CN116075326A - 多层细胞胶囊及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水凝胶胶囊，该水凝胶胶囊包含细胞、蛋白质和交联剂；其中该细胞位于包含该蛋白质的第一核心层内；并且其中该第一核心层被包含该蛋白质和该交联剂的第二层包围。本发明还提供了在治疗、预后和诊断中使用的水凝胶胶囊、培养细胞的方法、分化细胞的方法以及制备该水凝胶胶囊的方法。本发明的水凝胶胶囊特别适用于包封胰岛。

Description

多层细胞胶囊及其用途

相关申请的引证

本申请要求2019年9月10日提交的欧洲专利申请EP19382785.4的权益。

技术领域

本发明涉及用于细胞包封的胶囊。具体地，本发明涉及提高细胞活力和生物相容性的多层水凝胶细胞胶囊。本发明的胶囊特别适用于包封胰岛。

背景技术

水凝胶胶囊由于其相对较低的细胞毒性和与细胞外基质类似的结构而在用于组织工程和再生医学的活细胞的包封方面得到深入研究。它们被设计成允许氧和营养物的扩散以及包封的细胞分泌的治疗性蛋白质的释放。重要的是，它们还必须能够抵御宿主免疫系统的识别。

非特异性宿主应答是包封的细胞的临床应用的一个主要挑战。该反应涉及早期先天免疫细胞(诸如中性粒细胞和巨噬细胞)的募集，随后是成纤维细胞，该成纤维细胞沉积胶原，形成包围植入物体的纤维囊。胶囊上的纤维化细胞过度生长切断氧和营养物的扩散并且导致包封的细胞坏死，因此导致许多植入式医疗装置诸如包封的胰岛最终失效。

最常见的是，用于细胞包封的水凝胶胶囊基于单层藻酸盐水凝胶。这类胶囊的一个挑战是它们的生物相容性。事实上，藻酸盐显示出低生物相容性，其不能诱导有效的细胞附着或增殖。

当用于包封胰岛时，藻酸盐胶囊还存在胰岛覆盖不完全的问题。当胰岛在藻酸盐溶液中的数密度增加或胶囊尺寸减小时(这两者都是最小化移植体积所期望的)，更频繁地观察到突出在胶囊外的胰岛。已经认识到，不完全覆盖不仅会引起暴露的细胞的排斥，而且还可能允许巨噬细胞和成纤维细胞通过暴露区域渗入胶囊中。

已经提出了一种双包封方法，其中双流体同轴电喷射系统允许形成两层藻酸盐胶囊。然而，使用的材料和合成方法没有提供其中两层胶囊不混合的清晰核-壳结构，从而降低了细胞活力和生物相容性。此外，双包封方法通常涉及导致胰岛损坏的多个步骤，并且不清楚涂层对于临床用途是否足够坚固。

总之，尽管多年来在多种动物模型中进行了有前景的研究，但是迄今为止，包封的人细胞在临床环境中尚未产生影响。许多非免疫学和免疫学因素诸如生物相容性、降低的免疫保护、缺氧、囊周纤维化过度生长、包封方法的影响和移植后炎症阻碍了这项有前景的技术的成功应用。

因此，仍然需要用于包封细胞的胶囊，其模拟细胞天然环境的复杂性，同时有效地防止免疫系统攻击。

发明内容

本发明人已经开发了一种用于细胞包封的新型水凝胶胶囊，其可改善细胞活力和生物相容性。

如下文实施例中所示，本发明人惊奇地发现，包含仅在胶囊外层上共价交联的蛋白质的水凝胶细胞胶囊可提供增强的细胞活力、减少的胶囊降解和有效的免疫逃避。

意料不到的是，本发明人发现其中使用单一材料通过不同交联方法形成双层胶囊的双包封方法允许形成清晰的核-壳结构，其中不存在细胞突出到外部的风险。

本文提供的新型胶囊所显示的显著优点是很清楚的：它们提供与细胞外基质结构极其相似的核心核，同时提供外表面，该外表面允许有效保护细胞同时允许代谢物交换。重要的是，如以下实施例所示，本发明人还发现外保护壳的形成令人惊讶地增强了包封的胰岛细胞的胰岛素产生。

此外，本发明人已经发现这些新型胶囊为细胞分化提供了最佳环境，特别是对于形成聚集体的细胞类型。因此，当在本发明的胶囊内进行转分化或分化方法时，该过程的速度和效率得到极大提高。

使用单一天然材料作为胶囊的两个层的主要成分极大地促进了这两个层的合成，从而避免了可能影响细胞活力的多个且复杂的步骤。本文提供的胶囊的材料与胶囊的孔尺寸相结合，显著缩短了葡萄糖感测与胰岛素释放之间的时间。同时，该胶囊提供针对宿主免疫细胞的有效保护。

此外，当用于包埋胰岛时，形成胶囊的核心层的可生物降解的蛋白质很容易使其自身适应细胞聚集和生长。此外，细胞被限制在不可生物降解的交联涂层内，该涂层防止胰岛分散，但同时不影响新毛细血管的形成。由于纳米技术、生物学和组织工程的整合，这种新的复杂系统是实现更好的胰岛性能的关键。

鉴于上述情况，本文提供的新的细胞胶囊是医学领域的巨大进步，特别是用于治疗需要细胞植入物的疾病。

因此，在第一方面，本发明提供了包含细胞、蛋白质和交联剂的水凝胶胶囊，其中细胞位于包含蛋白质的第一核心层内，并且其中第一核心层被包含蛋白质和交联剂的第二层包围，具体地其中交联剂是单宁酸。

本发明人还开发了通过将上述胶囊包埋在微孔支架中形成的新型植入物，这极大地促进了它们的处理、植入和取出。

因此，在第二方面，本发明提供了包含根据第一方面的水凝胶胶囊和微孔支架的植入物。

在第三方面，本发明提供了在治疗、诊断或预后中使用的根据第一方面的水凝胶胶囊或根据第二方面的植入物。

在第四方面，本发明提供了如第一方面中所定义的水凝胶胶囊或如第二方面中所定义的植入物用于细胞的体外培养的用途。

在第五方面，本发明提供了用于将未分化细胞分化成胰岛细胞或者另选地用于将分化细胞转分化成胰岛细胞的离体方法，该离体方法包括以下步骤：(a)制备如第一方面中所定义的水凝胶胶囊，其中细胞是未分化或分化细胞；(b)使(a)中制备的水凝胶胶囊与选自KGF、SANT1、视黄酸以及它们的混合物的因子接触。

在第六方面，本发明提供了用于制备如第一方面中所定义的水凝胶胶囊的方法，该方法包括以下步骤：(a)形成包含蛋白质和细胞的第一核心层；(b)允许蛋白质的非共价网状化以形成水凝胶；以及(c)将水凝胶浸没在包含交联剂的溶液中。

在第七方面，本发明提供了能够通过如第六方面中所定义的方法获得的水凝胶胶囊。

在第八方面，本发明提供了如第一方面中所定义的水凝胶胶囊或如第二方面中所定义的植入物在体外伴随诊断方法中的用途。

附图说明

图1示出了胶原和甲基丙烯酸化胶原的NMR-¹H谱。a)表示甲基丙烯酸酯的甲基信号；b)表示烯烃质子的信号；c)表示赖氨酸的信号。H)表示高；M)表示中等，L)表示低；并且C)表示对照。

图2示出了在0.25U/ml的I型胶原酶存在下本发明的水凝胶胶囊的降解速率。测试了甲基丙烯酸化胶原(ColMA，圆形)、用单宁酸处理的胶原(ColTA，正方形)和随温度网状化的胶原(胶原，三角形)的胶囊。Y轴表示降解(％)，并且x轴表示时间(h)。

图3示出了甲基丙烯酸化胶原(ColMA)、用单宁酸处理的胶原(ColTA)和随温度网状化的胶原(胶原)的SEM图像。比例尺＝3μm。

图4示出了三种材料的流变分析：甲基丙烯酸化胶原(ColMA，圆形)、用单宁酸处理的胶原(ColTA，正方形)和随温度网状化的胶原(胶原，三角形)。Y轴表示刚度(Pa)，并且x轴表示频率(Hz)。

图5示出了仅由胶原形成的胶囊(左)和由与单宁酸交联的胶原形成的本发明的胶囊(右)的形态照片。本发明的胶囊保持完美的圆形形态并且能够容易地处理。

图6示出了由与单宁酸溶液交联的胶原形成的水凝胶的刚度。x轴表示位置(以mm计)，并且y轴表示刚度(KPa)。

图7示出了通过Imaged软件对由SEM图像获得的原始胶原(对照)、用单宁酸1％w/t交联的胶原(T.A 1x)和用单宁酸3％w/t交联的胶原(T.A3x)的多孔直径的定量。Y轴表示Feret直径(μm)。

图8示出了通过用CFDA-SE标记在胶原和在用单宁酸处理的胶原(ColTA)中制备的水凝胶胶囊中的细胞来评估细胞活力的活体染色(原始图片中绿色的活细胞)。在包封15天后记录的图像。比例尺＝500μm。箭头标记ColTA胶囊中的细胞数量增加。

图9示出了使用Alamar蓝和MTS进行的细胞增殖评估。在第0天细胞密度为7×10⁶个细胞/mL，并且培养多达30天。灰条表示胶原胶囊，并且白条表示本发明的ColTA胶囊。左侧y轴表示Alamar蓝(570nm)，并且右侧y轴表示MTS(510nm)。

图10示出了细胞逃逸测定。在第0天，将每个球状体(细胞密度为7×10⁶个细胞/mL)置于96孔板中。在指定的时间点，取出球状体并且置于新的孔板中，同时用胰蛋白酶-EDTA处理孔，以将逃逸的细胞从孔的底部分离。使用自动细胞计数器Countess^TM(15397802，fisher scientific)进行细胞计数。Y轴表示细胞数量。

图11中的A和图11中的B示出了在胶原和用单宁酸处理的胶原(ColTA)中制备的水凝胶胶囊中的胰岛素的活体染色和免疫染色。在包封15天后记录的图像。比例尺为500μm。箭头标记由ColTA胶囊中的细胞产生的胰岛素量增加。

图12示出了胶原球状体(对照)和具有单宁酸1x的胶原交联球状体(ColTA 1x)的GSIS测定的胰岛素定量。y轴表示胰岛素分泌(ng胰岛素)。

图13的A)示出了使用2种不同生物打印设置的水凝胶的宏观照片。B)示出了使用50000μs的开阀时间生物打印的球状体，显示100000μs时球状体较小，具有较低的组内可变性。Y轴表示直径(μm)。

图14在左图中示出了胶原和胶原加单宁酸中3D球状体细胞分布的代表性图像。在右图中示出了2种不同基质内的活细胞(原图中为绿色)和死细胞(原图中为红色)的共聚焦图像。比例尺为200μm。

图15在左图中示出了含有标记了白蛋白的肝细胞的3D球状体的代表性共聚焦图像(原图中为绿色)。在右图中示出了DAPI(原图中为蓝色)复染细胞核。比例尺为200μm。

图16示出了具有不同浓度的羧甲基化纤维素的微孔支架的孔分布。y轴表示以μm计的孔径，并且x轴表示羧甲基化纤维素的浓度。

图17示出了用所示化合物制备的微孔支架的溶胀率。y轴表示溶胀率(％)。

图18示出了通过用于制备微孔支架的不同化合物的压缩测定获得的刚度测量值。y轴表示刚度(KPa)。

图19示出了羧甲基化纤维素冷冻凝胶的SEM图像。比例尺＝300μm。

具体实施方式

除非另有说明，否则本申请中所用的所有术语应理解为本领域已知的普通含义。在本申请中使用的某些术语的其它更具体的定义如下所述，并且旨在统一地应用于整个说明书和权利要求书，除非另外明确阐述的定义提供更宽泛的定义。

如本文所用，不定冠词“一”和“一个”与“至少一个”或“一个或多个”同义。除非另有说明，否则本文使用的定冠词诸如“该”也包括名词的复数形式。

如本文所用，“胶囊”是指由水凝胶形成的颗粒，其具有被共价交联的层包围的非共价交联的核心(或核)，从而形成保护壳。胶囊可具有适于细胞包封的任何形状。本发明的胶囊在核心层中包含一个或多个细胞，从而“包封”细胞。术语“核心”是指不与外部接触的胶囊的离散内部部分。

如本文所用，“水凝胶”是指当蛋白质或蛋白质片段经由共价键、离子键或氢键交联形成三维开放晶格结构时形成的物质，该结构捕获水分子以形成凝胶。生物相容性水凝胶是指形成凝胶的聚合物，该凝胶对活细胞无毒并且允许氧和营养物充分扩散至包埋的细胞以维持活力。在本发明中，水凝胶由蛋白质或蛋白质片段形成。

如本文所用，“蛋白质”是指由氨基酸组成的聚合物。该术语旨在包括蛋白质、多肽、肽或它们的片段，其中蛋白质、多肽或肽是天然的或合成的。例如，在一些实施方案中，蛋白质聚合物由胶原蛋白形成。本文的示例性蛋白质是能够从液体溶液转变成水凝胶的任何蛋白质。转变通常可随时间、温度、蛋白质浓度和其它因素的变化而自发发生。

术语“交联剂”是指含有至少两个能够与形成水凝胶的蛋白质形成共价键的反应性基团的单体。

如本文所用，术语“胶原”是指由胶原单体组成的同源三聚体和异源三聚体蛋白质家族。存在多种已知的胶原，其在体内发挥多种功能。存在甚至更大量的胶原单体，每一种胶原单体由单独的基因编码，这些胶原单体是制备不同胶原所必需的。最常见的胶原是I型、II型和III型。胶原分子含有大面积的螺旋结构，其中三个胶原单体形成三股螺旋。胶原分子螺旋区域中的胶原单体区通常具有序列G-X-Y，其中G是甘氨酸，并且X和Y是任何氨基酸，但最常见的X和Y是脯氨酸和/或羟基脯氨酸。可使用任何胶原来形成本发明的水凝胶胶囊。

如本文所用，术语“原纤维胶原”是指一类通常可形成胶原原纤维的胶原。原纤维胶原是I-III、V和XI型胶原。术语原纤维胶原包括天然(即天然存在的)和变体原纤维胶原(即在一个或多个原纤维胶原单体的序列中具有一种或多种改变的原纤维胶原)两者。

术语“胶原水解产物”和“明胶”可互换使用，并且是指包含胶原片段的组合物。胶原单体可以是原纤维胶原单体或非原纤维胶原单体。胶原水解产物通常通过胶原的酸或碱水解形成。

如本文所用，“细胞”是指单个细胞、细胞聚集体或类器官。细胞可以是例如异种的、自体的或同种异体的。细胞也可以是原代细胞。细胞也可以是来源于从受试者获得的细胞的培养和扩增的细胞。例如，细胞也可以是干细胞或来源于干细胞。细胞也可以是永生化细胞。细胞也可经基因工程改造以表达或产生蛋白质、核酸或其它产物。细胞可从重编程细胞分化或从分化细胞转分化。

如本文所用，“细胞转分化”是指一种成熟分化细胞在不经历中间多能状态或变成祖细胞的情况下其表型和功能转换为另一种成熟分化细胞类型的表型和功能的过程。术语“细胞重编程”是指具有受限发育潜能的分化细胞向多能细胞的转化。重编程与转分化之间的基本差异如下：(i)重编程需要将分化细胞逆转为多能干细胞(即iPS)，iPS接下来可经历分化为另一分化细胞的分化过程，(ii)转分化不需要完全逆转成iPS细胞，以便转化为另一种细胞类型。转分化是一种成体细胞向另一种细胞类型的直接转化，而不经历多能干细胞状态。其中iPS细胞重编程是相当耗时的过程，转分化通常是快速和高效的。

如本文所用，“自体”是指取自同一个体的移植细胞。“同种异体”是指取自相同物种的不同个体的移植细胞。“异种”是指取自不同物种的移植细胞。

如本文所用，术语“类器官”是指通过三维培养系统(诸如本发明的三维水凝胶)由干细胞或未分化细胞生成的类似整个器官的结构。类器官也可来源于分离的器官祖细胞。

术语“微孔支架”是指包含基本上连接的类似或不同尺寸的孔阵列的生物相容性聚合物材料。

如本文所用，术语“冷冻凝胶”是指通过包括冷冻干燥凝胶溶液的方法形成的微孔支架。

“抗炎药物”是指直接或间接减轻组织中炎症的药物。该术语包括但不限于免疫抑制药物。该术语包括抗增殖免疫抑制药物，诸如抑制淋巴细胞增殖的药物。“免疫抑制药物”是指抑制或防止受试者对外来物质的免疫应答的药物。免疫抑制药物通常通过抑制T细胞活化、破坏增殖或抑制炎症而发挥作用。经历免疫抑制的人被认为是免疫失能的。

如本文所用，术语“尺寸”是指特征性物理维度。例如，在胶囊基本上为球形的情况下，胶囊的尺寸对应于胶囊的直径。当谈及一组胶囊具有特定尺寸时，预期该组胶囊可具有指定尺寸左右的尺寸分布。因此，如本文所用，一组胶囊的尺寸可以指尺寸分布的模式，诸如尺寸分布的峰值尺寸。另外，当不是完全球形时，直径是包括物体的球形体的当量直径。该直径通常称为“流体力学直径”，其可使用与Atlas细胞加压系统或Malvern耦接的WyattMobius进行测量。透射电子显微镜(TEM)或扫描电子显微镜(SEM)图像也给出关于直径的信息。

如本文所用，术语组分的“％w/w”、“wt％”或“重量百分比”是指单一组分相对于组合物或(如果具体提及的话)其它组分的总重量的量。

如本文所用，“伴随诊断方法”是用于鉴定对特定药物治疗敏感的受试者、监测治疗和/或鉴定受试者或受试者亚组的有效剂量的测定法。伴随诊断可用于将患者疾病、障碍或病症的严重程度进行分层，允许调节治疗方案和剂量以降低成本、缩短临床试验的持续时间、增加安全性和/或提高有效性。伴随诊断可用于预测疾病、障碍或病症的发展，以及帮助开出预防性治疗的处方。一些伴随诊断可用于选择受试者进行一个或多个临床试验。在一些情况下，伴随诊断测定可与特定治疗一起进行，以促进治疗优化。在一个具体的实施方案中，用本发明的水凝胶胶囊或植入物进行伴随诊断方法的治疗。

如上所述，在第一方面，本发明提供了包含细胞、蛋白质聚合物和交联剂的双层胶囊，其中细胞位于包含蛋白质的第一核心层内；并且其中第一核心层被包含蛋白质和交联剂的第二层包围，具体地其中交联剂是单宁酸。

本发明的胶囊由内核心或核形成，内核心或核含有包埋在通过蛋白质单元的非共价键合形成的水凝胶结构中的细胞。包围内核心的是由蛋白质形成的外壳，其进一步以共价方式与交联剂交联。因此，本文提供的胶囊呈现为核心层和第二层，核心层为促进细胞活力的细胞友好层，第二层保护胶囊免于降解和免疫系统攻击。这两层由相同的水凝胶形成蛋白质形成。

用于构建基质(胶囊的蛋白质性核心和壳)的优选蛋白质包括形成细胞外基质(ECM)的一部分的水溶胀性蛋白质。因此，在第一方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文提供的实施方案中任一个实施方案结合，蛋白质包含胶原。在一个更具体的实施方案中，胶原是原纤维胶原。在一个更具体的实施方案中，原纤维胶原是I型胶原。

在另一个实施方案中，任选与上文或下文提供的实施方案中任一个实施方案结合，胶原选自纯胶原、胶原衍生物、胶原水解产物、包含胶原和细胞外基质蛋白的混合物以及它们的组合。适于制备本发明胶囊的一种含有胶原的蛋白质混合物是Matrigel^TM(BDBiosciences)。

在第一方面的另一个实施方案中，任选地与上文或下文提供的实施方案中任一个实施方案结合，交联剂选自单宁酸、甲基丙烯酸酐、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、己二酸二酰肼以及它们的混合物。用本领域技术人员已知的技术进行蛋白质的交联。例如，本领域技术人员将会知道，一些交联剂诸如单宁酸直接与蛋白质残基反应，而其它交联剂诸如甲基丙烯酸酐需要使用光引发剂和紫外光。

在通过蛋白质的非共价网状化形成水凝胶之后，将交联剂从外部施加到胶囊上，所述非共价网状化例如通过热处理进行。这样，所得的胶囊由非共价交联的蛋白质形成，其具有另外共价交联的外层。这种双网状结构为本发明的胶囊提供了细胞功能和生物相容性方面的最佳特性。

在一个具体实施方案中，第二层是抗胶原酶的。在一个更具体的实施方案中，第二层抵抗胶原酶降解超过2天。

在一个具体的实施方案中，如通过平行板流变仪所测量，胶囊的刚度为800Pa至16000Pa。更具体地，882Pa至15184Pa。在另一个具体实施方案中，如通过平行板流变仪所测量，核心层的刚度为500Pa至1000Pa、700Pa至900Pa或882Pa。在另一个具体实施方案中，如通过平行板流变仪所测量，第二层的刚度为10000Pa至20000Pa、14000Pa至16000Pa或15184Pa。这些粘弹性值可有利于细胞存活。

使用平行板流变仪(Discovery HR-2流变仪，TA instruments，Inc.，UK)评估水凝胶的机械特性。将水凝胶制成圆柱体形状(厚1mm，直径8mm)，并且在室温下使用8mm铝板几何结构在1Hz至10Hz的频率范围内记录体积模量(G’)和粘性模量(G”)测量值。从初始样品高度开始调整间隙，并且压缩样品以达到0.3N的法向力。在凝胶化后24小时对水凝胶进行流变学测量。

在任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合的一个特定实施方案中，胶囊的第二层的孔尺寸小于5μm。在一个具体实施方案中，其小于200nm。在一个更具体的实施方案中，其为50nm至200nm。在一个甚至更具体的实施方案中，其为80nm至120nm。这些孔尺寸允许氧和营养物的交换，同时不允许免疫细胞的渗透。

孔尺寸由第二层中交联剂的浓度决定。因此，在任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合的一个具体实施方案中，交联剂以0.1％w/w至4％w/w，更具体地0.3％w/w至3.5％w/w，或更具体地0.5％w/w至3％w/w的浓度存在于第二层中。

第二层应具有合适的厚度，以有效地保护胶囊免于降解。在第一方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，第二层具有5μm至50μm，更具体地10μm至25μm的厚度。

在第一方面的另一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，胶囊包含细胞、胶原和单宁酸，其中细胞位于包含胶原的第一核心层内；并且其中第一核心层被包含胶原和单宁酸的第二层包围。

在第一方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，胶囊具有200μm至3mm，更具体地400μm至2mm，更具体地450μm至1mm，甚至更具体地500μm至750μm的平均直径。尺寸由沉积在超疏水基底中的水凝胶的体积控制。该体积由打印机中压电阀的孔径控制。所有这些数据都已经进行了计算，并且我们得到了阀的孔径时间与尺寸之间的关系(参见下面的3D打印方法)。

在第一方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，胶囊的第二层的孔尺寸小于5μm，胶囊具有200μm至3mm的平均直径，并且胶囊的刚度为800Pa至16000Pa，如通过平行板流变仪所测量。

在第一方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，胶囊具有形状，其中该形状选自球体、类球体形状、球状体、类球状体形状、椭圆体、类椭圆体形状、体育场状、类体育场状形状、圆盘、类圆盘形状、圆柱体、类圆柱体形状、棒、类棒形状、立方体、类立方体形状、长方体、类长方体形状、圆环、类圆环形状、平坦表面、弯曲表面或它们的组合。在一个更具体的实施方案中，胶囊具有选自球体或球状体的形状。

所选的用于包封在所公开的组合物中的细胞类型取决于所需的治疗效果。细胞可以来自患者(自体细胞)、来自相同物种的另一供体(同种异体细胞)或来自另一物种(异种)。异种细胞是容易获得的，但是排斥的可能性和可能向患者传播病毒的危险限制了它们的临床应用。抗炎药物对抗由此类细胞的存在所引起的免疫应答。在自体细胞的情况下，抗炎药物可降低由外来水凝胶材料的存在或由于移植手术的创伤而引起的免疫应答。细胞可从患者或供体的活检或切除、细胞培养物或尸体获得。显然，不同细胞类型的混合物也可以被包封。

在一些实施方案中，细胞分泌治疗学上有效的物质，诸如蛋白质或核酸。在一些实施方案中，细胞代谢毒性物质。在一些实施方案中，细胞形成结构组织，诸如皮肤、骨、软骨、血管或肌肉。在一些实施方案中，细胞是天然的，诸如天然分泌胰岛素的胰岛细胞，或天然解毒的肝细胞。在一些实施方案中，将细胞遗传工程化，以表达异源蛋白质或核酸和/或过表达内源性蛋白质或核酸。

因此，在一个特定实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，细胞选自胰细胞、肝细胞、心血管细胞、神经细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、皮肤细胞、造血细胞、免疫细胞、生殖细胞、干细胞、遗传工程化细胞、重编程细胞以及它们的混合物。

在一个更具体的实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，细胞是产生激素的细胞。产生激素的细胞可产生一种或多种激素，诸如胰岛素、甲状旁腺激素、抗利尿激素、催产素、生长激素、催乳素、促甲状腺激素、肾上腺皮质激素、促卵泡激素、促黄体激素、甲状腺素、降钙素、醛固酮、氢化可的松、肾上腺素、胰高血糖素、雌激素、孕酮和睾酮。

在一个更具体的实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，细胞是胰细胞。在一个甚至更具体的实施方案中，胰细胞是胰岛细胞。在一个甚至更具体的实施方案中，胰岛细胞是β细胞。

在一个更具体的实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，细胞是肝细胞。当本发明的胶囊包含肝细胞时，该胶囊可用于治疗具有肝脏问题的患者，例如，可将本发明的胶囊或植入物植入具有肝功能障碍的受试者，胶囊或植入物将充当人工肝脏，从而进行肝透析。

用于包封在所公开的水凝胶胶囊中的细胞类型包括来自天然来源的细胞，诸如来自异种组织的细胞、来自尸体的细胞和原代细胞；干细胞，诸如胚胎干细胞、间充质干细胞和诱导型多能干细胞；衍生细胞，诸如衍生自干细胞的细胞、衍生自细胞系的细胞、重编程细胞、重编程干细胞、衍生自重编程干细胞的细胞和转分化细胞；以及遗传工程化细胞，诸如遗传工程化以表达蛋白质或核酸的细胞、遗传工程化以产生代谢产物的细胞和遗传工程化以代谢毒性物质的细胞。因此，在一个更具体的实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，细胞是重编程细胞或转分化细胞。

细胞可直接从供体获得，从建立的细胞培养系获得，或从供体细胞的细胞培养获得。在一些具体实施方案中，直接从供体获得细胞，洗涤并且与蛋白质材料结合直接植入。在其它具体实施方案中，从供体获得细胞，在体外重编程为多能干细胞，然后分化为所需的细胞类型，然后包封。在其它特定实施方案中，从供体获得细胞，在体外重编程为多能干细胞，然后将干细胞包封并且随后在胶囊内分化为所需的细胞类型。在其它具体实施方案中，从供体获得分化的细胞，在体外转分化为所需的细胞类型，然后包封。在其它具体实施方案中，从供体获得分化的细胞并且直接包封，然后在胶囊内分化为所需的细胞类型。使用细胞和组织培养领域的技术人员已知的技术对细胞进行培养、重编程、分化或转分化。具体地，细胞转分化或重编程的各种方法是本领域已知的(Zhou,Q.等人，“In vivo reprogrammingof adult pancreatic exocrine cells to b-cells”,2008,Nature,第455(7213)卷，第627-32页)。转分化的细胞可任选地在包封前培养或使用本领域已知的培养胰岛细胞的任何合适方法培养。

因此，在第一方面的一个更具体的实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，细胞是分化细胞、多能干细胞或转分化细胞。

本发明人惊奇地发现本发明的胶囊改善了细胞向胰岛细胞的分化或转分化过程的效率。

可使用标准技术诸如组织学和荧光显微镜法来评估细胞活力。可使用这些技术和功能测定的组合来确定包封的细胞的功能。例如，可植入胰岛细胞和其它产生胰岛素的细胞，以通过适当分泌胰岛素来实现葡萄糖调节。也可植入其它内分泌组织和细胞。

包封在所公开的水凝胶胶囊中的细胞的量和密度根据细胞、水凝胶和植入部位的选择而变化。

因此，在一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，胶囊包含浓度为0.1x10⁶至10x10⁶个细胞/ml，更具体地0.5x10⁶至2x10⁶个细胞/ml，并且甚至更具体地1x10⁶个细胞/ml的细胞。

在其它具体实施方案中，细胞形成细胞聚集体或类器官。例如，对于直径为150μm的每个聚集体，胰岛细胞聚集体(或整个胰岛)包含50至1000个细胞，其被定义为一个胰岛当量(IE)。因此，在一些实施方案中，胰岛细胞以50至10000IE/ml，具体地200至3000IE/ml，更具体地500至750IE/ml的浓度存在。

在一些实施方案中，所公开的胶囊包含经遗传工程改造以产生治疗性蛋白质或核酸的细胞。在这些实施方案中，细胞可以是干细胞(例如，多能的)、祖细胞(例如，多能的或寡能的)或终末分化细胞(即，单能的)。细胞可经工程改造以包含编码治疗性多核苷酸诸如miRNA或RNAi的核酸或编码蛋白质的多核苷酸。核酸可整合到细胞基因组DNA中用于稳定表达，或者可以在表达载体(例如，质粒DNA)中。可基于待治疗的疾病和移植部位来选择治疗性多核苷酸或蛋白质。在一些实施方案中，治疗性多核苷酸或蛋白质是抗肿瘤的。在其它实施方案中，治疗性多核苷酸或蛋白质是激素、生长因子或酶。

遗传工程细胞分泌的治疗剂包括例如，胰岛素、胰高血糖素、促甲状腺激素；有益的脂蛋白，诸如Apol；前列环素和其它血管活性物质、抗氧化剂和自由基清除剂；可溶性细胞因子受体，例如可溶性转化生长因子(TGF)受体，或细胞因子受体拮抗剂，例如I Lira；可溶性粘附分子，例如ICAM-1；病毒的可溶性受体，例如用于HIV的CD4、CXCR4、CCR5；细胞因子；弹性蛋白酶抑制剂；骨形态发生蛋白(BMP)和BMP受体1和2；内皮糖蛋白；血清素受体；组织抑制金属蛋白酶；钾通道或钾通道调节剂；抗炎因子；血管生成因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、肝生长因子和低氧诱导因子(HIF)；具有神经营养和/或抗血管生成活性的多肽，包括睫状神经营养因子(CNTF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、nurturin、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮抑制素、ATF、血小板反应蛋白片段、它们的变体等。更优选的多肽是FGF，诸如酸性FGF(aFGF)、碱性FGF(bFGF)、FGF-1和FGF-2以及内皮抑制素。

在一些具体实施方案中，分泌剂是蛋白质或肽。蛋白质活性剂的示例包括但不限于细胞因子和它们的受体，以及包括细胞因子或它们的受体的嵌合蛋白，它们中的一些先前提及过，并且包括例如肿瘤坏死因子α和β、它们的受体和它们的衍生物；肾素；脂蛋白；秋水仙碱；催乳素；促肾上腺皮质激素；加压素；促生长素抑制素；赖氨酸加压素；肠促胰酶素；亮丙瑞林；α-1-抗胰蛋白酶；凝血因子诸如因子VII IC、因子IX、组织因子和vonWillebrand因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性物质；组织型纤溶酶原激活物(t-PA)以外的纤溶酶原激活物，例如尿激酶；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES(正常T细胞表达和分泌的活化调节)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；苗勒管抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；绒毛膜促性腺素；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；激活素；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-βI、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(l-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，诸如CD3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；干扰素，诸如干扰素-α(例如干扰素、α.2A)、-β、-γ、-λ和共有干扰素；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；转运蛋白；归巢受体；地址素；生育抑制剂，诸如前列腺素；生育促进剂；调节蛋白；抗体(包括其片段)和嵌合蛋白，诸如免疫粘附素；这些化合物的前体、衍生物、前药和类似物，以及这些化合物的药学上可接受的盐，或它们的前体、衍生物、前药和类似物。合适的蛋白质或肽可以是天然的或重组的，并且包括例如融合蛋白。包含在所公开的水凝胶胶囊中的激素或最优选地由包含在所公开的水凝胶胶囊中的细胞产生的激素可以是任何感兴趣的激素。所公开的胶囊也可用于提供疫苗组分。例如，表达疫苗抗原的细胞可包含在水凝胶胶囊中。所公开的水凝胶胶囊也可用于提供抗体。例如，表达抗体的细胞可包含在水凝胶胶囊中。

待植入细胞的一个或多个部位是基于个体需要确定的，细胞的必需数量也是如此。对于替代或补充器官或腺体功能的细胞(例如肝细胞或胰岛细胞)，可将混合物注射到肠系膜、皮下组织、后腹膜、腹膜前间隙和肌内间隙中。

本发明还提供了一种水凝胶胶囊，其包含细胞；蛋白质；和交联剂；其中细胞位于包含蛋白质的第一核心层内；其中第一核心层被包含蛋白质和交联剂的第二层包围；其中蛋白质包含胶原，其中胶囊的第二层的孔尺寸小于5μm，并且其中胶囊具有200μm至3mm的平均直径。

如上所述，在第二方面，本发明提供了包含本发明的胶囊和微孔支架的植入物。

本发明人已经发现，将本发明的胶囊包埋在微孔支架中有利于胶囊的处理和植入到患者体内。

在第二方面的一个特定实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，微孔支架包含选自以下的化合物：多糖(例如，纤维素、羧甲基纤维素、纳米原纤化纤维素、琼脂糖或藻酸盐)、胶原、明胶、聚磷腈、聚乙二醇、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(环氧烷)、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)以及它们的共聚物和共混物。更具体地，多糖选自纤维素、羧甲基纤维素、纳米原纤化纤维素、琼脂糖、藻酸盐以及它们的混合物。

在第二方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，微孔支架包含0.25％w/w至5％w/w或0.5％w/w至1％w/w的羧甲基纤维素。在一个更具体的实施方案中，微孔支架是冷冻凝胶。在一个甚至更具体的实施方案中，微孔支架是0.5％w/w的羧甲基纤维素的冷冻凝胶。

在一个更具体的实施方案中，微孔支架的孔具有10μm至350μm的平均直径。更具体地，20μm至150μm。在一个甚至更具体的实施方案中，微孔支架由具有不同孔尺寸的两个水平层形成。在一个更具体的实施方案中，下层的孔尺寸为20μm至100μm，并且上层的孔尺寸为20μm至150μm。这种双层结构允许将胶囊有效地保持在支架内。

在一个具体实施方案中，微孔支架的刚度为0.3kPa至1kPa，通过从连续压缩测定获得的杨氏模量测量，如以下实施例中所示。

可将任何药物或生物活性剂掺入到本发明的胶囊或植入物中，前提条件是其不干扰包封的细胞的所需功能。合适的药物或生物活性剂的示例可包括但不限于抗血栓形成剂、抗生素、抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗血管生成剂、促血管生成剂、抗炎剂、细胞周期调节剂、它们的同系物、衍生物、片段、药用盐以及它们的组合。在一些实施方案中，支架可包括血管生成剂，诸如VEGF，以促进植入物周围的血管生长，从而促进氧和营养物到达植入的细胞。在一些实施方案中，支架可包括抗炎药物，诸如类固醇抗炎剂。

因此，在一个具体实施方案中，本发明的胶囊或植入物还包含抗炎剂、抗生素、促血管生成因子或它们的组合。在一个具体实施方案中，促血管生成因子是VEGF。

如上所述，在第三方面，提供了在治疗、诊断或预后使用的的本发明的胶囊或植入物。

可将包封的细胞施用(例如注射或移植)到有需要的患者体内以治疗疾病或障碍。在一些实施方案中，疾病或障碍由患者体内的激素或蛋白质分泌细胞的功能障碍引起或涉及该功能障碍。在这些实施方案中，激素或蛋白质分泌细胞被包封并且施用给患者。例如，包封的胰岛细胞可施用给患有糖尿病的患者。在其它实施方案中，细胞用于修复受试者的组织。在这些实施方案中，细胞形成结构组织，诸如皮肤、骨、软骨、肌肉或血管。在这些实施方案中，细胞优选地是干细胞或祖细胞。

可用本发明的胶囊和植入物治疗的疾病或障碍的非限制性列表包括神经退化性疾病，诸如阿尔茨海默病、亨廷顿病或帕金森氏病；心血管疾病；代谢疾病，诸如I型和II型糖尿病、肝功能衰竭、氨基酸代谢障碍、有机酸代谢障碍、脂肪酸代谢障碍、嘌呤和嘧啶代谢障碍、溶酶体贮积障碍和过氧化物酶体代谢障碍；炎性疾病；以及癌症，包括非实体癌和实体癌。

因此，在第三方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，本发明的胶囊或植入物用于治疗代谢疾病。在一个更具体的实施方案中，代谢疾病是糖尿病。在一个甚至更具体的实施方案中，胶囊或植入物在治疗I型糖尿病中使用。

该实施方案也可以表述为第一方面的胶囊或第二方面的植入物制备用于治疗和/或预防I型糖尿病的药物的用途。该方面也可以表述为用于治疗和/或预防I型糖尿病的方法，该方法包括将向有需要的受试者施用或植入治疗有效量的第一方面的胶囊或第二方面的植入物。

在另一个实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，本发明的胶囊或植入物用于治疗肝脏疾病(即肝病)。本发明可用于治疗涉及任何种类的肝功能异常的任何疾病，例如慢性肝病、肝炎、肝硬化、肝癌、非酒精性脂肪肝、Reye综合征、I型糖原贮积病或Wilson病。

本文提供的胶囊和植入物可单独施用或植入，或与任何合适的药物或其它疗法组合施用或植入。此类药物和疗法也可以在胶囊或植入物存在于患者体内期间分开地施用(即，平行使用)。尽管所公开的胶囊或植入物减少纤维化和免疫反应，但不排除与胶囊或植入物一起或平行地使用抗炎和免疫系统抑制药物。然而，在优选的实施方案中，所公开的胶囊或植入物在不使用抗炎和免疫系统抑制药物的情况下使用。在优选的实施方案中，所使用的任何抗炎或免疫系统抑制药物的使用、浓度、效果或它们的组合低于有效水平后，纤维化仍保持减少。

本发明的胶囊或植入物还可用于疾病的体外诊断或预后，例如，通过包封来自患者的细胞以在体外培养它们，然后对它们进行功能测试，诸如胰岛素分泌测试。细胞可以是分化细胞、重编程细胞或转分化细胞。这些测定可以在允许测定复用的微流体阵列上进行。

如前所述，本发明还提供了本发明的水凝胶胶囊或植入物用于细胞体外培养的用途。

本发明的胶囊的组成和结构为细胞培养，特别是细胞聚集体或类器官提供了最佳条件。

如上所述，在第五方面，本发明还提供了一种用于将未分化细胞分化成胰岛细胞或者另选地用于将分化细胞转分化成胰岛细胞的离体方法，其包括以下步骤：(a)制备本发明的水凝胶胶囊，其中细胞是未分化或分化细胞；(b)使(a)的水凝胶胶囊与选自KGF(角质形成细胞生长因子)、SANT1((4-苄基-哌嗪-1-基)-(3,5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基亚甲基)-胺)、视黄酸以及它们的混合物的因子接触。

在第五方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，步骤(b)包括在序贯培养步骤中使水凝胶胶囊与KGF、SANT1和视黄酸接触。本领域技术人员将会知道，存在各种生成胰岛细胞(即β细胞)的技术，所有这些技术都可应用于本发明的胶囊(参见，例如，Felicia W.Pagliuca等人，“Generation offunctional human pancreaticβcells in vitro”,Cell.2014，第159(2)卷，第428至439页)。

在第五方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，步骤(b)还包括使水凝胶胶囊与来自胰腺的细胞外基质(ECM)接触。胰腺ECM可通过各种方法获得，诸如下文实施例中公开的方法。

由本发明的胶囊提供的细胞的3D培养的最佳条件有利于分化和转分化过程，特别是当所得的细胞是聚集体形成细胞时。

如上所述，本发明还提供了一种用于制备如第一方面中所定义的水凝胶胶囊的方法，该方法包括以下步骤：(a)形成包含蛋白质和细胞的第一核心层；(b)允许蛋白质的非共价网状化以形成水凝胶；以及(c)将水凝胶浸没在包含交联剂的溶液中。

在第六方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，步骤(a)包括：(i)提供具有喷嘴的电喷射装置；(ii)将包含蛋白质和细胞的组合物泵入喷嘴的管中；(iii)使液滴落到超疏水表面中。通过测量接触角来表征疏水表面。接触角被定义为由液-固界面和液-气界面相交形成的角度(通过从接触点沿着液滴轮廓中的液-气界面施加切线而通过几何方式获得)。更具体地，接触角小于90°表明表面的润湿是有利的，并且流体将在表面上大面积扩散，该表面被定义为亲水表面；而接触角大于90°通常意味着表面的润湿是不利的，因此流体将最小化其与表面的接触并且形成紧凑的液滴，该表面被定义为疏水表面。对于超疏水表面，水接触角通常大于150°,表明液滴与表面之间几乎没有接触。因此，在一个更具体的实施方案中，液滴落到水接触角大于或等于150°的表面中。

在第六方面的一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，步骤(b)是通过热处理进行的。更具体地，热处理在30℃至40℃、35℃至40℃或在37℃下进行。甚至更具体地，热处理进行1分钟至15分钟、2分钟至12分钟或3分钟至10分钟。在一个具体实施方案中，步骤(b)在37℃下进行3分钟或在37℃下进行15分钟。

在一个具体实施方案中，任选地与上文或下文中提供的实施方案中任一个实施方案结合，步骤(c)在包含浓度为0.1％w/w至10％w/w、0.5％w/w至5％w/w、0.5％w/w至2％w/w、0.5％w/w至3％w/w或1％w/w的单宁酸的溶液中进行。在一个更具体的实施方案中，步骤(c)进行0.5分钟至3分钟、0.5分钟至2分钟或1分钟。在一个甚至更具体的实施方案中，步骤(c)在包含1％w/w单宁酸的溶液中进行1分钟。在一个甚至更具体的实施方案中，步骤(c)在包含3％w/w单宁酸的溶液中进行1分钟。

如上所述，本发明还提供了能够通过本发明第六方面中所定义的方法获得的水凝胶胶囊。关于第一方面的水凝胶胶囊及其用途的所有实施方案也意味着适用于该第六方面。该方面提供的胶囊也适合于制备第二方面的植入物。

如上所述，在第八方面，本发明提供了如第一方面中所定义的水凝胶胶囊或如第二方面中所定义的植入物在体外伴随诊断方法中的用途。

在第八方面的一个具体实施方案中，伴随诊断方法包括(a)制备如第一方面中所定义的水凝胶胶囊，其中细胞是来自受试者的细胞；(b)使(a)中制备的水凝胶胶囊与药物接触；以及(c)确定治疗受试者的有效药物剂量。本领域技术人员将会理解，本发明的胶囊和植入物可用于多种疾病诸如糖尿病的伴随诊断方法。在这种情况下，来自受试者的胰岛细胞可被包封并且体外测试葡萄糖应答。因此，本发明的胶囊和植入物是个性化医学领域的巨大进步。

该实施方案还可被表述为用于为有需要的受试者确定药物有效剂量的伴随诊断方法，该方法包括：a)制备如第一方面中所定义的水凝胶胶囊，其中细胞是来自受试者的细胞；(b)使(a)中制备的水凝胶胶囊与药物接触；以及(c)确定治疗受试者的有效药物剂量。本发明的伴随诊断方法还可用于决定或推荐对受试者启动医疗方案，或用于确定医疗方案对患者的疗效。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和该词语的变型形式并不旨在排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包含”包括“由……组成”的情况。本发明的附加目的、优点和特征对于本领域技术人员来说在阅读本说明书后将变得显而易见，或者可通过本发明的实践而获知。以下实施例和附图是以举例说明的方式提供的，并且它们并不旨在限制本发明。与附图相关并放置在权利要求中的括号中的附图标记仅用于试图提高权利要求的可理解性，并且不得理解为限制权利要求的范围。此外，本发明涵盖本文所述的具体和优选实施方案的所有可能组合。

实施例

1.水凝胶制备

胶原

按照制造说明书在低温条件下制备胶原溶液。简而言之，将8.43mg/mL的大鼠尾无菌酸溶性I型胶原(Corning目录号354249)以1:10的比例溶于10xPBS(Sigma-Aldrich，目录号P4417/100TAB)中，并且用1M NaOH(PanReac-AppliChem目录号131687.1210)中和，以达到7.5的pH。将所得的水凝胶溶液用RPMI 1640培养基(Gibco^TM目录号11875085)溶解，以达到4mg/mL的最终浓度。然后将水凝胶溶液倒入直径8mm且高3mm的圆柱体形PDMS(硅氧烷弹性体)(DOW Corning目录号SYLGARD 184)模具中。胶原水凝胶在37℃下10分钟后聚合。聚合后，通过将交联水凝胶浸没在预热的1xPBS溶液中，可容易地将其从模具上分离。

用单宁酸交联的胶原

为了获得更稳定的网状结构，使用单宁酸(TA)(Sigma-Aldrich目录号403040-50G)作为胶原的交联剂。该方法包括将交联的圆柱体形水凝胶浸没在1wt％的单宁酸溶液中1分钟。聚合发生在两种材料之间的界面处，保持较短的浸没时间，有可能在外表面上获得比内部部分更网状的水凝胶。最后，将单宁酸交联的水凝胶用1xPBS溶液洗涤3次，同时连续搅拌，每次洗涤10分钟。

用甲基丙烯酸酯交联的胶原

以根据William T.Brinkman等人在“Photo-Cross-Linking of Type I CollagenGels in the Presence of Smooth Muscle Cells:Mechanical Properties,CellViability,and Function”,Biomacromolecules,2003，第4(4)卷，第890-895页中报告的方法改进的方式，通过I型大鼠尾胶原与甲基丙烯酸酐的反应制备甲基丙烯酸酯胶原。简而言之，将9.5mg/mL的I型大鼠尾胶原(Corning目录号354249)溶解在0.02N乙酸(Pan ReacAppliChem目录号1310081612)中，在4℃下连续搅拌过夜，产生4mg/mL溶液。以2:1000的比例添加甲基丙烯酸酐(Sigma-Aldrich目录号276685)并且在4℃下用力搅拌。反应24小时后，将混合物在4℃下用0.02N乙酸透析48小时，频繁更换透析液。透析后，将甲基丙烯酸酯胶原溶液冷冻过夜并且冻干72小时，最后重悬于0.02N乙酸中，最终浓度为8.43mg/mL。

然后将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸锂(LAP)光引发剂(TCI EUROPE N.V.目录号L0290)以1％w/v在10xPBS溶液中稀释。将甲基丙烯酸酯胶原储备溶液在含有光引发剂的10xPBS中以1:10的比例稀释，并且用1M NaOH中和，以达到7.5的pH。将所得的水凝胶溶液用RPMI培养基溶解以达到4mg/mL的最终浓度。

然后将水凝胶溶液倒入直径8mm且高3mm的圆柱体形PDMS模具中。胶原水凝胶在37℃下10分钟后聚合，并且使用UVP交联剂(AnaltitikJena G116427)用14.82mW/cm2的UV光照射96秒。聚合后，通过将交联水凝胶浸没在预热的1xPBS溶液中，可容易地将其从模具上分离。

胰细胞外基质水凝胶

首先将人尸体胰腺切成小的立方块。在连续搅拌下用Milli-Q水将组织块洗涤3次。

使用在1xPBS中的1％w/v Triton X-100(Sigma-Aldrich CAS:9002-93-1目录号X100-100ML)进行脱细胞处理。然后添加青霉素/链霉素(Thermofisher目录号15140122)，最终浓度为50I.U./mL。将组织脱细胞48小时，每12小时更换一次溶液。

在洗涤剂处理之后，将组织用水彻底冲洗，置于新的无菌烧杯中，并且在Milli-Q水中再搅拌5天。每12小时更换一次溶液。然后，将ECM冷冻过夜，在72小时期间冻干并且研磨以产生细粉。

为了生成水凝胶形式，使用酸性胃蛋白酶溶液将所得的胰腺ECM粉末进行酶促消化。将新鲜的酸性胃蛋白酶(Sigma-Aldrich目录号P6887-1G)溶解在0.1M HCl中，最终浓度为1mg/mL。将ECM粉末置于5mL小瓶中(每个小瓶30mg)，并且其中添加胃蛋白酶溶液，使最终浓度为30mg ECM/mL胃蛋白酶溶液，并且搅拌48小时。消化后，使用1M NaOH和0.1M HCl将液体ECM中和至生理pH，并且用10xPBS调节盐条件。所得的预凝胶溶液能够在37℃下温育12小时后聚合。

2.水凝胶表征

甲基丙烯酸化胶原的NMR-¹H表征

使用¹H-NMR谱表征官能化胶原，显示在d＝5.3ppm与5.5ppm之间存在甲基丙烯酰胺的丙烯酸质子的双键特征峰(参见图1)。另外，d＝1.8ppm处的信号对应于乙烯基官能团的甲基基团。d＝2.89ppm处的信号归属于赖氨酸胺的亚甲基氢，该信号用作定量修饰程度的参考信号。通过NMR分析测定的官能化程度为可用胺官能团的79％至81％。

降解

如上所述制备直径为8mm的圆柱体形水凝胶用于降解分析。将水凝胶置于24孔板中，并且使其在1xPBS溶液中溶胀1天。将1xPBS中的总共3mL 0.25U/mL的I型胶原酶添加到水凝胶上，并且将它们在37℃、100rpm振荡条件下温育。然后，在1小时、2小时、4小时、24小时、48小时和7天后对水凝胶进行称重。剩余的水凝胶百分比(％Wr)通过以下公式确定：

此处，Wt和Wi表示胶原酶温育后水凝胶复合物的重量和溶胀后的初始重量。

如图2所示，用甲基丙烯酸酯交联的胶原(ColMa)具有改善的抗胶原酶降解性。令人惊奇的是，当用单宁酸处理胶原(ColTA)时，这种抗性大大增加。对照水凝胶在8小时内经历降解，而ColMa在48小时内经历降解，显示针对胶原酶的酶降解较低。浸没在单宁酸中的胶原(ColTA)在7天的实验中没有显示任何程度的降解。

SEM图像

如上所述制备直径为8mm的圆柱体形水凝胶用于孔径定量。然后，让它们在Milli-Q水中溶胀3天。之后，通过依次浸入Milli-Q水中的梯度乙醇溶液进行脱水：30％v/v、50％v/v、70％v/v、80％v/v、90％v/v和96％v/v乙醇溶液各10分钟，并且100％乙醇两次。然后，将样品置于临界点干燥器(K850，Quorum technologies，UK)的室中，密封并且冷却。乙醇被液体CO₂完全替代，并且缓慢加热。该技术允许水凝胶脱水，同时避免其塌缩。在临界点干燥后，用超薄涂层金覆盖水凝胶并且通过超高分辨率扫描电子显微镜(SEM)成像。

如图3所示，所获得的生物材料由细互连原纤维的薄重叠层组成。这些互连原纤维在纳米级范围内形成多孔。这些纳米孔允许胰岛素六聚体扩散穿过水凝胶(直径为5纳米)和葡萄糖分子(直径为1.5纳米)，并且防止微米范围内的细胞如巨噬细胞(直径为20微米至80微米)进入。

刚度

使用平行板流变仪(Discovery HR-2流变仪，TA instruments，Inc.，UK)评估水凝胶的机械特性。将水凝胶制成圆柱体形状(厚1mm，直径8mm)，并且在室温下使用8mm铝板几何结构在1Hz至10Hz的频率范围内记录体积模量(G’)和粘性模量(G”)测量值。从初始样品高度开始调整间隙，并且压缩样品以达到0.3N的法向力。在凝胶化后24小时对水凝胶进行流变学测量。

下表汇总了所测试的不同材料的储能模量和损耗模量：

表1

样品	储能模量(Pa)	损耗模量(Pa)
			Col	882	124
ColMA	187	37
			ColTA	15184	1162

如图4所示，储能模量值从ColMa水凝胶的182Pa增加到ColTA的15184Pa。储能模量表示材料的弹性部分或刚度。作为热量耗散的能量表示粘性部分，并且显示为损耗模量。来自所有配方的生物材料的频率依赖性测量结果显示储能模量总是高于损耗模量，表明所有水凝胶主要是弹性的。

图5显示本发明的胶囊呈现完美的圆形形态并且可以容易地操作。这种完美的形态为细胞包封提供了很大的优点，因为它最小化了营养物和激素在胶囊内扩散的通常限制，因此减少了细胞坏死。

AFM(原子力显微镜)表征

使用1cm×0.5cm的矩形PDMS模具制备I型胶原水凝胶溶液。将体积为160ul的4mg/mL水凝胶溶液倒入每个模具中并且使其在37℃下聚合30分钟。聚合后，将矩形PDMS模具加长，以便在矩形的一个小侧面中形成池。这些池用1％wt/v的单宁酸溶液填充1分钟，在水凝胶中进行梯度交联。然后将水凝胶脱模，并且用PBS 1x冲洗三次。

用安装在倒置光学显微镜(Nikon Eclipse Ti-U)的载物台上的原子力显微镜(AFM)探测水凝胶的微观流变学。使用力常数为0.08N/m、共振频率为17kHz以及悬臂长度为200μm的Pyrex-Nitride三角形悬臂(Nanoworld innovative technologies，PNP-TR-50)分析样品。在室温下在培养的玻璃盖玻片上进行AFM测量。在测量之前校准光电二极管信号与悬臂偏转之间的关系。校准因子取为光电二极管与位置传感器信号之间的线性关系的斜率，用与培养的玻璃盖玻片的裸露区域接触的悬臂记录。使用JPK Nanowizard Control软件计算悬臂上的力(F)。

然后，本发明人分析了沿着水凝胶的刚度，以确定单宁酸溶液的交联效果。如图6所示，在所有3个样品中，刚度沿x轴降低，证实单宁酸在交联水凝胶时扩散。

多孔水凝胶尺寸

让圆柱体形水凝胶在Milli-Q水中溶胀3天。之后，通过依次浸入Milli-Q水中的梯度乙醇溶液进行脱水：30％v/v、50％v/v、70％v/v、80％v/v、90％v/v和96％v/v乙醇溶液各10分钟，并且100％乙醇两次。然后，将样品置于临界点干燥器(K850，Quorumtechnologies，UK)的室中，密封并且冷却。乙醇被液体CO2完全替代，并且缓慢加热。在临界点干燥后，用超薄涂层金覆盖水凝胶并且通过超高分辨率扫描电子显微镜(SEM)成像。

通过Imaged对孔直径进行定量(图7)，证实所有条件下的直径平均尺寸均远小于T淋巴细胞直径。对照、T.A 1x和T.A 3x的孔的平均尺寸分别为0.118μm、0.098μm和0.082μm，而T淋巴细胞的尺寸为7μm至15μm。

球状体直径尺寸

关于球状体尺寸的控制，本发明人研究了如何生成多达5种不同直径的球体。通过使用不同的水凝胶体积来控制阀的打开和关闭时间，本发明人能够成功地制备直径在1490+/-30μm至460+/-60μm尺寸范围内的负载细胞的球状体。

3.3D球状体生物打印

使用3DDiscovery^TM(regenHU Ltd.,Switzerland)作为生物打印机平台，它是多功能且细胞友好的三维(3D)生物打印机，其允许在130x90x60mm的工作范围内制造3D结构。生物打印机设备包括封闭在无菌罩内的台式仪器和温度控制单元，以确保在打印过程中沿打印头保持恒定温度。

分配模块配备有3种不同的打印头，即基于时间-压力、基于挤出和基于喷墨/阀的打印头。用于球状体制造的打印头是喷墨/阀打印头(Microvalve CF300，MVJ-D0.1S0.06)，其结合有气动阀，该气动阀可被自动控制，以喷射纳升级的少量低粘性材料。根据阀的打开和关闭时间，可以控制沉积液滴的体积，并且因此控制最终球状体的直径，如下表所示：

表2

利用这种技术，本发明人的策略是在超疏水表面上沉积一系列液滴。预处理的表面能够保持负载细胞的水凝胶液滴的球形形状。使用这种方法，可以自动制造100个球状体/分钟。

超疏水表面

使用基于两部分涂料体系(底部和顶部)的Ultra-Ever Dry(SE7.6.110)溶剂制备超疏水表面。为了活化表面，将标准培养皿(Thermofisher目录号055061-INF)用超纯水洗涤3次并且用乙醇(PanReac AppliChem目录号131085.1212)洗涤1次。将每种组分倒入两个专用喷雾器中。将第一组分混合并且在5秒内施加到培养皿，直至形成薄的湿涂层。将培养皿在室温下干燥15分钟至20分钟，然后施加第二组分。在施加第二组分涂层30分钟后，涂层变成超疏水的。

负载细胞的生物墨水的制备

HFF 10.3人成纤维细胞被直接重编程(Sara Cervantes等人，“Late-stagedifferentiation of embryonic pancreatic p-cells requires Jarid2”,SciRep.2017，第14卷；7(1)，第11643页)为购自IDIBAPS的β样细胞，并且在37℃和5％ CO₂气氛下，在添加有10％胎牛血清(FBS)(Thermofisher目录号16000044)和1％青霉素/链霉素(P/S)(Thermofisher目录号15140122)的RPMI 1640培养基(Gibco^TM目录号11875085)中扩增。使用0.05％胰蛋白酶-0.25％ EDTA(Sigma-Aldrich目录号T4049-100ML)在37℃下用5分钟时间将p-样细胞解离成单个细胞，并且置于2mL无菌Eppendorf中。然后将p-样细胞以1200r.p.m离心3分钟，以诱导细胞团形成到孔的底部。

为了制备负载细胞的水凝胶，将浓度为4mg/mL的1体积冷胶原溶液与细胞团混合，最终密度为1x10⁶个细胞/mL。生物打印机墨盒/注射器用冷胶原生物墨水填充并且装到生物打印机分配模块中。使用BioCAD v1.0软件(regenHU Ltd.,Switzerland)设计由50个点组成的正方形阵列图案，并且将其发射到生物打印机平台。在6℃下使用0.1mm喷嘴直径、0.2巴压力和50000ps的阀打开时间和关闭时间获得最佳可印性。打印后，将培养皿在37℃下放置3分钟。然后，通过用1wt％单宁酸溶液交联，将球状体浸没1分钟，进一步实现更稳定的凝胶化。然后将球状体置于24个未处理的MW板(Costar目录号3738)中，并且在连续搅拌下用RPMI培养基洗涤3次。然后，将球状体在3D悬浮液中培养，48MW板保持连续轻度搅拌。

负载细胞的肝细胞生物墨水的制备

AML12(α小鼠肝脏12)细胞系由小鼠肝细胞(CD1株，MT42系)建立，并且购自ATCC(

目录号CRL-2254^TM)。这些细胞表现出典型的肝细胞特征，诸如过氧化物酶体和胆小管样结构。AML12细胞保留表达高水平血清(白蛋白、α1抗胰蛋白酶和转铁蛋白)和间隙连接(连接蛋白26和32)蛋白的mRNA的能力，并且仅含有乳酸脱氢酶的同工酶5。

该细胞系的基础培养基是DMEM:F12培养基，其添加有10％胎牛血清(FBS)(

目录号30-2020)、1％青霉素/链霉素(P/S)(Thermofisher目录号15140122)和胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-G)(Thermofisher目录号41400045)，称为完全培养基(CM)。

这些细胞在37℃和5％ CO2气氛下培养。在每次实验之前，将AML12细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，使用1mL的0.05％胰蛋白酶-0.25％ EDTA(Sigma-Aldrich目录号T4049-100ML)在37℃下从烧瓶(

目录号CLS430641)中分离5分钟，并且收集在具有9mL CM的15mL falcon管(Thermofisher目录号11507411)中，以灭活胰蛋白酶。之后，将细胞以1200r.p.m离心3分钟，以诱导细胞团形成到管的底部，用PBS洗涤并且计数。

为了制备负载细胞的水凝胶，将浓度为4mg/mL的1mL冷胶原溶液与细胞团混合，最终密度为1x10⁶个细胞/mL，如先前在“AFM表征”部分中所述。生物打印机墨盒/注射器用冷胶原生物墨水填充并且装到生物打印机分配模块中。使用BioCAD v1.0软件(regenHULtd.,Switzerland)设计由50个点组成的正方形阵列图案，并且将其发射生物打印机平台。在6℃下使用0.1mm喷嘴直径、1巴压力和50000μs或100000μs的阀打开时间和关闭时间获得最佳可印性。打印后，将培养皿在37℃下放置3分钟。然后，通过用1％w/V单宁酸溶液交联，将球状体浸没1分钟，进一步实现更稳定的凝胶化。然后将球状体置于24个未处理的MW板(Costar目录号3738)中，并且在连续搅拌下在CM中洗涤3次。然后，将球状体在3D悬浮液中培养，48MW板保持连续轻度搅拌。

大鼠胰β-细胞生物打印

在37℃和5％ CO₂气氛下，在添加有10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.05mM de 2-巯基乙醇、10％胎牛血清(FBS)(v/v)(Thermofisher)和1％青霉素/链霉素(Thermofisher)的RPMI R8758培养基(Sigma-Aldrich)(11.1mM葡萄糖)中培养由AugustPi Sunyer Biomedical Research Institute(I DI BAPS)提供的大鼠胰β-细胞系INS1E细胞。在37℃下使用0.05％胰蛋白酶-0.25％ EDTA(Sigma-Aldrich)用3分钟至4分钟将p-细胞解离成单个细胞，离心后在孔的底部获得细胞团。使用3DDiscovery^TM(regenHU Ltd.,Switzerland)作为生物打印机平台。用于球状体制造的打印头是喷墨/阀打印头(Microvalve CF300，MVJ-D0.1S0.06)。生物打印机墨盒/注射器用与细胞团混合的浓度为4mg/mL的一体积冷胶原溶液填充，实现7×10⁶个细胞/mL的细胞密度。使用BioCAD v1.0软件(regenHU Ltd.,Switzerland)设计由50个点组成的正方形阵列图案，并且将其发射到生物打印机平台。在6℃下使用0.1mm喷嘴直径、0.2巴压力以及等同于0.83μm直径的10毫秒的阀打开时间和关闭时间实现最佳可印性。打印后，将疏水性培养皿在37℃下放置15分钟。然后将球状体浸入1x和3x两种不同浓度的单宁酸溶液中。随后，将球状体置于24个未处理的MW板(Costar)中，并且在连续搅拌下洗涤3次。然后，在连续搅拌下将球状体在3D悬浮液中培养，使用基于具有低葡萄糖(5.5mM)和5％FBS的RPMI 1640培养基(Gibco^TM)的低生长培养基。

4.水凝胶胶囊的功能表征

细胞活力

如前所述，将HFF 10.3人细胞包封在各水凝胶中。使用CFDA-SE测定试剂盒(Astarte Biologics，Inc)和Hoechst标记细胞的方案，在1天和7天后研究活力。通过测定每毫升10⁷个细胞所必需的体积来制备用于标记的细胞悬浮液。向一小瓶CFDA中添加90ulDMSO来制备10mM CFDA溶液，并且充分混合。从该溶液中取出10uL，并且用10mL的PBS或HBSS稀释，制成10uM溶液。最后将10uM溶液以1:20稀释，以制备足够的0.5uM CFDA，从而使细胞以10⁷/mL重悬。将细胞以200xg离心10分钟以进行标记，滗出上清液，并且将细胞团重悬于0.5uM CFDA中。将细胞在37℃下温育15分钟，以允许染料扩散到细胞中。将细胞再次离心，并且将细胞团重悬于细胞培养基中，并且在37℃下温育30分钟。温育后，将细胞再次以200xg离心10分钟。滗出上清液并且将细胞团重悬于培养基中，浓度为5x10⁶/mL。使用共聚焦显微镜捕获荧光图像，并且通过FIJI软件处理。

图8示出了在培养7天后，胶原和ColTA的负载细胞的水凝胶内的活细胞(绿色)的代表性荧光图像。两种水凝胶都表现出高活力。重要的是，单个β样细胞在两种水凝胶内逐渐自组装并且聚集，形成3D球状体。

将ML12肝细胞包封在3D球状体中，并且在24小时后根据制造商的方案评估活力(Thermofisher目录号L3224)。简而言之，将包封在水凝胶内的细胞在CM中培养24小时。之后，用PBS将细胞洗涤三次，每次5分钟，随后用钙黄绿素AM(4μM-绿)、乙锭同源二聚体-1(2μm-红)和Hoechst 33342(Thermofisher，目录号62249)在PBS中室温避光温育25分钟。用PBS洗涤三次，每次5分钟，并且拍摄共聚焦图像(图14)。尽管与胶原和单宁酸相比，不受限制的胶原基质会促进细胞增殖，但两种水凝胶均显示出高细胞活力。

使用LIVE/DEAD^TM活力/细胞毒性试剂盒(Thermo Fisher)根据制造商的说明书测量INS1E球状体的活力。通过混合0.2％(v/v)乙锭同源二聚体-1、0.05％(v/v)钙黄绿素AM和0.1％(v/v)Hoechest PBS1x制备染料溶液。使用共聚焦显微镜捕获荧光z-stack图像，并且通过FIJI软件处理。

该分析表明，在细胞包封和生物打印球状体制造后，球状体内的细胞在所有条件下都保持存活。该数据证明单宁酸不影响球状体内部的活力。

这些结果通过两种不同的活力测试证实：

和MTS(分别为DAL1025-Thermofisher和G3582-Promega)。这些生物测定基于氧化还原指示剂，其中产物与细胞增殖定量相关。在整个实验过程中将每个球状体置于96孔板中(n＝10)。在MTS的情况下，将20μL的MTS添加到100μL培养基中并且温育3小时，并且在490nm处测量吸光度。对于

测定，将10μL试剂与90μL培养基混合，并且在黑色平底板中温育3小时，并且在590nm处测量荧光。图9示出了培养多达30天的INS1E球状体。在所有实验条件下，在第1天未检测到细胞活力和代谢活性的差异。

令人惊讶的是，包封在用T.A.(单宁酸)处理的水凝胶胶囊中的细胞与对照胶囊(未用T.A.处理的胶原)中的细胞相比，显示出增强的增殖。这些结果清楚地表明本发明的胶囊适合于长期细胞包封，并且它们为细胞提供改善其活力的最佳环境。

逃逸测定

使用前面部分中描述的用于INS1E球状体的相同实验设置(将单个球状体置于96孔板中)来评估从球状体逃逸的细胞。具体地，在第1天、第10天和第30天，将球状体从孔中取出并且置于新的96孔板中，以避免潜在的增殖细胞从球状体中逃逸并且附着在孔的底部。在上清液和培养基中评估逃逸的细胞。对于上清液，将每个样品离心(1200rpm，10分钟)，但我们在研究的实验条件中任一实验条件下不对任何细胞进行计数。对于附着的细胞，将50μL胰蛋白酶-EDTA(0.025％)添加到孔中并且温育10分钟。将细胞团重悬于10μL中，并且与10μL 0.4％台盼蓝(15250061，thermofisher)混合，并且使用自动细胞计数器Countess^TM(15397802，fisher scientific)计数。图10显示，在整个实验中多达600个细胞/球状体能够从胶原逃逸，而在ColTA 1x和ColTA 3x条件下几乎没有或没有发现细胞。值得注意的是，在ColTA 1x和ColTA 3x中计数的少数细胞中，超过50％是死亡的。

胰岛素测定

另外，通过免疫染色研究水凝胶内的胰岛素分泌。为此，在制备后14天将水凝胶固定在10％福尔马林溶液(Sigma-Aldrich)中。然后，用PBS洗涤水凝胶，并且用Block-Perm溶液(0.2％v/v Triton X-100(Sigma-Aldrich)和1％w/v BSA(Sigma-Aldrich)在PBS中将细胞透化1小时。之后，将水凝胶在1xPBS中洗涤，并且与原抗胰岛素小鼠Igg 1(Acris，目录号BM508)溶液在4℃下温育过夜。用PBS洗涤3次后，用Block-Perm溶液(0.2％v/v Triton X-100(Sigma-Aldrich)和1％w/v BSA(Sigma-Aldrich)在PBS中将细胞透化2小时。然后，与第二抗体Alexa Fluor抗小鼠IgG647(Invitrogen，目录号A32728)溶液在4℃下温育过夜。水凝胶用1xPBS洗涤3次，封片并且储存在4℃下，然后通过共聚焦显微镜观察。

在图11中的A中，示出了使用抗胰岛素抗体免疫荧光染色的共聚焦图像。图像显示，包封在两种生物材料(胶原和ColTa)中的细胞是功能性的，并且在培养7天后能够分泌胰岛素激素(红色)。图11中的B示出了在所示条件下对用单宁酸处理的胶囊中的抗胰岛素抗体进行免疫荧光染色的其它图片。

重要的是，该数据显示球状体内的大多数细胞产生胰岛素，并且它们能够组织成功能性簇。每种条件下3个球状体的4个不同z-stack显示在整个球状体中胰岛素的均匀产生。因此，根据在球状体内部的位置，功能性没有差异。条件之间没有定性差异，这意味着用单宁酸处理似乎不影响包埋细胞的功能性。

还通过ELISA测量葡萄糖刺激的胰岛素分泌测定。在制备后第8天，用含有2.8mM葡萄糖的Krebs-Ringer碳酸氢盐HEPES缓冲溶液(115mM NaCl、24mM NaHCO3、5mM KCL、1mMMgCa2-6H2O、1mM CaCI22H2O、20mM HEPES和0.5％ BSA，pH7.4)预温育包封的P-细胞30分钟。然后，将球状体在低葡萄糖(2.8mM)条件下温育1小时，随后在高葡萄糖(16.7mM)条件下温育。每次温育后，收集上清液并且在酸-乙醇溶液中回收细胞胰岛素内容物。按照标准程序通过ELISA测定胰岛素浓度(图12)。结果显示，包封在本发明胶囊中的p-细胞能够产生胰岛素。

白蛋白免疫荧光染色

使用免疫荧光技术检测白蛋白的细胞质内表达，作为健康肝细胞的功能标记。为此，将如上所述制备的具有肝细胞的水凝胶在CM中培养24小时，并且使用中性缓冲的10％福尔马林溶液(Sigma-Aldrich，目录号HT501128)固定1小时。在搅拌下将细胞洗涤3次，持续5分钟。随后，用Block-Perm溶液：0.2％v/v Triton^TMX-100(Sigma-Aldrich，目录号T8787)在PBS中将细胞透化。避免使用牛血清白蛋白，以免产生伪品或不期望的结合。然后，在搅拌下用PBS将水凝胶洗涤3次，持续5分钟，并且与原抗白蛋白抗体(Genetex，目录号GTX102419)在加湿室中在4度下温育过夜。次日，将细胞与第二抗体Alexa Fluor抗小鼠IgG647(Invitrogen，目录号A32728)在室温下温育2小时。用PBS将水凝胶洗涤3次，用DAPI复染，封片并且储存在4度下，然后通过共聚焦显微镜观察(图15)。有趣的是，单宁酸导致的进一步交联减慢了肝细胞的增殖速率，但同时增加了分化状态，如白蛋白的高表达所证实。

体内球状体移植

NSG小鼠(n＝9)用于评估3种不同生物材料条件的生物降解能力：用1％wt/vol和3％wt/vol单宁酸交联的胶原，以及为了比较目的，用藻酸盐壳覆盖的胶原核心。对于每种条件，每只小鼠移植3个球状体。所选的位置是网膜囊。在15和30天后评价体内移植。

使用4mg/mL的胶原制造直径2mm的球状体。在PBS 1x中制备1％wt/vol和3％wt/vol的单宁酸(403040Sigma Aldrich)溶液。然后将溶液加热并且用0.22ym过滤器(SLGP033RB Millex GP)过滤。对藻酸钠(W201502Sigma Aldrich)粉末进行称重，然后在UV中灭菌15分钟。将藻酸盐以1.5％wt/vol溶于PBS 1x溶液中。对氯化钙(C3306 SigmaAldrich)粉末进行称重，然后在UV中灭菌15分钟。将氯化钙以2％wt/vol溶于Mili Q水中。

一方面，将胶原球状体浸入单宁酸溶液中1分钟。然后用PBS1x洗涤3次。另一方面，为了用藻酸盐第二层覆盖胶原核心，将每个球状体置于96孔板中。然后，在每个孔中添加用CaCI2 1:20预聚合的20YI藻酸盐。最后，将球状体浸入CaCI2溶液中。

在所有植入的动物中均未观察到毒性，并且胶囊在所有实验中是稳定的(即至少30天)。令人惊奇的是，与具有藻酸盐壳的胶囊相比，本发明的胶囊(即用单宁酸交联)在宿主组织中产生显著更少的纤维化。

该实验证明，本发明的胶囊适于在体内长期安全使用，并且在宿主体内无炎症或纤维化作用。

5.用于包埋3D生物打印的水凝胶胶囊的微孔支架的制备

冷冻凝胶形成(纤维素0.5％)

为了制备0.5％(w/v)的羧甲基纤维素(CMC)冷冻凝胶，本发明人称量50mg CMC，并且本发明人将其在搅拌条件下稀释到小瓶中的5ml MilliQ水中，以进一步稀释至0.5％(w/v)。同时，CMC溶解，本发明人制备了我们的模具。模具由高1mm和直径10mm的PDMS圆形池组成。本发明人在其底部放置正方形的24x24mm盖玻片，并且在顶部放置圆形的12mm直径盖玻片，并且我们将模具放置到冰箱中。一旦CMC溶解，本发明人就制备交联试剂；AAD为50mg/mL，MES缓冲液为0.5M(pH为5.5)，并且EDC为1ug/ml，将它们全部溶解在MilliQ水中并且涡旋，以确保所有溶液的均匀性。为了制备1ml CMC溶液的预聚物溶液，本发明人添加了100ulMES缓冲液、7ul AAD和4ul EDC，并且用力移液以避免冷冻前过早交联。然后，本发明人用最终预聚物溶液填充PDMS模具，并且本发明人将其快速放入冷冻机中，并且放置24小时。第二天，本发明人小心地取出盖玻片和PDMS模具并且按顺序浸入以下液体中进行清洁：1xMilliQ水、1x NaOH 100Mm、1x 10mM EDTA、1x MilliQ和3xPBS。一旦完成清洗规程，将冷冻凝胶灭菌，用于在高压釜中进行进一步的细胞接种实验。

将冷冻凝胶置于24孔板中(1冷冻凝胶/孔)。将3D球状体以100或1000个球状体/冷冻凝胶的密度接种在少量DMEM/F12+0.5％ BSA中。15分钟至20分钟后，添加500μL相同培养基，并且在进一步实验前将3D球状体在37℃和5％ CO2条件下温育2天或3天。

6.微孔支架表征

孔分析

为了进行孔分析，在前述预聚物溶液中添加12μl的1mM荧光素胺来对冷冻凝胶的纤维进行染色。一旦染色，就在共聚焦显微镜中拍摄z-stack图像，并且可以用Imaged对孔径的分布进行定量。

如图16所示，孔分布随着材料浓度的增加而减小。从5％图中可以看出，应当理解孔分布从20μm较小的孔达到100μm较大的孔。相比之下，将材料的量降低至0.25％，较小的孔为约20μm，然而较大的孔直径可达到250μm。观察发现的结果，本发明人选择在具有较高材料浓度的底部制造较小层以生成小孔隙率层，并且在顶部生成达到150μm的较大分布孔隙率。

溶胀

溶胀是冷冻凝胶吸收的水量的比例。为了测量该比例，如前所述制备冷冻凝胶，并且在灭菌后，将冷冻凝胶在室温下干燥并且称重。接着，将它们浸没在MilliQ水中5天，当它们达到平衡时再次称重。溶胀率计算如下：

其中W_eq是平衡时的重量，并且W_d是干重。在这些实验中，每个冷冻凝胶进行3次测量，并且对每种条件的3个冷冻凝胶进行称重。

图17显示，在使用相同量的材料，但改变材料比例的情况下，溶胀率改变。在这种情况下，每种冷冻凝胶复合物的吸水能力取决于明胶比例。如图17中所观察到的，全CMC冷冻凝胶具有约98％的溶胀率，然而如果添加明胶，则该溶胀率在全明胶冷冻凝胶中降至96％。

刚度

进行压缩测定以确定我们样品的刚度。在具有5N测压元件的Zwick Z0.5 TN仪器(Zwick-Roell，Germany)中进行压缩测定。在0.1mN的预加载力和20％/分钟的应变速率下，在室温下对样品进行实验，最高至30％的最终压缩范围。最后，用10％至20％的压缩范围斜率计算杨氏模量。在这些实验中，每个冷冻凝胶进行3次测量，并且每种条件测试3个冷冻凝胶。

在图18中显示，刚度结果与溶胀结果相关。如所理解的，与全明胶冷冻凝胶相比，全CMC冷冻凝胶具有更高的刚度(0.3kDa与0.7kDa)。这样，可以说，添加明胶降低了冷冻凝胶的刚度但孔分布没有任何变化。

SEM图像

对于SEM图像，如前所述制备冷冻凝胶。灭菌后，进行乙醇脱水，以将水替换为乙醇。通过增加乙醇的百分比进行连续洗涤，从50％开始，直到70％、80％、90％、96％(x2)和99.5％乙醇。一旦所有的水被替换为乙醇，就进行临界点干燥，以除去所有的乙醇并且替换CO₂。然后进行碳溅射，并且拍摄SEM图像。

如图19所示，应当理解我们中的高孔分布。可以看出，在第一层中存在这种高的孔不均匀性，一些区域具有大孔而其它区域具有较小的孔。

7.植入物用于治疗糖尿病受试者的用途

胰岛素依赖型糖尿病(T1DM)是由产生胰岛素的胰β细胞的破坏引起的自体免疫性紊乱。与T1DM相关联的全球负担是糖尿病患者总数的5％至10％，为382,000,000人。到2035年，该数量预期上升到592,000,000。外源性胰岛素施用和严格血糖控制是延缓糖尿病并发症进程和死亡的推荐疗法。然而，胰岛素不像功能性胰岛β细胞那样提供有效的葡萄糖控制。近十年来，由多能干细胞生成β细胞和体细胞重编程方面的重大进展为患者个性化胰岛替代治疗的发展带来了很大的希望。然而，胰岛移植存在主要局限性，诸如免疫抑制、感染和短期治疗(β细胞活力有限)。本文提供了一种新型3D生物打印胰岛微胶囊，其可作为可植入骨骼肌组织的人工胰腺，有效地解决了这三个局限性。另外，可植入微装置将避免连续和侵入性外科手术干预，因为替换葡萄糖传感器需要这种干预。对于所有这些，本发明代表了T1DM治疗的重要治疗选择。

本发明是一种新方法，其开发了作为T1DM的β细胞替代疗法的胰岛移植支架，因为本发明试图填补这一治疗领域目前存在的重要空白。主要目的是利用生物工程材料的最新知识开发和定制支架，该支架将促进移植的胰岛移植物的移入并且使它们能够在稍后的时间点被取回。其通过结合PEG和胶原，可以改善长期移植物血管再生(这至今仍是临床胰岛移植的主要障碍)，以产生用于支持胰岛和新形成的血管的理想结构。通过开发用于胰岛移植的创新支架，本发明寻求创新用于有效治疗T1D的β细胞替代疗法。我们的工作代表了使临床胰岛移植成为治疗T1D的有效且安全的手段的重要进展。这继而有可能通过消除胰岛素疗法的负担、降低与T1D相关联的直接和间接成本，以及最重要的是，改善全球受该疾病影响的数百万人的生活质量，产生积极的社会、临床和经济影响。

通过多次皮下注射外源性胰岛素或皮下泵治疗T1DM无法重现生理胰岛素特征。此外，它需要严格自我监测血糖水平，长远来看，这不能防止低血糖和高血糖事件，从而不利地影响患者的日常生活和预期寿命。尽管可植入人工胰腺将成为T1DM治疗的替代治疗选择，但其存在几个局限性，这些局限性源于植入移植物存活有限以及葡萄糖感测和胰岛素产生延迟的事实。另一方面，葡萄糖传感器寿命短和算法控制不充分使得泵不是T1DM患者的安全治疗选择。本发明是朝着建立T1DM的确定性治疗迈出的重要一步，有可能挽救数百万人的生命。本文提出的可植入人工胰腺解决了最近的可植入胰岛技术的三个重要问题。首先，本文所提出的植入物的解剖部位(骨骼肌)代表了用于最佳营养/氧供应的安全且高血管化龛，并使该过程的可逆性变得极其可行。第二，这里使用的材料，特别是ColTA，及其3nm至5nm的孔径，显著缩短了葡萄糖感测与胰岛素释放之间的时间。同时，其提供针对宿主免疫细胞的有效保护。第三，胰岛被包埋在生物可降解的胶原中，该胶原易于使自身适应细胞聚集和生长。此外，细胞被限制在不可生物降解的单宁酸涂层内，这防止胰岛分散，但同时不影响新毛细血管的形成。由于纳米技术、生物学和组织工程的整合，这种新的复杂系统是实现更好的胰岛性能的关键。此外，其能够根据循环的葡萄糖自我调节胰岛素释放，从而提供长时间的高水平稳定性和功能性，但对患者只造成微创。

因此，将包含胰岛的本发明的水凝胶胶囊或植入物植入患有I型糖尿病的受试者的组织中，例如植入骨骼肌内。每个胶囊的胰岛量和待植入胶囊的量可根据各种参数确定，如疾病严重性、年龄、性别等。重要的是，本发明的胶囊还可用于确定疾病严重性或治疗前的药物反应。

条款

本发明的其它方面/实施方案可见于以下条款：

条款1：一种水凝胶胶囊，所述水凝胶胶囊包括：

-细胞；

-蛋白质；和

-交联剂；

其中所述细胞位于包含所述蛋白质的第一核心层内；并且

其中所述第一核心层被包含所述蛋白质和所述交联剂的第二层包围。

条款2：根据条款1所述的水凝胶胶囊，其中所述蛋白质包含胶原。

条款3：根据条款1至2中任一项所述的水凝胶胶囊，其中所述交联剂选自单宁酸、甲基丙烯酸酐、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、己二酸二酰肼以及它们的混合物。

条款4：根据条款1至3中任一项所述的水凝胶胶囊，其中所述交联剂是单宁酸。

条款5：根据条款1至4中任一项所述的水凝胶胶囊，其中所述细胞选自胰细胞、肝细胞、心血管细胞、神经细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、皮肤细胞、造血细胞、免疫细胞、生殖细胞、干细胞、遗传工程化细胞、重编程细胞、转分化细胞以及它们的混合物。

条款6：根据条款5所述的水凝胶胶囊，其中所述胰细胞是β细胞。

条款7：根据条款1至6中任一项所述的水凝胶胶囊，其中所述细胞形成细胞聚集体或类器官。

条款8：一种植入物，所述植入物包含根据条款1至7中任一项所述的水凝胶胶囊和微孔支架。

条款9：根据条款8所述的植入物，其中所述微孔支架包含选自以下的聚合物：多糖、胶原、明胶、聚磷腈、聚乙二醇、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(环氧烷)、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯吡咯烷酮以及它们的混合物。

条款10：根据条款1至7中任一项所述的水凝胶胶囊或根据条款8至9中任一项所述的植入物，所述水凝胶胶囊或所述植入物在治疗、诊断或预后中使用。

条款11：根据条款10所述的使用的水凝胶胶囊或植入物，所述水凝胶胶囊或所述植入物在治疗I型糖尿病中使用。

条款12：根据条款1至7中任一项所述的水凝胶胶囊或根据条款8至9中任一项所述的植入物用于细胞体外培养的用途。

条款13：一种用于使未分化细胞分化成胰岛细胞，或者另选地用于使分化细胞转分化成胰岛细胞的离体方法，所述方法包括以下步骤：

(a)制备如条款1至7中任一项所述的水凝胶胶囊，其中包封的细胞是未分化的或分化的细胞；

(b)使(a)中制备的所述水凝胶胶囊与选自KGF、SANT1、视黄酸以及它们的混合物的因子接触。

条款14：一种用于制备根据条款1至7中任一项所述的水凝胶胶囊的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)形成包含所述蛋白质和所述细胞的第一核心层；

(b)允许所述蛋白质的非共价网状化以形成水凝胶；以及

(c)将所述水凝胶浸没在包含所述交联剂的溶液中。

条款15：一种水凝胶胶囊，所述水凝胶胶囊能够通过根据条款14所述的方法获得。

引用列表

William T.Brinkman et al.，“Photo-Cross-Linking of Type I CollagenGels in the Presence of Smooth Muscle Cells：Mechanical Properties，CellViability，and Function”，Biomacromolecules，2003，vol.4(4)，pp890-895.

Felicia W.Pagliuca et al.，“Generation of functionnal human pancreaticβcells in vitro”，Cell.2014，vol.159(2)，pp.428-439

Zhou，Q.，et al.，“In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrinecells to b-cells”，2008，Nature，vol.455(7213)，pp.627-32.

Sara Cervantes et al.，“Late-stage differentiation of embryonicpancreatic β-cells requires Jarid2”，Sci Rep.2017，voI.14；7(1)，pp.11643)。

Claims (15)

1.一种水凝胶胶囊，所述水凝胶胶囊包括：

-细胞；

-蛋白质；和

-交联剂；

其中所述细胞位于包含所述蛋白质的第一核心层内；

其中所述第一核心层被包含所述蛋白质和所述交联剂的第二层包围；并且

其中所述交联剂是单宁酸。

2.根据权利要求1所述的水凝胶胶囊，其中所述蛋白质包含胶原。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的水凝胶胶囊，其中所述细胞选自由以下各项组成的组：胰细胞、肝细胞、心血管细胞、神经细胞、肌细胞、软骨细胞、骨细胞、皮肤细胞、造血细胞、免疫细胞、生殖细胞、干细胞、遗传工程化细胞、重编程细胞、转分化细胞以及它们的混合物。

4.根据权利要求3所述的水凝胶胶囊，其中所述胰细胞是β细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的水凝胶胶囊，其中所述细胞形成细胞聚集体或类器官。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的水凝胶胶囊，其中所述胶囊的所述第二层的孔尺寸小于5μm。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的水凝胶胶囊，其中所述胶囊具有200μm至3mm的平均直径。

8.一种植入物，所述植入物包含根据权利要求1至7中任一项所述的水凝胶胶囊和微孔支架。

9.根据权利要求8所述的植入物，其中所述微孔支架包含选自由以下各项组成的组的聚合物：多糖、胶原、明胶、聚磷腈、聚乙二醇、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(环氧烷)、聚(乙酸乙烯酯)、聚乙烯吡咯烷酮以及它们的混合物。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的水凝胶胶囊或根据权利要求8至9中任一项所述的植入物，所述水凝胶胶囊或所述植入物在治疗、诊断或预后中使用。

11.根据权利要求10所述的用于使用的水凝胶胶囊或植入物，所述水凝胶胶囊或所述植入物在治疗I型糖尿病中使用。

12.根据权利要求1至7中任一项所述的水凝胶胶囊或根据权利要求8至9中任一项所述的植入物用于细胞体外培养的用途。

13.一种用于使未分化细胞分化成胰岛细胞，或者另选地用于使分化细胞转分化成胰岛细胞的离体方法，所述方法包括以下步骤：

(a)制备根据权利要求1至7中任一项所述的水凝胶胶囊，其中包封的细胞是未分化的或分化的细胞；

(b)使(a)中制备的所述水凝胶胶囊与选自由KGF、SANT1、视黄酸以及它们的混合物组成的组的因子接触。

14.一种用于制备根据权利要求1至7中任一项所述的水凝胶胶囊的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)形成包含所述蛋白质和所述细胞的所述第一核心层；

(b)允许所述蛋白质的非共价网状化以形成水凝胶；以及

(c)将所述水凝胶浸没在包含所述交联剂的溶液中。

15.一种水凝胶胶囊，所述水凝胶胶囊能够通过根据权利要求14所述的方法获得。

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