JP2023533567A - 組み換えワクシニアウイルス - Google Patents
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Abstract
本開示は、ヒトIL-2バリアント、IL-2バリアントを含む組み換え腫瘍溶解性ウイルス、IL-2バリアントまたは組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、および個体における癌を治療するためのIL-2バリアント、組み換え腫瘍溶解性ウイルス、または組成物の使用を提供する。【図25】TIFF2023533567000021.tif135162
Description
関連出願への言及
本出願は、2020年7月14日に出願された米国仮特許出願第63/051,628号、および2020年7月14日に出願された米国仮特許出願第63/051,890号の利益を主張するものである。仮出願のそれぞれについての内容は、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
本出願は、2020年7月14日に出願された米国仮特許出願第63/051,628号、および2020年7月14日に出願された米国仮特許出願第63/051,890号の利益を主張するものである。仮出願のそれぞれについての内容は、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
配列表への言及
本出願は、EFS-Webを介して電子的に出願されており、.txt形式の電子的に提出された配列を含む。.txtファイルは、2021年6月22日に作成された「PC72649A_SequenceListing_ST25.txt」と題され、80KBのサイズを有する配列表を含有する。この.txtファイルに含有される配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
本出願は、EFS-Webを介して電子的に出願されており、.txt形式の電子的に提出された配列を含む。.txtファイルは、2021年6月22日に作成された「PC72649A_SequenceListing_ST25.txt」と題され、80KBのサイズを有する配列表を含有する。この.txtファイルに含有される配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
インターロイキン-2(IL-2)は、T細胞およびナチュラルキラー細胞成長の刺激等、哺乳類免疫系の複数の機能に重要であるサイトカインであり、癌に対する免疫療法剤として認可されている。しかしながら、様々な因子(例えば、狭い治療域(therapeutic window);潜在的な深刻な副作用)がその臨床的使用を制限している。抗癌剤としてのIL-2の使用の制限の1つは、それがエフェクターT細胞およびNK細胞(抗腫瘍活性を有する)を刺激し得かつ増大させ得る一方で、それは、免疫応答を抑える調節性T細胞(Treg)も増大させ得ることである。
IL-2シグナル伝達は、種々の細胞タイプに種々の形式で存在するIL-2受容体(IL-2R)を通して媒介される。高アフィニティーIL-2受容体は、IL-2Rアルファ(「IL-2Rα」;CD25としても知られる)、IL-2Rベータ(「IL-2Rβ」;CD122としても知られる)、およびIL-2Rガンマ(「IL-2Rγ」;CD132としても知られる)と称される3種のポリペプチド鎖を含有する。高アフィニティーIL-2Rは、Treg上に構成的に発現され、活性化T細胞およびNK細胞上に一過性に発現される。中アフィニティーIL-2Rは、IL-2RβおよびIL-2Rγポリペプチド鎖を含有し、例えば休止CD4+およびCD8+ T細胞ならびにナチュラルキラー(NK)細胞上に発現される。低アフィニティーIL-2Rは、IL-2Rαポリペプチド鎖を含有する。
IL-2は、高アフィニティーIL-2Rを介してTreg細胞を活性化し、中アフィニティーIL-2Rを介して休止CD4+およびCD8+ T細胞ならびにナチュラルキラー(NK)細胞を活性化することから、Tregを活性化することなく、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、およびNK細胞を選択的に活性化するための1つの考え得る手法は、IL-2を中アフィニティーIL-2Rへと選択的に標的化することである。高アフィニティーIL-2受容体と低アフィニティーIL-2受容体との間の違いは、高アフィニティーIL-2受容体におけるIL-2Rαポリペプチド鎖の存在であることを考慮すると、IL-2とIL-2Rαポリペプチド鎖との間の相互作用を遮断するまたは損なうことによって、IL-2は潜在的に中アフィニティーIL-2Rへと選択的に標的化され得る。
腫瘍溶解性ウイルス(OV)は、癌細胞に選択的にまたは優先的に感染しかつ殺滅するウイルスである。生の複製OVは、多様なヒト癌における臨床試験において試験されている。OVは、抗腫瘍免疫応答、ならびに腫瘍細胞の直接溶解を誘導し得る。OVは天然に存在し得る、または他のウイルスを改変することによって構築され得る。よく見られるOVは、単純ヘルペスウイルス(HSV)、アデノウイルス(Ad)、麻疹ウイルス(MV)、コクサッキーウイルス(CV)、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、およびワクシニアウイルス(VV)の弱毒化系統に基づいて構築されるものを含む。
ワクシニアウイルス(VV)は、ポックスウイルスファミリーのオルソポックスウイルス(orthopoxvirus)属のメンバーである。それは、約200種の遺伝子をコードする、長さがおよそ190kbの線状二本鎖DNAゲノムを有する。ワクシニアウイルスは、宿主細胞の細胞質において複製する。大きなワクシニアウイルスゲノムは、ウイルスDNA複製に使用される様々な酵素およびタンパク質をコードする。複製の間、ワクシニアウイルスは、それらの外膜が異なるいくつかの感染型:細胞内成熟ビリオン(IMV)、細胞内エンベロープビリオン(IEV)、細胞結合型エンベロープビリオン(CEV)、および細胞外エンベロープビリオン(EEV)を産生する。IMVは、最も豊富な感染型であり、宿主間での拡散に関与していると考えられる;CEVは、細胞間拡散における役割を果たすと思われる;EEVは、宿主生物内の長距離伝播に重要であると考えられる。EEV特異的タンパク質は、遺伝子A33R、A34R、A36R、A56R、B5R、およびF13Lによってコードされる。A34R遺伝子によってコードされるII型膜貫通糖タンパク質であるA34は、アクチン尾部の誘導、感染細胞の表面からのエンベロープウイルスの放出、およびウイルス侵入前のリガンド結合後のウイルスエンベロープの崩壊に関わる。
一部の態様において、本開示は、ヒトインターロイキン2(IL-2)バリアント、ならびに関連する融合タンパク質、組成物、方法、および使用を提供する。IL-2バリアントは、中アフィニティー二量体IL-2受容体複合体(IL-2Rβ+IL-2Rγを含有する)に結合する能力を保持するが、野生型ヒトIL-2ポリペプチドと比較して、IL-2受容体アルファ(「IL-2Rα」/CD25)への結合の減少を有するもしくは結合を有しない、または野生型ヒトIL-2ポリペプチドと比較して、高アフィニティー三量体IL-2受容体複合体(IL-2Rα+IL-2Rβ+IL-2Rγを含有する)への結合の減少を有するもしくは結合を有しない。
本明細書において提供されるIL-2バリアントは、野生型ヒトIL-2アミノ酸配列と比較して1つまたは複数のアミノ酸置換を有する。一部の実施形態において、IL-2バリアントにおけるアミノ酸置換は、IL-2バリアントタンパク質において1つまたは複数の操作されたN-グリコシル化部位をもたらす。
一部の実施形態において、単離されたヒトインターロイキン2(IL-2)バリアントは、野生型ヒトIL-2と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントは、a)K35、b)R38およびL40の両方、c)T41およびK43の両方、d)K43およびY45の両方、e)E62およびK64の両方、ならびにf)L72およびQ74の両方からなる群から選択されるアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含む。任意選択により、バリアントは、a)K35(K35置換はK35Nである)、b)R38およびL40の両方(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、c)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、d)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、e)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、ならびにf)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)からなる群から選択されるアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含む。任意選択により、IL-2バリアントはK35位に置換を含み、IL-2バリアントは、a)R38およびL40の両方(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、b)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、c)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、d)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、e)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびにf)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。任意選択により、IL-2バリアントはR38およびL40位に置換を含み、IL-2バリアントは、a)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、b)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、c)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、d)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびにe)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。任意選択により、IL-2バリアントはT41およびK43位に置換を含み、IL-2バリアントは、a)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、b)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびにc)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。任意選択により、IL-2バリアントはK43およびY45位に置換を含み、IL-2バリアントは、a)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、b)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびにc)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。任意選択により、IL-2バリアントはE62およびK64位に置換を含み、IL-2バリアントは、L72およびQ74位に置換をさらに含み、L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである。
一部の実施形態において、本明細書において提供される単離されたヒトインターロイキン2(IL-2)バリアントは、野生型ヒトIL-2と比較して少なくとも4つのアミノ酸置換を含み、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントは、a)R38、L40、K43、およびY45のそれぞれ;またはb)K43、Y45、L72、およびQ74のそれぞれからなる群から選択されるアミノ酸位置に置換を含む。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置R38、L40、K43、およびY45に置換を含み、R38置換はR38Nである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置R38、L40、K43、およびY45に置換を含み、L40置換はL40Tである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置R38、L40、K43、およびY45に置換を含み、K43置換はK43Nである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置R38、L40、K43、およびY45に置換を含み、Y45置換はY45Tである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置R38、L40、K43、およびY45に置換を含み、R38置換はR38Nであり、K43置換はK43Nである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置R38、L40、K43、およびY45に置換を含み、アミノ酸置換はR38N、L40T、K43N、およびY45Tである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置K43、Y45、L72、およびQ74に置換を含み、K43置換はK43Nである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置K43、Y45、L72、およびQ74に置換を含み、Y45置換はY45Tである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置K43、Y45、L72、およびQ74に置換を含み、L72置換はL72Nである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置K43、Y45、L72、およびQ74に置換を含み、Q74置換はQ74Tである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置K43、Y45、L72、およびQ74に置換を含み、K43置換はK43Nであり、L72置換はL72Nである。任意選択により、IL-2バリアントは、アミノ酸位置K43、Y45、L72、およびQ74に置換を含み、アミノ酸置換はK43N、Y45T、L72N、およびQ74Tである。任意選択により、IL-2バリアントは、配列番号31または配列番号35に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、野生型ヒトインターロイキン2(IL-2)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトIL-2バリアントであって、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントはE62位にアミノ酸置換を含む、単離されたヒトIL-2バリアントが本明細書において提供される。任意選択により、E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである。
一部の実施形態において、配列番号31または35に示されるアミノ酸配列を含む単離されたヒトインターロイキン2(IL-2)バリアントが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、野生型ヒトインターロイキン2(IL-2)と比較して少なくとも4つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトIL-2バリアントであって、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントは、4つのアミノ酸置換R38N、L40T、K43N、およびY45Tを含む、単離されたヒトIL-2バリアントが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、野生型ヒトインターロイキン2(IL-2)と比較して少なくとも4つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトIL-2バリアントであって、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントは、4つのアミノ酸置換K43N、Y45T、L72N、およびQ74Tを含む、単離されたヒトIL-2バリアントが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、本明細書において提供される単離されたヒトインターロイキン2(IL-2)バリアントは、野生型ヒトIL-2と比較して、ヒトIL-2受容体アルファ(IL-2Rα)への結合の低下を有する。
一部の実施形態において、本明細書において提供される単離されたヒトインターロイキン2(IL-2)バリアントは、導入されたアスパラギン(N)残基置換上でグリコシル化される。
一部の実施形態において、本明細書において提供される単離されたヒトインターロイキン2(IL-2)バリアントは、T3およびC125位の一方または両方に置換をさらに含む。任意選択により、T3およびC125位における置換は、T3AまたはT3GおよびC125AまたはC125Sである。
一部の実施形態において、a)本明細書において提供されるIL-2バリアント;およびb)ヒト抗体のFc領域を含む単離された融合タンパク質であって、IL-2バリアントはFc領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質が本明細書において提供される。
一部の実施形態において、a)本明細書において提供される単離された融合タンパク質であって、ヒト抗体のFc領域は第1のFc領域である、単離された融合タンパク質;およびb)ヒト抗体の第2のFc領域を含むヘテロ二量体タンパク質であって、第1のFc領域および第2のFc領域は、少なくとも1つのジスルフィド結合によって共有結合で連結されている、ヘテロ二量体タンパク質が本明細書において提供される。任意選択により、第1のFc領域は、野生型ヒトIgG Fc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を含んで、ノブ(knob)またはホール(hole)を形成し、第2のFc領域は、野生型ヒトIgG Fc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を含んで、ノブまたはホールを形成し、第1および第2のFc領域の一方はノブを含有し、第1および第2のFc領域の一方はホールを含有する。任意選択により、ノブを含むFc領域は、変異Y349CおよびT366Wを含み、ホールを含むFc領域は、変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含む。
一部の実施形態において、a)本明細書において提供されるIL-2バリアント;およびb)Fcドメインを含む抗体を含む単離された融合タンパク質であって、Fcドメインは第1のFc領域および第2のFc領域を含み、IL-2バリアントは抗体のFc領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質が本明細書において提供される。任意選択により、Fcドメインは、野生型Fcドメインと比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の減少を有するまたはADCC活性を有しない。一部の実施形態において、a)本明細書において提供されるIL-2バリアント;およびb)Fcドメインを含む抗体を含む単離された融合タンパク質であって、抗体は第1の軽鎖および第2の軽鎖を含み、IL-2バリアントは抗体の軽鎖に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質が本明細書において提供される。任意選択により、Fcドメインは、野生型Fcドメインと比較して、ADCC活性の減少を有するまたはADCC活性を有しない。任意選択により、抗体は腫瘍または免疫細胞に結合する。任意選択により、抗体は、抗B7H4抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD3抗体、抗B7H4/抗CD3二重特異性抗体、抗CD28抗体、抗B7H4/抗CD28二重特異性抗体、抗EDB1抗体、抗ULBP2抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗4-1BB抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗IL-8抗体、抗IL-7Rアルファ(CD127)抗体、抗IL15抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体、抗CD47抗体、抗CSF1R抗体、抗CSF1抗体、抗MARCO抗体、抗CXCR4抗体、抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体、抗TNFR1抗体、抗TNFR2抗体、抗CD3二重特異性抗体、抗CD19抗体、抗CD20、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗ICOS抗体、抗CD22抗体、抗CD52抗体、抗CCR4抗体、抗CCR8抗体、抗CD200R抗体、抗VISG4抗体、抗CCR2抗体、抗LILRb2抗体、抗CXCR4抗体、抗CD206抗体、抗CD163抗体、抗KLRG1抗体、抗FLT3抗体、抗B7H3抗体、KLRG1抗体、および抗GITR抗体からなる群から選択される。任意選択により、IL-2バリアントは、ポリペプチドリンカーおよび/またはポリペプチドタグによって、それぞれFc領域または軽鎖に共有結合で連結されている。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるIL-2バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質をコードする単離された核酸が本明細書において提供される。例えば、一実施形態において、置換R38N、L40T、K43N、およびY45Tを含有するIL-2バリアントをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、配列番号32に示されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるIL-2バリアントをコードする核酸を含む組み換え発現ベクターが本明細書において提供される。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるIL-2バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。
一部の実施形態において、それを必要とする対象における癌等の疾患を治療するための方法であって、方法は、本明細書に記載されるIL-2バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、それにより疾患と関連した1つまたは複数の症状が対象において改善される、方法が本明細書において提供される。任意選択により、方法は、第2の治療剤の有効量を投与する工程をさらに含み、任意選択により、投与は、別個、逐次的、または同時である。
一部の実施形態において、それを必要とする対象における免疫系を刺激する方法であって、方法は、本明細書に記載されるIL-2バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、それにより免疫系が対象において刺激される、方法が本明細書において提供される。
一部の実施形態において、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための医薬の製造における使用のための、本明細書に記載されるIL-2バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物が本明細書において提供される。
一部の実施形態において、参照タンパク質は結合パートナータンパク質に結合し、参照タンパク質における結合ドメインが結合パートナータンパク質と相互作用する、参照タンパク質のバリアントを調製する方法であって、方法は、参照タンパク質の結合ドメインにグリコシル化部位を導入する工程であって、グリコシル化部位は、アミノ酸配列N-x-S、N-x-T、S-x-N、またはT-x-Nを含む、工程を含み、グリコシル化部位を導入する工程は、参照タンパク質の結合ドメインのアミノ酸配列に少なくとも1つのアミノ酸置換を導入して、アミノ酸配列N-x-S、N-x-T、S-x-N、またはT-x-N(式中、xはプロリンを除く任意のアミノ酸である)を作り出す工程を含み、N-x-S、N-x-T、S-x-N、またはT-x-N配列におけるN、S、またはT残基の少なくとも1つは、参照タンパク質のグリコバリアントを作り出すためのアミノ酸置換であり、バリアントは、参照タンパク質と比較して、結合パートナータンパク質への結合の低下を有する、方法が本明細書において提供される。任意選択により、方法は、参照タンパク質の結合ドメインに少なくとも2つのアミノ酸置換を導入する工程を含み、グリコシル化部位を導入する工程は、参照タンパク質の結合ドメインのアミノ酸配列に少なくとも2つのアミノ酸置換を導入して、アミノ酸配列N-x-S、N-x-T、S-x-N、またはT-x-Nを作り出す工程を含み、N-x-S、N-x-T、S-x-N、またはT-x-N配列におけるN、S、またはT残基はアミノ酸置換である。
一部の他の態様において、本開示は、本明細書において提供されるIL-2バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルス、IL-2バリアントまたは腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、ならびに腫瘍溶解性ウイルスに関連した方法および使用を提供する。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号29のアミノ酸配列を含むヒトIL-2バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、異種チミジンキナーゼ(TK)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態において、異種TKポリペプチドは、配列番号28のアミノ酸配列を含むHSV-TKバリアントである。
一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスチミジンキナーゼを欠損した状態にする改変をさらに含む。特定の実施形態において、改変は、ウイルスJ2R遺伝子の少なくとも一部分の欠失である。
一部の他の実施形態において、本開示によって提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、子孫ビリオンの拡散を増強する改変をさらに含む。特定の実施形態において、改変は、ウイルスA34R遺伝子産物におけるK151E置換をもたらす。
一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは組み換えワクシニアウイルスである。特定の実施形態において、本開示は、a)配列番号29のIL-2バリアントをコードするヌクレオチド配列;b)配列番号28のアミノ酸配列を含むHSV-TKバリアントをコードするヌクレオチド配列;c)野生型A34R遺伝子産物と比べてK151E置換を含むA34タンパク質をコードするA34R遺伝子;およびd)ウイルスJ2R遺伝子の少なくとも一部分の欠失を含む複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはコペンハーゲン系統である、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。具体的な実施形態において、ウイルスのA34R遺伝子によってコードされるA34タンパク質は、配列番号38のアミノ酸配列を含む。別の具体的な実施形態において、ウイルスのA34R遺伝子は、配列番号39のヌクレオチド配列を含む。
一部の他の態様において、本開示は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、および腫瘍または癌を有する個体において腫瘍溶解を誘導するまたは個体における癌を治療するために腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物を使用する方法を提供する。
一部の他の実施形態において、本開示は、ガンシクロビル等、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量を個体に投与する工程を含む、ウイルスを投与されている個体の体内において、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスの複製を制御する方法を提供する。
他の態様および実施形態の例は、下で詳細に記載される。
詳細な説明
A.定義
「抗体」という用語は、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的抗原への特異的結合能を有する免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリンの5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および3次元立体配置は周知である。完全なIgG抗体分子は、2本の同一の重鎖および2本の同一の軽鎖を含有する。重鎖および軽鎖のそれぞれは、可変領域および定常領域を含有する。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる、3つの相補性決定領域(CDR)によって接続された4つのフレームワーク領域(FR)からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。本明細書において使用するとき、「抗体」という用語は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、別様に指定されない限り、特異的結合をインタクト抗体と競合するその任意の抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置も包含する。抗原結合部分は、例えばFab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、ドメイン抗体(dAb、例えばサメおよびラクダ科抗体)、相補性決定領域(CDR)を含むフラグメント、単鎖可変フラグメント抗体(scFv)、マキシボディ(maxibody)、ミニボティ(minibody)、イントラボディ(intrabody)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ、v-NARおよびbis-scFv、ならびにポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドを含む。
A.定義
「抗体」という用語は、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的抗原への特異的結合能を有する免疫グロブリン分子を指す。免疫グロブリンの5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および3次元立体配置は周知である。完全なIgG抗体分子は、2本の同一の重鎖および2本の同一の軽鎖を含有する。重鎖および軽鎖のそれぞれは、可変領域および定常領域を含有する。重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる、3つの相補性決定領域(CDR)によって接続された4つのフレームワーク領域(FR)からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。本明細書において使用するとき、「抗体」という用語は、完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、別様に指定されない限り、特異的結合をインタクト抗体と競合するその任意の抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置も包含する。抗原結合部分は、例えばFab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、ドメイン抗体(dAb、例えばサメおよびラクダ科抗体)、相補性決定領域(CDR)を含むフラグメント、単鎖可変フラグメント抗体(scFv)、マキシボディ(maxibody)、ミニボティ(minibody)、イントラボディ(intrabody)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、テトラボディ、v-NARおよびbis-scFv、ならびにポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドを含む。
「縮重バリアント」という用語は、参照核酸配列と比べて塩基の置換を有するが、参照核酸配列と同じアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。
「有効量」という用語は、哺乳類において所望の効果を引き起こすのに十分である、哺乳類に投与される量を指す。
「Fc領域」または「Fc鎖」という用語は、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を指す。「Fc領域」は、天然配列Fc領域またはバリアントFc領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変動し得るものの、ヒトIgG重鎖Fcは、通常、Cys226位におけるアミノ酸残基から、またはPro230からそのカルボキシル末端に及ぶと規定される。Fc領域における残基の番号付けは、KabatにあるようにEU指標のものである。Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.、1991。免疫グロブリンのFc領域は、一般的に、2つの定常ドメイン、CH2、およびCH3を含む。当技術分野において公知であるように、Fc領域は、二量体または単量体形態で存在し得る。
「Fcドメイン」という用語は、2つのFc領域/Fc鎖を含む、抗体の領域を指す。例えば、標準的なIgG形式において、抗体は2本の重鎖を有し、その両方ともFc領域/Fc鎖を有する。集合的に、2つのFc領域/Fc鎖は、本明細書において「Fcドメイン」と称される。
「宿主細胞」という用語は、ポリヌクレオチドインサートの組み入れのためのベクターに対するレシピエントであり得るまたはレシピエントになっている、個々の細胞または細胞培養物を指す。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異に起因して、元の親細胞と必ずしも完全に同一である(形態においてまたはゲノムDNA相補体において)必要はなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトされた細胞を含む。
「免疫エフェクター細胞エンハンサー」または「IECエンハンサー」という用語は、哺乳類の1種または複数のタイプの免疫エフェクター細胞の数、品質、または機能を増加させ得るまたは増強し得る物質を指す。免疫エフェクター細胞の例は、細胞溶解性CD8 T細胞、CD4 T細胞、NK細胞、およびB細胞を含む。
「免疫抑制細胞阻害剤」または「ISC阻害剤」という用語は、哺乳類の免疫抑制細胞の数または機能を低下させ得るまたは抑制し得る物質を指す。免疫抑制細胞の例は、調節性T細胞(「Treg」)、骨髄由来サプレッサー細胞、および腫瘍関連マクロファージを含む。
「免疫モジュレーター」という用語は、宿主哺乳類の自然、液性、もしくは細胞性免疫系の任意の構成要素の免疫応答(本明細書に規定される)または働きを変更し(例えば、阻害し、減少させ、増加させ、増強させ、または刺激し)得る物質を指す。ゆえに、「免疫モジュレーター」という用語は、本明細書に規定される「免疫エフェクター細胞エンハンサー」および本明細書に規定される「免疫抑制細胞阻害剤」、ならびに哺乳類の免疫系の他の構成要素に影響を及ぼす物質を包含する。
「免疫応答」という用語は、自然免疫応答(例えば、Toll受容体シグナル伝達カスケードの活性化)、細胞媒介性免疫応答(例えば、抗原特異的T細胞等のT細胞および免疫系の非特異的細胞によって媒介される応答)、および液性免疫応答(例えば、抗体の作出ならびに血漿、リンパ、および/または組織液への分泌等、B細胞によって媒介される応答)等、宿主哺乳類の免疫系による特定の物質(抗原または免疫原等)に対する任意の検出可能な応答を指す。
本明細書において互換可能に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、ネズミ科(例えば、ラット、マウス)、ウサギ目(例えば、ウサギ)、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄類(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ)を含むがそれらに限定されない哺乳類を指す。
「新生物障害」という用語は、細胞が、異常に高くかつ無制御の速度で増殖し、速度は周囲の正常組織のものを超えかつそれと協調しない、病態を指す。それは、通常、「腫瘍」として知られる充実性病変(solid lesion)またはしこりをもたらす。この用語は、良性および悪性の新生物障害を包含する。本開示において「癌」という用語と互換可能に使用される「悪性新生物障害」という用語は、体内における他の場所に拡散する腫瘍細胞の能力によって特徴付けられる新生物障害(「転移」として知られる)を指す。「良性新生物障害」という用語は、腫瘍細胞が、転移する能力を欠如する新生物障害を指す。
「腫瘍溶解性」ウイルスという用語は、正常(非癌性)細胞と比較して、癌細胞に優先的に感染しかつ殺滅するウイルスを指す。
本明細書において互換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドにかかわらず、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ゆえに、この用語は、一本鎖、二本鎖、または多鎖のDNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然の、化学的にもしくは生化学的に改変された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、それらに限定されるわけではない。
「阻止すること」または「阻止する」という用語は、(a)障害が生じるのを防ぐこと、または(b)障害の発生もしくは障害の症状の発生を遅延させることを指す。
「複製能を有する」ウイルスという用語は、特定の宿主細胞に感染し得かつその中で複製し得るウイルスを指す。
「組み換え」ウイルスという用語は、ウイルスゲノムに変化を導入するためにおよび/またはウイルスタンパク質に変化を導入するために、例えば組み換え核酸技法を使用して、インビトロで操縦されているウイルスを指す。例えば、組み換えウイルスは、野生型の内因性核酸配列、ならびに変異体および/または外因性核酸配列の両方を含み得る。組み換えウイルスは、改変されたタンパク質構成要素も含み得る。「組み換えワクシニアウイルス」とは、ワクシニアウイルスゲノム骨格に基づいて改変されているまたは構築されている組み換えウイルスを指す。
「治療」、「治療すること」等の用語は、障害を阻害すること、すなわちその発症を食い止めること、障害を軽減すること、すなわち障害の退縮を引き起こすこと、障害の重症度を低下させること、または障害の症状の発生頻度を低下させること等、所望の薬理学的および/または生理学的効果を獲得することを指す。
「治療上有効量」または「効果的な量」という用語は、疾患を治療するために対象に投与された場合に、疾患に対するそのような治療に意図される効果を引き起こすのに十分である、作用物質(例えば、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス)の量、または2種以上の作用物質(例えば、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよび第2の治療剤)の組み合わせた量を指す。「治療上有効量」は、作用物質、疾患およびその重症度、ならびに治療されるべき対象の年齢、重量等に応じて変動するであろう。
「インターロイキン-2」または「IL-2」という用語は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシ等、任意の哺乳類種の野生型インターロイキン-2タンパク質を指す。1種の例示的な野生型ヒトIL-2は、Uniprotアクセッション番号P60568として見出される。全長の野生型ヒトIL-2のアミノ酸配列は、配列番号21に提供される。全長の野生型ヒトIL-2は、シグナルペプチド(最初の20個のアミノ酸)を含有し、それは、IL-2タンパク質の成熟の間に除去される。シグナルペプチドを含有しない、ヒトIL-2の成熟した活性形態のアミノ酸配列は、配列番号1に提供される(APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)。別様に記されない限り、ヒトIL-2配列における特定のアミノ酸への本明細書におけるすべての言及は、成熟IL-2タンパク質のアミノ酸配列(すなわち、配列番号1)に従って番号付けされたアミノ酸へのものである。例えば、IL-2 R38残基は、配列番号1に示されるアミノ酸配列における38番目の残基(R)を指す。配列番号1のアミノ酸配列におけるR38残基は、配列番号21のアミノ酸におけるR58に対応することが理解されるべきである。
「バリアントIL-2」、「IL-2バリアント」、または「IL-2v」という用語は、別様に記されない限り、野生型IL-2タンパク質のアミノ酸配列と比べて1つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、かつ野生型IL-2タンパク質の活性の少なくとも一部を保持するポリペプチドを指す。
「IL-2受容体アルファ」という用語は、IL-2受容体のアルファポリペプチド鎖を指す。「IL-2受容体アルファ」は、「IL-2Ra」、「IL-2Rアルファ」、「IL-2Ra」、および「CD25」としても知られ、本明細書においてそのように称される。1種の例示的な野生型ヒトIL-2Rアルファアミノ酸配列は、Uniprotアクセッション番号P01589として見出される。
「IL-2受容体ベータ」という用語は、IL-2受容体のベータポリペプチド鎖を指す。「IL-2受容体ベータ」は、「IL-2Rb」、「IL-2Rベータ」、「IL-2Rb」、および「CD122」としても知られ、本明細書においてそのように称される。1種の例示的な野生型ヒトIL-2Rベータアミノ酸配列は、Uniprotアクセッション番号P14784として見出される。
「IL-2受容体ガンマ」という用語は、IL-2受容体のガンマポリペプチド鎖を指す。「IL-2受容体ガンマ」は、「IL-2Rγ」、「IL-2Rガンマ」、「IL-2Rg」、および「CD132」としても知られ、本明細書においてそのように称される。1種の例示的な野生型ヒトIL-2Rガンマアミノ酸配列は、Uniprotアクセッション番号P31785として見出される。
「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すために、本明細書において互換可能に使用される。鎖は線状または分岐であり得、それは、改変されたアミノ酸を含み得、かつ/または非アミノ酸によって中断され得る。該用語は、天然に、または介入;例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識化構成要素とのコンジュゲーション等の任意の他の操縦もしくは改変、によって改変されているアミノ酸鎖も包含する。例えば、アミノ酸の1種または複数の類似体(例えば、非天然アミノ酸等を含む)、ならびに当技術分野において公知の他の改変を含有するポリペプチドも定義に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または結び付いた鎖として存在し得ることが理解される。
値の域が提供される場合、その域の上限と下限の間にある、文脈上別様にはっきりと指示されない限り、下限の単位の10分の1までのそれぞれの介在する値、および任意の他の記述される値またはその記述される域内の介在する値は、本発明の内に包含される。これらのより小さな域の上限および下限は、より小さな域に独立して含まれ得、記述される域における任意の具体的に除外される限度に従って、また本発明の内に包含される。記述される域が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除外した域も本発明に含まれる。
別様に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価の任意の方法および材料も、本発明の実践または試験において使用され得るものの、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書において触れられるすべての刊行物は、関連して刊行物が引用される方法および/または材料を開示しかつ記載するために、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、「a」、「an」、および「the」という単数形は、文脈上別様にはっきりと指示されない限り、複数形の指示対象を含む。ゆえに、例えば「ワクシニアウイルス(a vaccinia virus)」への言及は、複数のそのようなワクシニアウイルスを含み、「バリアントIL-2ポリペプチド(the variant IL-2 polypeptide)」への言及は、1種または複数のバリアントIL-2ポリペプチド、および当業者に公知のその等価物等を含む。特許請求の範囲は、任意の任意選択による要素を除外するように起草され得ることがさらに留意される。そのため、この記述は、請求項要素の列挙と関連した、「だけ」、「のみ」等のような排他的術語の使用、または「否定的」限定の使用に対する先行詞として働くことが意図される。
明瞭性のために別個の実施形態の文脈において記載される本発明のある特定の特質は、単一の実施形態において組み合わせでも提供され得ることが解される。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈において記載される本発明の様々な特質は、別個にまたは任意の適切な部分組み合わせでも提供され得る。本発明に関する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に内包され、まさにあたかもありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されるかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびその要素のすべての部分組み合わせも、本明細書によって具体的に内包され、まさにあたかもありとあらゆるそのような部分組み合わせが個々にかつ明示的に本明細書に開示されるかのように本明細書に開示される。
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示に対してだけ提供される。本明細書における何も、先行発明の理由で本発明がそのような刊行物に先行する資格がないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の刊行日とは異なり得、それは独立して確認される必要があり得る。
B.IL-2バリアントおよび関連する態様
B-1.IL-2バリアント
一部の第1の態様において、本開示は、野生型ヒトIL-2アミノ酸配列と比較して1つまたは複数のアミノ酸置換を有するIL-2バリアント(例えば、ヒトIL-2バリアント)を提供する。一部の実施形態において、IL-2バリアントは、以下のアミノ酸位置:T3、K35、R38、L40、T41、K43、Y45、E62、K64、L72、Q74、およびC125のうちの1つまたは複数に、成熟ヒト野生型IL-2タンパク質配列(配列番号1)と比べて1つまたは複数の置換を含む。
B-1.IL-2バリアント
一部の第1の態様において、本開示は、野生型ヒトIL-2アミノ酸配列と比較して1つまたは複数のアミノ酸置換を有するIL-2バリアント(例えば、ヒトIL-2バリアント)を提供する。一部の実施形態において、IL-2バリアントは、以下のアミノ酸位置:T3、K35、R38、L40、T41、K43、Y45、E62、K64、L72、Q74、およびC125のうちの1つまたは複数に、成熟ヒト野生型IL-2タンパク質配列(配列番号1)と比べて1つまたは複数の置換を含む。
一部の実施形態において、IL-2バリアントは、以下の群の位置:R38およびL40;T41およびK43;K43およびY45;E62およびK64;L72およびQ74;R38、L40、K43、およびY45;K43、Y45、L72、およびQ74;T3、R38、L40、K43、およびY45;T3、K43、Y45、L72、およびQ74;R38、L40、K43、Y45、およびC125;K43、Y45、L72、Q74、およびC125;T3、R38、L40、K43、Y45、およびC125;T3、K43、Y45、L72、Q74、およびC125のうちの1つまたは複数にアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態において、IL-2バリアントは、成熟ヒト野生型IL-2タンパク質と比べて以下のアミノ酸置換:T3A、K35N、R38N、L40S、L40T、T41N、K43S、K43T、K43N、Y45S、Y45T、E62N、E62A、E62K、E62R、K64S、K64T、L72N、Q74S、Q74T、C125A、C125Sのうちの1つまたは複数を含む。一部の特定の実施形態において、IL-2バリアントは、成熟ヒトIL-2タンパク質と比べて以下のアミノ酸置換:K35N、R38N、K43N、E62N、またはL72Nのうちの1つまたは複数を含む。
一部の他の実施形態において、本明細書において提供されるIL-2バリアントは、野生型ヒトIL-2ポリペプチドと比較して、IL-2Rαへの結合の減少、無視できるほどの結合を有する、または結合を有しない。本発明のIL-2バリアントは、さらに、野生型ヒトIL-2ポリペプチドと比較して、高アフィニティーIL-2受容体三者(tertiary)複合体(IL-2Rα+IL-2Rβ+IL-2Rγを含有する)への結合の減少を有するまたは結合を有しない。本発明のIL-2バリアントは、中アフィニティー二量体IL-2受容体複合体(IL-2Rβ+IL-2Rγを含有する)に結合する能力を保持する。
一部の実施形態において、本明細書において提供されるIL-2バリアントにおけるアミノ酸置換は、IL-2バリアントタンパク質において操作されたN-グリコシル化部位をもたらす。N-グリコシル化に対するコンセンサス配列は、3アミノ酸配列N-x-S、N-x-T、S-x-N、またはT-x-Nであり、式中、Nはアスパラギンであり、xはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Sはセリンであり、Tはスレオニンである。IL-2アミノ酸配列における操作されたN-グリコシル化部位を作出するために、1つの実施形態において、野生型セリン(S)またはスレオニン(T)残基から1つのアミノ酸で離れた位置で、IL-2アミノ酸配列にアスパラギン(N)置換が導入される。この状況において、アミノ酸配列N-x-S、N-x-T、S-x-N、またはT-x-NがIL-2バリアントに作出され、式中、Nはアミノ酸置換であり、TまたはSは野生型アミノ酸である。別の実施形態において、野生型N残基から1つのアミノ酸で離れた位置で、IL-2アミノ酸配列にSまたはT置換が導入される。この状況において、アミノ酸配列N-x-S、N-x-T、S-x-N、またはT-x-NがIL-2バリアントに作出され、式中、TまたはSはアミノ酸置換であり、Nは野生型アミノ酸である。別の実施形態において、互いから1つのアミノ酸で離れた位置で、IL-2アミノ酸残基にN置換およびSまたはT置換の両方が導入される。この状況において、アミノ酸配列N-x-S、N-x-T、S-x-N、またはT-x-NがIL-2バリアントに作出され、式中、TまたはSはアミノ酸置換であり、Nもアミノ酸置換である。一部の実施形態において、本明細書において提供されるIL-2バリアントは、野生型IL-2と比較して複数の置換を有して、IL-2バリアントアミノ酸配列において1、2、3、4、または5個の操作されたN-グリコシル化部位/コンセンサス配列を作出し得る。
IL-2アミノ酸配列への1つまたは複数の操作されたN-グリコシル化部位の導入は、操作されたN-グリコシル化部位でグリコシル化され得るIL-2バリアントをもたらす。グリコシル化は、N(アスパラギン)残基にオリゴ糖部分を連結させ;このオリゴ糖は、「グリカン」とも称される。一部の実施形態において、本明細書において提供されるIL-2バリアントは、IL-2バリアントに導入された操作されたN-グリコシル化部位の数に基づいて、「単一グリカン」または「二重グリカン」と称される。例えば、本明細書において使用するとき、「単一グリカン」IL-2バリアントとは、1つの操作されたグリコシル化部位を有するIL-2バリアントを指し、「二重グリカン」IL-2バリアントとは、2つの操作されたグリコシル化部位を有するIL-2バリアントを指す。
一部の実施形態において、操作されたグリコシル化部位におけるN残基のグリコシル化は、IL-2バリアントとIL-2Rαとの相互作用を阻害する。ゆえに、一部の実施形態において、IL-2配列において1つまたは複数の操作されたN-グリコシル化部位をもたらす1つまたは複数のアミノ酸置換を含有し、操作されたグリコシル化部位でグリコシル化され、野生型IL-2と比較してIL-2Rαに対するアフィニティーの低下を有するIL-2バリアントが本明細書において提供される。理論によって拘束されることなく、操作されたグリコシル化部位で付加されたグリカン基は、IL-2とIL-2Rαとの間の相互作用を立体的に遮断することによって、IL-2とIL-2Rαとの間の結合を妨害すると思われる。ゆえに、例えば、置換R38NおよびL40Tを導入する(それによって、配列N-x-Tを創出する)ことによって、本明細書において提供されるIL-2バリアントに、操作されたグリコシル化部位が導入される場合、38位におけるN残基はグリコシル化され得る。38位における操作されたN残基に付加されたグリカン基は、IL-2とIL-2Rαとの間の相互作用を立体的に妨害すると思われる。
関心対象の分子(例えば、IL-2バリアント)と第2の分子(例えば、IL-2Rα)との間の結合の強度/結合アフィニティーは、当技術分野において公知の方法(例えば、等温滴定熱量測定(ITC)または表面プラズモン共鳴(SPR))によって判定され得る。典型的に、結合アフィニティーは、「KD」値(平衡解離定数)として報告される。本明細書において使用するとき、参照分子/分析物(例えば、野生型IL-2)のものと比較した、関心対象の分子/分析物(例えば、IL-2バリアント)とリガンド(例えば、IL-2Rα)との間の「結合の低下」とは、関心対象の分子が、参照分子とリガンドとの間の結合アフィニティーよりも低いアフィニティーでリガンドに結合する状況を指す。KD値に関しては、より小さな数ほど、より強い結合アフィニティーを表す(例えば、1nMのKDは、5nMのKDよりも強い結合アフィニティーである)。IL-2バリアントとIL-2Rαとの間の相互作用に関するKD値が、同じ結合条件下で、野生型IL-2とIL-2Rαとの間の相互作用に関するKD値よりも大きな数である場合、IL-2バリアントは、野生型IL-2と比較して、IL-2Rαへの結合の低下を有する。一部の実施形態において、野生型IL-2のものと比較して、IL-2Rαへの結合の低下を有するIL-2バリアントは、同じ結合条件下で、野生型IL-2とIL-2Rαとの間の相互作用についてのKD値よりも少なくとも1.5、2、3、5、10、15、20、50、100、200、または500倍大きいKD値を有する。IL-2バリアントが、野生型IL-2のものと比較して、IL-2Rαへの結合の低下を有する状況では、一部の実施形態において、b)IL-2バリアント-IL-2Rα相互作用についてのKD値と比べた、a)野生型IL-2-IL-2Rα相互作用についてのKD値の比[すなわち、(野生型IL-2-IL-2Rα相互作用についてのKD値)/(IL-2バリアント-IL-2Rα相互作用についてのKD値)]は、約0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005、0.0025、または0.001に等しいまたはそれ未満である。一部の実施形態において、野生型IL-2のものと比較して、IL-2Rαへの結合の低下を有するIL-2バリアントは、IL-2Rαへの検出不能な結合を有し、一方で野生型IL-2は、同じ結合条件下で、IL-2Rαへの検出可能/測定可能な結合を有する。
一部の実施形態において、IL-2バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換K35Nによって作出される。K35N置換の後、操作されたIL-2バリアントのアミノ酸番号35~37に対するアミノ酸配列はN35-L36-T37である。ゆえに、N35置換と野生型T37アミノ酸残基との組み合わせを考慮すると、コンセンサスN-グリコシル化部位(N-x-T)は、K35N置換によって作出される。
一部の実施形態において、IL-2バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換R38NおよびL40SまたはL40Tによって作出される。R38NおよびL40SまたはL40T置換の後、操作されたIL-2バリアントのアミノ酸番号38~40に対するアミノ酸配列は、N38-M39-S40またはN38-M39-T40である。ゆえに、コンセンサスN-グリコシル化部位(N-x-TまたはN-x-S)は、R38NおよびL40SまたはL40T置換によって作出される。
一部の実施形態において、IL-2バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換T41NおよびK43SまたはK43Tによって作出される。T41NおよびK43SまたはK43T置換の後、操作されたIL-2バリアントのアミノ酸番号41~43に対するアミノ酸配列は、N41-F42-S43またはN41-F42-T43である。ゆえに、コンセンサスN-グリコシル化部位(N-x-TまたはN-x-S)は、T41NおよびK43SまたはK43T置換によって作出される。
一部の実施形態において、IL-2バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換K43NおよびY45SまたはY45Tによって作出される。K43NおよびY45SまたはY45T置換の後、操作されたIL-2バリアントのアミノ酸番号43~45に対するアミノ酸配列は、N43-F44-S45またはN43-F44-T45である。ゆえに、コンセンサスN-グリコシル化部位(N-x-TまたはN-x-S)は、K43NおよびY45SまたはY45T置換によって作出される。
一部の実施形態において、IL-2バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換E62NおよびK64SまたはK64Tによって作出される。E62NおよびK64SまたはK64T置換の後、操作されたIL-2バリアントのアミノ酸番号62~64に対するアミノ酸配列は、N62-L63-S64またはN62-L63-T64である。ゆえに、コンセンサスN-グリコシル化部位(N-x-TまたはN-x-S)は、E62NおよびK64SまたはK64T置換によって作出される。
一部の実施形態において、IL-2バリアントにおける操作されたグリコシル化部位は、アミノ酸置換L72NおよびQ74SまたはQ74Tによって作出される。L72NおよびQ74SまたはQ74T置換の後、操作されたIL-2バリアントのアミノ酸番号72~74に対するアミノ酸配列は、N72-A73-S74またはN72-A73-T74である。ゆえに、コンセンサスN-グリコシル化部位(N-x-TまたはN-x-S)は、L72NおよびQ74SまたはQ74T置換によって作出される。
一部の実施形態において、本明細書において提供されるアミノ酸置換は、操作されたコンセンサスN-グリコシル化部位の一部ではないが、置換も、IL-2とIL-2Rαとの間の結合アフィニティーを低下させる。例えば、置換E62A、E62K、およびE62Rは、IL-2とIL-2Rαとの間の結合アフィニティーを低下させるが、コンセンサスN-グリコシル化部位の一部ではない。別の例において、置換E62Nは、K64位における置換なしでも導入され得る(すなわち、それにより、操作されたコンセンサスN-グリコシル化部位を作出することなく、E62N置換が導入される)。これらの置換は、例えば、IL-2バリアントにおいて1つまたは複数の操作されたコンセンサスN-グリコシル化部位を作出する本明細書において提供される他のアミノ酸置換と組み合わせられ得る。
一部の実施形態において、本明細書において提供されるアミノ酸置換は、IL-2バリアントの均一性を増加させる。例えば、T3またはC125位における置換(例えば、T3A、T3G、C125A、またはC125S)は、IL-2タンパク質の均一性を増加させ得、例えば、IL-2バリアントにおいて1つもしくは複数の操作されたコンセンサスN-グリコシル化部位を作出しかつ/またはIL-2とIL-2Rαとの間の結合アフィニティーを低下させる本明細書において提供される他のアミノ酸置換と組み合わせられ得る。
B-2.IL-2バリアントを含む融合分子
一部の実施形態において、抗体または抗体のFc領域等の別のタンパク質に連結された、本開示によって提供されるIL-2バリアントを含むIL-2融合タンパク質が本明細書において提供される。一部のさらなる実施形態において、本開示によって提供されるIL-2バリアントおよび2つの抗体Fc領域を含むIL-2ヘテロ二量体タンパク質であって、IL-2バリアントはFc領域の一方に連結されており、2つのFc領域はジスルフィド結合によって共有結合で連結されている、IL-2ヘテロ二量体タンパク質が本明細書において提供される。IL-2融合タンパク質およびヘテロ二量体タンパク質は、集合的にIL-2「融合分子」と称される。これらのIL-2融合分子は、安定性またはインビボ半減期の増加等、IL-2バリアントタンパク質単独と比較して、向上したまたは付加的な特性を有し得る。別の例において、IL-2融合分子は、抗体のFc領域、重鎖、または軽鎖に共有結合で連結された、本明細書において提供されるIL-2バリアントを含む。これらのIL-2バリアント-抗体融合タンパク質は、抗体によって認識される抗原を含有する特異的な細胞タイプまたは組織(例えば、腫瘍細胞)へと標的化され得る。そのため、これらのIL-2バリアント-抗体融合タンパク質は、IL-2バリアントを所望の細胞タイプまたは組織タイプに送達し得、一方でIL-2バリアントのオフターゲット/周辺曝露、ゆえにIL-2関連毒性を最小限に抑える。
一部の実施形態において、抗体または抗体のFc領域等の別のタンパク質に連結された、本開示によって提供されるIL-2バリアントを含むIL-2融合タンパク質が本明細書において提供される。一部のさらなる実施形態において、本開示によって提供されるIL-2バリアントおよび2つの抗体Fc領域を含むIL-2ヘテロ二量体タンパク質であって、IL-2バリアントはFc領域の一方に連結されており、2つのFc領域はジスルフィド結合によって共有結合で連結されている、IL-2ヘテロ二量体タンパク質が本明細書において提供される。IL-2融合タンパク質およびヘテロ二量体タンパク質は、集合的にIL-2「融合分子」と称される。これらのIL-2融合分子は、安定性またはインビボ半減期の増加等、IL-2バリアントタンパク質単独と比較して、向上したまたは付加的な特性を有し得る。別の例において、IL-2融合分子は、抗体のFc領域、重鎖、または軽鎖に共有結合で連結された、本明細書において提供されるIL-2バリアントを含む。これらのIL-2バリアント-抗体融合タンパク質は、抗体によって認識される抗原を含有する特異的な細胞タイプまたは組織(例えば、腫瘍細胞)へと標的化され得る。そのため、これらのIL-2バリアント-抗体融合タンパク質は、IL-2バリアントを所望の細胞タイプまたは組織タイプに送達し得、一方でIL-2バリアントのオフターゲット/周辺曝露、ゆえにIL-2関連毒性を最小限に抑える。
一部の実施形態において、IL-2融合タンパク質は、抗体とIL-2バリアントとの間にポリペプチドリンカー(例えば、異種または同種配列)を含む。ポリペプチドリンカーは、抗体のアミノ末端、カルボキシル末端、またはアミノおよびカルボキシル末端の両方で接合され得るまたはコンジュゲートされ得る。一部の実施形態において、ポリペプチドリンカーはグリシン-セリン(GS)リンカーである。
本明細書において提供されるIL-2融合タンパク質において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fc等)、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖(ScFv)、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質(例えば、ドメイン抗体)、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に改変された抗体を含めた、要される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置であり得る。抗体は、ネズミ科、ラット、ヒト、または任意の他の起源であり得る(キメラまたはヒト化抗体を含む)。
一部の実施形態において、抗体は、IgG1、IgG2、IgG2Δa、IgG4、IgG4Δb、IgG4Δc、IgG4 S228P、IgG4Δb S228P、およびIgG4Δc S228Pからなる群から選択されるアイソタイプを有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されるIL-2融合タンパク質の抗体はFcドメインを含み、そのようなFcドメインは、ヒトIgG1、IgG2、またはIgG4であり得る。
一部の実施形態において、抗体は、ヒトIgG2のヒンジ領域における223、任意選択により225、および228位に(例えば、(C223EまたはC223R)、(E225R)、および(P228EまたはP228R))、ならびにCH3領域における409または368位に(例えば、K409RまたはL368E(EU番号付けスキーム))アミノ酸改変を含む。一部の他の実施形態において、抗体は、ヒトIgG1のヒンジ領域における221および228位に(例えば、(D221RまたはD221E)および(P228RまたはP228E))、ならびにCH3領域における409または368位に(例えば、K409RまたはL368E(EU番号付けスキーム))アミノ酸改変を含む。さらになお他の実施形態において、抗体は、ヒトIgG1のCH3領域における349、354、366、368、および/または407位(EU番号付けスキーム)にアミノ酸改変、例えばY349C、S354C、T366W、T366S、L368A、および/またはY407Vを含む。一部の他の実施形態において、抗体は、ヒトIgG4のヒンジ領域における228位に(例えば、(S228D、S228E、S228R、またはS228K))、およびCH3領域における409または368位に(例えば、R409K、R409、またはL368E(EU番号付けスキーム))アミノ酸改変を含む。一部の他の実施形態において、抗体は、ヒトIgG2の265(例えば、D265A)、330(例えば、A330S)、および331位(例えば、P331S)のうちの1つもしくは複数;またはヒトIgG1の234(例えば、L234A)、235(例えば、L235A)、および237位(例えば、G237A)のうちの1つもしくは複数にアミノ酸改変を含む。一部の他の実施形態において、抗体は、ヒトIgG4のアミノ酸改変E233P/F234V/L235A(IgG4Δc)を含む。さらに別の実施形態において、アミノ酸改変は、ヒトIgG4の欠失G236(IgG4Δb)を有するE233P/F234V/L235Aである。
一部の実施形態において、本明細書において提供されるIL-2融合タンパク質における抗体は、ヒトFcガンマ受容体への結合アフィニティーの増加または減少を有する改変された定常領域を含み、免疫学的に不活性であるまたは部分的に不活性である、例えば補体媒介性溶解を誘発しない、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を刺激しない、もしくはミクログリアを活性化しない;または以下のもの:補体媒介性溶解を誘発すること、ADCCを刺激すること、もしくはミクログリアを活性化すること、のうちの任意の1つもしくは複数における活性の低下(非改変抗体と比較して)を有する。定常領域の種々の改変を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび/または組み合わせを達成し得る。例えば、Morganら、Immunology 86:319~324、1995;Lundら、J.Immunology 157:4963~9 157:4963~4969、1996;Idusogieら、J.Immunology 164:4178~4184、2000;Taoら、J.Immunology 143:2595~2601、1989;およびJefferisら、Immunological Reviews 163:59~76、1998を参照されたい。一部の実施形態において、定常領域は、Eur.J.Immunol.、1999、29:2613~2624;PCT公報第WO99/058572号に記載されるように改変される。
一部の実施形態において、抗体定常領域を改変して、Fcガンマ受容体および補体および免疫系との相互作用を回避し得る。そのような抗体の調製のための技法は、WO99/58572に記載される。例えば、定常領域を、ヒト定常領域により類似するように操作して、抗体が臨床試験およびヒトにおける治療において使用される場合に、免疫応答を回避し得る。例えば、米国特許第5,997,867号および第5,866,692号を参照されたい。
さらになお他の実施形態において、抗体定常領域は、N-結合型グリコシル化に対してアグリコシル化(aglycosylate)される。一部の実施形態において、定常領域は、定常領域におけるオリゴ糖付着残基および/またはN-グリコシル化認識配列の一部である隣接残基を変異させることによって、N-結合型グリコシル化に対してアグリコシル化される。例えば、N-グリコシル化部位N297は、例えばA、Q、K、またはHに変異し得る。Taoら、J.Immunology 143:2595~2601、1989;およびJefferisら、Immunological Reviews 163:59~76、1998を参照されたい。一部の実施形態において、定常領域は、N-結合型グリコシル化に対してアグリコシル化される。定常領域は、酵素的に(酵素PNGaseによって糖質を除去する等)またはグリコシル化欠損宿主細胞における発現によって、N-結合型グリコシル化に対してアグリコシル化され得る。
本明細書において提供されるIL-2融合タンパク質において使用される他の抗体の例は、抗CTLA-4抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗4-1BB抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗IL-7Rアルファ(CD127)抗体、抗IL-8抗体、抗IL-15抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体、抗CD47抗体、抗CSF1R抗体、抗CSF1抗体、抗MARCO抗体、抗CXCR4抗体、抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体、抗TNFR1抗体、抗TNFR2抗体、抗CD3二重特異性抗体、抗CD19抗体、抗CD20、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗ICOS抗体、抗CD22抗体、抗CD52抗体、抗CCR4抗体、抗CCR8抗体、抗CD200R抗体、抗VISG4抗体、抗CCR2抗体、抗LILRb2抗体、抗CXCR4抗体、抗CD206抗体、抗CD163抗体、抗KLRG1抗体、抗FLT3抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H3抗体、KLRG1抗体、抗BTN1A1抗体、抗UL16結合タンパク質2(ULBP2)抗体、および抗GITR抗体を含む。
本明細書において提供されるIL-2バリアントおよび融合分子は、蛍光分子、放射性分子、または当技術分野において公知の任意の他の標識等の標識剤に連結され得る。シグナルを一般的に提供する(直接的にまたは間接的に)標識は、当技術分野において公知である。
本明細書において提供されるIL-2バリアントおよび融合分子は、当技術分野において公知の方法によって、例えば合成的にまたは組み換えにより構築され得る。典型的に、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載される組み換え法を使用して、それらをコードするポリヌクレオチドを調製しかつ発現させることによって作製されるが、とはいえそれらは、例えば化学合成を含めた、当技術分野において公知の他の手段によっても調製され得る。
B-3.ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本開示は、本明細書に記載されるIL-2バリアントタンパク質、IL-2バリアント融合タンパク質、および他のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。特定の実施形態において、置換R38N、L40T、K43N、およびY45Tを含有するIL-2バリアントをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列:
GCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTAATATGACCACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC(配列番号32)
を含む、ポリヌクレオチドが本明細書において提供される。
本開示は、本明細書に記載されるIL-2バリアントタンパク質、IL-2バリアント融合タンパク質、および他のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。特定の実施形態において、置換R38N、L40T、K43N、およびY45Tを含有するIL-2バリアントをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列:
GCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTAATATGACCACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC(配列番号32)
を含む、ポリヌクレオチドが本明細書において提供される。
任意のそのような配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コーディングまたはアンチセンス)または二本鎖であり得、DNA(ゲノム、cDNA、または合成)またはRNA分子であり得る。RNA分子は、イントロンを含有しかつ1対1の様式でDNA分子に対応するHnRNA分子、およびイントロンを含有しないmRNA分子を含む。付加的なコーディングまたはノンコーディング配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが必ずしも存在しなくてもよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および/または支持材料に連結され得るが必ずしも連結されなくてもよい。遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列があることは当業者によって解されるであろう。同じポリペプチド配列をコードする異なるヌクレオチド配列は、「縮重バリアント」とも称される。
一部の他の実施形態において、本開示は、本明細書において提供されるIL-2バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター等のベクターを提供する。発現ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター(アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスに由来するベクター等)、コスミド、およびPCT公報第WO87/04462号に開示される発現ベクターを含む。ベクター構成要素は、以下の構成要素:シグナル配列;複製の起点;1種または複数のマーカー遺伝子;適切な転写制御エレメント(プロモーター、エンハンサー、およびターミネーター等)のうちの1種または複数を一般的に含む。発現(すなわち、翻訳)に関して、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドン等、1種または複数の翻訳制御エレメントも通常要される。発現ベクターを使用して、対象におけるIL-2バリアントまたはILバリアント融合タンパク質の発現を指揮し得る。当業者であれば、インビボで外因性タンパク質の発現を獲得するための発現ベクターの投与を熟知している。例えば、米国特許第6,436,908号;第6,413,942号;および第6,376,471号を参照されたい。発現ベクターの投与は、注射、経口投与、パーティクルガンまたはカテーテル挿入による投与、および局部投与を含めた、局所または全身投与を含む。別の実施形態において、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に、または冠動脈、心房、心室、もしくは心膜内に直接投与される。
本発明は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種DNAを過剰発現し得る任意の宿主細胞は、関心対象の抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用され得る。哺乳類宿主細胞の非限定的な例は、COS、HeLa、およびCHO細胞を含むが、それらに限定されるわけではない。PCT公報第WO87/04462号も参照されたい。適切な非哺乳類宿主細胞は、原核生物(大腸菌(E.coli)またはB.サブティリス(B.subtillis)等)および酵母(S.セレビジエ(S.cerevisae)、S.ポンベ(S.pombe);またはK.ラクティス(K.lactis)等)を含む。
B-4.病態を阻止するまたは治療する組成物および方法
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるIL-2バリアントまたはIL-2バリアント融合分子の有効量を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、抗ULBP2抗体およびヒトIL-2バリアントを含むIL-2バリアント融合タンパク質を含み、ヒトIL-2バリアントは、抗体のFcドメインに共有結合で連結されている。一部の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。IL-2バリアントまたは融合分子を含む医薬組成物における使用のための適切な薬学的に許容できる担体の例は、下で本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物に適切であるものを含む。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるIL-2バリアントまたはIL-2バリアント融合分子の有効量を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、抗ULBP2抗体およびヒトIL-2バリアントを含むIL-2バリアント融合タンパク質を含み、ヒトIL-2バリアントは、抗体のFcドメインに共有結合で連結されている。一部の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。IL-2バリアントまたは融合分子を含む医薬組成物における使用のための適切な薬学的に許容できる担体の例は、下で本明細書に記載される組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物に適切であるものを含む。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるIL-2バリアントまたはIL-2バリアント融合分子を含む組成物(例えば、医薬組成物)の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における癌もしくは腫瘍を治療する方法、腫瘍成長もしくは進行を阻害する方法、または癌細胞の転移を阻害する方法を提供する。
癌は、液性癌または固形癌であり得る。液性癌の例は、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、急性骨髄白血病、および他の造血細胞関連癌を含む。本明細書において提供される方法を用いて治療され得る他の腫瘍または癌の例は、下で記載される本開示によって提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスを用いて治療され得るものを含む。
本明細書に記載されるIL-2バリアントまたはIL-2バリアント融合分子は、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、関節内、舌下に、滑液嚢内、吹送を介した、髄腔内、経口、吸入、または局部経路等、任意の適切な経路を介して対象に投与され得る。
一部の実施形態において、IL-2バリアントまたはIL-2バリアント融合分子は、1種または複数の付加的な治療剤との組み合わせで投与される。付加的な治療剤の例は、バイオ治療剤(biotherapeutic agent)、化学療法剤、ワクチン、CAR-T細胞ベースの療法、放射線療法、別のサイトカイン療法(例えば、インターフェロン、インターロイキン、および造血成長因子等、免疫応答を刺激する様々なシグナル伝達タンパク質を含めた免疫刺激性サイトカイン)、他の免疫抑制経路の阻害剤、血管新生の阻害剤、T細胞活性化因子、代謝経路の阻害剤、mTOR(ラパマイシンのメカニズム的標的)阻害剤(例えば、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムス)、アデノシン経路の阻害剤、インライタ、ALK(未分化リンパ腫キナーゼ)阻害剤(例えば、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、およびスニチニブ)等のチロシンキナーゼ阻害剤、BRAF阻害剤(例えば、ベムラフェニブおよびダブラフェニブ)、エピジェネティック修飾因子、Treg細胞および/または骨髄由来サプレッサー細胞の阻害剤または枯渇因子、JAK(ヤヌスキナーゼ)阻害剤(例えば、ルキソリチニブおよびトファシチニブ(tofacitinb)、バリシチニブ(varicitinib)、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、モメロチニブ、パクリチニブ、ならびにウパダシチニブ)、STAT(シグナル伝達兼転写活性化因子)阻害剤(例えば、フルダラビン等、STAT1、STAT3、およびSTAT5阻害剤)、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、免疫原(例えば、弱毒化癌性細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸でパルスされた樹状細胞等の抗原提示細胞)、MEK阻害剤(例えば、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、およびセルメチニブ)、GLS1阻害剤、PAP阻害剤、腫瘍溶解性ウイルス、IDO(インドールアミン-ピロール2,3-ジオキシゲナーゼ)阻害剤、PRR(パターン認識受容体)アゴニスト、ならびにGM-CSF等であるがそれに限定されない免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞を含む。
一部の実施形態において、IL-2バリアントまたはIL-2バリアント融合分子は、例えば抗PD-L1アンタゴニスト抗体;ニボルマブ(OPDIVO(登録商標))、ペムブロリズマブ(KEYTRUDA(登録商標))、およびササンリマブ(sasanlimab)等、抗PD-1アンタゴニスト抗体;例えばイピリムマブ(YERVOY(登録商標))等、抗CTLA-4アンタゴニスト抗体;BMS-986016およびIMP701等、抗LAG-3アンタゴニスト抗体;抗TIM-3アンタゴニスト抗体;例えばMGA271等、抗B7-H3アンタゴニスト抗体;抗VISTAアンタゴニスト抗体;抗TIGITアンタゴニスト抗体;抗CD28アンタゴニスト抗体;抗CD80抗体;抗CD86抗体;抗B7-H4アンタゴニスト抗体;抗ICOSアゴニスト抗体;抗CD28アゴニスト抗体;自然免疫応答モジュレーター(例えば、TLR、KIR、NKG2A);IDO阻害剤;PF-05082566またはウレルマブ(BMS-663513)等、4-1BB(CD137)アゴニスト;OX40アゴニスト(抗OX-40アゴニスト抗体等);GITRアゴニスト(TRX518等);ならびにIL-10、IL-12、IL-7、IL-15、IL-21、IL-33、CSF-1、MCSF-1等のサイトカイン(ペグ化または非ペグ化)療法と併せて使用される。
B-5.本開示の非限定的な実施形態の例
本開示によって提供されるIL-2バリアントに関する本発明の他の実施形態の例は、下の項目に記載される。
本開示によって提供されるIL-2バリアントに関する本発明の他の実施形態の例は、下の項目に記載される。
項目1.野生型ヒトインターロイキン2(IL-2)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトIL-2バリアントであって、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントは、
a)K35、
b)R38およびL40の両方、
c)T41およびK43の両方、
d)K43およびY45の両方、
e)E62およびK64の両方、ならびに
f)L72およびQ74の両方
からなる群から選択されるアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含む、単離されたヒトIL-2バリアント。
a)K35、
b)R38およびL40の両方、
c)T41およびK43の両方、
d)K43およびY45の両方、
e)E62およびK64の両方、ならびに
f)L72およびQ74の両方
からなる群から選択されるアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含む、単離されたヒトIL-2バリアント。
項目2.a)K35(K35置換はK35Nである)、
b)R38およびL40の両方(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
c)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
d)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
e)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、ならびに
f)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)
からなる群から選択されるアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含む、項目1に記載のIL-2バリアント。
b)R38およびL40の両方(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
c)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
d)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
e)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、ならびに
f)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)
からなる群から選択されるアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含む、項目1に記載のIL-2バリアント。
項目3.K35位に置換を含み、
a)R38およびL40の両方(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
b)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
c)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
d)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
e)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
f)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目1または2に記載のIL-2バリアント。
a)R38およびL40の両方(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
b)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
c)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
d)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
e)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
f)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目1または2に記載のIL-2バリアント。
項目4.R38およびL40位に置換を含み、
a)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
b)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
c)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
d)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
e)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目1または2に記載のIL-2バリアント。
a)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
b)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
c)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
d)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
e)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目1または2に記載のIL-2バリアント。
項目5.T41およびK43位に置換を含み、
a)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
b)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
c)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目1または2に記載のIL-2バリアント。
a)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
b)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
c)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目1または2に記載のIL-2バリアント。
項目6.K43およびY45位に置換を含み、
a)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
b)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
c)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目1または2に記載のIL-2バリアント。
a)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
b)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
c)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、項目1または2に記載のIL-2バリアント。
項目7.E62およびK64位に置換を含み、L72およびQ74位に置換をさらに含み、L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである、項目1または2に記載のIL-2バリアント。
項目8.野生型ヒトインターロイキン2(IL-2)と比較して少なくとも4つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトIL-2バリアントであって、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントは、
a)R38、L40、K43、およびY45のそれぞれ;または
b)K43、Y45、L72、およびQ74のそれぞれ
からなる群から選択されるアミノ酸位置に置換を含む、単離されたヒトIL-2バリアント。
a)R38、L40、K43、およびY45のそれぞれ;または
b)K43、Y45、L72、およびQ74のそれぞれ
からなる群から選択されるアミノ酸位置に置換を含む、単離されたヒトIL-2バリアント。
項目9.アミノ酸位置R38、L40、K43、およびY45に置換を含み、R38置換はR38Nである、項目8に記載のIL-2バリアント。
項目10.アミノ酸位置R38、L40、K43、およびY45に置換を含み、L40置換はL40Tである、項目8または9のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目11.K43置換はK43Nである、項目8から10のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目12.Y45置換はY45Tである、項目8から11のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目13.アミノ酸位置K43、Y45、L72、およびQ74に置換を含み、L72置換はL72Nである、項目8に記載のIL-2バリアント。
項目14.アミノ酸位置K43、Y45、L72、およびQ74に置換を含み、Q74置換はQ74Tである、項目8または13のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目15.R38置換はR38Nであり、K43置換はK43Nである、項目8から12のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目16.K43置換はK43Nであり、L72置換はL72Nである、項目8または11から14のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目17.アミノ酸置換R38N、L40T、K43N、およびY45Tを含む、項目8から12のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目18.配列番号31に示されるアミノ酸配列を含む、項目17に記載のIL-2バリアント。
項目19.アミノ酸置換K43N、Y45T、L72N、およびQ74Tを含む、項目8、11から14、または16のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目20.配列番号35に示されるアミノ酸配列を含む、項目19に記載のIL-2バリアント。
項目21.配列番号31または35に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたヒトインターロイキン2(IL-2)バリアント。
項目22.野生型ヒトインターロイキン2(IL-2)と比較して少なくとも4つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトIL-2バリアントであって、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントは、4つのアミノ酸置換R38N、L40T、K43N、およびY45Tを含む、単離されたヒトIL-2バリアント。
項目23.野生型ヒトインターロイキン2(IL-2)と比較して少なくとも4つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトIL-2バリアントであって、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントは、4つのアミノ酸置換K43N、Y45T、L72N、およびQ74Tを含む、単離されたヒトIL-2バリアント。
項目24.野生型ヒトIL-2と比較して、ヒトIL-2受容体アルファ(IL-2Rα)への結合の低下を有する、項目1から23のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目25.導入されたアスパラギン(N)残基置換上でグリコシル化される、項目1から24のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目26.T3およびC125位の一方または両方に置換をさらに含む、項目1から25のいずれか一項に記載のIL-2バリアント。
項目27.T3およびC125置換は、T3A、T3G、C125A、およびC125Sからなる群から選択される、項目26に記載のIL-2バリアント。
項目28.a)項目1から27のいずれか一項に記載のIL-2バリアント;およびb)ヒト抗体のFc領域を含む単離された融合タンパク質であって、IL-2バリアントはFc領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質。
項目29.a)項目28に記載の単離された融合タンパク質であって、ヒト抗体のFc領域は第1のFc領域である、単離された融合タンパク質;およびb)ヒト抗体の第2のFc領域を含むヘテロ二量体タンパク質であって、第1のFc領域および第2のFc領域は、少なくとも1つのジスルフィド結合によって共有結合で連結されている、ヘテロ二量体タンパク質。
項目30.第1のFc領域は、野生型ヒトIgG Fc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を含んで、ノブまたはホールを形成し、第2のFc領域は、野生型ヒトIgG Fc領域と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を含んで、ノブまたはホールを形成し、第1および第2のFc領域の一方はノブを含有し、第1および第2のFc領域の一方はホールを含有する、項目29に記載のヘテロ二量体タンパク質。
項目31.ノブを含むFc領域は、変異Y349CおよびT366Wを含み、ホールを含むFc領域は、変異S354C、T366S、L368A、およびY407Vを含む、項目30に記載のヘテロ二量体タンパク質。
項目32.a)項目1から27のいずれか一項に記載のIL-2バリアント;およびb)Fcドメインを含む抗体を含む単離された融合タンパク質であって、Fcドメインは第1のFc領域および第2のFc領域を含み、IL-2バリアントは抗体のFc領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質。
項目33.Fcドメインは、野生型Fcドメインと比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の減少を有するまたはADCC活性を有しない、項目32に記載の単離された融合タンパク質。
項目34.a)項目1から27のいずれか一項に記載のIL-2バリアント;およびb)Fcドメインを含む抗体を含む単離された融合タンパク質であって、抗体は第1の軽鎖および第2の軽鎖を含み、IL-2バリアントは抗体の軽鎖に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質。
項目35.Fcドメインは、野生型Fcドメインと比較して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性の減少を有するまたはADCC活性を有しない、項目34に記載の単離された融合タンパク質。
項目36.抗体は腫瘍または免疫細胞に結合する、項目32から35のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
項目37.抗体は、抗B7H4抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD3抗体、抗B7H4/抗CD3二重特異性抗体、抗CD28抗体、抗B7H4/抗CD28二重特異性抗体、抗EDB1抗体、抗ULBP2抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗4-1BB抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗IL-8抗体、抗IL-7Rアルファ(CD127)抗体、抗IL15抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体、抗CD47抗体、抗CSF1R抗体、抗CSF1抗体、抗MARCO抗体、抗CXCR4抗体、抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体、抗TNFR1抗体、抗TNFR2抗体、抗CD3二重特異性抗体、抗CD19抗体、抗CD20、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗ICOS抗体、抗CD22抗体、抗CD52抗体、抗CCR4抗体、抗CCR8抗体、抗CD200R抗体、抗VISG4抗体、抗CCR2抗体、抗LILRb2抗体、抗CXCR4抗体、抗CD206抗体、抗CD163抗体、抗KLRG1抗体、抗FLT3抗体、抗B7H3抗体、KLRG1抗体、および抗GITR抗体からなる群から選択される、項目32から36のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
項目38.IL-2バリアントは、ポリペプチドリンカーおよび/またはポリペプチドタグによって、それぞれFc領域または軽鎖に共有結合で連結されている、項目28から37のいずれか一項に記載の単離された融合タンパク質またはヘテロ二量体タンパク質。
項目39.項目1から38のいずれか一項に記載のIL-2バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質を産生する、細胞株。
項目40.項目1から38のいずれか一項に記載のIL-2バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質をコードする、単離された核酸。
項目41.項目40に記載の核酸を含む、組み換え発現ベクター。
項目42.項目40に記載の単離された核酸または項目41に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
項目43.IL-2バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質の発現に適切な条件下で、項目42に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、項目1から38のいずれか一項に記載のIL-2バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質を産生する方法。
項目44.項目43に記載の方法に従って産生された、IL-2バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質。
項目45.項目1から38のいずれか一項に記載のIL-2バリアント、融合タンパク質、またはヘテロ二量体タンパク質、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
項目46.項目45に記載の医薬組成物、およびそれを必要とする対象への組成物の投与のための使用説明書を含む、癌の治療のためのキット。
項目47.項目1から38または45のいずれか一項に記載のIL-2バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、それにより疾患と関連した1つまたは複数の症状が対象において改善される、それを必要とする対象における疾患を治療するための方法。
項目48.疾患は癌である、項目47に記載の方法。
項目49.疾患は固形癌である、項目48に記載の方法。
項目50.疾患は液性癌である、項目48に記載の方法。
項目51.癌は再燃性、難治性、または転移性である、項目47から50のいずれか一項に記載の方法。
項目52.第2の治療剤の有効量を投与する工程をさらに含み、任意選択により、投与は、別個、逐次的、または同時である、項目47から51のいずれか一項に記載の方法。
項目53.第2の治療剤は、抗CTLA-4抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗4-1BB抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗IL-7Rアルファ(CD127)抗体、抗IL-8抗体、抗IL-15抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体、抗CD47抗体、抗CSF1R抗体、抗CSF1抗体、抗IL-7R抗体、抗MARCO抗体、抗CXCR4抗体、抗VEGF抗体、抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体、抗TNFR1抗体、抗TNFR2抗体、抗CD3二重特異性抗体、抗CD19抗体、抗CD20、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗ICOS抗体、抗CD22抗体、抗CD52抗体、抗CCR4抗体、抗CCR8抗体、抗CD200R抗体、抗VISG4抗体、抗CCR2抗体、抗LILRb2抗体、抗CXCR4抗体、抗CD206抗体、抗CD163抗体、抗KLRG1抗体、抗FLT3抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H3抗体、KLRG1抗体、抗BTN1A1抗体、および抗GITR抗体からなる群から選択される抗体である、項目52に記載の方法。
項目54.項目1から38または45のいずれか一項に記載のIL-2バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物の有効量を対象に投与する工程を含み、それにより免疫系が対象において刺激される、それを必要とする対象における免疫系を刺激する方法。
項目55.それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、項目1から38または45のいずれか一項に記載のIL-2バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物。
項目56.疾患は癌であり、任意選択により、癌は固形癌もしくは液性癌であり、かつ/または癌は再燃性、難治性、もしくは転移性である、項目55に記載の使用のためのIL-2バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物。
項目57.使用は第2の治療剤との組み合わせであり、任意選択により、組み合わせは同時の、並行した、または同時の投与のためのものである、項目55または56のいずれか一項に記載の使用のためのIL-2バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物。
項目58.それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための医薬の製造における使用のための、項目1から38または45のいずれか一項に記載のIL-2バリアント、融合タンパク質、ヘテロ二量体タンパク質、または医薬組成物。
C.組み換え腫瘍溶解性ウイルスおよび関連する態様
C-1.組み換え腫瘍溶解性ウイルス
一部の他の態様において、本開示は、ヒトIL-2バリアントのIL-2gv1またはIL-2gv2等、上で本明細書に記載されるIL-2バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列(導入遺伝子)を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。ウイルスは、アデノウイルス、1型単純ヘルペスウイルス、2型単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスまたはレオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、およびこれらのより大きな群の内の任意の種または系統を含めた、当技術分野において公知の多様な腫瘍溶解性ウイルスから構築され得る。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは複製能を有する。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは複製能を有しない。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルスである。特定の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、組み換えワクシニアウイルスコペンハーゲン系統である。
C-1.組み換え腫瘍溶解性ウイルス
一部の他の態様において、本開示は、ヒトIL-2バリアントのIL-2gv1またはIL-2gv2等、上で本明細書に記載されるIL-2バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列(導入遺伝子)を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。ウイルスは、アデノウイルス、1型単純ヘルペスウイルス、2型単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスまたはレオウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ワクシニアウイルス、およびこれらのより大きな群の内の任意の種または系統を含めた、当技術分野において公知の多様な腫瘍溶解性ウイルスから構築され得る。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは複製能を有する。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは複製能を有しない。一部の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルスである。特定の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、組み換えワクシニアウイルスコペンハーゲン系統である。
一部の実施形態において、IL-2バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスゲノム、タンパク質、またはウイルスの他の構成要素への1つまたは複数の改変または変異をさらに含み、それは、腫瘍選択性の増加もしくは向上、細胞外エンベロープウイルス(EEV)の産生の増強、子孫ビリオンの拡散の増強、安全性およびPET-CTイメージングの向上、または抗腫瘍免疫応答の増強等、ウイルスの1種または複数の望ましい抗腫瘍特性を増加させるまたは増強する。
ウイルスゲノムへの特異的な改変または変異の例は、下で本明細書に詳細に記載される。
C-1A.IL-2バリアント
上で記載されるように、組み換えVV等、本開示によって提供される組み換えOVは、上で本明細書に記載されるIL-2バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。
上で記載されるように、組み換えVV等、本開示によって提供される組み換えOVは、上で本明細書に記載されるIL-2バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、組み換えOVは、ヒトIL-2ポリペプチドもしくはネズミ科IL-2ポリペプチド等の野生型IL-2ポリペプチド、またはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。野生型ヒトIL-2(hIL-2)ポリペプチドの成熟形態のアミノ酸配列は、配列番号1に明記される。野生型hIL-2ポリペプチドの全長の前駆体形態のアミノ酸配列は、配列番号21に明記される。野生型hIL-2ポリペプチドの前駆体形態は、シグナルペプチド(例えば、MYRMQLLSCIALSLALVTNS(配列番号22))を含む。野生型マウスIL-2(mIL-2)ポリペプチドの成熟形態のアミノ酸配列は、配列番号23に明記される。マウス野生型IL-2ポリペプチドの前駆体形態のアミノ酸配列は、配列番号24に明記される。
一部の実施形態において、バリアントインターロイキン-2(IL-2v)ポリペプチドは、野生型ヒトIL-2ポリペプチドと比較して、IL-2受容体アルファ(「IL-2Ra」/CD25)への結合の減少、または高アフィニティー三量体IL-2受容体複合体(IL-2Ra+IL-2Rb+IL-2Rgを含有する)への結合の減少を有するが、中アフィニティー二量体IL-2受容体複合体(IL-2Rb+IL-2Rgを含有する)に結合する能力を保持する。
一部の他の実施形態において、IL-2vポリペプチドは、組み換えOVを投与されている対象において発現した場合、毒性の低下、免疫抑制T調節性細胞(T-reg細胞)の刺激の低下、または免疫抑制活性の別様の低下を有する。
IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組み換えOVのゲノムに存在し、「導入遺伝子」と称され得る。IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、野生型ワクシニアウイルスに天然には存在せず、ゆえに野生型ワクシニアウイルスに対して異種である。ゆえに、IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、バリアントIL-2ポリペプチドをコードする「異種ヌクレオチド配列」または「挿入されたヌクレオチド配列」と称され得る。
一部の場合において、本開示の組み換えOVによってコードされるIL-2vポリペプチドは、野生型IL-2と比較した場合、望ましくない生物学的活性の低下を提供する。一部の場合において、望ましくない生物学的活性の低下は、野生型IL-2と比較した場合の、CD25+CD4+ Treg細胞におけるpSTAT5レベルの増加を誘導することにおける効力を測定することによって判定される。一部の場合において、IL-2vポリペプチドは、CD25+CD4+ Treg細胞におけるpSTAT5レベルの増加を誘導することにおいて、野生型IL-2と比較した場合、濃度効力の低下を提供する。一部の場合において、IL-2vポリペプチドは、CD25+CD4+ Treg細胞におけるpSTAT5レベルの増加を誘導することにおいて、野生型IL-2と比較した場合、少なくとも1、少なくとも2、または少なくとも3対数の濃度効力の低下を提供する。一部の場合において、IL-2vポリペプチドは、CD25+CD4+ Treg細胞におけるpSTAT5レベルの増加を誘導することにおいて、野生型IL-2と比較した場合、約1、約2、または約3対数の濃度効力の低下を提供する。一部の場合において、望ましくない生物学的活性の低下は、実施例9に開示されるように、野生型IL-2と比較した場合の、組み換えワクシニアウイルスによってコードされるIL-2vポリペプチドを用いた処理後の炎症促進性サイトカインレベルを測定することによって判定される。一部の場合において、IL-2vポリペプチドは、野生型IL-2と比較した場合、炎症促進性サイトカインレベルの低下を提供する(例えば、実施例9に開示される試験を使用して)。一部の場合において、IL-2vポリペプチドは、野生型IL-2と比較した場合、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%の、炎症促進性サイトカインレベルの低下を提供する。
一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、シグナルペプチド(例えば、MYRMQLLSCIALSLALVTNS(配列番号22))を含むIL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ゆえに、例えば、一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号21(MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)に描写されるIL-2アミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号21に描写されるアミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくIL-2のF62、Y65、およびL92のうちの1つまたは複数の置換を含むIL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。解されるであろうように、配列番号21に描写されるIL-2アミノ酸配列のF62、Y65、およびL92は、配列番号1に描写されるアミノ酸配列のF42、Y45、およびL72に対応する。
他の適切なIL-2vポリペプチドは、例えば、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつF76A、Y79A、およびL106G置換を含む(すなわち、Ala-76、Ala-79、およびGly-106を含む)アミノ酸配列を含む、マウスIL-2vポリペプチドを含む。配列番号3のIL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号2に明記される。
一部の場合において、マウスIL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルス用にコドン最適化される。ワクシニアウイルス用にコドン最適化されている、マウスIL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号19に明記される。
他の適切なIL-2vポリペプチドは、例えば、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつF62A、Y65A、およびL92G置換を含む(すなわち、Ala-62、Ala-65、およびGly-92を含む)アミノ酸配列を含む、ヒトIL-2vポリペプチドを含む。
IL-2vポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列の例は、例えば、ヒトIL-2vポリペプチドをコードし、かつ配列番号12のヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コードされたIL-2vポリペプチドは、F62A、Y65A、およびL92G置換を含む(すなわち、Ala-62、Ala-65、およびGly-92を含む)。IL-2vポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列の他の例は、例えば、ヒトIL-2vポリペプチドをコードし、かつ配列番号13のヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コードされたIL-2vポリペプチドは、F62A、Y65A、およびL92G置換を含む(すなわち、Ala-62、Ala-65、およびGly-92を含む)。
他の適切なIL-2vポリペプチドは、例えば、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつF42A、Y45A、およびL72G置換を含む(すなわち、Ala-42、Ala-45、およびGly-72を含む)アミノ酸配列を含む、ヒトIL-2vポリペプチドを含む。
IL-2vポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列の例は、例えば、ヒトIL-2vポリペプチドをコードし、かつ配列番号10のヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コードされたIL-2vポリペプチドは、F42A、Y45A、およびL72G置換を含む(すなわち、Ala-42、Ala-45、およびGly-72を含む)。IL-2vポリペプチドをコードする適切なヌクレオチド配列の他の例は、例えば、ヒトIL-2vポリペプチドをコードし、かつ配列番号11のヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、コードされたIL-2vポリペプチドは、F42A、Y45A、およびL72G置換を含む(すなわち、Ala-42、Ala-45、およびGly-72を含む)。
一部の実施形態において、本開示の組み換えOVは、ヒト成熟形態IL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含み、ヒトIL-2vポリペプチドは、配列番号1に描写されるIL-2アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくK35、R38、L40、T41、F42、K43、Y45、Y45、E62、K64、L72、およびQ74からなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態において、本開示によって提供される組み換えOVは、以下の位置:T3、K35、R38、L40、T41、F42、K43、Y45、E62、K64、Y65、L72、Q74、およびC125に、配列番号1のヒトIL-2タンパク質配列と比べて1つまたは複数のアミノ酸置換を含むヒトIL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。一部の他の実施形態において、IL-2vは、以下の群の位置:R38およびL40;T41およびK43;K43およびY45;E62およびK64;L72およびQ74;R38、L40、K43、およびY45;K43、Y45、L72、およびQ74;T3、R38、L40、K43、およびY45;T3、K43、Y45、L72、およびQ74;R38、L40、K43、Y45、およびC125;K43、Y45、L72、Q74、およびC125;T3、R38、L40、K43、Y45、およびC125;T3、K43、Y45、L72、Q74、およびC125のうちの1つまたは複数にアミノ酸置換を含む。所与のアミノ酸位置における置換の例は、T3A、K35N、R38N、L40S、L40T、T41N、K43S、K43T、K43N、Y45S、Y45T、E62N、E62A、E62K、E62R、K64S、K64T、L72N、Q74S、Q74T、C125A、およびC125Sを含む。
一部の特定の実施形態において、組み換えOVによってコードされるIL-2vポリペプチドは、野生型ヒトIL-2と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、野生型ヒトIL-2は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有し、IL-2バリアントは、
a)K35(K35置換はK35Nである)、
b)R38およびL40(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
c)T41およびK43(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
d)K43およびY45(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
e)E62およびK64(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、ならびに
f)L72およびQ74(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)
からなる群から選択される置換を含み、番号付けは配列番号1のアミノ酸配列に基づく。
a)K35(K35置換はK35Nである)、
b)R38およびL40(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
c)T41およびK43(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
d)K43およびY45(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
e)E62およびK64(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、ならびに
f)L72およびQ74(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)
からなる群から選択される置換を含み、番号付けは配列番号1のアミノ酸配列に基づく。
一部の他の特定の実施形態において、IL-2vはK35位に置換を含み、
a)R38およびL40(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
b)T41およびK43(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
c)K43およびY45(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
d)E62およびK64(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
e)L72およびQ74(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
f)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。
a)R38およびL40(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
b)T41およびK43(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
c)K43およびY45(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
d)E62およびK64(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
e)L72およびQ74(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
f)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。
さらになお他の特定の実施形態において、IL-2バリアントはT41およびK43位に置換を含み、
a)E62およびK64(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
b)L72およびQ74(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
c)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。
a)E62およびK64(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
b)L72およびQ74(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
c)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む。
一部のさらなる特定の実施形態において、IL-2バリアントはK43NおよびY45Tを含み、
a)E62NおよびK64SまたはK64T、
b)L72NおよびQ74SまたはQ74T、
c)E62N、E62A、E62K、またはE62R;
e)R38NおよびL40T;ならびに
f)L72NおよびQ74T
からなる群から選択される置換をさらに含む。
a)E62NおよびK64SまたはK64T、
b)L72NおよびQ74SまたはQ74T、
c)E62N、E62A、E62K、またはE62R;
e)R38NおよびL40T;ならびに
f)L72NおよびQ74T
からなる群から選択される置換をさらに含む。
一部の特定の実施形態において、組み換えOVは、
a)配列番号29(MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTNMTTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換R58N、L60T、K63N、およびY65Tを含むアミノ酸配列;ならびに
b)配列番号31(APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTNMTTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換R38N、L40T、K43N、およびY45Tを含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むIL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。
a)配列番号29(MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTNMTTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換R58N、L60T、K63N、およびY65Tを含むアミノ酸配列;ならびに
b)配列番号31(APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTNMTTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換R38N、L40T、K43N、およびY45Tを含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むIL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、挿入されたヌクレオチド配列は、配列番号29または配列番号31のアミノ酸配列を含むIL-2vポリペプチドをコードする。
一部の他の特定の実施形態において、組み換えOVは、
a)配列番号33(MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNNATSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換K63N、Y65T、L92N、およびQ94Tを含むアミノ酸配列;ならびに
b)配列番号35(APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNNATSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換K43N、Y45T、L72N、およびQ74Tを含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むIL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。
a)配列番号33(MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNNATSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換K63N、Y65T、L92N、およびQ94Tを含むアミノ酸配列;ならびに
b)配列番号35(APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFNFTMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNNATSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)のアミノ酸配列同一性を有し、かつ置換K43N、Y45T、L72N、およびQ74Tを含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むIL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、IL-2vポリペプチドをコードする挿入された核酸は、配列番号30(ATGTATCGTATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCTTTATCTTTAGCTTTAGTGACCAACAGCGCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTAATATGACCACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC)もしくは配列番号32(GCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTAATATGACCACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC)のヌクレオチド配列、または配列番号30もしくは配列番号32のヌクレオチド配列の縮重バリアントを含む。
別の特定の実施形態において、IL-2vポリペプチドをコードする挿入された核酸は、配列番号34(ATGTATCGTATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCTTTATCTTTAGCTTTAGTGACCAACAGCGCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATAACGCCACCAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC)もしくは配列番号36(GCCCCTACCAGCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAACTTCACTATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCACCTCCAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCTTTAGAGGAGGTGCTGAATAACGCCACCAGCAAGAATTTCCATTTAAGGCCTCGTGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTGCTGGAGCTGAAAGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGAGCATCATCAGCACTTTAACC)のヌクレオチド配列、または配列番号34もしくは配列番号36のヌクレオチド配列の縮重バリアントを含む。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、IL-2vポリペプチドをコードする相同組み換えドナーフラグメントを含み、相同組み換えドナーフラグメントは、配列番号4(VV27/VV38相同組み換えドナーフラグメント)、配列番号5(VV39相同組み換えドナーフラグメント)、配列番号15(hIL-2v(ヒトコドン最適化された)を含有するVV75相同組み換えドナーフラグメント)、配列番号16(hIL-2v(ヒトコドン最適化された)を含有するコペンハーゲンJ2R相同組み換えプラスミド)、配列番号17(hIL-2v(ワクシニアウイルスコドン最適化された)を含有する相同組み換えドナーフラグメント)、配列番号18(hIL-2v(ワクシニアウイルスコドン最適化された)を含有するコペンハーゲンJ2R相同組み換えプラスミド)、および配列番号20(マウスIL-2バリアント(ワクシニアウイルスコドン最適化された)相同組み換えドナーフラグメント)のいずれか1つに明記されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号6(コペンハーゲンJ2R相同組み換えプラスミド)に明記されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号7(マウスIL-2バリアント(mIL-2v)ポリペプチドを含有するコペンハーゲンJ2R相同組み換えプラスミド)に明記されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、配列番号8(mIL-2vを含有するウェスタンリザーブJ2R相同組み換えプラスミド)に明記されるヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の具体的な場合において、本開示の組み換えVVは、VV27(A34R-K151EおよびmIL-2v導入遺伝子を含有するコペンハーゲンワクシニア)である。一部の場合において、組み換えVVは、mIL-2vポリペプチドの代わりに、上で記載されるヒトIL-2バリアント(hIL-2v)ポリペプチドを含む。
一部の具体的な場合において、本開示の組み換えOVは、VV38(mIL-2v導入遺伝子を含有するコペンハーゲンワクシニア)である。一部の場合において、組み換えVVは、mIL-2vポリペプチドの代わりに、上で記載されるヒトIL-2バリアント(hIL-2v)ポリペプチドを含む。
一部の具体的な場合において、本開示の組み換えOVは、VV39(mIL-2v導入遺伝子を含有するウェスタンリザーブワクシニア)である。一部の場合において、組み換えVVは、mIL-2vポリペプチドの代わりに、上で記載されるヒトIL-2バリアント(hIL-2v)ポリペプチドを含む。
一部の他の具体的な実施形態において、本開示の組み換えOVは、実施例に記載されるようにVV97、VV98、VV110、またはVV117である。
C-1B.異種チミジンキナーゼ(TK)ポリペプチド
一部の実施形態において、上で本明細書に記載されるIL-2バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、異種チミジンキナーゼ(TK)ポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、異種TKポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスTK(HSV-TK)ポリペプチドのバリアントである。野生型HSV-TKのバリアントは、本明細書において「HSV-TKv」とも称される。HSV-TKvは、一部の場合において、I型TKポリペプチド、すなわちデオキシグアノシン(dG)のリン酸化を触媒してそれぞれdG一リン酸を生成し得るTKポリペプチドである。
一部の実施形態において、上で本明細書に記載されるIL-2バリアントをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、異種チミジンキナーゼ(TK)ポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、異種TKポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスTK(HSV-TK)ポリペプチドのバリアントである。野生型HSV-TKのバリアントは、本明細書において「HSV-TKv」とも称される。HSV-TKvは、一部の場合において、I型TKポリペプチド、すなわちデオキシグアノシン(dG)のリン酸化を触媒してそれぞれdG一リン酸を生成し得るTKポリペプチドである。
一部の場合において、HSV-TKvをコードするヌクレオチド配列等、異種TKをコードするヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスTKをコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部に取って代わる。野生型ワクシニアウイルスにおいて、J2R領域はワクシニアウイルスTKをコードする。例えば、一部の場合において、異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ワクシニアウイルスのJ2R領域の少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、または100%に取って代わる。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、内因性(ワクシニアウイルスによってコードされる)TKをコードする遺伝子の転写が低下するまたは排除されるような改変を含む。例えば、一部の場合において、内因性(ワクシニアウイルスによってコードされる)TKをコードする遺伝子の転写は、改変なしの内因性(ワクシニアウイルスによってコードされる)TKをコードする遺伝子の転写と比較して、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または90%を上回る割合低下する。
一部の場合において、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製は、野生型HSV-TKポリペプチドをコードする複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製が阻害される濃度よりも低い濃度のガンシクロビルで阻害される。例えば、野生型HSV-TKのバリアントをコードする本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製が、最大の50%阻害されるガンシクロビル阻害濃度(IC50)は、野生型HSV-TKポリペプチドをコードする複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製の阻害に対するガンシクロビルIC50よりも、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、または少なくとも80%低い。
一部の実施形態において、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに存在するヌクレオチド配列によってコードされる異種TKポリペプチドは、野生型HSV-TKのバリアントであり、TKvポリペプチドは、野生型HSV-TK(配列番号25)と比べて1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに存在するヌクレオチド配列によってコードされるHSV-TKvポリペプチドは、野生型HSV-TKと比べて1~40個のアミノ酸置換を含む。例えば、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに存在するヌクレオチド配列によってコードされるTKvポリペプチドは、野生型HSV-TK(配列番号25)と比べて1~5、5~10、10~15、15~20、20~25、25~30、30~35、または35~40個のアミノ酸置換を含む。
一部の特定の実施形態において、本開示の組み換えワクシニアウイルスに存在する異種TKポリペプチドは、配列番号25
一部の場合において、異種TKポリペプチドは、野生型HSV-TKアミノ酸配列(配列番号25に明記される)と比べて1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。例えば、一部の場合において、異種TKポリペプチドは、L159、I160、F161、A168、およびL169のうちの1つまたは複数の置換を含む。
一部の場合において、異種TKポリペプチドは、配列番号25に明記される野生型HSV-TKアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、L159に置換を有する、すなわちアミノ酸159はLeu以外である。例えば、アミノ酸159は、Gly、Ala、Val、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。一部の場合において、置換はL159I置換である。一部の場合において、置換はL159A置換である。一部の場合において、置換はL159V置換である。
一部の場合において、異種TKポリペプチドは、配列番号25に明記される野生型HSV-TKアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、I160に置換を有する、すなわちアミノ酸160はIle以外である。例えば、アミノ酸160は、Gly、Ala、Val、Leu、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。一部の場合において、置換はI160L置換である。一部の場合において、置換はI160V置換である。一部の場合において、置換はI160A置換である。一部の場合において、置換はI160F置換である。一部の場合において、置換はI160Y置換である。一部の場合において、置換はI160W置換である。
一部の場合において、異種TKポリペプチドは、配列番号25に明記される野生型HSV-TKアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、F161に置換を有する、すなわちアミノ酸161はPhe以外である。例えば、アミノ酸161は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。一部の場合において、置換はF161A置換である。一部の場合において、置換はF161L置換である。一部の場合において、置換はF161V置換である。一部の場合において、置換はF161I置換である。
一部の場合において、異種TKポリペプチドは、配列番号25に明記される野生型HSV-TKアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、A168に置換を有する、すなわちアミノ酸168はAla以外である。例えば、アミノ酸168は、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。一部の場合において、置換はA168Hである。一部の場合において、置換はA168Rである。一部の場合において、置換はA168Kである。一部の場合において、置換はA168Yである。一部の場合において、置換はA168Fである。一部の場合において、置換はA168Wである。一部の場合において、TKvポリペプチドは、A168の置換以外の任意の他の置換を含まない。
一部の場合において、異種TKポリペプチドは、配列番号25に明記される野生型HSV-TKアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むが、L169に置換を有する、すなわちアミノ酸169はLeu以外である。例えば、アミノ酸169は、Gly、Ala、Val、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。一部の場合において、置換はL169Fである。一部の場合において、置換はL169Mである。一部の場合において、置換はL169Yである。一部の場合において、置換はL169Wである。
一部の場合において、異種TKポリペプチドは、配列番号25に明記される野生型HSV-TKアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、i)アミノ酸159はLeu以外であり;ii)アミノ酸160はIle以外であり;iii)アミノ酸161はPhe以外であり;iv)アミノ酸168はAla以外であり;かつv)アミノ酸169はLeu以外である。一部の場合において、異種TKポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:
一部の場合において、異種TKポリペプチドは、配列番号25に明記される野生型HSV-TKアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、i)アミノ酸159はLeu以外であり;ii)アミノ酸160はIle以外であり;iii)アミノ酸161はPhe以外であり;iv)アミノ酸168はAla以外であり;かつv)アミノ酸169はLeu以外である。一部の場合において、異種TKポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:
一部の場合において、異種TKポリペプチドは、配列番号25に明記される野生型HSV-TKアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸168はAla以外であり、例えばアミノ酸168は、Gly、Val、Ile、Leu、Pro、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Met、Gln、Asn、Lys、Arg、His、Asp、またはGluである。一部の場合において、アミノ酸168はHisである。一部の場合において、アミノ酸168はArgである。一部の場合において、アミノ酸168はLysである。一部の場合において、異種TKポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:
アミノ酸168がHisである配列番号28の異種TKポリペプチドは、本開示において「TK.007」または「HSV-TK.007」とも称される。
C-1C.他の挿入、欠失、または変異
IL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列、および上で本明細書に記載される異種TKをコードする挿入されたヌクレオチド配列に加えて、本開示によって提供される組み換えワクシニアウイルスは、特異的タンパク質の機能を欠損した状態にする、特異的遺伝子もしくはタンパク質の発現を抑制するもしくは増強する、または外因性タンパク質を発現させる改変等、腫瘍溶解性ウイルスとしてのその望ましい特性を増加させるまたは増強するさらなる改変を含み得る。
IL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列、および上で本明細書に記載される異種TKをコードする挿入されたヌクレオチド配列に加えて、本開示によって提供される組み換えワクシニアウイルスは、特異的タンパク質の機能を欠損した状態にする、特異的遺伝子もしくはタンパク質の発現を抑制するもしくは増強する、または外因性タンパク質を発現させる改変等、腫瘍溶解性ウイルスとしてのその望ましい特性を増加させるまたは増強するさらなる改変を含み得る。
一部の実施形態において、本開示によって提供される組み換えワクシニアウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍選択性を増加させる1つまたは複数の改変をさらに含む。本明細書において使用するとき、「腫瘍選択性」とは、正常細胞(例えば、非腫瘍細胞)へのものよりも高い、腫瘍細胞への毒性(例えば、腫瘍溶解性)を意味する。そのような改変の例は、(1)ワクシニア成長因子(VGF)の機能においてウイルスを欠損した状態にする改変(McCartら(2001)Cancer Research 61:8751);(2)ワクシニアウイルスTK遺伝子、ヘマグルチニン(HA)遺伝子、もしくはF3遺伝子、または中断されたF3遺伝子座への改変(WO2005/047458);(3)VGFおよびO1Lの機能においてワクシニアウイルスを欠損した状態にする改変(WO2015/076422);(4)B5R遺伝子の3’ノンコーディング領域への、癌細胞において発現が減少するマイクロRNAの挿入(WO2011/125469);(5)B18R(Kirnら(2007)PLoS Medicine 4:e353)、リボヌクレオチドレダクターゼ(Gammonら(2010)PLoS Pathogens 6:e1000984)、セリンプロテアーゼ阻害剤(例えば、SPI-1、SPI-2)(Guoら(2005)Cancer Research 65:9991)、SPI-1およびSPI-2(Yangら(2007)Gene Therapy 14:638)、リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子F4LもしくはI4L(Childら(1990)Virology 174:625;Pottsら(2017)EMBO Mol.Med.9:638)、B18R(コペンハーゲン系統におけるB19R)(Symonsら(1995)Cell 81:551)、A48R(Hughesら(1991)J.Biol.Chem.266:20103);B8R(Verardiら(2001)J.Virol.75:11)、B15R(コペンハーゲン系統におけるB16R)(Spriggsら(1992)Cell 71:145)、A41R(Ngら(2001)Journal of General Virology 82:2095)、A52R(Bowieら(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:10162)、F1L(Gerlicら(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:7808)、E3L(Changら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4825)、A44R-A46R(Bowieら(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:10162)、K1L(Bravo Cruzら(2017)Journal of Virology 91:e00524)、A48R、B18R、C11R、およびTK(Mejias-Perezら(2017)Molecular Therapy:Oncolytics 8:27)、E3LおよびK3L領域(WO2005/007824)、またはO1L(Schwenekerら(2012)J.Virol.86:2323)の機能においてワクシニアウイルスを欠損した状態にする改変を含む。さらに、組み換えワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスを、B5Rの細胞外領域において欠損した状態にする(Bellら(2004)Virology 325:425)、A34R領域において欠損した状態にする(Thirunavukarasuら(2013)Molecular Therapy 21:1024)、またはインターロイキン-1μ(IL-1μ)受容体において欠損した状態にする(WO2005/030971)改変を含み得る。さらに、そのような遺伝子改変の2つ以上の組み合わせを有するワクシニアウイルスが、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにおいて使用され得る。外来遺伝子のそのような挿入、またはワクシニアウイルスゲノム上の遺伝子の欠失もしくは変異は、例えば公知の相同組み換えまたは部位指向性変異導入によって行われ得る。
本明細書において使用するとき、「欠損した」または「欠損」という用語は、この用語によって指定される遺伝子領域またはタンパク質が機能の低下を有するまたは機能を有しないことを意味する。組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが所与のワクシニアウイルス遺伝子において「欠損した」状態にされる改変を含む、本開示の組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、遺伝子産物(例えば、mRNA遺伝子産物;ポリペプチド遺伝子産物)の産生および/または活性の低下を呈し;例えば、遺伝子産物の量および/または活性は、野生型ワクシニアウイルスによってまたは遺伝子変更を含まない対照ワクシニアウイルスによって産生される同じ遺伝子産物の量および/または活性の75%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、または1%未満である。
遺伝子またはタンパク質を欠損した状態にし得る改変は、i)この用語によって指定される遺伝子領域の変異(例えば、置換、逆位等)および/またはトランケーションおよび/または欠失;ii)遺伝子領域の発現を制御するプロモーター領域の変異および/またはトランケーションおよび/または欠失;ならびにiii)遺伝子領域によってコードされるポリペプチドの翻訳が低下するまたは排除されるような、ポリアデニル化配列の変異および/またはトランケーションおよび/または欠失を含むがそれらに限定されるわけではない。そのような改変の例は、指定された遺伝子領域からなる領域における欠失または指定された遺伝子領域を含む近隣遺伝子領域における欠失;欠損をもたらし得る、遺伝子領域の転写を低下させる、プロモーター領域の変異および/またはトランケーションおよび/または欠失;遺伝子領域によってコードされるポリペプチドの翻訳が低下するまたは排除されるような、転写終結エレメントの組み入れ;遺伝子領域の転写を低下させるまたは排除する、遺伝子編集酵素または遺伝子編集複合体(例えば、ガイドRNAと複合したCRISPR/Casエフェクターポリペプチド)の使用によるもの;遺伝子領域の転写を低下させるまたは排除する、競合リバースプロモーター/ポリメラーゼ占有率の使用によるもの;ならびに、それによって遺伝子領域をノックアウトする、遺伝子領域への核酸の挿入を含む。
一部の具体的な実施形態において、ワクシニアウイルス等の本開示の組み換えウイルスは、上で本明細書において提供されるIL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含み、ウイルスは、ウイルスの内因性チミジンキナーゼ(TK)活性を欠如する。本明細書において使用するとき、「内因性」という用語は、ウイルス等の生物またはその細胞内に天然に存在するまたは天然に発現される、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質等の任意の材料を指す。ワクシニアウイルスTKは、ワクシニアウイルスゲノム上のTK遺伝子およびオープンリーディングフレーム(ORF)J2Rによってコードされる。内因性TK活性を欠如するウイルスは、「チミジンキナーゼ欠損」または「TK欠損」と称され得る。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスがTK欠損であるような、ワクシニアウイルスTKコーディング領域のすべてまたは一部分の欠失を含む。例えば、一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはJ2R欠失を含む。例えば、Mejia-Perezら(2018)Mol.Ther.Oncolytics 8:27を参照されたい。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスはJ2R領域への挿入を含み、それによって、ワクシニアウイルスTK活性の低下または活性なしをもたらす。一部の他の実施形態において、組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスTK遺伝子欠損でもありB16R遺伝子欠損でもある。
一部の他の実施形態において、本開示によって提供される複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、子孫ビリオンの拡散を増強する改変をさらに含む。特定の実施形態において、本開示は、上で本明細書において提供されるIL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列を含む複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであって、ウイルスのA34R遺伝子はK151E置換を含む(すなわち、コードされたポリペプチドにおいてK151E置換を提供する改変を含む)、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。例えば、Blascoら(1993)J.Virol.67(6):3319~3325;およびThirunavukarasuら(2013)Mol.Ther.21:1024を参照されたい。A34R遺伝子は、ワクシニアウイルスgp22~24(タンパク質A34としても知られる)をコードする。A34R遺伝子は、ウイルスコートタンパク質(A34タンパク質)をコードする。ワクシニアウイルス系統コペンハーゲンのA34タンパク質のアミノ酸配列は、UniProt(UniProtKB-P21057(Q34_VACCC))において入手可能であり、それは168個のアミノ酸からなる。K151E置換を含むA34タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号38に明記される(MKSLNRQTVSMFKKLSVPAAIMMILSTIISGIGTFLHYKEELMPSACANGWIQYDKHCYLDTNIKMSTDNAVYQCRKLRARLPRPDTRHLRVLFSIFYKDYWVSLKKTNNKWLDINNDKDIDISKLTNFKQLNSTTDAEACYIYKSGKLVETVCKSTQSVLCVKKFYK)。K151E変異を含むA34タンパク質をコードするA34R遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号39に明記される(ATGAAATCGCTTAATAGACAAACTGTAAGTATGTTTAAGAAGTTGTCGGTGCCGGCCGCTATAATGATGATACTCTCAACCATTATTAGTGGCATAGGAACATTTCTGCATTACAAAGAAGAACTGATGCCTAGTGCTTGCGCCAATGGATGGATACAATACGATAAACATTGTTATCTAGATACCAACATTAAAATGTCCACAGATAATGCGGTTTATCAGTGTCGTAAATTACGAGCTAGATTGCCTAGACCTGATACTAGACATCTGAGAGTATTGTTTAGTATTTTTTATAAAGATTATTGGGTAAGTTTAAAAAAGACCAATAATAAATGGTTAGATATTAATAATGATAAAGATATAGATATTAGTAAATTAACAAATTTTAAACAACTAAACAGTACGACGGATGCTGAAGCGTGTTATATATACAAGTCTGGAAAACTGGTTGAAACAGTATGTAAAAGTACTCAATCTGTACTATGTGTTAAAAAATTCTACAAGTGA)(野生型遺伝子配列と比べてA415G変異を含有する)。
一部の他の実施形態において、本開示によって提供される組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、(1)IL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列;(2)異種TKポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列;および(3)A34R遺伝子におけるK151E置換を含み、組み換えワクシニアウイルスはTK欠損である。一部の特定の実施形態において、組み換えワクシニアウイルスによってコードされるIL-2vポリペプチドは、配列番号29のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換R58N、L60T、K63N、およびY65Tを含み、アミノ酸番号付けは配列番号29のアミノ酸配列に基づく。一部のさらなる特定の実施形態において、異種TKポリペプチドは、配列番号28のアミノ酸配列と少なくとも95%(例えば、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)の同一性を有するアミノ酸配列を含み、アミノ酸168はHisである。特定の実施形態において、本開示によって提供される組み換えワクシニアウイルスは、(1)IL-2vポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列;(2)異種TKポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列;および(3)A34R遺伝子におけるK151E置換を含み、組み換えワクシニアウイルスは系統コペンハーゲンでありかつTK欠損であり、IL-2vポリペプチドは配列番号29のアミノ酸配列を含み、異種TKポリペプチドは配列番号28のアミノ酸配列を含む。
C-2.組み換え腫瘍溶解性ウイルスの構築
本開示によって提供される複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、当技術分野において公知の方法によって構築され得る。具体的には、本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、現在既知であるまたは将来発見されるにかかわらず、ワクシニアウイルスの多様な系統のいずれかから構築され得る。使用に適切なワクシニアウイルスの系統は、リスター、ニューヨーク市衛生局(New York City Board of Health)(NYBH)、ワイエス(Wyeth)、コペンハーゲン、ウェスタンリザーブ(WR)、改変ワクシニアアンカラ(MVA)、EM63、イケダ、ダリアン(Dalian)、LIVP、天壇(Tian Tan)、IHD-J、タシュケント、ベルン、パリ、ダイレン(Dairen)、および誘導体等を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスである。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、WR系統ワクシニアウイルスである。
本開示によって提供される複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、当技術分野において公知の方法によって構築され得る。具体的には、本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、現在既知であるまたは将来発見されるにかかわらず、ワクシニアウイルスの多様な系統のいずれかから構築され得る。使用に適切なワクシニアウイルスの系統は、リスター、ニューヨーク市衛生局(New York City Board of Health)(NYBH)、ワイエス(Wyeth)、コペンハーゲン、ウェスタンリザーブ(WR)、改変ワクシニアアンカラ(MVA)、EM63、イケダ、ダリアン(Dalian)、LIVP、天壇(Tian Tan)、IHD-J、タシュケント、ベルン、パリ、ダイレン(Dairen)、および誘導体等を含むが、それらに限定されるわけではない。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスである。一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、WR系統ワクシニアウイルスである。
様々な系統のワクシニアウイルスのゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、Goebelら(1990)Virology 179:247;Goebelら(1990)Virology 179:517を参照されたい。コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスのヌクレオチド配列は公知であり;例えば、GenBankアクセッション番号M35027を参照されたい。WR系統ワクシニアウイルスのヌクレオチド配列は公知であり;例えば、GenBankアクセッション番号AY243312;およびGenBankアクセッション番号NC_006998を参照されたい。ワクシニアウイルスのWR系統は、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC);ATCC VR-1354から入手可能である。
本開示の、ワクシニアウイルス等の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性活性を呈する。ウイルスの腫瘍溶解性活性は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって評価され得る。所与のウイルスが腫瘍溶解性活性を呈するかどうかを評価するための方法の例は、ウイルスの添加による癌細胞の生存率の減少を評価するためのインビトロ方法を含む。使用され得る癌細胞または細胞株の例は、悪性黒色腫細胞RPMI-7951(例えば、ATCC HTB-66)、肺腺癌HCC4006(例えば、ATCC CRL-2871)、肺癌腫A549(例えば、ATCC CCL-185)、肺癌腫HOP-62(例えば、DCTD Tumor Repository)、肺癌腫EKVX(例えば、DCTD Tumor Repository)、小細胞肺癌細胞DMS 53(例えば、ATCC CRL-2062)、肺扁平上皮細胞癌腫NCI-H226(例えば、ATCC CRL-5826)、腎臓癌細胞Caki-1(例えば、ATCC HTB-46)、膀胱癌細胞647-V(例えば、DSMZ ACC 414)、頭頸部癌デトロイト562(例えば、ATCC CCL-138)、乳癌細胞JIMT-1(例えば、DSMZ ACC 589)、乳癌細胞MDA-MB-231(例えば、ATCC HTB-26)、乳癌細胞MCF7(例えば、ATCC HTB-22)、乳癌HS-578T(例えば、ATCC HTB-126)、乳管癌腫T-47D(例えば、ATCC HTB-133)、食道癌細胞OE33(例えば、ECACC 96070808)、膠芽細胞腫U-87MG(例えば、ECACC 89081402)、神経芽細胞腫GOTO(例えば、JCRB JCRB0612)、骨髄腫RPMI 8226(例えば、ATCC CCL-155)、卵巣癌細胞SK-OV-3(例えば、ATCC HTB-77)、卵巣癌細胞OVMANA(例えば、JCRB JCRB1045)、子宮頸癌HeLa(例えば、ATCC CCL-2)、結腸癌細胞RKO(例えば、ATCC CRL-2577)、結腸癌細胞HT-29(例えば、ATCC HTB-38)、結腸癌Colo 205(例えば、ATCC CCL-222)、結腸癌SW620(例えば、ATCC CCL-227)、結腸直腸癌腫HCT 116(例えば、ATCC CCL-247)、膵臓癌細胞BxPC-3(例えば、ATCC CRL-1687)、骨の骨肉腫U-2 OS(例えば、ATCC HTB-96)、前立腺癌細胞LNCaPクローンFGC(例えば、ATCC CRL-1740)、肝細胞癌腫JHH-4(例えば、JCRB JCRB0435)、中皮腫NCI-H28(例えば、ATCC CRL-5820)、子宮頸癌細胞SiHa(例えば、ATCC HTB-35)、および胃癌細胞Kato III(例えば、RIKEN BRC RCB2088)を含む。
IL-2バリアントポリペプチドまたは異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ヘルパーウイルスを用いた再活性化および相同組み換えを含めた確立された技法を使用して、ワクシニアウイルスに導入され得る。例えば、IL-2バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挿入されるプラスミド(移入ベクタープラスミドDNAとも称される)が作出され得、組み換え移入ベクターを作出し;組み換え移入ベクターは、ワクシニアウイルスに感染した細胞に導入され得る。次いで、IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、相同組み換えを介して、組み換え移入ベクターからワクシニアウイルスに導入される。
同様に、異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が挿入されるプラスミド(移入ベクタープラスミドDNAとも称される)が作出され得、組み換え移入ベクターを作出し;組み換え移入ベクターは、ワクシニアウイルス由来の消化されたゲノムDNAをトランスフェクトされかつヘルパーウイルスに感染した細胞に導入され得る。次いで、TKvポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、相同組み換えを介して、組み換え移入ベクターからワクシニアウイルスに導入される。TKvポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が導入される領域は、内因性ワクシニアウイルスTKをコードする遺伝子、例えばJ2Rであり得る。TKvポリペプチドをコードする核酸は、ワクシニアウイルスJ2Rのすべてまたは一部分に取って代わり得る。
一部の場合において、IL-2vポリペプチドまたは異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御エレメント、例えばプロモーターに作動可能に連結される。一部の場合において、プロモーターは、腫瘍細胞におけるポリペプチドの発現を提供する。適切なプロモーターは、pSELプロモーター、PSFJ1-10プロモーター、PSFJ2-16プロモーター、pHybプロモーター、後期-初期最適化プロモーター、p7.5Kプロモーター、p11Kプロモーター、T7.10プロモーター、CPXプロモーター、改変H5プロモーター、H4プロモーター、HFプロモーター、H6プロモーター、およびT7ハイブリッドプロモーターを含むが、それらに限定されるわけではない。
一部の場合において、IL-2vポリペプチドまたは異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される。一部の場合において、調節可能なプロモーターは可逆的プロモーターである。一部の場合において、IL-2vポリペプチドまたは異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、テトラサイクリン調節性プロモーター(例えば、TetActivator、TetON、TetOFF、Tet-On Advanced、Tet-On 3G等のプロモーターシステム)に作動可能に連結される。一部の場合において、IL-2vポリペプチドまたは異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、抑制可能なプロモーターに作動可能に連結される。一部の場合において、IL-2vポリペプチドまたは異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、テトラサイクリン抑制可能であるプロモーターに作動可能に連結され、例えばプロモーターは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体もしくは誘導体の存在下で抑制される。一部の場合において、IL-2vポリペプチドまたは異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、TetOFFプロモーターシステムに作動可能に連結される。BujardおよびGossen(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547。例えば、TetOFFプロモーターシステムは、テトラサイクリン(または、ドキシサイクリン等、適切な類似体または誘導体)の存在下で抑制され(不活性であり);テトラサイクリンが除去されると、プロモーターは活性でありかつポリペプチドの発現を推進する。一部の場合において、IL-2vポリペプチドまたは異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、テトラサイクリン活性化可能であるプロモーターに作動可能に連結され、例えばプロモーターは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体もしくは誘導体の存在下で活性化される。
IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が導入される領域は、ワクシニアウイルスの生活環に不必要である遺伝子領域であり得る。例えば、IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が導入される領域は、VGF機能を欠損したワクシニアウイルスにおけるVGF遺伝子内の領域、O1L機能を欠損したワクシニアウイルスにおけるO1L遺伝子内の領域、またはVGFおよびO1L機能の両方を欠損したワクシニアウイルスにおけるVGFおよびO1L遺伝子のいずれかもしくは両方の内の1つもしくは複数の領域であり得る。上記において、外来遺伝子は、VGFおよびO1L遺伝子のものと同じまたは反対の方向に転写されるように導入され得る。別の例として、IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が導入される領域は、B18(B19)機能を欠損したワクシニアウイルスにおけるB18遺伝子(コペンハーゲンにおけるB19)内の領域であり得る。特定の実施形態において、IL-2バリアントポリペプチドをコードする挿入されたヌクレオチド配列は、内因性ワクシニアウイルスTKをコードする遺伝子、例えばJ2Rの領域に配置される。IL-2バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ウイルスJ2R遺伝子の全体または一部分に取って代わり得る。別の特定の実施形態において、HSV-tk.007ポリペプチド等の異種tkをコードする挿入されたヌクレオチド配列は、ウイルスB16R遺伝子(ウェスタンリザーブのような他のワクシニアウイルス系統においてB15R遺伝子と呼ばれる)の領域に配置され、B16R遺伝子の全体または一部分に取って代わり得る。
C-3.組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物
別の態様において、本開示は、本開示によって提供される、ワクシニアウイルス等の組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を提供する。組成物は、溶液または懸濁液等、含まれる特定の活性成分に適切な任意の形態にあり得る。一部の場合において、組成物は、ヒトへの投与に適切な医薬組成物である。
別の態様において、本開示は、本開示によって提供される、ワクシニアウイルス等の組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を提供する。組成物は、溶液または懸濁液等、含まれる特定の活性成分に適切な任意の形態にあり得る。一部の場合において、組成物は、ヒトへの投与に適切な医薬組成物である。
一部の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。本明細書において使用するとき、「薬学的に許容できる担体」という用語は、活性成分と組み合わされた場合、活性成分が生物学的活性を保持するのを可能にし、対象に投与された場合に重大な長期的または永続的な有害作用を有しない任意の物質または材料を指し、薬学的に許容できる「ビヒクル」、「安定剤」、「希釈剤」、「補助剤」、または「賦形剤」等の用語を包含する。そのような担体は、一般的に、活性成分(例えば、本開示のIL-2バリアントまたは融合分子または組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス)と混合され、固体、半固体、または液体作用物質であり得る。限定されることなく、緩衝剤、防腐剤、張度調整剤、塩、抗酸化物質、増量剤、乳化剤、湿潤剤等を含めた、多様な薬学的に許容できる担体のいずれかが使用され得る。結果として生じる調製物が薬学的に許容できるという条件で、pHを調整するための様々な緩衝剤および手段を使用して、本明細書に開示される医薬組成物を調製し得る。そのような緩衝剤は、限定されることなく、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝溶液、およびホウ酸塩緩衝液を含む。必要に応じて、酸または塩基を使用して組成物のpHを調整し得ることが理解される。薬学的に許容できる抗酸化物質は、限定されることなく、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、ブチル化ヒドロキシアニソール、およびブチル化ヒドロキシトルエンを含む。有用な防腐剤は、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、および安定化オキシクロロ組成物、例えばPURITE(商標)を含む。対象医薬組成物への内包に適切な張度調整剤は、限定されることなく、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩、マンニトールまたはグリセリン、および他の薬学的に許容できる張度調整剤を含む。薬理学の技術分野において公知のこれらのおよび他の物質が、対象医薬組成物に含まれ得ることが理解される。
本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物は、mlあたり約102プラーク形成単位(pfu)(pfu/ml)~約104pfu/ml、約104pfu/ml~約105pfu/ml、約105pfu/ml~約106pfu/ml、約106pfu/ml~約107pfu/ml、約107pfu/ml~約108pfu/ml、約108pfu/ml~約109pfu/ml、約109pfu/ml~約1010pfu/ml、約1010pfu/ml~約1011pfu/ml、または約1011pfu/ml~約1012pfu/mlの量のウイルスを含有し得る。
C-4.組み換え腫瘍溶解性ウイルスの使用
C-4A.使用および投与
別の態様において、本開示は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスの使用およびそれを使用する方法、ならびに組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を提供する。使用または方法は、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導するまたは癌を治療するためのものを含み、方法は、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたは本開示の組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与する工程を含む。本開示のウイルスの投与は、本明細書において「ウイルス療法」とも称される。
C-4A.使用および投与
別の態様において、本開示は、組み換え腫瘍溶解性ウイルスの使用およびそれを使用する方法、ならびに組み換え腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を提供する。使用または方法は、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導するまたは癌を治療するためのものを含み、方法は、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたは本開示の組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与する工程を含む。本開示のウイルスの投与は、本明細書において「ウイルス療法」とも称される。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、個体における癌細胞の数または腫瘍量を低下させる量である。例えば、一部の場合において、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、組み換えウイルスの投与前のまたは組み換えワクシニアウイルスを用いた投与の非存在下での個体における癌細胞の数と比較して、個体における癌細胞の数を少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%低下させる量である。一部の場合において、組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、個体における癌細胞の数を検出不能なレベルまで低下させる量である。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、個体における腫瘍量を低下させる量である。例えば、一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、組み換えウイルスの投与前のまたは複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスを用いた投与の非存在下での個体における腫瘍量と比較して、個体における腫瘍量を少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%低下させる量である。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、個体の生存時間を増加させる量である。例えば、一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、組み換え腫瘍溶解性ウイルスを用いた投与の非存在下での個体の予想生存時間と比較して、個体の生存時間を少なくとも1カ月間、少なくとも2カ月間、少なくとも3カ月間、3カ月間~6カ月間、6カ月間~1年間、1年間~2年間、2年間~5年間、5年間~10年間、または10年間を上回る期間増加させる量である。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、IFN-γ産生T細胞の数の増加を提供する量である。例えば、一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与前のまたは複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスを用いた投与の非存在下での個体におけるIFN-γ産生T細胞の数と比較して、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍の、個体におけるIFN-γ産生T細胞の数の増加を提供する量である。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、個体におけるIL-2またはIL-2vの循環レベルの増加を提供する量である。例えば、一部の場合において、組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、腫瘍溶解性ウイルスの投与前のまたは腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた投与の非存在下での個体におけるIL-2またはIL-2vの循環レベルと比較して、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍の、個体におけるIL-2またはIL-2vの循環レベルの増加を提供する量である。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、個体におけるIL-2vポリペプチドの循環レベルの増加を提供する量である。例えば、一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与前のまたは腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた投与の非存在下での個体におけるIL-2vポリペプチドの循環レベルと比較して、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍の、個体におけるIL-2vポリペプチドの循環レベルの増加を提供する量である。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、CD8+腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の数の増加を提供する量である。例えば、一部の場合において、ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、ウイルスの投与前のまたはウイルスを用いた投与の非存在下での個体におけるCD8+ TILの数と比較して、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍のCD8+ TILの数の増加を提供する量である。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの「有効量」は、それを必要とする個体に1回または複数の投薬で投与された場合に、持続的な抗腫瘍免疫応答、例えば、少なくとも1カ月間、少なくとも2カ月間、少なくとも6カ月間、または少なくとも1年間、腫瘍細胞数および/または腫瘍量および/または腫瘍成長の低下を提供する抗腫瘍免疫応答を誘導する量である。
適切な投薬量は、様々な臨床的因子に基づいて、主治医または他の資格のある医療従事者によって判定され得る。医学の技術分野において周知であるように、任意の1人の患者に対する投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、腫瘍負荷、および他の関連因子を含めた多くの因子に依存する。
本開示の組み換えウイルスは、投薬あたり約102プラーク形成単位(pfu)~約104pfu、約104pfu~約105pfu、約105pfu~約106pfu、約106pfu~約107pfu、約107pfu~約108pfu、約108pfu~約109pfu、約109pfu~約1010pfu、または約1010pfu~約1011pfuの量で投与され得る。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、約1×109pfu~5×1011pfuの総量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、約1×109pfu~約5×109pfu、約5×109pfu~約1010pfu、約1010pfu~約5×1010pfu、約5×1010pfu~約1011pfu、または約1011pfu~約5×1011pfuの総量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、約2×1010pfuの総量で投与される。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、約1×108pfu/kg患者重量~約5×109pfu/kg患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、約1×108pfu/kg患者重量~約5×108pfu/kg患者重量、約5×108pfu/kg患者重量~約109pfu/kg患者重量、または約109pfu/kg患者重量~約5×109pfu/kg患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、1×108pfu/kg患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、2×108pfu/kg患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、3×108pfu/kg患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、4×108pfu/kg患者重量の量で投与される。一部の場合において、本開示の組み換えウイルスは、5×108pfu/kg患者重量の量で投与される。
一部の場合において、本開示の組み換えウイルスの複数回の投薬が投与される。本開示の組み換えウイルスの投与の頻度は、多様な因子、例えば症状の重症度等のいずれかに応じて変動し得る。例えば、一部の実施形態において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは、月に1回、月に2回、月に3回、隔週で(qow)、週に1回(qw)、週に2回(biw)、週に3回(tiw)、週に4回、週に5回、週に6回、隔日で(qod)、毎日(qd)、1日2回(bid)、または1日3回(tid)投与される。
本開示の組み換えウイルスの投与の継続期間は、多様な因子、例えば患者応答等のいずれかに応じて変動し得る。例えば、本開示の組み換えウイルスは、約1日~約1週間、約2週間~約4週間、約1カ月間~約2カ月間、約2カ月間~約4カ月間、約4カ月間~約6カ月間、約6カ月間~約8カ月間、約8カ月間~約1年間、約1年間~約2年間、もしくは約2年間~約4年間、またはそれを上回る期間に及ぶ期間にわたって投与され得る。
本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、インビボおよびエクスビボ方法、ならびに投与の全身的および限局的経路を含めた、薬物送達に適切な任意の利用可能な方法および経路を使用して個体に投与される。
投与の従来的でかつ薬学的に許容できる経路は、腫瘍内、腫瘍周辺、筋肉内、気管内、髄腔内、頭蓋内、皮下、皮内、局部適用、静脈内、動脈内、腹腔内、膀胱内、直腸、経鼻、経口、ならびに他の腸内および非経口の投与の経路を含む。投与の経路は、所望の場合には組み合わされ得る、または組み換えワクシニアウイルスおよび/もしくは所望の効果に応じて調整され得る。本開示の組み換えワクシニアウイルスは、単回投薬でまたは複数回投薬で投与され得る。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、静脈内に、筋肉内に、局所的に、腫瘍内に、腫瘍周辺に、頭蓋内に、皮下に、動脈内に、腹腔内に、膀胱内の投与の経路を介して、または髄腔内に投与される。
C-4B.組み合わせ
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、別の療法または作用物質との組み合わせで投与される。例えば、組み換えウイルスは、標準的な癌療法に対するアジュバント療法として投与され得る、別の癌療法との組み合わせで投与され得る、または組み換えワクシニアウイルスの抗腫瘍効果を増強する作用物質との組み合わせで投与され得る。標準的な癌療法は、手術(例えば、癌性組織の外科的除去)、放射線療法、骨髄移植、化学療法治療、抗体治療、生物学的応答修飾物質治療、免疫療法治療、および前述のもののある特定の組み合わせを含む。ゆえに、一実施形態において、本開示は、a)本開示の組み換えワクシニアウイルス、またはそれを含む組成物;およびb)第2の癌療法をそれを必要とする個体に投与する工程を含む、個体における癌を治療する方法を提供する。一部の場合において、第2の癌療法は、化学療法、生物学的療法(抗体を用いた療法等)、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法(例えば、本開示の組み換えワクシニアウイルス以外の腫瘍溶解性ウイルス)、細胞療法、および手術から選択される。
一部の場合において、本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、別の療法または作用物質との組み合わせで投与される。例えば、組み換えウイルスは、標準的な癌療法に対するアジュバント療法として投与され得る、別の癌療法との組み合わせで投与され得る、または組み換えワクシニアウイルスの抗腫瘍効果を増強する作用物質との組み合わせで投与され得る。標準的な癌療法は、手術(例えば、癌性組織の外科的除去)、放射線療法、骨髄移植、化学療法治療、抗体治療、生物学的応答修飾物質治療、免疫療法治療、および前述のもののある特定の組み合わせを含む。ゆえに、一実施形態において、本開示は、a)本開示の組み換えワクシニアウイルス、またはそれを含む組成物;およびb)第2の癌療法をそれを必要とする個体に投与する工程を含む、個体における癌を治療する方法を提供する。一部の場合において、第2の癌療法は、化学療法、生物学的療法(抗体を用いた療法等)、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法(例えば、本開示の組み換えワクシニアウイルス以外の腫瘍溶解性ウイルス)、細胞療法、および手術から選択される。
放射線療法は、ビーム等の外部から適用される供給源からまたは小さな放射線源の埋め込みによって送達される、x線またはガンマ線を含むが、それらに限定されるわけではない。
癌治療における使用のための適切な抗体の例は、トラスツズマブ(ハーセプチン)、ベバシズマブ(Avastin(商標))、セツキシマブ(Erbitux(商標))、パニツムマブ(Vectibix(商標))、イピリムマブ(Yervoy(商標))、リツキシマブ(リツキサン)、アレムツズマブ(Lemtrada(商標))、オファツムマブ(Arzerra(商標))、オレゴボマブ(OvaRex(商標))、ランブロリズマブ(MK-3475)、ペルツズマブ(Perjeta(商標))、ラニビズマブ(Lucentis(商標))等、およびコンジュゲート抗体、例えばゲムツズマブオゾガマイシン(Mylortarg(商標))、ブレンツキシマブベドチン(Adcetris(商標))、90Y標識イブリツモマブチウキセタン(Zevalin(商標))、131I標識トシツモマブ(tositumoma)(Bexxar(商標))等を含む。癌治療における使用のための適切な抗体は、例えば、CTLA-4を標的にするイピリムマブ(黒色腫、前立腺癌、RCCの治療において使用される);CTLA-4を標的にするトレメリムマブ(CRC、胃、黒色腫、NSCLCの治療において使用される);PD-1を標的にするニボルマブ(黒色腫、NSCLC、RCCの治療において使用される);PD-1を標的にするMK-3475(黒色腫の治療において使用される);PD-1を標的にするピジリズマブ(血液悪性腫瘍の治療において使用される);PD-L1を標的にするBMS-936559(黒色腫、NSCLC、卵巣、RCCの治療において使用される);PD-L1を標的にするMEDI4736;PD-L1を標的にするMPDL33280A(黒色腫の治療において使用される);CD20を標的にするリツキシマブ(非ホジキンリンパ腫の治療において使用される);イブリツモマブチウキセタンおよびトシツモマブ(リンパ腫の治療において使用される);CD30を標的にするブレンツキシマブベドチン(ホジキンリンパ腫の治療において使用される);CD33を標的にするゲムツズマブオゾガマイシン(急性骨髄性白血病の治療において使用される);CD52を標的にするアレムツズマブ(慢性リンパ球性白血病の治療において使用される);EpCAMを標的にするIGN101およびアデカツムマブ(上皮腫瘍(乳房、結腸、および肺)の治療において使用される);CEAを標的にするラベツズマブ(乳房、結腸、および肺腫瘍の治療において使用される);gpA33を標的にするhuA33(結腸直腸癌腫の治療において使用される);ムチンを標的にするペムツモマブ(Pemtumomab)およびオレゴボマブ(乳房、結腸、肺、および卵巣腫瘍の治療において使用される);TAG-72を標的にするCC49(ミンレツモマブ(minretumomab))(乳房、結腸、および肺腫瘍の治療において使用される);CAIXを標的にするcG250(腎細胞癌腫の治療において使用される);PSMAを標的にするJ591(前立腺癌腫の治療において使用される);葉酸結合タンパク質を標的にするMOv18およびMORAb-003(ファルレツズマブ)(卵巣腫瘍の治療において使用される);ガングリオシド(GD2、GD3、およびGM2等)を標的にする3F8、ch14.18、およびKW-2871(神経外胚葉腫瘍および一部の上皮腫瘍の治療において使用される);Le yを標的にするhu3S193およびIgN311(乳房、結腸、肺、および前立腺腫瘍の治療において使用される);VEGFを標的にするベバシズマブ(腫瘍血管系の治療において使用される);VEGFRを標的にするIM-2C6およびCDP791(上皮由来固形腫瘍の治療において使用される);インテグリン_V_3を標的にするエタラシズマブ(腫瘍血管系の治療において使用される);インテグリン_5_1を標的にするヴォロシキシマブ(腫瘍血管系の治療において使用される);EGFRを標的にするセツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、および806(神経膠腫、肺、乳房、結腸、および頭頸部腫瘍の治療において使用される);ERBB2を標的にするトラスツズマブおよびペルツズマブ(乳房、結腸、肺、卵巣、および前立腺腫瘍の治療において使用される);ERBB3を標的にするMM-121(乳房、結腸、肺、卵巣、および前立腺腫瘍の治療において使用される);METを標的にするAMG 102、METMAB、およびSCH 900105(乳房、卵巣、および肺腫瘍の治療において使用される);IGF1Rを標的にするAVE1642、IMC-A12、MK-0646、R1507、およびCP 751871(神経膠腫、肺、乳房、頭頸部、前立腺、および甲状腺癌の治療において使用される);EPHA3を標的にするKB004およびIIIA4(肺、腎臓、および結腸腫瘍、黒色腫、神経膠腫、ならびに血液悪性腫瘍の治療において使用される);TRAILR1を標的にするマパツムマブ(HGS-ETR1)(結腸、肺、および膵臓腫瘍、ならびに血液悪性腫瘍の治療において使用される);TRAILR2を標的にするHGS-ETR2およびCS-1008;RANKLを標的にするデノスマブ(前立腺癌および骨転移の治療において使用される);FAPを標的にするシブロツズマブ(Sibrotuzumab)およびF19(結腸、乳房、肺、膵臓、および頭頸部腫瘍の治療において使用される);テネイシンを標的にする81C6(神経膠腫、乳房および前立腺腫瘍の治療において使用される);CD3を標的にするブリナツモマブ(ビーリンサイト;Amgen)(ALLの治療において使用される);癌免疫療法において使用される、PD-1を標的にするペムブロリズマブ;c-Mycを標的にする9E10抗体;等を含むが、それらに限定されるわけではない。
一部の場合において、本開示の方法は、a)本開示の、ワクシニアウイルス等の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量;およびb)抗PD-1抗体を投与する工程を含む。一部の場合において、本開示の方法は、a)本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量;およびb)抗PD-L1抗体を投与する工程を含む。適切な抗PD-1抗体は、ペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標);MK-3475)、ニボルマブ(Opdivo(登録商標);BMS-926558;MDX1106)、ピジリズマブ(CT-011)、AMP-224、AMP-514(MEDI-0680)、PDR001、およびPF-06801591を含むが、それらに限定されるわけではない。適切な抗PD-L1抗体は、BMS-936559(MDX1105)、デュルバルマブ(MEDI4736;イミフィンジ)、アテゾリズマブ(MPDL33280A;テセントリク)を含むが、それらに限定されるわけではない。例えば、SunshineおよびTaube(2015)Curr.Opin.Pharmacol.23:32;ならびにHeeryら(2017)The Lancet Oncology 18:587;Iwaiら(2017)J.Biomed.Sci.24:26;Hu-Lieskovanら(2017)Annals of Oncology 28:issue Suppl.5、mdx376.048;ならびに米国特許公報第2016/0159905号を参照されたい。
一部の場合において、適切な抗体は、二重特異性抗体、例えば二重特異性モノクローナル抗体である。カツマクソマブ、ブリナツモマブ、ソリトマブ(solitomab)、パソツキシズマブ(pasotuxizumab)、およびフロテツズマブは、癌療法における使用に適切な二重特異性抗体の非限定的な例である。例えば、ChamesおよびBaty(2009)MAbs 1:539;ならびにSedykhら(2018)Drug Des.Devel.Ther.12:195を参照されたい。
本開示の方法と併せた使用に適切な生物学的応答修飾物質は、(1)チロシンキナーゼ(RTK)活性の阻害剤;(2)セリン/スレオニンキナーゼ活性の阻害剤;(3)腫瘍抗原に特異的に結合する抗体等、腫瘍関連抗原アンタゴニスト;(4)アポトーシス受容体アゴニスト;(5)インターロイキン-2;(6)インターフェロン-α;(7)インターフェロン-γ;(8)コロニー刺激因子;(9)血管新生の阻害剤;および(10)腫瘍壊死因子のアンタゴニストを含むが、それらに限定されるわけではない。
化学療法剤は、癌細胞の増殖を低下させる非ペプチド性(すなわち、非タンパク性)化合物であり、細胞毒性剤および細胞増殖抑制剤を包含する。化学療法剤の非限定的な例は、アルキル化剤、ニトロソウレア、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、植物性(ビンカ)アルカロイド、およびステロイドホルモンを含む。
細胞増殖を低下させるように作用する作用物質は、当技術分野において公知であり、広く使用されている。そのような作用物質は、メクロレタミン、シクロホスファミド(Cytoxan(商標))、メルファラン(L-サルコリシン)、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、セムスチン(メチル-CCNU)、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、ダカルバジン、およびテモゾロミドを含むがそれらに限定されない、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、およびトリアゼン等のアルキル化剤を含む。
代謝拮抗剤は、シタラビン(CYTOSAR-U)、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル(5-FU)、フロクスウリジン(FudR)、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン(6-MP)、ペントスタチン、5-フルオロウラシル(5-FU)、メトトレキサート、10-プロパルギル-5,8-ジデアザ葉酸(PDDF、CB3717)、5,8-ジデアザテトラヒドロ葉酸(DDATHF)、ロイコボリン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビンを含むがそれらに限定されない、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む。
適切な天然産物およびそれらの誘導体(例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポドフィロトキシン)は、Ara-C、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン-C、L-アスパラギナーゼ、アザチオプリン;ブレキナル;アルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン等;ポドフィロトキシン、例えばエトポシド、テニポシド等;抗生物質、例えばアントラサイクリン、ダウノルビシン塩酸塩(ダウノマイシン、ルビドマイシン、セルビジン)、イダルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、およびモルホリノ誘導体等;フェノキシゾンビスシクロペプチド(phenoxizone biscyclopeptide)、例えばダクチノマイシン;塩基性グリコペプチド、例えばブレオマイシン;アントラキノングリコシド、例えばプリカマイシン(ミトラマイシン);アントラセンジオン、例えばミトキサントロン;アジリノピロロ(azirinopyrrolo)インドールジオン、例えばマイトマイシン;大環状免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、FK-506(タクロリムス、プログラフ)、ラパマイシン等;等を含むが、それらに限定されるわけではない。
他の抗増殖性細胞毒性剤は、ナベルビン(navelbene)、CPT-11、アナストロゾール(anastrazole)、レトロゾール(letrazole)、カペシタビン、レロキサフィン(reloxafine)、シクロホスファミド、イホスファミド(ifosamide)、およびドロロキサフィン(droloxafine)である。
抗増殖活性を有する、微小管に影響を及ぼす作用物質も、使用に適切であり、アロコルヒチン(NSC 406042)、ハリコンドリンB(NSC 609395)、コルヒチン(NSC 757)、コルヒチン誘導体(例えば、NSC 33410)、ドラスタチン(dolstatin)10(NSC 376128)、マイタンシン(NSC 153858)、リゾキシン(NSC 332598)、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、Taxol(登録商標)誘導体、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、チオコルヒチン(NSC 361792)、トリチルシステリン(trityl cysterin)、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、エポチロン(eopthilone)A、エポチロンBを含むがそれらに限定されない天然および合成エポチロン、ディスコデルモライド;エストラムスチン、ノコダゾール等を含むが、それらに限定されるわけではない。
使用に適切であるホルモンモジュレーターおよびステロイド(合成類似体を含む)は、副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾン、デキサメタゾン等;エストロゲンおよびプロゲスチン(pregestin)、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、エストラジオール、クロミフェン、タモキシフェン等;ならびに副腎皮質抑制剤、例えばアミノグルテチミド;17α-エチニルエストラジオール;ジエチルスチルベストロール、テストステロン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、メチルプレドニゾロン、メチル-テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド(ドロゲニル)、トレミフェン(フェアストン)、およびZoladex(登録商標)を含むが、それらに限定されるわけではない。エストロゲンは、増殖および分化を刺激し、それゆえ、エストロゲン受容体に結合する化合物を使用して、この活性を遮断する。コルチコステロイドは、T細胞増殖を阻害し得る。
他の化学療法剤は、金属錯体、例えばシスプラチン(cis-DDP)、カルボプラチン等;ウレア、例えばヒドロキシウレア;およびヒドラジン、例えばN-メチルヒドラジン;エピドフィロトキシン(epidophyllotoxin);トポイソメラーゼ阻害剤;プロカルバジン;ミトキサントロン;ロイコボリン;テガフール;等を含む。関心対象の他の抗増殖剤は、免疫抑制剤、例えばミコフェノール酸、サリドマイド、デオキシスパガリン(desoxyspergualin)、アザスポリン(azasporine)、レフルノミド、ミゾリビン、アザスピラン(SKF 105685);Iressa(登録商標)(ZD 1839、4-(3-クロロ-4-フルオロフェニルアミノ)-7-メトキシ-6-(3-(4-モルホリニル)プロポキシ)キナゾリン);等を含む。
「タキサン」は、パクリタキセル、ならびに任意の活性タキサン誘導体またはプロドラッグを含む。「パクリタキセル」(例えばドセタキセル、TAXOLμ、TAXOTEREμ(ドセタキセルの製剤)、パクリタキセルの10-デスアセチル類似体、およびパクリタキセルの3’N-デスベンゾイル(desbenzoyl)-3’N-t-ブトキシカルボニル類似体等、類似体、製剤、および誘導体を含むと本明細書において理解されるべきである)は、当業者に公知の技法を利用して容易に調製され得る(WO94/07882、WO94/07881、WO94/07880、WO94/07876、WO93/23555、WO93/10076;米国特許第5,294,637号;第5,283,253号;第5,279,949号;第5,274,137号;第5,202,448号;第5,200,534号;第5,229,529号;およびEP590,267も参照されたい)、または例えばSigma Chemical Co.、St.Louis、Mo.を含めた、多様な商業的供給元から獲得され得る(タイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia)由来のT7402;またはウンナンイチイ(Taxus yannanensis)由来のT-1912)。
パクリタキセルは、パクリタキセルのよく見られる化学的に入手可能な形態だけでなく、類似体および誘導体(例えば、上で記されるTaxotereμドセタキセル)、ならびにパクリタキセルコンジュゲート(例えば、パクリタキセル-PEG、パクリタキセル-デキストラン、またはパクリタキセル-キシロース)も指すと理解されるべきである。
細胞療法は、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法(CAR-T療法);ナチュラルキラー(NK)細胞療法;樹状細胞(DC)療法(例えば、DCベースのワクチン);T細胞受容体(TCR)を操作されたT細胞ベースの療法;等を含む。
C-4C.癌および腫瘍
本開示の方法および組成物によって治療され得る癌細胞は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯茎、頭、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、脊髄、精巣、舌、または子宮等、任意の臓器または組織由来のまたはそれにおける癌細胞を含む。加えて、癌は、任意の組織学的タイプのもの、例えば新生物、悪性腫瘍;癌腫;癌腫、未分化;巨細胞および紡錘細胞癌腫;小細胞癌腫;乳頭状癌腫;扁平上皮細胞癌腫;リンパ上皮癌腫;基底細胞癌腫;ピロマトリックス癌腫;移行細胞癌腫;乳頭状移行細胞癌腫;腺癌;ガストリノーマ、悪性;胆管癌腫;肝細胞癌腫;混合型肝細胞癌腫および胆管癌腫;索状腺癌;腺様嚢胞癌腫;腺腫性ポリープにおける腺癌;腺癌、家族性結腸ポリポーシス;固形癌腫;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支(branchiolo)-肺胞腺癌;乳頭状腺癌;色素嫌性癌腫;好酸性癌腫;好酸性腺癌;好塩基性癌腫;明細胞腺癌;顆粒細胞癌腫;濾胞状腺癌;乳頭状および濾胞状腺癌;非被包性硬化性癌腫;副腎皮質癌腫;類内膜(endometroid)癌腫;皮膚付属器癌腫;アポクリン腺癌;脂腺腺癌;耳垢腺癌;粘表皮癌腫;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液性嚢胞腺癌;粘液性嚢胞腺癌;粘液腺癌;印環細胞癌腫;浸潤性導管癌腫;髄様癌腫;小葉癌腫;炎症性癌腫;パジェット病、乳房;腺房細胞癌腫;腺扁平上皮癌腫;腺癌w/扁平上皮化生;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫瘍、悪性;卵胞膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫瘍、悪性;アンドロブラストーマ、悪性;セルトリ細胞癌腫;ライディッヒ細胞腫瘍、悪性;脂質細胞腫瘍、悪性;傍神経節腫、悪性;乳房外傍神経節腫、悪性;褐色細胞腫;グロムス血管肉腫(glomangiosarcoma);悪性黒色腫;無色素性黒色腫;表在性拡大性黒色腫;巨大色素性母斑における悪性(malig)黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽細胞腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胚性癌腫;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管外皮腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨の巨細胞腫瘍;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星状細胞腫;星状芽細胞腫;膠芽腫;乏突起膠腫;乏突起神経膠芽細胞腫;未分化神経外胚葉性;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅神経原腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫瘍、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキン;側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;他の指定された非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;肥満細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞性白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞性白血病;骨髄白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥満細胞性白血病;巨核芽球性白血病;骨髄性肉腫;膵臓癌;直腸癌;ならびに有毛細胞白血病であり得る。
本開示の方法および組成物によって治療され得る癌細胞は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯茎、頭、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、脊髄、精巣、舌、または子宮等、任意の臓器または組織由来のまたはそれにおける癌細胞を含む。加えて、癌は、任意の組織学的タイプのもの、例えば新生物、悪性腫瘍;癌腫;癌腫、未分化;巨細胞および紡錘細胞癌腫;小細胞癌腫;乳頭状癌腫;扁平上皮細胞癌腫;リンパ上皮癌腫;基底細胞癌腫;ピロマトリックス癌腫;移行細胞癌腫;乳頭状移行細胞癌腫;腺癌;ガストリノーマ、悪性;胆管癌腫;肝細胞癌腫;混合型肝細胞癌腫および胆管癌腫;索状腺癌;腺様嚢胞癌腫;腺腫性ポリープにおける腺癌;腺癌、家族性結腸ポリポーシス;固形癌腫;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支(branchiolo)-肺胞腺癌;乳頭状腺癌;色素嫌性癌腫;好酸性癌腫;好酸性腺癌;好塩基性癌腫;明細胞腺癌;顆粒細胞癌腫;濾胞状腺癌;乳頭状および濾胞状腺癌;非被包性硬化性癌腫;副腎皮質癌腫;類内膜(endometroid)癌腫;皮膚付属器癌腫;アポクリン腺癌;脂腺腺癌;耳垢腺癌;粘表皮癌腫;嚢胞腺癌;乳頭状嚢胞腺癌;乳頭状漿液性嚢胞腺癌;粘液性嚢胞腺癌;粘液腺癌;印環細胞癌腫;浸潤性導管癌腫;髄様癌腫;小葉癌腫;炎症性癌腫;パジェット病、乳房;腺房細胞癌腫;腺扁平上皮癌腫;腺癌w/扁平上皮化生;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫瘍、悪性;卵胞膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫瘍、悪性;アンドロブラストーマ、悪性;セルトリ細胞癌腫;ライディッヒ細胞腫瘍、悪性;脂質細胞腫瘍、悪性;傍神経節腫、悪性;乳房外傍神経節腫、悪性;褐色細胞腫;グロムス血管肉腫(glomangiosarcoma);悪性黒色腫;無色素性黒色腫;表在性拡大性黒色腫;巨大色素性母斑における悪性(malig)黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽細胞腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胚性癌腫;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管外皮腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨の巨細胞腫瘍;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星状細胞腫;星状芽細胞腫;膠芽腫;乏突起膠腫;乏突起神経膠芽細胞腫;未分化神経外胚葉性;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅神経原腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫瘍、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキン;側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;他の指定された非ホジキンリンパ腫;悪性組織球症;多発性骨髄腫;肥満細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞性白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞性白血病;骨髄白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥満細胞性白血病;巨核芽球性白血病;骨髄性肉腫;膵臓癌;直腸癌;ならびに有毛細胞白血病であり得る。
本開示の方法を使用して治療され得る腫瘍は、例えば脳腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍を含む。
一部の場合において、腫瘍は結腸直腸腺癌である。一部の場合において、腫瘍は非小細胞肺癌腫である。一部の場合において、腫瘍はトリプルネガティブ乳癌である。一部の場合において、腫瘍は固形腫瘍である。一部の場合において、腫瘍は液性腫瘍である。一部の場合において、腫瘍は再発性である。一部の場合において、腫瘍は原発性腫瘍である。一部の場合において、腫瘍は転移性である。
多様な対象が、癌を治療する対象方法を用いた治療に適切である。適切な対象は、癌を有する、癌を有すると診断されたことがある、癌を発症するリスクがある、癌を有したことがありかつ癌の再発のリスクがある、癌に対して本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス以外の作用物質で治療されたことがあり、そのような治療に応答しなかった、または癌に対して本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルス以外の作用物質で治療されたことがあるがそのような治療への初期応答後に再発した、任意の個体、例えばヒトまたは非ヒト動物を含む。
C-5.腫瘍溶解性ウイルス免疫原性組成物
別の態様において、本開示によって提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、そのゲノムに、腫瘍関連抗原および新抗原等の癌抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。「癌関連抗原」(腫瘍関連抗原としても知られる)という用語は、正常細胞によってよりも癌細胞によってより多く発現されるタンパク質である。「新抗原」という用語は、癌細胞において発現されるが正常細胞において発現されないタンパク質を指す。一部の実施形態において、組み換えワクシニアウイルスは、そのゲノムに、i)上で本明細書に記載されるIL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;ii)異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;およびiii)癌抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような組み換えワクシニアウイルスは、それを必要とする個体(例えば、癌を有する個体)に投与された場合に、コードされた癌抗原への個体における免疫応答を誘導し得るまたは増強し得る。免疫応答は、個体における癌細胞の数を低下させ得る。適切なIL-2vポリペプチドおよび異種TKポリペプチドは、上で記載されるとおりである。
別の態様において、本開示によって提供される組み換え腫瘍溶解性ウイルスは、そのゲノムに、腫瘍関連抗原および新抗原等の癌抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。「癌関連抗原」(腫瘍関連抗原としても知られる)という用語は、正常細胞によってよりも癌細胞によってより多く発現されるタンパク質である。「新抗原」という用語は、癌細胞において発現されるが正常細胞において発現されないタンパク質を指す。一部の実施形態において、組み換えワクシニアウイルスは、そのゲノムに、i)上で本明細書に記載されるIL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;ii)異種TKポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;およびiii)癌抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような組み換えワクシニアウイルスは、それを必要とする個体(例えば、癌を有する個体)に投与された場合に、コードされた癌抗原への個体における免疫応答を誘導し得るまたは増強し得る。免疫応答は、個体における癌細胞の数を低下させ得る。適切なIL-2vポリペプチドおよび異種TKポリペプチドは、上で記載されるとおりである。
癌関連抗原の例は、α-葉酸受容体;炭酸脱水酵素IX(CAIX);CD19;CD20;CD22;CD30;CD33;CD44v7/8;癌胎児性抗原(CEA);上皮糖タンパク質-2(EGP-2);上皮糖タンパク質-40(EGP-40);葉酸結合タンパク質(FBP);胎児アセチルコリン受容体;ガングリオシド抗原GD2;Her2/neu;IL-13R-a2;カッパ軽鎖;LeY;L1細胞接着分子;黒色腫関連抗原(MAGE);MAGE-A1;メソテリン;MUC1;NKG2Dリガンド;腫瘍胎児抗原(h5T4);前立腺幹細胞抗原(PSCA);前立腺特異的膜抗原(PSMA);腫瘍関連糖タンパク質-72(TAG-72);血管内皮成長因子受容体-2(VEGF-R2)(例えば、Vigneronら(2013)Cancer Immunity 13:15;およびVigneron(2015)BioMed Res.Int’l Article ID 948501を参照されたい);および上皮成長因子受容体(EGFR)vIIIポリペプチド(例えば、Wongら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2965;およびMiaoら(2014)PLoSOne 9:e94281を参照されたい);MUC1ポリペプチド;ヒトパピローマウイルス(HPV)E6ポリペプチド;LMP2ポリペプチド;HPV E7ポリペプチド;上皮成長因子受容体(EGFR)vIIIポリペプチド;HER-2/neuポリペプチド;黒色腫抗原ファミリーA、3(MAGE A3)ポリペプチド;p53ポリペプチド;変異体p53ポリペプチド;NY-ESO-1ポリペプチド;葉酸ヒドロラーゼ(前立腺特異的膜抗原;PSMA)ポリペプチド;癌胎児性抗原(CEA)ポリペプチド;T細胞によって認識される黒色腫抗原(メランA/MART1)ポリペプチド;Rasポリペプチド;gp100ポリペプチド;プロテイナーゼ3(PR1)ポリペプチド;bcr-ablポリペプチド;チロシナーゼポリペプチド;サバイビンポリペプチド;前立腺特異的抗原(PSA)ポリペプチド;hTERTポリペプチド;肉腫転座切断点ポリペプチド;滑膜肉腫X(SSX)切断点ポリペプチド;EphA2ポリペプチド;前立腺酸ホスファターゼ(PAP)ポリペプチド;黒色腫アポトーシス阻害剤(melanoma inhibitor of apoptosis)(ML-IAP)ポリペプチド;アルファ-フェトプロテイン(AFP)ポリペプチド;上皮細胞接着分子(EpCAM)ポリペプチド;ERG(TMPRSS2 ETS融合体)ポリペプチド;NA17ポリペプチド、ペアードボックス-3(PAX3)ポリペプチド;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK)ポリペプチド;アンドロゲン受容体ポリペプチド;サイクリンB1ポリペプチド;N-mycがん原遺伝子(MYCN)ポリペプチド;Rasホモログ遺伝子ファミリーメンバーC(RhoC)ポリペプチド;チロシナーゼ関連タンパク質-2(TRP-2)ポリペプチド;メソテリンポリペプチド;前立腺幹細胞抗原(PSCA)ポリペプチド;黒色腫関連抗原-1(MAGE A1)ポリペプチド;シトクロムP450 1B1(CYP1B1)ポリペプチド;胎盤特異的タンパク質1(PLAC1)ポリペプチド;BORISポリペプチド(CCCTC結合因子またはCTCFとしても知られる);ETV6-AMLポリペプチド;乳癌抗原NY-BR-1ポリペプチド(アンキリンリピートドメイン含有タンパク質30Aとも称される);G-タンパク質シグナル伝達の調節因子(RGS5)ポリペプチド;T細胞によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原(SART3)ポリペプチド;炭酸脱水酵素IXポリペプチド;ペアードボックス-5(PAX5)ポリペプチド;OY-TES1(精巣抗原;アクロシン結合タンパク質としても知られる)ポリペプチド;精子タンパク質17ポリペプチド;リンパ球特異的タンパク質-チロシンキナーゼ(LCK)ポリペプチド;高分子量黒色腫関連抗原(HMW-MAA);A-キナーゼアンカータンパク質-4(AKAP-4);滑膜肉腫X切断点2(SSX2)ポリペプチド;X抗原ファミリーメンバー1(XAGE1)ポリペプチド;B7ホモログ3(B7H3;CD276としても知られる)ポリペプチド;レグマインポリペプチド(LGMN1;アスパラギニルエンドペプチダーゼとしても知られる);IgおよびEGF相同ドメインを有するチロシンキナーゼ-2(Tie-2;アンジオポエチン-1受容体としても知られる)ポリペプチド;P抗原ファミリーメンバー4(PAGE4)ポリペプチド;血管内皮成長因子受容体2(VEGF2)ポリペプチド;MAD-CT-1ポリペプチド;線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)ポリペプチド;血小板由来成長因子受容体ベータ(PDGFβ)ポリペプチド;MAD-CT-2ポリペプチド;Fos関連抗原-1(FOSL)ポリペプチド;ならびにウィルムス腫瘍-1(WT-1)ポリペプチドを含む。
癌関連抗原のアミノ酸配列は当技術分野において公知であり;例えば、MUC1(GenBank CAA56734);LMP2(GenBank CAA47024);HPV E6(GenBank AAD33252);HPV E7(GenBank AHG99480);EGFRvIII(GenBank NP_001333870);HER-2/neu(GenBank AAI67147);MAGE-A3(GenBank AAH11744);p53(GenBank BAC16799);NY-ESO-1(GenBank CAA05908);PSMA(GenBank AAH25672);CEA(GenBank AAA51967);メラン/MART1(GenBank NP_005502);Ras(GenBank NP_001123914);gp100(GenBank AAC60634);bcr-abl(GenBank AAB60388);チロシナーゼ(GenBank AAB60319);サバイビン(GenBank AAC51660);PSA(GenBank CAD54617);hTERT(GenBank BAC11010);SSX(GenBank NP_001265620);Eph2A(GenBank NP_004422);PAP(GenBank AAH16344);ML-IAP(GenBank AAH14475);AFP(GenBank NP_001125);EpCAM(GenBank NP_002345);ERG(TMPRSS2 ETS融合体)(GenBank ACA81385);PAX3(GenBank AAI01301);ALK(GenBank NP_004295);アンドロゲン受容体(GenBank NP_000035);サイクリンB1(GenBank CAO99273);MYCN(GenBank NP_001280157);RhoC(GenBank AAH52808);TRP-2(GenBank AAC60627);メソテリン(GenBank AAH09272);PSCA(GenBank AAH65183);MAGE A1(GenBank NP_004979);CYP1B1(GenBank AAM50512);PLAC1(GenBank AAG22596);BORIS(GenBank NP_001255969);ETV6(GenBank NP_001978);NY-BR1(GenBank NP_443723);SART3(GenBank NP_055521);炭酸脱水酵素IX(GenBank EAW58359);PAX5(GenBank NP_057953);OY-TES1(GenBank NP_115878);精子タンパク質17(GenBank AAK20878);LCK(GenBank NP_001036236);HMW-MAA(GenBank NP_001888);AKAP-4(GenBank NP_003877);SSX2(GenBank CAA60111);XAGE1(GenBank NP_001091073;XP_001125834;XP_001125856;およびXP_001125872);B7H3(GenBank NP_001019907;XP_947368;XP_950958;XP_950960;XP_950962;XP_950963;XP_950965;およびXP_950967);LGMN1(GenBank NP_001008530);TIE-2(GenBank NP_000450);PAGE4(GenBank NP_001305806);VEGFR2(GenBank NP_002244);MAD-CT-1(GenBank NP_005893 NP_056215);FAP(GenBank NP_004451);PDGFβ(GenBank NP_002600);MAD-CT-2(GenBank NP_001138574);FOSL(GenBank NP_005429);およびWT-1(GenBank NP_000369)を参照されたい。これらのポリペプチドは、例えばCheeverら(2009)Clin.Cancer Res.15:5323およびその中で引用される参考文献;Wagnerら(2003)J.Cell.Sci.116:1653;Matsuiら(1990)Oncogene 5:249;ならびにZhangら(1996)Nature 383:168にも論じられる。
一部の場合において、本開示の、ワクシニアウイルス等の組み換え腫瘍溶解性ウイルスは複製能を有しない。一部の場合において、組み換えウイルスは、ウイルスが複製できない能力をもたらす、ウイルス遺伝子の改変を含む。複製に要される遺伝子産物をコードする1種または複数のウイルス遺伝子は、ウイルスが複製することができないように改変され得る。例えば、組み換えウイルスは、中間転写因子(例えば、A8Rおよび/またはA23R)(例えば、Wyattら(2017)mBio 8:e00790;およびWarrenら(2012)J.Virol.86:9514を参照されたい)および/または後期転写因子(例えば、G8R、A1L、およびA2Lのうちの1種または複数)(例えば、Yangら(2013)Virology 447:213を参照されたい)のレベルおよび/または活性を低下させるように改変され得る。中間転写因子および/または後期転写因子のレベルおよび/または活性を低下させることは、初期ウイルスプロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドを発現し得る改変ワクシニアウイルスをもたらし得るが;しかしながら、ウイルスは複製することができないであろう。改変は、例えば、遺伝子のすべてまたは一部の欠失;遺伝子への挿入;等を含む。例えば、A8R遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。別の例として、A23R遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。別の例として、G8R遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。別の例として、A1L遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。別の例として、A2L遺伝子のすべてまたは一部分が欠失され得る。
上で記されるように、一部の場合において、本開示の組み換えワクシニアウイルスは非腫瘍溶解性である。
C-6.2’-デオキシグアノシンの類似体の投与
別の態様において、本開示は、2’-デオキシグアノシンの合成類似体との組み合わせでの、本明細書に記載される異種TKポリペプチドを含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与を提供する。
別の態様において、本開示は、2’-デオキシグアノシンの合成類似体との組み合わせでの、本明細書に記載される異種TKポリペプチドを含む組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与を提供する。
腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスの投与を受けた対象において有害な副作用を引き起こし得る。副作用の例は、水疱性病変または「小水疱性皮疹」等の皮膚病変を含む。一部の実施形態において、本開示は、a)本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの有効量;およびb)2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量を個体に投与する工程を含む、個体における癌を治療する方法であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは異種TKポリペプチドを含む、方法を提供する。一部の他の実施形態において、本開示は、組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与を受けている対象に2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量を投与する工程を含む、本開示の組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの副作用を治療する、低下させる、または管理する方法であって、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは異種TKポリペプチドを含む、方法を提供する。
2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の「有効量」は、投与された複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによって引き起こされる有害な副作用を低下させるのに有効である量である。例えば、有害な副作用が皮膚病変である場合、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量は、1回または複数の投薬で個体に投与された場合に、個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変の数および/または重症度および/または継続期間を低下させるのに有効である量である。例えば、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量は、1回または複数の投薬で個体に投与された場合に、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の投与前のまたは2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の投与の非存在下での個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変の数および/または重症度および/または継続期間と比較して、個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変の数および/または重症度および/または継続期間を少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、または75%を上回る割合低下させるのに有効である量であり得る。一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量は、1回または複数の投薬で個体に投与された場合に、ワクシニアウイルス誘導性皮膚病変からのウイルスの排出を低下させるのに有効である量である。例えば、一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量は、1回または複数の投薬で個体に投与された場合に、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の投与前のまたは2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の投与の非存在下での個体におけるワクシニアウイルス誘導性皮膚病変からのウイルス排出のレベルまたは程度と比較して、ワクシニアウイルス誘導性皮膚病変からのウイルスの排出を少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、または75%を上回る割合低下させるのに有効である量である。有害な副作用が皮膚病変である場合、一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は、投与の任意の好都合な経路によって(例えば、局部的に、経口的に、静脈内に等)投与され得る。例えば、有害な副作用が皮膚病変である場合、一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は局部的に投与され得る。皮膚病変を低下させるために、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は、典型的に、例えば皮膚の病変エリアへの2’-デオキシ-グアノシン類似体の適用によって、局部的に投与される。
2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の投与は、異種TKポリペプチドを含む複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製を低下させる。本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製のそのような低下は、例えば、個体における複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのレベルを制御することにとって、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの効果を制御することにとって等、望ましくあり得る。ゆえに、一部の他の実施形態において、本開示は、a)本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの有効量を投与する工程;およびb)2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量を投与する工程を含む、個体における癌を治療する方法を提供する。一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量は、1回または複数の投薬で個体に投与された場合に、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の投与前のまたは2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の投与の非存在下での個体における複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製のレベルと比較して、個体における本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製を少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、または75%を上回る割合低下させるのに有効である量である。
2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の後に投与され得る。例えば、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は、複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の1日~7日、7日~2週間、2週間~1カ月、1カ月~3カ月、または3カ月を上回る期間後に投与され得る。
一部の場合において、本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが投与されている個体への2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の投与は、個体における迅速な全身性の腫瘍溶解(癌細胞の溶解)を誘導する。例えば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス誘導による腫瘍成長の減速が生じた時点で、および/またはウイルス複製がそのピークにあるもしくはその直後にある時点で、および/またはワクシニアウイルスタンパク質に対する循環抗体がそれらのピークにあるもしくはその直後にある時点で、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は個体に投与され得る。本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与の後、腫瘍成長の減速が生じているかどうかは、腫瘍成長および/または癌細胞数を測定するための多様な確立された方法のいずれかを使用して判定され得る。個体における本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの複製がそのピークにあるまたはその直後にあるかどうかは、本明細書に記載されるように個体におけるTKvポリペプチドのレベルを検出しかつ/または測定することによって判定され得、適切な方法の非限定的な例はPETである。本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに対する循環抗体がそのピークにあるまたはその直後にあるかどうかは、抗体のレベルを測定するための標準的方法を使用して測定され得、そのような方法は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)等を含む。
例として、本開示の方法は、a)本開示の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量をそれを必要とする個体に投与する工程;b)i)個体における腫瘍サイズおよび/もしくは癌細胞数;ならびに/またはii)個体におけるTKvポリペプチドのレベル、ならびに/またはiii)個体における組み換え腫瘍溶解性ウイルスに対する抗体のレベルを測定する工程;ならびにc)測定する工程が、i)組み換え腫瘍溶解性ウイルスの投与前の腫瘍成長および/もしくは癌細胞の数と比較して、腫瘍成長が減速しておりかつ/もしくは癌細胞の数が減少していること;ならびに/またはii)個体におけるTKvポリペプチドのレベルがそのピークにあるもしくはその直後にあること;ならびに/またはiii)個体における組み換え腫瘍溶解性ウイルスに対する循環抗体のレベルがそのピークにあるもしくはその直後にあることを示す場合、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体を投与する工程を含み得る。例えば、本開示の方法は、a)本開示の複製能を有する組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量をそれを必要とする個体に投与する工程;およびb)2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の有効量を個体に投与する工程を含み得、投与工程(b)は、工程(a)の5日~20日(例えば、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、または20日)後に行われる。
2’-デオキシ-グアノシンの適切な合成類似体は、例えば、アシクロビル(アシクログアノシン)、5’-ヨードデオキシウリジン(「イドクスウリジン」とも称される)、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、2’-フルオロ-2’-デオキシ-5-ヨード-1-ベータ-d-アラビノフラノシルウラシル(FIAU)等を含む。2’-デオキシ-グアノシンの適切な合成類似体の一部についての構造が、下で示される。
ガンシクロビル:
バルガンシクロビル:
バラシクロビル:
ファムシクロビル:
一部の特定の実施形態において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は、ガンシクロビルまたはアシクロビルである。
2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は、1日あたり4000mg未満の用量で経口的に投与され得る。一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の適切な経口用量は、1日あたり約50mg~1日あたり約2500mg、例えば1日あたり約50mg~1日あたり約100mg、1日あたり約100mg~1日あたり約200mg、1日あたり約200mg~1日あたり約300mg、1日あたり約300mg~1日あたり約400mg、1日あたり約400mg~1日あたり約500mg、1日あたり約500mg~1日あたり約600mg、1日あたり約600mg~1日あたり約700mg、1日あたり約700mg~1日あたり約800mg、1日あたり約800mg~1日あたり約900mg、1日あたり約900mg~1日あたり約1000mg、1日あたり約1000mg~1日あたり約1250mg、1日あたり約1250mg~1日あたり約1500mg、1日あたり約1500mg~1日あたり約1750mg、1日あたり約1750mg~1日あたり約2000mg、1日あたり約2000mg~1日あたり約2250mg、または1日あたり約2250mg~1日あたり約2500mgの域にある。一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の適切な経口用量は、1日あたり約2500mg~1日あたり約3000mg、1日あたり約3000mg~1日あたり約3500mg、または1日あたり約3500mg~1日あたり約4000mgの域にある。
1つの非限定的な例として、ガンシクロビルは、3000mgの総1日用量に対して、1日あたり1000mg3回の用量で投与され得る。ガンシクロビルは、3000mg未満(例えば、1日あたり約50mg~1日あたり約2500mg、例えば1日あたり約50mg~1日あたり約100mg、1日あたり約100mg~1日あたり約200mg、1日あたり約200mg~1日あたり約300mg、1日あたり約300mg~1日あたり約400mg、1日あたり約400mg~1日あたり約500mg、1日あたり約500mg~1日あたり約600mg、1日あたり約600mg~1日あたり約700mg、1日あたり約700mg~1日あたり約800mg、1日あたり約800mg~1日あたり約900mg、1日あたり約900mg~1日あたり約1000mg、1日あたり約1000mg~1日あたり約1250mg、1日あたり約1250mg~1日あたり約1500mg、1日あたり約1500mg~1日あたり約1750mg、1日あたり約1750mg~1日あたり約2000mg、1日あたり約2000mg~1日あたり約2250mg、または1日あたり約2250mg~1日あたり約2500mg)の総1日用量で投与され得る。一部の場合において、ガンシクロビルは経口投与により投与される。
別の非限定的な例として、アシクロビルは、1000mg~4000mgの総1日用量で投与され得る。アシクロビルは、4000mg未満(例えば、1日あたり約50mg~1日あたり約2500mg、例えば1日あたり約50mg~1日あたり約100mg、1日あたり約100mg~1日あたり約200mg、1日あたり約200mg~1日あたり約300mg、1日あたり約300mg~1日あたり約400mg、1日あたり約400mg~1日あたり約500mg、1日あたり約500mg~1日あたり約600mg、1日あたり約600mg~1日あたり約700mg、1日あたり約700mg~1日あたり約800mg、1日あたり約800mg~1日あたり約900mg、1日あたり約900mg~1日あたり約1000mg、1日あたり約1000mg~1日あたり約1250mg、1日あたり約1250mg~1日あたり約1500mg、1日あたり約1500mg~1日あたり約1750mg、1日あたり約1750mg~1日あたり約2000mg、1日あたり約2000mg~1日あたり約2250mg、または1日あたり約2250mg~1日あたり約2500mg)の総1日用量で投与され得る。一部の場合において、アシクロビルは経口投与により投与される。
別の例として、バルガンシクロビルは、約900mg~約1800mgの総1日用量で投与される。バルガンシクロビルは、1800mg未満(例えば、約500mg/日~約600mg/日、約600mg/日~約700mg/日、約700mg/日~約800mg/日、約800mg/日~約900mg/日、約900mg/日~約1000mg/日、約1000mg/日~約1200mg/日、約1200mg/日~約1400mg/日、または約1400mg/日~約1600mg/日)の総1日用量で投与され得る。一部の場合において、バルガンシクロビルは経口投与により投与される。
別の例として、ファムシクロビルは、約2000mg/日~約4000mg/日の総1日用量で投与される。ファムシクロビルは、4000mg未満(例えば、1日あたり約50mg~1日あたり約2500mg、例えば1日あたり約50mg~1日あたり約100mg、1日あたり約100mg~1日あたり約200mg、1日あたり約200mg~1日あたり約300mg、1日あたり約300mg~1日あたり約400mg、1日あたり約400mg~1日あたり約500mg、1日あたり約500mg~1日あたり約600mg、1日あたり約600mg~1日あたり約700mg、1日あたり約700mg~1日あたり約800mg、1日あたり約800mg~1日あたり約900mg、1日あたり約900mg~1日あたり約1000mg、1日あたり約1000mg~1日あたり約1250mg、1日あたり約1250mg~1日あたり約1500mg、1日あたり約1500mg~1日あたり約1750mg、1日あたり約1750mg~1日あたり約2000mg、1日あたり約2000mg~1日あたり約2250mg、または1日あたり約2250mg~1日あたり約2500mg)の総1日用量で投与され得る。一部の場合において、ファムシクロビルは経口投与により投与される。
別の例として、バラシクロビルは、約2000mg~約4000mgの総1日用量で投与される。バラシクロビルは、4000mg未満(例えば、1日あたり約50mg~1日あたり約2500mg、例えば1日あたり約50mg~1日あたり約100mg、1日あたり約100mg~1日あたり約200mg、1日あたり約200mg~1日あたり約300mg、1日あたり約300mg~1日あたり約400mg、1日あたり約400mg~1日あたり約500mg、1日あたり約500mg~1日あたり約600mg、1日あたり約600mg~1日あたり約700mg、1日あたり約700mg~1日あたり約800mg、1日あたり約800mg~1日あたり約900mg、1日あたり約900mg~1日あたり約1000mg、1日あたり約1000mg~1日あたり約1250mg、1日あたり約1250mg~1日あたり約1500mg、1日あたり約1500mg~1日あたり約1750mg、1日あたり約1750mg~1日あたり約2000mg、1日あたり約2000mg~1日あたり約2250mg、または1日あたり約2250mg~1日あたり約2500mg)の総1日用量で投与され得る。一部の場合において、バラシクロビルは経口投与により投与される。
別の例として、ガンシクロビルは、約10mg/kgの総1日用量で投与される。ガンシクロビルは、10mg/kg未満(例えば、約1mg/kg~約2mg/kg、約2mg/kg~約3mg/kg、約3mg/kg~約4mg/kg、約4mg/kg~約5mg/kg、約5mg/kg~約6mg/kg、約6mg/kg~約7mg/kg、約7mg/kg~約8mg/kg、または約8mg/kg~約9mg/kg)の総1日用量で投与され得る。一部の場合において、ガンシクロビルは、注射(例えば、筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射)により投与される。
別の例として、アシクロビルは、約15mg/kg~約30mg/kg、または約30mg/kg~約45mg/kgの総1日用量で投与される。アシクロビルは、45mg/kg未満(例えば、約5mg/kg~約7.5mg/kg、約7.5mg/kg~約10mg/kg、約10mg/kg~約12.5mg/kg、約12.5mg/kg~約15mg/kg、約15mg/kg~約20mg/kg、約20mg/kg~約25mg/kg、約25mg/kg~約30mg/kg、または約30mg/kg~約35mg/kg)の総1日用量で投与され得る。一部の場合において、アシクロビルは、注射(例えば、筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射)により投与される。
別の例として、バルガンシクロビルは、約10mg/kgの総1日用量で投与される。バルガンシクロビルは、10mg/kg未満(例えば、約1mg/kg~約2mg/kg、約2mg/kg~約3mg/kg、約3mg/kg~約4mg/kg、約4mg/kg~約5mg/kg、約5mg/kg~約6mg/kg、約6mg/kg~約7mg/kg、約7mg/kg~約8mg/kg、または約8mg/kg~約9mg/kg)の総1日用量で投与され得る。一部の場合において、バルガンシクロビルは、注射(例えば、筋肉内注射、静脈内注射、または皮下注射)により投与される。
一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は局部的に投与される。局部投与に適切な製剤は、例えば経皮製剤(例えば、液体、クリーム、ゲル等)および眼科製剤(例えば、クリーム、液体、ゲル等)を含む。ガンシクロビルの局部用量は、例えば眼科適応症に関して、例えば1日あたり1滴の0.15%製剤5回であり得る。アシクロビルの局部用量は、皮膚病変を覆うのに十分な量で、例えば5%製剤の1日あたり6回の適用であり得る。イドクスウリジンの局部用量は、例えば1滴の0.5%軟膏または0.1%クリームの4時間ごとの適用であり得る。
一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は、10mg/kg体重未満の用量で静脈内に投与される。一部の場合において、2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体の適切な静脈内用量は、約1mg/kg体重~約2.5mg/kg体重、約2.5mg/kg体重~約5mg/kg体重、約5mg/kg体重~約7.5mg/kg体重、または約7.5mg/kg体重~約10mg/kg体重の域にある。
C-7.本開示の非限定的な態様の例
上で記載される腫瘍溶解性ウイルス関連の主題についての実施形態を含めた態様は、単独でまたは1つもしくは複数の他の態様もしくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示のある特定の非限定的な態様が下で提供される。本開示を読めば当業者に明白であろうように、個々に番号付けされた態様のそれぞれは、先行するまたは後続の個々に番号付けされた態様のいずれかとともに使用され得るまたは組み合わされ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせへの支持を提供することを意図され、下で明示的に提供される態様の組み合わせを限定するわけではない。
上で記載される腫瘍溶解性ウイルス関連の主題についての実施形態を含めた態様は、単独でまたは1つもしくは複数の他の態様もしくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。前述の説明を限定することなく、本開示のある特定の非限定的な態様が下で提供される。本開示を読めば当業者に明白であろうように、個々に番号付けされた態様のそれぞれは、先行するまたは後続の個々に番号付けされた態様のいずれかとともに使用され得るまたは組み合わされ得る。これは、態様のすべてのそのような組み合わせへの支持を提供することを意図され、下で明示的に提供される態様の組み合わせを限定するわけではない。
態様1.そのゲノムに、(1)バリアントインターロイキン-2(IL-2)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、バリアントIL-2ポリペプチドは、野生型IL-2と比較して、望ましくない特性の低下を有する、ヌクレオチド配列;および(2)異種チミジンキナーゼ(TK)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え腫瘍溶解性ウイルス(OV)。
態様2.ワクシニアチミジンキナーゼを欠損した状態にする改変をさらに含む、態様1に記載のOV。
態様3.改変は、J2R発現および/または機能の欠如をもたらす、態様2に記載のOV。
態様4.コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスである、態様1から3のいずれか一項に記載のOV。
態様5.WR系統ワクシニアウイルスである、態様1から3のいずれか一項に記載のOV。
態様6.K151E置換を含むA34R遺伝子を含む、態様1から5のいずれか一項に記載のOV。
態様7.バリアントIL-2ポリペプチドは、配列番号1に描写されるIL-2アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくF42、Y45、およびL72のうちの1つまたは複数の置換を含む、態様1から6のいずれか一項に記載のOV。
態様8.IL-2vポリペプチドは、配列番号1に描写されるIL-2アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくF42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42D、F42R、またはF42K置換を含む、態様1から7のいずれか一項に記載のOV。
態様9.IL-2vポリペプチドは、配列番号1に描写されるIL-2アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくY45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、またはY45K置換を含む、態様1から8のいずれか一項に記載のOV。
態様10.IL-2vポリペプチドは、配列番号1に描写されるIL-2アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくL72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72R、またはL72K置換を含む、態様1から9のいずれか一項に記載のOV。
態様11.IL-2vポリペプチドは、配列番号1に描写されるIL-2アミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくF42A、Y45A、およびL72G置換を含む、態様1から10のいずれか一項に記載のOV。
態様12.IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結されている、態様1から11のいずれか一項に記載のOV。
態様13.調節可能なプロモーターは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体もしくは誘導体によって調節される、態様12に記載のOV。
態様14.a)態様1から13のいずれか一項に記載のOV;およびb)薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物。
態様15.態様1から13のいずれか一項に記載のOVまたは態様14に記載の組成物の有効量を個体に投与する工程を含む、腫瘍を有する個体において腫瘍溶解を誘導する方法。
態様16.前記投与する工程は、ウイルスまたは組成物の単回投薬を投与する工程を含む、態様15に記載の方法。
態様17.単回投薬は、少なくとも106プラーク形成単位(pfu)のウイルスを含む、態様16に記載の方法。
態様18.単回投薬は、109~1012pfuのウイルスを含む、態様16に記載の方法。
態様19.前記投与する工程は、ウイルスまたは組成物の複数回投薬を投与する工程を含む、態様15に記載の方法。
態様20.ウイルスまたは組成物は隔日で投与される、態様19に記載の方法。
態様21.ウイルスまたは組成物は週に1回投与される、態様15から20のいずれか一項に記載の方法。
態様22.ウイルスまたは組成物は隔週で投与される、態様15から20のいずれか一項に記載の方法。
態様23.腫瘍は、脳腫瘍、頭頸部癌腫瘍、食道癌腫瘍、皮膚癌腫瘍、肺癌腫瘍、胸腺癌腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、肝臓癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、子宮癌腫瘍、膀胱癌腫瘍、精巣癌腫瘍、直腸癌腫瘍、乳癌腫瘍、または膵臓癌腫瘍である、態様15から21のいずれか一項に記載の方法。
態様24.腫瘍は結腸直腸腺癌である、態様15から22のいずれか一項に記載の方法。
態様25.腫瘍は非小細胞肺癌腫である、態様15から22のいずれか一項に記載の方法。
態様26.腫瘍はトリプルネガティブ乳癌である、態様15から22のいずれか一項に記載の方法。
態様27.腫瘍は固形腫瘍である、態様15から22のいずれか一項に記載の方法。
態様28.腫瘍は液性腫瘍である、態様15から22のいずれか一項に記載の方法。
態様29.腫瘍は再発性である、態様15から28のいずれか一項に記載の方法。
態様30.腫瘍は原発性腫瘍である、態様15から28のいずれか一項に記載の方法。
態様31.腫瘍は転移性である、態様15から28のいずれか一項に記載の方法。
態様32.第2の癌療法を個体に投与する工程をさらに含む、態様15から31のいずれか一項に記載の方法。
態様33.第2の癌療法は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、細胞療法、および手術から選択される、態様32に記載の方法。
態様34.第2の癌療法は、抗PD1抗体または抗PD-L1抗体を含む、態様32に記載の方法。
態様35.個体は免疫欠陥がある、態様15から34のいずれか一項に記載の方法。
態様36.ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は腫瘍内投与である、態様15から35のいずれか一項に記載の方法。
態様37.ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は腫瘍周辺である、態様15から35のいずれか一項に記載の方法。
態様38.ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は静脈内投与である、態様15から35のいずれか一項に記載の方法。
態様39.ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は動脈内投与である、態様15から35のいずれか一項に記載の方法。
態様40.ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は膀胱内投与である、態様15から35のいずれか一項に記載の方法。
態様41.ワクシニアウイルスまたは組成物の前記投与は髄腔内投与である、態様15から35のいずれか一項に記載の方法。
態様42.そのゲノムに、バリアントインターロイキン-2(IL-2v)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換えOVであって、IL-2vポリペプチドは、野生型IL-2と比較して、CD25への結合の低下を提供する1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、組み換えOV。
態様43.そのゲノムに、配列番号9を含むバリアントインターロイキン-2(IL-2v)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換えOVであって、ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損であり、K151E置換を含むA34R遺伝子を含む、組み換えOV。
態様44.シグナルペプチドをさらに含む、態様43に記載のウイルス。
態様45.シグナルペプチドは配列番号22を含む、態様44に記載のウイルス。
態様46.そのゲノムに、配列番号10を含むバリアントインターロイキン-2(IL-2v)ヌクレオチド配列を含む組み換えOVであって、ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損であり、K151E置換を含むA34R遺伝子を含む、組み換えOV。
態様47.そのゲノムに、配列番号12を含むバリアントインターロイキン-2(IL-2v)ヌクレオチド配列を含む組み換えOVであって、ワクシニアウイルスは、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損であり、K151E置換を含むA34R遺伝子を含む、組み換えOV。
態様48.(i)態様42から47のいずれか一項に記載のウイルス、および(ii)薬学的に許容できる担体を含む組成物。
態様49.そのゲノムに、バリアントインターロイキン-2(IL-2v)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換えOVであって、IL-2vポリペプチドは、野生型IL-2と比較した場合、望ましくない生物学的活性の低下を提供する、組み換えOV。
態様50.そのゲノムに、ヒトバリアントIL-2をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えOVであって、バリアントIL-2は、T3、R38、L40、K43、Y45、E62、Y65、L72、Q74、およびC125から選択される位置に、配列番号1のヒトIL-2タンパク質配列と比べて1つまたは複数の置換を含む、組み換えOV。
態様51.バリアントIL-2は、以下の群の位置:R38およびL40;T41およびK43;K43およびY45;E62およびK64;L72およびQ74;R38、L40、K43、およびY45;K43、Y45、L72、およびQ74;T3、R38、L40、K43、およびY45;T3、K43、Y45、L72、およびQ74;R38、L40、K43、Y45、およびC125;K43、Y45、L72、Q74、およびC125;T3、R38、L40、K43、Y45、およびC125;T3、K43、Y45、L72、Q74、およびC125のうちの1つまたは複数にアミノ酸置換を含む、態様50に記載の組み換えOV。
態様52.バリアントIL-2は、T3A、K35N、R38N、L40S、L40T、T41N、K43S、K43T、K43N、Y45S、Y45T、E62N、E62A、E62K、E62R、K64S、K64T、L72N、Q74S、Q74T、C125A、およびC125Sからなる群から選択される1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、態様50に記載の組み換えOV。
態様53.バリアントIL-2ポリペプチドは、配列番号1に描写されるIL-2アミノ酸配列のアミノ酸番号に基づくR38N、L40T、K43N、およびY45T置換を含む、態様50に記載の組み換えOV。
態様54.組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである、態様1から53のいずれか一項において言及される組み換えOV。
D.本出願において開示される配列の説明
E.実施例
以下の実施例は、本発明を行いかつ使用する方法についての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが本発明者らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図されるわけではなく、それらは、下の実験が、実施されたすべてのまたは唯一の実験であることを表すことを意図されるわけでもない。使用される数字(例えば、量、温度等)に関する精度を確保するために努力がなされているが、いくらかの実験誤差およびズレは考慮されるべきである。別様に示されない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度単位であり、圧力は大気圧下におけるまたはその付近におけるものである。標準的な略語、例えば、pl、ピコリットル;sまたはsec、秒;min、分;hまたはhr、時間;aa、アミノ酸;kb、キロベース;bp、塩基対;nt、ヌクレオチド;i.m.、筋肉内の(に);i.p.、腹腔内の(に);s.c.、皮下の(に);i.v.、静脈内の(に);i.t.、腫瘍内の(に);等が使用され得る。明瞭性のために、実施例において言及されるある特定の導入遺伝子の説明が、表1に提供される。
以下の実施例は、本発明を行いかつ使用する方法についての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが本発明者らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図されるわけではなく、それらは、下の実験が、実施されたすべてのまたは唯一の実験であることを表すことを意図されるわけでもない。使用される数字(例えば、量、温度等)に関する精度を確保するために努力がなされているが、いくらかの実験誤差およびズレは考慮されるべきである。別様に示されない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度単位であり、圧力は大気圧下におけるまたはその付近におけるものである。標準的な略語、例えば、pl、ピコリットル;sまたはsec、秒;min、分;hまたはhr、時間;aa、アミノ酸;kb、キロベース;bp、塩基対;nt、ヌクレオチド;i.m.、筋肉内の(に);i.p.、腹腔内の(に);s.c.、皮下の(に);i.v.、静脈内の(に);i.t.、腫瘍内の(に);等が使用され得る。明瞭性のために、実施例において言及されるある特定の導入遺伝子の説明が、表1に提供される。
(実施例1)
組み換えワクシニアウイルス構築物の作出
下で提供される実施例に関連して作出された例示的な組み換えワクシニアウイルス構築物のある特定の特質が、下の表2に要約される。表2における各ウイルスは、J2R遺伝子の挿入不活性化を有するVV10およびVV18を除いて、J2R遺伝子の欠失を有する。VV27、VV79、VV91~VV96、およびIGV-121は、マウス細胞における発現のためにコドン最適化されたマウスIL-2バリアント(F76A、Y79A、L106G置換を有する;配列番号3)をコードする遺伝子を有する。VV75およびVV100~VV103は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトIL-2バリアント(F62A、Y65A、およびL92G置換を有する;配列番号14)をコードする遺伝子を有する。VV97、VV110、およびVV117は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトIL-2グリコバリアント(「IL-2gv」または「IL-2gv1」とも称される;R58N、L60T、K63N、およびY65T置換を有する;配列番号29)をコードする遺伝子を有する。VV98は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトIL-2グリコバリアント2(「IL-2gv2」とも称される;K63N、Y65T、L92N、およびQ94T置換を有する;配列番号33)をコードする遺伝子を有する。VV99は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトIL-2(野生型)をコードする遺伝子を有する。
組み換えワクシニアウイルス構築物の作出
下で提供される実施例に関連して作出された例示的な組み換えワクシニアウイルス構築物のある特定の特質が、下の表2に要約される。表2における各ウイルスは、J2R遺伝子の挿入不活性化を有するVV10およびVV18を除いて、J2R遺伝子の欠失を有する。VV27、VV79、VV91~VV96、およびIGV-121は、マウス細胞における発現のためにコドン最適化されたマウスIL-2バリアント(F76A、Y79A、L106G置換を有する;配列番号3)をコードする遺伝子を有する。VV75およびVV100~VV103は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトIL-2バリアント(F62A、Y65A、およびL92G置換を有する;配列番号14)をコードする遺伝子を有する。VV97、VV110、およびVV117は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトIL-2グリコバリアント(「IL-2gv」または「IL-2gv1」とも称される;R58N、L60T、K63N、およびY65T置換を有する;配列番号29)をコードする遺伝子を有する。VV98は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトIL-2グリコバリアント2(「IL-2gv2」とも称される;K63N、Y65T、L92N、およびQ94T置換を有する;配列番号33)をコードする遺伝子を有する。VV99は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されたヒトIL-2(野生型)をコードする遺伝子を有する。
VV27構築
ウイルスは、ワクシニアのコペンハーゲン系統に基づき、合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの制御下でマウスIL-2バリアントをコードする遺伝子を有する。A34R遺伝子におけるK151E置換の組み入れによって、ウイルスを細胞外エンベロープウイルス(EEV)産生の増強のために操作した。ヘルパーウイルス媒介性の制限酵素ガイドによる相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV27を構築した。まず、マウスIL-2v(F76A、Y79A、L106G)をコードする遺伝子を、マウス細胞における発現のためにコドン最適化し、GeneWiz(South Plainfield、NJ)によって合成した。DNAをBglII/AsiSIで消化し、またBglII/AsiSIで消化されたコペンハーゲンJ2R相同組み換えプラスミドに挿入した。マウスIL-2v遺伝子および隣接する左および右のワクシニア相同領域をPCRによって増幅して、相同組み換えドナーフラグメントを作出した。BSC-40細胞に、ヘルパーウイルスのショープ線維腫ウイルス(SFV)を1時間感染させ、その後にドナーアンプリコンとJ2R領域内であらかじめ制限消化された精製ワクシニアゲノムDNAとの混合物をトランスフェクトした。親ゲノムDNAは、天然J2R遺伝子の代わりにホタルルシフェラーゼおよびGFP、ならびにEEV産生の増強のためのA34R遺伝子内のK151E変異(置換)を有するコペンハーゲン系統ワクシニアウイルスを起源とした。トランスフェクトされた細胞を、重大な細胞変性効果が観察されるまでインキュベートし、総細胞溶解物を3ラウンドの凍結/融解および超音波処理によって収集した。溶解物を連続希釈し、BSC-40単層上に播き、寒天重層によって覆った。GFP陰性プラークを、合計3ラウンドのプラーク精製にわたって蛍光顕微鏡下で単離した。20層セルファクトリーでのHeLa細胞における大規模増幅の前に、T225フラスコ中でのBSC-40細胞における中間増幅のために1つのプラーク(KR144)を選択した。ウイルスをショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて徹底的に特徴付けした。
ウイルスは、ワクシニアのコペンハーゲン系統に基づき、合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの制御下でマウスIL-2バリアントをコードする遺伝子を有する。A34R遺伝子におけるK151E置換の組み入れによって、ウイルスを細胞外エンベロープウイルス(EEV)産生の増強のために操作した。ヘルパーウイルス媒介性の制限酵素ガイドによる相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV27を構築した。まず、マウスIL-2v(F76A、Y79A、L106G)をコードする遺伝子を、マウス細胞における発現のためにコドン最適化し、GeneWiz(South Plainfield、NJ)によって合成した。DNAをBglII/AsiSIで消化し、またBglII/AsiSIで消化されたコペンハーゲンJ2R相同組み換えプラスミドに挿入した。マウスIL-2v遺伝子および隣接する左および右のワクシニア相同領域をPCRによって増幅して、相同組み換えドナーフラグメントを作出した。BSC-40細胞に、ヘルパーウイルスのショープ線維腫ウイルス(SFV)を1時間感染させ、その後にドナーアンプリコンとJ2R領域内であらかじめ制限消化された精製ワクシニアゲノムDNAとの混合物をトランスフェクトした。親ゲノムDNAは、天然J2R遺伝子の代わりにホタルルシフェラーゼおよびGFP、ならびにEEV産生の増強のためのA34R遺伝子内のK151E変異(置換)を有するコペンハーゲン系統ワクシニアウイルスを起源とした。トランスフェクトされた細胞を、重大な細胞変性効果が観察されるまでインキュベートし、総細胞溶解物を3ラウンドの凍結/融解および超音波処理によって収集した。溶解物を連続希釈し、BSC-40単層上に播き、寒天重層によって覆った。GFP陰性プラークを、合計3ラウンドのプラーク精製にわたって蛍光顕微鏡下で単離した。20層セルファクトリーでのHeLa細胞における大規模増幅の前に、T225フラスコ中でのBSC-40細胞における中間増幅のために1つのプラーク(KR144)を選択した。ウイルスをショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて徹底的に特徴付けした。
VV38構築
ウイルスは、ワクシニアのコペンハーゲン系統に基づき、合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの制御下でマウスIL-2バリアントをコードする遺伝子を有する。ウイルスは、それが野生型A34R遺伝子を有し、EEV産生の増強のために操作されていないという点を除いて、VV27と同一である。ヘルパーウイルス媒介性の制限酵素ガイドによる相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV38を構築した。BSC-40細胞に、SFVヘルパーウイルスを1~2時間感染させ、その後にドナーアンプリコンとJ2R領域においてAsiSIであらかじめ消化された精製ワクシニアゲノムDNAとの混合物をトランスフェクトした。親ゲノムDNAは、天然J2R遺伝子の代わりにホタルルシフェラーゼおよびGFPを有するコペンハーゲン系統ワクシニアウイルスを起源とした。トランスフェクトされた細胞を、重大な細胞変性効果が観察されるまでインキュベートし、総細胞溶解物を3ラウンドの凍結/融解および超音波処理によって収集した。溶解物を連続希釈し、BSC-40単層上に播き、寒天重層によって覆った。GFP陰性プラークを、合計3ラウンドのプラーク精製に対して蛍光顕微鏡下で単離した。20層セルファクトリーでのHeLa細胞における大規模増幅の前に、T225フラスコ中でのBSC-40細胞における中間増幅のために1つのプラーク(LW226)を選択した。ウイルスをショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて徹底的に特徴付けした。
ウイルスは、ワクシニアのコペンハーゲン系統に基づき、合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの制御下でマウスIL-2バリアントをコードする遺伝子を有する。ウイルスは、それが野生型A34R遺伝子を有し、EEV産生の増強のために操作されていないという点を除いて、VV27と同一である。ヘルパーウイルス媒介性の制限酵素ガイドによる相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV38を構築した。BSC-40細胞に、SFVヘルパーウイルスを1~2時間感染させ、その後にドナーアンプリコンとJ2R領域においてAsiSIであらかじめ消化された精製ワクシニアゲノムDNAとの混合物をトランスフェクトした。親ゲノムDNAは、天然J2R遺伝子の代わりにホタルルシフェラーゼおよびGFPを有するコペンハーゲン系統ワクシニアウイルスを起源とした。トランスフェクトされた細胞を、重大な細胞変性効果が観察されるまでインキュベートし、総細胞溶解物を3ラウンドの凍結/融解および超音波処理によって収集した。溶解物を連続希釈し、BSC-40単層上に播き、寒天重層によって覆った。GFP陰性プラークを、合計3ラウンドのプラーク精製に対して蛍光顕微鏡下で単離した。20層セルファクトリーでのHeLa細胞における大規模増幅の前に、T225フラスコ中でのBSC-40細胞における中間増幅のために1つのプラーク(LW226)を選択した。ウイルスをショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて徹底的に特徴付けした。
VV39構築
ウイルスは、ワクシニアのウェスタンリザーブ(WR)系統に基づき、合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの制御下でマウスIL-2バリアントをコードする遺伝子を有する。ヘルパーウイルス媒介性の制限酵素ガイドによる相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV39を構築した。BSC-40細胞に、SFVヘルパーウイルスを1~2時間感染させ、その後にドナーアンプリコンとJ2R領域においてAsiSIであらかじめ消化された精製ワクシニアゲノムDNAとの混合物をトランスフェクトした。親ゲノムDNAは、天然J2R遺伝子および野生型A34Rの代わりにルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター遺伝子カセットを有するWR系統ワクシニアウイルスを起源とし、それはEEV産生の増強のために操作されていない。トランスフェクトされた細胞を、重大な細胞変性効果が観察されるまでインキュベートし、総細胞溶解物を3ラウンドの凍結/融解および超音波処理によって収集した。溶解物を連続希釈し、BSC-40単層上に播き、寒天重層によって覆った。GFP陰性プラークを、合計3ラウンドのプラーク精製に対して蛍光顕微鏡下で単離した。20層セルファクトリーでのHeLa細胞における大規模増幅の前に、T225フラスコ中でのBSC-40細胞における中間増幅のために1つのプラーク(LW228)を選択した。ウイルス(ロット#180330)をショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて徹底的に特徴付けした。
ウイルスは、ワクシニアのウェスタンリザーブ(WR)系統に基づき、合成初期後期プロモーターおよびオペレーターの制御下でマウスIL-2バリアントをコードする遺伝子を有する。ヘルパーウイルス媒介性の制限酵素ガイドによる相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV39を構築した。BSC-40細胞に、SFVヘルパーウイルスを1~2時間感染させ、その後にドナーアンプリコンとJ2R領域においてAsiSIであらかじめ消化された精製ワクシニアゲノムDNAとの混合物をトランスフェクトした。親ゲノムDNAは、天然J2R遺伝子および野生型A34Rの代わりにルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター遺伝子カセットを有するWR系統ワクシニアウイルスを起源とし、それはEEV産生の増強のために操作されていない。トランスフェクトされた細胞を、重大な細胞変性効果が観察されるまでインキュベートし、総細胞溶解物を3ラウンドの凍結/融解および超音波処理によって収集した。溶解物を連続希釈し、BSC-40単層上に播き、寒天重層によって覆った。GFP陰性プラークを、合計3ラウンドのプラーク精製に対して蛍光顕微鏡下で単離した。20層セルファクトリーでのHeLa細胞における大規模増幅の前に、T225フラスコ中でのBSC-40細胞における中間増幅のために1つのプラーク(LW228)を選択した。ウイルス(ロット#180330)をショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて徹底的に特徴付けした。
VV79構築
コペンハーゲンVV27のWR系統等価物であるVV79は、A34R K151E置換の付加を除いて、VV39と同一である。VV39親ウイルス骨格内にK151E変異を挿入するために、ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、それを構築した。
コペンハーゲンVV27のWR系統等価物であるVV79は、A34R K151E置換の付加を除いて、VV39と同一である。VV39親ウイルス骨格内にK151E変異を挿入するために、ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、それを構築した。
VV101構築
VV101は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン(Cop)系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R(チミジンキナーゼ)遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるヒトIL-2バリアント(hIL-2v)発現カセットの挿入、3)hIL-2vカセットと反対の配向で、J2R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御される単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV101を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのJ2R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV27から抽出し、HSV TK.007/J2R相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV93とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、マウスIL-2バリアント(mIL-2v)をコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたhIL-2vをコードする遺伝子で置き換えることによって、VV101をVV93から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、VV101をHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV101は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン(Cop)系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R(チミジンキナーゼ)遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるヒトIL-2バリアント(hIL-2v)発現カセットの挿入、3)hIL-2vカセットと反対の配向で、J2R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御される単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV101を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのJ2R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV27から抽出し、HSV TK.007/J2R相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV93とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、マウスIL-2バリアント(mIL-2v)をコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたhIL-2vをコードする遺伝子で置き換えることによって、VV101をVV93から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、VV101をHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV102構築
VV102は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるhIL-2v発現カセットの挿入、3)天然B16R遺伝子の157個の塩基を置き換える、B16R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(HSV TK.007;配列番号28)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV102を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのB16R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV27から抽出し(IGNT-001に記載される)、HSV TK.007/B16相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV91とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、mIL-2vをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたhIL-2vをコードする遺伝子で置き換えることによって、VV102をVV91から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、VV102をHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV102は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるhIL-2v発現カセットの挿入、3)天然B16R遺伝子の157個の塩基を置き換える、B16R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(HSV TK.007;配列番号28)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV102を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのB16R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV27から抽出し(IGNT-001に記載される)、HSV TK.007/B16相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV91とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、mIL-2vをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたhIL-2vをコードする遺伝子で置き換えることによって、VV102をVV91から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、VV102をHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV103構築
VV103は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるhIL-2v発現カセットの挿入、3)天然B16R遺伝子全体を置き換える、B16R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV103を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのB16R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV27から抽出し(IGNT-001に記載される)、HSV TK.007/B16相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV96とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、mIL-2vをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたhIL-2vをコードする遺伝子で置き換えることによって、VV103をVV96から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、VV103をHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV103は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるhIL-2v発現カセットの挿入、3)天然B16R遺伝子全体を置き換える、B16R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV103を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのB16R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV27から抽出し(IGNT-001に記載される)、HSV TK.007/B16相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV96とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、mIL-2vをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたhIL-2vをコードする遺伝子で置き換えることによって、VV103をVV96から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、VV103をHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV94構築
VV94は、ワクシニアウイルスのマウス適合ウェスタンリザーブ(WR)系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)順方向の配向での、J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるmIL-2v発現カセットの挿入、3)逆方向の配向での、J2R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親WR系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV94を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。WR J2R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV79から抽出し、HSVTK.007/J2R相同組み換えアンプリコンとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV94とラベルされたウイルスを、まずBSC-40細胞において、次いでHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV94は、ワクシニアウイルスのマウス適合ウェスタンリザーブ(WR)系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)順方向の配向での、J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるmIL-2v発現カセットの挿入、3)逆方向の配向での、J2R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親WR系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV94を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。WR J2R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV79から抽出し、HSVTK.007/J2R相同組み換えアンプリコンとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV94とラベルされたウイルスを、まずBSC-40細胞において、次いでHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV110構築
VV110は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるヒトIL-2グリコバリアント(R58N、L60T、K63N、およびY65T;配列番号29)発現カセットの挿入、3)天然B16R遺伝子の157個の塩基を置き換える、B16R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV110を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのB16R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV27から抽出し(IGNT-001に記載される)、HSV TK.007/B16相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV91とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、マウスIL-2vをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたヒトIL-2グリコバリアントをコードする遺伝子で置き換えることによって、VV110をVV91から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、VV110をHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV110は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるヒトIL-2グリコバリアント(R58N、L60T、K63N、およびY65T;配列番号29)発現カセットの挿入、3)天然B16R遺伝子の157個の塩基を置き換える、B16R遺伝子座内への、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親コペンハーゲン天然痘ワクチン系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV110を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアコペンハーゲンのB16R領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV27から抽出し(IGNT-001に記載される)、HSV TK.007/B16相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結および融解によって収集した。ウイルスを4ラウンドのプラーク精製に供し、PCRによってHSV-TK.007の存在についてスクリーニングした。VV91とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。最後に、上で記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、マウスIL-2vをコードする遺伝子を、ヒトにおける発現に対して最適化されたヒトIL-2グリコバリアントをコードする遺伝子で置き換えることによって、VV110をVV91から構築した。組み換え、プラーク精製、およびスクリーニングの後、VV110をHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
IGV-121構築
IGV-121は、ワクシニアウイルスのマウス適合WR系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるmIL-2vバリアント発現カセットの挿入、3)B15R(WR197としても知られる)とB17L(WR198)との間の遺伝子間領域における、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親WR系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、IGV-121を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアWR系統のB15RとB17Lとの間の遺伝子間領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV79(マウスIL-2vによって置き換えられたJ2RおよびA34R K151E変異を有するWR系統)から抽出し、HSV TK.007/B15R-B17L相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染Vero-B4細胞にトランスフェクトした。2日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結、融解、および超音波処理によって収集した。ウイルスをBSC-40細胞での3ラウンドのプラーク精製に供した。IGV-121とラベルされたウイルスをHeLa S3細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
IGV-121は、ワクシニアウイルスのマウス適合WR系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるmIL-2vバリアント発現カセットの挿入、3)B15R(WR197としても知られる)とB17L(WR198)との間の遺伝子間領域における、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親WR系統とは異なる。ヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、IGV-121を構築した。まず、HSV TK.007をコードする遺伝子を、ワクシニアウイルスによる発現のためにコドン最適化し、Genscriptによって合成した。ワクシニアWR系統のB15RとB17Lとの間の遺伝子間領域を標的にする相同組み換えベクターにおけるF17プロモーター(PF17)の下流に遺伝子をクローニングした。第二に、ワクシニア核酸を精製VV79(マウスIL-2vによって置き換えられたJ2RおよびA34R K151E変異を有するWR系統)から抽出し、HSV TK.007/B15R-B17L相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染Vero-B4細胞にトランスフェクトした。2日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結、融解、および超音波処理によって収集した。ウイルスをBSC-40細胞での3ラウンドのプラーク精製に供した。IGV-121とラベルされたウイルスをHeLa S3細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV117構築
VV117は、ワクシニアウイルスのマウス適合WR系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるヒトIL-2グリコバリアント(R58N、L60T、K63N、およびY65T;配列番号29)発現カセットの挿入、3)B15R(WR197としても知られる)とB17L(WR198)との間の遺伝子間領域における、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親WR系統とは異なる。以前に記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV117を構築した。ワクシニア核酸を精製IGV-121(マウスIL-2vによって置き換えられたJ2R、A34R K151E変異、およびB15RとB17Rとの間の遺伝子間領域に挿入されたHSV TK.007を有するWR系統)から抽出し、ヒトIL-2グリコバリアント相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結、融解、および超音波処理によって収集した。ウイルスをBSC-40細胞での3ラウンドのプラーク精製に供した。VV117とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
VV117は、ワクシニアウイルスのマウス適合WR系統に基づく武装化腫瘍溶解性ウイルスである。それは、1)天然ワクシニアJ2R遺伝子の欠失;2)J2R遺伝子座内への、合成初期-後期プロモーターによって制御されるヒトIL-2グリコバリアント(R58N、L60T、K63N、およびY65T;配列番号29)発現カセットの挿入、3)B15R(WR197としても知られる)とB17L(WR198)との間の遺伝子間領域における、F17プロモーターによって制御されるHSVチミジンキナーゼバリアント(TK.007)発現カセットの挿入、および4)A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換(K151E)を導入する、ウイルスA34R遺伝子内の変異を含めた4つの遺伝子改変によって、親WR系統とは異なる。以前に記載されるヘルパーウイルス媒介性の相同組み換え修復およびレスキュー技法を使用して、VV117を構築した。ワクシニア核酸を精製IGV-121(マウスIL-2vによって置き換えられたJ2R、A34R K151E変異、およびB15RとB17Rとの間の遺伝子間領域に挿入されたHSV TK.007を有するWR系統)から抽出し、ヒトIL-2グリコバリアント相同組み換えプラスミドとともに、ショープ線維腫ウイルス感染BSC-40細胞にトランスフェクトした。3日間のインキュベーションの後、溶解物を繰り返しの凍結、融解、および超音波処理によって収集した。ウイルスをBSC-40細胞での3ラウンドのプラーク精製に供した。VV117とラベルされたウイルスをHeLa細胞において増大させ、ショ糖密度勾配超遠心分離によって精製し、全ゲノム次世代シーケンシングを含めた品質管理アッセイにおいて特徴付けした。
図1は、VV91、VV93、およびVV96に関する全ゲノムの概略的表示である。
図2は、VV94およびIGV-121に関する全ゲノムの概略的表示である。
図3は、VV101~VV103に関する全ゲノムの概略的表示である。
図26は、VV97~100に関する全ゲノムの概略的表示である。略語:LITR=左逆位末端反復;RITR=右逆位末端反復;A~O=HindIII消化フラグメントによって歴史的に規定されたウイルス遺伝子領域;PSEL=合成初期後期プロモーター;IL-2gv=ヒトインターロイキン-2グリコバリアント(R58N:L60T、K63N:Y65T);IL-2gv2=ヒトインターロイキン-2グリコバリアント2(K63N:Y65T、L92N:Q94T);IL-2=ヒトインターロイキン-2(野生型);IL-2v=ヒトインターロイキン-2バリアント(F62A、Y65A、L92G)。
図27は、VV110に関する全ゲノムの概略的表示である。略語:LITR=左逆位末端反復;RITR=右逆位末端反復;A~O=HindIII消化フラグメントによって歴史的に規定されたウイルス遺伝子領域;PSEL=合成初期後期プロモーター;IL-2gv=ヒトインターロイキン-2グリコバリアント;*=A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換をコードする変異;PF17=F17R遺伝子由来のプロモーター;HSV TK.007=168位におけるアラニンからヒスチジンへの置換をコードする変異を有する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。
図28は、VV117に関する全ゲノムの概略的表示である。略語:LITR=左逆位末端反復;RITR=右逆位末端反復;A~O=HindIII消化フラグメントによって歴史的に規定されたウイルス遺伝子領域;PSEL=合成初期後期プロモーター;IL-2gv=ヒトインターロイキン-2グリコバリアント;*=A34タンパク質の151位におけるリジンからグルタミン酸への置換をコードする変異;PF17=F17R遺伝子由来のプロモーター;HSV TK.007=168位におけるアラニンからヒスチジンへの置換をコードする変異を有する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。
(実施例2)
ウェスタンブロットによる、ウイルス感染細胞における組み換えワクシニアウイルスからのIL-2v発現
HeLa細胞を、6ウェルプレートにおいて2mLの培養培地中に6e5個細胞/ウェルで播き、培養下でおよそ24時間後に、MOI=3のウイルスを24時間感染させた。各ウェルからの細胞をその後収集し、200μLのレムリ(Laemmli)緩衝液中で溶解し、次いでmilliQ水で1:1希釈した。12μLのサンプルを、95℃で5分間のインキュベーション、およびNuPage4-12%Bis-Trisゲルでのローディングの前に、還元剤および1×NuPage LDSサンプル緩衝液を含有するTris緩衝生理食塩水(TBS)中20μLの最終容積に調製した。1×MESランニング緩衝液を用いたゲル電気泳動を200Vで30分間実施した。タンパク質をiBlot装置を使用してPVDF膜に転写し、ウェスタンブロットをiBlot装置を使用して実施した。mIL-2vの検出に関しては、以下の抗体を使用した-1:2000希釈での抗IL-2一次抗体(Abcam、ab11510)、1:1000希釈でのヤギ抗ラットIgG-HRP二次抗体(Invitrogen、#629526)。hIL-2vの検出に関しては、以下の抗体を使用した-1:500希釈での抗IL-2一次抗体(Novus Biologicals、NBP2-16948)、1:2000希釈でのマウス抗ウサギIgG-HRP二次抗体(Pierce、#31460)。その後、TMB基質を膜に添加してバンドを可視化した。膜を水でリンスし、乾燥させ、スキャンした。結果は、図4(組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後のmIL-2v発現分析)および図5(組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後のhIL-2v発現分析)に示されている。
ウェスタンブロットによる、ウイルス感染細胞における組み換えワクシニアウイルスからのIL-2v発現
HeLa細胞を、6ウェルプレートにおいて2mLの培養培地中に6e5個細胞/ウェルで播き、培養下でおよそ24時間後に、MOI=3のウイルスを24時間感染させた。各ウェルからの細胞をその後収集し、200μLのレムリ(Laemmli)緩衝液中で溶解し、次いでmilliQ水で1:1希釈した。12μLのサンプルを、95℃で5分間のインキュベーション、およびNuPage4-12%Bis-Trisゲルでのローディングの前に、還元剤および1×NuPage LDSサンプル緩衝液を含有するTris緩衝生理食塩水(TBS)中20μLの最終容積に調製した。1×MESランニング緩衝液を用いたゲル電気泳動を200Vで30分間実施した。タンパク質をiBlot装置を使用してPVDF膜に転写し、ウェスタンブロットをiBlot装置を使用して実施した。mIL-2vの検出に関しては、以下の抗体を使用した-1:2000希釈での抗IL-2一次抗体(Abcam、ab11510)、1:1000希釈でのヤギ抗ラットIgG-HRP二次抗体(Invitrogen、#629526)。hIL-2vの検出に関しては、以下の抗体を使用した-1:500希釈での抗IL-2一次抗体(Novus Biologicals、NBP2-16948)、1:2000希釈でのマウス抗ウサギIgG-HRP二次抗体(Pierce、#31460)。その後、TMB基質を膜に添加してバンドを可視化した。膜を水でリンスし、乾燥させ、スキャンした。結果は、図4(組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後のmIL-2v発現分析)および図5(組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後のhIL-2v発現分析)に示されている。
(実施例3)
RT-qPCRによる、ウイルス感染細胞における組み換えワクシニアウイルスからのHSV TK.007発現
HeLa細胞を、6ウェルプレートにおいて2mLの培養培地中に7e4個細胞/ウェルで播き、培養下でおよそ72時間後に、MOI=3のウイルスを18時間感染させた。各ウェルからの細胞をその後収集し、Rneasy Plus Universal Mini Kit(Qiagen、#73404)を使用してRNA抽出のために処理した。500ngの総RNAを、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(applied Biosystems、#4368814)を使用して逆転写した。組み換えウイルスにおいてコードされるHSV TK.007導入遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブ、ならびにPrimeTime Gene Expression Master Mix(IDT、#1055772)を使用して、HSV TK.007 mRNA発現レベルを分析するqPCRにおける使用の前に、cDNAを1:10希釈した。PCRをViiA7機器(Applied Biosystems)で行った。HSV TK.007 cDNA配列を含有するプラスミドDNAを標準物質として使用し、各試験サンプルにおけるコピー/μLを標準曲線から判定した。結果は、図6(組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後のHSV TK.007発現分析)に示されている。
RT-qPCRによる、ウイルス感染細胞における組み換えワクシニアウイルスからのHSV TK.007発現
HeLa細胞を、6ウェルプレートにおいて2mLの培養培地中に7e4個細胞/ウェルで播き、培養下でおよそ72時間後に、MOI=3のウイルスを18時間感染させた。各ウェルからの細胞をその後収集し、Rneasy Plus Universal Mini Kit(Qiagen、#73404)を使用してRNA抽出のために処理した。500ngの総RNAを、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(applied Biosystems、#4368814)を使用して逆転写した。組み換えウイルスにおいてコードされるHSV TK.007導入遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブ、ならびにPrimeTime Gene Expression Master Mix(IDT、#1055772)を使用して、HSV TK.007 mRNA発現レベルを分析するqPCRにおける使用の前に、cDNAを1:10希釈した。PCRをViiA7機器(Applied Biosystems)で行った。HSV TK.007 cDNA配列を含有するプラスミドDNAを標準物質として使用し、各試験サンプルにおけるコピー/μLを標準曲線から判定した。結果は、図6(組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる細胞の感染後のHSV TK.007発現分析)に示されている。
(実施例4)
MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(mIL-2vを発現するCopウイルス)
雌C57BL/6マウス(8~10週齢)に、5e5個のMC38腫瘍細胞を右上後部脇腹に皮下に(SC)埋め込んだ。MC38はネズミ科結腸腺癌細胞株である。例えば、Cancer Research(1975)vol.35、pp.2434~2439を参照されたい。腫瘍細胞埋め込みの11日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=18/群)。埋め込み後12日目に、腫瘍に、60μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7プラーク形成単位(pfu)の組み換えコペンハーゲン(Cop)ワクシニアウイルスバリアントを含有する60μLのビヒクルを直接注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、またはiii)重度に減退した健康状態、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:
群i)ビヒクルのみ;
群ii)VV16:A34R-K151E変異(アミノ酸置換)を有し、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質(Luc-2A-GFP)二重レポーターカセットで武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iii)VV27:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iv)VV91:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群v)VV93:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(J2R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;または
群vi)VV96:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス。
MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(mIL-2vを発現するCopウイルス)
雌C57BL/6マウス(8~10週齢)に、5e5個のMC38腫瘍細胞を右上後部脇腹に皮下に(SC)埋め込んだ。MC38はネズミ科結腸腺癌細胞株である。例えば、Cancer Research(1975)vol.35、pp.2434~2439を参照されたい。腫瘍細胞埋め込みの11日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=18/群)。埋め込み後12日目に、腫瘍に、60μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7プラーク形成単位(pfu)の組み換えコペンハーゲン(Cop)ワクシニアウイルスバリアントを含有する60μLのビヒクルを直接注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、またはiii)重度に減退した健康状態、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:
群i)ビヒクルのみ;
群ii)VV16:A34R-K151E変異(アミノ酸置換)を有し、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質(Luc-2A-GFP)二重レポーターカセットで武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iii)VV27:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iv)VV91:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群v)VV93:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(J2R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;または
群vi)VV96:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス。
群(i)~(vi)の腫瘍成長プロファイル間の比較(図7)は、すべての試験ウイルスが、連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらし、mIL-2v武装化Copワクシニアウイルス(VV27、VV91、VV93、およびVV96)のすべてが、対照ウイルス(VV16)と比較して、連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらすこと(図8、ANCOVA結果)、およびVV27(mIL-2vのみ)とVV91、VV93、またはVV96(それぞれmIL-2vおよびHSV TK.007を有する)のいずれかとを比較した場合、統計的に有意な差は観察されないことを明らかにした。
図7A~7Gは、MC38腫瘍細胞をSCに埋め込まれたC57BL/6雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。ビヒクルのみ(A)、またはルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター(Cop.Luc-GFP.A34R-K151E;VV16)(B)、mIL-2vのみ(Cop.mGM-CSF.A34R-K151E;VV27)(C)、B16R遺伝子座において順方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For);VV91)(D)、J2R遺伝子座において逆方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(J2R_Rev);VV93)(E)、もしくはB16R遺伝子座において逆方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_Rev);VV96)(F)、のいずれかで武装化された、A34R K151E変異を含有するコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。各処理群に関する平均腫瘍容積(mm3)±95%信頼区間が、各群におけるすべての動物がまだ生きている最後の腫瘍測定時点である、腫瘍埋め込み後28日目まで示されている(G)。
図8は、ANCOVAを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。ビヒクル/ウイルス処理後(腫瘍埋め込み後14日目~27日目)の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をANCOVAによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果(p値)を示している。太字フォントの値は、p≦0.05の場合の比較ANCOVA結果を表す。
各処理群(N=18/群)における動物の生存率も、腫瘍埋め込み後最高41日目まで査定した(図9)。非武装化ワクシニア対照(VV16)は、ビヒクル対照と比べて生存率を有意に向上させなかった(ログランク/マンテル・コックス検定、p=0.133)。しかしながら、武装化ワクシニアウイルスバリアントVV27、VV91、VV93、およびVV96で処理されたマウスは、レポーター導入遺伝子武装化ワクシニア対照(VV16)処理群と比べて、統計的に有意な平均生存率優位性を示した(ログランク/マンテル・コックス検定、それぞれp=0.009、0.006、<0.0001、および0.013)。
図9は、埋め込み後12日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、MC38腫瘍を埋め込まれたC57BL/6雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧1400mm3の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値(50%)閾値を示す。
腫瘍成長阻害および生存率をモニターすることに加えて、ビヒクルまたは組み換えCopワクシニアウイルスを用いた注射の24時間および48時間後に、腫瘍を持つマウスから血清を回収して、循環IL-2レベルを査定した。腫瘍内注射を受けた24時間および48時間後に、各処理群から回収された血清における循環IL-2レベルを、ELISAによって定量した(図10)。mIL-2v武装化Copワクシニアウイルスバリアント(VV27、VV91、VV93、およびVV96)で処理されたほとんどの動物からの血清において測定可能なレベルのIL-2が検出され、一方でビヒクルまたは他のCopワクシニアウイルス(VV16)群からの任意の動物において、バックグラウンドレベルのIL-2が見られた。この後者の結果は、少なくとも試験された用量レベルでの、mIL-2v導入遺伝子を欠如するCopワクシニアウイルスの腫瘍内注射が、処理された動物の血清における循環IL-2レベルの増加を誘導するには不十分であったことを示す。ゆえに、mIL-2v武装化Copワクシニアウイルスで処理されたマウスの血清において見られたレベルの上昇は、腫瘍内注射後の導入遺伝子媒介性発現を示していることになる。
図10は、ビヒクルまたは組み換えCopワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の24時間および48時間後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6雌マウスから回収された血清において検出されたIL-2レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスに対する算出されたIL-2血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均(N=9/群)を表す。エラーバーは、95%信頼区間を表す。
(実施例5)
ルイス肺癌腫(LLC)腫瘍を持つC57BL/6マウスにおけるmIL-2v武装化ワクシニアウイルス活性(mIL-2vを発現するCopウイルス)
雌C57BL/6マウス(8~10週齢)に、1e5個のLLC腫瘍細胞を左上後部脇腹に皮下に(SC)埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの12日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=20/群)。埋め込み後13日目に、腫瘍に、60μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7プラーク形成単位(pfu)の組み換えコペンハーゲン(Cop)ワクシニアウイルスバリアントを含有する60μLのビヒクルを直接注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、またはiii)重度に減退した健康状態、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:
群i)ビヒクルのみ;
群ii)VV16:A34R-K151E変異(アミノ酸置換)を有し、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質(Luc-2A-GFP)二重レポーターカセットで武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iii)VV27:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iv)VV91:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群v)VV93:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(J2R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;または
群vi)VV96:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス。
ルイス肺癌腫(LLC)腫瘍を持つC57BL/6マウスにおけるmIL-2v武装化ワクシニアウイルス活性(mIL-2vを発現するCopウイルス)
雌C57BL/6マウス(8~10週齢)に、1e5個のLLC腫瘍細胞を左上後部脇腹に皮下に(SC)埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの12日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=20/群)。埋め込み後13日目に、腫瘍に、60μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7プラーク形成単位(pfu)の組み換えコペンハーゲン(Cop)ワクシニアウイルスバリアントを含有する60μLのビヒクルを直接注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、またはiii)重度に減退した健康状態、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:
群i)ビヒクルのみ;
群ii)VV16:A34R-K151E変異(アミノ酸置換)を有し、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質(Luc-2A-GFP)二重レポーターカセットで武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iii)VV27:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iv)VV91:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群v)VV93:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(J2R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;または
群vi)VV96:A34R-K151E置換を有し、mIL-2v導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス。
群(i)~(vi)の腫瘍成長プロファイル間の比較(図11)は、すべての試験ウイルスが、腫瘍成長に対して阻害効果をもたらし、mIL-2v武装化Copワクシニアウイルス(VV27、VV91、VV93、およびVV96)は、対照ウイルス(VV16)と比較して、腫瘍成長に対してより顕著な阻害効果をもたらすことを明らかにした。調査中の多くの動物は、種々のウイルスバリアントと関連した腫瘍成長阻害の統計分析を制限する、腫瘍潰瘍形成および関連した健康状態の減退に起因して人道的に屠殺された。しかしながら、個々の動物の分析は、VV91、VV93、またはVV96を用いた処理の後、それぞれ7/20、2/20、および1/20の腫瘍が、埋め込み後30日目までに<50mm3でありまたは完全に退縮し、他の処理群においては小さな腫瘍または完全な退縮は観察されなかったことを実証した。
図11A~11Fは、LLC腫瘍細胞をSCに埋め込まれたC57BL/6雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。ビヒクルのみ(A)、またはA34R K151E変異を含有し、ルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター(Cop.Luc-GFP.A34R-K151E;VV16)(B)、mIL-2vのみ(Cop.IL-2v.A34R-K151E;VV27)(C)、B16R遺伝子座において順方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For);VV91)(D)、J2R遺伝子座において逆方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(J2R_Rev);VV93)(E)、B16R遺伝子座において逆方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_Rev);VV96)(F)、のいずれかで武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
腫瘍成長阻害および生存率をモニターすることに加えて、ビヒクルまたは組み換えCopワクシニアウイルスを用いた注射の24、48、および72時間後に、腫瘍を持つマウスから血清を回収して、循環IL-2レベルを査定した。腫瘍内注射を受けた後のこれらの時点における、各処理群から回収された血清における循環IL-2レベルを、ELISAによって定量した(図12)。mIL-2v武装化Copワクシニアウイルスバリアント(VV27、VV91、VV93、およびVV96)で処理されたほとんどの動物からの血清において測定可能なレベルのIL-2が検出され、一方でビヒクルまたは他のCopワクシニアウイルス(VV16)群からの任意の動物において、バックグラウンドレベルのIL-2が見られた。この後者の結果は、少なくとも試験された用量レベルでの、mIL-2v導入遺伝子を欠如するCopワクシニアウイルスの腫瘍内注射が、処理された動物の血清における循環IL-2レベルの増加を誘導するには不十分であったことを示す。ゆえに、mIL-2v武装化Copワクシニアウイルスで処理されたマウスの血清において見られたレベルの上昇は、腫瘍内注射後の導入遺伝子媒介性発現を示していることになる。
図12は、ビヒクルまたは組み換えCopワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の24、48、および72時間後の、LLC腫瘍を持つC57BL/6雌マウスから回収された血清において検出されたIL-2レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスに対する算出されたIL-2血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均(N=5/群)を表す。エラーバーは、95%信頼区間を表す。
(実施例6)
MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを使用した単回IVウイルス療法(mIL-2vを発現するWRウイルス)
C57BL/6雌マウスに、5e5個のMC38腫瘍細胞を左脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの10日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=15/群)。腫瘍細胞埋め込み後11日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを使用した単回IVウイルス療法(mIL-2vを発現するWRウイルス)
C57BL/6雌マウスに、5e5個のMC38腫瘍細胞を左脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの10日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=15/群)。腫瘍細胞埋め込み後11日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
各試験ウイルスに対する群平均として(図13A)または各試験群内の個々のマウスとして(図13B~13F)示される腫瘍成長プロファイルの分析は、重要な知見を明らかにした。mIL-2v導入遺伝子武装化WRウイルス(単独でまたはHSV TK.007とともに、mIL-2vをコードする)のIV投与は、ビヒクルおよびレポーター導入遺伝子武装化WRウイルス(VV17)処理と比較して、MC38腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながった。VV79およびIGV-121によって誘導された腫瘍成長阻害の間に統計的に有意な差はなかったが、しかしながら、VV79とVV94との間に統計的に有意な差が検出された(図14、ANCOVA結果)。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、腫瘍成長阻害について上で報告されたものと非常に類似した成果を示した。これは、対応するLuc-GFPレポーター武装化WRウイルスと比較して、HSV TK.007の存在下または非存在下におけるmIL-2v導入遺伝子武装化WRウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ(図15)。全体として、mIL-2v導入遺伝子武装化WRウイルスバリアントのIV送達は、MC38 SC腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力を実証した。
循環IL-2レベルの査定のために、IVウイルス投薬の72時間後(14日目)に、各試験群におけるMC38腫瘍を持つマウスから血清も回収した。mIL-2v導入遺伝子武装化ウイルスが試験された他の調査と一致して、mIL-2v導入遺伝子武装化WRウイルスが投与されたすべての試験群において、上昇しかつ統計的に有意な血清レベルのIL-2が検出された(図16)。
図13A~13Fは、MC38腫瘍細胞をSCに埋め込まれたC57BL/6雌マウスに対する単回の(11日目)IVウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長軌道が、各処理に関して、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高32日目までの群平均±95%信頼区間として(A)、または各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで(B~F)示されている。試験ウイルスは、A34R K151E変異を含有し、ルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター(WR.Luc-GFP.A34R-K151E;VV17)(C)、mIL-2vのみ(WR.mIL-2v.A34R-K151E;VV79)(D)、J2R遺伝子座において逆方向の配向でHSV TK.007とともにmIL-2v(WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(J2R_Rev);VV94)(E)、ならびにB15R/B17R遺伝子座において順方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For);IGV-121)(F)、のいずれかで武装化されたWRワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのIV注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図14.皮下MC38腫瘍モデル調査に関する、ANCOVAを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をANCOVAによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果(p値)を示している。太字フォントの値は、p値≦0.05が観察された場合の比較ANCOVA結果を表す。
図15は、SC腫瘍埋め込み後11日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたIV処理後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6雌マウスの生存率(aurvival)の結果を示している。毎日、≧1400mm3の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値(50%)閾値を示す。P値は、選択ウイルス群の間のログランク検定(マンテル・コックス)比較の統計的結果を表す。
図16は、5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを用いたIV注射の72時間後(14日目)の、MC38腫瘍を持つC57BL/6雌マウスから回収された血清において検出されたIL-2レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスにおいて検出されたIL-2血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均(N=10/群)を表す。エラーバーは、95%信頼区間を表す。
(実施例7)
LLC腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを使用した単回IVウイルス療法(mIL-2vを発現するWRウイルス)
このセットの実験では、C57BL/6雌マウスに、1e5個のLLC腫瘍細胞を右脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの12日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=20/群)。14日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスバリアントを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)2000mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
LLC腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを使用した単回IVウイルス療法(mIL-2vを発現するWRウイルス)
このセットの実験では、C57BL/6雌マウスに、1e5個のLLC腫瘍細胞を右脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの12日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=20/群)。14日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスバリアントを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)2000mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
各試験ウイルスに対する群平均として(図17A)または各試験群内の個々のマウスとして(図17B~17D)示される腫瘍成長プロファイルの分析は、HSV TK.007およびA34R-K151E変異をコードするmIL-2v導入遺伝子武装化WRウイルス(IGV-121)のIV投与が、レポーター導入遺伝子武装化WRウイルス処理と比較して、LLC腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながることを実証した(図18、ANCOVA結果)。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、腫瘍成長阻害について上で報告されたものと非常に類似した成果を示した。これは、対応するLuc-GFPレポーター武装化WRウイルスと比較して、mIL-2vおよびHSV TK.007導入遺伝子武装化WRウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ(図19)。全体として、mIL-2v導入遺伝子武装化WRウイルスバリアントのIV送達は、LLC SC腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力を実証した。
図17A~17Dは、LLC腫瘍細胞をSCに埋め込まれたC57BL/6雌マウスに対する単回の(14日目)IVウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長軌道が、各処理に関して、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高27日目までの群平均±95%信頼区間として(A)、または各群における個々のマウスに関して、屠殺もしくは調査終結のときまで(B~D)示されている。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター(WR.Luc-GFP;VV3)(C)、またはA34R K151E変異を有して、B15R/B17R遺伝子座において順方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(WR.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For);IGV-121)(D)、のいずれかで武装化されたWRワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのIV注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図18は、皮下LLC腫瘍モデル調査に関する、ANCOVAを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をANCOVAによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果(p値)を示している。太字フォントの値は、p値≦0.05が観察された場合の比較ANCOVA結果を表す。
図19は、SC腫瘍埋め込み後14日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたIV処理後の、LLC腫瘍を持つC57BL/6雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧2000mm3の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値(50%)閾値を示す。P値は、選択ウイルス群の間のログランク検定(マンテル・コックス)比較の統計的結果を表す。
(実施例8)
MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(mIL-2vまたはhIL-2vを発現するCopウイルス)
雌C57BL/6マウス(8~10週齢)に、5e5個のMC38腫瘍細胞を右上後部脇腹に皮下に(SC)埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの10日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=20/群)。埋め込み後11日目に、腫瘍に、60μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7もしくは2e8プラーク形成単位(pfu)の組み換えコペンハーゲン(Cop)ワクシニアウイルスバリアントを含有する60μLのビヒクルを直接注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、またはiii)重度に減退した健康状態、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:
群i)ビヒクルのみ;
群ii)2e8pfu用量レベルのVV7:ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質(Luc-2A-GFP)二重レポーターカセットで武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iii)5e7pfu用量レベルのVV91:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群iv)2e8pfu用量レベルのVV91:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群v)5e7pfu用量レベルのVV102:A34R-K151E置換を有し、ヒトインターロイキン2バリアント(hIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群vi)2e8pfu用量レベルのVV102:A34R-K151E置換を有し、ヒトインターロイキン2バリアント(hIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群vii)5e7pfu用量レベルのVV10:マウスGM-CSFおよびLacZレポーター導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス;または
群viii)2e8pfu用量レベルのVV10:マウスGM-CSFおよびLacZレポーター導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス。
MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(mIL-2vまたはhIL-2vを発現するCopウイルス)
雌C57BL/6マウス(8~10週齢)に、5e5個のMC38腫瘍細胞を右上後部脇腹に皮下に(SC)埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの10日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=20/群)。埋め込み後11日目に、腫瘍に、60μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7もしくは2e8プラーク形成単位(pfu)の組み換えコペンハーゲン(Cop)ワクシニアウイルスバリアントを含有する60μLのビヒクルを直接注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、またはiii)重度に減退した健康状態、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:
群i)ビヒクルのみ;
群ii)2e8pfu用量レベルのVV7:ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質(Luc-2A-GFP)二重レポーターカセットで武装化されたCopワクシニアウイルス;
群iii)5e7pfu用量レベルのVV91:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群iv)2e8pfu用量レベルのVV91:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群v)5e7pfu用量レベルのVV102:A34R-K151E置換を有し、ヒトインターロイキン2バリアント(hIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群vi)2e8pfu用量レベルのVV102:A34R-K151E置換を有し、ヒトインターロイキン2バリアント(hIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群vii)5e7pfu用量レベルのVV10:マウスGM-CSFおよびLacZレポーター導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス;または
群viii)2e8pfu用量レベルのVV10:マウスGM-CSFおよびLacZレポーター導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス。
群(i)~(viii)の腫瘍成長プロファイル間の比較(図20)は、すべての試験ウイルスが、連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらすこと、ならびにマウスおよびヒトIL-2v武装化Copワクシニアウイルス(それぞれVV91およびVV102)が、マウスGM-CSF武装化Copワクシニアウイルス(VV10)と比較して、連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらすことを明らかにした(図21、ANCOVA結果)。VV91(mIL-2vおよびHSV TK.007)によって誘導される腫瘍成長阻害効果と、VV102(hIL-2vおよびHSV TK.007)とを比較した場合、統計的に有意な差は観察されなかった。
図20A~20Iは、MC38腫瘍細胞をSCに埋め込まれたC57BL/6雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。ビヒクルのみ(A)、5e7pfuでの、B16R遺伝子座において順方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For);VV91)(B)、5e7pfuでの、B16R遺伝子座において順方向の配向でhIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.hIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For);VV102)(C)、5e7pfuでの、mGM-CSFおよびLacZレポーター導入遺伝子(Cop.mGM-CSF/LacZ;(VV10))(D)、2e8pfuでの、ルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター(Cop.Luc-GFP;VV7)(E)、2e8pfuでの、B16R遺伝子座において順方向の配向でmIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.mIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For);VV91)(F)、2e8pfuでの、B16R遺伝子座において順方向の配向でhIL-2vおよびHSV TK.007(Cop.hIL-2v.A34R-K151E.HSV TK.007(B16R_For);VV102)(G)、ならびに2e8pfuでの、mGM-CSFおよびLacZレポーター導入遺伝子(Cop.mGM-CSF/LacZ;(VV10))(H)、のいずれかで武装化されたコペンハーゲンワクシニアウイルスで処理された群における個々のマウスに関して、腫瘍成長軌道が示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。各処理群に関する平均腫瘍容積(mm3)が、腫瘍埋め込み後28日目まで示されている(I)。
図21は、ANCOVAを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。ビヒクル/ウイルス処理後(腫瘍埋め込み後14日目~28日目)の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をANCOVAによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果(p値)を示している。太字フォントの値は、p≦0.05の場合の比較ANCOVA結果を表す。
各処理群(N=20/群)における動物の生存率も、腫瘍埋め込み後最高42日目まで査定した(図22)。この場合、VV91およびVV102の両方で処理されたマウスは、ビヒクル、VV7、およびVV10処理群と比べて、統計的に有意な平均生存率優位性を示した(ログランク/マンテル・コックス検定によるP値に関しては、図22における表を参照されたい)。
図22A~22Bは、埋め込み後11日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、MC38腫瘍を埋め込まれたC57BL/6雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧1400mm3の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値(50%)閾値を示す。(A)は、5e7pfuウイルスを投薬された群を示している。(B)は、2e8pfuのウイルスを投薬された群を示している。
腫瘍成長阻害および生存率をモニターすることに加えて、ビヒクルまたは組み換えCopワクシニアウイルスを用いた注射の24時間後に、腫瘍を持つマウスから血清を回収して、循環IL-2レベルを査定した。腫瘍内注射を受けた24時間後に、各処理群から回収された血清における循環マウスIL-2およびヒトIL-2レベルを、ELISAによって定量した(それぞれ図23および図24)。IL-2v武装化Copワクシニアウイルスバリアント(VV91およびVV102)で処理されたほとんどの動物からの血清において測定可能なレベルのIL-2が検出され、一方でビヒクルまたは他のCopワクシニアウイルス(VV7およびVV10)群からの任意の動物において、バックグラウンドレベルのIL-2が見られた。目立ったことには、有意に上昇したレベルのマウスIL-2は、mIL-2v発現ウイルス(VV91)を受けたマウスの血清においてのみ検出され、有意に上昇したレベルのヒトIL-2は、hIL-2v発現ウイルス(VV102)を受けたマウスの血清においてのみ検出された。ゆえに、IL-2v武装化Copワクシニアウイルスで処理されたマウスの血清において見られたレベルの上昇は、腫瘍内注射後の導入遺伝子媒介性発現を示していることになる。
図23は、ビヒクルまたは組み換えCopワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の24時間後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6雌マウスから回収された血清において検出されたマウスIL-2レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスに対する算出されたIL-2血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均(N=10/群)を表す。エラーバーは、95%信頼区間を表す。
図24は、ビヒクルまたは組み換えCopワクシニアウイルスを用いた腫瘍内注射の24時間後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6雌マウスから回収された血清において検出されたヒトIL-2レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスに対する算出されたIL-2血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均(N=9/群)を表す。エラーバーは、95%信頼区間を表す。
(実施例9)
HCT-116腫瘍を持つヌードマウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2vを発現するCopウイルス)
ヌード雌マウスに、5e6個のHCT-116腫瘍細胞を右脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの8日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=20/群)。腫瘍細胞埋め込み後9日目に、マウスに、100μLのビヒクルのみ、または準最適用量(3e5pfu)の組み換え腫瘍溶解性Copワクシニアウイルスを含有するビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:
群i)ビヒクルのみ;
群ii)VV90:欠失したJ2R遺伝子領域に挿入された導入遺伝子を有しない、A34R-K151E変異(アミノ酸置換)を有するCopワクシニアウイルス;
群iii)VV27:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス(VV27);
群iv)VV91:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群v)VV93:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(J2R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;または
群vi)VV96:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス。
HCT-116腫瘍を持つヌードマウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2vを発現するCopウイルス)
ヌード雌マウスに、5e6個のHCT-116腫瘍細胞を右脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの8日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約50mm3;N=20/群)。腫瘍細胞埋め込み後9日目に、マウスに、100μLのビヒクルのみ、または準最適用量(3e5pfu)の組み換え腫瘍溶解性Copワクシニアウイルスを含有するビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:
群i)ビヒクルのみ;
群ii)VV90:欠失したJ2R遺伝子領域に挿入された導入遺伝子を有しない、A34R-K151E変異(アミノ酸置換)を有するCopワクシニアウイルス;
群iii)VV27:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化されたCopワクシニアウイルス(VV27);
群iv)VV91:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、順方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;
群v)VV93:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(J2R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス;または
群vi)VV96:A34R-K151E置換を有し、ネズミ科インターロイキン2バリアント(mIL-2v)導入遺伝子で武装化され、HSV TK.007(B16R挿入、逆方向の配向)をコードするCopワクシニアウイルス。
群(i)~(vi)の腫瘍成長プロファイル間の比較(図25)は、すべての試験ウイルスが、ヒト異種移植片腫瘍において連続複数日にわたって腫瘍成長に対して統計的に有意な阻害効果をもたらすことを明らかにした。
図25は、HCT-116腫瘍細胞をSCに埋め込まれたヌード雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。各処理群に関する平均腫瘍容積(mm3)が、腫瘍埋め込み後40日目まで示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスの腫瘍内注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
(実施例10)
導入遺伝子武装化WRワクシニアウイルスに感染した細胞から産生されたhIL-2gvおよびhIL-2vタンパク質の機能的査定
IL-2受容体複合体へのIL-2結合は、シグナル伝達分子STAT5のリン酸化をもたらす。ゆえに、STAT5のリン酸化を使用して、IL-2受容体シグナル伝達を測定し得る。ワクシニアウイルスによって産生された導入遺伝子を回収するために、HeLa細胞に、T-150フラスコ中でMOI=3の表示ウイルスを24時間感染させた。インキュベーションの後、上清を回収しかつ濃縮し、濃縮された上清におけるIL-2レベルをMSDアッセイによって判定し、pSTAT5アッセイにおいて正規化した。IL2導入遺伝子生物活性を査定するために、ナイーブC57BL/6雌マウス由来の脾細胞を単離し、丸底96ウェルプレートに1e6個細胞/ウェルで播き、ウイルス単離IL-2、IL-2グリコバリアント、またはIL-2バリアントと15分間インキュベートした。細胞を固定し、透過処理し、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25、抗Foxp3、抗NKp46、および抗pSTAT5抗体で染色し、LSR Fortessaフローサイトメーターで取得した。pSTAT5の蛍光強度中央値を、FlowJoソフトウェアを使用して特異的細胞集団において分析した。組み換えワクシニアウイルスによってコードされるIL-2グリコバリアント(すなわち、IL-2gv1およびIL-2gv2)は、pSTAT5を誘導することにおける濃度効力の低下によって示されるように、野生型IL-2と比較した場合、Treg細胞(CD3+CD4+CD25+Foxp3+)に対する活性の低下を示した。対照的に、IL-2バリアント(IL-2v)およびIL-2グリコバリアントは、CD8+ T細胞およびNK細胞の両方において、野生型IL-2と同様のシグナル伝達濃度効力を示した。まとめると、これらのデータは、中アフィニティーIL-2Rを発現する細胞を刺激することにおいて、野生型hIL-2に匹敵する、ヒト細胞において産生されるhIL-2グリコバリアントおよびhIL-2バリアントの予想される能力と一致しているが、高アフィニティーIL-2Rα(別名CD25)を発現する細胞に対してはほんの弱い活性である。
導入遺伝子武装化WRワクシニアウイルスに感染した細胞から産生されたhIL-2gvおよびhIL-2vタンパク質の機能的査定
IL-2受容体複合体へのIL-2結合は、シグナル伝達分子STAT5のリン酸化をもたらす。ゆえに、STAT5のリン酸化を使用して、IL-2受容体シグナル伝達を測定し得る。ワクシニアウイルスによって産生された導入遺伝子を回収するために、HeLa細胞に、T-150フラスコ中でMOI=3の表示ウイルスを24時間感染させた。インキュベーションの後、上清を回収しかつ濃縮し、濃縮された上清におけるIL-2レベルをMSDアッセイによって判定し、pSTAT5アッセイにおいて正規化した。IL2導入遺伝子生物活性を査定するために、ナイーブC57BL/6雌マウス由来の脾細胞を単離し、丸底96ウェルプレートに1e6個細胞/ウェルで播き、ウイルス単離IL-2、IL-2グリコバリアント、またはIL-2バリアントと15分間インキュベートした。細胞を固定し、透過処理し、抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD25、抗Foxp3、抗NKp46、および抗pSTAT5抗体で染色し、LSR Fortessaフローサイトメーターで取得した。pSTAT5の蛍光強度中央値を、FlowJoソフトウェアを使用して特異的細胞集団において分析した。組み換えワクシニアウイルスによってコードされるIL-2グリコバリアント(すなわち、IL-2gv1およびIL-2gv2)は、pSTAT5を誘導することにおける濃度効力の低下によって示されるように、野生型IL-2と比較した場合、Treg細胞(CD3+CD4+CD25+Foxp3+)に対する活性の低下を示した。対照的に、IL-2バリアント(IL-2v)およびIL-2グリコバリアントは、CD8+ T細胞およびNK細胞の両方において、野生型IL-2と同様のシグナル伝達濃度効力を示した。まとめると、これらのデータは、中アフィニティーIL-2Rを発現する細胞を刺激することにおいて、野生型hIL-2に匹敵する、ヒト細胞において産生されるhIL-2グリコバリアントおよびhIL-2バリアントの予想される能力と一致しているが、高アフィニティーIL-2Rα(別名CD25)を発現する細胞に対してはほんの弱い活性である。
図29A~29Cは、組み換えWRワクシニアウイルスによって発現されたIL-2バリアント導入遺伝子とインキュベートされたネズミ科脾細胞におけるSTAT5リン酸化の査定の結果を示している。hIL-2、hIL-2バリアント、またはhIL-2グリコバリアントのいずれかとインキュベートされたネズミ科脾細胞のサブセットにおけるpSTAT5誘導の比較。IL-2機能性を、IL-2R媒介性シグナル伝達の読み出しとして細胞内pSTAT5レベルの測定を使用して査定した。脾細胞を、細胞表面マーカー(CD3、CD4、CD8、CD25、およびNKp46)および細胞内タンパク質(FoxP3)に対する抗体で付加的に染色して、種々のIL2R複合体を発現するネズミ科リンパ球の様々なサブセットを描出した。グラフは、表示ウイルスによって分泌されるhIL-2、hIL-2バリアント、またはhIL-2グリコバリアントタンパク質の増加する処理濃度(x軸)に応答した、pSTAT5の細胞内染色の蛍光強度中央(MFI)値(y軸)の変化を示している。略語:pSTAT5=リン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子5;MFI=蛍光強度中央値;Treg=CD3+CD4+CD25+Foxp3+ T調節性細胞。
(実施例11)
IV投与後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2、hIL-2v、hIL-2gv1、hIL-2gv2を発現するWRウイルス)
C57BL/6雌マウスに、5e5個のMC38腫瘍細胞を左脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの10日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約60mm3;N=20/群)。腫瘍細胞埋め込み後11日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
IV投与後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2、hIL-2v、hIL-2gv1、hIL-2gv2を発現するWRウイルス)
C57BL/6雌マウスに、5e5個のMC38腫瘍細胞を左脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの10日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約60mm3;N=20/群)。腫瘍細胞埋め込み後11日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
体重分析は、野生型IL-2導入遺伝子武装化WRウイルスが、任意の他のバリアントを受けた動物と比較して、体重のより大きな喪失と関連付けられることを示した(図30)。
図30は、埋め込み後11日目にビヒクルまたはウイルスを用いた処理後の、MC38腫瘍を埋め込まれたC57BL/6雌マウスの体重の結果を示している。体重は、処理開始時の個々の体重に基づいて%単位で示されている。各処理は、腫瘍埋め込み後最高24日目までの群幾何平均±95%信頼区間として示されている。それらの初期体重と比較して20%を上回る体重喪失を有する動物を、人道的理由で安楽死させた。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター(WR.Luc-GFP(VV3))、WT IL-2、IL-2v、IL-2gv1、またはIL-2gv2のいずれかで武装化されたWRワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのIV注射を受けた時点を表す。グラフ上の水平線は、各マウスの初期体重を表す100%体重ベースラインを表す。
循環IL-2および炎症性サイトカインレベルの査定のために、IVウイルス投薬の72時間後(腫瘍埋め込み後14日目)に、各試験群におけるMC38腫瘍を持つマウスから血清も回収した。IL-2導入遺伝子武装化ウイルスが試験された他の調査と一致して、IL-2導入遺伝子武装化WRウイルスが投与されたすべての試験群において、上昇しかつ統計的に有意な血清レベルのIL-2が検出された(図31)。さらに、hIL-2gv武装化腫瘍溶解性ウイルスを受けたマウスは、野生型hIL-2武装化腫瘍溶解性ウイルスを受けた動物と比較して、統計的に有意な上昇した血清レベルのIL-2を有した。炎症性サイトカインの分析は、hIL-2gv導入遺伝子武装化WRワクシニアウイルスではなくhIL-2のIV投与が、IFNγ、IL-12p70、IL-1β、TNFα、IL-4、IL-5、およびIL-10を含めた、いくつかの炎症促進性サイトカインの有意な上昇を引き起こすことを明らかにした(図32、表3)。
図31は、5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを用いたIV注射の72時間後(14日目)の、MC38腫瘍を持つC57BL/6雌マウスから回収された血清において検出されたIL-2レベルの結果を示している。各符号は、個々のマウスにおいて検出されたIL-2血清レベルを表し、一方で棒は、群幾何平均(N=10/群)を表す。エラーバーは、95%信頼区間を表す。統計学を、*=p<0.05;**=p<0.01;および***=p<0.001を有して、VV99と比較した、テューキーの事後多群比較検定とともに一元配置Anova検定を使用して実施した。
図32(表3)は、5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを用いたIV注射の72時間後(14日目)の、MC38腫瘍を持つC57BL/6雌マウスから回収された血清において検出された炎症性サイトカインレベルの結果を示している。MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスの静脈内投与の72時間後に、血清サイトカインレベルを測定した。VV99処理された動物と比較した、検出されたサイトカインレベルの間の統計比較を、テューキーの事後多群比較検定とともに一元配置ANOVAを使用して実施した。各列は、示されたサイトカインに対する幾何平均サイトカインレベル(N=10/試験群)を示している。*=p<0.05;**=p,0.01;+=p<0.001;^=p<0.0001。
各試験ウイルスに対する群平均として示される腫瘍成長プロファイルの分析(図33)は、重要な知見を明らかにした。すべてのIL-2導入遺伝子武装化WRウイルスのIV投与は、ビヒクルおよびレポーター導入遺伝子武装化WRウイルス(VV3)処理と比較して、MC38腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながった。すべてのバリアントは、ビヒクル対照またはVV3と比較して、腫瘍成長を有意に低下させた。一部の時点は、野生型IL-2と比較して、IL-2バリアントおよびグリコバリアント含有ウイルスの間の統計的に有意な差も明らかにしたが、しかしながら最も顕著な知見は、任意の形態のIL-2を含有するすべてのウイルスバリアントが、腫瘍成長の導入遺伝子媒介性低下をもたらしたことであった(表4、ANCOVA結果)。
図33は、MC38腫瘍細胞をSCに埋め込まれたC57BL/6雌マウスに対する、単回の(11日目に投与される)IVウイルス送達を使用したウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長曲線は、その時点で調査が終結した腫瘍埋め込み後最高49日目までの群幾何平均±95%信頼区間として、各処理に対して示されている。動物の15%が、1400mm3に達した腫瘍負荷に起因して安楽死され次第、その群はもはや幾何平均データを報告しなかった。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター(WR.Luc-GFP(VV3))、WT IL-2、IL-2v、IL-2gv1、またはIL-2gv2のいずれかで武装化されたWRワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのIV注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図34(表4)は、皮下MC38腫瘍モデル調査に関する、ANCOVAを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をANCOVAによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果(p値)を示している。太字フォントの値は、p値≦0.05が観察された場合の比較ANCOVA結果を表す。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、より多くの数の動物が、腫瘍負荷と無関係の病的状態に起因して死亡し、IL-2バリアントまたはグリコバリアントを持つバリアントと比較してより短い生存率中央値を経験することから、WT IL-2が、バリアントよりも低い忍容性の閾値を有することを示した(図35)。これは、対応するLuc-GFPレポーター武装化WRウイルスと比較して、IL-2v/gv導入遺伝子武装化WRウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ(図36、表5)。全体として、IL-2vまたはIL-2gv導入遺伝子武装化WRウイルスバリアントのIV送達は、MC38 SC腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力および野生型IL-2よりも低い毒性を実証した。
図35は、SC腫瘍埋め込み後11日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたIV処理後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6雌マウスの生存率の結果を示している。マウスを毎日モニターし、動物が>20%の体重を喪失した場合、≧1400mm3の腫瘍容積に達し次第、死んだものとみなした、または臨床観察に基づいて瀕死であると判定した。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値(50%)閾値を示す。
図36(表5)は、皮下MC38腫瘍モデル調査におけるウイルス療法後の生存率の統計比較の結果を示している。図35からの生存率データを、ログランク検定(マンテル・コックス)によって分析した。P値は、選択ウイルス群の間のログランク検定(マンテル・コックス)比較の統計的結果を表す。
(実施例12)
HCT-116腫瘍を持つヌードマウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2gv、hIL-2vを発現するCopウイルス、およびhGM-CSF/LacZを発現するワイエスウイルス)
ヌード雌マウスに、5e6個のHCT-116腫瘍細胞を右脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの12日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約150mm3;N=16/群)。腫瘍細胞埋め込み後13日目に、マウスに、100μLのビヒクルのみ、または3e6pfuの組み換え腫瘍溶解性Copワクシニアウイルスを含有するビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:群i)ビヒクルのみ;群ii)VV7:欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたluc-2A-GFP導入遺伝子を有するCopワクシニアウイルス;群iii)VV102:K151E変異およびHSV-TK.007を有する、欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたhIL2v導入遺伝子を有するCopワクシニアウイルス;群iv)VV75:K151E変異を有する、欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたhIL2v導入遺伝子を有するCopワクシニアウイルス;群v)VV08:欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたluc-2A-GFP導入遺伝子を有するワイエスワクシニアウイルス;群vi)VV12:欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたhGM-CSF導入遺伝子を有するワイエスワクシニアウイルス;または群vii)VV110:K151E変異およびHSV-TK.007を有する、欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたhIL2gv導入遺伝子を有するCopワクシニアウイルス。
HCT-116腫瘍を持つヌードマウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2gv、hIL-2vを発現するCopウイルス、およびhGM-CSF/LacZを発現するワイエスウイルス)
ヌード雌マウスに、5e6個のHCT-116腫瘍細胞を右脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの12日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約150mm3;N=16/群)。腫瘍細胞埋め込み後13日目に、マウスに、100μLのビヒクルのみ、または3e6pfuの組み換え腫瘍溶解性Copワクシニアウイルスを含有するビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。マウスの群を以下のように処理した:群i)ビヒクルのみ;群ii)VV7:欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたluc-2A-GFP導入遺伝子を有するCopワクシニアウイルス;群iii)VV102:K151E変異およびHSV-TK.007を有する、欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたhIL2v導入遺伝子を有するCopワクシニアウイルス;群iv)VV75:K151E変異を有する、欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたhIL2v導入遺伝子を有するCopワクシニアウイルス;群v)VV08:欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたluc-2A-GFP導入遺伝子を有するワイエスワクシニアウイルス;群vi)VV12:欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたhGM-CSF導入遺伝子を有するワイエスワクシニアウイルス;または群vii)VV110:K151E変異およびHSV-TK.007を有する、欠失したJ2R遺伝子領域に挿入されたhIL2gv導入遺伝子を有するCopワクシニアウイルス。
群(i)~(vii)の腫瘍成長プロファイル間の比較(図37)は、すべての試験ウイルスが、HCT-116ヒト異種移植片モデルにおいて連続複数日にわたって腫瘍成長に対して阻害効果をもたらすことを明らかにした。図38、表6に示されるように、統計的有意性は種々の比較について達成された。
図37は、HCT-116腫瘍細胞をSCに埋め込まれたヌード雌マウスに対する、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。各処理群に関する平均腫瘍容積(mm3)が、腫瘍埋め込み後43日目まで示されている。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルスのIV注射を受けた時点を表す。グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図38(表6)は、ヌードマウスにおける皮下HCT-116腫瘍に関する、ANCOVAを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をANCOVAによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果(p値)を示している。太字フォントの値は、p値≦0.05が観察された場合の比較ANCOVA結果を表す。
HCT-116腫瘍を持ち、上で記載されるようにウイルスでIV処理されたヌードマウスを、生存率についてモニターした。2000mm3に達した腫瘍を安楽死基準として規定し、動物を45日間毎日モニターした。
図39は、HCT-116腫瘍細胞をSCに埋め込まれたヌード雌マウスに関するウイルス療法誘導性生存率の査定の結果を示している。腫瘍が2000mm3に達し次第、安楽死を実施した。各グラフ上の垂直破線は、マウスがビヒクルまたはウイルス(3E6PFU)のIV注射を受けた時点を表す。グラフ上の水平破線は、50パーセント生存率、すなわち生存率中央値を表す。
図40(表7)は、HCT-116腫瘍細胞をSCに埋め込まれたヌード雌マウスにおけるウイルス療法誘導性生存率の統計比較の結果を示している。生存率をモニターし、次いでログランク検定(マンテル・コックス)によって分析した。各群比較に対してP値が挙げられている。
(実施例13)
IV投与後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2v、hIL-2gv1、mIL-2vを発現するWRウイルス)
C57BL/6雌マウスに、5e5個のMC38腫瘍細胞を左脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの15日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約100mm3;N=20/群)。腫瘍細胞埋め込み後16日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
IV投与後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2v、hIL-2gv1、mIL-2vを発現するWRウイルス)
C57BL/6雌マウスに、5e5個のMC38腫瘍細胞を左脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの15日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約100mm3;N=20/群)。腫瘍細胞埋め込み後16日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
各試験ウイルスに対する群平均として示される腫瘍成長プロファイルの分析(図41)は、重要な知見を明らかにした。すべてのIL-2導入遺伝子武装化WRウイルスのIV投与は、ビヒクルおよびレポーター導入遺伝子武装化WRウイルス(VV3)処理と比較して、MC38腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながった。K151E変異&HSV TK.007導入遺伝子の付加は、腫瘍成長阻害をさらに向上させた。VV117およびIGV-121によって誘導された腫瘍成長阻害の間に統計的に有意な差はなかったが、しかしながら、VV117とVV100との間およびIGV-121とVV39との間に統計的に有意な差が検出された(図42、表8、ANCOVA結果)。
図41は、MC38腫瘍細胞をSCに埋め込まれたC57BL/6雌マウスに対する単回の(16日目)IVウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長軌道が、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高55日目までの群平均±95%信頼区間として各処理に関して示されている。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター(WR.Luc-GFP(VV3))、hIL-2gv1(WR.hIL-2gv1.HSV TK.007.A34K151E(VV117、IGV-121)、hIL-2v(VV100)、またはmIL-2v(VV3))のいずれかで武装化されたWRワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのIV注射を受けた時点を表す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図42(表8)は、皮下MC38腫瘍モデル調査に関する、ANCOVAを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をANCOVAによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果(p値)を示している。太字フォントの値は、p値≦0.05が観察された場合の比較ANCOVA結果を表す。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、腫瘍成長阻害について上で報告されたものと非常に類似した成果を示した(図43)。これは、対応するLuc-GFPレポーター武装化WRウイルスと比較して、IL-2v/gv導入遺伝子武装化WRウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ(図44、表9)。全体として、IL-2v導入遺伝子武装化WRウイルスバリアントのIV送達は、MC38 SC腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力を実証した。
図43は、SC腫瘍埋め込み後16日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたIV処理後の、MC38腫瘍を持つC57BL/6雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧1400mm3の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値(50%)閾値を示す。P値は、選択ウイルス群の間のログランク検定(マンテル・コックス)比較の統計的結果を表す。
図44(表9)は、ウイルス療法誘導性生存率の統計比較の結果を示している。生存率をモニターし、次いでログランク検定(マンテル・コックス)によって分析した。各群比較に対してP値が挙げられている。
(実施例14)
IV投与後の、B16腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2gv1を発現するWRウイルス)
C57BL/6雌マウスに、2.5e5個のB16F10腫瘍細胞を右脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの17日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約100mm3;N=20/群)。腫瘍細胞埋め込み後18日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍細胞埋め込み後21、24、27、31、34、および38日目に、マウスに、100uLの抗体製剤(2mg/mL、抗PD-1またはIgG1アイソタイプ)をSC注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
IV投与後の、B16腫瘍を持つC57BL/6マウスにおける組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス活性(hIL-2gv1を発現するWRウイルス)
C57BL/6雌マウスに、2.5e5個のB16F10腫瘍細胞を右脇腹にSCに埋め込んだ。腫瘍細胞埋め込みの17日後、マウスを、腫瘍容積に基づいて無作為に別個の処理群に分けた(群あたりの平均腫瘍容積約100mm3;N=20/群)。腫瘍細胞埋め込み後18日目に、マウスに、100μLのビヒクル(30mM Tris、10%スクロース、pH8.0)、または5e7pfuの組み換えWRワクシニアウイルスを含有する100μLのビヒクルをIV注射した。腫瘍細胞埋め込み後21、24、27、31、34、および38日目に、マウスに、100uLの抗体製剤(2mg/mL、抗PD-1またはIgG1アイソタイプ)をSC注射した。腫瘍を持つマウスを毎日観察し、マウスが、i)1400mm3を超える腫瘍容積、ii)≧20%の体重喪失、iii)重度に減退した健康状態、またはiv)調査終結、のいずれかに起因して人道的に屠殺されるまで、腫瘍容積および体重の両方を2週間に1回測定した。
各試験ウイルスに対する群平均として示される腫瘍成長プロファイルの分析(図45)は、重要な知見を明らかにした。IL-2gv導入遺伝子武装化WRウイルスのIV投与は、ビヒクルおよびレポーター導入遺伝子武装化WRウイルス(VV3)処理と比較して、MC38腫瘍成長の統計的に有意な阻害につながった。ビヒクル処理された腫瘍に対して、抗PD-1またはIgG1アイソタイプ抗体処理によって誘導された腫瘍成長阻害の間に統計的に有意な差はなかった。しかしながら、VV3およびVV117に関しては、抗PD-1またはIgG1アイソタイプ抗体処理の間に統計的に有意な差が検出された(図46、表10、ANCOVA結果)。
図45は、抗PD-1抗体処理との組み合わせで、B16F10腫瘍細胞をSCに埋め込まれたC57BL/6雌マウスに対する単回の(18日目)IVウイルス送達を使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の査定の結果を示している。腫瘍成長軌道が、屠殺のときまでの腫瘍埋め込み後最高35日目までの群平均±95%信頼区間として各処理に関して示されている。試験ウイルスは、ルシフェラーゼ-2A-GFPレポーター(WR.Luc-GFP(VV3))、hIL-2gv1(WR.hIL-2gv1.HSV TK.007.A34K151E(VV117))のいずれかで武装化されたWRワクシニアウイルスを含んだ。各グラフ上の垂直破線は、マウスがウイルスのIV注射を受けた時点を表す。灰色のブロックは、2週間に1回のSC抗PD1抗体処理に対する時間ウィンドウ(21日目~38日目)を示す。各グラフ上の水平破線は、動物を調査から外す基準として使用された腫瘍容積閾値を表す。
図46(表10)は、皮下B16F10腫瘍モデル調査に関する、ANCOVAを使用した、ウイルス療法誘導性腫瘍成長阻害の統計比較の結果を示している。処理の複数日後の各群における個々のマウスに関する腫瘍容積をANCOVAによって分析して、様々な処理群にわたる腫瘍成長に対する統計的に有意な阻害効果を判定した。列は、具体的な処理群ペア間の比較の統計的結果(p値)を示している。太字フォントの値は、p値≦0.05が観察された場合の比較ANCOVA結果を表す。
同じ試験ウイルスに関する生存率結果は、腫瘍成長阻害について上で報告されたものと非常に類似した成果を示した。これは、対応するLuc-GFPレポーター武装化WRウイルスと比較して、IL-2gv導入遺伝子武装化WRウイルスに伴う統計的に優れた群生存率を含んだ(図47)。アイソタイプ処理された腫瘍と比較して、抗PD-1抗体で処理されたビヒクル処理腫瘍に関して、生存率有益性は観察されなかった。しかしながら、VV3およびVV117に関しては、抗PD-1およびIgG1アイソタイプ抗体処理の間に統計的に有意な差が検出された(図48、表11)。全体として、IL-2gv導入遺伝子武装化WRウイルスバリアントのIV送達は、B16F10 SC腫瘍モデルにおける有効な抗腫瘍療法であることが判明し、ウイルスの単回の治療的投与の効力を実証した。
図47は、SC腫瘍埋め込み後18日目に組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いたIV処理後の、B16F10腫瘍を持つC57BL/6雌マウスの生存率の結果を示している。毎日、≧1400mm3の腫瘍容積に達し次第、マウスを死んだものとみなした。各群の曲線と水平破線との交点は、群の生存率中央値(50%)閾値を示す。
図48(表11)は、B16F10腫瘍モデルにおけるウイルス療法誘導性生存率の統計比較の結果を示している。生存率をモニターし、次いでログランク検定(マンテル・コックス)によって分析した。各群比較に対してP値が挙げられている。
(実施例15)
本実施例では、様々な潜在的単一および二重グリカンヒトIL-2バリアントを発現させ、導入された潜在的グリコシル化部位におけるグリコシル化についてアッセイした。
本実施例では、様々な潜在的単一および二重グリカンヒトIL-2バリアントを発現させ、導入された潜在的グリコシル化部位におけるグリコシル化についてアッセイした。
IL-2バリアントのそれぞれを、IL-2バリアントが、アミノ酸配列:GGGGSGGGGS(配列番号37)を有するリンカーを介してヒトIgG1 Fcドメインに共有結合で連結された融合タンパク質として発現させた。Fcドメインは、第1のFc鎖および第2のFc鎖を含有し、第1のFc鎖は「ノブ」アミノ酸置換を含有しかつ第2のFc鎖は「ホール」アミノ酸置換を含有して、Fc鎖の間でのヘテロ二量体形成を促進する。IL-2バリアントのN末端を、第1のFc鎖のC末端にリンカーを介して共有結合で連結させた。Fc-IL-2分子の概略は、図49に描写されている。
融合タンパク質をコードする遺伝子を調製するために、ヒトIgG1 Fc(結晶化可能なフラグメントUniProtKB:P01857)のC末端に融合したヒトIL-2(Refseq:NM_000586.3、CCDS:CCDS3726.1、UniProtKB:P60568)の内因性コドンを使用して、遺伝子合成を実施した。Fcフラグメントは、上部ヒンジ残基D221(221~447位EU番号付け)から開始し、エフェクター機能不活性化変異L234A、L235A、およびG237Aを含んだ。ノブ・イン・ホール重鎖ペアを利用して、GGGGSGGGGSリンカー(配列番号37)を使用して、ノブ鎖のC末端に単一IL-2バリアントを融合させた。ノブ鎖対合変異をY349CおよびT366Wに、ホール鎖変異をS354C、T366S、L368A、およびY407Vに作製した。定常領域は、G1mからnG1m1へのD356EおよびL358Mアロタイプ変異も含有した。遺伝子を、ATUM(Newark、CA)によって哺乳類発現ベクターpCEP4(Invitrogen)にサブクローニングした。
融合タンパク質を、供給元の使用説明書に従って、Expi293またはExpiCHO発現システム(ThermoFisher Scientific)のいずれかを使用して一過性のトランスフェクションによって発現させた。Fc-IL2融合タンパク質を、AKTA Avant 25クロマトグラフィーシステム(GE Healthcare)で、5mL HiTrap MabSelect SuReカラム(GE Heathcare)を使用したタンデムプロテインAアフィニティークロマトグラフィー、およびHiLoad 16/600 Superdex 200pgカラム(GE Healthcare)を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。精製された融合タンパク質をフィルター滅菌し、使用前に-80℃で保管した。
Fc-IL2融合タンパク質の純度および均一性を、TSKgel SuperSW mAb HRカラム(Tosoh Bioscience)でAgilent 1260 HPLCを用いた分析サイズ排除クロマトグラフィー、LabChip GXII Touch(PerkinElmer)を使用したマイクロ流体電気泳動分離、および質量分析によって評価した。精製された融合タンパク質のインタクト質量を、Acquity UPLC Protein BEH C4 300Å 1.7μmカラム(Agilent)につないだXevo G2-XS QTof Quadrupole飛行時間型質量分析計(Waters)によって確認した。
精製されたFc-IL2バリアント分子を、PNGase F処理に供して、分子がグリコシル化されたかどうか、そうである場合には、一方または両方の(適用可能である場合)導入された潜在的グリコシル化部位においてグリコシル化されたかどうかを検出した。具体的には、Fc-IL2融合タンパク質を、まず、rapid PNGase F酵素(New England Biolabs、P0710SおよびP0711S)を使用して非還元および還元条件において脱グリコシル化して、インタクトタンパク質(非還元)および還元タンパク質の質量を判定した。Fc-IL2融合タンパク質由来のN-結合型グリカンの特徴付けを、供給元のプロトコールに従って、「GlycoWorksTM RapiFluor-MSTM N-Glycan Kit」(Waters)を使用して行った。タンパク質をRapiGest溶液で処理し、変性させた。Rapid PNGase Fを添加して、N-結合型グリカンをグリコシルアミンとして放出した。消化の後、放出されたグリコシルアミンのアミノ基を、メーカーの使用説明書に従ってRFMS標識で標識した。標識されたN-グリカンを、ギ酸アンモニウムおよびアセトニトリル溶液中にてWaters親水性相互作用液体クロマトグラフィー(HILIC)μElutionプレートを使用して精製し、次いでLC-MS(Waters)によって直接分析した。
表Aは、発現させかつグリコシル化についてアッセイした、潜在的単一および二重グリカンIL-2バリアント分子を挙げている。対照として、Fc-IL2(野生型)分子も発現させかつ試験した。下で挙げられるIL-2タンパク質において、「部位1」とは、タンパク質名における第1の挙げられた潜在的グリコシル化部位であり、「部位2」とは、タンパク質名における第2の挙げられた潜在的グリコシル化部位である(適用可能である場合)。例えば、「Fc-IL2-R38N:L40T-T41N:K43T」というタンパク質において、部位1はR38N:L40Tであり、部位2はT41N:K43Tである。付加的に、グリコシル化を、PNGase F処理後に、アスパラギン酸形成の検出を通じて質量分析によっても確認した。Fcドメイン上にAsn297部位を含むグリカン修飾の総数、ならびに融合したIL-2サイトカインに特異的に起因するものが示されている。(各分子は2つのAsn297グリカンを有し、そのため各分子は少なくとも2つの総N-グリカンを有する)。
表Aに示されるように、導入されたグリコシル化部位R38N:K40T、T41N:K43T、K43N:Y45T、およびL72N:Q74Tは、関連するアスパラギン上ですべて高度にグリコシル化された(ほとんどが>99%を超えて、分子の90%を上回る割合)。部分的グリコシル化が潜在的グリコシル化部位K35Nに関して観察され、導入されたアスパラギンは中程度にグリコシル化された(分子のおよそ3分の1)。対照的に、導入された潜在的グリコシル化部位F42N:F44T、E62N:K64T、およびE68N:L70Tはグリコシル化されなかった。
(実施例16)
本実施例では、上で記載される様々な二重グリカンIL-2バリアントを、ヒトIL-2RαおよびヒトIL-2Rβへの結合アフィニティーについてアッセイした。
本実施例では、上で記載される様々な二重グリカンIL-2バリアントを、ヒトIL-2RαおよびヒトIL-2Rβへの結合アフィニティーについてアッセイした。
すべての実験をBiacore 8K表面プラズモン共鳴ベースのバイオセンサー(GE Healthcare)で実施した。精製された可溶性リガンドを、メーカーの推奨に従って、Amine Coupling Kit(GE Healthcare、製品# BR100050)を使用してCM5センサーチップに共有結合させた。濃度に幅があるHBS-EP+ランニング緩衝液(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%P-20)を、すべてのフローセルに20μL/分で7分間インジェクトした。CD25およびCD122を、それぞれ約20および約500RUの表面密度まで捕捉した。非誘導体化フローセルを参照表面として使用した。すべてのフローセルを、10μL/分の200mMホウ酸塩緩衝液pH8.5中100mMエチレンジアミンで7分間ブロッキングした。
タンパク質相互作用実験を、各スポットで25℃にてHBS-EP+(pH7.4)を使用して実施した。抗原の捕捉後、分析物(1.23、3.7、11.1、33.3、100、300、および900nMの濃度のIL-2バリアント)をすべてのフローセルに50μL/分の流速で50秒間インジェクトした。各分析物インジェクションの後、解離を5分間モニターし、その後に10mMグリシン(pH2.1)の20秒間のインジェクションを用いたすべてのフローセルの再生が続いた。二重参照目的のために、緩衝液サイクルを各サンプルに関して回収した(Myszka,D.G.、Improving biosensor analysis.J.Mol.Recognit.12、279~284(1999)に記載される二重参照)。反応速度論分析に関しては、二重参照されたセンサーグラムを、Biacore 8K Evaluation Softwareバージョン1.1.1.7442を使用して、大量輸送結合モデルに関する単純1:1ラングミュアに全体的にフィットさせた。定常状態アフィニティー分析に関しては、二重参照された平衡結合応答を、Biacore 8K Evaluation Softwareバージョン1.1.1.7442を使用して、1:1ラングミュア定常状態モデルとフィットさせた。
試験されたIL-2バリアントに関する反応速度論およびアフィニティーパラメーターが、下の表Bに示されている。
表Bに示されるように、Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45TおよびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tバリアントは、野生型IL-2 Fc融合体と同様の、ヒトIL-2Rβへの結合アフィニティーを保持する。野生型Fc-IL-2融合体は、IL-2Rβへよりも、IL-2Rαへのはるかに高い結合アフィニティーを示した。対照的に、Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45TおよびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tバリアントは、IL-2Rαへの測定可能な結合を有しない。
(実施例17)
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンIL-2バリアントを、IL-2 CD122/CD132(β/γ)受容体複合体(HH細胞)またはIL-2 CD25/CD122/CD132(α/β/γ)受容体複合体(誘導性Treg(または「iTreg」))のいずれかを含有するリンパ球の活性化についてアッセイした。
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンIL-2バリアントを、IL-2 CD122/CD132(β/γ)受容体複合体(HH細胞)またはIL-2 CD25/CD122/CD132(α/β/γ)受容体複合体(誘導性Treg(または「iTreg」))のいずれかを含有するリンパ球の活性化についてアッセイした。
実施例15に記載される様々なFc連結単一および二重グリカンIl-2バリアントを試験した。試験されたバリアントは、Fc-IL2-R38N:L40T;Fc-IL2-T41N:K43T;Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-E62N:K64T;Fc-IL2-L72N:Q74T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-K43N:Y45T-E62N:K64T;およびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tであった。加えて、Fc連結野生型ヒトIL-2(「Fc-IL2」)およびFc連結IL2v(「Fc-IL2v」)も試験した。「IL2v」とは、IL-2Rα結合を無効にする変異を有する、ヒトIL-2のバリアントである(Klein,Cら、Oncoimmunology、Vol.6、No.3、2017)。IL2vは、IL-2とIL-2Rαとの間の相互作用を排除する以下の変異:F42A、Y45A、およびL72Gを有する。加えて、IL2vは、変異T3AおよびC125Aを有する。
HH細胞およびiTregを活性化するIL-2バリアントの能力を、IL-2バリアントを用いた細胞の処理に応答したリン酸化STAT5(pSTAT5)の相対的変化をモニターすることによって測定した。pSTAT5は、IL-2シグナル伝達の下流の結果であることが公知である。HH T細胞(ATCC CRL-2105)は、IL-2受容体複合体のアルファ鎖を欠如するが、IL-2受容体複合体のベータおよびガンマ鎖を含有するT細胞の株である。iTreg細胞は、STEMCELL Technologiesから獲得されたFresh Leuko Paks(CAT#70500.1、ドナー#D001003551)から調製された。
IL-2活性化に関しては、HH細胞およびiTreg細胞を、50ul無血清RPMI 1640培地(Gibco)中に2*10e6個細胞/ウェルで播き、37℃で静置させた。静置の後、細胞を、上で挙げられたIL-2分子で処理し、次いで細胞を遠心分離によってペレットにした。
IL-2分子を用いた処理の後、細胞誘導状態をInstantOne ELISA pSTAT5検出キット(Invitrogen)によって評価した。
図50Aおよび50Bは、pSTAT5誘導の増加によって測定される、それぞれHH細胞およびiTregの活性化に対する、挙げられたIL-2バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図50Aに示されるように、試験されたIL-2バリアントのすべては、HH細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。具体的には、Fc-IL2-R38N:L40T;Fc-IL2-T41N:K43T;Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-E62N:K64T;Fc-IL2-L72N:Q74T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-K43N:Y45T-E62N:K64T;およびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tタンパク質の試験された各濃度に関して、これらの分子は、対応する濃度のFc-IL2(野生型)を用いた細胞の処理によって生み出されるのと同様の、HH細胞におけるpSTAT5光学密度(OD)の増加をもたらす。対照的に、図50Bに示されるように、試験されたIL-2バリアントのそれぞれは、野生型IL-2と比較して、iTreg細胞の活性化の低下を有する。
図50A~50Bに示されるデータに基づき、GraphaPad Prism 8を使用して、最大値の50%のpSTAT5レベルをもたらすそれぞれのFc-IL-2バリアントの濃度を算出することによって、試験されたFc-IL-2分子のそれぞれに関してEC50値を算出した。種々のFc-IL-2分子および細胞タイプに関するEC50値が、下の表Cに提供されている。
図50A、50B、および表Cに示されるように、種々のIL-2バリアント融合体のほとんどは、HH細胞を活性化することにおいて、野生型IL-2融合体と同様の効力(すなわち、10×/1桁以内)を有する(図50Aおよび表C)。対照的に、IL-2バリアントは、iTregを活性化することにおいて、野生型IL-2と比較して、有意に低下した効力(すなわち、100倍/2桁を上回る低下)を有する(図50Bおよび表C)。表Cは、HH細胞対iTreg細胞の活性化に関する各分子の選択性(EC50 HH細胞/EC50 iTreg細胞)についての判定も提供し、より高い値ほど、HH細胞対iTreg細胞に対するより大きな相対的選択性を示す。表Cに示されるように、IL-2バリアントのFc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T、Fc-IL2-K43N:Y45T-E62N:K64T、およびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tは、試験された分子のHH細胞対iTreg細胞に対する最も大きな相対的選択性を有する。
(実施例18)
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンIL-2バリアントを、ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)におけるCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞におけるSTAT5シグナル伝達のそれらの活性化について試験した。
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンIL-2バリアントを、ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)におけるCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞におけるSTAT5シグナル伝達のそれらの活性化について試験した。
IL-2バリアント-単一グリカンバリアント
本実験では、CD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞を活性化するIL-2バリアントの能力を、IL-2バリアントを用いた細胞の処理に応答したpSTAT5の相対的変化をモニターすることによって測定した。本実験において試験されるIL-2バリアントをそれぞれ、実施例15に記載されるようにヒトIgG Fcドメインに融合させた。試験されたバリアントは、Fc-IL2-K35N;Fc-IL2-R38N:L40T;Fc-IL2-T41N:K43T;Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-E62N:K64T;Fc-IL2-L72N:Q74Tであった。加えて、実施例3に記載されるFc連結野生型ヒトIL-2(「Fc-IL2」)およびFc連結IL2v(「Fc-IL2v」)も試験した。
本実験では、CD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞を活性化するIL-2バリアントの能力を、IL-2バリアントを用いた細胞の処理に応答したpSTAT5の相対的変化をモニターすることによって測定した。本実験において試験されるIL-2バリアントをそれぞれ、実施例15に記載されるようにヒトIgG Fcドメインに融合させた。試験されたバリアントは、Fc-IL2-K35N;Fc-IL2-R38N:L40T;Fc-IL2-T41N:K43T;Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-E62N:K64T;Fc-IL2-L72N:Q74Tであった。加えて、実施例3に記載されるFc連結野生型ヒトIL-2(「Fc-IL2」)およびFc連結IL2v(「Fc-IL2v」)も試験した。
健常ボランティア由来の血液を採取し、hPBMCをficoll-paque(GE Healthcare)勾配を使用して単離し、PBSで洗浄して血小板を除去し、ACK溶解緩衝液(Gibco)を使用して赤血球を取り除いた。次いで、細胞を、90ul無血清RPMI 1640培地(Gibco)中に1*10e6個細胞/ウェルで播き、37℃で2~4時間静置させた。静置の後、細胞を、表示される濃度の上で挙げられるIL-2分子(10uL)で37℃にて20分間処理し、25uLの20%PFAを、穏やかにピペッティングしながら直ちに添加した。次いで、細胞を遠心分離によってペレットにし、吸引した(400RCF、7分間)。
Phosflow Perm Buffer III(BD Biosciences)を添加し(200uL)、細胞を、凝集を阻止するために上下に一度ピペッティングすることによって穏やかに混合した。次いで、細胞を200uLのFACS緩衝液で2回洗浄し、その後に遠心分離(400RCF、7分間)によるペレット化が続いた。細胞を200uLのFACS緩衝液に再懸濁し、標準的手順によって表Dおよび表Eにおける抗体とインキュベートし、次いでFACS分析のために200uLのFACS緩衝液に懸濁した。データをFlowJo v10ソフトウェアを使用して分析した。
図51A、51B、および51Cは、細胞におけるpSTAT5の増加によって測定される、それぞれCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞の活性化に対する、挙げられたIL-2バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図51Aおよび51Bに示されるように、試験されたIL-2バリアントのすべては、CD8 T細胞およびNK細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。具体的には、Fc-IL2-K35N;Fc-IL2-R38N:L40T;Fc-IL2-T41N:K43T;Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-E62N:K64T;およびFc-IL2-L72N:Q74T分子の試験された各濃度に関して、これらの分子は、対応する濃度のFc-IL2(野生型)を用いた細胞の処理によって生み出されるのと同様の、CD8 T細胞およびNK細胞におけるpSTAT5平均蛍光強度(MFI)の増加をもたらす。対照的に、図51Cに示されるように、試験されたFc-IL-2バリアントのそれぞれは、野生型Fc-IL-2と比較して、Treg細胞の活性化の低下を有する。
図51A~51Cに示されるデータに基づき、上で記載される試験されたFc-IL-2分子のそれぞれに関してEC50値を算出した。EC50値が、下の表Fに提供されている。
CD8 T細胞対Treg細胞またはNK細胞対Treg細胞に対する、それぞれのIL-2バリアントの選択性に関する値も表Fに提供されており、より大きな数値ほど、Treg細胞と比べてCD8 T細胞またはNK細胞に対するより大きな選択性を示す。表Fに示されるように、様々なIL-2バリアントは、Fc-IL2(野生型)と同様のEC50でCD8 T細胞およびNK細胞を活性化するが、野生型融合タンパク質よりもはるかに低くTreg細胞を活性化する。同様に、Fc-IL2バリアントは、Fc-IL2(野生型)と比較して、CD8 T細胞およびNK細胞対Treg細胞に対するより大きな選択性を有する。
IL-2バリアント-二重グリカンバリアント
次に、様々な二重グリカンIL-2バリアントを試験した。本実験において試験されるIL-2バリアントはそれぞれ、実施例15に記載されるようにヒトIgG Fcドメインに共有結合で連結された。試験された二重グリカンIL-2バリアント分子は、Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-E62N:K64T;Fc-IL2-R38N:L40T-L72N:Q74T;Fc-IL2-T41N:K43T-E62N:K64T;Fc-IL2-T41N:K43T-L72N:Q74T;Fc-IL2-K43N:Y45T-E62N:K64T;およびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tであった。加えて、単一グリカンIL-2バリアント分子のFc-IL2-R38N:L40T;Fc-IL2-T41N:K43T;およびFc-IL2-K43N:Y45T、ならびにFc-IL2(野生型)およびFc-IL2vも、比較のために試験した。
次に、様々な二重グリカンIL-2バリアントを試験した。本実験において試験されるIL-2バリアントはそれぞれ、実施例15に記載されるようにヒトIgG Fcドメインに共有結合で連結された。試験された二重グリカンIL-2バリアント分子は、Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-E62N:K64T;Fc-IL2-R38N:L40T-L72N:Q74T;Fc-IL2-T41N:K43T-E62N:K64T;Fc-IL2-T41N:K43T-L72N:Q74T;Fc-IL2-K43N:Y45T-E62N:K64T;およびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tであった。加えて、単一グリカンIL-2バリアント分子のFc-IL2-R38N:L40T;Fc-IL2-T41N:K43T;およびFc-IL2-K43N:Y45T、ならびにFc-IL2(野生型)およびFc-IL2vも、比較のために試験した。
hPBMCを、単一グリカンバリアントに関する上記のように調製した。次いで、細胞を、すぐ上に挙げられるIL-2二重グリカンバリアントおよび関連対照IL-2分子で処理し、次いで、単一グリカンバリアントに関して上で記載されるように、フローサイトメトリーのために調製した。
図52A、52B、および52Cは、細胞におけるpSTAT5の増加によって測定される、それぞれCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞の活性化に対する、R38N:L40T含有二重グリカンIL-2バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図52Aおよび52Bに示されるように、試験されたIL-2バリアントのすべては、CD8 T細胞およびNK細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。対照的に、図52Cに示されるように、試験されたR38N:L40T含有二重グリカンIL-2バリアントのそれぞれは、野生型IL-2分子と比較して、Treg細胞の活性化の実質的な低下、およびまたR38N:L40T単一グリカンIL-2バリアント分子と比較して、Treg細胞の活性化の低下を有する。
図53A、53B、および53Cは、細胞におけるpSTAT5の増加によって測定される、それぞれCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞の活性化に対する、T41N:K43T含有二重グリカンIL-2バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図53Aおよび53Bに示されるように、試験されたIL-2バリアントのすべては、CD8 T細胞およびNK細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。対照的に、図53Cに示されるように、試験されたT41N:K43T含有二重グリカンIL-2バリアントのそれぞれは、野生型IL-2分子と比較して、Treg細胞の活性化の実質的な低下、およびまたT41N:K43T単一グリカンIL-2バリアント分子と比較して、Treg細胞の活性化の低下を有する。
図54A、54B、および54Cは、細胞におけるpSTAT5の増加によって測定される、それぞれCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞の活性化に対する、K43N-Y45T含有二重グリカンIL-2バリアントの様々な濃度の効果を描写している。図54Aおよび54Bに示されるように、試験されたIL-2バリアントのすべては、CD8 T細胞およびNK細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。対照的に、図54Cに示されるように、試験されたK43N-Y45T含有二重グリカンIL-2バリアントのそれぞれは、野生型IL-2分子と比較して、Treg細胞の活性化の実質的な低下を有する。
(実施例19)
本実施例では、単一の導入されたグリコシル化部位(R38N:L40T)およびアミノ酸位置62における置換を含有する様々なIL-2バリアントを、CD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞のそれらの活性化について試験した。試験されたバリアントは、Fc-IL2-R38N:L40T-E62A;Fc-IL2-R38N:L40T-E62N;Fc-IL2-R38N:L40T-E62K;およびFc-IL2-R38N:L40T-E62Rであった。加えて、二重グリカンバリアントのFc-IL2-R38N:L40T-E62N:K64T、Fc連結野生型ヒトIL-2(「Fc-IL2」)、およびFc連結IL2v(「Fc-IL2v」)も対照として試験した。CD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞を活性化するIL-2バリアントの能力を、IL-2バリアントを用いた細胞の処理に応答したリン酸化STAT5(pSTAT5)の相対的変化をモニターすることによって測定した。細胞活性化/pSTAT5アッセイを、実施例18に記載されるように実施した。
本実施例では、単一の導入されたグリコシル化部位(R38N:L40T)およびアミノ酸位置62における置換を含有する様々なIL-2バリアントを、CD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞のそれらの活性化について試験した。試験されたバリアントは、Fc-IL2-R38N:L40T-E62A;Fc-IL2-R38N:L40T-E62N;Fc-IL2-R38N:L40T-E62K;およびFc-IL2-R38N:L40T-E62Rであった。加えて、二重グリカンバリアントのFc-IL2-R38N:L40T-E62N:K64T、Fc連結野生型ヒトIL-2(「Fc-IL2」)、およびFc連結IL2v(「Fc-IL2v」)も対照として試験した。CD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞を活性化するIL-2バリアントの能力を、IL-2バリアントを用いた細胞の処理に応答したリン酸化STAT5(pSTAT5)の相対的変化をモニターすることによって測定した。細胞活性化/pSTAT5アッセイを、実施例18に記載されるように実施した。
図55A、55B、および55Cは、細胞におけるpSTAT5の増加によって測定される、それぞれCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞の活性化に対する、IL-2バリアント融合タンパク質の様々な濃度の効果を描写している。図55Aおよび55Bに示されるように、試験されたIL-2バリアントのすべては、CD8 T細胞およびNK細胞を活性化することにおいて同様の有効性を有する。対照的に、図55Cに示されるように、試験されたIL-2バリアントのそれぞれは、野生型IL-2分子と比較して、Treg細胞の活性化の実質的な低下を有する。
(実施例20)
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンIL-2バリアントを、インビボにおけるCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞の増大に対するそれらの効果について試験した。試験されたバリアントは、Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tであった。加えて、Fc連結野生型ヒトIL-2(「Fc-IL2」)およびFc連結IL2v(「Fc-IL2v」)も対照として試験した。
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンIL-2バリアントを、インビボにおけるCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞の増大に対するそれらの効果について試験した。試験されたバリアントは、Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tであった。加えて、Fc連結野生型ヒトIL-2(「Fc-IL2」)およびFc連結IL2v(「Fc-IL2v」)も対照として試験した。
マウスを、上で挙げられる分子の1種またはPBS対照を受ける群に無作為に分けた。処理群は以下のとおりであった:PBS;Fc-IL2;Fc-IL2v;Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T。Fc-IL2融合分子を、それぞれの対照またはそれらの割り当てられた群の、その濃度におけるIL-2バリアントとともに、皮下注射によって連続4日間毎日0.5、1、または2mg/kgで投薬した。免疫表現型解析を、各群から脾臓を回収することによって、最初の処理(0日目)後3日目に行った。
図56A、56B、および56Cは、細胞の倍増大によって測定される、それぞれCD8 T細胞、NK細胞、およびTreg細胞の増大に対する、挙げられた単一および二重グリカンIL-2バリアントの様々な濃度の効果を描写している。野生型Fc-IL2群において、1mg/kg群における2/3匹のマウスおよび2mg/kg群における1/3匹のマウスは、処理を生き延びなかった。図56Aおよび56Bに示されるように、Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;およびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tのそれぞれは、CD8 T細胞およびNK細胞の増大を促進し、より大きな濃度のこれらの分子ほど、CD8 T細胞およびNK細胞の増大を増加させた。対照的に、Fc-IL2およびFc-IL2vは、CD8 T細胞およびNK細胞の増大を増加させず;実際のところ、増加する濃度のこれらの分子は、全身毒性に起因してCD8 T細胞およびNK細胞の増大を減少させた。図56Cに示されるように、増加する濃度のFc-IL2;Fc-IL2v;Fc-IL2-K43N:Y45Tのそれぞれは、逆用量応答を有してTreg増殖の小幅な増加を示し、一方でFc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45TおよびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tは、すべての用量でTreg細胞の増殖に対して最小限の効果を有した。
(実施例21)
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンIL-2バリアントを、マウスにおける忍容性および腫瘍成長阻害について試験した。試験されたバリアントは、Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tであった。加えて、Fc連結野生型ヒトIL-2(「Fc-IL2」)およびFc連結IL2v(「Fc-IL2v」)も対照として試験した。
本実施例では、上で記載される様々な単一および二重グリカンIL-2バリアントを、マウスにおける忍容性および腫瘍成長阻害について試験した。試験されたバリアントは、Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tであった。加えて、Fc連結野生型ヒトIL-2(「Fc-IL2」)およびFc連結IL2v(「Fc-IL2v」)も対照として試験した。
実験の0日目に、雌C57BL/6マウスに、(1*10^7個細胞の)単一の低継代バイアルから新たに融解され、埋め込みのための十分な細胞を確立するために要される最小限の時間培養された、およそ500,000個のB16F10細胞を大腿上部において皮下に埋め込んだ。
実験の5日目に、マウスを、上で挙げられる分子の1種または対照を受ける群に無作為に分けた。処理群は以下のとおりであった:PBS;Fc-IL2;Fc-IL2v;Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;Fc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T。Fc-IL2融合分子を、それぞれの対照またはそれらの割り当てられた群の、その濃度におけるバリアントFc-IL2融合分子とともに、皮下注射によって5、6、7、および8日目に1mg/kgで投薬した。15匹の動物の群を維持して、1mg/kg用量の忍容性および腫瘍成長阻害を査定した。腫瘍容積、体重、および動物生存率を、実験の経過を通じて追跡した。腫瘍がおよそ2000mm^3に達し次第、または処理の2週間後に、動物を屠殺した。
生存率および腫瘍成長阻害を、図57Aおよび57Bに示されるように、処理群の開始投薬からおよそ2週間にわたってモニターした。忍容性は、他の実施例に見られるように、IL-Ra結合の減衰の程度と相関した。Fc-IL2およびFc-IL2v対照分子群は、8日目までの生存を有せず、同様の忍容性が示された(図57A)。Fc-IL2-K43N:Y45Tは、7/15匹のマウスを有して中間の生存率を有した。二重グリカンバリアントのFc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45TおよびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tで処理された群は、最初の処理後12日目に11/15匹および14/15匹の生存マウスを有した。腫瘍成長阻害を、PBS対照と比較して、より良好な忍容性が示されたFc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45TおよびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74T群からの生存マウスに対して査定した。図57Bに示されるように、Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45TおよびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tで処理されたマウスに関して、有意な腫瘍成長阻害が観察された。
これらの実験は、Fc-IL2-K43N:Y45T;Fc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45T;およびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tタンパク質が、Fc-IL2およびFc-IL2vよりもマウスにおいて良好な忍容性が示されること、ならびにFc-IL2-R38N:L40T-K43N:Y45TおよびFc-IL2-K43N:Y45T-L72N:Q74Tが腫瘍成長阻害活性を有することを示している。
(実施例22)
ヒト腫瘍細胞株のパネルにおけるVV110のインビトロ効力
VV110およびVV12(JX-594模倣体)を、NSCLC、黒色腫、RCC、CRC、およびHCC適応症由来のヒト腫瘍細胞株のパネルにおける細胞毒性アッセイにおいて試験した。細胞をそれらの対応する完全培地中で培養した。細胞を、アッセイの当日にコンフルエントの単層を形成するように、細胞タイプ特異的播種密度で96ウェルプレートにアッセイの24時間前に播いた。試験ウイルスを、2.5%FBSを含有する細胞株特異的培地中に、30の開始MOIから連続希釈した(1:5)。培地吸引後、細胞に、ウイルス(30~1.54×10-5のMOIの)を感染させた。次いで、プレートを、37℃、5%CO2インキュベーターにおいて48、72、または96時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、CCK-8試薬を各ウェルに添加し、450nmにおける吸光度をSpectraMax i3Xを使用して読み取った。データを、細胞のみ(100%生存能)および溶解された細胞のみ対照(0%生存能)に対して正規化した。EC50を、4パラメーターロジスティックフィットを使用して算出した。EC50および最大殺滅%を各時点に関して報告した。
ヒト腫瘍細胞株のパネルにおけるVV110のインビトロ効力
VV110およびVV12(JX-594模倣体)を、NSCLC、黒色腫、RCC、CRC、およびHCC適応症由来のヒト腫瘍細胞株のパネルにおける細胞毒性アッセイにおいて試験した。細胞をそれらの対応する完全培地中で培養した。細胞を、アッセイの当日にコンフルエントの単層を形成するように、細胞タイプ特異的播種密度で96ウェルプレートにアッセイの24時間前に播いた。試験ウイルスを、2.5%FBSを含有する細胞株特異的培地中に、30の開始MOIから連続希釈した(1:5)。培地吸引後、細胞に、ウイルス(30~1.54×10-5のMOIの)を感染させた。次いで、プレートを、37℃、5%CO2インキュベーターにおいて48、72、または96時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、CCK-8試薬を各ウェルに添加し、450nmにおける吸光度をSpectraMax i3Xを使用して読み取った。データを、細胞のみ(100%生存能)および溶解された細胞のみ対照(0%生存能)に対して正規化した。EC50を、4パラメーターロジスティックフィットを使用して算出した。EC50および最大殺滅%を各時点に関して報告した。
試験された細胞株のすべては、感染、ならびに細胞株に応じて感染の2~4日後に観察される≧90%の殺滅を有して、VV110およびVV12の両方によって誘導されるインビトロでの腫瘍溶解を受けやすかった(図58)。VV110の効力は、試験された最も感受性の高い株(769-P)に対する2.52×10-4PFU/細胞から、試験された最も感受性の低い株(SK-MEL-5)に対する7.08×10-1PFU/細胞に及び、他のものよりもVV110に対して一貫してより感受性であるまたは抵抗性である腫瘍適応症はなかった(図59)。試験されたすべての細胞株は、JX-594模倣体であるVV12にも感受性であった。VV110と比べたVV12のEC50比を算出し、VV110は、15種の腫瘍細胞株のうち13種において、VV12と比較してより高いインビトロ効力を示した(図60)。
図58:感染後48、72、および96時間の時点での最大ヒト腫瘍細胞殺滅パーセンテージ。ヒト腫瘍細胞株に、VV110またはVV12(JX-594)を48、72、または96時間感染させ、その時点で細胞生存能を判定した。平均±SDとして表されたデータ。
図59:感染後48、72、および96時間の時点でのヒト腫瘍細胞株におけるVV110およびVV12の効力。ヒト腫瘍細胞株に、VV110またはVV12(JX-594)を72時間感染させ、その時点で細胞生存能を判定し、EC50(pfu/細胞)を4-PLロジスティックフィットを使用して算出した。平均±SDとして表されたデータ。
図60:ヒト腫瘍細胞株におけるVV110およびVV12の相対的効力(EC50比)。ヒト腫瘍細胞株に、VV110またはVV12(JX-594)を72時間感染させ、その時点で細胞生存能を判定し、EC50(pfu/細胞)を4-PLロジスティックフィットを使用して算出した。VV110と比べたVV12のEC50比を算出した。平均±SDとして表されたデータ。
(実施例23)
カニクイザルにおけるVV110のIV投与後に生じる自然発生的皮膚病変の局部アシクロビル処理
カニクイザルは、調査1日目にIV投与により5×107PFUのVV110を受けた。動物は、調査5日目までに自然発生的皮膚病変を発症し、その時点で、局部アシクロビル(ゾビラックス)を用いた病変処理なし(群1)またはあり(群2)での、病変進行およびウイルス排出の検討のために、3つの病変を含有するエリアを同定した。処理を受けた動物は、エリアに局部アシクロビルを11日間1日4回(2時間間隔)適用された。病変進行を写真で記録した。病変からのウイルス排出を5、7、および9日目に査定した。個々の病変のスワブを回収し、U2OSプラークアッセイにおける感染性ウイルス力価に対するアッセイの前に-80℃で保管した。簡潔には、U-2OS細胞を、6ウェルプレートにおいて、力価アッセイのおよそ24時間前に播いた。1mLのPBSをスワブに添加し、サンプルを超音波処理した。培地を細胞から除去し、700μLの連続希釈されたウイルス/スワブサンプルを添加した。37℃インキュベーターにおける2時間のインキュベーションの後、接種源を除去し、2mLの1.5%CMC、10%FBS、0.5×マッコイ重層を各ウェルに添加した。プレートを37℃インキュベーターにおいて48時間インキュベートした。このインキュベーション期間の終了時に、プレートをDPBS中で1回洗浄し、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで1時間染色し、次いで水で洗浄した。画像をImmunospot S6 MACRO Analyzerを用いて取得した。プラークをCTL ImmunoSpotソフトウェアを使用してカウントし、力価(PFU/mL)を判定した。
カニクイザルにおけるVV110のIV投与後に生じる自然発生的皮膚病変の局部アシクロビル処理
カニクイザルは、調査1日目にIV投与により5×107PFUのVV110を受けた。動物は、調査5日目までに自然発生的皮膚病変を発症し、その時点で、局部アシクロビル(ゾビラックス)を用いた病変処理なし(群1)またはあり(群2)での、病変進行およびウイルス排出の検討のために、3つの病変を含有するエリアを同定した。処理を受けた動物は、エリアに局部アシクロビルを11日間1日4回(2時間間隔)適用された。病変進行を写真で記録した。病変からのウイルス排出を5、7、および9日目に査定した。個々の病変のスワブを回収し、U2OSプラークアッセイにおける感染性ウイルス力価に対するアッセイの前に-80℃で保管した。簡潔には、U-2OS細胞を、6ウェルプレートにおいて、力価アッセイのおよそ24時間前に播いた。1mLのPBSをスワブに添加し、サンプルを超音波処理した。培地を細胞から除去し、700μLの連続希釈されたウイルス/スワブサンプルを添加した。37℃インキュベーターにおける2時間のインキュベーションの後、接種源を除去し、2mLの1.5%CMC、10%FBS、0.5×マッコイ重層を各ウェルに添加した。プレートを37℃インキュベーターにおいて48時間インキュベートした。このインキュベーション期間の終了時に、プレートをDPBS中で1回洗浄し、細胞を固定し、クリスタルバイオレットで1時間染色し、次いで水で洗浄した。画像をImmunospot S6 MACRO Analyzerを用いて取得した。プラークをCTL ImmunoSpotソフトウェアを使用してカウントし、力価(PFU/mL)を判定した。
局部アシクロビル処理を受けなかった動物である群1の病変は、およそ15~17日目までに解消した。局部アシクロビルで処理された群2の動物の病変は、およそ11~13日目までにより急速に解消した。群1において、病変スワブ力価は、5日目の71~1060PFU/mLから7日目の<3~73,000PFU/mLに及び、一方で群2の動物において、ACVで処理された病変からの病変スワブ力価は、5日目の14~9,710PFU/mLから7日目の3~54PFUに及んだ。9日目および11日目に、病変スワブのいずれも、いかなる検出可能な感染力価も有しなかった。平均すると、ACVで処理された病変のスワブからの感染性ウイルス力価(群2)は、未処理病変から検出されたもの(群1)よりも、より短い継続期間にわたって分量が減少した(図61)。
図61:局部アシクロビル処理の有無での、カニクイザルへのVV110のIV投与後に生じる自然発生的皮膚病変からの感染性ウイルス力価。局部アシクロビル投与なし(群1)またはあり(群2)で、5×107PFUのVV110をIVに受けた動物の個々の皮膚病変からスワブを回収した。
これらのデータは、VV110に含まれるHSV TK.007安全性「オフスイッチ」が、局部抗ウイルス薬にウイルス感受性を付与し、VV治療後に一部の癌患者において生じ得る自然発生的皮膚病変からのウイルス排出の重症度、継続期間、およびレベルを低下させる潜在的手段を提供するという概念を支持する。
Claims (50)
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトインターロイキン2(IL-2)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含む単離されたヒトIL-2バリアントであって、
a)K35、
b)R38およびL40の両方、
c)T41およびK43の両方、
d)K43およびY45の両方、
e)E62およびK64の両方、ならびに
f)L72およびQ74の両方
からなる群から選択されるアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含む、単離されたヒトIL-2バリアント。 - a)請求項1に記載のIL-2バリアント;およびb)ヒト抗体のFc領域を含む単離された融合タンパク質であって、IL-2バリアントはFc領域に共有結合で連結されている、単離された融合タンパク質。
- 請求項1に記載のIL-2バリアントをコードする、単離された核酸。
- 請求項3に記載の単離された核酸を含む宿主細胞。
- 請求項1に記載のIL-2バリアントを含む医薬組成物。
- 請求項5に記載の医薬組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与する工程を含む、対象における癌を治療するための方法。
- 請求項1に記載のIL-2バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え腫瘍溶解性ウイルス(OV)。
- IL-2バリアントは、
a)K35(K35置換はK35Nである)、
b)R38およびL40の両方(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
c)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
d)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
e)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、ならびに
f)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)
からなる群から選択されるアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含む、請求項7に記載のOV。 - IL-2バリアントはK35位に置換を含み、IL-2バリアントは、
a)R38およびL40の両方(R38置換はR38Nであり、L40置換はL40SまたはL40Tである)、
b)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
c)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
d)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
e)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
f)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、請求項7に記載のOV。 - IL-2バリアントはR38およびL40位に置換を含み、IL-2バリアントは、
a)T41およびK43の両方(T41置換はT41Nであり、K43置換はK43SまたはK43Tである)、
b)K43およびY45の両方(K43置換はK43Nであり、Y45置換はY45SまたはY45Tである)、
c)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
d)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
e)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、請求項7に記載のOV。 - IL-2バリアントはT41およびK43位に置換を含み、IL-2バリアントは、
a)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
b)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
c)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、請求項7に記載のOV。 - IL-2バリアントはK43およびY45位に置換を含み、IL-2バリアントは、
a)E62およびK64の両方(E62置換はE62Nであり、K64置換はK64SまたはK64Tである)、
b)L72およびQ74の両方(L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである)、ならびに
c)E62(E62置換はE62N、E62A、E62K、またはE62Rである)
からなる群から選択される位置に置換をさらに含む、請求項7に記載のOV。 - IL-2バリアントはE62およびK64位に置換を含み、IL-2バリアントはL72およびQ74位に置換をさらに含み、L72置換はL72Nであり、Q74置換はQ74SまたはQ74Tである、請求項7に記載のOV。
- IL-2バリアントは、R38、L40、K43、およびY45位に置換を含む、請求項7に記載のOV。
- IL-2バリアントは、アミノ酸置換R38N、L40T、K43N、およびY45Tを含む、請求項7に記載のOV。
- IL-2バリアントは、配列番号29または配列番号31のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のOV。
- IL-2バリアントは、アミノ酸位置K43、Y45、L72、およびQ74に置換を含む、請求項7に記載のOV。
- IL-2バリアントは、アミノ酸置換K43N、Y45T、L72N、およびQ74Tを含む、請求項7に記載のOV。
- IL-2バリアントは、配列番号33または配列番号35のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載のOV。
- IL-2vポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項7から19のいずれか一項に記載のOV。
- 調節可能なプロモーターは、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン類似体もしくは誘導体によって調節される、請求項15に記載のOV。
- 異種チミジンキナーゼ(TK)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項7から21のいずれか一項に記載のOV。
- 異種TKポリペプチドは、デオキシグアノシンのリン酸化を触媒し得る、請求項22に記載のOV。
- 異種TKポリペプチドは、バリアント単純ヘルペスウイルス(HSV)TKポリペプチドである、請求項22または23に記載のOV。
- バリアントHSV TKポリペプチドは、野生型HSV TKと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号1の野生型HSV TKアミノ酸配列のアミノ酸番号付けに基づくL159、I160、F161、A168、およびL169のうちの1つまたは複数の置換を含む、請求項24に記載のOV。
- バリアントHSV TKポリペプチドはA168H置換を含む、請求項25に記載のOV。
- バリアントHSV TKポリペプチドは、L159I置換、I160L置換、F161A置換、A168Y置換、およびL169F置換を含む、請求項25に記載のOV。
- バリアントHSV TKポリペプチドは、L159I置換、I160F置換、F161L置換、A168F置換、およびL169M置換を含む、請求項25に記載のOV。
- バリアントHSV TKポリペプチドは、配列番号26、27、または28のアミノ酸配列を含む、請求項25に記載のOV。
- K151E置換を含むA34R遺伝子を含む、請求項7から29のいずれか一項に記載のOV。
- ワクシニアチミジンキナーゼを欠損した状態にする改変を含む、請求項7から30のいずれか一項に記載のOV。
- ワクシニアチミジンキナーゼを欠損した状態にする改変は、J2R遺伝子のすべてまたは一部分の欠失である、請求項31に記載のOV。
- ワクシニアウイルスである、請求項7から27のいずれか一項に記載のOV。
- ワクシニアウイルスはコペンハーゲン系統である、請求項33に記載のOV。
- ワクシニアウイルスはウェスタンリザーブ(WR)系統である、請求項33に記載のOV。
- そのゲノムに、(1)配列番号29のアミノ酸配列を含むバリアントインターロイキン-2(IL-2v)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(2)配列番号28のアミノ酸配列を含む異種チミジンキナーゼ(TK)ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および(3)A34R遺伝子におけるK151E置換を含む組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス(OV)であって、コペンハーゲン系統ワクシニアウイルスであり、ワクシニアチミジンキナーゼ欠損である、組み換えOV。
- a)請求項7から36のいずれか一項に記載のOV;およびb)薬学的に許容できる担体を含む組成物。
- 請求項7から36のいずれか一項に記載のOVまたは請求項37に記載の組成物の有効量を個体に投与する工程を含む、癌を有する個体における癌を治療する方法。
- 癌は、脳腫瘍、頭頸部癌、食道癌、皮膚癌、肺癌、胸腺癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、精巣癌、直腸癌、乳癌、または膵臓癌である、請求項38に記載の方法。
- 癌は、結腸直腸腺癌、非小細胞肺癌腫、またはトリプルネガティブ乳癌である、請求項37に記載の方法。
- 癌は再発性である、請求項38から40のいずれか一項に記載の方法。
- 癌は原発性腫瘍である、請求項38から41のいずれか一項に記載の方法。
- 癌は転移性である、請求項38から41のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の癌療法を個体に投与する工程をさらに含む、請求項38から43のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の癌療法は、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、抗血管療法、凍結療法、毒素療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、細胞療法、および手術から選択される、請求項44に記載の方法。
- 第2の癌療法は、抗PD1抗体または抗PD-L1抗体を含む、請求項44に記載の方法。
- 個体は免疫欠陥がある、請求項38から46のいずれか一項に記載の方法。
- OVまたは組成物の前記投与は、腫瘍内、腫瘍周辺、動脈内、膀胱内、髄腔内、または静脈内投与である、請求項38から47のいずれか一項に記載の方法。
- a)請求項22から29のいずれか一項に記載の組み換え腫瘍溶解性ウイルスの有効量;およびb)腫瘍溶解性ウイルスの有害な副作用を低下させるのに有効である量の2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体を個体に投与する工程を含む、個体における癌を治療する方法。
- 2’-デオキシ-グアノシンの合成類似体は、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、バラシクロビル、およびバルガンシクロビルからなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
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