JP2023534774A - 多層細胞カプセル及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞、タンパク質、及び架橋剤を含むヒドロゲルカプセルを提供し、細胞はタンパク質を含む第１コア層内にあり、第１コア層はタンパク質と架橋剤とを含む第２層によって囲まれている。本発明は更に、療法、予後及び診断における使用のためのヒドロゲルカプセル、細胞を培養する方法、細胞を分化させる方法、並びにヒドロゲルカプセルを生成する方法を提供する。本発明のヒドロゲルカプセルは、膵島のカプセル化に特に有用である。

Description

本出願は、２０１９年９月１０日に出願された欧州特許出願第１９３８２７８５．４号の優先権利益を主張する。

本発明は、細胞をカプセル化するためのカプセルに関する。特に、本発明は、細胞の生存率及び生体適合性を向上させる多層ヒドロゲルの細胞カプセルに関する。本発明のカプセルは、膵島のカプセル化に特に有用である。

ヒドロゲルカプセルは、それらの細胞毒性が比較的低く、また構造が細胞外マトリックスに類似していることから、ティッシュエンジニアリング及び再生医療のための生細胞のカプセル化について精力的に研究されている。それらは、酸素及び栄養素の拡散及びカプセル化された細胞によって分泌される治療用タンパク質の放出を可能にするように設計される。重要なこととして、それらはまた、宿主の免疫系による認識を回避可能である必要がある。

非特異的な宿主応答は、カプセル化された細胞の臨床適用への１つの主要な課題である。この反応は、好中球及びマクロファージなどの初期の自然免疫細胞と、それに続くコラーゲンを沈着させて移植された物体を取り囲む線維性カプセルを形成する線維芽細胞の動員を伴う。カプセル上での線維性細胞の過剰な成長は、酸素及び栄養素の拡散を遮断して、カプセル化された細胞を壊死させ、ひいては、カプセル化された膵島などの多くの移植可能な医療デバイスの最終的な不良につながる。

最も一般的には、細胞のカプセル化のためのヒドロゲルカプセルは、単層のアルギネートのヒドロゲルをベースとしている。このタイプのカプセルの１つの課題は、それらの生体適合性である。実際、アルギネートの生体適合性は低いことが明らかになっており、それにより効果的な細胞の付着又は成長は誘導されない。

膵島のカプセル化に使用した場合、アルギネートカプセルはまた、膵島の被覆が不完全であるという問題を示す。アルギネート溶液中のそれらの数密度が増加するか、又はカプセルサイズが減少する場合、これらは両方とも移植体積を最小化するために望ましいものであり、カプセルの外側に突出する膵島がより頻繁に観察される。不完全な被覆は、露出された細胞の拒絶反応を引き起こすだけでなく、露出された領域を通してマクロファージ及び線維芽細胞をカプセルに浸潤させることがあることも認識されている。

二流体同軸電子噴射システムによって２層のアルギネートカプセルを形成することができる二重カプセル化プロセスが提案されている。しかしながら、使用される材料及び合成方法は、カプセルの２つの層が混合しない明確なコア－シェル構造を与えず、それによって細胞生存率及び生体適合性が低下する。更に、二重カプセル化の方法は、多くの場合、複数のステップを伴い、膵島に損傷を引き起こし、また、コーティングが臨床使用のために十分に堅牢であるかどうかが明らかではない。

要約すると、長年にわたる様々な動物モデルにおける有望な研究にもかかわらず、カプセル化されたヒト細胞は、これまでのところ、臨床現場において影響を与えてはいない。多くの非免疫学的及び免疫学的因子、例えば、生体適合性、免疫保護の低下、低酸素、カプセル周囲の線維化の過剰亢進、カプセル化プロセスの影響、及び移植後の炎症によって、この有望な技術の適用の成功が阻害される。

したがって、免疫系の攻撃を効率的に防止しながら、細胞の自然環境の複雑さを再現する細胞のカプセル化のためのカプセルが依然として必要とされている。

本発明者らは、細胞生存率及び生体適合性を改善する細胞のカプセル化のための新規なタイプのヒドロゲルカプセルを開発した。

下の実施例に示すように、本発明者は、驚くべきことに、ヒドロゲルの細胞カプセルであって、その外層上でのみ共有結合で架橋されたタンパク質を含む、ヒドロゲルの細胞カプセルが、細胞生存率の向上、カプセルの分解の低減、及び効率的な免疫回避を提供することを見出した。

予想外に、本発明者らは、単一材料を使用して異なる架橋方法で２層カプセルを生成する二重カプセル化プロセスによって、細胞が外側に突出するリスクのない明確なコア－シェル構造を形成できることを見出した。

本明細書で提供される新規なカプセルによって示される顕著な利点は明らかであり、それらは、細胞外マトリックスに極めて類似した構造のコア核を提供する一方で、代謝産物の交換を可能にしながら細胞を効率的に保護することができる外表面を提供する。重要なこととして、下の実施例に示すように、本発明者らはまた、外側の保護シェルの形成によって、カプセル化された膵島細胞のインスリン産生が驚くほど増強されることを見出した。

更に、本発明者らは、これらの新規なカプセルが、細胞の分化、特に凝集体を形成する細胞型に最適な環境を提供することを見出した。したがって、本発明のカプセル内で分化転換又は分化方法を実施する場合、プロセスの速度及び効率が非常に改善される。

カプセルの２つの層の主成分として単一の天然材料を使用することによって、それらの合成が非常に容易になり、それによって、細胞生存率に影響を及ぼし得る複数の複雑なステップが回避される。本明細書で提供されるカプセルの材料は、それらの細孔サイズと組み合わされて、グルコース感知とインスリン放出との間の時間を著しく短縮する。同時に、それらは宿主免疫細胞からの効率的な防御を提供する。

また、膵島の埋め込みに使用される場合、カプセルのコア層を形成する生分解性タンパク質は、細胞のクラスター形成及び成長に容易に適応する。更に、細胞は、膵島の分散を阻止するが同時に新しい毛細血管の形成に影響を及ぼさない、非生分解性の架橋コーティング内に閉じ込められる。この新しい複雑な系は、ナノテクノロジー、生物学及びティッシュエンジニアリングの統合のおかげで、より良い膵島のパフォーマンスを実現するための鍵となっている。

上記を考慮すると、本明細書で提供される新規な細胞カプセルは、特に細胞移植を必要とする障害の治療のための医療の分野において一つの大きな進歩となる。

したがって、第１の態様において、本発明は、細胞、タンパク質、及び架橋剤を含むヒドロゲルカプセルを提供し、細胞は、タンパク質を含む第１コア層内にあり、第１コア層は、タンパク質と架橋剤とを含む第２層によって囲まれ、特に架橋剤はタンニン酸である。

本発明者らはまた、上記のカプセルを微孔性の足場に埋め込むことによって形成される新規なインプラントを開発し、これによって、それらの取り扱い、移植、及び回収が非常に容易になる。

したがって、第２の態様において、本発明は、第１による態様のヒドロゲルカプセルと微孔性の足場とを含むインプラントを提供する。

第３の態様において、本発明は、療法、診断又は予後における使用のための、第１の態様によるヒドロゲルカプセル又は第２の態様によるインプラントを提供する。

第４の態様において、本発明は、細胞のインビトロでの培養のための、第１の態様において特定されたヒドロゲルカプセル又は第２の態様において特定されたインプラントの使用を提供する。

第５の態様において、本発明は、未分化細胞を膵島細胞に分化させるための、あるいは分化した細胞を膵島細胞に分化転換させるためのエクスビボの方法を提供し、方法は、（ａ）細胞が未分化細胞又は分化した細胞である、第１の態様で特定されたヒドロゲルカプセルを生成するステップ、（ｂ）（ａ）で生成されたヒドロゲルカプセルを、ＫＧＦ、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、及びそれらの混合物からなる群から選択される因子と接触させるステップ、を含む。

第６の態様において、本発明は、第１の態様で特定されたヒドロゲルカプセルを製造する方法を提供し、方法は、（ａ）タンパク質と細胞とを含む第１コア層を形成するステップ、（ｂ）タンパク質の非共有結合性の網状化を可能にしてヒドロゲルを形成するステップ、（ｃ）ヒドロゲルを、架橋剤を含む溶液中に浸漬するステップ、を含む。

第７の態様において、本発明は、第６の態様で特定された方法によって得ることができるヒドロゲルカプセルを提供する。

第８の態様において、本発明は、インビトロのコンパニオン診断方法における第１の態様で特定されたヒドロゲルカプセル又は第２の態様で特定されたインプラントの使用を提供する。

コラーゲン及びメタクリル化コラーゲンのＮＭＲ－^１Ｈスペクトルを示す。ａ）はメタクリレートのメチルシグナルを表し、ｂ）はオレフィンプロトンのシグナルを表し、ｃ）はリジンのシグナルを表す。Ｈ）は高、Ｍ）は中、Ｌ）は低、Ｃ）は対照を表す。 ０．２５Ｕ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼの存在下における本発明のヒドロゲルカプセルの分解速度を示す。メタクリル化コラーゲン（ＣｏｌＭＡ、丸）、タンニン酸で処理したコラーゲン（ＣｏｌＴＡ、四角）、及び温度で網状化したコラーゲン（コラーゲン、三角）のカプセルを試験した。Ｙ軸に分解（％）を示し、ｘ軸に時間（ｈ）を示す。 メタクリル化コラーゲン（ＣｏｌＭＡ）、タンニン酸で処理したコラーゲン（ＣｏｌＴＡ）、及び温度で網状化したコラーゲン（コラーゲン）のＳＥＭ画像を示す。スケールバー＝３μｍ。 ３つの材料、メタクリル化コラーゲン（ＣｏｌＭＡ、丸）、タンニン酸で処理したコラーゲン（ＣｏｌＴＡ、四角）、及び温度で網状化したコラーゲン（コラーゲン、三角）のレオメトリー分析を示す。Ｙ軸に剛性（Ｐａ）を示し、ｘ軸に周波数（Ｈｚ）を示す。 コラーゲンのみによって形成されたカプセル（左）及びタンニン酸で架橋されたコラーゲンによって形成された本発明のカプセル（右）の形態の写真を示す。本発明のカプセルは、完全に丸い形態を維持しており、容易に取り扱うことができる。 タンニン酸溶液で架橋されたコラーゲンによって形成されたヒドロゲルの剛性を示す。ｘ軸に位置（ｍｍ単位）を示し、ｙ軸に剛性（ＫＰａ）を示す。 元のコラーゲン（対照）、タンニン酸１ｗ／ｔ％で架橋されたコラーゲン（Ｔ．Ａ１ｘ）及びタンニン酸３ｗ／ｔ％で架橋されたコラーゲン（Ｔ．Ａ３ｘ）のＩｍａｇｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅによってＳＥＭ画像から得られた細孔径の定量化を示す。ｙ軸にフェレ径（μｍ）を示す。 コラーゲン及びタンニン酸で処理されたコラーゲン（ＣｏｌＴＡ）にて作製されたヒドロゲルカプセル中の細胞生存率を評価するための、ＣＦＤＡ－ＳＥでの標識による生体染色を示す（元の写真において生細胞は緑色である）。画像はカプセル化１５日後に記録された。スケールバー＝５００μｍ。矢印はＣｏｌＴＡカプセル中の細胞数の増加を示す。 Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ及びＭＴＳを用いた細胞増殖の評価を示す。細胞密度は０日目に７×１０^６細胞／ｍＬであり、３０日まで培養した。灰色のバーはコラーゲンカプセルを表し、白色のバーは本発明のＣｏｌＴＡカプセルを表す。左ｙ軸はＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（５７０ｎｍ）を表し、右ｙ軸はＭＴＳ（５１０ｎｍ）を表す。 細胞漏出アッセイを示す。０日目に、各スフェロイド（細胞密度は７×１０^６細胞／ｍＬであった）を９６ウェルプレートに入れた。指定の時点で、スフェロイドを取り出して新しいウェルプレートに入れ、ウェルをトリプシン－ＥＤＴＡで処理してウェルの底から漏出した細胞を分離した。細胞の計数は自動細胞計数装置Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）（１５３９７８０２、ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。ｙ軸に細胞の数を示す。 コラーゲン及びタンニン酸で処理されたコラーゲン（ＣｏｌＴＡ）にて作製されたヒドロゲルカプセル中の生体染色及びインスリンの免疫染色を示す。画像はカプセル化１５日後に記録された。５００μｍのスケールバー。矢印はＣｏｌＴＡカプセル中の細胞によって産生されたインスリンの量の増加を示す。 コラーゲンスフェロイド（対照）及びタンニン酸１ｘを含むコラーゲン架橋スフェロイド（ＣｏｌＴＡ１ｘ）のＧＳＩＳアッセイのインスリン定量化を示す。ｙ軸にインスリン分泌（ｎｇのインスリン）を示す。 Ａ）に２つの異なるバイオプリンティング設定を用いたヒドロゲルの巨視的写真を示す。Ｂ）５００００μｓの開放弁時間を使用してバイオプリントされたスフェロイドであり、１０００００μｓではより小さく、より低い群内変動性を示した。ｙ軸に直径（μｍ）を示す。 左パネルに、コラーゲン及びコラーゲン＋タンニン酸における３Ｄスフェロイドの細胞分布の代表的な画像を示す。右パネルは、２つの異なるマトリックス内の生細胞（元は緑色）及び死細胞（元は赤色）の共焦点画像である。スケールバーは２００μｍである。 左パネルに、アルブミンについて標識された肝細胞を含有する３Ｄスフェロイドの代表的な共焦点画像を示す（元は緑色）。右パネルでは、ＤＡＰＩ（元は青色）で核を対比染色している。スケールバーは２００μｍである。 様々な濃度のカルボキシメチル化セルロースを含む微孔性の足場の細孔分布を示す。ｙ軸に細孔径（μｍ）を示し、ｘ軸にカルボキシメチル化セルロースの濃度を示す。 示された化合物を用いて生成された微孔性の足場の膨潤比を示す。ｙ軸に膨潤率（％）を示す。 微孔性の足場を生成するために使用される様々な化合物の圧縮アッセイによって得られた剛性の測定値を示す。ｙ軸に剛性（ＫＰａ）を示す。 カルボキシメチル化セルロースクリオゲルのＳＥＭ画像を示す。スケールバー＝３００μｍ。

本出願において本明細書で使用される場合、全ての用語は、別段の記載がない限り、当技術分野で知られている通常の意味で理解されるものとする。本出願において使用される場合、特定の用語についての他のより具体的な定義は、以下に記載される通りであり、別段に明示的に記載された定義がより広い定義を提供しない限り、本明細書及び特許請求の範囲の全体に等しく適用されることが意図される。

本明細書で使用される場合、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、「少なくとも１つ」又は「１つ以上」と同義である。別段の指示がない限り、「ｔｈｅ」などの本明細書で使用される定冠詞はまた、名詞の複数形も含む。

本明細書で使用される場合、「カプセル」とは、共有結合で架橋されそれによって保護シェルを形成する層によって囲まれた非共有結合で架橋されたコア（又は核）を有する、ヒドロゲルから形成された粒子を指す。カプセルは細胞のカプセル化に適した任意の形状を有し得る。本発明のカプセルは、コア層中に１つ以上の細胞を含み、それによって細胞を「カプセル化」する。「コア」という用語は、外部と接触していないカプセルの別個の内側部分を指す。

本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル」とは、タンパク質又はタンパク質断片が、共有結合、イオン結合、又は水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開格子構造を生成するときに形成される物質を指す。生体適合性ヒドロゲルとは、生細胞に対して毒性がなく、生存能力を維持するように捕捉された細胞に十分な酸素及び栄養素を拡散させることが可能である、ゲルを形成するポリマーを指す。本発明において、ヒドロゲルはタンパク質又はタンパク質断片によって形成される。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」とは、アミノ酸から構成されたポリマーを指す。この用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、又はそれらの断片を含むことを意味し、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、天然又は合成である。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質ポリマーはコラーゲンタンパク質によって形成される。本明細書における例示的なタンパク質は、液体溶液からヒドロゲルに移行することができる任意のものである。移行は、概して、時間、温度、タンパク質濃度、及び他の因子の関数として自発的に起こり得る。

「架橋剤」という用語は、ヒドロゲルを形成するタンパク質と共有結合を形成することができる少なくとも２つの反応性基を含有するモノマーを指す。

本明細書中で使用される場合、「コラーゲン」という用語は、コラーゲンモノマーから構成されたホモトリマータンパク質及びヘテロトリマータンパク質のファミリーを指す。体内で様々な機能を果たす多数のコラーゲンが知られている。様々なコラーゲンを生成するために必要な更に多数のコラーゲンモノマーが存在し、各々が別個の遺伝子によってコードされている。最も一般的なコラーゲンは、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型である。コラーゲン分子は、３つのコラーゲンモノマーが三重らせんを形成するらせん構造の大きな領域を含有している。コラーゲン分子のらせん領域におけるコラーゲンモノマーの領域は概して、配列Ｇ－Ｘ－Ｙを有し、式中、Ｇはグリシンであり、Ｘ及びＹは任意のアミノ酸であるが、最も一般的にはＸ及びＹはプロリン及び／又はヒドロキシプロリンである。任意のコラーゲンを、本発明のヒドロゲルカプセルを生成するために使用することができる。

本明細書中で使用される場合、「線維性コラーゲン」という用語は、コラーゲン原線維を正常に形成し得る型のコラーゲンを意味する。線維性コラーゲンは、Ｉ型～ＩＩＩ型、Ｖ型、及びＸＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンという用語は、天然（すなわち、天然に存在する）及び変異線維性コラーゲン（すなわち、線維性コラーゲンモノマーの配列のうちの１つ以上に１つ以上の改変を有する線維性コラーゲン）の両方を包含する。

「コラーゲン加水分解物」及び「ゼラチン」という用語は互換的に使用され、コラーゲン断片を含む組成物を指す。コラーゲンモノマーは、線維性コラーゲンモノマーであっても非線維性コラーゲンモノマーであってもよい。コラーゲン加水分解物は、一般的に、コラーゲンの酸又は塩基加水分解によって形成される。

本明細書で使用される場合、「細胞」とは、個々の細胞、細胞凝集体、又はオルガノイドを指す。細胞は、例えば、異種、自家、又は同種異系であってもよい。細胞はまた、初代細胞であってもよい。細胞はまた、対象から得られた細胞の培養及び増殖に由来する細胞であってもよい。例えば、細胞はまた、幹細胞であっても、幹細胞に由来してもよい。細胞はまた、不死化細胞であってもよい。細胞はまた、タンパク質、核酸、又は他の産物を発現又は産生するように遺伝子操作されてもよい。細胞は、リプログラミングされた細胞から分化されてもよく、又は分化した細胞から分化転換されてもよい。

本明細書で使用される場合、「細胞の分化転換」とは、１つの成熟分化細胞が、中間の多能性状態を経ることもなく、前駆細胞になることもなく、その表現型及び機能を別の成熟分化細胞型のものに切り替えるプロセスを指す。「細胞のリプログラミング」という用語は、発生能が制限された分化細胞の多能性細胞への変換を指す。リプログラミングと分化転換との基本的な違いは以下の通りである。（ｉ）リプログラミングは、分化した細胞の多能性幹細胞（すなわち、ｉＰＳ）への逆転化を必要とし、それは次に別の分化した細胞への分化プロセスを経ることができる。（ｉｉ）分化転換では、別の細胞型に形質転換するためのｉＰＳ細胞への完全な逆転化を必要としない。それは、多能性幹細胞の状態になることのない、１つの成体細胞の別の細胞型への直接の変換である。ｉＰＳ細胞のリプログラミングはかなり時間のかかるプロセスであるが、分化転換は多くの場合速く、非常に効率的である。

本明細書で使用される場合、「自家」とは、同じ個体から採取された移植細胞を指す。「同種異系」とは、同じ種の異なる個体から採取された移植細胞を指す。「異種」とは、異なる種から採取された移植細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「オルガノイド」という用語は、本発明の三次元ヒドロゲルなどの三次元培養系によって幹細胞又は未分化細胞から生成された臓器全体に類似した構造を指す。オルガノイドはまた、単離された臓器前駆細胞に由来してもよい。

「微孔性の足場」という用語は、実質的に接続された同様の、又は異なるサイズの細孔のアレイを含有する生体適合性ポリマー材料を指す。

本明細書で使用される場合、「クリオゲル」という用語は、ゲル溶液を凍結乾燥することを含むプロセスによって形成された微孔性の足場を指す。

「抗炎症薬」とは、組織における炎症を直接的又は間接的に軽減する薬物を指す。この用語は免疫抑制性の薬物を含むが、それに限定されない。この用語は、リンパ球の増殖を阻害する薬物などの抗増殖免疫抑制薬を含む。「免疫抑制薬」とは、対象における外来物質に対する免疫応答を阻害又は防止する薬物を指す。免疫抑制薬は概して、Ｔ細胞の活性化を阻害することによって、増殖を妨害することによって、又は炎症を抑制することによって作用する。免疫抑制を受けている人は、免疫不全であると言われる。

本明細書で使用される場合、「サイズ」という用語は、特徴的な物理的寸法を指す。例えば、実質的に球形であるカプセルの場合、カプセルのサイズはカプセルの直径に相当する。カプセルのセットが特定のサイズのものとして言及される場合、そのセットは、指定されたサイズ付近のサイズ分布を有し得ると考える。したがって、本明細書で使用される場合、カプセルのセットのサイズは、サイズ分布のピークのサイズなどのサイズ分布のモードを指すことができる。また、完全な球形でない場合には、物体を含む球体の等価直径である。この直径は概して、「流体力学的径」と呼ばれ、この測定は、Ａｔｌａｓセル加圧システムと連結されたＷｙａｔｔ Ｍｏｂｉｕｓ又はＭａｌｖｅｒｎを使用して行うことができる。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）又は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像もまた、直径に関する情報を与える。

本明細書で使用される場合、成分の「ｗ／ｗ％」、「ｗｔ％」、又は「重量パーセント」という用語は、組成物の総重量、又は具体的に言及される場合は他の成分の総重量に対する単一成分の量を指す。

本明細書で使用される場合、「コンパニオン診断方法」とは、特定の薬物による治療に対して感受性である対象を特定するため、治療をモニターするため、及び／又は対象若しくは対象のサブグループに対する有効投薬量を特定するために使用されるアッセイである。コンパニオン診断は、患者の疾患、障害又は状態の重症度レベルの層別化に有用であり、それによって、費用を低減し、臨床試験の期間を短縮し、安全性を向上させ、及び／又は有効性を向上させるために、治療レジメン及び用量の調節が可能になる。コンパニオン診断を使用して、疾患、障害又は状態の発生を予測し、予防的療法薬の処方に役立てることができる。一部のコンパニオン診断を使用して、１つ以上の臨床試験の対象を選択することができる。場合によっては、コンパニオン診断アッセイを特定の治療と連携させて、治療の最適化を容易にすることができる。特定の実施形態では、コンパニオン診断方法の治療は、本発明のヒドロゲルカプセル又はインプラントを用いて行われる。

上述のように、第１の態様において、本発明は、細胞、タンパク質ポリマー、及び架橋剤を含む２層カプセルを提供し、細胞はタンパク質を含む第１コア層内にあり、第１コア層はタンパク質と架橋剤とを含む第２層によって囲まれ、特に架橋剤はタンニン酸である。

本発明のカプセルは、タンパク質ユニットの非共有結合によって形成されたヒドロゲル構造に埋め込まれた細胞を含有する、内部コア又は核によって形成される。内部コアの周囲には、タンパク質によって形成された外側シェルがあり、それは更に架橋剤によって共有結合の様式で架橋される。したがって、本明細書で提供されるカプセルは、細胞生存率を向上させる細胞親和性の層であるコア層と、分解及び免疫系の攻撃からカプセルを保護する第２層とを与える。２つの層は、同じヒドロゲル形成タンパク質によって形成される。

マトリックス（カプセルのタンパク質のコア及びシェル）の作製に使用される好ましいタンパク質としては、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の一部を形成する水膨潤性タンパク質が挙げられる。したがって、第１の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、タンパク質はコラーゲンを含む。より具体的な実施形態では、コラーゲンは線維性コラーゲンである。より具体的な実施形態では、線維性コラーゲンはＩ型コラーゲンである。

別の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、コラーゲンは純粋なコラーゲン、コラーゲン誘導体、コラーゲン加水分解物、コラーゲンと細胞外マトリックスタンパク質とを含む混合物、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。本発明のカプセルの生成に適したコラーゲンを含有するタンパク質の混合物の１つは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。

第１の態様の別の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、架橋剤はタンニン酸、無水メタクリル酸、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、アジピン酸ジヒドラジド、及びそれらの混合物からなる群から選択される。タンパク質の架橋は当業者に公知の技術を用いて行われる。例えば、当業者は、タンニン酸などいくつかの架橋剤はタンパク質残基と直接反応するが、メタクリル酸無水物などの他の架橋剤は光開始剤と紫外線との使用を必要とすることを知っている。

架橋剤は、タンパク質の非共有結合での網状化によるヒドロゲルの形成の後にカプセルに外部から適用され、当該非共有結合での網状化は、例えば熱処理による。このように、得られるカプセルは、非共有結合で架橋されたタンパク質と、更に共有結合で架橋された外層によって形成される。この二重網状構造によって、細胞機能及び生体適合性に最適な特性を有する本発明のカプセルが得られる。

特定の実施形態では、第２層はコラゲナーゼ抵抗性である。より具体的な実施形態では、第２層は２日を超えてコラゲナーゼによる分解に抵抗する。

特定の実施形態では、カプセルの剛性は、平行プレートレオメトリーで測定して、８００Ｐａ～１６０００Ｐａである。より具体的には、８８２Ｐａ～１５１８４Ｐａである。別の特定の実施形態では、コア層の剛性は、平行プレートレオメトリーで測定して、５００Ｐａ～１０００Ｐａ、７００Ｐａ～９００Ｐａ、又は８８２Ｐａである。別の特定の実施形態では、第２層の剛性は、平行プレートレオメトリーで測定して、１００００Ｐａ～２００００Ｐａ、１４０００Ｐａ～１６０００Ｐａ、又は１５１８４Ｐａである。これらの粘弾性値は細胞の生存に有利である。

ヒドロゲルの機械的特性は、平行プレートレオメトリー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲ－２レオメーター、ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，ＵＫ）を使用して評価した。ヒドロゲルを円筒形（厚さ１ｍｍ、直径８ｍｍ）で作製し、体積弾性率（Ｇ’）及び粘弾性率（Ｇ”）の測定値を、８ｍｍのアルミニウムプレートの形状を使用して、室温で１～１０Ｈｚの周波数範囲にて記録した。ギャップは、元のサンプルの高さから始めて、０．３Ｎの法線力に達するまでサンプルを圧縮して調整した。ヒドロゲルのレオロジー測定はゲル化の２４時間後に行った。

特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、カプセルの第２層の細孔サイズは５μｍ未満である。特定の実施形態では、それは２００ｎｍ未満である。より具体的な実施形態では、それは５０ｎｍ～２００ｎｍである。更により具体的な実施形態では、それは８０ｎｍ～１２０ｎｍである。これらの細孔サイズによって、酸素及び栄養素の交換は可能であるが、免疫細胞は浸透させない。

細孔サイズは、第２層中の架橋剤の濃度によって決定される。したがって、特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、架橋剤は第２層中に０．１～４ｗ／ｗ％、より具体的には０．３～３．５ｗ／ｗ％、又はより具体的には０．５～３ｗ／ｗ％の濃度で存在する。

第２層はカプセルを分解から効率的に保護するために適切な厚さを示す必要がある。第１の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、第２層は５μｍ～５０μｍ、より具体的には１０μｍ～２５μｍの厚さを有する。

第１の態様の別の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、カプセルは細胞、コラーゲン、及びタンニン酸を含み、細胞はコラーゲンを含む第１コア層内にあり、第１コア層はコラーゲンとタンニン酸とを含む第２層によって囲まれる。

第１の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、カプセルは２００μｍ～３ｍｍの平均直径を有する。より具体的には、４００μｍ～２ｍｍである。より具体的には、４５０μｍ～１ｍｍである。更により具体的には、５００μｍ～７５０μｍである。サイズは、超疎水性の基質に堆積されたヒドロゲルの体積によって制御される。この体積は、プリンタ内の圧電弁の開口によって制御される。これらのデータは全て計算されており、弁の開口時間とサイズとに関係がある（下の３Ｄ印刷方法を参照）。

第１の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、カプセルの第２層の細孔サイズは５μｍ未満であり、カプセルは２００μｍ～３ｍｍの平均直径を有し、カプセルの剛性は平行プレートレオメトリーによって測定して８００Ｐａ～１６０００Ｐａである。

第１の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、カプセルは形状を有し、形状は、球、球様の形状、回転楕円体（スフェロイド）、回転楕円体様の形状、楕円体、楕円体様の形状、スタジアム形、スタジアム形様の形状、円盤、円盤様の形状、円筒、円筒様の形状、棒、棒様の形状、立方体、立方体様の形状、直方体、直方体様の形状、円環、円環様の形状、平面、曲面、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。より具体的な実施形態では、カプセルは球又は回転楕円体から選択される形状を有する。

開示する組成物におけるカプセル化のために選択される細胞の型は、所望の治療効果に依存する。細胞は、患者由来（自家細胞）であっても、同じ種の別のドナー由来（同種異系細胞）であっても、別の種由来（異種）であってもよい。異種細胞は容易に入手することができるが、拒絶反応の可能性及び患者へのウイルスの伝染が起こり得るという危険性によって、それらの臨床適用は制限される。抗炎症薬はそのような細胞の存在によって誘発される免疫応答に対抗する。自家細胞の場合、抗炎症薬は、外来のヒドロゲル材料の存在によって、又は移植手術の外傷によって引き起こされる免疫応答を軽減する。細胞は、患者又はドナーの生検若しくは切除、細胞培養、又は死体から得ることができる。明らかに、異なる細胞型の混合物もまた、カプセル化することができる。

いくつかの実施形態では、細胞は、タンパク質又は核酸などの治療に有効な物質を分泌する。いくつかの実施形態では、細胞は毒性物質を代謝する。いくつかの実施形態では、細胞は皮膚、骨、軟骨、血管、又は筋肉などの構造組織を形成する。いくつかの実施形態では、細胞は、インスリンを自然に分泌する膵島細胞、又は自然に解毒する肝細胞などの天然のものである。いくつかの実施形態では、細胞は、異種タンパク質若しくは核酸を発現するように、及び／又は内因性タンパク質若しくは核酸を過剰発現するように遺伝子操作される。

したがって、特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、細胞は膵臓細胞、肝細胞、心血管細胞、神経細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、皮膚細胞、造血細胞、免疫細胞、生殖細胞、幹細胞、遺伝子操作された細胞、リプログラミングされた細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される。

より具体的な実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、細胞はホルモン産生細胞である。ホルモン産生細胞は、インスリン、副甲状腺ホルモン、抗利尿ホルモン、オキシトシン、成長ホルモン、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、チロキシン、カルシトニン、アルドステロン、コルチゾール、エピネフリン、グルカゴン、エストロゲン、プロゲステロン、及びテストステロンなどの１つ以上のホルモンを産生することができる。

より具体的な実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、細胞は膵臓細胞である。更により具体的な実施形態では、膵臓細胞は膵島細胞である。更により具体的な実施形態では、膵島細胞はβ細胞である。

より具体的な実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、細胞は肝細胞である。本発明のカプセルが肝細胞を含む場合、それらは、肝臓に問題を有する患者を治療するために使用することができ、例えば、肝機能障害を有する対象に、人工肝臓として作用する本発明のカプセル又はインプラントを移植して、それによって肝臓透析を行うことができる。

開示するヒドロゲルカプセルにおけるカプセル化のための細胞の型としては、異種組織由来の細胞、死体由来の細胞、及び初代細胞などの天然由来の細胞；胚性幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞などの幹細胞；幹細胞に由来する細胞、細胞株に由来する細胞、リプログラミングされた細胞、リプログラミングされた幹細胞、リプログラミングされた幹細胞に由来する細胞、及び分化転換された細胞などの由来がある細胞；並びに、タンパク質又は核酸を発現するように遺伝子操作された細胞、代謝産物を産生するように遺伝子操作された細胞、及び毒性物質を代謝するように遺伝子操作された細胞などの遺伝子操作された細胞が挙げられる。したがって、より具体的な実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、細胞はリプログラミングされた細胞又は分化転換された細胞である。

細胞は、ドナーから、樹立された細胞培養株から、又はドナー由来の細胞の細胞培養から直接得ることができる。いくつかの特定の実施形態では、細胞をドナーから直接得て、洗浄し、タンパク質材料と組み合わせて直接移植する。他の特定の実施形態では、細胞をドナーから得て、インビトロで多能性幹細胞にリプログラミングし、次いで所望の細胞型に分化させ、その後カプセル化する。他の特定の実施形態では、細胞をドナーから得て、インビトロで多能性幹細胞にリプログラミングし、次いで幹細胞をカプセル化して、後にカプセル内で所望の細胞型に分化させる。他の特定の実施形態では、分化した細胞をドナーから得て、所望の細胞型にインビトロで分化転換し、次いでカプセル化する。他の特定の実施形態では、分化した細胞をドナーから得て、直接カプセル化し、次いでカプセル内で所望の細胞型に分化させる。細胞は、細胞及び組織培養の技術分野の当業者に公知の技術を使用して、培養、リプログラミング、分化、又は分化転換される。特に、細胞の分化転換又はリプログラミングの様々な方法が当技術分野で知られている（Ｚｈｏｕ，Ｑ．ら、”Ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｘｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｂ－ｃｅｌｌｓ”，２００８，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４５５（７２１３），ｐｐ．６２７～３２）。分化転換された細胞は、任意に、カプセル化の前に、又は当技術分野で知られている膵島細胞を培養する任意の好適な方法を使用して培養されてもよい。

したがって、第１の態様のより具体的な実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、細胞は分化した細胞、多能性幹細胞又は分化転換された細胞である。

驚くべきことに、本発明者らは、本発明のカプセルが、細胞の膵島細胞への分化又は分化転換プロセスの効率を改善することを見出した。

細胞生存率は、組織学及び蛍光顕微鏡などの標準的な技術を用いて評価することができる。カプセル化された細胞の機能は、これらの技術と機能アッセイとの組み合わせを使用して決定することができる。例えば、膵島細胞及び他のインスリン産生細胞を移植して、インスリンの適切な分泌によってグルコースの調節を実現することができる。他の内分泌組織及び細胞もまた移植することができる。

開示するヒドロゲルカプセル中にカプセル化される細胞の量及び密度は、細胞、ヒドロゲル、及び移植部位の選択に依存して変化する。

したがって、特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、カプセルは０．１×１０^６～１０×１０^６細胞／ｍｌ、より具体的には０．５×１０^６～２×１０^６細胞／ｍｌ、更により具体的には１×１０^６細胞／ｍｌの濃度で細胞を含む。

他の特定の実施形態では、細胞は細胞凝集体又はオルガノイドを形成している。例えば、膵島細胞凝集体（又は膵島全体）は、直径１５０μｍの各凝集体に５０～１０００個の細胞を含有し、これは１膵島当量（ＩＥ）と定義される。したがって、いくつかの実施形態では、膵島細胞は、５０～１００００ＩＥ／ｍｌ、具体的には２００～３０００ＩＥ／ｍｌ、より具体的には５００～７５０ＩＥ／ｍｌの濃度で存在する。

いくつかの実施形態では、開示するカプセルは、治療用タンパク質又は核酸を産生するように遺伝子操作された細胞を含有する。これらの実施形態では、細胞は幹細胞（例えば、多能性）であっても、前駆細胞（例えば、多能性又は寡能性）であっても、最終分化細胞（すなわち、単能性）であってもよい。細胞は、ｍｉＲＮＡ若しくはＲＮＡｉなどの治療用ポリヌクレオチドをコードする核酸、又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するように操作されてもよい。核酸は、安定な発現のために細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれてもよく、又は発現ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ）中にあってもよい。治療用ポリヌクレオチド又はタンパク質は、治療する疾患及び移植部位に基づいて選択することができる。いくつかの実施形態では、治療用ポリヌクレオチド又はタンパク質は抗腫瘍性である。他の実施形態では、治療用ポリヌクレオチド又はタンパク質はホルモン、成長因子、又は酵素である。

遺伝子操作された細胞によって分泌される治療剤としては、例えば、インスリン、グルカゴン、甲状腺刺激ホルモン；Ａｐｏｌなどの有益なリポタンパク質；プロスタサイクリン及び他の血管作用性物質、抗酸化剤及びフリーラジカルスカベンジャー；例えば可溶性形質転換成長因子（ＴＧＦ）受容体である可溶性サイトカイン受容体、又は例えばＩ Ｌｉｒａであるサイトカイン受容体アンタゴニスト；例えばＩＣＡＭ－１である可溶性接着分子；例えばＨＩＶに対するＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５であるウイルスに対する可溶性受容体；サイトカイン；エラスターゼ阻害剤；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）並びに１型及び２型ＢＭＰ受容体；エンドグリン；セロトニン受容体；組織阻害メタロプロテイナーゼ；カリウムチャネル又はカリウムチャネルモジュレーター；抗炎症因子；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、肝細胞成長因子、及び低酸素誘導因子（ＨＩＦ）を含む血管新生因子；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、ニューツリン(nurturin)、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、エンドスタチン、ＡＴＦ、トロンボスポンジン断片、それらの変異体などを含む神経栄養及び／又は抗血管新生活性を有するポリペプチドが挙げられる。より好ましいポリペプチドは、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ－１及びＦＧＦ－２並びにエンドスタチンなどのＦＧＦである。

いくつかの特定の実施形態では、分泌される因子はタンパク質又はペプチドである。タンパク質活性因子の例としては、これらに限定されないが、サイトカイン及びそれらの受容体、並びにサイトカイン又はそれらの受容体を含むキメラタンパク質が挙げられるが、それらのいくつかは前述したものであり、また、例えば、腫瘍壊死因子α及びβ、それらの受容体及びそれらの誘導体；レニン；リポタンパク質；コルヒチン；プロラクチン；コルチコトロフィン；バソプレッシン；ソマトスタチン；リプレシン；パンクレオザイミン；リュープロリド；α－１－アンチトリプシン；第ＶＩＩ因子ＩＣ、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子などの凝固因子；プロテインＣなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿ペプチド；肺サーファクタント；例えばウロキナーゼである組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－Ｐａ）以外のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－α）；例えばヒト血清アルブミンである血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；絨毛性ゴナドトロピン；例えばβ－ラクタマーゼである微生物タンパク質；デオキシリボヌクレアーゼ；インヒビン；アクチビン；ホルモン又は成長因子の受容体；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－２、ＴＧＦ－３、ＴＧＦ－４、又はＴＧＦ－５を含むＴＧＦ－α及びＴＧＦ－βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ－４、ＣＤ－８、及びＣＤ－１９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；インターフェロン－α（例えば、インターフェロン、α２Ａ）、－β、－γ、－λ及びコンセンサスインターフェロンなどのインターフェロン；例えばＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦであるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；例えばＩＬ－１～ＩＬ－１０であるインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；プロスタグランジンなどの受精阻害因子；受精促進因子；調節タンパク質；抗体（それらの断片を含む）、及び例えばイムノアドヘシンであるキメラタンパク質；これらの化合物の前駆体、誘導体、プロドラッグ及び類似体、並びにこれらの化合物又はそれらの前駆体、誘導体、プロドラッグ及び類似体の薬学的に許容される塩が挙げられる。好適なタンパク質又はペプチドは、天然であっても、又は組換えであってもよく、例えば融合タンパク質が挙げられる。開示するヒドロゲルカプセル中に含まれるホルモン、又は最も好ましくは、開示するヒドロゲルカプセル中に含まれる細胞から産生されるホルモンは、任意の目的のホルモンであることができる。開示するカプセルはまた、ワクチン成分の提供に使用することができる。例えば、ワクチン抗原を発現する細胞を、ヒドロゲルカプセル中に含めることができる。開示するヒドロゲルカプセルはまた、抗体を提供するために使用することができる。例えば、抗体を発現する細胞を、ヒドロゲルカプセル中に含めることができる。

細胞が移植される部位、又は複数の部位は、細胞の必須の数のとおり、個々の必要性に基づいて決定される。臓器又は腺の機能を置換又は補完する細胞（例えば、肝細胞又は膵島細胞）については、混合物を、腸間膜、皮下組織、後腹膜、腹膜前腔、及び筋内腔に注射することができる。

本発明はまた、細胞、タンパク質、及び架橋剤を含むヒドロゲルカプセルを提供し、細胞は、タンパク質を含む第１コア層内にあり、第１コア層はタンパク質と架橋剤とを含む第２層によって囲まれ、タンパク質はコラーゲンを含み、カプセルの第２層の細孔サイズは５μｍ未満であり、カプセルは２００μｍ～３ｍｍの平均直径を有する。

上述のように、第２の態様において、本発明は、本発明のカプセルと微孔性の足場とを含むインプラントを提供する。

本発明者らは、本発明のカプセルを微孔性の足場に埋め込むことにより、それらの取り扱い及び患者への移植が容易になることを見出した。

第２の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、微孔性の足場は、多糖類（例えば、セルロース、カルボキシルメチルセルロース、ナノフィブリル化セルロース、アガロース、又はアルギネート）、コラーゲン、ゼラチン、ポリホスファゼン、ポリエチレングリコール、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、並びにそれらのコポリマー及びブレンドからなる群から選択される化合物を含む。より具体的には、多糖類は、セルロース、カルボキシメチルセルロース、ナノフィブリル化セルロース、アガロース、アルギネート、及びそれらの混合物から選択される。

第２の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、微孔性の足場は、０．２５～５ｗ／ｗ％又は０．５～１ｗ／ｗ％のカルボキシメチルセルロースを含む。より具体的な実施形態では、微孔性の足場はクリオゲルである。更により具体的な実施形態では、微孔性の足場は０．５ｗ／ｗ％のカルボキシメチルセルロースのクリオゲルである。

より具体的実施形態では、微孔性の足場の孔は１０μｍ～３５０μｍの平均直径を有する。より具体的には、２０μｍ～１５０μｍである。更により具体的な実施形態では、微孔性の足場は、異なる細孔サイズを有する２つの水平な層によって形成される。より具体的な実施形態では、下層の細孔サイズは２０μｍ～１００μｍであり、上層の細孔サイズは２０μｍ～１５０μｍである。この二重層構造によって、足場内部でカプセルを効率的に保持することができる。

特定の実施形態では、微孔性の足場の剛性は、下の実施例に示すように、連続圧縮アッセイから得られるヤング率によって測定され、０．３ｋＰａ～１ｋＰａである。

カプセル化された細胞の必要な機能を妨害しないという条件で、任意の薬物又は生物活性剤を本発明のカプセル又はインプラントに組み込むことができる。好適な薬物又は生物活性剤の例としては、限定されるものではないが、抗血栓剤、抗生物質、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗血管新生剤、血管新生促進剤、抗炎症剤、細胞周期調節剤、それらのホモログ、誘導体、断片、それらの薬学的な塩及び組み合わせが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、足場は、インプラントの周囲の血管の成長を促進し、それによって、移植された細胞への酸素及び栄養素の到達を容易にするために、ＶＥＧＦなどの血管新生剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、足場はステロイド系抗炎症薬などの抗炎症薬を含んでもよい。

したがって、特定の実施形態では、本発明のカプセル又はインプラントは更に、抗炎症剤、抗生物質、血管新生促進剤、又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、血管新生促進因子はＶＥＧＦである。

上述のように、第３の態様において、療法、診断又は予後における使用のための本発明のカプセル又はインプラントを提供する。

カプセル化した細胞を、それを必要とする患者に投与、例えば、注射又は移植して、疾患又は障害を治療することができる。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、患者におけるホルモン又はタンパク質の分泌細胞の機能不全によって引き起こされるか、又はそれを伴う。これらの実施形態では、ホルモン又はタンパク質の分泌細胞がカプセル化されて患者に投与される。例えば、カプセル化された膵島細胞を糖尿病患者に投与することができる。他の実施形態では、細胞を対象の組織の回復に使用する。これらの実施形態では、細胞は、皮膚、骨、軟骨、筋肉、又は血管などの構造組織を形成する。これらの実施形態では、細胞は、好ましくは幹細胞又は前駆細胞である。

本発明のカプセル及びインプラントで治療することができる疾患又は障害の非限定的なリストには、アルツハイマー病、ハンチントン病、又はパーキンソン病などの神経変性疾患；心血管疾患；Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、肝不全、アミノ酸代謝異常、有機酸代謝異常、脂肪酸代謝異常、プリン及びピリミジン代謝異常、ライソゾーム病、並びにペルオキシソーム代謝異常などの代謝性疾患；炎症性疾患；並びに非固形癌及び固形癌を含む癌が含まれる。

したがって、第３の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明のカプセル又はインプラントは、代謝疾患の治療において使用するためのものである。より具体的な実施形態では、代謝疾患は糖尿病である。更により具体的な実施形態では、カプセル又はインプラントは、Ｉ型糖尿病の治療に使用するためのものである。

この実施形態はまた、Ｉ型糖尿病の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、第１の態様のカプセル又は第２の態様のインプラントの使用として定式化することもできる。この態様はまた、Ｉ型糖尿病を治療及び／又は予防するための方法として定式化することもでき、方法は、治療有効量の第１の態様のカプセル又は第２の態様のインプラントを、それを必要とする対象に投与又は移植することを含む。

別の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明のカプセル又はインプラントは、肝疾患（すなわち肝臓の疾患）の治療に使用するためのものである。本発明は、任意の種類の肝機能障害、例えば、慢性肝疾患、肝炎、肝硬変、肝臓がん、非アルコール性脂肪肝、ライエ症候群、Ｉ型糖原病、又はウィルソン病を伴う任意の疾患を治療するために使用することができる。

本明細書において提供されるカプセル及びインプラントは、単独で、又は任意の好適な薬物若しくは他の療法と組み合わせて、投与又は移植することができる。このような薬物及び療法薬はまた、カプセル又はインプラントが患者体内に存在する期間中に、別々に投与することができる（すなわち、並行して用いることができる）。開示するカプセル又はインプラントは線維症及び免疫反応を軽減するが、カプセル又はインプラントと一緒に、又は並行して抗炎症薬及び免疫抑制薬を使用することは除外されない。しかしながら、好ましい実施形態では、開示するカプセル又はインプラントは、抗炎症薬及び免疫抑制薬を用いずに使用される。好ましい実施形態では、使用する任意の抗炎症薬又は免疫抑制薬の使用、濃度、効果、又はそれらの組み合わせが有効レベル未満に低下した後、線維症は使用後軽減されたままである。

本発明のインプラントのカプセルはまた、例えば、患者由来の細胞をカプセル化してそれらをインビトロで培養し、次いでそれらについてインスリン分泌試験などの機能試験を行うことによって、疾患のインビトロ診断又は予後のために使用することもできる。細胞は、分化した細胞であっても、リプログラミングされた細胞であっても、分化転換された細胞であってもよい。これらのアッセイは、アッセイの多重化を可能にするマイクロ流体アレイ上で実施することができる。

前述のように、本発明はまた、細胞のインビトロでの培養のための本発明のヒドロゲルカプセル又はインプラントの使用を提供する。

本発明のカプセルの組成及び構造によって、細胞培養、特に細胞凝集体又はオルガノイドに最適な条件が得られる。

上述のように、本発明はまた、第５の態様において、未分化細胞を膵島細胞に分化させるための、あるいは分化した細胞を膵島細胞に分化転換させるためのエクスビボの方法を提供し、方法は、（ａ）細胞が未分化細胞又は分化した細胞である、本発明のヒドロゲルカプセルを生成するステップ、（ｂ）（ａ）のヒドロゲルカプセルを、ＫＧＦ（ケラチノサイト成長因子）、ＳＡＮＴ１（（４－ベンジル－ピペラジン－１－イル）－（３，５－ジメチル－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール－４－イルメチレン）－アミン）、レチノイン酸、及びそれらの混合物からなる群から選択される因子と接触させるステップ、を含む。

第５の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ステップ（ｂ）は、ヒドロゲルカプセルをＫＧＦ、ＳＡＮＴ１、及びレチノイン酸と逐次培養ステップで接触させることを含む。当業者は、膵島細胞（すなわち、β細胞）を生成するための様々な技術が存在することを知っており、それらの全ては、本発明のカプセルに適用することができる（例えば、Ｆｅｌｉｃｉａ Ｗ．Ｐａｇｌｉｕｃａら、”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ β ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”，Ｃｅｌｌ．２０１４，ｖｏｌ．１５９（２），ｐｐ．４２８～４３９を参照）。

第５の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ステップ（ｂ）は更に、ヒドロゲルカプセルを膵臓由来の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と接触させることを含む。膵臓ＥＣＭは、下の実施例に開示するものなど、様々な方法によって得ることができる。

本発明のカプセルによって提供される細胞の３Ｄ培養のための最適条件は、特に得られる細胞が凝集体を形成する細胞である場合、分化及び分化転換プロセスを容易にする。

上述のように、本発明はまた、第１の態様において特定されたヒドロゲルカプセルを生成する方法を提供し、方法は、（ａ）タンパク質と細胞とを含む第１コア層を形成するステップ、（ｂ）タンパク質の非共有結合性の網状化を可能にしてヒドロゲルを形成するステップ、（ｃ）ヒドロゲルを、架橋剤を含む溶液中に浸漬するステップ、を含む。

第６の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ステップ（ａ）は、（ｉ）ノズルを有するエレクトロスプレー装置を提供するステップ、（ｉｉ）タンパク質と細胞とを含む組成物をノズルのチューブにポンプ注入するステップ、（ｉｉｉ）液滴を超疎水性表面に落とすステップ、を含む。疎水性表面は接触角を測定して特徴付けた。接触角は、液体－固体界面と液体－蒸気界面との交差によって形成される角度として定義される（液滴プロファイルにおける液体－蒸気界面に沿って接触点から接線を適用することによって幾何学的に得られる）。より具体的には、９０°未満の接触角は表面の濡れが好ましいことを示し、流体は表面上の広い領域にわたって広がり、親水性表面として定義され、一方、９０°より大きい接触角は概して、表面の濡れが好ましくないことを意味し、流体は表面との接触を最小限にして小型の液滴を形成し、疎水性表面として定義される。超疎水性表面では、水接触角が通常１５０°より大きく、液滴と表面との間の接触がほとんどないことを示す。したがって、より具体的な実施形態では、液滴は１５０°以上の水接触角を有する表面に落ちる。

第６の態様の特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ステップ（ｂ）は熱処理によって行われる。より具体的には、熱処理は３０～４０℃、３５～４０℃、又は３７℃で行われる。更により具体的には、熱処理は１～１５分間、２～１２分間、又は３～１０分間行われる。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は３７℃で３分間、又は３７℃で１５分間行われる。

特定の実施形態では、任意に上又は下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ステップ（ｃ）は０．１～１０ｗ／ｗ％、０．５～５ｗ／ｗ％、０．５～２ｗ／ｗ％、０．５～３ｗ／ｗ％、又は１ｗ／ｗ％の濃度でタンニン酸を含む溶液中で行われる。更に具体的な実施形態では、ステップ（ｃ）は０．５～３分間、０．５～２分間、又は１分間行なわれる。更により具体的な実施形態では、ステップ（ｃ）は１ｗ／ｗ％のタンニン酸を含む溶液中で１分間行われる。更により具体的な実施形態では、ステップ（ｃ）は３ｗ／ｗ％のタンニン酸を含む溶液中で１分間行われる。

上述のように、本発明はまた、本発明の第６の態様において特定される方法によって得ることができるヒドロゲルカプセルを提供する。第１の態様のヒドロゲルカプセル及びそれらの使用に関する全ての実施形態は、この第６の態様にも適用されることが意図される。この態様によって提供されるカプセルはまた、第２の態様のインプラントの製造にも適する。

上述のように、第８の態様において、本発明は、インビトロのコンパニオン診断方法における第１の態様において特定されたヒドロゲルカプセル又は第２の態様において特定されたインプラントの使用を提供する。

第８の態様の特定の実施形態では、コンパニオン診断方法は、（ａ）細胞が対象由来の細胞である第１の態様で特定されたヒドロゲルカプセルを生成するステップ、（ｂ）（ａ）で生成されたヒドロゲルカプセルを薬物と接触させるステップ、（ｃ）対象を治療するために有効な薬物の用量を決定するステップ、を含む。当業者には、本発明のカプセル及びインプラントが、糖尿病などの多種多様な疾患のコンパニオン診断方法において使用できることが理解される。この場合、対象由来の膵島細胞をカプセル化して、グルコース応答についてインビトロで試験することができる。したがって、本発明のカプセル及びインプラントは、個別化医療の分野において大きな進歩となる。

この実施形態はまた、それを必要とする対象に対する薬物の有効投薬量を特定するためのコンパニオン診断方法として定式化することができ、方法は、ａ）細胞が対象由来の細胞である第１の態様において特定されたヒドロゲルカプセルを生成するステップ、（ｂ）（ａ）で生成されたヒドロゲルカプセルを薬物と接触させるステップ、（ｃ）対象を治療するために有効な薬物の用量を決定するステップ、を含む。本発明のコンパニオン診断方法はまた、対象の医療レジメンを開始することを決定若しくは推奨するために、又は患者の医療レジメンの有効性を決定するために使用することができる。

本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む（comprise）」という語及びこの単語の変形は、他の技術的特徴、添加物、成分、又はステップを除外することは意図していない。更に、単語「含む（comprise）」は、「からなる（consisting of）」の場合を包含する。本発明の更なる目的、利点、及び特徴は、説明を検討することによって当業者に明らかになるか、又は本発明の実施によって習得される。以下の実施例及び図面は例示のために提供され、それらによって本発明が限定されることは意図していない。特許請求の範囲において括弧内に記載された図面に関連する参照記号は、単に特許請求の範囲の理解を深めるためのものであり、特許請求の範囲を限定するものと解釈するべきではない。更に、本発明は、本明細書に記載される特定の、また好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。

１． ヒドロゲルの調製
コラーゲン
コラーゲン溶液を製造説明書に従って低温条件で調製した。簡潔には、８．４３ｍｇ／ｍＬのラット尾由来の滅菌した酸可溶性Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２４９）を、１０ｘＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ４４１７／１００ＴＡＢ）に１：１０の比で溶解し、１ＭのＮａＯＨ（ＰａｎＲｅａｃ－ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号１３１６８７．１２１０）で中和して、７．５のｐＨにした。得られたヒドロゲル溶液をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）、カタログ番号１１８７５０８５）で溶解して、４ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。次いで、ヒドロゲル溶液を直径８ｍｍ及び高さ３ｍｍの円筒形のＰＤＭＳ鋳型（シリコーンエラストマー）（ＤＯＷ Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号ＳＹＬＧＡＲＤ１８４）に注いだ。コラーゲンヒドロゲルを３７℃で１０分後に重合させた。重合の後、架橋ヒドロゲルは、予熱した１ｘＰＢＳ溶液中に浸漬することによって、鋳型から容易に離型することができた。

タンニン酸で架橋したコラーゲン
より安定な網の目構造を得るために、コラーゲンの架橋剤としてタンニン酸（ＴＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４０３０４０－５０Ｇ）を使用した。この方法は架橋した円筒状ヒドロゲルを１ｗｔ％のタンニン酸溶液中に１分間浸漬することからなる。重合は２つの材料の間の界面で起こり、浸漬時間を短く保つことにより、内側部分よりも外側表面上でより網状化されたヒドロゲルを得ることができる。最後に、タンニン酸で架橋したヒドロゲルを１ｘＰＢＳ溶液で３回洗浄し、１０分間の各洗浄中、１一定に撹拌した。

メタクリレートで架橋したコラーゲン
Ｗｉｌｌｉａｍ Ｔ．Ｂｒｉｎｋｍａｎら、”Ｐｈｏｔｏ－Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｇｅｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００３，ｖｏｌ．４（４），ｐｐ８９０～８９５によって報告された方法論を改造した様式で、ラット尾のＩ型コラーゲンを無水メタクリル酸と反応させることによって、メタクリル化コラーゲンを調製した。簡潔には、９．５ｍｇ／ｍＬのラット尾のＩ型コラーゲン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２４９）を０．０２Ｎの酢酸（ＰａｎＲｅａｃ－ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号１３１００８１６１２）に、一晩一定に撹拌しながら４℃で溶解させて、４ｍｇ／ｍＬ溶液を生成した。無水メタクリル酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２７６６８５）を２：１０００の比で添加して、４℃で激しく撹拌した。２４時間の反応時間の後、混合物を０．０２Ｎの酢酸に４℃で、透析液を頻繁に交換しながら４８時間透析した。透析の後、メタクリル化コラーゲン溶液を一晩凍結させ、７２時間凍結乾燥し、最後に最終濃度８．４３ｍｇ／ｍＬで０．０２Ｎの酢酸中に再懸濁させた。

次いで、フェニル－２，４，６－トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）光開始剤（ＴＣＩ ＥＵＲＯＰＥ Ｎ．Ｖ．、カタログ番号Ｌ０２９０）を１０ｘＰＢＳ溶液中に１％ｗ／ｖで希釈した。メタクリル化コラーゲンのストック溶液を、光開始剤を含有する１０ｘＰＢＳ中に１：１０の比で希釈し、７．５のｐＨになるように１ＭのＮａＯＨで中和した。得られたヒドロゲル溶液をＲＰＭＩ培地で溶解して、最終濃度を４ｍｇ／ｍＬとした。

次いで、ヒドロゲル溶液を、直径８ｍｍ及び高さ３ｍｍの円筒形のＰＤＭＳ鋳型に注いだ。コラーゲンヒドロゲルを３７℃で１０分後に重合させ、ＵＶＰクロスリンカー（ＡｎａｌｔｉｔｉｋＪｅｎａ、Ｇ１１６４２７）を用いて１４．８２ｍＷ／ｃｍ２のＵＶ光を９６秒間照射した。重合後、架橋ヒドロゲルは、予熱した１ｘＰＢＳ溶液中に浸漬することによって、鋳型から容易に離型することができた。

膵臓の細胞外マトリックスヒドロゲル
ヒト死体の膵臓を最初に小さな立方体片に切断した。一定に撹拌しながら、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で組織片を３回洗浄した。

脱細胞は、１ｘＰＢＳ中の１ｗ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣＡＳ：９００２－９３－１、カタログ番号Ｘ１００－１００ＭＬ）を用いて行った。次いで、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１５１４０１２２）を５０Ｉ．Ｕ．／ｍＬの最終濃度で添加した。組織を４８時間脱細胞し、１２時間毎に溶液を交換した。

界面活性剤処理の後、組織を水で徹底的にすすぎ、新しい滅菌ビーカーに入れて、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中で更に５日間撹拌した。溶液は１２時間毎に交換した。次に、ＥＣＭを一晩凍結させ、７２時間凍結乾燥し、粉砕して微粉末を生成した。

ヒドロゲルの形態を生成するために、得られた膵臓ＥＣＭ粉末を、酸性ペプシン溶液を使用して酵素的に消化した。新鮮な酸性ペプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ６８８７－１Ｇ）を０．１ＭのＨＣｌに最終濃度１ｍｇ／ｍＬで溶解させた。ＥＣＭ粉末を５ｍＬのバイアルに入れて（各バイアル３０ｍｇ）、ペプシン溶液を３０ｍｇＥＣＭ／ｍＬペプシン溶液の最終濃度で添加し、４８時間撹拌した。消化の後、液体ＥＣＭを、１ＭのＮａＯＨ及び０．１ＭのＨＣｌを使用して生理学的ｐＨに中和し、塩の条件を１０ｘＰＢＳで調整した。得られたプレゲル溶液は、３７℃、１２時間のインキュベーションで重合することができた。

２． ヒドロゲルの特徴付け
メタクリル化コラーゲンのＮＭＲ－^１Ｈによる特徴付け
^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル法を用いた官能化コラーゲンの特徴付けから、メタクリルアミドのアクリルプロトンの二重結合に特徴的なｄ＝５．３～５．５ｐｐｍのピークの存在が示された（図１を参照）。更に、ｄ＝１．８ｐｐｍのシグナルは、ビニル官能基のメチル基に対応する。ｄ＝２．８９ｐｐｍのシグナルはリジンアミンのメチレン水素に帰属しており、修飾の程度を定量するための参照シグナルとして使用した。ＮＭＲ分析によって測定された官能化度は、利用可能なアミン官能基の７９～８１％であった。

分解
分解分析のために、直径８ｍｍの円筒形のヒドロゲルを上記のように作製した。ヒドロゲルを２４ウェルプレートに入れ、１ｘＰＢＳ溶液に１日間浸しておいて膨潤させた。合計で３ｍＬの１ｘＰＢＳ中０．２５Ｕ／ｍＬのＩ型コラゲナーゼをヒドロゲルに添加し、それらを１００ｒｐｍの振盪条件下、３７℃でインキュベートした。次いで、ヒドロゲルを１、２、４、２４、４８時間及び７日後に秤量した。残存ヒドロゲルのパーセント（％Ｗｒ）を以下の式によって決定した。

式中、Ｗｔ及びＷｉはコラゲナーゼとインキュベーションした後のヒドロゲル複合体の重量及び膨潤後の初期重量を表す。

図２に示すように、メタクリレートによるコラーゲンの架橋（ＣｏｌＭａ）は、コラゲナーゼによる分解に対する耐性が改善された。驚くべきことに、この耐性は、コラーゲンを代わりにタンニン酸で処理した場合（ＣｏｌＴＡ）に大きく向上した。対照ヒドロゲルは８時間で分解したが、ＣｏｌＭＡは４８時間で分解し、コラゲナーゼに対するより低い酵素分解を示した。タンニン酸（ＣｏｌＴＡ）に浸漬したコラーゲンは、実験の７日間にわたっていかなる程度の分解も示さなかった。

ＳＥＭ画像
細孔径の定量のために、直径８ｍｍの円筒形のヒドロゲルを上記のように作製した。次いで、それらをＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で３日間膨潤させた。その後、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中での段階的なエタノール溶液（３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、及び９６ｖ／ｖ％）にそれぞれ１０分間、１００％エタノールに２回、順に浸して脱水を行った。次に、サンプルを臨界点乾燥装置（Ｋ８５０、Ｑｕｏｒｕｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、英国）のチャンバーに入れ、密封して冷却した。エタノールをゆっくりと加熱して液体ＣＯ_２で完全に置き換えた。この技術によって、それらの崩壊を回避しながら、ヒドロゲルを脱水することができた。臨界点乾燥の後、ヒドロゲルを極薄コーティング金で被覆して、超高分解能走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で画像化した。

図３に示すように、得られた生体材料は、微細な相互接続したフィブリルが薄く重なり合った層からなる。これらの相互接続されたフィブリルは、ナノスケールの範囲の多孔質を形成した。これらのナノ細孔は、インスリン六量体及びグルコース分子（直径１．５ナノメートル）のヒドロゲル（直径５ナノメートル）を横切った拡散を可能にし、マイクロメートル（直径２０～８０マイクロメートル）の範囲であるマクロファージのような細胞の侵入を防止した。

剛性
ヒドロゲルの機械的特性は、平行プレートレオメトリー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＲ－２レオメーター、ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、英国）を使用して評価した。ヒドロゲルを円筒形（厚さ１ｍｍ、直径８ｍｍ）で作製し、体積弾性率（Ｇ’）及び粘弾性率（Ｇ”）の測定値を、８ｍｍのアルミニウムプレートのジオメトリを使用して、室温で１～１０Ｈｚの周波数範囲で記録した。ギャップは、元のサンプル高さから始めて、０．３Ｎの法線力に達するまでサンプルを圧縮して調整した。ヒドロゲルのレオロジー測定はゲル化の２４時間後に行った。

以下の表に試験した様々な材料の貯蔵弾性率及び損失弾性率をまとめる。

図４に示すように、貯蔵弾性率値は、ＣｏｌＭＡヒドロゲルの１８２ＰａからＣｏｌＴＡの１５１８４Ｐａに上昇した。貯蔵弾性率は材料の弾性の部分又は剛性を表す。熱として放散されたエネルギーは粘性の部分を表し、損失弾性率として示される。全ての配合の生体材料の周波数依存の測定から、貯蔵弾性率が常に損失弾性率より高いことが示され、全てのヒドロゲルが主に弾性であることが示された。

図５は本発明のカプセルが完全に丸い形態を示し、容易に取り扱うことができることを示している。この完全な形態は、カプセル内部での栄養素及びホルモンの拡散における通常の制限を最小限にし、したがって細胞の壊死を減少させることから、細胞のカプセル化に大きな利点を与える。

ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）による特性評価
Ｉ型コラーゲンヒドロゲル溶液を１ｃｍｘ０．５ｃｍの長方形のＰＤＭＳ鋳型を用いて調製した。４ｍｇ／ｍＬのヒドロゲル溶液を１６０μｌの体積でそれぞれの鋳型に注ぎ、３７℃で３０分間重合させた。重合の後、長方形の短辺側の１つにプールを形成するために、長方形のＰＤＭＳ鋳型を長くした。これらのプールを１ｗｔ／ｖ％のタンニン酸溶液で１分間満たして、ヒドロゲル中に架橋の勾配を作製した。次いで、ヒドロゲルを離型して、ＰＢＳ１ｘで３回すすいだ。

ヒドロゲルのマイクロレオロジーを、倒立光学顕微鏡（ニコン、Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｕ）のステージ上に取り付けられた原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて調べた。０．０８Ｎ／ｍの力定数、１７ｋＨｚの共振周波数、及び２００μｍのカンチレバー長を有するＰｙｒｅｘ－Ｎｉｔｒｉｄｅ三角カンチレバー（Ｎａｎｏｗｏｒｌｄ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＰＮＰ－ＴＲ－５０）を用いてサンプルを分析した。ＡＦＭ測定は培養ガラスのカバースリップ上、室温で実施した。フォトダイオードの信号とカンチレバーのゆがみとの間の関係を測定前に較正した。較正係数は、培養ガラスのカバースリップの裸の領域と接触しているカンチレバーで記録されたフォトダイオードの信号と位置センサの信号との間の線形関係の傾きとした。カンチレバー上の力（Ｆ）は、ＪＰＫ Ｎａｎｏｗｉｚａｒｄ Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアを使用して計算した。

次いで、本発明者らは、ヒドロゲルに沿った剛性を分析して、タンニン酸溶液の架橋効果を決定した。図６に示すように、３つのサンプルの全てにおいて、剛性はｘ軸に沿って減少し、タンニン酸がヒドロゲルを架橋しながら拡散することが確認された。

多孔性ヒドロゲルのサイズ
円筒形のヒドロゲルをＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で３日間膨潤させた。その後、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中での段階的なエタノール溶液、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、及び９６ｖ／ｖ％にそれぞれ１０分間、１００％エタノールに２回、順に浸漬して脱水を行った。次に、サンプルを臨界点乾燥装置（Ｋ８５０、Ｑｕｏｒｕｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、英国）のチャンバーに入れ、密封して冷却した。エタノールをゆっくりと加熱して液体ＣＯ２で完全に置き換えた。臨界点乾燥の後、ヒドロゲルを極薄コーティング金で被覆して、超高分解能走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で画像化した。

画像化による細孔の直径の定量化（図７）から、全ての条件がＴリンパ球の直径よりもはるかに小さい直径の平均サイズを示すことが確認された。対照、Ｔ．Ａ １ｘ及びＴ．Ａ ３ｘの孔の平均サイズは、それぞれ０．１１８、０．０９８及び０．０８２μｍであり、一方、Ｔリンパ球の直径サイズは７～１５μｍであった。

スフェロイドの直径サイズ
スフェロイドのサイズの制御に関して、本発明者らは最大５つの異なる直径の球体を生成する方法を検討した。弁の開閉時間を制御して様々なヒドロゲルの体積を使用することによって、本発明者らは直径１４９０＋／－３０μｍ～４６０＋／－６０μｍのサイズの範囲の細胞含有スフェロイドを成功裏に生成することができた。

３． ３Ｄスフェロイドのバイオプリンティング
多用途で細胞にフレンドリーな３次元（３Ｄ）バイオプリンターである３ＤＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）（ｒｅｇｅｎＨＵ Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をバイオプリンタープラットフォームとして使用し、これによって、１３０×９０×６０ｍｍの作業範囲で３Ｄ構造を作製することができる。バイオプリンター装置は、滅菌フード内に封入されたデスクトップ機器と、印刷プロセス中にプリントヘッドに沿って一定の温度を保証するための温度制御ユニットとを含む。

ディスペンサーモジュールは３つの異なるプリントヘッド、すなわち、時間－圧力ベース、押出ベース、及びインクジェット／弁ベースのプリントヘッドを備える。スフェロイドの作製に使用したプリントヘッドは、ナノリットルスケールの少量の低粘性材料を噴射するように自動制御される空気圧弁が組み込まれたインクジェット／弁のプリントヘッド（Ｍｉｃｒｏｖａｌｖｅ ＣＦ３００、ＭＶＪ－Ｄ０．１Ｓ０．０６）であった。以下の表に示すように、弁の開閉時間に応じて堆積した液滴の体積、したがって最終的なスフェロイドの直径を制御することができる。

この技術を利用して、本発明者らの戦略は、超疎水性表面上に整然と並んだ液滴を堆積させることからなる。前処理された表面によって、細胞含有ヒドロゲルの液滴の球状の形を維持することができる。この方法論を用いて、１００スフェロイド／分を自動的に作製することができる。

超疎水性表面
二層コーティング系（ベースコート及びトップコート）をベースとしたＵｌｔｒａ－Ｅｖｅｒ Ｄｒｙ（ＳＥ７．６．１１０）溶媒を使用して、超疎水性表面を調製した。表面を活性化させるために、標準ペトリ皿（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号０５５０６１－ＩＮＦ）を超純水で３回、エタノール（ＰａｎＲＥａｃ ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、カタログ番号１３１０８５．１２１２）で１回洗浄した。各成分を２つの専用の噴霧器に注いだ。第１成分を混合して、薄い湿潤コーティングが形成されるまで５秒間ペトリ皿に塗布した。ペトリ皿を室温で１５～２０分間乾燥させ、次いで第２成分を塗布した。コーティングは、第２成分のコーティングの塗布の３０分後に超疎水性になった。

細胞含有バイオインクの調製
ＨＦＦ１０．３ヒト線維芽細胞を、ＩＤＩＢＡＰＳから購入したβ様細胞に直接リプログラミングして（Ｓａｒａ Ｃｅｒｖａｎｔｅｓら、”Ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｄｉｆｆｅｒａｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐ－ｃｅｌｌｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｊａｒｉｄ２”，Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７，ｖｏｌ．１４；７（１），ｐｐ．１１６４３）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１６００００４４）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１５１４０１２２）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（商標）、カタログ番号１１８７５０８５）中で、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で増殖させた。０．０５％トリプシン－０．２５％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ４０４９－１００ＭＬ）を３７℃で５分間使用して、ｐ様細胞を１つずつの細胞に解離させて、２ｍＬの滅菌エッペンドルフに入れた。次いで、ｐ様細胞を１２００ｒ．ｐ．ｍで３分間遠心分離して、ウェルの底に細胞ペレットを形成させた。

細胞含有ヒドロゲルを作製するために、４ｍｇ／ｍＬの濃度の冷コラーゲン溶液の１体積を細胞ペレットと混合して、１×１０^６細胞／ｍＬの最終密度にした。バイオプリンターのカートリッジ／シリンジに冷コラーゲンバイオインクを充填して、バイオプリンターのディスペンサーモジュールに装填した。５０個の点からなる正方形アレイパターンを、ＢｉｏＣＡＤ ｖ１．０ソフトウェア（ｒｅｇｅｎｔＨＵ Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して設計し、バイオプリンタープラットフォームに載せた。最適な印刷適性は、０．１ｍｍのノズル直径、０．２バールの圧力、並びに５００００ｐｓの弁開放及び閉鎖時間を使用して、６℃で得られた。印刷後、ペトリ皿を３７℃で３分間置いた。次いで、１ｗｔ％のタンニン酸溶液にスフェロイドを１分間浸漬して架橋することによって、より安定なゲル化を更に実現した。次いで、スフェロイドを２４ウェル無処理ＭＷプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３７３８）に入れて、ＲＰＭＩ培地で一定に撹拌しながら３回洗浄した。その後、４８ウェルＭＷプレートを一定に軽く撹拌しながら維持して、スフェロイドを３Ｄ懸濁液中で培養した。

細胞含有肝細胞バイオインクの調製
ＡＭＬ１２（α ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ １２）細胞株はマウス（ＣＤ１株、ＭＴ４２株）由来肝細胞から樹立され、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号ＣＲＬ－２２５４（商標））から購入した。これらの細胞はペルオキシソーム及び毛細胆管様構造などの典型的な肝細胞の特徴を示す。ＡＭＬ１２細胞は、血清（アルブミン、α１アンチトリプシン及びトランスフェリン）及びギャップ結合（コネキシン２６及び３２）タンパク質のｍＲＮＡを高レベルで発現する能力を保持し、乳酸デヒドロゲナーゼのアイソザイム５のみを含有する。

この細胞株の基礎培地はＤＭＥＭである。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＡＴＣＣ（登録商標）、カタログ番号３０－２０２０）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１５１４０１２２）及びインスリン－トランスフェリン－セレン（ＩＴＳ－Ｇ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号４１４０００４５）を補充したＦ１２培地は完全培地（ＣＭ）と呼ばれる。

これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。各実験の前に、ＡＭＬ１２細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、カタログ番号ＣＬＳ４３０６４１）から１ｍＬの０．０５％トリプシン－０．２５％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ４０４９－１００ＭＬ）を使用して３７℃、５分間で剥がし、９ｍＬのＣＭを入れた１５ｍＬのファルコンチューブ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１５０７４１１）に集めてトリプシンを失活させた。その後、細胞を１２００ｒ．ｐ．ｍで３分間遠心分離して、チューブの底に細胞ペレットを形成させ、ＰＢＳで洗浄して、計数した。

細胞含有ヒドロゲルを作製するために、「ＡＦＭの特徴付け」の項に前述した４ｍｇ／ｍＬの濃度の冷コラーゲン溶液１ｍＬを細胞ペレットと混合して、最終密度を１×１０^６細胞／ｍＬにした。バイオプリンターのカートリッジ／シリンジに冷コラーゲンバイオインクを充填して、バイオプリンターのディスペンサーモジュールに装填した。５０個の点からなる正方形アレイパターンを、ＢｉｏＣＡＤ ｖ１．０ソフトウェア（ｒｅｇｅｎＨＵ Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して設計し、バイオプリンタープラットフォームに載せた。最適な印刷適性は、０．１ｍｍのノズル直径、１バールの圧力、並びに５００００μｓ又は１０００００μｓの弁開放及び閉鎖時間を使用して、６℃で得られた。印刷後、ペトリ皿を３７℃で３分間置いた。次いで、１ｗ／Ｖ％のタンニン酸溶液にスフェロイドを１分間浸漬して架橋することによって、より安定なゲル化を更に実現した。次いで、スフェロイドを２４ウェル無処理ＭＷプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３７３８）に入れて、ＣＭ中で一定に撹拌しながら３回洗浄した。その後、４８ウェルＭＷプレートを一定に軽く撹拌しながら維持して、スフェロイドを３Ｄ懸濁液中で培養した。

ラット膵臓β細胞のバイオプリント
Ａｕｇｕｓｔ Ｐｉ ｉ Ｓｕｎｙｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｉ ＤＩ ＢＡＰＳ）から提供されたラット膵臓β細胞株ＩＮＳ１Ｅ細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭのｄｅ ２－メルカプトエタノール、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ｖ／ｖ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を補充したＲＰＭＩ Ｒ８７５８培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（１１．１ｍＭのグルコース）中、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養した。０．０５％トリプシン－０．２５％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して３７℃、３～４分間で、ｐ細胞を一つずつの細胞に解離させ、遠心分離してウェルの底に細胞ペレットを得た。３ＤＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）（ｒｅｇｅｎＨＵ Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をバイオプリンタープラットフォームとして使用した。スフェロイドの作製に使用したプリントヘッドは、インクジェット／弁のプリントヘッド（Ｍｉｃｒｏｖａｌｖｅ ＤＦ３００、ＭＮＪ－Ｄ０．１Ｓ０．０６）であった。バイオプリンターのカートリッジ／シリンジを、細胞ペレットと混合して７×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度とした４ｍｇ／ｍＬの濃度の冷コラーゲン溶液の１体積で充填した。５０個の点からなる正方形アレイパターンを、ＢｉｏＣＡＤ ｖ１．０ソフトウェア（ｒｅｇｅｎｔＨＵ Ｌｔｄ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して設計し、バイオプリンタープラットフォームに載せた。最適な印刷適性は、０．１ｍｍのノズル直径、０．２バールの圧力、並びに０．８３μｍの直径に相当する１０ミリ秒の弁開放及び閉鎖時間を使用して、６℃で得られた。印刷後、疎水性ペトリ皿を３７℃で１５分間置いた。次いで、スフェロイドを２つの異なる濃度１ｘ及び３ｘのタンニン酸溶液中に浸漬した。続いて、スフェロイドを２４ウェル無処理ＭＷプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に入れて、一定に撹拌しながら３回洗浄した。その後、スフェロイドを、低グルコース（５．５ｍｍ）及び５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（商標））をベースとした低成長培地で、一定に撹拌しながら３Ｄ懸濁液中で培養した。

４． ヒドロゲルカプセルの機能的特徴付け
細胞生存率
ＨＦＦ１０．３ヒト細胞を、前述のように各ヒドロゲル中に封入した。ＣＦＤＡ－ＳＥアッセイキット（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）及びＨｏｅｃｈｓｔを用いた細胞標識プロトコルを使用して、１日後及び７日後に生存率を検討した。１０^７細胞／ｍＬに必要な体積を決定して、標識のための細胞懸濁液を調製した。９０μｌのＤＭＳＯを１つのＣＦＤＡのバイアルに添加して１０ｍＭのＣＦＤＡ溶液を調製して、十分に混合した。この溶液から１０μＬを取り出して、１０ｍＬのＰＢＳ又はＨＢＳＳで希釈して１０μＭの溶液を作製した。最後に、１０μＭの溶液を１：２０に希釈して、細胞を１０^７／ｍＬで再懸濁するために十分な０．５μＭのＣＦＤＡを作製した。標識する細胞を２００ｘｇで１０分間遠心分離して、上清をデカントし、細胞ペレットを０．５μＭのＣＦＤＡに再懸濁した。細胞を３７℃で１５分間インキュベートして、色素を細胞内に拡散させた。細胞を再び遠心分離して、ペレットを細胞培地に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞をもう一度２００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、細胞ペレットを培養培地中に５×１０^６／ｍＬの濃度で再懸濁させた。共焦点顕微鏡を使用して蛍光画像を取り込み、ＦＩＪＩソフトウェアによって処理した。

図８に培養７日後のコラーゲン及びＣｏｌＴＡの細胞含有ヒドロゲル内の生細胞（緑色）の代表的な蛍光画像を示す。両方のヒドロゲルは高い生存率を示した。重要なこととして、両方のヒドロゲル内で一つずつのβ様細胞は次第に自己集合し、凝集して、３Ｄスフェロイドを形成した。

ＭＬ１２肝細胞を３Ｄスフェロイドに封入し、製造業者のプロトコルに従って生存率を２４時間後に評価した（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｌ３２２４）。簡潔には、ヒドロゲル内に封入した細胞をＣＭ中で２４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳでそれぞれ５分間ずつ３回洗浄し、続いてカルセインＡＭ（４μＭ－緑色）、エチジウムホモダイマー－１（２μＭ－赤色）及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号６２２４９）とともにＰＢＳ中、室温、暗所で２５分間インキュベートした。ＰＢＳでそれぞれ５分間ずつ３回洗浄して、共焦点画像を撮影した（図１４）。両方のヒドロゲルは高い細胞生存率を示したが、束縛されていないコラーゲンマトリックスは、コラーゲンとタンニン酸との場合と比較して細胞増殖を促進した。

ＩＮＳ１Ｅスフェロイドの生存率を、製造業者の指示に従ってＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。色素溶液を、０．２％（ｖ／ｖ）エチジウムホモダイマー－１、０．０５％（ｖ／ｖ）カルセインＡＭ及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｈｏｅｃｈｓｔ ＰＢＳ１ｘを混合して調製した。蛍光ｚスタック画像を、共焦点顕微鏡を使用して撮像し、ＦＩＪＩソフトウェアによって処理した。

この分析から、スフェロイド内の細胞が、細胞のカプセル化及びバイオプリンティングによるスフェロイド作製の後に、全ての条件において生存可能なままであることが実証された。このデータは、タンニン酸がスフェロイド内部の生存率に影響を及ぼさないことを示している。

これらの結果は、２つの異なる生存率試験：Ａｌａｍａｒｂｌｕｅ（登録商標）及びＭＴＳ（それぞれ、ＤＡＬ１０２５－Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ及びＧ３５８２－プロメガ）によって裏付けられた。これらのバイオアッセイは、生成物が細胞の増殖に定量的に相関する酸化還元指示薬に基づく。各スフェロイドを、全実験（ｎ＝１０）を通して９６ウェルプレートに入れた。ＭＴＳの場合、２０μＬのＭＴＳを１００μＬの培地に添加し、３時間インキュベートして、４９０ｎｍで吸光度を測定した。Ａｌａｍａｒｂｌｕｅ（登録商標）アッセイでは、１０μＬの試薬を９０μＬの培地と混合し、黒色の平底プレート中で３時間インキュベートして、蛍光を５９０ｎｍで測定した。図９に３０日まで培養したＩＮＳ１Ｅのスフェロイドを示す。全ての実験条件の間で、１日目には細胞生存率及び代謝活性における差は検出されなかった。

驚くべきことに、Ｔ．Ａ．（タンニン酸）で処理したヒドロゲルカプセル中にカプセル化された細胞は、対照カプセル（Ｔ．Ａ．処理されていないコラーゲン）中の細胞と比較して増殖が増強されたことを示した。これらの結果は、本発明のカプセルが長期の細胞のカプセル化に適していること、及びそれらが細胞にとって最適な環境を提供して細胞の生存率を改善することを明確に示唆している。

漏出アッセイ
ＩＮＳ１Ｅスフェロイドに関して前のセクションに記載した同じ実験設定（９６ウェルプレートに配置された１つずつのスフェロイド）を用いて、スフェロイドからの細胞の漏出を評価した。具体的には、１、１０及び３０日目に、スフェロイドをウェルから取り出して新しい９６ウェルプレートに入れて、細胞がスフェロイドから漏出してウェルの底に付着した細胞の増殖の可能性を回避した。漏出した細胞を、上清及び培地の両方において評価した。上清については、各サンプルを（１２００ｒｐｍで１０分間）遠心分離したが、調査したいずれの実験条件においても細胞は計数されなかった。付着した細胞について、５０μＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（０．０２５％）を使用し、ウェルに添加して１０分間インキュベートした。ペレットを１０μＬに再懸濁し、１０μＬの０．４％トリパンブルー（１５２５００６１、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）と混合し、自動細胞計数装置Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）（１５３９７８０２、フィッシャーサイエンティフィック）を用いて計数した。図１０は、全ての実験を通して最大６００個の細胞／スフェロイドがコラーゲンから漏出することができた一方、ＣｏｌＴＡ １ｘ及びＣｏｌＴＡ ３ｘの両方の条件において細胞はほとんど又は全く見られなかったことを示している。かなり少ないＣｏｌＴＡ １ｘ及びＣｏｌＴＡ ３ｘにおいて計数された細胞のうち、５０％超が死んでいた。

インスリンアッセイ
更に、ヒドロゲル内のインスリン分泌を免疫染色によって検討した。この目的のために、ヒドロゲルを作製の１４日後に１０％ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で固定した。次いで、ヒドロゲルをＰＢＳで洗浄し、細胞をＢｌｏｃｋ－Ｐｅｒｍ溶液：ＰＢＳ中の０．２ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１ｗ／ｖ％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で１時間透過処理した。その後、ヒドロゲルを１ｘＰＢＳで洗浄し、一次抗インスリン抗体マウスＩｇｇ１（Ａｃｒｉｓ、カタログ番号ＢＭ５０８）溶液と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ヒドロゲルをＢｌｏｃｋ－Ｐｅｒｍ溶液：ＰＢＳ中の０．２ｖ／ｖ％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１ｗ／ｖ％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で２時間透過処理した。次いで、二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ抗マウスＩｇＧ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ３２７２８）溶液と共に４℃で一晩インキュベートした。ヒドロゲルを１ｘＰＢＳで３回洗浄し、マウントして４℃で保存して、共焦点顕微鏡で観察した。

図１１Ａに、抗インスリン抗体による免疫蛍光染色を用いた共焦点画像を示す。画像から、両方の生体材料、コラーゲン及びＣｏｌＴＡ中に封入された細胞が機能的であり、培養の７日後にインスリンホルモン（赤色）を分泌できることが示された。図１１Ｂに、示した条件で、タンニン酸で処理したカプセルにおける抗インスリン抗体による免疫蛍光染色を使用した更なる写真を示す。

重要なこととして、このデータは、スフェロイド内のほとんどの細胞がインスリンを産生し、それらが機能的クラスターを組織できたことを示した。条件当たり３つのスフェロイドからの４つの異なるｚスタックは、スフェロイド全体におけるインスリンの産生が均一であることを示している。したがって、スフェロイド内の位置に依存した機能性の差は見られなかった。条件間に質的な差はなく、このことはタンニン酸による処理が埋め込まれた細胞の機能性に影響しないようであることを意味している。

グルコース刺激インスリン分泌アッセイもＥＬＩＳＡによって測定した。作製後８日目のカプセル化Ｐ細胞を、２．８ｍＭのグルコースを含有するＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ重炭酸ＨＥＰＥＳ緩衝溶液（１１５ｍＭのＮａＣｌ、２４ｍＭのＮａＨＣＯ３、５ｍＭのＫＣＬ、１ｍＭのＭｇＣａ２－６Ｈ２Ｏ、１ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び０．５％のＢＳＡ、ｐＨ７．４）と共に３０分間プレインキュベートした。その後、スフェロイドを低グルコース（２．８ｍＭ）で１時間インキュベートし、続いて高グルコース（１６．７ｍＭ）でインキュベートした。各インキュベーションの後、上清を回収し、細胞のインスリン含量を酸－エタノール溶液中に回収した。インスリンの濃度を、標準的手順に従ってＥＬＩＳＡによって決定した（図１２）。結果は、本発明のカプセルに封入されたｐ－細胞がインスリンを産生できることを示している。

アルブミンの免疫蛍光染色
アルブミンのサイトゾル発現を、健康な肝細胞の機能的マーカーとして免疫蛍光技術を用いて検出した。この目的のために、上記のように調製した肝細胞を含むヒドロゲルを、ＣＭ中で２４時間培養を続けて、１０％中性緩衝ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＨＴ５０１１２８）を用いて１時間固定した。細胞を撹拌しながら５分間、３回洗浄した。続いて、細胞をＢｌｏｃｋ－Ｐｅｒｍ溶液：ＰＢＳ中の０．２ｖ／ｖ％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ８７８７）で透過処理した。アーティファクト又は望まない結合を生じないように、ウシ血清アルブミンの使用は避けた。その後、ヒドロゲルを、撹拌下で５分間、ＰＢＳで３回洗浄し、一次抗アルブミン抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ、カタログ番号ＧＴＸ１０２４１９）と共に加湿チャンバー中、４°で一晩インキュベートした。翌日、細胞を二次抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ抗マウスＩｇＧ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ３２７２８）と共に室温で２時間インキュベートした。ヒドロゲルをＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色し、マウントして４℃で保存し、共焦点顕微鏡で観察した（図１５）。興味深いことに、タンニン酸による更なる架橋は肝細胞の増殖速度を低下させるが、同時に、アルブミンの高発現によって示されるように分化状態を向上させる。

インビボでのスフェロイド移植
ＮＳＧマウス（ｎ＝９）を使用して、３つの異なる生体材料条件：１ｗｔ／ｖｏｌ％及び３ｗｔ／ｖｏｌ％のタンニン酸で架橋されたコラーゲン、並びに比較目的のためのアルギネートのシェルで被覆されたコラーゲンコアの生分解性を評価した：。各条件について、マウス当たり３つのスフェロイドを移植した。部位として網嚢を選択した。インビボの移植を１５日後及び３０日後に評価した。

４ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを用いて直径２ｍｍのスフェロイドを作製した。１ｗｔ／ｖｏｌ％及び３ｗｔ／ｖｏｌ％のタンニン酸（４０３０４０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液はＰＢＳ１ｘ中で調製した。次いで、溶液を温めて、０．２２μｍフィルター（ＳＬＰＧ０３３ＲＢ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ）で濾過した。アルギン酸ナトリウム（Ｗ２０１５０２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）粉末を秤量し、次いでＵＶ中で１５分間滅菌した。アルギネートをＰＢＳ１ｘ溶液に１．５ｗｔ／ｖｏｌ％で溶解させた。塩化カルシウム（Ｃ３３０６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）粉末を秤量し、次いでＵＶ中で１５分間滅菌した。塩化カルシウムをＭｉｌｌｉ Ｑ水に２ｗｔ／ｖｏｌ％で溶解させた。

一方で、コラーゲンスフェロイドをタンニン酸溶液に１分間浸漬した。次いで、ＰＢＳ１ｘで３回洗浄した。一方で、コラーゲンコアをアルギネートの第２層で覆うために、各スフェロイドを９６ウェルプレートに入れた。次に、１：２０のＣａＣｌ２でプレ重合した２０μｌのアルギネートを各ウェルに添加した。最後に、スフェロイドをＣａＣｌ２溶液に浸漬した。

移植した動物の全てにおいて毒性は観察されず、カプセルは全ての実験について安定であった（すなわち、少なくとも３０日間）。驚くべきことに、本発明のカプセル（すなわち、タンニン酸で架橋された）は、アルギネートのシェルを有するカプセルよりも宿主組織の線維症の発生が有意に少なかった。

この実験は、本発明のカプセルが、宿主において安全であり、炎症性又は線維性の影響を生じずに、長期間にわたるインビボでの使用に適していることを実証している。

５． ３Ｄバイオプリントされたヒドロゲルカプセルを埋め込むための微孔性の足場の調製
クリオゲルの形成（セルロース０．５％）
０．５％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）クリオゲルを作製するために、本発明者らは、５０ｍｇのＣＭＣを秤量し、０．５％（ｗ／ｖ）まで更に希釈するために、それをバイアル中の５ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に撹拌条件下で希釈した。ＣＭＣを溶解させている間に、本発明者らは本発明者らの鋳型を準備した。鋳型は、高さ１ｍｍ及び直径１０ｍｍのＰＤＭＳの円形プールからなっていた。その底部に、本発明者らは、２４×２４ｍｍの正方形のカバーガラスを置き、上部に丸い直径１２ｍｍのカバーガラスを置いて、鋳型を冷蔵庫に入れた。ＣＭＣを溶解させた後、本発明者らは以下のように架橋試薬を調製した。５０ｍｇ／ｍＬのＡＡＤ、０．５ＭでｐＨ５．５のＭＥＳ緩衝液、及び１μｇ／ｍＬのＥＤＣの全てをＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、ボルテックスで撹拌して溶液全体における均一性を確実にした。１ｍＬのＣＭＣ溶液のプレポリマー溶液を作製するために、本発明者らは、１００μｌのＭＥＳ緩衝液、７μｌのＡＡＤ及び４μｌのＥＤＣを添加して、凍結前の早期架橋を回避するために激しくピペッティングした。次に、本発明者らは、ＰＤＭＳ鋳型に最終プレポリマー溶液を充填し、本発明者らはそれを冷凍庫に速やかに入れて、それを２４時間置いた。翌日、本発明者らは、カバーガラス及びＰＤＭＳ鋳型を注意深く取り出して、浸して、１ｘＭｉｌｌｉＱ水、１ｘＮａＯＨ １００ｍＭ、１×１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｘＭｉｌｌｉＱ及び３ｘＰＢＳの連続的な洗浄ステップにした。洗浄プロトコルの終了後、更なる細胞播種実験のために、クリオゲルをオートクレーブ内で滅菌した。

クリオゲルを２４ウェルプレートに入れた（１クリオゲル／ウェル）。３Ｄスフェロイドを、少量のＤＭＥＭ／Ｆ１２＋０．５％ＢＳＡ中で１００又は１０００スフェロイド／クリオゲルの密度で播種した。１５～２０分後、５００μＬの同じ培地を添加し、更なる実験の前に３Ｄスフェロイドを３７℃、５％ＣＯ２で２日又は３日間インキュベートした。

６． 微孔性の足場の特徴付け
細孔の分析
細孔の分析のために、先のプレポリマー溶液中に１２μｌの１ｍＭのフルオレセインアミンを添加して、クリオゲルの繊維を染色した。染色の後、共焦点顕微鏡でｚスタック画像を撮影しており、細孔径の分布をＩｍａｇｅｄで定量化することができる。

図１６に見られるように、細孔の分布は、材料の濃度が高くなるにつれて小さくなる。５％のグラフを見ると、細孔の分布が２０μｍの小さい細孔から１００μｍの大きい細孔までに達することが理解される。対照的に、材料の量を０．２５％に低下させると、小さい方の細孔は約２０μｍであったが、大きい方の細孔は最大で２５０μｍの直径に達することができる。見られた結果を観察して、本発明者らは、より高い濃度の材料でより小さな層を作製して底部にはより小さな多孔性層を生成し、上部には最大１５０μｍに達するより大きな分布の多孔性を生成することを選択した。

膨潤
膨潤とは、クリオゲルによる水の取り込み量の比である。これを測定するために、クリオゲルを先に説明したように作製し、滅菌した後、クリオゲルを室温で乾燥させて秤量した。次に、それらをＭｉｌｌｉＱ水中に５日間浸漬し、それらが平衡に達したときに再び秤量した。膨潤比は以下のように計算した。

式中、Ｗ_ｅｑは平衡状態の重量であり、Ｗ_ｄは乾燥重量である。これらの実験では、クリオゲル当たり３つの測定値及び条件当たり３つのクリオゲルを秤量した。

図１７に、同じ量の材料であっても、材料の割合を変化させると膨潤比が変化することを示す。この場合、各クリオゲル複合体の吸水容量は、ゼラチンの割合に依存する。図１７で観察されるように、完全なＣＭＣのクリオゲルは約９８％の膨潤比を有するが、ゼラチンが添加された場合、この膨潤比は完全なゼラチンのクリオゲルにおける９６％まで低下する。

剛性
圧縮アッセイを行なって、本発明者らのサンプルの剛性を決定した。圧縮アッセイは、５Ｎのロードセルを備えたＺｗｉｃｋ Ｚ０．５ＴＮ装置（Ｚｗｉｃｋ－Ｒｏｅｌｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。実験は、室温で０．１ｍＮの予負荷及び２０％／分の歪み速度で、３０％の最終圧縮範囲までサンプルを用いて行なった。最後に、ヤング率を圧縮の１０％～２０％の範囲の傾きから計算した。これらの実験では、クリオゲル当たり３つの測定及び条件当たり３つのクリオゲルを試験した。

図１８から、剛性結果が膨潤結果と関係していることが示される。理解されるように、完全なＣＭＣのクリオゲルは、完全なゼラチンのクリオゲルと比較してより高い剛性を有する（０．３ｋＤａに対して０．７ｋＤａ）。このように、ゼラチンの添加はその剛性を低下させるが、細孔の分布には何ら変動がないと言うことができる。

ＳＥＭ画像
ＳＥＭ画像のために、クリオゲルを先に説明したように作製した。滅菌後、エタノール脱水を行って、水をエタノールで置換した。５０％から開始して、７０％、８０％、９０％、９６％（ｘ２）及び９９．５％エタノールまでエタノールの百分率割合を増加させることによって、連続洗浄を行った。全ての水をエタノールに置換した後、全てのエタノールを除去してＣＯ_２に置換するために、臨界点乾燥を行った。次に、カーボンスパッタリングを行って、ＳＥＭ画像を撮影した。

図１９に示すように、本発明者らのものの高い細孔分布が理解される。第１層において、大きな細孔を有する領域とより小さな細孔を有する他の領域とを含む、この高い細孔の不均一性が存在することが分かる。

７． 糖尿病の対象を治療するためのインプラントの使用
インスリン依存性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）は、インスリン産生膵臓β細胞の破壊から生じる自己免疫障害である。Ｔ１ＤＭに関連する世界の負担は、３億８２００万人を占め、全糖尿病患者の５～１０％である。この数は、２０３５年までに５億９２００万人に増加すると予想されている。インスリンの外因性投与及び厳密な血糖制御が、糖尿病に関連する合併症の進行及び死亡を遅らせるために推奨される療法である。しかしながら、インスリンは、機能的な膵臓β細胞の膵島が行なうような効率的なグルコースの制御を提供しない。直近１０年間に、多能性幹細胞からのβ細胞の生成及び体細胞のリプログラミングの大きな進歩により、患者に個別化された膵島の置換療法の開発に対する大きな期待が高まった。しかしながら、膵島の移植には、免疫抑制、感染、及び短期療法（β細胞の限られた生存率）などの大きな制限が存在する。本明細書では、これらの３つの制限に効率的に取り組む、骨格筋組織に移植可能な人工膵臓としての３Ｄバイオプリントされた膵島の新しいマイクロカプセル化を提供する。更に、移植可能なマイクロデバイスでは、グルコースセンサーの交換のために必要とされる連続的かつ侵襲的な外科的介入が回避される。この全てについて、本発明はＴ１ＤＭ治療のための重要な療法の選択肢である。

本発明は、この療法領域に現在存在する重要なギャップを埋めようとするものであることから、Ｔ１ＤＭのβ細胞置換療法として膵島移植の足場を開発するための新規なアプローチである。主な目的は、移植された膵島移植片の生着を促進し、それらを後の時点で回収することを可能にし、生物操作された材料における最新の知識を利用する足場を開発しカスタマイズすることである。それは、ＰＥＧとコラーゲンとを組み合わせて、膵島と新たに形成された血管とを支持するために理想的な構造を作製することによって、これまで臨床の膵島移植に対する主要な障害であった長期移植片の血行再建を改善することができる。膵島移植のための革新的な足場の開発によって、本発明はＴ１Ｄを効果的に治療するためのβ細胞置換療法を革新しようとするものである。本発明者らの研究は、臨床の膵島移植をＴ１Ｄの治療の有効かつ安全な手段にすることに向けた重要な進歩を示す。これは、結果として、インスリン療法の負担をなくし、Ｔ１Ｄに関連する直接的及び間接的コストを低減し、また最も重要なこととして、世界中でこの疾患に罹患している数百万人の生活の質を改善することによって、社会的、臨床的及び経済的な正の効果を生じさせる可能性を有する。

外因性インスリンの複数回の皮下注射又は皮下ポンプによるＴ１ＤＭの治療では、生理学的インスリンプロファイルを再現することができない。更に、それは長期にわたっては低血糖及び高血糖の事象から保護することがなく、患者の日常生活及び平均余命に負の影響を及ぼす、厳密な血糖値の自己モニタリングを必要とする。移植可能な人工膵臓はＴ１ＤＭ治療の代替的な療法の選択肢となるが、それには移植された移植片の生存が限られること、並びにグルコース感知及びインスリン産生の遅延という事実に由来するいくつかの制限がある。一方、グルコースセンサーの短い寿命及び不適切なアルゴリズム制御によって、ポンプはＴ１ＤＭ患者の安全な治療の選択肢にならない。本発明は、Ｔ１ＤＭの決定的治療の創出に向けた重要な一歩であり、数百万人の命を救う可能性がある。本明細書に示した移植可能な人工膵臓は、最新の移植可能な膵島の技術の３つの重要な問題に取り組むものである。第１に、本明細書で提案するインプラントの解剖学的部位である骨格筋は、最適な栄養／酸素供給のための安全で血管化度の高い適所であり、手順の可逆性の実現性を極めて高くする。第２に、本明細書で使用される材料、特にＣｏｌＴＡ、及びその３～５ｎｍという細孔径は、グルコース感知とインスリン放出との間の時間を著しく短縮する。同時に、それによって宿主免疫細胞から効率的に保護される。第３に、膵島は生分解性コラーゲンに埋め込まれ、それは細胞のクラスター形成及び成長に容易に適応する。更に、細胞は、膵島の分散を防止するが、同時に新しい毛細血管の形成に影響を及ぼさない、非生分解性のタンニン酸コーティング内に閉じ込められる。この新しい複雑な系は、ナノテクノロジー、生物学及びティッシュエンジニアリングの統合のおかげで、より良い膵島のパフォーマンスを実現するための鍵となっている。更に、それは、循環グルコースに従ってインスリン放出を自己調節することができ、長期にわたって高いレベルの安定性及び機能性を提供し、更には患者への侵襲を最小限にする。

このように、膵島を含む本発明のヒドロゲルカプセル又はインプラントは、Ｉ型糖尿病に罹患している対象の組織、例えば骨格筋の内部に移植される。カプセル当たりの膵島の量及び移植されるカプセルの量は、疾患の重症度、年齢、性別のような様々なパラメータを考慮して決定することができる。重要なこととして、本発明のカプセルはまた、治療の前に疾患の重症度又は薬物応答性を判定するために使用することもできる。

条項
本発明の更なる態様／実施形態は以下の条項に見ることができる。

条項１．ヒドロゲルカプセルであって、
細胞、
タンパク質、及び
架橋剤を含み、
当該細胞が当該タンパク質を含む第１コア層内にあり、また
当該第１コア層が当該タンパク質と当該架橋剤とを含む第２層によって囲まれている、ヒドロゲルカプセル。

条項２．当該タンパク質がコラーゲンを含む、条項１に記載のヒドロゲルカプセル。

条項３．当該架橋剤が、タンニン酸、無水メタクリル酸、１－エチル３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、アジピン酸ジヒドラジド、及びそれらの混合物からなる群から選択される、条項１又は２に記載のヒドロゲルカプセル。

条項４．当該架橋剤がタンニン酸である、条項１～３のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。

条項５．当該細胞が、膵臓細胞、肝細胞、心血管細胞、神経細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、皮膚細胞、造血細胞、免疫細胞、生殖細胞、幹細胞、遺伝子操作された細胞、リプログラミングされた細胞、分化転換された細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される、条項１～４のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。

条項６．膵臓細胞がβ細胞である、条項５に記載のヒドロゲルカプセル。

条項７．当該細胞が細胞凝集体又はオルガノイドを形成している、条項１～６のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。

条項８．条項１～７のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセルと微孔性の足場とを含むインプラント。

条項９．当該微孔性の足場が、多糖類、コラーゲン、ゼラチン、ポリホスファゼン、ポリエチレングリコール、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリビニルピロリドン、及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリマーを含む、条項８に記載のインプラント。

条項１０．療法、診断又は予後における使用のための条項１～７のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル又は条項８～９のいずれか一項に記載のインプラント。

条項１１．Ｉ型糖尿病の治療に使用するための条項１０に記載の使用のためのヒドロゲルカプセル又はインプラント。

条項１２．細胞のインビトロでの培養のための条項１～７のいずれか一項で特定されたヒドロゲルカプセル又は条項８又は９で特定されたインプラントの使用。

条項１３．未分化細胞を膵島細胞に分化させるための、あるいは分化した細胞を膵島細胞に分化転換させるためのエクスビボの方法であって、
（ａ）当該カプセル化された細胞が未分化細胞又は分化細胞である、条項１～７のいずれか一項で特定されたヒドロゲルカプセルを生成するステップ、
（ｂ）（ａ）で生成された当該ヒドロゲルカプセルを、ＫＧＦ、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、及びそれらの混合物からなる群から選択される因子と接触させるステップ、を含む、方法。

条項１４．条項１～７のいずれか一項で特定されたヒドロゲルカプセルの生成方法であって、
（ａ）当該タンパク質と当該細胞とを含む当該第１コア層を形成するステップ、
（ｂ）当該タンパク質の非共有結合性の網状化を可能にしてヒドロゲルを形成するステップ、及び
（ｃ）当該ヒドロゲルを、当該架橋剤を含む溶液中に浸漬するステップ、を含む、方法。

条項１５．第１４項で特定された方法によって得られるヒドロゲルカプセル。

引用リスト
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Claims (15)

1. ヒドロゲルカプセルであって、
   細胞、
   タンパク質、及び
   架橋剤を含み、
   前記細胞が前記タンパク質を含む第１コア層内にあり、
   前記第１コア層が前記タンパク質と前記架橋剤とを含む第２層によって囲まれ、
   前記架橋剤がタンニン酸である、ヒドロゲルカプセル。
2. 前記タンパク質がコラーゲンを含む、請求項１に記載のヒドロゲルカプセル。
3. 前記細胞が、膵臓細胞、肝細胞、心血管細胞、神経細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、皮膚細胞、造血細胞、免疫細胞、生殖細胞、幹細胞、遺伝子操作された細胞、リプログラミングされた細胞、分化転換された細胞、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のヒドロゲルカプセル。
4. 前記膵臓細胞がβ細胞である、請求項３に記載のヒドロゲルカプセル。
5. 前記細胞が細胞凝集体又はオルガノイドを形成している、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
6. 前記カプセルの前記第２層の細孔サイズが５μｍ未満である、請求項１～５のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
7. 前記カプセルが２００μｍ～３ｍｍの平均直径を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセルと微孔性の足場とを含むインプラント。
9. 前記微孔性の足場が、多糖類、コラーゲン、ゼラチン、ポリホスファゼン、ポリエチレングリコール、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリビニルピロリドン、及びそれらの混合物からなる群から選択されるポリマーを含む、請求項８に記載のインプラント。
10. 療法、診断又は予後における使用のための請求項１～７のいずれか一項に記載のヒドロゲルカプセル又は請求項８若しくは９に記載のインプラント。
11. Ｉ型糖尿病の治療に使用するための請求項１０に記載の使用のためのヒドロゲルカプセル又はインプラント。
12. 細胞のインビトロでの培養のための請求項１～７のいずれか一項で特定されたヒドロゲルカプセル又は請求項８若しくは９で特定されたインプラントの使用。
13. 未分化細胞を膵島細胞に分化させるための、あるいは分化した細胞を膵島細胞に分化転換させるためのエクスビボの方法であって、
    （ａ）前記カプセル化された細胞が未分化細胞又は分化細胞である請求項１～７のいずれか一項で特定されたヒドロゲルカプセルを生成するステップ、
    （ｂ）（ａ）で生成された前記ヒドロゲルカプセルを、ＫＧＦ、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、及びそれらの混合物からなる群から選択される因子と接触させるステップ、を含む、方法。
14. 請求項１～７のいずれか一項で特定されたヒドロゲルカプセルの生成方法であって、
    （ａ）前記タンパク質と前記細胞とを含む前記第１コア層を形成するステップ、
    （ｂ）前記タンパク質の非共有結合性の網状化を可能にしてヒドロゲルを形成するステップ、及び
    （ｃ）前記ヒドロゲルを、前記架橋剤を含む溶液中に浸漬するステップ、を含む、方法。
15. 請求項１４で特定された方法によって得られるヒドロゲルカプセル。