JP2023544225A - 癌のためのフィブロネクチンエクストラドメインｂ（ｅｄｂ）特異性ｃ－ｔ - Google Patents

癌のためのフィブロネクチンエクストラドメインｂ（ｅｄｂ）特異性ｃ－ｔ Download PDF

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Abstract

本発明は、フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異性があるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、癌や炎症性疾患の治療のための免疫細胞（たとえば、Ｔ細胞やＮＫ細胞）の改変に有用である。

Description

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合および免疫細胞（たとえば、Ｔ細胞）活性化機能を単一の受容体に融合させた工学的受容体で、そしてこのような工学的受容体を有する免疫細胞に特定のタンパク質を標的とする新たな能力を付与する。
ＣＡＲは、近年、既に癌治療の療法に使用され、修飾されたＴ細胞が新たに獲得した癌細胞における癌抗原を認識する能力により、より有効的にそれらをターゲッティングして破壊する。通常、ＣＡＲ－Ｔ療法が必要な患者から自己Ｔ細胞を採取した後、体外でＣＡＲをＴ細胞に導入し、さらに得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を患者の体内に再注入することで、ＣＡＲが認識する抗原を持つ腫瘍を攻撃する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者自身の血液におけるＴ細胞由来（自家）のものでも、別の健常者のドナーのＴ細胞由来（他家）のものでもよい。安全性を考慮すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞を腫瘍で発現されるが、健康の細胞で発現されない抗原に対して特異性を有するように改変することが好ましい。一旦、ＣＡＲ－Ｔ細胞を患者の体内に導入すると、癌細胞に対抗する「生きる薬」になり、癌抗原と結合して活性化され、増殖して癌細胞に対抗する細胞毒性を発揮する。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の改変は、Ｔ細胞が刺激された後の増殖能力の強化、ほかの生細胞に対する細胞毒性作用の強化、サイトカイン、インターロイキン、成長因子のような多くの活性因子の分泌の増加を含む多くの形でＴ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷作用を増強させることができる。
近年、ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法は、悪性血液腫瘍の治療において非常に有効な結果が得られた。ＣＡＲ－Ｔ療法は、血液腫瘍の治療において多く進展したが、固形腫瘍への使用において固形腫瘍の治療で遭遇した特異性、持久性、安全性および免疫抑制性微環境などの問題を含む、多くのチャレンジに直面しており、より幅広い臨床応用が制限されている。そのため、現在のＣＡＲ－Ｔ細胞の固形腫瘍における制限を克服するには、より信頼性が高く、安全で、有効なＣＡＲ－Ｔ療法が必要で、それで固形腫瘍を含むより幅広い腫瘍の治療まで広がる。
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（１）フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異性がある抗原結合ドメインと、（２）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７膜タンパク質から選ばれる膜貫通（ＴＭ）ドメインと、（３）共刺激ドメインを有するか、有さないＣＤ３ζ細胞内ＩＴＡＭ（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）ドメインとを含み、Ｔ細胞の表面に発現された場合、ＣＡＲが（ａ）可溶性ＥＤＢ、（ｂ）膜結合ＥＤＢおよび／または（ｃ）細胞外基質におけるＥＤＢと結合すると（たとえば、フィブロネクチンの網状構造の構成成分であって、細胞付着支持体の作用を果たすもの）、Ｔ細胞を活性化させることができるものを提供する。
ある実施形態において、抗原結合ドメインは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ナノボディ抗体（たとえば、ＶＨＨ（ラクダ科動物Ｉｇ）の誘導体）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ、ＶＨまたはＶＬドメインの誘導体）、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ、二重特異性抗体）および二重親和性再標的化（Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ、ＤＡＲＴ、二重特異性抗体）；アンチカリン（リポタンパク質の誘導体）；アドネクチン（１０番目のＦＮ３（フィブロネクチン））；設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；あるいはアビマー（ａｖｉｍｅｒ）である。
ある実施形態において、抗原結合ドメインはヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。
ある実施形態において、ＣＡＲは、さらに、抗原結合ドメインとＴＭドメインの間にあるヒンジ／スペーサードメインを含む。
ある実施形態において、ヒンジ／スペーサードメインおよびＴＭドメインは同様のタンパク質由来のものである。
ある実施形態において、同様のタンパク質はＣＤ８αで、そしてヒンジ／スペーサードメインはＣＤ８αの細胞外ドメインである。
ある実施形態において、（３）は共刺激ドメインを含む。
ある実施形態において、共刺激ドメインはＣＤ２８由来のものである。
ある実施形態において、（３）は２つの共刺激ドメインを含む。
ある実施形態において、２つの共刺激ドメインはＣＤ２８由来の共刺激ドメイン、ならびに／あるいはＣＤ２７、４－１ＢＢまたはＯＸ－４０由来の共刺激ドメインである。
ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１の残基２１－２３６のｓｃＦｖ、ＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは、さらに、Ｎ末端シグナルペプチド配列（たとえば、ｈＩＬ－２シグナルペプチド配列、または配列番号１の残基１－２０）を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１のポリペプチドを含む。
本発明のもう一つの側面では、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。たとえば、ポリヌクレオチドは配列番号２でもよい。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドはヒト細胞において発現されるようにコドンが最適化されている。
本発明のもう一つの側面では、本発明のヌクレオチドを含むベクターを提供する。
ある実施形態において、ベクターはＴ細胞、マクロファージおよび／またはＮＫ細胞、たとえば、初代ヒトＴ細胞、マクロファージまたはＮＫ細胞において前記ＣＡＲを感染および／または発現させることができるウイルスベクターである。
ある実施形態において、ベクターは末梢単核球、単核球由来の樹状細胞、造血幹細胞および／または誘導されるＰＳＣ（多能性幹細胞）において前記ＣＡＲを感染および／または発現させることができるウイルスベクターである。
ある実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクターである。
ある実施形態において、レンチウイルスベクターは自己不活性型レンチウイルスベクターである。
本発明のもう一つの側面では、本発明のＣＡＲを発現し、本発明のヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む細胞を提供する。
ある実施形態において、細胞は免疫細胞である。
ある実施形態において、細胞はＴ細胞である。
ある実施形態において、細胞はＮＫ細胞である。
ある実施形態において、細胞は単核球またはマクロファージである。
ある実施形態において、細胞は患者から分離された初代細胞である。
ある実施形態において、細胞は確立された細胞系由来のものであり、たとえば、細胞を施用する患者に対して同種異体の細胞系由来のものである。
ある実施形態において、細胞はサイトカインを発現する。
ある実施形態において、サイトカインはＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１を含む。
ある実施形態において、サイトカインの発現は免疫細胞の活性化で活性化するプロモーターによって制御される。
ある実施形態において、細胞は、さらに、免疫細胞の活性を下方調節するための安全スイッチを含む。
ある実施形態において、安全スイッチはｉＣａｓｐａｓｅ９（誘導型ｃａｓｐａｓｅ－９）単量体のコード配列を含み、たとえば、ＦＫＢＰ二量体で活性化されることで、免疫細胞のアポトーシスが触発される。
本発明のもう一つの側面では、血管新生抑制作用で治療できる疾患または病態を罹患した被験者において血管新生を抑制する方法であって、前記被験者に治療有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を施用することを含み、当該キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（１）フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異性がある抗原結合ドメインと、（２）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７膜タンパク質から選ばれる膜貫通（ＴＭ）ドメインと、（３）共刺激ドメインを有するか、有さないＣＤ３ζ細胞内ＩＴＡＭ（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）ドメインとを含む方法を提供する。
ある実施形態において、ＣＡＲは本明細書に記載のＣＡＲのうちのいずれかである。
ある実施形態において、疾患または病態は固形腫瘍または慢性炎症性病態である。
ある実施形態において、固形腫瘍由来の癌細胞は細胞表面にＥＤＢを発現しない。
ある実施形態において、疾患または病態は固形腫瘍で、そして当該方法は、さらに、免疫チェックポイント阻害剤、たとえば、ＰＤ－１阻害剤（たとえば、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）やセミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ））、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（たとえば、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）やデュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ））、ＣＴＬＡ－４標的薬（たとえば、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ））または免疫調節剤（たとえば、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）やレナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ））を施用することを含む。
ある実施形態において、慢性炎症性病態は、乾癬、関節リウマチ、関節リウマチ、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、骨関節炎、喘息、肺線維化、ＩＢＤ）、炎症によって誘導されるリンパ管新生、肥満症、糖尿病、網膜血管新生（ＲＮＶ）、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、メタボリックシンドローム関連疾患、長期間腹膜透析、若年性関節炎またはアテローム性動脈硬化である。
ある実施形態において、当該方法は、さらに、有効に血管新生を抑制する第二の治療剤を施用することを含む。
ある実施形態において、第二の治療剤は、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、レナリドミド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｅｄ）、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、ラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、サリドマイド（ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、バンデタニブ（ｖａｎｄｅｔａｎｉｂ）および／またはジブ－アフリベルセプト（ｚｉｖ－ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）を含む。
ある実施形態において、体外で本発明のベクターを被験者から分離された初代免疫細胞に導入し、そして任意に体外でベクターを導入された初代免疫細胞を培養および／または増幅することで、免疫細胞を生成させる。
ある実施形態において、当該方法は、さらに、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を抑制する試薬、たとえば、抗ＩＬ－６モノクローナル抗体（たとえば、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ））を施用すること、および／またはグロブリン治療を行うことを含む。
もちろん、本発明のいずれの実施形態も、例示または請求の範囲にしか記載されていない任意の実施形態を含め、明確に排除された（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｄ）か、ほかに不適切な箇所があるものでない限り、本発明の任意の一つまたは複数の別の実施形態と合わせることができる。
図１は、フローサイトメトリー分析においてＥＤＢ－ＣＡＲのレンチウイルスを形質導入されたヒトＴ細胞における発現を示す。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図２Ａは、組み換えＥＤＢタンパク質の存在において、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞がＩＦＮ－γを生成したことを示す。 図２Ｂは、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率が５：１の場合、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞と２－２４時間共培養した後のＵ８７－ＭＧ細胞の分解を示す。ＬＤＨ法によって細胞の分解を測定した。Ｎ＝３、各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図３Ａ－３Ｂは、ウエスタンブロッティングによってタンパク質レベルにおいて（図３Ａ）およびｑＰＣＲによってｍＲＮＡレベルにおいて（図３Ｂ）検出された複数の細胞系におけるＥＤＢの発現レベルを示す。 図３Ａ－３Ｂは、ウエスタンブロッティングによってタンパク質レベルにおいて（図３Ａ）およびｑＰＣＲによってｍＲＮＡレベルにおいて（図３Ｂ）検出された複数の細胞系におけるＥＤＢの発現レベルを示す。 図４Ａ－４Ｂは、各Ｅ：Ｔ比で２４時間共培養した後のＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞のヒトまたはマウス癌細胞およびＨＵＶＥＣ細胞に対する細胞毒性を示す。ＬＤＨ測定法によって標的細胞の分解を測定した。（Ｎ ＝ ３；両側スチューデントｔ検定。） 図４Ａ－４Ｂは、各Ｅ：Ｔ比で２４時間共培養した後のＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞のヒトまたはマウス癌細胞およびＨＵＶＥＣ細胞に対する細胞毒性を示す。ＬＤＨ測定法によって標的細胞の分解を測定した。（Ｎ ＝ ３；両側スチューデントｔ検定。） 図５は、腫瘍細胞が存在する場合、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞が体外でＩＦＮ－γを生成したことを示す。ＥＤＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞を癌細胞と異なるＥ：Ｔ比で２４時間共培養し、上清を収集してＩＦＮ－ γを検出した。Ｎ ＝ ３；両側スチューデントｔ検定。 図６は、腫瘍細胞が存在する場合、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞がＴＮＦ－αを生成したことを示す。ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞を癌細胞と異なるＥ：Ｔ比で２４時間共培養し、上清を収集してＴＮＦ－αを検出した。（Ｎ ＝ ３；両側スチューデントｔ検定。） 図７は、フローサイトメトリーによって分析された形質導入後のＥＤＢ－ＣＡＲのＮＫ－９２における発現を示す。 図８Ａは、ＥＤＢ－ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞の細胞毒性を示し、図８Ｂは、各Ｅ：Ｔ比でＵ８７－ＭＧ細胞と２４時間共培養した後、ＥＤＢ－ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞がＩＦＮ－γを上清液に放出したことを示す。（Ｎ ＝ ３；両側スチューデントｔ検定。） 図９は、ヘマトキシリン・エオジン染色によるマウス器官組織に対する組織病理学的分析の結果を示し、非常に高い投与量のＥＤＢ特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射された正常のマウスに病理学的変化／毒性が生じなかったことがわかる。Ｌｅｉｃａ Ａｐｅｒｉｏ ＶＥＲＳＡ ８切片スキャナーによって２０倍の拡大倍率で画像を撮影した。各目盛りは１００ μｍを示す。 図１０Ａ－１０Ｂは、ＣＤ１４＋単核球の純度およびＥＤＢ－ＣＡＲの発現を示す。具体的に、図１０Ａは、ＣＤ１４マイクロビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）でＰＢＭＣから分離されたＣＤ１４＋単核球／マクロファージ）の純度（フローサイトメトリーによって証明された）を示す。図１０Ｂは、フローサイトメトリーによって分析されたＥＤＢ－ＣＡＲのレンチウイルスを形質導入されたヒト単核球における発現を示す。Ｍ１は模擬形質導入陰性対照を表す。また、形質導入効率を示す。 図１１Ａ－１１Ｊは、ＥＤＢを標的とするＣＡＲ単核球の特徴づけを示す。具体的に、ＥＤＢ－ＣＡＲ－単核球／マクロファージをＥＤＢを発現する各細胞系と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率（図１１Ａ－１１Ｆ）または５μｇ／ ｍＬのＥＤＢタンパク質（図１１Ｇ－１１Ｊ）で２４時間インキュベートした。培養上清液を収集してＴＮＦ－α（図１１Ｃ、１１Ｆおよび１１Ｊ）、ＩＬ－１２（図１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｈ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ａ、１１Ｄ、１１Ｇ）の発現を測定した。データは３回の独立した実験を表す。各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図１１Ａ－１１Ｊは、ＥＤＢを標的とするＣＡＲ単核球の特徴づけを示す。具体的に、ＥＤＢ－ＣＡＲ－単核球／マクロファージをＥＤＢを発現する各細胞系と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率（図１１Ａ－１１Ｆ）または５μｇ／ ｍＬのＥＤＢタンパク質（図１１Ｇ－１１Ｊ）で２４時間インキュベートした。培養上清液を収集してＴＮＦ－α（図１１Ｃ、１１Ｆおよび１１Ｊ）、ＩＬ－１２（図１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｈ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ａ、１１Ｄ、１１Ｇ）の発現を測定した。データは３回の独立した実験を表す。各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図１１Ａ－１１Ｊは、ＥＤＢを標的とするＣＡＲ単核球の特徴づけを示す。具体的に、ＥＤＢ－ＣＡＲ－単核球／マクロファージをＥＤＢを発現する各細胞系と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率（図１１Ａ－１１Ｆ）または５μｇ／ ｍＬのＥＤＢタンパク質（図１１Ｇ－１１Ｊ）で２４時間インキュベートした。培養上清液を収集してＴＮＦ－α（図１１Ｃ、１１Ｆおよび１１Ｊ）、ＩＬ－１２（図１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｈ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ａ、１１Ｄ、１１Ｇ）の発現を測定した。データは３回の独立した実験を表す。各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図１１Ａ－１１Ｊは、ＥＤＢを標的とするＣＡＲ単核球の特徴づけを示す。具体的に、ＥＤＢ－ＣＡＲ－単核球／マクロファージをＥＤＢを発現する各細胞系と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率（図１１Ａ－１１Ｆ）または５μｇ／ ｍＬのＥＤＢタンパク質（図１１Ｇ－１１Ｊ）で２４時間インキュベートした。培養上清液を収集してＴＮＦ－α（図１１Ｃ、１１Ｆおよび１１Ｊ）、ＩＬ－１２（図１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｈ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ａ、１１Ｄ、１１Ｇ）の発現を測定した。データは３回の独立した実験を表す。各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図１１Ａ－１１Ｊは、ＥＤＢを標的とするＣＡＲ単核球の特徴づけを示す。具体的に、ＥＤＢ－ＣＡＲ－単核球／マクロファージをＥＤＢを発現する各細胞系と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率（図１１Ａ－１１Ｆ）または５μｇ／ ｍＬのＥＤＢタンパク質（図１１Ｇ－１１Ｊ）で２４時間インキュベートした。培養上清液を収集してＴＮＦ－α（図１１Ｃ、１１Ｆおよび１１Ｊ）、ＩＬ－１２（図１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｈ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ａ、１１Ｄ、１１Ｇ）の発現を測定した。データは３回の独立した実験を表す。各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図１１Ａ－１１Ｊは、ＥＤＢを標的とするＣＡＲ単核球の特徴づけを示す。具体的に、ＥＤＢ－ＣＡＲ－単核球／マクロファージをＥＤＢを発現する各細胞系と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率（図１１Ａ－１１Ｆ）または５μｇ／ ｍＬのＥＤＢタンパク質（図１１Ｇ－１１Ｊ）で２４時間インキュベートした。培養上清液を収集してＴＮＦ－α（図１１Ｃ、１１Ｆおよび１１Ｊ）、ＩＬ－１２（図１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｈ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ａ、１１Ｄ、１１Ｇ）の発現を測定した。データは３回の独立した実験を表す。各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図１１Ａ－１１Ｊは、ＥＤＢを標的とするＣＡＲ単核球の特徴づけを示す。具体的に、ＥＤＢ－ＣＡＲ－単核球／マクロファージをＥＤＢを発現する各細胞系と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率（図１１Ａ－１１Ｆ）または５μｇ／ ｍＬのＥＤＢタンパク質（図１１Ｇ－１１Ｊ）で２４時間インキュベートした。培養上清液を収集してＴＮＦ－α（図１１Ｃ、１１Ｆおよび１１Ｊ）、ＩＬ－１２（図１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｈ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ａ、１１Ｄ、１１Ｇ）の発現を測定した。データは３回の独立した実験を表す。各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図１１Ａ－１１Ｊは、ＥＤＢを標的とするＣＡＲ単核球の特徴づけを示す。具体的に、ＥＤＢ－ＣＡＲ－単核球／マクロファージをＥＤＢを発現する各細胞系と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率（図１１Ａ－１１Ｆ）または５μｇ／ ｍＬのＥＤＢタンパク質（図１１Ｇ－１１Ｊ）で２４時間インキュベートした。培養上清液を収集してＴＮＦ－α（図１１Ｃ、１１Ｆおよび１１Ｊ）、ＩＬ－１２（図１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｈ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ａ、１１Ｄ、１１Ｇ）の発現を測定した。データは３回の独立した実験を表す。各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図１１Ａ－１１Ｊは、ＥＤＢを標的とするＣＡＲ単核球の特徴づけを示す。具体的に、ＥＤＢ－ＣＡＲ－単核球／マクロファージをＥＤＢを発現する各細胞系と異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比率（図１１Ａ－１１Ｆ）または５μｇ／ ｍＬのＥＤＢタンパク質（図１１Ｇ－１１Ｊ）で２４時間インキュベートした。培養上清液を収集してＴＮＦ－α（図１１Ｃ、１１Ｆおよび１１Ｊ）、ＩＬ－１２（図１１Ｂ、１１Ｅおよび１１Ｈ）およびＩＦＮ－γ（図１１Ａ、１１Ｄ、１１Ｇ）の発現を測定した。データは３回の独立した実験を表す。各データポイントが３回の平均ＳＥＭを反映する。（＊， Ｐ ＜ ０．０５； ＊＊， Ｐ ＜ ０．０１； ＊＊＊， Ｐ ＜ ０．００１； 両側スチューデントｔ検定。） 図１２は、フローサイトメトリー分析においてＥＤＢ－ＣＡＲ（配列番号１－１７）の初代ヒトＴ細胞における発現を示す。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図１３は、ＥＤＢ－ＣＡＲ（配列番号１、３－７）を形質導入された初代ヒトＴ細胞を繰り返して刺激すると、形質導入細胞の増殖を活性化させることができることを示す。細胞計数によって増殖を確認した。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図１４は、ＥＤＢ－ＣＡＲ（配列番号１、３－７）を形質導入された初代ヒトＴ細胞がＵ８７ＭＧ癌細胞に細胞毒性があることを示す。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図１５は、ＥＤＢ－ＣＡＲ（配列番号１、３、１８）を形質導入された初代ヒトＴ細胞を繰り返して刺激すると、形質導入細胞の増殖を活性化させることができることを示す。なお、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ染料でＴ細胞を標識した後、フローサイトメトリー分析によって増殖を確認した。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図１６は、ＥＤＢ－ＣＡＲを形質導入された初代ヒトＴ細胞がＵ８７ＭＧ癌細胞に細胞毒性があることを示す。ＥＤＢ ＢＢ： 配列番号１； ＥＤＢ１３７ｐｒｏ：配列番号１０； ＥＤＢ－αＣＤ３：配列番号１８； ＥＤＢ－αＣＤ３／ＥＤＢ ＢＢ： 配列番号１８および配列番号１で共形質導入した； ＥＤＢ－αＣＤ３／１３７ｐｒｏ：配列番号１８および配列番号１０で共形質導入した。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図１７は、ＥＤＢ－ＣＡＲを形質導入された初代ヒトＴ細胞を繰り返して刺激すると、形質導入細胞の増殖を活性化させることができることを示す。ＥＤＢ ＢＢ： 配列番号１； ＥＤＢ２８：配列番号３；ＣＤ３ｚ：配列番号１２； ＣＤ３ｚ／２８ｐｒｏ：配列番号１２および配列番号９で共形質導入した； ＣＤ３ｚ／１３７ｐｒｏ： 配列番号１２および配列番号１０で共形質導入した； ＣＤ３ｚ／ＣＤ４ＣＤ２８：配列番号１２および配列番号８で共形質導入した。なお、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ染料でＴ細胞を標識した後、フローサイトメトリー分析によって増殖を確認した。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図１８は、ＥＤＢ－ＣＡＲを形質導入された初代ヒトＴ細胞がＵ８７ＭＧ癌細胞に細胞毒性があることを示す。ＥＤＢ ＢＢ： 配列番号１； ＥＤＢ２８：配列番号３；ＣＤ３ｚ：配列番号１２； ＣＤ３ｚ／２８ｐｒｏ：配列番号１２および配列番号９で共形質導入した； ＣＤ３ｚ／１３７ｐｒｏ： 配列番号１２および配列番号１０で共形質導入した； ＣＤ３ｚ／ＣＤ４ＣＤ２８：配列番号１２および配列番号８で共形質導入した。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図１９は、ＥＤＢ－ＣＡＲを形質導入された初代ヒトＴ細胞を繰り返して刺激すると、形質導入細胞の増殖を活性化させることができることを示す。ＥＤＢ ＢＢ：配列番号１；ＥＤＢ２８：配列番号３；ＣＤ３ｚＦＬ：配列番号１１；ＣＤ３ｅＦＬ：配列番号１５。なお、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ染料でＴ細胞を標識した後、フローサイトメトリー分析によって増殖を確認した。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図２０は、ＥＤＢ－ＣＡＲを形質導入された初代ヒトＴ細胞がＵ８７ＭＧ癌細胞に細胞毒性があることを示す。ＥＤＢ ＢＢ： 配列番号１； ＥＤＢ２８：配列番号３； ＣＤ３ｚＦＬ：配列番号１１； ＣＤ３ｚＦＬ／２８ｐｒｏ： 配列番号１１および配列番号９で共形質導入した； ＣＤ３ｚＦＬ／１３７ｐｒｏ：配列番号１１および配列番号１０で共形質導入した； ＣＤ３ｚＦＬ／ＣＤ４ＣＤ２８：配列番号１１および配列番号８で共形質導入した； ＣＤ３ｅＦＬ：配列番号１５； ＣＤ３ｅＦＬ／２８ｐｒｏ：配列番号１５および配列番号９で共形質導入した； ＣＤ３ｅＦＬ／１３７ｐｒｏ：配列番号１５および配列番号１０で共形質導入した； ＣＤ３ｅＦＬ／ＣＤ４ＣＤ２８：配列番号１５および配列番号８で共形質導入した。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図２１は、ＥＤＢ－ＣＡＲを形質導入された初代ヒトＴ細胞を繰り返して刺激すると、形質導入細胞の増殖を活性化させることができることを示す。ＥＤＢ ＢＢ：配列番号１；ＥＤＢ２８：配列番号３；ＣＤ３ｅＦＬＣＤ２８：配列番号１６；ＣＤ３ｅＦＬＣＤ１３７：配列番号１７。なお、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ染料でＴ細胞を標識した後、フローサイトメトリー分析および増殖性Ｔ細胞集合状態を示すイメージングによって確認した。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図２２は、ＥＤＢ－ＣＡＲを形質導入された初代ヒトＴ細胞がＵ８７ＭＧ癌細胞に細胞毒性があることを示す。ＥＤＢ ＢＢ： 配列番号１；ＥＤＢ２８：配列番号３； ＣＤ３ｅＦＬ／２８ｐｒｏ：配列番号１５および配列番号９で共形質導入した； ＣＤ３ｅＦＬ／１３７ｐｒｏ： 配列番号１５および配列番号１０で共形質導入した； ＣＤ３ｅＦＬＣＤ２８：配列番号１６；ＣＤ３ｅＦＬＣＤ１３７：配列番号１７。Ｍ１：模擬形質導入Ｔ細胞。Ｔ：未形質導入のＴ細胞。 図２３は、配列番号１６および１７に基づいた「Ｈｉｊａｃｋ Ｐｌｕｓ」ＥＤＢ－ＣＡＲがＴＣＲ複合体に取り込まれたことを示す。「Ｈｉｊａｃｋ Ｐｌｕｓ」ＥＤＢ－ＣＡＲでヒト初代Ｔ細胞を形質導入し、そしてビオチンで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片ポリクローナル抗体で免疫沈降させた。抗ＣＤ３ζ抗体でＴＣＲ複合体のＣＤ３ζサブユニットを検出した（図２３Ａ）。「Ｈｉｊａｃｋ Ｐｌｕｓ」ＥＤＢ－ＣＡＲでＪｕｒｋａｔ細胞を形質導入し、そしてビオチンで標識されたポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片抗体で免疫沈澱させた。抗ＣＤ３ζ抗体でＴＣＲ複合体のＣＤ３ζサブユニットを検出した（図２３Ｂ）。 図２４は、各ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞のＮＣＧマウスを使用したＵ８７ＭＧ細胞によって形成された腫瘍の治療における体内効果を示す。第二世代ＥＤＢ ＣＡＲ（図２４Ａ）、「トランス」ＥＤＢ ＣＡＲ（図２４Ｂ）、二重特異性ＥＤＢ－αＣＤ３（図２４Ｃ）、「Ｈｉｊａｃｋ Ｐｌｕｓ」ＥＤＢ－ＣＡＲ（図２４Ｄ）または「Ｈｉｊａｃｋ Ｐｌｕｓ」ＥＤＢ－ＣＡＲ（図２４Ｅ）は異なるレベルの腫瘍成長の抑制または腫瘍の消退を示した。
具体的な実施形態
１．概要
本明細書に記載の発明の一部は、フィブロネクチンＥＤＢドメインに特異性がある抗体またはその抗原結合断片はＣＡＲ（キメラ抗原受容体）構造の構築に有用で、膜結合ＥＤＢ、または細胞外基質におけるＥＤＢ（腫瘍組織に沈着したもの）のみならず、溶液におけるＥＤＢの可溶様態も認識することができるという知見に基づいている。
本明細書に記載の発明の別の一部は、ある不思議な発見、すなわち、ＥＤＢ特異性ＣＡＲを持つ免疫細胞（たとえば、ＣＡＲ Ｔ細胞）が体外で正常のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に細胞毒性を有するが、非常に大量のこのようなＣＡＲを持つ免疫細胞（たとえば、Ｔ細胞）をマウス体内に注射しても予想される毒性が生じないことに基づいている。本分野で既知のように、毒性はＣＡＲ Ｔ細胞療法の幅広い使用の主な障害で、主にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）および神経毒性である。たとえば、健康な組織を標的とする毒性のため、ＣＡＲでＨｅｒ２または炭酸脱水酵素ＩＸに対抗して固形腫瘍治療を行う早期の試みが成功せず、制御されない炎症につながり、組織損傷ひいては死亡を引き起こした。ＣＲＳの所見は、発熱、低血圧、酸欠、終末臓器機能障害、血球減少、血液凝固障害および血球貪食症候群を含む。神経系毒性は様々で、脳症、認知障害、発語障害、癲癇発作および脳浮腫を含む。しかしながら、本発明のＣＡＲ構造を使用する場合、これらの症状がないようだ。
そのため、本発明のＣＡＲ構造は、ＣＡＲに基づいた免疫療法、たとえば、ＣＡＲ ＴまたはＣＡＲ ＮＫ細胞による血管新生が病理的病態になる疾患の治療に有用である。これらの疾患は、癌および炎症性疾患を含む。
そのため、一つの側面では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、（１）フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異性がある抗原結合ドメインと、（２）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７膜タンパク質から選ばれる膜貫通（ＴＭ）ドメインと、（３）共刺激ドメインを有するか、有さないＣＤ３ζ細胞内ＩＴＡＭ（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）ドメインとを含み、Ｔ細胞の表面に発現された場合、ＣＡＲができるが（ａ）可溶性ＥＤＢ、（ｂ）膜結合ＥＤＢおよび／または（ｃ）細胞外基質におけるＥＤＢと結合すると（たとえば、フィブロネクチンの構成成分であって、細胞付着支持体の作用を果たすもの）、Ｔ細胞を活性化させることができるものを提供する。本発明の代表的なＣＡＲは配列番号１である。
本発明のほかの代表的なＣＡＲは配列番号３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７で示される。
本発明のもう一つの側面では、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、たとえば、配列番号２を提供する。
本発明のもう一つの側面では、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、たとえば、配列番号２を含むレンチウイルスベクターを提供する。
本発明のもう一つの側面では、本発明のＣＡＲ、本発明のポリペプチドおよび／または本発明のベクターを含む細胞、たとえば、免疫細胞を提供する。当該細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞でもよい。
本発明のもう一つの側面では、血管新生抑制作用で治療できる疾患または病態を罹患した被験者において血管新生を抑制する方法であって、前記被験者に治療有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を施用することを含み、当該キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（１）フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異性がある抗原結合ドメインと、（２）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７膜タンパク質から選ばれる膜貫通（ＴＭ）ドメインと、（３）共刺激ドメインを有するか、有さないＣＤ３ζ細胞内ＩＴＡＭ（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）ドメインとを含む方法を提供する。
当該疾患または病態は固形腫瘍または慢性炎症性病態でもよい。
以上は本明細書に記載の本発明の一般的な側面で、次は本発明の異なる側面のさらなる詳細を提供する。
２．フィブロネクチン（ＦＮ）のＥＤＢ
フィブロネクチンは、細胞外基質（ＥＣＭ）における高分子量の糖タンパク質で、膜貫通受容体タンパク質インテグリンおよびＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン、フィブリンやヘパラン硫酸プロテオグリカン）と結合する。フィブロネクチンはタンパク質二量体として存在し、二つのほぼ同様の単量体が一対のジスルフィド結合を介して連結してなる。フィブロネクチンは単一の遺伝子によってコードされるが、その前駆体ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって人類において少なくとも２０種類の異なるアイソフォームができる（ＷｈｉｔｅおよびＭｕｒｏのＦＮ機能に対する一般的な討論，“Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ： ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．” ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ． ６３（７）：５３８－５４６， ２０１１（引用で本明細書に取り入れる）を参照する）。
Ｆｎ単量体は一つのサイズが約２５０ ｋｄａで、Ｃ末端の近くでジスルフィド結合を介して連結している。ＦＮはＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型という３種類の異なるホモロジーの重複単位からなり、それぞれ約４０、６０および９０アミノ酸である。これらの独立してフォールディングするドメインのうちの多くも様々なＥＣＭタンパク質の中に存在する。中では、ＩＩＩ型モジュールはＦＮ分子において最も多く存在するモジュールで、多くの種の様々なタンパク質にも発見され、一方、Ｉ型モジュールは脊柱動物にしか発見されていない。
ヒトにおいて、ＦＮタンパク質の多様性は交互にスプライシングする２つのそれぞれエクストラドメインＡとＢ（Ｅｘｔｒａ Ｄｏｍａｉｎｓ ＡとＢ、ＥＩＩＩＡとＥＩＩＩＢとも呼ばれる）と呼ばれるＩＩＩ型エクソン、およびほかの２つのＩＩＩ型反復配列を連結する断片－ＩＩＩ型コネクティングセグメント（ＩＩＩＣＳ）によるものである。ＥＤＡとＥＤＢのスプライシングはすべての種において類似している（あるいは完全に含むか、排除されている）が、ＩＩＩＣＳ領域のスプライシングは種によって特異的である（ヒトはバリアントが５つ、齧歯動物は３つ、トリは２つある）。
ＦＮは血漿における可溶性二量体でもよく、肝細胞からそのまま循環に分泌され（血漿ＦＮまたはｐＦＮ）、あるいは不溶性線維として組織のＥＣＭに沈着している（細胞性ＦＮまたはｃＦＮ）。この２種類のＦＮアイソフォームはＥＤＡとＥＤＢドメインの存在において異なる。（ａ）ｐＦＮは交互にスプライシングするＥＤＡとＥＤＢ配列が欠けており、（ｂ）ｃＦＮは異なる比率のこれらのドメインを含む。
本明細書で用いられるように、用語「ＥＤＢ」、「ＥＩＩＩＢ」、「ＥＤＢドメイン」または「ＥＤ－Ｂドメイン」とは（ヒト）フィブロネクチンのエクストラドメインＢのことである。ヒトにおいて、ＥＤＢは約９１残基を有するＩＩＩ型ホモロジードメインである。ＥＤＢは健康な成人組織にほぼ検出されないが、多くの侵襲性固形腫瘍の脈管系に多く存在するため、ＥＤＢは本発明の抗癌および／または抗炎症治療の適切な標的になる。
一つの実施形態において、本発明のＣＡＲが認識する抗原はフィブロネクチンのスプライシングアイソフォーム、たとえば、ＦＮのＥＤ－Ｂドメインである。
３．ＥＤＢの抗体および抗原結合断片
ある実施形態において、フィブロネクチンのＥＤＢドメインと結合するＣＡＲは高い親和力を示し、たとえば、ナノモルまたはサブナノモルのＫＤ値を有する。本分野で公認される任意の方法、たとえば、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）またはＢＩＡＣＯＲＥ、あるいはほかの方法によって親和力を測定することができる。
ある実施形態において、ＣＡＲの抗原結合部分はＥＤＢ特異性抗体またはその抗原結合断片に基づいたもの、たとえば、ＷＯ９９／０５８５７０に記載のもの（いずれも引用で本明細書に取り入れる）である。
ある実施形態において、ＥＤＢ特異性抗体またはその抗原結合断片はＣＡＡ０６８６４．２（引用で本明細書に取り入れる）に基づいたものである。
ある実施形態において、ＥＤＢ特異性抗体またはその抗原結合断片はＬ１９抗体の少なくとも一つのＣＤＲ配列に基づいたものである。
ある実施形態において、ＥＤＢ特異性抗体またはその抗原結合断片はｈｕＢＣ１に基づいたもので、ｈｕＢＣ１はヒト化抗体で、多くの侵襲性腫瘍の内皮下細胞外基質に存在するＥＤＢ－ＦＮを標的とするものである。ＥＤＢ－ＦＮは癌胎児性抗原および血管新生に関連する。
ある実施形態において、ＣＡＲの抗原結合部分は本明細書で提供されるＣＡＲのアミノ酸配列の任意の抗原結合部分と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。ある実施形態において、ＣＡＲの抗原結合部分は本明細書で例示される一つの抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域における５以下（たとえば、４、３、２または１）個のアミノ酸残基の多様性を含み、そしてほぼ同様の親和力でＥＤＢの同一のエピトープと結合する（たとえば、同オーダーのＫＤ値を有する）。ある実施形態において、アミノ酸残基の多様性は保存的なアミノ酸残基の置換によるものである。本明細書で用いられるように、「保存的なアミノ酸置換」とはアミノ酸置換されたタンパク質の相対的電荷またはサイズの特徴を変えないアミノ酸置換のことである。
本明細書で用いられるように、「抗体」または「グロブリン（Ｉｇ）」は、通常、４つのポリペプチド鎖を含み、２つの重鎖（ＨＣ）と２つの軽鎖（ＬＣ）であるが、さらに同等のＩｇホモログを含み、たとえば、ラクダ科動物（たとえば、アルパカ）のナノボディ抗体（重鎖のみを含み）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（重鎖または軽鎖からの誘導体でもよい）を含み、そしてその全長または機能性特全変異体、バリアントまたは誘導体（ネズミ、キメラ、ヒト化および全ヒト由来抗体を含むが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらはＩｇ分子の基本のエピトープ結合特徴が残っており、二重特異性、双特異性、多重特異性および二重可変領域グロブリンを含む。抗体またはグロブリンは任意の種類、たとえば、ＩｇＧ 、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ（グロブリンで、トリ類、爬虫類動物およびハイギョの血液における主な抗体で、そして卵黄における濃度が高い）、あるいはサブタイプ、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ ２およびアロタイプでもよい。
天然に存在する非ヒト抗体またはその断片のアミノ酸配列、たとえば、ＶＨＨ配列（特に、フレーム配列）における１つまたは複数のアミノ酸残基をヒト由来の通常の４本鎖抗体のＶＨドメインの相応する位置に現れる１つまたは複数のアミノ酸残基に置き換えることで、「ヒト化」抗体またはその抗原結合断片が得られる。ヒト化の方法は周知のものである。相応する天然に存在する非ヒト抗体またはそのドメインと比べ、ヒト化抗体またはその抗原結合断片はいくつかの利点があり、たとえば、免疫原性が低下する。
天然に存在する抗体をコードするヌクレオチド配列を提供し、さらに新たなヌクレオチド配列がその「ヒト化」様態をコードするように、ヌクレオチド配列における１つまたは複数のコドンを改変することによって「ヒト化」を行うことができる。その後、当該核酸を発現させると、ヒト化抗体または断片を提供することができる。あるいは、天然に存在する非ヒト配列のアミノ酸配列に基づき、ヒト化様態を設計した後、ペプチド合成技術によって一から合成することもできる。また、当業者は適切な形で一つまたは複数の天然に存在する配列（たとえば、一つまたは複数のＦＲ配列またはＣＤＲ配列）ならびに／あるいは一つまたは複数の合成または半合成配列の一つまたは複数の部分を組み合わせることで、ヒト化抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列または核酸を提供することができる。任意に、ヒト化配列はコドン最適化後、宿主の免疫細胞、たとえば、ヒトＴ細胞、ＮＫ細胞、単核球またはマクロファージにおいて発現することもできる。
本明細書で用いられるように、「抗体誘導体または抗原結合断片」は、少なくとも一つの非全長抗体から誘導されるポリペプチド鎖を含む分子を含み、（ｉ）Ｆａｂ断片で、可変軽鎖（ＶＬ）、可変重鎖（ＶＨ）、定常軽鎖（ＣＬ）および定常重鎖１（ＣＨ１）からなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して連結した二つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）Ｆａｂ（Ｆｄ）片段の重鎖部分で、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるもの；（ｉｖ）可変領域（Ｆｖ）断片で、抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるもの；（ｖ）単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片、単一の可変ドメインを含むもの；（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）二価抗体で、ＶＨおよびＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖に発現されるが、使用されるリンカーが短すぎて同一の鎖における二つのドメインの間でペアリングできないため、これらのドメインがもう一本の鎖の相補的ドメインとペアリングし、そして二つの抗原結合部位が生じる二価二重特異性抗体；（ｉｘ）線状抗体で、一対の線状に連結したＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含み、相補性軽鎖ポリペプチドとともに一対の抗原結合領域を形成するもの；（ｘ）グロブリンの重鎖および／または軽鎖のほかの非全長部分、あるいはその突然変異体、バリアントまたは誘導体、単独または任意の組み合わせの形態を含むが、これらに限定されない。
ある実施形態において、抗原結合ドメインは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ナノボディ抗体（たとえば、ＶＨＨ（ラクダ科動物Ｉｇ）の誘導体）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ、ＶＨまたはＶＬドメインの誘導体）、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ、二重特異性抗体）および二重親和性再標的化（Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ、ＤＡＲＴ、二重特異性抗体）；アンチカリン（リポタンパク質の誘導体）；アドネクチン（１０番目のＦＮ３（フィブロネクチン））；設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；あるいはアビマー（ａｖｉｍｅｒ）である。
ある実施形態において、抗原結合ドメインはヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。
いずれの場合も、前記誘導体または断片は全長抗体の標的結合特性を維持するか、ほぼ維持する（たとえば、ＫＤが５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％未満で、全長抗体よりも２倍、３倍、５倍、７倍、８倍または１０倍高い）。
ある実施形態において、本発明の抗原結合断片は、さらに、「抗体に基づいた結合タンパク質」を含むが、本明細書で用いられるように、ほかの非グロブリンまたは非抗体の誘導成分である場合、少なくとも一つのから誘導されるＶＨ（重鎖可変領域）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、またはＣＨ（重鎖定常領域）を含む。このような抗体に基づいたタンパク質は、（ｉ）結合タンパク質のＦｃ融合タンパク質で、全部または一部のグロブリンＣＨドメインの受容体または受容体成分を含むもの、（ｉｉ）ＶＨおよび／またはＶＬドメインが代替可能な分子足場とカップリングした結合タンパク質、（ｉｉｉ）グロブリンＶＨおよび／またはＶＬおよび／またはＣＨドメインが天然抗体または抗体断片で通常見られない様態で組み合わせた分子および／または組み立てられた分子を含むが、これらに限定されない。
ある実施形態において、本発明の抗原結合断片は、「修飾された抗体形態」を含むが、本明細書で用いられるように、抗体薬物複合体、ポリアルキレンオキシドで修飾されたｓｃＦｖ、モノボディ（Ｍｏｎｏｂｏｄｙ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ラクダ科動物（たとえば、アルパカ）抗体、ドメイン抗体、二重特異性または三重特異性抗体、ＩｇＡまたはＪ鎖および分泌成分を介して連結した二つのＩｇＧ構造、サメ抗体、新世界霊長類動物フレームワーク＋非新世界霊長類動物ＣＤＲ、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体、ＣＨ３ドメインにおいて２つの余分な結合部位を改変したＩｇＧ、Ｆｃγ受容体に対する親和力が強くなるようにＦｃ領域を改変した抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量体などを含む。
ある実施形態において、本発明の抗原結合断片は、さらに、「抗体ミメティック」を含むが、本明細書で用いられるように、グロブリンファミリーに属しないタンパク質で、ひいてはタンパク質ではなく、たとえば、アプタマーや合成重合体である。ある種類は抗体に類似するβシート構造を有する。「抗体ミメティック」または「代替足場」は、抗体に対する潜在的な利点がより優れた溶解性、より高い組織浸透性、熱および酵素に対するより高い安定性ならびに比較的に低い生産コストである。一部の大型ライブラリーにおいて一部の抗体ミメティックが提供され、各可能な標的に対して特異的に結合する候補が提供される。抗体と同様に、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術および構築されたディスプレイ技術（たとえば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母または哺乳動物ディスプレイ）によって標的特異性抗体ミメティックを開発することができる。現在、開発された抗体ミメティックは、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎと呼ばれる）、Ｃ型レクチン、黄色ブドウ球菌のＡドメインタンパク質、トランスフェリン、リポタンパク質、フィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメイン、クニッツドメインプロテアーゼ阻害剤、ユビキチンから誘導される結合剤（アフィリンと呼ばれる）、γクリスタリンから誘導される結合剤、シスチンノットまたはノットタンパク質、チオレドキシンＡを足場とした結合剤、ＳＨ－３ドメイン、ストラドボディ（ｓｔｒａｄｏｂｏｄｙ）、ジスルフィド結合およびＣａ２＋で安定する膜受容体の「Ａドメイン」、ＣＴＬＡ４に基づいた化合物、Ｆｙｎ ＳＨ３、およびアプタマー（特定の標的分子と結合するペプチド分子）を含む。
特異的にＥＤＢフィブロネクチンを認識するＣＡＲの抗原結合部分、特にＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖは、本明細書に記載の様々な抗体の様態を使用してもよい。たとえば、ｓｃＦｖ以外、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたＣＤＲ配列は、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、ダイアボディ、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）またはナノボディ抗体を使用してもよい。ある実施形態において、その抗原結合断片はｓｃＦｖ形態である。もう一つの実施例において、重鎖と軽鎖はペプチドリンカーを介して連結している。
ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の配列を含む。
４．ＥＤＢに対して特異性があるＣＡＲ
本発明の一つの側面では、フィブロネクチンのＥＤＢに特異性がある抗原結合部分を有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、Ｔ細胞の表面に発現された場合、ＣＡＲが（ａ）可溶性ＥＤＢ、（ｂ）膜結合ＥＤＢ、および／または（ｃ）細胞外基質におけるＥＤＢと結合すると（たとえば、フィブロネクチンの網状構造の構成成分であって、細胞付着支持体の作用を果たすもの）、Ｔ細胞を活性化させることができるものを提供する。
ある実施形態において、キメラ抗原受容体は細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通（ＴＭ）領域、一つまたは複数の共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは、さらに、抗原結合ドメインとＴＭドメインの間にあるヒンジ／スペーサードメインを含む。ヒンジとＴＭドメインは同一のタンパク質由来のものでもよく、異なるタンパク質由来のものでもよい。
たとえば、ある実施形態において、ＣＡＲは、（１）フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異性がある抗原結合ドメインと、（２）たとえば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７膜タンパク質から選ばれる膜貫通（ＴＭ）ドメイン、（３）共刺激ドメインを有するか、有さないＣＤ３ζできる細胞内ＩＴＡＭ（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）ドメインとを含む。
ある実施形態において、細胞外抗原結合領域はそのｓｃ－Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂまたはｓｃＩｇＧ断片でもよい。
ある実施形態において、膜貫通領域はＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７の膜貫通領域を含む。
ある実施形態において、膜貫通領域はＣＤ８膜貫通ドメインの膜貫通領域を含む。
ある実施形態において、膜貫通領域はＣＤ８膜貫通ドメイン、たとえば、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（たとえば、配列番号１に含まれるＣＤ８αヒンジ領域）の膜貫通領域を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは、さらに、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にあるヒンジ領域を含む。ある実施形態において、ヒンジ領域はＣＤ８ヒンジ領域、たとえば、配列番号１に含まれるＣＤ８αヒンジ領域由来のものである。
ある実施形態において、ヒンジ領域とＴＭ領域は同一のタンパク質由来のもの、たとえば、いずれもＣＤ８タンパク質由来のものでもよい。
ある実施形態において、ヒンジ領域とＴＭ領域は異なるタンパク質由来のもの、たとえば、ヒンジ領域はＣＤ８αタンパク質由来のもので、ＴＭ領域はＣＤ３またはＣＤ２８のＴＭ領域由来のものでもよい。
ある実施形態において、ヒンジ領域はＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３７またはＣＤ２８タンパク質由来のもので、ＴＭ領域はＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ１３７またはＣＤ２８など由来のＴＭ領域でもよい。
ある実施形態において、キメラ受容体のヒンジおよび／または膜貫通領域はキメラタンパク質がＴＣＲ複合体に混入できるようになっている。
ある実施形態において、ＴＣＲ複合体に混入するキメラ受容体は余分な共刺激シグナルを持つものでもよい。
ある実施形態において、１種類のポリペプチドに一次Ｔ細胞活性化シグナル、たとえば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εやＣＤ３ζから誘導されるもの、一方、もう１種類のポリペプチドに共刺激シグナル、たとえば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７やＯＸ４０から誘導されるものが見られる。
ある実施形態において、Ｔ細胞の共刺激があってもなくても、一次Ｔ細胞活性化シグナルは腫瘍抗原およびＴ細胞受容体と結合する二重特異性ポリペプチドによって仲介される。
ある実施形態において、一次Ｔ細胞活性化シグナルは腫瘍抗原およびＴ細胞受容体と結合する二重特異性ポリペプチドによって仲介されるが、当該二重特異性ポリペプチドは活性化したＴ細胞によって分泌されるものまたは外部から添加されるものでもよい。
ある実施形態において、ＣＡＲにおけるヒンジ領域の長さは配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７におけるヒンジ領域の長さとほぼ同様である。たとえば、ヒンジ領域は、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７におけるヒンジ領域よりも１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個以下の残基で長いか、短くてもよい。
ある実施形態において、ＣＡＲは一つまたは複数のＣＡＲを発現する免疫細胞を活性化させるシグナル伝達ドメインを含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは一つまたは複数（たとえば、二つ）のＴ細胞を刺激して活性化させるシグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、一つまたは複数のシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、及ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄのシグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、ＣＡＲはＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、たとえば、配列番号１におけるＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
ある実施形態において、２つの共刺激ドメインはＣＤ２８由来の共刺激ドメイン、ならびに／あるいはＣＤ２７、４－１ＢＢまたはＯＸ－４０由来の共刺激ドメインである。
ある実施形態において、ＣＡＲは、さらに、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７／４ －１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ－４０、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＤＡＰ１０、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ３ζまたはＩＣＯＳの一つまたは複数からの一つまたは複数の共刺激ドメインを含む。ある実施形態において、一つまたは複数の共刺激ドメインはＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＰＫＣθまたはＺＡＰ７０由来の細胞内シグナル伝達領域を含む。ある実施形態において、ＣＡＲはＣＤ２８共刺激ドメインを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインとして、そして抗原活性化の増強および効力の増加のために、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）由来のＩＴＡＭを含む。ある別の実施例において、ＣＡＲはＣＤ２８の共刺激ドメイン由来のＩＴＡＭ含み、ＣＡＲが仲介するＴ細胞の活性化も増加させる。
ある実施形態において、ＣＡＲは、さらに、一次刺激シグナル、たとえば、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δをコードする一つのポリペプチド、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７ ／ ４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＯＸ－４０、ＰＤ－１、ＬＦＡ１、Ｌｃｋ、ＤＡＰ１０、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３またはＩＣＯＳのうちの一つの共刺激シグナルをコードするもう一つのポリペプチドを含む。ある実施形態において、一つまたは複数の共刺激ドメインはＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＰＫＣθまたはＺＡＰ７０由来の細胞内シグナル伝達領域を含む。このような立体配座において、一次または共刺激シグナル伝達ドメインの膜近接性は天然の様態の膜近接性に類似する。
ある実施形態において、ＣＡＲの発現を促進するために、ＣＡＲのＮ末端にリーダー配列またはシグナルペプチドが融合している。ある実施形態において、ＧＭ－ＣＳＦ受容体のリーダー配列を使用してもよい。ある実施形態において、リーダー配列はヒトＩＬ－２のリーダー配列である。
ある実施形態において、ＣＡＲは、さらに、ＣＡＲ発現をディスプレイまたはトラッキングするレポーター分子、たとえば、ＧＦＰを含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＥＤＢ ＣＡＲ全体は原形質膜にガイドするためのシグナルペプチド（たとえば、ヒトインターロイキン－２のシグナルペプチド）で発現する。
もう一つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号３のアミノ酸配列を含む。
もう一つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、ＣＤ４細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号４のアミノ酸配列を含む。
もう一つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、ＣＤ８細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号５のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、ＣＤ４細胞内ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号６のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、ＣＤ８細胞内ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号７のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、ＣＤ４細胞内ドメインおよびＣＤ２８細胞内ドメインに融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号８のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８細胞外と膜貫通ドメインおよびＣＤ２８細胞内ドメイン（ＣＤ２８ ａａ１３８－２２０）に融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号９のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、４－１ＢＢ細胞外と膜貫通ドメインおよび４－１ＢＢ細胞内ドメイン（ＣＤ１３７ ａａ１６０－２５５）に融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８ヒンジドメインおよびＣＤ３ζ細胞外と膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、後にＣＤ３ε細胞外と膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインが続いている、短鎖リンカー（ＧＲＡＳＧ）に融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、後にＣＤ３ε細胞外と膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインが続いている、１０アミノ酸のリンカー（２ＸＧ４Ｓ）に融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、後にＣＤ３ε細胞外と膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインが続いている、１５アミノ酸のリンカー（３ＸＧ４Ｓ）に融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、後にＣＤ３ε細胞外と膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン、ならびにＣＤ２８細胞内ドメインが続いている、１５アミノ酸のリンカー（３ＸＧ４Ｓ）に融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
またもう一つの実施形態において、ＣＡＲは、後にＣＤ３ε細胞外と膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン、ならびに４－１ＢＢ細胞内ドメインが続いている、１５アミノ酸のリンカー（３ＸＧ４Ｓ）に融合された、ＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖを含む。ある実施形態において、ＣＡＲは配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１１のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１２のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１３のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号８のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１１のアミノ酸配列および配列番号９のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１２のアミノ酸配列および配列番号９のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１３のアミノ酸配列および配列番号９のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号９のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号９のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１１のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１２のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１３のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１４のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、ＣＡＲは２本の単独のポリペプチド鎖からなり、前記ポリペプチド鎖は配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、二重特異性分子はＣＡＡ０６８６４．２に基づいたｓｃＦｖおよび抗ＣＤ３ε抗体に基づいたｓｃＦｖを含む。配列番号１８のアミノ酸配列の例示により、ＥＤＢ抗原およびＴ細胞受容体と結合できるこのようなポリペプチドが説明された。
表１に、配列ＩＤ番号、概要および名称の命名法を含め、本発明で公開されるすべてのキメラ抗原受容体をまとめた。
Figure 2023544225000001
５．ポリヌクレオチド
本発明のもう一つの側面では、本明細書に記載の本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは配列番号２を含む。
ある実施形態において、核酸は合成核酸である。ある実施形態において、核酸はＤＮＡ分子である。ある実施形態において、核酸はＲＮＡ分子（たとえば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ分子）である。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、キャッピング、ポリアデノシン化、５－メチルシチジン置換、シュードウリジン置換またはこれらの組み合わせをされている。
ある実施形態において、核酸（たとえば、ＤＮＡ）は、核酸の発現を制御するために、調節エレメント（たとえば、プロモーター）と連結している。ある実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。ある実施形態において、プロモーター是誘導型プロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは細胞特異的プロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは生物特異的プロモーターである。
幅広く使用されているプロモーターは、ｐｏｌ Ｉプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーターおよびβ－アクチンプロモーターを含む。
一つの側面では、本発明によって提供される核酸配列は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。
二つのアミノ酸配列または二つの核酸配列の同一性百分率を決定するために、最適比較目的で配列をアラインメントする（たとえば、第一および第二のアミノ酸または核酸配列のうちの一つまたは二つにギャップを挿入することによって最適アラインメントを実現し、比較のために、非相同配列を無視してもよい）。通常、アラインメントされる参照配列の長さは参照配列の長さの少なくとも８０％で、そしてある実施形態において、参照配列の長さの９０％、９５％または１００％である。その後、相応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が第二の配列における相応する位置と同様のアミノ酸残基またはヌクレオチドに占められている場合、分子は当該位置において同様である。二つの配列の間の同一性百分率は二つの配列が共有する同様の位置の数の関数で、二つの配列の最適アラインメントを考慮すると、挿入されるギャップ数および各ギャップの長さも必要である。本開示の目的のために、二つの配列の比較および二つの配列の間の同一性百分率のけったいは、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスで完成することができ、ギャップペナルティが１２で、ギャップ延長ペナルティが４で、フレームシフトギャップペナルティが５であった。
ある実施形態において、ＣＡＲタンパク質およびその誘導体または機能性断片をコードする核酸分子はコドン最適化を経た後、宿主細胞または生物において発現される。宿主細胞は構築される細胞系（たとえば、Ｔ／ＮＫ細胞）または単離される初代細胞を含んでもよい。任意の標的生物、特にヒト免疫細胞のために、核酸をコドン最適化してもよい。コドン使用表は容易に得られ、たとえば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／の「コドン使用データベース」で見つり、そしてこれらの表は多くの手段によって修正することができる（Ｎａｋａｍｕｒａら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：２９２， ２０００を参照する）。また、特定の宿主細胞において発現するように特定の配列を最適化するコドンのアルゴリズム、たとえば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）が提供されている。
コドン最適化配列の例は、このような場合、真核生物、たとえば、ヒトにおいて発現するように最適化されるもの（すなわち、ヒトにいて発現するように最適化される）、あるいはもう一つの本明細書で検討される真核生物、動物または哺乳動物のＣＡＲコード配列である。これは好適であるが、もちろん、ほかの実例も可能で、そしてヒト以外の宿主種のためのコドン最適化または特定の器官のためのコドン最適化は既知のものである。通常、コドン最適化とは、天然アミノ酸配列を維持すると同時に、当該宿主細胞の遺伝子において費用頻度がより高いか、最も使用されるコドンで少なくとも１個（たとえば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０またはそれ以上）の天然配列のコドンを置き換えることで、宿主細胞における修飾核酸配列の発現を増強させる方法である。異なる種は特定のアミノ酸のあるコドンに特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物体の間のコドン使用の違い）は、通常、伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）の翻訳効率に関連し、また伝令ＲＮＡは特に翻訳されるコドンの性質および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の有用性によって決められる。細胞における得られるｔＲＮＡの優勢は、通常、ペプチド合成において最も使用されるコドンを反映する。そのため、所定の生物において最適な遺伝子発現が実現するように、コドン最適化に基づき、遺伝子をカスタマイズすることができる。コドン使用表は容易に得られ、たとえば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／の「コドン使用データベース」で見つり、そしてこれらの表は多くの手段によって修正することができる（Ｎａｋａｍｕｒａら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：２９２， ２０００を参照する）。また、特定の宿主細胞において発現するように特定の配列を最適化するコドンのアルゴリズム、たとえば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）が提供されている。ある実施形態において、ＣＡＲをコードする配列における１つまたは複数のコドン（たとえば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０またはそれ以上、あるいはすべてのコドンは特定のアミノ酸の最も使用されるコドンに相応する。
ある実施形態において、本発明の一つまたは複数のポリヌクレオチドまたは核酸はベクター（たとえば、ウイルスベクター）に存在する。
本明細書で用いられるように、用語「ベクター」とは、通常、それに連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子のことである。ベクターは、一本鎖、二本鎖または部分二本鎖の核酸分子、一つまたは複数の自由末端を含むか、自由末端がない（たとえば、環状）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは両者を含む核酸分子、ならびに本分野で既知のほかのポリヌクレオチドバリアントを含むが、これらに限定されない。
ある実施形態において、ベクターよいはクローニングベクターまたは発現ベクターでもよい。ベクターはプラスミド、ファージミド、コスミドなどでもよい。ベクターは、ベクターを標的細胞（たとえば、哺乳動物細胞、たとえば、ヒト免疫細胞、たとえば、Ｔ／ＮＫ細胞）において増殖させる一つまたは複数の調節エレメントを含んでもよい。
ある実施形態において、ベクターは「プラスミド」で、環状二本鎖ＤＮＡ環であって、たとえば標準分子クローニング技術によって別のＤＮＡセグメントをそれに挿入することができるものを指す。
ある実施形態において、ベクターはウイルスベクターで、ここで、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列がベクターに存在し、ウイルス（たとえば、レトロウイルス、レンチウイルス、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損型アデノウイルス、ＨＳＶおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））にパッケージングされている。ウイルスベクターは、さらに、ウイルスが持つ宿主細胞に形質移入するためのポリヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクターである。ある実施形態において、レンチウイルスベクターは自己不活性型レンチウイルスベクターである。たとえば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら， “Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．” Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ７２（１２）： ９８７３‐９８８０， １９９８を参照する（引用で本明細書に取り入れる）。
ある実施形態において、前記ベクターは「スリーピングビューティー」（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＳＢ）トランスポゾンに基づいたもので、当該トランスポゾンはすでに非ウイルスベクターとして遺伝子を脊柱動物のゲノムに導入するために、そして遺伝子治療のために使用されている。ＳＢシステムはＤＮＡのみで構成されるため、ウイルスベクターと比べ、生産と運搬コストが大幅に低下する。ＳＢトランスポゾンは既にヒト臨床試験において遺伝子修飾Ｔ細胞に使用されている。
ある実施形態において、ベクターはそれらを導入される宿主細胞において自己複製することができる。ある実施形態において、宿主細胞に導入した後、ベクター（たとえば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）を宿主細胞のゲノムに組み込み、そしてこれによって宿主ゲノムとともに複製される。ある実施形態において、ベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれ、それと操作可能に連結した遺伝子の発現をガイドすることができる。真核生物において発現するベクターは「真核発現ベクター」である。
ある実施形態において、ベクターは組み換え発現ベクターで、宿主細胞において発現するのに適する様態の本発明の核酸を含む。組み換え発現ベクターは一つまたは複数の調節エレメントを含んでもよいが、発現に使用される宿主細胞によって調節エレメントを選択し、そして発現される核酸配列と操作可能に連結していてもよい。ここで、「操作可能に連結する」とは、標的のヌクレオチド配列が当該ヌクレオチド配列を発現させるように調節エレメントに連結することである（たとえば、体外転写／翻訳システムにあるか、ベクターが宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞の中にある）。
用語「調節エレメント」はプロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）およびほかの発現制御エレメント（たとえば、転写終止シグナル、たとえば、ポリアデニル化シグナルやポリＵ配列）を含む。たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ， ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）にこのような調節エレメントが記載されている。調節エレメントは多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現をガイドするものおよびある宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現をガイドするもの（たとえば、組織特異性調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは主に必要な標的組織、たとえば、筋肉、ニューロン、骨格、皮膚、血液、特定の器官（たとえば、肝臓、膵臓腺）または特定の細胞種類（たとえば、リンパ球、たとえば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）において発現をガイドする。また、調節エレメントは時系列依存性の様態、たとえば、細胞周期依存性または発育段階依存性の様態で発現をガイドすることができるが、当該様態は組織または細胞種類特異的なものでもそうでなくてもよい。
ある実施形態において、ベクターは１つまたは複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（たとえば、１、２、３、４、５または複数個のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つまたは複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター（たとえば、１、２、３、４、５または複数個のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つまたは複数のｐｏｌ Ｉプロモーター（たとえば、１、２、３、４、５または複数個のｐｏｌ Ｉプロモーター）あるいはこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの実例はＵ６およびＨ１プロモーターを含むが、これらに限定されない。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例は、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサー付き）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサー付き）［たとえば、Ｂｏｓｈａｒｔら， Ｃｅｌｌ， ４１ ：５２１－５３０（１９８５）を参照する］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１ａプロモーターを含むが、これらに限定されない。
用語「調節エレメント」は、さらに、エンハンサーエレメント、たとえば、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＴＬＶ－１のＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’断片［Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ８（１）、ｐ．４６６－４７２、１９８８］、ＳＶ４０エンハンサー、およびウサギｂ－グロビンのエクソン２と３の間のイントロン配列［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， Ｖｏｌ．７８（３）， ｐ．１５２７－３１、１９８１］を含む。
当業者には、発現ベクターの設計はたとえば形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要素によって決まることがわかる。ベクターを宿主細胞に導入することによって本明細書に記載の核酸がコードする転写物、タンパク質またはペプチドを生成することができるが、融合タンパク質またはペプチドを含む。
ある実施形態において、ベクターはレンチウイルスまたはＡＡＶベクターで、特定の種類の細胞を標的とするように選択することができる（たとえば、組織および／または細胞種類特異性を有する）。
多くの本分野で公認される方法、たとえば、形質移入、脂質ベクター、感染、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胃腸外注射、エアゾール剤、ジーンガンまたは弾道粒子などによって本発明のベクターを標的細胞、たとえば、初代Ｔ／ＮＫ細胞または「既存の」同種異体Ｔ／ＮＫ細胞に導入することができる。
ある実施形態において、形質移入は、たとえば、リン酸カルシウム、脂質またはタンパク質複合体でベクターを導入する化学的形質移入を含む。リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、リポソームおよびリポプレックス（遺伝子の経口投与のためのもの）界面活性剤およびペルフルオロ化学液体は、遺伝子のエアロゾル送達のためのものでる。
ある実施形態において、リポソームが形成するようなプラスミドＤＮＡと脂質溶液の組み合わせで脂質ベクターを生成させ、多くの細胞種類の細胞膜と融合できるため、ベクターＤＮＡをコード遺伝子を発現する細胞質および細胞核に導入する。ある実施形態において、葉酸をＤＮＡまたはＤＮＡ－脂質複合体と連結することで、より有効にベクターを高いレベルで葉酸受容体を発現する細胞に導入する。ほかのターゲッティング部分は同様にベクターをターゲッティング部分が標的とする特定の細胞種類に送達することができる。
ある実施形態において、ベクターＤＮＡは受容体が仲介する取り込み作用によって内在化される。
ある実施形態において、ベクターはレンチウイルスで、そしてベクターのパッケージング細胞系（ＰＣＬ）における別のウイルゲノムの遺伝子で表面糖タンパク質の遺伝子を置き換えることによってベクターの標的細胞感染スペクトルが拡大する。
６．免疫細胞
本発明のＣＡＲは、ＣＡＲが仲介する治療のための様々な免疫細胞に導入することができる。ＣＡＲが導入可能な免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単核球（末梢単核球を含む）、単核球由来の樹状細胞、マクロファージ、造血幹細胞および／または人工多能性幹細胞（ＰＳＣ）などを含む。
そのため、一つの側面では、本発明は、また、本発明の任意のＣＡＲ、ＣＡＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドを含む本発明のベクターを含む細胞を提供する。
ある実施形態において、細胞は真核生物である。ある実施形態において、細胞はヒト細胞である。ある実施形態において、細胞は免疫細胞である。ある実施形態において、細胞はＴ細胞、たとえば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。ある実施形態において、細胞はＮＫ細胞である。ある実施形態において、細胞は単核球である。ある実施形態において、細胞はマクロファージである。ある実施形態において、細胞は患者の体内から単離された初代細胞で、細胞を患者に戻す前に、ＣＡＲを発現するようにＣＡＲ発現ベクターを細胞に導入する。ある実施形態において、細胞は健常者のドナー由来のもので、前記細胞を健常者のドナーと別の患者に戻す前に、ＣＡＲを発現するようにＣＡＲ発現ベクターを細胞に導入する。任意に、健常者のドナーのＨＬＡ型は患者のＨＬＡ型とマッチする。
ある実施形態において、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞および／または単核球および／またはマクロファージは様々な非制限的な方法によって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍を含む多くの非制限的な由来で得られる。
ある実施形態において、免疫細胞はＣＡＲ治療が必要な患者（たとえば、癌または炎症性疾患と診断された患者）の体内から単離されたものである。本実施例において、Ｔ細胞／ＮＫ細胞／単核球／マクロファージは自家の細胞である。
本明細書で用いられるように、「自家」とは、細胞治療の対象で、当該対象由来の細胞系または細胞群のことである。
ある実施形態において、免疫細胞は治療の必要がない健常者のドナーから単離されたものである。本実施形態において、免疫細胞は異系の宿主由来もので、好ましくはヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）が適合する宿主由来ものである。
ある実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。ある実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。
本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は本分野で既知の任意の方法によって製造することができる。たとえば、発現ベクター、たとえば、本発明のＣＡＲのポリヌクレオチドを含み、そして発現させることができるウイルスに基づいたベクター（たとえば、レンチウイルスベクター）は、陽的のＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫなどの細胞を得るために、単離された免疫細胞の導入に使用することができる。当業者は、容易に、発現構造体、たとえば、タンパク質の発現に適するウイルスベクターを構築することができる。
ある実施形態において、細胞（たとえば、免疫細胞）は、さらに、サイトカイン、たとえば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１、あるいはこれらの組み合わせを発現する。ある実施形態において、ＣＡＲがその標的抗原と結合したとき、一つまたは複数のサイトカインの発現が活性化される。ある実施形態において、サイトカインの発現は免疫細胞の活性化で活性化するプロモーターによって制御される。
ある実施形態において、細胞は、さらに、免疫細胞の活性を下方調節するための安全スイッチを含む。
ある実施形態において、安全スイッチはｉＣａｓｐａｓｅ９（誘導型ｃａｓｐａｓｅ－９）単量体のコード配列を含み、たとえば、ＦＫＢＰ二量化で活性化させることで、免疫細胞のアポトーシスを触発させることができる。
７．薬物組成物およびその応用
本発明のもう一つの側面では、疾患または病態、たとえば、癌または炎症性疾患を治療するための薬物組成物であって、本発明の修飾されたＴ／ＮＫ細胞／単核球／マクロファージと薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。また、本発明では、疾患を治療する薬物の製造における本発明の修飾されたＴ／ＮＫ細胞／単核球／マクロファージの使用の保護を請求されている。
本明細書で用いられるように、「薬学的に許容される担体」は、あらゆる生理的に相溶する溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。ある実施形態において、担体は静脈内、筋肉内、皮下、胃腸外、脊髄または表皮の施用（たとえば、注射や輸液によるもの）に適する。
ある実施形態において、本発明は、本発明のＣＡＲを発現するＣＡＲに基づいた免疫細胞（たとえば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を施用することによって固形腫瘍または炎症性疾患を罹患した患者を治療する方法を提供する。もう一つの実施形態において、本発明は、ＣＡＲを発現するＣＡＲ－ＴまたはＣＡＲ－ＮＫ細胞を施用することによって免疫細胞を患者の体内における固形腫瘍に募らせる方法を提供する。ある場合、リンパ球の輸液によってＣＡＲ－Ｔ／ＣＡＲ－ＮＫ細胞を施用することができる。好適に、治療において自家リンパ球で輸液する。本明細書に記載および本分野で既知の方法によって治療が必要な患者から自家ＰＢＭＣを収集し、そしてＴ／ＮＫ細胞を活性化・増幅させ、さらにそれを患者の体内に注入する。

８．使用方法
本発明のもう一つの側面では、血管新生抑制作用で治療できる疾患または病態を罹患した被験者において血管新生を抑制する方法であって、被験者に治療有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞、あるいは免疫細胞を含む薬物組成物を施用することをことを含み、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（１）フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異性がある抗原結合ドメインと、（２）ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７膜タンパク質から選ばれる膜貫通（ＴＭ）ドメインと、（３）共刺激ドメインを有するか、有さないＣＤ３ζ細胞内ＩＴＡＭ（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）ドメインとを含む方法を提供する。
本明細書で用いられるように、「治療有効量」または「治療有効投与量」または「有効量」とは、十分な量の物質、化合物、材料または細胞を施用することによって所望の治療効果を果たすことである。そのため、投与量は、疾患または病態の少なくとも一つの症状を予防、治癒または改善するか、疾患または病態の進展／悪化を完全にまたは部分的に阻止するのに十分な量である。施用量は、毒性の閾値レベル未満の量でもあり、当該閾値毒性レベルを超えると、被験者が治療を終止または中止することができる。
たとえば、有効量で被験者に施用する場合、本発明の免疫細胞および本発明の免疫細胞を含む薬物組成物は一つまたは複数の疾患の症状を減少／遅延／消失させ、その発作の頻度および／または持続時間を減らし、あるいは疾患による傷害または障害による疼痛を予防または軽減することができる。たとえば、腫瘍の治療では、未治療の対象または対照群と比べ、本発明の免疫細胞および免疫細胞を含む薬物組成物は癌細胞の生長を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％抑制することができる。適切な動物モデルシステムいおいて本発明の免疫細胞および免疫細胞を含む薬物組成物の腫瘍生長を抑制する能力を評価することで、ヒト腫瘍に対する治療効果を予想することができる。代わりにまたは別途に、疾患または病態と合理的に関連するモデルシステムによって体外で腫瘍細胞生長を抑制する能力を測定することができる。
本発明の薬物組成物における免疫細胞の量および投与量のレベルは、患者の具体的な需要、施用形態、被験者の癌の種類および／または程度、必要な治療反応、耐える程度、患者に対する毒性、および主治医が関連すると考えるほかの要素によって変わる。すなわち、選択される投与量のレベルは、使用される特定の組成物、投与経路、患者の年齢、併用するほかの薬物組成物、投与の持続時間、排泄またはクリアランス速度、性別、体重、状況、全体の健康状態および病歴ならびに医学の分野において周知される患者の類似する要素を含む多くの薬物動態学の要素によって決められる。当業者は、過度な実験をせずに、経験によって本発明の有効量を決めることができる。本明細書によって与えられる教示と合わせると、様々な活性免疫細胞および加重の要素、たとえば、効力、相対生物利用能、患者の体重、不良な副作用の重篤度および好適な投与様態において選択することで、有効な予防または治療プランを立てることができ、当該プランは実質的な毒性を引き起こさず、特定の被験者に対する治療に完全に有効である。
本発明例の毒性および効果は細胞培養または実験動物における標準薬学プロトコール、たとえば、ＬＤ５０（５０％の数量をさせる投与量）およびＥＤ５０（５０％の数量に有効な投与量）によって決定することができる。毒性と治療効果の間の投与量比は治療指数で、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表示することができる。大きい治療指数を表す予防剤および／または治療剤は好適である。毒性・副作用のある予防および／または治療薬物を使用することができるが、未感染細胞への潜在的な損害が最大限に減少するように、このような薬物を感染された組織部位にターゲッティングさせる送達システムを慎重に設計することで、副作用を減少させるべきである。
ある実施形態において、細胞培養測定、動物研究および臨床研究から得られたデータは、ヒトのための予防剤および／または治療剤の投与量の範囲の決定に使用することができる。このような試薬の投与量は循環濃度の範囲内が好ましく、ほとんど毒性がないか、無毒性のＥＤ５０を含む。使用される剤形および使用される投与経路により、投与量はこの範囲内で変わる。本発明の方法で使用される薬剤のいずれにも、細胞培養試験から初歩的に治療有効投与量を推測することができる。動物モデルにおいて、細胞培養において確定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分に達する場合の試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度の範囲に達するように、投与量を決定することができる。このような情報はより正確にヒトに有用な投与量を決定するのに使用することができる。たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって血漿におけるレベルを測定することができる。
ある実施形態において、免疫細胞におけるＣＡＲは本明細書に記載の本発明の任意のＣＡＲである。
ある実施形態において、免疫細胞は自家または他家のＴ細胞、ＮＫ細胞、単核球またはマクロファージである。
ある実施形態において、前記疾患または病態は固形腫瘍、慢性炎症性病態、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞、線維化または傷口である。
癌または固形腫瘍の例は、肺癌、卵巣癌、結腸癌、結腸・直腸癌、メラノーマ、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、リンパ腫、血液系悪性腫瘍、頭頚部癌、膠細胞腫、胃癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、子宮頚癌、子宮体癌および骨肉腫を含む。
本発明の方法または薬物組成物で治療できるほかの癌の例は、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、前立腺癌、皮膚または眼内悪性メラノーマ、子宮癌、肛門部癌、睾丸癌、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性または急性白血病（急性骨髄球性白血病、骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む）、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎臓癌、中枢神経系癌（ＣＮＳ）、原発性中枢神経系リンパ腫、脊柱腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞性リンパ腫、アスベストによる癌を含む環境による癌、および前記癌の組み合わせを含む。
ある実施形態において、癌は固形腫瘍／癌である。ある実施形態において、癌は肺癌、たとえば肺扁平上皮癌である。ある実施形態において、癌は卵巣癌である。ある実施形態において、癌は結腸癌である。
ある実施形態において、固形腫瘍由来の癌細胞は細胞表面にＥＤＢを発現しない。
ある実施形態において、当該方法は、さらに、免疫チェックポイント阻害剤、たとえば、ＰＤ－１阻害剤（たとえば、ペムブロリズマブ、ニボルマブやセミプリマブ）、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（たとえば、アテゾリズマブ、アベルマブやデュルバルマブ）、ＣＴＬＡ－４標的薬（たとえば、イピリムマブ）または免疫調節剤（たとえば、サリドマイドやレナリドミド）を施用することを含む。
ある実施形態において、当該方法は、さらに、被験者に放射線療法および／または化学療法および／または手術および／またはほかの腫瘍を標的とする薬物（たとえば、ほかの抗原または小分子化合物を標的とするモノクローナル抗体）を施用することを含む。
ある実施形態において、化学療法は、全トランス型レチノイン酸、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、アナストロゾール、アザシチジン、アザチオプリン、アルケラン、Ａｒａ－Ｃ、三酸化二ヒ素、ＢｉＣＮＵブレオマイシン、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ＤＴＩＣ、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、アドリアマイシン、５－フルオロウラシル、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、エキセメスタン、エルロチニブ、フルダラビン、フルオロウラシル、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、レトロゾール、ラパチニブ、ロイスタチン、６－ＭＰ、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、メクロレタミン、メゲストロール、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ナベルビン、ナイトロジェンマスタード、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸二ナトリウム、ペメトレキセド、リツキサン、６－ＴＧ、タキソール、トポテカン、タモキシフェン、タキソテール、テニポシド、チオグアニン、トレミフェン、トリメトレキサート、トラスツズマブ、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ベルバン、ＶＰ－１６および／またはゼローダを含む。
ある実施形態において、慢性炎症性疾患は、乾癬、関節リウマチ、関節リウマチ、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、骨関節炎、喘息、肺線維化、ＩＢＤ、炎症によって誘導されるリンパ管新生、肥満症、糖尿病、網膜血管新生（ＲＮＶ）、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、メタボリックシンドローム関連疾患、長期間腹膜透析、若年性関節炎またはアテローム性動脈硬化である。
ある実施形態において、当該方法は、さらに、有効に血管新生を抑制する第二の治療剤を施用することを含む。
ある実施形態において、第二の治療剤は、アキシチニブ、ベバシズマブ、カボザンチニブ、エベロリムス、レナリドミド、パゾパニブ、ラムシルマブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、サリドマイド、バンデタニブおよび／またはジブ－アフリベルセプトを含む。
ある実施形態において、体外で本発明のベクターを被験者から分離された初代免疫細胞に導入し、そして任意に体外でベクターを導入された初代免疫細胞を培養および／または増幅することで、免疫細胞を生成させる。
ある実施形態において、当該方法は、さらに、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を抑制する試薬、たとえば、抗ＩＬ－６モノクローナル抗体（たとえば、トシリズマブ）を施用すること、および／またはグロブリン治療を行うことを含む。
ある実施形態において、被験者はヒト、非ヒト霊長類動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯類動物である。ある実施形態において、前記被験者はヒト被験者である。癌における予測療法に関連する本発明の各側面では、被験者は癌の疑い／高いリスクがあるか、癌と診断されたヒトである。癌の疑いがある被験者を識別する方法は、身体検査、被験者の家族史、被験者の病歴、生検または多くのイメージング技術、たとえば、超音波検査、コンピューター断層撮影、磁気共鳴画像、磁気共鳴スペクトルや陽電子放出断層撮影を含む。癌の診断方法および癌診断の臨床描写は医学分野の技術者に周知されるものである。
９．キット
本発明のもう一つの側面では、本発明の免疫細胞を製造する方法のためのキットであって、患者から免疫細胞を単離するための試薬、単離された免疫細胞を培養および増幅するための培地、単離された本発明のＣＡＲを発現する免疫細胞に感染させるための本発明のベクターを含む試薬、免疫細胞（たとえば、Ｔ細胞）を活性化させるための試薬、誘導される本発明のＣＡＲの発現を検出／検証するための試薬、被験者の病変組織におけるＥＤＢの存在の有無を確認するための試薬（たとえば、免疫組織化学または免疫蛍光試薬またはほかのイメージング手段、たとえば、Ｉｍｍｕｎｏ－ＰＥＴ／ＣＴなどの非侵襲的体内イメージング手段）などのうちの一つまたは複数を含むキットを提供する。
前記キットは、さらに、本発明の方法の実施によるＣＡＲを持つ免疫細胞およびその用途の説明書を含む。
キットは、一つまたは複数の容器に本明細書に記載の任意の一つまたは複数の構成成分を含んでもよい。たとえば、一つの実施形態において、キットは前記キットの一つまたは複数の構成成分の混合ならびに／あるいはサンプルの分離と混合および被験者への施用の説明書を含んでもよい。キットは本明細書に記載の試薬を収納する容器を含んでもよい。試薬は、無菌で調製し、注射器にパッケージングして冷蔵して運送することができる。あるいは、それをバイアル瓶またはほかの容器に収納して保存することができる。第二の容器は無菌で調製されたほかの試薬を有してもよい。あるいは、キットは予め混合して注射器、バイアル瓶、試験管またはほかの容器の中で運送される活性試薬を含んでもよい。
実施例１：ＥＤＢ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
ＥＤＢ－ＣＡＲ（配列番号１）キメラ抗原受容体は新しく設計された分子で、そのコード配列（配列番号２）はＧｅｎｅｗｉｚによって合成された。ＥＤＢ－ＣＡＲの一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）はＣＡＡ０６８６４．２に基づいて設計され、特異的にＥＤＢ抗原を認識する。具体的に、ＥＤＢ ＣＡＲの構築は遺伝子断片の融合で、中では、ＥＤＢ特異性ｓｃＦｖがＣＤ８α細胞外と膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインに融合された。ヒトＩＬ－２シグナルペプチドを使用することによってＥＤＢ－ＣＡＲ受容体全体を原形質膜にガイドする。ＥＤＢ－ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）はＧｅｎｅｗｉｚによって一から合成された。
ＥＤＢ ＣＡＲを発現させるために、融合遺伝子ＤＮＡ断片をレンチウイルスベクターＭ１にクローニングした後、偽型化されたレンチウイルスを活性化したＴ細胞に導入した。
メーカー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９６－５３５）によって提供されたプロトコールに従い、磁気ビーズ陰性選択法によって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＴ細胞を単離した。完全ＲＰＭＩ（１０％熱不活性化されたウシ胎児血清および１００ Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを追加されたＲＰＭＩ、５００ Ｕ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、ＧＭＰ－１１８４８－ＨＮＡＥ）、１０ ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７（ＳｉｎｏｉＢｏｌｏｇｉｃ、ＧＭＰ－１１８４０－ＨＮＡＥ）および１０ ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃ、ＧＭＰ－ １１８４６－ＨＮＡＥ））培地において、磁気ビーズを抗ヒトＣＤ３とＣＤ２８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１１３１Ｄ）およびＴ細胞と２４時間インキュベートした。その後、ＦｕＳｕｒｅ（Ｂｏｓｔｏｎ ３Ｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合したレンチウイルスベクターで回転感染（ｓｐｉｎ－ｆｅｃｔ）させた。細胞を１２日増幅させ、そして体外の測定に使用した。
ヒト可変フレームワーク配列を認識するＦａｂ断片を使用し、フローサイトメトリーによってＥＤＢ－ＣＡＲのＴ細胞の表面における発現を検出した。具体的に、１０６個の形質移入された細胞を８ μｇ／ｍＬの再構築されたビオチンで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－０６６－０９７）とＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．４％ ＦＢＳ）において４℃で２５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ干渉液で細胞を洗浄し、そして５．５ μｌ フィコエリスリン（Ｒ－フィコエリトリン ストレプトアビジン、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、０１６－１１０－０８４）とＦＡＣＳ緩衝液において光を避けて冰の上で２０分間インキュベートした。冷えたＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄し、そしてＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅフローサイトメーターによって分析した。Ｆａｂ断片はＥＤＢキメラ受容体で形質導入されたＴ細胞のみを認識した（図１）。
また、ＥＤＢ－ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞は可溶性ＥＤＢ抗原を認識してＩＦＮ－γを生成したことが見だされたが、これは当該設計におけるＥＤＢ－ＣＡＲは可溶性抗原によって活性化されることを示す。注目すべきは、ＥＤＢ特異性抗体は部分的にＩＦＮ－γの誘導を抑制したことである（図２Ａ）。また、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞はＵ８７－ＭＧ細胞の表面にＥＤＢ抗原が付いた細胞を殺傷することができた（図２Ｂ）。
そのため、可溶性抗原も膜結合抗原も受容体を刺激することで、Ｔ細胞を活性化させることができるから、ＥＤＢ－ＣＡＲのいまの設計は独特なものである。
実施例２：ＥＤＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＥＤＢタンパク質を発現する細胞に対して細胞毒性を有する
標的細胞に含まれるフィブロネクチンのＥＤＢドメインの存在を確認するために、抗ＥＤＢモノクローナル抗体ＢＣ－１（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５４２１０）で標準のウエスタンブロッティング分析を行った後、二次抗体による検出を行った。ＥＤＢは、ヒト結腸癌細胞系Ｃａｃｏ－２、ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ－７、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ヒト膠芽細胞腫細胞系Ｕ８７－ＭＧを含む、いくつかの代表的なヒト癌細胞系において発現される。また、マウス結腸・直腸癌細胞系ＣＴ２６およびヒト臍帯静脈内皮細胞系ＨＵＶＥＣの細胞にもＥＤＢタンパク質の発現が見られた（図３Ａ）。
ウエスタンブロッティング分析を実証するために、ＥＤＢドメインに特異性があるプライマーを使用し、ｑＰＣＲによって各細胞におけるＥＤＢタンパク質のｍＲＮＡレベルにおける発現を確認した。標的細胞の全ＲＮＡを抽出し（１９２２１、ＹＥＡＳＥＮ）、そして全ＲＮＡを鋳型として逆転写して（１１１２１ＥＳ６０、ＹＥＡＳＥＮ）ｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマーでｑＰＣＲ反応を行った：ＧＡＤＰＨ Ｆ－プライマー ５’－ＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧ－３’およびＲ－プライマー ５’－ＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣ－３’およびＥＤＢ Ｆ－プライマー ５’－ＡＡＣ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＣＣ ＴＡＡ ＧＣＴ ＴＴ－３’およびＲ－プライマー ５’－ＣＧＴ ＴＴＧ ＴＧＴ ＣＡＧ ＴＧＴ ＡＧ－３’およびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素（１１１９９ＥＳ０３、ＹＥＡＳＥＮ）。データから、ＥＤＢ特異性ｍＲＮＡは多くの癌細胞系およびＨＵＶＥＣ細胞に異なるレベルで存在したが、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８に検出されなかったことが示された（図３Ｂ）。
異なるレベルのＥＤＢ発現を示す一組の細胞においてＥＤＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性をテストした。９６ウェルＵ型底プレートにおいて、１０４個の標的細胞を形質導入されたＴ細胞とエフェクター標的比が１：１、５：１および１０：１の比率で混合した。２４時間培養した後、ＬＤＨ検出キット（Ｙｅａｓｅｎ、４０２０９ＥＳ７６）によって標的細胞の分解を検出した。発現の分析と一致し（図３Ａ－３Ｂ）、ＨＵＶＥＣ、Ｕ８７－ＭＧ、Ｈｓ５７８、Ａ５４９、Ｆ９はＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔによって誘導される細胞分解に敏感であったが、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ４６８は影響されなかった（図４Ａ－４Ｂ）。Ｃａｃｏ－２細胞系では、低レベルの細胞殺傷力は細胞が体外で集合体になる傾向によるものかもしれない（データは示されていない）。
興味深いのは、ＥＤＢの発現の多さと細胞分解のレベルの間に明らかな関連性がなかったことである。あらゆる特定の理論に縛られたくないが、これらの細胞系におけるＥＤＢドメインのアクセス性または特定の配座は変化が可能で、細胞の分解に対する敏感性に影響するかもしれない。
全体的に、これらのデータはＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞で癌治療を行うことに支持している。
実施例３：ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞はＨＵＶＥＣ内皮細胞に対して細胞毒性を有する
血管新生は腫瘍生長および転移の前提である。ベバシズマブおよびアフリベルセプトの治療効果（Ｋｅａｔｉｎｇ ２０１４、Ｓｙｅｄ ２０１５）の成功によって腫瘍の血管新生を標的として治療する実行性が実証された。
当該実施例は、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞がＨＵＶＥＣ細胞に対して細胞毒性を生じうることを示し、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞は血管新生の治療標的に有用である。ＨＵＶＥＣ細胞はチューブ状構造を形成しうる内皮細胞である。ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒性のレベルはエフェクター標的比の増加とともに増加した（図Ａ、下段、中間）。
これは、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞が有効な血管新生阻害剤になれることを示す。新たな血管構造が形成する過程においてＥＤＢ＋フィブロネクチンが関与するため、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞は単独で使用してもよく、現在使える血管新生阻害剤（たとえば、ベバシズマブまたはアフリベルセプト）と併用してもよい。
実施例４：ＥＤＢ陽性癌細胞がＥＤＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化させることができる
ＩＦＮ－γはＴ細胞活性化の印である。配列番号１に基づいたＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞が細胞毒性反応期間における活性化の有無を評価するために、ＥＬＩＳＡによってＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ発現を検出した。実際に、標的細胞が存在する場合、培養上清液にＩＦＮ－γが検出された（図５）。ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ４６８細胞では、ＩＦＮ－γ誘導が見られず、これはこれらの細胞におけるＥＤＢの低いか、検出できない発現レベルと一致している。これらの発見によって、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞によって誘導される細胞分解がＥＤＢ含有フィブロネクチンとの結合によるものであることが強く示された。
興味深いのは、細胞毒性が低いが、Ｃａｃｏ－２細胞では、高いレベルのＩＦＮ－γが誘導されたことである（図２）。当該発見は意外なことで、そして細胞毒性のよく見られる観察結果と一致しないが、これはＩＦＮ－γ誘導経路がＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒性経路と独立していることを示す。
実際に、初歩的なデータから、細胞毒性反応を経た後、本発明のＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔは増殖しないことがあることが示され、これは非常に意外なことである。一方、当該データから、本発明のＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔによる治療はより安全であることが示された。
また、ＣＡＲ Ｔ細胞は細胞毒性による殺傷後、ＴＮＦ－αを生成することがあることが観察された（Ｊｉａｎｇら ２０１８）。標的細胞とＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞のインキュベート後のＴＮＦ－α誘導をテストした。ＩＦＮ－γ発現と一致し、Ｃａｃｏ－２およびＨＳ５７８Ｔ細胞とインキュベートすると、ＴＮＦ－αの生成が誘導され、高いエフェクター標的比で増強したが、ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞とインキュベートすると、大量のＴＮＦ－αを生成することがなかった（図６）。
実施例５：ＥＤＢ－ＣＡＲ ＮＫ細胞も癌細胞に対して細胞毒性を有する
当該実験により、本発明の配列番号１に基づいたＥＤＢ－ＣＡＲを使用するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に基づいた治療プランの潜在的な応用が証明された。
ＮＫ－９２細胞系は患者由来の不死化細胞系で、既に臨床研究に使用されている。ＥＤＢ－ＣＡＲのＮＫに基づいた療法における適用性を証明するために、ＥＤＢ－ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターでＮＫ－９２細胞系を形質導入したが、その方法はＣＡＲ Ｔ細胞を生成する方法と類似する。前記のように、抗Ｆａｂ断片抗体を使用してフローサイトメトリーによってＥＤＢ－ＣＡＲの発現を分析した。５５％超のＮＫ－９２細胞は細胞表面にＥＤＢ－ＣＡＲの発現を示した（図７）。
ＥＤＢ－ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞とインキュベートすることにより、膠芽細胞腫細胞系Ｕ８７－ＭＧの細胞分解が誘導された（図８Ａ）。当該結果は細胞毒性の測定と一致し、標的細胞が活性化すると、ＥＤＢ－ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞がＩＦＮ－γを生成した。
これらの結果から、ＥＤＢ－ＣＡＲで形質導入されたナチュラルキラー細胞の癌における潜在的な治療作用がはっきりと証明された。
実施例６：ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の体内注射
ＣＡＲ－Ｔ細胞が体外でＨＵＶＥＣ細胞に細胞毒性を有することがしめされたため、このようなＥＤＢ特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞が体内で患者の正常の血管に許容できない毒性を有する可能性が危惧される。当該実験により、ＨＵＶＥＣ細胞に対して体外細胞毒性を有するが、被験ＣＡＲ－Ｔ細胞は体内で安全に使用できることが示された。
当該実験において、マウスに１×１０７のＴ細胞、１×１０７のＥＤＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞または２×１０７のＥＤＢ ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射した。Ｔ細胞の注入から２１日目にマウスを殺処分した。異なる組織を収集し、ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、そしてＨ＆Ｅで染色した。代表的な顕微写真を図９に示す。当該写真はＬｅｉｃａ Ａｐｅｒｉｏ ＶＥＲＳＡ ８切片スキャナーによって２０倍の拡大倍率で撮影されたものである。各スケールバーは１００μｍを表す。
結果から、すべての検査の組織はいずれも明らかな病理的変化がなく、各群の間で有意差がなかったことがわかる。図９を参照する。
当該実験において、２０ ｇ程度のマウスに、高投与量群では、ＥＤＢ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を２０００万個／匹で注射した。当該数量のＣＡＲ－Ｔ細胞は、６０ ｋｇのヒトに約６００億個の細胞を注射することに相当し、これは実践で到達しない非常に高い投与量である。
実施例７：体内注射のＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞
近年、ＣＡＲが仲介する免疫療法はより幅広い治療の応用が得られたが、このような免疫療法の癌細胞を殺傷する確かな機序に対する理解はまだ不完全である。最近、ＣＡＲ－Ｔ細胞の長期殺傷能力がＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＡＲが仲介する免疫シナプス（ＩＳ）の質と正相関することが報告されたため、ＩＳの質はＣＡＲで修飾された免疫細胞の有効性を予想できるとされている。異体移植モデルのデータにより、体外ＩＳの質が体内ＣＡＲ修飾免疫細胞の性能と正相関することも実証された。Ｘｉｏｎｇら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６（４）：９６３－９７５， ２０１８を参照する。
しかし、当該実例により、ＥＤＢ－ＣＡＲ形質導入後のマクロファージがＴＮＦαを生成することが示され、これはＥＤＢ－ＣＡＲが仲介する癌細胞殺傷が部分的にある抗癌サイトカインの分泌を促進することによるもので、そして免疫シナプスの機序への依存が少ないかないことを示す。
当該実験において、メーカーによって提供されたプロトコールに従い（１３０－０５０－２０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、磁気ビーズ陽性選択法によってＰＢＭＣから単核球を単離した。選ばれたＣＤ１４＋単核球を、１０％ＦＢＳよび１０ ｎｇ／ｍｌ ヒト組み換えＧＭ－ＣＳＦ（３００－０３－２０、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含有するＲＰＭＩ中の未処理細胞培養フラスコにおいて８日播種し、さらに６日目に、ＦｕＳｕｒｅ（Ｂｏｓｔｏｎ ３Ｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合した配列番号１ ＥＤＢ－ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターで回転感染させた。７日目に単核球／マクロファージを収集し、そしてＥＤＢ－ＣＡＲ（配列番号１）の発現をテストした。図１０Ａ－１０Ｂを参照する。
ＥＤＢ－ＣＡＲ形質導入後の単核球／マクロファージが放出するサイトカインを検出するために、標的細胞をＥＤＢタンパク質とエフェクター標的比が１０、２０および４０の比率で９６ウェルＵ型底プレートにおいて混合した。２４時間培養した後、ＥＬＩＳＡ（ＤＡＫＥＷＥ）によってＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１２の発現を測定した。図１１Ａ－１１Ｊを参照する。
以下、実験工程の概要を提供する。
Figure 2023544225000002
１日目：末梢血から単核球を単離し、そしてフローサイトメトリーによってＣＤ１４＋細胞の比率を検出し、１０ ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦを入れ、５日続けた。
５日目：付着細胞を消化してトリパンブルーで染色して細胞活力を計算した。
６日目：ウイルスを形質導入した。
７日目：細胞活性が観察された。
８日目：フローサイトメトリーによってＣＡＲ陽性率を検出した。
９日目：標的細胞またはＥＤＢ抗原とインキュベートした。
１０日目：ＥＬＩＳＡによってサイトカインの発現を検出した。
ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒性に対する早期の観察により、その殺傷活性が標的細胞におけるＥＤＢ－フィブロネクチンの発現レベルと比例しないように見えた。実施例４を参照する。また、標的細胞とともに培養する場合、ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞がＴＮＦαを分泌した。
ＴＮＦαは細胞毒性の機能を有する。当該実施例により、ＥＤＢ－ＣＡＲを発現する単核球／マクロファージもＴＮＦαを分泌することが示された。図１１Ｃおよび１１Ｊを参照する。インターフェロン－γもＴＮＦ－αも免疫細胞の強刺激剤および癌細胞の抑制剤であることが知られている。そのため、本発明のＥＤＢ－ＣＡＲで修飾された免疫細胞がサイトカイン、たとえば、ＩＦＮ－γおよび／またはＴＮＦαを癌組織に送達することによってＥＤＢ－ＣＡＲが仲介する殺傷を実現するのに有用であることが確信された。
実施例８：Ｔ細胞において発現される別のＥＤＢ－ＣＡＲ
ＣＤ４およびＣＤ８細胞内ドメインがＴ細胞シグナル伝達に関与するリンパ球特異性タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）と相互作用することが知られている。ＣＤ４ｉｃおよびＣＤ８ｉｃの細胞内ドメインを二代目のＥＤＢ ＣＡＲ（配列番号１、３）に導入することで、潜在的なＬｃｋ招集能力を有するＥＤＢ ＣＡＲ（配列番号４、５、６、７、８）を生成させた。実施例１に記載のように、ＣＤ４ｉｃおよびＣＤ８ｉｃ ＥＤＢ ＣＡＲの発現テストを行った（図１２を参照する）。テストされたＥＤＢ ＣＡＲに相応する配列ＩＤは表１で見つけられる。陰性対照は未形質導入のＴ細胞（Ｔ）またはモックベクター（Ｍ１）で形質導入されたＴ細胞で表す。当該実施例において、ＢＢＣＤ４ＣＤ３ｚおよびＢＢＣＤ８ＣＤ３ｚ（配列ＩＤ ４、５）と名付けられたＥＤＢ ＣＡＲの発現はほとんど検出されなかった（図１２）。しかし、ＢＢＣＤ４ＣＤ３ｚおよびＢＢＣＤ８ＣＤ３ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞では、抗原誘導後の増殖活性および癌細胞に対する細胞毒性はほかの二代目のＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞に相当する（実施例９、１０を参照する）が、これはＢＢＣＤ４ＣＤ３ｚおよびＢＢＣＤ８ＣＤ３ｚ ＣＡＲ Ｔ細胞が有効な生物活性を有することを示す。
実施例９：癌細胞によって活性化されるＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞
膜貫通タンパク質の標的と異なり、ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞は可溶性ＥＤＢタンパク質または細胞外基質に入ったＥＤＢ含有フィブロネクチンを標的とするため、ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗原刺激が増殖および細胞毒活性を駆動するのに足りるかということはまだ不明である。二代目のＥＤＢ ＣＡＲ（一次シグナルおよび共刺激シグナルを含有する単一キメラ抗原受容体と定義する）、およびＣＤ４ｉｃ－とＣＤ８ｉｃ－を含有するＥＤＢ ＣＡＲの抗原刺激後の増殖活性を測定した。当該測定の１日目と７日目に、Ｕ８７ＭＧ細胞で形質導入されたＴ細胞を刺激し、１０％熱不活性化されたＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０において、エフェクターと標的の比率が５対１であった。図１３に示すように、Ｕ８７ＭＧの刺激によって形質導入されたＴ細胞が急激に生長し、低発現のＢＢＣＤ４ＣＤ３ｚおよびＢＢＣＤ８ＣＤ３ｚ（配列ＩＤ ４、５）ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。注目すべきのは、本発明において、増殖および細胞毒性測定で形質導入されたＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞を総量の約２０％に調節したことである。

実施例１０：様々なＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の癌細胞に対する体外細胞毒性
一次シグナルおよび共刺激シグナルを有するＥＤＢ－ＣＡＲで誘導して形質導入されたＴ細胞の細胞毒活性を測定した。所定のレンチウイルスベクターでヒト初代Ｔ細胞に形質導入し、そしてＵ８７ＭＧ細胞と様々なＥ：Ｔ比率で２４時間インキュベートした。ＬＤＨ測定法によって細胞分解を測定した。データは３つの独立した実験を表す（図１４）。二代目のＥＤＢ ＣＡＲ（一次シグナルおよび共刺激シグナルを含むと定義される）およびＣＤ４ｉｃ－とＣＤ８ｉｃ－を含有するＥＤＢ ＣＡＲはいずれもＵ８７ＭＧ癌細胞に対する顕著な細胞毒活性を示す。ＥＤＢ２８ ＣＡＲ Ｔ細胞はＵ８７ＭＧ癌細胞に対する体外細胞毒性が最も高かった。実施例９における観察に類似するが、低発現ＢＢＣＤ４ＣＤ３ｚおよびＢＢＣＤ８ＣＤ３ｚ（配列ＩＤ ４、５）ＣＡＲ Ｔ細胞が高発現ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞と類似する細胞毒性レベルを示した。
実施例１１：癌細胞によって活性化される二重特異性分子／ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞
本発明の一つの側面では、抗ＣＤ３ε ＳｃＦｖ融合した抗ＥＤＢ ＳｃＦｖを提供するが、二重特異性分子になり、単独で使用してもよく、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７タンパク質と融合した抗ＥＤＢフィブロネクチンＳｃＦｖからなるキメラ抗原受容体と組み合わせて使用してもよい。また、抗ＣＤ３ε ＳｃＦｖと融合した二重特異性抗ＥＤＢ ＳｃＦｖは修飾されたＴ細胞によって分泌される。もう一つの応用において、抗ＣＤ３ε ＳｃＦｖと融合した二重特異性抗ＥＤＢ ＳｃＦｖは単独で生成および使用してもよく、併用してもよい。二重特異性結合物とＥＤＢ抗原およびＣＤ３εがＴ細胞において相互作用することで、Ｔ細胞の増殖および細胞毒性が活性化される。
当該実施例において、二重特異性結合物ＥＤＢ－αＣＤ３（配列番号１８）でＴ細胞に形質導入した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５６４）で形質導入されたＴ細胞を標識し、そしてＵ８７ＭＧ細胞で１：５のエフェクター標的比で刺激した。すべての細胞は１０％熱不活性化されたＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０において生長した。異なる時点で、６３０ ｎｍ励起源でフローサイトメトリーによって細胞を分析した（図１５）。主要ピークに対するトレイリング蛍光（括弧内の領域）はＴ細胞の増殖活性を表す。括弧の上方の数字は総面積の百分率で、Ｔ細胞の増殖部分を表す。当該実施例により、単独の二重特異性ＥＤＢ－αＣＤ３がＴ細胞の増殖を刺激することができることが証明された。
実施例１２：二重特異性分子／ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の癌細胞に対する細胞毒性
Ｕ８７ＭＧ細胞で単独またはＥＤＢ標的ＣＡＲとともに形質導入された二重特異性ＥＤＢ－αＣＤ３（配列番号１８）分子の体外細胞毒活性を測定した（図１６）。所定の分子で形質導入された初代ヒトＴ細胞をＵ８７ＭＧ細胞と様々なＥ：Ｔ比率で２４時間インキュベートした。ＬＤＨ測定法によって細胞分解を測定した。データは３つの独立した実験を表す。二重特異性ＥＤＢ－αＣＤ３（配列番号１８）と１３７Ｐｒｏ（配列番号１０）の組み合わせは協同の細胞毒性を有するように見える。なお、当該組み合わせでは、Ｔ細胞の形質導入に使用されたレンチウイルスベクターは半分に減少したが、細胞毒活性が二代目のＥＤＢ ＣＡＲに相当する。
実施例１３：癌細胞によって活性化される「トランス」ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞
天然ＴＣＲ複合体において、ＩＴＡＭを含有するＣＤ３ζ細胞内ドメインは原形質膜に近い。多くのいわゆる二代目のＣＡＲでは、ＣＤ３細胞内ドメインとＣＤ２８、４－１ＢＢまたはＯＸ４０由来の共刺激シグナルが融合することで、ＩＴＡＭが膜の遠端の位置に置かれる。ＣＤ３ζのリン酸化はその膜近接性に影響され、ＩＴＩＭの遠端の位置はリン酸化に影響する。そのため、ＥＤＢ特異性ＳｃＦｖとＣＤ３ζおよびＣＤ２８細胞外ドメインが融合するようにＥＤＢ ＣＡＲを生成した。同様に、ＥＤＢ特異性ＳｃＦｖはＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＯＸ４０、ＣＤ２８ またはＣＤ１３７から選ばれる膜タンパク質の細胞外ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞内ドメインと融合することができ、ＥＤＢ特異性ＳｃＦｖに連結するリンカー領域（たとえば、配列番号９、１０、１１、１３、１４、１５）を有しても有さなくてもよい。細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインはほかのタンパク質、たとえば、ＣＤ８（たとえば、配列番号１２）から誘導されるものでもよい。
抗ＥＤＢフィブロネクチン一本鎖抗体と全長ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δまたはＣＤ３ζタンパク質が融合すると、抗ＥＤＢ ＳｃＦｖを細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に入らせ、そして部分または全長ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δまたはＣＤ３ζタンパク質と融合した抗ＥＤＢフィブロネクチンＳｃＦｖがＥＤＢ癌抗原と結合すると、ＴＣＲ複合体が集合する。また、共刺激シグナルはＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７タンパク質と融合した単独のポリペプチドの抗ＥＤＢ ＳｃＦｖによって提供される。共刺激シグナル領域は単独のポリペプチドによって提供されるため、このような種類の融合分子をＣＡＲの「トランス」バージョンと定義する。トランスＣＡＲは従来の「シス」ＣＡＲ構造の様態と対比になり、当該構造において、共刺激ドメインは一本のポリペプチド鎖に位置する。
２本のポリペプチドで「トランス」ＥＤＢ－ＣＡＲを生成するが、その１本のＳｃＦｖはＣＤ３εまたはＣＤ３ζと融合して初代Ｔ細胞活性化シグナルに使用され、もう１本はＣＤ１３７またはＣＤ２８共刺激ドメインと融合する。ＣＤ３ζまたは共刺激ドメインのＩＴＡＭドメインが原形質膜に近いため、その形態が天然の構造と最も類似すると推測される。ＴＣＲシグナル伝達に関与するほかの分子（たとえば、ＬＣＫ）は原形質膜にアンカーするため、「トランス」ＣＡＲの形態はＬＣＫに関わるシグナル伝達複合体の形成により理想的である。一次刺激シグナル（たとえば、配列番号１１、１２、１３、１４または１５）を有する任意のＥＤＢ－ＣＡＲは共刺激シグナル（たとえば、配列番号８、９、１０）を有するＥＤＢ－ＣＡＲと組み合わせて「トランス」ＥＤＢ－ＣＡＲを生成することができる。いまの実施例において、Ｔ細胞はＣＤ３ζ（配列番号１２）と融合した抗ＥＤＢ ＳｃＦｖで形質導入し、単独または共刺激シグナル（配列番号がそれぞれ９、１０または８）を有するＥＤＢ ＣＡＲ分子と共に形質導入する。
実施例１に記載のように、「トランス」 ＥＤＢ ＣＡＲの発現テストを行った（図１２を参照する）。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５６４）で形質導入されたＴ細胞を標識し、そしてＵ８７ＭＧ細胞で１：５のエフェクター標的比で刺激した。すべての細胞は１０％熱不活性化されたＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０において生長した。異なる時点で、６３０ ｎｍ励起源でフローサイトメトリーによって細胞を分析した（図１７）。主要ピークに対するトレイリング蛍光（括弧内の領域）はＴ細胞の増殖活性を表す。括弧の上方の数字は総面積の百分率で、Ｔ細胞の増殖部分を表す。
実施例１４：「トランス」ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の癌細胞に対する細胞毒性
「トランス」ＥＤＢ－ＣＡＲは２本の独立したポリペプチド鎖において生じる一次シグナルおよび共刺激シグナルからなる。「トランス」 ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、ＣＤ３ζ（配列番号１２）と融合した抗ＥＤＢ ＳｃＦｖで、単独または共刺激シグナル（配列番号がそれぞれ９、１０または８）を有するＥＤＢ ＣＡＲ分子と共にＴ細胞形質導入する。標的Ｕ８７ＭＧ細胞と様々なＥ：Ｔ比率で２４時間インキュベートすることによって形質導入されたＴ細胞の細胞毒活性の誘導をテストした。ＬＤＨ測定法によって細胞分解を測定した。データは３つの独立した実験を表す（図１８）。なお、「トランス」様態では、Ｔ細胞の形質導入に使用されたレンチウイルスベクターは半分に減少したが、「トランス」 ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒活性が二代目のＥＤＢ ＣＡＲまたは一代目のＣＤ３ζ ＣＡＲに相当する。
実施例１５：癌細胞によって活性化される「Ｈｉ ｊａｃｋ」／ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞
本発明において、全長ＣＤ３ε、 ＣＤ３ζタンパク質でキメラ抗原受容体を生成し、ＥＤＢフィブロネクチン結合ドメインに連結するリンカー領域を有するか、有さない。典型的なＴＣＲ複合体はＴＣＲα、 ＴＣＲβ、 ＣＤ３γ、 ＣＤ３δ、 ＣＤ３ζ および ＣＤ３εサブユニットを含有する。全長ＣＤ３εまたはＣＤ３ζと融合したタンパク質が細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に導入されるため、キメラＥＤＢ ＣＡＲ受容体に導入されたキメラＴＣＲはＭＨＣ Ｉ複合体と独立した形で癌抗原ＥＤＢと結合すると予想される。従来のＣＡＲ構造と逆に、ＴＣＲ複合したＣＡＲはＴＣＲシグナル伝達機能を得て「ｈｉｊａｃｋ」ＣＡＲになり、抗原特異性ＳｃＦｖの抗原特異性およびキメラＴＣＲのＴ細胞に対する活性化のおかげである。腫瘍抗原と結合する。キメラＴＣＲを有する任意の初代Ｔ細胞はＭＨＣ複合体と独立した癌抗原の存在によって活性化される。要するに、従来のＣＡＲ構造は独立した分子とされる。本発明において、「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲは工学的改変によってＴＣＲ複合体に入った受容体である。キメラ「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲの関与によってＥＤＢ抗原はＴＣＲ活性化が触発されることで、ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖および細胞毒性につながる。
「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲは一次のＴ細胞刺激シグナルを提供することができるが、共刺激シグナルは単独のポリペプチドによって提供され、中では、ＥＤＢ特異性ＳｃＦｖがＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７タンパク質のＴ細胞活性化ドメインと融合する。ＥＤＢ ＣＡＲのこのような様態も「トランス」とされてもよい。
当該実施例において、抗ＥＤＢ ＳｃＦｖをリンカー配列（配列番号１１、１３、１４、１５）を有するか、有さないＣＤ３εまたはＣＤ３ζ全長タンパク質と融合させる。本実施例で使用されるＣＤ３εまたはＣＤ３ζポリペプチド断片はＴＣＲ複合体に入るように十分な構造情報を含有する。実際に、ある「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲ（配列番号１１、１３、１４、１５）も「トランス」ＥＤＢ ＣＡＲの様態で使用してもよい。当該実験において、ＣＤ３ζと融合した抗ＥＤＢ ＳｃＦｖ（配列番号１１）または１５アミノ酸のリンカー（配列番号１５）を介してＣＤ３εと融合した抗ＥＤＢ ＳｃＦｖでＴ細胞に単独または共刺激シグナルを有するＥＤＢ ＣＡＲ分子（配列番号９、１０または８）とともに形質導入した。実施例１に記載のように、「ｈｉｊａｃｋ」 ＥＤＢ ＣＡＲの発現テストを行った（図１２を参照する）。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５６４）で形質導入されたＴ細胞を標識し、そしてＵ８７ＭＧ細胞で１：５のエフェクター標的比で刺激した。すべての細胞は１０％熱不活性化されたＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０において生長した。異なる時点で、６３０ ｎｍ励起源でフローサイトメトリーによって細胞を分析した（図１９）。主要ピークに対するトレイリング蛍光（括弧内の領域）はＴ細胞の増殖活性を表す。括弧の上方の数字は総面積の百分率で、Ｔ細胞の増殖部分を表す。「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲを単独のＥＤＢ ＣＡＲポリペプチドがトランスで持つＣＤ２８共刺激ドメインと合わせることにより、増殖の増強が見られた。
実施例１６：「Ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の癌細胞に対する細胞毒性
「Ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲは全長ＣＤ３ζ または ＣＤ３εタンパク質と融合した抗ＥＤＢ ＳｃＦｖを含み、単独のポリペプチド鎖で生成する共刺激分子を有するか、有さない。「ｈｉｊａｃｋ」 ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、ＣＤ３ζまたはＣＤ３ε全長（配列番号１１）と融合した抗ＥＤＢ ＳｃＦｖは、単独または共刺激シグナル（配列番号がそれぞれ９、１０または８）を有するＥＤＢ ＣＡＲ分子と共にＴ細胞に形質導入する。もう一つのバージョンの「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞において、Ｔ細胞は単独または共刺激を有するＥＤＢ ＣＡＲ分子とともにＣＤ３ε全長（配列番号１３、１４または１５）と融合した抗ＥＤＢ ＳｃＦｖでシグナルを伝達する（配列番号がそれぞれ９、１０または８）。標的Ｕ８７ＭＧ細胞と様々なＥ：Ｔ比率で２４時間インキュベートすることによって形質導入されたＴ細胞の細胞毒活性をテストした。ＬＤＨ測定法によって細胞分解を測定した。データは３つの独立した実験を表す（図２０）。なお、「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲが共刺激ＥＤＢ ＣＡＲ分子と結合したとき、Ｔ細胞の形質導入に使用されるレンチウイルスベクターが半分に減少する。
実施例１７：癌細胞によって活性化される「Ｈｉｊａｃｋ Ｐｌｕｓ」ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞
「ｈｉｊａｃｋ」ＣＡＲの「トランス」様態において、抗ＥＤＢフィブロネクチンＳｃＦｖは全長ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ またはＣＤ３ζと（ｈｉｊａｃｋ ＣＡＲ）、あるいは部分または全長ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７と融合し、単独のポリペプチドで、すなわち、トランスで共刺激シグナル伝達ドメインを提供する。「Ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲは工学的改変によってＴＣＲ複合体に組み込まれた受容体であるが、それら自身は増殖の増強に必要な共刺激ドメインが欠けている。特にＥＤＢのような標的では、一次および共刺激シグナルを別々のポリペプチド鎖に分離することでＴ細胞の最適な活性化になるかというのはまだ不明である。この問題を解決するために、一次および共刺激シグナルの「シス」様態を生成し、すなわち、共刺激ドメインを「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲに合併させた（配列番号１６、１７）。このような場合、キメラＴＣＲがＥＤＢ抗原を認識し、ＴＣＲ活性化によって一次生存シグナルを提供し、そしてついている共刺激ドメインによってＴ細胞の増殖および細胞毒性の機能が増強する。
共刺激ドメインを有する「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲを設計するために、ＥＤＢ ＣＤ３εＦＬ（配列番号１５）はそのＣ末端にＣＤ２８またはＣＤ１３７の共刺激ドメインを連結し、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ構築体（配列番号１６、１７）になる。実際に、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＣＡＲでは、抗ＥＤＢフィブロネクチンＳｃＦｖは全長ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ またはＣＤ３ζと融合し、さらに部分または全長ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７と融合することで、共刺激シグナル伝達ドメインを提供することができる。同様のポリペプチド鎖である。抗原に露出することによって活性化される「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞をテストするために、抗「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ（配列番号がそれぞれ１６または１７）でＴ細胞に形質導入した。実施例１に記載のように、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲの発現テストを行った（図１２を参照する）。形質導入されるＴ細胞はＣｅｌｌＴｒａｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５６４）で標識され、そして１：５のエフェクター標的比でＵ８７ＭＧ細胞で刺激し、すべての細胞は１０％熱不活性化されたＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０において生長させ、そして異なる時点で６３０ ｎｍのフローサイトメトリーによって細胞の励起源を分析した（図２１、上方の図）。主要ピークに対するトレイリング蛍光（括弧付きの領域）はＴ細胞の増殖活性を表す。括弧の上方の数字は総面積の百分率で、Ｔ細胞の増殖部分を表す。抗原が存在しない対照と比べ、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞は増殖が活性化されたことが証明された。
図２１の下方の図は、Ｕ８７ＭＧ細胞に露出した後の「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞の形態を描いたものである。ＥＤＢ２８ ＣＡＲ Ｔ（配列番号３）細胞は最も高い集合を示し、主にＴ細胞の活性化後の表面粘着タンパク質によるものである。Ｕ８７ＭＧ細胞による誘導後、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＣＤ３ｅＦＬＣＤ２８ ＣＡＲ Ｔ（配列番号１６）細胞は増殖して顕著に集合した。
実施例１８：「Ｈｉｊａｃｋ Ｐｌｕｓ」ＥＤＢ－ＣＡＲ Ｔ細胞の癌細胞に対する細胞毒性
「Ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ －ＣＡＲは全長ＣＤ３ζ または ＣＤ３εタンパク質と融合した抗ＥＤＢ ＳｃＦｖを含み、共刺激分子が同一のポリペプチド鎖にある。そのため、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲの一次シグナルと共刺激シグナルはシス様態である。このようなシス様態がまだ形質導入されたＴ細胞の細胞毒性を活性化させるかというのをテストするために、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞を生成し、そして標的Ｕ８７ＭＧ細胞と様々なＥ：Ｔ比率で２４時間インキュベートすることによって形質導入されたＴ細胞の細胞毒活性の誘導をテストした。ＬＤＨ測定法によって細胞分解を測定した。データは３つの独立した実験を表す（図２２）。ＣＤ２８共刺激シグナル（配列番号１６）を有する“ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ”ＥＤＢ ＣＡＲは細胞毒性活性を有する。なお、ＣＤ１３７共刺激分子（配列番号１７）を有する“ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ”ＥＤＢ ＣＡＲは軽度ではあるが、顕著な細胞毒性活性を示す。
実施例１９：“ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ” ＥＤＢ ＣＡＲ細胞をＴＣＲ複合体に取り込む
「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲは構造情報のあるＣＤ３ζ または ＣＤ３εポリペプチド断片を含むため、ＴＣＲ複合体に取り込まれるが、ＣＤ２８またはＣＤ１３７共刺激ドメインとの融合によって取り込みが抑制されるかというのはまだ不明である。当該実施例において、ＮＰ－４０洗剤で「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲで形質導入されたＴ細胞を溶かし、そしてビオチンで標識されたポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－０６６－０９７）で免疫沈降させた。ＣＤ３ζ特異性抗体を使用するウエスタンブロッティング（図２３Ａ）またはＣＤ３δ特異性抗体を使用するウエスタンブロッティング（図２３Ｂ）によって免疫沈降物を分析した。ＣＤ３ζでは、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲと複合した約１７ｋＤａのバンド（配列番号１６、１７）が検出され（図２３Ａ）、ＣＤ３δでは、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」と複合した約１９ｋＤａのバンドが検出された。あるいは、「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲ（配列番号１５、１６、１７）であった（図２３Ｂ）。この例により、「ｈｉｊａｃｋ」または「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ（配列番号１５、１６または１７）はＣＤ３δおよびＣＤ３ζと関連することが示され、これらのＥＤＢ ＣＡＲは好適にＴＣＲ複合体に取り込まれ、共刺激ドメインがＣＤ３ζまたはＣＤ３εのＣ末端に融合し、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲの組み立てを邪魔しないことがわかる。
実施例２０：体内における腫瘍の減少および腫瘍生長の抑制
本発明において、一連のＥＤＢ ＣＡＲが構築され、そしてこれらはいずれも体外でＴ細胞の抗原特異的活性化および細胞毒活性の誘導が証明された。しかしながら、いずれの工学的ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍組織を浸透して腫瘍細胞を殺傷することができるかというのはまだ不明である。既に発表された仕事（Ｗａｇｎｅｒら， ２０２１， ＤＯＩ： １０．１１５８／２３２６－６０６６．ＣＩＲ－２０－０２８０）から、二代目のＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞を使用し、腫瘍生長に対する軽度の抑制が現れ、そして既にできた腫瘍組織が減少しなかったことがわかる。当該実施例は、本発明のＥＤＢ ＣＡＲの体内における効果を分析するためのものである。免疫欠損のＮＣＧマウスをＵ８７ＭＧ腫瘍モデルの構築に使用し、６週齢のＮＣＧマウスの背側に腫瘍ができるように、約１００万個のＵ８７ＭＧ細胞を皮下注射した。一旦腫瘍が触れられるようになり、そして測定された腫瘍の大きさが約２０－５０ ｍｍ３になると、マウスを群に分けた（５／群）。尾静脈注射によって５００万の形質導入された各ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞をマウスに注入した。文献では、二代目のＥＤＢ ＣＡＲが腫瘍生長にほとんど抑制作用がないことが報告された（図２４．Ａ）。「トランス」または二重特異性ＥＤＢ ＣＡＲに共刺激シグナルを合わせた場合、腫瘍生長に対する顕著な抑制が示されなかった（図２４．ＢとＣ）。「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞は腫瘍生長に対する軽度の抑制を示した（図２４．Ｄ）。「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞を使用した場合、最も有効な抑制作用が観察され、腫瘍生長が長期間遅延した（図２４．Ｅの上方の図）。注目すべきは、できた腫瘍は治療の早期段階でほとんど検出されないように減少したことであるが（図２４．Ｅの下方の図）、これは「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞は腫瘍組織を浸透して腫瘍細胞を分解させることができ、ほぼ完全な消退を実現することを示す。「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞を１０日注入した後、腫瘍組織が触れられなくなった。そのため、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞毒活性は免疫抑制性微環境に影響されず、すなわち、活性化したＴ細胞が腫瘍組織の免疫抑制によって抑制されず、そして腫瘍細胞を分解させることができ、これは「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞が癌治療の治療剤として有用であることを示し、強い免疫抑制性微環境のある腫瘍でもそうである。
体内研究の実験結果から、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲのみが顕著に腫瘍生長を抑制し、腫瘍消退を促進することができることが示されたが、この発見は先の観察結果と一致し、すなわち、ＣＤ３ζおよびＣＤ２８細胞内ドメインを有する二代目のＥＤＢ ＣＡＲが腫瘍生長を抑える面において良くない。二代目のＥＤＢ ＣＡＲの体内における欠陥はまだ不明ではあるが、ＥＤＢ抗原自身の特殊性によるものかもしれない。ＥＤＢ含有フィブロネクチンは細胞外基質（ＥＣＭ）の構成成分で、腫瘍組織にＥＣＭ、間質沈降および血管周囲を含む多くの形態で存在する。ＥＤＢ含有フィブロネクチンの形態はいずれも完全な膜タンパク質ではなく、体内において典型的な膜タンパク質の横方向の流動性が欠けている。そのため、体内においてＣＤ３ζおよびＣＤ２８細胞内ドメインを有する二代目のＥＤＢ ＣＡＲはクラスター状の構造を形成してＴ細胞の活性化と増殖を増強させるのに不十分であるかもしれない。
逆に、「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞の体外と体内の細胞毒性はいずれも実証された。私たちの発見は少なくとも「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＥＤＢ ＣＡＲ Ｔ細胞が体内で活性化されて細胞毒性を有することを示す。キメラＴＣＲ受容体はＴ細胞の細胞毒性を活性化させて体内における大きな腫瘍負荷を除く。キメラＴＣＲの活性化の機序はまだ不明ではあるが、ＴＣＲ活性化およびシス様態の共刺激シグナル伝達ドメインの存在が必要である。二代目のＣＤ３ζを含有するＥＤＢ ＣＡＲが体内の腫瘍生長の抑制に不十分という減少を合わせると、当該例示は、「ｈｉｊａｃｋ」ＥＤＢ ＣＡＲがさらにＴＣＲ複合体におけるエレメントおよびＣＤ３ ＩＴＡＭ（たとえば、ＣＤ３δおよび／またはＣＤ３γ）を通してシグナルを出していることを示す。また、キメラ「ｈｉｊａｃｋ ｐｌｕｓ」ＴＣＲ複合体の活性化に同時に一次および共刺激シグナルを含む必要があるが、これはシグナロソームの一次および共刺激シグナルとの近接が体内におけるＥＤＢを標的とするキメラ抗原受容体の活性化に重要であることを示す。
ＦＡＳＴＡフォーマットの配列表：
＞ＥＤＢ１３７ｉｃ
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＞ＥＤＢ１３７ｉｃヌクレオチド配列
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＞ＥＤＢ２８ｉｃ
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（配列番号１０）

＞ＥＤＢ ＣＤ３ｚＦＬ ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩ ＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＤＧＳＳＧ ＧＳＧＧＡＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥ ＣＡＲＰＡＡＧＧＡＶＨＱＳＦＧＬＬＤＰＫＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥ ＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴ ＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１１）

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＞ＥＤＢ １０ａａリンカー ＣＤ３ｅＦＬ ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩ ＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＤＧＳＳＧ ＧＳＧＧＡＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩ ＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹ ＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰ ＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ（配列番号１４）

＞ＥＤＢ １５ａａリンカー ＣＤ３ｅＦＬ ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩ ＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＤＧＳＳＧ ＧＳＧＧＡＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰ ＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥ ＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫ ＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ（配列番号１５）

＞ＥＤＢ １５ａａリンカー ＣＤ３ｅＦＬ ＣＤ２８ｉｃ ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩ ＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＤＧＳＳＧ ＧＳＧＧＡＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰ ＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥ ＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫ ＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ
（配列番号１６）

＞ＥＤＢ １５ａａリンカー ＣＤ３ｅＦＬ ＣＤ１３７ｉｃ ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩ ＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＤＧＳＳＧ ＧＳＧＧＡＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰ ＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥ ＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫ ＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥ
Ｌ（配列番号１７）

＞ＥＤＢ－αＣＤ３ ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＳＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩ ＳＧＳＳＧＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＦＰＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＤＧＳＳＧ ＧＳＧＧＡＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＹＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＴＧＲＩＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＲＡＳＧＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫ ＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹ ＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳ ＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡ ＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１８）

Claims (41)

  1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    （１）フィブロネクチンのエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異性を有する抗原結合ドメインと、
    （２）ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７膜タンパク質から選ばれる細胞外ドメインおよび／または膜貫通（ＴＭ）ドメインと、
    （３）共刺激ドメインを有するか、有さないＣＤ３ζ細胞内ＩＴＡＭ（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）ドメインとを含み、
    前記ＣＡＲがＴ細胞の表面に発現された場合、前記ＣＡＲが（ａ）可溶性ＥＤＢ、（ｂ）膜結合ＥＤＢ、および／または（ｃ）細胞外基質（たとえば、細胞付着支持体のフィブロネクチンの網状構造の構成成分である細胞外基質）におけるＥＤＢと結合すると、Ｔ細胞を活性化させることができる、ＣＡＲ。
  2. 前記抗原結合ドメインはｓｃＦｖ、一本鎖抗体、ナノボディ抗体（たとえば、ＶＨＨ（ラクダ科動物Ｉｇ）の誘導体）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ、ＶＨまたはＶＬドメインの誘導体）、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ、二重特異性の二本鎖抗体）および二重親和性再標的化タンパク質（ＤＡＲＴ、二重特異性の二本鎖抗体）；アンチカリン（リポタンパク質の誘導体）；アドネクチン（１０番目のＦＮ３（フィブロネクチン））；設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）；あるいはアビマー（ａｖｉｍｅｒ）である、請求項１に記載のＣＡＲ。
  3. 前記抗原結合ドメインはヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである、請求項１に記載のＣＡＲ。
  4. さらに、抗原結合ドメインとＴＭドメインの間にあるヒンジ／スペーサードメインを含む、請求項１－３のいずれかに１に記載のＣＡＲ。
  5. 前記ヒンジ／スペーサードメインおよびＴＭドメインは同様のタンパク質由来のものである、請求項４に記載のＣＡＲ。
  6. 前記同様のタンパク質はＣＤ８αであり、および前記ヒンジ／スペーサードメインはＣＤ８αの細胞外ドメインである、請求項５に記載のＣＡＲ。
  7. （３）は前記共刺激ドメインを含む、請求項１－６のいずれか１に記載のＣＡＲ。
  8. 前記共刺激ドメインはＣＤ２８由来のものである、請求項７に記載のＣＡＲ。
  9. （３）は２つの共刺激ドメインを含む、請求項１－８のいずれか１に記載のＣＡＲ。
  10. 前記２つの共刺激ドメインはＣＤ２８由来の１つの共刺激ドメイン、および／またはＣＤ２７、４－１ＢＢもしくはＯＸ－４０由来の１つの共刺激ドメインを含む、請求項９に記載のＣＡＲ。
  11. 配列番号１の残基２１－２３６のｓｃＦｖ、ＣＤ８α細胞外ドメインと膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ細胞内ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
  12. さらに、Ｎ末端シグナルペプチド配列（たとえば、ｈＩＬ－２シグナルペプチド配列、または配列番号１の残基１－２０）を含む、請求項１１に記載のＣＡＲ。
  13. 配列番号１のポリペプチドを含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。
  14. 請求項１－１３のいずれか１に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、たとえば、配列番号２のポリヌクレオチド。
  15. ヒト細胞において発現されるようにコドンが最適化されている、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  17. 前記ベクターはウイルスベクターで、Ｔ細胞、マクロファージおよび／またはＮＫ細胞、たとえば、初代ヒトＴ細胞、マクロファージまたはＮＫ細胞において前記ＣＡＲを感染および／または発現させることができるものであることを特徴とする、請求項１６に記載のベクター。
  18. レンチウイルスベクターである、請求項１７に記載のベクター。
  19. 前記レンチウイルスベクターは自己不活性型レンチウイルスベクターである、請求項１８に記載のベクター。
  20. 請求項１－１３のいずれか１に記載のＣＡＲを発現する細胞であって、請求項１４または１５に記載のポリヌクレオチドあるいは請求項１６－１９のいずれか１に記載のベクターを含む細胞。
  21. 前記細胞は免疫細胞である、請求項２０に記載の細胞。
  22. 前記細胞はＴ細胞である、請求項２０に記載の細胞。
  23. 前記細胞はＮＫ細胞である、請求項２０に記載の細胞。
  24. 前記細胞はマクロファージである、請求項２０に記載の細胞。
  25. 前記細胞は患者から分離された初代細胞である、請求項２０－２４のいずれか１に記載の細胞。
  26. 前記細胞は確立された細胞系由来のものであり、たとえば、前記細胞を施用する患者に対して同種異体の細胞系由来のものである、請求項２０－２４のいずれか１に記載の細胞。
  27. 前記細胞はサイトカインを発現する、請求項２０－２６のいずれか１に記載の細胞。
  28. 前記サイトカインはＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ－２１を含む、請求項２７に記載の細胞。
  29. 前記サイトカインの発現は免疫細胞の活性化で活性化するプロモーターによって制御される、請求項２７または２８に記載の細胞。
  30. さらに、免疫細胞の活性を下方調節するための安全スイッチを含む、請求項２０－３０のいずれか１に記載の細胞。
  31. 前記安全スイッチはｉＣａｓｐａｓｅ９（誘導型ｃａｓｐａｓｅ－９）単量体のコード配列を含み、前記ｉＣａｓｐａｓｅ９（誘導型ｃａｓｐａｓｅ－９）単量体は、たとえば、ＦＫＢＰ二量体化で活性化されることで、免疫細胞のアポトーシスが触発される、請求項３０に記載の細胞。
  32. 血管新生抑制作用で治療できる疾患または病態を罹患した被験者において血管新生を抑制する方法であって、前記被験者に治療有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞を施用することを含み、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、
    （１）フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に特異性がある抗原結合ドメインと、
    （２）ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＣＤ１３７膜タンパク質から選ばれる膜貫通（ＴＭ）ドメインと、
    （３）共刺激ドメインを有するか、有さないＣＤ３ζ細胞内ＩＴＡＭ（免疫受容体活性化チロシンモチーフ）ドメインとを含む、方法。
  33. 前記ＣＡＲは請求項１－１３のいずれか１に記載のものである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記疾患または病態は固形腫瘍または慢性炎症性病態である、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. 前記固形腫瘍由来の癌細胞は細胞表面にＥＤＢを発現しない、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記疾患または病態は固形腫瘍であり、および前記方法は、さらに、免疫チェックポイント阻害剤、たとえば、ＰＤ－１阻害剤（たとえば、ペムブロリズマブ、ニボルマブやセミプリマブ）、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（たとえば、アテゾリズマブ、アベルマブやデュルバルマブ）、ＣＴＬＡ－４標的薬（たとえば、イピリムマブ）または免疫調節剤（たとえば、サリドマイドやレナリドミド）を施用することを含む、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 前記慢性炎症性病態は、乾癬、関節リウマチ、関節リウマチ、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎、骨関節炎、喘息、肺線維化、ＩＢＤ）、炎症によって誘導されるリンパ管新生、肥満症、糖尿病、網膜血管新生（ＲＮＶ）、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、メタボリックシンドローム関連疾患、長期間腹膜透析、若年性関節炎またはアテローム性動脈硬化である、請求項３４に記載の方法。
  38. さらに、有効に血管新生を抑制する第二の治療剤を施用することを含む、請求項３２－３７のいずれかに記載の方法。
  39. 前記第二の治療剤は、アキシチニブ、ベバシズマブ、カボザンチニブ、エベロリムス、レナリドミド、パゾパニブ、ラムシルマブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、サリドマイド、バンデタニブおよび／またはジブ－アフリベルセプトを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 体外で請求項１６－１９のいずれかに記載のベクターを前記被験者から分離された初代免疫細胞に導入し、そして任意に体外で前記ベクターを導入された初代免疫細胞を培養および／または増幅することで、前記免疫細胞を生成させる、請求項３２－３９のいずれか１に記載の方法。
  41. さらに、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を抑制する試薬、たとえば、抗ＩＬ－６モノクローナル抗体（たとえば、トシリズマブ）を施用すること、および／またはグロブリン治療を行うことを含む、請求項３２－４０のいずれか１に記載の方法。
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