JP2023548247A - 血管新生因子の阻害剤 - Google Patents
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Abstract
組換えヒトＦｃ融合タンパク質が、第１のヒトＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン、第２のヒトＶＥＧＦ受容体の異なる別のＩｇ様ドメイン、第３のヒトＶＥＧＦ受容体の少なくともさらに別のＩｇ様ドメイン、およびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分を含む。融合タンパク質は、異常な血管新生に病因を有する眼性の疾患、状態、または障害を処置するまたは制御するのに有用である。
Description
[0001]本発明は、血管新生因子の阻害剤に関する。具体的には、本発明は、血管内皮増殖因子のファミリーのメンバー（「ＶＥＧＦファミリーメンバー」）の阻害剤に関する。より具体的には、本発明は、ＶＥＧＦファミリーメンバーの活性の阻害剤、かかる阻害剤の使用および生成の方法に関する。
[0002]哺乳動物血管系の主たる細胞成分は内皮細胞、平滑筋細胞、および周皮細胞である。内皮細胞は、哺乳動物において全血管の内面の内張りを形成し、血液と組織の間に非血栓形成性の境界面を構成する。したがって、内皮細胞の増殖は新しい毛細管および血管の発達にとって重要な成分であり、次いでそのような発達は、哺乳動物組織の成長および／または再生にとって必須のプロセスである。
[0003]分泌されたポリペプチドのファミリーは、内皮細胞の増殖および血管新生を促進する上で極めて重要な役割を果たすことが示されてきた。ＶＥＧＦの過剰発現によって引き起こされる非制御性血管新生の病理学的特性は、高まった血管透過性であり、このような透過性が、周囲組織への体液漏出および周囲組織の腫脹をもたらす。哺乳動物では、このファミリーは、高度に保存された受容体結合構造を有する５つの関連する増殖因子から構成される：血管内皮増殖因子Ａ～Ｄ（「ＶＥＧＦ－Ａ」、「ＶＥＧＦ－Ｂ」、「ＶＥＧＦ－Ｃ」、および「ＶＥＧＦ－Ｄ」）ならびに胎盤増殖因子（「ＰＧＦ」）。本開示では、増殖因子のこのファミリーは、ＶＥＧＦファミリーとも呼ばれる。これらの増殖因子は、血管内皮細胞の表面にのみ存在するコグネート受容体型チロシンキナーゼ：ＶＥＧＦ受容体－１（「ＶＥＧＦＲ－１」、「ｆｌｔ－１」としても知られる）、ＶＥＧＦ受容体－２（「ＶＥＧＦＲ－２」、ヒトでは「ＫＤＲ」としておよびマウスでは「ｆｌｋ－１」として知られる）、ＶＥＧＦ受容体－３（「ＶＥＧＦＲ－３」、「ｆｌｔ－４」としても知られる）、のファミリーをとおして作用し、その結果、血管の形成を刺激する。
[0004]ＶＥＧＦ－Ａ（単にＶＥＧＦと呼ばれることもある）は、増殖因子のこのファミリーの最も重要なメンバーとして浮かび上がってきた。ヒトＶＥＧＦ－Ａは、複数のホモ二量体型（１単量体当たり１２１個、１４５個、１６５個、１８３個、１８９個、および２０６個のアミノ酸）として様々な組織で発現され、この場合、各型は、単一のＲＮＡ転写産物の選択的スプライシングの結果として生じる。
[0005]ＶＥＧＦは、血管内皮細胞の増殖および血管新生を促進することから、血管内皮細胞への増殖促進活性が；例えば、潰瘍、血管損傷、および心筋梗塞の処置の上で有益に重要である場合、多数の状態の治療処置にとって有効である可能性がある。
[0006]しかし、対照的に、血管内皮増殖はある特定の状況下では望ましいものであるが、一方、血管内皮増殖および血管新生は、腫瘍の増殖と転移、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後線維形成症、血管新生緑内障、血管新生加齢黄斑変性症、血管腫、移植角膜組織および他の組織の免疫拒絶、ならびに慢性炎症を始めとする、様々な疾患および障害の望ましくない成分でもある。こういった障害のいずれかを患う個体では、ＶＥＧＦの内皮増殖活性を妨げること、または少なくとも実質的に減少させることを望むものと思われる。
[0007]ｆｌｔ－１、ＫＤＲ、およびｆｌｔ－４のチロシンキナーゼ受容体のそれぞれは、リガンド結合に利用できる７つの細胞外免疫グロブリン様（「Ｉｇ様」）ドメインと、受容体が発現される細胞の表面に受容体を固着させる働きをする膜貫通ドメインと、細胞内触媒チロシンキナーゼドメインとを有する。Ｆｌｔ－１は、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、およびＰｌＧＦに結合する。ＫＤＲはＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、およびＶＥＧＦ－Ｄに結合する。Ｆｌｔ－４はＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄに結合する。
[0008]血管内皮増殖および血管新生におけるＶＥＧＦファミリーの増殖因子の役割、ならびにこれらのプロセスが様々な多くの疾患および障害において果たす役割に鑑みて、病態が異常な血管新生に根付いている患者においてこれら増殖因子の生物学的活性の１つまたは複数を減少させるまたは阻害するための薬理学的手段を有することが望ましい。異常な血管新生に根付いている病態に関して改善された処置または制御のための薬理学的手段を有することも望ましい。
[0009]本明細書で使用される場合、「制御」という用語には、減少、軽減、改善、または予防も含まれる。
[0010]全体的に、本発明は、融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質、それを生成する方法およびそれを含む組成物、ならびに病態が異常な血管新生に病因を有する、対象の少なくとも１つの病態を処置するまたは制御するための方法を提供する。
[0011]一態様では、本発明は、１つまたは複数のＶＥＧＦファミリーメンバーに実質的に結合し；それによって、ＶＥＧＦ受容体へのそれらの結合を減少させるまたは阻害することができる融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを提供する。
[0012]別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン、第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン、および第３のＶＥＧＦ受容体の少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む。
[0013]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１（またはｆｌｔ－１）のＩｇ様ドメイン２、または実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２（またはＫＤＲ）のＩｇ様ドメイン３、または実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３（またはｆｌｔ－４）のＩｇ様ドメイン１および２、または実質的にＩｇ様ドメイン１および２を含む。
[0014]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、または実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、または実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３、または実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３を含む。
[0015]さらに別の態様では、ヒトＶＥＧＦＲ－３は、配列番号１３に列挙されたアミノ酸配列を有する野生型ヒトＶＥＧＦＲ－３である；本発明のいずれかの融合タンパク質に含まれるヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１は、配列番号１４に列挙されたアミノ酸配列を有する。本発明の融合タンパク質は、ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、または実質的にＩｇ様ドメイン１を含み；ここで、配列番号１４の８０位～８２位のアミノ酸配列は、ＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり；Ｘは任意のアミノ酸である。一実施形態では、Ｘは天然に存在するアミノ酸である。
[0016]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、または実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、または実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、または実質的にＩｇ様ドメイン１および２を含み；ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－３のアミノ酸配列は配列番号１３に列挙されており；ここで、１０４位～１０６位のアミノ酸配列は、ＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり；ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。一実施形態では、Ｘは天然に存在するアミノ酸である。
[0017]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１（またはｆｌｔ－１）のＩｇ様ドメイン２、または実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２（またはＫＤＲ）のＩｇ様ドメイン３、または実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３（またはｆｌｔ－４）のＩｇ様ドメイン１および２、または実質的にＩｇ様ドメイン１および２を含み；多量体形成成分に連結される。
[0018]一実施形態では、前記多量体形成成分は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの一部を含む。
[0019]別の実施形態では、前記多量体形成成分は、ＩｇＧ１のアミノ末端にての最後の２つの重鎖ドメイン；換言すれば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを実質的に含む。
[0020]さらに別の態様では、本発明は、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
[0021]さらに別の態様では、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結された前記核酸分子を含む発現ベクターを含めて、前記核酸分子を含むベクターを提供する。
[0022]さらに別の態様では、本発明は、適切な宿主細胞中に発現ベクターを含む、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドの生成用の宿主－ベクター系を提供する。
[0023]別の態様では、本発明は、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを生成する方法であって、（ａ）融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドの産生を可能にする条件下で、宿主－ベクター系の細胞を増殖させるステップと；（ｂ）そのように産生された融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを回収するステップとを含む方法を提供する。
[0024]さらに別の態様では、本発明は、異常な血管新生に病因を有する、少なくとも１つの疾患、状態、または障害を、対象において、処置するまたは制御するための方法を提供する。
[0025]さらに別の態様では、本発明は、異常な血管新生に病因を有する、少なくとも１つの眼性の疾患、状態、または障害を、対象において、処置するまたは制御するための方法を提供する。
[0026]本発明の他の特性および利点は、以下の発明を実施する形態および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
[0049]本開示では、「融合ポリペプチド」、「融合タンパク質」、「キメラポリペプチド」、および「キメラタンパク質」という用語は互換的に使用される。
[0050]本発明は、ＶＥＧＦファミリーのうちの少なくとも１つのメンバー（「ＶＥＧＦファミリーメンバー」）に結合し；それによって、内皮細胞上のＶＥＧＦ受容体への結合に当たり前記ＶＥＧＦファミリーメンバーを実質的に利用不可能とすることができる結合構築物を提供する。結果として、本発明の結合構築物は、血管新生を促進する上で前記ＶＥＧＦファミリーメンバーの生物学的活性を実質的に阻害し；それによって、異常な血管新生に病因を有する病態を制御する。
[0051]本発明の結合構築物は、融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質を含むかまたはそれらからなり、共有結合性の形態またはその他の形態の付着によって互いに会合する１つまたは複数の結合ユニットを含む。本発明の結合構築物は、ＶＥＧＦファミリーメンバーまたはそれの一部に結合することができ、高親和性でこれに結合する。結合ユニットは好ましくは、少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドを含む。結合ユニットは好ましくは単一のポリペプチドを含むが、一方、単一のポリペプチドが特定の増殖因子に結合するのに十分でない場合、結合ユニットは複数のポリペプチドを含むことができる。２つ以上の結合ユニットまたはポリペプチドセグメントが所与の結合構築物にある場合、当該結合ユニットは直接またはリンカーをとおして互いに結合され得る。結合構築物は、異種ペプチドまたは他の化学部分をさらに含むことができる。かかる付加は、安定性、溶解性、毒性、血清半減期、免疫原性、検出性、または他の特質などの結合構築物の特質を改変することができる。
[0052]「高親和性」という用語は、哺乳動物、例えば、臨床検査用動物、飼い慣らされた家畜動物もしくは愛玩動物、またはヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの、ＶＥＧＦファミリーメンバーに対する結合構築物の相対的な親和性に関連する生理学的文脈において使用される。本発明において標的とされたＶＥＧＦメンバーは、典型的にはサブナノモルの解離定数（Ｋｄ）の観点から測定される、ｉｎ ｖｉｖｏでそれらの受容体に対する特徴的な親和性を有する。本発明の目的のために、本発明の結合構築物は、天然増殖因子受容体対のＫｄの、約１倍以下、または約５倍以下、または約１０倍以下、または約５０倍以下、または約１００倍以下、または約５００倍以下、または約１０００倍以下のＫｄで、その標的ＶＥＧＦファミリーメンバーに結合することができる。
[0053]一態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、互いに作動可能に連結された、第１のポリペプチド結合ユニット、第２のポリペプチド結合ユニット、および第３のポリペプチド結合ユニットを含む。ポリペプチド結合ユニットは、「結合ユニット」と略されて本明細書で言及される場合がある。全体として、第１、第２、および第３の結合ユニットは、直接または介在リンカーをとおして、任意の順序で互いに連結され得る。
[0054]別の態様では、標的化されたＶＥＧＦファミリーメンバーは、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドの１つまたは複数の結合ユニットに結合することができる。
[0055]さらに別の態様では、結合ユニットは、ＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインを実質的に含む。
[0056]別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインを含む第１の結合ユニット；第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインを含む第２の結合ユニット；および第３のＶＥＧＦ受容体の少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む第３の結合ユニットを含む。
[0057]別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン、第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン、および第３のＶＥＧＦ受容体の少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含み；ここで、前記第３のＶＥＧＦ受容体は、配列番号１３に列挙されたアミノ酸配列を有するヒトＶＥＧＦＲ－３（またはｆｌｔ－４）を含むが、ただし、配列番号１３の１０５位および１０６位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１３の１０４位～１０６位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする。
[0058]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む第３のＶＥＧＦ受容体の少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含み、ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－３は配列番号１３に列挙されたアミノ酸配列を有するが、ただし、配列番号１３の１０５位および１０６位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１３の１０４位～１０６位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする。
[0059]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む第３のＶＥＧＦ受容体の少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含み、ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－３は配列番号１３に列挙されたアミノ酸配列を有するが、ただし、配列番号１３の１０５位および１０６位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１３の１０４位～１０６位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする。
[0060]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１（もしくはｆｌｔ－１）のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２（もしくはＫＤＲ）のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３（もしくはｆｌｔ－４）のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２；またはヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３を含む。
[0061]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２；またはヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３を含み；ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－３は配列番号１３に列挙されたアミノ酸配列を有するが、ただし、配列番号１３の１０５位および１０６位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１３の１０４位～１０６位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする。
[0062]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２；またはヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３を含み；ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－３は配列番号１３に列挙されたアミノ酸配列を有するが、ただし、配列番号１３の１０４位～１０６位のアミノ酸配列は非置換でありＮＤＴのままであることを条件とする。
[0063]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２；またはヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３を含み；ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１は、配列番号１４に列挙されたアミノ酸配列を有しており；ここで、配列番号１４の８１位および８２位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１４の８０位～８２位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。
[0064]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２；またはヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２を含み；ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１は、配列番号１４に列挙されたアミノ酸配列を有しており；ここで、配列番号１４の８１位および８２位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１４の８０位～８２位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。
[0065]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２；またはヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２を含み；ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１は、配列番号１４に列挙されたアミノ酸配列を有しており；ここで、配列番号１４の８０位～８２位のアミノ酸配列は非置換でありＮＤＴのままである。
[0066]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２；またはヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３を含み；ここで、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドに含められたヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１は、配列番号１４に列挙されたアミノ酸配列を有する。
[0067]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２；またはヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３を含み；ここで、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドに含められたヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１は、配列番号１４に列挙されたアミノ酸配列を有し、位のアミノ酸配列は非置換でありＮＤＴのままである。
[0068]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３；ならびに（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２を含み；多量体形成成分に連結されており；ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－３は配列番号１３に列挙されたアミノ酸配列を有するが、ただし、配列番号１３の１０５位および１０６位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１３の１０４位～１０６位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする。
[0069]一実施形態では、前記多量体形成成分は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの一部を実質的に含む。
[0070]別の実施形態では、前記多量体形成成分は、ヒトＩｇＧ１の重鎖のＦｃドメインの一部を実質的に含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１の重鎖のＦｃドメインのかかる部分は、ＩｇＧ１重鎖のカルボキシ末端にての最後の２つのドメインを含む。
[0071]一部の実施形態では、２つ以上の結合ユニットが一緒に行動して単一のリガンド分子に結合する（この場合、リガンドは単量体を含んでも二量体を含んでもよい）。一部の他の実施形態では、結合ユニットは独立して行動する、すなわち、各結合ユニットは別々のリガンド分子に結合する。
[0072]一態様では、融合タンパク質またはキメラタンパク質は、（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３または実質的にＩｇ様ドメイン３に作動可能に連結された、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２または実質的にＩｇ様ドメイン２を含み、その（ｂ）は、（ｃ）（１）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２、または（ｃ）（２）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３に作動可能に連結され、その（ｃ）（１）または（ｃ）（２）は、ＩｇＧ１のＦｃドメインの一部に作動可能に連結されている。
[0073]一実施形態では、ポリペプチドリンカーが、最後の結合ユニットとＩｇＧ１のＦｃドメインの前記部分との間に挿入される。
[0074]一態様では、融合タンパク質またはキメラタンパク質は、（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３または実質的にＩｇ様ドメイン３に作動可能に連結された、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２または実質的にＩｇ様ドメイン２を含み、その（ｂ）は、（ｃ）（１）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２、または（ｃ）（２）ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３に作動可能に連結され、その（ｃ）（１）または（ｃ）（２）は、ＩｇＧ１のＦｃドメインの一部に作動可能に連結されており；ここで、ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２（「ＶＥＧＦＲ－１－Ｄ２」）は、配列番号２に列挙されたアミノ酸配列を有し；ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３（「ＶＥＧＦＲ－２－Ｄ３」）は、配列番号４に列挙されたアミノ酸配列を有し；ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２（「ＶＥＧＦＲ－３－Ｄ１Ｄ２」）は、配列番号６に列挙されたアミノ酸配列を有し；ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１，２、および３（「ＶＥＧＦＲ－３－Ｄ１Ｄ２Ｄ３」）は、配列番号１５に列挙されたアミノ酸配列を有し；ＩｇＧ１のＦｃドメインの部分（「ＩｇＧ１Ｆｃ」）は、配列番号８に列挙されたアミノ酸配列を有する。
[0075]別の態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、ＶＥＧＦＲ－３－Ｄ１Ｄ２のカルボキシ末端とＩｇＧ１Ｆｃのアミノ末端との間に挿入されるポリペプチドリンカーをさらに含み；ここで、前記リンカーは、配列番号１０に列挙されたアミノ酸配列を有する。
[0076]さらに別の態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、ＶＥＧＦＲ－１－Ｄ２のアミノ末端に先行するポリペプチドリーダー配列をさらに含むことができる。
[0077]さらに別の態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１５、配列番号８、および配列番号１０のそれぞれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、配列番号６および配列番号１５の８１位および８２位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号６および配列番号１５の８０位～８２位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。
[0078]さらに別の態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１５、配列番号８、および配列番号１０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、配列番号６および配列番号１５の８１位および８２位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号６および配列番号１５の８０位～８２位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。
[0079]さらに別の態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列を含む。配列番号１２および配列番号１６を有する融合タンパク質が試験用に調製されたが、それぞれ「ＥＢ－１０１」および「ＥＢ－１０１ＢＩｂ」と本明細書では呼ばれる。
[0080]さらに別の態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１２または配列番号１６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、配列番号１２または配列番号１６の２８６位および２８７位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。
[0081]さらに別の態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１２または配列番号１６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸は非置換である。
[0082]さらに別の態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１２または配列番号１６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、配列番号１２または配列番号１６の２８６位および２８７位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である。
[0083]さらに別の態様では、本発明の融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１２または配列番号１６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸は非置換である。
[0084]さらに別の態様では、１つまたは複数のアミノ酸置換が上記のアミノ酸配列のいずれでも行われ得る。好ましくは、かかる置換は保存的置換であり、この場合、以下の群のうちの１つのあるアミノ酸が同じ群の別のアミノ酸で置換される：（１）Ａ、Ｓ、Ｔ；（２）Ｄ、Ｅ；（３）Ｎ、Ｑ；（４）Ｒ、Ｋ；（５）Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ；および（６）Ｆ、Ｙ、Ｗ；このような置換は、融合ポリペプチドの結合活性を実質的に保存するように選択される。一実施形態では、保存的置換を有する本発明の融合ポリペプチドは、かかる置換前のＫｄ値の約１２０％未満のＫｄ値を有する。好ましくは、Ｋｄ値は、かかる置換前のＫｄ値の約１１０％未満である。より好ましくは、Ｋｄ値はかかる置換前のＫｄ値の約１０５％未満である。
[0085]ほとんどの保存された置換は、融合ポリペプチドのＩｇ様の１つまたは複数のドメインの特徴に過激な変化を生み出すとは予想されない。しかし、置換の正確な効果をあらかじめ予測することが困難な場合、当業者であれば、当該効果がルーチンのスクリーニングアッセイによって評価されることを理解するであろう。例えば、Ｉｇ様ドメインバリアントは、通常には、インタクトの融合ポリペプチドをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発、組換え細胞培養におけるバリアント核酸の発現、細胞培養物からのバリアント融合ポリペプチドの精製、およびバリアント融合ポリペプチドがＶＥＧＦリガンドに特異的に結合する能力を検出することによって、作製される。Ｉｇ様の１つまたは複数ドメインにおける特定の１つまたは複数の置換が、ＶＥＧＦファミリーメンバーに結合しかつその活性を阻害する融合ポリペプチドの能力に影響を及ぼすかどうかを判定するのに用いられ得る例示的な結合アッセイは、Ｐａｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５６４６～２５６５４頁（１９９４）による論文に記載されている。
[0086]融合タンパク質のＶＥＧＦＲ－１－Ｄ２結合ユニットは、遊離のＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、およびＰＧＦに高親和性で結合することができる（Ｄａｖｉｓ－Ｓｍｙｔｈら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１５（１８）：４９１９頁（１９９６））。融合タンパク質のＶＥＧＦＲ－２－Ｄ３結合ユニットは、遊離のＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ、およびＶＥＧＦ－Ｄに高親和性で結合することができる（Ｓｔｕｔｔｆｅｌｄら、６１（９）：９１５頁（２００９））。融合タンパク質のＶＥＧＦＲ－３－Ｄ１Ｄ２またはＶＥＧＦＲ－３－Ｄ１Ｄ２Ｄ３（ＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３）の結合ユニットは、遊離のＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄに高親和性で結合することができる。したがって、本発明の融合タンパク質は、疾患部位の内皮細胞上でこれらのＶＥＧＦファミリーメンバーの血管形成活性を実質的に阻害することができる。
[0087]さらに別の態様では、本発明は、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。
[0088]さらに別の態様では、本発明は、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し；ここで、前記単離された核酸分子は、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１（またはｆｌｔ－１）のＩｇ様ドメイン２、または実質的にＩｇ様ドメイン２をコードする核酸配列；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２（またはＫＤＲ）のＩｇ様ドメイン３、または実質的にＩｇ様ドメイン３をコードする核酸配列；ならびに、（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３（またはｆｌｔ－４）のＩｇ様ドメイン１および２、または実質的にＩｇ様ドメイン１および２をコードする核酸配列を含む。
[0089]さらに別の態様では、本発明は、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し；ここで、前記単離された核酸分子は、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１（もしくはｆｌｔ－１）のＩｇ様ドメイン２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン２をコードする核酸配列；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２（もしくはＫＤＲ）のＩｇ様ドメイン３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン３をコードする核酸配列；（ｃ）（１）ヒトＶＥＧＦＲ－３（もしくはｆｌｔ－４）のＩｇ様ドメイン１および２、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１および２をコードする核酸配列、または（ｃ）（２）ヒトＶＥＧＦＲ－３（もしくはｆｌｔ－４）のＩｇ様ドメイン１、２、および３、もしくは実質的にＩｇ様ドメイン１、２、および３をコードする核酸配列；ならびに（ｄ）ＩｇＧ１のＦｃドメインの一部をコードする核酸配列を含む。
[0090]さらに別の態様では、本発明は、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し；ここで、前記単離された核酸分子は、（ａ）ヒトＶＥＧＦＲ－１（またはｆｌｔ－１）のＩｇ様ドメイン２、または実質的にＩｇ様ドメイン２をコードするおよび配列番号１に列挙された配列を有する、核酸配列；（ｂ）ヒトＶＥＧＦＲ－２（またはＫＤＲ）のＩｇ様ドメイン３、または実質的にＩｇ様ドメイン３をコードするおよび配列番号３に列挙された配列を有する、核酸配列；（ｃ）ヒトＶＥＧＦＲ－３（またはｆｌｔ－４）のＩｇ様ドメイン１および２、または実質的にＩｇ様ドメイン１および２をコードするおよび配列番号５に列挙された配列を有する、核酸配列、ならびに（ｄ）ＩｇＧ１のＦｃドメインの一部をコードするおよび配列番号７に列挙された配列を有する、核酸配列を含む。
[0091]さらに別の態様では、本発明は、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し；ここで、前記単離された核酸分子は、（ａ）配列番号２に列挙されたアミノ酸配列をコードする核酸配列；（ｂ）配列番号４に列挙されたアミノ酸配列をコードする核酸配列；（ｃ）配列番号６または配列番号１５に列挙されたアミノ酸配列をコードする核酸配列；ならびに（ｄ）配列番号８に列挙されたＩｇＧ１のＦｃドメインの一部のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
[0092]さらに別の態様では、前記単離された核酸分子は、ポリペプチドリンカーをコードする連結核酸配列をさらに含み；ここで、前記連結核酸は、配列番号９に列挙された配列を有し、配列番号５と配列番号７との間に挿入される。
[0093]さらに別の態様では、前記単離された核酸は、ポリペプチドリーダー配列をコードするリーディング核酸配列をさらに含むことができる。前記リーディング核酸配列は、前記単離された核酸中に存在する場合、配列番号１に先行する。
[0094]さらに別の態様では、本発明は、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し；ここで、前記単離された核酸分子は、配列番号１１に列挙された核酸配列を含む。
[0095]さらに別の態様では、本発明は、融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し；ここで、前記融合もしくはキメラのポリペプチドまたはタンパク質は、配列番号１２または配列番号１６を有する。
[0096]別の態様では、本発明は、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供し；ここで、前記単離された核酸分子は、遺伝暗号の縮重の結果として、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される核酸配列とは１つまたは複数のコドンの点で異なる核酸配列を含む。かかる様々な核酸配列は本発明の範囲内である。
[0097]さらに別の態様では、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結された前記核酸分子のいずれかを含む発現ベクターを含めて、前記核酸分子のいずれかを含むベクターを提供する。ベクターの実施形態は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される核酸配列を含む。特に、本発明のベクターは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号１１からなる群から選択される核酸配列を含む。
[0098]さらに別の態様では、本発明は、適切な宿主細胞中に発現ベクターを含む、前記融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドの生成用の宿主－ベクター系を提供する。
[0099]一態様では、本発明は、本明細書に開示の融合ポリペプチドをコードする核酸分子の構築を提供し、この核酸は、適当な宿主細胞に導入される場合に融合ポリペプチドを発現することができるベクターに挿入される。適当な宿主細胞には、それらに限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれる。ＤＮＡ断片のベクターへの挿入のための当業者であれば知られる任意の方法を使用して、転写／翻訳制御シグナルの制御下でキメラポリペプチド分子をコードする発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組換えＤＮＡ技法および合成技法、ならびにｉｎ ｖｉｖｏ組換え（遺伝子組換え）が含まれ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照されたい）。
[00100]本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸分子の発現は、融合ポリペプチドが当該核酸分子で形質転換された宿主において発現されるように、第２の核酸配列（プロモーター）によって調節され得る。例えば、本明細書に記載の融合ポリペプチドの発現は、当技術分野で知られる任意のプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御され得る。
[00101]一般に、宿主細胞に適合する種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターが、そのような宿主との関係で使用される。ベクターはたいてい、複製部位ならびに形質転換細胞中で表現型選択を提供することができる識別配列（ｍａｒｋｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する。例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、通常にはｐＢＲ３２２を、大腸菌種に由来するプラスミドを使用して形質転換される（例えばＢｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ、２：９５頁（１９７７）を参照されたい）。ｐＢＲ３２２プラスミドは、アンピシリンおよびテトラサイクリンの耐性遺伝子を含有し、したがって形質転換細胞を特定するための容易な手段をもたらす。ｐＢＲ３２２プラスミドまたはその他の微生物プラスミドもしくはファージはまた、タンパク質の発現向けに微生物体によって使用され得るプロモーターを含有する必要がある、または、含有するように改変され得る必要がある。
[00102]組換えＤＮＡ構築で最もよく使用されるそういったプロモーターには、β－ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系ならびにトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、８：４０５７頁（１９８０））が含まれる。それらが最もよく使用されるが、他の微生物プロモーターが発見されかつ利用されてきた。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐオペロンとｌａｃオペロン由来のプロモーターの組合せから生成される合成的に生成されたＤＮＡプロモーターである（ｄｅ Ｂｏｅｒら、ＰＮＡＳ、（１９８３－０１－８０（１）：２１～２５頁（１９８３））。これは、大腸菌におけるタンパク質生成によく使用される（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ、２５：１６７頁（１９８３））。これらのプロモーターのいずれもが、本発明の融合ポリペプチドの生成方法との関係で使用され得る。
[00103]原核生物に加えて、酵母培養物などの真核微生物もまた使用され得る。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または普通のパン酵母が真核微生物の中でも最も普通に使用されるが、いくつかの他の株が普通に利用可能である。サッカロマイセスでの発現の場合、例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９頁（１９７９））が普通には使用される。他のプラスミドが米国特許第４，６１５，９７４号；Ｓｔｒｕｈｌら、ＰＮＡＳ、７６（３）：１０３５頁（１９７９）に開示されている。プラスミドＹＲｐ７は、トリプトファン無しで増殖する能力を欠く酵母の突然変異型株、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．４４，０７６またはＲＨ２１８（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：２３頁（１９７７））に対する選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を含有する。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在は、次いで、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
[00104]酵母ベクター中で適切なプロモーター配列には、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ用（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２５５：２０７３頁（１９８０））、または他の糖分解酵素用、例えば、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ用、ヘキソキナーゼ用、ピルビン酸デカルボキシラーゼ用、およびグルコキナーゼ用（Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ、８：４２３頁（１９９２）；Ｗｅｉｎｈａｎｄｌら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、１３：５頁（２０１４））のプロモーターが含まれる。適切な発現プラスミドを構築する場合、これらの遺伝子に付随する終止配列はまた、発現されるのが望ましい配列の発現ベクター３’中にライゲートされて、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止をもたらす。増殖条件により制御される転写に関するさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２の、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域である（Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｗｅｉｎｈａｎｄｌら、上掲）。酵母適合性プロモーター、複製起点および終止の各配列を含有する任意のプラスミドベクターが適切である。
[00105]微生物に加えて、多細胞生物体に由来する細胞の培養もまた宿主として使用され得る。原則として、任意のかかる細胞培養が、脊椎動物培養由来にしろ無脊椎動物培養由来にしろ、実現可能である。しかし、脊椎動物細胞に大きな関心が注がれており、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖が、近年では慣用の手順となってきた（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、編者（１９７３））。かかる有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯ細胞およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株およびＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７，２９３、およびＭＤＣＫの各細胞株である。かかる細胞用の発現ベクターはたいてい、必要な任意のリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列とともに、（必要であれば）複製起点、発現される遺伝子の前に位置するプロモーターを含む。
[00106]哺乳動物細胞での使用の場合、発現ベクター上の制御機能はウイルス材料により提供されることが多い。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２に由来し、最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有する断片として上記ウイルスから両プロモーターが容易に得られるので（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３頁（１９７８））、特に有用である。上記ウイルスの複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位へ向けて伸長する概２５０ｂｐ配列が含まれているのであれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片も使用され得る。さらに、かかる制御配列が宿主細胞系と適合性であれば、所望の遺伝子配列に正常に付随するプロモーターまたは制御配列を利用することが、可能でもありそして多くの場合で望ましい。
[00107]したがって、本発明によれば、本明細書に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸を含む、細菌、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞の各宿主で複製されることが可能な発現ベクターを使用して、宿主へのトランスフェクションを行い、それによって、融合ポリペプチドを生成するようにかかる核酸の発現を方向付けるが、次いでこのペプチドは生物学的に活性な形態で回収され得る。本明細書で使用される場合、生物学的に活性な形態には、少なくとも１つのＶＥＧＦファミリーメンバーに結合することができる形態が含まれる。
[00108]一部の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌、ＣＯＳ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞とすることができる。一部の他の実施形態では、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞とすることができる。
ベクター構築
[00109]所望のコーディング配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築は、標準ライゲーション技法を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、必要なプラスミドを形成するのに望ましい形態で切断、調整、およびライゲートされる。用いられる方法は、ＤＮＡ源または意図される宿主に左右されない。切断は、適切な緩衝剤中の制限酵素（または複数の制限酵素）で処理することによって実行される。
[00109]所望のコーディング配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築は、標準ライゲーション技法を用いる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、必要なプラスミドを形成するのに望ましい形態で切断、調整、およびライゲートされる。用いられる方法は、ＤＮＡ源または意図される宿主に左右されない。切断は、適切な緩衝剤中の制限酵素（または複数の制限酵素）で処理することによって実行される。
[00110]ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２、またはＶＥＧＲ－３の１つまたは複数のＩｇ様ドメインを実質的にコードする核酸配列は、米国特許第６，８９７，２９４号に開示の方法に従って生成され得る。
[00111]ＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３、ならびにＶＥＧＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２を実質的にコードする核酸配列が所望の順序でタンデムにライゲートされる。次いで、この構築物は、ＩｇＧ１の所望のＦｃ部分をコードする核酸配列のＮ末端にライゲートされる。次いで、核酸配列全体が、遺伝子のリーディングフレームにプロモーターを含有し、提案された宿主細胞と適合するベクターに、配置される。米国特許第４，４５６，７４８号；同第５，４６０，８１１号；同第５，８８８，８０８号；および同第６，３３３，１４７号に記載のものなどの、いくつかのプラスミドが、本発明の融合ポリペプチドの生成に使用され得る。
[00112]一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、米国特許第７，０７０，９５９号に記載の方法に従って生成される。融合ポリペプチド（「ＶＥＧＦＲ－１－Ｄ２－ＶＥＧＦＲ－２－Ｄ３－ＶＥＧＦＲ－３－Ｄ１Ｄ２－Ｆｃ」または「ＶＥＧＦＲ－１－Ｄ２－ＶＥＧＦＲ－２－Ｄ３－ＶＥＧＦＲ－３－Ｄ１Ｄ２Ｄ３－Ｆｃ」）の核酸配列全体が、ＣＭＶプロモーターを有する発現ベクターｐＥＥ１４．１（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）に挿入される。ＣＨＯ Ｋ１細胞が、ｐＥＥ１４．１／ＶＥＧＦＲ－１－Ｄ２－ＶＥＧＦＲ－２－Ｄ３－ＶＥＧＦＲ－３－Ｄ１Ｄ２－Ｆｃ ＤＮＡ構築物またはｐＥＥ１４．１／ＶＥＧＦＲ－１－Ｄ２－ＶＥＧＦＲ－２－Ｄ３－ＶＥＧＦＲ－３－Ｄ１Ｄ２Ｄ３－Ｆｃ ＤＮＡ構築物をトランスフェクトされ、次いで増殖される。米国特許第７，０７０，９５９号に記載のように、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞から得られた融合ポリペプチドは精製され、結合アッセイによって特徴付けられる。
[00113]一実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、Ｋｄ≦１０－９ＭでＶＥＧＦファミリーメンバーに結合することができる。別の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、Ｋｄ≦５×１０－１０ＭでＶＥＧＦファミリーメンバーに結合することができる。さらに別の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、Ｋｄ≦１０－１０ＭでＶＥＧＦファミリーメンバーに結合することができる。
[00114]一態様では、本発明は、異常な血管新生に病因を有する疾患、状態、または障害を処置するまたは制御するための化合物、組成物、および方法を提供する。
[00115]別の態様では、本発明は、異常な血管新生に病因を有する、少なくとも１つの眼性の疾患、状態、または障害を、対象において、処置するまたは制御するための方法を提供する。方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１５、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む組成物を、かかる処置または制御を必要とする対象に投与するステップを含む。
[00116]さらに別の態様では、方法は、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８６位および２８７位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする、アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む組成物を、対象に投与するステップを含む。
[00117]さらに別の態様では、方法は、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列は非置換でありＮＤＴのままである、アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む組成物を、対象に投与するステップを含む。
[00118]さらに別の態様では、方法は、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８６位および２８７位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする、アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む組成物を、対象に投与するステップを含む。
[00119]さらに別の態様では、方法は、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列は非置換でありＮＤＴのままであることを条件とする、アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む組成物を、対象に投与するステップを含む。
[00120]さらに別の態様では、前記眼性の疾患、状態、または障害は、脈絡膜血管新生（近視性脈絡膜血管新生を含めて）、ポリープ状脈絡膜血管症、網膜血管新生、血管漏出、網膜浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症および非感染性後部ブドウ膜炎からなる群から選択される状態によって引き起こされる黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、角膜血管新生、角膜炎症、近視性血管新生、血管新生緑内障、ならびに血管新生加齢黄斑変性症（網膜血管新生に起因する滲出型加齢黄斑変性症）からなる群から選択される
[00121]別の態様では、本発明は、異常な血管新生に病因を有する、少なくとも１つの眼性の疾患、状態、または障害を、対象において、処置するまたは制御するための医薬の調製または製造のための融合ポリペプチドの使用を提供し；ここで、融合ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１５、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
[00121]別の態様では、本発明は、異常な血管新生に病因を有する、少なくとも１つの眼性の疾患、状態、または障害を、対象において、処置するまたは制御するための医薬の調製または製造のための融合ポリペプチドの使用を提供し；ここで、融合ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１５、配列番号１２、および配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
[00122]さらに別の態様では、本発明は、異常な血管新生に病因を有する、少なくとも１つの眼性の疾患、状態、または障害を、対象において、処置するまたは制御するための医薬の調製または製造のための融合ポリペプチドの使用を提供し；ここで、融合ポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８６位および２８７位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする、アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
[00123]さらに別の態様では、前記使用のための融合ポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列は非置換でありＮＤＴのままである、アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
[00124]さらに別の態様では、本発明は、異常な血管新生に病因を有する、少なくとも１つの眼性の疾患、状態、または障害を、対象において、処置するまたは制御するための医薬の調製または製造のための融合ポリペプチドの使用を提供し；ここで、融合ポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８６位および２８７位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする、アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
[00125]さらに別の態様では、前記使用のための融合ポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列は非置換でありＮＤＴのままである、アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
[00126]さらに別の態様では、前記眼性の疾患、状態、または障害は、本明細書に開示の疾患、状態、または障害からなる群から選択される。
[00127]一実施形態では、対象は、約２５～４０００マイクログラムの用量の融合ポリペプチドを投与される。別の実施形態では、対象は、約５０～４０００、約１００～４０００、約５００～４０００、約１０００～４０００、約２０００～４０００、約５０～３０００、約５０～２０００、約５０～１０００、または約５０～５００マイクログラムの用量の融合ポリペプチドを投与される。
[00128]さらに別の態様では、融合ポリペプチドを含む組成物は、点眼薬または眼注射（例えば、硝子体内、房内、眼窩周囲、テノン嚢下、網膜下、または脈絡膜上の各注射）の形態である。かかる組成物は眼科用組成物を含む。本発明の融合ポリペプチドはまた、疾患組織内にまたはその近傍に移植することができる医療デバイスに組み込まれることがある。
[00129]一実施形態では、前部疾患、状態、または障害；例えば、角膜血管新生、角膜炎症、または血管新生緑内障を処置するまたは制御する場合、融合ポリペプチドを含む組成物は、点眼薬または眼房内もしくは結膜下の注射の形態とすることができる。別の実施形態では、後眼部疾患、状態、または障害；例えば、脈絡膜血管新生（近視性脈絡膜血管新生を含めて）、血管新生加齢黄斑変性、血管漏出、網膜浮腫、または糖尿病性網膜症を処置するまたは制御する場合、融合ポリペプチドを含む組成物は、硝子体内注射の形態とすることができる。
[00130]さらに別の態様では、点眼薬は、疾患、状態、または障害が実質的に処置または制御されるまで、１日当たり少なくとも１回、１週間当たり少なくとも１回、または１か月当たり少なくとも１回、対象に投与される。
[00131]さらに別の態様では、組成物は、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、または少なくとも６か月の期間、対象に投与される。
[00132]さらに別の態様では、硝子体内注射または患部組織内へのもしくはその近傍への注射は、特定の患者に対して医師によって推奨されるレジメンに従って対象に投与される。例えば、注射は、疾患、状態、または障害が実質的に処置または制御されるまで、１か月当たり少なくとも１回、２か月毎に少なくとも１回、３か月毎に少なくとも１回、または６か月毎に少なくとも１回投与され得る。一実施形態では、処置は、医師によって決定され得るとおりに、最初にはより頻繁に、次いで、一定期間後には少ない頻度で投与され得る。
[00133]かかる眼科用組成物中の本発明の融合ポリペプチドの濃度は、約０．１から約２００ｍｇ／ｍｌまで（または、代替的に、約０．２５から約２００ｍｇ／ｍｌまで、または約０．２５から約１６０ｍｇ／ｍｌまで、または約０．５から約１００ｍｇ／ｍｌまで、または約０．２５から約５０ｍｇ／ｍｌまで、または約０．５から約２００ｍｇ／ｍｌまで、または約０．５から約１６０ｍｇ／ｍｌまで、または約０．５から約１００ｍｇ／ｍｌまで、または約０．５から約５０ｍｇ／ｍｌまで、または約１から約２００ｍｇ／ｍｌまで、または１から約１６０ｍｇ／ｍｌまで、または約０．５から約１００ｍｇ／ｍｌまで、または約１から約５０ｍｇ／ｍｌまで）の範囲とすることができる。
[00134]さらに別の態様では、本発明の組成物を調製するための方法は、（ａ）本発明の融合ポリペプチドのある量と（ｂ）生理学的に許容される担体とを組み合わせるステップを含む。
[00135]一実施形態では、かかる生理学的に許容される担体は、滅菌生理食塩水または生理学的に許容される緩衝剤とすることができる。別の実施形態では、かかる担体は、薬学的に許容される油などの疎水性媒体を含む。さらに別の実施形態では、担体などは疎水性材料と水のエマルジョンを含む。さらに別の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、長い循環時間をもたらすために、高分子量物質と会合していても連結されていてもよい。
[00136]生理学的に許容される緩衝剤には、それらに限定されないが、リン酸緩衝剤またはＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝剤（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびＨＣｌを含む）が含まれる。例えば、７．４のｐＨを有するトリス－ＨＣｌ緩衝剤は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３ｇ／ｌおよびＨＣｌ ０．７６ｇ／ｌを含む。さらに別の態様では、緩衝剤は、１０×リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）または５×ＰＢＳ溶液である。
[00137]その他の緩衝剤も一部の状況では、例えば、２５℃で７．５のｐＫａおよび約６．８～８．２の範囲のｐＨを有するＨＥＰＥＳ（Ｎ－｛２－ヒドロキシエチル｝ピペラジン－Ｎ’－｛２－エタンスルホン酸｝）；２５℃で７．１のｐＫａおよび約６．４～７．８の範囲のｐＨを有するＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス｛２－ヒドロキシエチル｝２－アミノエタンスルホン酸）；２５℃で７．２のｐＫａおよび約６．５～７．９の範囲のｐＨを有するＭＯＰＳ（３－｛Ｎ－モルホリノ｝プロパンスルホン酸）；２５℃で７．４のｐＫａおよび約６．８～８．２の範囲のｐＨを有するＴＥＳ（Ｎ－トリス｛ヒドロキシメチル｝－メチル－２－アミノエタンスルホン酸）；２５℃で７．６のｐＫａおよび約６．９～８．３の範囲のｐＨを有するＭＯＢＳ（４－｛Ｎ－モルホリノ｝ブタンスルホン酸）；２５℃で７．５２のｐＫａおよび約７～８．２の範囲のｐＨを有するＤＩＰＳＯ（３－（Ｎ，Ｎ－ビス｛２－ヒドロキシエチル｝アミノ）－２－ヒドロキシプロパン））；２５℃で７．６１のｐＫａおよび約７～８．２の範囲のｐＨを有するＴＡＰＳＯ（２－ヒドロキシ－３｛トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ｝－１－プロパンスルホン酸））；２５℃で８．４のｐＫａおよび約７．７～９．１の範囲のｐＨを有するＴＡＰＳ（｛（２－ヒドロキシ－１，１－ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ｝－１－プロパンスルホン酸）；２５℃で８．９のｐＫａおよび約８．２～９．６の範囲のｐＨを有するＴＡＢＳ（Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－４－アミノブタンスルホン酸）；２５℃で９．０のｐＫａおよび約８．３～９．７の範囲のｐＨを有するＡＭＰＳＯ（Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）；２５℃で９．５のｐＫａおよび約８．６～１０．０の範囲のｐＨを有するＣＨＥＳ（２－シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）；２５℃で９．６のｐＫａおよび約８．９～１０．３の範囲のｐＨを有するＣＡＰＳＯ（３－（シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸）；または、２５℃で１０．４のｐＫａおよび約９．７～１１．１の範囲のｐＨを有するＣＡＰＳ（３－（シクロヘキシルアミノ）－１－プロパンスルホン酸）をベースとした各緩衝剤も、適切であるまたは望ましいと見出され得る。
[00138]ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、約４から約６．８までなどの、または代替的に約５から約６．８までなどの、酸性ｐＨを有する緩衝剤中で製剤化される。かかる実施形態では、組成物の緩衝キャパシティは望ましくは、患者に投与された後、組成物が急速に生理学的ｐＨになることを可能にする。
[00139]緩衝剤に加えて、本発明の組成物は、界面活性剤、安定剤、防腐剤、共溶媒、湿潤剤、皮膚軟化薬、キレート剤、張性調整剤、および抗酸化剤からなる群から選択される材料を含むことができる。
[00140]一態様では、本発明の組成物で使用され得るこれらの材料のいずれもが、眼科的に許容される材料である。
[00141]用いられ得る水溶性防腐剤には、重亜硫酸ナトリウム、重硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、エチルアルコール、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、ベンジルアルコール、およびフェニルエチルアルコールが含まれる。これらの薬剤は、約０．００１重量％から約５重量％まで（好ましくは、約０．０１重量％～約２重量％）の個々の量で存在し得る。用いられ得る適切な水溶性緩衝剤は、所望の投与経路向けに米国食品医薬品局（「ＵＳＦＤＡ」）によって承認されているとおり、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどである。
[00142]界面活性剤の非限定的な例としては、それらに限定されないが、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート（例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェノール／ポリ（オキシエチレン）ポリマー（例えばチロキサポール（商標）で販売されているポリマー）、ポリ（オキシエチレン）－ポリ（オキシプロピレン）ブロックコポリマー、脂肪酸のグリコール酸エステルなど、およびそれらの混合物が挙げられる。
[00143]一態様では、組成物のｐＨは、約４から約１１までの範囲である。代替的に、組成物のｐＨは、約６から約８まで、または約６．５から約８までの範囲である。
[00144]別の態様では、組成物は約７のｐＨを有する。代替的に、組成物は約７から約７．５までの範囲のｐＨを有する。
[00145]さらに別の態様では、組成物は約７．４のｐＨを有する。
[00146]さらに別の態様では、組成物はまた、対象への組成物の投与を容易にするようにまたは対象における生物学的利用能を促進するように設計された粘度調整化合物を含むことができる。さらに別の態様では、粘度調整化合物は、眼の環境に投与された後に組成物が容易には分散しないように、選択され得る。かかる化合物は、組成物の粘度を増強することができ、かかる化合物には、それらに限定されないが：グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコールなどのモノマーポリオール；ポリエチレングリコールなどのポリマーポリオール；ヒドロキシプロピルメチルセルロース（「ＨＰＭＣ」）、カルボキシメチルセルロース（「ＣＭＣ」）ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース（「ＨＰＣ」）などのセルロースファミリーの種々のポリマー；ヒアルロン酸およびその塩、コンドロイチン硫酸およびその塩、デキストラン例えばデキストラン７０などの、多糖類；ゼラチンなどの水溶性タンパク質；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポビドンなどのビニルポリマー；カルボマー９３４Ｐ、カルボマー９４１、カルボマー９４０、またはカルボマー９７４Ｐなどのカルボマー；およびアクリル酸ポリマー、が含まれ得る。一般に、所望の粘度は、約１から約４００センチポアズ（「ｃｐｓ」）またはｍＰａ．ｓまでの範囲とすることができる。
[00147]キレート剤の非限定的な例には、エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）、ジエチレントリアミンペンタキス（メチルホスホン酸）、エチドロン酸、エチドロン酸の四ナトリウム塩（「ＨＡＰ」としても知られる）が挙げられる。
[00148]緩衝剤自体、点眼液を特定のイオン濃度およびｐＨに大まかに維持する「張性調整剤」および「ｐＨ調整剤」であるが、溶液の最終張性を調整するために、さらなる「張性調整剤」が添加され得る。かかる張性調節剤は当業者によく知られており、これには、それらに限定されないが、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、スクロース、尿素、プロピレングリコール、およびグリセリンが含まれる。また、１価カチオンのハロゲン化物塩（例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ）を含めて、種々の塩も利用され得る。典型的には、本発明の製剤の張性は、約２００から４００ｍＯｓｍ／ｋｇまでの範囲である。代替的に、本発明の製剤の張性は、約２２０から４００ｍＯｓｍ／ｋｇまで、または約２２０から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇまで、または約２２０から３００ｍＯｓｍ／ｋｇまで、または約２５０から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇまでの範囲である。
[00149]抗酸化剤の非限定的な例としては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）ならびにその塩およびエステル；トコフェロール（例えばα－トコフェロール）およびトコトリエノール（ビタミンＥ）ならびにそれらの塩およびエステル（例えばビタミンＥ ＴＧＰＳ（コハク酸Ｄ－α－トコフェリルポリエチレングリコール１０００））；グルタチオン；リポ酸；尿酸；ブチル化ヒドロキシアニソール（「ＢＨＡ」）；ブチル化ヒドロキシトルエン（「ＢＨＴ」）；三級ブチルヒドロキノン（「ＴＢＨＱ」）；ならびにポリフェノール系抗酸化剤（例えば没食子酸、桂皮酸、フラボノイド、ならびにそれらの塩、エステル、および誘導体）が挙げられる。
[00150]安定剤の非限定的な例としては、スクロース、マンニトール、ソルビトール、およびトレハロースが挙げられる。
[00151]以下の実施例における種々の成分または混合物の割合は、適当な状況で調整され得ることを理解されたい。
[00152]別の態様では、本発明の融合ポリペプチドおよび適当な量の１つまたは複数の所望の賦形剤が、眼の一部、例えば前眼部もしくは後眼部、または硝子体液への局所投与用または注射用の製剤に組み込まれる。注射用製剤は、約１週間よりも長い（または約１、２、３、４、５、または６か月よりも長い）期間などの、有効成分の持続放出をもたらす担体を望ましくは含むことができる。
[00153]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドおよび所望の賦形剤を含む組成物が凍結乾燥され、対象への投与の実質的に直前に生理学的に許容される液体担体で再構成される。
[00154]一実施形態では、本発明の化合物または組成物は、２５～３５ゲージなどの極細ゲージの針で注射され得る。典型的には、本発明の融合ポリペプチド約２５～４０００μｇを含む約２５μｌから約１００μｌまでの量の組成物が患者に投与される。一実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８６位および２８７位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であることを条件とする、アミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは配列番号１２または配列番号１６に列挙されたとおりのアミノ酸配列を有する。かかる融合ポリペプチドの濃度は上に開示の範囲から選択される。
[00155]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドは、生分解性材料を含む眼科用デバイスに組み込まれ、そしてデバイスは、対象の後眼部組織に移植されて、血管新生疾患、状態、または障害の長期の（例えば、約１週間よりも長く、または約１、２、３、４、５、もしくは６か月よりも長く）処置または制御をもたらす。かかるデバイスは、熟練した医師によって対象の眼組織または眼周囲組織に移植され得る。有効成分の持続放出向けの眼科インプラントシステムまたはデバイスの非限定的な例は、米国特許第５，３７８，４７５号；同第５，７７３，０１９号；同第５，９０２，５９８号；同第６，００１，３８６号；同第６，０５１，５７６号；および同第６，７２６，９１８号に開示されている。
[00156]さらに別の態様では、眼の血管新生疾患、状態、または障害を処置するまたは制御するための方法は、本発明の融合ポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
[00157]さらに別の態様では、眼の血管新生疾患、状態、または障害を処置するまたは制御するための方法は、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたとおりのアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
[00158]さらに別の態様では、眼の後眼部における異常な血管新生に病因を有する眼の血管新生疾患、状態、または障害を処置するまたは制御するための方法は、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたとおりのアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドを含む組成物を、それを必要とする対象に硝子体内で注射するステップを含む。
[00159]別の実施形態では、かかる疾患、状態、または障害は、脈絡膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、近視性血管新生、未熟児網膜症を始めとする網膜血管新生、血管漏出、糖尿病性黄斑浮腫および網膜静脈閉塞症や非感染性後部ブドウ膜炎などの他の網膜状態によって引き起こされる黄斑浮腫を始めとする網膜浮腫、増殖性糖尿病網膜症を始めとする糖尿病性網膜症、角膜血管新生、ならびに血管新生緑内障、からなる群から選択される。
[00160]さらに別の態様では、本発明の組成物は、週に１回、月に１回、年に１回、年に２回、年に４回、または、前眼部炎症性の疾患、状態、または障害を処置するまたは制御するのに適当であると判定される適切な頻度で投与される。
[00161]さらに別の態様では、本発明の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、がん、乾癬、関節リウマチ、およびアテローム性動脈硬化症などの、異常な血管新生によって促進されるかまたは異常な血管新生に病因を有する他の非眼性の疾患または状態の処置または制御のためにも使用され得る。かかる処置または制御は、例えば、全身投与によって実施されてもよい。
[00162]さらに別の態様では、本発明は、がん、乾癬、関節リウマチ、およびアテローム性動脈硬化症などの、異常な血管新生によって促進されるかまたは異常な血管新生に病因を有する非眼性の疾患または状態を処置するまたは制御するための医薬の調製または製造のための融合ポリペプチドまたは融合タンパク質の使用を提供する。
[00163]本発明による処置に適合するがんには、それらに限定されないが、癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が含まれる。かかるがんのより具体的な例としては、扁平上皮細胞がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含めて）、腹膜のがん、肝細胞がん、胃がんもしくは胃のがん（消化器がんを含めて）、膵がん、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞癌、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓がんまたは腎がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰部のがん、甲状腺がん、肝癌および様々なタイプの頭頸部がん、ならびに、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球ＮＨＬ、高悪性度非小開裂細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含めて）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に伴う異常な血管増殖、浮腫（例えば、脳腫瘍に伴う浮腫）、およびメーグス症候群が、挙げられる。一部の実施形態では、がんは、乳がん、直腸結腸がん、結腸がん、非小細胞肺がん、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、腎細胞がん、前立腺がん、肝臓がん、膵がん、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド癌、頭頸部がん、悪性黒色腫、卵巣がん、中皮腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される。別の実施形態では、がんは結腸直腸がんである。本発明の処置に適合するがん性状態には転移性がんが含まれる。本発明の方法は血管化した腫瘍の処置に特に適する。
実施例１
組成物１
[00164]本発明の組成物を、１０～１００ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質ＥＢ－１０１、１０ｍＭヒスチジンＨＣｌ緩衝剤、１０（重量）％α、α－トレハロース、および０．０１（重量）％ポリソルベート２０を組み合わせることによって調製する。一部の実施形態では、組成物はまた、抗酸化剤、キレート剤、および防腐剤、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む場合がある。組成物は、約５～６の範囲のｐＨを有し、硝子体内を含めて眼内投与に適する。
組成物１
[00164]本発明の組成物を、１０～１００ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質ＥＢ－１０１、１０ｍＭヒスチジンＨＣｌ緩衝剤、１０（重量）％α、α－トレハロース、および０．０１（重量）％ポリソルベート２０を組み合わせることによって調製する。一部の実施形態では、組成物はまた、抗酸化剤、キレート剤、および防腐剤、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される材料を含む場合がある。組成物は、約５～６の範囲のｐＨを有し、硝子体内を含めて眼内投与に適する。
実施例２
組成物２
[00165]本発明の組成物を、１０～１００ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質ＥＢ－１０１、１０ｍＭリン酸緩衝剤、４０ｍＭ ＮａＣｌ、５（重量）％スクロース、および０．０３（重量）％ポリソルベート２０を組み合わせることによって調製する。組成物は、約５．５～６．５の範囲のｐＨを有し、硝子体内を含めて眼内投与に適する。
組成物２
[00165]本発明の組成物を、１０～１００ｍｇ／ｍＬの融合タンパク質ＥＢ－１０１、１０ｍＭリン酸緩衝剤、４０ｍＭ ＮａＣｌ、５（重量）％スクロース、および０．０３（重量）％ポリソルベート２０を組み合わせることによって調製する。組成物は、約５．５～６．５の範囲のｐＨを有し、硝子体内を含めて眼内投与に適する。
実施例３
ＨＥＫ２９３細胞におけるＥＢ－１０１の一過性発現
[00166]配列番号１２により指示されるようなＥＢ－１０１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し、タンパク質を発現するためのベクターを構築した。発現ベクターを使用して、合成培養培地を用いて一過性に２９３細胞へのトランスフェクションを行った。生成されたタンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティーカラム、限外ろ過によって精製し、次いで０．２μｍの無菌ろ過に供して高純度のバルクを得た。ＨＥＫ２９３細胞でのＥＢ－１０１の発現は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により分析した場合、ＭＷおよそ２００ＫＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて非還元型）および純度９６％のタンパク質を産生していた。図２を参照されたい。
ＨＥＫ２９３細胞におけるＥＢ－１０１の一過性発現
[00166]配列番号１２により指示されるようなＥＢ－１０１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し、タンパク質を発現するためのベクターを構築した。発現ベクターを使用して、合成培養培地を用いて一過性に２９３細胞へのトランスフェクションを行った。生成されたタンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティーカラム、限外ろ過によって精製し、次いで０．２μｍの無菌ろ過に供して高純度のバルクを得た。ＨＥＫ２９３細胞でのＥＢ－１０１の発現は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）により分析した場合、ＭＷおよそ２００ＫＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて非還元型）および純度９６％のタンパク質を産生していた。図２を参照されたい。
実施例４
ＣＨＯ細胞におけるＥＢ－１０１の一過性発現。
[00167]配列番号１２により指示されるようなＥＢ－１０１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し、タンパク質を発現するためのベクターを構築した。発現ベクターを使用して、合成培養培地を用いて一過性にＣＨＯ細胞へのトランスフェクションを行った。生成されたタンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティーカラム、限外ろ過によって精製し、次いで０．２μｍの無菌ろ過に供して高純度のバルクを得た。ＣＨＯ細胞でのＥＢ－１０１の発現は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより分析した場合、ＭＷおよそ２００ＫＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて非還元型）および純度１００％のタンパク質を産生していた。図３を参照されたい。
ＣＨＯ細胞におけるＥＢ－１０１の一過性発現。
[00167]配列番号１２により指示されるようなＥＢ－１０１のアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し、タンパク質を発現するためのベクターを構築した。発現ベクターを使用して、合成培養培地を用いて一過性にＣＨＯ細胞へのトランスフェクションを行った。生成されたタンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティーカラム、限外ろ過によって精製し、次いで０．２μｍの無菌ろ過に供して高純度のバルクを得た。ＣＨＯ細胞でのＥＢ－１０１の発現は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより分析した場合、ＭＷおよそ２００ＫＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて非還元型）および純度１００％のタンパク質を産生していた。図３を参照されたい。
[00168]
実施例５
ＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅを使用した、ヒト組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ｂ１６７／１８９、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰｌＧＦに対する結合親和性について、ＥＢ－１０１とアフリベルセプトとの比較。図４～８を参照されたい。
実施例５
ＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅを使用した、ヒト組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－Ｂ１６７／１８９、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、およびＰｌＧＦに対する結合親和性について、ＥＢ－１０１とアフリベルセプトとの比較。図４～８を参照されたい。
[00169]ＣＭ５センサーチップ表面上への抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体の固定化によりＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを実施し、ＳＰＲ Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによりリガンド固定化のレベルを決定した。ＣＭ５センサーチップ上にカップリングする抗Ｆｃ抗体の量は、約７，０００～１４，０００レスポンス単位（「ＲＵ」）であった。次いで、ＥＢ－１０１またはアフリベルセプトをサンプルチャネルに注入し、その結果約４００ＲＵの捕捉レベルに達した。最終的に、流している緩衝剤で希釈された様々な濃度の被検物質（本アッセイではＶＥＧＦ－Ａ）を、親和性およびキネティクスの測定のために注入した。１：１結合モデルを使用して、結合親和性および／またはキネティクスを測定した。ＥＢ－１０１へのＶＥＧＦ－Ａ１６５結合の反応速度定数は以下のとおりであった：平衡解離定数ＫＤ＝７．５１×１０－１２Ｍ（７．５１ｐＭ）、結合速度定数Ｋａ＝５．０６×１０７Ｍ－１ｓ－１、解離速度定数Ｋｄ＝３．６４×１０－４ｓ－１。アフリベルセプトへのＶＥＧＦ－Ａ１６５結合の反応速度定数は以下のとおりであった：平衡解離定数ＫＤ＝３．３６×１０－１１Ｍ（３３．６ｐＭ）、結合速度定数Ｋａ＝１．３６×１０７Ｍ－１ｓ－１、解離速度定数Ｋｄ＝４．５８×１０－４ｓ－１。
[00170]ＥＢ－１０１へのＶＥＧＦ－Ｂ１６７／１８９結合の反応速度定数は以下のとおりであった：平衡解離定数ＫＤ＝１．３８×１０－１０Ｍ（１３８ｐＭ）、結合速度定数Ｋａ＝２．２０×１０６Ｍ－１ｓ－１、解離速度定数Ｋｄ＝３．０３×１０－４ｓ－１。アフリベルセプトへのＶＥＧＦ－Ｂ１６７／１８９結合の反応速度定数は以下のとおりであった：平衡解離定数ＫＤ＝１．７３×１０－１１Ｍ（１７．３ｐＭ）、結合速度定数Ｋａ＝３．２７×１０６Ｍ－１ｓ－１、解離速度定数Ｋｄ＝５．６７×１０－５ｓ－１。
[00171]ＥＢ－１０１へのＶＥＧＦ－Ｃ結合の反応速度定数は以下のとおりであった：平衡解離定数ＫＤ＝４．６４×１０－１０Ｍ（０．４６４ｎＭ）、結合速度定数Ｋａ＝３．１１×１０６Ｍ－１ｓ－１、解離速度定数Ｋｄ＝１．４４×１０－３ｓ－１。ＶＥＧＦ－Ｃとアフリベルセプトの結合は検出され得ない。
[00172]ＶＥＧＦ－ＤとＥＢ－１０１またはアフリベルセプトとの結合は検出され得ない。
[00173]ＥＢ－１０１へのＰｌＧＦ結合の反応速度定数は以下のとおりであった：平衡解離定数ＫＤ＝２．０９×１０－１０Ｍ（２０９ｐＭ）、結合速度定数Ｋａ＝１．６８×１０７Ｍ－１ｓ－１、解離速度定数Ｋｄ＝３．１５×１０－３ｓ－１。アフリベルセプトへのＰｌＧＦ結合の反応速度定数は以下のとおりであった：平衡解離定数ＫＤ＝４．８４×１０－１０Ｍ（４８４ｐＭ）、結合速度定数Ｋａ＝１．２６×１０６Ｍ－１ｓ－１、解離速度定数Ｋｄ＝６．１０×１０－４ｓ－１。
[00174]したがって、これらのＶＥＧＦファミリーメンバーへのＥＢ－１０１の結合は、アフリベルセプトと比較してより良好である。
実施例６
ＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１とアフリベルセプトおよびベバシズマブとの比較。
[00175]組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に及ぼすＥＢ－１０１の効果は、アフリベルセプトまたはベバシズマブによって阻害された効果に匹敵した。図９を参照されたい。
ＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１とアフリベルセプトおよびベバシズマブとの比較。
[00175]組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に及ぼすＥＢ－１０１の効果は、アフリベルセプトまたはベバシズマブによって阻害された効果に匹敵した。図９を参照されたい。
実施例７
ＶＥＧＦＲ２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞における、ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達の阻害に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１とアフリベルセプトとの比較。
[00176]組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃを試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。アフリベルセプトではなく、ＥＢ－１０１が、ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の濃度依存性の阻害を有した。図１０を参照されたい。
ＶＥＧＦＲ２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞における、ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達の阻害に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１とアフリベルセプトとの比較。
[00176]組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃを試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。アフリベルセプトではなく、ＥＢ－１０１が、ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の濃度依存性の阻害を有した。図１０を参照されたい。
実施例８
ＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に及ぼすそれらの阻害効果に関する、ＥＢ－１０１と、アフリベルセプトおよび７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３（ｒｈＶＥＧＦＲ－３－７ＥＣＤ）との比較。
[00177]組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃを試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。アフリベルセプトではなく、ＥＢ－１０１およびｒｈＶＥＧＦＲ－３が、ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の用量依存性の阻害を有した。図１１を参照されたい。
ＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に及ぼすそれらの阻害効果に関する、ＥＢ－１０１と、アフリベルセプトおよび７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３（ｒｈＶＥＧＦＲ－３－７ＥＣＤ）との比較。
[00177]組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃを試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。アフリベルセプトではなく、ＥＢ－１０１およびｒｈＶＥＧＦＲ－３が、ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の用量依存性の阻害を有した。図１１を参照されたい。
実施例９
ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃにより刺激されたＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に及ぼす効果について、アフリベルセプトおよび７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３（ｒｈＶＥＧＦＲ－３）とともに、ＥＢ－１０１の定量的分析。
[00178]試験化合物を、６０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ１６５および２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ｃを含有するカクテルと混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで結果として生成する溶液を４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエルを含有するウエルに添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。ＥＢ－１０１、およびｒｈＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５プラスＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達を効果的に阻害したが、一方、アフリベルセプトまたはｒｈＶＥＧＦＲ３いずれか単独では、ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に対して限定された効果のみを示した。図１２を参照されたい。
ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃにより刺激されたＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に及ぼす効果について、アフリベルセプトおよび７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３（ｒｈＶＥＧＦＲ－３）とともに、ＥＢ－１０１の定量的分析。
[00178]試験化合物を、６０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ１６５および２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ｃを含有するカクテルと混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで結果として生成する溶液を４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエルを含有するウエルに添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。ＥＢ－１０１、およびｒｈＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５プラスＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達を効果的に阻害したが、一方、アフリベルセプトまたはｒｈＶＥＧＦＲ３いずれか単独では、ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に対して限定された効果のみを示した。図１２を参照されたい。
実施例１０
ヒトリンパ内皮細胞（ＨＬＥＣ）のＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１とアフリベルセプトおよびベバシズマブとの比較。
[00179]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を、試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＨＬＥＣ増殖の阻害に及ぼすＥＢ－１０１の効果は、アフリベルセプトおよびベバシズマブによって阻害された効果に匹敵した。図１３を参照されたい。
ヒトリンパ内皮細胞（ＨＬＥＣ）のＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１とアフリベルセプトおよびベバシズマブとの比較。
[00179]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を、試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＨＬＥＣ増殖の阻害に及ぼすＥＢ－１０１の効果は、アフリベルセプトおよびベバシズマブによって阻害された効果に匹敵した。図１３を参照されたい。
[00180]
実施例１１
ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＨＬＥＣ増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１と、アフリベルセプトおよび７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３（ｒｈＶＥＧＦＲ－３ＥＣＤ）との比較。
[00181]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、インキュベーターで３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃを、試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。アフリベルセプトではなく、ＥＢ－１０１およびｒｈＶＥＧＦＲ－３が、ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＨＬＥＣ増殖の濃度依存性の阻害を示した。図１４を参照されたい。
実施例１１
ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＨＬＥＣ増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１と、アフリベルセプトおよび７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３（ｒｈＶＥＧＦＲ－３ＥＣＤ）との比較。
[00181]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、インキュベーターで３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃを、試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。アフリベルセプトではなく、ＥＢ－１０１およびｒｈＶＥＧＦＲ－３が、ＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＨＬＥＣ増殖の濃度依存性の阻害を示した。図１４を参照されたい。
実施例１２
ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ヒトリンパ管内皮細胞（ＨＬＥＣ）増殖に関する、ＥＢ－１０１、アフリベルセプト、および７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３（ｒｈＶＥＧＦＲ－３ ＥＣＤ）の定量的分析。
[00182]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、インキュベーターで３７℃で一晩培養した。翌日、６０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ１６５および２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ｃを含有するカクテルを試験化合物と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。ＥＢ－１０１、およびｒｈＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達を効果的に阻害したが、一方、アフリベルセプトまたはｒｈＶＥＧＦＲ３いずれか単独は、ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＨＬＥＣ増殖において限定された阻害のみを有した。図１５を参照されたい。
ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ヒトリンパ管内皮細胞（ＨＬＥＣ）増殖に関する、ＥＢ－１０１、アフリベルセプト、および７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３（ｒｈＶＥＧＦＲ－３ ＥＣＤ）の定量的分析。
[00182]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、インキュベーターで３７℃で一晩培養した。翌日、６０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ１６５および２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ｃを含有するカクテルを試験化合物と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。ＥＢ－１０１、およびｒｈＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達を効果的に阻害したが、一方、アフリベルセプトまたはｒｈＶＥＧＦＲ３いずれか単独は、ＶＥＧＦ－Ａ１６５およびＶＥＧＦ－Ｃ媒介性ＨＬＥＣ増殖において限定された阻害のみを有した。図１５を参照されたい。
実施例１３
ＥＢ－１０１ＢＩｂの分子設計および発現。
[00183]ＥＢ－１０１ＢＩｂは、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～３を含む組換えヒトＦｃ融合タンパク質である。配列番号１６により指示されるようなＥＢ－１０１ＢＩｂのアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し、タンパク質を発現するためのベクターを構築した。発現ベクターを使用して、合成培養培地を用いて一過性にＣＨＯ細胞へのトランスフェクションを行った。生成されたタンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティーカラム、限外ろ過によって精製し、次いで０．２μｍの無菌ろ過に供して高純度のバルクを得た。ＣＨＯ細胞でのＥＢ－１０１ＢＩｂの発現は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより分析した場合、ＭＷおよそ２００ＫＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて非還元型）および純度８８％のタンパク質を産生していた。図１６を参照されたい。
ＥＢ－１０１ＢＩｂの分子設計および発現。
[00183]ＥＢ－１０１ＢＩｂは、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～３を含む組換えヒトＦｃ融合タンパク質である。配列番号１６により指示されるようなＥＢ－１０１ＢＩｂのアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し、タンパク質を発現するためのベクターを構築した。発現ベクターを使用して、合成培養培地を用いて一過性にＣＨＯ細胞へのトランスフェクションを行った。生成されたタンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティーカラム、限外ろ過によって精製し、次いで０．２μｍの無菌ろ過に供して高純度のバルクを得た。ＣＨＯ細胞でのＥＢ－１０１ＢＩｂの発現は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより分析した場合、ＭＷおよそ２００ＫＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて非還元型）および純度８８％のタンパク質を産生していた。図１６を参照されたい。
実施例１４
ＶＥＧＦＲ２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞における、ＶＥＧＦ－Ａ媒介性ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂとアフリベルセプト、ＥＢ－１０１、ＥＢ－１０１ＢＩａとの比較。
[00184]組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に及ぼすＥＢ－１０１ＢＩｂの効果は、アフリベルセプト、ＥＢ－１０１およびＥＢ－１０１ＢＩａによって阻害された効果に匹敵した。後２種の分子は、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～２を含有し、しかし、ＶＥＧＦＲ－３のドメイン３を含有せず、それぞれＨＥＫ２９３（ＥＢ－１０１）細胞およびＣＨＯ（ＥＢ－１０１ＢＩａ）細胞において発現された。図１７を参照されたい。
ＶＥＧＦＲ２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞における、ＶＥＧＦ－Ａ媒介性ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂとアフリベルセプト、ＥＢ－１０１、ＥＢ－１０１ＢＩａとの比較。
[00184]組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害に及ぼすＥＢ－１０１ＢＩｂの効果は、アフリベルセプト、ＥＢ－１０１およびＥＢ－１０１ＢＩａによって阻害された効果に匹敵した。後２種の分子は、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～２を含有し、しかし、ＶＥＧＦＲ－３のドメイン３を含有せず、それぞれＨＥＫ２９３（ＥＢ－１０１）細胞およびＣＨＯ（ＥＢ－１０１ＢＩａ）細胞において発現された。図１７を参照されたい。
実施例１５
ＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄ媒介性のＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプト、ＥＢ－１０１およびＥＢ－１０１ＢＩａとの比較。
[00185]組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄを試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。ＥＢ－１０１ＢＩｂが、ＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄ媒介性のＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の濃度依存性の阻害を示したが、一方、ＥＢ－１０１およびＥＢ－１０１ＢＩａは、ＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄ媒介性のＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の限定された阻害を示した。アフリベルセプトは、ＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄ媒介性のＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に及ぼす効果をまったく示さなかった。ＥＢ－１０１およびＥＢ－１０１ＢＩａは、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～２を含有し、しかし、ＶＥＧＦＲ－３のドメイン３を含有せず、それぞれＨＥＫ２９３（ＥＢ－１０１）細胞およびＣＨＯ（ＥＢ－１０１ＢＩａ）細胞において発現された。図１８を参照されたい。
ＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄ媒介性のＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプト、ＥＢ－１０１およびＥＢ－１０１ＢＩａとの比較。
[00185]組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄを試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエル含有のウエルに次いで添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。ＥＢ－１０１ＢＩｂが、ＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄ媒介性のＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の濃度依存性の阻害を示したが、一方、ＥＢ－１０１およびＥＢ－１０１ＢＩａは、ＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄ媒介性のＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の限定された阻害を示した。アフリベルセプトは、ＶＥＧＦ－Ｃおよび－Ｄ媒介性のＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に及ぼす効果をまったく示さなかった。ＥＢ－１０１およびＥＢ－１０１ＢＩａは、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～２を含有し、しかし、ＶＥＧＦＲ－３のドメイン３を含有せず、それぞれＨＥＫ２９３（ＥＢ－１０１）細胞およびＣＨＯ（ＥＢ－１０１ＢＩａ）細胞において発現された。図１８を参照されたい。
実施例１６
ＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦ－Ａ、－Ｃ、および－Ｄ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプト、ＥＢ－１０１、および組換えヒトＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せとの比較。
[00186]試験化合物を、６０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ１６５および２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ｃおよび１５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ｄを含有するカクテルと混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで結果として生成する溶液を４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエルを含有するウエルに添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。アフリベルセプトはＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害をほとんど示さなかったが、一方、ＥＢ－１０１ＢＩｂは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、－Ｃおよび－Ｄからなるカクテルにより刺激されたＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞においてＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の濃度依存性の阻害を示した（図１９Ａ）。ＥＢ－１０１ＢＩｂは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達を完全に阻害した。ＥＢ－１０１は限定的な阻害効果を示したが、一方、アフリベルセプトは、ＥＢ－１０１ＢＩｂおよびＥＢ－１０１と比較して、ＶＥＧＦ－Ａ、－Ｃ、および－Ｄ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に関して最小の阻害を有した。ＥＢ－１０１ＢＩｂがもたらした完全な阻害は、組換えヒトＶＥＧＦＲ－３とＥＢ－１０１の組合せによって再現された（図１９Ｂ）。ＥＢ－１０１は、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～２を含有し、しかし、ＶＥＧＦＲ－３のドメイン３を含有しない。ＥＢ－１０１ＢＩｂは、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～３を含有する。図１９を参照されたい。
ＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞におけるＶＥＧＦ－Ａ、－Ｃ、および－Ｄ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプト、ＥＢ－１０１、および組換えヒトＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せとの比較。
[00186]試験化合物を、６０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ａ１６５および２５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ｃおよび１５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ－Ｄを含有するカクテルと混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで結果として生成する溶液を４×１０４個のＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞／ウエルを含有するウエルに添加し、これに続いて、３７℃で６時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｌｉｔｅ ５０μｌの添加の後、プレートリーダーによりルシフェラーゼシグナルを検出した。アフリベルセプトはＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の阻害をほとんど示さなかったが、一方、ＥＢ－１０１ＢＩｂは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、－Ｃおよび－Ｄからなるカクテルにより刺激されたＶＥＧＦＲ－２－ＮＦＡＴ－ＲＥルシフェラーゼレポーター細胞においてＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達の濃度依存性の阻害を示した（図１９Ａ）。ＥＢ－１０１ＢＩｂは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達を完全に阻害した。ＥＢ－１０１は限定的な阻害効果を示したが、一方、アフリベルセプトは、ＥＢ－１０１ＢＩｂおよびＥＢ－１０１と比較して、ＶＥＧＦ－Ａ、－Ｃ、および－Ｄ媒介性ＶＥＧＦＲ－２シグナル伝達に関して最小の阻害を有した。ＥＢ－１０１ＢＩｂがもたらした完全な阻害は、組換えヒトＶＥＧＦＲ－３とＥＢ－１０１の組合せによって再現された（図１９Ｂ）。ＥＢ－１０１は、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～２を含有し、しかし、ＶＥＧＦＲ－３のドメイン３を含有しない。ＥＢ－１０１ＢＩｂは、ＶＥＧＦＲ－１の結合ドメイン２、ＶＥＧＦＲ－２のドメイン３、およびＶＥＧＦＲ－３のドメイン１～３を含有する。図１９を参照されたい。
実施例１７
ヒトリンパ管内皮細胞（ＨＬＥＣ）のＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプトおよびＥＢ－１０１ＢＩａとの比較。
[00187]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を、試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＨＬＥＣ増殖の阻害に及ぼすＥＢ－１０１ＢＩｂの効果は、アフリベルセプトおよびＥＢ－１０１ＢＩａによって阻害された効果に匹敵した。図２０を参照されたい。
ヒトリンパ管内皮細胞（ＨＬＥＣ）のＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプトおよびＥＢ－１０１ＢＩａとの比較。
[00187]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を、試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５媒介性ＨＬＥＣ増殖の阻害に及ぼすＥＢ－１０１ＢＩｂの効果は、アフリベルセプトおよびＥＢ－１０１ＢＩａによって阻害された効果に匹敵した。図２０を参照されたい。
実施例１８
ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ媒介性ＨＬＥＣ増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプト、ＥＢ－１０１ＢＩａおよび７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３との比較。
[00188]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、インキュベーターで３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃ（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＶＥＧＦ－Ｄ（１５０ｎｇ／ｍｌ）を試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。ＥＢ－１０１ＢＩｂおよびｒｈＶＥＧＦＲ－３は、ＥＢ－１０１ＢＩａ処理群と比較して、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ媒介性ＨＬＥＣ増殖の阻害に対してより強力な効果を示した。図２１を参照されたい。
ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ媒介性ＨＬＥＣ増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプト、ＥＢ－１０１ＢＩａおよび７つの細胞外ドメイン含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３との比較。
[00188]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、インキュベーターで３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ｃ（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＶＥＧＦ－Ｄ（１５０ｎｇ／ｍｌ）を試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次いで、結果として生成する溶液を各ウエルに添加し、これに続いて、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。ＥＢ－１０１ＢＩｂおよびｒｈＶＥＧＦＲ－３は、ＥＢ－１０１ＢＩａ処理群と比較して、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ媒介性ＨＬＥＣ増殖の阻害に対してより強力な効果を示した。図２１を参照されたい。
実施例１９
ＶＥＧＦ－Ａ、－Ｃおよび－Ｄ媒介性ヒトリンパ内皮細胞（ＨＬＥＣ）の増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプト、７つの細胞外ドメイン（７つのＥＣＤ）含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３、およびＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せとの比較。
[00189]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、インキュベーターで３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄを含有するカクテルを等量の試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートした（ＶＥＧＦ－Ａ１６５、－Ｃおよび－Ｄの各最終濃度：それぞれ６０、２５および１５０ｎｇ／ｍｌ）。結果として生成する溶液を各群で９つのウエルに添加し、次いで、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。アフリベルセプトまたはＶＥＧＦＲ－３いずれか単独は限定的な阻害を示したが、一方、ＥＢ－１０１ＢＩｂ、またはＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、－Ｃおよび－Ｄにより刺激されたＨＬＥＣ増殖を完全に阻害した。図２２を参照されたい。
ＶＥＧＦ－Ａ、－Ｃおよび－Ｄ媒介性ヒトリンパ内皮細胞（ＨＬＥＣ）の増殖に及ぼす効果について、ＥＢ－１０１ＢＩｂと、アフリベルセプト、７つの細胞外ドメイン（７つのＥＣＤ）含有の組換えヒトＶＥＧＦＲ－３、およびＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せとの比較。
[00189]初代ＨＬＥＣを９６ウエルプレートに２５００個の細胞／ウエルの密度で播種し、インキュベーターで３７℃で一晩培養した。翌日、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄを含有するカクテルを等量の試験化合物の連続希釈液と混合し、室温で３０分間インキュベートした（ＶＥＧＦ－Ａ１６５、－Ｃおよび－Ｄの各最終濃度：それぞれ６０、２５および１５０ｎｇ／ｍｌ）。結果として生成する溶液を各群で９つのウエルに添加し、次いで、３７℃で７２時間インキュベートした。各ウエルに１０％ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ色素を添加し、５時間インキュベートし、これに続いて、プレートリーダーを使用した蛍光読取りによって、細胞増殖を評価した。アフリベルセプトまたはＶＥＧＦＲ－３いずれか単独は限定的な阻害を示したが、一方、ＥＢ－１０１ＢＩｂ、またはＶＥＧＦＲ－３とアフリベルセプトの組合せは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５、－Ｃおよび－Ｄにより刺激されたＨＬＥＣ増殖を完全に阻害した。図２２を参照されたい。
核酸およびアミノ酸の配列表
[00190]
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[00191]
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[00202]
[00203]
[00204]
[00205]
配列表
[00206]以上、本発明の特定の実施形態について説明してきたが、添付の特許請求の範囲において定義の本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの均等物、改変、置換、および変形をそれらに行うことができることを、当業者であれば理解するであろう。
Claims (28)
- 第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン、第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメイン、および第３のＶＥＧＦ受容体の少なくとも１つのＩｇ様ドメインを含む組換えヒトＦｃ融合タンパク質であって、
前記第３のＶＥＧＦ受容体は、配列番号１３に列挙されたアミノ酸配列を有するヒトＶＥＧＦＲ－３（ｆｌｔ－４）を含むが、ただし、配列番号１３の１０５位および１０６位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１３の１０４位～１０６位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸である、
前記組換えヒトＦｃ融合タンパク質。 - 前記第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ－１（ｆｌｔ－１）のＩｇ様ドメイン２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；
前記第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）のＩｇ様ドメイン３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；
前記第３のＶＥＧＦ受容体の少なくとも１つのＩｇ様ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の融合タンパク質。 - 前記第１のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ－１（ｆｌｔ－１）のＩｇ様ドメイン２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み；
前記第２のＶＥＧＦ受容体のＩｇ様ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ）のＩｇ様ドメイン３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み；
前記第３のＶＥＧＦ受容体の少なくとも１つのＩｇ様ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の融合タンパク質。 - 前記第３のＶＥＧＦ受容体の少なくとも１つのＩｇ様ドメインは、ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１、２、および３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項３に記載の融合タンパク質。 - （ｄ）前記Ｉｇ様ドメインに連結された多量体形成成分をさらに含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
- 前記多量体形成成分は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの一部を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
- 前記ヒトＶＥＧＦＲ－１のＩｇ様ドメイン２は、配列番号２に列挙されたアミノ酸配列を含み；
前記ヒトＶＥＧＦＲ－２のＩｇ様ドメイン３は、配列番号４に列挙されたアミノ酸配列を含み；
前記ヒトＶＥＧＦＲ－３のＩｇ様ドメイン１および２は、配列番号６に列挙されたアミノ酸配列を含み；
ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの一部は、配列番号８に列挙されたアミノ酸配列を含む、
請求項３に記載の融合タンパク質。 - 配列番号１２に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２の２８６位および２８７位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１２の２８５～２８７位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えヒトＦｃ融合タンパク質。
- 配列番号１２に列挙されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
- 配列番号１２に列挙されたとおりのアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
- 前記融合ポリペプチドは、解離定数Ｋｄ≦１０－９ＭでＶＥＧＦファミリーメンバーに結合する、請求項１０に記載の融合タンパク質。
- 前記融合ポリペプチドは、解離定数Ｋｄ≦１０－１０ＭでＶＥＧＦファミリーメンバーに結合する、請求項１０に記載の融合タンパク質。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- 実質的に配列番号１１に列挙されたとおりの配列を有する、請求項１３に記載の単離された核酸分子。
- 請求項１３または１４に記載の核酸分子を含むベクター。
- 発現制御配列に作動可能に連結された前記核酸分子を含む、請求項１５に記載のベクター。
- 宿主細胞中に請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主－ベクター系。
- 実質的に精製された融合ポリペプチドを生成する方法であって、
（ａ）融合ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、請求項１７に記載の宿主－ベクター系の細胞を増殖させるステップと；
（ｂ）融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを回収して、回収された融合ポリペプチドを生成するステップと；
（ｃ）前記回収された融合ポリペプチドを精製して、実質的に精製された融合ポリペプチドを生成するステップと
を含む、前記方法。 - 異常な血管新生に病因を有する、少なくとも１つの疾患、状態、または障害の処置または制御を必要とする対象において、少なくとも１つの疾患、状態、または障害を処置するまたは制御するための方法であって、
配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列であって、ただし、配列番号１２または配列番号１６の２８６位および２８７位のアミノ酸は置換可能であり、それにより、配列番号１２または配列番号１６の２８５位～２８７位のアミノ酸配列がＮＤＴ、ＮＤＳ、ＮＸＴ、またはＮＸＳであり、ここでＸはＡ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質の組成物のある量を、前記対象に投与するステップを含む、前記方法。 - 前記融合タンパク質は、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
- 前記融合タンパク質は、配列番号１２または配列番号１６に列挙されたとおりのアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の方法。
- 前記疾患、状態、または障害は、脈絡膜血管新生、ポリープ状脈絡膜血管症、近視性血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症、血管漏出、網膜浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症または非感染性後部ブドウ膜炎によって引き起こされる黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、角膜血管新生、および血管新生緑内障からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
- 対象は、約２５～４０００マイクログラムの用量の融合ポリペプチドを投与される、請求項２２に記載の方法。
- 組成物は、点眼薬、硝子体内注射、網膜下注射、または脈絡膜上注射として対象に投与される、請求項２３に記載の方法。
- 組成物は、眼内投与される場合、少なくとも１か月の期間対象に投与される、請求項２３に記載の方法。
- 組成物は、眼内投与される場合、１か月当たり少なくとも１回の頻度で対象に投与される、請求項２３に記載の方法。
- 前記疾患、状態、または障害は、異常な血管新生に病因を有する、非眼性の疾患、状態、または障害である、請求項２１に記載の方法。
- 前記疾患、状態、または障害は、がん、乾癬、関節リウマチ、およびアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
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