JP2023535064A - ゲノム編集のための新規の天然に存在しないｃｒｉｓｐｒ－ｃａｓヌクレアーゼ - Google Patents

Abstract

本発明は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子であって、（ａ）配列番号２９、１若しくは３のアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなる、当該ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、（ｂ）配列番号３０、２若しくは４のヌクレオチド配列を含む、又は当該ヌクレオチド配列からなる、核酸分子、（ｃ）アミノ酸配列が前記アミノ酸配列（ａ）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、（ｄ）前記ヌクレオチド配列（ｂ）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、又は当該同一であるヌクレオチド配列からなる、核酸分子、（ｅ）前記核酸分子（ｄ）に関して縮重した核酸分子、又は（ｆ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つの核酸分子に対応する核酸分子であって、ＴがＵによって置換されている、核酸分子に関する。【選択図】 なし

Description

本発明は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子であって、（ａ）配列番号２９、１若しくは３のアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなる、当該ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、（ｂ）配列番号３０、２若しくは４のヌクレオチド配列を含む、又は当該ヌクレオチド配列からなる、核酸分子、（ｃ）アミノ酸配列が前記アミノ酸配列（ａ）と少なくとも９０％、、好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、（ｄ）前記ヌクレオチド配列（ｂ）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、又は当該同一であるヌクレオチド配列からなる、核酸分子、（ｅ）核酸分子（ｄ）に関して縮重した、核酸分子、又は（ｆ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つの核酸分子に対応する核酸分子であって、ＴがＵによって置換されている、核酸分子に関する。

本明細書において、特許出願及び製造元のマニュアルを含むいくつかの文書が引用されている。これらの文書の開示は、本発明の特許性に対して関連しているとはみなされないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、参照される文書はすべて、あたかも各個々の文書が具体的かつ個々に参照により組み込まれるよう示されているかのように同程度まで、参照により組み込まれる。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系は、外来核酸の侵入に対する原核生物の広範な適応免疫系である。これまで、遺伝子座の構造、数、及びＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質をコードする遺伝子の同一性が異なる、３０を超える異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系が同定されている。

原核生物ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲの系の典型的な特徴は、同様の長さの変動可能な配列（スペーサー）が介在する短い（３０～４５ｂｐ）反復配列（リピート）の存在である。Ｃａｓタンパク質は、リピート－スペーサークラスターの上流又は下流のいずれかに位置する。このＣａｓタンパク質の遺伝子の組成及びメカニズムの違いによるとサブタイプは、２つのＣＲＩＳＰＲクラス（クラス１及び２）に分類される。これらの主な違いのうちの1つは、クラス１のＣＲＩＳＰＲの系が、ＤＮＡを分解するために複数のＣａｓタンパク質の複合体を必要としているのに対し、クラス２のＣａｓタンパク質は、単一の大きな多重ドメインヌクレアーゼであることである。クラス２のＣａｓタンパク質の配列特異性は、標的とされる二本鎖ＤＮＡの切断を導入するための合成ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）によって容易に変更することができる。かかるクラス２Ｃａｓタンパク質の最も広く知られているメンバーは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）、及びＣｍｓ１であり、これらは、ゲノム編集のために利用され、真菌、植物、及び哺乳動物細胞を含む多くの真核生物においてうまく適用される。Ｃａｓ９及びそのオルソログが、クラス２のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであるのに対し、Ｃｐｆ１（特許文献１，ＢＲＯＡＤ Ｉｎｓｔ．、特許文献２，Ｂｅｎｓｏｎ Ｈｉｌｌ）及びＣｍｓ１（特許文献３，Ｂｅｎｓｏｎ Ｈｉｌｌ）は、クラス２のＶ型ヌクレアーゼに属する。Ｃｍｓ１ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＣｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＩＩ型ヌクレアーゼなど他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと比較して、ある種の所望の特性を有するクラスのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは対照的に、Ｃｍｓ１及びＣｐｆ１は、ｃｒＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）と部分的に相補的であるトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要としない（非特許文献１）。ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの塩基対形成は、Ｃａｓ９結合型ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を形成し、これがＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ及び他の同定されていないヌクレアーゼによるプロセシングを受けている。この成熟したｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖は、Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの認識及び開裂に介在する。対照的に、Ｖ型ヌクレアーゼは、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は（ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのような）細胞性ヌクレアーゼを必要とせず、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのプロセシングを行うことができ、このことは、（多重）ゲノム編集に対するＶ型ヌクレアーゼの適用を有意に簡素化している。

いくつかの新たなクラス２タンパク質、例えば、Ｃ２ｃ１（Ｃａｓ１２ｂ）、Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａ）、及びＣ２ｃ３（Ｃａｓ１２ｃ）は、培養された細菌のゲノムにおいて、又は一般に公開されているメタゲノム解析データセット、例えば腸管メタゲノム（非特許文献２）において同定されている。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系の近年の分類によると、クラス２は、３つのタイプと１７のサブタイプとを含む（非特許文献３）。

さらに、近年の刊行物において、２つの新たなクラス２タンパク質（ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ａ）及びＣａｓＹ（Ｃａｓ１２ｄ））が、培養されていない原核生物においてメガゲノム配列決定によって発見され（非特許文献４）、まだ培養されていない及び／又は同定されていない生物由来の、利用されたことのないＣａｓタンパク質の存在を示した。

論議されるように、既知のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系は、作用様式に関してある種の特異性を示す。これらの分子的特異性は、様々な遺伝的バックグラウンドの広範な範囲でのゲノム編集に対してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系を用いる可能性を拡大するが、それのみならず、特定のＣａｓヌクレアーゼを特定の生物に適用する場合の問題、例えば、ヒトにおけるＣａｓ９に対する既存免疫応答（非特許文献５）といった問題を回避する必要もある。それゆえ、より高次の真核生物との直接的な接触がほとんどない細菌種由来のＣａｓヌクレアーゼ、或いは非天然起源のＣａｓヌクレアーゼの同定は特に重要である。特徴が未知のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系は、自然界に存在するか或いはタンパク質工学によって設計することができると想定される。従って、すでにいくつかの異なるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系が従来技術から既知ではあるものの、さらなるＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを同定することには継続的な需要がある。

国際公開第２０１６／２０５７１１号 国際公開第２０１７／１４１１７３号 国際公開第２０１９／０３０６９５号

Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ，４７１（７３４０）：６０２～６０７ Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，６０（３）：３８５～３９７ Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０２０），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１８（２）：６７～８３ Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ，５４２：２３７～２４１ Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｎａｔ Ｍｅｄ，２５（２）：２４９～２５４

したがって、本発明は、第１の態様において、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子であって、（ａ）配列番号２９、１若しくは３のアミノ酸配列を含む、又は当該アミノ酸配列からなる、当該ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、（ｂ）配列番号３０、２若しくは４のヌクレオチド配列を含む、又は当該ヌクレオチド配列からなる、核酸分子、（ｃ）アミノ酸配列が前記アミノ酸配列（ａ）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、（ｄ）前記ヌクレオチド配列（ｂ）と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、又は当該同一であるヌクレオチド配列からなる、核酸分子、（ｅ）（ｄ）の核酸分子に関して縮重した、核酸分子、或いは（ｆ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つの核酸分子に対応する核酸分子であって、ＴがＵによって置換されている、核酸分子に関する。

配列番号１、３、及び２９は、それぞれ新規のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエンドヌクレアーゼＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０のアミノ酸配列であって、ＢＥＣは、ＢＲＡＩＮ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓの略語である。配列１、３、及び２９のアミノ酸配列のうち、配列番号２９、したがって、ＢＥＣ１０のアミノ酸配列が好ましい。新規のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエンドヌクレアーゼＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、それぞれ配列番号２、４、及び３０のヌクレオチド配列によってコードされる。配列番号２、４、及び３０のヌクレオチド配列のうち、配列番号３０、したがって、ＢＥＣ１０のヌクレオチド配列が好ましい。本明細書で以下により詳細に論議されるように、新規のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエンドヌクレアーゼＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、天然には生じないが、タンパク質工学によって調製されている。

図面は以下を示す。

ＳｐＣａｓ９と比較して、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０についてのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃにおけるＡｄ２ノックアウト戦略を可視化する概略図。 ＳｐＣａｓ９と比較して、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０の異なる分子機序を可視化するために、形質転換４８時間後のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２２８ｃコロニーを示す例示的な培養プレート。 隣接配列ＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３と比較して、ＢＥＣファミリーヌクレアーゼのコロニー低減及びゲノム編集効率を可視化するために、形質転換４８時間（３０℃でインキュベート）後のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２２８ｃコロニーを示す例示的な培養プレート。編集された細胞と編集されていない細胞との混合物である橙色のコロニーが矢印でマークされる。 隣接配列ＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３と比較して、ＢＥＣファミリーヌクレアーゼの低温（２１℃）でのコロニー低減及びゲノム編集効率を可視化するために、形質転換４８時間（２１℃でインキュベート）後のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２２８ｃコロニーを示す例示的な培養プレート。 隣接配列ＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３と比較して、ＢＥＣファミリーヌクレアーゼの高温（３７℃）でのコロニー枯渇効率を可視化するために、形質転換４８時間（３７℃でインキュベート）後のＥ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３コロニーを示す例示的な培養プレート。

本発明に従って、「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドの線状分子鎖を定義する。本発明による核酸分子は、少なくとも３３２７個のヌクレオチドからなる。本明細書で「核酸分子」と呼ばれる分子の群はまた、完全な遺伝子を含む。「核酸分子」という用語は、本明細書では「ポリヌクレオチド」という用語と相互交換可能に使用される。

本発明に従った「核酸分子」という用語は、ｃＤＮＡ又は二本鎖若しくは一本鎖のゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ、及びＲＮＡを含む。この点において、「ＤＮＡ」（デオキシリボ核酸）は、デオキシリボース糖のバックボーン上で互いに連結している、ヌクレオチド塩基と呼ばれる化学構築ブロックである、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）のいずれかの鎖又は配列を意味する。ＤＮＡは、ヌクレオチド塩基からなる１本の鎖、又は二重らせん構造を形成し得る２本の相補的な鎖を有することができる。「ＲＮＡ」（リボ核酸）は、リボース糖のバックボーン上で互いに連結している、ヌクレオチド塩基と呼ばれる化学構築ブロックである、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）、のいずれかの鎖又は配列を意味する。ＲＮＡは典型的には、ヌクレオチド塩基からなる１本の鎖を有する。また、一本鎖分子及び二本鎖雑種分子、すなわち、ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ、及びＲＮＡ－ＲＮＡも含まれる。核酸分子はまた、当該技術分野で既知の多くの手段によって修飾され得る。かかる修飾の非限定例としては、メチル化、「キャップ形成」、天然のヌクレオチドのうちの１つ以上の類似体との置換、並びに、例えば、非荷電性結合を有するもの（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバマートなど）及び荷電性結合を有するもの（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）などヌクレオチド間修飾がある。ポリヌクレオチドは、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ－Ｌ－リジンなど）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤（例えば、金属類、放射性金属類、鉄、酸化金属類など）、及びアルキル化剤など、１つ以上の追加の共有結合部分を含有し得る。ポリヌクレオチドは、メチルホスホトリエステル結合若しくはエチルホスホトリエステル結合、又はアルキルホスホルアミダート結合の形成によって誘導体化され得る。さらに、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成誘導体又は半合成誘導体、及び混合型ポリマーなど、当該技術分野で既知の核酸模倣分子が含まれる。本発明によるかかる核酸模倣分子または核酸誘導体としては、ホスホロチオアート核酸、ホスホルアミダート核酸、２’－Ｏ－メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びロック型核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）がある（Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００１，８：１を参照されたい）。ＬＮＡは、リボース環が、２’－酸素と４’－炭素の間にあるメチレン結合によって制限されたＲＮＡ誘導体である。また、修飾された塩基、例えば、チオ－ウラシル、チオ－グアニン、及びフルオロ－ウラシルを含有する核酸も含まれる。核酸分子は典型的には、タンパク質及び／又はポリペプチドをつくる細胞機構によって使用される情報を含む、遺伝情報を保有する。本発明の核酸分子は追加として、プロモーター、エンハンサー、応答要素、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’－非コード領域、及び３’－非コード領域、並びにこれらに類するものを含んでよい。

本明細書で「タンパク質」という用語と相互交換可能に使用される「ポリペプチド」という用語は、単一鎖のタンパク質又はその断片を含む、アミノ酸の線状分子鎖を説明する。本発明によるポリペプチド／タンパク質は、少なくとも１１０８個のアミノ酸を含有する。ポリペプチドは、少なくとも２つの同一の又は異なる分子からなるオリゴマーを形成し得る。かかる多量体の対応する、より高次の構造は、それに相当するものとして、ホモ二量体又はヘテロ二量体、ホモ三量体又はヘテロ三量体などと称される。本発明のポリペプチドは、ヘテロ二量体又はホモ二量体など、ヘテロ多量体又はホモ多量体を形成し得る。さらに、アミノ酸及び／又はペプチド結合が機能的類似体によって置き換えられたかかるタンパク質／ポリペプチドのペプチド模倣体もまた、本発明によって包含される。かかる機能的類似体としては、セレノシステイン等の、２０の遺伝子によりコードされるアミノ酸以外のあらゆる公知のアミノ酸が含まれる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、天然に修飾されたポリペプチド及びタンパク質も指し、例えば、当該技術分野で周知のグリコシル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、及び同様の修飾によって影響を受けた、天然に修飾されたポリペプチド及びタンパク質も指す。

「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ」又は「ＣＲＩＳＰＲ（－Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ」という用語は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）鎖内でホスホジエステル結合を開裂させ、それにより二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じる能力を有する酵素を説明する。ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、５’オーバーハングを備えた段違い切断（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｃｕｔ）を導入することが知られている新規のＶ型クラスのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとして分類される。この故に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼドメイン、特にＲｕｖＣドメインを含む。ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０のＲｕｖＣドメインは各々、３つの分岐ＲｕｖＣモチーフ（ＲｕｖＣ Ｉ～ＩＩＩ、配列番号５～７）を含む。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼはまた、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、本明細書ではＤＮＡターゲティングＲＮＡとも呼ばれる）としても知られているｃｒＲＮＡへ結合することができるドメインも含む。

ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの切断部位は、ガイドＲＮＡによって誘導される。ｇＲＮＡは、標的配列特異性をＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼに与える。かかるｇＲＮＡは、相補的標的ＤＮＡ配列へ結合する非コード短鎖ＲＮＡ配列である。ｇＲＮＡはまず、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼへ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと相互作用することができる結合ドメインによって結合する。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと相互作用することができる結合ドメインは典型的には、ステム－ループ構造をもつ領域を含む。このステム－ループは好ましくは、ステム－ループのステムを形成するための「ＵＣＵＡＣ」と「ＧＵＡＧＡ」との塩基対形成を有する、配列ＵＣＵＡＣＮ_３～５ＧＵＡＧＡＵ（配列番号８）を含む。Ｎ_３～５は、いずれかの塩基がこの位置で存在し得ることを示し、３個、４個、又は５個のヌクレオチドがこの位置で含まれ得る。ステム－ループは、最も好ましくは、ＢＥＣ８５（配列番号９）、ＢＥＣ６７（配列番号１０）、及びＢＥＣ１０（配列番号１０）のステムループダイレクトリピート配列であるが、ＲＮＡの形状にある（すなわち、ＴがＵに置き換わっている）配列をそれぞれ含む。ｇＲＮＡ配列は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼがそのエンドヌクレアーゼ活性を標的部位でＤＮＡ鎖を切断することによって発揮するＤＮＡ鎖上の特定の位置に対する対形成を介して（ｇＲＮＡとＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとのＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として知られた）複合体を誘導する。ｇＲＮＡのゲノム標的部位は、いずれかの約２０（典型的には１７～２６）のヌクレオチドＤＮＡ配列であり得、但し、２つの条件、すなわち、（ｉ）配列がゲノムの残部と比較して独特である、及び（ｉｉ）標的がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に直接隣接して存在する、を満たすことを条件とする。

ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの切断部位は従って、さらにＰＡＭによって規定される。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲの系によって切断の標的とされるＤＮＡ領域に後続する短いＤＮＡ配列（通常、長さ２～６塩基対）である。実際の配列は、使用されるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに依存する。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及びその個々のＰＡＭ配列は、当該技術分野で既知である（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｇｕｉｄｅ／＃ｐａｍ－ｔａｂｌｅを参照されたい）。例えば、この最初に同定されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼＣａｓ９によって認識されるＰＡＭは、５’－ＮＧＧ－３’（式中、「Ｎ」はいずれかのヌクレオチド塩基であり得る）である。ＰＡＭは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる切断に必須である。Ｃａｓ９において、ＰＡＭは、ガイドＲＮＡによって標的とされるＤＮＡ配列の下流の２～６個のヌクレオチド及び切断部位から下流の３～６個のヌクレオチドとわかっている。Ｖ型の系（ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０を含む）において、ＰＡＭは、標的配列及び切断部位の両方の下流に位置する。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとからなる複合体は、いわゆるＰＡＭ相互作用ドメインを含む（Ａｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｎａｔｕｒｅ，５１３（７５１９）：５６９－５７３）。この故に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる編集のための標的とすることができるゲノム位置は、ヌクレアーゼ特異的ＰＡＭ配列の存在及び位置によって制限される。ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、Ｖ型クラス２のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの群に属するので、ＴリッチなＰＡＭ部位が推定され、ＴＴＴＡ ＰＡＭ部位が機能的であることが示された(実施例を参照されたい）。

「パーセント（％）配列同一性」という用語は、テンプレートの核酸配列又はアミノ酸配列の全体長を構成するヌクレオチド又はアミノ酸残基の数と比較して２つ以上の整列した核酸配列又はアミノ酸配列の同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致（「ヒット」）数を説明する。言い換えれば、アラインメントを用いて、２つ以上の配列又は部分配列について、同じである（例えば、７０％同一性）アミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセンテージが、当該（部分）配列を最大対応について比較範囲と、若しくは当該技術分野で既知の配列比較アルゴリズムを用いて測定されるような指定領域と比較及び整列すると、又は手動で整列させ視覚的に検査すると、決定され得る。この定義はまた、整列するいずれかの配列の補完に適用される。

本発明と関係するアミノ酸配列並びにヌクレオチド配列の分析及びアラインメントは好ましくは、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて行われる（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）。当業者であれば、核酸配列を整列させるための追加の適切なプログラムが認識される。

本明細書で先に定義されたように、少なくとも９０％のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列同一性が本発明によって想定されている。さらに、より好ましくは、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、及び少なくとも９９．９％のアミノ酸配列同一性が本発明によって想定されている。

これらのアミノ酸配列及びこれらのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に関して、本発明の配列番号１、３、及び２９のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を維持する又は本質的に維持することが好ましい。それ故、維持される又は本質的に維持されるものとは、ｇＲＮＡへ結合して目的のＤＮＡ標的部位へ結合することができる複合体を形成し、当該エンドヌクレアーゼ活性がＤＳＢを誘導するとの能力である。

ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性の維持又は本質的な維持は、例えば、実施例３～５において説明されるように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集実験において分析することができる。配列番号５～７に示されるように、アミノ酸配列が、ＲｕｖＣドメインを含み、ヌクレオチド配列がＲｕｖＣドメインをコードすることが好ましい。記載されたように、ＲｕｖＣドメインはエンドヌクレアーゼドメインである。

「縮重している」という用語は、遺伝暗号の縮重を示す。周知のように、１つのアミノ酸をコードするコドンは、その３つの位置のいずれかにおいて異なり得るが、この差異は第２又は第３の位置で生じる頻度はそれ以下である。例えば、アミノ酸グルタミン酸は、ＧＡＡ及びＧＡＧのコドン（第３の位置において差異）によって示され、アミノ酸ロイシンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧのコドン（第１又は第３の位置において差異）によって示され、アミノ酸セリンは、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、ＡＧＵ、ＡＧＣ（第１、第２、又は第３の位置において差異）によって示される。

添付の実施例からわかるように、本発明の新規のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、タンパク質工学及びインシリコ系アプローチを用いて生成された。この故に、本発明のＣａｓヌクレアーゼは、細菌種から単純には単離されたものではなく、非天然起源である。より詳細には、数多くの操作されたヌクレアーゼ配列のスクリーニングを実施し、同定された配列の活性を、タンパク質工学を用いて最適化した。本発明者らが知る限り、このことは、天然に認められる配列に直接関連していないＣａｓヌクレアーゼの新規の種類が開発された初めてのことである。

その上、本出願の添付の実施例における新規のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０を用いた実験結果は驚くべきことに、従来のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼと比較してＢＥＣファミリーのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの異なる分子機序を示した。例えば、ＲＮＡ誘導型二本鎖切断を導入することによって相同組換えを支援するＣａｓヌクレアーゼと比較して、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０介在性編集は、相同組換えを成功裏に達成した細胞の有意な濃縮と関係した、強い全体的なクローンの低減をもたらす。この理由から、新規のＢＥＣ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、効率的なゲノム編集用ＣＲＩＳＰＲ技術の使用可能性をさらに拡大する。

原理の証明として、実施例３は、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０が、ゲノム編集に首尾よく使用可能な、活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼであることを示している。実施例３において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｄｅ２遺伝子を、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０、ｇＲＮＡ、及び相同指向型修復テンプレートを用いてノックアウトした。

Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼＣｍｓ１及びＣｐｆ１と同様に、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要としない。その上、本出願において同定されたＣＲＩＳＰＲの系を含有するＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、Ｃｐｆ１及びＣｍｓタンパク質ファミリーのｃｒＲＮＡにおいて保存されているリピートの３’－末端にＲＮＡステムループを備えたＣＲＩＳＰＲリピート配列を含有しており、あらゆる既知のＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエンドヌクレアーゼのうちでＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０の「最も近い隣接因子」は、国際公開第２０１７／１４１１７３号由来のＣＭＳ様Ｃａｓタンパク質、特にＣＭＳ様Ｃａｓタンパク質ＳｕＣｍｓ１（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７））及び配列番号６３（国際公開第２０１９／０３０６９５号）である。興味深いことに、国際公開第２０１７／１４１１７３号、国際公開第２０１９／０３０６９５号、及びＢｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），ｂｉｏＲｘｉｖにおいて説明されたＣＭＳ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの活性特性は、ＢＥＣファミリーのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの活性特性と比較して完全に異なっている。実施例３は、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０のエンドヌクレアーゼ活性が、これまで説明されていなかった新規の分子機序に基づいていることを示す。より詳細には、従来技術のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼＳｐＣａｓ９及び本発明の新規のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを用いた実施例３の結果において、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０が提供される。本結果は驚くべきことに、従来のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼと比較して、３つのＢＥＣ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの完全に異なる分子ゲノム編集機序を明らかにした。ＳｐＣａｓ９が、ＲＮＡ指向型二本鎖切断を導入することによって相同組換えを支援するのに対し、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０介在性編集は、相同組換えをうまく達成した細胞の有意な濃縮と関係する強い全体的なクローン低減をもたらす。実施例３は、部位特異的で非常に効率的な相同指向型組換えによって、新規のゲノム編集ツールとして機能するＢＥＣ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの能力を証明している。

この理由のため、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、クラス１及びクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼの既知の集合体と全体的に有意な配列同一性がない、かつ個々のＣｍｓ１型エンドヌクレアーゼと全体的に低い配列同一性を有する、新規の非天然のクラス２のＶ型ヌクレアーゼとして分類することができる。

ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼの既知の集合体とは有意に異なる新規のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼであり、新規の活性機序を示しており、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、異なるバイオテクノロジー部門及び医薬部門におけるゲノム編集、ゲノム調節、及び核酸濃縮／精製に適用可能なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエンドヌクレアーゼの既知の集合体を拡大する。実施例３に説明する結果は、ＢＥＣ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、異なる遺伝子座構造を持つ新規のタイプのエフェクタータンパク質であるだけでなく、新たな分子ゲノム編集機序をも呈することを強く示している。

さらに、実施例４は、本発明の新規のＢＥＣファミリー型ヌクレアーゼを用いたゲノム編集が、その隣接因子配列ＳｕＣｍｓ１（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），ｂｉｏＲｘｉｖ）及び配列番号６３（国際公開第２０１９／０３０６９５号）と比較して、有意により高いクローン低減数及び有意により優れた編集比をもたらすことを実証している。実施例４の結果はさらに、既知のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼと比較した、ゲノム編集用ＢＥＣ型ヌクレアーゼの一般的な優位性を実証する。

なお、さらに、実施例５は、本発明の新規のＢＥＣファミリー型ヌクレアーゼが、２１℃～３７℃の温度水準で強い活性を実証し、且つ、その隣接因子配列ＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３と比較して優れたゲノム編集効率及びコロニー低減率を示すことを実証している。例えば、ＳｕＣｍｓ１ヌクレアーゼのゲノム編集効率は、２１℃で陰性対照と同等の水準（０．３％）まで有意に低下するのに対し、ＢＥＣ１０編集効率は、２１℃という比較的低温でさえ高水準（６５％）のままである。２１℃から３７℃までの温度範囲内での高い活性は、バイオテクノロジー、農業、及び医薬の応用にとって大いに関心の的であり、その理由は、この温度範囲内では、様々なタイプの細胞が培養されるからである（例えば、様々な植物及び植物細胞は約２１℃、様々な酵母細胞及び真菌細胞は約３０℃、様々な原核生物及び哺乳動物細胞株は３７℃である）。新規のＢＥＣファミリー型ヌクレアーゼはそれゆえ、普遍的に適用可能なＣＲＩＳＰＲの系の設計を有利に可能にする。

本発明の第１の態様の好ましい実施形態に従って、核酸分子は、当該核酸分子に対してネイティブの、又は異種性であるプロモーターへ使用可能に連結される。

プロモーターは、特定の遺伝子の転写の開始につながるＤＮＡの領域である。プロモーターは概して、ＤＮＡの上流の（センス鎖の５’領域に向かって）遺伝子の転写開始部位近くに位置する。プロモーターは典型的には、１００～１０００塩基対長である。転写が生じるために、ＲＮＡポリメラーゼとして知られた、ＲＮＡを合成する酵素は、遺伝子近くでＤＮＡへ結合しなければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのための、及びＲＮＡポリメラーゼを動員する転写因子と呼ばれるタンパク質のための保全された開始結合部位を提供する応答要素など特異的なＤＮＡ配列を含有する。この故に、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子がプロモーター部位へ結合することは、当該遺伝子の転写を確保する。

この関係において、「使用可能に連結された」という用語は、プロモーターが同じＤＮＡ鎖の遺伝子へ連結され、それにより、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の結合の際に、遺伝子の転写が開始されることを定義している。概して、各遺伝子は、生体のゲノムの天然の環境においてプロモーターへ使用可能に連結されている。このプロモーターは本明細書で「天然プロモーター」又は「野生型プロモーター」と呼ばれる。異種性プロモーターは、天然プロモーター又は野生型プロモーターとは異なる。この故に、核酸分子に対して異種性であるプロモーターへ使用可能に連結されている核酸分子は、天然には生じない。

所望の遺伝子を発現するために使用することができる異種性プロモーターは、当該技術分野で既知であり、例えば、ＥＰＤ（真核生物プロモーターデータベース）又はＥＤＰｎｅｗ（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｐｄ．ｅｐｆｌ．ｃｈ／／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）から入手することができる。このデータベースにおいて、動物、植物、及び酵母のプロモーターを含む真核生物プロモーターを見つけることができる。

プロモーターは例えば、構成性活性がある、誘導性の、組織特異的な、又は発達段階特異的なプロモーターであり得る。かかるプロモーターを用いることによって、発現の所望のタイミング及び部位を調節することができる。

酵母におけるＡＯＸ１プロモーター若しくはＧＡＬ１プロモーター、又はＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＳＶ４０－、ＲＳＶ－プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター（ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びサイトメガロウイルス最初期エンハンサー）、ｇａｉ１０プロモーター、ヒト伸長因子１α－プロモーター、ＣａＭ－キナーゼプロモーター、及びＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ多重核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）プロモーターは、構成性活性のあるプロモーターの例である。

誘導性プロモーターの例は、低酸素状態又は寒冷ストレスによって誘導可能であるＡｄｈＩプロモーター、熱ストレスによって誘導可能であるＨｓｐ７０プロモーター、光によっていずれも誘導可能であるＰＰＤＫプロモーター及びＰＥＰカルボキシラーゼプロモーターである。また、除草剤解毒剤により誘導されるＩｎ２－２プロモーター（米国特許第５，３６４，７８０号明細書）、及びエストロゲンにより誘導されるＥＲＥプロモーター、及びオーキシンにより誘導され且つタペート組織特異的だが、カルスにおいても活性のあるＡｘｉｇＩプロモーター（国際公開第０３０６０１２３号）など、化学的に誘導可能であるプロモーターも有用である。

組織特異的プロモーターは、ある特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターである。発生段階特異的プロモーターは、ある特定の発生段階においてのみ転写を開始するプロモーターである。

本明細書で後述の例において、Ｔｐｉ１（配列番号１２）及びＳＮＲ５２プロモーター（配列番号１８）が使用されている。それゆえ、Ｔｐｉ１及びＳＮＲ５２プロモーターの使用が好ましい。

本発明の第１の態様のさらに好ましい実施形態に従って、前記核酸分子は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする核酸配列へ連結される。

ＮＬＳに関するさらなる詳細は、本明細書で後述に提供される。

本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態に従って、前記核酸分子は、真核細胞、好ましくは酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞における発現のためにコドンの最適化がなされる。

論議されるように、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０は、タンパク質工学によって生成されたので、非天然のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。

ＢＥＣ８５ポリペプチドをコードする遺伝子、ＢＥＣ６７ポリペプチドをコードする遺伝子、及びＢＥＣ１０ポリペプチドをコードする遺伝子は、標的細胞内での発現のためにコドンの最適化がなされることができ、場合により、ＮＬＳ及び／又は精製タグ等のペプチドタグをコードする配列を含むことができる。タグに関するさらなる詳細は後述される。

コドンの最適化は、遺伝子発現を改善し、目的の遺伝子の転写効率を、宿主細胞のコドンバイアスを収容することによって上げるために使用されるプロセスである。「コドンの最適化がなされた遺伝子」はそれゆえ、宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度を模倣するよう設計されたコドン使用の頻度を有する遺伝子である。核酸分子は、全体的に又は部分的にコドン最適化がなされ得る。いずれか１つのアミノ酸（メチオニン及びトリプトファンを除く）は、いくつかのコドンによってコードされているので、核酸分子の配列は、コードされたアミノ酸を変更させることなく変更し得る。コドンの最適化は、１つ以上のコドンが核酸レベルで変化し、それによりアミノ酸が変更されないが特定の宿主生物における発現が高まるときである。当業者は、コドン表、及び広範な生物にとって好ましい情報を提供する他の参考文献が当該技術分野で入手可能であることを認識しているであろう（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｇｅｎｅ １０５：６１－７２、Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７－５０８を参照されたい）。発現のためにヌクレオチド配列を最適化するための方法論は、例えば、米国特許第６，０１５，８９１号において提供されている。コドンの最適化のためのプログラムは、当該技術分野で入手可能である（例えば、ｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲにおけるＯＰＴＩＭＩＺＥＲ、ｗｗｗ。ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｃｏｄｏｎ＿ｏｐｔ．ｈｔｍｌにおけるＧｅｎＳｃｒｉｐｔ由来のＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標））。

真核細胞は、好ましくは酵母細胞であり、したがって、コドンの最適化は、好ましくは酵母細胞における発現のための最適化である。酵母細胞は、特に商業的な目的のものであり、その理由は、酵母細胞が組換えタンパク質の産業規模の製造のために最も普遍的に使用される真核宿主のうちの１つだからである。

別の実施形態において、真核細胞は哺乳動物細胞であり、したがって、コドンの最適化は、好ましくは哺乳動物細胞における発現のための最適化である。また、哺乳動物細胞（好ましくはＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞）は、特に商業的な目的のものであり、その理由は、これらの細胞が通常、組換えタンパク質治療薬の産業規模の製造のために使用される宿主だからである。

植物細胞及び動物細胞を含む適切な真核細胞に関するさらなる詳細は後述される。

実施例２において、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０をコードするヌクレオチド配列は、酵母（特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は細菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）における発現のためにコドンの最適化がなされることが説明されている。

本発明は、第２の態様において、第１の態様の核酸分子をコードするベクターに関する。

本明細書で以上に説明したような定義及び好ましい実施形態は、適用できる場合は変更すべきところは変更して、第２の態様へ準用される。

本発明によるベクターは概して、好ましくは本発明の核酸分子の複製及び／若しくは発現、並びに／又はそれによりコードされるポリペプチドの発現を制御することができる。

好ましくは、当該ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、又は、例えば、遺伝子操作において従来より使用されている、別のベクターである。

例示的なプラスミド及びベクターは、例えば、Ｓｔｕｄｉｅｒ及び共同研究者ら（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｗ．Ｆ．；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ａ．Ｈ．； Ｄｕｎｎ Ｊ．Ｊ．； Ｄｕｂｅｎｄｒｏｆｆ Ｊ．Ｗ．，１９９０，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，６１－８９）又はＮｏｖａｇｅｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、及びＧｉｂｃｏ ＢＲＬ社によって供給されるパンフレットにおいて列挙されている。他の好ましいプラスミド及びベクターは、Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．，１９８５， ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ－ＩＩＩ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｄ．Ｔ．（ｅｄｓ），１９８８，Ｖｅｃｔｏｒｓ： ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，１７９－２０４，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｇｏｅｄｅｅｌ，Ｄ．Ｖ．，１９９０，Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，３－７、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．； Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて見つけることができる。

特に好ましいベクターは、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集のために使用することができるベクター、特にＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする本発明の核酸分子を発現するだけのベクター、又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする本発明の核酸分子と、ガイドＲＮＡ（いわゆる「オールインワン型ベクター」）との両方を発現するベクターである。前者の場合、第２のベクターは、ガイドＲＮＡの発現のために採用されるものとする。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集ベクターは、例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されている。

上述された本発明の核酸分子はまた、別の核酸分子との翻訳融合が生じるように、ベクター内へと挿入され得る。この目的のために、重複伸長ＰＣＲを適用することができる（例えば、Ｗｕｒｃｈ，Ｔ．，Ｌｅｓｔｉｅｎｎｅ，Ｆ．，ａｎｄ Ｐａｕｗｅｌｓ，Ｐ．Ｊ．，Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．Ｔｅｃｈｎ．１２，９，Ｓｅｐｔ．１９９８，６５３－６５７）。そこから生じる生成物は融合タンパク質と称されており、以下でさらに説明される。他の核酸分子は、例えば、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の溶解度を上げ得る及び／又は当該タンパク質の精製を容易にするタンパク質をコードし得る。非限定例としては、ｐＥＴ３２、ｐＥＴ４１、ｐＥＴ４３がある。ベクターはまた、正確なタンパク質の折りたたみを容易にするために１つ以上のシャペロンをコードする追加の発現可能な核酸を含有してもよい。適切な細菌発現宿主は、例えば、ＢＬ２１（ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＡＲＥ）又はＲｏｓｅｔｔａ（登録商標）に由来する株を含む。

ベクター修飾技術については、Ｊ．Ｆ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１，ＩＳＢＮ－１０ ０－８７９６９－５７７－３を参照されたい。概して、ベクターは、クローン化又は発現のための１つ以上の複製起点（ｏｒｉ）及び遺伝系、宿主における選択のための１つ以上のマーカー、例えば、抗生物質耐性、並びに１つ以上の発現カセットを含有することができる。適切な複製起点としては、例えば、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点、ＳＶ４０ウイルス複製起点、Ｍ１３複製起点がある。

ベクター内に挿入されたコード配列は、例えば、標準的な方法によって合成されることができ、又は天然源から単離されることができる。転写調節要素への及び／又は他のアミノ酸コード配列へのコード配列のライゲーションは、確立された方法を用いて行うことができる。原核細胞又は真核細胞における発現を確保する転写調節要素（発現カセットの一部）は、当業者に周知である。これらの要素は、転写の開始を確保する調節配列（例えば、翻訳開始コドン、転写終結配列、プロモーター、エンハンサー、及び／又はインスレーター）と、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）（Ｏｗｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１），ＰＮＡＳ．９８（４）１４７１－１４７６）と、場合により、転写の終結及び転写の安定化を確保するポリＡシグナルとを含む。追加の調節要素としては、転写エンハンサー及び翻訳エンハンサー、並びに／又は天然に結合している若しくは異種性のプロモーター領域があってもよい。調節要素は、本発明のエンドヌクレアーゼ又は異種性調節要素に対してネイティブであってもよい。好ましくは、本発明の核酸分子は、かかる発現制御配列が原核細胞又は真核細胞における発現を可能にするよう、使用可能に連結される。ベクターはさらに、分泌シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらなる調節要素として含んでもよい。かかる配列は当業者に周知である。さらに、使用される発現系により、発現したポリペプチドを細胞区画へと向かわせることができるリーダー配列は、本発明の核酸分子のコード配列へ付加されてもよい。かかるリーダー配列は当該技術分野で周知である。具体的に設計されるベクターは、細菌－真菌細胞又は細菌－動物細胞など、異なる宿主間でのＤＮＡ輸送を可能にする。

追加として、バキュロウイルスの系又はワクシニアウイルス若しくはセムリキ森林ウイルスに基づいた系は、本発明の核酸分子のための真核生物発現系におけるベクターとして使用することができる。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、標的とされる細胞集団へと核酸又はベクターを送達するのに使用され得る。当業者に周知である方法は、組換えウイルスベクターを構築するのに使用することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１において説明される技術を参照されたい。

真核宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例は、本明細書で上述したプロモーターを含む、プロモーターである。転写の開始の原因となる要素のほかに、かかる調節要素はまた、核酸の下流にあるＳＶ４０－ポリ－Ａ部位若しくはｔｋ－ポリ－Ａ部位、又はＳＶ４０、ｌａｘＺ及びＡｃＭＮＰＶ多面体ポリアデニル化シグナルなど、転写終結シグナルも含み得る。

大腸菌及び他の細菌において培養するための、カナマイシン又はアンピシリン耐性遺伝子など選択可能なマーカーとの同時形質移入は、形質移入した細胞の同定及び単離を可能にする。哺乳動物細胞培養のための選択可能なマーカーは、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ヒグロマイシン耐性遺伝子である。形質移入した核酸はまた、コードされた（ポリ）ペプチドを大量に発現するよう増幅させることもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、数百又は数千もの目的の遺伝子のコピーを担持する細胞株を開発するのに有用である。別の有用な選択マーカーは、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）という酵素である。かかるマーカーを用いて、細胞は選択培地中で生育し、最高の耐性を持つ細胞が選択される。

しかしながら、本明細書で上述したような本発明の核酸分子はまた、リポソームを介して、ファージベクター、又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス又はレトロウイルス）を細胞内へと直接導入するよう設計され得る。

本発明は、第３の態様において、第１の態様の核酸分子を含む、又は第２の態様のベクターを用いて形質転換された、形質導入された、若しくは形質移入された宿主細胞に関する。

本明細書で上述したような定義及び好ましい実施形態は、適用できる場合には変更すべきところは変更して、第３の態様へ準用される。

大量のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが当該宿主細胞によって産生され得、この中で、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする単離されたヌクレオチド配列が適切なベクター又は発現ベクター内へと挿入された後に宿主内へと挿入される。このベクター又は発現ベクターは、適切な宿主細胞内へと導入され（好ましくは、当該宿主は大量に増殖させることができ）、且つ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、宿主細胞又は培地から精製される。

宿主細胞はまた、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの精製を必要とすることなく、本発明のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを供給するために使用され得る（Ｙｕａｎ，Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．；Ｓｏｎｇ，Ｚ．；ａｎｄ Ｇａｏ，Ｒ．，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｌ－ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ｉｎｔｏ ｇｅｌａｔｉｎ ｐｅｌｌｅｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ，Ｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００２）．３５：１０７－１１３を参照されたい）。本発明のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、宿主細胞によって分泌され得る。分子生物学の分野の当業者は、広範な種々の発現系のいずれかを使用して、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを提供し得ることを理解するであろう。使用される正確な宿主細胞は、適切な生育条件下で生育されるときに、宿主細胞がＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを産生する限り、本発明にとって決定的ではない。

本発明の核酸分子を含有するベクターをクローン化することができる宿主細胞は、十分量の組換え酵素を複製及び単離するために使用される。この目的のために使用される方法は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）。

ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの発現は、宿主細胞においてＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを産生するために使用され得るだけでなく、その発現はまた、宿主細胞のゲノムを編集するためにも使用され得る。かかる場合、宿主細胞はまた、ガイドＲＮＡも含む。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集に使用することができるベクターは、本明細書で以上に論議した。

本発明の第３の態様の好ましい態様に従って、前記宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞であり、好ましくは植物細胞、酵母細胞、又は動物細胞である。

宿主細胞は真核細胞であり得、例えば、真菌、藻類、植物、又は動物の細胞であり得、この中で、動物は、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、頭足類、甲殻類、昆虫、蛛形類、有袋類、又は哺乳類であり得る。宿主細胞に関して非ネイティブであるＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０をコードする遺伝子は、プロモーターなど調節要素へ使用可能に連結することができる。プロモーターは、宿主生物に対してネイティブであり得、又は別の種のプロモーターであり得る。真核細胞など異種性宿主細胞においてＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０を発現するためのコンストラクトはさらに、場合により転写終結因子を含むことができる。ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０をコードする遺伝子は、場合により宿主種に対してコドンの最適化が行われてもよく、場合により１つ以上のイントロンを含むことができ、場合により１つ以上のペプチドタグ配列、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）及び／又は１つ以上のリンカー若しくは操作された切断部位（例えば、２ａ配列）を含むことができる。様々な実施形態において、宿主細胞は、以上に開示された操作されたＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０のＣＲＩＳＰＲの系のいずれかを含むことができ、ここで、当該エフェクターをコードする核酸配列は、ガイドＲＮＡの導入に先立って細胞内に存在する。他の実施態様において、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０のポリペプチドを発現するための遺伝子を含むよう操作された細胞はさらに、調節要素へ使用可能に連結されたガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。

細胞又は生物は、原核細胞であり得る。適切な原核宿主細胞は、例えば、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ２１（例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｌｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ3）ＲＩＬ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＲＡＲＥ、ＢＬ２１コドンプラス、ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス）、Ｒｏｓｅｔｔａ（登録商標）、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、ＮＭ５２２、ＪＭ１０１、ＪＭ１０９、ＪＭ１０５、ＲＲ１、ＤＨ５α、ＴＯＰ１０、ＨＢ１０１、又はＭＭ２９４を含む。さらに適切な細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓなどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、又はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓであるが、これらに限定されない。

概して、真核宿主細胞は、原核宿主細胞よりも好ましい。

真核細胞は、酵母細胞、真菌細胞、アメーバ細胞、昆虫細胞、脊椎動物細胞（例えば哺乳動物細胞）、又は植物細胞であり得る。

酵母細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ ａｎｇｕｓｔａ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ若しくはＫ．ｌａｃｔｉｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、又はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓなどのＰｉｃｈｉａ属、Ｙａｒｒｏａｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞若しくはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、植物細胞、又は真菌細胞であり得、好ましくはＴｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ科の、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、若しくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の、又はＵｓｔｉｌａｇｉｎａｃｅａｅ科の、好ましくはＵｓｔｉｌａｇｏ属の真菌細胞であり得る。

使用され得る植物宿主細胞には、作物植物細胞及びタバコ細胞など、単子葉植物及び双子葉植物（すなわち、それぞれ単子葉類及び双子葉類）がある。

使用され得る哺乳動物宿主細胞には、ヒトＨｅｌａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈ９細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＣ１２７細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、及びＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１～ＱＣ３細胞、マウスＬ細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、ＨａＣａＴ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＴ２９細胞、Ａ４３１細胞、Ａ５４９細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＣａＣｏ－２細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞がある。

本発明は、第４の態様において、植物、種子、若しくは単一の植物細胞ではない植物の一部、又は動物であって、第１の態様の核酸分子を含む、又は第２の態様のベクターを用いて形質転換された、形質導入された、若しくは形質移入された、植物、種子、若しくは植物の一部、又は動物に関する。

本明細書で以上に説明したような定義及び好ましい実施形態は、適用できる場合には変更すべきところは変更して、第４の態様へ準用される。

動物は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくは非ヒト哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、類人猿などであり得る。

植物、種子、若しくは植物の一部、又は動物において第１の態様の核酸分子をガイドＲＮＡとともに発現させることによって、宿主のゲノムは編集され得る。このゲノムは、例えば、遺伝子療法のために、染色体再構成の創造のために、遺伝子機能を研究するために、形質転換生物の作出のために、内在性遺伝子標識化のために、又は標的とされた導入遺伝子の付加のために、標的とされる遺伝子突然変異を導入する目的で編集され得る。

本発明は、第５の態様において、第３の態様の宿主細胞を培養することと、産生されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを単離することと、を含む、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの産生方法に関する。

本明細書で以上に説明したような定義及び好ましい実施形態は、適用できる場合には、変更すべきところは変更して、第５の態様へ準用される。

原核宿主又は真核宿主を培養するのに適した条件は、当業者に周知である。概して、細菌を培養するのに適した条件は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）培地中で通気下にて当該細菌を生育させることである。発現産物の収率及び溶解度を高めるために、いずれも亢進する又は促進することが知られた適切な添加物を用いて、培地を緩衝する又は懸濁することができる。Ｅ.ｃｏｌｉは、４～約３７℃で培養することができ、実際の温度又は温度の流れは、過剰発現することになる分子による。

概して、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属は、Ｓａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天、又はジャガイモデキストロース寒天の上で、約１０℃～約４０℃まで、好ましくは約２５℃で生育され得る。酵母培養に適した条件は、例えば、Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，”Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ“（２００２）；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．から知られている。当業者はまた、これらのあらゆる条件を認識しており、さらに、これらの条件を、特定の宿主種の必要性及び発現するポリペプチドの必要条件に適応させ得る。誘導性プロモーターが宿主細胞内に存在するベクターにおいて本発明の核酸を制御する場合、ポリペプチドの発現は適切な誘導剤の添加によって誘導することができる。適切な発現プロトコル及び戦略は、当業者に知られている。

細胞型及びその具体的な必要条件により、哺乳動物細胞培養は、例えば、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地又はＤＭＥＭ培地において行うことができる。これらの細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２、水飽和雰囲気下で維持することができる。真核細胞に適した発現プロトコルは、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２００１から取得することができる。

産生されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの単離のための方法は、当該技術分野で周知であり、限定されるものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ディスクゲル電気泳動法、又は免疫沈降などの方法ステップを含み、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２００１を参照されたい。

タンパク質単離のステップは好ましくは、タンパク質精製のステップである。本発明に従ったタンパク質精製は、本発明のポリペプチドを複合体混合物から好ましくは均一物へとさらに単離するよう企図されたプロセス又は一連のプロセスを明示する。精製のステップは例えば、タンパク質の大きさ、物理化学的特性、及び結合親和性の違いを利用する。例えば、タンパク質は、ｐＨ勾配のついたゲル又はイオン交換カラムを通過させることによって、等電点により精製され得る。さらに、タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーを介して又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法）分析によって、タンパク質の大きさ又は分子量により分離することができる。当該技術分野において、タンパク質は、２次元ＰＡＧＥを用いることによって精製されることが多く、次いで、タンパク質の同一性を確立するためにペプチド質量フィンガープリンティングによって分析される。このことは、科学的な目的にとって有用であり、タンパク質についての検出限界は非常に低く、ナノグラム量のタンパク質が分析にとって十分である。タンパク質はまた、高速液体クロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーを介して極性／疎水性によっても精製され得る。したがって、タンパク質精製のための方法は、当業者に周知である。

本発明は、第６の態様において、第１の態様の核酸分子によってコードされるＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼに関する。

本明細書で以上に説明したような定義及び好ましい実施形態は、適用できる場合には、変更すべきところは変更して、第６の態様へ準用される。

配列番号１、３、及び２９のアミノ酸配列は、本発明のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの特に好ましい例である。配列番号２９のアミノ酸配列を含む又はそれからなるＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが最も好ましい。

本発明の第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼはまた、融合タンパク質であり得、ここで、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列が融合パートナーへ融合している融合タンパク質であり得る。この融合は、直接的な融合、又はリンカーを介した融合であり得る。このリンカーは好ましくは、ＧＳ－リンカーなどのペプチドである。

融合パートナーは、Ｎ末端、Ｃ末端、両末端、又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドの内部位置の中に、好ましくは、Ｎ末端又はＣ末端に位置することができる。

融合パートナーは好ましくは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、細胞貫通ドメイン、プラスチドターゲティングシグナル、ミトコンドリアターゲティングシグナルペプチド、プラスチド及びミトコンドリアの両方を標的とするシグナルペプチド、マーカードメイン、タグ（精製タグなど）、ＤＮＡ修飾酵素、又はトランス活性化ドメインである。

ＤＮＡ修飾酵素は、平滑末端ＤＮＡのリン酸化、脱リン酸化によってＤＮＡを修飾し得、この中で、平滑末端化は、消化単一鎖オーバーハングを指す。脱リン酸化酵素の非限定例は、エビアルカリホスファターゼ（ｒＳＡＰ）、Ｑｕｉｃｋ ＣＩＰホスファターゼ、及び南極性ホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）である。リン酸化酵素の非限定例は、Ｔ４ ＰＮＫなどのポリヌクレオチドキナーゼである。平滑末端化酵素の非限定例は、ＤＮＡポリメラーゼＩ大型（クレノー）断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、又はリョクトウヌクレアーゼである。

トランス活性化ドメイン（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）（又はトランス活性化ドメイン（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ（ＴＡＤ）））は、転写共役因子などの他のタンパク質のための結合部位を含有する転写因子足場ドメインである。非限定例は、９アミノ酸トランス活性化ドメイン（９ａａＴＡＤ）及び高グルタミン（Ｑ）ＴＡＤである。

概して、ＮＬＳは、塩基性アミノ酸の鎖を含む。核局在化シグナルは当該技術分野で既知である。ＮＬＳは、本発明によるＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端又はその両方にあり得る。例えば、本発明によるＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれより多数のＮＬＳをアミノ末端に若しくはその近くに、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれより多数のＮＬＳをカルボキシ末端に若しくはその近くに、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端に０個又は少なくとも１個以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端に０個又は少なくとも１個以上のＮＬＳ）を含み得る。１つを超えるＮＬＳが存在するとき、各々は、その他とは独立して選択され得、それにより、単一のＮＬＳが１個を超えるコピーにおいて、及び／又は１個以上のコピーにおいて存在する１個以上の他のＮＬＳとの組み合わせで存在し得る。いくつかの実施形態において、ＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれより多数のアミノ酸内にあるとき、ＮＬＳは、Ｎ末端又はＣ末端近くにあるとみなされる。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチド配列及びＮＬＳは、いくつかの実施形態において、１～約２０のアミノ酸長のリンカーと融合し得る。

ＮＬＳの非限定例としては、ＳＶ４０ウイルス大Ｔ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、ヌクレオプラスミン二連体（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）、ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、ｈＲＮＰＡＩ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメイン、マイオーＴタンパク質、ｐ５３タンパク質、ｃ－ａｂｌ ＩＶタンパク質、又はインフルエンザウイルスＮＳ １の、ＮＬＳ配列、肝炎ウイルスデルタ抗原のＮＬＳ、Ｍｘｌタンパク質、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ、及びステロイドホルモン受容体（ヒト）糖質コルチコイドがある。概して、１個以上のＮＬＳは、真核細胞の核内において検出可能な量での本発明によるＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドの蓄積を駆動するのに十分な長さである。

プラスチドターゲティングシグナルペプチド局在性シグナル、ミトコンドリアターゲティングシグナルペプチド局在性シグナル、及び二重ターゲティングシグナルペプチド局在性シグナルも、当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｓｓｏｕｒｙ ａｎｄ Ｍｏｒｓｅ（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７４３：５－１９、Ｋｕｎｚｅ ａｎｄ Ｂｅｒｇｅｒ（２０１５）Ｆｒｏｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ６：２５９、Ｈｅｒｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｎｅｕｐｅｒｔ（２００３）ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ５５：２１９－２２５、Ｓｏｉｌ（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ５：５２９－５３５、Ｃａｒｒｉｅ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ（２０１３）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８３３：２５３－２５９、Ｃａｒｒｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＦＥＢＳ Ｊ ２７６：１１８７－１１９５、Ｓｉｌｖａ－Ｆｉｌｈｏ（２００３）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ ６：５８９－５９５、Ｐｅｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍａｌｌ（２００１）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５４１：５４－６３、Ｍｕｒｃｈａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐ Ｂｏｔ ６５：６３０１－６３３５、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５：５４８－５５４、Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：３１１－３３８を参照されたい）。

マーカードメインの非限定例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、及びエピトープタグがある。ある特定の実施形態において、マーカードメインは、蛍光タンパク質であり得る。適切な蛍光タンパク質の非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、タグＧＦＰ、ターボＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓグリーンＩ）。黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、ビーナス、ＹＰｅｔ、ＰｈｙＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔ－サファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎＩ、ミドリイシ－シアン）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍチェリー、ｍＲＦＰＩ、Ｄｓレッド－エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、ＨｃＲｅｄ－タンデム、ＨｃＲｅｄＩ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍラズベリー、ｍストロベリー、Ｊレッド）、及び橙色蛍光タンパク質（ｍオレンジ、ｍＫＯ、クサビラ－オレンジ）がある。

タグは、ポリペプチドの混合物中で本発明によるＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドの同定を可能にする短いアミノ酸配列である。この故に、タグは好ましくは、精製タグである。精製タグの非限定例は、Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ－６タグ）、ＧＳＴタグ、ＤＨＦＲタグ及びＣＢＰタグである。既知の精製タグの総説は、Ｋｉｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３；７３：Ｕｎｉｔ－９．９において見つけることができる。

本発明は第７の態様において、第１の態様の核酸分子、第２の態様のベクター、第３の態様の宿主細胞、第４の態様の植物、種子、細胞の一部、若しくは動物、第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、又はこれらの組み合わせ、を含む、組成物に関する。

本明細書で以上に説明したような定義及び好ましい実施形態は、適用できる場合には、変更すべきところは変更して、第７の態様へ準用される。

本明細書で使用する場合の「組成物」という用語は、第１の態様の核酸分子、第２の態様のベクター、第３の態様の宿主細胞、第４の態様の植物、種子、細胞の一部、若しくは動物、第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼのうちの少なくとも１つ、又はこれらの組み合わせ、を含む組成物を指し、それらはまた、以下において集約的に化合物とも呼ばれる。

第７の態様の好ましい実施形態に従って、前記組成物は、医薬組成物又は診断用組成物である。

本発明に従って、「医薬組成物」という用語は、患者、好ましくはヒト患者への投与のための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、先に列挙した化合物のうちの少なくとも１つを含む。この医薬組成物は、場合により、本発明の化合物の特徴を変化させ、それにより、例えば、当該化合物の機能を安定化させる、調節する、及び／又は活性化することができるさらなる分子を含み得る。この組成物は、固体、液体、又は気体の形態であり得、とりわけ、散剤、錠剤、液剤、又はエアロゾル剤の形態であり得る。本発明の医薬組成物は、場合により及び追加として、医薬として許容され得る担体を含んでもよい。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝塩類溶液、水、油／水エマルションなどのエマルション、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶媒、ＤＭＳＯを含む有機溶媒などを含む。かかる担体を含む組成物は、従来法によって製剤することができる。これらの医薬組成物は、対象へ適切な用量で投与され得る。投薬計画は、担当医及び臨床的な因子によって判断される。医学分野において周知であるように、いずれか１人の患者のための投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与の時刻及び経路、健康状態、並びに同時に投与される他の薬物を含む、多くの因子による。所与の状況についての治療有効量は、通例の実験法によって容易に決定され、当業の臨床医又は内科医の技能及び判断の範囲内にある。概して、医薬組成物の規則正しい投与としての投与計画は、活性のある化合物１日当たり１μｇ～５ｇの範囲にあるべきである。しかしながら、より好ましい投与量は、１日当たり０．０１ｍｇ～１００ｍｇ、さらにより好ましくは０．０１ｍｇ～５０ｍｇ、最も好ましくは０．０１ｍｇ～１０ｍｇの範囲にあり得る。処置後の応答が生じる変化及び間隔を観察するために必要とされる処置の長さは、所望の効果によって変わる。具体的な量は、当業者に周知である従来の検査によって決定され得る。

医薬組成物は、例えば、ウイルス性疾患又は細菌性疾患など、病原性疾患を処置又は予防するために使用され得る。例えば、第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、病原体のゲノムを標的とするｇＲＮＡと一緒に使用され、それにより、病原体によって発症する疾患が予防又は処置されるように、病原体のゲノムを修飾し得る。

医薬組成物はまた、例えば、微生物相の平衡異常を処置又は予防するためにも使用され得る。微生物相における平衡異常は、例えば、病原性の細菌及び酵母の異常増殖を生じ得る抗生物質過剰使用という理由から生じる可能性がある。

「診断用組成物」は、対象における感染性疾患及び非感染性疾患の両方の疾患を検出するのに適している組成物を指す。診断用組成物は特に、本発明の融合タンパク質が一本鎖ＤＮＡへ結合することと関係して、本明細書で先に説明したようなマーカー部分を含み得、それにより、本発明によるＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼポリペプチドが一本鎖ＤＮＡを切断すると、レポーターを活性化させ、それにより蛍光又は変化の色を生じ、したがって特定の疾患の核マーカーの視覚的検出が可能となる。診断用組成物は、血液、尿、又は唾液など、体液試料へ適用され得る。

本発明は、第８の態様において、対象又は植物のゲノムにおける標的部位のヌクレオチド配列を修飾することによって当該対象又は植物における疾患の処置における使用のための、第１の態様の核酸分子、第２の態様のベクター、第３の態様の宿主細胞、第４の態様の植物、種子、細胞の一部若しくは動物、第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、又はこれらの組み合わせに関する。

また、第１の態様の核酸分子、第２の態様のベクター、第３の態様の宿主細胞、第４の態様の植物、種子、細胞の一部若しくは動物、第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、又はこれらの組み合わせによって、対象又は植物のゲノムにおける標的部位のヌクレオチド配列を修飾することを含む、当該対象又は植物における疾患の処置方法又は予防方法も説明されている。

本明細書で以上に説明したような定義及び好ましい実施形態は、適用できる場合には、変更すべきところは変更して、第８の態様へ準用される。

対象又は植物のゲノムにおける標的部位のヌクレオチド配列の修飾は、本発明に従って、ＣＲＩＳＰＲ技術によるゲノム編集であり、特に、適切なｇＲＮＡと、場合によってはゲノム修飾の標的部位を決定するための後述される修復基質と併用される、本明細書に記載の新規のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによる、ゲノム編集である。

ゲノム編集（ゲノム工学としても知られている）は、遺伝子工学の１種であり、標的部位、好ましくは目的の遺伝子が、細胞のゲノム中で、挿入され、欠失され、修飾され、又は置換される。。標的部位、好ましくは目的の遺伝子はゲノム内にあり得るが、ミトコンドリアＤＮＡ（動物細胞）又は葉緑体ＤＮＡ（植物細胞）内にもあり得る。ゲノム編集は結果として、細胞のゲノム内での機能喪失型突然変異又は機能獲得型突然変異をもたらし得る。機能喪失型突然変異（不活性化型突然変異とも呼ばれる）は結果として、目的の遺伝子の機能が下がる又は全くなくなる（部分的に又は全体的に不活性化される）。対立遺伝子が、完全に機能喪失する(全体的に不活性化される)とき、このことは本明細書で（遺伝子）ノックアウトとも呼ばれる。遺伝子ノックアウトは、遺伝子の１つ以上のヌクレオチドを、挿入、欠失、修飾、又は置換することによって達成され得る。機能獲得型突然変異（活性化型突然変異とも呼ばれる）は、目的の遺伝子を変化させ、それによりその効果がより強くなる（活性の増強）又は異なる（例えば、異常な）機能によって取り代わりもする。かかる新たな機能又は効果を導入する機能獲得型突然変異は、遺伝子ノックインとも呼ばれる。ゲノム編集はまた、１つ以上の遺伝子の上方調節又は下方調節ももたらし得る。遺伝子の発現の調節の原因となるＤＮＡ部位（例えば、プロモーター領域又は転写因子コード遺伝子）を標的とすることによって、遺伝子の発現は、ＣＲＩＳＰＲ技術によって上方調節又は下方調節することができる。ＣＲＩＳＰＲ技術の作用様式に関するさらなる詳細は、本明細書で後述される。

発見以来、ＣＲＩＳＰＲ技術は、治療用ゲノム編集にますます適用されてきた。いくつかのウイルスベクター及び非ウイルスベクターの採用で、ＣＲＩＳＰＲの系を標的細胞又は標的組織へ、突然変異誘発、遺伝子組込み、エピゲノム調節、染色体配列換え、塩基編集、及びｍＲＮＡ編集など、様々な方法で効率的に送達することが可能となった（概要については、Ｌｅ ａｎｄ Ｋｉｍ（２０１９），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．；１３８（６）：５６３－５９０）。

対象のゲノムにおける標的部位のヌクレオチド配列の修飾は好ましくは、遺伝子療法である。遺伝子療法は、疾患、特にヒトの疾患を処置および予防するための、標的部位のヌクレオチド配列の遺伝子操作の原理に基づいている。

ＣＲＩＳＰＲ技術の臨床試験において、科学者は、ヒトにおける癌及び血液障害を根絶するためにＣＲＩＳＰＲ技術を用いている。これらの試験において、一部の細胞は、処置されることになる対象から取り出され、ＤＮＡがゲノム編集され、次いで、ゲノム編集された細胞が、対象の体内へと戻されてから、当該細胞が、処置されるべき疾患と戦うよう装備される。

本発明は、第９の態様において、細胞のゲノムにおける標的部位のヌクレオチド配列の修飾方法であって、当該細胞内へ、（ｉ）ＤＮＡを標的とするＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと、（ｂ）第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと相互作用する第２のセグメントと、を含む、前記ＤＮＡを標的とするＲＮＡ、又は前記ＤＮＡを標的とするＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、（ａ）ＤＮＡを標的とするＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と、（ｂ）部位特異的酵素活性を呈する活性部分と、を含む、第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、又は第１の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、又は第２の態様のベクター、を導入することを含む、ヌクレオチド配列の修飾方法に関する。

したがって、本発明はまた、医薬組成物（例えば、医薬組成物又は診断用組成物）であって、（ｉ）ＤＮＡを標的とするＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡにおける配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと、（ｂ）第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと相互作用する第２のセグメントと、を含む、ＤＮＡを標的とするＲＮＡ、又はＤＮＡを標的とするＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドと、（ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、（ａ）ＤＮＡを標的とするＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と、（ｂ）部位特異的酵素活性を呈する活性部分と、を含む、第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、又は第１の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、又は第２の態様のベクターと、を含む、医薬組成物にも関する。

本明細書で以上に説明したような定義及び好ましい実施形態は、適用できる場合には、変更すべきところは変更して、第９の態様へ準用される。

ＤＮＡを標的とするＲＮＡは、標的ＤＮＡにおける配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと相互作用する第２のセグメントと、を含む。本明細書で以上に論議したように、標的ＤＮＡにおける配列と相補的であるヌクレオチド配列は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの標的特異性を規定する。また本明細書で以上に論議したように、ＤＮＡを標的とするＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼへ結合し、それにより複合体が形成される。第２のセグメントは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと相互作用し、複合体の形成の原因となる。第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと相互作用する第２のセグメントは好ましくは、配列番号８、より好ましくは配列番号９又は１０を含む、又はそれからなる。配列番号８は、Ｖ型クラス２のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼにおいて、第２セグメントはまた、５’ハンドルとしても知られている。配列番号９又は１０はそれぞれ、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０の第２のセグメントである。

ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、第１のセグメントとして、ＤＮＡを標的とするＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と、第２のセグメントとして、部位特異的酵素活性を呈する活性部分と、を含む。第１のセグメントは、ＤＮＡを標的とするＲＮＡと相互作用し、論議された複合体の形成の原因となる。第２のセグメントは、エンドヌクレアーゼドメインを保有し、このドメインは好ましくは、本明細書で上述したようなＲｕｖＣドメイン（特に、配列番号５～７のＲｕｖＣドメイン）を含む。

また本明細書で以上に論議したように、ＤＮＡを標的とするＲＮＡは、ガイドＲＮＡである。ガイドＲＮＡは、細胞内へと直接導入されるか、又はＤＮＡを標的とするＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドとしてのいずれかであり得る。後者の場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは概して、ガイドＲＮＡの発現のために１つ以上のプロモーター配列へ使用可能に連結される。例えば、ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）によって認識されるプロモーター配列へ使用可能に連結されることができる。ＤＮＡを標的とするＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドは好ましくは、ベクターである。多くの単一のｇＲＮＡ空ベクター（ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ含有及び非含有）は、当該技術分野で入手可能である。また、（ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの発現の有無とともに）単一プラスミドから複数のｇＲＮＡを発現させるために使用することができる、いくつかの空の多重ｇＲＮＡベクターが入手可能である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、ＤＮＡを標的とするＲＮＡを、発現可能な形態でコードする。

同様に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、細胞内へと直接導入され得、又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子としてのいずれかであり得、後者は好ましくは、第２の態様のベクターである。ＤＮＡポリヌクレオチドは、発現可能な形態でＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする。

本明細書で以上により詳細に論議したように、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとＤＮＡを標的とするＲＮＡとはまた、オールインワン型のＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓベクターなど、同一のＤＮＡポリヌクレオチドによってもコードされ得る。

「発現可能な形態で」という用語は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとＤＮＡを標的とするＲＮＡとをコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドは、ＤＮＡを標的とするＲＮＡが転写されること、且つＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが転写され、細胞内の活性化している酵素へと翻訳されることを確保する形態にあることを意味する。

本発明の第９の態様の好ましい実施形態に従って、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ及び前記ＤＮＡを標的とするＲＮＡが直接、細胞内へと導入される場合、これらはリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形態で導入される。

ＲＮＰは、インビトロで集合させ、当該技術分野で既知の方法、例えば、電気穿孔法又はリポフェクションによって、細胞へと送達することができる。ＲＮＰは、核酸系（例えば、ベクター系）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして同様の効能を用いて、標的部位を切断することができる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（６）：１０１２－１０１９）。

タンパク質（又はペプチド）又はＲＮＰを性細胞内へと導入するための手段は、当該技術分野で既知であり、マイクロインジェクション、電気穿孔法、リポフェクション（リポソーム使用）、ナノ粒子系送達、及びタンパク質形質導入を含むが、これらに限定されない。これらの方法のいずれか１つが使用され得る。

リポフェクションに使用されるリポソームは、細胞膜と同じ材料から構成される小さな小胞であって、１つ以上のタンパク質を充填することができる（例えば、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ＶＰ．（２００６），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．，５８（１４）：１５３２－５５）。タンパク質又はＲＮＰを細胞内へと送達するために、リポソームの脂質二重層は、細胞膜の脂質二重層と融合し、それにより、含有されたタンパク質を細胞内へと送達することができる。本発明に従って使用されるリポソームは、カチオン性脂質から構成されることが好ましい。カチオン性リポソーム戦略は、タンパク質送達へうまく適用されている（Ｚｅｌｐｈａｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３５１０３－３５１１０）。当該技術分野で知られているとおり、使用される実際の組成物、及び／又はカチオン性脂質の混合物は、目的のタンパク質及び使用される細胞型によって変えることができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０－２５６１）。相同指向型ＤＮＡ修復の誘導のためのＣａｓ９リボ核タンパク質及びドナーＤＮＡのナノ粒子系送達は、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１：８８９－９０において説明されている。

タンパク質の形質導入は、外部環境から細胞内へのタンパク質のインターナリゼーションを規定する（Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ（２００１），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８：１－４）。この方法は、少数のタンパク質及びペプチド（好ましくは、１０～１６個のアミノ酸長）が細胞膜を貫通する固有の特性による。これらの分子の形質導入特性は、融合物として発現するタンパク質に関して付与することができ、したがって、例えば、治療用タンパク質を標的細胞内へと送達するための遺伝子療法に対する代案を提供することができる。通常使用される、細胞膜を貫通することができるタンパク質又はペプチドは、例えば、アンテナペディアペプチド、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン、神経伝達物質若しくはホルモンに由来するペプチド、又は９ｘＡｒｇタグである。

マイクロインジェクション及び電気穿孔法は、当該技術分野で周知であり、当業者は、これらの方法をいかに行うかをわかっている。マイクロインジェクションは、物質を顕微鏡レベルで又は巨視的な境界レベルで単一の生細胞内へと導入するプロセスを指す。電気穿孔法は、外部から適用される電場によって生じる細胞原形質膜の導電率及び透過性の有意な上昇である。透過性を上昇させることによって、タンパク質（又はペプチド又は核酸配列）は、生細胞内へと導入することができる。

ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、活性化している酵素として、又は酵素前駆体として、細胞内へと導入され得る。後者の場合、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、細胞内で、（例えば、活性化部位を露わにする加水分解反応や活性化部位を露わにさせる立体構造の変化により）生化学的に変化し、それにより酵素前駆体が、活性化している酵素になる。

核酸分子とＤＮＡを標的とするＲＮＡとを細胞内へと導入するための手段及び方法は同様に、当該技術分野で既知であり、これらの方法は、細胞を形質導入又は形質移入することを包含する。

形質導入は、ウイルス又はウイルスベクターによって外来ＤＮＡを細胞内へと導入するプロセスである。形質導入は、外来遺伝子を宿主細胞のゲノム内へと安定して導入するために分子生物学者によって使用される一般的なツールである。概して、プラスミドが構築され、このプラスミド内では、転移することになっている遺伝子がウイルス配列に隣接しており、このウイルス配列がウイルスタンパク質によって使用されて、ウイルスゲノムが認識され、このウイルスゲノムがウイルス粒子内へとパッケージされる。このプラスミドが（通常、形質移入によって）産生細胞内へと、感染性ビリオンの形成に必要とされるウイルス遺伝子を保有する他のプラスミド（ＤＮＡコンストラクト）と一緒に挿入される。これらの産生細胞において、これらのパッケージングコンストラクトによって発現するウイルスタンパク質は、転移するＤＮＡ／ＲＮＡ（ウイルスベクターの種類による）上の配列を結合し、それをウイルス粒子内へと挿入する。安全性のため、使用されるプラスミドはいずれも、ウイルス形成に必要とされる配列をすべて含有してはおらず、それにより複数のプラスミドの同時の形質移入が、感染性ビリオンを得るために必要とされる。その上、遺伝材料がビリオン内でパッケージされることを可能にするシグナルを、転移する配列を保有するプラスミドのみが含有しており、それによりウイルスタンパク質をコードする遺伝子はいずれもパッケージされない。これらの細胞から収集されたウイルスは次に、変わることになっている細胞へ適用される。これらの感染の初期ステージは、天然のウイルスによる感染を模倣しており、転移される遺伝子の発現と、（レンチウイルスベクター／レトロウイルスベクターの場合、）転移することになっているＤＮＡの、細胞ゲノム内への挿入とにつながる。しかしながら、転移する遺伝材料がウイルス遺伝子のいずれもコードしていないので、これらの感染は、新たなウイルスを生じない（ウイルスは「複製欠損型」である）。本発明の場合において、形質導入は、ゲノム内に発現可能な形態でＲＮＡ誘導型ＤＮＡを含む細胞を生じるために使用され得る。

形質移入は、むき出しの若しくは精製された核酸、又は精製されたタンパク質、又は集合したリボ核タンパク質複合体を細胞内へと意図的に導入するプロセスである。形質移入は、通常、非ウイルスベースの方法である。

形質移入は化学的な形質移入であり得る。化学的な形質移入は、いくつかの種類へと分けることができる。すなわち、シクロデキストリン、ポリマー、リポソーム、又はナノ粒子を用いた形質移入である。最も安価な方法の１つは、リン酸カルシウムを用いる。リン酸イオンを含有するＨＥＰＥＳ緩衝塩類溶液（ＨｅＢＳ）は、形質移入されるＤＮＡを含有する塩化カルシウム溶液と組み合わさる。この２つが組み合わさると、正に帯電したカルシウム及び負に帯電したリン酸の細かな沈殿物が形成され、形質移入されることになるＤＮＡをその表面上に結合させる。沈殿物の懸濁液は次に、形質移入されることになる細胞（通常、単層で成長した細胞培養物）へ添加される。完全には理解されていないプロセスによって、細胞は、沈殿物の一部、及びそれとともにＤＮＡを取り込む。このプロセスはこれまで、多くの癌遺伝子を同定する好ましい方法であった。他の方法は、非常に分枝した有機化合物、いわゆるデンドリマを用いて、ＤＮＡを結合させ、これを細胞内へと転移させる。別の方法は、ＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのカチオンポリマーの使用である。負に帯電したＤＮＡはポリカチオンへ結合し、この複合体は、細胞によって飲食作用を介して取り込まれる。リポフェクション（又はリポソーム形質移入）は、リポソームによって遺伝材料を細胞内へと注入するために使用される技術であり、リポソームは、細胞膜と容易に併合することができる小胞であり、その理由は、いずれもが以上に記載したように、リン脂質二重層でできているからである。リポフェクションは概して、正に帯電した（カチオン性の）脂質（カチオン性リポソーム又はカチオン性混合物）を用いて、負に帯電した（アニオン性の）遺伝材料との凝集体を形成する。このトランスフェクション技術は、ポリマー、ＤＥＡＥ－デキストラン、リン酸カルシウム、及び電気穿孔法を利用する他の生化学的手順と同じ作業を、細胞内への転移に関して行う。リポフェクションの効率は、形質移入を受けた細胞を穏和な熱ショックで処理することによって改善することができる。Ｆｕｇｅｎｅは、広範な種々の細胞を高い効率及び低い毒性で直接形質移入することができる、一連の広範に使用される所有権付き非リポソーム形質移入試薬である。

形質移入はまた、非化学的方法であってもよい。電気穿孔法（遺伝子の電気転移（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ））は、よく用いられる方法であり、細胞膜の透過性の一過性上昇は、細胞が強電場の短パルスへ曝露されると達成される。細胞の絞り込みは、細胞膜の変形を介して細胞内へと分子を送達するのを可能にする。音響穿孔法は、高強度の超音波を使用して細胞膜において孔形成を誘導する。この孔形成は主として、近傍の細胞膜と相互作用する気泡のキャビテーションによるものであり、その理由は、キャビテーション核の源である超音波造影剤の添加によって孔形成が亢進するからである。光形質移入は、小さな（約１μｍ径）の孔が細胞の原形質膜において、高度に焦点合わせされたレーザで一過性に生じる方法である。原形質体融合は、形質転換した細菌細胞が、細胞壁を取り望奥ためにリゾチームで処理される技術である。この後、融合促進因子（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）（例えば、センダイウイルス、ＰＥＧ、電気穿孔法）が、目的の遺伝子を保有する原形質体を、受け手の標的細胞と融合させるために使用される。

最後に、形質移入は、粒子を基にした方法であってもよい。形質移入のための直接的なアプローチは遺伝子銃であり、ここで、ＤＮＡは、不活性固体（通常、金）のナノ粒子へ連結され、次いでこれが標的細胞の核内へと直接「撃ち込まれる」（又は粒子衝突）。この故に、核酸は、微量発射体へ通常、接続されて、高速度で膜貫通を経て送達される。磁気移入（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）、又は磁石支援形質移入（ｍａｇｎｅｔ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、磁石の力を用いてＤＮＡを標的細胞内へと送達する形質移入法である。刺通移入（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）は、プラスミドＤＮＡで機能化されたカーボンナノファイバ又はシリコンナノワイヤなど細長いナノ構造及びかかるナノ構造のアレイによって細胞を刺通することによって実施される。

本発明の第９の態様の方法は、本発明のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いた細胞のゲノムにおける標的部位のヌクレオチド配列の編集（すなわち、「突然変異」）のための方法に関する。このことは、基本的に３つの連続的な前処理を必要とする。すなわち、（１）ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ自体の、標的細胞内への効率的な送達、（２）標的細胞内におけるＣＲＩＳＰＲ構成要素の効率的な発現又は存在（ＤＮＡを標的とするＲＮＡ及び第６の態様のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）、並びに（３）ＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質複合体による目的のゲノム部位のターゲティング、及び細胞自体の修復経路によるＤＮＡの修復である。ステップ（３）は、ゲノムが編集されることになる細胞におけるＣＲＩＳＰＲ構成要素の発現の際に、細胞内で自動的に実施される。

ゲノム編集によって、標的部位は、細胞のゲノムにおいて、挿入、欠失、修飾（一塩基多型（ＳＮＰ）を含む）、又は置換され得る。標的部位は、遺伝子のコード領域内、遺伝子のイントロン内、遺伝子の調節領域内、遺伝子間の非コード領域内などにあり得る。この遺伝子は、タンパク質コード遺伝子又はＲＮＡコード遺伝子であり得る。この遺伝子は、目的のいずれかの遺伝子であり得る。

この関係において、ゲノム編集は、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）又は相同指向型組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＨＤＲ））経路を含む、細胞自体の修復経路を用いる。ＤＮＡが一度、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断されると、細胞自体のＤＮＡ修復機構（ＮＨＥＪ又はＨＤＲ）は、数片の遺伝材料を付加し若しくは欠失させ、又は既存のセグメントを個別調整したＤＮＡ配列で置き換えることによってＤＮＡに対して変化をもたらす。この故に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系において、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＤＮＡにおける二本鎖切断を、短い（約２０個のヌクレオチド）ｇＲＮＡによって決定される部位で行い、この切断が次に、細胞内でＮＨＥＪ又はＨＤＲによって修復される。ゲノム編集はＮＨＥＪを用いることが好ましい。異なる実施形態において、ゲノム編集はＨＤＲを用いることが好ましい。

ＮＨＥＪは、二本鎖が切断されたＤＮＡ末端を直接結合するために様々な酵素を用いる。対照的に、ＨＤＲにおいて、相同配列は、切断地点で欠損しているＤＮＡ配列の再生のためのテンプレートとして利用される。ＮＨＥＪは、２つの末端の再ライゲーションのために１個のみからせいぜい数個のまでの相補的な塩基の整列を包含するので、カノニカルな相同性に非依存的な経路(canonical homology-independent pathway)であるのに対し、ＨＤＲは、ＤＮＡ損傷を修復するためのより長い配列相同鎖を用いる。

これらの経路の天然の特性は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを基にしたゲノム編集の正に基礎を形成する。ＮＨＥＪは、誤りがちであり、修復部位に突然変異を生じさせることが示されている。したがって、複数の試料において所望の遺伝子に二本鎖切断（ＤＳＢ）をつくることができる場合、エラーがＮＨＥＪ不忠実性によってつくられるので、突然変異が、処理の一部において当該部位で生じる可能性は非常に高い。その一方で、ＤＳＢを修復するための相同配列に対するＨＤＲの依存性は、ＤＳＢの隣接配列に対して相同である配列内に所望の配列を挿入することによって利用することができ、当該所望の配列は、ＨＤＲの系によってテンプレートとして使用されるとき、目的のゲノム領域内での所望の変化をつくることにつながり得る。異なる機序にもかかわらず、ＨＤＲに基づく遺伝子編集の概念は、相同組換えを基にした遺伝子ターゲティングの概念と同様のかたちにある。そのため、これらの原理に基づいて、ゲノム内の特定の位置にＤＳＢをつくることができる場合、細胞自体の修復の系は、所望の突然変異をつくる上で役立ち得る。

ＨＤＲのための相同配列テンプレートはまた、本明細書では「修復テンプレート」とも呼ばれる。

この故に、本発明の第９の態様によって細胞のゲノムにおける標的部位でヌクレオチド配列を修飾することによって、遺伝子は、（未成熟終止コドンの導入により）ノックアウトされ得、又は（修復基質を介して）ノックインされ得る。同様に、本発明の第９の態様の方法によって遺伝子の発現を変化させることが可能である。例えば、ゲノムにおける標的部位は、プロモーター領域が、標的プロモーター領域を介して制御される遺伝子の発現を増減し得るのを変更する、プロモーター領域であり得る。

この故に、第９の態様の好ましい実施形態に従って、前記方法はさらに、当該細胞内への修復基質の導入を含む。

ＨＤＲに適した修復テンプレートの設計及び構造は、当該技術分野で既知である。ＨＤＲは、修復テンプレートが二本鎖切断（ＤＳＢ）で元のＤＮＡ配列と同一である場合にエラー非含有であり、又は非常に特異的な突然変異をＤＮＡ内へと導入することができる。ＨＤＲ経路の３つの中心的なステップは、（１）５’末端ＤＮＡ鎖が切断部で切除され、３’オーバーハングをつくることである。このことは、鎖の侵入に必要とされるタンパク質のための基質と、ＤＮＡ修復合成のためのプライマーとの両方として機能する。（２）侵入鎖は次いで、相同ＤＮＡ二重鎖のうちの１つの鎖を置き換えることができ、もう一方と対形成することができる。この結果、置換ループ（Ｄループ）と呼ばれる雑種ＤＮＡが形成される。（３）組換え中間体は次いで、ＤＮＡ修復プロセスを完了するよう分解されることができる。

例えば、突然変異を導入するために、又は新たなヌクレオチド若しくはヌクレオチド配列を遺伝子内へと挿入するために用いられるＨＤＲテンプレートは、修飾される標的配列を取り囲むある程度の量の相同性を必要とする。ＣＲＩＳＰＲ誘導性ＤＳＢで開始する相同アームを使用することができる。概して、修飾の挿入部位は、ＤＳＢに非常に近くあるべきであり、理想的には、可能であれば１０ｂｐ未満であるべきである。特筆すべき１つの重要な点は、ＤＳＢが一度導入及び修復されると、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＤＮＡを切断し続け得ることである。ｇＲＮＡ標的部位／ＰＡＭ部位が未処置のままである限り、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断及び修復し続ける。この反復される編集は、非常に特異的な突然変異又は配列が、目的の遺伝子内へと導入されることになる場合、問題であり得る。これを移動させるために、修復テンプレートは、初期ＤＳＢが修復された後でさらなるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼターゲティングを究極的に遮断するような方法で設計することができる。さらなる編集を遮断する２つの一般的な方法は、ＰＡＭ配列又はｇＲＮＡシード配列を突然変異させることである。修復テンプレートを設計するとき、意図する編集のサイズが考慮されるべきである。ｓｓＤＮＡテンプレート（ｓｓＯＤＮとも呼ばれる）は通常、より小さな修飾に使用される。小さな挿入／編集は、各相同アームについて３０～５０塩基程度という少量を必要とし得、実際の最良の数は、目的の遺伝子に基づいて変わり得る。５０～８０塩基の相動性アームが通常使用される。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（３）：３３９－４４）は、非対称相同アーム（ＰＡＭに対して遠位の３６塩基、及びＰＡＭに対して近位の９１塩基）がＨＤＲ効率性を最大６０％まで支持することを発見した。２００塩基よりも長いｓｓＯＤＮをつくることと関係し得る困難さにより、目的の遺伝子内への蛍光タンパク質又は選択カセットなど、より大きな挿入のためのｄｓＤＮＡプラスミド修復テンプレートを用いることが好ましい。これらのテンプレートは、少なくとも８００ｂｐの相同アームを有することができる。プラスミド修復テンプレートに基づくＨＤＲ編集の頻度を高めるために、テンプレートと隣接するｇＲＮＡ標的部位を含有する自己切断プラスミドを使用することができる。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び適切なｇＲＮＡが存在するとき、テンプレートは、ベクターから遊離する。プラスミドクローン形成を回避するために、ＰＣＲで生成された長いｄｓＤＮＡテンプレートを使用することができる。その上、Ｑｕａｄｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１７；１８（１）：９２）は、大きな突然変異を行うことができ、ｓｓＯＤＮの利点を利用する技術である、Ｅａｓｉ－ＣＲＩＳＰＲを開発した。２００塩基よりも長いｓｓＯＤＮをつくるために、修復テンプレートをコードするＲＮＡをインビトロで転写し、次いで逆転写酵素を用いて相補的ｓｓＤＮＡをつくる。Ｅａｓｉ－ＣＲＩＳＰＲは、マウスノックインモデルにおいて十分に機能し、ｄｓＤＮＡを用いる１～１０％からｓｓＯＤＮを用いる２５～５０％まで編集効率を高める。ＨＤＲ効率は、遺伝子座及び実験系にわたって様々であるが、ｓｓＯＤＮテンプレートは概して、最高頻度のＨＤＲ編集を提供する。

第９の態様の好ましい実施形態に従って、前記細胞は、当該ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子の天然の宿主ではない。

本明細書で以上に論議したように、配列番号１、３、及び２９のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、様々なタンパク質工学戦略を用いて開発及び最適化され、これは、配列番号１、３、及び２９が天然の宿主を持たない非天然配列であることを意味する。

この故に、既知の細胞は、配列番号１、３、及び２９の天然宿主ではない。

第９の態様の別の好ましい実施形態に従って、前記細胞は、真核細胞、好ましくは、酵母細胞、植物細胞、又は動物細胞である。

真核細胞、植物細胞、及び動物細胞、並びにこれらの細胞の好ましい例を含む当該細胞が得られ得る真核生物、植物、及び動物は、本発明の第３及び第４の態様と関係して本明細書で以上に説明されている。

これらの細胞は同様に、本発明の第９の態様と関係して使用され得る。

第９の態様のより好ましい実施形態に従って、前記方法はさらに、
植物又は動物を作出するために、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが発現してヌクレオチド配列を標的部位で切断することによって修飾されたヌクレオチド配列が産生する条件下で植物細胞又は動物細胞を培養すること；及び、
当該修飾されたヌクレオチド配列を含む植物又は動物を選別すること、を含む。

この関係において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの系の構成要素が内部へと導入されることになる細胞は、完全な植物又は動物へと発達することができる全能性細胞、又は生殖系列細胞（卵母細胞及び／又は精子）又は幹細胞の集合でなければならない。植物又は動物を作出するためのかかる細胞の培養のための手段及び方法は、当該技術分野で既知である（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｂｏｏｋ．ｏｒｇ／ｎｏｄｅ／７２０を参照されたい）。

別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が優先される。

本発明は、第１０の態様において、対象における疾患の処置における使用のための、本発明の第９の態様による方法によって作製された、修飾された細胞に関する。修飾された細胞は好ましくは、修飾されたＴリンパ球であり、処置される疾患は好ましくは癌である（Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８ Ｆｅｂ ２０２０：Ｖｏｌ．３６７，Ｉｓｓｕｅ ６４８１，ｅａｂａ７３６５）。

本発明の第９の態様の方法によって修飾されることになる細胞は、好ましくは、処置される対象から得られ、次いで、修飾された細胞は、本発明の第１０の態様に従って用いられる。

本明細書において、特に特許請求の範囲において特徴づけられる実施形態に関して、従属請求項において言及される各実施形態は、当該従属請求項が従属する各請求項（独立又は従属）の各実施形態と組み合わされることが意図されている。例えば、選択肢Ａ、Ｂ、及びＣを列挙する独立請求項１、選択肢Ｄ、Ｅ、及びＦを列挙する従属請求項２、並びに請求項１及び２に従属し且つ選択肢Ｇ、Ｈ、及びＩを列挙する請求項３の場合、本明細書は、別段の具体的な言及がない限り、Ａ、Ｄ、Ｇ；Ａ、Ｄ、Ｈ；Ａ、Ｄ、Ｉ；Ａ、Ｅ、Ｇ；Ａ、Ｅ、Ｈ；Ａ、Ｅ、Ｉ；Ａ、Ｆ、Ｇ；Ａ、Ｆ、Ｈ；Ａ、Ｆ、Ｉ；Ｂ、Ｄ、Ｇ；Ｂ、Ｄ、Ｈ；Ｂ、Ｄ、Ｉ；Ｂ、Ｅ、Ｇ；Ｂ、Ｅ、Ｈ；Ｂ、Ｅ、Ｉ；Ｂ、Ｆ、Ｇ；Ｂ、Ｆ、Ｈ；Ｂ、Ｆ、Ｉ；Ｃ、Ｄ、Ｇ；Ｃ、Ｄ、Ｈ；Ｃ、Ｄ、Ｉ；Ｃ、Ｅ、Ｇ；Ｃ、Ｅ、Ｈ；Ｃ、Ｅ、Ｉ；Ｃ、Ｆ、Ｇ；Ｃ、Ｆ、Ｈ；Ｃ、Ｆ、Ｉという組み合わせに対応する実施形態を明白に開示することは理解されるものとする。

同様に、独立請求項及び／又は従属請求項が選択肢を列挙していない場合においても、従属請求項が複数の先行請求項を参照することは理解され、それにより網羅される発明の対象のいずれの組み合わせも、明示的に開示されているとみなされる。例えば、独立請求項１の場合、請求項１を参照する従属請求項２、並びに請求項２及び請求項１のいずれをも参照する従属請求項３の場合、請求項３及び請求項１の発明の対象の組み合わせが、請求項３、２、及び１の発明の対象の組み合わせであるのと同様に、明確かつ明白に開示されていることは理解される。請求項１～３のいずれか一項を指すさらなる従属請求項４が存在する場合、請求項４及び１の、請求項４、２、及び１の、請求項４、３、及び１の、並びに請求項４、３、２、及び１の発明の対象の組み合わせが、明確かつ明白に開示されていることは理解される。

実施例は本発明を説明する。

（実施例１：ＢＥＣファミリーヌクレアーゼの同定及び工学操作）
新規のゲノム編集ヌクレアーゼとして機能する能力を持つメタゲノム配列を、実験室内で配列決定される様々な生息環境においてインシリコで同定した（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１７）５４２，２３７－２４１。これらの配列のうちのいずれも、ゲノム編集に十分な、基本的なＤＮＡターゲティング効率を示さなかったので、関連する配列のランダムシャッフリングを行い（Ｃｏｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００１）１９，３５４－３５９）、無作為に創出したキメラ配列をランダム突然変異誘発で追加として最適化した（ＭｃＣｕｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１０）６３４，１０３－９）。最終的なステップにおいて、数多くの変異誘発されたキメラ配列をスクリーニングして、これらのＤＮＡターゲティング活性を評価した。

この無作為且つ非合理的なアプローチを用いて、ゲノム編集アプローチに潜在的に十分な、強いＤＮＡターゲティング活性を示す３つの配列（ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０）を成功裏に同定した。無作為なアプローチを用いたにもかかわらず、驚くべきことに、３つの同定および設計されたアミノ酸配列はいずれも互いに対して約９５％の配列同一性を共有している。この配列同一性及び当該３つの配列の独特なＤＮＡターゲティング機構（実施例３を参照されたい）に基づいて、当該３つの配列は、本明細書でＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの新たなファミリー（ＢＥＣファミリー：ＢＲＡＩＮ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓタンパク質）として分類される。

（実施例２：ＢＥＣファミリー、Ｃｍｓ１ファミリー、及びＳｐＣａｓ９のヌクレアーゼを含む機能的ゲノム編集系の構築）
（２．１ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃにおけるゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ及びＣｍｘ１のベクター系）
本発明の新規のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであるＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７及びＢＥＣ１０、並びに２つの既知のＣｍｓ１ファミリーＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであるＳｕＣｍｓ１（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），ｂｉｏＲｘｉｖ）及び配列番号６３（国際公開第２０１９／０３０６９５号）の恒常的発現にとって必要な遺伝要素と、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）転写にとって必要な遺伝要素とを、オールインワン型ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ８５、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ６７、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０、ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１、又はＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３のベクター系において提供した。

以下において、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０ベクター系の構築を説明する。ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ８５及びＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ６７、ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１及びＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３のベクター系を、類似のアプローチにおいて構築した。

（ＢＥＣ１０タンパク質発現カセットの設計）
３６９６ｂｐの合成ＢＥＣ１０ヌクレオチド配列は、遺伝子合成提供元であるＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供されるバイオインフォマティクスアプリケーションを用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃにおける発現用にコドン最適化した（配列番号３０）。追加として、ＤＮＡヌクレアーゼコード配列を、ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列番号１１をコードする配列によって５’伸長した（Ｋａｌｄｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３９（１９８４），４９９－５０９）。タンパク質発現について、結果として得られる３７２３ｂｐの合成遺伝子を恒常的なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ｔｐｉ１プロモーター（配列番号１２）及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ｃｐｓ１終結因子（配列番号１３）へ融合した。最終的なＢＥＣ１０タンパク質発現カセットをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＮＥＢ，Ｆｒａｎｋｕｆｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、組換えＥ.ｃｏｌｉ細胞及び組換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞のエピソーム増殖及び選択に必要な遺伝要素をすべて含有するＥ.ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクター内へと挿入した。

組換えＥ.ｃｏｌｉ細胞のベクターの増殖及び選択のために、このプラスミドは、Ｅｍ７合成プロモーター（配列番号１４）の制御下でｐＵＣ由来の高コピーＣｏｌＥ１複製起点と、カナマイシン耐性を与えるｋａｎＭＸマーカー遺伝子とを含有していた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ由来のＣＥＮ６動原体（配列番号１５）は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞においてシャトルプラスミドのエピソーム複製を可能にした。形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞の選択のために、ｋａｎＭＸマーカー遺伝子（配列番号１６）に対して上流の二機能性細菌／酵母プロモーター構造は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ｔｅｆ１プロモーター配列（配列番号１７）を含有していた。

（ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）発現カセットの設計）
ＢＥＣ１０ ＤＮＡヌクレアーゼによる特異的Ａｄｅ２遺伝子ターゲティングのためのキメラｇＲＮＡの発現を、ＳＵＰ４終結因子配列（配列番号１９）を備えたＳＮＲ５２ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（配列番号１８）によって駆動した（ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ（２０１３），４１，４３３６－４３４３）。キメラｇＲＮＡは、Ａｄｅ２標的特異的な２４ｂｐのスペーサー配列（配列番号２０）へ融合した１９ｂｐの定常ＢＥＣファミリーステム－ループ配列（配列番号９又は配列番号１０；ステムループ配列はいずれも、同様の結果につながる３つのＢＥＣファミリーヌクレアーゼすべての間で相互交換可能である）から構成された。標的スペーサー配列は、ヌクレアーゼＢＥＣ１０特異的ＰＡＭ駆動５’－ＴＴＴＡ－３’に対して下流のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ａｄｅ２遺伝子において同定された。

ＳＮＲ５２ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、設計されたキメラｇＲＮＡ、及びＳＵＰ４終結因子配列から構成された完全なＲＮＡ発現カセットは、合成遺伝子断片として、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。

オールインワン型ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０ベクター系の構築は、ＢＥＣ１０ ＤＮＡヌクレアーゼ発現カセットを含有する調製されたＥ.ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクターにおける合成ＲＮＡ発現カセットをクローニングすることにより完成させた。最終的なＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０ベクター系の構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＮＥＢ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により行った。

クローン化したＤＮＡ要素の同一性を、ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のサンガー配列決定法によって確認した。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０オールインワン型ベクター系）
構築されたＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０ベクター系の完全なヌクレオチド配列を配列番号３１として提供する。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ８５オールインワン型ベクター系）
構築されたＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ８５ベクター系の完全なヌクレオチド配列を配列番号２１として提供する。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ６７オールインワン型ベクター系）
構築されたＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ６７ベクター系の完全なヌクレオチド配列を配列番号２２として提供する。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１オールインワン型ベクター系）
構築されたＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１ベクター系の完全なヌクレオチド配列を配列番号３２として提供する。

（ＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３オールインワン型ベクター系）
構築されたＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３ベクター系の完全なヌクレオチド配列を配列番号３３として提供する。

（２．２ 相同指向型修復テンプレート（ＨＤＲテンプレート）の設計）
８３８ｂｐのＡｄｅ２ ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、ＢＥＣ１０、ＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３ ＨＤＲテンプレートを設計して、相同組換えにより、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ａｄｅ２染色体遺伝子において２９ｂｐの部位特異的欠失を発生させた。ＨＤＲテンプレート内で、導入したＡｄｅ２遺伝子欠失は、染色体標的領域に対して相同の４０７ｂｐ及び４２９ｂｐの配列によって隣接されていた。追加として、ＨＤＲ断片は、欠失したＡｄｅ２ゲノム部位の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩについての新たな認識配列を創出した。設計されたＨＤＲテンプレートによって介在されるうまくいった組換え事象は、染色体Ａｄｅ２遺伝子における先述のＰＡＭ及びプロトスペーサー領域（配列番号２０）を消失させて、プログラムされたｇＲＮＡ／ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０のＤＮＡヌクレアーゼ複合体がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８ｃゲノムを再度標的とすることを妨げた。なお、遺伝子欠失の導入によりＡｄｅ２突然変異体のクローンが生じるが、これは、アデニンを取り除いた突然変異細胞がその空胞内又は液胞内に赤色のプリン前駆体を蓄積するとの理由から、コロニーの赤色によって容易に認識された。（Ｕｇｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ（２００６），４８５－９２）。

ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、ＢＥＣ１０、ＳｕＣｍｓ１、及び配列番号６３についてのＡｄｅ２ ＨＤＲテンプレートの完全な配列を配列番号２３として提供する。

（２．３ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃにおけるゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９ベクター系）
ＳｐＣａｓ９（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９）ＤＮＡヌクレアーゼの恒常的発現のために、及び単一ガイドＲＮＡ転写のために必要な遺伝要素を、オールインワン型ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９ベクター系において提供した。

（ＳｐＣａｓ９タンパク質発現カセットの設計）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の公表されたＳｐＣａｓ９ヌクレオチド配列に基づく（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７１（２０１１），６０２－６０７）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃにおける発現のためにコドン最適化がなされたＳｐＣａｓ９コード配列のＤＮＡ合成は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に発注した（配列番号２４）。核転移のために、ＳｐＣａｓ９ ＤＮＡヌクレアーゼコード配列を、ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする配列（配列番号１１）によって５’伸長した。ＢＥＣ１０ ＤＮＡヌクレアーゼについて説明したタンパク質発現戦略に従って、結果として得られる４１３４ｂｐの合成ＳｐＣａｓ９遺伝子を、恒常的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ｔｐｉ１プロモーター（配列番号１２）及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ｃｐｓ１終結因子（配列番号１３）へ融合させた。最終的なＳｐＣａｓ９タンパク質発現カセットをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ （ＮＥＢ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０ベクター系について先述したような増殖及び選択のための同一の遺伝要素を保有するＥ.ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクター内へと挿入した。

（ガイドＲＮＡ発現（ｇＲＮＡ）カセットの設計）
ＳｐＣａｓ９ ＤＮＡヌクレアーゼによる特異的Ａｄｅ２遺伝子ターゲティングのためのキメラｇＲＮＡの発現を、ＳＵＰ４終結因子配列（配列番号１９）を備えたＳＮＲ５２ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（配列番号１８）によって駆動した。キメラガイドＲＮＡは、７６ｂｐのＳｐＣａｓ９特異的ｓｇＲＮＡ配列（配列番号２６）へ融合したＡｄｅ２標的特異的２０ｂｐスペーサー配列（配列番号２５）から構成された。標的スペーサー配列を、ヌクレアーゼＳｐＣａｓ９特異的ＰＡＭ駆動５’－ＡＧＧ－３’に対して上流のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ａｄｅ２遺伝子において同定した。

ＳＮＳ５２ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、設計されたキメラガイドＲＮＡ及びＳＵＰ４終結因子配列からなる完全なＲＮＡ発現カセットは、合成ＤＮＡ断片として、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。

最終的なＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９ベクター系を生成するために、合成ＲＮＡ転写カセットをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＮＥＢ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ＳｐＣａｓ９ ＤＮＡヌクレアーゼ発現カセットを含有する調製されたＥ.ｃｏｌｉ／Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシャトルベクター内へとクローニングした。すべてのクローンニングしたＤＮＡ要素の同一性を、ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でサンガー配列決定法によって確認した。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９オールインワン型ベクター系）
構築されたＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９ベクター系の完全なヌクレオチド配列を、配列番号２７として提供する。

（２．４ 相同指向型修復テンプレートの設計）
８３２ｂｐの合成Ａｄｅ２ ＳｐＣａｓ９ ＨＤＲテンプレートを設計して、相同組換えによる染色体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ Ａｄｅ２遺伝子における２６ｂｐの部位特異的欠失を生成した。ＨＤＲテンプレート内で、導入されたＡｄｅ２遺伝子欠失は、染色体標的領域と相同の４０２ｂｐ配列及び４２８ｂｐ配列によって隣接されていた。設計されたＨＤＲテンプレートによって介在されるうまくいった組換え事象は、染色体Ａｄｅ２遺伝子における先述のＰＡＭ及びプロトスペーサー領域（配列番号２５）を消失させて、プログラムされたｇＲＮＡ／ＳｐＣａｓ９ ＤＮＡヌクレアーゼ複合体がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ２８８ｃゲノムを再度標的とすることを妨げた。なお、遺伝子欠失の導入によりＡｄｅ２突然変異体のクローンが生じるが、これは、アデニンを取り除いた突然変異細胞がその空胞内又は液胞内に赤色のプリン前駆体を蓄積するとの理由から、コロニーの赤色によって容易に認識された（Ｕｇｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ（２００６），４８５－９２）。

８３２ｂｐのＡｄｅ２ ＨＤＲテンプレートのヌクレオチド配列を配列番号２８として提供する。

（２．５ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養及び形質転換）
（受容能力をもつＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ細胞の形質転換）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ細胞の調製及び形質転換を、Ｇｉｅｔｚ ＆ Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００７），２，３１－３４によって説明されるように行った。簡潔に言えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃの単一コロニーを、２５ｍｌの２×ＹＰＤ培地中に接種し、３０℃で１４～１６時間、２００ｒｐｍの水平振盪器上でインキュベートした。一晩生育した前培養物を、新鮮な２５０ｍｌの２×ＹＰＤ培地中へと、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が０．５になるまで希釈した。接種した培地を３０℃で２００ｒｐｍの水平振盪器上で、培養物が２．０～８．０のＯＤ６００の光学密度に到達するまでインキュベートした。細胞を５×５０ｍｌのコニカルチューブ内へと移し、３０００×ｇで５分間の遠心分離によって収穫した。２５０ｍｌ培養物からペレット化した細胞を１２５ｍＬの水に再懸濁し、３０００×ｇで５分間の遠心分離した。ペレット化した細胞を２．５ｍｌの水に再懸濁した。さらなる３０００×ｇで５分間の遠心分離での遠心分離工程の後に、ペレット化した細胞を、最終的に、２．５ｍｌの「凍結コンピテントセル溶液」（５％ｖ／ｖのグリセロール及び１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ）中に再懸濁した。５０μｌの受容能力をもつ細胞のアリコートを－８０℃で使用するまで保存した。形質転換の手順については、受容能力をもつ細胞のアリコートを３７℃で３０秒間解凍した後、１１，６００×ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを、１４μｌの水、２６０μｌの５０％ｗ／ｖ ＰＥＧ３３５０、３６μｌの１Ｍ酢酸Ｌｉ、及び５０μｌの一本鎖担体ＤＮＡ中に提供される１μｇのｐＳｃＣＥＮプラスミド誘導体と５００ｎｇのＨＤＲテンプレートとから構成される３６０μｌの形質転換混合物中で再懸濁した。調製した細胞を４２℃で４５分間、１５分ごとに混合しながら熱ショックをかけた。熱ショックのステップの後、形質転換した細胞を１３，０００×ｇで３０秒間遠心分離することによってペレット化し、上清を除去した。回収のため、細胞ペレットを１ｍｌのＹＰＤ中で再懸濁した。細胞懸濁液を５ｍｌチューブ内へと移し、３０℃で3時間、２００ｒｐｍの水平振盪器上でインキュベートした。最終的に、形質転換した細胞を、５０μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８）を含有する選択寒天プレート上に播種し、３０℃で少なくとも２日間インキュベートした。

（２．６ Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３におけるゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ Ｅ.ｃｏｌｉ及びＣｍｓ１ Ｅ.ｃｏｌｉベクター系）
ＢＥＣ１０、ＳｕＣｍｓ１、又は配列番号６３のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの恒常的発現及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）転写に必要な遺伝要素は、オールインワン型ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＿Ｅ.ｃｏｌｉ（配列番号３４）ベクター系、オールインワン型ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１＿Ｅ.ｃｏｌｉ（配列番号３５）ベクター系、又はオールインワン型ＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３＿Ｅ.ｃｏｌｉ（配列番号３６）ベクター系として準備した。

以下において、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＿Ｅ.ｃｏｌｉベクター系の構築を説明する。ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１＿Ｃｏｌｉ及びＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３＿Ｃｏｌｉのベクター系を類似のアプローチにおいて構築した。

（ＢＥＣ１０＿Ｃｏｌｉタンパク質発現カセットの設計）
３６９６ｂｐの合成ＢＥＣ１０ヌクレオチド配列は、遺伝子合成提供元のＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供されるバイオインフォマティクスアプリケーションを用いて、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３における発現用にコドン最適化した（配列番号３７）。タンパク質発現のために、結果として得られた合成遺伝子を、誘導性ａｒａＢＡＤプロモーター（配列番号３８）及びｆｄｔ終結因子（配列番号３９）へ融合した。最終的なＢＥＣ１０＿Ｅ.ｃｏｌｉタンパク質発現カセットを、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＮＥＢ， Ｆｒａｎｋｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、組換えＥ.ｃｏｌｉ細胞のエピソーム増殖及び選択のために必要な遺伝子要素をすべて含有するＥ.ｃｏｌｉシャトルベクター内へと挿入した。

（ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）発現カセットの設計）
ＢＥＣ１０ ＤＮＡヌクレアーゼによる特異的ｒｐｏＢ遺伝子ターゲティングのためのキメラｇＲＮＡの発現を、ＳａｃＢ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター(配列番号４０）によって駆動し、ｒｒｎＢ終結因子配列（配列番号４１）を用いて終結させた。キメラｇＲＮＡは、ｒｐｏＢ標的特異的２４ｂｐスペーサー配列（配列番号４２）へ融合した１９ｂｐの定常ＢＥＣファミリーステム－ループ配列（配列番号９又は配列番号１０、ステムループ配列はいずれも同様の結果につながる３つのすべてのＢＥＣファミリーヌクレアーゼ間で相互交換可能である）から構成された。標的スペーサー配列を、ヌクレアーゼＢＥＣ１０特異的ＰＡＭ駆動５’－ＴＴＴＡ－３’に対して下流のＥ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３ ｒｐｏＢ遺伝子において同定した。

ＳａｃＢ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、設計されたキメラｇＲＮＡ、及びｒｒｎＢ終結因子配列から構成される完全なＲＮＡ発現カセットは、合成遺伝子断片として、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。

オールインワン型ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＿Ｅ.ｃｏｌｉベクター系の構築は、ＢＥＣ１０＿Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡヌクレアーゼ発現カセットを含有する調製されたＥ.ｃｏｌｉシャトルベクターにおける合成ＲＮＡ発現カセットをクローニングすることによって完成させた。最終的なＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＿Ｅ.ｃｏｌｉベクター系の構築は、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＮＥＢ， Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行った。

すべてのクローンニングしたＤＮＡ要素の同一性を、ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でサンガー配列決定法によって確認した。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＿Ｅ.ｃｏｌｉオールインワン型ベクター系）
構築されたＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＿Ｃｏｌｉベクター系の完全なヌクレオチド配列を配列番号３４として提供する。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１＿Ｅ.ｃｏｌｉオールインワン型ベクター系）
構築されたＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１＿Ｃｏｌｉベクター系の完全なヌクレオチド配列を配列番号３５として提供する。

（ＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３＿Ｅ.ｃｏｌｉオールインワン型ベクター系）
構築されたＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍ１＿Ｃｏｌｉベクター系の完全なヌクレオチド配列を配列番号３６として提供する。

（２．７ Ｅ.ｃｏｌｉ培養及び形質転換）
（受容能力をもつＥ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３細胞の形質転換）
簡潔に言えば、Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３の単一コロニーを、５ｍｌのＬＢ－Ｋａｎ培地中に接種し、３７℃で１２～１４時間、２００ｒｐｍの水平振盪器上でインキュベートした。一晩生育した前培養物を、新鮮な６０ｍｌのＬＢ培地中へと、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）が０．０６になるまで希釈した。接種した培地を３０℃で２００ｒｐｍの水平振盪器上で、培養物をＯＤ６００が０．２との光学密度に到達するまでインキュベートした。２０％アラビノースを添加し、培養物をＯＤ６００が０．５との光学密度に到達するまで、細胞を３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。細胞を５×５０ｍｌのコニカルチューブ内へと移し、４℃、４０００×ｇで５分間の遠心分離によって収穫した。５０ｍｌ培養物からペレット化した細胞を、６０ｍｌの水中で再懸濁し、４℃、４０００×ｇで５分間遠心分離した。

洗浄手順を行い、細胞を４℃、４０００×ｇで５分間遠心分離した後、３０ｍｌの１０％グリセリン中で再懸濁した。第２の洗浄ステップにおいて、細胞を４℃、４０００×ｇで５分間遠心分離した後、６ｍｌの１０％グリセリン中で再懸濁した。最終的なステップにおいて、細胞を１５０μｌの１０％グリセリン中で再懸濁した。２５μｌの受容能力をもつ細胞のアリコートを－８０℃で使用するまで保存した。形質転換の手順については、受容能力をもつ細胞のアリコートを解凍し、５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを添加した。調製した細胞を、１８００Ｖ、２５μＦ、２００オームを５ミリ秒間用いて電気穿孔した。その後、９７５μＬのＮＥＢ（登録商標）１０ベータ／安定外殖培地を添加し、１００μｌの懸濁液を選択寒天プレート上に播種した。

（２．８ ＤＮＡ技術）
プラスミド単離、ＤＮＡの酵素操作、及びアガロースゲル電気泳動法を、標準的な手順により行った。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）をＰＣＲ増幅に用いた。この作業において使用されるオリゴヌクレオチドはすべて、ｂｉｏｍｅｒｓ．ｎｅｔ（Ｕｌｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成した。ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｋｉｔ及びＺｙｍｏＣｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をアガロース及び酵素反応からの精製に使用した。すべてのクローンニングしたＤＮＡ断片の同一性を、ＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でサンガー配列決定法によって確認した。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ細胞から精製されたゲノムＤＮＡを、製造元の説明書により、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ ＹｅａＳｔａｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。酵母細胞壁のザイモリアーゼ消化を、３７℃で６０分間行い、精製されたゲノムＤＮＡを６０μｌの５ｍM トリス／ＨＣｌ ｐＨ８．５中で溶出した。

（実施例３：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＳｐＣａｓ９と比較したＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０の機能的特徴づけ）
（３．１．実験のセットアップ）
本実施例において、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ８５（配列番号２１）、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ６７（配列番号２２）、又はＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０（配列番号３１）のベクター系、及び対応する相同指向型修復テンプレート（配列番号２３）を使用して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ＣにおいてＡｄｅ２遺伝子をノックアウトした。ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０を用いて行った実験との比較において、同様の実験を、ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９コンストラクト（配列番号２７）及び対応する相同指向型修復テンプレート（配列番号２８）を用いて行って、ＢＥＣ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの機能性を実証した。

Ａｄｅ２は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの非必須遺伝子であり、その遺伝子のノックアウト体は、液胞内に赤色のプリン前駆体を蓄積するため、赤色の表現型のコロニーをもたらす（Ｕｇｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ（２００６），４８５－９２）。この容易なリードアウトから、Ａｄｅ２遺伝子のノックアウト体は、ゲノム編集ツールとして機能するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質の能力をモニターするためのスクリーニングシステムとして利用することができる。

このアプローチにおいて、ＰＡＭ及びスペーサー配列を除去する部位特異的欠失につながる相同指向型修復テンプレートのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ指向型導入を用いた。さらに、フレームシフト突然変異を、Ａｄｅ２遺伝子のノックアウトにつながる相同指向型修復テンプレートによって導入して、ＳｐＣａｓ９（科学及び薬学において最も普遍的に使用されるＣａｓタンパク質）と比較したＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０のＤＮＡ切断活性を可視化した。

ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、ＢＥＣ１０、及びＳｐＣａｓ９に関して、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃにおいて使用したＡｄｅ２ノックアウト戦略を図１に概略的に示す。

まとめると、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ８５、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ６７、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０、又はＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９の発現コンストラクト、及び対応する相同指向型修復テンプレートを、実施例２．５において説明したように、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ｃ細胞内へと形質転換し、播種した。

併行して、Ａｄｅ２遺伝子を標的とするスペーサー配列を欠失させるＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ８５、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ６７、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０、又はＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９発現コンストラクトを用いた陰性対照実験を行い、特異的スペーサーによる標的ＤＮＡ領域へ誘導されることになるＣａｓタンパク質の依存性を実証した。

形質転換及び３０℃での４８時間のインキュベーション後に、培養プレートを、生育したコロニー数を計数することによって、及び当該コロニーの表現型（赤色又は白色）の評価によって分析した。

（３．２ 結果）
結果を表１にまとめ、例示的なプレートを図２に示す。

実験はすべて、５つの生物学的複製物において実施し、これらの複製物から得られた結果を合わせて、ＢＥＣ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのゲノム編集効率を可視化した。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９）
陰性対照コンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９（スペーサー非含有）＋相同指向型修復テンプレート）で形質転換した細胞は、５８３１個の白色コロニー及び１１個の赤色コロニーを示し、ＳｐＣａｓ９タンパク質が、失われたスペーサー配列により、Ａｄｅ２遺伝子のＤＮＡを標的としなかったことを実証した。それゆえ、コロニーの９９．８％は、野生型表現型（白色）を示した。さらに、１１個のコロニーは、相同指向型修復テンプレートがＡｄｅ２遺伝子座へと組込む天然の相同組換え事象により、ノックアウト表現型（赤色）を示した。

これとは対照的に、活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９（Ａｄｅ２遺伝子を標的とするスペーサー含有）＋相同指向型修復テンプレート）は、１１８２個の白色コロニー及び２５７５個の赤色コロニーにつながった。したがって、コロニーの０．２％のみが編集された陰性対照と比較して、編集されたコロニーの６８％を含有するＳｐＣａｓ９の分子機序及び効能が実証された。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ８５、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ６７、及びＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０）
驚くべきことに、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、又はＢＥＣ１０の配列を用いた同じ実験セットアップは、ＳｐＣａｓ９と比較して完全に異なる結果につながった。

陰性対照コンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０（スペーサー非含有）＋相同指向型修復テンプレート）で形質転換した細胞は、８０２１個の白色コロニー及び１４個の赤色コロニーを示し、ＢＥＣ１０タンパク質が、失われたスペーサー配列により、Ａｄｅ２遺伝子のＤＮＡを標的としなかったことを実証した。それゆえ、コロニーの９９．８％は、野生型表現型（白色）を示した。さらに、１４個のコロニーは、相同指向型修復テンプレートがＡｄｅ２遺伝子座へと組込む天然の相同組換え事象により、ノックアウト表現型（赤色）を示した。同様の結果は、ＢＥＣ８５（６６４３個の野生型（白色）コロニー及び１４個のノックアウト（赤色）コロニー）陰性対照コンストラクト及びＢＥＣ６７（９１３６個の野生型（白色）コロニー及び１６個のノックアウト（赤色）コロニー）陰性対照コンストラクトを用いて得られた。

これとは対照的に、活性のあるＢＥＣ１０コンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０（Ａｄｅ２遺伝子を標的とするスペーサー含有）＋相同指向型修復テンプレート）は、陰性対照（８０３５個）と比較して、また、活性のあるＳｐＣａｓ９アプローチ（３７５７個）とも比較して、可視的コロニー（１７４個）の有意な全体的低減につながった。しかしながら、これらの１７４個のコロニーのうちの１５５個は、８９％の編集効率につながるＡｄｅ２ノックアウト表現型（赤色）を示した。活性のあるＢＥＣ８５コンストラクト又はＢＥＣ６７コンストラクトを用いて、同様の結果を観察した。

ＢＥＣ８５：内訳として８２個の赤色コロニー及び９個の白色コロニーからなる９１個のコロニーへの有意なコロニー低減により編集効率９０％に至る

ＢＥＣ６７：内訳として４５個の赤色コロニー及び２１個の白色コロニーからなる６８個のコロニーへの有意なコロニー低減により編集効率６８％に至る

まとめると、ＳｐＣａｓ９、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０を備えた実験セットアップを用いて得られた結果は、驚くべきことに、従来のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓヌクレアーゼと比較して、ＢＥＣ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの完全に異なる、分子レベルのゲノム編集機序を示した。ＲＮＡ指向型二重鎖切断を導入することによって相同組換えを支援するＳｐＣａｓ９とは対照的に、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０が介在する編集は、相同組換えをうまく達成した細胞の有意な濃縮と関係した強い全体的なクローン低減をもたらす。

ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７、及びＢＥＣ１０が新規の分子機序を示すものの、本実施例において得られた結果は、部位特異的で高度に効率的な相同指向型組換えによる新規のゲノム編集ツールとして機能するＢＥＣ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの能力を証明した。

（実施例４：隣接配列ＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３との比較におけるＢＥＣファミリーヌクレアーゼのゲノム編集活性及び効率の評価）
実施例４は、本発明の新規のＢＥＣファミリーヌクレアーゼが、比較実験に基づいて当該ヌクレアーゼに最も近い既知のメンバーであるＳｕＣｍｓ１（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），ｂｉｏＲｘｉｖ）及び配列番号６３（国際公開第２０１９／０３０６９５号）と比較して優れていることを実証している。

（４．１．実験のセットアップ）
本実施例において、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０（配列番号３１）、ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１（配列番号３２）、又はＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３（配列番号３３）のベクター系、及び対応する相同指向型修復テンプレート（配列番号２３）を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８ＣにおけるＡｄｅ２遺伝子をノックアウトした。本実施例は、ＢＥＣファミリーヌクレアーゼのゲノム編集効率を、隣接配列ＳｕＣｍｓ１（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），ｂｉｏＲｘｉｖ）及び配列番号６３（国際公開第２０１９／０３０６９５号）と直接比較している。

本実験は、上述の実施例の第３．１節において説明したように行った。

（４．２ 結果）
結果を表２にまとめ、例示的なプレートを図３に示す。

実験はすべて、５つの生物学的複製物において実施し、これらの複製物から得られた結果を合わせて、従来技術のヌクレアーゼであるＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３との比較において、ＢＥＣ１０のゲノム編集効率を可視化した。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１）
活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１＋相同指向型修復テンプレート）で形質転換した細胞は、６２３個の白色コロニー、１９個の赤色コロニー、及び１４個の橙色のコロニー（図３の橙色のコロニーは矢印でマークされている）を示し、５％の編集効率につながった（橙色のコロニーがうまく編集された細胞として計数される場合）。しかしながら、橙色のコロニーのさらなる分析は、これらのクローンがうまく編集されている細胞と未編集（すなわち、野生型）の細胞との混合物を含有しており、完全に編集されたコロニーの編集効率が３％しかないことにつながることを示した。

（ＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３）
活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３＋相同指向型修復テンプレート）で形質転換した細胞は、５２３１個の白色コロニー及び８個の赤色コロニーを示し、０．２％に過ぎない編集効率につながった。総コロニー数及び編集効率は、実施例3に示す陰性対照結果と同様であり、配列番号６３がいかなるヌクレアーゼ活性も示さないことを実証している。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０）
活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＋相同指向型修復テンプレート）で形質転換した細胞は、１１個の白色コロニー及び５９個の赤色コロニーを示し、８４％の非常に高い編集効率につながったが、これは、ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６５、及びＢＥＣ１０について実施例３で得られたような編集効率と同様である。

（要約）
実施例４で得られた結果は、ＢＥＣ１０及びその他のＢＥＣファミリーヌクレアーゼ並びにＢＥＣ８５及びＢＥＣ６７（説明した実施例３のような結果に関して）、同じＤＮＡターゲティング機序を有することを示し、３つがすべて非常に高いかつ同様の編集効率を有することを示す。さらに、ＢＥＣファミリーヌクレアーゼは、隣接する配列であるＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３との比較において、有意に強いコロニー低減及び有意に優れた編集効率を示す。５％の編集効率を示すＳｕＣｍｓ１ヌクレアーゼとは対照的に（３３個の編集されたクローンのうち、１４個がただ部分的に編集されていることにも留意）、ＢＥＣ１０は８４％の、ＢＥＣ８５は９０％の、及びＢＥＣ６７は６８％の編集効率を示す（実施例３を参照されたい）。さらに、配列番号６３は、いかなるヌクレアーゼ活性も全く示さない。

（実施例５：異なる温度（２１℃及び３７℃）における隣接配列であるＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３との比較におけるＢＥＣファミリーヌクレアーゼのゲノム編集効率及び有効性の評価）
多くのバイオテクノロジーの及び薬学の応用のために、実験は、使用する生体についての必要条件を満たすための、並びに最良の挙動及び再現可能な結果を確保するための特定の温度で行われなければならない。バイオテクノロジーの、農業の、及び薬学の応用に用いられるほとんどの生体にとっての最適温度は、２１℃と３７℃の間である。この温度範囲における本発明のＢＥＣヌクレアーゼの挙動を実証するために、隣接配列ＳｕＣｍｓ１（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），ｂｉｏＲｘｉｖ）及び配列番号６３（国際公開第２０１９／０３０６９５号）との比較において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（２１℃）及びＥ.ｃｏｌｉ（３７℃）を用いて行った。

（５．１．実験のセットアップ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ２１℃））
本実施例において、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０（配列番号３１）、ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１（配列番号３２）、又はＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３（配列番号３３）のベクター系、及び対応する相同指向型修復テンプレート（配列番号２３）を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳ ２８８８ＣにおいてＡｄｅ２遺伝子をノックアウトした。細胞を２１℃でインキュベートして、隣接配列であるＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３との直接的な比較において、低温でのＢＥＣファミリーヌクレアーゼの編集効率を実証している。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの培養及び形質転換を、３０℃から２１℃まで変化させた培養温度を除き、実施例の第２．５節において説明したように行った。

実験は、実施例の第３．１節において説明されるように行った。

（５．２ 結果）
結果を表３にまとめ、例示的なプレートを図４に示す。

実験はすべて、５つの生物学的複製物において実施し、これらの複製物から得られた結果を合わせて、従来技術のヌクレアーゼであるＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３との比較において、ＢＥＣ１０のゲノム編集効率を可視化した。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１）
活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１＋相同指向型修復テンプレート）で形質転換した細胞は、８７４０個の白色コロニー及び２８個の赤色コロニーを示し、これは、陰性対照実験の編集効率（０．２％）のちょうどわずかに上であり、３０℃で得られた結果（実施例４）との比較において有意に低下している。

（ＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３）
活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３＋相同指向型修復テンプレート）で形質転換した細胞は、１０２４０個の白色コロニー及び１８個の赤色コロニーを示し、これは０．２％の編集効率につながった。総コロニー数及び編集効率は、実施例４において示される陰性対照結果と同様であり、配列番号６３がいかなるヌクレアーゼ活性も示さないことを実証している。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０）
活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＋相同指向型修復テンプレート）で形質転換した細胞は、２３個の白色コロニー及び４２個の赤色コロニーを示し、これは６４％の高い編集効率につながり、それにより、ＢＥＣ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いたゲノム編集が、また２１℃で用いると、可視的コロニーの有意な全体的低減及び高いゲノム編集率につながる。

（要約）
実施例５．２において得られた結果は、ＢＥＣファミリー由来のＢＥＣ１０ヌクレアーゼが、２１℃で使用したとき、有意な全体的コロニー低減及び強いゲノム編集効率（６５％）を示すことを実証している。

これとは対照的に、ＳｕＣｍｓ１ヌクレアーゼの全体的なコロニー低減及び編集効率は、２１℃で０．３％まで有意に低下し、これは、陰性対照の編集効率（０．２％）をちょうどわずかに上回っており、ゲノム編集ツールとして機能するのに適していない。

さらに、３０℃ですでに示したように、配列番号６３は、いかなるヌクレアーゼ活性も全く示さない。

（５．３．実験のセットアップ（Ｅ.ｃｏｌｉ ３７℃））
３７℃での隣接配列との比較においてＢＥＣファミリーヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性を評価するために、Ｅ.ｃｏｌｉアッセイの系を用いたが、その理由は、３７℃での理想的な生育条件だからである。

ヌクレアーゼの活性及び効率を可視化するために、いわゆる枯渇アッセイを行い、この中で、ヌクレアーゼターゲティングの後のＥ.ｃｏｌｉ細胞の生存率を陰性対照との比較でモニターする（生存率がより低いことは、より良好なヌクレアーゼ活性を意味する）。Ｅ.ｃｏｌｉ細胞は非相同末端接合（ＮＨＥＪ）を行うことができないので、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いたＤＮＡのターゲティングは細胞死につながる。追加として、必須ｒｐｏＢ遺伝子を本実験アプローチにおいて標的にしたが、Ｅ.ｃｏｌｉ細胞では、この遺伝子のノックアウトは致死的である。

この実験アプローチのために、ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＿Ｃｏｌｉ（配列番号３４）、ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１＿Ｃｏｌｉ（配列番号３５）、又はＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３＿Ｃｏｌｉ（配列番号３６）のベクター系を用いて、Ｅ.ｃｏｌｉにおけるｒｐｏＢ遺伝子を標的として、高温（３７℃）でのＢＥＣファミリーヌクレアーゼの編集効率を、隣接配列ＳｕＣｍｓ１（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），ｂｉｏＲｘｉｖ）及び配列番号６３（国際公開第２０１９／０３０６９５号）との直接的な比較において実証した。

併行して、ｒｐｏＢ遺伝子を標的とするスペーサー配列を欠失するＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＿Ｃｏｌｉ、ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１＿Ｃｏｌｉ、又はＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３＿Ｅ.ｃｏｌｉの発現コンストラクトを用いた陰性対照実験を行い、特異的なスペーサーによって標的ＤＮＡ領域へ誘導されることになるＣａｓタンパク質の依存性を実証した。

形質転換及び３７℃での４８時間のインキュベーションの後、培養プレートを、生育したコロニー数を計数することによって分析した。

（５．４ 結果）
結果を表４にまとめ、例示的なプレートを図５に示す。

実験はすべて、５つの生物学的複製物において実施し、これらの複製物から得られた結果を合わせて、ＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３との比較において、ＢＥＣ１０のゲノム編集効率を可視化した。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１）
陰性対照コンストラクトで形質転換した細胞は、３７℃で４８時間のインキュベーションの後に４９０５個のコロニーを示したのに対し、活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＳｕＣｍｓ１＿Ｃｏｌｉ）で形質転換した細胞は、１３６５個のコロニーを示したが、これは７２％のクローン低減につながる。

（ＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３）
陰性対照コンストラクトで形質転換した細胞は、３７℃で４８時間のインキュベーションの後に５００２個のコロニーを示したのに対し、活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／配列番号６３＿Ｃｏｌｉ）で形質転換した細胞は、５０２５個のコロニーを示したが、これは、０％のクローン低減につながり、本実験アプローチにおいて配列番号６３がいかなるヌクレアーゼ活性も示していないことを実証している。

（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０）
陰性対照コンストラクトで形質転換した細胞は、３７℃で４８時間のインキュベーションの後に４９６３個のコロニーを示したのに対し、活性のあるコンストラクト（ＣＲＩＳＰＲ／ＢＥＣ１０＿Ｃｏｌｉ）で形質転換した細胞は、１３０個のコロニーを示したが、これは、９７％のクローン低減につながる。

（要約）
実施例５．４において得られた結果は、Ｅ.ｃｏｌｉ系の枯渇アッセイを用いたとき、ＢＥＣ１０ヌクレアーゼが、３７℃で有意な全体的なコロニー低減（９７％）を示し、それにより、より高温でＢＥＣ１０ヌクレアーゼの非常に高い活性を証明することを実証している。これとは対照的に、ＳｕＣｍｓ１ヌクレアーゼは、コロニーの有意により低い低下（７２％）を示したが、３７℃でのＳｕＣｍｓ１との比較においてＢＥＣタイプのヌクレアーゼの優れた活性を示している。

さらに、配列番号６３は、陰性対照との比較において、０％のコロニー低減でいかなるヌクレアーゼ活性も全く示していない。

（実施例６－実施例３～５からの結果の考察）
まとめると、実施例３～５の結果は、互いに対して約９５％の配列同一性を有する新たに同定及び開発されたＢＥＣファミリーヌクレアーゼ（ＢＥＣ８５、ＢＥＣ６７，及びＢＥＣ１０）の配列が、Ｃｓ９（実施例３）と比較すると、新規の分子ゲノム編集機序に基づいた同様のゲノム編集効率を有することを示す。さらに、実施例４の結果は、ＢＥＣファミリータイプのヌクレアーゼを用いたゲノム編集が、隣接配列であるＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３との比較において有意に高いクローン低減数及び有意に優れた編集比につながることを実証しており、ゲノム編集のためのＢＥＣ型ヌクレアーゼが概して優れていることを確証している。

バイオテクノロジー、農業、および薬学の研究の応用において使用される、目的の生物のほとんどが、２１～３７℃の範囲の温度で培養される（例えば、様々な植物及び植物細胞は約２１℃、様々な酵母細胞及び真菌細胞は約３０℃、様々な原核生物及び哺乳動物細胞株は約３７℃）。それゆえ、普遍的に適用可能なＣＲＩＳＰＲの系は、この範囲の温度において使用されるとき、強い活性及びゲノム編集効率を示すことが必要である。本発明者らの新たに発見及び開発したＢＥＣ型のヌクレアーゼの温度依存性活性を評価するために、ＢＥＣ１０ヌクレアーゼを用いた実験をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（２１℃）及びＥ.ｃｏｌｉ（３７℃）で行い（実施例５）、隣接配列であるＳｕＣｍｓ１及び配列番号６３を用いて得られる結果と比較した。これらの実験において得られた結果は、隣接配列であるＳｕＣｍｓ１（Ｂｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７），ｂｉｏＲｘｉｖ）及び配列番号６３（国際公開第２０１９／０３０６９５号）と比較して優れた編集効率及びコロニー低減率をもつ、検査したすべての温度レベルでＢＥＣ１０の強い活性を証明した。それに加えて、ＳｕＣｍｓ１ヌクレアーゼの編集効率は、２１℃で陰性対照と同様のレベル（０．３％）まで有意に低下するのに対し、ＢＥＣ１０編集効率は、より低温でさえ、高レベル（６５％）のままであった。

Claims (15)

1. ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子であって、
   （ａ）配列番号２９、１若しくは３のアミノ酸配列を含む、又は前記アミノ酸配列からなる、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、
   （ｂ）配列番号３０、２若しくは４のヌクレオチド配列を含む、又は前記ヌクレオチド配列からなる、核酸分子、
   （ｃ）アミノ酸配列が前記アミノ酸配列（ａ）と少なくとも９３％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、
   （ｄ）前記ヌクレオチド配列（ｂ）と少なくとも９３％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、又は前記同一であるヌクレオチド配列からなる、核酸分子、
   （ｅ）前記核酸分子（ｄ）に関して縮重した、核酸分子、或いは
   （ｆ）（ａ）～（ｄ）のいずれか１つの核酸分子に対応する核酸分子であって、ＴがＵによって置換されている、核酸分子。
2. 前記核酸分子が、前記核酸分子に対してネイティブの、又は異種性であるプロモーターへ使用可能に連結されている、請求項１に記載の核酸分子。
3. 前記核酸分子が、真核細胞、好ましくは植物細胞又は動物細胞における発現に対してコドンの最適化がなされている、請求項１又は２に記載の核酸分子。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子をコードする、ベクター。
5. 請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、又は請求項４に記載のベクターを用いて形質転換された、形質導入された、若しくは形質移入された、宿主細胞。
6. 前記宿主細胞が、真核細胞又は原核細胞であり、好ましくは植物細胞又は動物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
7. 植物、種子、若しくは単一の植物細胞ではない植物の一部、又は動物であって、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、又は請求項４に記載のベクターを用いて形質転換された、形質導入された、若しくは形質移入された、植物、種子、若しくは植物の一部、又は動物。
8. 請求項５又は６に記載の宿主細胞を培養することと、産生されたＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼを単離することと、を含む、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼの産生方法。
9. 請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされた、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ。
10. 請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、請求項５若しくは６に記載の宿主細胞、請求項７に記載の植物、種子、細胞の一部、若しくは動物、請求項９に記載のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、又はこれらの組み合わせ、を含む、組成物。
11. 医薬組成物又は診断用組成物である、請求項１０に記載の組成物。
12. 対象又は植物のゲノムにおける標的部位のヌクレオチド配列を修飾することによる前記対象又は植物における疾患の処置における使用のための、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、請求項５若しくは６に記載の宿主細胞、請求項７に記載の植物、種子、細胞の一部若しくは動物、請求項９に記載のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、又はこれらの組み合わせ。
13. 細胞のゲノムにおける標的部位のヌクレオチド配列の改変方法であって、前記細胞内へ、
    （ｉ）ＤＮＡを標的とするＲＮＡ、又はＤＮＡを標的とするＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドであって、ここで、前記ＤＮＡを標的とするＲＮＡが、
    （ａ）前記標的ＤＮＡにおける配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメントと、
    （ｂ）請求項９に記載のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼと相互作用する第２のセグメントと、
    を含む、前記ＤＮＡを標的とするＲＮＡ、又は前記ＤＮＡを標的とするＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、及び
    （ｉｉ）請求項９に記載のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、又は請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、又は請求項４に記載のベクターであって、ここで、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、
    （ａ）前記ＤＮＡを標的とするＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分と、
    （ｂ）部位特異的酵素活性を呈する活性部分と、
    を含む、請求項９に記載のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、又は請求項１～３のいずれか一項に記載のＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸分子、又は請求項４に記載のベクター、
    を導入することを含む、ヌクレオチド配列の改変方法。
14. 前記細胞が、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子の天然の宿主ではない、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ及び前記ＤＮＡを標的とするＲＮＡが、前記細胞内へ直接導入される場合、これらがリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形態で導入される、請求項１３又は１４に記載の方法。

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