JP2023538667A - Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２感染症に対するワクチン - Google Patents

Abstract

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症およびＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置のための新規ワクチン、ならびにそのワクチンを作製する方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月２４日に出願された米国仮出願第６３／０６９，１７２号；２０２０年１２月２８日に出願された米国仮出願第６３／１３１，２７８号；２０２１年５月４日に出願された同第６３／１８４，０６５号；２０２１年５月１４日に出願された同第６３／２０１，８４８号の優先権を主張する。上述の優先権出願の開示は、それらの全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、米国保健福祉省およびＡＳＰＲ－ＢＡＲＤＡによって授与されたＨＨＳＯ１００２０１６００００５Ｉ；ならびに米国陸軍契約司令部ＡＣＣ－ＮＪによって交付され、米国保健福祉省および国防総省の共同ミッションとして授与された他の取引契約（ＯＴＡ）Ｗ１５ＱＫＮ－１６－９－１００２の下、政府支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる配列表を含有する。２０２１年８月２３日に作成された配列表の電子コピーは、０２５５３２＿ＷＯ００３＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、５９，５８２バイトのサイズである。

コロナウイルスは、多種多様な哺乳動物種およびトリ種に感染するエンベローププラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスのファミリーである。そのウイルスゲノムは、ウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質で構成され脂質エンベロープによって囲まれているカプシドに包まれている。脂質エンベロープには、膜（Ｍ）タンパク質、エンベロープ低分子膜（Ｅ）タンパク質、ヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）、およびスパイク（Ｓ）タンパク質が包埋されている。Ｓタンパク質はウイルスの細胞への付着および侵入を媒介する。

ヒトコロナウイルス（ｈＣｏＶ）は呼吸器疾患を引き起こす。低病原性ｈＣｏＶは、上気道に感染し、軽度の感冒を引き起こす。高病原性ｈＣｏＶは、主に下気道に感染し、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）および中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）などの重度で死に至る場合もある肺炎を引き起こし得る。ｈＣｏＶによって引き起こされる重度の肺炎は、典型的には、急速なウイルス複製、大規模な炎症細胞浸潤、ならびに炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの上昇に関連し、急性肺損傷および急性呼吸窮迫症候群をもたらす（例えば、非特許文献１を参照のこと）。

２０１９年新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）としても公知の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、および最初のＳＡＲＳ－ＣｏＶに次いで７番目に知られた、ヒトに感染するコロナウイルスである（非特許文献２）。２００３年のＳＡＲＳの大流行に関与したＳＡＲＳ関連コロナウイルス株と同様、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はサルベコウイルス亜属のメンバーである（ベータ－ＣｏＶ Ｂ系統）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は進行中の２０１９～２１年のコロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因である（非特許文献３；非特許文献４；ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３；非特許文献５）。ヒトからヒトへの伝播は主として呼吸器液滴およびエアロゾルを介して行われる。

ＣＯＶＩＤ－１９の臨床プロファイルは多様である。大部分の症例では、感染した個人は無症候性であり得るかまたは軽度の症状を有し得る。症状を有する個人において、典型的に現れる症状としては、発熱、咳、息切れ、嗅覚脱失、および疲労が挙げられる。より重度の所見としては、急性呼吸窮迫症候群、脳卒中、およびサイトカイン放出症候群が挙げられ、これらは場合によっては死に至る。重度の疾病は、いかなる年齢の健康な個人にも生じる可能性があるが、主に高齢であるかまたは基礎疾患を有する成人において生じる。老年者は、最も一般的に冒され、高い死亡率を有する。重度の疾病および死亡に関連する併存疾患および他の状態としては、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、免疫不全状態、肥満、重篤な心臓病（例えば、心不全、冠動脈疾患、または心ミオパチー）、鎌状赤血球症、糖尿病、高血圧症、肝疾患、および肺線維症が挙げられる。ＣＯＶＩＤ－１９のリスクは、国ごと、および世界中の国の中の地域ごとでも異なる（例えば、非特許文献６；非特許文献７を参照のこと）。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、細胞表面タンパク質のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）への結合を介して細胞に感染する（非特許文献８；非特許文献９）。ウイルスはＳタンパク質を介して宿主細胞への侵入を達成する。Ｓタンパク質は、クラスＩ融合タンパク質であり、ウイルスが免疫監視機構を逃れるのに役立つ多糖で厚くコーティングされている。このタンパク質は前駆体Ｓポリペプチドのプロセシングにより産生される。前駆体ポリペプチドは、グリコシル化、シグナルペプチドの除去、および残基６８５と６８６との間でのプロタンパク質転換酵素フーリンによる切断を受けて、２つのサブユニットＳ１およびＳ２を生じる。Ｓ１およびＳ２はプロトマーとして会合したままである。Ｓタンパク質は、プロトマーの三量体であり、準安定な融合前立体構造で存在する。Ｓ１サブユニットが宿主細胞受容体に結合すると、Ｓ１サブユニットはタンパク質から放出される。残りのＳ２サブユニットは高度に安定な融合後立体構造に移行し、ウイルスと宿主細胞との間での膜融合、したがってウイルスの細胞への侵入を容易にする（例えば、非特許文献１０；非特許文献１１を参照のこと）。

Ｓタンパク質はワクチン開発において重要な標的である。このタンパク質は、融合前立体構造において、中和感受性が最も高いエピトープを提示すると予期される（例えば、非特許文献１０、前出を参照のこと）。首尾よい免疫化戦略は安定な抗原を必要とし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を融合前立体構造で安定化させる試みは記載されている（例えば、非特許文献１２を参照のこと）。

ＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされた公衆衛生危機は、とりわけ開発途上国においては依然として収まっていない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株は出現し続けている。継続するＣＯＶＩＤ－１９の脅威と戦うのに役立ち得る有効なワクチンを開発する緊急の必要性は依然として存在する。

Ｃｈａｎｎａｐｐａｎａｖａｒ ａｎｄ Ｐｅｒｌｍａｎ、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ（２０１７）３９（５）：５２９～３９ Ｚｈｕら、Ｎ Ｅｎｇ Ｍｅｄ．（２０２０）３８２（８）：７２７～３３ Ｃｈａｎら、Ｌａｎｃｅｔ（２０２０）３９５（１０２２３）：５１４～２３ Ｘｕら、Ｌａｎｃｅｔ Ｒｅｓｐｉｒ Ｍｅｄ．（２０２０）ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ２２１３－２６００（２０）３００７６－Ｘ Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら、ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０）ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０２．０７．９３７８６２ ｄｅ Ｓｏｕｚａ、Ｎａｔ Ｈｕｍ Ｂｅｈａｖ．（２０２０）４：８５６～８６５ Ｃｈｅｎ、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．（２０２０）１１：４３８ Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ（２０２０）１８１（２）：２７１～８０ Ｗａｌｌｓら、Ｃｅｌｌ（２０２０）１８１（２）：２８１～９２ Ｗｒａｐｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２０）１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｂ２５０７ Ｓｈａｎｇら、ＰＮＡＳ（２０２０）１１７（２１）：１１７２７～３４ Ｘｉｏｎｇら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０２０）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９４－０２０－０４７８－５

本開示は、単離されたポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端へと、（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３と少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６、９７、９８、または９９％）同一であり、配列番号１０の６８７～６９０位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１０の９９１位および９９２位における残基ＰＰとが維持されている配列；および（ｉｉ）配列番号７を含むことができる三量体化ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端に、昆虫またはバキュロウイルスタンパク質（例えば、キチナーゼ）に由来するシグナルペプチドをさらに含み；さらなる実施形態では、シグナルペプチドは配列番号３を含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３または（ｉｉ）配列番号１４の残基１９～１２４０と同一の配列を含むかまたは有する。

一態様では、本開示は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質であって、本明細書に記載される組換えポリペプチドの三量体である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を提供する。一部の実施形態では、タンパク質は、（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３または（ｉｉ）配列番号１４の残基１９～１２４０と同一の配列を有するポリペプチドの三量体である。

本開示はまた、本明細書における組換えポリペプチドをコードする核酸分子であって、場合により配列番号９を含む、核酸分子を提供する。

本開示はまた、本明細書におけるポリペプチドを発現させるためのバキュロウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドの発現は、バキュロウイルス発現ベクターにおけるポリヘドリンプロモーターの制御下にある。本開示は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を産生する方法であって、バキュロウイルスベクターを昆虫細胞に導入する工程、ポリペプチドの発現および三量体化を可能にする条件下で昆虫細胞を培養する工程、ならびに培養物から、シグナル配列を有しないポリペプチドの三量体である組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を単離する工程を含む、方法をさらに提供する。また、この方法によって産生される組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質も提供される。

本開示は、本明細書に記載される１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、７．５ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含む）であり、場合により界面活性剤（例えば０．００５％～１％、例えば０．２％の濃度の、例えばポリソルベート２０）を含む。一部の実施形態では、組成物は、組換えＳタンパク質、または２つ以上が含まれる場合はそれぞれの組換えＳタンパク質（またはまとめて、一価シナリオと多価シナリオの両方に言及する際に本明細書で使用する場合、「それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質」）を約２μｇ～約５０μｇ、例えば、約２μｇ～約４５μｇまたは約５μｇ～約５０μｇ（例えば、２．５、５、１０、１５、または４５μｇ）含む。あるいは、上述のタンパク質量は、組成物における総タンパク質量である。組成物が２つまたはそれ以上のタンパク質を有すると記載される場合、これらのタンパク質は互いに異なることが意図されている。

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、水中油型エマルションであるアジュバントをさらに含み、免疫原性組成物の各用量（例えば、約０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、または０．７ｍＬにおける）について、免疫原性組成物は、（ｉ）それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質約２μｇ～約５０μｇ、例えば、約２μｇ～約４５μｇまたは約５μｇ～約５０μｇ（例えば、２．５、５、１０、１５、または４５μｇ）と、（ｉｉ）１用量のアジュバントであって、アジュバントの各用量は０．２５ｍＬの容量であり、７．５ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含むものなどのリン酸緩衝生理食塩水中スクアレン１２．５ｍｇ、オレイン酸（モノオレイン酸）ソルビタン１．８５ｍｇ、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル２．３８ｍｇ、およびマンニトール２．３１ｍｇを含むか、またはそれらを混合することによって調製される、アジュバントとを含むか、またはそれらを混合することによって調製される。あるいは、上述のタンパク質量は、組成物における総タンパク質量である。一部の実施形態では、組成物は、１つ（一価）またはそれ以上（多価）の異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。例えば、組成物は、２つ（二価）、３つ（三価）、または４つ（四価）の異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。

一部の実施形態では、本明細書における免疫原性組成物は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含み、組成物の用量（例えば、０．２ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．３ｍＬ、０．４ｍＬ、０．５ｍＬ、または０．６ｍＬにおける）ごとに、組成物は、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質２μｇ～５０μｇ、例えば、約２μｇ～約４５μｇまたは約５μｇ～約５０μｇ（例えば、２．５、５、１０、１５、または４５μｇ）、リン酸二水素ナトリウム一水和物０．０９７ｍｇ、リン酸水素ナトリウム十二水和物０．６５ｍｇ（または無水リン酸水素二ナトリウム０．２６ｍｇ）、塩化ナトリウム２．２ｍｇ、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）５０～６００（例えば、５５または５５０）μｇ、および水約０．２５ｍＬ（０．２５ｍＬまでの十分量の水）を含むか、またはそれらを混合することによって調製される。あるいは、上述のタンパク質量は、組成物における総タンパク質量である。

一部の実施形態では、免疫原性組成物０．２５または０．５ｍＬごとに、組成物は、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を２．５μｇ含み、場合により、組成物は、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。あるいは、上述のタンパク質量は、組成物における総タンパク質量である。

一部の実施形態では、免疫原性組成物０．２５または０．５ｍＬごとに、組成物は、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を５μｇ含み、場合により、組成物は、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。あるいは、上述のタンパク質量は、組成物における総タンパク質量である。

一部の実施形態では、免疫原性組成物０．２５または０．５ｍＬごとに、組成物は、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を１０μｇ含み、場合により、組成物は、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。あるいは、上述のタンパク質量は、組成物における総タンパク質量である。

一部の実施形態では、免疫原性組成物の各用量は、アジュバントを含有しないで０．２５ｍＬの容量であるか、またはアジュバントを含有して０．５ｍＬの容量である。

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号１０の残基１９～１２４３を含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質および／または配列番号１４の残基１９～１２４０を含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。

本開示はまた、本明細書における免疫原性組成物を含有する製造物品、例えば容器を提供する。一部の実施形態では、容器は、例えば免疫原性組成物０．２５ｍＬまたは０．５ｍＬを含有する単回用量の免疫原性組成物を含有する。一部の実施形態では、容器は充填済み使い捨てシリンジである。他の実施形態では、容器は複数回用量の免疫原性組成物を含有する。

本開示はまた、筋肉内ワクチン接種のためのキットであって、２つの容器を含み、第１の容器は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む医薬組成物を含有し、第２の容器は、アジュバントを含有する、キットを提供する。第２の容器は、トコフェロールとスクアレンとをどちらも含むということがなく、アジュバントＡＳ０３も含まない。一部の実施形態では、第１の容器は、１回またはそれ以上の用量の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含み、タンパク質の各用量は、（合計でまたは別個に）約２～５０、２～４５、または５～５０（例えば、２．５、５、１０、１５、２０、３０、４０、または４５）μｇであり、場合により（ｉ）７．５ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を含むリン酸緩衝生理食塩水０．２５ｍＬにおいて提供され、場合により、ＰＢＳは、０．００５％～１％（例えば、０．２％）のポリソルベート２０を含むか、または（ｉｉ）リン酸二水素ナトリウム０．０９７５ｍｇ、無水リン酸水素二ナトリウム０．２６ｍｇ、塩化ナトリウム２．２ｍｇ、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）５０～６００（例えば、５５もしくは５５０）μｇ、および水約０．２５ｍＬ（０．２５ｍＬまでの十分量の水）を含む。一部の実施形態では、各抗原用量は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を（２つ以上のタンパク質の場合は、合計でまたは別個に）２．５、５、１０、１５、２０、３０、４０、または４５μｇ含み、場合により、抗原用量は、（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３を含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、（ｉｉ）配列番号１４の残基１９～１２４０を含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。

一部の実施形態では、第２の容器は、１回またはそれ以上の用量のアジュバントを含み、アジュバントの各用量は、０．２５ｍＬの容量であり、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、７．５ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、および場合によりポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）を含む）中スクアレン１２．５ｍｇ、モノオレイン酸ソルビタン１．８５ｍｇ、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル２．３８ｍｇ、およびマンニトール２．３１ｍｇを含む。本開示は、ワクチンキットを作製する方法であって、本明細書における免疫原性組成物の抗原構成成分および／またはアジュバント構成成分を提供する工程、ならびにそれらを滅菌容器に包装する工程を含む、方法をさらに提供する。一部の実施形態では、方法は、免疫原性組成物の組換えＳタンパク質およびアジュバントを提供する工程、ならびにタンパク質およびアジュバントを別個の滅菌容器に包装する工程を含む。

本開示は、それを必要とする対象（例えば、ヒト対象）においてＣＯＶＩＤ－１９を防止または改善する方法であって、対象に予防有効量の免疫原性組成物を投与する工程を含む、方法をさらに提供する。一部の実施形態では、予防有効量は単回用量または２回もしくはそれ以上の用量で投与することができる。一部の実施形態では、予防有効量は、１用量当たり約２～５０μｇ、場合により１用量当たり５、１０、１５、または４５μｇの、単回用量または２回もしくはそれ以上の用量で筋肉内投与される組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（２つ以上のタンパク質の場合は、合計または別個）である。一部の実施形態では、方法は、２用量の免疫原性組成物を約２週間～約３か月の間隔で対象に投与する工程を含み、免疫原性組成物の各用量は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で５または１０μｇ含む。間隔は、例えば、約３週間もしくは約２１日、または約４週間もしくは約２８日、または約１か月であり得る。

一部の実施形態では、投与する工程の前に、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を発症した）ことがあってもよいか、または第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されたことがある。一部の実施形態では、投与する工程の前に、対象は、遺伝子もしくはサブユニットワクチン、または死滅ワクチンを接種されたことがあってもよい。一部の実施形態では、投与する工程の前に、対象は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ抗原をコードするｍＲＮＡを含む遺伝子ワクチンを接種されたことがある。一部の実施形態では、投与する工程は、感染から（例えば、回復から）、または対象が第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されてから４週間、１か月、３か月、６か月、または１年後に行うことができる。

一部の実施形態では、本明細書の方法において、免疫原性組成物は、アジュバントを含有してまたは含有しないで、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を２．５または５μｇ含み得る。

一部の実施形態では、本免疫原性組成物は、ブースターワクチンとして、過去にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した対象、または同じかもしくは異なるウイルス株に対する第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されたことがある対象に使用される。第１のワクチンは、死滅ワクチン、サブユニットワクチン、または遺伝子ワクチン（例えば、ｍＲＮＡもしくはウイルスベクターワクチン）であり得る。さらなる実施形態では、遺伝子ワクチンは、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ抗原をコードするｍＲＮＡを含み、場合により、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ抗原は、配列番号１、４、１０、１３、もしくは１４、またはその抗原性断片を含む。ある特定の実施形態では、本免疫原性組成物は、感染から、または対象が第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されてから約４週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、約７か月、約８か月、約９か月、約１０か月、約１１か月、約１年、またはそれ以上後に対象に投与される。一部の実施形態では、ブースターの時期は、感染から（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９からの回復から）または一次ワクチン接種から約４～約１０か月（例えば、約８か月）後である。

また、場合により本明細書に開示される方法における、ＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置のための医薬の製造のための組換えタンパク質または免疫原性組成物の使用、および場合により本明細書に開示される方法における、ＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置における使用のための組換えタンパク質または免疫原性組成物が本明細書において提供される。

本発明の他の構成、目的、および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示しているが、限定としてではなく例示としてのみ与えられていることが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者に明らかとなるだろう。

組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のバキュロウイルス発現カセットを含有する構築物１の設計を示す図である。発現カセットは、ポリヘドリンプロモーターと、キチナーゼシグナル配列（「ｓｓ」）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメインを含有するポリペプチドのコード配列とを含み、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメインは、Ｓ１／Ｓ２接合部の推定フーリン切断部位に突然変異、およびＳ２サブユニットに二重プロリン置換を含有する。図１は、記載順に、それぞれ配列番号５および６を開示する。 合成されたｇＢｌｏｃｋ断片を有するＳａｐＩ消化ｐＰＳＣ１２ＤＢ－ＬＩＣトランスファープラスミドの構築を示す概略図である。ＳａｐＩ線状化トランスファープラスミドは灰色で示し、ポリヘドリンプロモーターは緑色の矢印で示し、ｇＢｌｏｃｋ断片は、黄色、青色、および橙色で示し、各重複配列を同一の色で示す（上段のパネル）。ｐｒｅＳ ｄＴＭ遺伝子を含有する最終トランスファープラスミドを下段のパネルに示す。 ｇＢｌｏｃｋ断片の５’および３’末端配列を示す図である（記載順に、それぞれ配列番号１５～２４）。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を発現させるためのバキュロウイルス構築物を生成するプロセスを示す図である。ＭＶ：マスターウイルス。 ０日目／２１日目にアジュバントを含有しないｐｒｅＳ ｄＴＭおよびＳ ｄＴＭを注射したマウスにおける２１日目および３６日目の血清Ｓ特異的ＩｇＧレベルを示すプロットである。力価はＯＤ＝０．２の希釈倍率の逆数として表す。ＥＵ：ＥＬＩＳＡ単位。ｐｒｅＳ ｄＴＭ：膜貫通および細胞質ドメインを欠失した組換え安定化融合前ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（配列番号１０）。Ｓ ｄＴＭ：膜貫通および細胞質ドメインを欠失した組換え非安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質。 注射したマウスにおける２１日目および３６日目の、アジュバントＡＦ０３のＳ特異的ＩｇＧレベルに対する効果を示すプロットである。力価はＯＤ＝０．２の希釈倍率の逆数として表す。薄い色の図形：２１日目。濃い色の図形：３６日目。 Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスにおいてＡＦ０３の非存在下または存在下のｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発された、３６日目のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の中和力価を示すプロットである。中和は、３６日目に免疫化マウスから得た血清抗体のプラーク減少中和力価５０％（ＰＲＮＴ_５０）で表す。下方の水平破線は、出発希釈倍率の１／２である定量下限値（ＬＬＯＱ）を示す。上方の水平破線は、試験を行った最高希釈倍率である定量上限値（ＵＬＯＱ）を示す。Ｙ軸は、細胞単層において計数されたウイルスプラークの数の５０％減少を示す限界希釈倍率である。 Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスにおいてＡＦ０３の非存在下または存在下のｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発された、３６日目の個々のＳ特異的ＩｇＧ_１およびＩｇＧ_２ａ価（Ｌｏｇ_１０ＥＵ）を示すプロットである。バー＝平均。水平点線＝ＬＬＯＱ。 Ｓｗｉｓｓ ＷｅｂｓｔｅｒマウスにおいてＡＦ０３の存在下のｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発された、３６日目の個々のＳ特異的ＩｇＧ_２ａ／ＩｇＧ_１比（×１００）を示すプロットである。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＡＦ０３の存在下のｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発された、３６日目のＳ１特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を示すプロットである。バー：平均％。 ５または１５μｇの標的用量のＡＦ０３アジュバント含有または非含有ｐｒｅＳ ｄＴＭを用いて免疫化したアカゲザルにおける、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合前Ｓタンパク質に対する血清ＩｇＧのレベルを示すプロットである。ＩｇＧレベルは、０日目、２１日目、および２８日目に測定した。Ｘ軸における「－」はビヒクル対照を示す。ビヒクルはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）である。Ｙ軸はＥＵの対数スケールを表す。 アカゲザルにおいてＡＦ０３の非存在下または存在下のｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発された、２１日目および２８日目のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の中和力価を示すプロットである。図７と同じ研究由来の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を呈するＩｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ偽ウイルスに対する中和抗体の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）力価を測定した。Ｙ軸はＩＣ_５０力価のＬｏｇ_１０値を表す。「Ｃｏｎｖ」：ヒトＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２回復期血清（高力価）。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＩＭＩＣ ＣＤ４^＋リンパ組織等価物（ＬＴＥ）アッセイにおいて測定した、５０名のヒトドナー由来のヒトＰＢＭＣにおいてｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発されたＳ特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ１プロファイルを解析するグラフのパネルである。ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－２の分泌を解析した。グラフは、３種類のサイトカインを分泌するＣＤ４^＋ＣＤ１５４^＋細胞の百分率を非ワクチン条件と比較して示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＩＭＩＣ ＣＤ４^＋ＬＴＥアッセイにおいて測定した、５０名のヒトドナー由来のヒトＰＢＭＣにおいてｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発されたＳ特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ２プロファイルを解析するグラフのパネルである。ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１７の分泌を解析した。グラフは、３種類のサイトカインを分泌するＣＤ４^＋ＣＤ１５４^＋細胞の百分率を非ワクチン条件と比較して示す。 脂質ナノ粒子製剤を用いるｍＲＮＡ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンであるｍＲＮＡ－ＶＡＣ２によるワクチン接種後９０日目のＮＨＰにおける中和力価の低下を示す１組のグラフである。カニクイザルの群（ｎ＝４）に、１用量当たり１５、４５、または１３５μｇのｍＲＮＡ－ＶＡＣ２を０日目および２１日目にワクチン接種し、示された時点において採取した血清サンプルを偽ウイルス（ＰｓＶ）中和アッセイ（パネルａ）およびマイクロ中和（ＭＮ）アッセイ（パネルｂ）において試験した。各記号は個々のサンプルを表し、線は群の幾何平均を表す。ＩＤ_５０として示されるサンプルの中和価は、アッセイチャレンジウイルス用量と比較した場合にウイルス感染力が５０％低下した最高試験血清希釈倍率の逆数として定義した。９３のヒト回復期（Ｃｏｎｖ）血清のＰｓＶおよびＭＮ価を、他のサンプルと同じＹ軸のスケールにおいて別個に示す。 ＡＦ０３をアジュバントとしたｐｒｅＳ ｄＴＭ（ｒＡｇ／ＡＦ０３）を用いた１２３日目のブースティング後３、１４、２８、４２日目の強固な中和応答を示すグラフである。カニクイザルの群（ｎ＝４）に、１用量当たり１５、４５、または１３５μｇのｍＲＮＡ－ＶＡＣ２を０日目および２１日目に予めワクチン接種した。１２３日目に、全てのプライム用量群の６匹のＮＨＰを無作為化し、ｒＡｇ／ＡＦ０３ ３μｇを用いてブーストした（ｎ＝６）。３匹の対照ナイーブＮＨＰを、ｒＡｇ／ＡＦ０３ ３μｇを用いて免疫化した。免疫化の３日前（－３日目）、１４、２８、および４２日後に採取した血清サンプルをＭＮアッセイにおいて試験した。各記号は個々のサンプルを表し、線は群の幾何平均を表す。ＩＤ_５０として示されるサンプルの中和価は、図１１と同様に定義した。 ｒＡｇ／ＡＦ０３を用いた１２３日目のブースティング後の強固な結合抗体応答を示すグラフである。カニクイザルの群（ｎ＝４）に、１用量当たり１５、４５、または１３５μｇのｍＲＮＡ－ＶＡＣ２を０日目および２１日目にワクチン接種した。１２３日目に、全ての用量群の１２匹のＮＨＰを無作為化し、ｒＡｇ／ＡＦ０３ ３μｇを用いてブーストした（ｎ＝６）。３匹の対照ナイーブＮＨＰを、ｒＡｇ／ＡＦ０３ ３μｇを用いて免疫化した。免疫化の３日前（－３日目）、１４、２８、および４２日後に採取した血清サンプルをＭＮアッセイにおいて試験した。各記号は個々のサンプルを表し、線は群の幾何平均を表す。ＩＤ_５０として示されるサンプルの中和価は、図１１と同様に定義した。 ｍＲＮＡ－ＶＡＣ１をワクチン接種したＮＨＰ由来のＰＢＭＣを用いて得られたＴ細胞サイトカインプロファイルを示すグラフのパネルである。４２日目（２回目のｍＲＮＡ－ＶＡＣ１注射の２１日後）に採取したＰＢＭＣを、Ｓオープンリーディングフレーム全体に相当するＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ Ｓタンパク質ペプチドプールと共に一晩インキュベートした。ＩＦＮ－γ（左側のパネル）またはＩＬ－１３（右側のパネル）を分泌するＰＢＭＣの頻度を、ＰＢＭＣ１００万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として算出した。各記号は個々のサンプルを表し、棒は群の幾何平均を表す。点線は定量下限を表す。 ｍＲＮＡ－ＶＡＣ１をワクチン接種し（０日目および２１日目）、１２９日目にｒＡｇ／ＡＦ０３を用いてブーストしたＮＨＰ由来の１７１日目のＰＢＭＣを用いて得られたＴ細胞サイトカインプロファイルを示すグラフのパネルである。ブーストワクチン接種後４２日目に採取したＰＢＭＣを、Ｓオープンリーディングフレーム全体に相当した２種類のペプチドプールと共にインキュベートした。ＩＦＮ－γ（上段のパネル）またはＩＬ－１３（下段のパネル）を分泌するＰＢＭＣの応答を、ＰＢＭＣ１００万個当たりのＳＦＣとして算出した。各記号は個々のサンプルを表し、棒は群の幾何平均を表す。点線は定量下限を表す。

本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９に対する防御となる免疫原性組成物を提供する。組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に由来し、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系において発現する組換えタンパク質を含む。組換えタンパク質は、Ｓタンパク質の膜貫通および細胞質ドメインの全部または一部を欠く一方で、Ｓタンパク質の細胞外部分（例えば、Ｓタンパク質外部ドメインの全体または一部）を含み得る。組換えタンパク質は、３つの同一のサブユニットポリペプチドを含み（すなわち、ホモ三量体）、それぞれは、安定化した天然型融合前三量体配置における３つのサブユニットポリペプチドの三量体化を容易にするバキュロウイルス／昆虫細胞系での発現に最適化された三量体化モチーフを含有する。免疫原性組成物は、スクアレンベースＡＦ０３アジュバント（以下、「ＡＦ０３」）を含んでもよい。

本明細書における免疫原性組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブヒト対象における症候性ＣＯＶＩＤ－１９の防止、中等度～重度のＣＯＶＩＤ－１９の防止（例えば、入院または死の防止）、無症候性感染の防止のために使用することができ、同種適合株に対する免疫原性、ウイルス負荷の減少、および／または流行している変異型株に対する防御を誘発することができる。別段の指示がない限り、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２「変異株」とは、Ｓタンパク質におけるアミノ酸が、起源である武漢株（または「Ｄ６１４株」；配列番号１）と異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を指す。

本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」、「ワクチン」、および「ワクチン組成物」という用語は、交換可能であり、ＣＯＶＩＤ－１９症状の緩和ならびに疾患からの回復および生存の向上を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する予防的防御を誘発することができる構成成分を含有する組成物を指す。

本明細書で使用する場合、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントとは、問合せ配列と参照配列とを最大の同一性を求めてアラインメントした場合における、参照配列の残基と同一である問合せ配列におけるアミノ酸残基の百分率を指す。相同配列は、参照配列と同じ長さであっても、それより短くても（例えば、参照配列の少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）の長さであっても）よい。

Ｉ．免疫原性組成物の抗原構成成分
本開示の免疫原性組成物は組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む。組換えタンパク質は、ウイルスエンベロープにおいて天然型融合前三量体立体構造を維持するために安定化される。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は１２７３個のアミノ酸残基を有する。Ｓタンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＹＰ＿００９７２４３９０において入手可能である。配列を以下に示す。シグナル配列は四角で囲み（ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ（配列番号２））、膜貫通および細胞内ドメインは下線で示す。Ｓ１およびＳ２接合部は残基６８５と６８６との間にあり、これらの残基は太字かつ下線で示す。

本明細書における組換えＳタンパク質は、３つの同一のポリペプチド（本明細書では「組換えＳポリペプチド」）で構成される。成熟前、各組換えＳポリペプチドは、昆虫細胞におけるタンパク質発現に好適なシグナル配列を含んでもよい。例えば、シグナル配列は昆虫またはバキュロウイルスタンパク質に由来する。シグナル配列はまた、人工シグナル配列であり得る。一部の実施形態では、シグナル配列は、キチナーゼおよびＧＰ６４などの昆虫またはバキュロウイルスタンパク質に由来する。例示的なキチナーゼシグナル配列は、野生型キチナーゼシグナル配列
ＭＬＹＫＬＬＮＶＬＷ ＬＶＡＶＳＮＡ（配列番号１１）
または突然変異キチナーゼシグナル配列
ＭＰＬＹＫＬＬＮＶＬ ＷＬＶＡＶＳＮＡ（配列番号３）
である。このキチナーゼシグナル配列と相同（例えば、少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％同一）である配列もまた、シグナルペプチド機能が保持されている限り、使用することができる。米国特許第８，５４１，００３号もまた参照のこと。

本明細書における組換えＳタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメイン配列、例えば、配列番号１の残基１４～１，２１１に対応する配列を含む。例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質外部ドメイン配列は以下のように示される：

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、本明細書にさらに記載されるある特定のアミノ酸置換を除いては配列番号４の配列を含むことができ、配列番号４と少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％）同一である。さらなる実施形態では、配列番号４の６６９～６７２位における残基（太字）は残基ＧＳＡＳ（配列番号６）に変更される、ならびに／または配列番号４の９７３位および７４位における残基（下線）は残基ＰＰに変更される。

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックにおいて流行している変異株に見出される１つまたはそれ以上の共通の突然変異を含む。そのような突然変異の１つは、現在の世界中でのＣＯＶＩＤ－１９罹患の大部分に関連するＤ６１４Ｇ突然変異（配列番号１に従った番号付け）である。組換えＳタンパク質に含まれる場合がある他の突然変異は、Ｗ１５２Ｃ、Ｋ４１７Ｔ／Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｖ４４５Ｉ、Ｇ４４６Ａ／Ｓ、Ｌ４５２Ｒ、Ｙ４５３Ｆ、Ｌ４５５Ｆ、Ｆ４５６Ｌ、Ａ４７５Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｔ４７８Ｉ／Ｋ／Ａ、Ｖ４８３Ａ／Ｆ／Ｉ、Ｅ４８４Ｑ／Ｋ／Ｄ／Ａ、Ｆ４９０Ｓ／Ｌ、Ｑ４９３Ｌ／Ｒ、Ｓ４９４Ｐ／Ｌ、Ｙ４９５Ｎ、Ｇ４９６Ｌ、Ｐ４９９Ｈ、Ｎ５０１Ｙ、Ｖ５０３Ｆ／Ｉ、Ｙ５０５Ｗ／Ｈ、Ｑ５０６Ｈ／Ｋ、およびＰ６８１Ｈ突然変異（配列番号１に従った番号付け）のうちの１つまたはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、突然変異Ｎ４４０Ｋ、Ｔ４７９Ｉ／Ｋ／Ａ、およびＤ６１４Ｇのうちの１つまたはそれ以上を含み得る。

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、Ｂ．１．１．７（イギリスまたはアルファ変異株；例えば、Ｎ５０１Ｙ／Ｐ６８１Ｈ／Ｈ６９／Ｖ７０の欠失）、Ｂ．１．３５１（南アフリカまたはベータ変異株；例えば、Ｋ４１７Ｎ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ）、Ｂ１．６１７（インドまたはデルタ変異株；例えば、Ｌ４５２Ｒ／Ｅ４８４Ｑ突然変異）、Ｐ．１（ブラジルまたはガンマ変異株；例えば、Ｋ４１７Ｔ／Ｅ４８４Ｋ／Ｎ５０１Ｙ）、およびＣＡＬ．２０Ｃ株（ａｋａ．Ｂ．１．４２９；カリフォルニアまたはイプシロン変異株；例えば、Ｗ１５２Ｃ／Ｌ４５２Ｒ）などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に見出される１つまたはそれ以上の突然変異を含む。

組換えＳタンパク質における外部ドメイン配列は、宿主細胞（例えば、昆虫細胞）におけるタンパク質の発現および産生タンパク質の安定性を向上させるために改変してもよい。一部の実施形態では、Ｓ外部ドメイン配列は、Ｓ１サブユニットとＳ２サブユニットとの接合部におけるプロタンパク質転換酵素（ＰＰＣ）モチーフ（フーリン切断部位）を除去する突然変異を含有する。例えば、フーリン切断部位における配列ＲＲＡＲ（配列番号５；配列番号１の残基６８２～６８５に対応）は、ＧＳＡＳ（配列番号６）に変更される。そのような突然変異は、未変性Ｓタンパク質の融合前立体構造を保存するのに役立つ。

一部の実施形態では、外部ドメイン配列は、中和応答を生じる可能性がより高い融合前エピトープの抗原提示を容易にするために、組換えＳタンパク質をより安定な立体構造に維持するのに役立つ他の突然変異を含有する。例えば、配列番号１の残基９８６および９８７に対応するアミノ酸（ＫＶ）はＰＰに突然変異される（例えば、Ｗｒａｐｐ、前出；Ｋｉｒｃｈｄｏｅｒｆｅｒら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１８）８：１５７０１；Ｘｉｏｎｇ、前出を参照のこと）。

本明細書における組換えＳタンパク質は、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系での発現に最適化された三量体化ドメインをＣ末端領域に含み、その結果、Ｓタンパク質は未変性Ｓタンパク質の安定化した融合前立体構造をとることができる。フォルドンドメインコード配列は、Ｓ外部ドメインコード配列の最後のコドンと停止コドンとの間に挿入することができる。一部の実施形態では、三量体化ドメインは、Ｔ４ファージのフィブリチンのフォルドンドメインに由来する（例えば、Ｍｅｉｅｒら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００４）３４４（４）：１０５１～６９；国際公開第２０１８／０８１３１８号を参照のこと）。例示的なフォルドン配列を以下に示す：
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧ ＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷ ＶＦＬＳＴＦＬ（配列番号７）。

一部の実施形態では、フォルドン配列は、宿主細胞における組換えタンパク質の発現を増強するように最適化してもよい。例えば、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属の細胞）における組換えタンパク質の発現を増強するために、フォルドン配列をコードする配列をコドン最適化してもよい。以下は、フォルドンドメインの天然のコード配列（上）およびコドン最適化型（下）を示す（ヌクレオチド点突然変異はアスタリスクによって示される）：

組換えＳタンパク質は、精製を容易にするためにタグ（例えば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、またはＶ５タグ）を含んでもよい。

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、以下の配列を有するが、プロセシングされて構築された後はシグナル配列を有しない、ポリペプチドの三量体であり得る。以下の配列において、シグナル配列（残基１～１８）は下線、フォルドン配列（残基１２１７～１２４３）は二重下線で示し、野生型配列に対する突然変異（人工的に導入した）は太字かつ下線で示す（残基６８７～６９０および９９１～９９２）。このタンパク質は、本明細書において「ｐｒｅＳ ｄＴＭ」または「Ｄ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭ」とも称される。

配列番号１０と相同である配列もまた使用することができる。例えば、配列が配列番号１０と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６、９７、９８、または９９％）同一である組換えＳポリペプチドが使用可能である。相同配列は、配列番号１０と同じ長さであっても、配列番号１０より１０％以下（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％以下）だけ短いかまたは長くてもよい。さらなる実施形態では、配列番号１０の６８７～６９０位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）ならびに／または配列番号１０の９９１位および９９２位における残基ＰＰは、そのような相同配列に維持される。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、例えば、初期パラメータを使用するＢＬＡＳＴ（登録商標）（米国立医学図書館の米国立生物工学情報センターのウェブサイトにおいて利用可能）によって得ることができる。

一部の実施形態では、ｐｒｅＳ ｄＴＭの変異株（本明細書ではまた「ｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株」）、すなわち、配列番号１０と異なるアミノ酸を（例えば、シグナル配列領域の外側に）１つまたはそれ以上含有する組換えＳタンパク質が使用される。さらなる実施形態では、組換えＳタンパク質は南アフリカまたはベータ変異株Ｂ．１．３５１に由来する。この変異株は、以下の突然変異（武漢株または配列番号１に対する）：（ｉ）ＮＴＤドメインにおける：Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｌ２４２ｄｅｌ、Ａ２４３ｄｅｌ、およびＬ２４４ｄｅｌ；（ｉｉ）ＲＢＤドメインにおける：Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ；（ｉｉｉ）Ｓ１ドメインにおける：Ｄ６１４Ｇ；ならびに（ｉｖ）Ａ７０１Ｖを含有する。Ｓタンパク質は、プロセシングされて産生細胞から分泌された後はシグナル配列（下線；残基１～１８）を有しない以下の配列（配列番号１４）を含み得る。Ｔ４フォルドン配列（残基１２１４～１２４０）は二重下線で示し；配列番号１０からの変異は四角で囲んで太字で示し；人工的に導入された突然変異（残基６８４～６８７および残基９８８～９８９）は下線かつ太字で示す。武漢株に由来するＳタンパク質と比較して、このタンパク質は、以下の２４３～２４６位における「ＦＱＴＬ」の直後に３個の残基「ＬＡＬ」の欠失も有する。

一部の実施形態では、本免疫原性組成物は多価（例えば、二価、三価、または四価）である。すなわち、組成物は、複数（例えば、２つ、３つ、または４つの）異なる組換えＳタンパク質を含む。多価組成物における１つまたはそれ以上の組換えＳタンパク質は、Ｄ６１４ＧなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に見出される１つまたはそれ以上の突然変異、ならびに新たに出現した変異型株、例えば、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．６１７、Ｐ．１、およびＣＡＬ．２０Ｃに見出される突然変異を含み得る。

一部の実施形態では、本免疫原性組成物は二価である。さらなる実施形態では、二価組成物は、武漢株に由来する第１の組換えＳタンパク質と、南アフリカ株に由来する第２の組換えＳタンパク質とを含む。ある特定の実施形態では、二価組成物は、シグナル配列を有しない配列番号１０を含む組換えＳタンパク質と、シグナル配列を有しない配列番号１４を含む組換えＳタンパク質とを含む。

ＩＩ．免疫原性組成物のアジュバント構成成分
本免疫原性組成物は、薬学的に許容される成分を有するアジュバントを含んでもよい。本免疫原性組成物は、トコフェロールとスクアレンとをどちらも含むということがない。本免疫原性組成物はまた、アジュバントＡＳ０３（トコフェロールおよびスクアレンを含む水中油型エマルション；例えば、国際公開第２００６／１００１０９号；Ｇａｒｃｏｎら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１２）１１：３４９～６６；Ｃｏｈｅｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１９）３７（２３）：３００６～２１を参照のこと）を含まない。アジュバントは、組換えＳタンパク質に対する免疫応答の規模および／または質を増強する。一部の実施形態では、本免疫原性組成物は、スクアレンを含有するがトコフェロールを含有しない水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルションアジュバントを用いてもよい。アジュバントは、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ２ヘルパーＴ応答を促進し得る。例えば、米国特許第８，７０３，０９５号、同第９，３２７，０２１号、および同第９，５０４，６５９号を参照のこと。

スクアレンは、６つの二重結合を有する実験化学式Ｃ_３０Ｈ_５０を有する油である。この油は代謝可能であり、注射用医薬品において使用するのに必要とされる品質を有する。これはサメの肝臓に由来する（動物起源）が、オリーブ油から抽出することもできる（植物起源）。濃縮エマルションの調製のために使用されるスクアレンの量は０．５％～５％の間（例えば、２．５％）であり得る。

Ｏ／Ｗスクアレンベースアジュバントは、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）値が１０以上の非イオン性親水性界面活性剤を含む。そのような界面活性剤の例は、ポリオキシエチレン化脂肪族アルコールエーテル、またはｎ－アルコールポリオキシエチレングリコールエーテル、またはマクロゴールエーテルとも称されるポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＰＡＥまたはＰＯＥ）である。これらの非イオン性界面活性剤は、脂肪族アルコールとエチレンオキシドとの化学的縮合によって得られる。これらは、一般化学式ＣＨ_３（ＣＨ_２）_ｘ－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－ＯＨを有し、式中、「ｎ」はエチレンオキシド単位の数（典型的には１０～６０）を表し、（ｘ＋１）はアルキル鎖における炭素原子の数であり、典型的には１２（ラウリル（ドデシル））、１４（ミリスチル（テトラデシル））、１６（セチル（ヘキサデシル））、または１８（ステアリル（オクタデシル））であるため、「ｘ」は１１～１７の範囲である。ＰＯＥは、わずかに変動する分子量のポリマーの混合物となる傾向がある。したがって、エマルションはＰＯＥの混合物を含んでもよく、本明細書においてそのようなものとしてエマルションにおける使用に好適なＰＯＥに言及する場合、記載されるエーテルは、第一級であり、必然的ではないが、エマルションに存在する唯一のＰＯＥである。使用に好適なＰＯＥは、周囲温度で液体または固体形態であり得る。好適な固体化合物は、水相に直接溶解するか、または実質的な加熱を必要としないものである。エチレンオキシド単位の数が十分である限り、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、および／またはステアリルアルコールが本明細書において使用可能である。ＰＯＥの例は、セテアレス－１２（例えば、Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｂ１）、セテアレス－２０（例えば、Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｂ２）、ステアレス－２１（例えば、Ｅｕｍｕｌｇｉｎ（登録商標）Ｓ２１）、セテス－２０（例えば、Ｓｉｍｕｌｓｏｌ（商標）５８またはＢｒｉｊ（登録商標）５８）、セテス－１０（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６）、ステアレス－１０（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６）、ステアレス－２０（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）、オレス－１０（例えば、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６または９７）、およびオレス－２０（Ｂｒｉｊ（登録商標）９８または９９）であり、各化学名に付されている数は、化学式中のエチレンオキシド単位の数に相当する。

Ｏ／Ｗスクアレンベースエマルションアジュバントはまた、非イオン性疎水性界面活性剤を含む。この点において好適な界面活性剤としては、例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステルが挙げられる。これらは、全体のＨＬＢが９未満（例えば、６未満）の疎水性界面活性剤である。例は、ＳＰＡＮ（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ；例えば、ＳＰＡＮ８０またはモノオレイン酸ソルビタン）、Ｄｅｈｙｍｕｌｓ（商標）（Ｃｏｇｎｉｓ；例えば、Ｄｅｈｙｍｕｌｓ（登録商標）ＳＭＯ（オレイン酸ソルビタン））、Ａｒｌａｃｅｌ（商標）（ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ Ｉｎｃ）、およびＭＯＮＴＡＮＥ（商標）（Ｓｅｐｐｉｃ；例えば、ＭＯＮＴＡＮＥ（商標）８０）である。有用なマンニドエステルとしては、例えば、モノオレイン酸マンニド（例えば、Ｓｉｇｍａ；またはＳｅｐｐｉｃによるＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）８０）が挙げられる。

Ｏ／Ｗ（例えば、スクアレンベース）エマルションアジュバントは、水、および一部の実施形態では塩を含む水相を有する。水相は、例えば、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、またはヒスチジンを含有する緩衝溶液であり得る。緩衝溶液は、約６．４～約９の間のｐＨ（例えば、約６．８～約７．５、例えば、７．０、７．２、または７．４のｐＨ）を有し得る。

一部の実施形態では、Ｏ／Ｗ（例えば、スクアレンベース）エマルションアジュバントは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、ＴＬＲ４アゴニストＥＲ８０４０５７もしくはＥ６０２０）、ポリオール（例えば、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、キシリトール、もしくはエリスリトール）、ならびに／または無機塩（例えば、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、およびリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム塩；もしくは鉄塩）を含んでもよい。

Ｏ／Ｗ（例えば、スクアレンベース）エマルションアジュバントは、液滴サイズか小さい（例えば、サブミクロン）単分散エマルションを生じ、エマルションを高度に安定かつ滅菌フィルターによって容易に濾過可能にする転相温度（ＰＩＴ）法によって調製することができる。この方法は、温度を上げることによってＷ／Ｏ逆相エマルションを得る工程、および温度を下げることによってＷ／Ｏ逆相エマルションをＯ／Ｗエマルションに変換する工程を含む。この変換は、得られたＷ／Ｏエマルションを、このエマルションの転相温度未満の温度に冷却する場合に行われる。この方法によって作製されるＯ／Ｗエマルションは「熱可逆的」であるとみなされる。

概して、本明細書で使用する熱可逆的エマルションは均一である。「均一なエマルション」という用語は、油滴のサイズ分布のグラフ表示（「グラニュログラム（ｇｒａｎｕｌｏｇｒａｍ）」）が単峰型であるエマルションを指す。典型的には、このグラフ表示は「ガウス」型である。一部の実施形態では、エマルションの油滴の体積による少なくとも９０％の集団は、２００ｎｍ以下（例えば、５０～２００ｎＭ、７５～１７５ｎＭ、７５～１５０ｎＭ、７５～１２５ｎＭ、７５～１００ｎＭ、８０～１２０ｎＭ、または９０～１１０ｎＭ）のサイズを有する。概して、これらのエマルションの油滴の体積による少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％）の集団は、１１０ｎｍ以下のサイズを有する。１つの具体的な特徴においては、油滴の体積による少なくとも９０％の集団は１８０ｎｍ以下のサイズを有し、油滴の体積による少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％）の集団は１１０ｎｍ以下のサイズを有する。液滴のサイズは、様々な手段、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒのＬＳシリーズの装置（例えば、ＬＳ２３０）またはＭａｌｖｅｒｎのＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒシリーズの装置（例えば、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００）などのレーザー回折粒径分析装置によって測定することができる。

ある特定の実施形態では、アジュバントはＡＦ０３アジュバントである。ＡＦ０３はスクアレンベースＯ／Ｗエマルションである（Ｋｌｕｃｋｅｒら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．（２０１２）１０１（１２）：４４９０～５００；Ｒｕｄｉｃｅｌｌら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１９）３７（４２）：６２０８～２０；Ｒｕａｔら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（２００８）８２（５）：２５６５～９）。ＡＦ０３ ０．２５ｍＬごとに、アジュバントは、スクアレン１２．５ｍｇ、モノオレイン酸ソルビタン（例えば、Ｄｅｈｙｍｕｌｓ ＳＭＯ（商標））１．８５ｍｇ、ＰＯＥ（１２）セトステアリルエーテル（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ ＣＳ１２（商標））２．３８ｍｇ、マンニトール２．３１ｍｇを含有し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（７．５ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）を用いて０．５ｍＬの容量にされる。米国特許第８，７０３，０９５号および国際公開第２００７／００６９３９号もまた参照のこと。ＡＦ０３は、ＰＩＴ法によって取得可能であり、約１００ｎＭの平均液滴サイズを有するか、または６０％超（例えば、約８５％）の液滴が１００ｎｍ以下である。一部の実施形態では、筋肉内注射のため（例えば、ヒト成人のため）のＡＦ０３の単回用量は０．２５ｍＬである。下記の表９もまた参照のこと。単回用量のＡＦ０３は、同じ液体容量において提供される単回用量の抗原構成成分と混合して、例えば筋肉内注射のための０．５ｍＬの最終容量を達成してもよい。

コロナウイルスワクチンに関する潜在的な安全性の問題は、野生型ウイルスへの曝露時にワクチン由来の免疫病態が増強し得ることである（Ｓｍａｔｔｉら、Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１８）９：２９９１）。ウイルス感染の抗体依存性増強または免疫増強と称されるこの現象の分子機構は依然として完全には理解されていない。コロナウイルス感染症の文脈では、様々な因子がこの現象に潜在的に寄与すると示唆されている。これらの因子としては、標的となるエピトープ、抗原の送達方法、免疫応答の規模、結合抗体と機能抗体とのバランス、特定のＦｃ受容体との結合などの機能的特徴を有する抗体の誘発、およびヘルパーＴ細胞応答の性質が挙げられる（Ｔｓｅｎｇら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１２）７（４）；Ｙａｓｕｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）１８１（９）：６３３７～４８；Ｃｚｕｂら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００５）２３（１７～１８）：２２７３～９）。ＡＦ０３などのアジュバントを含むアジュバント製剤を含めることは、中和抗体応答の規模をさらに増強し、それによって、大半が非中和抗体によって媒介されると考えられるウイルス感染の抗体依存性増強を緩和すると予想される。

ＩＩＩ．組換えＳタンパク質の作製
本免疫原性組成物のウイルス抗原構成成分は、組換え技術によって、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ：Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ）に由来するものなどのバキュロウイルス発現ベクターによって形質導入された昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞、またはｅｘｐｒｅｓＳＦ＋細胞）において産生することができる。ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロウイルスは、大きなタンパク質の結晶性包埋体を感染細胞の核内に形成し、ポリヘドリンと称される単一ポリペプチドがそのタンパク質塊のおよそ９５％を占める。ポリヘドリンの遺伝子は、単一コピーとしてバキュロウイルスゲノムに存在し、培養細胞におけるウイルス複製に必須ではないため、外来遺伝子と容易に置き換えることができる。組換えＳポリペプチドなどの外来遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルスゲノムＤＮＡと外来遺伝子を含有するトランスファープラスミドとの間での相同組換えによって構築される。

ある特定の実施形態では、トランスファープラスミドは組換えＳポリペプチドの発現カセットを含有し、発現カセットは、ＡｃＭＮＰＶにおいてポリヘドリン座位に天然に隣接する配列に隣接する（図１）。トランスファープラスミドはバキュロウイルスゲノムＤＮＡと同時に宿主細胞にトランスフェクトされる。バキュロウイルスゲノムＤＮＡは、ポリヘドリン遺伝子とポリヘドリン座位の下流にある必須遺伝子の一部とを除去する酵素（例えば、Ｂｓｕ３６Ｉ）で線状化されており、そのため親ウイルスＤＮＡ分子は複製することができず、ゲノムＤＮＡは非感染性となっているが；必須遺伝子のこの部分はトランスファープラスミドに存在する。同時トランスフェクション後、トランスファープラスミドと線状化ゲノムＤＮＡとの間での相同組換えにより、ゲノムウイルスＤＮＡは再び環状化し、その複製能を回復する。線状化前の本来のバキュロウイルスゲノムＤＮＡはポリヘドリン遺伝子を含有するため、非組換えウイルスによって形成されたプラークは濁っている（感染細胞における結晶性包埋体のため）が、組換えウイルスによって形成されたプラークは透明である。

バキュロウイルス発現ベクターは、組換えタンパク質の収量を増加するように操作してもよい。一部の実施形態では、バキュロウイルスベクターは１つまたはそれ以上の遺伝子がノックアウトされる。バキュロウイルスゲノムは、細胞培養におけるウイルス複製および組換えタンパク質の発現に必須ではない遺伝子を含有している。そのような遺伝子の欠失は、不要な遺伝的荷重を取り除き、より安定なバキュロウイルス発現ベクターを生成するのに役立ち、昆虫細胞感染の確立に必要な時間を減少し、結果として組換えタンパク質のより効率的な発現をもたらし得る。一部の実施形態では、ポリヘドリンプロモーターは、２コピー以上のバースト配列をポリヘドリンプロモーターに含めることによって改変され；例えば、プロモーターは、ヌクレオチド配列ＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡ（配列番号１２）の２つの反復を含有する「二重バースト」（ＤＢ）プロモーターを生じる２つのバースト配列を含むように操作してもよい。例えば、Ｍａｎｏｈａｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．（２０１０）１０７：９０９～１６を参照のこと。ウイルス抗原コード配列をバキュロウイルス発現ベクターに組み込むために、コード配列を有するトランスファープラスミドを、バキュロウイルスゲノムをコードするＤＮＡに相同組換えによって組み込んでもよい。ウイルス同一性は、例えば、精製されたバキュロウイルスＤＮＡ由来のＳタンパク質コード配列挿入断片のサザンブロットまたはサンガー配列決定解析、および感染昆虫細胞において産生された組換えタンパク質のウェスタンブロット解析によって確認することができる。例えば、米国特許第６，２４５，５３２号および同第８，５４１，００３号を参照のこと。

ウイルス抗原発現構築物を含有する宿主細胞は、バイオリアクター（例えば、４５Ｌ、６０Ｌ、４５９Ｌ、２０００Ｌ、または２０，０００Ｌ）において、例えば、バッチ法または流加法で培養される。産生されたＳタンパク質は、例えばカラムクロマトグラフィーによって、フロースルーモードまたは結合－溶出モードのいずれかで細胞培養物から単離することができる。例としては、レンズマメレクチンセファロースなどのイオン交換樹脂および親和性樹脂、ならびに混合モードカチオン交換疎水性相互作用カラム（ＣＥＸ－ＨＩＣ）である。タンパク質は、濃縮しても、限外濾過によって緩衝液交換してもよく、限外濾過の保持液は、０．２２μｍフィルターにより濾過してもよい。例えば、Ｓｕｎｉｌ Ｔｈｏｍａｓ（編）、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｖｏｌｕｍｅ １：Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０１６におけるＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＳＡＲＳ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｒｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｌｕｓ Ｄｅｌｔａ Ｉｎｕｌｉｎ Ａｄｊｕｖａｎｔ」、第４章を参照のこと。米国特許第５，７６２，９３９号もまた参照のこと。

バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）は、理想的なサブユニットワクチンの開発のための優れた方法を提供する。組換えタンパク質はそのような系によっておよそ８週間で作製可能である。迅速な作製は、パンデミックの脅威が存在する場合にはとりわけ重要である。さらに、バキュロウイルスは、分類学的に関連する数種類の昆虫種に限定される狭い宿主範囲のために安全であり、哺乳動物細胞において複製することが観察されていない。加えて、昆虫細胞と哺乳動物細胞の両方で複製可能であることが公知の微生物はほとんど存在せず；したがって、昆虫細胞によって産生される臨床産物における外来性感染性因子汚染の可能性は非常に低い。さらに、バキュロウイルスの天然宿主である昆虫は非刺咬性であるため、ヒトは概してこれらの昆虫由来のタンパク質に対する既存の免疫を有しておらず；したがって、ＢＥＶ系において産生される臨床産物に対するアレルギー反応は起こらないと考えられる。さらに、昆虫細胞においてタンパク質に付加される炭水化物部分は、哺乳動物細胞において発現される対応物におけるものほど複雑ではないと考えられるが、昆虫細胞発現糖タンパク質の免疫原性と哺乳動物細胞発現糖タンパク質の免疫原性とは同等であると考えられる。バキュロウイルス系において発現される全長タンパク質は、通例、自己組織化して、通常では界面活性剤濃度を調節することによって天然タンパク質がとる、より高次の構造になる。最後に、ＢＥＶＳ系は、ポリヘドリンプロモーターの極度に高い活性のために非常に効率的であり、高レベルの組換えタンパク質の産生を著しく低いコストで可能にする。

ＩＶ．ワクチンの製剤化および包装
組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭ）は、単独で、または組換えＳタンパク質に対する免疫原性応答を増強するのに効果的な量のアジュバントと組み合わせて製剤化および包装することができる。免疫原性組成物は、上に記載したように一価であっても多価であってもよい。免疫原性組成物は、非経口（例えば、筋肉内、皮内、もしくは皮下）投与または上咽頭（例えば、鼻腔内）投与のために製剤化することができる。組成物は、薬学的に許容される保存剤を含有しても含有しなくてもよい。そのような保存剤としては、限定されないが、パラベン、チメロサール、チオメルサール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム、およびキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が挙げられる。

免疫原性組成物は、抗原とアジュバントとの混合物の形態で提供してもよいが、但し、アジュバントはトコフェロールとスクアレンとをどちらも含むということがなく、ＡＳ０３アジュバントも含まない。

免疫原性組成物はまた、抗原とアジュバントとが使用直前または使用時に接触する、即時製剤の形態であり得る。例えば、抗原（液体）は注射前にアジュバント（エマルション）と同容量で混合することができる。一部の実施形態では、抗原製剤は、アジュバントとの混合前に、緩衝水溶液である。緩衝液は、場合によりリン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、およびポリソルベートナトリウムを用いて調製されたリン酸緩衝生理食塩水であり得る。緩衝液はまた、界面活性剤を含んでもよい（例えば、０．０１～１％）。

一部の実施形態では、界面活性剤は親水性および／または非イオン性である。界面活性剤は：エトキシ化ポリソルベート、例えば、それぞれＴｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０の商品名で市販されているポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、およびポリソルベート８０；以下においてポロキサマーと称されるエチレンオキシド／プロピレンオキシドコポリマー、例えば、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ／Ｌ４４の商品名で市販されているポロキサマー１２４、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８もしくはＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ／Ｆ６８の商品名で市販されているポロキサマー１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ８７もしくはＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ／Ｆ８７の商品名で市販されているポロキサマー２３７；Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ／Ｆ１０８の商品名で市販されているポロキサマー３３８、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ／Ｆ１２７、もしくはＬｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ１２７の商品名で市販されているポロキサマー４０７；ならびにヒドロキシステアリン酸ポリエチレン、例えばＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ１５の商品名で市販されているヒドロキシステアリン酸ポリエチレン６６０から選択することができる。

一部の実施形態では、抗原を含有する水性緩衝製剤は、ポリソルベート２０を０．０１～０．５％含んでもよい。一部の実施形態では、製剤はポリソルベート２０を約０．０２％～０．２％含有する。ある特定の実施形態では、水性抗原製剤（アジュバントを含有しない）０．２５ｍＬごとに、製剤はポリソルベート２０を５０～６００（例えば、５５または５５０）μｇ含有する。

一部の実施形態では、抗原は、凍結乾燥され、使用直前にアジュバント（エマルション）と混ぜ合わせてもよく、または反対に、アジュバントが凍結乾燥形態であり、抗原の溶液（例えば、緩衝水溶液）と混ぜ合わせてもよい。

したがって、本開示は、本免疫原性組成物の抗原およびアジュバント構成成分を別個の容器（例えば、予め処理したガラスバイアルまたはアンプル）において提供するキットなどの製造物品を提供し、２つの構成成分は注射前に混合される。溶液が凍結乾燥構成成分の再懸濁に必要である場合、その溶液もキットなどの製造物品において提供することができる。あるいは、抗原構成成分とアジュバントとは同じ容器において混合および提供され、組成物はワクチン接種を必要とする対象に直接投与することができる。製造物品は使用のための説明書も含み得る。製造物品（例えば、キット）もまた、使用のための説明書を含み得る。

免疫原性組成物は、単位投薬量フォーマット（単回用量）、または複数回用量フォーマットで提供することができる。一部の実施形態では、抗原構成成分は１つの容器において複数回用量フォーマットで提供され、アジュバント構成成分は別個の容器において単回または複数回用量フォーマットで提供され；使用前に、単回用量の抗原構成成分が容器から取り出され、単回用量のアジュバントと混合される。

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、筋肉内（ＩＭ）または皮下注射における使用のために提供される。免疫原性組成物は、抗原構成成分とアジュバント構成成分とを混合することによってベッドサイドで作製した後、対象に、例えば対象の上腕の三角筋において注射することができる。一部の実施形態では、免疫原性組成物の抗原および／またはアジュバント構成成分は、充填済みシリンジまたは注射器（例えば、シングルチャンバーまたはマルチチャンバー）において提供される。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、吸入における使用のために提供され、充填済みポンプ、エアロゾル噴霧器、または吸入器において提供される。

一部の実施形態では、ＩＭ注射のための単位投薬量は、例えば注射容量約０．２～０．６ｍＬ（例えば、０．２５ｍＬまたは０．５ｍＬ）において、１用量当たり組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭおよびその変異株から選択される１つまたはそれ以上、例えば２つの組換えＳタンパク質）１～５０または５～５０（例えば、２．５、５、１０、１５、３０、または４５）μｇである。一部の実施形態では、単位投薬量は、注射容量０．２５または０．５ｍＬにおいて、組換えＳタンパク質合計２．５μｇである。他の実施形態では、単位投薬量は、注射容量０．２５または０．５ｍＬにおいて、組換えＳタンパク質合計５μｇである。一部の他の実施形態では、単位投薬量は、注射容量０．２５または０．５ｍＬにおいて、組換えＳタンパク質合計１０μｇである。一部の他の実施形態では、単位投薬量は、注射容量０．２５または０．５ｍＬにおいて、組換えＳタンパク質合計１５μｇである。一部の実施形態では、単位投薬量は、注射容量０．２５または０．５ｍＬにおいて、組換えＳタンパク質合計４５μｇである。これらの実施形態では、注射容量０．２５ｍＬまたは０．５ｍＬはアジュバントを含んでもよい。

一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、容器において単回用量または複数回用量で供給される。各用量は、例えば０．２５ｍＬの容量であり得る。Ｓタンパク質は、保存剤も抗生物質も含有しない０．２％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）の濃度のリン酸緩衝生理食塩水（十分量、０．２５ｍＬ）において製剤化される場合がある。タンパク質溶液は、使用前にアジュバント（例えば、ＡＦ０３アジュバント；ＡＳ０３アジュバントではない）と混合される場合がある。

一部の実施形態では、１単位投薬量のＩＭ注射のための抗原組成物は、以下の表Ａに示す成分を含有する。

一部の実施形態では、この単位投薬量は、Ｄ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭ（シグナル配列を有しない配列番号１０）を２．５、５、または１０μｇ含む。一部の実施形態では、この単位用量は、Ｂ．１．３５１ ｐｒｅＳ ｄＴＭ（シグナル配列を有しない配列番号１４）を２．５、５、または１０μｇ含む。一部の実施形態では、この単位投薬量は、二価であり、Ｄ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭおよびＢ．１．３５１ ｐｒｅＳ ｄＴＭを合計で２．５、５、または１０μｇ含み、２つのタンパク質は等量で存在する。抗原組成物の単位投薬量は、ワクチン接種のために単独で使用しても、ワクチン接種前にアジュバントと混合してもよい。

一部の実施形態では、単位投薬量は、アジュバントを含まない０．２５ｍＬまたは０．５ｍＬにおいて、組換えＳタンパク質合計２．５、５、１０、１５、または４５μｇである。用量は、例えば、以下でさらに説明されるように、アジュバントと共にまたはアジュバントを伴わずにブースター用量として投与してもよい。

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭ（シグナル配列を有しない配列番号１０）または変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１４）２．５μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８または表８Ａを参照のこと）を、注射前にＡＦ０３アジュバント０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。他の実施形態では、この抗原溶液は、アジュバントを伴わずに、または別のアジュバントと共にブースターとして投与されるが、但し、アジュバントはトコフェロールとスクアレンとをどちらも含むということがなく、ＡＳ０３も含まない。

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭ（シグナル配列を有しない配列番号１０）または変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１４）５μｇ（例えば、表Ａ、下記の表８または表８Ａを参照のこと）を、注射前にＡＦ０３ ０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。他の実施形態では、この抗原溶液は、アジュバントを伴わずに、または別のアジュバントと共にブースターとして投与されるが、但し、アジュバントはトコフェロールとスクアレンとをどちらも含むということがなく、ＡＳ０３も含まない。

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭ（シグナル配列を有しない配列番号１０）または変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１４）１０μｇ（例えば、表Ａ、下記の表８または表８Ａを参照のこと）を、注射前にＡＦ０３ ０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。他の実施形態では、この抗原溶液は、アジュバントを伴わずに、または別のアジュバントと共にブースターとして投与されるが、但し、アジュバントはトコフェロールとスクアレンとをどちらも含むということがなく、ＡＳ０３も含まない。

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭ（シグナル配列を有しない配列番号１０）または変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１４）１５μｇ（例えば、表Ａ、下記の表８または表８Ａを参照のこと）を、注射前にＡＦ０３ ０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。他の実施形態では、この抗原溶液は、アジュバントを伴わずに、または別のアジュバントと共に投与されるが、但し、アジュバントはトコフェロールとスクアレンとをどちらも含むということがなく、ＡＳ０３も含まない。

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭ（シグナル配列を有しない配列番号１０）または変異株（例えば、シグナル配列を有しない配列番号１４）４５μｇ（例えば、表Ａ、下記の表８または表８Ａを参照のこと）を、注射前にＡＦ０３ ０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。他の実施形態では、この抗原溶液は、アジュバントを伴わずに、または別のアジュバントと共に投与されるが、但し、アジュバントはトコフェロールとスクアレンとをどちらも含むということがなく、ＡＳ０３も含まない。

一部の実施形態では、ＩＭ注射によるヒトワクチン接種ごとに、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中、２つの異なる組換えＳタンパク質合計１０μｇ（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはＢ．１．３５１に由来するものなどの変異株（シグナル配列を有しない配列番号１４）；各５μｇ）（例えば、表Ａ、以下の表８または表８Ａを参照のこと）を、注射前にＡＦ０３アジュバント０．２５ｍＬと同容量で混合して、最終注射容量０．５ｍＬを達成する。

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、一価であり、単一組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはＢ．１．３５１ ｐｒｅＳ ｄＴＭなどのｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株）を１用量当たり１０μｇ含有する

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、二価であり、２つの異なる組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭおよびＢ．１．３５１ ｐｒｅＳ ｄＴＭなどのｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株）を１用量当たりそれぞれ５μｇ含有する。

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、三価であり、３つの異なる組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭおよび２つの異なるｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株）を１用量当たりそれぞれ３．３μｇ含有する。

一部の実施形態では、免疫原性組成物は、一価であり、単一組換えＳタンパク質（例えば、ｐｒｅＳ ｄＴＭ、またはＢ．１．３５１ ｐｒｅＳ ｄＴＭなどのｐｒｅＳ ｄＴＭ変異株）を１用量当たり２．５μｇ含有する。

一部の実施形態では、本開示のワクチン製品は２～８℃で保存される。

Ｖ．ワクチンの使用
本開示のワクチン組成物によるワクチン接種に好適な対象としては、１８～４９歳の成人、１８～５９歳、５０歳もしくはそれ以上の成人、６０歳もしくはそれ以上の成人、６５歳もしくはそれ以上の成人、２～１８歳の小児、１２歳未満の小児、または２歳未満の小児などの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に感受性のヒトが挙げられる。対象に投与されるワクチンの量は、使用されるアジュバントの種類、投与経路、ならびに対象の年齢および体重を含む当業者に周知の標準的な技法に従って決定することができる。一部の実施形態では、アジュバントを伴うかまたは伴わない２．５μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、アジュバントを伴うかまたは伴わない５μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、アジュバントを伴うかまたは伴わない１０μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、ンアジュバントを伴うかまたは伴わない１５μｇ用量の抗原が投与される。一部の実施形態では、アジュバントを伴うかまたは伴わない４５μｇ用量の抗原が投与される。組成物は、単回用量または一連の用量（例えば、その後の「ブースター」用量を含む１～３回の一次用量）で投与することができる。一部の実施形態では、第１の用量と第２の用量とは約１４日（または約２週間）～約６か月空けて投与される。例えば、用量の間隔は、１４～３５日（例えば、約２１もしくは２８日）、または約２～５週間（例えば、約３もしくは４週間）空けてもよい。

一部の実施形態では、単回用量は、表Ａ、表８、または表８Ａに示す抗原組成物約０．２５ｍＬ（組換えＳタンパク質５または１０μｇを含有）とアジュバント（例えば、ＡＦ０３）との混合物である。さらなる実施形態では、対象はそのような用量を２回投与され、各用量は２１日または３週間空けられる。他のさらなる実施形態では、対象はそのような用量を２回投与され、各用量は２８日もしくは４週間空けられる。

ワクチン組成物は予防有効量で対象に提供され、これは単回用量で投与しても一連の用量で投与してもよい。「予防有効量」とは、ＣＯＶＩＤ－１９の１つまたはそれ以上の症状の発現を防止もしくは遅延する、ならびに／またはその頻度および／もしくは重症度を低下させるのに十分な免疫応答を誘導するために必要とされる量を指す。一部の実施形態では、上記量は、１つもしくはそれ以上の症状の重症度および／もしくは１つもしくはそれ以上の症状が対象によって経験される時間を部分的もしくは完全に低下させる、チャレンジ後に、確立された感染症を発症する可能性を低下させる、疾病の進行を遅らせ、場合により生存を延長させる、ならびに／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を産生させる、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質特異的Ｔ細胞応答である免疫応答を誘発する。

一部の実施形態では、本明細書において提供されるワクチン接種方法は、ＣＯＶＩＤ－１９、例えばその症状のうちの１つもしくはそれ以上を防止もしくは改善するか、またはＣＯＶＩＤ－１９に関連する入院もしくは死亡のリスクを防止もしくは低下する。ある方法では、ＣＯＶＩＤ－１９ナイーブまたは未ワクチン接種対象は、水性抗原構成成分０．２５ｍＬとアジュバントとを混合することによって調製された免疫原性組成物をＩＭによって投与される。水性抗原構成成分０．２５ｍＬは、一価（ＭＶ）であり得、場合により表Ａに示すようにＰＢＳにおいて製剤化されたＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはＢ．１．３５１（ベータ）ｐｒｅＳ ｄＴＭ ５または１０μｇを含む。あるいは、水性抗原構成成分は、二価（ＢＶ）であり、場合により表Ａに示すようにＰＢＳにおいて製剤化されたＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇおよびベータｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇを含むか；または場合により表Ａに示すようにＰＢＳにおいて製剤化されたＤ６１４ ｐｒｅＳ ｄＴＭ ２．５μｇおよびベータｐｒｅＳ ｄＴＭ ２．５μｇを含む。対象は免疫原性組成物を２回、３週間もしくは４週間空けて、または１か月空けて投与される場合がある。

ＶＩ．ブースターとしてのワクチンの使用
本ワクチン組成物は、汎用ブースターとして使用することができる。本ワクチン組成物は、以前に投与されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのブースターとして、すなわち、プライム－ブーストワクチン接種レジメン、例えば異種または同種プライム－ブーストワクチン接種レジメンの一部として使用することができる。レジメンにおけるプライム用量（すなわち、一次ワクチン）は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または麻疹ウイルスベクター）、ペプチドまたはタンパク質、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、カプシド様粒子（ＣＬＰ）、弱毒生ウイルス、不活化ウイルス（死滅ワクチン）などに基づくワクチンであり得る。一部の実施形態では、一次ワクチンはブースターワクチンと同じ抗原を含有する（すなわち、同種プライム－ブーストワクチン接種レジメン）。プライム－ブーストレジメンは、部分的には、とりわけプライムのウイルスベクターの再利用、ならびにブーストによってもたらされる定性的および定量的に異なる免疫プロファイルのために好都合であり得る。そのようなレジメンは、ワクチン接種された対象における抗ウイルス免疫の幅、効力、および持続性の点で向上した転帰をもたらすと予期される。

体内においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原（例えば、Ｓタンパク質抗原）を発現させるための遺伝子材料（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはウイルスベクター）を含むワクチンは、まとめて「遺伝子ワクチン」と称される。例えば、遺伝子ワクチンとしては、化学修飾またはヌクレオチド類似体を有するかまたは有しないｍＲＮＡを含むものが挙げられる。ｍＲＮＡは、封入（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に）されても、担体またはアジュバント（例えば、プロタミンまたはサポニン）と複合体を形成してもよい。ｍＲＮＡは、自己複製型であっても自己複製型でなくてもよい。本ワクチン組成物は、遺伝子ワクチンのブースターとして有用であるが、その理由は、遺伝子ワクチンは、ワクチン接種された対象において、その後の同じワクチンの用量の効能を損なわせる、したがって低下させる抗薬物免疫応答を誘発し得るためである。そのような場合、遺伝子ワクチンは同じ対象に繰り返し（例えば、季節ごとに）投与することができない。

本プライム－ブーストレジメンの一部の実施形態では、プライム用量は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の外部ドメインを含み得る組換えＳタンパク質をコードする遺伝子ワクチンであり得る。一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、配列番号１、４、１０、１３、もしくは１４のアミノ酸配列、またはその抗原性断片を含み得る。一部の実施形態では、組換えＳタンパク質は、ＳＡＲＶ－ＣｏＶ－２外部ドメインまたは受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）由来の配列および三量体化配列（例えば、天然のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ三量体化ドメイン）を含むポリペプチドの三量体である。一部の実施形態では、コードされる組換えＳタンパク質は、ワクチン接種された対象における産生細胞からの組換えＳタンパク質の分泌を容易にするシグナルペプチド配列（例えば、Ｓタンパク質などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のシグナルペプチド）を含み得る。

一部の実施形態では、遺伝子ワクチンは、特異的設計を目的として、参照（例えば、天然に存在する）Ｓタンパク質と比較して１つまたはそれ以上の突然変異を有するＳタンパク質またはその抗原性部分をコードする。例えば、コードされるＳタンパク質は、（ｉ）フーリン切断を防止するためのフーリン切断部位における突然変異（例えば、「ＧＳＡＳ」（配列番号６）突然変異）、（ｉｉ）小胞体（ＥＲ）保留を変更する突然変異、（ｉｉｉ）推定グリコシル化を抑制する突然変異、（ｉｖ）代替シグナルペプチドを導入する突然変異、および／または（ｖ）Ｓポリペプチドの融合前立体構造を安定化する突然変異（例えば、「ＰＰ」突然変異）を含有し得る。

一部の実施形態では、遺伝子ワクチンによってコードされるＳタンパク質は、Ｄ６１４Ｇ突然変異などの天然に存在する突然変異および本明細書に記載される他の突然変異を含み得る。ある特定の実施形態では、遺伝子ワクチンは、上に記載したものなどのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２変異株に由来する組換えＳタンパク質をコードする。

ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡワクチンなどの遺伝子ワクチンは以下の組換えＳポリペプチドをコードし得る：

上記配列において、四角で囲まれた配列（ＧＳＡＳ；配列番号６）は野生型ＲＲＡＲ（配列番号５）から変更される。下線で示された残基（ＰＰ）は野生型ＫＶから変更される。これらの変更は三量体Ｓタンパク質を安定な融合前立体構造に維持するのに役立ち得る。

一部の実施形態では、遺伝子ワクチンは、Ｍｏｄｅｒｎａ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、Ｊａｎｓｓｅｎ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン、またはＶａｘｚｅｖｒｉａ（以前はＣＯＶＩＤ－１９ワクチンＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）である。

本プライム－ブーストレジメンの一部の実施形態では、プライム用量は、Ｓｉｎｏｖａｃ－ＣｏｒｏｎａＶａｃおよびＳｉｎｏｐｈａｒｍ ＢＩＢＰワクチンなどの死滅ワクチンである。

プライム－ブーストレジメンは、一次ワクチン（例えば、遺伝子ワクチンまたはサブユニットワクチン）と、その後の本タンパク質ワクチンを用いる１回またはそれ以上のブースター用量を用いるワクチン接種を含む。一部の実施形態では、一次ワクチンは、ワクチンの１回の投与（例えば、筋肉内、皮下、皮内、または鼻腔内投与）、またはある期間（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週間、またはそれ以上）空けたワクチンの２回の投与を伴う。

一部の実施形態では、本組換えタンパク質を用いるブースター用量は、一次ワクチン接種の少なくとも２週間（例えば、４週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、１年半、２年、３年、４年、５年、またはそれ以上）後に投与することができる。例えば、遺伝子ワクチン（例えば、ｍＲＮＡもしくはアデノウイルスに基づくワクチン）またはサブユニットワクチンが投与された後、本タンパク質ワクチンを用いるブースター用量は、毎年または半年ごとに対象に投与することができる。便宜のために、ブースターワクチンは、毎年、インフルエンザワクチンと同時に投与してもよい（例えば、別個の製剤または配合剤として）。

一部の実施形態では、ブースターは、アジュバントと共にまたはアジュバントを伴わずに使用される、本明細書に記載される一価または多価免疫原性組成物である。一部の実施形態では、ブースターは一価免疫原性組成物（例えば、武漢株または南アフリカ変異株に由来する組換えＳタンパク質を含有するもの）である。他の実施形態では、ブースターは二価免疫原性組成物（例えば、武漢株に由来する組換えＳタンパク質と南アフリカ変異株に由来する組換えＳタンパク質とを含有するもの）である。

ある特定の実施形態では、ブースター用量は、ｐｒｅＳ ｄＴＭまたはその変異株２．５または５μｇを含む０．２５または０．５ｍＬ免疫原性組成物であり得る。一部の実施形態では、ブースター接種はアジュバントを含まない。一部の実施形態では、ブースター用量は、アジュバント（例えば、ＡＦ０３アジュバント；ＡＳ０３アジュバントではない）を含有し、例えば、注射前に抗原を含む溶液をアジュバントと同容量で混合することによって調製することができる。一部の実施形態では、ブースター接種は、注射前に滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭまたは変異株２．５または５μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８または表８Ａを参照のこと）をＡＦ０３アジュバント０．２５ｍＬと同容量で混合することによって調製される。さらなる実施形態では、変異株はベータ変異株（例えば、シグナル配列を有する配列番号１４）である。

ある特定の実施形態では、一次ワクチン接種は組換えＳタンパク質を含むサブユニットワクチンを用いて行われ、ブースターワクチンは、一次（非ブースター）ワクチン接種のために使用したワクチンよりも少ない量の組換えＳタンパク質を含有する。例えば、一次ワクチン接種は、接種１回当たり組換えＳタンパク質１０μｇを用いる、間隔（例えば、３、４、５、６、７、８週間、またはそれ以上の間隔）を空けた２回の接種を伴い、ブースター接種は、組換えＳタンパク質をわずか２．５または５μｇ含有し得る。

一部の実施形態では、一次ワクチン接種は、注射前に滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭまたは変異株１０μｇ（または二価ワクチンの場合、ｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇと変異株５μｇ）（例えば、表Ａ、以下の表８または表８Ａを参照のこと）をＡＦ０３アジュバント０．２５ｍＬと同容量で混合することによって調製される０．５ｍＬ免疫原性組成物の２回の接種を伴い、２回の接種の間には間隔（例えば、３、４、５、６、７、８週間、またはそれ以上の間隔）が設けられる。次いで、対象は後の時点（例えば、一次ワクチン接種の２回目の接種の少なくとも３、６、８、９、または１２か月後）においてブースターワクチンを投与され、ここで、ブースターワクチンは、滅菌無色透明ＰＢＳ溶液０．２５もしくは０．５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭもしくは変異株２．５もしくは５μｇ（例えば、表Ａ、以下の表８もしくは表８Ａを参照のこと）であり得るか、またはＰＢＳ溶液０．２５ｍＬ中ｐｒｅＳ ｄＴＭもしくは変異株２．５もしくは５μｇをＡＦ０３アジュバント０．２５ｍＬと同容量で混合することによって調製してもよい。

一部の実施形態では、ブースターワクチンはアジュバントを必要としない。組換えＳタンパク質は、ＩＭ注射のための水性液体溶液（例えば、表Ａ、表８、または表８Ａに示すＰＢＳなどのＰＢＳ）において提供してもよい。

本明細書に別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料は以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料もまた本発明の実施または試験において使用することができる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。概して、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ウイルス学、免疫学、微生物学、遺伝子学、分析化学、合成有機化学、医薬品および創薬化学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法ならびにこれらの技法は、当技術分野において周知であり一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技法は、当技術分野において一般的に遂行されるようにまたは本明細書に記載されるように、製造業者の仕様書に従って実施される。さらに、文脈上別段の要件がない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および実施形態全体にわたって、「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの活用形は、記載された整数または整数群を含むが、任意の他の整数も整数群も除外するものではないということを含意していると理解されるだろう。本明細書で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み入れられる。いくつかの文書が本明細書に引用されるが、この引用は、これらの文書のいずれかが当技術分野における通常の一般的知識の一部を形成することを承認するものではない。

本明細書で使用する場合、１つまたはそれ以上の目的の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記載された参照値と類似した値を指す。ある特定の実施形態では、この用語は、別段の記載がなく、別段のことが文脈から明白でもない限り、記載される参照値のいずれかの方向（より大きいかまたはより小さい）の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下に収まる値の範囲を指す。

本発明がより良好に理解されるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示のみを目的としており、いかなる点においても、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓコード配列のバキュロウイルストランスファープラスミドへのクローニング
ギブソン・アセンブリ（ＧＡ）を使用して、ゲノム分離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ０４５５１２由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質ＹＰ＿００９７２４３９０．１から改変された適応ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質を保持するトランスファープラスミドを生成した。構築物ごとに３つの遺伝子断片（ｇＢｌｏｃｋ）を、線状化ＳａｐＩ ｐＰＳＣ１２ ＤＢトランスファーベクターへのクローニングのために設計した。ｇＢｌｏｃｋ遺伝子断片は、接合部位に４０ｂｐの重複配列を有し、ｇＢｌｏｃｋ断片１および３のそれぞれ５’および３’にｐＰＳＣ１２と重複する配列を有する。ｇＢｌｏｃｋはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって合成された。ギブソン・アセンブリ反応の描写を（図２Ａおよび２Ｂ）に示す。最終トランスファープラスミドはＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓによってサンガー配列決定により確認された。部位特異的突然変異導入もまた、変異タンパク質を生成するために使用することができる。

組換えＳタンパク質の作製および精製
ポリヘドリンプロモーターの制御下のｐｒｅＳ ｄＴＭをコードする配列を含有する組換えバキュロウイルスを使用して、ツマジロクサヨトウ細胞に感染させた。細胞をＰＳＦＭ培地（ＳＡＦＣ）において２７℃で２．５×１０^６個／ｍＬの密度まで増殖し、２％（容量／容量）の組換えバキュロウイルスを感染させた。細胞を、感染の７２時間後に３，４００×ｇでの１５分間の遠心分離によって回収した。上清を組換えＳタンパク質の精製のために使用した。

１つの精製プロセスにおいて、分泌された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有する上清を、ＳＵＰＲＡＣＡＰ１００二層Ｋ２５０Ｐ／ＫＳ５０Ｐ ５”フィルター（Ｐａｌｌ、＃ＮＰ５ＬＰＤＧ４１）を使用して深層濾過した。深層濾液を、１００ｋＤａ Ｓａｒｔｏｃｏｎスライスカセット、０．１ｍ^２、１５ｐｓｉにおいて２００ｍＬ／分の流量を使用して１０倍に濃縮し、続いて、２０ｍＭトリス；５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて５倍ダイアフィルトレーションを行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有するダイアフィルトレーション濾液を、捕捉工程精製として、Ｃａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチン（Ｃｙｔｉｖａ）クロマトグラフィーによって精製した。Ｃａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチンカラムを、２０ｍＭトリス；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭメチル－α－Ｄ－マンノピラノシド、ｐＨ７．４を用いて平衡化した。これらの条件下において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質はＣａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチン樹脂に結合し、夾雑物はカラムを通過した。カラムを、２０ｍＭトリス；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭメチル－α－Ｄ－マンノピラノシド、ｐＨ７．４を用いて洗浄して、未結合タンパク質を除去した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を、２０ｍＭトリス；５００ｍＭメチル－α－Ｄ－マンノピラノシド、ｐＨ７．４を含有する溶出緩衝液を用いてＣａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチンカラムから溶出した。

Ｃａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチン溶出液を、最終精製工程として、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）によってさらに精製した。Ｃａｐｔｏ（商標）レンズマメレクチン溶出液を７５０ｍＭ硫酸アンモニウム濃度、０．０１％トリトンＸ－１００濃度に調整し、５０ｍＭリン酸ナトリウム；７５０ｍＭ硫酸アンモニウム；０．０１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、ｐＨ７．０を含有する緩衝液を用いて平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムに充填した。充填後、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムを、５０ｍＭリン酸ナトリウム；７５０ｍＭ硫酸アンモニウム；０．０１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、ｐＨ７．０を用いて洗浄して、未結合夾雑物を除去した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質を、５０ｍＭリン酸ナトリウム；３００ｍＭ硫酸アンモニウム；０．０１％ｖ／ｖトリトンＸ－１００、ｐＨ７．０を含有する溶出緩衝液でＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムから溶出した。

Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ溶出液を蒸留水で３．２５倍に希釈し、単一Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ ＸＴ Ａｃｒｏｄｉｓｃフィルター（Ｐａｌｌ、＃ＭＳＴＧＸＴ２５Ｑ１６）を使用してＱ膜濾過を実施した。Ｑ膜濾過後、Ｓａｒｔｏｃｏｎスライス５０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ、＃３Ｄ９１４６５０５０ＥＬＬＰＵ）を使用してＴＦＦを実施した。Ｑ濾液を０．２５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８～７．２を用いて１０倍ダイアフィルトレーションを行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を含有するＴＦＦ保持液を０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０と共に製剤化し、０．２μｍフィルターを使用して滅菌濾過し、使用まで４℃で保存した。

代替的な精製プロセスはＣＥＸ－ＨＩＣを使用する。回収は、深層濾過（最初の遠心分離工程を伴うかまたは伴わない）によって達成してもよい。次いで、捕捉された組換えタンパク質は、限外濾過／ダイアフィルトレーション工程によってさらに精製してもよい。

中枢的マウス研究
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えタンパク質ワクチン製剤のマウスにおける研究を記載する。ワクチン製剤は、膜貫通および細胞質領域が欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合前安定化Ｓタンパク質（ＣｏＶ－２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ）を含有した。ワクチンはＡＦ０３アジュバントを含有した。このワクチン研究では、液性免疫と細胞性免疫に対する用量反応およびアジュバント効果を検討した。本研究ではまた、非安定化Ｓ外部ドメイン（膜貫通および細胞質領域を欠失；「Ｓ ｄＴＭ」）とｐｒｅＳ ｄＴＭとの間で効果を比較した。Ｓ ｄＴＭは、Ｈｉｓタグを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ＥＣＤ Ｓ１およびＳ２領域（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を含有した。

ここで使用したマウスは、６～８週齢の非近交系雌Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスであった。これらにワクチン製剤５０μＬ（抗原溶液２５μＬおよびアジュバント２５μＬ）を０日目および２１日目に筋肉内注射した。

以下のデータは、標的抗原用量と実際の抗原用量とを示す。実験を行った後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｒｅＳタンパク質を検出するために使用した重要なポリクローナル抗体試薬は、グリコシル化宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）も認識することが認められた。結果として、標的の純度およびＨＣＰレベルは不正確であり、製剤化ワクチン製品におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｒｅＳタンパク質の濃度は計画よりも有意に低いものであった。表１は投薬レジメンを示し、表２は以下の通りに再度算出した場合の実際の用量を示す。

新たな定量アッセイに基づいた投薬調整のため、実際の用量は０日目および２１日目の注射において異なっていた。一貫性のため、本文および図面には標的用量のみを示す。

血液を－４日目、２１日目、および３６日目に動物から採取した。Ｓ特異的ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ａレベルを、Ｓ１およびＳ２領域を含有するスパイクＥＣＤ（Ｓ ｄＴＭ；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でプレートをコーティングしたＥＬＩＳＡによって測定した。力価は０．２よりも大きいＯＤ値をもたらす最終希釈倍率の逆数として報告した。ＯＤ＝０．２という値は、アッセイバックグラウンドの少なくとも２倍であることを表す。初めに、血清抗体の生ウイルスを中和する能力を、ＢＳＬ３におけるプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ／ＷＡ１／２０２０株のウイルスを使用して評価した。並行して、第２の中和アッセイを、ＢＳＬ２において２９３－ｈｓＡＣＥ２クローナル細胞に対するＩｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＧＦＰ－偽ウイルスアッセイを使用して実施した。

データは、アジュバントを含有しない場合、１または２回投与後の非常に低いかまたは存在しないＩｇＧおよび中和抗体応答によって実証されたように、ｐｒｅＳ ｄＴＭおよびＳ ｄＴＭは免疫原性ではなかった。血清Ｓ特異的ＩｇＧレベルは２つの抗原間で類似しており、２１日目～３６日目に統計的に有意な力価変化は存在しなかった（図４）。対照的に、ＡＦ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンは、試験を行った全ての用量にわたって、１回投与（２１日目）後に高いＩｇＧ応答を誘発した（平均は、異なるワクチン用量群において３．４～４．１Ｌｏｇ_１０ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）の範囲であった）。応答は、２回目の注射（３６日目）によってさらに増大し、ＩｇＧ平均力価はワクチン用量次第では４．４～４．９Ｌｏｇ_１０ＥＵに達した。アジュバント効果（増加倍率およびＰ値）とブースター効果の両方が実証された。アジュバントＡＦ０３は、２１日目と３６日目の両方において、ｐｒｅＳ ｄＴＭを用いた免疫化によって誘導された動物におけるＳ特異的ＩｇＧ価を有意に増加させ、３６日目は２１日目よりも高い力価を示した（図５）。要約すると、ＡＦ０３含有ワクチン製剤の用量反応効果はｐ＜０．００１で統計的に有意であった。しかしながら、非アジュバント製剤の用量反応効果は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．７８６６）。手短に述べると、いかなる用量を使用したとしても、有意なＡＦ０３アジュバント効果が示され、全ての投薬量は０．００１未満のｐ値を有した。

ＩｇＧ応答と一致して、ＡＦ０３アジュバントワクチンは、ＰＲＮＴアッセイにおいて評価されたように、２回投与後に強固な中和抗体応答を誘発した。このアッセイを実施するために、血清サンプルを５６℃で３０分間熱失活させ、希釈剤（ＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ）に希釈した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを調製し、使用するまで氷上に保持した。希釈した血清サンプルを、１ウェル当たり３０ＰＦＵを含有するように希釈した等容量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。コンフルエントのＶｅｒｏ Ｅ６細胞のプレートに血清＋ウイルス混合物２５０μＬを２連で播種し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートに０．５％メチルセルロース培地１ｍＬを重層し、プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で３日間インキュベートした。次いで、メチルセルロース培地を除去し、ウェルを、ＰＢＳ １ｍＬを用いて１回洗浄した。洗浄後、プレートを、１ウェルごとに－２０℃で３０分間、氷冷メタノールで固定した。固定後、メタノールを廃棄し、単層を０．２％クリスタルバイオレットで３０分間室温にて染色し、次いで、ＰＢＳまたはｄＨ_２Ｏを用いて洗浄した。プレートを乾燥させ、中和抗体価を、試験においてウイルスプラークの数を５０％またはそれ以上減少した最も高い血清希釈倍率として同定した。

ＰＲＮＴ_５０力価は、０．５μｇ群の１匹のマウスを除く全てのマウスにおいて検出された。中和平均は、最低ワクチン用量群（０．１６７μｇ）における２．０Ｌｏｇ_１０から最高ワクチン用量群（４．５μｇ）における２．９Ｌｏｇ_１０の範囲であった。したがって、アジュバント製剤を用いて免疫化した動物は、３６日目までに非アジュバント群よりも有意に高い量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を用量依存的に生成した（図６Ａ）。

ＩｇＧ_１（Ｔｈ２に関連する）およびＩｇＧ_２ａ（Ｔｈ１と関連する）価を３６日目に測定して、Ｔｈ１／Ｔｈ２極性化プロファイル応答を記録した。非アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンは、ＩｇＧ_１およびＩｇＧ_２ａ応答を誘発しなかったか、または非常に低いＩｇＧ_１およびＩｇＧ_２ａ応答を誘発したが、ＡＦ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンは、全てのワクチン用量において強固なＩｇＧ_１応答を誘発した（４．６～４．９Ｌｏｇ_１０ＥＵのＩｇＧ_１平均価）。ＩｇＧ_２ａはより低いレベルで誘発され、力価はワクチン用量と共に増加した（２．５～３．９Ｌｏｇ_１０ＥＵの平均価）（図６Ｂ）。ＩｇＧ_２ａ／ＩｇＧ_１比は、Ｔｈ１／Ｔｈ２プロファイルの指標として算出され、ワクチン用量の増加と共に有意に高い比を示した（ｐ＜０．０５）（図６Ｃ）。

補助マウス研究
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えタンパク質ワクチン製剤のマウスにおける第２のマウス研究を記載する。この研究は、免疫化マウスにおける細胞性免疫（ＣＭＩ）を評価することに焦点を当てた。ここで使用したマウスは６～８週齢の雌近交系ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。これらにワクチン製剤５０μＬを０日目および１４日目に筋肉内注射した。１群当たりマウス５匹として、投薬レジメンを以下に示す。注射したｐｒｅＳ ｄＴＭは、アジュバント（ＡＦ０３）の有無にかかわらず、４．５μｇを標的とした。一貫性のため、本文および図面には標的用量のみを示す。

血液を０日目、１４日目、および２４日目に動物から採取した。脾臓を２４日目にＣＭＩ解析のために回収し、脾臓細胞を、１１アミノ酸の重複を有するＳ１＋Ｓ２ １５マーペプチドプール（ＪＰＴ）で刺激した。細胞の表現型をフローサイトメトリー手法によって決定し、サイトカイン産生を細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって評価した。評価したバイオマーカーパネルを以下に示す。

細胞内染色（ＩＣＳ）を実施するために、脾臓をホモジナイズし、赤血球を溶血させ、細胞を３７℃および５％ＣＯ_２で１時間静置した。次いで、脾細胞を計数し、２×１０^６個の細胞をＧｏｌｇｉ Ｐｌｕｇ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に３７℃および５％ＣＯ_２で６時間、４つの条件：ペプチド刺激なし（培地のみの対照）、陽性対照刺激、および２つの個々のスパイクペプチドプール（ＪＰＴ製品ＰＭ－ＷＣＰＶ－Ｓ－１）での刺激の下でインキュベートした。個々の各動物からの細胞を、陽性対照としてブレフェルジンＡ含有細胞活性化カクテル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で刺激した。刺激後、細胞を洗浄し、Ｍｏｕｓｅ ＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（商標）（クローン２．４Ｇ２）に４℃で１０分間再懸濁した。次いで、細胞を遠心沈降し、Ｆｃ ｂｌｏｃｋを除去し、細胞を、以下：ＣＤ４（ＲＭ４－５）ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（５３－６．７）ＡＦ７００（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３－６Ｂ２）ＰＥ／Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１４（Ｓａ１４－２）ＰＥ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を染色緩衝液（ＦＢＳ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に含有する抗体カクテルを用いて４℃で３０分間、表面染色および生／死染色した。表面染色後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて４℃で３０分間固定および透過処理した。次いで、細胞を、１倍Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて洗浄し、続いて以下：ＣＤ３ｅ（１７Ａ２）ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２）Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４）ＢＶ６０５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩＬ－４（１１Ｂ１１）ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびＩＬ－５（ＴＲＦＫ５）ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１倍Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に含有するカクテルを用いて、遮光して４℃で３０分間、細胞内染色した。次いで、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルをＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にかけ、解析をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．６．１）において行った。

ＩＣＳ解析は、ＡＦ０３アジュバントワクチン免疫化マウスにおいて、Ｓ１ペプチドプールとＳ２ペプチドプールの両方での脾細胞刺激に応答してＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－５を発現するＳ特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞が存在しないかまたは該細胞の頻度が少ないことを示した（０．５％未満、アジュバント単独免疫化マウスにおいて検出された非特異的シグナルの範囲内（図６Ｄ）。Ｓ１ペプチドプールおよびＳ２ペプチドプールに対する応答は類似していた。Ｓ１ペプチドに対する応答のみを示す。Ｓ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は検出されなかった（データは示していない）。

非ヒト霊長類研究
この実施例は、液性免疫を評価する非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における研究を記載する。ここで使用した動物は４～１２歳齢のアカゲザルであった。ＮＨＰに、５または１５μｇの標的用量のＡＦ０３と混合したｐｒｅＳ ｄＴＭを０．５ｍＬの容量で０日目および２１日目に筋肉内注射した。血清を４日目、２１日目、２８日目、および３５日目に採取した。５６日目に、免疫化動物を１０^６ＰＦＵのＳＡＲ２－ＣｏＶ－２ ＵＳＡ／ＷＡ１／２０２０株で鼻腔内（合計１ｍＬ）および気管内（合計１ｍＬ）経路を介してチャレンジした。一貫性のため、本文および図面には標的用量のみを示す。

ｐｒｅＳ ｄＴＭを用いたマウスにおいて観察された抗体応答と一致して、アジュバントの非存在下では応答は検出されなかったかまたは非常に低い応答が検出された。しかしながら、ＡＦ０３アジュバントにおいて製剤化した場合、ワクチンは全ての免疫化サルにおいて、早ければ投与１の２週間後に、融合前Ｓに結合する高レベルのＩｇＧを誘発した（５および１５μｇ用量においてそれぞれ３．６および３．９Ｌｏｇ_１０ＥＵの平均価）。２回目の免疫化は２８日目におけるＩｇＧ価を強力に増加させた（５および１５μｇ用量においてそれぞれ４．７および４．９Ｌｏｇ_１０ＥＵの平均価）。重要なことに、力価は２つの抗原用量群（５および１５μｇ）の間で異ならなかった（図７）。ｐｒｅＳ ｄＴＭワクチンによって誘発された機能的抗体応答を、ＧＦＰ－偽ウイルス（Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）中和アッセイを使用して評価した。投与１の３週間後では、偽ウイルス中和力価は検出されなかった。しかしながら、２回目の注射の１週間後（２８日目）では、偽ウイルス中和力価は、全てのＡＦ０３アジュバントｐｒｅＳ ｄＴＭ免疫化マカクにおいて測定された（５および１５μｇ群においてそれぞれ２．１および２．５Ｌｏｇ_１０ＩＣ_５０の平均価）。２つの用量（５および１５μｇ）の間の統計的有意差は証明されなかった。免疫化アカゲザルの機能的抗体応答は、ヒト回復期血清（Ｃｏｎｖ．）のパネルから得られた力価と比較して、ＡＦ０３アジュバントワクチン群において類似した力価を示した（図８）。

初代ヒト細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
この実施例は、ＡＦ０３アジュバントを含有するかまたは含有しないｐｒｅＳ ｄＴＭによって誘導されたＴｈプロファイルを検討した研究を記載する。この研究では、５０名のヒトドナー由来のプールされたＰＢＭＣを、ＡＦ０３または別のアジュバントを含有するかまたは含有しない２．５または５μｇの標的用量のｐｒｅＳ ｄＴＭを用いてプライミングした。アジュバントは２５０μｇ／ｍＬにおいて提供した。次いで、細胞を固定および透過処理し、細胞表面マーカーに対する抗体、ならびにＴｈ１（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－２）またはＴｈ２（ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１７）応答に特徴的なサイトカインに対する抗体で染色した。

データは、ｐｒｅＳ ｄＴＭがＬＴＥにおいて主にＴｈ１応答を誘導し、アジュバント効果が観察されなかったことを示す（図９および図１０）。

臨床研究
この実施例は、本開示のワクチン組成物の安全性および効能を評価するための第Ｉ／ＩＩ相臨床プロトコルを記載する。参加者、転帰評価者、治験責任医師、検査技師、および治験依頼者の大部分の研究スタッフ（ＥＳＤＲおよび関心を持たれた参加者に関与する者のみ除く）はワクチン群割付け群に対して盲検化され（製剤およびアジュバント；注射スケジュールは非盲検化される）。研究介入を準備／管理する者はワクチン群割付けに対して非盲検化される。参加者は無作為化され、年齢によって層別化される。

組成物は、アジュバントを含有するかまたは含有しないｐｒｅＳ ｄＴＭ（シグナルペプチドを有しない配列番号１０のポリペプチドの三量体）を含む。ワクチン組成物は２つの有効性成分含量：それぞれ５μｇ（低用量）および１５μｇ（高用量）のＣｏＶ２ ｐｒｅＳ ｄＴＭ抗原を含有する製剤１および２で提供される。抗原組成物を以下に示す：

その後の研究のために、抗原は、以下の表８Ａに示すように、任意のアジュバントとの混合前に、水性液体溶液において提供してもよい。

アジュバントの効果を評価するために、ＡＦ０３を使用する。アジュバント研究群の単位活性成分含量はｐｒｅＳ ｄＴＭ ５μｇおよび１５μｇである。スクアレンベースＡＦ０３の各単回用量バイアルは以下に示す成分を含有する。

抗原組成物とアジュバント組成物とを使用前に混合し、０．５ｍＬの総容量にする。プラセボは１用量当たり０．５ｍＬの０．９％生理食塩水である。

投与経路は、上腕の三角筋への筋肉内注射である。

各研究介入は、個々の箱において提供する（抗原およびアジュバント、または抗原および希釈剤（ＰＢＳ）を２バイアル箱に入れて１つのキットにする）。

参加者は、１８歳以上の健康な個人であり、複数の年齢群に無作為化される。１８～４９歳の参加者から構成される小規模センチネルコホート（コホート１）は単回用量を投与される。コホート１における０９日目までの安全性データおよび臨床検査値が非盲検データ審査に基づいて許容されるとみなされる場合、コホート１の残っている参加者およびコホート２の全ての参加者を登録する。全ての参加者は、０１日目に、治験ワクチン製剤またはプラセボ対照のいずれか一方の１回の注射を受ける（ワクチン接種［ＶＡＣ］１）。コホート２の参加者は、２２日目に、研究ワクチン製剤またはプラセボの２回目の注射を受ける（ＶＡＣ２）。各参加者の研究への参加期間は、最後の注射からおよそ３６５日である。

ＣＯＶＩＤ－１９様疾病は、能動的および受動的サーベイランスによる効能目的の一部である。この研究のために選択したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２候補抗原の設計は、結合抗体を超える強力な中和抗体の生成を促進すると予想される。アジュバント製剤を含めることは、中和抗体応答の規模をさらに増強し、バランスのとれたＴｈ１／Ｔｈ－２ヘルパーＴ細胞応答を誘導すると予想される。総合すると、これらの戦略は、ウイルス感染の免疫増強の理論上のリスクを設計によって軽減する。重度のＣＯＶＩＤ－１９のリスクの増大に関連すると考えられる慢性合併症を有する個人は除外する。

本研究の主要目的は、０１日目、２２日目、および３６日目における中和抗体のレベルおよびプロファイルを記載することによってワクチン組成物の免疫原性を評価することである。中和抗体価は、中和アッセイを用いて測定する。２２日目および３６日目におけるワクチン接種後の血清抗体中和価は０１日目に対して約２～４倍増加すると予期される。中和抗体の抗体陽転の発生は、ベースライン時に定量下限（ＬＬＯＱ）未満の値、かつ２２日目および３６日目にアッセイＬＬＯＱを超える検出可能な中和価として定義される。

本研究の副次的目的は、各研究介入群の０１日目、２２日目、３６日目、１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）における結合抗体プロファイルを記載すること、ならびに各研究介入群の１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）における中和抗体プロファイルを記載することによってワクチン組成物の免疫原性を評価することである。全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する結合抗体価は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて研究介入群ごとに測定する。抗Ｓ抗体濃度の上昇倍率［後／前］は、２２日目、３６日目、１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）において２もしくはそれ以上、または４もしくはそれ以上になると予期される。中和抗体価は、中和アッセイを用いて測定する。１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）における、０１日目に対するワクチン接種後の血清中和価の上昇倍率は、２もしくはそれ以上、または４もしくはそれ以上になると予期される。中和抗体の抗体陽転の発生は、ベースライン時にＬＬＯＱ未満の値、かつ１８１日目（コホート１）または２０２日目（コホート２）、および３６６日目（コホート１）または３８７日目（コホート２）にアッセイ定量下限を超える検出可能な中和価として定義される。

本研究の別の副次的な目的は、ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９様疾病および血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の発生を記載すること、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えタンパク質に対する抗体応答とＣＯＶＩＤ－１９様疾病および／または血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症のリスクとの間の相関性／関連性を評価することによって効能を評価することである。ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９様疾病は、規定の臨床症状および徴候によって定義され、核アッセイウイルス検出アッセイによって確認される。血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、非Ｓ ＥＬＩＳＡにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体の検出によって定義される。リスク／防御相関は、上で定義されたウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９様疾病および／または血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を考慮してウイルス中和またはＥＬＩＳＡを使用して評価されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体応答に基づく。

本研究の探索的目的は、コホート２の各研究介入群の２２日目および３６日目における細胞免疫応答プロファイルを記載すること、ならびに中和抗体と結合抗体との比を記載することによって免疫原性を評価することである。全長Ｓタンパク質および／またはＳ抗原ペプチドのプールでの刺激後、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインを全血および／または凍結保存ＰＢＭＣにおいて測定する。結合抗体（ＥＬＩＳＡ）濃度と中和抗体価との比を算出する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を、中和アッセイを使用して測定する。このアッセイでは、血清サンプルを一定濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと混合する。血清サンプルに存在する抗体による中和に起因するウイルス感染力（ウイルス抗原産生）の低下はＥＬＩＳＡによって検出することができる。洗浄および固定後、細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原産生は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体、ＨＲＰ ＩｇＧコンジュゲート、および発色基質との連続インキュベーションによって検出することができる。得られた光学密度を、マイクロプレートリーダーを使用して測定する。ウイルス対照ウェルにおけるものと比較したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染力の低下は、血清サンプルにおける中和抗体の存在を示す陽性中和反応とみなされる。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗体血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗Ｓタンパク質ＩｇＧ抗体を、ＥＬＩＳＡを使用して測定する。マイクロタイタープレートを、最適濃度までコーティング緩衝液に希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質抗原でコーティングする。ブロッキング緩衝液の全てのウェルへの添加、および定義された期間のインキュベーションによってプレートをブロッキングしてもよい。インキュベーション後、プレートを洗浄する。全ての対照、参照、およびサンプルを、希釈緩衝液を用いて予め希釈する。次いで、予め希釈した対照、参照、およびサンプルを、コーティングした試験プレートのウェルにおいてさらに段階希釈する。プレートを定義された期間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを洗浄し、最適化された希釈倍率のヤギ抗ヒトＩｇＧ酵素コンジュゲートを全てのウェルに添加し、プレートをさらにインキュベートする。このインキュベーション後、プレートを洗浄し、酵素基質溶液を全てのウェルに添加する。プレートを定義された期間インキュベートして、基質を発色させる。基質の発色を、各ウェルへの停止溶液の添加によって停止する。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートリーダーを使用し、アッセイ特異的ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏテンプレートを使用して試験プレートを読み取る。プレートのブランクの平均光学密度（ＯＤ）値を各プレートにおける全てのＯＤから減算する。試行における各アッセイプレートに含まれるブランク、対照、および参照の標準曲線の測定値を使用してサンプル力価を導出する。

細胞性の免疫（全血および／またはＰＢＭＣを使用）
全長Ｓタンパク質および／またはＳ抗原ペプチドのプールでの刺激後、サイトカインを全血および／または凍結保存ＰＢＭＣにおいて測定する。

ＣＯＶＩＤ－１９様疾病
ＣＯＶＩＤ－１９様疾病は、（ｉ）以下のうちのいずれか１つ（少なくとも１２時間にわたって持続するか、もしくは１２時間以内に再発する）：咳（乾性もしくは湿性）；嗅覚脱失；味覚消失；凍瘡（ＣＯＶＩＤ足指）；呼吸困難もしくは息切れ；臨床上もしくはＸ線検査上の肺炎の証拠；ならびに脳卒中、心筋炎、心筋梗塞、血栓塞栓性事象（例えば、肺塞栓症、深部静脈血栓症、および脳卒中）、および／もしくは電撃性紫斑病の臨床診断を伴う任意の入院；または（ｉｉ）以下のうちのいずれか２つ（少なくとも１２時間にわたって持続するか、もしくは１２時間以内に再発する）：咽頭炎；悪寒；筋肉痛；頭痛；鼻漏；腹痛；ならびに悪心、下痢、および嘔吐のうちの少なくとも１つとして定義される。

ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９疾病
ウイルス学的に確認されたＣＯＶＩＤ－１９疾病は、ＣＯＶＩＤ－１９様疾病との関連における、呼吸器サンプルに対する核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の陽性結果として定義される。

血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症
血清学的に確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症は、血清における、ＥＬＩＳＡによって検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非スパイクタンパク質に特異的な抗体の存在の陽性結果として定義される。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質抗体血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗核タンパク質抗体を、ＥＬＩＳＡを使用して測定する。マイクロタイタープレートを、最適濃度までコーティング緩衝液に希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核タンパク質抗原でコーティングする。ブロッキング緩衝液の全てのウェルへの添加、および定義された期間のインキュベーションによってプレートをブロッキングしてもよい。インキュベーション後、プレートを洗浄する。全ての対照、参照、およびサンプルを、希釈緩衝液を用いて予め希釈する。次いで、予め希釈した対照、参照、およびサンプルを、コーティングした試験プレートのウェルにおいてさらに段階希釈する。プレートを定義された期間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを洗浄し、最適化された希釈倍率のヤギ抗ヒトＩｇＧ酵素コンジュゲートを全てのウェルに添加し、プレートをさらにインキュベートする。このインキュベーション後、プレートを洗浄し、酵素基質溶液を全てのウェルに添加する。プレートを定義された期間インキュベートして、基質を発色させる。基質の発色を、各ウェルへの停止溶液の添加によって停止する。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートリーダーを使用し、アッセイ特異的ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏテンプレートを使用して試験プレートを読み取る。プレートのブランクの平均ＯＤ値を各プレートにおける全てのＯＤから減算する。試行における各アッセイプレートに含まれるブランク、対照、および参照の標準曲線の測定値を使用してサンプル力価を導出する。

ＣＯＶＩＤ－１９症例検出のための核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）
アッセイにおいて、呼吸器サンプルを採取し、ＲＮＡを抽出する。次いで、精製された鋳型を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的を特異的に増幅するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的プライマーを使用するＮＡＡＴによって評価する。

組換えＳワクチンのプライム－ブーストレジメンの一部としての使用
近年の研究は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する液性応答は急速に生じ、症状発現後の約２または３週目にピークに達するが、次の３か月で着実に低下することを示している（例えば、Ｂｅａｕｄｏｉｎ－Ｂｕｓｓｉｅｒｅｓら、ｍＢｉｏ（２０２０）１１（５）：ｅ０２５９０－２０；ＡｌｔｍａｎｎおよびＢｏｙｔｏｎ、Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０２０）５（４９）：ｅａｂｄ６１６０；Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｘ（２０２０）６：１０００７６ｊ；Ｓｅｏｗら、Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０２０）５：１５９８～１６０７；Ｔａｎら、Ｆｒｏｎｔ Ｍｅｄ．（２０２０）５：１～６を参照のこと）。これらの所見は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する液性応答の早期動態が他の急性ウイルス感染症のものと類似していることを示唆する。ｍＲＮＡワクチンの２回投与によって誘発された結合抗体濃度およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和力価もまたこのパターンを取り、２回目の投与の５週間後に低下を示すことが報告されている（Ｓａｈｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ（２０２０）５８６：５９４～９；Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ（２０２０）５８６：５８９～５９３）。

この実施例は、本開示のタンパク質ワクチンをｍＲＮＡワクチン、すなわちｍＲＮＡ－ＶＡＣ１またはｍＲＮＡ－ＶＡＣ２のブースターとして使用したＮＨＰモデルにおける研究を記載する。ｍＲＮＡ－ＶＡＣ１およびｍＲＮＡ－ＶＡＣ２はｍＲＮＡワクチンである。これらはどちらもポリペプチド配列が配列番号１３である組換えＳタンパク質をコードするが、異なる脂質ナノ粒子製剤を含有する。ｍＲＮＡ－ＶＡＣ１は、結合および中和抗体、ならびにマウスおよびＮＨＰにおいてＴｈ１系Ｔ細胞応答を誘導することが示されている（ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０２０．１０．１４．３３７５３５ｖ１）。

材料および方法
酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｂプレートを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ Ｓ－ＧＣＮ４タンパク質（ＧｅｎｅＡｒｔにおいて特注した）で４℃にて一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．１％を用いて３回洗浄した後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．１％中１％ＢＳＡを用いて周囲温度で１時間ブロッキングした。サンプルを、ブロッキング緩衝液における初期希釈倍率１：４５０からの３倍７点段階希釈を用いてプレーティングした。プレートを、室温での１時間のインキュベーション後に３回洗浄し、その後、１：５０００ウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）５０μＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、３回洗浄した。プレートを、Ｐｉｅｒｃｅ １－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液を使用して０．１時間発色させ、ＴＭＢ停止溶液によって停止した。プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）プレートリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取った。抗体価を、０．２以上の光学密度（ＯＤ）カットオフである最高希釈倍率として報告した。

偽ウイルス中和アッセイ
血清サンプルを培地（ＦｌｕｏｒｏＢｒｉｔｅ（商標）フェノールレッド不含ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１％ＰＳ＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））に１：４に希釈し、５６℃で０．５時間熱失活させた。さらに２倍段階希釈した熱失活させた血清を調製し、１ウェル当たり３００個の感染性粒子を含有するように希釈したレポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）－ＧＦＰ（Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。５０％コンフルエントの２９３Ｔ－ｈｓＡＣＥ２クローナル細胞７５μＬの９６ウェルプレートに血清／ウイルス混合物５０μＬを接種し、３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、プレートをハイコンテントイメージング装置において走査し、個々のＧＦＰ発現細胞を計数した。阻害希釈価（ＩＤ_５０）を、試験においてウイルスプラークの数を５０％減少した希釈倍率の逆数として報告した。各試験サンプルのＩＤ_５０を、プラーク数が５０％中和点未満である最後の希釈倍率とプラーク数が５０％中和点超である最初の希釈倍率とを使用して傾きおよび切片を算出することによって内挿した。ＩＤ_５０力価＝（５０％中和点－切片）／傾き。

マイクロ中和アッセイ
２倍段階希釈の熱失活させた血清サンプルを、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）を標的とするチャレンジ用量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０株［ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ；カタログ番号ＮＲ－５２２８１］）と共に３７℃および５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。血清－ウイルス混合物を、予め形成したＶｅｒｏ Ｅ６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８６（商標））細胞単層を有する９６ウェルマイクロプレートのウェルに接種し、３７℃および５％ＣＯ_２で０．５時間吸着させた。既存の播種材料を除去せずに、追加のアッセイ培地を全てのウェルに添加し、３７℃および５％ＣＯ_２で２日間インキュベートした。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞単層の洗浄および固定後、細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原産生が、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ核タンパク質マウスモノクローナル抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号４０１４３－ＭＭ０５）、ＨＲＰ ＩｇＧコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号１１５－０３５－０６２）、および発色基質との連続インキュベーションによって検出された。得られた光学密度を、マイクロプレートリーダーを使用して測定した。ウイルス対照ウェルにおけるものと比較したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染力の低下は、血清サンプルにおける中和抗体の存在を示す陽性中和反応とみなされる。５０％中和価（ＭＮ ＩＤ_５０）は、ウイルス感染力が各プレートのウイルス対照に対して５０％低下した血清希釈倍率の逆数として定義した。各サンプルのＭＮ ＩＤ_５０を、ＯＤが５０％中和点未満である最後の希釈倍率とＯＤが５０％中和点超である最初の希釈倍率とを使用して傾きおよび切片を算出することによって内挿した；ＭＮ ＩＤ_５０力価＝（５０％中和点のＯＤ－切片）／傾き。

メモリーＢ細胞解析
ＮＨＰにおけるＢ細胞メモリー応答を試験するために、サルＩｇＧ／ＩｇＡ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ Ｋｉｔ（Ｋｉｔ；ＭＡＢＴＥＣＨ、カタログ番号ＦＳ－０５Ｒ２４Ｇ－１０）を使用した。凍結ＰＢＭＣを培養培地（Ｌ－グルタミン、１０％ＦＣＳ、および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０）において洗浄し、ペトリ皿において、それぞれ１μｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のＲ８４８および組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）を補充した同じ培養培地に再懸濁し、３７℃および５％ＣＯ_２で３日間インキュベートした。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレートを、４μｇ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓ－ＧＣＮ４タンパク質（ＧｅｎｅＡｒｔ）またはＫｉｔにおいて提供された１５μｇ／ｍＬの抗ＩｇＧおよびＩｇＡ ｍＡｂで一晩コーティングした。次いで、プレートを完全培地によって１時間ブロッキングした。予備刺激したＰＢＭＣを、洗浄し、計数して生存細胞の数を決定し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓ－ＧＣＮ４タンパク質でコーティングしたウェルについては１ウェル当たり５×１０^５個、抗ＩｇＧおよびＩｇＡ ｍＡｂでコーティングしたウェルについては１ウェル当たり１×１０^５個でプレートに添加した。プレートを３７℃および５％ＣＯ_２で１６～２４時間インキュベートした。洗浄後、蛍光標識抗ＩｇＧおよびＩｇＡ検出抗体を２時間添加し、続いて蛍光増強剤を添加した。プレートを２４時間風乾した後、蛍光スポットを、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアナライザーを用いて計数した。データは、ＰＢＭＣ１００万個当たりの抗体分泌細胞（ＡＳＣ）数として報告した。

サイトカインＥＬＩＳＰＯＴ解析
ＮＨＰにおけるサイトカイン応答を試験するために、サルＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴ（ＣＴＬ、カタログ番号３４２１Ｍ－４ＡＰＷ）およびＩＬ－１３ ＥＬＩＳＰＯＴキット（ＣＴＬ、カタログ番号３４７０Ｍ－４ＡＰＷ）を使用した。予め凍結させたＰＢＭＣを洗浄し、キットによって提供された培養培地に再懸濁し、計数した。ＰｅｐＭｉｘ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドプールおよびＣｏｖＡを刺激のために使用した。ＰＢＭＣを１ウェル当たり３００，０００個プレーティングし、一晩刺激した。一晩のインキュベーション後、プレートを洗浄し、製造業者の説明書に従って発色させた。プレートを一晩乾燥させ、走査し、スポットを、ＣＴＬアナライザー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ６ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＣＴＬ）を使用して計数した。データは、ＰＢＭＣ１００万個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）として報告した。

結果
本研究では、２～６歳齢および２～６ｋｇの範囲の体重のモーリシャス産のカニクイザルに、ｍＲＮＡ－ＶＡＣ２（１５μｇ、４５μｇ、または１３５μｇ）を０日目（Ｄ０）に右前肢の三角筋、次いで２１日目（Ｄ２１）に同じ量のｍＲＮＡ－ＶＡＣ２を反対の前肢に筋肉内注射した。ＮＨＰ血清サンプルを４、１４、２１、２８、３５、４２日目に採取し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を４２日目に単離した。データは、９０日目の血清サンプルにおける中和活性の劇的な低下を明らかにする（図１１）。商業的販売業者（Ｓａｎｇｕｉｎｅ Ｂｉｏｂａｎｋ、ｉＳｐｅｃｉｍｅｎ、およびＰＰＤ）から得た回復期ヒト血清を全てのアッセイにおいて免疫応答の評価に含めた。抗体価は、単回用量の免疫化に対応するレベルに低下した。

１２９日目に、６匹のｍＲＮＡ－ＶＡＣ２免疫化動物を、ＡＦ０３をアジュバントとしたｐｒｅＳ ｄＴＭ（３μｇ）を用いてブーストした。ブースト後１４日目（１４３日目）に、ブースターは、１０倍～１５倍の、マイクロ中和（ＭＮ_５０）（図１２）価および結合抗体価（図１３）の強固な増加を誘導した。ブーストの２～６週間後にＭＮおよび結合価の有意ではない低下が観察された。

一次応答がＢ細胞メモリー構成成分を提供したか否かもまた探索した。ブースト投与前（９０日目）に採取したＮＨＰ ＰＢＭＣサンプルのＥＬＩＳＰＯＴ解析を実施した。個々のＮＨＰ由来のＰＢＭＣにおけるスパイク特異的メモリーＢ細胞を、０日目のｍＲＮＡ－ＶＡＣ１を用いた免疫化後９０日目に計数した（表１０）。総およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的ＩｇＧ ＡＳＣを、上に記載したようにＥＬＩＳＰＯＴによって計数した。ＩｇＧ比活性を（Ｓ特異的ＩｇＧ ＡＳＣ／総ＩｇＧメモリーＡＳＣ）×１００％として算出した。

表１０におけるデータは、９０日目のｍＲＮＡ－ＶＡＣ１免疫化動物における循環メモリーＢ細胞のレベルが、使用したプライム投薬量にかかわらず０．６％～４％であったことを明らかにする。このレベルは、他のワクチンの場合に報告されたものよりも５～１０倍高かった（Ｓｃｈｅｒｅｒら、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．（２０１４）１０（１２）：ｅ１００４４６１；Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２０１９）１５：２４６６～７４）。このメモリーＢ細胞のレベルは、感染の６か月後のＣＯＶＩＤ－１９患者における免疫学的記憶評価に関する近年の報告とも矛盾しない。

表１１は、ＡＦ０３をアジュバントとしたｐｒｅＳ ｄＴＭ ３μｇを用いたブースト前後の個々のＮＨＰ由来のＰＢＭＣにおけるスパイク特異的メモリーＢ細胞のレベルを示す。１２９日目のブースト前、これらのＮＨＰにｍＲＮＡ－ＶＡＣ２を表に示した用量で０日目および２１日目に注射した。総およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ特異的ＩｇＧ ＡＳＣを、上に記載したようにＥＬＩＳＰＯＴによって計数した。ＩｇＧ比活性を（Ｓ特異的ＩｇＧ ＡＳＣ／総ＩｇＧメモリーＡＳＣ）×１００％として算出した。

表１１におけるデータは、ｍＲＮＡワクチン接種によって誘導されたメモリーＢ細胞レベルが、中和および結合抗体価の明確な増加にもかかわらず、プライム投薬量によって用量依存的に影響されなかったことを示す。表１１における結果は、ｍＲＮＡワクチン接種によって誘導されたメモリーＢ細胞レベルが非常に高く、サブユニットワクチン接種によってあまり効率的にブーストされなかった可能性があることを示唆する。この所見は、実験の観察期間が短かったこと（ワクチン接種後６か月未満）にも起因し得る。

次に、ワクチン接種ＮＨＰにおけるＴ細胞応答プロファイルを検討した。ワクチン関連呼吸器疾患増強（ＶＡＥＲＤ）は、開発中のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの安全性に対する懸念事項の１つであるが、この段階での懸念事項は理論上のものに過ぎない（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２０）３６８：９４５～６を参照のこと）。ＶＡＥＲＤは、麻疹および呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に対する全不活化ウイルスワクチンにおいて報告されている（Ｇｒａｈａｍ、前出）。ＶＡＥＲＤに関する説明の１つは、抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１３）の産生の偏りを示唆する。Ｔｈ２プロファイルと疾患増強との間の同様の関連がマウスにおける不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ワクチンにおいて報告されている（Ｂｏｌｌｅｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（２０１１）８５：１２２０１～５；Ｔｓｅｎｇら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１２）７：ｅ３５４２１）。より重症度が低いＳＡＲＳの症例は、Ｔｈ１細胞応答の誘導の加速に関連した（Ｏｈら、Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｉｎｆｅｃｔ．（２０１２）１：１～６）。同様の現象はヒトにおいて観察されている。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的細胞応答は疾患の重症度に関連し：軽度のＣＯＶＩＤ－１９症状を有していた回復した患者由来のＰＢＭＣはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原による高レベルのＩＦＮ－γ誘導を実証し、重度の肺炎を有していたＣＯＶＩＤ－１９患者由来のＰＢＭＣはこのサイトカインの有意に低いレベルを示した（Ｋｒｏｅｍｅｒら、Ｊ ｉｎｆｅｃｔ．（２０２０）４８１６、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｎｆ．２０２０．０８．０３６）。したがって、本ワクチン接種レジメンによって誘導されたＴ細胞プロファイルを理解することは重要である。

Ｔ細胞サイトカイン応答を、ＮＨＰにおいて、２１日目の２回目のｍＲＮＡ－ＶＡＣ１ワクチン接種の３週間後に試験した。プールされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ペプチドでの再刺激によって誘導されたサイトカインを、ＩＦＮ－γ（Ｔｈ１サイトカイン）およびＩＬ－１３（Ｔｈ２サイトカイン）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって４２日目にＰＢＭＣにおいて評価した。試験を行った３つの用量レベル群の大部分の動物（１２匹中１０匹）はＩＦＮ－γ分泌細胞の存在を実証し、スポット形成細胞はＰＢＭＣ１００万個当たり２～１００個超の範囲であった。低用量および高用量レベル群の動物は同等の頻度のＩＦＮ－γ分泌細胞を示したため、用量依存的応答は観察されなかった。対照的に、ＩＬ－１３サイトカイン分泌細胞は、試験を行った群のいずれにおいても、またいずれの用量レベルにおいても検出されず、Ｔｈ１系細胞応答の誘導を示唆した（図１４）。これらのデータは、ＮＨＰにおけるｍＲＮＡ－ＶＡＣ１ワクチン接種後のＳ抗原に対するＴｈ２応答の不足に関する明確な証拠を提示した。次いで、本発明者らは１２９日目にｐｒｅＳ ｄＴＭを用いてブーストした動物由来のＰＢＭＣのサイトカイン分泌プロファイルを調査した。１７１日目（ブースト後４２日目）において、ブーストした動物由来のＰＭＢＣは、ブースト前比と類似したＴｈ１／Ｔｈ２比を維持した（図１５）。

これらの結果は、３週間空けて投与されたｍＲＮＡ－ＶＡＣ１または類似のｍＲＮＡ製剤（例えば、ｍＲＮＡ－ＶＡＣ２）の２回の筋肉内免疫化によって誘導された一次液性記憶応答が、１２９日目の単回用量のアジュバントタンパク質ワクチン製剤の単回投与によって効果的にブーストされたことを実証する。結論として、本明細書に記載したプライム－ブーストレジメンは、遺伝子ワクチンを介して送達されたＳ免疫原の初回導入後の血液において、抗体の急速な再出現を可能にした。これらの結果は、本タンパク質ワクチンが、ブースターとしてＣＯＶＩＤ－１９ワクチン定期接種に導入されて、免疫前集団において持続的かつ高度に効果的な防御を実現し得ることを示唆する。

Claims (38)

1. 単離されたポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端へと、
   （ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３と少なくとも９５％同一であり、配列番号１０の６８７～６９０位における残基ＧＳＡＳ（配列番号６）と配列番号１０の９９１位および９９２位における残基ＰＰとが維持されている配列；および
   （ｉｉ）配列番号７を含む三量体化ドメイン
   を含む単離されたポリペプチド。
2. （ｉｉｉ）昆虫またはバキュロウイルスタンパク質に由来するシグナルペプチドをさらに含み、場合により、昆虫またはバキュロウイルスタンパク質はキチナーゼである、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
3. シグナルペプチドは配列番号３を含む、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
4. ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３または（ｉｉ）配列番号１４の残基１９～１２４０と同一の配列を含むかまたは有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
5. 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質であって、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドの三量体である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質。
6. （ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３または（ｉｉ）配列番号１４の残基１９～１２４０と同一の配列を有するポリペプチドの三量体である、請求項５に記載の組換えタンパク質。
7. 請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子であって、場合により配列番号９を含む、核酸分子。
8. ポリペプチドを発現させるためのバキュロウイルスベクターであって、請求項７に記載の核酸分子を含む、バキュロウイルスベクター。
9. ポリペプチドの発現は、ポリヘドリンプロモーターの制御下にある、請求項８に記載のバキュロウイルスベクター。
10. 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を産生する方法であって、
    請求項８または９に記載のバキュロウイルスベクターを昆虫細胞に導入する工程、
    ポリペプチドの発現および三量体化を可能にする条件下で昆虫細胞を培養する工程、ならびに
    培養物から、シグナル配列を有しないポリペプチドの三量体である組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を単離する工程
    を含む、方法。
11. 請求項１０に記載の方法によって産生される組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質。
12. 請求項５、６、または１１に記載の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物であって、場合により、薬学的に許容される担体は、７．５ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、ならびに場合により０．２％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むリン酸緩衝生理食塩水を含む、免疫原性組成物。
13. 請求項５、６、または１１に記載の１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む免疫原性組成物であって、組成物０．２５ｍＬごとまたは組成物の各用量について、
    組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質合計２μｇ～５０μｇ、
    リン酸一ナトリウム一水和物０．０９７ｍｇ、
    無水リン酸二水素ナトリウム０．２６ｍｇ、
    塩化ナトリウム２．２ｍｇ、
    ポリソルベート２０ ５５０μｇ、および
    水約０．２５ｍＬ
    を含むか、またはそれらを混合することによって調製される、免疫原性組成物。
14. 組成物の各用量は：
    （ｉ）組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で約２～約４５μｇ含む抗原構成成分と；
    （ｉｉ）１用量のアジュバントであって、アジュバントの各用量は０．２５ｍＬの容量であり、
    スクアレン１２．５ｍｇ、
    モノオレイン酸ソルビタン１．８５ｍｇ、
    ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル２．３８ｍｇ、
    マンニトール２．３１ｍｇ、および
    リン酸緩衝生理食塩水
    を含むか、またはそれらを混合することによって調製される、アジュバントと
    を含むか、またはそれらを混合することによって調製される、請求項１２または１３に記載の免疫原性組成物。
15. 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を１用量当たり合計で２．５、５、１０、１５、または４５μｇ含み、場合により、免疫原性組成物の各用量は、アジュバントを含有しないで０．２５ｍＬの容量であるか、またはアジュバントを含有して０．５ｍＬの容量である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
16. 組成物の各用量は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で５μｇ含み、場合により、組成物は、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を等量で含み、場合により、免疫原性組成物の各用量は、アジュバントを含有しないで０．２５ｍＬの容量であるか、またはアジュバントを含有して０．５ｍＬの容量である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
17. 組成物の各用量は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で１０μｇ含み、場合により、組成物は、２つの異なる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を等量で含み、場合により、免疫原性組成物の各用量は、アジュバントを含有しないで０．２５ｍＬの容量であるか、またはアジュバントを含有して０．５ｍＬの容量である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
18. 配列番号１０の残基１９～１２４３を含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質および／または配列番号１４の残基１９～１２４０を含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
19. 請求項１２～１８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含有する容器。
20. バイアルまたはシリンジである、請求項１９に記載の容器。
21. 単回用量または複数回用量の免疫原性組成物を含有する、請求項１９または２０に記載の容器。
22. 筋肉内ワクチン接種のためのキットであって、２つの容器を含み、
    第１の容器は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の請求項５、６または１１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含む医薬組成物を含有し；第２の容器は、アジュバントを含有する、
    キット。
23. 第１の容器は、１回またはそれ以上の抗原用量を含み、各抗原用量は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．２５ｍＬにおいて提供される組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で約２～４５μｇ含み、場合により、ＰＢＳは、
    （ｉ）７．５ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、ならびに場合により０．２％ポリソルベート２０、または
    （ｉｉ）リン酸一ナトリウム一水和物０．０９７ｍｇ、無水リン酸二水素ナトリウム０．２６ｍｇ、塩化ナトリウム２．２ｍｇ、ポリソルベート２０ ５５０μｇ、および０．２５ｍＬまでの十分量の水
    を含む、請求項２２に記載のキット。
24. 各抗原用量は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で２．５、５、１０、１５、または４５μｇ含み、場合により、抗原用量は、
    （ｉ）配列番号１０の残基１９～１２４３を含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、
    （ｉｉ）配列番号１４の残基１９～１２４０を含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、または
    （ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方
    を含む、請求項２３に記載のキット。
25. 第２の容器は、１回またはそれ以上の用量のアジュバントを含み、アジュバントの各用量は、０．２５ｍＬの容量であり、ＰＢＳ中：
    スクアレン１２．５ｍｇ、
    モノオレイン酸ソルビタン１．８５ｍｇ、
    ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル２．３８ｍｇ、および
    マンニトール２．３１ｍｇ
    を含み、場合により、ＰＢＳは、
    （ｉ）７．５ｍＭリン酸塩および１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、ならびに場合によりポリソルベート、場合によりポリソルベート２０；または
    （ｉｉ）リン酸一ナトリウム一水和物０．０９７ｍｇ、無水リン酸水素二ナトリウム０．２６ｍｇ、塩化ナトリウム２．２ｍｇ、ポリソルベート、場合によりポリソルベート２０ ５０～６００、場合により５５または５５０μｇ、および０．２５ｍＬまでの十分量の水
    を含むか、またはそれらを混合することによって調製される、請求項２２～２４のいずれか１項に記載のキット。
26. ワクチンキットを作製する方法であって：
    請求項１２～１８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を提供する工程、および
    組成物を滅菌容器に包装する工程
    を含む、方法。
27. それを必要とする対象においてＣＯＶＩＤ－１９を防止または改善する方法であって、対象に、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の予防有効量の免疫原性組成物を投与する工程を含む、方法。
28. それを必要とする対象においてＣＯＶＩＤ－１９を防止または改善する方法であって、対象に、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の予防有効量の免疫原性組成物を投与する工程を含み、投与する工程の前に、対象はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したことがあるか、または第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されたことがある、方法。
29. 投与する工程の前に、対象は、遺伝子、サブユニット、または死滅ワクチンを接種されたことがある、請求項２８に記載の方法。
30. 投与する工程の前に、対象は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ抗原をコードするｍＲＮＡを含む遺伝子ワクチンを接種されたことがある、請求項２９に記載の方法。
31. 投与する工程は、感染から、または対象が第１のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを接種されてから４週間、１か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、または１年後、場合により４～１０か月後、さらに場合により８か月後に行われ、場合により、免疫原性組成物は、それぞれの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を２．５または５μｇ含み、さらに場合により、免疫原性組成物は一価または多価である、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 予防有効量は、１用量当たり約２～５０μｇ、場合により１用量当たり２．５、５、１０、１５、または４５μｇである、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 予防有効量は単回用量または２回もしくはそれ以上の用量で、場合により筋肉内に投与される、請求項２７～３２のいずれか１項に記載の方法。
34. ２用量の免疫原性組成物を約２週間～約３か月の間隔で対象に投与する工程を含み、免疫原性組成物の各用量は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を合計で２．５、５、または１０μｇ含む、請求項３３に記載の方法。
35. 間隔は、約３週間もしくは約２１日、または約４週間もしくは約２８日、または約１か月である、請求項３４に記載の方法。
36. 対象はヒト対象であり、場合により、ヒト対象は、小児、成人、または高齢者である、請求項２７～３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 場合により請求項２７～３６のいずれか１項に記載の方法における、ＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置のための医薬の製造のための、請求項５、６、もしくは１１に記載の組換えタンパク質、または請求項１２～１８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
38. 場合により請求項２７～３６のいずれか１項に記載の方法における、ＣＯＶＩＤ－１９の予防的処置における使用のための、請求項５、６、もしくは１１に記載の組換えタンパク質、または請求項１２～１８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

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