JP2023533567A - 組み換えワクシニアウイルス - Google Patents

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Abstract

本開示は、ヒトＩＬ－２バリアント、ＩＬ－２バリアントを含む組み換え腫瘍溶解性ウイルス、ＩＬ－２バリアントまたは組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、および個体における癌を治療するためのＩＬ－２バリアント、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、または組成物の使用を提供する。【図２５】TIFF2023533567000021.tif135162

Description

関連出願への言及
本出願は、２０２０年７月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０５１，６２８号、および２０２０年７月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０５１，８９０号の利益を主張するものである。仮出願のそれぞれについての内容は、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
配列表への言及
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に出願されており、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列を含む。．ｔｘｔファイルは、２０２１年６月２２日に作成された「ＰＣ７２６４９Ａ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題され、８０ＫＢのサイズを有する配列表を含有する。この．ｔｘｔファイルに含有される配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞成長の刺激等、哺乳類免疫系の複数の機能に重要であるサイトカインであり、癌に対する免疫療法剤として認可されている。しかしながら、様々な因子（例えば、狭い治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）；潜在的な深刻な副作用）がその臨床的使用を制限している。抗癌剤としてのＩＬ－２の使用の制限の１つは、それがエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞（抗腫瘍活性を有する）を刺激し得かつ増大させ得る一方で、それは、免疫応答を抑える調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）も増大させ得ることである。
ＩＬ－２シグナル伝達は、種々の細胞タイプに種々の形式で存在するＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）を通して媒介される。高アフィニティーＩＬ－２受容体は、ＩＬ－２Ｒアルファ（「ＩＬ－２Ｒα」；ＣＤ２５としても知られる）、ＩＬ－２Ｒベータ（「ＩＬ－２Ｒβ」；ＣＤ１２２としても知られる）、およびＩＬ－２Ｒガンマ（「ＩＬ－２Ｒγ」；ＣＤ１３２としても知られる）と称される３種のポリペプチド鎖を含有する。高アフィニティーＩＬ－２Ｒは、Ｔｒｅｇ上に構成的に発現され、活性化Ｔ細胞およびＮＫ細胞上に一過性に発現される。中アフィニティーＩＬ－２Ｒは、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγポリペプチド鎖を含有し、例えば休止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に発現される。低アフィニティーＩＬ－２Ｒは、ＩＬ－２Ｒαポリペプチド鎖を含有する。
ＩＬ－２は、高アフィニティーＩＬ－２Ｒを介してＴｒｅｇ細胞を活性化し、中アフィニティーＩＬ－２Ｒを介して休止ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化することから、Ｔｒｅｇを活性化することなく、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を選択的に活性化するための１つの考え得る手法は、ＩＬ－２を中アフィニティーＩＬ－２Ｒへと選択的に標的化することである。高アフィニティーＩＬ－２受容体と低アフィニティーＩＬ－２受容体との間の違いは、高アフィニティーＩＬ－２受容体におけるＩＬ－２Ｒαポリペプチド鎖の存在であることを考慮すると、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαポリペプチド鎖との間の相互作用を遮断するまたは損なうことによって、ＩＬ－２は潜在的に中アフィニティーＩＬ－２Ｒへと選択的に標的化され得る。
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、癌細胞に選択的にまたは優先的に感染しかつ殺滅するウイルスである。生の複製ＯＶは、多様なヒト癌における臨床試験において試験されている。ＯＶは、抗腫瘍免疫応答、ならびに腫瘍細胞の直接溶解を誘導し得る。ＯＶは天然に存在し得る、または他のウイルスを改変することによって構築され得る。よく見られるＯＶは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、コクサッキーウイルス（ＣＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、およびワクシニアウイルス（ＶＶ）の弱毒化系統に基づいて構築されるものを含む。
ワクシニアウイルス（ＶＶ）は、ポックスウイルスファミリーのオルソポックスウイルス（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）属のメンバーである。それは、約２００種の遺伝子をコードする、長さがおよそ１９０ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質において複製する。大きなワクシニアウイルスゲノムは、ウイルスＤＮＡ複製に使用される様々な酵素およびタンパク質をコードする。複製の間、ワクシニアウイルスは、それらの外膜が異なるいくつかの感染型：細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープビリオン（ＩＥＶ）、細胞結合型エンベロープビリオン（ＣＥＶ）、および細胞外エンベロープビリオン（ＥＥＶ）を産生する。ＩＭＶは、最も豊富な感染型であり、宿主間での拡散に関与していると考えられる；ＣＥＶは、細胞間拡散における役割を果たすと思われる；ＥＥＶは、宿主生物内の長距離伝播に重要であると考えられる。ＥＥＶ特異的タンパク質は、遺伝子Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、およびＦ１３Ｌによってコードされる。Ａ３４Ｒ遺伝子によってコードされるＩＩ型膜貫通糖タンパク質であるＡ３４は、アクチン尾部の誘導、感染細胞の表面からのエンベロープウイルスの放出、およびウイルス侵入前のリガンド結合後のウイルスエンベロープの崩壊に関わる。
一部の態様において、本開示は、ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）バリアント、ならびに関連する融合タンパク質、組成物、方法、および使用を提供する。ＩＬ－２バリアントは、中アフィニティー二量体ＩＬ－２受容体複合体（ＩＬ－２Ｒβ＋ＩＬ－２Ｒγを含有する）に結合する能力を保持するが、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体アルファ（「ＩＬ－２Ｒα」／ＣＤ２５）への結合の減少を有するもしくは結合を有しない、または野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、高アフィニティー三量体ＩＬ－２受容体複合体（ＩＬ－２Ｒα＋ＩＬ－２Ｒβ＋ＩＬ－２Ｒγを含有する）への結合の減少を有するもしくは結合を有しない。
本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントは、野生型ヒトＩＬ－２アミノ酸配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を有する。一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントにおけるアミノ酸置換は、ＩＬ－２バリアントタンパク質において１つまたは複数の操作されたＮ－グリコシル化部位をもたらす。
一部の実施形態において、単離されたヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）バリアントは、野生型ヒトＩＬ－２と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントは、ａ）Ｋ３５、ｂ）Ｒ３８およびＬ４０の両方、ｃ）Ｔ４１およびＫ４３の両方、ｄ）Ｋ４３およびＹ４５の両方、ｅ）Ｅ６２およびＫ６４の両方、ならびにｆ）Ｌ７２およびＱ７４の両方からなる群から選択されるアミノ酸位置に１つまたは複数の置換を含む。任意選択により、バリアントは、ａ）Ｋ３５（Ｋ３５置換はＫ３５Ｎである）、ｂ）Ｒ３８およびＬ４０の両方（Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｌ４０置換はＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔである）、ｃ）Ｔ４１およびＫ４３の両方（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、ｄ）Ｋ４３およびＹ４５の両方（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、ｅ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、ならびにｆ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）からなる群から選択されるアミノ酸位置に１つまたは複数の置換を含む。任意選択により、ＩＬ－２バリアントはＫ３５位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントは、ａ）Ｒ３８およびＬ４０の両方（Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｌ４０置換はＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔである）、ｂ）Ｔ４１およびＫ４３の両方（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、ｃ）Ｋ４３およびＹ４５の両方（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、ｄ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、ｅ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびにｆ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。任意選択により、ＩＬ－２バリアントはＲ３８およびＬ４０位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントは、ａ）Ｔ４１およびＫ４３の両方（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、ｂ）Ｋ４３およびＹ４５の両方（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、ｃ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、ｄ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびにｅ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。任意選択により、ＩＬ－２バリアントはＴ４１およびＫ４３位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントは、ａ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、ｂ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびにｃ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。任意選択により、ＩＬ－２バリアントはＫ４３およびＹ４５位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントは、ａ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、ｂ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびにｃ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。任意選択により、ＩＬ－２バリアントはＥ６２およびＫ６４位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントは、Ｌ７２およびＱ７４位に置換をさらに含み、Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである。
一部の実施形態において、本明細書において提供される単離されたヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）バリアントは、野生型ヒトＩＬ－２と比較して少なくとも４つのアミノ酸置換を含み、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントは、ａ）Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５のそれぞれ；またはｂ）Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４のそれぞれからなる群から選択されるアミノ酸位置に置換を含む。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５に置換を含み、Ｒ３８置換はＲ３８Ｎである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５に置換を含み、Ｌ４０置換はＬ４０Ｔである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５に置換を含み、Ｋ４３置換はＫ４３Ｎである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５に置換を含み、Ｙ４５置換はＹ４５Ｔである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５に置換を含み、Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３Ｎである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５に置換を含み、アミノ酸置換はＲ３８Ｎ、Ｌ４０Ｔ、Ｋ４３Ｎ、およびＹ４５Ｔである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４に置換を含み、Ｋ４３置換はＫ４３Ｎである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４に置換を含み、Ｙ４５置換はＹ４５Ｔである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４に置換を含み、Ｌ７２置換はＬ７２Ｎである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４に置換を含み、Ｑ７４置換はＱ７４Ｔである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４に置換を含み、Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｌ７２置換はＬ７２Ｎである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４に置換を含み、アミノ酸置換はＫ４３Ｎ、Ｙ４５Ｔ、Ｌ７２Ｎ、およびＱ７４Ｔである。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、配列番号３１または配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、野生型ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトＩＬ－２バリアントであって、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントはＥ６２位にアミノ酸置換を含む、単離されたヒトＩＬ－２バリアントが本明細書において提供される。任意選択により、Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである。
一部の実施形態において、配列番号３１または３５に示されるアミノ酸配列を含む単離されたヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）バリアントが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、野生型ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）と比較して少なくとも４つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトＩＬ－２バリアントであって、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントは、４つのアミノ酸置換Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｔ、Ｋ４３Ｎ、およびＹ４５Ｔを含む、単離されたヒトＩＬ－２バリアントが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、野生型ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）と比較して少なくとも４つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトＩＬ－２バリアントであって、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントは、４つのアミノ酸置換Ｋ４３Ｎ、Ｙ４５Ｔ、Ｌ７２Ｎ、およびＱ７４Ｔを含む、単離されたヒトＩＬ－２バリアントが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、本明細書において提供される単離されたヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）バリアントは、野生型ヒトＩＬ－２と比較して、ヒトＩＬ－２受容体アルファ（ＩＬ－２Ｒα）への結合の低下を有する。
一部の実施形態において、本明細書において提供される単離されたヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）バリアントは、導入されたアスパラギン（Ｎ）残基置換上でグリコシル化される。
一部の実施形態において、本明細書において提供される単離されたヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）バリアントは、Ｔ３およびＣ１２５位の一方または両方に置換をさらに含む。任意選択により、Ｔ３およびＣ１２５位における置換は、Ｔ３ＡまたはＴ３ＧおよびＣ１２５ＡまたはＣ１２５Ｓである。
一部の実施形態において、ａ）本明細書において提供されるＩＬ－２バリアント；およびｂ）ヒト抗体のＦｃ領域を含む単離された融合タンパク質であって、ＩＬ－２バリアントはＦｃ領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質が本明細書において提供される。
一部の実施形態において、ａ）本明細書において提供される単離された融合タンパク質であって、ヒト抗体のＦｃ領域は第１のＦｃ領域である、単離された融合タンパク質；およびｂ）ヒト抗体の第２のＦｃ領域を含むヘテロ二量体タンパク質であって、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって共有結合で連結されている、ヘテロ二量体タンパク質が本明細書において提供される。任意選択により、第１のＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含んで、ノブ（ｋｎｏｂ）またはホール（ｈｏｌｅ）を形成し、第２のＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含んで、ノブまたはホールを形成し、第１および第２のＦｃ領域の一方はノブを含有し、第１および第２のＦｃ領域の一方はホールを含有する。任意選択により、ノブを含むＦｃ領域は、変異Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、ホールを含むＦｃ領域は、変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む。
一部の実施形態において、ａ）本明細書において提供されるＩＬ－２バリアント；およびｂ）Ｆｃドメインを含む抗体を含む単離された融合タンパク質であって、Ｆｃドメインは第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域を含み、ＩＬ－２バリアントは抗体のＦｃ領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質が本明細書において提供される。任意選択により、Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の減少を有するまたはＡＤＣＣ活性を有しない。一部の実施形態において、ａ）本明細書において提供されるＩＬ－２バリアント；およびｂ）Ｆｃドメインを含む抗体を含む単離された融合タンパク質であって、抗体は第１の軽鎖および第２の軽鎖を含み、ＩＬ－２バリアントは抗体の軽鎖に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質が本明細書において提供される。任意選択により、Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、ＡＤＣＣ活性の減少を有するまたはＡＤＣＣ活性を有しない。任意選択により、抗体は腫瘍または免疫細胞に結合する。任意選択により、抗体は、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗Ｂ７Ｈ４／抗ＣＤ２８二重特異性抗体、抗ＥＤＢ１抗体、抗ＵＬＢＰ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＩＬ－８抗体、抗ＩＬ－７Ｒアルファ（ＣＤ１２７）抗体、抗ＩＬ１５抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＣＳＦ１抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＣＤ２００Ｒ抗体、抗ＶＩＳＧ４抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＬＩＬＲｂ２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ２０６抗体、抗ＣＤ１６３抗体、抗ＫＬＲＧ１抗体、抗ＦＬＴ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、ＫＬＲＧ１抗体、および抗ＧＩＴＲ抗体からなる群から選択される。任意選択により、ＩＬ－２バリアントは、ポリペプチドリンカーおよび／またはポリペプチドタグによって、それぞれＦｃ領域または軽鎖に共有結合で連結されている。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質をコードする単離された核酸が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、置換Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｔ、Ｋ４３Ｎ、およびＹ４５Ｔを含有するＩＬ－２バリアントをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－２バリアントをコードする核酸を含む組み換え発現ベクターが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。
一部の実施形態において、それを必要とする対象における癌等の疾患を治療するための方法であって、方法は、本明細書に記載されるＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、それにより疾患と関連した１つまたは複数の症状が対象において改善される、方法が本明細書において提供される。任意選択により、方法は、第２の治療剤の有効量を投与する工程をさらに含み、任意選択により、投与は、別個、逐次的、または同時である。
一部の実施形態において、それを必要とする対象における免疫系を刺激する方法であって、方法は、本明細書に記載されるＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、それにより免疫系が対象において刺激される、方法が本明細書において提供される。
一部の実施形態において、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための医薬の製造における使用のための、本明細書に記載されるＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物が本明細書において提供される。
一部の実施形態において、参照タンパク質は結合パートナータンパク質に結合し、参照タンパク質における結合ドメインが結合パートナータンパク質と相互作用する、参照タンパク質のバリアントを調製する方法であって、方法は、参照タンパク質の結合ドメインにグリコシル化部位を導入する工程であって、グリコシル化部位は、アミノ酸配列Ｎ－ｘ－Ｓ、Ｎ－ｘ－Ｔ、Ｓ－ｘ－Ｎ、またはＴ－ｘ－Ｎを含む、工程を含み、グリコシル化部位を導入する工程は、参照タンパク質の結合ドメインのアミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸置換を導入して、アミノ酸配列Ｎ－ｘ－Ｓ、Ｎ－ｘ－Ｔ、Ｓ－ｘ－Ｎ、またはＴ－ｘ－Ｎ（式中、ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）を作り出す工程を含み、Ｎ－ｘ－Ｓ、Ｎ－ｘ－Ｔ、Ｓ－ｘ－Ｎ、またはＴ－ｘ－Ｎ配列におけるＮ、Ｓ、またはＴ残基の少なくとも１つは、参照タンパク質のグリコバリアントを作り出すためのアミノ酸置換であり、バリアントは、参照タンパク質と比較して、結合パートナータンパク質への結合の低下を有する、方法が本明細書において提供される。任意選択により、方法は、参照タンパク質の結合ドメインに少なくとも２つのアミノ酸置換を導入する工程を含み、グリコシル化部位を導入する工程は、参照タンパク質の結合ドメインのアミノ酸配列に少なくとも２つのアミノ酸置換を導入して、アミノ酸配列Ｎ－ｘ－Ｓ、Ｎ－ｘ－Ｔ、Ｓ－ｘ－Ｎ、またはＴ－ｘ－Ｎを作り出す工程を含み、Ｎ－ｘ－Ｓ、Ｎ－ｘ－Ｔ、Ｓ－ｘ－Ｎ、またはＴ－ｘ－Ｎ配列におけるＮ、Ｓ、またはＴ残基はアミノ酸置換である。
一部の他の態様において、本開示は、本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルス、ＩＬ－２バリアントまたは腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、ならびに腫瘍溶解性ウイルスに関連した方法および使用を提供する。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号２９のアミノ酸配列を含むヒトＩＬ－２バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＳＶ－ＴＫバリアントである。
一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスチミジンキナーゼを欠損した状態にする改変をさらに含む。特定の実施形態において、改変は、ウイルスＪ２Ｒ遺伝子の少なくとも一部分の欠失である。
一部の他の実施形態において、本開示によって提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、子孫ビリオンの拡散を増強する改変をさらに含む。特定の実施形態において、改変は、ウイルスＡ３４Ｒ遺伝子産物におけるＫ１５１Ｅ置換をもたらす。
一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは組み換えワクシニアウイルスである。特定の実施形態において、本開示は、ａ）配列番号２９のＩＬ－２バリアントをコードするヌクレオチド配列；ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＳＶ－ＴＫバリアントをコードするヌクレオチド配列；ｃ）野生型Ａ３４Ｒ遺伝子産物と比べてＫ１５１Ｅ置換を含むＡ３４タンパク質をコードするＡ３４Ｒ遺伝子；およびｄ）ウイルスＪ２Ｒ遺伝子の少なくとも一部分の欠失を含む複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはコペンハーゲン系統である、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。具体的な実施形態において、ウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子によってコードされるＡ３４タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施形態において、ウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子は、配列番号３９のヌクレオチド配列を含む。
一部の他の態様において、本開示は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、および腫瘍または癌を有する個体において腫瘍溶解を誘導するまたは個体における癌を治療するために腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物を使用する方法を提供する。
一部の他の実施形態において、本開示は、ガンシクロビル等、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量を個体に投与する工程を含む、ウイルスを投与されている個体の体内において、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスの複製を制御する方法を提供する。
他の態様および実施形態の例は、下で詳細に記載される。
組み換え腫瘍溶解性ウイルスＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６に関する全ゲノムの概略的表示である。略語：ＬＩＴＲ＝左逆位末端反復；ＲＩＴＲ＝右逆位末端反復；Ａ～Ｏ＝ＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントによって歴史的に規定されたウイルス遺伝子領域；ＰＳＥＬ＝合成初期後期プロモーター；ｍＩＬ２ｖ＝マウスインターロイキン－２バリアント；＊＝Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換をコードする変異；ＰＦ１７＝Ｆ１７Ｒ遺伝子由来のプロモーター；ＨＳＶ ＴＫ．００７＝１６８位におけるアラニンからヒスチジンへの置換をコードする変異を有する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。 組み換え腫瘍溶解性ウイルスＶＶ９４およびＩＧＶ－１２１に関する全ゲノムの概略的表示である。略語：ＬＩＴＲ＝左逆位末端反復；ＲＩＴＲ＝右逆位末端反復；Ａ～Ｏ＝ＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントによって歴史的に規定されたウイルス遺伝子領域；ＰＳＥＬ＝合成初期後期プロモーター；ｍＩＬ２ｖ＝マウスインターロイキン－２バリアント；＊＝Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換をコードする変異；ＰＦ１７＝Ｆ１７Ｒ遺伝子由来のプロモーター；ＨＳＶ ＴＫ．００７＝１６８位におけるアラニンからヒスチジンへの置換をコードする変異を有する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。 組み換え腫瘍溶解性ウイルスＶＶ１０１～ＶＶ１０３に関する全ゲノムの概略的表示である。略語：ＬＩＴＲ＝左逆位末端反復；ＲＩＴＲ＝右逆位末端反復；Ａ～Ｏ＝ＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントによって歴史的に規定されたウイルス遺伝子領域；ＰＳＥＬ＝合成初期後期プロモーター；ｈＩＬ２ｖ＝ヒトインターロイキン－２バリアント；＊＝Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換をコードする変異；ＰＦ１７＝Ｆ１７Ｒ遺伝子由来のプロモーター；ＨＳＶ ＴＫ．００７＝１６８位におけるアラニンからヒスチジンへの置換をコードする変異を有する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。 組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後の、ｍＩＬ－２ｖ発現分析の図である。 組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後の、ｈＩＬ－２ｖ発現分析の図である。 組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後の、ＨＳＶ ＴＫ．００７発現分析の図である。 図７Ａ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。ビヒクルのみ（Ａ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図７Ｂ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーターで武装化された、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１６）（Ｂ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図７Ｃ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。ｍＩＬ－２ｖのみで武装化された、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．ｍＧＭ－ＣＳＦ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ２７）（Ｃ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。 図７Ｄ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７で武装化された、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｄ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図７Ｅ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７で武装化された、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９３）（Ｅ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図７Ｆ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。Ｂ１６Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７で武装化された、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９６）（Ｆ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。 図７Ｇ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。各処理群に関する平均腫瘍容積（ｍｍ３）±９５％信頼区間が、各群におけるすべての動物がまだ生きている最後の腫瘍測定時点である、腫瘍埋め込み後２８日目まで示されている（Ｇ）。 ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の表である。太字フォントの値は、ｐ≦０．０５の場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。 埋め込み後１２日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、ＭＣ３８腫瘍を埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の図である。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。 ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の２４時間（ｈｒ）および４８時間後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたＩＬ－２レベルの図である。各符号は、個々のマウスに対する算出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝９／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。 図１１Ａ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。ビヒクルのみ（Ａ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図１１Ｂ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーターで武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１６）（Ｂ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図１１Ｃ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ｍＩＬ－２ｖのみで武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．ＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ２７）（Ｃ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。 図１１Ｄ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｄ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図１１Ｅ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９３）（Ｅ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図１１Ｆ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルス（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９６）（Ｆ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。 ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の２４、４８、および７２時間後の、ＬＬＣ腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたＩＬ－２レベルの図である。各符号は、個々のマウスに対する算出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝５／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。 図１３Ａ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１１日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各処理に関して、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高３２日目までの群平均±９５％信頼区間として示されている（Ａ）。試験ウイルスは、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１７）（Ｃ）、ｍＩＬ－２ｖのみ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ７９）（Ｄ）、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でＨＳＶ ＴＫ．００７とともにｍＩＬ－２ｖ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９４）（Ｅ）、ならびにＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｆ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。図１３Ｂ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１１日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで示されている（Ｂ～Ｆ）。試験ウイルスは、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１７）（Ｃ）、ｍＩＬ－２ｖのみ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ７９）（Ｄ）、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でＨＳＶ ＴＫ．００７とともにｍＩＬ－２ｖ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９４）（Ｅ）、ならびにＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｆ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。図１３Ｃ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１１日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで示されている（Ｂ～Ｆ）。試験ウイルスは、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１７）（Ｃ）、ｍＩＬ－２ｖのみ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ７９）（Ｄ）、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でＨＳＶ ＴＫ．００７とともにｍＩＬ－２ｖ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９４）（Ｅ）、ならびにＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｆ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。 図１３Ｄ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１１日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで示されている（Ｂ～Ｆ）。試験ウイルスは、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１７）（Ｃ）、ｍＩＬ－２ｖのみ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ７９）（Ｄ）、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でＨＳＶ ＴＫ．００７とともにｍＩＬ－２ｖ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９４）（Ｅ）、ならびにＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｆ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。図１３Ｅ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１１日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで示されている（Ｂ～Ｆ）。試験ウイルスは、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１７）（Ｃ）、ｍＩＬ－２ｖのみ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ７９）（Ｄ）、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でＨＳＶ ＴＫ．００７とともにｍＩＬ－２ｖ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９４）（Ｅ）、ならびにＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｆ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。図１３Ｆ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１１日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで示されている（Ｂ～Ｆ）。試験ウイルスは、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１７）（Ｃ）、ｍＩＬ－２ｖのみ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ７９）（Ｄ）、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でＨＳＶ ＴＫ．００７とともにｍＩＬ－２ｖ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９４）（Ｅ）、ならびにＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｆ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。 皮下ＭＣ３８腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の表である。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。 ＳＣ腫瘍埋め込み後１１日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の図である。Ｐ値は、選択ウイルス群の間のログランク検定（マンテル・コックス）比較の統計的結果を表す。 ５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを用いたＩＶ注射の７２時間後（１４日目）の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたＩＬ－２レベルの図である。各符号は、個々のマウスにおいて検出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝１０／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。 図１７Ａ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１４日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各処理に関して、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高２７日目までの群平均±９５％信頼区間として示されている（Ａ）。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ；ＶＶ３）（Ｃ）、またはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を有して、Ｂ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｄ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。 図１７Ｂ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１４日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで示されている（Ｂ～Ｄ）。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ；ＶＶ３）（Ｃ）、またはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を有して、Ｂ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｄ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。図１７Ｃ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１４日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで示されている（Ｂ～Ｄ）。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ；ＶＶ３）（Ｃ）、またはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を有して、Ｂ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｄ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。図１７Ｄ ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１４日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。腫瘍成長軌道が、各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで示されている（Ｂ～Ｄ）。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ；ＶＶ３）（Ｃ）、またはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を有して、Ｂ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｄ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。 皮下ＬＬＣ腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の表である。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。 ＳＣ腫瘍埋め込み後１４日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、ＬＬＣ腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の図である。Ｐ値は、選択ウイルス群の間のログランク検定（マンテル・コックス）比較の統計的結果を表す。 図２０Ａ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。ビヒクルのみ（Ａ）で処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図２０Ｂ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。５ｅ７ｐｆｕでの、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｂ）で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図２０Ｃ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。５ｅ７ｐｆｕでの、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｈＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｃ）で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。 図２０Ｄ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。５ｅ７ｐｆｕでの、ｍＧＭ－ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ－ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｄ）で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図２０Ｅ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。２ｅ８ｐｆｕでの、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ；ＶＶ７）（Ｅ）で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図２０Ｆ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。２ｅ８ｐｆｕでの、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｆ）で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。 図２０Ｇ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。２ｅ８ｐｆｕでの、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｈＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｇ）で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図２０Ｈ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。２ｅ８ｐｆｕでの、ｍＧＭ－ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ－ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｈ）で武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。図２０Ｉ ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。各処理群に関する平均腫瘍容積（ｍｍ３）が、腫瘍埋め込み後２８日目まで示されている（Ｉ）。 ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の表である。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果（ｐ値）を示している。太字フォントの値は、ｐ≦０．０５の場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。 図２２Ａ 埋め込み後１１日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、ＭＣ３８腫瘍を埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の図である。毎日、≧１４００ｍｍ３の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。（Ａ）は、５ｅ７ｐｆｕウイルスを投薬された群を示している。 図２２Ｂ 埋め込み後１１日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、ＭＣ３８腫瘍を埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の図である。毎日、≧１４００ｍｍ３の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。（Ｂ）は、２ｅ８ｐｆｕのウイルスを投薬された群を示している。 ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の２４時間後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたマウスＩＬ－２レベルの図である。各符号は、個々のマウスに対する算出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝１０／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。 ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の２４時間後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたヒトＩＬ－２レベルの図である。各符号は、個々のマウスに対する算出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝９／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。 ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたヌード雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。各処理群に関する平均腫瘍容積（ｍｍ３）が、腫瘍埋め込み後４０日目まで示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。 ＶＶ９７～１００に関する全ゲノムの概略的表示である。 ＶＶ１１０に関する全ゲノムの概略的表示である。 ＶＶ１１７に関する全ゲノムの概略的表示である。 図２９Ａ 組み換えＷＲワクシニアウイルスによって発現されたＩＬ－２バリアント導入遺伝子とインキュベートされたネズミ科脾細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の査定の図である。ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２バリアント、またはｈＩＬ－２グリコバリアントのいずれかとインキュベートされたネズミ科脾細胞のサブセットにおけるｐＳＴＡＴ５誘導の比較。ＩＬ－２機能性を、ＩＬ－２Ｒ媒介性シグナル伝達の読み出しとして細胞内ｐＳＴＡＴ５レベルの測定を使用して査定した。脾細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＮＫｐ４６）および細胞内タンパク質（ＦｏｘＰ３）に対する抗体で付加的に染色して、種々のＩＬ２Ｒ複合体を発現するネズミ科リンパ球の様々なサブセットを描出した。グラフは、表示ウイルスによって分泌されるｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２バリアント、またはｈＩＬ－２グリコバリアントタンパク質の増加する処理濃度（ｘ軸）に応答した、ｐＳＴＡＴ５の細胞内染色の蛍光強度中央（ＭＦＩ）値（ｙ軸）の変化を示している。略語：ｐＳＴＡＴ５＝リン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）５；ＭＦＩ＝蛍光強度中央値；Ｔｒｅｇ＝ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ調節性細胞。図２９Ｂ 組み換えＷＲワクシニアウイルスによって発現されたＩＬ－２バリアント導入遺伝子とインキュベートされたネズミ科脾細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の査定の図である。ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２バリアント、またはｈＩＬ－２グリコバリアントのいずれかとインキュベートされたネズミ科脾細胞のサブセットにおけるｐＳＴＡＴ５誘導の比較。ＩＬ－２機能性を、ＩＬ－２Ｒ媒介性シグナル伝達の読み出しとして細胞内ｐＳＴＡＴ５レベルの測定を使用して査定した。脾細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＮＫｐ４６）および細胞内タンパク質（ＦｏｘＰ３）に対する抗体で付加的に染色して、種々のＩＬ２Ｒ複合体を発現するネズミ科リンパ球の様々なサブセットを描出した。グラフは、表示ウイルスによって分泌されるｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２バリアント、またはｈＩＬ－２グリコバリアントタンパク質の増加する処理濃度（ｘ軸）に応答した、ｐＳＴＡＴ５の細胞内染色の蛍光強度中央（ＭＦＩ）値（ｙ軸）の変化を示している。略語：ｐＳＴＡＴ５＝リン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子５；ＭＦＩ＝蛍光強度中央値；Ｔｒｅｇ＝ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ調節性細胞。図２９Ｃ 組み換えＷＲワクシニアウイルスによって発現されたＩＬ－２バリアント導入遺伝子とインキュベートされたネズミ科脾細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の査定の図である。ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２バリアント、またはｈＩＬ－２グリコバリアントのいずれかとインキュベートされたネズミ科脾細胞のサブセットにおけるｐＳＴＡＴ５誘導の比較。ＩＬ－２機能性を、ＩＬ－２Ｒ媒介性シグナル伝達の読み出しとして細胞内ｐＳＴＡＴ５レベルの測定を使用して査定した。脾細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＮＫｐ４６）および細胞内タンパク質（ＦｏｘＰ３）に対する抗体で付加的に染色して、種々のＩＬ２Ｒ複合体を発現するネズミ科リンパ球の様々なサブセットを描出した。グラフは、表示ウイルスによって分泌されるｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２バリアント、またはｈＩＬ－２グリコバリアントタンパク質の増加する処理濃度（ｘ軸）に応答した、ｐＳＴＡＴ５の細胞内染色の蛍光強度中央（ＭＦＩ）値（ｙ軸）の変化を示している。略語：ｐＳＴＡＴ５＝リン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子５；ＭＦＩ＝蛍光強度中央値；Ｔｒｅｇ＝ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ調節性細胞。 埋め込み後１１日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、ＭＣ３８腫瘍を埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスの体重の図である。 ５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを用いたＩＶ注射の７２時間後（１４日目）の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたＩＬ－２レベルの図である。統計学を、＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；および＊＊＊＝ｐ＜０．００１を有して、ＶＶ９９と比較した、テューキーの事後多群比較検定とともに一元配置Ａｎｏｖａ検定を使用して実施した。 表３。５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを用いたＩＶ注射の７２時間後（１４日目）の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出された炎症性サイトカインレベルの表である。各列は、示されたサイトカインに対する幾何平均サイトカインレベル（Ｎ＝１０／試験群）を示している。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ，０．０１；＋＝ｐ＜０．００１；＾＝ｐ＜０．０００１。 ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、単回の（１１日目に投与される）ＩＶウイルス送達を使用したウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。 表４。皮下ＭＣ３８腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の表である。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。 ＳＣ腫瘍埋め込み後１１日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の図である。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。 表５。皮下ＭＣ３８腫瘍モデル調査におけるウイルス療法後の生存率の統計比較の表である。図３５からの生存率データを、ログランク検定（マンテル・コックス）によって分析した。Ｐ値は、選択ウイルス群の間のログランク検定（マンテル・コックス）比較の統計的結果を表す。 ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたヌード雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。各処理群に関する平均腫瘍容積（ｍｍ３）が、腫瘍埋め込み後４３日目まで示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスのＩＶ注射を受けた時点を表す。 表６。ヌードマウスにおける皮下ＨＣＴ－１１６腫瘍に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の表である。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。 ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたヌード雌マウスに関するウイルス療法誘導性生存率の査定の図である。腫瘍が２０００ｍｍ３に達し次第、安楽死を実施した。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルス（３Ｅ６ＰＦＵ）のＩＶ注射を受けた時点を表す。グラフ上の水平破線は、５０パーセント生存率、すなわち生存率中央値を表す。 表７。ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたヌード雌マウスにおけるウイルス療法誘導性生存率の統計比較の表である。各群比較に対してＰ値が挙げられている。 ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１６日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。 表８。皮下ＭＣ３８腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の表である。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。 ＳＣ腫瘍埋め込み後１６日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の図である。Ｐ値は、選択ウイルス群の間のログランク検定（マンテル・コックス）比較の統計的結果を表す。 表９。ウイルス療法誘導性生存率の統計比較の表である。生存率をモニターし、次いでログランク検定（マンテル・コックス）によって分析した。各群比較に対してＰ値が挙げられている。 抗ＰＤ－１抗体処理との組み合わせで、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１８日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の図である。 表１０。皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の表である。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。 ＳＣ腫瘍埋め込み後１８日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の図である。 表１１。Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおけるウイルス療法誘導性生存率の統計比較の表である。生存率をモニターし、次いでログランク検定（マンテル・コックス）によって分析した。各群比較に対してＰ値が挙げられている。 Ｆｃドメインに共有結合で連結されたＩＬ－２バリアントを含むＩＬ－２バリアント融合タンパク質を描写した概略的図面である。Ｆｃドメインは、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖を含有し、第１のＦｃ鎖は「ノブ」アミノ酸置換を含有し、第２のＦｃ鎖は「ホール」アミノ酸置換を含有する。ＩＬ－２バリアントのＮ末端は、第１のＦｃ鎖のＣ末端にリンカーを介して共有結合で連結されている。 ＥＬＩＳＡによって判定される、ＨＨ細胞における（図５０Ａ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５０Ａおよび５０Ｂの両方に関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５０Ｂに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５光学密度（ＯＤ）を示している。 ＥＬＩＳＡによって判定される、ｉＴｒｅｇ細胞における（図５０Ｂ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５０Ａおよび５０Ｂの両方に関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５０Ｂに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５光学密度（ＯＤ）を示している。 図５１Ａ フローサイトメトリーによって判定される、ＣＤ８ Ｔ細胞における（図５１Ａ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５１Ａ、５１Ｂ、および５１Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５１Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。図５１Ｂ フローサイトメトリーによって判定される、ＮＫ細胞における（図５１Ｂ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５１Ａ、５１Ｂ、および５１Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５１Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５１Ｃ フローサイトメトリーによって判定される、Ｔｒｅｇ細胞における（図５１Ｃ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５１Ａ、５１Ｂ、および５１Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５１Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５２Ａ フローサイトメトリーによって判定される、ＣＤ８ Ｔ細胞における（図５２Ａ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５２Ａ、５２Ｂ、および５２Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５２Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。図５２Ｂ フローサイトメトリーによって判定される、ＮＫ細胞における（図５２Ｂ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５２Ａ、５２Ｂ、および５２Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５２Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５２Ｃ フローサイトメトリーによって判定される、Ｔｒｅｇ細胞における（図５２Ｃ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５２Ａ、５２Ｂ、および５２Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５２Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５３Ａ フローサイトメトリーによって判定される、ＣＤ８ Ｔ細胞における（図５３Ａ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５３Ａ、５３Ｂ、および５３Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５３Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。図５３Ｂ フローサイトメトリーによって判定される、ＮＫ細胞における（図５３Ｂ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５３Ａ、５３Ｂ、および５３Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５３Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５３Ｃ フローサイトメトリーによって判定される、Ｔｒｅｇ細胞における（図５３Ｃ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５３Ａ、５３Ｂ、および５３Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５３Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５４Ａフローサイトメトリーによって判定される、ＣＤ８ Ｔ細胞における（図５４Ａ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５４Ａ、５４Ｂ、および５４Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５４Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。図５４Ｂ フローサイトメトリーによって判定される、ＮＫ細胞における（図５４Ｂ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５４Ａ、５４Ｂ、および５４Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５４Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５４Ｃ フローサイトメトリーによって判定される、Ｔｒｅｇ細胞における（図５４Ｃ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５４Ａ、５４Ｂ、および５４Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５４Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５５Ａ フローサイトメトリーによって判定される、ＣＤ８ Ｔ細胞における（図５５Ａ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５５Ａ、５５Ｂ、および５５Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５５Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。図５５Ｂ フローサイトメトリーによって判定される、ＮＫ細胞における（図５５Ｂ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５５Ａ、５５Ｂ、および５５Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５５Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５５Ｃ フローサイトメトリーによって判定される、Ｔｒｅｇ細胞における（図５５Ｃ）ｐＳＴＡＴ５レベルに対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。図５５Ａ、５５Ｂ、および５５Ｃに関するＩＬ－２バリアント融合タンパク質は、図５５Ｃに挙げられている。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質濃度（ｎＭ）を示し、Ｙ軸はｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。 図５６Ａ ＣＤ８ Ｔ細胞（図５６Ａ）の増大に対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質（それぞれ３種の異なる濃度の）を示し、Ｙ軸は細胞の倍増大を示している。図５６Ｂ ＮＫ細胞（図５６Ｂ）の増大に対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質（それぞれ３種の異なる濃度の）を示し、Ｙ軸は細胞の倍増大を示している。 図５６Ｃ Ｔｒｅｇ細胞（図５６Ｃ）の増大に対する、種々のＩＬ－２融合タンパク質の様々な濃度の効果を要約した図である。Ｘ軸はＩＬ－２融合タンパク質（それぞれ３種の異なる濃度の）を示し、Ｙ軸は細胞の倍増大を示している。 図５７Ａ マウスにおける種々のＩＬ－２融合タンパク質の忍容性（図５７Ａ）の図である。図５７Ａにおいて、Ｘ軸は処理後の日数を示し、Ｙ軸はマウスの生存率パーセントを示している。種々のタンパク質に関する生存率データが、以下の符号で注釈を付された線で描写されている：塗りつぶした丸：ＰＢＳ（タンパク質なし）；空の丸：Ｆｃ－ＩＬ２；塗りつぶした三角：Ｆｃ－ＩＬ２ｖ；空の三角：Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；塗りつぶした四角：Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；空の四角：Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ。図５７Ｂ マウスにおける種々のＩＬ－２融合タンパク質の腫瘍成長阻害活性（図５７Ｂ）の図である。図５７Ｂにおいて、Ｘ軸は処理後の日数を示し、Ｙ軸は腫瘍容積（ｍｍ３）を示している。種々のタンパク質に関するデータが、以下の符号で注釈を付された線で描写されている：星印：ＰＢＳ（タンパク質なし）；「Ｘ」：Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；「Ｏ」：Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ。 感染後４８、７２、および９６時間の時点における、ＶＶ１１０またはＶＶ１２（ＪＸ－５９４）によって誘導された最大ヒト腫瘍細胞殺滅の表である。データは、平均±ＳＤとして表されている。 感染後４８、７２、および９６時間の時点における、ＶＶ１１０またはＶＶ１２（ＪＸ－５９４）によって誘導されたヒト腫瘍細胞株におけるＶＶ１１０およびＶＶ１２の効力の表である。データは、平均±ＳＤとして表されている。 ヒト腫瘍細胞株におけるＶＶ１１０およびＶＶ１２の相対的効力（ＥＣ５０比）の図である。データは、平均±ＳＤとして表されている。 局部アシクロビル処理の有無での、カニクイザルへのＶＶ１１０のＩＶ投与後に生じる自然発生的皮膚病変からの感染性ウイルス力価の表である。局部アシクロビル投与なし（群１）またはあり（群２）で、５×１０７ＰＦＵのＶＶ１１０をＩＶに受けた動物の個々の皮膚病変からスワブを回収した。
詳細な説明
Ａ．定義
「抗体」という用語は、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的抗原への特異的結合能を有する免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および３次元立体配置は周知である。完全なＩｇＧ抗体分子は、２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖を含有する。重鎖および軽鎖のそれぞれは、可変領域および定常領域を含有する。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。本明細書において使用するとき、「抗体」という用語は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、別様に指定されない限り、特異的結合をインタクト抗体と競合するその任意の抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置も包含する。抗原結合部分は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えばサメおよびラクダ科抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメント、単鎖可変フラグメント抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）、ミニボティ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲおよびｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ならびにポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドを含む。
「縮重バリアント」という用語は、参照核酸配列と比べて塩基の置換を有するが、参照核酸配列と同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。
「有効量」という用語は、哺乳類において所望の効果を引き起こすのに十分である、哺乳類に投与される量を指す。
「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ鎖」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るものの、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃは、通常、Ｃｙｓ２２６位におけるアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端に及ぶと規定される。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔにあるようにＥＵ指標のものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般的に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。当技術分野において公知であるように、Ｆｃ領域は、二量体または単量体形態で存在し得る。
「Ｆｃドメイン」という用語は、２つのＦｃ領域／Ｆｃ鎖を含む、抗体の領域を指す。例えば、標準的なＩｇＧ形式において、抗体は２本の重鎖を有し、その両方ともＦｃ領域／Ｆｃ鎖を有する。集合的に、２つのＦｃ領域／Ｆｃ鎖は、本明細書において「Ｆｃドメイン」と称される。
「宿主細胞」という用語は、ポリヌクレオチドインサートの組み入れのためのベクターに対するレシピエントであり得るまたはレシピエントになっている、個々の細胞または細胞培養物を指す。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異に起因して、元の親細胞と必ずしも完全に同一である（形態においてまたはゲノムＤＮＡ相補体において）必要はなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。
「免疫エフェクター細胞エンハンサー」または「ＩＥＣエンハンサー」という用語は、哺乳類の１種または複数のタイプの免疫エフェクター細胞の数、品質、または機能を増加させ得るまたは増強し得る物質を指す。免疫エフェクター細胞の例は、細胞溶解性ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞を含む。
「免疫抑制細胞阻害剤」または「ＩＳＣ阻害剤」という用語は、哺乳類の免疫抑制細胞の数または機能を低下させ得るまたは抑制し得る物質を指す。免疫抑制細胞の例は、調節性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）、骨髄由来サプレッサー細胞、および腫瘍関連マクロファージを含む。
「免疫モジュレーター」という用語は、宿主哺乳類の自然、液性、もしくは細胞性免疫系の任意の構成要素の免疫応答（本明細書に規定される）または働きを変更し（例えば、阻害し、減少させ、増加させ、増強させ、または刺激し）得る物質を指す。ゆえに、「免疫モジュレーター」という用語は、本明細書に規定される「免疫エフェクター細胞エンハンサー」および本明細書に規定される「免疫抑制細胞阻害剤」、ならびに哺乳類の免疫系の他の構成要素に影響を及ぼす物質を包含する。
「免疫応答」という用語は、自然免疫応答（例えば、Ｔｏｌｌ受容体シグナル伝達カスケードの活性化）、細胞媒介性免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞等のＴ細胞および免疫系の非特異的細胞によって媒介される応答）、および液性免疫応答（例えば、抗体の作出ならびに血漿、リンパ、および／または組織液への分泌等、Ｂ細胞によって媒介される応答）等、宿主哺乳類の免疫系による特定の物質（抗原または免疫原等）に対する任意の検出可能な応答を指す。
本明細書において互換可能に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、ネズミ科（例えば、ラット、マウス）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄類（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）を含むがそれらに限定されない哺乳類を指す。
「新生物障害」という用語は、細胞が、異常に高くかつ無制御の速度で増殖し、速度は周囲の正常組織のものを超えかつそれと協調しない、病態を指す。それは、通常、「腫瘍」として知られる充実性病変（ｓｏｌｉｄ ｌｅｓｉｏｎ）またはしこりをもたらす。この用語は、良性および悪性の新生物障害を包含する。本開示において「癌」という用語と互換可能に使用される「悪性新生物障害」という用語は、体内における他の場所に拡散する腫瘍細胞の能力によって特徴付けられる新生物障害（「転移」として知られる）を指す。「良性新生物障害」という用語は、腫瘍細胞が、転移する能力を欠如する新生物障害を指す。
「腫瘍溶解性」ウイルスという用語は、正常（非癌性）細胞と比較して、癌細胞に優先的に感染しかつ殺滅するウイルスを指す。
本明細書において互換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドにかかわらず、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ゆえに、この用語は、一本鎖、二本鎖、または多鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学的にもしくは生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、それらに限定されるわけではない。
「阻止すること」または「阻止する」という用語は、（ａ）障害が生じるのを防ぐこと、または（ｂ）障害の発生もしくは障害の症状の発生を遅延させることを指す。
「複製能を有する」ウイルスという用語は、特定の宿主細胞に感染し得かつその中で複製し得るウイルスを指す。
「組み換え」ウイルスという用語は、ウイルスゲノムに変化を導入するためにおよび／またはウイルスタンパク質に変化を導入するために、例えば組み換え核酸技法を使用して、インビトロで操縦されているウイルスを指す。例えば、組み換えウイルスは、野生型の内因性核酸配列、ならびに変異体および／または外因性核酸配列の両方を含み得る。組み換えウイルスは、改変されたタンパク質構成要素も含み得る。「組み換えワクシニアウイルス」とは、ワクシニアウイルスゲノム骨格に基づいて改変されているまたは構築されている組み換えウイルスを指す。
「治療」、「治療すること」等の用語は、障害を阻害すること、すなわちその発症を食い止めること、障害を軽減すること、すなわち障害の退縮を引き起こすこと、障害の重症度を低下させること、または障害の症状の発生頻度を低下させること等、所望の薬理学的および／または生理学的効果を獲得することを指す。
「治療上有効量」または「効果的な量」という用語は、疾患を治療するために対象に投与された場合に、疾患に対するそのような治療に意図される効果を引き起こすのに十分である、作用物質（例えば、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス）の量、または２種以上の作用物質（例えば、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび第２の治療剤）の組み合わせた量を指す。「治療上有効量」は、作用物質、疾患およびその重症度、ならびに治療されるべき対象の年齢、重量等に応じて変動するであろう。
「インターロイキン－２」または「ＩＬ－２」という用語は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシ等、任意の哺乳類種の野生型インターロイキン－２タンパク質を指す。１種の例示的な野生型ヒトＩＬ－２は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ６０５６８として見出される。全長の野生型ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列は、配列番号２１に提供される。全長の野生型ヒトＩＬ－２は、シグナルペプチド（最初の２０個のアミノ酸）を含有し、それは、ＩＬ－２タンパク質の成熟の間に除去される。シグナルペプチドを含有しない、ヒトＩＬ－２の成熟した活性形態のアミノ酸配列は、配列番号１に提供される（ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ）。別様に記されない限り、ヒトＩＬ－２配列における特定のアミノ酸への本明細書におけるすべての言及は、成熟ＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列（すなわち、配列番号１）に従って番号付けされたアミノ酸へのものである。例えば、ＩＬ－２ Ｒ３８残基は、配列番号１に示されるアミノ酸配列における３８番目の残基（Ｒ）を指す。配列番号１のアミノ酸配列におけるＲ３８残基は、配列番号２１のアミノ酸におけるＲ５８に対応することが理解されるべきである。
「バリアントＩＬ－２」、「ＩＬ－２バリアント」、または「ＩＬ－２ｖ」という用語は、別様に記されない限り、野生型ＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、かつ野生型ＩＬ－２タンパク質の活性の少なくとも一部を保持するポリペプチドを指す。
「ＩＬ－２受容体アルファ」という用語は、ＩＬ－２受容体のアルファポリペプチド鎖を指す。「ＩＬ－２受容体アルファ」は、「ＩＬ－２Ｒａ」、「ＩＬ－２Ｒアルファ」、「ＩＬ－２Ｒａ」、および「ＣＤ２５」としても知られ、本明細書においてそのように称される。１種の例示的な野生型ヒトＩＬ－２Ｒアルファアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１５８９として見出される。
「ＩＬ－２受容体ベータ」という用語は、ＩＬ－２受容体のベータポリペプチド鎖を指す。「ＩＬ－２受容体ベータ」は、「ＩＬ－２Ｒｂ」、「ＩＬ－２Ｒベータ」、「ＩＬ－２Ｒｂ」、および「ＣＤ１２２」としても知られ、本明細書においてそのように称される。１種の例示的な野生型ヒトＩＬ－２Ｒベータアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１４７８４として見出される。
「ＩＬ－２受容体ガンマ」という用語は、ＩＬ－２受容体のガンマポリペプチド鎖を指す。「ＩＬ－２受容体ガンマ」は、「ＩＬ－２Ｒγ」、「ＩＬ－２Ｒガンマ」、「ＩＬ－２Ｒｇ」、および「ＣＤ１３２」としても知られ、本明細書においてそのように称される。１種の例示的な野生型ヒトＩＬ－２Ｒガンマアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３１７８５として見出される。
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すために、本明細書において互換可能に使用される。鎖は線状または分岐であり得、それは、改変されたアミノ酸を含み得、かつ／または非アミノ酸によって中断され得る。該用語は、天然に、または介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化構成要素とのコンジュゲーション等の任意の他の操縦もしくは改変、によって改変されているアミノ酸鎖も包含する。例えば、アミノ酸の１種または複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）、ならびに当技術分野において公知の他の改変を含有するポリペプチドも定義に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または結び付いた鎖として存在し得ることが理解される。
値の域が提供される場合、その域の上限と下限の間にある、文脈上別様にはっきりと指示されない限り、下限の単位の１０分の１までのそれぞれの介在する値、および任意の他の記述される値またはその記述される域内の介在する値は、本発明の内に包含される。これらのより小さな域の上限および下限は、より小さな域に独立して含まれ得、記述される域における任意の具体的に除外される限度に従って、また本発明の内に包含される。記述される域が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除外した域も本発明に含まれる。
別様に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価の任意の方法および材料も、本発明の実践または試験において使用され得るものの、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書において触れられるすべての刊行物は、関連して刊行物が引用される方法および／または材料を開示しかつ記載するために、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上別様にはっきりと指示されない限り、複数形の指示対象を含む。ゆえに、例えば「ワクシニアウイルス（ａ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）」への言及は、複数のそのようなワクシニアウイルスを含み、「バリアントＩＬ－２ポリペプチド（ｔｈｅ ｖａｒｉａｎｔ ＩＬ－２ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、１種または複数のバリアントＩＬ－２ポリペプチド、および当業者に公知のその等価物等を含む。特許請求の範囲は、任意の任意選択による要素を除外するように起草され得ることがさらに留意される。そのため、この記述は、請求項要素の列挙と関連した、「だけ」、「のみ」等のような排他的術語の使用、または「否定的」限定の使用に対する先行詞として働くことが意図される。
明瞭性のために別個の実施形態の文脈において記載される本発明のある特定の特質は、単一の実施形態において組み合わせでも提供され得ることが解される。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈において記載される本発明の様々な特質は、別個にまたは任意の適切な部分組み合わせでも提供され得る。本発明に関する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に内包され、まさにあたかもありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されるかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびその要素のすべての部分組み合わせも、本明細書によって具体的に内包され、まさにあたかもありとあらゆるそのような部分組み合わせが個々にかつ明示的に本明細書に開示されるかのように本明細書に開示される。
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示に対してだけ提供される。本明細書における何も、先行発明の理由で本発明がそのような刊行物に先行する資格がないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の刊行日とは異なり得、それは独立して確認される必要があり得る。
Ｂ．ＩＬ－２バリアントおよび関連する態様
Ｂ－１．ＩＬ－２バリアント
一部の第１の態様において、本開示は、野生型ヒトＩＬ－２アミノ酸配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸置換を有するＩＬ－２バリアント（例えば、ヒトＩＬ－２バリアント）を提供する。一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントは、以下のアミノ酸位置：Ｔ３、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｔ４１、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｌ７２、Ｑ７４、およびＣ１２５のうちの１つまたは複数に、成熟ヒト野生型ＩＬ－２タンパク質配列（配列番号１）と比べて１つまたは複数の置換を含む。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントは、以下の群の位置：Ｒ３８およびＬ４０；Ｔ４１およびＫ４３；Ｋ４３およびＹ４５；Ｅ６２およびＫ６４；Ｌ７２およびＱ７４；Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５；Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４；Ｔ３、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５；Ｔ３、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４；Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、Ｙ４５、およびＣ１２５；Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、Ｑ７４、およびＣ１２５；Ｔ３、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、Ｙ４５、およびＣ１２５；Ｔ３、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、Ｑ７４、およびＣ１２５のうちの１つまたは複数にアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントは、成熟ヒト野生型ＩＬ－２タンパク質と比べて以下のアミノ酸置換：Ｔ３Ａ、Ｋ３５Ｎ、Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｓ、Ｌ４０Ｔ、Ｔ４１Ｎ、Ｋ４３Ｓ、Ｋ４３Ｔ、Ｋ４３Ｎ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｅ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、Ｅ６２Ｒ、Ｋ６４Ｓ、Ｋ６４Ｔ、Ｌ７２Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｑ７４Ｔ、Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｓのうちの１つまたは複数を含む。一部の特定の実施形態において、ＩＬ－２バリアントは、成熟ヒトＩＬ－２タンパク質と比べて以下のアミノ酸置換：Ｋ３５Ｎ、Ｒ３８Ｎ、Ｋ４３Ｎ、Ｅ６２Ｎ、またはＬ７２Ｎのうちの１つまたは複数を含む。
一部の他の実施形態において、本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントは、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２Ｒαへの結合の減少、無視できるほどの結合を有する、または結合を有しない。本発明のＩＬ－２バリアントは、さらに、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、高アフィニティーＩＬ－２受容体三者（ｔｅｒｔｉａｒｙ）複合体（ＩＬ－２Ｒα＋ＩＬ－２Ｒβ＋ＩＬ－２Ｒγを含有する）への結合の減少を有するまたは結合を有しない。本発明のＩＬ－２バリアントは、中アフィニティー二量体ＩＬ－２受容体複合体（ＩＬ－２Ｒβ＋ＩＬ－２Ｒγを含有する）に結合する能力を保持する。
一部の実施形態において、本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントにおけるアミノ酸置換は、ＩＬ－２バリアントタンパク質において操作されたＮ－グリコシル化部位をもたらす。Ｎ－グリコシル化に対するコンセンサス配列は、３アミノ酸配列Ｎ－ｘ－Ｓ、Ｎ－ｘ－Ｔ、Ｓ－ｘ－Ｎ、またはＴ－ｘ－Ｎであり、式中、Ｎはアスパラギンであり、ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓはセリンであり、Ｔはスレオニンである。ＩＬ－２アミノ酸配列における操作されたＮ－グリコシル化部位を作出するために、１つの実施形態において、野生型セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）残基から１つのアミノ酸で離れた位置で、ＩＬ－２アミノ酸配列にアスパラギン（Ｎ）置換が導入される。この状況において、アミノ酸配列Ｎ－ｘ－Ｓ、Ｎ－ｘ－Ｔ、Ｓ－ｘ－Ｎ、またはＴ－ｘ－ＮがＩＬ－２バリアントに作出され、式中、Ｎはアミノ酸置換であり、ＴまたはＳは野生型アミノ酸である。別の実施形態において、野生型Ｎ残基から１つのアミノ酸で離れた位置で、ＩＬ－２アミノ酸配列にＳまたはＴ置換が導入される。この状況において、アミノ酸配列Ｎ－ｘ－Ｓ、Ｎ－ｘ－Ｔ、Ｓ－ｘ－Ｎ、またはＴ－ｘ－ＮがＩＬ－２バリアントに作出され、式中、ＴまたはＳはアミノ酸置換であり、Ｎは野生型アミノ酸である。別の実施形態において、互いから１つのアミノ酸で離れた位置で、ＩＬ－２アミノ酸残基にＮ置換およびＳまたはＴ置換の両方が導入される。この状況において、アミノ酸配列Ｎ－ｘ－Ｓ、Ｎ－ｘ－Ｔ、Ｓ－ｘ－Ｎ、またはＴ－ｘ－ＮがＩＬ－２バリアントに作出され、式中、ＴまたはＳはアミノ酸置換であり、Ｎもアミノ酸置換である。一部の実施形態において、本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントは、野生型ＩＬ－２と比較して複数の置換を有して、ＩＬ－２バリアントアミノ酸配列において１、２、３、４、または５個の操作されたＮ－グリコシル化部位／コンセンサス配列を作出し得る。
ＩＬ－２アミノ酸配列への１つまたは複数の操作されたＮ－グリコシル化部位の導入は、操作されたＮ－グリコシル化部位でグリコシル化され得るＩＬ－２バリアントをもたらす。グリコシル化は、Ｎ（アスパラギン）残基にオリゴ糖部分を連結させ；このオリゴ糖は、「グリカン」とも称される。一部の実施形態において、本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントは、ＩＬ－２バリアントに導入された操作されたＮ－グリコシル化部位の数に基づいて、「単一グリカン」または「二重グリカン」と称される。例えば、本明細書において使用するとき、「単一グリカン」ＩＬ－２バリアントとは、１つの操作されたグリコシル化部位を有するＩＬ－２バリアントを指し、「二重グリカン」ＩＬ－２バリアントとは、２つの操作されたグリコシル化部位を有するＩＬ－２バリアントを指す。
一部の実施形態において、操作されたグリコシル化部位におけるＮ残基のグリコシル化は、ＩＬ－２バリアントとＩＬ－２Ｒαとの相互作用を阻害する。ゆえに、一部の実施形態において、ＩＬ－２配列において１つまたは複数の操作されたＮ－グリコシル化部位をもたらす１つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、操作されたグリコシル化部位でグリコシル化され、野生型ＩＬ－２と比較してＩＬ－２Ｒαに対するアフィニティーの低下を有するＩＬ－２バリアントが本明細書において提供される。理論によって拘束されることなく、操作されたグリコシル化部位で付加されたグリカン基は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間の相互作用を立体的に遮断することによって、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間の結合を妨害すると思われる。ゆえに、例えば、置換Ｒ３８ＮおよびＬ４０Ｔを導入する（それによって、配列Ｎ－ｘ－Ｔを創出する）ことによって、本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントに、操作されたグリコシル化部位が導入される場合、３８位におけるＮ残基はグリコシル化され得る。３８位における操作されたＮ残基に付加されたグリカン基は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間の相互作用を立体的に妨害すると思われる。
関心対象の分子（例えば、ＩＬ－２バリアント）と第２の分子（例えば、ＩＬ－２Ｒα）との間の結合の強度／結合アフィニティーは、当技術分野において公知の方法（例えば、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））によって判定され得る。典型的に、結合アフィニティーは、「ＫＤ」値（平衡解離定数）として報告される。本明細書において使用するとき、参照分子／分析物（例えば、野生型ＩＬ－２）のものと比較した、関心対象の分子／分析物（例えば、ＩＬ－２バリアント）とリガンド（例えば、ＩＬ－２Ｒα）との間の「結合の低下」とは、関心対象の分子が、参照分子とリガンドとの間の結合アフィニティーよりも低いアフィニティーでリガンドに結合する状況を指す。ＫＤ値に関しては、より小さな数ほど、より強い結合アフィニティーを表す（例えば、１ｎＭのＫＤは、５ｎＭのＫＤよりも強い結合アフィニティーである）。ＩＬ－２バリアントとＩＬ－２Ｒαとの間の相互作用に関するＫＤ値が、同じ結合条件下で、野生型ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間の相互作用に関するＫＤ値よりも大きな数である場合、ＩＬ－２バリアントは、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒαへの結合の低下を有する。一部の実施形態において、野生型ＩＬ－２のものと比較して、ＩＬ－２Ｒαへの結合の低下を有するＩＬ－２バリアントは、同じ結合条件下で、野生型ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間の相互作用についてのＫＤ値よりも少なくとも１．５、２、３、５、１０、１５、２０、５０、１００、２００、または５００倍大きいＫＤ値を有する。ＩＬ－２バリアントが、野生型ＩＬ－２のものと比較して、ＩＬ－２Ｒαへの結合の低下を有する状況では、一部の実施形態において、ｂ）ＩＬ－２バリアント－ＩＬ－２Ｒα相互作用についてのＫＤ値と比べた、ａ）野生型ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒα相互作用についてのＫＤ値の比［すなわち、（野生型ＩＬ－２－ＩＬ－２Ｒα相互作用についてのＫＤ値）／（ＩＬ－２バリアント－ＩＬ－２Ｒα相互作用についてのＫＤ値）］は、約０．５、０．２５、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１、０．００５、０．００２５、または０．００１に等しいまたはそれ未満である。一部の実施形態において、野生型ＩＬ－２のものと比較して、ＩＬ－２Ｒαへの結合の低下を有するＩＬ－２バリアントは、ＩＬ－２Ｒαへの検出不能な結合を有し、一方で野生型ＩＬ－２は、同じ結合条件下で、ＩＬ－２Ｒαへの検出可能／測定可能な結合を有する。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換Ｋ３５Ｎによって作出される。Ｋ３５Ｎ置換の後、操作されたＩＬ－２バリアントのアミノ酸番号３５～３７に対するアミノ酸配列はＮ３５－Ｌ３６－Ｔ３７である。ゆえに、Ｎ３５置換と野生型Ｔ３７アミノ酸残基との組み合わせを考慮すると、コンセンサスＮ－グリコシル化部位（Ｎ－ｘ－Ｔ）は、Ｋ３５Ｎ置換によって作出される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換Ｒ３８ＮおよびＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔによって作出される。Ｒ３８ＮおよびＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔ置換の後、操作されたＩＬ－２バリアントのアミノ酸番号３８～４０に対するアミノ酸配列は、Ｎ３８－Ｍ３９－Ｓ４０またはＮ３８－Ｍ３９－Ｔ４０である。ゆえに、コンセンサスＮ－グリコシル化部位（Ｎ－ｘ－ＴまたはＮ－ｘ－Ｓ）は、Ｒ３８ＮおよびＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔ置換によって作出される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換Ｔ４１ＮおよびＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔによって作出される。Ｔ４１ＮおよびＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔ置換の後、操作されたＩＬ－２バリアントのアミノ酸番号４１～４３に対するアミノ酸配列は、Ｎ４１－Ｆ４２－Ｓ４３またはＮ４１－Ｆ４２－Ｔ４３である。ゆえに、コンセンサスＮ－グリコシル化部位（Ｎ－ｘ－ＴまたはＮ－ｘ－Ｓ）は、Ｔ４１ＮおよびＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔ置換によって作出される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換Ｋ４３ＮおよびＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔによって作出される。Ｋ４３ＮおよびＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔ置換の後、操作されたＩＬ－２バリアントのアミノ酸番号４３～４５に対するアミノ酸配列は、Ｎ４３－Ｆ４４－Ｓ４５またはＮ４３－Ｆ４４－Ｔ４５である。ゆえに、コンセンサスＮ－グリコシル化部位（Ｎ－ｘ－ＴまたはＮ－ｘ－Ｓ）は、Ｋ４３ＮおよびＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔ置換によって作出される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換Ｅ６２ＮおよびＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔによって作出される。Ｅ６２ＮおよびＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔ置換の後、操作されたＩＬ－２バリアントのアミノ酸番号６２～６４に対するアミノ酸配列は、Ｎ６２－Ｌ６３－Ｓ６４またはＮ６２－Ｌ６３－Ｔ６４である。ゆえに、コンセンサスＮ－グリコシル化部位（Ｎ－ｘ－ＴまたはＮ－ｘ－Ｓ）は、Ｅ６２ＮおよびＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔ置換によって作出される。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換Ｌ７２ＮおよびＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔによって作出される。Ｌ７２ＮおよびＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔ置換の後、操作されたＩＬ－２バリアントのアミノ酸番号７２～７４に対するアミノ酸配列は、Ｎ７２－Ａ７３－Ｓ７４またはＮ７２－Ａ７３－Ｔ７４である。ゆえに、コンセンサスＮ－グリコシル化部位（Ｎ－ｘ－ＴまたはＮ－ｘ－Ｓ）は、Ｌ７２ＮおよびＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔ置換によって作出される。
一部の実施形態において、本明細書において提供されるアミノ酸置換は、操作されたコンセンサスＮ－グリコシル化部位の一部ではないが、置換も、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間の結合アフィニティーを低下させる。例えば、置換Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、およびＥ６２Ｒは、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間の結合アフィニティーを低下させるが、コンセンサスＮ－グリコシル化部位の一部ではない。別の例において、置換Ｅ６２Ｎは、Ｋ６４位における置換なしでも導入され得る（すなわち、それにより、操作されたコンセンサスＮ－グリコシル化部位を作出することなく、Ｅ６２Ｎ置換が導入される）。これらの置換は、例えば、ＩＬ－２バリアントにおいて１つまたは複数の操作されたコンセンサスＮ－グリコシル化部位を作出する本明細書において提供される他のアミノ酸置換と組み合わせられ得る。
一部の実施形態において、本明細書において提供されるアミノ酸置換は、ＩＬ－２バリアントの均一性を増加させる。例えば、Ｔ３またはＣ１２５位における置換（例えば、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｃ１２５Ａ、またはＣ１２５Ｓ）は、ＩＬ－２タンパク質の均一性を増加させ得、例えば、ＩＬ－２バリアントにおいて１つもしくは複数の操作されたコンセンサスＮ－グリコシル化部位を作出しかつ／またはＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間の結合アフィニティーを低下させる本明細書において提供される他のアミノ酸置換と組み合わせられ得る。
Ｂ－２．ＩＬ－２バリアントを含む融合分子
一部の実施形態において、抗体または抗体のＦｃ領域等の別のタンパク質に連結された、本開示によって提供されるＩＬ－２バリアントを含むＩＬ－２融合タンパク質が本明細書において提供される。一部のさらなる実施形態において、本開示によって提供されるＩＬ－２バリアントおよび２つの抗体Ｆｃ領域を含むＩＬ－２ヘテロ二量体タンパク質であって、ＩＬ－２バリアントはＦｃ領域の一方に連結されており、２つのＦｃ領域はジスルフィド結合によって共有結合で連結されている、ＩＬ－２ヘテロ二量体タンパク質が本明細書において提供される。ＩＬ－２融合タンパク質およびヘテロ二量体タンパク質は、集合的にＩＬ－２「融合分子」と称される。これらのＩＬ－２融合分子は、安定性またはインビボ半減期の増加等、ＩＬ－２バリアントタンパク質単独と比較して、向上したまたは付加的な特性を有し得る。別の例において、ＩＬ－２融合分子は、抗体のＦｃ領域、重鎖、または軽鎖に共有結合で連結された、本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントを含む。これらのＩＬ－２バリアント－抗体融合タンパク質は、抗体によって認識される抗原を含有する特異的な細胞タイプまたは組織（例えば、腫瘍細胞）へと標的化され得る。そのため、これらのＩＬ－２バリアント－抗体融合タンパク質は、ＩＬ－２バリアントを所望の細胞タイプまたは組織タイプに送達し得、一方でＩＬ－２バリアントのオフターゲット／周辺曝露、ゆえにＩＬ－２関連毒性を最小限に抑える。
一部の実施形態において、ＩＬ－２融合タンパク質は、抗体とＩＬ－２バリアントとの間にポリペプチドリンカー（例えば、異種または同種配列）を含む。ポリペプチドリンカーは、抗体のアミノ末端、カルボキシル末端、またはアミノおよびカルボキシル末端の両方で接合され得るまたはコンジュゲートされ得る。一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーはグリシン－セリン（ＧＳ）リンカーである。
本明細書において提供されるＩＬ－２融合タンパク質において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ等）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質（例えば、ドメイン抗体）、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に改変された抗体を含めた、要される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置であり得る。抗体は、ネズミ科、ラット、ヒト、または任意の他の起源であり得る（キメラまたはヒト化抗体を含む）。
一部の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４Δｂ Ｓ２２８Ｐ、およびＩｇＧ４Δｃ Ｓ２２８Ｐからなる群から選択されるアイソタイプを有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるＩＬ－２融合タンパク質の抗体はＦｃドメインを含み、そのようなＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４であり得る。
一部の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ２のヒンジ領域における２２３、任意選択により２２５、および２２８位に（例えば、（Ｃ２２３ＥまたはＣ２２３Ｒ）、（Ｅ２２５Ｒ）、および（Ｐ２２８ＥまたはＰ２２８Ｒ））、ならびにＣＨ３領域における４０９または３６８位に（例えば、Ｋ４０９ＲまたはＬ３６８Ｅ（ＥＵ番号付けスキーム））アミノ酸改変を含む。一部の他の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域における２２１および２２８位に（例えば、（Ｄ２２１ＲまたはＤ２２１Ｅ）および（Ｐ２２８ＲまたはＰ２２８Ｅ））、ならびにＣＨ３領域における４０９または３６８位に（例えば、Ｋ４０９ＲまたはＬ３６８Ｅ（ＥＵ番号付けスキーム））アミノ酸改変を含む。さらになお他の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３領域における３４９、３５４、３６６、３６８、および／または４０７位（ＥＵ番号付けスキーム）にアミノ酸改変、例えばＹ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、および／またはＹ４０７Ｖを含む。一部の他の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ４のヒンジ領域における２２８位に（例えば、（Ｓ２２８Ｄ、Ｓ２２８Ｅ、Ｓ２２８Ｒ、またはＳ２２８Ｋ））、およびＣＨ３領域における４０９または３６８位に（例えば、Ｒ４０９Ｋ、Ｒ４０９、またはＬ３６８Ｅ（ＥＵ番号付けスキーム））アミノ酸改変を含む。一部の他の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ２の２６５（例えば、Ｄ２６５Ａ）、３３０（例えば、Ａ３３０Ｓ）、および３３１位（例えば、Ｐ３３１Ｓ）のうちの１つもしくは複数；またはヒトＩｇＧ１の２３４（例えば、Ｌ２３４Ａ）、２３５（例えば、Ｌ２３５Ａ）、および２３７位（例えば、Ｇ２３７Ａ）のうちの１つもしくは複数にアミノ酸改変を含む。一部の他の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ４のアミノ酸改変Ｅ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ４Δｃ）を含む。さらに別の実施形態において、アミノ酸改変は、ヒトＩｇＧ４の欠失Ｇ２３６（ＩｇＧ４Δｂ）を有するＥ２３３Ｐ／Ｆ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａである。
一部の実施形態において、本明細書において提供されるＩＬ－２融合タンパク質における抗体は、ヒトＦｃガンマ受容体への結合アフィニティーの増加または減少を有する改変された定常領域を含み、免疫学的に不活性であるまたは部分的に不活性である、例えば補体媒介性溶解を誘発しない、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない、もしくはミクログリアを活性化しない；または以下のもの：補体媒介性溶解を誘発すること、ＡＤＣＣを刺激すること、もしくはミクログリアを活性化すること、のうちの任意の１つもしくは複数における活性の低下（非改変抗体と比較して）を有する。定常領域の種々の改変を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組み合わせを達成し得る。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９～３２４、１９９５；Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５７：４９６３～９ １５７：４９６３～４９６９、１９９６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４：４１７８～４１８４、２０００；Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５～２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９～７６、１９９８を参照されたい。一部の実施形態において、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３～２６２４；ＰＣＴ公報第ＷＯ９９／０５８５７２号に記載されるように改変される。
一部の実施形態において、抗体定常領域を改変して、Ｆｃガンマ受容体および補体および免疫系との相互作用を回避し得る。そのような抗体の調製のための技法は、ＷＯ９９／５８５７２に記載される。例えば、定常領域を、ヒト定常領域により類似するように操作して、抗体が臨床試験およびヒトにおける治療において使用される場合に、免疫応答を回避し得る。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および第５，８６６，６９２号を参照されたい。
さらになお他の実施形態において、抗体定常領域は、Ｎ－結合型グリコシル化に対してアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）される。一部の実施形態において、定常領域は、定常領域におけるオリゴ糖付着残基および／またはＮ－グリコシル化認識配列の一部である隣接残基を変異させることによって、Ｎ－結合型グリコシル化に対してアグリコシル化される。例えば、Ｎ－グリコシル化部位Ｎ２９７は、例えばＡ、Ｑ、Ｋ、またはＨに変異し得る。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４３：２５９５～２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６３：５９～７６、１９９８を参照されたい。一部の実施形態において、定常領域は、Ｎ－結合型グリコシル化に対してアグリコシル化される。定常領域は、酵素的に（酵素ＰＮＧａｓｅによって糖質を除去する等）またはグリコシル化欠損宿主細胞における発現によって、Ｎ－結合型グリコシル化に対してアグリコシル化され得る。
本明細書において提供されるＩＬ－２融合タンパク質において使用される他の抗体の例は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＩＬ－７Ｒアルファ（ＣＤ１２７）抗体、抗ＩＬ－８抗体、抗ＩＬ－１５抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＣＳＦ１抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＣＤ２００Ｒ抗体、抗ＶＩＳＧ４抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＬＩＬＲｂ２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ２０６抗体、抗ＣＤ１６３抗体、抗ＫＬＲＧ１抗体、抗ＦＬＴ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、ＫＬＲＧ１抗体、抗ＢＴＮ１Ａ１抗体、抗ＵＬ１６結合タンパク質２（ＵＬＢＰ２）抗体、および抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントおよび融合分子は、蛍光分子、放射性分子、または当技術分野において公知の任意の他の標識等の標識剤に連結され得る。シグナルを一般的に提供する（直接的にまたは間接的に）標識は、当技術分野において公知である。
本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントおよび融合分子は、当技術分野において公知の方法によって、例えば合成的にまたは組み換えにより構築され得る。典型的に、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載される組み換え法を使用して、それらをコードするポリヌクレオチドを調製しかつ発現させることによって作製されるが、とはいえそれらは、例えば化学合成を含めた、当技術分野において公知の他の手段によっても調製され得る。
Ｂ－３．ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本開示は、本明細書に記載されるＩＬ－２バリアントタンパク質、ＩＬ－２バリアント融合タンパク質、および他のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。特定の実施形態において、置換Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｔ、Ｋ４３Ｎ、およびＹ４５Ｔを含有するＩＬ－２バリアントをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列：
ＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣＴＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣ（配列番号３２）
を含む、ポリヌクレオチドが本明細書において提供される。
任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有しかつ１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を含む。付加的なコーディングまたはノンコーディング配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが必ずしも存在しなくてもよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るが必ずしも連結されなくてもよい。遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることは当業者によって解されるであろう。同じポリペプチド配列をコードする異なるヌクレオチド配列は、「縮重バリアント」とも称される。
一部の他の実施形態において、本開示は、本明細書において提供されるＩＬ－２バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター等のベクターを提供する。発現ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスに由来するベクター等）、コスミド、およびＰＣＴ公報第ＷＯ８７／０４４６２号に開示される発現ベクターを含む。ベクター構成要素は、以下の構成要素：シグナル配列；複製の起点；１種または複数のマーカー遺伝子；適切な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーター等）のうちの１種または複数を一般的に含む。発現（すなわち、翻訳）に関して、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドン等、１種または複数の翻訳制御エレメントも通常要される。発現ベクターを使用して、対象におけるＩＬ－２バリアントまたはＩＬバリアント融合タンパク質の発現を指揮し得る。当業者であれば、インビボで外因性タンパク質の発現を獲得するための発現ベクターの投与を熟知している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；第６，４１３，９４２号；および第６，３７６，４７１号を参照されたい。発現ベクターの投与は、注射、経口投与、パーティクルガンまたはカテーテル挿入による投与、および局部投与を含めた、局所または全身投与を含む。別の実施形態において、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に、または冠動脈、心房、心室、もしくは心膜内に直接投与される。
本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現し得る任意の宿主細胞は、関心対象の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用され得る。哺乳類宿主細胞の非限定的な例は、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞を含むが、それらに限定されるわけではない。ＰＣＴ公報第ＷＯ８７／０４４６２号も参照されたい。適切な非哺乳類宿主細胞は、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）等）および酵母（Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；またはＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）等）を含む。
Ｂ－４．病態を阻止するまたは治療する組成物および方法
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるＩＬ－２バリアントまたはＩＬ－２バリアント融合分子の有効量を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、抗ＵＬＢＰ２抗体およびヒトＩＬ－２バリアントを含むＩＬ－２バリアント融合タンパク質を含み、ヒトＩＬ－２バリアントは、抗体のＦｃドメインに共有結合で連結されている。一部の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。ＩＬ－２バリアントまたは融合分子を含む医薬組成物における使用のための適切な薬学的に許容できる担体の例は、下で本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物に適切であるものを含む。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるＩＬ－２バリアントまたはＩＬ－２バリアント融合分子を含む組成物（例えば、医薬組成物）の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における癌もしくは腫瘍を治療する方法、腫瘍成長もしくは進行を阻害する方法、または癌細胞の転移を阻害する方法を提供する。
癌は、液性癌または固形癌であり得る。液性癌の例は、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄白血病、および他の造血細胞関連癌を含む。本明細書において提供される方法を用いて治療され得る他の腫瘍または癌の例は、下で記載される本開示によって提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスを用いて治療され得るものを含む。
本明細書に記載されるＩＬ－２バリアントまたはＩＬ－２バリアント融合分子は、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、関節内、舌下に、滑液嚢内、吹送を介した、髄腔内、経口、吸入、または局部経路等、任意の適切な経路を介して対象に投与され得る。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントまたはＩＬ－２バリアント融合分子は、１種または複数の付加的な治療剤との組み合わせで投与される。付加的な治療剤の例は、バイオ治療剤（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、化学療法剤、ワクチン、ＣＡＲ－Ｔ細胞ベースの療法、放射線療法、別のサイトカイン療法（例えば、インターフェロン、インターロイキン、および造血成長因子等、免疫応答を刺激する様々なシグナル伝達タンパク質を含めた免疫刺激性サイトカイン）、他の免疫抑制経路の阻害剤、血管新生の阻害剤、Ｔ細胞活性化因子、代謝経路の阻害剤、ｍＴＯＲ（ラパマイシンのメカニズム的標的）阻害剤（例えば、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムス）、アデノシン経路の阻害剤、インライタ、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）阻害剤（例えば、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、およびスニチニブ）等のチロシンキナーゼ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブおよびダブラフェニブ）、エピジェネティック修飾因子、Ｔｒｅｇ細胞および／または骨髄由来サプレッサー細胞の阻害剤または枯渇因子、ＪＡＫ（ヤヌスキナーゼ）阻害剤（例えば、ルキソリチニブおよびトファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｎｂ）、バリシチニブ（ｖａｒｉｃｉｔｉｎｉｂ）、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、モメロチニブ、パクリチニブ、ならびにウパダシチニブ）、ＳＴＡＴ（シグナル伝達兼転写活性化因子）阻害剤（例えば、フルダラビン等、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、およびＳＴＡＴ５阻害剤）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、免疫原（例えば、弱毒化癌性細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸でパルスされた樹状細胞等の抗原提示細胞）、ＭＥＫ阻害剤（例えば、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、およびセルメチニブ）、ＧＬＳ１阻害剤、ＰＡＰ阻害剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＩＤＯ（インドールアミン－ピロール２，３－ジオキシゲナーゼ）阻害剤、ＰＲＲ（パターン認識受容体）アゴニスト、ならびにＧＭ－ＣＳＦ等であるがそれに限定されない免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞を含む。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントまたはＩＬ－２バリアント融合分子は、例えば抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体；ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、およびササンリマブ（ｓａｓａｎｌｉｍａｂ）等、抗ＰＤ－１アンタゴニスト抗体；例えばイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））等、抗ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト抗体；ＢＭＳ－９８６０１６およびＩＭＰ７０１等、抗ＬＡＧ－３アンタゴニスト抗体；抗ＴＩＭ－３アンタゴニスト抗体；例えばＭＧＡ２７１等、抗Ｂ７－Ｈ３アンタゴニスト抗体；抗ＶＩＳＴＡアンタゴニスト抗体；抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体；抗ＣＤ２８アンタゴニスト抗体；抗ＣＤ８０抗体；抗ＣＤ８６抗体；抗Ｂ７－Ｈ４アンタゴニスト抗体；抗ＩＣＯＳアゴニスト抗体；抗ＣＤ２８アゴニスト抗体；自然免疫応答モジュレーター（例えば、ＴＬＲ、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ）；ＩＤＯ阻害剤；ＰＦ－０５０８２５６６またはウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）等、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト；ＯＸ４０アゴニスト（抗ＯＸ－４０アゴニスト抗体等）；ＧＩＴＲアゴニスト（ＴＲＸ５１８等）；ならびにＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－３３、ＣＳＦ－１、ＭＣＳＦ－１等のサイトカイン（ペグ化または非ペグ化）療法と併せて使用される。
Ｂ－５．本開示の非限定的な実施形態の例
本開示によって提供されるＩＬ－２バリアントに関する本発明の他の実施形態の例は、下の項目に記載される。
項目１．野生型ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトＩＬ－２バリアントであって、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントは、
ａ）Ｋ３５、
ｂ）Ｒ３８およびＬ４０の両方、
ｃ）Ｔ４１およびＫ４３の両方、
ｄ）Ｋ４３およびＹ４５の両方、
ｅ）Ｅ６２およびＫ６４の両方、ならびに
ｆ）Ｌ７２およびＱ７４の両方
からなる群から選択されるアミノ酸位置に１つまたは複数の置換を含む、単離されたヒトＩＬ－２バリアント。
項目２．ａ）Ｋ３５（Ｋ３５置換はＫ３５Ｎである）、
ｂ）Ｒ３８およびＬ４０の両方（Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｌ４０置換はＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔである）、
ｃ）Ｔ４１およびＫ４３の両方（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、
ｄ）Ｋ４３およびＹ４５の両方（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、
ｅ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、ならびに
ｆ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）
からなる群から選択されるアミノ酸位置に１つまたは複数の置換を含む、項目１に記載のＩＬ－２バリアント。
項目３．Ｋ３５位に置換を含み、
ａ）Ｒ３８およびＬ４０の両方（Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｌ４０置換はＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔである）、
ｂ）Ｔ４１およびＫ４３の両方（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、
ｃ）Ｋ４３およびＹ４５の両方（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、
ｄ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
ｅ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
ｆ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目１または２に記載のＩＬ－２バリアント。
項目４．Ｒ３８およびＬ４０位に置換を含み、
ａ）Ｔ４１およびＫ４３の両方（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、
ｂ）Ｋ４３およびＹ４５の両方（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、
ｃ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
ｄ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
ｅ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目１または２に記載のＩＬ－２バリアント。
項目５．Ｔ４１およびＫ４３位に置換を含み、
ａ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
ｂ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
ｃ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目１または２に記載のＩＬ－２バリアント。
項目６．Ｋ４３およびＹ４５位に置換を含み、
ａ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
ｂ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
ｃ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目１または２に記載のＩＬ－２バリアント。
項目７．Ｅ６２およびＫ６４位に置換を含み、Ｌ７２およびＱ７４位に置換をさらに含み、Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである、項目１または２に記載のＩＬ－２バリアント。
項目８．野生型ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）と比較して少なくとも４つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトＩＬ－２バリアントであって、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントは、
ａ）Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５のそれぞれ；または
ｂ）Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４のそれぞれ
からなる群から選択されるアミノ酸位置に置換を含む、単離されたヒトＩＬ－２バリアント。
項目９．アミノ酸位置Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５に置換を含み、Ｒ３８置換はＲ３８Ｎである、項目８に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１０．アミノ酸位置Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５に置換を含み、Ｌ４０置換はＬ４０Ｔである、項目８または９のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１１．Ｋ４３置換はＫ４３Ｎである、項目８から１０のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１２．Ｙ４５置換はＹ４５Ｔである、項目８から１１のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１３．アミノ酸位置Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４に置換を含み、Ｌ７２置換はＬ７２Ｎである、項目８に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１４．アミノ酸位置Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４に置換を含み、Ｑ７４置換はＱ７４Ｔである、項目８または１３のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１５．Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３Ｎである、項目８から１２のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１６．Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｌ７２置換はＬ７２Ｎである、項目８または１１から１４のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１７．アミノ酸置換Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｔ、Ｋ４３Ｎ、およびＹ４５Ｔを含む、項目８から１２のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１８．配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む、項目１７に記載のＩＬ－２バリアント。
項目１９．アミノ酸置換Ｋ４３Ｎ、Ｙ４５Ｔ、Ｌ７２Ｎ、およびＱ７４Ｔを含む、項目８、１１から１４、または１６のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目２０．配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む、項目１９に記載のＩＬ－２バリアント。
項目２１．配列番号３１または３５に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）バリアント。
項目２２．野生型ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）と比較して少なくとも４つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトＩＬ－２バリアントであって、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントは、４つのアミノ酸置換Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｔ、Ｋ４３Ｎ、およびＹ４５Ｔを含む、単離されたヒトＩＬ－２バリアント。
項目２３．野生型ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）と比較して少なくとも４つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトＩＬ－２バリアントであって、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントは、４つのアミノ酸置換Ｋ４３Ｎ、Ｙ４５Ｔ、Ｌ７２Ｎ、およびＱ７４Ｔを含む、単離されたヒトＩＬ－２バリアント。
項目２４．野生型ヒトＩＬ－２と比較して、ヒトＩＬ－２受容体アルファ（ＩＬ－２Ｒα）への結合の低下を有する、項目１から２３のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目２５．導入されたアスパラギン（Ｎ）残基置換上でグリコシル化される、項目１から２４のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目２６．Ｔ３およびＣ１２５位の一方または両方に置換をさらに含む、項目１から２５のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント。
項目２７．Ｔ３およびＣ１２５置換は、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｃ１２５Ａ、およびＣ１２５Ｓからなる群から選択される、項目２６に記載のＩＬ－２バリアント。
項目２８．ａ）項目１から２７のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント；およびｂ）ヒト抗体のＦｃ領域を含む単離された融合タンパク質であって、ＩＬ－２バリアントはＦｃ領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質。
項目２９．ａ）項目２８に記載の単離された融合タンパク質であって、ヒト抗体のＦｃ領域は第１のＦｃ領域である、単離された融合タンパク質；およびｂ）ヒト抗体の第２のＦｃ領域を含むヘテロ二量体タンパク質であって、第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって共有結合で連結されている、ヘテロ二量体タンパク質。
項目３０．第１のＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含んで、ノブまたはホールを形成し、第２のＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含んで、ノブまたはホールを形成し、第１および第２のＦｃ領域の一方はノブを含有し、第１および第２のＦｃ領域の一方はホールを含有する、項目２９に記載のヘテロ二量体タンパク質。
項目３１．ノブを含むＦｃ領域は、変異Ｙ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、ホールを含むＦｃ領域は、変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む、項目３０に記載のヘテロ二量体タンパク質。
項目３２．ａ）項目１から２７のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント；およびｂ）Ｆｃドメインを含む抗体を含む単離された融合タンパク質であって、Ｆｃドメインは第１のＦｃ領域および第２のＦｃ領域を含み、ＩＬ－２バリアントは抗体のＦｃ領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質。
項目３３．Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の減少を有するまたはＡＤＣＣ活性を有しない、項目３２に記載の単離された融合タンパク質。
項目３４．ａ）項目１から２７のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント；およびｂ）Ｆｃドメインを含む抗体を含む単離された融合タンパク質であって、抗体は第１の軽鎖および第２の軽鎖を含み、ＩＬ－２バリアントは抗体の軽鎖に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質。
項目３５．Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインと比較して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の減少を有するまたはＡＤＣＣ活性を有しない、項目３４に記載の単離された融合タンパク質。
項目３６．抗体は腫瘍または免疫細胞に結合する、項目３２から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
項目３７．抗体は、抗Ｂ７Ｈ４抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗Ｂ７Ｈ４／抗ＣＤ２８二重特異性抗体、抗ＥＤＢ１抗体、抗ＵＬＢＰ２抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＩＬ－８抗体、抗ＩＬ－７Ｒアルファ（ＣＤ１２７）抗体、抗ＩＬ１５抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＣＳＦ１抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＣＤ２００Ｒ抗体、抗ＶＩＳＧ４抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＬＩＬＲｂ２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ２０６抗体、抗ＣＤ１６３抗体、抗ＫＬＲＧ１抗体、抗ＦＬＴ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、ＫＬＲＧ１抗体、および抗ＧＩＴＲ抗体からなる群から選択される、項目３２から３６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
項目３８．ＩＬ－２バリアントは、ポリペプチドリンカーおよび／またはポリペプチドタグによって、それぞれＦｃ領域または軽鎖に共有結合で連結されている、項目２８から３７のいずれか一項に記載の単離された融合タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質。
項目３９．項目１から３８のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質を産生する、細胞株。
項目４０．項目１から３８のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質をコードする、単離された核酸。
項目４１．項目４０に記載の核酸を含む、組み換え発現ベクター。
項目４２．項目４０に記載の単離された核酸または項目４１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
項目４３．ＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質の発現に適切な条件下で、項目４２に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、項目１から３８のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質を産生する方法。
項目４４．項目４３に記載の方法に従って産生された、ＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質。
項目４５．項目１から３８のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
項目４６．項目４５に記載の医薬組成物、およびそれを必要とする対象への組成物の投与のための使用説明書を含む、癌の治療のためのキット。
項目４７．項目１から３８または４５のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、それにより疾患と関連した１つまたは複数の症状が対象において改善される、それを必要とする対象における疾患を治療するための方法。
項目４８．疾患は癌である、項目４７に記載の方法。
項目４９．疾患は固形癌である、項目４８に記載の方法。
項目５０．疾患は液性癌である、項目４８に記載の方法。
項目５１．癌は再燃性、難治性、または転移性である、項目４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
項目５２．第２の治療剤の有効量を投与する工程をさらに含み、任意選択により、投与は、別個、逐次的、または同時である、項目４７から５１のいずれか一項に記載の方法。
項目５３．第２の治療剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＩＬ－７Ｒアルファ（ＣＤ１２７）抗体、抗ＩＬ－８抗体、抗ＩＬ－１５抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＣＳＦ１抗体、抗ＩＬ－７Ｒ抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＣＤ２００Ｒ抗体、抗ＶＩＳＧ４抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＬＩＬＲｂ２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ２０６抗体、抗ＣＤ１６３抗体、抗ＫＬＲＧ１抗体、抗ＦＬＴ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、ＫＬＲＧ１抗体、抗ＢＴＮ１Ａ１抗体、および抗ＧＩＴＲ抗体からなる群から選択される抗体である、項目５２に記載の方法。
項目５４．項目１から３８または４５のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、それにより免疫系が対象において刺激される、それを必要とする対象における免疫系を刺激する方法。
項目５５．それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、項目１から３８または４５のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物。
項目５６．疾患は癌であり、任意選択により、癌は固形癌もしくは液性癌であり、かつ／または癌は再燃性、難治性、もしくは転移性である、項目５５に記載の使用のためのＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物。
項目５７．使用は第２の治療剤との組み合わせであり、任意選択により、組み合わせは同時の、並行した、または同時の投与のためのものである、項目５５または５６のいずれか一項に記載の使用のためのＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物。
項目５８．それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための医薬の製造における使用のための、項目１から３８または４５のいずれか一項に記載のＩＬ－２バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物。
Ｃ．組み換え腫瘍溶解性ウイルスおよび関連する態様
Ｃ－１．組み換え腫瘍溶解性ウイルス
一部の他の態様において、本開示は、ヒトＩＬ－２バリアントのＩＬ－２ｇｖ１またはＩＬ－２ｇｖ２等、上で本明細書に記載されるＩＬ－２バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列（導入遺伝子）を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。ウイルスは、アデノウイルス、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスまたはレオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、およびこれらのより大きな群の内の任意の種または系統を含めた、当技術分野において公知の多様な腫瘍溶解性ウイルスから構築され得る。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは複製能を有する。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは複製能を有しない。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルスである。特定の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、組み換えワクシニアウイルスコペンハーゲン系統である。
一部の実施形態において、ＩＬ－２バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスゲノム、タンパク質、またはウイルスの他の構成要素への１つまたは複数の改変または変異をさらに含み、それは、腫瘍選択性の増加もしくは向上、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）の産生の増強、子孫ビリオンの拡散の増強、安全性およびＰＥＴ－ＣＴイメージングの向上、または抗腫瘍免疫応答の増強等、ウイルスの１種または複数の望ましい抗腫瘍特性を増加させるまたは増強する。
ウイルスゲノムへの特異的な改変または変異の例は、下で本明細書に詳細に記載される。
Ｃ－１Ａ．ＩＬ－２バリアント
上で記載されるように、組み換えＶＶ等、本開示によって提供される組み換えＯＶは、上で本明細書に記載されるＩＬ－２バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、組み換えＯＶは、ヒトＩＬ－２ポリペプチドもしくはネズミ科ＩＬ－２ポリペプチド等の野生型ＩＬ－２ポリペプチド、またはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。野生型ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）ポリペプチドの成熟形態のアミノ酸配列は、配列番号１に明記される。野生型ｈＩＬ－２ポリペプチドの全長の前駆体形態のアミノ酸配列は、配列番号２１に明記される。野生型ｈＩＬ－２ポリペプチドの前駆体形態は、シグナルペプチド（例えば、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２２））を含む。野生型マウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２）ポリペプチドの成熟形態のアミノ酸配列は、配列番号２３に明記される。マウス野生型ＩＬ－２ポリペプチドの前駆体形態のアミノ酸配列は、配列番号２４に明記される。
一部の実施形態において、バリアントインターロイキン－２（ＩＬ－２ｖ）ポリペプチドは、野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体アルファ（「ＩＬ－２Ｒａ」／ＣＤ２５）への結合の減少、または高アフィニティー三量体ＩＬ－２受容体複合体（ＩＬ－２Ｒａ＋ＩＬ－２Ｒｂ＋ＩＬ－２Ｒｇを含有する）への結合の減少を有するが、中アフィニティー二量体ＩＬ－２受容体複合体（ＩＬ－２Ｒｂ＋ＩＬ－２Ｒｇを含有する）に結合する能力を保持する。
一部の他の実施形態において、ＩＬ－２ｖポリペプチドは、組み換えＯＶを投与されている対象において発現した場合、毒性の低下、免疫抑制Ｔ調節性細胞（Ｔ－ｒｅｇ細胞）の刺激の低下、または免疫抑制活性の別様の低下を有する。
ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組み換えＯＶのゲノムに存在し、「導入遺伝子」と称され得る。ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、野生型ワクシニアウイルスに天然には存在せず、ゆえに野生型ワクシニアウイルスに対して異種である。ゆえに、ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、バリアントＩＬ－２ポリペプチドをコードする「異種ヌクレオチド配列」または「挿入されたヌクレオチド配列」と称され得る。
一部の場合において、本開示の組み換えＯＶによってコードされるＩＬ－２ｖポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較した場合、望ましくない生物学的活性の低下を提供する。一部の場合において、望ましくない生物学的活性の低下は、野生型ＩＬ－２と比較した場合の、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞におけるｐＳＴＡＴ５レベルの増加を誘導することにおける効力を測定することによって判定される。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドは、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞におけるｐＳＴＡＴ５レベルの増加を誘導することにおいて、野生型ＩＬ－２と比較した場合、濃度効力の低下を提供する。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドは、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞におけるｐＳＴＡＴ５レベルの増加を誘導することにおいて、野生型ＩＬ－２と比較した場合、少なくとも１、少なくとも２、または少なくとも３対数の濃度効力の低下を提供する。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドは、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞におけるｐＳＴＡＴ５レベルの増加を誘導することにおいて、野生型ＩＬ－２と比較した場合、約１、約２、または約３対数の濃度効力の低下を提供する。一部の場合において、望ましくない生物学的活性の低下は、実施例９に開示されるように、野生型ＩＬ－２と比較した場合の、組み換えワクシニアウイルスによってコードされるＩＬ－２ｖポリペプチドを用いた処理後の炎症促進性サイトカインレベルを測定することによって判定される。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較した場合、炎症促進性サイトカインレベルの低下を提供する（例えば、実施例９に開示される試験を使用して）。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較した場合、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％の、炎症促進性サイトカインレベルの低下を提供する。
一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、シグナルペプチド（例えば、ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２２））を含むＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ゆえに、例えば、一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号２１（ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ）に描写されるＩＬ－２アミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号２１に描写されるアミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくＩＬ－２のＦ６２、Ｙ６５、およびＬ９２のうちの１つまたは複数の置換を含むＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。解されるであろうように、配列番号２１に描写されるＩＬ－２アミノ酸配列のＦ６２、Ｙ６５、およびＬ９２は、配列番号１に描写されるアミノ酸配列のＦ４２、Ｙ４５、およびＬ７２に対応する。
他の適切なＩＬ－２ｖポリペプチドは、例えば、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつＦ７６Ａ、Ｙ７９Ａ、およびＬ１０６Ｇ置換を含む（すなわち、Ａｌａ－７６、Ａｌａ－７９、およびＧｌｙ－１０６を含む）アミノ酸配列を含む、マウスＩＬ－２ｖポリペプチドを含む。配列番号３のＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２に明記される。
一部の場合において、マウスＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルス用にコドン最適化される。ワクシニアウイルス用にコドン最適化されている、マウスＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号１９に明記される。
他の適切なＩＬ－２ｖポリペプチドは、例えば、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつＦ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、およびＬ９２Ｇ置換を含む（すなわち、Ａｌａ－６２、Ａｌａ－６５、およびＧｌｙ－９２を含む）アミノ酸配列を含む、ヒトＩＬ－２ｖポリペプチドを含む。
ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列の例は、例えば、ヒトＩＬ－２ｖポリペプチドをコードし、かつ配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コードされたＩＬ－２ｖポリペプチドは、Ｆ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、およびＬ９２Ｇ置換を含む（すなわち、Ａｌａ－６２、Ａｌａ－６５、およびＧｌｙ－９２を含む）。ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列の他の例は、例えば、ヒトＩＬ－２ｖポリペプチドをコードし、かつ配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コードされたＩＬ－２ｖポリペプチドは、Ｆ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、およびＬ９２Ｇ置換を含む（すなわち、Ａｌａ－６２、Ａｌａ－６５、およびＧｌｙ－９２を含む）。
他の適切なＩＬ－２ｖポリペプチドは、例えば、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇ置換を含む（すなわち、Ａｌａ－４２、Ａｌａ－４５、およびＧｌｙ－７２を含む）アミノ酸配列を含む、ヒトＩＬ－２ｖポリペプチドを含む。
ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列の例は、例えば、ヒトＩＬ－２ｖポリペプチドをコードし、かつ配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コードされたＩＬ－２ｖポリペプチドは、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇ置換を含む（すなわち、Ａｌａ－４２、Ａｌａ－４５、およびＧｌｙ－７２を含む）。ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列の他の例は、例えば、ヒトＩＬ－２ｖポリペプチドをコードし、かつ配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コードされたＩＬ－２ｖポリペプチドは、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇ置換を含む（すなわち、Ａｌａ－４２、Ａｌａ－４５、およびＧｌｙ－７２を含む）。
一部の実施形態において、本開示の組み換えＯＶは、ヒト成熟形態ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含み、ヒトＩＬ－２ｖポリペプチドは、配列番号１に描写されるＩＬ－２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくＫ３５、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｌ７２、およびＱ７４からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態において、本開示によって提供される組み換えＯＶは、以下の位置：Ｔ３、Ｋ３５、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｙ６５、Ｌ７２、Ｑ７４、およびＣ１２５に、配列番号１のヒトＩＬ－２タンパク質配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換を含むヒトＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。一部の他の実施形態において、ＩＬ－２ｖは、以下の群の位置：Ｒ３８およびＬ４０；Ｔ４１およびＫ４３；Ｋ４３およびＹ４５；Ｅ６２およびＫ６４；Ｌ７２およびＱ７４；Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５；Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４；Ｔ３、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５；Ｔ３、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４；Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、Ｙ４５、およびＣ１２５；Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、Ｑ７４、およびＣ１２５；Ｔ３、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、Ｙ４５、およびＣ１２５；Ｔ３、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、Ｑ７４、およびＣ１２５のうちの１つまたは複数にアミノ酸置換を含む。所与のアミノ酸位置における置換の例は、Ｔ３Ａ、Ｋ３５Ｎ、Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｓ、Ｌ４０Ｔ、Ｔ４１Ｎ、Ｋ４３Ｓ、Ｋ４３Ｔ、Ｋ４３Ｎ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｅ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、Ｅ６２Ｒ、Ｋ６４Ｓ、Ｋ６４Ｔ、Ｌ７２Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｑ７４Ｔ、Ｃ１２５Ａ、およびＣ１２５Ｓを含む。
一部の特定の実施形態において、組み換えＯＶによってコードされるＩＬ－２ｖポリペプチドは、野生型ヒトＩＬ－２と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、野生型ヒトＩＬ－２は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、ＩＬ－２バリアントは、
ａ）Ｋ３５（Ｋ３５置換はＫ３５Ｎである）、
ｂ）Ｒ３８およびＬ４０（Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｌ４０置換はＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔである）、
ｃ）Ｔ４１およびＫ４３（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、
ｄ）Ｋ４３およびＹ４５（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、
ｅ）Ｅ６２およびＫ６４（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、ならびに
ｆ）Ｌ７２およびＱ７４（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）
からなる群から選択される置換を含み、番号付けは配列番号１のアミノ酸配列に基づく。
一部の他の特定の実施形態において、ＩＬ－２ｖはＫ３５位に置換を含み、
ａ）Ｒ３８およびＬ４０（Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｌ４０置換はＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔである）、
ｂ）Ｔ４１およびＫ４３（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、
ｃ）Ｋ４３およびＹ４５（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、
ｄ）Ｅ６２およびＫ６４（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
ｅ）Ｌ７２およびＱ７４（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
ｆ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。
さらになお他の特定の実施形態において、ＩＬ－２バリアントはＴ４１およびＫ４３位に置換を含み、
ａ）Ｅ６２およびＫ６４（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
ｂ）Ｌ７２およびＱ７４（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
ｃ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。
一部のさらなる特定の実施形態において、ＩＬ－２バリアントはＫ４３ＮおよびＹ４５Ｔを含み、
ａ）Ｅ６２ＮおよびＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔ、
ｂ）Ｌ７２ＮおよびＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔ、
ｃ）Ｅ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒ；
ｅ）Ｒ３８ＮおよびＬ４０Ｔ；ならびに
ｆ）Ｌ７２ＮおよびＱ７４Ｔ
からなる群から選択される置換をさらに含む。
一部の特定の実施形態において、組み換えＯＶは、
ａ）配列番号２９（ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＮＭＴＴＦＮＦＴＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換Ｒ５８Ｎ、Ｌ６０Ｔ、Ｋ６３Ｎ、およびＹ６５Ｔを含むアミノ酸配列；ならびに
ｂ）配列番号３１（ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＮＭＴＴＦＮＦＴＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｔ、Ｋ４３Ｎ、およびＹ４５Ｔを含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、挿入されたヌクレオチド配列は、配列番号２９または配列番号３１のアミノ酸配列を含むＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする。
一部の他の特定の実施形態において、組み換えＯＶは、
ａ）配列番号３３（ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＮＦＴＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＮＡＴＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換Ｋ６３Ｎ、Ｙ６５Ｔ、Ｌ９２Ｎ、およびＱ９４Ｔを含むアミノ酸配列；ならびに
ｂ）配列番号３５（ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＮＦＴＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＮＡＴＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ）のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換Ｋ４３Ｎ、Ｙ４５Ｔ、Ｌ７２Ｎ、およびＱ７４Ｔを含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入された核酸は、配列番号３０（ＡＴＧＴＡＴＣＧＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＡＧＣＴＴＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣＴＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣ）もしくは配列番号３２（ＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣＴＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＴＴＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣ）のヌクレオチド配列、または配列番号３０もしくは配列番号３２のヌクレオチド配列の縮重バリアントを含む。
別の特定の実施形態において、ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入された核酸は、配列番号３４（ＡＴＧＴＡＴＣＧＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＴＣＧＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＡＧＣＴＴＴＡＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣＴＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣ）もしくは配列番号３６（ＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣＴＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＧＴＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣ）のヌクレオチド配列、または配列番号３４もしくは配列番号３６のヌクレオチド配列の縮重バリアントを含む。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする相同組み換えドナーフラグメントを含み、相同組み換えドナーフラグメントは、配列番号４（ＶＶ２７／ＶＶ３８相同組み換えドナーフラグメント）、配列番号５（ＶＶ３９相同組み換えドナーフラグメント）、配列番号１５（ｈＩＬ－２ｖ（ヒトコドン最適化された）を含有するＶＶ７５相同組み換えドナーフラグメント）、配列番号１６（ｈＩＬ－２ｖ（ヒトコドン最適化された）を含有するコペンハーゲンＪ２Ｒ相同組み換えプラスミド）、配列番号１７（ｈＩＬ－２ｖ（ワクシニアウイルスコドン最適化された）を含有する相同組み換えドナーフラグメント）、配列番号１８（ｈＩＬ－２ｖ（ワクシニアウイルスコドン最適化された）を含有するコペンハーゲンＪ２Ｒ相同組み換えプラスミド）、および配列番号２０（マウスＩＬ－２バリアント（ワクシニアウイルスコドン最適化された）相同組み換えドナーフラグメント）のいずれか１つに明記されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号６（コペンハーゲンＪ２Ｒ相同組み換えプラスミド）に明記されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号７（マウスＩＬ－２バリアント（ｍＩＬ－２ｖ）ポリペプチドを含有するコペンハーゲンＪ２Ｒ相同組み換えプラスミド）に明記されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号８（ｍＩＬ－２ｖを含有するウェスタンリザーブＪ２Ｒ相同組み換えプラスミド）に明記されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の具体的な場合において、本開示の組み換えＶＶは、ＶＶ２７（Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１ＥおよびｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子を含有するコペンハーゲンワクシニア）である。一部の場合において、組み換えＶＶは、ｍＩＬ－２ｖポリペプチドの代わりに、上で記載されるヒトＩＬ－２バリアント（ｈＩＬ－２ｖ）ポリペプチドを含む。
一部の具体的な場合において、本開示の組み換えＯＶは、ＶＶ３８（ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子を含有するコペンハーゲンワクシニア）である。一部の場合において、組み換えＶＶは、ｍＩＬ－２ｖポリペプチドの代わりに、上で記載されるヒトＩＬ－２バリアント（ｈＩＬ－２ｖ）ポリペプチドを含む。
一部の具体的な場合において、本開示の組み換えＯＶは、ＶＶ３９（ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子を含有するウェスタンリザーブワクシニア）である。一部の場合において、組み換えＶＶは、ｍＩＬ－２ｖポリペプチドの代わりに、上で記載されるヒトＩＬ－２バリアント（ｈＩＬ－２ｖ）ポリペプチドを含む。
一部の他の具体的な実施形態において、本開示の組み換えＯＶは、実施例に記載されるようにＶＶ９７、ＶＶ９８、ＶＶ１１０、またはＶＶ１１７である。
Ｃ－１Ｂ．異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチド
一部の実施形態において、上で本明細書に記載されるＩＬ－２バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、異種ＴＫポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスＴＫ（ＨＳＶ－ＴＫ）ポリペプチドのバリアントである。野生型ＨＳＶ－ＴＫのバリアントは、本明細書において「ＨＳＶ－ＴＫｖ」とも称される。ＨＳＶ－ＴＫｖは、一部の場合において、Ｉ型ＴＫポリペプチド、すなわちデオキシグアノシン（ｄＧ）のリン酸化を触媒してそれぞれｄＧ一リン酸を生成し得るＴＫポリペプチドである。
一部の場合において、ＨＳＶ－ＴＫｖをコードするヌクレオチド配列等、異種ＴＫをコードするヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスＴＫをコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部に取って代わる。野生型ワクシニアウイルスにおいて、Ｊ２Ｒ領域はワクシニアウイルスＴＫをコードする。例えば、一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスのＪ２Ｒ領域の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または１００％に取って代わる。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、内因性（ワクシニアウイルスによってコードされる）ＴＫをコードする遺伝子の転写が低下するまたは排除されるような改変を含む。例えば、一部の場合において、内因性（ワクシニアウイルスによってコードされる）ＴＫをコードする遺伝子の転写は、改変なしの内因性（ワクシニアウイルスによってコードされる）ＴＫをコードする遺伝子の転写と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９０％を上回る割合低下する。
一部の場合において、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製は、野生型ＨＳＶ－ＴＫポリペプチドをコードする複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製が阻害される濃度よりも低い濃度のガンシクロビルで阻害される。例えば、野生型ＨＳＶ－ＴＫのバリアントをコードする本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製が、最大の５０％阻害されるガンシクロビル阻害濃度（ＩＣ５０）は、野生型ＨＳＶ－ＴＫポリペプチドをコードする複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製の阻害に対するガンシクロビルＩＣ５０よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％低い。
一部の実施形態において、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに存在するヌクレオチド配列によってコードされる異種ＴＫポリペプチドは、野生型ＨＳＶ－ＴＫのバリアントであり、ＴＫｖポリペプチドは、野生型ＨＳＶ－ＴＫ（配列番号２５）と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに存在するヌクレオチド配列によってコードされるＨＳＶ－ＴＫｖポリペプチドは、野生型ＨＳＶ－ＴＫと比べて１～４０個のアミノ酸置換を含む。例えば、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに存在するヌクレオチド配列によってコードされるＴＫｖポリペプチドは、野生型ＨＳＶ－ＴＫ（配列番号２５）と比べて１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、または３５～４０個のアミノ酸置換を含む。
一部の特定の実施形態において、本開示の組み換えワクシニアウイルスに存在する異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２５
Figure 2023533567000001
 の野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２５と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列（配列番号２５に明記される）と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、Ｌ１５９、Ｉ１６０、Ｆ１６１、Ａ１６８、およびＬ１６９のうちの１つまたは複数の置換を含む。
一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２５に明記される野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ｌ１５９に置換を有する、すなわちアミノ酸１５９はＬｅｕ以外である。例えば、アミノ酸１５９は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。一部の場合において、置換はＬ１５９Ｉ置換である。一部の場合において、置換はＬ１５９Ａ置換である。一部の場合において、置換はＬ１５９Ｖ置換である。
一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２５に明記される野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ｉ１６０に置換を有する、すなわちアミノ酸１６０はＩｌｅ以外である。例えば、アミノ酸１６０は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。一部の場合において、置換はＩ１６０Ｌ置換である。一部の場合において、置換はＩ１６０Ｖ置換である。一部の場合において、置換はＩ１６０Ａ置換である。一部の場合において、置換はＩ１６０Ｆ置換である。一部の場合において、置換はＩ１６０Ｙ置換である。一部の場合において、置換はＩ１６０Ｗ置換である。
一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２５に明記される野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ｆ１６１に置換を有する、すなわちアミノ酸１６１はＰｈｅ以外である。例えば、アミノ酸１６１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。一部の場合において、置換はＦ１６１Ａ置換である。一部の場合において、置換はＦ１６１Ｌ置換である。一部の場合において、置換はＦ１６１Ｖ置換である。一部の場合において、置換はＦ１６１Ｉ置換である。
一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２５に明記される野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ａ１６８に置換を有する、すなわちアミノ酸１６８はＡｌａ以外である。例えば、アミノ酸１６８は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。一部の場合において、置換はＡ１６８Ｈである。一部の場合において、置換はＡ１６８Ｒである。一部の場合において、置換はＡ１６８Ｋである。一部の場合において、置換はＡ１６８Ｙである。一部の場合において、置換はＡ１６８Ｆである。一部の場合において、置換はＡ１６８Ｗである。一部の場合において、ＴＫｖポリペプチドは、Ａ１６８の置換以外の任意の他の置換を含まない。
一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２５に明記される野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、Ｌ１６９に置換を有する、すなわちアミノ酸１６９はＬｅｕ以外である。例えば、アミノ酸１６９は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。一部の場合において、置換はＬ１６９Ｆである。一部の場合において、置換はＬ１６９Ｍである。一部の場合において、置換はＬ１６９Ｙである。一部の場合において、置換はＬ１６９Ｗである。
一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２５に明記される野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉ）アミノ酸１５９はＬｅｕ以外であり；ｉｉ）アミノ酸１６０はＩｌｅ以外であり；ｉｉｉ）アミノ酸１６１はＰｈｅ以外であり；ｉｖ）アミノ酸１６８はＡｌａ以外であり；かつｖ）アミノ酸１６９はＬｅｕ以外である。一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023533567000002
 （式中、アミノ酸１５９はＩｌｅであり、アミノ酸１６０はＬｅｕであり、アミノ酸１６１はＡｌａであり、アミノ酸１６８はＴｙｒであり、かつアミノ酸１６９はＰｈｅである）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２５に明記される野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ｉ）アミノ酸１５９はＬｅｕ以外であり；ｉｉ）アミノ酸１６０はＩｌｅ以外であり；ｉｉｉ）アミノ酸１６１はＰｈｅ以外であり；ｉｖ）アミノ酸１６８はＡｌａ以外であり；かつｖ）アミノ酸１６９はＬｅｕ以外である。一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023533567000003
 （式中、アミノ酸１５９はＩｌｅであり、アミノ酸１６０はＰｈｅであり、アミノ酸１６１はＬｅｕであり、アミノ酸１６８はＰｈｅであり、かつアミノ酸１６９はＭｅｔである）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２５に明記される野生型ＨＳＶ－ＴＫアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸１６８はＡｌａ以外であり、例えばアミノ酸１６８は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕである。一部の場合において、アミノ酸１６８はＨｉｓである。一部の場合において、アミノ酸１６８はＡｒｇである。一部の場合において、アミノ酸１６８はＬｙｓである。一部の場合において、異種ＴＫポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
Figure 2023533567000004
 （式中、アミノ酸１６８はＨｉｓである）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
アミノ酸１６８がＨｉｓである配列番号２８の異種ＴＫポリペプチドは、本開示において「ＴＫ．００７」または「ＨＳＶ－ＴＫ．００７」とも称される。
Ｃ－１Ｃ．他の挿入、欠失、または変異
ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列、および上で本明細書に記載される異種ＴＫをコードする挿入されたヌクレオチド配列に加えて、本開示によって提供される組み換えワクシニアウイルスは、特異的タンパク質の機能を欠損した状態にする、特異的遺伝子もしくはタンパク質の発現を抑制するもしくは増強する、または外因性タンパク質を発現させる改変等、腫瘍溶解性ウイルスとしてのその望ましい特性を増加させるまたは増強するさらなる改変を含み得る。
一部の実施形態において、本開示によって提供される組み換えワクシニアウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍選択性を増加させる１つまたは複数の改変をさらに含む。本明細書において使用するとき、「腫瘍選択性」とは、正常細胞（例えば、非腫瘍細胞）へのものよりも高い、腫瘍細胞への毒性（例えば、腫瘍溶解性）を意味する。そのような改変の例は、（１）ワクシニア成長因子（ＶＧＦ）の機能においてウイルスを欠損した状態にする改変（ＭｃＣａｒｔら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：８７５１）；（２）ワクシニアウイルスＴＫ遺伝子、ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子、もしくはＦ３遺伝子、または中断されたＦ３遺伝子座への改変（ＷＯ２００５／０４７４５８）；（３）ＶＧＦおよびＯ１Ｌの機能においてワクシニアウイルスを欠損した状態にする改変（ＷＯ２０１５／０７６４２２）；（４）Ｂ５Ｒ遺伝子の３’ノンコーディング領域への、癌細胞において発現が減少するマイクロＲＮＡの挿入（ＷＯ２０１１／１２５４６９）；（５）Ｂ１８Ｒ（Ｋｉｒｎら（２００７）ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４：ｅ３５３）、リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｇａｍｍｏｎら（２０１０）ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ６：ｅ１０００９８４）、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＳＰＩ－１、ＳＰＩ－２）（Ｇｕｏら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６５：９９９１）、ＳＰＩ－１およびＳＰＩ－２（Ｙａｎｇら（２００７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １４：６３８）、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子Ｆ４ＬもしくはＩ４Ｌ（Ｃｈｉｌｄら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４：６２５；Ｐｏｔｔｓら（２０１７）ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：６３８）、Ｂ１８Ｒ（コペンハーゲン系統におけるＢ１９Ｒ）（Ｓｙｍｏｎｓら（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１：５５１）、Ａ４８Ｒ（Ｈｕｇｈｅｓら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２０１０３）；Ｂ８Ｒ（Ｖｅｒａｒｄｉら（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１）、Ｂ１５Ｒ（コペンハーゲン系統におけるＢ１６Ｒ）（Ｓｐｒｉｇｇｓら（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：１４５）、Ａ４１Ｒ（Ｎｇら（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２：２０９５）、Ａ５２Ｒ（Ｂｏｗｉｅら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０１６２）、Ｆ１Ｌ（Ｇｅｒｌｉｃら（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０：７８０８）、Ｅ３Ｌ（Ｃｈａｎｇら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４８２５）、Ａ４４Ｒ－Ａ４６Ｒ（Ｂｏｗｉｅら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０１６２）、Ｋ１Ｌ（Ｂｒａｖｏ Ｃｒｕｚら（２０１７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９１：ｅ００５２４）、Ａ４８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、Ｃ１１Ｒ、およびＴＫ（Ｍｅｊｉａｓ－Ｐｅｒｅｚら（２０１７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ８：２７）、Ｅ３ＬおよびＫ３Ｌ領域（ＷＯ２００５／００７８２４）、またはＯ１Ｌ（Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒら（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：２３２３）の機能においてワクシニアウイルスを欠損した状態にする改変を含む。さらに、組み換えワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスを、Ｂ５Ｒの細胞外領域において欠損した状態にする（Ｂｅｌｌら（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３２５：４２５）、Ａ３４Ｒ領域において欠損した状態にする（Ｔｈｉｒｕｎａｖｕｋａｒａｓｕら（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１：１０２４）、またはインターロイキン－１μ（ＩＬ－１μ）受容体において欠損した状態にする（ＷＯ２００５／０３０９７１）改変を含み得る。さらに、そのような遺伝子改変の２つ以上の組み合わせを有するワクシニアウイルスが、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにおいて使用され得る。外来遺伝子のそのような挿入、またはワクシニアウイルスゲノム上の遺伝子の欠失もしくは変異は、例えば公知の相同組み換えまたは部位指向性変異導入によって行われ得る。
本明細書において使用するとき、「欠損した」または「欠損」という用語は、この用語によって指定される遺伝子領域またはタンパク質が機能の低下を有するまたは機能を有しないことを意味する。組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが所与のワクシニアウイルス遺伝子において「欠損した」状態にされる改変を含む、本開示の組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ遺伝子産物；ポリペプチド遺伝子産物）の産生および／または活性の低下を呈し；例えば、遺伝子産物の量および／または活性は、野生型ワクシニアウイルスによってまたは遺伝子変更を含まない対照ワクシニアウイルスによって産生される同じ遺伝子産物の量および／または活性の７５％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満である。
遺伝子またはタンパク質を欠損した状態にし得る改変は、ｉ）この用語によって指定される遺伝子領域の変異（例えば、置換、逆位等）および／またはトランケーションおよび／または欠失；ｉｉ）遺伝子領域の発現を制御するプロモーター領域の変異および／またはトランケーションおよび／または欠失；ならびにｉｉｉ）遺伝子領域によってコードされるポリペプチドの翻訳が低下するまたは排除されるような、ポリアデニル化配列の変異および／またはトランケーションおよび／または欠失を含むがそれらに限定されるわけではない。そのような改変の例は、指定された遺伝子領域からなる領域における欠失または指定された遺伝子領域を含む近隣遺伝子領域における欠失；欠損をもたらし得る、遺伝子領域の転写を低下させる、プロモーター領域の変異および／またはトランケーションおよび／または欠失；遺伝子領域によってコードされるポリペプチドの翻訳が低下するまたは排除されるような、転写終結エレメントの組み入れ；遺伝子領域の転写を低下させるまたは排除する、遺伝子編集酵素または遺伝子編集複合体（例えば、ガイドＲＮＡと複合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクターポリペプチド）の使用によるもの；遺伝子領域の転写を低下させるまたは排除する、競合リバースプロモーター／ポリメラーゼ占有率の使用によるもの；ならびに、それによって遺伝子領域をノックアウトする、遺伝子領域への核酸の挿入を含む。
一部の具体的な実施形態において、ワクシニアウイルス等の本開示の組み換えウイルスは、上で本明細書において提供されるＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含み、ウイルスは、ウイルスの内因性チミジンキナーゼ（ＴＫ）活性を欠如する。本明細書において使用するとき、「内因性」という用語は、ウイルス等の生物またはその細胞内に天然に存在するまたは天然に発現される、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質等の任意の材料を指す。ワクシニアウイルスＴＫは、ワクシニアウイルスゲノム上のＴＫ遺伝子およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ｊ２Ｒによってコードされる。内因性ＴＫ活性を欠如するウイルスは、「チミジンキナーゼ欠損」または「ＴＫ欠損」と称され得る。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスがＴＫ欠損であるような、ワクシニアウイルスＴＫコーディング領域のすべてまたは一部分の欠失を含む。例えば、一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはＪ２Ｒ欠失を含む。例えば、Ｍｅｊｉａ－Ｐｅｒｅｚら（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ８：２７を参照されたい。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはＪ２Ｒ領域への挿入を含み、それによって、ワクシニアウイルスＴＫ活性の低下または活性なしをもたらす。一部の他の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスＴＫ遺伝子欠損でもありＢ１６Ｒ遺伝子欠損でもある。
一部の他の実施形態において、本開示によって提供される複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、子孫ビリオンの拡散を増強する改変をさらに含む。特定の実施形態において、本開示は、上で本明細書において提供されるＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、ウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子はＫ１５１Ｅ置換を含む（すなわち、コードされたポリペプチドにおいてＫ１５１Ｅ置換を提供する改変を含む）、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。例えば、Ｂｌａｓｃｏら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（６）：３３１９～３３２５；およびＴｈｉｒｕｎａｖｕｋａｒａｓｕら（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１：１０２４を参照されたい。Ａ３４Ｒ遺伝子は、ワクシニアウイルスｇｐ２２～２４（タンパク質Ａ３４としても知られる）をコードする。Ａ３４Ｒ遺伝子は、ウイルスコートタンパク質（Ａ３４タンパク質）をコードする。ワクシニアウイルス系統コペンハーゲンのＡ３４タンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２１０５７（Ｑ３４＿ＶＡＣＣＣ））において入手可能であり、それは１６８個のアミノ酸からなる。Ｋ１５１Ｅ置換を含むＡ３４タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３８に明記される（ＭＫＳＬＮＲＱＴＶＳＭＦＫＫＬＳＶＰＡＡＩＭＭＩＬＳＴＩＩＳＧＩＧＴＦＬＨＹＫＥＥＬＭＰＳＡＣＡＮＧＷＩＱＹＤＫＨＣＹＬＤＴＮＩＫＭＳＴＤＮＡＶＹＱＣＲＫＬＲＡＲＬＰＲＰＤＴＲＨＬＲＶＬＦＳＩＦＹＫＤＹＷＶＳＬＫＫＴＮＮＫＷＬＤＩＮＮＤＫＤＩＤＩＳＫＬＴＮＦＫＱＬＮＳＴＴＤＡＥＡＣＹＩＹＫＳＧＫＬＶＥＴＶＣＫＳＴＱＳＶＬＣＶＫＫＦＹＫ）。Ｋ１５１Ｅ変異を含むＡ３４タンパク質をコードするＡ３４Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３９に明記される（ＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴＴＡＡＴＡＧＡＣＡＡＡＣＴＧＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＴＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＧＧＴＧＣＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＣＴＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＧＴＧＧＣＡＴＡＧＧＡＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＧＡＴＧＣＣＴＡＧＴＧＣＴＴＧＣＧＣＣＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＡＴＡＣＧＡＴＡＡＡＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＴＡＡＡＡＴＧＴＣＣＡＣＡＧＡＴＡＡＴＧＣＧＧＴＴＴＡＴＣＡＧＴＧＴＣＧＴＡＡＡＴＴＡＣＧＡＧＣＴＡＧＡＴＴＧＣＣＴＡＧＡＣＣＴＧＡＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＡＴＴＧＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＧＧＧＴＡＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＧＴＴＡＧＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＡＧＡＴＡＴＡＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＣＴＡＡＡＣＡＧＴＡＣＧＡＣＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＧＴＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＣＡＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＡＡＣＡＧＴＡＴＧＴＡＡＡＡＧＴＡＣＴＣＡＡＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＧＴＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＡＡＧＴＧＡ）（野生型遺伝子配列と比べてＡ４１５Ｇ変異を含有する）。
一部の他の実施形態において、本開示によって提供される組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、（１）ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列；（２）異種ＴＫポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列；および（３）Ａ３４Ｒ遺伝子におけるＫ１５１Ｅ置換を含み、組み換えワクシニアウイルスはＴＫ欠損である。一部の特定の実施形態において、組み換えワクシニアウイルスによってコードされるＩＬ－２ｖポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換Ｒ５８Ｎ、Ｌ６０Ｔ、Ｋ６３Ｎ、およびＹ６５Ｔを含み、アミノ酸番号付けは配列番号２９のアミノ酸配列に基づく。一部のさらなる特定の実施形態において、異種ＴＫポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸１６８はＨｉｓである。特定の実施形態において、本開示によって提供される組み換えワクシニアウイルスは、（１）ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列；（２）異種ＴＫポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列；および（３）Ａ３４Ｒ遺伝子におけるＫ１５１Ｅ置換を含み、組み換えワクシニアウイルスは系統コペンハーゲンでありかつＴＫ欠損であり、ＩＬ－２ｖポリペプチドは配列番号２９のアミノ酸配列を含み、異種ＴＫポリペプチドは配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
Ｃ－２．組み換え腫瘍溶解性ウイルスの構築
本開示によって提供される複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、当技術分野において公知の方法によって構築され得る。具体的には、本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、現在既知であるまたは将来発見されるにかかわらず、ワクシニアウイルスの多様な系統のいずれかから構築され得る。使用に適切なワクシニアウイルスの系統は、リスター、ニューヨーク市衛生局（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＹＢＨ）、ワイエス（Ｗｙｅｔｈ）、コペンハーゲン、ウェスタンリザーブ（ＷＲ）、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、ＥＭ６３、イケダ、ダリアン（Ｄａｌｉａｎ）、ＬＩＶＰ、天壇（Ｔｉａｎ Ｔａｎ）、ＩＨＤ－Ｊ、タシュケント、ベルン、パリ、ダイレン（Ｄａｉｒｅｎ）、および誘導体等を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスである。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、ＷＲ系統ワクシニアウイルスである。
様々な系統のワクシニアウイルスのゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、Ｇｏｅｂｅｌら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：２４７；Ｇｏｅｂｅｌら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：５１７を参照されたい。コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスのヌクレオチド配列は公知であり；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ３５０２７を参照されたい。ＷＲ系統ワクシニアウイルスのヌクレオチド配列は公知であり；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２４３３１２；およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００６９９８を参照されたい。ワクシニアウイルスのＷＲ系統は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）；ＡＴＣＣ ＶＲ－１３５４から入手可能である。
本開示の、ワクシニアウイルス等の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性活性を呈する。ウイルスの腫瘍溶解性活性は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって評価され得る。所与のウイルスが腫瘍溶解性活性を呈するかどうかを評価するための方法の例は、ウイルスの添加による癌細胞の生存率の減少を評価するためのインビトロ方法を含む。使用され得る癌細胞または細胞株の例は、悪性黒色腫細胞ＲＰＭＩ－７９５１（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－６６）、肺腺癌ＨＣＣ４００６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２８７１）、肺癌腫Ａ５４９（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）、肺癌腫ＨＯＰ－６２（例えば、ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、肺癌腫ＥＫＶＸ（例えば、ＤＣＴＤ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）、小細胞肺癌細胞ＤＭＳ ５３（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２０６２）、肺扁平上皮細胞癌腫ＮＣＩ－Ｈ２２６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８２６）、腎臓癌細胞Ｃａｋｉ－１（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－４６）、膀胱癌細胞６４７－Ｖ（例えば、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４１４）、頭頸部癌デトロイト５６２（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１３８）、乳癌細胞ＪＩＭＴ－１（例えば、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５８９）、乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－２６）、乳癌細胞ＭＣＦ７（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－２２）、乳癌ＨＳ－５７８Ｔ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１２６）、乳管癌腫Ｔ－４７Ｄ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１３３）、食道癌細胞ＯＥ３３（例えば、ＥＣＡＣＣ ９６０７０８０８）、膠芽細胞腫Ｕ－８７ＭＧ（例えば、ＥＣＡＣＣ ８９０８１４０２）、神経芽細胞腫ＧＯＴＯ（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０６１２）、骨髄腫ＲＰＭＩ ８２２６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１５５）、卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－７７）、卵巣癌細胞ＯＶＭＡＮＡ（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ１０４５）、子宮頸癌ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）、結腸癌細胞ＲＫＯ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２５７７）、結腸癌細胞ＨＴ－２９（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３８）、結腸癌Ｃｏｌｏ ２０５（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２２）、結腸癌ＳＷ６２０（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２２７）、結腸直腸癌腫ＨＣＴ １１６（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４７）、膵臓癌細胞ＢｘＰＣ－３（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６８７）、骨の骨肉腫Ｕ－２ ＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－９６）、前立腺癌細胞ＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７４０）、肝細胞癌腫ＪＨＨ－４（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０４３５）、中皮腫ＮＣＩ－Ｈ２８（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－５８２０）、子宮頸癌細胞ＳｉＨａ（例えば、ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３５）、および胃癌細胞Ｋａｔｏ ＩＩＩ（例えば、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ ＲＣＢ２０８８）を含む。
ＩＬ－２バリアントポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ヘルパーウイルスを用いた再活性化および相同組み換えを含めた確立された技法を使用して、ワクシニアウイルスに導入され得る。例えば、ＩＬ－２バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挿入されるプラスミド（移入ベクタープラスミドＤＮＡとも称される）が作出され得、組み換え移入ベクターを作出し；組み換え移入ベクターは、ワクシニアウイルスに感染した細胞に導入され得る。次いで、ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、相同組み換えを介して、組み換え移入ベクターからワクシニアウイルスに導入される。
同様に、異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されるプラスミド（移入ベクタープラスミドＤＮＡとも称される）が作出され得、組み換え移入ベクターを作出し；組み換え移入ベクターは、ワクシニアウイルス由来の消化されたゲノムＤＮＡをトランスフェクトされかつヘルパーウイルスに感染した細胞に導入され得る。次いで、ＴＫｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、相同組み換えを介して、組み換え移入ベクターからワクシニアウイルスに導入される。ＴＫｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が導入される領域は、内因性ワクシニアウイルスＴＫをコードする遺伝子、例えばＪ２Ｒであり得る。ＴＫｖポリペプチドをコードする核酸は、ワクシニアウイルスＪ２Ｒのすべてまたは一部分に取って代わり得る。
一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御エレメント、例えばプロモーターに作動可能に連結される。一部の場合において、プロモーターは、腫瘍細胞におけるポリペプチドの発現を提供する。適切なプロモーターは、ｐＳＥＬプロモーター、ＰＳＦＪ１－１０プロモーター、ＰＳＦＪ２－１６プロモーター、ｐＨｙｂプロモーター、後期－初期最適化プロモーター、ｐ７．５Ｋプロモーター、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、改変Ｈ５プロモーター、Ｈ４プロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、およびＴ７ハイブリッドプロモーターを含むが、それらに限定されるわけではない。
一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される。一部の場合において、調節可能なプロモーターは可逆的プロモーターである。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、テトラサイクリン調節性プロモーター（例えば、ＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ、Ｔｅｔ－Ｏｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ等のプロモーターシステム）に作動可能に連結される。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、抑制可能なプロモーターに作動可能に連結される。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、テトラサイクリン抑制可能であるプロモーターに作動可能に連結され、例えばプロモーターは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体もしくは誘導体の存在下で抑制される。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＴｅｔＯＦＦプロモーターシステムに作動可能に連結される。ＢｕｊａｒｄおよびＧｏｓｓｅｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７。例えば、ＴｅｔＯＦＦプロモーターシステムは、テトラサイクリン（または、ドキシサイクリン等、適切な類似体または誘導体）の存在下で抑制され（不活性であり）；テトラサイクリンが除去されると、プロモーターは活性でありかつポリペプチドの発現を推進する。一部の場合において、ＩＬ－２ｖポリペプチドまたは異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、テトラサイクリン活性化可能であるプロモーターに作動可能に連結され、例えばプロモーターは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体もしくは誘導体の存在下で活性化される。
ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が導入される領域は、ワクシニアウイルスの生活環に不必要である遺伝子領域であり得る。例えば、ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が導入される領域は、ＶＧＦ機能を欠損したワクシニアウイルスにおけるＶＧＦ遺伝子内の領域、Ｏ１Ｌ機能を欠損したワクシニアウイルスにおけるＯ１Ｌ遺伝子内の領域、またはＶＧＦおよびＯ１Ｌ機能の両方を欠損したワクシニアウイルスにおけるＶＧＦおよびＯ１Ｌ遺伝子のいずれかもしくは両方の内の１つもしくは複数の領域であり得る。上記において、外来遺伝子は、ＶＧＦおよびＯ１Ｌ遺伝子のものと同じまたは反対の方向に転写されるように導入され得る。別の例として、ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が導入される領域は、Ｂ１８（Ｂ１９）機能を欠損したワクシニアウイルスにおけるＢ１８遺伝子（コペンハーゲンにおけるＢ１９）内の領域であり得る。特定の実施形態において、ＩＬ－２バリアントポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列は、内因性ワクシニアウイルスＴＫをコードする遺伝子、例えばＪ２Ｒの領域に配置される。ＩＬ－２バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ウイルスＪ２Ｒ遺伝子の全体または一部分に取って代わり得る。別の特定の実施形態において、ＨＳＶ－ｔｋ．００７ポリペプチド等の異種ｔｋをコードする挿入されたヌクレオチド配列は、ウイルスＢ１６Ｒ遺伝子（ウェスタンリザーブのような他のワクシニアウイルス系統においてＢ１５Ｒ遺伝子と呼ばれる）の領域に配置され、Ｂ１６Ｒ遺伝子の全体または一部分に取って代わり得る。
Ｃ－３．組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物
別の態様において、本開示は、本開示によって提供される、ワクシニアウイルス等の組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を提供する。組成物は、溶液または懸濁液等、含まれる特定の活性成分に適切な任意の形態にあり得る。一部の場合において、組成物は、ヒトへの投与に適切な医薬組成物である。
一部の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。本明細書において使用するとき、「薬学的に許容できる担体」という用語は、活性成分と組み合わされた場合、活性成分が生物学的活性を保持するのを可能にし、対象に投与された場合に重大な長期的または永続的な有害作用を有しない任意の物質または材料を指し、薬学的に許容できる「ビヒクル」、「安定剤」、「希釈剤」、「補助剤」、または「賦形剤」等の用語を包含する。そのような担体は、一般的に、活性成分（例えば、本開示のＩＬ－２バリアントまたは融合分子または組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス）と混合され、固体、半固体、または液体作用物質であり得る。限定されることなく、緩衝剤、防腐剤、張度調整剤、塩、抗酸化物質、増量剤、乳化剤、湿潤剤等を含めた、多様な薬学的に許容できる担体のいずれかが使用され得る。結果として生じる調製物が薬学的に許容できるという条件で、ｐＨを調整するための様々な緩衝剤および手段を使用して、本明細書に開示される医薬組成物を調製し得る。そのような緩衝剤は、限定されることなく、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝溶液、およびホウ酸塩緩衝液を含む。必要に応じて、酸または塩基を使用して組成物のｐＨを調整し得ることが理解される。薬学的に許容できる抗酸化物質は、限定されることなく、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソール、およびブチル化ヒドロキシトルエンを含む。有用な防腐剤は、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、および安定化オキシクロロ組成物、例えばＰＵＲＩＴＥ（商標）を含む。対象医薬組成物への内包に適切な張度調整剤は、限定されることなく、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩、マンニトールまたはグリセリン、および他の薬学的に許容できる張度調整剤を含む。薬理学の技術分野において公知のこれらのおよび他の物質が、対象医薬組成物に含まれ得ることが理解される。
本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物は、ｍｌあたり約１０２プラーク形成単位（ｐｆｕ）（ｐｆｕ／ｍｌ）～約１０４ｐｆｕ／ｍｌ、約１０４ｐｆｕ／ｍｌ～約１０５ｐｆｕ／ｍｌ、約１０５ｐｆｕ／ｍｌ～約１０６ｐｆｕ／ｍｌ、約１０６ｐｆｕ／ｍｌ～約１０７ｐｆｕ／ｍｌ、約１０７ｐｆｕ／ｍｌ～約１０８ｐｆｕ／ｍｌ、約１０８ｐｆｕ／ｍｌ～約１０９ｐｆｕ／ｍｌ、約１０９ｐｆｕ／ｍｌ～約１０１０ｐｆｕ／ｍｌ、約１０１０ｐｆｕ／ｍｌ～約１０１１ｐｆｕ／ｍｌ、または約１０１１ｐｆｕ／ｍｌ～約１０１２ｐｆｕ／ｍｌの量のウイルスを含有し得る。
Ｃ－４．組み換え腫瘍溶解性ウイルスの使用
Ｃ－４Ａ．使用および投与
別の態様において、本開示は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスの使用およびそれを使用する方法、ならびに組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を提供する。使用または方法は、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導するまたは癌を治療するためのものを含み、方法は、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたは本開示の組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与する工程を含む。本開示のウイルスの投与は、本明細書において「ウイルス療法」とも称される。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、個体における癌細胞の数または腫瘍量を低下させる量である。例えば、一部の場合において、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、組み換えウイルスの投与前のまたは組み換えワクシニアウイルスを用いた投与の非存在下での個体における癌細胞の数と比較して、個体における癌細胞の数を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低下させる量である。一部の場合において、組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、個体における癌細胞の数を検出不能なレベルまで低下させる量である。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、個体における腫瘍量を低下させる量である。例えば、一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、組み換えウイルスの投与前のまたは複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスを用いた投与の非存在下での個体における腫瘍量と比較して、個体における腫瘍量を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％低下させる量である。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、個体の生存時間を増加させる量である。例えば、一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを用いた投与の非存在下での個体の予想生存時間と比較して、個体の生存時間を少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、３カ月間～６カ月間、６カ月間～１年間、１年間～２年間、２年間～５年間、５年間～１０年間、または１０年間を上回る期間増加させる量である。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の数の増加を提供する量である。例えば、一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与前のまたは複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスを用いた投与の非存在下での個体におけるＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の数と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の、個体におけるＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞の数の増加を提供する量である。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、個体におけるＩＬ－２またはＩＬ－２ｖの循環レベルの増加を提供する量である。例えば、一部の場合において、組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、腫瘍溶解性ウイルスの投与前のまたは腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた投与の非存在下での個体におけるＩＬ－２またはＩＬ－２ｖの循環レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の、個体におけるＩＬ－２またはＩＬ－２ｖの循環レベルの増加を提供する量である。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、個体におけるＩＬ－２ｖポリペプチドの循環レベルの増加を提供する量である。例えば、一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与前のまたは腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた投与の非存在下での個体におけるＩＬ－２ｖポリペプチドの循環レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍の、個体におけるＩＬ－２ｖポリペプチドの循環レベルの増加を提供する量である。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数の増加を提供する量である。例えば、一部の場合において、ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、ウイルスの投与前のまたはウイルスを用いた投与の非存在下での個体におけるＣＤ８＋ ＴＩＬの数と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍のＣＤ８＋ ＴＩＬの数の増加を提供する量である。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に１回または複数の投薬で投与された場合に、持続的な抗腫瘍免疫応答、例えば、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも６カ月間、または少なくとも１年間、腫瘍細胞数および／または腫瘍量および／または腫瘍成長の低下を提供する抗腫瘍免疫応答を誘導する量である。
適切な投薬量は、様々な臨床的因子に基づいて、主治医または他の資格のある医療従事者によって判定され得る。医学の技術分野において周知であるように、任意の１人の患者に対する投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、腫瘍負荷、および他の関連因子を含めた多くの因子に依存する。
本開示の組み換えウイルスは、投薬あたり約１０２プラーク形成単位（ｐｆｕ）～約１０４ｐｆｕ、約１０４ｐｆｕ～約１０５ｐｆｕ、約１０５ｐｆｕ～約１０６ｐｆｕ、約１０６ｐｆｕ～約１０７ｐｆｕ、約１０７ｐｆｕ～約１０８ｐｆｕ、約１０８ｐｆｕ～約１０９ｐｆｕ、約１０９ｐｆｕ～約１０１０ｐｆｕ、または約１０１０ｐｆｕ～約１０１１ｐｆｕの量で投与され得る。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、約１×１０９ｐｆｕ～５×１０１１ｐｆｕの総量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、約１×１０９ｐｆｕ～約５×１０９ｐｆｕ、約５×１０９ｐｆｕ～約１０１０ｐｆｕ、約１０１０ｐｆｕ～約５×１０１０ｐｆｕ、約５×１０１０ｐｆｕ～約１０１１ｐｆｕ、または約１０１１ｐｆｕ～約５×１０１１ｐｆｕの総量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、約２×１０１０ｐｆｕの総量で投与される。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、約１×１０８ｐｆｕ／ｋｇ患者重量～約５×１０９ｐｆｕ／ｋｇ患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、約１×１０８ｐｆｕ／ｋｇ患者重量～約５×１０８ｐｆｕ／ｋｇ患者重量、約５×１０８ｐｆｕ／ｋｇ患者重量～約１０９ｐｆｕ／ｋｇ患者重量、または約１０９ｐｆｕ／ｋｇ患者重量～約５×１０９ｐｆｕ／ｋｇ患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、１×１０８ｐｆｕ／ｋｇ患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、２×１０８ｐｆｕ／ｋｇ患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、３×１０８ｐｆｕ／ｋｇ患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、４×１０８ｐｆｕ／ｋｇ患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、５×１０８ｐｆｕ／ｋｇ患者重量の量で投与される。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの複数回の投薬が投与される。本開示の組み換えウイルスの投与の頻度は、多様な因子、例えば症状の重症度等のいずれかに応じて変動し得る。例えば、一部の実施形態において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、月に１回、月に２回、月に３回、隔週で（ｑｏｗ）、週に１回（ｑｗ）、週に２回（ｂｉｗ）、週に３回（ｔｉｗ）、週に４回、週に５回、週に６回、隔日で（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｂｉｄ）、または１日３回（ｔｉｄ）投与される。
本開示の組み換えウイルスの投与の継続期間は、多様な因子、例えば患者応答等のいずれかに応じて変動し得る。例えば、本開示の組み換えウイルスは、約１日～約１週間、約２週間～約４週間、約１カ月間～約２カ月間、約２カ月間～約４カ月間、約４カ月間～約６カ月間、約６カ月間～約８カ月間、約８カ月間～約１年間、約１年間～約２年間、もしくは約２年間～約４年間、またはそれを上回る期間に及ぶ期間にわたって投与され得る。
本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、インビボおよびエクスビボ方法、ならびに投与の全身的および限局的経路を含めた、薬物送達に適切な任意の利用可能な方法および経路を使用して個体に投与される。
投与の従来的でかつ薬学的に許容できる経路は、腫瘍内、腫瘍周辺、筋肉内、気管内、髄腔内、頭蓋内、皮下、皮内、局部適用、静脈内、動脈内、腹腔内、膀胱内、直腸、経鼻、経口、ならびに他の腸内および非経口の投与の経路を含む。投与の経路は、所望の場合には組み合わされ得る、または組み換えワクシニアウイルスおよび／もしくは所望の効果に応じて調整され得る。本開示の組み換えワクシニアウイルスは、単回投薬でまたは複数回投薬で投与され得る。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、静脈内に、筋肉内に、局所的に、腫瘍内に、腫瘍周辺に、頭蓋内に、皮下に、動脈内に、腹腔内に、膀胱内の投与の経路を介して、または髄腔内に投与される。
Ｃ－４Ｂ．組み合わせ
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、別の療法または作用物質との組み合わせで投与される。例えば、組み換えウイルスは、標準的な癌療法に対するアジュバント療法として投与され得る、別の癌療法との組み合わせで投与され得る、または組み換えワクシニアウイルスの抗腫瘍効果を増強する作用物質との組み合わせで投与され得る。標準的な癌療法は、手術（例えば、癌性組織の外科的除去）、放射線療法、骨髄移植、化学療法治療、抗体治療、生物学的応答修飾物質治療、免疫療法治療、および前述のもののある特定の組み合わせを含む。ゆえに、一実施形態において、本開示は、ａ）本開示の組み換えワクシニアウイルス、またはそれを含む組成物；およびｂ）第２の癌療法をそれを必要とする個体に投与する工程を含む、個体における癌を治療する方法を提供する。一部の場合において、第２の癌療法は、化学療法、生物学的療法（抗体を用いた療法等）、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法（例えば、本開示の組み換えワクシニアウイルス以外の腫瘍溶解性ウイルス）、細胞療法、および手術から選択される。
放射線療法は、ビーム等の外部から適用される供給源からまたは小さな放射線源の埋め込みによって送達される、ｘ線またはガンマ線を含むが、それらに限定されるわけではない。
癌治療における使用のための適切な抗体の例は、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標））、イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））、リツキシマブ（リツキサン）、アレムツズマブ（Ｌｅｍｔｒａｄａ（商標））、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（商標））、オレゴボマブ（ＯｖａＲｅｘ（商標））、ランブロリズマブ（ＭＫ－３４７５）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））等、およびコンジュゲート抗体、例えばゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｒｔａｒｇ（商標））、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標））、９０Ｙ標識イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（商標））、１３１Ｉ標識トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａ）（Ｂｅｘｘａｒ（商標））等を含む。癌治療における使用のための適切な抗体は、例えば、ＣＴＬＡ－４を標的にするイピリムマブ（黒色腫、前立腺癌、ＲＣＣの治療において使用される）；ＣＴＬＡ－４を標的にするトレメリムマブ（ＣＲＣ、胃、黒色腫、ＮＳＣＬＣの治療において使用される）；ＰＤ－１を標的にするニボルマブ（黒色腫、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣの治療において使用される）；ＰＤ－１を標的にするＭＫ－３４７５（黒色腫の治療において使用される）；ＰＤ－１を標的にするピジリズマブ（血液悪性腫瘍の治療において使用される）；ＰＤ－Ｌ１を標的にするＢＭＳ－９３６５５９（黒色腫、ＮＳＣＬＣ、卵巣、ＲＣＣの治療において使用される）；ＰＤ－Ｌ１を標的にするＭＥＤＩ４７３６；ＰＤ－Ｌ１を標的にするＭＰＤＬ３３２８０Ａ（黒色腫の治療において使用される）；ＣＤ２０を標的にするリツキシマブ（非ホジキンリンパ腫の治療において使用される）；イブリツモマブチウキセタンおよびトシツモマブ（リンパ腫の治療において使用される）；ＣＤ３０を標的にするブレンツキシマブベドチン（ホジキンリンパ腫の治療において使用される）；ＣＤ３３を標的にするゲムツズマブオゾガマイシン（急性骨髄性白血病の治療において使用される）；ＣＤ５２を標的にするアレムツズマブ（慢性リンパ球性白血病の治療において使用される）；ＥｐＣＡＭを標的にするＩＧＮ１０１およびアデカツムマブ（上皮腫瘍（乳房、結腸、および肺）の治療において使用される）；ＣＥＡを標的にするラベツズマブ（乳房、結腸、および肺腫瘍の治療において使用される）；ｇｐＡ３３を標的にするｈｕＡ３３（結腸直腸癌腫の治療において使用される）；ムチンを標的にするペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）およびオレゴボマブ（乳房、結腸、肺、および卵巣腫瘍の治療において使用される）；ＴＡＧ－７２を標的にするＣＣ４９（ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ））（乳房、結腸、および肺腫瘍の治療において使用される）；ＣＡＩＸを標的にするｃＧ２５０（腎細胞癌腫の治療において使用される）；ＰＳＭＡを標的にするＪ５９１（前立腺癌腫の治療において使用される）；葉酸結合タンパク質を標的にするＭＯｖ１８およびＭＯＲＡｂ－００３（ファルレツズマブ）（卵巣腫瘍の治療において使用される）；ガングリオシド（ＧＤ２、ＧＤ３、およびＧＭ２等）を標的にする３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、およびＫＷ－２８７１（神経外胚葉腫瘍および一部の上皮腫瘍の治療において使用される）；Ｌｅ ｙを標的にするｈｕ３Ｓ１９３およびＩｇＮ３１１（乳房、結腸、肺、および前立腺腫瘍の治療において使用される）；ＶＥＧＦを標的にするベバシズマブ（腫瘍血管系の治療において使用される）；ＶＥＧＦＲを標的にするＩＭ－２Ｃ６およびＣＤＰ７９１（上皮由来固形腫瘍の治療において使用される）；インテグリン＿Ｖ＿３を標的にするエタラシズマブ（腫瘍血管系の治療において使用される）；インテグリン＿５＿１を標的にするヴォロシキシマブ（腫瘍血管系の治療において使用される）；ＥＧＦＲを標的にするセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、および８０６（神経膠腫、肺、乳房、結腸、および頭頸部腫瘍の治療において使用される）；ＥＲＢＢ２を標的にするトラスツズマブおよびペルツズマブ（乳房、結腸、肺、卵巣、および前立腺腫瘍の治療において使用される）；ＥＲＢＢ３を標的にするＭＭ－１２１（乳房、結腸、肺、卵巣、および前立腺腫瘍の治療において使用される）；ＭＥＴを標的にするＡＭＧ １０２、ＭＥＴＭＡＢ、およびＳＣＨ ９００１０５（乳房、卵巣、および肺腫瘍の治療において使用される）；ＩＧＦ１Ｒを標的にするＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ－Ａ１２、ＭＫ－０６４６、Ｒ１５０７、およびＣＰ ７５１８７１（神経膠腫、肺、乳房、頭頸部、前立腺、および甲状腺癌の治療において使用される）；ＥＰＨＡ３を標的にするＫＢ００４およびＩＩＩＡ４（肺、腎臓、および結腸腫瘍、黒色腫、神経膠腫、ならびに血液悪性腫瘍の治療において使用される）；ＴＲＡＩＬＲ１を標的にするマパツムマブ（ＨＧＳ－ＥＴＲ１）（結腸、肺、および膵臓腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍の治療において使用される）；ＴＲＡＩＬＲ２を標的にするＨＧＳ－ＥＴＲ２およびＣＳ－１００８；ＲＡＮＫＬを標的にするデノスマブ（前立腺癌および骨転移の治療において使用される）；ＦＡＰを標的にするシブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）およびＦ１９（結腸、乳房、肺、膵臓、および頭頸部腫瘍の治療において使用される）；テネイシンを標的にする８１Ｃ６（神経膠腫、乳房および前立腺腫瘍の治療において使用される）；ＣＤ３を標的にするブリナツモマブ（ビーリンサイト；Ａｍｇｅｎ）（ＡＬＬの治療において使用される）；癌免疫療法において使用される、ＰＤ－１を標的にするペムブロリズマブ；ｃ－Ｍｙｃを標的にする９Ｅ１０抗体；等を含むが、それらに限定されるわけではない。
一部の場合において、本開示の方法は、ａ）本開示の、ワクシニアウイルス等の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量；およびｂ）抗ＰＤ－１抗体を投与する工程を含む。一部の場合において、本開示の方法は、ａ）本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量；およびｂ）抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与する工程を含む。適切な抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）；ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）；ＢＭＳ－９２６５５８；ＭＤＸ１１０６）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４（ＭＥＤＩ－０６８０）、ＰＤＲ００１、およびＰＦ－０６８０１５９１を含むが、それらに限定されるわけではない。適切な抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ１１０５）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６；イミフィンジ）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３３２８０Ａ；テセントリク）を含むが、それらに限定されるわけではない。例えば、ＳｕｎｓｈｉｎｅおよびＴａｕｂｅ（２０１５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２３：３２；ならびにＨｅｅｒｙら（２０１７）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １８：５８７；Ｉｗａｉら（２０１７）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２４：２６；Ｈｕ－Ｌｉｅｓｋｏｖａｎら（２０１７）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２８：ｉｓｓｕｅ Ｓｕｐｐｌ．５、ｍｄｘ３７６．０４８；ならびに米国特許公報第２０１６／０１５９９０５号を参照されたい。
一部の場合において、適切な抗体は、二重特異性抗体、例えば二重特異性モノクローナル抗体である。カツマクソマブ、ブリナツモマブ、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、パソツキシズマブ（ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、およびフロテツズマブは、癌療法における使用に適切な二重特異性抗体の非限定的な例である。例えば、ＣｈａｍｅｓおよびＢａｔｙ（２００９）ＭＡｂｓ １：５３９；ならびにＳｅｄｙｋｈら（２０１８）Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．１２：１９５を参照されたい。
本開示の方法と併せた使用に適切な生物学的応答修飾物質は、（１）チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）活性の阻害剤；（２）セリン／スレオニンキナーゼ活性の阻害剤；（３）腫瘍抗原に特異的に結合する抗体等、腫瘍関連抗原アンタゴニスト；（４）アポトーシス受容体アゴニスト；（５）インターロイキン－２；（６）インターフェロン－α；（７）インターフェロン－γ；（８）コロニー刺激因子；（９）血管新生の阻害剤；および（１０）腫瘍壊死因子のアンタゴニストを含むが、それらに限定されるわけではない。
化学療法剤は、癌細胞の増殖を低下させる非ペプチド性（すなわち、非タンパク性）化合物であり、細胞毒性剤および細胞増殖抑制剤を包含する。化学療法剤の非限定的な例は、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、植物性（ビンカ）アルカロイド、およびステロイドホルモンを含む。
細胞増殖を低下させるように作用する作用物質は、当技術分野において公知であり、広く使用されている。そのような作用物質は、メクロレタミン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））、メルファラン（Ｌ－サルコリシン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、ダカルバジン、およびテモゾロミドを含むがそれらに限定されない、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、およびトリアゼン等のアルキル化剤を含む。
代謝拮抗剤は、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ－Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦｕｄＲ）、６－チオグアニン、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、ペントスタチン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、メトトレキサート、１０－プロパルギル－５，８－ジデアザ葉酸（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８－ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビンを含むがそれらに限定されない、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む。
適切な天然産物およびそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン）は、Ａｒａ－Ｃ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン－Ｃ、Ｌ－アスパラギナーゼ、アザチオプリン；ブレキナル；アルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等；ポドフィロトキシン、例えばエトポシド、テニポシド等；抗生物質、例えばアントラサイクリン、ダウノルビシン塩酸塩（ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン）、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、およびモルホリノ誘導体等；フェノキシゾンビスシクロペプチド（ｐｈｅｎｏｘｉｚｏｎｅ ｂｉｓｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅ）、例えばダクチノマイシン；塩基性グリコペプチド、例えばブレオマイシン；アントラキノングリコシド、例えばプリカマイシン（ミトラマイシン）；アントラセンジオン、例えばミトキサントロン；アジリノピロロ（ａｚｉｒｉｎｏｐｙｒｒｏｌｏ）インドールジオン、例えばマイトマイシン；大環状免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、ＦＫ－５０６（タクロリムス、プログラフ）、ラパマイシン等；等を含むが、それらに限定されるわけではない。
他の抗増殖性細胞毒性剤は、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ－１１、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、レロキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イホスファミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、およびドロロキサフィン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）である。
抗増殖活性を有する、微小管に影響を及ぼす作用物質も、使用に適切であり、アロコルヒチン（ＮＳＣ ４０６０４２）、ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ ６０９３９５）、コルヒチン（ＮＳＣ ７５７）、コルヒチン誘導体（例えば、ＮＳＣ ３３４１０）、ドラスタチン（ｄｏｌｓｔａｔｉｎ）１０（ＮＳＣ ３７６１２８）、マイタンシン（ＮＳＣ １５３８５８）、リゾキシン（ＮＳＣ ３３２５９８）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、Ｔａｘｏｌ（登録商標）誘導体、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、チオコルヒチン（ＮＳＣ ３６１７９２）、トリチルシステリン（ｔｒｉｔｙｌ ｃｙｓｔｅｒｉｎ）、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、エポチロン（ｅｏｐｔｈｉｌｏｎｅ）Ａ、エポチロンＢを含むがそれらに限定されない天然および合成エポチロン、ディスコデルモライド；エストラムスチン、ノコダゾール等を含むが、それらに限定されるわけではない。
使用に適切であるホルモンモジュレーターおよびステロイド（合成類似体を含む）は、副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾン、デキサメタゾン等；エストロゲンおよびプロゲスチン（ｐｒｅｇｅｓｔｉｎ）、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェン等；ならびに副腎皮質抑制剤、例えばアミノグルテチミド；１７α－エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチル－テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド（ドロゲニル）、トレミフェン（フェアストン）、およびＺｏｌａｄｅｘ（登録商標）を含むが、それらに限定されるわけではない。エストロゲンは、増殖および分化を刺激し、それゆえ、エストロゲン受容体に結合する化合物を使用して、この活性を遮断する。コルチコステロイドは、Ｔ細胞増殖を阻害し得る。
他の化学療法剤は、金属錯体、例えばシスプラチン（ｃｉｓ－ＤＤＰ）、カルボプラチン等；ウレア、例えばヒドロキシウレア；およびヒドラジン、例えばＮ－メチルヒドラジン；エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）；トポイソメラーゼ阻害剤；プロカルバジン；ミトキサントロン；ロイコボリン；テガフール；等を含む。関心対象の他の抗増殖剤は、免疫抑制剤、例えばミコフェノール酸、サリドマイド、デオキシスパガリン（ｄｅｓｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、アザスポリン（ａｚａｓｐｏｒｉｎｅ）、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン（ＳＫＦ １０５６８５）；Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ＺＤ １８３９、４－（３－クロロ－４－フルオロフェニルアミノ）－７－メトキシ－６－（３－（４－モルホリニル）プロポキシ）キナゾリン）；等を含む。
「タキサン」は、パクリタキセル、ならびに任意の活性タキサン誘導体またはプロドラッグを含む。「パクリタキセル」（例えばドセタキセル、ＴＡＸＯＬμ、ＴＡＸＯＴＥＲＥμ（ドセタキセルの製剤）、パクリタキセルの１０－デスアセチル類似体、およびパクリタキセルの３’Ｎ－デスベンゾイル（ｄｅｓｂｅｎｚｏｙｌ）－３’Ｎ－ｔ－ブトキシカルボニル類似体等、類似体、製剤、および誘導体を含むと本明細書において理解されるべきである）は、当業者に公知の技法を利用して容易に調製され得る（ＷＯ９４／０７８８２、ＷＯ９４／０７８８１、ＷＯ９４／０７８８０、ＷＯ９４／０７８７６、ＷＯ９３／２３５５５、ＷＯ９３／１００７６；米国特許第５，２９４，６３７号；第５，２８３，２５３号；第５，２７９，９４９号；第５，２７４，１３７号；第５，２０２，４４８号；第５，２００，５３４号；第５，２２９，５２９号；およびＥＰ５９０，２６７も参照されたい）、または例えばＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．を含めた、多様な商業的供給元から獲得され得る（タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）由来のＴ７４０２；またはウンナンイチイ（Ｔａｘｕｓ ｙａｎｎａｎｅｎｓｉｓ）由来のＴ－１９１２）。
パクリタキセルは、パクリタキセルのよく見られる化学的に入手可能な形態だけでなく、類似体および誘導体（例えば、上で記されるＴａｘｏｔｅｒｅμドセタキセル）、ならびにパクリタキセルコンジュゲート（例えば、パクリタキセル－ＰＥＧ、パクリタキセル－デキストラン、またはパクリタキセル－キシロース）も指すと理解されるべきである。
細胞療法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ療法）；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法；樹状細胞（ＤＣ）療法（例えば、ＤＣベースのワクチン）；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を操作されたＴ細胞ベースの療法；等を含む。
Ｃ－４Ｃ．癌および腫瘍
本開示の方法および組成物によって治療され得る癌細胞は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯茎、頭、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、脊髄、精巣、舌、または子宮等、任意の臓器または組織由来のまたはそれにおける癌細胞を含む。加えて、癌は、任意の組織学的タイプのもの、例えば新生物、悪性腫瘍；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌腫；小細胞癌腫；乳頭状癌腫；扁平上皮細胞癌腫；リンパ上皮癌腫；基底細胞癌腫；ピロマトリックス癌腫；移行細胞癌腫；乳頭状移行細胞癌腫；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌腫；肝細胞癌腫；混合型肝細胞癌腫および胆管癌腫；索状腺癌；腺様嚢胞癌腫；腺腫性ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性結腸ポリポーシス；固形癌腫；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ）－肺胞腺癌；乳頭状腺癌；色素嫌性癌腫；好酸性癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；濾胞状腺癌；乳頭状および濾胞状腺癌；非被包性硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ）癌腫；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；脂腺腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌腫；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌腫；浸潤性導管癌腫；髄様癌腫；小葉癌腫；炎症性癌腫；パジェット病、乳房；腺房細胞癌腫；腺扁平上皮癌腫；腺癌ｗ／扁平上皮化生；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；アンドロブラストーマ、悪性；セルトリ細胞癌腫；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫（ｇｌｏｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在性拡大性黒色腫；巨大色素性母斑における悪性（ｍａｌｉｇ）黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の指定された非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；膵臓癌；直腸癌；ならびに有毛細胞白血病であり得る。
本開示の方法を使用して治療され得る腫瘍は、例えば脳腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍を含む。
一部の場合において、腫瘍は結腸直腸腺癌である。一部の場合において、腫瘍は非小細胞肺癌腫である。一部の場合において、腫瘍はトリプルネガティブ乳癌である。一部の場合において、腫瘍は固形腫瘍である。一部の場合において、腫瘍は液性腫瘍である。一部の場合において、腫瘍は再発性である。一部の場合において、腫瘍は原発性腫瘍である。一部の場合において、腫瘍は転移性である。
多様な対象が、癌を治療する対象方法を用いた治療に適切である。適切な対象は、癌を有する、癌を有すると診断されたことがある、癌を発症するリスクがある、癌を有したことがありかつ癌の再発のリスクがある、癌に対して本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス以外の作用物質で治療されたことがあり、そのような治療に応答しなかった、または癌に対して本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス以外の作用物質で治療されたことがあるがそのような治療への初期応答後に再発した、任意の個体、例えばヒトまたは非ヒト動物を含む。
Ｃ－５．腫瘍溶解性ウイルス免疫原性組成物
別の態様において、本開示によって提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、そのゲノムに、腫瘍関連抗原および新抗原等の癌抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。「癌関連抗原」（腫瘍関連抗原としても知られる）という用語は、正常細胞によってよりも癌細胞によってより多く発現されるタンパク質である。「新抗原」という用語は、癌細胞において発現されるが正常細胞において発現されないタンパク質を指す。一部の実施形態において、組み換えワクシニアウイルスは、そのゲノムに、ｉ）上で本明細書に記載されるＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ｉｉ）異種ＴＫポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；およびｉｉｉ）癌抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような組み換えワクシニアウイルスは、それを必要とする個体（例えば、癌を有する個体）に投与された場合に、コードされた癌抗原への個体における免疫応答を誘導し得るまたは増強し得る。免疫応答は、個体における癌細胞の数を低下させ得る。適切なＩＬ－２ｖポリペプチドおよび異種ＴＫポリペプチドは、上で記載されるとおりである。
癌関連抗原の例は、α－葉酸受容体；炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ４４ｖ７／８；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；上皮糖タンパク質－２（ＥＧＰ－２）；上皮糖タンパク質－４０（ＥＧＰ－４０）；葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）；胎児アセチルコリン受容体；ガングリオシド抗原ＧＤ２；Ｈｅｒ２／ｎｅｕ；ＩＬ－１３Ｒ－ａ２；カッパ軽鎖；ＬｅＹ；Ｌ１細胞接着分子；黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）；ＭＡＧＥ－Ａ１；メソテリン；ＭＵＣ１；ＮＫＧ２Ｄリガンド；腫瘍胎児抗原（ｈ５Ｔ４）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；腫瘍関連糖タンパク質－７２（ＴＡＧ－７２）；血管内皮成長因子受容体－２（ＶＥＧＦ－Ｒ２）（例えば、Ｖｉｇｎｅｒｏｎら（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：１５；およびＶｉｇｎｅｒｏｎ（２０１５）ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓ．Ｉｎｔ’ｌ Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９４８５０１を参照されたい）；および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ｖＩＩＩポリペプチド（例えば、Ｗｏｎｇら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２９６５；およびＭｉａｏら（２０１４）ＰＬｏＳＯｎｅ ９：ｅ９４２８１を参照されたい）；ＭＵＣ１ポリペプチド；ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６ポリペプチド；ＬＭＰ２ポリペプチド；ＨＰＶ Ｅ７ポリペプチド；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ｖＩＩＩポリペプチド；ＨＥＲ－２／ｎｅｕポリペプチド；黒色腫抗原ファミリーＡ、３（ＭＡＧＥ Ａ３）ポリペプチド；ｐ５３ポリペプチド；変異体ｐ５３ポリペプチド；ＮＹ－ＥＳＯ－１ポリペプチド；葉酸ヒドロラーゼ（前立腺特異的膜抗原；ＰＳＭＡ）ポリペプチド；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ポリペプチド；Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原（メランＡ／ＭＡＲＴ１）ポリペプチド；Ｒａｓポリペプチド；ｇｐ１００ポリペプチド；プロテイナーゼ３（ＰＲ１）ポリペプチド；ｂｃｒ－ａｂｌポリペプチド；チロシナーゼポリペプチド；サバイビンポリペプチド；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ポリペプチド；ｈＴＥＲＴポリペプチド；肉腫転座切断点ポリペプチド；滑膜肉腫Ｘ（ＳＳＸ）切断点ポリペプチド；ＥｐｈＡ２ポリペプチド；前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）ポリペプチド；黒色腫アポトーシス阻害剤（ｍｅｌａｎｏｍａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）（ＭＬ－ＩＡＰ）ポリペプチド；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）ポリペプチド；上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）ポリペプチド；ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合体）ポリペプチド；ＮＡ１７ポリペプチド、ペアードボックス－３（ＰＡＸ３）ポリペプチド；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）ポリペプチド；アンドロゲン受容体ポリペプチド；サイクリンＢ１ポリペプチド；Ｎ－ｍｙｃがん原遺伝子（ＭＹＣＮ）ポリペプチド；Ｒａｓホモログ遺伝子ファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）ポリペプチド；チロシナーゼ関連タンパク質－２（ＴＲＰ－２）ポリペプチド；メソテリンポリペプチド；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）ポリペプチド；黒色腫関連抗原－１（ＭＡＧＥ Ａ１）ポリペプチド；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）ポリペプチド；胎盤特異的タンパク質１（ＰＬＡＣ１）ポリペプチド；ＢＯＲＩＳポリペプチド（ＣＣＣＴＣ結合因子またはＣＴＣＦとしても知られる）；ＥＴＶ６－ＡＭＬポリペプチド；乳癌抗原ＮＹ－ＢＲ－１ポリペプチド（アンキリンリピートドメイン含有タンパク質３０Ａとも称される）；Ｇ－タンパク質シグナル伝達の調節因子（ＲＧＳ５）ポリペプチド；Ｔ細胞によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原（ＳＡＲＴ３）ポリペプチド；炭酸脱水酵素ＩＸポリペプチド；ペアードボックス－５（ＰＡＸ５）ポリペプチド；ＯＹ－ＴＥＳ１（精巣抗原；アクロシン結合タンパク質としても知られる）ポリペプチド；精子タンパク質１７ポリペプチド；リンパ球特異的タンパク質－チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）ポリペプチド；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）；Ａ－キナーゼアンカータンパク質－４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）ポリペプチド；Ｘ抗原ファミリーメンバー１（ＸＡＧＥ１）ポリペプチド；Ｂ７ホモログ３（Ｂ７Ｈ３；ＣＤ２７６としても知られる）ポリペプチド；レグマインポリペプチド（ＬＧＭＮ１；アスパラギニルエンドペプチダーゼとしても知られる）；ＩｇおよびＥＧＦ相同ドメインを有するチロシンキナーゼ－２（Ｔｉｅ－２；アンジオポエチン－１受容体としても知られる）ポリペプチド；Ｐ抗原ファミリーメンバー４（ＰＡＧＥ４）ポリペプチド；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦ２）ポリペプチド；ＭＡＤ－ＣＴ－１ポリペプチド；線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）ポリペプチド；血小板由来成長因子受容体ベータ（ＰＤＧＦβ）ポリペプチド；ＭＡＤ－ＣＴ－２ポリペプチド；Ｆｏｓ関連抗原－１（ＦＯＳＬ）ポリペプチド；ならびにウィルムス腫瘍－１（ＷＴ－１）ポリペプチドを含む。
癌関連抗原のアミノ酸配列は当技術分野において公知であり；例えば、ＭＵＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ５６７３４）；ＬＭＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ４７０２４）；ＨＰＶ Ｅ６（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＤ３３２５２）；ＨＰＶ Ｅ７（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＨＧ９９４８０）；ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１３３３８７０）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＩ６７１４７）；ＭＡＧＥ－Ａ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ１１７４４）；ｐ５３（ＧｅｎＢａｎｋ ＢＡＣ１６７９９）；ＮＹ－ＥＳＯ－１（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ０５９０８）；ＰＳＭＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ２５６７２）；ＣＥＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＡ５１９６７）；メラン／ＭＡＲＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５５０２）；Ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１１２３９１４）；ｇｐ１００（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ６０６３４）；ｂｃｒ－ａｂｌ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＢ６０３８８）；チロシナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＢ６０３１９）；サバイビン（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ５１６６０）；ＰＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＤ５４６１７）；ｈＴＥＲＴ（ＧｅｎＢａｎｋ ＢＡＣ１１０１０）；ＳＳＸ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１２６５６２０）；Ｅｐｈ２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００４４２２）；ＰＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ１６３４４）；ＭＬ－ＩＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ１４４７５）；ＡＦＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１１２５）；ＥｐＣＡＭ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２３４５）；ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合体）（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＣＡ８１３８５）；ＰＡＸ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＩ０１３０１）；ＡＬＫ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００４２９５）；アンドロゲン受容体（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００００３５）；サイクリンＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＯ９９２７３）；ＭＹＣＮ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１２８０１５７）；ＲｈｏＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ５２８０８）；ＴＲＰ－２（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ６０６２７）；メソテリン（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ０９２７２）；ＰＳＣＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＨ６５１８３）；ＭＡＧＥ Ａ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００４９７９）；ＣＹＰ１Ｂ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＭ５０５１２）；ＰＬＡＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＧ２２５９６）；ＢＯＲＩＳ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１２５５９６９）；ＥＴＶ６（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１９７８）；ＮＹ－ＢＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿４４３７２３）；ＳＡＲＴ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０５５５２１）；炭酸脱水酵素ＩＸ（ＧｅｎＢａｎｋ ＥＡＷ５８３５９）；ＰＡＸ５（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０５７９５３）；ＯＹ－ＴＥＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿１１５８７８）；精子タンパク質１７（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ２０８７８）；ＬＣＫ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１０３６２３６）；ＨＭＷ－ＭＡＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１８８８）；ＡＫＡＰ－４（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００３８７７）；ＳＳＸ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＡ６０１１１）；ＸＡＧＥ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１０９１０７３；ＸＰ＿００１１２５８３４；ＸＰ＿００１１２５８５６；およびＸＰ＿００１１２５８７２）；Ｂ７Ｈ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１０１９９０７；ＸＰ＿９４７３６８；ＸＰ＿９５０９５８；ＸＰ＿９５０９６０；ＸＰ＿９５０９６２；ＸＰ＿９５０９６３；ＸＰ＿９５０９６５；およびＸＰ＿９５０９６７）；ＬＧＭＮ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１００８５３０）；ＴＩＥ－２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０００４５０）；ＰＡＧＥ４（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１３０５８０６）；ＶＥＧＦＲ２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２２４４）；ＭＡＤ－ＣＴ－１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５８９３ ＮＰ＿０５６２１５）；ＦＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００４４５１）；ＰＤＧＦβ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２６００）；ＭＡＤ－ＣＴ－２（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００１１３８５７４）；ＦＯＳＬ（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００５４２９）；およびＷＴ－１（ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿０００３６９）を参照されたい。これらのポリペプチドは、例えばＣｈｅｅｖｅｒら（２００９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：５３２３およびその中で引用される参考文献；Ｗａｇｎｅｒら（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１６：１６５３；Ｍａｔｓｕｉら（１９９０）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：２４９；ならびにＺｈａｎｇら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８３：１６８にも論じられる。
一部の場合において、本開示の、ワクシニアウイルス等の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは複製能を有しない。一部の場合において、組み換えウイルスは、ウイルスが複製できない能力をもたらす、ウイルス遺伝子の改変を含む。複製に要される遺伝子産物をコードする１種または複数のウイルス遺伝子は、ウイルスが複製することができないように改変され得る。例えば、組み換えウイルスは、中間転写因子（例えば、Ａ８Ｒおよび／またはＡ２３Ｒ）（例えば、Ｗｙａｔｔら（２０１７）ｍＢｉｏ ８：ｅ００７９０；およびＷａｒｒｅｎら（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：９５１４を参照されたい）および／または後期転写因子（例えば、Ｇ８Ｒ、Ａ１Ｌ、およびＡ２Ｌのうちの１種または複数）（例えば、Ｙａｎｇら（２０１３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４７：２１３を参照されたい）のレベルおよび／または活性を低下させるように改変され得る。中間転写因子および／または後期転写因子のレベルおよび／または活性を低下させることは、初期ウイルスプロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを発現し得る改変ワクシニアウイルスをもたらし得るが；しかしながら、ウイルスは複製することができないであろう。改変は、例えば、遺伝子のすべてまたは一部の欠失；遺伝子への挿入；等を含む。例えば、Ａ８Ｒ遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。別の例として、Ａ２３Ｒ遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。別の例として、Ｇ８Ｒ遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。別の例として、Ａ１Ｌ遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。別の例として、Ａ２Ｌ遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。
上で記されるように、一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは非腫瘍溶解性である。
Ｃ－６．２’－デオキシグアノシンの類似体の投与
別の態様において、本開示は、２’－デオキシグアノシンの合成類似体との組み合わせでの、本明細書に記載される異種ＴＫポリペプチドを含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与を提供する。
腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスの投与を受けた対象において有害な副作用を引き起こし得る。副作用の例は、水疱性病変または「小水疱性皮疹」等の皮膚病変を含む。一部の実施形態において、本開示は、ａ）本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの有効量；およびｂ）２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量を個体に投与する工程を含む、個体における癌を治療する方法であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは異種ＴＫポリペプチドを含む、方法を提供する。一部の他の実施形態において、本開示は、組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与を受けている対象に２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量を投与する工程を含む、本開示の組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの副作用を治療する、低下させる、または管理する方法であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは異種ＴＫポリペプチドを含む、方法を提供する。
２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の「有効量」は、投与された複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによって引き起こされる有害な副作用を低下させるのに有効である量である。例えば、有害な副作用が皮膚病変である場合、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量は、１回または複数の投薬で個体に投与された場合に、個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変の数および／または重症度および／または継続期間を低下させるのに有効である量である。例えば、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量は、１回または複数の投薬で個体に投与された場合に、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の投与前のまたは２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の投与の非存在下での個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変の数および／または重症度および／または継続期間と比較して、個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変の数および／または重症度および／または継続期間を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または７５％を上回る割合低下させるのに有効である量であり得る。一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量は、１回または複数の投薬で個体に投与された場合に、ワクシニアウイルス誘導性皮膚病変からのウイルスの排出を低下させるのに有効である量である。例えば、一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量は、１回または複数の投薬で個体に投与された場合に、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の投与前のまたは２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の投与の非存在下での個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変からのウイルス排出のレベルまたは程度と比較して、ワクシニアウイルス誘導性皮膚病変からのウイルスの排出を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または７５％を上回る割合低下させるのに有効である量である。有害な副作用が皮膚病変である場合、一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は、投与の任意の好都合な経路によって（例えば、局部的に、経口的に、静脈内に等）投与され得る。例えば、有害な副作用が皮膚病変である場合、一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は局部的に投与され得る。皮膚病変を低下させるために、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は、典型的に、例えば皮膚の病変エリアへの２’－デオキシ－グアノシン類似体の適用によって、局部的に投与される。
２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の投与は、異種ＴＫポリペプチドを含む複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製を低下させる。本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製のそのような低下は、例えば、個体における複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのレベルを制御することにとって、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの効果を制御することにとって等、望ましくあり得る。ゆえに、一部の他の実施形態において、本開示は、ａ）本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの有効量を投与する工程；およびｂ）２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量を投与する工程を含む、個体における癌を治療する方法を提供する。一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量は、１回または複数の投薬で個体に投与された場合に、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の投与前のまたは２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の投与の非存在下での個体における複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製のレベルと比較して、個体における本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、または７５％を上回る割合低下させるのに有効である量である。
２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の後に投与され得る。例えば、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の１日～７日、７日～２週間、２週間～１カ月、１カ月～３カ月、または３カ月を上回る期間後に投与され得る。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが投与されている個体への２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の投与は、個体における迅速な全身性の腫瘍溶解（癌細胞の溶解）を誘導する。例えば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス誘導による腫瘍成長の減速が生じた時点で、および／またはウイルス複製がそのピークにあるもしくはその直後にある時点で、および／またはワクシニアウイルスタンパク質に対する循環抗体がそれらのピークにあるもしくはその直後にある時点で、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は個体に投与され得る。本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の後、腫瘍成長の減速が生じているかどうかは、腫瘍成長および／または癌細胞数を測定するための多様な確立された方法のいずれかを使用して判定され得る。個体における本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製がそのピークにあるまたはその直後にあるかどうかは、本明細書に記載されるように個体におけるＴＫｖポリペプチドのレベルを検出しかつ／または測定することによって判定され得、適切な方法の非限定的な例はＰＥＴである。本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに対する循環抗体がそのピークにあるまたはその直後にあるかどうかは、抗体のレベルを測定するための標準的方法を使用して測定され得、そのような方法は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等を含む。
例として、本開示の方法は、ａ）本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量をそれを必要とする個体に投与する工程；ｂ）ｉ）個体における腫瘍サイズおよび／もしくは癌細胞数；ならびに／またはｉｉ）個体におけるＴＫｖポリペプチドのレベル、ならびに／またはｉｉｉ）個体における組み換え腫瘍溶解性ウイルスに対する抗体のレベルを測定する工程；ならびにｃ）測定する工程が、ｉ）組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与前の腫瘍成長および／もしくは癌細胞の数と比較して、腫瘍成長が減速しておりかつ／もしくは癌細胞の数が減少していること；ならびに／またはｉｉ）個体におけるＴＫｖポリペプチドのレベルがそのピークにあるもしくはその直後にあること；ならびに／またはｉｉｉ）個体における組み換え腫瘍溶解性ウイルスに対する循環抗体のレベルがそのピークにあるもしくはその直後にあることを示す場合、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体を投与する工程を含み得る。例えば、本開示の方法は、ａ）本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量をそれを必要とする個体に投与する工程；およびｂ）２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の有効量を個体に投与する工程を含み得、投与工程（ｂ）は、工程（ａ）の５日～２０日（例えば、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、または２０日）後に行われる。
２’－デオキシ－グアノシンの適切な合成類似体は、例えば、アシクロビル（アシクログアノシン）、５’－ヨードデオキシウリジン（「イドクスウリジン」とも称される）、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、２’－フルオロ－２’－デオキシ－５－ヨード－１－ベータ－ｄ－アラビノフラノシルウラシル（ＦＩＡＵ）等を含む。２’－デオキシ－グアノシンの適切な合成類似体の一部についての構造が、下で示される。
ガンシクロビル：
Figure 2023533567000005
バルガンシクロビル：
Figure 2023533567000006
バラシクロビル：
Figure 2023533567000007
ファムシクロビル：
Figure 2023533567000008
一部の特定の実施形態において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は、ガンシクロビルまたはアシクロビルである。
２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は、１日あたり４０００ｍｇ未満の用量で経口的に投与され得る。一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の適切な経口用量は、１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ～１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ～１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ～１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ～１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ～１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ～１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ～１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ～１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ～１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ～１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ～１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ～１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ～１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ～１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇの域にある。一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の適切な経口用量は、１日あたり約２５００ｍｇ～１日あたり約３０００ｍｇ、１日あたり約３０００ｍｇ～１日あたり約３５００ｍｇ、または１日あたり約３５００ｍｇ～１日あたり約４０００ｍｇの域にある。
１つの非限定的な例として、ガンシクロビルは、３０００ｍｇの総１日用量に対して、１日あたり１０００ｍｇ３回の用量で投与され得る。ガンシクロビルは、３０００ｍｇ未満（例えば、１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ～１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ～１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ～１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ～１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ～１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ～１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ～１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ～１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ～１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ～１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ～１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ～１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ～１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ～１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇ）の総１日用量で投与され得る。一部の場合において、ガンシクロビルは経口投与により投与される。
別の非限定的な例として、アシクロビルは、１０００ｍｇ～４０００ｍｇの総１日用量で投与され得る。アシクロビルは、４０００ｍｇ未満（例えば、１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ～１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ～１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ～１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ～１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ～１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ～１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ～１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ～１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ～１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ～１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ～１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ～１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ～１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ～１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇ）の総１日用量で投与され得る。一部の場合において、アシクロビルは経口投与により投与される。
別の例として、バルガンシクロビルは、約９００ｍｇ～約１８００ｍｇの総１日用量で投与される。バルガンシクロビルは、１８００ｍｇ未満（例えば、約５００ｍｇ／日～約６００ｍｇ／日、約６００ｍｇ／日～約７００ｍｇ／日、約７００ｍｇ／日～約８００ｍｇ／日、約８００ｍｇ／日～約９００ｍｇ／日、約９００ｍｇ／日～約１０００ｍｇ／日、約１０００ｍｇ／日～約１２００ｍｇ／日、約１２００ｍｇ／日～約１４００ｍｇ／日、または約１４００ｍｇ／日～約１６００ｍｇ／日）の総１日用量で投与され得る。一部の場合において、バルガンシクロビルは経口投与により投与される。
別の例として、ファムシクロビルは、約２０００ｍｇ／日～約４０００ｍｇ／日の総１日用量で投与される。ファムシクロビルは、４０００ｍｇ未満（例えば、１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ～１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ～１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ～１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ～１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ～１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ～１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ～１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ～１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ～１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ～１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ～１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ～１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ～１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ～１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇ）の総１日用量で投与され得る。一部の場合において、ファムシクロビルは経口投与により投与される。
別の例として、バラシクロビルは、約２０００ｍｇ～約４０００ｍｇの総１日用量で投与される。バラシクロビルは、４０００ｍｇ未満（例えば、１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇ、例えば１日あたり約５０ｍｇ～１日あたり約１００ｍｇ、１日あたり約１００ｍｇ～１日あたり約２００ｍｇ、１日あたり約２００ｍｇ～１日あたり約３００ｍｇ、１日あたり約３００ｍｇ～１日あたり約４００ｍｇ、１日あたり約４００ｍｇ～１日あたり約５００ｍｇ、１日あたり約５００ｍｇ～１日あたり約６００ｍｇ、１日あたり約６００ｍｇ～１日あたり約７００ｍｇ、１日あたり約７００ｍｇ～１日あたり約８００ｍｇ、１日あたり約８００ｍｇ～１日あたり約９００ｍｇ、１日あたり約９００ｍｇ～１日あたり約１０００ｍｇ、１日あたり約１０００ｍｇ～１日あたり約１２５０ｍｇ、１日あたり約１２５０ｍｇ～１日あたり約１５００ｍｇ、１日あたり約１５００ｍｇ～１日あたり約１７５０ｍｇ、１日あたり約１７５０ｍｇ～１日あたり約２０００ｍｇ、１日あたり約２０００ｍｇ～１日あたり約２２５０ｍｇ、または１日あたり約２２５０ｍｇ～１日あたり約２５００ｍｇ）の総１日用量で投与され得る。一部の場合において、バラシクロビルは経口投与により投与される。
別の例として、ガンシクロビルは、約１０ｍｇ／ｋｇの総１日用量で投与される。ガンシクロビルは、１０ｍｇ／ｋｇ未満（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約４ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約６ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ～約７ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、または約８ｍｇ／ｋｇ～約９ｍｇ／ｋｇ）の総１日用量で投与され得る。一部の場合において、ガンシクロビルは、注射（例えば、筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射）により投与される。
別の例として、アシクロビルは、約１５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ～約４５ｍｇ／ｋｇの総１日用量で投与される。アシクロビルは、４５ｍｇ／ｋｇ未満（例えば、約５ｍｇ／ｋｇ～約７．５ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１２．５ｍｇ／ｋｇ、約１２．５ｍｇ／ｋｇ～約１５ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、または約３０ｍｇ／ｋｇ～約３５ｍｇ／ｋｇ）の総１日用量で投与され得る。一部の場合において、アシクロビルは、注射（例えば、筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射）により投与される。
別の例として、バルガンシクロビルは、約１０ｍｇ／ｋｇの総１日用量で投与される。バルガンシクロビルは、１０ｍｇ／ｋｇ未満（例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約４ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約６ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ～約７ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、または約８ｍｇ／ｋｇ～約９ｍｇ／ｋｇ）の総１日用量で投与され得る。一部の場合において、バルガンシクロビルは、注射（例えば、筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射）により投与される。
一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は局部的に投与される。局部投与に適切な製剤は、例えば経皮製剤（例えば、液体、クリーム、ゲル等）および眼科製剤（例えば、クリーム、液体、ゲル等）を含む。ガンシクロビルの局部用量は、例えば眼科適応症に関して、例えば１日あたり１滴の０．１５％製剤５回であり得る。アシクロビルの局部用量は、皮膚病変を覆うのに十分な量で、例えば５％製剤の１日あたり６回の適用であり得る。イドクスウリジンの局部用量は、例えば１滴の０．５％軟膏または０．１％クリームの４時間ごとの適用であり得る。
一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は、１０ｍｇ／ｋｇ体重未満の用量で静脈内に投与される。一部の場合において、２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体の適切な静脈内用量は、約１ｍｇ／ｋｇ体重～約２．５ｍｇ／ｋｇ体重、約２．５ｍｇ／ｋｇ体重～約５ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重～約７．５ｍｇ／ｋｇ体重、または約７．５ｍｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重の域にある。
Ｃ－７．本開示の非限定的な態様の例
上で記載される腫瘍溶解性ウイルス関連の主題についての実施形態を含めた態様は、単独でまたは１つもしくは複数の他の態様もしくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示のある特定の非限定的な態様が下で提供される。本開示を読めば当業者に明白であろうように、個々に番号付けされた態様のそれぞれは、先行するまたは後続の個々に番号付けされた態様のいずれかとともに使用され得るまたは組み合わされ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせへの支持を提供することを意図され、下で明示的に提供される態様の組み合わせを限定するわけではない。
態様１．そのゲノムに、（１）バリアントインターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、バリアントＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較して、望ましくない特性の低下を有する、ヌクレオチド配列；および（２）異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）。
態様２．ワクシニアチミジンキナーゼを欠損した状態にする改変をさらに含む、態様１に記載のＯＶ。
態様３．改変は、Ｊ２Ｒ発現および／または機能の欠如をもたらす、態様２に記載のＯＶ。
態様４．コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスである、態様１から３のいずれか一項に記載のＯＶ。
態様５．ＷＲ系統ワクシニアウイルスである、態様１から３のいずれか一項に記載のＯＶ。
態様６．Ｋ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、態様１から５のいずれか一項に記載のＯＶ。
態様７．バリアントＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１に描写されるＩＬ－２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくＦ４２、Ｙ４５、およびＬ７２のうちの１つまたは複数の置換を含む、態様１から６のいずれか一項に記載のＯＶ。
態様８．ＩＬ－２ｖポリペプチドは、配列番号１に描写されるＩＬ－２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくＦ４２Ｌ、Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｓ、Ｆ４２Ｔ、Ｆ４２Ｑ、Ｆ４２Ｅ、Ｆ４２Ｄ、Ｆ４２Ｒ、またはＦ４２Ｋ置換を含む、態様１から７のいずれか一項に記載のＯＶ。
態様９．ＩＬ－２ｖポリペプチドは、配列番号１に描写されるＩＬ－２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくＹ４５Ａ、Ｙ４５Ｇ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｙ４５Ｑ、Ｙ４５Ｅ、Ｙ４５Ｎ、Ｙ４５Ｄ、Ｙ４５Ｒ、またはＹ４５Ｋ置換を含む、態様１から８のいずれか一項に記載のＯＶ。
態様１０．ＩＬ－２ｖポリペプチドは、配列番号１に描写されるＩＬ－２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくＬ７２Ｇ、Ｌ７２Ａ、Ｌ７２Ｓ、Ｌ７２Ｔ、Ｌ７２Ｑ、Ｌ７２Ｅ、Ｌ７２Ｎ、Ｌ７２Ｒ、またはＬ７２Ｋ置換を含む、態様１から９のいずれか一項に記載のＯＶ。
態様１１．ＩＬ－２ｖポリペプチドは、配列番号１に描写されるＩＬ－２アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇ置換を含む、態様１から１０のいずれか一項に記載のＯＶ。
態様１２．ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結されている、態様１から１１のいずれか一項に記載のＯＶ。
態様１３．調節可能なプロモーターは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体もしくは誘導体によって調節される、態様１２に記載のＯＶ。
態様１４．ａ）態様１から１３のいずれか一項に記載のＯＶ；およびｂ）薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物。
態様１５．態様１から１３のいずれか一項に記載のＯＶまたは態様１４に記載の組成物の有効量を個体に投与する工程を含む、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法。
態様１６．前記投与する工程は、ウイルスまたは組成物の単回投薬を投与する工程を含む、態様１５に記載の方法。
態様１７．単回投薬は、少なくとも１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルスを含む、態様１６に記載の方法。
態様１８．単回投薬は、１０９～１０１２ｐｆｕのウイルスを含む、態様１６に記載の方法。
態様１９．前記投与する工程は、ウイルスまたは組成物の複数回投薬を投与する工程を含む、態様１５に記載の方法。
態様２０．ウイルスまたは組成物は隔日で投与される、態様１９に記載の方法。
態様２１．ウイルスまたは組成物は週に１回投与される、態様１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
態様２２．ウイルスまたは組成物は隔週で投与される、態様１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
態様２３．腫瘍は、脳腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍である、態様１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
態様２４．腫瘍は結腸直腸腺癌である、態様１５から２２のいずれか一項に記載の方法。
態様２５．腫瘍は非小細胞肺癌腫である、態様１５から２２のいずれか一項に記載の方法。
態様２６．腫瘍はトリプルネガティブ乳癌である、態様１５から２２のいずれか一項に記載の方法。
態様２７．腫瘍は固形腫瘍である、態様１５から２２のいずれか一項に記載の方法。
態様２８．腫瘍は液性腫瘍である、態様１５から２２のいずれか一項に記載の方法。
態様２９．腫瘍は再発性である、態様１５から２８のいずれか一項に記載の方法。
態様３０．腫瘍は原発性腫瘍である、態様１５から２８のいずれか一項に記載の方法。
態様３１．腫瘍は転移性である、態様１５から２８のいずれか一項に記載の方法。
態様３２．第２の癌療法を個体に投与する工程をさらに含む、態様１５から３１のいずれか一項に記載の方法。
態様３３．第２の癌療法は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、細胞療法、および手術から選択される、態様３２に記載の方法。
態様３４．第２の癌療法は、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、態様３２に記載の方法。
態様３５．個体は免疫欠陥がある、態様１５から３４のいずれか一項に記載の方法。
態様３６．ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は腫瘍内投与である、態様１５から３５のいずれか一項に記載の方法。
態様３７．ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は腫瘍周辺である、態様１５から３５のいずれか一項に記載の方法。
態様３８．ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は静脈内投与である、態様１５から３５のいずれか一項に記載の方法。
態様３９．ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は動脈内投与である、態様１５から３５のいずれか一項に記載の方法。
態様４０．ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は膀胱内投与である、態様１５から３５のいずれか一項に記載の方法。
態様４１．ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は髄腔内投与である、態様１５から３５のいずれか一項に記載の方法。
態様４２．そのゲノムに、バリアントインターロイキン－２（ＩＬ－２ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＯＶであって、ＩＬ－２ｖポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５への結合の低下を提供する１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、組み換えＯＶ。
態様４３．そのゲノムに、配列番号９を含むバリアントインターロイキン－２（ＩＬ－２ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＯＶであって、ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損であり、Ｋ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、組み換えＯＶ。
態様４４．シグナルペプチドをさらに含む、態様４３に記載のウイルス。
態様４５．シグナルペプチドは配列番号２２を含む、態様４４に記載のウイルス。
態様４６．そのゲノムに、配列番号１０を含むバリアントインターロイキン－２（ＩＬ－２ｖ）ヌクレオチド配列を含む組み換えＯＶであって、ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損であり、Ｋ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、組み換えＯＶ。
態様４７．そのゲノムに、配列番号１２を含むバリアントインターロイキン－２（ＩＬ－２ｖ）ヌクレオチド配列を含む組み換えＯＶであって、ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損であり、Ｋ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、組み換えＯＶ。
態様４８．（ｉ）態様４２から４７のいずれか一項に記載のウイルス、および（ｉｉ）薬学的に許容できる担体を含む組成物。
態様４９．そのゲノムに、バリアントインターロイキン－２（ＩＬ－２ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＯＶであって、ＩＬ－２ｖポリペプチドは、野生型ＩＬ－２と比較した場合、望ましくない生物学的活性の低下を提供する、組み換えＯＶ。
態様５０．そのゲノムに、ヒトバリアントＩＬ－２をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＯＶであって、バリアントＩＬ－２は、Ｔ３、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｅ６２、Ｙ６５、Ｌ７２、Ｑ７４、およびＣ１２５から選択される位置に、配列番号１のヒトＩＬ－２タンパク質配列と比べて１つまたは複数の置換を含む、組み換えＯＶ。
態様５１．バリアントＩＬ－２は、以下の群の位置：Ｒ３８およびＬ４０；Ｔ４１およびＫ４３；Ｋ４３およびＹ４５；Ｅ６２およびＫ６４；Ｌ７２およびＱ７４；Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５；Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４；Ｔ３、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５；Ｔ３、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４；Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、Ｙ４５、およびＣ１２５；Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、Ｑ７４、およびＣ１２５；Ｔ３、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、Ｙ４５、およびＣ１２５；Ｔ３、Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、Ｑ７４、およびＣ１２５のうちの１つまたは複数にアミノ酸置換を含む、態様５０に記載の組み換えＯＶ。
態様５２．バリアントＩＬ－２は、Ｔ３Ａ、Ｋ３５Ｎ、Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｓ、Ｌ４０Ｔ、Ｔ４１Ｎ、Ｋ４３Ｓ、Ｋ４３Ｔ、Ｋ４３Ｎ、Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｔ、Ｅ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、Ｅ６２Ｒ、Ｋ６４Ｓ、Ｋ６４Ｔ、Ｌ７２Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｑ７４Ｔ、Ｃ１２５Ａ、およびＣ１２５Ｓからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、態様５０に記載の組み換えＯＶ。
態様５３．バリアントＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１に描写されるＩＬ－２アミノ酸配列のアミノ酸番号に基づくＲ３８Ｎ、Ｌ４０Ｔ、Ｋ４３Ｎ、およびＹ４５Ｔ置換を含む、態様５０に記載の組み換えＯＶ。
態様５４．組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、態様１から５３のいずれか一項において言及される組み換えＯＶ。
Ｄ．本出願において開示される配列の説明
Figure 2023533567000009
Figure 2023533567000010
Figure 2023533567000011
Ｅ．実施例
以下の実施例は、本発明を行いかつ使用する方法についての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが本発明者らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図されるわけではなく、それらは、下の実験が、実施されたすべてのまたは唯一の実験であることを表すことを意図されるわけでもない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関する精度を確保するために努力がなされているが、いくらかの実験誤差およびズレは考慮されるべきである。別様に示されない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度単位であり、圧力は大気圧下におけるまたはその付近におけるものである。標準的な略語、例えば、ｐｌ、ピコリットル；ｓまたはｓｅｃ、秒；ｍｉｎ、分；ｈまたはｈｒ、時間；ａａ、アミノ酸；ｋｂ、キロベース；ｂｐ、塩基対；ｎｔ、ヌクレオチド；ｉ．ｍ．、筋肉内の（に）；ｉ．ｐ．、腹腔内の（に）；ｓ．ｃ．、皮下の（に）；ｉ．ｖ．、静脈内の（に）；ｉ．ｔ．、腫瘍内の（に）；等が使用され得る。明瞭性のために、実施例において言及されるある特定の導入遺伝子の説明が、表１に提供される。
Figure 2023533567000012
（実施例１）
組み換えワクシニアウイルス構築物の作出
下で提供される実施例に関連して作出された例示的な組み換えワクシニアウイルス構築物のある特定の特質が、下の表２に要約される。表２における各ウイルスは、Ｊ２Ｒ遺伝子の挿入不活性化を有するＶＶ１０およびＶＶ１８を除いて、Ｊ２Ｒ遺伝子の欠失を有する。ＶＶ２７、ＶＶ７９、ＶＶ９１～ＶＶ９６、およびＩＧＶ－１２１は、マウス細胞における発現のためにコドン最適化されたマウスＩＬ－２バリアント（Ｆ７６Ａ、Ｙ７９Ａ、Ｌ１０６Ｇ置換を有する；配列番号３）をコードする遺伝子を有する。ＶＶ７５およびＶＶ１００～ＶＶ１０３は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトＩＬ－２バリアント（Ｆ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、およびＬ９２Ｇ置換を有する；配列番号１４）をコードする遺伝子を有する。ＶＶ９７、ＶＶ１１０、およびＶＶ１１７は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトＩＬ－２グリコバリアント（「ＩＬ－２ｇｖ」または「ＩＬ－２ｇｖ１」とも称される；Ｒ５８Ｎ、Ｌ６０Ｔ、Ｋ６３Ｎ、およびＹ６５Ｔ置換を有する；配列番号２９）をコードする遺伝子を有する。ＶＶ９８は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトＩＬ－２グリコバリアント２（「ＩＬ－２ｇｖ２」とも称される；Ｋ６３Ｎ、Ｙ６５Ｔ、Ｌ９２Ｎ、およびＱ９４Ｔ置換を有する；配列番号３３）をコードする遺伝子を有する。ＶＶ９９は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトＩＬ－２（野生型）をコードする遺伝子を有する。
Figure 2023533567000013
Figure 2023533567000014
ＶＶ２７構築
ウイルスは、ワクシニアのコペンハーゲン系統に基づき、合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの制御下でマウスＩＬ－２バリアントをコードする遺伝子を有する。Ａ３４Ｒ遺伝子におけるＫ１５１Ｅ置換の組み入れによって、ウイルスを細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）産生の増強のために操作した。ヘルパーウイルス媒介性の制限酵素ガイドによる相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＶＶ２７を構築した。まず、マウスＩＬ－２ｖ（Ｆ７６Ａ、Ｙ７９Ａ、Ｌ１０６Ｇ）をコードする遺伝子を、マウス細胞における発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＷｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）によって合成した。ＤＮＡをＢｇｌＩＩ／ＡｓｉＳＩで消化し、またＢｇｌＩＩ／ＡｓｉＳＩで消化されたコペンハーゲンＪ２Ｒ相同組み換えプラスミドに挿入した。マウスＩＬ－２ｖ遺伝子および隣接する左および右のワクシニア相同領域をＰＣＲによって増幅して、相同組み換えドナーフラグメントを作出した。ＢＳＣ－４０細胞に、ヘルパーウイルスのショープ線維腫ウイルス（ＳＦＶ）を１時間感染させ、その後にドナーアンプリコンとＪ２Ｒ領域内であらかじめ制限消化された精製ワクシニアゲノムＤＮＡとの混合物をトランスフェクトした。親ゲノムＤＮＡは、天然Ｊ２Ｒ遺伝子の代わりにホタルルシフェラーゼおよびＧＦＰ、ならびにＥＥＶ産生の増強のためのＡ３４Ｒ遺伝子内のＫ１５１Ｅ変異（置換）を有するコペンハーゲン系統ワクシニアウイルスを起源とした。トランスフェクトされた細胞を、重大な細胞変性効果が観察されるまでインキュベートし、総細胞溶解物を３ラウンドの凍結／融解および超音波処理によって収集した。溶解物を連続希釈し、ＢＳＣ－４０単層上に播き、寒天重層によって覆った。ＧＦＰ陰性プラークを、合計３ラウンドのプラーク精製にわたって蛍光顕微鏡下で単離した。２０層セルファクトリーでのＨｅＬａ細胞における大規模増幅の前に、Ｔ２２５フラスコ中でのＢＳＣ－４０細胞における中間増幅のために１つのプラーク（ＫＲ１４４）を選択した。ウイルスをショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて徹底的に特徴付けした。
ＶＶ３８構築
ウイルスは、ワクシニアのコペンハーゲン系統に基づき、合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの制御下でマウスＩＬ－２バリアントをコードする遺伝子を有する。ウイルスは、それが野生型Ａ３４Ｒ遺伝子を有し、ＥＥＶ産生の増強のために操作されていないという点を除いて、ＶＶ２７と同一である。ヘルパーウイルス媒介性の制限酵素ガイドによる相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＶＶ３８を構築した。ＢＳＣ－４０細胞に、ＳＦＶヘルパーウイルスを１～２時間感染させ、その後にドナーアンプリコンとＪ２Ｒ領域においてＡｓｉＳＩであらかじめ消化された精製ワクシニアゲノムＤＮＡとの混合物をトランスフェクトした。親ゲノムＤＮＡは、天然Ｊ２Ｒ遺伝子の代わりにホタルルシフェラーゼおよびＧＦＰを有するコペンハーゲン系統ワクシニアウイルスを起源とした。トランスフェクトされた細胞を、重大な細胞変性効果が観察されるまでインキュベートし、総細胞溶解物を３ラウンドの凍結／融解および超音波処理によって収集した。溶解物を連続希釈し、ＢＳＣ－４０単層上に播き、寒天重層によって覆った。ＧＦＰ陰性プラークを、合計３ラウンドのプラーク精製に対して蛍光顕微鏡下で単離した。２０層セルファクトリーでのＨｅＬａ細胞における大規模増幅の前に、Ｔ２２５フラスコ中でのＢＳＣ－４０細胞における中間増幅のために１つのプラーク（ＬＷ２２６）を選択した。ウイルスをショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて徹底的に特徴付けした。
ＶＶ３９構築
ウイルスは、ワクシニアのウェスタンリザーブ（ＷＲ）系統に基づき、合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの制御下でマウスＩＬ－２バリアントをコードする遺伝子を有する。ヘルパーウイルス媒介性の制限酵素ガイドによる相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＶＶ３９を構築した。ＢＳＣ－４０細胞に、ＳＦＶヘルパーウイルスを１～２時間感染させ、その後にドナーアンプリコンとＪ２Ｒ領域においてＡｓｉＳＩであらかじめ消化された精製ワクシニアゲノムＤＮＡとの混合物をトランスフェクトした。親ゲノムＤＮＡは、天然Ｊ２Ｒ遺伝子および野生型Ａ３４Ｒの代わりにルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター遺伝子カセットを有するＷＲ系統ワクシニアウイルスを起源とし、それはＥＥＶ産生の増強のために操作されていない。トランスフェクトされた細胞を、重大な細胞変性効果が観察されるまでインキュベートし、総細胞溶解物を３ラウンドの凍結／融解および超音波処理によって収集した。溶解物を連続希釈し、ＢＳＣ－４０単層上に播き、寒天重層によって覆った。ＧＦＰ陰性プラークを、合計３ラウンドのプラーク精製に対して蛍光顕微鏡下で単離した。２０層セルファクトリーでのＨｅＬａ細胞における大規模増幅の前に、Ｔ２２５フラスコ中でのＢＳＣ－４０細胞における中間増幅のために１つのプラーク（ＬＷ２２８）を選択した。ウイルス（ロット＃１８０３３０）をショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて徹底的に特徴付けした。
ＶＶ７９構築
コペンハーゲンＶＶ２７のＷＲ系統等価物であるＶＶ７９は、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ置換の付加を除いて、ＶＶ３９と同一である。ＶＶ３９親ウイルス骨格内にＫ１５１Ｅ変異を挿入するために、ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、それを構築した。
ＶＶ１０１構築
ＶＶ１０１は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Ｃｏｐ）系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ（チミジンキナーゼ）遺伝子の欠失；２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内への、合成初期－後期プロモーターによって制御されるヒトＩＬ－２バリアント（ｈＩＬ－２ｖ）発現カセットの挿入、３）ｈＩＬ－２ｖカセットと反対の配向で、Ｊ２Ｒ遺伝子座内への、Ｆ１７プロモーターによって制御される単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼバリアント（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入する、ウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の変異を含めた４つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＶＶ１０１を構築した。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのＪ２Ｒ領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製ＶＶ２７から抽出し、ＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｊ２Ｒ相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染ＢＳＣ－４０細胞にトランスフェクトした。３日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを４ラウンドのプラーク精製に供し、ＰＣＲによってＨＳＶ－ＴＫ．００７の存在についてスクリーニングした。ＶＶ９３とラベルされたウイルスをＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、マウスＩＬ－２バリアント（ｍＩＬ－２ｖ）をコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたｈＩＬ－２ｖをコードする遺伝子で置き換えることによって、ＶＶ１０１をＶＶ９３から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、ＶＶ１０１をＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
ＶＶ１０２構築
ＶＶ１０２は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失；２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内への、合成初期－後期プロモーターによって制御されるｈＩＬ－２ｖ発現カセットの挿入、３）天然Ｂ１６Ｒ遺伝子の１５７個の塩基を置き換える、Ｂ１６Ｒ遺伝子座内への、Ｆ１７プロモーターによって制御されるＨＳＶチミジンキナーゼバリアント（ＨＳＶ ＴＫ．００７；配列番号２８）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入する、ウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の変異を含めた４つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＶＶ１０２を構築した。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのＢ１６Ｒ領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製ＶＶ２７から抽出し（ＩＧＮＴ－００１に記載される）、ＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｂ１６相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染ＢＳＣ－４０細胞にトランスフェクトした。３日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを４ラウンドのプラーク精製に供し、ＰＣＲによってＨＳＶ－ＴＫ．００７の存在についてスクリーニングした。ＶＶ９１とラベルされたウイルスをＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ｍＩＬ－２ｖをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたｈＩＬ－２ｖをコードする遺伝子で置き換えることによって、ＶＶ１０２をＶＶ９１から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、ＶＶ１０２をＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
ＶＶ１０３構築
ＶＶ１０３は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失；２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内への、合成初期－後期プロモーターによって制御されるｈＩＬ－２ｖ発現カセットの挿入、３）天然Ｂ１６Ｒ遺伝子全体を置き換える、Ｂ１６Ｒ遺伝子座内への、Ｆ１７プロモーターによって制御されるＨＳＶチミジンキナーゼバリアント（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入する、ウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の変異を含めた４つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＶＶ１０３を構築した。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのＢ１６Ｒ領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製ＶＶ２７から抽出し（ＩＧＮＴ－００１に記載される）、ＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｂ１６相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染ＢＳＣ－４０細胞にトランスフェクトした。３日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを４ラウンドのプラーク精製に供し、ＰＣＲによってＨＳＶ－ＴＫ．００７の存在についてスクリーニングした。ＶＶ９６とラベルされたウイルスをＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ｍＩＬ－２ｖをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたｈＩＬ－２ｖをコードする遺伝子で置き換えることによって、ＶＶ１０３をＶＶ９６から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、ＶＶ１０３をＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
ＶＶ９４構築
ＶＶ９４は、ワクシニアウイルスのマウス適合ウェスタンリザーブ（ＷＲ）系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失；２）順方向の配向での、Ｊ２Ｒ遺伝子座内への、合成初期－後期プロモーターによって制御されるｍＩＬ－２ｖ発現カセットの挿入、３）逆方向の配向での、Ｊ２Ｒ遺伝子座内への、Ｆ１７プロモーターによって制御されるＨＳＶチミジンキナーゼバリアント（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入する、ウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の変異を含めた４つの遺伝子改変によって、親ＷＲ系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＶＶ９４を構築した。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。ＷＲ Ｊ２Ｒ領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製ＶＶ７９から抽出し、ＨＳＶＴＫ．００７／Ｊ２Ｒ相同組み換えアンプリコンとともに、ショープ線維腫ウイルス感染ＢＳＣ－４０細胞にトランスフェクトした。３日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを４ラウンドのプラーク精製に供し、ＰＣＲによってＨＳＶ－ＴＫ．００７の存在についてスクリーニングした。ＶＶ９４とラベルされたウイルスを、まずＢＳＣ－４０細胞において、次いでＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
ＶＶ１１０構築
ＶＶ１１０は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失；２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内への、合成初期－後期プロモーターによって制御されるヒトＩＬ－２グリコバリアント（Ｒ５８Ｎ、Ｌ６０Ｔ、Ｋ６３Ｎ、およびＹ６５Ｔ；配列番号２９）発現カセットの挿入、３）天然Ｂ１６Ｒ遺伝子の１５７個の塩基を置き換える、Ｂ１６Ｒ遺伝子座内への、Ｆ１７プロモーターによって制御されるＨＳＶチミジンキナーゼバリアント（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入する、ウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の変異を含めた４つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＶＶ１１０を構築した。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのＢ１６Ｒ領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製ＶＶ２７から抽出し（ＩＧＮＴ－００１に記載される）、ＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｂ１６相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染ＢＳＣ－４０細胞にトランスフェクトした。３日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを４ラウンドのプラーク精製に供し、ＰＣＲによってＨＳＶ－ＴＫ．００７の存在についてスクリーニングした。ＶＶ９１とラベルされたウイルスをＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、マウスＩＬ－２ｖをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたヒトＩＬ－２グリコバリアントをコードする遺伝子で置き換えることによって、ＶＶ１１０をＶＶ９１から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、ＶＶ１１０をＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
ＩＧＶ－１２１構築
ＩＧＶ－１２１は、ワクシニアウイルスのマウス適合ＷＲ系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失；２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内への、合成初期－後期プロモーターによって制御されるｍＩＬ－２ｖバリアント発現カセットの挿入、３）Ｂ１５Ｒ（ＷＲ１９７としても知られる）とＢ１７Ｌ（ＷＲ１９８）との間の遺伝子間領域における、Ｆ１７プロモーターによって制御されるＨＳＶチミジンキナーゼバリアント（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入する、ウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の変異を含めた４つの遺伝子改変によって、親ＷＲ系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＩＧＶ－１２１を構築した。まず、ＨＳＶ ＴＫ．００７をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって合成した。ワクシニアＷＲ系統のＢ１５ＲとＢ１７Ｌとの間の遺伝子間領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるＦ１７プロモーター（ＰＦ１７）の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製ＶＶ７９（マウスＩＬ－２ｖによって置き換えられたＪ２ＲおよびＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を有するＷＲ系統）から抽出し、ＨＳＶ ＴＫ．００７／Ｂ１５Ｒ－Ｂ１７Ｌ相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染Ｖｅｒｏ－Ｂ４細胞にトランスフェクトした。２日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結、融解、および超音波処理によって収集した。ウイルスをＢＳＣ－４０細胞での３ラウンドのプラーク精製に供した。ＩＧＶ－１２１とラベルされたウイルスをＨｅＬａ Ｓ３細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
ＶＶ１１７構築
ＶＶ１１７は、ワクシニアウイルスのマウス適合ＷＲ系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、１）天然ワクシニアＪ２Ｒ遺伝子の欠失；２）Ｊ２Ｒ遺伝子座内への、合成初期－後期プロモーターによって制御されるヒトＩＬ－２グリコバリアント（Ｒ５８Ｎ、Ｌ６０Ｔ、Ｋ６３Ｎ、およびＹ６５Ｔ；配列番号２９）発現カセットの挿入、３）Ｂ１５Ｒ（ＷＲ１９７としても知られる）とＢ１７Ｌ（ＷＲ１９８）との間の遺伝子間領域における、Ｆ１７プロモーターによって制御されるＨＳＶチミジンキナーゼバリアント（ＴＫ．００７）発現カセットの挿入、および４）Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換（Ｋ１５１Ｅ）を導入する、ウイルスＡ３４Ｒ遺伝子内の変異を含めた４つの遺伝子改変によって、親ＷＲ系統とは異なる。以前に記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、ＶＶ１１７を構築した。ワクシニア核酸を精製ＩＧＶ－１２１（マウスＩＬ－２ｖによって置き換えられたＪ２Ｒ、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異、およびＢ１５ＲとＢ１７Ｒとの間の遺伝子間領域に挿入されたＨＳＶ ＴＫ．００７を有するＷＲ系統）から抽出し、ヒトＩＬ－２グリコバリアント相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染ＢＳＣ－４０細胞にトランスフェクトした。３日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結、融解、および超音波処理によって収集した。ウイルスをＢＳＣ－４０細胞での３ラウンドのプラーク精製に供した。ＶＶ１１７とラベルされたウイルスをＨｅＬａ細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
図１は、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６に関する全ゲノムの概略的表示である。
図２は、ＶＶ９４およびＩＧＶ－１２１に関する全ゲノムの概略的表示である。
図３は、ＶＶ１０１～ＶＶ１０３に関する全ゲノムの概略的表示である。
図２６は、ＶＶ９７～１００に関する全ゲノムの概略的表示である。略語：ＬＩＴＲ＝左逆位末端反復；ＲＩＴＲ＝右逆位末端反復；Ａ～Ｏ＝ＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントによって歴史的に規定されたウイルス遺伝子領域；ＰＳＥＬ＝合成初期後期プロモーター；ＩＬ－２ｇｖ＝ヒトインターロイキン－２グリコバリアント（Ｒ５８Ｎ：Ｌ６０Ｔ、Ｋ６３Ｎ：Ｙ６５Ｔ）；ＩＬ－２ｇｖ２＝ヒトインターロイキン－２グリコバリアント２（Ｋ６３Ｎ：Ｙ６５Ｔ、Ｌ９２Ｎ：Ｑ９４Ｔ）；ＩＬ－２＝ヒトインターロイキン－２（野生型）；ＩＬ－２ｖ＝ヒトインターロイキン－２バリアント（Ｆ６２Ａ、Ｙ６５Ａ、Ｌ９２Ｇ）。
図２７は、ＶＶ１１０に関する全ゲノムの概略的表示である。略語：ＬＩＴＲ＝左逆位末端反復；ＲＩＴＲ＝右逆位末端反復；Ａ～Ｏ＝ＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントによって歴史的に規定されたウイルス遺伝子領域；ＰＳＥＬ＝合成初期後期プロモーター；ＩＬ－２ｇｖ＝ヒトインターロイキン－２グリコバリアント；＊＝Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換をコードする変異；ＰＦ１７＝Ｆ１７Ｒ遺伝子由来のプロモーター；ＨＳＶ ＴＫ．００７＝１６８位におけるアラニンからヒスチジンへの置換をコードする変異を有する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。
図２８は、ＶＶ１１７に関する全ゲノムの概略的表示である。略語：ＬＩＴＲ＝左逆位末端反復；ＲＩＴＲ＝右逆位末端反復；Ａ～Ｏ＝ＨｉｎｄＩＩＩ消化フラグメントによって歴史的に規定されたウイルス遺伝子領域；ＰＳＥＬ＝合成初期後期プロモーター；ＩＬ－２ｇｖ＝ヒトインターロイキン－２グリコバリアント；＊＝Ａ３４タンパク質の１５１位におけるリジンからグルタミン酸への置換をコードする変異；ＰＦ１７＝Ｆ１７Ｒ遺伝子由来のプロモーター；ＨＳＶ ＴＫ．００７＝１６８位におけるアラニンからヒスチジンへの置換をコードする変異を有する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。
（実施例２）
ウェスタンブロットによる、ウイルス感染細胞における組み換えワクシニアウイルスからのＩＬ－２ｖ発現
ＨｅＬａ細胞を、６ウェルプレートにおいて２ｍＬの培養培地中に６ｅ５個細胞／ウェルで播き、培養下でおよそ２４時間後に、ＭＯＩ＝３のウイルスを２４時間感染させた。各ウェルからの細胞をその後収集し、２００μＬのレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液中で溶解し、次いでｍｉｌｌｉＱ水で１：１希釈した。１２μＬのサンプルを、９５℃で５分間のインキュベーション、およびＮｕＰａｇｅ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルでのローディングの前に、還元剤および１×ＮｕＰａｇｅ ＬＤＳサンプル緩衝液を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中２０μＬの最終容積に調製した。１×ＭＥＳランニング緩衝液を用いたゲル電気泳動を２００Ｖで３０分間実施した。タンパク質をｉＢｌｏｔ装置を使用してＰＶＤＦ膜に転写し、ウェスタンブロットをｉＢｌｏｔ装置を使用して実施した。ｍＩＬ－２ｖの検出に関しては、以下の抗体を使用した－１：２０００希釈での抗ＩＬ－２一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１５１０）、１：１０００希釈でのヤギ抗ラットＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃６２９５２６）。ｈＩＬ－２ｖの検出に関しては、以下の抗体を使用した－１：５００希釈での抗ＩＬ－２一次抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢＰ２－１６９４８）、１：２０００希釈でのマウス抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、＃３１４６０）。その後、ＴＭＢ基質を膜に添加してバンドを可視化した。膜を水でリンスし、乾燥させ、スキャンした。結果は、図４（組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後のｍＩＬ－２ｖ発現分析）および図５（組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後のｈＩＬ－２ｖ発現分析）に示されている。
（実施例３）
ＲＴ－ｑＰＣＲによる、ウイルス感染細胞における組み換えワクシニアウイルスからのＨＳＶ ＴＫ．００７発現
ＨｅＬａ細胞を、６ウェルプレートにおいて２ｍＬの培養培地中に７ｅ４個細胞／ウェルで播き、培養下でおよそ７２時間後に、ＭＯＩ＝３のウイルスを１８時間感染させた。各ウェルからの細胞をその後収集し、Ｒｎｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７３４０４）を使用してＲＮＡ抽出のために処理した。５００ｎｇの総ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃４３６８８１４）を使用して逆転写した。組み換えウイルスにおいてコードされるＨＳＶ ＴＫ．００７導入遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブ、ならびにＰｒｉｍｅＴｉｍｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＩＤＴ、＃１０５５７７２）を使用して、ＨＳＶ ＴＫ．００７ ｍＲＮＡ発現レベルを分析するｑＰＣＲにおける使用の前に、ｃＤＮＡを１：１０希釈した。ＰＣＲをＶｉｉＡ７機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ＨＳＶ ＴＫ．００７ ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドＤＮＡを標準物質として使用し、各試験サンプルにおけるコピー／μＬを標準曲線から判定した。結果は、図６（組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後のＨＳＶ ＴＫ．００７発現分析）に示されている。
（実施例４）
ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｍＩＬ－２ｖを発現するＣｏｐウイルス）
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８～１０週齢）に、５ｅ５個のＭＣ３８腫瘍細胞を右上後部脇腹に皮下に（ＳＣ）埋め込んだ。ＭＣ３８はネズミ科結腸腺癌細胞株である。例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９７５）ｖｏｌ．３５、ｐｐ．２４３４～２４３９を参照されたい。腫瘍細胞埋め込みの１１日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約５０ｍｍ３；Ｎ＝１８／群）。埋め込み後１２日目に、腫瘍に、６０μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）、または５ｅ７プラーク形成単位（ｐｆｕ）の組み換えコペンハーゲン（Ｃｏｐ）ワクシニアウイルスバリアントを含有する６０μＬのビヒクルを直接注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）１４００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、またはｉｉｉ）重度に減退した健康状態、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。マウスの群を以下のように処理した：
群ｉ）ビヒクルのみ；
群ｉｉ）ＶＶ１６：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ変異（アミノ酸置換）を有し、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（Ｌｕｃ－２Ａ－ＧＦＰ）二重レポーターカセットで武装化されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｉｉ）ＶＶ２７：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子で武装化されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｖ）ＶＶ９１：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｖ）ＶＶ９３：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ネズミ科ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ挿入、逆方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；または
群ｖｉ）ＶＶ９６：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、逆方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス。
群（ｉ）～（ｖｉ）の腫瘍成長プロファイル間の比較（図７）は、すべての試験ウイルスが、連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらし、ｍＩＬ－２ｖ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６）のすべてが、対照ウイルス（ＶＶ１６）と比較して、連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらすこと（図８、ＡＮＣＯＶＡ結果）、およびＶＶ２７（ｍＩＬ－２ｖのみ）とＶＶ９１、ＶＶ９３、またはＶＶ９６（それぞれｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７を有する）のいずれかとを比較した場合、統計的に有意な差は観察されないことを明らかにした。
図７Ａ～７Ｇは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。ビヒクルのみ（Ａ）、またはルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１６）（Ｂ）、ｍＩＬ－２ｖのみ（Ｃｏｐ．ｍＧＭ－ＣＳＦ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ２７）（Ｃ）、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｄ）、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９３）（Ｅ）、もしくはＢ１６Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９６）（Ｆ）、のいずれかで武装化された、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。各処理群に関する平均腫瘍容積（ｍｍ３）±９５％信頼区間が、各群におけるすべての動物がまだ生きている最後の腫瘍測定時点である、腫瘍埋め込み後２８日目まで示されている（Ｇ）。
図８は、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。ビヒクル／ウイルス処理後（腫瘍埋め込み後１４日目～２７日目）の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果（ｐ値）を示している。太字フォントの値は、ｐ≦０．０５の場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。
各処理群（Ｎ＝１８／群）における動物の生存率も、腫瘍埋め込み後最高４１日目まで査定した（図９）。非武装化ワクシニア対照（ＶＶ１６）は、ビヒクル対照と比べて生存率を有意に向上させなかった（ログランク／マンテル・コックス検定、ｐ＝０．１３３）。しかしながら、武装化ワクシニアウイルスバリアントＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６で処理されたマウスは、レポーター導入遺伝子武装化ワクシニア対照（ＶＶ１６）処理群と比べて、統計的に有意な平均生存率優位性を示した（ログランク／マンテル・コックス検定、それぞれｐ＝０．００９、０．００６、＜０．０００１、および０．０１３）。
図９は、埋め込み後１２日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、ＭＣ３８腫瘍を埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧１４００ｍｍ３の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。
腫瘍成長阻害および生存率をモニターすることに加えて、ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた注射の２４時間および４８時間後に、腫瘍を持つマウスから血清を回収して、循環ＩＬ－２レベルを査定した。腫瘍内注射を受けた２４時間および４８時間後に、各処理群から回収された血清における循環ＩＬ－２レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した（図１０）。ｍＩＬ－２ｖ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルスバリアント（ＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６）で処理されたほとんどの動物からの血清において測定可能なレベルのＩＬ－２が検出され、一方でビヒクルまたは他のＣｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ１６）群からの任意の動物において、バックグラウンドレベルのＩＬ－２が見られた。この後者の結果は、少なくとも試験された用量レベルでの、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子を欠如するＣｏｐワクシニアウイルスの腫瘍内注射が、処理された動物の血清における循環ＩＬ－２レベルの増加を誘導するには不十分であったことを示す。ゆえに、ｍＩＬ－２ｖ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルスで処理されたマウスの血清において見られたレベルの上昇は、腫瘍内注射後の導入遺伝子媒介性発現を示していることになる。
図１０は、ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の２４時間および４８時間後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたＩＬ－２レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスに対する算出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝９／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。
（実施例５）
ルイス肺癌腫（ＬＬＣ）腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｍＩＬ－２ｖ武装化ワクシニアウイルス活性（ｍＩＬ－２ｖを発現するＣｏｐウイルス）
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８～１０週齢）に、１ｅ５個のＬＬＣ腫瘍細胞を左上後部脇腹に皮下に（ＳＣ）埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの１２日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約５０ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。埋め込み後１３日目に、腫瘍に、６０μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）、または５ｅ７プラーク形成単位（ｐｆｕ）の組み換えコペンハーゲン（Ｃｏｐ）ワクシニアウイルスバリアントを含有する６０μＬのビヒクルを直接注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）１４００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、またはｉｉｉ）重度に減退した健康状態、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。マウスの群を以下のように処理した：
群ｉ）ビヒクルのみ；
群ｉｉ）ＶＶ１６：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ変異（アミノ酸置換）を有し、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（Ｌｕｃ－２Ａ－ＧＦＰ）二重レポーターカセットで武装化されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｉｉ）ＶＶ２７：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子で武装化されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｖ）ＶＶ９１：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｖ）ＶＶ９３：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ挿入、逆方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；または
群ｖｉ）ＶＶ９６：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、逆方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス。
群（ｉ）～（ｖｉ）の腫瘍成長プロファイル間の比較（図１１）は、すべての試験ウイルスが、腫瘍成長に対して阻害効果をもたらし、ｍＩＬ－２ｖ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６）は、対照ウイルス（ＶＶ１６）と比較して、腫瘍成長に対してより顕著な阻害効果をもたらすことを明らかにした。調査中の多くの動物は、種々のウイルスバリアントと関連した腫瘍成長阻害の統計分析を制限する、腫瘍潰瘍形成および関連した健康状態の減退に起因して人道的に屠殺された。しかしながら、個々の動物の分析は、ＶＶ９１、ＶＶ９３、またはＶＶ９６を用いた処理の後、それぞれ７／２０、２／２０、および１／２０の腫瘍が、埋め込み後３０日目までに＜５０ｍｍ３でありまたは完全に退縮し、他の処理群においては小さな腫瘍または完全な退縮は観察されなかったことを実証した。
図１１Ａ～１１Ｆは、ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。ビヒクルのみ（Ａ）、またはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１６）（Ｂ）、ｍＩＬ－２ｖのみ（Ｃｏｐ．ＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ２７）（Ｃ）、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｄ）、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９３）（Ｅ）、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９６）（Ｆ）、のいずれかで武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
腫瘍成長阻害および生存率をモニターすることに加えて、ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた注射の２４、４８、および７２時間後に、腫瘍を持つマウスから血清を回収して、循環ＩＬ－２レベルを査定した。腫瘍内注射を受けた後のこれらの時点における、各処理群から回収された血清における循環ＩＬ－２レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した（図１２）。ｍＩＬ－２ｖ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルスバリアント（ＶＶ２７、ＶＶ９１、ＶＶ９３、およびＶＶ９６）で処理されたほとんどの動物からの血清において測定可能なレベルのＩＬ－２が検出され、一方でビヒクルまたは他のＣｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ１６）群からの任意の動物において、バックグラウンドレベルのＩＬ－２が見られた。この後者の結果は、少なくとも試験された用量レベルでの、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子を欠如するＣｏｐワクシニアウイルスの腫瘍内注射が、処理された動物の血清における循環ＩＬ－２レベルの増加を誘導するには不十分であったことを示す。ゆえに、ｍＩＬ－２ｖ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルスで処理されたマウスの血清において見られたレベルの上昇は、腫瘍内注射後の導入遺伝子媒介性発現を示していることになる。
図１２は、ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の２４、４８、および７２時間後の、ＬＬＣ腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたＩＬ－２レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスに対する算出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝５／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。
（実施例６）
ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを使用した単回ＩＶウイルス療法（ｍＩＬ－２ｖを発現するＷＲウイルス）
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、５ｅ５個のＭＣ３８腫瘍細胞を左脇腹にＳＣに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの１０日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約５０ｍｍ３；Ｎ＝１５／群）。腫瘍細胞埋め込み後１１日目に、マウスに、１００μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）、または５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを含有する１００μＬのビヒクルをＩＶ注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）１４００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、ｉｉｉ）重度に減退した健康状態、またはｉｖ）調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。
各試験ウイルスに対する群平均として（図１３Ａ）または各試験群内の個々のマウスとして（図１３Ｂ～１３Ｆ）示される腫瘍成長プロファイルの分析は、重要な知見を明らかにした。ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルス（単独でまたはＨＳＶ ＴＫ．００７とともに、ｍＩＬ－２ｖをコードする）のＩＶ投与は、ビヒクルおよびレポーター導入遺伝子武装化ＷＲウイルス（ＶＶ１７）処理と比較して、ＭＣ３８腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながった。ＶＶ７９およびＩＧＶ－１２１によって誘導された腫瘍成長阻害の間に統計的に有意な差はなかったが、しかしながら、ＶＶ７９とＶＶ９４との間に統計的に有意な差が検出された（図１４、ＡＮＣＯＶＡ結果）。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、腫瘍成長阻害について上で報告されたものと非常に類似した成果を示した。これは、対応するＬｕｃ－ＧＦＰレポーター武装化ＷＲウイルスと比較して、ＨＳＶ ＴＫ．００７の存在下または非存在下におけるｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ（図１５）。全体として、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスバリアントのＩＶ送達は、ＭＣ３８ ＳＣ腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力を実証した。
循環ＩＬ－２レベルの査定のために、ＩＶウイルス投薬の７２時間後（１４日目）に、各試験群におけるＭＣ３８腫瘍を持つマウスから血清も回収した。ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子武装化ウイルスが試験された他の調査と一致して、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスが投与されたすべての試験群において、上昇しかつ統計的に有意な血清レベルのＩＬ－２が検出された（図１６）。
図１３Ａ～１３Ｆは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１１日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長軌道が、各処理に関して、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高３２日目までの群平均±９５％信頼区間として（Ａ）、または各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで（Ｂ～Ｆ）示されている。試験ウイルスは、Ａ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を含有し、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ１７）（Ｃ）、ｍＩＬ－２ｖのみ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ；ＶＶ７９）（Ｄ）、Ｊ２Ｒ遺伝子座において逆方向の配向でＨＳＶ ＴＫ．００７とともにｍＩＬ－２ｖ（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ＿Ｒｅｖ）；ＶＶ９４）（Ｅ）、ならびにＢ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｆ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのＩＶ注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図１４．皮下ＭＣ３８腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果（ｐ値）を示している。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。
図１５は、ＳＣ腫瘍埋め込み後１１日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率（ａｕｒｖｉｖａｌ）の結果を示している。毎日、≧１４００ｍｍ３の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。Ｐ値は、選択ウイルス群の間のログランク検定（マンテル・コックス）比較の統計的結果を表す。
図１６は、５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを用いたＩＶ注射の７２時間後（１４日目）の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたＩＬ－２レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスにおいて検出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝１０／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。
（実施例７）
ＬＬＣ腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを使用した単回ＩＶウイルス療法（ｍＩＬ－２ｖを発現するＷＲウイルス）
このセットの実験では、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、１ｅ５個のＬＬＣ腫瘍細胞を右脇腹にＳＣに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの１２日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約５０ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。１４日目に、マウスに、１００μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）、または５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスバリアントを含有する１００μＬのビヒクルをＩＶ注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）２０００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、ｉｉｉ）重度に減退した健康状態、またはｉｖ）調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。
各試験ウイルスに対する群平均として（図１７Ａ）または各試験群内の個々のマウスとして（図１７Ｂ～１７Ｄ）示される腫瘍成長プロファイルの分析は、ＨＳＶ ＴＫ．００７およびＡ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ変異をコードするｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルス（ＩＧＶ－１２１）のＩＶ投与が、レポーター導入遺伝子武装化ＷＲウイルス処理と比較して、ＬＬＣ腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながることを実証した（図１８、ＡＮＣＯＶＡ結果）。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、腫瘍成長阻害について上で報告されたものと非常に類似した成果を示した。これは、対応するＬｕｃ－ＧＦＰレポーター武装化ＷＲウイルスと比較して、ｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７導入遺伝子武装化ＷＲウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ（図１９）。全体として、ｍＩＬ－２ｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスバリアントのＩＶ送達は、ＬＬＣ ＳＣ腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力を実証した。
図１７Ａ～１７Ｄは、ＬＬＣ腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１４日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長軌道が、各処理に関して、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高２７日目までの群平均±９５％信頼区間として（Ａ）、または各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで（Ｂ～Ｄ）示されている。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ；ＶＶ３）（Ｃ）、またはＡ３４Ｒ Ｋ１５１Ｅ変異を有して、Ｂ１５Ｒ／Ｂ１７Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（ＷＲ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＩＧＶ－１２１）（Ｄ）、のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのＩＶ注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図１８は、皮下ＬＬＣ腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果（ｐ値）を示している。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。
図１９は、ＳＣ腫瘍埋め込み後１４日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、ＬＬＣ腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧２０００ｍｍ３の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。Ｐ値は、選択ウイルス群の間のログランク検定（マンテル・コックス）比較の統計的結果を表す。
（実施例８）
ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｍＩＬ－２ｖまたはｈＩＬ－２ｖを発現するＣｏｐウイルス）
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８～１０週齢）に、５ｅ５個のＭＣ３８腫瘍細胞を右上後部脇腹に皮下に（ＳＣ）埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの１０日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約５０ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。埋め込み後１１日目に、腫瘍に、６０μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）、または５ｅ７もしくは２ｅ８プラーク形成単位（ｐｆｕ）の組み換えコペンハーゲン（Ｃｏｐ）ワクシニアウイルスバリアントを含有する６０μＬのビヒクルを直接注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）１４００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、またはｉｉｉ）重度に減退した健康状態、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。マウスの群を以下のように処理した：
群ｉ）ビヒクルのみ；
群ｉｉ）２ｅ８ｐｆｕ用量レベルのＶＶ７：ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（Ｌｕｃ－２Ａ－ＧＦＰ）二重レポーターカセットで武装化されたＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｉｉ）５ｅ７ｐｆｕ用量レベルのＶＶ９１：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ネズミ科インターロイキン２バリアント（ｍＩＬ－２ｖ）導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｖ）２ｅ８ｐｆｕ用量レベルのＶＶ９１：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ネズミ科インターロイキン２バリアント（ｍＩＬ－２ｖ）導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｖ）５ｅ７ｐｆｕ用量レベルのＶＶ１０２：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ヒトインターロイキン２バリアント（ｈＩＬ－２ｖ）導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｖｉ）２ｅ８ｐｆｕ用量レベルのＶＶ１０２：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ヒトインターロイキン２バリアント（ｈＩＬ－２ｖ）導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｖｉｉ）５ｅ７ｐｆｕ用量レベルのＶＶ１０：マウスＧＭ－ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子で武装化されたＣｏｐワクシニアウイルス；または
群ｖｉｉｉ）２ｅ８ｐｆｕ用量レベルのＶＶ１０：マウスＧＭ－ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子で武装化されたＣｏｐワクシニアウイルス。
群（ｉ）～（ｖｉｉｉ）の腫瘍成長プロファイル間の比較（図２０）は、すべての試験ウイルスが、連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらすこと、ならびにマウスおよびヒトＩＬ－２ｖ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルス（それぞれＶＶ９１およびＶＶ１０２）が、マウスＧＭ－ＣＳＦ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ１０）と比較して、連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらすことを明らかにした（図２１、ＡＮＣＯＶＡ結果）。ＶＶ９１（ｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７）によって誘導される腫瘍成長阻害効果と、ＶＶ１０２（ｈＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７）とを比較した場合、統計的に有意な差は観察されなかった。
図２０Ａ～２０Ｉは、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。ビヒクルのみ（Ａ）、５ｅ７ｐｆｕでの、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｂ）、５ｅ７ｐｆｕでの、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｈＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｃ）、５ｅ７ｐｆｕでの、ｍＧＭ－ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ－ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｄ）、２ｅ８ｐｆｕでの、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（Ｃｏｐ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ；ＶＶ７）（Ｅ）、２ｅ８ｐｆｕでの、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｍＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｍＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ９１）（Ｆ）、２ｅ８ｐｆｕでの、Ｂ１６Ｒ遺伝子座において順方向の配向でｈＩＬ－２ｖおよびＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｃｏｐ．ｈＩＬ－２ｖ．Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ．ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ＿Ｆｏｒ）；ＶＶ１０２）（Ｇ）、ならびに２ｅ８ｐｆｕでの、ｍＧＭ－ＣＳＦおよびＬａｃＺレポーター導入遺伝子（Ｃｏｐ．ｍＧＭ－ＣＳＦ／ＬａｃＺ；（ＶＶ１０））（Ｈ）、のいずれかで武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。各処理群に関する平均腫瘍容積（ｍｍ３）が、腫瘍埋め込み後２８日目まで示されている（Ｉ）。
図２１は、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。ビヒクル／ウイルス処理後（腫瘍埋め込み後１４日目～２８日目）の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果（ｐ値）を示している。太字フォントの値は、ｐ≦０．０５の場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。
各処理群（Ｎ＝２０／群）における動物の生存率も、腫瘍埋め込み後最高４２日目まで査定した（図２２）。この場合、ＶＶ９１およびＶＶ１０２の両方で処理されたマウスは、ビヒクル、ＶＶ７、およびＶＶ１０処理群と比べて、統計的に有意な平均生存率優位性を示した（ログランク／マンテル・コックス検定によるＰ値に関しては、図２２における表を参照されたい）。
図２２Ａ～２２Ｂは、埋め込み後１１日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、ＭＣ３８腫瘍を埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧１４００ｍｍ３の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。（Ａ）は、５ｅ７ｐｆｕウイルスを投薬された群を示している。（Ｂ）は、２ｅ８ｐｆｕのウイルスを投薬された群を示している。
腫瘍成長阻害および生存率をモニターすることに加えて、ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた注射の２４時間後に、腫瘍を持つマウスから血清を回収して、循環ＩＬ－２レベルを査定した。腫瘍内注射を受けた２４時間後に、各処理群から回収された血清における循環マウスＩＬ－２およびヒトＩＬ－２レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量した（それぞれ図２３および図２４）。ＩＬ－２ｖ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルスバリアント（ＶＶ９１およびＶＶ１０２）で処理されたほとんどの動物からの血清において測定可能なレベルのＩＬ－２が検出され、一方でビヒクルまたは他のＣｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ７およびＶＶ１０）群からの任意の動物において、バックグラウンドレベルのＩＬ－２が見られた。目立ったことには、有意に上昇したレベルのマウスＩＬ－２は、ｍＩＬ－２ｖ発現ウイルス（ＶＶ９１）を受けたマウスの血清においてのみ検出され、有意に上昇したレベルのヒトＩＬ－２は、ｈＩＬ－２ｖ発現ウイルス（ＶＶ１０２）を受けたマウスの血清においてのみ検出された。ゆえに、ＩＬ－２ｖ武装化Ｃｏｐワクシニアウイルスで処理されたマウスの血清において見られたレベルの上昇は、腫瘍内注射後の導入遺伝子媒介性発現を示していることになる。
図２３は、ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の２４時間後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたマウスＩＬ－２レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスに対する算出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝１０／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。
図２４は、ビヒクルまたは組み換えＣｏｐワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の２４時間後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたヒトＩＬ－２レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスに対する算出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝９／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。
（実施例９）
ＨＣＴ－１１６腫瘍を持つヌードマウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｈＩＬ－２ｖを発現するＣｏｐウイルス）
ヌード雌マウスに、５ｅ６個のＨＣＴ－１１６腫瘍細胞を右脇腹にＳＣに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの８日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約５０ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。腫瘍細胞埋め込み後９日目に、マウスに、１００μＬのビヒクルのみ、または準最適用量（３ｅ５ｐｆｕ）の組み換え腫瘍溶解性Ｃｏｐワクシニアウイルスを含有するビヒクルをＩＶ注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）１４００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、ｉｉｉ）重度に減退した健康状態、またはｉｖ）調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。マウスの群を以下のように処理した：
群ｉ）ビヒクルのみ；
群ｉｉ）ＶＶ９０：欠失したＪ２Ｒ遺伝子領域に挿入された導入遺伝子を有しない、Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ変異（アミノ酸置換）を有するＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｉｉｉ）ＶＶ２７：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ネズミ科インターロイキン２バリアント（ｍＩＬ－２ｖ）導入遺伝子で武装化されたＣｏｐワクシニアウイルス（ＶＶ２７）；
群ｉｖ）ＶＶ９１：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ネズミ科インターロイキン２バリアント（ｍＩＬ－２ｖ）導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、順方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；
群ｖ）ＶＶ９３：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ネズミ科インターロイキン２バリアント（ｍＩＬ－２ｖ）導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｊ２Ｒ挿入、逆方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス；または
群ｖｉ）ＶＶ９６：Ａ３４Ｒ－Ｋ１５１Ｅ置換を有し、ネズミ科インターロイキン２バリアント（ｍＩＬ－２ｖ）導入遺伝子で武装化され、ＨＳＶ ＴＫ．００７（Ｂ１６Ｒ挿入、逆方向の配向）をコードするＣｏｐワクシニアウイルス。
群（ｉ）～（ｖｉ）の腫瘍成長プロファイル間の比較（図２５）は、すべての試験ウイルスが、ヒト異種移植片腫瘍において連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらすことを明らかにした。
図２５は、ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたヌード雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。各処理群に関する平均腫瘍容積（ｍｍ３）が、腫瘍埋め込み後４０日目まで示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
（実施例１０）
導入遺伝子武装化ＷＲワクシニアウイルスに感染した細胞から産生されたｈＩＬ－２ｇｖおよびｈＩＬ－２ｖタンパク質の機能的査定
ＩＬ－２受容体複合体へのＩＬ－２結合は、シグナル伝達分子ＳＴＡＴ５のリン酸化をもたらす。ゆえに、ＳＴＡＴ５のリン酸化を使用して、ＩＬ－２受容体シグナル伝達を測定し得る。ワクシニアウイルスによって産生された導入遺伝子を回収するために、ＨｅＬａ細胞に、Ｔ－１５０フラスコ中でＭＯＩ＝３の表示ウイルスを２４時間感染させた。インキュベーションの後、上清を回収しかつ濃縮し、濃縮された上清におけるＩＬ－２レベルをＭＳＤアッセイによって判定し、ｐＳＴＡＴ５アッセイにおいて正規化した。ＩＬ２導入遺伝子生物活性を査定するために、ナイーブＣ５７ＢＬ／６雌マウス由来の脾細胞を単離し、丸底９６ウェルプレートに１ｅ６個細胞／ウェルで播き、ウイルス単離ＩＬ－２、ＩＬ－２グリコバリアント、またはＩＬ－２バリアントと１５分間インキュベートした。細胞を固定し、透過処理し、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５、抗Ｆｏｘｐ３、抗ＮＫｐ４６、および抗ｐＳＴＡＴ５抗体で染色し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで取得した。ｐＳＴＡＴ５の蛍光強度中央値を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して特異的細胞集団において分析した。組み換えワクシニアウイルスによってコードされるＩＬ－２グリコバリアント（すなわち、ＩＬ－２ｇｖ１およびＩＬ－２ｇｖ２）は、ｐＳＴＡＴ５を誘導することにおける濃度効力の低下によって示されるように、野生型ＩＬ－２と比較した場合、Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）に対する活性の低下を示した。対照的に、ＩＬ－２バリアント（ＩＬ－２ｖ）およびＩＬ－２グリコバリアントは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方において、野生型ＩＬ－２と同様のシグナル伝達濃度効力を示した。まとめると、これらのデータは、中アフィニティーＩＬ－２Ｒを発現する細胞を刺激することにおいて、野生型ｈＩＬ－２に匹敵する、ヒト細胞において産生されるｈＩＬ－２グリコバリアントおよびｈＩＬ－２バリアントの予想される能力と一致しているが、高アフィニティーＩＬ－２Ｒα（別名ＣＤ２５）を発現する細胞に対してはほんの弱い活性である。
図２９Ａ～２９Ｃは、組み換えＷＲワクシニアウイルスによって発現されたＩＬ－２バリアント導入遺伝子とインキュベートされたネズミ科脾細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の査定の結果を示している。ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２バリアント、またはｈＩＬ－２グリコバリアントのいずれかとインキュベートされたネズミ科脾細胞のサブセットにおけるｐＳＴＡＴ５誘導の比較。ＩＬ－２機能性を、ＩＬ－２Ｒ媒介性シグナル伝達の読み出しとして細胞内ｐＳＴＡＴ５レベルの測定を使用して査定した。脾細胞を、細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＮＫｐ４６）および細胞内タンパク質（ＦｏｘＰ３）に対する抗体で付加的に染色して、種々のＩＬ２Ｒ複合体を発現するネズミ科リンパ球の様々なサブセットを描出した。グラフは、表示ウイルスによって分泌されるｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２バリアント、またはｈＩＬ－２グリコバリアントタンパク質の増加する処理濃度（ｘ軸）に応答した、ｐＳＴＡＴ５の細胞内染色の蛍光強度中央（ＭＦＩ）値（ｙ軸）の変化を示している。略語：ｐＳＴＡＴ５＝リン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子５；ＭＦＩ＝蛍光強度中央値；Ｔｒｅｇ＝ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔ調節性細胞。
（実施例１１）
ＩＶ投与後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｈＩＬ－２、ｈＩＬ－２ｖ、ｈＩＬ－２ｇｖ１、ｈＩＬ－２ｇｖ２を発現するＷＲウイルス）
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、５ｅ５個のＭＣ３８腫瘍細胞を左脇腹にＳＣに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの１０日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約６０ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。腫瘍細胞埋め込み後１１日目に、マウスに、１００μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）、または５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを含有する１００μＬのビヒクルをＩＶ注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）１４００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、ｉｉｉ）重度に減退した健康状態、またはｉｖ）調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。
体重分析は、野生型ＩＬ－２導入遺伝子武装化ＷＲウイルスが、任意の他のバリアントを受けた動物と比較して、体重のより大きな喪失と関連付けられることを示した（図３０）。
図３０は、埋め込み後１１日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、ＭＣ３８腫瘍を埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスの体重の結果を示している。体重は、処理開始時の個々の体重に基づいて％単位で示されている。各処理は、腫瘍埋め込み後最高２４日目までの群幾何平均±９５％信頼区間として示されている。それらの初期体重と比較して２０％を上回る体重喪失を有する動物を、人道的理由で安楽死させた。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＶＶ３））、ＷＴ ＩＬ－２、ＩＬ－２ｖ、ＩＬ－２ｇｖ１、またはＩＬ－２ｇｖ２のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのＩＶ注射を受けた時点を表す。グラフ上の水平線は、各マウスの初期体重を表す１００％体重ベースラインを表す。
循環ＩＬ－２および炎症性サイトカインレベルの査定のために、ＩＶウイルス投薬の７２時間後（腫瘍埋め込み後１４日目）に、各試験群におけるＭＣ３８腫瘍を持つマウスから血清も回収した。ＩＬ－２導入遺伝子武装化ウイルスが試験された他の調査と一致して、ＩＬ－２導入遺伝子武装化ＷＲウイルスが投与されたすべての試験群において、上昇しかつ統計的に有意な血清レベルのＩＬ－２が検出された（図３１）。さらに、ｈＩＬ－２ｇｖ武装化腫瘍溶解性ウイルスを受けたマウスは、野生型ｈＩＬ－２武装化腫瘍溶解性ウイルスを受けた動物と比較して、統計的に有意な上昇した血清レベルのＩＬ－２を有した。炎症性サイトカインの分析は、ｈＩＬ－２ｇｖ導入遺伝子武装化ＷＲワクシニアウイルスではなくｈＩＬ－２のＩＶ投与が、ＩＦＮγ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１０を含めた、いくつかの炎症促進性サイトカインの有意な上昇を引き起こすことを明らかにした（図３２、表３）。
図３１は、５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを用いたＩＶ注射の７２時間後（１４日目）の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出されたＩＬ－２レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスにおいて検出されたＩＬ－２血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均（Ｎ＝１０／群）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間を表す。統計学を、＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ＜０．０１；および＊＊＊＝ｐ＜０．００１を有して、ＶＶ９９と比較した、テューキーの事後多群比較検定とともに一元配置Ａｎｏｖａ検定を使用して実施した。
図３２（表３）は、５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを用いたＩＶ注射の７２時間後（１４日目）の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスから回収された血清において検出された炎症性サイトカインレベルの結果を示している。ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスの静脈内投与の７２時間後に、血清サイトカインレベルを測定した。ＶＶ９９処理された動物と比較した、検出されたサイトカインレベルの間の統計比較を、テューキーの事後多群比較検定とともに一元配置ＡＮＯＶＡを使用して実施した。各列は、示されたサイトカインに対する幾何平均サイトカインレベル（Ｎ＝１０／試験群）を示している。＊＝ｐ＜０．０５；＊＊＝ｐ，０．０１；＋＝ｐ＜０．００１；＾＝ｐ＜０．０００１。
各試験ウイルスに対する群平均として示される腫瘍成長プロファイルの分析（図３３）は、重要な知見を明らかにした。すべてのＩＬ－２導入遺伝子武装化ＷＲウイルスのＩＶ投与は、ビヒクルおよびレポーター導入遺伝子武装化ＷＲウイルス（ＶＶ３）処理と比較して、ＭＣ３８腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながった。すべてのバリアントは、ビヒクル対照またはＶＶ３と比較して、腫瘍成長を有意に低下させた。一部の時点は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２バリアントおよびグリコバリアント含有ウイルスの間の統計的に有意な差も明らかにしたが、しかしながら最も顕著な知見は、任意の形態のＩＬ－２を含有するすべてのウイルスバリアントが、腫瘍成長の導入遺伝子媒介性低下をもたらしたことであった（表４、ＡＮＣＯＶＡ結果）。
図３３は、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する、単回の（１１日目に投与される）ＩＶウイルス送達を使用したウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長曲線は、その時点で調査が終結した腫瘍埋め込み後最高４９日目までの群幾何平均±９５％信頼区間として、各処理に対して示されている。動物の１５％が、１４００ｍｍ３に達した腫瘍負荷に起因して安楽死され次第、その群はもはや幾何平均データを報告しなかった。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＶＶ３））、ＷＴ ＩＬ－２、ＩＬ－２ｖ、ＩＬ－２ｇｖ１、またはＩＬ－２ｇｖ２のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのＩＶ注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図３４（表４）は、皮下ＭＣ３８腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果（ｐ値）を示している。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、より多くの数の動物が、腫瘍負荷と無関係の病的状態に起因して死亡し、ＩＬ－２バリアントまたはグリコバリアントを持つバリアントと比較してより短い生存率中央値を経験することから、ＷＴ ＩＬ－２が、バリアントよりも低い忍容性の閾値を有することを示した（図３５）。これは、対応するＬｕｃ－ＧＦＰレポーター武装化ＷＲウイルスと比較して、ＩＬ－２ｖ／ｇｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ（図３６、表５）。全体として、ＩＬ－２ｖまたはＩＬ－２ｇｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスバリアントのＩＶ送達は、ＭＣ３８ ＳＣ腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力および野生型ＩＬ－２よりも低い毒性を実証した。
図３５は、ＳＣ腫瘍埋め込み後１１日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の結果を示している。マウスを毎日モニターし、動物が＞２０％の体重を喪失した場合、≧１４００ｍｍ３の腫瘍容積に達し次第、死んだものとみなした、または臨床観察に基づいて瀕死であると判定した。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。
図３６（表５）は、皮下ＭＣ３８腫瘍モデル調査におけるウイルス療法後の生存率の統計比較の結果を示している。図３５からの生存率データを、ログランク検定（マンテル・コックス）によって分析した。Ｐ値は、選択ウイルス群の間のログランク検定（マンテル・コックス）比較の統計的結果を表す。
（実施例１２）
ＨＣＴ－１１６腫瘍を持つヌードマウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｈＩＬ－２ｇｖ、ｈＩＬ－２ｖを発現するＣｏｐウイルス、およびｈＧＭ－ＣＳＦ／ＬａｃＺを発現するワイエスウイルス）
ヌード雌マウスに、５ｅ６個のＨＣＴ－１１６腫瘍細胞を右脇腹にＳＣに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの１２日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約１５０ｍｍ３；Ｎ＝１６／群）。腫瘍細胞埋め込み後１３日目に、マウスに、１００μＬのビヒクルのみ、または３ｅ６ｐｆｕの組み換え腫瘍溶解性Ｃｏｐワクシニアウイルスを含有するビヒクルをＩＶ注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）１４００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、ｉｉｉ）重度に減退した健康状態、またはｉｖ）調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。マウスの群を以下のように処理した：群ｉ）ビヒクルのみ；群ｉｉ）ＶＶ７：欠失したＪ２Ｒ遺伝子領域に挿入されたｌｕｃ－２Ａ－ＧＦＰ導入遺伝子を有するＣｏｐワクシニアウイルス；群ｉｉｉ）ＶＶ１０２：Ｋ１５１Ｅ変異およびＨＳＶ－ＴＫ．００７を有する、欠失したＪ２Ｒ遺伝子領域に挿入されたｈＩＬ２ｖ導入遺伝子を有するＣｏｐワクシニアウイルス；群ｉｖ）ＶＶ７５：Ｋ１５１Ｅ変異を有する、欠失したＪ２Ｒ遺伝子領域に挿入されたｈＩＬ２ｖ導入遺伝子を有するＣｏｐワクシニアウイルス；群ｖ）ＶＶ０８：欠失したＪ２Ｒ遺伝子領域に挿入されたｌｕｃ－２Ａ－ＧＦＰ導入遺伝子を有するワイエスワクシニアウイルス；群ｖｉ）ＶＶ１２：欠失したＪ２Ｒ遺伝子領域に挿入されたｈＧＭ－ＣＳＦ導入遺伝子を有するワイエスワクシニアウイルス；または群ｖｉｉ）ＶＶ１１０：Ｋ１５１Ｅ変異およびＨＳＶ－ＴＫ．００７を有する、欠失したＪ２Ｒ遺伝子領域に挿入されたｈＩＬ２ｇｖ導入遺伝子を有するＣｏｐワクシニアウイルス。
群（ｉ）～（ｖｉｉ）の腫瘍成長プロファイル間の比較（図３７）は、すべての試験ウイルスが、ＨＣＴ－１１６ヒト異種移植片モデルにおいて連続複数日にわたって腫瘍成長に対して阻害効果をもたらすことを明らかにした。図３８、表６に示されるように、統計的有意性は種々の比較について達成された。
図３７は、ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたヌード雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。各処理群に関する平均腫瘍容積（ｍｍ３）が、腫瘍埋め込み後４３日目まで示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスのＩＶ注射を受けた時点を表す。グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図３８（表６）は、ヌードマウスにおける皮下ＨＣＴ－１１６腫瘍に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果（ｐ値）を示している。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。
ＨＣＴ－１１６腫瘍を持ち、上で記載されるようにウイルスでＩＶ処理されたヌードマウスを、生存率についてモニターした。２０００ｍｍ３に達した腫瘍を安楽死基準として規定し、動物を４５日間毎日モニターした。
図３９は、ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたヌード雌マウスに関するウイルス療法誘導性生存率の査定の結果を示している。腫瘍が２０００ｍｍ３に達し次第、安楽死を実施した。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルス（３Ｅ６ＰＦＵ）のＩＶ注射を受けた時点を表す。グラフ上の水平破線は、５０パーセント生存率、すなわち生存率中央値を表す。
図４０（表７）は、ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたヌード雌マウスにおけるウイルス療法誘導性生存率の統計比較の結果を示している。生存率をモニターし、次いでログランク検定（マンテル・コックス）によって分析した。各群比較に対してＰ値が挙げられている。
（実施例１３）
ＩＶ投与後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｈＩＬ－２ｖ、ｈＩＬ－２ｇｖ１、ｍＩＬ－２ｖを発現するＷＲウイルス）
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、５ｅ５個のＭＣ３８腫瘍細胞を左脇腹にＳＣに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの１５日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約１００ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。腫瘍細胞埋め込み後１６日目に、マウスに、１００μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）、または５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを含有する１００μＬのビヒクルをＩＶ注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）１４００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、ｉｉｉ）重度に減退した健康状態、またはｉｖ）調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。
各試験ウイルスに対する群平均として示される腫瘍成長プロファイルの分析（図４１）は、重要な知見を明らかにした。すべてのＩＬ－２導入遺伝子武装化ＷＲウイルスのＩＶ投与は、ビヒクルおよびレポーター導入遺伝子武装化ＷＲウイルス（ＶＶ３）処理と比較して、ＭＣ３８腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながった。Ｋ１５１Ｅ変異＆ＨＳＶ ＴＫ．００７導入遺伝子の付加は、腫瘍成長阻害をさらに向上させた。ＶＶ１１７およびＩＧＶ－１２１によって誘導された腫瘍成長阻害の間に統計的に有意な差はなかったが、しかしながら、ＶＶ１１７とＶＶ１００との間およびＩＧＶ－１２１とＶＶ３９との間に統計的に有意な差が検出された（図４２、表８、ＡＮＣＯＶＡ結果）。
図４１は、ＭＣ３８腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１６日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長軌道が、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高５５日目までの群平均±９５％信頼区間として各処理に関して示されている。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＶＶ３））、ｈＩＬ－２ｇｖ１（ＷＲ．ｈＩＬ－２ｇｖ１．ＨＳＶ ＴＫ．００７．Ａ３４Ｋ１５１Ｅ（ＶＶ１１７、ＩＧＶ－１２１）、ｈＩＬ－２ｖ（ＶＶ１００）、またはｍＩＬ－２ｖ（ＶＶ３））のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのＩＶ注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図４２（表８）は、皮下ＭＣ３８腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果（ｐ値）を示している。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、腫瘍成長阻害について上で報告されたものと非常に類似した成果を示した（図４３）。これは、対応するＬｕｃ－ＧＦＰレポーター武装化ＷＲウイルスと比較して、ＩＬ－２ｖ／ｇｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ（図４４、表９）。全体として、ＩＬ－２ｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスバリアントのＩＶ送達は、ＭＣ３８ ＳＣ腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力を実証した。
図４３は、ＳＣ腫瘍埋め込み後１６日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、ＭＣ３８腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧１４００ｍｍ３の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。Ｐ値は、選択ウイルス群の間のログランク検定（マンテル・コックス）比較の統計的結果を表す。
図４４（表９）は、ウイルス療法誘導性生存率の統計比較の結果を示している。生存率をモニターし、次いでログランク検定（マンテル・コックス）によって分析した。各群比較に対してＰ値が挙げられている。
（実施例１４）
ＩＶ投与後の、Ｂ１６腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性（ｈＩＬ－２ｇｖ１を発現するＷＲウイルス）
Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスに、２．５ｅ５個のＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞を右脇腹にＳＣに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの１７日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた（群あたりの平均腫瘍容積約１００ｍｍ３；Ｎ＝２０／群）。腫瘍細胞埋め込み後１８日目に、マウスに、１００μＬのビヒクル（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％スクロース、ｐＨ８．０）、または５ｅ７ｐｆｕの組み換えＷＲワクシニアウイルスを含有する１００μＬのビヒクルをＩＶ注射した。腫瘍細胞埋め込み後２１、２４、２７、３１、３４、および３８日目に、マウスに、１００ｕＬの抗体製剤（２ｍｇ／ｍＬ、抗ＰＤ－１またはＩｇＧ１アイソタイプ）をＳＣ注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、ｉ）１４００ｍｍ３を超える腫瘍容積、ｉｉ）≧２０％の体重喪失、ｉｉｉ）重度に減退した健康状態、またはｉｖ）調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を２週間に１回測定した。
各試験ウイルスに対する群平均として示される腫瘍成長プロファイルの分析（図４５）は、重要な知見を明らかにした。ＩＬ－２ｇｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスのＩＶ投与は、ビヒクルおよびレポーター導入遺伝子武装化ＷＲウイルス（ＶＶ３）処理と比較して、ＭＣ３８腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながった。ビヒクル処理された腫瘍に対して、抗ＰＤ－１またはＩｇＧ１アイソタイプ抗体処理によって誘導された腫瘍成長阻害の間に統計的に有意な差はなかった。しかしながら、ＶＶ３およびＶＶ１１７に関しては、抗ＰＤ－１またはＩｇＧ１アイソタイプ抗体処理の間に統計的に有意な差が検出された（図４６、表１０、ＡＮＣＯＶＡ結果）。
図４５は、抗ＰＤ－１抗体処理との組み合わせで、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞をＳＣに埋め込まれたＣ５７ＢＬ／６雌マウスに対する単回の（１８日目）ＩＶウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長軌道が、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高３５日目までの群平均±９５％信頼区間として各処理に関して示されている。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ－２Ａ－ＧＦＰレポーター（ＷＲ．Ｌｕｃ－ＧＦＰ（ＶＶ３））、ｈＩＬ－２ｇｖ１（ＷＲ．ｈＩＬ－２ｇｖ１．ＨＳＶ ＴＫ．００７．Ａ３４Ｋ１５１Ｅ（ＶＶ１１７））のいずれかで武装化されたＷＲワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのＩＶ注射を受けた時点を表す。灰色のブロックは、２週間に１回のＳＣ抗ＰＤ１抗体処理に対する時間ウィンドウ（２１日目～３８日目）を示す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図４６（表１０）は、皮下Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデル調査に関する、ＡＮＣＯＶＡを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をＡＮＣＯＶＡによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果（ｐ値）を示している。太字フォントの値は、ｐ値≦０．０５が観察された場合の比較ＡＮＣＯＶＡ結果を表す。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、腫瘍成長阻害について上で報告されたものと非常に類似した成果を示した。これは、対応するＬｕｃ－ＧＦＰレポーター武装化ＷＲウイルスと比較して、ＩＬ－２ｇｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ（図４７）。アイソタイプ処理された腫瘍と比較して、抗ＰＤ－１抗体で処理されたビヒクル処理腫瘍に関して、生存率有益性は観察されなかった。しかしながら、ＶＶ３およびＶＶ１１７に関しては、抗ＰＤ－１およびＩｇＧ１アイソタイプ抗体処理の間に統計的に有意な差が検出された（図４８、表１１）。全体として、ＩＬ－２ｇｖ導入遺伝子武装化ＷＲウイルスバリアントのＩＶ送達は、Ｂ１６Ｆ１０ ＳＣ腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力を実証した。
図４７は、ＳＣ腫瘍埋め込み後１８日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたＩＶ処理後の、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を持つＣ５７ＢＬ／６雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧１４００ｍｍ３の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値（５０％）閾値を示す。
図４８（表１１）は、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおけるウイルス療法誘導性生存率の統計比較の結果を示している。生存率をモニターし、次いでログランク検定（マンテル・コックス）によって分析した。各群比較に対してＰ値が挙げられている。
（実施例１５）
本実施例では、様々な潜在的単一および二重グリカンヒトＩＬ－２バリアントを発現させ、導入された潜在的グリコシル化部位におけるグリコシル化についてアッセイした。
ＩＬ－２バリアントのそれぞれを、ＩＬ－２バリアントが、アミノ酸配列：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３７）を有するリンカーを介してヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに共有結合で連結された融合タンパク質として発現させた。Ｆｃドメインは、第１のＦｃ鎖および第２のＦｃ鎖を含有し、第１のＦｃ鎖は「ノブ」アミノ酸置換を含有しかつ第２のＦｃ鎖は「ホール」アミノ酸置換を含有して、Ｆｃ鎖の間でのヘテロ二量体形成を促進する。ＩＬ－２バリアントのＮ末端を、第１のＦｃ鎖のＣ末端にリンカーを介して共有結合で連結させた。Ｆｃ－ＩＬ－２分子の概略は、図４９に描写されている。
融合タンパク質をコードする遺伝子を調製するために、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（結晶化可能なフラグメントＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８５７）のＣ末端に融合したヒトＩＬ－２（Ｒｅｆｓｅｑ：ＮＭ＿０００５８６．３、ＣＣＤＳ：ＣＣＤＳ３７２６．１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６０５６８）の内因性コドンを使用して、遺伝子合成を実施した。Ｆｃフラグメントは、上部ヒンジ残基Ｄ２２１（２２１～４４７位ＥＵ番号付け）から開始し、エフェクター機能不活性化変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａを含んだ。ノブ・イン・ホール重鎖ペアを利用して、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号３７）を使用して、ノブ鎖のＣ末端に単一ＩＬ－２バリアントを融合させた。ノブ鎖対合変異をＹ３４９ＣおよびＴ３６６Ｗに、ホール鎖変異をＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖに作製した。定常領域は、Ｇ１ｍからｎＧ１ｍ１へのＤ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍアロタイプ変異も含有した。遺伝子を、ＡＴＵＭ（Ｎｅｗａｒｋ、ＣＡ）によって哺乳類発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。
融合タンパク質を、供給元の使用説明書に従って、Ｅｘｐｉ２９３またはＥｘｐｉＣＨＯ発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかを使用して一過性のトランスフェクションによって発現させた。Ｆｃ－ＩＬ２融合タンパク質を、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）を使用したタンデムプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、およびＨｉＬｏａｄ １６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製された融合タンパク質をフィルター滅菌し、使用前に－８０℃で保管した。
Ｆｃ－ＩＬ２融合タンパク質の純度および均一性を、ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ ｍＡｂ ＨＲカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣを用いた分析サイズ排除クロマトグラフィー、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用したマイクロ流体電気泳動分離、および質量分析によって評価した。精製された融合タンパク質のインタクト質量を、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４ ３００Å １．７μｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）につないだＸｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴｏｆ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ飛行時間型質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）によって確認した。
精製されたＦｃ－ＩＬ２バリアント分子を、ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理に供して、分子がグリコシル化されたかどうか、そうである場合には、一方または両方の（適用可能である場合）導入された潜在的グリコシル化部位においてグリコシル化されたかどうかを検出した。具体的には、Ｆｃ－ＩＬ２融合タンパク質を、まず、ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐ０７１０ＳおよびＰ０７１１Ｓ）を使用して非還元および還元条件において脱グリコシル化して、インタクトタンパク質（非還元）および還元タンパク質の質量を判定した。Ｆｃ－ＩＬ２融合タンパク質由来のＮ－結合型グリカンの特徴付けを、供給元のプロトコールに従って、「ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓＴＭ ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳＴＭ Ｎ－Ｇｌｙｃａｎ Ｋｉｔ」（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して行った。タンパク質をＲａｐｉＧｅｓｔ溶液で処理し、変性させた。Ｒａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆを添加して、Ｎ－結合型グリカンをグリコシルアミンとして放出した。消化の後、放出されたグリコシルアミンのアミノ基を、メーカーの使用説明書に従ってＲＦＭＳ標識で標識した。標識されたＮ－グリカンを、ギ酸アンモニウムおよびアセトニトリル溶液中にてＷａｔｅｒｓ親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）μＥｌｕｔｉｏｎプレートを使用して精製し、次いでＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）によって直接分析した。
表Ａは、発現させかつグリコシル化についてアッセイした、潜在的単一および二重グリカンＩＬ－２バリアント分子を挙げている。対照として、Ｆｃ－ＩＬ２（野生型）分子も発現させかつ試験した。下で挙げられるＩＬ－２タンパク質において、「部位１」とは、タンパク質名における第１の挙げられた潜在的グリコシル化部位であり、「部位２」とは、タンパク質名における第２の挙げられた潜在的グリコシル化部位である（適用可能である場合）。例えば、「Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ」というタンパク質において、部位１はＲ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔであり、部位２はＴ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔである。付加的に、グリコシル化を、ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理後に、アスパラギン酸形成の検出を通じて質量分析によっても確認した。Ｆｃドメイン上にＡｓｎ２９７部位を含むグリカン修飾の総数、ならびに融合したＩＬ－２サイトカインに特異的に起因するものが示されている。（各分子は２つのＡｓｎ２９７グリカンを有し、そのため各分子は少なくとも２つの総Ｎ－グリカンを有する）。
Figure 2023533567000015
表Ａに示されるように、導入されたグリコシル化部位Ｒ３８Ｎ：Ｋ４０Ｔ、Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ、Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ、およびＬ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔは、関連するアスパラギン上ですべて高度にグリコシル化された（ほとんどが＞９９％を超えて、分子の９０％を上回る割合）。部分的グリコシル化が潜在的グリコシル化部位Ｋ３５Ｎに関して観察され、導入されたアスパラギンは中程度にグリコシル化された（分子のおよそ３分の１）。対照的に、導入された潜在的グリコシル化部位Ｆ４２Ｎ：Ｆ４４Ｔ、Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ、およびＥ６８Ｎ：Ｌ７０Ｔはグリコシル化されなかった。
（実施例１６）
本実施例では、上で記載される様々な二重グリカンＩＬ－２バリアントを、ヒトＩＬ－２ＲαおよびヒトＩＬ－２Ｒβへの結合アフィニティーについてアッセイした。
すべての実験をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ表面プラズモン共鳴ベースのバイオセンサー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。精製された可溶性リガンドを、メーカーの推奨に従って、Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品＃ ＢＲ１０００５０）を使用してＣＭ５センサーチップに共有結合させた。濃度に幅があるＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｐ－２０）を、すべてのフローセルに２０μＬ／分で７分間インジェクトした。ＣＤ２５およびＣＤ１２２を、それぞれ約２０および約５００ＲＵの表面密度まで捕捉した。非誘導体化フローセルを参照表面として使用した。すべてのフローセルを、１０μＬ／分の２００ｍＭホウ酸塩緩衝液ｐＨ８．５中１００ｍＭエチレンジアミンで７分間ブロッキングした。
タンパク質相互作用実験を、各スポットで２５℃にてＨＢＳ－ＥＰ＋（ｐＨ７．４）を使用して実施した。抗原の捕捉後、分析物（１．２３、３．７、１１．１、３３．３、１００、３００、および９００ｎＭの濃度のＩＬ－２バリアント）をすべてのフローセルに５０μＬ／分の流速で５０秒間インジェクトした。各分析物インジェクションの後、解離を５分間モニターし、その後に１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．１）の２０秒間のインジェクションを用いたすべてのフローセルの再生が続いた。二重参照目的のために、緩衝液サイクルを各サンプルに関して回収した（Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２、２７９～２８４（１９９９）に記載される二重参照）。反応速度論分析に関しては、二重参照されたセンサーグラムを、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．１．７４４２を使用して、大量輸送結合モデルに関する単純１：１ラングミュアに全体的にフィットさせた。定常状態アフィニティー分析に関しては、二重参照された平衡結合応答を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．１．１．７４４２を使用して、１：１ラングミュア定常状態モデルとフィットさせた。
試験されたＩＬ－２バリアントに関する反応速度論およびアフィニティーパラメーターが、下の表Ｂに示されている。
Figure 2023533567000016
表Ｂに示されるように、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５ＴおよびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔバリアントは、野生型ＩＬ－２ Ｆｃ融合体と同様の、ヒトＩＬ－２Ｒβへの結合アフィニティーを保持する。野生型Ｆｃ－ＩＬ－２融合体は、ＩＬ－２Ｒβへよりも、ＩＬ－２Ｒαへのはるかに高い結合アフィニティーを示した。対照的に、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５ＴおよびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔバリアントは、ＩＬ－２Ｒαへの測定可能な結合を有しない。
（実施例１７）
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンＩＬ－２バリアントを、ＩＬ－２ ＣＤ１２２／ＣＤ１３２（β／γ）受容体複合体（ＨＨ細胞）またはＩＬ－２ ＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２（α／β／γ）受容体複合体（誘導性Ｔｒｅｇ（または「ｉＴｒｅｇ」））のいずれかを含有するリンパ球の活性化についてアッセイした。
実施例１５に記載される様々なＦｃ連結単一および二重グリカンＩｌ－２バリアントを試験した。試験されたバリアントは、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ；およびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔであった。加えて、Ｆｃ連結野生型ヒトＩＬ－２（「Ｆｃ－ＩＬ２」）およびＦｃ連結ＩＬ２ｖ（「Ｆｃ－ＩＬ２ｖ」）も試験した。「ＩＬ２ｖ」とは、ＩＬ－２Ｒα結合を無効にする変異を有する、ヒトＩＬ－２のバリアントである（Ｋｌｅｉｎ，Ｃら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．６、Ｎｏ．３、２０１７）。ＩＬ２ｖは、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの間の相互作用を排除する以下の変異：Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇを有する。加えて、ＩＬ２ｖは、変異Ｔ３ＡおよびＣ１２５Ａを有する。
ＨＨ細胞およびｉＴｒｅｇを活性化するＩＬ－２バリアントの能力を、ＩＬ－２バリアントを用いた細胞の処理に応答したリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の相対的変化をモニターすることによって測定した。ｐＳＴＡＴ５は、ＩＬ－２シグナル伝達の下流の結果であることが公知である。ＨＨ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２１０５）は、ＩＬ－２受容体複合体のアルファ鎖を欠如するが、ＩＬ－２受容体複合体のベータおよびガンマ鎖を含有するＴ細胞の株である。ｉＴｒｅｇ細胞は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから獲得されたＦｒｅｓｈ Ｌｅｕｋｏ Ｐａｋｓ（ＣＡＴ＃７０５００．１、ドナー＃Ｄ００１００３５５１）から調製された。
ＩＬ－２活性化に関しては、ＨＨ細胞およびｉＴｒｅｇ細胞を、５０ｕｌ無血清ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中に２＊１０ｅ６個細胞／ウェルで播き、３７℃で静置させた。静置の後、細胞を、上で挙げられたＩＬ－２分子で処理し、次いで細胞を遠心分離によってペレットにした。
ＩＬ－２分子を用いた処理の後、細胞誘導状態をＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ ＥＬＩＳＡ ｐＳＴＡＴ５検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって評価した。
図５０Ａおよび５０Ｂは、ｐＳＴＡＴ５誘導の増加によって測定される、それぞれＨＨ細胞およびｉＴｒｅｇの活性化に対する、挙げられたＩＬ－２バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図５０Ａに示されるように、試験されたＩＬ－２バリアントのすべては、ＨＨ細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。具体的には、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ；およびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔタンパク質の試験された各濃度に関して、これらの分子は、対応する濃度のＦｃ－ＩＬ２（野生型）を用いた細胞の処理によって生み出されるのと同様の、ＨＨ細胞におけるｐＳＴＡＴ５光学密度（ＯＤ）の増加をもたらす。対照的に、図５０Ｂに示されるように、試験されたＩＬ－２バリアントのそれぞれは、野生型ＩＬ－２と比較して、ｉＴｒｅｇ細胞の活性化の低下を有する。
図５０Ａ～５０Ｂに示されるデータに基づき、ＧｒａｐｈａＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して、最大値の５０％のｐＳＴＡＴ５レベルをもたらすそれぞれのＦｃ－ＩＬ－２バリアントの濃度を算出することによって、試験されたＦｃ－ＩＬ－２分子のそれぞれに関してＥＣ５０値を算出した。種々のＦｃ－ＩＬ－２分子および細胞タイプに関するＥＣ５０値が、下の表Ｃに提供されている。
Figure 2023533567000017
図５０Ａ、５０Ｂ、および表Ｃに示されるように、種々のＩＬ－２バリアント融合体のほとんどは、ＨＨ細胞を活性化することにおいて、野生型ＩＬ－２融合体と同様の効力（すなわち、１０×／１桁以内）を有する（図５０Ａおよび表Ｃ）。対照的に、ＩＬ－２バリアントは、ｉＴｒｅｇを活性化することにおいて、野生型ＩＬ－２と比較して、有意に低下した効力（すなわち、１００倍／２桁を上回る低下）を有する（図５０Ｂおよび表Ｃ）。表Ｃは、ＨＨ細胞対ｉＴｒｅｇ細胞の活性化に関する各分子の選択性（ＥＣ５０ ＨＨ細胞／ＥＣ５０ ｉＴｒｅｇ細胞）についての判定も提供し、より高い値ほど、ＨＨ細胞対ｉＴｒｅｇ細胞に対するより大きな相対的選択性を示す。表Ｃに示されるように、ＩＬ－２バリアントのＦｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ、およびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔは、試験された分子のＨＨ細胞対ｉＴｒｅｇ細胞に対する最も大きな相対的選択性を有する。
（実施例１８）
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンＩＬ－２バリアントを、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）におけるＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５シグナル伝達のそれらの活性化について試験した。
ＩＬ－２バリアント－単一グリカンバリアント
本実験では、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞を活性化するＩＬ－２バリアントの能力を、ＩＬ－２バリアントを用いた細胞の処理に応答したｐＳＴＡＴ５の相対的変化をモニターすることによって測定した。本実験において試験されるＩＬ－２バリアントをそれぞれ、実施例１５に記載されるようにヒトＩｇＧ Ｆｃドメインに融合させた。試験されたバリアントは、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ３５Ｎ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔであった。加えて、実施例３に記載されるＦｃ連結野生型ヒトＩＬ－２（「Ｆｃ－ＩＬ２」）およびＦｃ連結ＩＬ２ｖ（「Ｆｃ－ＩＬ２ｖ」）も試験した。
健常ボランティア由来の血液を採取し、ｈＰＢＭＣをｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配を使用して単離し、ＰＢＳで洗浄して血小板を除去し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して赤血球を取り除いた。次いで、細胞を、９０ｕｌ無血清ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中に１＊１０ｅ６個細胞／ウェルで播き、３７℃で２～４時間静置させた。静置の後、細胞を、表示される濃度の上で挙げられるＩＬ－２分子（１０ｕＬ）で３７℃にて２０分間処理し、２５ｕＬの２０％ＰＦＡを、穏やかにピペッティングしながら直ちに添加した。次いで、細胞を遠心分離によってペレットにし、吸引した（４００ＲＣＦ、７分間）。
Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し（２００ｕＬ）、細胞を、凝集を阻止するために上下に一度ピペッティングすることによって穏やかに混合した。次いで、細胞を２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、その後に遠心分離（４００ＲＣＦ、７分間）によるペレット化が続いた。細胞を２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、標準的手順によって表Ｄおよび表Ｅにおける抗体とインキュベートし、次いでＦＡＣＳ分析のために２００ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に懸濁した。データをＦｌｏｗＪｏ ｖ１０ソフトウェアを使用して分析した。
Figure 2023533567000018
Figure 2023533567000019
図５１Ａ、５１Ｂ、および５１Ｃは、細胞におけるｐＳＴＡＴ５の増加によって測定される、それぞれＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞の活性化に対する、挙げられたＩＬ－２バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図５１Ａおよび５１Ｂに示されるように、試験されたＩＬ－２バリアントのすべては、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。具体的には、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ３５Ｎ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ；およびＦｃ－ＩＬ２－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ分子の試験された各濃度に関して、これらの分子は、対応する濃度のＦｃ－ＩＬ２（野生型）を用いた細胞の処理によって生み出されるのと同様の、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞におけるｐＳＴＡＴ５平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加をもたらす。対照的に、図５１Ｃに示されるように、試験されたＦｃ－ＩＬ－２バリアントのそれぞれは、野生型Ｆｃ－ＩＬ－２と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の活性化の低下を有する。
図５１Ａ～５１Ｃに示されるデータに基づき、上で記載される試験されたＦｃ－ＩＬ－２分子のそれぞれに関してＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値が、下の表Ｆに提供されている。
Figure 2023533567000020
ＣＤ８ Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞またはＮＫ細胞対Ｔｒｅｇ細胞に対する、それぞれのＩＬ－２バリアントの選択性に関する値も表Ｆに提供されており、より大きな数値ほど、Ｔｒｅｇ細胞と比べてＣＤ８ Ｔ細胞またはＮＫ細胞に対するより大きな選択性を示す。表Ｆに示されるように、様々なＩＬ－２バリアントは、Ｆｃ－ＩＬ２（野生型）と同様のＥＣ５０でＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化するが、野生型融合タンパク質よりもはるかに低くＴｒｅｇ細胞を活性化する。同様に、Ｆｃ－ＩＬ２バリアントは、Ｆｃ－ＩＬ２（野生型）と比較して、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞対Ｔｒｅｇ細胞に対するより大きな選択性を有する。
ＩＬ－２バリアント－二重グリカンバリアント
次に、様々な二重グリカンＩＬ－２バリアントを試験した。本実験において試験されるＩＬ－２バリアントはそれぞれ、実施例１５に記載されるようにヒトＩｇＧ Ｆｃドメインに共有結合で連結された。試験された二重グリカンＩＬ－２バリアント分子は、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ；およびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔであった。加えて、単一グリカンＩＬ－２バリアント分子のＦｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ；およびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ、ならびにＦｃ－ＩＬ２（野生型）およびＦｃ－ＩＬ２ｖも、比較のために試験した。
ｈＰＢＭＣを、単一グリカンバリアントに関する上記のように調製した。次いで、細胞を、すぐ上に挙げられるＩＬ－２二重グリカンバリアントおよび関連対照ＩＬ－２分子で処理し、次いで、単一グリカンバリアントに関して上で記載されるように、フローサイトメトリーのために調製した。
図５２Ａ、５２Ｂ、および５２Ｃは、細胞におけるｐＳＴＡＴ５の増加によって測定される、それぞれＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞の活性化に対する、Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ含有二重グリカンＩＬ－２バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図５２Ａおよび５２Ｂに示されるように、試験されたＩＬ－２バリアントのすべては、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。対照的に、図５２Ｃに示されるように、試験されたＲ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ含有二重グリカンＩＬ－２バリアントのそれぞれは、野生型ＩＬ－２分子と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の活性化の実質的な低下、およびまたＲ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ単一グリカンＩＬ－２バリアント分子と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の活性化の低下を有する。
図５３Ａ、５３Ｂ、および５３Ｃは、細胞におけるｐＳＴＡＴ５の増加によって測定される、それぞれＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞の活性化に対する、Ｔ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ含有二重グリカンＩＬ－２バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図５３Ａおよび５３Ｂに示されるように、試験されたＩＬ－２バリアントのすべては、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。対照的に、図５３Ｃに示されるように、試験されたＴ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ含有二重グリカンＩＬ－２バリアントのそれぞれは、野生型ＩＬ－２分子と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の活性化の実質的な低下、およびまたＴ４１Ｎ：Ｋ４３Ｔ単一グリカンＩＬ－２バリアント分子と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の活性化の低下を有する。
図５４Ａ、５４Ｂ、および５４Ｃは、細胞におけるｐＳＴＡＴ５の増加によって測定される、それぞれＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞の活性化に対する、Ｋ４３Ｎ－Ｙ４５Ｔ含有二重グリカンＩＬ－２バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図５４Ａおよび５４Ｂに示されるように、試験されたＩＬ－２バリアントのすべては、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。対照的に、図５４Ｃに示されるように、試験されたＫ４３Ｎ－Ｙ４５Ｔ含有二重グリカンＩＬ－２バリアントのそれぞれは、野生型ＩＬ－２分子と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の活性化の実質的な低下を有する。
（実施例１９）
本実施例では、単一の導入されたグリコシル化部位（Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ）およびアミノ酸位置６２における置換を含有する様々なＩＬ－２バリアントを、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞のそれらの活性化について試験した。試験されたバリアントは、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｅ６２Ａ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｅ６２Ｎ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｅ６２Ｋ；およびＦｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｅ６２Ｒであった。加えて、二重グリカンバリアントのＦｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｅ６２Ｎ：Ｋ６４Ｔ、Ｆｃ連結野生型ヒトＩＬ－２（「Ｆｃ－ＩＬ２」）、およびＦｃ連結ＩＬ２ｖ（「Ｆｃ－ＩＬ２ｖ」）も対照として試験した。ＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞を活性化するＩＬ－２バリアントの能力を、ＩＬ－２バリアントを用いた細胞の処理に応答したリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の相対的変化をモニターすることによって測定した。細胞活性化／ｐＳＴＡＴ５アッセイを、実施例１８に記載されるように実施した。
図５５Ａ、５５Ｂ、および５５Ｃは、細胞におけるｐＳＴＡＴ５の増加によって測定される、それぞれＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞の活性化に対する、ＩＬ－２バリアント融合タンパク質の様々な濃度の効果を描写している。図５５Ａおよび５５Ｂに示されるように、試験されたＩＬ－２バリアントのすべては、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。対照的に、図５５Ｃに示されるように、試験されたＩＬ－２バリアントのそれぞれは、野生型ＩＬ－２分子と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の活性化の実質的な低下を有する。
（実施例２０）
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンＩＬ－２バリアントを、インビボにおけるＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞の増大に対するそれらの効果について試験した。試験されたバリアントは、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔであった。加えて、Ｆｃ連結野生型ヒトＩＬ－２（「Ｆｃ－ＩＬ２」）およびＦｃ連結ＩＬ２ｖ（「Ｆｃ－ＩＬ２ｖ」）も対照として試験した。
マウスを、上で挙げられる分子の１種またはＰＢＳ対照を受ける群に無作為に分けた。処理群は以下のとおりであった：ＰＢＳ；Ｆｃ－ＩＬ２；Ｆｃ－ＩＬ２ｖ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ。Ｆｃ－ＩＬ２融合分子を、それぞれの対照またはそれらの割り当てられた群の、その濃度におけるＩＬ－２バリアントとともに、皮下注射によって連続４日間毎日０．５、１、または２ｍｇ／ｋｇで投薬した。免疫表現型解析を、各群から脾臓を回収することによって、最初の処理（０日目）後３日目に行った。
図５６Ａ、５６Ｂ、および５６Ｃは、細胞の倍増大によって測定される、それぞれＣＤ８ Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞の増大に対する、挙げられた単一および二重グリカンＩＬ－２バリアントの様々な濃度の効果を描写している。野生型Ｆｃ－ＩＬ２群において、１ｍｇ／ｋｇ群における２／３匹のマウスおよび２ｍｇ／ｋｇ群における１／３匹のマウスは、処理を生き延びなかった。図５６Ａおよび５６Ｂに示されるように、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；およびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔのそれぞれは、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増大を促進し、より大きな濃度のこれらの分子ほど、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増大を増加させた。対照的に、Ｆｃ－ＩＬ２およびＦｃ－ＩＬ２ｖは、ＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増大を増加させず；実際のところ、増加する濃度のこれらの分子は、全身毒性に起因してＣＤ８ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増大を減少させた。図５６Ｃに示されるように、増加する濃度のＦｃ－ＩＬ２；Ｆｃ－ＩＬ２ｖ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔのそれぞれは、逆用量応答を有してＴｒｅｇ増殖の小幅な増加を示し、一方でＦｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５ＴおよびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔは、すべての用量でＴｒｅｇ細胞の増殖に対して最小限の効果を有した。
（実施例２１）
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンＩＬ－２バリアントを、マウスにおける忍容性および腫瘍成長阻害について試験した。試験されたバリアントは、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔであった。加えて、Ｆｃ連結野生型ヒトＩＬ－２（「Ｆｃ－ＩＬ２」）およびＦｃ連結ＩＬ２ｖ（「Ｆｃ－ＩＬ２ｖ」）も対照として試験した。
実験の０日目に、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、（１＊１０＾７個細胞の）単一の低継代バイアルから新たに融解され、埋め込みのための十分な細胞を確立するために要される最小限の時間培養された、およそ５００，０００個のＢ１６Ｆ１０細胞を大腿上部において皮下に埋め込んだ。
実験の５日目に、マウスを、上で挙げられる分子の１種または対照を受ける群に無作為に分けた。処理群は以下のとおりであった：ＰＢＳ；Ｆｃ－ＩＬ２；Ｆｃ－ＩＬ２ｖ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ。Ｆｃ－ＩＬ２融合分子を、それぞれの対照またはそれらの割り当てられた群の、その濃度におけるバリアントＦｃ－ＩＬ２融合分子とともに、皮下注射によって５、６、７、および８日目に１ｍｇ／ｋｇで投薬した。１５匹の動物の群を維持して、１ｍｇ／ｋｇ用量の忍容性および腫瘍成長阻害を査定した。腫瘍容積、体重、および動物生存率を、実験の経過を通じて追跡した。腫瘍がおよそ２０００ｍｍ＾３に達し次第、または処理の２週間後に、動物を屠殺した。
生存率および腫瘍成長阻害を、図５７Ａおよび５７Ｂに示されるように、処理群の開始投薬からおよそ２週間にわたってモニターした。忍容性は、他の実施例に見られるように、ＩＬ－Ｒａ結合の減衰の程度と相関した。Ｆｃ－ＩＬ２およびＦｃ－ＩＬ２ｖ対照分子群は、８日目までの生存を有せず、同様の忍容性が示された（図５７Ａ）。Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔは、７／１５匹のマウスを有して中間の生存率を有した。二重グリカンバリアントのＦｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５ＴおよびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔで処理された群は、最初の処理後１２日目に１１／１５匹および１４／１５匹の生存マウスを有した。腫瘍成長阻害を、ＰＢＳ対照と比較して、より良好な忍容性が示されたＦｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５ＴおよびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔ群からの生存マウスに対して査定した。図５７Ｂに示されるように、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５ＴおよびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔで処理されたマウスに関して、有意な腫瘍成長阻害が観察された。
これらの実験は、Ｆｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；Ｆｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ；およびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔタンパク質が、Ｆｃ－ＩＬ２およびＦｃ－ＩＬ２ｖよりもマウスにおいて良好な忍容性が示されること、ならびにＦｃ－ＩＬ２－Ｒ３８Ｎ：Ｌ４０Ｔ－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５ＴおよびＦｃ－ＩＬ２－Ｋ４３Ｎ：Ｙ４５Ｔ－Ｌ７２Ｎ：Ｑ７４Ｔが腫瘍成長阻害活性を有することを示している。
（実施例２２）
ヒト腫瘍細胞株のパネルにおけるＶＶ１１０のインビトロ効力
ＶＶ１１０およびＶＶ１２（ＪＸ－５９４模倣体）を、ＮＳＣＬＣ、黒色腫、ＲＣＣ、ＣＲＣ、およびＨＣＣ適応症由来のヒト腫瘍細胞株のパネルにおける細胞毒性アッセイにおいて試験した。細胞をそれらの対応する完全培地中で培養した。細胞を、アッセイの当日にコンフルエントの単層を形成するように、細胞タイプ特異的播種密度で９６ウェルプレートにアッセイの２４時間前に播いた。試験ウイルスを、２．５％ＦＢＳを含有する細胞株特異的培地中に、３０の開始ＭＯＩから連続希釈した（１：５）。培地吸引後、細胞に、ウイルス（３０～１．５４×１０－５のＭＯＩの）を感染させた。次いで、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて４８、７２、または９６時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、ＣＣＫ－８試薬を各ウェルに添加し、４５０ｎｍにおける吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３Ｘを使用して読み取った。データを、細胞のみ（１００％生存能）および溶解された細胞のみ対照（０％生存能）に対して正規化した。ＥＣ５０を、４パラメーターロジスティックフィットを使用して算出した。ＥＣ５０および最大殺滅％を各時点に関して報告した。
試験された細胞株のすべては、感染、ならびに細胞株に応じて感染の２～４日後に観察される≧９０％の殺滅を有して、ＶＶ１１０およびＶＶ１２の両方によって誘導されるインビトロでの腫瘍溶解を受けやすかった（図５８）。ＶＶ１１０の効力は、試験された最も感受性の高い株（７６９－Ｐ）に対する２．５２×１０－４ＰＦＵ／細胞から、試験された最も感受性の低い株（ＳＫ－ＭＥＬ－５）に対する７．０８×１０－１ＰＦＵ／細胞に及び、他のものよりもＶＶ１１０に対して一貫してより感受性であるまたは抵抗性である腫瘍適応症はなかった（図５９）。試験されたすべての細胞株は、ＪＸ－５９４模倣体であるＶＶ１２にも感受性であった。ＶＶ１１０と比べたＶＶ１２のＥＣ５０比を算出し、ＶＶ１１０は、１５種の腫瘍細胞株のうち１３種において、ＶＶ１２と比較してより高いインビトロ効力を示した（図６０）。
図５８：感染後４８、７２、および９６時間の時点での最大ヒト腫瘍細胞殺滅パーセンテージ。ヒト腫瘍細胞株に、ＶＶ１１０またはＶＶ１２（ＪＸ－５９４）を４８、７２、または９６時間感染させ、その時点で細胞生存能を判定した。平均±ＳＤとして表されたデータ。
図５９：感染後４８、７２、および９６時間の時点でのヒト腫瘍細胞株におけるＶＶ１１０およびＶＶ１２の効力。ヒト腫瘍細胞株に、ＶＶ１１０またはＶＶ１２（ＪＸ－５９４）を７２時間感染させ、その時点で細胞生存能を判定し、ＥＣ５０（ｐｆｕ／細胞）を４－ＰＬロジスティックフィットを使用して算出した。平均±ＳＤとして表されたデータ。
図６０：ヒト腫瘍細胞株におけるＶＶ１１０およびＶＶ１２の相対的効力（ＥＣ５０比）。ヒト腫瘍細胞株に、ＶＶ１１０またはＶＶ１２（ＪＸ－５９４）を７２時間感染させ、その時点で細胞生存能を判定し、ＥＣ５０（ｐｆｕ／細胞）を４－ＰＬロジスティックフィットを使用して算出した。ＶＶ１１０と比べたＶＶ１２のＥＣ５０比を算出した。平均±ＳＤとして表されたデータ。
（実施例２３）
カニクイザルにおけるＶＶ１１０のＩＶ投与後に生じる自然発生的皮膚病変の局部アシクロビル処理
カニクイザルは、調査１日目にＩＶ投与により５×１０７ＰＦＵのＶＶ１１０を受けた。動物は、調査５日目までに自然発生的皮膚病変を発症し、その時点で、局部アシクロビル（ゾビラックス）を用いた病変処理なし（群１）またはあり（群２）での、病変進行およびウイルス排出の検討のために、３つの病変を含有するエリアを同定した。処理を受けた動物は、エリアに局部アシクロビルを１１日間１日４回（２時間間隔）適用された。病変進行を写真で記録した。病変からのウイルス排出を５、７、および９日目に査定した。個々の病変のスワブを回収し、Ｕ２ＯＳプラークアッセイにおける感染性ウイルス力価に対するアッセイの前に－８０℃で保管した。簡潔には、Ｕ－２ＯＳ細胞を、６ウェルプレートにおいて、力価アッセイのおよそ２４時間前に播いた。１ｍＬのＰＢＳをスワブに添加し、サンプルを超音波処理した。培地を細胞から除去し、７００μＬの連続希釈されたウイルス／スワブサンプルを添加した。３７℃インキュベーターにおける２時間のインキュベーションの後、接種源を除去し、２ｍＬの１．５％ＣＭＣ、１０％ＦＢＳ、０．５×マッコイ重層を各ウェルに添加した。プレートを３７℃インキュベーターにおいて４８時間インキュベートした。このインキュベーション期間の終了時に、プレートをＤＰＢＳ中で１回洗浄し、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで１時間染色し、次いで水で洗浄した。画像をＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓ６ ＭＡＣＲＯ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて取得した。プラークをＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェアを使用してカウントし、力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を判定した。
局部アシクロビル処理を受けなかった動物である群１の病変は、およそ１５～１７日目までに解消した。局部アシクロビルで処理された群２の動物の病変は、およそ１１～１３日目までにより急速に解消した。群１において、病変スワブ力価は、５日目の７１～１０６０ＰＦＵ／ｍＬから７日目の＜３～７３，０００ＰＦＵ／ｍＬに及び、一方で群２の動物において、ＡＣＶで処理された病変からの病変スワブ力価は、５日目の１４～９，７１０ＰＦＵ／ｍＬから７日目の３～５４ＰＦＵに及んだ。９日目および１１日目に、病変スワブのいずれも、いかなる検出可能な感染力価も有しなかった。平均すると、ＡＣＶで処理された病変のスワブからの感染性ウイルス力価（群２）は、未処理病変から検出されたもの（群１）よりも、より短い継続期間にわたって分量が減少した（図６１）。
図６１：局部アシクロビル処理の有無での、カニクイザルへのＶＶ１１０のＩＶ投与後に生じる自然発生的皮膚病変からの感染性ウイルス力価。局部アシクロビル投与なし（群１）またはあり（群２）で、５×１０７ＰＦＵのＶＶ１１０をＩＶに受けた動物の個々の皮膚病変からスワブを回収した。
これらのデータは、ＶＶ１１０に含まれるＨＳＶ ＴＫ．００７安全性「オフスイッチ」が、局部抗ウイルス薬にウイルス感受性を付与し、ＶＶ治療後に一部の癌患者において生じ得る自然発生的皮膚病変からのウイルス排出の重症度、継続期間、およびレベルを低下させる潜在的手段を提供するという概念を支持する。

Claims (50)

  1. 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトＩＬ－２バリアントであって、
    ａ）Ｋ３５、
    ｂ）Ｒ３８およびＬ４０の両方、
    ｃ）Ｔ４１およびＫ４３の両方、
    ｄ）Ｋ４３およびＹ４５の両方、
    ｅ）Ｅ６２およびＫ６４の両方、ならびに
    ｆ）Ｌ７２およびＱ７４の両方
    からなる群から選択されるアミノ酸位置に１つまたは複数の置換を含む、単離されたヒトＩＬ－２バリアント。
  2. ａ）請求項１に記載のＩＬ－２バリアント；およびｂ）ヒト抗体のＦｃ領域を含む単離された融合タンパク質であって、ＩＬ－２バリアントはＦｃ領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質。
  3. 請求項１に記載のＩＬ－２バリアントをコードする、単離された核酸。
  4. 請求項３に記載の単離された核酸を含む宿主細胞。
  5. 請求項１に記載のＩＬ－２バリアントを含む医薬組成物。
  6. 請求項５に記載の医薬組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における癌を治療するための方法。
  7. 請求項１に記載のＩＬ－２バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）。
  8. ＩＬ－２バリアントは、
    ａ）Ｋ３５（Ｋ３５置換はＫ３５Ｎである）、
    ｂ）Ｒ３８およびＬ４０の両方（Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｌ４０置換はＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔである）、
    ｃ）Ｔ４１およびＫ４３の両方（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、
    ｄ）Ｋ４３およびＹ４５の両方（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、
    ｅ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、ならびに
    ｆ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）
    からなる群から選択されるアミノ酸位置に１つまたは複数の置換を含む、請求項７に記載のＯＶ。
  9. ＩＬ－２バリアントはＫ３５位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントは、
    ａ）Ｒ３８およびＬ４０の両方（Ｒ３８置換はＲ３８Ｎであり、Ｌ４０置換はＬ４０ＳまたはＬ４０Ｔである）、
    ｂ）Ｔ４１およびＫ４３の両方（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、
    ｃ）Ｋ４３およびＹ４５の両方（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、
    ｄ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
    ｅ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
    ｆ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
    からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、請求項７に記載のＯＶ。
  10. ＩＬ－２バリアントはＲ３８およびＬ４０位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントは、
    ａ）Ｔ４１およびＫ４３の両方（Ｔ４１置換はＴ４１Ｎであり、Ｋ４３置換はＫ４３ＳまたはＫ４３Ｔである）、
    ｂ）Ｋ４３およびＹ４５の両方（Ｋ４３置換はＫ４３Ｎであり、Ｙ４５置換はＹ４５ＳまたはＹ４５Ｔである）、
    ｃ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
    ｄ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
    ｅ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
    からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、請求項７に記載のＯＶ。
  11. ＩＬ－２バリアントはＴ４１およびＫ４３位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントは、
    ａ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
    ｂ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
    ｃ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
    からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、請求項７に記載のＯＶ。
  12. ＩＬ－２バリアントはＫ４３およびＹ４５位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントは、
    ａ）Ｅ６２およびＫ６４の両方（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎであり、Ｋ６４置換はＫ６４ＳまたはＫ６４Ｔである）、
    ｂ）Ｌ７２およびＱ７４の両方（Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである）、ならびに
    ｃ）Ｅ６２（Ｅ６２置換はＥ６２Ｎ、Ｅ６２Ａ、Ｅ６２Ｋ、またはＥ６２Ｒである）
    からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、請求項７に記載のＯＶ。
  13. ＩＬ－２バリアントはＥ６２およびＫ６４位に置換を含み、ＩＬ－２バリアントはＬ７２およびＱ７４位に置換をさらに含み、Ｌ７２置換はＬ７２Ｎであり、Ｑ７４置換はＱ７４ＳまたはＱ７４Ｔである、請求項７に記載のＯＶ。
  14. ＩＬ－２バリアントは、Ｒ３８、Ｌ４０、Ｋ４３、およびＹ４５位に置換を含む、請求項７に記載のＯＶ。
  15. ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸置換Ｒ３８Ｎ、Ｌ４０Ｔ、Ｋ４３Ｎ、およびＹ４５Ｔを含む、請求項７に記載のＯＶ。
  16. ＩＬ－２バリアントは、配列番号２９または配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＯＶ。
  17. ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸位置Ｋ４３、Ｙ４５、Ｌ７２、およびＱ７４に置換を含む、請求項７に記載のＯＶ。
  18. ＩＬ－２バリアントは、アミノ酸置換Ｋ４３Ｎ、Ｙ４５Ｔ、Ｌ７２Ｎ、およびＱ７４Ｔを含む、請求項７に記載のＯＶ。
  19. ＩＬ－２バリアントは、配列番号３３または配列番号３５のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＯＶ。
  20. ＩＬ－２ｖポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項７から１９のいずれか一項に記載のＯＶ。
  21. 調節可能なプロモーターは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体もしくは誘導体によって調節される、請求項１５に記載のＯＶ。
  22. 異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項７から２１のいずれか一項に記載のＯＶ。
  23. 異種ＴＫポリペプチドは、デオキシグアノシンのリン酸化を触媒し得る、請求項２２に記載のＯＶ。
  24. 異種ＴＫポリペプチドは、バリアント単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＴＫポリペプチドである、請求項２２または２３に記載のＯＶ。
  25. バリアントＨＳＶ ＴＫポリペプチドは、野生型ＨＳＶ ＴＫと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１の野生型ＨＳＶ ＴＫアミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくＬ１５９、Ｉ１６０、Ｆ１６１、Ａ１６８、およびＬ１６９のうちの１つまたは複数の置換を含む、請求項２４に記載のＯＶ。
  26. バリアントＨＳＶ ＴＫポリペプチドはＡ１６８Ｈ置換を含む、請求項２５に記載のＯＶ。
  27. バリアントＨＳＶ ＴＫポリペプチドは、Ｌ１５９Ｉ置換、Ｉ１６０Ｌ置換、Ｆ１６１Ａ置換、Ａ１６８Ｙ置換、およびＬ１６９Ｆ置換を含む、請求項２５に記載のＯＶ。
  28. バリアントＨＳＶ ＴＫポリペプチドは、Ｌ１５９Ｉ置換、Ｉ１６０Ｆ置換、Ｆ１６１Ｌ置換、Ａ１６８Ｆ置換、およびＬ１６９Ｍ置換を含む、請求項２５に記載のＯＶ。
  29. バリアントＨＳＶ ＴＫポリペプチドは、配列番号２６、２７、または２８のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のＯＶ。
  30. Ｋ１５１Ｅ置換を含むＡ３４Ｒ遺伝子を含む、請求項７から２９のいずれか一項に記載のＯＶ。
  31. ワクシニアチミジンキナーゼを欠損した状態にする改変を含む、請求項７から３０のいずれか一項に記載のＯＶ。
  32. ワクシニアチミジンキナーゼを欠損した状態にする改変は、Ｊ２Ｒ遺伝子のすべてまたは一部分の欠失である、請求項３１に記載のＯＶ。
  33. ワクシニアウイルスである、請求項７から２７のいずれか一項に記載のＯＶ。
  34. ワクシニアウイルスはコペンハーゲン系統である、請求項３３に記載のＯＶ。
  35. ワクシニアウイルスはウェスタンリザーブ（ＷＲ）系統である、請求項３３に記載のＯＶ。
  36. そのゲノムに、（１）配列番号２９のアミノ酸配列を含むバリアントインターロイキン－２（ＩＬ－２ｖ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（２）配列番号２８のアミノ酸配列を含む異種チミジンキナーゼ（ＴＫ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（３）Ａ３４Ｒ遺伝子におけるＫ１５１Ｅ置換を含む組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＯＶ）であって、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損である、組み換えＯＶ。
  37. ａ）請求項７から３６のいずれか一項に記載のＯＶ；およびｂ）薬学的に許容できる担体を含む組成物。
  38. 請求項７から３６のいずれか一項に記載のＯＶまたは請求項３７に記載の組成物の有効量を個体に投与する工程を含む、癌を有する個体における癌を治療する方法。
  39. 癌は、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、皮膚癌、肺癌、胸腺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、精巣癌、直腸癌、乳癌、または膵臓癌である、請求項３８に記載の方法。
  40. 癌は、結腸直腸腺癌、非小細胞肺癌腫、またはトリプルネガティブ乳癌である、請求項３７に記載の方法。
  41. 癌は再発性である、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 癌は原発性腫瘍である、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 癌は転移性である、請求項３８から４１のいずれか一項に記載の方法。
  44. 第２の癌療法を個体に投与する工程をさらに含む、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 第２の癌療法は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、細胞療法、および手術から選択される、請求項４４に記載の方法。
  46. 第２の癌療法は、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、請求項４４に記載の方法。
  47. 個体は免疫欠陥がある、請求項３８から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. ＯＶまたは組成物の前記投与は、腫瘍内、腫瘍周辺、動脈内、膀胱内、髄腔内、または静脈内投与である、請求項３８から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. ａ）請求項２２から２９のいずれか一項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量；およびｂ）腫瘍溶解性ウイルスの有害な副作用を低下させるのに有効である量の２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体を個体に投与する工程を含む、個体における癌を治療する方法。
  50. ２’－デオキシ－グアノシンの合成類似体は、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、およびバルガンシクロビルからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
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