JP2023548073A - 多微生物性バイオフィルムを防止する、阻害する、破壊する、または処置するための組成物および方法 - Google Patents

多微生物性バイオフィルムを防止する、阻害する、破壊する、または処置するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

例えばそれを必要とする対象における、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌を含む多微生物性バイオフィルムをｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで、以下：防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法が提供される。この方法は、多微生物性バイオフィルムを、（ｉ）抗ＤＮＡ結合性およびベンディングタンパク質（ＤＮＡＢＩＩ）抗体もしくはその生物学的に活性な断片、ならびに（ｉｉ）抗ＩＶ型線毛（Ｔ４Ｐ）の大多数サブユニット（ＰｉｌＡ）抗体もしくはその生物学的に活性な断片と接触させるステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。加えて、この方法は、多微生物性バイオフィルムを、必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む抗生物質と接触させるステップをさらに含んでいてもよい。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年１１月１日に出願された米国仮出願第６３／１０８，４２１号の米国特許法第１１９（ｅ）条の利益、および２０２１年６月３０日に出願された米国出願第１７／３６４，５７８号の米国特許法第３６５（ｃ）条の利益を主張し、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
背景
疾病管理予防センターおよび国立衛生研究所は、バイオフィルムがすべての細菌感染症のうちの約８０％の病態形成に寄与すると推定している（Dongari-Bagtzoglou, 2008）。多くの他のものの中でも、バイオフィルム関連疾患、例えば、中耳炎（ＯＭ）、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、慢性鼻副鼻腔炎、慢性創傷感染症、歯周炎、膀胱炎、ならびに医療インプラントおよび留置カテーテルの感染症は、典型的には、宿主の免疫エフェクターおよび抗生物質による死滅に対して非常に耐性であるバイオフィルム内の細菌の存在に起因して、慢性および／または再発性である（Costerton et al., 1999；Flemming and Wingender, 2010）。そのため、これらの疾患を処置するための有効な療法を見出す必要性が当技術分野に存在する。本開示は、この必要性を充足し、同様に関連する利点を提供する。
開示の概要
上気道および下気道の多くの疾患は、分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）によって引き起こされ、ここで、バイオフィルムは、それぞれの疾患経過に大いに寄与する（Autio et al., 2015；Cardines et al., 2012；Zhang et al., 2012）。ＮＴＨＩが主たる病原体である１つのそのような疾患の例は、小児において最も一般的な細菌性疾患である（Hassan, 2013；Mittal et al., 2018）中耳炎（ＯＭ）である（Barkai et al., 2009；Cleary et al., 2018；Grevers et al., 2012；Vergison, 2008；Wiertsema et al., 2011）。ＯＭの病態形成、慢性化および再発におけるバイオフィルムの役割は、広く受け入れられている。それにもかかわらず、ほとんどのＮＴＨＩ誘発性疾患のように、ＯＭは、依然として一般には、広域スペクトル経口抗生物質で処置され、これは、バイオフィルム、またはさらにこの解剖学的ニッチ内でプランクトン様に成長する細菌を根絶するために中耳（または他の部位）において十分なレベルに達しない（Belfield et al., 2015）。それらの使用は、示される場合があるか、または必要であるが、広域スペクトル抗生物質は、付随する免疫学的および／または発達上の帰結を伴って、皮膚の発疹、下痢および腸内マイクロバイオームの生涯にわたる破壊の形態の付帯的損害も引き起こし得る（Gilbert et al., 2018；Kuehn et al., 2015；Lamont et al., 2020）。また、よくありがちな無差別のおよび多くの場合に効果がない抗生物質の使用は、多抗生物質耐性細菌の発生の全世界的に急増している問題に大いに寄与している（Beekmann et al., 2005；Leibovitz et al., 2010；Song et al., 2012）。
ワクチンの送達は、これらが予防を標的にするので（Andre et al., 2008）、感染性疾患を管理するための最も費用効率が高い方法であり、それ自体は、実行可能で真に理想的な目標のままである。しかしながら、バイオフィルムが関連する慢性感染症または回帰感染症が存在するこれらの小児および成人のために、有効な治療的アプローチが非常に必要とされている。
本明細書に開示される発見を適用することで、それを必要とする対象におけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、またはそれが生成するバイオフィルムを含む多微生物性バイオフィルムを防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法が本明細書に提供される。この方法は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片を対象に投与するステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。ある特定の実施形態では、抗チップキメラ抗体のＣＤＲは、下記に示される配列番号１～３、７～９、１３および１４に示される。抗テールキメラのＣＤＲは、配列番号４～６および１０～１２に示される。一態様では、抗体は、ポリクローナル抗体である。一態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様では、抗体は、モノクローナル抗体またはその生物学的に活性な断片である。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一部の実施形態では、この方法は、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質および／またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
それを必要とする対象におけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、またはそれを含む多微生物性バイオフィルム感染に関連する疾患を防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法も提供される。この方法は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片を対象に投与するステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一態様では、抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。ある特定の実施形態では、抗チップキメラ抗体のＣＤＲは、下記に示される配列番号１～３、７～９、１３および１４に示される。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一部の実施形態では、疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、肺ＣＦ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）、歯周炎、インプラント周囲炎、中耳感染症、中耳炎（ＯＭ）、急性中耳炎（ＡＯＭ）、滲出性中耳炎（ＯＭＥ）、鼓膜切開チューブ挿入後の耳漏（ＰＴＴＯ）、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、市中感染性肺炎（ＣＡＰ）、胸腔チューブ／カテーテル／留置デバイスバイオフィルム感染症、扁桃炎、咽頭炎（pharyngitis）、咽頭炎（laryngitis）、喉頭蓋炎、副鼻腔炎、肺炎、気管支炎、または他の気道感染症（ＲＴＩ）から選択される。一部の実施形態では、この方法は、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質および／またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
また別の態様では、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、またはそれを含む多微生物性バイオフィルムを防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法が提供される。この方法は、バイオフィルムを、（ｉ）抗ＤＮＡ結合性およびベンディングタンパク質（ＤＮＡＢＩＩ）抗体またはその生物学的に活性な断片、ならびに（ｉｉ）抗ＩＶ型線毛（Ｔ４Ｐ）の大多数サブユニット（ＰｉｌＡ）抗体またはその生物学的に活性な断片と接触させるステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。一部の態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片である。ある特定の実施形態では、抗チップキメラ抗体のＣＤＲは、下記に示される配列番号１～３、７～９、１３および１４に示される。一部の実施形態では、この方法は、多微生物性バイオフィルムを抗生物質と接触させるステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質および／またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。
さらなる態様では、抗生物質療法のためにＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、もしくはそれを含む多微生物性バイオフィルムに感作する、または多微生物性バイオフィルムを形成する細菌を新たに放出された（ＮＲｅｌ）状態に誘導するための方法が提供される。この方法は、バイオフィルムを、（ｉ）抗ＤＮＡ結合性およびベンディングタンパク質（ＤＮＡＢＩＩ）抗体またはその生物学的に活性な断片、ならびに（ｉｉ）抗ＩＶ型線毛（Ｔ４Ｐ）の大多数サブユニット（ＰｉｌＡ）抗体またはその生物学的に活性な断片と接触させるステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、またはそれらの生物学的に活性な断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。ある特定の実施形態では、抗チップキメラ抗体のＣＤＲは、下記に示される配列番号１～３、７～９、１３および１４に示される。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。一部の実施形態では、この方法は、多微生物性バイオフィルムを抗生物質と接触させるステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質および／またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。
またさらなる態様では、抗生物質療法のためにそれを必要とする対象におけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、もしくはそれを含むポリクローナル微生物性バイオフィルムに感作する、またはそれを必要とする対象における多微生物性バイオフィルムの細菌を新たに放出された（ＮＲｅｌ）状態に誘導するための方法が提供される。この方法は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片、および（ｉｉ）ＰｉｌＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片を対象に投与するステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。ある特定の実施形態では、抗チップキメラ抗体のＣＤＲは、下記に示される配列番号１～３、７～９、１３および１４に示される。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一部の実施形態では、この方法は、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質および／またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
例えば本明細書に開示される方法における使用のための、キットおよび組成物も提供される。一態様では、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、（ｉｉ）抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、またはＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片のうちの一方または両方、あるいは（ｉｉｉ）抗生物質のうちの少なくとも２つ、および必要に応じて、使用説明書を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるキットが提供される。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。ある特定の実施形態では、抗チップキメラ抗体のＣＤＲは、下記に示される配列番号１～３、７～９、１３および１４に示される。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。一部の実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質および／またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
別の態様では、以下：（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、（ｉｉ）抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、またはＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片のうちの一方または両方、あるいは（ｉｉｉ）抗生物質のうちの少なくとも２つ、および担体、必要に応じて、薬学的に許容される担体を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる組成物が提供される。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。ある特定の実施形態では、抗チップキメラ抗体のＣＤＲは、下記に示される配列番号１～３、７～９、１３および１４に示される。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。一部の実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質および／またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体、ポリペプチド、それらのそれぞれの生物学的に活性な断片、またはそれらの任意の組合せは、本明細書に開示される組成物中で対象に投与されてもよい。他の実施形態では、抗体、ポリペプチド、それらのそれぞれの生物学的に活性な断片、またはそれらの任意の組合せは、そのような抗体、ポリペプチド、生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチド、またはそれらに相補的なポリヌクレオチドとして対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、例えば、発現を指示する調節配列をさらに含むことにより、対象における抗体、ポリペプチド、生物学的に活性な断片を発現するのに好適であり得る。さらなる実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、遺伝子送達ビヒクルも、投与のために使用されてもよい。ベクターは、本明細書に開示されるウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってもよい。またさらなる実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよび／またはベクターのうちの１つまたは複数を含む宿主細胞が提供される。したがって、対応する発現される抗体、ペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片に加えて、またはその代わりに、そのようなポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび／または宿主細胞のうちの１つまたは複数を含むキットならびに組成物が提供される。そのようなポリペプチド、抗体、生物学的に活性な断片、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞を産生するのに好適な方法ならびに組成物がさらに提供される。
加えて、本明細書に開示される方法による、以下：防止、阻害、破壊、分散、処置または感作のうちの１つまたは複数に好適なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、またはそれを含む多微生物性バイオフィルムを選択するための方法が提供される。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。スクリーニングする方法は、（ａ）多微生物性バイオフィルム、またはそれらから単離および成長した多微生物性バイオフィルムを、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、またはＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片のうちのいずれか１つと接触させるステップ、ならびに（ｂ）以下の遺伝子：ｄｅａＤ、ａｒｔＭ、ｆｉｓ、ｆｏｌＡ、ｆｏｌＰ、ｅｍｒＡ、ｅｍｒＢ、またはａｃｒＲのうちの１つまたは複数の発現、およびタンパク質：ＡｓｎＣ、ＣｙａＡ、ＧｌｐＣ、ＮｒｆＡ、ＴｅｈＢ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ、ＴｒｕＡ、ＴｒｘＡ；ＡｂｇＡ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ、ＡｒｔＰ、ＡｔｐＨ、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＦ、ＣｃｍＡ、ＣｉｔＤ、ＣｉｔＴ、ＣｍＫ、ＣｏａＤ、ＤｃＤ、ＤｊｌＡ、ＤｋｓＡ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、ＤｓｂＥ、ＦａｂＧ、ＦｄｈＸ、ＦｔｎＢ、ＦｔｓＥ、ＦｔｓＩ、ＦｕｍＣ、Ｆｕｒ、ＧｌｐＡ、ＧｌｐＢ、ＧｍＫ、ＧｐｓＡ、ＧｒｅＡ、Ｈｆｑ、ＨｉｓＩ、ＨｕｇＺ、ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ、Ｌｉｃ２Ａ、ＬｉｃＣ、ＬｉｃＤ、ＬｏｌＡ、ＬｐｓＡ、ｍｅｎＣ、ＭｅｎＣ、ＮａｐＡ、ＮｒｆＢ、ＮｒｆＣ、ＮＴＨＩ００５３、ＮＴＨＩ０２４９、ＮＴＨＩ０２９１、ＮＴＨＩ０３１９、ＮＴＨＩ０３４９、ＮＴＨＩ０４３６、ＮＴＨＩ０４８７、ＮＴＨＩ０４９０、ＮＴＨＩ０５５５、ＮＴＨＩ０７３２、ＮＴＨＩ０７７９、ＮＴＨＩ０８２０、ＮＴＨＩ１０２５、ＮＴＨＩ１０８５、ＮＴＨＩ１１９９、ＮＴＨＩ１４３７、ＮＴＨＩ１４３９、ＮＴＨＩ１５０３、ＮＴＨＩ１５９０、ＮＴＨＩ１７４８、ＯｐｐＦ、ＰａｎＦ、ＰｄｘＨ、ＰｅｐＴ、ＰｈｏＢ、ＰｌｓＣ、ＰｏｌＡ、ＰｐＣ、ＰｐｉＢ、ＰｒｆＢ、ＰｕｒＵ、ＲａｄＡ、ＲｅｌＢ、ＲｉｂＡ、ＲｐｌＷ、ＲｐｏＥ、ＲｐｏＺ、ＲｓｅＡ、ＳｅｃＦ、Ｓｘｙ、ＴｅｓＢ、ＴｈｒＢ、ＴｏｌＡ、ＵｎＧ、ＵｒｅＧ、ＵｕａＰ、ＵｖｒＢ；ＣｌｐＢ、ＣｙｄＤ、ＤｅａＤ、ＤｌＤ、ＤｍｓＢ、ＥｘｂＤ、ＧｒｏＥＳ、ＨｆｅＡ、ＨｆｅＢ、ＨｇｐＢ、ＨｉｓＪ、ＨｉｓＪ、ＨｉｔＡ、ＨｋｔＥ、ＨｘｕＣ、ＬｃｔＰ、ＬｌｄＤ、ＬｐｘＣ、ＭｕｒＢ、ＮｄｈＡ、ＮｉｆＳ２、ＮＴＨＩ００４３、ＮＴＨＩ００５２、ＮＴＨＩ０１７５、ＮＴＨＩ０３６４、ＮＴＨＩ１２０８、ＮＴＨＩ１２１４、ＮＴＨＩ１３６９、ＮＴＨＩ１７０３、ＯｍｐＰ２、ＯｒｆＧ、Ｐａｌ、ＰｄｇＸ、ＲｂｆＡ、ＲｅｃＮ、ＲｐｌＯ、ＲｐｌＵ、ＲｐｍＥ、ＲｐｓＥ、ＲｐｓＪ、ＲｐｓＬ、ＲｐｓＱ、ＲｐｓＴ、ＳｏｄＡ、Ｔｂｐ１、ＴｏｌＢ、ＴｏｎＢ、ＴｒｐＡ、ＴｒｘＡ、またはＺｎｕＡのうちの１つまたは複数のレベルについて、（ａ）のバイオフィルムから放出された細菌をアッセイするステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、以下：以下の遺伝子：ｄｅａＤ、ａｒｔＭ、ｆｉｓ、ｆｏｌＡ、ｆｏｌＰ、ｅｍｒＡ、ｅｍｒＢ、またはａｃｒＲのうちの１つまたは複数の変更された遺伝子発現；以下のタンパク質：ＡｓｎＣ、ＣｙａＡ、ＧｌｐＣ、ＮｒｆＡ、ＴｅｈＢ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ、ＴｒｕＡ、またはＴｒｘＡのうちの１つまたは複数の変更されたレベル；以下のタンパク質：ＡｂｇＡ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ、ＡｒｔＰ、ＡｔｐＨ、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＦ、ＣｃｍＡ、ＣｉｔＤ、ＣｉｔＴ、ＣｍＫ、ＣｏａＤ、ＤｃＤ、ＤｊｌＡ、ＤｋｓＡ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、ＤｓｂＥ、ＦａｂＧ、ＦｄｈＸ、ＦｔｎＢ、ＦｔｓＥ、ＦｔｓＩ、ＦｕｍＣ、Ｆｕｒ、ＧｌｐＡ、ＧｌｐＢ、ＧｍＫ、ＧｐｓＡ、ＧｒｅＡ、Ｈｆｑ、ＨｉｓＩ、ＨｕｇＺ、ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ、Ｌｉｃ２Ａ、ＬｉｃＣ、ＬｉｃＤ、ＬｏｌＡ、ＬｐｓＡ、ｍｅｎＣ、ＭｅｎＣ、ＮａｐＡ、ＮｒｆＢ、ＮｒｆＣ、ＮＴＨＩ００５３、ＮＴＨＩ０２４９、ＮＴＨＩ０２９１、ＮＴＨＩ０３１９、ＮＴＨＩ０３４９、ＮＴＨＩ０４３６、ＮＴＨＩ０４８７、ＮＴＨＩ０４９０、ＮＴＨＩ０５５５、ＮＴＨＩ０７３２、ＮＴＨＩ０７７９、ＮＴＨＩ０８２０、ＮＴＨＩ１０２５、ＮＴＨＩ１０８５、ＮＴＨＩ１１９９、ＮＴＨＩ１４３７、ＮＴＨＩ１４３９、ＮＴＨＩ１５０３、ＮＴＨＩ１５９０、ＮＴＨＩ１７４８、ＯｐｐＦ、ＰａｎＦ、ＰｄｘＨ、ＰｅｐＴ、ＰｈｏＢ、ＰｌｓＣ、ＰｏｌＡ、ＰｐＣ、ＰｐｉＢ、ＰｒｆＢ、ＰｕｒＵ、ＲａｄＡ、ＲｅｌＢ、ＲｉｂＡ、ＲｐｌＷ、ＲｐｏＥ、ＲｐｏＺ、ＲｓｅＡ、ＳｅｃＦ、Ｓｘｙ、ＴｅｓＢ、ＴｈｒＢ、ＴｏｌＡ、ＵｎＧ、ＵｒｅＧ、ＵｕａＰ、またはＵｖｒＢのうちの１つまたは複数の低いレベル；あるいは以下のタンパク質：ＣｌｐＢ、ＣｙｄＤ、ＤｅａＤ、ＤｌＤ、ＤｍｓＢ、ＥｘｂＤ、ＧｒｏＥＳ、ＨｆｅＡ、ＨｆｅＢ、ＨｇｐＢ、ＨｉｓＪ、ＨｉｓＪ、ＨｉｔＡ、ＨｋｔＥ、ＨｘｕＣ、ＬｃｔＰ、ＬｌｄＤ、ＬｐｘＣ、ＭｕｒＢ、ＮｄｈＡ、ＮｉｆＳ２、ＮＴＨＩ００４３、ＮＴＨＩ００５２、ＮＴＨＩ０１７５、ＮＴＨＩ０３６４、ＮＴＨＩ１２０８、ＮＴＨＩ１２１４、ＮＴＨＩ１３６９、ＮＴＨＩ１７０３、ＯｍｐＰ２、ＯｒｆＧ、Ｐａｌ、ＰｄｇＸ、ＲｂｆＡ、ＲｅｃＮ、ＲｐｌＯ、ＲｐｌＵ、ＲｐｍＥ、ＲｐｓＥ、ＲｐｓＪ、ＲｐｓＬ、ＲｐｓＱ、ＲｐｓＴ、ＳｏｄＡ、Ｔｂｐ１、ＴｏｌＢ、ＴｏｎＢ、ＴｒｐＡ、ＴｒｘＡ、またはＺｎｕＡのうちの１つまたは複数の高いレベルのうちの１つまたは複数が、バイオフィルムが本明細書に開示される方法に好適であることを示す。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。ある特定の実施形態では、抗チップキメラ抗体のＣＤＲは、下記に示される配列番号１～３、７～９、１３および１４に示される。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。必要に応じて、高い、低い、変更された発現またはレベルは、同じであるがプランクトン様に成長した細菌と比較される。使用説明書およびアッセイに好適なプローブを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる、方法における使用のためのキットがさらに提供される。一部の実施形態では、プローブのうちの１つまたは複数は、標識されている。
図１Ａ～１Ｂは、抗ｒｓＰｉｌＡまたは抗ＩＨＦのいずれかによってバイオフィルム所在から放出されたＮＴＨＩの定量化を示す。１６時間確立されたＮＴＨＩバイオフィルムを、追加で、（図１Ａ）６時間、ウサギ抗ｒｓＰｉｌＡ ＩｇＧとともに、もしくは（図１Ｂ）１５分間、ウサギ抗ＩＨＦ ＩｇＧとともに、または３つの陰性対照（ｓＢＨＩ、ナイーブ血清から単離されたＩｇＧ、または抗ＯＭＰ Ｐ５血清から単離されたＩｇＧ）のそれぞれとともにインキュベートし、それに続いて、バイオフィルム上の上清から回収されたＮＴＨＩの定量化を行った。抗ｒｓＰｉｌＡおよび抗ＩＨＦは、バイオフィルム所在から新たに放出された（ＮＲｅｌ）状態へのＮＴＨＩの有意な放出を誘導した。個々のデータポイントを示し、バーは平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１、ホルム－シダック補正を伴う一元配置分散分析。
図２Ａ～図２Ｅは、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌが、個々の細胞としてバイオフィルムから放出された一方で、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌが凝集していたことを示す。図２Ａは、２つの対照試料についての側方散乱および前方散乱のプロファイルを示す輪郭プロットを提供し、ＮＴＨＩを、短時間超音波処理して、個々の細胞懸濁液を生成したか、またはＮＴＨＩコロニーを、寒天プレートから収集して、細菌凝集体とし、フローサイトメトリーによって評価した。（図２Ｂ）抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび（図２Ｃ）抗ＩＨＦ ＮＲｅｌの代表的な輪郭プロットは、２つのＮＲｅｌ集団間の固有の散乱プロファイルを実証した。（図２Ｄ）前方散乱および（図２Ｅ）側方散乱による抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ（右ヒストグラム）対抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ（左ヒストグラム）の分布も明確に異なった。（図２Ｄ）および（図２Ｅ）に示される抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌと比較した抗ＩＨＦ ＮＲｅｌの累積分布の増加パーセントを、コルモゴロフ－スミルノフ検定（９９％のＣＩ）によって決定した。これらのデータは、バイオフィルム所在からのＮＴＨＩの抗ｒｓＰｉｌＡ抗体または抗ＤＮＡＢＩＩ抗体媒介放出のいずれかへの曝露を介して生成されたＮＲｅｌ集団の追加の判別可能な特徴を表した。 同上。
図３Ａ～３Ｄは、プランクトン様に成長したＮＴＨＩと、重要なことには互いと比較して、明確に異なるプロテオミクス発現プロファイルで、抗ｒｓＰｉｌＡ抗体または抗ＩＨＦ抗体が生成したＮＲｅｌ集団とのインキュベーションによるバイオフィルムからのＮＴＨＩの放出を示す。図３Ａは、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ（中央の円中のドット）、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ（左の円中のドット）およびプランクトン様に成長したＮＴＨＩ（右の円中のドット）におけるそれぞれのタンパク質の正規化されたスペクトルカウントから生成した主成分分析（ＰＣＡ）プロットを提供する。それぞれの集団の三反復の試料を、９５％の信頼楕円によって取り囲む。抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび抗ＩＨＦ ＮＲｅｌのプロテオミクス発現プロファイルは、プランクトン様に成長したＮＴＨＩからおよび互いからの両方で明確に異なった。図３Ｂは、プランクトン様ＮＴＨＩと比較した抗ｒｓＰｉｌＡ（左部分）、抗ＩＨＦ（右部分）または共通（中央部）に特異的な有意な（Ｐ＜０．０５）１．５倍の増加（破線の上）または２／３の減少（破線の下）を有するタンパク質の数のベン図を提供する。図３Ｃは、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ（それぞれの群の上側のバー）および抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ（それぞれの群の下側のバー）が、プランクトン様に成長したＮＴＨＩと比較した場合に、異なるＣＯＧカテゴリーによって表される有意な（Ｐ＜０．０５）１．５倍の増加または２／３の減少を有する明確に異なるタンパク質発現パターンを実証したことを示す。図３Ｄは、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ対抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌのボルケーノプロットによって示される、互いと比較して有意な（Ｐ＜０．０５）１．５倍の増加または２／３の減少を有する抗ＩＨＦ ＮＲｅｌおよび抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌの集団のタンパク質発現プロファイルの相違の直接比較を提供する。負の有意な倍数減少は、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ（左上部におけるドット）においてより高い存在量のタンパク質を表す一方、正の倍数増加は、互いと比較して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ（右上部におけるドット）においてより高いタンパク質存在量を表す。
図４Ａ～４Ｃは、抗生物質感受性を含む観察された明確に異なる抗ＩＨＦ ＮＲｅｌおよび抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌの表現型を支持する相対遺伝子発現の相違を示す。プランクトン様ＮＴＨＩと比べたＮＲｅｌによる遺伝子の発現を調べるためのｑＲＴ－ＰＣＲアッセイの結果。図４Ａは、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ対抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌにおいて有意に大きかった、成長の誘導期に関連する遺伝子であるｄｅａＤ、ａｒｔＭ、およびｆｉｓの相対発現を提供する。図４Ｂは、ＴＭＰおよびＳＭＸによって標的にされる酵素が、それぞれ、ｆｏｌＡおよびｆｏｌＰによってコードされ、それによって、増加した発現が、耐性を付与することを示す。抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌによるｆｏｌＡおよびｆｏｌＰの相対発現は、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌによるよりも有意に少なかった。図４Ｃは、ＴＭＰ－ＳＭＸを輸送する排出ポンプのサブユニットをコードするｅｍｒＡおよびｅｍｒＢの相対発現が、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ対抗ＩＨＦ ＮＲｅｌによって有意に少なかったことを示す。ＡＭＣを輸送する排出ポンプを表すａｃｒＲの発現は、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ対抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌにおいて有意に上昇した。相対遺伝子発現のこれらのパターンは、それぞれ、ＴＭＰ－ＳＭＸまたはＡＭＣに対する抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌまたは抗ＩＨＦ ＮＲｅｌの増強された感受性を支持する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、スチューデントのｔ検定。
図５Ａ～５Ｅは、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩ集団が、それらのプランクトン様対応物よりも死滅に対して感受性がより高く、この感受性が、互いに明確に異なったことを示す。図５Ａは、本明細書で試験されたＮＴＨＩの４つの集団の図を提供する。ＮＲｅｌは、ＮＴＨＩバイオフィルムの抗ｒｓＰｉｌＡ血清（６時間、左下）からまたは抗ＩＨＦ血清（１５分、右下）から単離されたウサギポリクローナルＩｇＧとのインキュベーションによって生成された。図５Ｂおよび図５Ｃは、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌが、プランクトン様ＮＴＨＩよりもトリメトプリム／スルファメトキサゾールによる死滅に対して有意に感受性がより高かったが（それぞれ、１ｍｌあたり０．９４μｇおよび４．７μｇのＴＭＰ－ＳＭＸ、図５Ｂ）、アモキシシリン／クラブラン酸塩による死滅に対して感受性は同等でしかなかった（それぞれ、１ｍｌあたり２．５μｇおよび１．２５μｇのＡＭＣ、図５Ｃ）ことを示す。バイオフィルム内在ＮＴＨＩは、予想通り、ＴＭＰ－ＳＭＸまたはＡＭＣのいずれかに対して、最小の感受性を提示した。対照的に、図５Ｄおよび５Ｅに示されるように、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌは、プランクトン様ＮＴＨＩと、ＴＭＰ－ＳＭＸによる死滅に対して感受性は同等でしかなかったが（それぞれ、０．０９および０．４５μｇ／ｍｌ、図５Ｄ）、ＡＭＣによる死滅に対して有意に感受性がより高かった（それぞれ、０．３０および０．１５μｇ／ｍｌ、図５Ｅ）。ＴＭＰ－ＳＭＸまたはＡＭＣのいずれかによる死滅に対するＮＴＨＩ ＮＲｅｌの固有に高められた感受性は、それらがバイオフィルム所在から放出された機構に依存した。個々のデータポイントを示し、バーは平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ホルム－シダック補正を伴う一元配置分散分析。
図６Ａ～６Ｄは、それぞれ、ＴＭＰ－ＳＭＸまたはＡＭＣに対する抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ ＮＴＨＩまたは抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ ＮＴＨＩの増強された感受性が、バイオフィルム所在からのＮＴＨＩ放出のタイミングと無関係であったことを提供する。出願人は、バイオフィルムを、抗ｒｓＰｉｌＡ血清または抗ＩＨＦ血清のいずれかから単離されたウサギポリクローナルＩｇＧに２時間曝露し、次いで、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩを収集し、相対抗生物質感受性についてアッセイした。（図６Ａおよび図６Ｂ）は、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌが、プランクトン様ＮＴＨＩよりもＴＭＰ／ＳＭＸによる死滅に対して有意に感受性がより高かったが（それぞれ、１ｍｌあたり０．０９μｇおよび０．４５μｇのＴＭＰ－ＳＭＸ）（図６Ａ）、ＡＭＣによる死滅に対して感受性は同等でしかなかった（それぞれ、１ｍｌあたり０．３μｇおよび０．１５μｇのＡＭＣ、図）ことを示す。対照的に、（図６Ｃおよび図６Ｄ）に示されるように、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌは、プランクトン様ＮＴＨＩと、ＴＭＰ－ＳＭＸによる死滅に対して感受性は同等でしかなかったが（それぞれ、０．９４および４．７μｇ／ｍｌ、図６Ｃ）、ＡＭＣによる死滅に対して有意に感受性がより高かった（それぞれ、２．５および１．２５μｇ／ｍｌ、図６Ｄ）。これらのデータは、１５分の抗ＩＨＦ ＮＲｅｌを６時間の抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌと比較した場合に示されるように、時間が一致した抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌまたは抗ＩＨＦ ＮＲｅｌが、同じ明確に異なる抗生物質感受性の表現型を維持したことを示した（図５を参照されたい）。個々のデータポイントを示し、バーは平均±ＳＥＭを表す。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１、ホルム－シダック補正を伴う一元配置分散分析。
図７は、抗ｒｓＰｉｌＡ抗体および抗ＩＨＦ（例えば、抗ＤＮＡＢＩＩ）抗体の相乗効果を示す。ウェルを、１：１：１の比のＮＴＨＩ＋Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ＋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓを用いてインキュベートし、３７℃および５％のＣＯ２で１６時間バイオフィルムを形成させた後、２時間処置して、培地単独による処置と比較した相対破壊を決定した（図にマークされた処置を参照されたい）。細菌をＦＭ１－４３ ＦＸで標識し、相対蛍光をウェルごとに算出した。明確な相乗的な転帰は、抗ｒｓＰｉｌＡと抗チップキメラモノクローナル抗体による組合せ処置を介して達成され、ここで、最初に実証された。
図８Ａ～８Ｃは、抗ＩＨＦＮＴＨＩによってバイオフィルムから新たに放出されたＮＴＨＩの抗生物質感受性を示す。バイオフィルムを、３７℃で１６時間成長させ、次いで、抗ＩＨＦＮＴＨＩ（１：５０希釈）またはｓＢＨＩのみで６時間処置した。プランクトン様集団を収集し、抗生物質感受性についてアッセイした。使用したＡＣ濃度は１／０．５μｇ／ｍｌであり、使用したＴＳ濃度は７．５／３７．５μｇ／ｍｌである。（図８Ａ）は、１／１０で希釈された抗ＩＨＦまたは抗ＩＨＦ処置なしからのデータをプロットする。（図８Ｂ）は、１／１００で希釈された抗ＩＨＦまたは抗ＩＨＦ処置なしからのデータをプロットする。（図８Ｃ）は、死滅のパーセンテージを提供する。Ｎ＝３。 同上。
図９Ａ～９Ｃは、複数種のバイオフィルムに対する相乗的活性を示す。（図９Ａ）は、ＮＴＨＩ＋Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａを示す。ＮＴＨＩ単独のバイオフィルムは、明確に示されるカクテルの相乗性で予想されるように、機能し続けた。２種のバイオフィルムについて、両方の抗血清のみが有効であったが、カクテルは、２種のバイオフィルムからの両方の種の統計学的に有意な相乗的放出を誘導した。（図９Ｂ）は、ＮＴＨＩ＋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓバイオフィルムに対する活性を示す。（図９Ｃ）は、ＮＴＨＩ＋Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａを示す。 同上。 同上。
図１０Ａ～１０Ｅは、二重種のバイオフィルムからのＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（Ｍｃａｔ）による放出に対する抗ｒｓＰｉｌＡ＋抗チップキメラの相乗活性を示す。（図１０Ａ）非処置バイオフィルムからの無関係の細菌と比較した、２．５μｇの抗ｒｓＰｉｌＡ抗体、抗Ｔｉｐ抗体、または両方の抗体の組合せのいずれかへの曝露２時間後のＮＴＨＩ＋Ｍｃａｔによって形成された２種のバイオフィルムまたはＮＴＨＩバイオフィルムのいずれかから放出されたＮＲｅｌ。（図１０Ｂ）非処置バイオフィルムからの無関係の細菌と比較した、２．５μｇの抗ｒｓＰｉｌＡ抗体、抗Ｔｉｐ抗体、または両方の抗体の組合せのいずれかへの曝露６時間後のＮＴＨＩ＋Ｍｃａｔによって形成された２種のバイオフィルムまたはＮＴＨＩバイオフィルムのいずれかから放出されたＮＲｅｌ。（図１０Ｃ）非処置バイオフィルムからの無関係の細菌と比較した、２．５μｇの抗ｒｓＰｉｌＡ抗体、抗Ｔｉｐ抗体、または両方の抗体の組合せのいずれかへの曝露１６時間後のＮＴＨＩ＋Ｍｃａｔによって形成された２種のバイオフィルムまたはＮＴＨＩバイオフィルムのいずれかから放出されたＮＲｅｌ。（図１０Ｄ）非処置バイオフィルムからの無関係の細菌と比較した、１０μｇの抗ｒｓＰｉｌＡ抗体、抗Ｔｉｐ抗体、または両方の抗体の組合せのいずれかへの曝露６時間後のＮＴＨＩ＋Ｍｃａｔによって形成された２種のバイオフィルムまたはＮＴＨＩバイオフィルムのいずれかから放出されたＮＲｅｌ。（図１０Ｅ）非処置バイオフィルムからの無関係の細菌と比較した、１０μｇの抗ｒｓＰｉｌＡ抗体、抗Ｔｉｐ抗体、または両方の抗体の組合せのいずれかへの曝露１６時間後のＮＴＨＩ＋Ｍｃａｔによって形成された２種のバイオフィルムまたはＮＴＨＩバイオフィルムのいずれかから放出されたＮＲｅｌ。 同上。 同上。
詳細な説明
定義
本明細書で引用されるすべての技術的刊行物および特許公開は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示が、以前の開示によって、そのような開示に先行する権利がないという自白として、本明細書で解釈されない。本開示全体を通して、さまざまな技術的刊行物が、それらの第一著者および発行年または他の特定する引用によって参照される。第一著者および発行年によって特定される刊行物についての完全な引用は、特許請求の範囲に直前に見ることができる。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似のまたは等価な任意の方法および材料を、本開示の実行または試験において使用することができるが、ここでは、好ましい方法、デバイス、および材料を記載する。
本開示の実行は、他に指示されない限り、当技術分野の技能内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡについての従来の技法を利用する。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition；Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；米国特許第４，６８３，１９５号；Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002))；Sohail (ed.) (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)を参照されたい。
範囲を含むすべての数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は近似値であり、これは、適切な場合、０．１または１．０の増分によって（＋）または（－）に変動する。常に明確に述べられているとは限らないが、すべての数字表示に「約」という用語が先行することが理解されるべきである。常に明確に述べられているとは限らないが、本明細書に記載される試薬が単なる例示的なものであり、その等価物が当技術分野において公知であることも理解されるべきである。
「約」という用語は、量または濃度などのような測定値に言及するときに本明細書で使用される場合、規定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他を明らかに指示しない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、複数の抗体を、それらの混合物を含めて、含む。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味することを意図する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、述べられた目的のための組合せに対して任意の本質的に重要な他の要素を排除することを意味するものとする。そのため、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法由来の微量の夾雑物および薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、保存剤などを排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分の微量の要素および本開示の組成物を投与するための実質的な方法のステップまたは組成物を生成するためもしくは意図される結果を達成するためのプロセスのステップよりも多くのステップを排除することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、後に記載する状況が生じてもよく、または生じなくてもよいことを意味し、その結果、この記載には、この状況が生じる事例およびこれが生じない事例を含む。
本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連するリストされた項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組合せ、ならびに選択的に（「ｏｒ」）解釈される場合には、組合せの欠如を指し、それを包含する。
「実質的に」または「本質的に」は、一部の所与の量の、ほぼ全体的にまたは完全に、例えば、９５％またはそれよりも多くを意味する。一部の実施形態では、「実質的に」または「本質的に」は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．９％を意味する。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される比較用語、例えば、高い、低い、増加する、減少する、低減する、またはそれらの任意の文法的変形形態は、参照からのある特定の変動を指し得る。一部の実施形態では、そのような変動は、参照よりも約１０％、もしくは約２０％、もしくは約３０％、もしくは約４０％、もしくは約５０％、もしくは約６０％、もしくは約７０％、もしくは約８０％、もしくは約９０％、もしくは約１倍、もしくは約２倍、もしくは約３倍、もしくは約４倍、もしくは約５倍、もしくは約６倍、もしくは約７倍、もしくは約８倍、もしくは約９倍、もしくは約１０倍、もしくは約２０倍、もしくは約３０倍、もしくは約４０倍、もしくは約５０倍、もしくは約６０倍、もしくは約７０倍、もしくは約８０倍、もしくは約９０倍、もしくは約１００倍、またはそれよりも高い増加を指し得る。一部の実施形態では、そのような変動は、参照の約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約６％、または約７％、または約８％、または約０％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％などの減少を指し得る。
本明細書で使用される場合、「多微生物性バイオフィルム」という用語は、２種以上のバイオフィルムを引き起こす細菌によって引き起こされるバイオフィルムを意図する。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、および別の細菌、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。
一部の実施形態では、「破壊する」という用語またはその文法的変形形態は、微生物性バイオフィルムの構成要素であるＤＮＡ／タンパク質マトリックスの妨害、例えば、細菌などの微生物の外側のバイオフィルムの構造上の根幹中の抗原を標的にし、このようにしてバイオフィルムを壊し、バイオフィルムの低減および／または排除をもたらすことを意図する。一部の実施形態では、そのような破壊プロセスは、細菌などの微生物によって提供されない。本明細書に示される一部の実施形態では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、バイオフィルムを破壊する。さらなる実施形態では、そのような破壊は、微生物種特異的ではない。
ある特定の実施形態では、バイオフィルムを破壊することは、バイオフィルムを分散させること、バイオフィルムのＤＮＡ／タンパク質マトリックスから微生物を放出させること、ならびに必要に応じて、宿主の免疫エフェクターおよび／または抗生物質によって微生物の死滅を可能にすることを指す。
「分散させる」という用語または文法的変形形態は、バイオフィルム中の微生物の表面上または内側の分子の妨害、例えば、微生物の表面上の抗原を標的にし、このようにしてバイオフィルムを壊し、バイオフィルムの低減および／または排除をもたらすことを指す。本明細書に示される一部の実施形態では、抗ＰｉｌＡ抗体は、バイオフィルムを分散させる。さらなる実施形態では、バイオフィルムは、分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを含み、および／またはそれによって生成される。
バイオフィルムを「阻害すること、防止すること、または破壊すること」は、バイオフィルムの構造における予防的なまたは治療的な低減を意図する。
「微生物ＤＮＡ」は、バイオフィルムに組み込まれた細菌などの微生物由来の一本鎖または二本鎖ＤＮＡを意図する。本明細書で使用される場合、「ｅＤＮＡ」という用語は、病原性バイオフィルムに対する構成要素として見出される細胞外ＤＮＡを指す。
「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を行い得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識化構成要素とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに改変され得る。この用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。他に規定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが公知または予測される２つの相補的一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を行い得る。
ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡである場合に、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）の特定の配列から構成される。そのため、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現は、中央演算処理装置を有するコンピューターのデータベースに入力され、バイオインフォマティクス適用、例えば、機能的ゲノミクスおよび相同性検索のために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリッドである。
「単離された」という用語は、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡに関して本明細書で使用される場合、高分子の天然起源中に存在する、それぞれ、他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。「単離された核酸」という用語は、断片として天然に存在せず、天然状態で見出されない核酸断片を含むことを意味する。「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチド、タンパク質および／または宿主細胞を指すために本明細書で使用され、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。他の実施形態では、「単離された」という用語は、細胞の構成物質、およびそうでなければ、通常天然で会合している細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、似ていない表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離された細胞である。当業者に明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、その天然に存在する対応物からそれを区別するための「単離」を必要としない。
一部の実施形態では、「操作された」または「組換え」という用語は、言及される種の天然に存在するタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、株、野生型株または親宿主株において通常見出されない少なくとも１つの改変を有することを指す。一部の実施形態では、「操作された」または「組換え」という用語は、ヒトの介入によって合成されていることを指す。
本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、その等価物または生物学的等価物が、本開示の範囲内と意図されることは、明白な記述なしで、かつ他に意図されない限り、推測されるべきである。本明細書で使用される場合、「その生物学的等価物」という用語は、参照タンパク質、抗体、断片、ポリペプチドまたは核酸を指す場合、「その等価物」と同義であることが意図され、最小限の相同性を有するが、所望の構造または機能性を依然として維持しているものを意図する。本明細書で具体的に列挙されない限り、本明細書で言及される任意のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、その等価物も含むことが企図される。一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対する等価物は、参照によってコードされる同じ配列をコードする。一部の実施形態では、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対する等価物は、必要に応じて高ストリンジェンシーの条件下で、参照、相補体参照、逆参照、および／または逆相補体参照とハイブリダイズする。
加えてまたは代替的に、等価な核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％の配列同一性、または代替的に、少なくとも８５％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９０％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９２％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９５％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９７％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９８％の配列同一性を有するものであるか、あるいは代替的に、等価な核酸は、高ストリンジェンシーの条件下で、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズする。一態様では、等価物は、本明細書に記載される１つまたは複数のアッセイにより必要に応じて特定され得る機能的タンパク質をコードしなければならない。別の態様では、等価物は、参照核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％、もしくは少なくとも８０％の配列同一性、または代替的に、少なくとも８５％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９０％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９２％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９５％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９７％の配列同一性、または代替的に、少なくとも９８％の配列同一性を有するか、あるいは代替的に、等価な核酸は、高ストリンジェンシーの条件下で、参照ポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズし、但し、１つまたは複数の天然に存在しないグリコシル化部位を有する本明細書で特定された１つまたは複数の突然変異したポリヌクレオチドが、開示される配列中の対応する突然変異したポリヌクレオチドから突然変異していない。
一態様では、等価なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、記載される方法における使用のための本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの相補物とハイブリダイズするものである。別の態様では、等価な抗体または抗原結合性ポリペプチドは、参照抗体または抗原結合性断片と比較して、少なくとも７０％、もしくは代替的に、少なくとも７５％、もしくは代替的に、少なくとも８０％、もしくは代替的に、少なくとも８５％、もしくは代替的に、少なくとも９０％、もしくは代替的に、少なくとも９５％の親和性、またはそれよりも高い親和性で抗原に結合するものを意図する。別の態様では、その等価物は、競合ＥＬＩＳＡアッセイ下で、参照抗体または抗原結合性断片のその抗原への結合と競合する。別の態様では、等価物は、少なくとも約８０％の相同性または同一性、および代替的に、少なくとも約８５％、または代替的に、少なくとも約９０％、または代替的に、少なくとも約９５％、または代替的に、９８％の相同性パーセントまたは同一性パーセントを意図し、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸に対して実質的に等価な生物活性を示す。生物学的に等価なポリペプチドの例は、開示されるアミノ酸配列に対する保存的アミノ酸置換を特定するＷＯ２０１１／１２３３９６号の表９に提供されている。
別の配列に対してある特定のパーセンテージ（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、整列された場合に、塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが、２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアライメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性は、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものを使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメーターが、アライメントのために使用される。あるアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用する、ＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメーターを使用する、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載＝５０配列；ソート＝高スコア；データベース＝重複しないＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見ることができる。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較の目的のために整列され得るそれぞれの配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占有される場合、分子はその位置で相同である。配列間の相同性の度合いは、配列によって共有される一致する位置または相同位置の数の関数である。「非関連」または「非相同」配列は、本開示の配列のうちの１つと、４０％未満の同一性、または代替的に、２５％未満の同一性を共有する。
「相同性」または「同一性」または「類似性」はまた、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸分子を指し得る。「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化されている複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複数鎖の複合体を形成する３つもしくはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスのステップ、例えば、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成していてもよい。
「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化されている複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン－クリック塩基対形成、フーグスティーン結合によって、または任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複数鎖の複合体を形成する３つもしくはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範なプロセスのステップ、例えば、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成していてもよい。ハイブリダイゼーションが、２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行配置で起こる場合、反応は、「アニーリング」と呼ばれ、これらのポリヌクレオチドは、「相補的」と記載される。ハイブリダイゼーションが、第１のポリヌクレオチドの鎖の１つと第２のポリヌクレオチドの鎖の１つとの間で起こり得る場合、二本鎖ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに対して「相補的」または「相同」であり得る。「相補性」または「相同性」（１つのポリヌクレオチドが別のものと相補的である度合い）は、一般に許容される塩基対形成のルールに従って、互いと水素結合を形成すると予想される逆の鎖中の塩基の割合に関して定量化可能である。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。一般に、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、１０×ＳＳＣ中約４０℃で、または等価なイオン強度／温度の溶液で行われる。中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、典型的には、６×ＳＳＣ中約５０℃で行われ、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応は、一般に、１×ＳＳＣ中約６０℃で行われる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の他の例としては、約２５℃～約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ～約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液濃度；約０％～約２５％のホルムアミド濃度；および約４×ＳＳＣ～約８×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中ハイブリダイゼーション条件の例としては、約４０℃～約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの緩衝液濃度；約３０％～約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ～約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は、５分間～２４時間であり、１、２回またはそれよりも多くの洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は、約１、２または１５分間である。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用するＳＳＣの等価物を用いることができることが理解される。ハイブリダイゼーション反応はまた、当業者に周知である「生理学的条件」下で行うことができる。生理学的条件の非限定的な例は、細胞中で通常見出される、温度、イオン強度、ｐＨおよびＭｇ２＋の濃度である。
「ポリヌクレオチドの増幅」という表現は、ＰＣＲ、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）および増幅方法などの方法を含む。これらの方法は、当技術分野において、公知であり、広く実行されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにInnis et al., 1990（ＰＣＲのため）、およびWu et al. (1989) Genomics 4:560-569（ＬＣＲのため）を参照されたい。一般に、ＰＣＲ手順は、（ｉ）ＤＮＡ試料（またはライブラリー）内の特異的遺伝子へのプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを使用する、アニーリング、伸長および変性の複数ラウンドを含むその後の増幅、ならびに（ｉｉｉ）正しいサイズのバンドについてのＰＣＲ産物のスクリーニングから構成される遺伝子増幅の方法を記載する。使用されるプライマーは、十分な長さのオリゴヌクレオチドおよび重合の開始を提供するのに適切な配列であり、すなわち、それぞれのプライマーは、増幅されるゲノム遺伝子座のそれぞれの鎖に相補的であるように特異的に設計される。
ＰＣＲを実行するための試薬およびハードウェアは、市販されている。特定の遺伝子領域から配列を増幅するために有用なプライマーは、好ましくは、標的領域またはその隣接領域中の配列に相補的であり、それと特異的にハイブリダイズする。増幅によって生成された核酸配列は、直接配列決定されてもよい。あるいは、増幅された配列は、配列分析の前にクローニングされてもよい。酵素的に増幅されたゲノム分節の直接クローニングおよび配列分析のための方法は、当技術分野において公知である。
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。
「発現」という用語は、遺伝子産物の産生を指す。本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含んでいてもよい。
「コードする」という用語は、それがポリヌクレオチドに適用される場合、その天然状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、それが転写および／または翻訳されて、ポリペプチドおよび／またはその断片のためのｍＲＮＡを産生することができる場合、ポリペプチドを「コードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのような核酸の相補体であり、コード配列は、それらから推定することができる。
「遺伝子産物」または代替的に「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写および翻訳された場合に作成されるｍＲＮＡおよび／またはアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。
「転写制御下」は、当技術分野において十分に理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、それが転写の開始に寄与するかまたは転写を促進するエレメントに作動可能に連結されていることに依存することを示す。「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチドが、細胞中でそれらが機能することが可能な様式で配置されていることを意図する。
「調節配列」、「発現制御エレメント」または「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、転写および／または複製される標的ポリヌクレオチドに作動可能に連結されており、標的ポリヌクレオチドの発現および／または複製を容易にするポリヌクレオチドを意図する。プロモーターは、発現制御エレメントまたは調節配列の例である。プロモーターは、５’、または調節された遺伝子の転写のための制御ポイントを提供する遺伝子または他のポリヌクレオチドの上流に位置し得る。ポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩは、プロモーターの例である。
エンハンサーは、標的配列の発現を増加させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列は、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能を含有する。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種性」であり得る。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム中の所与の遺伝子と天然で連結されているものである。「外因性」または「異種性」エンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技法）の手段によって遺伝子に並置されているものである。
「プローブ」は、ポリヌクレオチド操作の文脈で使用される場合、標的とハイブリダイズすることによって、目的の試料中に潜在的に存在する標的を検出する試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを指す。通常、プローブは、検出可能な標識もしくはマーカー、または標識もしくはマーカーが、ハイブリダイゼーション反応の前または後のいずれかに付着することができる手段を含む。あるいは、「プローブ」は、目的の試料中に潜在的に存在する標的に結合することができるポリペプチド、抗体またはその断片などの生体化合物であり得る。
「プライマー」は、短いポリヌクレオチド、一般に、標的とハイブリダイズすることによって、目的の試料中に潜在的に存在する標的または「鋳型」に結合し、その後、標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する、遊離３’－ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドである。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、複製コピーが、「上流」および「下流」プライマーからなる「プライマーの対」または「プライマーのセット」、ならびに重合の触媒、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、および典型的には、熱的に安定なポリメラーゼ酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドを作る反応である。ＰＣＲのための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)に教示されている。ポリヌクレオチドの複製コピーを生成するすべてのプロセス、例えば、ＰＣＲまたは遺伝子クローニングは、本明細書でまとめて「複製」と称される。プライマーは、ハイブリダイゼーション反応、例えば、サザンブロット分析またはノーザンブロット分析におけるプローブとして使用することもできる。Sambrook and Russell (2001)、以下。
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、それらの最も広範な意味では、２つまたはそれよりも多くのサブユニットのアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣薬の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていてもよい。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結されていてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に対する制限はない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸、または合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシンならびにＤおよびＬ光学異性体の両方、アミノ酸アナログ、ならびにペプチド模倣薬を含む。
「Ｃ末端ポリペプチド」は、少なくとも１０個、もしくは代替的に、少なくとも１５個、もしくは代替的に、少なくとも２０個、もしくは少なくとも２５個のＣ末端アミノ酸、または代替的にポリペプチドの半分を意図する。別の態様では、９０アミノ酸を含有するポリペプチドについて、Ｃ末端ポリペプチドは、アミノ酸４６から９０を含む。一態様では、この用語は、カルボキシル末端からＣ末端の２０アミノ酸を意図する。
本明細書で使用される場合、参照配列において特定された位置に「対応する」目的の配列におけるアミノ酸（ａａ）またはヌクレオチド（ｎｔ）残基の位置は、目的の配列と参照配列との間の配列アライメントにおける特定された位置に整列された残基の位置を指す。Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａおよびＢＬＡＳＴなどのさまざまなプログラムが、そのような配列アライメントを行うために利用可能である。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に対してわずかな影響があるか、または影響がないような、天然アミノ酸残基の、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸を含む標準残基による置換を指す。例えば、保存的置換は、ポリペプチド中の非極性残基の任意の他の非極性残基による置き換えから生じる。さらに、ポリペプチド中の任意の天然残基はまた、「アラニンスキャニング突然変異誘発」の方法に従って、アラニンで置換されてもよい。天然に存在するアミノ酸は、以下の通り、それらの側鎖に基づいて特徴付けられる：塩基性：アルギニン、リシン、ヒスチジン；酸性：グルタミン酸、アスパラギン酸；非荷電極性：グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン；および非極性：フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、プロリン、メチオニン、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン。アミノ酸置換についての一般的なルールを、下記に示す。
等価物および生物学的等価物という用語は、例えば、参照としての抗体、抗体断片、タンパク質またはポリペプチドに言及する場合、互換的に使用される。一部の実施形態では、等価な抗体、抗体断片、タンパク質またはポリペプチドは、参照タンパク質またはポリペプチドに対して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するものである。一部の実施形態では、等価な抗体、抗体断片、タンパク質またはポリペプチドは、本明細書に開示されるポリペプチドまたはタンパク質に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、等価な抗体、抗体断片、タンパク質またはポリペプチドは、本明細書で述べられる等価なポリヌクレオチドによってコードされる抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはタンパク質に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。加えて、または代替的に、ポリヌクレオチドの等価物は、参照または親ポリヌクレオチドと同じまたは類似の機能の抗体、抗体断片、タンパク質またはポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、等価物は、本明細書に記載される１つまたは複数のアッセイにより必要に応じて特定され得る機能的タンパク質である。別の態様では、等価物は、参照タンパク質またはポリペプチドに対して、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、等価なまたは生物学的に等価な抗体、抗体断片、タンパク質またはポリペプチドは、野生型と類似の機能を行うか、および／または野生型と比較して類似のレベルで機能を行う。
本明細書で使用される場合、「ＥＣ５０」という用語は、規定された曝露時間後に、ベースラインと最大との間の中間の応答（例えば、抗体またはその断片とその標的との間の結合）を誘導する抗体またはその断片の濃度を指す。
いくつかのパラメーターが、受容体（Ｒ、例えば、抗体またはその断片）とリガンド（Ｌ、例えば、抗体またはその断片の標的）分子の結合および非結合反応を記載するために本明細書で使用され、これは、Ｒ＋Ｌ⇔ＲＬとして式化される。この反応は、それぞれ、Ｍ－１秒－１および秒－１の単位を有するオンレート定数ｋｏｎおよびオフレート定数ｋｏｆｆによって特徴付けられる。平衡では、順方向の結合推移Ｒ＋Ｌ→ＲＬは、逆方向の非結合推移ＲＬ→Ｒ＋Ｌとバランスを取らなければならない。すなわち、ｋｏｎ［Ｒ］［Ｌ］＝ｋｏｆｆ［ＲＬ］であり、ここで、［Ｒ］、［Ｌ］および［ＲＬ］は、非結合遊離受容体の濃度、非結合遊離リガンドの濃度、および受容体－リガンド複合体の濃度を表す。さらに、平衡解離定数「ＫＤ」は、［Ｒ］×［Ｌ］／［ＲＬ］であるｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出することができる一方、平衡結合定数「ＫＡ」は、［ＲＬ］／（［Ｒ］×［Ｌ］）であるｋｏｎ／ｋｏｆｆとして算出することができる。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「チップ」または「コンフォメーションチップドメイン」という用語は、構造が、プロリン残基によって典型的には媒介される急な回転を有する逆平行ベータリボンを有する一次アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
ポリペプチドの「チップキメラ」は、１つまたは複数のポリペプチドのうちの２つのチップを含むポリペプチドを意図する。チップキメラは、同じポリペプチドの２つのチップ、または２つの異なるポリペプチド由来のチップを含んでいてもよい。ＤＮＡＢＩＩポリペプチドのチップキメラは、例としてＩＨＦアルファおよびＩＨＦベータを使用して、２つのアームのタンパク質を形成するＤＮＡＢＩＩポリペプチドを意図する（参照により組み込まれる米国特許第１１，１０４，７２３号の図１を参照されたい）。その非限定的な例としては、本明細書でＡチップ断片：ＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶ、配列番号 とも称されるＩｈｆＡのチップ断片、および本明細書でｍＢ４チップ断片とも称されるＩｈｆＢ改変Ｂ４：ＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶＮＬ（配列番号 ）もしくはＦＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶ、配列番号 、または２ ＩｈｆＡチップ断片、または２ ＩｈｆＢ改変Ｂ４チップ断片が挙げられる。追加の例は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１２９０７８号に開示されている。ある特定の実施形態では、チップキメラペプチドは、
（ここで、「Ｘ」は、必要に応じて１～２０アミノ酸を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる必要に応じたアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は、任意のアミノ酸であるか、または代替的に、「Ｘ１」は、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴから選択される）のポリペプチド配列を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる、本明細書でＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩと指定されるペプチドを含む。さらなる態様では、「Ｘ１」は、ＫまたはＱである。さらなる実施形態では、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩは、
（ここで、「Ｘ」は、必要に応じて１～２０アミノ酸を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる必要に応じたアミノ酸リンカー配列である）のポリペプチド配列を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。またさらなる実施形態では、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩは、
のポリペプチド配列を含むか、またはそれから本質的になるかまたはまたさらにそれからなり、一部の実施形態では、これは、本明細書でチップキメラとも称され、ここで、ＧＰＳＬは、アミノ酸リンカー配列としての機能を果たす。
ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの「テール断片」は、バルク培地に曝露され、ＤＮＡまたは他のポリペプチドによって妨げられない両方のタンパク質の領域を意図する。
免疫優性抗原は、抗体を認識し、高親和性で抗体に結合するタンパク質の領域を意図する。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、全抗体、およびその任意の抗原結合性断片または一本鎖、それらのバリアントまたは誘導体を含む。そのため、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有する任意のタンパク質またはペプチドを含む。そのような例としては、限定されるものではないが、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合性部分、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域、あるいはその任意の部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部分が挙げられ、これらのいずれかは、本開示の抗体に組み込まれ得る。「抗体」という用語は、消化断片、その規定される部分、誘導体およびバリアントを包含することをさらに意図し、抗体模倣物を含むか、あるいは一本鎖抗体およびその断片を含む抗体またはそれらの規定される断片もしくは部分の構造および／もしくは機能を模倣する抗体の部分を含む。抗体の「抗原結合性部分」という用語内に包含される結合性断片の例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；ＶＨおよびＣＨドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al. (1989) Nature 341:544-546）；ならびに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらにまた、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、単一のタンパク質鎖としてそれらが作成されるのを可能にする合成リンカーによって接続することができ、ここで、ＶＬおよびＶＨ領域は、対形成して、一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）を形成する。Bird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85: 5879-5883。一本鎖抗体は、「抗体の断片」または抗体の「生物学的に活性な断片」という用語内に包含されることも意図する。上記で述べた抗体断片のいずれかは、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片は、無傷抗体である場合と同じ様式で、結合特異性および中和活性についてスクリーニングされる。
「抗体」、「複数の抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの免疫グロブリン、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片、ｄＡｂ、ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、およびＶ－ＮＡＲドメインを含む、抗原への特異的結合を保持する抗体の断片；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびカッパボディ；抗体断片から形成される多特異性の抗体断片および１つまたは複数の単離されたものも含む。そのような例としては、限定されるものではないが、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合性部分、重鎖または軽鎖可変領域（本明細書で可変ドメインとも称される）、重鎖または軽鎖定常領域（本明細書で定常ドメインとも称される）、フレームワーク（ＦＲ）領域、またはそれらの任意の部分、結合タンパク質の少なくとも一部分、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体の抗原結合性部分および非抗体タンパク質を含む融合タンパク質が挙げられる。免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体（Ａｂ）の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織への結合を媒介し得る。
「抗」または「対する」という用語は、タンパク質の名称の前に使用される場合、例えば、抗ＤＮＡＢＩＩ、抗ＩＨＦ、抗ＨＵ、抗チップキメラ、抗ＰｉｌＡ、抗ＯＭＰ Ｐ５は、特定のタンパク質に結合し、および／またはそれに対する親和性を有するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそれらの生物学的に活性な断片を指す。例えば、「抗ＩＨＦ」は、ＩＨＦタンパク質に結合する抗体を指す。特異的抗体は、それに対して生じたタンパク質以外のタンパク質に対する親和性を有し得るか、またはそれに結合し得る。例えば、抗ＩＨＦは、ＩＨＦタンパク質に対して特異的に生じたが、配列相同性または構造相同性のいずれかにより関連する他のタンパク質にも結合し得る。
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、それぞれ、Ｂ細胞およびＴ細胞によって生成された抗体またはＴ細胞受容体の可変領域の部分であり、ここで、これらの分子は、それらの特異的抗原（エピトープとも呼ばれる）に結合する。ある特定の実施形態では、「可変領域」および「可変ドメイン」という用語は互換的に使用され、ある抗体から別のものまでアミノ酸残基のその配列が大きく変化し、そして、特定の抗原に対して抗体の特異性を付与する結合部位のコンフォメーションを決定する、抗体の軽鎖または重鎖のポリペプチドを指す。さらなる実施形態では、可変領域は、約９０アミノ酸長～約２００アミノ酸長、例えば、限定されるものではないが、約１００アミノ酸長、または代替的に、約１１０アミノ酸長、または代替的に、約１２０アミノ酸長、または代替的に、約１３０アミノ酸長、または代替的に、約１４０アミノ酸長、または代替的に、約１５０アミノ酸長、または代替的に、約１６０アミノ酸長、または代替的に、約１７０アミノ酸長、または代替的に、約１８０アミノ酸長、または代替的に、約１９０アミノ酸長である。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列の可変領域は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列の最初の約１００アミノ酸、または代替的に、約１１０アミノ酸、または代替的に、約１２０アミノ酸、または代替的に、約１３０アミノ酸、または代替的に、約１４０アミノ酸、または代替的に、約１５０アミノ酸（適用可能な場合、シグナルペプチドを含むか、またはそれを排除する）が可変領域であることを指す。
ＣＤＲのセットは、抗原を認識し、それに結合する抗体の一部分である、抗原結合性部位とも呼ばれるパラトープを構成する。重鎖または軽鎖などの抗原受容体の可変領域のアミノ酸配列上に、必要に応じてアミノ末端からカルボキシル末端に非連続的に配置された３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）が存在する。本明細書で使用される場合、ＣＤＲｎは、免疫グロブリン鎖におけるＣＤＲｎまたは免疫グロブリン鎖に由来するＣＤＲｎを指し、ここで、数字ｎは１～３から選択される。一実施形態では、ＣＤＲＬｎは、軽鎖におけるＣＤＲｎまたは軽鎖に由来するＣＤＲｎを指し、ここで、数字ｎは１～３から選択される一方、ＣＤＲＨｎは、重鎖におけるＣＤＲｎまたは重鎖に由来するＣＤＲｎを指し、ここで、数字ｎは１～３から選択される。ある特定の実施形態では、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲではない可変領域の部分を指す。ある特定の実施形態では、ＦＲｎは、重鎖もしくは軽鎖におけるＦＲまたは重鎖もしくは軽鎖に由来するＦＲを指し、ここで、数字ｎは１～４から選択される。ある特定の実施形態では、可変領域は、以下（必要に応じて、提供された順序に従い、さらに必要に応じて、アミノ末端からカルボキシル末端に）：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
抗体の可変領域および／もしくはＣＤＲ、またはそれらの断片は、例えば、公に利用可能なまたは市販のツールを使用して、当業者によって決定され得る。そのようなツールの非限定的な例としては、ＩｇＢｌａｓｔ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／でアクセス可能）、Ｓｃａｌｉｇｎｅｒ（ｗｗｗ．ｓｃａｌｉｇｎｅｒ．ｃｏｍ／のｄｒｕｇｄｅｓｉｇｎｔｅｃｈから利用可能）、ＩＭＧＴのルールおよび／もしくはツール（例えば、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／ＩＭＧＴ－ＦＲＣＤＲｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ．ｈｔｍｌを参照されたく、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／でもアクセス可能）、Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｃｈｏｔｈｉａ．ｈｔｍｌでアクセス可能）、Ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＮＡＲＣＩ、ｏｐｉｇ．ｓｔａｔｓ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｗｅｂａｐｐｓ／ｎｅｗｓａｂｄａｂ／ｓａｂｐｒｅｄ／ａｎａｒｃｉ／でアクセス可能）、Ｋａｂａｔの番号付け方法／スキーム（例えば、Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）またはＰａｒａｔｏｍｅウェブサーバー（ｗｗｗ．ｏｆｒａｎｌａｂ．ｏｒｇ／ｐａｒａｔｏｍｅ／でアクセス可能、Vered Kunik, et al, Nucleic Acids Research, Volume 40, Issue W1, 1 July 2012, Pages W521-W524を参照されたい）が挙げられる。
抗体は、それらが、所望の生物活性を示す限り、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性（例えば、二特異性抗体）および抗体断片であり得る。抗体は、任意の好適な生物学的起源、例えば、マウス、ラット、ヒツジおよびイヌから単離することができる。本明細書で使用される場合、そして具体的に述べられない限り、「抗体」という用語は、その生物学的に活性な断片、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、バリアント、誘導体化、キメラ、またはそれらの他の公知の改変を含む。
「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、異なるＢ細胞系に由来する抗体の調製物を指す。それらは、特定の抗原に対して分泌された免疫グロブリン分子の混合物であり、異なるエピトープをそれぞれ認識する。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、それぞれのモノクローナル抗体が抗原上の単一の決定基に対するものであるので、非常に特異的である。抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な産物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識されていてもよい。抗体は、他の部分、例えば、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などにさらにコンジュゲートされていてもよい。抗体はまた、限定されるものではないが、ポリスチレンのプレートまたはビーズなどを含む、固体支持体に結合されていてもよい。
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知のハイブリドーマ技法または組換えＤＮＡ法を使用して生成されてもよい。ハイブリドーマは、抗体産生リンパ球、および非抗体産生がん細胞、通常、骨髄腫またはリンパ腫の融合から研究室で産生される細胞である。ハイブリドーマは、増殖し、特異的モノクローナル抗体の連続試料を産生する。抗体を生成または選択するための代替技法としては、リンパ球の目的の抗原へのｉｎ ｖｉｔｒｏ曝露、および細胞、ファージまたは類似の系における抗体ディスプレイライブラリーのスクリーニングが挙げられる。
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本明細書で開示されるヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでランダムにまたは部位特異的突然変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏで体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含んでいてもよい。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上にグラフトされている抗体を含むことを意図しない。そのため、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的にあらゆる部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、ヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、少ない配列の変化または変形形態のみを伴う抗体を指す。同様に、霊長類（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、げっ歯動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなど）および他の哺乳動物が指定された抗体は、そのような種、亜属、属、亜科、科に特異的な抗体を指定する。さらに、キメラ抗体は、上記の任意の組合せを含む。そのような変化または変形形態は、必要に応じて、非改変抗体と比べて、ヒトまたは他の種において免疫原性を保持または低減する。そのため、ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体とは明確に異なる。ヒト抗体は、機能的に再配置されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核細胞もしくは真核細胞によって産生され得ることを指摘する。さらに、ヒト抗体が一本鎖抗体である場合、これは、天然ヒト抗体で見出されないリンカーペプチドを含むことができる。例えば、Ｆｖは、リンカーペプチド、例えば、２～約８個のグリシンまたは他のアミノ酸残基を含むことができ、これは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を接続する。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源のものであると見なされる。
本明細書で使用される場合、抗体が、ヒト免疫グロブリン配列を使用する系から、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫することによって、またはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって得られる場合、ヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列に「由来」する。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に「由来」するヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することによってそれ自体特定することができる。選択されたヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較した場合に、ヒト抗体をヒトであると特定するアミノ酸残基を含有する。ある特定の場合では、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列において少なくとも９５％、またはさらに、少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは１０個以下のアミノ酸の相違を提示する。ある特定の場合では、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５個以下、またはさらに、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の相違を提示し得る。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するヒト／非ヒトキメラ抗体を指す。大部分では、ヒト化抗体は、レシピエントの可変領域またはその断片（例えば、１、２、３、４、５、または６つすべてのＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種の可変領域またはその断片（例えば、１、２、３、４、５、または６つすべてのＣＤＲ）（ドナー抗体）由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてまたはドナー抗体において見出されない残基を含んでいてもよい。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリンのものの少なくとも一部分、フレームワーク領域、定常領域またはＣＤＲ中に、ヒト抗体由来の対応して位置するアミノ酸で置換された１つまたは複数のアミノ酸を含有する非ヒト抗体を含み得る。理論に拘束されることは望まないが、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化バージョンと比較して、ヒト宿主において低減された免疫応答を生じる。ヒト化抗体は、抗原結合または他の抗体機能に対して実質的に効果を有さない保存的アミノ酸置換を有していてもよい。保存的置換のグループ分けとしては、グリシン－アラニン、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リシン－アルギニン、アラニン－バリン、セリン－トレオニンおよびアスパラギン－グルタミンが挙げられる。具体的には、本明細書に開示されるヒト化抗体は、ある特定の範囲の以下の１つまたは複数：ＥＣ５０、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、ＫＡおよび／またはＫＤで、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはその断片（チップキメラペプチドまたはテールキメラペプチドなど）に特異的に結合し、対象を処置する際にある特定のサイトカインを阻害または放出する。さらなる実施形態では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドのチップ領域（チップキメラペプチドなど）に特異的に結合するヒト化抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でバイオフィルムを破壊する。加えて、ヒト化のプロセスは、合理的設計プロセスであるが、例えば、結合親和性、抗原特異性、または可溶性もしくは凝集性などの物理特性において予想外の変化（正または負）を生じることがあり、それ故に、ヒト化抗体の特性は、出発の非ヒト抗体の特性から生得的に予測可能ではない。
一実施形態では、抗体は、本明細書で使用される場合、組換え抗体であってもよい。「組換え抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、組換え手段によって調製、発現、作出または単離されるすべての抗体、例えば、免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックもしくはトランス染色体である動物（例えば、マウス）、またはそれらから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、および免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングに関与する他の任意の手段によって調製、発現、作出もしくは単離された抗体を含む。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換え抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、Ｉｇ配列に対してトランスジェニックの動物が使用される場合、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）に付すことができ、そのため、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。これらの抗体を作製する方法を、本明細書に記載する。
一実施形態では、抗体は、本明細書で使用される場合、キメラ抗体であってもよい。本明細書で使用される場合、キメラ抗体は、異なる種に属する抗体可変領域および定常領域の遺伝子から、典型的には遺伝子工学によって、軽鎖および重鎖遺伝子が構築されている抗体である。
抗体は、本明細書で使用される場合、「抗体誘導体」であってもよい。一部の実施形態では、抗体誘導体は、アミノ酸のうちの１つまたは複数が、例えば、抗体を第２の分子に連結するために、アルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成またはアミド形成などによって化学的に改変されている、全長抗体または抗体の断片を含む。これとしては、限定されるものではないが、ペグ化抗体、システイン－ペグ化抗体、およびそれらのバリアントが挙げられる。一部の実施形態では、「抗体誘導体」という用語は、上記に定義されるエピトープに結合し、本開示の天然モノクローナル抗体の改変または誘導体である分子を包含することを意図する。誘導体としては、限定されるものではないが、例えば、二特異性、多特異性、異種特異性、三特異性、四特異性、多特異性の抗体、ダイアボディ、キメラ、組換えおよびヒト化が挙げられる。
抗体は、本明細書で使用される場合、「抗体バリアント」であってもよく、これは、マウス以外の種において産生された抗体を含むことを意図する。これはまた、抗体または断片の線状ポリペプチド配列に対する翻訳後改変を含有する抗体も含む。これは、完全ヒト抗体をさらに包含する。
「抗原」および「抗原性」という用語は、抗体によって認識される能力、またはそうでなければ、抗体－リガンド対のメンバーとして作用する能力を有する分子を指す。「特異的結合」または「結合」とは、抗原の免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域との相互作用を指す。抗体－抗原結合は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで起こり得る。当業者は、タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖および多糖を含む巨大分子が、抗原として作用する可能性を有することを理解するであろう。当業者は、抗体リガンドとして作用する可能性を有するタンパク質をコードする核酸が、必然的に抗原をコードすることをさらに理解するであろう。当業者は、抗原が、全長分子に限定されないが、部分的分子も含み得ることをさらに理解するであろう。「抗原性」という用語は、抗原の特性を有する分子に対する形容詞的言及である。この用語は、免疫原性である物質、すなわち、免疫原、および免疫学的無反応またはアネルギーを誘導する物質、すなわち、アネルジェンを包含する。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、結合対（例えば、抗体および抗原、または受容体およびリガンド）間の相互作用を指す。さまざまな事例では、特異的結合は、約１０－６モル／リットル、約１０－７モル／リットル、もしくは約１０－８モル／リットル、またはそれ未満の親和性定数によって具体化され得る。
免疫優性抗原は、抗体を認識し、高親和性で抗体に結合するタンパク質の領域を意図する。一部の実施形態では、免疫保護抗原は、タンパク質の機能を妨げる抗体を認識し、高親和性でそれと結合するタンパク質の領域を意図し、免疫保護抗原に対して生成した抗体は、タンパク質の機能、一部の場合では、バイオフィルムを消去する改善された能力による妨害に対する結果として標的の指標に対する増強された効果または最適な効果によって特徴付けられる。
「変更された抗原」は、対応する野生型抗原のものとは異なる一次配列を有するものである。変更された抗原は、合成方法または組換え方法によって作製することができ、限定されるものではないが、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質切断、抗体分子、膜分子または他のリガンドへの連結によって、翻訳の間または翻訳後に異なって改変された抗原性ペプチドを含む。例えば、Ferguson et al. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:285-320を参照されたい。本明細書で開示される合成抗原または変更された抗原は、天然エピトープと同じＣＤＲセットおよび／またはＴＣＲに結合することが意図される。
「免疫応答」は、リンパ球の外来性物質への抗原特異的応答を広範に指す。「免疫原」および「免疫原性」という用語は、免疫応答を誘発する能力を有する分子を指す。すべての免疫原は抗原であるが、しかしながら、すべての抗原が免疫原性ではない。本明細書に開示される免疫応答は、体液性（抗体活性を介する）または細胞媒介性（Ｔ細胞活性化を介する）であり得る。応答は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで起こり得る。当業者は、タンパク質、核酸、脂肪酸、脂質、リポ多糖および多糖を含む各種の巨大分子が、免疫原性である可能性を有することを理解するであろう。当業者は、免疫応答を誘発することができる分子をコードする核酸が、必然的に免疫原をコードすることをさらに理解するであろう。当業者は、免疫原が、全長分子に限定されないが、部分的分子を含んでいてもよいことをさらに理解するであろう。
「受動免疫」という用語は、抗体の移入によるある対象から別の対象への免疫の移入を指す。受動免疫は、母体の抗体が胎児に移入される場合に、天然に起こり得る。受動免疫はまた、抗体組成物が非免疫対象に投与される場合、人工的に起こり得る。抗体のドナーおよびレシピエントは、ヒトまたは非ヒト対象であり得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで生成してもよく、実施形態に応じて、精製されてもよく、部分的に精製されてもよく、または未精製であってもよい。本明細書に記載される一部の実施形態では、受動免疫は、特定の抗原を特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片の投与により、それを必要とする対象に付与される。一部の実施形態では、受動免疫は、特定の抗原を特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドの投与により付与される。
「繁殖する」という用語は、細胞または細胞の集団が成長することを意味する。「成長する」という用語も、支持培地、栄養素、増殖因子、支持細胞、または所望の数の細胞もしくは細胞型を得るために必要な任意の化学化合物または生体化合物の存在下での細胞の増殖を指す。
「培養する」という用語は、さまざまな種類の培地上またはその中での細胞または生物のｉｎ ｖｉｔｒｏ繁殖を指す。培養において成長した細胞の子孫は、親細胞と完全に同一でなくてもよい（すなわち、形態学的に、遺伝子学的に、または表現型的に）ことが理解される。
「細胞」または「宿主細胞」は、特定の対象の細胞だけでなく、そのような細胞の後代または潜在的な後代も指す。ある特定の改変が、突然変異または環境の影響のいずれかに起因してその後の世代において起こり得るので、そのような後代は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞である。他の実施形態では、細胞は、原核細胞である。
細胞の集団は、表現型および／または遺伝子型において同一であるか（クローン）、または同一ではない２つ以上の細胞の収集物を意図する。集団は、本明細書に記載されるように、精製され得るか、非常に精製され得るか、実質的に同質であり得るか、または異種であり得る。
「遺伝子送達ビヒクル」は、挿入されるポリヌクレオチドを宿主細胞に運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、ミセル、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー、リポタンパク質、ポリペプチド、多糖、リポ多糖、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、ならびに細菌またはウイルス、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびにさまざまな真核宿主および原核宿主における発現について記載されており、遺伝子治療および単純なタンパク質発現に使用され得る当技術分野において典型的に使用される他の組換えビヒクルである。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して細胞または組織または対象に送達することができる。「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、「形質導入」などは、本明細書で使用される場合、導入のために使用される方法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチド（場合により「導入遺伝子」と称される）の宿主細胞への導入について言及する用語である。そのような方法としては、各種の周知の技法、例えば、ベクター媒介遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、またはさまざまな他のタンパク質に基づくもしくは脂質に基づく遺伝子送達複合体による）および「ネイキッド」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技法（電気穿孔、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入のために使用されるさまざまな他の技法など）が挙げられる。導入されるポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定に、または一過性に維持され得る。安定な維持は、典型的には、導入されるポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合する複製起点を含有するか、あるいは宿主細胞のレプリコン、例えば、染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核染色体もしくはミトコンドリア染色体に組み込むことのいずれかを必要とする。当技術分野において公知であり、本明細書に記載されるように、いくつかのベクターは、遺伝子の哺乳動物細胞への移入を媒介することができることが公知である。
「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは無関係に複製することができる、染色体ＤＮＡから分離されている染色体外ＤＮＡ分子である。多くの場合に、これは環状で二本鎖である。プラスミドは、微生物の集団内で水平方向の遺伝子移入のための機構を提供し、典型的には、所与の環境状態下で選択的な利点を提供する。プラスミドは、競合的環境ニッチにおいて天然に存在する抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を運び得るか、または代替的に、産生されるタンパク質は、類似の条件下で毒素として作用し得る。
遺伝子工学において使用される「プラスミド」は、「プラスミドベクター」と呼ばれる。多くのプラスミドは、そのような使用のために市販されている。複製される遺伝子は、特定の抗生物質に対して細胞を耐性にする遺伝子、およびいくつかの一般に使用される制限部位を含有し、この場所でＤＮＡ断片の容易な挿入を可能にする短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳ、またはポリリンカー）を含有するプラスミドのコピーに挿入される。プラスミドの別の主要な使用は、大量のタンパク質を作製することである。この場合では、研究者らは、目的の遺伝子を保有するプラスミドを含有する細菌を成長させる。細菌が、その抗生物質耐性を付与するタンパク質を産生するのと全く同じように、それは、挿入された遺伝子から大量のタンパク質を産生するように誘導することもできる。これは、遺伝子、または次いでそれがコードするタンパク質を大量に産生する安価で容易な方法である。
「酵母人工染色体」または「ＹＡＣ」は、大きなＤＮＡ断片（１００ｋｂよりも大きく、最大で３０００ｋｂ）をクローニングするために使用されるベクターを指す。これは、人工的に構築された染色体であり、酵母細胞における複製および保存に必要なテロメア配列、セントロメア配列および複製起点配列を含有する。最初に環状プラスミドを使用して構築すると、それらは、制限酵素を使用することによって線状化され、次いで、ＤＮＡリガーゼを、付着末端の使用によって線状分子内に目的の配列または遺伝子を付加することができる。酵母発現ベクター、例えば、ＹＡＣ、ＹＩｐ（酵母組込みプラスミド）およびＹＥｐ（酵母エピソームプラスミド）は、酵母それ自身が真核細胞であるため、翻訳後改変を有する真核生物タンパク質産物を得ることができるので、極めて有用であるが、しかしながら、ＹＡＣは、ＢＡＣよりも不安定であり、キメラ効果を生じることが見出されている。
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む組換え的に産生されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。感染性タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に基づくベクターは、タンパク質を製造するために使用することができ、タバコ葉においてグリフィスシンを発現することが報告されている（O'Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104）。アルファウイルスベクター、例えば、セムリキ森林熱ウイルスに基づくベクターおよびシンドビスウイルスに基づくベクターは、遺伝子治療および免疫療法における使用のためにも開発されている。Schlesinger & Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439およびYing et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827を参照されたい。遺伝子移入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、レトロウイルスゲノムまたはその部分および治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス媒介遺伝子移入」または「レトロウイルス形質導入」は、同じ意味を持ち、遺伝子または核酸配列が、細胞に侵入し、ウイルスのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスによって、宿主細胞に安定に移入されるプロセスを指す。ウイルスは、その正常な感染の機構を介して宿主細胞に侵入することができ、またはウイルスが異なる宿主細胞表面受容体もしくはリガンドに結合して、細胞に侵入するように改変することができる。本明細書で使用される場合、レトロウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様侵入機構により外因性核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。
レトロウイルスは、それらの遺伝子情報をＲＮＡの形態で運ぶが、しかしながら、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡは、ＤＮＡ形態に逆転写され、これが、感染した細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれるＤＮＡ形態は、プロウイルスと呼ばれる。
遺伝子移入がＤＮＡウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその部分および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は、比較的良く特徴付けられているウイルスの同種の群であり、５０を超える血清型を含む。例えば、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９５／２７０７１号を参照されたい。Ａｄは、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に、組換えおよび野生型ウイルスの生成の可能性が低減されたものも、構築されている。ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９５／００６５５号および同第ＷＯ９５／１１９８４号を参照されたく、野生型ＡＡＶは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる高い感染力および特異性を有する。Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470およびLebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996を参照されたい。
ポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るプロモーターおよびクローニング部位の両方を含有するベクターは、当技術分野において周知である。そのようなベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）などの供給源から市販されている。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更して、余分の潜在的で不適切な代替の翻訳開始コドン、または転写もしくは翻訳のレベルのいずれかで発現を妨げ得るか、もしくはそれを低減し得る他の配列を除外することが必要であり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位は、開始コドンのすぐ５’に挿入されて、発現を増強することができる。
遺伝子送達ビヒクルとしては、ＤＮＡ／リポソーム複合体、ミセルおよび標的化ウイルスタンパク質－ＤＮＡ複合体も挙げられる。標的化抗体またはその断片も含むリポソームは、本明細書に開示される方法において使用することができる。ポリヌクレオチドの細胞または細胞集団への送達に加えて、本明細書に記載されるタンパク質の細胞または細胞集団への直接的導入は、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技法によって行うことができ、あるいは本明細書に開示されるタンパク質の発現を増強し、および／またはその活性を促進することができる培養条件は、他の非限定的な技法である。
遺伝子移入がレンチウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、レンチウイルスゲノムまたはその部分および治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、「レンチウイルス媒介遺伝子移入」または「レンチウイルス形質導入」は、同じ意味を持ち、遺伝子または核酸配列が、細胞に侵入し、ウイルスのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスによって、宿主細胞に安定に移入されるプロセスを指す。ウイルスは、その正常な感染の機構を介して宿主細胞に侵入することができ、またはウイルスが異なる宿主細胞表面受容体もしくはリガンドに結合して、細胞に侵入するように改変することができる。レトロウイルスは、それらの遺伝子情報をＲＮＡの形態で運ぶが、しかしながら、ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡは、ＤＮＡ形態に逆転写され、これが、感染した細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれるＤＮＡ形態は、プロウイルスと呼ばれる。本明細書で使用される場合、レンチウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様侵入機構により外因性核酸を細胞に導入することができるウイルス粒子を指す。「レンチウイルスベクター」は、他のレトロウイルスベクターと比較して、非分裂細胞を形質導入するある特定の利点を有する当技術分野において周知のある種類のレトロウイルスベクターである。Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelbergを参照されたい。
本開示のレンチウイルスベクターは、オンコレトロウイルス（ＭＬＶを含有するレトロウイルスの亜群）およびレンチウイルス（ＨＩＶを含有するレトロウイルスの亜群）に基づくか、またはそれに由来する。例としては、ＡＳＬＶ、ＳＮＶおよびＲＳＶが挙げられ、これらのすべてが、レンチウイルスベクター粒子産生系のためのパッケージングおよびベクター構成要素に分けられる。本開示によるレンチウイルスベクター粒子は、遺伝子学的にまたはそうでなければ（例えば、細胞系をパッケージングする特異的な選択によって）変更された特定のレトロウイルスのバージョンに基づいていてもよい。
本開示によるベクター粒子が特定のレトロウイルスに「基づく」ということは、ベクターが特定のレトロウイルスに由来することを意味する。ベクター粒子のゲノムは、骨格としてそのレトロウイルス由来の構成要素を含む。ベクター粒子は、逆転写および組込み系を含むＲＮＡゲノムに適合性の必須のベクター構成要素を含有する。通常、これらとしては、特定のレトロウイルスに由来するｇａｇおよびｐｏｌタンパク質が挙げられる。そのため、ベクター粒子の構造構成要素の大多数は、通常、レトロウイルスに由来するが、それらは、遺伝子学的にまたはそうでなければ所望の有用な特性を提供するように変更されていてもよい。しかしながら、ある特定の構造構成要素、特に、ｅｎｖタンパク質は、異なるウイルスが起源であってもよい。ベクターの宿主範囲および感染または形質導入される細胞型は、ベクター粒子産生系において異なるｅｎｖ遺伝子を使用して、異なる特異性をベクター粒子に与えることによって変更することができる。
「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、この名称に関連し、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。このウイルスの複数の血清型は、遺伝子送達に好適であることが公知であり、公知の血清型はすべて、さまざまな組織型由来の細胞に感染することができる。少なくとも１１の連続して番号付けされたＡＡＶ血清型が、当技術分野において公知である。本明細書に開示される方法において有用な非限定的な例示的な血清型としては、１１の血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはバリアントもしくは合成血清型、例えば、ＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂのいずれかが挙げられる。ＡＡＶ粒子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の３つの主要なウイルスタンパク質を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一実施形態では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ ＰＨＰ．ＢまたはＡＡＶ ｒｈ７４のものを指す。これらのベクターは、市販されているか、または特許文献もしくは技術文献に記載されている。
「検出可能な標識」、「標識」、「検出可能なマーカー」または「マーカー」は、互換的に使用され、限定されるものではないが、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質を含む。検出可能な標識は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体または組成物に付着することもできる。
本明細書で使用される場合、「標識」または検出可能な標識という用語は、「標識された」組成物を生成するために、検出される組成物に直接的にまたは間接的にコンジュゲートされている直接的にまたは間接的に検出可能な化合物または組成物、例えば、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｎ－Ｈｉｓ）、磁気的に活性な同位元素、例えば、１１５Ｓｎ、１１７Ｓｎおよび１１９Ｓｎ、非放射性同位元素、例えば、１３Ｃおよび１５Ｎ、ポリヌクレオチドまたはタンパク質、例えば、抗体を意図する。この用語は、挿入される配列の発現の際にシグナルを提供する、ポリヌクレオチドにコンジュゲートされる配列、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）なども含む。標識は、それ自身によって検出可能であってもよく（例えば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合では、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学変化を触媒してもよい。標識は、小スケールの検出に好適であり得るか、またはハイスループットスクリーニングにより好適であり得る。そのため、好適な標識としては、限定されるものではないが、磁気的に活性な同位元素、非放射性同位元素、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、色素、および酵素を含むタンパク質が挙げられる。標識は、単に検出されてもよく、またはそれは、定量化されてもよい。単に検出される応答は、一般に、その存在が単に確認される応答を含む一方、定量化される応答は、一般に、定量可能な（例えば、数字で報告可能な）値、例えば、強度、偏光および／または他の特性を有する応答を含む。発光または蛍光アッセイでは、検出可能な応答は、結合に実際に関与するアッセイ構成要素と会合した発光団もしくはフルオロフォアを使用して直接的に、または別の（例えば、レポーターまたはインジケーター）構成要素と会合した発光団またはフルオロフォアを使用して間接的に生成されてもよい。シグナルを生成する発光標識の例としては、限定されるものではないが、生物発光および化学発光が挙げられる。検出可能な発光応答は、一般に、発光シグナルの変化、または発光シグナルの発生を含む。アッセイ構成要素を発光標識するための好適な方法および発光団は、当技術分野において公知であり、例えば、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed)に記載されている。発光プローブの例としては、限定されるものではないが、エクオリンおよびルシフェラーゼが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「イムノコンジュゲート」という用語は、第２の薬剤、例えば、細胞傷害剤、検出可能な薬剤、放射活性剤、標的化剤、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、半合成抗体、もしくは多特異性抗体と会合したか、またはそれに連結された、抗体あるいは抗体誘導体を含む。
好適な蛍光標識の例としては、限定されるものではないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル－クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）、およびテキサスレッドが挙げられる。他の好適な光学色素は、Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th ed.)に記載されている。
別の態様では、蛍光標識は、細胞表面マーカーなどの細胞もしくは組織中、またはその表面上に存在する細胞構成要素への共有結合的な付着を容易にするように官能化されている。好適な官能基としては、限定されるものではないが、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジルエステルおよびスルホニルハライドが挙げられ、これらのすべては、蛍光標識を第２の分子に付着させるために使用され得る。蛍光標識の官能基の選択は、リンカー、薬剤、マーカーまたは第２の標識化剤のいずれかへの付着の部位に依存する。
本明細書で使用される場合、精製標識または精製マーカーは、標識がコンジュゲートされる分子または構成要素を精製するのに使用され得る標識、例えば、エピトープタグ（限定されるものではないが、Ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグを含む）、親和性タグ（限定されるものではないが、グルタチオン－Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含む）、または蛍光タグを指す。
「許容される」、「有効な」、または「十分な」という用語は、本明細書に開示される任意の構成要素、範囲、剤形などの選択を記載するために使用される場合、前記構成要素、範囲、剤形などが開示された目的のために好適であることを意図する。
本開示の文脈では、「リガンド」は、ポリペプチドである。一態様では、「リガンド」という用語は、本明細書で使用される場合、別の分子上の特定の部位に結合する任意の分子を指す。言い換えれば、リガンドは、免疫エフェクター細胞、またはタンパク質に対する抗体、またはタンパク質に対するＤＮＡとの反応においてタンパク質の特異性を付与する。一態様では、これは、免疫エフェクター細胞上の相補的結合部位と直接的に組み合わされるタンパク質内のリガンド部位である。
本明細書で使用される場合、「処置すること」、「処置」などの用語は、有益なもしくは所望の薬理的効果および／もしくは生理的効果、ならびに／または臨床結果を含む所望の結果を得ることを意味するために本明細書で使用される。一部の実施形態では、効果および／または結果は、障害またはその徴候もしくは症状を完全にまたは部分的に防止することのうちの１つまたは複数の観点で予防的であり得、ならびに／あるいは検出可能または検出不能にかかわらず、障害および／もしくは障害に起因する有害効果に対する部分的なもしくは完全な治癒、および／または１つもしくは複数の症状の軽減もしくは改善、状態（疾患を含む）の程度の減少、状態（疾患を含む）の安定化された（すなわち、悪化していない）状態、状態（疾患を含む）の進行の遅延もしくは減速、状態（疾患を含む）の状況の改善または軽減、および寛解（部分的または全体的かどうか）という観点で治療的であり得る。「処置」の例としては、限定されるものではないが、障害にかかりやすくあり得るが、それを有するとしてまだ診断されていない対象において障害が生じるのを防止すること、障害を阻害すること、すなわち、その発生を阻むこと、および／または障害の症状を緩和することもしくは改善することが挙げられる。一態様では、処置は、疾患または障害の症状の発生の差し止めである。一部の実施形態では、それらは、（１）疾患にかかりやすいか、もしくは疾患の症状をまだ示していない対象において症状または疾患が起こるのを防止すること；（２）疾患を阻害すること、またはその発生を阻むこと；あるいは（３）疾患もしくは疾患の症状を改善することまたはその退縮を引き起こすことを指す。一態様では、処置は、予防または防止を除外する。
一部の実施形態では、処置によって達成される別の有益なまたは所望の薬理学的効果および／または生理学的効果は、以下のうちの１つもしくは複数を含み得るか、またはそれから本質的になり得るか、またはまたさらにそれからなり得る：抗生物質のみを使用する処置と比較して抗生物質の用量を低減すること、抗生物質のみを使用する処置と比較してより短い抗生物質を使用する期間、抗生物質のみを使用する処置と比較してより低い抗生物質を使用する頻度、または抗生物質のみを使用する処置と比較して抗生物質の使用に起因する副作用がより少ない（より穏やかな副作用、副作用がない、または副作用に苦しむより低い頻度、副作用に苦しむより短い期間）。そのような副作用は、皮膚の発疹、下痢および腸内マイクロバイオームの生涯にわたる破壊のうちの１つまたは複数を含み得るか、またはそれから本質的になり得るか、またはまたさらにそれからなり得る。
防止することは、障害または影響にかかりやすい系または対象において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、疾患または障害または影響を防止することを意図する。そのような例は、それを産生することが公知の微生物に感染している系におけるバイオフィルムの形成を防止することである。
一部の実施形態では、「バイオフィルムを処置すること」またはその文法的変形形態は、バイオフィルムを壊すこと（分散および／または破壊を介してなど）を指す。加えて、または代替的に、「バイオフィルムを処置すること」は、バイオフィルムを形成する微生物の微生物負荷（例えば、数および／または濃度として示される）の低減および／または除去も指し得る。一部の実施形態では、微生物負荷は、以下の形態：プランクトン様、バイオフィルムまたは新たに放出のいずれか１つまたは２つまたは３つすべての微生物に基づいて算出される。一部の実施形態では、微生物負荷は、バイオフィルム中の微生物にのみ基づいて算出される。
一実施形態では、「疾患」または「障害」という用語は、本明細書で使用される場合、多微生物性バイオフィルム、そのような疾患と診断される状態、そのような疾患を有すると疑われる状態、もしくはそのような疾患を有する高リスクの状態によって引き起こされるか、および／またはそれらに関するものなどの疾患を指す。一部の実施形態では、疾患は、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、敗血症性関節炎、髄膜炎、分娩後および新生児感染症、分娩後および新生児敗血症、急性および慢性卵管炎、心膜炎（pericardis）、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染症、尿路感染症、 乳様突起炎、大動脈移植感染症、結膜炎（conjunctitivitis）、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症、ならびに基礎的肺疾患、例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症（bronchietasis）および嚢胞性線維症の悪化から選択される。加えて、または代替的に、疾患は、嚢胞性線維症（ＣＦ）、肺ＣＦ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）、歯周炎、インプラント周囲炎、中耳感染症、中耳炎（ＯＭ）、急性中耳炎（ＡＯＭ）、滲出性中耳炎（ＯＭＥ）、鼓膜切開チューブ挿入後の耳漏（ＰＴＴＯ）、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、市中感染性肺炎（ＣＡＰ）、胸腔チューブ／カテーテル／留置デバイスバイオフィルム感染症、扁桃炎、咽頭炎（pharyngitis）、咽頭炎（laryngitis）、喉頭蓋炎、副鼻腔炎、肺炎、気管支炎、または他の気道感染症（ＲＴＩ）から選択される。一部の実施形態では、疾患は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（分類可能なおよび分類不可能な株）が関与する任意の病態、例えば、ＯＭ、肺炎、副鼻腔炎、敗血症、心内膜炎、喉頭蓋炎、敗血症性関節炎、髄膜炎、分娩後および新生児感染症、分娩後および新生児敗血症、急性および慢性卵管炎、喉頭蓋、心膜炎、蜂巣炎、骨髄炎、心内膜炎、胆嚢炎、腹腔内感染症、尿路感染症、 乳様突起炎、大動脈移植感染症、結膜炎、ブラジル紫斑熱、潜在性菌血症、慢性閉塞性肺疾患、ならびに基礎的肺疾患、例えば、慢性気管支炎、気管支拡張症および嚢胞性線維症の悪化である。一部の実施形態では、疾患は、ＮＴＨＩなどの本明細書に開示される細菌性バイオフィルムによって直接的にまたは間接的に引き起こされる対象の任意の障害である。一部の実施形態では、バイオフィルムは、多微生物性バイオフィルムである。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。
抗体、ワクチン、ペプチド、細胞もしくはベクター、またはそれを含有する他の薬剤および組成物の「投与」または「送達」は、１用量で、処置の過程全体にわたって連続的または間欠的にもたらされ得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的、処置される標的の感染症またはバイオフィルム、および処置される対象により変わる。単回投与または複数回投与は、処置する医師によって、または動物の場合では処置する獣医師によって、選択される用量レベルおよびパターンで行うことができる。好適な投薬製剤および薬剤を投与する方法は、当技術分野において公知である。投与経路も決定することができ、投与の最も有効な経路を決定する方法は、当業者に公知であり、処置のために使用される組成物、処置の目的、処置される対象の健康状態または疾患ステージ、および標的細胞または組織により変わる。投与経路の非限定的な例としては、経口投与、腹腔内、注入、経鼻投与、吸入、注射、および局所適用が挙げられる。
投与という用語は、限定されないが、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、脳室内（ＩＣＶ）、くも膜下腔内、大槽内注射もしくは注入、皮下注射、またはインプラント）による投与、経鼻吸入スプレー、膣、直腸、舌下、尿道（例えば、尿道坐剤）または局所投与経路（例えば、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなど）による投与を含むものとし、単独または一緒に、それぞれの投与経路に適切な従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、およびビヒクルを含有する好適な投薬単位製剤において製剤化することができる。本開示は、投与経路、製剤または投薬スケジュールによって限定されない。
「投与」は、１用量で、処置の過程全体にわたって連続的または間欠的にもたらされ得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療の目的、処置される標的細胞、および処置される対象により変わる。単回投与または複数回投与は、処置する医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行うことができる。好適な投薬製剤および薬剤を投与する方法は、当技術分野において公知である。
本開示の薬剤は、投与の任意の好適な経路によって治療のために投与することができる。最適な経路が、レシピエントの状態および年齢、ならびに処置される疾患により変わることも認識されるであろう。
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、２つまたはそれよりも多くの分子間の直接的なまたは間接的な結合または相互作用を意味する。直接的な相互作用の特定の例は、結合である。間接的な相互作用の特定の例は、１つの実体が中間の分子に対して作用し、次に、それが第２の参照実体に対して作用する場合である。接触させることは、本明細書で使用される場合、溶液中、固相中、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、細胞中、およびｉｎ ｖｉｖｏを含む。ｉｎ ｖｉｖｏで接触させることは、投与することまたは投与と称され得る。
「組成物」は、活性薬剤、および不活性な（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性な別の化合物または組成物、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、脂溶性溶媒、保存剤、アジュバントなどとの組合せを意味することを意図し、薬学的に許容される担体を含む。担体としては、医薬賦形剤および添加剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四オリゴ糖、およびオリゴ糖を含む糖；誘導体化糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化糖など；ならびに多糖または糖ポリマー）も挙げられ、これは、単独でまたは１～９９．９９重量％または体積％の組合せを含んで、単独または組合せで存在し得る。例示的なタンパク質賦形剤としては、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが挙げられる。緩衝能においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体構成要素としては、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。炭水化物賦形剤はまた、この技術の範囲内で意図され、その例としては、限定されるものではないが、単糖、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど；二糖、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；およびアルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールが挙げられる。
「医薬組成物」は、活性なポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体と、組成物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に好適にする不活性なまたは活性な担体、例えば、固体支持体との組合せを含むことを意図する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準的な医薬担体のいずれか、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、およびエマルジョン、例えば、油／水型または水／油型エマルジョン、ならびにさまざまな種類の湿潤剤を包含する。組成物は、安定剤および保存剤を含むこともできる。担体、安定剤およびアジュバントの例について、Martin (1975) Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton)を参照されたい。一部の実施形態では、「薬学的に許容される担体」は、本明細書に開示される組成物において使用され得る任意の希釈剤、賦形剤または担体を指す。薬学的に許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。好適な医薬担体は、この分野の標準的な参考テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Companyに記載されている。それらは、意図される投与の形態、すなわち、経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関して、および従来の薬務と一致して、選択され得る。
生物学的に適合性の担体または媒体という用語と互換的に使用され得る薬学的に許容される担体（または媒体）という用語は、治療的に投与される細胞および他の薬剤と適合性であるだけでなく、正当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または妥当な利益／リスク比に釣り合った他の複雑な要因なく、人間および動物の組織と接触する使用に好適でもある、試薬、細胞、化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。本開示における使用に好適な薬学的に許容される担体としては、液体、半固体（例えば、ゲル）および固体の材料（例えば、細胞足場およびマトリックス、チューブシート、ならびに当技術分野において公知のおよび本明細書により詳細に記載される他のそのような材料）を含む。これらの半固体材料および固体材料は、身体内での分解に耐えるように設計されていてもよく（非生分解性）、またはそれらは、身体内で分解するように設計されていてもよい（生分解性、生体内分解性）。生分解性材料は、さらに、生体吸収型または生体吸収性であってもよく、すなわち、これは、体液に溶解および吸収されてもよく（水溶性インプラントが一例である）、または天然経路による他の材料への変換もしくは破綻および排泄のいずれかによって、分解され、最終的に身体から排泄されてもよい。
本明細書で使用される場合、互換的に使用される「固相支持体」または「固体支持体」は、特定の種類の支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が、利用可能であり、当業者に公知である。固相支持体としては、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、ワタ、プラスチックビーズ、アルミナゲルが挙げられる。本明細書で使用される場合、「固体支持体」としては、合成抗原提示マトリックス、細胞およびリポソームも挙げられる。好適な固相支持体は、所望の最終使用、およびさまざまなプロトコールに対する好適性に基づいて選択され得る。例えば、ペプチド合成のために、固相支持体は、樹脂、例えば、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから得られるＰＡＭ樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（登録商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ、Ｃａｎａｄａから得られる）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールとグラフトしたポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｃａｌｉｆ．から得られる）を指し得る。
固相支持体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩ならびにマグネタイトが挙げられる。担体の特質は、ある程度まで可溶性、または不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、カップリングした分子がポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体に結合することができる限り、実際上、任意の可能な構造的配置を有していてもよい。したがって、支持体配置は、ビーズにおけるように球状、または試験管の内側表面またはロッドの外部表面におけるように円柱状であってもよい。あるいは、表面は、平面、例えば、シート、試験紙など、または代替的に、ポリスチレンビーズであってもよい。当業者であれば、抗体または抗原の結合のための多くの他の好適な担体を知っているか、またはルーチン実験の使用によってこれを解明することが可能であろう。
本開示に従って使用される組成物は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態で包装され得る。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象における使用に好適な物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、その投与、すなわち、適切な経路およびレジメンに関連して所望の応答を生じるように算出された所定量の組成物を含有する。処置の回数および単位用量の両方に従って投与される量は、所望される結果および／または保護に依存する。組成物の正確な量は、開業医の判断にも依存し、それぞれの個体に固有である。用量に影響を及ぼす因子としては、対象の身体的状態および臨床的状態、投与経路、意図される処置の目標（症状の軽減対治癒）、ならびに特定の組成物の効力、安定性および毒性が挙げられる。製剤化の際に、液剤は、投薬製剤と適合性の様式で、治療的にまたは予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、各種の剤形、例えば、本明細書に記載される注射用液剤の種類で容易に投与される。
診断または処置の「対象」（本明細書で「個体」または「患者」と互換的に使用される）は、細胞または動物、例えば、哺乳動物もしくはヒトである。診断または処置に付される非ヒト動物は、感染に付されるものまたは動物モデル、例えば、サル、ネズミ科動物、例えば、ラット、マウス、チンチラ、イヌ科動物、例えば、イヌ、ウサギ科動物、例えば、ウサギ、家畜、狩猟動物およびペットである。「対象」、「宿主」、「個体」および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用される場合、動物、典型的に哺乳動物を指す。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクなど）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、および実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢または任意の発達段階であり得る（例えば、成体、小児患者、青年、十代、思春期前の対象、子供、幼児、胎児、または子宮内の哺乳動物）。哺乳動物は、雄または雌であり得る。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一態様では、対象は、発症前の対象である。別の態様では、対象は、疾患の最小限の臨床症状を有する。対象は、雄もしくは雌の成体、幼児または小児の対象であり得る。追加の態様では、対象は、成体である。一部の事例では、成体は、成体ヒト、例えば、１８歳よりも上の成体ヒトである。
本明細書で使用される場合、生体試料または試料は、対象、細胞系、または培養された細胞もしくは組織から得ることができる。例示的な試料としては、限定されるものではないが、細胞試料、組織試料、液体試料、例えば、血液および生体起源の他の液体試料（限定されるものではないが、眼液（水性および硝子体液）、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液もしくは尿道球腺液、女性の膣液、汗、涙液、嚢胞液、胸膜液および腹腔液、心膜液、腹水、リンパ、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、月経、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物／洗浄液、滑液、粘膜分泌物、糞便汁、膵液、洞腔からの洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞腔（blastocyl cavity）液、または臍帯血が挙げられる。一実施形態では、生体試料は、バイオフィルムを有すると疑われている。別の実施形態では、生体試料はバイオフィルムを含む。一部の実施形態では、試料は、対象の気道、例えば、粘液由来である。
「有効量」は、有益なまたは所望の効果を生じさせるために十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬量で投与することができる。そのような送達は、個々の投薬単位が使用される期間、治療剤の生物学的利用率、投与経路などを含むいくつかの変数に依存する。しかしながら、任意の特定の対象に対する本開示の治療剤の特定の用量レベルが、用いられる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事、投与の回数、排泄率、薬物の組合せ、ならびに処置される特定の障害の重症度および投与の形態を含む各種の因子に依存する。処置投薬量は、一般に、安全性および有効性を最適化するために用量設定され得る。典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ試験からの投薬量－効果の関係は、最初に、患者投与のための適正な用量に対する有用なガイダンスを提供することができる。一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有効であることが見出された濃度に釣り合う血清レベルを達成するのに有効である化合物の量を投与することが望ましい。これらのパラメーターの決定は、十分に当技術分野の技能内である。これらの考慮事項、ならびに有効な製剤および投与手順は、当技術分野において周知であり、標準的なテキストに記載されている。免疫原性組成物の文脈では、一部の実施形態では、有効量は、病原体に対する保護的応答をもたらすために十分な量である。他の実施形態では、免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体生成をもたらすために十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、それを必要とする対象に対して受動免疫を付与するために必要な量である。免疫原性組成物に関して、一部の実施形態では、有効量は、上記に記載される因子に加えて、意図される使用、特定の抗原性化合物の免疫原性の度合い、および対象の免疫系の健康／応答性に依存する。当業者は、これらのおよび他の因子に応じて適切な量を決定することが可能であろう。
組成物の「免疫原性用量」は、投与前に検出可能な免疫応答と比較して、または投与前の標準的な免疫応答と比較して、投与後に、検出可能な体液性（抗体）および／または細胞性（Ｔ細胞）免疫応答を発生させるものである。一部の実施形態では、免疫応答は、保護的および／または治療的であり得る方法から生じる。一部の実施形態では、抗体および／またはＴ細胞免疫応答は、本明細書に開示されるバイオフィルム感染症、特に、中耳および／または鼻咽頭もしくは下気道の感染症から個体を保護する。この使用では、正確な用量は、患者の健康状態および体重、投与の方式、製剤の特質などに依存するが、一般に、７０キログラムの患者あたり約１．０ｍｕ．ｇ～約５０００ｍｕ．ｇ、より一般に、７０キログラムの体重あたり約１０～約５００ｍｕ．ｇの範囲である。
体液性免疫応答は、多くの周知の方法、例えば、一元放射免疫拡散アッセイ（ＳＲＩＤ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）および赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）によって測定されてもよい。特に、ＳＲＩＤは、試験される免疫原を含有する寒天などのゲルの層を利用する。ウェルを、ゲル中で切断し、試験される血清を、ウェルに入れる。ゲルへの抗体の拡散は、沈殿物のリングの形成をもたらし、その面積は、試験される血清中の抗体の濃度に比例する。ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノアッセイ）としても公知のＥＩＡは、試料中の総抗体を決定するために使用される。免疫原は、マイクロタイタープレートの表面に吸着される。試験血清を、プレート、それに続いてＩｇＧなどの免疫グロブリンに連結された酵素に曝露する。プレートに付着した酵素活性は、任意の従来の手段、例えば、分光測定法によって定量化し、試験試料中に存在する免疫原に対する抗体の濃度に比例する。ＨＡＩは、ニワトリ赤血球（など）を凝集させるウイルスタンパク質などの免疫原の能力を利用する。アッセイは、中和抗体、すなわち、赤血球凝集を阻害することが可能な抗体を検出する。試験血清の希釈物を、標準的な濃度の免疫原とともにインキュベートし、それに続いて赤血球を添加する。中和抗体の存在は、免疫原による赤血球の凝集を阻害するであろう。細胞免疫応答を測定するための試験としては、遅延型過敏症の決定、または免疫原を標的にするリンパ球の増殖性応答を測定することが挙げられる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ適用の場合では、一部の実施形態では、有効量は、問題の適用のサイズおよび特質に依存する。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ標的の特質および感受性、ならびに使用における方法にも依存する。当業者は、これらのおよび他の考慮事項に基づいて有効量を決定することが可能であろう。有効量は、実施形態に応じて組成物の１回または複数回の投与を含んでいてもよい。
本開示を行うための方法
一態様では、それを必要とする対象における、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、またはそれを含む多微生物性バイオフィルムを防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法が提供される。この方法は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片を対象に投与するステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体もしくは抗チップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、例えば、ＥＳＫＡＰＥ細菌によっても引き起こされる。一部の実施形態では、この方法は、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一態様では、対象は、哺乳動物またはヒト患者である。
別の態様では、それを必要とする対象におけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、またはそれを含む多微生物性バイオフィルム感染に関連する疾患を防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法が提供される。この方法は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片を対象に投与するステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体もしくは抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそのそれぞれの生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、例えば、ＥＳＫＡＰＥ細菌によっても引き起こされる。一部の実施形態では、この方法は、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、疾患は、本明細書に開示されるように、例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）、肺ＣＦ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）、歯周炎、インプラント周囲炎、中耳感染症、中耳炎（ＯＭ）、急性中耳炎（ＡＯＭ）、滲出性中耳炎（ＯＭＥ）、鼓膜切開チューブ挿入後の耳漏（ＰＴＴＯ）、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、市中感染性肺炎（ＣＡＰ）、胸腔チューブ／カテーテル／留置デバイスバイオフィルム感染症、扁桃炎、咽頭炎（pharyngitis）、咽頭炎（laryngitis）、喉頭蓋炎、副鼻腔炎、肺炎、気管支炎、または他の気道感染症（ＲＴＩ）から選択される。一態様では、対象は、哺乳動物またはヒト患者である。
また別の態様では、抗生物質療法のためにそれを必要とする対象におけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、もしくはそれを含むポリクローナル微生物性バイオフィルムに感作する、またはそれを必要とする対象における多微生物性バイオフィルムの細菌を新たに放出された（ＮＲｅｌ）状態に誘導するための方法が提供される。この方法は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片を対象に投与するステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップ抗体、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片のうちの１つまたは複数を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、例えば、ＥＳＫＡＰＥ細菌によっても引き起こされる。一部の実施形態では、この方法は、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一態様では、対象は、哺乳動物またはヒト患者である。
一態様では、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、またはそれを含む多微生物性バイオフィルムを防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法が提供される。この方法は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片を対象に投与するステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、例えば、ＥＳＫＡＰＥ細菌によっても引き起こされる。一部の実施形態では、この方法は、バイオフィルムを抗生物質と接触させるステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏである。
別の態様では、抗生物質療法のために多微生物性バイオフィルムに感作する、またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされたか、それによって将来引き起こされるか、もしくはそれを含む多微生物性バイオフィルムを形成する細菌を新たに放出された（ＮＲｅｌ）状態に誘導するための方法が提供される。この方法は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片を対象に投与するステップを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、例えば、ＥＳＫＡＰＥ細菌によっても引き起こされる。一部の実施形態では、この方法は、バイオフィルムを抗生物質と接触させるステップをさらに含む。さらなる実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏである。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、抗生物質は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片と同時的にまたはその後に、バイオフィルムと接触するか、または対象に投与される。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、この方法は、接触させるステップまたは投与するステップの前に、対象または多微生物性バイオフィルムの試料中の細菌を特定するステップをさらに含む。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、例えば、ＥＳＫＡＰＥ細菌によっても引き起こされる。またさらなる実施形態では、細菌は、２つ以上のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌を含む、またはそれから本質的になる、またはまたさらにそれからなるとして特定された。一部の実施形態では、細菌は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌および別の非Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌を含む、またはそれから本質的になる、またはまたさらにそれからなるとして特定された。一部の態様では、細菌は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数である。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、本明細書に開示される方法を適用することを介して、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされるか、それによって将来引き起こされるか、またはそれを含む多微生物性バイオフィルムは、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片、あるいは抗生物質単独のうちの１つを接触させるまたは投与するのと比較して、相乗的な様式で、防止される、阻害される、破壊される、分散される、または処置されるのうちの１つまたは複数である。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、例えば、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌、例えば、ＥＳＫＡＰＥ細菌によっても引き起こされる。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、バイオフィルムから放出された細菌の新たに放出された（ＮＲｅｌ）状態は、同じであるがプランクトン様に成長した細菌とは異なる。一部の実施形態では、ＮＲｅｌ細菌は、以下のうちの１つまたは複数を含む：以下の遺伝子：ｄｅａＤ、ａｒｔＭ、ｆｉｓ、ｆｏｌＡ、ｆｏｌＰ、ｅｍｒＡ、ｅｍｒＢ、またはａｃｒＲのうちの１つまたは複数の変更された遺伝子発現；以下のタンパク質：ＡｓｎＣ、ＣｙａＡ、ＧｌｐＣ、ＮｒｆＡ、ＴｅｈＢ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ、ＴｒｕＡ、またはＴｒｘＡのうちの１つまたは複数の変更されたレベル；以下のタンパク質：ＡｂｇＡ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ、ＡｒｔＰ、ＡｔｐＨ、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＦ、ＣｃｍＡ、ＣｉｔＤ、ＣｉｔＴ、ＣｍＫ、ＣｏａＤ、ＤｃＤ、ＤｊｌＡ、ＤｋｓＡ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、ＤｓｂＥ、ＦａｂＧ、ＦｄｈＸ、ＦｔｎＢ、ＦｔｓＥ、ＦｔｓＩ、ＦｕｍＣ、Ｆｕｒ、ＧｌｐＡ、ＧｌｐＢ、ＧｍＫ、ＧｐｓＡ、ＧｒｅＡ、Ｈｆｑ、ＨｉｓＩ、ＨｕｇＺ、ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ、Ｌｉｃ２Ａ、ＬｉｃＣ、ＬｉｃＤ、ＬｏｌＡ、ＬｐｓＡ、ｍｅｎＣ、ＭｅｎＣ、ＮａｐＡ、ＮｒｆＢ、ＮｒｆＣ、ＮＴＨＩ００５３、ＮＴＨＩ０２４９、ＮＴＨＩ０２９１、ＮＴＨＩ０３１９、ＮＴＨＩ０３４９、ＮＴＨＩ０４３６、ＮＴＨＩ０４８７、ＮＴＨＩ０４９０、ＮＴＨＩ０５５５、ＮＴＨＩ０７３２、ＮＴＨＩ０７７９、ＮＴＨＩ０８２０、ＮＴＨＩ１０２５、ＮＴＨＩ１０８５、ＮＴＨＩ１１９９、ＮＴＨＩ１４３７、ＮＴＨＩ１４３９、ＮＴＨＩ１５０３、ＮＴＨＩ１５９０、ＮＴＨＩ１７４８、ＯｐｐＦ、ＰａｎＦ、ＰｄｘＨ、ＰｅｐＴ、ＰｈｏＢ、ＰｌｓＣ、ＰｏｌＡ、ＰｐＣ、ＰｐｉＢ、ＰｒｆＢ、ＰｕｒＵ、ＲａｄＡ、ＲｅｌＢ、ＲｉｂＡ、ＲｐｌＷ、ＲｐｏＥ、ＲｐｏＺ、ＲｓｅＡ、ＳｅｃＦ、Ｓｘｙ、ＴｅｓＢ、ＴｈｒＢ、ＴｏｌＡ、ＵｎＧ、ＵｒｅＧ、ＵｕａＰ、またはＵｖｒＢのうちの１つまたは複数の低いレベル；以下のタンパク質：ＣｌｐＢ、ＣｙｄＤ、ＤｅａＤ、ＤｌＤ、ＤｍｓＢ、ＥｘｂＤ、ＧｒｏＥＳ、ＨｆｅＡ、ＨｆｅＢ、ＨｇｐＢ、ＨｉｓＪ、ＨｉｓＪ、ＨｉｔＡ、ＨｋｔＥ、ＨｘｕＣ、ＬｃｔＰ、ＬｌｄＤ、ＬｐｘＣ、ＭｕｒＢ、ＮｄｈＡ、ＮｉｆＳ２、ＮＴＨＩ００４３、ＮＴＨＩ００５２、ＮＴＨＩ０１７５、ＮＴＨＩ０３６４、ＮＴＨＩ１２０８、ＮＴＨＩ１２１４、ＮＴＨＩ１３６９、ＮＴＨＩ１７０３、ＯｍｐＰ２、ＯｒｆＧ、Ｐａｌ、ＰｄｇＸ、ＲｂｆＡ、ＲｅｃＮ、ＲｐｌＯ、ＲｐｌＵ、ＲｐｍＥ、ＲｐｓＥ、ＲｐｓＪ、ＲｐｓＬ、ＲｐｓＱ、ＲｐｓＴ、ＳｏｄＡ、Ｔｂｐ１、ＴｏｌＢ、ＴｏｎＢ、ＴｒｐＡ、ＴｒｘＡ、またはＺｎｕＡのうちの１つまたは複数の高いレベル。さらなる実施形態では、高い（本明細書で増加したとも称される）、低い（本明細書で減少したとも称される）、変更された発現またはレベルは、同じであるがプランクトン様に成長した細菌と比較される。
一態様では、本明細書に開示される方法による、以下：防止、阻害、破壊、分散、処置または感作のうちの１つまたは複数に好適な多微生物性バイオフィルムを選択するための方法が提供される。この方法は、（ａ）多微生物性バイオフィルム、またはそれらから単離および成長した多微生物性バイオフィルムを、本明細書に開示されるように、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片の一方または両方と接触させるステップ、ならびに（ｂ）本明細書に開示される遺伝子および／または本明細書に開示されるタンパク質のうちの１つもしくは複数の発現について、（ａ）のバイオフィルムから放出された細菌をアッセイするステップを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、遺伝子は、以下：ｄｅａＤ、ａｒｔＭ、ｆｉｓ、ｆｏｌＡ、ｆｏｌＰ、ｅｍｒＡ、ｅｍｒＢ、またはａｃｒＲのうちの１つまたは複数から選択される。加えて、または代替的に、タンパク質は、以下：ＡｓｎＣ、ＣｙａＡ、ＧｌｐＣ、ＮｒｆＡ、ＴｅｈＢ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ、ＴｒｕＡ、ＴｒｘＡ；ＡｂｇＡ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ、ＡｒｔＰ、ＡｔｐＨ、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＦ、ＣｃｍＡ、ＣｉｔＤ、ＣｉｔＴ、ＣｍＫ、ＣｏａＤ、ＤｃＤ、ＤｊｌＡ、ＤｋｓＡ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、ＤｓｂＥ、ＦａｂＧ、ＦｄｈＸ、ＦｔｎＢ、ＦｔｓＥ、ＦｔｓＩ、ＦｕｍＣ、Ｆｕｒ、ＧｌｐＡ、ＧｌｐＢ、ＧｍＫ、ＧｐｓＡ、ＧｒｅＡ、Ｈｆｑ、ＨｉｓＩ、ＨｕｇＺ、ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ、Ｌｉｃ２Ａ、ＬｉｃＣ、ＬｉｃＤ、ＬｏｌＡ、ＬｐｓＡ、ｍｅｎＣ、ＭｅｎＣ、ＮａｐＡ、ＮｒｆＢ、ＮｒｆＣ、ＮＴＨＩ００５３、ＮＴＨＩ０２４９、ＮＴＨＩ０２９１、ＮＴＨＩ０３１９、ＮＴＨＩ０３４９、ＮＴＨＩ０４３６、ＮＴＨＩ０４８７、ＮＴＨＩ０４９０、ＮＴＨＩ０５５５、ＮＴＨＩ０７３２、ＮＴＨＩ０７７９、ＮＴＨＩ０８２０、ＮＴＨＩ１０２５、ＮＴＨＩ１０８５、ＮＴＨＩ１１９９、ＮＴＨＩ１４３７、ＮＴＨＩ１４３９、ＮＴＨＩ１５０３、ＮＴＨＩ１５９０、ＮＴＨＩ１７４８、ＯｐｐＦ、ＰａｎＦ、ＰｄｘＨ、ＰｅｐＴ、ＰｈｏＢ、ＰｌｓＣ、ＰｏｌＡ、ＰｐＣ、ＰｐｉＢ、ＰｒｆＢ、ＰｕｒＵ、ＲａｄＡ、ＲｅｌＢ、ＲｉｂＡ、ＲｐｌＷ、ＲｐｏＥ、ＲｐｏＺ、ＲｓｅＡ、ＳｅｃＦ、Ｓｘｙ、ＴｅｓＢ、ＴｈｒＢ、ＴｏｌＡ、ＵｎＧ、ＵｒｅＧ、ＵｕａＰ、ＵｖｒＢ；ＣｌｐＢ、ＣｙｄＤ、ＤｅａＤ、ＤｌＤ、ＤｍｓＢ、ＥｘｂＤ、ＧｒｏＥＳ、ＨｆｅＡ、ＨｆｅＢ、ＨｇｐＢ、ＨｉｓＪ、ＨｉｓＪ、ＨｉｔＡ、ＨｋｔＥ、ＨｘｕＣ、ＬｃｔＰ、ＬｌｄＤ、ＬｐｘＣ、ＭｕｒＢ、ＮｄｈＡ、ＮｉｆＳ２、ＮＴＨＩ００４３、ＮＴＨＩ００５２、ＮＴＨＩ０１７５、ＮＴＨＩ０３６４、ＮＴＨＩ１２０８、ＮＴＨＩ１２１４、ＮＴＨＩ１３６９、ＮＴＨＩ１７０３、ＯｍｐＰ２、ＯｒｆＧ、Ｐａｌ、ＰｄｇＸ、ＲｂｆＡ、ＲｅｃＮ、ＲｐｌＯ、ＲｐｌＵ、ＲｐｍＥ、ＲｐｓＥ、ＲｐｓＪ、ＲｐｓＬ、ＲｐｓＱ、ＲｐｓＴ、ＳｏｄＡ、Ｔｂｐ１、ＴｏｌＢ、ＴｏｎＢ、ＴｒｐＡ、ＴｒｘＡ、またはＺｎｕＡのうちの１つまたは複数から選択される。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。
一部の実施形態では、方法は、選択されたバイオフィルムを、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片、および（ｉｉｉ）必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む必要に応じた抗生物質と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、選択された多微生物性バイオフィルムは、対象中にある。さらなる実施形態では、方法は、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片、（ｉｉ）ＰｉｌＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、および（ｉｉｉ）必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む必要に応じた抗生物質を対象に投与するステップをさらに含む。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、以下のうちの１つまたは複数が、バイオフィルムが本明細書に開示される方法に好適であること、およびそのようにして選択されることを示す：
以下の遺伝子：ｄｅａＤ、ａｒｔＭ、ｆｉｓ、ｆｏｌＡ、ｆｏｌＰ、ｅｍｒＡ、ｅｍｒＢ、またはａｃｒＲのうちの１つまたは複数の変更された遺伝子発現；
以下のタンパク質：ＡｓｎＣ、ＣｙａＡ、ＧｌｐＣ、ＮｒｆＡ、ＴｅｈＢ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ、ＴｒｕＡ、またはＴｒｘＡのうちの１つまたは複数の変更されたレベル；
以下のタンパク質：ＡｂｇＡ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ、ＡｒｔＰ、ＡｔｐＨ、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＦ、ＣｃｍＡ、ＣｉｔＤ、ＣｉｔＴ、ＣｍＫ、ＣｏａＤ、ＤｃＤ、ＤｊｌＡ、ＤｋｓＡ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、ＤｓｂＥ、ＦａｂＧ、ＦｄｈＸ、ＦｔｎＢ、ＦｔｓＥ、ＦｔｓＩ、ＦｕｍＣ、Ｆｕｒ、ＧｌｐＡ、ＧｌｐＢ、ＧｍＫ、ＧｐｓＡ、ＧｒｅＡ、Ｈｆｑ、ＨｉｓＩ、ＨｕｇＺ、ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ、Ｌｉｃ２Ａ、ＬｉｃＣ、ＬｉｃＤ、ＬｏｌＡ、ＬｐｓＡ、ｍｅｎＣ、ＭｅｎＣ、ＮａｐＡ、ＮｒｆＢ、ＮｒｆＣ、ＮＴＨＩ００５３、ＮＴＨＩ０２４９、ＮＴＨＩ０２９１、ＮＴＨＩ０３１９、ＮＴＨＩ０３４９、ＮＴＨＩ０４３６、ＮＴＨＩ０４８７、ＮＴＨＩ０４９０、ＮＴＨＩ０５５５、ＮＴＨＩ０７３２、ＮＴＨＩ０７７９、ＮＴＨＩ０８２０、ＮＴＨＩ１０２５、ＮＴＨＩ１０８５、ＮＴＨＩ１１９９、ＮＴＨＩ１４３７、ＮＴＨＩ１４３９、ＮＴＨＩ１５０３、ＮＴＨＩ１５９０、ＮＴＨＩ１７４８、ＯｐｐＦ、ＰａｎＦ、ＰｄｘＨ、ＰｅｐＴ、ＰｈｏＢ、ＰｌｓＣ、ＰｏｌＡ、ＰｐＣ、ＰｐｉＢ、ＰｒｆＢ、ＰｕｒＵ、ＲａｄＡ、ＲｅｌＢ、ＲｉｂＡ、ＲｐｌＷ、ＲｐｏＥ、ＲｐｏＺ、ＲｓｅＡ、ＳｅｃＦ、Ｓｘｙ、ＴｅｓＢ、ＴｈｒＢ、ＴｏｌＡ、ＵｎＧ、ＵｒｅＧ、ＵｕａＰ、またはＵｖｒＢのうちの１つまたは複数の低いレベル；あるいは
以下のタンパク質：ＣｌｐＢ、ＣｙｄＤ、ＤｅａＤ、ＤｌＤ、ＤｍｓＢ、ＥｘｂＤ、ＧｒｏＥＳ、ＨｆｅＡ、ＨｆｅＢ、ＨｇｐＢ、ＨｉｓＪ、ＨｉｓＪ、ＨｉｔＡ、ＨｋｔＥ、ＨｘｕＣ、ＬｃｔＰ、ＬｌｄＤ、ＬｐｘＣ、ＭｕｒＢ、ＮｄｈＡ、ＮｉｆＳ２、ＮＴＨＩ００４３、ＮＴＨＩ００５２、ＮＴＨＩ０１７５、ＮＴＨＩ０３６４、ＮＴＨＩ１２０８、ＮＴＨＩ１２１４、ＮＴＨＩ１３６９、ＮＴＨＩ１７０３、ＯｍｐＰ２、ＯｒｆＧ、Ｐａｌ、ＰｄｇＸ、ＲｂｆＡ、ＲｅｃＮ、ＲｐｌＯ、ＲｐｌＵ、ＲｐｍＥ、ＲｐｓＥ、ＲｐｓＪ、ＲｐｓＬ、ＲｐｓＱ、ＲｐｓＴ、ＳｏｄＡ、Ｔｂｐ１、ＴｏｌＢ、ＴｏｎＢ、ＴｒｐＡ、ＴｒｘＡ、またはＺｎｕＡのうちの１つまたは複数の高いレベル。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、変更された発現は、増加した発現および減少した発現の両方を指す。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、高い発現は、参照よりも約１０％、もしくは約２０％、もしくは約３０％、もしくは約４０％、もしくは約５０％、もしくは約６０％、もしくは約７０％、もしくは約８０％、もしくは約９０％、もしくは約１倍、もしくは約２倍、もしくは約３倍、もしくは約４倍、もしくは約５倍、もしくは約６倍、もしくは約７倍、もしくは約８倍、もしくは約９倍、もしくは約１０倍、もしくは約２０倍、もしくは約３０倍、もしくは約４０倍、もしくは約５０倍、もしくは約６０倍、もしくは約７０倍、もしくは約８０倍、もしくは約９０倍、もしくは約１００倍、またはそれよりも高く増加した発現を指す。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、低い発現は、参照の約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約６％、または約７％、または約８％、または約０％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％減少した発現を指す。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、参照は、同じであるがプランクトン様に成長した細菌の対応する発現である。
一態様では、キット、例えば、本明細書に開示される方法における使用のためのキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、以下のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる：（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、あるいは（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片、それらのそれぞれのエレメントをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、またはポリヌクレオチドおよび／もしくはベクターを含み、必要に応じて抗体もしくはその断片を発現する宿主細胞、あるいは（ｉｉｉ）必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む抗生物質、ならびに必要に応じて、使用説明書。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。
別の態様では、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体、その生物学的に活性な断片、それをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、またはポリヌクレオチドおよび／もしくはベクターを含み、必要に応じて抗体もしくはその断片を発現する宿主細胞、（ｉｉ）抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、ＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片、それをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター、またはポリヌクレオチドおよび／もしくはベクターを含み、必要に応じて抗体もしくはその断片を発現する宿主細胞、あるいは（ｉｉｉ）必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む抗生物質のうちの１つまたは複数、ならびに担体、必要に応じて薬学的に許容される担体を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる組成物が提供される。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。
例えば本明細書に開示される方法における使用のための、キットおよび組成物も提供される。一態様では、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、（ｉｉ）抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、またはＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片のうちの一方または両方、あるいは（ｉｉｉ）抗生物質のうちの少なくとも２つ、および必要に応じて、使用説明書を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるキットが提供される。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗チップキメラ抗体を含む。一部の実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質および／またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。
別の態様では、以下：（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、（ｉｉ）抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、またはＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片のうちの一方または両方、あるいは（ｉｉｉ）抗生物質のうちの少なくとも２つ、および担体、必要に応じて、薬学的に許容される担体を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる組成物が提供される。抗体は、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、それらの誘導体、バリアント断片であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。一態様では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体またはその生物学的に活性な断片を含む。さらなる態様では、抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体は、例えば本明細書に開示される、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。別の態様では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、ＰｉｌＡ表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。抗体は、検出可能に標識され得る。一部の実施形態では、抗生物質は、β－ラクタム抗生物質および／またはスルホンアミド抗生物質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体、ポリペプチド、それらのそれぞれの生物学的に活性な断片、またはそれらの任意の組合せは、本明細書に開示される組成物中で対象に投与されてもよい。他の実施形態では、抗体、ポリペプチド、それらのそれぞれの生物学的に活性な断片、またはそれらの任意の組合せは、そのような抗体、ポリペプチド、生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチド、またはそれらに相補的なポリヌクレオチドとして対象に投与されてもよい。一部の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、例えば、発現を指示する調節配列をさらに含むことにより、対象における抗体、ポリペプチド、生物学的に活性な断片を発現するのに好適であり得る。さらなる実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、遺伝子送達ビヒクルも、投与のために使用されてもよい。ベクターは、本明細書に開示されるウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってもよい。またさらなる実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよび／またはベクターのうちの１つまたは複数を含む宿主細胞が提供される。したがって、対応する発現される抗体、ペプチド、またはそれらの生物学的に活性な断片に加えて、またはその代わりに、そのようなポリヌクレオチドおよび／またはベクターおよび／または宿主細胞のうちの１つまたは複数を含むキットならびに組成物が提供される。そのようなポリペプチド、抗体、生物学的に活性な断片、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞を産生するのに好適な方法ならびに組成物がさらに提供される。
バイオフィルム
「バイオフィルム」は、微生物が、分泌、放出および／または細菌溶解に起因して細胞外環境において利用可能になるＤＮＡなどのポリマーと一緒に、有機または無機であり得る構造の表面に付着することがある、微生物の組織化された群集を意図する。バイオフィルムは、マクロビオティクスおよび抗微生物剤に対して非常に耐性である。それらは、歯肉組織、歯および修復物上で生存し、歯周プラーク疾患としても公知の虫歯および歯周病を引き起こす。それらは、慢性中耳感染症も引き起こす。バイオフィルムは、歯科インプラント、ステント、カテーテルラインおよびコンタクトレンズの表面上でも形成され得る。それらは、ペースメーカー、心臓弁置換物、人工関節および他の外科的インプラント上で成長する。疾病管理センターは、院内で起こる（病院内で獲得される）感染症の６５％よりも多くが、バイオフィルムによって引き起こされると推定している。それらは、慢性膣感染症を引き起こし、免疫系が妨害されている人々において生命を脅かす全身性感染症に至る。バイオフィルムは、多くの疾患にも関与する。一実施形態では、バイオフィルムは、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質を含む。さらなる実施形態では、バイオフィルムは、ＩＨＦおよび／またはＨＵを含む。またさらなる実施形態では、バイオフィルムは、ＩＨＦＡおよび／またはＩＨＦＢを含む。
細菌はまた、プランクトン様に、すなわち、単一細胞として浮遊して、および／またはバイオフィルムを形成しないが表面に付着して、存在していてもよい。一部の実施形態では、プランクトン様細菌は、人工的に、例えば、超音波処理を介して研究室で生成される。一部の実施形態では、出願人が、そのような新たに放出された（ＮＲｅｌ）細菌が、超音波処理によって生成したプランクトン様細菌と比較して、異なって機能することを発見したので、本明細書で使用される場合、プランクトン様細菌は、本明細書に開示される組成物の処置に起因してバイオフィルムから放出されたそれらの細菌を含まない。ＮＲｅｌ細菌のより多くの特徴およびプランクトン様のものと比較したそれらの相違を、本明細書に、例えば、表２および３に開示する。
バイオフィルムは、限定されるものではないが、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えば、Ｂ３１）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、Ｔｏｈａｍａ Ｉ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（例えば、６６８）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ（例えば、ＨＩ２４２４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、Ｋ１２ ＭＧ１６５５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（例えば、Ｖ５８３）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、Ｒｄ ＫＷ２０）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（例えば、２６６９５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（例えば、ＲＨ４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（例えば、ＭＣ２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えば、ＣＤＣ１５５１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（例えば、ＦＡ１０９０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（例えば、ＭＣ５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（例えば、Ｗ８３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（例えば、１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）２５８４５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＭＷ２）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（例えば、ＲＰ６２Ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（例えば、２６０３Ｖ／Ｒ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（例えば、ＵＣＮ３４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ（例えば、ＮＣＴＣ ７８６８（Ｃｈａｌｌｉｓ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（例えば、ＵＡ１５９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、Ｒ６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＭＧＡＳ１０２７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（例えば、６７１５）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（例えば、ｔｙｐｈｉ、ＣＴ１８）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）３５４０５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｕｍ（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ（例えば、Ｅｌ Ｔｏｒ、Ｎ１６９６１）によって引き起こされるものを含む多数の疾患にも関与する。バイオフィルムに関連することおよび／またはそれを形成することが公知の追加の生物としては、限定されるものではないが、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが挙げられる。例えば、嚢胞性線維症患者は、多くの場合に抗生物質耐性バイオフィルムをもたらすＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染症を有する。バイオフィルムに関連する他の疾患としては、限定されるものではないが、嚢胞性線維症患者の肺感染症、中耳炎、鼓膜切開チューブ挿入後の耳漏（ottorhea）、慢性化膿性中耳炎、自然弁感染性心内膜炎、骨髄炎、鼻副鼻腔炎（rhinosinositis）、前立腺炎、尿路感染症、創傷、虫歯および歯周炎が挙げられる。食物経由病原体、例えば、限定されるものではないが、上記にリストされた生物（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）の一部も、それらが汚染する食品上でバイオフィルムを形成し得る。動物においてバイオフィルムを引き起こす疾患（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ種）も、下流の食品汚染および／またはヒト宿主における疾患を引き起こし得る。さらに、バイオフィルムは、１つの同種の微生物集団のものである必要はなく、他の病原体およびさらに宿主細胞に組み込んでいてもよい。
院内で起こるおよびその他の両方で疾患に関連するもの、ならびに食品汚染に加えて、バイオフィルムは、最も注目すべきは、水を処理すること、およびそれらと接触する表面に関して、工業汚染の原因である場合が多い。工業汚染物としてバイオフィルムを形成する生物を含む複雑な事態としては、限定されるものではないが、バイオフィルム形成の結果としての生物腐食、生物付着、および設備の損傷が挙げられる。工業的状況でのバイオフィルムに関連する非限定的な例示的生物としては、Ferrera et al. (2015) Biofouling 31(2):173-180に開示されているものおよびＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ種が挙げられる。バイオフィルムに関する追加の詳細は、例えば、Donlan (2002) Emerging Infectious Diseases 8(9):881-890に見られ得る。
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓは、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科に属するグラム陰性の多形性のｃｏｃｃｏｂａｃｉｌｌｉ細菌の属である。これらの生物は、上気道、口、膣、および腸管の粘膜を阻害する。この属は、軟性下疳の原因病原体であるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉなどの一部の重要な病原体種と一緒に共生生物を含む。すべての膜は、好気性または通性に嫌気性のいずれかである。
「Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ」という用語は、例えば、耳感染症、眼感染症、ＯＭおよび副鼻腔炎などの多くの異なる感染症を引き起こし得る病原性細菌を指す。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａの臨床分離株は、細菌上の型特異的多糖莢膜の存在もしくは非存在にそれぞれ応じて、血清型「ａ」から「ｆ」、または分類不可能（ＮＴＨＩ）のいずれかとして分類される。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの多くの異なる株が分離されており、ＩｈｆＡ、ｉｈｆＢおよびｈｕｐＡ遺伝子またはタンパク質を有する。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの異なる株の一部の非限定的な例としては、Ｒｄ ＫＷ２０、８６－０２８ＮＰ、Ｒ２８６６、ＰｉｔｔＧＧ、ＰｉｔｔＥＥ、Ｒ２８４６、および２０１９が挙げられる。プロトタイプＮＴＨｉ分離株は、慢性ＯＭを有する子供から回収された低継代分離株８６－０２８ＮＰである。８６－０２８ＮＰは、２００１年１０月１６日に、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０に寄託され、寄託番号ＰＴＡ－４７６４が割り当てられた。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、本明細書で議論されるバイオフィルムは、多微生物性バイオフィルム、すなわち、２つ以上の細菌を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる多微生物性バイオフィルムである。一部の実施形態では、バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌を含む。さらなる実施形態では、多微生物性バイオフィルムは、２つ以上のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。加えて、または代替的に、多微生物性バイオフィルムは、１つまたは２つ以上のＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓではない細菌（すなわち、非Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌）を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（例えば、分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）、Ｒｄ ＫＷ２０、８６－０２８ＮＰ、Ｒ２８６６、ＰｉｔｔＧＧ、ＰｉｔｔＥＥ、Ｒ２８４６、および２０１９のうちの１つまたは複数）を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。
一部の実施形態では、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌は、分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一実施形態では、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌は、分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）の１つの株、例えば、８６－０２８ＮＰ、および必要に応じて、ＮＴＨＩ以外の１つもしくは複数の細菌（すなわち、非ＮＴＨＩ細菌）を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ＨＩ１７１６またはＮＴＨＩ ２０１９などの他のＮＴＨＩ株は、当業者によって特定され得る。例えば、Greiner et al. 2004を参照されたい。別の実施形態では、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌は、分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）の２つ以上の株、および必要に応じて、ＮＴＨＩ以外の１つもしくは複数の細菌を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の態様では、多微生物性バイオフィルムは、ＮＴＨＩ、およびＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのうちの１つまたは複数によって引き起こされる。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、非Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌および／または非ＮＴＨＩ細菌は、以下のうちの１つまたは複数から選択される：Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、ＥＳＫＡＰＥＥ病原体（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．から選択される）、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（例えば、Ｂ３１）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（例えば、Ｔｏｈａｍａ Ｉ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（例えば、６６８）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ（例えば、ＨＩ２４２４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、Ｋ１２ ＭＧ１６５５）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（例えば、Ｖ５８３）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（例えば、２６６９５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（例えば、ＲＨ４）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（例えば、ＭＣ２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（例えば、ＣＤＣ１５５１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（例えば、ＦＡ１０９０）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（例えば、ＭＣ５８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（例えば、Ｗ８３）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（例えば、１７）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）２５８４５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、ＭＷ２）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（例えば、ＲＰ６２Ａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（例えば、２６０３Ｖ／Ｒ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（例えば、ＵＣＮ３４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ（例えば、ＮＣＴＣ ７８６８（Ｃｈａｌｌｉｓ））、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ（例えば、ＵＡ１５９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（例えば、Ｒ６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（例えば、ＭＧＡＳ１０２７０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ（例えば、６７１５）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（例えば、ｔｙｐｈｉ、ＣＴ１８）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）３５４０５）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｕｍ（例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ（例えば、Ｅｌ Ｔｏｒ、Ｎ１６９６１）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ（Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、Ｂ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｂ．ｍａｌｌｅｉ、Ｂ．ｃｅｐａｃｉ、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、またはＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、多微生物性バイオフィルムは、ＮＴＨＩ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、またはＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、多微生物性バイオフィルムは、再発性、または抗生物質単剤療法に対して抵抗性である。本明細書で使用される場合、抗生物質単剤療法、すなわち、バイオフィルムの処置において抗生物質のみを使用することを指す抗生物質単剤療法に対して抵抗性のバイオフィルムは、所望の効果をもたらさず、および／またはバイオフィルムの再発を防止しない。
バイオフィルムは、バイオフィルム内在細菌が、宿主免疫エフェクターおよび抗生物質による死滅に対して非常に抵抗性であるという事実に起因して、細菌性疾患の慢性化および再発に大いに寄与する。そのため、バイオフィルム所在から周囲の環境への細菌の抗体媒介放出は、そうでなければ処置が困難なバイオフィルム関連疾患を解決する強力な戦略を支持する。以前の研究では、出願人は、分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）の２つの固有の決定基（例えば、ＮＴＨＩのＩＶ型線毛（Ｔ４Ｐ）または細菌性ＤＮＡＢＩＩ ＤＮＡ結合タンパク質、細菌性バイオフィルムに構造的完全性を提供する種に無関係な標的）に対する抗体が、別個の機構を介してバイオフィルム内在細菌を放出することを明らかにした。本明細書では、出願人は、得られた新たに放出された（またはＮＲｅｌ）ＮＴＨＩの表現型が、放出の特異的機構に依存することを示した。出願人は、フローサイトメトリー、プロテオミクスプロファイル、および標的化トランスクリプトミクスを使用して、２つのＮＲｅｌ集団が、プランクトン様に成長したＮＴＨＩからだけでなく、重要なことには、遺伝的同一性にもかかわらず、互いと有意に異なったことを示した。また、それぞれのＮＲｅｌ集団は、プランクトン様ＮＴＨＩと比較して、スルホンアミド抗生物質またはβ－ラクタム抗生物質のいずれかによる死滅に対する明確に異なる有意に増加した敏感性、それらの個々のプロテオームと一致した観察を有し、さらに、標的化遺伝子発現における相対的な相違によって支持された。Ｔ４ＰまたはＤＮＡＢＩＩ結合タンパク質の特異的エピトープに対する抗体によってバイオフィルムから放出されたＮＴＨＩの明確に異なる表現型は、バイオフィルムの根絶および疾患の解決のための標的化治療戦略を開発するための新たな機会を提供する。抗ｒｓＰｉｌＡが、予想外であるがＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓによって発現されないＮＴＨＩ抗原を特異的に標的にすること、抗ｒｓＰｉｌＡが、純粋なＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓバイオフィルムに対して効果を有さない一方で、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが、ＮＴＨＩの固有の構造形態とバイオフィルムを構築するのを可能にし、それによって、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが、ＮＴＨＩバイオフィルムのローンの中央にこれらの「バレル」に見える構造を構築する場合に、ＮＴＨＩが、次にそのＩＶ型線毛を使用して、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ「バレル」の上で単収縮して、それらを完全に覆うことも公知である。抗ｒｓＰｉｌＡによるＮＴＨＩ＋Ｍｃａｔ多微生物性バイオフィルムの処置が、ＮＴＨＩがそれ自身を分散させることを示した。
一部の実施形態では、バイオフィルムは、グラム陰性またはグラム陽性のバイオフィルム産生細菌に由来する。状態の非限定的な例は、静脈性潰瘍および糖尿病性足潰瘍を含む慢性の非回復期創傷、耳感染症、静脈洞感染症、尿路感染症、胃腸管疾病、肺感染症、気道感染症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、カテーテル関連感染症、留置デバイス関連感染症、移植されたプロステーシスに関連する感染症、骨髄炎、蜂巣炎、膿瘍、ならびに歯周病の群から選択される。
ＰｉｌＡおよびワクチン
ＮＴＨＩによって引き起こされる気道の疾患に対するワクチンを開発するための出願人の長年にわたる努力において、出願人は、２つの固有のバイオフィルム関連決定基に焦点を合わせた。第１の標的は、付着、コロニー形成、バイオフィルム形成、単収縮性運動および形質転換受容性において複数の役割を有する重要な付着因子であるＮＴＨＩ Ｔ４Ｐである（Bakaletz et al., 2005；Carruthers et al., 2012；Das et al., 2017；Jurcisek et al., 2007；Mokrzan et al., 2019；Mokrzan et al., 2016；Toone et al., 2020）。ＮＴＨＩ Ｔ４Ｐ（ＰｉｌＡ）の大多数サブユニットに対する抗体、およびＰｉｌＡの特異的な組換え体および可溶性形態（「ｒｓＰｉｌＡ」）に対する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで既存のＮＴＨＩおよび多微生物性バイオフィルム、ならびにまたＮＴＨＩ誘発性ＯＭの臨床モデルにおいて中耳内に存在するバイオフィルムの分散を誘導し、ここで、バイオフィルムの分散は、迅速な疾患の解決をもたらす（Mokrzan et al., 2018；Novotny et al., 2009；Novotny et al., 2013b；Novotny et al., 2016；Novotny et al., 2015；Ysebaert et al., 2019）。この転帰についての機構は、Ｔ４ＰおよびＬｕｘＳ両方の発現を必要とし、後者は、ＮＴＨＩにおけるクオラムセンシングを媒介する（Armbruster et al., 2009；Daines et al., 2005；Surette et al., 1999）。Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒらは、クオラムセンシング分子である自己誘導物質２（ＡＩ－２）のｌｕｘＳ誘導産生が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増加したバイオフィルム形成、およびＯＭのチンチラモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで持続をもたらすことを示し（Armbruster et al., 2009）、さらに、ＮＴＨＩが、ＲｂｓＢを介してその環境からＡＩ－２を吸収することを明らかにした（Armbruster et al., 2011）。バイオフィルム成熟およびバイオフィルム分散の防止におけるｌｕｘＳ媒介ＡＩ－２シグナル伝達の役割は、ｌｕｘＳ発現を誘導可能であったＮＴＨＩ構築物を使用したＰａｎｇらによってさらに実証された（Pang et al., 2018）。
研究は、抗ｒｓＰｉｌＡ抗体によって誘導されるバイオフィルム分散の間の、ＮＴＨＩ Ｔ４Ｐ発現およびＡＩ－２のｌｕｘＳ誘導産生の両方を必要とする特異的なｌｕｘＳクオラムシグナル伝達についての追加の役割を明らかにした（Novotny et al., 2015）。ＮＴＨＩは、インキュベーションの６時間以内に上清への最大の分散で、「トップダウン」プロセスにおいて放出される（Mokrzan et al., 2018；Novotny et al., 2015）。Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒらはまた、ＡＩ－２を発現しないＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが、これらの２つの種によって形成される多微生物性バイオフィルム内でＮＴＨＩによって生じるＡＩ－２シグナルにおける「傍受」にもかかわらず、増加したＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓバイオフィルム形成をもたらすことを示した（Armbruster et al., 2010）。興味深いことに、出願人が、事前に形成した二重種のＮＴＨＩとＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓのバイオフィルムを、ｒｓＰｉｌＡに対する抗体（ＮＴＨＩによってもっぱら発現される抗原を標的にする）とともにインキュベートした場合、ＮＴＨＩおよびＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓは両方とも、バイオフィルムから分散された（Mokrzan et al., 2018）。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ分散についての機構は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが抗ｒｓＰｉｌＡへの曝露に応答してＮＴＨＩによって産生されたＡＩ－２において傍受されている別の例を明らかにした（Mokrzan et al., 2018）。
ＰｉｌＡは、ＩＶ型線毛主要サブユニットタンパク質について短い。ＩＶ型線毛は、典型的には、５～７ｎｍの直径、数マイクロメートルの長さであり、単一タンパク質のＳｕｂ ｐｅｒｔｕｒｎから構成される（Bardy et al., Microbiology, 149,295-304, 2003；Wall and Kaiser, Mol. Microbiol., 32, 1-10, 1999）。ＩＶ型ピリンサブユニットは、通常、１４５～１６０アミノ酸の長さであり、グリコシル化またはリン酸化されていてもよい。ＩＶａ型およびＩＶｂ型の２つのピリンサブユニットのクラスがあり、これらは、リーダーペプチドおよび成熟サブユニットの平均長さによって互いと区別され、このＮメチル化アミノ酸は、成熟タンパク質のＮ末端位置および平均長さのＤ領域（ジスルフィド領域のため）を占める。呼吸器病原体のほとんどは、クラスＩＶａピリンを発現する一方、腸管病原性のものは、より典型的には、クラスＩＶｂピリンを発現する。ＩＶａ型線毛は、高度に保存された疎水性Ｎ末端メチル化フェニルアラ（phenylala）１Ｃの存在によって区別される。
一部の実施形態では、ＰｉｌＡの生物学的に活性な断片は、野生型ＰｉｌＡの少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％、もしくは少なくとも１．５倍、もしくは少なくとも２倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも６倍、もしくは少なくとも７倍、もしくは少なくとも８倍、もしくは少なくとも９倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍、またはそれよりも高い生物活性を有する。一部の実施形態では、ＰｉｌＡの生物学的に活性な断片は、ＰｉｌＡの断片を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、生物活性は、ＰｉｌＡに対して対象における抗体または他の免疫応答を誘導することを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。そのような生物活性は、例えば、生物学的に活性な断片で免疫された対象の試料中の抗体の濃度および／またはＰｉｌＡ親和性を定量化することを介して、当業者によって測定され得る。加えて、または代替的に、本明細書の生物活性は、対象におけるバイオフィルムを防止すること、阻害すること、破壊すること、分散させること、または処置することのうちの１つもしくは複数を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、ＰｉｌＡは、本明細書に開示されるキメラタンパク質である。本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、ＰｉｌＡまたはその生物学的に活性な断片は、分類不可能なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）のＩＶ型線毛主要サブユニットタンパク質（ＰｉｌＡ）の断片、およびＮＴＨＩ ＯＭＰ Ｐ５タンパク質（Ｐ５－フィンブリン、フィンブリンまたはＯＭＰ Ｐ５－相同付着因子とも呼ばれる）の断片を含むキメラタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。さらなる実施形態では、ＰｉｌＡまたはその生物学的に活性な断片は、ＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを提示するように改変されたＰｉｌＡを含むキメラタンパク質を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ＰｉｌＡまたはその生物学的に活性な断片として、本明細書に開示される１つまたは複数のキメラタンパク質を含むワクチン組成物、および本明細書に開示されるキメラタンパク質を使用する免疫応答を誘発する方法も本明細書に提供される。そのようなキメラタンパク質は、米国特許第ＵＳ７８１１５９１号に開示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、ＰｉｌＡまたはその生物学的に活性な断片は、本明細書に記載されるキメラタンパク質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
ＬＢ１ペプチドは、ＮＴＨＩに対する免疫原性応答を誘導し、それが退屈な精製技法を必要としないので有益である、４０アミノ酸の合成キメラＰ５－フィンブリン由来ペプチド
である。ＬＢ１ペプチドは、Ｂ細胞エピトープ（Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ、配列番号 ）であるＮ末端の１９アミノ酸ペプチドを含む。Ｂ細胞エピトープは、ＯＭＰ Ｐ５（Ｐ５－フィンブリンまたはＯＭＰ Ｐ５－相同付着因子とも呼ばれる）として表示されるＮＴＨｉの外膜タンパク質（フィンブリン）の予測される表面露出ループ３に由来した。ＬＢ１ペプチドは、短い５ｍｅｒのリンカーペプチドおよび１６残基のＴ細胞プロミスキャスエピトープをさらに含む。Ｔ細胞エピトープは、麻疹ウイルスの融合タンパク質に由来した。Ｔ細胞プロミスキャスエピトープは、このエピトープに曝露された個体において、非常に強いＴ細胞応答を誘導する。
一部の実施形態では、ＰｉｌＡまたはその生物学的に活性な断片は、Ｂ細胞応答を誘導する有効性が低減されていない安全で選択的な担体タンパク質に挿入されたＬＢ１ペプチドの断片を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。好ましくは、ＬＢ１ペプチドの断片は、それ自身がＮＴＨｉ誘発性疾患に対する保護も付与する担体に挿入される。ＮＴＨｉ誘発性疾患に対する保護を誘導し得る１つのそのような担体は、ＰｉｌＡタンパク質としても公知のＮＴＨｉ ＩＶ型線毛（単収縮性線毛）タンパク質
の配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる）を含むタンパク質である。ＰｉｌＡタンパク質は、ｐｉｌＡ遺伝子（
の配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる）によってコードされる。
一部の実施形態では、ＰｉｌＡまたはその生物学的に活性な断片は、免疫原性応答を誘導するペプチドを提示するために、ＬＢ１ペプチドの断片を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。そのようなＬＢ１ペプチドの断片は、１２～３５アミノ酸長、または１５～３０アミノ酸長、または１８～１９アミノ酸長であり得、フィンブリンタンパク質のサブユニットである。一部の実施形態では、ＬＢ１ペプチドの断片は、Ｎ末端アミノ酸配列ＲＳＤＹＫＦＹＥＤＡＮＧＴＲＤＨＫＫＧ（配列番号 ）を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
別の実施形態では、ＰｉｌＡまたはその生物学的に活性な断片は、２４アミノ酸ペプチドを提示するように改変されたＰｉｌＡタンパク質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。２４アミノ酸ペプチドは、ＬＶＲＳＤＹＫＦＹＥＤＡＮＧＴＲＤＨＫＫＧＲＨＴ（配列番号 ）のアミノ酸配列に示されるように改変されたＬＢ１ペプチドのＢ細胞エピトープを含み得、ここで、ロイシンおよびバリンは、ＬＢ１のＢ細胞エピトープのＮ末端に付加され、アルギニン、ヒスチジンおよびトレオニンは、ＬＢ１のＢ細胞エピトープのＣ末端にある。Ｂ細胞エピトープに対するこれらの改変は、タンパク質フォールディングおよび／または抗原提示を支援することが企図される。タンパク質フォールディングおよび／または抗原提示を支援するであろうＬＢ１のＢ細胞エピトープに対する任意の改変が使用され得る。
ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５の表面露出ループ３のアミノ酸配列は、ＮＴＨｉ株間で変わり得る。ＰｉｌＡまたはその生物学的に活性な断片は、ＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５のループ３の任意のバリアントアミノ酸配列のＢ細胞エピトープを提示するように改変されたＰｉｌＡタンパク質の断片を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。特に、ＰｉｌＡまたはその生物学的に活性な断片は、以下のバリアントＮＴＨｉ ＯＭＰ Ｐ５アミノ酸配列：ＲＳＤＹＫＬＹＮＫＮＳＳＳＮＳＴＬＫＮＬＧＥ（配列番号 ）、ＲＳＤＹＫＬＹＮＫＮＳＳＴＬＫＤＬＧＥ（配列番号 ）およびＲＳＤＹＫＦＹＤＮＫＲＩＤ（配列番号 ）のうちの１つを提示するように改変されたＰｉｌＡタンパク質を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。バリアントペプチドはまた、Ｎ末端に付加されたロイシンおよびバリン、ならびにＣ末端に付加されたアルギニン、ヒスチジンおよびトレオニン、またはタンパク質フォールディングおよび／もしくは抗原提示を支援する任意の他の改変により提示され得る。
本発明のキメラタンパク質は、天然ＰｉｌＡアミノ酸が、ＬＢ１ペプチドの一部分で置換されている、改変されたＰｉｌＡアミノ酸を含む。加えて、本発明のキメラタンパク質は、ＬＢ１ペプチドの一部分が、天然ＰｉｌＡアミノ酸内およびそれに加えて挿入されている、改変されたＰｉｌＡアミノ酸配列を含む。本発明のキメラタンパク質は、２つのタンパク質に対する抗体の形成を誘導する能力を有し、したがって、より有効で、より特異的なワクチン候補である。
一実施形態では、キメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質（配列番号５１）の成熟アミノ酸配列（残基１３～１４９）を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの一部分が、配列番号５１の６２位および７２位のシステイン残基間に挿入され、
のアミノ酸配列を有するキメラタンパク質などの天然アミノ酸を置換していてもよい。このキメラタンパク質は、配列番号 の残基４０～１４９を含み、配列番号５１の残基６２と残基７２との間に挿入されたＬＢ１のＢ細胞エピトープ（Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｔｈｒ、配列番号５２）を有する。別の実施形態では、ＬＢ１ペプチドの部分は、配列番号５１の１３１位および１４４位のシステイン残基間に挿入され、
のアミノ酸配列を有するタンパク質などの天然アミノ酸を置換していてもよい。このキメラタンパク質は、配列番号５１の残基４０～１４９を含み、配列番号５１の残基１３１と残基１４４との間に挿入されたＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５２）を有する。
別の実施形態では、キメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質（配列番号５１）の成熟アミノ酸配列（残基１３～１４９）を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの部分は、ＰｉｌＡタンパク質のＣ末端に挿入されている。例えば、
のキメラタンパク質は、配列番号５１の残基４０～１４９を含み、ＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５２）は、配列番号５１の残基１４９の後に挿入されている。
別の実施形態では、キメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質（配列番号５１）の成熟アミノ酸配列（残基１３～１４９）を含み、ここで、ＬＢ１ペプチドの部分は、ＰｉｌＡタンパク質のＮ末端に挿入されている。例えば、
のキメラタンパク質は、配列番号２の残基４０～１４９を含み、ＬＢ１のＢ細胞エピトープ（配列番号５２）は、配列番号５１の残基４０の前に挿入されている。
さらなる実施形態では、キメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分、および本明細書に記載されるＬＢ１ペプチドのうちの１つまたは複数を含む。本発明のキメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部内に２回以上の同じＬＢ１ペプチドが存在するもの、およびＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部内に２つまたはそれよりも多くの異なるＬＢ１ペプチドが存在するものを含む。
本開示は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分、および免疫応答を誘発する任意の抗原性タンパク質を含むキメラタンパク質をさらに提供する。
キメラタンパク質は、遺伝子ｐｉｌＡによってコードされるＮＴＨｉ ＩＶ型線毛の主要サブユニットの全長または一部分を含んでいてもよい。ＮＴＨｉ分離株８６－０２８ＮＰのＰｉｌＡタンパク質（例えば、配列番号５１）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，５０１，１３１号に記載されている核酸配列によってコードされる。ＮＴＨｉ臨床分離株１７２８ＭＥＥ、１７２９ＭＥＥ、３２２４Ａ、１０５４８ＭＥＥ、１０６０ＭＥＥ、１８８５ＭＥＥ、１７１４ＭＥＥ、１２３６ＭＥＥ、１１２８ＭＥＥおよび２１４ＮＰ由来のＰｉｌＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。これらのＰｉｌＡポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ、
に示される。代替コドン使用頻度の可能性は、具体的には、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて企図される。一実施形態では、ポリペプチドは、それぞれ、米国特許第７，８１１，５９１号に開示される配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９および５１（配列のそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ＮＴＨｉ ＰｉｌＡタンパク質の一部分を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５１にそれぞれ示されるＮＴＨｉ ８６－０２８ＮＰアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドは、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２および６３に示されるＰｉｌＡポリペプチドも含む。追加の実施形態では、本発明のＰｉｌＡポリペプチドは、他の分類不可能なＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株のもの、ならびにＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株ａ、ｂ、ｃ、ｅおよびｆ由来のものである。
ＰｉｌＡのポリペプチドは、具体的には、本発明の全長ポリペプチドの１つもしくは複数の生物学的なまたは免疫原性の特性を保持するＰｉｌＡポリペプチドのペプチド断片（すなわち、ペプチド）または断片を含む。一実施形態では、本発明によって提供されるＰｉｌＡペプチド断片は、ＴｆｐＱ２、ＴｆｐＱ３、ＴｆｐＱ４およびＯＬＰ３と指定され、それぞれ、配列番号５１のアミノ酸３５から６８、配列番号５１のアミノ酸６９から１０２、配列番号５１のアミノ酸１０３から１３７、および配列番号５１のアミノ酸２１から３５を含む。本開示によって提供される別のＰｉｌＡペプチド断片は、配列番号５１のアミノ酸４０から１４９を含む。
一部の実施形態では、キメラタンパク質は、ＰｉｌＡポリペプチドの生物活性および／または免疫原性活性に影響を及ぼさない１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有するＰｉｌＡポリペプチドの一部分を含む。あるいは、ＰｉｌＡポリペプチドは、生物活性を変更してもよく、または変更しなくてもよい、保存的アミノ酸置換を有することが企図される。
一部の実施形態では、キメラタンパク質は、本発明のＮＴＨｉ ＰｉｌＡポリペプチドのバリアントの一部分（例えば、生物活性および／または免疫原性活性を保持する配列番号５１、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２および６３のポリペプチドに対して、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、典型的には、少なくとも約９５％、９６％、９７％、より典型的には、少なくとも約９８％、または最も典型的には、少なくとも約９９％のアミノ酸同一性を示すポリペプチド）を含む。加えて、配列中の改変は、適切な残基の置換、付加または削除によって容易に行われる。例えば、システイン残基は、カルボキシ末端に付加されて、担体タンパク質に好都合な連結のためのスルフヒドリル基を提供してもよく、または追加のグリシン残基などのスペーサーエレメントは、ペプチドのＣ末端で連結しているアミノ酸とペプチドの残部との間の配列に組み込まれていてもよい。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、ＰｉｌＡは、組換えの可溶性ＰｉｌＡ（ｒｓＰｉｌＡ）である。組換えＰｉｌＡタンパク質（ｒＰｉｌＡ）は、より容易に再生可能な産物としての機能を果たすように生成されてもよい。これを行うために、天然ピリンサブユニットの機能的性質を有するようにｒＰｉｌＡが同様に適切にフォールドされることが重要であるので、４つのＣｙｓ残基も有するピリンを研究したKeizer et al. (J. Biol. Chem., 276:24186-14193, 2001)の公開されたプロトコールが利用される。簡潔には、切断型ピリンは、操作され、ここで、最初の２８残基が、Ｎ末端から除去されて、凝集が防止され、この切断型ピリンは、構築物中のＯｍｐＡリーダー配列の組み込みによってペリプラズムに輸送されるようにさらに操作される。この戦略を使用して、Ｋｅｉｚｅｒらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでその受容体（ａｓｉａｌｏ ＧＭ１）に結合することができ、ペプチドが異種チャレンジの１５分前に送達された場合に、マウスにおける罹患率および死亡率を減少させる、組換えの可溶性単量体Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａピリンタンパク質を生成した。この可溶性の単量体の切断型ＮＴＨｉ ＰｉｌＡは、本明細書に記載される研究において有用である。
一部の実施形態では、キメラタンパク質は、標準的な技法を使用して、合成され、精製され、配列決定されてもよい。例えば、キメラタンパク質は、段階的なＦｍｏｃ－ｔｅｒｔ－ブチル固相合成によって半手動でアセンブルされ、ＨＰＬＣによって精製されてもよい。組換えの合成キメラタンパク質の組成およびアミノ酸配列は、アミノ酸分析および／または質量スペクトル分析によって確認されてもよい。
抗ＰｉｌＡ抗体
一部の実施形態では、抗ＰｉｌＡ抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。一態様では、ポリクローナル抗体は、ＰｉｌＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片で免疫された対象から単離された血清中にある。一部の実施形態では、そのような血清は、精製および処理されて、例えば、消化されて、抗体のＦａｂ断片を産生し得る。
一態様では、抗体は、ＰｉｌＡペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合し、そのような例としては、表面抗原または組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）が挙げられる。一態様では、抗体は、ポリクローナル抗体である。別の態様では、抗体は、モノクローナル抗体またはその生物学的に活性な断片である。モノクローナル抗体、その誘導体、断片およびバリアントを生成する方法は、当技術分野において公知である。
一部の実施形態では、抗ＰｉｌＡ抗体の生物学的に活性な断片は、参照抗ＰｉｌＡ抗体の少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％、もしくは少なくとも１．５倍、もしくは少なくとも２倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも６倍、もしくは少なくとも７倍、もしくは少なくとも８倍、もしくは少なくとも９倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍、またはそれよりも高い生物活性を有する。一部の実施形態では、生物活性は、ＰｉｌＡを特異的に認識し、それに特異的に結合することを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。そのような生物活性は、例えば、参照抗体と比較して、抗体のＰｉｌＡ親和性および／もしくは特異性、ならびに／またはＰｉｌＡの競合的結合を定量化することを介して、当業者によって測定され得る。加えて、または代替的に、本明細書の生物活性は、対象におけるバイオフィルムを防止すること、阻害すること、破壊すること、分散させること、もしくは処置することのうちの１つもしくは複数を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、生物活性は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌を死滅させる能力を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。他の好適な活性は、以下から選択されてもよい：菌力を低減すること、付着を阻害すること、単収縮性運動を阻害すること、細胞分裂を阻害すること、ならびに／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌の上皮への侵入および／もしくはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ細菌のファゴサイトーシスの増強を阻害すること。一部の実施形態では、抗ＰｉｌＡ抗体またはその生物学的に活性な断片は、ＰｉｌＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片に特異的に結合し、それを特異的に認識する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に媒介される細菌アッセイ系（Musher et al., Infect. Immun. 39:297-304, 1983；Anderson et al., J. Clin. Invest. 51:31-38, 1972）を使用して、抗キメラタンパク質抗体の生物活性を測定してもよい。
ＤＮＡＢＩＩ
組込み宿主因子（ＩＨＦ）は、細菌性バイオフィルムマトリックスの重要な構造エレメントである。ＩＨＦおよびＨＵ（ヒストン様タンパク質）は、細菌ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡＢＩＩファミリーの遍在性の２つのメンバーを含む。ＩＨＦおよび／またはＨＵをコードする遺伝子は、真正細菌のあらゆるメンバーのゲノム中に存在する（Goodman et al., 2011）。それ故に、この標的は、ＮＴＨＩに固有ではないが、代わりに、高い優先度のＥＳＫＡＰＥ病原体（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．）のそれぞれを含む、これまでのすべての試験された病原体形成バイオフィルム中のその存在に起因して種独立性である（Devaraj et al., 2018；Devaraj et al., 2015；Novotny et al., 2013a）。細胞外ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）および関連するＤＮＡＢＩＩタンパク質は、これらのバイオフィルムの基本的構造物および構造完全性に必須である（Flemming and Wingender, 2010；Goodman et al., 2011；Jurcisek and Bakaletz, 2007；Whitchurch et al., 2002）。バイオフィルムマトリックス内で、ｅＤＮＡの交差した鎖は、ＩＨＦおよびＨＵによって安定化される（Swinger and Rice, 2004）。結果は、バイオフィルム構造物を支持および維持する格子様ｅＤＮＡ足場である。細菌性バイオフィルムのＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗体への曝露は、ｅＤＮＡマトリックスを不安定にし、バイオフィルム構造の崩壊を引き起こす（Goodman et al., 2011）。この転帰のための機構は、バイオフィルムを取り囲む環境中のＤＮＡＢＩＩ分子が、抗体複合体の形成に起因して隔離され、このようにして、ｅＤＮＡマトリックス内のＤＮＡＢＩＩタンパク質が放出される、平衡シフトの誘導である（Brockson et al., 2014；Novotny et al., 2016）。結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗ＤＮＡＢＩＩ抗体への曝露の３分以内に開始する、ｅＤＮＡ足場の突然の完全な崩壊およびバイオフィルム内在細菌の放出である（Brockson et al., 2014；Novotny et al., 2019）。ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対するワクチン誘導抗体は、宿主免疫エフェクターによるクリアランスを許容するＮＴＨＩ誘発性ＯＭのチンチラモデルにおいて既存のバイオフィルムを破壊する（Goodman et al., 2011；Novotny et al., 2019；Novotny et al., 2016）。また、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体による治療的処置は、既存のＡｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓバイオフィルムのラットモデルにおける溶骨性インプラント周囲炎を解決し（Freire et al., 2017）、マウス肺からのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの凝集バイオフィルムも根絶する（Novotny et al., 2016）。
「核様体関連タンパク質」または「ＮＡＰ」という用語は、本明細書で使用される場合、原核細胞の核様体中の核酸の動的な空間組織化に影響を及ぼすタンパク質のクラスを指す。これらのタンパク質は、ＤＮＡの屈曲、結合、および凝集をもたらすことにより、ゲノムを組織化する。ある特定のＮＡＰは、ＤＮＡ結合タンパク質であり、ＤＮＡＢＩＩタンパク質であるＤＰＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４９１６９）、Ｈ－ＮＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４７７４０）、Ｈｆｑ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＣＥ６３２５６）、ＣｂｐＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＡＡ０３９５０）、およびＣｂｐＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１８８１３）を含むバイオフィルムに関連し得る。ＮＡＰのうち、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、明確に異なり、一般に、アルファへリックス二量体化ドメインとの強い配列同一性を有し、逆平行ベータリボンを含んでいてもよく、これは、多くの場合、ＤＮＡの副溝に結合し、その中に挿入されるチップを含む
（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸配列であるか、またはアミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択され得る）を有し、それをもつれさせる。機能的プロトマーは、同一または相同サブユニットの二量体である。
ＤＮＡＢＩＩファミリーは、細胞内細菌核様体を一部では形作る細菌タンパク質の核様体関連タンパク質（ＮＡＰ）と称されるタンパク質のクラスのメンバーである（Browning et al. (2010) Curr. Opin. Microbiol. 13:773-780）。加えて、このファミリーは、遍在性で、実際上、すべての真正細菌によって発現される。これまでにすべての特徴付けられたファミリーメンバーは、サブユニットのホモ二量体またはヘテロ二量体いずれかとして機能する。ファミリーは、ＨＵ（ヒストン様タンパク質）およびＩＨＦ（組込み宿主因子）の２つの種類に分けられ、Ｂ．ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａは両方を発現することができる（株Ｊ２３１５遺伝子：ＢＣＡＬ３５３０、ｈｕｐＡ；ＢＣＡＬ１５８５、ｈｕｐＢ；ＢＣＡＬ１４８７、ｉｈｆＡ、およびＢＣＡＬ２９４９、ｉｈｆｂ）。これらのファミリーメンバー間の主な差異は、ＨＵが独立した様式で配列中のＤＮＡに結合する一方で、ＩＨＦが属にわたって保存されたコンセンサス配列（ＷＡＴＣＡＡＮＮＮＮＴＴＲ（ここで、Ｗは、ＡまたはＴであり、Ｒは、プリンである）、配列番号 ）に結合する点である（Swinger et al. (2004) Curr. Opin. Struct. Biol. 14:28-35）。すべてのＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ＤＮＡに結合して、それを大きく屈曲させる、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＩＨＦは、実際上、ＵターンにＤＮＡを屈曲させることができる（Rice et al. (1996) Cell 87:1295-1306）。加えて、すべてのファミリーメンバーは、屈曲前またはカーブしたＤＮＡ構造、例えば、ＤＮＡ組換えの中央の十字型様構造であるホリデイジャンクションに対する優先傾向を有する。実際に、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、遺伝子発現、組換え、修復および複製を含むすべての細胞内ＤＮＡ機能を促進する補助因子として機能する（Swinger et al. (2004) Curr. Opin. Struct. Biol. 14:28-35）。
「ＤＮＡＢＩＩポリペプチドまたはタンパク質」は、ＤＮＡ結合性ドメインから構成され、このようにして、微生物ＤＮＡに対して特異的なまたは一般的な親和性を有するＤＮＡ結合タンパク質またはポリペプチドを意図する。一態様では、それらは、副溝においてＤＮＡに結合する。ＤＮＡＢＩＩタンパク質の非限定的な例は、組込み宿主因子（ＩＨＦ）タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ株Ｕ９３由来のヒストン様タンパク質（ＨＵ）である。バイオフィルムに関連し得る他のＤＮＡ結合タンパク質としては、ＤＰＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４９１６９）、Ｈ－ＮＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＣＡＡ４７７４０）、Ｈｆｑ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＣＥ６３２５６）、ＣｂｐＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＡＡ０３９５０）、およびＣｂｐＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ＿４１８８１３）が挙げられる。
「組込み宿主因子」または「ＩＨＦ」タンパク質は、それらのＤＮＡを宿主細菌に組み入れるためにバクテリオファージによって使用される細菌タンパク質である。それらは、細胞外微生物ＤＮＡにも結合する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＩＨＦタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、ｈｉｍＡ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＰＯＡ６Ｘ７．１）およびｈｉｍＤ遺伝子（ＰＯＡ６Ｙ１．１）である。これらの遺伝子に対するホモログは、他の生物体において見出される。ある特定の実施形態では、「ＩＨＦ」という用語は、２つのＩＨＦサブユニット：組込み宿主因子サブユニットアルファ（ＩＨＦＡまたはＩｈｆＡ）および組込み宿主因子サブユニットベータ（ＩＨＦＢまたはＩｈｆＢ）の一方または両方を指す。
「ＨＵ」または「Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｕ９３由来のヒストン様タンパク質」は、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉに関連するヘテロ二量体タンパク質のクラスを指す。ＨＵタンパク質は、ＤＮＡジャンクションに結合することが公知である。関連するタンパク質は、他の微生物から単離されている。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＵの完全なアミノ酸配列は、Laine et al. (1980) Eur. J. Biochem 103(3)447-481によって報告された。ＨＵタンパク質に対する抗体は、Ａｂｅａｍから市販されている。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨＵタンパク質サブユニットをコードする遺伝子は、それぞれ、配列番号２９および３０に対応するｈｕｐＡおよびｈｕｐＢである。これらの遺伝子についてのホモログは、他の生物において見出され、他の生物由来のこれらの遺伝子に対応するペプチドは、ＷＯ２０１１／１２３３９６号の表１０に見ることができる。
「表面抗原」または「表面タンパク質」という用語は、細菌細胞などの細胞の表面上のタンパク質またはペプチドを指す。外膜タンパク質の例は、例えば、ＯＭＰ Ｐ５（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿００４１３９０７９．１）、ＯＭＰ Ｐ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＺＺＸ８７１９９．１）およびＯＭＰ Ｐ２６（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＹＰ＿６６５０９１．１）である一方で、表面抗原の例は、ｒｓＰｉｌＡまたは組換えの可溶性ＰｉｌＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＥＦＵ９６７３４．１）およびＩＶ型ピリン（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｙｐ＿００３８６４３５１．１）である。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、ＤＮＡＢＩＩは、組込み宿主因子（ＩＨＦ）またはヒストン様タンパク質（ＨＵ）のタンパク質から選択される。本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、ＤＮＡＢＩＩは、野生型ＤＮＡＢＩＩもしくはその生物学的に活性な断片を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、ＤＮＡＢＩＩの生物学的に活性な断片は、本明細書に開示されるキメラを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一部の実施形態では、ＤＮＡＢＩＩは、ＷＯ２０１４／２０１３０５号の配列番号１から３４８（配列のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、またはそれらのそれぞれの断片もしくは等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。グラム（＋）およびグラム（－）細菌によって産生される他の好適なＤＮＡＢＩＩまたはその生物学的に活性な断片は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９９９，２９１号の表８、ならびにＷＯ２０１４／２０１３０５号、ＷＯ２０１７／０２３８６３号、ＷＯ２０１７／０６６７１９号、ＷＯ２０１８／１２９０９２号、ＷＯ２０１８／１２９０７８号、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４１０８２および同第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０４０５７６号に見ることができる。これらのタンパク質およびそれらの断片に結合する抗体は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体と称される。
さまざまな実施形態のＤＮＡ結合タンパク質の関連部分の配列アライメントは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９９９，２９１号の表９に公開されている。太字は、コンセンサスとの完全な一致を示し、薄い灰色の文字は、保存的アミノ酸変化を示し、薄いまたは濃い影付きの配列は、種にわたって高度に保存されている。アミノ末端および／またはカルボキシ末端の灰色の影付きの未定義の配列は、コンセンサス配列と共有されない未定義のアミノ酸である。この表は、Obeto et al. (1994) Biochimie 76:901-908において以前に公開された情報に基づく。断片「ＡＲＭ」は、表の下部に示され、これらの断片またはそれらの等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるポリペプチド断片は、本明細書で述べられる生物活性を有する。
そのような非限定的な例としては、下記の表にリストされたアミノ酸配列またはそれらの断片もしくは等価物を含む単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドおよびそのそれぞれの等価物が挙げられる。さらなる非限定的な例としては、アミノ酸ＡＡＲＫＧＩＮＰＫＴＫＫＳＩＳＩＰＡＲＫＶＶＲＦ（配列番号 ）を含むか、もしくは代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそのアミノ酸の単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドが挙げられる。またさらなる態様では、本開示は、Ｉ（または代替的に、別の疎水性アミノ酸、例えば、ＶまたはＦ）および／またはＫに改変された６１位および／または６４位のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのアミノ酸に対応するアミノ酸を有する、成熟または組換えＨＵ抗原性ポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドの生物学的等価物は、本開示にさらに挙げられるが、但し、配列は、単離された野生型配列全体を含まない。
各種の種由来の非限定的な例示的ＨＵタンパク質配列のリスト。
好適なポリペプチド断片の非限定的な例としては、限定されるものではないが、
（ａ）
（ｂ）
（ｃ）
（ｄ）
（ｅ）
（ｆ）
（ｇ）
（ｈ）
（ｉ） アミノ酸配列ＮＰＸＴを含むポリペプチド、または
（ｊ） （ａ）から（ｉ）の等価物
が挙げられ、ここで、等価物は、それらに対して少なくとも約８０％の相同性もしくはアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、または高ストリンジェンシーの条件下でアミノ酸配列もしくはその相補体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含み、ここで、高ストリンジェンシーの条件は、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液または脱イオン水を含む。
本明細書で使用される場合、「キメラ」または「キメラペプチド」という用語は、互いに直接的にもしくは間接的に（リンカーを介してなど）コンジュゲートされたＤＮＡＢＩＩポリペプチドの２つまたはそれよりの多くの断片またはドメインを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる組換えポリペプチドを指す。一実施形態では、ドメインは、コンフォメーションチップドメインおよび／またはコンフォメーションテールドメインである。加えて、または代替的に、２つまたはそれよりも多くの断片またはドメインは、同じまたは異なるＤＮＡＢＩＩポリペプチドに由来する。一実施形態では、キメラペプチドは、互いに直接的にもしくは間接的に（リンカーを介してなど）コンジュゲートされたＩｈｆＡのチップドメインおよびＩｈｆＢのチップドメインを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１１，１０４，７２３号を参照されたい。別の実施形態では、キメラペプチドは、互いに直接的にもしくは間接的に（リンカーを介してなど）コンジュゲートされたＩｈｆＡのテールドメインおよびＩｈｆＢのテールドメインを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１１，１０４，７２３号を参照されたい。ポリペプチドの「コンフォメーションチップドメイン」は、構造が、プロリン残基によって典型的には媒介される急な回転を有する逆平行ベータリボンを有する一次アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。ＩＨＦポリペプチドの「チップ」は、ＷＯ２０１８／１２９０７８号の図１に示されている。
ポリペプチドの「コンフォメーションチップドメイン」は、構造が、プロリン残基によって典型的には媒介される急な回転を有する逆平行ベータリボンを有する一次アミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
下記の表は、コンフォメーションチップドメインポリペプチドの例を示す。
ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの「チップ断片」は、例としてＩＨＦアルファおよびＩＨＦベータを使用して、２つのアームのタンパク質を形成するＤＮＡＢＩＩポリペプチドを意図する。そのような非限定的な例としては、ＩｈｆＡのチップ断片（本明細書でＡチップ断片とも称される）：ＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮＰＫＴＧＤＶＶ、配列番号 、およびＩｈｆＢのチップ断片（本明細書でＢチップ断片とも称される）：ＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶＮＬ（配列番号 ）またはＦＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶ（配列番号 ）が挙げられる。
ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの「テール断片」は、バルク培地に曝露され、ＤＮＡまたは他のポリペプチドによって妨げられない両方のタンパク質の領域を意図する。
ある特定の実施形態では、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩは、
（ここで、「Ｘ」は、必要に応じて１～２０アミノ酸を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる必要に応じたアミノ酸リンカー配列であり、「Ｘ１」は、任意のアミノ酸であるか、または代替的に、「Ｘ１」は、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される）のポリペプチド配列を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。さらなる態様では、「Ｘ１」は、ＫまたはＱである。さらなる実施形態では、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩは、
（ここで、「Ｘ」は、必要に応じて１～２０アミノ酸を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる必要に応じたアミノ酸リンカー配列である）のポリペプチド配列を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。またさらなる実施形態では、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩは、
（配列番号 、一部の実施形態では、これは、本明細書でチップキメラとも称される）のポリペプチド配列を含むか、またはそれから本質的になるかまたはまたさらにそれからなる。
ある特定の実施形態では、テールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩは、ＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦ－Ｘ－ＴＬＳＡＫＥＩＥＮＭＶＫＤＩＬＥＦＩＳＱ（配列番号 ）（ここで、「Ｘ」は、必要に応じて１～２０アミノ酸を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる必要に応じたアミノ酸リンカー配列である）のポリペプチド配列を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、リンカーは、本明細書に開示されるいずれか１つまたは複数のものから選択される。一実施形態では、テールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩは、ＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦＧＰＳＬＴＬＳＡＫＥＩＥＮＭＶＫＤＩＬＥＦＩＳＱ（配列番号 ）を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
下記に開示されるＡ１～Ａ４およびＡ６、ならびにＢ１～Ｂ６に開示されるものがポリペプチドとしてさらに提供され、これは、コンフォメーションチップドメイン、およびＤＮＡＢＩＩポリペプチドを産生する本明細書で特定された異なる生物由来のこれらのポリペプチドの等価物を含有しない。配列は、
ＭＡＴＩＴＫＬＤＩＩＥＹＬＳＤＫＹＨＬＳ（本明細書でＡ１とも称される；（配列番号 ））；
ＫＹＨＬＳＫＱＤＴＫＮＶＶＥＮＦＬＥＥＩ（本明細書でＡ２とも称される；（配列番号 ））；
ＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦ（本明細書でＡ３とも称される；（配列番号 ））；
ＫＬＳＧＦＧＮＦＥＬＲＤＫＳＳＲＰＧＲＮ（本明細書でＡ４とも称される；（配列番号 ））；
ＡＲＲＶＶＴＦＫＰＧＱＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫ（本明細書でＡ６とも称される；（配列番号 ））；
ＭＴＫＳＥＬＭＥＫＬＳＡＫＱＰＴＬＳＡＫ（本明細書でＢ１とも称される（配列番号 ））；
ＴＬＳＡＫＥＩＥＮＭＶＫＤＩＬＥＦＩＳＱ（本明細書でＢ２とも称される（配列番号 ））；
ＥＦＩＳＱＳＬＥＮＧＤＲＶＥＶＲＧＦＧＳ（本明細書でＢ３とも称される（配列番号 ））；
ＲＧＦＧＳＦＳＬＨＨＲＱＰＲＬＧＲＮＰＫ（本明細書でＢ４とも称される（配列番号 ））；
ＧＲＮＰＫＴＧＤＳＶＮＬＳＡＫＳＶＰＹＦ（本明細書でＢ５とも称される；（配列番号 ））；および
ＳＶＰＹＦＫＡＧＫＥＬＫＡＲＶＤＶＱＡ（本明細書でＢ６とも称される；（配列番号 ））
を含む。
ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの非限定的な例としては、ＩＨＦまたはＨＵアルファまたはベータポリペプチド；ＩＨＦアルファポリペプチド；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ ＨＵ；Ｅ．ｃｏｌｉ ＨｕｐＡ、ＨｕｐＢ、ｈｉｍＡ、ｈｉｍＤ；Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＨＵ（Ｖ５８３など）が挙げられる。
同じまたは異なる細菌種によって産生され得る３～５のコンフォメーションチップドメインを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる組換えポリペプチドも提供され、そのアミノ酸配列は、同じ（例えば、Ａ５アミノ酸配列すべて）であり得るか、または少なくとも２つ、もしくは少なくとも３つ、もしくは少なくとも４つ、もしくは５つすべてが異なるアミノ酸配列を有し（例えば、Ａ５およびｍＢ４、ならびにそれらのそれぞれの等価物、および
を含有する断片のさまざまな組合せ）、ここで、Ｘ１は、任意のアミノ酸であるか、または一態様では、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴから選択されるアミノ酸である。組換えポリペプチド中のコンフォメーションチップドメインは、線状または分枝状のコンフォメーションであり得る。それらは、それらに連結された検出可能な標識および／または精製標識をさらに含むことができる。チップドメインの構造配向性は、「ヘッド」からテール；テールからヘッド（ここで、ポリペプチドは、３つまたはそれよりも多くのチップドメイン、ヘッドからテールの任意の組合せを含む、例えば、ヘッド－ヘッド－ヘッド）；テール－ヘッド－ヘッド；テール－ヘッド－テールであり得、ここで、野生型配列のアミン末端は、「ヘッド」であり、野生型配列のカルボキシ末端は、ポリペプチドの「テール」である。一態様では、ポリペプチドは、要するに、４１～１２０アミノ酸の長さであり得る。
等価なポリペプチドの非限定的な例としては、それらに対して、またはポリペプチド配列について、少なくとも６０％、もしくは代替的に、少なくとも６５％、もしくは代替的に、少なくとも７０％、もしくは代替的に、少なくとも７５％、もしくは代替的に、８０％、もしくは代替的に、少なくとも８５％、もしくは代替的に、少なくとも９０％、もしくは代替的に、少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチド、または高ストリンジェンシーの条件下でそのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはその相補体によってコードされるポリペプチドが挙げられる。高ストリンジェンシーの条件は、本明細書に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、太字および下線付きのアミノ酸が、重度に保存されており、したがって、一態様では、等価なポリペプチドの設計において改変または変更されないことを決定した。等価なポリペプチドの追加の例としては、例えば、
（ここで、「Ｘ１」は、任意のアミノ酸であるか、または代替的に、「Ｘ１」は、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される）が挙げられる。
等価なポリペプチド、１種の生物学的に活性な断片はまた、アミン末端またはカルボキシ末端のいずれかに（またはその両方に）、最大で２５個、または代替的に、２０個、または代替的に、１５個、または代替的に、最大で１０個、または代替的に、最大で５個のランダムなアミノ酸の付加を有する上記で述べられたポリペプチドからなるか、またはそれを含むポリペプチドも含む。別の態様では、等価なポリペプチドは、対応する野生型配列の隣接アミノ酸および野生型隣接アミノ酸の等価物から選択される、アミン末端またはカルボキシ末端のいずれかに（またはその両方に）、最大で２５個、または代替的に、２０個、または代替的に、１５個、または代替的に、最大で１０個、または代替的に、最大で５個のアミノ酸の付加を有する上記で述べられたポリペプチドからなるか、またはそれを含むポリペプチドも含む。
抗ＤＮＡＢＩＩ抗体
一部の実施形態では、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片は、必要に応じて、ＤＮＡＢＩＩ Ａ５ペプチド、ＤＮＡＢＩＩ ｍＢ４ペプチド、またはＡ５ペプチドおよびｍＢ４ペプチドを含む組換えポリペプチド（すなわち、チップキメラ）のうちの１つまたは複数から選択される、ＤＮＡＢＩＩまたはその生物学的に活性な断片を認識し、それに結合する。
一部の実施形態では、ＤＮＡＢＩＩの生物学的に活性な断片は、参照抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、もしくは少なくとも約１００％、もしくは少なくとも１．５倍、もしくは少なくとも２倍、もしくは少なくとも３倍、もしくは少なくとも４倍、もしくは少なくとも５倍、もしくは少なくとも６倍、もしくは少なくとも７倍、もしくは少なくとも８倍、もしくは少なくとも９倍、もしくは少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍、もしくは少なくとも１００倍、またはそれよりも高い生物活性を有する。一部の実施形態では、生物活性は、ＤＮＡＢＩＩまたはその生物学的に活性な断片を特異的に認識し、それに特異的に結合することを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。そのような生物活性は、例えば、参照抗体と比較して、抗体のＤＮＡＢＩＩ親和性および／もしくは特異性、ならびに／またはＤＮＡＢＩＩもしくは生物学的に活性な断片の競合的結合を定量化することを介して、当業者によって測定され得る。加えて、または代替的に、本明細書の生物活性は、対象におけるバイオフィルムを防止すること、阻害すること、破壊すること、分散させること、または処置することのうちの１つまたは複数を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
好適な抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片は、米国特許第１１，１０４，７２３号、ＷＯ２０１４／２０１３０５号、ＷＯ２０１７／０２３８６３号、ＷＯ２０１７／０６６７１９号、ＷＯ２０１８／１２９０９２号、ＷＯ２０１８／１２９０７８号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０２１／００７２６０号に見ることができ、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に含められる。
抗ＩＨＦ抗体の非限定的な例は、本明細書に記載されており、一態様では、本明細書で特定されたポリペプチドを特異的に認識し、それに特異的に結合する抗体、あるいはそこで特定されたＡｒｍ断片（上記で特定）、あるいはそのようなポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、または配列：ＴＣＴＣＡＡＣＧＡＴＴＴＡ（配列番号）；ＷＡＴＣＡＡＮＮＮＮＴＴＲ（ここで、Ｗは、ＡまたはＴであり、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｒは、ＡまたはＧである；（配列番号 ））；
（本明細書でｈＩＦＡ１とも称される；（配列番号 ））；
（本明細書でｈＩＦＡ２とも称される；（配列番号 ））；
（本明細書でｈＩＦＡ３とも称される；（配列番号 ））；
（本明細書でｈＩＦＡ４とも称される；（配列番号））；
（本明細書でｈＩＦＡ５とも称される；（配列番号 ））；ＡＲＲＶＶＴＦＫＰＧＱＫＬＲＡＲＶＥＫＴＫ（本明細書でｈＩＦＡ６とも称される；（配列番号 ））、またはそれらの等価物のうちの１つもしくは複数を含むポリペプチドの等価物、あるいはそれらに対して、またはポリペプチド配列について、少なくとも６０％、または代替的に、少なくとも６５％、または代替的に、少なくとも７０％、または代替的に、少なくとも７５％、または代替的に、８０％、または代替的に、少なくとも８５％、または代替的に、少なくとも９０％、または代替的に、少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドまたはペプチドであって、高ストリンジェンシーの条件下でそのようなポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはその相補体によってコードされるポリヌクレオチドまたはペプチドのうちの１つまたは複数である。高ストリンジェンシーの条件は、上記に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、太字および下線付きのアミノ酸が、重度に保存されており、したがって、一態様では、等価なポリペプチドの設計において改変または変更されないことを決定した。等価なポリペプチドの追加の例としては、例えば、アミン末端またはカルボキシ末端のいずれかに（またはその両方に）、最大で２５個、または代替的に、２０個、または代替的に、１５個、または代替的に、最大で１０個、または代替的に、最大で５個のランダムなアミノ酸の付加を有する上記で述べられたポリペプチドからなるか、またはそれを含む、ポリペプチドが挙げられる。
ある特定の態様では、本開示は、Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ（配列番号６４）、
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ（配列番号６７）、アミノ酸配列ＮＰＸＴを含むポリペプチド、もしくはそれらのそれぞれの等価物から選択されるアミノ酸配列から本質的になる単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片に関する。さらなる態様では、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドは、合計で、少なくとも１５個、または代替的に、少なくとも１８個、または代替的に、少なくとも２０個のアミノ酸を含む。さらなる態様では、ＮＰＸＴ配列は、ポリペプチドの末端アミノ酸ではない。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体ではない。
加えて、抗体は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質の「チップ」領域に対して生成され得、これは、一態様では、逆平行ベータリボンおよび／または配列ＮＰＸＴ（ここで、「Ｘ」は、任意のアミノ酸を指す）を含有するか、またはそのターンを含有するように変更されている。一部の実施形態では、Ｘは、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴから選択される。そのような抗体は、前記配列の一方または両方の端に約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のアミノ酸の間で必要に応じて隣接した、ＮＰＸＴ配列を含むＤＮＡＢＩＩタンパク質の断片を使用して生成されてもよい。そのような非限定的な例は、下線および太字テキストのコンセンサスアミノ酸配列
により本明細書に開示されている。別の態様では、抗体は、コンセンサス配列ＮＰＸＴ（ここで、「Ｘ」は、任意のアミノ酸であるか、または代替的に、「Ｘ」は、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される）を提供するＤＮＡＢＩＩタンパク質のチップ領域に対して生成されてもよい。当業者は、これらの配列のうちのいずれか１つで、Ｘ位の残基（下記の例では

でマークされる）が、任意のアミノ酸、例えば、Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、またはＴで置換されていてもよいことを認識するであろう。例としては、以下が挙げられる。
配列番号６８：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ、Ａ５断片：
配列番号６９：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ、Ａ５断片：
配列番号６５：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ、改変Ｂ４（ｍＢ４）断片：
配列番号７０：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＡ、Ａチップ断片：
配列番号７１：Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＩｈｆＢ、Ｂチップ断片：
配列番号６６ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＵ、断片：ＶＮＥＲ
一部の実施形態では、
を含むポリペプチドは、少なくとも約２０アミノ酸長であり、ＮＰＸＴは、配列の中心にある。そのような配列の非限定的な例としては、配列番号６８、６９、および６６が挙げられる。あるいは、ＮＰＸＴモチーフ（例えば、上記で述べた通り）を有するポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸の置換または欠失のいずれかによってＮＰＸＴモチーフを除去するように改変することができ、モノクローナル抗体は、これらのポリペプチドに対して生じ得る。出願人は、ＮＰＸＴモチーフを欠くＤＮＡＢＩＩポリペプチドに対して生じた抗体が、画像化する、ならびにバイオフィルムの形成および／または破壊をモニターする診断方法において有用であると決定した。一態様では、ＮＰＸＴモチーフを有するＤＮＡＢＩＩに対して生じた抗体またはそれに結合する抗体、およびＮＰＸＴモチーフを欠くＤＮＡＢＩＩに対して生じた抗体またはそれに結合する抗体（例えば、改変されたポリペプチドまたは天然に存在するポリペプチド）を含むキットが提供される。例えば、キットは、ポリペプチドＡ５、Ｂ４、またはｍＢ４を認識し、それに結合する抗体（治療的）を含むことができ、キットにおいて、ポリペプチドＡ３またはＢ２を認識し、それに結合する抗体（診断的）と組み合わせることができる。キットは、診断、処置、およびバイオフィルム処置のモニタリングのために有用である。
ある特定の態様では、本開示は、配列番号６４～６５、配列番号６６、配列番号６７から選択されるアミノ酸配列を含むか、もしくはそれから本質的になる単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチド、アミノ酸配列ＮＰＸＴを含むポリペプチド、またはそれらのそれぞれの等価物を特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片に関する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体ではない。開示されるハイブリドーマによって産生される非限定的な例示的抗体は、下記の表に開示される。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＩｈｆＡ断片Ａ５（配列番号６８）、ＩｈｆＢ断片Ｂ４（Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ、配列番号７２）、およびＩｈｆＢ断片ｍＢ４（配列番号６５）を特異的に認識し、それに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系は、下記の表にリストされた寄託番号で、ブダペスト条約の規定に準拠して２０１５年７月３０日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、それぞれのハイブリドーマ細胞系を、下記の表にリストする。さらなる非限定的な例示的抗体としては、ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ３ ＮＴＨＩ ９Ｂ１０．Ｆ２．Ｈ３、ＩｈｆＢ２ ＮＴＨＩ ７Ａ４．Ｅ４．Ｇ４、およびＩｈｆＢ２ ＮＴＨＩ ７Ａ４．Ｅ４．Ｇ１１（これらのハイブリドーマは、下記の表にリストされた寄託番号で、ブダペスト条約の規定に準拠して２０１６年８月１日にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託された）によって産生されたＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＩｈｆＡ断片Ａ３（配列番号６４）またはＩｈｆＢ断片Ｂ２（Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ 配列番号７３）を特異的に認識し、それに特異的に結合するもの、ならびに配列番号６６、配列番号６７を含むポリペプチド、アミノ酸配列ＮＰＸＴを含むポリペプチド、またはそれらのそれぞれの等価物を特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体が挙げられる。
一態様では、本開示は、（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体からなる群から選択される抗体に対して少なくとも８５％同一である単離された抗体を提供する。
一態様では、本開示は、（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、または（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のＣＤＲを含む単離された抗体を提供する。一態様では、本開示は、（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、または（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体に対して少なくとも８５％同一であるＣＤＲを有する単離された抗体を提供する。
本明細書に提供される抗体の一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、もしくは（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＭＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のＨＣ可変ドメイン配列を含み、ならびに／またはＬＣ可変ドメイン配列は、（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、もしくは（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のＬＣ可変ドメイン配列を含む。
本明細書に提供される抗体の一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のＨＣ可変ドメイン配列に対して少なくとも８５％同一のＨＣ可変ドメイン配列を含み、ならびに／またはＬＣ可変ドメイン配列は、（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のＬＣ可変ドメイン配列に対して少なくとも８５％同一のＬＣ可変ドメイン配列を含む。
一態様では、本開示は、重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列を含む単離された抗体であって、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のエピトープに結合する抗原結合性部位を形成する、単離された抗体を提供する。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ１を含むアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ２を含むアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ３を含むアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つの重鎖可変領域配列を含むアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ１を含むアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ２を含むアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ３を含むアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つの軽鎖可変領域配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＦＳＬＴＳＹＳ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＦＳＬＴＳＹＳＶ（配列番号 ）、ＦＳＬＴＳＹＳＶＨ（配列番号 ）、ＧＦＳＬＴＳＹＳ（配列番号 ）、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＦＮＩＫＤＹＹ（配列番号１１０）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＦＮＩＫＤＹＹＭ（配列番号 ）、ＦＮＩＫＤＹＹＭＨ（配列番号 ）、ＧＦＮＩＫＤＹＹ（配列番号 ）、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＨ１配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＶＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号 ）、ＧＶＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号 ）、ＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号 ）、ＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴ（配列番号 ）、ＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号 ）、ＶＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号 ）、ＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号 ）、ＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号 ）、ＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮ（配列番号 ）、ＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号 ）、ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号 ）、ＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号 ）、ＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号 ）、ＷＬＧＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹ（配列番号 ）、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＷＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号 ）、ＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号 ）、ＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号 ）、ＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴ（配列番号 ）、ＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号 ）、ＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号 ）、ＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号 ）、ＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号 ）、ＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥ（配列番号 ）、ＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号 ）、ＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号 ） ＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号 ）、ＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号 ）、ＷＩＧＷＩＤＰＥＮＤＤＴＥＹ（配列番号 ）、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＨ２配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＲＥＤＳ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＡＲＥＤＳ（配列番号 ）、またはその生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、ＴＥＬＧＡＹ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列またはその生物学的等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＨ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、下記に述べるポリヌクレオチド配列：
またはその生物学的等価物によってコードされるポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
またはその生物学的等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、下記に述べるポリヌクレオチド配列：
またはその生物学的等価物によってコードされるポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の重鎖可変領域は、アミノ酸配列：
またはその生物学的等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＱＮＶＧＴＮ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＱＮＶＧＴＮＶ（配列番号 ）、ＱＮＶＧＴＮＶＡ（配列番号 ）、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹＬ（配列番号 ）、ＱＳＬＬＤＳＮＧＫＴＹＬＮ（配列番号 ）、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＬ１配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＳＡＳ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＹＳＡＳ（配列番号 ）、ＩＹＳＡＳ（配列番号 ）、ＬＩＹＳＡＳ（配列番号 ）、ＡＬＩＹＳＡＳ（配列番号 ）、ＳＡＳＹ（配列番号 ）、ＹＳＡＳＹ（配列番号 ）、ＩＹＳＡＳＹ（配列番号 ）、ＬＩＹＳＡＳＹ（配列番号 ）、ＡＬＩＹＳＡＳＹ（配列番号 ）、ＳＡＳＹＲ（配列番号 ）、ＹＳＡＳＹＲ（配列番号 ）、ＩＹＳＡＳＹＲ（配列番号 ）、ＬＩＹＳＡＳＹＲ（配列番号 ）、ＡＬＩＹＳＡＳＹＲ（配列番号 ）、ＳＡＳＹＲＹ（配列番号 ）、ＹＳＡＳＹＲＹ（配列番号 ）、ＩＹＳＡＳＹＲＹ（配列番号 ）、ＬＩＹＳＡＳＹＲＹ（配列番号 ）、ＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹ（配列番号 ）、ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号 ）、ＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号 ）、ＩＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号 ）、ＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号 ）、ＡＬＩＹＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号 ）、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＬＶＳ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＹＬＶＳ（配列番号 ）、ＩＹＬＶＳ（配列番号 ）、ＬＩＹＬＶＳ（配列番号 ）、ＲＬＩＹＬＶＳ（配列番号 ）、ＬＶＳＫ（配列番号 ）、ＹＬＶＳＫ（配列番号 ）、ＩＹＬＶＳＫ（配列番号 ）、ＬＩＹＬＶＳＫ（配列番号 ）、ＲＬＩＹＬＶＳＫ（配列番号 ）、ＬＶＳＫＬ（配列番号 ）、ＹＬＶＳＫＬ（配列番号 ）、ＩＹＬＶＳＫＬ（配列番号 ）、ＬＩＹＬＶＳＫＬ（配列番号 ）、ＲＬＩＹＬＶＳＫＬ（配列番号 ）、ＬＶＳＫＬＤ（配列番号 ）、ＹＬＶＳＫＬＤ（配列番号 ）、ＩＹＬＶＳＫＬＤ（配列番号 ）、ＬＩＹＬＶＳＫＬＤ（配列番号 ）、ＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤ（配列番号 ）、ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号 ）、ＹＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号 ）、ＩＹＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号 ）、ＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号 ）、ＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号 ）、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＬ２配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＱＱＹＮＳＹＰ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＱＱＹＮＳＹＰＴ（配列番号 ）またはその生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ＷＱＳＴＨＦＰＨ（配列番号 ）を含むアミノ酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＷＱＳＴＨＦＰＨＴ（配列番号 ）またはその生物学的等価物で開始するか、それで終了するか、またはそれから本質的になるアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲＬ３配列を含む。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
またはその生物学的等価物によってコードされるポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗体またはその断片の軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
またはその生物学的等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列：
またはその生物学的等価物によってコードされるポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、アミノ酸配列：
またはその生物学的等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
開示されるＣＤＲ配列ならびに重鎖および軽鎖可変配列を含む例示的抗体を、それぞれ、下記の表に開示する。代替ＣＤＲ予測は、重鎖および／または軽鎖配列に基づいて、例えば、ＣＤＲ特異性のＫａｂａｔ、Ｃｌｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、またはｃｏｎｔａｃｔの定義に基づいて行われてもよく、これらのＣＤＲ予測方法の詳細は、当技術分野において公知であり（例えば、ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／＃ｃｄｒｉｄを参照されたい）、および／または市販されている。表に開示されるものは、Ｏｆｒａｎ Ｌａｂ（ｏｆｒａｎｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｂｉｕ．ａｃ．ｉｌ／ｓｉｔｅ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｐａｒａｔｏｍｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで利用可能なＰａｒａｔｏｍｅ）およびＧｒｅｅｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓのＣＤＲ予測プログラムによって提供されるＣＤＲ予測アルゴリズムを利用する結果である。
一態様では、本開示は、Ｉｈｆ Ａ５、Ｉｈｆ ｍＢ４、またはそれらのそれぞれの生物学的等価物からなる群から選択される抗体に対して、少なくとも８５％、または代替的に、少なくとも９０％、または代替的に、少なくとも９５％同一である単離された抗体を提供する。
一態様では、本開示は、Ｉｈｆ Ａ５のＣＤＲを含む単離された抗体を提供する。一態様では、本開示は、Ｉｈｆ Ａ５またはその生物学的等価物に対して、少なくとも８５％、または代替的に、少なくとも９０％、または代替的に、少なくとも９５％同一である単離された抗体を提供する。
一態様では、本開示は、Ｉｈｆ ｍＢ４のＣＤＲを含む単離された抗体を提供する。一態様では、本開示は、Ｉｈｆ ｍＢ４またはその生物学的等価物に対して、少なくとも８５％、または代替的に、少なくとも９０％、または代替的に、少なくとも９５％同一である単離された抗体を提供する。
本明細書に提供される抗体の一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｉｈｆ Ａ５の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｉｈｆ Ａ５の可変ドメイン配列を含む。
本明細書に提供される抗体の一部の態様では、ＨＣ可変ドメイン配列は、Ｉｈｆ ｍＢ４の可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、Ｉｈｆ ｍＢ４の可変ドメイン配列を含む。
上記で述べたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、それを含有するベクターおよび宿主細胞、ならびに当技術分野において公知のおよび本明細書に記載される組換え細胞系を使用するポリペプチドの組換え産生のための方法が本明細書にさらに提供される。
本技術の別の態様では、単離された抗体は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含む：
（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインのＣＤＲに対して、少なくとも８５％、または代替的に、少なくとも９０％、または代替的に、少なくとも９５％同一である１つまたは複数のＣＤＲを含む；
（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインのＣＤＲに対して、少なくとも８５％、または代替的に、少なくとも９０％、または代替的に、少なくとも９５％同一である１つまたは複数のＣＤＲを含む；
（ｃ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインに対して、少なくとも８５％、または代替的に、少なくとも９０％、または代替的に、少なくとも９５％同一である；
（ｄ）ＨＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインに対して、少なくとも８５％、または代替的に、少なくとも９０％、または代替的に、少なくとも９５％同一である；および
（ｅ）抗体が、開示される配列のうちのいずれかに結合するエピトープと重複するエピトープに結合する。
一部の態様では、抗体は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つの重鎖定常領域配列に対して少なくとも８０％同一である重鎖定常領域を含む。
一部の態様では、抗体は、以下の抗体：（ｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６によって産生された抗体、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２によって産生された抗体、および（ｉｉｉ）ハイブリドーマ細胞系ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５によって産生された抗体のうちのいずれか１つの軽鎖定常領域配列に対して少なくとも８０％同一である軽鎖定常領域を含む。
非限定的な例示的抗体としては、本明細書に開示されるもの、例えば、限定されるものではないが、
（ａ）
（ｂ）
（ｃ）
（ｄ）
（ｅ）
（ｆ）
（ｇ）
（ｈ）
（ｉ） アミノ酸配列ＮＰＸＴを含むポリペプチド、または
（ｊ） （ａ）から（ｉ）の等価物
を含む開示されるポリペプチド断片に対して生成されたものが挙げられ、ここで、等価物は、それらに対して少なくとも約８０％の相同性もしくはアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、または高ストリンジェンシーの条件下でアミノ酸配列もしくはその相補体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を含み、ここで、高ストリンジェンシーの条件は、約５５℃～約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ～約０．１×ＳＳＣの緩衝液濃度；約５５％～約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液または脱イオン水を含む。
本開示は、抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片または抗原結合性断片）を提供する。本開示は、Ｆａｂ断片または抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片）のアミノ酸配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる単離されたポリペプチドであって、断片またはポリペプチドが、ＤＮＡＢＩＩタンパク質もしくはポリペプチドを含むＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび／もしくはバイオフィルム構成要素に結合するか、ならびに／またはそれを特異的に認識する、単離されたポリペプチドも提供する。
本開示は、重鎖（ＨＣ）可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン配列を含む単離された抗体であって、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のエピトープに結合する抗原結合性部位を形成する、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡＢＩＩペプチド（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含むＤＮＡＢＩＩペプチドのチップ領域；ならびに／あるいは限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含むＤＮＡＢＩＩペプチドのテール領域など）に結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩに結合する。別の実施形態では、抗体またはその断片は、テールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩに結合する。
一態様では、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のアミノ酸（ａａ）２５～ａａ１４４の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／あるいは配列番号７～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ１２６の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。
さらなる態様では、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のａａ２５～ａａ４７３の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）；および／あるいは配列番号７～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ２３９、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ２３３の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が提供される。
またさらなる態様では、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）；および／あるいは配列番号７～１２、１４、２５もしくは２７の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が提供される。
別の態様では、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のアミノ酸（ａａ）２５～１４４の群から選択される配列、またはそれらの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／あるいは配列番号６～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ１２６の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。
また別の態様では、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物のいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つすべてのＣＤＲ；および／あるいは配列番号７～１２、１４、２５もしくは２７の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物のいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つすべてのＣＤＲを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。
別の態様では、配列番号１３、２４もしくは２６のａａ２５～ａａ１４４の群から選択される配列、またはそれらの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および配列番号１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号２７のａａ２１～ａａ１２６の群から選択される配列、またはそれらの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のａａ２５～ａａ１４４の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列；および／あるいは配列番号７～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ１２６の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。
配列番号１のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ１２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片も提供される。別の態様では、配列番号２のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ１２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、または代替的にそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体またはその断片が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号３のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ１２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。
またさらなる態様では、配列番号４のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ１２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。配列番号５のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ１２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはまたそれからなる抗体およびその抗原結合性断片も提供される。配列番号６のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７～９、１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号１０～１２もしくは２７のａａ２１～ａａ１２６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片がまたさらに提供される。
別の態様では、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のうちのいずれか１つのａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体またはその抗原結合性断片が本明細書に提供される。配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のうちのいずれか１つのａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号８のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその抗原結合性断片がまたさらに提供される。別の態様では、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のうちのいずれか１つのａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号９のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその抗原結合性断片も提供される。
さらなる態様では、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のうちのいずれか１つのａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１０のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその抗原結合性断片も提供される。配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のうちのいずれか１つのａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１１のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメインを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体およびその抗原結合性断片も提供される。配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のうちのいずれか１つのａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列、またはそれらのそれぞれの等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１２のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体およびその抗原結合性断片も提供される。
一態様では、配列番号１のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一実施形態では、配列番号１のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号８のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が提供される。別の実施形態では、配列番号１のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号９のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗チップキメラ（すなわち、チップキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。
別の態様では、配列番号２のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、それからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。別の態様では、配列番号２のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列もしくはその等価物を含む重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号８のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。さらなる別の態様では、配列番号２のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号９のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗チップキメラ（すなわち、チップキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。
別の態様では、配列番号３のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号７のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号３のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号８のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一実施形態では、配列番号３のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号９のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含む軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗チップキメラ（すなわち、チップキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。
配列番号４のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１０のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片も提供される。別の態様では、配列番号４のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１１のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号４のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１２のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗テールキメラ（すなわち、テールキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。
一実施形態では、配列番号５のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１０のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。別の実施形態では、配列番号５のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１１のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。さらなる態様では、配列番号５のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１２のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗テールキメラ（すなわち、テールキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。
別の実施形態では、配列番号６のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１０のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一態様では、配列番号６のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１１のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一実施形態では、配列番号６のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号１２のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる抗体およびその抗原結合性断片が本明細書に提供される。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗テールキメラ（すなわち、テールキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。
一態様では、配列番号２４のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号２５のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡＢＩＩペプチドのチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩに結合する。またさらなる実施形態では、断片は、抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗チップキメラ（すなわち、チップキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号７のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号８のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号９のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号７のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号８のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号９のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号７のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号８のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号９のａａ２１～ａａ１３２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。
別の態様では、配列番号２６のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および配列番号２７のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡＢＩＩペプチドのテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、テールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩに結合する。またさらなる実施形態では、断片は、抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗テールキメラ（すなわち、テールキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号１０のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号１１のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号１２のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号１０のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号１１のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号１２のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号１０のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号１１のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６のａａ２５～ａａ１４４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列、および／あるいは配列番号１２のａａ２１～ａａ１２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。
一態様では、配列番号２４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号２５のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡＢＩＩペプチドのチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗チップキメラ（すなわち、チップキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。またさらなる実施形態では、断片は、抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号７のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号８のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号７のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号８のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号７のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号８のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。
別の態様では、配列番号２６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および配列番号２７のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡＢＩＩペプチドのテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、テールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗テールキメラ（すなわち、テールキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。またさらなる実施形態では、断片は、抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１０のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１１のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１０のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１１のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１０のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１１のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１２のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。
一態様では、配列番号２４のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号２５のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡＢＩＩペプチドのチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗チップキメラ（すなわち、チップキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。またさらなる実施形態では、断片は、抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号７のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号８のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号９のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号７のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号８のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号９のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号７のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号８のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号３のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号９のａａ２１～ａａ２３９のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。
別の態様では、配列番号２６のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および配列番号２７のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡＢＩＩペプチドのテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、テールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗テールキメラ（すなわち、テールキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。またさらなる実施形態では、断片は、抗原結合性断片である。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１０のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１１のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１２のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１０のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１１のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号５のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１２のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１０のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１１のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。また別の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６のａａ２５～ａａ４７３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる重鎖（ＨＣ）、および／あるいは配列番号１２のａａ２１～ａａ２３３のアミノ酸配列またはその等価物を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる軽鎖（ＬＣ）を含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。
一態様では、配列番号１～３もしくは２４の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物のいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つすべてのＣＤＲ；および／あるいは配列番号７～９もしくは２５の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物のいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つすべてのＣＤＲを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡＢＩＩペプチドのチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗チップキメラ（すなわち、チップキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。またさらなる実施形態では、断片は、抗原結合性断片である。一実施形態では、配列番号１～３もしくは２４の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物の３つすべてのＣＤＲ；および／あるいは配列番号７～９もしくは２５の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物の３つすべてのＣＤＲを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。
別の実施形態では、配列番号４～６もしくは２６の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物のいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つすべてのＣＤＲ；および／あるいは配列番号１０～１２もしくは２７の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物のいずれか１つまたはいずれか２つまたは３つすべてのＣＤＲを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。さらなる実施形態では、抗体またはその断片は、ＤＮＡＢＩＩペプチドのテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体またはその断片は、テールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗テールキメラ（すなわち、テールキメラに特異的に結合し、それを特異的に認識する）である。またさらなる実施形態では、断片は、抗原結合性断片である。一実施形態では、配列番号４～６もしくは２６の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物の３つすべてのＣＤＲ；および／あるいは配列番号１０～１２もしくは２７の群から選択される配列、またはそれらのそれぞれの等価物の３つすべてのＣＤＲを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる抗体またはその断片が提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体またはその断片は、１つまたは複数のシグナルペプチドをさらに含む。一実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１～６、１３、２４もしくは２６のうちのいずれか１つのアミノ酸（ａａ）１～ａａ２４を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。別の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号７～１２、１４、２５および２７のうちのいずれか１つのａａ１～ａａ２０を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、軽鎖可変領域のアミノ末端に位置する。加えて、または代替的に、同じシグナルペプチドまたは異なるシグナルペプチドが、重鎖可変領域のアミノ末端に位置する。
本明細書に提供される抗体またはその断片は、単特異性または二特異性であってもよい。一実施形態では、抗体またはその断片は、三特異性、または四特異性、または五特異性である。加えて、または代替的に、抗体は、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２など）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４など）、またはＩｇＭ抗体の群から選択される。一実施形態では、抗体は、ＩｇＡ定常領域（ＩｇＡ１定常領域またはＩｇＡ２定常領域など）、ＩｇＤ定常領域、ＩｇＥ定常領域、ＩｇＧ定常領域（ＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域など）、またはＩｇＭ定常領域の群から選択される定常領域をさらに含む。
ある特定の実施形態では、アミノ酸配列に対する等価物は、アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（約８０％～１００％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む）のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。加えて、または代替的に、アミノ酸配列に対する等価物は、高ストリンジェンシーの条件下でアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。さらなる実施形態では、アミノ酸配列に対する等価物は、アミノ酸配列に対して少なくとも８０％（約８０％～１００％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む）の同一性のポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列（抗体またはその断片、あるいは限定されるものではないが、配列番号１３、２４もしくは２６のａａ２５～ａａ１４４、配列番号１４もしくは２５のａａ２１～ａａ１３２、配列番号２７のａａ２１～ａａ１２６、配列番号１３、２４もしくは２６のａａ２５～ａａ４７３、配列番号１４もしくは２５のａａ２１～ａａ２３９、配列番号２７のａａ２１～ａａ２３３を含む本明細書に開示される配列番号１～１４および２４～２６のうちのいずれか１つもしくは複数、またはそれらの断片など）に対する等価物は、アミノ酸配列のうちの１つもしくは複数もしくはすべてのＣＤＲを含むポリペプチドを含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。加えて、または代替的に、ポリペプチドは、アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（約８０％～１００％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む）のアミノ酸同一性である。
ある特定の実施形態では、アミノ酸配列に対する等価物、例えば、抗体、その断片、その相補性決定領域（ＣＤＲ）、またはＣＤＲ含有ポリペプチドは、ＣＤＲにおけるアミノ酸配列に対するアミノ酸の相違を欠く。しかしながら、アミノ酸配列に対する等価物、例えば、抗体、その断片、そのＣＤＲ、またはＣＤＲ含有ポリペプチドは、非ＣＤＲ領域におけるアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（例えば、限定されるものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）のアミノ酸の相違を含んでいてもよく、但し、ＣＤＲの三次元配置および／またはＣＤＲは、保持されている。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列に対して等価なポリペプチド、例えば、抗体、その断片、そのＣＤＲ、またはＣＤＲ含有ポリペプチドは、アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％（約８０％～１００％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む）のアミノ酸同一性であるが、但し、ＣＤＲの三次元配置および／またはＣＤＲは、保持されている。
そのような非ＣＤＲ領域の非限定的な例としては、フレームワーク領域（ＦＲ）、定常領域、Ｆｃ領域、ｐＦｃ’領域、定常重鎖（ＣＨ）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４など）、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン、またはヒンジ領域が挙げられる。一実施形態では、そのようなアミノ酸の相違は、保存的アミノ酸置換であってもよく、および／または抗体、その断片、そのＣＤＲ、もしくはＣＤＲ含有ポリペプチドの三次元配置を変化させない。別の実施形態では、等価物は、ＣＤＲの境界において、例えば、ＣＤＲのアミノ末端、カルボキシル末端またはその両方の１個または２個のアミノ酸の保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。
一態様では、本明細書に開示される抗体またはその断片のＣＤＲのうちの１つまたは複数（いずれか１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つのＣＤＲなど）が提供される。一実施形態では、本明細書に開示される抗体またはその断片のＣＤＲのうちの１つもしくは複数（いずれか１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つのＣＤＲなど）を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲのセットが提供される。一実施形態では、本明細書に開示される可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲのセットが提供される。さらなる実施形態では、本明細書に開示される可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲのセットが提供される。またさらなる実施形態では、本明細書に開示される可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３、ならびに本明細書に開示される別の可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなるＣＤＲのセットが提供される。ある特定の実施形態では、ＣＤＲセットは、パラトープを構成する。加えて、または代替的に、ＣＤＲセットは、ＤＮＡＢＩＩペプチド（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、チップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む、チップ領域および／またはテール領域など）に特異的に結合する。さらなる実施形態では、本明細書に開示されるいずれか１つまたは複数のＣＤＲを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる、抗体、その断片、またはそれらのそれぞれの等価物が提供される。またさらなる実施形態では、本明細書に開示されるＣＤＲセットを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる、抗体、その断片、またはそれらのそれぞれの等価物が提供される。
ある特定の実施形態では、抗チップキメラ抗体のＣＤＲは、以下の表に示される配列番号１～３、７～９、１３および１４に示される。抗テールキメラのＣＤＲは、配列番号４～６および１０～１２に示される。ある特定の実施形態では、配列番号１～６、１３、２４または２６のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ１は、それぞれ、配列番号１～６、１３、２４または２６のアミノ酸（ａａ）５０～ａａ５７を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１～６、１３、２４または２６のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ２は、それぞれ、配列番号１～６、１３、２４または２６のアミノ酸（ａａ）７５～ａａ８２を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１～６、１３、２４または２６のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ３は、それぞれ、配列番号１～６、１３、２４または２６のアミノ酸（ａａ）１２１～ａａ１３３を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９、１４または２５のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ１は、それぞれ、配列番号７～９、１４または２５のアミノ酸（ａａ）４７～ａａ５７を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９、１４または２５のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ２は、それぞれ、配列番号７～９、１４または２５のアミノ酸（ａａ）７５～ａａ７７を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９、１４または２５のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号７～９、１４または２５のアミノ酸（ａａ）１１４～ａａ１２２を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２または２７のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ１は、それぞれ、配列番号１０～１２または２７のアミノ酸（ａａ）４７～ａａ５２を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２または２７のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ２は、それぞれ、配列番号１０～１２または２７のアミノ酸（ａａ）７０～ａａ７２を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２または２７のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ３は、それぞれ、配列番号１０～１２または２７のアミノ酸（ａａ）１０９～ａａ１１６を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
ある特定の実施形態では、以下の２つの表において特定されるＣＤＲが下記に提供される。
SEQ:配列番号
SEQ:配列番号
ある特定の実施形態では、対応する可変領域配列において、そのアミノ末端もしくはカルボキシル末端、またはその両方に、追加の１アミノ酸、または代替的に、２アミノ酸、または代替的に、３アミノ酸、または代替的に、４アミノ酸、または代替的に、５アミノ酸、または代替的に、６アミノ酸、または代替的に、７アミノ酸、または代替的に、８アミノ酸をさらに含む本明細書で特定されたＣＤＲである代替ＣＤＲが提供される。加えて、または代替的に、対応する可変領域配列において、そのアミノ末端もしくはカルボキシル末端、またはその両方で切断された、１アミノ酸、または代替的に、２アミノ酸、または代替的に、３アミノ酸、または代替的に、４アミノ酸、または代替的に、５アミノ酸、または代替的に、６アミノ酸、または代替的に、７アミノ酸、または代替的に、８アミノ酸を有する本明細書で特定されたＣＤＲである代替ＣＤＲが提供される。例えば、配列番号１のＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸５０～アミノ酸５７であってもよい。しかしながら、配列番号１のＣＤＲ１はまた、配列番号１のアミノ酸４２、または４３、または４４、または４５、または４６、または４７、または４８、または４９、または５０、または５１、または５２、または５３、または５４、または５５、または５６、または５７、または５８から開始することができる。さらに、配列番号１のＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸４９、または５０、または５１、または５２、または５３、または５４、または５５、または５６、または５７、または５８、または５９、または６０、または６１、または６２、または６３、または６４、または６５で終わることができ、但し、ＣＤＲ１は、その開始後に終わる。加えて、または代替的に、ＣＤＲは、約１、または代替的に、約２、または代替的に、約３、または代替的に、約４、または代替的に、約５、または代替的に、約６、または代替的に、約７、または代替的に、約８、または代替的に、約９、または代替的に、約１０、または代替的に、約１１、または代替的に、約１２、または代替的に、約１３、または代替的に、約１４、または代替的に、約１５アミノ酸長である。
ある特定の実施形態では、配列番号１～６のうちのいずれか１つのＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号１～６のそれぞれのアミノ酸７１～アミノ酸８５を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１～６のうちのいずれか１つのＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１～６のそれぞれのアミノ酸１２１～アミノ酸１３３を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９のうちのいずれか１つのＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号７～９のそれぞれのアミノ酸７１～アミノ酸８１を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９のうちのいずれか１つのＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７～９のそれぞれのアミノ酸１１４～アミノ酸１２１を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号１０～１２のそれぞれのアミノ酸６６～アミノ酸７６を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１０～１２のそれぞれのアミノ酸１０９～アミノ酸１１５を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
ある特定の実施形態では、配列番号１～６のうちのいずれか１つのＣＤＲ１は、それぞれ、配列番号１～６のそれぞれのアミノ酸５０～アミノ酸５７を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１～６のうちのいずれか１つのＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号１～６のそれぞれのアミノ酸７５～アミノ酸８２を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１～６のうちのいずれか１つのＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１～６のそれぞれのアミノ酸１２１および１２２を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９のうちのいずれか１つのＣＤＲ１は、それぞれ、配列番号７～９のそれぞれのアミノ酸４７～アミノ酸５７を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９のうちのいずれか１つのＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号７～９のそれぞれのアミノ酸７５～アミノ酸７７を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９のうちのいずれか１つのＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７～９のそれぞれのアミノ酸１１４および１２０を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのＣＤＲ１は、それぞれ、配列番号１０～１２のそれぞれのアミノ酸４７～アミノ酸５２を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号１０～１２のそれぞれのアミノ酸７０～アミノ酸７２を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１０～１２のそれぞれのアミノ酸１０９および１１０を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
ある特定の実施形態では、配列番号１～６のうちのいずれか１つのＣＤＲ１は、それぞれ、配列番号１～６のそれぞれのアミノ酸４７～アミノ酸５９を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１～６のうちのいずれか１つのＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号１～６のそれぞれのアミノ酸７４～アミノ酸８３を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９のうちのいずれか１つのＣＤＲ１は、それぞれ、配列番号７～９のそれぞれのアミノ酸４４～アミノ酸５９を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９のうちのいずれか１つのＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号７～９のそれぞれのアミノ酸７４～アミノ酸８１を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号７～９のうちのいずれか１つのＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号７～９のそれぞれのアミノ酸１１４および１２２を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのＣＤＲ１は、それぞれ、配列番号１０～１２のそれぞれのアミノ酸４４～アミノ酸５４を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのＣＤＲ２は、それぞれ、配列番号１０～１２のそれぞれのアミノ酸７９～アミノ酸７６を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、配列番号１０～１２のうちのいずれか１つのＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１０～１２のそれぞれのアミノ酸１０９および１１６を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一態様では、本明細書に開示される抗体もしくはその断片の可変領域のうちの１つもしくは複数、および／または可変領域の等価物のうちの１つもしくは複数のうちの１つまたは複数が提供される。さらなる実施形態では、本明細書に開示される可変領域のうちのいずれか１つもしくはいずれか２つもしくはそれよりも多く、および／または可変領域の等価物のうちの１つもしくは複数を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる抗体、その断片、またはそれらのそれぞれの等価物が提供される。加えて、または代替的に、可変領域のうちの１つまたは複数は、ＤＮＡＢＩＩペプチド（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、チップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む、チップ領域および／またはテール領域など）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、可変領域は、以下：配列番号１～６、１３、２４および２６のアミノ酸（ａａ）２５～ａａ１４４；配列番号７～９、１４および２５のａａ２１～ａａ１３２；配列番号１０～１２または２７のａａ２１～ａａ１２６；配列番号１～６、１３、２４および２６のアミノ酸２４～アミノ酸１４４；配列番号７～１２、１４、２５および２７のアミノ酸２０～アミノ酸１３２；配列番号７～１２、１４、２５および２７のアミノ酸２０～アミノ酸１２６から選択される。
さらなる実施形態では、可変領域またはその等価物は、配列番号で本明細書に提供される対応する配列において、そのアミノ末端もしくはカルボキシル末端、またはその両方に、追加の１アミノ酸、または代替的に、２アミノ酸、または代替的に、３アミノ酸、または代替的に、４アミノ酸、または代替的に、５アミノ酸、または代替的に、６アミノ酸、または代替的に、７アミノ酸、または代替的に、８アミノ酸をさらに含む本明細書に開示される可変領域である。加えて、または代替的に、可変領域またはその等価物は、配列番号で本明細書に提供される対応する配列において、そのアミノ末端もしくはカルボキシル末端、またはその両方で切断された、１アミノ酸、または代替的に、２アミノ酸、または代替的に、３アミノ酸、または代替的に、４アミノ酸、または代替的に、５アミノ酸、または代替的に、６アミノ酸、または代替的に、７アミノ酸、または代替的に、８アミノ酸を有する本明細書に開示される可変領域である。例えば、配列番号１は、配列番号１のアミノ酸５０～アミノ酸５７であってもよい。しかしながら、配列番号１のアミノ酸２４～アミノ酸１４４からなる可変領域に関する可変領域またはその等価物はまた、配列番号１のアミノ酸１６、または１７、または１８、または１９、または２０、または２１、または２２、または２３、または２４、または２５、または２６、または２７、または２８、または２９、または３０、または３１、または３２から開始することができる。さらに、配列番号１のアミノ酸２４～アミノ酸１４４からなる可変領域に関する可変領域またはその等価物は、配列番号１のアミノ酸１３６、または１３７、または１３８、または１３９、または１４０、または１４１、または１４２、または１４３、または１４４、または１４５、または１４６、または１４７、または１４８、または１４９、または１５０、または１５１、または１５２で終わることができ、但し、可変領域は、その開始後に終わる。加えて、または代替的に、可変領域は、約９０アミノ酸長～約２００アミノ酸長、例えば、約１００アミノ酸長、または代替的に、約１１０アミノ酸長、または代替的に、約１２０アミノ酸長、または代替的に、約１３０アミノ酸長、または代替的に、約１４０アミノ酸長、または代替的に、約１５０アミノ酸長、または代替的に、約１６０アミノ酸長、または代替的に、約１７０アミノ酸長、または代替的に、約１８０アミノ酸長、または代替的に、約１９０アミノ酸長、または代替的に、約２００アミノ酸長である。
加えて、または代替的に、抗体またはその断片に対する等価物は、可変ドメイン以外の領域（本明細書で非ＶＨ領域と称される）における抗体またはその断片と比較して、１つまたは複数（例えば、限定されるものではないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）のアミノ酸の相違を含む。そのような非ＶＨ領域としては、限定されるものではないが、定常領域、Ｆｃ領域、ｐＦｃ’領域、定常重鎖（ＣＨ）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４など）、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン、またはヒンジ領域が挙げられる。本明細書に開示される抗体、その断片、またはそれらのそれぞれの等価物は、非ＶＨ領域においてさらに改変され（重鎖の軽鎖とのアセンブリーを増加させるため、検出可能なマーカーもしくは精製マーカーまたは薬物に直接的にまたは間接的にコンジュゲートするため、相補体の活性化を増加させるまたは減少させるため、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強するまたは低減するため、あるいは免疫細胞の活性化および動員を増加させるまたは減少させるためなど）、さらなる等価物を提供し得ることが当業者によって理解されるであろう。
ある特定の実施形態では、等価物は、アミノ末端もしくはカルボキシル末端、またはその両方のいずれかに、最大で５０個、または代替的に、最大で３０個、または代替的に、最大で２５個、または代替的に、最大で２０個、または代替的に、最大で１５個、または代替的に、最大で１０個、または代替的に、最大で５個のランダムなアミノ酸をさらに含む。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列に対する等価物は、アミノ末端もしくはカルボキシル末端またはその両方で切断されたアミノ酸配列、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０または２５個のアミノ酸を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。そのような付加または切断は、ＣＤＲの三次元配置、および／または抗体、その断片、そのＣＤＲ、もしくはＣＤＲ含有ポリペプチドの三次元配置を変化させることはできない。
ある特定の実施形態では、抗体またはその断片は、ＶＨのアミノ末端および／またはＶＬのアミノ末端にシグナルペプチドを含む。一実施形態では、ＶＨシグナルペプチドは、ＶＬシグナルペプチドと異なる。別の実施形態では、ＶＨシグナルペプチドは、ＶＬシグナルペプチドと比較して、同じである。さらなる実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～２４のアミノ酸配列を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。またさらなる実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号７のアミノ酸１～２０のアミノ酸配列を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。ある特定の実施形態では、抗体またはその断片に対する等価物は、抗体のシグナルペプチドとは異なるシグナルペプチドを含み、但し、等価物のシグナルペプチドは、ＶＨおよび／またはＶＬを、抗体のシグナルペプチドと同じ細胞の場所に方向付ける。
ある特定の実施形態では、抗体またはその断片に対する等価物は、抗体または断片の機能活性の少なくとも５０％（少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％など）を保持するか、またはそのうちの１つもしくは複数を改善する。そのような機能活性としては、限定されるものではないが、ＤＮＡＢＩＩペプチド（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、チップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む、チップ領域および／またはテール領域など）に対する結合特異性、結合アビディティーおよび／または親和性、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでのバイオフィルムの形成を防止すること、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでバイオフィルムを破壊することが挙げられる。そのような機能活性を定量化する方法は、実施例に示される。
さらなる態様では、エピトープへの結合について本明細書に開示される抗体またはその断片と競合する抗体またはその断片が提供される。抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および／またはヒト化抗体であってもよい。
一態様では、抗体は、二特異性抗体、または三特異性、四特異性もしくは五特異性抗体である。さらなる態様では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体である。別の態様では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ定常領域から選択される定常領域をさらに含む。具体的な態様では、定常領域は、ＩｇＧ１定常領域である。別の態様では、エピトープへの結合について本明細書に開示される抗体と競合する抗体が本明細書に提供される。これらは、従来の技法、例えば競合的ＥＬＩＳＡを使用して特定することができる。
本明細書に開示される抗体は、ポリクローナル、モノクローナルまたはヒト化であり得る。一態様では、抗体は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの「チップ」領域、例えば、ＨＵまたはＩＨＦ（ＩｈｆＡおよびＩｈｆＢなど）に結合する。さらなる態様では、抗体は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドの「テール」領域、例えば、ＨＵまたはＩＨＦ（ＩｈｆＡおよびＩｈｆＢなど）に結合する。上記で述べたように、本開示は、抗原結合性断片を提供する。抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖまたはＦｖのうちのいずれか１つであり、これは、当業者に公知の従来の技法を使用して調製することができる。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、可溶性Ｆａｂである。別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体のＦａｂ断片であって、抗体が、ＤＮＡＢＩＩペプチドのチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に特異的に結合する、Ｆａｂ断片を提供する。本開示の一態様では、ＤＮＡＢＩＩは、ＩＨＦペプチドまたはＨＵペプチドである。具体的な態様では、ＤＮＡＢＩＩは、ＩＨＦペプチドである。
上記で述べたように、本開示は、抗体および抗原結合性断片に対する等価物を提供する。等価物は、ポリペプチドに対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または高ストリンジェンシーの条件下でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含み得る。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、５００ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、２５０ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、２００ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、１５０ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、１００ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、９０ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、８０ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、７０ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、６５ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、６０ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、５５ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、５０ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、４５ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、４０ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、３５ｎｇ／ｍＬ未満、または代替的に、３０ｎｇ／ｍＬ未満の半数最大有効濃度（ＥＣ５０）で、ＤＮＡＢＩＩタンパク質（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、チップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する。さらなる実施形態では、そのようなＥＣ５０は、実施例において示されるＥＬＩＳＡ方法を使用して決定される。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍ未満の平衡定数ＫＤで、ＤＮＡＢＩＩタンパク質（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、チップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、１０００ｎＭ未満、または代替的に、９００ｎＭ未満、または代替的に、８００ｎＭ未満、または代替的に、７００ｎＭ未満、または代替的に、６００ｎＭ未満、または代替的に、５００ｎＭ未満、または代替的に、４００ｎＭ未満、または代替的に、３００ｎＭ未満、または代替的に、２００ｎＭ未満、または代替的に、１００ｎＭ未満、または代替的に、９０ｎＭ未満、または代替的に、８０ｎＭ未満、または代替的に、７０ｎＭ未満、または代替的に、６０ｎＭ未満、または代替的に、５０ｎＭ未満、または代替的に、４０ｎＭ未満、または代替的に、３０ｎＭ未満、または代替的に、２０ｎＭ未満、または代替的に、１５ｎＭ未満、または代替的に、１０ｎＭ未満、または代替的に、９ｎＭ未満、または代替的に、８ｎＭ未満、または代替的に、７ｎＭ未満、または代替的に、６ｎＭ未満、または代替的に、５ｎＭ未満、または代替的に、４ｎＭ未満、または代替的に、３ｎＭ未満、または代替的に、２ｎＭ未満、または代替的に、１ｎＭ未満のＫＤで、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に結合する。一実施形態では、そのようなＫＤは、実施例に示される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法を使用して決定される。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗原結合性部位は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に特異的に結合する。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、１．０Ｅ－０２秒－１未満、または代替的に、９．０Ｅ－０３秒－１未満、または代替的に、８．０Ｅ－０３秒－１未満、または代替的に、７．０Ｅ－０３秒－１未満、または代替的に、６．０Ｅ－０３秒－１未満、または代替的に、５．０Ｅ－０３秒－１未満、または代替的に、４．０Ｅ－０３秒－１未満、または代替的に、３．０Ｅ－０３秒－１未満、または代替的に、２．０Ｅ－０３秒－１未満、または代替的に、１．０Ｅ－０３秒－１未満、または代替的に、９．０Ｅ－０４秒－１未満、または代替的に、８．０Ｅ－０４秒－１未満、または代替的に、７．０Ｅ－０４秒－１未満、または代替的に、６．０Ｅ－０４秒－１未満、または代替的に、５．０Ｅ－０４秒－１未満、または代替的に、４．０Ｅ－０４秒－１未満、または代替的に、３．０Ｅ－０４秒－１未満、または代替的に、２．０Ｅ－０４秒－１未満、または代替的に、１．０Ｅ－０４秒－１未満、または代替的に、９．０Ｅ－０５秒－１未満、または代替的に、８．０Ｅ－０５秒－１未満、または代替的に、７．０Ｅ－０５秒－１未満、または代替的に、６．０Ｅ－０５秒－１未満、または代替的に、５．０Ｅ－０５秒－１未満、または代替的に、４．０Ｅ－０５秒－１未満、または代替的に、３．０Ｅ－０５秒－１未満、または代替的に、２．０Ｅ－０５秒－１未満、または代替的に、１．０Ｅ－０５秒－１未満のＫｏｆｆで、ＤＮＡＢＩＩタンパク質（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、チップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、そのようなＫｏｆｆは、実施例に示される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法を使用して決定される。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、９．０Ｅ－０２Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、８．０Ｅ－０２Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、７．０Ｅ－０２Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、６．０Ｅ－０２Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、５．０Ｅ－０２Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、４．０Ｅ－０２Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、３．０Ｅ－０２Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、２．０Ｅ－０２Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、１．０Ｅ－０２Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、９．０Ｅ－０３Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、８．０Ｅ－０３Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、７．０Ｅ－０３Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、６．０Ｅ－０３Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、５．０Ｅ－０３Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、４．０Ｅ－０３Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、３．０Ｅ－０３Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、２．０Ｅ－０３Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、１．０Ｅ－０３Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、９．０Ｅ－０４Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、８．０Ｅ－０４Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、７．０Ｅ－０４Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、６．０Ｅ－０４Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、５．０Ｅ－０４Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、４．０Ｅ－０４Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、３．０Ｅ－０４Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、２．０Ｅ－０４Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、１．０Ｅ－０４Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、９．０Ｅ－０５Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、８．０Ｅ－０５Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、７．０Ｅ－０５Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、６．０Ｅ－０５Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、５．０Ｅ－０５Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、４．０Ｅ－０５Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、３．０Ｅ－０５Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、２．０Ｅ－０５Ｍ－１秒－１未満、または代替的に、１．０Ｅ－０５Ｍ－１秒－１未満のＫｏｎで、ＤＮＡＢＩＩタンパク質（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、チップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、そのようなＫｏｎは、実施例に示される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法を使用して決定される。
本発明の一部の態様では、ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩチップキメラペプチドについての結合定数ＫＡ（１／Ｍ）は、約３Ｅ＋０５～約２Ｅ＋０８である。別の態様では、ＫＡは、約３Ｅ＋０５～約１Ｅ＋０８、または代替的に、約２Ｅ＋０５～約１Ｅ＋０８、または代替的に、約１Ｅ＋０５～約１Ｅ＋０８、または代替的に、約１Ｅ＋０６～約１Ｅ＋０８、または代替的に、約１Ｅ＋０７～約１Ｅ＋０８、または代替的に、約１Ｅ＋０４～約１Ｅ＋０９、代替的に約１Ｅ＋０５～約１Ｅ＋０９、代替的に約１Ｅ＋０６～約１Ｅ＋０９、代替的に約１Ｅ＋０７～約１Ｅ＋０９、代替的に約１Ｅ＋０８～約１Ｅ＋０９、代替的に約１Ｅ＋０４～約１Ｅ＋０９、または代替的に、約１Ｅ＋０３～約１Ｅ＋１０である。
別の態様では、ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩチップキメラペプチドについての解離定数ＫＤ（Ｍ）は、約５Ｅ－０９～約３Ｅ－０６、または代替的に、約１Ｅ－０９～約１Ｅ－０６、または代替的に、約１Ｅ－０８～約１Ｅ－０５、または代替的に、約１Ｅ－０７～約１Ｅ－０５、または代替的に、約１Ｅ－０６～約１Ｅ－０５、または代替的に、約１Ｅ－０９～約１Ｅ－０８、または代替的に、約１Ｅ－０８～約１Ｅ－０７、または代替的に、約１Ｅ－９～約１Ｅ－０８、または代替的に、約１Ｅ－１０～約１Ｅ－０９、または代替的に、約１Ｅ－１１～約１Ｅ－１０である。
一態様では、ＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩテールキメラペプチドについてのＫＡ（１／Ｍ）は、約７Ｅ＋０６～約２Ｅ＋０９、または代替的に、約１Ｅ＋０５～約１Ｅ＋０８、または代替的に、約１Ｅ＋０６～約１Ｅ＋０８、または代替的に、約１Ｅ＋０７～約１Ｅ＋０８、または代替的に、約１Ｅ＋０４～約１Ｅ＋０９、代替的に、約１Ｅ＋０５～約１Ｅ＋０９、代替的に、約１Ｅ＋０６～約１Ｅ＋０９、代替的に、約１Ｅ＋０７～約１Ｅ＋０９、代替的に、約１Ｅ＋０８～約１Ｅ＋０９、代替的に、約１Ｅ＋０４～約１Ｅ＋０９、または代替的に、約１Ｅ＋０３～約１Ｅ＋１０、または代替的に、約１Ｅ＋０３～約１Ｅ＋１１、または代替的に、約１Ｅ＋０３～約１Ｅ＋１２、または代替的に、約１Ｅ＋０９～約１Ｅ＋１０、または代替的に、約１Ｅ＋１０～約１Ｅ＋１１、または代替的に、約１Ｅ＋１１～約１Ｅ＋１２である。
別の態様では、ＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩテールキメラペプチドについてのＫＤ（Ｍ）は、約６Ｅ－１０～約２Ｅ－０７、または代替的に、約１Ｅ－０９～約１Ｅ－０６、または代替的に、約１Ｅ－０８～約１Ｅ－０５、または代替的に、約１Ｅ－０７～約１Ｅ－０５、または代替的に、約１Ｅ－０６～約１Ｅ－０５、または代替的に、約１Ｅ－０９～約１Ｅ－０８、または代替的に、約１Ｅ－０８～約１Ｅ－０７、または代替的に、約１Ｅ－９～約１Ｅ－０８、または代替的に、約１Ｅ－１０～約１Ｅ－０９、または代替的に、約１Ｅ－１１～約１Ｅ－１０、または代替的に、約１Ｅ－１１～約１Ｅ－１２である。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、少なくとも約１０％、または代替的に、少なくとも約１５％、または代替的に、少なくとも約２０％、または代替的に、少なくとも約２５％、または代替的に、少なくとも約３０％、または代替的に、少なくとも約３５％、または代替的に、少なくとも約４０％、または代替的に、少なくとも約４５％、または代替的に、少なくとも約５０％、または代替的に、少なくとも約５５％、または代替的に、少なくとも約６０％、または代替的に、少なくとも約６５％、または代替的に、少なくとも約７０％、または代替的に、少なくとも約７５％、または代替的に、少なくとも約８０％、または代替的に、少なくとも約８５％、または代替的に、少なくとも約９０％、または代替的に、少なくとも約９５％、ｉｎ ｖｉｔｒｏでバイオフィルムのバイオマスを低減する。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、約１％未満、または代替的に、約２％未満、または代替的に、約３％未満、または代替的に、約４％未満、または代替的に、約５％未満、または代替的に、約６％未満、または代替的に、約７％未満、または代替的に、約８％未満、または代替的に、約９％未満、または代替的に、約１０％未満、または代替的に、約１２％未満、または代替的に、約１５％未満、または代替的に、約２０％未満、または代替的に、約２５％未満、または代替的に、約３０％未満、または代替的に、約３５％未満、または代替的に、約４０％未満、または代替的に、約４５％未満、または代替的に、約５０％未満、ｉｎ ｖｉｔｒｏでバイオフィルムのバイオマスを低減する。一実施形態では、そのようなバイオマスの変化は、実施例３または４に示される方法を使用して決定される。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、少なくとも約１０％、または代替的に、少なくとも約１５％、または代替的に、少なくとも約２０％、または代替的に、少なくとも約２５％、または代替的に、少なくとも約３０％、または代替的に、少なくとも約３５％、または代替的に、少なくとも約４０％、または代替的に、少なくとも約４５％、または代替的に、少なくとも約５０％、または代替的に、少なくとも約５５％、または代替的に、少なくとも約６０％、または代替的に、少なくとも約６５％、または代替的に、少なくとも約７０％、または代替的に、少なくとも約７５％、または代替的に、少なくとも約８０％、または代替的に、少なくとも約８５％、または代替的に、少なくとも約９０％、または代替的に、少なくとも約９１％、または代替的に、少なくとも約９２％、または代替的に、少なくとも約９３％、または代替的に、少なくとも約９４％、または代替的に、少なくとも約９５％、または代替的に、少なくとも約９６％、または代替的に、少なくとも約９７％、または代替的に、少なくとも約９８％、または代替的に、少なくとも約９９％、対象において細菌負荷を低減する。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、約１％未満、または代替的に、約２％未満、または代替的に、約３％未満、または代替的に、約４％未満、または代替的に、約５％未満、または代替的に、約６％未満、または代替的に、約７％未満、または代替的に、約８％未満、または代替的に、約９％未満、または代替的に、約１０％未満、または代替的に、約１２％未満、または代替的に、約１５％未満、または代替的に、約２０％未満、または代替的に、約２５％未満、または代替的に、約３０％未満、または代替的に、約３５％未満、または代替的に、約４０％未満、または代替的に、約４５％未満、または代替的に、約５０％未満、対象において細菌負荷を低減する。一実施形態では、そのような細菌負荷の変化は、実施例に示される方法を使用して決定される。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、少なくとも約１０％、または代替的に、少なくとも約１５％、または代替的に、少なくとも約２０％、または代替的に、少なくとも約２５％、または代替的に、少なくとも約３０％、または代替的に、少なくとも約３５％、または代替的に、少なくとも約４０％、または代替的に、少なくとも約４５％、または代替的に、少なくとも約５０％、または代替的に、少なくとも約５５％、または代替的に、少なくとも約６０％、または代替的に、少なくとも約６５％、または代替的に、少なくとも約７０％、または代替的に、少なくとも約７５％、または代替的に、少なくとも約８０％、または代替的に、少なくとも約８５％、または代替的に、少なくとも約９０％、または代替的に、少なくとも約９１％、または代替的に、少なくとも約９２％、または代替的に、少なくとも約９３％、または代替的に、少なくとも約９４％、または代替的に、少なくとも約９５％、または代替的に、少なくとも約９６％、または代替的に、少なくとも約９７％、または代替的に、少なくとも約９８％、または代替的に、少なくとも約９９％、中耳炎（ＯＭ）を有する対象における中耳閉塞を低減する。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、約１％未満、または代替的に、約２％未満、または代替的に、約３％未満、または代替的に、約４％未満、または代替的に、約５％未満、または代替的に、約６％未満、または代替的に、約７％未満、または代替的に、約８％未満、または代替的に、約９％未満、または代替的に、約１０％未満、または代替的に、約１２％未満、または代替的に、約１５％未満、または代替的に、約２０％未満、または代替的に、約２５％未満、または代替的に、約３０％未満、または代替的に、約３５％未満、または代替的に、約４０％未満、または代替的に、約４５％未満、または代替的に、約５０％未満、中耳炎（ＯＭ）を有する対象における中耳閉塞を低減する。一実施形態では、中耳閉塞のそのような変化は、実験ＯＭモデルにおいて実施例に示される方法を使用して決定される。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、少なくとも約１０％、または代替的に、少なくとも約１５％、または代替的に、少なくとも約２０％、または代替的に、少なくとも約２５％、または代替的に、少なくとも約３０％、または代替的に、少なくとも約３５％、または代替的に、少なくとも約４０％、または代替的に、少なくとも約４５％、または代替的に、少なくとも約５０％、または代替的に、少なくとも約５５％、または代替的に、少なくとも約６０％、または代替的に、少なくとも約６５％、または代替的に、少なくとも約７０％、または代替的に、少なくとも約７５％、または代替的に、少なくとも約８０％、または代替的に、少なくとも約８５％、または代替的に、少なくとも約９０％、または代替的に、少なくとも約９１％、または代替的に、少なくとも約９２％、または代替的に、少なくとも約９３％、または代替的に、少なくとも約９４％、または代替的に、少なくとも約９５％、または代替的に、少なくとも約９６％、または代替的に、少なくとも約９７％、または代替的に、少なくとも約９８％、または代替的に、少なくとも約９９％、粘膜バイオフィルムを有する（ＯＭを有するなど）対象における相対粘膜バイオフィルムスコアおよび／またはバイオマススコアを低減する。一実施形態では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、少なくとも約０．５、または代替的に、少なくとも約１、または代替的に、少なくとも約１．５、または代替的に、少なくとも約２、または代替的に、少なくとも約２．５、または代替的に、少なくとも約３、または代替的に、少なくとも約３．５、または代替的に、少なくとも約４、粘膜バイオフィルムを有する（ＯＭを有するなど）対象における相対粘膜バイオフィルムスコアおよび／またはバイオマススコアを低減する。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、約１％未満、または代替的に、約２％未満、または代替的に、約３％未満、または代替的に、約４％未満、または代替的に、約５％未満、または代替的に、約６％未満、または代替的に、約７％未満、または代替的に、約８％未満、または代替的に、約９％未満、または代替的に、約１０％未満、または代替的に、約１２％未満、または代替的に、約１５％未満、または代替的に、約２０％未満、または代替的に、約２５％未満、または代替的に、約３０％未満、または代替的に、約３５％未満、または代替的に、約４０％未満、または代替的に、約４５％未満、または代替的に、約５０％未満、粘膜バイオフィルムを有する（ＯＭを有するなど）対象における相対粘膜バイオフィルムスコアおよび／またはバイオマススコアを低減する。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、約０．１未満、または代替的に、約０．２未満、または代替的に、約０．３未満、または代替的に、約０．４未満、または代替的に、約０．５未満、または代替的に、約０．６未満、または代替的に、約０．７未満、または代替的に、約０．８未満、または代替的に、約０．９未満、または代替的に、約１未満、または代替的に、約１．５未満、または代替的に、約２未満、または代替的に、約２．５未満、粘膜バイオフィルムを有する（ＯＭを有するなど）対象における相対粘膜バイオフィルムスコアおよび／またはバイオマススコアを低減する。一実施形態では、そのようなスコアは、実施例に示される方法を使用して決定される。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ＨＵまたはＩＨＦである。さらなる実施形態では、ＤＮＡＢＩＩタンパク質は、ＩｈｆＡ、ＩｈｆＢ、またはその両方である。またさらなる実施形態では、抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質のチップ領域またはテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、チップ－キメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に結合する。一実施形態では、抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、ＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩチップキメラペプチドに結合する。別の実施形態では、抗体、その断片、ポリペプチドまたはＣＤＲは、ＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩテールキメラペプチドに結合する。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、可溶性Ｆａｂである。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、同じポリペプチド鎖の構成要素である。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成要素である。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、全長抗体である。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、キメラまたはヒト化である。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、Ｆｃドメインを含む。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、非ヒト動物、例えば、ラット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコまたはウサギ抗体である。本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、ヒトもしくはヒト化抗体であるか、またはヒトにおいて非免疫原性である。
本明細書に提供される抗体の態様の一部では、抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。ＬＣおよびＨＣ配列に融合され得るフレームワーク領域の例は、当技術分野において公知であり、そのような例は、配列番号１５～２３、またはそれらのそれぞれの等価物に提供される。
他の態様では、本明細書に提供される抗体のＣＤＲにおける１つまたは複数のアミノ酸残基は、別のアミノ酸で置換されている。置換は、アミノ酸の同じファミリー内の置換であるという意味で「保存的」であってもよい。天然に存在するアミノ酸は、以下の４つのファミリーに分けられてもよく、保存的置換は、これらのファミリー内で行われる。
１）塩基性側鎖を有するアミノ酸：リシン、アルギニン、ヒスチジン。
２）酸性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸。
３）非荷電極性側鎖を有するアミノ酸：アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン。
４）非極性側鎖を有するアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン。
別の態様では、１つまたは複数のアミノ酸残基が、抗体の１つまたは複数のＣＤＲに付加されるか、またはそれから欠失される。そのような付加または欠失は、ＣＤＲのＮ末端もしくはＣ末端で、またはＣＤＲ内の位置で起こる。
アミノ酸の付加、欠失または置換により抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を変化させることによって、標的抗原に対する増加した結合親和性などのさまざまな効果が得られ得る。
そのような変化したＣＤＲ配列を含む本開示の抗体が、依然として、開示される抗体と類似の特異性および感受性プロファイルで、ＤＮＡＢＩＩタンパク質に結合することが理解されるべきである。これは、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＲなどの結合アッセイの方法によって試験することができる。
さらなる態様では、抗体は、適切なアッセイおよびスクリーニングを使用して決定される、免疫優性および免疫保護性の両方であることによって特徴付けられる。
別の態様では、抗体は、従来の技法によって改変することができ、これは、一態様では、抗体の半減期を増加させ得、例えば、ペグ化、ＰＥＧミメティック、ポリシアル化、ＨＥＳ化またはグリコシル化であり得る。
抗体および抗原結合性断片は、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含むことができる。
抗体およびその誘導体
本開示は、本明細書に開示される方法における使用のための単離されたポリペプチドに結合する抗体、および／またはそれを特異的に認識し、それに特異的に結合する抗体も提供する。抗体は、本明細書に記載されるさまざまな抗体のいずれかであり得、そのような非限定的な例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ベニア化抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、抗体誘導体、組換えヒト化抗体、またはそれらのそれぞれの等価物（誘導体など）もしくは断片が挙げられる。一態様では、断片は、抗体のＣＤＲを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。一態様では、抗体は、検出可能に標識されるか、またはそれにコンジュゲートされる検出可能な標識をさらに含む。
本明細書に開示されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も提供される。上記の実施形態のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる組成物が、本明細書にさらに提供される。抗体および断片のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに抗体ポリペプチドおよびその断片を組換え的に産生するか、またはそれを化学合成する方法がさらに提供される。抗体ポリペプチドは、真核細胞もしくは原核細胞において、または当技術分野において公知のおよび本明細書に記載される他の方法によって産生することができる。
ＣＤＲ配列の例としては、限定されないが、以下：抗体またはその断片の重鎖可変領域が、下記のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなることを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはまたさらにそれからなることが挙げられる。
抗体は、当技術分野において公知のおよび文献に十分に記載されている従来の技法を使用して生成することができる。ポリクローナル抗体の産生のためのいくつかの方法論がある。例えば、ポリクローナル抗体は、典型的には、限定されるものではないが、ニワトリ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、マウス、ラット、およびウサギなどの好適な哺乳動物の免疫によって産生される。抗原を、哺乳動物に注射し、Ｂリンパ球を誘導して、抗原に特異的な免疫グロブリンを産生する。免疫グロブリンは、哺乳動物の血清から精製されてもよい。
この方法論の変形形態としては、最適な産生および動物の人道的な処置のために、アジュバント、投与の経路および部位、部位あたりの注射体積、ならびに動物あたりの部位の数の改変が挙げられる。例えば、アジュバントは、典型的には、抗原に対する免疫応答を改善または増強するために使用される。ほとんどのアジュバントは、流入領域リンパ節への抗原の徐放を可能にする、注射部位抗原デポーを提供する。他のアジュバントは、大きな表面積および免疫賦活性分子にわたるタンパク質抗原分子の濃縮を促進する界面活性物質を含む。ポリクローナル抗体生成のためのアジュバントの非限定的な例としては、フロイントアジュバント、Ｒｉｂｉアジュバントシステム、およびＴｉｔｅｒｍａｘが挙げられる。ポリクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法を使用して生成することができ、その一部は、米国特許第７，２７９，５５９号；同第７，１１９，１７９号；同第７，０６０，８００号；同第６，７０９，６５９号；同第６，６５６，７４６号；同第６，３２２，７８８号；同第５，６８６，０７３号；および同第５，６７０，１５３号に記載されている。
本開示の抗体誘導体は、本明細書に開示される抗体をコードするポリヌクレオチドを好適な宿主に送達して、例えば、そのような抗体をそれらの乳汁中で産生する、トランスジェニック動物または哺乳動物、例えば、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどを提供することによって調製することもできる。これらの方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号；同第５，５６５，３６２号；および同第５，３０４，４８９号に記載されている。
「抗体誘導体」という用語は、抗体または断片の線状ポリペプチド配列への翻訳後改変を含む。例えば、米国特許第６，６０２，６８４Ｂ１号は、増強されたＦｅ媒介性細胞毒性を有する、全抗体分子、抗体断片、または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価の領域を含む融合タンパク質を含む、改変されたグリコール形態の抗体の生成のための方法、およびそのようにして生成された糖タンパク質を記載している。
本明細書に開示される抗体は、共有結合性付着が、抗体が抗イディオタイプ応答を生成するのを防止しないような、抗体への任意の種類の分子の共有結合性付着によって改変された誘導体も含む。抗体誘導体としては、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変された抗体が挙げられる。加えて、誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有していてもよい。
抗体誘導体は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを送達して、植物部分またはそれから培養された細胞においてそのような抗体、規定の部分またはバリアントを産生するトランスジェニック植物および培養植物細胞（例えば、限定されるものではないが、タバコ、トウモロコシ、およびウキクサ）を提供することによって調製することもできる。例えば、Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118およびそこで引用された参考文献は、例えば、誘導性プロモーターを使用して、大量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の産生を記載している。トランスジェニックトウモロコシを使用して、他の組換え系において産生されたもの、または天然起源から精製されたものと等価な生物活性を有する哺乳動物タンパク質を商業的生産レベルで発現させた。例えば、Hood et al. (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147、およびそこで引用された参考文献を参照されたい。抗体誘導体はまた、タバコ種子およびジャガイモ塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含むトランスジェニック植物種子から大量に産生されている。例えば、Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109、およびそこで引用された参考文献を参照されたい。そのため、抗体を、公知の方法に従って、トランスジェニック植物を使用して産生することもできる。
抗体誘導体は、例えば、外因性配列を付加して、免疫原性を改変する、または結合、親和性、オンレート、オフレート、アビディティー、特異性、半減期もしくは任意の他の好適な特徴を低減、増強もしくは改変することによって、産生させることもできる。一般に、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の部分または全体は維持されるが、非ヒト配列の可変領域および定常領域は、ヒト、または他のアミノ酸、または他のアイソタイプ由来の可変領域もしくは定常領域で置き換えられる。
一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的におよび最も実質的に関与する。抗体のヒト化または操作は、任意の公知の方法、例えば、限定されるものではないが、米国特許第５，７２３，３２３号；同第５，９７６，８６２号；同第５，８２４，５１４号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７６３，１９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６６，８８６号；同第５，７１４，３５２号；同第６，２０４，０２３号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，２２５，５３９号；および同第４，８１６，５６７号に記載されているものを使用して行うことができる。
本開示のキメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化抗体は、標準的な分子生物学技法を使用して調製された参照モノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学技法を使用して、目的のハイブリドーマから得、非参照（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作出するために、マウス可変領域を、当技術分野において公知の方法（米国特許第４，８１６，５６７号）を使用して、ヒト定常領域に連結することができる。ヒト化抗体を作出するために、マウスＣＤＲ領域を、当技術分野において公知の方法（米国特許第５，２２５，５３９号ならびに米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号）を使用して、ヒトフレームワークに挿入することができる。同様に、霊長類化抗体を作出するために、マウスＣＤＲ領域を、当技術分野において公知の方法（ＷＯ９３／０２１０８号およびＷＯ９９／５５３６９号）を使用して、霊長類フレームワークに挿入することができる。
部分的な～完全なヒト抗体を作製するための技法は、当技術分野において公知であり、任意のそのような技法を使用することもできる。一実施形態によれば、完全なヒト抗体配列は、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製される。異なるクラスの抗体を産生することができる、そのようなトランスジェニックマウスの複数の株が作製されている。望ましい抗体を産生しているトランスジェニックマウス由来のＢ細胞を融合させて、所望の抗体の持続的産生のためのハイブリドーマ細胞系を作製することができる（例えば、Russel et al. (2000) Infection and Immunity April 2000:1820-1826；Gallo et al. (2000) European J. of Immun. 30:534-540；Green (1999) J. of Immun. Methods 231:11-23；Yang et al. (1999A) J. of Leukocyte Biology 66:401-410；Yang (1999B) Cancer Research 59(6):1236-1243；Jakobovits (1998) Advanced Drug Reviews 31:33-42；Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3):483-495；Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4):607-614；Tsuda et al. (1997) Genomics 42:413-421；Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14)；Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156；Jakobovits (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194.1-194.7；Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:561-566；Mendez et al. (1995) Genomics 26:294-307；Jakobovits (1994) Current Biology 4(8):761-763；Arbones et al. (1994) Immunity 1(4):247-260；Jakobovits (1993) Nature 362(6417):255-258；Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6):2551-2555；および米国特許第６，０７５，１８１を参照されたい。
本明細書に開示される抗体を改変して、キメラ抗体を作出することもできる。キメラ抗体は、抗体の重鎖および軽鎖のさまざまなドメインが、２つ以上の種由来のＤＮＡによってコードされるものである。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。
あるいは、本明細書に開示される抗体を改変して、ベニア化抗体を作出することもできる。ベニア化抗体は、第１の種の抗体が、第２の種において免疫原性ではなく、それによって、抗体の免疫原性が低減するように、ある種の抗体の外側アミノ酸残基が、第２の種のもので思慮深く置き換えられたか、または「ベニア化された」ものである。タンパク質の抗原性は、その表面の特質に主に依存するので、抗体の免疫原性は、別の哺乳動物種において通常見出される残基とは異なる露出した残基を置き換えることによって、低減され得る。外側残基のこの思慮深い置き換えは、内側ドメインまたはドメイン間接触に対してわずかな効果を有するか、または有さないはずである。そのため、リガンド結合特性は、可変領域フレームワーク残基に限定される変更の帰結として、影響を受けないはずである。抗体の外表面または外皮のみが変更され、支持する残基は破壊されないままであるので、このプロセスは、「ベニア化」と称される。
「ベニア化」のための手順は、Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological interest, 4th ed., Bethesda, Md., National Institutes of Healthによってコンパイルされたヒト抗体可変ドメインについての利用可能配列データ、このデータベースのアップデート、ならびに他のアクセス可能な米国および外国のデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を活用する。ベニア化抗体を生成するために使用される方法の非限定的な例としては、ＥＰ５１９５９６号；米国特許第６，７９７，４９２号が挙げられ、Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28(4-5):489-498に記載されている。
「抗体誘導体」という用語は、２つの抗原結合性部位を有する小さな抗体断片である「ダイアボディ」も含み、ここで、断片は、同じポリペプチド鎖において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（例えば、ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびHollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448を参照されたい）。同じ鎖における２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成することを強制し、２つの抗原結合性部位を作出する（親抗体の超可変領域に挿入された１つまたは複数のアミノ酸を有し、抗原に対する親抗体の結合親和性よりも少なくとも約２倍強い標的抗原に対する結合親和性を有する抗体バリアントを開示する、Ｃｈｅｎらに対する米国特許第６，６３２，９２６号も参照されたい）。
「抗体誘導体」という用語は、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、ナノボディ、ミニボディ、ユニボディ、およびアフィボディなどの操作された抗体分子、断片および単一ドメインをさらに含む（およびHudson (2005) Nature Biotech 23(9):1126-36；米国特許出願公開第２００６／０２１１０８８号；ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２００７／０５９７８２号；米国特許第５，８３１，０１２号）。
「抗体誘導体」という用語は、「線状抗体」をさらに含む。線状抗体を作製するための手順は、当技術分野において公知であり、Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062に記載されている。簡潔には、これらの抗体は、一対の抗原結合性領域を形成する一対のタンデムＥｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二特異性または単特異性であり得る。
本明細書に開示される抗体は、限定されるものではないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を、精製のために使用することもできる。
本開示の抗体は、天然で精製された産物、化学合成手順の産物、ならびに例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主から、または代替的に、上記に記載される原核生物宿主から組換え技法によって産生された産物を含む。いくつかの抗体産生系が、Birch & Radner (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:671-685に記載されている。
試験される抗体が、タンパク質またはポリペプチドと結合する場合、試験される抗体および本開示によって提供される抗体は、等価物である。試験される抗体によって、本明細書に開示される抗体が、この抗体が正常に反応するタンパク質またはポリペプチドに結合することを防止するかどうかを決定することによって、過度の実験なしで、抗体が、本明細書に開示される抗体と同じ特異性を有するかどうかを決定することも可能である。本明細書に開示されるモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、試験される抗体が、本明細書に開示される抗体と競合する場合、２つの抗体は、同じまたは密接に関連するエピトープに結合する可能性がある。あるいは、本明細書に開示される抗体を、それが正常な反応性であるタンパク質とともにプレインキュベートし、試験される抗体が、抗原に結合するその能力において阻害されるかを決定することができる。試験される抗体が阻害される場合、ほぼ確実に、これは、本明細書に開示される抗体と同じまたは密接に関連するエピトープ特異性を有する。
「抗体」という用語はまた、すべての免疫グロブリンアイソタイプおよびサブクラスの抗体を含むことを意図する。特定のアイソタイプのモノクローナル抗体は、最初の融合物から選択することによって直接的に調製することができ、またはｓｉｂ選択技法を使用することによって異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製して、Steplewski et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8653またはSpira et al. (1984) J. Immunol. Methods 74:307に記載されている手順を使用してクラススイッチバリアントを単離することができる。あるいは、組換えＤＮＡ技法が使用されてもよい。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体の特異性を有する他のモノクローナル抗体の単離は、抗イディオタイプ抗体を産生することによって、当業者により達成することもできる。Herlyn et al. (1986) Science 232:100。抗イディオタイプ抗体は、目的のモノクローナル抗体に存在する固有の決定基を認識する抗体である。
本明細書に開示される一部の態様では、抗体を検出可能にまたは治療的に標識することが有用である。好適な標識は、上記に記載されている。抗体をこれらの薬剤にコンジュゲートするための方法は、当技術分野において公知である。説明だけの目的のために、抗体は、検出可能な部分、例えば、放射活性原子、発色団、フルオロフォアなどで標識することができる。そのような標識された抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで、または単離された試験試料においてのいずれかで、診断技法のために使用することができる。
低分子量ハプテンへの抗体のカップリングは、アッセイにおける抗体の感受性を増加させることができる。次いで、ハプテンは、第２の反応によって特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェノール、ピリドキサールおよびフルオレセインなどのハプテンを使用することが一般的である。Harlow and Lane (1988)、上記を参照されたい。
本開示の抗体の可変領域は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することによって改変することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発によって導入されてもよく、目的の抗体結合または他の機能特性に対する効果は、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて評価することができる。ある特定の実施形態では、保存的改変が導入され、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５残基以下が変更される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であってもよい。
フレームワーク改変を、例えば、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「戻し突然変異する」ことによって、抗体に対して行って、免疫原性を減少させることができる。
加えて、本明細書に開示される抗体は、Ｆｃ領域内に改変を含むように操作して、抗体の１つまたは複数の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞性細胞傷害性を変更してもよい。そのような改変としては、限定されるものではないが、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易にするため、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるためのヒンジ領域におけるシステイン残基の数の変更（米国特許第５，６７７，４２５号）、ならびに抗体の生物学的半減期を減少させるためのＦｃヒンジ領域におけるアミノ酸突然変異（米国特許第６，１６５，７４５号）が挙げられる。
加えて、本明細書に開示される抗体は、化学的に改変されていてもよい。抗体のグリコシル化は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を改変して、抗原に対する抗体の親和性を増加させることによって変更することができる（米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号）。あるいは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性を増加させるために、低減された量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体、または増加した二分型ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって得ることができる（Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180）。
本明細書に開示される抗体は、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体または抗体断片に付着するようになる条件下、抗体またはその断片をＰＥＧまたはＰＥＧの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体と反応させることによって、ペグ化して、生物学的半減期を増加させることができる。抗体のペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行われてもよい。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－もしくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコール－マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することを意図する。ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体であり得る。タンパク質をペグ化するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に開示される抗体に適用することができる（ＥＰ０１５４３１６号およびＥＰ０４０１３８４号）。
加えて、抗体は、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質に抗体の抗原結合性領域をコンジュゲートまたは融合することによって化学的に改変して、得られる分子の半減期を増加させてもよい。そのようなアプローチは、例えば、ＥＰ０３２２０９４号およびＥＰ０４８６５２５号に記載されている。
本開示の抗体またはその断片は、診断剤にコンジュゲートされ、診断的に使用して、例えば、疾患の発生または進行をモニターしてもよく、所与の処置レジメンの有効性を決定してもよい。診断剤の例としては、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、さまざまな陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、当技術分野において公知の技法を使用して、抗体もしくはその断片に直接的に、またはリンカーを通じて間接的にのいずれかで、カップリングまたはコンジュゲートされていてもよい。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光材料の例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。好適な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、インジウム－１１１、ルテチウム－１７１、ビスマス－２１２、ビスマス－２１３、アスタチン－２１１、銅－６２、銅－６４、銅－６７、イットリウム－９０、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、リン－３２、リン－３３、スカンジウム－４７、銀－１１１、ガリウム－６７、プラセオジム－１４２、サマリウム－１５３、テルビウム－１６１、ジスプロシウム－１６６、ホルミウム－１６６、レニウム－１８６、レニウム－１８８、レニウム－１８９、鉛－２１２、ラジウム－２２３、アクチニウム－２２５、鉄－５９、セレン－７５、ヒ素－７７、ストロンチウム－８９、モリブデン－９９、ロジウム－１１０５、パラジウム－１０９、プラセオジム－１４３、プロメチウム－１４９、エルビウム－１６９、イリジウム－１９４、金－１９８、金－１９９、および鉛－２１１が挙げられる。モノクローナル抗体は、抗体に共有結合的に連結された二官能性キレート化剤の使用により、放射性金属イオンと間接的にコンジュゲートされていてもよい。キレート化剤は、ａｍｉｔｉｅｓ（Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142:68-78）；アミノ酸残基のスルフヒドリル（sulfhydral）基（Koyama (1994) Chem. Abstr. 120:217-262）、および炭水化物基（Rodwell et al. (1986) PNAS USA 83:2632-2636；Quadri et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:559-570）を通して付着されていてもよい。
さらに、本開示の抗体またはその断片は、治療剤にコンジュゲートされていてもよい。好適な治療剤としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、代謝拮抗薬（メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５－フルオロウラシル、ダカルバジン（decarbazine）、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン（gemcitabinc）、クラドリビンなど）、アルキル化剤（メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロラムブシル（chloramhucil）、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、およびカルボプラチンなどの他の白金誘導体など）、抗生物質（ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）など）、ジフテリア毒素および関連分子（ジフテリアＡ鎖およびその活性断片、ならびにハイブリッド分子など）、リシン毒素（リシンＡまたは脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素など）、コレラ毒素、志賀様毒素（ＳＬＴ－Ｉ、ＳＬＴ－ＩＩ、ＳＬＴ－ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボウマン－バークプロテアーゼ阻害剤、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリエトシン（restrietocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）毒素および混合毒素が挙げられる。
追加の好適なコンジュゲートされた分子としては、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ分子などの阻害性ＲＮＡ分子、免疫賦活性核酸、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成性分子、および外部ガイド配列が挙げられる。アプタマーは、ステムループまたはＧ－カルテットなどの定義された二次構造および三次構造にフォールドされた１５～５０塩基の長さの範囲の小型核酸であり、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（theophiline）（米国特許第５，５８０，７３７号）などの小分子、ならびに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）などの大分子に結合することができる。リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで、化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識および結合と、その後の切断により、核酸基質を切断する。三重鎖形成性機能的核酸分子は、三重鎖を形成することによって、二本鎖または一本鎖核酸と相互作用することができ、ここで、３つのＤＮＡ鎖は、ワトソン－クリック塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成の両方に依存する複合体を形成する。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で、標的領域に結合することができる。
機能的核酸分子は、標的分子によって保有される比活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーターおよび刺激因子として作用してもよく、または機能的核酸分子は、任意の他の分子から独立したｄｅ ｎｏｖｏ活性を保有していてもよい。
治療剤は、多数の利用可能な方法のいずれかを使用して、直接的にまたは間接的に抗体に連結することができる。例えば、薬剤は、還元された抗体構成要素のヒンジ領域で、Ｎ－スクシニル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの架橋剤を使用したジスルフィド結合形成を介して、または抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介して、付着することができる（Yu et al. 1994 Int. J. Cancer 56: 244；Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)；Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)）。
治療剤を抗体にコンジュゲートするための技法は、周知である（Amon et al. "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy；Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al. "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.)；Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al. "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," (1982) Immunol. Rev. 62:119-58）。
本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性領域は、別の機能的分子、例えば、別の抗体または受容体のためのリガンドに連結されて、少なくとも２つまたはそれよりも多くの異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性分子または多特異性分子を生成することができる。別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物などの１つまたは複数の他の結合分子への抗体の連結は、例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有結合的会合によって行うことができる。多特異性分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。
二特異性分子および多特異性分子は、当技術分野において公知の方法を使用して調製することができる。例えば、二特異的分子のそれぞれの結合単位を別々に生成し、次いで、互いにコンジュゲートすることができる。結合分子がタンパク質またはペプチドである場合、各種のカップリング剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションのために使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸（2-nitroberizoic acid））（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン（cyclohaxane）－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が挙げられる（Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686；Liu et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648）。結合分子が抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートすることができる。
本開示の抗体またはその断片は、抗体が結合される細胞に対して毒性がある部分に連結されて、「枯渇」抗体を形成してもよい。これらの抗体は、ＮＫ細胞を枯渇させることが望ましい適用において特に有用である。
本明細書に開示される抗体はまた、固体支持体に付着されていてもよく、これは、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用である。そのような固体支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
抗体は、多くの異なる担体に結合させることもできる。そのため、本開示は、抗体、および活性なまたは不活性な別の物質を含有する組成物も提供する。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびにマグネタイトが挙げられる。担体の特質は、本明細書に開示される目的のために、可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者であれば、モノクローナル抗体の結合のための他の好適な担体が公知であるか、またはルーチンの実験を使用して、それを解明することが可能であろう。
ある特定の態様では、本開示は、ＤＮＡＢＩＩタンパク質もしくはその断片のチップもしくはテールドメイン、テール断片またはチップ断片を特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片に関する。ＤＮＡＢＩＩタンパク質またはその断片は、ＩＨＦポリペプチドまたはＨＵポリペプチドであり得る。
抗体による機能分析
本明細書に開示される抗体を使用して、本明細書に開示されるポリペプチドを精製し、生物学的に等価なポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを特定することができる。それらを使用して、本明細書に開示されるポリペプチドの機能を改変する薬剤を特定することもできる。これらの抗体としては、当業者に良く知られており、上記に記載されている、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、およびこれらの調製物に由来するさまざまな試薬が挙げられる。
特定された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を中和する抗体はまた、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで使用して、そのような中和抗体をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの試験系に添加することによって機能を実証することができる。それらは、本明細書に開示されるポリペプチドの活性をモジュレートするための医薬品としても有用である。
さまざまな抗体調製物は、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウエスタンブロットなどの分析方法において使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、試験細胞によって特定された遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を実証することもできる。代謝の間にプロテアーゼ分解によって生成されたそのようなタンパク質の断片は、適切なポリクローナル抗血清と実験試料に由来する試料を使用することによって特定することもできる。
本明細書に開示される抗体は、単独で、あるいはペプチドもしくはタンパク質に基づくワクチンまたは樹状細胞に基づくワクチンと組み合わせて、ワクチン接種のため、またはワクチン接種をブーストするために使用されてもよい。
抗体の一般構造は、当技術分野において公知であり、ここでは簡潔に要約するのみである。免疫グロブリンモノマーは、ジスルフィド結合によって接続された２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。それぞれの重鎖は、ジスルフィド結合を介して直接的に結合される軽鎖の１つと対形成する。それぞれの重鎖は、定常領域（抗体のアイソタイプに応じて変わる）および可変領域を含む。可変領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３と指定され、フレームワーク領域内で支持される、３つの超可変領域（または相補性決定領域）を含む。それぞれの軽鎖は、定常領域および可変領域を含み、可変領域は、重鎖の可変領域と類似の様式で、フレームワーク領域によって支持される３つの超可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３と指定される））を含む。
重鎖および軽鎖のそれぞれの対の超可変領域は、互いに協力して、標的抗原に結合することができる抗原結合性部位を提供する。重鎖および軽鎖の対の結合特異性は、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列によって定義される。そのため、特定の結合特異性を生じるＣＤＲ配列（すなわち、重鎖および軽鎖についてＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の配列）のセットが決定されると、ＣＤＲ配列のセットは、原理上、同じ抗原結合特異性を有する異なる抗体を提供するために、任意の抗体の定常領域内で連結された任意の他の抗体フレームワーク領域内の適切な位置に挿入され得る。
Ｆａｂ断片の生成のための抗体は、当技術分野において公知のおよび文献に十分に記載されている従来の技法を使用して生成することができる。ポリクローナル抗体の産生のためのいくつかの方法論がある。例えば、ポリクローナル抗体は、典型的には、限定されるものではないが、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、ウマ、イヌ、マウス、ラット、およびウサギなどの好適な哺乳動物の免疫によって産生される。抗原を、哺乳動物に注射し、Ｂリンパ球を誘導して、抗原に特異的な免疫グロブリンを産生する。免疫グロブリンは、哺乳動物の血清から精製されてもよい。ＩＨＦαおよび／またはＩＨＦβサブユニットに対して特異的な抗体は、ＩＨＦαおよびＩＨＦβの異なるエピトープに対応するポリペプチドの注射によって生成することができる。例えば、抗体は、それぞれ、ＩＨＦの断片Ａ３およびＡ５、ＨＵの断片Ａ５、ＩＨＦの断片Ｂ２、Ｂ４、およびｍＢ４などのそれぞれのサブユニットの２０アミノ酸を使用して生成することができる。
この方法論の変形形態としては、最適な産生および動物の人道的な処置のために、アジュバント、投与の経路および部位、部位あたりの注射体積、ならびに動物あたりの部位の数の改変が挙げられる。例えば、アジュバントは、典型的には、抗原に対する免疫応答を改善または増強するために使用される。ほとんどのアジュバントは、流入領域リンパ節への抗原の徐放を可能にする、注射部位抗原デポーを提供する。他のアジュバントは、大きな表面積および免疫賦活性分子にわたるタンパク質抗原分子の濃縮を促進する界面活性物質を含む。ポリクローナル抗体生成のためのアジュバントの非限定的な例としては、フロイントアジュバント、Ｒｉｂｉアジュバントシステム、ＭＰＬ由来アジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシンに由来するもの（例えば、ｄｍＬＴ＝二重突然変異不安定毒素）、およびＴｉｔｅｒｍａｘが挙げられる。ポリクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法を使用して生成することができ、その一部は、米国特許第７，２７９，５５９号；同第７，１１９，１７９号；同第７，０６０，８００号；同第６，７０９，６５９号；同第６，６５６，７４６号；同第６，３２２，７８８号；同第５，６８６，０７３号；および同第５，６７０，１５３号に記載されている。
モノクローナル抗体は、当技術分野において公知のおよび文献に十分に記載されている従来のハイブリドーマ技法を使用して生成することができる。例えば、ハイブリドーマは、好適な不死化細胞系（例えば、骨髄腫細胞系、例えば、限定されるものではないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０－ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ－１、Ｌ．５、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８，６５３、Ｓｐ２ ＳＡ３、Ｓｐ２ ＭＡＩ、Ｓｐ２ ＳＳ１、Ｓｐ２ ＳＡ５、Ｕ３９７、ＭＩＡ １４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ－１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ－５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３１３、ＨＬ－６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａ、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ．６、ＹＢ２／Ｏ）など、またはヘテロミエローマ、その融合産物、またはそれらが由来する任意の細胞もしくは融合細胞、または当技術分野において公知の任意の他の好適な細胞系（以下のウェブアドレス、例えば、ａｔｃｃ．ｏｒｇ，ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ、最終アクセス２００７年１１月２６日のものを参照されたい）を、内因性核酸または異種核酸のいずれかとして、組換えまたは内因性の、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯動物、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡもしくはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖、ハイブリダイズされたものなど、あるいはそれらの任意の組み合わせとして、抗体産生細胞、例えば、限定されないが、単離されたまたはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ、扁桃腺、または他の免疫細胞もしくはＢ細胞を含有する細胞、あるいは重鎖または軽鎖の定常配列または可変配列またはフレームワーク配列またはＣＤＲ配列を発現する任意の他の細胞と融合することによって産生される。抗体産生細胞は、目的の抗原で免疫されたヒトもしくは他の好適な動物の、末梢血から、または特定の実施形態では、脾臓もしくはリンパ節から得ることもできる。本開示の抗体、その規定の断片またはバリアントをコードする異種核酸または内因性核酸を発現させるために、任意の他の好適な宿主細胞を使用することもできる。融合された細胞（ハイブリドーマ）または組換え細胞は、選択的培養条件または他の好適な公知の方法を使用して単離し、限界希釈もしくは細胞選別、または他の公知の方法によってクローニングすることができる。本明細書に開示される一部の実施形態は、ＩＨＦ断片に対してモノクローナル抗体を産生する特異的なハイブリドーマに関し、非限定的な例としては、ＩｈｆＡ５ ＮＴＨＩ １４Ｇ８．Ｆ５．Ｇ６（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２２３３４）、ＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ ４Ｅ１１．Ｅ５．Ｇ２（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２２３３６）、ｍＩｈｆＢ４ ＮＴＨＩ １２Ｅ６．Ｆ８．Ｄ１２．Ｄ５（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ－１２２３３５）が挙げられる。
限定されるものではないが、当技術分野において公知の方法を使用して、ペプチドまたはタンパク質ライブラリー（例えば、限定されるものではないが、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡなど、ディスプレイライブラリー；例えば、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ、Ｄｅｌ．）、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）、Ａｆｆｉｔｅｃｈ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）などのさまざまな商業的ベンダーから利用可能なもの）から組換え抗体を選択する方法を含む、必要な特異性の抗体を産生または単離する他の好適な方法を使用することができる。当技術分野の公知の方法は、特許文献に記載されており、その一部としては、米国特許第４，７０４，６９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８２４，５１４号；同第５，９７６，８６２号が挙げられる。代替方法は、当技術分野において公知であるように、および／または本明細書に記載されるように、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、ＳＣＩＤマウス、Nguyen et al. (1977) Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997)；Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118；Eren et al. (1998) Mumma 93:154-161）の免疫に依拠する。そのような技法としては、限定されるものではないが、リボソームディスプレイ（例えば、Wanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942；Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130-14135）；単一細胞抗体産生技術（例えば、選択されたリンパ球抗体方法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号、Wen et al. (1987) J. Immunol 17:887-892；Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848）；ゲル微小液滴およびフローサイトメトリー（Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337；Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）；Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163；およびKenny et al. (1995) Bio. Technol. 13:787-790）；Ｂ細胞選択（Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134）が挙げられる。追加の方法は、当技術分野において公知の技法を使用するヒト血清からのヒト抗体の単離に依拠し、米国特許第７，９３９，３４４号を参照されたい。
抗体はまた、リンパ球集団においてｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導することによって、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは非常に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生されてもよい（Orlandi et al. (1989) PNAS 86:3833-3837；Winter et al. (1991) Nature 349:293-299）。
あるいは、一本鎖抗体の産生のための技法が使用されてもよい。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、リンカーペプチド（典型的には、おおよそ５～２５アミノ酸の長さ）で接続された重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ｓｃＦｖでは、重鎖および軽鎖の可変領域は、同じ抗体または異なる抗体に由来していてもよい。ｓｃＦｖは、組換え技法を使用して、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主生物においてｓｃＦｖをコードするベクターの発現によって、合成されてもよい。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、鋳型として上記で言及した抗体の重鎖または重鎖の可変領域をコードするＤＮＡおよびその軽鎖または軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡから選択されるＤＮＡの全体のまたは所望アミノ酸配列をコードする部分ＤＮＡを使用する増幅を行うことによって、その両末端を定義するプライマー対を使用するＰＣＲ、ならびにそれぞれ、リンカーの両末端が重鎖および軽鎖にライゲーションされるように、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両末端を定義するプライマー対を組み合わせて増幅を行うことによって、得ることができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを含有する発現ベクター、および発現ベクターによって形質転換される宿主は、当技術分野において公知の従来の方法に従って得ることができる。
抗原結合性断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生され得るＦａｂ断片のペプシン消化によって産生することができる。Ｆａｂ断片、特に、マウスモノクローナル抗体から産生されるマウスＦａｂ断片は、システインの存在下でチオールプロテアーゼのフィシンによる抗体の消化によって産生することもできる。Ｆａｂ断片、特に、ウサギポリクローナル抗体から産生されるウサギＦａｂ断片はまた、システイン－ＨＣｌの存在下でプロテアーゼのパパインによる抗体の消化によって産生されてもよい。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速で容易な特定を可能にしてもよい（Huse et al. (1989) Science 256:1275-1281）。断片の生成の際に、断片は、従来の技法を使用して単離および配列決定することができ、アミノ酸配列が決定される。
本開示の抗体誘導体は、本明細書に開示される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを好適な宿主に送達して、例えば、そのような抗体をそれらの乳汁中で産生する、トランスジェニック動物または哺乳動物、例えば、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどを提供することによって調製することもできる。これらの方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８２７，６９０号；同第５，８４９，９９２号；同第４，８７３，３１６号；同第５，８４９，９９２号；同第５，９９４，６１６号；同第５，５６５，３６２号；および同第５，３０４，４８９号に記載されている。
本明細書に開示される抗体断片、抗原結合性断片およびポリペプチドが由来する親抗体は、共有結合性付着が、抗体が抗イディオタイプ応答を生成するのを防止しないような、抗体への任意の種類の分子の共有結合性付着によって改変された誘導体も含む。抗体誘導体としては、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって改変された抗体が挙げられる。本明細書で企図される改変された抗体の非限定的な例は、アグリコシル化全抗体分子、抗体断片、または免疫グロブリンのＦｃ領域と等価な領域を含む融合タンパク質である。そのようなアグリコシル化形態は、例えば、Ｎ連結グリカンを有するタンパク質を改変する能力を欠く宿主細胞において、または目的の抗体上のＮ連結コンセンサス部位を突然変異させることによって生成することができる。加えて、誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含有していてもよい。
親抗体の抗体誘導体は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを送達して、植物部分またはそれから培養された細胞においてそのような抗体、規定の部分またはバリアントを産生するトランスジェニック植物および培養植物細胞（例えば、限定されるものではないが、タバコ、トウモロコシ、およびウキクサ）を提供することによって調製することもできる。例えば、Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol Immunol 240: 95-8およびそこで引用された参考文献は、例えば、誘導性プロモーターを使用して、大量の組換えタンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉の産生を記載している。トランスジェニックトウモロコシを使用して、他の組換え系において産生されたもの、または天然起源から精製されたものと等価な生物活性を有する哺乳動物タンパク質を商業的生産レベルで発現させた。例えば、Hood et al. (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147、およびそこで引用された参考文献を参照されたい。抗体誘導体はまた、タバコ種子およびジャガイモ塊茎を含む、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの抗体断片を含むトランスジェニック植物種子から大量に産生されている。例えば、Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109、およびそこで引用された参考文献を参照されたい。そのため、抗体を、公知の方法に従って、トランスジェニック植物を使用して産生することもできる。
親抗体の抗体誘導体は、例えば、外因性配列を付加して、免疫原性を改変する、または結合、親和性、オンレート、オフレート、アビディティー、特異性、半減期もしくは任意の他の好適な特徴を低減、増強もしくは改変することによって、産生させることもできる。一般に、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の部分または全体は維持されるが、非ヒト配列の可変領域および定常領域は、ヒト、または他のアミノ酸で置き換えられる。
抗体のヒト化または操作は、任意の公知の方法、例えば、限定されるものではないが、米国特許第５，７２３，３２３号；同第５，９７６，８６２号；同第５，８２４，５１４号；同第５，８１７，４８３号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７６３，１９２号；同第５，７２３，３２３号；同第５，７６６，８８６号；同第５，７１４，３５２号；同第６，２０４，０２３号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，２２５，５３９号；および同第４，８１６，５６７号に記載されているものを使用して行うことができる。
Ｆａｂ断片もしくは抗原結合性断片、または本明細書に記載される検出可能な標識または精製標識をさらに含む本明細書に開示されるポリペプチドを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる単離されたポリペプチドがさらに提供される。
本開示の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドのキメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化抗体は、標準的な分子生物学技法を使用して調製された参照モノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。そのような抗体は、本開示の抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片または抗原結合性断片）を生成するために使用されてもよい。
重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学技法を使用して、目的のハイブリドーマから得、非参照（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作出するために、マウス可変領域を、当技術分野において公知の方法（米国特許第４，８１６，５６７号）を使用して、ヒト定常領域に連結することができる。ヒト化抗体を作出するために、マウスＣＤＲ領域を、当技術分野において公知の方法（米国特許第５，２２５，５３９号ならびに米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号）を使用して、ヒトフレームワークに挿入することができる。同様に、霊長類化抗体を作出するために、マウスＣＤＲ領域を、当技術分野において公知の方法（ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ９３／０２１０８号および同第ＷＯ９９／５５３６９号）を使用して、霊長類フレームワークに挿入することができる。
部分的な～完全なヒト抗体を作製するための技法は、当技術分野において公知であり、任意のそのような技法を使用することもできる。一実施形態によれば、完全なヒト抗体配列は、ヒト重鎖および軽鎖抗体遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製される。異なるクラスの抗体を産生することができる、そのようなトランスジェニックマウスの複数の株が作製されている。望ましい抗体を産生しているトランスジェニックマウス由来のＢ細胞を融合させて、所望の抗体の持続的産生のためのハイブリドーマ細胞系を作製することができる（例えば、Russel et al. (2000) Infection and Immunity April 2000:1820-1826；Gallo et al. (2000) European J. of Immun. 30:534-540；Green (1999) J. of Immun. Methods 231:11-23；Yang et al. (1999A) J. of Leukocyte Biology 66:401-410；Yang (1999B) Cancer Research 59(6):1236-1243；Jakobovits (1998) Advanced Drug Reviews 31:33-42；Green and Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3):483-495；Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4):607-614；Tsuda et al. (1997) Genomics 42:413-421；Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14)；Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156；Jakobovits (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194.1-194.7；Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:561-566；Mendez et al. (1995) Genomics 26:294-307；Jakobovits (1994) Current Biology 4(8):761-763；Arbones et al. (1994) Immunity 1(4):247-260；Jakobovits (1993) Nature 362(6417):255-258；Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6):2551-2555；および米国特許第６，０７５，１８１を参照されたい。
本明細書に開示される抗体を改変して、キメラ抗体を作出することもできる。キメラ抗体は、抗体の重鎖および軽鎖のさまざまなドメインが、２つ以上の種由来のＤＮＡによってコードされるものである。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。
あるいは、本明細書に開示される抗体を改変して、ベニア化抗体を作出することもできる。ベニア化抗体は、第１の種の抗体が、第２の種において免疫原性ではなく、それによって、抗体の免疫原性が低減するように、ある種の抗体の外側アミノ酸残基が、第２の種のもので思慮深く置き換えられたか、または「ベニア化された」ものである。タンパク質の抗原性は、その表面の特質に主に依存するので、抗体の免疫原性は、別の哺乳動物種抗体において通常見出される残基とは異なる露出した残基を置き換えることによって、低減され得る。外側残基のこの思慮深い置き換えは、内側ドメインまたはドメイン間接触に対してわずかな効果を有するか、または有さないはずである。そのため、リガンド結合特性は、可変領域フレームワーク残基に限定される変更の帰結として、影響を受けないはずである。抗体の外表面または外皮のみが変更され、支持する残基は破壊されないままであるので、このプロセスは、「ベニア化」と称される。
「ベニア化」のための手順は、Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological interest, 4th ed., Bethesda, Md., National Institutes of Healthによってコンパイルされたヒト抗体可変ドメインについての利用可能配列データ、このデータベースのアップデート、ならびに他のアクセス可能な米国および外国のデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を活用する。ベニア化抗体を生成するために使用される方法の非限定的な例としては、ＥＰ５１９５９６号；米国特許第６，７９７，４９２号が挙げられ、Padlan et al. (1991) Mol. Immunol. 28(4-5):489-498に記載されている。
本明細書に開示される抗体断片、抗原結合性断片およびポリペプチドは、限定されるものではないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を、精製のために使用することもできる。
本開示の抗体断片、抗原結合性断片の調製のための抗体は、天然で精製された産物、化学合成手順の産物、ならびに例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主から、または代替的に、上記に記載される原核生物宿主から組換え技法によって産生された産物を含む。いくつかの抗体産生系が、Birch & Radner (2006) Adv. Drug Delivery Rev. 58:671-685に記載されている。
試験される抗体断片が、タンパク質またはポリペプチドと結合する場合、試験される抗体断片および本開示によって提供される抗体断片は、等価物である。試験される抗体によって、本明細書に開示される抗体断片が、この抗体断片が正常に反応するタンパク質またはポリペプチドに結合することを防止するかどうかを決定することによって、過度の実験なしで、抗体断片が、本明細書に開示される抗体断片と同じ特異性を有するかどうかを決定することも可能である。本明細書に開示される抗体断片による結合の減少によって示されるように、試験される抗体断片が、本明細書に開示される抗体断片と競合する場合、２つの抗体断片は、同じまたは密接に関連するエピトープに結合する可能性がある。あるいは、本明細書に開示される抗体断片を、それが正常な反応性であるタンパク質とともにプレインキュベートし、試験される抗体断片が、抗原に結合するその能力において阻害されるかを決定することができる。試験される抗体断片が阻害される場合、ほぼ確実に、これは、本明細書に開示される抗体断片と同じまたは密接に関連するエピトープ特異性を有する。
「抗体」および「抗体断片」という用語はまた、すべての免疫グロブリンアイソタイプおよびサブクラスの抗体を含むことを意図する。特定のアイソタイプのモノクローナル抗体は、最初の融合物から選択することによって直接的に調製することができ、またはｓｉｂ選択技法を使用することによって異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製して、Steplewski et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8653またはSpira et al. (1984) J. Immunol. Methods 74:307に記載されている手順を使用してクラススイッチバリアントを単離することができる。あるいは、組換えＤＮＡ技法が使用されてもよい。
本明細書に記載されるモノクローナル抗体の特異性を有する抗体断片、抗原結合性断片およびポリペプチドを生成する使用のための他のモノクローナル抗体の単離は、抗イディオタイプ抗体を産生することによって、当業者により達成することもできる。Herlyn et al. (1986) Science 232:100。抗イディオタイプ抗体は、目的のモノクローナル抗体に存在する固有の決定基を認識する抗体である。
本明細書に開示される一部の態様では、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドを検出可能にまたは治療的に標識することが有用である。好適な標識は、本明細書に記載されている。抗体およびポリペプチドをこれらの薬剤にコンジュゲートするための方法は、当技術分野において公知である。説明だけの目的のために、抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、検出可能な部分、例えば、放射活性原子、発色団、フルオロフォアなどで標識することができる。そのような標識された抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで、または単離された試験試料においてのいずれかで、診断技法のために使用することができる。
低分子量ハプテンへの抗体、断片およびポリペプチドのカップリングは、アッセイにおける抗体断片またはポリペプチドの感受性を増加させることができる。次いで、ハプテンは、第２の反応によって特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェノール、ピリドキサールおよびフルオレセインなどのハプテンを使用することが一般的である。Harlow and Lane (1988)、上記を参照されたい。
本開示の親抗体の可変領域は、ＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善することによって改変することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発によって導入されてもよく、目的の抗体結合または他の機能特性に対する効果は、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて評価することができる。ある特定の実施形態では、保存的改変が導入され、典型的には、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４または５残基以下が変更される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失であってもよい。
フレームワーク改変を、例えば、１つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「戻し突然変異する」ことによって、親抗体に対して行って、免疫原性を減少させることができる。
加えて、本明細書に開示される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、Ｆｃ領域内に改変を含むように操作して、抗体の１つまたは複数の機能特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞性細胞傷害性を変更してもよい。そのような改変としては、限定されるものではないが、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易にするため、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるためのヒンジ領域におけるシステイン残基の数の変更（米国特許第５，６７７，４２５号）、ならびに抗体の死生物学的半減期を減少させるためのＦｃヒンジ領域におけるアミノ酸突然変異（米国特許第６，１６５，７４５号）が挙げられる。
加えて、本明細書に開示される抗体断片は、化学的に改変されていてもよい。抗体のグリコシル化は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を改変して、抗原に対する抗体の親和性を増加させることによって変更することができる（米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号）。あるいは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性を増加させるために、低減された量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体、または増加した二分型ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体を、変更されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって得ることができる（Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180）。
本明細書に開示される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、１つまたは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体または抗体断片に付着するようになる条件下、抗体またはその断片をＰＥＧまたはＰＥＧの反応性エステルもしくはアルデヒド誘導体と反応させることによって、ペグ化して、生物学的半減期を増加させることができる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行われてもよい。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－もしくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコール－マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することを意図する。ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体であり得る。タンパク質をペグ化するための方法は、当技術分野において公知であり、本明細書に開示される抗体に適用することができる（ＥＰ０１５４３１６号およびＥＰ０４０１３８４号）。
加えて、抗体結合性断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質に抗原結合性領域をコンジュゲートまたは融合することによって化学的に改変して、得られる分子の半減期を増加させてもよい。そのようなアプローチは、例えば、ＥＰ０３２２０９４号およびＥＰ０４８６５２５号に記載されている。
本明細書に開示される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、診断剤にコンジュゲートされ、診断的に使用して、例えば、疾患の発生または進行をモニターしてもよく、所与の処置レジメンの有効性を決定してもよい。診断剤の例としては、酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、さまざまな陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、当技術分野において公知の技法を使用して、抗体もしくはその断片に直接的に、またはリンカーを通じて間接的にのいずれかで、カップリングまたはコンジュゲートされていてもよい。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光材料の例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。好適な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、インジウム－１１１、ルテチウム－１７１、ビスマス－２１２、ビスマス－２１３、アスタチン－２１１、銅－６２、銅－６４、銅－６７、イットリウム－９０、ヨウ素－１２５、ヨウ素－１３１、リン－３２、リン－３３、スカンジウム－４７、銀－１１１、ガリウム－６７、プラセオジム－１４２、サマリウム－１５３、テルビウム－１６１、ジスプロシウム－１６６、ホルミウム－１６６、レニウム－１８６、レニウム－１８８、レニウム－１８９、鉛－２１２、ラジウム－２２３、アクチニウム－２２５、鉄－５９、セレン－７５、ヒ素－７７、ストロンチウム－８９、モリブデン－９９、ロジウム－１１０５、パラジウム－１０９、プラセオジム－１４３、プロメチウム－１４９、エルビウム－１６９、イリジウム－１９４、金－１９８、金－１９９、および鉛－２１１が挙げられる。モノクローナル抗体は、抗体に共有結合的に連結された二官能性キレート化剤の使用により、放射性金属イオンと間接的にコンジュゲートされていてもよい。キレート化剤は、ａｍｉｔｉｅｓ（Meares et al. (1984) Anal. Biochem. 142:68-78）；アミノ酸残基のスルフヒドリル基（Koyama 1994 Chem. Abstr. 120:217262t）、および炭水化物基（Rodwell et al. (1986) PNAS USA 83:2632-2636；Quadri et al. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:559-570）を通して付着されていてもよい。
さらに、本開示の抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、治療剤にコンジュゲートされていてもよい。好適な治療剤としては、例えば、抗生物質もしくは抗微生物薬、または宿主防御ペプチド（例えば、特異的標的化抗菌ペプチド（ＳＴＡＭＰ））が挙げられる。
追加の好適なコンジュゲートされた分子としては、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ分子などの阻害性ＲＮＡ分子、免疫賦活性核酸、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成性分子、および外部ガイド配列が挙げられる。アプタマーは、ステムループまたはＧ－カルテットなどの定義された二次構造および三次構造にフォールドされた１５～５０塩基の長さの範囲の小型核酸であり、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）などの小分子、ならびに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）などの大分子に結合することができる。リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで、化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識および結合と、その後の切断により、核酸基質を切断する。三重鎖形成性機能的核酸分子は、三重鎖を形成することによって、二本鎖または一本鎖核酸と相互作用することができ、ここで、３つのＤＮＡ鎖は、ワトソン－クリック塩基対形成およびフーグスティーン塩基対形成の両方に依存する複合体を形成する。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で、標的領域に結合することができる。好適なコンジュゲートされた分子は、ＤＮＡに結合する任意のタンパク質をさらに含んでいてもよく、但し、バイオフィルム構造物を作出も安定化もせず、そのようなタンパク質の少なくともサブセットが、本明細書に開示される薬剤についての結合の動態を容易にし得ることが構想される。
機能的核酸分子は、標的分子によって保有される比活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーターおよび刺激因子として作用してもよく、または機能的核酸分子は、任意の他の分子から独立したｄｅ ｎｏｖｏ活性を保有していてもよい。
治療剤は、多数の利用可能な方法のいずれかを使用して、直接的にまたは間接的に断片またはポリペプチドに連結することができる。例えば、薬剤は、還元された抗体構成要素のヒンジ領域で、Ｎ－スクシニル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの架橋剤を使用したジスルフィド結合形成を介して、または抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介して、付着することができる（Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56:244；Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995)；Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)）。
治療剤を抗体および抗体断片にコンジュゲートするための技法は、周知である（Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al, (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-58）。
断片またはポリペプチドは、別の機能的分子、例えば、別の抗体または受容体のためのリガンドに連結されて、少なくとも２つまたはそれよりも多くの異なる結合部位または標的分子に結合する二特異性分子または多特異性分子を生成することができる。別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物などの１つまたは複数の他の結合分子への抗体の連結は、例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、または非共有結合的会合によって行うことができる。多特異性分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。
二特異性分子および多特異性分子は、当技術分野において公知の方法を使用して調製することができる。例えば、二特異的分子のそれぞれの結合単位を別々に生成し、次いで、互いにコンジュゲートすることができる。結合分子がタンパク質またはペプチドである場合、各種のカップリング剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションのために使用することができる。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ－スクシンイミジルＳ－アセチル－チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ－フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）が挙げられる（Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686；Liu et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648）。結合分子が抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートすることができる。
本明細書に開示される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドはまた、固体支持体に付着されていてもよく、これは、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用である。そのような固体支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドは、多くの異なる担体に結合させることもできる。そのため、本開示は、断片またはポリペプチド、および活性なまたは不活性な別の物質を含有する組成物も提供する。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびにマグネタイトが挙げられる。担体の特質は、本明細書に開示される目的のために、可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者であれば、モノクローナル抗体の結合のための他の好適な担体が公知であるか、またはルーチンの実験を使用して、それを解明することが可能であろう。
上記の実施形態のうちの１つまたは複数を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる組成物が、本明細書にさらに提供される。抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ならびに断片およびポリペプチドを組換え的に産生するか、またはそれを化学合成する方法がさらに提供される。抗体ポリペプチドおよび断片は、真核細胞もしくは原核細胞において、または当技術分野において公知のおよび本明細書に簡潔に記載される他の方法によって産生することができる。
本明細書に開示される断片および断片を含む単離されたポリペプチドは、それらが、高レベルのエピトープ結合特異性およびバイオフィルムに対する高い結合親和性を有するように、選択されてもよい。一般に、抗体または抗体断片または抗体断片を含む単離されたポリペプチドのより高い結合親和性では、よりストリンジェントな洗浄条件を、イムノアッセイにおいて行って、標的を除去することなく、非特異的に結合した材料を除去することができる。したがって、開示される方法において有用な本技術の断片および抗体断片を含む単離されたポリペプチドは、通常、少なくとも１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、または１０－１２Ｍの結合親和性を有する。ある特定の態様では、断片および抗体断片を含む単離されたポリペプチドは、少なくとも１２時間、少なくとも５時間、少なくとも１時間、または少なくとも３０分以内に標準的な条件下で平衡に達する十分な動態学的なオンレートを有する。別の態様では、抗体または抗原結合性断片の親和性は、１０００ピコモル（ｐＭ）未満もしくは約１０００ｐＭ、約９００ｐＭ未満、約８００ｐＭ未満、約７００ｐＭ未満、約６００ｐＭ未満、約５００ｐＭ未満、約４００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、約５０ｐＭ未満、約４０ｐＭ未満、約３０ｐＭ未満、約２０ｐＭ未満、または約１０ｐＭ、または約９ｐＭ、または約８ｐＭ、または代替的に、約４ｐＭ未満、または代替的に、約２ｐＭ未満である。
上記の実施形態のいずれかでは、ペプチドリンカーを、本明細書に開示される抗体断片、抗原結合性断片またはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加することができる。「リンカー」または「ペプチドリンカー」は、ポリペプチド配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結されたペプチド配列を指す。一態様では、リンカーは、約１～約２０アミノ酸残基長、または代替的に、２～約１０、約３～約５アミノ酸残基長である。ペプチドリンカーの例は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（配列番号４３）である。他の例としては、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号４４）；Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ（配列番号４５）；Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ（配列番号４６）；Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号４７）；Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号４８）、およびＳｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（配列番号４９）が挙げられる。
抗生物質
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、β－ラクタム抗生物質は、アモキシシリンとクラブラン酸（ＡＭＣ）を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、β－ラクタム抗生物質は、ベンザチン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、ベンザチンペニシリンＧ、ベンザチンペニシリンＶ、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリン、フェネチシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシシリン、アンピシリン、メシリナム、ピペラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン、アズロシリン、メズロシリン；セファゾリン、セファレキシン、セファロスポリンＣ、セファロチン、セファピリン、セファクロル、セファマンドール、セフロキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフィキシム、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフジニル、セフェピム、セフピロム、セフタロリン；ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、チエナマイシン；アズトレオナム、チゲモナム、ノカルディシンＡ、またはタブトキシニンβ－ラクタムのうちの１つまたは複数を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、スルホンアミド抗生物質は、トリメトプリムとスルファメトキサゾール（ＴＭＰ－ＳＭＸ）を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。本明細書に開示される任意の態様の一部の実施形態では、スルホンアミド抗生物質は、以下：スルファフラゾール；スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファフラゾール（スルフイソキサゾール）、スルフイソミジン（スルファイソジミジン）、スルファメトキサゾール、スルファモキソール、スルファニトラン、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリダジン、スルファメトキシジアジン、スルファドキシン、スルファメトピラジン、またはテレフチル（Terephtyl）のうちの１つまたは複数を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
一部の実施形態では、抗生物質は、以下：アンピシリン、アモキシシリン－クラブラン酸塩、およびセフジニルのうちの１つまたは複数を含むか、またはそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
投与プロトコール
本明細書に開示される方法に適用可能な投与経路としては、鼻腔内、筋肉内、尿道、気管内、皮下、皮内、経皮、局所的適用、静脈内、直腸、経鼻、経口、吸入、ならびに他の腸内および非経口投与経路が挙げられる。投与経路は、薬剤および／または所望の効果に応じて、所望により、組み合わされてもよく、または調整されてもよい。活性薬剤は、単一用量または複数回用量で投与することができる。送達に好適なこれらの方法および経路の実施形態としては、全身経路または局部経路が挙げられる。一般に、本明細書に開示される方法に好適な投与の経路としては、限定されるものではないが、直接注射、腸、非経口、または吸入経路が挙げられる。
吸入投与以外の非経口投与経路としては、限定されるものではないが、局所、経皮、皮下、筋肉内、眼窩内、嚢内、脊髄内、胸骨内、および静脈内の経路、すなわち、消化管を通る以外の任意の投与経路が挙げられる。非経口投与は、阻害性薬剤の全身送達または局所送達をもたらすように実施することができる。全身送達が所望される場合、投与は、典型的には、医薬調節物の浸潤性のまたは全身吸収性の、局所のまたは粘膜の投与を含む。
本明細書に開示される薬剤は、腸内投与によって対象に送達することもできる。腸内投与経路としては、限定されるものではないが、経口および直腸（例えば、坐剤を使用する）送達が挙げられる。
皮膚または粘膜を通じた活性物の投与の方法としては、限定されるものではないが、好適な医薬調製物の局所適用、経皮的伝達、経皮伝達、注射および上皮投与が挙げられる。経皮伝達のためには、吸収促進剤またはイオントフォレーシスは、好適な方法である。イオントフォレーシス伝達は、それらの製品を、壊れていない皮膚を通じた電気パルスを介して連続的に、数日またはそれよりも長い期間送達する市販の「パッチ」を使用して達成することができる。
本明細書に開示される方法のさまざまな実施形態では、干渉性薬剤は、連続して毎日、少なくとも１日１回（ＱＤ）、およびさまざま実施形態では、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）またはさらに１日４回、吸入、注射または経口で投与される。典型的には、治療有効一日用量は、少なくとも約１ｍｇ、または少なくとも約１０ｍｇ、または少なくとも約１００ｍｇ、または約２００～約５００ｍｇ、および時には、化合物に応じて、最大で約１ｇ～約２．５ｇ程度であろう。
投薬は、カプセル剤、錠剤、経口懸濁剤、筋内注射用懸濁剤、静脈内注入用懸濁剤、局所適用用ゲルもしくはクリーム、または関節内注射用懸濁剤を使用して、本明細書に開示される方法に従って達成することができる。
本明細書に記載される組成物の投薬量、毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。ある特定の実施形態では、組成物は、高い治療指数を示す。毒性副作用を示す化合物が使用さてもよいが、非感染細胞への潜在的損傷を最小化し、それによって、副作用を低減するために、そのような化合物を、罹患組織の部位を標的にする送達システムを設計することに注意すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のためのある範囲の投薬量の製剤化において使用することができる。そのような化合物の投薬量は、ある特定の実施形態では、わずかな毒性でまたは毒性なしで、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定されてもよい。
一部の実施形態では、治療効果または予防効果を達成するために十分な組成物の有効量は、１投与あたり体重１キログラムあたり約０．０００００１ｍｇ～１投与あたり体重１キログラムあたり約１０，０００ｍｇの範囲である。好適には、投薬量範囲は、１投与あたり体重１キログラムあたり約０．０００１ｍｇ～１投与あたり体重１キログラムあたり約１００ｍｇである。投与は、初期用量、それに続いて１回または複数の「ブースター」用量として提供することができる。ブースター用量は、初期用量の１日、２日、３日、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、または１２か月後に提供することができる。一部の実施形態では、ブースター用量は、前の投与に対する対象の応答の評価後に投与される。
当業者は、限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含む、ある特定の因子が、対象を有効に処置するために必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。また、治療有効量の本明細書に記載される治療用組成物による対象の処置は、単回処置または一連の処置を含むことができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される場合、方法は、本明細書に開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体もしくはその断片、宿主細胞、小分子および組成物と同じ、類似のもしくは逆の能力を有する薬剤をスクリーニングするため、またはそれを確認するために有用である。あるいは、それらは、どの薬剤が微生物感染を処置するために最も適しているかを特定するために使用することができる。例えば、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡおよび試験される薬剤を含有する２つの試料を有することによって、例えば、新しい薬剤または組合せ治療についてスクリーニングすることができる。第２の試料は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡ、ならびに活性であることが公知の薬剤、例えば、陽性対照としての機能を果たす抗ＩＨＦ抗体または小分子を含有する。さらなる態様では、いくつかの試料が提供され、薬剤は、臨床環境において対象を処置するのに有効である可能性がある最適用量を決定するために、希釈を増加させて系に添加される。当業者に明らかであるように、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡを含有する陰性対照を提供することができる。さらなる態様では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドおよび微生物ＤＮＡは、例えば、互いに密接に接触した場合にシグナルを放出する発光分子を用いて、検出可能に標識される。試料は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドと微生物ＤＮＡとの間の相互作用を阻害する、競合する、または滴定する薬剤のための有効な期間、類似の条件下で含有され、次いで、試料は、発光分子からのシグナルの放出についてアッセイされる。試料がシグナルを放出する場合、薬剤は、結合を阻害するために有効ではない。
別の態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法は、感染を引き起こす微生物（細菌など）分離株がヒト／動物から単離され、次いで、培養されて、それがｉｎ ｖｉｔｒｏでバイオフィルムとして成長することを可能にし得る小型化チャンバースライドシステムにおいて実施され、例えば、下記の実験を参照されたい。薬剤（抗ＩＨＦ抗体など）または潜在的な薬剤は、潜在的な薬剤または抗ＩＨＦ（または他の抗体、小分子、薬剤など）などの薬剤の希釈を増加させて、または増加させずに、培養物に単独で、または培養物に別の薬剤を組み合わせて添加して、感染が存在した対象に送達された場合にその患者を処置するのに有効である可能性がある最適用量が見出される。当業者に明らかであるように、陽性対照および陰性対照を同時に行うことができる。
さらなる態様では、方法は、フローセルにおいて薬剤（抗ＩＨＦ抗体など）および／または潜在的な薬剤（単独で、または別の薬剤と組み合わせて）を用いるハイスループットプラットホームにおいて実施される。薬剤（抗ＩＨＦ抗体など）または潜在的な薬剤は、潜在的な薬剤または抗ＩＨＦ（または他の抗体、小分子、薬剤など）などの薬剤の希釈を増加させて、または増加させずに、培養物に単独で、または培養物に別の薬剤を組み合わせて添加して、感染が存在した対象に送達された場合にその患者を処置するのに有効である可能性がある最適用量が見出される。バイオフィルム分離株は、超音波処理されて、微生物ＤＮＡに結合したＩＨＦなどのＤＮＡＢＩＩポリペプチドからバイオフィルム細菌が分離される。ＤＮＡＢＩＩポリペプチド－ＤＮＡ複合体は、プラットホームにおいて抗ＩＨＦ抗体によって単離される。次いで、微生物ＤＮＡは、例えば、塩洗浄により放出され、添加されたバイオフィルム細菌を特定するために使用される。次いで、遊離したＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ配列決定することによって特定される。ＤＮＡが遊離しない場合、薬剤は、微生物ＤＮＡが成功裏に機能するか、またはそれに結合した。ＤＮＡが試料中に見られる場合、薬剤は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチド－微生物ＤＮＡ結合に干渉しなかった。当業者に明らかであるように、陽性対照および／または陰性対照を同時に行うことができる。
別の態様では、本明細書に開示される薬剤または抗体のうちの１つまたは複数は、ｉｎ ｖｉｖｏでバイオフィルムを検出する方法において使用される。さらなる実施形態では、薬剤または抗体は、例えば、発光分子または蛍光分子で検出可能に標識される。本明細書に開示される方法のさらなる適用としては、例えば、バイオフィルムへの結合の際に検出可能なシグナルを提供する検出可能に標識された一次薬剤もしくは一次抗体、またはそれがバイオフィルムに結合した場合に一次薬剤または一次抗体に結合する検出可能に標識された二次抗体を使用して、バイオフィルムを画像化するためのそのような薬剤または抗体の使用の方法が挙げられる。
上記の方法はまた、所与の細菌種が、別のものよりもある薬剤によるそのバイオフィルムの反転に対してよりよく応答する可能性があるので、診断試験として使用することができ、この迅速なハイスループットアッセイシステムは、当業者が、可能性のある薬剤のパネルをアッセイして、群の最も効果的なものを特定することを可能にし得る。
これらの方法の利点は、ほとんどの病院内の臨床微生物検査室が、液体培養において（またはプランクトン様に）成長している細菌を使用するこれらいくつかのアッセイ（すなわち、ＭＩＣ、ＭＢＣ値の決定）を行うための既に設備が整っていることである。当業者に明らかであるように、細菌は、一般に、それらが疾患を引き起こしている場合、プランクトン様に成長しない。代わりに、それらは、安定なバイオフィルムとして成長しており、これらのバイオフィルムは、抗生物質、抗体または他の治療薬による処置に対して有意に耐性がより高い。この耐性は、ほとんどのＭＩＣ／ＭＢＣ値がｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を正確に予測することができない理由である。そのため、どの「用量」の薬剤が（上記に記載されるように）ｉｎ ｖｉｔｒｏで細菌バイオフィルムを反転させ得るかを決定することによって、出願人の前臨床アッセイは、個別化医療の適用としてでさえも、臨床有効性のより信頼性のある予測因子になるであろう。
臨床環境に加えて、方法は、工業環境において、感染を引き起こす微生物を特定するため、および／または有効な薬剤を確認するために使用することができる。
上記の方法のさらなる態様では、基礎となる感染の成長を阻害することが公知の抗生物質または抗微生物薬を、連続してまたは同時的に添加して、感染が阻害され得るかを決定する。薬剤を微生物ＤＮＡまたはＤＮＡＢＩＩポリペプチドに添加した後、複合体を添加して、バイオフィルム阻害についてアッセイすることも可能である。
非ヒト動物、例えば、チンチラにおいてｉｎ ｖｉｖｏで実施される場合、方法は、単独で、またはバイオフィルムを壊す他の薬剤と組み合わせて使用され得る薬剤を特定するための前臨床スクリーニングを提供する。
別の態様では、有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片を対象に投与し、それによって、微生物性バイオフィルムを阻害する、防止する、溶解する、または壊すことによる、対象におけるバイオフィルムを阻害する、溶解する、防止する、または壊す方法が本明細書に提供される。
代替的に、または加えて、バイオフィルムを阻害する、溶解する、防止する、または壊す方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで実施されてもよく、対象から採取されたかまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成したバイオフィルムの試料を提供するステップ、および有効量のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片を投与し、それによって微生物性バイオフィルムを阻害し、防止し、または壊すステップを含む。同様に、本明細書に開示される組成物は、限定されるものではないが、病院の装置、産業機器、および生きている組織を構成しない他の材料などのバイオフィルムによってコロニー形成される表面上の微生物性バイオフィルムを阻害する、防止する、または壊すための方法の実施形態において使用されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を、単独でまたは組み合わせて投与するステップを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれを含む。開示される方法のさらなる実施形態では、薬剤は、同時に投与されてもよい。代替の実施形態では、抗体は、連続して投与される。
それを必要とする対象において免疫応答を誘導する、またはそれに対する受動免疫を付与するための方法であって、有効量の本明細書に開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、抗体またはその抗原結合性断片のうちの１つまたは複数を対象に投与するステップを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる、方法も本明細書に提供される。
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ポリクローナル抗体ではない。
さらなる態様では、方法は、有効量の抗微生物薬、抗原ペプチドまたはアジュバントのうちの１つまたは複数を対象に投与するステップをさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる。
抗微生物剤の非限定的な例は、表面抗原、例えば、ＯＭＰ Ｐ５、ｒｓＰｉｌＡ、ＯＭＰ ２６、ＯＭＰ Ｐ２、またはＩＶ型ピリンタンパク質などのワクチン構成要素に対する抗体である（Jurcisek and Bakaletz (2007) J. Bacteriology 189(10):3868-3875；Murphy et al. (2009) The Pediatric Infectious Disease Journal 28:S121-S126；Novotny et al. (2015) Mol Microbiol. 96(2):276-92を参照されたい）。
本明細書に開示される薬剤および組成物は、他の抗微生物剤および／または表面抗原とともに、同時的にまたは連続して投与することができる。特定の一態様では、投与は、例えば、直接注射によって、または吸入によって、感染の部位に局所的である。投与の他の非限定的な例としては、経皮、尿道、舌下、直腸、経膣、眼内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、吸入による、または経口を含む１つまたは複数の方法によるものが挙げられる。
これらの微生物感染は、上気道、中気道および下気道に存在し得る（耳炎、副鼻腔炎、気管支炎、それだけでなく、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の悪化、慢性咳、嚢胞性線維症（ＣＦ）の合併症および／またはＣＦの主原因、ならびに市中感染性肺炎（ＣＡＰ））。そのため、本明細書に開示されるｉｎ ｖｉｖｏ方法を実施することによって、これらの疾患およびこれらの感染からの合併症を、防止または処置することもできる。
感染症はまた、口腔（虫歯、歯周炎）において起こり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｖｃｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓによって引き起こされる可能性がある。感染症はまた、皮膚に局在し（膿瘍、「ブドウ球菌」感染症、膿痂疹、熱傷の二次感染症、ライム病）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉによって引き起こされる可能性がある。尿路感染症（ＵＴＩ）を処置することもでき、これは、典型的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによって引き起こされる。胃腸管感染症（ＧＩ）（下痢、コレラ、胆石、胃潰瘍）は、典型的には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉによって引き起こされる。生殖器感染症は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを含み、典型的には、これによって引き起こされる。感染症は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓによって引き起こされる膀胱の感染症または留置デバイスの感染症であり得る。典型的には、各種の細菌によって引き起こされる、移植されたプロステーシスデバイス、例えば、人工臀部もしくは膝置換物、または歯科インプラント、または医療デバイス、例えば、ポンプ、カテーテル、ステントもしくはモニタリングシステムに関連する感染症は、本明細書に開示される方法によって処置することができる。これらのデバイスは、本明細書に記載される薬剤でコーティングすることができ、またはそれにコンジュゲートすることができる。そのため、本明細書に開示されるｉｎ ｖｉｖｏ方法を実施することによって、これらの疾患およびこれらの感染からの合併症を、防止または処置することもできる。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる感染症は、本明細書に開示される方法によって処置することもでき、それは、新生児における細菌性敗血症の主原因である。髄膜炎を引き起こし得るＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによって引き起こされる感染症も、処置することができる。
一部の実施形態では、抗体の生物学的に活性な断片は、アミノ末端またはカルボキシル末端（またはその両方）のいずれかに最大で２５個、または代替的に、２０個、または代替的に、１５個、または代替的に、最大で１０個、または代替的に、最大で５個のランダムなアミノ酸の付加を有する、抗体の重鎖および軽鎖、その抗原結合性断片、ＣＤＲ、ならびにそれらのそれぞれの等価物を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる単離されたポリペプチドを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。生物学的に活性な断片は、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含むことができる。
一部の実施形態では、ペプチドおよび／または抗体の生物学的に活性な断片は、本明細書に開示されるポリペプチド、または断片、またはそれらのそれぞれの等価物のうちの１つ、２つもしくはそれよりも多く、または３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、１０もしくはそれよりも多く、１１もしくはそれよりも多く、１２もしくはそれよりも多く、１３もしくはそれよりも多く、１４もしくはそれよりも多く、またはすべてを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含むか、あるいはそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれからなる。
上記の実施形態のいずれかでは、ペプチドリンカーを、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加することができる。「リンカー」または「ペプチドリンカー」は、ポリペプチド配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに連結されたペプチド配列を指す。一態様では、リンカーは、約１～約２０アミノ酸残基長、または代替的に、２～約１０、約３～約５アミノ酸残基長である。ペプチドリンカーの例は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（配列番号）である。他の例としては、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ（配列番号）；Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ；Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号）；Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ（配列番号）、およびＳｅｒ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（配列番号）が挙げられる。
本明細書に開示される単離されたポリペプチドは、原核宿主細胞および真核宿主細胞から組換え的に産生されたポリペプチドおよびタンパク質、ならびにそのムテイン、アナログおよび断片を含むことが意図され、そのような細胞の例は上記に記載されている。一部の実施形態では、この用語は、本明細書に記載される抗体および抗イディオタイプ抗体も含む。そのようなポリペプチドは、当技術分野において公知のおよび本明細書に簡潔に記載される方法を使用して、単離または産生することができる。
野生型ポリペプチドまたはタンパク質の機能的等価物またはバリアント、例えば、アミノ酸の保存的アミノ酸置換を有するものも、本開示の範囲内であることが理解される。
さらなる態様では、ポリペプチドを、検出可能な標識または薬剤にコンジュゲートまたは連結して、ポリペプチドの半減期を増加させ、例えば、ペグ化、ＰＥＧ模倣物、ポリシアル化、ＨＥＳ化、またはグリコシル化である。好適な標識は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載される。
またさらなる態様では、検出可能な標識を有するまたは有しないポリペプチドは、宿主原核細胞、または真核宿主細胞、例えば、樹状細胞に含有され得るか、またはその表面上で発現され得る。
タンパク質およびポリペプチドは、精製、化学合成、および組換え方法を含む当業者に公知のいくつかのプロセスによって得られる。ポリペプチドは、抗体による免疫沈降、ならびに標準的な技法、例えば、ゲル濾過、イオン交換、逆相、およびアフィニティークロマトグラフィーなどの方法によって宿主細胞系などの調製物から単離することができる。そのような方法論について、例えば、Deutscher et al. (1999) Guide To Protein Purification: Methods In Enzymology (Vol. 182, Academic Press)を参照されたい。したがって、本開示は、これらのポリペプチドを得るためのプロセス、ならびにこれらのプロセスによって得られ得るおよび得られる産物も提供する。
ポリペプチドは、市販の自動ペプチド合成機、例えば、Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、モデル４３０Ａまたは４３１Ａ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡによって製造されたものを使用する化学合成によって得ることもできる。合成されたポリペプチドは、沈殿させ、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製することができる。したがって、本開示は、タンパク質および試薬、例えば、アミノ酸および酵素の配列を提供すること、およびアミノ酸を適正な方向および線状配列に一緒に連結することによって、本明細書に開示されるタンパク質を化学合成するためのプロセスも提供する。
あるいは、タンパク質およびポリペプチドは、本明細書に記載される宿主細胞およびベクター系を使用して、例えば、Sambrook et al. (1989)、上記に記載されている周知の組換え方法によって得ることができる。
診断方法における使用のための検出可能な薬剤にコンジュゲートされた本明細書に記載されるポリペプチドも本出願によって提供される。一部の実施形態では、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドのテール領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのテール領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのテール領域、および／またはテールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩを含む）に対して特異的である抗体は、バイオフィルムの検出のための診断アッセイにおいて特に有用であり、単独で、または本明細書に記載される１つもしくは複数の抗体と組み合わせて使用することができる。一態様では、テール領域に対して特異的な抗体は、ＤＮＡＢＩＩポリペプチドのチップ領域（限定されるものではないが、ＩＨＦもしくはＨＵのチップ領域、ＩＨＦＡもしくはＩＨＦＢのチップ領域、および／またはチップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩを含む）に対して特異的な抗体のためのコンパニオン診断として使用される。
改変を本明細書に開示されるペプチドに対して行って、変更された特性をそれらに提供することができることは、当業者に周知である。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸、または合成アミノ酸のいずれかを指し、グリシンならびにＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣薬を含む。３個またはそれよりも多くのアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合には、一般に、オリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは、一般に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
本明細書に開示されるペプチドは、非天然アミノ酸を含むように改変することができる。そのため、ペプチドは、ペプチドに特別な特性を伝えるために、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸の組合せ、およびさまざまな「デザイナー」アミノ酸（例えば、ベータ－メチルアミノ酸、Ｃ－アルファ－メチルアミノ酸、およびＮ－アルファ－メチルアミノ酸など）を含んでいてもよい。加えて、特定のカップリングステップで特定のアミノ酸を割り当てることによって、アルファヘリックス、ベータターン、ベータシート、ガンマターンを有するペプチド、および環状ペプチドを生成することができる。一般に、アルファヘリックス二次構造またはランダム二次構造が、特に役立ち得ると考えられる。
本明細書に開示されるポリペプチドは、さまざまな固相担体、例えば、インプラント、ステント、ペースト、ゲル、歯科用インプラント、もしくは医療用インプラント、または液相担体、例えば、ビーズ、滅菌溶液もしくは水溶液、薬学的に許容される担体、薬学的に許容されるポリマー、リポソーム、ミセル、懸濁液、およびエマルジョンと組み合わせることもできる。非水性溶媒の例としては、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油が挙げられる。抗体を調製するために、またはｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘導するために使用される場合、担体は、特異的免疫応答を非特異的に増大させるのに有用であるアジュバントを含むこともできる。当業者は、アジュバントが必要であるかどうかを容易に決定することができ、１つを選択することができる。しかしながら、説明だけの目的のために、好適なアジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバント、無機塩、ならびにポリヌクレオチドが挙げられる。他の好適なアジュバントとしては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｅ．ｃｏｌｉの易熱性エンテロトキシンの突然変異誘導体、コレラ毒素の突然変異誘導体、ＣＰＧオリゴヌクレオチド、およびスクアレンに由来するアジュバントが挙げられる。
本開示は、本明細書に開示されるポリペプチド、アナログ、ムテイン、もしくは断片のいずれかを、単独で、または互いにもしくは他の薬剤、例えば、抗生物質および許容される担体もしくは固相支持体と組み合わせて、含むか、または代替的にそれから本質的になるか、またはまたさらにそれからなる医薬組成物も提供する。これらの組成物は、本明細書に記載されるさまざまな診断方法および治療方法に有用である。
ポリヌクレオチド
上記で特定された抗体、その断片、ＣＤＲ、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド、およびそれらのそれぞれの相補鎖のうちの１つまたは複数をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドも提供される。単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含むベクターが、さらに提供され、その例は、当技術分野において公知であり、本明細書に簡潔に記載する。２つ以上の単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドが単一単位として発現される一態様では、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドは、多シストロン性ベクター内に含有され得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、または干渉ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはｄｓＲＮＡであり得る。そのようなポリヌクレオチドおよびベクターは、対象に投与すること、および抗体、ポリペプチドまたは生物学的に活性な断片を発現させることを介して、抗体、ポリペプチド、またはそれらのそれぞれの生物学的に活性な断片を必要とする対象に送達するために使用することができる。
別の態様では、本開示は、ＤＮＡの微生物性バイオフィルム中のポリペプチドまたはタンパク質への結合を妨げるポリヌクレオチド、またはホリデイジャンクションに類似する４方向ジャンクションポリヌクレオチド、複製フォークに類似する３方向ジャンクションポリヌクレオチド、固有の柔軟性を有するポリヌクレオチド、またはベントポリヌクレオチドである干渉性薬剤を提供し、これは、ＤＮＡＢＩＩポリヌクレオチド（ＨＵまたはＩＨＦ）が微生物ＤＮＡに結合するのを処置または阻害することができ、同様に、バイオフィルム形成ならびに関連する感染症および障害を処置、防止または阻害することができる。当業者は、本明細書に提供される情報および当業者の知識を使用して、そのようなポリヌクレオチドを作製することができる。Goodman and Kay (1999) J. Biological Chem. 274(52):37004-37011およびKamashev and Rouviere-Yaniv (2000) EMBO J. 19(23):6527-6535を参照されたい。
本開示は、ＲＮＡ転写のプロモーター、ならびにＤＮＡもしくはＲＮＡの複製および／または一過性もしくは安定な発現のための他の調節配列に作動可能に連結された単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドをさらに提供する。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、プロモーターが、ＤＮＡ分子からのＲＮＡの転写を方向付けるような様式で配置されることを意味する。そのようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４、およびＴ７である。ある特定の実施形態では、細胞特異的プロモーターは、挿入されるポリヌクレオチドの細胞特異的発現のために使用される。プロモーターまたはプロモーター／エンハンサーを、終止コドン、および選択マーカー配列、ならびに挿入されたＤＮＡ小片をそのプロモーターに作動可能に連結させることができるクローニング部位とともに含有するベクターは、当技術分野において公知であり、市販されている。一般的な方法論およびクローニング戦略について、Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press, Inc. (1991))およびそこで引用された参考文献、ならびにマップ、機能的特性、商業的供給業者、およびさまざまな好適なベクターのＧｅｎＥＭＢＬ受託番号に対する参照を含有するVectors: Essential Data Series (Gacesa and Ramji, eds., John Wiley & Sons, N.Y. (1994))を参照されたい。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに由来するポリヌクレオチドは、本明細書に記載される診断的なおよび治療的な有用性を有するポリペプチドまたはタンパク質、ならびに存在していてもよく、または存在していなくてもよいタンパク質の転写物を特定するためのプローブをコードする。これらの核酸断片は、例えば、より大きなポリヌクレオチドの制限酵素消化によって調製され、次いで、検出可能なマーカーによって標識することができる。あるいは、ランダムな断片を、分子のニック翻訳を使用して生成することができる。そのような断片の調製および標識化のための方法論について、Sambrook et al. (1989)、上記を参照されたい。
これらの核酸分子を含有する発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを産生するための宿主ベクター系を得るために有用である。これらの発現ベクターが、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な部分としてのいずれかで、宿主生物において複製可能でなければならないことが意味される。好適な発現ベクターの非限定的な例としては、プラスミド、酵母ベクター、ウイルスベクター、およびリポソームが挙げられる。アデノウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で、それらの高レベルの発現および細胞の効率的な形質転換を理由として、遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで組織に導入するために特に有用である。核酸が、好適な宿主細胞、例えば、原核細胞または真核細胞に挿入されると、宿主細胞は、複製し、タンパク質を、組換え的に産生することができる。好適な宿主細胞は、ベクターに依存し、公知の方法を使用して構築された哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞を含み得る。Sambrook et al. (1989)、上記を参照されたい。外因性核酸の細胞への挿入のためのウイルスベクターの使用に加えて、核酸を、当技術分野において公知の方法、例えば、細菌細胞のための形質転換；哺乳動物細胞のためのリン酸カルシウム沈殿を使用するトランスフェクション；またはＤＥＡＥ－デキストラン；電気穿孔；またはマイクロインジェクションによって、宿主細胞に挿入することができる。方法論について、Sambrook et al. (1989)、上記を参照されたい。そのため、本開示は、タンパク質またはポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、動物細胞（ラットまたはマウス）、ヒト細胞、または原核細胞、例えば、細菌細胞も提供する。
ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリヌクレオチドのアセンブリー前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識化構成要素とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに改変され得る。この用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。他に規定または要求されない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に開示される任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが公知のまたは予測される２つの相補的一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。
ベクターが、本明細書に開示される方法において、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療として使用される場合、薬学的に許容されるベクター、例えば、複製インコンピテントレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターは、例示的なものであり（しかし限定的ではない）、特に役立ち得る。本明細書に開示される核酸を含有する薬学的に許容されるベクターは、挿入されるポリヌクレオチドの一過性または安定な発現のためにさらに改変することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容されるベクター」という用語は、限定されるものではないが、核酸を分裂している細胞に選択的に標的化し、導入する能力を有するベクターまたは送達ビヒクルを含む。そのようなベクターの例は、ウイルスタンパク質を産生することができないこと、感染した宿主細胞においてベクターの伝播が不可能であることによって定義される「複製インコンピテント」ベクターである。複製インコンピテントレトロウイルスベクターの例は、ＬＮＬ６（Miller et al. (1989) BioTechniques 7:980-990）である。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介遺伝子移入のために複製インコンピテントレトロウイルスを使用する方法論は確立されている（Bordignon (1989) PNAS USA 86:8912-8952; Culver (1991) PNAS USA 88:3155；およびRill (1991) Blood 79(10):2694-2700）。
本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含有および／または発現する遺伝子改変細胞も提供する。遺伝子改変細胞は、プロモーターおよび遺伝子活性化因子などの上流の調節配列の挿入によって産生することができる（米国特許第５，７３３，７６１号を参照されたい）。一実施形態では、改変細胞は、真核細胞または原核細胞である。
ポリヌクレオチドは、細胞における核酸の検出および／または遺伝子の発現のための検出可能なマーカー、例えば、酵素標識または放射性同位元素にコンジュゲートすることができる。検出可能なシグナルを与えることができる蛍光、放射活性、酵素、または他のリガンド、例えば、アビジン／ビオチンを含む、多種多様な適切な検出マーカーが当技術分野において公知である。一態様では、放射活性のまたは他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ、例えば、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼを用いることが望ましい可能性がある。酵素タグの場合では、熱量測定指標基質を用いて、人間の眼に見える手段を提供することができ、または分光光度法で、相補的核酸含有試料との特異的ハイブリダイゼーションを特定することができる。そのため、本開示は、標的の一本鎖ポリヌクレオチドを、相補的一本鎖ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする条件（必要に応じて、中ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、または必要に応じて、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの一部分である標識された一本鎖ポリヌクレオチド（プローブ）と接触させることによって、一本鎖ポリヌクレオチドまたはその相補体を検出するための方法をさらに提供する。ハイブリダイズされたポリヌクレオチド対を、ハイブリダイズされていない一本鎖ポリヌクレオチドから分離する。ハイブリダイズされたポリヌクレオチド対は、当業者に公知の方法、および例えば、Sambrook et al. (1989)、上記に示される方法を使用して検出される。
本開示において具体化されるポリヌクレオチドは、化学合成、組換えクローニング方法、ＰＣＲ、またはそれらの任意の組合せを使用して得ることができる。ポリヌクレオチド化学合成の方法は、当技術分野において公知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書に提供される配列データを使用して、ＤＮＡ合成機を用いることによって、または商業的サービスから注文することによって、所望のポリヌクレオチドを得ることができる。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＰＣＲを使用して単離または複製することができる。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，８００，１５９号；同第４，７５４，０６５号；および同第４，６８３，２０２号の主題であり、PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al. eds., Birkhauser Press, Boston (199.4))またはMacPherson et al. (1991)および(1995)、上記、ならびにそこで引用された参考文献に記載されている。あるいは、当業者は、本明細書に提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して、ＤＮＡを複製することができる。したがって、本開示は、ポリヌクレオチドの線状配列、ヌクレオチド、適切なプライマー分子、化学物質、例えば、酵素、およびそれらの複製のための説明書を提供すること、ならびにポリヌクレオチドを得るためにヌクレオチドを適正な方向に化学的に複製するか、または連結することによる、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを得るためのプロセスも提供する。別々の実施形態では、これらのポリヌクレオチドは、さらに単離されている。またさらに、当業者は、ポリヌクレオチドを好適な複製ベクターに挿入することができ、ベクターを複製および増幅のために好適な宿主細胞（原核細胞または真核細胞）に挿入することができる。そのように増幅されたＤＮＡは、当業者に公知の方法によって細胞から単離することができる。この方法によってポリヌクレオチドを得るためのプロセス、ならびにそのように得られたポリヌクレオチドが、本明細書にさらに提供される。
ＲＮＡは、最初に、ＤＮＡポリヌクレオチドを好適な宿主細胞に挿入することによって得ることができる。ＤＮＡは、任意の適切な方法によって、例えば、適切な遺伝子送達ビヒクル（例えば、リポソーム、プラスミド、またはベクター）の使用によって、または電気穿孔によって、送達することができる。細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、次いで、ＲＮＡは、当業者に公知の方法、例えば、Sambrook et al. (1989)、上記に示される方法を使用して単離することができる。例えば、ｍＲＮＡは、Sambrook et al. (1989)、上記に示される手順に従ってさまざまな溶菌酵素もしくは化学溶液を使用して単離することができ、または製造業者によって提供された添付の説明書に従って核酸結合樹脂によって抽出することができる。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドに対する配列相補性または相同性を示すポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションプローブとして、または本明細書で特定された特異的ポリヌクレオチドの等価物として有用である。転写物の全コード配列が公知であるので、この配列または相同配列の任意の部分は、本明細書に開示される方法において使用することができる。
「完全一致」プローブが、特異的ハイブリダイゼーションのために必要ではないことは公知である。少数の塩基の置換、欠失、または挿入によって達成されるプローブ配列のマイナーな変化は、ハイブリダイゼーションの特異性に影響を及ぼさない。一般に、２０％程度の塩基対のミスマッチ（最適に整列させた場合）が許容され得る。一部の実施形態では、前述のｍＲＮＡを検出するために有用なプローブは、相同領域に対して少なくとも約８０％同一である。一部の実施形態では、プローブは、相同領域のアライメント後、対応する遺伝子配列に対して８５％同一であり、一部の実施形態では、これは、９０％の同一性を示す。
これらのプローブは、放射アッセイ（例えば、サザンブロットおよびノーザンブロット分析）において使用して、さまざまな細胞またはこれらの細胞を含有する組織を検出、予知、診断、またはモニターすることができる。プローブは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現の検出のためのハイスループットスクリーニングアッセイにおける使用のために、固相支持体、またはチップなどのアレイに付着させることもできる。したがって、本開示は、ハイスループットスクリーニングにおける使用のための固相支持体に付着した、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、またはその等価物、またはその相補体、またはその断片を含むか、またはそれに対応するプローブも提供する。
断片の総サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、特定の核酸セグメントの意図される使用または適用に依存する。より小さな断片は、一般に、ハイブリダイゼーション実施形態における使用が見出され、ここで、相補領域の長さは、例えば、少なくとも５～１０～約１００ヌクレオチド、またはさらには検出しようとする相補配列に応じて全長まで変わり得る。
５ヌクレオチド超～１０ヌクレオチドの長さのストレッチにわたる相補配列を有するヌクレオチドプローブは、一般に、ハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それによって、得られた特定のハイブリッド分子の特異性を改善するために十分に適している。ある特定の実施形態では、１０ヌクレオチドもしくはそれよりも長い、または５０ヌクレオチドの長さよりも長い、または望ましい場合はさらにより長い遺伝子相補ストレッチを有するポリヌクレオチドを設計することができる。そのような断片は、例えば、化学的手段により断片を直接合成することによって、核酸再生技術、例えば、米国特許第４，６０３，１０２号に記載される２つのプライミングオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ技術の適用によって、または組換え産生のための組換えベクターに選択された配列を導入することによって、容易に調製され得る。一態様では、プローブは、約５０～７５ヌクレオチドもしくはそれよりも長い、あるいは５０～１００ヌクレオチドの長さである。
本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に記載される細胞において発現される遺伝子または遺伝子転写物の検出のためのプライマーとしての機能を果たすことができる。この文脈では、増幅は、妥当な忠実度で標的配列を複製することができるプライマー依存性ポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、および逆転写酵素などの天然または組換えＤＮＡポリメラーゼによって行われてもよい。説明だけの目的で、プライマーは、プローブに関して同定された長さと同じ長さである。
ポリヌクレオチドを増幅するための一方法は、ＰＣＲであり、ＰＣＲ増幅のためのキットが市販されている。増幅後、得られたＤＮＡ断片を、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって、例えば、アガロースゲル電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色および紫外線照射による可視化によって、検出することができる。
細胞に有効量の遺伝子送達ベクターまたはビヒクルを投与するための方法が開発されており、当業者に公知であり、本明細書に記載される。細胞における遺伝子発現を検出するための方法は、当技術分野において公知であり、ＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、およびノーザンブロット分析などの技法が挙げられる。そのような方法は、細胞における遺伝子の発現を検出および定量するために有用である。あるいは、コードされるポリペプチドの発現を、さまざまな方法によって検出することができる。特に、標的ポリペプチドに特異的な反応性のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を調製することは有用である。そのような抗体は、免疫組織学、ＥＬＩＳＡ、およびウエスタンブロットなどの技法を使用して、ポリペプチドを発現する細胞を可視化するために有用である。これらの技法を使用して、発現されたポリヌクレオチドの発現レベルを決定することができる。
産生方法
抗体、断片、ＣＤＲ、またはポリペプチドを産生する方法であって、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、ポリヌクレオチドの発現のための条件下で培養するステップ、ならびに必要に応じて、細胞および／または培養物から抗体、断片、ＣＤＲ、および／またはポリペプチドを単離するステップを含むか、または代替的にそれからなるか、またはまたさらにそれからなる方法も提供される。加えて、ポリヌクレオチドの発現のための条件下の、抗体、抗原結合性断片、ポリペプチド、またはＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供される。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞または原核細胞である。さらなる実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
組成物
組成物がさらに提供される。組成物は、担体、ならびに本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、本明細書に開示される小分子、または抗体および／もしくは抗原結合断片のうちの１つまたは複数を含む。担体は、固体支持体または薬学的に許容される担体のうちの１つまたは複数であり得る。組成物は、アジュバント、またはワクチンとしての投与に好適な他の構成要素をさらに含むことができる。一態様では、組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、担体および／またはアジュバントとともに製剤化される。加えて、本開示の組成物の実施形態は、１つまたは複数の薬学的に許容される物質とともに製剤化された、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、小分子、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本開示の抗体のうちの１つまたは複数を含む。
経口調製物について、本明細書に記載される単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチド、本明細書に記載される単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド、本明細書に記載されるベクター、本明細書に記載される単離された宿主細胞、本明細書に記載される小分子または抗体もしくはその断片のうちいずれか１つまたは複数は、単独で、あるいは化合物を、錠剤、散剤、顆粒剤もしくはカプセル剤を作製するための適切な添加物と組み合わせて、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプンもしくはジャガイモデンプンなどの従来の添加物；結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシデンプンもしくはゼラチンなどの結合剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤；タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；および所望により、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤および香味剤と組み合わせて含むか、またはこれから本質的になる本明細書に開示される医薬製剤において使用することができる。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または類似の特性の化合物のいずれかを含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料などの香味剤。
経口投与に好適な医薬製剤および単位用量形態は、慢性状態、感染症の処置、および患者が薬物を自己投与する治療において特に有用である。一態様では、製剤は、小児投与に特異的である。
本開示は、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本明細書に開示される抗体のうちの１つまたは複数が、所望により、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤または他の抗微生物剤などの従来の添加物とともに、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステル、またはプロピレングリコールなどの水性または非水性溶媒に溶解、懸濁または乳化することによって、本開示による注射用調製物に製剤化され得る、医薬製剤を提供する。そのような非限定的な例は、表面抗原、例えば、ＯＭＰ Ｐ５、ＯＭＰ ２６、ＯＭＰ Ｐ２またはＩＶ型ピリンタンパク質（Jurcisek and Bakaletz (2007) J. of Bacteriology 189(10):3868-3875およびMurphy, T F, Bakaletz, L O and Smeesters, P R (2009) The Pediatric Infectious Disease Journal, 28:S121-S126を参照されたい）などの他のワクチン構成要素、および抗微生物剤などの抗微生物剤である。静脈内投与のためには、好適な担体としては、生理的静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合で、非経口投与のための組成物は、滅菌されていなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。
本開示によって提供されるエアロゾル製剤は、吸入を介して投与することができ、噴霧剤または非噴霧剤ベースであり得る。例えば、本明細書に開示される医薬製剤の実施形態は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧剤中に製剤化された本明細書に開示される化合物を含む。吸入による投与のためには、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器もしくはディスペンサー、または噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達することができる。非噴霧剤の非限定的な例は、機械力（すなわち、その指でピストンを押し下げること、または容器の圧縮、例えば、容器の壁に適用される圧縮力、もしくは例えば弾性嚢によって、壁それ自身によって発揮される弾性力による）によって閉鎖容器から噴出されるポンプスプレーである。
本明細書に開示される坐剤は、本明細書に開示される化合物を、乳化基剤または水溶性基剤などの各種の基剤のいずれかと混合することによって、調製することができる。本明細書に開示される化合物のこの医薬製剤の実施形態は、坐剤により直腸投与することができる。坐剤は、体温で融解するが、室温で凝固するビヒクル、例えば、カカオバター、カルボワックスおよびポリエチレングリコールを含むことができる。
経口または直腸投与のための単位剤形、例えば、シロップ剤、エリキシル剤および懸濁剤が提供され得、ここで、それぞれの投薬量単位、例えば、ディースプーン、テーブルスプーン、錠剤または坐剤は、本明細書に開示される１つまたは複数の化合物を含有する所定の量の組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または別の薬学的に許容される担体中の溶液として、組成物中に本明細書に開示される化合物を含んでいてもよい。
本明細書に開示される医薬製剤の実施形態は、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本開示における使用のための小分子、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本明細書に開示される抗体もしくはその断片のうちの１つまたは複数が、注射用組成物に製剤化されるものを含む。本明細書に開示される注射用医薬製剤は、液体の液剤もしくは懸濁剤として；または注射前の液体ビヒクルへの溶解もしくは懸濁に好適な固体形態として調製される。調製物は、本明細書に開示される医薬製剤の他の実施形態に従って、乳化されていてもよく、またはリポソームビヒクルに封入された活性成分であってもよい。
ある実施形態では、本明細書に開示される単離されたポリペプチド、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示されるベクター、本明細書に開示される単離された宿主細胞、または本明細書に開示される抗体のうちの１つまたは複数は、持続送達システムによる送達のために製剤化される。「持続送達システム」という用語は、本明細書で「制御送達システム」と互換的に使用され、カテーテル、注射デバイスなどと組み合わせた、持続的（例えば、制御された）送達デバイス（例えば、ポンプ）を包含し、多種多様なものが当技術分野において公知である。
機械的または電気機械的注入ポンプも、本開示による使用に好適であり得る。そのようなデバイスの例としては、例えば、米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号；同第５，８２０，５８９号；同第５，６４３，２０７号；同第６，１９８，９６６号などに記載されているものが挙げられる。一般に、本明細書に開示される化合物の送達は、各種の詰め替え可能なポンプシステムのいずれかを使用して、達成することができる。ポンプは、経時的に一貫した制御放出を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示される化合物は、薬物不透過性リザーバーにおける液体製剤中にあり、持続的様式で個体に送達される。
一実施形態では、薬物送達システムは、少なくとも部分的に植込み型デバイスである。植込み型デバイスは、当技術分野において周知の方法およびデバイスを使用して、任意の好適な植込み部位に植え込むことができる。植込み部位は、薬物送達デバイスが導入され、設置される、対象の身体内の部位である。植込み部位は、必ずしも限定されるものではないが、真皮下、皮下、筋肉内、または対象の身体内の他の好適な部位が挙げられる。皮下植込み部位は、一部の実施形態では、薬物送達デバイスの植込みおよび除去における便宜のために、使用される。
本開示における使用に好適な薬物放出デバイスは、各種の操作の方式のいずれか、例えば、いくつかの供給業者、例えばＢｉｏＤｅｇｍｅｒおよびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されているポリ（グリコリド－ｃｏ－ラクチド）（ＰＧＬＡ）などのポリマーに基づいていてもよい。例えば、薬物放出デバイスは、拡散システム、対流システムまたは侵食可能システム（例えば、侵食に基づくシステム）に基づくことができる。例えば、薬物放出デバイスは、電気化学ポンプ、浸透圧ポンプ、電気浸透圧ポンプ、蒸気圧ポンプまたは浸透圧バーストマトリックスであり得、例えば、ここで、薬物は、ポリマー（例えば、ＰＧＬＡ）に組み込まれ、ポリマーは、薬物含浸ポリマー材料（例えば、生分解性の薬物含浸ポリマー材料）の分解に付随して薬物製剤の放出を提供する。他の実施形態では、薬物放出デバイスは、電気拡散システム、電解ポンプ、発泡ポンプ、圧電ポンプ、加水分解システムなどに基づく。
機械的または電気機械的注入ポンプに基づく薬物放出デバイスも、本開示による使用に好適であり得る。そのようなデバイスの例としては、例えば、米国特許第４，６９２，１４７号；同第４，３６０，０１９号；同第４，４８７，６０３号；同第４，３６０，０１９号；同第４，７２５，８５２号などに記載されているものが挙げられる。一般に、対象処置方法は、各種の詰め替え可能なポンプシステム、交換不可能なポンプシステムのいずれかを使用して達成することができる。ポンプおよび他の対流システムは、それらの一般により一貫性のある経時的な制御放出に起因して利用されてもよい。浸透圧ポンプは、一部の実施形態では、より一貫性のある制御放出および比較的小さいサイズというそれらの複合的利点に起因して使用される（例えば、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ９７／２７８４０ならびに米国特許第５，９８５，３０５号および同第５，７２８，３９６号を参照されたい）。本開示における使用に好適な例示的な浸透圧駆動デバイスは、必ずしも限定されるものではないが、米国特許第３，７６０，９８４号；同第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第３，９２３，４２６号；同第３，９８７，７９０号；同第３，９９５，６３１号；同第３，９１６，８９９号；同第４，０１６，８８０号；同第４，０３６，２２８号；同第４，１１１，２０２号；同第４，１１１，２０３号；同第４，２０３，４４０号；同第４，２０３，４４２号；同第４，２１０，１３９号；同第４，３２７，７２５号；同第４，６２７，８５０号；同第４，８６５，８４５号；同第５，０５７，３１８号；同第５，０５９，４２３号；同第５，１１２，６１４号；同第５，１３７，７２７号；同第５，２３４，６９２号；同第５，２３４，６９３号；同第５，７２８，３９６号などに記載されているものが挙げられる。本開示に適応され得るさらなる例示的なデバイスは、Ｓｙｎｃｈｒｏｍｅｄ注入ポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）である。
一部の実施形態では、薬物送達デバイスは、植込み型デバイスである。薬物送達デバイスは、当技術分野において周知の方法およびデバイスを使用して、任意の好適な植込み部位に植え込むことができる。本明細書で述べられるように、植込み部位は、薬物送達デバイスが導入され、設置される、対象の身体内の部位である。植込み部位は、必ずしも限定されるものではないが、真皮下、皮下、筋肉内、または対象の身体内の他の好適な部位が挙げられる。
本明細書に開示される化合物のための好適な賦形剤ビヒクルは、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せである。加えて、所望により、ビヒクルは、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤などの少量の補助物質を含有していてもよい。そのような剤形を調製する方法は、公知であるか、または本開示の考慮の際に、当業者に明らかになるであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 17th edition, 1985を参照されたい。投与される組成物または製剤は、いずれにしても、処置されている対象における所望の状態を達成するために適切な化合物の含量を含有する。
本開示の組成物は、持続放出マトリックスまたは制御放出マトリックスを含むものを含む。加えて、本開示の実施形態は、持続放出製剤を使用する他の処置と併せて使用することができる。本明細書で使用される場合、持続放出マトリックスは、酵素的にもしくは酸に基づく加水分解によって、または溶解によって分解可能である材料、通常は、ポリマーから作製されたマトリックスである。身体に挿入されると、マトリックスは、酵素および体液による作用を受ける。持続放出マトリックスは、望ましくは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドｃｏ－グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸（carboxcylic acid）、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン（phenylatanine）、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーンなどの生体適合性材料から選択される。実例となる生分解性マトリックスとしては、ポリラクチドマトリックス、ポリグリコリドマトリックス、およびポリラクチドｃｏ－グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）マトリックスが挙げられる。
別の実施形態では、ポリペプチド、抗体またはその断片（および組合せ組成物）は、制御放出システムにおいて送達される。例えば、本明細書に開示される化合物は、静脈内注入、植込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与の方式を使用して投与されてもよい。一実施形態では、ポンプが使用されてもよい（Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201；Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507；Saudek et al. (1989) N. Engl. J. Med. 321:574）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用される。また別の実施形態では、制御放出システムは、治療標的、すなわち、肝臓の近位に配置され、このようにして、全身用量のごく一部しか必要としない。また別の実施形態では、制御放出システムは、治療標的に近位に配置され、このようにして、全身性のごく一部しか必要としない。他の制御放出システムは、Langer (1990) Science 249:1527-1533による概説において議論されている。
別の実施形態では、本開示の組成物（および別々のまたは一緒の組合せ組成物）は、組成物を送達するための、吸収性材料、例えば、縫合糸、包帯およびガーゼへの本明細書に記載される阻害性薬剤の含浸によって形成されたもの、または固相材料、例えば、手術用ステープル、ジッパーおよびカテーテルの表面にコーティングされたものを含む。この種類の他の送達システムは、本開示を考慮して、当業者に容易に明らかであろう。
本開示は、微生物感染症の処置のための、干渉性薬剤のうちの１つまたは複数の宿主（例えば、ヒト）への投与のための方法および組成物を提供する。さまざまな実施形態では、本明細書に開示されるこれらの方法は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ方法、ならびに全身および局部投与経路を含む、薬物送達に好適なほとんどの任意の利用可能な方法および経路に及ぶ。
製剤および共製剤
本明細書に提供される開示は、本明細書で上記に開示されたものなどの薬学的に許容される賦形剤と一緒の、本明細書に開示される薬剤の特定の製剤および共製剤を企図する。
具体的な態様では、本開示は、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む製剤または共製剤を提供する。本明細書に開示される抗体は、それらが、高レベルのエピトープ結合特異性およびバイオフィルムに対する高い結合親和性を有するように、選択されてもよい。一般に、抗体のより高い結合親和性では、よりストリンジェントな洗浄条件を、イムノアッセイにおいて行って、標的を除去することなく、非特異的に結合した材料を除去することができる。したがって、開示される方法において有用な本技術の抗体は、通常、少なくとも１０－６、１０－７、１０－８、１０－９、１０－１０、１０－１１、または１０－１２Ｍの結合親和性を有する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも１２時間、少なくとも５時間、少なくとも１時間、または少なくとも３０分以内に標準的な条件下で平衡に達する十分な動態学的なオンレートを有する。別の態様では、抗体または抗原結合性断片の親和性は、１０００ピコモル（ｐＭ）未満もしくは約１０００ｐＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、約１００ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ、または４ｐＭである。
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、約１～約１５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、約２ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、約３ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、約４ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤中に存在する。一部の実施形態では、抗体は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。一部の実施形態では、複数の抗体のうちの少なくとも１つは、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約３ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約９０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１２０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、または代替的に、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
複数の異なる抗体が抗体共製剤に含まれる一部の実施形態では、異なる抗体は、実質的に等しい濃度で存在していてもよい。そのような実施形態の別の態様では、異なる抗体の１つまたは複数の抗体は、他の抗体よりも実質的に高い濃度で、例えば、約１．５：１、または代替的に、約１．５：１：１、または代替的に、約１．５：１：１：１、または代替的に、約２：１、または代替的に、約２：１：１、または代替的に、約２：１：１：１、または代替的に、少なくとも約２．５：１、または代替的に、少なくとも約２．５：１：１、または代替的に、少なくとも約２．５：１：１：１の比で存在していてもよい。
一部の実施形態では、共製剤は、Ａ５、その断片もしくは等価物（例えば、重複、またはｍＢ４などの別のものと組み合わせて）のうちの２つもしくはそれよりも多く、またはｍＢ４ポリペプチド、その断片もしくは等価物のうちの２つもしくはそれよりも多く、またはＡ５と組み合わせたｍＢ４、そのそれぞれの断片もしくは等価物から本質的になる、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれを含む。一部の実施形態では、製剤中の１つまたは複数の抗体は、ポリクローナル抗体ではない。一部の実施形態では、この製剤は、治療法として使用される。
一部の実施形態では、共製剤は、Ａ１～Ａ４もしくはＡ６もしくはＢ１～Ｂ６、またはそれらの断片もしくは等価物のうちの２つまたはそれよりも多くから本質的になる単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドを特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体を含むか、あるいは代替的にそれから本質的になるか、あるいはまたさらにそれを含む。一部の実施形態では、製剤中の１つまたは複数の抗体は、ポリクローナル抗体ではない。一部の実施形態では、この製剤は、診断法として使用される。
抗体の製剤および共製剤を安定に製剤化する方法は、当技術分野に開示される技法に従って行うことができ、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１１／００５９０７９号を参照されたい。
本発明のキメラタンパク質に対して機能する抗体の投与を介した受動免疫療法によって宿主に短期の保護を付与することも可能である。そのため、本発明の抗体は、受動免疫療法において使用され得る。ヒト免疫グロブリンは、異種免疫グロブリンが、その外来免疫原性構成要素に対する免疫応答を起こさせ得るので、ヒト医薬において好ましい。そのような受動免疫は、特定のリスクに対する免疫されていない個々の対象の即時保護のための緊急事態において使用され得る。
スクリーニングアッセイ
本開示は、本明細書に記載されるポリクローナル抗体と等価なモノクローナル抗体などの等価な薬剤、および活性薬剤の活性をモジュレートするさまざまな薬剤、および本明細書に開示される医薬組成物、または本明細書に開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもしくはペプチド産物の機能についてスクリーニングするための方法を提供する。本開示の目的のために、「薬剤」は、限定されるものではないが、単純なもしくは複雑な有機もしくは無機分子（本明細書で、核酸などの小分子と称される）、ペプチド、タンパク質（例えば、抗体）、ポリヌクレオチド（アンチセンス）、またはリボザイムなどの生体化合物または化学化合物を含むことを意図する。広範囲の化合物、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマー、ならびにさまざまなコア構造に基づく合成有機化合物を合成することができ、これらも、「薬剤」という用語に含まれる。加えて、さまざまな天然の起源が、スクリーニングのための化合物、例えば、植物または動物抽出物などを提供することができる。常に明確に記述されていないが、薬剤が、単独で、または本発明のスクリーニングによって特定された薬剤と同じもしくは異なる生物活性を有する別の薬剤と組み合わせて使用されることが理解されるべきである。
小分子化合物などの薬剤の潜在的な阻害効果または結合効果（すなわち、相互作用または会合）を、コンピューターモデリング技法の使用によって、その実際の合成および試験前に分析してもよい。所与の化合物の理論的構造が、バイオフィルムおよび／またはＤＮＡＢＩＩタンパク質におけるそれと微生物ＤＮＡとの間の不十分な相互作用ならびに会合を示唆する場合、薬剤の合成および試験を回避することができる。しかしながら、コンピューターモデリングが強い相互作用を示す場合、薬剤を合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ実験などのさまざまな方法を使用して、結合する能力または相互作用を阻害するその能力について試験することができる。単独でまたは別の薬剤と併せたバイオフィルムを阻害または滴定する薬剤の能力を試験する方法が本明細書に開示される。この様式では、効力がない薬剤および化合物の合成を回避することができる。
当業者は、ＤＮＡＢＩＩまたは微生物ＤＮＡと、より詳細には、特異的結合部位と会合するそれらの能力について、化学実体もしくは生物実体または断片をスクリーニングするいくつかの方法のいずれかを使用してもよい。次いで、選択された断片または化学実体を、各種の方向で配置してもよく、またはＤＮＡもしくはＤＮＡＢＩＩポリペプチドの個々の結合部位内でドッキングさせてもよい。ドッキングは、ＱＵＡＮＴＡ、ＳＹＢＹＬなどのソフトウェア、それに続いてエネルギー最小化および標準的な分子機械力場による分子動力学、例えば、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲを使用して達成されてもよい。
市販のコンピュータープログラムも、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ設計のために利用可能である。例としては、限定されないが、ＧＲＩＤ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）、ＭＣＳＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ＤＯＣＫ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＧＬＩＤＥ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ Ｉｎｃ．）、ＦｌｅｘＸ（Ｔｒｉｐｏｓ Ｉｎｃ．）およびＧＯＬＤ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｒｅ）が挙げられる。
薬剤または化合物が、上記の方法によって設計または選択されたら、薬剤または化合物が互いに結合し得る効率を試験し、コンピューター評価によって最適化することができる。例えば、有効なＤＮＡＢＩＩ断片は、その結合状態と遊離状態（すなわち、結合の小さい変形エネルギー）との間のエネルギーの比較的小さな相違を実証し得る。
設計または選択された化合物は、その結合状態において、それが必要に応じて標的タンパク質との静電反発相互作用を欠き得るように、コンピューターでさらに最適化され得る。そのような非相補的（例えば、静電）相互作用としては、反発性の電荷－電荷相互作用、双極子－双極子相互作用、および電荷－双極子相互作用が挙げられる。具体的には、薬剤または化合物がいずれかの薬剤に結合した場合のバイオフィルム中の薬剤およびＤＮＡＢＩＩならびに／または微生物ＤＮＡの間のすべての静電相互作用の合計は、必要に応じて結合のエンタルピーに中立的にまたは好ましく寄与する。
コンピューターソフトウェアも、化合物の変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するために当技術分野で使用可能である。例としては、限定されないが、Ｇａｕｓｓｉａｎ ９２［Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、Ｐａ．］；ＡＭＢＥＲ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ］；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．］；およびＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ［Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．］が挙げられる。
結合薬剤が、上記に記載されるように最適に選択または設計されたら、次いで、その結合特性を改善または改変するために、置換を、その原子または側鎖基の一部において行ってもよい。一般に、最初の置換は保存的である、すなわち、置き換え基は、元の基とおよそ同じサイズ、形状、疎水性、および電荷を有する。当然ながら、コンフォメーションを変更することが当技術分野において公知の構成要素が回避されるべきであることが理解されるべきである。次いで、そのような置換された化学化合物を、上記で詳細に記載される同じコンピューター方法によってバイオフィルム中のＤＮＡＢＩＩタンパク質および／または微生物ＤＮＡへのフィットの効率について分析してもよい。
ある特定の実施形態は、本明細書に開示されるタンパク質またはポリヌクレオチドと相互作用することができる小分子をスクリーニングするための方法に関する。本開示の目的のために、「小分子」は、一実施形態では、目的のタンパク質に結合することができ、それによって、タンパク質の機能を変更する低分子量（ＭＷ）を有する分子である。一部の実施形態では、小分子のＭＷは、１，０００以下である。タンパク質機能を変更することができる小分子をスクリーニングするための方法は、当技術分野において公知である。例えば、細胞における小分子－タンパク質相互作用を検出するための小型化アレイアッセイが、You et al. (1997) Chem. Biol. 4:961-968によって議論されている。
スクリーニング方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施するために、処置される微生物に感染した好適な細胞培養物または組織が、最初に提供される。細胞を、密度依存的な制約なしで、指数的増殖に達する条件（温度、成長または培養培地、および気体（ＣＯ２））下で、適切な期間、培養する。対照として、感染していない追加の別々の細胞培養物を維持することも望ましい。
当業者に明らかであるように、好適な細胞を、マイクロタイタープレートにおいて培養することができ、いくつかの薬剤を、遺伝子型変化、表現型変化または微生物力価の低減に注目することによって同時にアッセイすることができる。
薬剤が、上記に記載される小分子などのＤＮＡまたはＲＮＡ以外の組成物である場合、薬剤は、細胞培養物に直接的に添加することができ、または添加のために、培養培地に添加することができる。当業者に明らかであるように、経験的に決定することができる「有効」量が添加されなければならない。
薬剤が、抗体または抗原結合性断片である場合、薬剤は、競合的ＥＬＩＳＡを行うための条件下で、標的抗原および本明細書に記載されるポリクローナル抗体と接触させることができ、またはそれとともにインキュベートすることができる。そのような方法は、当業者に公知である。
アッセイは、対象において行うこともできる。対象が、ラット、チンチラ、マウスまたはサルなどの動物である場合、方法は、ヒト患者における薬剤の臨床試験の前に使用することができる便利な動物モデル系を提供する。この系では、疾患または微生物感染症の症状が、同じ感染を有する未処置動物とそれぞれ比較して、低減または排除される場合、候補薬剤は、見込みがある薬物である。比較のための基礎を提供する、健康な処置されない細胞または動物の別々の陰性対照群を有することも有用であり得る。
薬剤および組成物は、医薬組成物における活性成分などの、医薬の製造において、ならびに従来の手順に従った投与によるヒトおよび他の動物の処置のために使用することができる。
併用療法
本開示の組成物および関連する方法は、他の療法の投与と組み合わせて使用されてもよい。これらとしては、限定されるものではないが、ＤＮａｓｅ酵素、抗生物質、抗微生物薬、抗感染症薬、抗真菌薬、抗寄生生物薬、抗ウイルス薬、または他の抗体の投与が挙げられる。
一部の実施形態では、方法および組成物は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体と相乗的に作用するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）酵素を含む。ＤＮａｓｅは、ＤＮＡ骨格におけるホスホジエステル連結の切断を触媒する任意の酵素である。十字型構造だけでなく、ＤＮＡの各種の二次構造も標的にすることが公知のＤＮａｓｅ酵素の３つの非限定的な例としては、ＤＮａｓｅ Ｉ、Ｔ４ ＥｎｄｏＶＩＩ、Ｔ７ Ｅｎｄｏ Ｉ、ＲｕｖＡＢＣ、およびＲｕｓＡが挙げられる。ある特定の実施形態では、バイオフィルムを不安定化するために必要な抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の有効量は、ＤＮａｓｅと組み合わせた場合に低減される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで投与される場合、ＤＮａｓｅは、アッセイに直接的に、または酵素を安定化することが公知の好適な緩衝液中で添加することができる。ＤＮａｓｅの有効な単位用量およびアッセイ条件は、変わり得、当技術分野において公知の手順に従って最適化することができる。
他の実施形態では、方法および組成物は、抗生物質および／または抗微生物薬と組み合わせることができる。抗微生物薬は、細菌、真菌または原生動物などの微生物を死滅させるか、またはその成長を阻害する物質である。バイオフィルムは、一般に、抗生物質の作用に対して耐性であるが、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、バイオフィルムが関与する感染症を、感染症を処置するための従来の治療方法に対して感受性にすることができる。他の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物と組み合わせた抗生物質または抗微生物薬の使用は、抗微生物薬および／またはバイオフィルム低減剤の有効量の低減を可能にする。本開示の方法と組み合わせて有用な抗微生物薬および抗生物質の一部の非限定的な例としては、アモキシシリン、アモキシシリン－クラブラン酸塩、セフジニル、アジスロマイシンおよびスルファメトキサゾール－トリメトプリムが挙げられる。バイオフィルム低減剤と組み合わせた抗微生物薬および／または抗生物質の治療有効用量は、従来の方法によって容易に決定することができる。一部の実施形態では、バイオフィルム低減剤と組み合わせた抗微生物剤の用量は、他の細菌感染症、例えば、感染の病因がバイオフィルムを含まない細菌感染症において有効であることが示された平均有効用量である。他の実施形態では、用量は、平均有効用量の０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０または５倍である。抗生物質または抗微生物薬は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の添加の前に、それと同時的にまたはその後に添加することができる。
他の実施形態では、方法および組成物は、細菌感染症を処置する抗体と組み合わせることができる。本明細書に記載される方法および組成物と組み合わせて有用な抗体の一例は、無関係の外膜タンパク質（すなわち、ＯＭＰ Ｐ５）に対する抗体である。この抗体単独による処置は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでバイオフィルムを減量しない。この抗体およびバイオフィルム低減剤による組み合わせ療法は、同じ濃度で単独で使用された試薬のいずれかによって達成されるものよりも高い効果をもたらす。バイオフィルム低減剤またはバイオフィルムを低減する方法と組み合わせた場合に相乗効果を生じ得る他の抗体としては、抗ｒｓＰｉｌＡ、抗ＯＭＰ２６、抗ＯＭＰ Ｐ２および抗全ＯＭＰ調製物が挙げられる。
本明細書に記載される組成物および方法を使用して、バイオフィルムが関与する細菌感染症を、バイオフィルムなしの細菌感染症の処置において有効であるが、そうでなければバイオフィルムが関与する細菌感染症の処置において効果がない一般的な治療モダリティに対して感受性にすることができる。他の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、バイオフィルムが関与する細菌感染症の処置において有効な治療モダリティと組み合わせて使用することができるが、そのような追加の療法およびバイオフィルム低減剤または方法の組合せは、相乗効果を生じ、その結果、バイオフィルム低減剤または追加の治療剤のいずれかの有効用量が低減され得る。他の事例では、そのような追加の療法およびバイオフィルム低減剤または方法の組合せは、処置が増強されるような相乗効果を生じる。処置の増強は、感染症を処置するのに必要なより短い時間によって証拠付けられ得る。
追加の治療的処置は、バイオフィルムを低減するために使用される方法もしくは組成物の前に、それと同的時に、またはその後に追加することができ、同じ製剤／組成物内に、または別々の製剤／組成物として含有され得る。
キット
本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法を行うために必要な薬剤および説明書を含有するキットも特許請求の範囲に記載される。したがって、本開示は、本明細書に定義されるように、抗体、抗体断片、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞、ならびに本明細書に開示される方法を行う、例えば、試料を収集する、および／またはスクリーニングを行う、および／または結果を分析する、および／または抗体、抗体断片、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞の有効量の投与のための説明書を含み得る、これらの方法を行うためのキットを提供する。これらは、単独でまたは他の好適な抗微生物剤と組み合わせて使用することができる。
例えば、キットは、上記で特定された薬剤、例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞のうちのいずれか１つもしくは複数、および使用説明書を含み得るか、または代替的に本質的にそれからなり得るか、またはまたさらにそれからなり得る。キットは、アジュバント、抗原ペプチド、または抗微生物薬のうちの１つまたは複数をさらに含むことができる。担体の例としては、液体担体、薬学的に許容される担体、固相担体、薬学的に許容される担体、薬学的に許容されるポリマー、リポソーム、ミセル、インプラント、ステント、ペースト、ゲル、歯科用インプラント、または医療用インプラントが挙げられる。
本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法を行うために必要な薬剤および説明書を含有するキットも特許請求の範囲に記載される。したがって、本開示は、本明細書に定義されるように、本明細書に開示される薬剤、ならびに本明細書に開示される方法を行う、例えば、試料を収集する、および／またはスクリーニングを行う、および／または結果を分析する、および／または薬剤の有効量の投与のための説明書を含み得る、これらの方法を行うためのキットを提供する。これらは、単独でまたは他の好適な抗微生物剤と組み合わせて使用することができる。
例えば、キットは、いずれか１つまたは複数の上記で特定された薬剤、例えば、単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチド、またはそれらのそれぞれの断片もしくは等価物；上記で述べたポリペプチドのうちのいずれか１つをコードする単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド；抗体またはその断片：および使用説明書を含み得るか、あるいは代替的にそれから本質的になり得るか、あるいはまたさらにそれからなり得る。キットは、アジュバント、抗原ペプチド、または抗微生物薬のうちの１つまたは複数をさらに含むことができる。担体の例としては、液体担体、薬学的に許容される担体、固相担体、薬学的に許容される担体、薬学的に許容されるポリマー、リポソーム、ミセル、インプラント、ステント、ペースト、ゲル、歯科用インプラント、または医療用インプラントが挙げられる。
以下の実施例は、説明することを意図し、本明細書に開示される実施形態を限定するものではない。
実験方法
実験番号１ － 抗体媒介分散対抗体媒介破壊によるバイオフィルムから新たに放出された（ＮＲｅｌ）分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは表現型的に明確に異なる
ここで使用した２つの標的化抗血清の機構および動態が非常に異なるという事実にもかかわらず、ＮＴＨＩバイオフィルムの抗ｒｓＰｉｌＡ抗体または抗ＤＮＡＢＩＩ抗体への曝露の転帰は、周囲環境に耐性のバイオフィルム所在からのＮＴＨＩの放出である。いくつかの研究室からの先駆的研究は、バイオフィルムから放出された細菌が、それらのバイオフィルム内在対応物またはプランクトン様対応物とは明確に異なる表現型を実証する（Chua et al., 2014；Marks et al., 2013；Sauer et al., 2004）ことを明らかにしている。注目すべきは、これらの放出された細菌の共通の特徴が、さらにプランクトン様に成長した細菌によって示されるものよりも高い抗生物質死滅に対する感受性である（Brockson et al., 2014；Chambers et al., 2017；Goodwine et al., 2019；Mokrzan et al., 2018）。興味深いことに、グルタミン酸塩または一酸化窒素のいずれかへの曝露によるバイオフィルムから放出されたＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、互いと比較してトブラマイシンおよび／またはコリスチンに対する可変の感受性を示したが、両方の集団は、それらのプランクトン様対応物よりも抗生物質死滅に対して感受性がより高かった（Chambers et al., 2017；Petrova and Sauer, 2016）。出願人は、抗ｒｓＰｉｌＡ抗体による二重種バイオフィルムから放出されたＮＴＨＩおよびＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓが、それらの寒天成長対応物よりも、それぞれ、トリメトプリムとスルファメトキサゾールまたはクラリスロマイシンのいずれかによる死滅に対して有意に感受性がより高いことを示した（Mokrzan et al., 2018）。また、抗生物質と組み合わせて抗ＤＮＡＢＩＩ抗体に曝露されたＮＴＨＩバイオフィルムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＯＭを処置するために使用される３つすべてのファーストライン抗生物質（例えば、アンピシリン、アモキシシリン－クラブラン酸塩、セフジニル）による新たに放出されたＮＴＨＩの死滅を有意に増大する（Brockson et al., 2014）。さらに、出願人のｉｎ ｖｉｖｏ研究は、アミノグリコシド抗生物質のトブラマイシンと組み合わせた抗ＤＮＡＢＩＩ抗体による処置が、抗体または抗生物質単独による処置と比較して、マウス肺からのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの根絶に対する追加の利益を付与することを実証する（Novotny et al., 2016）。
本明細書では、出願人は、モデル生物としてＮＴＨＩを使用して、本明細書の以下で「ＮＲｅｌ」と称される新たに放出された細菌の表現型をさらに特徴付けた。ＮＴＨＩが、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体と比較して、抗ｒｓＰｉｌＡによってバイオフィルムから放出される固有の方法を考慮すると、出願人は、すべての発現したタンパク質の存在量（定量的質量分析によって決定される通り）、標的化トランスクリプトミクス、フローサイトメトリーおよびスルホンアミド抗生物質またはβ－ラクタム抗生物質による死滅に対する敏感性の比較分析を使用して、抗ｒｓＰｉｌＡ誘導ＮＲｅｌ ＮＴＨＩ（Novotny et al., 2015）が、これらの２つの集団の遺伝的同一性にもかかわらず、抗ＤＮＡＢＩＩ誘導ＮＲｅｌ ＮＴＨＩ（Brockson et al., 2014）と表現型的に異なったかどうかを調べた。
抗ｒｓＰｉｌＡ抗体または抗ＩＨＦ抗体とのＮＴＨＩバイオフィルムのインキュベーションは、バイオフィルム所在からＮＴＨＩを放出した。
これまでに、出願人は、ＮＲｅｌ状態へのバイオフィルム内在細菌の抗ｒｓＰｉｌＡ抗体または抗ＤＮＡＢＩＩ抗体媒介放出の２つの機構と転帰との間の広範な相違を示しており、ここでは、表２に示される２つの新たな識別を追加した（Devaraj et al., 2015；Goodman et al., 2011；Novotny et al., 2013a；Novotny et al., 2016）。この理解においてさらにここで拡張するために、出願人は、最初に、抗ｒｓＰｉｌＡ血清または抗ＩＨＦ血清のいずれかから単離されたウサギポリクローナルＩｇＧとのインキュベーション後にバイオフィルム所在から放出されたＮＴＨＩの数を定量化した。無菌培養培地から、またはナイーブ血清もしくは確立されたＮＴＨＩバイオフィルムを分散させないＮＴＨＩ付着因子外膜タンパク質Ｐ５（ＯＭＰ Ｐ５）（Mokrzan et al., 2018；Novotny et al., 2015）に対する抗血清から回収された同等の濃度のポリクローナルＩｇＧは、陰性対照としての役割を果たした。出願人の以前の研究は、１６時間確立され、抗ｒｓＰｉｌＡとともにインキュベートされたＮＴＨＩバイオフィルムが、６時間後に最大に分散されるが（Mokrzan et al., 2018；Novotny et al., 2015）、同様に熟成したバイオフィルムの完全な崩壊は、抗ＩＨＦにより１５分後に達成される（Novotny et al., 2019）ことを明らかにしている。そのため、このアッセイについて、抗ｒｓＰｉｌＡまたは抗ＩＨＦによって誘導されたＮＲｅｌを、それぞれ、６時間または１５分のいずれかで計数のために収集した（Mokrzan et al., 2018；Novotny et al., 2019；Novotny et al., 2015）。
表2. 抗rsPilAまたは抗IHFによって媒介されるNRel状態へのバイオフィルム所在からのNTHI放出の機構間の相違
ナイーブ血清または抗ＯＭＰ Ｐ５血清のいずれからのポリクローナルＩｇＧとともにインキュベートされたバイオフィルム上の上清から回収されたＮＴＨＩの濃度は、無菌ｓＢＨＩとともにインキュベートされた場合の濃度と類似していた（図１ａおよび１ｂ）。このことは、これらの３つの処置のいずれもが、６時間または１５分間のインキュベーション期間内のバイオフィルムの成長およびリモデリングの天然の一部分として、細菌がバイオフィルムに出入りする通常の平衡を有意に変更するとは予想されなかったので、予期された。逆に、抗ｒｓＰｉｌＡ ＩｇＧとの６時間のインキュベーションは、放出されたＮＴＨＩの濃度の有意な＞２倍の増加を誘導した（図１ａ、Ｐ＜０．０００１）。同様に、抗ＩＨＦ ＩｇＧとの１５分間のインキュベーションは、放出されたＮＴＨＩの濃度の有意な＞３倍の増加を誘導した（Ｐ＜０．０００１）（図１ｂ）。図１ａに同様に表すものと比較した３つの対照集団のより低い濃度は、より短い１５分のインキュベーション期間を反映する。出願人は、本明細書で、バイオフィルム所在から新たに放出されたこれらのＮＴＨＩの集団を「抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ」または「抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ」と称して、２つの固有におよび特異的に標的化された抗体の作用に起因するそれらの生成を反映し、ここで、バイオフィルム内在ＮＴＨＩの放出の機構および動態は異なる（表２）。
抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ集団および抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団のＦＡＣＳ解析
それらが回収されたＮＲｅｌ集団の巨視的観察において仮定され、それに基づくように、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび抗ＩＨＦ ＮＲｅｌについての散乱プロファイルも明確に異なる。出願人は、フローサイトメトリーを行い、それぞれのＮＲｅｌ集団についての前方散乱および側方散乱のプロファイルを調べて、サイズおよび複雑性の潜在的相違を明らかにした。評価前に短く超音波処理されたＮＴＨＩの懸濁液についての散乱プロファイルは、類似のサイズの細胞（すなわち、単一細胞）の集団を明らかにしたが、より大きく、より複雑な集団（すなわち、凝集体）は、より大きい側方散乱および前方散乱によって示される細菌凝集体を有する試料において追加で観察された（図２ａ）。抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌは、単一の均一な集団が明らかになったので、個々の細胞として放出されていると思われる（図２ｂ）。逆に、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌについての散乱プロファイルは、細菌凝集体および／またはバイオフィルムレムナントを示すより大きい集団を含んでいた（図２ｃ）。また、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団は、それぞれの集団の明確に異なる特徴のさらなる証拠である、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌと比較して１０％大きいサイズ（図２ｄ）および４７％より複雑（図２ｅ）であった。また、これらのデータは、分散を介して媒介されたプログラム化放出が実際に個々の細胞としての放出を好むが、破壊を介してＮＴＨＩを放出するバイオフィルムの急速な物理的崩壊は、凝集体としての放出を好むので、それぞれの抗血清がバイオフィルム所在からのＮＴＨＩの放出をどのように媒介するのかについての記載される相違に十分にフィットする（表２）。
抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび抗ＩＨＦ ＮＲｅｌのプロテオミクス発現プロファイルは、それらのプランクトン様に成長した対応物の両方と、および重要なことには互いと明確に異なった。
抗生物質による死滅に対するＮＲｅｌ ＮＴＨＩの相対感受性における出願人の最終的な目的を考慮して、次に、出願人は、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ集団および抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団が、プランクトン様に成長したＮＴＨＩ（抗生物質感受性またはＭＩＣ値を決定するために臨床的に使用した集団）とだけでなく、互いと、どのように表現型的に比較されるかについて疑問を持った。この核心となる疑問に対処し始めるために、出願人は、質量分光分析によって、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌおよびプランクトン様ＮＴＨＩ（ブロス中で対数中期まで静的に成長した）のプロテオミクス発現プロファイルを調べた。抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび抗ＩＨＦ ＮＲｅｌについての総プロテオミクス発現プロファイルは、主成分分析（ＰＣＡ）プロットにおいてそれぞれの集団の別個の場所によって示されるように、プランクトン様ＮＴＨＩとは異なった（図３ａ）。また、出願人は、ＮＲｅｌ集団のプロテオミクスプロファイルが、プランクトン様細胞と異なるであろうと予期したが（Brockson et al., 2014；Mokrzan et al., 2018）、２つのＮＲｅｌ集団は、遺伝的同一性にもかかわらず、９５％の信頼楕円によって強調されるように、互いとも非常に異なった。
抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌまたは抗ＩＨＦ ＮＲｅｌとプランクトン様に成長したＮＴＨＩとの間のタンパク質発現の全体的なグローバルの変化に起因して、出願人は、次に、それぞれが最初にプランクトン様ＮＴＨＩと比較した後に、２つのＮＲｅｌ集団間で存在量の相違を有するタンパク質を調べた。それぞれ、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ集団および抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団におけるプランクトン様ＮＴＨＩ（Ｐ＜０．０５）と比較した存在量の有意な＞１．５倍の増加または＜２／３の減少を伴う合計で６３および１０３の差次的に発現したタンパク質（ＤＥＰ）が存在した（図３ｂおよび表１）。また、プランクトン様ＮＴＨＩと比較して存在量の固有の有意差で、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌは、４０のタンパク質を発現し、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌは、８０のタンパク質を発現し、これは、２つのＮＲｅｌ集団間の相違のさらなる証拠を提供した（図３ｂ）。
表1. NRel対プランクトン様に成長したNTHIまたは抗IHF対抗rsPilAの比較の存在量の有意な(P<0.05)1.5倍の増加または2/3の減少を有するタンパク質の概要
＊タンパク質のオルソロガスな群のクラスター
δＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号(Clark, K. 2016 D67)
†ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託番号からのアノテーション(Clark, K. 2016 D67)またはAziz, A. 2019 p1622からのアノテーション
‡Ｆｃ＝有意（Ｐ＜０．０５）な倍数変化、（－）倍数減少
φ２つ以上のＣＯＧカテゴリー内
出願人は、次に、ＤＥＰをタンパク質のオルソロガスな群のクラスター（ＣＯＧ）（Aziz et al., 2019；Tatusov et al., 2000）によってアノテートして、明確に異なる抗体媒介分散対破壊を介したバイオフィルム所在からの放出の結果として、２つのＮＲｅｌ ＤＥＰの相対機能を評価した。抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌについて、６３のＤＥＰのアノテーションは、最も頻繁に表されるＣＯＧカテゴリー（３６．５％）が、エネルギー生産および変換（１９．０％）またはアミノ酸輸送および代謝（１７．５％）のいずれかに関与したことを明らかにした（図３ｃ、抗ｒｓＰｉｌＡのバーおよび表１）。エネルギー生産および変換カテゴリーに特異的に、解糖、三カルボン酸サイクル、窒素代謝、およびグリセロールの嫌気的代謝に関与する酵素は、プランクトン様ＮＴＨＩと比較して、存在量が＜２／３に減少した。一方で、乳酸の取り込みおよび利用に関与するタンパク質は、プランクトン様ＮＴＨＩと比較して、存在量が＞１．５倍増加した（表１）。同じカテゴリーでは、＞１．５倍の増加で抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌに特異的なＤＥＰは、トリプトファン生合成およびシステイン代謝酵素を含んでいた。タンパク質機能カテゴリーにおける集団的な相違は、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌが、主に、能動的な適応エネルギー利用およびアミノ酸代謝状態にあったことを示した。
対照的に、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団内では、「翻訳、リボソーム構造およびバイオジェネシス」は、プランクトン様ＮＴＨＩと比較して、１０３のＤＥＰの中で最も頻繁に表されたＣＯＧカテゴリー（１３．６％）であった（図３ｃ、抗ＩＨＦのバーおよび表１）。抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ ＤＥＰに特異的に、８つは、＞１．５倍の増加を有する３０Ｓおよび５０Ｓリボソームタンパク質であったが、リボソーム構造タンパク質も増加し、２つの翻訳開始因子は、＜２／３に減少した（表１）。さらに、細胞表層バイオジェネシス、補酵素代謝、および脂質代謝のＣＯＧカテゴリーのタンパク質のそれぞれの発現は、プランクトン様ＮＴＨＩ、例えば、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の改変およびホスホリルコリン部分による装飾の原因となるタンパク質であるＬｉｃ２Ａ、ＬｉｃＣおよびＬｉｃＤ（Poole et al., 2013；Swords et al., 2003）、ならびにリポタンパク質を内膜から外膜に往復させるリポタンパク質担体タンパク質ＬｏｌＡ（Kaplan et al., 2018）と比較して、＜２／３に減少した。また、プランクトン様ＮＴＨＩと比較して、発現が有意に＜２／３に減少した脂質代謝カテゴリー内で４つの抗ＩＨＦ ＮＲｅｌが存在した（図３ｃ）。加えて、脂肪酸生合成における補助因子である、ビオチンの生合成のために必要な補酵素代謝タンパク質も、発現を有意に＜２／３に減少させた（Parsons and Rock, 2013）。対照的に、外膜の完全性の維持およびペプチドグリカンへの付着に関与する外膜リポタンパク質ＯＭＰ Ｐ６、ならびに主要外膜タンパク質ＯＭＰ Ｐ２は、プランクトン様ＮＴＨＩと比較して、発現を有意に増加させた（表１）（Murphy et al., 2006；Sikkema and Murphy, 1992）。まとめると、これらのデータは、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌが、タンパク質の翻訳のために豊富なリボソームを含有したが、しかしながら、翻訳は、低減された翻訳開始因子タンパク質に起因して制限されたことを示唆した。さらに、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌは、ＬＯＳ改変酵素および脂質代謝遺伝子の減少した発現が、外膜完全性維持タンパク質の発現の増加と併せて、プランクトン様に成長したＮＴＨＩと比較して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌの膜組成の相違を示唆したことを実証した。
抗ＩＨＦ ＮＲｅｌのプロテオミクスプロファイルにおいて観察されたリボソームタンパク質の増加した存在量は、成長の誘導期における細菌の特徴でもある（Rolfe et al., 2012）。抗ＩＨＦ ＮＲｅｌが、誘導期の細菌と他の類似性を示したかどうかを決定するために、出願人は、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、誘導期における細菌によって規範的に発現される３つの遺伝子の発現を調べた（Martinez-Antonio and Collado-Vides, 2003）。ｄｅａＤ、ａｒｔＭおよびｆｉｓの発現は、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ対プランクトン様ＮＴＨＩにおいて有意に（＞２倍）上方調節された（図４ａ）。興味深いことに、これらの遺伝子の３つすべてについて、プランクトン様ＮＴＨＩに対する転写物の存在量の倍数増加は、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ対抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌについて、有意に大きかった（Ｐ＜０．０５）。そのため、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌは、誘導期を模倣した状態においてバイオフィルム所在から放出されると思われ、抗ＩＨＦ表現型と抗ｒｓＰｉｌＡ表現型との間の別の有意な相違を表し（表２）、再び、バイオフィルム構造の物理的崩壊が迅速な放出において生じたが、ＮＴＨＩが、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌよりも代謝的により不活発であったことを示唆した。
２つのＮＲｅｌのプロテオミクス発現プロファイルが互いに異なったので（図３ａ）、出願人は、次に、ボルケーノプロットによって表されるように、２つのＮＲｅｌ集団間のＤＥＰの直接比較を実施した（図３ｄ）。＞１．５倍の増加または＜２／３の減少を有する５１のＤＥＰを、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ対抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌの中で特定した（図３ｄおよび表１）。これらのうち、１５のタンパク質（２９．４％）が、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌと比較して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌによる発現の＞１．５倍の増加を実証し、これらのタンパク質は、前に記載した５つの３０Ｓおよび５０Ｓリボソームタンパク質を含んでいた。また、ＯＭＰ Ｐ６は、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌと比較して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌにおいてより豊富であった。抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌと比較して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌにおいて＜２／３の減少を有する（例えば、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌにおいてより多い存在量）ＤＥＰは、豊富に発現されたトリプトファン生合成タンパク質の特徴であった。これらの区別は、プランクトン様ＮＴＨＩと比較して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団において発現が減少したとして既に特定されている脂質代謝タンパク質の相対的相違に加えてであった。とりわけ、２つのＮＲｅｌプロテオミクス発現プロファイルのこの直接比較は、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌと比較して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ ＤＥＰ内のペプチドグリカン合成タンパク質であるＭｕｒＢ（Nikolaidis et al., 2014）の有意な増加も明らかにし、これは、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌの変更された細胞表層組成をさらに示唆した（表１）。
抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌまたは抗ＩＨＦ ＮＲｅｌは、プランクトン様ＮＴＨＩよりも特定の抗生物質による死滅に対して有意に感受性がより高かった。
実証された２つのＮＲｅｌ集団間の明確に異なるタンパク質の相対発現において観察された有意な相違により、出願人は、次に、これらの相違が表現型の特徴をどのように変更したかを調べた。バイオフィルムから新たに放出された細菌は、典型的には、それらのプランクトン様対応物よりも抗生物質による死滅に対して感受性がより高いので（Brockson et al., 2014；Chambers et al., 2017；Goodwine et al., 2019；Mokrzan et al., 2018）、出願人は、ＮＴＨＩ誘発ＯＭおよび呼吸器感染症のために一般に処方される抗生物質を表すＴＭＰ－ＳＭＸまたはＡＭＣに対するＮＲｅｌ ＮＴＨＩの感受性を評価した（Harrison et al., 2009；K et al., 2017；Pelton, 2020；Sethi and Murphy, 2008；Tristram et al., 2007；Wald and DeMuri, 2018；Wasserman and Gerber, 2017）。出願人は、ＴＭＰ－ＳＭＸまたはＡＭＣによる死滅に対する抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび抗ＩＨＦ ＮＲｅｌの敏感性を、両方のバイオフィルム内在ＮＴＨＩ（規範的に高い耐性）、ならびに成長の対数中期まで成長したプランクトン様ＮＴＨＩのものと比較した（臨床微生物学研究室でＭＩＣ値を決定するために一般に使用される集団の規範的な感受性および代表）（図５ａ）。１５分間の抗ＩＨＦ ＩｇＧまたは６時間の抗ｒｓＰｉｌＡ ＩｇＧへの曝露によって放出されたＮＴＨＩの数の相違について制御するために（図１を参照されたい）、出願人は、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団または抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ集団のいずれかのものと一致するようにそれぞれの実験におけるプランクトン様ＮＴＨＩの密度を調整した。出願人が、それぞれの細菌密度でプランクトン様ＮＴＨＩの約２５％を再現性よく死滅させるために必要なＡＭＣまたはＴＭＰ－ＳＭＸの濃度を特定した後、次いで、出願人は、これらの濃度を使用して、対応するＮＲｅｌまたはバイオフィルム内在ＮＴＨＩの相対死滅を評価した。
予想通り、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌは、ＴＭＰ－ＳＭＸまたはＡＭＣのいずれかによる死滅に対して、バイオフィルム内在ＮＴＨＩよりも有意に感受性がより高かった（Ｐ≦０．０００１）（図５ｂおよび５ｃ）。しかしながら、とりわけ、ＴＭＰ－ＳＭＸによる死滅に対する抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌの感受性は、２時間のみの抗生物質曝露後、プランクトン様ＮＴＨＩについての感受性と比較して、有意に高かった（Ｐ≦０．００１）（図５ｂ）。対照的に、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌは、β－ラクタム抗生物質のＡＭＣによる死滅に対して、それらのプランクトン様対応物と感受性は同等でしかなかった（図５ｃ）。次いで、出願人は、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌを同様に評価し、再び予想通り、それらが、ＴＭＰ－ＳＭＸまたはＡＭＣのいずれかによる死滅に対して、バイオフィルム内在ＮＴＨＩよりも有意に感受性がより高かったことも見出した（Ｐ≦０．０００１）（図５ｄおよび５ｅ）。しかしながら、興味深いことに、そして抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌとはまったく対照的に、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団は、それらのプランクトン様対応物とＴＭＰ－ＳＭＸ媒介死滅に対して感受性が同等でしかなかったが（図５ｄ）、ＡＭＣに対して有意に感受性がより高かった（Ｐ≦０．０００１）（図５ｅ）。
抗生物質死滅に対する細菌の感受性は、薬物の取り込み、排出、および分解を含む複数のプロセス、ならびに抗生物質の作用の直接機構の結果である（Kapoor et al., 2017）。抗ＩＨＦ ＮＲｅｌまたは抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌの選択的に増強された抗生物質感受性についての可能性のある機構を特定するために、出願人は、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＴＭＰ－ＳＭＸまたはＡＭＣに対する敏感性または耐性において役割を果たす可能性があるいくつかの遺伝子の相対発現を調べた。ＴＭＰおよびＳＭＸのタンパク質標的であるジヒドロ葉酸レダクターゼおよびジヒドロプテロイン酸シンテターゼは、それぞれ、ｆｏｌＡおよびｆｏｌＰによってコードされ、ＦｏｌＡおよびＦｏｌＰの過剰産生は、ＴＭＰ－ＳＭＸに対する耐性に関連する（Huovinen, 2001）。したがって、出願人は、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ ＮＴＨＩが、選択された時点で、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌよりもｆｏｌＡおよび／またはｆｏｌＰの低い相対発現を実証する可能性があると推測した。出願人の結果は、ｆｏｌＡおよびｆｏｌＰ発現としてのこの仮説が、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ対抗ＩＨＦ ＮＲｅｌにおいて両方とも有意に低減されたことを確認した（図４ｂ、Ｐ＜０．００１）。
排出ポンプは、細菌が細胞内抗生物質の濃度を減少するのを可能にする。ＥｍｒＥ排出系は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにおいてβ－ラクタム抗生物質を輸送し（Du et al., 2018）、Ｅ．ｃｏｌｉでは、ＴＭＰ－ＳＭＸ曝露は、ＥｍｒＡＢ排出ポンプの発現を刺激し（Barrero et al., 2014）、これは、ＥｍｒＡＢ排出ポンプが、ＴＭＰ－ＳＭＸに対するＮＲｅｌの感受性に影響を及ぼすことを示唆した。出願人は、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌによるｅｍｒＡおよびｅｍｒＢの相対発現が、ＴＭＰ－ＳＭＸに対するより高い抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌの感受性と一致して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌによるものよりも有意に低かったことを見出した（図４ｃ、Ｐ＜０．００１）。対照的に、ＡｒｃＡＢ排出ポンプは、β－ラクタム抗生物質を輸送することができ、転写リプレッサーａｃｒＲの制御下にある（Anes et al., 2015）。ａｃｒＲ突然変異を介した増強されたＡｃｒＡＢ発現は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（ａａｃ．ａｓｍ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／５１／７／２５６４．ｌｏｎｇ）におけるアモキシシリン耐性に関連していた一方で、出願人は、ａｃｒＲの増強された発現が、反対の効果であるＡＭＣに対するＮＴＨＩの増強された敏感性を有する可能性があることを主張した。出願人が予期したように、相対ａｃｒＲ発現は、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌについて観察されたＡＭＣに対する増大した感受性と一致して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ対抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌによって有意に高かった（図４ｃ、Ｐ＜０．０００１）。
総合すれば、抗生物質の感受性および転写物の存在量のデータは、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび抗ＩＨＦ ＮＲｅｌが、それらがバイオフィルム所在から放出された機構に起因してそれらの相対抗生物質感受性において有意に異なったことを示唆した。しかしながら、出願人は、最大破壊（分）対分散（時間）に必要な時間の相違も観察された表現型において役割を果たす可能性があることに関心を持った。それにより、出願人は、両方の抗体についての最大放出の時間のおよそ中間の時点である２時間の抗ｒｓＰｉｌＡ ＩｇＧまたは抗ＩＨＦ ＩｇＧのいずれかとのインキュベーション後に回収された時間が一致したＮＲｅｌ集団に対する相対抗生物質感受性の分析を繰り返した。図５に示される結果と類似して、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌは、プランクトン様ＮＴＨＩと、ＴＭＰ－ＳＭＸによる死滅に対して有意により敏感であり（Ｐ≦０．０００１）（図６ａ）、ＡＭＣによる死滅に対して同等に敏感であった（図６ｂ）。また、時間が一致した抗ＩＨＦ ＮＲｅｌは、プランクトン様ＮＴＨＩと比較して、ＡＭＣによる死滅に対して有意により敏感であり（Ｐ≦０．０００１）（図６ｃ）、ＴＭＰ－ＳＭＸによる死滅に対して同等に敏感であった（図６ｄ）。これらの結果は、示された明確に異なる抗生物質の感受性表現型が、放出、分散対破壊の２つの異なる機構から生じたという仮説についてのさらなる支持を提供した。
まとめると、これらのデータは、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌと抗ＩＨＦ ＮＲｅｌとの間の追加の表現型の差異を追加し、ここで、これらの２つの遺伝学的に同一の集団が、独特のプロテオミクス発現プロファイルおよび標的化トランスプロテオミクス発現プロファイルを示しただけでなく、それらが、凝集体対個々の細胞のいずれかとしての放出で、成長の明確に異なる段階でバイオフィルム所在から放出されたことを明らかにし、プランクトン様ＮＴＨＩと比較した場合に、その両方がＮＴＨＩ誘発性疾患の処置のために推奨されるファーストライン抗生物質であるスルホンアミド抗生物質またはβ－ラクタム抗生物質のいずれかによる死滅に対して有意に増加したが異なる敏感性を実証した。
議論
歴史的に、ワクチンのための開発経路および抗生物質のための開発経路は、並行して進んでおり、一方は防止に焦点を当て、他方は処置に焦点を当てていた（Tagliabue and Rappuoli, 2018）。この戦略は、実際に多くの疾患に対して成功していたが、いずれの経路もまだ全体的な成功を達成していない、複数の慢性感染症および再発性感染症の問題が依然として存在する。これに関して進展の障害が広く認識されており、少なくともこれは、典型的には、本質的に遅いワクチン開発プロセスではない（Koff and Schenkelberg, 2019）。同様に、抗生物質開発経路に対するおびただしい課題が存在し、世界的な多抗生物質耐性細菌の上昇の心配な急速な増加によって必要とされた莫大な努力にもかかわらず、臨床的に承認された真に新しいクラスの薬物は３０年超も導入されていない（2017a; Ribeiro da Cunha et al., 2019）。これらの進展の障害は、慢性疾患の当然の所与の複雑さおよび処置の困難さの特質であり、これは、両方の発見経路を複雑にした。そのような持続的感染および回帰感染は、バイオフィルムを形成する原因病原体に原因があり、ここで、常在細菌は、固有のトランスクリプトーム、ならびに抗生物質およびそれらのプランクトン様対応物を容易に死滅させる宿主免疫エフェクターに対してそれらを耐性にする非常に不応性の表現型を有する（Ahearn et al., 2017；Hall and Mah, 2017；Pang et al., 2012；Sharma et al., 2019；Silva and Sillankorva, 2019；Stewart, 2002）。ＮＲｅｌ表現型の認識および理解の前進は、ここに、死滅に対して現在著しくより脆弱な状態に不応性のバイオフィルム所在から細菌を放出する治療用抗体の使用を考慮するためにこれらの開発経路の態様を統合する機会を我々に提供する。
以前の研究では、出願人は、細菌ＤＮＡＢＩＩタンパク質に対する抗血清および抗生物質の両方に同時的に曝露された確立されたＮＴＨＩバイオフィルムが、それらのプランクトン様対応物と比較して、ＭＩＣの≦１／４の濃度で、ＯＭを処置するために一般に使用される３つの抗生物質（例えば、アンピシリン、ＡＭＣおよびセフジニル）による死滅に対して有意に感受性がより高かったことを示した（Brockson et al., 2014）。出願人は、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩおよびＮＲｅｌ Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの両方が、寒天上での成長からのものよりも、抗ｒｓＰｉｌＡとのインキュベーションによって二重種バイオフィルムから放出された場合に、それぞれ、ＴＭＰ－ＳＭＸまたはクラリスロマイシンに対してより敏感であることも示した（Mokrzan et al., 2018）。出願人の以前の観察を考慮して、ここで、出願人は、これが、得られたＮＲｅｌ集団の根絶を最も媒介する関係がある臨床アプローチにおいて注目に値する影響を有し得るので、別個の機構によってバイオフィルム所在からＮＴＨＩを放出する、特異的に標的にされる抗ｒｓＰｉｌＡ血清および抗ＩＨＦ血清によって誘導された２つのＮＲｅｌ集団の相対表現型を理解することを始めることを目標にした。
この研究では、出願人は、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび抗ＩＨＦ ＮＲｅｌを特徴付け、それらの相対プロテオミクス発現プロファイル、標的化遺伝子の相対発現、および抗生物質による死滅に対する感受性が、プランクトン様に成長したＮＴＨＩと明確に異なっただけでなく、重要なことには、互いとも明確に異なったことを示した。抗ＩＨＦ媒介破壊対抗ｒｓＰｉｌＡ媒介分散による放出の動態は明確に異なるが、出願人の結果は、ＮＲｅｌ表現型の観察された相違が、バイオフィルム所在からの放出を媒介する特異的抗体に依存したことを強く示唆した。プロテオミクス発現プロファイルは、総放出ＮＲｅｌ集団の時間でのスナップショットを提供した。抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ集団のプロテオミクスプロファイルは、エネルギー代謝および変換の適応状態、ならびにバイオフィルムから能動的に分散するように誘導されているそれらに応答したアミノ酸の輸送および代謝によって定義された。この適応代謝状態は、それらが、６時間のインキュベーション期間にわたってＡＩ－２およびＩＶ型単収縮線毛の両方の発現に起因してバイオフィルムから能動的に分散するので、細胞のより段階的な放出に起因して、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ ＮＴＨＩよりもいくらかより均一である可能性がある。それにもかかわらず、この抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ集団の適応代謝状態は、バイオフィルムからの放出に応答する他の属（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）について記載されたものと非常に類似しており、それによって非定型的であるとは思われなかった（Guilhen et al., 2016；Pettigrew et al., 2014；Rumbaugh and Sauer, 2020）。
抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団の分析において、出願人は、それが、ＬＯＳ改変、細胞膜維持および脂質代謝タンパク質の同時的な減少を伴うリボソームタンパク質の増加した産生によって定義されたことを見出した。リボソームタンパク質の富化は、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団が、周囲環境への一斉の迅速な受動的放出に応答する変更された膜組成を伴うタンパク質合成を平衡に保ったことを示唆した。そのため、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌは、依然として非常に似ているバイオフィルム内在ＮＴＨＩ細菌と予想され得る。実際に、標的化トランスクリプトミクスは、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌが、誘導期に類似する成長の段階にあったことを示した。それにもかかわらず、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ表現型はまた、バイオフィルム内在ＮＴＨＩと比較してスルホンアミド抗生物質およびβ－ラクタム抗生物質の両方によるそれらの有意により高い死滅によって明らかにされたように、バイオフィルム内在ＮＴＨＩのものとは明確に異なった。
出願人の以前の研究（Brockson et al., 2014；Mokrzan et al., 2018）からの予想通り、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩは、ＮＴＨｉ誘発性疾患を処置するために処方される２つのファーストライン抗生物質に非常に感受性であった。しかしながら、ここで、出願人は、これらのＮＲｅｌ集団が、それらが分散（例えば、抗ｒｓＰｉｌＡを介して）または破壊（例えば、抗ＩＨＦを介して）のいずれかによってバイオフィルム所在から放出されたかどうかに応じて、異なるクラスの抗生物質による死滅に対する固有の増強された感受性を提示したことを最初に示した。これらの相違は、ＮＴＨＩ生存率もこれらの抗生物質のいずれかによる死滅に対する敏感性も、いずれかの抗体とのインキュベーションによって影響されないので、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩに対する抗ｒｓＰｉｌＡまたは抗ＩＨＦのいずれかの直接効果によって説明することができなかった（Brockson et al., 2014；Mokrzan et al., 2018）。まとめると、２つの得られたＮＲｅｌ集団は、相対プロテオミクス発現プロファイル、標的化トランスクリプトミクスプロファイル、バイオフィルム所在からの放出の特徴（両方の成長期、および単一細胞対凝集体として）、および抗生物質感受性において有意な相違を示した。
スルホンアミドクラスの抗生物質が、アミノ酸合成に関与する葉酸合成経路を標的にするので、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ適応アミノ酸輸送および代謝状態は、この集団の固有に増加したＴＭＰ－ＳＭＸに対する敏感性の機構への洞察を提供した（Fernandez-Villa et al., 2019）。また、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌと比較して、それぞれ、ＴＭＰおよびＳＭＸのためのタンパク質標的をコードするｆｏｌＡおよびｆｏｌＰのより低い相対発現は、ＴＭＰ－ＳＭＸを細胞の外に輸送するＥｍｒＡＢ排出ポンプのサブユニットをコードするｅｍｒＡおよびｅｍｒＢのより低い発現と一緒に、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ対抗ＩＨＦ ＮＲｅｌのＴＭＰ－ＳＭＸに対するより高い感受性も支持した。同様に、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ脂質代謝および細胞膜組成タンパク質において述べた相違は、観察されたＡＭＣに対する増加した感受性を支持し、ここで、改変された膜の内容物は、それらがペニシリン結合タンパク質に結合して、ペプチドグリカンの架橋を防止するペリプラズムへのβ－ラクタム抗生物質のより多くの通過を可能にする変更された膜透過性を有していた（Delcour, 2009）。抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団におけるβ－ラクタム抗生物質に対する固有の感受性の機構への追加の洞察は、ペプチドグリカン合成タンパク質ＭｕｒＢの増加した存在量によって提供され、これは、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌが、β－ラクタム抗生物質の活性に対するそれらのより高い敏感性を支持するペプチドグリカンを能動的に合成したことを示唆した（Delcour, 2009；Zapun et al., 2008）。ＡｃｒＡＢ排出ポンプの発現を抑制するａｃｒＲの上方調節は、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ内の増加したＡＭＣ濃度および増強された死滅をもたらす可能性がある。抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ集団におけるｆｉｓの上方調節は、非機能的ｆｉｔ遺伝子を有するＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＥ．ｃｏｌｉ突然変異体の両方が、β－ラクタム抗生物質に対する増強された耐性を示したので、ＡＭＣに対する増加した感受性についてのまた別の可能性のある機構を提示する（Grkovic et al., 2001；Long et al., 2020；Martin and Rosner, 1997）。上記で議論した可能性のある機構に加えて、多くの他の因子、例えば、周囲の環境にバイオフィルムマトリックスから放出された細菌に対するアクセス性は、代謝活性の全体的な変化ならびに／または膜内容物および透過性の変更と組み合わされて、すべてが、示された特定のクラスの抗生物質に対する観察された敏感性、およびおそらくまだ試験されていない追加のクラスの抗生物質に寄与した可能性がある。出願人が、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ ＮＴＨＩおよび抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ ＮＴＨＩの表現型をさらに定義し続けているので、この根拠は、現在調査中である。
総合すれば、出願人のデータは、ＮＲｅｌ表現型が「一般的」ではないが、むしろ非常に明確に異なり、バイオフィルム所在からのＮＴＨＩの放出の抗体媒介機構に依存していることを示唆した。出願人が、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩが、免疫エフェクター単独（Novotny et al., 2019；Novotny et al., 2015）、または必要な場合に共送達される抗生物質（現在低減された用量であるが）と組み合わせて（Novotny et al., 2016）のいずれかによってｉｎ ｖｉｖｏで迅速に根絶されることを既に示したことを考慮して、表現型の差異が存在するが、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩおよび他のＮＲｅｌ細菌種（Brockson et al., 2014；Chambers et al., 2017；Goodwine et al., 2019；Mokrzan et al., 2018；Petrova and Sauer, 2016）が、それらが非常に有効に排除され得る非常に脆弱な状態にあると思われることは明らかである。ＮＲｅｌ ＮＴＨＩ集団間の可能性がある多様な差異を特徴付けるためのさらなる調査は、バイオフィルムが形成される環境条件、突然変異の状態、およびＮＴＨＩの多様な株によって形成されるバイオフィルムの特徴、ならびに他の細菌の属の検討を含む。さらにまた、ここに記載される２つのＮＲｅｌ集団が適応状態を表すので、ＮＲｅｌ表現型は、経時的に動的である可能性がある。実際に、放出動態およびバイオフィルムを分散または破壊する手段の寄与を精査することは、明確に異なる抗生物質感受性表現型の開始および期間をさらに特徴付ける検討の焦点である。
world 'running out of antibiotics’ (2017b)では、新しい抗微生物薬を特定し、抗生物質の適正使用支援を制定し、不適切な抗生物質の使用の危険性に関して市民を教育することを迫っている（Piltcher et al., 2018）。この状況は、新規の創造性に富んだ方法で、多くの人にこの問題に取り組むことを呼び起こした。Nature commentary, Rappuoli, Bloom and Black (Rappuoli et al., 2017)では、出願人は、出願人の「多剤耐性細菌性疾患および持続性疾患に対する最後の希望」として、ワクチン誘発抗体の力と抗生物質のより適切な使用を組み合わせることを提案した。それらの焦点は、保因、したがって、抗生物質耐性細菌の伝達を低減する抗生物質であったが（Rappuoli et al., 2017）、出願人は、これらの非常に耐性の群集からバイオフィルム内在ＮＴＨＩを放出し、そのようにして、それらが、宿主の免疫エフェクターおよび必要な場合に、従来の抗生物質によって死滅され得るような特異的に誘導された抗体の使用を構想し、後者は、ここで、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩの非常に感受性の表現型に起因して、著しく低減された用量、およびより短い経過で使用される。より頻度が低い抗生物質処置レジメンの追加の潜在的な利益は、オフターゲット副作用の低減、および経口抗生物質使用の他の望ましくない続発症であり、これには、抗生物質耐性の発達（Patini et al., 2020；Tagliabue and Rappuoli, 2018）および／または腸内マイクロバイオームの破壊（Bailey et al., 2020；Gillies et al., 2015；Kuehn et al., 2015; MacPherson et al., 2018；Pallav et al., 2014）を含む。
本明細書では、出願人は、この重要なヒト病原体の固有のバイオフィルム関連標的に対するＮＲｅｌ誘導抗体の使用を介して、ＮＴＨＩによって引き起こされるバイオフィルム関連疾患を処置するためのこの戦略の原理の証明を提供した。また、種に無関係の抗ＤＮＡＢＩＩアプローチの使用は、多様なヒト病原体によって引き起こされる多くの他の疾患の処置のためのこの組合せ戦略の潜在的な使用を拡大し、ここで、バイオフィルムは、同様に、病態形成、慢性化、再発、および処置に対する抵抗に大きく寄与する。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でＤＮＡＢＩＩタンパク質に対するＮＲｅｌ誘導モノクローナル抗体の最近のヒト化および実証された有効性は、ヒトの臨床試験への移行を促進することが予想される（D'Andrea and Lau, 2020；Novotny et al., 2020）。
実験番号２ － 材料および方法
ＮＲｅｌ ＮＴＨＩの収集および定量化
分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株８６－０２８ＮＰは、慢性ＯＭに起因する鼓膜切開チューブ挿入を受けている小児の鼻咽頭から回収された臨床分離株であり（Harrison et al., 2005；Sirakova et al., 1994）、低継代数で凍結して維持した。ＮＴＨＩバイオフィルムを、（Jurcisek et al., 2011）に記載されるようにして、１ｍｌあたりそれぞれ２μｇのβ－ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（β－ＮＡＤ）およびヘムで補充された脳心臓注入ブロス（ｓＢＨＩ）中、８ウェルチャンバーのあるカバーガラススライドにおいて、１６時間確立した。１６時間後、バイオフィルムを、２００μｌのカルシウムまたはマグネシウムなしの平衡化（３７℃）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄した。
ＮＲｅｌを収集および計数するために、１６時間のＮＴＨＩバイオフィルムを穏やかに洗浄し、次いで、バイオフィルムの表面積１ｃｍ２あたり１３．６μｇの抗ｒｓＰｉｌＡ抗血清に由来するウサギポリクローナルＩｇＧ（ＮＴＨＩ株８６－０２８ＮＰによって発現されたｒｓＰｉｌＡに対して生成）（Novotny et al., 2009）とともに６時間（「抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ」）、またはバイオフィルムの表面積１ｃｍ２あたり６．２μｇの抗天然ＩＨＦ抗血清に由来するウサギポリクローナルＩｇＧ（ＮＴＨＩ株８６－０２８ＮＰによって発現された天然ＩＨＦに対して生成）（Novotny et al., 2019）とともに１５分間（「抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ」）、インキュベートし、抗体を、事前に温めて平衡化した（３７℃、５％のＣＯ２）ｓＢＨＩに希釈した。これらのＩｇＧの量は、以前の研究（Brockson et al., 2014；Mokrzan et al., 2018）において出願人が使用したそれぞれ個々のウサギ高度免疫血清の１：５０希釈内に存在するＩｇＧ濃度と一致した。使用したインキュベーション時間は、バイオフィルム所在からＮＴＨＩの最大放出が達成される時間と一致した（Mokrzan et al., 2018；Novotny et al., 2019）。陰性対照としての機能を果たす抗ＮＴＨＩ ＯＭＰ Ｐ５に由来するウサギポリクローナルＩｇＧまたは天然ウサギ血清から単離されたものを、ＮＲｅｌ誘導抗血清と同等の濃度で使用した（例えば、抗ｒｓＰｉｌＡと比較される場合１１μｇ、または抗ＩＨＦと比較される場合５μｇのいずれか）。ウサギポリクローナルＩｇＧを、製造業者の説明書（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＧｒａｖｉＴｒａｐカラムにより、全血清または抗血清の継代によって生成した。６時間（抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ）または１５分間（抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ）のいずれかのインキュベーション後、バイオフィルム上の１９０μｌの上清を、それぞれのウェルから穏やかに収集し、水浴超音波処理器中で２分間超音波処理して、任意の凝集したＮＴＨＩを壊し、次いで、連続希釈し、チョコレート寒天上に蒔いて、ＮＴＨＩのＣＦＵを定量化した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのための試料調製
抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび抗ＩＨＦ ＮＴＨＩを、記載されるようにして収集した。プランクトン様ＮＴＨＩを、成長の対数中期まで、ｓＢＨＩ中で静的にインキュベートした。試料を、１３，２００×ｇで４分間遠心分離し、１ｍｌのＤＰＢＳに再懸濁させ、再度遠心分離した。ペレットを、急速凍結し、－８０℃で保管した。すべてのさらなる処理は、次に記載されるようにして、ＭＳ Ｂｉｏｗｏｒｋｓ，ＬＬＣ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）によって行った。
細胞ペレットを、緩衝液（２％のドデシル硫酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ８）に懸濁させ、音波プローブ（Ｑ Ｓｏｎｉｃａ、Ｎｅｗｔｏｗｎ、ＣＴ）を用いて溶解し、１００℃で１０分間加熱した。抽出物のタンパク質濃度を、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度法によって決定し、１０μｇのそれぞれの試料を、ＭＥＳ緩衝系中、１０％のＢｉｓ Ｔｒｉｓ ＮｕＰａｇｅ ｍｉｎｉ－ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって処理した。遊走ウィンドウ（１ｃｍのゲルレーン）を切除し、以下のプロトコールによりＰｒｏＧｅｓｔロボット（ＤｉｇｉＬａｂ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、トリプシンで、ゲル中で消化した：１）２５ｍＭの重炭酸アンモニウムとそれに続くアセトニトリルによる洗浄；２）６０℃での１０ｍＭのジチオスレイトールによる還元とそれに続く室温での５０ｍＭのヨードアセトアミドによるアルキル化；３）トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）による３７℃で４時間の消化；４）ギ酸によるクエンチ。上清を、さらなる処理なしで直接分析した。
質量分析
それぞれプールされた画分の半分を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計と接続されたＷａｔｅｒｓ Ｍ－クラスＨＰＬＣシステムによるナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ペプチドを、捕捉カラムにロードし、３５０ｎＬ／分で、７５μｍの分析カラム上で溶出させ、両方のカラムは、Ｌｕｎａ Ｃ１８樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で充填されていた。質量分析計を、データ依存モードで動作させ、ＭＳおよびＭＳ－ＭＳを、Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて、それぞれ、６０，０００ＦＷＨＭ（半値全幅）の分解能および１５，０００ＦＷＨＭの分解能で行った。装置を、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳのために３秒サイクルで実行した。２時間の装置時間を、それぞれの試料の分析のために用いた。
質量分析データ処理
データを、以下のパラメーターを用いてＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）のローカルコピーを使用して検索した：酵素、トリプシン／Ｐ；データベース、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＣＰ００００５７．２（フォワードおよびリバースと共通の夾雑物を連結）；固定化改変、カルバミドメチル（Ｃ）；可変の改変：アセチル（Ｎ末端）、脱アミド（Ｎ，Ｑ）、酸化（Ｍ）、ピロ－ｇｌｕ（Ｎ末端Ｑ）；質量値、モノ同位体；ペプチド質量トレランス、１０ｐｐｍ；断片質量トレランス、０．０２Ｄａ；最大見逃し切断、２。Ｍａｓｃｏｔ ＤＡＴファイルを、バリデーション、フィルタリング、および試料ごとの非重複リストを作出するためにＳｃａｆｆｏｌｄ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）にパースした。データを、タンパク質あたり少なくとも２つの固有のペプチドを必要とする１％のタンパク質およびペプチドの偽発見率（ＦＤＲ）を使用してフィルタリングした。出願人は、下流の分析のために正規化されたスペクトルカウントを使用した。複製における変形形態および再現性を評価するために、出願人は、プランクトン様群、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ群および抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ群の３つの試料において質量分析によって特定されたそれぞれのタンパク質についての正規化されたスペクトルカウントを用いて、それぞれの集団を取り囲む９５％の信頼楕円を用いてＰＣＡプロットを作成した（Ｒ中のＦａｃｔｏＭｉｎｅＲおよびｇｇｐｌｏｔ２パッケージを使用する）（Le et al., 2008；Wickham et al., 2016）。
差次的発現分析
３つの試料群（プランクトン様、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌおよび抗ＩＨＦ ＮＲｅｌ）の３つの生物学的複製からの正規化されたスペクトルカウントを、ペアワイズ比較のために使用して、両側ｔ検定を使用して、それぞれのタンパク質の差次的発現を決定した。Ｐ値、ベンジャミニ－ホッホバーグ調整Ｐ値、および倍数変化を提供する（補充データセット１）。＞１．５倍の増加または＜２／３の減少、および関連するＰ＜０．０５を有するタンパク質を、発現において有意差があると見なした。ＮＴＨＩ株８６－０２８ＮＰタンパク質を、タンパク質のオルソロガスな群のクラスター（Aziz et al., 2019；Tatusov et al., 2000）によってアノテートした。
バイオフィルム内在ＮＴＨＩ、プランクトン様ＮＴＨＩまたはＮＲｅｌ ＮＴＨＩの抗生物質感受性
出願人は、ＮＲｅｌがある特定の抗生物質に対してプランクトン様ＮＴＨＩよりも感受性がより高いと仮説を立てたので、出願人は、プランクトン様の死滅についてのベースラインを２５％に設定し、その結果、出願人は、所与の抗生物質によるＮＲｅｌ死滅におけるダイナミックレンジを実証することが可能であった。ＮＲｅｌ ＮＴＨＩの過剰の操作または希釈を回避するため、ならびにプランクトン様およびＮＲｅｌの同等の数の直接比較を可能にするために、出願人は、プランクトン様細胞の密度を、以下の通り、それぞれの実験において、ＮＲｅｌ集団として同じ１ｍｌあたりのＣＦＵに調整した：ＮＴＨＩを、成長の対数中期まで静的にインキュベートし、次いで、６時間で収集された抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌとの比較のために３×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、または１５分で収集された抗ＩＨＦ ＮＲｅｌとの比較のために２×１０８ＣＦＵ／ｍｌのいずれかに希釈した（図１を参照されたい）。次いで、出願人は、それぞれの密度でおよそ２５％のプランクトン様ＮＴＨＩを死滅させた、アモキシシリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびクラブラン酸塩（米国薬局方、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）、またはトリメトプリム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびスルファメトキサゾール（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）の濃度を決定した。同じ抗生物質濃度を、抗ＩＨＦ ＮＲｅｌまたは抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ、密度が一致した（同じＣＦＵ／ｍｌ）プランクトン様ＮＴＨＩ、およびそれぞれ関連する実験についての付着バイオフィルムのために使用した。同様に、２時間で収集された抗ＩＨＦ ＮＲｅｌまたは抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌについて、出願人は、最初にＮＲｅｌを定量化し、それぞれ、抗ｒｓＰｉｌＡ ＩｇＧまたは抗ＩＨＦ ＩｇＧへのバイオフィルムの曝露によって放出された約２．０×１０８または４．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌを見出した。次いで、出願人は、同じ密度で２５％のプランクトン様ＮＴＨＩを死滅させた、アモキシシリンとクラブラン酸（「オーグメンチン」、ＡＭＣ）またはトリメトプリムとスルファメトキサゾール（ＴＭＰ－ＳＭＸ）の濃度による抗ＩＨＦ ＮＲｅｌまたは抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌの死滅を評価した。
抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌまたは抗ＩＨＦ ＮＲｅｌを、上記に記載されるようにして収集し、超音波処理した。水浴超音波処理器中で２分間超音波処理して、任意のＮＴＨＩ凝集体を壊した後、ＮＲｅｌまたはプランクトン様ＮＴＨＩを、示される抗体とともに３７℃で２時間インキュベートし、次いで、連続希釈し、チョコレート寒天上に蒔いて、可変ＮＴＨＩを定量化した。バイオフィルム内在ＮＴＨＩを評価するために、バイオフィルムを、上記に記載されるようにして、３７℃で１６時間確立し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、示された抗生物質で補充されたｓＢＨＩ中、３７℃でインキュベートした。２時間後、バイオフィルム内在ＮＴＨＩを、強力なピペッティングによって収集し、２分間超音波処理し、上記に記載されるようにして計数した。すべての実験は、それぞれの処置群および対照群について２回または３回の技術的反復で、別々の日に少なくとも３回行った。
フローサイトメトリー
上記に記載されたように、ＮＴＨＩバイオフィルムを、８ウェルチャンバーのあるカバーガラススライドにおいて確立した。１６時間後、培地を、それぞれのウェルから吸引し、バイオフィルムを、５μｇのウサギポリクローナルＩＨＦ由来ＩｇＧとともに１５分間、または１１μｇのポリクローナルウサギ抗ｒｓＰｉｌＡ由来ＩｇＧとともに６時間、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。それぞれの個々の時点で、それぞれのバイオフィルムの上の１９０μｌの上清を収集し、ハンクス平衡塩溶液中の１μＭのＦＭ１－４３ＦＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移し、室温で１５分間、静的にインキュベートした。緩衝液にチョコレート寒天培地から集めたＮＴＨＩは、「塊になった」細菌対照としての役割を果たした。穏やかなピペッティングとそれに続く５分間の超音波処理によって緩衝液に懸濁されたＮＴＨＩは、「塊になっていない」細菌対照としての役割を果たした。蛍光染色されたＮＴＨＩの前方散乱および側方散乱のプロファイルを、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターおよびＦｌｏＪｏソフトウェアを用いて調べ、１０，０００事象を、それぞれの試料について収集した。
ＲＮＡ単離およびｑＲＴ－ＰＣＲアッセイ
ＲＮＡ単離のために、出願人は、Ｔ－２５組織培養フラスコに、２×１０５ＣＦＵ／ｍｌの６ｍｌのＮＴＨＩを播種した。３７℃、５％のＣＯ２での１６時間のインキュベーション後、フラスコを、穏やかに反転させ、培地を注ぎ出した。フラスコを逆さまにして、６ｍｌの事前に温めたＤＰＢＳを添加し、次いで、フラスコをゆっくりと反転させて、バイオフィルムを穏やかに洗浄した。ＤＰＢＳ洗浄液を除去するために、フラスコを再び反転させ、ＤＰＢＳを注ぎ出した。ｓＢＨＩに希釈された抗体を、依然として逆さまにしたフラスコに添加して、チャンバースライドアッセイにおいて使用されたのと同じ濃度の抗体／ｃｍ２を送達した（１ｍｌあたり５１．５μｇの抗ＩＨＦ ＩｇＧ、または１ｍｌあたり１１３μｇの抗ｒｓＰｉｌＡ ＩｇＧ）。フラスコを、インキュベーターに戻し、培地がバイオフィルムを再び覆うように、穏やかに逆さまにした。抗ＩＨＦについて３分後、または抗ｒｓＰｉｌＡについて３時間後、フラスコを逆さまにし、培地を注ぎ出して、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩを収集し、１６．１×ｇで１分間遠心分離した。上清を吸引し、細菌ペレットに、１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を直ぐに添加した。試料を－８０℃で保管した。
ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて精製した。残ったＤＮＡを、２０ＵのＳＵＰＥＲａｓｅ Ｉｎ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ａｍｂｉｏｎ）の存在下、３７℃で４５分間、製造業者の説明書により、ＤＮａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）による処置によって除去した。相対遺伝子発現を、製造業者により、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いる定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって評価した。遺伝子発現を１６Ｓに対して正規化し、相対発現を、比較（ΔΔＣＴ）方法によって算出し、遺伝子発現の倍数変化を、２（－ΔΔＣＴ）として表した。結果は、三反復でそれぞれアッセイされた３つの生体試料の平均を表す。遺伝子発現の２倍の変化を生物学的に有意と見なした。使用したプライマーを表３にリストする。
表3. 本研究で使用したプライマー
統計分析
データは、１試料あたり２回または３回の技術的反復で別々の日に行われた少なくとも３回の生物学的反復の平均±ＳＥＭとして表される。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアバージョン８．２を用いて行った。多重比較を、ホルム－シダック補正を伴う一元配置分散分析によって行った。すべての他の比較は、スチューデントのｔ検定を用いて行った。質量分析および世代主成分分析によって特定されたタンパク質の正規化されたスペクトルカウントにおける倍数変化の比較を、Ｒ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）において行った。フローサイトメトリーデータを、コルモゴロフ－スミルノフ検定によって分析して、前方散乱および前方散乱のプロファイルについて、抗ｒｓＰｉｌＡ ＮＲｅｌ対抗ＩＨＦ ＮＲｅｌの累積分布を比較した。
データ利用可能性
この研究の間に作成および分析されたすべてのデータは、表１に見ることができる。
実験番号３ － 抗ｒｓＰｉｌＡ抗体および抗ＤＮＡＢＩＩチップキメラ抗体の相乗効果
ＮＴＨＩ＋Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ＋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓを、１：１：１の比で、３７℃および５％のＣＯ２で１６時間成長させ、バイオフィルムを形成させた後、２時間処置した。４つの処置群は、例えば、陰性対照として培地のみ、３μｇの抗ｒｓＰｉｌＡ抗体、１．２５μｇの抗ＭｓＴｉｐＭａｂ（すなわち、ＤＮＡＢＩＩチップキメラに対するマウスモノクローナル抗体）、および３μｇの抗ｒｓＰｉｌＡ抗体と１．２５μｇの抗ＭｓＴｉｐＭａｂを含む。細菌をＦＭ１－４３ ＦＸで標識し、相対蛍光をウェルごとに算出した。図７に示されるように、３０．５％のバイオフィルムの低減が、組合せ処置において観察されたが、単剤処置は、４．６％および０．７％の低減を示し、明確な相乗的な転帰が、抗ｒｓＰｉｌＡと抗チップキメラモノクローナル抗体による組合せ処置を介して達成されたことを示唆する。
実験番号４ － ２つの固有の機構を活用して細菌をバイオフィルムからＮＲｅｌ状態に放出して、格好の拡大された治療域を達成する
出願人は、バイオフィルム所在からの細菌の放出による正確な機構が、新たに放出された（ＮＲｅｌ）集団の表現型に著明な影響を有していたと決定した。例えば、実験番号１を参照されたい。明確に異なる決定基を標的にするこれらの２つの方法を組み合わせることによって、出願人は、処置および／または防止のいくつかの重要なボトルネックを克服することができる。
各種の機構を介してバイオフィルムから放出された細菌が、バイオフィルム内に内在するもの、またはプランクトン様に成長した（実験室において一般に行われる通り）場合のものとは異なることを示したが、出願人は、遺伝的同一性にもかかわらず、ＮＲｅｌ細菌の集団が、それらがバイオフィルムから放出された正確な様式に起因して固有であると決定した。これらのＮＲｅｌ細菌集団の表現型は、バイオフィルムが病態形成および疾患経過に大いに寄与する慢性および再発性の細菌性疾患の処置および／または防止の両方に対する複数のボトルネックを克服する固有の方法で活用することができる。
この予期せぬ発生を考慮して、出願人は、抗ＤＮＡＢＩＩおよび抗ＰｉｌＡを組み合わせる相乗的な保護／治療転帰をさらに観察し、そのような相乗効果を繰り返すように、ＤＮＡＢＩＩタンパク質およびＰｉｌＡの両方で免疫した。方法および他に関するより詳細について、Novotny et al 2015およびNovotny et al 2017 Clinical Vaccine Immunology 24:e00563-16を参照されたい。出願人はまた、ＰｉｌＡに対する抗体またはＩＨＦに対する抗体が、バイオフィルムから細菌を放出させ、バイオフィルム中のものとは異なる抗生物質の作用に対して非常に感受性になった状態にしたことも実証した（Brockson, ME et al. 2014；Mokrzan, EM et al. 2018を参照されたい）。これらの結果の前に、出願人は、これらの２つの免疫原によって誘導された抗体が、異なるプロテオーム、トランスクリプトーム、および抗生物質に対する敏感性を有する、２つの遺伝子学的に同一であるが表現型的に明確に異なる細菌の集団をもたらすことを予想していなかった。他の免疫エフェクターに対する敏感性は、調査中である。
慢性および再発性の細菌性疾患は、かなりの世界的な健康負荷を示す。それらは、生来、処置することが非常に困難であり、従来の抗生物質に対して非常に耐性である。出願人は、処置および／または相乗的な臨床転帰の持続的な絶好の機会を発展させる様式で、免疫誘導抗体および／または明確に異なる記載されたＮＲｅｌ状態を誘導する抗体の治療的送達を組み合わせることが可能であると構想した。
文献では、任意のいくつかの方法を介してバイオフィルム所在から放出された細菌が、それらが、バイオフィルム群衆の部分であった場合および／またはそれらが、典型的には実験室で行われるように、プランクトン様に成長された場合の両方とは異なることを実証した。出願人は、この観察に興味をそそられ、ＮＴＨＩのＩＶ型単収縮線毛に特異的に対するアプローチ、または種に依存せず、２つのＤＮＡＢＩＩタンパク質のいずれか内の保護エピトープに特異的に対するアプローチのいずれかを疑問に思い、バイオフィルム所在から放出されたＮＴＨＩおよびの他の細菌は両方とも、実際に、これらの新たに放出された（ＮＲｅｌ）細菌を抗生物質による死滅に対して非常に感受性になった。これは、細菌が、疾患状態で真にプランクトン様であることは決してなく、それらは、悪名高くも処置することが困難な保護バイオフィルム内に存在することを好むので、臨床的に関連する疑問である。出願人は、出願人が抗ｒｓＰｉｌＡ抗血清または抗ＤＮＡＢＩＩ抗血清のいずれかによりバイオフィルムから細菌を非常に脆弱な状態（従来の抗生物質および／または免疫エフェクターのいずれかに対して）に放出する場合、おそらく、これを臨床的に活用できると仮説を立てた。出願人は、実際に、ＮＲｅｌ ＮＴＨＩおよびＮＲｅｌ Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの両方に対する抗生物質によるこの増強された死滅を実証することができたが、しかしながら、出願人が予期できなかったのは、少なくともＮＴＨＩについて、抗ｒｓＰｉｌＡ血清または抗ＤＮＡＢＩＩ血清のいずれかによってバイオフィルム所在からの放出後に生じたＮＲｅｌの集団が、遺伝子学的に同一であるにもかかわらず、表現型が明確に異なったことであった。この差異は、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、および所与の抗生物質による明確に異なる統計的に有意な増加した死滅によって証拠付けられた。理論によって拘束されることを望まないが、出願人は、混合細菌バイオフィルム感染の状態で、出願人が、抗ｒｓＰｉｌＡの力を十分に利用して、ＬｕｘＳおよびＩＶ型線毛の両方のプログラムされた発現に起因して確立されたバイオフィルムからのＮＴＨＩの持続的であるがゆっくりとしたトップダウン放出を誘導するだけでなく、能動免疫および／または保護エピトープに特異的に対する抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の治療的送達のいずれかも介するが、能動免疫の結果としての任意の新たなＮＴＨＩバイオフィルムの形成を防止し、プログラムされていない機構を介した複数の細菌種によって形成されたバイオフィルムを迅速に破壊するというこの理解を活用することができると仮説を立てた。これらの抗血清の両方が、明確に異なるＮＲｅｌ表現型を誘導することを考慮して、これは、必要により、抗生物質処置のため、およびいずれかが単独で誘導することが可能である可能性があることを超えて持続および増幅される宿主媒介クリアランスのための絶好の機会を提供する。この仮説は、ＮＲｅｌ状態の誘導が、ＮＲｅｌ集団の遺伝的同一性にもかかわらず、放出の正確な機構と明確に異なり、それに寄与した、非常に予想外の結果において予測される。バイオフィルムが、長期間所定の場所にあり、複数の細菌から構成される疾患では、出願人は、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体が、種に依存しない様式でこれらの既存のバイオフィルムを減量し、特定の抗生物質の死滅作用およびおそらく免疫エフェクターに敏感性の複数のＮＲｅｌ集団を生成する一方で、抗ｒｓＰｉｌＡ抗血清が、防止的および治療的の両方で、抗生物質、および必要により免疫エフェクターに対するその自身の固有の敏感性を有するＮＲｅｌ集団を誘導することによって哺乳動物の気道全体にわたって疾患において役割を果たすＮＴＨＩを特異的に標的にするように作用するという仮説を立てた。有効な抗バイオフィルム戦略を誘導することができる方法が多くなれば、予期される力がより大きくなり、より多くの肯定的な臨床転帰が予測される。理想的には、治療的適用のためには、出願人は、出願人が特定および特徴付けたｒｓＰｉｌＡおよびＤＮＡＢＩＩタンパク質両方の特異的保護エピトープに対するヒト化モノクローナル抗体も使用する。能動免疫適用のためには、出願人は、出願人が設計し、それらの相対有効性について広範囲に前臨床で試験したワクチン候補で同様に免疫した。
出願人は、複数の高い優先度の病原体による多様な単一種および混合種のバイオフィルムの両方を構築するために開発されたハイスループット９６ウェルバイオフィルムプレートアッセイを使用し、これらのバイオフィルムを、抗ｒｓＰｉｌＡ単独、抗ＤＮＡＢＩＩ単独、または両方の組合せのいずれかで処置して、既存のバイオフィルムを破壊／分散させるそれらの相対的な能力を決定する。試験される細菌は以下を含む：ＮＴＨＩ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、ＥＳＫＡＰＥ病原体およびその他。
さらに、出願人は、ＮＲｅｌ細菌を生成／回収するためにハイスループットアッセイを使用して、上記の単一種および混合種のバイオフィルムの両方を試験するプランクトン様対応物（臨床微生物学研究室でＭＩＣ値および患者のための処置レジメンを決定するために使用される通り）と比較した場合に、相対抗生物質感受性について試験する。
加えて、出願人は、バイオフィルム疾患の３つの動物モデル（ＯＭのチンチラモデル、インプラント周囲炎のラットモデルまたは肺疾患のマウスモデル）のいずれかを使用して、上記で仮説を立てた組み合わされた能動免疫＋治療アプローチを試験する。
実験番号５ － ２種バイオフィルムの破壊／分散相乗アッセイ
細菌を寒天上で１８～２０時間成長させ、次いで、補充されたＢＨＩブロス（ｓＢＨＩ）に希釈して、両方の微生物が一緒に培養されて生存することを可能にするように事前に決定された特定の標的濃度を達成し、我々が、ＮＴＨＩが処置されたときに同じ年齢の単一種バイオフィルム中にあった場合に達成可能な濃度と類似の濃度でＮＴＨＩを回収することを可能にした。１００μｌの２つの細菌懸濁液のそれぞれを、８ウェルのカバーされたチャンバーガラススライドの適切なウェルに添加した。しかしながら、ＮＴＨＩのみが播種されたウェルについて、１００μｌのｓＢＨＩを、すべてのウェルが２００μｌに培養培地の最終体積を含有するように、添加した。それぞれの細菌のペアリングについての標的濃度を下記にリストする（ＮＴＨＩ：第２の細菌種の比がそれぞれのペアリングに固有であったことに留意されたい）。
表4.
チャンバーのあるカバーガラススライドを、次いで、３７℃、５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。ウェルを、２００μｌの事前に温めたｓＢＨＩで１回穏やかに洗浄して、バイオフィルム内ではない任意の細菌を除去し、次いで、２００μｌの無菌ｓＢＨＩ（陰性対照）、抗ｒｓＰｉｌＡモノクローナル抗体、抗チップキメラモノクローナル抗体（Ａ５－ｍＢ４チップキメラ抗体）、または抗ｒｓＰｉｌＡ＋抗チップキメラモノクローナル抗体のカクテル（「コンボ」、すべてｓＢＨＩに希釈）のいずれかをウェルに添加した。チャンバーのあるカバーガラススライドを、次いで、３７℃、５％のＣＯ２で２時間インキュベートした。
インキュベーション後、１５０μｌの培地を、それぞれのウェルから除去し、無菌エッペンドルフ管に入れた。次いで、２００μｌの無菌ＤＰＢＳを、任意の残ったバイオフィルムを妨げないようにそれぞれのウェルに注意深く添加し、この１５０μｌを収集し、エッペンドルフ管に添加し、それぞれのウェルについて繰り返した。これらのプールされた液体は、適用されたモノクローナル抗体または抗体カクテルの作用によってバイオフィルム所在から新たに放出された（ＮＲｅｌ）細菌、または陰性対照（ｓＢＨＩ）で「処置された」バイオフィルムの場合における細菌を含有し、細菌は、それらがバイオフィルムから剥がれたかまたはバイオフィルムと全く会合せず、「バイオフィルムリモデリング」の通常の部分として培養液中で単に成長していたので、培養液中に単に存在することを表す。
出願人が、ＤＮＡＢＩＩタンパク質を標的にする抗血清の作用を介して産生されたＮＲｅｌが、小さな凝集体中のバイオフィルム所在からの細菌の放出を誘導した（一方で、抗ｒｓＰｉｌＡの作用によって産生されたものは単一細胞である）ことをすでに決定していたので、すべての管を、２分間穏やかに超音波処理をした後、連続希釈し、最も正確なカウントを保証するために、適切な寒天上に細菌を蒔いた。
この研究では、出願人は、ＮＴＨＩ、およびバイオフィルムが病態形成に寄与する多くのヒト疾患においてＮＴＨＩとともに一般に見出される別のヒト気道病原体によって形成されるバイオフィルムを調べた。ＮＴＨＩ＋Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａは、特に、嚢胞性線維症（ＣＦ）を有する個体において非常に問題があり；ＮＴＨＩ＋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓは、気道全体にわたって問題があるコンボであり、ＮＴＨＩ＋Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、気道全体にわたって問題がある。図９におけるそれぞれのプロットは、多くの細菌（ＮＲｅｌ）が、陰性対照である培地単独（ｓＢＨＩ）によって、抗ｒｓＰｉｌＡによって、抗ＴｉｐＭａｂによって、または抗血清カクテルによって新たに放出されることを示す。白色のバーは、それがバイオフィルムを単独で構築した場合に、ＮＴＨＩに起こることを表す（図７を参照されたく、ここで、ｓＢＨＩが、バイオフィルムから細菌を放出しないが、抗ｒｓＰｉｌＡ抗体および抗ＴｉｐＭａｂの両方が放出し、カクテルが、相乗的であり、このようにして最も高い放出を誘導することを示す）－白色のバー。それらは灰色で影が付けられたバー、および黒色のバーは、ＮＴＨＩが別の細菌種とバイオフィルムを形成し、ｓＢＨＩ、２つの抗血清のうちの１つ、または両方の抗血清のカクテルで処置された場合を示す。図９を参照されたい。図１０は、ＮＴＨＩおよびＭ．ｃａｔ．バイオフィルムの処置の結果を示す。
実験番号６ － 中耳炎
中耳感染症（または中耳炎、ＯＭ）は、世界的に非常に蔓延している疾患であり、最も重度の形態（慢性化膿性ＯＭまたはＣＳＯＭと呼ばれる）に、世界で毎年５０００万～３億３０００万人の小児が苦しんでいる。ＯＭの社会経済的負荷も大きく、費用は、米国単独で毎年５０～６０億ドルと推定される。ＯＭの普及している細菌性病原体の３つすべてが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でバイオフィルムを形成することが公知であり、最近、臨床医らは、ＯＭの慢性性および再発性が、少なくとも部分的に、中耳腔内の細菌性バイオフィルムの形成に起因することを認識するようになっている。
実際に、微生物培養物と組み合わせた、鼓膜切開チューブおよび持続性耳漏を伴う小児患者由来の耳漏固体をｅＤＮＡおよびＩＨＦについて標識した結果は、バイオフィルムが、慢性耳漏において役割を果たすことを示す。具体的には、分析された１５の小児耳漏試料のうち、９（６０％）は、ｅＤＮＡ（ウサギ抗ＩＨＦを使用して標識され、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ ５９４にコンジュゲートされたヤギ抗ウサギＩｇＧで検出される）の格子と関連するＩＨＦの標識化について陽性の固体を含有し、７５％は、陽性の細菌培養物を生じた。細菌培養結果は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの存在を実証した。これらのデータは、ＤＮＡＢＩＩタンパク質が、他の耳疾患の中で、鼓膜切開チューブ挿入後の耳漏における治療標的としての機能を果たし得ることを示唆する。
ＯＭの１つのチンチラモデルでは、若年チンチラに、最初に、ウイルス性「風邪」与え、それに続いて１週間後、生菌の接種物により鼻腔内的にチャレンジした。「私の子供は風邪をひき、１週間後に耳感染症になった」ヒトの状態と同様に、チンチラも、チャレンジのおよそ１週間後に、細菌性ＯＭを発生した一方で、ウイルス性上気道感染症を経験した。細菌の増加が中耳に達すると（耳管の上昇を介して、または中耳洞への直接的なチャレンジ後のいずれか）、それらは、頑強なバイオフィルムを形成する。そのため、出願人は、本明細書で報告されるように、チンチラモデルを企図し、これを実際にすでに使用して、既存のバイオフィルムの迅速な消失をもたらすＩＨＦ免疫化の保護有効性を実証した。このモデルはまた、抗ＤＮＡＢＩＩ抗体の受動送達を介した、またはＩＨＦもしくは他のＤＮＡＢＩＩファミリーメンバーに結合することが公知の小分子もしくは他の薬剤の送達を介した、治療アプローチのために有用である。
本明細書に開示される組合せおよび／または方法の有効性を決定するために、ＮＴＨＩ細菌を、チンチラの中耳洞に注射し、バイオフィルムを形成させた。特に、中耳疾患の証拠がない成体チンチラ（Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ ｌａｎｉｇｅｒａ）を購入し（Ｒａｕｓｃｈｅｒ’ｓ Ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａ Ｒａｎｃｈ，ＬＬＣ）、７日間休息させた後、無菌のパイロジェンフリー生理食塩水に希釈された水疱あたり１０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）の分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ番号８６－０２８ＮＰによる経水疱チャレンジを行った（ゼロ（０）日目）。次いで、４日目および５日目、または４日目、５日目および６日目のいずれかに、本明細書に開示される組成物を、それぞれの中耳洞に注入する（水疱あたり１００μｌ）。４日目および５日目に投与されたチンチラについて、コホートあたり３頭のチンチラを、６日目または１２日目（２用量の実験）のいずれかに犠牲にする。４日目、５日目および６日目に投与されたチンチラについて、コホートあたり３頭のチンチラを、１３日目（３用量の実験）に犠牲にする。犠牲にした後、チンチラを、画像化し、中耳粘膜を収集し、付着バイオフィルムを評価し、中耳液を収集し、細菌の定量化を行い、中耳液を、サイトカイン多重アッセイを使用して評価する。
中耳液を収集し、アリコートを連続希釈し、チョコレート寒天上に蒔き、相対プランクトン様細菌負荷を定量化する。残った液体を、１０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を分離し、細胞ペレットおよび液体画分の両方を、急速凍結した後、－８０℃で保管する。中耳粘膜および付着細菌バイオマスを、デジタル的に画像化し、事前に秤量した微量遠心分離管に収集し、１．０ｍｌの無菌の０．９％塩化ナトリウム中でホモジナイズする。ホモジネートも、前のように、連続希釈して、蒔き、組織／バイオマスの１ｍｇあたりの中耳洞内で付着した細菌の集団を定量化する。残った試料を、急速凍結した後、－８０℃で保管する。培養プレートを、加湿雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした後、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ２装置（Ｓｙｎｂｉｏｓｉｓ）を介して細菌コロニーを計数する。
デジタルカメラシステム（ＭｅｄＲｘ、Ｌａｒｇｏ、ＦＬ）に接続された０度の３インチプローブを使用するビデオ耳鏡検査を利用して、ＯＭの徴候（例えば、鼓膜炎症および／または中耳洞における液体の存在）をモニターする。ティンパノメトリーを、ＭＡＤＳＥＮ Ｏｔｏｆｌｅｘティンパノメーターを用いて行い、データを、ＯＴＯｓｕｉｔｅソフトウェア（Ｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ、ＩＬ）を用いて分析する。ＯＭの全体的な徴候は、確立された０～４＋のスケールに対して盲検的に格付けし、≧２．０のスコアを有する中耳は、中耳液が鼓膜の後で見える場合に、ＯＭについて陽性と見なす。鼓膜が、外耳道内の閉塞に起因して（すなわち、耳垢蓄積に起因して）見ることができない場合、その耳は、毎日のカウントから除外する。確立されたプロトコールにより、それぞれの中耳は独立していると見なし、それぞれのコホートについて、ＯＭを有する中耳のパーセンテージを算出する。
中耳洞内の残存バイオフィルムをランク付けするために、中耳の画像をスクランブルし、７人の個人によって盲検的にレビューする。確立された解説を使用して、０～４のスコアをそれぞれの画像に割り当てる：０：見えるバイオフィルムはない、１：バイオフィルムは中耳洞の≦２５％を満たす、２：バイオフィルムは中耳洞の＞２５％～≦５０％を満たす、３：バイオフィルムは中耳洞の＞５０％～≦７５％を満たす、４：バイオフィルムは中耳洞の＞７５％～≦１００％を満たす。
このランク付け／スコア付けスケールは、下記の表に詳細に記載され、それぞれの動物の中耳内に残っているバイオマスの相対量を示す。
表5
清澄化された中耳液中の炎症誘発性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインのパネル（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１７Ａ、ＴＮＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１３）の相対量を、製造業者の説明書に従って、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して決定し、試料を、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６サイトメーターにおいて評価する。データを、ＦｌｏＪｏ Ｖ＿１０ソフトウェアを用いて分析する。
実験番号７ － 口腔疾患の処置
いくつかの口腔細菌（例えば、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が、歯槽骨および歯肉を破壊する歯周炎およびインプラント周囲炎などの炎症性疾患の病態形成に関わっている。これらの細菌の病態形成の調査は、有効な動物モデルの欠如によって妨げられている。特定の細菌の病原性を調査することの課題の１つは、外因性細菌が、動物の口腔に導入された場合のバイオフィルムを確立する困難さである。歯周炎の動物モデルは開発されているが、培養可能な細菌が、接種された動物の口腔から回収されることは稀である。特定の細菌の病原性を評価することができる有効な動物モデルを開発することは、それらの病原性機構を解明するのに大いに役立つ。
機械加工したチタン歯科インプラント（１．２×４．５ｍｍ）の表面を、Ａ１０３によるグリットブラスティング（１００μｍ）、およびＨＣｌエッチング（ｐＨ７．８、８０℃で２０分間）によって改変することができる。機械加工およびナノテクスチャー加工したインプラントを、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ（Ａａ）のＤ７Ｓ臨床株を接種したＴＳＢ培地中、３７℃で１～３日間インキュベートする。インプラント上の細菌バイオフィルムを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）で染色した後、ＳＥＭによって、および共焦点レーザー走査性顕微鏡法によって分析する。Ａａバイオフィルムが確立されたインプラントおよび確立されていないインプラントを、雌ラットの上顎の小臼歯領域と切歯領域との間で歯槽骨に経粘膜的に配置する。ｉｎ ｖｉｖｏで配置されたインプラント上のＡａバイオフィルムの存在を検出するために、細菌試料を、２日後に唾液およびインプラントの口腔表面から収集する。Ａａは、培養によって、およびＰＣＲ分析によって検出することができる。さまざまな時点、例えば、植え込みの６週間後に、インプラント周囲の骨および粘膜組織のマイクロＣＴおよび組織学的分析を行うことができる。
さらに、口腔は、バイオフィルム群集内に共存する数々の細菌種を含有する。これらの群集は、共生細菌、例えば、一部の口腔のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、および他の細菌種、例えば、歯周炎の病原体であるＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの両方を含有する。以前から存在するバイオフィルム内のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの侵入し、持続し、拡大する能力は、バイオフィルム内に存在する共生細菌と相互作用するその能力に依存する。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの１つの十分に特徴付けられている結合パートナーは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉである。どのようにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓがＳ．ｇｏｒｄｏｎｉｉと相互作用するかを理解すること、およびその相互作用を妨げることで、口腔内の天然バイオフィルム群集からこの重要な歯周炎の病原体の排除または除去を可能にし得る。共焦点顕微鏡法を利用して、バイオフィルム構造を分析し、差次的プレーティングおよび免疫蛍光顕微鏡法を使用して、バイオフィルム内に存在する細菌種の組成を決定することができる。
本明細書に開示される方法および組成物は、これらのバイオフィルムの低減および／または排除のための治療戦略および防止戦略の両方を開発することを企図する。感染した対照と比較した発赤、炎症および出血の減少は、バイオフィルムの低減および／または排除を示すであろう。加えて、感染した対照と比較した、インプラントスクリューについての炎症性または炎症誘発性組織構造の低減または非存在およびトルク除去力の維持は、バイオフィルムの低減および／または排除を示すであろう。
実験番号８ － 嚢胞性線維症
この実験は、嚢胞性線維症を処置する干渉性薬剤の前臨床試験のためのブタモデルを提供する。Stoltz et al. (2010) Science Translational Medicine 2(29):29-31を参照されたい。嚢胞性線維症は、ＣＦ膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲと呼ばれる）のアニオンチャネルをコードする遺伝子の突然変異に起因する常染色体劣性疾患である。このモデルでは、「ＣＦＴＲ」と呼ばれる遺伝子に欠損を持つように特異的に交配され、ＣＦブタと呼ばれているブタは、複数の細菌種による下気道の感染症を含むＣＦ肺疾患の顕著な特色を自発的に発生する。本明細書に開示される方法および組成物は、これらのバイオフィルムの低減および／もしくは排除、ならびに／または疾患および関連する病状の徴候の改善のための治療戦略および防止戦略の両方を開発することを企図する。
実験番号９ － ＰｉｌＡワクチン
本明細書に記載される方法を使用して、ヒトおよび動物におけるＰｉｌＡに対する免疫応答を誘発し得る。免疫原性組成物を、限定されるものではないが、アルミニウム塩およびリポソームなどのアジュバントの存在下で、ヒトおよび動物対象に投与し得る。当業者は、任意のいくつかの薬学的に許容されるアジュバントも使用することができることを理解するであろう。免疫原性組成物は、筋肉内、真皮下、鼻腔内、または任意の他の好適な経路により、ヒトまたは動物対象に投与され得る。免疫原性組成物は、選択された投与の方式と一致した方式で調製され得る。免疫原性組成物は、ポリペプチド、核酸またはそれらの組合せの形態をとってもよく、全長抗原または部分抗原を含んでいてもよい。加えて、または代替的に、免疫原性組成物は、特定の抗原によるパルス状のＡＰＣ、または特定の抗原をコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドで移入されたＡＰＣの形態をとってもよい。投与は、免疫原性組成物の単一用量を含んでいてもよく、または初回投与とそれに続く１回もしくは複数回のブースター用量を含んでいてもよい。ブースター用量は、初期用量の１日、２日、３日、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、もしくは１２か月後、またはその後の任意の他の時点に提供されてもよい。ブースター用量は、対象の抗体力価の評価後に投与されてもよい。
実験番号１０ － 受動免疫
本明細書に記載される方法を使用して、本明細書に開示されるＰｉｌＡおよび／またはＤＮＡＢＩＩに対して非免疫対象に受動免疫を付与し得る。所与の抗原に対する受動免疫は、特定の抗原を特異的に認識するか、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片の移入により付与され得る。抗体のドナーおよびレシピエントは、ヒトまたは非ヒト対象であり得る。加えて、または代替的に、抗体組成物は、特定の抗原を特異的に認識し、またはそれに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドを含み得る。
受動免疫は、免疫原性組成物の投与が、レシピエント対象に対してリスクがあり、レシピエント対象が、免疫的に無防備であるか、またはレシピエント対象が、即時の免疫を必要とする場合に付与され得る。免疫原性組成物は、選択された投与の方式と一致した方式で調製され得る。組成物は、全抗体、抗原結合性断片、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ｉｎ ｖｉｖｏで生成された抗体、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された抗体、精製されたもしくは部分的に精製された抗体、または全血清を含み得る。投与は、抗体組成物の単一用量を含んでいてもよく、または初回投与とそれに続く１回もしくは複数回のブースター用量を含んでいてもよい。ブースター用量は、初期用量の１日、２日、３日、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月、もしくは１２か月後、またはその後の任意の他の時点に提供されてもよい。ブースター用量は、対象の抗体力価の評価後に投与されてもよい。
均等物
本発明を、上記の実施形態と併せて記載したが、前述の記載および例は、説明を意図し、本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。本発明が付与する本発明の範囲内の他の態様、利点および改変は、当業者に明らかであろう。
本開示が、具体的な実施形態、ならびに当業者によって用いられ得る本明細書に開示されるその実施形態の必要に応じた特色、改変、改善および変形形態によって具体的に開示されているが、そのような改変、改善および変形形態は、本開示の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。本明細書に提供される材料、方法、および例は、特定の実施形態の代表であり、例示であり、そして本開示の範囲に対する限定として意図されるものではない。
本開示の範囲は、本明細書に広くおよび一般的に記載されている。一般的な開示内のより狭い種および下位属のグループ分けのそれぞれはまた、本開示の一部を形成する。これは、排除される材料が本明細書に具体的に列挙されているかどうかにかかわらず、任意の主題をその属から除去するという但し書きまたは否定的限定により、一般的記載を含む。
加えて、本発明の特色または態様がマーカッシュ群の観点で記載される場合、当業者は、本発明が、それによって、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位群の観点でも記載されることを認識するであろう。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それぞれが個々に参照によって組み込まれたのと同程度まで、それらの全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
配列表
配列番号１（Ｈ１０２１０（１Ｆ８．Ｆ１ヒト化ＨＣ１（抗チップキメラ抗体））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号２（Ｈ１０２１１（１Ｆ８．Ｆ１ヒト化ＨＣ２、抗チップキメラ抗体）
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号３（Ｈ１０２１２（１Ｆ８．Ｆ１ヒト化ＨＣ３、抗チップキメラ抗体））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号４（Ｈ１０２１３（１１Ｅ７．Ｃ７））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号５（Ｈ１０２１４（１１Ｅ７．Ｃ７ヒト化ＨＣ２））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号６（Ｈ１０２１５（１１Ｅ７．Ｃ７ヒト化ＨＣ３、抗チップキメラ抗体））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号７（Ｌ１０２１０（１Ｆ８．Ｆ１ヒト化ＬＣ１、抗チップキメラ抗体））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号８（Ｌ１０２１１（１Ｆ８．Ｆ１ヒト化ＬＣ２、抗チップキメラ抗体））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号９（Ｌ１０２１２（１Ｆ８．Ｆ１ヒト化ＬＣ３、抗チップキメラ抗体））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号１０（Ｌ１０２１３（１１Ｅ７．Ｃ７ヒト化ＬＣ１））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号１１（Ｌ１０２１４（１１Ｅ７．Ｃ７ヒト化ＬＣ２））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号１２（Ｌ１０２１５（１１Ｅ７．Ｃ７ヒト化ＬＣ３））
太字フォントは、例示的な可変領域を示す一方、太字のイタリック体の下線付きフォントは、例示的なＣＤＲを示す。
配列番号１３（重鎖コンセンサス配列、抗チップキメラ抗体）
ここで、Ｘおよび小文字は、対応する位置において、任意のアミノ酸で、または代替的に、配列番号１～６から選択されるアミノ酸で置換することができる。一実施形態では、Ｘは、アミノ酸残基の非存在も示し得る。
配列番号１４（軽鎖コンセンサス配列、抗チップキメラ抗体）
ここで、Ｘおよび小文字は、対応する位置において、任意のアミノ酸で、または代替的に、配列番号７～１２から選択されるアミノ酸で置換することができる。一実施形態では、Ｘは、アミノ酸残基の非存在も示し得る。
配列番号１５ ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０
配列番号１６ ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７
配列番号１７ ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９
配列番号１８ ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０
配列番号１９ ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１
配列番号２０ ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１
配列番号２１ ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６
配列番号２２ ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７
配列番号２３ ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４
配列番号２４（チップ重鎖コンセンサス配列）
ここで、小文字は、対応する位置において、配列番号１～３から選択されるアミノ酸で置換することができる。
配列番号２５（チップ軽鎖コンセンサス配列）
ここで、小文字は、対応する位置において、配列番号７～９から選択されるアミノ酸で置換することができる。
配列番号２６（テール重鎖コンセンサス配列）
ここで、小文字は、対応する位置において、配列番号４～６から選択されるアミノ酸で置換することができる。
配列番号２７（テール軽鎖コンセンサス配列）
ここで、小文字は、対応する位置において、配列番号１０～１２から選択されるアミノ酸で置換することができる。
配列番号２８（ＩＨＦが結合するコンセンサス配列）
ここで、Ｗは、ＡまたはＴであり、Ｒは、プリンである。
配列番号２９（Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｕｐＡ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＰ＿００３８１８、最終アクセス２０１１年３月２１日）
配列番号３０（Ｅ．ｃｏｌｉ ｈｕｐＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＰ＿００１０９０．１、最終アクセス２０１１年３月２１日）
配列番号３１（ＩｈｆＡ、Ａチップ断片）
配列番号３２（ＩｈｆＢ、Ｂチップ断片）
配列番号３３（ペプチドリンカー）
配列番号３４（ペプチドリンカー）
配列番号３５（ペプチドリンカー）
配列番号３６（ペプチドリンカー）
配列番号３７（ペプチドリンカー）
配列番号３８（チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ）
ここで、「Ｘ」は、必要に応じて、１～２０アミノ酸を含むか、またはそれから本質的になるか、またはさらにそれからなる、必要に応じたアミノ酸リンカー配列であり、
「Ｘ１」は、任意のアミノ酸であるか、または代替的に、「Ｘ１」は、アミノ酸Ｑ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、もしくはＴから選択される。
配列番号３９（チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ）
ここで、「Ｘ」は、必要に応じて、１～２０アミノ酸を含む、必要に応じたアミノ酸リンカー配列である。
配列番号４０（チップキメラペプチドＩｈｆＡ５－ｍＩｈｆＢ４ＮＴＨＩ、一部の実施形態では、本明細書でチップキメラと称される）
配列番号４１（テールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ）
配列番号４２：非限定的な例示的リンカー：ＧＧＳＧＧＳ
配列番号４３：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳＬＫＬ
配列番号４４：非限定的な例示的リンカー：ＧＧＧ
配列番号４５：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳＬ
配列番号４６：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳ
配列番号４７：非限定的な例示的リンカー：ＰＳＬＫ
配列番号４８：非限定的な例示的リンカー：ＧＰＳＬＫ
配列番号４９：非限定的な例示的リンカー：ＳＬＫＬ
配列番号５０（テールキメラペプチドＩｈｆＡ３－ＩｈｆＢ２ＮＴＨＩ）
ＦＬＥＥＩＲＬＳＬＥＳＧＱＤＶＫＬＳＧＦＧＰＳＬＴＬＳＡＫＥＩＥＮＭＶＫＤＩＬＥＦＩＳＱ
参考文献

Claims (40)

  1. それを必要とする対象におけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされるか、それを含むか、またはそれによって将来引き起こされる多微生物性バイオフィルムを防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法であって、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  2. Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされるか、それを含むか、またはそれによって将来引き起こされる多微生物性バイオフィルムに関連する疾患を防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法であって、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片および抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、または（ｉｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片およびＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  3. 前記疾患が、嚢胞性線維症（ＣＦ）、肺ＣＦ、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）、歯周炎、インプラント周囲炎、中耳感染症、中耳炎（ＯＭ）、急性中耳炎（ＡＯＭ）、滲出性中耳炎（ＯＭＥ）、鼓膜切開チューブ挿入後の耳漏（ＰＴＴＯ）、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、市中感染性肺炎（ＣＡＰ）、胸腔チューブ／カテーテル／留置デバイスバイオフィルム感染症、扁桃炎、咽頭炎（pharyngitis）、咽頭炎（laryngitis）、喉頭蓋炎、副鼻腔炎、肺炎、気管支炎、または他の気道感染症（ＲＴＩ）から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む抗生物質を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌によって引き起こされるか、それを含むか、またはそれによって将来引き起こされる多微生物性バイオフィルムを防止する、阻害する、破壊する、分散させる、または処置するのうちの１つまたは複数のための方法であって、（ｉ）抗ＤＮＡ結合性およびベンディングタンパク質（ＤＮＡＢＩＩ）抗体またはその生物学的に活性な断片、ならびに（ｉｉ）抗ＩＶ型線毛（Ｔ４Ｐ）の大多数サブユニット（ＰｉｌＡ）抗体またはその生物学的に活性な断片を前記多微生物性バイオフィルムと接触させるステップを含む、方法。
  6. 前記多微生物性バイオフィルムを、必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む抗生物質と接触させるステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記接触させるステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏである、請求項５または６に記載の方法。
  8. 抗生物質療法のためにＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌を含む多微生物性バイオフィルムに感作する、または多微生物性バイオフィルムを形成する細菌を新たに放出された（ＮＲｅｌ）状態に誘導するための方法であって、前記バイオフィルムを、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片、および（ｉｉ）抗ＰｉｌＡ抗体またはその生物学的に活性な断片と接触させるステップを含む、方法。
  9. 前記バイオフィルムを、必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む抗生物質と接触させるステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
  10. 抗生物質療法のためにそれを必要とする対象におけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌を含むポリクローナル微生物性バイオフィルムに感作する、またはそれを必要とする対象における多微生物性バイオフィルムの細菌を新たに放出された（ＮＲｅｌ）状態に誘導するための方法であって、（ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片、および（ｉｉ）抗ＰｉｌＡポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片を前記対象に投与するステップを含む、方法。
  11. 必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む抗生物質を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＤＮＡＢＩＩが、組込み宿主因子（ＩＨＦ）またはヒストン様タンパク質（ＨＵ）タンパク質から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片が、ＤＮＡＢＩＩ Ａ５ペプチド、ＤＮＡＢＩＩ ｍＢ４ペプチド、チップペプチド、チップキメラペプチド、またはＡ５ペプチドおよびｍＢ４ペプチドを含む組換えチップキメラポリペプチドのうちの１つまたは複数を認識し、それに結合する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記ＰｉｌＡが、組換えの可溶性ＰｉｌＡ（ｒｓＰｉｌＡ）である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記β－ラクタム抗生物質が、アモキシシリンとクラブラン酸（ＡＭＣ）を含む、請求項４、６～７、９および１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記β－ラクタム抗生物質が、ベンザチン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、ベンザチンペニシリンＧ、ベンザチンペニシリンＶ、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリン、フェネチシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシシリン、アンピシリン、メシリナム、ピペラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン、アズロシリン、メズロシリン；セファゾリン、セファレキシン、セファロスポリンＣ、セファロチン、セファピリン、セファクロル、セファマンドール、セフロキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフィキシム、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフジニル、セフェピム、セフピロム、セフタロリン；ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、チエナマイシン；アズトレオナム、チゲモナム、ノカルディシンＡ、またはタブトキシニンβ－ラクタムのうちの１つまたは複数を含む、請求項４、６～７、９および１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記スルホンアミド抗生物質が、トリメトプリムとスルファメトキサゾール（ＴＭＰ－ＳＭＸ）を含む、請求項４、６～７、９および１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記スルホンアミド抗生物質が、以下：スルファフラゾール；スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファフラゾール（スルフイソキサゾール）、スルフイソミジン（スルファイソジミジン）、スルファメトキサゾール、スルファモキソール、スルファニトラン、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリダジン、スルファメトキシジアジン、スルファドキシン、スルファメトピラジン、またはテレフチル（Terephtyl）のうちの１つまたは複数を含む、請求項４、６～７、９および１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記抗生物質が、（ｉ）および（ｉｉ）と同時的に、またはその後に、前記バイオフィルムと接触するか、または前記対象に投与される、請求項４、６～７、９および１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌が、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａまたは分類不可能なＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＮＴＨＩ）を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記多微生物性バイオフィルムが、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ細菌、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ、ＥＳＫＡＰＥ病原体（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．から選択される）、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓのうちの少なくとも１つを含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記多微生物性バイオフィルムが、ＮＴＨＩ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記多微生物性バイオフィルムが、再発性、または抗生物質単剤療法に対して抵抗性である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 接触させるステップまたは投与するステップの前に、前記対象または前記多微生物性バイオフィルムの試料中の細菌を特定するステップをさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記多微生物性バイオフィルムが、（ｉ）もしくは（ｉｉ）のうちの１つ、または抗生物質単独の接触または投与と比較して、相乗的な様式で、防止される、阻害される、破壊される、分散される、または処置されるのうちの１つまたは複数である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記バイオフィルムから放出された前記細菌の前記新たに放出された（ＮＲｅｌ）状態が、以下：
    以下の遺伝子：ｄｅａＤ、ａｒｔＭ、ｆｉｓ、ｆｏｌＡ、ｆｏｌＰ、ｅｍｒＡ、ｅｍｒＢ、またはａｃｒＲのうちの１つまたは複数の変更された遺伝子発現；
    以下のタンパク質：ＡｓｎＣ、ＣｙａＡ、ＧｌｐＣ、ＮｒｆＡ、ＴｅｈＢ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ、ＴｒｕＡ、またはＴｒｘＡのうちの１つまたは複数の変更されたレベル；
    以下のタンパク質：ＡｂｇＡ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ、ＡｒｔＰ、ＡｔｐＨ、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＦ、ＣｃｍＡ、ＣｉｔＤ、ＣｉｔＴ、ＣｍＫ、ＣｏａＤ、ＤｃＤ、ＤｊｌＡ、ＤｋｓＡ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、ＤｓｂＥ、ＦａｂＧ、ＦｄｈＸ、ＦｔｎＢ、ＦｔｓＥ、ＦｔｓＩ、ＦｕｍＣ、Ｆｕｒ、ＧｌｐＡ、ＧｌｐＢ、ＧｍＫ、ＧｐｓＡ、ＧｒｅＡ、Ｈｆｑ、ＨｉｓＩ、ＨｕｇＺ、ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ、Ｌｉｃ２Ａ、ＬｉｃＣ、ＬｉｃＤ、ＬｏｌＡ、ＬｐｓＡ、ｍｅｎＣ、ＭｅｎＣ、ＮａｐＡ、ＮｒｆＢ、ＮｒｆＣ、ＮＴＨＩ００５３、ＮＴＨＩ０２４９、ＮＴＨＩ０２９１、ＮＴＨＩ０３１９、ＮＴＨＩ０３４９、ＮＴＨＩ０４３６、ＮＴＨＩ０４８７、ＮＴＨＩ０４９０、ＮＴＨＩ０５５５、ＮＴＨＩ０７３２、ＮＴＨＩ０７７９、ＮＴＨＩ０８２０、ＮＴＨＩ１０２５、ＮＴＨＩ１０８５、ＮＴＨＩ１１９９、ＮＴＨＩ１４３７、ＮＴＨＩ１４３９、ＮＴＨＩ１５０３、ＮＴＨＩ１５９０、ＮＴＨＩ１７４８、ＯｐｐＦ、ＰａｎＦ、ＰｄｘＨ、ＰｅｐＴ、ＰｈｏＢ、ＰｌｓＣ、ＰｏｌＡ、ＰｐＣ、ＰｐｉＢ、ＰｒｆＢ、ＰｕｒＵ、ＲａｄＡ、ＲｅｌＢ、ＲｉｂＡ、ＲｐｌＷ、ＲｐｏＥ、ＲｐｏＺ、ＲｓｅＡ、ＳｅｃＦ、Ｓｘｙ、ＴｅｓＢ、ＴｈｒＢ、ＴｏｌＡ、ＵｎＧ、ＵｒｅＧ、ＵｕａＰ、またはＵｖｒＢのうちの１つまたは複数の低いレベル；
    以下のタンパク質：ＣｌｐＢ、ＣｙｄＤ、ＤｅａＤ、ＤｌＤ、ＤｍｓＢ、ＥｘｂＤ、ＧｒｏＥＳ、ＨｆｅＡ、ＨｆｅＢ、ＨｇｐＢ、ＨｉｓＪ、ＨｉｓＪ、ＨｉｔＡ、ＨｋｔＥ、ＨｘｕＣ、ＬｃｔＰ、ＬｌｄＤ、ＬｐｘＣ、ＭｕｒＢ、ＮｄｈＡ、ＮｉｆＳ２、ＮＴＨＩ００４３、ＮＴＨＩ００５２、ＮＴＨＩ０１７５、ＮＴＨＩ０３６４、ＮＴＨＩ１２０８、ＮＴＨＩ１２１４、ＮＴＨＩ１３６９、ＮＴＨＩ１７０３、ＯｍｐＰ２、ＯｒｆＧ、Ｐａｌ、ＰｄｇＸ、ＲｂｆＡ、ＲｅｃＮ、ＲｐｌＯ、ＲｐｌＵ、ＲｐｍＥ、ＲｐｓＥ、ＲｐｓＪ、ＲｐｓＬ、ＲｐｓＱ、ＲｐｓＴ、ＳｏｄＡ、Ｔｂｐ１、ＴｏｌＢ、ＴｏｎＢ、ＴｒｐＡ、ＴｒｘＡ、またはＺｎｕＡのうちの１つまたは複数の高いレベル
    のうちの１つまたは複数を含む、請求項８～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記高い、低い、変更された発現またはレベルが、同じであるがプランクトン様に成長した細菌と比較される、請求項２６に記載の方法。
  28. （ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、
    （ｉｉ）抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、またはＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片のうちの一方または両方、あるいは
    （ｉｉｉ）必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む抗生物質
    のうちの少なくとも２つ、
    および必要に応じて、使用説明書
    を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキット。
  29. 以下：
    （ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、
    （ｉｉ）抗ＰｉｌＡ抗体もしくはその生物学的に活性な断片、またはＰｉｌＡポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片のうちの一方または両方、あるいは
    （ｉｉｉ）β－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を必要に応じて含む抗生物質
    のうちの少なくとも２つ、
    および担体、必要に応じて、薬学的に許容される担体
    を含む、組成物。
  30. 前記ＤＮＡＢＩＩが、組込み宿主因子（ＩＨＦ）またはヒストン様タンパク質（ＨＵ）タンパク質から選択される、請求２９に記載の組成物。
  31. 前記抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片が、ＤＮＡＢＩＩ Ａ５ペプチド、ＤＮＡＢＩＩ ｍＢ４ペプチド、またはＡ５ペプチドおよびｍＢ４ペプチドを含む組換えポリペプチドのうちの１つまたは複数を認識し、それに結合する、請求項２９または３０に記載の組成物。
  32. 前記ＰｉｌＡが、組換えの可溶性ＰｉｌＡ（ｒｓＰｉｌＡ）である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記β－ラクタム抗生物質が、アモキシシリンとクラブラン酸（ＡＭＣ）を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記β－ラクタム抗生物質が、ベンザチン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、ベンザチンペニシリンＧ、ベンザチンペニシリンＶ、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリン、フェネチシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシシリン、アンピシリン、メシリナム、ピペラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、カルボキシペニシリン、ウレイドペニシリン、アズロシリン、メズロシリン；セファゾリン、セファレキシン、セファロスポリンＣ、セファロチン、セファピリン、セファクロル、セファマンドール、セフロキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフィキシム、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフトリアキソン、セフジニル、セフェピム、セフピロム、セフタロリン；ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、チエナマイシン；アズトレオナム、チゲモナム、ノカルディシンＡ、またはタブトキシニンβ－ラクタムのうちの１つまたは複数を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記スルホンアミド抗生物質が、トリメトプリムとスルファメトキサゾール（ＴＭＰ－ＳＭＸ）を含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記スルホンアミド抗生物質が、以下：スルファフラゾール；スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジミジン、スルファフラゾール（スルフイソキサゾール）、スルフイソミジン（スルファイソジミジン）、スルファメトキサゾール、スルファモキソール、スルファニトラン、スルファジメトキシン、スルファメトキシピリダジン、スルファメトキシジアジン、スルファドキシン、スルファメトピラジン、またはテレフチルのうちの１つまたは複数を含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法による、以下：防止、阻害、破壊、分散、処置または感作のうちの１つまたは複数に好適な多微生物性バイオフィルムを選択するための方法であって、
    （ａ）前記多微生物性バイオフィルム、またはそれらから単離および成長した多微生物性バイオフィルムを、（ｉ）または（ｉｉ）の一方または両方と接触させるステップ、ならびに
    （ｂ）以下の遺伝子：ｄｅａＤ、ａｒｔＭ、ｆｉｓ、ｆｏｌＡ、ｆｏｌＰ、ｅｍｒＡ、ｅｍｒＢ、またはａｃｒＲのうちの１つまたは複数の発現、およびタンパク質：ＡｓｎＣ、ＣｙａＡ、ＧｌｐＣ、ＮｒｆＡ、ＴｅｈＢ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ、ＴｒｕＡ、ＴｒｘＡ；ＡｂｇＡ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ、ＡｒｔＰ、ＡｔｐＨ、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＦ、ＣｃｍＡ、ＣｉｔＤ、ＣｉｔＴ、ＣｍＫ、ＣｏａＤ、ＤｃＤ、ＤｊｌＡ、ＤｋｓＡ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、ＤｓｂＥ、ＦａｂＧ、ＦｄｈＸ、ＦｔｎＢ、ＦｔｓＥ、ＦｔｓＩ、ＦｕｍＣ、Ｆｕｒ、ＧｌｐＡ、ＧｌｐＢ、ＧｍＫ、ＧｐｓＡ、ＧｒｅＡ、Ｈｆｑ、ＨｉｓＩ、ＨｕｇＺ、ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ、Ｌｉｃ２Ａ、ＬｉｃＣ、ＬｉｃＤ、ＬｏｌＡ、ＬｐｓＡ、ｍｅｎＣ、ＭｅｎＣ、ＮａｐＡ、ＮｒｆＢ、ＮｒｆＣ、ＮＴＨＩ００５３、ＮＴＨＩ０２４９、ＮＴＨＩ０２９１、ＮＴＨＩ０３１９、ＮＴＨＩ０３４９、ＮＴＨＩ０４３６、ＮＴＨＩ０４８７、ＮＴＨＩ０４９０、ＮＴＨＩ０５５５、ＮＴＨＩ０７３２、ＮＴＨＩ０７７９、ＮＴＨＩ０８２０、ＮＴＨＩ１０２５、ＮＴＨＩ１０８５、ＮＴＨＩ１１９９、ＮＴＨＩ１４３７、ＮＴＨＩ１４３９、ＮＴＨＩ１５０３、ＮＴＨＩ１５９０、ＮＴＨＩ１７４８、ＯｐｐＦ、ＰａｎＦ、ＰｄｘＨ、ＰｅｐＴ、ＰｈｏＢ、ＰｌｓＣ、ＰｏｌＡ、ＰｐＣ、ＰｐｉＢ、ＰｒｆＢ、ＰｕｒＵ、ＲａｄＡ、ＲｅｌＢ、ＲｉｂＡ、ＲｐｌＷ、ＲｐｏＥ、ＲｐｏＺ、ＲｓｅＡ、ＳｅｃＦ、Ｓｘｙ、ＴｅｓＢ、ＴｈｒＢ、ＴｏｌＡ、ＵｎＧ、ＵｒｅＧ、ＵｕａＰ、ＵｖｒＢ；ＣｌｐＢ、ＣｙｄＤ、ＤｅａＤ、ＤｌＤ、ＤｍｓＢ、ＥｘｂＤ、ＧｒｏＥＳ、ＨｆｅＡ、ＨｆｅＢ、ＨｇｐＢ、ＨｉｓＪ、ＨｉｓＪ、ＨｉｔＡ、ＨｋｔＥ、ＨｘｕＣ、ＬｃｔＰ、ＬｌｄＤ、ＬｐｘＣ、ＭｕｒＢ、ＮｄｈＡ、ＮｉｆＳ２、ＮＴＨＩ００４３、ＮＴＨＩ００５２、ＮＴＨＩ０１７５、ＮＴＨＩ０３６４、ＮＴＨＩ１２０８、ＮＴＨＩ１２１４、ＮＴＨＩ１３６９、ＮＴＨＩ１７０３、ＯｍｐＰ２、ＯｒｆＧ、Ｐａｌ、ＰｄｇＸ、ＲｂｆＡ、ＲｅｃＮ、ＲｐｌＯ、ＲｐｌＵ、ＲｐｍＥ、ＲｐｓＥ、ＲｐｓＪ、ＲｐｓＬ、ＲｐｓＱ、ＲｐｓＴ、ＳｏｄＡ、Ｔｂｐ１、ＴｏｌＢ、ＴｏｎＢ、ＴｒｐＡ、ＴｒｘＡ、またはＺｎｕＡのうちの１つまたは複数のレベルについて、（ａ）の前記バイオフィルムから放出された細菌をアッセイするステップ
    を含み、
    以下：
    以下の遺伝子：ｄｅａＤ、ａｒｔＭ、ｆｉｓ、ｆｏｌＡ、ｆｏｌＰ、ｅｍｒＡ、ｅｍｒＢ、またはａｃｒＲのうちの１つまたは複数の変更された遺伝子発現；
    以下のタンパク質：ＡｓｎＣ、ＣｙａＡ、ＧｌｐＣ、ＮｒｆＡ、ＴｅｈＢ、ＴｒｐＢ、ＴｒｐＣ、ＴｒｐＤ、ＴｒｕＡ、またはＴｒｘＡのうちの１つまたは複数の変更されたレベル；
    以下のタンパク質：ＡｂｇＡ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ、ＡｒｔＰ、ＡｔｐＨ、ＢｉｏＢ、ＢｉｏＦ、ＣｃｍＡ、ＣｉｔＤ、ＣｉｔＴ、ＣｍＫ、ＣｏａＤ、ＤｃＤ、ＤｊｌＡ、ＤｋｓＡ、ＤｎａＥ、ＤｎａＱ、ＤｓｂＥ、ＦａｂＧ、ＦｄｈＸ、ＦｔｎＢ、ＦｔｓＥ、ＦｔｓＩ、ＦｕｍＣ、Ｆｕｒ、ＧｌｐＡ、ＧｌｐＢ、ＧｍＫ、ＧｐｓＡ、ＧｒｅＡ、Ｈｆｑ、ＨｉｓＩ、ＨｕｇＺ、ＩｎｆＡ、ＩｎｆＢ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＦ、Ｌｉｃ２Ａ、ＬｉｃＣ、ＬｉｃＤ、ＬｏｌＡ、ＬｐｓＡ、ｍｅｎＣ、ＭｅｎＣ、ＮａｐＡ、ＮｒｆＢ、ＮｒｆＣ、ＮＴＨＩ００５３、ＮＴＨＩ０２４９、ＮＴＨＩ０２９１、ＮＴＨＩ０３１９、ＮＴＨＩ０３４９、ＮＴＨＩ０４３６、ＮＴＨＩ０４８７、ＮＴＨＩ０４９０、ＮＴＨＩ０５５５、ＮＴＨＩ０７３２、ＮＴＨＩ０７７９、ＮＴＨＩ０８２０、ＮＴＨＩ１０２５、ＮＴＨＩ１０８５、ＮＴＨＩ１１９９、ＮＴＨＩ１４３７、ＮＴＨＩ１４３９、ＮＴＨＩ１５０３、ＮＴＨＩ１５９０、ＮＴＨＩ１７４８、ＯｐｐＦ、ＰａｎＦ、ＰｄｘＨ、ＰｅｐＴ、ＰｈｏＢ、ＰｌｓＣ、ＰｏｌＡ、ＰｐＣ、ＰｐｉＢ、ＰｒｆＢ、ＰｕｒＵ、ＲａｄＡ、ＲｅｌＢ、ＲｉｂＡ、ＲｐｌＷ、ＲｐｏＥ、ＲｐｏＺ、ＲｓｅＡ、ＳｅｃＦ、Ｓｘｙ、ＴｅｓＢ、ＴｈｒＢ、ＴｏｌＡ、ＵｎＧ、ＵｒｅＧ、ＵｕａＰ、またはＵｖｒＢのうちの１つまたは複数の低いレベル；
    以下のタンパク質：ＣｌｐＢ、ＣｙｄＤ、ＤｅａＤ、ＤｌＤ、ＤｍｓＢ、ＥｘｂＤ、ＧｒｏＥＳ、ＨｆｅＡ、ＨｆｅＢ、ＨｇｐＢ、ＨｉｓＪ、ＨｉｓＪ、ＨｉｔＡ、ＨｋｔＥ、ＨｘｕＣ、ＬｃｔＰ、ＬｌｄＤ、ＬｐｘＣ、ＭｕｒＢ、ＮｄｈＡ、ＮｉｆＳ２、ＮＴＨＩ００４３、ＮＴＨＩ００５２、ＮＴＨＩ０１７５、ＮＴＨＩ０３６４、ＮＴＨＩ１２０８、ＮＴＨＩ１２１４、ＮＴＨＩ１３６９、ＮＴＨＩ１７０３、ＯｍｐＰ２、ＯｒｆＧ、Ｐａｌ、ＰｄｇＸ、ＲｂｆＡ、ＲｅｃＮ、ＲｐｌＯ、ＲｐｌＵ、ＲｐｍＥ、ＲｐｓＥ、ＲｐｓＪ、ＲｐｓＬ、ＲｐｓＱ、ＲｐｓＴ、ＳｏｄＡ、Ｔｂｐ１、ＴｏｌＢ、ＴｏｎＢ、ＴｒｐＡ、ＴｒｘＡ、またはＺｎｕＡのうちの１つまたは複数の高いレベル
    のうちの１つまたは複数が、前記バイオフィルムが請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法に好適であることを示す、方法。
  38. 前記高い、低い、変更された発現またはレベルが、同じであるがプランクトン様に成長した細菌と比較される、請求項３７に記載の方法。
  39. 選択されたバイオフィルムを、
    （ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片、
    （ｉｉ）抗ＰｉｌＡ抗体または生物学的に活性な断片、および
    （ｉｉｉ）必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む必要に応じた抗生物質
    と接触させるステップをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 選択された多微生物性バイオフィルムが、対象中にあり、前記方法が、
    （ｉ）抗ＤＮＡＢＩＩ抗体またはその生物学的に活性な断片、
    （ｉｉ）ＰｉｌＡポリペプチドまたは生物学的に活性な断片、および
    （ｉｉｉ）必要に応じてβ－ラクタム抗生物質またはスルホンアミド抗生物質を含む必要に応じた抗生物質
    を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
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