JP2023540746A - タンパク質－オリゴヌクレオチド複合体の調製方法 - Google Patents

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Abstract

本開示の側面は、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂、例としてヒドロキシアパタイト樹脂を使用して、分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド、荷電オリゴヌクレオチド、または疎水性小分子)に共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体)を含む複合体を精製する方法に関する。複合体を製造する方法も提供される。

Description

関連出願
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2020年9月3日に出願された「METHODS OF PREPARING PROTEIN-OLIGONUCLEOTIDE COMPLEXES」と題する米国仮出願第63/074439号、および2020年9月3日に出願された「METHODS OF PREPARING PROTEIN-OLIGONUCLEOTIDE COMPLEXES」と題する米国仮出願第63/074436号の優先権を主張し、その各々の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の分野
本出願は、複合体(例として、タンパク質-オリゴヌクレオチド抱合体および抗体-薬物抱合体)を精製する方法に関する。
EFS-WEBを介しテキストファイルとして提出された配列表への言及
これはEFS-WebからASCIIフォーマットで提出されており、その全体が参照によってここに組み込まれる。2021年9月3日に作成された該ASCIIコピーは、D082470043WO00-SEQ-ZJGと称され、サイズは57,060バイトである。
近年、組織または細胞特異的疾患(例として、筋肉特異的疾患、例として、様々な形態の筋ジストロフィー)に対抗するために、いくつかのオリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)が開発されている。それにもかかわらず、これらのオリゴヌクレオチドをそれらの所望の組織または細胞に効果的に送達することは困難であることが証明されている。
治療用オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した組織または細胞特異的タンパク質(例として、抗体)を含む複合体は、該治療用オリゴヌクレオチドを送達する優れた機会を提供する。そのような治療用オリゴヌクレオチドは、例えば、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO、PNAなど)ならびに荷電オリゴヌクレオチド(例として、gapmer、ミキサー、siRNAなど)を含む。しかしながら、過剰なタンパク質およびオリゴヌクレオチドからの該複合体の精製および単離は課題を提示する。本開示は、いくつかの側面において、複合体から非抱合オリゴヌクレオチドおよびタンパク質(例として、抗体)を分離する、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したタンパク質を含む複合体をプロセシングする方法を提供する。複合体を製造する方法も提供される。いくつかの態様において、本明細書中に記載される複合体を製造する方法は、アルキン基を含む非連結抗体のレベルを低減させる。いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体を製造する方法は、抱合反応後にアルキン基を含む微量の非連結抗体のみをもたらす。
本開示の一側面は、1つ以上の電荷中性オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体をそれぞれ含む複合体をプロセシングする方法であって、
(i)有機溶媒、複合体および非連結電荷中性オリゴヌクレオチドを含む混合物を、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂と、複合体が混合モード樹脂に吸着する条件下で接触させることと、
(ii)複合体が混合モード樹脂から解離する条件下で複合体を混合モード樹脂から溶出させることと、
を含む、前記方法に関する。いくつかの態様では、有機溶媒は、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である。いくつかの態様では、有機溶媒は、ステップ(i)の混合物中の5％～30％(v/v)であり、任意に、有機溶媒は、ステップ(i)の混合物中の15％(v/v)である。いくつかの態様において、有機溶媒は、ステップ(i)の混合物において30％(v/v)である。
いくつかの態様では、ステップ(i)の混合物は、最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大20mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様では、方法は、ステップ(i)とステップ(ii)との間の混合モード樹脂を、有機溶媒を含む洗浄溶液で洗浄することをさらに含み、任意に、有機溶媒が、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である。いくつかの態様では、有機溶媒は洗浄溶液中の5％～30％(v/v)であり、任意に有機溶媒は洗浄溶液中の15％(v/v)である。いくつかの態様において、有機溶媒は、洗浄溶液中で30％(v/v)である。いくつかの態様では、洗浄溶液は、最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大20mMの塩化物イオンをさらに含む。
いくつかの態様では、ステップ(ii)は、複合体を溶出するために混合モード樹脂に溶出溶液を適用することを含み、溶出溶液は有機溶媒を含み、任意に有機溶媒はジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である。いくつかの態様では、有機溶媒は溶出溶液中10％～30％(v/v)であり、任意に有機溶媒は溶出溶液中10％(v/v)である。いくつかの態様では、溶出溶液は少なくとも30mMのリン酸イオンを含み、任意に溶出溶液は少なくとも100mMのリン酸イオンを含む。いくつかの態様では、溶出溶液は、徐々に増加する濃度のリン酸イオンを含み、任意に、リン酸イオンの濃度は少なくとも10mMから少なくとも100mMまで増加する。いくつかの態様では、溶出溶液は、7.6～8.5のpHを有する。
本開示の別の側面は、1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体を生成する方法であって、
(i)nが3である、以下の構造を含むオリゴヌクレオチドを得ることと、
Figure 2023540746000002
 (B)
(ii)mが4である、以下の構造を含む抗体を得ることと、
Figure 2023540746000003
 (F)
(iii)ステップ(i)のオリゴヌクレオチドとステップ(ii)で得られた抗体とを反応させて複合体を得ることと、
を含む、前記方法に関する。
本開示の別の側面は、1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体を生成する方法であって、
(i)nが3であり、mが4である、以下の構造を含むオリゴヌクレオチドを得ることと、
Figure 2023540746000004
 (D)
(ii)抗体を得ることと、
(iii)ステップ(i)のオリゴヌクレオチドとステップ(ii)で得られた抗体とを反応させて複合体を得ることと、
を含む、前記方法に関する。
いくつかの態様では、複合体は、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000005
 (E)
式中、nは3であり、mは4であり、抗体がリジンを介して連結されている。
本開示の別の側面は、複合体と非連結オリゴヌクレオチドとを含み、各複合体は、1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む、混合物であって、
(i)バリン-シトルリン配列を含む切断可能なリンカーに共有結合的に連結したオリゴヌクレオチドを含む第1の中間体を得ることと、
(ii)ステップ(i)で得られた第1の中間体をビシクロノニンを含む化合物と連結させて、第2の中間体を得ることと、
(iii)ステップ(ii)で得られた第2の中間体を抗体に連結して複合体を得ることと、
を含む、方法によって製造され、
ここで、ビシクロノニンを含む化合物は、ステップ(iii)の反応において、ステップ(ii)の化合物の出発量の5％未満の量で存在し、任意に、オリゴヌクレオチドは、5'末端にバリン-シトルリン配列を含む切断可能なリンカーに共有結合しており、および/または抗体は、リジンを介して結合している、
前記混合物に関する。
本開示の別の側面は、複合体と、ii)非連結オリゴヌクレオチドと、を含み、各複合体は、1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む、混合物であって、
(i)1つ以上のオリゴヌクレオチドを、式中nが3である式(A)と、
Figure 2023540746000006
 (A)
式中nが3である式(B)
Figure 2023540746000007
 (B)
の生成物を生成する反応条件下で、組み合わせることと、
(ii)式(B)の生成物を、mが4である式(C)の化合物と、
Figure 2023540746000008
 (C)
nが3であり、mが4である式(D)
Figure 2023540746000009
 (D)
の生成物を生成する反応条件下で、組み合わせることと、
(iii)式(D)の生成物を、nが3であり、mが4である式(E)
Figure 2023540746000010
 (E)
の複合体を生成する反応条件下で抗体と接触させることと、
を含む方法によって製造され、
式(C)の化合物が、ステップ(ii)の反応における式(C)の化合物の出発量の5％未満の量でステップ(iii)の反応において存在する、前記混合物に関する。
本開示の別の側面は、それぞれが1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体をプロセシングする方法であって、
(i)上記の2つの混合物のいずれか1つの混合物を、複合体が混合モード樹脂に吸着する条件下で、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂と接触させることであって、混合物が、アルキン基を含む微量の非連結抗体を含む、ことと、
(ii)複合体が混合モード樹脂から解離する条件下で複合体を混合モード樹脂から溶出させることと、
を含む、前記方法に関する。いくつかの態様では、ステップ(i)の混合物は以前の精製に供されていない。いくつかの態様では、ステップ(i)の混合物は、微量のリン酸イオンおよび/または塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、方法は、ステップ(i)とステップ(ii)との間の混合モード樹脂を、最大20mMのリン酸イオンおよび/または最大30mMの塩化物イオンを含む洗浄溶液で洗浄するステップをさらに含み、任意に、溶液は、最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大25mMの塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、洗浄溶液は5.0～7.6のpHを有する。いくつかの態様では、ほとんどまたはすべての非連結オリゴヌクレオチドは、洗浄ステップにおいて混合モード樹脂から除去される。
いくつかの態様では、ステップ(ii)は、少なくとも30mMのリン酸イオンおよび/または少なくとも50mMの塩化物イオンを含む溶出溶液を混合モード樹脂に適用して、複合体を溶出させることを含み、任意に溶出溶液は少なくとも100mMのリン酸イオンおよび/または少なくとも100mMの塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、溶出溶液は、7.5～8.5のpHを有する。
いくつかの態様において、抗体は抗トランスフェリン受容体抗体である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、荷電オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、負に荷電したオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、任意にgapmerである。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖であり、任意に二本鎖オリゴヌクレオチドはsiRNAであり、任意に一本鎖はsiRNAのセンス鎖である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合を含み、任意に、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート連結である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、任意に、修飾ヌクレオチドは、2'-O-メトキシエチルリボース(MOE)、ロックド核酸(LNA)、2'-フルオロ修飾、またはモルホリノ修飾を含む。
オリゴヌクレオチドペイロードへの抗TfR抗体の連結に関与する分子の化学構造を示す図である。図1Aは、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドの構造を示す。図1Bは、endo-BCN-PEG4-PFPエステルを示す。 図1Cは、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを示す。BCN:ビシクロノニン。PFP:ペンタフルオロフェニル。PAB:4-アミノ安息香酸。VC:val-cit。図1A～1Cのすべてにおいて、nは3であり、mは4である。
様々な比の抗TfR Fab対オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する反応で製造された粗Fab-オリゴヌクレオチド抱合体のSDS-PAGEゲルを示す図である。左端のレーンは分子量ラダーを示し、2番目のレーンは未反応の抗TfR Fabを示す。A、B、C、D、EおよびFと標識されたレーンは、反応生成物を示す。標識D0、D1、D2およびD3は、それぞれ0、1、2および3の薬物対抗体比を有する反応生成物を示す。
様々な比の抗TfR Fab対オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルおよび様々な溶媒条件を含有する反応で製造された粗Fab-オリゴヌクレオチド抱合体のSDS-PAGEゲルを示す図である。左端のレーンは分子量ラダーを示す。G、H、I、J、K、LおよびMと標識されたレーンは、反応生成物を示す。
エンド-BCN-PEG4-PFPエステルとオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG4-アジドとの間の反応の経時的なRP C18 UPLCモニタリングの結果を示す図である。エンド-BCN-PEG4-PFPエステル出発物質のピーク面積は、220nmで経時的に測定され、時間0での元の出発物質ピークのパーセントとして示される。
260nmおよび280nmで測定された、精製後の抗TfR Fab'-オリゴヌクレオチド抱合体のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)クロマトグラムを示す図である。
精製後のSDS-PAGEゲル抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体を示す図である。右端のレーンは分子量ラダーを示す。残りの3つのレーンは、精製カラムから溶出した画分を示す。標識D0、D1、D2およびD3は、それぞれ0、1、2および3の薬物対抗体比を有する反応生成物を示す。
本明細書に記載の方法を用いて処理した複合体の、in vitroでのDMPK mRNAレベルの低減における活性を示すグラフである。複合体1は2段階抱合によって調製された:実施例6を参照されたい。複合体2は反応前抱合によって調製された:実施例1を参照されたい。
粗および精製抗TfR-BCN反応生成物の分析HPLC-SECトレースを示す図である。粗生成物の曲線は約17.4分に第二の主要なピークを示し、これは精製生成物の曲線には存在せず、非抱合BCNの除去を実証する。BCN:ビシクロノニン。
粗リンカー-オリゴヌクレオチド反応生成物の分析RP-HPLCを示し、所望のオリゴヌクレオチド-リンカー生成物のピークに加えて、遊離オリゴヌクレオチドならびに遊離リンカーに対応するピークを示す図である。
アルコール沈殿によって精製されたリンカー-オリゴヌクレオチド反応生成物の分析RP-HPLCを示す図である。曲線は、図9に示す曲線と比較して、実質的に低減した遊離オリゴヌクレオチドピークおよびほとんど消失した遊離リンカーピークを示し、精製プロセスによる遊離オリゴヌクレオチドおよびリンカーの除去を示す。
精製されたオリゴヌクレオチド-リンカー生成物のLCMSを示し、ただ1つの主ピークを示す図である。
抗TfR-オリゴヌクレオチド抱合反応生成物のSDS-PAGE分析を示す図である。左のレーンは分子量ラダーを示し、右のレーンは反応生成物を示す。DAR0、DAR1、DAR2、DAR3およびDAR4の標識は、それぞれ0、1、2、3または4の薬物-抗体比(DAR)を有する生成物を示す。
抗TfR-オリゴヌクレオチド抱合反応生成物の分析SEC曲線を示す図である。
5分、35分、および65分の反応持続時間での220nmでの経時的なエンド-BCN-PEG4-PFPエステル出発物質の消失による反応前進行のRP-C18 UPLCモニタリングを示す図である。PFP:ペンタフルオロフェニル。
20時間進行させたオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルとの抗TfR Fabの抱合後の粗反応混合物のSDS-PAGE分析を示す図である。左のレーンは分子量ラダーを示す。D0、D1、D2、D3、D4、D5およびD6の標識は、それぞれ0、1、2、3、4、5または6の薬物-抗体比(DAR)を有する生成物を示す。
クロマトグラフィー精製中のHAフロースルー画分のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)クロマトグラム(260nm)を示す図である。クロマトグラムは、10.5分および11.3分で遊離(非抱合)ペイロード種を示す。ロードフロースルーでは、Fab-オリゴヌクレオチド抱合体(約9.1分の主ピーク)はほとんどまたは全く観察されなかった。
クロマトグラフィー精製中のHA溶出ピークのSECクロマトグラム(260nm)を示す図である。クロマトグラムは、遊離(非抱合)オリゴヌクレオチドペイロード種の完全な除去を示し(約10.5分および約11.3分で予想されるピーク)、代わりにFab-オリゴヌクレオチド抱合体のみを示す(約9.1分での主ピーク)。
100％の回収率(3.24μg/μLで7.4μL、13.9mLの体積;1つの主要ピークのみを有する「HA溶出液」曲線)を仮定した、粗抱合体反応生成物(6μg/μLで4.0μl;2つの主要なピークを有する「粗反応混合物」曲線)の24μg注入およびHA溶出液中の理論上の24μgのFab-オリゴヌクレオチド抱合体の重ね合わせSECクロマトグラム(260nm)を示す図である。
260nm(図19A)および280nm(図19B)での最終精製抗TfR-オリゴヌクレオチドFab-オリゴヌクレオチド抱合体のSECクロマトグラムを示す図である。
図20は、Fab-オリゴヌクレオチド抱合体を形成するためのオリゴヌクレオチドへの抗TfR Fabの抱合後の、50mM His(pH6.0)緩衝液中の精製反応生成物のSDS-PAGE分析を示す図である。左のレーンは精製されたFab-オリゴヌクレオチド抱合体反応生成物を示し、右のレーンは分子量ラダーを示す。
様々なモル比でのオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルの抗TfR Fabへの抱合後の粗反応生成物のSDS-PAGE分析を示す図である。左のレーンは分子量ラダーを示す。レーンA、B、CおよびDは、それぞれ抗TfRに対して2、4、6、または10モル当量のBCNを用いて行われた抱合反応の生成物を示す。右側のレーンは未反応の抗TfR Fabを示す。D0、D1、D2、D3、D4、D5およびD6の標識は、それぞれ0、1、2、3、4、5または6の薬物-抗体比(DAR)を有する生成物を示す。
様々なモル比でのオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルの抗TfR Fabへの抱合後の粗反応生成物のSDS-PAGE分析を示す図である。左端および右端のレーンは分子量ラダーを示す。レーンI、H、G、FおよびEは、それぞれ抗TfRに対して8、6、5、4またはモル当量のBCNを用いて行われた抱合反応の生成物を示す。D0、D1、D2、D3、D4、D5およびD6の標識は、それぞれ0、1、2、3、4、5または6の薬物-抗体比(DAR)を有する生成物を示す。
エンド-BCN-PEG4-PFPエステルの加水分解速度を示す図である。青色曲線の結果は、1:1 DMAでは、エンド-BCN-PEG4-PFPエステルが約0.9％/hの初期加水分解速度を有することを示す。緑色の曲線は、同じ1:1 DMA反応条件下でのモデルval-cit-PAB-PEG3-アジドペイロードとエンド-BCN-PEG4-PFPエステルとの反応を示す。両方の曲線は220nmでの吸光度を示す。
粗反応混合物(図24A)、サンプルフロースルー(図24B)、およびプールHA溶出液(図24C)のSEC-UPLC分析を示す図である。粗反応混合物は、遊離オリゴヌクレオチドおよび抗TfR-オリゴヌクレオチドFab-オリゴヌクレオチド抱合体を含む。サンプルフロースルーは、高DAR種、高抗体-オリゴヌクレオチド抱合を有する種を含む。プールされたHA溶出液は、残留オリゴヌクレオチドおよび抗体-オリゴヌクレオチド抱合体を含む。 粗反応混合物(図24A)、サンプルフロースルー(図24B)、およびプールHA溶出液(図24C)のSEC-UPLC分析を示す図である。粗反応混合物は、遊離オリゴヌクレオチドおよび抗TfR-オリゴヌクレオチドFab-オリゴヌクレオチド抱合体を含む。サンプルフロースルーは、高DAR種、高抗体-オリゴヌクレオチド抱合を有する種を含む。プールされたHA溶出液は、残留オリゴヌクレオチドおよび抗体-オリゴヌクレオチド抱合体を含む。 粗反応混合物(図24A)、サンプルフロースルー(図24B)、およびプールHA溶出液(図24C)のSEC-UPLC分析を示す図である。粗反応混合物は、遊離オリゴヌクレオチドおよび抗TfR-オリゴヌクレオチドFab-オリゴヌクレオチド抱合体を含む。サンプルフロースルーは、高DAR種、高抗体-オリゴヌクレオチド抱合を有する種を含む。プールされたHA溶出液は、残留オリゴヌクレオチドおよび抗体-オリゴヌクレオチド抱合体を含む。
緩衝液交換された最終抱合体のSEC-UPLC分析を示す図である。全体的な抱合効率の収率は62％であり、残留オリゴヌクレオチドが右のピークに現れている。
プールされたHA溶出液(図26A)およびサンプルフロースルー(図26B)のSEC-UPLC分析を示す図である。試料は21℃および0.25mL/分の流速に維持された。移動相はpH7.3で100mMリン酸ナトリウムおよび10％MeCNを含む。プールされたHA溶出液およびサンプルフロースルーは、遊離オリゴヌクレオチドの存在を示す。 プールされたHA溶出液(図26A)およびサンプルフロースルー(図26B)のSEC-UPLC分析を示す図である。試料は21℃および0.25mL/分の流速に維持された。移動相はpH7.3で100mMリン酸ナトリウムおよび10％MeCNを含む。プールされたHA溶出液およびサンプルフロースルーは、遊離オリゴヌクレオチドの存在を示す。
最終抗体断片-薬物抱合体(FDC)のSEC-UPLCを示す図である。試料は、21℃および0.25mL/分の流速に維持された。移動相はpH7.3で100mMのNaPOおよび10％のMeCNを含む。抱合体の47.2％が回収され、右のピークに遊離オリゴヌクレオチドが現れた。
HA精製クロマトグラム(図28A)および各溶液のSDS-PAGE(図28B)を示す図である。反応混合物のpHは、pH3.5の500mM MESで5.7に調整された。 HA精製クロマトグラム(図28A)および各溶液のSDS-PAGE(図28B)を示す図である。反応混合物のpHは、pH3.5の500mM MESで5.7に調整された。
異なる平衡緩衝液および6mg/mLの負荷比を用いたSECによる、サンプルフロースルークロマトグラムを示す図である。図29Aは、0％IPAを含むpH5.6の10mMリン酸ナトリウム平衡緩衝液中のサンプルフロースルーを示す。 図29Bは、25％IPAを含むpH5.6の10mM NaPO平衡化緩衝液中のサンプルフロースルーを示す。 図29Cは、25％IPAを含むpH5.6の5mMリン酸ナトリウム平衡緩衝液中のサンプルフロースルーを示す。
本明細書に記載されるように、本開示は、複合体、例としてタンパク質(例として、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドまたは小分子)に共有結合的に連結した筋標的化剤(例として、抗体))を含む複合体をプロセシング(例として、生成、精製)する方法を提供する。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法による複合体プロセスにおける分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO)または荷電オリゴヌクレオチド)または疎水性小分子である。いくつかの態様では、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂(例として、ヒドロキシアパタイト樹脂、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、ヒドロキシフルオロアパタイト樹脂、フルオロアパタイト樹脂、クロルアパタイト樹脂)を使用して、分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)に共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体)を含む複合体または複数の複合体は、該複合体および非連結(例として、過剰)分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)を含む混合物から精製され、有機溶媒は、混合モード樹脂クロマトグラフィーの移動相に存在する。混合モードクロマトグラフィーの移動相中の有機溶媒の存在は、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO)または荷電オリゴヌクレオチド)などの分子ペイロードと疎水性小分子との間の混合モード樹脂との非特異的相互作用を低減させ、複合体の収率を増加させる。
いくつかの態様において、精製される複合体は、例として、筋疾患を有するかまたはこれを有すると疑われる対象において、筋細胞における標的遺伝子の発現または活性をモジュレートする分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を送達するのに特に有用である。例えば、いくつかの態様では、複合体は、筋緊張性ジストロフィー(例として、筋緊張性ジストロフィー1型)、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)、ポンペ病、中心核筋症、進行性骨化性線維異形成症、フリードライヒ運動失調症、およびデュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む希な筋疾患を有する対象を治療するのに有用である。いくつかの態様では、治療される状態に応じて、異なるオリゴヌクレオチドはそのような複合体で使用されてもよい。
定義された用語の記載を含む本開示のさらなる側面は、以下に提供される。
I.定義
投与すること:本明細書に使用される場合、用語「投与すること」または「投与」は、生理学的におよび/または薬理学的に有用なやり方で対象へ複合体を提供することを意味する(例として、対象における疾病を処置すること)。
およそ:本明細書に使用される場合、用語「およそ」または「約」は、目的の1つ以上の値へ適用されるとき、規定された参照値と類似の値を指す。ある態様において、用語「およそ」または「約」は、別様に述べられない限りまたは文脈から明らかでない限り(かかる数字が実行可能な値の100％を超える場合を除く)、規定された参照値のプラスマイナス(超又は未満)の15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、またはこれ未満に収まる広範な値を指す。
抗体:本明細書に使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメインまたは少なくとも1つの抗原決定基、例として、抗原へ特異的に結合するパラトープを包含するポリペプチドを指す。いくつかの態様において、抗体は完全長抗体、例として完全長IgGである。いくつかの態様において、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化抗体である。しかしながら、いくつかの態様において、抗体は、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、またはscFvフラグメントである。いくつかの態様において、抗体は、ラクダ科の動物の抗体に由来するナノボディー、またはサメ抗体に由来するナノボディーである。いくつかの態様において、抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は、ヒト生殖細胞系配列を有するフレームワークを含む。別の態様において、抗体は、IgG、IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgM、およびIgEの定常領域からなる群から選択される重鎖定常領域を含む。いくつかの態様において、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書中VHと略される)、および/または軽(L)鎖可変領域(本明細書中VLと略される)を含む。いくつかの態様において、抗体は、定常領域、例としてFc領域を含む。免疫グロブリン定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域を指す。ヒトIgG重鎖および軽鎖定常領域アミノ酸配列およびそれらの機能的バリエーションは知られている。重鎖に関し、いくつかの態様において本明細書に記載の抗体の重鎖は、アルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖であり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体の重鎖は、ヒトのアルファ(α)、デルタ(Δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)、またはミュー(μ)重鎖を含み得る。具体的な態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒトのガンマ1 CH1ドメイン、CH2ドメイン、および/またはCH3ドメインを含む。いくつかの態様において、VHドメインのアミノ酸配列は、ヒトガンマ(γ)重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば当該技術分野において知られているいずれの配列も含む。ヒト定常領域配列の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、米国特許第5,693,780号および上記のKabat E A et al.(1991)を見よ。いくつかの態様において、VHドメインは、本明細書に提供される可変鎖定常領域のいずれかと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/またはメチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/またはホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、抗体は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域へ共有結合的に連結された本開示の1個以上の抗原結合性フラグメントを含むポリペプチドを含む構築物である。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって結び合わされた2個以上のアミノ酸残基を含み、1個以上の抗原結合部と連結させるために使用される。リンカーポリペプチドの例は報告されている(例として、Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123を見よ)。またさらに、抗体は、1以上の他のタンパク質またはペプチドと、抗体もしくは抗体部分との共有結合または非共有結合の結び付きによって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってもよい。かかる免疫接着分子の例は、四量体scFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101)、ならびに二価のおよびビオチン化されたscFv分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびC末ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov,S.M.,et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)を包含する。
CDR:本明細書に使用される場合、用語「CDR」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域の各々において3つのCDRがあり、これらは可変領域の各々につきCDR1、CDR2、およびCDR3と指定される。用語「CDRセット」は、本明細書に使用されるとき、抗原に結合することが可能な単一の可変領域に生じる3つのCDRの一群を指す。これらのCDRの厳密な境界は、種々の系に従い異なって定義されている。Kabat(Kabat et al.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(国立衛生研究所,Bethesda,Md.(1987)および(1991))によって記載される系は、抗体のいずれの可変領域へも適用可能な一義的な残基ナンバリング系を提供するのみならず、3つのCDRを定義する正確な残基境界をも提供する。これらのCDRは、Kabat CDRと称されることもある。CDRの下位部(Sub-portions)は、L1、L2、およびL3、またはH1、H2、およびH3と指定されることがあり、ここで「L」および「H」は夫々、軽鎖および重鎖領域を指定する。これらの領域は、Kabat CDRと重複する境界を有するChothia CDRと称されることもある。Kabat CDRと重複するCDRを定義する他の境界は、Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))およびMacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))によって記載されている。さらに他のCDR境界定義は、上の系の1つに厳重に従わなくてもよいが、それでもなおKabat CDRと重複することがあり、具体的な残基もしくは残基の群またはCDR全体でさえも抗原結合に有意に影響を及ぼすものではないという予測あるいは実験的知見を踏まえ、それらは短縮または伸長されてもよい。本明細書で使用される方法は、これらの系のいずれかに従って定義されるCDRを利用してもよいが、好ましい態様は、KabatまたはChothia定義のCDRを使用する。
CDR接合(-grafted)抗体:用語「CDR接合抗体」は、マウス重鎖および軽鎖可変領域を有するがマウスCDRの1以上(例として、CDR3)がヒトCDR配列に置き換えられている抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、そのVHおよび/またはVLのCDR領域の1以上の配列が別の種のCDR配列に置き換えられている抗体を指す。
キメラ抗体:用語「キメラ抗体」は、ヒト定常領域へ連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体などの、ある種からの重鎖および軽鎖可変領域配列と別の種からの定常領域配列を含む抗体を指す。
相補的:本明細書に使用されるとき、用語「相補的」は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間の正確な対形成のための能力(capacity)を指す。とりわけ、相補的は、2ヌクレオチド間または2組のヌクレオチド間に結合をもたらす水素結合対形成の程度を特徴付ける用語である。例えば、ある位置のオリゴヌクレオチドの塩基が、対応する位置の標的核酸(例として、mRNA)の塩基と水素結合することが可能である場合、そのとき塩基は、その位置にて互いに相補的であると見なされる。塩基対合は、標準的なWatson-Crick塩基対合と非Watson-Crick塩基対合(例として、Wobble塩基対合およびHoogsteen塩基対合)との両方を包含してもよい。例えば、いくつかの態様において、相補的な塩基対合として、アデノシン型塩基(A)は、チミジン型塩基(T)またはウラシル型塩基(U)に相補的であり、シトシン型塩基(C)は、グアノシン型塩基(G)に相補的であり、3-ニトロピロールまたは5-ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、いずれかのA、C、U、またはTとハイブリダイズし得る。イノシン(I)はまた、当該技術分野においてユニバーサル塩基であるとも見なされており、いずれかのA、C、U、またはTに相補的であると見なされる。
保存アミノ酸置換:本明細書に使用されるとき、「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得、例えば、かかる方法をまとめた参考文献、例として、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Fourth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2012、またはCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley&Sons,Inc.,New Yorkから見出される。アミノ酸の保存的置換は、以下の群:(a)M、I、L、V;(b)F、Y、W;(c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T;(f)Q、N;および(g)E、D内のアミノ酸に対してなされる置換を包含する。
共有結合的に連結された(または、連結されている):本明細書に使用されるとき、用語「共有結合的に連結された(または、連結されている)」は、少なくとも1個の共有結合を介して一緒に連結されている2個以上の分子の特徴を指す。いくつかの態様において、2個の分子は一緒に、分子間リンカーとして働く単結合(例として、ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋)によって共有結合的に連結され得る。しかしながら、いくつかの態様において、複数の共有結合を通して2個以上の分子を一緒に結び合わせるリンカーとして働く分子を介して、2個以上の分子は一緒に、共有結合的に連結され得る。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。
交差反応すること:本明細書に使用されるとき、および標的化剤(例として、抗体)の文脈において、用語「交差反応すること」は、同様のタイプまたはクラスの1種より多くの抗原(例として、複数のホモログ、パラログ、もしくはオルソログの抗原)へ、同様の親和性または結合活性で特異的に結合することが可能な剤の特性を指す。例として、いくつかの態様において、同様のタイプまたはクラスのヒトおよび霊長目の非ヒト動物の抗原(例として、ヒトトランスフェリン受容体および霊長目の非ヒト動物のトランスフェリン受容体)に対して交差反応する抗体は、ヒト抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原へ、同様の親和性または結合活性で結合することが可能である。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原および齧歯類動物抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスの齧歯類動物の抗原および霊長目の非ヒト動物の抗原に対して交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、同様のタイプまたはクラスのヒト抗原、霊長目の非ヒト動物の抗原、および齧歯類動物の抗原に対して交差反応する。
疾患アレル:本明細書に使用されるとき、用語「疾患アレル」は、アレルが疾患と相関する、および/またはこれに直接的にもしくは間接的に寄与する、またはこれを引き起こす、遺伝子の代替的な形態(例として、突然変異型)のいずれか1つを指す。疾患アレルは、野生型(非疾患)アレルと比べて、これらに限定されないが、挿入(例として、下に記載の疾患関連反復)、欠失、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異およびスプライス部位突然変異を含む遺伝子変更を含んでもよい。いくつかの態様において、疾患アレルは、機能喪失型突然変異を有する。いくつかの態様において、疾患アレルは、機能獲得型突然変異を有する。いくつかの態様において、疾患アレルは、活性化突然変異をコードする(例として、構成的に活性であるタンパク質をコードする)。いくつかの態様において、疾患アレルは、劣性表現型を有する劣性アレルである。いくつかの態様において、疾患アレルは、優性表現型を有する優性アレルである。
疾患関連反復:本明細書に使用されるとき、用語「疾患関連反復」は、反復ヌクレオチド配列の数ユニットが、遺伝的疾患と相関する、および/またはこれに直接的にもしくは間接的に寄与する、またはこれを引き起こす、ゲノムの場所での反復ヌクレオチド配列を指す。疾患関連反復の各反復単位は、長さが、2、3、4、5またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。例えば、いくつかの態様において、疾患関連反復は、ジヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、トリヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、テトラヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、ペンタヌクレオチド反復である。いくつかの態様において、疾患関連反復は、CAG反復、CTG反復、CUG反復、CGG反復、CCTG反復、またはそれらのいずれかのヌクレオチド相補体を含む。いくつかの態様において、疾患関連反復は、遺伝子の非コード部分にある。しかしながら、いくつかの態様において、疾患関連反復は、遺伝子のコード領域にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、正常な状態から、遺伝的疾患に直接的にまたは間接的に寄与するまたはこれを引き起こす長さへ、拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、RNA(例として、RNA転写産物)にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、DNA(例として、染色体、プラスミド)にある。いくつかの態様において、疾患関連反復は、生殖細胞系列細胞の染色体において拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、体細胞の染色体において拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、先天性発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、疾患の小児期発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。いくつかの態様において、疾患関連反復は、疾患の成人発症に関連する数多の反復単位へ拡張される。
フレームワーク:本明細書に使用されるとき、用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」は、CDRを差し引いた可変領域の残りの配列を指す。CDR配列の厳密な定義が種々の系によって決定され得ることから、フレームワーク配列の意味は、相応に異なる解釈に依存する。6つのCDR(軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3、ならびに重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)もまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の4つの下位領域(FR1、FR2、FR3、およびFR4)に分け、ここでCDR1はFR1とFR2との間に、CDR2はFR2とFR3との間に、CDR3はFR3とFR4との間に位置付けられる。具体的な下位領域をFR1、FR2、FR3、またはFR4と特定しないフレームワーク領域は、他によって言及されるとき、天然に存在する単一の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせされたFR(複数)を表す。本明細書に使用されるとき、FRは4つの下位領域のうち1つを表し、FR(複数)はフレームワーク領域を含有する4つの下位領域のうち2つ以上を表す。ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、当該技術分野において知られている。一態様において、当該技術分野において知られているアクセプター配列は、本明細書に開示の抗体に使用されていてもよい。
ヒト抗体:用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することが意図される。本開示のヒト抗体は、例えばCDR、とりわけCDR3において、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例として、in vitroでのランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によってか、またはin vivoでの体細胞変異によって導入された突然変異)を包含していてもよい。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上へ接合された抗体を包含することは意図されない。
ヒト化抗体:用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種(例として、マウス)からの重鎖および軽鎖の可変領域配列を含むが、VH配列および/またはVL配列の少なくとも一部がより「ヒト様」に、すなわち、ヒト生殖細胞系可変配列とより同様なものに変更された抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプは、ヒトCDR配列が非ヒトVHおよびVL配列上へ導入されて対応する非ヒトCDR配列と置き換えられたCDR接合抗体である。一態様において、ヒト化された抗トランスフェリン受容体抗体および抗原結合部分が提供される。かかる抗体は、既存のハイブリドーマ技術、これに続くin vitroの遺伝子工学を使用するヒト化(KasaianらのPCT刊行物第WO 2005/123126 A2号に開示されたものなど)を使用してマウス抗トランスフェリン受容体モノクローナル抗体を得ることによって生成されてもよい。
内在化する細胞表面受容体:本明細書に使用されるとき、用語「内在化する細胞表面受容体」は、例として、外部刺激(例として、受容体へ結合するリガンド)の際、細胞によって内在化される細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、エンドサイトーシスによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリン媒介エンドサイトーシスによって内在化される。しかしながら、いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、クラスリンに依存しない経路、例えば、食作用、マクロピノサイトーシス、カベオラ-およびラフト-媒介取り込み、またはクラスリンに依存しない構成的エンドサイトーシスなどによって内在化される。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または細胞外ドメインを含み、これらは任意にさらにリガンド結合ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞表面受容体は、リガンド結合後に細胞によって内在化されるようになる。いくつかの態様において、リガンドは、筋標的化タンパク質または筋標的化抗体であってもよい。いくつかの態様において、内在化する細胞表面受容体は、トランスフェリン受容体である。
単離された抗体:「単離された抗体」は、本明細書に使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を指すことが意図される(例として、トランスフェリン受容体に特異的に結合する単離された抗体は、トランスフェリン受容体以外の抗原に特異的に結合する抗体が実質的にない)。しかしながら、トランスフェリン受容体複合体に特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのトランスフェリン受容体分子などの他の抗原への交差反応性を有していてもよい。その上、単離された抗体は、他の細胞の材料および/または化学物質が実質的になくてもよい。
Kabatナンバリング:用語「Kabatナンバリング」、「Kabat定義」、および「Kabat標識化」は本明細書中、互換的に使用される。これらの用語は、当該技術分野において認識されているが、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基より可変(すなわち、高可変)であるアミノ酸残基をナンバリングする系を指す(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382-391および、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。重鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置31～35、CDR2につきアミノ酸位置50～65、およびCDR3につきアミノ酸位置95～102に及ぶ。軽鎖可変領域において、超可変領域は、CDR1につきアミノ酸位置24～34、CDR2につきアミノ酸位置50～56、およびCDR3につきアミノ酸位置89～97に及ぶ。
混合モード樹脂:本明細書で使用される場合、「混合モード樹脂」という用語は、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む生体分子の精製、分離、および/または単離に使用するためのクロマトグラフィー樹脂または材料を指す。いくつかの態様では、金属部位はカルシウムを含む。いくつかの態様では、負に帯電したイオン部位は、ホスファート、スルファート、フッ化物、または塩化物を含む。いくつかの態様では、金属部位はカルシウムを含み、負に帯電したイオン部位はホスファートを含み、任意にスルファート、フッ化物、または塩化物を含む。いくつかの態様では、混合モード樹脂はアパタイト樹脂である。いくつかの態様では、アパタイト樹脂は、ヒドロキシアパタイト樹脂、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、ヒドロキシフルオロアパタイト樹脂、フルオロアパタイト樹脂、またはクロルアパタイト樹脂である。いくつかの態様では、アパタイト樹脂は、式:Ca10(PO4)6(OH)2の鉱物を含む。いくつかの態様では、アパタイト樹脂は、式:Ca10(PO4)6F2の鉱物を含む。いくつかの態様では、アパタイト樹脂は、式:Ca10(PO4)6Cl2の鉱物を含む。
分子ペイロード:本明細書に使用されるとき、用語「分子ペイロード」は、生物学的結果(biological outcome)をモジュレートするよう機能する分子または種を指す。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ共有結合的に連結されているか、または別様に結び付けられている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、またはオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様では、分子ペイロードは疎水性小分子である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO))または荷電オリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、DNA配列の転写をモジュレートするよう、タンパク質の発現をモジュレートするよう、またはタンパク質の活性をモジュレートするよう機能する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド、例として、標的遺伝子に対して相補性の領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。
筋疾患遺伝子:本明細書に使用されるとき、用語「筋疾患遺伝子」は、筋疾患と相関するおよび/またはこれに直接的にまたは間接的に寄与するまたはこれを引き起こす、最も少ない疾患アレルを有する遺伝子を指す。いくつかの態様において、筋疾患は、希少疾患であり、例として、National Center for Advancing Translational Sciences(NCATS)のプログラムであるGenetic and Rare Diseases Information Center(GARD)によって定義されるものである。いくつかの態様において、筋疾患は、200,000人未満を冒すものとして特徴付けられる希少疾患である。いくつかの態様において、筋疾患は、単一遺伝子疾患である。いくつかの態様において、筋疾患遺伝子は、表1に列挙された遺伝子である。
筋標的化剤:本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化剤」は、筋細胞上に発現されている抗原へ特異的に結合する分子を指す。筋細胞中または筋細胞上の抗原は、膜タンパク質、例えば、内在性膜タンパク質または表在性膜タンパク質であってもよい。典型的には、筋標的化剤は、筋細胞中への筋標的化剤(および結び付けられたあらゆる分子ペイロード)の内在化を容易にさせる筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋肉上の内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合し、受容体媒介内在化を通して筋細胞中へ内在化されることが可能である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸(例として、アプタマー)、または抗体である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている。いくつかの態様では、筋標的化剤は、筋標的化タンパク質(例として、抗体)である。
筋標的化抗体:本明細書に使用されるとき、用語「筋標的化抗体」は、筋細胞中または筋細胞上に見出される抗原へ特異的に結合する抗体である筋標的化剤を指す。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞中への筋標的化抗体(および結び付けられたあらゆる分子ペイロード)の内在化を容易にする筋細胞上の抗原へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋細胞上に存在する、内在化する細胞表面受容体へ特異的に結合する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗体である。
オリゴヌクレオチド:本明細書に使用されるとき、用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが最大200ヌクレオチドまでのオリゴマーの核酸化合物を指す。オリゴヌクレオチドの例は、これらに限定されないが、RNAiオリゴヌクレオチド(例として、siRNA、shRNA)、マイクロRNA、gapmer、mixmer、ホスホロジアミダイト、モルホリノ、ペプチド核酸、アプタマー、ガイド核酸(例として、Cas9ガイドRNA)等々を包含する。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド(例として、2'-O-メチル糖修飾、プリンまたはピリミジン修飾)を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド間連結を含んでいてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RpまたはSpの立体化学配置にあってもよい1個以上のホスホロチオアート連結を含んでいてもよい。
組換え抗体:用語「組換えヒト抗体」は、本明細書に使用されるとき、組換え手段によって調製、発現、創出、もしくは単離されたすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞中へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体(本開示により詳細に記載される)、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体(Hoogenboom H.R.,(1997)TIB Tech.15:62-70;Azzazy H.,and Highsmith W.E.,(2002)Clin.Biochem.35:425-445;Gavilondo J.V.,and Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29:128-145;Hoogenboom H.,and Chames P.(2000)Immunology Today 21:371-378)、ヒト免疫グロブリン遺伝子トランスジェニック動物(例として、マウス)から単離された抗体(例として、Taylor,L.D.,et al.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295;Kellermann S-A.,and Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593-597;Little M.et al(2000)Immunology Today 21:364-370を見よ)、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列とのスプライシングを伴うあらゆる他の手段によって調製、発現、創出、もしくは単離された抗体を包含することが意図される。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある態様において、かかる組換えヒト抗体は、in vitroでの変異誘発(または、ヒトIg配列トランスジェニック動物が使用されるとき、in vivoでの体細胞変異誘発)へ供され、よって、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のVH配列およびVL配列に由来しかつこれに関するとはいえ、in vivoでのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内には天然に存在しないこともある配列である。本開示の一態様は、当該技術分野において周知である技法を使用して、例えば、これらに限定されないが、ヒトIgファージライブラリ(例えば、JermutusらのPCT刊行物第WO2005/007699 A2号に開示されたもの)を使用する技法を使用して生成され得るヒトトランスフェリン受容体に結合することが可能な完全ヒト抗体を提供する。
相補性のある領域:本明細書に使用されるとき、用語「相補性のある領域」は、2つのヌクレオチド配列が生理学的な条件下(例として、細胞中)相互にアニーリングすることが可能であるような、同族の(cognate)ヌクレオチド配列(例として、標的核酸のヌクレオチド配列)に充分に相補的であるヌクレオチド配列(例として、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列)を指す。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に完全に相補的である。しかしながら、いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列に部分的に相補的(例として、少なくとも80％、90％、95％、または99％相補性)である。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の同族のヌクレオチド配列と比較して1個、2個、3個、または4個のミスマッチを含有する。
特異的に結合する:本明細書に使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、結合アッセイまたは他の結合に関する文脈(binding context)において、分子が、適切な対照から結合パートナーを区別するために使用され得る親和性または結合活性の程度での、分子の、結合パートナーへの結合能を指す。抗体に関し、用語「特異的に結合する」は、親和性または結合活性の程度で(例として、本明細書に記載のとおり、抗原への結合を通してある細胞(例として、筋細胞)への優先的な標的化を許容する程度で)、適切な参照抗原、または抗体が他の抗原から特定の抗原を区別するために使用され得る抗原と比較して、抗体が特定の抗原へ結合する能力を指す。いくつかの態様において、抗体が標的へ結合する際少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはこれ未満のKDを有する場合、抗体は標的へ特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体が、トランスフェリン受容体、例として、トランスフェリン受容体の先端ドメインのエピトープへ特異的に結合する。
対象:本明細書に使用されるとき、用語「対象」は、哺乳動物を指す。いくつかの態様において、対象は、霊長目の非ヒト動物または齧歯類動物である。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、疾患を有するかまたは疾患を有すると疑われる患者/患畜(patient)、例として、ヒト患者である。いくつかの態様において、対象は、筋疾患(例として、表1に提供されたいずれかの疾患)を有するかまたはそれを有すると疑われるヒト患者である。
トランスフェリン受容体:本明細書に使用されるとき、用語「トランスフェリン受容体」(またTFRC、CD71、p90、TFR、またはTFR1としても知られている)は、エンドサイトーシスによる鉄取り込みを容易にするためのトランスフェリンへ結合する、内在化する細胞表面受容体を指す。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体は、ヒト(NCBI Gene ID 7037)、霊長目の非ヒト動物(例として、NCBI Gene ID 711568もしくはNCBI Gene ID 102136007)、または齧歯類の動物(例として、NCBI Gene ID 22042)を起源としていてもよい。加えて、受容体の種々のアイソフォームをコードした複数のヒト転写産物バリアントが(例として、GenBank RefSeq受託番号:NP＿001121620.1、NP＿003225.2、NP＿001300894.1、およびNP＿001300895.1の注釈付きのものであるように)特徴付けられている。
NCBI配列NP＿003225.2(トランスフェリン受容体タンパク質1アイソフォーム1、homo sapiens)に対応する、ヒトトランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号1).
NCBI配列NP＿001244232.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca mulatta)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKPNGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号2)
NCBI配列XP＿005545315.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca fascicularis)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKANGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号3).
NCBI配列NP＿001344227.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、mus musculus)に対応する、マウストランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAADEEENADNNMKASVRKPKRFNGRLCFAAIALVIFFLIGFMSGYLGYCKRVEQKEECVKLAETEETDKSETMETEDVPTSSRLYWADLKTLLSEKLNSIEFADTIKQLSQNTYTPREAGSQKDESLAYYIENQFHEFKFSKVWRDEHYVKIQVKSSIGQNMVTIVQSNGNLDPVESPEGYVAFSKPTEVSGKLVHANFGTKKDFEELSYSVNGSLVIVRAGEITFAEKVANAQSFNAIGVLIYMDKNKFPVVEADLALFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGKMEGSCPARWNIDSSCKLELSQNQNVKLIVKNVLKERRILNIFGVIKGYEEPDRYVVVGAQRDALGAGVAAKSSVGTGLLLKLAQVFSDMISKDGFRPSRSIIFASWTAGDFGAVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKVVLGTSNFKVSASPLLYTLMGKIMQDVKHPVDGKSLYRDSNWISKVEKLSFDNAAYPFLAYSGIPAVSFCFCEDADYPYLGTRLDTYEALTQKVPQLNQMVRTAAEVAGQLIIKLTHDVELNLDYEMYNSKLLSFMKDLNQFKTDIRDMGLSLQWLYSARGDYFRATSRLTTDFHNAEKTNRFVMREINDRIMKVEYHFLSPYVSPRESPFRHIFWGSGSHTLSALVENLKLRQKNITAFNETLFRNQLALATWTIQGVANALSGDIWNIDNEF(配列番号4).
非連結分子ペイロード:本明細書で使用される場合、用語「非連結分子ペイロード」は、例として、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドまたは小分子)に結合したタンパク質を含む複合体を生成するための抱合反応後に、溶液中に存在する遊離分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドまたは小分子)あるいは過剰な分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドまたは小分子)を指す。いくつかの態様では、非連結分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドまたは小分子)は、タンパク質(例として、抗体)に連結されていない。いくつかの態様では、非連結分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドまたは小分子)は、いずれの他の部分にも連結されていない。いくつかの態様では、非連結分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドまたは小分子)は、官能基に連結されているが、タンパク質(例として、抗体)に連結されて複合体を形成しない。いくつかの態様では、非連結分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドまたは小分子)は、リンカーまたはリンカーの一部に連結されているが、タンパク質(例として、抗体)に連結されて複合体を形成しない。
非連結タンパク質:本明細書で使用される場合、「非連結タンパク質」という用語は、例として分子ペイロードに結合したタンパク質を含む複合体を生成するための抱合反応後に溶液中に存在する遊離タンパク質または過剰タンパク質(例として、遊離抗体または過剰な抗体)を指す。いくつかの態様では、非連結タンパク質(例として、抗体)は化学修飾されていない。いくつかの態様では、非連結(例として、抗体)は化学修飾されている。いくつかの態様では、非連結(例として、抗体)は、官能基を含むように化学修飾されているが、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドまたは小分子)に連結されていない。いくつかの態様では、官能基は、分子ペイロードへの抱合(例として、クリックケミストリーを介して)のためのものである。いくつかの態様では、官能基はアルキン基である。いくつかの態様では、非連結(例として、抗体)は、アルキン基を含む。
複合体:本明細書で使用される場合、「複合体」という用語は、1つ以上の分子ペイロード(例として、小分子またはオリゴヌクレオチドなどの治療剤)に共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体)を含む抱合体を指す。いくつかの態様では、複合体中のタンパク質は、標的化剤(例として、抗体)を含む。いくつかの態様において、標的化剤は筋肉(例として、抗トランスフェリン受容体抗体)を標的とする。
プロセス:本明細書で使用される場合、「プロセス」という用語は、本明細書に記載の複合体の製造(例として、抱合を介して)、単離(例として、反応混合物から)、および/または(例として、および)修飾を含むが、これらに限定されない。
アルキン:本明細書で使用される場合、「アルキン」という用語は、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含有する不飽和炭化水素を指す。
荷電オリゴヌクレオチド:本明細書で使用される場合、「荷電オリゴヌクレオチド」という用語は、生理学的pH(例として、pH7.35～pH7.45)で正味の負電荷または正味の正電荷を有する骨格を含むオリゴヌクレオチド類似体を指す。いくつかの態様において、荷電オリゴヌクレオチドは、生理学的pHで正味の負電荷を有する(本明細書において負に荷電したオリゴヌクレオチドと呼ばれる)。いくつかの態様において、荷電オリゴヌクレオチドは、生理学的pHで正味の正電荷を有する(本明細書において正に荷電したオリゴヌクレオチドと呼ばれる)。いくつかの態様において、荷電オリゴヌクレオチドは、生理学的pHにおいて正味の負電荷を有するホスホジエステル骨格を含む。いくつかの態様において、荷電オリゴヌクレオチドは、生理学的pHにおいて正味の負電荷を有するホスホチオエート骨格を含む。
電荷中性オリゴヌクレオチド:本明細書で使用される場合、「電荷中性オリゴヌクレオチド」という用語は、生理学的pH(例として、pH7.35～pH7.45)で電荷中性骨格を含むオリゴヌクレオチド類似体を指す。電荷中性オリゴヌクレオチドの例としては、例として、参照により本明細書に組み込まれるJarver et al.,(Nucleic Acid Therapeutics,Vol.25,No.2,2015)に記載されているように、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)およびペプチド核酸(PNA)が挙げられるがこれらに限定されない。
有機溶媒:本明細書で使用される場合、「有機溶媒」という用語は、他の物質を溶解することができる炭素系物質を指す。炭素系であることにより、有機溶媒は、それらの化合物の構造中に存在する炭素原子を有する。本開示に従って使用され得る有機溶媒の非限定的な例には、限定されないが、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)を包含する。
％(v/v):本明細書で使用される場合、「％(v/v)」という用語は、混合物の全体積中の混合物の1つの成分(例として、有機溶媒)の体積の％を指す。
薬物抗体比(DAR):本明細書で使用される場合、「薬物抗体比(DAR)」という用語は、抗体に抱合された薬物の数を指す。このDAR数は、抱合に使用される実験条件(出発反応材料中の抗体と分子ペイロードとの比、反応時間、溶媒の性質およびもしあれば共溶媒の性質)と共に使用される抗体および薬物の性質によって変化し得る。決定されるDARは平均値である。DARを決定するために使用され得る方法の一例が、参照により本明細書中に組み込まれるDimitrov et al.,2009,Therapeutic Antibodies and Protocols,vol 525,445,Springer Scienceに記載される。
中間体:本明細書で使用される場合、「中間体」という用語は、複合体が得られる前に複合体を製造する方法を行って生成される分子を指す。いくつかの態様において、中間体は、リンカー(例として、切断可能なリンカー、例としてval-citリンカー(すなわち、バリン-シトルリン配列を含む切断可能なリンカー)に連結されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、中間体は、ビシクロノニンを含む化合物に共有結合的に連結されたリンカー(例として、切断可能なリンカー、例として、val-citリンカー)に共有結合的に連結したオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、中間体は、ビシクロノニンを含む化合物に共有結合的に連結した抗体を含む。
2'修飾ヌクレオシド:本明細書に使用されるとき、用語「2'修飾ヌクレオシド」および「2'修飾リボヌクレオシド」は互換的に使用され、2'位にて修飾された糖部分を有するヌクレオシドを指す。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは、2'-4'二環式ヌクレオシドであり、ここで糖の2'および4'位は架橋されている(例として、メチレン、エチレン、または(S)-拘束エチル架橋による)。いくつかの態様において、2'修飾ヌクレオシドは非二環式2'修飾ヌクレオシドであり、例えばここで糖部分の2'位は置換されている。2'修飾ヌクレオシドの非限定例は、以下:2'デオキシ、2'-フルオロ(2'-F)、2'-O-メチル(2'-O-Me)、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)、ロックド核酸(LNA、メチレン架橋核酸)、エチレン架橋核酸(ENA)、および(S)-拘束エチル架橋核酸(cEt)を包含する。いくつかの態様において、本明細書に記載の2'修飾ヌクレオシドは高親和性修飾ヌクレオチドであり、2'修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比べて標的配列に対する増大した親和性を有する。2'修飾ヌクレオシドの構造の例は、下に提供される:
Figure 2023540746000011
II.複合体をプロセシングする方法
いくつかの側面では、本開示は、1つ以上の分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)に共有結合的に連結したタンパク質、例として抗体を含む複合体をプロセシング(例として、製造、単離)する方法を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、1つ以上のオリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)に共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体)を含む複合体を製造する方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、(i)オリゴヌクレオチドを切断可能なリンカー(例として、val-citリンカー)に共有結合的に連結させて、第1の中間体を得ることを含む。いくつかの態様では、方法は、(ii)ステップ(i)で得られた第1の中間体をビシクロノニン化合物と共有結合的に連結させて第2の中間体を得るステップをさらに含む。いくつかの態様では、方法は、(iii)ステップ(ii)で得られた第2の中間体を抗体に共有結合的に連結させて複合体を得るステップをさらに含む。いくつかの態様では、ビシクロノニン化合物は、ステップ(iii)の反応において、ステップ(ii)のビシクロノニン化合物の出発量の10％以下または5％以下(例として、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、0.5％未満、または0.1％未満)の量で存在する。いくつかの態様において、切断可能なリンカー(例として、val-citリンカー)は、オリゴヌクレオチドの5'末端に連結される。いくつかの態様において、切断可能なリンカー(例として、val-citリンカー)は、さらなる化学部分を介してオリゴヌクレオチドに連結される。いくつかの態様では、ステップ(iii)は、第2の中間体に連結されている抗体のリジン残基をもたらす。
いくつかの態様では、複合体を製造する方法は、(i)オリゴヌクレオチドを切断可能なリンカー(例として、val-citリンカー)に共有結合的に連結させて、第1の中間体を得ることと、(ii)ステップ(i)で得られた第1の中間体をビシクロノニン化合物と共有結合的に連結させて、第2の中間体を得ることと、(iii)ステップ(ii)で得られた第2の中間体を抗体に共有結合的に連結させて複合体を得ることと、を含み、ここで、ビシクロノニン化合物は、ステップ(iii)の反応において、ステップ(ii)の化合物の出発量の10％以下または5％以下(例として、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、0.5％未満、または0.1％未満)の量で存在する。この方法では、切断可能なリンカー(例として、val-citリンカー)は、オリゴヌクレオチドの5'末端に任意に連結される。いくつかの態様において、切断可能なリンカー(例として、val-citリンカー)は、さらなる化学部分を介してオリゴヌクレオチドに連結される。さらに、いくつかの態様では、ステップ(iii)は、第2の中間体に連結されている抗体のリジン残基をもたらす。
いくつかの態様では、分子ペイロードは疎水性小分子である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、電荷中性オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、分子ペイロードは、荷電オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、一本鎖オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性一本鎖オリゴヌクレオチドまたは電荷一本鎖オリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、電荷中性鎖オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、電荷中性オリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である。いくつかの態様において、電荷中性オリゴヌクレオチドはペプチド核酸(PNA)である。いくつかの態様において、荷電オリゴヌクレオチドはgapmerである。いくつかの態様では、抗体は、一本鎖オリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結している(例として、gapmerまたはPMO)。いくつかの態様では、抗体は、一本鎖オリゴヌクレオチドの3'末端に共有結合的に連結している(例として、gapmerまたはPMO)。いくつかの態様では、抗体は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例として、gapmerまたはPMO)の5'末端に共有結合的に連結している。
いくつかの態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖である。いくつかの態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖は、抗体に共有結合的に抱合され得、複合体は、本明細書に記載の方法を使用して単離され得、二本鎖オリゴヌクレオチドの他方の鎖のアニーリングが続く。いくつかの態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドはsiRNAであり、センス鎖は抗体に共有結合的に連結している(例として、3'末端または5'末端において)。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法を使用して精製された複合体は、siRNAのセンス鎖の3'末端に共有結合的に連結した抗体を含む。siRNAのアンチセンス鎖は、精製後にセンス鎖にアニールされ得る。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾ヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、少なくとも1個の修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、修飾ヌクレオチドは、2'-O-メトキシエチルリボース(MOE)、ロックド核酸(LNA)、2'-フルオロ修飾、またはモルホリノ修飾を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-O-メトキシエチルリボース(MOE)、ロックド核酸(LNA)、2'-フルオロ修飾、またはモルホリノ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)である。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、2'-O-メトキシエチルリボース(MOE)、ロックド核酸(LNA)、または2'-フルオロ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含むgapmerである。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例としてMOEおよび2'-フルオロ修飾を有する、本明細書に記載の2種類以上の修飾を含んでもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-O-メトキシエチルリボース(MOE)、ロックド核酸(LNA)、または2'-フルオロ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチド(例として、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの二本鎖RNAの一本鎖)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-O-メトキシエチルリボース(MOE)、ロックド核酸(LNA)、または2'-フルオロ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含むsiRNAのセンス鎖である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-O-メトキシエチルリボース(MOE)、ロックド核酸(LNA)、または2'-フルオロ修飾を含む修飾ヌクレオチドを含むsiRNAのアンチセンス鎖である。siRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、本明細書に記載の同じタイプまたは異なるタイプの修飾を含んでもよい。siRNAの一方または両方の鎖は、例として、MOEおよび2'-フルオロ修飾を有する、本明細書に記載の2種類以上の修飾を含んでもよい。
いくつかの態様において、1つ以上のオリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)に共有結合的に連結した抗体を含む複合体を製造する方法は、
(i)オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)を式(A):
Figure 2023540746000012
 (A)、
式中、nは0～15(例として、3)である、のリンカーに共有結合的に連結させて、式(B):
Figure 2023540746000013
 (B)、
式中、nは0～15(例として、3)である、の修飾オリゴヌクレオチドを提供することと、
(ii)式(B)の修飾オリゴヌクレオチドを式(C):
Figure 2023540746000014
 (C)、
式中、mは0～15(例として、4)である、の化合物と接触させて、式(D):
Figure 2023540746000015
 (D)、
式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である、の修飾オリゴヌクレオチドを提供することと、
(iii)式(D)の修飾オリゴヌクレオチドを抗体と接触させて、式(E):
Figure 2023540746000016
 (E)、
式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である、の複合体を提供することと、
を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体を製造する方法は、複合体、非連結オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)および/または非連結抗体を含む反応混合物を製造する。いくつかの態様において、反応混合物は、式(E):
Figure 2023540746000017
 (E)、
式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である、の複合体;式(B):
Figure 2023540746000018
 (B)、
式中、nは0～15(例として、3)である、の非連結オリゴヌクレオチド;および、非連結抗体、を含む。いくつかの態様では、式(C)の化合物は、ステップ(iii)の反応混合物中に、ステップ(ii)の反応における式(C)の化合物の出発量の10％以下または5％以下(例として、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、0.5％未満、または0.1％未満)の量で存在し、任意に、式(C)の化合物は、ステップ(iii)の抗体と接触されて、反応混合物中に式(F)の非連結抗体を形成する。
Figure 2023540746000019
 (F)、
式中、mは0～15(例として、4)である。
いくつかの態様において、それぞれが1つ以上のオリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)に共有結合的に連結した抗体を含む複合体を製造する方法は、オリゴヌクレオチドをリンカー(例として、切断可能なリンカー(例として、val-citリンカー))に共有結合的に連結させて第1の中間体を得ることを含む。いくつかの態様では、方法は、抗体をビシクロノニン化合物と共有結合的に連結させて、第2の中間体を得ることをさらに含む。いくつかの態様では、方法は、複合体を得るために第1の中間体および第2の中間体を共有結合的に連結させることをさらに含む。この方法では、リンカー(例として、val-citリンカー)は、オリゴヌクレオチドの5'末端に任意に連結される。いくつかの態様において、リンカー(例として、val-citリンカー)は、さらなる化学部分を介してオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。さらに、いくつかの態様では、ステップ(iii)は、第2の中間体に共有結合的に連結されている抗体のリジン残基をもたらす。
いくつかの態様において、1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)をそれぞれ含む複合体を製造する方法は、(i)オリゴヌクレオチドをリンカー(例として、切断可能なリンカー(例として、val-citリンカー))に共有結合的に連結させて、第1の中間体を得ることと、(ii)抗体をビシクロノニンを含む化合物と共有結合的に連結させて、第2の中間体を得ることと、(iii)ステップ(i)で得られた第1の中間体およびステップ(ii)で得られた第2の中間体を共有結合的に連結させて複合体を得ることと、を含む。この方法では、リンカー(例として、val-citリンカー)は、オリゴヌクレオチドの5'末端に任意に連結される。いくつかの態様において、リンカー(例として、val-citリンカー)は、さらなる化学部分を介してオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される。さらに、いくつかの態様では、ステップ(iii)は、第2の中間体に共有結合的に連結されている抗体のリジン残基をもたらす。
いくつかの態様において、1つ以上のオリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)に共有結合的に連結した抗体を含む複合体を製造する方法は、
(i)オリゴヌクレオチドを式(A):
Figure 2023540746000020
 (A)、
式中、nは0～15(例として、3)である、のリンカーに共有結合的に連結させて、式(B):
Figure 2023540746000021
 (B)、
式中、nは0～15(例として、3)である、の修飾オリゴヌクレオチドを提供することと、
(ii)抗体を式(C):
Figure 2023540746000022
 (C)、
式中、mは0～15(例として、4)である、の化合物と共有結合的に連結させて、式(F):
Figure 2023540746000023
 (F)、
式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である、の修飾抗体を提供することと、
(iii)式(B)の修飾オリゴヌクレオチドを式(F)の修飾抗体と接触させて、式(E):
Figure 2023540746000024
 (E)、
式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である、の複合体を提供することと、
を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体を製造する方法は、複合体、非連結オリゴヌクレオチド、および/または非連結抗体を含む反応混合物を製造する。いくつかの態様において、反応混合物は、式(E):
Figure 2023540746000025
 (E)、
式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である、の複合体;式(B):
Figure 2023540746000026
 (B)、
式中、nは0～15(例として、3)である、の非連結オリゴヌクレオチド;および式(F):
Figure 2023540746000027
 (F)、
式中、0～15(例として、4)である、の非連結抗体を含む。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO)または荷電オリゴヌクレオチド)は、10～50(例として、10～50、10～40、10～30、10～20、20～50、20～40、20～30、30～50、30～40、または40～50)ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO)または荷電オリゴヌクレオチド)は、15～30(例として、15～30、15～25、15～20、20～30、20～25、または25～30)ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO)または荷電オリゴヌクレオチド)は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO)または荷電オリゴヌクレオチド)は、30ヌクレオチド長である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO)または荷電オリゴヌクレオチド)は、リジンまたはシステインを介して抗体に共有結合的に連結される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO)または荷電オリゴヌクレオチド)は、リンカー(例として、Val-citリンカーを含むリンカー)を介して抗体に共有結合的に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、式(G)のものであり、
Figure 2023540746000028
 (G)
式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、Xは、NH(例として、リジンのアミン基からのNH)、S(例として、システインのチオール基からのS)または抗体のO(例として、セリン、トレオニンまたはチロシンのヒドロキシル基からのO)である。
いくつかの態様において、複合体は、式(E)であり、
Figure 2023540746000029
 (E)
式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、電荷中性オリゴヌクレオチド(例として、PMO)または荷電オリゴヌクレオチド(例として、gapmer)である。
いくつかの側面では、本明細書に記載の複合体を単離する方法は、複合体および非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)を含む混合物を、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂と接触させることと、非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)を除去することと、吸着した複合体を混合モード樹脂から溶出することと、を伴う。いくつかの態様では、混合モード樹脂はアパタイト樹脂である。いくつかの態様では、アパタイト樹脂は、ヒドロキシアパタイト樹脂、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、ヒドロキシフルオロアパタイト樹脂、フルオロアパタイト樹脂、またはクロルアパタイト樹脂である。
いくつかの態様では、混合モードクロマトグラフィーに供される、複合体および非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)を含有する混合物は、複合体を製造する反応(例として、抗体および分子ペイロードの場合の抱合を介して)の反応混合物である。いくつかの態様では、混合モードクロマトグラフィーに供される複合体および非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)の混合物は、混合モードクロマトグラフィーの前にいずれの前の精製ステップにも供されていない複合体を製造する反応(例として、抗体および分子ペイロードの場合の抱合を介して)の反応混合物である。いくつかの態様において、混合モードクロマトグラフィーに供される混合物中の複合体は、少なくとも約1.0(例として、約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0以上)の平均薬物抗体比(DAR)を有する。
いくつかの態様では、本明細書に記載の混合モード樹脂クロマトグラフィーを使用して、複合体は、非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)から実質的に精製される。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法を用いた精製後の複合体の組成物は、検出可能なレベルの非連結オリゴヌクレオチドまたは非連結タンパク質を含まない。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体を単離するのに適している。いくつかの態様では、抗体は、完全長IgG、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、またはFvフラグメントであってもよい。特異的抗体配列は精製結果に影響を及ぼさない。いくつかの態様において、抗体は抗トランスフェリン受容体抗体(例として、表2に列挙される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか)またはそのいずれかの抗原結合フラグメント(例として、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、またはFvフラグメント)である。
A.混合モード樹脂を使用した複合体からの非連結電荷中性オリゴヌクレオチドの除去
いくつかの態様では、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位(例として、アパタイト樹脂、例として、ヒドロキシアパタイト樹脂)を含む混合モード樹脂の使用は、非連結分子ペイロード、特に電荷中性または疎水性分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)を複合体から除去するのに有効であり、精製プロセス全体を通した有機溶媒の使用は、非連結分子ペイロードを含まない複合体の収率を有意に増加させることが本明細書で示された。本明細書に記載の混合モード樹脂精製方法は、非連結分子ペイロードおよび/または過剰な塩を除去する(脱塩する)他の公知の方法と比較して有利である。そのような既知の方法の1つは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)である。混合モード樹脂精製方法は、少なくともそのスケーラビリティ、およびより高い回収率のためにSECより有利である。本明細書に記載の混合モード樹脂法を使用して少なくとも50％の複合体の回収が達成されたが、SECは複合体の20～30％の回収しか達成し得ない。
いくつかの側面では、本開示は、それぞれが1つ以上の分子ペイロードに共有結合的に連結した抗体を含む複合体をプロセシングする方法(例として、単離)を提供する。いくつかの態様では、分子ペイロードは小分子(例として、疎水性小分子)である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド)である。
いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体をプロセシングする方法は、(i)有機溶媒、複合体および非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)を含む混合物を、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂と、複合体が混合モード樹脂に吸着する条件下で接触させることと、(ii)複合体が混合モード樹脂から解離する条件下で混合モード樹脂から複合体を溶出することと、を含む。いくつかの態様において、ステップ(i)の混合物は、30％以下(例として、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下または0.5％未満)の非連結抗体をさらに含む。いくつかの態様において、ステップ(i)の混合物は、検出不能なレベルの非連結抗体をさらに含む。いくつかの態様において、ステップ(i)の混合物は、複合体を製造する反応混合物である。いくつかの態様では、ステップ(i)の混合物は、精製の前のいずれかのステップに供されていない複合体を製造する反応混合物である。いくつかの態様において、ステップ(i)の混合物は、アルキン基を含む微量の非連結抗体を含む。
いくつかの態様では、分子ペイロード(連結または非連結)は、混合モード樹脂と非特異的に相互作用し、複合体の収率に影響を及ぼす。混合モードクロマトグラフィーの移動相に有機溶媒を含めることは、電荷中性オリゴヌクレオチドと混合モード樹脂との間の非特異的相互作用を効果的に低減/排除することが本明細書で実証された。いくつかの態様では、分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)間の非特異的相互作用を減少させると、そのような非特異的相互作用を低減させない場合と比較して、複合体の増加した収率(例として、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも2倍、少なくとも5倍、またはそれを超えて)をもたらす。
クロマトグラフィー法で一般的に使用される有機溶媒は、本明細書に記載の方法全体にわたって使用され得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体をプロセシングする方法のステップ(i)で使用される有機溶媒は、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法のステップ(i)において使用される有機溶媒は、ジメチルアセトアミド(DMA)である。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法のステップ(i)において使用される有機溶媒は、イソプロピルアルコール(IPA)である。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法のステップ(i)において使用される有機溶媒は、ジメチルスルホキシド(DMSO)である。いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法のステップ(i)において使用される有機溶媒は、アセトニトリル(ACN)である。いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法のステップ(i)において使用される有機溶媒は、プロピレングリコール(PG)である。
いくつかの態様において、有機溶媒は、ステップ(i)の混合物において2～50％(v/v)である。例えば、有機溶媒は、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物中、2～50％(v/v)、5～50％(v/v)、10～50％(v/v)、20～50％(v/v)、30～50％(v/v)、40～50％(v/v)、2～40％(v/v)、5～40％(v/v)、10～40％(v/v)、20～40％(v/v)、30～40％(v/v)、2～30％(v/v)、5～30％(v/v)、10～30％(v/v)、20～30％(v/v)、2～20％(v/v)、5～20％(v/v)、10～20％(v/v)、2～10％(v/v)、5～10％(v/v)、5～20％(v/v)、5～15％(v/v)、5～10％(v/v)、10～15％(v/v)、または15～20％(v/v)であってもよい。いくつかの態様において、有機溶媒は、ステップ(i)の混合物において5～20％(v/v)である。いくつかの態様において、有機溶媒は、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物中の5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)、8％(v/v)、9％(v/v)、10％(v/v)、11％(v/v)、12％(v/v)、13％(v/v)、14％(v/v)、15％(v/v)、16％(v/v)、17％(v/v)、18％(v/v)、19％(v/v)、または20％(v/v)である。いくつかの態様において、20％(v/v)を超える有機溶媒が、本明細書中に記載される方法におけるステップ(i)の混合物において使用されてもよい。いくつかの態様において、有機溶媒は、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物において15％(v/v)である。いくつかの態様において、有機溶媒は、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物において30％(v/v)である。
いくつかの態様では、複合体が吸着するステップ(i)の条件は、複合体が混合モード樹脂に吸着することを可能にする濃度でステップ(i)の混合物にリン酸イオンおよび/または塩化物イオンを含めることによって達成される。いくつかの態様において、ステップ(i)における混合物は、約5.0～8.0(例として、約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)のpHを有する。いくつかの態様において、ステップ(i)における混合物は、約5.0～6.0(例として、約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、または6.0)のpHを有する。いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物は、リン酸イオンまたは塩化物イオンを含まない。いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物は、最大10mMのリン酸イオンをさらに含む。いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物は、最大10mM(例として、最大10mM、または最大5mM)のリン酸イオンをさらに含み、任意に、いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物は、最大20mM(例として、最大20mM、最大15mM、最大10mM、または最大5mM)の塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物は、5～10mM(例として、5、6、7、8、9、または10mM)のリン酸イオンをさらに含み、任意に、いくつかの態様において、本明細書中に記載される方法のステップ(i)における混合物は、5～20mMの塩化物イオン(例として、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20mM)をさらに含む。これらの条件下では、非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)はフロースルー中に残り、混合モード樹脂に吸着しない。
いくつかの態様では、非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)は、ステップ(i)の混合モード樹脂に吸着しない。いくつかの態様では、5％未満(例として、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、または0.5％未満)の非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)は、ステップ(i)において混合モード樹脂に吸着する。いくつかの態様では、5％未満(例として、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、1％未満、または0.5％未満)の非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)は、混合モード樹脂と非特異的に相互作用する。
いくつかの態様では、混合モード樹脂は、混合モード樹脂に緩く結合しているが吸着していない非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)を除去する条件下で、ステップ(i)とステップ(ii)との間でさらに洗浄されてもよい。いくつかの態様では、洗浄ステップは、洗浄溶液を使用して実施される。いくつかの態様では、洗浄溶液は有機溶媒を含む。いくつかの態様では、洗浄溶液に使用される有機溶媒は、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である。いくつかの態様では、洗浄溶液に使用される有機溶媒はジメチルアセトアミド(DMA)である。いくつかの態様では、洗浄溶液に使用される有機溶媒はイソプロピルアルコール(IPA)である。いくつかの態様において、洗浄溶液に使用される有機溶媒は、ジメチルスルホキシド(DMSO)である。いくつかの態様では、洗浄溶液に使用される有機溶媒はアセトニトリル(ACN)である。いくつかの態様では、洗浄溶液に使用される有機溶媒はプロピレングリコール(PG)である。
いくつかの態様において、有機溶媒は、洗浄溶液中で5％～20％(v/v)である。例えば、有機溶媒は、洗浄溶液において5％～20％(v/v)、5％～15％(v/v)、5％～10％(v/v)、10％～20％(v/v)、10％～15％(v/v)、または15％～20％(v/v)であってもよい。いくつかの態様において、有機溶媒は、洗浄溶液中の5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)、8％(v/v)、9％(v/v)、10％(v/v)、11％(v/v)、12％(v/v)、13％(v/v)、14％(v/v)、15％(v/v)、16％(v/v)、17％(v/v)、18％(v/v)、19％(v/v)、または20％(v/v)である。いくつかの態様では、20％(v/v)を超える有機溶媒が洗浄溶液に使用されてもよい。いくつかの態様において、有機溶媒は、洗浄溶液中で15％(v/v)である。いくつかの態様において、有機溶媒は、洗浄溶液中で30％(v/v)である。
いくつかの態様では、洗浄溶液は、緩く結合した分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)を除去するが、複合体を混合モード樹脂から解離させない濃度でリン酸イオンおよび/または塩化物を含む。いくつかの態様において、洗浄溶液は、5.0～8.0(例として、約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、または8.0)のpHを有する。いくつかの態様において、洗浄溶液は、5.0～6.0(例として、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、または6.0)のpHを有する。いくつかの態様では、洗浄溶液はリン酸イオンまたは塩化物イオンを含まない。いくつかの態様では、洗浄溶液は、最大10mMのリン酸イオンをさらに含む。いくつかの態様では、洗浄溶液は最大10mM(例として、最大10mM、または最大5mM)のリン酸イオンをさらに含み、任意に、いくつかの態様では、洗浄溶液は最大20mM(例として、最大20mM、最大15mM、最大10mM、または最大5mM)の塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様では、洗浄溶液は、5～10mM(例として、5、6、7、8、9、または10mM)のリン酸イオンをさらに含み、任意に、いくつかの態様では、洗浄溶液は、5～20mMの塩化物イオン(例として、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20mM)をさらに含む。
いくつかの態様では、混合モード樹脂から複合体を溶出するために、ステップ(ii)において、混合モードおよび結合した複合体は、混合モード樹脂からの複合体の解離を可能にする条件に供される。いくつかの態様では、複合体の解離を可能にするステップ(ii)の条件は、ステップ(i)の混合物中または洗浄溶液中のリン酸イオンおよび/または塩化物イオンの濃度と比較して、より高濃度のリン酸イオンおよび/または塩化物イオンを含む溶出溶液を混合モード樹脂に適用することによって達成される。いくつかの態様では、溶出溶液は、ステップ(i)の混合物中または洗浄溶液中のホスファートの濃度と比較して、より高い濃度のリン酸塩イオンを含み、塩化物イオンを含まない。溶出ステップは、単一のリン酸イオン濃度を含む溶出溶液を使用して、または増加するリン酸イオン濃度の勾配を有する溶出溶液を使用して行われてもよい。
いくつかの態様において、溶出溶液は、約6.5～8.5(例として、約6.5、7.0、7.5、8.0、または8.5)のpHを有する。いくつかの態様において、溶出溶液は、約7.6～8.5(例として、約7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、または8.5)のpHを有する。
いくつかの態様では、溶出溶液は有機溶媒を含む。いくつかの態様では、溶出溶液に使用される有機溶媒は、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である。いくつかの態様では、溶出溶液に使用される有機溶媒はジメチルアセトアミド(DMA)である。いくつかの態様では、溶出溶液に使用される有機溶媒はイソプロピルアルコール(IPA)である。いくつかの態様では、溶出溶液に使用される有機溶媒はジメチルスルホキシド(DMSO)である。いくつかの態様では、溶出溶液に使用される有機溶媒はアセトニトリル(ACN)である。いくつかの態様では、溶出溶液に使用される有機溶媒はプロピレングリコール(PG)である。
いくつかの態様では、有機溶媒は、溶出溶液中2～50％(v/v)である。例えば、有機溶媒は、溶出溶液中、2～50％(v/v)、5～50％(v/v)、10～50％(v/v)、20～50％(v/v)、30～50％(v/v)、40～50％(v/v)、2～40％(v/v)、5～40％(v/v)、10～40％(v/v)、20～40％(v/v)、30～40％(v/v)、2～30％(v/v)、5～30％(v/v)、10～30％(v/v)、20～30％(v/v)、2～20％(v/v)、5～20％(v/v)、10～20％(v/v)、2～10％(v/v)、5～10％(v/v)、5～20％(v/v)、5～15％(v/v)、5～10％(v/v)、10～15％(v/v)、または15～20％(v/v)であってもよい。いくつかの態様では、有機溶媒は、溶出溶液中5～20％(v/v)である。いくつかの態様において、有機溶媒は、溶出溶液中5％(v/v)、6％(v/v)、7％(v/v)、8％(v/v)、9％(v/v)、10％(v/v)、11％(v/v)、12％(v/v)、13％(v/v)、14％(v/v)、15％(v/v)、16％(v/v)、17％(v/v)、18％(v/v)、19％(v/v)、または20％(v/v)である。いくつかの態様では、20％(v/v)を超える有機溶媒が溶出溶液に使用されてもよい。いくつかの態様では、有機溶媒は、溶出溶液中15％(v/v)である。いくつかの態様では、有機溶媒は、溶出溶液中30％(v/v)である。
いくつかの態様において、ステップ(ii)の溶出溶液は、少なくとも30mMのリン酸イオンを含む。いくつかの態様において、ステップ(ii)の溶出溶液は、少なくとも30mM(例として、少なくとも30mM、少なくとも40mM、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mM、少なくとも110mM、少なくとも120mM、少なくとも130mM、少なくとも140mM、または少なくとも150mM)のリン酸イオンを含む。いくつかの態様において、ステップ(ii)の溶出溶液は、少なくとも100mMのリン酸イオンを含む。いくつかの態様において、ステップ(ii)の溶出溶液は、100mMのリン酸イオンを含む。
いくつかの態様では、溶出溶液は、徐々に増加する濃度のリン酸イオンを含む。いくつかの態様では、リン酸イオンの濃度は、ステップ(ii)中に少なくとも10mM(例として、10mM、15mM、または20mM)から、少なくとも100mM(例として、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、またはそれを超える)に増加する。いくつかの態様において、リン酸イオンの濃度は、ステップ(ii)の間に10mMから100mMに増加する。
いくつかの態様では、溶出溶液を混合モード樹脂に適用することは、複合体の少なくとも50％(例として、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％)を混合モード樹脂から解離させる。いくつかの態様では、溶出溶液を混合モード樹脂に適用することは、複合体の50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％またはそれ超を混合モード樹脂から解離させる。
いくつかの態様では、溶出溶液は塩化物イオンを含まない。いくつかの態様では、溶出溶液は、少なくとも50mM(例として、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mM、少なくとも110mM、少なくとも120mM、少なくとも130mM、少なくとも140mM、少なくとも150mM、少なくとも160mM、少なくとも170mM、少なくとも180mM、少なくとも190mM、または少なくとも200mM)の塩化物イオンをさらに含んでもよい。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、解離した複合体を回収することをさらに含む。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、製剤緩衝液中で複合体を調製することをさらに含む(例として、緩衝液交換によって)。いくつかの態様では、緩衝液交換は、限外濾過/ダイアフィルトレーション(UF/DF)またはタンジェンシャルフロー濾過(TFF)によって実施され得る。
いくつかの側面では、本開示は、それぞれが1つ以上の電荷中性オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体をプロセシングする方法を提供し、方法は、
(i)15％(v/v)のDMAまたはIPA、複合体および非連結電荷中性オリゴヌクレオチドを含む混合物を、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含むヒドロキシアパタイト(HA)樹脂と接触させることであって、混合物は、約5.7のpHを有し、任意に10mMのリン酸イオンおよび/または(例として、および)20mMの塩化物イオンをさらに含む、ことと、
(ii)約5.7のpHを有し、15％(v/v)のDMAまたはIPAを含み、任意に、10mMのリン酸イオンおよび/または(例として、および)20mMの塩化物イオンをさらに含む洗浄溶液でHA樹脂を洗浄することと、
(iii)HA樹脂に溶出溶液を適用することによって複合体を混合モード樹脂から溶出させることであって、溶出溶液は約7.6のpHを有し、
(a)15％(v/v)のDMAまたはIPA、および
(b)100mMのリン酸イオンまたは30mM～100mMの濃度範囲を有するリン酸イオンの勾配
を含む、ことと、
(iv)選択された複合体を収集することと、
を含む。
いくつかの態様において、抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体の精製は、2パート精製プロセスを必要とする。いくつかの態様では、複合体ならびに非連結Fabおよび/またはオリゴヌクレオチドを含有する反応混合物は、ヌクレアーゼ非含有水で希釈され(例として、1:3)、適切な緩衝液(例として、MES緩衝液)を適切な濃度(例として、約50mM)で添加することによりpHが調整される(例として、5.7まで)。いくつかの態様では、セラミックヒドロキシアパタイト(HA)カラムは、15:85 v/v％の有機溶媒DMAおよびpH5.8の10mMリン酸ナトリウムを使用して、平衡化されるいくつかの態様において、粗反応混合物はHAカラムに負荷されて、非抱合オリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの態様では、HAカラムは、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH5.8)中15:85 v/v％のDMAで洗浄される。いくつかの態様では、溶出は、DMAを15:85 v/v％で含有する100mMリン酸ナトリウム、pH7.6緩衝液を用いて5mL/分の流速で段階勾配によって開始される。いくつかの態様では、HA溶出液は最終製剤に緩衝液交換される。いくつかの態様において、最終的な精製抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体が分析される(例として、SEC、SDS-PAGEデンシトメトリー、および/またはBCAによる)。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法で使用される混合物および溶液は、リン酸イオンおよび/または塩化物イオンの対イオンをさらに含む。いくつかの態様では、ホスファートの対イオンは、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、またはマンガンである。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法で使用される対イオンはナトリウムである。いくつかの態様では、リン酸イオン源は、NaH2PO4、Na2HPO4、またはNa3PO4である。いくつかの態様では、塩化物の対イオンは、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、またはマンガンである。いくつかの態様では、塩化物イオン源はNaClである。当業者は、多くの他の等価な塩およびイオンが本明細書に記載の方法に使用されてもよいことを容易に理解するであろう。
いくつかの態様では、洗浄溶液および/または溶離液は、一貫したpHを維持するために緩衝剤をさらに含んでもよい。本明細書における使用のための緩衝剤の例は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、スクシナート、シトレート、アスパラギン酸、グルタミン酸、マレアート、カコジラート、2-(N-モルホリノ)-エタンスルホン酸(MES)、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)、ピペラジン-N,N'-2-エタンスルホン酸(PIPES)、2-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N-ビス-(ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、3-(N-モルホリノ)-プロパンスルホン酸(MOPS)、N-2-ヒドロキシエチル-ピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)、3-(N-トリス-(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(TAPSO)、3-(N,N-ビス［2-ヒドロキシエチル］アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)(HEPPSO)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸(EPPS)、N-［トリス(ヒドロキシメチル)-メチル］グリシン(トリシン)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(ビシン)、［(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)アミノ］-1-プロパンスルホン酸(TAPS)、N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(AMPSO)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)、およびビス［2-ヒドロキシエチル］イミノトリス-［ヒドロキシメチル］メタン(Bis-Tris)を包含する。他の緩衝液組成物、緩衝液濃度、および本明細書で使用するための溶液のさらなる成分は、当業者には明らかであろう。
正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含むいずれかの混合モード樹脂が、本開示に従って使用されてもよい。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法で使用される混合モード樹脂は、アパタイト樹脂である。いくつかの態様では、アパタイト樹脂は、ヒドロキシアパタイト樹脂、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、ヒドロキシフルオロアパタイト樹脂、フルオロアパタイト樹脂、またはクロルアパタイト樹脂である。アパタイト樹脂は、いずれの形態のアパタイトを含んでもよく、典型的には、親和性、イオン交換、疎水性相互作用、またはそれらの組み合わせを使用して、生体分子、例として、本明細書に記載の複合体の分離および精製におけるクロマトグラフィー固相として使用される。
いくつかの態様では、ヒドロキシアパタイト樹脂は、例として、Bio-Rad Laboratories,Inc.(Hercules,Calif.,USA)からのBio-Gel HT樹脂である。いくつかの態様では、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂は、例として、Bio-Rad Laboratories,Inc.からのBio-Scale Mini CHT樹脂である。いくつかの態様では、アパタイト樹脂、例として、セラミックヒドロキシアパタイトは、アパタイトの球状粒子を含む。いくつかの態様では、アパタイトの球状粒子は、直径が約10μm～約100μm、約25μm～約50μm、約20μm、約30μm、約40μm、約50μm、約60μm、または約80μmである。いくつかの態様では、アパタイト樹脂、例として、セラミックヒドロキシアパタイトは、I型(中程度の多孔性および高い結合能力)またはII型(より大きな多孔性およびより低い結合能力)である。いくつかの態様では、アパタイト粒子は、別の分離媒体または支持体と混合して使用されてもよい。
いくつかの態様では、混合モード樹脂は、複合体および非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)の混合物と接触される前に平衡化されてもよい。いくつかの態様では、混合モード樹脂は、上記のように洗浄液を使用して平衡化される。いくつかの態様において、混合モード樹脂は、pHを約5.0～8.0にするために平衡化される。
いくつかの態様において、混合モード樹脂は、カラム、例として、垂直カラムに充填される。いくつかの態様では、カラムは、圧力下で、任意に上から下または下から上への圧力下で使用されてもよい。いくつかの態様では、例として重力流のみを使用して、外圧なしでカラムが使用されてもよい。いくつかの態様では、混合モード樹脂は、例としてバッチ法を使用して、遊離樹脂として使用される。いくつかの態様では、バッチ法は、樹脂を複合体および非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)の混合物と接触させた後、遠心分離および/または濾過ステップをさらに含んでもよい。
いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のステップ(i)および/または(例として、および)本明細書に記載される方法のステップ(ii)で溶出される混合物中の複合体は、1～10(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)に共有結合的に連結した抗体を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のステップ(i)および/または(例として、および)ステップ(ii)で溶出される混合物中の複合体の少なくとも50％(例として、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％またはそれを超える)は、1～3(例として、1、2、または3)の分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)に共有結合的に連結した抗体を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される方法のステップ(i)および/または(例として、および)ステップ(ii)で溶出される混合物中の複合体は、少なくとも約1.5(例として、少なくとも約1.5、少なくとも約1.6、少なくとも約1.7、少なくとも約1.8、少なくとも約1.9、または少なくとも約2)の平均薬物抗体比(DAR)を有する。いくつかの態様において、ステップ(ii)から得られる溶離剤は、検出不能なレベルの非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは疎水性小分子)を含む。いくつかの態様において、ステップ(ii)から得られる溶離液は、検出不能なレベルの非連結抗体を含む。
B.混合モード樹脂を使用した複合体からの非連結荷電オリゴヌクレオチドの除去
いくつかの態様では、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位(例として、アパタイト樹脂、例として、ヒドロキシアパタイト樹脂)を含む混合モード樹脂の使用が、非連結オリゴヌクレオチドからの複合体の精製に有効であることが本明細書で示された。他の精製戦略代替物は、タンパク質-オリゴヌクレオチド複合体を含む組成物から本質的にすべての非連結オリゴヌクレオチドを除去することができなかったため、これは大部分において驚くべき発見であった。さらに、本明細書に記載の混合モード樹脂精製方法は、非連結オリゴヌクレオチドおよび/または過剰な塩を除去する(脱塩する)他の公知の方法と比較して有利である。そのような既知の方法の1つは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)である。混合モード樹脂精製方法は、少なくともそのスケーラビリティ、およびより高い回収率のためにSECより有利である。本明細書に記載の混合モード樹脂法を使用して少なくとも90％の複合体の回収が達成されたが、SECは複合体の20～30％の回収しか達成し得ない。
いくつかの態様において、それぞれが1つ以上のオリゴヌクレオチド(例として、荷電オリゴヌクレオチド)に共有結合的に連結した抗体を含む複合体または複数の複合体を単離する方法は、(i)複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物を、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂と、複合体が混合モード樹脂に吸着する条件下で接触させることと、(ii)複合体が混合モード樹脂から解離する条件下で混合モード樹脂から複合体を溶出させることと、を含む。いくつかの態様において、ステップ(i)の混合物は、アルキン基を含む微量の非連結抗体を含む。いくつかの態様において、ステップ(i)における混合物は、混合モード樹脂と接触させる前に精製に供されていない。本明細書に記載されるように、いくつかの態様では、複合体が混合モード樹脂に吸着するステップ(i)の条件は、非連結オリゴヌクレオチドが混合モード樹脂に吸着することを可能にするかまたは排除するように調整されてもよい。
いくつかの態様では、複合体が混合モード樹脂に吸着するステップ(i)の条件は、非連結オリゴヌクレオチドが混合モード樹脂に吸着することを可能にせず、したがって複合体を非連結オリゴヌクレオチドから分離する。いくつかの態様では、条件は、ステップ(i)の混合物中に、非連結オリゴヌクレオチドではなく複合体が混合モード樹脂に吸着することを可能にする濃度でリン酸イオンおよび/または塩化物イオンを含めることによって達成される。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、最大20mMのリン酸イオンおよび/または最大30mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、最大20mM(例として、最大20mM、最大15mM、最大10mM、または最大5mM)のリン酸イオンをさらに含む。さらに、いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、最大30mM(例として、最大30mM、最大25mM、最大20mM、最大15mM、最大10mM、または最大5mM)の塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、5～20mM(例として、5～20mM、5～15mM、5～10mM、10～20mM、10～15mM、または15～20mM)のリン酸イオンおよび/または5～30mMの塩化物イオン(例として、5～30mM、5～25mM、5～20mM、5～15mM、5～10mM、10～30mM、10～25mM、10～20mM、10～15mM、15～30mM、15～25mM、15～20mM、20～30mM、20～25mM、または25～30mM)をさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、20mM、15mM、10mM、5mM、もしくは1mMのリン酸イオンおよび/または30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、もしくは5mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、20mMのリン酸イオンおよび/または30mMの塩化物イオン、例として、20mMリン酸イオンおよび30mM塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大25mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、5～10mMのリン酸イオンおよび/または5～25mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、10mMのリン酸イオンおよび/または25mMの塩化物イオン、例として10mMのリン酸イオンおよび25mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、微量のリン酸イオンを含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、微量の塩化物イオンを含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、微量のリン酸イオンおよび塩化物イオンの両方を含有する。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、リン酸イオンを含まず、塩化物イオンを含まず、またはリン酸イオンもしくは塩化物イオンのいずれも含まない。これらの条件下では、非連結オリゴヌクレオチドはフロースルー中に残り、混合モード樹脂に吸着しない。いくつかの態様において、混合モード樹脂は、混合モード樹脂に緩く結合しているが吸着していない非連結オリゴヌクレオチドを除去するために、これらの同じ条件下でステップ(i)とステップ(ii)との間でさらに洗浄されてもよい。
いくつかの態様では、複合体が混合モード樹脂に吸着するステップ(i)の条件はまた、非連結オリゴヌクレオチドの一部または全部(例として、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または100％)が混合モード樹脂に吸着することを可能にし、いくつかの態様では、条件は、複合体および非連結オリゴヌクレオチドの両方が混合モード樹脂に吸着することを可能にする濃度でステップ(i)の混合物にリン酸イオンおよび/または塩化物イオンを含めることによって達成される。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、最大5mMのリン酸イオンおよび/または最大10mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、最大5mM(例として、最大5mM、最大4mM、最大3mM、最大2mM、または最大1mM)のリン酸イオンをさらに含む。さらに、いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、最大10mM(例として、最大10mM、最大9mM、最大8mM、最大7mM、最大6mM、最大5mM、最大4mM、最大3mM、最大2mM、または最大1mM)の塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、1～5mM(例として、1～5mM、1～4mM、1～3mM、1～2mM、2～5mM、2～4mM、2～3mM、3～5mM、3～4mM、または4～5mM)のリン酸イオンおよび/または1～10mM(例として、1～10mM、1～8mM、1～6mM、1～4mM、1～2mM、2～10mM、2～8mM、2～6mM、2～4mM、4～10mM、4～8mM、4～6mM、6～10mM、6～8mM、または8～10mM)の塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、5mM、4mM、3mM、2mM、もしくは1mMのリン酸イオンおよび/または10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、もしくは1mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、最大3mMのリン酸イオンおよび/または最大8mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、1～3mM(例として、1、2、または3mM)のリン酸イオンおよび/または1～8mM(例として、1、2、3、4、5、6、7、または8mM)の塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、3mMのリン酸イオンおよび/または8mMの塩化物イオン、例として3mMのリン酸イオンおよび8mMの塩化物イオンをさらに含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、微量のリン酸イオンを含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、微量の塩化物イオンを含む。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、微量のリン酸イオンおよび塩化物イオンの両方を含有する。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、リン酸イオンを含まず、塩化物イオンを含まず、またはリン酸イオンもしくは塩化物イオンのいずれも含まない。これらの条件下では、すべての非連結オリゴヌクレオチドの一部も混合モード樹脂に吸着する。
いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、5.0～8.0(例として、約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5または8.0)のpHを有する。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、(約)5.0～6.0(例として、約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、または6.0)のpHを有する。いくつかの態様において、複合体および非連結オリゴヌクレオチドを含む混合物は、または約5.7のpHを有する。
いくつかの態様において、非連結オリゴヌクレオチドの一部または全部が混合モード樹脂にも吸着する場合、本明細書中に記載の方法は、ステップ(i)とステップ(ii)との間に混合モード樹脂を、複合体ではなく非連結オリゴヌクレオチドを混合モード樹脂から解離させる溶液で洗浄するステップをさらに含む。いくつかの態様では、洗浄に使用される溶液は、最大20mMのリン酸イオンおよび/または最大30mMの塩化物イオン、例として20mMのリン酸イオンおよび30mMの塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、洗浄に使用される溶液は、最大20mM(例として、最大20mM、最大15mM、最大10mM、または最大5mM)のリン酸イオンを含む。さらに、いくつかの態様では、洗浄に使用される溶液は、最大30mM(例として、最大30mM、最大25mM、最大20mM、最大15mM、最大10mM、または最大5mM)の塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、洗浄に使用される溶液は、5～20mM(例として、5～20mM、5～15mM、5～10mM、10～20mM、10～15mM、または15～20mM)のリン酸イオンおよび/または5～30mMの塩化物イオン(例として、5～30mM、5～25mM、5～20mM、5～15mM、5～10mM、10～30mM、10～25mM、10～20mM、10～15mM、15～30mM、15～25mM、15～20mM、20～30mM、20～25mM、または25～30mM)を含む。いくつかの態様では、洗浄に使用される溶液は、20mM、15mM、10mM、5mM、もしくは1mMのリン酸イオンおよび/または30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、もしくは5mMの塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、洗浄に使用される溶液は、20mMのリン酸イオンおよび/または30mMの塩化物イオン、例として、20mMのリン酸イオンおよび30mMの塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、洗浄に使用される溶液は、最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大25mMの塩化物イオン、例として10mMのリン酸イオンおよび最大25mMの塩化物イオンを含む。
いくつかの態様において、非連結オリゴヌクレオチドの一部または全部が混合モード樹脂にも吸着する場合、本明細書中に記載の方法は、ステップ(i)とステップ(ii)との間に混合モード樹脂を、複合体ではなく非連結オリゴヌクレオチドを混合モード樹脂から解離させる一連の溶液で洗浄するステップをさらに含む。いくつかの態様では、洗浄に使用される第1の溶液は、10mMまたは約10mMのリン酸イオンおよび10mMまたは約10mMの塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、洗浄用の第2の溶液は、15mMまたは約15mMのリン酸イオンおよび15mMまたは約15mMの塩化物イオンを含む。いくつかの態様において、洗浄用の第3の溶液は、19mMまたは約19mMのリン酸イオンおよび19mMまたは約19mMの塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、ステップ(i)とステップ(ii)との間で混合モード樹脂を洗浄することは、10mMのリン酸イオンおよび10mMの塩化物イオンを含む第1の溶液、14.5mMリン酸イオンおよび14.5mM塩化物イオンを含む第2の溶液、ならびに19mMリン酸イオンおよび19mM塩化物イオンを含む第3の溶液で樹脂を洗浄することを含む。
いくつかの態様において、洗浄のための溶液は、6.0～8.5のpHを有する。いくつかの態様では、洗浄のための溶液は、(約)6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、または8.5のpHを有する。いくつかの態様において、洗浄のための溶液は、約6.5のpHを有する。
いくつかの態様では、混合モード樹脂から複合体を溶出するために、ステップ(ii)において、混合モードおよび結合した複合体は、混合モード樹脂からの複合体の解離を可能にする条件に供される。いくつかの態様では、複合体の解離を可能にするステップ(ii)の条件は、より高濃度のリン酸イオンおよび/または塩化物イオンを含む溶出溶液を混合モード樹脂に適用することによって達成される。溶出ステップは、単一のリン酸イオン濃度を含む溶出溶液を使用して、または増加するリン酸イオン濃度の勾配を有する溶出溶液を使用して行われてもよい。溶出中(ステップ(ii))に増加するリン酸イオン濃度の勾配を使用することは、異なる数の薬物:抗体比(DAR)を有する複合体の分離を可能にする。例えば、増加するリン酸イオン濃度が溶出溶液中で増加するにつれて、より低いDARを有する複合体が最初に溶出し、次いでより高いDARを有する複合体が溶出する。
いくつかの態様では、ステップ(ii)は、少なくとも30mMのリン酸イオンおよび/または少なくとも50mMの塩化物イオンを含む溶出溶液を混合モード樹脂に適用して、複合体を溶出させることを含む。いくつかの態様において、溶出溶液は、少なくとも30mM(例として、少なくとも30mM、少なくとも40mM、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mM、少なくとも110mM、少なくとも120mM、少なくとも130mM、少なくとも140mM、または少なくとも150mM)のリン酸イオンを含む。さらに、いくつかの態様では、溶出溶液は、少なくとも50mM(例として、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mM、少なくとも110mM、少なくとも120mM、少なくとも130mM、少なくとも140mM、少なくとも150mM、少なくとも160mM、少なくとも170mM、少なくとも180mM、少なくとも190mM、または少なくとも200mM)の塩化物イオンを含む。いくつかの態様では、溶出溶液は、少なくとも100mMのリン酸イオンおよび/または少なくとも100mMの塩化物イオンを含む。いくつかの態様において、溶出溶液は、100mMのリン酸イオンおよび100mMの塩化物イオンを含む。
いくつかの態様において、溶出溶液は、6.0～8.5のpHを有する。いくつかの態様では、溶出溶液は、(約)6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、または8.5のpHを有する。いくつかの態様において、溶出溶液は約7.5のpHを有する。
いくつかの態様では、荷電オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗TfR Fabを含む複合体を単離するために、複合体ならびに非連結Fabおよび/またはオリゴヌクレオチドを含有する反応混合物が、ヌクレアーゼ非含有水で希釈され(例として、1:3)、適切な緩衝液(例として、MES緩衝液)を適切な濃度(例として、約50mM)で添加してpHが調整される(例として、5.7まで)。いくつかの態様では、希釈した反応混合物は、セラミックヒドロキシアパタイト(HA)カラム(例として、8mg/mLの樹脂の生体分子濃度で)に充填される。いくつかの態様において、カラムは、非連結オリゴヌクレオチドを除去するために洗浄溶液(例として、5mMのNa2HPO4、25mMのNaCl pH7.0)で洗浄される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドに連結された抗TfR Fabを含む複合体は、製剤緩衝液(例として、100mMのNa2HPO4、100mMのNaCl、pH7.6)中でHAカラムから溶出される。いくつかの態様では、単離および精製された抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体は分析されて(例として、SDS-PAGEおよび/または分析SECによって)、非連結オリゴヌクレオチドの完全な除去を実証する。いくつかの態様では、単離および精製された抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体は、ヒトTfR1/cyno TfR1結合およびエンドトキシンレベルについてELISAによって分析される。いくつかの態様では、複合体は、カチオン交換およびアニオン交換によって代替的に精製されてもよい。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法で使用される混合物および溶液は、リン酸イオンおよび/または塩化物イオンの対イオンをさらに含む。いくつかの態様では、ホスファートの対イオンは、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、またはマンガンである。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法で使用される対イオンはナトリウムである。いくつかの態様では、リン酸イオン源は、NaH2PO4、Na2HPO4、またはNa3PO4である。いくつかの態様では、塩化物の対イオンは、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、またはマンガンである。いくつかの態様では、塩化物イオン源はNaClである。当業者は、多くの他の等価な塩およびイオンが本明細書に記載の方法に使用されてもよいことを容易に理解するであろう。
いくつかの態様では、洗浄溶液および/または溶離液は、一貫したpHを維持するために緩衝剤をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、洗浄緩衝液および/または溶離緩衝液は中性pHを含む。いくつかの態様において、洗浄緩衝液および/または溶離緩衝液は、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、または約6～8のpHを含む。本明細書における使用のための緩衝剤の例は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、スクシナート、シトレート、アスパラギン酸、グルタミン酸、マレアート、カコジラート、2-(N-モルホリノ)-エタンスルホン酸(MES)、N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸(ACES)、ピペラジン-N,N'-2-エタンスルホン酸(PIPES)、2-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシ-プロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N-ビス-(ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸(BES)、3-(N-モルホリノ)-プロパンスルホン酸(MOPS)、N-2-ヒドロキシエチル-ピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)、3-(N-トリス-(ヒドロキシメチル)メチルアミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(TAPSO)、3-(N,N-ビス［2-ヒドロキシエチル］アミノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)(HEPPSO)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸(EPPS)、N-［トリス(ヒドロキシメチル)-メチル］グリシン(トリシン)、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン(ビシン)、［(2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル)アミノ］-1-プロパンスルホン酸(TAPS)、N-(1,1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル)-3-アミノ-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(AMPSO)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)、およびビス［2-ヒドロキシエチル］イミノトリス-［ヒドロキシメチル］メタン(Bis-Tris)を包含する。他の緩衝液組成物、緩衝液濃度、および本明細書で使用するための溶液のさらなる成分は、当業者には明らかであろう。
正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含むいずれかの混合モード樹脂が、本開示に従って使用されてもよい。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法で使用される混合モード樹脂は、アパタイト樹脂である。いくつかの態様では、アパタイト樹脂は、ヒドロキシアパタイト樹脂、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、ヒドロキシフルオロアパタイト樹脂、フルオロアパタイト樹脂、またはクロルアパタイト樹脂である。アパタイト樹脂は、いずれの形態のアパタイトを含んでもよく、典型的には、親和性、イオン交換、疎水性相互作用、またはそれらの組み合わせを使用して、生体分子、例として、本明細書に記載の複合体の分離および精製におけるクロマトグラフィー固相として使用される。
いくつかの態様では、ヒドロキシアパタイト樹脂は、例として、Bio-Rad Laboratories,Inc.(Hercules,Calif.,USA)からのBio-Gel HT樹脂である。いくつかの態様では、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂は、例として、Bio-Rad Laboratories,Inc.からのBio-Scale Mini CHT樹脂である。いくつかの態様では、アパタイト樹脂、例として、セラミックヒドロキシアパタイトは、アパタイトの球状粒子を含む。いくつかの態様では、アパタイトの球状粒子は、直径が約10μm～約100μm、約25μm～約50μm、約20μm、約30μm、約40μm、約50μm、約60μm、または約80μmである。いくつかの態様では、アパタイト樹脂、例として、セラミックヒドロキシアパタイトは、I型(中程度の多孔性および高い結合能力)またはII型(より大きな多孔性およびより低い結合能力)である。いくつかの態様では、アパタイト粒子は、別の分離媒体または支持体と混合して使用されてもよい。
いくつかの態様において、混合モード樹脂は、複合体および非連結オリゴヌクレオチドの混合物と接触される前に平衡化されてもよい。いくつかの態様では、混合モード樹脂は、上記のように洗浄液を使用して平衡化される。いくつかの態様において、混合モード樹脂は、樹脂のpHを中性pH、pH6～8、pH約6.5、pH約7.0、pH約7.5、またはpH約8.0にするために平衡化される。
いくつかの態様において、混合モード樹脂は、カラム、例として、垂直カラムに充填される。いくつかの態様では、カラムは、圧力下で、任意に上から下または下から上への圧力下で使用されてもよい。いくつかの態様では、例として重力流のみを使用して、外圧なしでカラムが使用されてもよい。いくつかの態様では、混合モード樹脂は、例としてバッチ法を使用して、遊離樹脂として使用される。いくつかの態様において、バッチ法は、樹脂を、複合体および非連結オリゴヌクレオチドの混合物と接触させた後に、遠心分離および/または濾過ステップをさらに含んでもよい。
いくつかの態様では、本明細書に記載の混合モード樹脂クロマトグラフィーのステップ(ii)で溶出される複合体は、1、2、または3個のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む。いくつかの態様において、異なる数の連結オリゴヌクレオチド(例として、1、2、または3)を有する複合体は、異なる溶出画分で分離される。いくつかの態様において、ステップ(ii)から得られる溶離剤は、検出不能なレベルの非連結オリゴヌクレオチドを含む。
C.精製複合体の組成
本明細書に記載の方法は、実質的に精製された複合体を製造し得、精製された複合体の組成物は、検出可能な量の非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)または非連結抗体を含まない。いくつかの態様では、精製複合体の組成物は、少なくとも9:1、少なくとも95:5、96:4、97:3、98:2、99:1、99.5:0.5、またはそれを超える複合体:非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)のモル比または重量比を含む。いくつかの態様では、精製複合体の組成物は、少なくとも9:1、少なくとも95:5、96:4、97:3、98:2、99:1、99.5:0.5、またはそれを超える複合体:非連結タンパク質のモル比または重量比を含む。
いくつかの態様では、精製複合体の組成物は、検出可能なレベル(例として、検出可能な量)の非連結タンパク質を含まない。いくつかの態様では、精製された複合体の組成物は、検出可能なレベル(例として、検出可能な量)の非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)を含まない。
いくつかの態様では、精製複合体の組成物は、モル比で10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、5％未満、または0.5％未満の非連結タンパク質(例として、抗体)を含む。いくつかの態様では、精製複合体の組成物は、モル比で10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、5％未満、または0.5％未満の非連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)を含む。いくつかの態様では、精製複合体の組成物は、モル比で10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、5％未満、または0.5％未満の未連結タンパク質(例として、抗体)を含み、モル比で10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、5％未満、または0.5％未満の未連結分子ペイロード(例として、電荷中性オリゴヌクレオチドまたは荷電オリゴヌクレオチド)を含む。
いくつかの態様では、精製された複合体の組成物は、モル比で少なくとも90％(例として、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または少なくとも99.9％)の複合体(すなわち、1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体))を含む。
いくつかの態様では、精製複合体の組成物は、1つのオリゴヌクレオチド、2つのオリゴヌクレオチド、3つのオリゴヌクレオチドおよび/またはそれを超えるオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体)を含む。いくつかの態様において、精製複合体の組成物では、複合体の少なくとも50％(例として、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)以上が、1つのオリゴヌクレオチド(DAR1)に共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体)を含む。いくつかの態様において、精製された複合体の組成物において、約50％、60％、70％、80％、90％、または95％の複合体は、1つのオリゴヌクレオチド(DAR1)に共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体)を含む。
いくつかの態様において、精製された複合体の組成物では、複合体の約5％、10％、15％、20％、25％、30％またはそれ以上が、2つのオリゴヌクレオチド(DAR2)に共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体)を含む。いくつかの態様において、精製された複合体の組成物では、複合体の約1％、2％、3％、5％、7％、10％、20％またはそれ以上が、3つ以上のオリゴヌクレオチド(DAR3＋)に共有結合的に連結したタンパク質(例として、抗体)を含む。
III.複合体
いくつかの側面では、分子ペイロード、例として、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した標的化剤、例として、抗体を含む複合体が本明細書で提供される。いくつかの態様において、複合体は、オリゴヌクレオチドへ共有結合的に連結された筋標的化抗体を含む。複合体は、単一の抗原部位に特異的に結合する抗体、または同じ抗原上もしくは異なる抗原上に存在していてもよい少なくとも2つの抗原部位へ結合する抗体を含んでいてもよい。複合体は、少なくとも1つの遺伝子、タンパク質、および/または核酸の活性あるいは機能をモジュレートするために使用されてもよい。いくつかの態様において、複合体と共に存在する分子ペイロードは、遺伝子、タンパク質、および/または核酸のモジュレーションを担う。分子ペイロードは、細胞中の遺伝子、タンパク質、および/または核酸の活性あるいは機能をモジュレートすることが可能な、小分子、タンパク質、核酸、オリゴヌクレオチド、あるいはいずれの分子実体であってもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋細胞における筋疾患アレルを標的にするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様において、複合体は、分子ペイロード(例として、筋疾患アレルを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結された、筋標的化剤(例として、抗トランスフェリン受容体抗体)を含む。
いくつかの態様において、複合体は、分子ペイロードが表1で提供された対応する遺伝子の活性に影響する筋疾患を、処置するために有用である。例えば、疾病に応じて、分子ペイロードは、遺伝子の転写または発現をモジュレート(例として、減少、増大)、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現をモジュレート、またはコードされたタンパク質の活性をモジュレートしてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードは、表1に提供された標的遺伝子と相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。
Figure 2023540746000030
A.細胞標的化剤
本開示のいくつかの側面は、例として、筋細胞にオリゴヌクレオチドを送達するための細胞標的化剤、例として、筋標的化タンパク質を提供する。いくつかの態様では、そのような細胞標的化タンパク質は、例として該細胞上の抗原に特異的に結合し、関連するオリゴヌクレオチドを細胞に送達することを介して、特定の細胞に結合することができる。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、細胞標的化剤に結合し(例として、共有結合)、細胞標的化剤が細胞上の抗原に結合すると、例としてエンドサイトーシスによって該細胞に内在化される。
本開示のいくつかの側面は、筋標的化剤、例として、分子ペイロードを筋細胞へ送達するための筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、かかる筋標的化剤は、例として、筋細胞上の抗原への特異的な結合を介して、筋細胞へ結合すること、および結び付けられた分子ペイロードを筋細胞へ送達することが可能である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ結合されて(例として、共有結合的に結合されて)おり、筋標的化剤が筋細胞上の抗原へ結合した際、例としてエンドサイトーシスを介して、筋細胞中へ内在化される。例示の筋標的化剤は本明細書中さらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の筋標的化剤が限定されることを意図していないことは解されるはずである。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従って使用されてもよく、いずれの筋標的(例として、筋肉表面タンパク質)も本明細書に記載のいずれかのタイプの筋標的化剤によって標的化され得ることを理解されるべきである。例えば、筋標的化剤は、小分子、核酸(例として、DNAまたはRNA)、ペプチド(例として、抗体)、脂質(例として、マイクロベシクル)、または糖部(例として、多糖類)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
本開示のいくつかの側面は、骨格筋、平滑筋、または心筋などの筋肉上の抗原へ特異的に結合する筋標的化剤を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または心筋細胞上の抗原へ結合する(例として、特異的に結合する)。
筋肉特異的細胞表面認識要素(例として、細胞膜タンパク質)との相互作用によって、組織局在化と筋細胞への選択的取り込みとの両方が達成され得る。いくつかの態様において、筋肉の取り込みトランスポーターの基質である分子は、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を筋組織中へ送達するのに有用である。筋肉表面認識要素への結合、これに続くエンドサイトーシスは、抗体などの巨大分子さえも筋細胞へ侵入できるようにし得る。別の例として、トランスフェリンまたは抗トランスフェリン受容体抗体へ抱合されたオリゴヌクレオチドは、トランスフェリン受容体への結合を介し筋細胞によって取り入れられ得、次いで、例としてクラスリン媒介エンドサイトーシスを介し、形質膜陥入され(endocytosed)てもよい。
筋標的化剤の使用は、他の組織において効果に関連する毒性を低減しつつ、筋肉中の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)を濃縮するのに有用なこともある。いくつかの態様において、筋標的化剤は、対象内の別の細胞型と比較して、筋細胞中の結合された分子ペイロードを濃縮させる。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、または心筋細胞)中の結合された分子ペイロードを、非筋細胞(例として、肝臓細胞、神経細胞、血液細胞、または脂肪細胞)中の量より少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、または100倍多い量で濃縮する。いくつかの態様において、筋標的化剤へ結合された場合の分子ペイロードの対象における毒性は、これが対象へ送達されたとき、少なくとも1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、または95％低減される。
いくつかの態様において、筋肉選択性を獲得するために、筋肉認識要素(例として、筋細胞抗原)が要されることもある。一例として、筋標的化剤は、筋肉特異的取り込みトランスポーターの基質である小分子であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、トランスポーター媒介エンドサイトーシスを介して筋細胞へ侵入する抗体であってもよい。別の例として、筋標的化剤は、筋細胞上の細胞表面受容体へ結合するリガンドであってもよい。トランスポーターをベースとしたアプローチが細胞侵入への直通路を提供するのに対し、受容体をベースとした標的化が所望の作用部位に達するために刺激されたエンドサイトーシスを伴うこともあることは解されるはずである。
本開示に包含される筋細胞は、これらに限定されないが、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、およびミオサイトを含む。
i.筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化剤は抗体である。一般に、それらの標的抗原に対する抗体の高い特異性は、筋細胞(例として、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および/または心筋細胞)を選択的に標的にする潜在力を提供する。この特異性はまた、オフターゲット毒性(off-target toxicity)を限定することもある。筋細胞の表面抗原を標的にすることが可能である抗体の例は報告されており、かつ本開示の範囲内にある。例えば、筋肉細胞の表面を標的とする抗体は、Arahata K.,et al.「Immunostaining of skeletal and cardiac muscle surface membrane with antibody against Duchenne muscular dystrophy peptide」Nature 1988;333:861-3;Song K.S.,et al.「Expression of caveolin-3 in skeletal,cardiac,and smooth muscle cells.に記載されている。Caveolin-3 is a component of the sarcolemma and co-fractionates with dystrophin and dystrophin-associated glycoproteins」J Biol Chem 1996;271:15160-5;およびWeisbart R.H.et al.,「Cell type specific targeted intracellular delivery into muscle of a monoclonal antibody that bind myosin IIb」Mol Immunol.2003 Mar,39(13):78309に記載され、その各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
a.抗トランスフェリン受容体抗体
本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体、例として抗トランスフェリン受容体抗体へ結合する剤は筋細胞を標的にすることが可能であるという認識に基づく。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体へ結合することが可能なトランスフェリン受容体結合タンパク質を提供する。結果的に、本開示の側面は、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質(例として、抗体)を提供する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ結合する結合タンパク質は、結合されたいずれかの分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)と共に、筋細胞中へ内在化される。本明細書で使用される場合、トランスフェリン受容体に結合する抗体は、抗トランスフェリン受容体抗体と呼ばれてもよい。トランスフェリン受容体へ結合する、例として特異的に結合する抗体は、トランスフェリン受容体へ結合した際、例として受容体媒介エンドサイトーシスを通して、細胞中へ内在化されてもよい。
抗トランスフェリン受容体抗体が、知られている数種の方法論、例としてファージディスプレーを使用するライブラリ設計を使用して、産生、合成、および/または誘導体化されてもよいことは解されるはずである。例示の方法論は当該技術分野において特徴付けられており、参照により組み込まれる(Diez,P.et al.「High-throughput phage-display screening in array format」,Enzyme and microbial technology,2015,79,34-41.;Christoph M.H.and Stanley,J.R.「Antibody Phage Display:Technique and Applications」J Invest Dermatol.2014,134:2.;Engleman,Edgar(Ed.)「Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies.」1985,Springer)。他の態様において、抗トランスフェリン抗体はこれまでに特徴付けられているかまたは開示されている。トランスフェリン受容体に特異的に結合する抗体は、当技術分野で公知である(例として、米国特許第4,364,934号、12/4/1979出願、「Monoclonal antibody to a human early thymocyte antigen and methods for preparing same」;米国特許第8,409,573号、6/14/2006出願、「Anti-CD71 monoclonal antibodies and uses thereof for treating malignant tumor cells」;米国特許第9,708,406号、5/20/2014出願、「Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use」;米国特許第9,611,323号、12/19/2014出願、「Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor」;WO 2015/098989、12/24/2014出願、「Novel anti-Transferrin receptor antibody that passes through blood-brain barrier」;Schneider C.et al.「Structural features of the cell surface receptor for transferrin that is recognized by the monoclonal antibody OKT9.」J Biol Chem.1982,257:14,8516-8522.;Lee et al.「Targeting Rat Anti-Mouse Transferrin Receptor Monoclonal Antibodies through Blood-Brain Barrier in Mouse」2000,J Pharmacol.Exp.Ther.,292:1048-1052を見よ)。
いずれの適切な抗トランスフェリン受容体抗体も、本明細書中に開示される複合体において使用されてもよい。抗トランスフェリン受容体抗体(関連する参考文献および結合エピトープを包含する)の例は、表2に挙げられる。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体、例として、表2に挙げられる抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかの相補性決定領域(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)を含む。
Figure 2023540746000031
Figure 2023540746000032
いくつかの態様では、筋標的化剤は抗トランスフェリン受容体抗体である。いくつかの態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を有するトランスフェリンタンパク質に特異的に結合する。いくつかの態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、トランスフェリン受容体のいずれかの細胞外エピトープ、または頂端ドメイン、トランスフェリン結合ドメイン、およびプロテアーゼ様ドメインを包含する抗体に曝露されるようになるエピトープに特異的に結合してもよい。いくつかの態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、アミノ酸C89～F760の範囲内の配列番号1～3で提供されるように、ヒトまたは非ヒト霊長類トランスフェリン受容体のアミノ酸セグメントに結合する。いくつかの態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、少なくとも約10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、またはそれ未満の結合親和性で特異的に結合する。本明細書で使用される抗トランスフェリン受容体抗体は、10-3M、10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、またはそれ未満のトランスフェリン受容体に結合する他の抗トランスフェリン受容体抗体、例として、OKT9、8D3と結合について競合することができる。
NCBI配列NP＿003225.2(トランスフェリン受容体タンパク質1アイソフォーム1、homo sapiens)に対応する、ヒトトランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号1).
NCBI配列NP＿001244232.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca mulatta)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKPNGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF
(配列番号2)
NCBI配列XP＿005545315.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、Macaca fascicularis)に対応する、霊長目の非ヒト動物トランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLGVDEEENTDNNTKANGTKPKRCGGNICYGTIAVIIFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPAREEPEEDFPAAPRLYWDDLKRKLSEKLDTTDFTSTIKLLNENLYVPREAGSQKDENLALYIENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSNVLKETKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSSVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQDVKHPVTGRSLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELVERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDTELNLDYERYNSQLLLFLRDLNQYRADVKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFRNAEKRDKFVMKKLNDRVMRVEYYFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLSALLESLKLRRQNNSAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF(配列番号3).
NCBI配列NP＿001344227.1(トランスフェリン受容体タンパク質1、mus musculus)に対応する、マウストランスフェリン受容体アミノ酸配列の例は、以下のとおりである:
MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAADEEENADNNMKASVRKPKRFNGRLCFAAIALVIFFLIGFMSGYLGYCKRVEQKEECVKLAETEETDKSETMETEDVPTSSRLYWADLKTLLSEKLNSIEFADTIKQLSQNTYTPREAGSQKDESLAYYIENQFHEFKFSKVWRDEHYVKIQVKSSIGQNMVTIVQSNGNLDPVESPEGYVAFSKPTEVSGKLVHANFGTKKDFEELSYSVNGSLVIVRAGEITFAEKVANAQSFNAIGVLIYMDKNKFPVVEADLALFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSQSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGKMEGSCPARWNIDSSCKLELSQNQNVKLIVKNVLKERRILNIFGVIKGYEEPDRYVVVGAQRDALGAGVAAKSSVGTGLLLKLAQVFSDMISKDGFRPSRSIIFASWTAGDFGAVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKVVLGTSNFKVSASPLLYTLMGKIMQDVKHPVDGKSLYRDSNWISKVEKLSFDNAAYPFLAYSGIPAVSFCFCEDADYPYLGTRLDTYEALTQKVPQLNQMVRTAAEVAGQLIIKLTHDVELNLDYEMYNSKLLSFMKDLNQFKTDIRDMGLSLQWLYSARGDYFRATSRLTTDFHNAEKTNRFVMREINDRIMKVEYHFLSPYVSPRESPFRHIFWGSGSHTLSALVENLKLRQKNITAFNETLFRNQLALATWTIQGVANALSGDIWNIDNEF
(配列番号4)
いくつかの態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、以下:FVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKE(配列番号5)のように受容体のアミノ酸セグメントに結合し、トランスフェリン受容体とトランスフェリンおよび/またはヒトヘモクロマトーシスタンパク質(HFEとしても知られる)との間の結合相互作用を阻害しない。
適切な方法論は、例として、組換えDNAプロトコルの使用を通じて、抗体、抗体フラグメント、もしくは抗原結合剤を得るか、および/または産生するために使用されてもよい。いくつかの態様において、抗体はまた、ハイブリドーマの生成を通しても産生されてよい(例として、Kohler,G and Milstein,C.「Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity」Nature,1975,256:495-497を見よ)。関心のある抗原は、あらゆる型または実体の、例として、組換え型もしくは天然に存在する型または実体の免疫原として使用されてもよい。ハイブリドーマは、標準的な方法、例としてELISAスクリーニングを使用してスクリーニングされることで、具体的な抗原を標的にする抗体を産生する少なくとも1個のハイブリドーマが見出される。抗体はまた、抗体を発現するタンパク質発現ライブラリ(例として、ファージディスプレーライブラリ)のスクリーニングを通しても産生されてよい。ファージディスプレーライブラリ設計はまた、いくつかの態様において使用されてもよい(例として、米国特許第5,223,409号、3/1/1991出願、「Directed evolution of novel binding proteins」;WO 1992/18619、4/10/1992出願、「Heterodimeric receptor libraries using phagemids」;WO 1991/17271、5/1/1991出願、「Recombinant library screening methods」;WO 1992/20791、5/15/1992出願、「Methods for producing members of specific binding pairs」;およびWO 1992/15679、2/28/1992出願、「Improved epitope displaying phage」を見よ)。いくつかの態様において、関心のある抗原は、非ヒト動物、例として、齧歯類の動物またはヤギを免疫するために使用されてもよい。いくつかの態様において、次いで抗体が非ヒト動物から得られたら、任意に数多の方法論を使用し、例として組換えDNA技法を使用し、修飾してもよい。抗体産生および方法論の追加の例も当該技術分野において知られている(例として、Harlow et al.「Antibodies:A Laboratory Manual」,Cold Spring Harbor Laboratory,1988を見よ)。
いくつかの態様において、抗体は修飾されている(例として、グリコシル化、リン酸化、SUMO化、および/またはメチル化を介して修飾されている)。いくつかの態様において、抗体は、1個以上の糖または炭水化物分子へ抱合されたグリコシル化抗体である。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、N-グリコシル化、O-グリコシル化、C-グリコシル化、グリピエーション(GPIアンカー付着)、および/またはホスホグリコシル化を介して、抗体へ抱合されている。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、またはグリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、分枝オリゴ糖類または分枝グリカンである。いくつかの態様において、1個以上の糖または炭水化物分子は、マンノース単位、グルコース単位、N-アセチルグルコサミン単位、N-アセチルガラクトサミン単位、ガラクトース単位、フコース単位、またはホスホ脂質単位を包含する。いくつかの態様において、糖分子は、約1～10個、約1～5個、約5～10個、約1～4個、約1～3個、または約2個存在する。いくつかの態様において、グリコシル化抗体は、全体的にまたは部分的にグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、化学反応によって、または酵素的な手段によってグリコシル化されている。いくつかの態様において、抗体は、in vitroでまたは細胞(任意にN-またはO-グリコシル化経路中の酵素(例として、グリコシルトランスフェラーゼ)を欠乏していてもよい)内部でグリコシル化される。いくつかの態様において、抗体は、「Modified antibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof」と題する2014年5月1日に公開された国際特許出願公開WO2014065661に記載のとおりの糖または炭水化物分子で官能化されている。
本開示のいくつかの側面は、トランスフェリン受容体(例として、トランスフェリン受容体の細胞外部分)に結合するタンパク質を提供する。いくつかの態様では、本明細書に提供されるトランスフェリン受容体抗体は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に特異的に結合する。トランスフェリン受容体は、細胞膜を越えてトランスフェリンを輸送し細胞内鉄レベルの調節およびホメオスタシスに加わる内在化する細胞表面受容体である。いくつかの態様において、本明細書に提供されるトランスフェリン受容体抗体はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラットなどからのトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるトランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体に結合する。いくつかの態様では、本明細書に提供されるトランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合する。いくつかの態様では、本明細書に提供されるトランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体の頂端ドメインに結合する。いくつかの態様では、本明細書に提供されるトランスフェリン受容体抗体は、ヒトトランスフェリン受容体の頂端ドメインに特異的に結合する。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つからのCDR-H(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)アミノ酸配列の1つ以上を包含する。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を包含する。本開示は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つについて提供されるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3を含む分子をコードするいずれかの核酸配列をもまた包含する。いくつかの態様において、抗体の重鎖および軽鎖CDR3ドメインは、ある抗原についての抗体の結合特異性/親和性に特に重要な役割を演じ得る。したがって、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つの少なくとも重鎖および/または軽鎖CDR3を包含し得る。
いくつかの例において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかは、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体の1つからのCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、および/またはCDR-L3配列のいずれかに実質的に類似の1以上のCDR(例として、CDR-HまたはCDR-L)配列を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のVH(例として、CDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3)および/またはVL(例として、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3)領域上の1以上のCDRの位置は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、1、2、3、4、5、または6アミノ酸位置だけ変動し得る。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載のいずれかの抗体のCDRを定義する位置は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、CDRのN末端および/またはC末端境界を、本明細書に記載の抗体のいずれか1つのCDR位置と比べて1、2、3、4、5、または6アミノ酸だけずらすことによって変動し得る。別の態様においては、本明細書に記載の抗体のVH(例として、CDR-H1、CDR-H2、またはCDR-H3)および/またはVL(例として、CDR-L1、CDR-L2、またはCDR-L3)領域上の1以上のCDRの長さは、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ変動し得る(例として、より短いかまたはより長い)。
したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上よりも1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多く短くあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上よりも1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多く長くあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3のアミノ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ延伸され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3のカルボキシ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ延伸され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3のアミノ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ短縮され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、および/またはCDR-H3のカルボキシ部分は、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、本明細書に記載のCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)の1つ以上と比較して1、2、3、4、5アミノ酸、またはより多くだけ短縮され得る。例えば当該技術分野において記載された結合アッセイおよび条件を使用して、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持されるかどうかを確かめるためのいずれかの方法が使用され得る。
いくつかの例において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかは、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つに実質的に類似の1以上のCDR(例として、CDR-HまたはCDR-L)配列を有する。例えば、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に対する免疫特異的結合が維持される(例として、実質的に維持される。例えば、それが由来する元の抗体の結合と比べて少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％)限り、抗体は、本明細書に提供されるCDR(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからのCDR)のいずれか1つの対応するCDR領域と比較して最大5、4、3、2、または1アミノ酸残基バリエーションまでを含有する表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかからの1以上のCDR配列(単数または複数)を包含し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供されるCDRのいずれかにおけるアミノ酸バリエーションのいずれかは、保存的なバリエーションであり得る。保存的なバリエーションは、例えば結晶構造に基づいて決定されるとおり、残基がトランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体タンパク質)との相互作用に関わることが蓋然的ではない位置においてCDRに導入され得る。本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される重鎖可変(VH)および/または軽鎖可変(VL)ドメインの1つ以上を含むトランスフェリン受容体抗体を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるVHドメインのいずれかは、本明細書に提供されるCDR-H配列(例として、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)の1つ以上、例えば、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つで提供されるCDR-H配列のいずれかを包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるVLドメインのいずれかは、本明細書に提供されるCDR-L配列(例として、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)の1つ以上、例えば、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つで提供されるCDR-L配列のいずれかを包含する。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメインを包含するいずれかの抗体を包含する。いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変および軽鎖可変ペアを包含するいずれかの抗体を包含する。
本開示の側面は、本明細書に記載のもののいずれかと相同な重鎖可変(VH)および/または軽鎖可変(VL)ドメインアミノ酸配列を有する抗トランスフェリン受容体抗体を提供する。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の重鎖可変配列および/またはいずれかの軽鎖可変配列と少なくとも75％(例として、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)同一である重鎖可変配列または軽鎖可変配列を含む。いくつかの態様において、相同な重鎖可変および/または軽鎖可変アミノ酸配列は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかにおいては変動しない。例えば、いくつかの態様において、配列バリエーションの程度(例として、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％)は、本明細書に提供されるCDR配列のいずれかを排除する重鎖可変および/または軽鎖可変配列内において生起し得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかは、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどのいずれかの抗トランスフェリン受容体抗体のフレームワーク配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一であるフレームワーク配列を含む重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含む。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれかの、本明細書に提供されるCDR-Lドメイン(CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3)またはCDR-Lドメインバリアントのいずれかを含む軽鎖可変VLドメインを含む。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む軽鎖可変VLドメインを含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1、2、3、または4つを含む軽鎖可変(VL)領域配列を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1、2、3、または4つと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、または100％同一である軽鎖可変領域配列のフレームワーク領域の1、2、3、または4つを含む。いくつかの態様において、該アミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、最大10アミノ酸までの置換、欠失、および/または挿入、好ましくは最大10アミノ酸までの置換の存在を除けば、該アミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、該アミノ酸配列に由来する軽鎖可変フレームワーク領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10アミノ酸残基が、対応する霊長目の非ヒト動物またはヒトの軽鎖可変フレームワーク領域中の類似した位置に見出されるアミノ酸と置換された該アミノ酸配列からなる。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体へ特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。いくつかの態様において、抗体はさらに、ヒトもしくは霊長目の動物の抗体のVLに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。本明細書に記載の軽鎖CDR配列との併用のための選択される抗体の霊長目の動物またはヒトの軽鎖フレームワーク領域は、例えば、非ヒト親抗体の軽鎖フレームワーク領域と、少なくとも70％(例として、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または少なくとも99％)の同一性を有し得る。選択される霊長類またはヒトの抗体は、その軽鎖相補性決定領域において、本明細書に提供される抗体のいずれか(例として、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか)の軽鎖相補性決定領域のアミノ酸に対し、同じ数または実質的に同じ数のアミノ酸を有し得る。いくつかの態様において、霊長目の動物またはヒトの軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸残基は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖フレームワーク領域と少なくとも75％同一性、少なくとも80％同一性、少なくとも85％同一性、少なくとも90％同一性、少なくとも95％同一性、少なくとも98％同一性、少なくとも99％(またはこれを超える)同一性を有する、天然の霊長目の動物またはヒトの抗体軽鎖フレームワーク領域からのものである。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体はさらに、ヒト軽鎖可変カッパサブファミリーに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体はさらに、ヒト軽鎖可変ラムダサブファミリーに由来する1つ、2つ、3つ、または4つすべてのVLフレームワーク領域を含む。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれも、軽鎖定常領域をさらに含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域である。いくつかの態様において、カッパまたはラムダ軽鎖定常領域は、哺乳動物から、例として、ヒト、サル、ラット、またはマウスからのものである。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域である。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、ヒトラムダ軽鎖定常領域である。本明細書に提供される軽鎖定常領域のいずれも、本明細書に提供される軽鎖定常領域のいずれかのバリアントであってもよいことは解されるはずである。いくつかの態様において、軽鎖定常領域は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体の軽鎖定常領域のいずれかと少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体である。
いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、表2から選択される抗トランスフェリン受容体抗体のいずれか1つなどの、いずれかの抗トランスフェリン受容体抗体のアミノ酸配列を含むVLドメインを含み、ここで定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、またはヒトIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗トランスフェリン受容体抗体は、VLドメイン、またはVLドメインのバリアントのいずれか、およびVHドメイン、またはVHドメインバリアントのいずれかを含み、ここでVLおよびVHドメイン、またはそれらのバリアントは、同じ抗体クローンからものであり、ここで定常領域は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、もしくはIgY免疫グロブリン分子、いずれかのクラス(例として、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)またはいずれかのサブクラス(例として、IgG2aおよびIgG2b)の免疫グロブリン分子の定常領域のアミノ酸配列を含む。ヒト定常領域の非限定例は当該技術分野において記載されており、例として、上述のKabat E A et al.(1991)を見よ。
いくつかの態様において、本開示の抗体は、比較的高い親和性で、例として、10-6M未満、10-7M未満、10-8M未満、10-9M未満、10-10M未満、10-11M未満またはそれ未満のKDで、標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)に結合し得る。例えば、抗トランスフェリン受容体抗体は、5pM～500nM、例として、50pM～100nM、例として、500pM～50nMの親和性でトランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に結合し得る。本開示はまた、トランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への結合について本明細書に記載される抗体のいずれかと競合し、50nM以下(例として、20nM以下、10nM以下、500pM以下、50pM以下、または5pM以下)の親和性を有する抗体を包含する。抗トランスフェリン受容体抗体の親和性および結合動態は、バイオセンサ技術(例として、OCTETまたはBIACORE)を包含するがこれらに限定されないいずれか好適な方法を使用して試験され得る。
いくつかの態様において、本開示の抗体は、比較的高い親和性で、例として、10-6M未満、10-7M未満、10-8M未満、10-9M未満、10-10M未満、10-11M未満またはそれ未満のKDで、標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)に結合し得る。例えば、抗トランスフェリン受容体抗体は、5pM～500nM、例として、50pM～100nM、例として、500pM～50nMの親和性でトランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体)に結合し得る。本開示はまた、トランスフェリン受容体タンパク質(例として、ヒトトランスフェリン受容体)への結合について本明細書に記載される抗体のいずれかと競合し、50nM以下(例として、20nM以下、10nM以下、500pM以下、50pM以下、または5pM以下)の親和性を有する抗体を包含する。抗トランスフェリン受容体抗体の親和性および結合動態は、バイオセンサ技術(例として、OCTETまたはBIACORE)を包含するがこれらに限定されないいずれか好適な方法を使用して試験され得る。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスフェリン受容体抗体(例として、国際出願刊行物WO 2016/081643(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のとおりの抗体およびそのバリアント)である。
種々の定義系に従う抗体の重鎖および軽鎖CDRは、表3中に提供される。種々の定義系、例として、Kabat定義、Chothia定義、および/またはContact定義は記載されている。例として、(例として、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,Chothia et al.,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;およびAlmagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)を見よ。またhgmp.mrc.ac.ukおよびbioinf.org.uk/absも見よ)を見よ。
Figure 2023540746000033
重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン配列もまた提供される:
VH
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSS(配列番号33)
VL
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASDNLYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELK(配列番号34)
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表3に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含む。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表3に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じであるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含み、これは、表3に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と比較して、合わせてわずか5アミノ酸バリエーション(例として、わずか5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。「合わせて」は、3つの重鎖CDRのすべてにおけるアミノ酸バリエーションの全数が、定義された範囲内であることを意味する。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み得、これは、表3に示されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と比較して、合わせてわずか5アミノ酸バリエーション(例として、わずか5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含み、これらの少なくとも1つは、表3に示されるカウンターパート重鎖CDRと比較してわずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み得、これらの少なくとも1つは、表3に示されるカウンターパート軽鎖CDRと比較してわずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、CDR-L3を含み、これは表3に示されるCDR-L3と比較してわずか3アミノ酸バリエーション(例として、わずか3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表3に示されるCDR-L3と比較して1つのアミノ酸バリエーションを含有するCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、QHFAGTPLT(KabatおよびChothia定義系に従う配列番号31)またはQHFAGTPL(Contact定義系に従う配列番号32)のCDR-L3を含む。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表3に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、およびCDR-L2を含み、QHFAGTPLT(KabatおよびChothia定義系に従う配列番号31)またはQHFAGTPL(Contact定義系に従う配列番号32)のCDR-L3を含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表3に示される重鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である重鎖CDRを含む。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表3に示される軽鎖CDRと、合わせて少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一である軽鎖CDRを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号34のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号33で示されるVHと比較して、わずか20アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号34で示されるVLと比較して、わずか15アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号33で表されるとおりのVHと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号34で表されるとおりのVLと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体(例として、抗体のヒト化バリアント)である。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、表3に示されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じであるCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、ヒト化重鎖可変領域および/またはヒト化軽鎖可変領域を含む。
ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)からのその残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDRからの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体から見出されない残基も、移入された(imported)CDRまたはフレームワーク配列から見出されない残基も含んでいてもよいが、抗体の性能をさらに洗練および最適化するために包含される残基を含むこともある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つの、典型的には2つの可変ドメインのすべてを実質的に含むであろうが、前記可変ドメインにおいて、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、かつFR領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン(典型的には、ヒト免疫グロブリンの)定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部も含むであろう。抗体は、WO 99/58572に記載のとおりに修飾されたFc領域を有していてもよい。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更された1以上のCDR(1、2、3、4、5、6)を有しており、これらはまた、元の抗体からの1以上のCDRに由来する1以上のCDRとも呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟も伴うことがある。
いくつかの態様において、ヒト化は、CDR(例として、表3に示されるとおりの)をIGKV1-NL1＊01およびIGHV1-3＊01ヒト可変ドメイン中へ接合させることによって達成される。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号34に示されるVLと比較して、9、13、17、18、40、45、および70位に1以上のアミノ酸置換、ならびに/または配列番号33に示されるVHと比較して、1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87、および108位に1以上のアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号34に示されるVLと比較して、9、13、17、18、40、45、および70位のすべてにアミノ酸置換、ならびに/または配列番号33に示されるVHと比較して、1、5、7、11、12、20、38、40、44、66、75、81、83、87、および108位のすべてにアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体であって、配列番号34で示されるVLの43および48位で残基を含有する。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト化抗体であって、配列番号33で示されるVHの48、67、69、71、および73位での残基を含有する。
本開示に従い使用されてもよいヒト化抗体の例の、VHおよびVLアミノ酸配列は、以下に提供される:
ヒト化されたVH
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSS(配列番号35)
ヒト化されたVL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTFGQGTKVEIK(配列番号36)
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号36のアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号35で示されるVHと比較して、わずか20アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有するVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号36で示されるVLと比較して、わずか15アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有するVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号35で表されるとおりのVHと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVHを含む。代替的にまたは加えて、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号36で表されるとおりのVLと少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一であるアミノ酸配列を含むVLを含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号34に示されるVLと比較して、43および48位の1以上におけるアミノ酸置換、ならびに/あるいは配列番号33に示されるVHと比較して、48、67、69、71および73位の1以上におけるアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号34に示されるVLと比較して、S43Aおよび/またはV48L突然変異、ならびに/あるいは配列番号33に示されるVHと比較して、A67V、L69I、V71R、およびK73Tの1以上の突然変異を含むヒト化バリアントである。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号34に示されるVLと比較して、9、13、17、18、40、43、48、45、および70位の1以上におけるアミノ酸置換、ならびに/あるいは配列番号33に示されるVHと比較して、1、5、7、11、12、20、38、40、44、48、66、67、69、71、73、75、81、83、87、および108位の1以上におけるアミノ酸置換を含むヒト化バリアントである。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第1の種からの可変領域または一部の可変領域、および第2の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、ある種の哺乳動物(例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物)に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体中の配列と相同である。いくつかの態様において、アミノ酸修飾は、可変領域および/または定常領域においてなされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を包含し得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第1の種からの可変領域または一部の可変領域、および第2の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖と重鎖との両方の可変領域は、ある種の哺乳動物(例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物)に由来する抗体の可変領域を模倣する一方で、定常部は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体中の配列と相同である。いくつかの態様において、アミノ酸修飾は、可変領域および/または定常領域においてなされ得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの抗トランスフェリン受容体抗体のいずれの重鎖も、重鎖定常領域(CH)またはこの一部(例として、CH1、CH2、CH3、またはそれらの組み合わせ)を含んでいてもよい。重鎖定常領域は、あらゆる好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギ、に属し得る。特定の一例において、重鎖定常領域は、ヒトIgG(ガンマ重鎖)、例として、IgG1、IgG2、またはIgG4からのものである。例示的なヒトIgG1定常領域が以下に与えられる。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号37)
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体のいずれの軽鎖も、軽鎖定常領域(CL)をさらに含んでいてもよいが、これは当該技術分野において知られているいずれのCLでもあり得る。いくつかの例において、CLは、カッパ軽鎖である。他の例において、CLは、ラムダ軽鎖である。いくつかの態様において、CLはカッパ軽鎖であって、その配列は下に与えられる:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号38)
他の抗体の重鎖および軽鎖定常領域は当該技術分野において周知であり、例として、IMGTデータベース(www.imgt.org)において、またはwww.vbase2.org/vbstat.php.にて提供されるものであるが、これらの両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
記載されるトランスフェリン受容体抗体の重鎖および軽鎖アミノ酸配列の例は、下に提供される:
重鎖(VH＋ヒトIgG1定常領域)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号39)
軽鎖(VL＋カッパ軽鎖)
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASDNLYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGTYYCQHFWGTPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号40)
重鎖(ヒト化VH＋ヒトIgG1定常領域)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号41)
軽鎖(ヒト化されたVL＋カッパ軽鎖)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASDNLYSNLAWYQQKPGKSPKLLVYDATNLADGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWGTPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号42)
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号39と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号40と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号40のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号39に示される重鎖と比較して、わずか20のアミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号40に示される軽鎖と比較して、わずか15アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号41と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号42と少なくとも80％(例として、80％、85％、90％、95％、または98％)同一のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号41のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。代替的にまたは加えて、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号42のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本開示の抗トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39に示されるヒト化抗体の重鎖と比較して、わずか20アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する重鎖を含む。代替え的または追加で、本開示のトランスフェリン受容体抗体は、配列番号40に示されるヒト化抗体の軽鎖と比較して、わずか15アミノ酸バリエーション(例として、わずか20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、9、8、7、6、5、4、3、2、または1アミノ酸バリエーション)を含有する軽鎖を含む。
いくつかの態様において、トランスフェリン受容体抗体は、無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメント(Fab)である。無傷の抗体(完全長抗体)の抗原結合性フラグメントは、定型的な方法を介して調製され得る。例えば、F(ab')2フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって産生され得、Fabフラグメントは、F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る。本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体の例示的なFabアミノ酸配列は、下に提供される:
重鎖FAB(VH＋ヒトIgG1定常領域の一部)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGTRAYHYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号43)
重鎖FAB(ヒト化VH＋ヒトIgG1定常領域の一部)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEINPTNGRTNYIEKFKSRATLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGTRAYHYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP(配列番号44)
本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、これらに限定されないが、無傷の(すなわち、完全長)抗体、それらの抗原結合性フラグメント(Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどの)、単一鎖抗体、二重特異性抗体、またはナノボディーを包含する、いずれの抗体の形態でもあり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、scFvである。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、scFv-Fab(例として、一部の定常領域と縮合されたscFv)である。いくつかの態様において、本明細書に記載のトランスフェリン受容体抗体は、定常領域(例として、配列番号39で示されるヒトIgG1定常領域)と縮合されたscFvである。
b.他の筋標的抗体
いくつかの態様において、筋標的化抗体は、ヘモジュベリン(hemojuvelin)、カベオリン-3、デュシェンヌ型筋ジストロフィーペプチド、ミオシンIib、またはCD63に特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、筋原性前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の筋原性前駆体タンパク質は、限定せずに、ABCG2、M-カドヘリン/カドヘリン-15、カベオリン-1、CD34、FoxK1、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、MYF-5、MyoD、ミオゲニン、NCAM-1/CD56、Pax3、Pax7、およびPax9を包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、骨格筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の骨格筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-サルコグリカン、ベータ-サルコグリカン、カルパインインヒビター、クレアチンキナーゼMM/CKMM、eIF5A、エノラーゼ2/ニューロン特異的エノラーゼ、イプシロン-サルコグリカン、FABP3/H-FABP、GDF-8/ミオスタチン、GDF-11/GDF-8、インテグリンアルファ7、インテグリンアルファ7ベータ1、インテグリンベータ1/CD29、MCAM/CD146、MyoD、ミオゲニン、ミオシン軽鎖キナーゼインヒビター、NCAM-1/CD56、およびトロポニンIを包含する。いくつかの態様において、筋標的化抗体は、平滑筋タンパク質に特異的に結合する抗体である。例示の平滑筋タンパク質は、限定せずに、アルファ-平滑筋アクチン、VE-カドヘリン、カルデスモン/CALD1、カルポニン1、デスミン、ヒスタミンH2 R、モチリンR/GPR38、トランスジェリン(Transgelin)/TAGLN、およびビメンチンを包含する。しかしながら、追加の標的への抗体が本開示の範囲内であること、および本明細書に提供される標的の例示のリストが限定することを意図していないことは解されるはずである。
c.抗体特色/変更
いくつかの態様において、保存的突然変異は、例えば結晶構造に基づき決定されるとき、その残基が標的抗原(例として、トランスフェリン受容体)との相互作用に関与しそうにない位置にて、抗体配列(例として、CDRまたはフレームワーク配列)中へ導入され得る。いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または細胞への抗原依存的細胞傷害性などの、抗体の1以上の機能特性を変更させるために、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/またはCH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/またはヒンジ領域中)へ導入される。
いくつかの態様において、1、2つ以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が、例として米国特許第5,677,425号に記載のとおり変動(例として、増大または減少)され得るように、Fc領域(CH1ドメイン)のヒンジ領域中へ導入される。CH1ドメインのヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例として、軽鎖および重鎖の会合(assembly)を容易にさせるため、または抗体の安定性を変更(例として、増大もしくは減少)するため、またはリンカー抱合を容易にさせるため、変更され得る。
いくつかの態様において、1、2個以上の突然変異(例として、アミノ酸置換)は、抗体の、エフェクター細胞表面上のFc受容体(例として、活性化されたFc受容体)への親和性を増加または減少させるため、本明細書に記載の筋標的化抗体のFc領域中(例として、Kabatナンバリング系(例として、KabatのEUインデックス)に従うナンバリングで、CH2ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中、および/またはCH3ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中、および/またはヒンジ領域中)へ導入される。抗体のFc受容体への親和性を増大または減少させる抗体のFc領域中の突然変異、およびかかる突然変異をFc受容体中またはそのフラグメント中へ導入するための技法は、当業者に知られている。抗体のFc受容体への親和性を変更するためになされ得る、抗体のFc受容体中の突然変異の例は、例として、Smith P et al.,(2012)PNAS 109:6181-6186、米国特許第6,737,056号、ならびに国際公開第WO02/060919号;第WO98/23289号;および第WO97/34631号(これらは参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。例えば、in vivoでの抗体の半減期を変更(例として、増加または減少)させるであろう突然変異について、例として、国際公開第WO02/060919号;第WO98/23289号;および第WO97/34631号;ならびに米国特許第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号、および第6,165,745号を見よ。
いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗トランスフェリン受容体抗体の半減期を減少させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、1、2個以上のアミノ酸突然変異(すなわち、置換、挿入、または欠失)は、in vivoでの抗体の半減期を増加させるため、IgG定常領域またはそのFcRn-結合フラグメント(好ましくは、Fcまたはヒンジ-Fcドメインフラグメント)中へ導入される。いくつかの態様において、抗体は、KabatのEUインデックス(上記のKabat E Aら(1991))に従うナンバリングで第2定常(CH2)ドメイン(ヒトIgG1の残基231～340)中および/または第3定常(CH3)ドメイン(ヒトIgG1の残基341～447)中に、1個以上のアミノ酸突然変異(例として、置換)を有し得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のIgG1定常領域は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置252におけるメチオニン(M)からチロシン(Y)への置換、位置254におけるセリン(S)からトレオニン(T)への置換、および位置256におけるトレオニン(T)からグルタミン酸(E)への置換を含む。米国特許第7,658,921号(これは、参照により本明細書に組み込まれる)を見よ。「YTE突然変異体」と称されるこのタイプの突然変異IgGは、同じ抗体の野生型バージョンと比較して4倍増大した半減期を発揮したことが示されている(Dall'Acqua W F et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514-24を見よ)。いくつかの態様において、抗体は、KabatにあるようなEUインデックスに従ってナンバリングされた位置251～257、285～290、308～314、385～389、および428～436でのアミノ酸残基の、1、2、3以上のアミノ酸置換を含むIgG定常領域を含む。
いくつかの態様において、1、2以上のアミノ酸置換は、抗トランスフェリン受容体抗体のエフェクター機能(単数または複数)を変更するため、IgG定常領域Fc領域中へ導入される。自身への親和性が変更されたエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。このアプローチは、米国特許第5,624,821号および第5,648,260号においてさらに詳細に記載される。いくつかの態様において、定常領域ドメインの欠失または不活化(点突然変異または他の手段を通して)は、循環抗体のFc受容体への結合を低減し、それによって腫瘍局在化を増大し得る。定常領域を欠失または不活化し、それによって腫瘍局在化を増大させる突然変異の記載については、例として、米国特許第5,585,097号および第8,591,886号を見よ。いくつかの態様において、1以上のアミノ酸置換は、Fc領域上の潜在的なグリコシル化部位を除去するため(これによってFc受容体への結合が低減されることもある)、本明細書に記載の抗体のFc領域中へ導入されてもよい(例として、Shields R L et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591-604を見よ)。
いくつかの態様において、本明細書に記載の筋標的化抗体の定常領域中の1以上のアミノ酸残基は、抗体が変更されたClq結合および/または低減もしくは消失された補体依存性細胞傷害性(CDC)を有し得るように、異なるアミノ酸残基に置き換えられ得る。このアプローチは、米国特許第6,194,551号(Idusogie et al)においてさらに詳細に記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のCH2ドメインのN末領域中の1以上のアミノ酸残基は変更されて、それによって抗体の補体結合能を変更する。このアプローチは、国際刊行物第WO 94/29351号においてさらに記載されている。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体のFc領域は、抗体の、細胞への抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の媒介能を増大させるため、および/または抗体のFcγ受容体への親和性を増大させるため、修飾されている。このアプローチは、国際刊行物第WO 00/42072号においてさらに記載されている。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体の重鎖および/または軽鎖可変ドメイン(単数または複数)配列(単数または複数)は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、例えば、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは複合ヒト抗体、または抗原結合性フラグメントを生成するために使用され得る。当業者によって理解されるとおり、本明細書に提供される抗体のいずれかに由来するあらゆるバリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体は、本明細書に記載の組成物および方法に有用であってもよく、バリアント、CDR接合抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または複合抗体が、これが由来する元の抗体と比べて、トランスフェリン受容体への少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％以上の結合を有し得るように、トランスフェリン受容体への特異的結合能を維持するであろう。
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗体は、所望の特性を抗体へ付与する突然変異を含む。例えば、ネイティブなIgG4 mAbに生じることが知られているFabアーム交換(Fab-arm exchange)に起因する潜在的合併症を回避するため、本明細書に提供される抗体は、安定化「Adair」突然変異を含んでいてもよく(Angal S.,et al.,「A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody」,Mol Immunol 30,105-108;1993)、ここでセリン228(EUナンバリング;残基241 Kabatナンバリング)は、IgG1様ヒンジ配列をもたらすプロリンへ変換されている。結果的に、抗体のいずれも、安定化「Adair」突然変異を包含していてもよい。
本明細書に提供されるとおり、本開示の抗体は、任意に、定常領域またはその一部を含んでいてもよい。例えば、VLドメインは、そのC末端にて、軽鎖定常領域様CκまたはCλへ付着されていてもよい。同様に、VHドメインまたはその一部は、すべてのまたは一部の重鎖様IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、およびいずれのアイソタイプのサブクラスへ付着されていてもよい。抗体は、好適な定常領域を包含していてもよい(例えば、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,No.91-3242,National Institutes of Health Publications,Bethesda,Md.(1991)を見よ)。したがって、本開示の範囲内の抗体は、いずれの好適な定常領域と組み合わせされて、VHおよびVLドメイン、またはその抗原結合部を包含していてもよい。
ii.筋標的化ペプチド
本開示のいくつかの側面は、筋標的化ペプチドを筋標的化剤として提供する。特定の細胞型へ結合する短いペプチド配列(例として、長さが5～20アミノ酸のペプチド配列)は記載されている。例えば、細胞標的化ペプチドは、Vines e.,et al.,A.、「Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery」Biochim Biophys Acta 2008,1786:126-38;Jarver P.,et al.,「In vivo biodistribution and efficacy of peptide mediated delivery」Trends Pharmacol Sci 2010;31:528-35;Samoylova T.I.,et al.,「Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening」Muscle Nerve 1999;22:460-6;米国特許第6,329,501号、2001年12月11日発行、題名「METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING COMPOUNDS TO MUSCLE」;およびSamoylov A.M.,et al.,「Recognition of cell-specific binding of phage display derived peptides using an acoustic wave sensor」Biomol Eng 2002;18:269-72に記載されており、これらのそれぞれの内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。特定の細胞表面抗原(例として、受容体)と相互作用するようにペプチドを設計することによって、所望される組織、例として、筋肉への選択性が獲得され得る。骨格筋標的化が調査されており、広範な分子ペイロードが送達されることができる。巨大な抗体またはウイルス粒子についての実際上の不利な点の多くが存在しないこれらのアプローチは、筋組織への高選択性を有していてもよい。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、長さが4アミノ酸から50アミノ酸までの筋標的化ペプチドである。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、長さが4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50アミノ酸である。筋標的化ペプチドは、ファージディスプレーなどの数種の方法のいずれかを使用して生成され得る。
いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、他のある細胞と比較して、筋細胞において過剰発現されているかまたは相対的に高度に発現されている、内在化する細胞表面受容体(例として、トランスフェリン受容体)へ結合してもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、トランスフェリン受容体を標的にしてもよい(例として、トランスフェリン受容体へ結合してもよい)。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、天然に存在するリガンド、例として、トランスフェリンのセグメントを含んでいてもよい。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第6,743,893号、11/30/2000出願、「RECEPTOR-MEDIATED UPTAKE OF PEPTIDES THAT BIND THE HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、Kawamoto,M.et al,「A novel transferrin receptor-targeted hybrid peptide disintegrates cancer cell membrane to induce rapid killing of cancer cells.」BMC Cancer.2011 Aug 18;11:359に記載のとおりである。いくつかの態様において、トランスフェリン受容体を標的にするペプチドは、米国特許第8,399,653号、5/20/2011出願、「TRANSFERRIN/TRANSFERRIN RECEPTOR-MEDIATED SIRNA DELIVERY」に記載のとおりである。
上述のとおり、筋標的化ペプチドの例は報告されている。例えば、筋肉特異的ペプチドは、表面へプタペプチドを提示するファージディスプレーライブラリを使用して同定された。一例として、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号6)を有するペプチドは、in vitroでC2C12マウス筋管へ結合し、かつin vivoでマウス筋組織へ結合した。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列ASSLNIA(配列番号6)を含む。このペプチドは、肝臓、腎臓、および脳への結合が低減された、マウスへの静脈内注射後の心筋組織および骨格筋組織への結合について改善された特異性を発揮した。追加の筋肉特異的ペプチドがファージディスプレーを使用して同定されている。例えば、DMDへの処置という文脈において、12アミノ酸ペプチドが、筋標的化のためのファージディスプレーライブラリによって同定された。Yoshida D.,et al.,「Targeting of salicylate to skin and muscle following topical injections in rats」Int J Pharm 2002;231:177-84を見よ;その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。ここで、配列SKTFNTHPQSTP(配列番号7)を有する12アミノ酸ペプチドが同定され、この筋標的化ペプチドは、ASSLNIA(配列番号6)ペプチドと比べてC2C12細胞への改善された結合を示した。
他の細胞型より筋肉(例として、骨格筋)に対して選択的なペプチドを同定するためのあらゆる追加の方法はin vitroでの選択を包含し、これはGhosh D.,et al.,「Selection of muscle-binding peptides from context-specific peptide-presenting phage libraries for adenoviral vector targeting」J Virol 2005;79:13667-72に記載されている;この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。ランダム12-merペプチドファージディスプレーライブラリを非筋細胞型の混合物とプレインキュベートすることによって、非特異的細胞バインダーが選出された。選択を繰り返した後、12アミノ酸ペプチドTARGEHKEEELI(配列番号8)が最も頻繁に出現した。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、アミノ酸配列TARGEHKEEELI(配列番号8)を含む。
筋標的化剤は、アミノ酸含有分子またはペプチドであってもよい。筋標的化ペプチドは、筋細胞から見出されたタンパク質受容体へ優先的に結合するタンパク質の配列に対応していてもよい。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、ペプチドが筋細胞を優先的に標的にし得るように、疎水性アミノ酸(例として、バリン)の性質(propensity)を高く含有する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、これまでに特徴付けも開示もされていない。これらのペプチドは、数種の方法論のいずれか、例として、ファージディスプレードペプチドライブラリ、1ビーズ・1化合物(one-bead one-compound)ペプチドライブラリ、または位置走査性(positional scanning)合成ペプチドコンビナトリアルライブラリを使用して、想起、産生、合成、および/または誘導体化されてもよい。例示の方法論は、当該技術分野において特徴付けられてきており、参照により組み込まれる(Gray,B.P.and Brown,K.C.「Combinatorial Peptide Libraries:Mining for Cell-Binding Peptides」Chem Rev.2014,114:2,1020-1081.;Samoylova,T.I.and Smith,B.F.「Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening.」Muscle Nerve,1999,22:4.460-6.)。いくつかの態様では、筋標的化ペプチドが以前に開示されている(例として、Writer M.J.et al.「Targeted gene delivery to human airway epithelial cells with synthetic vectors incorporating novel targeting peptides selected by phage display.」J.Drug Targeting.2004;12:185;Cai,D.「BDNF-mediated enhancement of inflammation and injury in the aging heart.」Physiol Genomics.2006,24:3,191-7.;Zhang,L.「Molecular profiling of heart endothelial cells.」Circulation,2005,112:11,1601-11.;McGuire,M.J.et al.「In vitro selection of a peptide with high selectivity for cardiomyocytes in vivo.」J Mol Biol.2004,342:1,171-82.を見よ)。例示の筋標的化ペプチドは、以下の群のアミノ酸配列を含む:CQAQGQLVC(配列番号9)、CSERSMNFC(配列番号10)、CPKTRRVPC(配列番号11)、WLSEAGPVVTVRALRGTGSW(配列番号12)、ASSLNIA(配列番号6)、CMQHSMRVC(配列番号13)、およびDDTRHWG(配列番号14)。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは、約2～25アミノ酸、約2～20アミノ酸、約2～15アミノ酸、約2～10アミノ酸、または約2～5アミノ酸を含んでいてもよい。筋標的化ペプチドは、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないか、もしくは修飾アミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、筋標的化ペプチドは線状であってもよい;他の態様において、筋標的化ペプチドは環状(例として、二環式)であってもよい(例として、Silvana,M.G.et al.Mol.Therapy,2018,26:1,132-147を見よ)。筋標的化剤は、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にするアプタマー、例としてペプチドアプタマーであってもよい。
iii.筋標的化受容体リガンド
筋標的化剤は、リガンド、例として、受容体タンパク質へ結合するリガンドであってもよい。筋標的化リガンドは、タンパク質、例としてトランスフェリンであってもよく、それは筋細胞によって発現される内在化する細胞表面受容体へ結合する。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスフェリン、またはトランスフェリン受容体へ結合するその誘導体である。筋標的化リガンドは、代替的に、小分子、例として、他の細胞型と比べて優先的に筋細胞を標的にする親油性小分子であってもよい。筋細胞を標的にしてもよい例示の親油性小分子は、コレステロール、コレステリル、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、オレイル、リノレン酸、リノール酸、ミリスチン酸、ステロール、ジヒドロテストステロン、テストステロン誘導体、グリセリン、アルキル鎖、トリチル基、およびアルコキシ酸を含む化合物を包含する。
iv.他の筋標的化剤
筋細胞(例として、骨格筋細胞)を標的にするための1つのストラテジーは、筋線維鞘上に発現されたトランスポータータンパク質などの筋肉トランスポータータンパク質の基質を使用することである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、筋組織に特異的な流入トランスポーターの基質である。いくつかの態様において、流入トランスポーターは、骨格筋組織に特異的である。骨格筋の筋線維鞘上に発現されるトランスポーターの二大クラスは、(1)骨格筋組織からの流出に容易にさせる、アデノシン三リン酸(ATP)結合カセット(ABC)スーパーファミリー、および(2)基質の骨格筋中への流入を容易にし得る、溶質輸送体(solute carrier)(SLC)スーパーファミリーである。いくつかの態様において、筋標的化剤は、トランスポーターのABCスーパーファミリーまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在する基質である。いくつかの態様において、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合する基質は、天然に存在しない基質、例えば、トランスポーターのABCまたはSLCスーパーファミリーへ結合するその合成誘導体である。
いくつかの態様では、筋標的化剤は、輸送体のSLCスーパーファミリーを標的とする本明細書に記載のいずれかの筋標的化剤(例として、抗体、核酸、小分子、ペプチド、アプタマー、脂質、糖部分)である。いくつかの態様では、筋標的化剤は輸送体(例として、基質であってもよい)を標的としてもよい。SLCトランスポーターは、平衡型であるか、または基質の輸送を推進させる膜にわたって創出されたプロトンもしくはナトリウムのイオン勾配を使用するかのいずれかである。骨格筋への高発現を有する例示のSLCトランスポーターは、限定せずに、SATTトランスポーター(ASCT1;SLC1A4)、GLUT4トランスポーター(SLC2A4)、GLUT7トランスポーター(GLUT7;SLC2A7)、ATRC2トランスポーター(CAT-2;SLC7A2)、LAT3トランスポーター(KIAA0245;SLC7A6)、PHT1トランスポーター(PTR4;SLC15A4)、OATP-Jトランスポーター(OATP5A1;SLC21A15)、OCT3トランスポーター(EMT;SLC22A3)、OCTN2トランスポーター(FLJ46769;SLC22A5)、ENTトランスポーター(ENT1;SLC29A1およびENT2;SLC29A2)、PAT2トランスポーター(SLC36A2)、およびSAT2トランスポーター(KIAA1382;SLC38A2)を包含する。これらのトランスポーターは、基質の骨格筋中への流入を容易にさせることで、筋標的化のための好機を提供し得る。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、平衡型ヌクレオシドトランスポーター2(ENT2)トランスポーターの基質である。他のトランスポーターと比べて、ENT2は、骨格筋において最高発現するmRNAの1つを有する。ヒトENT2(hENT2)は、脳、心臓、胎盤、胸腺、膵臓、前立腺、および腎臓などのほとんどの体器官に発現されるものの、特に骨格筋に豊富である。ヒトENT2は、その基質の取り込みを、それらの濃度勾配に応じて容易にさせる。ENT2は、広範なプリンおよびピリミジン核酸塩基を輸送することによってヌクレオシドホメオスタシスを維持する役割を果たす。hENT2トランスポーターは、イノシンを除くすべてのヌクレオシド(アデノシン、グアノシン、ウリジン、チミジン、およびシチジン)に対して低親和性を有する。結果的に、いくつかの態様において、筋標的化剤は、ENT2基質である。例示のENT2基質は、限定せずに、イノシン、2',3'-ジデオキシイノシン、およびクロファラビンを包含する。いくつかの態様において、本明細書に提供される筋標的化剤のいずれも、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)に関連する。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、筋標的化剤は、分子ペイロードへ非共有結合的に連結されている。
いくつかの態様において、筋標的化剤は、ナトリウムイオン依存性の高親和性カルニチントランスポーターである有機カチオン/カルニチントランスポーター(OCTN2)の基質である。いくつかの態様において、筋標的化剤は、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはOCTN2へ結合するそのいずれかの誘導体である。いくつかの態様において、カルニチン、ミルドロネート、アセチルカルニチン、またはそれらの誘導体は、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチドペイロード)へ共有結合的に連結されている。
筋標的化剤は、筋細胞を標的にする少なくとも1つの可溶性形態で存在するタンパク質であるタンパク質であってもよい。いくつかの態様において、筋標的化タンパク質は、鉄過剰およびホメオスタシスに関与するタンパク質ヘモジュベリン(またrepulsive guidance molecule Cまたはヘモクロマトーシスタイプ2タンパク質としても知られている)であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、完全長もしくはフラグメントであっても、または機能的ヘモジュベリンタンパク質と少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％配列同一性をもつ突然変異体であってもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリン突然変異体は、可溶性フラグメントであってもよく、N末シグナリングを欠いていてもよく、および/またはC末アンカードメイン(anchoring domain)を欠いていてもよい。いくつかの態様において、ヘモジュベリンは、GenBank RefSeq受託番号NM＿001316767.1、NM＿145277.4、NM＿202004.3、NM＿213652.3、またはNM＿213653.3の注釈付きのものであってもよい。ヘモジュベリンがヒト、霊長目の非ヒト動物、または齧歯類の動物を起源とするものであってもよいことは解されるはずである。
B.分子ペイロード
本開示のいくつかの側面は、分子ペイロード、例として、生物学的結果(例として、DNA配列の転写、タンパク質の発現、またはタンパク質の活性)をモジュレートするための分子ペイロードを提供する。いくつかの態様において、分子ペイロードは、筋標的化剤へ共有結合的に連結されているか、または別様に結び付けられている。様々なタイプの筋標的化剤が本開示に従って使用されてもよいことは解されるはずである。例えば、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)、ペプチド(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質に結合するペプチド)、タンパク質(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質に結合するタンパク質)、または小分子(例として、疾患に関連する筋細胞中の核酸もしくはタンパク質の機能をモジュレートする小分子)を含んでいてもよく、またはこれらからなっていてもよい。いくつかの態様において、かかる分子ペイロードは、例として、結び付けられた筋標的化剤による筋細胞への送達を受けた筋細胞中の核酸またはタンパク質への特異的結合を介して、筋細胞を標的にすることが可能である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、表1で提供された遺伝子に相補性のある領域を有する鎖を含むオリゴヌクレオチドである。例示の分子ペイロードは本明細書にさらに詳細に記載されているが、しかしながら、本明細書に提供される例示の分子ペイロードが限定されることを意図していないことは解されるはずである。
いくつかの態様において、少なくとも1(例として、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10)の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)は、筋標的化剤へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、筋標的化剤へ連結されたすべての分子ペイロードは、同じであり、例として同じ遺伝子を標的にする。いくつかの態様において、筋標的化剤へ連結されたすべての分子ペイロードは、異なっており、例えば分子ペイロードは、同じ標的遺伝子の異なる部分を標的にしてもよく、または分子ペイロードは、少なくとも2つの異なる標的遺伝子を標的にしてもよい。いくつかの態様において、筋標的化剤は、同じであるいくつかの分子ペイロードおよび異なるいくつかの分子ペイロードへ連結されてもよい。
本開示はまた、複合体の少なくとも80％(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％)が同数の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ共有結合的に連結された筋標的化剤を含む、複数の複合体を含む組成物を提供する。
i.オリゴヌクレオチド
いずれの好適なオリゴヌクレオチドも、分子ペイロードとして、本明細書に記載のとおり使用されてよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの分解を引き起こすよう設計されていてもよい(例として、オリゴヌクレオチドは、分解を引き起こすgapmer、siRNA、リボザイム、またはアプタマーであってもよい)。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳を遮断するよう設計されていてもよい(例として、オリゴヌクレオチドは、翻訳を遮断するmixmer、siRNA、またはアプタマーであってもよい)。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、mRNAの分解を引き起こしてその翻訳を遮断するよう設計されていてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、酵素(例として、遺伝子編集酵素)の活性に向かわせるためのガイド核酸(例として、ガイドRNA)であってもよい。オリゴヌクレオチドの他の例は本明細書に提供されている。いくつかの態様において、一方のフォーマット(format)からの機能的配列(例として、アンチセンス鎖配列)を他方のフォーマットへ組み込むことによって、あるフォーマットのオリゴヌクレオチド(例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド)が、別のフォーマット(例として、siRNAオリゴヌクレオチド)へ好適に適応されてもよいことは解されるはずである。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1で提供された標的遺伝子と相補性のある領域を含んでもよい。さらなる非限定例は、表1の選択された遺伝子について、以下提供される。
DMPK/DM1
いくつかの態様において、DMPKを標的にするために、例としてDM1の処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、Compound And Method For Treating Myotonic Dystrophyと題する2010年1月1日に公開された米国特許出願公開第20100016215A1号;Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase(DMPK)Expressionと題する2010年7月19日に公開された米国特許出願公開第20130237585A1号;「Antisense Conjugates For Decreasing Expression Of Dmpk」と題する2015年3月5日に公開された米国特許出願公開第20150064181A1号;「Peptide-Linked Morpholino Antisense Oligonucleotides For Treatment Of Myotonic Dystrophy」と題する2015年8月27日に公開された米国特許出願公開第20150238627A1号;Pandey,S.K.et al.「Identification and Characterization of Modified Antisense Oligonucleotides Targeting DMPK in Mice and Nonhuman Primates for the Treatment of Myotonic Dystrophy Type 1」J.of Pharmacol Exp Ther,2015,355:329-340.;Langlois,M.et al.「Cytoplasmic and Nuclear Retained DMPK mRNAs Are Targets for RNA Interference in Myotonic Dystrophy Cells」J.Biological Chemistry,2005,280:17,16949-16954.;Jauvin,D.et al.「Targeting DMPK with Antisense Oligonucleotide Improves Muscle Strength in Myotonic Dystrophy Type 1 Mice」,Mol.Ther:Nucleic Acids,2017,7:465-474.;Mulders,S.A.et al.「Triplet-repeat oligonucleotide-mediated reversal of RNA toxicity in myotonic dystrophy」PNAS,2009,106:33,13915-13920.;Wheeler,T.M.et al.,「Targeting nuclear RNA for in vivo correction of myotonic dystrophy」Nature,2012,488(7409):111-115.;および「Compounds And Methods For Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase(Dmpk)Expression」と題する2016年10月20日に公開された米国特許出願公開第20160304877A1に提供され、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
DMPK遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、「Genetic Correction Of Myotonic Dystrophy Type 1」と題する2017年3月3日に公開された米国特許出願公開第20170088819A1号;および、「Materials And Methods For Treatment Of Myotonic Dystrophy Type 1(DM1)And Other Related Disorders」と題する2018年4月1日に公開された国際特許出願公開WO18002812A1号を包含し、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DMPKの突然変異型、例として、Botta A.et al.「The CTG repeat expansion size correlates with splicing defect in muscle from myotonic dystrophy type 1 patients」J Med Genet.2008 Oct;45(10):639-46.;およびMachuca-Tzili L.et al.「Clinical and molecular aspects of the myotonic dystrophies:a review」Muscle Nerve.2005 Jul;32(1):1-18に報告されている突然変異型に対する相補性領域を有してもよく、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、DMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド標的化は、参照により本明細書に組み込まれる「Compounds And Methods For Modulation Of Dystrophia Myotonica-Protein Kinase(DMPK)Expression」と題する2016年10月20日に公開された米国特許出願公開US20160304877A1号に記載された、DMPKを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド(例として、Gapmer)のいずれか1つである。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、Genbank受託番号NM＿001081560.2で表されるまたはGenbank受託番号NG＿009784.1で表されるDMPK遺伝子配列の領域を標的にする。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、Genbank受託番号NM＿001081560.2中の少なくとも10個の連続的なヌクレオチド(例として、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも14個、少なくとも16個、またはそれ以上の連続的なヌクレオチド)である標的領域に相補的な領域を含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、gapmerモチーフを含む。「Gapmer」は、RNase H切断を支持する複数のヌクレオチドを有する内部領域が、1個以上のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置されるキメラのアンチセンス化合物を意味し、ここで内部領域を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドまたは外部領域を含むヌクレオチドとは化学的に別個である。内部領域は「ギャップセグメント」と称され得、外部領域は「ウイングセグメント」と称され得る。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1個以上の修飾ヌクレオチド、および/または1個以上の修飾ヌクレオチド間連結を含む。いくつかの態様において、ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオアート連結である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、完全なホスホロチオアート主鎖を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、cET末端を伴うDNA gapmer(例として、3-10-3;cET-DNA-cET)である。いくつかの態様において、DMPK標的化オリゴヌクレオチドは、1以上の6'-(S)-CH3二環式ヌクレオチド、1以上のβ-D-2'-デオキシリボヌクレオチド、および/または1以上の5-メチル-シトシンヌクレオチドを含む。
DUX4/FSHD
いくつかの態様において、DUX4を標的にするために、例として、FSHDの処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、「AGENTS USEFUL IN TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2017年2月2日に公開された米国特許第9,988,628号;「RECOMBINANT VIRUS PRODUCTS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF DUX4」と題する2014年10月30日に公開された米国特許第9,469,851号;「AGENTS USEFUL IN TREATING FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2012年9月6日に公開された米国特許出願公開第20120225034号;「MORPHOLINO TARGETING DUX4 FOR TREATING FSHD」と題する2013年8月15日に公開されたPCT特許出願公開番号WO 2013/120038号;Chen et al.,「Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics」、Molecular Therapy,2016,24:8,1405-1411.;およびAnsseau et al.,「Antisense Oligonucleotides Used to Target the DUX4 mRNA as Therapeutic Approaches in Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy(FSHD)」,Genes,2017,8,93.に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的DUX4遺伝子またはmRNAとハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、モルホリノ、siRNA、shRNA、または別のヌクレオチドである。
いくつかの態様において、例として、FSHDの処置のために、オリゴヌクレオチドは、2015年にCurr Opin Genet Devで公開されたDaxinger,et al.,「Genetic and Epigenetic Contributors to FSHD」、Lim J-W,et al.,DICER/AGO-dependent epigenetic silencing of D4Z4 repeats enhanced by exogenous siRNA suggests mechanisms and therapies for FSHD Hum Mol Genet.2015 Sep 1;24(17):4817-4828(これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、低メチル化され縮小されたD4Z4反復と相補性のある領域を有してもよい。
DNM2/CNM
いくつかの態様において、DNM2を標的にするために、例として、CNMの処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、「DYNAMIN 2 INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF DUCHENNE'S MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2018年5月24日に公開された米国特許出願公開第20180142008号、および「ALLELE-SPECIFIC SILENCING THERAPY FOR DYNAMIN 2-RELATED DISEASES」と題する2018年6月7日に公開されたPCT出願公開番号WO 2018/100010A1号に提供されている。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DNM2発現と特異的に干渉するRNAi、アンチセンス核酸、siRNA、またはリボザイムである。DNM2を標的にするための有用なオリゴヌクレオチドの他の例は、2018年4月4日にMol.Ther.で公開されたTasfaout,et al.,「Single Intramuscular Injection of AAV-shRNA Reduces DNM2 and Prevents Myotubular Myopathy in Mice」およびTasfaout,et al.,「Antisense oligonucleotide-mediated Dnm2 knockdown prevents and reverts myotubular myopathy in mice」,Nature Communications volume 8,Article number:15661(2017)に提供されている。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、DNM2 mRNAを効率的に標的にするshRNAまたはモルホリノである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2015年7月にMol.Cell Biol.で発表されたTodaka,et al.「Overexpression of NF90-NF45 Represses Myogenic MicroRNA Biogenesis,Resulting in Development of Skeletal Muscle Atrophy and Centronuclear Muscle Fibers」にあるような、miR-133活性に対して抵抗性である野生型DNM2をコードする。DNM2を標的とするのに有用なオリゴヌクレオチドのさらなる例は、2013年にPLoS Oneに発表されたGibbs,et al.,「Two Dynamin-2 Genes are Required for Normal Zebrafish Development」に提供されており、その各々の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、例として、CNMの処置のために、オリゴヌクレオチドは、2012年にHum.Mutat.で公開されたBoehm et al,「Mutation Spectrum in the Large GTPase Dynamin 2,and Genotype-Phenotype Correlation in Autosomal Dominant Centronuclear Myopathy」(この内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、CNMに関連するDNM2における突然変異体と相補性のある領域を有してもよい。
ポンペ病
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、オリゴヌクレオチドは、van der Wal,et al.,「GAA Deficiency in Pompe Disease is Alleviated by Exon Inclusion in iPSC-Derived Skeletal Muscle Cells」、Mol Ther Nucleic Acids.2017 Jun 16;7:101-115(この内容全体は本明細書に組み込まれる)におけるとおり、GAA疾患アレル中にエキソン2封入を媒介する。結果的に、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、GAA疾患アレルと相補性のある領域を有してもよい。
いくつかの態様において、例として、ポンペ病の処置のために、RNAiまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、例えば、2017年にMol Ther Nucleic Acidsで公開されたClayton,et al.,「Antisense Oligonucleotide-mediated Suppression of Muscle Glycogen Synthase 1 Synthesis as an Approach for Substrate Reduction Therapy of Pompe Disease」、または「INHIBITING OR DOWNREGULATING GLYCOGEN SYNTHASE BY CREATING PREMATURE STOP CODONS USING ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES」と題する2017年6月29日に公開された米国特許出願公開第2017182189号(これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる)において報告されたように、筋細胞中の野生型GYS1の発現を抑制するために利用される。結果的に、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、RefSeq番号NM＿002103.4に対応するヒトGYS1配列および/またはRefSeq番号NM＿030678.3に対応するマウスGYS1配列である配列と、相補性のある領域を有するアンチセンス鎖を有してもよい。
ACVR1/FOP
いくつかの態様では、例として、FOPの処置のために、ACVR1を標的にするのに有用なオリゴヌクレオチドの例は、米国特許出願2009/0253132、10/8/2009公開、「Mutated ACVR1 for diagnosis and treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva(FOP)」;WO 2015/152183、10/8/2015公開、「Prophylactic agent and therapeutic agent for fibrodysplasia ossificans progressive」;Lowery,J.W.et al,「Allele-specific RNA Interference in FOP-Silencing the FOP gene」,GENE THERAPY,vol.19,2012,pages 701-702;Takahashi,M.et al.「Disease-causing allele-specific silencing against the ALK2 mutants,R206H and G356D,in fibrodysplasia ossificans progressiva」Gene Therapy(2012)19,781-785;Shi,S.et al.「Antisense-Oligonucleotide Mediated Exon Skipping in Activin-Receptor-Like Kinase 2:Inhibiting the Receptor That Is Overactive in Fibrodysplasia Ossificans Progressiva」Plos One,July 2013,Vol 8:7,e69096.;米国特許出願2017/0159056、6/8/2017公開、「Antisense oligonucleotides and methods of use thereof」;米国特許第8,859,752号、10/4/2014発行、「SIRNA-based therapy of Fibrodyplasia Ossificans Progressiva(FOP)」;WO2004/094636、11/4/2004公開、「Effective sirna knock-down constructs」に提供されているが、これら各々の内容はそれら全体が本明細書に組み込まれる。
FXN/フリートライヒ運動失調症
いくつかの態様において、FXNを標的にするためにおよび/またはそうでなければフラタキシン欠乏症を補償するために、例として、フリートライヒ運動失調症の処置のために、有用なオリゴヌクレオチドの例は、Li,L.et al「Activating frataxin expression by repeat-targeted nucleic acids」Nat.Comm.2016,7:10606.;WO 2016/094374、6/16/2016公開、「Compositions and methods for treatment of friedreich's ataxia.」;WO 2015/020993、2/12/2015公開、「RNAi COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF FRIEDREICH'S ATAXIA」;WO 2017/186815、11/2/2017公開、「Antisense oligonucleotides for enhanced expression of frataxin」;WO 2008/018795、2/14/2008公開、「Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders」;米国特許出願2018/0028557、2/1/2018公開、「Hybrid oligonucleotides and uses thereof」;WO 2015/023975、2/19/2015公開、「Compositions and methods for modulating RNA」;WO 2015/023939、2/19/2015公開、「Compositions and methods for modulating expression of frataxin」;米国特許出願2017/0281643、10/5/2017公開、「Compounds and methods for modulating frataxin expression」;Li L.et al.,「Activating frataxin expression by repeat-targeted nucleic acids」Nature Communications,2016年2月4日公開;およびLi L.et al.「Activation of Frataxin Protein Expression by Antisense Oligonucleotides Targeting the Mutant Expanded Repeat」Nucleic Acid Ther.2018 Feb;28(1):23-33.に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドペイロードは、例として、米国特許第9,593,330号、6/9/2011出願、「Treatment of frataxin(FXN)related diseases by inhibition of natural antisense transcript to FXN」(この内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる)において開示されたように、FXN発現を阻害する天然アンチセンス転写産物の発現を阻害するために構成される(例として、gapmerまたはRNAiオリゴヌクレオチドとして)。
FXN遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、WO 2016/094845、6/16/2016公開、「Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides」;WO 2015/089354、6/18/2015公開、「Compositions and methods of use of CRISPR-Cas systems in nucleotide repeat disorders」;WO 2015/139139、9/24/2015公開、「CRISPR-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof」;およびWO 2018/002783、1/4/2018公開、「Materials and methods for treatment of Friedreich ataxia and other related disorders」を包含し、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
非FXN遺伝子、例としてFXNの後成的調節因子、の標的化を通じてFXN遺伝子発現を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、WO 2015/023938、2/19/2015公開、「Epigenetic regulators of frataxin」を包含し、この内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ヒト由来のFXN遺伝子(Gene ID 2395;NC＿000009.12)および/またはマウス由来のFXN遺伝子(Gene ID 14297;NC＿000085.6)として規定される配列と、相補性のある領域を有してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として、Montermini,L.et al.「The Friedreich ataxia GAA triplet repeat:premutation and normal alleles」Hum.Molec.Genet.,1997,6:1261-1266.;Filla,A.et al.「The relationship between trinucleotide(GAA)repeat length and clinical features in Friedreich ataxia」Am.J.Hum.Genet.1996,59:554-560.;Pandolfo,M.Friedreich ataxia:the clinical picture.J.Neurol.2009,256,3-8に報告されるように、FXNの突然変異型と相補性のある領域を有してもよく、その各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
DMD/ジストロフィン異常症
DMDを標的にするための有用なオリゴヌクレオチドの例は、「MULTIPLE EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR DMD」と題する2010年5月27日に公開された米国特許出願公開US20100130591A1;「MEANS AND METHOD FOR INDUCING EXON-SKIPPING」と題する2013年1月29日に登録された米国特許第8,361,979号;「METHOD FOR EFFICIENT EXON(44)SKIPPING IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY AND ASSOCIATED MEANS」と題する2012年3月8日に公開された米国特許出願公開20120059042;「EXON SKIPPING COMPOSITIONS FOR TREATING MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2014年11月6日に公開された米国特許出願公開20140329881;「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES FOR INDUCING EXON SKIPPING AND METHODS OF USE THEREOF」と題する2012年7月31日に登録された米国特許第8,232,384号;「METHODS AND MEANS FOR EFFICIENT SKIPPING OF EXON 45 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY PRE-MRNA」と題する2012年1月26日に公開された米国特許出願公開20120022134A1;「ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR FOR EXON SKIPPING IN A GENE ENCODING A DISPENSABLE DOMAN PROTEIN」と題する2012年3月29日に公開された米国特許出願公開20120077860;「OLIGOMERS」と題する2012年12月4日に登録された米国特許第8,324,371号;「ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES」と題する2015年7月14日に登録された米国特許第9,078,911号;「ANTISENSE NUCLEIC ACIDS」と題する2015年7月14日に登録された米国特許第9,079,934号;「MIR-31 IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY THERAPY」と題する2015年5月19日に登録された米国特許第9,034,838号;および「OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF」と題する2017年4月13日に公開された国際特許公開WO2017062862A3に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
DMD遺伝子編集を促進するためのオリゴヌクレオチドの例は、「METHODS OF MODIFYING THE DYSTROPHIN GENE AND RESTORING DYSTROPHIN EXPRESSION AND USES THEREOF」と題する2018年3月29日に公開された国際特許公開WO2018053632A1;「MODIFICATION OF THE DYSTROPHIN GENE AND USES THEREOF」と題する2017年3月30日に公開された国際特許公開WO2017049407A1;「CRISPR/CAS-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY AND BECKER MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2016年10月6日に公開された国際特許公開WO2016161380A1;「THERAPEUTIC TARGETS FOR THE CORRECTION OF THE HUMAN DYSTROPHIN GENE BY GENE EDITING AND METHODS OF USE」と題する2017年6月8日に公開された国際特許公開WO2017095967;「MATERIALS AND METHODS FOR TREATMENT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY」と題する2017年5月4日に公開された国際特許公開WO2017072590A1;「PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CPF1-MEDIATED GENE EDITING」と題する2018年5月31日に公開された国際特許公開WO2018098480A1;、「RNA-Guided Systems for In Vivo Gene Editing」と題する2017年9月21日に公開された米国特許出願公開US20170266320A1;「PREVENTION OF MUSCULAR DYSTROPHY BY CRISPR/CAS9-MEDIATED GENE EDITING」と題する2016年2月18日に公開された国際特許公開WO2016025469A1;「RNA-GUIDED GENE EDITING AND GENE REGULATION」と題する2016年7月14日に公開された米国特許出願公開2016/0201089;および「MEGANUCLEASE VARIANTS CLEAVING A DNA TARGET SEQUENCE FROM THE DYSTROPHN GENE AND USES THEREOF」と題する2013年6月6日に公開された米国特許出願刊公開2013/0145487を包含し、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として、ヒト、マウスおよび非ヒト種から選択される、複数の種のDMD遺伝子配列と相補性のある領域を有してもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、突然変異体DMDアレル、例えば、フレームシフトおよび不適当なRNAスプライシング/プロセシングに繋がるヒト中DMDのエキソン1～79のいずれかにおける少なくとも1個の突然変異を伴うDMDアレル、と相補性のある領域を有してもよい。
MYH7/肥大性心筋症
ペイロードとして、例として、MYH7を標的にするための、有用なオリゴヌクレオチドの例は、Inhibitors of MYH7B and Uses Thereofと題する2018年4月5日に公開された米国特許出願公開20180094262;Oligonucleotides and Methods for Treatment of Cardiomyopathy Using RNA Interferenceと題する2016年12月1日に公開された米国特許出願公開20160348103;「Allele-specific RNA Silencing for the Treatment of Hypertrophic Cardiomyopathy」と題する2016年8月18日に公開された米国特許出願公開20160237430;「Inhibitors of MYH7B and Uses Thereof」と題する2016年2月4日に公開された米国特許出願公開20160032286;「MicroRNA Inhibitors Comprising Locked Nucleotides」と題する2014年7月3日に公開された米国特許出願公開20140187603;「Dual Targeting of miR-208 and miR-499 in the Treatment of Cardiac Disorders」と題する2014年6月26日に公開された米国特許出願公開20140179764;「Compositions and Methods to Treat Muscular and Cardiovascular Disorders」と題する2012年5月10日に公開された米国特許出願公開20120114744に提供され、これら各々の内容全体は本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、lncRNAまたはmRNAを、例として分解のために、標的にしてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、例として分解のために、ミスマッチ修復経路に関与するタンパク質をコードする核酸、例として、MSH2、MutLアルファ、MutSベータ、MutLアルファを標的にしてもよい。ミスマッチ修復経路に関与するタンパク質(かかるタンパク質をコードするmRNAは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドによって標的にされてもよい)の非限定例は、Iyer,R.R.et al.,「DNA triplet repeat expansion and mismatch repair」Annu Rev Biochem.2015;84:199-226;およびSchmidt M.H.and Pearson C.E.,「Disease-associated repeat instability and mismatch repair」DNA Repair(Amst).2016 Feb;38:117-26に記載される。
a.オリゴヌクレオチドサイズ/配列
オリゴヌクレオチドは、例としてフォーマットに応じて、様々な異なる長さのものであってもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチドであるか、またはこれより長い。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～50ヌクレオチド、長さが8～40ヌクレオチド、長さが8～30ヌクレオチド、長さが10～15ヌクレオチド、長さが10～20ヌクレオチド、長さが15～25ヌクレオチド、長さが21～23ヌクレオチド等々である。
いくつかの態様において、本開示の目的上オリゴヌクレオチドの相補的な核酸配列は、前記配列の標的分子(例として、mRNA)への結合が標的(例として、mRNA)の正常な機能に干渉して活性の喪失(例として、翻訳の阻害)または発現の喪失(例として、標的mRNAの分解)を引き起こしたとき、かつ非特異的結合の回避が所望される条件下、例として、in vivoアッセイまたは治療処置のケースおよびin vitroアッセイのケースにおける生理学的な条件下、アッセイがストリンジェンシー(stringency)の好適な条件下で実施される条件下で、前記配列の非標的配列への非特異的結合を回避するのに充分な程度の相補性があるとき、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的である。よって、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の連続したヌクレオチドに少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％相補的であってもよい。いくつかの態様において、相補的なヌクレオチド配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能であるか、または標的核酸に特異的であるその標的の配列に100％相補的である必要はない。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、長さが8～15、8～30、8～40、または10～50、または5～50、または5～40ヌクレオチドの範囲にある標的核酸と相補性のある領域を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの、標的核酸と相補性のある領域は、長さが5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50ヌクレオチドである。いくつかの態様において、相補性のある領域は、標的核酸の少なくとも連続した8ヌクレオチドと相補的である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の一部の連続したヌクレオチドと比較して1、2または3塩基ミスマッチを含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、15塩基にわたり最大3ミスマッチまで、または10塩基にわたり最大2ミスマッチまで有していてもよい。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つの標的配列に対して相補的である(例として、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または100％)。いくつかの態様において、かかる標的配列は本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドに対して100％相補的である。
いくつかの態様では、C5位での核酸塩基ウラシルのメチル化がチミンを形成することを理解されるべきである。したがって、いくつかの態様では、C5メチル化ウラシル(または5-メチル-ウラシル)を有するヌクレオチドまたはヌクレオシドは、チミンヌクレオチドまたはヌクレオシドとして同等に同定されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つのチミン塩基(T's)のいずれか1つ以上は、独立しておよび任意に、ウラシル塩基(U's)であってもよく、および/または本明細書中に提供されるオリゴヌクレオチド中のUのいずれか1つ以上は、独立しておよび任意に、T'sであってもよい。
b.オリゴヌクレオチド修飾:
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよく、例として、修飾された糖部、修飾されたヌクレオシド間連結、修飾ヌクレオチド、および/またはそれらの組み合わせを含む。加えて、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の特性の1以上を呈してもよい:選択的スプライシングを媒介しない;免疫刺激性ではない;ヌクレアーゼ抵抗性である;非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された細胞取り込みを有する;細胞または哺乳動物への毒性がない;改善されたエンドソームの内部への出口(exit)を細胞中に有する;TLR刺激を最小限に抑える;または、パターン認識受容体を回避する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの修飾された化学的性質またはフォーマットのいずれも、互いに組み合わせられ得る。例えば、1、2、3、4、5、またはこれより多くの異なるタイプの修飾が、同じオリゴヌクレオチド内に包含され得る。
いくつかの態様において、修飾が組み込まれるオリゴヌクレオチドを、ネイティブなオリゴデオキシヌクレオチド分子またはオリゴリボヌクレオチド分子よりヌクレアーゼ消化に耐性があるようにさせる、特定のヌクレオチド修飾が使用されてもよい;これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドより長時間無傷で存続する。修飾されたオリゴヌクレオチドの特定例は、修飾された主鎖、例えば、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または短鎖ヘテロ原子のもしくは複素環式の糖間連結などの修飾されたヌクレオシド間連結を含むものを包含する。結果的に、本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾、例として、ヌクレオチド修飾の組み込み等による核酸分解に対して安定化され得る。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30、2～40、2～45ヌクレオチド、またはこれより多いヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが最大50ヌクレオチドまでまたは最大100ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～10、2～15、2～16、2～17、2～18、2～19、2～20、2～25、2～30ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの2～4、2～5、2～6、2～7、2～8、2～9、2～10、2～11、2～12、2～13、2～14ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、長さが8～15ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであってもよい。任意に、オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを除き、どのヌクレオチドも修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチド修飾は本明細書にさらに記載されている。
c.修飾ヌクレオチド
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2'-修飾ヌクレオチド、例として、2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、または2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)を包含する。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの2'-O-メチル修飾ヌクレオチドを包含し得、いくつかの態様において、すべてのヌクレオチドは、2'-O-メチル修飾を包含する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、リボース環が環内の2個の原子を接続する、例として、2'-O原子を4'-C原子に接続する架橋部分を含む修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、「ロックされている」、例として、リボース環が2'-O原子と4'-C原子とを接続するメチレン架橋によって「ロックされている」修飾ヌクレオチドを含む。LNAの例は、2008年4月17日に公開され「RNA Antagonist Compounds For The Modulation Of PCSK9」と題する国際特許出願公開WO/2008/043753(この内容は、その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されている。
本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドに使用されてもよい他の修飾は、エチレン架橋核酸(ENA)を包含する。ENAは、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸を包含するが、これらに限定されない。ENAの例は、2005年5月12日に公開され「APP/ENA Antisense」と題する国際特許公開番号WO 2005/042777;Morita et al.,Nucleic Acid Res.,Suppl 1:241-242,2001;Surono et al.,Hum.Gene Ther.,15:749-757,2004;Koizumi,Curr.Opin.Mol.Ther.,8:144-149,2006;およびHorie et al.,Nucleic Acids Symp.Ser(Oxf),49:171-172,2005に提供されており、これらの開示はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸(LNA)ヌクレオチド、拘束性エチル(cEt)ヌクレオチド、またはエチレン架橋核酸(ENA)ヌクレオチドなどの架橋ヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、以下の米国特許または特許出願公開うち1つに開示された修飾ヌクレオチドを含む:米国特許7,399,845、2008年7月15日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,741,457、2010年6月22日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許8,022,193、2011年9月20日発行、表題「6-Modified Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,569,686、2009年8月4日発行、表題「Compounds And Methods For Synthesis Of Bicyclic Nucleic Acid Analogs」;米国特許7,335,765、2008年2月26日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,314,923、2008年1月1日発行、表題「Novel Nucleoside And Oligonucleotide Analogues」;米国特許7,816,333、2010年10月19日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」および米国公開第2011/0009471号、現在米国特許8,957,201、2015年2月17日発行、表題「Oligonucleotide Analogues And Methods Utilizing The Same」、すべての用途において(for all purposes)、これら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、糖の2'位で修飾された少なくとも1つのヌクレオチド、好ましくは2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-O-アルキルまたは2'-フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい態様では、RNA修飾は、ピリミジンのリボース、RNAの3'末端の脱塩基残基または逆性塩基に対する2'-フルオロ、2'-アミノおよび2'O-メチル修飾を包含する。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の修飾ヌクレオチドも有さないオリゴヌクレオチドと比較して、1℃、2℃、3℃、4℃、または5℃の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを有してもよい。オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、合計で2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、またはこれを超える温度の範囲にあるオリゴヌクレオチドのTmの増大をもたらす複数の修飾ヌクレオチドを有していてもよい。
オリゴヌクレオチドは、異なる種類の交互のヌクレオチドを含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、交互のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび2'-フルオロ-デオキシリボヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、交互のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび2'-O-メチルヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、交互の2'-フルオロヌクレオチドおよび2'-O-メチルヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、交互の架橋ヌクレオチドおよび2'-フルオロまたは2'-O-メチルヌクレオチドを含んでもよい。
d.ヌクレオシド間連結/主鎖
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートまたは他の修飾ヌクレオチド間連結を含有していてもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、少なくとも2個のヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結を、すべてのヌクレオチド間に含む。例えば、いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド間連結を、ヌクレオチド配列の5'または3'末端の、第1の、第2の、および/または第3のヌクレオシド間連結にて含む。
使用されてもよい、リンを含有する連結は、これらに限定されないが、正常な3'-5'連結、これらの2'-5'連結類似体を有する、ホスホロチオアート、キラルのホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホナート(3'アルキレンホスホナートおよびキラルのホスホナートを含む)、ホスフィナート、ホスホロアミダート(3'-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含む)、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスファートと、逆方向の極性を有するこれら(ここでヌクレオシド単位の隣接する対は3'-5'から5'-3'へまたは2'-5'から5'-2'へ連結されている)とを包含する;米国特許第3,687,808号;第4,469,863号;第4,476,301号;第5,023,243号;第5,177,196号;第5,188,897号;第5,264,423号;第5,276,019号;第5,278,302号;第5,286,717号;第5,321,131号;第5,399,676号;第5,405,939号;第5,453,496号;第5,455,233号;第5,466,677号;第5,476,925号;第5,519,126号;第5,536,821号;第5,541,306号;第5,550,111号;第5,563,253号;第5,571,799号;第5,587,361号;および第5,625,050号を見よ。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、メチレン(メチルイミノ)またはMMI主鎖;アミド主鎖(De Mesmaeker et al.Ace.Chem.Res.1995,28:366-374を見よ);モルホリノ主鎖(SummertonおよびWeller、米国特許第5,034,506号を見よ);またはペプチド核酸(PNA)主鎖(ここでオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖に置き換えられており、ヌクレオチドがポリアミド主鎖のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている、Nielsen et al.,Science 1991,254,1497を見よ)などのヘテロ原子主鎖を有していてもよい。
e.立体特異的オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間のリン原子はキラルであり、およびオリゴヌクレオチドの特性はキラルのリン原子の立体配置に基づき調整される。いくつかの態様において、適切な方法は、立体制御されたやり方(例として、Oka N,Wada T,Stereocontrolled synthesis of oligonucleotide analogs containing chiral internucleotidic phosphorus atoms.Chem Soc Rev.2011 Dec;40(12):5829-43に記載のとおりの)でP-キラルオリゴヌクレオチド類似体を合成するために使用されてもよい。いくつかの態様において、実質的にすべてのSpホスホロチオアート糖間連結または実質的にすべてのRpホスホロチオアート糖間連結のいずれかによって一緒に結び合わされたヌクレオシド単位を含む、ホスホロチオアート含有オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、実質的にキラル純粋な糖間連結を有するかかるホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、例えば、1996年12月12日に発行された米国特許5,587,261(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり、酵素合成または化学合成によって調製される。いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸の選択的切断パターンを提供する。例えば、いくつかの態様において、キラル制御されたオリゴヌクレオチドは、例えば、2017年2月2日に公開された表題「CHIRAL DESIGN」の米国特許出願公開20170037399 A1(この内容は全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる)に記載のとおり、核酸の相補的な配列内に単一の切断部位を提供する。
f.モルホリノ
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、モルホリノをベースとした化合物であってもよい。モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、Dwaine A.Braasch and David R.Corey,Biochemistry,2002,41(14),4503-4510);Genesis,volume 30,issue 3,2001;Heasman,J.,Dev.Biol.,2002,243,209-214;Nasevicius et al.,Nat.Genet.,2000,26,216-220;Lacerra et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,2000,97,9591-9596;および1991年7月23日発行の米国特許第5,034,506号に記載されている。いくつかの態様において、モルホリノをベースとしたオリゴマー化合物は、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である(例として、Iverson,Curr.Opin.Mol.Ther.,3:235-238,2001;およびWang et al.,J.Gene Med.,12:354-364,2010に記載のとおり;これらの開示はこれら全体が参照により本明細書に組み込まれる)。
g.ペプチド核酸(PNA)
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連結(主鎖)との両方とも、新規な基に置き換えられている。いくつかの態様において、塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。かかるオリゴマー化合物の1つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物中のオリゴヌクレオチドの糖-主鎖は、アミド含有主鎖、例えば、アミノエチルグリシン主鎖に置き換えられている。核酸塩基は保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子へ直接的または間接的に結合されている。PNA化合物の調製を報告する代表的な刊行物は、これらに限定されないが、米国特許第5,539,082号;第5,714,331号;および第5,719,262号(これら各々は参照により本明細書に組み込まれる)を包含する。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500から見出され得る。
h. gapmer
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはgapmerである。gapmerオリゴヌクレオチドは、一般に、ギャップ領域Yの周りのフランキング領域としてXおよびZを有する式5'-X-Y-Z-3'を有する。いくつかの態様では、Y領域は、RNAse HなどのRNAseを動員することができる連続したヌクレオチドのストレッチ、例として、少なくとも6個のDNAヌクレオチドの領域である。いくつかの態様では、gapmerは標的核酸に結合し、その時点でRNAseが動員され、次いで標的核酸を切断し得る。いくつかの態様において、Y領域は、高親和性修飾ヌクレオチド、例として、1～6個の修飾ヌクレオチドを含む領域XおよびZによって5'および3'の両方に挟まれている。修飾ヌクレオチドの例は、2'MOEもしくは2'OMeまたはロックド核酸塩基(LNA)を包含するが、これらに限定されない。フランキング配列XおよびZは、いくつかの態様では、1～20ヌクレオチド、1～8ヌクレオチドまたは1～5ヌクレオチド長であってもよい。フランキング配列XおよびZは類似の長さまたは非類似の長さであり得る。ギャップセグメントYは、いくつかの態様では、長さが5～20ヌクレオチド、サイズが12ヌクレオチドまたは6～10ヌクレオチドのヌクレオチド配列であってもよい。
いくつかの態様において、gapmerオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、DNAヌクレオチドに加えて、効率的なRNase H作用にとって許容されることが知られている修飾ヌクレオチド、例えばC4'置換ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、およびアラビノ型ヌクレオチドを含有し得る。いくつかの態様において、ギャップ領域は1以上の未修飾のヌクレオシド間を含む。いくつかの態様において、一方または両方のフランキング領域は、各々独立して、1以上のホスホロチオアートヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。いくつかの態様において、ギャップ領域および2つのフランキング領域は、各々が独立して、修飾されたヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、またはより多くのヌクレオチド間に含む。
gapmerは適切な方法を使用して生じ得る。gapmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許公開公報、およびPCT公開公報は、米国特許第5,013,830号、第5,149,797号、第5,220,007号、第5,256,775号、第5,366,878号、第5,403,711号、第5,491,133号、第5,565,350号、第5,623,065号、第5,652,355号、第5,652,356号、第5,700,922号、第5,898,031号、第7,432,250号、および第7,683,036号、米国特許公開第20090286969号、米国特許第20100197762号、および第20110112170号、およびPCT公開第WO2008049085およびWO2009090182を包含するが、これらに限定されず、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
i. mixmer
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、mixmerであってもよく、またはmixmer配列パターンを含んでいてもよい。一般に、mixmerは、天然に存在するヌクレオシドと天然に存在しないヌクレオシチドとの両方を含むオリゴヌクレオチドであるか、または2つの異なるタイプの天然に存在しないヌクレオチドを、典型的には互い違いなパターンで含むオリゴヌクレオチドである。Mixmerは一般に、非修飾オリゴヌクレオチドより高い結合親和性を有し、標的分子に特異的に結合する、例として、標的分子上の結合部位を遮断するために使用されてもよい。一般に、mixmerは、RNAseを標的分子へ動員させず、よって標的分子の切断を促進しない。RNAse Hを動員することが可能ではない、かかるオリゴヌクレオチドは記載されており、例えば、WO2007/112754またはWO2007/112753を見よ。
いくつかの態様において、mixmerは、ヌクレオチド類似体と天然に存在するヌクレオチドとの反復パターン、もしくは1タイプのヌクレオチド類似体ともう1タイプのヌクレオチド類似体との反復パターンを含むか、またはこれらからなる。しかしながら、mixmerは、反復パターンを含む必要がなく、その代わりに、修飾ヌクレオチドと天然に存在するヌクレオチドとのいずれの配置も、または1タイプの修飾ヌクレオチドともう1タイプの修飾ヌクレオチドとのいずれの配置も含むことができる。反復パターンは、実例として、2ヌクレオチド毎または3ヌクレオチド毎に、LNAなどの修飾ヌクレオシドであってもよく、残りのヌクレオチドは、DNAなどの天然に存在するヌクレオチドであるか、あるいは2'MOEもしくは2'フルオロ類似体などの2'置換ヌクレオチド類似体、または本明細書に記載のいずれかの他の修飾ヌクレオチドである。LNA単位などの修飾ヌクレオチドの反復パターンが、固定された位置にて-例として5'末端または3'末端にて、修飾ヌクレオチドと組み合わせされてもよいことは認識されている。
いくつかの態様において、mixmerは、5個より多く、4個より多く、3個より多く、または2個より多く連続した、DNAヌクレオチドなどの天然に存在するヌクレオチドの領域を含まない。いくつかの態様において、mixmerは、少なくとも2個連続したLNAなどの、少なくとも2個連続した修飾ヌクレオチドからなる領域を少なくとも含む。いくつかの態様において、mixmerは、少なくとも3個連続したLNAなどの、少なくとも3個連続した修飾ヌクレオチドからなる領域を少なくとも含む。
いくつかの態様において、mixmerは、7個より多く、6個より多く、5個より多く、4個より多く、3個より多く、または2個より多く連続した、LNAなどのヌクレオチド類似体の領域を含まない。いくつかの態様において、LNA単位は、本明細書に言及されたヌクレオシド類似体などの他のヌクレオチド類似体に置き換えられていてもよい。
mixmerは、非限定例におけるLNAヌクレオチドおよび2'-O-メチルヌクレオチドなどの親和性増強修飾ヌクレオチドの混合物を含むよう設計されていてもよい。いくつかの態様において、mixmerは、修飾ヌクレオシド間連結(例として、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結または他の連結)を、少なくとも2個の、少なくとも3個の、少なくとも4個の、少なくとも5個の、またはこれより多くのヌクレオチド間に含む。
mixmerは、いずれの好適な方法を使用しても産生されてよい。mixmerの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許公開、およびPCT公開は、米国特許公開第US20060128646号、US20090209748号、US20090298916号、US20110077288号、およびUS20120322851号、および米国特許第7687617号を包含する。
いくつかの態様において、mixmerは、1以上のモルホリノヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの態様において、mixmerは、1以上の他のヌクレオチド(例として、DNA、RNAヌクレオチド)または修飾ヌクレオチド(例として、LNA、2'-O-メチルヌクレオチド)と(例として、互い違いなやり方で)混合されたモルホリノヌクレオチドを含んでいてもよい。
いくつかの態様において、mixmerは、例えば、Touznik A.,et al.,LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts Scientific Reports,volume 7,Article number:3672(2017),Chen S.et al.,Synthesis of a Morpholino Nucleic Acid(MNA)-Uridine Phosphoramidite,and Exon Skipping Using MNA/2'-O-Methyl Mixmer Antisense Oligonucleotide,Molecules 2016,21,1582(これら各々の内容は参照により本明細書に組み込まれる)に報告されるとおり、スプライス修正(splice correcting)またはエキソンスキッピングに有用である。
j. RNA干渉(RNAi)
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、低分子干渉RNAまたはサイレンシングRNAとしても知られている、低分子干渉RNA(siRNA)の形態であってもよい。siRNAは、二本鎖RNA分子の類であって、細胞中のRNA干渉(RNAi)経路を介した分解のために核酸(例として、mRNA)を標的にする、典型的には長さが約20～25塩基対である。siRNA分子の特異性は、アンチセンス鎖分子のその標的RNAへの結合によって決定されてもよい。有効なsiRNA分子は一般に、より長いsiRNAもまた有効であり得るが、細胞中の非特異的なRNA干渉経路の引き金を、インターフェロン応答を介して引くことを防止するため、長さが30～35個未満の塩基対である。
適切な標的RNA配列の選択を受けて、すべてのまたは一部の標的配列に相補的なヌクレオチド配列、すなわちアンチセンス配列を含むsiRNA分子は、適切な方法(例として、PCT公開番号WO2004/016735;および米国特許公開第2004/0077574号および第2008/0081791号を見よ)を使用して設計および調製され得る。
siRNA分子は、二本鎖(すなわち、アンチセンス鎖と、相補的センス鎖とを含むdsRNA分子)または一本鎖(すなわち、アンチセンス鎖だけを含むssRNA分子)であり得る。siRNA分子は、自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピン、または非対称ヘアピン2次構造を含み得る。
二本鎖siRNAは、同じ長さまたは異なる長さのRNA鎖を含んでもよい。二本鎖siRNA分子はまた、ステムループ構造の単一オリゴヌクレオチド(ここでsiRNA分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースのまたは非核酸ベースのリンカー(単数または複数)を用いて連結されている)、ならびに2以上のループ構造と自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を含むステムとを有する環状一本鎖RNA(ここで環状RNAは、in vivoまたはin vitroのいずれかで処理されてRNAiを媒介することが可能な活性siRNA分子を生成し得る)からも会合され得る。よって小さいヘアピンRNA(shRNA)分子もまた、本明細書に企図される。これらの分子は、逆相補的(センス)配列に加えて、特定のアンチセンス配列を含み、典型的にはスペーサーまたはループ配列によって分離されている。スペーサーまたはループの切断は、(任意に、片鎖または両鎖の3'末端および/または5'末端から1、2、3個以上のヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともある追加のプロセシングステップにより)一本鎖RNA分子およびその逆相補体を、それらがアニールしてdsRNA分子を形成し得るように提供する。スペーサーは、スペーサーの切断(および任意に、これに続く、片鎖または両鎖の3'末端および/または5'末端から1、2、3、4、もしくはこれより多いヌクレオチドの付加または除去をもたらすこともあるプロセシングステップ)に先立ちアンチセンス配列とセンス配列とをアニールさせて二本鎖構造体(またはステム)を形成させるのに充分な長さであり得る。スペーサー配列は、2つの相補的ヌクレオチド配列領域間に置かれた無関係なヌクレオチド配列であってもよく、領域はアニールして二本鎖核酸になったらshRNAを含むことになる。
siRNA分子の全体的な長さは、設計されたsiRNA分子のタイプに応じて、約14ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。一般に、これらのヌクレオチドの約14個と約50個との間は、RNA標的配列に相補的である、すなわちsiRNA分子の特定のアンチセンス配列を構成する。例えば、siRNAが二本鎖siRNAまたは一本鎖siRNAであるとき、長さは約14ヌクレオチドから約50ヌクレオチドまで変動し得るが一方、siRNAがshRNAまたは環状分子であるとき、長さは約40ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで変動し得る。
siRNA分子は、分子の一方の末端にて3'突出を含んでいてもよく、他方の末端は平滑末端であっても、または突出(5'または3')も有していてよい。siRNA分子が分子の両末端にて突出を含むとき、突出の長さは、同じであっても、または異なっていてもよい。一態様において、本開示のsiRNA分子は、分子の両末端上に約1～約3ヌクレオチドの3'突出を含む。
k. microRNA(miRNA)
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、マイクロRNA(miRNA)であってもよい。マイクロRNA(「miRNA」と称される)は、標的RNA転写産物上の相補的な部位へ結合することによって遺伝子発現を制御する調節性分子の類に属する、小さい非コーディングRNAである。典型的には、miRNAは、巨大なRNA前駆体(pri-miRNAと呼ばれる)から生成されるが、前記前駆体は核中で処理されておよそ70ヌクレオチドpre-miRNAになり、これが折り畳まれて不完全なステムループ構造体になる。これらのpre-miRNAは、典型的には、細胞質内で追加のプロセシングステップを経るが、前記細胞質内の長さが18～25ヌクレオチドの成熟miRNAは、RNase III酵素であるDicerによってpre-miRNAヘアピンの片側から切除される。
本明細書に使用されるとき、miRNAは、pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、または成熟miRNAの生物活性を保持するそのバリアントのフラグメントを包含する。一態様では、miRNAのサイズ範囲は、21ヌクレオチド～170ヌクレオチドであり得る。一態様において、miRNAのサイズ範囲は、長さが70ヌクレオチドから170ヌクレオチドまでである。別の態様において、長さが21ヌクレオチドから25ヌクレオチドまでの成熟miRNAが使用され得る。
l.アプタマー
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、アプタマーの形態であってもよい。一般に、分子ペイロードの文脈において、アプタマーは、細胞中の小分子、タンパク質、核酸などの標的へ特異的に結合するあらゆる核酸である。いくつかの態様において、アプタマーは、DNAアプタマーまたはRNAアプタマーである。いくつかの態様において、核酸アプタマーは、一本鎖のDNAまたはRNA(ssDNAまたはssRNA)である。一本鎖核酸アプタマーが、ヘリックスおよび/またはループ構造を形成してもよいことは理解されるべきである。核酸アプタマーを形成する核酸は、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、炭化水素リンカー(例として、アルキレン)もしくはポリエーテルリンカー(例として、PEGリンカー)が1以上のヌクレオチド間に挿入された天然に存在するヌクレオチド、炭化水素もしくはPEGリンカーが1以上のヌクレオチド間に挿入された修飾ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。アプタマーおよびアプタマーを産生する方法を記載する例示の刊行物および特許は、例として、Lorsch and Szostak,1996;Jayasena,1999;米国特許第5,270,163号;第5,567,588号;第5,650,275号;第5,670,637号;第5,683,867号;第5,696,249号;第5,789,157号;第5,843,653号;第5,864,026号;第5,989,823号;第6,569,630号;第8,318,438号およびPCT出願WO 99/31275を包含するが、これら各々は参照により本明細書に組み込まれる。
m.リボザイム
いくつかの態様において、本明細書に提供されるオリゴヌクレオチドは、リボザイムの形態であってもよい。リボザイム(リボ核酸酵素)は、タンパク質酵素の作用と同様の特定の生化学的反応を実施することが可能な分子、典型的にはRNA分子である。リボザイムは、これらがハイブリダイズしているRNA分子(mRNA、RNA含有基質、lncRNA、およびリボザイム自体など)中の特定のホスホジエステル連結での切断能を包含する酵素活性をもつ分子である。
リボザイムは、数種の物理的構造の1つを取り得、これらの1つが「ハンマーヘッド」と呼ばれる。ハンマーヘッド型リボザイムは、保存された9塩基を含有する触媒コア、二本鎖ステムおよびループ構造(ステムループII)、ならびに触媒コアを囲む標的RNAフランキング領域に相補的な2つの領域から構成される。フランキング領域は、二本鎖ステムIおよびIIIを形成することによって、リボザイムが標的RNAに特異的に結合することを可能にする。切断は、3',5'-リン酸ジエステルから2',3'-環状リン酸ジエステルへのエステル交換反応による特定のリボヌクレオチド三塩基(triplet)の次に、cis(すなわち、ハンマーヘッドモチーフを含有する同じRNA分子の切断)で、またはtrans(リボザイムを含有するもの以外のRNA基質の切断)で生じる。理論によって拘束されることは望まないが、この触媒活性は、リボザイムの触媒領域中に高度に保存された特定の配列が存在することを要すると考えられている。
リボザイム構造中の修飾はまた、様々な分子の非コア部分の、非ヌクレオチド分子との置換または置き換えも包含する。例えば、Benseler et al.(J.Am.Chem.Soc.(1993)115:8483-8484)は、ハンマーヘッド様分子を開示しており、ここでステムIIの2塩基対およびループIIの4ヌクレオチドすべてが、ヘキサエチレングリコール、プロパンジオール、ビス(トリエチレングリコール)ホスファート、トリス(プロパンジオール)ビスホスファート、またはビス(プロパンジオール)ホスファートを基にする非ヌクレオシドリンカーに置き換えられていた。Ma et al.(Biochem.(1993)32:1751-1758;Nucleic Acids Res.(1993)21:2585-2589)は、TARリボザイムヘアピンの6ヌクレオチドループを、エチレングリコールに関する非ヌクレオチドリンカーに置き換えた。Thomson et al.(Nucleic Acids Res.(1993)21:5600-5603)は、ループIIを、長さが13、17、および19原子の線状の非ヌクレオチドリンカーに置き換えた。
リボザイムオリゴヌクレオチドは、周知の方法(例として、PCT公開WO9118624;WO9413688;WO9201806;およびWO92/07065;ならびに米国特許5436143および5650502を見よ)を使用して調製され得るか、または商業的供給源(例として、US Biochemicals)から購入され得、所望の場合、細胞中ヌクレアーゼによる分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性を増大させるためにヌクレオチド類似体を組み込み得る。リボザイムは、例として、市販の合成機(例として、Applied Biosystems,Inc.またはMilligenによって製造された)の使用による、任意の知られているやり方で合成されてもよい。リボザイムはまた、従来の手段によって、組換えベクターにおいても産生されてよい。Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(Current edition)を見よ。リボザイムRNA配列は、例えば、T7またはSP6などのRNAポリメラーゼを使用することによる従来法で、合成されてもよい。
n.ガイド核酸
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ガイド核酸、例として、ガイドRNA(gRNA)分子である。一般に、ガイドRNAは、(1)Cas9などの、核酸をプログラムできるDNA結合タンパク質(napDNAbp)へ結合する骨格(scaffold)配列、および(2)gRNAが、核酸をプログラムできるDNA結合タンパク質をDNA標的配列に近づけるために結合するDNA標的配列(例として、ゲノムDNA標的)を定義するヌクレオチドスペーサー部分から構成される低分子合成RNAである。いくつかの態様において、napDNAbpは、核酸をプログラムできるタンパク質に、標的DNA配列(例として、標的ゲノムDNA配列)を標的にさせる1以上のRNA(単数または複数)と(例として、これと結合して、またはこれと結び付いて)複合体を形成する、核酸をプログラムできるタンパク質である。いくつかの態様において、核酸プログラム可能なヌクレアーゼは、RNAとの複合体にあるとき、ヌクレアーゼ:RNA複合体と称されることもある。ガイドRNAは、2以上のRNAの複合体として、または単一のRNA分子として存在し得る。
単一のRNA分子として存在するガイドRNA(gRNA)は、単一のガイドRNA(sgRNA)と称されることもあるが、gRNAはまた、単一分子または2以上の分子の複合体のいずれかとして存在するガイドRNAを指すためにも使用される。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは、2つのドメインを含む:(1)標的核酸(すなわち、Cas9複合体の標的への結合に向かわせる)との相同性を共有するドメイン;および(2)Cas9タンパク質に結合するドメイン。いくつかの態様において、ドメイン(2)は、tracrRNAとして知られている配列に対応し、ステムループ構造を含む。いくつかの態様において、ドメイン(2)は、Jinek et al.,Science 337:816-821(2012)(この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる)に提供されるとおり、tracrRNAと同一または相同である。
いくつかの態様において、gRNAは、ドメイン(1)および(2)の2以上を含み、伸長(extended)gRNAと称されることもある。例えば、伸長gRNAは、本明細書に記載のとおり、2以上のCas9タンパク質に結合し、および2以上の別個の領域での標的核酸に結合するであろう。gRNAは、ヌクレアーゼ/RNA複合体の該標的部位への結合を媒介する標的部位に相補的なヌクレオチド配列を含み、ヌクレアーゼ:RNA複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、RNAプログラム可能ヌクレアーゼは、(CRISPR関連系)Cas9エンドヌクレアーゼ、例えば、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)由来のCas9(Csn1)である(例として、「Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes」Ferretti,J.J.,McShan W.M.,Ajdic D.J.,Savic D.J.,Savic G.,Lyon K.,Primeaux C.,Sezate S.,Suvorov A.N.,Kenton S.,Lai H.S.,Lin S.P.,Qian Y.,Jia H.G.,Najar F.Z.,Ren Q.,Zhu H.,Song L.,White J.,Yuan X.,Clifton S.W.,Roe B.A.,McLaughlin R.E.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:4658-4663(2001);「CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III」Deltcheva E.,Chylinski K.,Sharma C.M.,Gonzales K.,Chao Y.,Pirzada Z.A.,Eckert M.R.,Vogel J.,Charpentier E.,Nature 471:602-607(2011);および「A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity」Jinek M.,Chylinski K.,Fonfara I.,Hauer M.,Doudna J.A.,Charpentier E.Science 337:816-821(2012)を見よ。これらの各々の内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
o.スプライス変更オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチド(例として、モルホリノを包含するアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、スプライシングを標的にする。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、エキソンスキッピングを誘導することおよび遺伝子内の読み取りフレームを修復することによって、スプライシングを標的にする。非限定例として、オリゴヌクレオチドは、フレームシフト突然変異をコードするエキソンおよび/または未熟終止コドンをコードするエキソンのスキッピングを誘導してもよい。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、スプライス部位のスプライソソーム認識をブロッキングすることにより、エキソンスキッピングを誘導してもよい。いくつかの態様において、エキソンスキッピングは、参照タンパク質と比べて、トランケートされたが機能的なタンパク質(例として、以下に記載された、トランケートされたが機能的なDMDタンパク質)をもたらす。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、特定のエキソン(例として、以下に記載された、SMN2遺伝子のエキソン7)の封入を促進する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、スプライス部位阻害配列を標的にすることによって、エキソンの封入を誘導してもよい。RNAスプライシングは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)および脊髄性筋萎縮症(SMA)を包含する筋疾患に関与してきた。
ジストロフィン(DMD)をコードする遺伝子における変更(例として、欠失、点突然変異、および複製)は、DMDを引き起こす。これらの変更は、フレームシフト突然変異および/またはナンセンス突然変異へ繋がり得る。いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、1以上のDMDエキソン(例として、エキソン8、エキソン43、エキソン44、エキソン45、エキソン50、エキソン51、エキソン52、エキソン53、および/またはエキソン55)のスキッピングを促進し、機能的なトランケートされたタンパク質をもたらす。例として、2013年7月16日に公開された米国特許第8,486,907号および2014年9月18日に公開されたU.S.20140275212を見よ。
SMAにおいて、機能的SMN1の喪失がある。SMN2遺伝子はSMN1に対するパラログであるが、SMN2遺伝子の選択的スプライシングは、主としてエキソン7のスキッピング、およびこれに続くSMN1喪失について補償し得ないトランケートされたSMNタンパク質の産生へ繋がる。いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチドは、SMN2エキソン7の封入を促進する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、SMN2スプライス部位阻害配列を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである(例として、2010年11月23日に公開された米国特許第7,838,657号を見よ)。
p.マルチマー
いくつかの態様において、分子ペイロードは、リンカーによって接続された2以上のオリゴヌクレオチドのマルチマー(例として、コンカテマー)を含んでいてもよい。このように、いくつかの態様において、複合体/抱合体のオリゴヌクレオチドの負荷(loading)は、標的化剤上の利用可能な連結部位(例として、抗体上の利用可能なチオール部位)を超えて増大され得るか、または具体的なペイロード負荷量に達するよう別様に整え得る。マルチマー中のオリゴヌクレオチドは、同じかまたは異なり得る(例として、異なる遺伝子、もしくは同じ遺伝子上の異なる部位、またはそれらの産物を標的にする)。
いくつかの態様において、マルチマーは、切断可能なリンカーによって一緒に連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。しかしながら、いくつかの態様において、マルチマーは、切断不能なリンカーによって一緒に連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、一緒に連結された2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはこれより多くのオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、一緒に連結された2～5、2～10、または4～20オリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの態様において、マルチマーは、(線状配置において)末端間(end-to-end)で連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、オリゴヌクレオチドベースのリンカー(例として、ポリ-dTリンカー、塩基性リンカー)を介して、末端間で連結された2以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、マルチマーは、別のオリゴヌクレオチドの3'末端に連結された1つのオリゴヌクレオチドの5'末端を含む。いくつかの態様において、マルチマーは、別のオリゴヌクレオチドの3'末端に連結された1つのオリゴヌクレオチドの3'末端を含む。いくつかの態様において、マルチマーは、別のオリゴヌクレオチドの5'末端に連結された1つのオリゴヌクレオチドの5'末端を含む。またさらに、いくつかの態様において、マルチマーは、分枝リンカーによって一緒に連結された複数のオリゴヌクレオチドを含む分枝構造を含み得る。
本明細書に提供される複合体に使用されてもよいマルチマーのさらなる例は、例えば、2015年11月5日に公開され、Methods of delivering multiple targeting oligonucleotides to a cell using cleavable linkersと題する米国特許出願第2015/0315588 A1号;2015年9月3日に公開され、Multimeric Oligonucleotide Compoundsと題する米国特許出願第2015/0247141 A1号;2011年6月30日に公開され、Immunostimulatory Oligonucleotide Multimersと題する米国特許出願第US 2011/0158937 A1号;および1997年12月2日に発行され、Triplex-Forming Antisense Oligonucleotides Having Abasic Linkers Targeting Nucleic Acids Comprising Mixed Sequences Of Purines And Pyrimidinesと題する米国特許第5,693,773号に開示されており、これら各々の内容はそれら全体が参照されることにより本明細書に組み込まれる。
C.リンカー
本明細書に記載の複合体は、一般に、本明細書に記載の筋標的剤(例として、抗TfR抗体)のいずれか1つを分子ペイロードに接続するリンカーを含む。リンカーは、少なくとも1つの共有結合を含む。いくつかの態様では、リンカーは、筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)を分子ペイロードに接続する単結合、例としてジスルフィド結合またはジスルフィド架橋であってもよい。しかし、いくつかの態様では、リンカーは、本明細書に記載の筋標的剤(例として、抗TfR抗体)のいずれか1つを複数の共有結合を介して分子に接続してもよい。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであってもよい。しかしながら、いくつかの態様において、リンカーは、切断不能なリンカーであってもよい。リンカーは一般に、in vitroおよびin vivoで安定しており、ある細胞環境において安定していてもよい。加えて、一般にリンカーは、抗TfR抗体または分子ペイロードのあらゆる機能特性に負の影響を及ぼさない。リンカーの合成の例および方法は、当技術分野で公知である(例として、Kline,T.et al.「Methods to Make Homogenous Antibody Drug Conjugates」Pharmaceutical Research,2015,32:11,3480-3493.;Jain,N.et al.「Current ADC Linker Chemistry」Pharm Res.2015,32:11,3526-3540.;McCombs,J.R.and Owen,S.C.「Antibody Drug Conjugates:Design and Selection of Linker,Payload and Conjugation Chemistry」AAPS J.2015,17:2,339-351を見よ)。
リンカーの前駆体は、典型的には、抗TfR抗体と分子ペイロードとの両方へ付着できる2つの異なる反応性の高い種を含有しているであろう。いくつかの態様において、2つの異なる反応性の高い種は、求核試薬および/または(例として、および)求電子試薬であってもよい。いくつかの態様では、リンカーは、抗TfR抗体のリジン残基またはシステイン残基への抱合を介して筋標的化剤(例として、抗TfR抗体)に接続される。いくつかの態様では、リンカーは、マレイミド含有リンカーを介して筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)のシステイン残基に接続され、任意選択で、マレイミド含有リンカーは、マレイミドカプロイルまたはマレイミドメチルシクロヘキサン-1-カルボキシレート基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、3-アリールプロピオニトリル官能基を介して、筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)またはチオール官能化分子ペイロードのシステイン残基に接続される。いくつかの態様では、リンカーは、筋肉標的剤(例として、抗TfR抗体)のリジン残基に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、カルバメート結合、ヒドラジド、トリザオール、チオエーテル、またはジスルフィド結合を介して、筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)および/または(例として、および)分子ペイロードに接続される。
i.切断可能なリンカー
切断可能なリンカーは、プロテアーゼ感受性リンカー、pH感受性リンカー、またはグルタチオン感受性リンカーであってもよい。これらのリンカーは一般に、細胞内のみで切断可能であって、好ましくは、細胞外環境において、例として、筋細胞の細胞外において安定している。
プロテアーゼ感受性リンカーは、プロテアーゼ酵素活性によって切断可能である。これらのリンカーは、典型的にはペプチド配列を含んでおり、長さが2～10アミノ酸、約2～5アミノ酸、約5～10アミノ酸、約10アミノ酸、約5アミノ酸、約3アミノ酸、または約2アミノ酸であってもよい。いくつかの態様において、ペプチド配列は、天然に存在するアミノ酸、例として、システイン、アラニン、または天然に存在しないかもしくは修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。天然に存在しないアミノ酸は、β-アミノ酸、ホモ-アミノ酸、プロリン誘導体、3-置換アラニン誘導体、線形コアアミノ酸、N-メチルアミノ酸、および当該技術分野において知られているその他のアミノ酸を包含する。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、バリン-シトルリンまたはアラニン-シトルリンの配列を含む。いくつかの態様において、プロテアーゼ感受性リンカーは、リソソームのプロテアーゼ、例として、カテプシンB、および/または(例として、および)エンドソームのプロテアーゼによって切断され得る。
pH感受性リンカーは、高または低pH環境において容易に分解される共有結合の連結である。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、4～6の範囲にあるpHにて切断されてもよい。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、ヒドラゾンまたは環状アセタールを含む。いくつかの態様において、pH感受性リンカーは、エンドソームまたはリソソーム内で切断される。
いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、ジスルフィド部を含む。いくつかの態様において、グルタチオン感受性リンカーは、細胞内部でのグルタチオン種とのジスルフィド交換反応によって切断される。いくつかの態様において、ジスルフィド部はさらに、少なくとも1アミノ酸、例としてシステイン残基を含む。
いくつかの態様において、リンカーは、Val-citリンカー(例として、米国特許6,214,345(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるとおり)である。いくつかの態様において、抱合前に、val-citリンカーは以下の構造を有する。
Figure 2023540746000034
いくつかの態様において、抱合後、val-citリンカーは以下の構造を有する。
Figure 2023540746000035
いくつかの態様において、Val-citリンカーは、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着される。いくつかの態様では、クリックケミストリー抱合の前に、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着されたval-citリンカーは、以下の構造を有し、
Figure 2023540746000036
 (A)
式中、nは0～15の任意の数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)へ付着されるval-citリンカーは、(例として、異なる化学的部分を介して)分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)へ抱合される。いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着され、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)に抱合されたval-citリンカーは、(クリックケミストリー抱合前)以下の構造を有し、
Figure 2023540746000037
 (B)
式中、nは0～15の任意の数である。いくつかの態様において、nは3である。
いくつかの態様では、分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)への抱合後、val-citリンカーは、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000038
 (D)
式中、nは0～15の任意の数であり、mは0～15の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、およびmは4である。
ii.切断不能リンカー
いくつかの態様において、切断不能なリンカーが使用されてもよい。一般に、切断不能なリンカーは、細胞環境または生理環境において容易に分解され得ない。いくつかの態様において、切断不能なリンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル基を含むが、ここで置換は、ハロゲン、ヒドロキシル基、酸素種、および他の一般的な置換を包含していてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、任意に置換されていてもよいアルキル、任意に置換されていてもよいアルキレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、ヘテロアリーレン、少なくとも1個の非天然アミノ酸を含むペプチド配列、トランケートされたグリカン、酵素的に分解され得ない糖(単数もしくは複数)、アジド、アルキン-アジド、LPXT配列を含むペプチド配列、チオエーテル、ビオチン、ビフェニル、反復単位のポリエチレングリコールもしくは等価な化合物、酸エステル、酸アミド、スルファミド、および/または(例として、および)、アルコキシ-アミンリンカーを含んでいてもよい。いくつかの態様では、ソルターゼ媒介ライゲーションを利用して、LPXT配列を含む筋肉標的剤(例として、抗TfR抗体)を、(G)n配列を含む分子ペイロードに共有結合的に連結させる(例として、Proft T.Sortase-mediated protein ligation:an emerging biotechnology tool for protein modification and immobilization.Biotechnol Lett.2010,32(1):1-10を見よ)。
いくつかの態様において、リンカーは、置換されたアルキレン、任意に置換されていてもよいアルケニレン、任意に置換されていてもよいアルキニレン、任意に置換されていてもよいシクロアルキレン、任意に置換されていてもよいシクロアルケニレン、任意に置換されていてもよいアリーレン、N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロアリーレン;N、O、およびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子をさらに含む任意に置換されていてもよいヘテロシクリレン;イミノ、任意に置換されていてもよい窒素種、任意に置換されていてもよい酸素種O、任意に置換されていてもよい硫黄種、またはポリ(アルキレンオキシド)、例として、ポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドを含んでいてもよい。
iii.リンカー抱合
いくつかの態様では、リンカーは、ホスファート、チオエーテル、エーテル、炭素-炭素、カルバメート、またはアミド結合を介して筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)および/または(例として、および)分子ペイロードに接続される。いくつかの態様において、リンカーは、ホスファートまたはホスホロチオアート基、例として、オリゴヌクレオチド主鎖の末端のホスファートを介してオリゴヌクレオチドへ接続されている。いくつかの態様では、リンカーは、筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)上に存在するリジンまたはシステイン残基を介して、筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)に接続される。
いくつかの態様では、リンカーは、アジドとアルキンとの間の環化付加反応によって筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)および/または(例として、および)分子ペイロードに接続してトリアゾールを形成し、アジドおよびアルキンは、筋肉標的化剤(例えば、抗TfR抗体)、分子ペイロード、またはリンカー上に位置してもよい。いくつかの態様において、アルキンは、環状アルキン、例としてシクロオクチンであってもよい。いくつかの態様において、アルキンは、ビシクロノニン(またビシクロ［6.1.0］ノニンまたはBCNとしても知られている)または置換ビシクロノニンであってもよい。いくつかの態様において、シクロオクタンは、2011年11月3日に公開の国際特許出願公開WO2011136645号、表題「Fused Cyclooctyne Compounds And Their Use In Metal-free Click Reactions」に記載のとおりである。BCNのエキソ形態およびエンド形態の両方が、連結共役のために使用されてもよく、本明細書中に提供される式(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、および(H)のBCNは、エンドBCNまたはエキソBCNのいずれかであり得る。
いくつかの態様において、アジドは、アジドを含む糖または炭水化物分子であってもよい。いくつかの態様において、アジドは、6-アジド-6-デオキシガラクトースまたは6-アジド-N-アセチルガラクトサミンであってもよい。いくつかの態様において、アジドを含む糖または炭水化物分子は、2016年10月27日に公開の国際特許出願公開WO2016170186号、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。いくつかの態様において、トリアゾールを形成するアジドとアルキンとの間のシクロ付加反応(ここでアジドおよびアルキンは、抗筋標的化剤(例として、TfR抗体)、分子ペイロード、またはリンカー上に位置付けられていてもよい)は、2014年5月1日に公開の国際特許出願公開WO2014065661号、表題「Modified antibody,antibody-conjugate and process for the preparation thereof」;または2016年10月27日に公開の国際特許出願公開WO2016170186、表題「Process For The Modification Of A Glycoprotein Using A Glycosyltransferase That Is Or Is Derived From A β(1,4)-N-Acetylgalactosaminyltransferase」に記載のとおりである。
いくつかの態様において、リンカーはさらに、スペーサー、例として、ポリエチレングリコールスペーサーまたはアシル/カルバモイルスルファミドスペーサー、例として、HydraSpace(商標)スペーサーを含む。いくつかの態様において、スペーサーは、Verkade,J.M.M.et al.,「A Polar Sulfamide Spacer Significantly Enhances the Manufacturability,Stability,and Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates」、Antibodies,2018,7,12に記載のとおりである。
いくつかの態様では、リンカーは、ジエノフィルとジエン/ヘテロ-ジエンとの間のディールス・アルダー反応によって筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)および/または(例として、および)分子ペイロードに接続され、ここで、ジエノフィルおよびジエン/ヘテロジエンは、筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)、分子ペイロード、またはリンカー上に位置してもよい。いくつかの態様では、リンカーは、他の周環状反応、例として、エン反応によって、筋肉標的剤(例として、抗TfR抗体)および/または(例として、および)分子ペイロードに接続される。いくつかの態様において、リンカーは、アミド、チオアミド、またはスルホンアミド結合反応によって、筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)および/または(例として、および)分子ペイロードに接続される。いくつかの態様では、リンカーは、縮合反応によって筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)および/または(例として、および)分子ペイロードに接続されて、リンカーと筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)および/または(例として、および)分子ペイロードとの間に存在するオキシム、ヒドラゾン、またはセミカルバジド基を形成する。
いくつかの態様では、リンカーは、求核試薬、例としてアミンまたはヒドロキシル基と求電子試薬、例としてカルボン酸、カーボネート、またはアルデヒドとの間の抱合付加反応によって、筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)および/または(例として、および)分子ペイロードに接続される。いくつかの態様では、リンカーと筋標的化剤(例として、抗TfR抗体)または分子ペイロードとの間の反応の前に、リンカー上に求核試薬が存在してもよく、求電子試薬が筋標的化剤(例として、抗TfR抗体)または分子ペイロード上に存在してもよい。いくつかの態様では、リンカーと筋標的化剤(例として、抗TfR抗体)または分子ペイロードとの間の反応の前に、リンカー上に求電子試薬が存在してもよく、求核試薬が筋標的化剤(例として、抗TfR抗体)または分子ペイロード上に存在してもよい。いくつかの態様において、求電子試薬は、アジド、ペンタフルオロフェニル、パラ-ニトロフェノールエステル、ケイ素中心、カルボニル、カルボン酸、無水物、イソシアナート、チオイソシアナート、スクシニミジルエステル、スルホスクシニミジルエステル、マレイミド、アルキルハロゲン化物、アルキル擬ハロゲン化物、エポキシド、エピスルフィド、アジリジン、アリール、活性化リン中心、および/または(例として、および)、活性化硫黄中心であってもよい。いくつかの態様において、求核試薬は、任意に置換されていてもよいアルケン、任意に置換されていてもよいアルキン、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいヘテロシクリル、ヒドロキシル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アニリド基、またはチオール基であってもよい。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着されたval-citリンカーは、以下の構造によって抗TfR抗体に抱合され、
Figure 2023540746000039
 (C)
式中、mは0～15の任意の数である。いくつかの態様において、mは4である。
いくつかの態様では、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着されたval-citリンカーは、以下の構造を有する抗TfR抗体に抱合され、
Figure 2023540746000040
 (F)
式中、mは0～15の任意の数である。いくつかの態様において、mは4である。
いくつかの態様において、反応性の高い化学的部分(例として、クリックケミストリー抱合のためのSPAAC)に付着され、抗TfR抗体に抱合されたval-citリンカーは、以下の構造を有し:
Figure 2023540746000041
 (H)
式中、nは0～15の任意の数であり、mは0～15の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、式(H)の構造を含む化合物に共有結合し、それにより、式(E)の構造を含む複合体を形成する。式(H)において抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドは、リジンイプシロンアミンなどの抗TfR1抗体のアミンとの反応から生じることを理解されるべきである。
いくつかの態様では、抗TfR抗体および分子ペイロード(例として、、オリゴヌクレオチド)を共有結合的に連結するために使用されるval-citリンカーは、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000042
 (G)
式中、nは0～15の任意の数であり、mは0～15の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、nは3であり、および/または(例として、および)mは4である。いくつかの態様において、Xは、NH(例として、リジンのアミン基からのNH)、S(例として、システインのチオール基からのS)または抗体のO(例として、セリン、トレオニンまたはチロシンのヒドロキシル基からのO)である。いくつかの態様では、記載される複合体をプロセシングする方法は、複合体を製造するステップを含む。
いくつかの態様では、複合体を製造する方法は、
(i)以下の構造を含むオリゴヌクレオチド、
Figure 2023540746000043
 (B)
式中、nは0～15(例として、3)である、を得ることと、
(ii)以下の構造を含む抗体、
Figure 2023540746000044
 (F)
式中、mは0～15(例として、4)である、を得ることと、
(iii)ステップ(i)のオリゴヌクレオチドとステップ(ii)で得られた抗体とを反応させて複合体を得ることと、
を含む。
いくつかの態様では、方法は、
(i)以下の構造を含むオリゴヌクレオチド、
Figure 2023540746000045
 (D);式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)である、を得ることと、
(ii)抗体を得ることと、
(iii)ステップ(i)のオリゴヌクレオチドとステップ(ii)で得られた抗体とを反応させて複合体を得ることと、
を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法を使用して製造された複合体は、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000046
 (E)
式中、nは0～15(例として、3)であり、mは0～15(例として、4)であり、抗体はリジンを介して共有結合的に連結している。
いくつかの態様において、本明細書中に記載される複合体は、以下の構造を有し、
Figure 2023540746000047
 (I)
式中、nは0～10の任意の数であり、mは0～10の任意の数である。いくつかの態様において、nは3であり、およびmは4である。
構造式(I)中、L1は、いくつかの態様において、置換もしくは非置換の脂肪族、置換もしくは非置換のヘテロ脂肪族、置換もしくは非置換のカルボシクリレン、置換もしくは非置換のヘテロシクリレン、置換もしくは非置換のアリーレン、置換もしくは非置換のヘテロアリーレン、-O-、-N(RA)-、-S-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)NRA-、-NRAC(＝O)-、-NRAC(＝O)RA-、-C(＝O)RA-、-NRAC(＝O)O-、-NRAC(＝O)N(RA)-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)N(RA)-、-S(O)2NRA-、-NRAS(O)2-、またはそれらの組み合わせであるスペーサーであり、RAは、独立して、水素または置換もしくは非置換アルキルである。いくつかの態様において、L1は、次式であり、
Figure 2023540746000048
 、
式中、L2は、
Figure 2023540746000049
 であり、ここで、aは、式(I)のカルバメート部分に直接連結された部位を標識し、bは、オリゴヌクレオチドに(直接または追加の化学部分を介して)共有結合的に連結した部位を標識する。
いくつかの態様において、L1は、次式であり、
Figure 2023540746000050
 、
式中、aは、式(I)のカルバメート部分に直接連結された部位を標識し、bは、オリゴヌクレオチドに(直接または追加の化学部分を介して)共有結合的に連結した部位を標識する。
いくつかの態様において、L1は、
Figure 2023540746000051
 である。
いくつかの態様において、L1は、オリゴヌクレオチドの5'ホスファートへ連結される。
いくつかの態様において、L1は、任意である(例として、存在する必要はない)。
式(E)、式(F)、および式(I)において抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドは、リジンイプシロンアミンなどの抗TfR1抗体のアミンとの反応から生じることを理解されるべきである。
D.抗体-分子ペイロード複合体の例
本明細書に記載の分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)のいずれかに共有結合的に連結した本明細書に記載の筋肉標的化剤(例として、抗TfR抗体)のいずれか1つを含む複合体の非限定的な例が本明細書中にさらに提供される。いくつかの態様では、抗TfR抗体(例として、表2に提供される筋標的剤(例として、抗TfR抗体)のいずれか1つ)は、リンカーを介して分子ペイロード(例として、オリゴヌクレオチド)に共有結合的に連結される。本明細書に記載のリンカーのいずれも、使用されてもよい。いくつかの態様において、分子ペイロードがオリゴヌクレオチドである場合、リンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、リンカーは、チオール反応性の連結を介して(例として、抗TfR抗体中のシステインを介して)抗TfR抗体へ共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、抗体(例として、本明細書に記載の抗TfR抗体)へアミン基を介して(例として、抗体中のリジンを介して)共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された萎縮症遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードに共有結合的に連結された抗TfR抗体を含む複合体の構造の例が、以下に提供され、
Figure 2023540746000052
 式中、リンカーは、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体に共有結合的に連結されている。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された萎縮症遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
Val-citリンカーを介して分子ペイロードに共有結合的に連結した抗TfR抗体を含む複合体の構造の別の例を以下に提供し、
Figure 2023540746000053
 (E)
式中、nは0～15の数であり、mは0～15の数であり、リンカーはアミン基を介して抗体に共有結合しており(例として、リジン残基上)、および/または(例として、および)リンカーはオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結している(例えば、5'末端、3'末端、または内部において)。いくつかの態様において、リンカーはリジンを介して抗体へ共有結合的に連結され、リンカーはオリゴヌクレオチドに5'末端にて共有結合的に連結され、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、分子ペイロードは、オリゴヌクレオチド(例として、表1に列挙された萎縮症遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド)である。
抗体は、異なる化学量論を有するオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結され得、この特性は、「薬物」がオリゴヌクレオチドである薬物抗体比(DAR)と呼ばれてもよいことを理解されるべきである。いくつかの態様において、1つのオリゴヌクレオチドが、抗体に共有結合的に連結している(DAR＝1)。いくつかの態様において、2つのオリゴヌクレオチドが、抗体に共有結合的に連結している(DAR＝2)。いくつかの態様において、3つのオリゴヌクレオチドが、抗体に共有結合的に連結している(DAR＝3)。いくつかの態様において、4つのオリゴヌクレオチドが、抗体に共有結合的に連結している(DAR＝4)。いくつかの態様において、各々が異なるDARを有する異なる複合体の混合物が提供される。いくつかの態様において、かかる混合物中の複合体の平均DARは、1～3、1～4、1～5以上の範囲にあってもよい。DARは、オリゴヌクレオチドを抗体上の異なる部位に抱合することによって、ならびに/あるいは多量体を抗体上の1つ以上の部位に抱合することによって増加されてもよい。例えば、2のDARは、単一のオリゴヌクレオチドを抗体上の2つの異なる部位に抱合することによって、または二量体オリゴヌクレオチドを抗体の単一部位に抱合することによって達成されてもよい。
いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体(例として、本明細書に記載される抗体またはその任意の変異体)を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介してオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体(例として、本明細書に記載される抗体またはその任意の変異体)を含む。いくつかの態様において、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端、または内部に共有結合的に連結している。いくつかの態様では、リンカー(例として、Val-citリンカー)は、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)、抗体(例として、本明細書に記載される抗体またはその任意の変異体)に共有結合的に連結している。
いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、表3に示すCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含み、表3に示すCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を有するVHと、配列番号34のアミノ酸配列を有するVLと、を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を有するVHと、配列番号36のアミノ酸配列を有するVLと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体は、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介して、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、表3に示すCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含み、表3に示すCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介して、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を有するVHと、配列番号34のアミノ酸配列を有するVLと、を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介して、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を有するVHと、配列番号36のアミノ酸配列を有するVLと、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介して、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、リンカー(例として、Val-citリンカー)を介して、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、表3に示すCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3、ならびに表3に示すCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含み、複合体は以下の構造を含み、
Figure 2023540746000054
 式中、リンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端または内部に共有結合しており、Val-citリンカーは、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体(例として、本明細書に記載される抗体またはその任意の変異体)に共有結合的に連結される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を有するVHと、配列番号34のアミノ酸配列を有するVLと、を含み、複合体は以下の構造を含み、
Figure 2023540746000055
 式中、リンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端または内部に共有結合的に連結しており、Val-citリンカーは、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体(例として、本明細書に記載される抗体またはその任意の変異体)に共有結合的に連結される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を有するVHと、配列番号36のアミノ酸配列を有するVLと、を含み、複合体は以下の構造を含み、
Figure 2023540746000056
 式中、リンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端または内部に共有結合的に連結しており、Val-citリンカーは、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体(例として、本明細書に記載される抗体またはその任意の変異体)に共有結合的に連結される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39アミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含み、複合体は以下の構造を含み、
Figure 2023540746000057
 式中、リンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端または内部に共有結合しており、Val-citリンカーは、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体(例として、本明細書に記載される抗体またはその任意の変異体)に共有結合的に連結される。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、Val-citリンカーを介してオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号41アミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含み、複合体は以下の構造を含み、
Figure 2023540746000058
 式中、リンカーVal-citリンカーは、オリゴヌクレオチドの5'末端、3'末端または内部に共有結合的に連結しており、Val-citリンカーは、チオール反応性連結を介して(例として、抗体中のシステインを介して)抗体(例として、本明細書に記載される抗体またはその任意の変異体)に共有結合的に連結される。
いくつかの態様では、本明細書に記載の複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、表3に示すCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3と同じCDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3、ならびに表3に示されるCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3と同じCDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3を含み、複合体は、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000059
 (E)
式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙される萎縮症遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号33のアミノ酸配列を有するVHと、配列番号34のアミノ酸配列を有するVLと、を含み、複合体は、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000060
 (E)
式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙される萎縮症遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号35のアミノ酸配列を有するVHと、配列番号36のアミノ酸配列を有するVLと、を含み、複合体は、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000061
 (E)
式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙される萎縮症遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号40のアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含み、複合体は、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000062
 (E)
式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙される萎縮症遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
いくつかの態様では、本明細書に記載される複合体は、リジンを介してオリゴヌクレオチドの5'末端に共有結合的に連結したトランスフェリン受容体抗体を含み、トランスフェリン受容体抗体は、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号42のアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含み、複合体は、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000063
 (E)
式中、nは3であり、mは4である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、表1に列挙される萎縮症遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドである。
式(E)を有する複合体の例において抗TfR1抗体に隣接して示されるアミドは、リジンイプシロンアミンなどの抗TfR1抗体のアミンとの反応から生じることを理解されるべきである。
III.製剤
本明細書に提供される複合体は、いずれの好適なやり方でも製剤化されていてよい。一般に、本明細書に提供される複合体は、医薬への使用に好適なやり方で製剤化されている。例えば、複合体は、分解を最小限に抑え、送達および/または取り込みを容易にする製剤を使用して、対象へ送達され得るか、あるいは、製剤中の複合体へ別の有益な特性を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、複合体および薬学的に許容し得る担体を含む組成物である。かかる組成物は、対象の標的細胞周囲の環境中または対象の全身のいずれかへ投与されたとき充分量の複合体が標的筋細胞に侵入できるように、好適に製剤化され得る。いくつかの態様において、複合体は、リン酸緩衝生理食塩溶液などの緩衝溶液中、リポソーム中、ミセル構造体中、およびカプシド中に製剤化される。
いくつかの態様において、組成物が、本明細書に提供される複合体の1以上の構成要素(例として、筋標的化剤、リンカー、分子ペイロード、またはこれらのいずれか1つの前駆体分子)を個別に包含していてもよいことは解されるはずである。
いくつかの態様において、複合体は、水中または水性溶液(例として、pH調整された水)中に製剤化される。いくつかの態様において、複合体は、塩基性緩衝水性溶液(例として、PBS)中に製剤化される。いくつかの態様において、本明細書に開示のとおりの製剤は、賦形剤を含む。いくつかの態様において、賦形剤は、組成物へ、改善された安定性、改善された吸収、改善された可溶性、および/または活性成分の治療増強を付与する。いくつかの態様において、賦形剤は、緩衝剤(例として、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、もしくは水酸化ナトリウム)、またはビヒクル(例として、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、または鉱油)である。
いくつかの態様において、複合体またはその構成要素(例として、オリゴヌクレオチドまたは抗体)は、その貯蔵寿命を延長するため凍結乾燥され、次いで使用(例として、対象への投与)前に溶液にさせられる。結果的に、本明細書に記載の複合体またはその構成要素を含む組成物中の賦形剤は、凍結保護剤(lyoprotectant)(例として、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、もしくはポリビニルピロリドン)、または崩壊温度修飾因子(例として、デキストラン、フィコール、もしくはゼラチン)であってもよい。
いくつかの態様において、医薬組成物は、その意図された投与ルートに適合するよう製剤化されている。投与ルートの例は、非経口投与、例として、静脈内投与、皮内投与、皮下投与を包含する。典型的には、投与ルートは、静脈内投与または皮下投与である。いくつかの態様において、投与ルートは、筋肉外非経口投与である。
注射剤への使用に好適な医薬組成物は、滅菌水性溶液(ここで水に可溶性である)または分散溶液、および滅菌注射剤溶液または分散溶液の即時調製のための滅菌粉末を包含する。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、および好適なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。いくつかの態様において、製剤は、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを包含する。滅菌注射剤溶液は、要求量の複合体を、上に列挙された成分の1つまたはそれらの組み合わせと共に、選択された溶媒に組み込むこと、要求に応じ、これに続き濾過滅菌することによって調製され得る。
いくつかの態様において、組成物は、活性成分(単数または複数)のパーセンテージが組成物全体の重量または体積の約1％と約80％以上との間であってもよいが、少なくとも約0.1％の複合体もしくはその構成要素を含有していてもよい。可溶性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与ルート、産物の貯蔵寿命などの因子、ならびに他の薬理学的留意事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろう。そのため様々な投薬量および処置計画が所望されることもある。
IV.使用/処置の方法
本明細書に記載のとおりの分子ペイロードへ共有結合的に筋標的化剤を含む複合体は、筋疾患(例として、希少な筋疾患)を処置するのに有効である。いくつかの態様において、複合体は、表1に提供される筋疾患を処置するのに有効である。いくつかの態様において、筋疾患は、疾患アレルに関連しており、例えば、具体的な筋疾患の疾患アレルは、表1に挙げられた対応する遺伝子において遺伝子変化を含んでいてもよい。
いくつかの態様において、対象は、ヒト対象、霊長目の非ヒト動物対象、齧歯類動物対象、またはいずれの好適な哺乳類の動物対象であってもよい。いくつかの態様において、対象は、表1に提供された筋疾患を有してもよい。
本開示の側面は、本明細書に記載のとおりの有効量の複合体を対象へ投与することを伴う方法を包含する。いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に筋標的化剤を含む複合体を含む有効量の医薬組成物は、処置を必要とする対象へ投与され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの複合体を含む医薬組成物は、静脈内投与を包含してもよい好適なルートによって、例として、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続注入によって、投与されてもよい。いくつかの態様において、静脈内投与は、筋肉内の、腹腔内の、脳脊髄内の(intracerebrospinal)、皮下の、関節内の、滑液嚢内の、または髄腔内のルートによって実施されてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、固体形態、水性形態、または液体形態であってもよい。いくつかの態様において、水性または液体形態は、噴霧されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。いくつかの態様において、噴霧形態または凍結乾燥形態は、水性または液体溶液で再構成されてもよい。
静脈内投与のための組成物は、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)などの様々な担体を含有していてもよい。静脈内注射のための水可溶性抗体は点滴法によって投与され得、これによって抗体および薬学的に許容し得る賦形剤を含有する医薬製剤が注入される。生理学的に許容し得る賦形剤は、例えば、5％デキストロース、0.9％生理食塩水、リンガー溶液、または他の好適な賦形剤を包含していてもよい。筋肉内用調製物、例として、抗体の好適な可溶性の塩形態の滅菌製剤は、注射用水、0.9％生理食塩水、または5％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解されて投与され得る。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、部位特異的または局部的な送達技法を介して投与される。これらの技法の例は、複合体の埋め込み型デポー供給源、局部送達カテーテル、部位特異的担体、直接注射、または直塗り(direct application)を包含する。
いくつかの態様において、分子ペイロードへ共有結合的に筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、治療効果を対象に付与する有効濃度にて投与される。有効量は、当業者によって認識されるとおり、疾患の重症度、処置される対象の特有な特徴、例として、年齢、体調、健康状態、または体重、処置時間、あらゆる併用治療の性質、投与ルート、および関連因子に応じて変動する。これらの関連因子は当業者に知られており、わずかな定型的実験法で対処され得る。いくつかの態様において、有効濃度は、患者に安全であると見なされる最大用量である。いくつかの態様において、有効濃度は、最大限の効き目を提供する、実行可能な最低濃度であろう。
経験的考察、例として、対象における複合体の半減期は一般に、処置のために使用される医薬組成物の濃度の決定に寄与するであろう。投与頻度は、処置の効き目を最大化するために経験的に決定かつ調整されてもよい。
一般に、本明細書に記載の複合体のいずれかの投与について、当初の候補投薬量は、上に記載の因子、例として、安全性または有効性に応じて、約1～100mg/kgであってもよく、またはこれより多くてもよい。いくつかの態様において、処置は、一度施されるであろう。いくつかの態様において、処置は、毎日、隔週、毎週、隔月、毎月、または対象へ最大の効き目を提供しつつ安全性へのリスクを最小に抑えるあらゆる時間間隔にて、施されるであろう。一般に、有効性ならびに処置および安全性へのリスクは、処置過程を通してずっと監視されることもある。
処置の効き目は、いずれか好適な方法を使用して査定されてもよい。いくつかの態様において、処置の効き目は、筋疾患に関連する症状の所見の評価よって査定されてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の分子ペイロードへ共有結合的に筋標的化剤を含む複合体を含む医薬組成物は、対照(例として、処置に先立つ遺伝子発現のベースラインレベル)と比べて、標的遺伝子の活性または発現を少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％阻害するのに充分な有効濃度にて、対象へ投与される。
いくつかの態様において、医薬組成物は、分子ペイロードへ共有結合的に筋標的化剤を含む、1種より多くの複合体を含んでいてもよい。いくつかの態様において、医薬組成物は、対象、例として、筋疾患(例として、表1で提供された筋疾患)を有するヒト対象の処置のためのいずれか他の好適な治療剤をさらに含んでいてもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体の有効性を増強または補完するものであってもよい。いくつかの態様において、他の治療剤は、本明細書に記載の複合体とは異なる症状または疾患を処置するよう機能してもよい。
［実施例1］
オリゴヌクレオチドに連結された抗体を含む複合体の合成(抱合方法1-反応前抱合)
カテプシン切断可能リンカーを介して抗トランスフェリン受容体hIgG1-κFab抗体(抗TfR Fab)に共有結合的に連結したDMPKを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む筋標的化複合体を生成した。
1mLのCaptureSelect(商標)CH1-XLカラム(Thermo Fisher,Loughborough,UK)を使用して、CHO細胞培養上清から抗TfR Fabを精製した。カラムを1×DPBSを用いて洗浄し、続いて50mM酢酸ナトリウムpH4.0を用いてタンパク質を溶出した。その後、タンパク質を20mMクエン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH6.0に緩衝液交換した。次いで、移動相として20mMクエン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH6.0を含むHiLoad(商標)16/60 Superdex(商標)75 pgカラム(GE Healthcare,Little Chalfont,UK)を使用する分取SECによってFabをさらに精製した。単量体タンパク質を含有するピーク画分をプールし、濃縮し、濾過滅菌した後、予測されたアミノ酸配列に基づく吸光係数(Ec(0.1％))を用いてA280nmに従って定量した。次いで、精製Fabを、還元および非還元ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、分析サイズ排除クロマトグラフィー-高速液体クロマトグラフィー(SEC-HPLC)およびBiacore単一サイクル速度論(SCK)によって分析した。抱合反応を継続する前に、抗TfR Fabを50mM HEPES pH7.5に緩衝液交換した。
オリゴヌクレオチド(例として、荷電オリゴヌクレオチド)およびアジド-バリン-シトルリンリンカーを含むリンカー/ペイロード化合物を生成した。オリゴヌクレオチド(Na＋付加物)をRNAse非含有水に200mg/mLで溶解した。この溶液を乾燥ジメチルホルムアミド(DMF)で10mg/mLに希釈した。次いで、25倍モル過剰のトリブチルアミンを溶液に添加した。リンカー分子(DMFに20mg/mLで溶解したアジド-PEG3-Val-Cit-PAB-PNP)を2倍モル過剰でオリゴヌクレオチド溶液に室温(約25℃)で120分間添加した。アルコール沈殿を用いて反応をクエンチする前に、ニンヒドリン(カイザー試験)を用いて反応完了を測定した。0.1v/vの3M NaCl溶液を添加し、続いて3体積の-80℃イソプロパノールを添加することによって、アルコール沈殿を達成した。次いで、溶液を完全に混合し、続いて-20℃で1時間沈殿させた。沈殿した溶液を30分間遠心分離し(4300×gで;8℃)、溶媒をデカントした。ペレットをRNase非含有水中-80℃ 80％エタノール(出発反応に相当する一体積)で洗浄し、20分間遠心分離した(4300×gで;8℃)。次いで、エタノールをデカントし、ペレット(オリゴヌクレオチドおよびアジド-バリン-シトルリンリンカーを含む化合物を含有する)を37℃で10分間乾燥させた。オリゴヌクレオチドおよびアジド-バリン-シトルリンリンカーを含むリンカー/ペイロード化合物を、ヌクレアーゼ非含有水中の20％アセトニトリルに20mg/mLの濃度まで再懸濁した。
続いて、以下の条件でプレ反応を行った。5.87μM、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジド(図1Aに示す構造)および5.34mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル(1.1:1.0mol:mol当量;図1Bに示す構造)を、60:40 v/v％DMA～25mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)pH5.5緩衝液中、室温で合わせた。
オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステル(図1Cに示す構造)を生成するための前反応の完了を、220nmでのエンド-BCN-PEG4-PFPエステル出発物質の消失を観察することによって、30分毎の反復注射(5分、35分、および65分の時点で)でRP-C18 UPLCによって監視した。5分の時点に対して5％未満のエンド-BCN-PEG4-PFPエステルが残っている場合、反応が完了したと判定した。粗反応前混合物を、精製することなく直ちに抱合反応に進めた。総反応前時間は90分であり、エンド-BCN-PEG4-PFPエステルの反応前への添加と、この反応混合物のFab抱合反応への添加との間の時間と定義した。
オリゴヌクレオチド(例として、荷電オリゴヌクレオチド)と抗TfR Fabとの抱合は、Fabの溶媒にアクセス可能なリジン残基と、前反応ステップで生成されたオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルの活性化PFPエステルとの間のアミド結合の形成を含む。
抱合反応は、以下の溶液反応物パラメータ:抗TfR Fab(45mg、6mg/mL、125μM)および750μMの最終濃度のオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステル(1.0:6.0mol:mol当量の抗TfR Fab:オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステル)を用いて行った。オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステル濃度は、プレ反応におけるBCNのオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルへの100％の変換を想定している。最終反応混合物は、15:85v/v％DMA対25mM HEPES pH7.5緩衝液からなっていた。反応物およびストック溶液の適量を添加することによって、反応物を20mLのガラスシンチレーションバイアルにセットアップした。反応を室温(約25℃)で20時間進行させた。反応の開始を、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する反応前混合物の抗TfR Fab溶液への添加時間と定義した。停止時間を、その後の精製の前のpH調整の開始として定義した。抱合反応の総持続時間は20時間であった。
20時間反応させた後、粗抱合体混合物をSDS-PAGEで試験し、デンシトメトリーで分析して、薬物対抗体比(DAR)および非抱合Fab％を決定した。
［実施例2］
オリゴヌクレオチドに連結された筋肉標的化抗体を含む複合体の精製
実施例1からの粗反応生成物を、クロマトグラフィーを使用して首尾よく精製した。抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体、非抱合抗TfR Fabおよび非抱合オリゴヌクレオチドの混合物をヌクレアーゼ非含有水で1:3希釈し、混合物のpHを500mM MES緩衝液で5.7に調整した。次いで、この溶液をセラミックヒドロキシアパタイト(HA)カラム(HiLoad-26mm×40cmカラム、CHT(商標)40μm樹脂、Biorad製;カタログ番号732-4324)に生体分子濃度8mg/mLの樹脂［負荷流量:線形113cm/時、26mm ID-10.0mL/分の体積流量、滞留時間-21.4分］でロードした。HAカラムを5CVの洗浄溶液(5mM Na2HPO4、25mM NaCl pH7.0)で洗浄して、非連結オリゴヌクレオチドを除去した。非連結オリゴヌクレオチドの除去後、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗TfR Fabを含む複合体を配合緩衝液(100mM Na2HPO4、100mM NaCl、pH7.6)中でHAカラムから溶出した。
単離および精製された抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体を、非連結オリゴヌクレオチドの完全な除去を実証するためにSDS-PAGEおよび分析SECによって、ならびにヒトTfR1/cyno TfR1結合およびエンドトキシンレベルについてのELISAによって、分析した。SECクロマトグラムは、HA樹脂からの溶出画分が、オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗TfR Fabを含む実質的に精製された複合体を提供することを示した。さらに、HAフロースルー(例として、洗浄画分)は、非連結オリゴヌクレオチドを含んでいた。これらの結果は、ヒドロキシアパタイト樹脂を使用して複合体を非連結オリゴヌクレオチドから精製することができることを実証しており、他の場合では達成不可能であった驚くべき精製結果である。
陽イオン交換(CEX)および陰イオン交換(AEX)樹脂を含む、実施例1からのオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗TfR Fab、非連結オリゴヌクレオチド、および非連結抗TfR Fabを含む複合体の粗混合物の精製のためのいくつかの代替戦略を調査した。代替戦略のいずれも、本明細書に記載のアプローチ(セラミックヒドロキシアパタイト樹脂を使用)ほど効果的ではないことがわかった。
［実施例3］
Fab-オリゴヌクレオチド抱合反応に対するBCN対Fabの比の効果
反応前混合物からのBCNと抗TfRとの比の効果を調べるために、実施例1に記載の一般プロトコルに従って一連の反応を行った。
オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドとエンド-BCN-PEG4-PFPエステルとの間の予備反応を、以下の最終反応条件を使用して行った:2.43mMオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドを、DMAおよび25mM MES pH5.5緩衝液の1:1混合物中で1.62mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル(1.5:1mol:mol比)と反応させた。全反応前体積は0.17mLであり、反応前ステップを室温で4時間進行させた。
プレ反応が完了したら、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する粗(すなわち、非精製)プレ反応混合物を使用して、一連の抗TfR Fab抱合反応を設定した。独立した抗TfR Fab抱合反応を、Fabに関して反応前生成物混合物からの1.0、1.3、1.6、1.9、2.2、および2.5モル当量のBCNを使用して行った。他のすべての反応条件は、異なる抱合にわたって一定に保持された。抱合反応混合物において、Fab濃度は6mg/mLであり、反応あたり1mgの総Fabおよび20mM HEPES pH7.5緩衝液中15v/v％DMAであった。反応を室温で20時間行った。各抱合体の最終平均DARおよび％非抱合Fab(D0)をSDS-PAGEデンシトメトリーによって決定し、結果を表4に示す。SDS-PAGEゲルを図2に示す。
Figure 2023540746000064
［実施例4］
Fab-オリゴヌクレオチド抱合反応に対するBCN対Fabの比および反応条件の効果
反応前混合物からのBCNと抗TfRとの比の影響、ならびにオリゴヌクレオチド-Fab抱合反応におけるオリゴヌクレオチドおよびFab濃度の影響を調べるために、実施例1に記載の一般プロトコルに従って一連の反応を行った。
オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドとエンド-BCN-PEG4-PFPエステルとの間の予備反応を、以下の反応条件を使用して行った。6.15mMオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドを、DMAおよび25mM MES pH5.5緩衝液(60:40 DMA:MES)の混合物中の6.15mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル(1:1モル:モル比)と、0.11mLの総反応体積で反応させた。前反応を室温で110分間進行させた。
プレ反応が完了したら、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する粗(すなわち、非精製)プレ反応混合物を使用して、一連の抗TfR Fab抱合反応を設定した。独立した抗TfR Fab抱合反応を、Fabに対して反応前生成物混合物からの2、3、4、5、6、8、および10モル当量のBCNを使用して行った。各反応におけるFab濃度は10mg/mLであり、反応あたり合計Fabは0.65mgであった。DMA含有量を除く抱合のための他のすべての反応条件は、異なる抱合反応にわたって一定に保持された。2、3、4、5、および6モル当量のBCNを使用する反応を、50mM HEPES pH7.5緩衝液中15v/v％DMAで、23～25℃において20時間行った。8および10モル当量のBCNを使用する反応を、50mM HEPES pH7.5緩衝液中の20v/v％DMA中、23～25℃で19時間行った。各抱合体の最終平均DARをSDS-PAGEデンシトメトリーによって決定し、その結果を表5に示す。SDS-PAGEゲルを図3に示す。
Figure 2023540746000065
［実施例5］
Fab-オリゴヌクレオチドの抱合および精製
オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドとエンド-BCN-PEG4-PFPエステルとの間の予備反応は、以下の反応条件を使用して行った。2.61mMオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドを、DMAおよび25mM MES pH5.5緩衝液の1:1v/v％混合物中、1.74mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル(1.5:1.0mol:mol当量)と反応させ、総反応体積は0.44mLであった。前反応を室温で4.75時間進行させた。プレ反応の完了を、経時的なRP C18 UPLCによるエンド-BCN-PEG4-PFPエステル出発物質のピーク面積の減少を測定することによって監視した(図4)。
プレ反応が完了したら、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する粗(すなわち、非精製)プレ反応混合物を使用して、一連の抗TfR Fab抱合反応を設定した。Fabに対する反応前生成物混合物からの2.2:1mol:mol当量のオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを用いて抗TfR Fab抱合を行った。抱合反応におけるFab濃度は6mg/mLであり、10mgの総Fabのスケールで反応を行った。最終反応混合物は、20mM HEPES pH7.5緩衝液中15v/v％DMAの組成を有していた。
室温で19時間反応させた後、粗抱合体生成物混合物をクロマトグラフィーによって精製して、遊離オリゴヌクレオチド種を除去した。まず、1mLのCHT I型ヒドロキシアパタイトカラムに負荷した後、抱合体を5カラム容量(CV)の100％緩衝液A(10mMリン酸ナトリウムおよび10mM塩化ナトリウム、pH6.5)で洗浄した。次いで、10CVの緩衝液Aおよび緩衝液Bの95:5混合物(100mMリン酸ナトリウムおよび100mM塩化ナトリウム、pH7.5)を用いて、流速1mL/分で2回目の洗浄を行った。最後に、10CVの緩衝液Aおよび緩衝液Bの90:10混合物を用いて、流速1ml/分で3回目の洗浄を行った。洗浄ステップ後、抱合体を流速1mL/分で100％緩衝液Bで溶出した。このプロセスにより、平均DARが1.30の抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体7.4mg(収率74％)が得られた。精製抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体のSECクロマトグラムおよびSDS-PAGEゲルをそれぞれ図5および図6に示す。
［実施例6］
オリゴヌクレオチドに連結された抗体を含む複合体の合成(抱合方法2-2ステップ抱合)
カテプシン切断可能リンカーを介して抗トランスフェリン受容体hIgG1-κ抗体(抗TfR抗体)に共有結合的に連結したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む筋標的化複合体を生成した。
抗TfR抗体は、15Lバッチ供給培養においてCHO-K1SP細胞(Genscript)中で安定に発現した。上清をMabSelectSureプロテインA親和性樹脂で精製し、20mMリン酸塩で洗浄し、pH＝3.5で50mMクエン酸ナトリウムで溶出した。溶出液を1.0M NaOHで中和し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によってDPBS pH＝7.4にさらに研磨し、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)によって10.0mg/mLに濃縮した。
精製した抗体を、FragIt solid supported IdeS enzyme(1.0gAb/10mL樹脂、125rpmの振盪フラスコ中、室温で120分間)を用いて、F(ab')2断片に部位特異的に切断した(CPAPELLG-GPSVF(配列番号45)の配列)。FCドメインおよび任意の未切断IgGを、HiLoadカラム(26mm×40 cm、［負荷流量:線形113 cm/時、26mm ID-10.0ml/分の体積流量、滞留時間-21.2分］)で25mg/mLの結合容量を有するCaptureSelect FcXL(ThermoScientific)を用いて除去した。精製F(ab')2を含むフロースルーを収集し、SDS-PAGE(4～12％NuPAGE、MES pH＝7.0、160v、40分)および分析HPLC-SEC(Zorbax GF-250、9.4mm×250mm、PBS pH＝7.2、25C)によって任意のブレークスルーについて検証した。F(ab')2断片を、ヒンジチオール当たり80モル過剰のシステアミン-HCl(ChemImpex番号02839)でFab'に37℃で90分間還元した。次いで、標準pH勾配(50mM Na3C6H5O7、pH＝2.6、20カラム体積にわたって60～100％勾配)を使用して、プロテインLクロマトグラフィー(GE＃17547855,10Xシリーズ)を用いて、非還元F(ab')2および遊離システアミンからFab'を直ちに精製した。抗TfR Fabも組換え生製造され得る。
抗TfR Fabをアセトニトリル(HPLCグレード)で1:10 v/vに希釈し、5モル過剰のエンド-BCN-PEG3-PFP((エンド)ビシクロノニン-PEG3-ペンタフルオロフェニル(式(C));DMSOに20mg/mLで溶解)と室温(約22.5℃)で2時間反応させた。反応後、抗TfR Fab BCN溶液を滅菌濾過またはデプス濾過して、沈殿したBCNを除去した。次いで、濾過した溶液を、LCMSおよびアジド-A488(20モル過剰)を90分間使用して平均反応性BCN部分についてアッセイした。BCNを組み込んだFab(Fab1モル当たりBCN＞1.3モル)を、5濾液体積の10kDa-TFF(1.2バール、Sartorius VivaFlow 200)で精製して、遊離BCNを除去した。遊離BCNの完全な除去を分析HPLC-SEC(Tosoh、TSKgel SuperSW mAb HR、7.8mm×300mm)によって確認した。BCN修飾抗TfR Fabの回収率は出発物質の＞90％であった。BCNを組み込んだ精製Fabを次のステップにもっていった。
オリゴヌクレオチド(例として、荷電オリゴヌクレオチド)およびアジド-バリン-シトルリンリンカーを含むリンカー/ペイロード化合物を生成した。オリゴヌクレオチド(Na＋付加物)をRNAse非含有水に200mg/mLで溶解した。この溶液を乾燥ジメチルホルムアミド(DMF)で10mg/mLに希釈した。次いで、25倍モル過剰のトリブチルアミンを溶液に添加した。リンカー分子(DMFに20mg/mLで溶解したアジド-PEG3-Val-Cit-PAB-PNP(式(A))を2倍モル過剰でオリゴヌクレオチド溶液に約25℃で120分間添加した。アルコール沈殿を用いて反応をクエンチする前に、ニンヒドリン(カイザー試験)を用いて反応完了を測定した。0.1v/vの3M NaCl溶液を添加し、続いて3体積の-80℃イソプロパノールを添加することによって、アルコール沈殿を達成した。次いで、溶液を完全に混合し、続いて-20℃で1時間沈殿させた。沈殿した溶液を30分間遠心分離し(4300×gで;8℃)、溶媒をデカントした。ペレットをRNase非含有水中-80℃ 80％エタノール(出発反応に相当する一体積)で洗浄し、20分間遠心分離した(4300×gで;8℃)。次いで、エタノールをデカントし、ペレット(オリゴヌクレオチドおよびアジド-バリン-シトルリンリンカーを含む化合物を含有する)を37℃で10分間乾燥させた。オリゴヌクレオチドおよびアジド-バリン-シトルリンリンカーを含むリンカー/ペイロード化合物を、ヌクレアーゼ非含有水中の20％アセトニトリルに20mg/mLの濃度まで再懸濁した。
BCN修飾抗TfR Fabを、オリゴヌクレオチドおよびアジド-バリン-シトルリンリンカーを含むリンカー/ペイロード化合物のBCNあたり2.5モル当量と室温(約25℃)で2時間反応させた。
カップリング反応の完了をSDS-PAGEおよび分析SECによって評価し、これはデンシトメトリーによって78％のカップリング効率を示した。
実施例1に記載の抱合方法により作製した抱合体および実施例6に記載の抱合方法により作製した抱合体の生物活性を試験した。両方の抱合体は、DMPK標的化オリゴヌクレオチド(ASO1)を含有し、RD細胞のDMPK mRNAレベルを効率的にノックダウンした(図7)。
［実施例7］
電荷中性オリゴヌクレオチドに連結された抗体を含む複合体の合成(抱合方法2-2ステップ抱合)
カテプシン切断可能リンカーを介して抗トランスフェリン(抗TfR)受容体Fab抗体に共有結合的に連結したオリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド)を含む筋標的化複合体を生成した。抗TfR Fabは、組換え製造され得(例として、CHO細胞において)、精製され得る。使用されるオリゴヌクレオチドは、30ヌクレオチド長であるホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である。
抗TfR Fabをプロピレングリコールで最終濃度40％v/vのプロピレングリコールに希釈し、5倍モル過剰のエンド-BCN-PEG3-PFP(エンド-ビシクロノニン-PEG3-ペンタフルオロフェニル、20mg/mLの濃度でDMSOに溶解)と共に室温(約22.5℃)で2時間インキュベートした。標識により、Fab1モル当たり2.0～2.5モルのBCNが得られると予想された。標識後、反応生成物を滅菌濾過またはデプス濾過して沈殿したBCNを除去した。次いで、濾過した溶液を、LCMS(ThermoFisher MAbPac RP 4um 2.1×100mm、＃088647;移動相A 100％UPLCグレード水中0.1％ギ酸;移動相B 100％UPLCグレードのアセトニトリル中0.1％ギ酸;流速0.3mL/分;カラム温度70℃;in-source CID 20eV;正極性;スプレー電圧3.5kV;スキャン範囲1000～3000m/z)を用いて分析的に平均反応性BCN部分についてアッセイした。
標識化度(DOL)＞2.3を有する抗TfRを抱合の次のステップに使用し、5濾液体積で、10kDaの分子量カットオフ(1.2バール)を使用するタンジェンシャルフロー濾過によってpH7.2のPBS中10％イソプロパノール中に精製して、遊離BCNおよびプロピレングリコールを除去した。BCNおよびプロピレングリコールの完全な除去を分析HPLC-SEC(Waters Xbridge Protein BEH SEC 3.5um、7.8×300mm、0.3mL/分、100mM PO4、100mM NaCl、15％v/vアセトニトリルpH7.0)によって検証した。粗生成物および精製生成物のSECトレースを図8に示す。BCN標識抗TfRの回収率は出発物質の＞90％であった。さらなる抱合ステップのために、精製溶液を3.5mg/mLに濃縮した。
別の反応では、オリゴヌクレオチド(例として、電荷中性オリゴヌクレオチド)をリンカー分子に抱合させた。オリゴヌクレオチドを37℃で無水DMSOに35mg/mLで溶解した。リンカー分子(アジド-PEG3-Val-Cit-PAB-PNP)を無水DMFに40mg/mLで溶解し、3倍モル過剰のN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を含むオリゴヌクレオチドに2.7倍モル過剰で添加した。このリンカー抱合反応を室温(約22.5℃)で2時間進行させた。反応の進行および完了を、アセトン沈殿を介して反応をクエンチする前にニンヒドリンアッセイ(Kaiser試験)を用いて測定した。
生成物溶液に8体積の冷却アセトンを添加することによって沈殿を行い、沈殿を3500×g、8℃で20分間の遠心分離によってペレット化した。次いで、ペレットを3体積のアセトンで洗浄して、残っている遊離リンカーを除去し、3500×gで8℃で20分間再度遠心分離した。次いで、精製したオリゴヌクレオチド-リンカーを、30mg/mLの濃度でヌクレアーゼ非含有水中の20％v/vアセトニトリルに溶解した。濃度および収率は、0.1N HCl中の光学密度(OD)によって測定し、90％を超える収率を示した。沈殿および洗浄ステップによる遊離リンカーの除去を確認するために、粗リンカー/オリゴヌクレオチド抱合反応生成物(図9)および精製オリゴヌクレオチド-リンカー(図10)に対して分析RP-HPLCを行った(Waters BEH-C18、4.6mm×150mm、0.5mL/分、水中5～90％v/vアセトニトリル、実行時間30分)。精製オリゴヌクレオチド-リンカーの確認LCMSも行った(図11)。
抗TfRとオリゴヌクレオチドを抱合させるために、BCN標識抗体を、室温(約22.5℃)で一晩、ガラス瓶中で5倍モル過剰のオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジド(図1A)と混合した。
反応の完了をSDS-PAGE(図12)および分析SEC分析(図13)によって評価したところ、10％未満の非連結抗TfR抗体(DAR0)およびデンシトメトリーによる90％のカップリング効率が実証された。
［実施例8］
Fab-オリゴヌクレオチド(電荷中性オリゴヌクレオチド)抱合体を調製するための抱合プロセス
(抱合方法1-反応前抱合)
この実施例は、val-citカテプシン切断可能ペプチドリンカーを介して抗トランスフェリン受容体(抗TfR)Fab抗体に共有結合的に連結したオリゴヌクレオチドで構成される抱合体の調製を記載する。抗TfR Fabは、組換え製造され得(例として、CHO細胞において)、精製され得る。使用されるオリゴヌクレオチドは、30ヌクレオチド長であるホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である。Fabとの抱合の前に、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジド分子(図1A)のアジド基と、エンド-BCN-PEG4-PFPエステル(図1B)ヘテロ二官能性架橋剤上の歪みビシクロノニン部分との間の銅非含有3＋2クリック反応(「前反応」)によって、オリゴヌクレオチドおよびリンカーを含有する中間体が生成される。
凍結乾燥オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジド(98.1mg)を、0.32mLのMilliQ水中の4mLガラス製のWheatonバイアル中で可溶化した。可溶化後、0.32mLのN,N-ジメチルアセトアミド(DMA)を添加し、混合物を5～10分間穏やかに撹拌した。継続する前に、バイアルを慎重に検査して、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドが完全に溶解し、ガラスバイアルの壁に残渣が残っていないことを確実にした。1:1 DMA:水中のオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドストック溶液の濃度を、Nanodrop UV/vis装置を用いて、265nmで0.1M HClの最終濃度を含有する1:1 DMA:水中で25倍、50倍、および100倍に希釈した一定分量を用いて、318,050m-1cm-1の吸光係数を用いて決定した。濃度測定の精度を確実にするためにHClを添加した。各希釈で計算した濃度を平均して、10.1mMの溶液濃度を決定した。
約25mgのエンド-BCN-PEG4-PFPエステル油を秤量して4mLのガラスWheatonバイアルに入れることによって、endo-BCN-PEG4-PFPエステルの32.5mg/mL(53.5mM)ストック溶液を調製した。次いで、適切な体積のDMAを添加して、32.5mg/mLのストック溶液を得た。
プレ反応は、以下の最終溶液反応条件で行った:室温の5.87μM(6.5μmol)オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジド、5.34mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル(1.1:1.0mol:mol当量)の60:40 v/v％DMA～25mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)pH5.5緩衝液中。表6に示すように、適切な量の反応物およびストック溶液を添加することによって、反応物を4mLのガラスWheatonバイアルにセットアップした。プレ反応の総最終体積は1.11mLであった。
Figure 2023540746000066
オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステル(図1C)を生成するための前反応の完了を、220nmでのエンド-BCN-PEG4-PFPエステル出発物質の消失を観察することによって、30分毎の反復注射(5分、35分、および65分の時点で)でRP-C18 UPLCによって監視した。このIPCは、反応が65分で完了したことを示した(図14)。5分の時点に対して5％未満のエンド-BCN-PEG4-PFPエステルが残っている場合、反応が完了したと判定した(表7)。粗反応前混合物を、精製することなく直ちに抱合反応に進めた。総反応前時間は90分であり、エンド-BCN-PEG4-PFPエステルの反応前への添加と、この反応混合物のFab抱合反応への添加との間の時間と定義した。
Figure 2023540746000067
オリゴヌクレオチドと抗TfR Fabとの抱合は、Fabの溶媒にアクセス可能なリジン残基と、前反応ステップで生成されたオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルの活性化PFPエステルとの間のアミド結合の形成を含む(図1C)。
抱合反応のセットアップの前に、20mMクエン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウムに製剤化された抗TfR Fabを50mM HEPES pH7.5に緩衝液交換した。抗TfR Fab(10.15mg/mLで10mL)を、50mM HEPES pH7.5平衡化NAP-25脱塩カラム(4×2.5mL)に負荷し、50mM HEPES pH7.5(4×3.5mL)で溶出した。溶出液をプールし、Amicon Ultra-15 10kDa遠心フィルターユニットを4000 rcfで回転させて濃縮して、体積を2.86mLに低減させた。得られた緩衝液の抗TfR Fabの濃度をNanodrop UV/visによって測定したところ、31.75mg/mLであった。
抱合反応は、以下の最終溶液反応物量で行った:抗TfR Fab(45mg、6mg/mL、125μM)および750μMの最終理論濃度でのオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステル(6.0:1.0mol:mol当量のオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステル対抗TfR Fab)。オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステル濃度は、プレ反応におけるBCNのオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルへの100％の変換を想定した。最終反応混合物は、15:85v/v％DMA対25mM HEPES pH7.5緩衝液からなっていた。表8に示すように、適切な量の反応物およびストック溶液を添加することによって、反応物を20mLのガラスシンチレーションバイアルにセットアップした。反応を室温(約25℃)で20時間進行させた。反応の開始を、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する反応前混合物の抗TfR Fab溶液への添加時間と定義した。抱合反応の総持続時間は20時間であった。
Figure 2023540746000068
20時間反応させた後、粗抱合体混合物をSDS-PAGEで試験し、デンシトメトリーで分析して、薬物対抗体比(DAR)および非抱合Fab％を決定した。結果を図15および表9に示す。
Figure 2023540746000069
［実施例9］
抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体の精製
実施例8に記載される抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体の合成に続いて、2パート精製プロセスを行った。最初に、遊離ペイロードをヒドロキシアパタイト(HA)クロマトグラフィーによって除去した。次いで、HA溶出液を最終製剤に緩衝液交換した。45mgスケールのFabで、30kDa遠心フィルター装置を用いて最終的な緩衝液交換を行った。HAカラムに負荷する前に、実施例8からの粗反応生成物(抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体)を希釈し、pHを7.5から5.7に調整した。最初に、7.5mLの粗抱合体を16.5mLの15v/v％DMA水溶液の添加によって希釈し、完全に混合した。この混合物に、0.75mLの500mM MES(pH3.3)を添加して、pHを5.7に調整した。
未反応オリゴヌクレオチド種を除去するためのクロマトグラフィー精製を、AKTA Pureクロマトグラフィー系において5mLのBio Rad CHT I型(セラミックヒドロキシアパタイト)カートリッジを使用して行った。反応混合物調製ステップから希釈抱合プールを負荷する前に、CHTカートリッジを調製し、15:85v/v％のDMA:10mMリン酸ナトリウム、pH5.8緩衝液を使用して製造業者の指示に従って平衡化した。平衡後、抱合プールを5mL/分の流速で負荷した。抱合を負荷した後、カラムを15:85v/v％の10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH5.8)中DMAで最低7CV洗浄した。洗浄の完了後、溶出を、DMAを15:85v/v％で含有する100mMリン酸ナトリウム、pH7.6緩衝液を用いて5mL/分の流速で段階勾配によって開始した。260nmおよび280nmで監視することによって特定された溶出ピーク全体を収集し、プールした。
SEC(図16)によるHAカラム負荷ステップ中のフロースルーの分析は、フロースルー中にFab-オリゴヌクレオチド抱合体がほとんどまたは全く存在しないことを示した。約10.5分および約11.3分において、オリゴヌクレオチドペイロード種に起因するピークのみが観察された。逆に、プールされた溶出ピークのSEC分析は、抱合体種(図17)のみを示し、異なるオリゴヌクレオチド(例として、PMO)ペイロード負荷を有する抱合体のサイズ差に起因する複数のピークおよびショルダーを有する。10.5分または11.3分でのペイロード種のピークは観察されなかった。HA精製のためのFabに対する抱合体質量バランスをSECクロマトグラフィーによって推定した。これは、粗抱合反応生成物から24μgのFabを注入し(6μg/mL濃度で4μL注入)、HA溶出液プールから100％の回収を仮定して理論的に24μgのFabを注入することによって達成した。HA溶出液プールは、理論的には45mgのFabを含有する13.9mLであり、3.24μg/μLの理論的濃度を得た。24μgのFabの注射を達成するために、7.4μL注射を使用した。これらの2つのSECクロマトグラム(図18)の重ね合わせは、Fab-オリゴヌクレオチド抱合体としてのFabのほぼ完全な回収を示す。9.1分のピーク高さを使用して、HAクロマトグラフィー精製後の反応生成物の97％回収率を推定した。
45mgの反応スケールで、Amicon Ultra-15 30kDa遠心濾過デバイスを使用して、HA溶出液の50mM His(pH6.0)への緩衝液交換を行った。まず、カラムを4000rcfで回転させることによって、HA溶出液プールを約1.5mLに濃縮した。その後、3mLの50mM His(pH6.0)の添加によって緩衝液交換を行い、体積が約1.5mLに達するまで4000rcfで遠心分離によって濃縮した。このステップを、15体積相当の緩衝液を使用して合計5回繰り返して、最終精製抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体を生成した。次いで、得られた約1.5mLの精製抱合体(50mM His、pH6.0中)を、さらなる50mM His(pH6.0)で3.0mLの最終体積に希釈した。
最終的に精製された抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体をSEC、SDS-PAGEデンシトメトリー、およびBCAによって分析した。最終的な抱合体(図19Aおよび図19Bに示す)のSECは、HA精製後の抱合プールの対応するSECデータとほぼ同一であり、精製プロセスが高分子量種の形成を誘導しなかったことを示した。平均DAR、DAR種分布、および非抱合FabパーセントをSDS-PAGEデンシトメトリー(図20に示すSDS-PAGEゲル)によって計算し、データ分析をLi-Cor BiosciencesからのImage Studio Liteソフトウェアパッケージを用いて行った(計算結果を表10に示す)。精製抗TfR Fab-オリゴヌクレオチド抱合体の最終平均DARは1.96であり、8.1％の非抱合抗TfR Fabを包含している。BCAアッセイによってタンパク質濃度が10.5mg/mLであると測定され、これは、70％の全プロセス収率で、最終生成物中の合計31.4mgの抱合体を示している。
Figure 2023540746000070
［実施例10］
Fab-オリゴヌクレオチド抱合反応に対するBCN対Fabの比および反応条件の効果
反応前混合物からのBCNと抗TfRとの比の影響、ならびにオリゴヌクレオチド-Fab抱合反応におけるオリゴヌクレオチドおよびFab濃度の影響を調べるために、実施例8に記載の一般プロトコルに従って一連の反応を行った。使用されるオリゴヌクレオチドは、30ヌクレオチド長のPMOである。
第1の反応セットでは、以下の条件を使用して、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドとエンド-BCN-PEG4-PFPエステルとの間の予備反応を行った。2.44mMオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドを、1.63mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル(1.5:1mol:mol比)とDMAおよび25mM MES pH5.5緩衝液の1:1混合物中で反応させた。全反応前体積は0.37mLであり、反応前ステップを室温(約25℃)で18時間進行させた。
プレ反応が完了したら、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する粗(すなわち、非精製)プレ反応混合物を使用して、一連の抗TfR Fab抱合反応を設定した。抗TfR Fab抱合反応は、Fabに対して反応前混合物からの2、4、6、および10モル当量のBCNを使用して行った。他のすべての反応条件は、異なる抱合にわたって一定に保持された。抱合反応混合物において、Fab濃度は3mg/mLであり、50mM HEPES pH7.5緩衝液中15v/v％DMA中で反応あたり1mgの総Fabであった。抱合反応を23～25℃で18時間行った。各抱合体の最終的なDAR種およびDAR種の分布をSDS-PAGEデンシトメトリーによって決定し、結果を表11に示す。SDS-PAGEゲルの画像を図21に示す。
Figure 2023540746000071
第2の反応セットでは、以下の条件を使用して、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドとエンド-BCN-PEG4-PFPエステルとの間の予備反応を行った。6.77mMオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドを、4.84mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル(1.4:1mol:mol比)とDMAおよび25mM MES pH5.5緩衝液の1:1混合物中で反応させた。全反応前体積は0.160mLであり、反応前ステップを室温(約25℃)で90分間進行させた。
プレ反応が完了したら、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する粗(すなわち、非精製)プレ反応混合物を使用して、一連の抗TfR Fab抱合反応を設定した。抗TfR Fab抱合反応は、Fabに対して反応前混合物からの2、4、5、6、および8モル当量のBCNを使用して行った。他のすべての反応条件は、異なる抱合にわたって一定に保持された。抱合反応混合物において、Fab濃度は6mg/mLであり、50mM HEPES pH7.5緩衝液中15v/v％DMA中で反応あたり1mgの総Fabであった。抱合反応を23～25℃で19時間行った。各抱合体の最終平均DARをSDS-PAGEデンシトメトリーによって決定し、結果を表12に示す。SDS-PAGEゲルの画像を図22に示す。
Figure 2023540746000072
第3の反応セットでは、以下の条件を使用して、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドとエンド-BCN-PEG4-PFPエステルとの間の予備反応を行った。6.77mMオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドを、4.84mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル(1.4:1mol:mol比)とDMAおよび25mM MES pH5.5緩衝液の60:40混合物中で反応させた。全反応前体積は0.160mLであり、反応前ステップを室温(約25℃)で90分間進行させた。
プレ反応が完了したら、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する粗(すなわち、非精製)プレ反応混合物を使用して、一連の抗TfR Fab抱合反応を設定した。抗TfR Fab抱合反応は、Fabに対して反応前混合物からの2、4、5、6、8、および10モル当量のBCNを使用して行った。他のすべての反応条件は、異なる抱合にわたって一定に保持された。抱合反応混合物において、Fab濃度は6mg/mLであり、50mM HEPES pH7.5緩衝液中15v/v％DMA中で反応あたり1mgの総Fabであった。抱合反応を室温(約25℃)で19時間行った。各抱合体の最終平均DARおよびDAR 0のパーセンテージをSDS-PAGEデンシトメトリーによって決定し、結果を表13に示す(反応J、K、L、M、N、O)。
第4の反応セットでは、以下の条件を使用して、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドとエンド-BCN-PEG4-PFPエステルとの間の予備反応を行った。6.77mMオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドを、6.45mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル(1.05:1mol:mol比)とDMAおよび25mM MES pH5.5緩衝液の60:40混合物中で反応させた。全反応前体積は0.080mLであり、反応前ステップを室温(約25℃)で160分間進行させた。
プレ反応が完了したら、オリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-トリアゾール-PEG4-PFPエステルを含有する粗(すなわち、非精製)プレ反応混合物を使用して、一連の抗TfR Fab抱合反応を設定した。抗TfR Fab抱合反応は、プレ反応中のBCNの濃度に基づいて、Fabに対して5、6、および7モル当量のプレ反応混合物からのBCNを使用して行った。他のすべての反応条件は、異なる抱合にわたって一定に保持された。抱合反応混合物では、Fab濃度は6mg/mLまたは12mg/mLであり、反応当たりの総Fabはそれぞれ0.6mgおよび1.2mgであった。すべての反応は、25mM HEPES pH7.5緩衝液中の15v/v％DMA中で行った。抱合反応を室温(約25℃)で約18時間行った。各抱合体の最終平均DARおよびDAR 0のパーセンテージをSDS-PAGEデンシトメトリーによって決定し、結果を表13に示す(反応P、Q、R、S)。
Figure 2023540746000073
［実施例11］
反応前エンド-BCN-PEG4-PFPエステル加水分解
偽反応前試験を使用して、RP-UPLCによるPFPエステル加水分解速度を監視した。予備反応は、以下の最終反応条件を使用して行った。1:1 DMA中1.63mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル～25mM MES pH5.5緩衝液、20～25Cで20時間。UPLCクロマトグラフィー条件はセクション5.4.3に提供されている。サンプルをUPLCに1時間毎に注入して、時間の関数としてエンド-BCN-PEG4-PFPエステルピーク面積の減少を監視して、出発試薬のPFPエステル加水分解速度を監視した。さらに、エンド-BCN-PEG4-PFPエステルとオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジド(オリゴヌクレオチドはPMOであった)との間のクリック反応の速度も評価した。プレ反応は、以下の条件を使用して行った。20～25Cで20時間、1:1 DMA～25mM MES pH5.5緩衝液中1.63mMエンド-BCN-PEG4-PFPエステル、2.47mMオリゴヌクレオチド-PAB-VC-PEG3-アジドリンカー-ペイロード(モル比1:1.5)。この試験のために、反応中のエンド-BCN-PEG4-PFPエステルのピーク面積の減少を、20時間の総反応時間まで30分、1時間、または5時間毎にRP-UPLCによって監視した。結果を図23に示す。
［実施例12］
初期抗体-オリゴヌクレオチド分析
反応混合物を、高DAR生成物の製造効率について評価した。最初に、粗反応混合物、サンプルフロースルー、およびプールHA溶出液をSEC-UPLC分析(図24A～24C)によって評価した。粗反応混合物は、抗体-オリゴヌクレオチド抱合体ならびに非抱合オリゴヌクレオチド(図24A)を含有していた。サンプルフロースルーは、非抱合オリゴヌクレオチドの存在下で高DAR種の存在を示した(図24B)。非抱合の残留オリゴヌクレオチドが、プールされたHA溶出液中に存在した(図24C)。これらの結果は、緩衝液交換された最終抱合体(図25)で一致し、全体の収率は62％であった。SEC-UPLCによるプールHA溶出液およびサンプルフロースルーのさらなる分析は、pH7.3で100mMリン酸ナトリウムおよび10％MeCNを含む移動相緩衝液中での抱合体損失を示した(図26A～26B)。同じ反応条件での最終抗体断片-薬物抱合体(FDC)混合物は、非抱合オリゴヌクレオチド(潜在的にオリゴヌクレオチド二量体)および抱合オリゴヌクレオチドの47.2％回収率を含むと決定された(図27)。HA精製クロマトグラムは、低い抱合体精製および非抱合オリゴヌクレオチドの存在を示した(図28A～28B)。まとめると、これらの結果は、より高濃度の抗体-オリゴヌクレオチド抱合体を得るための改善された反応条件の必要性を示唆した。
［実施例13］
反応条件
高濃度の抗体-オリゴヌクレオチド抱合体を得るための条件を決定するために、反応条件を変化させた。しかし、IPA濃度の増加およびリン酸ナトリウム濃度の減少は、非抱合オリゴヌクレオチドのフロースルーおよび試料適用中のFDCの保持を改善するようであった(図30A～30C)。最後に、DMA濃度を増加させることは、反応効率を改善し、より高い数の抗体-オリゴヌクレオチド抱合体、およびより低い数の非抱合オリゴヌクレオチドをもたらした(表14)。
Figure 2023540746000074
 追加の態様
1.それぞれが1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体と、非連結オリゴヌクレオチドと、を含む混合物であって、
(i)オリゴヌクレオチドをval-citリンカーに連結して、第1の中間体を得ることと、
(ii)ステップ(i)で得られた第1の中間体をビシクロノニンを含む化合物と連結させて、第2の中間体を得ることと、
(iii)ステップ(ii)で得られた第2の中間体を抗体に連結して複合体を得ることと、
を含む方法によって製造され、
ここで、ビシクロノニンを含む化合物は、ステップ(iii)の反応において、ステップ(ii)の化合物の出発量の5％未満の量で存在し、任意に、オリゴヌクレオチドは、5'末端でval-citリンカーに連結されており、および/または抗体は、リジンを介して連結されている、前記混合物。
2.それぞれが1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体と、非連結オリゴヌクレオチドと、を含む混合物であって、
(i)オリゴヌクレオチドを式(A):
Figure 2023540746000075
 (A)、
式中、nは3である、のリンカーに連結させて、式(B):
Figure 2023540746000076
 (B)、
式中、nは3である、のオリゴヌクレオチドを提供することと、
(ii)式(B)のオリゴヌクレオチドを式(C):
Figure 2023540746000077
 (C)、
式中、mは4である、の化合物と接触させて、式(D):
Figure 2023540746000078
 (D)、
式中、nは3であり、mは4である、のオリゴヌクレオチドを提供することと、
(iii)式(D)のオリゴヌクレオチドを抗体と接触させて、式(E):
Figure 2023540746000079
 (E)、
式中、nは3であり、mは4である、の複合体を提供することと、
を含む方法によって製造され、
式(C)の化合物は、ステップ(ii)の反応における式(C)の化合物の出発量の5％未満の量でステップ(iii)の反応混合物中に存在する、前記混合物。
3.それぞれが1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体をプロセシングする方法であって、
(i)態様1または態様2に記載の混合物を、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂と、複合体が混合モード樹脂に吸着する条件下で接触させることであって、混合物が、アルキン基を含む微量の非連結抗体を含む、ことと、
(ii)複合体が混合モード樹脂から解離する条件下で複合体を混合モード樹脂から溶出させることと、
を含む、前記方法。
4.ステップ(i)の混合物が5.0～6.0のpHを有する、態様3に記載の方法。
5.ステップ(i)の混合物が以前の精製に供されていない、態様3または態様4に記載の方法。
6.ステップ(i)の混合物が微量のリン酸イオンおよび/または塩化物イオンを含む、態様3～5のいずれか1つに記載の方法。
7.ステップ(i)の混合物がリン酸イオンおよび/または塩化物イオンを含まない、態様3～5のいずれか1つに記載の方法。
8.混合モード樹脂がアパタイト樹脂である、態様3～5のいずれか1つに記載の方法。
9.アパタイト樹脂が、ヒドロキシアパタイト樹脂、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、ヒドロキシフルオロアパタイト樹脂、フルオロアパタイト樹脂、またはクロルアパタイト樹脂である、態様8に記載の方法。
10.非連結オリゴヌクレオチドがステップ(i)において混合モード樹脂に吸着しない、態様3～9のいずれか1つに記載の方法。
11.ステップ(i)において、非連結オリゴヌクレオチドの一部または全部が混合モード樹脂に吸着する、態様3～9のいずれか1つに記載の方法。
12.ステップ(i)とステップ(ii)との間の混合モード樹脂を、最大20mMのリン酸イオンおよび/または最大30mMの塩化物イオンを含む洗浄溶液で洗浄するステップをさらに含み、任意に、溶液は、最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大25mMの塩化物イオンを含む、態様11に記載の方法。
13.洗浄溶液が5.0～7.6のpHを有する、態様12に記載の方法。
14.洗浄ステップにおいて、ほとんどまたはすべての非連結オリゴヌクレオチドが混合モード樹脂から除去される、態様12または態様13に記載の方法。
15.ステップ(ii)が、少なくとも30mMのリン酸イオンおよび/または少なくとも50mMの塩化物イオンを含む溶出溶液を混合モード樹脂に適用して、複合体を溶出させることを含み、任意に溶出溶液が少なくとも100mMのリン酸イオンおよび/または少なくとも100mMの塩化物イオンを含む、態様3～14のいずれか1つに記載の方法。
16.溶出溶液が7.5～8.5のpHを有する、態様15に記載の方法。
17.抗体が完全長IgG、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、またはFvフラグメントである、態様3～16のいずれか1つに記載の方法。
18.抗体が抗トランスフェリン受容体抗体である、態様3～17のいずれか1つに記載の方法。
19.オリゴヌクレオチドが一本鎖である、態様3～18のいずれか1つに記載の方法。
20.オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、任意にgapmerである、態様19に記載の方法。
21.オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖であり、任意に二本鎖オリゴヌクレオチドがsiRNAであり、任意に一本鎖がsiRNAのセンス鎖である、態様20に記載の方法。
22.オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合を含み、任意に、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合がホスホロチオエート連結である、態様3～21のいずれか1つに記載の方法。
23.オリゴヌクレオチドが1つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、任意に、修飾ヌクレオチドが、2'-O-メトキシエチルリボース(MOE)、ロックド核酸(LNA)、2'-フルオロ修飾、またはモルホリノ修飾を含む、態様3～22のいずれか1つに記載の方法。
24.オリゴヌクレオチドが10～50ヌクレオチド長であり、任意に15～25ヌクレオチド長である、態様3～23のいずれか1つに記載の方法。
25.抗体がオリゴヌクレオチドの5'に共有結合的に連結している、態様3～24のいずれか1つに記載の方法。
26.抗体がオリゴヌクレオチドの3'に共有結合的に連結している、態様3～25のいずれか1つに記載の方法。
27.抗体がリジンを介して連結されている、態様3～26のいずれか1つに記載の方法。
28.ステップ(ii)から得られる溶離剤が検出不能なレベルの非連結オリゴヌクレオチドを含む、態様2～27のいずれか1つに記載の方法。
29.1つ以上の電荷中性オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体をそれぞれ含む複合体をプロセシングする方法であって、
(i)有機溶媒、複合体および非連結電荷中性オリゴヌクレオチドを含む混合物を、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂と、複合体が混合モード樹脂に吸着する条件下で接触させることと、
(ii)複合体が混合モード樹脂から解離する条件下で複合体を混合モード樹脂から溶出させることと、
を含む、前記方法。
30.混合モード樹脂がアパタイト樹脂である、態様29に記載の方法。
31.アパタイト樹脂が、ヒドロキシアパタイト樹脂、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂、ヒドロキシフルオロアパタイト樹脂、フルオロアパタイト樹脂、またはクロルアパタイト樹脂である、態様2に記載の方法。
32.有機溶媒が、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である、態様29～31のいずれか1つに記載の方法。
33.有機溶媒が、ステップ(i)の混合物中の5％～20％(v/v)であり、任意に、有機溶媒が、ステップ(i)の混合物中の15％(v/v)である、態様29～32のいずれか1つに記載の方法。
34.ステップ(i)の混合物がリン酸イオンまたは塩化物イオンを含まない、態様29～33のいずれか1つに記載の方法。
35.ステップ(i)の混合物が最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大20mMの塩化物イオンをさらに含む、態様29～34のいずれか1つに記載の方法。
36.ステップ(i)の混合物が5.0～6.0のpHを有する、態様29～35のいずれか1つに記載の方法。
37.非連結電荷中性オリゴヌクレオチドがステップ(i)において混合モード樹脂に吸着しない、態様29～36のいずれか1つに記載の方法。
38.ステップ(i)とステップ(ii)との間の混合モード樹脂を、有機溶媒を含む洗浄溶液で洗浄することをさらに含み、任意に、有機溶媒が、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である、態様29～37のいずれか1つに記載の方法。
39.有機溶媒が洗浄溶液中の5％～20％(v/v)であり、任意に有機溶媒が洗浄溶液中の15％(v/v)である、態様38に記載の方法。
40.洗浄溶液が、最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大20mMの塩化物イオンをさらに含む、態様38または態様39に記載の方法。
41.ステップ(ii)が、複合体を溶出するために混合モード樹脂に溶出溶液を適用することを含み、溶出溶液が有機溶媒を含み、任意に有機溶媒がジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である、態様29～40のいずれか1つに記載の方法。
42.有機溶媒が溶出溶液中10％～20％(v/v)であり、任意に有機溶媒が溶出溶液中10％(v/v)である、態様41に記載の方法。
43.溶出溶液が少なくとも30mMのリン酸イオンを含み、任意に溶出溶液が少なくとも100mMのリン酸イオンを含む、態様41または態様42に記載の方法。
44.溶出溶液が塩化物イオンを含まない、態様43に記載の方法。
45.溶出溶液が、徐々に増加する濃度のリン酸イオンを含み、任意に、リン酸イオンの濃度が少なくとも10mMから少なくとも100mMまで増加する、態様41または態様42に記載の方法。
46.溶出溶液が7.6～8.5のpHを有する、態様41から45のいずれか1つに記載の方法。
47.抗体が完全長IgG、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、scFv、またはFvフラグメントである、態様29～46のいずれか1つに記載の方法。
48.抗体が抗トランスフェリン受容体抗体である、態様29～47のいずれか1つに記載の方法。
49.電荷中性オリゴヌクレオチドが一本鎖である、態様29～48のいずれか1つに記載の方法。
50.電荷中性オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、態様49記載の方法。
51.電荷中性オリゴヌクレオチドがホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー(PMO)である、態様29～50のいずれか1つに記載の方法。
52.電荷中性オリゴヌクレオチドが10～50ヌクレオチド長であり、任意に20～30ヌクレオチド長である、態様29～51のいずれか1つに記載の方法。
53.抗体が電荷中性オリゴヌクレオチドの5'に共有結合的に連結している、態様29～52のいずれか1つに記載の方法。
54.抗体が電荷中性オリゴヌクレオチドの3'に共有結合的に連結している、態様29～53のいずれか1つに記載の方法。
55.抗体が、リンカー、任意にVal-citリンカーを介して電荷中性オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結される、態様29～54のいずれか1つに記載の方法。
56.リンカーが、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000080
 (G)
式中、nは3であり、mは4である、態様55に記載の方法。
57.複合体が、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000081
 (E)
式中、nは3であり、mは4であり、抗体はリジンを介して連結されている、態様56に記載の方法。
58.ステップ(i)の混合物中の複合体が、少なくとも約1.8の平均薬物抗体比(DAR)を有する、態様29～57のいずれか1つに記載の方法。
59.ステップ(ii)から得られる溶離液が検出不能なレベルの非連結電荷中性オリゴヌクレオチドを含む、態様29～58のいずれか1つに記載の方法。
60.複合体が、電荷中性オリゴヌクレオチドを抗体に連結することを介して製造され、電荷中性オリゴヌクレオチドが以下の構造を含み、
Figure 2023540746000082
 (B)
抗体は、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000083
 (F)
式中、nは3であり、mは4である、態様29～59のいずれか1つに記載の方法。
61.複合体が、電荷中性オリゴヌクレオチドを抗体に連結することを介して製造され、電荷中性オリゴヌクレオチドが以下の構造を含み、
Figure 2023540746000084
 (D)
式中、nは3であり、mは4である、態様29～59のいずれか一つの方法。
62.1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体を生成する方法であって、
(i)nが3である、以下の構造を含むオリゴヌクレオチドを得ることと、
Figure 2023540746000085
 (B)
(ii)mが4である、以下の構造を含む抗体を得ることと、
Figure 2023540746000086
 (F)
(iii)ステップ(i)のオリゴヌクレオチドとステップ(ii)で得られた抗体とを反応させて複合体を得ることと、
を含む、前記方法。
63.1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体を生成する方法であって、
(i)nが3であり、mが4である、以下の構造を含むオリゴヌクレオチドを得ることと、
Figure 2023540746000087
 (D)
(ii)抗体を得ることと、
(iii)ステップ(i)のオリゴヌクレオチドとステップ(ii)で得られた抗体とを反応させて複合体を得ることと、
を含む、前記方法。
64.複合体が、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000088
 (E)
式中、nは3であり、mは4であり、抗体はリジンを介して連結されている、態様62または態様63に記載の方法。
等価物および用語
例証的に本明細書に記載された開示は、好適には、本明細書に具体的には開示されないいずれかの要素(単数または複数)、限定(単数または複数)の非存在下において実施され得る。それゆえに、例えば、本出願の各事例において、用語「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかは、他の2つの用語のどちらかによって置き換えられ得る。採用された用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用され、かかる用語および表現の使用には、示されるおよび記載される特徴のいずれかの等価物またはそれらの部分を排除する意図はなく、種々の改変が本開示の範囲内で可能であることが認識される。それゆえに、本開示は好ましい態様によって具体的に開示されたが、本明細書に開示される概念の任意の特徴、改変、および変形が当業者によって頼られ得ることと、かかる改変および変形は本開示の範囲内であると考慮されることとは理解されるべきである。
加えて、本開示の特徴または側面がマーカッシュ群または代替物の他の群分けとして記載されるところでは、当業者は、本開示がそれによってマーカッシュ群または他の群のいずれかの個々の構成員または構成員のサブグループとしてもまた記載されることを認識するであろう。
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸の構造を記載する際には、配列表で提示される配列が参照され得ることは了解されるべきである。かかる態様において、実際のオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、指定された配列と本質的に同じかまたは類似の相補的な特性を保持しながら、指定された配列と比較して、1以上の代替的なヌクレオチド(例として、DNAヌクレオチドのRNAカウンターパート、またはRNAヌクレオチドのDNAカウンターパート)および/または1以上の修飾ヌクレオチドおよび/または1以上の修飾されたヌクレオチド間連結および/または1以上の他の改変を有し得る。
本発明を記載する文脈における(特に次の請求項の文脈における)用語「a」および「an」および「the」ならびに類似のレファレントの使用は、本明細書に別様に指し示されないかまたは文脈によって明瞭に否定されない限り、単数および複数両方をカバーすると解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「包含する」、および「含有する」は、別様に指摘されない限り、開放型の用語として解釈されるべきである(すなわち、「包含するが、これらに限定されない」を意味する)。本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別様に指し示されない限り、単に、範囲内に収まる各別個の値を個々に参照する簡略な方法として働くことを意図され、各別個の値は、それが本明細書に個々に記載される場合のように本明細書に組み込まれる。本明細書に別様に指し示されないかまたは別様には文脈によって明瞭に否定されない限り、本明細書に記載のすべての方法はいずれかの好適な順序で行われ得る。別様に請求されない限り、本明細書に提供されるいずれかのおよびすべての例または例示的な文言(例として、「などの」)の使用は、単に本発明をより良く解き明かすことを意図され、本発明の範囲に限定を課さない。本明細書のいかなる文言も、いずれかの請求されない要素を本発明の実施にとって必須であると指し示すものと解釈されるべきではない。
本発明の態様が本明細書に記載されている。それらの態様の変形は、先述の記載を読むことによって当業者には明らかになり得る。
本発明者は当業者がかかる変形を適当に採用することを予期し、本発明者は本発明が本明細書に具体的に記載されるとおりとは別様に実施されることを意図する。したがって、本発明は、然るべき法律によって許可される本明細書に添付される請求項に記載される主題のすべての改変および等価物を包含する。その上、それらのすべての可能な変形における上に記載された要素のいずれかの組み合わせは、本明細書に別様に指し示されないかまたは別様に文脈によって明瞭に否定されない限り、本発明によって包摂される。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの均等物を認識するか、またはせいぜい慣例的な実験作業を用いて確かめることができるであろう。かかる等価物は次の請求項によって包摂されることを意図される。

Claims (33)

1つ以上の電荷中性オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体をそれぞれ含む複合体をプロセシングする方法であって、
(i)有機溶媒、複合体および非連結電荷中性オリゴヌクレオチドを含む混合物を、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂と、複合体が混合モード樹脂に吸着する条件下で接触させることと、
(ii)複合体が混合モード樹脂から解離する条件下で複合体を混合モード樹脂から溶出させることと、
を含む、前記方法。
有機溶媒が、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である、請求項1に記載の方法。
有機溶媒が、ステップ(i)の混合物中の5％～30％(v/v)であり、任意に、有機溶媒が、ステップ(i)の混合物中の15％(v/v)である、請求項1または2に記載の方法。
ステップ(i)の混合物が最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大20mMの塩化物イオンをさらに含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
ステップ(i)とステップ(ii)との間の混合モード樹脂を、有機溶媒を含む洗浄溶液で洗浄することをさらに含み、任意に、有機溶媒が、ジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
有機溶媒が洗浄溶液中の5％～30％(v/v)であり、任意に有機溶媒が洗浄溶液中の15％(v/v)である、請求項5に記載の方法。
洗浄溶液が、最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大20mMの塩化物イオンをさらに含む、請求項5または請求項6に記載の方法。
ステップ(ii)が、複合体を溶出するために、混合モード樹脂に溶出溶液を適用することを含み、溶出溶液が有機溶媒を含み、任意に有機溶媒がジメチルアセトアミド(DMA)、イソプロピルアルコール(IPA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル(ACN)、またはプロピレングリコール(PG)である、請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
有機溶媒が溶出溶液中10％～30％(v/v)であり、任意に有機溶媒が溶出溶液中10％(v/v)である、請求項8に記載の方法。
溶出溶液が少なくとも30mMのリン酸イオンを含み、任意に溶出溶液が少なくとも100mMのリン酸イオンを含む、請求項8または請求項9に記載の方法。
溶出溶液が、徐々に増加する濃度のリン酸イオンを含み、任意に、リン酸イオンの濃度が少なくとも10mMから少なくとも100mMまで増加する、請求項8または請求項9に記載の方法。
溶出溶液が7.6～8.5のpHを有する、請求項8～11のいずれか一項に記載の方法。
1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体を製造する方法であって、
(i)以下の構造を含むオリゴヌクレオチド、
Figure 2023540746000089
 (B)、nが3である、を得ることと、
(ii)以下の構造を含む抗体、
Figure 2023540746000090
 (F)、mが4である、を得ることと、
(iii)ステップ(i)のオリゴヌクレオチドとステップ(ii)で得られた抗体とを反応させて複合体を得ることと、
を含む、前記方法。
1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体を製造する方法であって、
(i)以下の構造を含むオリゴヌクレオチド、
Figure 2023540746000091
 (D)、nが3であり、mが4である、を得ることと、
(ii)抗体を得ることと、
(iii)ステップ(i)のオリゴヌクレオチドとステップ(ii)で得られた抗体とを反応させて複合体を得ることと、
を含む、前記方法。
複合体が、以下の構造を含み、
Figure 2023540746000092
 (E)
式中、nは3であり、mは4であり、抗体がリジンを介して連結されている、請求項14に記載の方法。
複合体と非連結オリゴヌクレオチドとを含み、各複合体は、1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む、混合物であって、
(i)バリン-シトルリン配列を含む切断可能なリンカーに共有結合的に連結したオリゴヌクレオチドを含む第1の中間体を得ることと、
(ii)ステップ(i)で得られた第1の中間体をビシクロノニンを含む化合物と連結させて、第2の中間体を得ることと、
(iii)ステップ(ii)で得られた第2の中間体を抗体に連結して複合体を得ることと、
を含む、方法によって製造され、
ここで、ビシクロノニンを含む化合物は、ステップ(iii)の反応において、ステップ(ii)の化合物の出発量の5％未満の量で存在し、任意に、オリゴヌクレオチドは、5'末端にバリン-シトルリン配列を含む切断可能なリンカーに共有結合しており、および/または抗体は、リジンを介して連結している、
前記混合物。
複合体と、ii)非連結オリゴヌクレオチドと、を含み、各複合体は、1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む、混合物であって、
(i)1つ以上のオリゴヌクレオチドを式(A):
Figure 2023540746000093
 (A)、
式中nは3である、のリンカーと、
式(B):
Figure 2023540746000094
 (B)、
式中nは3である、の生成物を製造する反応条件下で、組み合わせることと、
(ii)式(B)の生成物を、式(C):
Figure 2023540746000095
 (C)、
式中mは4である、の化合物と、
式(D):
Figure 2023540746000096
 (D)、
式中nは3であり、mは4である、の生成物を製造する反応条件下で、接触させることと、
(iii)式(D)の生成物を、式(E):
Figure 2023540746000097
 (E)、
式中nは3であり、mは4である、
の複合体を製造する反応条件下で抗体と接触させることと、
を含む方法によって製造され、
式(C)の化合物が、ステップ(ii)の反応における式(C)の化合物の出発量の5％未満の量でステップ(iii)の反応において存在する、前記混合物。
それぞれが1つ以上のオリゴヌクレオチドに共有結合的に連結した抗体を含む複合体をプロセシングする方法であって、
(i)請求項16または請求項17に記載の混合物を、正に帯電した金属部位および負に帯電したイオン部位を含む混合モード樹脂と、複合体が混合モード樹脂に吸着する条件下で接触させることであって、混合物が、アルキン基を含む微量の非連結抗体を含む、ことと、
(ii)複合体が混合モード樹脂から解離する条件下で複合体を混合モード樹脂から溶出させることと、
を含む、前記方法。
ステップ(i)の混合物が以前の精製に供されていない、請求項18に記載の方法。
ステップ(i)の混合物が、微量のリン酸イオンおよび/または塩化物イオンを含む、18または19記載の方法。
ステップ(i)とステップ(ii)との間の混合モード樹脂を、最大20mMのリン酸イオンおよび/または最大30mMの塩化物イオンを含む洗浄溶液で洗浄することをさらに含み、任意に、溶液は、最大10mMのリン酸イオンおよび/または最大25mMの塩化物イオンを含む、請求項18に記載の方法。
洗浄溶液が5.0～7.6のpHを有する、請求項21に記載の方法。
ほとんどまたはすべての非連結オリゴヌクレオチドが洗浄ステップにおいて混合モード樹脂から除去される、請求項21または請求項22に記載の方法。
ステップ(ii)が、少なくとも30mMのリン酸イオンおよび/または少なくとも50mMの塩化物イオンを含む溶出溶液を混合モード樹脂に適用して、複合体を溶出させることを含み、任意に溶出溶液が少なくとも100mMのリン酸イオンおよび/または少なくとも100mMの塩化物イオンを含む、請求項18～23のいずれか一項に記載の方法。
溶出溶液が7.5～8.5のpHを有する、請求項24に記載の方法。
抗体が抗トランスフェリン受容体抗体である、請求項18～25のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが荷電オリゴヌクレオチドである、請求項18～26のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが負に帯電したオリゴヌクレオチドである、請求項27に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項27または請求項28に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、任意にgapmerである、請求項27～29のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖であり、任意に二本鎖オリゴヌクレオチドがsiRNAであり、任意に一本鎖がsiRNAのセンス鎖である、請求項30に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合を含み、任意に、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチド間結合がホスホロチオエート連結である、請求項18～31のいずれか一項に記載の方法。
オリゴヌクレオチドが1つ以上の修飾ヌクレオチドを含み、任意に、修飾ヌクレオチドが、2'-O-メトキシエチルリボース(MOE)、ロックド核酸(LNA)、2'-フルオロ修飾、またはモルホリノ修飾を含む、請求項18～32のいずれか一項に記載の方法。
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