CN116568700A - 血管生成因子的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

一种重组人Fc融合蛋白包括第一人VEGF受体的Ig样结构域、另一个不同的第二人VEGF受体的Ig样结构域、第三人VEGF受体的至少又另一个Ig样结构域和人IgG1的Fc部分。所述融合蛋白可用于治疗或控制眼部疾病、病状或病症，所述眼部疾病、病状或病症的病因有异常血管生成。

Description

血管生成因子的抑制剂
背景技术
本发明涉及血管生成因子的抑制剂。具体地，本发明涉及血管内皮生长因子家族成员(“VEGF家族成员”)的抑制剂。更具体地，本发明涉及VEGF家族成员的活性抑制剂、用途以及用于产生此类抑制剂的方法。
哺乳动物血管系统的主要细胞组成是内皮、平滑肌细胞和周细胞。内皮细胞形成哺乳动物的所有血管内表面的衬里，并构成血液与组织之间的非血栓形成界面。因此，内皮细胞的增殖是新毛细血管和血管发育的重要组成，所述新毛细血管和血管发育进而是哺乳动物组织生长和/或再生的必要过程。
已示出分泌多肽家族在促进内皮细胞增殖和血管生成中起极其重要的作用。由VEGF过表达引起的不受控制的血管生成的一种病理特征是血管通透性增加，这导致流体渗漏到周围组织中并使周围组织肿胀。在哺乳动物中，此家族由五个相关的生长因子组成，所述生长因子具有高度保守的受体结合结构：血管内皮生长因子A-D(“VEGF-A”、“VEGF-B”、“VEGF-C”和“VEGF-D”)和胎盘生长因子(“PGF”)。在本公开中，此生长因子家族也称为VEGF家族。这些生长因子通过仅存在于血管内皮细胞表面上的同源受体酪氨酸激酶家族起作用来刺激血管形成：VEGF受体-1(“VEGFR-1”，也称为“flt-1”)、VEGF受体-2(“VEGFR-2”，在人类中也称为“KDR”，并且在小鼠中也称为“flk-1”)、VEGF受体-3(“VEGFR-3”，也称为“flt-4”)。
VEGF-A(有时也简称为VEGF)已成为此生长因子家族中最重要的成员。人VEGF-A在多种组织中以多种同源二聚体形式(每个单体121、145、165、183、189和206个氨基酸)表达，其中每种形式都是由单个RNA转录物的替代性剪接产生的。
由于VEGF促进血管内皮细胞增殖和血管生成，其可以用于治疗许多病状，其中对血管内皮细胞的生长促进活性是有益重要的；例如，用于治疗溃疡、血管损伤和心肌梗塞。
然而，相反，虽然在某些情况下期望血管内皮增殖，但血管内皮增殖和血管生成也是多种疾病和病症的不期望的组成，所述多种疾病和病症包含肿瘤生长和转移、类风湿性关节炎、牛皮癣、动脉粥样硬化、糖尿病视网膜病变、晶状体后纤维增生症、新生血管性青光眼、新生血管性年龄相关黄斑变性、血管瘤、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥和慢性炎症。在患有这些病症中的任何病症的个体中，想要抑制或至少显著降低VEGF的内皮增殖活性。
flt-1、KDR和flt-4酪氨酸激酶受体中的每一个具有可用于配体结合的七个细胞外免疫球蛋白样(“Ig样”)结构域，用于将受体锚定在表达受体的细胞表面上的跨膜结构域，以及细胞内催化酪氨酸激酶结构域。Flt-1与VEGF-A、VEGF-B和PlGF结合。KDR与VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D结合。Flt-4与VEGF-C和VEGF-D结合。
鉴于VEGF家族的生长因子在血管内皮增殖和血管生成中的作用，以及这些过程在许多不同疾病和病症中的作用，期望具有一种用于降低或抑制患者的这些生长因子的一种或多种生物活性的药理学手段，所述患者的病理病状源于异常血管生成。还期望具有一种用于改进治疗或控制源于异常血管生成的病理病状的药理学手段。
发明内容
如本文所用，术语“控制”还包含减少、减轻、改善或预防。
通常，本发明提供了融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白、其产生方法和包括其的组合物以及用于治疗或控制受试者的至少一种病理病状的方法，所述病状的病因有异常血管生成。
一方面，本发明提供了融合多肽或嵌合多肽，其能够基本上与一个或多个VEGF家族成员结合；由此减少或抑制其与VEGF受体的结合。
另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括第一VEGF受体的Ig样结构域、第二VEGF受体的Ig样结构域和第三VEGF受体的至少一个Ig样结构域。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1(或flt-1)的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2(或KDR)的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3(或flt-4)的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2，或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3，或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3，或基本上Ig样结构域1、2和3。
在仍另一方面，人VEGFR-3是具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列的野生型人VEGFR-3；并且包含在本发明的任何融合蛋白中的人VEGFR-3的Ig样结构域1具有SEQ IDNO:14中列出的氨基酸序列。本发明的融合蛋白包括人VEGFR-3的Ig样结构域1，或基本上Ig样结构域1；其中SEQ ID:14的位置80-82处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS；并且X是任何氨基酸。在一个实施方式中，X是天然存在的氨基酸。
在又另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2，或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3，或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2，或基本上Ig样结构域1和2；其中人VEGFR-3的氨基酸序列在SEQID NO:13中列出；并且其中位置104-106处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS；其中X是任何氨基酸。在一个实施方式中，X是天然存在的氨基酸。
在又另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1(或flt-1)的Ig样结构域2，或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2(或KDR)的Ig样结构域3，或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3(或flt-4)的Ig样结构域1和2，或基本上Ig样结构域1和2；与多聚化组分连接。
在一个实施方式中，所述多聚化组分包括人IgG1的Fc结构域的一部分。
在另一个实施方式中，所述多聚化组分基本上包括IgG1的氨基末端的最后两个重链结构域；换言之，人IgG1的Fc CH2和CH3结构域。
在仍另一方面，本发明提供了一种编码所述融合多肽或嵌合多肽的分离的核酸分子。
在仍另一方面，本发明提供了一种载体，所述载体包括所述核酸分子，所述载体包括表达载体，所述表达载体包括与表达控制序列操作性地连接的所述核酸分子。
在仍另一方面，本发明提供了一种用于产生所述抗体融合多肽或嵌合多肽的宿主-载体系统，所述宿主-载体系统包括在合适宿主细胞中的表达载体。
另一方面，本发明提供了一种产生融合多肽或嵌合多肽的方法，所述方法包括：(a)在允许产生所述融合蛋白或嵌合蛋白的条件下生长宿主-载体系统的细胞；以及(b)回收如此产生的融合多肽或嵌合多肽。
在仍另一方面，本发明提供了一种用于治疗或控制受试者的至少一种疾病、病状或病症的方法，所述疾病、病状或病症的病因有异常血管生成。
在又另一方面，本发明提供了一种用于治疗或控制受试者的至少一种眼部疾病、病状或病症的方法，所述眼部疾病、病状或病症的病因有异常血管生成。
根据以下详细描述和权利要求，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
附图简要说明
图1示意性示出了本发明的融合多肽，所述融合多肽包括VEGFR-1的Ig样结构域2、VEGFR-2的Ig样结构域3、VEGFR-3的Ig样结构域1和2以及Fc结构域。
图2示出了EB-101在HEK293细胞中瞬时表达的SDS-PAGE和SEC-HPLC结果。
图3示出了EB-101在CHO细胞中瞬时表达的SDS-PAGE和SEC-HPLC结果。
图4示出了使用SPR Biacore进行的EB-101对人重组人VEGF-A165的结合亲和力与阿柏西普(aflibercept)对其的结合亲和力的比较。
图5示出了使用SPR Biacore进行的EB-101对人VEGF-B167/189的结合亲和力与阿柏西普对其的结合亲和力的比较。
图6示出了使用SPR Biacore进行的EB-101对人VEGF-C的结合亲和力与阿柏西普对其的结合亲和力的比较。
图7示出了使用SPR Biacore进行的EB-101对人VEGF-D的结合亲和力与阿柏西普对其的结合亲和力的比较。
图8示出了使用SPR Biacore进行的EB-101对人PlGF的结合亲和力与阿柏西普对其的结合亲和力的比较。
图9示出了EB-101对VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-A165介导的VEGFR-2信号传导的抑制的作用与阿柏西普和贝伐单抗(bevacizumab)对其抑制的作用的比较。
图10示出了EB-101对VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-C介导的VEGFR-2信号传导的抑制的作用与阿柏西普对其的抑制的作用的比较。
图11示出了EB-101对VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-C介导的VEGFR-2信号传导的抑制作用与阿柏西普和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR-3(rhVEGFR-3-7ECD)对其的抑制作用的比较。
图12示出了对EB-101对由VEGF-A165和VEGF-C刺激的VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGFR-2信号传导的抑制的作用与阿柏西普和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR-3(rhVEGFR-3)对其的抑制的作用的定量分析。
图13示出了EB-101对VEGF-A165介导的人淋巴管内皮细胞(HLEC)增殖的作用与阿柏西普和贝伐单抗对其的作用的比较。
图14示出了EB-101对VEGF-C介导的HLEC增殖的作用与阿柏西普和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR3(rhVEGFR3 ECD)对其的作用的比较。
图15示出了EB-101以及阿柏西普和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR3(rhVEGFR3 ECD)对VEGF-A165加VEGF-C介导的HLEC增殖的定量分析。
图16示意性示出了本发明的融合多肽，所述融合多肽包括VEGFR-1的Ig样结构域2、VEGFR-2的Ig样结构域3、VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3以及Fc结构域。
图17示出了EB-101BIb对VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-A介导的VEGFR-2信号传导的作用与阿柏西普、EB-101、EB-101BIa对其的作用的比较。
图18示出了EB-101BIb对由重组人VEGF-C和VEGF-D刺激的VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGFR-2信号传导的作用与阿柏西普、EB-101和EB-101BIa对其的作用的比较。
图19示出了EB-101BIb对VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D介导的VEGFR-2信号传导的抑制作用与阿柏西普、EB-101以及阿柏西普与重组人VEGFR-3的组合对其的抑制作用的比较。
图20示出了EB-101BIb对VEGF-A165介导的人淋巴管内皮细胞(HLEC)增殖的作用与阿柏西普和EB-101BIa对其的作用的比较。
图21示出了EB-101BIb对VEGF-C和VEGF-D介导的HLEC增殖的作用与阿柏西普、EB-101BIa和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR-3对其的作用的比较。
图22示出了EB-101BIb对VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D介导的人淋巴管内皮细胞(HLEC)增殖的作用与阿柏西普、含有7个细胞外结构域(7个ECD)的重组人VEGFR-3以及阿柏西普与VEGFR-3的组合对其的作用的比较。
具体实施方式
在本公开中，术语“融合多肽”、“融合蛋白”、“嵌合多肽”和“嵌合蛋白”可互换使用。
本发明提供了结合构建体，其能够与VEGF家族的至少一个成员(“VEGF家族成员”)结合；由此使所述VEGF家族成员基本上不能与内皮细胞上的VEGF受体结合。因此，本发明的结合构建体基本上抑制了所述VEGF家族成员在促进血管生成中的生物活性；由此控制病理病状，所述病理病状的病因有异常血管生成。
本发明的结合构建体包括以下或由以下组成：融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白，并且包括通过共价或其它连接形式相互关联的一个或多个结合单位。本发明的结合构建体能够结合VEGF家族成员或其一部分并且以高亲和力结合。结合单位优选地包括至少一种肽或多肽。虽然结合单位优选地包括单一多肽，但如果单一多肽不足以结合特定生长因子，所述结合单位也可以包括多种多肽。当给定的结合构建体中有多于一个结合单位或多肽片段时，结合单位可以直接或通过连接子连接在一起。结合构建体可以进一步包含异源肽或其它化学部分。此类添加可以改变结合构建体性质，如稳定性、溶解度、毒性、血清半衰期、免疫原性、可检测性或其它性质。
术语“高亲和力”是在生理学背景下使用的，是指结合构建体在哺乳动物(如实验室测试动物、驯养的农场或宠物动物或人类)体内对VEGF家族成员的相对亲和力。本发明中的靶向VEGF成员对其体内受体具有特征性亲和力，通常以亚纳摩尔解离常数(Kd)测量。出于本发明的目的，本发明的结合构建体可以与其靶向VEGF家族成员结合，其Kd小于或等于天然生长因子-受体对的Kd的约1、或约5、或约10、或约50、或约100、或约500或约1000倍。
一方面，本发明的融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白包括操作性地连接在一起的第一多肽结合单元、第二多肽结合单元和第三多肽结合单元。多肽结合单元在本文中可以简称为“结合单元”。通常，第一结合单元、第二结合单元和第三结合单元可以以任何顺序直接或通过中间连接子连接在一起。
另一方面，靶向VEGF家族成员可以与融合多肽或嵌合多肽的一个或多个结合单元结合。
在仍另一方面，结合单元基本上包括VEGF受体的Ig样结构域。
另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括第一结合单元，所述第一结合单元包括第一VEGF受体的Ig样结构域；第二结合单元，所述第二结合单元包括第二VEGF受体的Ig样结构域；以及第三结合单元，所述第三结合单元包括第三VEGF受体的至少一个Ig样结构域。
另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括第一VEGF受体的Ig样结构域、第二VEGF受体的Ig样结构域和第三VEGF受体的至少一个Ig样结构域；其中所述第三VEGF受体包括具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列的人VEGFR-3(或flt-4)，条件是SEQ ID NO:13的位置105和106处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:13的位置104-106处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽包括：(a)第一VEGF受体的Ig样结构域，其包括与人VEGFR-1的Ig样结构域2至少90％相同的氨基酸序列；(b)第二VEGF受体的Ig样结构域，其包括与人VEGFR-2的Ig样结构域3至少90％相同的氨基酸序列；以及(c)第三VEGF受体的至少一个Ig样结构域，其包括与人VEGFR-3的Ig样结构域1和2至少90％相同的氨基酸序列；其中所述人VEGFR-3具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:13的位置105和106处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:13的位置104-106处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽包括：(a)第一VEGF受体的Ig样结构域，其包括与人VEGFR-1的Ig样结构域2至少95％相同的氨基酸序列；(b)第二VEGF受体的Ig样结构域，其包括与人VEGFR-2的Ig样结构域3至少95％相同的氨基酸序列；以及(c)第三VEGF受体的至少一个Ig样结构域，其包括与人VEGFR-3的Ig样结构域1和2至少95％相同的氨基酸序列；其中所述人VEGFR-3具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:13的位置105和106处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:13的位置104-106处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1(或flt-1)的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2(或KDR)的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3(或flt-4)的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；或人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3或基本上Ig样结构域1、2和3。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；或人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3或基本上Ig样结构域1、2和3；其中所述人VEGFR-3具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:13的位置105和106处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:13的位置104-106处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；或人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3或基本上Ig样结构域1、2和3；其中所述人VEGFR-3具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:13的位置104-106处的氨基酸序列未被取代并且保持NDT。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；或人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3或基本上Ig样结构域1、2和3；其中所述人VEGFR-3的所述Ig样结构域1具有SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:14的位置81和82处的氨基酸是可取代的，使得SEQ IDNO:14的位置80-82处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；或人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；其中所述人VEGFR-3的所述Ig样结构域1具有SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:14的位置81和82处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:14的位置80-82处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；或人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；其中所述人VEGFR-3的所述Ig样结构域1具有SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:14的位置80-82处的氨基酸序列未被取代并且保持NDT。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；或人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3或基本上Ig样结构域1、2和3；其中包含在融合多肽或嵌合多肽中的人VEGFR-3的Ig样结构域1具有SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2，或基本上Ig样结构域1和2；或人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3或基本上Ig样结构域1、2和3；其中包含在融合多肽或嵌合多肽中的人VEGFR-3的Ig样结构域1具有SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列，并且位置处的氨基酸序列未被取代并且保持NDT。
在又另一方面，本发明的融合多肽或嵌合多肽包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2；(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3；以及(c)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2；与多聚化组分连接；其中所述人VEGFR-3具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:13的位置105和106处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:13的位置104-106处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在一个实施方式中，所述多聚化组分基本上包括人IgG1的Fc结构域的一部分。
在另一个实施方式中，所述多聚化组分基本上包括人IgG1的重链的Fc结构域的一部分。在一个实施方式中，人IgG1的重链的Fc结构域的此类部分包括IgG1重链的羧基末端处的最后两个结构域。
在一些实施方式中，两个或更多个结合单元一起作用以结合单个配体分子(其中配体可以包括单体或二聚体)。在一些其它实施方式中，结合单元独立地起作用，即每个结合单元结合单独的配体分子。
一方面，所述融合蛋白或嵌合蛋白包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2，(a)与(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3操作性地连接，(b)与(c)(1)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2或(c)(2)人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3或基本上Ig样结构域1、2和3操作性地连接，(c)(1)和(c)(2)与IgG1的Fc结构域的一部分操作性地连接。
在一个实施方式中，在最后一个结合单元与IgG1的Fc结构域的所述部分之间插入多肽连接子。
一方面，融合蛋白或嵌合蛋白包括：(a)人VEGFR-1的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2，(a)与(b)人VEGFR-2的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3操作性地连接，(b)与(c)(1)人VEGFR-3的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2或(c)(2)人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3或基本上Ig样结构域1、2和3操作性地连接，(c)(1)和(c)(2)与IgG1的Fc结构域的一部分操作性地连接；其中人VEGFR-1的Ig样结构域2(“VEGFR-1-D2”)具有SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列；人VEGFR-2的Ig样结构域3(“VEGFR-2-D3”)具有SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列；人VEGFR-3的Ig样结构域1和2(“VEGFR-3-D1D2”)具有SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列；人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3(“VEGFR-3-D1D2D3”)具有SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列；并且IgG1的Fc结构域部分(“IgG1Fc”)具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。
另一方面，本发明的融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白进一步包括插入VEGFR-3-D1D2的羧基末端与IgG1Fc的氨基末端之间的多肽连接子；其中所述连接子具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列。
在仍另一方面，本发明的融合肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白还可以包括位于VEGFR-1-D2的氨基末端之前的多肽前导序列。
在又另一方面，本发明的融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10中的每一个至少90％相同的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:15的位置81和82处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15的位置80-82处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白包括与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10至少95％相同的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:15的位置81和82处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15的位置80-82处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白包括SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列。制备具有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16的融合蛋白用于测试，并且所述融合蛋白在本文中分别被称为“EB-101”和“EB-101BIb”。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16至少90％相同的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置286和287处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16至少90％相同的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸是未经取代的。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16至少95％相同的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置286和287处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16至少95％相同的氨基酸序列；其中SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸是未经取代的。
在仍另一方面，可以在任何上述氨基酸序列中进行一个或多个氨基酸取代。优选地，此类取代是保守取代，其中以下组之一中的氨基酸被同一组中的另一个取代：(1)A、S、T；(2)D、E；(3)N、Q；(4)R、K；(5)I、L、M、V；以及(6)F、Y、W；并且选择此类取代以基本上保持融合多肽的结合活性。在一个实施方式中，具有保守取代的本发明的融合多肽的Kd值小于此类取代前的约120％。优选地，所述Kd值小于此类取代前的约110％。更优选地，所述Kd值小于此类取代前的约105％。
预计大多数保守取代不会对Ig样结构域或融合多肽的结构域的特性产生根本性改变。然而，当在这样做之前难以预测取代的确切效果时，本领域技术人员将理解，所述效果将通过常规筛选测定来评估。例如，Ig样结构域变体通常通过对完整融合多肽进行编码的核酸的位点特异性诱变、在重组细胞培养物中表达变体核酸、从细胞培养物中纯化变体融合多肽以及检测变体融合多肽与VEGF配体特异性结合的能力进行。Park等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》269:25646-25654(1994)的文章中描述了可以用于确定一个或多个Ig样结构域中的一个或多个特定取代是否影响融合多肽与VEGF家族成员结合并抑制其活性的能力的示例性结合测定。
融合蛋白的VEGFR-1-D2结合单元能够以高亲和力结合游离的VEGF-A、VEGF-B和PGF(Davis-Smyth等人,《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》,15(18):4919(1996))。融合蛋白的VEGFR-2-D3结合单元能够以高亲和力结合游离的VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D(Stuttfeld等人,61(9):915(2009))。融合蛋白的VEGFR-3-D1D2或VEGFR-3-D1D2D3(VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3)结合单元能够以高亲和力结合游离的VEGF-C和VEGF-D。因此，本发明的融合蛋白能够基本上抑制这些VEGF家族成员在疾病部位的内皮细胞上的血管生成活性。
在仍另一方面，本发明提供了一种编码所述融合多肽或嵌合多肽的分离的核酸分子。
在又另一方面，本发明提供了编码所述融合多肽或嵌合多肽的分离的核酸分子；其中所述分离的核酸分子包括：(a)编码人VEGFR-1(或flt-1)的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2的核酸序列；(b)编码人VEGFR-2(或KDR)的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3的核酸序列；以及(c)编码人VEGFR-3(或flt-4)的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2的核酸序列。
在仍另一方面，本发明提供了编码所述融合多肽或嵌合多肽的分离的核酸分子；其中所述分离的核酸分子包括：(a)编码人VEGFR-1(或flt-1)的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2的核酸序列；(b)编码人VEGFR-2(或KDR)的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3的核酸序列；(c)(1)编码人VEGFR-3(或flt-4)的Ig样结构域1和2或基本Ig样结构域1和2的核酸序列，或(c)(2)编码Ig样结构域1、2和3或基本Ig样结构域1、2和3的核酸序列；以及(d)编码IgG1的Fc结构域的一部分的核酸序列。
在仍另一方面，本发明提供了编码所述融合多肽或嵌合多肽的分离的核酸分子；其中所述分离的核酸分子包括：(a)编码人VEGFR-1(或flt-1)的Ig样结构域2或基本上Ig样结构域2并且具有SEQ ID NO:1中列出的序列的核酸序列；(b)编码人VEGFR-2(或KDR)的Ig样结构域3或基本上Ig样结构域3并且具有SEQ ID NO:3中列出的序列的核酸序列；(c)编码人VEGFR-3(或flt-4)的Ig样结构域1和2或基本上Ig样结构域1和2并且具有SEQ ID NO:5中列出的序列的核酸序列；以及(d)编码IgG1的Fc结构域的一部分并且具有SEQ ID NO:7中列出的序列的核酸序列。
在仍另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码所述融合多肽或嵌合多肽；其中所述分离的核酸分子包括：(a)编码SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的核酸序列；(b)编码SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列的核酸序列；(c)编码SEQID NO:6或SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的核酸序列；以及(d)编码SEQ ID NO:8中列出的IgG1的Fc结构域的一部分的氨基酸序列的核酸序列。
在又另一方面，所述分离的核酸分子进一步包括编码多肽连接子的连接核酸序列；其中所述连接核酸具有SEQ ID NO:9中列出的序列，并且被插入在SEQ ID NO:5与SEQID NO:7之间。
在又另一方面，所述分离的核酸可以进一步包括编码多肽前导序列的前导核酸序列。当所述前导核酸序列存在于所述分离的核酸中时，它位于SEQ ID NO:1之前。
在仍另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码所述融合多肽或嵌合多肽；其中所述分离的核酸分子包括SEQ ID NO:11中列出的核酸序列。
在仍另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白；其中所述融合多肽或蛋白或嵌合多肽或蛋白具有SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:16。
另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码所述融合多肽或嵌合多肽；其中所述分离的核酸分子包括由于遗传密码简并而在一个或多个密码子上不同于选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11组成的组的核酸序列的核酸序列。此类不同的核酸序列处于本发明的范围内。
在仍另一方面，本发明提供了包括所述核酸分子中的任何核酸分子的载体，所述载体包含包括操作性地与表达控制序列连接的所述核酸分子中的任何核酸分子的表达载体。载体的实施例包括选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11。具体地，本发明的载体包括选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11。
在仍另一方面，本发明提供了一种用于产生所述抗体融合多肽或嵌合多肽的宿主-载体系统，所述宿主-载体系统包括在合适宿主细胞中的表达载体。
一方面，本发明提供了编码本文所公开的融合多肽的核酸分子的构建，所述核酸被插入到在被引入到适当的宿主细胞中时能够表达该融合多肽的载体中。合适的宿主细胞包含但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入到载体中的任何方法都可以用于构建在转录/翻译控制信号的控制下对嵌合多肽分子进行编码的表达载体。这些方法可以包含体外重组DNA和合成技术以及体内重组(基因重组)(参见Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,编辑,Ausubel等人,格林出版协会(Greene Publ.Assoc.),纽约的威利国际科学出版社(Wiley-Interscience,NY))。
编码本发明的融合多肽的核酸分子的表达可以由第二核酸序列(启动子)调节，使得融合多肽在用核酸分子转化的宿主中表达。例如，本文所描述的融合多肽的表达可以由本领域已知的任何启动子/增强子元件控制。
通常，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主结合使用。所述载体通常携带复制位点以及能够在经转化的细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌(E.coli)通常使用pBR322(即一种源自大肠杆菌物种的质粒)进行转化(参见例如Bolivar等人,《基因(Gene)》,2:95(1977))。质粒pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，并且因此提供了用于鉴定经转化的细胞的简单方法。pBR322质粒或其它微生物质粒或噬菌体还必须包含或被修饰以包含微生物有机体可用于表达蛋白质的启动子。
那些最常用于重组DNA构建的启动子包含β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统或色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,8:4057(1980))。虽然这些是最常用的，但已经发现和利用了其它微生物启动子。例如，tac启动子是合成产生的DNA启动子，其由来自trp和lac操纵子的启动子的组合产生(de Boer等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,(1983-01-80(1):21-25(1983))。通常用于大肠杆菌中的蛋白质产生(Amann等人,Gene,25:167(1983))。这些启动子中的任何一个都可以与产生本发明的融合多肽的方法结合使用。
除了原核生物之外，还可以使用真核微生物，如酵母培养物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，即使许多其它菌株通常可用。为了在酵母菌属中表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等人,《自然(Nature)》,282:39(1979))。其它质粒公开于美国专利4,615,974；Struhl等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》,76(3):1035(1979)中。质粒YRp7含有trp1基因，所述基因为在没有色氨酸的情况下缺乏生长能力的酵母突变菌株提供选择标志物，例如ATCC编号44,076或RH218(Jones,《遗传学(Genetics)》,85:23(1977))。作为酵母宿主细胞基因组特性的trp1病变的存在然后为在不存在色氨酸的情况下通过生长检测转化提供了有效环境。
酵母载体中合适的启动序列包含3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》,255:2073(1980))或其它糖酵解酶的启动子，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶和葡萄糖激酶(Romanos等人,《酵母(Yeast)》,8:423(1992)；Weinhandl等人,《微生物细胞工厂(Microb.Cell factories)》,13:5(2014))。在构建合适的表达质粒时，与这些基因相关的终止序列也被连接到期望表达的序列的表达载体3'中，以提供mRNA的聚腺苷酸化和终止。具有受生长条件控制的转录的额外优势的其它启动子，如乙醇脱氢酶2的启动子区以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶(Romanos等人,Weinhandl等人,同上)。任何含有酵母相容性启动子、复制起点和终止序列的质粒载体都是合适的。
除了微生物之外，源自多细胞生物体的细胞培养物也可以用作宿主。原则上，任何此类细胞培养物都是可行的，无论是来自脊椎动物还是无脊椎动物培养物。然而，更多关注脊椎动物细胞，并且近年来脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序(《组织培养物(Tissue Culture)》,学术出版社(Academic Press),Kruse和Patterson,编辑(1973))。此类有用的宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系以及W138、BHK、COS-7、293和MDCK细胞系。用于此类细胞的表达载体通常包含(如果需要)复制起点、位于待表达基因前面的启动子以及任何必要的核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。
为了在哺乳动物细胞中使用，表达载体上的控制功能通常由病毒材料提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2，并且最常见的是猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子特别有用，因为两者都可以很容易地从病毒中作为片段获得，所述片段还包含SV40病毒复制起点(Fiers等人,《自然》,273:113(1978))。也可以使用更小或更大的SV40片段，条件是包含从HindIII位点朝向位于病毒复制起点的BglI位点延伸的大约250bp序列。此外，还可能并且通常期望利用通常与所期望的基因序列相关的启动子或控制序列，条件是此类控制序列与宿主细胞系统相容。
因此，根据本发明，包括如本文所描述的编码融合多肽的核酸的能够在细菌、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞宿主中复制的表达载体用于转染宿主，并且由此引导此类核酸表达以产生融合多肽，然后可以以生物活性形式回收所述融合多肽。如本文所用，生物活性形式包含能够与至少一个VEGF家族成员结合的形式。
在一些实施方式中，宿主细胞可以是大肠杆菌、COS细胞或中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞。在一些其它实施方式中，宿主细胞可以是HEK293细胞。
载体构建
包含所期望的编码和控制序列的合适载体的构建采用标准连接技术。分离的质粒或DNA片段被切割、剪裁和连接成所期望的形式，以形成所需的质粒。所采用的方法不依赖于DNA来源或预期宿主。通过在合适的缓冲液中用一种或多种限制酶处理来进行切割。
可以根据美国专利6,897,294中公开的方法产生基本上对VEGFR-1、VEGFR-2或VEGR-3的一个或多个Ig样结构域进行编码的核酸序列。
基本上编码VEGFR-1的Ig样结构域2、VEGFR-2的Ig样结构域3和VEGR-3的Ig样结构域1和2的核酸序列以期望的顺序串联连接。然后将此构建体与编码IgG1的期望Fc部分的核酸序列的N末端连接。然后将整个核酸序列定位在载体中，所述载体包含与基因使用相同读框并与所提出的宿主细胞相容的启动子。许多质粒，如在美国专利4,456,748；5,460,811；5,888,808和6,333,147中描述的那些质粒可以用于产生本发明的融合多肽。
在一个实施方式中，根据美国专利7,070,959中描述的方法产生本发明的融合多肽。融合多肽(“VEGFR-1-D2-VEGFR-2-D3-VEGFR-3-D1D2-Fc”或“VEGFR-1-D2-VEGFR-2-D3-VEGFR-3-D1D2D3-Fc)的完整核酸序列被插入到具有CMV启动子的表达载体pEE14.1(龙沙生物公司(Lonza Biologics))中。CHO K1细胞用pEE14.1/VEGFR-1-D2-VEGFR-2-D3-VEGFR-3-D1D2-Fc或pEE14.1/VEGFR-1-D2-VEGFR-2-D3-VEGFR-3-D1D2D3-Fc DNA构建体转染，并且然后生长。如美国专利7,070,959中所描述的，可以通过结合测定纯化和表征从CHO细胞或HEK293细胞中获得的融合多肽。
在一个实施方式中，本发明的融合多肽可以以Kd≤10-9M与VEGF家族成员结合。在另一个实施方式中，本发明的融合多肽可以以Kd≤5×10-10M与VEGF家族成员结合。在仍另一个实施方式中，本发明的融合多肽可以以Kd≤10-10M与VEGF家族成员结合。
一方面，本发明提供了用于治疗或控制疾病、病状或病症的化合物、组合物和方法，所述疾病、病状或病症的病因有异常血管生成。
另一方面，本发明提供了一种用于治疗或控制受试者的至少一种眼部疾病、病状或病症的方法，所述眼部疾病、病状或病症的病因有异常血管生成。所述方法包括向需要此类治疗或控制的受试者施用包括融合多肽的组合物，所述融合多肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16。
在仍另一方面，所述方法包括向受试者施用包括融合多肽的组合物，所述融合多肽包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置286和287处的氨基酸是可取代的，使得SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，所述方法包括向受试者施用包括融合多肽的组合物，所述融合多肽包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列未被取代并且保持NDT。
在仍另一方面，所述方法包括向受试者施用包括融合多肽的组合物，所述融合多肽包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置286和287处的氨基酸是可取代的，使得SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，所述方法包括向受试者施用包括融合多肽的组合物，所述融合多肽包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列未被取代并且保持NDT。
在仍另一方面，所述眼部疾病、病状或病症选自由以下组成的组：脉络膜新生血管(包含近视脉络膜新生血管)、息肉状脉络膜血管病变、视网膜新生血管、血管渗漏、视网膜水肿、糖尿病性黄斑水肿、由选自由视网膜静脉阻塞和非感染性后葡萄膜炎组成的组的病状引起的黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、角膜新生血管、角膜炎症、近视新生血管、新生血管性青光眼和新生血管性年龄相关黄斑变性(由视网膜新生血管引起的湿性年龄相关黄斑变性)。
另一方面，本发明提供了融合多肽用于制备或制造用于治疗或控制受试者的至少一种眼部疾病、病状或病症的药物的用途，所述至少一种眼部疾病、病状或病症的病因有异常血管生成；其中所述融合多肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:16。
在仍另一方面，本发明提供了融合多肽用于制备或制造用于治疗或控制受试者的至少一种眼部疾病、病状或病症的药物的用途，所述至少一种眼部疾病、病状或病症的病因有异常血管生成；其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置286和287处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，用于所述用途的融合多肽包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列未被取代并且保持NDT。
在仍另一方面，本发明提供了融合多肽用于制备或制造用于治疗或控制受试者的至少一种眼部疾病、病状或病症的药物的用途，所述至少一种眼部疾病、病状或病症的病因有异常血管生成；其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置286和287处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
在仍另一方面，用于所述用途的融合多肽包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列未被取代并且保持NDT。
在仍另一方面，所述眼部疾病、病状或病症选自由以下组成的组：本文所公开的疾病、病状或病症。
在一个实施方式中，向受试者施用的剂量为约25-4000微克的融合多肽。在另一个实施方式中，向受试者施用的剂量为约50-4000、约100-4000、约500-4000、约1000-4000、约2000-4000、约50-3000、约50-2000、约50-1000或约50-500微克的融合多肽。
在仍另一方面，包括融合多肽的组合物呈滴眼剂或眼部注射液(如玻璃体内注射液、前房内注射液、眶周注射液、囊下注射液、视网膜下注射液或脉络膜上注射液)的形式。此类组合物包含眼用组合物。本发明的融合多肽也可以掺入可植入到病变组织中或附近的医疗装置中。
在一个实施方式中，用于治疗或控制前部疾病、病状或病症；例如角膜新生血管、角膜炎症或新生血管性青光眼，包括融合多肽的组合物可以呈滴眼剂或前房内或结膜下注射液的形式。在另一个实施例中，用于治疗或控制后段疾病、病状或病症；如脉络膜新生血管(包含近视性脉络膜新生血管)、新生血管性年龄相关黄斑变性、血管渗漏、视网膜水肿或糖尿病性视网膜病，包括融合多肽的组合物可以呈玻璃体内注射液的形式。
在又另一方面，将滴眼剂每天至少一次、每周至少一次或每月至少一次施用于受试者，直到疾病、病状或病症被基本上治疗或控制为止。
在又另一方面，向受试者施用组合物持续至少一个月、至少两个月、至少三个月或至少六个月的时间段。
在仍另一方面，根据医疗从业者为特定患者推荐的方案，向受试者施用玻璃体内注射液或向病变组织中或附近施用注射液。例如，可以至少每月一次、至少每两个月一次、至少每三个月一次或至少每六个月一次施用注射液，直到疾病、病状或病症被基本上治疗或控制为止。在一个实施方式中，可以在开始时更频繁地施用治疗，并且然后在一段时间后降低频率，如可以由执业医师来确定。
本发明的融合多肽在此类眼用组合物中的浓度可以在约0.1至约200mg/ml(或者可替代地约0.25至约200mg/ml、或约0.25至约160mg/ml、或约0.5至约100mg/ml、或约0.25至约50mg/ml、或约0.5至约200mg/ml、或约0.5至约160mg/ml、或约0.5至约100mg/ml、或约0.5至约50mg/ml、或约1至约200mg/ml、或1至约160mg/ml、或约0.5至约100mg/ml或约1至约50mg/ml)的范围内。
在仍另一方面，用于制备本发明的组合物的方法包括将以下组合：(a)一定量的本发明的融合多肽；以及(b)生理上可接受的载体。
在一个实施方式中，此类生理学上可接受的载体可以是无菌盐水溶液或生理学上可接受的缓冲液。在另一个实施方式中，此类载体包括疏水介质，如药学上可接受的油。在仍另一个实施方式中，如载体包括疏水材料和水的乳液。在又另一个实施方式中，本发明的融合多肽可以与高分子量材料缔合或连接以提供长循环时间。
生理学上可接受的缓冲液包含但不限于磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液(包括三(羟甲基)氨基甲烷和HCl)。例如，pH为7.4的Tris-HCl缓冲液包括3g/l三(羟甲基)氨基甲烷和0.76g/l HCl。在又另一方面，缓冲液是10X磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)或5X PBS溶液。
在一些情况下，也可能发现其它缓冲液是合适或期望的，如在25℃下pKa为7.5并且pH在约6.8-8.2范围内的基于HEPES(N-{2-羟乙基}哌嗪-N'-{2-乙磺酸})的缓冲液；在25℃下pKa为7.1并且pH在约6.4-7.8范围内的BES(N,N-双{2-羟乙基}2-氨基乙磺酸)；在25℃下pKa为7.2并且pH在约6.5-7.9范围内的MOPS(3-{N-吗啉代}丙磺酸)；在25℃下pKa为7.4并且pH在约6.8-8.2范围内的TES(N-三{羟甲基}-甲基-2-氨基乙磺酸)；在25℃下pKa为7.6并且pH在约6.9-8.3范围内的MOBS(4-{N-吗啉代}丁磺酸)；在25℃下pKa为7.52并且pH在约7-8.2范围内的DIPSO(3-(N,N-双{2-羟乙基}氨基)-2-羟基丙烷)；在25℃下pKa为7.61并且pH在约7-8.2范围内的TAPSO(2-羟基-3{三(羟甲基)甲基氨基}-1-丙磺酸；在25℃下pKa为8.4并且pH在约7.7-9.1范围内的TAPS({(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)氨基}-1-丙磺酸)；在25℃下pKa为8.9并且pH在约8.2-9.6范围内的TABS(N-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸)；在25℃下pKa为9.0并且pH在约8.3-9.7范围内的AMPSO(N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸)；在25℃下pKa为9.5并且pH在约8.6-10.0范围内的CHES((2-环己基氨基)乙磺酸)；在25℃下pKa为9.6并且pH在约8.9-10.3范围内的CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)；或者在25℃下pKa为10.4并且pH在约9.7-11.1范围内的CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙磺酸)。
在某些实施例中，本发明的组合物被调配在具有酸性pH(如约4至约6.8，或可替代地约5至约6.8)的缓冲液中。在此类实施例中，组合物的缓冲能力理想地允许组合物在被施用于患者后迅速达到生理pH。
除了缓冲液之外，本发明的组合物可以包括选自由以下组成的组的材料：表面活性剂、稳定剂、防腐剂、助溶剂、湿润剂、润肤剂、螯合剂、张力调节剂和抗氧化剂。
一方面，可以用于本发明的组合物的任何这些材料是眼科上可接受的材料。
可以采用的水溶性防腐剂包含亚硫酸氢钠、硫酸氢钠、硫代硫酸钠、苯扎氯铵、三氯叔丁醇、硫柳汞、乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、聚乙烯醇、苯甲醇和苯乙醇。这些药剂可以以约0.001重量％至约5重量％(优选地，约0.01重量％至约2重量％)的单独量存在。可以采用的合适的水溶性缓冲剂是碳酸钠、硼酸钠、磷酸钠、乙酸钠、碳酸氢钠等，如美国食品与药品监督管理局(“US FDA”)批准的期望的施用途径。
表面活性剂的非限制性实例包含但不限于非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚/聚(氧乙烯)聚合物(如以商标Tyloxapol出售的聚合物)、聚(氧乙烯)-聚(氧丙烯)嵌段共聚物、脂肪酸的乙醇酸酯等以及其混合物。
一方面，组合物的pH在约4至约11的范围内。可替代地，组合物的pH在约6至约8或约6.5至约8的范围内。
另一方面，所述组合物的pH为约7。可替代地，组合物的pH在约7至约7.5的范围内。
在仍另一方面，组合物的pH为约7.4。
在又另一方面，组合物还可以包括粘度调节化合物，所述粘度调节化合物被设计成促进将组合物施用于受试者中或促进受试者的生物利用度。在仍另一方面，可以选择粘度调节化合物，使得组合物在施用于眼睛环境中后不易分散。此类化合物可以增强组合物的粘度，并且包含但不限于：单体多元醇，如甘油、丙二醇、乙二醇；聚合多元醇，如聚乙二醇；纤维素家族的各种聚合物，如羟丙基甲基纤维素(“HPMC”)、羧甲基纤维素(“CMC”)钠、羟丙基纤维素(“HPC”)；多糖，如透明质酸以及其盐、硫酸软骨素以及其盐、葡聚糖，如葡聚糖70；水溶性蛋白质，如明胶；乙烯基聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮；卡波姆，如卡波姆934P、卡波姆941、卡波姆940或卡波姆974P；以及丙烯酸聚合物。通常，所需的粘度可以在约1到约400厘泊(“cps”)或mPa.s的范围内。
螯合剂的非限制性实例包含乙二胺四乙酸(“EDTA”)、二亚乙基三胺五(甲基膦酸)、羟基亚乙基二膦酸、羟基亚乙基二膦酸的四钠盐(也称为“HAP”)。
虽然缓冲液本身是一种广泛地将眼用溶液维持在特定的离子浓度和pH下的“张力调节剂”和“pH调节剂”，但可以添加另外的“张力调节剂”来调节溶液的最终张力。此类张度调节剂是本领域技术人员熟知的并且包含但不限于甘露醇、山梨糖醇、右旋糖、蔗糖、尿素、丙二醇和甘油。此外，可以使用各种盐，包含一价阳离子的卤化物盐(例如，NaCl或KCl)。通常，本发明的制剂的张力在约200至400mOsm/kg的范围内。可替代地，本发明的制剂的张力在约220至400mOsm/kg、或约220至350mOsm/kg、或约220至300mOsm/kg、或约250至350mOsm/kg的范围内。
抗氧化剂的非限制性实例包含：抗坏血酸(维生素C)以及其盐和酯；生育酚(如α-生育酚)和生育三烯酚(维生素E)以及其盐和酯(如维生素E TGPS(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯))；谷胱甘肽；硫辛酸；尿酸；叔丁基化羟基茴香醚(“BHA”)；叔丁基化羟基甲苯(“BHT”)；叔丁基对苯二酚(“TBHQ”)；以及多酚类抗氧化剂(如没食子酸、肉桂酸、类黄酮以及其盐、酯和衍生物)。
稳定剂的非限制性实例包含蔗糖、甘露醇、山梨糖醇和海藻糖。
应当理解，以下实例中的各种组分或混合物的比例可以根据适当情况进行调整。
另一方面，将本发明的融合多肽和适量的一种或多种所需赋形剂掺入到制剂中，以局部施用或注射到眼睛的一部分中，如前段或后段或玻璃体液。可注射制剂可以期望地包括提供活性成分持续释放的载体，如持续超过约1周(或超过约1、2、3、4、5或6个月)的时间段。
在仍另一方面，包括本发明的融合多肽和所期望的赋形剂的组合物被冻干，并在施用于受试者之前基本上立即用生理学上可接受的液体载体重构。
在一个实施方式中，本发明的化合物或组合物可以用细规格针注射，如25-35号针。通常，将约25μl至约100μl的包括约25-4000μg本发明的融合多肽的组合物的量施用于患者。在一个实施例中，所述融合多肽具有与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置286和287处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。在另一个实施方式中，所述融合多肽具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列。此类融合多肽的浓度选自上文所公开的范围。
在仍另一方面，将本发明的融合多肽掺入到包括生物可降解材料的眼科装置中，并且将所述装置植入到受试者的后段组织中以提供对血管生成疾病、病状或病症的长期(例如，长于约1周或长于约1、2、3、4、5或6个月)治疗或控制。此类装置可以由熟练的医生植入受试者的眼部或眼周组织中。用于持续释放活性成分的眼科植入系统或装置的非限制性实例公开于美国专利5,378,475；5,773,019；5,902,598；6,001,386；6,051,576；以及6,726,918。
在仍另一方面，一种用于治疗或控制眼血管生成疾病、病状或病症的方法包括向有需要的受试者施用包括本发明的融合多肽的组合物。
在仍另一方面，一种用于治疗或控制眼血管生成疾病、病状或病症的方法包括向有需要的受试者施用包括具有如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的融合多肽的组合物。
在仍另一方面，一种用于治疗或控制在眼后段的病因有异常血管生成的眼血管生成疾病、病状或病症的方法包括向有需要的受试者玻璃体内注射包括具有如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的融合多肽的组合物。
在另一个实施方式中，此类疾病、病状或病症选自由以下组成的组：脉络膜新生血管、息肉状脉络膜血管病变、近视新生血管、包含早产儿视网膜病变的视网膜新生血管、血管渗漏、包含糖尿病性黄斑水肿和由其它视网膜病状如视网膜静脉阻塞和非感染性后葡萄膜炎引起的黄斑水肿的视网膜水肿、包含增生性糖尿病性视网膜病变的糖尿病性视网膜病变、角膜新生血管和新生血管性青光眼。
在又另一方面，本发明的组合物每周一次、每月一次、每年一次、每年两次、每年四次或以确定适合于治疗或控制前段炎性疾病、病状或病症的合适频率施用。
在仍另一方面，本发明的融合多肽或蛋白也可以用于治疗或控制由异常血管生成促进或病因有异常血管生成的其它非眼部疾病或病状，如癌症、银屑病、类风湿性关节炎和动脉粥样硬化。此类治疗或控制可以通过例如全身施用来实现。
在又另一方面，本发明提供了融合多肽或蛋白用于制备或制造用于治疗或控制由异常血管生成促进或病因有异常血管生成的非眼部疾病或病状的药物的用途，所述非眼部疾病或病状如癌症、银屑病、类风湿性关节炎和动脉粥样硬化。
可通过本发明治疗的癌症包含但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例包含鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包含小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包含胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌以及B细胞淋巴瘤(包含低度/滤泡型非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡型NHL；中度弥散性NHL、高度成免疫母细胞性NHL、高度成淋巴细胞性NHL、高度小无核裂细胞性NHL、巨大肿块NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤；以及瓦登斯特陆巨球蛋白血症(Waldenstrom'sMacroglobulinemia))、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病、以及移植后淋巴增生性病症(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(如与脑肿瘤相关的水肿)以及梅格斯综合征(Meigs'syndrome)。在一些实施方式中，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、结直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、类癌、头颈癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在另一个实施例中，癌症为结直肠癌。适用于本发明的治疗的癌性病状包含转移性癌症。本发明的方法特别适用于血管化肿瘤的治疗。
实施例1：组合物1
本发明的组合物通过将10-100mg/mL融合蛋白EB-101、10mM组氨酸HCl缓冲液、10％(按重量计)的α,α-海藻糖和0.01％(按重量计)聚山梨醇酯20进行组合来制备。在一些实施例中，组合物还可以包含选自由以下组成的组的材料：抗氧化剂、螯合剂和防腐剂以及其组合。组合物的pH在约5-6的范围内，并且适于眼内施用，包含玻璃体内施用。
实施例2：组合物2
本发明的组合物通过将10-100mg/mL融合蛋白EB-101、10mM磷酸盐缓冲液、40mMNaCl、5％(按重量计)蔗糖和0.03％(按重量计)聚山梨醇酯20进行组合来制备。组合物的pH在约5.5-6.5的范围内，并且适于眼内施用，包含玻璃体内施用。
实施例3：EB-101在HEK293细胞中的瞬时表达
合成编码如由SEQ ID NO:12所指示的EB-101氨基酸序列的基因，并且构建用于表达蛋白质的载体。表达载体用于用化学限定的培养基瞬时转染293细胞。通过蛋白A亲和柱纯化所产生的蛋白质，超滤并且然后经受0.2μm无菌过滤以得到大量高纯度。当通过体积排阻色谱法(SEC-HPLC)分析时，EB-101在HEK293细胞中的表达产生具有MW～200KDa以及纯度为96％的蛋白质(SDS-PAGE上的非还原形式)。参见图2。
实施例4：EB-101在CHO细胞中的瞬时表达。
合成编码如由SEQ ID NO:12所指示的EB-101氨基酸序列的基因，并且构建用于表达蛋白质的载体。表达载体用于用化学限定的培养基瞬时转染CHO细胞。通过蛋白A亲和柱纯化所产生的蛋白质，超滤并且然后经受0.2μm无菌过滤以得到大量高纯度。当通过SEC-HPLC分析时，EB-101在CHO细胞中的表达产生具有MW～200KDa以及纯度为约100％的蛋白质(SDS-PAGE上的非还原形式)。参见图3。
实施例5：使用SPR Biacore进行的EB-101对人类重组人VEGF-A165、VEGF-B167/189、VEGF-C、VEGF-D和PlGF的结合亲和力与阿柏西普对其的结合亲和力的比较。参见图4-8。
通过将抗人IgG(Fc)抗体固定在CM5传感器芯片表面上进行SPR Biacore分析，并且确定配体固定的水平。偶联到CM5传感器芯片上的抗Fc抗体的量为约7,000～14,000应答单位(“RU”)。然后，将EB-101或阿柏西普注射到样品通道，以达到约400RU的捕获水平。最后，注射在运行缓冲液中稀释的不同浓度的分析物(在此测定中为VEGF-A)用于亲和力和动力学测量。1:1结合模型用于测量结合亲和力和/或动力学。VEGF-A165与EB-101结合的动力学常数如下：平衡解离常数KD＝7.51×10-12M(7.51pM)，缔合速率常数Ka＝5.06×107M-1s-1，解离速率常数Kd＝3.64×10-4s-1。VEGF-A165与阿柏西普结合的动力学常数如下：平衡解离常数KD＝3.36×10-11M(33.6pM)，缔合速率常数Ka＝1.36×107M-1s-1，解离速率常数Kd＝4.58×10-4s-1。
VEGF-B167/189与EB-101结合的动力学常数如下：平衡解离常数KD＝1.38×10-10M(138pM)，缔合速率常数Ka＝2.20×106M-1s-1，解离速率常数Kd＝3.03×10-4s-1。VEGF-B167/189与阿柏西普结合的动力学常数如下：平衡解离常数KD＝1.73×10-11M(17.3pM)，缔合速率常数Ka＝3.27×106M-1s-1，解离速率常数Kd＝5.67×10-5s-1。
VEGF-C与EB-101结合的动力学常数如下：平衡解离常数KD＝4.64×10-10M(0.464nM)，缔合速率常数Ka＝3.11×106M-1s-1，解离速率常数Kd＝1.44×10-3s-1。VEGF-C与阿柏西普之间的结合不能被检测到。
VEGF-D与EB-101或阿柏西普之间的结合不能被检测到。
PlGF与EB-101结合的动力学常数如下：平衡解离常数KD＝2.09×10-10M(209pM)，缔合速率常数Ka＝1.68×107M-1s-1，解离速率常数Kd＝3.15×10-3s-1。PlGF与阿柏西普结合的动力学常数如下：平衡解离常数KD＝4.84×10-10M(484pM)，缔合速率常数Ka＝1.26×106M-1s-1，解离速率常数Kd＝6.10×10-4s-1。
表1：
使用SPR Biacore进行的EB-101对VEGF-A165、VEGF-B167/189、VEGF-C、VEGF-D和PlGF的结合亲和力与阿柏西普对其的结合亲和力的比较
KD(SPR Biacore) VEGFA165 VEGF-B167/189 VEGF-C VEGF-D PlGF
EB-101 7.51pM 0.14nM 0.46nM 无结合 0.21nM
阿柏西普 33.60pM 17.30pM 无结合 无结合 0.48nM
因此，EB-101与这些VEGF家族成员的结合比阿柏西普更有利。
实施例6：EB-101对VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-A165介导的VEGFR-2信号传导的抑制的作用与阿柏西普和贝伐单抗对其的抑制的作用的比较。
将重组人VEGF-A165与测试化合物的连续稀释液混合，在室温下温育30分钟，并且然后添加到含有4×104个VEGFR-2(KDR)-NFAT-RE荧光素酶报告细胞/孔的孔中，随后在37℃下温育6小时。在添加50μl Bright-Lite后，通过酶标仪检测荧光素酶信号。EB-101对抑制VEGF-A165介导的VEGFR-2信号传导的作用与由阿柏西普或贝伐单抗抑制作用的相当。参见图9。
实施例7：EB-101对VEGFR2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-C介导的VEGFR2信号传导的抑制的作用与阿柏西普对其的抑制的作用的比较。
将重组人VEGF-C与测试化合物的连续稀释液混合，在室温下温育30分钟，并且然后添加到含有4×104个VEGFR-2(KDR)-NFAT-RE荧光素酶报告细胞/孔的孔中，随后在37下温育6小时。在添加50μl Bright-Lite后，通过酶标仪检测荧光素酶信号。EB-101，而不是阿柏西普，对VEGF-C介导的VEGFR-2信号传导具有浓度依赖性抑制。参见图10。
实施例8：EB-101对VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-C介导的VEGFR-2信号传导的抑制作用与阿柏西普和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR-3(rhVEGFR-3-7ECD)对其的抑制作用的比较。
将重组人VEGF-C与测试化合物的连续稀释液混合，在室温下温育30分钟，并且然后添加到含有4×104个VEGFR-2(KDR)-NFAT-RE荧光素酶报告细胞/孔的孔中，随后在37下温育6小时。在添加50μl Bright-Lite后，通过酶标仪检测荧光素酶信号。EB-101和rhVEGFR-3，而不是阿柏西普，对VEGF-C介导的VEGFR-2信号传导具有剂量依赖性抑制。参见图11。
实施例9：对EB-101对由VEGF-A165和VEGF-C刺激的VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGFR-2信号传导的抑制的作用与阿柏西普和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR-3(rhVEGFR-3)对其的抑制的作用的定量分析。
将测试化合物与含有60ng/ml VEGF-A165和25ng/ml VEGF-C的混合物混合，并在室温下温育30分钟，并且然后将所得溶液添加到含有4×104个VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞/孔的孔中，随后在37℃温育6小时。在添加50μl Bright-Lite后，通过酶标仪检测荧光素酶信号。EB-101以及阿柏西普与rhVEGFR-3的组合有效抑制VEGF-A165加VEGF-C介导的VEGFR-2信号传导，而单独的阿柏西普或rhVEGFR3显示出对VEGF-A165和VEGF-C介导的VEGFR-2信号传导的有限抑制作用。参见图12。
实施例10：EB-101对VEGF-A165介导的人淋巴管内皮细胞(HLEC)增殖的作用与阿柏西普和贝伐单抗对其的作用的比较。
将原代HLEC以2500个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并且在37℃下培养过夜。第二天，将重组人VEGF-A165与测试化合物的连续稀释液混合，并在室温下温育30分钟，并且然后将所得溶液添加到每个孔中，随后在37℃下温育72小时。通过将10％ AlamarBlue染料添加到每个孔中并温育5小时，随后使用酶标仪进行荧光读数来评估细胞增殖。EB-101对抑制VEGF-A165介导的HLEC增殖的作用与阿柏西普和贝伐单抗的抑制作用相当。参见图13。
实施例11：EB-101对VEGF-C介导的HLEC增殖的作用与阿柏西普和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR-3(rhVEGFR-3ECD)对其的作用的比较。
将原代HLEC以2500个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并且在37℃下于培养箱中培养过夜。第二天，将重组人VEGF-C与测试化合物的连续稀释液混合，并在室温下温育30分钟，并且然后将所得溶液添加到每个孔中，随后在37℃下温育72小时。通过将10％AlamarBlue染料添加到每个孔中并温育5小时，随后使用酶标仪进行荧光读数来评估细胞增殖。EB-101和rhVEGFR-3，而不是阿柏西普，显示出对VEGF-C介导的HLEC增殖的浓度依赖性抑制。参见图14。
实施例12：对EB-101、阿柏西普和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR-3(rhVEGFR-3ECD)对VEGF-A165和VEGF-C介导的人淋巴管内皮细胞(HLEC)增殖的定量分析。
将原代HLEC以2500个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并且在37℃下于培养箱中培养过夜。第二天，将含有60ng/ml VEGF-A165和25ng/ml VEGF-C的混合物与测试化合物混合，并在室温下温育30分钟，并且然后将所得溶液添加到孔中，随后在37℃下温育72小时。通过添加10％ AlamarBlue染料并温育5小时，随后使用酶标仪进行荧光读数来评估细胞增殖。EB-101以及阿柏西普与rhVEGFR-3的组合有效地抑制VEGF-A165和VEGF-C介导的VEGFR2信号传导，而单独的阿柏西普或rhVEGFR3对VEGF-A165和VEGF-C介导的HLEC增殖仅具有有限的抑制。参见图15。
实施例13：EB-101BIb的分子设计和表达。
EB-101BIb是一种重组人Fc融合蛋白，包含VEGFR-1的结合结构域2、VEGFR-2的结构域3和VEGFR-3的结构域1-3。合成编码如由SEQ ID NO:16所指示的EB-101BIb的氨基酸序列的基因，并且构建用于表达蛋白质的载体。表达载体用于用化学限定的培养基瞬时转染CHO细胞。通过蛋白A亲和柱纯化所产生的蛋白质，超滤并且然后经受0.2μm无菌过滤以得到大量高纯度。当通过SEC-HPLC分析时，EB-101BIb在CHO细胞中的表达产生具有MW～200KDa以及纯度为88％的蛋白质(SDS-PAGE上的非还原形式)。参见图16。
实施例14：EB-101BIb对VEGFR2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-A介导的VEGFR-2信号传导的作用与阿柏西普、EB-101、EB-101BIa对其的作用的比较。
将重组人VEGF-A165与测试化合物的连续稀释液混合，在室温下温育30分钟，并且然后添加到含有4×104个VEGFR2(KDR)-NFAT-RE荧光素酶报告细胞/孔的孔中，随后在37℃下温育6小时。在添加50μl Bright-Lite后，通过酶标仪检测荧光素酶信号。EB-101BIb对抑制VEGF-A165介导的VEGFR-2信号传导的作用与阿柏西普、EB-101和EB-101BIa抑制的作用相当。后两种分子含有VEGFR-1的结合结构域2、VEGFR-2的结构域3和结构域1-2，但不含VEGFR-3的结构域3，并且分别在HEK293(EB-101)细胞和CHO(EB-101BIa)细胞中表达。参见图17。
实施例15：EB-101BIb对VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-C和VEGF-D介导的VEGFR-2信号传导的作用与阿柏西普、EB-101和EB-101BIa对其的作用的比较。
将重组人VEGF-C和VEGF-D与测试化合物的连续稀释液混合，在室温下温育30分钟，并且然后添加到含有4×104个VEGFR-2(KDR)-NFAT-RE荧光素酶报告细胞/孔的孔中，随后在37℃下温育6小时。在添加50μl Bright-Lite后，通过酶标仪检测荧光素酶信号。EB-101BIb显示出对VEGF-C和VEGF-D介导的VEGFR-2信号传导的浓度依赖性抑制，而EB-101和EB-101BIa显示出对VEGF-C和VEGF-D介导的VEGFR-2信号传导的有限抑制。阿柏西普对VEGF-C和VEGF-D介导的VEGFR-2信号传导没有作用。EB-101和EB-101BIa含有VEGFR-1的结合结构域2、VEGFR-2的结构域3和结构域1-2，但不含VEGFR-3的结构域3，并且分别在HEK293(EB-101)细胞和CHO(EB-101BIa)细胞中表达。参见图18。
实施例16：EB-101BIb对VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中的VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D介导的VEGFR-2信号传导的作用与阿柏西普、EB-101以及阿柏西普与重组人VEGFR-3的组合对其的作用的比较。
将测试化合物与含有60ng/ml VEGF-A165和25ng/ml VEGF-C以及150ng/ml VEGF-D的混合物混合，随后在室温下温育30分钟，并且然后将所得溶液添加到含有4×104个VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞/孔的孔中，随后在37℃下温育6小时。在添加50μlBright-Lite后，通过酶标仪检测荧光素酶信号。在由VEGF-A165、VEGF-C和VEGF-D组成的混合物刺激的VEGFR-2-NFAT-RE荧光素酶报告细胞中，阿柏西普显示出对VEGFR-2信号传导的很少抑制，而EB-101BIb显示出对VEGFR-2信号传导的浓度依赖性抑制(图19A)。EB-101BIb完全抑制VEGF-A165、VEGF-C和VEGF-D介导的VEGFR-2信号传导。与EB-101BIb和EB-101相比，EB-101显示出有限的抑制作用，而阿柏西普对VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D介导的VEGFR-2信号传导的抑制最小。通过EB-101与重组人VEGFR-3的组合复制了EB-101BIb的完全抑制作用(图19B)。EB-101包含VEGFR-1的结合结构域2、VEGFR-2的结构域3和结构域1-2，但不含VEGFR-3的结构域3。EB-101BIb包含VEGFR-1的结合结构域2、VEGFR-2的结构域3和VEGFR-3的结构域1-3。参见图19。
实施例17：EB-101BIb对VEGF-A165介导的人淋巴管内皮细胞(HLEC)增殖的作用与阿柏西普和EB-101BIa对其的作用的比较。
将原代HLEC以2500个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并在37℃下培养过夜。第二天，将重组人VEGF-A165与测试化合物的连续稀释液混合，并在室温下温育30分钟，并且然后将所得溶液添加到每个孔中，随后在37℃下温育72小时。通过将10％AlamarBlue染料添加到每个孔中并温育5小时，随后使用读板仪进行荧光读数来评估细胞增殖。EB-101BIb对抑制VEGF-A165介导的HLEC增殖的作用与阿柏西普和EB-101BIa抑制的作用相当。参见图20。
实施例18：EB-101BIb对VEGF-C和VEGF-D介导的HLEC增殖的作用与阿柏西普、EB-101BIa和含有7个细胞外结构域的重组人VEGFR-3对其的作用的比较。
将原代HLEC以2500个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并且在37℃下于培养箱中培养过夜。第二天，将重组人VEGF-C(25ng/ml)和VEGF-D(150ng/ml)与测试化合物的连续稀释液混合，并在室温下温育30分钟，并且然后将所得溶液添加到每个孔中，随后在37℃下温育72小时。通过将10％AlamarBlue染料添加到每个孔中并温育5小时，随后使用酶标仪进行荧光读数来评估细胞增殖。与经EB-101Bia处理的组相比，EB-101BIb和rhVEGFR-3显示出对抑制VEGF-C和VEGF-D介导的HLEC增殖的更有效的作用。参见图21。
实施例19：EB-101BIb对VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D介导的人淋巴管内皮细胞(HLEC)增殖的作用与阿柏西普、含有7个细胞外结构域(7个ECD)的重组人VEGFR-3以及阿柏西普与VEGFR-3的组合对其的作用的比较。
将原代HLEC以2500个细胞/孔的密度接种于96孔板中，并且在37℃下于培养箱中培养过夜。第二天，将含有重组人VEGF-A165、VEGF-C和VEGF-D的混合物与等体积的测试化合物连续稀释液混合，并在室温下温育30分钟(VEGF-A165、VEGF-C和VEGF-D的最终浓度分别为60、25和150ng/ml)。将所得溶液添加到每组中的9个孔中，并且然后在37℃下温育72小时。通过将10％AlamarBlue染料添加到每个孔中并温育5小时，随后使用酶标仪进行荧光读数来评估细胞增殖。单独的阿柏西普或VEGFR-3显示出有限的抑制，而EB-101BIb或阿柏西普与VEGFR-3的组合完全抑制由VEGF-A165、VEGF-C和VEGF-D刺激的HLEC增殖。参见图22。
核酸和氨基酸序列表
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虽然已经展示了本发明的具体实施方式，但本领域技术人员将理解，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对其进行各种等效形式、修改、取代和改变，如在下文中所附权利要求中所定义的。
序列表
<110> 典晶生物医药科技（苏州）有限公司
（Eluminex Biosciences (Suzhou) Limited）
<120> 血管生成因子的抑制剂
<130> 076908-8001WO01
<160> 16
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 306
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
agtgataccg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60
actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120
ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180
agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240
gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300
atcata 306
<210> 2
<211> 102
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile
100
<210> 3
<211> 309
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
gatgtggttc tgagtccgtc tcatggaatt gaactatctg ttggagaaaa gcttgtctta 60
aattgtacag caagaactga actaaatgtg gggattgact tcaactggga atacccttct 120
tcgaagcatc agcataagaa acttgtaaac cgagacctaa aaacccagtc tgggagtgag 180
atgaagaaat ttttgagcac cttaactata gatggtgtaa cccggagtga ccaaggattg 240
tacacctgtg cagcatccag tgggctgatg accaagaaga acagcacatt tgtcagggtc 300
catgaaaag 309
<210> 4
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
1 5 10 15
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
20 25 30
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
35 40 45
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
50 55 60
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
85 90 95
Phe Val Arg Val His Glu Lys
100
<210> 5
<211> 614
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
tactccatga cccccccgac cttgaacatc acggaggagt cacacgtcat cgacaccggt 60
gacagcctgt ccatctcctg caggggacag caccccctcg agtgggcttg gccaggagct 120
caggaggcgc cagccaccgg agacaaggac agcgaggaca cgggggtggt gcgagactgc 180
gagggcacag acgccaggcc ctactgcaag gtgttgctgc tgcacgaggt acatgccaac 240
gacacaggca gctacgtctg ctactacaag tacatcaagg cacgcatcga gggcaccacg 300
gccgccagct cctacgtgtt cgtgagagac tttgagcagc cattcatcaa caagcctgac 360
acgctcttgg tcaacaggaa ggacgccatg tgggtgccct gtctggtgtc catccccggc 420
ctcaatgtca cgctgcgctc gcaaagctcg gtgctgtggc cagacgggca ggaggtggtg 480
tgggatgacc ggcggggcat gctcgtgtcc acgccactgc tgcacgatgc cctgtacctg 540
cagtgcgaga ccacctgggg agaccaggac ttcctttcca accccttcct ggtgcacatc 600
acaggcaacg agct 614
<210> 6
<211> 205
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Thr Gly Asn Glu Leu
195 200 205
<210> 7
<211> 678
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggt 678
<210> 8
<211> 226
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 9
ggtggctctg gagggggttc cggtggcgga ggttcaggtg gcggaggggg ttcgggtggc 60
ggaggg 66
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 10
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Gly Gly
20
<210> 11
<211> 1974
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 11
agtgataccg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60
actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120
ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180
agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240
gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300
atcatagatg tggttctgag tccgtctcat ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt 360
gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac 420
ccttcttcga agcatcagca taagaaactt gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg 480
agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540
ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600
agggtccatg aaaagtactc catgaccccc ccgaccttga acatcacgga ggagtcacac 660
gtcatcgaca ccggtgacag cctgtccatc tcctgcaggg gacagcaccc cctcgagtgg 720
gcttggccag gagctcagga ggcgccagcc accggagaca aggacagcga ggacacgggg 780
gtggtgcgag actgcgaggg cacagacgcc aggccctact gcaaggtgtt gctgctgcac 840
gaggtacatg ccaacgacac aggcagctac gtctgctact acaagtacat caaggcacgc 900
atcgagggca ccacggccgc cagctcctac gtgttcgtga gagactttga gcagccattc 960
atcaacaagc ctgacacgct cttggtcaac aggaaggacg ccatgtgggt gccctgtctg 1020
gtgtccatcc ccggcctcaa tgtcacgctg cgctcgcaaa gctcggtgct gtggccagac 1080
gggcaggagg tggtgtggga tgaccggcgg ggcatgctcg tgtccacgcc actgctgcac 1140
gatgccctgt acctgcagtg cgagaccacc tggggagacc aggacttcct ttccaacccc 1200
ttcctggtgc acatcacagg caacgagctc ggtggctctg gagggggttc cggtggcgga 1260
ggttcaggtg gcggaggggg ttcgggtggc ggaggggaca aaactcacac atgcccaccg 1320
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 1380
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 1440
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 1500
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1560
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1620
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1680
tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1740
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1800
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1860
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1920
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggt 1974
<210> 12
<211> 658
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成
<400> 12
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Tyr Ser Met
195 200 205
Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val Ile Asp Thr
210 215 220
Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp
225 230 235 240
Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser
245 250 255
Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp Ala Arg Pro
260 265 270
Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn Asp Thr Gly
275 280 285
Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile Glu Gly Thr
290 295 300
Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu Gln Pro Phe
305 310 315 320
Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp Ala Met Trp
325 330 335
Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr Leu Arg Ser
340 345 350
Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val Trp Asp Asp
355 360 365
Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp Ala Leu Tyr
370 375 380
Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu Ser Asn Pro
385 390 395 400
Phe Leu Val His Ile Thr Gly Asn Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gly
405 410 415
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
420 425 430
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
435 440 445
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
450 455 460
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
465 470 475 480
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
485 490 495
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
500 505 510
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
515 520 525
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
530 535 540
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
545 550 555 560
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
565 570 575
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
580 585 590
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
595 600 605
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
610 615 620
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
625 630 635 640
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
645 650 655
Pro Gly
<210> 13
<211> 1363
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Met Gln Arg Gly Ala Ala Leu Cys Leu Arg Leu Trp Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Asp Gly Leu Val Ser Gly Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu
20 25 30
Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala
50 55 60
Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val
65 70 75 80
Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu
85 90 95
Leu Leu His Glu Val His Ala Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr
100 105 110
Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser
115 120 125
Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp
130 135 140
Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val
145 150 155 160
Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu
165 170 175
Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu
180 185 190
Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr
195 200 205
Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile
210 215 220
Thr Gly Asn Glu Leu Tyr Asp Ile Gln Leu Leu Pro Arg Lys Ser Leu
225 230 235 240
Glu Leu Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Val Trp Ala
245 250 255
Glu Phe Asn Ser Gly Val Thr Phe Asp Trp Asp Tyr Pro Gly Lys Gln
260 265 270
Ala Glu Arg Gly Lys Trp Val Pro Glu Arg Arg Ser Gln Gln Thr His
275 280 285
Thr Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Ile His Asn Val Ser Gln His Asp
290 295 300
Leu Gly Ser Tyr Val Cys Lys Ala Asn Asn Gly Ile Gln Arg Phe Arg
305 310 315 320
Glu Ser Thr Glu Val Ile Val His Glu Asn Pro Phe Ile Ser Val Glu
325 330 335
Trp Leu Lys Gly Pro Ile Leu Glu Ala Thr Ala Gly Asp Glu Leu Val
340 345 350
Lys Leu Pro Val Lys Leu Ala Ala Tyr Pro Pro Pro Glu Phe Gln Trp
355 360 365
Tyr Lys Asp Gly Lys Ala Leu Ser Gly Arg His Ser Pro His Ala Leu
370 375 380
Val Leu Lys Glu Val Thr Glu Ala Ser Thr Gly Thr Tyr Thr Leu Ala
385 390 395 400
Leu Trp Asn Ser Ala Ala Gly Leu Arg Arg Asn Ile Ser Leu Glu Leu
405 410 415
Val Val Asn Val Pro Pro Gln Ile His Glu Lys Glu Ala Ser Ser Pro
420 425 430
Ser Ile Tyr Ser Arg His Ser Arg Gln Ala Leu Thr Cys Thr Ala Tyr
435 440 445
Gly Val Pro Leu Pro Leu Ser Ile Gln Trp His Trp Arg Pro Trp Thr
450 455 460
Pro Cys Lys Met Phe Ala Gln Arg Ser Leu Arg Arg Arg Gln Gln Gln
465 470 475 480
Asp Leu Met Pro Gln Cys Arg Asp Trp Arg Ala Val Thr Thr Gln Asp
485 490 495
Ala Val Asn Pro Ile Glu Ser Leu Asp Thr Trp Thr Glu Phe Val Glu
500 505 510
Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Lys Leu Val Ile Gln Asn Ala Asn Val
515 520 525
Ser Ala Met Tyr Lys Cys Val Val Ser Asn Lys Val Gly Gln Asp Glu
530 535 540
Arg Leu Ile Tyr Phe Tyr Val Thr Thr Ile Pro Asp Gly Phe Thr Ile
545 550 555 560
Glu Ser Lys Pro Ser Glu Glu Leu Leu Glu Gly Gln Pro Val Leu Leu
565 570 575
Ser Cys Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Tyr Glu His Leu Arg Trp Tyr Arg
580 585 590
Leu Asn Leu Ser Thr Leu His Asp Ala His Gly Asn Pro Leu Leu Leu
595 600 605
Asp Cys Lys Asn Val His Leu Phe Ala Thr Pro Leu Ala Ala Ser Leu
610 615 620
Glu Glu Val Ala Pro Gly Ala Arg His Ala Thr Leu Ser Leu Ser Ile
625 630 635 640
Pro Arg Val Ala Pro Glu His Glu Gly His Tyr Val Cys Glu Val Gln
645 650 655
Asp Arg Arg Ser His Asp Lys His Cys His Lys Lys Tyr Leu Ser Val
660 665 670
Gln Ala Leu Glu Ala Pro Arg Leu Thr Gln Asn Leu Thr Asp Leu Leu
675 680 685
Val Asn Val Ser Asp Ser Leu Glu Met Gln Cys Leu Val Ala Gly Ala
690 695 700
His Ala Pro Ser Ile Val Trp Tyr Lys Asp Glu Arg Leu Leu Glu Glu
705 710 715 720
Lys Ser Gly Val Asp Leu Ala Asp Ser Asn Gln Lys Leu Ser Ile Gln
725 730 735
Arg Val Arg Glu Glu Asp Ala Gly Arg Tyr Leu Cys Ser Val Cys Asn
740 745 750
Ala Lys Gly Cys Val Asn Ser Ser Ala Ser Val Ala Val Glu Gly Ser
755 760 765
Glu Asp Lys Gly Ser Met Glu Ile Val Ile Leu Val Gly Thr Gly Val
770 775 780
Ile Ala Val Phe Phe Trp Val Leu Leu Leu Leu Ile Phe Cys Asn Met
785 790 795 800
Arg Arg Pro Ala His Ala Asp Ile Lys Thr Gly Tyr Leu Ser Ile Ile
805 810 815
Met Asp Pro Gly Glu Val Pro Leu Glu Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Ser
820 825 830
Tyr Asp Ala Ser Gln Trp Glu Phe Pro Arg Glu Arg Leu His Leu Gly
835 840 845
Arg Val Leu Gly Tyr Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Ser Ala
850 855 860
Phe Gly Ile His Lys Gly Ser Ser Cys Asp Thr Val Ala Val Lys Met
865 870 875 880
Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu His Arg Ala Leu Met Ser Glu
885 890 895
Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly Asn His Leu Asn Val Val Asn Leu
900 905 910
Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gln Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu
915 920 925
Phe Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Phe Leu Arg Ala Lys Arg Asp
930 935 940
Ala Phe Ser Pro Cys Ala Glu Lys Ser Pro Glu Gln Arg Gly Arg Phe
945 950 955 960
Arg Ala Met Val Glu Leu Ala Arg Leu Asp Arg Arg Arg Pro Gly Ser
965 970 975
Ser Asp Arg Val Leu Phe Ala Arg Phe Ser Lys Thr Glu Gly Gly Ala
980 985 990
Arg Arg Ala Ser Pro Asp Gln Glu Ala Glu Asp Leu Trp Leu Ser Pro
995 1000 1005
Leu Thr Met Glu Asp Leu Val Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg
1010 1015 1020
Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu
1025 1030 1035
Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Ser Asp Val Val Lys Ile
1040 1045 1050
Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr
1055 1060 1065
Val Arg Lys Gly Ser Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro
1070 1075 1080
Glu Ser Ile Phe Asp Lys Val Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp
1085 1090 1095
Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser
1100 1105 1110
Pro Tyr Pro Gly Val Gln Ile Asn Glu Glu Phe Cys Gln Arg Leu
1115 1120 1125
Arg Asp Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Glu Leu Ala Thr Pro Ala
1130 1135 1140
Ile Arg Arg Ile Met Leu Asn Cys Trp Ser Gly Asp Pro Lys Ala
1145 1150 1155
Arg Pro Ala Phe Ser Glu Leu Val Glu Ile Leu Gly Asp Leu Leu
1160 1165 1170
Gln Gly Arg Gly Leu Gln Glu Glu Glu Glu Val Cys Met Ala Pro
1175 1180 1185
Arg Ser Ser Gln Ser Ser Glu Glu Gly Ser Phe Ser Gln Val Ser
1190 1195 1200
Thr Met Ala Leu His Ile Ala Gln Ala Asp Ala Glu Asp Ser Pro
1205 1210 1215
Pro Ser Leu Gln Arg His Ser Leu Ala Ala Arg Tyr Tyr Asn Trp
1220 1225 1230
Val Ser Phe Pro Gly Cys Leu Ala Arg Gly Ala Glu Thr Arg Gly
1235 1240 1245
Ser Ser Arg Met Lys Thr Phe Glu Glu Phe Pro Met Thr Pro Thr
1250 1255 1260
Thr Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val
1265 1270 1275
Leu Ala Ser Glu Glu Phe Glu Gln Ile Glu Ser Arg His Arg Gln
1280 1285 1290
Glu Ser Gly Phe Ser Cys Lys Gly Pro Gly Gln Asn Val Ala Val
1295 1300 1305
Thr Arg Ala His Pro Asp Ser Gln Gly Arg Arg Arg Arg Pro Glu
1310 1315 1320
Arg Gly Ala Arg Gly Gly Gln Val Phe Tyr Asn Ser Glu Tyr Gly
1325 1330 1335
Glu Leu Ser Glu Pro Ser Glu Glu Asp His Cys Ser Pro Ser Ala
1340 1345 1350
Arg Val Thr Phe Phe Thr Asp Asn Ser Tyr
1355 1360
<210> 14
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser
100
<210> 15
<211> 306
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Thr Gly Asn Glu Leu Tyr Asp Ile
195 200 205
Gln Leu Leu Pro Arg Lys Ser Leu Glu Leu Leu Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Val Trp Ala Glu Phe Asn Ser Gly Val Thr Phe
225 230 235 240
Asp Trp Asp Tyr Pro Gly Lys Gln Ala Glu Arg Gly Lys Trp Val Pro
245 250 255
Glu Arg Arg Ser Gln Gln Thr His Thr Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr
260 265 270
Ile His Asn Val Ser Gln His Asp Leu Gly Ser Tyr Val Cys Lys Ala
275 280 285
Asn Asn Gly Ile Gln Arg Phe Arg Glu Ser Thr Glu Val Ile Val His
290 295 300
Glu Asn
305
<210> 16
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 由VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的细胞外结构域构建的融合蛋白。
<400> 16
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu
225 230 235 240
Ser His Val Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly
245 250 255
Gln His Pro Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala
260 265 270
Thr Gly Asp Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu
275 280 285
Gly Thr Asp Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val
290 295 300
His Ala Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys
305 310 315 320
Ala Arg Ile Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg
325 330 335
Asp Phe Glu Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn
340 345 350
Arg Lys Asp Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu
355 360 365
Asn Val Thr Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln
370 375 380
Glu Val Val Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu
385 390 395 400
Leu His Asp Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln
405 410 415
Asp Phe Leu Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Thr Gly Asn Glu Leu
420 425 430
Tyr Asp Ile Gln Leu Leu Pro Arg Lys Ser Leu Glu Leu Leu Val Gly
435 440 445
Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Val Trp Ala Glu Phe Asn Ser Gly
450 455 460
Val Thr Phe Asp Trp Asp Tyr Pro Gly Lys Gln Ala Glu Arg Gly Lys
465 470 475 480
Trp Val Pro Glu Arg Arg Ser Gln Gln Thr His Thr Glu Leu Ser Ser
485 490 495
Ile Leu Thr Ile His Asn Val Ser Gln His Asp Leu Gly Ser Tyr Val
500 505 510
Cys Lys Ala Asn Asn Gly Ile Gln Arg Phe Arg Glu Ser Thr Glu Val
515 520 525
Ile Val His Glu Asn Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
530 535 540
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
545 550 555 560
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
565 570 575
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
580 585 590
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
595 600 605
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
610 615 620
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
625 630 635 640
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
645 650 655
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
660 665 670
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
675 680 685
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
690 695 700
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
705 710 715 720
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
725 730 735
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
740 745 750
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
755

Claims (28)

1.一种重组人Fc融合蛋白，其包括第一VEGF受体的Ig样结构域、第二VEGF受体的Ig样结构域和第三VEGF受体的至少一个Ig样结构域；其中所述第三VEGF受体包括具有SEQ IDNO:13中列出的氨基酸序列的人VEGFR-3(flt-4)，条件是SEQ ID NO:13的位置105和106处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:13的位置104-106处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一VEGF受体的Ig样结构域包括与人VEGFR-1(flt-1)的Ig样结构域2至少90％相同的氨基酸序列；所述第二VEGF受体的Ig样结构域包括与人VEGFR-2(KDR)的Ig样结构域3至少90％相同的氨基酸序列；并且
所述第三VEGF受体的至少一个Ig样结构域包括与人VEGFR-3的Ig样结构域1和2至少90％相同的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述第一VEGF受体的Ig样结构域包括与人VEGFR-1(flt-1)的Ig样结构域2至少95％相同的氨基酸序列；所述第二VEGF受体的Ig样结构域包括与人VEGFR-2(KDR)的Ig样结构域3至少95％相同的氨基酸序列；并且
所述第三VEGF受体的至少一个Ig样结构域包括与人VEGFR-3的Ig样结构域1和2至少95％相同的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述第三VEGF受体的至少一个Ig样结构域包括与人VEGFR-3的Ig样结构域1、2和3至少95％相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其进一步包括(d)与所述Ig样结构域连接的多聚化组分。
6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述多聚化组分包括人IgG1的Fc结构域的一部分。
7.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述人VEGFR-1的Ig样结构域2包括SEQ IDNO:2中列出的氨基酸序列；所述人VEGFR-2的Ig样结构域3包括SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列；所述人VEGFR-3的Ig样结构域1和2包括SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列；并且所述人IgG1的Fc结构域的一部分包括SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。
8.一种融合蛋白，其包括与SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12的位置286和287处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:12的位置285-287处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其包括与SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的融合蛋白，其包括如SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述融合多肽以解离常数Kd≤10-9M与VEGF家族成员结合。
12.根据权利要求10所述的融合蛋白，其中所述融合多肽以解离常数Kd≤10-10M与VEGF家族成员结合。
13.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至12中任一项的融合多肽。
14.根据权利要求13所述的分离的核酸分子，其具有基本上如SEQ ID NO:11中列出的序列。
15.一种载体，其包括根据权利要求13或14所述的核酸分子。
16.根据权利要求15所述的载体，其包括与表达控制序列操作性地连接的所述核酸分子。
17.一种宿主-载体系统，其包括在宿主细胞中的权利要求16的表达载体。
18.一种产生基本上纯化的融合多肽的方法，所述方法包括：(a)在允许产生所述融合多肽的条件下生长根据权利要求17所述的宿主-载体系统的细胞；以及(b)回收所述融合多肽或嵌合多肽以产生经回收的融合多肽；以及(c)纯化所述经回收的融合多肽以产生所述基本上纯化的融合多肽。
19.一种用于治疗或控制有需要的受试者的至少一种疾病、病状或病症的方法，所述疾病、病状或病症的病因有异常血管生成；所述方法包括向所述受试者施用一定量的融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包括与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，条件是SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置286和287处的氨基酸是可取代的，使得SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的位置285-287处的氨基酸序列是NDT、NDS、NXT或NXS，其中X是选自由以下组成的组的氨基酸：A、R、N、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述融合蛋白包括与SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:16中列出的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述疾病、病状或病症选自由以下组成的组：脉络膜新生血管、息肉状脉络膜血管病变、近视新生血管、视网膜新生血管、早产儿视网膜病变、血管渗漏、视网膜水肿、糖尿病性黄斑水肿、由视网膜静脉阻塞或非感染性后葡萄膜炎引起的黄斑水肿、糖尿病性视网膜病变、增生性糖尿病性视网膜病变、角膜新生血管和新生血管性青光眼。
23.根据权利要求22所述的方法，其中向所述受试者施用的剂量为约25-4000微克所述融合多肽。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述组合物以滴眼剂、玻璃体内、视网膜下或脉络膜上注射的形式施用于所述受试者。
25.根据权利要求23所述的方法，其中如果眼内施用，那么向所述受试者施用所述组合物持续至少一个月的时间段。
26.根据权利要求23所述的方法，其中如果眼内施用，那么以每月至少一次的频率向所述受试者施用所述组合物。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述疾病、病状或病症是病因有异常血管生成的非眼部疾病、病状或病症。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述疾病、病状或病症选自由以下组成的组：癌症、银屑病、类风湿性关节炎和动脉粥样硬化。
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