JP2023550395A - Ｎｇｆレベルを増加させる方法及び薬剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、被験者に治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を投与することを含む、成熟ＮＧＦの形成を促進する、及びＮＧＦの発現を増加させる方法に係る。本発明はまた、ＮＧＦの形成を促進し、ＮＧＦの発現を増加させるための、プラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、製品及びキットを提供する。

Description

本発明は、損傷した神経を修復するために、有効量のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物、例えばプラスミノーゲンを、それを必要とする被験者に投与することを含む、成熟ＮＧＦの形成を促進し、ＮＧＦのレベルを増加させる方法に関する。

神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）は、神経栄養因子ファミリーの中で最も重要なクラスである。神経栄養因子ファミリーには、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４／５、ニューロトロフィン－６、及びニューロトロフィン－７などが含まれ、主に最初の４つが含まれる。ＮＧＦは主に組織中に前駆体の形で存在し、顎下腺で加工されて成熟したＮＧＦを形成する。

ＮＧＦの生物学的効果は、神経に栄養を与える効果、神経を保護する効果、神経再生を促進する効果、及びその他の効果を含む。胚発生の特定の期間中、ＮＧＦはエフェクターニューロンの生存に必要である。ＮＧＦとその受容体は中枢神経系に広く分布しており、海馬と大脳皮質で生成されたＮＧＦは、コリン作動性神経を介して前脳の基底核に逆行的に輸送され、コリン作動性ニューロンの生存と機能を維持する。初期の胚発生では、中枢のＮＧＦの含有量がコリン作動性神経の密度を決定する。

ＮＧＦのエフェクターニューロンが外傷、薬物損傷、さらには虚血、低酸素などで損傷を受けると、ニューロンは死を含む一連の病理学的変化を起こす。ＮＧＦは上記の神経損傷を阻害する効果の考えられるメカニズムは次のとおりである：（１）有毒なアミノ酸の放出を阻害する；（２）カルシウムイオン過負荷を阻害する；（３）スーパーオキシドフリーラジカルの放出を阻害する；（４）アポトーシスやその他のメカニズムを阻害して、これらの二次的な病理学的損傷の発生を大幅に軽減または防止する。

軸索切断後のＮＧＦの投与は、あるいくつかのニューロンの変性と死を減らすことになり、これは間違いなく軸索再生の可能性を高めるのに役立つ。同時に、軸索再生の開始時間、再生に関与するニューロンの数、及び再生された神経の質と速度にも影響する。

さらに、ＮＧＦには他の機能もあり、例えば、ＮＧＦは免疫細胞の活動に影響を与え、それによって免疫系の機能を調節することができる。ＮＧＦは、一部の腫瘍の有糸分裂を阻害し、良性の分化を促進する。ＮＧＦは、創傷組織の修復応答を促進し、創傷治癒を促進することもできる。

本発明は研究によって、プラスミノーゲンなどのプラスミノーゲン経路活性化剤が、成熟ＮＧＦの形成を有意に促進し、ＮＧＦのレベルを増加させ、それによってニューロンの生存、分化、成長及び発達において役割を果たすことができることを発見した。

一態様では、本発明は下記のことに係る。

１、治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を被験者に投与することを含む、成熟ＮＧＦの形成を促進し、ＮＧＦレベルを増加させる方法。

２、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の神経組織におけるＰｒｏ－ＮＧＦ（神経成長因子前駆体）の切断による成熟ＮＧＦの形成及びＮＧＦの発現を促進する、項１に記載の方法。

３、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、神経組織損傷を有する被験者の神経組織における成熟ＮＧＦの形成を促進し、及び／またはＮＧＦの発現を増加させ、前記神経組織損傷が、
１）髄膜炎、脳炎、灰白髄炎、及び硬膜外膿瘍から選択されるの１つまたは複数の感染症；
２）脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、くも膜下出血、硬膜下出血及び血腫、ならびに硬膜外出血から選択される１つまたは複数の血管疾患；
３）脳または脊髄損傷、ベル麻痺、頸椎症、手根管症候群、脳または脊髄腫瘍、末梢神経障害及びギラン・バレー症候群から選択される１つまたは複数の神経構造損傷疾患；
４）頭痛、てんかん、不眠症、神経痛、不安症、及びうつ病から選択される１つまたは複数の機能障害；
５）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）、脊髄小脳失調症、及びピック病から選択される１つまたは複数の神経変性疾患；
６）脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ）、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、及び原発性側索硬化症から選択される１つまたは複数の運動ニューロン疾患；
７）脳腫瘍及び脳癌から選択される１つまたは複数の腫瘍
から選択される１つまたは複数の疾患もしくは状態によって引き起こされる、項１または２に記載の方法。

４、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、アルツハイマー病を有する被験者の神経組織におけるＰｒｏ―ＮＧＦの切断による成熟ＮＧＦの形成及びＮＧＦの発現を促進する、項１に記載の方法。

５、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、ＮＧＦレベルの増加を促進する、項１に記載の方法。

いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、被験者の損傷した神経組織における他の神経栄養因子の発現及びレベルを増加させる。いくつかの実施形態では、前記神経栄養因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ－３）、神経栄養因子４／５（ＮＴ－４／５）、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＧＤＮＦ）、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ＬＩＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ－ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１、ＩＧＦ－１）、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ）、上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）または血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）を含む。

いくつかの実施形態では、本願はまた、治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を被験者に投与することを含む、ＮＧＦ関連疾患または状態を予防または治療する方法に係る。

いくつかの実施形態では、前記ＮＧＦ関連疾患または状態は、
１）髄膜炎、脳炎、灰白髄炎及び硬膜外膿瘍のいずれかから選択される感染症；
２）脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、くも膜下出血、硬膜下出血及び血腫、ならびに硬膜外出血のいずれかから選択される血管疾患；
３）脳または脊髄損傷、ベル麻痺、頸椎症、手根管症候群、脳または脊髄腫瘍、末梢神経障害及びギラン・バレー症候群のいずれかから選択される神経構造損傷疾患；
４）頭痛、てんかん、不眠症、神経痛、不安症及びうつ病のいずれかから選択される機能障害；
５）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）、脊髄小脳失調症、及びピック病のいずれかから選択される神経変性疾患；
６）脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ）、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、及び原発性側索硬化症のいずれかから選択される運動ニューロン疾患；
７）脳腫瘍及び脳癌のいずれかから選択される腫瘍；
８）末梢神経障害、外傷による神経損傷、視神経障害、多発性神経炎、帯状疱疹、顔面神経麻痺、火傷、床ずれ、角膜潰瘍、放射線療法または化学療法による副作用
からなる群から選択されるいずれか１つを含む。

上記の全ての技術案において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の神経組織におけるプラスミノーゲンレベルを増加させる。

６、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、１つまたは複数の他の薬剤または治療方法と組み合わせて使用される、項１～５のいずれか一項に記載の方法。

７、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、静脈内、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、または点眼薬によって投与される、項１～６のいずれか一項に記載の方法。

８、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、プラスミノーゲン活性化経路の成分であり、好ましくはプラスミノーゲンである、項１～７のいずれか一項に記載の方法。

９、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、神経に栄養を与えること；神経を保護すること；神経再生を促進すること；神経損傷を阻害すること、創傷組織の修復を促進すること、及び創傷治癒を促進することから選択される１つまたは複数の用途もしくは活性を有する、項１～８のいずれか一項に記載の方法。

１０、前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つプラスミノーゲン活性を有する、項１～９のいずれか一項に記載の方法。

１１、前記プラスミノーゲンが、プラスミノーゲン活性フラグメントであり、且つプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性またはリジン結合活性を有するタンパク質である、項１～９のいずれか一項に記載の方法。

１２、前記プラスミノーゲンが、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、またはそれらの、プラスミノーゲン活性を保持した変異体から選択される、項１～９のいずれか一項に記載の方法。

１３、前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含む、項１～９のいずれか一項に記載の方法。

上記の技術案において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つまたは複数である。

いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、天然または組換えプラスミノーゲン、ヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のクリングルドメイン及び／またはプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである。いくつかの特定の実施形態では、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、天然または組み換えＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの阻害剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体である。

いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、１つまたは複数の他の薬剤及び／または治療方法と組み合わせて投与され、好ましくは、前記治療方法は、細胞療法（例えば幹細胞療法）及び遺伝子療法（例えばアンチセンスＲＮＡ、低分子スプライシング修飾子）を含む。

いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、例えばプラスミノーゲンである。いくつかの特定の実施形態において、前記プラスミノゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは有し、且つプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を有する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を付加、削除、及び／または置換され、かつプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンの活性フラグメントを含み、且つプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲンの活性フラグメントは、プラスミノーゲンセリンプロテアーゼドメインまたはプラスミノーゲンプロテアーゼドメインを含むかまたは有する。いくつかの特定の実施形態において、前記プラスミノーゲンの活性フラグメントのアミノ酸配列は、配列１４に示される。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン（ヒト全長プラスミノーゲン）、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン（７６～７７番目のアミノ酸の間で切断されたヒト全長プラスミノーゲン）、ミニプラスミノーゲン（クリングル５（Ｋ５）及びセリンプロテアーゼドメインを含む）、マイクロプラスミノーゲン（セリンプロテアーゼドメインを含む）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン（クリングル１及びセリンプロテアーゼドメインを含む）、またはプラスミノーゲン活性を保持したそれらの変異体から選択される。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、ヒト全長プラスミノーゲン、またはプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を依然として保持したその変異体もしくはフラグメントである。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。

いくつかの実施形態では、本発明はまた下記のことに係る。

１、一態様では、本願は、被験者の神経組織において成熟ＮＧＦの形成を促進する、及び／またはＮＧＦのレベルを増加させるための、プラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物に関する。一態様では、本願はまた、被験者の神経組織において成熟ＮＧＦの形成を促進する、及び／またはＮＧＦのレベルを増加させるための薬剤の調製におけるプラスミノーゲン経路活性化剤の使用に関する。

２、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の神経組織における成熟ＮＧＦの形成を促進し、及び／またはＮＧＦの発現を増加させる、項１に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

３、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の神経組織における他の神経栄養因子の発現及びレベルを増加させる、項１または２に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

４、前記神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ－３）、神経栄養因子４／５（ＮＴ－４／５）、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＧＤＮＦ）、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ＬＩＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ－ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１、ＩＧＦ－１）、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ）、上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）または血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）を含む、項３に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

５、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、神経に栄養を与えること、神経を保護すること、神経再生を促進すること、神経損傷を阻害すること、創傷組織の修復を促進すること、及び創傷治癒を促進することから選択される１つまたは複数の用途もしくは活性を有する、項１～４のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

６、前記被験者が、神経または脳組織の損傷を患っている被験者であり、前記神経または脳組織の損傷が、
１）髄膜炎、脳炎、灰白髄炎、及び硬膜外膿瘍から選択されるの１つまたは複数の感染症；
２）脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、くも膜下出血、硬膜下出血及び血腫、ならびに硬膜外出血から選択される１つまたは複数の血管疾患；
３）脳または脊髄損傷、ベル麻痺、頸椎症、手根管症候群、脳または脊髄腫瘍、末梢神経障害及びギラン・バレー症候群から選択される１つまたは複数の神経構造損傷疾患；
４）頭痛、てんかん、不眠症、神経痛、不安症、及びうつ病から選択される１つまたは複数の機能障害；
５）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）、脊髄小脳失調症、及びピック病から選択される１つまたは複数の神経変性疾患；
６）脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ）、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、及び原発性側索硬化症から選択される１つまたは複数の運動ニューロン疾患；
７）脳腫瘍及び脳癌から選択される１つまたは複数の腫瘍
から選択される１つまたは複数の疾患もしくは状態によって引き起こされる、項１～５のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

７、ＮＧＦ関連疾患または状態を予防または治療するためのプラスミノーゲン経路活性化剤、または前記プラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、またはＮＧＦ関連疾患または状態の予防または治療のための薬剤の調製におけるプラスミノーゲン経路活性化剤の使用。

８、前記ＮＧＦ関連疾患または状態が、
１）髄膜炎、脳炎、灰白髄炎及び硬膜外膿瘍のいずれかから選択される感染症；
２）脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、くも膜下出血、硬膜下出血及び血腫、ならびに硬膜外出血のいずれかから選択される血管疾患；
３）脳または脊髄損傷、ベル麻痺、頸椎症、手根管症候群、脳または脊髄腫瘍、末梢神経障害及びギラン・バレー症候群のいずれかから選択される神経構造損傷疾患；
４）頭痛、てんかん、不眠症、神経痛、不安症及びうつ病のいずれかから選択される機能障害；
５）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）、脊髄小脳失調症、及びピック病のいずれかから選択される神経変性疾患；
６）脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ）、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、及び原発性側索硬化症のいずれかから選択される運動ニューロン疾患；
７）脳腫瘍及び脳癌のいずれかから選択される腫瘍；
８）末梢神経障害、外傷による神経損傷、視神経障害、多発性神経炎、帯状疱疹、顔面神経麻痺、火傷、床ずれ、角膜潰瘍、放射線療法または化学療法による副作用
からなる群から選択されるいずれか１つを含む、項７に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、医薬組成物、または使用。

９、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の損傷した神経組織におけるプラスミノーゲンレベルを増加させる、項１～８のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

１０、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、１つまたは複数の他の薬剤または治療方法と組み合わせて使用される、項１～９のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

１１、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、静脈内、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、または点眼薬によって投与される、項１～１０のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

１２、前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つまたは複数である、項１～１１のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

１３、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、天然または組換えプラスミノーゲン、ヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のクリングルドメイン及び／またはプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである、請求項１２に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

１４、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、天然または組み換えＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの拮抗剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体である、項１２に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

１５、前記プラスミノーゲン経路活性化剤がプラスミノーゲンである、項１～１３のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

１６、前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を有する、項１５に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

１７、前記プラスミノーゲンが、
１）配列１４に示されるものを有するセリンプロテアーゼドメイン；
２）配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、タンパク質分解活性を保持するセリンプロテアーゼドメイン；
３）クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４及びクリングル５から選択される１つまたは複数のクリングルドメイン；及び
４）クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４及びクリングル５のうちの１つまたは複数と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、リジン結合活性を保持するクリングルドメイン
から選択される１つまたは複数を含む、項１５に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

１８、前記プラスミノーゲンが、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、またはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択される、項１５に記載のプラスミノーゲン経路活性化剤、またはプラスミノーゲン経路活性化剤を含む医薬組成物、または使用。

いくつかの特定の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は全身または局所にて投与され、例えば、静脈内、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、または点眼薬によって投与される。いくつかの実施形態では、前記被験者はヒトである。いくつかの実施形態では、前記被験者は、プラスミノーゲンが不足、または欠乏している。いくつかの実施形態において、前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である。いくつかの実施形態では、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１～８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１～６００ｍｇ／ｋｇ、０．１～４００ｍｇ／ｋｇ、１～２００ｍｇ／ｋｇ、１～１００ｍｇ／ｋｇ、１０～１００ｍｇ／ｋｇ（体重１キロあたりで計算）または０．０００１～２０００ｍｇ／ｃｍ^２、０．００１～８００ｍｇ／ｃｍ^２、０．０１～６００ｍｇ／ｃｍ^２、０．１～４００ｍｇ／ｃｍ^２、１～２００ｍｇ／ｃｍ^２、１～１００ｍｇ／ｃｍ^２、１０～１００ｍｇ／ｃｍ^２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量で、毎日、２日おき、または３日おきに連続して投与される。

一態様では、本出願はまた、上記のプラスミノーゲンなどの上記のプラスミノーゲン経路活性化剤を含む、上記の方法で使用される医薬組成物、薬剤、製剤、キット、及び製品にも関する。

いくつかの実施形態では、前記医薬組成物、薬剤、製剤は、薬学的に許容される担体及びプラスミノーゲン経路活性化剤、例えばプラスミノーゲン活性化経路の成分、例えばプラスミノーゲンを含む。いくつかの実施形態では、前記キット及び製品は、前記医薬組成物、薬剤、または製剤を含む１つまたは複数の容器を含む。いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、プラスミノーゲン経路活性化剤、例えばプラスミノーゲン活性化経路の成分、例えばプラスミノーゲンを上記の方法に使用することを指示する、ラベルまたはプロトコルをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、１つまたは複数の他の薬剤を含む、別の１つまたは複数の容器をさらに含む。

一態様では、本出願はまた、上記のプラスミノーゲンなど、上記の用途に使用するためのプラスミノーゲン経路活性化剤にも関する。

一態様では、本出願はまた、上述の方法に使用するための医薬組成物、薬剤、製剤、キット、及び製品の調製における、治療有効量の上記のプラスミノーゲン経路活性化剤の使用に関する。

いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つまたは複数である。

いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性化経路の成分は、プラスミノーゲン、組換えヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のクリングルドメイン及びプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである。いくつかの特定の実施形態では、前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの阻害剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体である。

いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、１つまたは複数の他の薬剤及び／または治療方法と組み合わせて投与され、好ましくは、前記治療方法は、細胞療法（例えば幹細胞療法）及び遺伝子療法（例えばアンチセンスＲＮＡ、低分子スプライシング修飾子）を含む。

いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン経路活性化剤は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、例えばプラスミノーゲンである。いくつかの特定の実施形態において、前記プラスミノゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むかまたは有し、且つプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を有する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を付加、削除、及び／または置換され、かつプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンの活性フラグメントを含み、且つプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質である。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲン活性は、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性である。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲンの活性フラグメントは、プラスミノーゲンセリンプロテアーゼドメインまたはプラスミノーゲンプロテアーゼドメインを含むかまたは有する。いくつかの特定の実施形態において、前記プラスミノーゲンの活性フラグメントのアミノ酸配列は、配列１４に示される。いくつかの特定の実施形態では、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン（ヒト全長プラスミノーゲン）、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン（７６～７７番目のアミノ酸の間で切断されたヒト全長プラスミノーゲン）、ミニプラスミノーゲン（クリングル５（Ｋ５）及びセリンプロテアーゼドメインを含む）、マイクロプラスミノーゲン（セリンプロテアーゼドメインを含む）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン（クリングル１及びセリンプロテアーゼドメインを含む）、またはプラスミノーゲン活性を保持したそれらの変異体から選択される。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、ヒト全長プラスミノーゲン、またはプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を依然として保持したその変異体もしくはフラグメントである。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を保持した変異体若しくはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンである。

いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤、例えばプラスミノーゲン活性化経路の成分、例えばプラスミノーゲンは、１つまたは複数の他の薬剤及び／または治療方法と組み合わせて使用される。いくつかの特定の実施形態において、前記プラスミノーゲン経路活性化剤、例えばプラスミノーゲン活性化経路の成分、例えばプラスミノーゲンは、静脈内、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、または点眼薬によって投与される。

いくつかの実施形態では、前記医薬組成物、薬剤、製剤は、薬学的に許容される担体及びプラスミノーゲン経路活性化剤、例えばプラスミノーゲン活性化経路の成分、例えばプラスミノーゲンを含む。いくつかの実施形態では、前記キット及び製品は、前記医薬組成物、薬剤、または製剤を含む１つまたは複数の容器を含む。いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、プラスミノーゲン経路活性化剤、例えばプラスミノーゲン活性化経路の成分、例えばプラスミノーゲンを上記の用途に使用することを指示する、ラベルまたはプロトコルをさらに含む。

いくつかの実施形態では、前記キットまたは製品は、１つまたは複数の他の薬剤を含む、別の１つまたは複数の容器をさらに含む。

本発明は、本発明の実施形態に属する技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、これらの組み合わせ後の技術構成は、上記の技術構成が別個に明確に開示されたのと同様に、本出願において明確に開示された。さらに、本発明はまた、各実施形態とそれらの要素との間の組み合わせを明確にカバーし、組み合わせ後の技術構成は、本明細書に明確に開示されている。

図１Ａ～Ｂは、プラスミノーゲン投与後のＳＭＡマウスの代表的脳組織のウエスタンブロット検出結果及びＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ光学密度（ＯＤ）値の定量分析結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脳組織には一定のＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ比があり、投与群のマウスの脳組織のＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ比は溶媒群のマウスよりも有意に高く、しかも統計的差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＡモデルマウスの脳組織においてＰｒｏ－ＮＧＦからＮＧＦへの変換を促進し、成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。 図２Ａ～Ｂは、正常マウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウエスタンブロットの画像であり、ＢはウエスタンブロットにおけるＰｒｏ－ＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果であり、ＣはウエスタンブロットにおけるＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＮＧＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であり（＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、プラスミノーゲン投与群のＮＧＦ量は溶媒対照群より有意に高く、その差は有意であった。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。 図３Ａ～Ｃは、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおける組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦに対するプラスミノーゲンの効果を示す図である。Ａはウエスタンブロットの画像であり、ＢはウエスタンブロットにおけるＰｒｏ－ＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果であり、ＣはウェスタンブロットにおけるＮＧＦバンドの光学密度（ＯＤ）値の分析結果である。その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＮＧＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＮＧＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、組換えヒトＰｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。 図４Ａ～Ｄは、プラスミノーゲン投与後のＳＭＡマウスの脊髄組織のＮＧＦ免疫組織化学染色の結果を示す図である。その結果、投与群におけるＮＧＦの発現レベルが溶媒群よりも有意に高く、しかもその統計的差が有意であった（Ｐ＜０．０５）ことが示されている。 プラスミノーゲン持続投与後、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脳組織中のプラスミノーゲン含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。その結果、ブランク対照群の野生型マウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが１．１８±１．５４ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが１．４９±１．５９ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して、溶媒群のマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルは有意に変化しなかった；投与群のＳＭＡトランスジェニックマウスのプラスミノーゲンのレベルは１２．０９±５．３２ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約８倍であった。これは、プラスミノーゲンを補給すると、ＳＭＡ疾患条件下でプラスミノーゲンに対する血液脳関門の透過性が増加し、プラスミノーゲンが血液脳関門を通過して脳に到達できることを示唆している。 プラスミノーゲン持続投与後、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡ脊髄組織中のプラスミノーゲン含有量をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。その結果、ブランク対照群の野生型マウスにおける脊髄プラスミノーゲンのレベルが８．５１±９．５１ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のＳＭＡトランスジェニックマウスの脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルは１９．９５±４．０６ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群よりわずかに高かった。正常投与対照群のプラスミノーゲンレベルは１３．０３±７．５１ｎｇ／ｍｇであった。投与群のＳＭＡトランスジェニックマウスの脊髄プラスミノーゲンレベルは６２．３３±１７．３７ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群マウスの約３倍であり、投与群と溶媒群の比較統計解析Ｐ値は０．０２９であり、正常投与対照群の約４．８倍であり、投与群と正常投与対照群の比較統計解析Ｐ値は０．０２６であった。これは、プラスミノーゲンの投与が、ＳＭＡの条件下でプラスミノーゲンに対する血液脊髄関門の透過性の増加を促進し、プラスミノーゲンが血液脊髄関門を通過して脊髄に到達できることを示している。 ＬＰＳによって誘発された肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにおけるプラスミノーゲンの単一尾静脈注射の２時間後、脊髄ホモジネートプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡで検出した結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄組織ホモジネート中のプラスミノーゲンのレベルが２．７０±０．７４ｎｇ／ｍｇであり、ＬＰＳの気管注入後、溶媒群のマウスの脊髄組織ホモジネート中のプラスミノーゲンのレベルは３．１７±１．５１ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して有意な変化はなかった；投与群のマウスに生理的用量レベルの２．５倍のプラスミノーゲンを補充した後、プラスミノーゲンのレベルは１２１．１６±４４．６８ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約３８．２倍であった。これは、プラスミノーゲンを補充すると、ＬＰＳによって誘発された肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにおいて、プラスミノーゲンに対する血液脊髄関門の透過性の増加を促進し、この条件下では、プラスミノーゲンが血液脊髄関門を通過して中枢神経系に入ることができることを示唆している。 ＬＰＳによって誘発された肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにおけるプラスミノーゲンの単一尾静脈注射の２時間後、脊髄ホモジネートプラスミノーゲンレベルを酵素基質動態法で検出した結果を示す図である。その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄組織におけるプラスミノーゲンのレベルは０．０００１１±４．５１ｘ１０^－５Ｕ／ｍｇであった；ＬＰＳの気管注入後、溶媒群マウスの脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルは０．０００１０±９．７２×１０^－６Ｕ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して有意な変化はなかった；投与群のマウスに生理的用量レベルの２．５倍のプラスミノーゲンを補充した後、プラスミノーゲンのレベルは０．０００３４±１．０４×１０^－４Ｕ／ｍｇに上昇し、溶媒群と比較して、統計解析のＰ値は０．０５８であった。これは、プラスミノーゲンを補充すると、ＬＰＳによって誘発された肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにおいて、プラスミノーゲンに対する血液脊髄関門の透過性の増加を促進し、プラスミノーゲンが血液脊髄関門を通過して脊髄に蓄積できることを示唆している。 ＬＰＳによって誘発された肺炎マウスにおけるプラスミノーゲンの単一尾静脈注射の２時間後、脊髄ホモジネートプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡで検出した結果を示す図である。脊髄組織ホモジネート中のプラスミノーゲンレベルをＥＬＩＳＡで検出した結果、ブランク対照群の脊髄組織のＰｌｇ含有量は７．７１±０．５１ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群マウスの脊髄組織のＰｌｇ含有量は１４．０４±３．２５ｎｇ／ｍｇであり、ＬＰＳの気管注入後、マウスの脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルは増加した；投与Ａ群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹あたり約１ｍｇ）のプラスミノーゲンを投与した後、脊髄組織中のプラスミノーゲンのレベルは８５．１０±１１．５９ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約６．１倍であり、投与Ｂ群のマウスに１７ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹あたり約０．３４ｍｇ）のプラスミノーゲンを投与した後、脊髄組織中のプラスミノーゲンのレベルは７７．９０±２１．３９ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約５．５倍であった；投与Ｃ群のマウスに６ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹あたり約０．１ｍｇ）のプラスミノーゲンを投与した後、脊髄組織中のプラスミノーゲンのレベルは６４．００±１９．６３ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約４．６倍であった。これは、１）プラスミノーゲンを補充すると、ＬＰＳによって誘発された肺炎マウスにおいて、プラスミノーゲンに対する血液脳関門の透過性の増加を促進し、プラスミノーゲンが血液脳関門を通過して脊髄組織に蓄積できること；２）脊髄におけるリシノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、６ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で、脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮レベルは、投与されるプラスミノーゲンの用量の増加とともに増加することを示唆している。 Ｃ５７肺炎モデルマウスへのプラスミノーゲンの尾静脈注射後の異なる時点での脊髄組織ホモジネート中のヒトプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。その結果、偽手術＋溶媒群及びＬＰＳ＋溶媒群のマウスはプラスミノーゲン注射を受けず、０、２、６、１２及び２４時間で脊髄組織ホモジネート中にヒトプラスミノーゲンが検出されなかった。偽手術＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群及びＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重のプラスミノーゲンを注射したところ、注射２時間後の脊髄組織ホモジネート中のヒトプラスミノーゲンはいずれも有意に増加し、注射の６～１２時間後にプラスミノーゲンのレベルは有意に減少し、２４時間にはヒトプラスミノーゲンは基本的に検出できなくなった。ＬＰＳ＋６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群のマウスに６ｍｇ／ｋｇ体重のプラスミノーゲンを注射すると、注射２時間後の脊髄組織ホモジネートで検出されたプラスミノーゲンのレベルは、ＬＰＳ＋溶媒群のマウスよりも有意に高く、ＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群マウスよりも有意に低かった。この結果は、１）生理学的及び病理学的条件下でプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンが血液脳関門を通過し、脊髄組織に蓄積するのを促進することができること；２）正常なマウスにプラスミノーゲンを静脈内注射すると、脊髄組織におけるプラスミノーゲンのレベルが有意に増加すること；３）脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されること；４）脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、用量が高いほど、脊髄組織におけるプラスミノーゲンのレベルが高くなることを示唆している。 Ｃ５７肺炎モデルマウスにおけるプラスミノーゲンの尾静脈注射後、異なる時点での脳組織ホモジネート中のプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。その結果、ブランク＋溶媒群マウス及びＬＰＳ＋溶媒群のマウスはプラスミノーゲン注射を受けず、０、２、６、１２及び２４時間で脳組織ホモジネート中にヒトプラスミノーゲンが検出されなかった。ブランク＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群及びＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重のプラスミノーゲンを注射したところ、注射２時間後に脳組織ホモジネート中にヒトプラスミノーゲンはいずれも有意に増加し、注射の６～１２時間後にプラスミノーゲンのレベルは有意に減少し、２４時間にはヒトプラスミノーゲンは基本的に検出できなくなった。ＬＰＳ＋６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群のマウスに６ｍｇ／ｋｇ体重のプラスミノーゲンを注射すると、注射２時間後の脳組織ホモジネートで検出されたプラスミノーゲンのレベルは、ＬＰＳ＋溶媒群のマウスよりも有意に高く、ＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群マウスよりも有意に低かった。この結果は、１）生理学的及び病理学的条件下でプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンが血液脳関門を通過し、脳組織に蓄積するのを促進することができること；２）正常なマウスにプラスミノーゲンを静脈内注射すると、脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが有意に増加すること；３）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されること；４）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、用量が高いほど、脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが高くなることを示唆している。 ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスへのプラスミノーゲンの尾静脈注射後の異なる時点での脊髄組織ホモジネート中のヒトプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄のＥＬＩＳＡ検出の結果、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄のプラスミノーゲンのレベルが、５０ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇのプラスミノーゲンの尾静脈注射後に有意に増加し、５０ｍｇ／ｋｇ投与群ではプラスミノーゲンのレベルが６ｍｇ／ｋｇ投与群よりも有意に高かった。プラスミノーゲンのレベルは投与２時間後から徐々に減少し、１２～２４時間でほぼ完全に代謝された。 この結果は、１）生理学的用量レベルでプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンがＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの血液脳関門を通過し、脊髄組織に蓄積することができること；２）脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、投与されるプラスミノーゲンの用量が高いほど、より濃縮されること；３）脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されることを示唆している。 ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスへのプラスミノーゲンの尾静脈注射後の異なる時点での脳組織ホモジネート中のプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脳におけるＥＬＩＳＡレベル検出の結果、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルは、５０ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲンの尾静脈注射後に有意に増加し、５０ｍｇ／ｋｇ投与群のプラスミノーゲンのレベルは、６ｍｇ／ｋｇ投与群よりも有意に高かった。プラスミノーゲンは投与２時間後から徐々に減少し、１２～２４時間でほぼ完全に代謝された。この結果は、１）生理学的用量レベルでプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンがＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの血液脳関門を通過し、脳組織に蓄積することができること；２）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、投与されるプラスミノーゲンの用量が高いほど、より濃縮されること；３）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されることを示唆している。 ＦＡＤマウスへのプラスミノーゲンの尾静脈注射後の異なる時点での脊髄組織ホモジネート中のプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。脊髄組織ホモジネートのＥＬＩＳＡ検出の結果、ＦＡＤマウスの脊髄組織のプラスミノーゲンのレベルが、５０ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇのプラスミノーゲンの尾静脈注射後に有意に増加し、５０ｍｇ／ｋｇ投与群ではプラスミノーゲンのレベルが６ｍｇ／ｋｇ投与群よりも有意に高かった。プラスミノーゲンは投与２時間後から徐々に減少し、１２～２４時間でほぼ完全代謝された。この結果は、１）生理学的用量レベルでプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンがＦＡＤマウスの血液脳関門を通過し、脊髄組織に蓄積することができること；２）脊髄組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、投与されるプラスミノーゲンの用量が高いほど、より濃縮されること；３）脊髄組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されることを示唆している。 ＦＡＤマウスへのプラスミノーゲンの尾静脈注射後の異なる時点での脳組織ホモジネート中のプラスミノーゲンレベルのＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す図である。脳組織ホモジネートのＥＬＩＳＡレベルの検出の結果、ＦＡＤマウスの脳組織のプラスミノーゲンのレベルが、５０ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇのプラスミノーゲンの尾静脈注射後に有意に増加し、５０ｍｇ／ｋｇ投与群ではプラスミノーゲンのレベルが６ｍｇ／ｋｇ投与群よりも有意に高かった。プラスミノーゲンは投与２時間後から徐々に減少し、１２～２４時間でほぼ完全代謝された。この結果は、１）生理学的用量レベルでプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンがＦＡＤマウスの血液脳関門を通過し、脳組織に蓄積することができること；２）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、投与されるプラスミノーゲンの用量が高いほど、より濃縮されること；３）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されることを示唆している。

発明の詳細な説明

線維素溶解系（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）は、線溶系とも呼ばれ、線維素溶解（線溶）の過程に関与する一連の化学物質からなる系であり、主にプラスミノーゲン（ＰＬＧ）、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子、及び線維素溶解阻害剤を含む。プラスミノーゲン活性化因子には、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）、及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）が含まれる。ｔ－ＰＡはセリンプロテアーゼであり、血管内皮細胞によって合成される。ｔ－ＰＡはプラスミノーゲンを活性化し、このプロセスは主にフィブリンで行われる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕ－ＰＡ）は、尿細管上皮細胞と血管内皮細胞によって産生され、補因子としてフィブリンを必要とすることなくプラスミノーゲンを直接活性化することができる。プラスミノーゲン（ＰＬＧ）は肝臓で合成される。血液が凝固すると、ＰＬＧはフィブリンネットに大量に吸着され、ｔ－ＰＡまたはｕ－ＰＡの作用によりプラスミンに活性化されてフィブリン溶解を促進する。プラスミナーゼ（ＰＬ）はセリンプロテアーゼであり、フィブリンとフィブリノーゲンを分解し、様々な凝固因子Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＩＩなどを加水分解し、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、補体を加水分解するなどの作用がある。線維素溶解阻害剤には、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ）、及びα２－抗チプラスミン（α２－ＡＰ）が含まれる。ＰＡＩには主にＰＡＩ－１とＰＡＩ－２の２つの形態があり、ｔ－ＰＡに１：１の比率で特異的に結合することによってｔ－ＰＡを不活性化すると同時にＰＬＧを活性化することができる。α２－ＡＰは肝臓で合成され、ＰＬと１：１の比率で結合して複合体を形成し、それによってＰＬ活性を阻害する。ＦＸＩＩＩはα２－ＡＰをフィブリンと共有結合させ、それによってＰＬに対するフィブリンの感受性を弱める。インビボでの線維素溶解系の活性を阻害する物質としては、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンが挙げられる。

本明細書で使用される「プラスミノーゲン経路活性化剤」または「ＰＬＧ経路活性化剤」という用語は、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤をカバーする。

本明細書で使用される「プラスミノーゲン活性化経路の成分」または「ＰＬＧ活性化経路の成分」という用語は、
１、プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体；
２、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
３、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、ｔＰＡ及びｕＰＡ、ならびにｔＰＡまたはｕＰＡの１つ以上のドメイン（１つ以上のクリングルドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど）を含むｔＰＡまたはｕＰＡ変異体及び類縁体をカバーする。

前記「線維素溶解阻害剤の拮抗剤」という用語は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの拮抗剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体をカバーする。

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を付加、削除、及び／または置換されてかつ依然としてプラスミノーゲン活性、プラスミン活性、ｔＰＡまたはｕＰＡ活性を有するタンパク質を含む。例えば、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」は、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個の保存的アミノ酸によって置換されて得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。

本発明の「プラスミノゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性をするアミノ酸配列を含むかまたは有し、且つプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質をカバーする。例えば、本発明の「プラスミノーゲン変異体」は、配列２、６、８、１０または１２に基づいて、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を付加、削除、及び／または置換し、且つ依然としてプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を有するタンパク質であり得る。具体的には、本発明のプラスミノーゲン変異体は、すべての天然に存在するヒトの遺伝的変異体及びこれらのタンパク質の他の哺乳動物型、並びに、例えば、１～１００、１～９０、１～８０、１～７０、１～６０、１～５０、１～４５、１～４０、１～３５、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、１～４、１～３、１～２、１個のアミノ酸を保存的置換によって得られるこれらのタンパク質の突然変異体を含む。

本発明のプラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を保持した変異体、例えば、配列２、６、８、１０または１２に示されるプラスミノーゲン、例えば、配列２に示されるヒト天然プラスミノーゲンであり得る。

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「類縁体」はそれぞれ、プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果を与える化合物を含む。

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のドメイン（例えば、１つ以上のクリングルドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡ及びｕＰＡの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。例えば、プラスミノーゲンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミノーゲンドメイン（例えば、１つ以上のクリングル（ｋ）ドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン（またはセリンプロテアーゼドメイン、またはプラスミノーゲンプロテアーゼドメインと呼ばれる））を含むプラスミノーゲン変異体及び類縁体、例えば、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）をカバーする。プラスミンの「変異体」及び「類縁体」は、１つ以上のプラスミンドメイン（例えば、１つまたは複数のクリングルドメイン及びタンパク質加水分解ドメイン）を含むミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）やδ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）などのプラスミンの「変異体」及び「類縁体」をカバーする。

上記プラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの「変異体」または「類縁体」がそれぞれプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡの活性を有するかどうか、またはそれらがプラスミノーゲン、プラスミン、ｔＰＡまたはｕＰＡと実質的に同様の効果をそれぞれ与えるかどうかは、当技術分野で知られている方法、例えば、ザイモグラフィー（ｅｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）及びＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング法）を使用して、活性化されたプラスミン活性のレベルによって測定できる。例えば、次の文献に記載されている方法を参照して測定することができる。Ｎｙ，Ａ．，Ｌｅｏｎａｒｄｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｈａｇｇｌｕｎｄ，Ａ．Ｃ，Ｈａｇｇｌｏｆ，Ｐ．，Ｐｌｏｐｌｉｓ，Ｖ．Ａ．，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ． ａｎｄ Ｎｙ，Ｔ． （１９９９）． Ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４０，５０３０－５０３５；Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ ＲＬ， Ｌｅｕｎｇ ＬＬ， Ｈａｒｐｅｌ ＰＣ， Ｎａｃｈｍａｎ ＲＬ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９８４）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ”． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７４ （５）： １６２５－３３；Ｇｒａｖａｎｉｓ Ｉ， Ｔｓｉｒｋａ ＳＥ （Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８）． “Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ”． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ． １２ （２）： １５９－７０；Ｇｅｉｇｅｒ Ｍ， Ｈｕｂｅｒ Ｋ， Ｗｏｊｔａ Ｊ， Ｓｔｉｎｇｌ Ｌ， Ｅｓｐａｎａ Ｆ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ， Ｂｉｎｄｅｒ ＢＲ （Ａｕｇ １９８９）． “Ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ”． Ｂｌｏｏｄ． ７４ （２）： ７２２-８。

本発明の一部の実施形態において、本発明の「プラスミノーゲン活性化経路の成分」はプラスミノーゲンであり、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ－プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体から選択される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、または依然としてプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、または依然としてプラスミノーゲン活性及び／またはリジン結合活性を保持した保存的突然変異体若しくはそのフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は、配列２、６、８、１０または１２に示されるようなアミノ酸配列を含むかまたは有する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト全長プラスミノーゲンである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２に示されるヒト全長プラスミノーゲンである。

「プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる化合物」とは、プラスミノーゲンを直接活性化できる、若しくはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによってプラスミノーゲンを間接に活性化できる任意の化合物を指し、例えば、ｔＰＡ、ｕＰＡ、ストレプトキナーゼ、サルプラーゼ、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、ラノテプラーゼ、パミテプラーゼ、及びスタフィロキナーゼが挙げられる。

本発明の「線維素溶解阻害剤の拮抗剤」は、線維素溶解阻害剤の作用に拮抗し、その作用を弱め、遮断し、阻止する化合物である。前記線維素溶解阻害剤は、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミン、及びα２－マクログロブリンである。前記拮抗剤は、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの抗体、または、例えばＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの発現を遮断またはダウンレギュレートするアンチセンスＲＮＡもしくはミニＲＮＡ、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの結合部位を占めるが、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンまたはα２－マクログロブリンの機能を持たない化合物、または、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２－抗プラスミンもしくはα２－マクログロブリンの結合ドメイン及び／または活性ドメインをブロックする化合物である。

プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ－ＭＭＰｓ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡｓの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳格な調節を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２－抗プラスミン（α２－ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－１（ＰＡＩ－１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノーゲン活性化剤阻害剤－２（ＰＡＩ－２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある。

プラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸－プラスミノゲン（Ｇｌｕ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン－プラスミノゲン（Ｌｙｓ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌され及び分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ－末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸－プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸－プラスミノゲンはＬｙｓ７６－Ｌｙｓ７７においてリジン－プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸－プラスミノゲンと比較して、リジン－プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡsによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０－Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡまたはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって連結された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同三環を含み、即ちいわゆるクリングルであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のクリングルはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２－ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたプラスミノゲンは３８ｋＤａのフラグメントであり、クリングルｌ－４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンギオスタチン（Angiostatin）と命名され、幾つかのプロテアーゼによりプラスミノゲンを加水分解することによって生成される。

プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理性血栓の形成を予防するキーポイントである。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらの成分はラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している。間接的に、プラスミンはさらにＭＭＰ－１、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３及びＭＭＰ－９を含むいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解する。そのため、プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子であることを提唱することがある。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する。インビトロで、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。

「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解する。

「プラスミノーゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドを含む天然ヒト由来プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）として計算すれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのクリングルドメイン（クリングル１－５）を含む。ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１－Ｇｌｙ１９を含み、ＰＡｐは残基Ｇｌｕ２０－Ｖａｌ９８を含み、クリングル１は残基Ｃｙｓ１０３－Ｃｙｓ１８１を含み、クリングル２は残基Ｇｌｕ１８４－Ｃｙｓ２６２を含み、クリングル３は残基Ｃｙｓ２７５－Ｃｙｓ３５２を含み、クリングル４は残基Ｃｙｓ３７７－Ｃｙｓ４５４を含み、クリングル５は残基Ｃｙｓ４８１－Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１－Ａｒｇ８０４を含む。

Ｇｌｕ－プラスミノーゲンは天然のフルサイズのプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。生体内において、さらにＧｌｕ－プラスミノーゲンの７６－７７番目のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ－プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。Ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン（δ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにクリングル２－クリングル５構造が欠損したフラグメントであり、クリングル１及びセリンプロテアーゼ（構造）ドメインしか含有せず（プロテアーゼドメイン、またはプラスミノーゲンプロテアーゼドメインとも呼ばれる）、δ－プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はクリングル５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）を含みそのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りであることを報告している文献がある。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３－Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）を含むことを報告している文献があり、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはその配列が残基Ｌｙｓ５３１－Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ－プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列について、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。

本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。

本願において、前記プラスミノーゲンの「不足」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。前記プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。

当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションをとるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ－二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションに維持する重要なエピトープを含み、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などを含む。

本出願における「プラスミノーゲンの活性フラグメント」には、１）プラスミノーゲンタンパク質において、クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４、及び／またはクリングル５を含むフラグメントなどのリジン結合フラグメントとしても知られる、基質中の標的配列に結合することができる活性フラグメント（前記プラスミノーゲンの構造について、Ａｉｓｉｎａ Ｒ Ｂ，Ｍｕｋｈａｍｅｔｏｖａ Ｌ Ｉ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／ｐｌａｓｍｉｎ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，４０（６）：５９０－６０５を参照されたい）；２）配列１４に示されるプラスミノーゲン活性（タンパク質加水分解機能）を含むフラグメントなど、プラスミノーゲンタンパク質においてタンパク質加水分解機能を果たす活性フラグメント；３）プラスミノーゲンタンパク質において、基質中の標的配列への結合活性（リジン結合活性）とプラスミノーゲン活性（タンパク質加水分解機能）との両方を有するフラグメントが含まれる。本願のいくつかの実施形態では、前記プラスミノーゲンは、配列１４に示されるプラスミノーゲンの活性フラグメントを含むタンパク質である。本願の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４、及び／またはクリングル５のリジン結合フラグメントを含むタンパク質である。一部の実施形態では、本願のプラスミノーゲン活性フラグメントは、配列１４、または配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質を含む。したがって、本発明のプラスミノーゲンは、当該プラスミノーゲンの活性フラグメントを含み、且つ依然として当該プラスミノーゲンの活性を保持したタンパク質を含む。一部の実施形態において、本願のプラスミノーゲンは、クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４、及び／またはクリングル５を含むか、あるいはクリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４、またはクリングル５と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、且つ依然としてリジン結合活性を有するタンパク質を含む。

現在、血液中のプラスミノーゲン及びその活性測定方法は組織プラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ－ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ－ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン－抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）を含む。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象（被験者）の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてＰＬＭとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。

「オーソログまたはオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含み、直系遺伝子ともいう。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンのオーソログまたはオルソログを含む。

「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの所定のアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、アルカリ性、疎水性など）のアミノ酸で親タンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％～９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然または親タンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。

「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になるまで精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造され、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。

用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するあるいは有しない）を含む融合物；等々である。

参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的としたアライメントは本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、該パラメータが比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ－２により得られるものである。

ＡＬＩＧＮ－２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのある％のアミノ酸配列同一性を有するまたは含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００

ここで、Ｘは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムによって得られるものである。

用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。

「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲンの量を指す。「治療上有効量」は、使用するプラスミノーゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度ならびに年齢、体重などに従って変化するものである。

疾患状態の「治療」という用語は、前記疾患状態またはその臨床症状の進行を抑制または阻止し、あるいは疾患状態または症状を緩和して、疾患状態またはその臨床症状の一時的または永久的な減退をもたらすことを含む。

本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ｐａｇｅ ３－２８４、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ Ａ．２００６Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．６：３－１０及びＣａｍａｒｅｒｏ ＪＡ ｅｔ ａｌ．，２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３－８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンとＮ保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、その後それを切除する。

標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に連結させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。

適切な発現ベクターは通常宿主体内において遊離体または宿主染色体ＤＮＡの組み込む部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）は、プラスミノーゲンをコードするポリヌクレオチドをクローニングするために使用できる原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β－ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列などを有してもよい。

その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３－ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターには特にアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルトースとガラクトースの利用のための酵素由来のプロモーターを含む。

微生物以外に、哺乳動物細胞（例えばインビトロ細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノーゲン（例えば、プラスミノーゲンをコードするポリヌクレオチド）の発現及び生成に用いることができる。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報サイト、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。

一旦（化学または組み換え的に）合成されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％～９０％の純度で、少なくとも約９０％～９５％の純度で、または９８％～９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞破片、プラスミノーゲン以外の大分子などである。

薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲンと必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；ｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド（約１０個より少ない残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛－タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、降圧薬、抗不整脈薬、糖尿病薬などが挙げられる。

本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。

本発明のプラスミノーゲンは徐放製剤を調製できる。徐放製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチル－メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７－２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８－１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン－ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｖｉｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸－ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン－酢酸エチル及び乳酸－ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ－Ｓ結合を形成することであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。

投与及び使用量
異なる方式、例えば静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内（例えば、頸動脈を介して）、筋肉内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。

胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。

医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明のプラスミノーゲンを含有する医薬組成物の用量の範囲は、毎日約０．０００１～２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１～５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）被験者体重とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１－５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってに従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日１～１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性をリアルタイムに評価する必要がある。

製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は、糖尿病によって引き起こされる心血管疾患及び関連病症の治療に使用することができる本願のプラスミノーゲンまたはプラスミンを含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくひとつの容器、ラベルまたはプロトコールを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン／プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の糖尿病によって引き起こされる心血管疾患及び関連病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これには例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲンの組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬剤を患者に投与することを指示することを含む。

以下の実施例で使用されるヒトプラスミノーゲンは、ドナーの血漿に由来し、文献［１～３］に記載された方法に基づいてプロセスを最適化し、ヒトドナーの血漿から精製して得られた。ここでヒトＬｙｓ－プラスミノーゲン（Ｌｙｓ－プラスミノーゲン）及びＧｌｕ－プラスミノーゲン（Ｇｌｕ－プラスミノーゲン）は９８％を上回った。

［実施例１］
実施例１は、プラスミノーゲンが、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）モデルマウスの脳組織における成熟ＮＧＦの形成を促進することに関するものである。
ＦＶＢ．Ｃｇ－Ｇｒｍ７Ｔｇ（ＳＭＮ２）８９Ａｈｍｂ Ｓｍｎ１ｔｍ１ＭｓｄＴｇ（ＳＭＮ２＊ｄｅｌｔａ７）４２９９Ａｈｍｂ／Ｊ遺伝子変異マウス（以下においてＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスと略称）は、ＳＭＮ１遺伝子にホモ接合変異があり、ヒトＳＭＮ２遺伝子を発現する。これらのマウスの臨床的及び病理学的症状は、ヒトのＳＭＡの症状に似ている。繁殖マウスは、米国のＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した（血統番号：００５０２５）。
３日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス７匹を取り、溶媒群のマウスで４匹とし、最初の９日間では、６μｌ／ｇ／回でウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ腹腔内注射により一回投与し、その後、６μｌ／ｇ／回でウシ血清アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を毎日腹腔内注射により一回投与した。投与群のマウスで３匹とし、最初の９日間では、３０μｇ／６μｌでプラスミノーゲンを毎日の午前と午後にそれぞれ腹腔内注射により１回投与し、その後、６０μｇ／６μｌでプラスミノーゲンを毎日腹腔内注射により１回投与した。野生型マウス４匹をブランク対照群とし、最初の９日間では、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を毎日の午前と午後にそれぞれ腹腔内注射により１回投与し、１０日目から、６μｌのウシ血清アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を毎日腹腔内注射により投与した。１２日目に、マウスを殺処分して後肢筋組織を採取して組織ホモジネートを調製し、ＮＧＦタンパク質のウェスタンブロット検出を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製の説明書に従って、１２％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で均一に混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで４５分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗マウスＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ５２９１８）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊで各バンドの光学密度値を得て定量的に分析した。
神経成長因子（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）は、神経栄養因子ファミリーの重要なメンバーである。シグナルペプチド、リーダーペプチド、及び成熟ペプチドを含む前駆体の形でインビボで合成される。研究では、神経成長因子ＮＧＦの前駆体（Ｐｒｏ－ＮＧＦ）が、切断されて形成するＮＧＦと相反の役割を果たしていることが報告されている。Ｐｒｏ－ＮＧＦはニューロンのアポトーシスを促進することができる。成熟したＮＧＦは、ニューロンの成長、発達、分化、生存、損傷後の修復などのプロセスの調節に関与しており、中枢及び末梢ニューロンの機能発現の調節にも重要な役割を果たしている^［４］。ＮＧＦ／ＰｒｏＮＧＦ比＝ＮＧＦ光学密度（ＯＤ）／ＰｒｏＮＧＦ光学密度（ＯＤ）値である。
その結果、ブランク対照群のマウスの脳組織には一定のＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ比があり、投与群のマウスの脳組織のＮＧＦ／Ｐｒｏ－ＮＧＦ比は溶媒群のマウスよりも有意に高く、しかも統計的差は極めて有意であった（＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）（図１）。この結果は、プラスミノーゲンがＳＭＡモデルマウスの脳組織においてＰｒｏＮＧＦからＮＧＦへの変換を促進し、成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。

［実施例２］
実施例２は、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進することに関するものである。
１１～１２週齢の１８～２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊオスマウス４匹を選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってから１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳでそれぞれ加え、４℃でホモジナイズし（１分、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で遠心分離し、上澄み、すなわち脳ホモジネートを新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１．５μＬ Ｐｒｏ－ＮＧＦ（上海強耀（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，）、カスタム発現ヒトＰｒｏ－ＮＧＦ、１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬ溶媒溶液（クエン酸－クエン酸ナトリウム溶液）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１．μＬ Ｐｒｏ－ＮＧＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、１００μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製キットの説明書に従って、１５％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで３０分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５２９１８）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンドの光学密度をＩｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
ＮＧＦは、神経栄養因子ファミリーの重要なメンバーである。シグナルペプチド、リーダーペプチド、及び成熟ペプチドを含む前駆体の形でインビボで合成される。研究では、神経成長因子ＮＧＦの前駆体（Ｐｒｏ－ＮＧＦ）が、切断されて形成するＮＧＦと相反の役割を果たしていることが報告されている。Ｐｒｏ－ＮＧＦはニューロンのアポトーシスを促進することができる^［５］。成熟したＮＧＦは、ニューロンの成長、発達、分化、生存、損傷後の修復などのプロセスの調節に関与しており、中枢及び末梢ニューロンの機能発現の調節にも重要な役割を果たしている^［６］。
その結果、正常マウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＮＧＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であり（＊はＰ＜０．０５を表し、＊＊＊はＰ＜０．００１を表す）、プラスミノーゲン投与群のＮＧＦ量は溶媒対照群より有意に高く、その差は有意であった（図２）。これは、プラスミノーゲンが、正常マウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。

［実施例３］
実施例３は、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進することに関するものである。
１１週齢のＢ６ＳＪＬＴｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ，ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（ＦＡＤ）（在庫番号：０３４８４０）（ＦＡＤと略称）マウス４匹ずつを選択し、殺処分して全脳組織を採取し、重量を測ってからＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブに入れ、１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｐＨ７．４；１００１０－０３１）を１５０ｍｇ組織／ｍＬ ＰＢＳでそれぞれ加え、４℃でホモジナイズし（１分、３～４回）、ホモジナイズ後、４℃（１２０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）で遠心分離し、上澄み、すなわち脳ホモジネートを新しいＥＰチューブに移した。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（ＥＰ）チューブを取り、（１）ブランク群、（２）ブランク対照群、（３）溶媒対照群、（４）プラスミノーゲン群で、各群に５つの並列を設定した。ブランク対照群には、２１．５μＬの生理食塩水、４．６μＬのプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；溶媒対照群に２１.５μＬ Ｐｒｏ－ＮＧＦ（上海強耀（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．，）、カスタム発現ヒトＰｒｏ－ＮＧＦ、１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬ溶媒溶液（クエン酸－クエン酸ナトリウム溶液）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した；プラスミノーゲン群に２１．μＬ Ｐｒｏ－ＮＧＦ（１．０ｍｇ／ｍＬ）、４．６μＬプラスミノーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）、及び２３．９μＬのマウス脳ホモジネートを添加した。各群にサンプルを添加した後、３７℃で６時間インキュベートした後、１００μＬの０．１％トリフルオロ酢酸溶液をそれぞれ加えて反応を停止させた。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル調製の説明書に従って、１５％ゲルを調製した。各群のサンプルを４×ローディング緩衝液（ＴａＫａＲａ、ｅ２１３９）と体積比３：１で混合し、１００℃で５分間加熱し、冷却して２分間遠心分離した後、２０μＬのサンプルを採取してローディングした。電気泳動条件は、３０Ｖで３０分間実行した後、１００Ｖでゲルの底まで実行した。電気泳動後、ゲルをはがし、活性化したＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ、Ａ２９４３３７５３）に転写し、電気泳動条件は１５Ｖで２．５時間であった。転写したＰＶＤＦメンブレンをブロッキング溶液（５％スキムミルク液）に浸し、４℃の冷蔵庫で一晩ブロッキングし、ＴＢＳＴ（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＮａＣｌ、ｐＨ７．６緩衝液）で４回洗浄した後、ウサギ抗ヒトＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）を加えて室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２１）二次抗体を加え、室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで４回洗浄した後、クリーンなイメージングプレート上にＰＶＤＦメンブレンを置き、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ、ＷＢＫＬＳ０１００）を加えて呈色させ、生体分子イメージャーで撮影し、バンド光学密度をＩｍａｇｅ Ｊで定量的に分析した。
その結果、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいて、プラスミノーゲン投与群のＰｒｏ－ＮＧＦ量は溶媒対照群より有意に低く、その差は極めて有意であった（＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＮＧＦ量は溶媒対照群よりも有意に高く、その差は有意であった（図３）。これは、プラスミノーゲンが、アルツハイマー病モデルマウスの脳ホモジネートにおいてＰｒｏ－ＮＧＦの切断及び成熟ＮＧＦの形成を促進できることを示唆している。

［実施例４］
実施例４は、プラスミノーゲンが、ＳＭＡマウスの脊髄組織におけるＮＧＦの発現を促進することに関するものである。
３日齢または７日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡ変異型マウス８匹、及び同齢の野生型マウス４匹を取り、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡ変異型マウスをランダムに溶媒群と投与群に分け、各群で４匹とし、野生型マウス４匹をブランク対照群とした。投与群のマウスにはＴＰ０１ＨＮ１０６を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で６０ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスには溶媒を６ｍｌ／ｋｇ／日で腹腔内注射により投与し、いずれも生後１１日目まで投与した。マウスの生後１１日目に投与２時間後にすべてのマウスを殺処分して解剖し、脊髄組織の一部を採取し、１０％ホルムアルデヒド溶液で２４～４８時間固定した。固定した脊髄組織をアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。組織切片の厚さは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素で１５分間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングし、時間になったらヤギ血清を捨て、ウサギ抗マウスＮＧＦ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ５２９１８）を滴下して４℃で一晩インキューベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ｖｅｃｔｏｒ，ＭＰ－７４５１－５０）二次抗体を室温で１時間インキュベートし、０．０１Ｍ ＰＢＳで２回洗浄し、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水で３回洗浄した後にヘマトキシリンで３０秒対比染色して、流水で５分間すすいだ。アルコール勾配で脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
その結果、投与群（図４Ｃ）におけるＮＧＦの発現レベルが溶媒群（図４Ｂ）よりも有意に高く、しかもその統計的差が有意であった（Ｐ＜０．０５）（図４Ｄ）ことが示されている。これは、プラスミノーゲンがＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスの脊髄組織におけるＮＧＦの発現を促進できることを示している。

［実施例５］
実施例５は、プラスミノーゲンの投与が、ＳＭＡマウスの脳組織においてプラスミノーゲンのレベルを増加させることに関するものである。
３日齢または７日齢のＦＶＢ．Ｃｇ－Ｇｒｍ７Ｔｇ（ＳＭＮ２）８９Ａｈｍｂ Ｓｍｎ１ｔｍ１ＭｓｄＴｇ（ＳＭＮ２＊ｄｅｌｔａ７）４２９９Ａｈｍｂ／Ｊ遺伝子変異マウス（ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスと略称）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入、血統番号：００５０２５）８匹及び同齢の野生型ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス４匹を取り、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスをランダムに溶媒群と投与群に分け、各群で４匹とし、４匹の野生型マウスをブランク対照群とした。投与群のマウスにはプラスミノーゲンを６０ｍｇ／ｋｇ／日、濃度１０ｍｇ／ｍｌで腹腔内注射により投与し、溶媒群とブランク対照群のマウスにはプラスミノーゲンを６ｍｌ／ｋｇ／日で腹腔内注射により投与し、いずれも生後１１日まで投与した。マウスの生後１１日目に投与２時間後に全てのマウスを殺処分して解剖し、脳組織の一部を採取してホモジナイズした後、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（メーカー：ＡｓｓａｙＭａｘ、カタログ番号：ＥＰ１２００－１）の説明書に従って検出した。内部標準としてヒトプラスミノーゲン作業標準を使用して、各サンプルの濃度を較正し、較正された濃度を総タンパク質濃度で割って、各サンプルの単位総タンパク質量あたりのプラスミノーゲンの量を計算し、統計分析を行った。
ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスは、ＳＭＮ１遺伝子にホモ接合変異があり、ヒトＳＭＮ２遺伝子を発現する。これらのマウスの臨床的及び病理学的症状は、ヒトの脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の症状に似ている。
その結果、ブランク対照群の野生型マウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが１．１８±１．５４ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが１．４９±１．５９ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して、溶媒群のマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルは有意に変化しなかった；投与群のＳＭＡトランスジェニックマウスのプラスミノーゲンのレベルは１２．０９±５．３２ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群の約８倍であった（図５）。これは、プラスミノーゲンを補給すると、ＳＭＡ疾患条件下でプラスミノーゲンに対する血液脳関門の透過性が増加し、プラスミノーゲンが血液脳関門を通過して脳に到達できることを示唆している。

［実施例６］
実施例６は、プラスミノーゲンの投与が、ＳＭＡマウスの脊髄組織においてプラスミノーゲンのレベルを増加させることに関するものである。
３日齢または７日齢のＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウス８匹、同齢の野生型マウス４匹、及び同齢のＳＭＡヘテロマウス３匹を取り、ＳＭＮΔ７ ＳＭＡマウスをランダムに溶媒群と投与群に分け、各群で４匹とし、野生型マウス４匹をブランク対照群とし、ＳＭＡヘテロマウス３匹を正常投与対照群とした。投与群及び正常投与対照群のマウスにはプラスミノーゲンを１０ｍｇ／ｍｌの濃度で６０ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内注射により投与し、溶媒群及びブランク対照群のマウスには溶媒を６ｍｌ／ｋｇ／日で腹腔内注射により投与し、いずれも生後１１日目まで投与した。マウスの生後１１日目に投与２時間後にすべてのマウスを殺処分して解剖し、脊髄組織の一部を採取し、ホモジナイズし、プラスミノーゲンのＥＬＩＳＡによる検出を行った。
その結果、ブランク対照群の野生型マウスにおける脊髄プラスミノーゲンのレベルが８．５１±９．５１ｎｇ／ｍｇであった。溶媒群ＳＭＡトランスジェニックマウスの脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルは１９．９５±４．０６ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群よりわずかに増加した。正常投与対照群のプラスミノーゲンのレベルは１３．０３±７．５１ｎｇ／ｍｇであった。投与群のＳＭＡトランスジェニックマウスの脊髄プラスミノーゲンのレベルは６２．３３±１７．３７ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群マウスの約３倍であり、投与群と溶媒群の比較統計解析Ｐ値は０．０２９であり、正常投与対照群の約４．８倍であり、投与群と正常投与対照群の比較統計解析Ｐ値は０．０２６であった（図６）。これは、プラスミノーゲンの投与が、ＳＭＡの条件下でプラスミノーゲンに対する血液脊髄関門の透過性の増加を促進し、プラスミノーゲンが血液脊髄関門を通過して脊髄に到達できることを示している。

［実施例７］
実施例７は、プラスミノーゲンの投与が、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスの脊髄組織におけるプラスミノーゲンレベルの増加を促進することに関するものである。
ＳＭＡヘテロ接合マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入、血統番号：００５０２５）９匹を、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で３匹、モデル群で６匹とした。すべてのマウスをＺｏｌｅｔｉｌ ５０で麻酔した後、モデル群のマウスには、２．５ｍｇ／ｍｌの細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）溶液を気管に注入してモデリングし、モデリング用量は５ｍｇ／ｋｇであり、ブランク対照群のマウスには、２ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を注入した。２時間のモデリングの後、モデル群のすべてのマウスを体重に応じてランダムに２つの群に分け、溶媒群で３匹、投与群で３匹とした。群分けが終わった後に投与を始め、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群マウス及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹で溶媒を尾静脈注射により投与した。投与２時間後にすべてのマウスを殺処分して解剖し、脊髄組織を採取し、ホモジナイズし、Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（メーカー：ＡｓｓａｙＭａｘ、カタログ番号：ＥＰ１２００－１）の説明書に従って検出した。内部標準としてヒトプラスミノーゲン作業標準を使用して、各サンプルの濃度を較正し、較正された濃度を総タンパク質濃度で割って、各サンプルのの単位総タンパク質量あたりのプラスミノーゲンの量を計算し、統計分析を実行した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄組織ホモジネート中のプラスミノーゲンのレベルが２．７０±０．７４ｎｇ／ｍｇであり、ＬＰＳの気管注入後、溶媒群のマウスの脊髄組織ホモジネート中のプラスミノーゲンのレベルは３．１７±１．５１ｎｇ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して有意な変化はなかった；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノーゲンを補充した後、プラスミノーゲンのレベルは１２１．１６±４４．６８ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約３８．２倍であった（図７）。これは、プラスミノーゲンを補充すると、ＬＰＳによって誘発された肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにおいて、プラスミノーゲンに対する血液脊髄関門の透過性の増加を促進し、この条件下では、プラスミノーゲンが血液脊髄関門を通過して中枢神経系に入ることができることを示唆している。

［実施例８］
実施例８は、プラスミノーゲンの投与が、ＬＰＳ誘発性肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスの脊髄組織におけるプラスミノーゲンレベルの増加を促進することに関するものである。
ＳＭＡヘテロ接合マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入、血統番号：００５０２５）９匹を、体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で３匹、モデル群で６匹とした。すべてのマウスをＺｏｌｅｔｉｌ ５０で麻酔した後、モデル群のマウスには、２．５ｍｇ／ｍｌの細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）溶液を気管に注入してモデリングし、モデリング用量は５ｍｇ／ｋｇであり、ブランク対照群のマウスには、２ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を注入した。２時間のモデリングの後、モデル群のすべてのマウスを体重に応じてランダムに２つの群に分け、溶媒群で３匹、投与群で３匹とした。群分けが終わった後に投与を始め、投与群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群マウス及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹で溶媒を尾静脈注射により投与した。投与２時間後にすべてのマウスを殺処分して解剖し、脊髄組織を採取し、ホモジナイズした後、プラスミノーゲンの酵素基質動態法の検出を行った。マイクロプレート（メーカー：ＮＵＮＣ、カタログ番号：４４６４６９）に、７つの異なる濃度の標準溶液、ブランク、及びサンプルを８５μＬ／ウェルずつ加えた後、各ウェルに１５μＬの２０ｍＭ Ｓ－２２５１溶液（メーカー：Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、カタログ番号：８２０３３２３９）と１００ｎｇ／μＬ ｕＰＡ溶液との混合物（使用直前に容量比２：１で混合）を加え、３７℃でインキュベートした。反応の０分から、反応が９０分になるまで、Ａ４０５吸光度値を５分ごとに多機能マイクロプレートリーダーで読み取った。すべての反応は、時間と吸光度値に基づいて直線でフィッティングされ、直線の傾きは標準製品／サンプルの反応速度（△Ａ４０５／分）であった。最後に、標準製品の効力値と△Ａ４０５／分を標準曲線として使用して、試験サンプルの効力を計算した。各サンプルの単位総タンパク質量あたりのプラスミノーゲンの活性を計算した。
その結果、ブランク対照群のマウスの脊髄組織におけるプラスミノーゲンのレベルは０．０００１１±４．５１ｘ１０^－５Ｕ／ｍｇであった；ＬＰＳの気管注入後、溶媒群マウスの脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルは０．０００１０±９．７２×１０^－６Ｕ／ｍｇであり、ブランク対照群と比較して有意な変化はなかった；投与群のマウスに生理的用量の２．５倍のプラスミノーゲンを補充した後、プラスミノーゲンのレベルは０．０００３４±１．０４×１０^－４Ｕ／ｍｇに上昇し、溶媒群と比較して、統計解析のＰ値は０．０５８であった（図８）。これは、プラスミノーゲンを補充すると、ＬＰＳによって誘発された肺炎ＳＭＡヘテロ接合マウスにおいて、プラスミノーゲンに対する血液脊髄関門の透過性の増加を促進し、プラスミノーゲンが血液脊髄関門を通過して脊髄に蓄積できることを示唆している。

［実施例９］
実施例９は、プラスミノーゲンの投与が、ＬＰＳ誘発性肺炎マウスの脊髄組織におけるプラスミノーゲンレベルの増加を促進することに関するものである。
Ｃ５７オスマウス１５匹を取り、体重を測ってからランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で３匹、モデル群で１２匹とした。すべてのモデル群マウスをＺｏｌｅｔｉｌ ５０で麻酔した後、２．５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ溶液を気管に注入してモデリングし、モデリング用量は５ｍｇ／ｋｇであった。モデリングの２時間後、モデル群のすべてのマウスを体重に応じてランダムに４つの群に分け、溶媒群で３匹、投与Ａ群で３匹、投与Ｂ群で３匹、投与Ｃ群で３匹とした。群分けが終わった後に投与を始め、投与Ａ群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、投与Ｂ群のマウスに１７ｍｇ／ｋｇ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、投与Ｃ群のマウスに６ｍｇ／ｋｇ／匹でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与した。溶媒群マウス及びブランク対照群のマウスに５ｍｌ／ｋｇ／匹で溶媒を尾静脈注射により投与した。投与２時間後に脊髄組織を解剖し、特異的なヒトプラスミノーゲンのＥＬＩＳＡによる検出を行った。
脊髄組織ホモジネート中のプラスミノーゲンレベルをＥＬＩＳＡで検出した結果、ブランク対照群の脊髄組織のＰｌｇ含有量は７．７１±０．５１ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群マウスの脊髄組織のＰｌｇ含有量は１４．０４±３．２５ｎｇ／ｍｇであり、ＬＰＳの気管注入後、マウスの脊髄におけるプラスミノーゲンのレベルは増加した；投与Ａ群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹あたり約１ｍｇ）のプラスミノーゲンを投与した後、脊髄組織中のプラスミノーゲンのレベルは８５．１０±１１．５９ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約６．１倍であり、投与Ｂ群のマウスに１７ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹あたり約０．３４ｍｇ）のプラスミノーゲンを投与した後、脊髄組織中のプラスミノーゲンのレベルは７７．９０±２１．３９ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約５．５倍であった；投与Ｃ群のマウスに６ｍｇ／ｋｇ（マウス１匹あたり約０．１ｍｇ）のプラスミノーゲンを投与した後、脊髄組織中のプラスミノーゲンのレベルは６４．００±１９．６３ｎｇ／ｍｇであり、溶媒群のマウスの約４．６倍であった（図９）。これは、１）プラスミノーゲンを補充すると、ＬＰＳによって誘発された肺炎マウスにおいて、プラスミノーゲンに対する血液脳関門の透過性の増加を促進し、プラスミノーゲンが血液脳関門を通過して脊髄組織に蓄積できること；２）脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、６ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で、脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮レベルは、投与されるプラスミノーゲンの用量の増加とともに増加することを示唆している。

［実施例１０］
実施例１０は、プラスミノーゲンの投与が、ＬＰＳ誘発性肺炎マウスの脊髄組織におけるプラスミノーゲンレベルの増加を促進することに関するものである。
６～９週齢のＣ５７オスマウス５４匹を取り、体重を測ってからランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で１５匹、モデル群で３９匹とした。すべてのマウスをＺｏｌｅｔｉｌ ５０で麻酔した後、モデル群マウスに２．５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ溶液を気管に注入してモデリングし、モデリング用量は５ｍｇ／ｋｇであり、ブランク群のマウスには、２ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を注入した。モデル群マウスのＬＰＳモデリングの２時間後、体重に応じてランダムに３つの群に分け、ＬＰＳ＋溶媒群で１５匹、ＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群で１２匹、ＬＰＳ＋６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群で１２匹とした。ブランク群マウスを体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク＋溶媒群で３匹、ブランク＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群で１２匹、投与を始めた。ＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群及びブランク＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群に５０ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＬＰＳ＋溶媒群及びブランク＋溶媒群に５ｍｌ／ｋｇ／匹で溶媒を尾静脈注射により投与し、ＬＰＳ＋６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群に６ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与した。３匹のブランク＋溶媒群及び３匹のＬＰＳ＋溶媒群に投与した後０時間にマウスを殺処分し、２、６、１２及び２４時間の各時点で各群のマウスからランダムに３匹を殺処分し、脊髄を採取し、ホモジナイズした後に特異的なヒトプラスミノーゲンのＥＬＩＳＡ法による検出を行った。
その結果、偽手術＋溶媒群及びＬＰＳ＋溶媒群のマウスはプラスミノーゲン注射を受けず、０、２、６、１２及び２４時間で脊髄組織ホモジネート中にヒトプラスミノーゲンが検出されなかった。偽手術＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群及びＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重のプラスミノーゲンを注射したところ、注射２時間後の脊髄組織ホモジネート中のヒトプラスミノーゲンはいずれも有意に増加し、注射の６～１２時間後にプラスミノーゲンのレベルは有意に減少し、２４時間にはヒトプラスミノーゲンは基本的に検出できなくなった。ＬＰＳ＋６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群のマウスに６ｍｇ／ｋｇ体重のプラスミノーゲンを注射すると、注射２時間後の脊髄組織ホモジネートで検出されたプラスミノーゲンのレベルは、ＬＰＳ＋溶媒群のマウスよりも有意に高く、ＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群マウスよりも有意に低かった（図１０）。
この結果は、１）生理学的及び病理学的条件下でプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンが血液脳関門を通過し、脊髄組織に蓄積するのを促進することができること；２）正常なマウスにプラスミノーゲンを静脈内注射すると、脊髄組織におけるプラスミノーゲンのレベルが有意に増加すること；３）脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されること；４）脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、用量が高いほど、脊髄組織におけるプラスミノーゲンのレベルが高くなることを示唆している。

［実施例１１］
実施例１１は、プラスミノーゲンの投与が、ＬＰＳ誘発性肺炎マウスの脳組織におけるプラスミノーゲンレベルの増加を促進することに関するものである。
６～９週齢のＣ５７オスマウス５４匹を取り、体重を測ってからランダムに２つの群に分け、ブランク対照群で１５匹、モデル群で３９匹とした。すべてのマウスをＺｏｌｅｔｉｌ ５０で麻酔した後、モデル群マウスに２．５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ溶液を気管に注入してモデリングし、モデリング用量は５ｍｇ／ｋｇであり、ブランク群のマウスには、２ｍｌ／ｋｇの生理食塩水を注入した。すべてのモデル群マウスのＬＰＳモデリングの２時間後、体重に応じてランダムに３つの群に分け、ＬＰＳ＋溶媒群で１５匹、ＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群で１２匹、ＬＰＳ＋６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群で１２匹とした。ブランク群マウスを体重に応じてランダムに２つの群に分け、ブランク＋溶媒群で３匹、ブランク＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群で１２匹、投与を始めた。ＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群及びブランク＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群に５０ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、ＬＰＳ＋溶媒群及びブランク＋溶媒群に５ｍｌ／ｋｇ／匹で溶媒を尾静脈注射により投与し、ＬＰＳ＋６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群に６ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与した。３匹のブランク＋溶媒群及び３匹のＬＰＳ＋溶媒群に投与した後０時間にマウスを殺処分し、２、６、１２及び２４時間の各時点で各群のマウスからランダムに３匹ずつを殺処分し、脳を採取し、ホモジナイズした後に特異的なヒトプラスミノーゲンのＥＬＩＳＡ法による検出を行った。
その結果、ブランク＋溶媒群マウス及びＬＰＳ＋溶媒群のマウスはプラスミノーゲン注射を受けず、０、２、６、１２及び２４時間で脳組織ホモジネート中にヒトプラスミノーゲンが検出されなかった。ブランク＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群及びＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重のプラスミノーゲンを注射したところ、注射２時間後に脳組織ホモジネート中にヒトプラスミノーゲンはいずれも有意に増加し、注射の６～１２時間後にプラスミノーゲンのレベルは有意に減少し、２４時間にはヒトプラスミノーゲンは基本的に検出できなくなった。ＬＰＳ＋６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群のマウスに６ｍｇ／ｋｇ体重のプラスミノーゲンを注射すると、注射２時間後の脳組織ホモジネートで検出されたプラスミノーゲンのレベルは、ＬＰＳ＋溶媒群のマウスよりも有意に高く、ＬＰＳ＋５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン群マウスよりも有意に低かった（図１１）。
この結果は、１）生理学的及び病理学的条件下でプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンが血液脳関門を通過し、脳組織に蓄積するのを促進することができること；２）正常なマウスにプラスミノーゲンを静脈内注射すると、脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが有意に増加すること；３）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されること；４）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、用量が高いほど、脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルが高くなることを示唆している。

［実施例１２］
実施例１２は、プラスミノーゲンの投与が、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄組織におけるプラスミノーゲンレベルの増加を促進することに関するものである。
１５週齢のＢ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウス（以下においてＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスと略称）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入、血統番号：００４４３５）２７匹をランダムに３つの群に分け、溶媒群で３匹、５０ｍｇ／ｋｇ投与群で１２匹、６ｍｇ／ｋｇ投与群で１２匹とした。溶媒群のマウスに溶媒を尾静脈注射により投与し、５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン投与群に５０ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン投与群に６ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与した。溶媒群のマウスに投与した後２時間にマウスを殺処分し、その他のマウスについて、投与後２、６、１２及び２４時間に各群のマウスから３匹ずつを殺処分し、脊髄を採取し、ホモジナイズした後に特異的なヒトプラスミノーゲンのＥＬＩＳＡ法による検出を行った。
ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは、ヒト変異体ＳＯＤ１遺伝子を過剰発現しており、マウスの臨床的及び病理学的症状は、ヒトの筋萎縮性側索硬化症の症状に似ている。
ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄のＥＬＩＳＡレベル検出の結果、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脊髄のプラスミノーゲンのレベルが、５０ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇのプラスミノーゲンの尾静脈注射後に有意に増加し、５０ｍｇ／ｋｇ投与群ではプラスミノーゲンのレベルが６ｍｇ／ｋｇ投与群よりも有意に高かった。プラスミノーゲンは投与２時間後から徐々に減少し、１２～２４時間でほぼ完全に代謝された（図１２）。
この結果は、１）生理学的用量レベルでプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンがＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの血液脳関門を通過し、脊髄組織に蓄積することができること；２）脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、投与されるプラスミノーゲンの用量が高いほど、より濃縮されること；３）脊髄におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されることを示唆している。

［実施例１３］
実施例１３は、プラスミノーゲンの投与が、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンレベルの増加を促進することに関するものである。
１５週齢のＢ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊトランスジェニックマウス（以下においてＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスと略称）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入、血統番号：００４４３５）２７匹をランダムに３つの群に分け、溶媒群で３匹、５０ｍｇ／ｋｇ投与群で１２匹、６ｍｇ／ｋｇ投与群で１２匹とした。溶媒群のマウスに溶媒を尾静脈注射により投与し、５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン投与群に５０ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン投与群に６ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与した。溶媒群のマウスに投与した後２時間にマウスを殺処分し、その他のマウスについて、投与後２、６、１２及び２４時間に各群のマウスから３匹ずつを殺処分し、脳を採取し、ホモジナイズした後に特異的なヒトプラスミノーゲンのＥＬＩＳＡ法による検出を行った。
ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脳におけるＥＬＩＳＡレベル検出の結果、ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンのレベルは、５０ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲンの尾静脈注射後に有意に増加し、５０ｍｇ／ｋｇ投与群のプラスミノーゲンのレベルは、６ｍｇ／ｋｇ投与群よりも有意に高かった。プラスミノーゲンは投与２時間後から徐々に減少し、１２～２４時間でほぼ完全に代謝された（図１３）。
この結果は、１）生理学的用量レベルでプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンがＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスの血液脳関門を通過し、脳組織に蓄積することができること；２）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、投与されるプラスミノーゲンの用量が高いほど、より濃縮されること；３）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されることを示唆している。

［実施例１４］
実施例１４は、プラスミノーゲンの投与が、ＦＡＤマウスの脊髄組織におけるプラスミノーゲンレベルの増加を促進することに関するものである。
１５週齢のＢ６－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（以下においてＦＡＤマウスと略称）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入、血統番号：０３４８４０）２７匹をランダムに３つの群に分け、溶媒群で３匹、５０ｍｇ／ｋｇ投与群で１２匹、６ｍｇ／ｋｇ投与群で１２匹とした。溶媒群のマウスに溶媒を尾静脈注射により投与し、５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン投与群に５０ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン投与群に６ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与した。溶媒群のマウスに投与した後２時間にマウスを殺処分し、その他のマウスについて、投与後２、６、１２及び２４時間に各群のマウスから３匹ずつを殺処分し、脊髄を採取し、ホモジナイズした後に特異的なヒトプラスミノーゲンのＥＬＩＳＡ法による検出を行った。
ＦＡＤマウスは、アルツハイマー病の研究で一般的に使用される動物モデルである。
脊髄組織ホモジネートのＥＬＩＳＡレベル検出の結果、ＦＡＤマウスの脊髄組織のプラスミノーゲンのレベルが、５０ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇのプラスミノーゲンの尾静脈注射後に有意に増加し、５０ｍｇ／ｋｇ投与群ではプラスミノーゲンのレベルが６ｍｇ／ｋｇ投与群よりも有意に高かった。プラスミノーゲンは投与２時間後から徐々に減少し、１２～２４時間でほぼ完全代謝された（図１４）。
この結果は、１）生理学的用量レベルでプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンがＦＡＤマウスの血液脳関門を通過し、脊髄組織に蓄積することができること；２）脊髄組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、投与されるプラスミノーゲンの用量が高いほど、より濃縮されること；３）脊髄組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されることを示唆している。

［実施例１５］
実施例１５は、プラスミノーゲンの投与が、ＦＡＤマウスの脳組織におけるプラスミノーゲンレベルの増加を促進することに関するものである。
１５週齢のＢ６－Ｔｇ（ＡＰＰＳｗＦｌＬｏｎ、ＰＳＥＮ１＊Ｍ１４６Ｌ＊Ｌ２８６Ｖ）６７９９Ｖａｓ／Ｍｍｊａｘ（以下においてＦＡＤマウスと略称）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入、血統番号：０３４８４０）２７匹をランダムに３つの群に分け、溶媒群で３匹、５０ｍｇ／ｋｇ投与群で１２匹、６ｍｇ／ｋｇ投与群で１２匹とした。溶媒群のマウスに溶媒を尾静脈注射により投与し、５０ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン投与群に５０ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、６ｍｇ／ｋｇプラスミノーゲン投与群に６ｍｇ／ｋｇ体重でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与した。溶媒群のマウスに投与した後２時間にマウスを殺処分し、その他のマウスについて、投与後２、６、１２及び２４時間に各群のマウスから３匹ずつを殺処分し、脳を採取し、ホモジナイズした後に特異的なヒトプラスミノーゲンのＥＬＩＳＡ法による検出を行った。
脳組織ホモジネートのＥＬＩＳＡレベル検出の結果、ＦＡＤマウスの脳組織のプラスミノーゲンのレベルが、５０ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇのプラスミノーゲンの尾静脈注射後に有意に増加し、５０ｍｇ／ｋｇ投与群ではプラスミノーゲンのレベルが６ｍｇ／ｋｇ投与群よりも有意に高かった。プラスミノーゲンは投与２時間後から徐々に減少し、１２～２４時間でほぼ完全代謝された（図１５）。
この結果は、１）生理学的用量レベルでプラスミノーゲンを投与した後、プラスミノーゲンがＦＡＤマウスの血液脳関門を通過し、脳組織に蓄積することができること；２）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は用量依存的な効果を有し、投与されるプラスミノーゲンの用量が高いほど、より濃縮されること；３）脳組織におけるプラスミノーゲンの濃縮は、時間依存効果を有し、最初に増加し、２から１２時間で徐々に減少し、１２から２４時間でほぼ完全に代謝されることを示唆している。

参考文献：
[1]KENNETH C. ROBBINS, LOUIS SUMMARIA, DAVID ELWYN et al. Further Studies on the Purification and Characterization of Human Plasminogen and Plasmin. Journal of Biological Chemistry , 1965 , 240 (1) :541-550.
[2]Summaria L, Spitz F, Arzadon L et al. Isolation and characterization of the affinity chromatography forms of human Glu- and Lys-plasminogens and plasmins. J Biol Chem. 1976 Jun 25;251(12):3693-9.
[3]HAGAN JJ, ABLONDI FB, DE RENZO EC. Purification and biochemical properties of human plasminogen. J Biol Chem. 1960 Apr;235:1005-10.
[4]Aloe L, Rocco M L , Bianchi P , et al. Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use[J]. Journal of Translational Medicine, 2012, 10(1).
[5] Aloe L , Rocco M L , Bianchi P , et al. Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use[J]. Journal of Translational Medicine, 2012, 10(1).
[6] Lewin G R , Lechner S G , Smith E S J . Nerve Growth Factor and Nociception: From Experimental Embryology to New Analgesic Therapy[J]. 2014.

Claims (18)

1. 治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を被験者に投与することを含む、成熟ＮＧＦの形成を促進する、及び／またはＮＧＦレベルを増加させる方法。
2. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の神経組織におけるＰｒｏ－ＮＧＦの切断による成熟ＮＧＦの形成及び／またはＮＧＦの発現を促進する、請求項１に記載の方法。
3. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の神経組織における他の神経栄養因子の発現及びレベルを増加させる、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記他の神経栄養因子が、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ－３）、神経栄養因子４／５（ＮＴ－４／５）、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、ＧＤＮＦ）、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ＬＩＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ－ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１、ＩＧＦ－１）、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＴＧＦ）、上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）または血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、神経に栄養を与えること、神経を保護すること、神経再生を促進すること、神経損傷を阻害すること、創傷組織の修復を促進すること、及び創傷治癒を促進することから選択される１つまたは複数の用途もしくは活性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記被験者が、神経または脳組織の損傷を患っている被験者であり、前記神経または脳組織の損傷が、
   １）髄膜炎、脳炎、灰白髄炎、及び硬膜外膿瘍から選択される１つまたは複数の感染症；
   ２）脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、くも膜下出血、硬膜下出血及び血腫、ならびに硬膜外出血から選択される１つまたは複数の血管疾患；
   ３）脳または脊髄損傷、ベル麻痺、頸椎症、手根管症候群、脳または脊髄腫瘍、末梢神経障害及びギラン・バレー症候群から選択される１つまたは複数の神経構造損傷疾患；
   ４）頭痛、てんかん、不眠症、神経痛、不安症、及びうつ病から選択される１つまたは複数の機能障害；
   ５）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）、脊髄小脳失調症、及びピック病から選択される１つまたは複数の神経変性疾患；
   ６）脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ）、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、及び原発性側索硬化症から選択される１つまたは複数の運動ニューロン疾患；
   ７）脳腫瘍及び脳癌から選択される１つまたは複数の腫瘍
   から選択される１つまたは複数の疾患もしくは状態によって引き起こされる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 治療有効量のプラスミノーゲン経路活性化剤を被験者に投与することを含む、ＮＧＦ関連疾患または状態を予防または治療する方法。
8. 前記ＮＧＦ関連疾患または状態が、
   １）髄膜炎、脳炎、灰白髄炎及び硬膜外膿瘍のいずれかから選択される感染症；
   ２）脳卒中、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、くも膜下出血、硬膜下出血及び血腫、ならびに硬膜外出血のいずれかから選択される血管疾患；
   ３）脳または脊髄損傷、ベル麻痺、頸椎症、手根管症候群、脳または脊髄腫瘍、末梢神経障害及びギラン・バレー症候群のいずれかから選択される神経構造損傷疾患；
   ４）頭痛、てんかん、不眠症、神経痛、不安症及びうつ病のいずれかから選択される機能障害；
   ５）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）、脊髄小脳失調症、及びピック病のいずれかから選択される神経変性疾患；
   ６）脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ）、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、及び原発性側索硬化症のいずれかから選択される運動ニューロン疾患；
   ７）脳腫瘍及び脳癌のいずれかから選択される腫瘍；
   ８）末梢神経障害、外傷による神経損傷、視神経障害、多発性神経炎、帯状疱疹、顔面神経麻痺、火傷、床ずれ、角膜潰瘍、放射線療法または化学療法による副作用
   からなる群から選択されるいずれか１つを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、被験者の神経組織におけるプラスミノーゲンのレベルを増加させる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、１つまたは複数の他の薬剤または治療方法と組み合わせて使用される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、静脈内、筋肉内、髄腔内、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、または点眼薬によって投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤が、プラスミノーゲン活性化経路の成分、プラスミノーゲンを直接活性化し得るか、またはプラスミノーゲン活性化経路の上流成分を活性化することによって間接的にプラスミノーゲンを活性化し得る化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミンの活性を模倣する化合物、プラスミノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化剤の発現をアップレギュレートすることができる化合物、プラスミノーゲン類縁体、プラスミン類縁体、ｔＰＡまたはｕＰＡ類縁体及び線維素溶解阻害剤の拮抗剤から選択される１つまたは複数である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記プラスミノーゲン活性化経路の成分が、天然または組換えプラスミノーゲン、ヒトプラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンとプラスミンの１つ以上のクリングルドメイン及び／またはプロテアーゼドメインを含むプラスミノーゲン及びプラスミン変異体並びに類縁体、ミニプラスミノーゲン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、ミニプラスミン（ｍｉｎｉ－ｐｌａｓｍｉｎ）、マイクロプラスミノーゲン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）、マイクロプラスミン（ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｓｍｉｎ）、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミン（ｄｅｌｔａ－ｐｌａｓｍｉｎ）、プラスミノーゲン活性化剤、ｔＰＡ、及びｕＰＡから選択されるものである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記線維素溶解阻害剤の拮抗剤が、天然または組み換えＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの拮抗剤、例えば、ＰＡＩ－１、補体Ｃ１阻害剤、α２抗プラスミンまたはα２マクログロブリンの抗体である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記プラスミノーゲン経路活性化剤がプラスミノーゲンである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記プラスミノーゲンが、配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列２、６、８、１０または１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性及び／またはリジン結合活性を有する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記プラスミノーゲンが、
    １）配列１４に示されるものを有するセリンプロテアーゼドメイン；
    ２）配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、タンパク質分解活性を保持するセリンプロテアーゼドメイン；
    ３）クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４及びクリングル５から選択される１つまたは複数のクリングルドメイン；及び
    ４）クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４及びクリングル５のうちの１つまたは複数と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、かつリジン結合活性を保持するクリングルドメイン
    から選択される１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の方法。
18. 前記プラスミノーゲンが、Ｇｌｕ－プラスミノーゲン、Ｌｙｓ－プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、ｄｅｌｔａ－プラスミノーゲン、またはそれらの、プラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を保持した変異体から選択される、請求項１５に記載の方法。