JP2023550046A - 心不全（ｈｆ）及び関連疾患またはその結果生じる疾患の治療または予防に使用するための組織因子プロテアーゼ活性化受容体２（ｔｆ－ｐａｒ２）シグナル伝達経路の阻害剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、心不全（ＨＦ）の治療または予防に使用するための組織因子プロテアーゼ活性化受容体２（ＴＦ－ＰＡＲ２）シグナル伝達経路の阻害剤に関する。本発明はさらに、虚血性心不全（ＩＨＦ）または心筋梗塞（ＭＩ）後の有害なリモデリングを発症するリスクのある対象を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法にも関し、本方法は、ｉ．骨髄細胞中での組織因子（ＴＦ）細胞質ドメインのリン酸化、及び対象から採取した生体サンプル中での活性ＴＧＦ－β１のレベルを測定するステップと、ｉｉ．生体サンプル中のＴＦ細胞質ドメインのリン酸化レベルを正常で健康な対象におけるＴＦ細胞質ドメインのリン酸化レベルと、生体サンプル中の活性ＴＧＦ－β１のレベルを正常で健康な対象における活性ＴＧＦ－β１のレベルを比較するステップと、を含み、ここで、ＴＦ細胞質ドメイン及び活性ＴＧＦ－β１のリン酸化レベルの増加は、ＭＩ後のＩＨＦまたは有害なリモデリングを発症するリスクの増加を示す。【選択図】なし

Description

本発明は、心不全（ＨＦ）、及び関連疾患または結果として生じる疾患、例えば、虚血性心不全（ＩＨＦ）、心筋梗塞（Ｍｌ）、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）、または駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）などの治療または予防に使用するための、組織因子－プロテアーゼ活性化受容体２（ＴＦ－ＰＡＲ２）のシグナル伝達経路の阻害剤に関する。

適切な創傷治癒は、効果的な止血に依存し、これにより、欠損した組織機能の再生及び再構築が可能になる（１）。心筋梗塞（ＭＩ）の原因となる冠動脈血栓症（２）は、不可逆的組織損傷を引き起こし、自然免疫系及び適応免疫系の活性化が、心機能不全及び機能修復の両方の側面を媒介する（３）。虚血の程度及び再灌流までの時間に応じて、これらの免疫反応は、創傷修復及びコラーゲンの沈着を誘導し、心機能を回復させ得るか、または虚血性心不全（ＩＨＦ）となる炎症による有害なＬＶリモデリングを引き起こし得る（４）。心筋虚血は、ＦＸａの生成のためにＦＶＩＩａと複合体を形成する組織因子（ＴＦ）を発現する単球及びマクロファージに対する凝血促進活性によって駆動され（５）、免疫血栓症における多面的な血管内細胞の活性化に大きく寄与する（６）。

ＴＦは、分子量４５，０００を有する１つのポリペプチド鎖からなるグリコシル化膜貫通タンパク質に関連するトロンボプラスチンまたはＣＤ１４２としても知られている（７）。ＴＦの細胞外部分は、２つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインで構成されており、ＴＦの膜固定は、ＦＶＩＩａの完全なタンパク質分解活性を助けるために不可欠であることが証明されている（８）。ＴＦに結合すると、ＦＶＩＩは、限定的なタンパク質分解を介してその活性化形態（ＦＶＩＩａ）に急速に変換される（９、１０）。凝固は、外因性凝固経路の内因性阻害剤を構成する組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）によって厳密に調節されており、ＴＦＰＩは、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の強力な阻害剤である（１１）。ＦＶＩＩａは、心血管疾患における凝固カスケードの重要な開始因子であることが知られている（１２）。抗凝固治療は、主要な心血管イベントを予防するための確立された治療法である（１３、１４）。線虫類抗凝固タンパク質Ｃ２（ＮＡＰｃ２）は、阻害されたＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸ（ａ）複合体を安定化させることによってＴＦシグナル伝達及び凝固を遮断する（１５）。第２相臨床試験では、急性冠状動脈性心疾患に対する経皮的介入におけるこの薬物の安全性が実証されている（１６）。

心筋細胞特異的ＴＦまたはトロンビンを阻害することにより、心筋損傷及び炎症を軽減し得るが（１７）、これらの凝固プロテアーゼの骨髄細胞シグナル伝達機能が、血栓促進活性とは独立してＭＩ後の転帰に寄与するかは不明である。ＭＩ後、炎症期から線維性リモデリングへの一時的移行は、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ－β１）などの成長因子の放出（１８）及び筋線維芽細胞の活性化（１９）に依存する。凝固プロテアーゼは、凝固非依存性プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の活性化を媒介し、造血（２０）及び腫瘍発生（２１）のみでなく、ＴＧＦ－β１シグナル伝達を調節することによって心臓の線維化も制御する（２２）。凝固因子及びその受容体を標的にすることは、ＭＩの血栓性閉塞による重症度の改善に有益であり得る（２３）（２２）が、これらの経路に介入することによって心臓リモデリングに影響を与える可能性については、まだ調査されていない。

米国特許出願公開第２００４／０１０２４０２号明細書には、ＴＦの阻害剤、及びＴＦに関連する疾患または状態を有する動物の治療方法が記載されている。特に、ＴＦをコードする核酸分子を標的とする長さ８～８０の核酸塩基からなる核酸化合物について記載されている。

国際公開第９７／０２０９３９号には、外因性凝固経路を介してＴＦが血液凝固を誘導するのを阻害または中和することができる融合タンパク質が記載されている。

米国特許第６２３８８７８号明細書には、心筋梗塞も含むＦＶＩＩａ／ＴＦ関連疾患または障害の治療のための化合物及び方法が記載されている。しかし、血栓促進活性とは独立した心筋虚血後の転帰（特に、心不全の発症及び心臓リモデリング）については記載されていない。

ＴＦ及び／またはＦＶＩＩａを標的とするさらなる化合物も、国際公開第２０１８／１７０１３４号及び国際公開第２００７／０９２６０７号に記載されている。しかしながら、これらの参考文献のいずれも、ＭＩ後の線維化促進性リモデリングについては調査していない。さらに、心電図検査におけるＱ波またはＴ波反転、または亜急性事象と相関する心臓トロポニンの低下以外のバイオマーカーは、適時の血管再生にもかかわらず急性ＭＩよりも悪い転帰を有する亜急性ＭＩを示すものとしては、現在十分に確立されていない（２４）。同様に、発症時期（例えば、急性または亜急性ＭＩ）に関係なく、ＭＩ患者が虚血性心疾患を発症するリスクがあることを示すであろうマーカーは確立されていない。

欧州特許出願公開第３２０３２４０号明細書には、患者から生体サンプル中のペルオキシレドキシンの測定値を得るステップと、得られたペルオキシレドキシンの測定値に基づいて急性心筋梗塞に関する情報を取得するステップとを含む、急性心筋梗塞を判定するための方法が記載されている。したがって、ＭＩまたはＩＨＦのリスクがある患者の識別を可能にする高度に特異的なマーカーを有することが望ましいであろう。これは、長期にわたるＭＩ亜急性患者が、介入療法を早期に受けたＭＩ患者と比較して、２倍高い死亡及び心不全発症のリスクを有するためである（２５）。

米国特許出願公開第２００４／０１０２４０２号明細書 国際公開第９７／０２０９３９号 米国特許第６２３８８７８号明細書 国際公開第２０１８／１７０１３４号 国際公開第２００７／０９２６０７号 欧州特許出願公開第３２０３２４０号明細書

発明の開示
したがって、この背景に対して、本発明の目的は、心不全（ＨＦ）、及びＭＩ、ＩＨＦ、ＭＩ後のＩＨＦ、ＨＦｒＥＦまたはＨＦｐＥＦなどの関連疾患または同義の疾患の治療または予防において好適である化合物を提供することである。本発明のさらなる目的は、虚血性心不全（ＩＨＦ）または心筋梗塞後（ＭＩ）の有害なリモデリングを発症するリスクのある検査対象を同定するための方法を提供することである。これらの目的は、請求された発明によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項において請求されている。

本発明は、ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路がＴＧＦ－β１活性化の重要な駆動因子であるため、骨髄細胞ＴＦ－ＰＡＲ２依存性シグナル伝達の阻害が治療的介入の推定標的であるという想定外の発見に基づく。

本発明者らは、持続性ＭＩにおける心筋リモデリング及び骨髄細胞の動員がＥＲＫ活性化によって促進され、心臓リモデリングが分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）１／２阻害剤トラメチニブによる治療的介入によって阻害できることを見出した。

ＰＡＲ２は、単球ＥＲＫ１／２活性化の上流シグナルであることが判明している。ＰＡＲ２の上方制御により、ＥＲＫ１／２のリン酸化及びＴＧＦ－β１の活性化が増加する。

本発明によってさらに示されるとおり、浸潤性骨髄細胞におけるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達は、虚血に関連したＭＡＰＫ経路の過剰活性化、ＴＧＦ－β１活性化、及びＭＩ後の線維化促進リモデリングに関与している。

ＴＦを標的とすることは、株一致野生型（ＷＴ）と比較して、ＥＲＫ１／２リン酸化の顕著な減少、ＴＧＦ－β１活性化の減少（及びＴＧＦ－β１シグナル伝達の減少）、及び心臓細胞または骨髄単球細胞のＮＯＸ２発現の減少と関連している。本発明では、骨髄細胞のＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達をＭＩ後のＴＧＦ－β１依存性有害リモデリングにつながる骨髄細胞のＴＦ細胞質尾部依存性線維化促進活性の中心的役割を特定する。

ＴＦ－ＦＶＩＩａを標的とすることにより、ＴＧＦ－β１活性化を妨げることによって、心機能を改善させ得る。本発明によるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤を使用することにより、ＴＦ－シグナル伝達及び凝固は、例えば阻害されたＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸ（ａ）複合体の形成により遮断させ得る。

ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達の阻害には、ＮＯＸ２レベル及び活性ＴＧＦ－β１の低下を伴う。本発明によってさらに示されるとおり、本発明の阻害剤を使用することによるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達の阻害は、慢性ＭＩにおける心臓の線維化を顕著に減少させ、心臓機能を改善した。心臓損傷から保護することにより、治療を受けた検査対象の生存率の改善が得られた。したがって、骨髄細胞中でのＴＦシグナル伝達の標的化は、心臓リモデリング及びＭＩ後の心臓機能の改善に有益である。これは、骨髄細胞由来のＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達が慢性ＭＩにおけるＥＲＫ１／２－ＴＧＦ－β１活性化の駆動因子であるためである。

本発明によるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤は、ヒトまたは動物細胞におけるＴＦシグナル伝達の遮断をもたらす任意の生物学的または化学的化合物を指す。したがって、阻害剤は、（ｉ）分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ１（ＭＡＰＫ１）の過剰活性化、（ｉｉ）細胞外シグナル調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化、及び（ｉｉｉ）ＴＧＦ－β１活性化をもたらすＴＦシグナル伝達を調節する任意の化合物であり得る。したがって、ＴＦ－ＰＡＲ２阻害剤は、心機能を改善し、線維性リモデリングを防ぐことから、心不全（ＨＦ）及び関連疾患またはその結果として生じる疾患の治療に使用するための治療剤として好適であり、このため、心筋梗塞（ＭＩ）、虚血性心不全（ＩＨＦ）、及び心臓の線維化の治療に有益となる。

好ましい実施形態では、ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤は、ＮＯＸ２陽性骨髄細胞の動員の阻害剤であり、好ましくは、ＮＯＸ－２陽性単球の阻害剤であり、これは、これらの細胞の動員が、ＴＧＦ－β１活性化に重要であるためである。さらに好ましい実施形態では、ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤は、ＴＧＦ－β１活性化の阻害剤である。これらの要件を満たすＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の好ましい阻害剤は、線虫類抗凝固タンパク質Ｃ２（ＮＡＰｃ２）である。

本発明に関連して使用される他の好ましい阻害化合物としては、ＥＲＫ１／２リン酸化の減少、ＴＧＦ－β１活性化の減少、及び心臓細胞または骨髄単球細胞のＮＯＸ２発現の減少を引き起こすまたはこれらの結果として生じる阻害性タンパク質、ポリペプチド、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、ナノボディが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい抗体としては、単鎖抗体、またはアディロン、アフィボディ、アフィフィン、アフィリン、アンチカリン、アビマー、Ａｒｍａｄｉｌｌｏリピートタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、ファイノマー、プロテアーゼ阻害剤クニッツドメイン、モノマー及びペプチドアプタマーなどの抗体模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。このような模倣物は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測によって作製される。

本発明はまた、ＴＧＦ－β１活性化及び／または心臓もしくは骨髄単球細胞のＮＯＸ２発現及び／またはＮＯＸ２陽性骨髄細胞、好ましくはＮＯＸ２陽性単球の動員の減少に対する能力を保持する融合タンパク質、変異体、そのフラグメントのバリアントを含む阻害性化合物にも関する。

本発明は、本発明によるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸分子をさらに含む。好ましい実施形態では、ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達阻害剤は、タンパク質、ペプチド、抗体、その抗原結合フラグメント、酵素、酵素阻害剤、アプタマー、または低分子から選択される。本発明に関連して使用される低分子とは、９００Ｄａ未満の分子量を有する低分子量分子を指す。上限の分子量により、膜の迅速な通過が可能となり、これにより、より小さい分子が細胞内の作用部位に到達できるようになる。

代替的実施形態では、本発明によるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦ－β１活性化及び／または心臓もしくは骨髄単球細胞のＮＯＸ２の発現及び／またはＮＯＸ２陽性骨髄細胞、好ましくはＮＯＸ２陽性単球の動員を阻害するアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチドもしくは核酸アプタマーなどの１つ以上のオリゴヌクレオチド阻害剤に関する。本発明はまた、心不全（ＨＦ）の治療に使用するためのそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは核酸アプタマー、または他のＲＮＡ治療薬を含む医薬組成物、またはＴＧＦ－β１活性化及び／または心臓もしくは骨髄単球細胞のＮＯＸ２発現及び／もしくはＮＯＸ２陽性骨髄細胞、好ましくはＮＯＸ２陽性単球の動員を阻害するまたは減少させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは核酸アプタマー、または他のＲＮＡ治療薬の使用に関する。本発明はまた、心不全（ＨＦ）の治療において使用するための薬物を製造するための、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは核酸アプタマーまたは他のＲＮＡ治療薬を含む医薬組成物にも関する。本発明はまた、心不全（ＨＦ）またはその関連疾患もしくはそれらの結果生じる疾患を有する対象を治療するための方法において使用するのにも好適であり、この方法は、ＴＧＦ－β１の活性化及び／または心臓もしくは骨髄単球細胞のＮＯＸ２発現及び／またはＮＯＸ２陽性骨髄細胞、好ましくはＮＯＸ２陽性単球の動員を阻害するまたは減少させる、治療有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは核酸アプタマーまたは他のＲＮＡ治療薬を投与することを含む。一実施形態では、本発明は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは核酸アプタマーまたは他のＲＮＡ治療薬を含む医薬組成物に関する。治療剤として使用できるそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、例えばｍｉＲＮＡ及び長いノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸アプタマーとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＸＮＡ（異種核酸）などの合成核酸類似体または低分子のいずれかの一本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましくは、ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ阻害剤である。

「第ＶＩＩａ因子／組織因子」または「ＦＶＩＩａ／ＴＦ」または「ＦＶＩＩａ／ＴＦ」という用語は同義であり、セリンプロテアーゼ凝固第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）及び非酵素タンパク質組織因子（ＴＦ）との触媒活性複合体を指すことが一般に知られており、この複合体は、規定された組成物の生理学的に関連するリン脂質膜の表面上で組み立てられる。

本発明の文脈で使用される「ＦＶＩＩａ／ＴＦ阻害剤」という用語は、ＴＧＦ－β１、ＭＡＰＫ１、ＥＲＫ１／２、及びＮＯＸ２の活性化に対するＦＶＩＩａ／ＴＦ阻害活性を有する化合物である。化合物は、任意の天然に存在するかまたは人工的に産生された化合物であり得、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ポリペプチド、核酸分子、またはそれらの組み合わせを含み得る。本発明はまた、化学的または生物学的部分を付加する、除去する、または変更することによって修飾されたそのような阻害剤のバリアントにも関する。

好ましい実施形態では、ＴＦ／ＦＶＩＩａ阻害剤は、抗ＴＦ抗体、低分子、ＴＦ経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ヒト組換えＦＶＩＩａ阻害剤（ｒＦＶＩｌａｉ）、キメラタンパク質ＸＫ１、及びＰＡＲ２アンタゴニストからなる群から選択される。好ましい実施形態では、抗ＴＦ抗体は、ＡＰ－１、ＡＬＴ８３６、チソツマブベドチン、ＩＣＯＮ－２からなる群から選択される。

ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の好ましい阻害剤は、線虫類抗凝固タンパク質Ｃ２（ＮＡＰｃ２）である。本明細書で使用されるＮＡＰｃ２は、分子量９７３２Ｄａを有する単鎖の非グリコシル化８５アミノ酸タンパク質を指す。ＮＡＰｃ２は、ＦＸａに結合することによってその効果を発揮し、ＴＦＰＩに類似の阻害機構を有する。ＮＡＰｃ２の抗血栓効果は、膝関節全置換術を受ける患者における静脈血栓塞栓症の予防に関する用量設定試験で実証されている（２７）。本発明で示されるとおり、ＮＡＰｃ２治療は、心機能を改善し、骨髄細胞の心臓浸潤を軽減し、また梗塞心臓におけるＥＲＫ１／２のリン酸化、ＮＯＸ２の発現、ＴＧＦ－β１の活性化及び下流標的α－ＳＭＡの上方制御も減少させた。ＭＩ後７日までの短期ＮＡＰｃ２治療では、慢性ＭＩにおける心臓の線維化を有意に減少させ、心機能を改善した。

本発明はまた、修飾または組換えＮＡＰｃ２（ｒＮＡＰｃ２）などのＮＡＰｃ２の任意のバリアントを含む。好ましい実施形態では、ＮＡＰｃ２のアミノ酸配列のＣ末端に追加のプロリン残基を含むように改変されたｒＮＡＰｃ２が使用される（ＮＡＰｃ２／プロリン）。ｒＮＡＰｃ２は、本発明によれば、ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路を阻害することが理解される。

好ましくは、ＮＡＰｃ２及びＮＡＰｃ２／プロリンバリアントは、表１に示すアミノ酸配列を含む：

本発明はまた、これらのタンパク質のバリアント、変異体または相同体、例えば、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、または９９％の配列相同性を呈するＮＡＰｃ２バリアントを含み、そのようなバリアントは、ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路を阻害する能力を有する。

本発明のＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路阻害剤の有効な用量及び投与レジメンは、治療される心不全の重症度に依存し、疾患の種類及び重症度、例えば、ＩＨＦまたはＭＩの重症度などに応じて当業者によって決定され得る。

本発明のＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路阻害剤の治療上有効量の非限定的な範囲の例は、好ましくは０．１～１００μｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５～２０μｇ／ｋｇ、好ましくは１～１０μｇ／ｋｇである。本発明はまた、約５μｇ／ｋｇ、約７μｇ／ｋｇ、または約１０μｇ／ｋｇの量などの任意の範囲または上記範囲内の１つの値を含む。阻害剤の投与は、１日あたり単回投与もしくは複数回投与で達成することができ、または隔日もしくは他の投与スキームで与えることができる。当業者（医師または獣医）であれば、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方し得る。一般に、本発明の組成物の好適な一日用量は、治療効果を生じさせるのに有効な最低用量である化合物の量である。このような有効量は、一般に、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下投与などの投与様式に依存するであろう。必要に応じて、医薬組成物の有効１日量は、任意により単位剤形で、１日を通して適切な間隔で別々に投与される２、３、４、５、６またはそれ以上の分割用量として投与され得る。

ＮＡＰｃ２またはＮＡＰｃ２／プロリンなどのそのバリアントのいずれかは、好ましくは約５μｇ／ｋｇ～１０μｇ／ｋｇの用量で提供され、ここで、すべての中間値及び範囲は、本発明の範囲内に含まれる。本発明に含まれる他の阻害剤と同様に、ＮＡＰｃ２またはＮＡＰｃ２／プロリンなどのそのバリアントのいずれかの投与は、１日あたり単回用量もしくは複数回用量で達成することができ、または隔日もしくは他の投与スキームで与えることができる。好ましい実施形態では、ＮＡＰｃ２またはＮＡＰｃ２／プロリンなどのそのバリアントのいずれかは、約５μｇ／ｋｇの用量で、好ましくは約７．５μｇ／ｋｇの用量で、または好ましくは約１０μｇ／ｋｇの用量で提供される。いくつかの実施形態では、ＮＡＰｃ２またはＮＡＰｃ２／プロリンなどのそのバリアントのいずれかは、１日目に約７．５μｇ／ｋｇの用量、３日目に約５μｇ／ｋｇの用量、及び５日目に約５μｇ／ｋｇの用量で与えられる。

本発明の化合物を単独で投与することも可能であるが、ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路阻害剤を医薬組成物として投与することが好ましい。医薬組成物は、従来の技術に従って、任意の既知の薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに任意の他の既知のアジュバント及び賦形剤を用いて製剤化され得る。薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント及び賦形剤は、選択された本発明のＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路阻害剤及び選択された投与様式に好適であるものとする。本発明の医薬組成物は、希釈剤、増量剤、塩、緩衝剤、界面活性剤（例えば、非イオン界面活性剤）、安定剤（例えば、糖または無タンパク質アミノ酸）、保存剤、組織固定剤、可溶化剤、及び／または医薬組成物に含めるのに好適である他の材料を含み得る。

本発明の医薬組成物は、当業者に知られている方法により製剤化することができる。例えば、そのような医薬組成物は、組成物を水または別の薬学的に許容される液体と共に含む滅菌溶液または懸濁液である注射剤として非経口的に使用することができる。例えば、そのような組成物は、組成物を薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香料、賦形剤、ビヒクル、保存剤、結合剤などと適切に組み合わせることによって、医薬品を調製するための要件を満たす単位用量として製剤化され得る。このような調製物においては、有効成分の量は、所定の範囲内の適切な用量が得られ得るように調整される。

本発明はまた、本明細書に記載の組織因子プロテアーゼ活性化受容体２（ＴＦ－ＰＡＲ２）シグナル伝達経路の阻害剤、またはそのような阻害剤を含む医薬組成物を使用して、心不全（ＨＦ）、及びそれに関連するまたはその結果生じる疾患、例えば、虚血性心不全（ＩＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、駆出率の低下を伴う心不全（ＨＦｒＥＦ）、もしくは駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）を治療するまたは予防するための方法に関する。

本発明はまた、虚血性心不全（ＩＨＦ）または心筋梗塞（ＭＩ）後の有害なリモデリングを発症するリスクのある対象を同定するための方法にも関し、本方法は、骨髄細胞中での組織因子（ＴＦ）細胞質ドメインのリン酸化、及び対象から採取した生体サンプル中での活性ＴＧＦ－β１のレベルを測定するステップと、生体サンプル中のＴＦ細胞質ドメインのリン酸化レベルを正常で健康な対象におけるＴＦ細胞質ドメインのリン酸化レベルと、生体サンプル中の活性ＴＧＦ－β１のレベルを正常で健康な対象における活性ＴＧＦ－β１のレベルを比較するステップと、を含み、ここで、ＴＦ細胞質ドメイン及び活性ＴＧＦ－β１のリン酸化レベルの増加は、ＭＩ後のＩＨＦまたは有害なリモデリングを発症するリスクの増加を示す。一実施形態では、本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法として実施される。

好ましい実施形態では、対象の生体サンプルは、心臓生検、液体生検、血液、血清、または血漿から得られる。

好ましい実施形態では、骨髄細胞、好ましくは単球、より好ましくは循環単球におけるＴＦの細胞質ドメインのリン酸化が、対象におけるＭＩ後のＩＨＦ発症のリスクを特定するためのバイオマーカーとして使用される。この方法は、好ましくは、
１．対象から試験サンプルを得ることと、
２．ＴＦ、好ましくはＴＦの細胞質ドメインのリン酸化の量を定量することと、
３．ＴＦのリン酸化量を、正常で健康な対象のサンプルから得られた基準と比較することと、を含む。

正常で健康な対象とは、例えば、ＭＩまたはＨＦの状態を有しないヒトまたは動物である。ＴＦのリン酸化の測定は、定性的または定量的に行うことができる。定量的分析は、例えば、対象から単離された単球のフローサイトメトリー分析または共焦点顕微鏡検査のために実施できる。定性的分析は、例えば、ＴＦ細胞質ドメインのリン酸化（４Ｇ６）及びＴＦ（１０Ｈ１０）に関する単球タンパク質発現のウエスタンブロットまたは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）分析によって行うことができる。この方法はまた、患者がＭＩまたはＨＦを発症するリスクがあるかを判定するためにスコアリング方法を利用することもできる。好ましくは、所望のスコアがバイオマーカーに対して統合される。次いで、合計スコアが定量化され、所定の合計スコアと比較する。次のステップでは、上記で決定された合計スコアに基づいて、対象がＭＩまたはＨＦを発症するリスクがあるかを決定する。ＴＦ細胞質ドメイン及び活性ＴＧＦ－β１のリン酸化レベルの増加は、ＭＩ後のＩＨＦまたは有害なリモデリングを発症するリスクの増加を示すであろう。

本発明によって示されるとおり、ＴＦのリン酸化及びＴＧＦ－β１の活性化は、心臓生検から得た生体サンプル中でのＩＬ６、ＣＣＬ２及び／またはＣＣＲ２の上方制御とも一致する。したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＩＬ６、ＣＣＬ２及び／またはＣＣＲの上方制御があるかを決定することをさらに含む。これらのマーカーは、評価とスコアリングに統合することもできる。含まれ得るさらなるマーカーは、骨髄細胞の動員、ＴＧＦ－β１の活性化の増加、及び／またはＳＭＡＤ２の下流リン酸化である。さらに好ましい実施形態では、本方法は、生体サンプル内のＣＤ４５＋細胞の数を分析することをさらに含み、ＩＨＦでは、正常で健康な検査対象から収集されたサンプル中の数と比較して、ＣＤ４５＋細胞の数の増加を示す。

本発明の文脈で使用されるＰＢＭＣは、骨髄細胞及びリンパ細胞の混合集団を指す。骨髄細胞には、単球、樹状細胞、マクロファージが含まれる。単球は、血液を通って様々な組織に循環し、それによって組織常駐マクロファージ及び樹状細胞に分化する。

最後に、本発明はまた、ＩＨＦまたはＭＩを発症するリスクのある対象を同定するため、特にＭＩ後の対抗するモデリング、及びＩＨＦまたは有害なリモデリングを予防する薬物療法を同定するためのバイオマーカーとしての高リン酸化ＴＦの使用にも関する。

本発明を以下の実施例でさらに説明する。本発明は、決して、これらの例に限定するものではない。本明細書に記載の実施形態の組み合わせを含め、教示の特徴の任意の組み合わせが本発明の範囲に包含されることは明らかであろう。

結論：
本発明は、ＩＨＦにおける凝固の病態生理学についてのより詳細な洞察を提供し、虚血性心筋における有害なリモデリングにおける凝固関連シグナル伝達の重要な機能を明らかにする。動脈血栓症及び血管閉塞の治療は、急性冠症候群の治療の中心である。しかし、ここで本発明は、凝固の非標準的機構、梗塞心筋層におけるＴＧＦ－β１の活性化につながるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達、及びこれに関連する骨髄細胞の正確な役割についての新たな洞察を提供する。

ヒトＩＨＦにおける偏りのない（ホスホ）プロテオミクス、ならびにマウスモデルにおける遺伝的及び薬理学的介入に基づいて、本発明者らは、ＭＡＰＫ経路の過剰活性化と、永久Ｍｌの心臓に浸潤する炎症促進性骨髄細胞の浸潤によって駆動されるＴＧＦ－β１媒介性心臓リモデリングとの間の関連性を確立する。本発明者らは、虚血心臓に浸潤している骨髄細胞に特異的なＥＲＫ１／２活性化を局在化させ、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブによる前臨床介入により、梗塞心筋へのＣＣＲ２依存性（２９）Ｌｙ－６Ｃ^ｈｉｇｈ単球の動員が有意に減少することを示す。ＴＧＦ－β１の活性化は、その生物学的機能（２９）、特に筋線維芽細胞の活性化及びＭＩにおける疾患の進行（３０）に必須である。本発明者らは、単離された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで用いて、低酸素に曝露されたサイトカイン刺激単球が、Ｎｏｘ２及びＭＥＫ１／２シグナル伝達に依存して潜在的ＴＧＦ－β１を活性化することを直接示した。さらに、ＮＯＸ２^－／－及びＰＡＲ２^－／－から単離された単球を用いた実験と、骨髄細胞特異的ＰＡＲ２及びＴＦ欠失のｉｎ ｖｉｖｏ分析とを組み合わせて、骨髄細胞由来のＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達が、慢性ＭＩにおけるＥＲＫ１／２－ＴＧＦ－β１活性化の駆動因子であることを確認した。

せん断応力により誘導された血小板由来のＴＧＦ－β１活性化は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の減少に依存し（３１）、これもＴＦの復号化に重要な役割を果たす（３２、３３）。特に、ＴＦの復号化は、補体活性化によって促進され（３４、３５）、これは発明者のプロテオームスクリーニングによって同定された虚血性心筋の顕著な特徴であった。ＴＦ－ＦＶＩａ複合体はさらに、凝固活性化とは独立してインテグリンβ１と相互作用し（３６）、ＴＦ細胞質尾部に依存するエンドソームＮＯＸ２輸送によるＲＯＳ産生を調節する（３７）。ＲＯＳは、ＭＩにおける線維芽細胞の増殖及びコラーゲン合成を調節することができる（３８）が、ＲＯＳの主要細胞源、及びＲＯＳが心臓リモデリングを媒介する方法の基礎となる機構は、依然として不明であった。本発明者の現在のデータは、ＴＦ細胞質尾部を介して連結された骨髄細胞ＴＦ－ＰＡＲ２が、慢性ＭＩにおける心臓リモデリングを促進するための食細胞型ＮＡＤＰＨオキシダーゼ由来のＲＯＳ産生の増加及びＴＧＦ－β１の活性化に必要であることを示している。

ＭＩの臨床環境では、冠状動脈の非逆流性及び／または症状発症後の発現の遅れ（いわゆる亜急性ＭＩ）を有する患者は、血栓炎症の兆候を示し、より悪い臨床転帰を特徴とする（３９～４１）。しかし、心電図検査におけるＱ波またはＴ波反転以外のバイオマーカー（４２）は、亜急性ＭＩまたはＭＩの不良転帰を予測するためには現在確立されていない。本発明者のデータは、循環単球のＴＦリン酸化が、ＩＨＦ及びＭＩ後の有害なリモデリングを発症するリスクが高い患者のマーカーとして機能し得ることを示している。さらに、発明者の原理証明実験では、この経路を標的とする潜在的な高度に特異的な手段を明らかにする。推定上の臨床上の利益は、二重の抗血栓作用及びシグナル伝達の破壊を伴うＴＦ阻害剤ＮＡＰｃ２によって例示され、実験的ＭＩ後の線維化の減少をもたらす。ＭＩ患者のリキッドバイオプシーに適用できる同定されたバイオマーカーは、骨髄細胞の再プログラミングのための凝固ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達を特異的に標的とする戦略の臨床開発を促進し得る。この戦略は、過度の心臓損傷につながるＴＧＦ－β１の活性化を防ぎ、ＭＩ後のＩＨＦの発症を回避する可能性を有する。

ＭＩの臨床環境において、ＭＡＰＫ１またはＥＲＫ２の活性化が心筋虚血を媒介することを示す図である。 ＥＲＫ１／２活性化を阻害することにより、ＭＩの前臨床環境における心筋リモデリング及び炎症を軽減することを示す図である。 線維化促進ＭＥＫ１／２－ＴＧＦ－β１経路が、単球におけるＰＡＲ－２媒介ＲＯＳシグナル伝達に関連することを示す図である。 骨髄細胞由来のＴＦ－ＰＡＲ２複合体が、ＴＧＦ－β１の活性化に必要であることを示す図である。 ＴＦ細胞質尾部の欠失が、ＲＯＳ産生及びＥＲＫ１／２－ＴＧＦ－β１シグナル伝達依存の心臓の線維化を軽減し、心臓機能を改善することを示す図である。 骨髄細胞のＴＦ細胞質ドメインのリン酸化が、ＭＩの前臨床及び臨床環境におけるＥＲＫ１／２－ＴＧＦ－β１依存性の心臓リモデリングを媒介することを示す図である。 ＭＩの前臨床及び８５１の臨床環境における循環単球上のＴＦ細胞質ドメインのリン酸化を示す図である。 ＴＦ－ＦＶＩｌａの薬理学的標的化が、ＴＧＦ－β１の活性化を防ぐことにより、心機能を改善することを示す図である。 ビヒクルまたはトラメチニブ処置マウスから得た梗塞心筋におけるｐＪＮＫ／ＳＡＫ（総ＪＮＫ／ＳＡＫに対して正規化）及びｐ３８（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のタンパク質発現分析結果を示す図である。 ７日目のＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌ及びＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌ ＬｙｓＭＣｒｅ同腹子から得た梗塞心筋のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。 永久９１２ＬＡＤ結紮及び疑似手術を受けたＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）及びＴＦΔＣＴマウスの７日後の分析結果を示す図である。 永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を受けた骨髄（ＢＭ）移植マウスの７日後の分析結果を示す図である。 永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を受けた骨髄（ＢＭ）移植マウスの７日後の分析結果を示す図である。 梗塞心筋のフローサイトメトリー分析及びｐＥＲＫ１／２の定量分析結果を示す図である。 ＣＸ_３ＣＲ_１ ^＋骨髄細胞における凝固第ＶＩＩ因子の欠損が、浸潤免疫細胞の数への影響とは関係なく、虚血性心不全の発症を軽減させることを示す図である。 骨髄細胞におけるインテグリンβ１の欠損が、炎症細胞の浸潤を軽減させ、虚血性心不全の発症における心臓線維化促進タンパク質の発現を遮断することを示す図である。

本発明は、骨髄細胞のＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達がＴＧＦ－β１活性化の重要な駆動因子であり、ＩＨＦまたはＭＩの治療または予防の標的であるという驚くべき発見に基づく。以下の実施例は、例示のみを目的として示されており、本発明の趣旨の範囲内で様々な変更及び修正が当業者には明らかとなるであろう。

実施例
結果：
ＭＩ及びＩＨＦの臨床及び前臨床環境におけるＭＡＰＫ１の活性化。
ＩＨＦにおける不全心筋の分子病態生理学を調査するために、本発明者らは、５名のＩＨＦ患者から得た外植心臓の心臓組織について、５名の対照ドナー心臓と比較した、バイアスのないラベルフリー定量的プロテオミクス及びリンプロテオミクスプロファイリングを実施した。高分解能精度の質量分析により、２，７１４個のタンパク質及び１０，６０１個のリン酸化ペプチドの定量が可能になり、そのうち２０８個のタンパク質及び６８５個のリン酸化ペプチドが、１つ群のすべての測定のうちの少なくとも６０％の倍率変化０．５未満～２超で大幅に変化した（図１Ａ、図９～１４）。遺伝子オントロジー分析により、対照と比較して、ＩＨＦ群では補体及び凝固カスケード、自然免疫系、血小板活性化、及びエンドサイトーシスに関連する経路が大幅に豊富であることが明らかになった（図１Ｂ）。これらの変化に基づいて、発明者らは、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ ＳＴＲＩＮＧ－ＤＢアプリを使用して、タンパク質間相互作用分析を実施した。分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ１（ＭＡＰＫ１または細胞外シグナル調節キナーゼ、ＥＲＫ）のＴｈｒ１８５及び／またはＴｙｒ１８７のリン酸化が、統合ネットワークキナーゼ分析の中心ノードとして明らかになった（図１Ｃ）。さらに、統合推定キナーゼ活性（ＩｎＫＡ）分析により、ＭＡＰＫ１は、ＩＨＦの心筋サンプルでは（高）活性キナーゼ（平均ＩｎＫＡスコア４９）であるが、対照では高くないことが明らかになった（図１Ｄ）。

これらの臨床データに基づいて、発明者らは、左前下行冠動脈の永久結紮によって誘導されるＩＨＦの前臨床マウスモデルにおいて、ＥＲＫ１／２活性化因子分裂促進因子活性化細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＥＫ）をＭＥＫ１／２阻害剤トラメチニブで遮断することによって、ＩＨＦに対するＭＡＰＫ経路の寄与を評価した（ＬＡＤ、図２Ａ）。がん治療における長期の高用量トラメチニブレジメンは、心毒性の副作用を引き起こし得る１７。対照的に、本発明者らは、トラメチニブ（１ｍｇ／ｋｇ／日）による治療を１日目に開始し、ＭＩ後６日間継続することにより、心機能の悪化が軽減され（図２Ｂ）、心臓組織におけるＥＲＫ経路の活性化が防止された（図２Ｃ）ことを観察した。トラメチニブ療法は、疑似手術マウスの心機能には有意な効果を有さず（図２Ｂ）、ｐＪＮＫ／ＳＡＫまたはｐ３８ＭＡＰＫ経路を有意に妨害することはなかった（図９Ａ）。

ＴＧＦ－β１は、ＭＩ後の有害なＬＶリモデリング及び心不全の発症に関与するとされている（４、１８）。トラメチニブは、ＴＧＦ－β１の活性化（図２Ｃ）、ならびにコラーゲンＩ型及びＩＩＩ型α１鎖をコードするＣＯＬＯ１Ａ１及びＣＯＬＯ３Ａ１、ならびに梗塞心筋内の線維化マーカーであるペリオスチン及び平滑筋アクチンをコードするＰｏｓｎ及びＡＣＴＡ２（図９Ｂ）のｍＲＮＡ発現を有意に減少させた。Ｌｙ６Ｇ＋好中球及びＬｙ６Ｃｈｉｇｈ単球３の浸潤、及びその後のＬｙ６Ｃｌｏｗ単球及びマクロファージの拡大（１９）により、梗塞心筋層内の炎症反応が調整される。トラメチニブは、炎症性サイトカイン及びケモカインであるインターロイキン－６（ＩＬ６）、腫瘍壊死因子α（Ｔｎｆ）、及びＣ－Ｃケモカインリガンド２（Ｃｃｌ２）のｍＲＮＡ発現を減少させることはなく、これは、ＭＩ後の局所炎症反応が変化しなかったことを示唆する。重要なことに、トラメチニブは、ＣＣＬ２受容体及び単球マーカーＣ－Ｃケモカイン受容体２（Ｃｃｒ２、図２Ｄ）のｍＲＮＡ発現を有意に減少させた。一貫して、梗塞した心臓へのＣＤ４５＋、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ及びＬｙ６Ｃ^ｌｏ骨髄細胞の動員は、トラメチニブによって軽減された（図２Ｅ）。総合すると、これらの所見は、持続性ＭＩにおける心筋リモデリング及び骨髄細胞の動員が、ＥＲＫ活性化によって促進され、心臓リモデリングがＭＥＫ１／２阻害剤トラメチニブによる治療介入によって阻害され得ることを示す。

骨髄細胞のＰＡＲシグナル伝達は、線維化促進性ＭＥＫ１／２－ＴＧＦ－β１経路の上流にある
免疫蛍光染色では、ＣＤ３１＋内皮細胞、α－ＳＭＡ＋筋線維芽細胞、またはｃＴＮＴ＋心筋細胞と比較して、梗塞心筋層におけるＥＲＫ１／２活性化の増加の主な原因として、浸潤ＣＤ４５＋免疫細胞が重要な役割を果たしていることが裏付けられた（図３Ａ）。したがって、本発明者らは、単球におけるＭＡＰＫ経路の役割を調査し、ＥＲＫ１／２活性化が有害なリモデリングの主要な駆動因子、すなわちＴＧＦ－β１の活性化に関連しているかを調べた。本発明者らは、単離したマウス単球を低酸素及び虚血心臓で検出された炎症性サイトカインＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＣＣＬ２の両方に曝露した（図２Ｄ）。潜在的なＴＧＦ－β１の発現は、様々な実験条件の影響を受けなかったが、低酸素及び炎症性サイトカインの両方に曝露された単球は、ＥＲＫ１／２リン酸化を顕著に上方制御し、ＴＧＦ－β１の活性化の増加を示したが、これはトラメチニブによって遮断された（図３Ｂ）。

ヒト虚血性心筋のプロテオーム分析では、補体、自然免疫応答、及び凝固経路の顕著な変化が実証された。補体活性化は、心筋梗塞（５）、酸化ストレス及び血栓炎症（２１）に関係する単球性ＴＦ（２０）の機能に影響を与える特定の役割を果たす。リガンドＦＶＩＩａと複合体を形成したＴＦは、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）２を活性化し、インテグリンβ１ヘテロ二量体と複合体を形成して輸送することにより、持続的なエンドソームＥＲＫ１／２シグナル伝達を促進する（２４）。単球ＥＲＫ１／２活性化の上流シグナルとしてＰＡＲ２が関与していることから、本発明者らは、ＰＡＲ２－／－マウスから単離された単球が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで低酸素＋サイトカインに曝露された場合に、ＥＲＫ１／２リン酸化及びＴＧＦ－β１活性化を減少させることを見出した（図３Ｃ）。

これらのデータに基づいて、本発明者らは、ＰＡＲｆｌ／ｆＩ ＬｙｓＭｃｒｅマウスを７日間永久ＬＡＤ結紮に供することにより、単球発現ＰＡＲ２の役割を評価した。骨髄細胞ＰＡＲ２欠損マウスは、心筋におけるデカペンタプレジック相同体２（ＳＭＡＤ２、図３Ｅ）に対する低分子のＴＧＦ－β１活性化及びリン酸化を減少させ、ＭＩ後７日目には心機能不全から保護された（図３Ｆ）。しかし、梗塞心筋層への免疫細胞の動員は、骨髄細胞ＰＡＲ２欠損マウスでは減少しなかった（図１０）。これは、骨髄性１３５細胞ＰＡＲ２の主要機能が、局所的なＴＧＦ－β１をサポートし、ＭＩ後の心臓リモデリングを促進することを示している。

梗塞心筋層におけるＴＦ及びＣＤ４５の共染色実験により、ＣＤ４５／ＴＦ二重陽性細胞の有意な増加が明らかになった（図４Ａ）。ＰＡＲ２欠失と一致して、ＬｙｓＭｃｒｅを有する骨髄細胞中でのＴＦ欠失は、心臓ＥＲＫ１／２活性化（図４Ｂ）、ＴＧＦ－β１活性化及びＳＭＡＤ２リン酸化（図４Ｃ）の減少を示した。さらに、これらのマウスは、ＴＦｆｌ／ｆｌ同腹子対照と比較して、ＩＬ６及びＣｃｒ２（図４Ｄ）、ＣＯＬＯ１Ａ１、ＣＯＬＯ３Ａ１及びＡＣＴＡ２（図４Ｅ）のｍＲＮＡ発現の顕著な減少、ならびに心機能の改善（図４Ｆ）も示した。したがって、浸潤骨髄細胞におけるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達は、虚血に関連するＭＡＰＫ経路の過剰活性化、ＴＧＦ－β１活性化、及びＭＩ後の線維化促進性リモデリングの可能性の原因となる。

骨髄細胞のＴＦ細胞質ドメインシグナル伝達は、永久ＭＩにおけるＮＯＸ２／ＥＲＫ依存性のＴＧＦ－β１活性化に連携している。
次に、本発明者らは、ＴＦが線維化促進性ＴＧＦ－β１活性化に対して、シグナル伝達がさらに寄与するかについて調べた。ＦＶＩＩａによるＴＦのライゲーションは、ＴＦ細胞質ドメインに依存してｒａｃ及びｐ３８を活性化する（４３）。ＰＡＲシグナル伝達の文脈では、ＴＦ細胞質尾部は、ＰＩ３キナーゼの調節サブユニットとｒａｃアダプターｐ８５に結合し（４４）、エンドソーム転座及び活性酸素種（ＲＯＳ）の産生のためにＮＡＤＰＨオキシダーゼを動員する（３７）。本発明者らは、永久ＬＡＤ結紮を有するＴＦｆｌ／ｆｌ ＬｙｓＭｃｒｅマウスは、対照と比較して心臓ＮＯＸ２発現が顕著に減少しており、ＰＡＲ２－／－マウスから単離された単球は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて低酸素＋サイトカインに曝露された場合にＮＯＸ２発現が減少していることを見出した。同様に、ＰＡＲｆｌ／ｆｌ ＬｙｓＭｃｒｅマウスの虚血心筋層におけるスーパーオキシドアニオン（Ｏ２・－）形成は、ＰＡＲｆｌ／ｆｌ同腹子対照と比較して減少した（図１１Ａ～Ｃ）。

ＴＦｆｌ／ｆｌ ＬｙｓＭｃｒｅマウス及びＰＡＲｆｌ／ｆｌ ＬｙｓＭｃｒｅマウスの結果と一致して、永久ＭＩに曝露された細胞質尾欠損マウス（ＴＦΔＣＴマウス）では、梗塞心筋内でＣＤ４５＋／ＮＯＸ２＋免疫細胞浸潤（図５Ａ）及びＯ２・－形成（図５Ｂ）が顕著に減少した。さらに、ＭＩ後にＴＦΔＣＴマウスから単離された循環単核細胞は、ＬＡＤ結紮７日後のＷＴマウスと比較して、ＮＯＸ２及び調節サブユニットｐ６７ｐｈｏｘの発現を有意に減少させた（図１１Ｄ）。ＴＧＦ－β１及び活性酸素種（ＲＯＳ）は、線維化のフィードフォワード機構として機能することができ（４５）、食細胞型ＮＡＤＰＨオキシダーゼＮＯＸ２は、ＭＩ後の酸化ストレス及び心臓リモデリングに大きく寄与する（４６）。重要なことに、サイトカインミックス及び低酸素に曝露されたＮＯＸ２^－／－単球は、ＴＧＦ－β１活性化が損なわれ、ＥＲＫ１／２リン酸化が顕著に減少し、これが、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ由来ＲＯＳの中心的な役割であることを示している（図５Ｄ）。ＲＯＳ産生の減少と一致して、ＴＦΔＣＴマウスの梗塞心筋では、ＥＲＫ１／２のリン酸化の顕著な減少、ＴＧＦ－β１活性化の減少、ＴＧＦ－β１シグナル伝達の減少が示され、これは株が一致している野生型（ＷＴ）と比較して、ＳＭＡＤ２のリン酸化及び線維化促進性のα－ＳＭＡの誘導によって明らかになった（図５Ｃ、図１１Ｅ）。重要なことに、代替のＴＦシグナル伝達標的ｐ３８ＭＡＰＫ２５のリン酸化（図１１Ｆ）は、ＴＦΔＣＴマウスにおいて変化せず、これはＥＲＫ経路に対する特異性を強調している。

梗塞後の後期心臓リモデリングには初期のＴＧＦ－β１シグナル伝達が必要であるため（４７）、本発明者らはＭＩ後４週間のＴＦΔＣＴマウスを検査した。シリウスレッド染色により、疑似手術マウスと比較して、ＬＡＤ結紮マウスの心臓におけるコラーゲン沈着の増加及びより大きい線維化領域が明らかになったが、ＴＦΔＣＴマウスでは顕著に減少していた（図５Ｄ）。これらの形態学的利点は、機能低下からの保護に関連する：梗塞したＴＦΔＣＴマウスは、梗塞した対照と比較して、左心室の拡張が著しく低く、収縮が良好であり（図５Ｅ）、ＭＩ後の最初の３０日間の生存率が改善された（図５Ｆ）。

永久ＭＩの前臨床及び臨床環境における骨髄細胞ＴＦ細胞質ドメインのリン酸化。
本発明者の発見は、骨髄細胞のＴＦ尾部依存性線維化促進活性の中心的役割を示唆したため、本発明者らは、免疫組織化学染色を実施し、疑似ＭＩ群及び永久ＭＩ群の両方において、心筋中で、ＴＧＦ－β１＋ＣＤ３１＋細胞と比較して、ＴＧＦ－β１＋Ｌｙ６Ｃ＋炎症細胞が相対的に豊富であることを明らかにした。重要なことに、ＴＧＦ－β１＋Ｌｙ６Ｃ＋細胞は、対照マウスの梗塞心臓では劇的に増加したが、ＴＦΔＣＴマウスでは有意に少なかった（図６Ａ）。骨髄細胞のＴＧＦ－β１産生の役割がＴＦ細胞質尾部のシグナル伝達に依存するかを直接調べるために、本発明者らは、ＴＦΔＣＴマウスの骨髄（ＢＭ）キメラを作製した。生着が確認されて９～１０週間後（図１２Ａ～Ｂ）に、７日目後の分析を行うためにキメラマウスに永久ＭＩを誘導した。梗塞心筋へのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の動員は、移植群間で区別できないほどであったが（図１２Ｃ）、ＴＦΔＣＴマウスからのＢＭとのキメラのみ（ＴＦΔＣＴ－＞ＷＴ）が、ＭＩ後７日目にＳＭＡＤ２活性化の軽減（図１３Ａ）と並行して、心臓ＮＯＸ２の発現、ＥＲＫ１／２のリン酸化及び活性ＴＧＦ－β１の減少（図６Ｂ）を示した（図１３Ａ）。ＭＩ後６週間、ＴＦΔＣＴ－＞ＷＴマウスのみ、心機能の改善を示し、それによりＴＦΔＣＴ動物を表現コピーした（図１３Ｂ）。したがって、この前臨床証拠は、骨髄細胞のＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達を、ＭＩ後のＴＧＦ－β１依存性の有害なリモデリングに結び付ける。

梗塞心筋の分析により、ＷＴにおける実験的ＭＩの７日後に、ＴＦ細胞質ドメインのリン酸化が、ＣＤ４５＋細胞で特異的に検出可能であるが、ＴＦΔＣＴマウスでは検出できないことが明らかになり（図６Ｃ）、これは、この翻訳後修飾を測定することによってＴＦ依存性線維化促進経路の活性化を同定できることが示唆される。本発明者らは、この所見をヒトＩＨＦに翻訳するために、以前に検証されたＴＦ細胞質ドメインに対するリン酸化特異的抗体を利用した（４８）。リン酸化ＴＦについて染色されたＣＤ４５＋細胞の数２００は、ドナー心臓組織と比較して、ＩＨＦ患者から得たＬＶ組織サンプルで著しく増加した（図６Ｄ～Ｅ、表１）。このＴＦリン酸化の増加は、ＩＬ６、ＣＣＬ２及びＣＣＲ２の上方制御（図１３Ｃ）、ならびに骨髄細胞の動員ならびにＴＧＦ－β１の活性化及びＳＭＡＤ２の下流リン酸化の増加（図６Ｆ）を伴い、これは、その後の心臓線維性リモデリングを示している。

［表２］
年齢一致ドナーと比較した重度虚血性心不全患者の患者特徴（平均年齢（年齢）±ＳＥＭ：５２．０±３．５ｖｓ．５２．６±４．６、ｐ＝０．９５）。ヒト心臓サンプルは、全人工心臓移植（ＴＡＨ）及び左心室補助装置移植（ＬＶＡＤ）中に、虚血性心不全（ＩＨＦ）患者、または移植を拒否されたドナー心臓（Ｄ）（外植された非虚血性心臓（ＥＸＰＬ））から採取した。患者＃３～＃７及び＃１１～＃１５のサンプルは、（ホスホ）プロテオミクス研究にランダムに割り当てた。ｍ、男性；ｆ、女性。ＥＦ、駆出率；ｃＴＮＩ、心筋トロポニンＩ；ｎａ、利用不可、ａ、ｂドナー心臓は、ＥＦ＞５５％、トロポニンレベルが陰性の場合にのみ許可された。

図１に示すとおり、ＩＨＦサンプルの層をランダムに選択し、サンプル＃ＩＨＦ１～５とラベル付けし、サンプル＃Ｄ１～５と比較して、（ホスホ）プロテオミクス分析を４回に分けて実施した。

次に本発明者らは、リキッドバイオプシーにおけるＴＦリン酸化をＩＨＦのリスクのある患者を特定するために使用できるかを調べた。永久ＬＡＤ結紮マウスでは、循環ＰＢＭＣでのＴＦの有意な上方制御が明らかになった（図７Ａ～Ｂ）。長期にわたるＭＩ亜急性患者が、介入療法を早期に受けたＭＩ患者と比較して、２倍高い死亡及び心不全発症のリスクを有する（２５）。本発明者の観察臨床ＭＩＣＡＴ試験から採取したサンプルにおいて、本発明者らは、経皮的冠動脈インターベンション（ＰＣＩ、表２）のために入院した安定冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者と比較して、亜急性ＭＩに焦点を当てた。

循環単球中でのＴＦ細胞質ドメインのリン酸化及び活性ＴＧＦ－β１の血漿レベルは、安定ＣＡＤ患者と比較して、亜急性ＭＩにおいて顕著に増加した（図７Ｃ～Ｅ）。これらのデータは、骨髄細胞のＴＦリン酸化が、ＩＨＦの発症リスク及びＭＩ後の有害なリモデリングのリスクが高い患者のマーカーとして機能し得ることを示している。

［表３］
患者の特徴（ＭＩＣＡＴレジストリ）。本発明者らは、安定冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者または亜急性ＭＩ患者のいずれかにおいて経皮的冠動脈介入を受けた患者を含めた。すべての参加者は、ＭＩＣＡＴレジストリ（Ｍａｉｎｚ Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ ｄａｔａｂａｓｅ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２１８０１７８）。１００％が３枝病変ＣＡＤを有する、５０％が３枝病変４ ＣＡＤ、５０％が２枝病変ＣＡＤ、０％が１枝病変ＣＡＤを有する；ｎ．ｓ．カイ二乗検定；ＢＭＩ、肥満指数；ＷＢＣ、白血球数；ＣＲＰ、Ｃ反応性タンパク質；ｎ．ｓ．、有意でない。

ＴＦ－ＦＶＩｌａの薬理学的標的化は、ＴＧＦ－β１の活性化を防ぐことにより、心機能を改善する。
次に、本発明者らは、ＭＩ後の心臓リモデリングにおけるＴＦシグナル伝達を薬理学的に標的とする実現可能性を調査した。線虫類抗凝固タンパク質Ｃ２（ＮＡＰｃ２）は、阻害されたＴＦ－ＦＶＩＩａ－ＦＸ（ａ）複合体を形成することによりＴＦシグナル伝達及び凝固を遮断する（１５）。第２相臨床試験では、冠状動脈性心疾患に対する経皮的介入におけるこの薬剤の安全性が実証されていた（１６）。マウス単球における所見を再現すると、炎症性サイトカイン及び低酸素に曝露された単離されたヒト単球では、ＮＯＸ２発現及びＴＧＦ－β１活性化が増加したが、これらはＮＡＰｃ２の存在下で抑制され、それに伴ってＥＲＫ１／２のリン酸化も減少した（図８Ａ）。前臨床モデルにおいて、本発明者らは、永久ＬＡＤ結紮の７日目後、循環骨髄細胞のＮＯＸ２及び活性ＴＧＦ－β１レベルが上昇しており、これらは急性ＭＩの１日後に開始するＮＡＰｃ２治療によって軽減されたことを示した（図８Ｂ及びＣ）。さらに、ＮＡＰｃ２は、梗塞心臓において、心機能を改善し（図８Ｄ）、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞の心臓浸潤を軽減し（図１４Ａ）、ＥＲＫ１／２リン酸化、ＮＯＸ２発現、ＴＧＦ－β１活性化及び下流標的α－ＳＭＡの上方制御を減少させた（図８Ｅ、図１４Ｂ）。次に、本発明者らは、後期心筋リモデリング及び急性ＭＩからＩＨＦへの移行に対するＴＦシグナル伝達の急性ブロックの影響を調査した。ビヒクル処置マウスと比較して、ＭＩ後１日から７日までの短期ＮＡＰｃ２処置は、慢性ＭＩにおける心臓の線維化を有意に減少させ（図８Ｆ）、心臓機能を改善した（図８Ｇ）。重要なことに、この心臓損傷からの保護により、２３２の生存率が向上した（図８Ｈ）。まとめると、これらの結果は、骨髄細胞上のＴＦシグナル伝達機能の標的化が有益な心臓リモデリングをもたらし、ＭＩ後の心臓機能を改善することを示している。

図面の詳細な説明
図１：ＭＩの臨床環境において、ＭＡＰＫ１またはＥＲＫ２の活性化が心筋虚血を媒介する。ＩＨＦ（ＭＩ、ｎ＝５）及び非ＩＨＦドナー心臓（対照、ｎ＝５）の心臓生検から単離されたタンパク質を、ラベルフリー定量的プロテオミクスによって分析した。サンプルは、４回（タンパク質）及び３回（リンペプチド）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳを実施することにより測定した。Ａ）２０８のタンパク質及び６８５のリンペプチドの量プロファイルを示すヒートマップである。有意差（ｐ＜０．０５、倍率変化０．５未満～２超、対照群または梗塞群のいずれかにおいて、すべてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ反復の６０％超で同定）、ｌｏｇ１０は変換され、Ｚスコアを使用して行ごとに正規化し、倍率変化の降順にソートされている。Ｂ）差次的に豊富なタンパク質のリアクトーム経路濃縮分析結果である。Ｃ）差次的に調節された（ｐ＜０．０５）非リン酸化タンパク質及びリン酸化タンパク質を、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ ＳＴＲＩＮＧ ＤＢ検索によって相互の既知のタンパク質間相互作用について分析し、円形レイアウトでの相互作用の数によってソートした。本発明のキナーゼの中で、ＭＡＰＫ１が最も多くの相互作用を示し、次にｍＴＯＲ、ＴＴＮＣＤＫ１３、ＰＩ４ＫＡ、及びＴＡＯＫ２が続く。Ｄ）ボルケーノプロットは、梗塞群と対照群との間で有意に異なる統合推定キナーゼ活性（ＩｎＫＡ）スコアの結果を示す。

図２：ＥＲＫ１／２活性化を阻害することにより、ＭＩの前臨床環境における心筋リモデリング及び炎症を軽減する。Ａ）実験用マウスモデルの設計を示す。野生型（ＷＴ）マウスに、永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を施し、１日から７日目まで強制経口投与によるビヒクルまたはトラメチニブ（１ｍｇ／ｋｇ／日）またはビヒクル処置を１日１回施した。Ｂ）術後７日目の左心室駆出率（ＬＶＥＦ、％）及び左心室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ、μｌ）の測定を含む傍胸骨長軸（ＰＬＡＸ）で得られた高周波超音波心エコー検査結果を示す。Ｃ）ビヒクルまたはトラメチニブ処置マウスから得た梗塞心筋層におけるｐＥＲＫ１／２（総ＥＲＫ１／２に対して正規化）及び活性化ＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のタンパク質発現分析結果を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝４～７匹／群。Ｄ）梗塞心筋層からのＩｌ６、Ｔｎｆ、Ｃｃｌ２、及びＣｃｒ２の相対的なｍＲＮＡ発現分析結果を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、マウスｎ＝４～７匹／群。Ｅ）心臓重量に対して正規化されたビヒクルまたはトラメチニブ処置マウスから得た梗塞心筋のフローサイトメトリー分析結果を示す。ＣＤ４５＋白血球、ＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－／Ｂ２２０－／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋骨髄単球細胞、ＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－／Ｂ２２０－／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ－６Ｇ－／Ｆ４／８０－／Ｌｙ－６Ｃｈｉｇｈ単球及びＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－／Ｂ２２０－／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ－６Ｇ－／Ｆ４／８０－／Ｌｙ－６Ｃｎｅｇマクロファージの代表的なドットプロット及び定量化である。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～６匹／群。

図３：線維化促進性のＭＥＫ１／２－ＴＧＦ－β１経路は、単球におけるＰＡＲ－２媒介ＲＯＳシグナル伝達に関連する。Ａ）７日目にＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスから得た心筋凍結切片の共焦点顕微鏡画像を示す。７８１ＣＤ３１、ＣＤ４５、αＳＭＡ及びｃＴＮＴについて共染色されたｐＥＲＫ１／２＋細胞の代表的な画像及び定量化を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較試験、動物ｎ＝５匹／群。Ｂ～Ｃ、ＷＴマウスから単離され、トラメチニブ（１０μＭ）で１時間前処理された単球（Ｂ）及びＰＡＲ２－／－マウス（Ｃ）からのタンパク質発現分析結果を示す。低酸素の有無にかかわらず、細胞を、濃度２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６、ＴＮＦ－α、及びＣＣＬ２を含む炎症性サイトカインカクテルで４時間刺激した。ｐＥＲＫ１／２（総ＥＲＫ１／２に対して正規化）、ＮＯＸ２（図１１Ｅを参照）及び活性化ＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のウエスタンブロッティングを示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、ｎ＝５／群反復（各サンプルに対して２～３匹のマウスをプールした）。ＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌ及びＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌＬｙｓＭＣｒｅ同腹子に永久ＬＡＤ結紮を行い、７日後に調査した。（Ｄ）ＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌＬｙｓＭＣｒｅ及びＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌ同腹子から得た梗塞心筋における活性化ＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）及びｐ－ＳＭＡＤ２（総ＳＭＡＤ２に対して正規化）のウエスタンブロット分析結果を示す。代表的なブロット及び生物学的複製の定量化を示す。（Ｅ）ＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌＬｙｓＭＣｒｅ及びＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌ同腹子対照マウスから得た高周波超音波心エコー検査、ＬＶＥＦ（％）及びＬＶＥＤＶ（μｌ）の測定結果を示す。
７９４マン・ホイットニー検定、ｎ＝５匹／群の動物。

図４：骨髄細胞由来のＴＦ－ＰＡＲ２複合体は、ＴＧＦ－β１の活性化に必要である。Ａ）７日目にＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスから得た心筋凍結切片の共焦点顕微鏡画像を示す。ＣＤ４５について共染色されたＴＦ＋細胞の代表的な画像及び定量化を示す。対応のないｔ検定、動物ｎ＝５～６匹／群。ＴＦｆｌ／ｆｌ ＬｙｓＭＣｒｅ及びＴＦｆｌ／ｆｌ同腹子に永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を行い、７日後に調査した。Ｂ）ＴＦｆｌ／ｆｌＬｙｓＭＣｒｅ及びＴＦｆｌ／ｆｌ同腹子から得た梗塞心筋層におけるｐＥＲＫ１／２のタンパク質発現分析（全ＥＲＫ１／２に対して正規化）を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～６匹／群。（Ｃ）ＴＦ ｆｌ／ｆｌＬｙｓＭＣｒｅ及びＴＦ ｆｌ／ｆｌ同腹子から得た梗塞心筋における活性化ＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）及びｐ－ＳＭＡＤ２（総ＳＭＡＤ２に対して正規化）のウエスタンブロット分析結果を示す。代表的なブロット及び生物学的複製の定量化を示す。Ｄ～Ｅ）、ＴＦ ｆｌ／ｆｌ ＬｙｓＭＣｒｅ及びＴＦｆｌ／ｆｌ同腹子から得た梗塞心筋におけるＩｌ６、ＣＣｒ２（Ｄ）、ＣＯＬＯＡ１、ＣＯＬＯ３Ａ１及びＡｃｔａ２（Ｅ）の相対ｍＲＮＡ発現分析結果を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～７匹／群。Ｆ）ＴＦｆｌ／ｆｌ ＬｙｓＭＣｒｅ及びＴＦｆｌ／ｆｌ８０７同腹子から得た高周波超音波心エコー検査結果を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～７匹／群。

図５：ＴＦ細胞質尾部の欠失は、ＲＯＳ産生及びＥＲＫ１／２－ＴＧＦ－β１シグナル伝達依存の心臓の線維化を軽減し、心臓機能を改善する。ＷＴマウス及びＴＦΔＣＴマウスに永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を行い、７日後及び４週間後に調査した。Ａ）心筋凍結切片の共焦点顕微鏡検査画像を示す。ＣＤ４５／ｇｐ９１ｐｈｏｘ二重陽性細胞の８１２平均蛍光強度（ＭＦＩ）の代表的な画像及び定量化である。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～６匹／群。Ｂ）ＤＨＥ－ＨＰＬＣ分析による梗塞心筋におけるスーパーオキシド形成の評価を示す。ＤＨＥの酸化生成物である２－ＨＥの代表的なクロマトグラム、及び梗塞組織の重量に対して正規化された定量化である。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～６匹／群。Ｃ）ＭＩの７日目後にＷＴまたはＴＦΔＣＴマウスから得た梗塞心筋における活性化ＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）及びｐ－ＳＭＡＤ２（総ＳＭＡＤ２に対して正規化）のウエスタンブロット分析結果を示す。代表的なブロット及び生物学的複製の定量化を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～８匹／群。Ｄ）ＮＯＸ２－／－動物から単離し、低酸素状態がある場合とない場合で、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、及びＣＣＬ２を濃度２０ｎｇ／ｍｌで含む炎症性サイトカインカクテルで４時間刺激した単球のタンパク質発現分析結果を示す。ｐＥＲＫ１／２（ＥＲＫ１／２に対して正規化）及び活性化ＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のウエスタンブロッティングを示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、ｎ＝４／群反復（各サンプルに対して２～３匹のマウスをプールした）。Ｅ）ＭＩ及び疑似手術後４週間のパラフィン包埋心臓切片上の線維化領域のシリウスレッド染色及びデコンボリューション画像である。表面積に対して正規化させた線維化領域の代表的な画像及び８２７の定量化を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～６匹／群。Ｆ）ＰＬＡＸ ＭモードでのＬＶＥＦ（％）、ＬＶＥＤＶ（μｌ）に関する４週間にわたる縦断心エコー検査。二元配置分散分析、ボンフェローニの多重比較検定、動物ｎ＝６～１７匹／群。Ｇ）ＬＡＤ結紮マウス及び疑似手術を受けたＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＴＦΔＣＴマウスの４週間にわたるカプラン・マイヤー生存分析結果を示す。ログランク（マンテル－コックス）検定、動物ｎ＝１５～２０匹／群。

図６：骨髄細胞のＴＦ細胞質ドメインのリン酸化は、ＭＩの前臨床及び臨床環境におけるＥＲＫ１／２－ＴＧＦ－β１依存性の心臓リモデリングを媒介する。Ａ）ＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）及びＴＦΔＣＴマウスから得た心筋凍結切片の共焦点顕微鏡画像を示す。Ｌｙ６Ｃ／ＴＧＦβ－１及びＣＤ３１／ＴＧＦ－β１陽性細胞の代表的な画像及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）の定量化結果である。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５匹／群。骨髄（ＢＭ）移植マウスに永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を施し、７日後に調査した。Ｂ）キメラマウスから得た梗塞心筋におけるＮＯＸ２（ＧＡＰＤＨに対して正規化）、ｐＥＲＫ１／２（総ＥＲＫ１／２に対して正規化）及びＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のウエスタンブロット分析結果である。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～７匹／群。Ｃ）７日目後にＷＴまたはＴＦΔＣＴマウスから得た梗塞心筋層におけるＴＦのリン酸化状態の代表的な共焦点画像である。上：代表的な画像及び生物学的複製の定量化結果を示す。クラスカル・ウォリス検定及びＤｕｎｎ多重比較検定、動物ｎ＝３～４匹。Ｄ）ｎ＝５の非虚血性（ＮＩ）ドナー心臓及びｎ＝７のＩＨＦ患者（ＭＩ）から得たヒト心筋片におけるＣＤ４５陽性細胞及びＣＤ４５／ｐＴＦ二重陽性細胞８４４の代表的な免疫蛍光共焦点顕微鏡画像である。生物学的複製の定量化。マン・ホイットニー検定。Ｅ～Ｆ）、ｐＴＦ（総ＴＦに対して正規化）、ＴＦ（Ｅ）及びＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）及びｐＳＭＡＤ２（総ＳＭＡＤ２に対して正規化）（Ｆ）について、ｎ＝５の非虚血（Ｎｌ）ドナー心臓及びｎ＝９のＩＨＦ（ＭＩ）患者から得たヒト左心室組織のウエスタンブロット分析及び定量化結果である。マン・ホイットニー検定。

図７：ＭＩの前臨床及び８５１の臨床環境における循環単球上のＴＦ細胞質ドメインのリン酸化を示す。Ａ）７日目にＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスから単離された循環ＰＢＭＣにおけるＴＦのウエスタンブロット分析結果である。対応のないｔ検定、動物ｎ＝５～７匹／群。Ｂ）７日目にＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスから単離されたＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析結果である。ＣＤ４５＋／ＴＦ＋、ＣＤ４５＋／ＴＦ＋／ＣＤ１１５＋／Ｌｙ６Ｃｈｉ、ＴＦ＋／ＣＤ１１５＋Ｌｙ６Ｃｌｏ細胞の代表的なカウンタープロット及び定量化結果である。クラスカル・ウォリス検定、Ｄｕｎｎ多重比較検定、動物ｎ＝４～５匹。Ｃ）ｐ－ＴＦ（赤）、ＴＦ（赤）、及びＤＡＰＩ（青）で染色した、表１に記載の患者から単離した単球の共焦点顕微鏡写真である。Ｄ）ＴＦ細胞質ドメインリン酸化（４Ｇ６）及びＴＦ（１０Ｈ１０）に関する単球タンパク質発現のウエスタンブロット分析結果である。Ｅ）表１に記載の患者から得たサンプル中の活性化ＴＧＦ－β１の血漿レベルである。マン・ホイットニーの対応のないｔ検定。患者ｎ＝６名／群。

図８：ＴＦ－ＦＶＩｌａの薬理学的標的化は、ＴＧＦ－β１の活性化を防ぐことにより、心機能を改善する。Ａ）サイトカインカクテルミックス（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＮＡＰｃ２（２００ｎｇ／ｍｌ）を含む場合と含まない場合の低酸素に曝露された単離ヒト単球におけるｐＥＲＫ１／２（総ＥＲＫ１／２に正規化）、ＮＯＸ２及びＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに正規化）のタンパク質発現分析結果である。代表的なブロット及び定量化を示す。Ｂ）ＭＩの７日後に実験動物のＰＢＭＣから得たＮＯＸ２及びＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のウエスタンブロット分析結果である。複製の代表的な画像及び定量化結果を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～７匹／群。Ｃ）実験デザイン：１日目から７日目まで、マウスに１日１回腹腔内注射によりＮＡＰｃ２（１ｍｇ／ｋｇ／日）を注射した。Ｄ）ＬＡＤ結紮後７日目のＬＶＥＦ、ＬＶＥＤＶの測定を伴う傍胸骨長軸（ＰＬＡＸ）で得られた高周波心エコー検査結果である。Ｅ）ビヒクルまたはＮＡＰｃ２処置マウスから得た梗塞心筋層におけるｐＥＲＫ１／２、ＮＯＸ２、ＴＧＦ－β１及びα－ＳＭＡのタンパク質発現分析のための代表的なブロットである。Ｆ～Ｈ、１日目から７日目までマウスにＮＡＰｃ２（１ｍｇ／ｋｇ／日）及び／またはビヒクル（１ｍｇ／ｋｇ／日）を１日１回腹腔内注射により注射し、続いて長期分析を行った。表面積に対して正規化させた線維化領域の代表的な画像及び定量化を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～７匹／群（Ｆ）。ＰＬＡＸ ＭモードでのＬＶＥＦ（％）、ＬＶＥＤＶ（μｌ）に関する７日目以降４週間にわたる縦断心エコー検査。二元配置分散分析、ボンフェローニの多重比較検定、動物ｎ＝６～１２匹／群（Ｇ）。ＬＡＤ結紮マウス及び疑似手術ＮＡＰｃ２８７６及びビヒクル処置マウスの４週間後のカプラン・マイヤー生存分析。ログランク（マンテル－コックス）検定、動物ｎ＝７～１５匹／群（Ｈ）。

図９：ビヒクルまたはトラメチニブ処置マウスから得た梗塞心筋におけるｐＪＮＫ／ＳＡＫ（総ＪＮＫ／ＳＡＫに対して正規化）及びｐ３８（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のタンパク質発現分析結果を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝４～６匹／群。Ｂ）１日から７日目まで強制経口投与により１日１回、ビヒクルまたはトラメチニブ（１ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した動物から得た梗塞心筋層からのＣＯＬＯＡ１、ＣＯＬＯ３Ａ１、Ａｃｔａ２及びＰｏｓｎの相対的ｍＲＮＡ発現分析結果である。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝４～６匹／群。

図１０：７日目のＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌ及びＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌ ＬｙｓＭＣｒｅ同腹子から得た梗塞心筋のフローサイトメトリー分析結果を示す。ＣＤ４５＋白血球、ＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋骨髄単球細胞の代表的なドットプロット及び定量化結果である。マン・ホイットニー検定、ｎ＝５匹／群の動物。

図１１：永久９１２ＬＡＤ結紮及び疑似手術を受けたＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）及びＴＦΔＣＴマウスの７日後の分析結果を示す。Ａ）実験動物のＰＢＭＣで発現されたｇｐ９１ｐｈｏｘ及びｐ６７ｐｈｏｘ（α－アクチニンに対して正規化）のウエスタンブロット分析結果である。代表的なブロット及び生物学的複製の定量化を示す。通常の一元配置分散分析、及びＳｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝６～１０匹／群。Ｂ～Ｃ Ｍｌの７日目後にＷＴまたはＴＦΔＣＴマウスから得た梗塞心筋中でのｐＥＲＫ１／２（総ＥＲＫ１／２に対して正規化）、α－ＳＭＡ（ＧＡＰＤＨに対して正規化）（Ｂ）、及びＰｐ３８（総Ｐ３８に対して正規化）（Ｃ）のウエスタンブロット分析結果である。代表的なブロット及び生物学的複製の定量化を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～８匹／群。Ｄ）ＴＦｆｌ／ｆｌＬｙｓＭＣｒｅ及びＴＦｆｌ／ｆｌ同腹子から得た梗塞心筋層におけるＮＯＸ２（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のタンパク質発現分析を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～７匹／群。Ｆ）ＤＨＥ－ＨＰＬＣによる、７日目のＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌ及びＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌＬｙｓＭＣｒｅ同腹子から得た梗塞心筋におけるスーパーオキシド形成の評価を示す。ＤＨＥの酸化生成物である２－ＨＥの代表的なクロマトグラム、及び総タンパク質数に対して正規化させた定量化結果である。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重
９２５比較試験、動物ｎ＝５～６匹／群。

図１２：永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を受けた骨髄（ＢＭ）移植マウスの７日後の分析結果を示す。Ａ）ＢＭ移植実験のスキームを示す。Ｂ）ドナーキメラを定量化するための末梢血ＣＤ４５．１＋及びＣＤ４５．２＋細胞の割合を示す代表的な円グラフである。Ｃ）ＢＭ移植マウスから得た梗塞心筋のフローサイトメトリー分析結果である。ＣＤ４５＋白血球、ＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－３１／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋骨髄単球細胞の代表的なドットプロット及び定量化結果である。クラスカル・ウォリス検定及びＤｕｎｎ多重比較検定、動物ｎ＝３～６匹／群。

図１３：永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を受けた骨髄（ＢＭ）移植マウスの７日後の分析結果を示す。Ａ ＢＭ移植マウスから得た梗塞心筋層におけるｐＳＭＡＤ２（ＳＭＡＤ２に対して正規化）及びα－ＳＭＡ（ＧＡＰＤＨに対して正規化）のウエスタンブロット分析結果である。代表的なブロット及び生物学的複製の定量化を示す。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～６匹／群。Ｂ）ＭＩから６週間後のＰＬＡＸ ＭモードでのＬＶＥＦ（％）及びＬＶＥＤＶ（μｌ）である。通常の一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝６～１０匹／群。Ｃ）ｎ＝５の非梗塞（ＮＩ）ドナー心臓及びｎ＝９のＩＨＦ（ＭＩ）患者から得たヒト左心室組織におけるＩＬ６、ＣＣＬ２及びＣＣＲ２のｍＲＮＡ発現分析結果である。マン・ホイットニーの対応のないｔ検定。

図１４：梗塞心筋のフローサイトメトリー分析及びｐＥＲＫ１／２の定量分析結果を示す。Ａ）ＮＡＰｃ２処置動物（１ｍｇ／ｋｇ／日）（心臓重量に対して正規化）から得た梗塞心筋のフローサイトメトリー分析結果を示す。ＣＤ４５＋白血球及びＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋白血球の代表的なドットプロット及び定量化結果である。通常の９４４一元配置分散分析、Ｓｉｄａｋの多重比較検定、動物ｎ＝５～７匹／群。Ｂ）図８Ｅに示す代表的なウエスタンブロットのｐＥＲＫ１／２（総ＥＲＫ１／２に対して正規化）、ＮＯＸ２、ＴＧＦ－β１及びα－ＳＭＡ（ＧＡＰＤＨに対して正規化）の定量分析結果である。

図１５：ＣＸ_３ＣＲ_１ ^＋骨髄細胞における凝固第ＶＩＩ因子の欠損が、浸潤免疫細胞の数への影響とは関係なく、虚血性心不全の発症を軽減させる。

ＦＶＩＩ^{ｆｌ／ｆｌ}ＣＸ３ＣＲ１^Ｃｒｅ及びＦＶＩＩ^{ｆｌ／ｆｌ}同腹子に永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を行い、７日後に調査した。Ａ）ＦＶＩＩ^{ｆｌ／ｆｌ}ＣＸ３ＣＲ１^Ｃｒｅ及びＦＶＩＩ^{ｆｌ／ｆｌ}同腹子から得た高周波超音波心エコー検査結果を示す。マン・ホイットニー検定、ｎ＝５匹／群の動物。Ｂ）７日目にＦＶＩＩ^{ｆｌ／ｆｌ}ＣＸ３ＣＲ１^Ｃｒｅ及びＦＶＩＩ^{ｆｌ／ｆｌ}同腹子から得た梗塞心筋のフローサイトメトリー分析結果である。ＣＤ４５^＋白血球、ＣＤ４５^＋／ＣＤ９０．２^－／ＮＫ１．１^－／ＣＤ１１ｂ^＋骨髄単球細胞、及びＣＤ４５^＋／ＣＤ９０．２^－／ＮＫ１．１^－／ＣＤ１１ｂ^＋／Ｌｙ６Ｇ^－／Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ及びＣＤ４５^＋／ＣＤ９０．２^－／ＮＫ１．１^－／ＣＤ１１ｂ^＋／Ｌｙ６Ｇ^－／Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ炎症細胞の代表的なドットプロット及び定量化結果である。マン・ホイットニー検定、ｎ＝５匹／群の動物。

図１６：骨髄細胞におけるインテグリンβ１の欠損が、炎症細胞の浸潤を軽減させ、虚血性心不全の発症における心臓線維化促進タンパク質の発現を遮断する。
インテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}ＬｙｓＭ^Ｃｒｅ及びインテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}同腹子に永久ＬＡＤ結紮及び疑似手術を行い、７日後に調査した。Ａ）インテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}ＬｙｓＭ^Ｃｒｅ及びインテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}同腹子から得た高周波超音波心エコー検査画像である。マン・ホイットニー検定、ｎ＝５匹／群の動物。Ｂ）インテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}ＬｙｓＭ^Ｃｒｅ及びインテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}同腹子から得た梗塞心筋層における活性化ＴＧＦ－β１（ＧＡＰＤＨに対して正規化）及びｐ－ＳＭＡＤ２（総ＳＭＡＤ２に対して正規化）のウエスタンブロット分析結果である。代表的なブロット及び生物学的複製の定量化を示す。マン・ホイットニー検定、ｎ＝５匹／群の動物。Ｃ）７日目のインテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}ＬｙｓＭ^Ｃｒｅ及びインテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}同腹子から得た梗塞心筋のフローサイトメトリー分析結果である。ＣＤ４５^＋白血球、ＣＤ４５^＋／ＣＤ９０．２^－／ＮＫ１．１^－／ＣＤ１１ｂ^＋骨髄単球細胞、ならびにＣＤ４５^＋／ＣＤ９０．２^－／ＮＫ１．１^－／ＣＤ１１ｂ^＋／Ｌｙ６Ｇ^－／Ｌｙ６Ｃ^ｈｉ及びＣＤ４５^＋／ＣＤ９０．２^－／ＮＫ１．１^－／ＣＤ１１ｂ^＋／Ｌｙ６Ｇ^－／Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ炎症細胞の代表的なドットプロット及び定量化結果である。マン・ホイットニー検定、ｎ＝５匹／群の動物。Ｄ）７日目のインテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}ＬｙｓＭ^Ｃｒｅ及びインテグリンβ１^{ｆｌ／ｆｌ}同腹子から得た脾細胞のフローサイトメトリー分析結果である。ＣＤ４５^＋／ＣＤ９０．２^－／ＮＫ１．１^－／ＣＤ１１ｂ^＋／Ｌｙ６Ｇ^－／Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ炎症細胞の代表的なドットプロット及び定量化結果である。マン・ホイットニー検定、ｎ＝５匹／群の動物。

材料及び方法
臨床試験：１２名の患者がＭＩＣＡＴ（Ｍａｉｎｚ Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ Ｄａｔａｂａｓｅ，ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２１８０１７８）研究に登録された。試験プロトコールは、ｌｏｃａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｔｅ ｏｆ Ｒｈｉｎｅｌａｎｄ－Ｐａｌａｔｉｎａｔｅ，Ｇｅｒｍａｎｙによって承認を受けた。亜急性ＭＩ患者は、次のように定義される：ＭＩの第４の普遍な定義（Ｆｏｕｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｌ）による、心筋損傷と一致する循環心臓トロポニンＩの上昇（４９）；経皮的冠動脈介入の２４時間より前から２９日前までの急性冠症候群の症状；心電図における亜急性ＭＩの兆候。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。病歴が記録され、体重、身長、心拍数を測定した。右腕の肘部静脈から採取した最大３０ｍｌの静脈血を単球の単離に使用した。全血からの末梢血細胞を、ＨｉｓｔｏｐａｑｕｅＲ（ＣＡＴ＃１１１９１，１０７７，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）勾配細胞分離によって単離した。患者から採取した末梢血を、１：１の比率のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅＲ－１１１９及びＨｉｓｔｏｐａｑｕｅＲ－１０７７に加えた。室温で７００ｘｇで３０分間遠心分離後、さらに血小板を除去するために、収集した単核球層をＰＢＳで洗浄した。単球は、Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ（ヒト：ＣＡＴ＃１３０－１１７－３３７，ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者の指示に従って、ネガティブ選択によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。濃縮された単球を、さらにウエスタンブロット分析を行うために適切なＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。タンパク質発現分析に加えて、さらに共焦点イメージングを行うために細胞をカバースリップ上にプレーティングし、固定した。

ヒトの心臓サンプル：虚血心臓サンプルは、心臓移植後の外植心臓の左心室壁から、または左心室補助装置の移植中に得られた心臓組織から得た。ドナー心臓は、移植に心臓が使用されなかった臓器ドナーから得た。すべての対象は、ｔｈｅ Ｈｅｒｚ－ｕｎｄ Ｄｉａｂｅｔｅｓｚｅｎｔｒｕｍ ＮＲＷ（ＨＤＺ－ＮＲＷ），Ｅｒｉｃｈ＆Ｈａｎｎａ Ｋｌｅｓｓｍａｎｎ－ｌｎｓｔｉｔｕｔｅによる倫理的承認を得て、組織提供及び分析について書面によるインフォームドコンセントを提供した。取得した心臓サンプルを少なくとも３つの片に分割して、液体窒素中で急速冷凍し、ＨＤＺ－ＮＲＷによって－８０℃で保存した。サンプルを受領したら、ウエスタンブロット法、ＲＮＡ定量化、及び凍結切片によるタンパク質の分析にサンプルを使用した。得られたサンプルをＯ．Ｃ．Ｔ．に埋め込み、心筋組織の横断面を得た。

ヒトの心臓のプロテオミクスプロファイリング。５名の健康なドナー及び５名の虚血性心不全（ＩＨＦ）患者からの心臓組織生検サンプルを、全プロテオーム及びリンプロテオーム分析のために調製した。組織を緩衝液（７Ｍ尿素／２Ｍチオ尿素／１％ホスファターゼ阻害剤カクテル３（Ｓｉｇｍａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）／１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）中Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒデバイス（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ，Ｌｉｅｇｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））の高出力により、４℃で１５分間（３０秒のオン／オフサイクル）の超音波処理によって溶解させた。遠心分離（１５分／４℃／１３，０００ｒｐｍ）後、Ｐｉｅｒｃｅ ６６０ ３３５ｎｍタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ，ＵＳＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、タンパク質濃度を測定した。全プロテオーム分析では、フィルター支援サンプル調製（ＦＡＳＰ）用に２０μｇのタンパク質量を等分し、溶液内消化及びその後のリンペプチド濃縮のために７００μｇのタンパク質を等分した。タンパク質の２０μｇアリコートを、３０ｋＤａ ＭＷＣＯを含むＮａｎｏｓｅｐ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）スピンフィルターカラム（Ｐａｌｌ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＮＹ，ＵＳＡ）上に移し、以前に公開されたプロトコールに従って８Ｍ尿素で洗浄した（５０、５１）。ＤＴＴ及びＩＡＡを還元及びアルキル化に使用し、過剰のＩＡＡをＤＴＴでクエンチし、膜を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＭＢＩＣ）で洗浄した。タンパク質を、１：５０（ｗ／ｗ）の酵素対タンパク質比を使用して、トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｇｏｌｄ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ Ｗｌ，ＵＳＡ）を用いて３７℃で一晩消化した。消化後、遠心分離によりペプチドを溶出し、５０ｍＭ ＡＭＢＩＣで２回洗浄した。プールしたフロースルーをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で最終濃度１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡまで酸性化し、凍結乾燥した。精製されたペプチドは、ＬＣ－ＭＳ分析のために０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（ＦＡ）で再構成した。ＦＡＳＰ調製物からの２００ｎｇのトリプシンペプチドを、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ，ＵＳＡ）で逆相Ｃ１８カラム（ＨＳＳ－Ｔ３Ｃ１８ １．８μｍ、７５μｍｘ２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により３００ｎＬ／分で、５％溶離液Ａ（０．１％ＴＦＡ、３％ＤＭＳＯ、水）から４０％溶離液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、３％ＤＭＳＯ／ＡＣＮ）までの９０分間の直線勾配を使用して、５５℃で分離した（５２）。溶出ペプチドは、以前に記載されている［２，４］、ＳｙｎａｐｔＧ２－ＳＨＤＭＳ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）モードのイオンモビリティ分離（ＩＭＳ）ｅｎｈａｎｃｅｄデータ非依存取得（ＤＩＡ）ＵＤＭＳＥモードによるポジティブモードＥＳＩ－ＭＳで分析した。得られたＭＳデータは、［Ｇｌｕ１］－フィブリノペプチドＢを使用して取得後にロック質量補正され、ＮａｎｏＬｏｃｋＳｐｒａｙソースの基準噴霧器を介して、２５０ｆｍｏｌ／μＬの濃度で３０秒ごとに質量分析計にサンプリングさせた。

ＬＣ－ＭＳ ＤＩＡ生データ処理は、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ ＳＥＲＶＥＲ（ＰＬＧＳ）（バージョン３．０２ビルド５、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。一般的な夾雑物を含むＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔから得たヒト参照プロテオーム（登録：２０，３６５）は、固定修飾としてのカルバミドメチル化及び可変修飾としてのメチオニンの酸化という２つの切断の欠落が可能であったペプチドの同定に使用された。ペプチド及びタンパク質の同定に関する誤発見率（ＦＤＲ）は、リバースデコイデータベースを検索して評価し、ＰＬＧＳでのデータベース検索のしきい値１％に設定した。ラベルフリー定量分析は、前述のようにＩＳＯＱｕａｎｔを使用して実施した（５３）。Ｄｉｓｔｌｅｒ Ｕ，ｅｔ ａｌ．Ｄｒｉｆｔ ｔｉｍｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｉｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｄｅｅｐ－ｃｏｖｅｒａｇｅ ｄａｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４；１１：１６７－３６４ １７０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２７６７（５４）。

リンペプチド分析：最初に溶解緩衝液を５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で１：４．４４に希釈することによって、７００μｇのタンパク質アリコートを溶液中で消化した。３２℃で１０ｍＭ ＤＴＴと１時間インキュベートして還元し、室温、暗所で２５ｍＭ ＩＡＡを４５分間インキュベートしてアルキル化した後、酵素対タンパク質比１：２５（ｗ／ｗ）を使用して、３６７タンパク質をトリプシン（ＴＰＣＫ処理、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で一晩、３２℃で消化させた。０．５％ＴＦＡの添加により酸性化した後、サンプルを５００ｍｇＳｅｐ－ＰａｋｔＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で脱塩し、凍結乾燥した。リンペプチドの濃縮は、あらかじめロードされたＴｉＯ２スピンチップ（３ｍｇ ＴｉＯ２／２００μＬ ｔｉｐｓ，ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。２０μＬの洗浄緩衝液（８０％ＣＡＮ、０．４％ＴＦＡ）の遠心分離（３０００ｘｇ／２分／室温（ＲＴ））、続いて同じ設定で２０μＬのローディング緩衝液の遠心分離によってチップを調整した。ペプチドを１５０μＬのローディング緩衝液（５７％ＡＣＮ、０．３％ＴＦＡ、４０％乳酸）に再懸濁させ、スピンチップ上にロードし、遠心分離した（１０００ｘｇ／１０分／ＲＴ）。フロースルーを再度滴下し、同じ設定で遠心分離した。結合したリンペプチドを２０μＬのローディング緩衝液で洗浄し、遠心分離し（３０００ｘｇ、２分間、ＲＴ）、その後２０μＬの洗浄緩衝液で３回遠心分離した。精製したリンペプチドを、最初の５０μＬの１．５％ＮＨ３及び次の５０μＬの５％ピロリジンの遠心分離（１０００ｘｇ／１０分間、ＲＴ）によって１つの回収管に溶出した。１００μＬの２．５％ＴＦＡを加えて酸性化後、製造業業者のプロトコールに従って、Ｐｉｅｒｃｅグラファイトスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してリンペプチドを脱塩した。溶出及び凍結乾燥後、ＬＣ－ＭＳ分析用にリンペプチドを２０μＬの０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸（ＦＡ）で再構成した。２μＬの再構成リンペプチドをＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ｎａｎｏＵＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、逆相Ｃ１８カラム（ＨＳＳ－Ｔ３Ｃ１８ １．８μｍ、７５μｍｘ２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により、３００ｎＬ／分、５５℃で、５％溶離液Ａ（０．１％ＴＦＡ、３％ＤＭＳＯ、水）から３５％溶離液Ｂ（０．１％ＴＦＡ、３％ＤＭＳＯ／ＡＣＮ）の９０分間の直線勾配を使用して、分離し、その後、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘエレクトロスプレーイオン化源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してイオン化した。

すべてのサンプルを３回繰り返して測定した。溶出ペプチドの質量対電荷分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｘｐｌｏｒｉｓ ４８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をデータ依存取得（ＤＤＡ）モードで使用して実施した。フルスキャンＭＳ１スペクトルは、３００％の自動ゲイン制御（ＡＧＣ）ターゲットを使用して、２００ｍ／ｚで６０，０００の質量分解能で、３５０～１６００ｍ／ｚの範囲で収集し、最大注入時間を「自動」に設定し、ＲＦレンズは４０％に設定した。シグナルしきい値２ｘ１０４を超え、２～６の電荷を有する上位２０の最も強いピークが、正規化衝突エネルギー３０の高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を使用して、断片化の前駆体として、１．４Ｄａの分離ウィンドウ内で選択した。結果として得られたフラグメントイオンｍ／ｚ比は、２００ｍ／ｚで１５，０００の質量分解能で自動的に選択されたｍ／ｚ範囲のＭＳ２スペクトルとして測定された。ＡＧＣターゲットは「標準」に設定し、最大注入時間は「自動」に設定した。質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子ＰＸＤ０２４７２７と共にＰＲＩＤＥ［６］パートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｘｃｈａｎｇｅコンソーシアムに寄託されている。ディスカバリホスホプロテオミクス分析のための生データ処理は、処理ワークフローでＳｅｑｕｅｓｔ ＨＴ Ｓｅａｒｃｈ Ｅｎｇｉｎｅを使用してＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ Ｖ２．４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。ヒト参照プロテオームのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリ（エントリ：２０，３６５）をペプチド及びタンパク質同定のためのデータベース４００として使用し、最大許容切断ミスは２つ、最大前駆体及びフラグメントイオン質量許容差は、それぞれ１０ｐｐｍ及び０．０２Ｄａであった。システインのカルバミドメチル化（＋５７．０２１Ｄａ）のみを固定修飾として設定した。メチオニンの酸化（＋１５．９９５Ｄａ）及びセリン、スレオニン、チロシンのリン酸化（＋７９．９６６Ｄａ）を動的修飾として設定し、ペプチドごとに最大４つの動的修飾を許可した。さらに、可変修飾としてタンパク質のＮ末端アセチル化が可能になった。検索結果の検証は、連結されたターゲット／デコイアプローチを適用し、１％の誤検出率（ＦＤＲ）でフィルタリングすることにより、パーコレーターアルゴリズムを使用して実施した。リン酸化部位の局在確率は、ＰｈｏｓｐｈｏＲＳモードを有効にしたＩＭＰ－ｐｔｍＲＳを使用して決定した。特徴は、Ｍｉｎｏｒａ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒで検出した。コンセンサスワークフローでは、ラベルフリー定量化（ＬＦＱ）を、上位３つの強力なユニークなペプチドとレイザーペプチドを使用して、フィーチャーマッピング及びその後に前駆体イオン定量化によって実施した。統合推定キナーゼ活性（ＩｎＫＡ）分析の生データ処理は、「Ｍａｔｃｈ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｒｕｎｓ」を有効にしたＬＦＱを含むＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒと同じ検索エンジン設定を使用して、ＭａｘＱｕａｎｔＶ１．６．１４．０（５５）で実施した。その後、結果はＩｎＫＡ分析に提出した（５５）。得られたタンパク質及びリン酸化部位の定量情報は、パッケージｔｉｄｙｖｅｒｓｅ、ｐｈｅａｔｍａｐ、及びｉｍｐｕｔｅＬＣＭＤなど、Ｒを使用して分析した。急性心筋梗塞（ＡＭＩ）群及び対照群の倍率変化（ＦＣ）は、強度中央値を使用して計算した。等しい分散を仮定する両側ｔ検定は、少なくとも６０％の有効な強度値で確実に同定できるすべてのサンプルに対して実施した。ＡＭＩ条件で確実に出現したかまたは消失したすべてのサンプル（すなわち、一方の条件では少なくとも６０％の強度が識別され、もう一方の条件ではＮＡのみ）にＦＣ１００及び０．０１、及びｐ値０．００１を割り当てた。結果として得られたｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＦＤＲ）法を使用した複数の検定用に修正した。

次いで、得られたタンパク質及びリン酸化部位を、ＦＣ０．５未満～２超及び調整されたｐ値＜０．０５についてフィルタリングした。倍率変化の降順でソートした後、タンパク質及びリンペプチドの存在量をｌｏｇ１０変換し、Ｚスコアで正規化し、ヒートマップとしてプロットした。タンパク質－タンパク質相互作用４２５（ＰＰＩ）ネットワークは、ｓｔｒｉｎｇＡＰＰ、ＮｅｔｗｏｒｋＡｎａｌｙｚｅｒプラグイン、及びＣｌｕｅＧＯアプリを含むＣｙｔｏｓｃａｐｅＶ３．７．２を使用して生成した（５６、５７－５９）。ＩｎＫＡスコアの変化は、ＦＣを計算し、プロテオーム及びリンプロテオームデータと同じ設定を適用して、ｔ検定を実施することによって特定した。ＦＣのｌｏｇ２及び調整されたｐ値の－ｌｏｇ１０が計算され、ボルケーノプロットに表示した。

動物：Ｃ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドのＴＦの細胞質尾部の２１アミノ酸を含まない９～１２週齢の雄マウス（ＴＦΔＣＴマウス）及びＣ５７ＢＬ／６ＮバックグラウンドのＰＡＲ２－／－マウスを、系統一致対照と共に使用した（３７）。ＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌマウスをＬｙｓＭＣｒｅマウスと交配して、骨髄細胞コンパートメント上でＰＡＲ２の条件付きノックアウトを生成した（ＰＡＲ２ｆｌ／ｆｌＬｙｓＭＣｒｅ＋マウス）１３。対照としてＣｒｅ陰性ＰＡＲ２ｆｌ／ｆ４３２Ｉ同腹子を使用した。ＴＦｆｌ／ｆｌＬｙｓＭＣｒｅ＋／－マウスの作製は、以前に記載されている５６。すべての動物は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＴＡＲＣ）ｏｆ ｔｈｅ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍａｉｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で飼育し、収容された。すべての動物実験は、「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ」に従って実施し、「Ｌａｎｄｅｓｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｓａｍｔ Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ－Ｐｆａｌｚ」及びｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｊｏｈａｎｎｅｓ Ｇｕｔｅｎｂｅｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍａｉｎｚ）によって承認された。

実験的心筋梗塞（ＭＩ）及びｉｎ ｖｉｖｏ治療のマウスモデル：ＭＩは、以前に記載されたとおり、近位左前下行枝（ＬＡＤ）の永久結紮によって誘導させた（６０）。マウスをメデトミジン（５００μｇ／ｋｇ体重）、フェンタニル（５０μｇ／ｋｇ体重）及びミダザオラム（５ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔した。麻酔を弱めるために、アチパメゾール（２．５ｍｇ／ｋｇ体重）及びフルマゼニル（０．５μｇ／ｋｇ体重）を注射した。疑似手術は、ＬＡＤ結紮を除いて同じ手順に従った。マウスには、手術当日から始めて、ブプレノルフィン（０．０７５ｍｇ／ｋｇ皮下注射）を１日２回、２日間投与した。総数４０匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを疑似群（ｎ＝１３）及びＬＡＤ結紮群（ｎ＝２７）に分けた（ＭＩ）。この試験では、ＨＦは、ＬＶＥＦの３５％未満の低下及び／または視覚的ＬＶ梗塞によって定義した。これらの基準を満たさない動物は試験から除外した。ＬＡＤ結紮動物をさらに無作為にビヒクル処置群（ＭＩ＋ビヒクル）及びＭＩ＋トラメチニブ／ＭＩ＋ＮＡＰＣ２群に分けた。トラメテニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）をＳｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入し、２００μｌのビヒクル（メトセル／ポリソルベート緩衝液）で再構成し、ＭＩ後の１日目から開始して７日目まで１日１回マウスに経口投与した（１ｍｇ／ｋｇ／日）。ＮＡＰＣ２治療では、マウスをＮａＣｌで再構成したＮＡＰｃ２の腹腔内注射（１ｍｇ／ｋｇ／日）により治療した。投与は、ＭＩの１日後から７日目の屠殺まで１日１回行った。

骨髄移植：生後８～１１週目のＴＦΔＣＴ、Ｃ５７Ｌｙ５．１、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに致死量９Ｇｙの放射線を照射した。簡潔に説明すると、ドナー骨髄（ＢＭ）を２％ＰＢＳ／ＦＣＳで採取し、７０μｍセルストレーナーで濾過した。ドナーマウスから収集したＢＭ細胞を新鮮な２％ＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、最終濃度４ｘ１０８細胞／ｍｌで再懸濁した。照射の２４時間後、約２００μｌを尾静脈を介してレシピエントマウスに注射した。キメラ動物を９～１０週間かけて回復させた後、ＬＡＤ結紮を行った。梗塞心筋におけるドナー対宿主組成物は、ＭＩの７日後の梗塞心筋におけるフローサイトメトリー分析によって決定した。

心エコー検査：経胸壁心エコー検査は、ＶＥＶＯ－３１００及びＶＥＶＯ－７７０（ＦＵＪＩＦＩＬＭ ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ） Ｈｉｇｈ－Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ＨＦＵＳ）を使用して実施した３８ＭＨｚ（ＭＺ４００）リニアアレイトランスデューサーを装備し、画像は常に２００フレームを超えるフレームレートで取得した。心電図（ＥＣＧ）及び呼吸数をモニターし、ハンドリングプラットフォーム内の加熱システムを使用して体温を３７℃に維持した。実験的４６４プロトコールに応じて、マウスは、左心室（ＬＶ）拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）拡張期及び収縮期の内径（ＬＶＩＤ，ｄ及びＬＶＩＤ，ｓ）、拡張期の後壁の厚さ（ＬＶＰＷ，ｄ）、及び拡張期の心室中隔の厚さ（ＩＶＳ，ｄ）を測定するために、縦断的分析によって検査し（ＭＩ後１日から４週間）、これらを、２ＤＢモード画像にリンクされているＭモード画像を使用して、胸骨傍長軸（ＰＬＡＸ）で分析した。取得後の分析は、ＶｅｖｏＬａｂソフトウェアを使用して実施した。ＬＶＩＤ，ｄ及びＬＶＩＤ，ｓを適用して、ＬＶ拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）及びＬＶ駆出率（ＬＶＥＦ）を計算した。

心臓から単離された免疫細胞のフローサイトメトリー分析：梗塞心筋層への免疫細胞の浸潤をフローサイトメトリーにより分析した。実験動物から採取した梗塞心筋を、コラゲナーゼＩＩ（１ｍｇ／ｍｌ）／ＤＮａｓｅＩ（５０μｇ／ｍｌ）を使用して、３７℃で３０分間酵素消化した。溶解物を７０μｍセルストレーナーに通し、２％ＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄した。細胞染色：洗浄後、４℃、３００ｘｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、ＦＣブロッキング溶液（抗ＣＤ１６／ＣＤ３２）を使用して非特異的抗体結合をブロックした。ブロッキング後、単一細胞懸濁液を以下のモノクローナル抗体で染色した：ＣＤ４５ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローン３０－Ｆ１１）、ＣＤ４５．１ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローンＡ２０）、ＣＤ４５．２ ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローン１０４）、Ｂ２２０ ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローンＲＡ３－６Ｂ２）、ＣＤ１１ｂ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローンＭ１／７０）またはＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローンＭ１／７０）、ＣＤ９０．２ ＳｕｐｅｒＢｒｉｇｈｔ ６４５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローン５３－２．１）、ＮＫ１．１ ＰＥ－Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローンＰＫ１３６）、Ｌｙ６Ｇ ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローン１Ａ８）、Ｌｙ６Ｃ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローンＨＫ１．４）、Ｆ４／８０ ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，クローンＢＭ８）、ＴＦ ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅｆｌｕｏｒ ５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。Ａｔｔｕｎｅ（登録商標）ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、最大１００万件のイベントを得た。

生細胞、例えば、ＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－／ＣＤ２２０－／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｇ＋好中球、ＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－／ＣＤ２２０－／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｇ－／Ｆ４／８０－／Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ炎症性単球、ＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－／ＣＤ２２０－／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｇ－／Ｆ４／８０－／Ｌｙ６Ｃｎｅｇ修復単球及びＣＤ４５＋／ＣＤ９０．２－／ＣＤ２２０－／ＮＫ１．１－／ＣＤ１１ｂ＋／Ｆ４／８０＋マクロファージは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ１０，ＢＤ，ＵＳＡ）によって分析した。末梢血細胞上でのＴＦの発現を評価するために、循環単核球を全血から単離し、ＭＩの７日目後に生きているＣＤ４５＋／ＴＦ＋白血球及びＣＤ４５＋／ＴＦ＋／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１５＋／Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ炎症単球についてさらに分析した。

ＤＨＥ－ＨＰＬＣ：実験動物から採取したマウス心筋組織を小片に切断し、５０μｍｏｌ／Ｌのジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、心臓を付着したＤＨＥ緩衝液から乾燥させ、ＰＢＳで洗浄した。心臓重量を測定し、ＤＨＥ酸化生成物の抽出のために、４００μｌのＰＢＳ／アセトニトリル（１：１）中でガラス／ガラスホモジナイザーを使用することによって均質化した。２０，０００ｘｒｐｍで１０分間の遠心分離によってサンプルから変性タンパク質を除去し、スーパーオキシド（Ｏ２・^－）特異的酸化生成物２－ヒドロキシエチジウムについて、上清を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）４９６によって分析した。このシステムは、制御ユニット、２つのポンプ、ミキサー、検出器、カラムオーブン、脱気装置、Ｊａｓｃｏ（Ｇｒｏｓ－Ｕｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のオートサンプラー（ＡＳ－２０５７ｐｌｕｓ）、及びＣ１８－Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ１００－３（１２５ｘ４）カラム（（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ（Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））から構成される。アセトニトリル／水（９０／１０（ｖ／ｖ）％）及び５０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ２を移動相として使用し、以下の割合の有機溶媒を用いる高圧勾配を使用した：０分、４１％；７分、４５％；８～９分、１００％；１０分、４１％。流量は、１ｍｌ／分であり、ＤＨＥは、３５５ｎｍでの吸収によって検出され、一方、２－ヒドロキシエチジウム及びエチジウムは、蛍光（例えば、４８０ｎｍ／Ｅｍ．５８０ｎｍ）によって検出した。

単球の分離及びｉｎ ｖｉｔｒｏ培養：骨髄由来細胞懸濁液は、８～１２週齢のマウスの大腿骨及び脛骨を洗い流すことによって単離した。細胞凝集体を穏やかなピペッティングによって除去し、細胞溶解物を７０μｍのナイロンストレーナーに通して細胞破片を除去した。さらに、単球集団を濃縮するために、製造業者によって提供された標準プロトコールに従って、マウス単球単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を使用した。Ｉｎ ｖｉｖｏの虚血状態を模倣するために、酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）プロトコールを２０ｎｇ／ｍｌの濃度のサイトカインカクテルミックス（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、及びＭＣＰ－１）と共に４時間適用し、その後単離された単球上のｐＥＲＫ１／２、ＮＯＸ２及びＴＧＦ－β１のタンパク質の発現を分析した。ＥＲＫ１／２阻害の実験では、初代マウス単球をトラメチニブ（１０μＭ）で１時間簡単に前処理し、その後サイトカインカクテルミックスと共にＯＧＤで処理した。ヒト単球上のＴＦ－ＦＶＩｌａシグナル伝達をブロックするために、健康なヒトから単離した単球をサイトカインカクテルミックスと共にＯＧＤの存在下でＮＡＰｃ２により処置し、その後ｐＥＲＫ１／２、ＮＯＸ２、及びＴＧＦ－β１のタンパク質の発現を分析した。

共焦点顕微鏡：心筋の凍結切片（厚さ５～８μｍ）を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、０．１～０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で１０分間透過処理した。５％ＢＳＡでブロッキングした後、マウス心筋を、細胞質ＴＦ２７の保存されたＰｒｏ残基に隣接するリン酸化Ｓｅｒ残基及びＴｈｒ残基を含む合成ペプチドに対して生じたウサギポリクローナル抗体、及び抗ＣＤ４５（ａｂ１０５５８、Ａｂｃａｍ）で共染色した。ｐＥＲＫ１／２＋細胞を決定するために、抗ＣＤ３１（ＳＣ－１８９１６，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、抗ＣＤ４５（３０－Ｆ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗αＳＭＡ（Ａ２５４７，Ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ）、及び抗心筋トロポニンＴ（ａｂ９２５４６，Ａｂｃａｍ）について共染色した抗ｐＥＲＫ１／２（＃４３７０Ｓ，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（１４－９１０９－８２，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用した。さらに、抗ＮＯＸ２（６１１４１４，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、抗ＣＤ６８（ａｂ９５５、Ａｂｃａｍ）及びＴＧＦ－β１（ＮＢＰ２－２２１１４、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を使用して、ＮＯＸ２及びＴＧＦ－β１の局在をモニターした。ヒト末梢血から単離された単球については、１％ＢＳＡで抗体の非特異的結合をブロックした後、一次抗体をリン酸化特異的マウス抗ヒトＴＦ抗体（４Ｇ６）２７及びマウス抗ヒトＴＦ抗体（１０Ｈ１０）とインキュベートした。５２８一晩インキュベートした後、５２９切片を二次抗体ロバ抗ウサギＩｇＧ（ａｂ１５００７６、Ａｂｃａｍ）、ヤギ抗ラットＩｇＧ（ａｂ１５０１６０、Ａｂｃａｍ）、及びヤギ抗マウスＩｇＧ（ａｂ１５０１１６、Ａｂｃａｍ）で１時間対比染色し、共焦点レーザースキャン用の退色防止封入剤（Ｐ３６９６２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にマウントした。少なくとも３つの個別の画像が得られ、ＦＩＪＩ／ｉｍａｇｅＪを使用して各サンプルの蛍光強度を定量化した。

ウエスタンブロッティング：単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、心筋、または単球のいずれかを溶解緩衝液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４～７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭグリセロールホスファターゼ、１％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＰＭＳＦ、及び０．１％プロテアーゼホスファターゼ阻害剤カクテル）中で、氷上で２０分間均質化させた。溶解物を、４℃、１１，０００ｘｇで１５分間遠心分離することによって清澄化した。Ｌｏｗｒｙ Ａｓｓａｙ（ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ，Ｂｉｏｒａｄ）を使用して総タンパク質濃度を推定し、すべてのサンプルの等しいタンパク質量を６ｘＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中で混合し、９９℃で１０分間加熱し、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル（４～１５％）で分子量に応じて分離し、それぞれの一次抗体ｐＥＲＫ１／２（＃４３７０Ｓ，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＥＲＫ１／２（＃４６９５，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐＰ３８（＃４５１１Ｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ３８（＃９２１９，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＴＧＦ－β１（ＮＢＰ２－２２１１４，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ｐＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ２（＃１２７４７Ｔ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ６７ｐｈｏｘ（６１０９１２ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＮＯＸ２（６１１４１４，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗α平滑筋アクチン（ａｂ７８１７，ａｂｃａｍＲ）でプローブした。ＭＩＣＡＴ試験に登録された患者及びヒト心筋生検から単離された単球には、リン酸特異的マウス抗ヒトＴＦ抗体（４Ｇ６）及びマウス抗ヒトＴＦ抗体（１０Ｈ１０）が使用された。一次抗体と一晩インキュベートした後、ＰＶＤＦメンブレンを二次抗体（ヤギ抗ウサギＨＲＰ（＃７０７４、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗マウスＨＲＰ（＃７０７６、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））と２時間インキュベートし、ＦｕｓｉｏｎＦＸ（ＰＥＱＬＡＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＣＬのウエスタンブロッティングＥＣＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）化学発光試薬を使用して現像した。適切なソフトウェアを使用して、相対濃度測定を実施し、その比率を統計分析に使用した。

定量的ＲＴ－ＰＣＲ：ＬＡＤ結紮マウスの梗塞部分または疑似手術マウスの非梗塞心筋からの粉砕させた心臓サンプル由来のＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネートフェノールクロロホルム抽出によって抽出した。ケモカイン及びサイトカインの相対的なｍＲＮＡ発現分析は、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって実施した。０．０５μｇの全ＲＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）ＰｒｏｂｅＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｑＲＴ－ＰＣＲ検査に使用した。ｃＤＮＡ合成には、簡単に１μｇのＲＮＡを使用した。各ウェルのｑＰＣＲ緩衝液は、１０μｌ２ｘマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、５μｌ ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、プロテアーゼフリー精製水、調査対象の遺伝子の１μｌプライマー、及び５μｌのｃＤＮＡサンプルから構成されていた。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ｔｂｐ；Ｍｍ００４４６９７３＿ｍ１）、Ｃｃｒ２（Ｍｍ００４３８２７０＿ｍ１）、Ｉｌ６（Ｍｍ００４４６１９０＿ｍ１）、Ｃｃｌ２（Ｍｍ００４４１２４２＿ｍ１）、Ｔｎｆ（Ｍｍ００４４３２６０＿ｇ１）のＴａｑＭａｎＲ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。相対的なｍＲＮＡ発現レベルの定量化は、ΔΔＣｔ法に従って実施し、参照遺伝子（ＴＢＰ）に対して正規化させた。

ヒト心臓サンプルの場合、ＩＬ－６、ＣＣＲ２、及びＣＣＬ２特異的プライマーを使用した。データの正規化にはＧＡＰＤＨを使用した。

統計分析：統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア、バージョン８（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ．，ＵＳＡ）を使用して実施した。結果は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表示する。最初に、Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ及びＫｏｌｍｏｇｏｒｏｗ－Ｓｍｉｒｎｏｗ正規性検定を使用して、データが正規化されているかを判断した。正規分布の場合、２つの実験群の比較にｔ検定を使用し、通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）後にＳｉｄａｋの多重比較検定を３つ以上の実験群で実施した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を使用した二元配置分散分析は、３つ以上の検定群と２つ以上の測定時間に使用した。正規分布が存在しない場合、２つの試験群をマン・ホイットニー検定によって評価した。３つ以上の実験群については、クラスカル－ウォリス検定を実施、その後多重比較のためにＤｕｎｎ検定を実施した。アスタリスクは、次のとおり使用した：^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。
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１９．Ｆｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ ＮＧ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＴＧＦ）－β ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｆａｒｃｔｅｄ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ．Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｄｉｓ．２０１７；９：Ｓ５２－ｓ６３．
２０．Ｇｕｒ－Ｃｏｈｅｎ Ｓ， Ｉｔｋｉｎ Ｔ， Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ Ｓ， Ｇｒａｆ Ｃ， Ｋｏｌｌｅｔ Ｏ， Ｌｕｄｉｎ Ａ， Ｇｏｌａｎ Ｋ， Ｋａｌｉｎｋｏｖｉｃｈ Ａ， Ｌｅｄｅｒｇｏｒ Ｇ， Ｗｏｎｇ Ｅ， Ｎｉｅｍｅｙｅｒ Ｅ， Ｐｏｒａｔ Ｚ， Ｅｒｅｚ Ａ， Ｓａｇｉ Ｉ， Ｅｓｍｏｎ ＣＴ，
Ｒｕｆ Ｗ ａｎｄ Ｌａｐｉｄｏｔ Ｔ． ＰＡＲ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＥＰＣＲ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１５；２１ ：１３０７－１７．
２１．Ｇｒａｆ Ｃ， Ｗｉｌｇｅｎｂｕｓ Ｐ， Ｐａｇｅｌ Ｓ， Ｐｏｔｔ Ｊ， Ｍａｒｉｎｉ Ｆ， Ｒｅｙｄａ Ｓ， Ｋｉｔａｎｏ Ｍ， Ｍａｃｈｅｒ－Ｇｏｐｐｉｎｇｅｒ Ｓ， Ｗｅｉｌｅｒ Ｈ ａｎｄ Ｒｕｆ Ｗ． Ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｘ ｄａｍｐｅｎｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；４．
２２．Ｆｒｉｅｂｅｌ Ｊ， Ｗｅｉｔｈａｕｓｅｒ Ａ， Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ Ｍ， Ｒａｕｃｈ ＢＨ， Ｓａｖｖａｔｉｓ Ｋ， Ｄｏｒｎｅｒ Ａ， Ｔａｂａｒａｉｅ Ｔ， Ｋａｓｎｅｒ Ｍ， Ｍｏｏｓ Ｖ， Ｂｏｓｅｌ Ｄ， Ｇｏｔｔｈａｒｄｔ Ｍ， Ｒａｄｋｅ ＭＨ， Ｗｅｇｎｅｒ Ｍ， Ｂｏｂｂｅｒｔ Ｐ， Ｌａｓｓｎｅｒ Ｄ， Ｔｓｃｈｏｐｅ Ｃ， Ｓｃｈｕｔｈｅｉｓｓ Ｈ－Ｐ， Ｆｅｌｉｘ ＳＢ， Ｌａｎｄｍｅｓｓｅｒ Ｕ ａｎｄ Ｒａｕｃｈ Ｕ． Ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈｅａｒｔ Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１９；４０：３３１８－３３３２．
２３．Ｋｏｌｐａｋｏｖ ＭＡ， Ｒａｆｉｑ Ｋ， Ｇｕｏ Ｘ， Ｈｏｏｓｈｄａｒａｎ Ｂ， Ｗａｎｇ Ｔ， Ｖｌａｓｅｎｋｏ Ｌ， Ｂａｓｈｋｉｒｏｖａ ６３３
ＹＶ， Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｃｈｅｎ Ｘ， Ｉｆｔｉｋｈａｒ Ｓ， Ｌｉｂｏｎａｔｉ ＪＲ， Ｋｕｎａｐｕｌｉ ＳＰ ａｎｄ Ｓａｂｒｉ Ａ． Ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆｆｅｒｓ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ａｃｕｔｅ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１６ ；９０ ：２１ －９．
２４．Ｋｏｉｖｕｌａ Ｋ， Ｎｉｋｕｓ Ｋ， Ｖｉｉｋｉｌａ Ｊ， Ｌｉｌｌｅｂｅｒｇ Ｊ， Ｈｕｈｔａｌａ Ｈ， Ｂｉｒｎｂａｕｍ Ｙ ａｎｄ Ｅｓｋｏｌａ Ｍ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｑ ｗａｖｅｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔ ｗａｖｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ＥＣＧ ｏｆ ＳＴＥＭＩ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｎｎ Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｌ．２０１９；２４：ｅ１２５８５．
２５．Ｃｅｒｒａｔｏ Ｅ， Ｆｏｒｎｏ Ｄ， Ｆｅｒｒｏ Ｓ ａｎｄ Ｃｈｉｎａｇｌｉａ Ａ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｉｎ－ｈｏｓｐｉｔａｌ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｌａｔｅ ａｃｕｔｅ ＳＴ－ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｅｎｔｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７；１８：５６７－５７１．
２６．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＬＣ， Ｓｐｒｅｃｈｅｒ ＣＡ， Ｆｏｓｔｅｒ ＤＣ， Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｈ， Ｈａｍａｍｏｔｏ Ｔ， Ｋｉｓｉｅｌ Ｗ． Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ Ｋｕｎｉｔｚ－ｔｙｐｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６；３５：２６６－７２．
２７．Ｌｅｅ Ａ， Ａｇｎｅｌｌｉ Ｇ， Ｂｕｌｌｅｒ Ｈ， ｅｔ ａｌ．Ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆａｃｔｏｒ Ｖｌｌａ／ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃ２ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｔ－ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｔｏｔａｌ ｋｎｅｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０００；１０４：７４－７８．
２８．Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ Ｍ， Ｐｉｔｔｅｔ ＭＪ ａｎｄ Ｓｗｉｒｓｋｉ ＦＫ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ： ｐｒｏｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ｉｎｆａｒｃｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１０；１２１ ：２４３７－４５．
２９．Ｘｕ Ｘ， Ｚｈｅｎｇ Ｌ， Ｙｕａｎ Ｑ， Ｚｈｅｎ Ｇ， Ｃｒａｎｅ ＪＬ， Ｚｈｏｕ Ｘ ａｎｄ Ｃａｏ Ｘ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｂｏｎｅ Ｒｅｓ．２０１８；６：２．
３０．Ｂｕｊａｋ Ｍ ａｎｄ Ｆｒａｎｇｏｇｉａｎｎｉｓ ＮＧ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＴＧＦ－ｂｅｔａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ６８１ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７；７４：１８４－１９５．
３１ ．Ｂｒｏｐｈｙ ＴＭ， Ｃｏｌｌｅｒ ＢＳ ａｎｄ Ａｈａｍｅｄ Ｊ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｏｌ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ， ｍａｓｔｏｐａｒａｎ， ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｓｈｅａｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ βｉ （ＴＧＦ－β１） ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１３；２８８：１０６２８－３９．
３２．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｃ， ｖｏｎ Ｂｒｕｈｌ ＭＬ， Ｍａｎｕｋｙａｎ Ｄ， Ｇｒａｈｌ Ｌ， Ｌｏｒｅｎｚ Ｍ， Ａｌｔｍａｎｎ Ｂ， Ｄｌｕｇａｉ Ｓ， Ｈｅｓｓ Ｓ， Ｋｏｎｒａｄ Ｉ， Ｏｒｓｃｈｉｅｄｔ Ｌ， Ｍａｃｋｍａｎ Ｎ， Ｒｕｄｄｏｃｋ Ｌ， Ｍａｓｓｂｅｒｇ Ｓ ａｎｄ Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ Ｂ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｓ ａｓ ａｎ ｉｎｊｕｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｉｇｎａｌ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｆｉｂｒｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｖｉａ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００８ ；１１８：１１１０－２２．
３３．Ａｈａｍｅｄ Ｊ， Ｖｅｒｓｔｅｅｇ ＨＨ， Ｋｅｒｖｅｒ Ｍ， Ｃｈｅｎ ＶＭ， Ｍｕｅｌｌｅｒ ＢＭ， Ｈｏｇｇ ＰＪ ａｎｄ Ｒｕｆ Ｗ． Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｗｉｔｃｈｅｓ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６；１０３：１３９３２－７．
３４．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ Ｓ， Ｊｕｒｋ Ｋ， Ｈｏｂｏｈｍ Ｌ， Ｊａｃｋｅｌ Ｓ， Ｓａｆｆａｒｚａｄｅｈ Ｍ， Ｓｃｈｗｉｅｒｃｚｅｋ Ｋ， Ｗｅｎｚｅｌ Ｐ， Ｌａｎｇｅｒ Ｆ， Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｃ ａｎｄ Ｒｕｆ Ｗ． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｏ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｕｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７；１２９：２２９１－２３０２．
３５．Ｌａｎｇｅｒ Ｆ， Ｓｐａｔｈ Ｂ， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｃ， Ｓｔｏｌｚ Ｍ， Ａｙｕｋ ＦＡ， Ｋｒｏｇｅｒ Ｎ， Ｂｏｋｅｍｅｙｅｒ Ｃ ａｎｄ Ｒｕｆ Ｗ． Ｒａｐｉｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ａｎｔｉｔｈｙｍｏｃｙｔｅ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１ ：２３２４－３５．
３６．Ｖｅｒｓｔｅｅｇ ＨＨ， Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ Ｆ， Ｋｅｒｖｅｒ Ｍ， Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ＨＨ， Ａｈａｍｅｄ Ｊ， Ｆｅｌｄｉｎｇ－Ｈａｂｅｒｍａｎｎ Ｂ， Ｔａｋａｄａ Ｙ， Ｍｕｅｌｌｅｒ ＢＭ ａｎｄ Ｒｕｆ Ｗ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｂｌｏｏｄ．２００８；１１１ ：１９０－９．
３７．Ｍｕｌｌｅｒ－Ｃａｌｌｅｊａ Ｎ， Ｈｏｌｌｅｒｂａｃｈ Ａ， Ｒｉｔｔｅｒ Ｓ， Ｐｅｄｒｏｓａ ＤＧ， Ｓｔｒａｎｄ Ｄ， Ｇｒａｆ Ｃ， Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｃ， Ｓｔｒａｎｄ Ｓ， Ｐｏｎｃｅｌｅｔ Ｐ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＪＨ， Ｌａｃｋｎｅｒ ＫＪ ａｎｄ Ｒｕｆ Ｗ． Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｒｉｍｅｓ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１９；１３４：１１１９－１１３１．
３８．Ｇｒｉｅｖｅ ＤＪ， Ｂｙｒｎｅ ＪＡ， Ｃａｖｅ ＡＣ ａｎｄ Ｓｈａｈ ＡＭ．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｈｅａｒｔ， Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４；１３：１３２－１３８．
３９．Ｃｅｒｒａｔｏ Ｅ， Ｆｏｒｎｏ Ｄ， Ｆｅｒｒｏ Ｓ ａｎｄ Ｃｈｉｎａｇｌｉａ Ａ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｉｎ－ｈｏｓｐｉｔａｌ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ ７０５ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｌａｔｅ ａｃｕｔｅ ＳＴ－ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｅｎｔｅｒｓ．Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ （Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ）．７０６ ２０１７；１８：５６７－５７１．
４０．Ｆｒｅｕｎｄ Ａ， Ｓｃｈｏｃｋ Ｓ， Ｓｔｉｅｒｍａｉｅｒ Ｔ， ｄｅ Ｗａｈａ－Ｔｈｉｅｌｅ Ｓ， Ｅｉｔｅｌ Ｉ， Ｌｕｒｚ Ｐ， Ｔｈｉｅｌｅ Ｈ ａｎｄ Ｄｅｓｃｈ Ｓ． Ｔｈｒｏｍｂｕｓ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＳＴ－ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｌａｔｅ ａｆｔｅｒ ｓｙｍｐｔｏｍ ｏｎｓｅｔ： ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１９；１０８：１２０８－１２１４．
４１ ．Ｎｉｃｃｏｌｉ Ｇ， Ｂｕｒｚｏｔｔａ Ｆ， Ｇａｌｉｕｔｏ Ｌ ａｎｄ Ｃｒｅａ Ｆ． Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｎｏ－ｒｅｆｌｏｗ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００９；５４：２８１ －９２．
４２．Ｋｏｉｖｕｌａ Ｋ， Ｎｉｋｕｓ Ｋ， Ｖｉｉｋｉｌａ Ｊ， Ｌｉｌｌｅｂｅｒｇ Ｊ， Ｈｕｈｔａｌａ Ｈ， Ｂｉｒｎｂａｕｍ Ｙ ａｎｄ Ｅｓｋｏｌａ Ｍ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｑ ｗａｖｅｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔ ｗａｖｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ＥＣＧ ｏｆ ＳＴＥＭＩ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｎｎ Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｃａｒｄｉｏｌ．２０１９；２４：ｅ１２５８５．
４３．Ｏｔｔ Ｉ， Ｗｅｉｇａｎｄ Ｂ， Ｍｉｃｈｌ Ｒ， Ｓｅｉｔｚ Ｉ， Ｓａｂｂａｒｉ－Ｅｒｆａｎｉ Ｎ， Ｎｅｕｍａｎｎ Ｆ－Ｊ ａｎｄ Ｓｃｈｏｍｉｇ Ａ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧＴＰａｓｅ Ｒａｃ１ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｉｔｏｇｅｎ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ｐ３８．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００５；１１１ ：３４９－３５５．
４４．Ｒｏｔｈｍｅｉｅｒ ＡＳ， Ｌｉｕ Ｅ， Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ Ｓ， Ｄｉｓｓｅ Ｊ， Ｍｕｅｌｌｅｒ ＢＭ， Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｈ ａｎｄ Ｒｕｆ Ｗ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩｌａ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ＰＡＲ２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｂｌｏｏｄ．２０１８；１３１ ：６７４－６８５．
４５．Ｌｉｕ Ｒ－Ｍ ａｎｄ Ｄｅｓａｉ ＬＰ．Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－β ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ：Ａ ｐｅｒｖｅｒｓｅ ｃｙｃｌｅ ｆｏｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；６：５６５－５７７．
４６．Ｌｏｏｉ ＹＨ， Ｇｒｉｅｖｅ ＤＪ， Ｓｉｖａ Ａ， Ｗａｌｋｅｒ ＳＪ， Ａｎｉｌｋｕｍａｒ Ｎ， Ｃａｖｅ ＡＣ， Ｍａｒｂｅｒ Ｍ， Ｍｏｎａｇｈａｎ ＭＪ ａｎｄ Ｓｈａｈ ＡＭ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｏｘ２ ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ ａｄｖｅｒｓｅ ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２００８；５１ ：３１９－２５．
４７．Ｉｋｅｕｃｈｉ Ｍ， Ｔｓｕｔｓｕｉ Ｈ， Ｓｈｉｏｍｉ Ｔ， Ｍａｔｓｕｓａｋａ Ｈ， Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｓ， Ｗｅｎ Ｊ， Ｋｕｂｏｔａ Ｔ ａｎｄ Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ａ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＴＧＦ－β ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ ｅａｒｌｙ ｃａｒｄｉａｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｕｔ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｌａｔｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００４；６４：５２６－５３５．
４８．Ｒｙｄｅｎ Ｌ， Ｇｒａｂａｕ Ｄ， Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ Ｆ， Ｊｏｎｓｓｏｎ Ｐ－Ｅ， Ｒｕｆ Ｗ ａｎｄ Ｂｅｌｔｉｎｇ Ｍ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１２６：２３３０－２３４０．
４９．Ｔｈｙｇｅｓｅｎ Ｋ， Ａｌｐｅｒｔ ＪＳ， Ｊａｆｆｅ ＡＳ， Ｃｈａｉｔｍａｎ ＢＲ， Ｂａｘ ＪＪ， Ｍｏｒｒｏｗ ＤＡ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ ＨＤ．Ｆｏｕｒｔｈ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ （２０１８）．Ｅｕｒ ＨｅａｒｔＪ．２０１９；４０：２３７－２６９．
５０．Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ ＪＲ， Ｚｏｕｇｍａｎ Ａ， Ｎａｇａｒａｊ Ｎ ａｎｄ Ｍａｎｎ Ｍ． Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６：３５９－３６２．
５１．Ｄｉｓｔｌｅｒ Ｕ， Ｋｕｈａｒｅｖ Ｊ， Ｎａｖａｒｒｏ Ｐ ａｎｄ Ｔｅｎｚｅｒ Ｓ． Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｏｎ ｍｏｂｉｌｉｔｙ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄａｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６；１１ ：７９５－８１２．
５２．Ｈａｈｎｅ Ｈ， Ｐａｅｈｌ Ｆ， Ｒｕｐｒｅｃｈｔ Ｂ， Ｍａｉｅｒ ＳＫ， Ｋｌａｅｇｅｒ Ｓ， Ｈｅｌｍ Ｄ， Ｍｅｄａｒｄ Ｇ， Ｗｉｌｍ Ｍ， Ｌｅｍｅｅｒ Ｓ ａｎｄ Ｋｕｓｔｅｒ Ｂ． ＤＭＳＯ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ， ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３；１０：９８９－９１．
５３．Ｄｉｓｔｌｅｒ Ｕ， Ｋｕｈａｒｅｖ Ｊ， Ｎａｖａｒｒｏ Ｐ， Ｌｅｖｉｎ Ｙ， Ｓｃｈｉｌｄ Ｈ ａｎｄ Ｔｅｎｚｅｒ Ｓ． Ｄｒｉｆｔ ｔｉｍｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ ｅｎｅｒｇｉｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｄｅｅｐ－ｃｏｖｅｒａｇｅ ｄａｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４；１１ ：１６７－７０．
５４．Ｓｉｌｖａ ＪＣ， Ｇｏｒｅｎｓｔｅｉｎ ＭＶ， Ｌｉ ＧＺ， Ｖｉｓｓｅｒｓ ＪＰ ａｎｄ Ｇｅｒｏｍａｎｏｓ ＳＪ．Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ＬＣＭＳＥ： ａ ｖｉｒｔｕｅ ｏｆ ｐａｒａｌｌｅｌ ＭＳ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００６；５：１４４－５６．
５５．Ｃｏｘ Ｊ， Ｎｅｕｈａｕｓｅｒ Ｎ， Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ Ａ， Ｓｃｈｅｌｔｅｍａ ＲＡ， Ｏｌｓｅｎ ＪＶ ａｎｄ ７２８ Ｍａｎｎ Ｍ． Ａｎｄｒｏｍｅｄａ：Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｅｎｇｉｎｅ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ＭａｘＱｕａｎｔ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１ ；１０：１７９４－１８０５．
５６．Ｓｈａｎｎｏｎ Ｐ， Ｍａｒｋｉｅｌ Ａ， Ｏｚｉｅｒ Ｏ， Ｂａｌｉｇａ ＮＳ， Ｗａｎｇ ＪＴ， Ｒａｍａｇｅ Ｄ， Ａｍｉｎ Ｎ， Ｓｃｈｗｉｋｏｗｓｋｉ Ｂ ａｎｄ Ｉｄｅｋｅｒ Ｔ． Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ： ａ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３；１３：２４９８－５０４．
５７．Ｄｏｎｃｈｅｖａ ＮＴ， Ｍｏｒｒｉｓ ＪＨ， Ｇｏｒｏｄｋｉｎ Ｊ ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎ ＬＪ．Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ ＳｔｒｉｎｇＡｐｐ：Ｎｅｔｗｏｒｋ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｄａｔａ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１９；１８：６２３－６３２．
５８．Ａｓｓｅｎｏｖ Ｙ， Ｒａｍｉｒｅｚ Ｆ， Ｓｃｈｅｌｈｏｒｎ ＳＥ， Ｌｅｎｇａｕｅｒ Ｔ ａｎｄ Ａｌｂｒｅｃｈｔ Ｍ． Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００８；２４：２８２－４．
５９．Ｂｉｎｄｅａ Ｇ， Ｍｌｅｃｎｉｋ Ｂ， Ｈａｃｋｌ Ｈ， Ｃｈａｒｏｅｎｔｏｎｇ Ｐ， Ｔｏｓｏｌｉｎｉ Ｍ， Ｋｉｒｉｌｏｖｓｋｙ Ａ， Ｆｒｉｄｍａｎ ＷＨ， Ｐａｇｅｓ Ｆ， Ｔｒａｊａｎｏｓｋｉ Ｚ ａｎｄ Ｇａｌｏｎ Ｊ． ＣｌｕｅＧＯ： ａ Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ ｐｌｕｇ－ｉｎ ｔｏ ｄｅｃｉｐｈｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｇｒｏｕｐｅｄ ｇｅｎｅ ｏｎｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９ ；２５：１０９１ －３．
６０．Ｆｉｎｇｅｒ Ｓ， Ｋｎｏｒｒ Ｍ， Ｍｏｌｉｔｏｒ Ｍ， Ｓｃｈｕｌｅｒ Ｒ， Ｇａｒｌａｐａｔｉ Ｖ， Ｗａｉｓｍａｎ Ａ， Ｂｒａｎｄｔ Ｍ， Ｍｕｎｚｅｌ Ｔ， Ｂｏｐｐ Ｔ， Ｋｏｓｓｍａｎｎ Ｓ， Ｋａｒｂａｃｈ Ｓ ａｎｄ Ｗｅｎｚｅｌ Ｐ． Ａ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｏｓｔ－ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１９ ；１１５：１９０７－１９１７．

Claims (31)

1. 心不全（ＨＦ）の治療または予防に使用するための組織因子プロテアーゼ活性化受容体２シグナル伝達経路であるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
2. 前記心不全（ＨＦ）が、虚血性心不全（ＩＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、急性及び／または進行中のＭＩに起因するＩＨＦ、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）、または駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）と関連するか、またはそれらと同義である、請求項１に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
3. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路が、（ｉ）分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ１（ＭＡＰＫ１）の過剰活性化、（ｉｉ）細胞外シグナル調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化、及び（ｉｉｉ）ＴＧＦ－β１活性化を特徴とする、請求項１に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
4. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、ＥＲＫ１／２リン酸化の減少、ＴＧＦ－β１活性化の減少、及び心臓細胞または骨髄単球細胞のＮＯＸ２発現の減少に関連する化学的または生物学的化合物である、請求項１に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
5. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、ＮＯＸ２陽性骨髄細胞の動員の阻害剤、好ましくはＮＯＸ－２陽性単球の阻害剤である、請求項１に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
6. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、ＴＧＦ－β１活性化の阻害剤である、請求項１に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
7. 前記阻害剤が、ＴＦ／ＦＶＩＩａ阻害剤である、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
8. 前記ＴＦ／ＦＶＩＩａ阻害剤が、抗ＴＦ抗体、低分子、ＴＦ経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ヒト組換えＦＶＩＩａ阻害剤（ｒＦＶＩｌａｉ）、キメラタンパク質ＸＫ１、及びＰＡＲ２アンタゴニストからなる群から選択される、請求項７に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
9. 前記抗体が、ＡＰ－１、ＡＬＴ８３６、チソツマブ、ＩＣＯＮ－２から選択される、請求項８に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
10. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、線虫類抗凝固タンパク質ｃ２（ＮＡＰｃ２）である、請求項１に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
11. 前記ＮＡＰｃ２が、修飾されたＮＡＰｃ２または組換えＮＡＰｃ２バリアントである、請求項１０に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
12. 前記ＮＡＰｃ２バリアントが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＮＡＰｃ２／プロリン、またはその変異体もしくは相同体である、請求項１１に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
13. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、及び長いノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）；またはタンパク質、または核酸アプタマーから選択されるオリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用のためのＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤。
14. 心不全（ＨＦ）の治療または予防に使用するための、組織因子プロテアーゼ活性化受容体２シグナル伝達経路であるＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の阻害剤及び薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントまたは賦形剤を含む医薬組成物。
15. 前記心不全（ＨＦ）が、虚血性心不全（ＩＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、急性及び／または進行中のＭＩに起因するＩＨＦ、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）、または駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）と関連するか、またはそれらと同義である、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路が、（ｉ）分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ１（ＭＡＰＫ１）の過剰活性化、（ｉｉ）細胞外シグナル調節キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化、及び（ｉｉｉ）ＴＧＦ－β１活性化を特徴とする、請求項１４に記載の医薬組成物。
17. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、ＥＲＫ１／２リン酸化の減少、ＴＧＦ－β１活性化の減少、及び心臓細胞または骨髄単球細胞のＮＯＸ２発現の減少に関連する化学的または生物学的化合物である、請求項１４に記載の医薬組成物。
18. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、ＮＯＸ２陽性骨髄細胞の動員の阻害剤、好ましくはＮＯＸ－２陽性単球の阻害剤である、請求項１４に記載の医薬組成物。
19. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、ＴＧＦ－β１活性化の阻害剤である、請求項１４に記載の医薬組成物。
20. 前記阻害剤が、ＴＦ／ＦＶＩＩａ阻害剤である、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
21. 前記ＴＦ／ＦＶＩＩａ阻害剤が、抗ＴＦ抗体、低分子、ＴＦ経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、ヒト組換えＦＶＩＩａ阻害剤（ｒＦＶＩｌａｉ）、キメラタンパク質ＸＫ１、及びＰＡＲ２アンタゴニストからなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 前記抗体が、ＡＰ－１、ＡＬＴ８３６、チソツマブ、ＩＣＯＮ－２から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、線虫類抗凝固タンパク質ｃ２（ＮＡＰｃ２）である、請求項１４に記載の医薬組成物。
24. 前記ＮＡＰｃ２が、修飾されたＮＡＰｃ２または組換えＮＡＰｃ２バリアントである、請求項１４に記載の医薬組成物。
25. 前記ＮＡＰｃ２バリアントが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＮＡＰｃ２／プロリン、またはその変異体もしくは相同体である、請求項２４に記載の医薬組成物。
26. 前記ＴＦ－ＰＡＲ２シグナル伝達経路の前記阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ、及び長いノンコーディングＲＮＡ（ＩｎｃＲＮＡ）；またはタンパク質、または核酸アプタマーから選択されるオリゴヌクレオチド阻害剤である、請求項１４～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
27. 虚血性心不全（ＩＨＦ）または心筋梗塞（ＭＩ）後の有害なリモデリングを発症するリスクのある対象を同定するための方法であって、前記方法が、ｉ．骨髄細胞における組織因子（ＴＦ）細胞質ドメインのリン酸化と、前記対象から採取した生体サンプルにおける活性ＴＧＦ－β１のレベルを測定するステップと、
    ｉｉ．前記生体サンプルにおけるＴＦ細胞質ドメインのリン酸化レベル及び活性ＴＧＦ－β１のレベルを、正常で健康な対象におけるＴＦ細胞質ドメインのリン酸化レベル及び活性ＴＧＦ－β１のレベルと比較するステップであって、
    ここで、前記ＴＦ細胞質ドメイン及び活性ＴＧＦ－β１のリン酸化レベルの増加が、ＭＩ後のＩＨＦまたは有害なリモデリングを発症するリスクの増加を示す、ステップと、を含む、方法。
28. ＴＦ細胞質ドメインリン酸化（４Ｇ６）及びＴＦ（１０Ｈ１０）についての単球タンパク質発現のウエスタンブロットまたは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）分析をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記方法が、前記生体サンプル内で；
    ｉ．ＩＬ６、ＣＣＬ２、及び／またはＣＣＲ２の上方制御、及び／または
    ｉｉ．骨髄細胞の動員、及び／または
    ｉｉｉ．ＴＧＦ－β１活性化の増加、及び／または
    ｉｖ．ＳＭＡＤ２の下流のリン酸化
    が存在するかを決定することをさらに含む、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
30. 前記対象の生体サンプルが、心臓生検、液体生検、血液、血清、または血漿から得られる、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。