭ）を適用して、画像のピクセルとＣｙｔｏＶｉｖａ ＥＮＶＩソフトウェアフォルダ中に保存したスペクトルライブラリピクセルとの間の類似性を推定した。ＳＡＭは、画像とスペクトルライブラリとの間の角度を測定し、それをｎ－Ｄ空間における軌道として使用することによって実行する（ここで、「ｎ」はバンドの数を表す）。保存したスペクトルライブラリと標本スペクトルとの間の角度が最小であったときに、最良のスペクトル角マッチが得られた。ＳＡＭアルゴリズムを用いて同定したＤＯＮＢの成功裏のマッピングの後、それを、Ｉｍａｇｅ ｐｒｏ ｐｒｅｍｉｅｒ ９．０ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）機械学習ツールを使用して定量化した。

実施例２．製剤の最適化（表２）
本研究は、ＤＯＮＢを調製し、硝子体内送達のためのその応用を探求するために、４因子、３レベルの統計的最適化研究を含んだ。この計画を、Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ（バージョン１１．１．１．０，Ｓｔａｔ－Ｅａｓｅ Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を使用して二次応答曲面を探索し、二次多項式モデルを構築するために使用した。実験計画のための多項式を以下のように与える。
Ｙ_０＝ｂ_０＋ｂ_１Ｘ_１＋ｂ_２Ｘ_２＋ｂ_３Ｘ_３＋ｂ_１２Ｘ_１Ｘ_２＋ｂ_１３Ｘ_１Ｘ_３
＋ｂ２３Ｘ２Ｘ３＋ｂ１１Ｘ１２＋ｂ２２Ｘ２２＋ｂ３３Ｘ３２
式中、Ｙ_０は従属変数であり、ｂ_０は切片であり、ｂ_１～ｂ_３３は、Ｙの回帰係数（観察された実験値から計算された）であり、Ｘ_１、Ｘ_２、及びＸ_３（コード化されたレベル）、これらは独立変数であり、Ｘ_ｉ、ｊ及びＸ^２ _ｉ（Ｉ、ｊ＝１、２、又は３）は、相互作用及び二次項である。デキストラン（Ｘ_１）、カリウム（Ｘ_２）、超音波出力（Ｘ_３）、及びｐＨ（Ｘ_４）のソフトウェア生成された量を使用して、ＤＮＯＢの様々なバッチを調製し、観察される応答は、酸素放出（Ｙ_１）、％サイズ（Ｙ_２）、及びゼータ電位（Ｙ_３）である。

酸素放出。酸素についての（Ｒ^２；表２は、０．９９５６であると見出され、これは、良好な適合を示す。０．９７７２の予測されたＲ^２は、０９９１４の調整されたＲ^２と合理的に一致している。適切な精度を使用して、シグナル対ノイズ比を測定し、６４．８６１であると見出され、これは、酸素放出のための適切なシグナルを示す。

ナノバブルのサイズ。相関係数の値（Ｒ^２；表２）は、０．９９８５であると見出され、これは、良好な適合を示す。０．９９３０の予測されたＲ^２は、０．９９７１の調整されたＲ^２と合理的に一致している。９２．４５８のシグナル対ノイズ比は、ナノバブルサイズの適切なシグナルを示す。

ゼータ電位。ゼータ電位について、（Ｒ^２；表２）は、０．８６８５の値を示し、これは、モデルの良好な適合を示し、０．８２０８の予測されたＲ^２は、０．８４７５の調整されたＲ^２と合理的に一致している。２５．３８１のシグナル対ノイズ比は、ＤＯＮＢのゼータ電位に適切なシグナルを示す。

モデル適合性をグラフ分析によっても確認した。それぞれの応答Ｙ_１、Ｙ_２、及びＹ_３については、図１１ａ、図１１ｂ_、及び図１１ｃを参照されたい。モデルを改善するために、適切な変換を応答データに適用し得る。この場合、本発明者らは、モデルの変換において何も使用せず、ソフトウェアもまた変換を示唆せず、これは、これらのモデルを応答評価のためにより単純にする。Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアは、Ｂｏｘ－Ｃｏｘプロットにおける最小の位置から変換に最も適切なラムダ値を推奨する。ラムダは、変換分析における応答によってなされるべき乗である。図１１ａ、図１１ｂ及び図１１ｃに示すモデルについてのＢｏｘ－Ｃｏｘプロット。応答Ｙ_１、Ｙ_２、及びＹ_３の変換についての現在のラムダは_、酸素放出、ナノバブルサイズ及びナノバブルのゼータ電位の３つの応答変数について１であった。現在のラムダは、モデルを応答の評価に適したものにする信頼区間の間に入る。これは、現在の変換が、応答データに適用され得る最良のべき乗変換であることを示す。

実施例３．最適化されたＯＮＢの結果

変化＠６時間は、６時間でのものと低点との間の酸素濃度の変化である。
％変化＠６時間は、変化＠６時間と低点との間の比率である。それは、測定の間の酸素濃度の増加を示し、これは、主にＯＮＢからの酸素放出に起因する。
酸素曲線及び対応する統計を、一連の貯蔵時間後の様々な製剤からのＯＮＢについて実施する。
表４は、０．６ｍｌのＥｐｉｋｕｒｏｎを使用したときの酸素濃度の最大変化を示し（図１６）、ここで、ＯＮＢのサイズは２１８．７１ｎｍ±５１．０５ｎｍであり、ゼータ電位は－５８．８ｍＶ±１．３ｍＶである。他の製剤において、ＯＮＢのサイズは１１９．６ｎｍ±４４．９ｎｍであり、ゼータ電位は－３５．５４ｍＶ±１０．５４ｍＶである。他の製剤において得られた後者のより小さなサイズは、０．０６重量％のＫＣｌの使用から生じる。サイズを約２００ｎｍに更に増加させるために、本発明者らは、ＫＣｌを０．０４５重量％に減少させて、より多くの酸素を含有するより大きな粒子を作った。したがって、製剤を、ＯＮＢの直径を約２００ｎｍのサイズにするために調整し得、ＯＮＢを、ＫＣｌの量に応じてより大きく又はより小さくし得る。

酸素放出、直径、ゼータ電位、更にはＯＮＢの形態及び表面特性などの種々の特性を、合成の間に制御し得る。種々の条件下での酸素の放出に対する効果については、図１７～図２２もまた参照されたい。

図１７において、好ましいＯＮＢ製剤（Ｅｐｉｋｕｒｏｎ０．６ｍｌと表示する）は、８週間貯蔵した後でさえ、対照（ＯＮＢと同じ条件で貯蔵した酸素飽和水）と比較して、酸素濃度を有意に増加させ、これは、本発明者らのＯＮＢにおける酸素の良好な貯蔵を示す。ＯＮＢのデキストランベースの多機能シェルは、４℃～室温の様々な温度での酸素貯蔵を可能にする。３７℃ででさえ、ＯＮＢは良好な酸素保持能力を示し、これは、ＯＮＢの輸送及び貯蔵に大きな利益をもたらす。貯蔵能力の他に、開示するＯＮＢは、ｐＨ４．５～ｐＨ８．３の広いｐＨ範囲で酸素を放出し、これは、種々の条件のためのＯＮＢの使用を可能にする。ＯＮＢはまた、高イオン強度溶液及び模擬硝子体液を含む、種々の媒質において著しい量の酸素を放出する。

図１８に示すように、ＯＮＢは、低酸素チャンバーにおいて溶液試料に２４時間まで連続的に酸素を提供することがわかる。この結果は、ＯＮＢなしの対照試料のものと比較してＯＮＢの添加でより高い酸素濃度が達成されることを実証する。データは、１６００分の持続時間後でさえの酸素の放出を示す。

ＯＮＢのための合成手順は、堅牢であり、大規模工業生産に適している。合成のための基材は、費用対効果が高く、アクセスが容易であり、その一方で、合成は、単純な器具を必要とし、したがって、これは、ＯＮＢの商業化を容易にする。

最適化されたＯＮＢのための合成における成分。
与えるパーセンテージは、それぞれの溶液における％として表される成分の濃度である。例えば、「ＫＣｌ０．２ｍｌ、０．０４５重量％」は、ＫＣｌ濃度が、合成において添加される０．２ｍｌのＫＣｌ溶液において０．０４５重量％であることを意味する。製剤を、主成分であるＥｐｉｋｕｒｏｎ（レシチン）、デキストラン及びトレハロースを用いて調製する（図１７）。

Ａ．「Ｅｐｉｋｕｒｏｎ０．６ｍｌ」と表示する試料
１０ｍｌの水中
ＫＣｌ：０．２ｍｌ、０．０４５重量％
Ｅｐｉｋｕｒｏｎ：０．６ｍｌ、０．２３重量％
ＴＰＧＳ：０．４ｍｌ、０．０２８重量％
デキストラン：１ｍｌ、０．９重量％
パルミチン酸：０．３ｍｌ０．１９重量％
トレハロース：０．４ｍｌ、０．４重量％。
製剤において重量％で表される成分量：
重量％
ＫＣｌ：６．９８×１０^－４重量％
Ｅｐｉｋｕｒｏｎ：１．０７×１０^－２重量％
ＴＰＧＳ：８．６８×１０^－４重量％
デキストラン：６．９８×１０^－２重量％
パルミチン酸：４．４２×１０^－３重量％
トレハロース：１．２４×１０^－２重量％
調製した他の製剤：
Ｂ．「Ｅｐｉｋｕｒｏｎ０．３ｍｌ」と表示する試料
１０ｍｌの水中
ＫＣｌ：０．２ｍｌ、０．０４５重量％
Ｅｐｉｋｕｒｏｎ：０．３ｍｌ、０．２３重量％
ＴＰＧＳ：０．４ｍｌ、０．０２８重量％
デキストラン：１ｍｌ、０．９重量％
パルミチン酸：０．３ｍｌ０．１９重量％
トレハロース：０．４ｍｌ、０．４重量％
Ｃ．「Ｅｐｉｋｕｒｏｎ１．２ｍｌ」と表示する試料
１０ｍｌの水中
ＫＣｌ：０．２ｍｌ、０．０４５重量％
Ｅｐｉｋｕｒｏｎ：１．２ｍｌ、０．２３重量％
ＴＰＧＳ：０．４ｍｌ、０．０２８重量％
デキストラン：１ｍｌ、０．９重量％
パルミチン酸：０．３ｍｌ０．１９重量％
トレハロース：０．４ｍｌ、０．４重量％
Ｄ．「デキストラン０．５ｍｌ」と表示する試料
１０ｍｌの水中
ＫＣｌ：０．２ｍｌ、０．０４５重量％
Ｅｐｉｋｕｒｏｎ：０．６ｍｌ、０．２３重量％
ＴＰＧＳ：０．４ｍｌ、０．０２８重量％
デキストラン：０．５ｍｌ、０．９重量％
パルミチン酸：０．３ｍｌ０．１９重量％
トレハロース：０．４ｍｌ、０．４重量％
Ｅ．「トレハロース０．２ｍｌ」と表示する試料
１０ｍｌの水中
ＫＣｌ：０．２ｍｌ、０．０４５重量％
Ｅｐｉｋｕｒｏｎ：０．６ｍｌ、０．２３重量％
ＴＰＧＳ：０．４ｍｌ、０．０２８重量％
デキストラン：１．０ｍｌ、０．９重量％
パルミチン酸：０．３ｍｌ０．１９重量％
トレハロース：０．２ｍｌ、０．４重量％
Ｆ．「デキストラン２．０ｍｌ」と表示する試料
１０ｍｌの水中
ＫＣｌ：０．２ｍｌ、０．０４５重量％
Ｅｐｉｋｕｒｏｎ：０．６ｍｌ、０．２３重量％
ＴＰＧＳ：０．４ｍｌ、０．０２８重量％
デキストラン：２．０ｍｌ、０．９重量％
パルミチン酸：０．３ｍｌ０．１９重量％
トレハロース：０．４ｍｌ、０．４重量％
Ｇ．「トレハロース０．８ｍｌ」と表示する試料
１０ｍｌの水中
ＫＣｌ：０．２ｍｌ、０．０４５重量％
Ｅｐｉｋｕｒｏｎ：０．６ｍｌ、０．２３重量％
ＴＰＧＳ：０．４ｍｌ、０．０２８重量％
デキストラン：１．０ｍｌ、０．９重量％
パルミチン酸：０．３ｍｌ０．１９重量％
トレハロース：０．８ｍｌ、０．４重量％

ＯＮＢの調製のためのＫＣｌ、トレハロース及びＴＰＧＳの組み合わせを、眼への投与との適合性のために製剤化した。組成の意義を以下に記載する。

塩化カリウム。他のポリマーシェル酸素ナノ／マイクロ構造とは異なり、本発明者らは、開示するＯＮＢの特性、例えば、サイズ及びゼータ電位を調整するために塩化カリウムを使用する。回転可能性中心複合計画を使用して、得られたＯＮＢのサイズ及びゼータ電位に対する塩化カリウムの影響を研究し、結果を表１、表２及び図１２～図１４に示す。これらの結果は、合成における塩化カリウムの量を変化させることによって、ＯＮＢの特性を調整する価値のある方法を提供する。負電荷に対する影響は、組織における粒子運動にとって重要である。

トレハロース及びＤ－α－トコフェロールポリ－（エチレングリコール）１０００コハク酸（ＴＰＧＳ）。ＴＰＧＳは、表面張力を低下させ、ＯＮＢの合成における自己組織化プロセスに利益をもたらす。トレハロースは、ＯＮＢ間の引力を遮蔽して、凝集を防止することによってＯＮＢの安定性を改善する。デキストランベースのＯＮＢの合成において使用するこれらの成分は、臨床使用のためのＯＮＢの特性を改善する。

特定の実施形態を、開示される実施形態及び例を参照して上記したが、そのような実施形態は例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。以下の特許請求の範囲において定義されるようなそのより広い態様の本発明から逸脱することなしに当該技術分野における通常の技術に従って変更及び改変をなし得る。

全ての刊行物、特許、及び特許文献は、あたかも個別に参照により組み込まれるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。本開示と矛盾する制限は何もそれから理解されない。本発明を、種々の具体的かつ好ましい実施形態及び技術を参照して記載した。しかし、多くの変形及び改変が、本発明の主旨及び範囲内にとどまりながらなされ得ることを理解されたい。

Claims (20)

1. 組成物であって、
   多糖ナノバブルであって、前記ナノバブルは、内部カーゴを封入する自己組織化コロイドシェルを含み、
   前記シェルは、デキストラン、トレハロース、レシチン、パルミチン酸、及びトコフェロールを含む、多糖ナノバブルと、
   電解質と、を含み、
   前記ナノバブルは、約２００ｎｍ以上の平均直径を有し、前記組成物は、０ｍＶ未満のゼータ電位を有する、組成物。
2. 前記ナノバブルの前記カーゴが、酸素ガス（Ｏ_２）を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物が、約２×１０^－２重量％～約１０×１０^－２重量％のデキストランを含む、請求項１に記載の組成物。
4. デキストランが、約１００ｋＤａ～約３００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項３に記載の組成物。
5. 前記組成物が、約０．５×１０^－２重量％～約５×１０^－２重量％のトレハロースを含む、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物が、約０．５×１０^－２重量％～約５×１０^－２重量％のレシチンを含む、請求項１に記載の組成物。
7. 前記レシチンが、ダイズレシチンである、請求項６に記載の組成物。
8. 前記組成物が、約１×１０^－３重量％～約１０×１０^－３重量％のパルミチン酸を含む、請求項１に記載の組成物。
9. 前記組成物が、約３×１０^－４重量％～約３０×１０^－４重量％のトコフェロールを含む、請求項１に記載の組成物。
10. トコフェロールが、アルファ－トコフェロールである、請求項９に記載の組成物。
11. 前記電解質が、鉱物塩を含む、請求項１に記載の組成物。
12. 前記組成物が、約２×１０^－４重量％～約２０×１０^－４重量％ｗ／ｖの鉱物塩を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記鉱物塩が、塩化カリウムである、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記ゼータ電位が、約－６５ｍＶ～約－５５ｍＶであり、前記直径が、約１６５ｎｍ～約２７０ｎｍである、請求項１に記載の組成物。
15. 前記組成物が、約６．９８×１０^－２重量％のデキストラン、約１．２４×１０^－２重量％のトレハロース、約１．０７×１０^－２重量％のレシチン、約４．４２×１０^－３重量％のパルミチン酸、約８．６８×１０^－４重量％のトコフェロールを含み、前記電解質が、約６．９８×１０^－４重量％の塩化カリウムを含む、請求項１に記載の組成物。
16. 眼虚血を治療するための方法であって、
    眼虚血のための療法を必要とする対象の虚血性眼の内部に、有効用量の請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、
    前記組成物は、酸素ガスの内部カーゴを含有する複数のナノバブルを含み、
    前記ナノバブルは、投与後に崩壊して、前記酸素を放出し、それによって前記対象における眼虚血を治療する、方法。
17. １マイクロリットルの前記ナノバブル組成物当たりの放出される酸素の量が、１分当たり少なくとも５００ナノリットルである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記有効用量が、少なくとも５マイクロリットルの前記組成物である、請求項１７に記載の方法。
19. 治療が、１つより多い有効用量を含む、請求項１６に記載の方法。
20. 前記眼虚血が、網膜低酸素である、請求項１６に記載の方法。

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