JP2023535025A - Ｄｎａ結合ドメイントランス活性化因子およびその使用 - Google Patents

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Abstract

一部の態様では、本開示は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写調節因子ドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびにそれを使用する方法に関する。一部の実施形態では、この融合タンパク質の発現は、細胞における標的遺伝子の改変された発現を生じる。本開示の態様は、遺伝子送達のための単離された核酸および組換えＡＡＶベクターに関する。本開示は、標的遺伝子の発現を調節するための組成物（例えば、ｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶ）および方法に一部基づき、この標的遺伝子は、ハプロ不全、例えば、ＳＣＮ１Ａである。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年７月２４日出願の表題「ＤＮＡ－ＢＩＮＤＩＮＧ ＤＯＭＡＩＮ ＴＲＡＮＳＡＣＴＩＶＡＴＯＲＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」の米国仮特許出願第６３／０５６，５２８号の優先日の利益を主張し、その全内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
背景
標的遺伝子発現の調節は、生物医学研究の主要な領域として浮上してきている。遺伝子発現の上方調節は、減少した遺伝子発現から生じるハプロ不全状態を修正することができる。ハプロ不全は、典型的には、１つまたは複数の機能喪失型変異が遺伝子の少なくとも１つのコピー中に存在する場合に生じる。ハプロ不全に関連する疾患の処置のための遺伝子増強の、ＡＡＶベースのアプローチは、従来のｒＡＡＶベクターのパッケージング能力によって妨げられている。
概要
本開示の態様は、遺伝子送達のための単離された核酸および組換えＡＡＶベクターに関する。本開示は、標的遺伝子の発現を調節するための組成物（例えば、ｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶ）および方法に一部基づき、この標的遺伝子は、ハプロ不全、例えば、ＳＣＮ１Ａである。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）および転写調節因子ドメインを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示によって記載される組成物は、転写調節因子ドメインに融合されたＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ドメインなど）を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、本開示によって記載される融合タンパク質は、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を増加させ、したがって、正常細胞または対象と比較した、細胞または対象における標的遺伝子の不十分な発現によって特徴付けられる疾患（例えば、標的遺伝子のハプロ不全に関連する疾患）を処置するために有用である。
したがって、一部の態様では、本開示は、少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合された少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを発現するように構成された導入遺伝子を含む単離された核酸であって、ＤＮＡ結合ドメインが、（例えば、対象または細胞中の）標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域（例えば、エンハンサー配列、プロモーター配列、リプレッサー配列など）に結合し、標的遺伝子が、電位開口型ナトリウムチャネル（例えば、Ｎａｖ１．１）をコードする、単離された核酸を提供する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子である。一部の実施形態では、導入遺伝子には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）（ＩＴＲ）が隣接している。一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、（例えば、対象または細胞中の）標的遺伝子に結合し、転写調節因子ドメインは、標的遺伝子の発現を改変する、例えば、上方調節する。
一部の態様では、本開示は、少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合された少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインをコードする導入遺伝子を含む核酸および少なくとも１つのカプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、ＤＮＡ結合ドメインが、（例えば、対象または細胞中の）標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域に結合し、標的遺伝子が、電位開口型ナトリウムチャネル（例えば、Ｎａｖ１．１）をコードする、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子である。一部の実施形態では、導入遺伝子には、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接している。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、（例えば、対象または細胞中の）標的遺伝子に結合し、転写調節因子ドメインは、対象における標的遺伝子の発現を改変する、例えば、上方調節する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、標的遺伝子の非翻訳領域に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、標的遺伝子の調節領域、必要に応じて、エンハンサー配列、プロモーター配列および／またはリプレッサー配列に結合する。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、標的遺伝子の調節領域（例えば、エンハンサー配列、プロモーター配列、リプレッサー配列など）の２ｂｐ上流と２０００ｂｐ上流との間または２ｂｐ上流もしくは下流と２０００ｂｐ上流もしくは下流との間に結合する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ｄＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９もしくはｄＣａｓ１２ａ）および／またはホメオドメインをコードする。一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５～７のいずれか１つに示される核酸配列に結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３に示される核酸配列の少なくとも２（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多く）連続するヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１～１６、２３～２８または３５～４０のいずれか１つに示される配列を有する核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１７～２２、２９～３４または４１～４６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１１を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１２を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１３を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスおよび／または配列番号１６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号５７のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２３含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスおよび／または配列番号２８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号５９のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３９を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスおよび／または配列番号４０を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号６１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む認識ヘリックス、配列番号１８のアミノ酸配列を含む認識ヘリックス、配列番号１９のアミノ酸配列を含む認識ヘリックス、配列番号２０のアミノ酸配列を含む認識ヘリックス、配列番号２１のアミノ酸配列を含む認識ヘリックスおよび／または配列番号２２のアミノ酸配列を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２９を含む認識ヘリックス、配列番号３０を含む認識ヘリックス、配列番号３１を含む認識ヘリックス、配列番号３２を含む認識ヘリックス、配列番号３３を含む認識ヘリックスおよび／または配列番号３４を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、配列番号４１を含む認識ヘリックス、配列番号４２を含む認識ヘリックス、配列番号４３を含む認識ヘリックス、配列番号４４を含む認識ヘリックス、配列番号４５を含む認識ヘリックスおよび／または配列番号４６を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質）である。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（または「失活した（ｄｅａｄ）Ｃａｓタンパク質」）は、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２タンパク質である。一部の実施形態では、核酸またはｒＡＡＶは、少なくとも１つのガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、ガイド核酸は、ＳＣＮ１Ａを標的化するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸は、配列番号８５、８６、８９、９０、９３または９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を有するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸は、配列番号８３～９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ガイド核酸は、配列番号８３～９４のいずれか１つに示される核酸配列によってコードされる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの転写調節因子ドメインは、ＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４ドメイン、Ｒｔａドメイン、ｐ６５ドメイン、Ｈｓｆ１ドメイン、ＴＣＦ４ドメイン、ＭＥＦ２Ａドメイン、ＭＥＦ２Ｃドメイン、ＭＥＦ２Ｄドメイン、Ｓｐ１グルタミン－リッチドメイン、ｐ５３ドメイン、Ｅ２Ｆ１ドメイン、ＭｙｏＤドメイン、ＭＡＰＫ７ドメイン、ＮＦ１Ｂプロリンリッチドメイン、ＲｅｌＡドメイン、またはそれらの任意の組合せ、例えば、ＶＰＲドメイン（ＶＰ６４＋ｐ６５＋Ｒｔａ１ドメイン）を含むトランス活性化因子ドメインである。一部の実施形態では、少なくとも１つの転写調節因子ドメインは、配列番号４７に示される核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、少なくとも１つのトランス活性化因子ドメインは、配列番号４８または１２２～１３４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、核局在化配列（例えば、配列番号１３５～１４０のいずれか１つを含む配列）をさらに含む。
一部の実施形態では、導入遺伝子に隣接するＩＴＲは、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲまたはＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲからなる群より選択されるＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、ΔＴＲまたはｍＴＲである。
一部の実施形態では、単離された核酸の導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターは、ニューロンプロモーター、例えば、ＳＳＴ、ＮＹＰリン酸活性化グルタミナーゼ（ＰＡＧ）、小胞グルタミン酸トランスポーター－１（ＶＧＬＵＴ１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５および５７（ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７）、シナプシンＩ、ａ－ＣａｍＫＩＩ、Ｄｏｃｋ１０、Ｐｒｏｘ１、パルブアルブミン（ＰＶ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、カルレチニン（ＣＲ）またはニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）である。
一部の実施形態では、導入遺伝子のＤＮＡ結合ドメインは、リンカードメインによって転写調節因子ドメインに融合されている。一部の実施形態では、リンカードメインは、可撓性リンカー、例えば、グリシン－リッチリンカーもしくはグリシン－セリンリンカー、または切断可能なリンカー、例えば、光切断可能なリンカーもしくは酵素（例えば、プロテアーゼ）切断可能なリンカーである。
一部の実施形態では、単離された核酸は、複数のＤＮＡ結合ドメイン、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＤＮＡ結合ドメインをコードする導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、単離された核酸は、複数の転写調節因子ドメイン、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の転写調節因子ドメインをコードする導入遺伝子を含む。
一部の実施形態では、単離された核酸またはｒＡＡＶは、正常細胞または対象に関して、標的遺伝子の異常な発現またはハプロ不全（例えば、増加した発現または減少した発現）によって特徴付けられる細胞または対象において発現される。一部の実施形態では、単離された核酸またはｒＡＡＶは、正常細胞または対象に関して、標的遺伝子の不十分な（例えば、減少した）発現によって特徴付けられる細胞または対象において発現される。一部の実施形態では、単離された核酸またはｒＡＡＶの標的遺伝子は、ＳＣＮ１Ａである。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ．ＰＨＰＢからなる群より選択される。
一部の態様では、本開示は、標的遺伝子の発現を調節する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示の方法は、標的遺伝子を発現する細胞または対象に、本明細書に記載される単離された核酸またはｒＡＡＶを投与するステップを含み、この対象は、標的遺伝子についてハプロ不全（例えば、ＳＣＮ１Ａについてハプロ不全）である。例えば、一部の実施形態では、細胞または対象における標的遺伝子、例えばＳＣＮ１Ａの発現は、正常細胞または対象における標的遺伝子発現に関して、不十分である（例えば、減少している）。一部の実施形態では、単離された核酸またはｒＡＡＶが投与される細胞は、ニューロンである。一部の実施形態では、ニューロンは、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである。
一部の実施形態では、単離された核酸またはｒＡＡＶの投与は、単離された核酸またはｒＡＡＶが投与されていない対象と比較して少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍または少なくとも１００倍増加した標的遺伝子発現（例えば、ＳＣＮ１Ａ発現）を生じる。一部の実施形態では、単離された核酸またはｒＡＡＶの投与は、単離された核酸またはｒＡＡＶが投与される前の対象における標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）発現と比較して少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍または少なくとも１００倍増加した標的遺伝子発現（例えば、ＳＣＮ１Ａ発現）を生じる。
一部の態様では、本開示は、対象における遺伝子発現（例えば、ＳＣＮ１Ａの発現）を調節する方法であって、本明細書に記載される単離された核酸またはｒＡＡＶが、標的遺伝子を発現する対象に投与される、方法を提供する。一部の実施形態では、対象における標的遺伝子の発現は、健康な対象に関して異常である（例えば、増加または減少している）。一部の実施形態では、対象は、健康な対象と比較して、標的遺伝子の発現に関してハプロ不全である、またはハプロ不全であると疑われる。
一部の実施形態では、対象は、標的遺伝子のハプロ不全発現によって引き起こされる疾患もしくは状態を有する、または有すると疑われる。例えば、ＳＣＮ１Ａ発現についてハプロ不全である対象は、一部の実施形態では、ドラベ症候群に罹患している。一部の実施形態では、単離された核酸またはｒＡＡＶは、静脈内注射、筋肉内注射、吸入、皮下注射および／または頭蓋内注射によって対象に投与される。
一部の態様では、本開示は、本開示によって記載される単離された核酸またはｒＡＡＶを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
一部の態様では、本開示は、本開示によって記載される単離された核酸またはｒＡＡＶを収納する容器を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、薬学的に許容される担体を収納する容器を含む。一部の実施形態では、単離された核酸またはｒＡＡＶと薬学的に許容される担体とは、同じ容器中に収納される。一部の実施形態では、容器は、シリンジである。
一部の態様では、本開示は、本開示によって記載される単離された核酸またはｒＡＡＶを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、真核生物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞、必要に応じて、ニューロン、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである。
図１は、ヒト（ＨＥＫ）ＳＣＮ１Ａ遺伝子とマウス（ＨＥＰＧ２）ＳＣＮ１Ａ遺伝子との間での配列保存を示すクロマトグラフィー配列決定データを示す（コンセンサス配列－配列番号９８；標的配列－配列番号９９；Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（上）－配列番号１００；Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（下）－配列番号１０１）。 図１は、ヒト（ＨＥＫ）ＳＣＮ１Ａ遺伝子とマウス（ＨＥＰＧ２）ＳＣＮ１Ａ遺伝子との間での配列保存を示すクロマトグラフィー配列決定データを示す（コンセンサス配列－配列番号９８；標的配列－配列番号９９；Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（上）－配列番号１００；Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（下）－配列番号１０１）。 図１は、ヒト（ＨＥＫ）ＳＣＮ１Ａ遺伝子とマウス（ＨＥＰＧ２）ＳＣＮ１Ａ遺伝子との間での配列保存を示すクロマトグラフィー配列決定データを示す（コンセンサス配列－配列番号９８；標的配列－配列番号９９；Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（上）－配列番号１００；Ｈｅｐ－ＳＣＮ１Ａ＿Ｒ４配列（下）－配列番号１０１）。
図２は、ヒト（配列番号１）およびマウス（配列番号２）ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域の配列アラインメントを示し、保存された配列は強調されている。この保存された配列内に、太字の、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）結合領域についての目的の標的領域が存在する（配列番号４）。
図３は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域中の３つの重複する標的ＺＦＰ（ＺＦＰ－１、ＺＦＰ－２、ＺＦＰ－３）（配列番号５～７）結合部位の位置（配列番号３）を示す概略図である。
図４Ａ～４Ｄは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号２）内の個々の３塩基領域（「・」によって分離された、赤で示されるＤＮＡトリプレット）を認識するＺＦＰ－１中の個々のジンクフィンガー（フィンガー１～フィンガー６；Ｆ１～Ｆ６）についての６つの認識ヘリックス配列のアラインメントを示す。図４Ａは、ＺＦＰ－１のジンクフィンガー１～６（Ｆ１～Ｆ６）が結合するヌクレオチド配列（配列番号３）を強調する。図４Ｂは、ＺＦＰ－１のフィンガー１～６の各認識ヘリックス（７アミノ酸）（配列番号１７～２２）によって認識される３ヌクレオチド配列を示す。図４Ｃは、各行に１つの６つのフィンガーを含有するＺＦＰ－１のアミノ酸配列を示し（配列番号６５～７０）、フィンガー間のリンカーは、カノニカル（ＴＧＥＫＰ）および非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を指定するために強調される。図４Ｄは、ＺＦＰ－１（Ｆ１～Ｆ６）のヌクレオチド配列（配列番号１０２～１０７）を示す。
図５Ａ～５Ｄは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号３）内の個々の３塩基領域（「＊」によって分離された、赤で示されるＤＮＡトリプレット）を認識するＺＦＰ－２中の個々のジンクフィンガー（フィンガー１～フィンガー６；Ｆ１～Ｆ６）についての６つの認識ヘリックス配列のアラインメントを示す。図５Ａは、ＺＦＰ－２のジンクフィンガー１～６（Ｆ１～Ｆ６）が結合するヌクレオチド配列（配列番号３）を強調する。図５Ｂは、ＺＦＰ－２のフィンガー１～６の各認識ヘリックス（７アミノ酸）（配列番号２９～３４）によって認識される最初の３ヌクレオチドを示す。図５Ｃは、各行に１つの６つのフィンガーを含有するＺＦＰ－２のアミノ酸配列を示し（配列番号６９～７４）、フィンガー間のリンカーは、カノニカル（ＴＧＥＫＰ）および非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を指定するために強調される。図５Ｄは、ＺＦＰ－２（Ｆ１～Ｆ６）のヌクレオチド配列（配列番号１０８～１１３）を示す。
図６Ａ～６Ｄは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号４）内の個々の３塩基領域（「＊」によって分離された、赤で示されるＤＮＡトリプレット）を認識するＺＦＰ－３中の個々のジンクフィンガー（フィンガー１～フィンガー６；Ｆ１～Ｆ６）についての６つの認識ヘリックス配列のアラインメントを示す。図６Ａは、ＺＦＰ－３のジンクフィンガー１～６（Ｆ１～Ｆ６）が結合するヌクレオチド配列（配列番号３）を強調する。図６Ｂは、ＺＦＰ－３のフィンガー１～６の各認識ヘリックス（７アミノ酸）（配列番号４１～４６）によって認識される最初の３ヌクレオチドを示す。図６Ｃは、各行に１つの６つのフィンガーを含有するＺＦＰ－３のアミノ酸配列を示し（配列番号７５～８０）、フィンガー間のリンカーは、カノニカル（ＴＧＥＫＰ）および非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を指定するために強調される。図６Ｄは、ＺＦＰ－３（Ｆ１～Ｆ６）のヌクレオチド配列（配列番号１１４～１１９）を示す。
図７は、図４～６に記載されるＳＣＮ１Ａ結合性ＺＦＰが、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって測定した場合に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を増加させることを示すデータを示す。これらの発現構築物を、以下の転写調節因子をコードする発現プラスミドの一過的トランスフェクションを介して細胞に送達した：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９＋ＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ（ＳｐＣａｓ９＋Ｓｃｎ１ａ）；エンドヌクレアーゼ活性なしのＣａｓ９（ｄＣａｓ９）；ＶＰＲ活性化ドメイン＋ＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ（ｄＣａｓ９＿ＶＰＲ＋Ｓｃｎ１ａ）；ＶＰＲ活性化ドメイン＋ＺＦＰ１（ＶＰＲ＿ＺＦＰ１）；ＶＰＲ活性化ドメイン＋ＺＰＦ２（ＶＰＲ＿ＺＦＰ２）；ＶＰＲ活性化ドメイン＋ＺＦＰ３（ＶＰＲ＿ＺＦＰ３）；ＳｐＣａｓ９＋ＡＳＣＬ１ガイドＲＮＡ（ＳｐＣａｓ９＋Ａｓｃｌ１）；３つのＶＰＲ＿ＺＦＰ（ＶＰＲ＿ＺＦＰ１＋ＶＰＲ＿ＺＦＰ２＋ＶＰＲ＿ＺＦＰ３）。発現レベルを、各試料においてｑＲＴ－ＰＣＲによって決定したＴＢＰ発現レベルに対して正規化した。
図８は、図４～６に記載されるＳＣＮ１Ａ結合性ＺＦＰとＣａｓ９＋ＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡとが、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって測定した場合に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を増加させることを示すデータを示す。
図９は、ＳＣＮ１Ａを中心とした約１Ｍｂにわたるハイスループット染色体コンフォメーション捕捉（Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ）（Ｈｉ－Ｃ）データを示す。矢印は、１６５～１６６Ｍｂ間隔の異なる第２染色体領域間での潜在的相互作用を示す。
図１０は、ＧＡＢＡニューロン特異的ＡＡＶベクターを開発するための３つのアプローチを示す。 図１０は、ＧＡＢＡニューロン特異的ＡＡＶベクターを開発するための３つのアプローチを示す。 図１０は、ＧＡＢＡニューロン特異的ＡＡＶベクターを開発するための３つのアプローチを示す。
発明の詳細な説明
本開示の態様は、細胞または対象における標的遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、増加させる）ための方法および組成物に関し、この標的遺伝子は、ハプロ不全である（即ち、標的遺伝子は、１つの機能的コピーを含む）。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ＳＣＮ１Ａである。
一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＺＦＰおよび転写調節因子ドメインを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＺＦＰおよびトランス活性化因子ドメイン（例えば、ＶＰＲドメイン）を含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域の配列に結合する。一部の実施形態では、調節領域は、エンハンサー配列、プロモーター配列またはリプレッサー配列である。一部の実施形態では、プロモーター配列は、内部プロモーター（例えば、標的遺伝子のイントロン中に位置する）または外部プロモーター（例えば、標的遺伝子の転写開始部位の上流に位置する）であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）のプロモーター領域中の保存された配列に結合し、その際、トランス活性化因子ドメインは、遺伝子発現を増加させる。
一部の態様では、本開示は、細胞または対象における標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を増加させるための方法に関する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、細胞または対象を標的遺伝子についてハプロ不全にする変異を含有する。したがって、本開示の方法および組成物は、一部の実施形態では、電位開口型ナトリウムチャネルアルファサブユニットＮａｖ１．１のハプロ不全をもたらす１コピーのＳＣＮ１Ａ遺伝子における変異から典型的には生じる標的遺伝子産物のハプロ不全に関連する疾患および障害、例えば、ドラベ症候群を処置するために利用され得る。
トランス活性化因子融合タンパク質
本開示の一部の態様は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびトランス活性化因子ドメインを含む融合タンパク質に関する。本明細書で使用される場合、融合タンパク質は、２つまたはそれよりも多くの別々のアミノ酸配列によってコードされる２つまたはそれよりも多くの連結されたポリペプチドを含む。キメラタンパク質は、本明細書で使用される場合、２つまたはそれよりも多くの連結された遺伝子が異なる種由来である融合タンパク質である。融合タンパク質は、典型的には、組換え産生され、このとき、融合タンパク質をコードする遺伝子は、２つまたはそれよりも多くの連結された遺伝子の発現と、得られたｍＲＮＡの組換えタンパク質への翻訳とを支持する系中にある。一部の実施形態では、融合タンパク質は、原核生物細胞または真核生物細胞において組換え産生される。融合タンパク質は、複数の配置で構成され得る。例えば、１つのタンパク質（タンパク質Ａ）は、第２のタンパク質（タンパク質Ｂ）の上流に位置する。他の融合タンパク質構成では、タンパク質Ｂが、タンパク質Ａの上流に位置する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列は、トランス活性化因子ドメインをコードする核酸配列の上流に位置し、トランス活性化因子に連結されたＤＢＤを含む融合タンパク質を産生する。一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインをコードする核酸配列は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列の上流に位置し、ＤＮＡ結合ドメインに連結されたトランス活性化因子ドメインを含む融合タンパク質を産生する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインの上流に位置するトランス活性化因子ドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、トランス活性化因子ドメインの上流に位置するＤＮＡ結合ドメインを含む。
一部の実施形態では、本開示によって記載される融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）」は、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ）を認識する少なくとも１つの構造的モチーフを含む独立してフォールディングされたタンパク質を指す。ある特定のＤＢＤは、特異的配列（認識配列またはモチーフ）を認識するが、他の型のＤＢＤは、ＤＮＡに対する全般的な親和性を有する。一部の実施形態では、本開示によって記載される融合タンパク質は、配列特異的ＤＢＤを含む。一部の実施形態では、ＤＢＤは、ＳＣＮ１Ａタンパク質（例えば、Ｎａｖ１．１）をコードする遺伝子内のまたはその近隣の核酸配列を認識する（例えば、それに特異的に結合する）。ＤＢＤを含有するタンパク質は、典型的には、細胞性プロセス、例えば、転写、複製、修復およびＤＮＡ貯蔵に関与する。転写因子中のＤＢＤは、プロモーター領域中またはエンハンサーエレメント中の特異的ＤＮＡ配列を認識して、遺伝子発現を促進する。転写因子ＤＢＤは、標的遺伝子の発現を調節するための遺伝子操作において融合タンパク質として利用され、ＤＮＡ結合特異性またはＤＮＡ結合親和性を変更するように変異され得、そうして、所望の標的遺伝子の発現を調節する。ＤＢＤの例には、ヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフ、ジンクフィンガーモチーフ（Ｃｙｓ２－Ｈｉｓ２ジンクフィンガーが含まれる）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ウィングドヘリックスモチーフ、ＨＭＧ－ボックス、ｄＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａ）、ホメオドメインおよびＯＢ－フォールドドメインが含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、本開示は、ジンクフィンガーＤＢＤ融合タンパク質に関する。本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）」は、タンパク質フォールディングを安定化する１つまたは複数の亜鉛イオンの配位によって特徴付けられる少なくとも１つの構造的モチーフを含有するタンパク質を指す。ジンクフィンガーは、タンパク質において見出される最も多様な構造的モチーフの１つであり、ヒト遺伝子の最大で３％が、ジンクフィンガーをコードする。ほとんどのＺＦＰは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび小型タンパク質ユビキチンを含む標的分子とタンデムに接触する複数のジンクフィンガーを含有する。「古典的」ジンクフィンガーモチーフは、２つのシステインアミノ酸および２つのヒスチジンアミノ酸から構成され（Ｃ２Ｈ２）、配列特異的様式でＤＮＡに結合する。転写因子ＩＩＩＩＡ（ＴＦＩＩＩＡ）を含むこれらのＺＦＰは、典型的には、遺伝子発現に関与する。ＤＮＡ結合タンパク質中の複数のジンクフィンガーモチーフは、ＤＮＡ二重らせんの外側に結合し、それに巻き付く。それらの比較的小さいサイズ（例えば、各フィンガーは、約２５～４０アミノ酸、通常は２７～３５アミノ酸である）に起因して、ジンクフィンガードメイン融合タンパク質は、新規ＤＮＡ結合特異性を有するＤＢＤを創出するために利用される。これらのＤＢＤは、他の融合されたドメイン（例えば、転写活性化もしくは抑制ドメインまたはエピジェネティック改変ドメイン）を送達して、標的遺伝子の転写調節を変更することができる。一部の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、２～８つのフィンガーを含み、各フィンガーは、２７～４０アミノ酸（例えば、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０アミノ酸）を含有する。
一部の実施形態では、ＺＦＰは、１、２、３、４、５、６、７または８つのジンクフィンガーを含む。各ジンクフィンガーは、２５～４０、２５～３０、３０～３５、３５～４０または４０～４５アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、２７～３５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５アミノ酸を含む。ジンクフィンガーは、対象における、ハプロ不全である標的配列、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を特異的に認識し得るまたはそれに特異的に結合し得る。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子、例えば、例えば、配列番号４９に示されるヒトＳＣＮ１Ａの標的配列に結合する。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の標的配列に結合するジンクフィンガーは、配列番号６３～８０のうち１つもしくは複数のアミノ酸配列、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、トリヌクレオチド配列を含む標的配列を特異的に認識するまたはそれに特異的に結合する。
一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、標的配列、例えば、トリヌクレオチド配列を含む標的配列を認識するまたはそれに結合する認識ヘリックスを含む。一部の実施形態では、認識ヘリックスは、トリヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、認識ヘリックスは、４～１０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、認識ヘリックスは、４、６、７、８、９または１０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、認識ヘリックスは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のトリヌクレオチド配列に結合する。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合する認識配列は、配列番号１７～２２、２９～３４または４１～４６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合する認識配列は、配列番号１１～１６、２３～２８または３５～４０のいずれか１つによってコードされる。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、配列番号１７～２２、２９～３４または４１～４６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む認識ヘリックスと同じヌクレオチド配列に結合する。
一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、そのＣ末端に、このジンクフィンガーをさらなるジンクフィンガーに連結または接続するように機能し得るリンカー配列を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、例えば、ＴＧＥＫＰ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を含む、カノニカルリンカーであり得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、例えば、ＴＧＳＱＫＰ（配列番号１２１）のアミノ酸配列を含む、非カノニカルリンカーであり得る。一部の実施形態では、リンカー配列は、２～１０アミノ酸、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸であり得る。
一部の実施形態では、標的遺伝子、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、６つのジンクフィンガーを含み、その各々は、標的遺伝子、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の異なるトリヌクレオチド配列を認識するまたはそれに結合する。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号６３、６４、６５、６６、６７および／または６８のアミノ酸配列を含むジンクフィンガーを含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号１７、１８、１９、２０、２１および／または２２のアミノ酸配列を含む認識ヘリックスを含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号６９、７０、７１、７２、７３および／または７４のアミノ酸配列を含むジンクフィンガーを含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号２９、３０、３１、３２、３３および／または３４のアミノ酸配列を含む認識ヘリックスを含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号７５、７６、７７、７８、７９および／または８０のアミノ酸配列を含むジンクフィンガーを含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、配列番号４１、４２ ４３、４４、４５および／または４６のアミノ酸配列を含む認識ヘリックスを含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＦＰは、以下に示される配列番号５７、５９または６１に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
配列番号５７（ＺＦＰ１タンパク質のアミノ酸配列）
Figure 2023535025000002
 配列番号５９（ＺＦＰ２タンパク質のアミノ酸配列）
Figure 2023535025000003
 配列番号６１（ＺＦＰ３タンパク質のアミノ酸配列）
Figure 2023535025000004
一部の実施形態では、ＤＢＤは、転写活性化因子様エフェクタータンパク質（ＴＡＬＥ）である。ＴＡＬＥは、標的配列、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を特異的に認識し得るまたはそれに特異的に結合し得る。一部の実施形態では、対象は、標的遺伝子についてハプロ不全である。一部の実施形態では、ＴＡＬＥは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子、例えば、配列番号４９に提供されるヒトＳＣＮ１Ａの標的配列に結合する。ＴＡＬＥタンパク質は、細菌によって分泌され、宿主植物中のプロモーター配列に結合して、細菌感染を補助する植物遺伝子の発現を活性化する。典型的には、ＴＡＬＥタンパク質は、変動する数の約３０～３５アミノ酸リピートからなる中心リピートドメインを介して標的配列を認識するので、新たなＤＮＡ配列に結合するように操作され、各リピートは、標的配列内の単一の塩基対を認識する。これらのリピートのアレイが、典型的には、ＤＮＡ配列を認識するために必要である。
一部の実施形態では、ＤＢＤは、ホメオドメインである。ホメオドメインは、標的配列、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を特異的に認識し得るまたはそれに特異的に結合し得る。一部の実施形態では、対象は、標的遺伝子についてハプロ不全である。一部の実施形態では、ホメオドメインは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子、例えば、配列番号４９に提供されるヒトＳＣＮ１Ａの標的配列に結合する。ホメオドメインは、標的配列の認識を担う３つのアルファヘリックスおよびＮ末端アームを含有するタンパク質である。ホメオドメインは、典型的には、小さいＤＮＡ配列（約４～８塩基対）を認識するが、これらのドメインは、より長い伸長された配列（１２～２４塩基対）を認識するために、他のＤＮＡ結合ドメイン（他のホメオドメインまたはジンクフィンガータンパク質のいずれか）とタンデムで融合され得る。したがって、ホメオドメインは、ヒトゲノム内の独自の配列を認識するＤＢＤの構成成分であり得る。
一部の実施形態では、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓタンパク質）である。触媒的に不活性なＣａｓタンパク質（ｄＣａｓまたは「失活したＣａｓタンパク質」としても公知）は、弱まったヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）を有するようにまたは全てのヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）を欠如するように改変または変異されたＣａｓタンパク質である。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質は、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２タンパク質である。一部の実施形態では、ＤＢＤは、ｄＣａｓタンパク質（「失活したＣａｓ」としても公知）、例えば、ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ１２ａである。ｄＣａｓタンパク質は、触媒的に不活性化されるように、即ち、ヌクレオチド切断が不可能であるように変異されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａ）の変異体バリアントである。ｄＣａｓは、標的配列、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を特異的に認識し得るまたはそれに特異的に結合し得る。ｄＣａｓタンパク質およびガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む複合体は、ガイド核酸に対して相補的な特異的ヌクレオチド配列または遺伝子を標的化し得るおよび／またはそれに結合し得る。一部の実施形態では、対象は、標的遺伝子についてハプロ不全である。一部の実施形態では、ｄＣａｓは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子、例えば、配列番号４９に提供されるヒトＳＣＮ１Ａの標的配列に結合する。しかし、ｄＣａｓタンパク質は、標的ＤＮＡ配列に対して相補的または部分的に相補的なガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）に結合された場合に、この標的ＤＮＡ配列を認識しそれに結合するそれらの能力を保持する。一部の実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）タンパク質をＳＣＮ１Ａに標的化するためのガイド核酸は、配列番号８５、８６、８９、９０、９３または９４のいずれか１つを有するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）タンパク質をＳＣＮ１Ａに標的化するためのガイド核酸は、配列番号８５、８６、８９、９０、９３または９４のいずれか１つの少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９または２０）連続するヌクレオチドを有するスペーサー配列を含む。一部の実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）タンパク質をＳＣＮ１Ａに標的化するためのガイド核酸は、配列番号８３、８４、８７、８８、９１または９２のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ｄＣａｓ（例えば、ｄＣａｓ９）タンパク質をＳＣＮ１Ａに標的化するためのガイド核酸は、配列番号８３～９４のいずれか１つを含むまたはそれからなる。したがって、ｄＣａｓエンドヌクレアーゼは、ヒトゲノム内の独自の配列を認識するＤＢＤの構成成分であり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９タンパク質およびトランス活性化ドメイン（例えば、ＶＰＲドメイン）を含む。
本開示は、一部の態様では、電位開口型ナトリウムチャネル（例えば、Ｎａｖ１．１）をコードする遺伝子に結合するＤＮＡ結合ドメインに関する。一部の実施形態では、電位開口型ナトリウムチャネルをコードする遺伝子は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子であり、配列番号４９に示される配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、標的遺伝子の非翻訳領域、例えば、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）または５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に結合する。一部の実施形態では、非翻訳領域は、調節配列、例えば、エンハンサー、プロモーター、イントロンまたはリプレッサー配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５７～６２に示される配列を含むジンクフィンガータンパク質である。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５～７のいずれか１つに示される核酸配列に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５～７のいずれか１つに示される核酸配列の全長に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号５～７のいずれか１つに示される核酸配列の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０連続するヌクレオチドに結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３に示される核酸配列に結合する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号３のいずれか１つに示される核酸配列の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０連続するヌクレオチドに結合する。
配列番号３、ＳＣＮ１Ａ標的領域、ヌクレオチド配列
Figure 2023535025000005
導入遺伝子によってコードされるＤＮＡ結合ドメインの数は、変動し得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は、１つのＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、２つのＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、３つのＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、４つのＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、５つのＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、６つのＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、７つのＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、８つのＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、９つのＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、１０個のＤＮＡ結合ドメインをコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、１０個よりも多く（例えば、２０、３０、５０、１００個など）のＤＮＡ結合ドメインをコードする。ＤＮＡ結合ドメインは、同じＤＮＡ結合ドメイン（例えば、複数コピーの同じＤＢＤ）、異なるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、各ＤＢＤが独自の配列に結合する）、またはそれらの組合せであり得る。
本開示は、一部の態様では、トランス活性化因子ドメインを含む融合タンパク質に関する。本明細書で使用される場合、「トランス活性化ドメイン」は、遺伝子発現を調節する他のタンパク質、例えば、転写共調節因子のための結合部位を含有する転写因子中の足場ドメインを指す。一部の実施形態では、トランス活性化ドメイン（転写活性化ドメインとしても公知）は、ＤＢＤと共に、接触している転写因子を介して直接的に、または共活性化因子タンパク質を介して間接的に、プロモーターまたはエンハンサーからの転写を活性化するように作用する。トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）は、そのアミノ酸組成にちなんで一般に名付けられ、これらのアミノ酸は、活性にとって必須であるか、またはＴＡＤにおいて最も豊富であるかのいずれかである。ＴＡＤは、標的遺伝子の発現を調節するための遺伝子操作において融合タンパク質として利用され、転写活性化のレベルを変更し、したがって、標的遺伝子の発現を変更するように変異され得る。トランス活性化ドメインの例には、ＧＡＬ４、ＨＡＰ１、ＶＰ１６、Ｐ６５、ＲＴＡ、ＧＣＮ４、ＴＣＦ４ ＡＤ１、ＴＣＦ４ ＡＤ２、ＭＥＦ２Ａ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＦ２Ｄ、Ｓｐ１グルタミン－リッチドメイン、ｐ５３、Ｅ２Ｆ１、ＭｙｏＤ、ＭＡＰＫ７、ＮＦ１Ｂプロリンリッチドメイン、ＲｅｌＡおよびＨＳＦ１が含まれるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、ＶＰ６４ドメインを含む。ＶＰ６４は、単純ヘルペスウイルスによって天然に発現される、ＶＰ１６タンパク質の４つのタンデムコピーから構成される酸性ＴＡＤである。遺伝子のプロモーターまたはその近傍に結合するＤＢＤに融合されると、ＶＰ６４は、強い転写活性化因子として作用し、したがって、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を調節するために利用され得る。ＶＰ６４ドメインは、典型的には、単純ヘルペスタンパク質ＶＰ１６の最小限の活性化ドメインのテトラマーリピートから構成される。一部の実施形態では、ＶＰ６４ドメインは、ＶＰ１６中のアミノ酸残基４３７～４４８の、４つのリピートを含む。一部の実施形態では、ＶＰ１６タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＣ＿００１７９８．２に示される配列を含むヒトヘルペスウイルス２のＵＬ４８遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＶＰ１６遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＹＰ＿００９１３７２００．１に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１６タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号Ｑ６９１１３－１に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１６遺伝子は、配列番号５１に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＶＰ１６タンパク質は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、Ｐ６５活性化ドメインを含む。Ｐ６５は、そのＣ末端に２つの隣接する酸性ＴＡＤを含有するＮＦ－κβ転写因子のサブユニットである。遺伝子のプロモーターまたはその近傍に結合するＤＢＤに融合されると、例えば、Ｕｒｌｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． “Ｔｈｅ ｐ６５ ｄｏｍａｉｎ ｆｒｏｍ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｕｍａｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｇｅｎｅ， ２０００に記載されるように、ｐ６５タンパク質は、強い転写活性化因子として作用し、したがって、標的遺伝子の発現を調節するために利用され得る。一部の実施形態では、ｐ６５タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１１４５１３８．１、ＮＭ＿００１２４３９８４．１、ＮＭ＿００１２４３９８５．１またはＮＭ＿０２１９７５．３に示される配列を含むヒトＲＥＬＡ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＲＥＬＡ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１１４５１３８．１、ＮＭ＿００１２４３９８４．１、ＮＭ＿００１２４３９８５．１またはＮＭ＿０２１９７５．３のいずれかに示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｐ６５タンパク質は、ＮＰ＿００１１３８６１０．１、ＮＰ＿００１２３０９１３．１、ＮＰ＿００１２３０９１４．１、およびＮＰ＿０６８１１０．３に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＲＥＬＡ遺伝子は、配列番号５３に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｐ６５タンパク質は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、ＲＴＡドメインを含む。ＲＴＡは、エンハンサー領域に結合していくつかのウイルス遺伝子の発現を促進する強力なトランス活性化ドメインである、エプスタイン・バーウイルスに由来する疎水性ＴＡＤである。遺伝子のプロモーターまたはその近傍に結合するＤＢＤに融合されると、例えば、Ｍｉｙａｚａｗａ， ｅｔ ａｌ．， “ＩＬ－１０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ Ｋ－ＲＴＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｔｈｅ ｈｏｓｔ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ， ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ １ ａｎｄ ３，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１８に記載されるように、ＲＴＡタンパク質は、強い転写活性化因子として作用し、したがって、標的遺伝子の発現を調節するために利用され得る。一部の実施形態では、ＲＴＡタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＹＰ＿０４１６７４．１に示される配列を含むエプスタイン・バーウイルスＢＲＬＦ１遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＢＲＬＦ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＹＰ＿０４１６７４．１のいずれかに示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＲＴＡタンパク質は、ＹＰ＿０４１６７４．１に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＢＲＬＦ１遺伝子は、配列番号５５に示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＲＴＡタンパク質は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、転写因子４（ＴＣＦ４）活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＣＦ４活性化ドメインは、ＴＣＦ４タンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ＴＣＦ４タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００３１９９に示される配列を含むヒトＴＣＦ４遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＴＣＦ４遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００３１９９のいずれかに示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＴＣＦ４タンパク質は、ＮＰ＿００３１９０．１に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＣＦ４活性化ドメインは、配列番号１２２に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＣＦ４活性化ドメインは、配列番号１２３に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１２２、ＴＣＦ４活性化ドメイン１、アミノ酸配列
Figure 2023535025000006
 配列番号１２３、ＴＣＦ４活性化ドメイン２、アミノ酸配列
Figure 2023535025000007
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、筋細胞特異的エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ａ活性化ドメインは、ＭＥＦ２Ａタンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１１３０９２６．２、ＮＭ＿００１１３０９２７．３またはＮＭ＿００１１３０９２８．２のいずれかに示される配列を含むヒトＭＥＦ２Ａ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１１３０９２６．２、ＮＭ＿００１１３０９２７．３またはＮＭ＿００１１３０９２８．２に示される核酸によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一な配列を含む。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ａタンパク質は、ＮＰ＿００１１２４３９８．１、ＮＰ＿００１１２４３９９．１またはＮＰ＿００１１２４４００．１に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ａ活性化ドメインは、配列番号１２４に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１２４、ＭＥＦ２Ａ活性化ドメイン、アミノ酸配列
ＰＬＳＥＥＥＥＬＥＬＮＴＱＲ
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、筋細胞エンハンサー因子２Ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｃ活性化ドメインは、ＭＥＦ２Ｃタンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｃタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１１３１００５．２、ＮＭ＿００１１９３３４７．１、ＮＭ＿００１１９３３４８．１またはＮＭ＿００１１９３３４９．２のいずれか１つに示される配列を含むヒトＭＥＦ２Ｃ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｃ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１１３１００５．２、ＮＭ＿００１１９３３４７．１、ＮＭ＿００１１９３３４８．１またはＮＭ＿００１１９３３４９．２のいずれかに示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｃタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１１２４４７７．１、ＮＰ＿００１１８０２７６．１、ＮＰ＿００１１８０２７７．１またはＮＰ＿００１１８０２７８．１のいずれかに示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｃ活性化ドメインは、配列番号１２５に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１２５、ＭＥＦ２Ｃ活性化ドメイン、アミノ酸配列
ＳＶＳＥＤＶＤＬＬＬＮＱＲ
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、筋細胞エンハンサー因子２Ｄ（ＭＥＦ２Ｄ）活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｄ活性化ドメインは、ＭＥＦ２Ｄタンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｄタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１２７１６２９．２またはＮＭ＿００５９２０．４に示される配列を含むヒトＭＥＦ２Ｄ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｄ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１２７１６２９．２またはＮＭ＿００５９２０．４のいずれかに示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｄタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１２５８５５８．１またはＮＰ＿００５９１１．１のいずれかに示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭＥＦ２Ｄ活性化ドメインは、配列番号１２６に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１２６、ＭＥＦ２Ｄ活性化ドメイン、アミノ酸配列
ＨＬＴＥＤＨＬＤＬＮＮＡＱＲ
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、転写因子Ｓｐ１のグルタミン－リッチ活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、活性化ドメインは、タンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１２５１８２５．２に示される配列を含むヒトＳＰ１遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１２５１８２５．２に示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１２３８７５４．１に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、転写因子Ｓｐ１のグルタミン－リッチ活性化ドメインは、配列番号１２７に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１２７、ＳＰ１グルタミン－リッチ活性化ドメイン、アミノ酸配列
Figure 2023535025000008
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、腫瘍タンパク質ｐ５３活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ｐ５３活性化ドメインは、ｐ５３タンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ｐ５３タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿０００５４６．６またはＮＭ＿００１１２６１１２．２に示される配列を含むヒトｐ５３遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ｐ５３遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０００５４６．６またはＮＭ＿００１１２６１１２．２に示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｐ５３タンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０００５３７．３またはＮＰ＿００１１１９５８４．１に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｐ５３活性化ドメインは、配列番号１２８に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１２８、ｐ５３活性化ドメイン、アミノ酸配列
Figure 2023535025000009
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、Ｅ２Ｆ転写因子１（Ｅ２Ｆ１）活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｅ２Ｆ転写因子１活性化ドメインは、Ｅ２Ｆ転写因子１タンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、Ｅ２Ｆ転写因子１タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００５２２５．３に示される配列を含むヒトＥ２Ｆ１遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、Ｅ２Ｆ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５２２５．３に示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｅ２Ｆ１タンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００５２１６．１に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｅ２Ｆ１活性化ドメインは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００５２１６．１に示されるアミノ酸配列を有するＥ２Ｆ１タンパク質のアミノ酸残基３８０～４３７を含む。一部の実施形態では、Ｅ２Ｆ１活性化ドメインは、配列番号１２９に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１２９、Ｅ２Ｆ転写因子１活性化ドメイン、アミノ酸配列
Figure 2023535025000010
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、筋芽細胞決定タンパク質１（ＭｙｏＤ）活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＭｙｏＤ活性化ドメインは、ＭｙｏＤタンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ＭｙｏＤタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００２４７８．５に示される配列を含むヒトＭｙｏＤ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＭｙｏＤ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００２４７８．５に示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＭｙｏＤタンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００２４６９．２に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭｙｏＤ活性化ドメインは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００２４６９．２に示されるアミノ酸配列を有するＭｙｏＤタンパク質のアミノ酸残基１～６３を含む。一部の実施形態では、ＭｙｏＤ活性化ドメインは、配列番号１３０に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１３０、ＭｙｏＤ活性化ドメイン、アミノ酸配列
Figure 2023535025000011
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ７（ＭＡＰＫ７）活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＡＰＫ７活性化ドメインは、ＭＡＰＫ７タンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ＭＡＰＫ７タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００２７４９．４に示される配列を含むヒトＭＡＰＫ７遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＭＡＰＫ７遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００２７４９．４に示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＭＡＰＫ７タンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００２７４０．２に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭＡＰＫ７活性化ドメインは、配列番号１３１に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１３１、ＭＡＰＫ７活性化ドメイン、アミノ酸配列
Figure 2023535025000012
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、核因子１ Ｂ型（ＮＦ１Ｂ）プロリンリッチ活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＮＦ１Ｂプロリンリッチ活性化ドメインは、ＮＦ１Ｂタンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ＮＦ１Ｂタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１３６９４８０に示される配列を含むヒトＮＦ１Ｂ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＮＦ１Ｂ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１３６９４８０に示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＮＦ１Ｂタンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１３５６４０９．１に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＮＦ１Ｂ活性化ドメインは、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１３５６４０９．１に示されるアミノ酸配列を有するＮＦ１Ｂタンパク質のアミノ酸残基３１９～４１９を含む。一部の実施形態では、ＮＦ１Ｂ活性化ドメインは、配列番号１３２に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１３２、ＮＦ１Ｂプロリンリッチ活性化ドメイン、アミノ酸配列
Figure 2023535025000013
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、ＲｅｌＡ活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＲｅｌＡ活性化ドメインは、ＲｅｌＡタンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ＲｅｌＡタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００１１４５１３８．２またはＮＭ＿０２１９７５．４に示される配列を含むヒトＲｅｌＡ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＲｅｌＡ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１１４５１３８．２またはＮＭ＿０２１９７５．４に示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＲｅｌＡタンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００１１３８６１０．１またはＮＰ＿０６８８１０．３に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＲｅｌＡ活性化ドメインは、配列番号１３３に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１３３、ＲｅｌＡ活性化ドメイン、アミノ酸配列
Figure 2023535025000014
一部の実施形態では、トランス活性化因子ドメインは、熱ショック転写因子１（ＨＳＦ１）活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＨＳＦ１活性化ドメインは、ＨＳＦ１タンパク質のタンパク質ドメインである。一部の実施形態では、ＨＳＦ１タンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＭ＿００５５２６．４に示される配列を含むヒトＨＳＦ１遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＨＳＦ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００５５２６．４に示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＨＳＦ１タンパク質は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００５５１７．１に示されるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＨＳＦ１活性化ドメインは、配列番号１３４に示されるアミノ酸配列と１００％同一な、９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
配列番号１３４、ＨＳＦ１活性化ドメイン、アミノ酸配列
Figure 2023535025000015
本開示は、ハイブリッドトランス活性化因子ドメインを含む融合タンパク質に一部基づく。「ハイブリッドトランス活性化因子ドメイン」は、本明細書で使用される場合、１つよりも多くの転写活性化タンパク質またはその部分（例えば、２、３、４、５つもしくはそれよりも多くの転写活性化タンパク質、またはその部分）を含む融合タンパク質を指す。ハイブリッドトランス活性化ドメインは、標的遺伝子の発現を増加させるための遺伝子操作において利用される。本開示の一部の実施形態では、Ｃｈａｖｅｚ， ｅｔ ａｌ． “Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ”， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２０１５に記載される、ＶＰ６４－Ｐ６５－ＲＴＡ（ＶＰＲ）のヌクレオチド配列を含む三要素（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）ハイブリッドトランス活性化ドメイン（配列番号４７）が、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）発現を増加させるために利用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、ＤＢＤ（例えば、ＺＦＰ）および転写リプレッサータンパク質を含み得る。一部の態様では、本開示は、転写リプレッサードメインを含む融合タンパク質に関する。「転写リプレッサー」タンパク質は、本明細書で使用される場合、一般に、標的遺伝子の発現を下方調節するポリペプチドを指す。転写リプレッサーの例には、ＫＲＡＢ、ＳＭＲＴ／ＴＲＡＣ－２およびＮＣｏＲ／ＲＩＰ－１３が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、かかる転写リプレッサー融合タンパク質は、標的遺伝子（例えば、機能獲得型疾患において過剰発現される遺伝子）の発現レベルを低減させるために有用である。
一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含む。ＮＬＳは、細胞の核中へのタンパク質のインポートを促進するアミノ酸配列である。一部の実施形態では、ＮＬＳは、複数の正に荷電したアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）を含むアミノ酸配列である。一部の実施形態では、ＮＬＳは、配列番号１３５～１４０のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、配列番号１３５～１４０のうち１つまたは複数（例えば、任意の組合せ）を含む。ＮＬＳは、本明細書に記載される融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端にあり得る。一部の実施形態では、ＮＬＳは、タンパク質の内部に位置し得る。
Figure 2023535025000016
単離された核酸
単離された核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、本開示のタンパク質および核酸は、単離されている。本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、人工的に産生されたことを意味する。核酸に関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、以下を意味する：（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅されたこと；（ｉｉ）クローニングによって組換え産生されたこと；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離によって精製されたこと；または（ｉｖ）例えば、化学的合成によって合成されたこと。単離された核酸は、当該分野で周知の組換えＤＮＡ技法によって容易に操作可能な核酸である。したがって、５’および３’制限部位が公知である、またはそれに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されているベクター中に含有されるヌクレオチド配列は、単離されたとみなされるが、その天然の宿主中にそのネイティブ状態で存在している核酸配列は、単離されたとはみなされない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、その必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内の単離された核酸は、それが存在する細胞中の材料のごくわずかなだけのパーセンテージを構成している場合があるという点で、純粋ではない。かかる核酸は、単離されているが、それは、当業者に公知の標準的な技法によってこれが容易に操作可能であるので、この用語が本明細書で使用されるからである。タンパク質またはペプチドに関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、その天然の環境から単離されたまたは（例えば、化学的合成、組換えＤＮＡ技術などによって）人工的に産生されたタンパク質またはペプチドを指す。
一部の態様では、本開示は、１つまたは複数のＺＦＰ－トランス活性化ドメイン融合タンパク質を発現するように構成された単離された核酸（例えば、発現構築物、例えば、ｒＡＡＶベクター）に関する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１個と１０個との間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のＤＢＤおよび／または１個と１０個との間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のトランス活性化因子ドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１０個よりも多いＤＢＳおよび／または１０個よりも多いトランス活性化因子ドメインを含む。
本開示の一部の態様では、ＤＮＡ結合ドメインは、リンカーを介して間接的に、転写調節因子ドメインに融合されている。本明細書で使用される場合、「リンカー」は、一般に、単一の導入遺伝子内で２つの別個のポリペプチドを構造的に接合するポリペプチドのストレッチである。一部の実施形態では、リンカーは、別個のポリペプチドの動きを可能にするように柔軟である。一部の実施形態では、可撓性リンカーは、グリシン残基を含む。一部の実施形態では、可撓性リンカーは、グリシン残基およびセリン残基の混合物を含む。一部の実施形態では、リンカーは切断可能であり、ポリペプチドを分離させる。一部の実施形態では、切断可能なリンカーは、プロテアーゼによって切断される。一部の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンまたは第Ｘ因子である。
一部の実施形態では、リンカーは、５アミノ酸と３０アミノ酸との間（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、３アミノ酸と３０アミノ酸との間（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、３アミノ酸と２０アミノ酸との間（例えば、３、４ ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸）を含む。
本開示は、電位開口型ナトリウムイオンチャネルサブユニットタンパク質（ＳＣＮタンパク質とも呼ばれる）、例えば、ＳＣＮ１Ａをコードする遺伝子の発現を増加させるように操作された融合タンパク質に一部基づく。本明細書で使用される場合、「ＳＣＮタンパク質」は、興奮性膜の電位依存性ナトリウムイオン透過性を媒介して、ナトリウムイオンを膜通過させるナトリウムイオンチャネルタンパク質を指す。ヒトにおけるＳＣＮタンパク質の例には、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮ１０ＡおよびＳＣＮ１１Ａが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＳＣＮタンパク質は、１α１型イオンチャネルサブユニットをコードするＳＣＮ１Ａ（Ｎａｖ１．１とも呼ばれる）である。一部の実施形態では、ＳＣＮタンパク質は、１β１型イオンチャネルサブユニットをコードするＳＣＮ１Ｂタンパク質またはＳＣＮ１Ｃタンパク質である。一部の実施形態では、ＳＣＮタンパク質は、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ１Ｂおよび／またはＳＣＮ１Ｃタンパク質の組合せである。本明細書で開示される場合、ＳＣＮタンパク質は、ＳＣＮタンパク質の部分または断片であり得る。一部の実施形態では、本明細書で開示されるＳＣＮタンパク質は、ＳＣＮタンパク質のバリアント、例えば、点変異体または短縮型変異体である。
ヒトでは、ＳＣＮ１Ａは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子（Ｇｅｎｅ ＩＤ：６３２３、ヒト）によってコードされ、これは、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラットおよびニワトリにおいて保存されている。ヒトにおけるＳＣＮ１Ａ遺伝子は、脳、肺および精巣において主に発現される。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａタンパク質は、５つの構造的リピート（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｑ）を含む。
一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１１６５９６３．２、ＮＭ＿００１６５９６４．２、ＮＭ＿００１２０２４３５．２、ＮＭ＿００１３５３９４８．１、ＮＭ＿００１３５３９４９．１、ＮＭ＿００１３５３９５０．１、ＮＭ＿００１３５３９５．１、ＮＭ＿００１３５３９５２．１、ＮＭ＿００１３５３９５４．１、ＮＭ＿００３５３９５５．１、ＮＭ＿００１３５３９５７．１、ＮＭ＿００１３５３９５８．１、ＮＭ＿００１３５３９６０．１、ＮＭ＿００１３５３９６１．１またはＮＭ＿００６９２０．５に示される配列を含むヒトＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１３１３９９７．１またはＮＭ＿０１８７３３．２に示される配列を含むマウスＳＣＮ１Ａ遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＧ＿０１１９０６．１、ＮＭ＿００１３１３９９７．１またはＮＭ＿０１８７３３．２のいずれかに示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａ遺伝子は、配列番号５０に示される配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１１５９４３５．１、ＮＰ＿００１１１５９４３６．１、ＮＰ＿００１１８９３６４．１、ＮＰ＿００１３４０８７７．１、ＮＰ＿００１３４０８７８．１、ＮＰ＿００１３４０８７９．１、ＮＰ＿００１３４０８８０．１、ＮＰ＿００１３４０８８１．１、ＮＰ＿００１３４０８８３．１、ＮＰ＿００１３４０８８４．１、ＮＰ＿００１３４０８８６．１、ＮＰ＿００１３４０８８７．１、ＮＰ＿００１３４０８８９．１、ＮＰ＿００１３４０８９０．１、ＮＰ＿００８５１．３に示される配列を含む。一部の実施形態では、ＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＧ＿０１１９０６．１、ＮＭ＿００１３１３９９７．１またはＮＭ＿０１８７３３．２のいずれかに示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、マウスＳＣＮ１Ａタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１３００９２６．１またはＮＰ＿０６１２０３．２に示される配列を含む。一部の実施形態では、ヒトＳＣＮ１Ａタンパク質は、配列番号４９に示される核酸配列と９９％同一な、９５％同一な、９０％同一な、８０％同一な、７０％同一な、６０％同一なまたは５０％同一なアミノ酸配列を含む。
本開示の単離された核酸は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ｒＡＡＶベクター）であり得る。一部の実施形態では、本開示によって記載される単離された核酸は、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）またはそのバリアントを含む領域（例えば、第１の領域）を含む。単離された核酸（例えば、組換えＡＡＶベクター）は、カプシドタンパク質中にパッケージングされ得、対象に投与され得るおよび／または選択された標的細胞に送達され得る。「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、最低でも、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）から構成される。導入遺伝子は、本開示の他の箇所に記載されるように、例えばタンパク質および／または発現制御配列をコードする領域（例えば、ポリＡテイル）を含み得る。
一般に、ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐ長である。好ましくは、ＩＴＲをコードする配列の実質的に全体が、この分子において使用されるが、ある程度の、これらの配列の軽微な改変が許容可能である。これらのＩＴＲ配列を改変する能力は、当業者の技術範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）；およびＫ． Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ．， ７０：５２０ ５３２ （１９９６）などのテキストを参照されたい）。本開示において使用されるかかる分子の例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドであり、このプラスミドでは、選択された導入遺伝子配列および関連する調節エレメントに、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接している。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、本明細書で同定された哺乳動物ＡＡＶ型を含む、任意の公知のＡＡＶから得られ得る。一部の実施形態では、単離された核酸は、第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む領域（例えば、第２の領域、第３の領域、第４の領域など）をさらに含む。
組換えＡＡＶベクターについて上で同定された主要エレメントに加えて、ベクターは、本開示によって産生されたベクターでトランスフェクトされた細胞またはウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳および／または発現を可能にする様式で導入遺伝子のエレメントに作動可能に連結された従来の制御エレメントもまた含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」配列には、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたはある距離で作用する発現制御配列との両方が含まれる。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに所望により、コードされた産物の分泌を増強する配列が含まれる。ネイティブ、構成的、誘導性および／または組織特異的であるプロモーターが含まれるいくつかの発現制御配列が、当該分野で公知であり、利用され得る。
本明細書で使用される場合、核酸配列（例えば、コード配列）および調節配列は、核酸配列の発現または転写を調節配列の影響下または制御下に置くような方法で共有結合的に連結されている場合、作動可能に連結されたと言われる。核酸配列を機能的タンパク質へと翻訳することが所望される場合、５’調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写を生じ、２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じることも、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力を妨害することも、（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質へと翻訳される能力を妨害することもない場合、２つのＤＮＡ配列は、作動可能に連結されたと言われる。したがって、得られた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され得るように、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことが可能であった場合、そのプロモーター領域は、核酸配列に作動可能に連結されている。同様に、共通のプロモーターからのそれらの転写が、インフレームで翻訳された２つまたはそれよりも多くのタンパク質の発現を生じるような方法で連結されている場合、２つまたはそれよりも多くのコード領域は、作動可能に連結されている。一部の実施形態では、作動可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質を生じる。
導入遺伝子を含む（例えば、融合タンパク質などを含む）領域は、融合タンパク質の発現を可能にする、単離された核酸の任意の適切な位置に位置付けられ得る。
導入遺伝子が１つよりも多くのポリペプチドをコードする場合、各ポリペプチドは、導入遺伝子内の任意の適切な位置に位置付けられ得ることを理解すべきである。例えば、第１のポリペプチドをコードする核酸は、導入遺伝子のイントロン中に位置付けられ得、第２のポリペプチドをコードする核酸配列は、別の非翻訳領域中に（例えば、タンパク質コード配列の最後のコドンと導入遺伝子のポリＡシグナルの最初の塩基との間に）位置付けられ得る。
「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために要求される、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。語句「動作可能に連結された」、「動作可能に位置付けられた」、「制御下」または「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御する核酸に関して正確な位置および配向にあることを意味する。
タンパク質をコードする核酸について、ポリアデニル化配列が、一般に、導入遺伝子配列の後かつ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本開示において有用なｒＡＡＶ構築物は、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に望ましくは位置するイントロンもまた含有し得る。１つの可能なイントロン配列は、ＳＶ－４０に由来し、ＳＶ－４０ Ｔイントロン配列と呼ばれる。使用され得る別のベクターエレメントは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、単一の遺伝子転写物から１つよりも多くのポリペプチドを産生するために使用される。ＩＲＥＳ配列は、１つよりも多くのポリペプチド鎖を含有するタンパク質を産生するために使用される。これらおよび他の一般的なベクターエレメントの選択は、従来のものであり、多くのかかる配列が入手可能である［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、および例えば、３．１８～３．２６頁および１６．１７～１６．２７頁においてその中で引用された参考文献、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照されたい］。一部の実施形態では、口蹄疫ウイルス２Ａ配列が、ポリタンパク質中に含まれる；これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小さいペプチド（およそ１８アミノ酸長）である（Ｒｙａｎ， Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ， １９９４； ４： ９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ， Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６； ｐ． ８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ， Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１； ８： ８６４－８７３；およびＨａｌｐｉｎ， Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９９９； ４： ４５３－４５９）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子療法ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を含む人工の系において以前に実証されている（Ｒｙａｎ， Ｍ Ｄ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ， １９９４； ４： ９２８－９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ， Ｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６； ｐ． ８１２４－８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ， Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１； ８： ８６４－８７３；およびＨａｌｐｉｎ， Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， １９９９； ４： ４５３－４５９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ， Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １９９９； ６： １９８－２０８；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ， Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２０００； １１： １９２１－１９３１．；およびＫｌｕｍｐ， Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００１； ８： ８１１－８１７）。
構成的プロモーターの例には、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じて、ＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ４１：５２１－５３０ （１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、プロモーターは、Ｐ２プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、２つのＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶエンハンサーによって分離された２つのＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外因性に供給された化合物、環境因子、例えば、温度、または特定の生理的条件、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または複製している細胞のみにおいて調節され得る。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄが含まれるがこれらに限定されない種々の商業的供給源から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者によって容易に選択され得る。外因性に供給されたプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：３３４６－３３５１ （１９９６））、テトラサイクリン抑制可能な系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：５５４７－５５５１ （１９９２））、テトラサイクリン誘導性の系（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６８：１７６６－１７６９ （１９９５）、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２：５１２－５１８ （１９９８）もまた参照されたい）、ＲＵ４８６誘導性の系（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １５：２３９－２４３ （１９９７）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ４：４３２－４４１ （１９９７））およびラパマイシン誘導性の系（Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １００：２８６５－２８７２ （１９９７））が含まれる。これに関して有用であり得るなお他の型の誘導性プロモーターは、特定の生理的条件、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製している細胞のみにおいて調節されるプロモーターである。
別の実施形態では、導入遺伝子のためのネイティブプロモーターが使用される。ネイティブプロモーターは、導入遺伝子の発現がネイティブ発現を模倣すべきことが所望される場合に好まれ得る。ネイティブプロモーターは、導入遺伝子の発現が、時間的もしくは発生的に、または組織特異的様式で、または特定の転写刺激に応答して調節される必要がある場合に、使用され得る。さらなる実施形態では、他のネイティブ発現制御エレメント、例えば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはＫｏｚａｋコンセンサス配列もまた、ネイティブ発現を模倣するために使用され得る。
一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能を付与する。一部の場合には、組織特異的調節配列は、組織特異的様式で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。かかる組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当該分野で周知である。例示的な組織特異的調節配列には、以下の組織特異的プロモーターが含まれるがこれらに限定されない：肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、膵ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモーター、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモーター、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモーター、α－ミオシン重鎖（α－ＭＨＣ）プロモーターまたは心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモーター。他の例示的なプロモーターには、当業者に明らかな他のプロモーターの中でも、ベータ－アクチンプロモーター、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ３：１００２－９ （１９９６）；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ７：１５０３－１４ （１９９６））、骨オステオカルシンプロモーター（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐ．， ２４：１８５－９６ （１９９７））；骨シアロタンパク質プロモーター（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ．， １１：６５４－６４ （１９９６））、ＣＤ２プロモーター（Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６１：１０６３－８ （１９９８）；免疫グロブリン重鎖プロモーター；Ｔ細胞受容体α－鎖プロモーター、ニューロン、例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．， １３：５０３－１５ （１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：５６１１－５ （１９９１））およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ， １５：３７３－８４ （１９９５））が含まれる。
一部の実施形態では、ＤＢＤおよびトランス活性化因子を含む融合タンパク質をコードする導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、神経組織に特異的である。一部の実施形態では、プロモーターは、ＳＳＴまたはＮＰＹプロモーターである。
本開示の態様は、１つよりも多くのプロモーター（例えば、２、３、４、５つまたはそれよりも多くのプロモーター）を含む単離された核酸に関する。例えば、タンパク質をコードする第１の領域およびタンパク質をコードする第２の領域を含む導入遺伝子を有する構築物に関して、第１のプロモーター配列（例えば、タンパク質コード領域に作動可能に連結された第１のプロモーター配列）を使用して第１のタンパク質コード領域の発現を駆動すること、および第２のプロモーター配列（例えば、第２のタンパク質コード領域に作動可能に連結された第２のプロモーター配列）を使用して第２のタンパク質コード領域の発現を駆動すること望ましい場合がある。一般に、第１のプロモーター配列と第２のプロモーター配列とは、同じプロモーター配列または異なるプロモーター配列であり得る。一部の実施形態では、第１のプロモーター配列（例えば、タンパク質コード領域の発現を駆動するプロモーター）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列の非限定的な例には、Ｕ６およびＨ１プロモーター配列が含まれる。一部の実施形態では、第２のプロモーター配列（例えば、第２のタンパク質の発現を駆動するプロモーター配列）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ ＩＩ）プロモーター配列である。ｐｏｌ ＩＩプロモーター配列の非限定的な例には、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６、ＲＳＶおよびサイトメガロウイルスプロモーター配列が含まれる。一部の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列は、第１のタンパク質コード領域の発現を駆動する。一部の実施形態では、ｐｏｌ ＩＩプロモーター配列は、第２のタンパク質コード領域の発現を駆動する。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
一部の態様では、本開示は、単離されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、人工的に産生されたまたは得られたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組換え法を使用して産生され得る。かかるＡＡＶは、本明細書で「組換えＡＡＶ」と呼ばれる。ｒＡＡＶのヌクレアーゼおよび／または導入遺伝子が、１つまたは複数の所定の組織に特異的に送達されるように、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、好ましくは、組織特異的標的化能力を有する。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的標的化能力を決定する際の重要な要素である。したがって、標的化されている組織に適切なカプシドを有するｒＡＡＶが選択され得る。
所望のカプシドタンパク質を有する組換えＡＡＶを得るための方法は、当該分野で周知であり（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２号を参照されたい。その内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。典型的には、これらの方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子から構成された組換えＡＡＶベクター；ならびに組換えＡＡＶベクターのＡＡＶカプシドタンパク質中へのパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを伴う。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によってコードされる構造タンパク質である。ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質、ビリオンタンパク質１～３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と命名される）を含み、それらは全て、選択的スプライシングを介して単一のｃａｐ遺伝子から転写される。一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の分子量は、それぞれ約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａおよび約６２ｋＤａである。一部の実施形態では、翻訳の際に、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムの周囲に球状の６０マータンパク質シェルを形成する。一部の実施形態では、カプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを送達し、宿主と相互作用することである。一部の態様では、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムを組織特異的様式で宿主に送達する。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂからなる群より選択されるＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、非ヒト霊長類に由来する血清型、例えば、ＡＡＶｒｈ８血清型のＡＡＶカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、広い効率的なＣＮＳ形質導入のために派生された血清型、例えば、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＢのＡＡＶカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型９のカプシドタンパク質である。
ｒＡＡＶベクターをＡＡＶカプシド中にパッケージングするために宿主細胞において培養される構成成分は、宿主細胞にトランスで提供され得る。あるいは、要求される構成成分（例えば、組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／またはヘルパー機能）のうちのいずれか１つまたは複数は、当業者に公知の方法を使用して、要求される構成成分のうちの１つまたは複数を含有するように操作された安定な宿主細胞によって提供され得る。最も適切には、かかる安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下に、要求される構成成分（複数可）を含有する。しかし、要求される構成成分（複数可）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。適切な誘導性および構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に適切な調節エレメントの議論において、本明細書で提供される。なお別の代替法では、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下の選択された構成成分（複数可）および１つまたは複数の誘導性プロモーターの制御下の他の選択された構成成分（複数可）を含有し得る。例えば、２９３細胞（これは、構成的プロモーターの制御下にＥ１ヘルパー機能を含有する）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下にｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞が、生成され得る。なお他の安定な宿主細胞が、当業者によって生成され得る。
一部の実施形態では、本開示は、導入遺伝子（例えば、転写調節因子ドメインに融合されたＤＮＡ結合ドメイン）をコードするコード配列を含む核酸を含有する宿主細胞に関する。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞である。
本開示のｒＡＡＶを産生するために要求される組換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、任意の適切な遺伝子エレメント（ベクター）を使用して、パッケージング宿主細胞に送達され得る。選択された遺伝子エレメントは、本明細書に記載される方法を含む、任意の適切な方法によって送達され得る。本開示の任意の実施形態を構築するために使用される方法は、核酸操作の当業者に公知であり、これには、遺伝子操作、組換え操作および合成技法が含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は、周知であり、適切な方法の選択は、本開示を限定しない。例えば、Ｋ． Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７０：５２０－５３２ （１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、三重トランスフェクション法（米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載されている）を使用して産生され得る。典型的には、組換えＡＡＶは、宿主細胞を、ＡＡＶ粒子へとパッケージングされるＡＡＶベクター（ＩＴＲエレメントが隣接する導入遺伝子を含む）、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、およびアクセサリー機能ベクターでトランスフェクトすることによって産生される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的ＡＡＶ複製およびカプシド形成のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（例えば、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（例えば、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）も生成することなしに、効率的なＡＡＶベクター産生を支持する。本開示との使用に適切なベクターの非限定的な例には、米国特許第６，００１，６５０号に記載されるｐＨＬＰ１９および米国特許第６，１５６，３０３号に記載されるｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが含まれ、両方の全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。アクセサリー機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存する非ＡＡＶ由来のウイルスおよび／または細胞機能（例えば、「アクセサリー機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。アクセサリー機能には、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分が含まれるがこれらに限定されない、ＡＡＶ複製のために要求される機能が含まれる。ウイルスベースのアクセサリー機能は、公知のヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスのいずれかに由来し得る。
一部の態様では、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取込みを指すために使用され、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合には、「トランスフェクトされ」ている。いくつかのトランスフェクション技法が、当該分野で一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ． （１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＥｌｓｅｖｉｅｒおよびＣｈｕ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。かかる技法は、１つまたは複数の外因性核酸、例えば、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子を適切な宿主細胞中に導入するために使用され得る。
「宿主細胞」は、目的の物質を保有しているまたは保有することが可能な任意の細胞を指す。しばしば、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、ニューロン、必要に応じて、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである。「ＧＡＢＡ作動性ニューロン」は、本明細書で使用される場合、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を生成する神経細胞である。哺乳動物では、ＧＡＢＡは、それが結合するニューロンに結合しそれを抑制する、神経系に広く分布する神経伝達物質である。このように、ＧＡＢＡは、てんかん、自閉症および不安が含まれる、神経系に影響を与える多数の障害に関与する。ＳＣＮ１Ａ半接合体およびノックアウトマウスにおける研究で、脳のＧＡＢＡ作動性ニューロンにおける著明なナトリウム電流欠損が観察されている。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、アクセサリー機能ベクター、または組換えＡＡＶの産生に関連する他の移入ＤＮＡのレシピエントとして使用され得る。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指し得る。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶然のまたは意図的な変異に起因して、形態においても、ゲノムにおいても総ＤＮＡ総含量（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）においても、必ずしも元の親と完全に同一でない場合があることが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「細胞系」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの連続したまたは長期の成長および分裂が可能な細胞の集団を指す。しばしば、細胞系は、単一の前駆細胞に由来するクローン性集団である。自発的なまたは誘導された変化が、かかるクローン性集団の貯蔵または移入の間に核型において生じ得ることが、当該分野でさらに公知である。したがって、言及される細胞系に由来する細胞は、祖先細胞または培養物と正確に同一でなくてもよく、言及される細胞系は、かかるバリアントを含む。
本明細書で使用される場合、用語「組換え細胞」は、外因性ＤＮＡセグメント、例えば、生物学的に活性なポリペプチドの転写、または生物学的に活性な核酸、例えば、ＲＮＡの産生をもたらすＤＮＡセグメントが中に導入された細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、適切な制御エレメントに関連した場合に複製が可能であり、細胞間で遺伝子配列を移行させることができる任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどを含む。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、ｒＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどである。したがって、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、有用なベクターは、転写される核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に位置付けられたベクターであることが企図される。
「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために要求される、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。語句「動作可能に連結された」、「動作可能に位置付けられた」、「制御下」または「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御する核酸に関して正確な位置および配向にあることを意味する。用語「発現ベクターまたは構築物」は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能な、核酸を含有する任意の型の遺伝子構築物を意味する。一部の実施形態では、発現は、例えば、転写された遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物を生成する、核酸の転写を含む。所望のＡＡＶカプシド中に組換えベクターをパッケージングして本開示のｒＡＡＶを産生するための上述の方法は、限定を意味せず、他の適切な方法が当業者に明らかである。
標的遺伝子発現を調節するための方法
細胞または対象における遺伝子発現を調節するための方法が、本開示によって提供される。これらの方法は、典型的には、細胞または対象に、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰドメイン）およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む単離された核酸またはｒＡＡＶを投与することを伴う。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰおよびＶＰ６４トランス活性化因子を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰおよびｐ６５トランス活性化因子を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰおよびＲＴＡトランス活性化因子を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＺＦＰおよびＶＰＲトランス活性化因子を含む。一部の実施形態では、この方法は、細胞または対象に、ｄＣａｓ９タンパク質、およびＳＣＮ１Ａを標的化する少なくとも１つのガイド核酸（例えば、配列番号８３～９４のいずれか１つを含む、または配列番号８３～９４のいずれか１つによってコードされるガイド核酸）を投与することを伴う。
融合タンパク質（例えば、トランス活性化因子を含む融合タンパク質）をコードする単離された核酸またはｒＡＡＶを細胞または対象に投与することは、一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の増加した発現を生じる。したがって、一部の実施形態では、本開示によって記載される組成物および方法は、標的遺伝子のハプロ不全から生じる状態、例えば、ＳＣＮ１Ａ遺伝子のハプロ不全から生じるドラベ症候群を処置するために有用である。
本明細書で使用される場合、「ハプロ不全」は、遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の１つのコピーが、例えば、遺伝的変異によって不活性化されるか、または欠失され、その遺伝子の残りの機能的コピーが、その遺伝子の正常な機能を維持するのに十分な量の遺伝子産物を適切に産生しない、遺伝性状態を指す。
乳児重症ミオクロニーてんかんとしても公知のドラベ症候群は、人生の最初の３年間に典型的には顕在化する、稀な生涯にわたる形態のてんかんである。ドラベ症候群は、長期のおよび頻繁なてんかん発作、行動および発育遅延、運動およびバランス問題、遅延した言語および発話問題、ならびに自律神経系の混乱によって特徴付けられる。一部の実施形態では、対象は、ドラベ症候群に関連するハプロ不全、例えば、１コピーの変異したＳＣＮ１Ａ遺伝子を有し、細胞または対象における低減されたＳＣＮ１Ａタンパク質を生じる。ドラベ症候群患者の大部分は、短縮型タンパク質へと翻訳されるＳＣＮ１Ａ変異を保有する；ドラベ症候群に関連する他のＳＣＮ１Ａ変異には、スプライス部位変異およびミスセンス変異、ならびにＳＣＮ１Ａ遺伝子全体にランダムに分布する変異が含まれる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＳＣＮＡ１を標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＳＣＮ１Ａ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、対象は、ＭＥＤ１３Ｌハプロ不全症候群に関連するハプロ不全を有し、この対象は、ＭＥＤ１３Ｌ遺伝子の単一の機能的コピーのみを有する。ＭＥＤ１３Ｌハプロ不全症候群に罹患している対象は、典型的には、ＭＥＤ１３Ｌ遺伝子の第２の非機能的コピー中に変異を有する。ＭＥＤ１３Ｌハプロ不全症候群は、知的障害、発話問題、特徴的な顔面特色および発育遅延によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＭＥＤ１３Ｌ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＥＤ１３Ｌを標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＭＥＤ１３Ｌ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、対象は、骨髄異形成症候群に関連するハプロ不全を有する。骨髄異形成症候群に罹患している対象は、典型的には、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）および／またはＧＡＴＡ２遺伝子の１つのコピー中に変異を有する。骨髄異形成症候群は、骨髄中の未熟な血液細胞が健康な血液細胞に成熟しない一群のがんである。時々、この症候群は、急性骨髄性白血病をもたらし得る。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＩＤＨ１遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＤＨ１を標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＩＤＨ１遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＩＤＨ２遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩＤＨ２を標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＩＤＨ２遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＧＡＴＡ２遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＧＡＴＡ２を標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＧＡＴＡ２遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、対象は、ディジョージ症候群に関連するハプロ不全を有する。ディジョージ症候群に罹患している対象は、典型的には、２２ｑ１１．２として公知の位置における第２２染色体の中央部に３０～４０個の遺伝子の欠失を有する。特に、この疾患は、ＴＢＸ遺伝子のハプロ不全によって特徴付けられ得る。ディジョージ症候群は、先天性の心臓の問題、特定の顔面特色、頻繁な感染、発育遅延、学習問題および口蓋裂によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＴＢＸ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＢＸを標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＴＢＸ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、対象は、ＣＨＡＲＧＥ症候群に関連するハプロ不全を有する。症例の大部分では、ＣＨＡＲＧＥ症候群に罹患している対象は、ＣＨＤ７遺伝子についてハプロ不全である。ＣＨＡＲＧＥ症候群は、眼のコロボーマ、心臓欠損、鼻の後鼻孔の閉鎖症、成長および／または発育の遅滞、生殖器および／または泌尿器異常、ならびに耳の異常および聴覚消失によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＣＨＤ７遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＨＤ７を標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＣＨＤ７遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、対象は、エーラス・ダンロス症候群に関連するハプロ不全を有する。エーラス・ダンロス症候群に罹患している対象は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＴＮＸＢ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＰＬＯＤ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＤＳＥおよび／またはＤ４ＳＴ１／ＣＨＳＴ１４遺伝子についてハプロ不全であり得る。エーラス・ダンロス症候群は、皮膚の過伸展性（ｈｙｐｅｒｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）によって特徴付けられ、大動脈解離、脊柱側弯症および早期発症型変形性関節症を生じ得る。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＴＮＸＢ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＰＬＯＤ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＤＳＥまたはＤ４ＳＴ１／ＣＨＳＴ１４遺伝子のいずれか１つを特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＴＮＸＢ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＰＬＯＤ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＤＳＥまたはＤ４ＳＴ１／ＣＨＳＴ１４のいずれか１つを標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＴＮＸＢ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＰＬＯＤ１、Ｂ４ＧＡＬＴ７、ＤＳＥまたはＤ４ＳＴ１／ＣＨＳＴ１４遺伝子のいずれか１つを特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、対象は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）に関連するハプロ不全を有する。ＦＴＤに罹患している対象は、タウタンパク質をコードするＭＡＰＴ遺伝子、および／またはＧＲＮ遺伝子についてハプロ不全である。ＦＴＤは、記憶喪失、社会意識の欠如、不十分な衝動制御および発話困難によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＭＡＰＴ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＭＡＰＴを標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＭＡＰＴ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＧＲＮ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＧＲＮを標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＧＲＮ遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、対象は、ホルト・オーラム症候群に関連するハプロ不全を有する。ホルト・オーラム症候群に罹患している対象は、ＴＢＸ５遺伝子についてハプロ不全である。ホルト・オーラム症候群は、先天性心臓欠損および心伝導疾患を含む心臓合併症によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＴＢＸ５遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＢＸ５を標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＴＢＸ５遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、対象は、マルファン症候群に関連するハプロ不全を有する。マルファン症候群に罹患している対象は、典型的には、フィブリリン－１タンパク質をコードするＦＢＮ１遺伝子についてハプロ不全である。マルファン症候群は、不釣合いな肢の長さ、早期発症型関節炎、心臓合併症、および／または自律神経系の機能不全によって特徴付けられる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＦＢＮ１遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ＺＦＰドメインおよびトランス活性化ドメインを含む。一部の実施形態では、ＦＢＮ１を標的化するための組成物は、（ｉ）ｄＣａｓタンパク質およびトランス活性化ドメインを含む融合タンパク質、ならびに（ｉｉ）ＦＢＮ１遺伝子を特異的に標的化する（例えば、それに結合する）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。
本開示は、本明細書に記載される融合タンパク質を対象に投与する方法に一部基づく。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＢＤおよび転写活性化因子を含む。一部の実施形態では、ＤＢＤは、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に結合するＺＮＦ、ＴＡＬＥ、ｄＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９もしくはｄＣａｓ１２ａ）またはホメオドメインである。一部の実施形態では、転写活性化因子は、ＶＰ６４、ｐ６５、ＲＴＡ、またはＶＰ６４－ｐ６５－ＲＴＡ（ＶＰＲ）を含む三要素転写活性化因子である。一部の実施形態では、融合タンパク質には、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）配列が隣接している。一部の実施形態では、融合タンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、対象は、ＳＣＮ１Ａ中に、ＳＣＮ１Ａタンパク質ハプロ不全を生じる変異を有する、または有すると疑われる。一部の実施形態では、対象は、ドラベ症候群を有する、または有すると疑われる。
一部の態様では、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、増加させる、減少させるなど）方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、細胞における標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞は、対象中にある（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ）。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物対象、例えば、ヒトである。一部の実施形態では、細胞は、神経系細胞（中枢神経系細胞または末梢神経系細胞）、例えば、ニューロン（例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、単極ニューロン、双極ニューロン、かご細胞、ベッツ細胞、ルガロ細胞（Ｌｕｇａｒｏ ｃｅｌｌ）、有棘ニューロン、プルキンエ細胞、錐体細胞、レンショウ細胞、顆粒細胞、運動ニューロン、紡錘細胞など）またはグリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、放射状グリア、シュワン細胞、サテライト細胞など）である。
「正常」細胞または対象では、標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）の発現は、細胞または対象が標的遺伝子（例えば、ＳＣＮ１Ａ）に関してハプロ不全でないように、十分である。一部の実施形態では、導入遺伝子の「改善された」または「増加した」発現または活性は、本明細書に記載される１つまたは複数の単離された核酸、ｒＡＡＶまたは組成物が投与されていない細胞または対象におけるその導入遺伝子の発現または活性と比較して測定される。一部の実施形態では、導入遺伝子の「改善された」または「増加した」発現または活性は、対象に本明細書に記載される１つまたは複数の単離された核酸、ｒＡＡＶまたは組成物が投与された後の、その対象におけるその導入遺伝子の発現または活性と比較して測定される（例えば、その投与の前および後に、遺伝子発現が測定される）。例えば、一部の実施形態では、細胞または対象におけるＳＣＮ１Ａの「改善された」または「増加した」発現は、融合ＺＦＰ－トランス活性化因子をコードする導入遺伝子が投与されていない細胞または対象と比較して測定される。一部の実施形態では、本開示によって記載される方法は、本開示によって記載される１つまたは複数の組成物が投与されていない対象のＳＣＮ１Ａ発現および／または活性と比較して２倍と１００倍との間（例えば、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍など）増加した、対象におけるＳＣＮ１Ａ発現および／または活性を生じる。
本明細書で使用される場合、用語「処置」、「処置すること」および「療法」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）操作を指す。これらの用語は、既存の症状を好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）こと、さらなる症状を予防すること、症状の根底にある原因を好転させることまたは予防すること、症状、例えば、ハプロ不全遺伝子、例えば、ハプロ不全ＳＣＮ１Ａ遺伝子に関連する症状の原因を予防することまたは逆転させることをさらに含む。したがって、これらの用語は、障害（例えば、ハプロ不全遺伝子に関連する疾患または状態、例えば、ドラベ症候群）を有する対象、またはかかる障害を発症する潜在性を有する対象に、有益な結果が付与されたことを示す。さらに、用語「処置」は、疾患、疾患の症状、または疾患になる素因を癒す、治癒する、軽減する、緩和する、変更する、治療する、好転させる、改善するまたは影響を与えることを目的とした、疾患、疾患の症状、または疾患になる素因を有し得る対象、または対象から単離された組織もしくは細胞系への薬剤（例えば、治療剤または治療的組成物、例えば、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域を標的化するまたはそれに結合する単離された核酸またはｒＡＡＶ）の適用または投与もまた含む。
治療剤または治療的組成物は、特定の疾患（例えば、ハプロ不全遺伝子に関連する疾患または状態、例えば、ドラベ症候群）の症状を予防するおよび／または低減させる薬学的に許容される形態で、化合物を含み得る。例えば、治療的組成物は、ハプロ不全遺伝子に関連する疾患または状態、例えば、ドラベ症候群の症状を予防するおよび／または低減させる医薬組成物であり得る。本発明の治療的組成物は、任意の適切な形態で提供されることが企図される。治療的組成物の形態は、本明細書に記載される投与様式を含むいくつかの因子に依存する。治療的組成物は、本明細書に記載される他の成分の中でも、希釈剤、佐剤および賦形剤を含有し得る。
投与様式
本開示の単離された核酸、ｒＡＡＶおよび組成物は、当該分野で公知の任意の適切な方法に従って、組成物中で対象に送達され得る。例えば、生理学的に適合性の担体中に（例えば、組成物中に）好ましくは懸濁されたｒＡＡＶは、対象、即ち、宿主動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウまたは非ヒト霊長類（例えば、マカク）に投与され得る。一部の実施形態では、宿主動物は、ヒトを含まない。
哺乳動物対象へのｒＡＡＶの送達は、例えば、筋肉内注射によって、または哺乳動物対象の血流中への投与によってであり得る。血流中への投与は、静脈、動脈または任意の他の脈管導管中への注射によってであり得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、外科の分野において周知の技法である隔離肢灌流によって血流中に投与され、この方法は、当業者がｒＡＡＶビリオンの投与の前に全身循環から肢を隔離することを本質的に可能にする。米国特許第６，１７７，４０３号に記載される隔離肢灌流技法の変種もまた、筋肉細胞または組織中への形質導入を潜在的に増強するために、隔離された肢の脈管構造中にビリオンを投与するために当業者によって使用され得る。さらに、ある特定の場合には、対象のＣＮＳにビリオンを送達することが望ましい場合がある。「ＣＮＳ」は、脊椎動物の脳および脊髄の全ての細胞および組織を意味する。したがって、この用語には、ニューロン細胞、グリア細胞、アストロサイト、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔、骨、軟骨などが含まれるがこれらに限定されない。組換えＡＡＶは、例えば、脳室領域中への注射によってＣＮＳまたは脳に直接、ならびに針、カテーテルまたは関連のデバイスを用いて、当該分野で公知の神経外科的技法を使用して、例えば、定位的注射によって、線条体（例えば、線条体の尾状核または被殻）、視床、脊髄および神経筋接合部、または小脳小葉に、送達され得る（例えば、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：３４２４－３４２９， １９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９７：３４２８－３４３２， ２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３：２１９－２２３， １９９３；およびＡｌｉｓｋｙ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １１：２３１５－２３２９， ２０００を参照されたい）。一部の実施形態では、本開示に記載されるｒＡＡＶは、静脈内注射によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、脳内注射によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、髄腔内注射によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、線条体内注射によって投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、頭蓋内注射によって送達される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、大槽注射によって送達される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、大脳側脳室注射によって送達される。
本開示の態様は、カプシドタンパク質と導入遺伝子をコードする核酸とを含む組換えＡＡＶを含む組成物に関し、この導入遺伝子は、１つまたは複数のタンパク質をコードする核酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
本開示の組成物は、ｒＡＡＶを、単独で、または１つもしくは複数の他のウイルス（例えば、１つまたは複数の異なる導入遺伝子をコードする有する第２のｒＡＡＶ）と組み合わせて含み得る。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の異なる導入遺伝子を各々が有する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの異なるｒＡＡＶを含む。
適切な担体は、ｒＡＡＶが指向される適応症を考慮して、当業者によって容易に選択され得る。例えば、１つの適切な担体には、種々の緩衝溶液を用いて製剤化され得る食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）が含まれる。他の例示的な担体には、無菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ラッカセイ油、ゴマ油および水が含まれる。担体の選択は、本開示の限定ではない。
必要に応じて、本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体（複数可）に加えて、他の従来の薬学的成分、例えば、防腐剤または化学安定化剤を含有し得る。適切な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノールおよびポロクサマー（非イオン性界面活性剤）、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８が含まれる。適切な化学安定化剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。
ｒＡＡＶは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害効果なしに十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供するのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路には、選択された臓器への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内および他の非経口投与経路が含まれるがこれらに限定されない。投与経路は、所望により組み合わされ得る。
特定の「治療効果」を達成するために要求されるｒＡＡＶビリオンの用量、例えば、体重１キログラム当たりのゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）での用量の単位は、ｒＡＡＶビリオン投与の経路、治療効果を達成するために要求される遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、処置されている具体的な疾患または障害、および遺伝子またはＲＮＡ産物の安定性が含まれるがこれらに限定されないいくつかの因子に基づいて変動する。当業者は、上述の因子だけでなく、当該分野で周知の他の因子に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を処置するためのｒＡＡＶビリオン用量範囲を容易に決定することができる。
ｒＡＡＶの有効量は、動物の感染を標的化する、所望の組織を標的化するのに十分な量である。一部の実施形態では、有効量のｒＡＡＶは、リソソーム蓄積症の症状が出る前の段階の間に対象に投与される。一部の実施形態では、リソソーム蓄積症の症状が出る前の段階は、誕生時（例えば、周産期）と４週齢との間に存在する。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、特に、高いｒＡＡＶ濃度（例えば、約１０１３ＧＣ／ｍＬまたはそれよりも高い濃度）が存在する場合に、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を低減させるように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を低減させるための方法は、当該分野で周知であり、これには、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整などが含まれる（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ＦＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （２００５） １２， １７１－１７８を参照されたい。その内容は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤化は、本明細書に記載される特定の組成物を種々の処置レジメンにおいて使用するために適切な投薬および処置レジメンの開発同様、当業者に周知である。
典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多くの活性化合物を含有し得るが、活性成分（複数可）のパーセンテージは、もちろん変動し得、簡便には、製剤全体の約１もしくは２％と約７０％もしくは８０％またはそれよりも多くとの間の重量または体積であり得る。当然、各治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投薬量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方法で調製され得る。因子、例えば、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の保存可能期間、ならびに他の薬理学的考慮事項は、かかる医薬製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、種々の投薬量および処置レジメンが望まれ得る。
ある特定の状況では、本明細書で開示される適切に製剤化された医薬組成物中のｒＡＡＶベースの治療的構築物を、皮下、膵内、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、もしくは経口で、腹腔内で、または吸入によって送達することが望ましい。一部の実施形態では、米国特許第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号および同第５，３９９，３６３号（各々具体的に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される投与モダリティが、ｒＡＡＶを送達するために使用され得る。一部の実施形態では、好ましい投与様式は、門脈静脈注射によるものである。
注射可能な使用のために適切な薬学的形態には、無菌水性溶液または分散物、および無菌の注射可能な溶液または分散物の即時の調製のための無菌粉末が含まれる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中でも、ならびに油中でも調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。多くの場合、形態は、無菌であり、容易なシリンジ通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで、流動的である。形態は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用によって、分散物の場合には要求される粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中での、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
注射可能な水性溶液の投与のために、例えば、溶液は、適切に緩衝され得、必要に応じて、液体希釈剤は、十分な食塩水またはグルコースを用いて最初に等張にされ得る。これらの特定の水性溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のために特に適切である。これに関して、使用され得る無菌水性媒体は、当業者に公知である。例えば、１つの投薬量は、１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され得、１０００ｍＬの皮下注入液に添加され得るか、または提案された注入部位に注射され得る（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。投薬量におけるある程度の変動が、宿主の状態に依存して必然的に生じる。投与を担う人は、いずれにしろ、個々の宿主に適切な用量を決定する。
無菌の注射可能な溶液は、本明細書で列挙された種々の他の成分と共に、適切な溶媒中に、要求される量で活性なｒＡＡＶを取り込み、その後、必要に応じて、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本分散媒および上で列挙されたものからの要求される他の成分を含有する無菌ビヒクル中に、種々の滅菌された活性成分を取り込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、前もって無菌濾過されたその溶液から、活性成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥およびフリーズドライ技法である。
本明細書で開示されるｒＡＡＶ組成物は、中性または塩形態でも製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成された）および無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成された塩などが含まれる。遊離カルボキシル基を用いて形成された塩はまた、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。製剤化の際に、溶液は、投薬製剤と適合性の様式で、治療的に有効な量で、投与される。製剤は、種々の投薬形態、例えば、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどで容易に投与される。
本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁物、コロイドなどを含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。補足的活性成分もまた、組成物中に取り込まれ得る。語句「薬学的に許容される」は、宿主に投与された場合にアレルギー反応も同様の厄介な反応も生じない、分子実体および組成物を指す。
送達ビヒクル、例えば、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などが、適切な宿主細胞中への本開示の組成物の導入のために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクターで送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェアまたはナノ粒子など中にカプセル化されて、送達のために製剤化され得る。
かかる製剤は、本明細書で開示される核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容される製剤の導入のために好ましい場合がある。リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に公知である。最近、改善された血清安定性および循環半減時間を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の種々の方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号；同第５，５５２，１５７号；同第５，５６５，２１３号；同第５，７３８，８６８号および同第５，７９５，５８７号）。
リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに対して通常は抵抗性のいくつかの細胞型で首尾よく使用されてきた。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡの長さの制約から自由である。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを種々の培養細胞系および動物中に導入するために有効に使用されてきた。さらに、リポソーム媒介性薬物送達の有効性を調べるいくつかの首尾よい臨床試験が完了している。
リポソームは、水性媒体中に分散された、多重膜同心二重層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水性溶液を含有する、２００～５００Åの範囲内の直径を有する小さい単層膜小胞（ＳＵＶ）の形成を生じる。
あるいは、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤が使用され得る。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再現性のある方法で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、かかる超微細粒子（おおよそ０．１μｍのサイズ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで分解されることができるポリマーを使用して設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
上記送達の方法に加えて、以下の技法もまた、ｒＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替的な方法として企図される。ソノフォレーシス（即ち、超音波）が使用されており、循環系中へのおよび循環系を介した薬物浸透の速度および有効性を増強するためのデバイスとして、米国特許第５，６５６，０１６号に記載されている。企図される他の薬物送達代替法は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼科製剤（Ｂｏｕｒｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号および同第５，７８３，２０８号）およびフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）である。
（実施例１）
ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を上方調節するためのジンクフィンガータンパク質の設計
ヒト（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）ＳＣＮ１Ａプロモーター配列とマウス（ＨＥＰＧ２細胞）ＳＣＮ１Ａプロモーター配列との間の相同な領域を、各種についてのＲＩＫＥＮ ＣＡＧＥ－ｓｅｑデータセットにおいて同定された２つの目を引く転写開始部位の周囲の配列のアラインメントによって同定した（図１）。ヒト（ＨＥＫ）とマウス（ＨＥＰＧ２）との間で高度に保存された配列は、ＳＣＮ１Ａの近位プロモーター領域中に存在する（図２）。６つのフィンガーからなる３つのＺＦＰを、あらかじめ規定されたＤＮＡ結合特異性を有する１および２フィンガーモジュールのアセンブリを介して、ＳＣＮ１Ａの近位プロモーター領域中の重複する１５～２２ヌクレオチドの相同性の領域に結合するように設計した（図３）。各々６つのフィンガーからなる３つのＺＦＰ（ＺＦＰ１～ＺＦＰ３）を、図３中で同定された重複する高度に保存された配列に結合するように設計した。各フィンガーを、ＳＣＮ１Ａの近位プロモーターの高度に保存された領域中の３塩基領域（トリプレット）に結合するように設計する。
ＺＦＰ－１は、図４Ａに示されるように、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号２）内の個々の３塩基領域（「・」によって分離された、赤で示されるＤＮＡトリプレット）を認識する。ＺＦＰ－１のフィンガー１～６の各認識ヘリックス（７アミノ酸）は、図４Ｂに示されるように、３ヌクレオチド配列に結合する。ＺＦＰ－１の６つのフィンガーのアミノ酸配列（配列番号１７～２２）は、図４Ｃに示される；フィンガー間のリンカーは、カノニカル（ＴＧＥＫＰ）および非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を指定するために強調される。ＺＦＰ－１の６つのフィンガーのヌクレオチド配列（配列番号１１～１６）は、図４Ｄに示される。
Figure 2023535025000017
ＺＦＰ－２は、図５Ａに示されるように、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号３）内の個々の３塩基領域（「・」によって分離された、赤で示されるＤＮＡトリプレット）を認識する。ＺＦＰ－２のフィンガー１～６の各認識ヘリックス（７アミノ酸）は、図５Ｂに示されるように、３ヌクレオチド配列に結合する。ＺＦＰ－２の６つのフィンガーのアミノ酸配列（配列番号２９～３４）は、図５Ｃに示される；フィンガー間のリンカーは、カノニカル（ＴＧＥＫＰ）および非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を指定するために強調される。ＺＦＰ－１の６つのフィンガーのヌクレオチド配列（配列番号２３～２８）は、図５Ｄに示される。
Figure 2023535025000018
ＺＦＰ－３は、図６Ａに示されるように、ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域（配列番号４）内の個々の３塩基領域（「・」によって分離された、赤で示されるＤＮＡトリプレット）を認識する。ＺＦＰ－３のフィンガー１～６の各認識ヘリックス（７アミノ酸）は、図６Ｂに示されるように、３ヌクレオチド配列に結合する。ＺＦＰ－３の６つのフィンガーのアミノ酸配列（配列番号４１～４６）は、図６Ｃに示される；フィンガー間のリンカーは、カノニカル（ＴＧＥＫＰ）および非カノニカル（ＴＧＳＱＫＰ）リンカー配列を指定するために強調される。ＺＦＰ－１の６つのフィンガーのヌクレオチド配列（配列番号３５～４０）は、図６Ｄに示される。
Figure 2023535025000019
ＳＣＮ１Ａ遺伝子の近位プロモーター領域中の保存された配列を標的化するように設計されたさらなるＺＦＰは、各々５つまたは６つのフィンガードメインを含み、ヒトＳＣＮ１ＡとマウスＳＣＮ１Ａとの間で高度に保存された１５～２２ヌクレオチドの領域に結合する。
Figure 2023535025000020
Figure 2023535025000021
（実施例２）
ＺＦＰは、ヒト細胞においてＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を増加させる
ＳＣＮ１Ａの転写を上方調節するＺＦＰ１～ＺＦＰ３の能力を調べるために、ＺＦＰ１～ＺＦＰ３のＤＮＡ結合ドメインを、ハイブリッドのＶＰ６４、ｐ５３およびＲＴＡ（ＶＰＲ）の強い三要素転写活性化因子ドメインに融合させて、キメラトランス活性化因子を形成した。ＶＰＲ融合活性化因子ドメインは、転写調節複合体を動員し、クロマチンアクセス可能性を増加させるように作用し、高レベルの遺伝子発現を達成することを補助する。したがって、ＺＦＰドメインは、近位プロモーター領域中の高度に保存された配列にＶＰＲ活性化因子を標的化して、ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を増加させる。
ＶＰＲ－ＺＦＰ１、ＶＰＲ－ＺＦＰ２および／またはＶＰＲ－ＺＦＰ３融合タンパク質をコードする発現プラスミドを、一過的トランスフェクションを介してＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲ（正規化のための参照としてＴＢＰ発現を使用する）によって測定した。ＶＰＲ－ＺＦＰ融合物は、ＶＰＲに融合されたＺＦＰ１、ＺＦＰ２および／またはＺＦＰ３を含む。各々ＶＰＲに融合されたＺＦＰ１、ＺＦＰ２およびＺＦＰ３ ＤＮＡ結合ドメインを含有する、多重調節のための３つの構築物のトランスフェクションは、トランスフェクトされていない細胞と比較して、４５倍増加したＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を生じ、これは、ＶＰＲ－ＺＦＰキメラトランス活性化因子が、遺伝子のプロモーター近位領域中に結合することによって、ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を増加させることができることを示している（図７）。
ＶＰＲ－［ＺＦＰ１～ＺＦＰ３］融合タンパク質、ならびにＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが現在設計されているＶＰＲ－ＺＦＰ融合タンパク質を、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＰＧ２細胞中にトランスフェクトし、これらの細胞は共に、低レベルのＳＣＮ１Ａ発現を有する。ＶＰＲ－ＺＦＰ融合タンパク質は、ＶＰＲトランス活性化因子に融合された、単一のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン、ならびに複数のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインの組合せを含有する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定して、これらのＶＰＲ－ＺＦＰ融合物が遺伝子発現を増加させることができるかどうかを決定する。最も有望なＶＰＲ－ＺＦＰ融合物候補を、ＳＣＮ１Ａ発現を増加させる能力について、融合タンパク質のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）送達後に、初代マウス皮質ニューロンにおいて試験する。
ＺＦＰドメインの特異性を、細菌ワンハイブリッド選択システム（例えば、Ｍｅｎｇ， ｅｔ ａｌ．， “Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，” Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ２００８を参照されたい）を使用してさらに最適化して、ＤＮＡ結合において重要な残基が変動されたランダム化されたライブラリーから、理想的なＺＦＰを同定する。新たに選択されたＺＦＰを、個々に、ならびに複数のＺＦＰの組合せでの両方で、ＶＰＲトランス活性化因子ドメインに融合させ、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨＥＰＧ２細胞、ならびに初代マウス皮質ニューロン中にトランスフェクトして、ｑＲＴ－ＰＣＲ解析後にＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を最も増加させる候補ＺＦＰドメインを同定する。
（実施例３）
変動する効力を有するＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子シリーズを生成する
実施例２からの、ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を上方調節するのに最も有効なＺＦＰを、見込まれる効力の勾配で、一連のヒトトランス活性化ドメイン（例えば、Ｒｔａ、ｐ６５、Ｈｓｆ１など）に融合させて、ＡＡＶ感染多重度（ＭＯＩ）の範囲にわたりＳＣＮ１Ａ遺伝子発現の２倍の上方調節を達成するアセンブリを同定する。正常およびＳＣＮ１Ａ＋／－マウス由来のマウス初代皮質ニューロンに、ＺＦＰＳＣＮ１Ａ融合トランス活性化因子を発現するＡＡＶベクターを感染させる。ＮａＶ１．１タンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロット使用およびｑＰＣＲによって評価する。この処置は、ＮａＶ１．１タンパク質発現を約６～８倍増加させるので、ＴＧＦ－αで８時間処置した初代ニューロンを陽性対照として使用する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ １２： １２６）。他のＮａＶアルファサブユニット遺伝子の発現レベルにおける変化もまた評価して、ＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化の仕様を実証する。免疫蛍光を使用して、ＺＦＰＳＣＮ１Ａ（ＨＡタグ）に対する抗体およびＧＡＢＡ作動性ニューロンに特異的なマーカー（例えば、パルブアルブミン＋またはソマトスタチン＋）またはユニバーサルニューロンマーカー（例えば、ＮｅｕＮ、ＴＵＢＩＩＩおよび／またはＭａｐ２）による二重免疫蛍光染色を介して、ＮａＶ１．１発現がＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに制限されたままであるかどうかを決定する。ＳＣＮ１Ａ遺伝子のトランス活性化についてのＺＦＰＳＣＮ１Ａの特異性もまた、ＣｈＩＰ－ＳｅｑおよびＲＮＡ－Ｓｅｑによって評価して、ゲノム結合部位および遺伝子移入の際に生成された得られたトランスクリプトームプロファイルをマッピングする。
（実施例４）
プロモーター活性依存的なＳＣＮ１Ａ－ＺＦＰトランス活性化因子の設計をガイドするための、ＧＡＢＡ作動性抑制剤におけるＳＣＮ１Ａプロモーターのヒストン組織化およびエピゲノムランドスケープ
ＺＦＰがゲノム標的に結合する能力は、標的配列のアクセス可能性（例えば、ヌクレオソームなしの領域の存在）に依存する。ＤＮＡアクセス可能性についてのこの要件を活用して、ＤＮＡ標的配列アクセス可能性の存在に基づいて、細胞型のサブセットにおいてのみ機能的なＺＦＰトランス活性化因子を設計する。細胞型活性におけるさらなる制限を、ＺＦＰトランス活性化因子発現のための組織特異的プロモーターの使用を介して達成する。フグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）ソマトスタチンおよびニューロペプチドＹ遺伝子由来の小さいプロモーターは、ＡＡＶベクターおよびレンチウイルスの両方の状況下で、皮質および海馬の抑制性介在ニューロンにおいて高度に特異的な導入遺伝子発現を駆動することが示されている。一部の実施形態では、ＤＮＡアクセス可能性に対して敏感なＳＣＮ１Ａ特異的ＺＦＰのＡＡＶベースの転写制限の組合せは、脳のあらゆる場所の抑制性介在ニューロンにおけるＮａＶ１．１タンパク質発現の高度に特異的な上方調節を生じる。この二重調節アプローチは、それが通常発現されない細胞におけるＮａＶ１．１タンパク質の異所的発現から生じ得る副作用を最小化する。
ＳＣＮ１Ａプロモーターのヌクレオソーム構造およびエピジェネティックランドスケープを、マウスおよびヒトのＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンおよびグルタミン酸作動性興奮性ニューロンの両方において解析する。この情報を使用して、この細胞型においてのみアクセス可能なＳＣＮ１Ａ遺伝子座周囲の配列の標的化を介して、ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンに制限されるＺＦＰトランス活性化因子を設計する。
ＧＡＤ６７プロモーターの下でＴｄＴｏｍａｔｏを発現するトランスジェニックマウス由来のＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンと、Ｅｍｘ１－ＩＲＥＳ－ＣｒｅをＲＯＳＡ２６／ｓｔｏｐ／ＥＧＦＰマウスと交雑させることによって生成したＧＦＰ陽性グルタミン酸作動性興奮性ニューロンとを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して単離する。ヒトＧＡＢＡ作動性ニューロンおよび興奮性ニューロンを、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）細胞から生成し、これらの細胞型に特異的なマーカーについての免疫染色およびＲＴ－ＰＣＲの両方、ならびに電気生理学的活性を使用して確認する。マウスおよびヒトのニューロン集団におけるＳＣＮ１Ａプロモーター周囲のアクセス可能なゲノム領域を、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンについてのアッセイ（Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ－Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）（ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ）を使用して特徴付ける。
ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいてのみアクセス可能な配列を認識するＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子を、抑制性ニューロンおよび興奮性ニューロンにおけるＳＣＮ１Ａプロモーター周囲のゲノム領域の差次的クロマチンアクセス可能性に基づいて設計する。一連の候補ＺＦＰ－ＶＰＲトランス活性化因子融合物を、異なるＳＣＮ１Ａのアクセス可能な領域を標的化するために生成し、ここで、トランス活性化因子の結合は、抑制性領域におけるＮａＶ１．１発現を強力に上方調節するだけでなく、興奮性ニューロンにおけるＮａＶ１．１発現の任意の所望されない誘導された発現を明らかにすると予想される。
発現研究を、培養ヒトｉＰＳ由来ニューロンおよびドラベ症候群をモデル化するマウスＳＣＮ１Ａ＋／－初代ニューロンにおいて実施して、抑制性ニューロンにおいてのみアクセス可能なＤＮＡ配列を認識するように設計したＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子が、汎ニューロンヒトシナプシン－１または抑制性介在ニューロン特異的プロモーターの下でＡＡＶベクターから発現させた場合に、必要な特異性を提供するかどうかを決定する。ＮａＶ１．１発現レベルを、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ウエスタンブロット、ならびに抑制性ＧＡＢＡ作動性ニューロン（例えば、ＧＡＢＡ＋、ＧＡＤ６５／６７＋、ソマトスタチンおよび／またはパルブアルブミン）および興奮性グルタミン酸作動性ニューロン（例えば、Ｃｕｘ１＋、ＦｏｘＧ１、＋、ＧＡＢＡＡ受容体、ＧＡＢＡ－）についてのニューロン型特異的マーカーを用いた二重免疫蛍光によって測定する。シンテニー領域内のクロマチン構造およびＤＮＡ配列は種間で異なるので、ＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子の細胞型特異性を、マウスおよびヒトＳＣＮ１Ａプロモーター中の異なる配列を標的化するように設計する。これらの実験における対照は、ＧＦＰ、トランス活性化ドメインなしのＺＦＰ、またはＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインなしのトランス活性化因子をコードする同様のＡＡＶベクターを感染させたニューロン培養物を含む。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を、所望されない発現が生じている細胞型（例えば、グルタミン酸作動性興奮性ニューロン）に制限されるＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）内に取り込む。このアプローチは、ＡＡＶ送達された導入遺伝子の発現を制限するために以前に利用された（Ｘｉｅ， ｅｔ ａｌ．， “ＭｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ， ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｒＡＡＶ９： ａ ｓｔｅｐ ｃｌｏｓｅｒ ｔｏ ＣＮＳ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，” Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ２０１１）。ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンおよび他の細胞型のｍｉＲＮＡ発現プロファイルにおける差異を、スモールＲＮＡ配列決定によって決定する。
（実施例５）
患者由来のｉＰＳから生成されたＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおけるナトリウム電流欠損を修正するＡＡＶ－ＺＦＰＳＣＮ１Ａ遺伝子療法の潜在性を評価する
ドラベ症候群のためのＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子（複数可）の開発に向かう重要なステップは、これらの人工トランス活性化因子が、ヒトニューロンにおいて所望の機能を有することを実証することである。この目的のために、ドラベ患者（ｎ＝４～６）および非ドラベ患者（ｎ＝４）由来のｉＰＳ細胞を得る。非ドラベの遺伝的背景が、これらの細胞内で示され、これは、遺伝子発現を人工的に操作する必要性を取り除き、したがって、ｉＰＳ細胞は、生物医学研究のための最先端の細胞系として浮上している。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ゲノム編集技術を利用して、ＳＣＮ１Ａ中の遺伝的変異を野生型配列へと修復することによって、またはドラベ関連の変異を、対照細胞系内の正常対立遺伝子中に導入することによって、同質遺伝子細胞系を創出する。同質遺伝子系は、それにより、異なるヒト対象由来の細胞系を比較することから生じる天然の変動性を除外し、したがって、疾患特異的表現型を確認するおよび増強させるのに役立つ。確立された抑制性ニューロン分化プロトコールおよび検証パイプラインを使用して、ｉＰＳ細胞系を前脳ＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンへと分化させる。
ドラベ患者に由来する抑制性ニューロンは、ホールセルパッチクランプ電気生理学測定によって決定した場合、低減されたナトリウム電流および損なわれた活動電位発火を示す。同様の測定を実施して、本明細書に記載されるドラベ由来のニューロンがこれらの疾患関連表現型を再現することを確認する。ナトリウム電流欠損は、ドラベ患者の抑制性ニューロンにおいて生じるが、興奮性ニューロンでは生じず（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ）、したがって、抑制性ニューロンのみが本開示において利用される。ドラベ患者由来の抑制性ニューロンにおける変異誘導性のナトリウムチャネル欠損は、野生型ＳＣＮ１Ａの異所的発現によってレスキューすることができる（ｒｅｆ ２０）。したがって、本開示に記載される方法は、ドラベ症候群の状況における野生型ナトリウムチャネルの機能および生理の回復におけるＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子の有効性を試験するために適切である。
ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロン培養物に、ユニバーサルニューロンプロモーターまたは抑制性ニューロン特異的プロモーターの下にＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子をコードするＡＡＶベクターを感染させる。ＮａＶ１．１発現レベルにおける変化を、ウエスタンブロットによって評価する。抑制性ニューロンにおける機能的ナトリウム電流の回復を、トランスフェクトされた細胞と比較した、トランスフェクトされていない細胞のホールセルパッチクランプを介して評価する。全ての患者由来の抑制性ニューロンにおけるゲノムにわたるＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子の結合を、ＣｈＩＰ－ｓｅｑによって解析し、ＲＮＡ－ｓｅｑによって検出された任意の同定されたトランスクリプトーム変化と相関付ける。これらの実験における対照は、ＧＦＰ、ＶＰＲトランス活性化因子ドメインなしのＺＦＰ、およびＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインなしのＶＰＲトランス活性化因子ドメインをコードする同様のＡＡＶベクターを感染させたニューロン培養物である。
（実施例６）
ＳＣＮ１Ａマウスにおける異なる齢および送達経路におけるＡＡＶ－ＺＦＰＳＣＮ１Ａ介入の治療的潜在性を評価する
ＡＡＶの広いトロピズムは、広く発現される遺伝子のための遺伝子療法適用にとって重要な特性であるが、目的の導入遺伝子が細胞型特異的様式で発現される場合には、重要な課題になり得る。これは、組織特異的プロモーター、例えば、それぞれ、チロキシン結合タンパク質（ＴＢＰ）、クレアチンキナーゼおよびトロポニンＴの使用を介して、身体中の主要組織、例えば、肝臓、筋肉および心臓についてはほとんど解決している。さらなるレベルの制御が、それらの組織中で高度に豊富なｍｉｃｒｏＲＮＡ、例えば、肝臓中のｍｉＲ－１２２および骨格筋中のｍｉＲ－１に対する複数コピーの結合部位の取込みによって、特定の組織からのより高い程度の脱標的化（ｄｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を達成するために、組織特異的プロモーターに重ね合わされ得る。最近記載されたＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ血清型は、全身送達後のＣＮＳ遺伝子移入に関して例外的に効率的であり、広い範囲の細胞型を形質導入する。さらに、末梢組織へのそのトロピズムは、ほとんど、ＡＡＶ９と同様に広い。ドラベ症候群に対する遺伝子療法アプローチの目標は、他のニューロンおよび他の場所において、異所的発現からの有害な効果を防止しつつ、ＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンにおいて排他的にＮａＶ１．１発現を回復させることである。フグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ）ソマトスタチン（ｆＳＳＴ）およびニューロペプチドＹ（ｆＮＰＹ）遺伝子に由来する小さいプロモーター（＜２．８ｋｂ）の下にＧＦＰをコードするＡＡＶおよびレンチウイルスベクターは、頭蓋内注射の際にマウス脳における抑制性ニューロン特異的発現を駆動することが示されている。ＧＦＰ発現を駆動するこれらのプロモーターを保有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターを、遍在性の強力なＣＡＧプロモーターおよび比較的弱いマウス最小ＭｅＣＰ２プロモーターによって導入遺伝子発現が駆動される対照ベクターと比較する。ＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに対する、ｆＳＳＴおよびｆＮＹＰプロモーターを有するＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ＧＦＰベクターの特異性を、６週齢（尾部静脈）および出生後１日目（後眼窩）マウスにおける全身投与によるＣＮＳへの送達、新生仔におけるＣＳＦ送達、ならびに最後に、歯状回（ＤＧ）を標的化する片側性の注射に関して研究する（表５）。ＣＮＳ遺伝子移入の効率は送達経路によってかなり変動し、異なる齢のＳｃｎ１ａ＋／－マウスが処置されることに起因して、広い解析を実施して、各送達経路について、ニューロン形質導入有効性と、ＣＮＳの至る所でのＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンに対するプロモーター特異性とのベースラインを確立する。短いｆＳＳＴおよびｆＮＹＰプロモーターからのＧＦＰ発現を駆動するＡＡＶベクターは、直接注射の後に、海馬中の抑制性介在ニューロンに高度に特異的であることが以前に示されている。本開示のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターを、引き続く研究と同じ様式で検証し、ここで、歯状回と顆粒細胞層の内層とに特異的に位置するＳｃｎ１ａ＋／－マウスの海馬体中の抑制性ニューロンにおいてＮａＶ１．１発現を回復させることの治療的影響を評価する（論拠は以下に述べられる）。実験を、１２９ＳｖＪをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得たＣ５７ＢＬ／６マウスと交配することによってＵＭＭＳにおいて生成した１２９ＳｖＪ／Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて実施する。マウスを、注射の１か月後に安楽死させ、脳および脊髄を、細胞特異的マーカーおよびＧＦＰに対する抗体を用いた二重免疫蛍光を使用する形質導入効率および特異性の組織学的解析のために収集する。ＧＡＢＡ作動性抑制性介在ニューロンについての遺伝子移入効率および特異性を、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ；ＧＡＢＡ作動性ニューロンについてのマーカー）およびＧＦＰに対する抗体を用いた二重免疫蛍光染色によって、脳および脊髄の至る所で評価する。さらに、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、パルブアルブミン（ＰＶ）、カルレチニン（ＣＲ）、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）またはニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）を発現する抑制性介在ニューロンのサブセットに対するプロモーターおよび／またはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂの優先的な特異性を、それらのタンパク質およびＧＦＰに特異的な抗体を使用して評価する。肝臓、心臓および骨格筋を、全身およびＩＣＶ投与によって処置したマウスから収集して、ＧＦＰ発現を組織学的に評価し、ウエスタンブロットを利用して、末梢組織における異所的発現の可能性を決定する。
Figure 2023535025000022
 ＊群は、両方の性別からの同数のマウスから構成される。
＃ベクター１つ当たり１匹の同腹仔に注射した
略語：ＩＣＶ－脳室内注射； ＩＣ－頭蓋内注射； ＰＮＤ１－出生後１日目
６週齢Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスに、ＺＦＰＳｃｎ１ａ活性化ドメインを有するがＤＮＡ結合ドメインを有さない構築物である、異なるＺＦＰＳｃｎ１ａトランス活性化因子タンパク質をコードするＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターの、歯状回中への両側性注射を投与して、活性化因子単独、または同じ体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の影響について制御する（ｎ＝３匹の雄性＋３匹の雌性／群）。これらの実験で使用する一本鎖ＡＡＶベクターは、形質導入された細胞の同定を促進するために、ＺＦＰＳｃｎ１ａｃＤＮＡの下流にＩＲＥＳ－ＧＦＰカセットもまた保有する。種々のニューロンにおけるより広い活性化を有し得る少なくとも２つのＺＦＰＳｃｎ１ａトランス活性化因子、ならびに上記２つの最も有望なＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンに制限されたＺＦＰＳＣＮ１Ａトランス活性化因子を試験する。注射の１か月後、脳を収集し、一方の脳半球からの海馬を解剖して、ベータ－アクチンまたはチューブリンをローディング対照として使用するウエスタンブロットによって、ＺＦＰＳｃｎ１ａ、ＮａＶ１．１、ＮａＶ１．３、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７タンパク質の発現レベルを評価する。他方の脳半球を、連続脳切片（１０μｍ）を使用する組織学的研究によって調べて、ＧＡＤおよびＧＦＰに対する抗体、またはＧＡＤおよび全てのＺＦＰＳｃｎ１ａタンパク質中に含まれるエピトープタグ（ＨＡもしくはｍｙｃタグ）に対する抗体を用いた二重免疫蛍光染色によって、歯状回と顆粒細胞層の内葉（ｉｎｎｅｒ ｌｅａｆｌｅｔ）とにおける形質導入された抑制性介在ニューロンの％を解析する。また、ＮａＶ１．１およびＮａＶ１．３を発現するＧＡＤ陽性ニューロンのパーセンテージを決定して、ナトリウムチャネル発現の正常パターンの回復を実証する。ＮａＶ１．１およびＮａＶ１．３タンパク質発現の免疫蛍光検出に加えて、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンにおけるｍＲＮＡレベルの変化を、ＮａＶ１．１、ＮａＶ１．３、ＺＦＰＳｃｎ１ａおよびＧＡＤについてのＲＮＡｓｃｏｐｅプローブを使用して評価する。ＲＮＡＳｃｏｐｅは、脳のニューロン中のｍＲＮＡレベルを解析するための高感度のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法である。ＺＦＰＳｃｎ１ａ発現から生じるＮａＶ１．１レベルにおける変化を評価するためのこれら２つのアプローチの組合せは、介在ニューロンにおける変化が本開示の遺伝子療法アプローチによってどのように達成されるかの包括的な理解を提供する。
ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ－ＺＦＰＳｃｎ１ａ遺伝子療法の治療有効性を、尾部静脈を介して出生後１日目または６週齢において開始して、両方の性別のＳｃｎ１ａ＋／－マウスにおいて解析する。対照は、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインなしのＺＦＰ様タンパク質をコードするＡＡＶベクターで処置したマウス、ならびに齢が一致した未処置のＳｃｎ１ａ＋／－マウスおよび野生型同腹仔（１群当たりｎ＝１５匹の雄性および１５匹の雌性）を含む。各群中のマウスのサブセット（ｎ＝３匹の雄性および３匹の雌性）を、１２週齢の時点で安楽死させて、ウエスタンブロット、ならびにＧＡＤ（および他のニューロン型特異的マーカー、例えば、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７）およびＺＦＰに対する抗体を用いた免疫蛍光を使用して、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンへの遺伝子移入効率を評価し、脳および脊髄の至る所の細胞におけるＮａＶ１．１発現の回復を評価する。さらに、末梢組織におけるＺＦＰの異所的発現を、ＮａＶ１．１発現と一緒に評価する。各群中の動物の他のサブセット（ｎ＝２４）を使用して、生存（最大で１歳）、運動性能および行動に対する影響を研究し、これは、２月齢から１２月齢まで、２か月毎に試験する。Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスは、ＰＮＤ２１によって前肢および後肢の損なわれた協調を示すので、運動機能および協調を、加速ロータロッドおよび梁横断試験（ｂｅａｍ ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｔｅｓｔ）を使用して評価する。さらに、Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスにおいてひどく損なわれるようである、オープンフィールド、高架式十字迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ ｍａｚｅ）、営巣、ガラス玉覆い隠し（ｍａｒｂｌｅ ｂｕｒｙｉｎｇ）ならびに空間学習および記憶を試験するためのバーンズ迷路が含まれる、損なわれた性能をＳｃｎ１ａ＋／－マウスが示す、行動試験を利用する。ドラベ症候群患者に特徴的な自発的てんかん発作もまた、Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスにおいて明らかであり、その頻度は、齢および体温と共に増加する。さらに、Ｓｃｎ１ａ＋／－マウスの早期の突然死が、強直間代性てんかん発作の直後に生じる。したがって、２、６および１２月齢の時点での２４時間にわたる連続したビデオモニタリングを利用して、てんかん発作の頻度および持続時間を評価する。新たな物体、匂いおよびマウスに応答したチャンバー選好読み出し（ｃｈａｍｂｅｒ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅａｄｏｕｔ）を使用する社会的相互作用研究を、上記試験において測定された主要転帰において有意な変化が検出される場合に考慮する。脳、脊髄および末梢臓器を収集し、人道的エンドポイントのための実験において評価して、上に概説した分子的および組織学的解析を実施する。
（実施例７）
ＺＦＰおよびｄＣａｓ９系は、ヒト細胞においてＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を増加させる
ＺＦＰ１～ＺＦＰ３がＳＣＮ１Ａの転写を上方調節する能力を調べるために、ＺＦＰ１～ＺＦＰ３のＤＮＡ結合ドメインを、ハイブリッドのＶＰ６４、ｐ５３およびＲＴＡ（ＶＰＲ）の強い三要素転写活性化因子ドメインに融合させて、キメラトランス活性化因子を形成した。ＶＰＲ融合活性化因子ドメインは、転写調節複合体を動員し、クロマチンアクセス可能性を増加させるように作用し、高レベルの遺伝子発現を達成することを補助する。したがって、ＺＦＰドメインは、近位プロモーター領域中の高度に保存された配列にＶＰＲ活性化因子を標的化して、ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を増加させる。
さらに、ＳＣＮ１Ａを標的化するｄＣａｓ９系がＳＣＮ１Ａの転写を上方調節する能力を調べるために、ＳＣＮ１Ａを標的化する３つのガイドＲＮＡを、ｄＣａｓ９タンパク質と複合体化させた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、以下の実験条件のうちの１つで一過的にトランスフェクトした－（１）ＶＰＲ－ＺＦＰ１構築物；（２）ＶＰＲ－ＺＦＰ２構築物；（３）ＶＰＲ－ＺＦＰ３構築物；（４）ＶＰＲ－ＺＦＰ１構築物、ＶＰＲ－ＺＦＰ２構築物およびＶＰＲ－ＺＦＰ３構築物の３つ全て；（５）ｄＣａｓ９－ＶＰＲ構築物およびＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ１；（６）ｄＣａｓ９－ＶＰＲ構築物およびＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ２；（７）ｄＣａｓ９－ＶＰＲ構築物およびＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ３；（８）ｄＣａｓ９－ＶＰＲ構築物ならびにＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ１、ＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ２およびＳＣＮ１ＡガイドＲＮＡ３の３つ全て；ならびに（９）いずれのガイドＲＮＡも有さないｄＣａｓ９－ＶＰＲ構築物（対照）。ＳＣＮ１Ａ遺伝子発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ＳＣＮ１Ａの倍数活性化（ｆｏｌｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を、対照実験（いずれのガイドＲＮＡも有さないｄＣａｓ９－ＶＰＲ構築物）に対して正規化した。
試験した全ての実験条件が、対照実験と比較して、ＳＣＮ１Ａの遺伝子活性化における増加を生じた（図８）。これらのデータは、この実施例においておよび本開示を通じて記載されるジンクフィンガータンパク質が、遺伝子発現に影響を与えるためにＳＣＮ１Ａを標的化するが可能であることを実証している。これらのデータは、この実施例のガイドＲＮＡ配列（配列番号８３～９４）が、遺伝子発現に影響を与えるためにｄＣａｓ９をＳＣＮ１Ａに標的化することが可能であることをさらに実証している。
Figure 2023535025000023
（実施例８）
広い範囲の効力を有するＳＣＮ１Ａ特異的ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）トランス活性化因子
ＳＣＮ１Ａプロモーターの保存された領域を標的化するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）トランス活性化因子（例えば、２－フィンガーを有する）を、細菌ワンハイブリッド（Ｂ１Ｈ）システムを使用して、ＺＦＰアセンブリのために開発する。次いで、より大きいＺＦＰ認識配列内の各６塩基対のサブ部位について、Ｂ１Ｈ ２－フィンガーＺＦＰモジュール（２ＦＭ）ライブラリーを生成し、Ｂ１Ｈ選択を実施して、各６ｂｐのサブ部位についての候補２ＦＭを同定する。さらに、２ＦＭを、それらのＤＮＡ結合特異性について評価して、標的認識配列内の各６塩基対のサブ部位に対する優先的な特異性を有する２ＦＭを選択する。
次いで、特徴付けられ選択された２－フィンガーモジュール（２ＦＭ）の各々および全ての組合せを、改善されたＤＮＡ結合特異性を有する６－フィンガーＺＦＰへとアセンブルする。これらの６－フィンガーＺＦＰを発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで精製し、その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＳＥＬＥＸ－ｓｅｑおよび／またはＣＵＴ＆Ｔａｇを使用してＤＮＡ結合特異性について評価する。少なくとも１つの６－フィンガーＺＦＰが３つの異なる標的配列について同定されるように、各標的部位内の１４塩基以上に対する優先的な特異性でＳＣＮ１Ａを標的化する６－フィンガーＺＦＰを同定する。
次いで、６－フィンガーＺＦＰの親和性を微調整して、ゲノムワイド結合プロファイルを改善し、ゲノムワイド結合プロファイルに対するフィンガー間リンカー変更の影響を、（例えば、ＣＵＴ＆Ｔａｇを使用して）評価する。さらに、ゲノムワイド結合プロファイルに対する、非特異的ＤＮＡ結合親和性の低減の影響を、（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＣＵＴ＆Ｔａｇを使用して）評価する。候補６－フィンガーＺＦＰのＤＮＡ結合特異性を、（例えば、ＳＥＬＥＸ－ｓｅｑまたはＣＵＴ＆Ｔａｇを使用して）さらに評価する。これらの研究は、ゲノム内の改善された結合部位分布を有するＳＣＮ１Ａを標的化する少なくとも３つの異なるＺＦＰの発見を可能にする。
次いで、ニューロンにおいて変動する効力でＳＣＮ１Ａを標的化するＺＦＰ－トランス活性化因子融合タンパク質を同定する。候補活性化ドメイン（ＡＤ）モジュール（例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン中に存在する転写因子由来の８～１２個の異なるヒト活性化ドメイン（ＡＤ））を、ニューロンにおいて評価する。候補ＡＤを、リード候補ＺＦＰと融合させ、引き続く融合タンパク質を、規定された効力を有する合成ＡＤ（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４およびＶＰＲ）と比較して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＳＣＮ１Ａを活性化するそれらの能力について評価する。ｑＲＴ－ＰＣＲデータを使用して、ＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤ融合タンパク質の機能性および活性化潜在性を検証する。
ｉＣｅｌｌ ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロンにおけるＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤの活性化プロファイルを評価する。各リードＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤを、ｉＣｅｌｌ ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロン中に形質導入し、ＳＣＮ１Ａ発現に対する影響を（例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロットを使用して）評価し、トランスクリプトームに対する影響を（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑを使用して）評価する。ｑＲＴ－ＰＣＲおよびＲＮＡ－ｓｅｑデータは、ＳＣＮ１Ａ発現およびトランスクリプトームホメオスタシスに対する各ＡＤの影響の定量的解析（例えば、ボルケーノプロット）を可能にする。
ＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤ候補を、ゲノムワイド結合プロファイルに基づいてニューロンにおいて評価する。各候補ＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤを、ｉＣｅｌｌ ＧＡＢＡ作動性抑制性ニューロン中に形質導入し、ＤＮＡ結合特異性およびゲノムワイドプロファイルを、（例えば、ＣＵＴ＆Ｔａｇを使用して）評価する。ＳＣＮ１Ａ発現に対する影響を（例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロットを使用して）評価し、トランスクリプトームに対する影響を（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑを使用して）評価する。オフ－ターゲット部位（例えば、望ましくない遺伝子活性化）を、これらの尺度を使用して同定する。
（オフ－ターゲット結合と比較した）ＳＣＮ１Ａ結合についてのＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤの特異性を、Ｂ１Ｈ対抗選択戦略を利用することによって調整して、標的部位とオフ－ターゲット部位との間を識別するＺＦＰフィンガーセットを同定する。候補ＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤのＤＮＡ結合特異性およびゲノムワイドプロファイルを再評価する。修正されたＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤに関連する最適なＡＤを、ＳＣＮ１Ａ活性化について再評価して、各候補ＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤによるＳＣＮ１Ａの選択的活性化を実証する。
リード候補ＺＦＰＳｃｎ１Ａ－ＡＤを、野生型マウス中枢神経系（ＣＮＳ）において評価する。野生型マウス（４～５週齢）を、種々の異なる活性化潜在性を有する候補ＺＦＰＳｃｎ１ａ－ＡＤをコードするＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢベクター２×１０１２ｖｇで全身処置する。対照は、ＤＮＡ結合ドメインなしのＺＦＰをコードするＡＡＶベクターで処置した野生型マウス、および未処置のマウス対照を含む。各ＺＦＰＳｃｎ１ａ－ＡＤ処置群は、２匹の雄性マウスおよび２匹の雌性マウスから構成される。生存中の転帰尺度は、生存、標準的な行動評価および標準的な健康評価である。動物を、分子的および組織学的解析のために、処置の５週間後に安楽死させる。死後転帰尺度は、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞におけるＳＣＮ１ＡおよびＺＦＰＳｃｎ１ａタンパク質レベルのウエスタンブロットおよび組織学的解析、ならびにトランスクリプトーム変化のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ解析である。
マウス実験における有効なＡＡＶ－ＺＦＰＳｃｎ１ａベクターの結合プロファイルを、マウスＣＮＳにおけるそれらの結合プロファイルおよびＳＣＮ１Ａ活性化について引き続いて評価する。Ｃｒｅ駆動因子およびｌｏｘＰ－ｎＧＦＰマウスを使用して、異なるＧＡＢＡ作動性ニューロンサブセットを選択的に標識する。マウス（４～５週齢）を、候補ＺＦＰＳｃｎ１ａ－ＡＤをコードするＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢベクター２×１０１２ｖｇで全身処置する。対照は、ＤＮＡ結合ドメインなしのＺＦＰをコードするＡＡＶベクターで処置した野生型マウス、および未処置のマウス対照を含む。各ＺＦＰＳｃｎ１ａ－ＡＤ処置群は、２匹の雄性マウスおよび２匹の雌性マウスから構成される。生存中の転帰尺度は、生存、標準的な行動評価および標準的な健康評価である。動物を、分子的および組織学的解析のために、処置の５週間後に安楽死させる。死後転帰尺度は、ＧＡＢＡ作動性ニューロン由来の核のＦＡＣＳ解析、およびシングル核ＲＮＡｓｅｑ（ｓｎＲＮＡｓｅｑ）を使用するトランスクリプトーム解析である。ＺＦＰゲノムワイド結合解析を、ＣＵＴ＆Ｔａｇによって評価する。次いで、最も有効なＡＡＶ－ＺＦＰＳｃｎ１ａベクターを、ニューロントランスクリプトームプロファイルに対する最小限の影響でＳｃｎ１ａを活性化する能力に基づいて選択する。ある範囲の活性化潜在性を有する最も有望なベクターを、治療有効性について後に評価することもできる。
（実施例９）
ＧＡＢＡ作動性ニューロン特異的遺伝子発現系
抑制性ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンに特異的な導入遺伝子発現カセットを、以下に記載する３つのアプローチを使用して開発する。
アプローチ１．ＧＡＢＡ特異的プロモーターのバイオインフォマティックによりガイドされた設計
アプローチ１は、図１０、左パネルに記載される。
マウスおよびヒト脳からの全ゲノムＡＴＡＣｓｅｑ、ＣｈＩＰｓｅｑ、Ｄｎａｓｅ Ｉ、ＣＡＧＥおよびＨｉＣデータセットを、ＳＣＮ１Ａ、ＧＡＤ１およびＧＡＤ２プロモーター中の候補エンハンサーエレメントについて解析する。ＳＣＮ１Ａ近傍のヒト第４染色体におけるＨｉＣデータは、エンハンサーを示し得る３Ｄ染色体内相互作用の領域（ＳＣＮ１Ａを中心として約１Ｍｂ；矢印は、１６５～１６６Ｍｂ間隔の異なる第２染色体領域間での潜在的相互作用を示す）を示す。染色体間相互作用も評価する。
一次データは、ｌｏｘＰ－ＧＦＰマウスと交雑した、ＧＡＢＡニューロンのサブセットについてのＣｒｅ駆動因子マウス系（Ｓｃｎ１ａ、Ｇａｄ２、Ｓｓｔ、Ｃｃｋ、Ｖｉｐプロモーター）を使用して生成され得る（図１０、左パネル、網掛けボックス）。ＧＡＢＡニューロンを選別し、Ｓｃｎ１ａ、Ｇａｄ１、Ｇａｄ２遺伝子のエピジェネティックランドスケープを、ＣＵＴ＆Ｔａｇを使用して評価し、ならびに染色体相互作用を、ＧＡＢＡニューロンに特異的であり得るＨｉＣを使用して評価する。
ＧＡＢＡニューロン特異的発現のためのバイオインフォマティクスにより生成したエンハンサー候補を、評価する。ＳＣＮ１Ａ最小プロモーターに融合されたエンハンサー候補のバーコード化されたライブラリーを生成する。
６～８週齢の正常マウス（ｎ＝４）に、注射後４～６週間の時点における実験的エンドポイントで、１０１２ｖｇのＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢライブラリーを全身注入する。転帰尺度は、ＣＮＳ中の細胞集団における発現されたバーコード分布についてのｓｎＲＮＡｓｅｑ；肝臓、心臓および骨格筋におけるバーコードのＲＴ－ＰＣＲ増幅と、その後の、頻度のＮＧＳ解析である。独自の遺伝子発現プロファイルを使用して、解析した組織中の異なる細胞集団を同定する。エンハンサーを、ＧＡＢＡニューロンにおいて遺伝子発現（独自のバーコード）を特異的に駆動するそれらの能力に基づいて、さらなる研究のために選択し、第２の選択基準は、変動する程度の効力を有するＧＡＢＡ特異的エンハンサーを同定することである。３～４つのエンハンサーを、アプローチ２において同定されたものとの比較のために選択することもできる。
アプローチ２．ロングレンジエンハンサースキャニングアレイ
＞４×１０９のバリアントを有するＡＡＶカプシドライブラリーを生成した。これらのカプシドライブラリーを使用して、組織特異的エンハンサーの存在について全ゲノム領域をプローブする。約９８，８００個のオリゴヌクレオチド（１４０ヌクレオチド長）のライブラリーを合成し、ＡＡＶ－ｎｌｓＧＦＰベクター中の最小ＳＣＮ１Ａプロモーターの上流にクローニングする。オリゴヌクレオチドを、ゲノム領域（マウスおよびヒトにおけるＳＣＮ１Ａ、ＧＡＤ１、ＧＡＤ２遺伝子）にわたって敷き詰め（ｔｉｌｅ）、オリゴ間のオフセット（１ヌクレオチドから重複なしまで）は、約９９ｋｂ～１３Ｍｂのゲノム領域の標的サイズのサイズを決定する。ＡＡＶライブラリーは、１８ヌクレオチドバーコード（ＮＮＭ６＝約１０９のバーコード）を保有し、これらは、各エンハンサーに独自であり、導入遺伝子ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中に位置する。各エンハンサーに関連するバーコードを、低頻度制限酵素を使用してｎｌｓＧＦＰ ｃＤＮＡを除去した後に、ＮＧＳによって決定する。ＣＮＳおよび末梢組織中のＧＦＰ陽性核におけるバーコード読み取りの数は、特異性および全体的導入遺伝子発現効率の尺度を提供する。ＡＡＶエンハンサースキャニングアレイ（ＡＡＶｅＳＡ）ライブラリーの使用は、標的中の独自に発現された遺伝子をサンプリングすることによって、任意の細胞型のための細胞型特異的エンハンサーの迅速な開発を可能にする。
２０ヌクレオチドのオフセットを有するヒトおよびマウスのＳＣＮ１Ａ、ＧＡＤ１およびＧＡＤ２遺伝子についてのオリゴヌクレオチドライブラリーを生成して、各遺伝子周囲の約２Ｍｂの領域をプローブする。全ての配列の最小限の１００×カバレッジ（３遺伝子×２種×９８，８００オリゴ／遺伝子＝５９２，８００配列）または５．９×１０７のバリアントを有するＡＡＶエンハンサースキャニングアレイライブラリーを利用する。産生の前に、全てのエンハンサーバーコード、理論上は約１００のバーコード／エンハンサーの正体を、上記のようにＮＧＳによって決定する。
ＡＡＶｅＳＡライブラリーを、全身送達のためにＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ中にパッケージングする。
ＧＡＢＡニューロン特異的エンハンサーについてのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを、注射後４～６週間の時点における実験的エンドポイントで、６～８週齢の正常マウス（ｎ＝４）における１０１２ｖｇのＡＡＶｅＳＡライブラリーの全身注入によって実施する。転帰尺度は、ＣＮＳ中の細胞集団における発現されたバーコード分布についてのｓｎＲＮＡｓｅｑ；肝臓、心臓、骨格筋におけるバーコードのＲＴ－ＰＣＲ増幅と、その後の、頻度のＮＧＳ解析である。エンハンサーを、ＣＮＳ中のＧＡＢＡニューロンに対する特異性に基づいて、さらなる研究のために、ならびにある範囲の遺伝子発現レベルを網羅するように、選択する。
ＧＡＢＡ特異的ＡＡＶベクターを、互いに比較する。上で選択されたエンハンサーを保有するＡＡＶ－ｎｌｓＧＦＰベクターを、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢを用いてパッケージングし、個々に研究する。各アプローチからの３～４つのベクターを、さらなる研究のために選択する。
６～８週齢の正常マウス（ｎ＝４／ベクター）に、注射後４～６週間の時点における実験的エンドポイントで、１０１２ｖｇのＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ－ｎｌｓＧＦＰベクターを全身注入する。転帰尺度は、ＧＦＰならびにニューロン（ＮｅｕＮ）ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＤ１、およびＧＡＢＡニューロンのサブセットについての他のマーカー）、アストロサイト（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、ミクログリア（Ｉｂａ１）についての細胞特異的マーカーについての脳切片の二重免疫蛍光染色；肝臓、心臓、骨格筋におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット解析；脳および同じ末梢臓器におけるベクターゲノム生体内分布である。予想される転帰は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに制限される異なるレベルの遺伝子発現を提供するエンハンサーのセット（エンハンサーの組合せの）の定義である。
アプローチ３．ＣＮＳ中の非ＧＡＢＡニューロン細胞集団からの遺伝子発現のｍｉＲ転写後脱標的化
マウス脳におけるｍｉＲ発現プロファイルに関する既存のデータが解析されており、ＧＡＢＡニューロン、ならびにアストロサイトおよびミクログリアを除き、脳中のほとんどのニューロン集団から遺伝子発現を脱標的化するはずのいくつかの候補を、選択した。ヒトシナプシン－１プロモーターの下でｎｌｓＧＦＰを発現するＡＡＶベクターの３’ＵＴＲ中にクローニングされるｍｉＲ標的（ｍｉＲ－Ｔ）および多数のリピートの多数の組合せを網羅するオリゴヌクレオチドライブラリーを生成する。全てのｍｉＲ－Ｔカセットは、それぞれ筋肉および肝臓から遺伝子発現を脱標的化するために、ｍｉＲ－１およびｍｉＲ－１２２の標的を保有する。この特色を含める理由は、ＺＦＰ発現を駆動するための異なる強度のより遍在性のプロモーターの使用を可能にするためである。Ｓｃｎ１ａの発現は、プロモーター強度およびＺＦＰ効力を変動させることによって微調整することができる。最後に、各ｍｉＲ－Ｔ組合せを、ＲＮＡｓｅｑ解析のために、独自のバーコードに関連させる。ライブラリーアプローチは、アプローチ２で同定された他のエンハンサーと組み合わされ得る、ＧＡＢＡニューロン特異的発現を達成するためのエレメントの最も効率的な組合せの迅速な選択を可能にする。
ＡＡＶ－Ｓｙｎ１－ｎｌｓＧＦＰ－ｍｉＲＴライブラリーを、導入遺伝子カセットの３’ＵＴＲ中へのクローニングのためにこのライブラリーを設計および構築することによって生成する。上記原理を使用するプラスミドライブラリーのＮＧＳ解析。
ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢを使用するライブラリーを産生する。
ＧＡＢＡニューロン特異的ｍｉＲ－Ｔカセットについてのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを、注射後４～６週間の時点における実験的エンドポイントで、６～８週齢の正常マウス（ｎ＝４）における１０１２ｖｇのＡＡＶ．ｍｉＲ－Ｔライブラリーの全身注入を使用して実施する。転帰尺度は、ＣＮＳ中の細胞集団における発現されたバーコード分布についてのｓｎＲＮＡｓｅｑ；肝臓、心臓、骨格筋におけるバーコードのＲＴ－ＰＣＲ増幅と、その後の、頻度のＮＧＳ解析である。
ｍｉＲ－Ｔカセットを、ＣＮＳ中のＧＡＢＡニューロンに導入遺伝子発現を制限するかどうかについて検証する。上位のｍｉＲ－Ｔカセットを、Ｓｙｎ－１およびＣＢＡプロモーターによって駆動されるｎｌｓＧＦＰをコードする導入遺伝子カセットにおいて個々に試験する。ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ－ｎｌｓＧＦＰベクターを個々に研究する［（２つのｍｉＲ－Ｔカセット＋ｍｉＲ－Ｔなし）×２プロモーター＝６ベクター）。
６～８週齢の正常マウス（ｎ＝４／ベクター）に、注射後４～６週間の時点における実験的エンドポイントで、１０１２ｖｇのＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ－ｎｌｓＧＦＰベクターを全身注入する。転帰尺度は、ＧＦＰならびにニューロン（ＮｅｕＮ）ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＤ１、およびＧＡＢＡニューロンのサブセットについての他のマーカー）、アストロサイト（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、ミクログリア（Ｉｂａ１）についての細胞特異的マーカーについての脳切片の二重免疫蛍光染色；肝臓、心臓、骨格筋におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット解析；脳および同じ末梢臓器におけるベクターゲノム生体内分布である。予想される転帰は、遺伝子発現をＧＡＢＡ作動性ニューロンに制限することが可能な１つまたは複数のｍｉＲ－Ｔカセットの定義である。
選択されたエンハンサーおよびｍｉＲ－Ｔカセットを保有する最終ＡＡＶベクター設計を選択する。ある範囲の効力を網羅する３つのＧＡＢＡ特異的エンハンサーを、上位のｍｉＲ－Ｔカセットと組み合わせ、個々に研究する－合計で少なくとも６つのＡＡＶベクター設計。
６～８週齢の正常マウス（ｎ＝４／ベクター）に、注射後４～６週間の時点における実験的エンドポイントで、１０１２ｖｇのＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ－ｎｌｓＧＦＰベクター（６つのベクター設計）を全身注入する。転帰尺度は、ｓｎＲＮＡｓｅｑ、ＧＦＰならびにニューロン（ＮｅｕＮ）ＧＡＢＡ作動性ニューロン（ＧＡＤ１、およびＧＡＢＡニューロンのサブセットについての他のマーカー）、アストロサイト（ＡＬＤＨ１Ｌ１）、ミクログリア（Ｉｂａ１）についての細胞特異的マーカーについての脳切片の二重免疫蛍光染色；肝臓、心臓、骨格筋におけるＧＦＰ発現のウエスタンブロット解析；脳および同じ末梢臓器におけるベクターゲノム生体内分布である。予想される転帰は、ＧＡＢＡ作動性ニューロン集団の大部分において変動する効力を有するが、ＣＮＳまたは末梢組織中の他の細胞型においては導入遺伝子発現を有さない、少なくとも３つのＡＡＶベクターの選択である。

Claims (58)

  1. 少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合された少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを発現するように構成された導入遺伝子を含む単離された核酸であって、前記ＤＮＡ結合ドメインが、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域に結合し、前記標的遺伝子が、電位開口型ナトリウムチャネルをコードし、前記少なくとも１つの転写調節因子ドメインが、ＴＣＦ４トランス活性化因子、ＭＥＦ２Ａトランス活性化因子、ＭＥＦ２Ｃトランス活性化因子、ＭＥＦ２Ｄトランス活性化因子、Ｓｐ１グルタミン－リッチトランス活性化因子、ｐ５３トランス活性化因子ドメイン、Ｅ２Ｆ１トランス活性化因子、ＭｙｏＤトランス活性化因子、ＭＡＰＫ７トランス活性化因子ドメイン、ＮＦ１Ｂプロリンリッチトランス活性化因子、もしくはＲｅｌＡトランス活性化因子、またはそれらの任意の組合せを含む、単離された核酸。
  2. 前記導入遺伝子が、核局在化配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸。
  3. 少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合された少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを発現するように構成された導入遺伝子を含む単離された核酸であって、前記ＤＮＡ結合ドメインが、標的遺伝子または標的遺伝子の調節領域に結合し、前記標的遺伝子が、電位開口型ナトリウムチャネルをコードし、前記導入遺伝子が、核局在化配列を含む、単離された核酸。
  4. 前記少なくとも１つの転写調節因子ドメインが、ＶＰＲトランス活性化因子、Ｒｔａトランス活性化因子、ｐ６５トランス活性化因子、Ｈｓｆ１トランス活性化因子、ＴＣＦ４トランス活性化因子、ＭＥＦ２Ａトランス活性化因子、ＭＥＦ２Ｃトランス活性化因子、ＭＥＦ２Ｄトランス活性化因子、Ｓｐ１グルタミン－リッチトランス活性化因子、ｐ５３トランス活性化因子ドメイン、Ｅ２Ｆ１トランス活性化因子、ＭｙｏＤトランス活性化因子、ＭＡＰＫ７トランス活性化因子ドメイン、ＮＦ１Ｂプロリンリッチトランス活性化因子、もしくはＲｅｌＡトランス活性化因子、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項３に記載の単離された核酸。
  5. 前記核局在化配列が、配列番号１３５～１４０のいずれか１つを含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  6. 前記核局在化配列が、配列番号１３５～１４０の任意の組合せを含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  7. 前記導入遺伝子に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する末端逆位配列（ＩＴＲ）が隣接している、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  8. 前記転写調節因子ドメインが、前記標的遺伝子の発現を上方調節する、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  9. 前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、前記標的遺伝子の非翻訳領域に結合する、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  10. 前記非翻訳領域が、エンハンサー、プロモーター、イントロンおよび／またはリプレッサーである、請求項９に記載の単離された核酸。
  11. 前記ＤＮＡ結合ドメインが、前記標的遺伝子の調節領域の２ｂｐ上流～２０００ｂｐ上流の間または２ｂｐ下流～２０００ｂｐ下流の間に結合する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  12. 前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ｄＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９もしくはｄＣａｓ１２ａ）および／またはホメオドメインをコードする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  13. 前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号５～７のいずれか１つに示される核酸配列に結合する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  14. 前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号３に示される核酸配列の少なくとも２（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれよりも多く）連続するヌクレオチドに結合する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  15. 前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１１～１６、２３～２８または３５～４０のいずれか１つに示される配列を有する核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  16. （ｉ）前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１１を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１２を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１３を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号１５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスおよび／または配列番号１６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である；
    （ｉｉ）前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２３を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２４を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号２７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスおよび／または配列番号２８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である；あるいは
    （ｉｉｉ）前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号３５を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３６を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３７を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３８を含む核酸によってコードされる認識ヘリックス、配列番号３９を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスおよび／または配列番号４０を含む核酸によってコードされる認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である
    請求項１５に記載の単離された核酸。
  17. 前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１７～２２、２９～３４または４１～４６のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むジンクフィンガータンパク質である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  18. （ｉ）前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１７を含む認識ヘリックス、配列番号１８を含む認識ヘリックス、配列番号１９を含む認識ヘリックス、配列番号２０を含む認識ヘリックス、配列番号２１を含む認識ヘリックスおよび／または配列番号２２を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である；
    （ｉｉ）前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２９を含む認識ヘリックス、配列番号３０を含む認識ヘリックス、配列番号３１を含む認識ヘリックス、配列番号３２を含む認識ヘリックス、配列番号３３を含む認識ヘリックスおよび／または配列番号３４を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である；あるいは
    （ｉｉｉ）前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、配列番号４１を含む認識ヘリックス、配列番号４２を含む認識ヘリックス、配列番号４３を含む認識ヘリックス、配列番号４４を含む認識ヘリックス、配列番号４５を含む認識ヘリックスおよび／または配列番号４６を含む認識ヘリックスを含むジンクフィンガータンパク質である
    請求項１７に記載の単離された核酸。
  19. 前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、ｄＣａｓタンパク質、必要に応じて、ｄＣａｓ９タンパク質であり、必要に応じて、前記単離された核酸が、少なくとも１つのガイド核酸をさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  20. 前記ガイド核酸が、ＳＣＮ１Ａを標的化するスペーサー配列を含む、請求項１９に記載の単離された核酸。
  21. 前記ガイド核酸が、配列番号８５、８６、８９、９０、９３または９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を有するスペーサー配列を含む、請求項１９または２０に記載の単離された核酸。
  22. 前記ガイド核酸が、配列番号８３～９４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  23. 前記少なくとも１つの転写調節因子ドメインが、配列番号１２２～１３４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列によってコードされる、請求項１から２２のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  24. ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項１から２３のいずれかに記載の単離された核酸。
  25. 前記ＩＴＲが、ΔＴＲおよび／またはｍＴＲである、請求項２４に記載の単離された核酸。
  26. 前記導入遺伝子が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１から２５のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  27. 前記プロモーターが、組織特異的プロモーターであり、必要に応じて、前記プロモーターが、ニューロンプロモーター、例えば、ＳＳＴ、ＮＰＹ、リン酸活性化グルタミナーゼ（ＰＡＧ）、小胞グルタミン酸トランスポーター－１（ＶＧＬＵＴ１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５および５７（ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７）、シナプシンＩ、ａ－ＣａｍＫＩＩ、Ｄｏｃｋ１０、Ｐｒｏｘ１、パルブアルブミン（ＰＶ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、カルレチニン（ＣＲ）またはニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）である、請求項２６に記載の単離された核酸。
  28. 前記少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインが、リンカードメインによって前記少なくとも１つの転写調節因子ドメインに融合されている、請求項１から２７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  29. 前記リンカードメインが、必要に応じて、
    （ｉ）必要に応じてグリシンから構成される可撓性リンカー、または
    （ｉｉ）切断可能なリンカー
    である、請求項２８に記載の単離された核酸。
  30. 前記導入遺伝子が、１つのＤＮＡ結合ドメイン、２つのＤＮＡ結合ドメイン、３つのＤＮＡ結合ドメイン、４つのＤＮＡ結合ドメイン、５つのＤＮＡ結合ドメイン、６つのＤＮＡ結合ドメイン、７つのＤＮＡ結合ドメイン、８つのＤＮＡ結合ドメイン、９つのＤＮＡ結合ドメイン、または１０個のＤＮＡ結合ドメインをコードする、請求項１から２９のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  31. 前記導入遺伝子が、１つの転写調節因子ドメイン、２つの転写調節因子ドメイン、３つの転写調節因子ドメイン、４つの転写調節因子ドメイン、５つの転写調節因子ドメイン、６つの転写調節因子ドメイン、７つの転写調節因子ドメイン、８つの転写調節因子ドメイン、９つの転写調節因子ドメインまたは１０個の転写調節因子ドメインをコードする、請求項１から３０のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  32. （ｉ）請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離された核酸、
    （ｉｉ）少なくとも１つのカプシドタンパク質
    を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
  33. 前記ＡＡＶカプシドタンパク質の血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ．ＰＨＰＢからなる群より選択される、請求項３２に記載のｒＡＡＶ。
  34. 標的遺伝子の発現を増加させる方法であって、前記標的遺伝子を含む細胞または対象に、請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項３２もしくは３３に記載のｒＡＡＶを投与するステップを含む、方法。
  35. 前記対象が、前記標的遺伝子についてハプロ不全である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記標的遺伝子がＳＣＮ１Ａである、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 前記細胞が、ニューロン、必要に応じて、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項３２もしくは３３に記載のｒＡＡＶの投与が、投与の前の前記対象における前記導入遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍または少なくとも１００倍増加した標的遺伝子発現を生じる、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 対象におけるドラベ症候群を処置する方法であって、標的遺伝子を発現する対象に、請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項３２もしくは３３に記載のｒＡＡＶを投与するステップを含む、方法。
  40. 前記対象における前記標的遺伝子の発現が、正常対象と比較して減少されている、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記対象が、正常対象に関して、標的遺伝子発現においてハプロ不全である、またはハプロ不全であると疑われる、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 前記対象が、前記標的遺伝子のハプロ不全発現によって引き起こされる状態を有する、または有すると疑われる、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記標的遺伝子がＳＣＮ１Ａである、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記単離された核酸または前記ｒＡＡＶが、静脈内注射、筋肉内注射、吸入、皮下注射および／または頭蓋内注射によって投与される、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記単離された核酸または前記ｒＡＡＶの投与が、投与の前の前記対象における前記導入遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍または少なくとも１００倍増加した標的遺伝子発現を生じる、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 請求項１から３１のいずれかに記載の単離された核酸または請求項３２もしくは３３に記載のｒＡＡＶを含む組成物。
  47. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項４６に記載の組成物。
  48. 請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項３２もしくは３３に記載のｒＡＡＶを収納する容器を含むキット。
  49. 薬学的に許容される担体を収納する容器をさらに含む、請求項４８に記載のキット。
  50. 前記単離された核酸または前記ｒＡＡＶと前記薬学的に許容される担体とが、同じ容器中に収納される、請求項４８または４９に記載のキット。
  51. 前記容器がシリンジである、請求項４８から５０のいずれか一項に記載のキット。
  52. 請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項３２もしくは３３に記載のｒＡＡＶを含む宿主細胞。
  53. 真核生物細胞である、請求項５２に記載の宿主細胞。
  54. 哺乳動物細胞、必要に応じて、ヒト細胞、必要に応じて、ニューロン、必要に応じて、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである、請求項５２に記載の宿主細胞。
  55. ＧＡＢＡ作動性プロモーターを同定する方法であって、
    （ｉ）ニューロンプロモーターのバイオインフォマティックマイニングを行い、候補エンハンサーエレメントを選択するステップ；
    （ｉｉ）各候補エンハンサーエレメントを、導入遺伝子に連結された最小プロモーターと個々に融合させ、それにより、導入遺伝子に連結された候補プロモーターのライブラリーを生成するステップ；
    （ｉｉｉ）前記ライブラリーの各導入遺伝子を対象に送達するステップ；および
    （ｉｖ）非標的組織と比較した、前記対象のＧＡＢＡニューロンにおける各導入遺伝子の発現を評価するステップ
    を含む、方法。
  56. （ｉｉｉ）中の前記ライブラリーの各導入遺伝子が、同じ対象に同時発生的に送達される、請求項５５に記載の方法。
  57. 各導入遺伝子が、独自のバーコードを含む、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. 前記ニューロンプロモーターが、ＳＣＮ１Ａプロモーター、ＧＡＤ１プロモーターまたはＧＡＤ２プロモーターである、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の方法。
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