JP2023542298A - 肺高血圧症を治療又は予防する組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、一般に、肺高血圧症を予防、改善、若しくは治療する、及び／又は肺高血圧症に関連する１つ又は複数のリスク因子、徴候、若しくは症状の重症度を軽減する組成物並びに方法に関する。【選択図】図１０Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月１１日に出願された米国仮出願第６３／０７７，１０２号の利益及び優先権を主張するものであり、同仮出願の開示は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本技術は、一般に、肺高血圧症を予防、改善、若しくは治療する、及び／又は肺高血圧症に関連する１つ又は複数のリスク因子、徴候、若しくは症状の重症度を軽減する組成物並びに方法に関する。

本技術の背景に関する以下の説明は、本技術を理解する助けとして提供しているにすぎず、本技術の先行技術を説明又は構成することを認めるものではない。
肺高血圧症（ＰＨ）は平均肺動脈圧が正常値（安静時２５ｍｍＨｇ、運動時３０ｍｍＨｇ）よりも高い肺疾患である。ＰＨは、動脈性、静脈性、低酸素性、血栓塞栓性、及びその他種々な種類に分類される。これらの様々なＰＨのうち、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）は、通常、予後が極めて悪い。ＰＡＨは更に特発性ＰＡＨ（ＩＰＡＨ）、家族性ＰＡＨ（ＦＰＡＨ）、及び各種疾患に伴うＰＡＨ（ＡＰＡＨ）に分類される。肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）は、内皮機能不全や、内皮細胞及び平滑筋細胞の血管リモデリングによって肺動脈が閉塞し、その結果肺血管抵抗と肺動脈圧が増加する肺血管系の慢性進行性疾患である。治療しなければ、診断から２～３年以内に心拍出量低下、右室不全（肺性心）から最終的に死に至る。
米国では、ＰＡＨの推定発生率及び罹患率は、成人１００万人当たりそれぞれ２．３及び１２．４例である。ＰＡＨは性別や年齢を問わず発症する可能性があるが、女性の発症率は男性のほぼ２倍である。近年、ＰＡＨに関与する潜在的な分子経路の解明が進み、治療アプローチによって一部のＰＡＨ患者では生存期間の延長が認められるものの、ＰＡＨの予後は依然として不良であり、治療法は見つかっていない。

一態様では、本開示は、必要とする対象において肺高血圧症を治療又は予防する方法であって、本技術の組成物の治療有効量（即ち、キナクリン又はそれらの薬学的に許容される塩）を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）を有すると診断されている。特定の実施形態では、対象は特発性ＰＡＨ（ＩＰＡＨ）、家族性ＰＡＨ（ＦＰＡＨ）、又は各種疾患に伴うＰＡＨ（ＡＰＡＨ）を有すると診断されている。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、対象は骨形成タンパク質受容体ＩＩ型（ＢＭＰＲ２）、セロトニン（５－ＨＴＴ）トランスポーター、及びアクチビン様キナーゼＩ型受容体（ＡＬＫ－１）からなる群から選択される変異を有する。追加的又は代替的に、特定の実施形態では、対象は小児患者、高齢患者、免疫不全患者、女性患者、若しくは男性患者であり、及び／又はコーカソイド、南アジア人、東南アジア人、若しくは中東系である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

本明細書に開示する方法のあらゆる実施形態において、キナクリン（ＱＡ）の投与は、ＰＡＨの徴候若しくは症状を予防し、遅延させ、又は軽減する。いくつかの実施形態では、ＰＡＨの徴候又は症状は、労作性持続性呼吸困難、胸痛、めまい、労作性失神寸前状態／失神、動悸、疲労、脱力、拡張した肺動脈による左喉頭神経の圧迫に起因する声のかすれ、頸静脈怒張、肝頸静脈逆流、肝腫大、肝臓痛、下肢浮腫、腹水、全身性浮腫、肺動脈内膜線維症、肺動脈の内膜厚増加、筋性肺動脈の内膜過形成、肺動脈血栓病変、肺細動脈閉塞、肺血管剪定、肺動脈の叢状病変、右室収縮期圧の上昇、右室肥大の増加、肺血管過剰増殖、血清若しくは血漿中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の上昇（＞１８０ｐｇ／ｍＬ）、及び血清若しくは血漿中のｐｒｏＢＮＰのＮ末端フラグメント（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）の上昇（≧１４００ｐｇ／ｍＬ）のうち１つ又は複数を含む。
追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、対象は、キナクリン投与後に右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の低下及び／又は右室肥大（ＲＶＨ）の軽減を示す。追加的又は代替的に、特定の実施形態では、対象は、キナクリン投与後に、血管の筋性動脈化の減少及び／又は肺細動脈の内壁厚の減少を示す。

本明細書に開示する方法のあらゆる実施形態において、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩は、経口、局所、鼻腔内、吸入、胸膜内、全身、静脈内、皮下、腹腔内、皮内、眼内、イオン導入、経粘膜、又は筋肉内投与される。
追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩は、約１～約１５ｍｇ／ｋｇ又は約１～約１０μＭの有効量で投与される。特定の実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩は、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０．５ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１１．５ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１３．５ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１４．５ｍｇ／ｋｇ、又は約１５ｍｇ／ｋｇの有効量で投与される。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩は、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、又は約１０μＭの有効量で投与される。
追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、１つ又は複数の追加的な治療薬を別個に、連続的に、又は同時に対象に投与することを更に含む。追加的な治療薬の例として、エンドセリン受容体拮抗薬（ＥＴＲＡ）、グアニル酸シクラーゼ刺激薬、プロスタサイクリン類似体、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）－５阻害剤、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、シクロスポリン、タクロリムス、ベスタチン、イマチニブ、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、トリメタジジン、ラノラジン、４－フェニルブチレート、タウロウルソデオキシコール酸、及びサルブリナルがあるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩は、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、又は１２週間以上毎日投与される。

キナクリン（ＱＡ）の化学構造である。本明細書で使用する用語「ＰＴ００１」もＱＡを指す。 ＱＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性作用を示すグラフ。様々な濃度（０．１５～５０μＭ）のＱＡで初代ヒト肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）を２４時間処理した。細胞生存率はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅアッセイキットを用いて定量化した。 初代ヒトＰＡＳＭＣにおけるＱＡの濃度依存性抗増殖活性を示すグラフである。初代ヒトＰＡＳＭＣは最大濃度６．２μＭのＱＡで処理した。細胞増殖はＣｙｑｕａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔで定量化した。ヒトＰＡＳＭＣにおけるＱＡの抗増殖活性を示す。３．１及び６．２μＭでの単回ＱＡ処理後、３日目及び５日目に細胞過剰増殖の著しい低下が認められた。 初代ヒトＰＡＳＭＣにおけるＱＡの濃度依存性抗増殖活性を示すグラフである。初代ヒトＰＡＳＭＣは最大濃度６．２μＭのＱＡで処理した。細胞増殖はＣｙｑｕａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔで定量化した。血清飢餓ヒトＰＡＳＭＣにおけるＱＡの抗増殖活性を示す。３．１及び６．２μＭで５日目に、６．２μＭで３日目に細胞過剰増殖の著しい低下が認められた。 初代ウシＰＡＳＭＣにおけるＱＡの濃度依存性抗増殖活性を示すグラフである。ウシ高地ＰＡＳＭＣにおけるＱＡの抗増殖活性を示す。データは実験を３回超繰り返した平均±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。 初代ウシＰＡＳＭＣにおけるＱＡの濃度依存性抗増殖活性を示すグラフである。血清飢餓ウシＰＡＳＭＣにおけるＱＡの抗増殖活性を示す。データは実験を３回超繰り返した平均±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。 初代ウシＰＡＳＭＣにおけるＱＡの濃度依存性抗増殖活性を示すグラフである。ウシＰＡＳＭＣでの５－ヒドロキシトリプタミン誘導性細胞過剰増殖におけるＱＡの抗増殖活性を示す。データは実験を３回超繰り返した平均±ＳＤ（ｎ＝５）を表す。＊ｐ＜０．０５。 蛍光顕微鏡で測定した、初代ヒトＰＡＳＭＣにおけるＱＡの細胞取り込みを示す画像である。 初代ヒトＰＡＳＭＣにおける細胞アポトーシスに対するＱＡの影響を示すグラフである。カスパーゼ３アッセイで測定したアポトーシス誘導における変化を示す。 初代ヒトＰＡＳＭＣにおける細胞アポトーシスに対するＱＡの影響を示すグラフである。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ＦＩＴＣアッセイで測定したアポトーシス誘導における変化を示す。 初代ウシＰＡＳＭＣにおけるオートファジー過程に対するＱＡの影響を示すグラフである。Ｃｙｔｏ－ＩＤ（登録商標）オートファジーで測定した、オートファゴソーム阻害アッセイを用いたリソソーム融合の結果を示す。 初代ウシＰＡＳＭＣにおけるオートファジー過程に対するＱＡの影響を示すグラフである。ウエスタンブロット解析で測定した、ＬＣ３Ｂ－ＩＩ発現アッセイの結果を示す。 ユビキチンＥＬＩＳＡアッセイで測定した、ＩＴＣＨ／ＡＩＰ４ Ｅ３リガーゼ活性を直接阻害するＱＡの能力を示すグラフである。ＱＡは、２０μＭの用量で、ＩＴＣＨ／ＡＩＰ４ Ｅ３リガーゼによるポリユビキチン化全体を低下させ、ＩＴＣＨ／ＡＩＰ４活性によるポリユビキチン化全体の約２５％を低下させる用量依存的な能力を示した。 （図９Ａ）アポトーシス及びリソソーム分解経路の調節におけるＱＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すグラフである。ＰＡＳＭＣは、２４時間血清飢餓させ、次いで血清飢餓培地で様々なＱＡ濃度で処理した。Ｃｙｔｏ－ＩＤ（登録商標）オートファジーキット及びＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ／ＦＩＴＣアポトーシスキットを用いて定量化した。グラフは、蛍光で観察したオートファゴソーム蓄積の増加を示し、従ってオートファジーの阻害を実証している。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊ｐ＜０．０５。（図９Ｂ）アポトーシス及びリソソーム分解経路の調節におけるＱＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すグラフである。ＰＡＳＭＣは、２４時間血清飢餓させ、次いで血清飢餓培地で様々なＱＡ濃度で処理した。Ｃｙｔｏ－ＩＤ（登録商標）オートファジーキット及びＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ／ＦＩＴＣアポトーシスキットを用いて定量化した。グラフは、血清飢餓細胞膜におけるホスファチジルセリンへのＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖの相対的結合を示し、従ってＱＡ処理によるアポトーシス細胞数の増加を実証している。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊ｐ＜０．０５。（図９Ｃ）アポトーシス及びリソソーム分解経路の調節におけるＱＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すグラフである。ウエスタンブロットアッセイキットにより定量化したウシ高地ＰＡＳＭＣにおけるＬＣ３Ｂ－ＩＩ濃度の増加によって表される、ＱＡ（５μＭ）によるオートファジー阻害。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）を表す。＊ｐ＜０．０５。 肺高血圧症（ＰＨ）のモノクロタリン（ＭＣＴ）誘発治療ラットモデルにおけるＱＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。成体オスＳＤラットにＭＣＴ（５０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射して誘発した。ＭＣＴ投与の２１日（３週間）後にＱＡ投与を開始し、１日１回１０ｍｇ／ｋｇを１０日間皮下投与した。グラフは、ＭＣＴ誘発ラットモデルにおける右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の低下を示す。ＱＡは疾患発症後のＲＶＳＰを有意に低下させた。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）を表す。＊ｐ＜０．０５。 ＰＨのＭＣＴ誘発治療ラットモデルにおけるＱＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。成体オスＳＤラットにＭＣＴ（５０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射して誘発した。ＭＣＴ投与の２１日（３週間）後にＱＡ投与を開始し、１日１回１０ｍｇ／ｋｇを１０日間皮下投与した。グラフは、ＭＣＴ誘発ラットモデルにおける右室肥大（ＲＶＨ）の軽減を示す。ＱＡは疾患発症後のＲＶＨを有意に軽減した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）を表す。＊ｐ＜０．０５。 モノクロタリン（ＭＣＴ）誘発ＰＡＨ動物モデルの肺切片の三重染色を示す画像である。 ＭＣＴ誘発ＰＡＨ動物肺組織スライドの免疫蛍光イメージングである。２つの過剰増殖マーカー、Ｋｉ６７及びＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）は、対照と比べてＱＡ治療動物において発現が低下していることがわかる。 ＭＣＴ誘発ＰＡＨ動物肺組織スライドの免疫蛍光イメージングである。ｖＷＦ（フォン・ヴィレブランド因子）又はα平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）は、対照と比べてＱＡ治療動物において発現低下を示していないことがわかる。 ＭＣＴ誘発ＰＡＨ動物モデルにおける肺動脈の内壁厚に対するＱＡの効果を示すグラフである。ＭＣＴ誘発ＰＡＨ動物組織片において肺動脈内壁厚の有意な増加が認められたが（３倍超増加）、ＱＡ治療によりこれが低減し、対照動物と比べて壁厚はほぼ正常に戻った。 肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおけるＱＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。成体雄ラットにＳＵ５４１６（２０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、低酸素（１０％Ｏ²）下に３週間維持した。ＱＡは１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日目から開始し２１日間、１日１回腹腔内投与した。グラフは、ＱＡ治療による右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の低下を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４～５）を表す。＊ｐ＜０．０５。 肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおけるＱＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。成体雄ラットにＳＵ５４１６（２０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、低酸素（１０％Ｏ²）下に３週間維持した。ＱＡは１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日目から開始し２１日間、１日１回腹腔内投与した。グラフは、ＱＡ治療による右室肥大（ＲＶＨ）の軽減を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４～５）を表す。＊ｐ＜０．０５。 肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおけるＱＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。成体雄ラットにＳＵ５４１６（２０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、低酸素（１０％Ｏ²）下に３週間維持した。ＱＡは１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日目から開始し２１日間、１日１回腹腔内投与した。グラフは、ＱＡ治療による肺細動脈（直径＜２００ｍｍ）の筋性動脈化度を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４～５）を表す。＊ｐ＜０．０５。 肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおけるＱＡのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。成体雄ラットにＳＵ５４１６（２０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、低酸素（１０％Ｏ²）下に３週間維持した。ＱＡは１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日目から開始し２１日間、１日１回腹腔内投与した。グラフは、ＱＡ治療による肺細動脈の内壁厚を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４～５）を表す。＊ｐ＜０．０５。 ＳＵ５４１６／低酸素誘発ＰＡＨ動物モデルの肺切片の三重染色を示す。 ＳＵ５４１６／低酸素誘発ＰＡＨ動物モデルの肺動脈の内壁厚に対するＱＡの効果を示す。 ＳＵ５４１６／低酸素誘発ＰＡＨ動物肺組織スライドの免疫蛍光イメージングである。Ｋｉ６７及びｖＷＦのイメージングを示す。Ｋｉ６７は、ＱＡ治療動物において、対照と比べて発現低下を示した。ｖＷＦは、ＱＡ治療動物において、対照と比べて発現低下を示さなかった。 ＳＵ５４１６／低酸素誘発ＰＡＨ動物肺組織スライドの免疫蛍光イメージングである。ＰＣＮＡ及びα－ＳＭＡのイメージングを示す。ＰＣＮＡは、ＱＡ治療動物において、対照と比べて発現低下を示した。α－ＳＭＡは、ＱＡ治療動物において、対照と比べて発現低下を示さなかった。 肺動脈性肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおいて、疾患を引き起こす分子経路をＱＡがｉｎ ｖｉｖｏ調節することを示すグラフである。ＱＡ治療は炎症マーカーＩＬ－６のｍＲＮＡ発現を阻害した。ｍＲＮＡレベルはβ２ミクログロブリンｍＲＮＡで正規化した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～４）を表す。＊ｐ＜０．０５。 肺動脈性肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおいて、疾患を引き起こす分子経路をＱＡがｉｎ ｖｉｖｏ調節することを示すグラフである。ＱＡ治療は平滑筋アクチンマーカーＡｃｔａ２のｍＲＮＡ発現を阻害した。ｍＲＮＡレベルはβ２ミクログロブリンｍＲＮＡで正規化した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～４）を表す。＊ｐ＜０．０５。 肺動脈性肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおいて、疾患を引き起こす分子経路をＱＡがｉｎ ｖｉｖｏ調節することを示すグラフである。ＱＡ治療は内皮細胞増殖マーカーセルピン１のｍＲＮＡ発現を阻害した。ｍＲＮＡレベルはβ２ミクログロブリンｍＲＮＡで正規化した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～４）を表す。＊ｐ＜０．０５。 肺動脈性肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおいて、疾患を引き起こす分子経路をＱＡがｉｎ ｖｉｖｏ調節することを示すグラフである。ＱＡ治療はＢＭＰＲ２活性化マーカーＩｄ１のｍＲＮＡ発現を阻害しなかった。ｍＲＮＡレベルはβ２ミクログロブリンｍＲＮＡで正規化した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～４）を表す。 肺動脈性肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおいて、疾患を引き起こす分子経路をＱＡがｉｎ ｖｉｖｏ調節することを示すグラフである。ｐ６２、ＢＭＰＲ２、及びＬＣ３Ｂ－ＩＩを含む様々な疾患マーカータンパク質の発現について、対応するモノクローナル抗体を用いた、組織（右肺）溶解物のウエスタンブロット解析を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～４）を表す。＊ｐ＜０．０５。 肺動脈性肺高血圧症のＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおいて、疾患を引き起こす分子経路をＱＡがｉｎ ｖｉｖｏ調節することを示すグラフである。ｐ２１、ｐ６５、ｐ５３、リン酸化ｐ５３、及びリン酸化ＡＫＴを含む様々な疾患マーカータンパク質の発現について、対応するモノクローナル抗体を用いた、組織（右肺）溶解物のウエスタンブロット解析を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３～４）を表す。＊ｐ＜０．０５。

本技術の実質的な理解をもたらすために、本方法の特定の態様、様式、実施形態、変形、及び特徴を、以下に様々なレベルの詳細さで記載することを理解されたい。
本発明の方法の実施に当たっては、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学、及び組換えＤＮＡにおける多くの従来技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｄｓ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）ＰＣＲ １：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９９９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２００５）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇａｉｔ ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｄ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと。当技術分野においてポリペプチド遺伝子発現産物のレベル（即ち、遺伝翻訳レベル）を検出及び測定する方法は周知であり、抗体検出及び定量化技術などのポリペプチド検出法が使用できる（Ｓｔｒａｃｈａｎ＆Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９９９）も参照）。

本開示は、必要とする対象において、有効量のＱＡを対象に投与することを含む、肺高血圧症を予防、改善、若しくは治療する方法、及び／又は肺高血圧症に関連する１つ又は複数のリスク因子、徴候、若しくは症状の重症度を軽減する方法を提供する。特定の理論に縛られることは望まないが、ＱＡは、アポトーシス、オートファジー、ＢＭＰＲ２のリソソーム分解、及びＴＧＦ－βシグナル伝達を含むがこれらに限定されないＰＡＨ進行に関与する生物学的経路の上流の複数に作用すると考えられている。本明細書に記載する実施例で示すように、ＱＡは（ｉ）過剰増殖性ＰＡＳＭＣにおけるアポトーシスを誘導し、それにより肺血管過剰増殖を抑制する；（ｉｉ）オートファジーの強力な阻害剤であるため、ＳＭＣ増殖及びがん様増殖を抑制する；（ｉｉｉ）ＢＭＰＲ２のユビキチン化を阻止することによりＢＭＰＲ２分解を阻害し、結果としてリソソーム機構による認識が回避される、並びに（ｉｖ）ＴＧＦ－β１発現を阻害する。従って、ＱＡは肺高血圧症、特にＰＡＨを予防、改善、又は治療する方法において有用である。

定義
別段の定めがない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、一般に、本技術が属する技術分野における通常の技術者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容上明らかに他を規定しない限り、複数の指示物を含む。例えば、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、２つ以上の細胞の組み合せなどを含む。一般に、本明細書で使用する命名法、並びに以下に記載する細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学、及び核酸化学、及びハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野でよく知られ、通常採用されているものである。
本明細書で使用する、数に関する用語「約」は、別段の記載がない限り、又は文脈からそれ以外であることが明らかでない限り、一般に、数のいずれかの方向（より大きい又はより小さい）において１、５、又は１０％の範囲にある数を含むとみなされる（ただし、そのような数が、可能な値の０％未満又は１００％超となる場合を除く）。

本明細書で使用する、対象への薬剤又は薬物の「投与」は、その意図する機能を果たすために化合物を対象に導入又は送達する任意の経路を含む。投与は、経口、鼻腔内、吸入、胸膜内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、若しくは皮下）、直腸、髄腔内、又は局所を含むがこれらに限定されない任意の好適な経路によって実施できる。投与は、自己投与及び他者による投与を含む。
本明細書で使用する「対照」は、比較を目的として試験で使用する別の試料である。対照は「陽性」又は「陰性」であり得る。例えば、試験の目的が、特定種類の疾患の治療について治療薬の有効性の相関関係を決定することである場合、通常、陽性対照（所望の治療効果を示すことが知られている化合物又は組成物）と陰性対照（治療を受けない、又はプラセボを受け取らない対象又は試料）を使用する。
本明細書で使用する用語「有効量」は、所望の治療効果及び／又は予防効果を達成するのに十分な量、例えば、本明細書に記載する疾患若しくは状態、又は本明細書に記載する疾患若しくは状態に関連する１つ若しくは複数の徴候若しくは症状の予防又は軽減をもたらす量を指す。治療又は予防用途において、対象に投与する組成物の量は、組成物、疾患の程度、種類、及び重症度、並びに個人の特性、例えば全体的な健康、年齢、性別、体重、及び薬物耐性に応じて異なる。当業者は、これら及びその他の因子に応じて適切な投与量を決定する。組成物は、１つ又は複数の追加的な治療化合物と組み合わせて投与することもできる。本明細書に記載する方法では、治療組成物は、本明細書に記載する疾患又は状態の１つ又は複数の徴候又は症状を有する対象に投与してよい。本明細書で使用する、組成物の「治療有効量」は、疾患又は状態の生理作用を改善又は除去する組成物レベルを指す。治療有効量は１回又は複数回の投与で与え得る。

本明細書で使用する「発現」は、以下の１つ又は複数を含む：前駆ｍＲＮＡへの遺伝子の転写；前駆ｍＲＮＡのスプライシング及び他のプロセッシングによる成熟ｍＲＮＡの産生；ｍＲＮＡの安定；タンパク質への成熟ｍＲＮＡの翻訳（コドン使用頻度及びｔＲＮＡ利用度を含む）；並びに適切な発現及び機能のために必要である場合は、翻訳産物のグリコシル化及び／又は他の修飾も含む。
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、発現を制御するプロモーター、エクソン、イントロン、及び他の非翻訳領域を含む、ＲＮＡ産物の生合成調節のための情報全てを含むＤＮＡのセグメントを意味する。
本明細書で使用する用語「個人」、「患者」、又は「対象」は、個体、脊椎動物、哺乳動物、又はヒトであり得る。いくつかの実施形態では、個人、患者、又は対象はヒトである。
本明細書で使用する用語「薬学的に許容可能な担体」は、医薬品の投与に適合する、あらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌及び抗真菌化合物、等張及び吸収遅延化合物などである。薬学的に許容可能な担体及びそれらの製剤は当業者に知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）に記載されている。

本明細書で使用する、障害又は状態の「予防」又は「予防すること」は、化合物が、統計的試料において、未治療の対照試料と比べて、治療した試料で障害若しくは状態の発生を減少させること、又は未治療の対照試料と比べて、障害若しくは状態の１つ若しくは複数の症状の発現を遅延させることを指す。本明細書で使用する、肺高血圧症を予防することは、肺高血圧症の発生を予防する又は遅延させることを含む。本明細書で使用する、肺高血圧症の予防は、肺高血圧症の１つ若しくは複数の徴候又は症状の再発を予防することも含む。
本明細書で使用する用語「別個の」治療的使用は、少なくとも２つの有効成分の同時の投与、又は異なる経路での実質的に同時の投与を指す。
本明細書で使用する用語「連続的な」治療的使用は、異なる時間における少なくとも２つの有効成分の投与を指し、投与経路は同じでも異なっていてもよい。より具体的には、連続的な使用は、１つの有効成分を完全に投与した後に、他の有効成分（複数可）の投与を開始することを指す。従って、他の有効成分（複数可）の投与前に、数分、数時間、又は数日にわたって１つの有効成分を投与することが可能である。この場合、同時治療は行わない。
本明細書で使用する用語「同時の」治療的使用は、同じ経路で同時に、又は実質的に同時に少なくとも２つの有効成分を投与することを指す。
本明細書で使用する用語「治療薬」は、有効量で存在する場合、必要とする対象に所望の治療効果をもたらす化合物を意味すると意図される。
本明細書で使用する「治療すること」又は「治療」は、ヒトなどの対象における、本明細書に記載する疾患又は障害の治療を含み、（ｉ）疾患又は障害を抑制する、即ちその発症を妨げること；（ｉｉ）疾患又は障害を軽減する、即ち障害を後退させること；（ｉｉｉ）障害の進行を遅らせること；及び／又は（ｉｖ）疾患又は障害の１つ若しくは複数の症状の進行を抑制、軽減する、又は遅らせること、を含む。いくつかの実施形態では、治療は、疾患に関連する症状を、例えば改善、軽減する、治癒させる、又は寛解状態に置くことを意味する。
本明細書に記載する障害の治療又は予防の様々な態様は、完全な治療だけでなく完全な治療未満も含み、何らかの生物学的又は医学的に関連する結果が達成される「実質的」を意味すると意図されることも理解されたい。治療は、慢性疾患の継続的な長期治療でも、急性状態の治療のための単回若しくは数回の投与であってもよい。

肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）
ＰＡＨは、心臓から肺に血液を運ぶ血管である肺動脈の血圧の異常な高さ（高血圧）を特徴とし、肺高血圧症（ＰＨ）として知られる上位状態の一形態である。
ＰＡＨは、血管収縮、中膜肥厚、細胞増殖、線維症、複雑な病変（叢状病変）、及びｉｎ ｓｉｔｕ血栓症を特徴とする。肺動脈の変化は、肺動脈の３つの層、即ち外膜、中膜、及び内膜の全てで生じる。ＰＡＨの重要な病理学的変化には、血管収縮、動脈リモデリング／炎症、叢状病変、及び血栓性病変がある。血管収縮によって内腔が狭まり、内弾性板がきつく折り畳まれ、そのひだに内皮細胞が挟まれる。動脈リモデリング及び炎症は、平滑細胞と線維芽細胞の増殖や移動、及びリンパ組織新生による新生内膜形成と共に、外膜と中膜の肥厚を引き起こす。肺血管収縮が長期化すると、血管収縮物質（エンドセリン）濃度の増加、及び血管拡張物質（一酸化窒素やプロスタサイクリン）の産生低下を特徴とする内皮機能不全に至る。こうした機構に基づいて、ＰＡＨの発症に関与する因子を抑制する薬剤が開発されている。ＰＡＨはまれであり、ＢＭＰＲ２、５－ＨＴＴ、及びアクチビン様キナーゼＩ型受容体における変異など、素因となる遺伝要因と関連している。

ＰＡＨの徴候及び／又は症状には、労作性持続性呼吸困難、胸痛、めまい、労作性失神寸前状態／失神、動悸、疲労、脱力、拡張した肺動脈による左喉頭神経の圧迫に起因する声のかすれ、頸静脈怒張、肝頸静脈逆流、肝腫大、肝臓痛、下肢浮腫、腹水、全身性浮腫、肺動脈内膜線維症、肺動脈の内膜厚増加、筋性肺動脈の内膜過形成、肺動脈血栓病変、肺細動脈閉塞、肺血管剪定、肺動脈の叢状病変、右室収縮期圧の上昇、右室肥大の増加、肺血管過剰増殖、血清若しくは血漿中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の上昇（＞１８０ｐｇ／ｍＬ）、及び血清若しくは血漿中のｐｒｏＢＮＰのＮ末端フラグメント（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）の上昇（≧１４００ｐｇ／ｍＬ）があるがこれらに限定されない。
併存する他の基礎疾患に起因することの多い非特異的症状を伴う様々な病態生理学的・血行動態的機序によって起こるＰＡＨの診断は特に難しく、そのため段階的アプローチが必要となる。通常は最初に病歴と身体検査を評価する。ＰＡＨを診断し、他の疾患を排除するために一般に実施される検査は、心エコー検査、血液検査、肺機能検査、胸部Ｘ線、肺血流スキャン、心電図検査（ＥＣＧ）、及び６分間でどのくらい歩けるかを調べる「６分間歩行テスト」である。最終的に大部分の対象は、血管拡張検査を併う、又は伴わない心カテーテル法によって確認される。

リスク集団。ＢＭＰＲ２変異若しくはＰＡＨを引き起こす可能性のある他の変異の保有が判明している罹患家族が複数人いる個人、又は結合組織病（ＣＴＤ）若しくはＨＩＶを有する個人は、ドプラ心エコー検査などの方法によるスクリーニングが推奨される。
身体検査。鑑別診断に役立ち得る徴候のいくつかに、狭心症、労作時呼吸困難、運動不耐性、疲労、及び失神の病歴があるが、関連する徴候はこれらに限らない。身体検査時にパルスオキシメトリの異常値、三尖弁逆流、下肢の浮腫、及び右心不全の徴候が認められた場合、その一部はＰＡＨを示唆する徴候である可能性がある。これらの徴候のいずれかを呈する患者には、まず心エコー検査などの非侵襲的検査を実施する。
右心カテーテル検査（ＲＨＣ）及び血管拡張検査。右心カテーテル検査は今なおＰＡＨの診断基準である。重要な予後情報が得られる右心カテーテル検査は、肺毛細管楔入圧（ＰＣＷＰ）を測定して肺静脈高血圧を除外するために不可欠である。適切なＰＣＷＰ追跡が得られない場合は、左室拡張末期圧を測定すべきである。更に、混合静脈飽和度を抽出し、心拍出量の測定値を得る必要がある。ＰＡＨの血行動態的定義は、平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）≧２５ｍｍＨｇ、ＰＣＷＰ≦１５ｍｍＨｇ、肺血管抵抗＞３Ｗｏｏｄ単位である。

速効性で持続時間の短い血管拡張剤の投与によってｍＰＡＰ及び肺血管抵抗が急激に低下する度合いは、血管平滑筋の収縮が高血圧状態に関与する程度を反映している。血管拡張反応はＩＰＡＨの治療に大きな影響を及ぼすため、大部分の患者では最初の心カテーテル検査時に血管拡張剤の試験を実施する必要がある。急性血管拡張試験には、エポプロステノールの静脈内投与、アデノシンの静脈内投与、及びＮＯ吸入がよく用いられる。レトロスペクティブなデータに基づいて、この反応を有する患者はカルシウムチャネル遮断薬を用いた治療に対して有益な血行動態及び臨床反応を示す可能性が最も高いという観察から、良好な反応として一致した定義は、ｍＰＡＰが少なくとも１０ｍｍＨｇ低下して４０ｍｍＨｇ以下の値になることである。この反応が得られない患者はカルシウムチャネル遮断薬による治療で改善する可能性が低いが、この反応が得られた患者では、カルシウムチャネル遮断薬による治療を行い、治療の安全性と有効性の両方について注意深く追跡してよい。血管拡張反応が顕著な場合は、疾患の初期段階又は質的に異なる疾患過程を反映している可能性がある。

ＰＡＨの現在の治療法
ＰＡＨの現在の治療選択肢には、支持療法及び疾患特異的療法がある。
支持療法
ＰＡＨ患者の支持的管理では、経口抗凝固薬、利尿薬、酸素、ジゴキシン、及び貧血の管理が必要となることがある。右心不全と不動と併せて、凝固及び線維素溶解経路に異常があるため、特定の種類のＰＡＨでは静脈血栓塞栓症の可能性がある。体液貯留、腹水、末梢性浮腫、及びその他の関連症状をもたらす非代償性右心不全の症状を有する患者では、利尿療法を考慮してもよい。酸素は末梢血管抵抗を低下させることが示されているが、長期治療が有益であるとは示されていない。慢性閉塞性肺疾患を有し、動脈血酸素圧が低く、症状改善が認められ、且つ労作時労作時脱飽和度の治療可能な患者では、酸素投与が推奨される場合がある。ジゴキシンはＩＰＡＨの心拍出量を改善し、動脈の頻脈性不整脈を有する患者の心拍数を遅くすることがある。ＰＨでの慢性使用における有効性の証拠は不足している。この集団では鉄欠乏がよく見られるため、それが診断された場合には鉄分補給が推奨できる。理論的には、これらの患者では経口療法で吸収障害が生じるため、通常、経口療法よりも静脈内鉄分補給が好ましい。

標的／特異的薬物療法
現在のＰＡＨ特異的療法は、電位依存性カルシウムチャネル、Ｌ型カルシウムチャネル、一酸化窒素－サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、エンドセリン、及びプロスタサイクリンなどのＰＡＨ関連分子経路の構成要素を標的としている。
カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）。ＣＣＢは、血管拡張試験で良好な結果（例えば、ＲＨＣ時の急性血管拡張試験に反応してｍＰＡＰが１０～４０ｍｍＨｇ低下し、心拍出量は低下しない）が記録されているＰＡＨ患者のみに指示される。こうした患者はまれで（全症例の５～１０％）、様々な自然史を有し、ＣＣＢ単独療法での５年生存率が９０％である。ＣＣＢで治療した患者は、反応が適切か注意深くモニタリングし、症状が進行した場合はＰＡＨ特異的療法に移行すべきである。ＡＰＡＨ患者では、ＣＣＢに対して長期的に適切な反応が得られることはまれである。
一酸化窒素刑を標的とする薬物。一酸化窒素は、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）を活性化させてｃＧＭＰを産生する強力な肺血管拡張物質である。ｃＧＭＰは、伝導度が高いカルシウム感受性カリウムチャネルＢＫ_caを含む下流標的を活性化するｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼによって、肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）の弛緩を引き起こす。ＰＡＨ患者は、一酸化窒素を合成する内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の肺発現が低下し、ｃＧＭＰを５’－ＧＭＰに分解するホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）の発現が増加している。それによるｃＧＭＰの減少は、ＰＡＨにおける有害な肺血管リモデリングに関与している。ＰＤＥ５阻害剤及びｓＧＣ刺激剤は一酸化窒素－ｃＧＭＰ経路を増強し、ＰＡＨの治療に認可されている。ＰＡＨにおける長期吸入一酸化窒素の安全性と有効性は第ＩＩＩ相試験で評価中である（ＮＣＴ０２７２５３７２）。
ＰＤＥ５阻害剤であるシルデナフィル及びタダラフィルは、ＰＡＨの治療に認可されている。ＰＤＥ５阻害剤の主な副作用に、頭痛、潮紅、消化不良、及び鼻出血がある。
ｓＧＣ刺激剤リオシグアトは一酸化窒素とは無関係にｓＧＣを直接刺激し、ｃＧＭＰ及び肺血管拡張を増加させる。ＧＣ刺激剤及びＰＤＥ５阻害剤は、低血圧のリスクがあるため、同時に投与してはならない。しかし、ＰＤＥ５阻害剤からｓＧＣ刺激剤に移行すると、ＰＤＥ５阻害剤に対する反応が十分でない患者の運動能力と血行動態的が改善する。リオシグアトで最もよく見られる有害作用は、頭痛、めまい、低血圧、消化不良、及び胃食道逆流である。

エンドセリン受容体拮抗薬。エンドセリンは強力な血管収縮物質であり、平滑筋分裂促進因子である。エンドセリンＡ及びエンドセリンＢ受容体を通じて作用する。エンドセリンはＰＡＨ患者の肺及び血漿中で過剰発現する。内皮受容体拮抗薬（ＥＲＡ）であるボセンタン、アンブリセンタン、及びマシテンタンはＰＡＨに有効である。ＥＲＡの主な有害副作用に、肝毒性、末梢性浮腫、貧血、及び鼻閉がある。
プロスタサイクリン経路を標的とする薬物。プロスタサイクリン及びプロスタノイドは、環状アデノシン一リン酸の濃度を増加させ、非選択的肺血管拡張を引き起こすプロスタサイクリン（ＩＰ）受容体に結合する。これらは、抗血小板特性、抗血栓特性、抗増殖特性、及び抗炎症特性も有する。プロスタサイクリン発現は、ＰＡＨ患者の肺では低下している。プロスタノイドにはエポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、及びベラプロストがあるがこれらに限定されない。セレキシパグは、ＩＰ受容体の経口投与可能な非プロスタノイド活性化剤である。
心房中隔欠損作成術及び肺移植。心房中隔欠損作成術は、左右の心房間シャントを作成して心拍出量を増加させるものであり、全身動脈血酸素飽和度が低下していても、全身の酸素運搬を増加させ、右心不全の徴候及び症状を抑制し得る。高度先進医療が利用できる場合、心房中隔欠損作成術は、治療にもかかわらず難治性右心不全又は失神／失神寸前を呈する患者を適切に選択した上で、改善措置又は肺移植への橋渡しとして使用される。最新の医療が利用できない地域では、心房中隔欠損作成術が一次治療として使用されることもある。この処置にはかなりのリスクが伴うため、経験豊富な術者のみが行うべきである。肺移植は、一般に、利用可能な最善の薬物療法に失敗した場合にのみ行われる。肺移植を受けたＰＡＨ患者の１年後の生存率は約６６～７５％である。殆どの施設では、両肺移植が選択される。心臓と肺の移植は、一般に、複雑な先天性心疾患を持つ患者にのみ行われる。
現在利用可能な治療があるにもかかわらず、ＰＡＨの予後は依然として不良であり、この疾患の治療法はまだ確立されていない。これまでのＰＡＨ治療は、こうした従来の薬物療法が、細胞機能に直接関与している下流経路を標的とし、これに作用するため限定的である。このような戦略は症状軽減をもたらすにすぎず、疾患の逆転や持続的な臨床反応は達成できない。更に、標的となる下流経路は飽和性であるため、一般に獲得耐性が生じ、無反応性の患者の大部分は侵襲的な肺移植を選択せざるを得ない。

本技術の組成物を使用したＰＡＨの治療方法
一態様では、本開示は、必要とする対象において肺高血圧症を治療又は予防する方法であって、本技術の組成物の治療有効量（即ち、キナクリン又はそれらの薬学的に許容される塩）を対象に投与することを含む方法を提供する。キナクリンの化学構造は図１に示す。いくつかの実施形態では、対象は肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）を有すると診断されている。いくつかの実施形態では、対象は特発性ＰＡＨ（ＩＰＡＨ）、家族性ＰＡＨ（ＦＰＡＨ）、又は各種疾患に伴うＰＡＨ（ＡＰＡＨ）を有すると診断されている。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、対象は、骨形成タンパク質受容体ＩＩ型（ＢＭＰＲ２）、セロトニン（５－ＨＴＴ）トランスポーター、及びアクチビン様キナーゼＩ型受容体（ＡＬＫ－１）からなる群から選択される変異を有する。追加的又は代替的に、特定の実施形態では、対象は小児患者、高齢患者、免疫不全患者、女性患者、若しくは男性患者であり、及び／又はコーカソイド、南アジア人、東南アジア人、若しくは中東系である。
本明細書に開示する方法のあらゆる実施形態において、ＱＡの投与は、ＰＡＨＰＡＨの徴候若しくは症状を予防し、遅延させ、又は軽減する。いくつかの実施形態では、ＰＡＨの徴候又は症状は、労作性持続性呼吸困難、胸痛、めまい、労作性失神寸前状態／失神、動悸、疲労、脱力、拡張した肺動脈による左喉頭神経の圧迫に起因する声のかすれ、頸静脈怒張、肝頸静脈逆流、肝腫大、肝臓痛、下肢浮腫、腹水、全身性浮腫、肺動脈内膜線維症、肺動脈の内膜厚増加、筋性肺動脈の内膜過形成、肺動脈血栓病変、肺細動脈閉塞、肺血管剪定、肺動脈の叢状病変、右室収縮期圧の上昇、右室肥大の増加、肺血管過剰増殖、血清若しくは血漿中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の上昇（＞１８０ｐｇ／ｍＬ）、及び血清若しくは血漿中のｐｒｏＢＮＰのＮ末端フラグメント（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）の上昇（≧１４００ｐｇ／ｍＬ）のうち１つ又は複数を含む。

追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、対象は、キナクリン投与後に右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の低下及び／又は右室肥大（ＲＶＨ）の軽減を示す。ＲＶＳＰは、一般に、当業者には既知の右心カテーテル検査（上記参照）を用いて決定する。いくつかの実施形態では、対象はキナクリン投与後に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のＲＶＳＰ低下を示す。特定の実施形態では、対象はキナクリン投与後に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のＲＶＨ軽減を示す。
追加的又は代替的に、対象はキナクリン投与後に、血管の筋性動脈化の減少及び／又は肺細動脈の内壁厚の減少を示す。いくつかの実施形態では、対象はキナクリン投与後に、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％、少なくとも１７０％、少なくとも１８０％、少なくとも１９０％、少なくとも２００％、少なくとも２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも２３０％、少なくとも２４０％、少なくとも２５０％、少なくとも２６０％、少なくとも２７０％、少なくとも２８０％、少なくとも２９０％、少なくとも３００％、少なくとも３１０％、少なくとも３２０％、少なくとも３３０％、少なくとも３４０％、少なくとも３５０％、少なくとも３６０％、少なくとも３７０％、少なくとも３８０％、少なくとも３９０％、少なくとも４００％の内壁厚減少を示す。

追加的又は代替的に、対象はＱＡの投与後に、Ｋｉ６７、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、及びセルピン１などの過剰増殖バイオマーカーの発現低下を示す。追加的又は代替的に、対象はＱＡの投与後に、ＩＬ－６及び／又はＡｃｔａ２の発現低下を示す。
追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、本技術の方法は、１つ又は複数の追加的な治療薬を別個に、連続的に、又は同時に対象に投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、追加的な治療薬は、エンドセリン受容体拮抗薬（ＥＴＲＡ）、グアニル酸シクラーゼ刺激薬、プロスタサイクリン類似体、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）－５阻害剤、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、シクロスポリン、タクロリムス、ベスタチン、イマチニブ、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、トリメタジジン、ラノラジン、４－フェニルブチレート、タウロウルソデオキシコール酸、及びサルブリナルからなる群から選択される。
本明細書に開示する方法の任意の実施形態では、対象はヒトであり得る。

投与方法及び効果的な投与量
細胞、器官、又は組織とＱＡとの接触には、当技術分野で既知の方法を使用し得る。好適な方法に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏ法がある。ｉｎ ｖｉｖｏ法は、通常、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩の、哺乳動物、好適にはヒトへの投与を含む。ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩は、ｉｎ ｖｉｖｏで治療に用いる場合、有効量（即ち、所望の治療効果を有する量）を対象に投与する。用量及び投与レジメンは、対象の疾患状態の程度、使用する特定の組成物の特徴、例えばその治療指数、対象、及び対象の病歴によって決まる。
有効量は、医師及び臨床医によく知られている方法によって、前臨床試験及び臨床試験中に決定し得る。方法において有用なＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩の有効量は、医薬組成物の投与方法として既知の数多くの方法のいずれかによって、必要とする哺乳動物に投与し得る。ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を含む組成物は、全身又は局所に投与し得る。本明細書に開示する方法のあらゆる実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩は、経口、局所、鼻腔内、吸入、胸膜内、全身、静脈内、皮下、腹腔内、皮内、眼内、イオン導入、経粘膜、又は筋肉内投与される。

ＱＡは薬学的に許容される塩として処方し得る。用語「薬学的に許容される塩」は、哺乳動物などの患者への投与に許容される塩基又は酸から調製される塩を意味する（例えば、既定の投与レジメンに対して哺乳動物の安全性が許容できる塩）。しかしながら、患者への投与を意図しない中間組成物の塩などの塩は薬学的に許容される塩である必要がないことが理解される。薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機又は有機塩基、及び薬学的に許容される無機又は有機酸に由来し得る。加えて、組成物が、アミン、ピリジン、又はイミダゾールなどの塩基性部分と、カルボン酸又はテトラゾールなどの酸性部分の両方を含む場合、双性イオンが形成されることがあり、これは本明細書で使用する用語「塩」に含まれる。薬学的に許容される無機塩基に由来する塩には、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第二鉄塩、第一鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第二マンガン塩、第一マンガン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、及び亜鉛塩などがある。薬学的に許容される有機塩基に由来する塩には、置換アミン、環状アミン、天然に存在するアミンなどを含む第一級、第二級、第三級アミン、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２－ジエチルアミノエタノール、２－ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ－エチルモルホリン、Ｎ－エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン（ｐｉｐｅｒａｄｉｎｅ）、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどがある。薬学的に許容される無機酸に由来する塩には、ホウ酸、炭酸、ハロゲン化水素酸（臭化水素酸、塩酸、フッ化水素酸、又はヨウ化水素酸）、硝酸、リン酸、スルファミン酸、及び硫酸の塩がある。薬学的に許容される有機酸に由来する塩には、脂肪族ヒドロキシル酸（例えば、クエン酸、グルコン酸、グリコール酸、乳酸、ラクトビオン酸、リンゴ酸、及び酒石酸）、脂肪族モノカルボン酸（例えば、酢酸、酪酸、ギ酸、プロピオン酸、及びトリフルオロ酢酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸など）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸、ｐ－クロロ安息香酸、ジフェニル酢酸、ゲンチシン酸、馬尿酸、及びトリフェニル酢酸）、芳香族ヒドロキシル酸（例えば、ｏ－ヒドロキシ安息香酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸、１－ヒドロキシナフタレン－２－カルボン酸、及び３－ヒドロキシナフタレン－２－カルボン酸）、アスコルビン酸、ジカルボン酸（例えば、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸、及びコハク酸）、グルクロン酸、マンデル酸、ムチン酸、ニコチン酸、オロチン酸、パモ酸、パントテン酸、スルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸、樟脳スルホン（ｃａｍｐｈｏｓｕｌｆｏｎｉｃ）酸、エジシル（ｅｄｉｓｙｌｉｃ）酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２，６－ジスルホン酸、及びｐ－トルエンスルホン酸）、キシナホ酸などがある。

医薬組成物は、通常、投与の意図する経路に適合するように処方される。投与経路の例として、非経口（例えば、静脈内、皮内、腹腔内、又は皮下）、経口、吸入、経皮（局所）、眼内、イオン導入、及び経粘膜投与がある。
本明細書に記載する組成物又はそれらの薬学的に許容される塩は、本明細書に記載するＰＡＨの治療又は予防として対象に単独又は併用で投与するために、医薬組成物に包含できる。そのような組成物は、通常、活性剤及び薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」には、医薬品投与に適合する生理食塩水、溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などがある。追加の活性組成物も組成物に包含できる。
例えば、ＬＤ５０（集団の５０％で致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療効果のある用量）を決定するために、任意の治療薬の投与量、毒性、及び治療有効性を、細胞培養又は実験動物における標準的な製薬手順によって決定できる。毒性効果と治療効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。治療指数が高い組成物が有利である。毒性の副作用を示す組成物を使用してもよいが、非感染細胞に損傷を与える可能性を最小限にして副作用を低減するために、このような組成物を罹患組織の部位に向ける送達システムをデザインするよう気をつける必要がある。
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトで使用する投与量の範囲を策定する際に使用できる。このような組成物の投与量は、殆ど又は全く毒性がない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内とし得る。投与量は、採用する剤形及び利用する投与経路に応じて、この範囲内で変化してよい。方法で使用する任意の組成物について、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから推定できる。細胞培養で決定したＩＣ５０（即ち、症状の半数阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルで用量を策定できる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量を正確に決定するために使用できる。血漿中濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定してよい。

例示的な治療レジメンでは１日１回又は１週間に１回の投与を行う。治療用途では、疾患の進行が抑制される若しくは停止するまで、又は対象が疾患の症状の部分的若しくは完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投与量が必要となることがある。その後、患者には予防レジメンを投与できる。
通常、治療効果又は予防効果を得るのに十分な組成物の有効量は、約０．０００００１～約１０，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。好適には、投与量は約０．０００１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。例えば投与量は、毎日、１日おきに、若しくは２日おきに１若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は毎週、２週間ごとに、若しくは３週間ごとに１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。一実施形態では、組成物の単回投与量は０．００１～１０，０００μｇ／ｋｇ体重の範囲である。一実施形態では、担体中の組成物濃度は０．２～２０００μｇ／ｍｍ送達の範囲である。例示的な治療レジメンでは、１日１回又は１週間に１回の投与を行う。治療用途では、疾患の進行が抑制される若しくは停止するまで、又は対象が疾患の症状の部分的若しくは完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投与量が必要となることがある。その後、患者には予防レジメンを投与できる。
いくつかの実施形態では、組成物の治療有効量は、標的組織における組成物の濃度が１０^-12～１０^-6モル、例えば、およそ１０^-7モルと定義し得る。この濃度は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの全身用量、又は体表面積による相当用量で送達し得る。用量の計画は、１日１回又は１週間に１回の投与などにより、ただし継続投与も含み、標的組織で治療濃度が維持されるように最適化されよう（例えば、非経口注入又は経皮投与）。

当業者は、疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要な投与量及びタイミングに影響し得ることを理解するであろう。更に、本明細書に記載の治療組成物の治療有効量による対象の治療は、単回の治療又は一連の治療を含み得る。
本発明の方法に従って治療される哺乳動物は、例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、及びウマなどの家畜、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ラット、マウス、及びウサギなどの実験動物を含む任意の哺乳動物であり得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。

治療及び／又は予防用途では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を含む組成物を対象に投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を約１～約１５ｍｇ／ｋｇの有効量で投与する。特定の実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０．５ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１１．５ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１３．５ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１４．５ｍｇ／ｋｇ、又は約１５ｍｇ／ｋｇの有効量で投与する。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を約１～約１０μＭの有効量で投与する。特定の実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、又は約１０μＭの有効量で投与する。列挙した値の中間の値及び範囲も本開示の一部とみなされる。

いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を１日に１、２、３、４、又は５回投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を１日に６回以上投与する。追加的又は代替的に、いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を毎日、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、又は５日おきに投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を毎週、２週間ごとに、３週間ごとに、又は毎月投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を１、２、３、４、又は５週間にわたって投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を６週間以上投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を１２週間以上投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を１年未満の期間にわたって投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を１年以上の期間にわたって投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を対象の生涯にわたって投与する。
いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を１週間以上にわたって毎日投与する。本技術の方法のいくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を２週間以上にわたって毎日投与する。本技術の方法のいくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を３週間以上にわたって毎日投与する。本技術の方法のいくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を４週間以上にわたって毎日投与する。本技術の方法のいくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を６週間以上にわたって毎日投与する。本技術の方法のいくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を１２週間以上にわたって毎日投与する。いくつかの実施形態では、ＱＡ又はそれらの薬学的に許容される塩を対象の生涯にわたって毎日投与する。列挙した値の中間の値及び範囲も本開示の一部とみなされる。
以下の実施例によって本技術を更に説明するが、これらはいかなる形でも限定的に解釈されるべきではない。

（実施例１）
方法及び材料
ＰＡＨ患者から初代ヒトＰＡＳＭＣを単離する。これらの試験には、具体的には肺高血圧症ブレークスルー・イニシアチブ（ＰＨＢＩ）から得たＳＭＣ ＩＩのヒトＰＡＳＭＣ（患者ＩＤ：Ｌ１６４）を使用した。
細胞毒性
病変ＩＰＡＨ ＳＭＣ ＩＩ（患者ＩＤ：Ｌ１６４）細胞に対するＱＡの細胞毒性解析を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて実施した。簡潔に説明すると、９０％コンフルエントになった時点でＳＭＣ ＩＩ細胞を回収し、ＴＣ処理した９６ウェルプレートに細胞２５００個／ウェルの密度で播種して一晩付着させた。翌日、様々な濃度のＱＡ（０．１５～５０μＭ）で細胞を処理した。製造業者の手順書に従って、２４時間後に細胞生存率を測定した。簡潔に説明すると、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイ試薬を処理ウェルに添加し、プレートを３７℃／５％ＣＯ₂で２時間インキュベートした後、５４０ｅｘ／５９０ｅｍで蛍光を評価した。各処理群の細胞生存率（％）を、未処理の細胞の対照群と比較して計算した。データはＳＭＣ ＩＩについてｎ＝６から平均した。

標準細胞増殖
病変ＩＰＡＨ ＳＭＣ ＩＩ（患者ＩＤ：Ｌ１６４）細胞の細胞増殖を、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）Ｄｉｒｅｃｔ細胞増殖アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて評価した。簡潔に説明すると、９０％コンフルエントになった時点でＳＭＣを回収し、ＴＣ処理した９６ウェルプレートに細胞１０００個／ウェルの密度で播種して一晩付着させた。
様々な濃度のＱＡ（１．５、３．１、及び６．２μＭ）でヒト又はウシＰＡＳＭＣを処理した。細胞増殖は、１、３、及び５日目に製造業者の手順書に従って測定した。簡潔に説明すると、核酸染色とバックグラウンドサプレッサーの混合試薬をＰＢＳに添加した後、その混合物を処理ウェルに添加した（１００μＬ／ウェル）。プレートを３７℃／５％ＣＯ₂で１時間インキュベートした後、４８５ｅｘ／５３５ｅｍで蛍光を評価した。増殖阻害は各時点で対照ウェルと比較して解析した。データは、ＳＭＣ ＩＩについてはｎ＝６の２試験から、ＳＭＣ ＩＩＩについてはｎ＝４の１試験から平均した。
細胞飢餓後の増殖
簡潔に説明すると、病変ＩＰＡＨ ＳＭＣ ＩＩ細胞をＴＣ処理した９６ウェルプレートのＦＢＳに富む培地に播種し、一晩付着させた。翌日、ＦＢＳに富む培地をＦＢＳ飢餓培地（０％ＦＢＳ）に置き換えた。細胞を更に３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートした後、ＦＢＳ飢餓培地で希釈した様々な濃度のＱＡ（１．５、３．１、及び６．２μＭ）で処理した。細胞増殖は本明細書に記載するように測定した。

細胞取り込み
細胞取り込み試験を実施し、ＱＡの病変ＩＰＡＨ ＳＭＣ－ＩＩ細胞内移行を可視化した。この試験は、主に受動拡散によって細胞膜を通り抜けるＱＡの能力を実証するものである。簡潔に説明すると、ＳＭＣ－ＩＩ細胞をトリプシン処理し、ＴＣ処理した８チャンバーのカバーガラス（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、米国ニューヨーク州ホーポージ）に播種した（細胞１０，０００個／チャンバー）。細胞をインキュベートし、一晩付着させた。翌日、増殖培地を吸引し、細胞をＱＡ（５及び１０μＭ）で処理した後、３７℃／５％ＣＯ₂で３時間インキュベートした。更に、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて細胞を１０分間固定した。次いで、ＰＦＡを吸引し、チャンバーを氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。次に、カバーガラスからチャンバーを慎重に取り除いた。顕微鏡用スライドにＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ ＨａｒｄＳｅｔ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を載せて準備した後、気泡が入らないように、カバーガラスを反転させてスライドに載せた。続いて、スライドを４℃で一晩置いて封入剤を硬化させた。次いで、ＥＶＯＳ－ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）蛍光細胞イメージングシステムで２０倍レンスを用いて細胞を撮像した。

カスパーゼ３アッセイ
ＱＡが罹患患者由来のＰＡＳＭＣにおける過剰増殖をうまく阻害することが確認されたことから、この再利用分子の潜在的な作用機序を特定するために、ＳＭＣ－ＩＩ細胞を用いて分子マーカー及び経路の解析を行った。ＳＭＣ ＩＩ細胞中のカスパーゼ３レベルは、ＥｎｚＣｈｅｃｋ（登録商標）カスパーゼ３アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、製造業者の手順書に従って評価した。簡潔に説明すると、９０％コンフルエントになった時点でＳＭＣ ＩＩ細胞を回収し、ＴＣ処理した１００ｍｍ培養皿に細胞２５０，０００個／ウェルの密度で播種して一晩付着させた。翌日、細胞はＱＡ（５及び１０μＭ）で６時間処理した後に回収した。回収した細胞は、溶解バッファーを用いて氷上で３０分間溶解した。細胞を遠心分離し、上清を用いて、カスパーゼ３基質アミノメチルクマリン（ＡＭＣ）由来基質Ｚ－ＤＥＶＤ－ＡＭＣのレベルを解析した（３６０ｅｘ／４６０ｅｍでの蛍光測定）。
アネキシンＶアッセイ
ウシＰＡＳＭＣはＦＢＳフリー培地で２４時間血清飢餓させ、次いで、様々な濃度のＱＡ（０、２．５、又は５μＭ）で２４時間処理した。アネキシンＶレベルはアネキシンＶ ＦＩＴＣアッセイキット（＃６００３００，Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミシガン州アナーバー）を用いて製造業者の取扱説明書に従って測定した。

オートファジー阻害アッセイ
ウシＰＡＳＭＣはＦＢＳフリー培地で２４時間血清飢餓させ、次いで、様々な濃度のＱＡ（０、２．５、又は５μＭ）で２４時間処理した。オートファジー阻害（オートファゴソームとリソソームの融合）は、Ｃｙｔｏ－ＩＤ（登録商標）オートファジー検出キット（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ファーミングデール）を用いて製造業者の取扱説明書に従って測定した。
オートファジー阻害アッセイ（ＬＣ３Ｂ－ＩＩ発現）
ウシ高地ＰＡＳＭＣを用いて、オートファジーマーカーであるＬＣ３Ｂ－ＩＩに対するＱＡの効果を、ウェスタンブロット（＃３８６８Ｓ，ＬＣ３Ｂ（Ｄ１１）ＸＰ Ｒａｂｂｉｔモノクローナル抗体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンバース）によって決定した。
ＩＴＣＨ／ＡＩＰ Ｅ３リガンド活性アッセイ
ＩＴＣＨ／ＡＩＰ４ Ｅ３リガンド活性を直接阻害するＱＡの能力を評価するために、ユビキチンＥＬＩＳＡキットＵｂｉＱｕａｎｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｓｅｎｓｏｒｓ、ペンシルベニア州モルバーン）を製造業者の取扱説明書に従って使用した。ユビキチン存在下での複数の濃度（０、１０、又は２０μＭ）のＱＡによるリガンド活性阻害を定量化した。

肺動脈の可視化及び内壁厚の評価のための三重染色
ＱＡを用いた治療期間の最後に動物を屠殺した。外科的に開胸してラット肺を露出させた。肺組織を回収し、盲検組織をＲｅｖｅａｌ Ｂｉｏ（カリフォルニア州サンディエゴ）で５μｍ厚の切片にした。各動物につき２組織片を三重染色用に確保し、更に８つの切片をカスタム染色用にブランクで用意した。
三重染色を用いて組織片を染色し、全ての治療群と対照群について肺動脈を可視化した。染色した肺切片は、Ａｘｉｏｃａｍ５０６カラーカメラ及びＺｅｉｓｓ Ｚｅｎ ２．３ソフトウェアを装備したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃｏｐｅ Ａ１顕微鏡を用いて撮像した。同様の大きさの肺動脈の内壁厚は、Ｍｏｔｉｃ ＢＡ２１０顕微鏡及びＭｏｔｉｃ Ｉｍａｇｅ ｐｌｕｓ ２．０ソフトウェアを用いて測定した。動物（ｎ＝２～５）ごとに５つの肺動脈壁を解析した。

ＭＣＴモデルの免疫蛍光
事前にモノクロタリン（ＭＣＴ）誘発治療ＰＡＨモデルにおいて１日１回１０ｍｇ／ｋｇの用量でＱＡの前臨床ｉｎ ｖｉｖｏ試験を実施した。血行動態的パラメーターを収集し、肺組織も回収して、ｉｎ ｖｉｖｏで様々なＰＡＨバイオマーカーに対するＱＡ治療の影響を可視化するために切片にした。
対照動物、ＭＣＴ誘発ＰＡＨ動物、及びＱＡ治療動物のＯＣＴ化合物包埋組織片に更に免疫蛍光染色を行い、必須分子マーカーの発現レベルを解析した。簡潔に説明すると、組織片を１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄した後に、ブロッキングバッファー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国マサチューセッツ州ダンバース）を用いて１時間ブロッキングした。ブロッキング後、組織片はそれぞれ一次抗体で一晩染色した；ＶＷＦ ＃ａｂ１５４１９、１：１００（ａｂｃａｍ）、α－ＳＭＡ ＃４８９３８Ｓ、１：５００（ＣＳＴ）、Ｋｉ６７ ＃９１２９Ｓ（ＣＳＴ）、１：２５０、及びＰＣＮＡ ＃２５８６Ｓ（ＣＳＴ）、１：１００。翌日、組織片を１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄した後、抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）４８８標識）＃４４１２Ｓ １：２５０（ＣＳＴ）及び抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）５９４標識）＃８８９０Ｓ、１：５００（ＣＳＴ）で１時間インキュベートした。更に、組織片を１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ ＨａｒｄＳｅｔ退色防止封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いて核をＤＡＰＩで染色した。組織はＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ、ドイツ、イエナ）を用いて撮像した。
低酸素モデルの免疫蛍光
事前にＳＵ５４１６／低酸素誘発予防／予防処置ＰＡＨモデルにおいて１日１回１０ｍｇ／ｋｇの用量でＱＡの前臨床ｉｎ ｖｉｖｏ試験を実施した。血行動態的パラメーターを収集し、肺組織も回収して、ｉｎ ｖｉｖｏで様々なＰＡＨバイオマーカーに対するＱＡ治療の影響を可視化するために切片にした。
対照動物、低酸素誘発ＰＡＨ動物、及びＱＡ治療動物のパラフィン包埋組織片に更に免疫蛍光染色を行い、必須分子マーカーの発現レベルを解析した。組織片をキシレン溶液に３分間２回さらして組織の脱パラフィンを行った後、２００プルーフの無水エタノール９９．８％及びエタノール５０％で洗浄した。組織は１Ｘ ＰＢＳで更に２回洗浄し、確実に脱パラフィンを行った。組織片の免疫蛍光染色についても同様のプロトコルに従った。

（実施例２）
ＱＡが初代肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＨ関連細胞過剰増殖を改善
まず、初代ヒトＰＡＳＭＣに対するＱＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｂｌｕｅアッセイキットを用いて調べた。最大６．２μＭのＱＡ濃度で８５％超の生存率が認められたため、６．２μＭ以下の濃度では安全と考えられる（図２）。ウシＨＡＰＡＳＭＣにおけるＱＡの細胞毒性も最大４８時間試験し、細胞生存率が９０％超であったことから、正常細胞における薬剤の安全性が示された（データは示さず）。
初代ヒトＰＡＳＭＣ（図３）、初代ウシＰＡＳＭＣ（図４）、及び高地ＰＡＳＭＣ（ＨＡＰＡＳＭＣ）（図４）を用いて、肺高血圧症に対するＱＡの抗増殖活性を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を実施した。長時間の低酸素曝露によるＨＡＰＡＳＭＣは、通常の培養条件で過剰増殖性であることが知られているが、ＰＡＳＭＣ細胞では２４時間の血清飢餓、又は５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）への曝露によって過剰増殖が誘発された。結果から、ＱＡは、マイクロモル以下の濃度（１．５～５．０μＭ）で、時間及び濃度依存的に、全ての試験モデル、即ち、初代ヒトＰＡＳＭＣ（図３Ａ）、血清飢餓ヒトＰＡＳＭＣ（図３Ｂ）、生来的に高増殖性のウシＨＡＰＡＳＭＣ（図４Ａ）、血清飢餓ウシＰＡＳＭＣ（図４Ｂ）、及び５－ＨＴ誘発ウシＰＡＳＭＣ（図４Ｃ）において、肺動脈平滑筋細胞の増殖を有意に阻害することが示された。血管平滑筋細胞の過剰増殖は、ＰＨ病原の臨床進行の主な根本原因の１つであるため、これらの試験は、非毒性用量でＰＨの症状及び進行を逆転させるＱＡの治療可能性を明示している。
これらの結果は、キナクリンを含む組成物が、肺高血圧症を予防、改善、又は治療する方法及び／又は肺高血圧症に関連する１つ又は複数のリスク因子、徴候、若しくは症状の重症度を軽減する方法に有用であることを示している。

（実施例３）
ＱＡは生来的にＰＡＳＭＣ内に移行し、アポトーシスを誘導する
初代ヒトＰＡＳＭＣにおけるＱＡの細胞取り込みを調べた。細胞を８チャンバーのカバーガラスに播種し、ＱＡ（２．５～１０μＭ）で３時間処理した。処理後、細胞を固定し、ＥＶＯＳ－ＦＬ蛍光顕微鏡を用いて撮像した。ＱＡ（緑色蛍光）は濃度依存的に、生来的に初代ヒトＰＡＳＭＣ内に移行できることが観察された（図５）。
６時間の処理後、初代ヒトＰＡＳＭＣにおける細胞アポトーシスに対するＱＡの影響を理解するために、アポトーシス誘導アッセイ、即ちカスパーゼ３アッセイを実施した。ＱＡがＰＡＳＭＣ中のカスパーゼ３レベルを濃度依存的に増加させ、従って、ＱＡのアポトーシス誘導が主な作用機序の１つであるという仮説が立証されることが観察された（図６Ａ）。更に、別のアポトーシス誘導アッセイ、即ちアネキシンＶ ＦＩＴＣアッセイも用いて、血清飢餓ウシＰＡＳＭＣに対するＱＡの効果を測定した。同様に、ＱＡ処理により、濃度依存的に、アネキシン－Ｖ染色細胞の蛍光強度によって測定されるアポトーシス誘導が有意に増強した（図６Ｂ）。
これらの結果は、キナクリンを含む組成物が、肺高血圧症を予防、改善、又は治療する方法及び／又肺高血圧症に関連する１つ又は複数のリスク因子、徴候、若しくは症状の重症度を軽減する方法に有用であることを示している。

（実施例４）
ＱＡはウシＰＡＳＭＣにおけるオートファジー過程を阻害する
ＱＡによるオートファジー阻害（オートファゴソームとリソソームの融合）を調べた。ウシＰＡＳＭＣはＦＢＳフリー培地で２４時間血清飢餓させ、次いでＱＡ（２．５及び５μＭ）で２４時間処理した。オートファジー阻害はＣｙｔｏ－ＩＤ（登録商標）オートファジー検出キットで測定した。図７Ａに示すように、ＱＡ処理によってオートファゴソームにおける蛍光色素の蓄積が有意に増強し、従って、オートファゴソームとリソソームの融合が阻害されることでオートファジー過程が阻害された。ＨＡＰＡＳＭＣを用いて、ＬＣ３Ｂ－ＩＩ発現を標的とすることによるＱＡ誘導性オートファジー阻害を調べた。ＱＡ処理した高地ＰＡＳＭＣ細胞溶解物は、ＬＣ３Ｂ－ＩＩ発現が２倍超増加することが観察された。これは、ウシＨＡＰＡＳＭＣ細胞がＰＡＨ関連過剰増殖を模倣する能力があるため重要である（図７Ｂ、図９Ｃ）。
別の独立した試験では、オートファジー／アポトーシス経路を調節するＱＡの能力を血清飢餓ウシＰＡＳＭＣ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで定量化し、同様の結果が観察された。図９Ａに示すように、ＱＡ処理によってオートファゴソームにおける蛍光色素の蓄積が有意に増強し、従って、オートファゴソームとリソソームの融合が阻害されることでオートファジー過程が阻害された。ＱＡ処理は濃度依存的にアポトーシス誘導を濃度依存的に有意に増強した（アネキシンＶ ＦＩＴＣ染色細胞の蛍光強度によって測定）（図９Ｂ）。
ＩＴＣＨ／ＡＩＰ４ Ｅ３リガンド活性を直接阻害するＱＡの能力を評価するために、ユビキチンＥＬＩＳＡキットを使用して、ユビキチン存在下でリガンド活性を阻害するＱＡの能力を、複数の濃度で定量化した。ＱＡは、ＩＴＣＨ／ＡＩＰ４ Ｅ３リガーゼによるポリユビキチン化全体を減少させる用量依存的な能力を示し、２０μＭの用量では、ＩＴＣＨ／ＡＩＰ４活性に起因するポリユビキチン化全体を約２５％減少させた（図８）。
これらの結果は、キナクリンを含む組成物が、肺高血圧症を予防、改善、又は治療する方法及び／又は肺高血圧症に関連する１つ又は複数のリスク因子、徴候、若しくは症状の重症度を軽減する方法に有用であることを示している。

（実施例５）
ＱＡは、ＰＨのモノクロタリン（ＭＣＴ）誘発治療げっ歯類モデルにおいて、確立した疾患症状を改善し、疾患進行を防ぐ
ＰＨに対するＱＡの治療活性を決定するために、肺高血圧症のモノクロタリン（ＭＣＴ）誘発げっ歯類モデルで慢性血行動態試験を実施した。ＭＣＴ誘発は十分に確立された予備モデルで、ラットにＭＣＴの単回皮下注射を行い、３～４週間かけて慢性ＰＨ様症状を引き起こす。簡潔に説明すると、成体Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄ラットにＭＣＴを５０ｍｇ／ｋｇで皮下注射し、餌と水を自由に摂取できるようにして３週間収容した。３週間後から、１日１回のキナクリン皮下注射を１０ｍｇ／ｋｇで１０日間実施した。１０日目終了時に動物に麻酔をかけ、ＲＶカテーテル法によって右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を決定し、心肺ブロックを摘出して右室肥大（ＲＶＨ）を測定した。図１０Ａ及び１０Ｂからわかるように、ＭＣＴ投与によってＲＶＳＰが有意に上昇した（対照動物の２９．８±０．６ｍｍＨｇに対して７４．１±０．７ｍｍＨｇ）。ＱＡを投与すると、ＲＶＳＰは３９．９±１．８ｍｍＨｇに有意に低下し（図１０Ａ）、ＰＨ進行を防ぐＱＡの有効性が強く示された。ＱＡ投与によって、肺動脈血管拡張に起因する右室の仕事量及び増殖の減少を示す指標である右室肥大（ＲＶＨ）指数も、０．６６±０．０８（ＭＣＴのみ）から０．３６±０．０５（ＱＡ治療動物）に有意に軽減した（図１０Ｂ）。これらの結果は、キナクリンが血管拡張特性を有するとは示されていなかったことを考えると予想外であり、キナクリンの有効性に関連する新規の抗ＰＨ機序の可能性を示唆している。

加えて、三重染色を用いて、ＭＣＴ誘発ＰＡＨ肺組織の肺組織片を調べた。染色した試料の顕微鏡画像は、ＭＣＴ処理した肺細動脈の過剰なコラーゲン沈着及び筋肉壁形成を明確に示している（図１１、赤色の枠内）。ＱＡ治療によって、肺細動脈におけるコラーゲン及び筋肉の沈着に有意な減少が観察され（図１１）、これは血行動態的に測定された肺動脈圧の低下にも反映されている。ＭＣＴ誘発ＰＡＨ動物肺組織スライドの免疫蛍光イメージングも実施した。図１２Ａに示すように、ＱＡ治療動物では、ＰＡＨ動物モデルで過剰発現が頻繁に観察される過剰増殖マーカーのうちの２つ、Ｋｉ６７及びＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）の発現低下が示された。一方、ｖＷＦ（フォン・ヴィレブランド因子）又はα平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の発現については、ＱＡ治療動物では対照と比べて低下が見られなかった（図１２Ｂ）。興味深いことに、ｖＷＦ及びα－ＳＭＡの発現は、ＭＣＴ誘発ＰＡＨ動物においても変化しなかった（図１２Ｂ）。
肺動脈の内壁厚は、三重染色した顕微鏡画像を用いて測定した。ＭＣＴ誘発ＰＡＨ動物組織片で肺動脈の内壁厚の有意な増加が見られたが（３倍超増加）、ＱＡ治療によって減少し、対照動物と比べて壁厚はほぼ正常に戻った（図１３）。
これらの結果は、キナクリンを含む組成物が、肺高血圧症を予防、改善、又は治療する方法及び／又は肺高血圧症に関連する１つ又は複数のリスク因子、徴候、若しくは症状の重症度を軽減する方法に有用であることを示している。

（実施例６）
ＱＡは予防ＳＵ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおけるＰＡＨの発症及び進行を防ぐ
ＱＡは予防ＳＵ５４１６／低酸素誘発ＰＡＨモデルでも試験し、同様に傑出した予防結果と最低限の毒性が示された。図１４Ａ～１４Ｄからわかるように、動物はＳＵ５４１６注射後に低酸素（１０％Ｏ₂）中に保持し、１日目から３週間にわたって１０ｍｇ／ｋｇのＱＡを１日１回投与した。３週間後に血行動態試験を実施した。ＱＡ投与によって、ＲＶＳＰ（４５．６±７．９ｍｍＨｇに対して対照は６２．８±９．５ｍｍＨｇ、図１４Ａ）及びＲＶＨ指数（５１．８±７．２に対して対照は６８．３±１１．４、図１４Ｂ）が有意に低下した。ＱＡ治療では、血管の筋性動脈化（対照と比較して、完全に筋性動脈化した血管が３．５分の１、図１４Ｃ）及び内壁厚（図１４Ｄ）も有意に低下した。これらのデータは、ＰＨ症状の発現を防ぐＱＡの有効性を明示している。
加えて、三重染色では、ＳＵ５４１６／低酸素処理した肺細動脈における過剰なコラーゲン沈着及び筋肉壁形成を明確に示している（図１５、赤色の枠内）。ＱＡ治療によって、肺細動脈におけるコラーゲン及び筋肉の沈着に有意な減少が観察され、これは血行動態的に測定された肺動脈圧の低下にも反映されている。
内壁厚測定値からは、ＱＡ治療を行ったＳＵ５４１６／低酸素誘発ＰＡＨ動物組織で肺動脈の内壁厚の有意な減少が示され、ＳＵ５４１６／低酸素誘発ＰＡＨ動物組織片と比べて壁厚が約２分の１に減少した（図１６）。ＳＵ５４１６／低酸素誘発ＰＡＨ動物肺組織スライドの免疫蛍光イメージングから、ＱＡ治療動物が、ＳＵ５４１６／低酸素処理対照動物と比べて、Ｋｉ６７及びＰＣＮＡの発現低下を示した一方で、ｖＷＦ又はα－ＳＭＡの発現低下を示さなかったことがわかる（図１７Ａ、１７Ｂ）。
これらの結果は、キナクリンを含む組成物が、肺高血圧症を予防、改善、又は治療する方法及び／又は肺高血圧症に関連する１つ又は複数のリスク因子、徴候、若しくは症状の重症度を軽減する方法に有用であることを示している。

（実施例７）
ＱＡはＳ５４１６／低酸素誘発ラットモデルにおいて疾患を引き起こす複数の経路を調節することによってＰＨの進行を防ぐ
ＱＡの治療効果に関与する発症機序を突き止めるために、リアルタイムＰＣＲ及びウエスタンブロット解析を用いてｍＲＮＡ発現を定量化することにより、ＱＡが様々なタンパク質の発現に及ぼす効果を解析した（図１８Ａ～１８Ｆ）。ＳｕＨｘ ＰＨモデルではＢＭＰＲ２の発現が低下し、炎症性サイトカインの発現が促進されることが報告されている。ｍＲＮＡ解析では、ＱＡ治療動物でＩＬ－６ ｍＲＮＡレベルが減少したことが明らかとなった（図１８Ａ）。更に、ＱＡ治療動物でＡｃｔａ２遺伝子（α平滑筋アクチン）発現が低下した（図１８Ｂ）。セルピン１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１）は、通常、低酸素時に過剰発現し、血管リモデリング及び叢状形成に関与している。ＱＡ治療によりセルピン１のｍＲＮＡレベルが減少した（図１８Ｃ）。しかし、ＢＭＰＲ２発現に対応するＩｄ３ ｍＲＮＡレベルは、ＱＡ治療によって有意に変化しなかった（図１８Ｄ）。

キナクリンはオートファジーを阻害し、ＰＨ肺においてｉｎ ｖｉｖｏで内在性ＢＭＰＲ２を守る。治療有効性の機序を評価するために、ウェスタンブロットを用いて、ＳＵ５４１６／低酸素対照及びＱＡ治療動物の右肺ホモジネートにおけるいくつかのタンパク質マーカーを定量化した（図１８Ｅ、１８Ｆ）。ＱＡ治療後、オートファジーマーカーのＬＣ３Ｂ－ＩＩ及びｐ６２が細胞溶解物全体に蓄積しているのが観察された（図１８Ｅ）。オートファジー経路により分解されるタンパク質であるｐ６２の蓄積は、オートファジー阻害を示唆する。ウェスタンブロット試験から、ＱＡでは対照動物と比べてＢＭＰＲ２の蓄積が２倍超増大したことも明らかとなったのに対し（図１８Ｅ）、ｍＲＮＡ解析ではＢＭＰＲ２ ｍＲＮＡ発現に有意な変化は示されなかった。両結果をまとめると、これらの結果から、ＱＡ治療後のＢＭＰＲ２の蓄積増加は、実質的に、リソソーム経路でのＢＭＰＲ２タンパク質の分解をブロックするＱＡの能力の結果であり得ることが示される。この観察は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＢＭＰＲ２発現及び産生の改善に焦点を合わせた従来のアプローチとは異なる代替的な治療戦略が示されているため重要である。図１８Ｄ及び１８Ｅに示すように、ＱＡはＢＭＰＲ２タンパク質産生を促進せず、内在性ＢＭＰＲ２タンパク質を分解から守るため、ＢＭＰＲ２発現全体を改善する。
更に、ｐ２１、ｐ５３、及びリン酸化ｐ５３の発現／蓄積を測定して、アポトーシスに対するＱＡ治療の効果を観察した。ＱＡ治療によって、組織溶解物におけるｐ２１タンパク質の発現が有意に増加した（図１８Ｆ）。興味深いことに、ＱＡ治療によって、ＮＦ－ｋＢ発現の代替マーカーであり、優れた炎症マーカーであるｐ６５も有意に減少し、抗ＰＨ有効性におけるＱＡの抗炎症能の役割が示唆された（図１８Ｆ）。ホスホＡＫＴ及びホスホｐ６５（ＮＦ－ｋＢの分子マーカー）の発現も減少した。これらの結果は、ＰＨに対するＱＡの多標的性の可能性を示唆している。
これらの結果は、キナクリンを含む組成物が、肺高血圧症を予防、改善、又は治療する方法及び／又は肺高血圧症に関連する１つ又は複数のリスク因子、徴候、若しくは症状の重症度を軽減する方法に有用であることを示している。

等価物
本技術は、本技術の個々の態様の単一の例示として意図される、本願に記載された特定の実施形態に関して限定されるべきではない。当業者には明らかなように、本技術は、その精神及び範囲から逸脱することなく、多くの修正及び変形が可能である。本技術の範囲内にある機能的に等価な方法及び装置は、本明細書に列挙したものに加えて、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正及び変形は、本技術の範囲に入ることが意図されている。本技術は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物系に限定されず、当然のことながら変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図していないことも理解されたい。
更に、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、それによって本開示がマーカッシュ群の任意の個々の構成要素又は構成要素の下位群の観点からも記載されていることを認識するであろう。
当業者には理解されるように、あらゆる目的のために、特に記述説明を提供することに関して、本明細書に開示する全ての範囲は、あらゆる可能な部分範囲及びその部分範囲の組み合わせも包含している。任意の列挙した範囲は、同じ範囲が少なくとも２等分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分割されることを十分に説明し、可能にすると容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で検討する各範囲は、下部３分の１、中間３分の１、及び上部３分の１などに容易に分割できる。また、当業者には理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「よりも小さい」などの全ての文言は、言及した数を含み、上述したように、続いて部分範囲に分割できる範囲を意味する。最後に、当業者には理解されるように、範囲は個々の構成要素を含む。従って、例えば、１～３個の細胞を有する群は、１、２、又は３個の細胞を有する群を指す。同様に、１～５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、又は５個の細胞を有する群を指す。
本明細書で言及又は引用する全ての特許、特許出願、仮出願、及び出版物は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲で、全ての図及び表を含め、その全体が参照により援用される。

Claims (15)

1. それを必要とする対象において肺高血圧症を治療又は予防する方法であって、キナクリン又はその薬学的に許容される塩の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
2. 前記対象が肺動脈性肺高血圧症を有すると診断されている、請求項１に記載の方法。
3. 肺動脈性肺高血圧症の徴候又は症状が、労作性持続性呼吸困難、胸痛、めまい、労作性失神寸前状態／失神、動悸、疲労、脱力、拡張した肺動脈による左喉頭神経の圧迫に起因する声のかすれ、頸静脈怒張、肝頸静脈逆流、肝腫大、肝臓痛、下肢浮腫、腹水、全身性浮腫、肺動脈内膜線維症、肺動脈の内膜厚増加、筋性肺動脈の内膜過形成、肺動脈血栓病変、肺細動脈閉塞、肺血管剪定、肺動脈の叢状病変、右室収縮期圧の上昇、右室肥大の増加、肺血管過剰増殖、血清若しくは血漿中の脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の上昇（＞１８０ｐｇ／ｍＬ）、及び血清若しくは血漿中のｐｒｏＢＮＰのＮ末端フラグメント（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）の上昇（≧１４００ｐｇ／ｍＬ）のうち１つ又は複数を含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記対象がヒトである、請求項１～３のうちいずれか一項に記載の方法。
5. 前記キナクリン又はその薬学的に許容される塩が、経口、局所、鼻腔内、吸入、胸膜内、全身、静脈内、皮下、腹腔内、皮内、眼内、イオン導入、経粘膜、又は筋肉内投与される、請求項１～４のうちいずれか一項に記載の方法。
6. １つ又は複数の追加的な治療薬を別個に、連続的に、又は同時に前記対象に投与することを更に含む、請求項１～５のうちいずれか一項に記載の方法。
7. 前記追加的な治療薬が、エンドセリン受容体拮抗薬（ＥＴＲＡ）、グアニル酸シクラーゼ刺激薬、プロスタサイクリン類似体、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）－５阻害剤、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、シクロスポリン、タクロリムス、ベスタチン、イマチニブ、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、トリメタジジン、ラノラジン、４－フェニルブチレート、タウロウルソデオキシコール酸、及びサルブリナルからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記対象が、キナクリン投与後に右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の低下及び／又は右室肥大（ＲＶＨ）の軽減を示す、請求項１～７のうちいずれか一項に記載の方法。
9. 前記対象が、キナクリン投与後に血管の筋性動脈化の減少及び／又は肺細動脈の内壁厚の減少を示す、請求項１～８のうちいずれか一項に記載の方法。
10. 前記キナクリンが１週間以上にわたって毎日投与される、請求項１～９のうちいずれか一項に記載の方法。
11. 前記肺動脈性肺高血圧症が、特発性ＰＡＨ（ＩＰＡＨ）、家族性ＰＡＨ（ＦＰＡＨ）、又は各種疾患に伴うＰＡＨ（ＡＰＡＨ）である、請求項２～１０のうちいずれか一項に記載の方法。
12. 前記対象が、骨形成タンパク質受容体ＩＩ型（ＢＭＰＲ２）、セロトニン（５－ＨＴＴ）トランスポーター、及びアクチビン様キナーゼＩ型受容体（ＡＬＫ－１）からなる群から選択される変異を有する、請求項１～１１のうちいずれか一項に記載の方法。
13. 前記対象が、小児患者、高齢患者、免疫不全患者、女性患者、又は男性患者である、請求項１～１２のうちいずれか一項に記載の方法。
14. 前記対象が、コーカソイド、南アジア人、東南アジア人、又は中東系である、請求項１３に記載の方法。
15. キナクリンの前記有効量が、約１～約１５ｍｇ／ｋｇ又は約１～約１０μＭである、請求項１～１４のうちいずれか一項に記載の方法。

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