JP7487970B2 - 多発性硬化症を予防及び治療する方法並びに薬剤 - Google Patents
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Description
1、プラスミノーゲン、Lys-プラスミノーゲン、Glu-プラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン(micro-plasminogen)、delta-プラスミノーゲン、それらの変異体または類縁体;
2、プラスミン及びそれらの変異体または類縁体;及び
3、プラスミノーゲン活性化剤、例えば、tPA及びuPA、ならびにtPAまたはuPAの1つ以上のドメイン(1つ以上のkringleドメイン及びタンパク質加水分解ドメインなど)を含むtPAまたはuPA変異体及び類縁体をカバーする。
分数X/Y×100
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成(SPPS)(配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する)はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のSPPS、例えばFmoc及びBocは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている:Barany及びSolid-Phase Peptide Synthesis;3-284ページ、The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第二巻:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,tら J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963);Stewartら,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984);及びGanesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10及びCamarero JAら 2005Protein Pept Lett.12:723-8。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより小さい不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング/脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離N末端アミンとN保護を受けている単一のアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と連結する新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
所望の純度のプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)と必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.ed.(1980))を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む;防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメチレンジアミン;塩化ベンザルコニウム(benzalkonium chloride)、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール;アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル;ピロカテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;m-クレゾール);低分子量ポリペプチド(約10個より少ない残基を有するもの);タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである;単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む;キレート剤は例えばEDTAである;糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えば亜鉛-タンパク複合体);及び/または非イオン界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)である。好ましい凍結乾燥された抗VEGF抗体製剤は、WO97/04801に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
異なる方式、例えば鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内(例えば、頸動脈を介して)、筋肉内、及び直腸内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
本発明の一つの実施形態は、プラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)を含む製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましく容器、ラベルまたはプロトールを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する(例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む)。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)である。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の病症の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン活性化経路の成分またはその関連化合物(例えば、プラスミノーゲン)の組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
8週齢のC57オスマウス20匹を取り、ランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で6匹、モデル群で14匹とした。ブランク対照群のマウスに通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.2%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(クプリゾン、cuprizone)モデル飼料(南通トロフィー飼料科技有限公司)を6週間与え、脱髄モデルマウスを誘発した[1]。6週間後、モデル群のマウスを体重に応じて再びランダムにプラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群の2つの群に分け、各群で7匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1ml/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS対照群マウスに同量のPBSを同様に投与し、14日間連続投与し、ブランク対照群のマウスには注射しなかった。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。投与し始めた日を1日目とし、15日目に、マウスを解剖し、脳を4%パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは3μmであり、脱パラフィンさせてさらに再水和し、ミエリン染色液を用いてLFB染色を行った。アルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後に中性ゴムに封入させた。光学顕微鏡で観察し、写真を撮った。
その結果、ブランク対照群(図1A)の脳梁のミエリンは基本的に正常であり、プラスミノーゲン投与群(図1C)の脳梁のミエリン鞘の陽性染色(矢印でマーク)は、溶媒PBS投与対照群(図1B)より有意に多く、しかもその差は統計的に有意であった(図1D)(*はP<0.05を表す)。これは、プラスミノーゲンがヘキサノオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおけるミエリンの再生を促進できることを示している。
8週齢のC57オスマウス20匹を取り、ランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で6匹、モデル群で14匹とした。ブランク対照群のマウスに通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.2%ヘキサノンオキサリルジヒドラゾンモデル飼料(南通トロフィー飼料科技有限公司)を6週間与え、脱髄モデルマウスを誘発した[1]。6週間後、モデル群のマウスを体重に応じて再びランダムにプラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群の2つの群に分け、各群で7匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1ml/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS対照群マウスに同量のPBSを同様に投与し、3日間連続投与し、ブランク対照群のマウスには注射しなかった。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。投与し始めた日を1日目とし、4日目に、マウスを解剖し、脳を4%パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから1回水で洗った。クエン酸で30分間修復し、室温で10分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%のヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗プロテオリピドタンパク質(proteolipid protein,PLP)抗体(Abcam)を加えて4℃で一晩インキュベーションした後、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)の二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間ブルーイングさせ、PBSで1回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
プロテオリピドタンパク質(proteolipid protein,PLP)は疎水性の高い膜タンパク質であり、中枢神経系で最も豊富なミエリンである[2]。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図2C)における脳梁PLPの発現(矢印でマーク)は、溶媒PBS投与対照群(図2B)より有意に高く、発現は、後者と比較してブランク対照群マウス(図2A)に近かった。これは、プラスミノーゲンが脳梁におけるPLPの発現を促進し、ヘキサノオキサリルジヒドラゾン誘発脱髄モデルマウスにおけるミエリン再生を促進できることを示している。
8週齢のC57オスマウス20匹を取り、ランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で6匹、モデル群で14匹とした。ブランク対照群のマウスに通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.2%ヘキサノンオキサリルジヒドラゾンモデル飼料(南通トロフィー飼料科技有限公司)を6週間与え、脱髄モデルマウスを誘発した[1]。6週間後、モデル群のマウスを体重に応じて再びランダムにプラスミノーゲン投与群と溶媒PBS投与対照群の2つの群に分け、各群で7匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに1mg/0.1ml/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒PBS対照群マウスに同量のPBSを同様に投与し、14日間連続投与し、ブランク対照群のマウスには注射しなかった。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。投与し始めた日を1日目とし、15日目に、マウスを解剖し、脳を4%パラホルムアルデヒドで固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから1回水で洗った。クエン酸で30分間修復し、室温で10分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%のヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗NF抗体(Abcam、ab207176)を加えて4℃で一晩インキュベーションした後、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)の二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間ブルーイングさせ、PBSで1回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察した。
ニューロフィラメントタンパク質(Neurofilament protein,NFP)は、神経細胞軸索の中間フィラメントを構成するタンパク質である。その機能は、神経線維を容易に伸ばして破損を防ぐ弾力性を提供することであり、細胞骨格の維持、細胞形態の安定化、及び軸索輸送において非常に重要である[3]。
その結果、プラスミノーゲン投与群(図3C)のマウスの脳梁におけるNFPの発現(矢印でマーク)は、溶媒PBS投与対照群(図3B)よりも有意に高く、その差は統計的に有意であり(*はP<0.05を表す)(図3D)、溶媒PBS投与対照群と比較して、プラスミノーゲン投与群のNFPの発現はブランク対照群(図3A)のそれにより近かった。これは、プラスミノーゲンがNFPの発現を促進し、それによって神経線維の再生を促進できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、35日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。36日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して10%ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから1回水で洗った。クエン酸で30分間修復し、室温で10分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%のヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗NFP抗体(Abcam、ab207176)を加えて4℃で一晩インキュベーションした後、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)の二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間ブルーイングさせ、PBSで1回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で100倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群(図4A)の脳梁は一定レベルのNFPを発現し(矢印でマーク)、溶媒群(図4B)マウスの脳梁におけるNFPの発明は有意に減少し、投与群(図4C)のマウスの脳梁におけるNFPの発現レベルは溶媒群マウスよりも有意に高く、しかもその差は統計的に有意であった(*はP<0.05を表す)(図4D)。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるNFPの発現を促進できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食を与え、モデル群のマウスに0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、35日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与えた。36日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して10%ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和てから1回水で洗った。クエン酸で30分間修復し、室温で10分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%のヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗PLP抗体(Abcam)を加えて4℃で一晩インキュベーションした後、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)の二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間ブルーイングさせ、PBSで1回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で100倍にて観察した。
その結果、ブランク対照群(図5A)の脳梁は一定レベルのPLPを発現し(矢印でマーク)、溶媒群(図5B)のマウスの脳梁におけるPLPの発現は有意に減少し、投与群(図5C)のマウスの脳梁におけるPLPの発現レベルは溶媒群マウスのそれより有意に高かった。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるPLPの発現を促進できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、35日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。36日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して10%ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから1回水で洗った。クエン酸で30分間修復し、室温で10分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%のヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗ミエリン塩基性タンパク質(myelin basic protein,MBP)抗体(Abcam)を加えて4℃で一晩インキュベーションした後、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)の二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間ブルーイングさせ、PBSで1回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で100倍にて観察した。
ミエリン塩基性タンパク質(MBP)は、脊椎動物の中枢神経系のオリゴデンドロサイトと末梢神経系のシュワン細胞によって合成される強力な塩基性膜タンパク質であり、さまざまな塩基性アミノ酸を含んでいる。
その結果、ブランク対照群(図6A)の脳梁は一定レベルのMBPを発現し(矢印でマーク)、投与群(図6C)のマウスの脳梁のMBPは溶媒群(図6B)のマウスよりも有意に高く、しかも統計学的な差は有意に近かった(P=0.063)(図6D)。この結果は、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの脳梁におけるMBPレベルの上昇を促進できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、35日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。36日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して10%ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和てから1回水で洗った。クエン酸で30分間修復し、室温で10分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%のヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプタータンパク質-1(Ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)抗体(Abcam、ab178847)を加えて4℃で一晩インキュベーションした後、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)の二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間ブルーイングさせ、PBSで1回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察して写真を撮った。撮った写真に対してImaging-Proソフトウェアを使用して陽性染色デンシトメトリー分析をした。
イオン化カルシウム結合アダプタータンパク質-1(Ionized calcium binding adaptor molecule-1,Iba-1)は、中枢神経系のミクログリア表面マーカーである。中枢神経系の免疫細胞として、ミクログリアは、その病変または損傷時に神経障害を素早く感知して活性化される。活性化されたミクログリアは、数と形状が大幅に変化し、損傷部位に移動し、死細胞の食作用や炎症誘発性サイトカインの産生増加など、さまざまな機能を果たす[4]。
その結果、ブランク対照群(図7A)のマウスの海馬には一定量のミクログリアが存在し(矢印でマーク)、溶媒群(図7B)のマウスの海馬のミクログリア量は有意に増加し、投与群のマウスの海馬におけるミクログリアの数は溶媒群(図7C)よりも有意に高く、しかもその差は統計学的に有意(図7D)であった(*はP<0.05、***はP<0.001を表す)。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬損傷の炎症修復を促進できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、35日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。36日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して10%ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和してから1回水で洗った。クエン酸で30分間修復し、室温で10分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%のヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)抗体(BosterBio,PB9075)を加えて4℃で一晩インキュベーションした後、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)の二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間ブルーイングさせ、PBSで1回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で400倍にて観察して写真を撮った。撮った写真に対してImaging-Proソフトウェアを使用して陽性染色デンシトメトリー分析をした。
成熟した脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及びその受容体は、中枢神経系に広く分布しており、中枢神経系の発達中のニューロンの生存、分化、成長、発達に重要な役割を果たし、ニューロンが損傷を受けて死滅することを防ぎ、ニューロンの病理学的状態を改善し、損傷したニューロンの再生や分化などの生物学的効果を促進することができ、成熟した中枢神経系および末梢神経系におけるニューロンの生存と正常な生理学的機能に必要である[5]。
その結果、ブランク対照群(図8A)のマウスの海馬には一定レベルのBDNFがあり(矢印でマーク)、溶媒群(図8B)のマウスの海馬のBDNFレベルは増加し、投与群のマウスの海馬におけるBDNFレベルは溶媒群(図8C)よりも有意に高く、しかもその統計的な差は有意差に近かった(図8D)(P=0.095)。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬におけるBDNFレベルの上昇を促進できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、35日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。36日目に、マウスを殺処分し、脳組織を採取して10%ホルムアルデヒド溶液で固定し、脱水させて包埋した。固定後の組織サンプルをアルコール勾配で脱水させ、キシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋した。脳組織の冠状切片の厚みは3μmであり、切片を脱パラフィンさせ再水和てから1回水で洗った。クエン酸で30分間修復し、室温で10分間冷却した後、水でやさしくすすいだ。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%のヒツジ血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした。時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体(Abcam、ab4648)を加えて4℃で一晩インキュベーションした後、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)の二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、PBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、水で3回洗浄した後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間ブルーイングさせ、PBSで1回洗浄した。勾配で脱水させて透徹にして封入させ、切片を光学顕微鏡下で200倍にて観察して写真を撮った。撮った写真に対してImaging-Proソフトウェアを使用して陽性染色デンシトメトリー分析をした。
グリア線維性酸性タンパク質(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)は、細胞骨格に関与し、その引張強度を維持するアストロサイトの特徴的な中間径フィラメントタンパク質である[6]。
その結果、ブランク対照群(図9A)のマウスの海馬には一定レベルのGFAPがあり(矢印でマーク)、溶媒群(図9B)のマウスの海馬のGFAPの発現は減少し、投与群のマウスの海馬におけるGFAPレベルは溶媒群(図9C)よりも有意に高く、しかもその統計的な差は有意差に近かった(図9D)(P=0.051)。これは、プラスミノーゲンが、多発性硬化症モデルマウスの海馬におけるGFAPの発現の増加を促進し、アストロサイト活性の上昇を促進できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、28日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。29日目にオープンフィールド実験を行った。
多発性硬化症の患者には、精神医学的症状はよく見られ、主にうつ病、イライラ、癇癪として現れ、一部の患者は、多幸感や興奮のように見えるが、無関心、無気力、強い泣き笑い、無反応、知能の低下、言語の繰り返し、疑い、及び迫害の妄想などとして現れることもある。また、記憶喪失や注意力障害などの認知機能障害も発生する可能性がある[7]。
オープンフィールド実験
実験時、オープンフィールド(40×40×40cm)の底面中央にマウスを置き、撮影と計時を同時に行い、持続して5分間観察し、各マウスは3回の実験を行った。Smart Systemは、実験動物の行動を評価するための完全な使いやすいビデオ追跡システムである。軌跡、アクティビティ、特定の動作(回転、ストレッチ、摂食など)およびイベントを記録し、さまざまな分析パラメーターの計算を実行できる。この実験では、Smart3.0システムを使用して、マウスの動きを記録および分析した。パラメーターは、総移動距離、境界休憩時間率、中央ゾーンの平均移動速度、および境界の平均移動速度を含む。各実験では、匂いの好みを防ぐために70%のアルコールを使用してボックスを拭いた[8]。
オープンフィールド実験の設計原理は、マウスの回避に基づいている。これは、マウスが開けた場所、未知の場所、潜在的に危険な場所を恐れているため、「壁に張り付く」性質を持っていることを指す。回避は、フィールドの周辺領域(4つのコーナーと4つの側面)でのマウスの活動によって評価された。回避を反映した周囲での活動時間から判断すると、時間が短縮することは、マウスがより「冒険的」な傾向にあることを示し、中央ゾーンでの活動時間が大幅に長くなることは、回避と不安(うつ病)のレベルが低いことを示す。
総移動距離は、オープンフィールド実験中の各領域でのマウスの総移動距離である。その結果、ブランク対照群のマウスには一定の総移動距離があり、溶媒群のマウスの総移動距離は有意に増加し、投与群のマウスの総移動距離は溶媒群のマウスよりも有意に小さく、その差は統計的に有意であり(*はP<0.05を示す)(図10)、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動を緩和できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、28日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。29日目にオープンフィールド実験を行った。
境界ゾーンでの休憩時間の割合=境界ゾーンでの休憩時間/総観察時間である。その結果、ブランク対照群のマウスが境界ゾーンで一定の休憩時間の割合(約57.8%)を持っており、溶媒群のマウスの境界ゾーンでの休憩時間の割合は大幅に減少し、約49.3%であり、投与群のマウスは境界ゾーンでの休憩時間の割合は約58.4%であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計的に有意であり(*はP<0.05を表す)(図11)、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群のマウスに0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、34日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。35日目に3ボックスの社会的テスト実験を行った。
3ボックス実験の開始前に、環境に適応させるようにマウスを行動試験室に30分間入れた。3つのボックスを透明なガラス樹脂板で隔て、試験マウスを中央のボックスに5分間入れて適応させ、ストレンジャーマウス1を左または右のボックスの金属製ケージにランダムに入れ、もう一方のボックスの金属ケージは空にした。ボックスを隔てるガラス樹脂板を取り外して、試験マウスが3つのボックス内で10分間自由に移動できるようにした。すぐに撮影を開始し、関連するパラメーターを記録した。第1段階:1)実験マウスとストレンジャーマウス1または空の金属製ケージとの直接接触の回数及び持続時間を記録した。金属製ケージの周囲3~5cmを接触範囲と定義する。2)実験マウスが各ボックスに入った回数及び持続期間を記録した。マウスは、頭と足がボックスに入ったときにそのボックスの中にいると見なされる。第2段階:第2段階の実験では、2番目のストレンジャーマウス(ストレンジャーマウス2)を空の金属ケージに入れ、10分間記録し、実験マウスとストレンジャーマウス1及びストレンジャーマウス2との接触時間及び回数を記録した。正常なマウスは社会的行動を示し、1段階の実験では、正常なマウスは通常、ストレンジャーマウス1との接触の時間及び回数が、空の金属ケージとの接触の時間及び回数よりもはるかに多い。同時に、マウスは記憶力と「新しいものを喜び、古いものを嫌う」という特徴も持っているため、第2段階では、マウスは、10分間交流したことのあるストレンジャーマウス1よりも、一度もあったことのないストレンジャーマウス1と交流することを好む。
休憩時間の割合=休憩時間/総観察時間である。3ボックス社会的試験実験の第2段階の結果により明らかに、ブランク対照群のマウスは、ストレンジャーマウス2の接触範囲内で一定の割合の休憩時間を持っており、約13.7%であり、溶媒群では、約10.6%と有意に減少し、投与群は約16.1%であり、溶媒群よりも有意に高く、しかもその統計学的な差は有意に近かった(P=0.075)(図12)。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの社会的記憶を改善できることを示している。
3週齢のオスラット26匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なラットを除外した後、すべてのラットをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で18匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群に0.6%CPZのモデリング飼料を与え、14日間モデリングして多発性硬化症モデルを確立した[9]。同時に、すべてのラットに通常の維持食を与え始めた。モデリングが完了した後、すべてのラットをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のラットをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で7匹、投与群で8匹とした。群分けが完了した後、溶媒群及び投与群のラットに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、投与群のラットに35mg/kgでプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のラットに3.5ml/kgで溶媒を尾静脈注射により投与し、6日間連続投与し、ブランク対照群のラットには投与しなかった。投与の7日目にオープンフィールド実験を行った。
境界ゾーンの移動距離は、オープンフィールド実験の試験時間内における境界ゾーンの移動軌跡の長さである。境界ゾーンの移動距離の割合=境界ゾーンの移動距離/境界ゾーンと中央ゾーンの移動距離の合計である。その結果、ブランク対照群は境界ゾーンで一定の割合の移動距離を持っており、約91.1%であり、溶媒群は約93.6%と有意に増加し、投与群は約88.1%であり、溶媒群よりも有意に低く、しかもその差は統計的に有意であった(*はP<0.05を表す)(図13)。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルラットの抑うつ行動を緩和できることを示している。
3週齢のオスラット26匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なラットを除外した後、すべてのラットをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で18匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群に0.6%CPZのモデリング飼料を与え、14日間モデリングして多発性硬化症モデルを確立した[9]。同時に、すべてのラットに通常の維持食を与え始めた。モデリングが完了した後、すべてのラットをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のラットをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で7匹、投与群で8匹とした。群分けが完了した後、溶媒群及び投与群のラットに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、投与群のラットに35mg/kgでプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒群のラットに3.5ml/kgで溶媒を尾静脈注射により投与し、6日間連続投与し、ブランク対照群のラットには投与しなかった。投与の7日目にオープンフィールド実験を行った。
中心ゾーンの移動距離は、オープンフィールド実験の試験時間内における中心ゾーンの移動軌跡の長さである。中心ゾーンの移動距離の割合=中心ゾーンの移動距離/境界ゾーンと中央ゾーンの移動距離の合計である。その結果、ブランク対照群は中心ゾーンで一定の割合の距離を持っており、約8.9%であり、溶媒群は約6.4%と有意に低下し、投与群は約11.9%であり、溶媒群よりも有意に高く、しかもその差は統計的に有意であった(*はP<0.05を表す)(図14)。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルラットの不安行動を緩和できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群に0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、20日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。21日目に高架式十字迷路実験を行った。
高架式十字迷路は、動物の新しい異なる環境の探索特性及び高くぶら下げるオープンアームへの恐怖を利用して相反する行動を形成し、動物の不安状態を調べる。高架十字迷路には1対のオープンアームと1対のクローズアームがある。齧歯類は暗所嗜好のためクローズアームで移動する傾向があるが、好奇心と探索のためにオープンアームで移動し、新しい刺激に直面すると、動物は探索する衝動と恐怖を同時に感じる。これは、探索と回避の相反する行動を引き起こし、結果として不安が生じる。抗不安薬は、オープンアームに入る回数と時間を大幅に増やすことができる。十字迷路は地面から高く、崖の上に立っているのと同じであるため、被験者に恐怖と不安を感じさせる。高架式十字迷路は、新薬の開発/スクリーニング/評価、薬理学、毒物学、予防医学、神経生物学、動物心理学、行動生物学などの複数の分野における科学研究およびコンピューター支援教育などの分野で広く使用されており、医学部や科学研究機関での行動研究、特に不安やうつ病の研究における古典的な実験である。
実験の開始時に、マウスをクローズアームに向かって中央のグリッドから迷路に入れ、5分間の活動を記録した。観察指標は、オープンアームエントリの回数(2つの前足がアームに入る必要がある)、オープンアームの滞留時間、クローズアームエントリの回数、およびクローズアームの滞留時間を含む。オープンアームの滞留時間の割合、オープンアームエントリ時間の割合、および高架式十字迷路のエントリの総数を計算した。実験が終わった後、マウスを取り出し、両腕をきれいにし、アルコールをスプレーして臭いを取り除いた。最後に、動物行動学ソフトウェアを使用してデータ分析を行った。
オープンアームエントリの割合=オープンアームエントリの総数/オープンアームエントリとクローズアームエントリの合計である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のオープンアームエントリ率を有し、約14.9%であり、溶媒群のマウスのオープンアームエントリ率は、約23.0%と有意に増加し、投与群のマウスのオープンアームエントリ率は約14.5%であり、溶媒群よりも有意に少なく、その差は統計学的に有意であり(P=0.015)(図15)、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安行動をある程度緩和できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食を与え、モデル群に0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、20日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与えた。21日目に高架式十字迷路実験を行った。
クローズアームエントリの割合=クローズアームエントリの総数/オープンアームエントリとクローズアームエントリの合計である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアームエントリ率を有し、約34.4%であり、溶媒群のマウスのクローズアームエントリ率は、約28.1%と有意に低下し、投与群のマウスのクローズアームエントリ率は約37.1%であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計学的に有意であり(P=0.007)(図16)、しかもブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群に0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、27日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。28日目に高架式十字迷路実験を行った。
クローズアームの移動の合計距離は、高架式十字迷路実験の試験時間中にマウスのクローズアームの移動の合計距離である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアーム移動の合計距離を有し、溶媒群のマウスのクローズアーム移動の合計距離が有意に増加し、投与群のマウスのクローズアーム移動の合計距離は溶媒群よりも有意に少なく、その差は統計学的に有意であり(*はP<0.05を表す)(図17)、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
C57メスマウス30匹を取り、モデリング前に体重を測定し、体重に応じて異常なマウスを除外した後、すべてのマウスをランダムに2つの群に分け、ブランク対照群で8匹、モデル群で22匹とした。群分けが完了した後、ブランク対照群に通常の維持食(北京科澳協力有限公司から購入)を与え、モデル群に0.6%ジシクロヘキサノンオキサリルジヒドラゾン(CPZ)(製造元:上海源葉生物科技有限公司;カタログ番号:S30349)のモデリング飼料を42日間連続して与え、多発性硬化症モデルを誘発した[1]。モデリングが完了した後、すべてのマウスをオープンフィールドテストでテストし、モデル群のマウスをテスト結果に従って群分けし、溶媒群で11匹、投与群で11匹とした。群分けが完了した後、すべてのマウスに投与を開始し、これを投与の1日目として記録し、ブランク対照群マウス及び溶媒群マウスに0.1ml/匹/日で溶媒を尾静脈注射により投与し、投与群マウスに1mg/匹/日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、27日間連続投与した。投与期間中、すべてのマウスに通常の維持食を与えた。28日目に高架式十字迷路実験を行った。
クローズアーム休憩時間の割合=クローズアーム休憩時間/クローズアーム移動時間とクローズアーム休憩時間の合計である。その結果、ブランク対照群のマウスは一定のクローズアーム休憩時間の割合を有し、約51.8%であり、溶媒群のマウスのクローズアーム休憩時間の割合は36.8%と有意に低下し、投与群のマウスのクローズアーム休憩時間の割合は約50.1%であり、溶媒群よりも有意に大きく、その差は統計学的に有意であり(*はP<0.05を表す)(図18)、ブランク対照群に近かった。これは、プラスミノーゲンが多発性硬化症モデルマウスの不安や抑うつ行動をある程度緩和できることを示している。
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58(1-2):40.
配列表
配列1:
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配列2:
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配列3:
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Claims (9)
- プラスミノーゲンを含む、多発性硬化症を予防及び治療する医薬組成物。
- 前記プラスミノーゲンが、神経ミエリンの再生を促進する活性、ミエリンタンパク質の発現を促進する活性、神経組織NFPの発現を促進する活性、神経線維の再生を促進する活性、神経組織NFPの発現を促進する活性、神経組織のMBPレベルを上昇させる活性、神経組織のミクログリア数を増加させる活性、神経組織の炎症修復を促進する活性、神経組織のアストロサイトの活動を促進する活性、神経組織のBDNFのレベルを高める活性、神経組織のGFAPの発現を促進する活性、被験者の社会的行動能力を改善する活性、被験者の社会的記憶能力を改善する活性、被験者の抑うつ行動を緩和する活性、及び被験者の不安行動を緩和する活性から選択される1つまたは複数の活性を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記プラスミノーゲンが、配列2と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つプラスミノーゲンのタンパク質加水分解活性を有する、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記プラスミノーゲンが、配列2のプラスミノーゲンの保存的置換変異体である、請求項1~3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記プラスミノーゲンが、1つまたは複数の他の治療方法または薬剤と組み合わせて使用する、請求項1~4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記他の治療方法が、外科的治療、細胞療法、及び物理的療法から選択される1つまたは複数である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記細胞療法が、幹細胞療法である、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記他の薬剤が、ホルモン、免疫抑制剤、神経栄養薬、抗生物質、及び抗ウイルス薬から選択される1つまたは複数である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記プラスミノーゲンが、鼻吸入、エアロゾル吸入、点鼻薬、点眼薬、点耳薬、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、髄腔内、動脈内、及び筋肉内から選択される1つまたは複数の方法もしくは経路によって投与される、請求項1~8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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PLOS ONE,2015年04月27日,Vol. 10, No. 4, e0124510,p. 1-17,https://doi.org/10.1371/journal.pone.0124510 |
PNAS,Vol. 101, No. 17,2004年04月27日,p. 6698-6703,www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0303859101 |
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