JP2023550154A - サイトケラチンに対する抗腫瘍応答 - Google Patents

Abstract

本発明は、がんの免疫療法に使用できるシトルリン化サイトケラチンペプチドに関する。修飾ペプチドは、ワクチンとして、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び養子Ｔ細胞移入療法の標的として使用できる。このようなワクチン又は標的は、がんの治療に使用してもよい。

Description

本発明は、がん免疫療法において使用できる修飾サイトケラチンペプチドに関する。この修飾ペプチドは、ワクチンとして、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び養子Ｔ細胞移入療法の標的として使用できる。このようなワクチン又は標的は、がんの治療に使用できる。

がんワクチンが効果的であるためには、耐性を破壊し、免疫抑制性の腫瘍環境を克服できる強力な免疫応答を誘導する必要がある。最近、腫瘍を破壊するＣＤ４ Ｔ細胞の重要性が強調されているが、自己特異的なＣＤ４応答の誘導は困難であることが証明されている。一方、修飾された自己エピトープを認識するＣＤ４ Ｔ細胞は、関節リウマチ（ＲＡ）、コラーゲンＩＩ誘発関節炎、サルコイドーシス、セリアック病及び乾癬といったいくつかの自己免疫疾患の病態生理に関与することが示されている（Choy 2012；Grunewald and Eklund 2007；Coimbra et al. 2012；Holmdahl et al. 1985）。これらの一般的な修飾の１つはアルギニンのシトルリン化であり、アルギニンの正電荷のアルジミン基（＝ＮＨ）から、シトルリンの中性電荷のケトン基（＝Ｏ）への変換である。シトルリン化は、さまざまな組織に存在するカルシウム依存性酵素のペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）が関与する。最近、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるシトルリン化Ｔ細胞エピトープの提示が、オートファジー及びＰＡＤ活性に依存することも、Irelandらによって実証された（Ireland and Unanue 2011）。このプロセスは、プロフェッショナルＡＰＣ及び上皮細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子で提示するために、内因性の抗原処理を可能にするメカニズムであることも実証されている（Munz 2012；Schmid, Pypaert, and Munz 2007）。オートファジーはＡＰＣでは構成的であるが、他の細胞ではストレスによってのみ誘導される（Green and Levine 2014）。シトルリン化エピトープを認識するＴ細胞は、シトルリン化ペプチドを発現しない正常な細胞を標的としない。オートファジーは、低酸素及び栄養飢餓などのストレスで誘発され、腫瘍の生存を促進するためにアップレギュレートされる（Green and Levine 2014）。

サイトケラチンは、全ての上皮細胞で発現する中間径フィラメント（ＩＦ）タンパク質の最大のファミリーであり、それらは、著しい生化学的多様性（Liao, Ku, and Omary 1997）、広範な組織分布、複数の機能及び疾患との関連（Chou, Skalli, and Goldman 1997；Chang et al. 2013）を有している。それらは、細胞膜から細胞質に足場を形成することにより、細胞の形状と剛性を維持する上で重要な役割を果たす（Fuchs and Cleveland 1998）。構造的な機能に加え、細胞周期の進行、アポトーシス、ストレスに対する細胞応答、タンパク質合成、細胞サイズ及び膜輸送を調節する細胞シグナル伝達経路にも関与する（Paramio and Jorcano 2002；Coulombe and Omary 2002；Oshima 2002）。

サイトケラチンの発現をプロファイリングすることで、特定のサイトケラチンの存在による上皮細胞の分類が可能となる（Moll, Divo, and Langbein 2008；Moll et al. 1982）。サイトケラチン８、１８及び１９は単層上皮細胞で発現し、サイトケラチン５及び１４は基底上皮細胞で発現する。サイトケラチンフィラメントは柔軟であり、機械的及び非機械的な刺激の変化に応答して再編成して、細胞のシグナル伝達及び遊走を含むさまざまな細胞プロセスを調節できる（Gu and Coulombe 2007；Chung, Rotty, and Coulombe 2013）。

サイトケラチンの発現は、病理学者ががんを分類するのに使用してきた：がん細胞の大部分は上皮細胞に由来する。サイトケラチンタンパク質の発現を調査するために腫瘍を染色することは、病理学者が、腫瘍を特定するのに非常に役に立つことが証明されている；１９８０年代以降、サイトケラチン特異的モノクローナル抗体は、がんの診断に使用されてきた（Oshima 2007；Moll, Divo, and Langbein 2008）。例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）では、サイトケラチン１７の過剰発現は、腺がんよりも、扁平上皮がんに関連する（Moll, Divo, and Langbein 2008）。

サイトケラチンが、がん細胞の転移に関与し、患者の予後の一因となることを示す研究が増加している（Karantza 2011）。例えば、結腸直腸がんでは、サイトケラチン８及びサイトケラチン２０の発現の減少は、がん細胞の上皮間葉転換（ＥＭＴ）及び患者の生存率の低下と関連する（Knosel et al. 2006）。膵臓がん患者では、膵臓腺がん患者の骨髄及び／又は血液中のサイトケラチン２０の発現は、予後不良と相関する（Soeth et al. 2005；Matros et al. 2006；Schmitz-Winnenthal et al. 2006）。明細胞ＲＣＣにおけるサイトケラチン７及びサイトケラチン１９の共発現は、良好な臨床転帰に関連する（Mertz et al. 2008）。これに対して、循環腫瘍細胞におけるサイトケラチン８及び１８の共発現は、原発腫瘍切除の際の転移の存在及び低い全生存率と相関する（Bluemke et al. 2009）。サイトケラチンの発現と予後についての他の相関は、胃がん（Katsuragi et al. 2007）、肝細胞がん（Yang et al. 2008）、子宮内膜がん（Stefansson, Salvesen, and Akslen 2006）及び皮膚がん（Chen et al. 2009）を含む多くのがんにおいても見られる。

Ｉ型及びＩＩ型サイトケラチンのヘテロ二量体が形成され、更に重合してフィラメントを形成するように調節される、２８のＩ型配列及び２６のＩＩ型配列の５４のケラチン遺伝子が存在する。このプロセスは転写及び翻訳後の段階で調節されている（Gu and Coulombe 2007）。ケラチン、ＩＩ型細胞骨格８、ケラチン８としても知られているサイトケラチン８は、第１２染色体に局在するＩＩ型サイトケラチンのメンバーである。２つの選択的スプライシングバリアント、５３ｋＤａ、４８３アミノ酸のアイソフォーム１（P05787-1）、及び、５６ｋＤａ、５１１アミノ酸のアイソフォーム２（P05787-2）が、選択的プロモーターの使用と選択的スプライシングによって産生される（図１Ａ）。多くの変異も特定されており、肝臓疾患、膵炎及び炎症性腸疾患に関連している（Szeverenyi et al. 2008）。

サイトケラチン８（Ｃｙｋ８）は、サイトケラチン１８と重合する周知の上皮マーカータンパク質である。このサイトケラチンのペアは、胚で最初に発現する。成体の組織では、このペアの発現は、単層上皮（肝臓、膵臓、腎臓など）及び混合上皮（乳房、肺など）に限定される（Moll et al. 1982；Owens and Lane 2003；Franke et al. 1981；Blobel et al. 1984）。このペアの過剰発現は、腺がん及び扁平上皮がんで観察されている（Oshima, Baribault, and Caulin 1996；Vaidya et al. 1989）。乳がん及び黒色腫では、ビメンチンと共にサイトケラチン８及び１８が発現すると、薬剤耐性、浸潤及び転移が増加することが報告されている（Thomas et al. 1999）。Ｃｙｋ８の異常な発現は、非小細胞肺がんでも見いだされ、ＮＳＣＬＣの患者の血清にも存在する（Fukunaga et al. 2002）。Ｃｙｋ８の自己抗体は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者でも見いだされており、ＲＡに関連するいわゆる抗ケラチン抗体の真の抗原の１つとして説明されている（Wang et al. 2015）。

サイトケラチンタンパク質は、特にストレス時に上皮の構造的完全性を維持するのに重要な役割を果たす。これは重要な細胞調節因子であるが、上皮の腫瘍形成及びがん治療の応答性に関与することを示す証拠が増加している。タンパク質の翻訳後修飾は、細胞ストレス下で生じる。そのような修飾の１つに、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）酵素によるアルギニン残基のシトルリンへの変換であるシトルリン化がある。シトルリン化は、ストレスを受けた細胞で誘導される分解とリサイクル過程（オートファジー）の結果として生じる（Ireland and Unanue 2011）。シトルリン化されたエピトープは、その後、ＣＤ４ Ｔ細胞による認識のためにＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される。シトルリン化タンパク質に応答して放出される強力な免疫応答は、がん細胞を破壊するために利用され、方向転換される。この免疫応答はキラーＣＤ４ Ｔ細胞によるもので、大量のＩＦＮγが分泌される。これによりＭＨＣクラスＩＩの発現が増加し、ＣＤ８ Ｔ細胞が関与することなく腫瘍細胞を直接死滅させる（Brentville et al. 2016；Durrant, Metheringham, and Brentville 2016）。腫瘍の認識は、シトルリン化及びオートファジーの両者に依存する。細胞骨格タンパク質であるビメンチンに由来する２つのシトルリン化ペプチドでマウスを免疫した後に、多数のＩＦＮγ分泌ＣＤ４ Ｔ細胞が誘導されることが示されている。ex vivoでは、これらのＣＤ４ Ｔ細胞は、飢餓又はラパマイシンのいずれかによってオートファジーが誘導された腫瘍細胞を認識する。腫瘍におけるビメンチンの機能及び発現は、国際公開第2014/023957号に詳しく説明されている。

サイトケラチン８のアイソフォーム及びヒトサイトケラチン８と他の種の配列のアラインメント サイトケラチン８には２種類のアイソフォームが存在する（アイソフォーム１及びアイソフォーム２、図１Ａ）。 サイトケラチン８のアイソフォーム及びヒトサイトケラチン８と他の種の配列のアラインメント ヒトサイトケラチン８（Ｂ）と他の種（マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウサギ及びヒツジ）の配列のアラインメント。 図１Ｂの続き シトルリン化サイトケラチン８ペプチドプールに対するＩＦＮγ応答のスクリーニング HHDII/DP4を発現するトランスジェニックマウスを用いて、ペプチドに対するＩＦＮγ応答をスクリーニングした。マウスを、２～３個の重複しないヒトＣｙｋ８シトルリン化ペプチドのペプチドプールで３週間、免疫した。初回投与から２１日後に脾細胞を採取した。ヒトＣｙｋ８ ｃｉｔペプチドによる刺激に対するex vivo応答を、ＩＦＮγELISpotで評価した。培地のみの応答を陰性対照として用いた。各記号は個々のマウスの平均の応答を表し、横線はマウス間の中央値を表す。各プールの培地のみの応答に対するペプチド応答の統計的有意性を、ＡＮＯＶＡとDunnettの事後検定を用いて決定し、^＊ｐ＜０．５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１で有意なｐ値のみを示す。 シトルリン化サイトケラチン８ペプチドプールに対するＩＦＮγ応答のスクリーニング 親C57BLマウスを用いて、ペプチドに対するＩＦＮγ応答をスクリーニングした。マウスを、２～３個の重複しないヒトＣｙｋ８シトルリン化ペプチドのペプチドプールで３週間、免疫した。初回投与から２１日後に脾細胞を採取した。ヒトＣｙｋ８ ｃｉｔペプチドによる刺激に対するex vivo応答を、ＩＦＮγELISpotで評価した。培地のみの応答を陰性対照として用いた。各記号は個々のマウスの平均の応答を表し、横線はマウス間の中央値を表す。各プールの培地のみの応答に対するペプチド応答の統計的有意性を、ＡＮＯＶＡとDunnettの事後検定を用いて決定し、^＊ｐ＜０．５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１で有意なｐ値のみを示す。Cyk8 133-151 cit、Cyk8 217-236 cit、Cyk8 371-388 citペプチドを用い、０．００１μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌでペプチド滴定を行い（Ｃ）、データを対数目盛でプロットし、GraphPad Prismを用いてＥＣ_５０値を計算した。カーブフィット（Ｒ^２）が０．９５を超える曲線のみ示す。 シトルリン化サイトケラチン８ペプチドプールに対するＩＦＮγ応答のスクリーニング Cyk8 133-151 cit、Cyk8 217-236 cit、Cyk8 371-388 citペプチドを用い、０．００１μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌでペプチド滴定を行い、データを対数目盛でプロットし、GraphPad Prismを用いてＥＣ_５０値を計算した。カーブフィット（Ｒ^２）が０．９５を超える曲線のみ示す。 複数のシトルリン化サイトケラチン８ペプチドは強力なＩＦＮγ応答を誘導する HLA-DP4マウスを、Cyk8 101-120、Cyk8 133-151、Cyk8 217-236、Cyk8 371-388及びCyk8 381-399シトルリン化ペプチドで、３週間、毎週免疫した。３回目の投与の７日後に脾細胞を採取した。Ｃｙｋ８シトルリン化ペプチド及び野生型ペプチドに対する応答を決定するために、ex vivo ＩＦＮγELISpotを行った。各記号は個々のマウスの平均の応答を表し、横線はマウス間の中央値を表す。Ｃｙｋ８ ｗｔペプチドへの応答に対するＣｙｋ８ ｃｉｔへのペプチド応答の統計的有意性を、Mann-Whitney検定を用いて決定し、有意なｐ値のみを示す。 複数のシトルリン化サイトケラチン８ペプチドは強力なＩＦＮγ応答を誘導する HLA-DP4マウスを、Cyk8 101-120、133-151及び371-388野生型ペプチドで、３週間、毎週免疫した。３回目の投与の７日後に脾細胞を採取した。Ｃｙｋ８シトルリン化ペプチド及び野生型ペプチドに対する応答を決定するために、ex vivo ＩＦＮγELISpotを行った。各記号は個々のマウスの平均の応答を表し、横線はマウス間の中央値を表す。Ｃｙｋ８ ｗｔペプチドへの応答に対するＣｙｋ８ ｃｉｔへのペプチド応答の統計的有意性を、Mann-Whitney検定を用いて決定し、有意なｐ値のみを示す。 相同なヒト及びマウスのシトルリン化サイトケラチン８ 217-236ペプチドは、同様のＩＦＮγ応答を誘導する マウスサイトケラチン８とヒトサイトケラチン８の配列の比較した。 相同なヒト及びマウスのシトルリン化サイトケラチン８ 217-236ペプチドは、同様のＩＦＮγ応答を誘導する HHDII/DP4マウスで、マウス及びヒトCyk8 217-236 citを試験した。マウスを、マウスCyk8 217-236シトルリン化ペプチドで、３週間、毎週免疫した。３回目の投与の７日後に脾細胞を採取した。ex vivo ＩＦＮγELISpotを行い、マウス及びヒトCyk8 217-236シトルリン化ペプチド、並びにヒトCyk8 217-236野生型ペプチドに対する応答を決定した。各記号は個々のマウスの平均の応答を表し、横線はマウス間の中央値を表す。マウスＣｙｋ８ 217-236 cit、ヒトＣｙｋ８ 217-236 cit及びヒトＣｙｋ８ ｗｔペプチドに対するペプチド応答の統計的有意性を、Dunnettの多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡで決定した、^＊ｐ＜０．５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意性なし。 サイトケラチン８ペプチドは、他のサイトケラチンと相同性を有する 異なるサイトケラチン間の高度の配列相同性のために、今回特定したサイトケラチン８ペプチドについてペプチドのBLAST検索を行った。これらのペプチドは、相同であるか、アミノ酸のミスマッチが１つであるという結果が示される。 HHDII/DP4及びC57BL/6マウスにおけるサイトケラチン８（Ｃｙｋ８）ｃｉｔペプチド応答の特徴付け HHDII/DP4マウスを、個々のシトルリン化ペプチドで、３週間、毎週、免疫した。３回目の投与の７日後に脾細胞を採取した。ex vivo ELISpotは２１日目に行った。脾細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ブロッキング抗体の存在下、培地又はｃｉｔペプチドで再刺激した。各記号は個々のマウスの平均の応答を表し、横線はマウス間の中央値を表す。ＣＤ４／ＣＤ８ブロッキング抗体の非存在下での応答に対する、これらのブロッキング抗体の存在下での応答の統計的有意性を、Dunnettの多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡで決定した、^＊ｐ＜０．５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意性なし。 HHDII/DP4及びC57BL/6マウスにおけるサイトケラチン８（Ｃｙｋ８）ｃｉｔペプチド応答の特徴付け C57BL/6マウスを、個々のシトルリン化ペプチドで、３週間、毎週、免疫した。３回目の投与の７日後に脾細胞を採取した。ex vivo ELISpotは２１日目に行った。脾細胞を、ＣＤ４／ＣＤ８ブロッキング抗体の存在下、培地又はｃｉｔペプチドで再刺激した。各記号は個々のマウスの平均の応答を表し、横線はマウス間の中央値を表す。ＣＤ４／ＣＤ８ブロッキング抗体の非存在下での応答に対する、これらのブロッキング抗体の存在下での応答の統計的有意性を、Dunnettの多重比較検定を用いたＡＮＯＶＡで決定した、^＊ｐ＜０．５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意性なし。 マウスでは単回免疫の１４日後に応答が現れることから、これらはナイーブな応答であることが示唆される HHDII/DP4トランスジェニックマウスを、マウスを犠牲にする２日前又は１４日前に、CpG/MPLA中のサイトケラチン8 371-388 citペプチドを１回投与して免疫し、ex vivo ELISpotを行ってＩＦＮγ応答を決定した。各記号は個々のマウスの平均の応答を表し、横線はマウス間の中央値を表す。ｐ値は、１４日目のペプチド応答と比較した有意差を表し、有意なｐ値のみを示す。 がん細胞におけるサイトケラチン８の発現及びin vitroシトルリン化後のシトルリン化サイトケラチン８の検出 サイトケラチン８及びβアクチンをプローブしたがん細胞株である、組換えサイトケラチン８（レーン１）、ラダー（レーン２）、PY230（レーン３）、PANO2（レーン４）、LLC2（レーン５）、TRAMP（レーン６）、ID8（レーン７）、B16F1（レーン８）、PY8119（レーン９）の溶解物のイムノブロット。バンドは、サイトケラチン８（５３ｋＤａ）及びβ-アクチン（４３ｋＤａ）の予想されるサイズに対応する。 がん細胞におけるサイトケラチン８の発現及びin vitroシトルリン化後のシトルリン化サイトケラチン８の検出 Ｃｙｋ８のin vitroシトルリン化は、ＰＡＤ２又はＰＡＤ４のいずれかの存在下で行った。、組換えサイトケラチン８（レーン１）、サイトケラチン８＋ＰＡＤ２（レーン２）、サイトケラチン８＋ＰＡＤ４（レーン３）。 ヒトサイトケラチン８ 371-388 citペプチドは、抗腫瘍実験においてin vivoでの生存率に有利な点をもたらす HHDII/DP4マウスに、B16腫瘍とＩＦＮγ誘導ＤＰ４を投与した。４日、１１日及び１８日目に、HHDII/DP4マウスをCyk8 371-388 cit又はCyk8 371-388 wtペプチドで免疫した。免疫を行っていない対照マウス、及びCyk8 371-388 citペプチド又はCyk8 371-388 wtペプチドのいずれかで免疫したマウスの全生存率を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、Mantel-Cox検定で求め、ｐ値を示す（全群ｎ＝１０）。 ヒトサイトケラチン８ 371-388 citペプチドは、抗腫瘍実験においてin vivoでの生存率に有利な点をもたらす HHDII/DP4マウスに、B16腫瘍とＩＦＮγ誘導ＤＰ４を投与した。４日、１１日及び１８日目に、HHDII/DP4マウスをCyk8 371-388 cit又はCyk8 371-388 wtペプチドで免疫した。免疫を行っていない対照マウス、及びCyk8 371-388 citペプチド又はCyk8 371-388 wtペプチドのいずれかで免疫したマウスの、腫瘍移植後２９日目の腫瘍体積を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、Mantel-Cox検定で求め、ｐ値を示す。腫瘍体積の中央値及びMann Whitney U検定で求めたｐ値を示す（全群ｎ＝１０）。 ヒトサイトケラチン８ 371-388 citペプチドは、抗腫瘍実験においてin vivoでの生存率に有利な点をもたらす HHDII/DP4マウスに、B16腫瘍とＩＦＮγ誘導ＤＰ４を投与した。４日、１１日及び１８日目に、HHDII/DP4マウスをCyk8 371-388 cit又はCyk8 371-388 wtペプチドで免疫した。免疫を行っていない対照マウス、及びCyk8 371-388 citペプチド又はCyk8 371-388 wtペプチドのいずれかで免疫したマウスの、実験期間中の腫瘍体積を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、Mantel-Cox検定で求め、ｐ値を示す。腫瘍体積の中央値及びMann Whitney U検定で求めたｐ値を示す（全群ｎ＝１０）。 ヒトサイトケラチン８ 101-120 citペプチドは、抗腫瘍実験においてin vivoでの生存率に有利な点をもたらす HHDII/DP4マウスに、B16腫瘍とＩＦＮγ誘導ＤＰ４を投与した。４日、１１日及び１８日目に、HHDII/DP4マウスをCyk8 371-388 citペプチドで免疫した。免疫を行っていない対照マウス及びCyk8 101-120 citペプチドで免疫したマウスの全生存率を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、Mantel-Cox検定で求め、ｐ値を示す（全群ｎ＝１０）。 ヒトサイトケラチン８ 101-120 citペプチドは、抗腫瘍実験においてin vivoでの生存率に有利な点をもたらす HHDII/DP4マウスに、B16腫瘍とＩＦＮγ誘導ＤＰ４を投与した。４日、１１日及び１８日目に、HHDII/DP4マウスをCyk8 371-388 citペプチドで免疫した。免疫を行っていない対照マウス及びCyk8 101-120 citペプチドで免疫したマウスの腫瘍移植後２４日目の腫瘍体積を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、Mantel-Cox検定で求め、ｐ値を示す。腫瘍体積の中央値及びMann Whitney U検定で求めたｐ値を示す（全群ｎ＝１０）。 ヒトサイトケラチン８ 101-120 citペプチドは、抗腫瘍実験においてin vivoでの生存率に有利な点をもたらす HHDII/DP4マウスに、B16腫瘍とＩＦＮγ誘導ＤＰ４を投与した。４日、１１日及び１８日目に、HHDII/DP4マウスをCyk8 371-388 citペプチドで免疫した。免疫を行っていない対照マウス及びCyk8 101-120 citペプチドで免疫したマウスの実験期間中の腫瘍体積を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、Mantel-Cox検定で求め、ｐ値を示す。腫瘍体積の中央値及びMann Whitney U検定で求めたｐ値を示す（全群ｎ＝１０）。 サイトケラチン８ 8-26 citペプチドは、抗腫瘍実験においてin vivoでの生存率に有利な点をもたらす C57BL/6にB16腫瘍（親非トランスフェクト細胞株）を投与した。４日後、C57BL/6マウスをCyk8 8-26 citペプチドで免疫した。免疫を行っていない対照マウス及びCyk8 8-26 citペプチドで免疫したマウスの全生存率を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、Mantel-Cox検定で求め、ｐ値を示す（全群ｎ＝１０）。 サイトケラチン８ 8-26 citペプチドは、抗腫瘍実験においてin vivoでの生存率に有利な点をもたらす C57BL/6にB16腫瘍（親非トランスフェクト細胞株）を投与した。４日後、C57BL/6マウスをCyk8 8-26 citペプチドで免疫した。免疫を行っていない対照マウス及びCyk8 8-26 citペプチドで免疫したマウスの腫瘍移植後１３日目の腫瘍体積を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、Mantel-Cox検定で求め、ｐ値を示す。腫瘍体積の中央値及びMann Whitney U検定で求めたｐ値を示す（全群ｎ＝１０）。 サイトケラチン８ 8-26 citペプチドは、抗腫瘍実験においてin vivoでの生存率に有利な点をもたらす C57BL/6にB16腫瘍（親非トランスフェクト細胞株）を投与した。４日後、C57BL/6マウスをCyk8 8-26 citペプチドで免疫した。免疫を行っていない対照マウス及びCyk8 8-26 citペプチドで免疫したマウスの実験期間中の腫瘍体積を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、Mantel-Cox検定で求め、ｐ値を示す。腫瘍体積の中央値及びMann Whitney U検定で求めたｐ値を示す（全群ｎ＝１０）。 ヒトサイトケラチン101-120 citペプチドは、健康なドナーのＰＢＭＣで応答を誘導する １８人の健常者からＰＢＭＣを得、その大半でＨＬＡタイピングを行い、１３人はＨＬＡ-ＤＰ４陽性、２人はＨＬＡ-ＤＰ４陰性であり、３人のＨＬＡタイプは決定しなかった。単離したＰＢＭＣを、培地又はヒトCyk8 101-120 citペプチドと共に培養した。Cyk8 101-120 citペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。代表的なフローサイトメトリープロットを示す。 ヒトサイトケラチン101-120 citペプチドは、健康なドナーのＰＢＭＣで応答を誘導する １８人の健常者からＰＢＭＣを得、その大半でＨＬＡタイピングを行い、１３人はＨＬＡ-ＤＰ４陽性、２人はＨＬＡ-ＤＰ４陰性であり、３人のＨＬＡタイプは決定しなかった。単離したＰＢＭＣを、培地又はヒトCyk8 101-120 citペプチドと共に培養した。Cyk8 101-120 citペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。ＣＳＦＥ標識細胞集団内のＣＤ４ Ｔ細胞集団の増殖応答を、７日目及び１０日目にフローサイトメトリーで評価した。 ヒトサイトケラチン101-120 citペプチドは、健康なドナーのＰＢＭＣで応答を誘導する １８人の健常者からＰＢＭＣを得、その大半でＨＬＡタイピングを行い、１３人はＨＬＡ-ＤＰ４陽性、２人はＨＬＡ-ＤＰ４陰性であり、３人のＨＬＡタイプは決定しなかった。単離したＰＢＭＣを、培地又はヒトCyk8 101-120 citペプチドと共に培養した。Cyk8 101-120 citペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。７日目及び１０日目に、増殖ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ１３４の発現を評価し、１０日目の応答を示す。 ヒトサイトケラチン101-120 citペプチドは、健康なドナーのＰＢＭＣで応答を誘導する １８人の健常者からＰＢＭＣを得、その大半でＨＬＡタイピングを行い、１３人はＨＬＡ-ＤＰ４陽性、２人はＨＬＡ-ＤＰ４陰性であり、３人のＨＬＡタイプは決定しなかった。単離したＰＢＭＣを、培地又はヒトCyk8 101-120 citペプチドと共に培養した。Cyk8 101-120 citペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。７日目及び１０日目に、増殖ＣＤ４ Ｔ細胞におけるＩＦＮγの発現を評価し、１０日目の応答を示す。 ヒトサイトケラチン101-120 citペプチドは、健康なドナーのＰＢＭＣで応答を誘導する １８人の健常者からＰＢＭＣを得、その大半でＨＬＡタイピングを行い、１３人はＨＬＡ-ＤＰ４陽性、２人はＨＬＡ-ＤＰ４陰性であり、３人のＨＬＡタイプは決定しなかった。単離したＰＢＭＣを、培地又はヒトCyk8 101-120 citペプチドと共に培養した。Cyk8 101-120 citペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。７日目及び１０日目に、増殖ＣＤ４ Ｔ細胞におけるグランザイムＢの発現を評価し、１０日目の応答を示す。 ヒトサイトケラチン101-120 citペプチドは、がん患者のＰＢＭＣで応答を誘導する ５人の肺がん患者からＰＢＭＣを得た。ＨＬＡタイピングは行わなかった。単離したＰＢＭＣを、培地又はヒトCyk8 101-120 citペプチドと共に培養した。Cyk8 101-120 citペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。患者のＰＢＭＣのＣＳＦＥ標識細胞集団内のＣＤ４ Ｔ細胞集団の増殖応答を、７日目及び１０日目にフローサイトメトリーで評価した。 ヒトサイトケラチン101-120 citペプチドは、がん患者のＰＢＭＣで応答を誘導する １２人の卵巣がん患者からＰＢＭＣを得た。患者の大半ではＨＬＡタイピングを行い、９人はＨＬＡ-ＤＰ４陽性、２人はＨＬＡ-ＤＰ４陰性で、１人はＨＬＡタイピングを行わなかった。単離したＰＢＭＣを、培地又はヒトCyk8 101-120 citペプチドと共に培養した。Cyk8 101-120 citペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。患者のＰＢＭＣのＣＳＦＥ標識細胞集団内のＣＤ４ Ｔ細胞集団の増殖応答を、７日目及び１０日目にフローサイトメトリーで評価した。 ヒトサイトケラチン101-120 citペプチドは、がん患者のＰＢＭＣで応答を誘導する ５人の肺がん患者からＰＢＭＣを得た。ＨＬＡタイピングは行わなかった。単離したＰＢＭＣを、培地又はヒトCyk8 101-120 citペプチドと共に培養した。Cyk8 101-120 citペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。７日目及び１０日目に、増殖中のＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ１３４、ＩＦＮγ及びグランザイムＢの発現を評価し、１０日目の応答を示す。 ヒトサイトケラチン101-120 citペプチドは、がん患者のＰＢＭＣで応答を誘導する １２人の卵巣がん患者からＰＢＭＣを得た。患者の大半ではＨＬＡタイピングを行い、９人はＨＬＡ-ＤＰ４陽性、２人はＨＬＡ-ＤＰ４陰性で、１人はＨＬＡタイピングを行わなかった。単離したＰＢＭＣを、培地又はヒトCyk8 101-120 citペプチドと共に培養した。Cyk8 101-120 citペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。７日目及び１０日目に、増殖中のＣＤ４ Ｔ細胞におけるＣＤ１３４、ＩＦＮγ及びグランザイムＢの発現を評価し、１０日目の応答を 示す。 ヒトサイトケラチン８ 101-120 citペプチドに対する免疫応答は記憶Ｔ細胞が媒介する Cyk8 101-120 citペプチドに特異的なＣＳＦＥ^ｌｏｗ Ｔ細胞について、記憶及びナイーブＴ細胞集団を特定するマーカーを用いて表現型を解析し、１０日目に表現型をフローサイトメトリーで評価した。

本発明の第１の側面では、
(i) アミノ酸配列：
ＫＦＡＳＦＩＤＫＶＲＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１）（Cyk8 101-120）
ＬＲＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬＡＬＤＩＥＩ（配列番号２）（Cyk8 371-388）
ＫＳＹＫＭＳＴＳＧＰＲＡＦＳＳＲＳＦＴ（配列番号１６）（マウスCyk8 8-26）
ＫＳＹＫＶＳＴＳＧＰＲＡＦＳＳＲＳＹＴ（配列番号３）（Cyk8 8-26）
ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹＲＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号４）（Cyk8 381-399）
ＲＳＮＭＤＮＭＦＥＳＹＩＮＮＬＲＲＱＬ（配列番号５）（Cyk8 133-151）及び
ＬＴＤＥＩＮＦＬＲＱＬＹＥＥＥＩＲＥＬＱ（配列番号６）（Cyk8 217-236）
（前記配列中の少なくとも１つのアルギニン（Ｒ）残基はシトルリンに置換されている）
の１つ以上、並びに／又は
(ii) アルギニン以外の位置における、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の置換、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の挿入、及び／若しくは、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の欠失を除く、i) のアミノ酸配列の１つ以上、
を含む、から本質的になる、又は、からなる、シトルリン化Ｔ細胞抗原が提供される。

本発明者らは、予想外にも、腫瘍細胞で発現する、少なくとも１つのアルギニンがシトルリンに置換されたサイトケラチン８により、特定の抗原に対するＴ細胞応答を上昇させることが可能であることを発見した。さらに、シトルリン含有ペプチドは、腫瘍ワクチン、並びにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び養子Ｔ細胞移入療法を含むがこれらには限定されない、Ｔ細胞による治療法の開発を可能にする。本発明者らは、健常者、がん患者及びＨＬＡトランスジェニックマウスでは、シトルリン化サイトケラチンペプチドを認識し、ＩＦＮγを産生するＴ細胞のレパートリーが存在することを示した。また、彼らは、対象にシトルリン化されたサイトケラチンエピトープＫＦＡＳＦＩＤＫＶＲＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１）（Cyk8 101-120）及び／又はＬＲＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬＡＬＤＩＥＩ（配列番号２）（Cyk8 371-388）を投与して、前記シトルリン化エピトープを発現する腫瘍に対する免疫応答を刺激した。

本発明のＴ細胞抗原は、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ抗原であってもよく、すなわち、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子と複合体を形成し、それぞれＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子上に提示されてもよい。当業者は、特定のポリペプチドの存在下でＭＨＣ分子がリフォールディングされるか否かを決定することで、前記ポリペプチドと前記ＭＨＣ分子が複合体を形成するか否かを決定できる。ポリペプチドがＭＨＣと複合体を形成しない場合、ＭＨＣは適切にリフォールディングされない。通常、リフォールディングは折り畳まれた形態のＭＨＣのみを認識する抗体を用いて確認される。詳細については、Garboczi, Hung, and Wiley 1992を参照。

抗原中のアルギニンアミノ酸残基の全てがシトルリンに変換されることが好ましい。抗原中のアルギニン残基の１つ、２つ又は３つがシトルリンに変換されてもよく、残りは変換されない。したがって、本発明の抗原のシトルリン残基は１つ、２つ又は３つであってもよい。本発明の抗原のアミノ酸長は、最大で２５であってもよい。その長さは、少なくとも５アミノ酸であってもよい。その長さは、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４アミノ酸以下であってもよい。本発明のＴ細胞抗原は腫瘍関連抗原であってもよく、腫瘍に対する免疫応答を刺激する可能性がある。

本発明者らは、サイトケラチン８に関係するペプチドのアミノ酸配列と、同一又は類似のペプチドを含む他のサイトケラチン又は類似のタンパク質のアミノ酸配列との間に、高度の配列相同性を見いだした。
ＫＦＡＳＦＩＤＫＶＲＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１）（Cyk8 101-120）は、１８位のアミノ酸が置換されたサイトケラチン２内にも含まれ、その配列は本質的にＫＦＡＳＦＩＤＫＶＲＦＬＥＱＱＮＫＶＬＥ（配列番号７）からなる。
ＫＦＡＳＦＩＤＫＶＲＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１）（Cyk8 101-120）は、１８位のアミノ酸が置換されたサイトケラチン７内にも含まれ、その配列は本質的にＫＦＡＳＦＩＤＫＶＲＦＬＥＱＱＮＫＬＬＥ（配列番号８）からなる。
ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹＲＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号４）（Cyk8 381-399）と同じ配列は、サイトケラチン４に含まれている。
ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹＲＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号４）（Cyk8 381-399）は、２位のアミノ酸が置換されたビンチン内にも含まれ、その配列は本質的にＫＭＡＬＤＩＥＩＡＴＹＲＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号９）からなる。
ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹＲＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号４）（Cyk8 381-399）と同じ配列は、グリア線維性タンパク質にも含まれている。

本発明者らは、健常者及びＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて、シトルリン化Ｃｙｋ８ペプチドを認識するＴ細胞がＩＦＮγを産生し、Ｃｙｋ８ペプチドによる刺激の後に検出できることを示した。また、特定のシトルリン化Ｃｙｋ８ペプチドがin vivoでＴ細胞応答を生じ、それ自体、がん治療のワクチンとして使用できることを示した。

本発明のＴ細胞抗原は、
i) 以下のアミノ酸配列：
ＫＦＡＳＦＩＤＫＶＲＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１）
ＬＲＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬＡＬＤＩＥＩ（配列番号２）
ＫＳＹＫＭＳＴＳＧＰＲＡＦＳＳＲＳＦＴ（配列番号１６）
ＫＳＹＫＶＳＴＳＧＰＲＡＦＳＳＲＳＹＴ（配列番号３）
ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹＲＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号４）
ＲＳＮＭＤＮＭＦＥＳＹＩＮＮＬＲＲＱＬ（配列番号５）、及び
ＬＴＤＥＩＮＦＬＲＱＬＹＥＥＥＩＲＥＬＱ（配列番号６）
の１つ以上、並びに／又は
ii) アルギニン以外の位置における、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の置換、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の挿入、及び／若しくは、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の欠失を除く、i) のアミノ酸配列の１つ以上、
を含み、から本質的になり、又は、からなってもよい。抗原は、アルギニン以外の位置で、置換、挿入及び置換から選択される合計１、２、３、４又は５個のアミノ酸が修飾されていてもよい。ii) のＴ細胞抗原は、好ましくは、甲状腺がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、胃がん、肝臓がん、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び婦人科腫瘍を含むが、これらには限定されない腫瘍に対する免疫応答を上昇させることができる。

本発明のＴ細胞抗原は、
i) 以下のアミノ酸配列：
ＫＦＡＳＦＩＤＫＶ－ｃｉｔ－ＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１０）（Cyk8 101-120）
Ｌ－ｃｉｔ－ＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬＡＬＤＩＥＩ（配列番号１１）（Cyk8 371-388）
ＫＳＹＫＭＳＴＳＧＰ－ｃｉｔ－ＡＦＳＳ－ｃｉｔ－ＳＦＴ（配列番号４２）（Cyk8 8-26）
ＫＳＹＫＶＳＴＳＧＰ－ｃｉｔ－ＡＦＳＳ－ｃｉｔ－ＳＹＴ（配列番号１２）（Cyk8 8-26）
ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹ－ｃｉｔ－ＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号１３）（Cyk8 381-399）
ｃｉｔ－ＳＮＭＤＮＭＦＥＳＹＩＮＮＬ－ｃｉｔ－ｃｉｔ－ＱＬ（配列番号１４）（Cyk8 133-151）
ＬＴＤＥＩＮＦＬ－ｃｉｔ－ＱＬＹＥＥＥＩ－ｃｉｔ－ＥＬＱ（配列番号１５）（Cyk8 217-236）
（式中、「ｃｉｔ」はシトルリンを表す）
の１つ以上、並びに／又は
ii) シトルリン以外の位置における、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の置換、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の挿入、及び／若しくは、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の欠失を除く、i) のアミノ酸配列
を含む、から本質的になる、又は、からなることが好ましい。抗原は、アルギニン以外の位置で、置換、挿入及び置換から選択される合計１、２、３、４又は５個のアミノ酸が修飾されていてもよい。ii) のＴ細胞抗原は、好ましくは、甲状腺がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、胃がん、肝臓がん、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び婦人科腫瘍を含むが、これらには限定されない腫瘍に対する免疫応答を上昇させることができる。

本発明者らは、予想外にも、サイトケラチン８に由来する特定のシトルリン化ペプチドが、甲状腺がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、胃がん、肝臓がん、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び婦人科腫瘍を含むが、これらには限定されない腫瘍に対する免疫応答を上昇させるのに使用できることを発見した。本発明者らは、
ＫＳＹＫＶＳＴＳＧＰ－ｃｉｔ－ＡＦＳＳ－ｃｉｔ－ＳＹＴ（配列番号１２）（Cyk8 8-26、１８位及び２３位がシトルリン化）
ＫＦＡＳＦＩＤＫＶ－ｃｉｔ－ＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１０）（Cyk8 101-120、１１０位がシトルリン化）
ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹ－ｃｉｔ－ＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号１３）（Cyk8 381-399、３９２位がシトルリン化）
ｃｉｔ－ＳＮＭＤＮＭＦＥＳＹＩＮＮＬ－ｃｉｔ－ｃｉｔ－ＱＬ（配列番号１４）（Cyk8 133-151、１３３位、１４８位及び１４９位がシトルリン化）
Ｌ－ｃｉｔ－ＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬＡＬＤＩＥＩ（配列番号１１）（Cyk8 371-388、３７２位がシトルリン化）
ＬＴＤＥＩＮＦＬ－ｃｉｔ－ＱＬＹＥＥＥＩ－ｃｉｔ－ＥＬＱ（配列番号１５）（Cyk8 217-236、２２５位及び２３３位がシトルリン化）
がin vivoでシトルリン化Ｃｙｋ８エピトープに対して免疫応答を引き起こすことを示した。ペプチドＫＦＡＳＦＩＤＫＶ－ｃｉｔ－ＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１０）（Cyk8 101-12）、Ｌ－ｃｉｔ－ＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬＡＬＤＩＥＩ（配列番号１１）（Cyk8 371-388）及びｃｉｔ－ＳＮＭＤＮＭＦＥＳＹＩＮＮＬ－ｃｉｔ－ｃｉｔ－ＱＬ（配列番号１４）（Cyk8 133-151）は、マウスのものと相同である。ペプチドＫＳＹＫＶＳＴＳＧＰ－ｃｉｔ－ＡＦＳＳ－ｃｉｔ－ＳＹＴ（配列番号１２）（Cyk8 8-26）、ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹ－ｃｉｔ－ＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号１３）（Cyk8 381-399）及びＬＴＤＥＩＮＦＬ－ｃｉｔ－ＱＬＹＥＥＥＩ－ｃｉｔ－ＥＬＱ（配列番号１５）（Cyk8 217-236）は、それぞれ、１個及び２個のアミノ酸が一致しないため、マウスと相同ではない。

シトルリン化ペプチドは、ＨＬＡ-ＤＲ４モチーフを有する自己免疫疾患の患者のＴ細胞応答を刺激することが知られている。対照的に、本発明者らは、Cyk8 101-120（１１０位でシトルリン化）、Cyk8 133-151（１３３位、１４８位及び１４９位でシトルリン化）、Cyk8 217-236（２２５位でシトルリン化）、Cyk8 371-388（３７２位でシトルリン化）、Cyk8 381-399（３９２位でシトルリン化）及びCyk8 366-385（３７２位でシトルリン化）などの特定のシトルリン化Ｃｙｋ８ペプチドが、HLA-DP4トランスジェニックマウスにおいてＴ細胞応答を強力に刺激できることを初めて示した。さらに、Cyk8 8-26 citは、C57BL/6マウスでＣＤ４ Ｔ細胞応答を強力に刺激できる。ＨＬＡ-ＤＰ４は人口の７０％で発現していることから、これは血液腫瘍及び固形腫瘍の治療に有望なワクチンとなる。１１０位でシトルリン化されたCyk8 101-120 citに対する応答を示す一部の健常者はＨＬＡ-ＤＰ４を発現しているが、一部の健常者はＨＬＡ-ＤＰ４陽性ではなく、ＨＬＡクラスＩＩの他のアレルもこのペプチドを提示している可能性が示唆された。Cyk8 101-120 cit、Cyk8 133-151 cit、Cyk8 217-236 cit、Cyk8 371-388 cit及びCyk8 381-399 citの応答は、修飾されていない野生型配列に対して最小限であった。Cyk8 371-388、Cyk8 101-120、Cyk8 8-26シトルリン化ペプチド抗原を認識するＴ細胞は、腫瘍細胞を標的とし、in vivoで強力な抗腫瘍効果を誘発でき、したがって、シトルリン化Cyk8 371-388、Cyk8 101-120、Cyk8 8-26を、がんを治療するためのワクチンとして使用する最初の証拠を提供する。

ＭＨＣクラスＩＩ抗原処理経路は、外因性の抗原の取り込みと処理、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合モチーフ、及び、ＭＨＣクラスＩＩ：ペプチド複合体の輸送と安定性といった多くの因子の影響を受ける可能性がある。ＭＨＣクラスＩＩのペプチド収容溝は両端が開いており、ＭＨＣクラスＩ分子と比較してペプチドの長さによる制約が少ない。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの長さは、１３～２５アミノ酸であり、通常、ＭＨＣ分子からはみ出している（Kim et al. 2014；Sette et al. 1989）。これらのペプチドは、コア領域と呼ばれる連続する９個のアミノ酸を含む。これらのアミノ酸のいくつかはペプチド収容溝と直接相互作用する（Andreatta et al. 2017）。コアペプチドの両側のアミノ酸はペプチド収容溝からはみ出し；これらはペプチドフランキング領域として知られている。それらは、ペプチド結合とその後のＴ細胞との相互作用に影響を及ぼす可能性がある（Arnold et al. 2002；Carson et al. 1997；Godkin et al. 2001）。

ＭＨＣクラスＩＩ分子は高度に多型性であり、ペプチド結合モチーフは、複数のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できることが確認されている多くの入り混じったペプチドで、高度に退化している（Consogno et al. 2003）。ペプチド結合に重要なアミノ酸は、ＭＨＣクラスＩＩ：ペプチド複合体の結晶解析で特定されている（Corper et al. 2000；Dessen et al. 1997；Fremont et al. 1996；Ghosh et al. 1995；Latek et al. 2000；Li et al. 2000；Lee, Wucherpfennig, and Wiley 2001；Brown et al. 1993；Smith et al. 1998；Stern et al. 1994；Scott et al. 1998；Fremont et al. 1998）。これらの研究は、Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６及びＰ９が常にＭＨＣの方を向いているのに対して、Ｐ－１、Ｐ２、Ｐ５、Ｐ８及びＰ１１は常にＴＣＲの方を向いていることを示した。ＨＬＡ-ＤＲ及びＨＬＡ-ＤＰアレルの頻度を表１に示す（Thomsen and Nielsen 2012；Gonzalez-Galarza et al. 2015）。

これに対して、ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合特性は限定されている。ＭＨＣクラスＩとの結合に重要なアミノ酸は、既知の天然結合ペプチドを分析する予測アルゴリズムでも特定されており（Jurtz et al. 2017）、これは、（ＨＬＡ-Ｂ^＊０８０１を除く）Ｐ２及びＰ９が、結合アンカー残基として作用するＭＨＣの方を向いていることを示した。

サイトケラチン８は、その遺伝子がクローニングされた種（ニワトリ、マウス、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ及びヒト）の間で高度に保存されている（図１Ｂ）。したがって、本発明の抗原は、必要に応じて、このような抗原をコードする配列を含む核酸と組み合わせて、非ヒト哺乳動物におけるがんを処置するために使用できる。

本発明は、その範囲に、これまでに説明したアミノ酸配列を有するペプチド、及びそれに対して実質的な同一性、例えば、それに対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、並びに医薬、特にがんの治療方法におけるその使用も含む。そのようなペプチドは、好ましくは、甲状腺がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、胃がん、肝臓がん、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び婦人科腫瘍を含むが、これらには限定されない腫瘍に対する免疫応答を上昇させることができる。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性の割合は、一般に、最適な比較目的のために配列をアラインメントさせ（例えば、第２の配列との最良のアラインメントのために第１の配列にギャップを導入してもよい）、対応する位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することによって求められる。「最良のアラインメント」は、最も高い同一性をもたらす２つの配列のアラインメントである。同一性の割合は、配列内の同一アミノ酸残基又はヌクレオチドの数を比較することによって求められる（すなわち、同一性（％）＝［同一である位置の数／位置の総数］ × １００）。

２つの配列間の同一性の割合は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを用いて求めることができる。２つの配列を比較する数学的アルゴリズムの例は、KarlinとAltschulのアルゴリズム（Karlin and Altschul 1993）である。AltschulらのNBLAST及びXBLASTプログラムには、このようなアルゴリズムが組み込まれている（Altschul et al. 1990）。NBLASTプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いてBLASTヌクレオチド検索を行い、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。XBLASTプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いてBLASTタンパク質検索を行い、本発明のタンパク質と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Altschul et al. 1997に記載されているように、Gapped BLASTが利用できる。あるいは、PSI-Blastを用いて、分子間の関係を検出する反復検索を行うことができる。BLAST、Gapped BLAST及びPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例．XBLAST及びNBLAST）のデフォルトのパラメーターが使用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照。配列の比較に利用する数学的アルゴリズムの別の例は、Myers及びMillerのアルゴリズム（Myers and Miller 1989）である。GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）には、このようなアルゴリズムが組み込まれている。当該技術分野で公知の配列解析のための他のアルゴリズムには、Torelli and Robotti 1994に記載されたADVANCE及びADAM、並びにPearson and Lipman 1988に記載されたFASTAが含まれる。FASTAでは、ktupは検索の感度と速度を設定する制御オプションである。

アミノ酸の置換とは、アミノ酸残基が同じ位置で置換アミノ酸残基に置換されることを意味する。挿入されるアミノ酸残基は、任意の位置に挿入されてもよく、挿入されたアミノ酸残基の一部若しくは全てが互いに直接隣接するように挿入されてもよく、又は挿入されたアミノ酸残基のいずれもが別の挿入されたアミノ酸残基に直接隣接しないように挿入されてもよい。

本発明の抗原は、そのＣ末端及び／又はＮ末端に１個、２個又は３個の追加のアミノ酸が含まれてもよい。本発明の抗原は、１つのアミノ酸置換及び１つのアミノ酸挿入、１つのアミノ酸置換及び１つのアミノ酸欠失、又は１つのアミノ酸挿入及び１つのアミノ酸欠失を除いて、上記アミノ酸配列を含んでもよい。本発明の抗原は、１つのアミノ酸置換、１つのアミノ酸挿入及び／又は１つのアミノ酸欠失を除いて、上記アミノ酸配列を含んでもよい。

挿入されたアミノ酸及び置換されたアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、又は天然に存在しないアミノ酸であってもよく、例えば、天然にはない側鎖を有していてもよい。このような改変されたペプチドリガンドは、Douat-Casassus et al. 2007；Hoppes et al. 2014及びその中の参考文献で更に考察されている。２個以上のアミノ酸残基が置換及び／又は挿入される場合、置換／挿入アミノ酸残基は互いに同一であってもよく、又は互いに異なっていてもよい。各置換アミノ酸は、置換されるアミノ酸に対して異なる側鎖を有していてもよい。

好ましくは、本発明の抗原は、ＭＨＣ分子のペプチド収容溝でＭＨＣに結合する。一般に、上記アミノ酸修飾は、ＭＨＣに結合するペプチドの能力を損なわない。好ましい態様では、アミノ酸修飾は、ＭＨＣに結合するペプチドの能力を改善する。例えば、変異は、ペプチドをＭＨＣに固定する位置で行われてもよい。このような固定位置及びこれらの位置の好ましい残基は、当該技術分野で公知である。

本発明の抗原は、免疫応答（例．Ｔ細胞応答）を誘発するために使用してもよい。この場合、「オフターゲット」免疫応答に関連する可能性がある望ましくない副作用の危険性を回避するために、免疫応答が意図した標的に特異的であることが重要である。したがって、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、他のタンパク質、特にヒトのタンパク質に由来するペプチドのアミノ酸配列と一致しないことが好ましい。当業者は、公知のタンパク質配列のデータベースを検索して、本発明に係る抗原が別のタンパク質中に存在するかどうかを確かめる方法を理解している。

本発明は、シトルリン化エピトープに特異的なＴ細胞応答の誘導について標的ペプチドをスクリーニングすること；及び腫瘍を認識するためにシトルリン化エピトープに特異的なＴ細胞をスクリーニングすることを含む、抗腫瘍免疫を刺激する標的ペプチドのシトルリン化Ｔ細胞エピトープを特定するためのin vitroスクリーニング方法を記載する。シトルリン化エピトープに対するＴ細胞応答の誘導についてのスクリーニングは、シトルリン化エピトープがＣＤ４又はＣＤ８エピトープであるかどうかを特定するためのＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞のソーティングを含んでいてもよい。標的ペプチドは、サイトケラチン、より具体的にはサイトケラチン８であってもよい。

本発明の抗原は、固相合成としても知られているメリフィールド合成法、又は他のペプチド合成法によって容易に合成できる。ＧＭＰグレードのポリペプチドは、Multiple Peptide Systems, San Diego, CAの固相合成技術によって製造される。あるいは、ペプチドは、所望であれば、当該技術分野で公知の方法により、組換えで調製してもよい。このような方法は、通常、発現されるポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの使用を含み、in vivoで、例えば、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物細胞においてポリペプチドを発現する。あるいは、in vitro無細胞系を使用してもよい。このような系は、当該技術分野において公知であり、例えばLife Technologies, Paisley, UKから市販されている。抗原は、単離されてもよく、及び／又は実質的に純粋な形態で提供されてもよい。例えば、それらは、他のポリペプチド又はタンパク質を実質的に含まない形態で提供されてもよい。本発明のペプチドは、Ｆｍｏｃ化学又は当業者に公知の他の標準的な技術により合成できる。

第２の側面では、本発明は、第１の側面の抗原とＭＨＣ分子との複合体を提供する。好ましくは、抗原はＭＨＣ分子のペプチド収容溝に結合する。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩであってもよい。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＤＰ、ＤＲ又はＤＱアレル（例．ＨＬＡ-ＤＲ４、ＤＲ１、ＤＰ４、ＤＰ２、ＤＰ５、ＤＱ２、ＤＱ３、ＤＱ５及びＤＱ６）であってもよい。ＨＬＡ-ＤＰ４が好ましい。ＭＨＣクラスＩ分子はＡ又はＢアレルであってもよい。

本発明の抗原及び複合体は、単離されていてもよく、及び／又は実質的に純粋な形態であってもよい。例えば、抗原及び複合体は、他のポリペプチド又はタンパク質を実質的に含まない形態で提供されてもよい。本発明では、用語「ＭＨＣ分子」は、ペプチドとの結合が保持されることを条件として、組換えＭＨＣ分子、天然に存在しないＭＨＣ分子及びＭＨＣの機能的に等価な断片、並びにこれらの誘導体又は多様体を含むことに留意されたい。例えば、ＭＨＣ分子は、可溶性の形態、及び／又は多量体の形態で治療部分と融合してもよく、固体支持体と結合してもよい。

本発明の抗原が複合体を形成できる可溶性の組換えＭＨＣ分子の調製方法は、当該技術分野で公知である。適切な方法には、大腸菌細胞又は昆虫細胞からの発現及び精製が含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、ＭＨＣ分子は、合成的に、又は無細胞系により調製できる。

本発明の抗原及び／又は抗原－ＭＨＣ複合体は、治療効果を引き出すことができる部分と結合していてもよい。このような部分は、免疫原性であることが知られているキャリアタンパク質であってもよい。ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）は、ワクチン組成物で使用する適切なキャリアタンパク質の一例である。あるいは、本発明の抗原及び／又は抗原－ＭＨＣ複合体は、融合パートナーと結合していてもよい。融合パートナーは、検出のために、前記抗原若しくはＭＨＣを固体支持体と結合させるために、又はＭＨＣのオリゴマー化のために使用してもよい。ＭＨＣ複合体は、例えばＢｉｒＡ酵素を用い、ビオチンを付加できるビオチン化部位を組み込んでもよい。他の適切な融合パートナーには、蛍光標識、発光標識、放射性標識、核酸プローブ及び対比試薬、抗体、又は検出可能な産物を産生する酵素が含まれるが、これらに限定されるものではない。検出方法には、フローサイトメトリー、顕微鏡法、電気泳動又はシンチレーション計数が含まれてもよい。

本発明の抗原－ＭＨＣ複合体は、可溶性の形態で提供されてもよく、又は適切な固体支持体と結合して固定化されてもよい。固体支持体の例には、ビーズ、膜、セファロース、磁気ビーズ、プレート、チューブ、カラムが含まれるが、これらに限定されるものではない。

抗原－ＭＨＣ複合体は、ＥＬＩＳＡプレート、磁気ビーズ又は表面プラズモン共鳴バイオセンサーチップと結合してもよい。抗原－ＭＨＣ複合体を固体支持体に結合させる方法は、当業者に公知であり、例えば、親和性結合のペア（例．ビオチンとストレプトアビジン、抗体と抗原）の使用が含まれる。好ましい態様では、抗原－ＭＨＣ複合体をビオチンで標識し、ストレプトアビジンでコートした表面に結合させる。

本発明の抗原－ＭＨＣ複合体は、多量体の形態（例．二量体、四量体、五量体、八量体又はそれ以上）であってもよい。多量体ペプチドＭＨＣ複合体調製の適切な方法の例は、Greten and Schneck 2002及びそこで示された参考文献に記載されている。一般に、抗原－ＭＨＣ多量体は、ビオチン残基でタグ化され、蛍光標識５ストレプトアビジンで複合体化された抗原－ＭＨＣを用いて調製してもよい。あるいは、多量体抗原－ＭＨＣ複合体は、免疫グロブリンを分子足場として形成してもよい。この系では、ＭＨＣ分子の細胞外ドメインは、短いアミノ酸リンカーを介して免疫グロブリン重鎖の定常領域と融合している。抗原－ＭＨＣ多量体は、１０デキストランのようなキャリア分子（国際公開第02/072631号）を用いても調製される。多量体抗原－ＭＨＣ複合体は、アビディティー効果により前記複合体と結合するＴ細胞受容体のような結合部分の検出を改善するのに役に立つ。

本発明の抗原は、ＭＨＣとの複合体として細胞表面に提示されてもよい。したがって、本発明は、その表面に本発明の複合体を提示する細胞も提供する。このような細胞は、哺乳動物細胞、好ましくは免疫系の細胞、特に樹状細胞やＢ細胞のような特殊な抗原提示細胞であってもよい。他の好ましい細胞には、Ｔ２細胞が含まれる（Hosken and Bevan 1990）。本発明の抗原又は複合体を提示する細胞は、好ましくは集団の形態で単離されてもよく、又は実質的に純粋な形態で提供されてもよい。該細胞は、自然には本発明の複合体を提示しなくてもよく、あるいは、該細胞は、複合体を天然よりも高いレベルで提示してもよい。このような細胞は、該細胞を本発明の抗原でパルスすることで得ることができる。パルス化は、通常、１０^－５～１０^－１２Ｍのポリペプチド濃度を用い、細胞と抗原を数時間インキュベートすることを含む。細胞は、組換えにより調製してもよい。本発明の抗原を提示する細胞は、以下で詳しく説明するように、当該細胞によって活性化されるか、又は当該細胞に結合するＴ細胞及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を単離するために使用してもよい。

本発明のペプチドは、Ｆｍｏｃ化学又は当業者に公知の他の標準的な技術を用いて合成してもよい。

本発明のペプチドを調製する別の簡便な方法は、発現系でそれをコードする核酸を使用し、核酸を発現させることである。このような核酸は、本発明の別の側面を形成する。

当業者は、本発明のペプチドを提供するこのような核酸の置換、欠失及び／又は付加を決定できる。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ（例．クローニングで得たｍＲＮＡ又は化学合成で調製したｍＲＮＡ）であってもよい。治療的使用のために、核酸は、好ましくは、処置する対象で発現可能な形態である。本発明のペプチド又は本発明の核酸は、単離及び／若しくは精製された形態の単離物として、又は、それが天然に付随する物質を含まない若しくは実質的に含まない単離物として、提供されてもよい。核酸の場合、それは、発現のための１つ以上の調節配列以外のヒトゲノム中の遺伝子に隣接する核酸を含まないか、又は実質的に含まなくてもよい。核酸は、完全に又は部分的に合成してもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡを含んでいてもよい。本発明の核酸がＲＮＡを含む場合、示した配列は、ＴをＵで置換したＲＮＡ等価物として解釈されるべきである。

本発明のペプチドをコードする核酸配列は、核酸配列及びクローンが与えられれば、例えば、この明細書に記載の情報及び参考文献並びに当該技術分野で公知の技術（例えば、Sambrook 1989；Ausubel 1992を参照）により、当業者が容易に調製できる。これらの技術は、(i) 例えばゲノム源からのそのような核酸試料を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、(ii) 化学合成、又は、(iii) ｃＤＮＡ配列の調製を含む。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、当業者に公知の適切な方法で調製し、使用されてもよく、これには、コードされたＤＮＡを取得すること、発現されるべき部分のいずれかの側の適切な制限酵素認識部位を特定すること、及びＤＮＡから前記部分を切り出すことが含まれる。次いで、この部分は、標準的な市販の発現系の適切なプロモーターと動作可能に連結してもよい。別の組換えアプローチは、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅することである。修飾ペプチドを発現させるために、又は核酸の発現に使用する宿主細胞のコドン優先度を考慮して、例えば、部位特異的変異誘発によって、配列を修飾できる。

本発明は、上記少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態の構築物も提供する。本発明は、上記１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞も提供する。これまでに説明したように、本発明のペプチドをコードする核酸は、コードした核酸からの発現を含む組成物の製造方法と同様に、本発明の側面を形成する。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件で培養することで簡便に達成してもよい。発現による調製に続き、組成物は、適切な技術によって単離し、及び／又は精製され、次いで、必要に応じて使用してもよい。

さまざまな宿主細胞においてポリペプチドをクローニングし、発現させる系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用できる哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞及び他の多くのものが含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は大腸菌である。原核生物細胞（例．大腸菌）における抗体及び抗体断片の発現は、当該技術分野で十分に確立されている。培養真核生物細胞における発現も、特異的結合メンバーの産生の選択肢として当業者が利用できる、近年の総説として、例えば、Reff 1993；Trill, Shatzman, and Ganguly 1995を参照。総説については、例えばPluckthun 1991を参照。

プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含有する適切なベクターを選択又は構築できる。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス（例．ファージ）、又はファージミドであってもよい。詳細については、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrook 1989）を参照。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多くの公知の技術及びプロトコルは、Short Protocols in Molecular Biology（Ausubel 1992）に詳細に記載されている。

したがって、本発明の別の側面では、本明細書に記載の核酸を有する宿主細胞を提供し、これは、単離されてもよい。更に別の側面は、そのような核酸を宿主細胞に導入する方法を提供する。導入は、任意の方法で行うことができる。真核細胞では、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソームによるトランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス（例．ワクシニアウイルス、又は昆虫細胞ではバキュロウイルス）を用いる形質導入が含まれる。細菌では、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージによるトランスフェクションが含まれる。導入に続き、例えば、遺伝子を発現する条件で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を生じさせてもよく、又は可能にしてもよい。

ある態様では、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例．染色体）に組み込まれる。組込みは、標準的な技術で、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることによって促進してもよい。

本発明は、上記ポリペプチドを発現させるために、発現系で上記構築物を使用することを含む方法も提供する。本発明のポリペプチドを用いて、本発明のポリペプチドと特異的に結合する結合部分の特定及び／又は単離が可能である。このような結合部分は、免疫療法薬として使用してもよく、抗体を含んでいてもよい。したがって、別の側面では、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する結合部分を提供する。

本発明の抗原及び複合体を用いて、本発明の抗原及び／又は複合体と特異的に結合する結合部分の特定及び／又は単離が可能である。このような結合部分は、免疫療法薬として使用してもよく、抗体及びＴＣＲを含んでいてもよい。

第３の側面では、本発明は、本発明の抗原と結合する結合部分を提供する。

好ましくは、結合部分は、前記ポリペプチドがＭＨＣと複合体を形成している場合に、抗原と結合する。

後者の場合、結合部分は、それが抗原にも結合するという条件で、ＭＨＣに部分的に結合できる。結合部分は抗原のみと結合してもよく、その結合は特異的であってもよい。結合部分は抗原－ＭＨＣ複合体のみと結合してもよく、その結合は特異的であってもよい。

本発明の複合体に結合する結合部分について、「特異的」とは、通常、結合部分が、１つ以上の本発明の抗原－ＭＨＣ複合体以外の抗原－ＭＨＣ複合体とは有意な結合を示さない状況を指すために使用される。

結合部分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であってもよい。ＴＣＲは、ＴＣＲ配列のInternational Immunogenetics（ＩＭＧＴ）データベースとリンクするＩＭＧＴのＴＣＲ命名法によって記載される。ＩＭＧＴ命名法で定められた特有の配列は広く知られており、ＴＣＲ分野の研究者が利用できる。例えば、それらは“T cell Receptor Factsbook”, (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8；Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603；Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10; (Lefranc 2003)及びＩＭＧＴのウェブサイト（www.IMGT.org）に見いだされる。簡単に述べると、αβＴＣＲは、２つのジスルフィド結合鎖からなる。各鎖（α鎖及びβ鎖）は、通常、２つのドメイン、すなわち、可変ドメイン及び定常ドメインを有するとみなされる。短い連結領域が可変ドメイン及び定常ドメインを接続し、一般にα可変領域の一部と考えられる。さらに、β鎖は通常、連結領域の隣に短い多様性領域を有し、これも、一般にβ可変領域の一部と考えられる。

ＴＣＲは、当業者に公知のいずれの形式であってもよい。例えば、ＴＣＲは、αβヘテロ二量体であってもよく、また、（国際公開第99/18129号に記載されたような）一本鎖の形式であってもよい。

一本鎖ＴＣＲには、Ｖα－Ｌ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌ－Ｖα、Ｖα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ、Ｖα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβ又はＶα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβ型のαβＴＣＲポリペプチドを、場合によっては、その逆の向きで含み、ここで、Ｖα及びＶβは、それぞれＴＣＲα及びβの可変領域であり、Ｃα及びＣβは、それぞれＴＣＲα及びβの定常領域であり、Ｌはリンカー配列である。ＴＣＲは、可溶性の形態（すなわち、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインを有さない）であってもよく；又は全長のα鎖及びβ鎖を含んでいてもよい。

ＴＣＲは、Ｔ細胞のような細胞の表面に提示されてもよい。細胞は、ヒト細胞のような哺乳動物細胞であってよい。

この細胞は、医薬、特にがんの治療に使用できる。がんは、固形腫瘍又は血液腫瘍であってもよい。がんは、甲状腺がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、胃がん、肝臓がん、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び婦人科のがんであってもよい。細胞は、治療する対象に由来するものであってもよく、又は治療する対象に由来しないものであってもよい。

ＴＣＲのα及び／又はβ鎖定常ドメインは、天然の／天然に存在するＴＲＡＣ／ＴＲＢＣ配列と比較して切断されていてもよい。また、ＴＲＡＣ／ＴＲＢＣは修飾を含んでいてもよい。例えば、α鎖の細胞外配列は、ＩＭＧＴ番号で、ＴＲＡＣのアミノ酸Ｔ４８がＣ４８で置換される、天然の／天然に存在するＴＲＡＣに対する修飾を含んでいてもよい。同様に、β鎖の細胞外配列は、ＩＭＧＴ番号で、ＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２のＳ５７がＣ５７で置換される、天然の／天然に存在するＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２に対する修飾を含んでいてもよい。天然のα鎖及びβ鎖の細胞外配列に対するこれらのシステイン置換は、リフォールディングされた可溶性ＴＣＲ、すなわち、細胞外のα鎖及びβ鎖をリフォールディングすることで形成されるＴＣＲを安定化する非天然の鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする（国際公開第03/020763号）。この非天然のジスルフィド結合は、ファージ上で正確に折り畳まれたＴＣＲの提示を容易にする（Li et al. 2005）。さらに、可溶性ＴＣＲと結合した安定なジスルフィドを使用することで、結合親和性と結合半減期の簡便な評価が可能となる。非天然のジスルフィド結合を形成する別の位置は、国際公開第03/020763号に記載されている。

各鎖の可変ドメインはＮ末端に位置し、フレームワーク配列（ＦＲ）に埋め込まれた３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは、ペプチド－ＭＨＣ結合の認識部位を含む。α鎖可変（Ｖα）領域をコードする複数の遺伝子及びβ鎖可変（Ｖβ）領域をコードする複数の遺伝子があり、これらは、そのフレームワーク、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、並びに部分的に特定されたＣＤＲ３配列によって区切られる。ＩＭＧＴ命名法では、Ｖα遺伝子及びＶβ遺伝子は、それぞれ、接頭辞ＴＲＡＶ及びＴＲＢＶによって参照される（Folch et al. 2000；Lefranc 2001；“T cell Receptor Factsbook”, Academic Press）。同様に、α鎖及びβ鎖で、それぞれＴＲＡＪ又はＴＲＢＪと呼ばれる複数の結合遺伝子又はＪ遺伝子が存在し、β鎖では、ＴＲＢＤと呼ばれる多様性遺伝子又はＤ遺伝子が存在する（Folch et al. 2000；Lefranc 2001；“T cell Receptor Factsbook”, Academic Press）。Ｔ細胞受容体鎖の莫大な多様性は、アレルバリアントと接合部多様性を含むさまざまなＶ、Ｊ及びＤ遺伝子の間の組合せ再配列に起因する（Arstila et al. 1999；Robins et al. 2009）。ＴＣＲα鎖及びβ鎖の定常領域又はＣ領域は、それぞれＴＲＡＣ及びＴＲＢＣと呼ばれる（Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10）。本発明のＴＣＲは、変異を含むように改変してもよい。ファージディスプレイ及び部位特異的変異誘発といった変異を有する高親和性ＴＣＲバリアントを調製する方法は、当業者に公知である（例えば、国際公開第2004/044004号及びLiら（Li et al. 2005）を参照）。

ＴＣＲは、イメージング化合物、例えば、診断に適した標識によって標識してもよい。このような標識された高親和性ＴＣＲは、ＣＤ１－抗原複合体、細菌スーパー抗原及びＭＨＣ－ペプチド／スーパー抗原複合体から選択されるＴＣＲリガンドを検出する方法で役に立ち、この方法は、ＴＣＲリガンドを、ＴＣＲリガンドに特異的な高親和性ＴＣＲ（又は多量体高親和性ＴＣＲ複合体）と接触させる工程；及びＴＣＲリガンドとの結合を検出する工程を含む。Zhuら（Zhu et al. 2006）が説明する多量体高親和性ＴＣＲ複合体（例えば、ビオチン化ヘテロ二量体を用いて形成される）では、（市販の）蛍光ストレプトアビジンを使用して、検出可能な標識を提供できる。蛍光標識された多量体は、例えば、高親和性ＴＣＲに特異的なペプチドを担持する抗原提示細胞を検出するためのＦＡＣＳ分析における使用に適している。

本発明によれば、シトルリンを有するサイトケラチン８ペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介したがん免疫療法の標的として使用できる。ＴＣＲは、ＭＨＣ分子と複合体を形成してＡＰＣの表面に提示される短いペプチド抗原を認識するように設計されている（Davis et al. 1998）。特定のシトルリン含有ペプチドの同定は、新規な免疫療法の開発に有利である。このような治療用ＴＣＲは、例えば、腫瘍に細胞傷害性薬剤又は免疫エフェクター剤を送達するための可溶性標的化剤として使用してもよく（Boulter et al. 2003；Liddy et al. 2012；McCormack et al. 2013）、又は、これらは、養子療法用にＴ細胞を改変するために使用してもよい（June et al. 2014）。

本発明のＴＣＲ（又はその多価複合体）は、例えば、細胞殺傷における使用のための毒性部分であるか、又はインターロイキン若しくはサイトカインのような免疫刺激剤であってもよい治療薬と、代替的又は追加的に、（例えば、共有結合又は他の様式によって）結合していてもよい。本発明の多価高親和性ＴＣＲ複合体は、多量体ではない野生型のもの又は高親和性Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体と比較して、ＴＣＲリガンドに対する結合能が強化されていてもよい。したがって、本発明の多価高親和性ＴＣＲ複合体は、in vitro又はin vivoにおいて、特定の抗原を提示する細胞の追跡又は標的化に特に有用であり、また、このような用途の別の多価高親和性ＴＣＲ複合体を製造するための中間体としても有用である。したがって、高親和性ＴＣＲ又は多価高親和性ＴＣＲ複合体は、in vivoで使用する薬学的に許容される製剤として提供されてもよい。

本発明のＴＣＲは治療薬として使用できる。この場合、ＴＣＲは可溶性の形態であってもよく、好ましくは免疫エフェクターと融合していてもよい。適切な免疫エフェクターには、ＩＬ２及びＩＦＮαといったサイトカイン；スーパー抗原及びその変異体；ＩＬ８、血小板因子４、メラノーマ増殖刺激タンパク質といったケモカイン；Ｔ細胞又はＮＫ細胞といった免疫細胞上の抗原と結合する抗体（例．抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体又は抗ＣＤ１６抗体）、並びにその断片、誘導体及び多様体；並びに補体アクチベーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明の結合部分は抗体であってもよい。この明細書では、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、天然のものであるか、部分的に合成されたものであるか、又は全合成されたものであるかを問わず、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。用語「抗体」には、抗体の断片、誘導体、機能的等価物及び相同体、ヒト化抗体、免疫グロブリン結合ドメインを有するポリペプチド、又は、抗体結合ドメインであるか若しくは抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを有するポリペプチド若しくはタンパク質が含まれ、天然のものであるか、部分的に合成されたものであるか、又は全合成されたものであるかは問われない。したがって、別のポリペプチドと融合した免疫グロブリン結合ドメイン又は等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第0120694号及び同第0125023号に記載されている。ヒト化抗体は、非ヒト（例．マウス）抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域を有する改変された抗体であってもよい。ヒト化抗体の調製方法は、例えば、米国特許第5225539号に記載されている。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例．ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）及びそれらのサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄといった抗原結合ドメインを含む断片；及びダイアボディーである。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、この明細書では「ｍａｂ」と称する場合がある。

抗体、例えばモノクローナル抗体を用い、組換えＤＮＡ技術を使用して、元の抗体の特異性を保持する別の抗体又はキメラ分子を調製できる。このような技術には、抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域とフレームワーク領域に導入することが含まれてもよい（例えば、欧州特許出願公開第184187号、英国特許出願公開第2188638号又は欧州特許出願公開第239400号を参照）。ハイブリドーマ（又は抗体を産生する他の細胞）は、遺伝子が変異したり、他の変化が行われる可能性があり、その結果、産生された抗体の結合特異性が変化することも、変化しないこともある。

完全な抗体の断片は、抗原を結合する機能を実現できることが示されている。結合断片の例は、(i) ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；(ii) ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；(iii) １つの抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；(iv) ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al. 1989）；(v) 単離されたＣＤＲ領域；(vi) 連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）_２断片；(vii) ＶＨドメインとＶＬドメインが会合して抗原結合部位の形成を可能にするペプチドリンカーによって連結されているＶＨドメインとＶＬドメインである、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird et al. 1988；Huston et al. 1988）；(viii) 二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ国際出願PCT/US92/09965号）；(ix) 遺伝子融合により構築された多価又は多重特異性の断片である「ダイアボディー」（国際公開第94/13804号；Holliger and Winter 1993）、である。ダイアボディーは、ポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメイン及び免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインを含み、２つのドメインは、（例えば、ペプチドリンカーによって）連結しているが、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない：抗原結合部位は、多量体内のあるポリペプチドの第１のドメインと、多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合によって形成される（国際公開第94/13804号）。二重特異性抗体については、さまざまな方法で（例．化学的に、又はハイブリッドハイブリドーマから）製造されてもよい従来の二重特異性抗体（Holliger and Winter 1993）であってもよく、又は、このような二重特異性抗体の断片であってもよい。完全な抗体ではなく、ｓｃＦｖ二量体又はダイアボディーを使用することが好ましいかもしれない。ダイアボディー及びｓｃＦｖは、Ｆｃ領域がなく、可変ドメインのみを用いて構築でき、抗イディオタイプ反応を低下させる可能性がある。二重特異性抗体の他の形態には、Traunecker, Lanzavecchia, and Karjalainen 1991に記載の一本鎖「Janusins」が含まれる。二重特異性の完全な抗体とは対照的に、二重特異性ダイアボディーは容易に構築でき、大腸菌中で発現されるため、有用であるかもしれない。適切な結合特異性のダイアボディー（及び抗体断片のような他の多くのポリペプチド）は、ライブラリーのファージディスプレイ（国際公開第94/13804号）により容易に選択できる。ダイアボディーの一方のアームを、例えば、抗原Ｘに対する特異性で一定に保ち、他方のアームを変化させたライブラリーを調製し、適切な特異性の抗体を選択できる。「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部と特異的に結合し、抗原の一部又は全部と相補的である領域を含む抗体の一部分である。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合でき、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインが提供してもよい。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでいてもよい。

修飾されたタンパク質足場に基づく結合部分も、この発明に包含される。タンパク質骨格は、目的の標的分子の結合部位を提供するように修飾された、安定で可溶性の天然のタンパク質構造に由来する。修飾されたタンパク質足場の例には、２つのαヘリックスに結合界面を提供するブドウ球菌プロテインＡのＺ－ドメインに基づくアフィボディ（Nygren 2008）；βバレルフォールドの開口端に小さなリガンドの結合部位が組み込まれたリポカリンに由来するアンチカリン（Skerra 2008）、ナノボディ及びＤＡＲＰｉｎが含まれるが、これらに限定されるものではない。修飾されたタンパク質足場は、通常、抗体と同じ抗原タンパク質に結合するように標的化されており、治療薬となる可能性がある。これらは、in vivoで、特定の組織に対する阻害剤又は拮抗剤として、又は毒素のような標的分子を特定の組織に送達するビヒクルとして機能する可能性がある（Gebauer and Skerra 2009）。短いペプチドを使用して、標的タンパク質を結合してもよい。フィロマー（phylomer）は細菌のゲノムに由来する天然の構造ペプチドである。このようなペプチドは、タンパク質の折畳みのさまざまなアレイを表し、in vivoでタンパク質－タンパク質間相互作用を阻害／破壊するために使用できる（Watt 2006）。

これまでに説明したように、本発明者らは、ある修飾されたＣｙｋ８抗原が腫瘍と関係があり、シトルリン化ペプチドが、腫瘍に対する免疫応答を引き起こすために使用できるＴ細胞応答を刺激することを見いだした。本発明は、医薬として使用するための、第１の側面の抗原、第２の側面の複合体及び／又は第３の側面の結合部分を提供する。第１の側面の抗原、第２の側面の複合体及び／又は第３の側面の結合部分は、がんの治療方法に使用できる。また、がんを治療する医薬の製造における第１の側面の抗原、第２の側面の複合体及び／又は第３の側面の結合部分の使用、並びにがんの治療方法であって、本発明の第１の側面の抗原、第２の側面の複合体及び／又は第３の側面の結合部分を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む方法も提供される。本発明の抗原は、単独で使用してもよく、又はプールとして組み合わせて使用してもよい。加えて、それらは、イピリムマブ、ペムブロリズマブ及びニボルマブといったチェックポイント阻害薬を含むがこれらには限定されない抗がん剤のような他の治療薬と組み合わせて使用してもよい。

本発明者らは、シトルリン化されたサイトケラチン８ペプチドが、Ｔ細胞応答を強力に刺激できることを最初に示した。本発明は、対象の腫瘍組織に対する免疫応答を局所的に刺激する適切な手段を提供する。これらのCyk8 citペプチドに特異的なＴ細胞は、腫瘍細胞を標的とし、in vivoで強力な抗腫瘍効果を誘発でき、したがって、がんを治療するためのワクチンとして、Cyk8 citエピトープを使用する最初の証拠を提供する。ワクチンに対する免疫応答の刺激には、患者の自然免疫応答、及び腫瘍に対する免疫応答の誘導を目的とする免疫療法（例．チェックポイント阻害剤、腫瘍抗原に対するＣＡＲ－Ｔ及び他の腫瘍免疫療法）が含まれる。免疫応答のこのようなサポート又は誘導は、免疫応答を開始して維持し、しばしばこの活性化を遮断する腫瘍媒介免疫抑制を回避するために、さまざまな臨床現場で有益である可能性がある。これらの応答は、自己免疫疾患の治療で忍容される可能性がある。

いくつかの態様では、細胞性免疫の応答は、ストレス誘発翻訳後修飾ペプチドに特異的であり、ここで、免疫応答は、ＴＣＲαβ又はγδを発現するＴ細胞の活性化を含む。本発明はまた、ＴＣＲ、個々のＴＣＲサブユニット（単独又は組合せ）及びそれらのサブドメイン、可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ、例．定常ドメインの残基間に、ナイーブなＴＣＲには存在しない少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合を有する可溶性αβ二量体ＴＣＲ）、並びにクローン化ＴＣＲであって、前記ＴＣＲが自己又は同種異系Ｔ細胞又はＴ細胞前駆細胞に改変されたもの、それらの調製方法、並びに前記ＴＣＲを有する他の細胞に関する。

がんは、甲状腺がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、胃がん、肝臓がん、神経内分泌腫瘍、膵臓がん、腎臓がん、前立腺がん、肺がん、乳がん及び婦人科のがんであってもよい。

本発明は、本発明の抗原、複合体及び／又は結合部分を含む医薬組成物を提供する。製剤は、アジュバント又は他の薬学的に許容されるワクチン成分と共に製剤化してもよい。特定の態様では、アジュバントは、ＴＬＲリガンド（例．ＣｐＧ（ＴＬＲ９）、ＭＰＬＡ（ＴＬＲ４）、イミキモド（ＴＬＲ７）、ポリＩ：Ｃ又はamplivant ＴＬＲ１／２リガンド、ＧＭＣＳＦ、油エマルジョン、細菌産物又は全不活化細菌）である。

抗原は、Ｔ細胞抗原又はＢ細胞抗原であってもよい。本発明のペプチドは、単独で又は組み合わせて使用してもよい。加えて、それらは、イピリムマブのようなチェックポイント阻害薬を含むがこれらには限定されない抗がん剤のような他の治療薬と組み合わせて使用してもよい。

本発明の抗原は、ペプチドとして、必要に応じて国際公開第02/058728号で開示されているようなペプチドの形態で、in vivoで送達できる。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の抗原をペプチドとして投与された場合に強力な免疫応答を引き起こすことを見いだした。このようなペプチドは、ペプチドの配列そのものとして、抗原を含むポリペプチドとして、又は全長タンパク質としても投与できる。あるいは、本発明の抗原は、抗原をコードする核酸として、抗原を含むポリペプチドをコードする核酸として、又は全長タンパク質をコードする核酸としても、in vivoで投与できる。このような核酸は、ミニ遺伝子の形態であってもよく、すなわち、リーダー配列及び抗原、又はリーダー配列及び全長タンパク質をコードする。

この明細書では、用語「治療」は、ヒト又はヒト以外の動物に利益をもたらす治療計画を含む。抗原、核酸、複合体及び／又は結合部分は、薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を形成してもよい。このような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセリン、エタノール及びこれらの組合せが含まれるが、これらには限定されない。

本発明の組成物の投与方法としては、注射が主な経路であることが想定されるが、カテーテル又は他の外科用チューブで送達してもよい。いくつかの適切な投与経路には、静脈内、皮下、皮内、腹腔内及び筋肉内投与が含まれる。粉末製剤から調製した液体製剤を使用してもよい。

静脈内注射、又は患部への注射では、活性成分は、発熱物質を含まず、ｐＨが適切で、等張であり、安定性が維持される、非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液又はラクトリンゲル注射液といった等張なビヒクルを用いて、適切な溶液を調製できる。必要に応じて、保存料、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を配合してもよい。

経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤又は液剤の形態であってもよい。錠剤は、ゼラチン又はアジュバントといった固体の担体を含んでいてもよい。液体の医薬組成物は、一般に、水、石油、動物若しくは植物油、鉱油又は合成油といった液体の担体を含む。生理食塩水溶液、デキストロース若しくは他の糖類の溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコールを含んでいてもよい。製剤が液剤の場合、例えば、ｐＨ６．８～７．６の非リン酸緩衝液を含む生理学的塩溶液、又は凍結乾燥粉末であってもよい。

組成物は、腫瘍部位又は他の所望の部位に局所的に投与してもよく、又はそれが腫瘍若しくは他の細胞を標的とする様式で送達しもよい。いくつかの態様では、抗原は、ＴＣＲαβ又はγδを発現するＴ細胞の活性化を含む細胞性免疫応答のためのアジュバントを配合することなく投与される。

組成物は、好ましくは、「治療的に有効な量」で個体に投与され、これは、個体に利益をもたらすのに十分な量である。投与される実際の量、及び投与の速度と時間経過は、対照の特性及び重症度に依存する。治療の処方、例えば、投薬量などの決定は、開業医及び他の医師の責任で行われ、通常、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に公知の他の因子が考慮される。本発明の組成物は、特に、がんの治療と最初の治療又は手術の後の再発の予防に関連する。このような技術及びプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington 1980）に見いだすことができる。組成物は、治療されるべき状態に応じて、単独で又は他の治療と組み合わせて、同時に又は連続的に投与してもよい。他のがん治療には、他のモノクローナル抗体、他の化学療法薬、他の放射線療法技術又は当該技術分野において公知の他の免疫療法が含まれる。本発明の組成物の特定の用途の１つは、手術の補完として、すなわち、腫瘍を除去した後に再発するがんのリスクを低下させるのを助けることである。本発明の組成物は、化学合成によって、完全に又は部分的に製造できる。この組成物は、十分に確立された標準的な液相、又は好ましくは固相ペプチド合成法によって容易に製造できる（その一般的な説明は広く入手可能である（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition (Stewart 1984)、The Practice of Peptide Synthesis (Bodanzsky 1984)及びApplied Biosystems 430A User’s Manual, ABI Inc.を参照））。あるいは、この組成物は、溶液中で、液相法によって、又は固相、液相及び溶液化学の組合せによって製造でき、例えば、最初にそれぞれのペプチド骨格を完成させ、次いで、所望かつ適切であれば、保護基を除去した後、それぞれの炭酸若しくはスルホン酸又はその反応性誘導体の反応による残基Ｘの導入によって製造できる。

本発明の抗原、複合体、核酸分子、ベクター、細胞及び結合部分は、天然に存在しないものであってもよく、精製されたものであってもよく、修飾されたものであってもよく、及び／又は組換え体であってもよく、単離されたものであってもよく、及び／又は合成されたものであってもよい。

本発明は、本発明の複合体と結合する結合部分を特定する方法を提供し、この方法は、候補となる結合部分を複合体と接触させる工程、及び候補となる結合部分が複合体と結合するかどうかを決定する工程を含む。

本発明の各側面の好ましい特徴は、他の各側面にも準用される。この明細書で示した先行技術文献は、法律によって許容される最大限の範囲で組み込まれる。

以下の実施例及び図面を参照して、本発明を更に説明する。

方法
1.1 市販のｍＡｂ
抗ＩＦＮγ抗体（クローンXMG1.2）、抗マウスＣＤ４抗体（クローンGK1.5）、抗マウスＣＤ８抗体（クローン2.43）及び抗ヒトＣＤ４抗体（クローンOKT-4）は、BioXcell, USAから購入した。抗ヒトＣＤ１３４抗体（クローンREA621）及び抗ヒトＣＤ８抗体（クローンREA734）は、Miltenyi, Germanyから購入した。抗ヒトＣＤ４抗体（クローンRPA-T4）、抗ヒトグランザイムＢ抗体（クローンGB11）は、Thermo Fisher Scientific, USAから購入した。抗ヒトＩＦＮγ抗体（クローンE780）は、eBioscience, USAから購入した。

1.2 細胞株
マウス黒色腫B16F1、マウス膵臓pan02細胞株は、American Tissue Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手し、特に明記しない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、L-グルタミン（２ｍＭ）を補充し、炭酸水素ナトリウムで緩衝化したＲＰＭＩ培地１６４０（GIBCO/BRL）で培養した。トランスジェニックマウスTRAMP細胞は、ＡＴＣＣから入手し、炭酸水素ナトリウムが１．５ｇ／Ｌ、グルコースが４．５ｇ／Ｌとなるように調整された４ｍＭのL-グルタミンを含み、０．００５ｍｇ／ｍｌのウシインスリン及び１０ｎＭのデヒドロイソアンドロステロンが９０％；ウシ胎児血清が５％；Nu-Serum IVが５％を補充したダルベッコ改変イーグル培地で培養した。マウス乳腺がん細胞株PY8119及びPY230は、ＡＴＣＣから入手し、Ham’s F12 Kaighn培地、５％ ＦＢＳで培養し、PY230細胞株は、０．１％ ＭＩＴＯ＋Serum Extender（Corning）の存在下でも培養した。ヒト細胞株HeLa及びマウス細胞株LLC2は、ＡＴＣＣから入手し、１０％ ウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地で培養した。ID8細胞株はKUMC University（Kansas, USA）のK. Roby博士より提供を受け、１０％ ＦＣＳを補充したＤＭＥＭで培養した。

1.3 in vitroシトルリン化
サイトケラチン８のシトルリン化は、０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５（Fisher）、１０ｍＭのＣａＣｌ_２（Sigma）及び５ｍＭのＤＴＴ（Sigma）中で行った。溶液の最終濃度は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５が３７６ｍＭ、ＣａＣｌ_２が３．７６ｍＭ、ＤＴＴが１．８８ｍＭであった。試料をＰＡＤ酵素とともに３７℃で２時間インキュベートした後、－８０℃で一晩又は使用するまで保存した。ＰＡＤ２酵素は１４８ｍＵで使用し、ＰＡＤ４は最終濃度１５２ｍＵで使用した。ＰＡＤ酵素は、Modiquestから、ｈＰＡＤ２が３７ｍＵ／μｌ及びｈＰＡＤ４が３８ｍＵ／μｌのものを購入した。

1.4 免疫源
1.4.1 ペプチド
純度が９０％を超えるペプチドは、Peptide Synthetics（Fareham, UK）が合成し、０．２ｍｇのアリコートとして－８０℃で凍結乾燥保存した。使用する日に、１０％ジメチルホルムアミドで所望の濃度に再構成した。

1.5 プラスミド及びトランスフェクション
HHDIIプラスミドを調製するために、ＥＬ４-ＨＨＤ細胞の全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これは、フォワード及びリバースプライマーを使用してＨＨＤを増幅するためのテンプレートとして使用し、pCR2.1にサブクローニングした。次いで、ヒトＨＬＡ-Ａ２リーダー配列、グリシンセリンリンカーを介して、ヒトＨＬＡ-Ａ^＊０２０１ ＭＨＣクラスＩ分子のα１及びα２ドメイン、並びにマウスＨ-２ＤｂクラスＩ分子のα３、膜貫通及び細胞質ドメインと共有結合したヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）分子を含むＨＨＤ鎖を、Invitrogenから入手した哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1のEcoRV/HindIII部位に挿入した。

エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡを、endofree Qiagen maxiprepキット（Qiagen, Crawley）を使用して調製した。

以前に説明されたプロトコル（Brentville et al. 2016）を利用するリポフェクタミントランスフェクション試薬（Invitrogen）を使用して、細胞株をトランスフェクトした。B16F1細胞は、ＺＦＮ技術（Sigma）を使用してマウスＭＨＣ-Ｉ及び／又はＭＨＣ-ＩＩをノックアウトし、pVitro 2キメラプラスミドを使用して、構成的ＨＬＡ-ＤＰ４をトランスフェクトした。細胞は、以前に説明されている（Xue et al. 2016）ように、ヒトＨＬＡ-Ａ２リーダー配列、グリシンセリンリンカーを介して、ヒトＨＬＡ-０２０１ ＭＨＣクラス１分子のα１及びα２ドメイン、並びにマウスＨ-２Ｄｂクラス１分子のα３、膜貫通及び細胞質ドメインと共有結合したヒトβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）分子を含むHHDIIプラスミドでもトランスフェクトした。B16F1 HHDII細胞も、pVITRO2ヒトHLA-DP4プラスミドでトランスフェクトした。ＩＦＮγ誘導プラスミドpDCGASヒトHLA-DP4は以前に説明されている（Brentville et al. 2019）。

1.6 ウエスタンブロット
細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma）を含むＲＩＰＡバッファーで調製し、タンパク質を４～１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen）で分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。組換えサイトケラチン８タンパク質を陽性対照として使用した（ab73641, Abcam）。膜を３％ＢＳＡで１時間ブロックし、０．５μｇ／ｍｌのヒトサイトケラチン８（クローンTROMA-1, Millipore）及びβアクチン（Ab8227, Abcam）（１：１５０００）に対する抗体をプローブとして使用した。タンパク質を、蛍光二次抗体IRDye 800RD及びIRDye 680RD二次抗マウス抗体（βアクチン用）を使用して可視化した。Licor Odysseyスキャナーを使用して膜を画像化した。

1.7 免疫
1.7.1 免疫プロトコル
生後８～１２週の、国際公開2013/017545号に記載のHHDII/HLA-DP4トランスジェニック系統マウス（EMMA repository, France）及びC57BL/6マウス（Charles River, UK）を使用し、Nottingham Trent大学のスタッフが世話をした。全ての作業は、内務省のプロジェクト ライセンスの下で行った。ペプチドを１０％ジメチルホルムアミドに溶解して１ｍｇ／ｍＬとし、次いで、アジュバントとして各マウス６μｇのＣｐＧ及びＭＰＬＡ（Invivogen, UK）それぞれで（一連の希釈液に）乳化した。ペプチド（２５μｇ／マウス）を尾の付け根に皮下注射した。

腫瘍投与実験では、（特に明記しない限り）初回免疫の３日前に、マウスの右脇腹に１×１０^５のB16 HHDII/iDP4細胞を皮下投与し、次いで、上述のとおりに免疫した。腫瘍の成長を３～４日間隔で監視し、腫瘍の直径が１０ｍｍ以上となったらマウスを安楽死させた。

1.8 免疫応答の分析
1.8.1 動物組織の単離及び分析
脾臓を解体し、赤血球溶解緩衝液で２分間処理した。腫瘍を採取し、機械的にばらばらにした。

1.8.2 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
静脈穿刺で得た末梢血試料をリチウムヘパリンチューブ（Becton Dickinson）に採取し、直ちに処理した。ＰＢＭＣはFicoll-Hypaqueを使用する密度勾配遠心分離で単離した。ＰＢＭＣの増殖及び培養ELISpotアッセイは、単離の直後に行った。

1.8.3 ex vivo ELISpotアッセイ
ELISpotアッセイを製造元（Mabtech, Sweden）の指示に従い、マウスＩＦＮγ捕捉・検出試薬を使用して行った。簡単に説明すると、抗ＩＦＮγ抗体を９６ウエルImmobilin-Pプレートのウエルにコーティングした。（さまざまな濃度の）合成ペプチド及び１ウエルあたり５×１０^５個の脾細胞を、それぞれ、プレートの３つのウエルに加えた。５μｇ／ｍＬのＬＰＳを陽性対照として使用した。標的細胞でパルスしたペプチド、それぞれを１ウエルあたり５×１０^４個で３つのウエルに添加し、プレートを３７℃で４０時間インキュベートした。インキュベーション後、捕捉したＩＦＮγをビオチン化抗ＩＦＮγ抗体で検出し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼと発色基質で発色させた。リポ多糖（ＬＰＳ；５μｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用した。ブロッキング実験では、Bioxcellの抗ＣＤ４ブロッキング抗体（ＲＰＡ-Ｔ４）及び抗ＣＤ８ブロッキング抗体（２．４３）を２０μｇ／ｍＬで使用した。自動プレートリーダー（Cellular Technologies Ltd）を使用して、スポットを分析し、計数した。

1.9 増殖アッセイ
末梢血試料（約５０ｍＬ）をリチウムヘパリンチューブ（Becton Dickinson）に採取した。試料は室温に保ち、静脈穿刺の直後に処理した。ＰＢＭＣはFicoll-Hypaqueを使用する密度勾配遠心分離で単離した。ＰＢＭＣの単離直後に増殖アッセイを行った。健常者の試料から常法で得たＰＢＭＣの中央値は、１．０４×１０^６ＰＢＭＣ／ｍＬ全血（範囲：０．６×１０^６～１．４８×１０^６／ｍＬ）であった。トリパンブルー排除で評価した生存率の中央値は９３％（範囲９０～９５％）であった。

単離した新鮮なＰＢＭＣに、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ThermoFisher）を加えた。簡単に説明すると、暖かいＰＢＳ中の５０μＭストック溶液を、ＤＭＳＯ中５ｍＭのマスター溶液から調製した。ＣＦＳＥを、最終濃度５μＭとするためにＰＢＭＣ（５×１０^６細胞／ｍＬローディング緩衝液（５％v/v熱不活性化ＦＣＳを含むＰＢＳ））に直ちに追加した。ＰＢＭＣを暗所、室温で５分間インキュベートした後、過剰（×１０v/v容量）のローディング緩衝液で２回洗浄して（３００×ｇで１０分）、細胞に取り込まれていないＣＦＳＥを除去した。細胞を完全培地で１．５×１０^６／ｍＬとし、プレートに播種し、上述したように、ビヒクル（陰性対照）、ＰＨＡ（陽性対照、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）又はペプチド（１０μｇ／ｍＬ）を含む培地で刺激した。増殖が対照の２倍で１％を超える場合に、ペプチドに対するドナーの応答が生じたと見なした。

７～１１日目に、培養液から５００μＬの細胞を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、抗ＣＤ４抗体（PE-Cy5、クローンRPA-T4、ThermoFisher）、抗ＣＤ８抗体（クローンRPA-T8、ThermoFisher）及び抗ＣＤ１３４抗体（PE-Cy7、クローンREA621、Miltenyi）の１：５０希釈液で染色した。製造元の指示に従い、細胞内固定／透過化緩衝液（ThermoFisher）を使用して、細胞を洗浄、固定、透過化した。サイトカインの細胞内染色は、抗ＩＦＮγ抗体（clone 4S.B3, ThermoFisher）又は抗グランザイムＢ抗体（PE, Clone GB11, Thermofisher）の１：５０希釈液を使用して行った。染色した試料は、MACSQuantソフトウェアバージョン2.8.168.16380を備えたMACSQuant 10フローサイトメーターで分析し、染色したビヒクル刺激対照を使用して、適切なゲートを決定した。

1.10 Ｔ細胞集団のフェノタイピング
増殖アッセイを、上記1.9の項に記載の方法に従って行った。７～１１日目に、培養液から５００μＬの細胞を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、製造元の指示に従い、抗ＣＤ４抗体（PE-Cy5、クローンRPA-T4、ThermoFisher）、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体（VioGreen、クローンREA562、Miltenyi）、抗ＣＤ１７７抗体（CCR7、PE-Vio770、クローンREA108、Miltenyi）、抗ＣＤ１２７抗体（APC-Vio770、クローンREA614、Miltenyi）の１：５０希釈液で染色した。染色した試料は、MACSQuantソフトウェアバージョン2.8.168.16380を備えたMACSQuant10フローサイトメーターで分析し、染色したビヒクル刺激対照を使用して、適切なゲートを決定した。

1.11 ＦＡＣＳセルソーティング
１０日目に、培養ウエルの内容物を穏やかに混合し、（ペプチド刺激に従って）プールし、ＰＢＳで洗浄した（３００×ｇで１０分）。ペレットは、１０μＬの抗ＣＤ４抗体（eFluor450、クローンRPA-T4、ThermoFisher、カタログ番号48-0049-42）及び１０μＬの抗ＣＤ８抗体（APC、クローンRPA-T8、ThermoFisher、カタログ17-0088-41）を含む５００μＬのＰＢＳに穏やかに再懸濁した。細胞を４℃で３０分間染色した後、１ｍＬのＰＢＳで洗浄し（３００×ｇで５分）、３００μＬのＦＡＣＳソーティング緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１％v/vのＨＩ ＦＣＳを加えたＰＢＳ）に再懸濁した。染色したそれぞれの試料から１０μＬを取り出し、９０μＬのＦＡＣＳソーティング緩衝液を加えた。増殖を決定するために、MACSQuant Analyzer 10フローサイトメーターで１０，０００イベント収集した。残りの細胞は、バルクＦＡＣＳソーティングに使用した。

細胞を、MoFlo XDP高速セルソーターを滅菌条件で使用して並べ替える。全ての試料は、ＣＤ４＋ｖｅ／ＣＦＳＥ^高集団とＣＤ４＋ｖｅ／ＣＦＳＥ^低集団を分離する１ｍＬのＲＮＡプロテクト（プロテクト、Qiagen ５部：ＦＡＣＳソーティング緩衝液、Sigma １部）中でソートされる。ソートした細胞（バルク）を－８０℃で保存する。

シトルリンを含むサイトケラチン８ペプチドを認識するＴＣＲのα鎖とβ鎖のペアの決定。ＲＮＡプロテクト中のＣＤ４＋ｖｅ／ＣＦＳＥ^高集団とＣＤ４＋ｖｅ／ＣＦＳＥ^低集団にソートした細胞（バルク）を、ＴＣＲＡ及びＴＣＲＢ鎖のＮＧＳシーケンシングのためにiRepertoire Inc（Huntsville, AL, USA）に送り、増殖していないＣＤ４＋ｖｅ／ＣＦＳＥ^高集団に対する、ＣＤ４＋ｖｅ／ＣＦＳＥ^低細胞におけるＴＣＲの増殖を確認する。簡単に説明すると、ソートした細胞からＲＮＡを精製し、ＲＴ-ＰＣＲを行い、次いで、ｃＤＮＡを、ヒトＴＣＲα及びβ２５０ＰＥＲプライマー（iRepertoire Inc., Huntsville, AL, USA）を使用して、アンプリコンレスキューマルチプレックスＰＣＲ（ＡＲＭ-ＰＣＲ）にかける。プライマーに関する情報は、米国特許第7,999,092号及び同第9,012,148号に記載されている。ＰＣＲ／ＤＮＡ試料の評価後、１０個の試料ライブラリーをプールし、Illumina MiSeqプラットフォーム（Illumina, San Diego, CA, USA）を使用してシーケンシングした。生データを、iRwebソフトウェア（iRepertoire）を使用して分析した。使用されたＶ、Ｄ及びＪ遺伝子とＣＤＲ３の配列を特定して割り当て、iRwebツールを使用してツリーマップを生成した。ツリーマップは、各固有のＣＤＲ３を色付きの四角形として示し、各四角形のサイズは、レパートリー内の各ＣＤＲ３の存在量に対応し、位置はＶ領域によって決まる。

ＴＣＲα及びＴＣＲβ鎖の同族ペアと配列を解明するために、iRepertoireはiPair（登録商標）技術を使用して、（同時にバルクシーケンスされ、バルクソートされた）ＣＤ４＋ｖｅ／ＣＦＳＥ^低細胞集団の細胞が、iCapture 96ウェルプレートに１細胞／ウエルで播種する。ＲＴ-ＰＣＲを行い、アンプリコンレスキューマルチプレックスＰＣＲ（ＡＲＭ-ＰＣＲ）を使用して、単一の細胞からＴＣＲα及びβ鎖が増幅できる。データは、iPair（登録商標）ソフトウェアプログラムを利用して、特定の鎖のペアの頻度と、バルクデータとの比較でランク付けされた配列を分析できる。

1.12 統計的方法
データは、１００万個の脾細胞あたりのスポット数として表した。平均値と標準偏差（ＳＤ）は、４回の測定値から計算した。３匹のマウスの各群について、平均値とＳＤも計算した。必要に応じて、GraphPad Prism 6ソフトウェアを使用してＡＮＯＶＡ分析を行った。

実施例１ 異なる種のサイトケラチン８の相同性
サイトケラチン８には２つのアイソフォーム、アイソフォーム１（P05787-1）及びアイソフォーム２（P05787-2）が存在し、それらの配列を図１Ａに示す。サイトケラチン８は、マウス、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ及びヒトの間で高度に保存されている（図１Ｂ）。ワクチンは、ヒト及びマウスでＴ細胞応答を誘導し、マウスで抗腫瘍応答を誘導することから、他の種でも同様の応答が見られると仮定できる。

実施例２ HHDII/DP4及びC57BL/6マウスにおけるサイトケラチン８エピトープに対するＴ細胞応答
腫瘍関連エピトープに対するＴ細胞応答は、寛容と胸腺内のＴ細胞欠失のために、しばしば弱いか、存在しない。C57BL/6及びHHDII/DP4トランスジェニックマウスで、シトルリン化サイトケラチン８ペプチドのＩＦＮγ応答を刺激する能力をスクリーニングした。選択したペプチドについて、予測ＩＥＤＢ結合スコア及びペプチドスクリーニングELISpotアッセイの結果を、表２に要約する。

サイトケラチン８ペプチド応答のスクリーニング
HHDII/DP4及びC57BL/6マウスを、CpG/MPLAをアジュバントとして組み合わせてヒトシトルリン化ペプチドで免疫した。２５μｇのペプチドを、週１回、３週間、皮下投与した。３回目の免疫の７日後にマウスを選別し、各ペプチドに対する免疫応答を、ex vivo ＩＦＮγELISpotで評価した（図２）。我々は以前に、シトルリン化ペプチドがトランスジェニックDR4マウスで応答を誘導できることを示した。マウスが異なればＭＨＣレパートリーが異なることを考慮して、トランスジェニックHHDII/DP4及び非トランスジェニックC57BL/6マウスをスクリーニングに使用した。

トランスジェニックHHDII/DP4マウス（図２Ａ）及びC57BL/6マウス（図２Ｂ）において、ヒトＣｙｋ８シトルリン化ペプチドに対する有意なＩＦＮγ応答が検出された。HHDII/DP4マウスでは、Ｃｙｋ８シトルリン化ペプチド101-120、133-151、217-236、371-388、381-399は、有意な免疫応答を誘導した（それぞれ、p=<0.01、p=<0.001、p=<0.0001、p=<0.0001、p=<0.0001）。C57BL/6マウスでは、Cyk8 8-26シトルリン化ペプチドのみが有意な応答を誘導し（p=<0.001）、他のシトルリン化Ｃｙｋ８ペプチドに対する有意な応答は検出されなかった。HHDII/DP4におけるＴ細胞応答のアビディティーを、ペプチドCyk8 133-151 cit、Cyk8 217-236 cit、Cyk8 371-388 citによる滴定を行うことで決定した（図２Ｃ）。Ｔ細胞応答の最も高いアビディティーは、ペプチドCyk8 371-388 citでｌｏｇＥＣ_５０値が－７．１～－７．６Ｍであり、Cyk8 133-151 citペプチドのアビディティーは、ｌｏｇＥＣ_５０値が－６．０～－６．５Ｍでわずかに低く、Cyk8 217-236 citペプチドのアビディティーはｌｏｇＥＣ_５０値が－５．０～－５．９Ｍとわずかに低かった。

Ｃｙｋ８ペプチドに対する免疫応答が、野生型（ｗｔ）のペプチドではなく、シトルリン化ペプチドに特異的であるかどうかを判断するために、HHDII/DP4トランスジェニックマウスを、Cyk8 101-120 cit、133-151 cit、217-236 cit、371-388 cit、381-399 cit又はCyk8 101 wt、133-151 wt、371-388 wtペプチドで免疫した。HHDII/DP4マウスに、CpG/MPLAを含む２５μｇのペプチドを週１回、３週間、皮下投与した。３回目の免疫の７日後にマウスを選別し、各ペプチドに対する免疫応答をex vivo ELISpotで評価した（図３Ａ及び３Ｂ）。中等度から高度のＩＦＮγ応答が、Cyk8 101-120 cit、133-151cit、217-236 cit、371-388 cit、381-399 citで免疫したマウスで検出され、これらは、ｗｔペプチドに対する応答と比較して有意であった（それぞれ、p=0.0454、p=0.0087、p=0.0003、p=0.0022、p=0.0238）。低度から中程度のＩＦＮγ応答が、Cyk8 101-120 wt、Cyk8 131-15 wt、Cyk8 371-388 wtで免疫したマウスで検出されたが、ｃｉｔペプチドに対する応答と比較すると、有意な応答はなかった。このことから、HHDII/DP4マウスで生じた免疫応答が、シトルリン化したCyk8 101-120、Cyk8 133-151、Cyk8 217-236、Cyk8 371-388、Cyk8 381-399ペプチドで認められ、ｗｔに対する交差反応は観察されなかったことが確認された。

Cyk8 101-120、133-151、371-388ペプチドの配列は、ヒトとマウスで完全に相同であるが、Cyk8 217-236とCyk8 8-26ペプチドはアミノ酸のミスマッチが２つあり、Cyk8 381-399とCyk8 8-26はアミノ酸のミスマッチが１つある（図４Ａ）。マウスＣｙｋ８ペプチド217-236（位置２２７及び２２８でミスマッチ）に対する免疫応答がヒトＣｙｋ８ペプチドと同じであるかどうかを判断するために、HHDII/DP4トランスジェニックマウスをマウスCyk8 217-236citペプチドで免疫した。２５μｇのペプチドを、CpG/MPLAをアジュバントとして組み合わせて、HHDII/DP4マウスに週１回、３週間、皮下投与した。３回目の免疫の７日後にマウスを選別し、マウス及びヒトペプチド217-236に対する免疫応答を、ex vivo ELISpotで評価した（図４Ｂ）。マウス217-236 citペプチドで免疫したマウスで中程度のＩＦＮγ応答が検出され、その応答はヒト217-236 citと交差反応し、有意差は観察されなかった。

異なるサイトケラチン間には高度の配列類似性が存在する。今回特定したサイトケラチン８ペプチドが、他のサイトケラチン又はビメンチンなどの他の抗原で見いだされるか否かを判断するために、ペプチドのBLAST検索を行った。Cyk8 381-399（ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹＲＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号４））ペプチドが、完全な配列一致でサイトケラチン４及びグリア線維性タンパク質中でも見いだされ、位置２における１つのアミノ酸の違いでビメンチン中にも見いだされた（図５）。Cyk8 101-120（ＫＦＡＳＦＩＤＫＶＲＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１））ペプチドが、位置１８における１つのアミノ酸の違いで、サイトケラチン２及びサイトケラチン７でも見いだされた（図５）。サイトケラチン８に加えて、これらのペプチドは、サイトケラチン２、４、７、ビメンチン及びグリア線維性タンパク質を標的とするために使用できる。

シトルリン化ペプチド特異的応答は、ＣＤ４媒介性であることが以前に示されている。Cyk8 8-26 cit、Cyk8 101-120 cit、Cyk8 133-151 cit、Cyk8 371-388 cit、Cyk8 381-399 citに対する応答が、ＣＤ４依存性であるかどうかを判断するために、２５μｇのペプチドを、CpG/MPLAをアジュバントとして組み合わせて、HHDII/DP4トランスジェニックマウス及びC57BL/6マウスに１週間に１回、３週間、皮下投与した（図６Ａ HHDII/DP4、図６Ｂ C57BL/6）。３回目の免疫の７日後にマウスを選別し、抗ＣＤ４又はＣＤ８抗体の存在下でELISpotアッセイを行った。Cyk8 8-26 cit（p=<0.5）、Cyk8 101-120 cit（p=<0.01）、Cyk8 371-388 cit（p=<0.001）及びCyk8 381-399 cit（p=<0.001）ペプチドに対するＩＦＮγ応答は、抗ＣＤ４抗体の存在下で有意に減少したが、Cyk8 133-151 citペプチドに対する応答は有意には減少しなかった。Cyk8 8-26 cit、Cyk8 101-120 cit、Cyk8 133-151 cit、Cyk8 371-388ペプチドでは、抗ＣＤ８抗体の存在下におけるＩＦＮγ応答は有意に減少せず、これらのペプチドはＣＤ４ペプチドであることが確認された。Cyk8 133-151 citペプチドに対するＩＦＮγ応答は、抗ＣＤ４抗体の存在下で減少したが、これは有意ではなかった。Cyk8 381-399 citペプチドに対するＩＦＮγ応答は、抗ＣＤ８抗体（p=<0.01）及び抗ＣＤ４抗体（p=<0.001）の存在下で有意に減少し、このペプチドがＣＤ４（ＭＨＣクラスＩＩ）拘束性であるが、ネスト化ＣＤ８（ＭＨＣクラスＩ）拘束性ペプチドも含む可能性があることが確認された。

Cyk8 371-388 citペプチドに特異的なＴ細胞の既存の記憶集団が存在するかどうかを判断するために、２５μｇのペプチドをCpG/MPLAと組み合わせて、HHDII/DP4トランスジェニックマウスに、脾細胞回収の１４日又は２日前に皮下投与した（図７）。脾細胞回収の１４日前にCyk8 371-388 citペプチドで免疫したマウスで、中等度から高度のＩＦＮγ応答が検出され、これらは、対照と比較して有意であった（p=0.0163）。脾細胞回収の２日前にCyk8 371-388 citペプチドで免疫したマウスでは、応答は検出されなかった。これらの結果は、HHDII/DP4トランスジェニックマウスにおけるCyk8 371-388 citペプチドに対する応答は、ナイーブＴ細胞に由来し、回収の２日前の免疫で増強された既存の記憶集団に由来するものではないことを示す。

実施例３ 腫瘍細胞が提示したｃｉｔサイトケラチン８ペプチドは腫瘍治療の標的となる可能性がある
本発明者らは、ウエスタンブロット法により、メラノーマB16F1細胞がサイトケラチン８を構成的に発現し（図８Ａ）、in vitroでＰＡＤ２及びＰＡＤ４の両者がサイトケラチン８をシトルリン化できることを、既に立証した（図８Ｂ）。

ＩＦＮγ誘導ヒトＤＰ４（ｉＤＰ４）をトランスフェクトしたマウスB16メラノーマ細胞の増殖に対するCyk8 371-388（ｃｉｔ及びｗｔ）による免疫の効果を、HHDII/DP4トランスジェニックマウスで評価した（図９Ａ）。Cyk8 371-388 citペプチドは、ヒトとマウスで相同であり、ＣＤ４ Ｔ細胞による免疫応答も最強であることから、これを選択した。Cyk8 371-388 wt又はCyk8 371-388 citによる免疫の３日前に、マウスにB16 HHDII/iDP4腫瘍細胞を投与した。Cyk8 371-388 citペプチド又はCyk8 371-388 wtで免疫したマウスは、免疫を行っていない対照マウスよりも生存率が有意に高かった（それぞれp=0.0003、p=0.0018、図９Ａ）。６０日目の生存率は、対照マウスでは１０％であったのに対し、Cyk8 371-388 cit免疫マウスは７０％であり、Cyk8 371-388 wt免疫マウスでは４０％であった。これらの結果は、Cyk8 371-388 citペプチドが誘導する抗腫瘍応答とは有意差がない（p=0.2953）が、Cyk8 371-388 citによる免疫は、ｗｔペプチドによる免疫と比較して生存率を３０％の改善するHHDII/DP4トランスジェニックマウスにおける抗腫瘍応答を、Cyk8 371-388 wtペプチドが刺激できることも示唆する。毒性は認められなかった。腫瘍移植の２９日後の腫瘍体積は、対照群（中央値 ５０９ｍｍ^３）と比較して、Cyk8 371-388 cit免疫マウス（中央値 ０ｍｍ^３）では有意に低かった（p=0.0013、図９Ｂ）。Cyk8 371-388 wtで免疫したマウスの腫瘍体積（中央値 ４ｍｍ^３）も、対照群と比較して有意に低かった（p=0.0015）。免疫を行っていないマウスは、Cyk8 371-388 cit又はCyk8 371-388 wtペプチドで免疫したマウスと比較して、比較的急速に大きな腫瘍が発生した（図９Ｃ）。Cyk8 371-388 citペプチドは、腫瘍を有するHHDII/DP4トランスジェニックマウスにおいて抗腫瘍応答を誘導できることを、これらの結果は示している。

ＩＦＮγ誘導ヒトＤＰ４（ｉＤＰ４）をトランスフェクトしたマウスB16メラノーマ細胞の増殖に対するCyk8 101-120 citによる免疫の効果を、HHDII/DP4トランスジェニックマウスで評価した（図１０Ａ）。Cyk8 101-120 citペプチドは、ヒトとマウスで相同であり、ＣＤ４ Ｔ細胞による免疫応答も強力であることから、これを選択した。Cyk8 101-120 citペプチドによる免疫の３日前に、マウスにB16 HHDII/iDP4腫瘍細胞を投与した。Cyk8 101-120 citペプチドで免疫したマウスは、免疫を行っていない対照マウスよりも生存率が有意に高かった（p=0.0072、図１０Ａ）。５０日目の生存率は、対照マウスでは２０％であったのに対し、Cyk8 101-120 cit免疫マウスは７０％であった。毒性は認められなかった。腫瘍移植の２４日後の腫瘍体積は、対照群（中央値 ８９ｍｍ^３）と比較して、Cyk8 101-120 cit免疫マウス（中央値 ２ｍｍ^３）では有意に低かった（p=0.0221、図１０Ｂ）。免疫を行っていないマウスの腫瘍体積（２９日目の最高中央値 ５０９ｍｍ^３）は、免疫群（３５日及び３８日目の最高中央値 ９ｍｍ^３）と比較して大きかった（図１０Ｃ）。Cyk8 101-120 citペプチドは、腫瘍を有するHHDII/DP4トランスジェニックマウスにおいて抗腫瘍応答を誘導できることを、これらの結果は示している。

マウスB16メラノーマ細胞の増殖に対するCyk8 8-26 citによる免疫の効果を、C57BL/6で評価した。Cyk8 8-26 citによる免疫の３日前に、マウスにB16腫瘍細胞を投与した。Cyk8 8-26 citペプチドで免疫したマウスは、免疫を行っていない対照マウスよりも生存率が有意に高かった（p=0.0002、図１１Ａ）。２０日目の生存率は、対照マウスでは０％の生存率であったのに対して、Cyk8 8-26 cit免疫マウスは７０％で、２９日目では４０％に低下した。毒性は認められなかった。腫瘍移植の１３日後の腫瘍体積も、対照群（中央値 ５８６ｍｍ^３）と比較して、Cyk8 8-26 cit免疫マウス（中央値 １９ｍｍ^３）では有意に低かった（p=0.0054、図１１Ｂ）。免疫を行っていないマウスの腫瘍体積（１７日目の最高中央値 １１５０ｍｍ^３）は、免疫群（２３日目の最高中央値 ５２３ｍｍ^３）よりも大きかった（図１１Ｃ）。これらの結果は、Cyk8 8-26 citペプチドは、腫瘍を有するC57BL/6マウスにおいて、抗腫瘍応答を誘導できることを、これらの結果は示している。

実施例４ 健康なヒトドナー及びがん患者のサイトケラチン8に対する応答
HHDII/DP4マウスでは、Cyk8 371-388 citペプチドに対する応答は、免疫の２日後では検出できなかったが、１４日後には検出できた。このことは、これらがナイーブな応答であり、このマウスには既存の免疫が存在しないことを示唆している。これは、ヒトがシトルリン化Cyk8ペプチドに対して免疫応答を有するか、又は免疫応答を引き起こすことが可能であるかという問題を提起した。この実験のために、Cyk8 101-120 citペプチドに対する応答を、健常者及びがん患者で測定した。卵巣がん及び肺がん患者の臨床の詳細を、それぞれ表３及び４に示す。これを調べるために、１８人の健常者からＰＢＭＣを得、Cyk8 101-120 citペプチドの存在下で培養した。１３人のドナーはＨＬＡ-ＤＰ４陽性であり、２人のドナーはＨＬＡ-ＤＰ４陰性であり、３人のドナーについてはＨＬＡの型を決定できなかった。

Cyk8 101-120 citペプチドの存在下で培養する前に、１８人の健常者のＰＢＭＣを、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。７日目及び１０日目に、細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８蛍光色素結合抗体で染色し、増殖をフローサイトメトリーで評価した（図１２Ａ）。ＣＤ４ Cyk8 101-120 cit特異的増殖（ＣＦＳＥ^低）集団は、７日目では１８人中４人のドナーで検出でき、１０日目では増加して６人が特異的な応答を示した（図１２Ｂ）。１０日目にＣＤ４ Cyk8 101-120 cit特異的増殖応答が良好であった６人のドナーのうちの５人について機能解析を行った。増殖が認められたドナーのＴ細胞で、ＩＦＮγ、グランザイムＢ及びＣＤ１３４の発現を測定した（図１２Ｃ、Ｄ及びＥ）。５人のドナー、全てのＴ細胞はＣＤ１３４を（対照培地のバックグラウンドを超えて）発現し、４人はＩＦＮγも発現し、２人はグランザイムＢも発現した。このデータは、健康なドナーでは、Cyk8 101-120 citペプチドに対するＴ細胞応答を検出でき、これらのＴ細胞は増殖し、機能に関連するマーカーを発現することを示す。

Cyk8 101-120 citペプチドの存在下で培養する前に、５人の肺がん患者及び１２人の卵巣がん患者のＰＢＭＣを、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。７日目及び１０日目に、細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８蛍光色素結合抗体で染色し、増殖をフローサイトメトリーで評価した（図１３）。ＣＤ４ Cyk8 101-120 cit特異的増殖（ＣＦＳＥ^低）集団が、７日目に５人中１人の肺がん患者で検出された。これは１０日目に減少し、特異的応答を示す肺がん患者のＴ細胞は認められなかった（図１３Ａ）。Cyk8 101-120 citペプチド特異的増殖（ＣＦＳＥ^低）集団が、７日目に１２人中３人の卵巣がん患者で検出された。これは１０日目に増加し、１２人中４人のＴ細胞がCyk8 101-120 citペプチドに対して特異的な応答を示した（図１３Ｂ）。ＣＤ４ Cyk8 101-120 cit特異的増殖応答が良好であった１人の肺がん患者及び４人の卵巣がん患者（図１３Ｃ及び１２Ｄ）について、７日目及び１０日目に機能解析を行った。肺がん患者のＴ細胞は、ＣＤ１３４、ＩＦＮγ又はＣＤ１３４のいずれの発現も（対照培地のバックグラウンドを超えて）示さず（図１３Ｃ）、４人中１人の卵巣がん患者のみが、ＣＤ１３４及びグランザイムＢの特異的発現を（対照培地のバックグラウンドを超えて）示したが、ＩＦＮγの発現は示さなかった（図１３Ｄ）。このデータは、がん患者では、少数の患者でCyk8 101-120 citペプチドに対するＴ細胞応答が検出できるが、その頻度は低く、程度が小さいことを示す。

これらの結果は、健康なドナーのＴ細胞が、Cyk8 101-120 citペプチドに対するＣＤ４増殖応答を引き起こすことが可能であることを示唆し、これは、細胞傷害活性の機能マーカーの上方制御にも関連する。少数のがん患者のＰＢＭＣも、頻度は低いものの、Cyk8 101-120 citペプチドに対するＣＤ４応答を引き起こすことができる。Cyk8 101-120 citペプチド特異的Ｔ細胞応答の増殖の程度は、健常者と比較して、肺がん及び卵巣がん患者では小さかった。このがん患者におけるＴ細胞応答の小ささは、患者が服用している薬物又は患者の腫瘍媒介免疫抑制が原因の可能性がある。これらの結果は、健常者と比較して、Cyk8 101-120 citペプチドに応答するがん患者の数が少なく、Cyk8 101-120 cit特異的増殖応答を示したがん患者の大多数では、機能マーカーの共発現はなかったことを示す。

実施例５ 健康なヒトドナーでは、ナイーブＴ細胞集団はCyk8 101-120 citペプチドに応答する
１人の健常者のＰＢＭＣを、Cyk8 101-120 citペプチドの存在下で培養する前に、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。１０日目に、細胞を抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ１７７（ＣＣＲ７）抗体及び抗ＣＤ１２７抗体で染色し、増殖と応答Ｔ細胞の表現型をフローサイトメトリーで評価した（図１４）。１０日目に、ＣＤ４ Cyk8 101-120 cit特異的増殖集団が検出でき、これらのＴ細胞の大部分は記憶細胞で（５．９６％がＴＥＭＲＡ、５２．９１％がエフェクターメモリー、３２．７５％がセントラルメモリー）、８．３８％のみがナイーブＴ細胞であった。これらの結果は、健常ドナーでは、ペプチド刺激後にCyk8 371-388 cit特異的Ｔ細胞応答を引き起こすことができ、応答するＴ細胞の大部分は、記憶Ｔ細胞であることを示す。

参考文献
Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, and D. J. Lipman. 1990. 'Basic local alignment search tool', J Mol Biol, 215: 403-10.
Altschul, S. F., T. L. Madden, A. A. Schaffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, and D. J. Lipman. 1997. 'Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs', Nucleic Acids Res, 25: 3389-402.
Andreatta, M., V. I. Jurtz, T. Kaever, A. Sette, B. Peters, and M. Nielsen. 2017. 'Machine learning reveals a non-canonical mode of peptide binding to MHC class II molecules', Immunology, 152: 255-64.
Arnold, P. Y., N. L. La Gruta, T. Miller, K. M. Vignali, P. S. Adams, D. L. Woodland, and D. A. Vignali. 2002. 'The majority of immunogenic epitopes generate CD4+ T cells that are dependent on MHC class II-bound peptide-flanking residues', J Immunol, 169: 739-49.
Arstila, T. P., A. Casrouge, V. Baron, J. Even, J. Kanellopoulos, and P. Kourilsky. 1999. 'A direct estimate of the human alphabeta T cell receptor diversity', Science, 286: 958-61.
Ausubel, JM. 1992. Short protocols in molecular biology (John Wiley & Sons).
Bird, R. E., K. D. Hardman, J. W. Jacobson, S. Johnson, B. M. Kaufman, S. M. Lee, T. Lee, S. H. Pope, G. S. Riordan, and M. Whitlow. 1988. 'Single-chain antigen-binding proteins', Science, 242: 423-6.
Blobel, Gerd A., Roland Moll, Werner W. Franke, and Ingolf Vogt-Moykopf. 1984. 'Cytokeratins in normal lung and lung carcinomas', Virchows Archiv B, 45: 407-29.
Bluemke, K., U. Bilkenroth, A. Meye, S. Fuessel, C. Lautenschlaeger, S. Goebel, A. Melchior, H. Heynemann, P. Fornara, and H. Taubert. 2009. 'Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with renal cell carcinoma correlates with prognosis', Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 18: 2190-4.
Bodanzsky, Bodanzsky &. 1984. The practice of peptide synthesis (Springer Verlag: New York).
Boulter, J. M., M. Glick, P. T. Todorov, E. Baston, M. Sami, P. Rizkallah, and B. K. Jakobsen. 2003. 'Stable, soluble T-cell receptor molecules for crystallization and therapeutics', Protein Eng, 16: 707-11.
Brentville, V. A., R. L. Metheringham, B. Gunn, P. Symonds, I. Daniels, M. Gijon, K. Cook, W. Xue, and L. G. Durrant. 2016. 'Citrullinated Vimentin Presented on MHC-II in Tumor Cells Is a Target for CD4+ T-Cell-Mediated Antitumor Immunity', Cancer Res, 76: 548-60.
Brentville, V. A., P. Symonds, K. W. Cook, I. Daniels, T. Pitt, M. Gijon, P. Vaghela, W. Xue, S. Shah, R. L. Metheringham, and L. G. Durrant. 2019. 'T cell repertoire to citrullinated self-peptides in healthy humans is not confined to the HLA-DR SE alleles; Targeting of citrullinated self-peptides presented by HLA-DP4 for tumour therapy', Oncoimmunology, 8: e1576490.
Brown, J. H., T. S. Jardetzky, J. C. Gorga, L. J. Stern, R. G. Urban, J. L. Strominger, and D. C. Wiley. 1993. 'Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1', Nature, 364: 33-9.
Carson, R. T., K. M. Vignali, D. L. Woodland, and D. A. Vignali. 1997. 'T cell receptor recognition of MHC class II-bound peptide flanking residues enhances immunogenicity and results in altered TCR V region usage', Immunity, 7: 387-99.
Chang, X., Y. Zhao, Y. Wang, Y. Chen, and X. Yan. 2013. 'Screening citrullinated proteins in synovial tissues of rheumatoid arthritis using 2-dimensional western blotting', J Rheumatol, 40: 219-27.
Chen, N., J. Gong, X. Chen, M. Xu, Y. Huang, L. Wang, N. Geng, and Q. Zhou. 2009. 'Cytokeratin expression in malignant melanoma: potential application of in-situ hybridization analysis of mRNA', Melanoma Res, 19: 87-93.
Chou, Y. H., O. Skalli, and R. D. Goldman. 1997. 'Intermediate filaments and cytoplasmic networking: new connections and more functions', Curr Opin Cell Biol, 9: 49-53.
Choy, E. 2012. 'Understanding the dynamics: pathways involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis', Rheumatology (Oxford), 51 Suppl 5: v3-11.
Chung, B. M., J. D. Rotty, and P. A. Coulombe. 2013. 'Networking galore: intermediate filaments and cell migration', Curr Opin Cell Biol, 25: 600-12.
Coimbra, S., A. Figueiredo, E. Castro, P. Rocha-Pereira, and A. Santos-Silva. 2012. 'The roles of cells and cytokines in the pathogenesis of psoriasis', Int J Dermatol, 51: 389-95; quiz 95-8.
Consogno, G., S. Manici, V. Facchinetti, A. Bachi, J. Hammer, B. M. Conti-Fine, C. Rugarli, C. Traversari, and M. P. Protti. 2003. 'Identification of immunodominant regions among promiscuous HLA-DR-restricted CD4+ T-cell epitopes on the tumor antigen MAGE-3', Blood, 101: 1038-44.
Corper, A. L., T. Stratmann, V. Apostolopoulos, C. A. Scott, K. C. Garcia, A. S. Kang, I. A. Wilson, and L. Teyton. 2000. 'A structural framework for deciphering the link between I-Ag7 and autoimmune diabetes', Science, 288: 505-11.
Coulombe, P. A., and M. B. Omary. 2002. ''Hard' and 'soft' principles defining the structure, function and regulation of keratin intermediate filaments', Curr Opin Cell Biol, 14: 110-22.
Davis, M. M., J. J. Boniface, Z. Reich, D. Lyons, J. Hampl, B. Arden, and Y. Chien. 1998. 'Ligand recognition by alpha beta T cell receptors', Annu Rev Immunol, 16: 523-44.
Dessen, A., C. M. Lawrence, S. Cupo, D. M. Zaller, and D. C. Wiley. 1997. 'X-ray crystal structure of HLA-DR4 (DRA*0101, DRB1*0401) complexed with a peptide from human collagen II', Immunity, 7: 473-81.
Douat-Casassus, C., N. Marchand-Geneste, E. Diez, N. Gervois, F. Jotereau, and S. Quideau. 2007. 'Synthetic anticancer vaccine candidates: rational design of antigenic peptide mimetics that activate tumor-specific T-cells', J Med Chem, 50: 1598-609.
Durrant, L. G., R. L. Metheringham, and V. A. Brentville. 2016. 'Autophagy, citrullination and cancer', Autophagy, 12: 1055-6.
Folch, G., D. Scaviner, V. Contet, and M. P. Lefranc. 2000. 'Protein displays of the human T cell receptor alpha, beta, gamma and delta variable and joining regions', Exp Clin Immunogenet, 17: 205-15.
Franke, W. W., D. L. Schiller, R. Moll, S. Winter, E. Schmid, I. Engelbrecht, H. Denk, R. Krepler, and B. Platzer. 1981. 'Diversity of cytokeratins. Differentiation specific expression of cytokeratin polypeptides in epithelial cells and tissues', J Mol Biol, 153: 933-59.
Fremont, D. H., W. A. Hendrickson, P. Marrack, and J. Kappler. 1996. 'Structures of an MHC class II molecule with covalently bound single peptides', Science, 272: 1001-4.
Fremont, D. H., D. Monnaie, C. A. Nelson, W. A. Hendrickson, and E. R. Unanue. 1998. 'Crystal structure of I-Ak in complex with a dominant epitope of lysozyme', Immunity, 8: 305-17.
Fuchs, E., and D. W. Cleveland. 1998. 'A structural scaffolding of intermediate filaments in health and disease', Science, 279: 514-9.
Fukunaga, Y., S. Bandoh, J. Fujita, Y. Yang, Y. Ueda, S. Hojo, K. Dohmoto, Y. Tojo, J. Takahara, and T. Ishida. 2002. 'Expression of cytokeratin 8 in lung cancer cell lines and measurement of serum cytokeratin 8 in lung cancer patients', Lung Cancer, 38: 31-8.
Garboczi, D. N., D. T. Hung, and D. C. Wiley. 1992. 'HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides', Proc Natl Acad Sci U S A, 89: 3429-33.
Gebauer, M., and A. Skerra. 2009. 'Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics', Curr Opin Chem Biol, 13: 245-55.
Ghosh, P., M. Amaya, E. Mellins, and D. C. Wiley. 1995. 'The structure of an intermediate in class II MHC maturation: CLIP bound to HLA-DR3', Nature, 378: 457-62.
Godkin, A. J., K. J. Smith, A. Willis, M. V. Tejada-Simon, J. Zhang, T. Elliott, and A. V. Hill. 2001. 'Naturally processed HLA class II peptides reveal highly conserved immunogenic flanking region sequence preferences that reflect antigen processing rather than peptide-MHC interactions', J Immunol, 166: 6720-7.
Gonzalez-Galarza, F. F., L. Y. Takeshita, E. J. Santos, F. Kempson, M. H. Maia, A. L. da Silva, A. L. Teles e Silva, G. S. Ghattaoraya, A. Alfirevic, A. R. Jones, and D. Middleton. 2015. 'Allele frequency net 2015 update: new features for HLA epitopes, KIR and disease and HLA adverse drug reaction associations', Nucleic Acids Res, 43: D784-8.
Green, D. R., and B. Levine. 2014. 'To be or not to be? How selective autophagy and cell death govern cell fate', Cell, 157: 65-75.
Greten, T. F., and J. P. Schneck. 2002. 'Development and use of multimeric major histocompatibility complex molecules', Clin Diagn Lab Immunol, 9: 216-20.
Grunewald, J., and A. Eklund. 2007. 'Role of CD4+ T cells in sarcoidosis', Proc Am Thorac Soc, 4: 461-4.
Gu, L. H., and P. A. Coulombe. 2007. 'Keratin function in skin epithelia: a broadening palette with surprising shades', Curr Opin Cell Biol, 19: 13-23.
Holliger, P., and G. Winter. 1993. 'Engineering bispecific antibodies', Curr Opin Biotechnol, 4: 446-9.
Holmdahl, R., L. Klareskog, K. Rubin, E. Larsson, and H. Wigzell. 1985. 'T lymphocytes in collagen II-induced arthritis in mice. Characterization of arthritogenic collagen II-specific T-cell lines and clones', Scand J Immunol, 22: 295-306.
Hoppes, R., R. Oostvogels, J. J. Luimstra, K. Wals, M. Toebes, L. Bies, R. Ekkebus, P. Rijal, P. H. Celie, J. H. Huang, M. E. Emmelot, R. M. Spaapen, H. Lokhorst, T. N. Schumacher, T. Mutis, B. Rodenko, and H. Ovaa. 2014. 'Altered peptide ligands revisited: vaccine design through chemically modified HLA-A2-restricted T cell epitopes', J Immunol, 193: 4803-13.
Hosken, N. A., and M. J. Bevan. 1990. 'Defective presentation of endogenous antigen by a cell line expressing class I molecules', Science, 248: 367-70.
Huston, J. S., D. Levinson, M. Mudgett-Hunter, M. S. Tai, J. Novotny, M. N. Margolies, R. J. Ridge, R. E. Bruccoleri, E. Haber, R. Crea, and et al. 1988. 'Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli', Proc Natl Acad Sci U S A, 85: 5879-83.
Ireland, J. M., and E. R. Unanue. 2011. 'Autophagy in antigen-presenting cells results in presentation of citrullinated peptides to CD4 T cells', J Exp Med, 208: 2625-32.
June, C. H., M. V. Maus, G. Plesa, L. A. Johnson, Y. Zhao, B. L. Levine, S. A. Grupp, and D. L. Porter. 2014. 'Engineered T cells for cancer therapy', Cancer Immunol Immunother, 63: 969-75.
Jurtz, V., S. Paul, M. Andreatta, P. Marcatili, B. Peters, and M. Nielsen. 2017. 'NetMHCpan-4.0: Improved Peptide-MHC Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data', J Immunol, 199: 3360-68.
Karantza, V. 2011. 'Keratins in health and cancer: more than mere epithelial cell markers', Oncogene, 30: 127-38.
Karlin, S., and S. F. Altschul. 1993. 'Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences', Proc Natl Acad Sci U S A, 90: 5873-7.
Katsuragi, K., M. Yashiro, T. Sawada, H. Osaka, M. Ohira, and K. Hirakawa. 2007. 'Prognostic impact of PCR-based identification of isolated tumour cells in the peritoneal lavage fluid of gastric cancer patients who underwent a curative R0 resection', Br J Cancer, 97: 550-6.
Kim, A., I. Z. Hartman, B. Poore, T. Boronina, R. N. Cole, N. Song, M. T. Ciudad, R. R. Caspi, D. Jaraquemada, and S. Sadegh-Nasseri. 2014. 'Divergent paths for the selection of immunodominant epitopes from distinct antigenic sources', Nat Commun, 5: 5369.
Knosel, T., V. Emde, K. Schluns, P. M. Schlag, M. Dietel, and I. Petersen. 2006. 'Cytokeratin profiles identify diagnostic signatures in colorectal cancer using multiplex analysis of tissue microarrays', Cell Oncol, 28: 167-75.
Latek, R. R., A. Suri, S. J. Petzold, C. A. Nelson, O. Kanagawa, E. R. Unanue, and D. H. Fremont. 2000. 'Structural basis of peptide binding and presentation by the type I diabetes-associated MHC class II molecule of NOD mice', Immunity, 12: 699-710.
Lee, K. H., K. W. Wucherpfennig, and D. C. Wiley. 2001. 'Structure of a human insulin peptide-HLA-DQ8 complex and susceptibility to type 1 diabetes', Nat Immunol, 2: 501-7.
Lefranc, M. P. 2001. 'Nomenclature of the human T cell receptor genes', Curr Protoc Immunol, Appendix 1: Appendix 1O.
---. 2003. 'IMGT databases, web resources and tools for immunoglobulin and T cell receptor sequence analysis, http://imgt.cines.fr', Leukemia, 17: 260-6.
Li, Y., H. Li, R. Martin, and R. A. Mariuzza. 2000. 'Structural basis for the binding of an immunodominant peptide from myelin basic protein in different registers by two HLA-DR2 proteins', J Mol Biol, 304: 177-88.
Li, Y., R. Moysey, P. E. Molloy, A. L. Vuidepot, T. Mahon, E. Baston, S. Dunn, N. Liddy, J. Jacob, B. K. Jakobsen, and J. M. Boulter. 2005. 'Directed evolution of human T-cell receptors with picomolar affinities by phage display', Nat Biotechnol, 23: 349-54.
Liao, J., N. O. Ku, and M. B. Omary. 1997. 'Stress, apoptosis, and mitosis induce phosphorylation of human keratin 8 at Ser-73 in tissues and cultured cells', J Biol Chem, 272: 17565-73.
Liddy, N., G. Bossi, K. J. Adams, A. Lissina, T. M. Mahon, N. J. Hassan, J. Gavarret, F. C. Bianchi, N. J. Pumphrey, K. Ladell, E. Gostick, A. K. Sewell, N. M. Lissin, N. E. Harwood, P. E. Molloy, Y. Li, B. J. Cameron, M. Sami, E. E. Baston, P. T. Todorov, S. J. Paston, R. E. Dennis, J. V. Harper, S. M. Dunn, R. Ashfield, A. Johnson, Y. McGrath, G. Plesa, C. H. June, M. Kalos, D. A. Price, A. Vuidepot, D. D. Williams, D. H. Sutton, and B. K. Jakobsen. 2012. 'Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing', Nat Med, 18: 980-7.
Matros, E., G. Bailey, T. Clancy, M. Zinner, S. Ashley, E. Whang, and M. Redston. 2006. 'Cytokeratin 20 expression identifies a subtype of pancreatic adenocarcinoma with decreased overall survival', Cancer, 106: 693-702.
McCormack, E., K. J. Adams, N. J. Hassan, A. Kotian, N. M. Lissin, M. Sami, M. Mujic, T. Osdal, B. T. Gjertsen, D. Baker, A. S. Powlesland, M. Aleksic, A. Vuidepot, O. Morteau, D. H. Sutton, C. H. June, M. Kalos, R. Ashfield, and B. K. Jakobsen. 2013. 'Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors', Cancer Immunol Immunother, 62: 773-85.
Mertz, K. D., F. Demichelis, A. Sboner, M. S. Hirsch, P. Dal Cin, K. Struckmann, M. Storz, S. Scherrer, D. M. Schmid, R. T. Strebel, N. M. Probst-Hensch, M. Gerstein, H. Moch, and M. A. Rubin. 2008. 'Association of cytokeratin 7 and 19 expression with genomic stability and favorable prognosis in clear cell renal cell cancer', Int J Cancer, 123: 569-76.
Moll, R., M. Divo, and L. Langbein. 2008. 'The human keratins: biology and pathology', Histochem Cell Biol, 129: 705-33.
Moll, R., W. W. Franke, D. L. Schiller, B. Geiger, and R. Krepler. 1982. 'The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells', Cell, 31: 11-24.
Munz, C. 2012. 'Antigen Processing for MHC Class II Presentation via Autophagy', Front Immunol, 3: 9.
Myers, E. W., and W. Miller. 1989. 'Approximate matching of regular expressions', Bull Math Biol, 51: 5-37.
Nygren, P. A. 2008. 'Alternative binding proteins: affibody binding proteins developed from a small three-helix bundle scaffold', FEBS J, 275: 2668-76.
Oshima, R. G. 2002. 'Apoptosis and keratin intermediate filaments', Cell Death Differ, 9: 486-92.
---. 2007. 'Intermediate filaments: a historical perspective', Exp Cell Res, 313: 1981-94.
Oshima, R. G., H. Baribault, and C. Caulin. 1996. 'Oncogenic regulation and function of keratins 8 and 18', Cancer Metastasis Rev, 15: 445-71.
Owens, D. W., and E. B. Lane. 2003. 'The quest for the function of simple epithelial keratins', Bioessays, 25: 748-58.
Paramio, J. M., and J. L. Jorcano. 2002. 'Beyond structure: do intermediate filaments modulate cell signalling?', Bioessays, 24: 836-44.
Pearson, W. R., and D. J. Lipman. 1988. 'Improved tools for biological sequence comparison', Proc Natl Acad Sci U S A, 85: 2444-8.
Pluckthun, A. 1991. 'Antibody engineering: advances from the use of Escherichia coli expression systems', Biotechnology (N Y), 9: 545-51.
Reff, M. E. 1993. 'High-level production of recombinant immunoglobulins in mammalian cells', Curr Opin Biotechnol, 4: 573-6.
Remington, RP. 1980. Remington's pharmaceutical sciences (Mack Pub. Co).
Robins, H. S., P. V. Campregher, S. K. Srivastava, A. Wacher, C. J. Turtle, O. Kahsai, S. R. Riddell, E. H. Warren, and C. S. Carlson. 2009. 'Comprehensive assessment of T-cell receptor beta-chain diversity in alphabeta T cells', Blood, 114: 4099-107.
Sambrook, J, Fritsch and Maniatis. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Schmid, D., M. Pypaert, and C. Munz. 2007. 'Antigen-loading compartments for major histocompatibility complex class II molecules continuously receive input from autophagosomes', Immunity, 26: 79-92.
Schmitz-Winnenthal, F. H., C. Volk, B. Helmke, S. Berger, U. Hinz, M. Koch, J. Weitz, J. Kleeff, H. Friess, M. Zoller, M. W. Buchler, and K. Z'Graggen. 2006. 'Expression of cytokeratin-20 in pancreatic cancer: an indicator of poor outcome after R0 resection', Surgery, 139: 104-8.
Scott, C. A., P. A. Peterson, L. Teyton, and I. A. Wilson. 1998. 'Crystal structures of two I-Ad-peptide complexes reveal that high affinity can be achieved without large anchor residues', Immunity, 8: 319-29.
Sette, A., L. Adorini, S. M. Colon, S. Buus, and H. M. Grey. 1989. 'Capacity of intact proteins to bind to MHC class II molecules', J Immunol, 143: 1265-7.
Skerra, A. 2008. 'Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities', FEBS J, 275: 2677-83.
Smith, K. J., J. Pyrdol, L. Gauthier, D. C. Wiley, and K. W. Wucherpfennig. 1998. 'Crystal structure of HLA-DR2 (DRA*0101, DRB1*1501) complexed with a peptide from human myelin basic protein', J Exp Med, 188: 1511-20.
Soeth, E., U. Grigoleit, B. Moellmann, C. Roder, B. Schniewind, B. Kremer, H. Kalthoff, and I. Vogel. 2005. 'Detection of tumor cell dissemination in pancreatic ductal carcinoma patients by CK 20 RT-PCR indicates poor survival', J Cancer Res Clin Oncol, 131: 669-76.
Stefansson, I. M., H. B. Salvesen, and L. A. Akslen. 2006. 'Loss of p63 and cytokeratin 5/6 expression is associated with more aggressive tumors in endometrial carcinoma patients', Int J Cancer, 118: 1227-33.
Stern, L. J., J. H. Brown, T. S. Jardetzky, J. C. Gorga, R. G. Urban, J. L. Strominger, and D. C. Wiley. 1994. 'Crystal structure of the human class II MHC protein HLA-DR1 complexed with an influenza virus peptide', Nature, 368: 215-21.
Stewart. 1984. Solid phase peptide synthesis (Illinois Pierce Chemical Company: Rockford).
Szeverenyi, I., A. J. Cassidy, C. W. Chung, B. T. Lee, J. E. Common, S. C. Ogg, H. Chen, S. Y. Sim, W. L. Goh, K. W. Ng, J. A. Simpson, L. L. Chee, G. H. Eng, B. Li, D. P. Lunny, D. Chuon, A. Venkatesh, K. H. Khoo, W. H. McLean, Y. P. Lim, and E. B. Lane. 2008. 'The Human Intermediate Filament Database: comprehensive information on a gene family involved in many human diseases', Hum Mutat, 29: 351-60.
Thomas, P. A., D. A. Kirschmann, J. R. Cerhan, R. Folberg, E. A. Seftor, T. A. Sellers, and M. J. Hendrix. 1999. 'Association between keratin and vimentin expression, malignant phenotype, and survival in postmenopausal breast cancer patients', Clin Cancer Res, 5: 2698-703.
Thomsen, M. C., and M. Nielsen. 2012. 'Seq2Logo: a method for construction and visualization of amino acid binding motifs and sequence profiles including sequence weighting, pseudo counts and two-sided representation of amino acid enrichment and depletion', Nucleic Acids Res, 40: W281-7.
Torelli, A., and C. A. Robotti. 1994. 'ADVANCE and ADAM: two algorithms for the analysis of global similarity between homologous informational sequences', Comput Appl Biosci, 10: 3-5.
Traunecker, A., A. Lanzavecchia, and K. Karjalainen. 1991. 'Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells', EMBO J, 10: 3655-9.
Trill, J. J., A. R. Shatzman, and S. Ganguly. 1995. 'Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells', Curr Opin Biotechnol, 6: 553-60.
Vaidya, M. M., A. M. Borges, S. A. Pradhan, R. M. Rajpal, and A. N. Bhisey. 1989. 'Altered keratin expression in buccal mucosal squamous cell carcinoma', J Oral Pathol Med, 18: 282-6.
Wang, X., P. Chen, J. Cui, C. Yang, and H. Du. 2015. 'Keratin 8 is a novel autoantigen of rheumatoid arthritis', Biochem Biophys Res Commun, 465: 665-9.
Ward, E. S., D. Gussow, A. D. Griffiths, P. T. Jones, and G. Winter. 1989. 'Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli', Nature, 341: 544-6.
Watt, P. M. 2006. 'Screening for peptide drugs from the natural repertoire of biodiverse protein folds', Nat Biotechnol, 24: 177-83.
Xue, W., R. L. Metheringham, V. A. Brentville, B. Gunn, P. Symonds, H. Yagita, J. M. Ramage, and L. G. Durrant. 2016. 'SCIB2, an antibody DNA vaccine encoding NY-ESO-1 epitopes, induces potent antitumor immunity which is further enhanced by checkpoint blockade', Oncoimmunology, 5: e1169353.
Yang, X. R., Y. Xu, G. M. Shi, J. Fan, J. Zhou, Y. Ji, H. C. Sun, S. J. Qiu, B. Yu, Q. Gao, Y. Z. He, W. Z. Qin, R. X. Chen, G. H. Yang, B. Wu, Q. Lu, Z. Q. Wu, and Z. Y. Tang. 2008. 'Cytokeratin 10 and cytokeratin 19: predictive markers for poor prognosis in hepatocellular carcinoma patients after curative resection', Clin Cancer Res, 14: 3850-9.
Zhu, X., H. J. Belmont, S. Price-Schiavi, B. Liu, H. I. Lee, M. Fernandez, R. L. Wong, J. Builes, P. R. Rhode, and H. C. Wong. 2006. 'Visualization of p53(264-272)/HLA-A*0201 complexes naturally presented on tumor cell surface by a multimeric soluble single-chain T cell receptor', J Immunol, 176: 3223-32.

Claims (14)

1. i) アミノ酸配列：
   ＫＦＡＳＦＩＤＫＶＲＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ（配列番号１）、
   ＬＲＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬＡＬＤＩＥＩ（配列番号２）、
   ＫＳＹＫＭＳＴＳＧＰＲＡＦＳＳＲＳＦＴ（配列番号１６）、
   ＫＳＹＫＶＳＴＳＧＰＲＡＦＳＳＲＳＹＴ（配列番号３）、
   ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹＲＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号４）、
   ＲＳＮＭＤＮＭＦＥＳＹＩＮＮＬＲＲＱＬ（配列番号５）、及び
   ＬＴＤＥＩＮＦＬＲＱＬＹＥＥＥＩＲＥＬＱ（配列番号６）
   （前記配列中の少なくとも１つのアルギニン（Ｒ）残基はシトルリンに置換されている）
   の１つ以上、並びに／又は
   ii) アルギニン以外の位置における、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の置換、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の挿入、及び／若しくは、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の欠失を除く、i) のアミノ酸配列の１つ以上、
   を含む、から本質的になる、又は、からなる、シトルリン化Ｔ細胞抗原。
2. i) 以下のアミノ酸配列：
   ＫＦＡＳＦＩＤＫＶ－ｃｉｔ－ＦＬＥＱＱＮＫＭＬＥ
   Ｌ－ｃｉｔ－ＥＹＱＥＬＭＮＶＫＬＡＬＤＩＥＩ（配列番号１１）
   ＫＳＹＫＭＳＴＳＧＰ－ｃｉｔ－ＡＦＳＳＲＳＦＴ（配列番号２３）
   ＫＳＹＫＶＳＴＳＧＰ－ｃｉｔ－ＡＦＳＳ－ｃｉｔ－ＳＹＴ（配列番号１２）
   ＫＬＡＬＤＩＥＩＡＴＹ－ｃｉｔ－ＫＬＬＥＧＥＥ（配列番号１３）
   ｃｉｔ－ＳＮＭＤＮＭＦＥＳＹＩＮＮＬ－ｃｉｔ－ｃｉｔ－ＱＬ（配列番号１４）
   ＬＴＤＥＩＮＦＬ－ｃｉｔ－ＱＬＹＥＥＥＩ－ｃｉｔ－ＥＬＱ（配列番号１５）
   （式中、「ｃｉｔ」はシトルリンを表す）
   の１つ以上、並びに／又は
   ii) シトルリン以外の位置における、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の置換、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の挿入、及び／若しくは、１個、２個若しくは３個のアミノ酸の欠失を除く、i) のアミノ酸配列の１つ以上、
   を含む、から本質的になる、又は、からなる、請求項１に記載の抗原。
3. 請求項１又は２に記載の抗原とＭＨＣ分子の複合体であって、場合によっては、前記ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩＩであり、場合によってはＤＰ４である、複合体。
4. 請求項１又は２に記載の抗原と結合する結合部分。
5. 前記結合部分がＭＨＣと複合体を形成する場合に前記抗原が結合する、請求項４に記載の結合部分。
6. 前記結合部分が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗体である、請求項４又は５に記載の結合部分。
7. 前記ＴＣＲが細胞の表面にある、請求項７に記載の結合部分。
8. 医薬として使用するための、請求項１若しくは２に記載の抗原、請求項３に記載の複合体、及び／又は請求項４～７のいずれか一項に記載の結合部分。
9. がんの治療又は予防に使用するための、請求項８に記載の使用のための、抗原、複合体及び／又は結合部分。
10. 前記がんが、ＡＭＬ、肺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、乳がん、卵巣がん及び肝臓がんである、請求項９に記載の使用のための、抗原、複合体及び／又は結合部分。
11. 請求項１若しくは２に記載の抗原、請求項３に記載の複合体、及び／又は請求項４～７のいずれか一項に記載の結合部分を、薬学的に許容される担体と共に含む医薬組成物。
12. 請求項３に記載の複合体と結合する結合部分を特定する方法であって、前記方法は、候補となる結合部分を前記複合体と接触させる工程、及び前記候補となる結合部分が前記複合体と結合するかどうかを決定する工程を含む、方法。
13. 抗腫瘍免疫を刺激するサイトケラチンのシトルリン化Ｔ細胞エピトープを特定するin vitroスクリーニング方法であって、
    シトルリン化エピトープに特異的なＴ細胞応答の誘導のためのサイトケラチンのスクリーニング；及び
    腫瘍認識のためのシトルリン化エピトープに特異的なＴ細胞のスクリーニング
    を含む方法。
14. シトルリン化エピトープに対するＴ細胞応答の誘導のためのスクリーニングは、シトルリン化エピトープがＣＤ４エピトープ又はＣＤ８エピトープであるかどうかを特定するためのＣＤ４ Ｔ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の選別を含む、請求項１３に記載の方法。

Images