JP2023548313A - タンパク質のイン・シチュ合成のための遺伝子操作された抗原特異的ナチュラルキラー細胞 - Google Patents
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Abstract
【課題】【解決手段】遺伝子操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、レセプター要素、アクチュエーター要素、及びエフェクター要素を含む外因性ポリヌクレオチド配列を備える。レセプター要素は、膜貫通型ドメインに差動可能に連結する細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを備えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、細胞外抗原結合ドメインは、標的細胞の表面上の表面抗原を認識する。アクチュエーター要素は、エフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートさせる転写因子結合部位をコードする。エフェクター要素は、シグナルペプチドに作動可能に連結するエフェクタータンパク質をコードし、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、ＣＡＲの抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、活性化し、エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される。
Description
本開示は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から授与された助成金１ＤＰ２ＥＢ０２４２４５及びＲ２１ＣＡ２３６６４０、バラ日に国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）から授与された契約番号Ｄ１９ＡＰ０００２４による政府の支援を受けて行われた。政府は本開示について一定の権利を有する。
２０２１年１０月２８日に作成され、本明細書と同時に提出され、以下の「Ｓ１６４７１３２１１１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」と識別され、８３ｋｂのサイズのＡＳＣＩＩテキストファイルであるコンピュータ読み取り可能ヌクレオチド配列リストの全体が参照として組み込まれる。
様々な標準治療薬は、診断時に疾患を治療するように設計されている。多くの病原体や疾患細胞は生体内で大きく変化するが、現在の薬剤は生体内の疾患微小環境とともに共進化するように設計されていない。このような治療薬は、患者の体重に正規化された用量で投与される薬剤を含み得る。しかしながら、同じ体格の患者でも病状が異なる可能性がある。薬剤が過剰に投与された場合、治療薬は循環器系に行き着き、これは、正常な組織に病的な状態を引き起こし得る。薬物送達が最適でない場合、薬剤耐性が生じる可能性がある。患者をモニタリングし、健康状態に応じて投与量を調整することは可能であるが、連日のモニタリングにはコストがかかる。さらに、多くの疾患についてモニタリング戦略及び治療法が存在しない。従って、静的な治療薬では、進化及び／又は持続する動的な病原体や疾患を制御できないことが多い。動的な病状と静的な治療薬とのずれは、大きな社会的及び経済的負担を与えている。他の種由来の合成ペプチド及び宿主防御ペプチドが、様々な疾患に対して治療効果を発揮することが確認されている。しかしながら、このような合成ペプチドや宿主防御ペプチドは、免疫系により急速に分解され、正常な（宿主）細胞に対する毒となるため、現在では投与できない。
本開示は、イン・シチュにおいて活性化し、標的の疾患に対するヒト又は非ヒト治療用タンパク質（エフェクター）の合成を引き起こすことができる遺伝子操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株（ＮＫ－９２ＭＩ等）を含む、疾患を治療するための治療薬に関する上記及びその他の課題を克服することを対象とする。
本開示の様々な実施形態は、膜貫通型ドメインに差動可能に連結し、標的細胞の表面上の表面抗原を認識する細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを備えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレセプター要素と、ＣＡＲの抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、エフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートさせる転写因子結合部位をコードするアクチュエーター要素と、シグナルペプチドに作動可能に連結するエフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、を含む外因性ポリヌクレオチド配列を備える遺伝子操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を対象とする。遺伝子操作されたＮＫ細胞は、ＣＡＲの抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、活性化し、エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、存在する標的細胞の関数としてエフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される。いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質の量は、イン・シチュにおいて存在する標的細胞の量に比例する。
いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、エフェクタータンパク質の上流にあり、エフェクタータンパク質に対して非天然状態である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、エフェクタータンパク質に対して天然状態である。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメイン、アクチュエーター要素、
及びシグナルペプチドは、定常ドメインであり、細胞外抗原結合ドメイン及びエフェクタータンパク質は、可変ドメインである。
及びシグナルペプチドは、定常ドメインであり、細胞外抗原結合ドメイン及びエフェクタータンパク質は、可変ドメインである。
いくつかの実施形態において、アクチュエーター要素は、エフェクタータンパク質に結合し、ＮＫ細胞は、ＮＫ－９２ＭＩ細胞である。
いくつかの実施形態において、外因性ポリヌクレオチド配列は、レセプター要素に結合するエフェクター要素に結合するアクチュエーター要素を含む。
いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質は、検出可能なレポータータンパク質、治療用タンパク質、下流シグナル伝達タンパク質、及びそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内シグナル部分、４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達部分、及びＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達部分の１つ以上を含む。
いくつかの実施形態において、転写因子結合部位は、活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）応答要素、血清応答要素（ＳＲＥ）、及びサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）から成る群から選択される。
様々な実施形態は、遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団を対象とし、集団の各遺伝子操作されたＮＫ細胞は、レセプター要素に結合するエフェクター要素に結合するアクチュエーター要素を含む外因性ポリヌクレオチド配列を備え、レセプター要素は、膜貫通型ドメインに作動可能に連結し、標的細胞の表面上の表面抗原を認識する細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを備えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、アクチュエーター要素は、ＣＡＲの抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、エフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートさせる転写因子結合部位をコードし、エフェクター要素は、シグナルペプチドに作動可能に連結するエフェクタータンパク質をコードする。遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団は、ＣＡＲの抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、活性化し、そして標的細胞の存在に基づいて較正量のエフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される。
いくつかの実施形態において、外因性ポリヌクレオチド配列は、エフェクター要素に結合し、エフェクター要素の上流にあるアクチュエーター要素と、レセプター要素に結合し、レセプター要素の上流にあるエフェクター要素と、を含み、シグナルペプチドは、エフェクタータンパク質の上流にある。
いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質は、標的細胞に直接作用する治療用タンパク質であり、治療用タンパク質は、細胞傷害性タンパク質、免疫刺激タンパク質、及び免疫抑制タンパク質から成る群から選択される。
いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質の較正量は、複数の細胞中又はサンプル中に存在する標的細胞の量の関数である。
様々な実施形態は、複数の細胞を遺伝子操作されたＮＫ細胞に接触させることを含む方法を対象とし、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、膜貫通型ドメインに作動可能に連結する細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを備えるＣＡＲをコードするレセプター要素と、転写因子結合部位をコードするアクチュエーター要素と、シグナルペプチドに作動可能に連結するエフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、を備える。方法は、複数の細胞を遺伝子操作されたＮＫ細胞に接触させ、複数の細胞内に標的細胞が存在することに応答して、標的細胞の表面上の抗原に対するレセプター要素の結合を引き起こすことと、ＣＡＲの抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、アクチュエーター要素によりエフェクター要素の発現を開始させてエフェクタータンパク質及び分泌ペプチドを合成することと、分泌ペプチドによりエフェクタータンパク質を分泌することと、をさらに含む。
いくつかの実施形態において、方法は、エフェクタータンパク質の発現を検出することをさらに含み、エフェクタータンパク質の検出可能な発現は、標的細胞の存在を示す。
いくつかの実施形態において、方法は、ＣＡＲの抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、ＮＫ細胞を活性化させ、そして標的細胞の存在に基づいて較正量のエフェクタータンパク質を合成及び分泌することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質の量は、複数の細胞中に存在する標的細胞の量に比例する。
いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質は、標的細胞に直接作用する治療用タンパク質を含み、方法は、治療用タンパク質により標的細胞を中和することをさらに含む。
様々な実施形態は、付される図面に関連する以下の詳細な説明を考慮してより完全に理解され得る。
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を構成し、本開示が実施され得る特定の実施例の説明として例示される、付される図面を参照する。他の実施例が利用可能であり、本開示の範囲から逸脱せずに様々な変更を加えることができる点が理解される。従って、以下の詳細な説明は限定的な意味で捉えられるものではなく、本開示の範囲は付される請求の範囲により画定される。特別記載しない限り、本明細書において説明される様々な実施例は、その一部又は全部を互いに組み合わせることができることが理解される。
いくつかの実施形態において、細胞は、細胞内転写機構を自律的に制御する（複数の）膜貫通型受容体を含む遺伝的要素を発現するように操作できる。さらに、様々なイン・ビトロ、エクス・ビボ、及びイン・ビボ用途のためのベクターとして機能する能力を有する操作された細胞を得るように、細胞の遺伝的要素はモジュールであってよい及び／又は細胞は複数の遺伝的要素を含んでよい。そのような細胞は、パーツを保存できる及びパーツを異なる用途のために変更できるという点でモジュール化できる。遺伝子操作された細胞は、疾患細胞による刺激を受けて治療反応を自己制御し、免疫系を回避する又はその誤作動を含む癌及び新興病原体等の様々な細胞系疾患に適用可能である治療薬及び治療方法に使用できる。遺伝子操作されたＴ細胞等の複数の種類のそのような遺伝子操作された細胞は、イン・ビボにおいて複雑な疾患を治療の対象とする堅牢かつ再現性のある細胞系を提供する。また、そのような遺伝子操作されたエフェクター細胞は、様々な用途において、信頼性の高いイン・ビボイメージング技術及び信頼性の高いイン・ビトロセンサー技術を提供する。
本開示に係る実施形態は、標的細胞の表面上に発現する抗原を特異的に検出（例えば、結合）するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により遺伝子工学的に操作された初代ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株を含む。抗原に結合することにより、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、天然のＮＫ細胞よりも機能性が向上する可能性がある。例えば、腫瘍細胞は、腫瘍細胞表面上のＮＫ細胞活性化リガンドの発現の低下により、ＮＫ細胞に対する耐性を獲得し得る。さらに、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞療法よりも比較的効果的な設計が可能である。Ｔ細胞とＮＫ細胞との違いや初代ＮＫ細胞の操作の困難さから、やや驚くべきことに、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、改変Ｔ細胞と少なくともある程度類似したモジュール構造を利用できる。Ｔ細胞と比較して、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞活性化ドメインから引き出し、人工細胞シグナル伝達経路を改善できる。同系ＮＫ細胞の研究を含む様々な実験的な実施形態において、さらに驚くべきことに、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を示さず、これは、ＮＫ細胞が異なる標的タンパク質を産生するための生きたベクターとして使用できることを示す。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞に比較して、イン・ビボにおいて半減期が１～２週間程度と比較的短いが、半減期が短いため、健康な宿主細胞の標的化を最小限に抑えられるという利点がある。上記のように、初代ＮＫ細胞の遺伝子操作及び増殖は、特に初代Ｔ細胞と比較して困難である。多くの疾患状態において、宿主（例えば、患者又は他の被験者）は、ＮＫ細胞と比較して、Ｔ細胞数が少なく、ＮＫ細胞は、サイトカイン放出症候群、神経毒性、ＧｖＨＤによる有害事象を減少させることができる。
昨今の米国食品医薬品局（ＦＤＡ）等の様々な政府機関による細胞療法の承認にも関わらず、Ｔ細胞ベースの薬剤の完全な影響は限定的であった。これは、製造コスト、製品のばらつき、有害事象の可能性に寄与し得る養子細胞療法の自家製であるためと考えられる。さらに、細胞性病態の動的な状態及び患者間のばらつきは、最適な投与に課題を与え、個々の患者の病態を継続的にモニタリングする必要を伴う。上記のように、薬物送達は、体重や表面積に正規化された用量で投与されることが多い。しかしながら、同じ体格の患者でも病状は異なることがある。本開示に係る実施形態は、異なる標的タンパク質のバイオ工場として機能する細胞シャーシ又はベクターとして使用される、遺伝子操作されたＮＫ細胞を対象とする。操作されたＮＫ細胞は、較正量の標的タンパク質を合成し、人工的な細胞シグナル伝達によるオートクリン及びパラクリンシグナル伝達を誘発するために使用されてよい。ＮＫ細胞は、抗腫瘍効果、２４時間程度の倍加時間等、迅速に治療効果を発揮することができ、治療薬として有用である。
様々な実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、モジュール性であり、抗原特異的である。抗原特異性は、腫瘍抵抗性を克服するために使用でき、ヒト又は他の生物の宿主細胞等の異なる抗原提示標的細胞に細胞溶解機能を向ける。さらに、このような遺伝子操作されたＮＫ細胞の人工細胞シグナル伝達経路は、遺伝子操作されたＮＫ細胞が標的抗原に関与する際に、較正量のタンパク質ベースの治療薬を生産し、意図したオートクリン及びパラクリンシグナル伝達を引き起こすことにより、ベクターとして機能する能力を導入できる。遺伝子操作されたＮＫ細胞は、標的部位における生物製剤の集中的な合成を可能にする、及び／又は全身毒性を抑えることにより治療期間を延ばして患者の転帰を良好にすることができる。
様々な実施形態は、ＮＫ細胞株における人工細胞シグナル伝達経路の実装の成功例を示す。ＮＫ細胞株の例は、ＮＫ－９２ＭＩを含む。ＮＫ－９２ＭＩは、臨床効率における実績を有する、急速に成長する細胞溶解細胞株である。いくつかの実験的な実施形態において、ＮＫ－９２ＭＩ細胞株は、抗原提示標的細胞と関与するためのベクターに形質転換され、イン・シチュにおいて較正量の操作されたタンパク質（本明細書においてしばしば「エフェクタータンパク質」と呼称する）の合成を誘発する。遺伝子操作されたＮＫ細胞は、モジュール性である同種の生体ベクターを提供できる。例えば、モジュール性を利用して異なるレセプター要素を異なるエフェクター要素と組み合わせることができ、これにより、癌、ウイルス感染、及び／又は自己免疫疾患等の既知のバイオマーカーを備える疾患を標的とするようにＮＫ細胞を再プログラムできる。
本明細書において使用される「遺伝子操作されたＮＫ細胞」は、各々がモジュール性である（ｉ）レセプター要素、（ｉｉ）アクチュエーター要素、及び（ｉｉｉ）エフェクター要素を備えるように遺伝子操作された又は改変されたＮＫ細胞を含む及び／又は指す。本明細書において使用されるように、「モジュール」及び「モジュール性」の用語は、操作されたＮＫ細胞へ導入するために様々な組み合わせで組み立てられた際の組換え配列ドメイン及び得られる組換えポリペプチドに関連する汎用性を含む及び／又は指す。本明細書において使用されるように、「レセプター要素」は、標的細胞と特異的に相互作用し得るＣＡＲ等の膜貫通型受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む及び／又は指す。特定の用途に応じて、レセプター要素は、ＣＡＲの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）部分を異なる疾患関連抗原に特異的な細胞外抗原結合ドメインと交換することにより、再プログラムできる。使用可能な他のレセプター要素は、自己免疫疾患に関連する抗原に対して特異性を有するＣＡＲ、神経障害（例えば、 ＰＴＳＤ、パーキンソン病、アルツハイマー病）に関連する抗原に対して特異性を有するＣＡＲ、リガンド依存性ＧＰＣＲ（例えば、ＧＰＲ１グルコース受容体）、光依存性イオンチャネル（例えば、メラノプシン、ロドプシン、フォトプシン）、圧力感知イオンチャネル（例えば、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２）、及びリガンド依存性イオンチャネルを含むが、これらには限定されない。
本明細書において使用される「アクチュエーター要素」は、トリガーシグナル（例えば、感知要素の標的抗原への結合）の下流で転写及び翻訳イベントを開始する転写因子結合部位をコードするポリヌクレオチド配列を含む及び／又は指す。一般に、アクチュエーター要素の基礎となる分子メカニズムは、細胞内カルシウム［Ｃａ２＋］ｉの動態に基づき、これは、ほぼ全ての種類の細胞がその機能を調節するために使用するメカニズムである。応答要素は、ＮＦＡＴ（「活性化Ｔ細胞の核因子」）応答要素（ＮＦＡＴ－ＲＥ）、血清応答要素（ＳＲＥ）、及びサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）を含むが、これらには限定されない。
本明細書で使用される「エフェクター要素」は、エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、そしていくつかの例ではシグナルペプチドに作動可能に連結したエフェクタータンパク質を含む及び／又は指す。例えば、エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、以下の：ヒト遺伝子に由来する配列、非ヒト種の遺伝子に由来する配列、組換え配列、検出可能なレポーター分子をコードする配列、検出可能なイメージング分子をコードする配列、治療分子をコードする配列等である。
レセプター要素、アクチュエーター要素、及びエフェクター要素が導入される遺伝子操作されたＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞又は非ヒトＮＫ細胞（例えば、哺乳類、爬虫類、植物等）を含む任意のＮＫ細胞タイプであってよい。この態様において、モジュール要素の遺伝子改変細胞「ソース」は、とりわけ、レセプター要素、アクチュエーター要素、及びエフェクター要素の発現及び提示のための転写及び翻訳機械を提供する細胞シャーシ又はフレームを提供する。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、ソース（例えば、一人目のヒト）に由来し、改変され、ソースとは異なる生物（例えば、二人目のヒトである宿主）に投与されてよい。他の実施形態において、ＮＫ細胞は、ソース（例えば、一人目のヒト）に由来し、改変され、ソース（例えば、ソースが宿主である）に戻すように投与されてよい。
図面を参照すると、図１は、本開示に係る、遺伝子操作されたＮＫ細胞の例を示す。遺伝子操作されたＮＫ細胞１００は、要素が異なる標的細胞について、異なるエフェクタータンパク質を合成するために調製することができるという点でモジュールであってよい。
遺伝子操作されたＮＫ細胞１００は、作動的に関連して、レセプター要素１０２と、アクチュエーター要素１０６と、エフェクター要素１１０とを含む外因性ポリヌクレオチド配列を備える。ＮＫ－９２ＭＩ細胞株からのＮＫ細胞（しばしばＮＫ－９２ＭＩ細胞とも呼称される）等の様々な異なる種類のＮＫ細胞を使用可能である。
レセプター要素１０２は、ＣＡＲ１０４をコードする。ＣＡＲは、しばしば、「キメラ受容体」、「Ｔ－ボディ」、又は「キメラ免疫受容体（ＣＡＲ）」と呼称される。本明細書において使用されるＣＡＲは、膜貫通ドメイン１０５及び少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン１０７に作動可能に連結される抗体（例えば、ｓｃＦｖ）の細胞外抗原結合ドメイン１０３を含む人工構築ハイブリッドタンパク質又はポリペプチドを含む及び／又は指す。例えば、ＣＡＲ１０４は、膜貫通ドメイン１０５に作動可能に連結される細胞外抗原結合ドメイン１０３と、細胞内シグナル伝達ドメイン１０７とを含む。ＣＡＲ１０４は、宿主の標的細胞等の標的の表面抗原を識別するように設計されてよい。ＣＡＲ１０４は、抗原結合に応答して、細胞内Ｃａ＋２放出のために内部Ｃａ＋２貯蔵を動員できる。例えば、ＣＡＲ１０４の細胞外抗原結合ドメイン１０３は、宿主の疾患細胞等の標的細胞の表面上の表面抗原を認識できる。
本明細書で使用されるように、細胞外抗原結合ドメイン１０３は、標的細胞の表面抗原に相補的なポリヌクレオチド配列を含む及び／又は指す。上記のように、細胞外抗原結合ドメイン１０３は、標的細胞の表面抗原に結合できる。
膜貫通ドメイン１０５は、例えばＮＫ細胞１００の膜等の細胞の膜にまたがる種類の膜タンパク質である、膜貫通タンパク質の膜貫通セグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む及び／又は参照する。膜貫通ドメイン１０５は、天然のポリペプチドに由来してよく、又は人工的に設計されてもよい。天然ポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン１０５は、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質から得られる。例えば、Ｔ細胞受容体α若しくはβ鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、又はＧＩＴＲの膜貫通ドメインが使用可能である。
細胞内シグナル伝達ドメイン１０７は、細胞における生物学的プロセスの活性化又は阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られる任意のオリゴペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む及び／又は指す。細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達部分、４－１ＢＢの細胞間シグナル伝達部分、及びＣＤ３－ｚｅｔａの細胞内シグナル伝達部分が含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメイン１０７は、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達部分、４－１ＢＢの細胞間シグナル伝達部分、及びＣＤ３－ｚｅｔａの細胞内シグナル伝達部分が含む。しかしながら、実施形態はそれほど限定されず、他の種類及び組み合わせの細胞内シグナル伝達ドメインを含んでよい。例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン１０７は、同じ分子内に存在する細胞外抗原結合ドメイン１０３が抗原に結合した（相互作用する）時に、細胞にシグナルを伝達できる任意の分子をコードすることを含んでよい。
一般に、ＣＡＲ１０４の抗原結合ドメイン１０３は、目的とする標的細胞の表面上に発現する特定の抗原に対して特異性を有する。上記のように、抗原に結合可能な細胞外抗原結合ドメイン１０３は、抗原に結合可能な任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを含み、例えば、抗体の抗原結合ドメイン及び受容体のリガンド結合ドメインを含む。細胞外抗原結合ドメイン１０３は、例えば細胞表面上に存在する抗原である抗原に結合して相互作用し、それにより、ＣＡＲ１０４を発現する遺伝子操作されたＮＫ細胞１００に特異性を付与する。いくつかの実施形態において、レセプター要素１０２は、卵巣、子宮頸部、肺、乳房、腎臓、及び脳を含む様々な癌において過剰発現することが判明した抗原である葉酸受容体α（ＦＲα）に対する特異性を有する細胞外抗原結合ドメイン１０３を備えるＣＡＲ１０４をコードする。レセプター要素１０２の抗原結合部分として使用するのに適切な他のキメラ抗原受容体は、免疫細胞のサブセットに対する特異性、１つ以上の腫瘍抗原に対する特異性、及び／又は１つ以上のウイルス抗原に対する特異性を有するものを含む。
アクチュエーター要素１０６は、転写因子結合部位１０８をコードする。転写因子結合部位１０８は、ＣＡＲ１０４の細胞外抗原結合ドメイン１０３が標的細胞の抗原に結合したことに応答してエフェクタータンパク質１１２の合成をアップレギュレートさせるタンパク質の結合部位を含む及び／又は指す。転写因子結合部位１０８は、上記のように抗原結合に応答して放出させられる［Ｃａ２＋］をトリガーとして、転写因子に結合し得る。いくつかの実施形態において、転写因子結合部位１０８は、活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）応答要素、血清応答要素（ＳＲＥ）、及びサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）から選択される。それにより、アクチュエーター要素１０６は、［Ｃａ２＋］によりトリガーされる因子を結合するための配列を含んでよく、［Ｃａ２＋］ｉ上昇に応答してエフェクタータンパク質１１２の合成の増幅をトリガーしてよい。
いくつかの実施形態において、アクチュエーター要素１０６は、転写因子タンパク質のためのＮＦＡＴ転写因子結合部位をコードする。ＮＦＡＴ転写因子ファミリーは、ＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、及びＮＦＡＴ５の５つから成る。レビューについては、Ｓｈａｒｍａ Ｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＮＡＳ、１０８（２８）；Ｈｏｇａｎ ＰＧ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２８；Ｒａｏ Ａ、Ｈｏｇａｎ ＰＧ（２００９）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ、２３１（１）；Ｒａｏ Ａ（２００９）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０（１）、Ｍ・Ｒ・Ｍueｌｌｅｒ及びＡ・Ｒａｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１０，１０、６４５－６５６；Ｍ・Ｏｈ－Ｈｏｒａ及びＡ・Ｒａｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００８年、２０、２５０－２５８。Ｃｒａｂｔｒｅｅ ＆ Ｏｌｓｏｎ ＥＮ （Ａｐｒ ２００２）， Ｃｅｌｌ １０９ Ｓｕｐｐｌ （２）： Ｓ６７－７９が参照され、これらはそれぞれ、その教示のためにその全体が本明細書に組み込まれる。ＮＦＡＴｃ１～ＮＦＡＴｃ４は、カルシウムシグナルにより制御される。既知のカルシウムセンサータンパク質であるカルモジュリンがセリン／スレオニンホスファターゼであるカルシニューリンを活性化するため、カルシウムシグナルは、ＮＦＡＴの活性化に不可欠である。この戦略の基礎となる分子メカニズムは、細胞内Ｃａ＋２（［Ｃａ２＋］ｉ）の動態に基づく（図２によりさらに示される）。［Ｃａ２＋］ｉの動態は、ほとんど全ての細胞タイプに共通であり、従って、このアプローチは広範に適用可能である。ＣＡＲを介した細胞の刺激による［Ｃａ２＋］ｉの上昇は、（Ｃａ＋２／カルモジュリン依存性セリンホスファターゼカルシニューリンを通じて）活性化ＮＫ細胞１００タンパク質の核因子の脱リン酸化をもたらし、次に、このタンパク質は核に転移してＮＦＡＴ応答要素（ＮＦＡＴ－ＲＥ）と相互作用し、エフェクタータンパク質１１２の発現をアップレギュレートする。また、並行して、ＮＦＡＴ－ＲＥは、疾患の病状に比例するクローン拡大を制御する活性化された遺伝子操作されたＮＫ細胞１００にＩＬ－２を誘導するという本来の機能を発揮する。また、ＮＦＡＴ－ＲＥ誘導レポータータンパク質の発現は、遺伝子操作されたＮＫ細胞１００の活性化レベルを定量的に評価するために使用可能である。
エフェクター要素１１０は、エフェクタータンパク質１１２をコードし、いくつかの実施形態において、シグナルペプチド１１４に作動可能に連結するエフェクタータンパク質１１２をコードする。本明細書でさらに示されるように、いくつかの実施形態において、シグナルペプチド１１４は、エフェクタータンパク質１１２の上流にある。シグナルペプチド１１４は、エフェクタータンパク質１１２に対して非天然状態であってよい。例えば、エフェクタータンパク質１１２は、シグナルペプチド１１４の添加なしに細胞外環境へと分泌され得ない。しかしながら、実施形態はそれほど限定されず、いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質１１２は、天然状態のシグナルペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質１１２は、シグナルペプチド１１４を（天然状態で）含んでよい。
本明細書で使用されるように、「分泌体」、「分泌ペプチド」、及び「シグナルペプチド」の用語は、互換的に使用され、合成されたエフェクタータンパク質１１２を細胞外環境へと補助又は誘導する（例えば、エフェクター要素１１０の転流を補助）ペプチドを含む及び／又は指す。シグナルペプチド１１４は、細胞外環境への放出のために、エフェクタータンパク質１１２に作動可能に連結又は融合されてよい。このように、シグナルペプチド１１４は、エフェクタータンパク質１１２の移動を遺伝子操作されたＮＫ細胞１００の外側へと向けることができる。シグナルペプチド１１４は、天然にトランスロケーションできない及び／又は天然に最小限のトランスロケーションしかできないエフェクタータンパク質１１２を発現する遺伝子操作されたＮＫ細胞１００に含まれる場合に特に有益であり、エフェクタータンパク質１１２は、シグナルペプチド１１４の不在下で遺伝子操作されたＮＫ細胞１００内に留まることができる、及び／又は閾値未満の速度でトランスロケーションできる。一般に、シグナルペプチドは、新生分泌タンパク質のＮ末端に位置し、３つのドメイン：（１）Ｎ末端の基本ドメイン、（２）中央の疎水性コア、（３）カルボキシ末端の開裂領域を特徴的に有する。シグナルペプチドは、任意の適切なものを使用できる。例えば、シグナルペプチド１１４は、インターロイキン－６（ＩＬ－６）又はインターロイキン－２（ＩＬ－２）のシグナルペプチドであってよい。
様々な実施形態において、ＣＡＲ１０４の細胞外抗原結合ドメイン１０３が標的細胞（例えば、標的宿主細胞）の抗原に結合したことに応答して、遺伝子操作されたＮＫ細胞１００は、活性化し、エフェクタータンパク質１１２を合成及び分泌するように構成される。例えば、遺伝子操作されたＮＫ細胞１００は、環境（例えば、細胞外環境）に存在する標的細胞の量の関数として、環境に存在する標的細胞の数に比例する量のエフェクタータンパク質１１２を環境に分泌する等、エフェクタータンパク質１１２を合成及び分泌し得る。
エフェクタータンパク質１１２は、患者等の宿主に療法を提供するために使用され得る、様々な異なる種類のタンパク質を含んでよい。例えば、エフェクタータンパク質１１２は、検出可能なレポータータンパク質、治療用タンパク質、下流シグナル伝達タンパク質、及びそれらの組合せを含んでよい。本明細書で使用されるように、検出可能なレポータータンパク質は、光学的、電気的、又は他の種類の検出可能なシグナルを提供するタンパク質等の発現時に検出可能なタンパク質を含む及び／又は指す。治療用タンパク質は、患者に治療効果を提供するタンパク含む及び／又は指す。下流シグナル伝達タンパク質は、細胞成長、増殖、分化、アポトーシスの制御等のシグナル伝達経路の下流要素を駆動するタンパク質を含む及び／又は指す。
エフェクタータンパク質の非限定的な例は、細菌由来の細胞毒性ポリペプチド（例えば、パラスポリン、プランタリシンＡ）；昆虫由来（例えば、ポリビア－ＭＰ１）；ウイルス由来の抗ウイルスポリペプチド（例えば、αヘリックスペプチド（ＡＨＰ））；ウイルス由来の抗ウイルスポリペプチド（例えば、抗ウイルスペプチド（ＡＶＰ））；真菌由来の免疫抑制ペプチド（例えば、コルテリンＡ）；血管拡張剤（例えば、レラキシン、ブラジキニン）及びエンドペプチダーゼ（例えば、ヘパラナーゼ、レラキシン、コラゲナーゼ）；細胞透過性カチオン性ペプチド（例えば、ＬＬ－３７、ＴＡＴペプチド）である。コルテリンＡに関して、自己反応性ＮＫ細胞は、自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病、多発性筋炎、及び狼瘡）を有する宿主又は他の供給源から得られるＮＫ細胞から操作することができる。特に、ＮＫ細胞は、標的自己抗原による刺激時にコルテリンＡを局在的に発現させるために操作されてよい。免疫抑制剤の全身注入は、他の日和見性感染症のリスクにより、これらの条件を有する宿主に対して使用できない。血管拡張剤及びエンドペプチダーゼについて、このようなＮＫ細胞は、灌流を改善し（Ｃｈａｕｈａｎ ＶＰ ＆ Ｊａｉｎ ＲＫ （２０１３） Ｎａｔ． Ｍａｔｅｒ． １２（１１）：９５８－９６２参照）、構造組織を損傷させ腫瘍化するために全身投与できない抗がん剤の効率的な送達を補助するために使用できる。細胞透過性カチオン性ペプチドについて、これらの標的ペプチドは、細胞内細菌を標的とするために使用できる。例えば、そのようなペプチドの部位特異的な過剰発現は、結核の強力な治療法となり得る。
上記のように、いくつかの実施形態において、エフェクタータンパク質１１２は、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、標的細胞に直接作用し得る。別の実施形態において、治療用タンパク質は、標的細胞に隣接する細胞、又は非細胞成分に作用し得る。治療用タンパク質の例は、細胞毒性タンパク質、免疫刺激タンパク質、及び免疫抑制タンパク質を含む。
遺伝子操作されたＮＫ細胞１００の遺伝子要素１０２、１０６、１１０の異なる部分はモジュールであってよく、他の部分は保存されてよい（例えば、異なる実装例においても変化しない）。例えば、いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメイン１０７、アクチュエーター要素１０６、及びシグナルペプチド１１４は定常ドメインであり、細胞外抗原結合ドメイン１０３及びエフェクタータンパク質１１２は可変ドメインである。一例として、細胞外抗原結合ドメイン１０３は異なる標的用に変更できる及び／又はエフェクタータンパク質１１２は異なるタンパク質のイン・シチュ合成を引き起こすために変更できるが、細胞内シグナル伝達ドメイン１０７、アクチュエーター要素１０６、及びシグナルペプチド１１４は異なる実装において同じままである。部分を保存しておくことにより、製造時間が短縮できる。しかしながら、実施態様はそれほど限定されず、遺伝子操作されたＮＫ細胞１００の任意の部分を変更できる。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞１００は、遺伝子要素１０２、１０６、１１０の一部又は全ての内の複数（例えば、２つ以上）を含んでよい。例えば、遺伝子操作されたＮＫ細胞１００は、複数のレセプター要素１０２、複数のアクチュエーター要素１０６、及び／又は複数のエフェクター要素１１０を含んでよい。いくつかの実施形態において、多重性は、疾患を治療又は予防するための及び／又は他の目的のための複数の治療タスクを提供するために、本明細書に記載されるように改変した複数の遺伝子操作されたＮＫ細胞（例えば、複数の細胞）を宿主に提供する形態をとる。
いくつかの実施形態において、アクチュエーター要素１０６は、エフェクター要素１１０に結合する。いくつかの実施形態において、外因性ポリヌクレオチド１０１は、レセプター要素１０２に結合するエフェクター要素１１０に結合するアクチュエーター要素１０６を含む。例えば、外因性ポリヌクレオチド配列１０１は、エフェクター要素１１０に結合し、エフェクター要素１１０の上流にあるアクチュエーター要素１０６と、レセプター要素１０２に結合し、エフェクター要素１１０の上流にあるシグナルペプチド１１４を含んでよく、シグナルペプチド１１４は、エフェクタータンパク質１１２の上流にある。
図２は、本開示に係る、遺伝子操作されたＮＫ細胞及び疾患環境にある時にトリガーされる一連のイベントの例を示す図である。遺伝子操作されたＮＫ細胞は、人工的な細胞シグナル伝達経路を使用してエフェクタータンパク質２１２を合成するため、及び／又は一連のイベント２２０をトリガーするためのリビングベクターとして使用される又はその作用し得る。２２２で示されるように、遺伝子操作されたＮＫ細胞２００は、抗原提示標的細胞との相互作用時に、イン・シチュにおいて、操作されたエフェクタータンパク質２１２を合成する。
上記のように、遺伝子操作されたＮＫ細胞２００は、細胞外抗原結合ドメイン２０３、膜貫通ドメイン２０５、及び細胞内シグナル伝達ドメイン２０７をコードするレセプター要素２０２と、転写因子結合部位（例えば、ＮＦＡＴ）をコードするアクチュエーター要素２０６と、エフェクタータンパク質２１２及び任意にシグナルペプチド２１４をコードするエフェクター要素２１０とを備える。遺伝子操作されたＮＫ細胞２００は、シス配置される３つの定常ドメイン（例えば、アクチュエーター要素２０６、シグナルペプチド２１４、膜貫通ドメイン２０５及び細胞内シグナル伝達ドメイン２０７等のレセプター要素２０２の一部）及び２つの可変ドメイン（例えば、「センサー」と表示される抗原結合ドメイン２０３、及びエフェクタータンパク質２１２）を含む単一のプラスミド（例えば、それぞれを含む単一の構築物）を備えてよい。
定常ドメインは、遺伝子操作されたＮＫ細胞２００に機能性を提供するように構成されてよい。定常ドメインは、細胞内シグナル伝達経路の一部を形成し、エフェクター導入遺伝子を細胞外空間２２３に輸送することを補助するシグナルペプチド２１４に融合したエフェクター導入遺伝子（例えば、エフェクタータンパク質２１２）をアップレギュレートするためにカルシウム依存性転写機械（例えば、アクチュエーター要素２０６）を動員する膜貫通分子（例えば、膜貫通ドメイン２０５）を含む。
可変ドメインは、様々な異なる疾患、標的細胞、治療、及び／又は他の用途への遺伝子操作されたＮＫ細胞２００の適用可能性を担う。例えば、可変ドメインは、遺伝子操作されたＮＫ細胞２００に特定の疾患に対する特異性を付与できる。可変ドメインは、ペプチド－主要組織適合性複合体、及びエフェクター導入遺伝子（例えば、エフェクタータンパク質２１２）から独立して標的細胞（例えば、「疾患細胞」と表示）上の抗原バイオマーカーを識別するための可変重光（ＶＨ－ＶＬ）鎖（例えば、レセプター要素２０２の「センサー」として表示される抗原結合ドメイン２０３）を含んでよい。可変ドメインは、モジュール式である。例えば、抗原結合ドメイン２０３は、遺伝子操作されたＮＫ細胞２００を再プログラムして、異なる細胞ベースの疾患に特異的なバイオマーカーを標的とするように交換又は修正できる。別の例として、エフェクタータンパク質２１２は、遺伝子操作されたＮＫ細胞２００を活性化した病理を中和し、ＮＫ細胞の生来の細胞溶解活性によりさらに強化される既製のリビングベクターを本質的に作成するため等、異なる治療用導入遺伝子と交換又は修正できる。
いくつかの実施形態において、レセプター要素２０２は、ＣＡＲをコードする。ＣＡＲの特徴には、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、非ＭＨＣ制限的な方法で選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再誘導させる能力が含まれる。少し意外なことに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞にもそのような能力を同様に提供する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞に、抗原処理とは無関係に抗原を認識する能力を与え、従って、腫瘍脱出の主要なメカニズムを回避する。図２を参照すると、膜貫通型ＣＡＲの発現は、遺伝子操作されたＮＫ細胞２００が、標的細胞の表面上に発現する標的抗原を感知して結合することを可能にする。ＣＡＲと標的細胞上の標的表面抗原との結合は、遺伝子操作されたＮＫ細胞２００を活性化し、操作されたレポーター、イメージング、及び／又は治療タンパク質等のエフェクタータンパク質２１２の発現につながる活性化カスケードをトリガーする。例えば、エフェクタータンパク質２１２の発現は、標的細胞上に提示された抗原に対する膜貫通型受容体の結合に応答して、ＮＫ細胞２００活性化カスケードの一部として自律的に発現する。
より具体的には、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＮＫ細胞２００は、ＣＡＲを介して特定の抗原と結合し、これに応答してＮＫ細胞２００に信号が伝達され、その結果、ＮＫ細胞２００が活性化される。ＣＡＲを発現するＮＫ細胞２００の活性化は、標的細胞の種類及びＣＡＲの細胞内ドメインにより変化し、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認できる。例えば、活性化されたＮＫ細胞２００から細胞傷害性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子、リンパ毒素等）が放出されると、抗原を発現する標的細胞が破壊される。さらに、サイトカインの放出及び細胞表面分子の変化は、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージ等を刺激する。
図２により示されるように、遺伝子操作されたＮＫ細胞２００にトリガーされる又は関連するイベント２２０の配列の例は、（１）ＮＫ細胞２００の疾患環境への活発な移動、（２）ＮＫ細胞２００表面上のＣＡＲの標的細胞の抗原への関与、（３）ＮＫ細胞の活性化、（４）ＮＦＡＴを介してシグナルペプチド２１４を備えるエフェクタータンパク質２１２のアップレギュレーション、（５）シグナルペプチド２１４の切断及びエフェクタータンパク質２１２の細胞外空間２２３への輸送、（６）抗原刺激による病状に応じた細胞拡大を調節するサイトカインの調節、を含む。
図３は、本開示に係る、疾患環境における遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団の例を示す図である。集団３３１は、複数の遺伝子操作されたＮＫ細胞３００－１、３００－２、３００－３、３００－４、３００－５、３００－６、３００－Ｎ（本明細書において、参照を容易にするために「遺伝子操作されたＮＫ細胞３００」として概して参照する）を含むことができる。遺伝子操作されたＮＫ細胞３００の各々は、図１の遺伝子操作されたＮＫ細胞１００と少なくとも実質的に同じ特徴及び要素を含んでよく、その詳細は繰り返さない。
図３に示される例において、環境は、疾患環境と呼称できる、（複数の）標的細胞３３２を含む（存在する）細胞外空間３３０である。遺伝子操作されたＮＫ細胞３００の集団３３１は、ＣＡＲの抗原結合ドメインを介して（複数の）標的細胞３３２の抗原に結合してよい。結合に応答して、遺伝子操作されたＮＫ細胞３００は、活性化し、それに応答して、（複数の）標的細胞３３２の存在に基づく較正量のエフェクタータンパク質を合成及び分泌してよい。例えば、エフェクタータンパク質の較正量は、細胞外空間３３０又はサンプル中等の複数の（宿主）細胞中に存在する標的細胞３３２の量の関数である。上記のように、エフェクタータンパク質の較正量は、標的細胞３３２の量に比例してよい。細胞外空間３３０は遺伝子操作されたＮＫ細胞３００及び標的細胞３３２を示すが、細胞外空間３３０及び複数の（宿主）細胞は、他の非細胞成分のうち、他の正常細胞及び／又は病的細胞をさらに含んでよい。
図４は、本開示に係る、複数の細胞を遺伝子操作されたＮＫ細胞に接触させる方法の例を示す。方法４４０は、図１により示される遺伝子操作されたＮＫ細胞１００及び／又は図３により示される遺伝子操作されたＮＫ細胞３００の集団３３１を使用して実施できる。
４４２において、方法４４０は、複数の細胞を遺伝子操作されたＮＫ細胞と接触させることを含む。細胞は、サンプルに接触させる、又は遺伝子操作されたＮＫ細胞を患者等の宿主に投与することにより接触させることができる。遺伝子操作されたＮＫ細胞は、図１の遺伝子操作されたＮＫ細胞１００により上記において説明されたものと実質的に同じ特徴及び成分の少なくともいくつかを含むことができる、その詳細は繰り返さない。
４４４において、複数の細胞を遺伝子操作されたＮＫ細胞に接触させ、複数の細胞内に標的細胞が存在することに応答して、方法４４０は、レセプター要素を標的細胞の表面上の抗原に結合させることを含む。標的細胞を含む複数の細胞は、宿主の細胞（例えば、宿主細胞及び標的宿主細胞）を含んでよい。
４４６において、（ＣＡＲの）抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、方法４４０は、アクチュエーター要素によるエフェクター要素の発現（例えば、転写及び翻訳）を開始してエフェクタータンパク質及びシグナルペプチドを合成し、シグナルペプチドによりエフェクタータンパク質を分泌させることを含む。いくつかの実施形態において、方法４４０は、ＣＡＲの抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、ＮＫ細胞を活性化させ、それに応答して、標的細胞の存在に基づいて較正量のエフェクタータンパク質を合成及び分泌することをさらに含んでよい。上記のように、エフェクタータンパク質の較正量は、環境中の複数の細胞内に存在する標的細胞の量の関数（例えば、比例）であってよい。
いくつかの実施形態において、方法４４０は、エフェクタータンパク質の発現を検出することをさらに含む。エフェクタータンパク質の検出可能な発現は、標的細胞の存在を示してよい。いくつかの実施形態において、上記のように、エフェクタータンパク質は、治療用タンパク質を含む。治療用タンパク質は、標的細胞を殺す等、標的細胞に直接作用してよい。例えば、方法４４０は、治療用タンパク質により標的細胞を中和することを含んでよい。別の実施形態において、治療用タンパク質は、追加的及び／又は代替的に、炎症反応のため及び寒冷腫瘍に浸潤するために他の免疫細胞が従うことのできる走化性勾配を提供する等、標的細胞に隣接する細胞又は非細胞成分に作用してよい。
様々な実施形態は、図１の遺伝子操作されたＮＫ細胞１００及び／又は図３の遺伝子操作されたＮＫ細胞３００の集団３３１等の、遺伝子操作されたＮＫ細胞と、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物を対象とする。
例えば、医薬組成物等のＮＫ細胞組成物は、本明細書に記載の複数の遺伝子操作されたＮＫ細胞と、許容される担体、希釈剤、又は賦形剤（例えば、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はそれらの組合せ）とを含んでよい。このような組成物を作製する手段は、当技術分野で記載される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ Ｅｄ．， Ｍａｃｋ， ｅｄ． （１９８０）を参照）。好ましくは、組成物は、生体へＮＫ細胞を投与することを容易にするために調製される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の複数の遺伝子操作されたＮＫ細胞と、例えば平衡塩溶液、好ましくはハンクスの平衡塩溶液、又は通常の生理食塩水とを含む。
いくつかの実施形態は、図１の遺伝子操作されたＮＫ細胞１００により説明されるような成分及び特徴を含むようにＮＫ細胞を遺伝子操作又は改変する等の遺伝子操作されたＮＫ細胞を形成する方法を対象とする。
本明細書に提供される遺伝子操作されたＮＫ細胞及び細胞組成物は、様々なイン・ビトロ、エクス・ビボ、及びイン・ビボ用途において使用するために有利な特性を有する。例えば、本明細書で提供されるＮＫ細胞及び細胞組成物のイン・ビトロ用途は、限定されないが、標的細胞の表面上に発現する抗原に基づいて標的細胞を検出することを含む。標的細胞は、癌細胞（例えば、腫瘍細胞）、ウイルス又は細菌等の病原体に感染した細胞、自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病、狼瘡）に関連する細胞型、アルツハイマー病、ＡＬＳ、又はハンチントン病等の神経変性疾患に関連する細胞型であってよい。また、標的（宿主）細胞は、非罹患（宿主）細胞と比較して罹患（宿主）細胞が細胞表面抗原の異常発現を有する他の病態に関連する細胞型であってもよい。遺伝子操作されたＮＫ細胞又は細胞組成物をイン・ビトロ標的細胞検出のために使用する方法について、以下に説明する。
本明細書で提供される遺伝子操作されたＮＫ細胞及び細胞組成物のエクス・ビボ用途は、限定されないが、疾患標的細胞の表面上に発現する抗原に基づいて同定された疾患標的細胞の早期疾患検出及びコンパニオン診断又は治療用途が含まれる。例えば、ＮＫ細胞は、癌免疫療法のコンパニオン診断におけるエクス・ビボ用途に使用できる。例として、ＮＦＡＴ＿ＲＥ６Ｘ→Ｎｌｕｃ－２Ａ－ＧＦＰで操作されたＮＫ細胞は、異なる種類のＣＡＲを発現するように操作されてよい。非特異的Ｎｌｕｃの発現に対するＣＡＲが標的抗原に関与した時のＮｌｕｃの発現は、意図しないオフターゲット効果に対する意図したオンターゲット効果を引き起こす効率についての各ＣＡＲの比較的・定量的頑健性の情報を示す。エクス・ビボ治療用途において遺伝子操作されたＮＫ細胞又は細胞組成物を使用するための方法が、以下にさらに記載される。遺伝子操作されたＮＫ細胞及び細胞組成物の他のエクス・ビボ用途は、限定されないが、感染症、自己免疫疾患、神経変性疾患、及び影響を受けていない（宿主）細胞に対する細胞表面抗原の異常な発現に関連する他の細胞ベースの病理を治療するための細胞療法のコンパニオン診断のための用途を含む。
本明細書に提供される遺伝子操作されたＮＫ細胞及び細胞組成物のイン・ビボ用途は、限定されないが、疾患部位のイン・ビボイメージング、疾患部位（例えば、卵巣癌の標的療法）又は病原体の感染部位（例えば、デングウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、黄熱、ＨＩＶ、又は肝炎ウイルス（例えばＨｅｐＢ、ＨｅｐＣ）に感染した細胞に対する標的療法）における局所療法のための方法を含む。
様々な実施形態は、（他の相違点の中でも）異なるエフェクタータンパク質及び／又は細胞外抗原結合ドメインで操作された複数のＮＫ細胞等の異なる種類の遺伝子操作されたＮＫ細胞のパネルを対象とし、これらは、異なる細胞を同時に標的化する及び／又は異なるエフェクタータンパク質を同時に分泌するために使用される。
いくつかの実施形態において、標的細胞を検出する方法は、（ａ）遺伝子操作されたＮＫ細胞を細胞集団に接触させることと、（ｂ）エフェクタータンパク質の発現を検出することと、（ｃ）レポータータンパク質の発現を検出することと、を含み、エフェクタータンパク質の検出可能な発現は、目的の標的細胞の存在を示す。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＦＡＴ応答要素及びレポータータンパク質を含み、接触させた細胞集団中の標的細胞の存在下において、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、標的細胞上の表面分子抗原に結合し、ＮＦＡＴ応答エレメントを活性化させ、レポータータンパク質の検出可能な発現は、標的細胞の存在を示す。
いくつかの実施形態において、検出された標的細胞は癌細胞であり、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、標的細胞上の癌細胞特異的表面抗原と結合する。別の実施形態において、検出された標的細胞は、例えば、ジカウイルス感染細胞等のウイルス感染宿主細胞である。いくつかのそのような実施形態において、ウイルス感染細胞上に発現した表面分子抗原は、ジカウイルス特異的エンベロープ糖タンパク質（Ｅｇｐ）であってよい。例えば、ＣＡＲの抗原認識部分は、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、及び黄熱ウイルス（ＹＦＶ）等の異なるウイルス病原体を定量的に評価するように改変又は交換される。いくつかの実施形態において、方法は、感染宿主細胞の翻訳機械を利用し、ウイルスＲＮＡを、本明細書に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞により検出可能なウイルス特異的抗原に加工する。
いくつかの実施形態は、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＮＫ細胞を治療薬として使用して疾患を治療又は予防する方法を対象とする。例えば、本明細書は、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＮＫ細胞を活性治療薬として投与することを含む方法である。ＣＡＲを発現するＮＫ細胞が投与される疾患は、当該疾患がＮＫ細胞に対する感受性を示す限り、特に限定されない。疾患の例は、癌（例えば、血液癌（白血病）、固形癌）、炎症性疾患／自己免疫疾患（例えば、喘息、湿疹）、肝炎、並びにジカウイルス、インフルエンザ、及びＨＩＶ等のウイルス、細菌、又は真菌を原因とし、例えば、結核、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌感染症（ＶＲＥ）、及び深在性真菌症等の感染症である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＮＫ細胞は、上記の疾患の治療のために低減又は排除することを目標とする標的細胞の表面上に発現する腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原等である抗原に結合し、このような疾患を治療又は予防するために投与される。本明細書で使用される「治療する」、「予防する」という用語及びそれに由来する言葉は、必ずしも１００％又は完全な治療又は予防を意味しない。むしろ、当業者が潜在的な有益又は治療効果を有すると認識する治療又は予防の程度は様々である。この点、本明細書に記載の方法は、哺乳動物における癌の治療又は予防を任意のレベル、任意の量で提供できる。さらに、例示的な方法により提供される治療又は予防は、治療又は予防される例えば癌等の状態又は症状の１つ以上を治療又は予防を含んでよい。また、本明細書では、「予防」は、疾患、その症状又は状態の発症を遅らせることを包含してよい。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、本明細書に記載の適切な遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物、及び担体、希釈剤又は賦形剤として、それを必要とする宿主（例えば、対象者）に投与される。宿主に改変ＣＡＲ発現細胞を提供する任意の適切な方法を、本明細書に記載の方法に使用してよい。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞を宿主に提供する方法は、ドナー由来の免疫細胞をヒト宿主に注入するための細胞療法及び養子免疫療法の臨床プロトコルから適応させてよい。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法に適する適応された臨床プロトコルは、宿主からＮＫ細胞を取得することと、本明細書に記載のＣＡＲ及びＮＦＡＴ－ＲＥ制御タンパク質導入遺伝子を発現するようにＮＫ細胞を遺伝子操作（例えば、改変）することと、遺伝子操作したＮＫ細胞を宿主に注入して戻すこととを含む。本明細書で使用される宿主は、ヒト、動物（例えば、哺乳類、爬虫類、鳥類）、昆虫、植物等の任意の生物を含む及び／又は指し、これらは研究又は試験の対象及び／又は患者となり得る。
本明細書で提供される遺伝子操作されたＮＫ細胞の投与は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内、又は求心性リンパ管への投与、非経口投与、例えば注射又は注入による投与等の任意の適切な経路により投与することができるが、これらに限定されない。遺伝子操作されたＮＫ細胞又はそのようなＮＫ細胞の集団が投与されるいくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、哺乳動物等の宿主に対して同種又は自家由来である細胞であってよい。好ましくは、ＮＫ細胞は、宿主に対して自家由来である。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞が提供される宿主は、腫瘍クリアランスの増加（例えば、改善、より強固な）に関して監視又は評価される。従って、様々な実施形態は、癌治療に使用される方法を対象とする。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞が提供される宿主は、特定の抗原を発現する細胞のクリアランスについて監視又は評価される。
いくつかの実施形態は、目的の病原体の細胞ベースの治療又は予防のための方法を対象とする。そのような方法のために、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、検出可能なレポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の代わりに又はそれに加えて、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、細胞外輸送を補助するポリヌクレオチド配列の３’末端にシグナルペプチド（ｓｅｃ）と融合される。カスケードエフェクターＮＫ細胞活性化イベント及びＮＦＡＴ応答要素の活性化がトリガーされると、治療用タンパク質の発現が誘発される。方法は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞、感染細胞）の部位における治療用タンパク質の局所的な生産、及び疾患微小環境における治療用タンパク質の細胞外分泌を含んでよい。
いくつかの実施形態は、様々な用途における感知技術として遺伝子操作されたＮＫ細胞を使用するための方法を対象とする。例として、例えば、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）等の新興フラビウイルス病原体の輸血を介した拡散は、深刻なリスクとして認識されてきた。献血された血液を保護するために、血液検査を含む献血者のスクリーニングが推奨されている。ＺＩＫＶに感染した場合、臨床症状が現れるのはわずか２０％であり、臨床検査室以外で使用できる信頼性の高い市販のＺＩＫＶ診断キットは存在しない。従って、感染の特定は、特に他の疾患の症状との類似性及び他のアルボウイルス（例えば、デング、チクングニア）との抗体の交差反応性を考えると、困難である。従って、本明細書は、目的のウイルスに特異的な抗原を検出し結合するための抗原結合ドメインを有するＣＡＲを含む遺伝子操作ＮＫ細胞を、目的のウイルスに感染した細胞を含む又は含む疑いのあるサンプルと、目的のウイルスに感染した細胞の存在を知らせるＮＦＡＴ－ＲＥ制御レポーター導入遺伝子とに接触させることを含む方法である。
本明細書に記載の遺伝子操作されたＮＫ細胞の追加の用途は、以下を含む。
抗癌化学療法プロドラッグを腫瘍部位に標的化するために、遺伝子操作されたＮＫ細胞に酵素的に活性化可能なプロドラッグを装填でき、薬剤活性化酵素は腫瘍部位でのみ合成されるため、プロドラッグを局所的にその活性形態に変換することができる。いくつかの実施形態において、プロドラッグはＮＫ細胞には装填されず、遺伝子操作されたＮＫ細胞の注入に続いて複数回投与されてよい。代替的に、プロドラッグは、イメージングナノ粒子又は活性薬物送達の画像誘導手段の他の手段に結合してよい。プロドラッグをイメージングナノ粒子に結合させる又はイメージング導入遺伝子を発現するようにＮＫ細胞を操作することにより、操作されたＮＫ細胞は、手術の準備において患者の適切な病期分類を導き、細胞還元手術を補助するために腫瘍縁を視覚的に識別及び／又はイメージングすることができる。
いくつかの実施形態は、化学療法剤を疾患の部位（例えば、腫瘍塊、自己免疫疾患の部位）に局所的に送達する方法であって、遺伝子操作されたＮＫ細胞を宿主細胞集団に接触させることを含む方法を対象とし、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、（ｉ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする外因性ポリヌクレオチド配列と、（ｉｉ）酵素をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結するＮＦＡＴ応答要素とを含み、接触した細胞集団中の標的宿主細胞の存在下において、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、標的宿主細胞上の表面分子抗原に結合し、ＮＦＡＴ応答要素を活性化して酵素の発現を開始させ、酵素は、この酵素により活性化するように予め設計されるプロドラッグに作用し、その疎水性に起因する膜透過性を使用して疾患部位に放出される。
癌を治療するための外科的介入について、遺伝子操作されたエフェクターＮＫ細胞は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ変種）又は生物発光酵素（例えば、ルシフェラーゼ）等の検出可能なレポータータンパク質の発現を介して、腫瘍マージンの可視化及び／又はイメージングに使用できる。例えば、このような遺伝子操作されたＮＫ細胞は、外科的切除を補助するために腫瘍縁をマークすること、及び残存する陽性腫瘍マージンを識別することのために使用できる。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、腫瘍特異的ＣＡＲ ＮＫ細胞が腫瘍細胞上の抗原に関与した時に発現するイメージング酵素（例えば、チミジンキナーゼは放射性プローブあるいはその他の検出可能なプローブを捕捉でき；光音響イメージング又は磁気共鳴イメージングにより検出されるチロシナーゼ）の発現に基づいて腫瘍を非侵襲的に検出及びイメージングするために用いられる。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、フラビウイルスに対するワクチンに関連する安全性の懸念を回避するために使用されてよい。例えば、４つの異なるデングウイルス血清型間の抗原多様性は、抗体媒介免疫の欠如の原因であり、複数の連続して感染する可能性がある。一次感染では抗体が有効であるが、二次感染ではその中和度が低下し、急性期の大きな感染細胞塊に対して補体系を活性化させ、出血熱を増悪させることが分かっている。また、先にデング熱に感染しているとジカ熱の感染を悪化させることも判明している。上記のように、ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した細胞の表面上に発現するウイルスＥ糖タンパク質（Ｅｇｐ）を検出するとヒト又は非ヒト又は合成由来の抗ウイルスタンパク質を発現するように操作できるため、ＮＫ細胞を使用することにより、フラビウイルスに関するこれらの安全性に関する懸念を回避できる。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、標的癌細胞上の癌特異的抗原（例えば、子宮頸癌の場合、ＨＰＶ Ｅ６又はＥ７抗原）を検出するＣＡＲと、上記のようなレポータータンパク質の発現を駆動するＮＦＡＴ－ＲＥとを含む。このような実施形態は、癌の早期発見に利用できる。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、病原体感染細胞上の抗原を検出するＣＡＲ（例えば、ジカウイルス又はデングウイルス感染細胞上のＺＩＫＶ又はＤＥＮＶ Ｅ糖タンパク質を検出）と、レポーターポリペプチドの発現を誘導するＮＦＡＴ応答要素と、を含む。このような実施形態は、新興病原体（例えば、ジカウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス）の存在を検出する輸血医療に使用できる。
意図しない副作用を示すことなく意図した治療効果を発揮する細胞ベース療法のために、信号対雑音比を検出及び測定し、適切なＣＡＲを選択させる、ＮＦＡＴ－ＲＥ制御レポーターを備える遺伝子操作されたＮＫ細胞において、異なるＣＡＲを使用できる。
哺乳類細胞は、内部Ｃａ２＋貯蔵を動員するグルコース感知ＧＰＣＲ（ＧＰＲ１）と、操作されたインスリンを発現するように制御されたＮＦＡＴ応答要素と、を含む操作されたＮＫ細胞であってよい。このような操作されたＮＫ細胞は、グルコースを感知してインスリンを自律的に合成するために使用できる。このような実施形態は、β細胞置換療法に使用できる。
他の非限定的な遺伝子操作されたＮＫ細胞の使用例は、以下の：ｉ）外科的切除を補助又は疾患の進行／退行を監視するための疾患微小環境の位置のイメージング；ｉｉ）疾患細胞を殺すための細胞毒性；ｉｉｉ）Ｔ細胞の持続性を高めるための増殖；ｉｖ）他の免疫細胞を補充するための免疫刺激；ｖ）他の免疫細胞を補充するためのケモカイン；ｖｉ）局所的な免疫抑制微環境を作り出すための免疫抑制；及びｖｉｉ）組織の治癒を高めるための再生、を含む。
本明細書で使用されるように、標的細胞（本明細書において、しばしば「宿主の標的細胞」、「目的の標的細胞」、「疾患細胞」、又は「標的疾患細胞」と互換的に呼称される）は、生体（例えば、目的の生体成分）に関連する目的の細胞を含む及び／又は指す。標的細胞の抗原は、レセプター要素の抗原結合ドメインが結合できる（例えば、親和性を有する）標的細胞の構造（例えば、結合部位）を含む及び／又は指す。ＮＫ細胞は、ヒト及び非ヒト細胞等の様々な異なる種類の細胞から取得可能であり、本明細書において「ソース」と呼称することもある。本明細書で使用されるように、「遺伝子改変」及び「遺伝子操作」という用語は、互換的に使用され、挿入に使用される方法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含む原核細胞又は真核細胞を含む及び／又は指す。いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞は、人の手により（例えば、組換えデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）技術を使用して）作成又は改変された、又は（例えば、転写、翻訳等により）そのような分子に由来する、非自然発生核酸分子を含むように改変される。外因性、組換え、合成、及び／又はその他の方法で改変されたポリヌクレオチドを含むＮＫ細胞は、遺伝子操作されたＮＫ細胞であるとみなされる。
本明細書で使用されるように、「核酸」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」を含む及び／又は指し、一般に、ＤＮＡ又はリボ核酸（ＲＮＡ）のポリマーを意味し、これらは、一本鎖又は二本鎖であり得、合成される又は天然源から得られる（例えば、天然源から単離及び／又は精製）、天然、非天然、又は改変されたヌクレオチドを含んでよく、非改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりにホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合等の天然、非天然、又は改変したヌクレオチド間結合を含んでよい。いくつかの実施形態において、核酸は、いかなる挿入、欠失、逆位、及び／又は置換も含まない。しかしながら、本明細書において説明されるように、いくつかの実施態様において、核酸が１つ以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことは好適であり得る。いくつかの実施形態において、核酸は、ＣＡＲ及びポリヌクレオチドの機能に影響を与えず、宿主細胞による核酸の発現時に翻訳されてもされなくてもよい、追加のアミノ酸配列をコードし得る。
核酸は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．２８０－２８１ （１９８２）及び／又は米国特許出願公開第ＵＳ２００２／０１９０６６３号に記載されているものを含む、任意の適切な方法を使用して取得されてよく、これらの各々は、その教示のために全体が本明細書に完全に組み込まれる。生物学的サンプルから得られた核酸は、典型的には、分析に適した断片を生成するために断片化される。
核酸及び／又は他の部位は、単離されてよい。本明細書で使用されるように、「単離された」とは、天然に存在する供給源に由来するか合成的に作られるかにかかわらず、通常関連する成分の少なくとも一部から、全体的又は部分的に分離することを含む及び／又は指す。本発明の核酸及び／又は他の部位は、精製できる。本明細書で使用されるように、「精製された」は、他の大多数の化合物又は実体から分離されたものを含む及び／又は指す。化合物又は部位は、部分的に精製することも、実質的に精製することも可能である。純度は、重量基準で示すことができ、質量分析、ＨＰＬＣ等の様々な分析技術を使用して決定できるが、これらに限定されない。
遺伝子操作されたＮＫ細胞を生成し、ＮＫ細胞の機能性を特徴付けるために、多くの実験的な実施形態を実施した。遺伝子操作されたＮＫ細胞を生成するために使用された構築物の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７に記載されるヌクレオチド配列を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７はそれぞれ合成ＤＮＡである。
図５Ａ乃至５Ｄは、様々な実施形態に係る、ＦＲα及びＭＳＬＮ抗原に対する特異性を備える遺伝子操作されたＮＫ細胞機能の特徴付けの例を示す。ＦＲα及びＭＳＬＮは、複数のヒト癌で過剰発現し、正常組織では限定的に発現する抗原である。実験的な実施形態において、ＦＲα及びＭＳＬＮを内因的に過剰発現するＯＶＣＡＲ３ヒト卵巣癌細胞を標的細胞として使用した。Ａ２７８０ｃｉｓヒト卵巣癌細胞を、非標的ネガティブコントロールに使用した。Ａ２７８０ｃｉｓヒト卵巣癌細胞は、ＦＲα及びＭＳＬＮの発現を欠いている。細胞外抗原結合ドメイン（しばしば「センサードメイン」と呼称される）について、ヒトにおける発現にコドン最適化された抗ＦＲα抗体（ＭＯＲＡｂ－００３）及び抗ＭＳＬＮ（ＭＯＲＡｂ－００９）のＶＨ－ＶＬ配列を使用した。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｎｌｕｃ）（プロメガ株式会社）レポーター酵素を、オートクライン及びパラクリン効果を誘導するためにヒト又は非ヒトタンパク質又はペプチドにより置換可能なエフェクタードメイン（例えば、エフェクタータンパク質）を表すために使用した。
図５Ａは、遺伝子操作されたＮＫ細胞の抗原指向性機能応答における定常ドメインの役割を示す図である。最適に構成された人工細胞－シグナル経路は、アクチュエーター要素の核因子（例えば、ＮＦＡＴ）のコピー、そして細胞内共刺激ドメイン（例えば、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン）及びシグナルペプチドに関連する。実験的な実施形態において、定常ドメインをＦＲα特異的結合ドメインと組み合わせ、ＮＫ細胞が、非標的細胞であるＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇＡ２７８０ｃｉｓ細胞には反応しないが、ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋ＯＶＣＡＲ３標的細胞の表面上の標的リガンドに関与すると、エフェクタータンパク質を合成し放出することを示した。凡例で定義されるシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は、遺伝子操作されたＮＫ細胞の特異性を定量化する。細胞外空間におけるエフェクタータンパク質の放出するシグナルペプチドの機能を、完全に組み立てられた遺伝子操作されたＮＫ細胞とシグナルペプチドを欠く対照ＮＫ細胞とのＮｌｕｃ活性を比較することにより定量化した。シグナルペプチド（セクレター等）の存在は上清中のＮｌｕｃの蓄積と強固に相関し（ｐ＜０．０００１）、その不存在は細胞ペレット中のＮｌｕｃ構築と関連していた（ｐ＜０．０００１）。同様に、人工的な細胞シグナル伝達経路を制御し、標的細胞の特異性を誘導するレセプター要素（レセプター要素の一部であるセンサー又は細胞外抗原結合ドメイン）の機能を、レセプター要素を有するもの及び有さないものの２つのＮＫ細胞の細胞ペレットにおけるＮｌｕｃ活性の上昇を評価することにおり定量化した（ｐ＜０．０００１）。
図５Ｂは、ＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞からのエフェクタータンパク合成の動態を示す。エフェクター合成を報告するＮｌｕｃ活性は、１２５００個のＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞を２５００個のＯＶＣＡＲ３標的細胞で刺激した時、２時間（２時間で約２のＳ／Ｎ；６時間で約３．３のＳ／Ｎ、ｐ＜０．０００１）の早さで上昇した。この活性は２４時間以内に安定化し、少なくとも９６時間まで継続した。
図５Ｃは、ＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞からのエフェクタータンパク質の活性を標的細胞質量の関数として示す（ＮＫ細胞＝１２５００で収集したデータ）。低い標的／非標的数では刺激された遺伝子操作されたＮＫ細胞における標的細胞に誘導されたＮｌｕｃ活性は検出できなかったが、標的細胞数の増加とともに指数関数的に増加し、２５０００の細胞数超において非標的細胞で刺激されると、統計的に有意に異なり、例えばＥ：Ｔ≦５：１（ｐ＜０．０５であった。これは、遺伝子操作されたＮＫ細胞の用量が疾患負担に比例してスケールアップする必要がないことを立証し、遺伝子操作されたＮＫ細胞がイン・シチュにおいてエフェクタータンパク質の合成を自己制御できることを示す。
ＮＫ細胞を異なる標的抗原に再誘導できることを示すために、ＭＳＬＮ特異的ｓｃＦＶからのセンサードメイン（例えば、抗原結合ドメイン）を、ＦＲα特異的ｓｃＦＶ配列と交換した。図５Ｄに示されるように、２５時間の期間にわたり同じ数のＯＶＣＡＲ３標的細胞により刺激された場合、ＦＲα特異的ＮＫ細胞におけるＮｌｕｃ活性は、ＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞（１２５００個のエフェクター細胞及び２５００個の標的細胞、例えば、Ｅ：Ｔ＝５：１）と比較して、有意にアップレギュレートされていることが確認された。これは、改変されたＴ細胞で観察されたＭＳＬＮ特異性及びＦＲα特異性と同様又はそれらよりも高く、ＭＳＬＮ発現と比較して、ＯＶＣＡＲ３細胞上のＦＲαの発現が高いことに起因していると思われる。あるいは、ＭＳＬＮ特異的な人工細胞シグナル伝達経路の統合と比較して、遺伝子操作されたＮＫ細胞におけるＦＲα特異的な人工細胞シグナル伝達経路の統合が高いことに起因する可能性がある。異なるＥ：Ｔを用いた２４時間、４８時間、及び７２時間の追加の検証は、図８Ａ及び８Ｂによりさらに示される。
図６Ａ乃至６Ｈは、本開示に係る、標的細胞及び非標的細胞に対するＭＳＬＮ特異的及びＦＲα特異的な遺伝子操作されたＮＫ細胞の細胞溶解機能の例を示す。より詳細には、ＦＲα＋ＭＳＫＢ＋ＯＶＣＡＲ３標的細胞及びＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇＡ２７８０ｃｉｓ非標的細胞に対するＭＳＬＮ特異的及びＦＲα特異的なＮＫ細胞の細胞溶解機能を示す。標的細胞及び非標的細胞を、イン・ビトロ及びイン・ビボにおける生存率に関する６０．６ｋＤＡ、ＡＴＰ依存性の生物発光レポーターであるＬｕｃ２（登録商標）（ホタルルシフェラーゼ）（プロメガ株式会社）を発現するように操作した。
図６Ａ及び６Ｂは、６時間のＯＶＣＡＲ標的細胞との共培養におけるＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞（例えば、図６Ａ）及びＦＲα特異的ＮＫ細胞（例えば、図６Ｂ）の細胞溶解活性を示し、これは、非標的細胞に対するものと比較して統計的に著しく高い（図６Ａは０．９４：１以上の全てのＥ：Ｔでｐ＜０．０５を示し、図６Ｂは３．７５：１以上のすべてのＥ：Ｔでｐ＜０．０５を示した）。標的特異的細胞溶解効率を定義するパラメータη（Ｅ：Ｔ）５０を、遺伝子操作されたＮＫ細胞と６時間共培養した時の標的細胞又は非標的細胞のＬｕｃ２活性が、それぞれの正規化Ｌｕｃ２活性の最大値と最小値との差の５０％になるＥ：Ｔとして決定した。非標的Ａ２７８０ｃｉｓ細胞のη（Ｅ：Ｔ）５０は、標的ＯＶＣＡＲ３細胞のそれよりも高かった（ＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞では約６．５倍、ＦＲα特異的ＮＫ細胞では約２．５倍）。
図６Ｃ及び６Ｄは、Ｅ：Ｔ＝０．９４：１におけるＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞（例えば、図６Ｃ）及びＦＲα特異的ＮＫ細胞（例えば、図６Ｄ）の細胞溶解活性を時間の関数として示す。ＯＶＣＡＲ（標的）細胞の殺傷は、Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞の殺傷と比較して、再び統計的に高かった（全ての共培養期間において図６Ｃ及び６Ｄ ｐ＜０．０５）。Ｔｉｍｅ５０を、Ｅ：Ｔ＝０．９４：１においてＮＫ細胞と共培養した時に標的細胞又は非標的細胞のＬｕｃ２活性が、それぞれの正規化Ｌｕｃ２活性の最大値と最小値との差の５０％になった刺激期間として決定した（なお、各時点におけるＬｕｃ２活性は正規化され、１００％＝ＮＫ細胞の使用なし（ネガティブコントロール）、０％＝０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ポジティブコントロール）である）。平均値の差は２４時間でより顕著になり、より長い期間では再び減少し、非特異的細胞溶解活性の累積的な増加を可能にした。この効果は、図９Ａ乃至９Ｆによりさらに示される。
図６Ｅ及び６Ｆ並びに６Ｇ及び６Ｈは、それぞれ、ＯＶＡＲ３（標的）細胞及びＡ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞と６時間及び２４時間共培養した時の異なるＥ：ＴにおけるＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞（例えば図６Ｅ、６Ｇ）及びＦＲα特異的ＮＫ細胞（例えば図６Ｆ、６Ｈ）の細胞溶解活性を示す。Ｅ：Ｔが低いほど、共培養時間が長くても十分な細胞溶解効果が得られ、この効果はイン・ビボにおいても観察された。従って、Ｅ：Ｔと標的特異的な細胞溶解効果とが観察される期間は、イン・ビトロアッセイを設計する際に慎重にバランスを取る必要がある。より大きなＥ：Ｔの範囲における追加の検証を以下に示す。
ＮＫ－９２ＭＩは臨床に関連する細胞株であり、ヒトへの注入前に１０グレイ（Ｇｙ）で細胞を照射した。これにより、さらなる増殖が停止し、細胞は非発癌性となった。最大１００億個のＮＫ細胞／ｍ２が安全にヒトに注入され、深刻な副作用はなかった。しかしながら、ＤＮＡ損傷はアクチュエーター及びエフェクター要素の配列を破壊する可能性があり、遺伝子操作されたＮＫ細胞が機能しなくなる危険性がある。
図７Ａ乃至７Ｄは、本開示に係る、遺伝子操作されたＮＫ細胞の人工細胞シグナル伝達経路の例を示す。図７Ａ乃至７Ｄは、人工細胞シグナル伝達経路の完全性、ひいては遺伝子操作されたＮＫ細胞の完全性が、１５Ｇｙの放射線への曝露後も維持され、それにより臨床使用に対して安全であることを示す。
図７Ａは、ＦＲα特異的ＮＫ細胞からのエフェクタータンパク合成の動態を示す。エフェクタータンパク質合成を報告するＮｌｕｃ活性は、Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞と比較してＯＶＣＡＲ３（標的）細胞により刺激された場合、５時間で増加し（５時間で約３のＳ／Ｎ、ｐ＜０．０２）（１２５００個のＮＫ細胞及び２５００個の標的細胞、例えば、Ｅ：Ｔ＝５：１）、少なくとも７２時間まで指数関数的に増加した。
図７Ｂは、照射されたＦＲα特異的ＮＫ細胞からのエフェクタータンパク活性を、標的細胞質量の関数として示す。しばしばバイオファクトリーと呼称される１２５０００個のＮＫ細胞における標的細胞に誘導されたＮｌｕｃ活性は、細胞数でＡ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞と比較すると、ＯＶＣＡＲ３（標的）細胞により刺激されると統計的に上昇した（ｐ＝＜０．５０）。
図７Ｃは、同じ照射されたＦＲα特異的ＮＫ細胞からのエフェクタータンパク活性を、一定の標的／非標的細胞質量におけるそれらの数の増加の関数として示す。Ｅ：Ｔ＝０．６２５：１（２５００個の標的／非標的細胞に対して１５６２個のＮＫ細胞バイオファクトリー）を超える全ての細胞数において、Ｎｌｕｃ活性は、Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞と比較すると、２５００個のＯＶＣＡＲ３（標的）細胞により刺激されると統計的に上昇した（ｐ＝＜０．０１）。また、線量１０Ｇｙは、その細胞溶解効果の点で、臨床試験で許容されることが判明した。
図７Ｄは、１５Ｇｙで照射したＦＲα特異的ＮＫ細胞で実施した細胞溶解アッセイの結果を示す。照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＯＶＡＲ３（標的）細胞と６時間共培養した結果、Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞に対するものと比較して、標的特異的（ＯＶＣＡＲ３）細胞溶解が統計的に有意に増加（Ｅ：Ｔ＝１００：１においてｐ＜０．０５）した。
合成及び実験情報
（１）材料と試薬
レンチウイルス粒子を、完全ＤＭＥＭ［１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）及び１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液（コーニング、Ｃａｔ ＃１０－０１３－ＣＶ）により捕捉したＤＭＥＭ成長培地］中で培養したＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＲＬ－１１２６８）産生細胞において調製した。プラスミドトランスフェクションを、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ５TM試薬（ポリサイエンス社、Ｃａｔ＃２６００８－５）を使用して実施した。異なる遺伝子ペイロードをコードするプラスミド（トランスファープラスミド）を、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェア（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ）により設計し、レンチウイルスベクタープラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ＣＤ５１０Ｂ－１）にサブクローニングした。第２世代パッケージングプラスミドをコードするプラスミド（ｐｓＰＡＸ２－Ｃａｔ＃１２２６０、ｐＭＤ２．Ｇ－Ｃａｔ＃１２２５９）をＡｄｄｇｅｎｅから入手した。ｐＡｄｖａｎｔａｇｅをプロメガ株式会社から入手した（Ｃａｔ＃Ｅ１７１１）。プラスミド調製サービス（ＤＮＡ挿入配列の化学合成、各ベクターバックボーンへのサブクローニング、及び増幅）を、Ｅｐｏｃｈ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社（ミズーリ市、ＴＸ）から入手した。ＮＫ－９２ＭＩ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＲＬ－２４０８）細胞株を、完全ＮＫ－０２ＭＩ培地［ＲＰＭＩ１６４０（コーニング、Ｃａｔ＃１０－０４０－ＣＶ）、２０％ＦＢＳ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）、１ＸＧｌｕｔａＭＡＸ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃３５０５０－０６１）、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液（コーニング、Ｃａｔ＃３０－００２－ＣＩ）］中に保持した。ＯＶＣＡＲ３（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＨＴＢ－１６１）及びＡ２７８０ｃｉｓ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃９３１１２５１７）細胞株を、完全ＲＰＭＩ［ＲＰＭＩ１６４０（コーニング、Ｃａｔ＃１０－０４０－ＣＶ）、１０％ＦＢＳ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）、及び１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液（コーニング、Ｃａｔ－３０－００２－Ｃｌ）］中で維持した。Ｃａ＋２及びＭｇ＋２を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（コーニング、Ｃａｔ＃２１－０４０－ＣＶ）を、細胞の凝集を最小限に抑えるために使用した。全ての場合において、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼを選択マーカーとして使用した。ピューロマイシン二塩酸塩（ピューロマイシン）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、Ｃａｔ＃Ａ１１１３８０３）を、安定な細胞株を選択するために使用した。凍結培地は、細胞株の液体窒素ストックを維持するために、５０％熱不活性化ＦＢＳ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）、４０％ＲＰＭＩ１６４０（コーニング、Ｃａｔ＃１０－０４０－ＣＶ）、及び１０％ＤＭＳＯ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｄ２６５０）から成る。
レンチウイルス粒子を、完全ＤＭＥＭ［１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）及び１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液（コーニング、Ｃａｔ ＃１０－０１３－ＣＶ）により捕捉したＤＭＥＭ成長培地］中で培養したＨＥＫ２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＲＬ－１１２６８）産生細胞において調製した。プラスミドトランスフェクションを、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ５TM試薬（ポリサイエンス社、Ｃａｔ＃２６００８－５）を使用して実施した。異なる遺伝子ペイロードをコードするプラスミド（トランスファープラスミド）を、ＳｎａｐＧｅｎｅソフトウェア（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ）により設計し、レンチウイルスベクタープラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ＣＤ５１０Ｂ－１）にサブクローニングした。第２世代パッケージングプラスミドをコードするプラスミド（ｐｓＰＡＸ２－Ｃａｔ＃１２２６０、ｐＭＤ２．Ｇ－Ｃａｔ＃１２２５９）をＡｄｄｇｅｎｅから入手した。ｐＡｄｖａｎｔａｇｅをプロメガ株式会社から入手した（Ｃａｔ＃Ｅ１７１１）。プラスミド調製サービス（ＤＮＡ挿入配列の化学合成、各ベクターバックボーンへのサブクローニング、及び増幅）を、Ｅｐｏｃｈ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社（ミズーリ市、ＴＸ）から入手した。ＮＫ－９２ＭＩ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＲＬ－２４０８）細胞株を、完全ＮＫ－０２ＭＩ培地［ＲＰＭＩ１６４０（コーニング、Ｃａｔ＃１０－０４０－ＣＶ）、２０％ＦＢＳ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）、１ＸＧｌｕｔａＭＡＸ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃３５０５０－０６１）、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液（コーニング、Ｃａｔ＃３０－００２－ＣＩ）］中に保持した。ＯＶＣＡＲ３（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＨＴＢ－１６１）及びＡ２７８０ｃｉｓ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃９３１１２５１７）細胞株を、完全ＲＰＭＩ［ＲＰＭＩ１６４０（コーニング、Ｃａｔ＃１０－０４０－ＣＶ）、１０％ＦＢＳ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）、及び１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン溶液（コーニング、Ｃａｔ－３０－００２－Ｃｌ）］中で維持した。Ｃａ＋２及びＭｇ＋２を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（コーニング、Ｃａｔ＃２１－０４０－ＣＶ）を、細胞の凝集を最小限に抑えるために使用した。全ての場合において、ピューロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼを選択マーカーとして使用した。ピューロマイシン二塩酸塩（ピューロマイシン）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、Ｃａｔ＃Ａ１１１３８０３）を、安定な細胞株を選択するために使用した。凍結培地は、細胞株の液体窒素ストックを維持するために、５０％熱不活性化ＦＢＳ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｆ２４４２－５００ＭＬ）、４０％ＲＰＭＩ１６４０（コーニング、Ｃａｔ＃１０－０４０－ＣＶ）、及び１０％ＤＭＳＯ（シグマアルドリッチ、Ｃａｔ＃Ｄ２６５０）から成る。
（２）レンチウイルスの生成。
レンチウイルス粒子を、その教示が全体として本明細書に組み込まれるＲａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｈ、Ｊａｖｉｔｚ ＨＳ、Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｐ、題名「Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， １９００２８８ （２０２０）により説明されるように、第２世代レンチウイルスシステムを用いて対応するトランスファープラスミドをパッケージ化して調製した。
レンチウイルス粒子を、その教示が全体として本明細書に組み込まれるＲａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｈ、Ｊａｖｉｔｚ ＨＳ、Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｐ、題名「Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， １９００２８８ （２０２０）により説明されるように、第２世代レンチウイルスシステムを用いて対応するトランスファープラスミドをパッケージ化して調製した。
（３）ＮＫ細胞バイオファクトリーの作製。
９２ＭＩ懸濁細胞株を、Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｈ、Ｊａｖｉｔｚ ＨＳ、Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｐ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１９００２８８（２０２０）に記載されるような適切な（完全に組み立てられた（図２参照）又はコントロール）ＮＫ細胞バイオファクトリーを運ぶレンチウイルス粒子で遺伝子操作した。簡単に説明すると、細胞を８μｇ／ｍＬポリブレン（ａｂｍ（登録商標）、Ｃａｔ＃Ｇ０６２）の存在下においてレンチウイルスで処理した。４８時間後、細胞を０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩を用いた選択状態にした。ピューロマイシンによる細胞死に対するポジティブコントロールとして、未改変の親細胞株も選択下に置いた。選択後、細胞を、異なるアッセイで必要なように拡大し、凍結培地を用いて凍結した。いくつかの実験において、図２により示されるように、完全に組み立てられたバイオファクトリーと、その教示が全体として本明細書に組み込まれるＲｅｐｅｌｌｉｎ ＣＥ、Ｐａｔｅｌ Ｐ、Ｂｅｖｉｇｌｉａ Ｌ、Ｊａｖｉｔｚ Ｈ、Ｓａｍｂｕｃｅｔｔｉ Ｌ、Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｐ著、題名「Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、２（１２）：１８００２１０（２０１８）に説明されるような対照バイオファクトリー・プラスミドとの間に差異があった。
９２ＭＩ懸濁細胞株を、Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｈ、Ｊａｖｉｔｚ ＨＳ、Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｐ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１９００２８８（２０２０）に記載されるような適切な（完全に組み立てられた（図２参照）又はコントロール）ＮＫ細胞バイオファクトリーを運ぶレンチウイルス粒子で遺伝子操作した。簡単に説明すると、細胞を８μｇ／ｍＬポリブレン（ａｂｍ（登録商標）、Ｃａｔ＃Ｇ０６２）の存在下においてレンチウイルスで処理した。４８時間後、細胞を０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン二塩酸塩を用いた選択状態にした。ピューロマイシンによる細胞死に対するポジティブコントロールとして、未改変の親細胞株も選択下に置いた。選択後、細胞を、異なるアッセイで必要なように拡大し、凍結培地を用いて凍結した。いくつかの実験において、図２により示されるように、完全に組み立てられたバイオファクトリーと、その教示が全体として本明細書に組み込まれるＲｅｐｅｌｌｉｎ ＣＥ、Ｐａｔｅｌ Ｐ、Ｂｅｖｉｇｌｉａ Ｌ、Ｊａｖｉｔｚ Ｈ、Ｓａｍｂｕｃｅｔｔｉ Ｌ、Ｂｈａｔｎａｇａｒ Ｐ著、題名「Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、２（１２）：１８００２１０（２０１８）に説明されるような対照バイオファクトリー・プラスミドとの間に差異があった。
（４）照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーの作製。
１３７Ｃｓγ線照射装置ＭａｒｋＩ－６８Ａ（ＪＬ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いて、２２２ｍＧｙ／分の線量率、１５ＧｙでＮＫ細胞バイオファクトリーに対して照射した。対照群に対して、照射以外は同様の処理を行った。
１３７Ｃｓγ線照射装置ＭａｒｋＩ－６８Ａ（ＪＬ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いて、２２２ｍＧｙ／分の線量率、１５ＧｙでＮＫ細胞バイオファクトリーに対して照射した。対照群に対して、照射以外は同様の処理を行った。
（５）ＮＫ細胞（Ｅ）［ＮＫ細胞バイオファクトリー（ＭＳＬＮ特異的又はＦＲα特異的）］と標的細胞（Ｔ）［親株のＯＶＣＡＲ３又はＦＲα＋ＭＳＬＮ＋Ｌｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋ＯＶＣＡＲ３（標的）細胞又は親株のＡ２７８０ｃｉｓ又はＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇＬｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）］の共培養。
標的ＯＶＣＡＲ３細胞又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ細胞を、９６ウェルプレートの単一ウェルにおいて、１００μＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地中でＭＳＬＮ特異的又はＦＲα特異的ＮＫ細胞バイオファクトリーと異なるＮＫ細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で共培養した。特定の時間共培養した後、製造者のプロトコルによりレポーター活性、例えば、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（プロメガ株式会社、Ｃａｔ＃Ｎ１１２０）を用いたＮＫ細胞バイオファクトリーのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｎｌｕｃ）活性又はＯｎｅ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（プロメガ株式会社、Ｃａｔ＃Ｅ６１１０）を用いたＡ２７８０ｃｉｓ細胞及びＯＶＣＡＲ３細胞のＬｕｃ２活性を測定した。簡単に説明すると、酵素基質（Ｎｌｕｃ基質又はＬｕｃ２基質）をＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）又はＯｎｅ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイにより提供される細胞溶解バッファーで希釈し、それぞれ、９６ウェルプレートの共培養物に添加して、酵素（Ｎｌｕｃ又はＬｕｃ２）活性を評価した。短時間のインキュベーション（Ｎｌｕｃは３分、Ｌｕｃ２は１０分）後、マイクロプレートリーダー（株式会社パーキンエルマー、ＥｎＶｉｓｉｏｎTM Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ：２１０４－００１０Ａ）で生物発光を読み取った。
標的ＯＶＣＡＲ３細胞又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ細胞を、９６ウェルプレートの単一ウェルにおいて、１００μＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地中でＭＳＬＮ特異的又はＦＲα特異的ＮＫ細胞バイオファクトリーと異なるＮＫ細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）で共培養した。特定の時間共培養した後、製造者のプロトコルによりレポーター活性、例えば、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（プロメガ株式会社、Ｃａｔ＃Ｎ１１２０）を用いたＮＫ細胞バイオファクトリーのＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（Ｎｌｕｃ）活性又はＯｎｅ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（プロメガ株式会社、Ｃａｔ＃Ｅ６１１０）を用いたＡ２７８０ｃｉｓ細胞及びＯＶＣＡＲ３細胞のＬｕｃ２活性を測定した。簡単に説明すると、酵素基質（Ｎｌｕｃ基質又はＬｕｃ２基質）をＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）又はＯｎｅ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイにより提供される細胞溶解バッファーで希釈し、それぞれ、９６ウェルプレートの共培養物に添加して、酵素（Ｎｌｕｃ又はＬｕｃ２）活性を評価した。短時間のインキュベーション（Ｎｌｕｃは３分、Ｌｕｃ２は１０分）後、マイクロプレートリーダー（株式会社パーキンエルマー、ＥｎＶｉｓｉｏｎTM Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ：２１０４－００１０Ａ）で生物発光を読み取った。
（６）シグナルペプチドの実験及び共培養。
図２の３つの異なる操作されたＮＫ細胞バイオファクトリー［（ｉ）完全に組み立てられた（ＦＲα特異的）；（ｉｉ）シグナルペプチド又は分泌物ドメインなし（ＦＲα特異的）；及び（ｉｉｉ）シグナルペプチド及びレセプター要素ドメインなし］（１２５０００個の細胞）を無血清ＲＰＭＩで洗浄し、２００μＬの新鮮な完全ＮＫ－９２ＭＩ培地に再懸濁した。親株のＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋標的細胞株）及びＡ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ非標的細胞株）細胞を、２５００００の細胞／ウェルに播種し、同様に処理し、２００μＬの新鮮な完全なＮＫ－９２ＭＩ培地に再懸濁した。３つのＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＯＶＣＡＲ３標的細胞又はＡ２７８０ｃｉｓ非標的細胞と混合し、４００μＬの２４ウェルプレートで６つの個別共培養を行い、最終体積を完全ＮＫ－９２ＭＩ培地で１ｍＬにした。６時間後、各共培養から５００μＬのアリコートを１．５ｍＬチューブで２００ＲＣＦで５分間遠心分離した。
図２の３つの異なる操作されたＮＫ細胞バイオファクトリー［（ｉ）完全に組み立てられた（ＦＲα特異的）；（ｉｉ）シグナルペプチド又は分泌物ドメインなし（ＦＲα特異的）；及び（ｉｉｉ）シグナルペプチド及びレセプター要素ドメインなし］（１２５０００個の細胞）を無血清ＲＰＭＩで洗浄し、２００μＬの新鮮な完全ＮＫ－９２ＭＩ培地に再懸濁した。親株のＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋標的細胞株）及びＡ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ非標的細胞株）細胞を、２５００００の細胞／ウェルに播種し、同様に処理し、２００μＬの新鮮な完全なＮＫ－９２ＭＩ培地に再懸濁した。３つのＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＯＶＣＡＲ３標的細胞又はＡ２７８０ｃｉｓ非標的細胞と混合し、４００μＬの２４ウェルプレートで６つの個別共培養を行い、最終体積を完全ＮＫ－９２ＭＩ培地で１ｍＬにした。６時間後、各共培養から５００μＬのアリコートを１．５ｍＬチューブで２００ＲＣＦで５分間遠心分離した。
ａ．上清中のエフェクターＮｌｕｃ評価。
細胞ペレットを邪魔しないように上清を１００μＬ採取し、９６ウェルプレートに移した（共培養毎に４ウェルを用意）。Ｎｌｕｃ活性を、製造者のプロトコルを用いてＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイにより９６ウェルプレートにおいて評価した。
細胞ペレットを邪魔しないように上清を１００μＬ採取し、９６ウェルプレートに移した（共培養毎に４ウェルを用意）。Ｎｌｕｃ活性を、製造者のプロトコルを用いてＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイにより９６ウェルプレートにおいて評価した。
ｂ．細胞ペレット中のＮＫ細胞Ｎｌｕｃ評価。
ちょうど１ｍＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地を、各１．５ｍＬチューブ（細胞ペレットを含む）中に残る１００μＬに加えた。ちょうど１ｍＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地を毎回除去及び追加することにより、細胞ペレットを３回洗浄した。ちょうど４００μＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地を１．５ｍＬチューブ中に残る１００μＬに加え、細胞ペレットを合計５００μＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地に再懸濁した。各１．５ｍＬチューブからちょうど１００μＬの再懸濁細胞を採取し、９６ウェルプレートに移した（共培養毎に４ウェルを用意）。Ｎｌｕｃ活性を、製造者のプロトコルを用いてＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイにより９６ウェルプレートにおいて評価した。
ちょうど１ｍＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地を、各１．５ｍＬチューブ（細胞ペレットを含む）中に残る１００μＬに加えた。ちょうど１ｍＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地を毎回除去及び追加することにより、細胞ペレットを３回洗浄した。ちょうど４００μＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地を１．５ｍＬチューブ中に残る１００μＬに加え、細胞ペレットを合計５００μＬの完全ＮＫ－９２ＭＩ培地に再懸濁した。各１．５ｍＬチューブからちょうど１００μＬの再懸濁細胞を採取し、９６ウェルプレートに移した（共培養毎に４ウェルを用意）。Ｎｌｕｃ活性を、製造者のプロトコルを用いてＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）アッセイにより９６ウェルプレートにおいて評価した。
（７）実験設計及び統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．１．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を使用して全ての統計解析を行った。全ての群間比較及び適合式の統計方法は、以下に報告される。以下は、上記した図についての追加的な詳細を提供する。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．１．１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を使用して全ての統計解析を行った。全ての群間比較及び適合式の統計方法は、以下に報告される。以下は、上記した図についての追加的な詳細を提供する。
図５Ａ乃至５Ｄ（ＮＫ細胞バイオファクトリーの操作された機能）。
図５Ａ及び５Ｄについての統計分析は、共通分散及び０．０５の両側ｐ値を有する２標本ｔ検定［対応のないステューデントの両側ｔ検定］に基づく。多重比較のための調整は行わなかった。図５Ｂ及び図５Ｃの分析は、ＡＮＯＶＡ並びにその後のＢｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉの２段階線形ステップアップ手順に基づいて、１％未満の偽発見率で行った。Ｓ／Ｎを、親株のＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）細胞で刺激した時のＮＫ細胞バイオファクトリーの平均Ｎｌｕｃ活性を親株のＡ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞で刺激した時の平均Ｎｌｕｃ活性で除算した比として計算した。エラーバーは、平均値の上下に１ＳＤずつ伸びており、その平均値に対する６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
図５Ａ及び５Ｄについての統計分析は、共通分散及び０．０５の両側ｐ値を有する２標本ｔ検定［対応のないステューデントの両側ｔ検定］に基づく。多重比較のための調整は行わなかった。図５Ｂ及び図５Ｃの分析は、ＡＮＯＶＡ並びにその後のＢｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉの２段階線形ステップアップ手順に基づいて、１％未満の偽発見率で行った。Ｓ／Ｎを、親株のＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）細胞で刺激した時のＮＫ細胞バイオファクトリーの平均Ｎｌｕｃ活性を親株のＡ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞で刺激した時の平均Ｎｌｕｃ活性で除算した比として計算した。エラーバーは、平均値の上下に１ＳＤずつ伸びており、その平均値に対する６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
図５Ａ（ＮＫ細胞バイオファクトリーの機能的構成要素）。
縦棒は、標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された時の、異なる３つの操作されたＦＲα特異的ＮＫ細胞バイオファクトリーの平均Ｎｌｕｃ活性を示す。第１のＮＫ細胞バイオファクトリーは完全に組み立てられ（図２）、第２のＮＫ細胞バイオファクトリーは、ＩＦＮα２分泌ドメインを欠く対照（シグナルペプチドを有さない図２）、及び第３のＮＫ細胞バイオファクトリーは、ＩＦＮα２シグナルペプチド及びＦＲα特異的レセプター要素ドメイン（シグナルペプチド及びレセプター要素を有さない図２）対照であった。
縦棒は、標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された時の、異なる３つの操作されたＦＲα特異的ＮＫ細胞バイオファクトリーの平均Ｎｌｕｃ活性を示す。第１のＮＫ細胞バイオファクトリーは完全に組み立てられ（図２）、第２のＮＫ細胞バイオファクトリーは、ＩＦＮα２分泌ドメインを欠く対照（シグナルペプチドを有さない図２）、及び第３のＮＫ細胞バイオファクトリーは、ＩＦＮα２シグナルペプチド及びＦＲα特異的レセプター要素ドメイン（シグナルペプチド及びレセプター要素を有さない図２）対照であった。
図５Ｂ（ＮＫ細胞バイオファクトリーが２時間以内に活性化）。
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激されたＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）のＮｌｕｃ活性を、式Ｙ＝ａ＋ｂ＊ｌｏｇ１０（Ｘ）を用いて適合させ、Ｘは時間単位の刺激時間である。
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激されたＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）のＮｌｕｃ活性を、式Ｙ＝ａ＋ｂ＊ｌｏｇ１０（Ｘ）を用いて適合させ、Ｘは時間単位の刺激時間である。
図５Ｃ（ＮＫ細胞バイオファクトリーが標的細胞質量の関数として活性化）。
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激されたＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）のＮｌｕｃ活性を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［Ｔａｒｇｅｔ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、Ｘは標的細胞数のｌｏｇ１０であり、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータである、Ｔａｒｇｅｔ５０は（Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ）／２に対応するＸ値を表す推定パラメータである。
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激されたＭＳＬＮ特異的ＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）のＮｌｕｃ活性を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［Ｔａｒｇｅｔ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、Ｘは標的細胞数のｌｏｇ１０であり、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータである、Ｔａｒｇｅｔ５０は（Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ）／２に対応するＸ値を表す推定パラメータである。
図５Ｄ（ＮＫ細胞バイオファクトリーが異なる癌抗原に向けて再誘導可能である）。
テューキー箱ひげプロットは、標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された２つのＮＫ細胞バイオファクトリーのＮｌｕｃ活性（ＭＯＲＡｂ－００３からのＶＨ－ＶＬ配列を用いるＦＲα－特異的レセプター要素又はＭＯＲＡｂ－００９からのＶＨ－ＶＬ配列を用いるＭＳＬＮ－特異的レセプター要素）を示す。両方のＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的レセプター要素を有し、シグナルペプチドを有さない図２に従って生成した。
テューキー箱ひげプロットは、標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された２つのＮＫ細胞バイオファクトリーのＮｌｕｃ活性（ＭＯＲＡｂ－００３からのＶＨ－ＶＬ配列を用いるＦＲα－特異的レセプター要素又はＭＯＲＡｂ－００９からのＶＨ－ＶＬ配列を用いるＭＳＬＮ－特異的レセプター要素）を示す。両方のＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的レセプター要素を有し、シグナルペプチドを有さない図２に従って生成した。
図６Ａ～６Ｈ（ＮＫ細胞バイオファクトリーの先天的細胞溶解機能）。
Ｌｕｃ２活性を各時点において正規化し、ここで、１００％＝最大Ｌｕｃ２活性であり、０％＝０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（完全細胞殺傷）である。（Ａ）及び（Ｂ）の統計分析は、ＡＮＯＶＡ並びにその後のＢｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉの２段階線形ステップアップ手順に基づいて、１％未満の偽発見率で行った。（Ｃ）及び（Ｄ）の分析は、共通分散及び０．０５の両側ｐ値を有する２標本ｔ検定［対応のないステューデントの両側ｔ検定］に基づく。多重比較のための調整は行わなかった。エラーバーは、平均値の上下に１ＳＤずつ伸びており、その平均値に対する６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。全ての実験を、ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋Ｌｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋ＯＶＣＡＲ３（標的）細胞又はＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇＬｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞により刺激されたＮＫ細胞バイオファクトリー（ＭＯＲＡｂ－００３からのＶＨ－ＶＬ配列を用いるＦＲα特異的レセプター要素及びＭＯＲＡｂ－００９からのＶＨ－ＶＬ配列を用いるＭＳＬＮ特異的レセプター要素）の両方を含んだ。標的又は非標的のＬｕｃ２活性を、生細胞の代替バイオマーカーとして評価した。
Ｌｕｃ２活性を各時点において正規化し、ここで、１００％＝最大Ｌｕｃ２活性であり、０％＝０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（完全細胞殺傷）である。（Ａ）及び（Ｂ）の統計分析は、ＡＮＯＶＡ並びにその後のＢｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉの２段階線形ステップアップ手順に基づいて、１％未満の偽発見率で行った。（Ｃ）及び（Ｄ）の分析は、共通分散及び０．０５の両側ｐ値を有する２標本ｔ検定［対応のないステューデントの両側ｔ検定］に基づく。多重比較のための調整は行わなかった。エラーバーは、平均値の上下に１ＳＤずつ伸びており、その平均値に対する６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。全ての実験を、ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋Ｌｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋ＯＶＣＡＲ３（標的）細胞又はＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇＬｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞により刺激されたＮＫ細胞バイオファクトリー（ＭＯＲＡｂ－００３からのＶＨ－ＶＬ配列を用いるＦＲα特異的レセプター要素及びＭＯＲＡｂ－００９からのＶＨ－ＶＬ配列を用いるＭＳＬＮ特異的レセプター要素）の両方を含んだ。標的又は非標的のＬｕｃ２活性を、生細胞の代替バイオマーカーとして評価した。
図６Ａ及び６Ｂ（ＮＫ細胞バイオファクトリーの数に対する６時間での２つのＮＫ細胞バイオファクトリーの細胞溶解活性）。
ＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）をＬｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と共培養した時のＮｌｕｃ活性を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［ηＥ：Ｔ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、
ｉ）ＸはＮＫ細胞数のｌｏｇ１０であり、しばしばエフェクター細胞又はＮＫ細胞バイオファクトリーとも呼称され、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータであり、
ｉｉ）標的特異的細胞溶解効率を定義するためのパラメータη（Ｅ：Ｔ）５０を、ＮＫ細胞バイオファクトリーと共培養した時の標的細胞又は非標的細胞のＬｕｃ２活性が、それぞれの正規化Ｌｕｃ２活性の最大値と最小値との差の５０％になるＥ：Ｔとして決定し、例えば、η（Ｅ：Ｔ）５０は（Ｌｕｃ２ｍａｘ－Ｌｕｃ２ｍｉｎ／２）に対応するＥ：Ｔ推定値である。
ＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）をＬｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と共培養した時のＮｌｕｃ活性を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［ηＥ：Ｔ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、
ｉ）ＸはＮＫ細胞数のｌｏｇ１０であり、しばしばエフェクター細胞又はＮＫ細胞バイオファクトリーとも呼称され、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータであり、
ｉｉ）標的特異的細胞溶解効率を定義するためのパラメータη（Ｅ：Ｔ）５０を、ＮＫ細胞バイオファクトリーと共培養した時の標的細胞又は非標的細胞のＬｕｃ２活性が、それぞれの正規化Ｌｕｃ２活性の最大値と最小値との差の５０％になるＥ：Ｔとして決定し、例えば、η（Ｅ：Ｔ）５０は（Ｌｕｃ２ｍａｘ－Ｌｕｃ２ｍｉｎ／２）に対応するＥ：Ｔ推定値である。
図６Ｃ及び６Ｄ（ＮＫ細胞バイオファクトリー刺激の持続時間に対する０．９４：１のＥ：Ｔにおける２つのＮＫ細胞バイオファクトリーの細胞溶解活性）。
ＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）をＬｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と共培養した時の正規化Ｎｌｕｃ活性を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［Ｔｉｍｅ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、
ｉ）ＸはＮＫ細胞バイオファクトリー刺激の持続時間のｌｏｇ１０であり、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータであり、
ｉｉ）Ｔｉｍｅ５０を、ＮＫ細胞バイオファクトリーと共培養した時の標的細胞又は非標的細胞のＬｕｃ２活性が、それぞれの正規化Ｌｕｃ２活性の最大値と最小値との差の５０％になる刺激の持続時間として決定し、例えば、Ｔｉｍｅ５０は（Ｌｕｃ２ｍａｘ－Ｌｕｃ２ｍｉｎ／２）に対応する持続時間推定値である。
ＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）をＬｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と共培養した時の正規化Ｎｌｕｃ活性を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［Ｔｉｍｅ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、
ｉ）ＸはＮＫ細胞バイオファクトリー刺激の持続時間のｌｏｇ１０であり、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータであり、
ｉｉ）Ｔｉｍｅ５０を、ＮＫ細胞バイオファクトリーと共培養した時の標的細胞又は非標的細胞のＬｕｃ２活性が、それぞれの正規化Ｌｕｃ２活性の最大値と最小値との差の５０％になる刺激の持続時間として決定し、例えば、Ｔｉｍｅ５０は（Ｌｕｃ２ｍａｘ－Ｌｕｃ２ｍｉｎ／２）に対応する持続時間推定値である。
図６Ｅ及び６Ｆ（６時間のＮＫ細胞バイオファクトリー刺激の持続時間における、異なるＥ：Ｔでの２つのＮＫ細胞バイオファクトリーの細胞溶解活性）。
テューキー箱ひげプロットは、２つのＮＫ細胞バイオファクトリー（ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的）がＬｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と６時間共培養した時の正規化Ｌｕｃ２活性を示す。両方のＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的レセプター要素を有し、シグナルペプチドを有さない図２に従って生成した。３．７５：１及び７．５：１のＥ：Ｔを使用した。
テューキー箱ひげプロットは、２つのＮＫ細胞バイオファクトリー（ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的）がＬｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と６時間共培養した時の正規化Ｌｕｃ２活性を示す。両方のＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的レセプター要素を有し、シグナルペプチドを有さない図２に従って生成した。３．７５：１及び７．５：１のＥ：Ｔを使用した。
図６Ｇ及び６Ｈ（２４時間のＮＫ細胞バイオファクトリー刺激の持続時間における、異なるＥ：Ｔでの２つのＮＫ細胞バイオファクトリーの細胞溶解活性）。
テューキー箱ひげプロットは、２つのＮＫ細胞バイオファクトリー（ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的）がＬｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と２４時間共培養した時の正規化Ｌｕｃ２活性を示す。両方のＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的レセプター要素を有し、シグナルペプチドを有さない図２に従って生成した。３．７５：１及び７．５：１のＥ：Ｔを使用した。
テューキー箱ひげプロットは、２つのＮＫ細胞バイオファクトリー（ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的）がＬｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と２４時間共培養した時の正規化Ｌｕｃ２活性を示す。両方のＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＦＲα特異的又はＭＳＬＮ特異的レセプター要素を有し、シグナルペプチドを有さない図２に従って生成した。３．７５：１及び７．５：１のＥ：Ｔを使用した。
図７Ａ乃至７Ｄ（照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーの工学的機能及び先天的機能）。
統計分析は、多重ｔ検定並びにその後のＢｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉの２段階線形ステップアップ手順に基づいて、１％未満の偽発見率で行った。多重比較のための調整は行わなかった。エラーバーは、平均値の上下に１ＳＤずつ伸びており、その平均値に対する６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。全ての実験は、ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋Ｌｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋ＯＶＣＡＲ３（標的）細胞又はＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇＬｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞により刺激された、照射（１５Ｇｙ）されたＮＫ細胞バイオファクトリーを含んだ。（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）のＳ／Ｎを、親株のＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）細胞で刺激した時のＮＫ細胞バイオファクトリーの平均Ｎｌｕｃ活性を親株のＡ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞で刺激した時の平均Ｎｌｕｃ活性で除算した比として算出した。
統計分析は、多重ｔ検定並びにその後のＢｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉの２段階線形ステップアップ手順に基づいて、１％未満の偽発見率で行った。多重比較のための調整は行わなかった。エラーバーは、平均値の上下に１ＳＤずつ伸びており、その平均値に対する６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。全ての実験は、ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋Ｌｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋ＯＶＣＡＲ３（標的）細胞又はＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇＬｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞により刺激された、照射（１５Ｇｙ）されたＮＫ細胞バイオファクトリーを含んだ。（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）のＳ／Ｎを、親株のＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）細胞で刺激した時のＮＫ細胞バイオファクトリーの平均Ｎｌｕｃ活性を親株のＡ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞で刺激した時の平均Ｎｌｕｃ活性で除算した比として算出した。
図７Ａ（照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーの５時間以内の活性化）。
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された、照射されたＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）のＮｌｕｃ活性を、式Ｙ＝ａ＋ｂ＊Ｘを用いて適合し、Ｘは時間単位の刺激時間である。（非照射ＮＫ細胞バイオファクトリーの操作された機能は、対数曲線に基づいてモデル化される。しかしながら、この機能は、照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーについては減少し、対数曲線の初期部分を表す線形回帰モデルを用いて説明できることが理解される）。
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された、照射されたＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）のＮｌｕｃ活性を、式Ｙ＝ａ＋ｂ＊Ｘを用いて適合し、Ｘは時間単位の刺激時間である。（非照射ＮＫ細胞バイオファクトリーの操作された機能は、対数曲線に基づいてモデル化される。しかしながら、この機能は、照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーについては減少し、対数曲線の初期部分を表す線形回帰モデルを用いて説明できることが理解される）。
図７Ｂ（照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーの標的細胞質量の関数としての活性化）。
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された、照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーのＮｌｕｃ活性（シグナルペプチドを有さない図２）を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［Ｔａｒｇｅｔ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータであり、Ｔａｒｇｅｔ５０は（Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ／２）に対応するＸ値を示す推定パラメータである。
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された、照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーのＮｌｕｃ活性（シグナルペプチドを有さない図２）を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［Ｔａｒｇｅｔ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータであり、Ｔａｒｇｅｔ５０は（Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ／２）に対応するＸ値を示す推定パラメータである。
図７Ｃ（細胞数に比例する、照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーの標的細胞由来の機能）
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された、照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーのＮｌｕｃ活性（シグナルペプチドを有さない図２）を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［Ｅｆｆｅｃｔｏｒ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させた。
標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激された、照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーのＮｌｕｃ活性（シグナルペプチドを有さない図２）を、４パラメータロジスティックモデルＮｌｕｃ＝Ｎｌｕｃｍｉｎ＋｛Ｎｌｕｃｍａｘ－Ｎｌｕｃｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［Ｅｆｆｅｃｔｏｒ５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させた。
図７Ｄ（ＮＫ細胞バイオファクトリーの数に対する６時間後の照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーの先天的細胞溶解活性）。
Ｌｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と共培養された時の照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーに由来する標的細胞細胞溶解の代替マーカーである正規化Ｌｕｃ２活性（シグナルペプチドを有さない図２）を、４パラメータロジスティックモデルＬｕｃ２＝Ｌｕｃ２ｍｉｎ＋｛Ｌｕｃ２ｍａｘ－Ｌｕｃ２ｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［η（Ｅ：Ｔ）５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、
ｉ）ＸはＮＫ細胞バイオファクトリー刺激の持続時間のｌｏｇ１０であり、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータであり、
ｉｉ）標的特異的細胞溶解効率を定義するためのパラメータη（Ｅ：Ｔ）５０を、ＮＫ細胞バイオファクトリーと共培養した時の標的細胞又は非標的細胞のＬｕｃ２活性が、それぞれの正規化Ｌｕｃ２活性の最大値と最小値との差の５０％になるＥ：Ｔとして決定し、例えば、η（Ｅ：Ｔ）５０は（Ｌｕｃ２ｍａｘ－Ｌｕｃ２ｍｉｎ／２）に対応するＥ：Ｔ推定値である。
Ｌｕｃ２＋標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞と共培養された時の照射されたＮＫ細胞バイオファクトリーに由来する標的細胞細胞溶解の代替マーカーである正規化Ｌｕｃ２活性（シグナルペプチドを有さない図２）を、４パラメータロジスティックモデルＬｕｃ２＝Ｌｕｃ２ｍｉｎ＋｛Ｌｕｃ２ｍａｘ－Ｌｕｃ２ｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［η（Ｅ：Ｔ）５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させ、
ｉ）ＸはＮＫ細胞バイオファクトリー刺激の持続時間のｌｏｇ１０であり、ＮｌｕｃｍａｘはＮｌｕｃ活性の上限漸近を定義する推定パラメータであり、ＮｌｕｃｍｉｎはＮｌｕｃ活性の下限漸近を定義する推定パラメータであり、ｂは近似曲線の変曲点における傾きを定義する「ヒル」パラメータであり、
ｉｉ）標的特異的細胞溶解効率を定義するためのパラメータη（Ｅ：Ｔ）５０を、ＮＫ細胞バイオファクトリーと共培養した時の標的細胞又は非標的細胞のＬｕｃ２活性が、それぞれの正規化Ｌｕｃ２活性の最大値と最小値との差の５０％になるＥ：Ｔとして決定し、例えば、η（Ｅ：Ｔ）５０は（Ｌｕｃ２ｍａｘ－Ｌｕｃ２ｍｉｎ／２）に対応するＥ：Ｔ推定値である。
以下でさらに説明するように、図の統計分析について、図８Ａ及び８Ｂは、共通分散及び０．０５の両側ｐ値を有する２標本ｔ検定［対応のないステューデントの両側ｔ検定］に基づく、多重比較のための調整は行わなかった。図９Ａ乃至９Ｆの統計分析は、ＡＮＯＶＡ並びにその後のＢｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉの２段階線形ステップアップ手順に基づいて、１％未満の偽発見率で行った。エラーバーは、平均値の上下に１ＳＤずつ伸びており、その平均値に対する６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。
図８Ａ～８Ｂは、本開示に係る、異なる癌抗原に向けて再誘導される遺伝子操作されたＮＫ細胞の例を示す。テューキー箱ひげプロットは、標的（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋ＯＶＣＡＲ３）又は非標的（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇＡ２７８０ｃｉｓ）細胞により刺激された（ｉ）ＭＳＬＮ特異的（図８Ａ）及び（ｉｉ）ＦＲα特異的（図８Ｂ）ＮＫ細胞バイオファクトリーのＮｌｕｃ活性を示す。両方のＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＦＲα－又はＭＳＬＮ－特異的レセプター要素を有するがシグナルペプチドを有さない図２に従って生成した。全てのデータを、標的／非標的細胞＝２５００で収集した。例えば、２０：１、１０：１、及び５：１の異なるＥ：Ｔを使用し、示されるように、Ｎｌｕｃ活性を、２４時間、４８時間、及び７２時間で観察した。
図９Ａ～９Ｆは、本開示に係る、例示的な遺伝子操作されたＮＫ細胞の細胞溶解機能を例である。全ての実験は、ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋Ｌｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋ＯＶＣＡＲ３（標的）細胞又はＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇＬｕｃ２－２Ａ－Ｅ２Ｃｒｉｍｓｏｎ＋Ａ２７８０ｃｉｓ（非標的）細胞のいずれかにより刺激されたＮＫ細胞バイオファクトリー［（ｉ）ＭＳＬＮ特異的レセプター要素（図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ）及び（ｉｉ）ＦＲα特異的レセプター要素（図９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ）］の両方を含んだ。両方のＮＫ細胞バイオファクトリーを、ＦＲα－又はＭＳＬＮ－特異的レセプター要素を有し、シグナルペプチドを有さない図２に従って生成した。標的細胞又は非標的細胞のＬｕｃ２活性を、生細胞の代替バイオマーカーとして評価した。全ての実験において、０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０を細胞殺傷のポジティブコントロールとして使用した。Ｅ：Ｔの関数としての細胞溶解活性を、Ａ）２４時間（図９Ａ及び９Ｂ）、Ｂ）４８時間（図９Ｃ及び９Ｄ）、並びにＣ）７２時間（図９Ｅ及び９Ｆ）で４パラメータロジスティックモデルを使用して適合した。全てのデータを、標的／非標的細胞＝２５００で収集した。全ての観察のＬｕｃ２活性を、ｎ＝３を用いて測定した。エラーバーは、平均値の上下に１ＳＤずつ伸びており、その平均値に対する６８％信頼区間の半値幅とみなすこともできる。標的ＯＶＣＡＲ３（ＦＲα＋ＭＳＬＮ＋）又は非標的Ａ２７８０ｃｉｓ（ＦＲαｎｅｇＭＳＬＮｎｅｇ）細胞により刺激されたＮＫ細胞バイオファクトリー（シグナルペプチドを有さない図２）における正規化Ｌｕｃ２活性を、４パラメータロジスティックモデルＬｕｃ２＝Ｌｕｃ２ｍｉｎ＋｛Ｌｕｃ２ｍａｘ－Ｌｕｃ２ｍｉｎ｝／｛１＋１０＾［ｂ＊（ｌｏｇ１０［η（Ｅ：Ｔ）５０］－Ｘ）］｝を用いて適合させた。
様々な実施形態は、その利益を主張し、その一般及び特定の教示について参照により本明細書に完全に組み込まれる２０２０年１０月２８日に出願された「Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＮＫ－Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題する基礎となる仮出願セル番号６３／１０６，８３８に従い実施される。例えば、本明細書及び／又は仮出願の実施形態は、様々な程度で（完全に含む）組み合わせることができる。また、基礎となる仮出願において提供される実験的な教示及び基礎となる参考文献を参照することもできる。仮出願において記載された実施形態は、特に記載しない限り、技術開示全体、又は請求された開示の一部を限定することを、いかなる意味においても意図しない。
本明細書では特定の実施例を図示及び説明したが、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な代替及び／又は同等の実施例を図示及び説明する特定の実施例に置換できる。本出願は、本明細書で記載される具体例の任意の適応例又は変形例を包含することを意図している。
Claims (20)
- 膜貫通型ドメインに作動可能に連結し、標的細胞の表面上の表面抗原を認識する細胞外抗原結合ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを備える、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレセプター要素と、
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが前記標的細胞の前記抗原に結合したことに応答して、エフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートさせる転写因子結合部位をコードするアクチュエーター要素と、
シグナルペプチドに作動可能に連結する前記エフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、
を含み、
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが前記標的細胞の前記抗原に結合したことに応答して、活性化し、前記エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される、
遺伝子操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。 - 存在する前記標的細胞の関数として前記エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される、請求項１の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
- 前記エフェクタータンパク質の量は、イン・シチュにおいて存在する前記標的細胞の量に比例する、請求項２の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
- 前記シグナルペプチドは、前記エフェクタータンパク質の上流にあり、前記エフェクタータンパク質に対して非天然状態である、請求項１の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
- 前記シグナルペプチドは、前記エフェクタータンパク質に対して天然状態である、請求項１の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメイン、前記アクチュエーター要素、及び前記シグナルペプチドは、定常ドメインであり、
前記細胞外抗原結合ドメイン及び前記エフェクタータンパク質は、可変ドメインである、
請求項１の遺伝子操作されたＮＫ細胞。 - 前記アクチュエーター要素は、前記エフェクタータンパク質に結合し、
前記ＮＫ細胞は、ＮＫ－９２ＭＩ細胞である、
請求項１の遺伝子操作されたＮＫ細胞。 - 前記外因性ポリヌクレオチド配列は、前記レセプター要素に結合する前記エフェクター要素に結合する前記アクチュエーター要素を含む、請求項１の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
- 前記エフェクタータンパク質は、検出可能なレポータータンパク質、治療用タンパク質、下流シグナル伝達タンパク質、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞内シグナル部分、４－１ＢＢの細胞内シグナル伝達部分、及びＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達部分の１つ以上を含む、請求項１の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
- 前記転写因子結合部位は、活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）応答要素、血清応答要素（ＳＲＥ）、及びサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）から成る群から選択される、請求項１の遺伝子操作されたＮＫ細胞。
- 遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団であって、
前記集団の各前記遺伝子操作されたＮＫ細胞は、レセプター要素に結合するエフェクター要素に結合するアクチュエーター要素を含む外因性ポリヌクレオチド配列を備え、
前記レセプター要素は、膜貫通型ドメインに作動可能に連結し、標的細胞の表面上の表面抗原を認識する細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを備えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、
前記アクチュエーター要素は、前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが前記標的細胞の前記抗原に結合したことに応答して、エフェクタータンパク質の合成をアップレギュレートさせる転写因子結合部位をコードし、
前記エフェクター要素は、シグナルペプチドに作動可能に連結する前記エフェクタータンパク質をコードし、
前記遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団は、前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが前記標的細胞の前記抗原に結合したことに応答して、活性化し、前記標的細胞の存在に基づいて較正量の前記エフェクタータンパク質を合成及び分泌するように構成される、
遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団。 - 前記外因性ポリヌクレオチド配列は、前記エフェクター要素に結合し、前記エフェクター要素の上流にある前記アクチュエーター要素と、前記レセプター要素に結合し、前記レセプター要素の上流にある前記エフェクター要素と、を含み、
前記シグナルペプチドは、前記エフェクタータンパク質の上流にある、
請求項１２の遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団。 - 前記エフェクタータンパク質は、前記標的細胞に直接作用する治療用タンパク質であり、
前記治療用タンパク質は、細胞傷害性タンパク質、免疫刺激タンパク質、及び免疫抑制タンパク質から成る群から選択される、
請求項１２の遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団。 - 前記エフェクタータンパク質の較正量は、複数の細胞中又はサンプル中に存在する前記標的細胞の量の関数である、請求項１２の遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団。
- 複数の細胞を遺伝子操作されたＮＫ細胞に接触させることであって、前記遺伝子操作されたＮＫ細胞は、膜貫通型ドメインに作動可能に連結する細胞外抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを備えるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレセプター要素と、転写因子結合部位をコードするアクチュエーター要素と、シグナルペプチドに作動可能に連結するエフェクタータンパク質をコードするエフェクター要素と、を備え、前記細胞外抗原結合ドメインは複数の細胞の表面上の表面抗原を認識する、複数の細胞を遺伝子操作されたＮＫ細胞に接触させることと、
前記複数の細胞を前記遺伝子操作されたＮＫ細胞に接触させ、前記複数の細胞内に前記標的細胞が存在することに応答して、前記標的細胞の表面上の抗原に対する前記レセプター要素の結合を引き起こすことと、
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが前記標的細胞の抗原に結合したことに応答して、前記アクチュエーター要素により前記エフェクター要素の発現を開始させてエフェクタータンパク質及び分泌ペプチドを合成することと、分泌ペプチドによりエフェクタータンパク質を分泌することと、
を含む方法。 - 前記エフェクタータンパク質の発現を検出することをさらに含み、
前記エフェクタータンパク質の検出可能な発現は、前記標的細胞の存在を示す、
請求項１６の方法。 - 前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインが標的細胞の抗原に結合したことに応答して、前記ＮＫ細胞を活性化させ、そして前記標的細胞の存在に基づいて較正量の前記エフェクタータンパク質を合成及び分泌することをさらに含む、請求項１６の方法。
- 前記エフェクタータンパク質の量は、前記複数の細胞中に存在する前記標的細胞の量に比例する、請求項１８の方法。
- 前記エフェクタータンパク質は、前記標的細胞に直接作用する治療用タンパク質を含み、
前記治療用タンパク質により前記標的細胞を中和することをさらに含む、
請求項１６の方法。
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